BRPI0707824A2 - antigen-binding protein, and methods of neutralizing tyrosine kinase receptor activation, inhibiting angiogenesis, reducing tumor growth and producing an antigen-binding protein - Google Patents

Abstract

PROTEINA DE LIGAÇçO A ANTÍGENO, E, METODOS DE NEUTRALIZAÇçO DA ATIVAÇçO DE UM RECEPTOR DE TIROSINA QUINASE, DE INIBIÇçO DE ANGIOGÊNESE, DE REDUÇçO DE CRESCIMENTO DE TUMOR E DE PRODUÇçO DE UMA PROTEÍNA DE LIGAÇçO A ANTÍGENO A invenção é dirigida a novos anticorpos que compreende sítios de ligação de domínio único. Os anticorpos podem ser bivalentes ou multivalentes, e podem ser biespecificos. A invenção é ainda dirigida a anticorpos monoespecíficos e biespecificos, que ligam a mPDGFR<244>. Os anticorpos podem ser administrados sozinhos ou em combinação com drogas antiangiogénicas ou antineoplásícas.ANTIGEN BINDING PROTEIN AND METHODS FOR NEUTRALIZING THE ACTIVATION OF A THYROSINE KINASE RECEPTOR, ANGIOGENESIS INHIBITION, REDUCING TUMOR GROWTH ANTIBODIES AND UNDERSTANDING A ANTIGENE PROTEIN PROTECTION single domain link sites. Antibodies can be bivalent or multivalent, and can be bispecific. The invention is also directed to monospecific and bispecific antibodies, which bind to mPDGFR <244>. Antibodies can be administered alone or in combination with antiangiogenic or antineoplastic drugs.

Description

"PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, E, MÉTODOS DENEUTRALIZAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE UM RECEPTOR DE TIROSINAQUINASE, DE INIBIÇÃO DE ANGIOGÊNESE, DE REDUÇÃO DECRESCIMENTO DE TUMOR E DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNADE LIGAÇÃO A ANTÍGENO""ANTIGEN-BINDING PROTEIN AND METHODS DEENUTRALIZATION OF A TYROSINKINASE RECEIVER, ANGIOGENESIS INHIBITION, TUMOR GROWTH REDUCTION AND PRODUCTION OF ANTIGEN-BINDING PROTEIN"

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOSCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

Este pedido reivindica prioridade para pedido US 60/773.994,depositado em 15 de fevereiro de 2006, que é aqui incorporado por referênciaem sua totalidade.This application claims priority for application US 60 / 773,994, filed February 15, 2006, which is incorporated herein by reference in its entirety.

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION

A presente invenção é dirigida a novos anticorpos, quecompreendem sítios de ligação a domínio único. Os anticorpos podem serbivalentes ou multivalentes, e podem ser específicos ou multiespecíficos.Também são descritos anticorpos biespecíficos e multiespecíficos que ligam aproteínas de receptor de superfície. Quando administrados a um indivíduosozinhos ou em combinação com fármacos angiogênicas ou antineoplásicas,os anticorpos podem ser usados para inibir o crescimento de tumores bemcomo inibir as doenças hiperproliferativas.The present invention is directed to novel antibodies comprising single domain binding sites. Antibodies may be bivalent or multivalent, and may be specific or multispecific. Bispecific and multispecific antibodies that bind surface receptor proteins are also described. When administered to a single individual or in combination with angiogenic or antineoplastic drugs, antibodies may be used to inhibit tumor growth as well as inhibit hyperproliferative diseases.

ANTECEDENTESBACKGROUND

Anticorpos biespecíficos (BsAb) são moléculas baseadas emimunoglobulina (Ig) que ligam a dois epítopos diferentes nos mesmos ou emantígenos distintos. Tanto os estudos de laboratório como clínicos recentesdemonstram que BsAb pode ter aplicações significativas em terapia decâncer, por exemplo marcando no alvo as células de tumor com agentescitotóxicos como células efetoras, radionuclídeos, fármacos e toxinas (Weineret al., 1997, Câncer Immunol. Immunother. 45: 190-2; van Spriel et al., 2000,Immunol. Today 21: 391-7; Segai et al., 2000, J. Immunol. Methods 248: Ι-ό), ou marcando simultaneamente dois alvos de tumor diferentes (ouepítopos) a fim de melhorar as atividades biológicas de terapêuticos deanticorpos individuais (Lu et ai., 1999, J. Immunol. Methods 230: 159-71; Luet al., 2001, Câncer Res. 61: 7002-8; Lu et al., 2002, J. Immunol. Methods267: 213-26). Um obstáculo principal no desenvolvimento de agentesterapêuticos com base em BsAb é a dificuldade em produzir os materiais comqualidade e quantidade suficientes para estudos clínicos via métodostradicionais, incluindo hibridoma híbrido e conjugação química (Carter et al.,1995, J. Hemotherapy 4: 463-70). A co-expressão de dois conjuntosdiferentes de cadeias leves e pesadas de IgG pode resultar em uma variedadede pares de cadeias leves e pesadas, somente um dos quais é o heterodímerobiespecífico funcional desejado (Suresh et al., 1986, Methods Enzymol. 121:210-28). Por outro lado, a reticulação química de dois IgGs ou seusfragmentos é com freqüência ineficiente e pode levar à perda de atividade doanticorpo (Zhu et al., 1994, Câncer Lett. 86: 127-34). Em ambos os métodos,a purificação de BsAb de espécies não naturais, como homodímeros eheterodímeros com pares errados de cadeias leves e pesadas de Ig nãocognatas produzidos pelo hibridoma híbrido, e agregados multiméricosresultantes de conjugação química, é com freqüência difícil e o rendimento égeralmente baixo (Cao et al., 1998, Bioconj. Chem. 9: 635-44).Bispecific antibodies (BsAb) are immunoglobulin (Ig) -based molecules that bind to two different epitopes on the same or distinct antigens. Recent laboratory and clinical studies have shown that BsAb can have significant applications in cancer therapy, for example targeting tumor cells with cytotoxic agents such as effector cells, radionuclides, drugs and toxins (Weineret al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 190-2; van Spriel et al., 2000, Immunol Today 21: 391-7; Segai et al., 2000, J. Immunol. Methods 248: Ι-○), or simultaneously marking two different tumor targets (or epitopes) in order to improve the biological activities of individual antibody therapies (Lu et al., 1999, J. Immunol. Methods 230: 159-71; Luet al., 2001, Cancer Res. 61: 7002-8; Lu et al., 2002, J. Immunol. Methods 267: 213-26). A major obstacle in the development of BsAb-based therapeutic agents is the difficulty in producing materials of sufficient quality and quantity for clinical studies via traditional methods, including hybrid hybridoma and chemical conjugation (Carter et al., 1995, J. Hemotherapy 4: 463-70. ). Coexpression of two different sets of IgG light and heavy chains may result in a variety of heavy and light chain pairs, only one of which is the desired functional heterodimeric (Suresh et al., 1986, Methods Enzymol. 121: 210- 28). On the other hand, chemical cross-linking of two IgGs or their fragments is often inefficient and can lead to loss of antibody activity (Zhu et al., 1994, Cancer Lett. 86: 127-34). In both methods, purification of BsAb from unnatural species, such as homodimers and heterodimers with mismatched light and heavy chain Ig chains produced by the hybrid hybridoma, and multimeric aggregates resulting from chemical conjugation, is often difficult and the yield is generally low ( Cao et al., 1998, Bioconj. Chem. 9: 635-44).

Para melhorar a eficiência, vários métodos recombinantesforam desenvolvidos para a produção de BsAb, tanto como fragmentos deanticorpos (Carter et al., 1995; Pluckthun et al., 1997, Immunotechnology 3:83-105; Todorovska et al., 2001, J. Immunol. Methods 248: 47-66) comoformatos de IgG de comprimento completo (Carter, 2001, J. Immunol.Methods 248: 7-15). Por exemplo, a produção de BsAb de tipo de IgG decomprimento completo, homogênea, é obtida pela assim chamada engenhariade "nós-em-furos" para a heterodimerização eficiente do domínio Ch3(Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; Merchant et al., 1998, Nat.Biotech. 16: 677-81) e fusionando dois Fv de cadeia única (scFv) deespecificidades diferentes em qualquer um dos términos N ou C de umamolécula de IgG de comprimento completo (Zhuang et al., 2000, Protein Eng.13: 361-7; Coloma e Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 159-63). Os BsAbstambém são construídos fusionando geneticamente Fv de cadeia única (scFv)ou fragmentos Fab com ou sem o uso de ligadores flexíveis (Mallender et al.,1994, J. Biol. Chem. 269: 199-206; Mack et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sei.USA. 92: 7021-5; Zapata et al., 1995, Protein Eng. 8: 1057-62), via umdispositivo de dimerização como zipper de leucina (Kostelny et al., 1992, J.Immunol. 148: 1547-53; de Kruifet al., 1996, J. Biol.. Chem. 271: 7630-4), edomínios CL/CHI de Ig (Muller et al., 1998, FEBS Lett. 422: 259-64); pordiacorpo (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90: 6444-8; Zhuet al., 1996, Bio/Technology (NY) 14: 192-6); fusão Fab-scFv (Lu et al.,2002; Schoonjans et al., 2000, J. Immunol. 165: 7050-7); e formatos de mini-anticorpos (Pack et al., 1992, Biochemistry 31: 1579-84; Pack et al., 1993,Bio/Technology 11; 1271-7). Na maioria dos casos, estas abordagensrecombinantes resultam na produção de moléculas de anticorpos biespecíficosdivalentes que são monovalentes em cada um dos antígenos alvo. Além disso,os exemplos de anticorpos biespecíficos de tipo de a IgG compreendendodomínios Fc funcionais são limitados.To improve efficiency, various recombinant methods have been developed for the production of BsAb as both antibody fragments (Carter et al., 1995; Pluckthun et al., 1997, Immunotechnology 3: 83-105; Todorovska et al., 2001, J. Methods 248: 47-66) as full length IgG formates (Carter, 2001, J. Immunol.Methods 248: 7-15). For example, the production of homogeneous full-length IgG-type BsAb is achieved by so-called "we-in-hole" engineering for efficient heterodimerization of the Ch3 domain (Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617 Merchant et al., 1998, Nat.Biotech 16: 677-81) and fusing two single-chain Fv (scFv) of different specificities at either the N or C terminus of a full-length IgG molecule (Zhuang et al., 2000, Protein Eng. 13: 361-7; Coloma and Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15: 159-63). BsAbs are also constructed by genetically fusing single-stranded Fv (scFv) or Fab fragments with or without the use of flexible linkers (Mallender et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 199-206; Mack et al., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92: 7021-5 Zapata et al 1995 Protein Eng 8: 1057-62 via a leucine zipper dimerization device (Kostelny et al 1992). J. Immunol 148: 1547-53; from Kruifet al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 7630-4), Ig CL / CHI domains (Muller et al., 1998, FEBS Lett. 422: 259-64); poriacibody (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-8; Zhuet al., 1996, Bio / Technology (NY) 14: 192-6); Fab-scFv fusion (Lu et al., 2002; Schoonjans et al., 2000, J. Immunol. 165: 7050-7); and mini-antibody formats (Pack et al., 1992, Biochemistry 31: 1579-84; Pack et al., 1993, Bio / Technology 11; 1271-7). In most cases, these recombinant approaches result in the production of divalent bispecific antibody molecules that are monovalent in each of the target antigens. In addition, examples of IgG bispecific antibodies comprising functional Fc domains are limited.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

A invenção provê novos anticorpos biespecíficos quecompreendem sítios de ligação a antígeno de domínio variável único (sVD).Os anticorpos da invenção também podem incluir sítios de ligação a antígenoque compreendem sítios de ligação a anticorpos Fvs além de sítios de ligaçãoa antígenos VD.The invention provides novel bispecific antibodies comprising single variable domain antigen (sVD) binding sites. Antibodies of the invention may also include antigen binding sites which comprise Fvs antibody binding sites in addition to VD antigen binding sites.

Anticorpos da invenção podem ser específicos para qualquerantígeno. Em uma forma de realização, um anticorpo da invenção liga-se aum antígeno de superfície de célula, que pode ser um receptor tirosina quinase(incluindo, mas não limitado a PDGFR, VEGFRl, VEGFR2, EGFR). Emuma outra forma de realização, um anticorpo da invenção liga um ligando deum receptor de superfície de célula. Em uma forma de realização preferida,um anticorpo da invenção tem atividade de neutralização de receptor. Ainvenção ainda provê composições farmacêuticas dos anticorpos.Antibodies of the invention may be specific for any antigen. In one embodiment, an antibody of the invention binds to a cell surface antigen, which may be a receptor tyrosine kinase (including, but not limited to, PDGFR, VEGFR1, VEGFR2, EGFR). In another embodiment, an antibody of the invention binds a ligand from a cell surface receptor. In a preferred embodiment, an antibody of the invention has receptor neutralizing activity. The invention further provides pharmaceutical compositions of the antibodies.

A presente invenção provê métodos para a inibição da ativaçãode um ou mais receptores tirosina quinases. O crescimento de tumor em ummamífero pode ser tratado ou inibido administrando-se ao mamífero umaquantidade eficaz de um anticorpo presente. Os anticorpos presentes podemser co-administrados com anticorpos que se ligam a outro antígeno desuperfície de célula (incluindo, por exemplo, RTKs) ou citoquinas (incluindo,por exemplo, ligandos de RTK). Em determinadas formas de realização, osmétodos também compreendem a administração ao mamífero de um agenteantineoplásico ou tratamento, incluindo, por exemplo, um agentequimioterapêutico e/ou radiação. Em uma outra forma de realização, ainvenção provê um método para o tratamento de uma doençahiperproliferativa não câncer, por exemplo, psoríase, em um mamífero.The present invention provides methods for inhibiting activation of one or more receptor tyrosine kinases. Tumor growth in a mammal can be treated or inhibited by administering to the mammal an effective amount of an antibody present. Antibodies present may be co-administered with antibodies that bind to another cell surface antigen (including, for example, RTKs) or cytokines (including, for example, RTK ligands). In certain embodiments, the methods also comprise administering to the mammal an antineoplastic agent or treatment, including, for example, a chemotherapeutic agent and / or radiation. In another embodiment, the invention provides a method for treating a non-cancer hyperproliferative disease, e.g., psoriasis, in a mammal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

A figura 1 é um diagrama esquemático mostrando exemplos deproteínas de ligação a antígeno biespecíficas baseadas em anticorpo dedomínio único da invenção. O domínio único (designado VH2 no desenho)pode ser incorporado por fusão aos término N ou término C de outrosdomínios de anticorpos.Figure 1 is a schematic diagram showing examples of single domain antibody-based bispecific antigen binding proteins of the invention. The single domain (designated VH2 in the drawing) may be incorporated by fusion to the N-terminus or C-terminus of other antibody domains.

A figura 2 mostra a expressão e purificação de Fabsespecíficos de mPDGFRa. Os Fabs foram expressados em células HB2151hospedeiras de E. coli, purificados por cromatografia de afinidade eanalisados por SDS-PAGE. A) Fabs específicos de mPDGFRa "padrão"tendo cadeias pesadas (Vh-ChI) e leves (Vl-Cl) de peso molecular similar. B)Fragmentos de Fab 1F2 e 1F9 faltando domínios Vl e um controle de Fabpadrão na presença ou ausência de DTT. Os marcadores de peso molecularsão expressos em kilodaltons.A figura 3 mostra testes de ligação e de bloqueio de Fabspurificados. A) ELISA de ligação quantitativo de Fabs purificados emPDGFRa de murino. Várias quantidades de Fabs foram primeiro incubadasem uma placa de 96 cavidades pré-revestida com proteína de fusãomPDGFRa-Fc seguido por incubação com um conjugado de anticorpo - HRPanti-anti-humano- κ de coelho. Anticorpo - HRP ligado à placa foiquantificado pela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foi lida aA450 nm. B) Inibição da ligação de mPDGFRa a PDGF-AA imobilizado porFabs purificados. Várias quantidades de Fabs foram incubadas com umaquantidade fixa de mPDGFRa /Fc em solução. As misturas foram incubadasem placas de 96 cavidades revestidas com PDGF-AA seguido pelo conjugadoanticorpo-HRP anti-humano-Fc. mPDGFRa ligado foi então quantificadopela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foi lida a A450 nm. Osdados mostrados representam a média ± desvio padrão de amostras emduplicata.Figure 2 shows expression and purification of mPDGFRα specific Fabs. Fabs were expressed in E. coli host HB2151 cells, purified by affinity chromatography and assayed by SDS-PAGE. A) "Standard" mPDGFRa specific Fabs having heavy (Vh-ChI) and light (Vl-Cl) chains of similar molecular weight. B) Fab fragments 1F2 and 1F9 missing V1 domains and a standard Fab control in the presence or absence of DTT. Molecular weight markers are expressed in kilodaltons. Figure 3 shows binding and blocking of Fabspurified tests. A) Quantitative binding ELISA of purified Fabs in murine PDGFRα. Various amounts of Fabs were first incubated in a 96-well plate pre-coated with PDGFRa-Fc fusion protein followed by incubation with a rabbit HRPanti-anti-human-κ antibody conjugate. Plate - bound HRP antibody was quantified by the addition of peroxidase substrate, and the absorbance was read at A450 nm. B) Inhibition of binding of mPDGFRα to PDGF-AA immobilized by purified Fabs. Various amounts of Fabs were incubated with a fixed amount of mPDGFRa / Fc in solution. The mixtures were incubated in PDGF-AA coated 96-well plates followed by the anti-human-Fc-HRP-antibody conjugate. Bound mPDGFRα was then quantified by the addition of peroxidase substrate, and absorbance was read at A450 nm. The data shown represent the mean ± standard deviation of samples in duplicate.

A figura 4 descreve estruturas de Fabs monovalentes ebivalentes da invenção.Figure 4 depicts ebivalent monovalent Fabs structures of the invention.

A figura 5 mostra a expressão e purificação de Fabsespecíficos de mPDGFRa bivalentes. Os Fabs foram expressados em célulasHB2151 hospedeiras de E. Coli, purificadas por cromatografia de afinidade, eanalisadas por SDS-PAGE. Fab 1F2-2H bivalente é comparado com um Fabpadrão (5C5) em condições não redutoras. Os marcadores de peso molecularsão expressos em kilodaltons.Figure 5 shows the expression and purification of bivalent mPDGFRα specific Fabs. Fabs were expressed in affinity chromatography purified E. coli host HB2151 cells and assayed by SDS-PAGE. Divalent 1F2-2H Fab is compared to a standard Fab (5C5) under non-reducing conditions. Molecular weight markers are expressed in kilodaltons.

A figura 6 mostra testes de ligação e de bloqueio de anticorpospurificados. A) Teste de ligação quantitativo de anticorpos Fab IF2monovalentes e bivalentes anti- mPDGFRa purificados. Várias quantidadesde anticorpos foram incubadas em uma placa de 96 cavidades pré-revestidacom mPDGFRa/Fc, seguido por incubação com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-κ. O Anticorpo - HRP ligado à placa foi então quantificadopela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foi lida a 450 nm. B)Inibição da ligação de mPDGFRa a PDGF-AA imobilizado pelos anticorposFabs purificados. Várias quantidades de anticorpos foram incubadas com umaquantidade fixa de mPDGFRa/Fc e as misturas foram transferidas para placaspré-revestidas com PDGF-AA. Após lavagem, as placas foram entãoincubadas com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc. mPDGFRaligado foi quantificado pela adição de substrato de peroxidase, e a absorbânciafoi lida a A450 nm. Os dados mostrados representam a média ± desvio padrãode amostras em duplicata. 2B4 é um anticorpo dirigido contra VEGFR2 decamundongo (Flkl).Figure 6 shows binding and blocking tests of purified antibodies. A) Quantitative binding assay of purified anti-mPDGFRα IF-monovalent and bivalent Fab antibodies. Various amounts of antibodies were incubated in a 96-well plate coated with mPDGFRa / Fc, followed by incubation with an anti-human-κ antibody-HRP conjugate. The plate - bound HRP Antibody was then quantified by the addition of peroxidase substrate, and the absorbance was read at 450 nm. B) Inhibition of binding of mPDGFRα to immobilized PDGF-AA by purified Fabs antibodies. Various amounts of antibodies were incubated with a fixed amount of mPDGFRa / Fc and the mixtures were transferred to PDGF-AA pre-coated plates. After washing, the plates were then incubated with an anti-human HRP-Fc antibody conjugate. Connected mPDGFR was quantified by the addition of peroxidase substrate, and absorbance was read at A450 nm. The data shown represent the mean ± standard deviation of duplicate samples. 2B4 is an antibody directed against decamound VEGFR2 (Flkl).

A figura 7 provê uma representação esquemática de IgGs decomprimento completo com base em IF2. O Vh de IF2 é expressado comouma proteína de fusão em CL e/ou CH, provendo anticorpos tetravalentes(painel A; MW ~ 150.000) ou bivalentes (painéis B e C: MW ~ 125.000).Figure 7 provides a schematic representation of full-length IF2-based IgGs. IF 2 Vh is expressed as a fusion protein in CL and / or CH, providing tetravalent (panel A; MW ~ 150,000) or bivalent (panel B and C: MW ~ 125,000) antibodies.

A figura 8 mostra a expressão e purificação de anticorpos anti-mPDGFRa. No painel à direita, os anticorpos foram tratados com DTT antesde eletroforese.Figure 8 shows expression and purification of anti-mPDGFRα antibodies. In the right panel, antibodies were treated with DTT before electrophoresis.

A figura 9 mostra testes de ligação e de bloqueio de ligandospara anticorpos purificados. A) ligação quantitativa, anticorpos anti-mPDGFRa purificados. Várias quantidades de anticorpos foram incubadasem uma placa de 96 cavidades pré-revestida com mPDGFRa/Fc, seguido porincubação com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-κ. O anticorpoHRP ligado à placa foi quantificado pela adição de substrato de peroxidase, ea absorbância foi lida a A450 nm. B) Inibição da ligação de mPDGFRa aPDGF-AA imobilizado pelos anticorpos purificados. Várias quantidades deanticorpos foram incubadas com uma quantidade fixa de mPDGFRa/Fc etransferidas para placas pré-revestidas com PDGF-AA. As placas foramlavadas e incubadas com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc.mPDGFRa ligado foi então quantificado pela adição de substrato deperoxidase, e a absorbância foi lida a Ã450 nm. Os dados representam amédia ± desvio padrão de amostras em duplicata. 2B4 é um anticorpo dirigidocontra VEGFR2 de camundongo (Flkl).Figure 9 shows ligand binding and blocking assays for purified antibodies. A) quantitative binding, purified anti-mPDGFRα antibodies. Various amounts of antibodies were incubated in a 96-well plate pre-coated with mPDGFRa / Fc, followed by incubation with an anti-human κ-HRP antibody conjugate. The plate-bound HRP antibody was quantified by the addition of peroxidase substrate, and the absorbance was read at A450 nm. B) Inhibition of binding of immobilized mPDGFRα to PDGF-AA by purified antibodies. Various amounts of antibodies were incubated with a fixed amount of mPDGFRa / Fc and transferred to PDGF-AA pre-coated plates. The plates were washed and incubated with a bound antibody-anti-human HRP-Fc.mPDGFRα conjugate was then quantified by the addition of deperoxidase substrate, and the absorbance was read at ≤ 450 nm. Data represent mean ± standard deviation of duplicate samples. 2B4 is a mouse VEGFR2 (Flkl) directed antibody.

A figura 10 provê uma representação esquemática deanticorpos biespecíficos tetravalentes com base em IF2 selecionados queligam mPDGFRa e flk-1. A) Anticorpo de tipo IgG designado IF2/scFv2B4.Vh de IF2 é expressado como uma fusão a CL, e 2B4 é expressado como umafusão de scFv a CH. Β) O anticorpo de tipo IgG designado IF2-2B4. Vh de IF2é expressado como uma fusão ao término amino de Vl de 2B4.Figure 10 provides a schematic representation of selected IF2-based tetravalent bispecific antibodies that bind mPDGFRa and flk-1. A) IgG-like antibody designated IF2 / scFv2B4.Vh of IF2 is expressed as a fusion to CL, and 2B4 is expressed as a scFv fusion to CH. Β) The IgG type antibody designated IF2-2B4. IF2 Vh is expressed as an amino terminus fusion of 2B4 V1.

A figura 11 mostra a expressão e purificação de anticorposbiespecíficos com base em IF2. Os anticorpos foram expressados em célulasde mamífero, purificados por cromatografia de afinidade, e analisados porSDS-PAGE. Os anticorpos foram tratados com/sem (±) DTT antes deeletroforese. Os marcadores de peso molecular são expressos em kilodaltons.Figure 11 shows expression and purification of specific IF2-based antibodies. Antibodies were expressed on mammalian cells, purified by affinity chromatography, and analyzed by SDS-PAGE. Antibodies were treated with / without (±) DTT prior to electrophoresis. Molecular weight markers are expressed in kilodaltons.

A figura 12 mostra os testes de ligação quantitativos deanticorpos biespecíficos anti- mPDGFRa χ anti-Flk-1. A) Várias quantidadesde anticorpos foram primeiro incubadas em uma placa de 96 cavidades pré-revestida com mPDGFRa/Fc, seguido por incubação com um conjugadoanticorpo-HRP anti-humano-κ. B) Várias quantidades de anticorpos foramprimeiro incubadas em uma placa de 96 cavidades pré-revestidas com Flk-1/Fc, seguido por incubação com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-k. Os dados mostrados representam a média ± desvio padrão de amostras emduplicata.Figure 12 shows the quantitative binding tests of anti-mPDGFRα anti-Flk-1 bispecific antibodies. A) Various amounts of antibodies were first incubated in a 96-well plate pre-coated with mPDGFRa / Fc, followed by incubation with an anti-human-κ HRP-antibody conjugate. B) Various amounts of antibodies were first incubated in a Flk-1 / Fc pre-coated 96-well plate, followed by incubation with an anti-human-k-antibody HRP conjugate. The data shown represent the mean ± standard deviation of samples in duplicate.

A figura 13 mostra testes de bloqueio de anticorposbiespecíficos anti- mPDGFRa χ anti-Flk-1. A) Inibição da ligação demPDGFRa a PDGF-AA imobilizado pelos anticorpos biespecíficospurificados. B) Inibição da ligação de Flk-I a VEGF165 imobilizado pelosanticorpos biespecíficos purificados. Em ambos os testes, várias quantidadesde anticorpos foram incubadas com uma quantidade fixa de receptor(mPDGFRa/Fc ou Flk-1) em solução e transferidas para placas pré-revestidascom ligando (PDGF-AA ou VEGF165). As placas foram então incubadascom um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc. mPDGFRa ligado foientão quantificado pela adição de substrato de peroxidase, e a absorbância foilida a A450 nm. Os dados mostrados representam a média ± desvio padrão deamostras em duplicata.Figure 13 shows anti-FlP-1 anti-mPDGFRα specific antibody blockade tests. A) Inhibition of demPDGFRα binding to PDGF-AA immobilized by purified bispecific antibodies. B) Inhibition of Flk-I binding to VEGF165 immobilized by purified bispecific antibodies. In both tests, various amounts of antibodies were incubated with a fixed amount of receptor (mPDGFRa / Fc or Flk-1) in solution and transferred to ligand pre-coated plates (PDGF-AA or VEGF165). The plates were then incubated with an anti-human HRP-Fc antibody conjugate. Bound mPDGFRα was then quantified by the addition of peroxidase substrate, and the absorbance was A450 nm. The data shown represent the mean ± standard deviation of duplicate samples.

A figura 14 mostra inibição da fosforilação de receptorestimulada por PDGF e VEGF pelo IF2-2B4IgG biespecífico. Células eEnd.lforam primeiro incubadas com vários anticorpos a 37 0C durante 30 min,seguido por estímulo com VEGF ou PDGF a 37 0C durante 15 min. Após Iisede células, os receptores foram imunoprecipitados a partir do sobrenadante delisado de células por incubação com um anticorpo anti- mPDGFRa ou umanti-mVEGFR2, seguido por pérolas de ProA/G Sepharose . As proteínas dereceptor precipitadas foram resolvidas em um gel Nupage Bis-Tri 4-12% etransferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Fosfo-mVEGFR2 e fosfo- mPDGFRa foram detectados no blot usando umconjugado anticorpo - HRP anti-fosfo-tirosina. As proteínas de receptor totaiscarregadas no gel foram testadas com anticorpos em mPDGFRa oumVEGFR2.Figure 14 shows inhibition of PDGF and VEGF stimulated receptor phosphorylation by bispecific IF2-2B4IgG. EEnd.l cells were first incubated with various antibodies at 37 ° C for 30 min, followed by stimulation with VEGF or PDGF at 37 ° C for 15 min. Following cell isolation, receptors were immunoprecipitated from the delisated cell supernatant by incubation with an anti-mPDGFRa or an anti-mVEGFR2 antibody, followed by ProA / G Sepharose beads. Precipitated receptor proteins were resolved on a 4-12% Nupage Bis-Tri gel and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane. Phospho-mVEGFR2 and phospho-mPDGFRa were detected in the blot using an anti-phospho-tyrosine HRP antibody conjugate. Gel-loaded total receptor proteins were tested with antibodies on mPDGFRa or mVEGFR2.

A figura 15 mostra as seqüências de aminoácidos dosdomínios Vh e Vl de várias proteínas de Fab identificadas. Fabs IEl0, 1A11,3B2, 1C10, 3G7, 1F9 e IF2 foram identificados em uma triagem para o fagoFab que liga a PDGFRa de murino. Fab 2B4 foi identificado em uma triagempara fago de Fab que liga a VEGFR2 de murino; mutação com deslocamentode armação; * códon de parada resultante de mutação com deslocamento dearmação; deleção em armação.Figure 15 shows the amino acid sequences of domains Vh and Vl of various identified Fab proteins. Fabs IE10, 1A11,3B2, 1C10, 3G7, 1F9 and IF2 were identified in a screening for phageFab that binds to murine PDGFRα. Fab 2B4 has been identified in a screening for Fab phage that binds to murine VEGFR2; mutation with displacement of the frame; * stop codon resulting from mutation with displacement of information; frame deletion.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

A invenção provê novos anticorpos que compreendem sítiosde ligação a antígeno de domínio variável único (sVD). A invenção tambémprovê proteínas de ligação a antígeno que compreendem tanto os sítios deligação a antígeno de domínio único, como os sítios de ligação a antígeno detipo Fv de dois domínios.The invention provides novel antibodies comprising single variable domain antigen (sVD) binding sites. The invention also provides antigen-binding proteins comprising both single domain antigen-binding sites and two-domain Fv-type antigen binding sites.

Sítios de ligação a antígeno de domínio único são similares adomínios variáveis de imunoglobulina (por exemplo, Vh ou Vl), mas sãocapazes de ligação específica a antígeno na ausência de um segundo domíniode ligação a antígeno (por exemplo, uma contraparte Vl ou Vh). Os domíniosúnicos podem de fato ser incapazes de associação estável com a contrapartede domínios de ligação. No entanto, anticorpos de domínio único podem ligarantígeno com afinidades e avidez similares às de anticorpos que incluemambos os domínios Vl e VH. Além disso, como anticorpos naturais,anticorpos de domínio único podem bloquear as interações receptor-ligando.Conseqüentemente, os anticorpos da invenção que compreendem sítios dedomínio único são usados para os mesmos fins como anticorpos obtidos, porexemplo, a partir de hibridomas, camundongos transgênicos expressandoanticorpos humanos, e bibliotecas de exibição de fagos de domínios deligação Fab ou scFv.Single domain antigen binding sites are similar to variable immunoglobulin domains (e.g., Vh or Vl), but are antigen-specific binding capable in the absence of a second antigen-binding domain (e.g., a Vl or Vh counterpart). Single domains may in fact be incapable of stable association with the counterpart domains of binding. However, single domain antibodies can bind antigen with similar affinities and avidity to antibodies that include both V1 and VH domains. In addition, as natural antibodies, single domain antibodies can block receptor-ligand interactions. Consequently, antibodies of the invention comprising single domain sites are used for the same purposes as antibodies obtained, for example, from hybridomas, transgenic mice expressing antibodies. human, and Fab or scFv deletion domain phage display libraries.

Os anticorpos da invenção são de tipo imunoglobulina emvários aspectos. 1) Os anticorpos da invenção que são de tipo IgG sãoheterotetrâmeros, consistindo de duas dentre cada uma das duas cadeias depolipeptídeos dissimilares. 2) As cadeias de polipeptídeos dissimilaresassociam-se e podem ser covalentemente ligadas, por exemplo, por ligaçõesdissulfeto do mesmo modo que as regiões constantes de cadeias leve e pesadade imunoglobulinas de ocorrência natural, padrão. 3) Uma das cadeias depolipeptídeos é capaz de auto-associação estável no modo das cadeias pesadasde imunoglobulina de ocorrência natural. Por exemplo, uma das cadeias depolipeptídeos pode incluir um ou mais domínios correspondentes a CH2, CH3ou Ch4 de uma imunoglobulina de ocorrência natural. Em uma forma derealização preferida, um anticorpo da invenção compreende a estrutura dedomínio constante de uma IgG de ocorrência natural.Antibodies of the invention are immunoglobulin-like in various aspects. 1) IgG-like antibodies of the invention are heterotetramers, consisting of two of each of two dissimilar polypeptide chains. 2) The dissimilar polypeptide chains associate and may be covalently linked, for example, by disulfide bonds in the same manner as standard naturally occurring immunoglobulin light and heavy chain constant regions. 3) One of the polypeptide chains is capable of stable self-association in the naturally occurring immunoglobulin heavy chain mode. For example, one of the polypeptide chains may include one or more domains corresponding to CH2, CH3 or Ch4 of a naturally occurring immunoglobulin. In a preferred embodiment, an antibody of the invention comprises the constant domain structure of a naturally occurring IgG.

Uma vantagem enorme de uma estrutura de tipo deimunoglobulina é que as cadeias de anticorpos formam pares naturalmentequando da expressão. Diferente de muitos anticorpos tetraméricos da técnicaanterior, nenhuma outra manipulação é necessária para obter uma preparaçãode anticorpos homogêneos.A huge advantage of an immunoglobulin-like structure is that antibody chains naturally pair when expressing. Unlike many prior art tetrameric antibodies, no further manipulation is required to obtain a homogeneous antibody preparation.

As proteínas de ligação a antígeno da invenção compreendemsítios de ligação a antígeno que são domínios variáveis únicos (sVDs). Emcertas formas de realização da invenção, um sítio de ligação sVD substitui umdomínio variável de um anticorpo de tipo IgG, e um scFv substitui o outrodomínio variável. Exemplos destas formas de realização são descritos nafigura IA. Em outras formas de realização da invenção, um sítio de ligaçãosVD é enxertado em um anticorpo IgG no término N ou término C da cadeialeve e pesada de IgG. Exemplos destas formas de realização são mostrados nafigura 1B. Os sVDs também podem ser incorporados em um anticorpo de tipode imunoglobulina em outras posições. Por exemplo, os sVDs podem serfixados ao término C dos domínios constantes Ch e/ou CL. Além disso,combinando as substituições dos sítios de ligação sVD, como na figura 1, comadições de sítios de ligação sVD ao término dos domínios constantes Ch e/ouCL, anticorpos de tipo IgG que são multiespecíficos e/ou multivalentes paraum antígeno particular podem ser produzidos.The antigen binding proteins of the invention comprise antigen binding sites that are unique variable domains (sVDs). In certain embodiments of the invention, an sVD binding site replaces a variable domain of an IgG-like antibody, and an scFv replaces the other variable domain. Examples of such embodiments are described in Figure 1A. In other embodiments of the invention, a RV binding site is grafted onto an IgG antibody at the N or C-terminus of the IgG light and heavy chain. Examples of these embodiments are shown in Figure 1B. SVDs may also be incorporated into an immunoglobulin type antibody at other positions. For example, sVDs can be fixed at the C terminus of the constant domains Ch and / or CL. In addition, by combining sVD binding site substitutions, as in Figure 1, sVD binding site constraints at the end of the Ch and / orCL constant domains, IgG-like antibodies that are multispecific and / or multivalent for a particular antigen can be produced. .

Como se sabe, um Fv consiste de dois domínios (por exemplo,um domínio Vh e um domínio VL). Em um anticorpo padrão, os domínios Vhe Vl de Fv, embora associados para formar um sítio de ligação a antígeno,não estão diretamente ligados, mas são cada um unidos a regiões constantesde anticorpos ligados. Os domínios Vh e Vl de Fv também podem ser unidoscom um ligador sintético para formar um Fv de cadeia única (scFv).As you know, an Fv consists of two domains (for example, a Vh domain and a VL domain). In a standard antibody, Fv Vhe Vl domains, although associated to form an antigen binding site, are not directly linked, but are each joined to constant regions of bound antibodies. Fv domains Vh and Vl can also be joined with a synthetic linker to form a single chain Fv (scFv).

A especificidade do anticorpo refere-se ao reconhecimentoseletivo do anticorpo por um epítopo particular de um antígeno. Anticorposnaturais, por exemplo, são monoespecíficos. Os anticorpos biespecíficos(BsAbs) são anticorpos que têm dois sítios ou especificidades de ligação aantígeno diferentes. Quando uma proteína de ligação a antígeno tem mais doque uma especificidade, os epítopos reconhecidos podem ser associados comum antígeno único ou com mais do que um antígeno.Antibody specificity refers to the selective recognition of the antibody by a particular epitope of an antigen. Natural antibodies, for example, are monospecific. Bispecific antibodies (BsAbs) are antibodies that have two different antigen binding sites or specificities. When an antigen binding protein has more than one specificity, recognized epitopes may be associated with a single antigen or with more than one antigen.

Uma molécula de anticorpo natural é composta de duascadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Cada cadeia leve écovalentemente ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfetointercadeia. As duas cadeias pesadas são ainda ligadas umas à outras porligações dissulfeto múltiplas na região de gancho. As cadeias individuaisduplicam em domínios tendo tamanhos similares (cerca de 110-125aminoácidos) e estruturas, mas funções diferentes. A cadeia leve compreendeum domínio variável (Vl) e um domínio constante (CL). A cadeia pesadacompreende um domínio variável (Vh) e, dependendo da classe ou isotipo doanticorpo, três ou quatro domínios constantes (CH1, CH2, Ch3 e Ch4). Emcamundongos e humanos, os isotipos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com IgAe IgG ainda subdivididos em subclasses ou subtipos. A porção de umanticorpo consistindo de domínios Vl e Vh é designada "Fv" e constitui osítio de ligação a antígeno. Um Fv de cadeia única (scFV) é uma proteínaengenheirada contendo um domínio Vl e um domínio Vh em uma cadeia depolipeptídeo, em que o término N de um domínio e o término C do outrodomínio são unidos por um ligador flexível. "Fab" refere-se à porção doanticorpo consistindo dos domínios VL, VH, Cl e ChI .A natural antibody molecule is composed of two identical heavy chains and two identical light chains. Each light chain is covalently linked to a heavy chain by a disulfide interchain bond. The two heavy chains are further attached to each other multiple disulfide bonds in the hook region. Individual chains duplicate domains having similar sizes (about 110-125 amino acids) and structures, but different functions. The light chain comprises a variable domain (V1) and a constant domain (CL). The heavy chain comprises one variable domain (Vh) and, depending on the class or isotype of the antibody, three or four constant domains (CH1, CH2, Ch3 and Ch4). In mice and humans, the isotypes are IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, with IgAe IgG further subdivided into subclasses or subtypes. The portion of an antibody consisting of V1 and Vh domains is designated "Fv" and constitutes the antigen binding site. A single chain Fv (scFV) is an engineered protein containing a V1 domain and a Vh domain in a polypeptide chain, wherein the N-terminus of one domain and the C-terminus of the other domain are joined by a flexible linker. "Fab" refers to the portion of the antibody consisting of the VL, VH, Cl and ChI domains.

Os domínios variáveis mostram considerável variabilidade deseqüência de aminoácidos de um anticorpo para o seguinte, particularmentena localização do sítio de ligação a antígeno. Três regiões, denominadas"hiper-variáveis" ou "regiões de determinação da complementaridade"(CDRs) são encontradas em cada um dentre Vl e VH.The variable domains show considerable amino acid sequence variability from one antibody to the next, particularly in the location of the antigen binding site. Three regions, called "hypervariables" or "complementarity determining regions" (CDRs) are found in each of V1 and VH.

"Fc" é a designação para a porção de um anticorpo quecompreende domínios constantes de cadeia pesada formados aos pares. Emum anticorpo IgGi, por exemplo, o Fc compreende domínios CH2 e CH3. O Fcde um anticorpo IgA ou IgM ainda compreende um domínio CH4. O Fc éassociado com ligação do receptor de Fc, ativação de citotoxicidade mediadapelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Paraanticorpos naturais como IgA e IgM, que são complexos de proteínas de tipoIgG múltiplas, a formação do complexo requer domínios constantes de Fc."Fc" is the designation for the portion of an antibody that comprises pair-formed heavy chain constant domains. In an IgGi antibody, for example, Fc comprises CH2 and CH3 domains. The Fcde of an IgA or IgM antibody further comprises a CH4 domain. Fc is associated with Fc receptor binding, complement-mediated cytotoxicity activation and antibody-dependent cellular cytotoxicity. Natural paraantibodies such as IgA and IgM, which are complexes of multiple IgG type proteins, complex formation requires constant Fc domains.

Finalmente, a região de "gancho" separa as porções Fab e Fcdo anticorpo, provendo mobilidade de Fabs com relação um ao outro e comrelação a Fc, bem como incluindo ligações múltiplas de dissulfeto paraligação covalente das cadeias pesadas.Finally, the "hook" region separates the Fab and Fc portions of the antibody, providing Fabs with respect to each other and with respect to Fc, as well as including multiple covalent disulfide bonds to heavy chains.

Anticorpos da invenção têm uma combinação de aspectosdesejáveis. Primeiramente, eles são essencialmente homogêneos. Por projeto,a formação errada de pares de cadeias leves e pesadas de anticorpos é muitoreduzida ou eliminada. Por exemplo, alguns anticorpos biespecíficos fazemuso de duas cadeias pesadas diferentes para proporcionar duasespecificidades. Quatro combinações são possíveis quando estas cadeiaspesadas são arranjadas em uma molécula tipo IgG. Duas destas consistem decadeias pesadas com formação errada de pares de modo que o produto émonoespecífico. Nos anticorpos da invenção, a formação errada de pares ésubstancialmente eliminada.Antibodies of the invention have a combination of desirable aspects. Firstly, they are essentially homogeneous. By design, the wrong formation of antibody light and heavy chain pairs is greatly reduced or eliminated. For example, some bispecific antibodies make use of two different heavy chains to provide two specificities. Four combinations are possible when these heavy chains are arranged in an IgG-like molecule. Two of these consist of heavy decades with mismatch so that the product is monospecific. In the antibodies of the invention, mismatch is substantially eliminated.

Um segundo aspecto dos anticorpos da invenção é que eles sãobivalentes para cada especificidade de ligação. Muitos anticorposbiespecíficos são monovalentes para cada um dos sítios de ligação a anticorpoque estão incluídos. Isto é significativo para a função dos anticorpos porque abivalência permite o cooperativismo de ligação e um aumento significativo naavidez de ligação com relação a uma molécula compreendendo um sítio deligação específico de antígeno.A second aspect of the antibodies of the invention is that they are equivalent to each binding specificity. Many specific antibodies are monovalent for each of the antibody binding sites that are included. This is significant for antibody function because abivalence allows binding cooperativism and a significant increase in binding avidity with respect to a molecule comprising an antigen specific deletion site.

Uma terceira vantagem dos anticorpos da invenção é que umou mais domínios constantes de cadeia pesada que constituem a região Fc(por exemplo, CH2 e/ou Ch3 para uma molécula de IgGi) de um anticorponatural e que provê outras funções de anticorpos estão presentes. Além disso,os domínios de ligação múltiplos são separados dos domínios constantes demodo que as funções providas pelos domínios constantes não são afetadas. Asfunções de domínios constantes incluem ligação a certas moléculas acessórias(por exemplo, ligação à superfície de células e receptores de Fc solúveis,associação de cadeia J para IgA, IgM, proteína S para IgA), ativação da via decomplemento (citotoxicidade dependente de complemento, CDC),reconhecimento da ligação de anticorpos a células alvos por várias populaçõesde leucócitos diferentes (citotoxicidade mediada por células dependente deanticorpos, ADCC) e opsonização (melhora de fagocitose). Também, o(s)domínio(s) constante(s) de cadeia pesada de Fc pode(m) conferir meia vidasérica aumentada.A third advantage of the antibodies of the invention is that one or more heavy chain constant domains that constitute the Fc region (e.g., CH2 and / or Ch3 for an IgGi molecule) of an anti-spontaneous and providing other antibody functions are present. In addition, multiple linking domains are separated from constant domains so that the functions provided by constant domains are unaffected. Constant domain functions include binding to certain accessory molecules (e.g., surface binding of soluble Fc cells and receptors, IgA J-chain association, IgM, IgA S protein), activation of the complement pathway (complement-dependent cytotoxicity, CDC), recognition of antibody binding to target cells by several different leukocyte populations (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) and opsonization (phagocytosis amelioration). Also, the Fc heavy chain constant domain (s) may confer increased half-life.

Uma quarta vantagem das proteínas da invenção é que não énecessário o processamento ín vítro para obter o produto completo. Emborare-arranjado de um modo artificial, cada um dos domínios tem um caráternatural que permite a expressão em um sistema biológico. Por exemplo,anticorpos biespecíficos podem ser expressados em sistemas de expressãoprocarióticos e eucarióticos. As proteínas que são produzidas sãosubstancialmente biespecíficas.A fourth advantage of the proteins of the invention is that in vitro processing is not necessary to obtain the complete product. Bluntly arranged in an artificial way, each of the domains has a natural character that allows expression in a biological system. For example, bispecific antibodies may be expressed in prokaryotic and eukaryotic expression systems. The proteins that are produced are substantially bispecific.

Os sítios de ligação a antígeno sVD e sítios de ligaçãocontendo a região Fc para uso em um anticorpo da invenção podem serobtidos por uma variedade de métodos. As seqüências de aminoácidos dasporções Vh e/ou Vl de um domínio de ligação selecionado podem ser obtidasa partir de um anticorpo de ocorrência natural ou ser escolhidas oumodificadas, tríadas ou selecionadas para características de ligação desejadas.Por exemplo, os domínios Vh e/ou Vl podem ser obtidos diretamente a partirde um anticorpo monoclonal que tem as características de ligação desejadas.Alternativamente, os domínios Vh e/ou Vl podem ser de bibliotecas deseqüências de genes V de um mamífero de escolha. Os elementos destasbibliotecas expressam combinações aleatórias dos domínios Vh e/ou Vl e sãotriados com qualquer antígeno desejado para identificar os elementos que têmcaracterísticas de ligação desejadas. Particularmente preferida é umabiblioteca de genes V humanos. Os métodos para a triagem são conhecidos natécnica. Alternativamente, os domínios Vh e/ou Vl de uma fonte não humanaselecionada podem ser incorporados em anticorpo quimérico que compreendedomínios constantes humanos. Por exemplo, para administração a umhumano, pode-se desejar usar um anticorpo com um ou mais domíniosconstantes humanos funcionais em que os domínios Vh e Vl são selecionadosde uma fonte não humana. Para maximizar a função associada ao domínioconstante ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo, domínios constanteshumanos são preferidos.SVD antigen binding sites and binding sites containing the Fc region for use in an antibody of the invention can be obtained by a variety of methods. The amino acid sequences of the Vh and / or V1 portions of a selected binding domain may be obtained from a naturally occurring antibody or may be chosen or modified, triad or selected for desired binding characteristics. For example, the Vh and / or Vl domains may be obtained directly from a monoclonal antibody having the desired binding characteristics. Alternatively, the Vh and / or Vl domains may be from libraries of V gene sequences from a mammal of choice. The elements of these libraries express random combinations of the Vh and / or V1 domains and are screened with any desired antigen to identify elements that have desired binding characteristics. Particularly preferred is a library of human V genes. The methods for screening are known by nature. Alternatively, the Vh and / or Vl domains from a selected non-human source may be incorporated into chimeric antibody comprising human constant domains. For example, for administration to a human, one may wish to use an antibody with one or more functional human constant domains wherein the Vh and Vl domains are selected from a non-human source. To maximize the domain associated function or reduce the immunogenicity of the antibody, human constant domains are preferred.

Alternativamente, um domínio V pode ser produzido, que é"humanizado". Domínios variáveis humanizados são construídos, em que asseqüências de aminoácidos que compreendem uma ou mais regiõesdeterminantes de complementaridade (CDRs) de origem não humana sãoenxertadas em regiões de armação humanas (FRs). Para exemplos, ver: Jones,P.T. et al., 1996, Nature 321, 522-25; Riechman, L. Et al., 1988, Nature 332,323-27; e patente US 5.530.101 para Queen et al. Uma construçãohumanizada é particularmente valiosa para a eliminação de característicasimunogênicas adversas, por exemplo, quando um domínio de ligação aantígeno de uma fonte não humana é desejado para ser usado para tratamentode um humano. Os domínios variáveis têm um alto grau de homologiaestrutural, permitindo a fácil identificação de resíduos de aminoácidos emdomínios variáveis que correspondem a CDRs e FRs. Ver, por exemplo,Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a.edição, National Center for Biotechnology Information, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. Assim, os aminoácidos que participam na ligação aantígeno são facilmente identificados. Além disso, foram desenvolvidosmétodos para conservar ou para melhorar a afinidade para antígeno dedomínios de ligação humanizados compreendendo CDRs enxertados. Ummodo consiste em incluir no domínio variável do recipiente os resíduos dearmação estranhos que influenciam a conformação das regiões de CDR. Umsegundo modo é enxertar os CDRs estranhos sobre domínios variáveishumanos com a homologia mais próxima à região variável estranha. Queen,C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 10029-33. CDRs são maisfacilmente enxertados sobre FRs diferentes amplificando-se, em primeirolugar, as seqüências individuais usando iniciadores de sobreposição queincluem seqüências de CDR desejadas, e unindo os segmentos de genesresultantes em reações de amplificação subseqüentes. O enxerto de um CDRsobre um domínio variável diferente pode ainda envolver a substituição deresíduos de aminoácidos que são adjacentes ao CDR na seqüência deaminoácidos ou alocados contra o CDR na estrutura de domínio variávelduplicada que afeta a conformação do CDR. Os domínios variáveishumanizados da invenção, assim, incluem domínios humanos quecompreendem um ou mais CDRs não humanos bem como tais domínios emque outras substituições ou mudanças foram feitas para conservar ou melhoraras características de ligação.Alternatively, a domain V may be produced which is "humanized". Humanized variable domains are constructed, wherein amino acid sequences comprising one or more non-human complementarity determining regions (CDRs) are grafted onto human framework regions (FRs). For examples, see: Jones, P.T. et al., 1996, Nature 321, 522-25; Riechman, L. Et al., 1988, Nature 332,323-27; and US Patent 5,530,101 to Queen et al. A humanized construct is particularly valuable for the elimination of adverse immunogenic characteristics, for example, when an antigen-binding domain from a non-human source is desired to be used for treatment of a human. The variable domains have a high degree of structural homology, allowing for easy identification of amino acid residues in variable domains corresponding to CDRs and FRs. See, for example, Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Thus, amino acids that participate in antigen binding are easily identified. In addition, methods for conserving or improving affinity for antigen of humanized binding domains comprising grafted CDRs have been developed. One method is to include in the container variable domain foreign foreign residues that influence the conformation of the CDR regions. A second way is to graft foreign CDRs over human variable domains with the closest homology to the foreign variable region. Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Know. USA 86, 10029-33. CDRs are more easily grafted onto different RFs by first amplifying the individual sequences using overlapping primers that include desired CDR sequences, and joining the resulting gene segments into subsequent amplification reactions. Grafting a CDR over a different variable domain may further involve replacing amino acid residues that are adjacent to the CDR in the amino acid sequence or allocated against the CDR in the duplicate variable domain structure that affects the CDR conformation. The humanized variable domains of the invention thus include human domains comprising one or more non-human CDRs as well as such domains in which other substitutions or changes have been made to conserve or improve binding characteristics.

Um anticorpo da invenção também pode empregar domíniosvariáveis que foram tornados menos imunogênicos por substituição deresíduos expostos na superfície de modo a fazer o anticorpo parecer comopertencendo ao sistema imune (Padlan, E.A., 1991, Mol. Immunol. 28, 489-98). Os anticorpos foram modificados por este processo sem perda deafinidade (Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 969-973).Devido ao envelope interno de resíduos de aminoácidos na proximidade dosítio de ligação a antígeno permanecer inalterada, a afinidade é conservada. Asubstituição de resíduos expostos na superfície, de acordo com a invenção,visando imunogenicidade reduzida, não significa a substituição de resíduos deCDR ou resíduos adjacentes que influenciam as características de ligação.An antibody of the invention may also employ variable domains that have been rendered less immunogenic by substitution of surface-exposed residues to make the antibody appear to belong to the immune system (Padlan, E.A., 1991, Mol. Immunol. 28, 489-98). Antibodies were modified by this process without loss of affinity (Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 969-973). Due to the inner envelope of amino acid residues in the vicinity of antigen binding site remain unchanged, affinity is conserved. Substitution of surface exposed residues according to the invention for reduced immunogenicity does not mean substitution of CDR residues or adjacent residues that influence binding characteristics.

É preferível, com freqüência, empregar domínios variáveis quesão essencialmente humanos. Os domínios de ligação humanos podem serobtidos a partir de bibliotecas de exibição de fagos, em que as combinaçõesde domínios variáveis de cadeia leve e pesada humanos são exibidas nasuperfície de fago filamentoso (Ver, por exemplo, McCafferty et al., 1990,Nature 348, 552-54; Aujame et al., 1997, Human Antibodies 8, 155-68). Ascombinações de domínios variáveis são tipicamente exibidas no fagofilamentoso na forma de Fabs ou scFvs. A biblioteca é triada paracombinações de domínios variáveis contendo fagos tendo características deligação a antígeno desejadas. Combinações de domínio variável e de domínioúnico exibem alta afinidade para um antígeno selecionado e uma pequenareatividade cruzada para outros antígenos relacionados. Triando repertóriosmuito grandes de fragmentos de anticorpo (ver, por exemplo, Griffiths et al.,1994, EMBO J. 13, 3245-60), uma boa diversidade de domínios de ligação dealta afinidade é isolada, esperando-se que muitos tenham afinidades sub-nanomolares para o antígeno desejado.It is often preferable to employ variable domains that are essentially human. Human binding domains can be obtained from phage display libraries, where combinations of human light and heavy chain variable domains are displayed on the filamentous phage surface (See, for example, McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552-54; Aujame et al., 1997, Human Antibodies 8, 155-68). Combinations of variable domains are typically displayed in the phage as Fabs or scFvs. The library is screened for phage-containing variable domain combinations having desired antigen-deletion characteristics. Variable domain and single domain combinations exhibit high affinity for a selected antigen and small cross-reactivity for other related antigens. By screening very large repertoires of antibody fragments (see, for example, Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13, 3245-60), a good diversity of high affinity binding domains is isolated, and many are expected to have sub-affinities. -nomolars for the desired antigen.

Alternativamente, os domínios de ligação humanos podem serobtidos de animais transgênicos em que os segmentos de genes Ig nãorearranjados foram introduzidos e em que os genes Ig de camundongoendógeno foram inativados (revisto em Bruggemann e Taussig, 1997, Curr.Opin. Biotechnol. 8, 455-58). Animais transgênicos preferidos contêmfragmentos de genes Ig contíguos muito grandes que estão acima de 1 Mb emtamanho (Mendez et al., 1997, Nature Genet. 15, 146-56), mas Mabshumanos de afinidade moderada podem ser aumentados de animaistransgênicos contendo Ioci de genes menores (Ver, por exemplo, Wagner etal., Eur. J. Immunol. 42, 2672-81; Green et al., 1994, Nature Genet. 7, 13-21).Os sítios de ligação sVD podem ser obtidos de regiões Fvespecíficas (que compreendem ambos os domínios Vh e VL). Com freqüência,pode ser demonstrado que a afinidade de ligação e especificidade de umaregião Fv é dada primeiro por um dos domínios variáveis. Além disso, o scFvpode ser obtido diretamente. Fontes diretas de sVDs incluem mamíferos (porexemplo, camelídeos) que expressam naturalmente anticorpos contendosomente o domínio Vh e bibliotecas de exibição de fagos construídas paraexpressar somente um domínio variável único. Por exemplo, uma bibliotecade exibição de fagos de anticorpo de domínio humano está comercialmentedisponível de Domantis (Cambridge, Reino Unido). Como exemplificadoaqui, sítios de ligação sVD específicos para PDGFRa foram obtidos de umabiblioteca de fagos contendo variantes em que o domínio Vl foiespontaneamente deletado.Alternatively, human binding domains may be obtained from transgenic animals in which unranked Ig gene segments have been introduced and in which mouse Ig endogenous genes have been inactivated (reviewed in Bruggemann and Taussig, 1997, Curr.Opin. Biotechnol. 8, 455 -58). Preferred transgenic animals contain very large contiguous Ig gene fragments that are above 1 Mb in size (Mendez et al., 1997, Nature Genet. 15, 146-56), but moderate affinity Mabshumans may be augmented by smaller gene Ioci-containing animaistransgenics. (See, for example, Wagner et al., Eur. J. Immunol. 42, 2672-81; Green et al., 1994, Nature Genet. 7, 13-21.) SVD binding sites can be obtained from Fvespecific regions. (which comprise both Vh and VL domains). It can often be shown that the binding affinity and specificity of an Fv region is given first by one of the variable domains. In addition, scFv can be obtained directly. Direct sources of sVDs include mammals (eg, camelids) that naturally express antibodies containing only the Vh domain and phage display libraries constructed to express only a single variable domain. For example, a library of human domain antibody phage display is commercially available from Domantis (Cambridge, UK). As exemplified herein, PDGFRα specific sVD binding sites were obtained from a phage library containing variants in which the V1 domain was spontaneously deleted.

Em uma resposta imune fisiológica, mutação e seleção degenes de anticorpo expressados levam à produção de anticorpos tendo altaafinidade para seu antígeno alvo. Os domínios Vh e Vl incorporados nosanticorpos da invenção podem ser similarmente submetidos a procedimentosde mutação in vitro e triagem para obter variantes de alta afinidade. Assim, osdomínios de ligação da invenção incluem os para os quais as características deligação são melhoradas por mutação direta ou por métodos de maturação porafinidade. A afinidade e especificidade podem ser modificadas ou melhoradasmudando os CDRs e triando sítios de ligação a antígeno tendo ascaracterísticas desejadas (Ver, por exemplo, Yang et al., 1995. J. Mol. Bio.254, 392-403). Deve-se entender que os resíduos de aminoácidos que sãodeterminantes primárias da ligação de anticorpos de domínio único podemestar em CDRs definidos por Kabat, mas podem incluir outros resíduostambém, como, por exemplo, resíduos que podem ser de outro modoenterrados na interface de Vh-Vl de um heterodímero de Vh-Vl. CDRs ououtros resíduos que determinam ligação são mudados em uma variedade demodos. Um modo é randomizar os resíduos individuais ou combinações deresíduos de modo que os sítios de ligação a antígeno idênticos, todos de vinteaminoácidos, ou um subconjunto dos mesmos, são encontrados em posiçõesparticulares. Além disso, as mutações são induzidas em uma faixa de resíduosde CDR por métodos de PCR propenso a erro (Ver, por exemplo, Hawkins etai., 1992, J. Mol. Βίο. 226, 889-96). Vetores de exibição de fagos contendogenes codificando os domínios de ligação (por exemplo, genes de regiãovariável de cadeia pesada e/ou leve) podem ser propagados em cepas mutatorde E. coli (Ver, por exemplo, Low et al., 1996, J. Mol. Bio. 250, 359-68).Estes métodos de mutagenese são ilustrativos de muitos métodos conhecidospor um versado na técnica.In a physiological immune response, mutation and selection of expressed antibody degens lead to the production of antibodies having high affinity for its target antigen. The Vh and Vl domains incorporated into the antibodies of the invention may similarly be subjected to in vitro mutation and screening procedures to obtain high affinity variants. Thus, the binding domains of the invention include those for which deletion characteristics are enhanced by direct mutation or by affinity maturation methods. Affinity and specificity can be modified or improved by changing CDRs and screening antigen binding sites having desired characteristics (See, for example, Yang et al., 1995. J. Mol. Bio.254, 392-403). It should be understood that amino acid residues that are primary determinants of single domain antibody binding may be in Kabat-defined CDRs, but may include other residues as well, such as residues that may otherwise be buried at the Vh-V1 interface. of a Vh-V1 heterodimer. CDRs or other binding-determining residues are changed in a variety of ways. One way is to randomize individual residues or residue combinations such that identical antigen-binding sites, all of twenty amino acids, or a subset thereof, are found in particular positions. In addition, mutations are induced in a range of CDR residues by error-prone PCR methods (See, for example, Hawkins et al., 1992, J. Mol. Βίο. 226, 889-96). Containing gene phage display vectors encoding the binding domains (e.g., heavy and / or light chain variable region genes) can be propagated in E. coli mutator strains (See, for example, Low et al., 1996, J. Mol. Bio. 250, 359-68). These methods of mutagenesis are illustrative of many methods known to one skilled in the art.

Cada domínio variável dos anticorpos da presente invençãopode ser um domínio variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulinascompleto, ou pode ser um equivalente funcional ou um mutante ou derivadode um domínio de ocorrência natural, ou um domínio sintético construído, porexemplo, in vitro usando uma técnica como a descrita em WO 93/11236(Medicai Research Council / Griffiths et al.). Por exemplo, é possívelincorporar domínios correspondendo os domínios variáveis de anticorpos emque estão faltando um ou mais aminoácidos. O aspecto característicoimportante é a capacidade de cada domínio variável de se associar com umdomínio variável complementar para formar um sítio de ligação a antígeno.Each antibody variable domain of the present invention may be a complete immunoglobulin light or heavy chain variable domain, or may be a functional equivalent or a mutant or derivative of a naturally occurring domain, or a synthetic domain constructed, for example, in vitro using a technique. as described in WO 93/11236 (Medical Research Council / Griffiths et al.). For example, it is possible to incorporate domains corresponding to antibody variable domains in which one or more amino acids are missing. Important feature is the ability of each variable domain to associate with a complementary variable domain to form an antigen binding site.

Proteínas de ligação a antígeno da invenção têm sítios deligação para qualquer epítopo, sítio antigênico ou proteína. De particularinteresse são os anticorpos que são utilizáveis para o tratamento de doença.Os anticorpos preferidos neutralizam proteínas de receptor, como receptoresque estão envolvidos em angiogenese e/ou oncogenese. Neutralizar umreceptor significa inativar a atividade de quinase intrínseca do receptor paratransduzir um sinal. Um teste confiável para a neutralização do receptor é ainibição de fosforilação do receptor. A presente invenção não está limitada aqualquer mecanismo particular de neutralização de receptor. Algunsmecanismos possíveis incluem prevenir a ligação do ligando ao domínio deligação extracelular do receptor, e prevenir a dimerização ou oligomerizaçãodo receptor. Outros mecanismos não podem, no entanto ser excluídos.Antigen binding proteins of the invention have deletion sites for any epitope, antigenic site or protein. Of particular interest are antibodies that are usable for treating disease. Preferred antibodies neutralize receptor proteins such as receptors that are involved in angiogenesis and / or oncogenesis. Neutralizing a receptor means inactivating the intrinsic receptor kinase activity to transduce a signal. A reliable test for receptor neutralization is inhibition of receptor phosphorylation. The present invention is not limited to any particular receptor neutralization mechanism. Some possible mechanisms include preventing ligand binding to the extracellular receptor deletion domain, and preventing receptor dimerization or oligomerization. Other mechanisms cannot, however, be excluded.

A neutralização da ativação de um receptor em uma amostrade células endoteliais ou não endoteliais, como células de tumor, pode serrealizada in vitro ou in vivo. A neutralização da ativação de um receptor emuma amostra de receptor expressando células compreende contatar as célulascom um anticorpo da invenção. In vitro, as células são contatadas com oanticorpo antes, simultaneamente com, ou após adicionar VEGF à amostra decélula. In vivo, um anticorpo da invenção é contatado com um receptor poradministração a um mamífero. Métodos de administração a um mamíferoincluem, por exemplo, administração oral, intravenosa, intraperitoneal,subcutânea ou intramuscular.Neutralization of receptor activation in a sample of endothelial or nonendothelial cells, such as tumor cells, can be performed in vitro or in vivo. Neutralizing activation of a receptor in a cell expressing receptor sample comprises contacting the cells with an antibody of the invention. In vitro, cells are contacted with the antibody before, simultaneously with, or after adding VEGF to the cell sample. In vivo, an antibody of the invention is contacted with a receptor upon administration to a mammal. Methods of administration to a mammal include, for example, oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular administration.

Exemplos destes receptores incluem, mas não estão limitados areceptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-R), receptoresVEGF (por exemplo, VEGFR-2/KDR/Flk-1, VEGFRl/Flt-1, VEGFR3/Flt-4),receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator decrescimento como insulina (IGFR) e outros. Outros exemplos não limitantesde receptor tirosina quinases incluem Flt-4, HER2/neu, Tek e Tie2.Examples of these receptors include, but are not limited to, platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R), VEGF receptors (e.g., VEGFR-2 / KDR / Flk-1, VEGFR1 / Flt-1, VEGFR3 / Flt-4) , epidermal growth factor receptor (EGFR), degrowth factor receptor as insulin (IGFR) and others. Other non-limiting examples of receptor tyrosine kinases include Flt-4, HER2 / neu, Tek and Tie2.

Outros fatores implicados como possíveis reguladores deangiogenese e/ou crescimento de tumores in vivo incluem o fator decrescimento de fibroblastos (FGF), e o fator de crescimento de nervos (NGF).Os receptores correspondentes são o fator de crescimento de fibroblastos(FGF-R), e o fator de crescimento de nervos (NGFR). Um outro receptorimplicado em migração celular, mudanças morfológicas e invasividade é oreceptor de proteína estimulando macrófagos ("MSP-R" ou "RON").Receptores de interesse incluem proteínas humanas e homólogos de outrosmamíferos.Anticorpos da invenção podem incorporar domínios de ligaçãoa antígeno Ig de qualquer fonte. Por exemplo, os anticorpos são conhecidospara os receptores listados acima e são fontes de domínios Vh e Vl para usonos anticorpos da presente invenção. Exemplos de domínios de ligação deregiões variáveis de scFv específicos para KDR incluem, por exemplo, osdomínios Vh e Vl de IMC-ICll (seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VH: SEQ ID NOs: 1 e 2; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 3 e 4) (ver, WO 00/44777), IMC-2C6(seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para VH: SEQ ID Nos: 5 e 6;seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 7 e 8) (verWO 03/075840), e IMC-1121 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidosde VH: SEQ ID Nos: 5 e 6; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deVl: SEQ ID Nos: 9 e 10) (ver, WO 03/075840). Exemplos de domínios deligação específicos para Flt-I incluem 6.12 (seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 11 e 12; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 13 e 14) e IMC-18F1 (seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 27 e 28; seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 29 e 30).Other factors implicated as possible regulators of ingenesis and / or tumor growth in vivo include fibroblast growth factor (FGF), and nerve growth factor (NGF). Corresponding receptors are fibroblast growth factor (FGF-R). ), and nerve growth factor (NGFR). Another receptor implicated in cell migration, morphological changes and invasiveness is the macrophage stimulating protein receptor ("MSP-R" or "RON"). Receptors of interest include human proteins and homologues of other mammals. Antibodies of the invention may incorporate Ig antigen binding domains. from any source. For example, antibodies are known to the receptors listed above and are sources of Vh and Vl domains for the antibodies of the present invention. Examples of KDR-specific scFv variable region binding domains include, for example, the IMC-IC11 Vh and Vl domains (VH nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID NOs: 1 and 2; VL nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID Nos: 3 and 4) (see WO 00/44777), IMC-2C6 (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 5 and 6; VL nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos. : 7 and 8) (see WO 03/075840), and IMC-1121 (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 5 and 6; V1 nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 9 and 10) ( see, WO 03/075840). Examples of specific Flt-I deletion domains include 6.12 (VH nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID Nos: 11 and 12; VL nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID Nos: 13 and 14) and IMC-18F1 (sequences VH denucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 27 and 28; VL denucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 29 and 30).

Domínios de ligação específicos para EGFR incluem, porexemplo, ERBITUX® (Cetuximab; IMC-C225) (seqüências de nucleotídeos ede aminoácidos de Vh: SEQ ID Nos: 15 e 16; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 17 e 18) como descrito em WO 96/40210 eIMCl 1F8 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos:19 e 20; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 21e 22). Um exemplo de um domínio de ligação específico para IGFR é IMC-A12 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 23 e24; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 25 e26). Anticorpos que se ligam a receptores FGT (ver, WO 2005/037235) (ver,WO 2005/037235) incluem, por exemplo, FR1-H7 (seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 31 e 32); seqüências denucleotídeos e de aminoácidos de Vl: SEQ ID Nos: 33 e 34), FRl-Al(seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 35 e 36;seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 37 e 38), eFRl-4H (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH: SEQ ED Nos:39 e 40; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VL: SEQ ID Nos 41e 42). Anticorpos que se ligam a RON ou MSP-R (ver, WO 2005/120557)incluem IMC-41A10 (seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de VH:SEQ ID Nos: 43 e 44; seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de Vl:SEQ ID Nos: 45 e 46) e IMC-41B12 (seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VH: SEQ ID Nos: 47 e 48; seqüências de nucleotídeos e deaminoácidos de VL: SEQ ID Nos: 49 e 50). Anticorpos que se ligam aPDGFRa incluem, por exemplo, 3G3 e 7G11 (Loizos et al., 2005, Mol.Câncer Ther. 4: 369).EGFR-specific binding domains include, for example, ERBITUX® (Cetuximab; IMC-C225) (Vh nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 15 and 16; VL nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID Nos: 17 and 18) as described in WO 96/40210 eIMCl 1F8 (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 19 and 20; VL nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 21 and 22). An example of an IGFR-specific binding domain is IMC-A12 (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 23 and 24; VL nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 25 and 26). Antibodies that bind to FGT receptors (see, WO 2005/037235) (see, WO 2005/037235) include, for example, FR1-H7 (VH denucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 31 and 32); V1 denucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 33 and 34), FRl-Al (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 35 and 36; VL nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos : 37 and 38), eFR1-4H (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ED Nos: 39 and 40; VL nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos 41e 42). RON or MSP-R binding antibodies (see WO 2005/120557) include IMC-41A10 (VH nucleotide and amino acid sequences: SEQ ID Nos: 43 and 44; V1: SEQ nucleotide and amino acid sequences Nos. 45 and 46) and IMC-41B12 (VH nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID Nos: 47 and 48; VL nucleotide and deamino acid sequences: SEQ ID Nos: 49 and 50). Antibodies that bind to PDGFRα include, for example, 3G3 and 7G11 (Loizos et al., 2005, Mol.Cancer Ther. 4: 369).

Além disso, porções dos domínios de ligação listados acima,como as regiões de CDR, podem ser incorporadas nos domínios de ligaçãousados para produzir as proteínas de ligação aqui descritas.In addition, portions of the binding domains listed above, such as the CDR regions, may be incorporated into the binding domains used to produce the binding proteins described herein.

Certos anticorpos preferidos ligam-se a dois dos receptoreslistados acima. Em uma forma de realização da invenção, uma proteína deligação a antígeno biespecífica liga-se a e bloqueia a ativação de doisreceptores tirosina quinases diferentes envolvidos em angiogenese. Nestaforma de realização, o anticorpo liga-se a PDGFR e um receptor VEGF como,por exemplo, VEGFR2/Flk-1/KDR. Em uma outra forma de realização, oanticorpo liga-se a KDR e FLT-I.Certain preferred antibodies bind to two of the receptors listed above. In one embodiment of the invention, a bispecific antigen deletion protein binds to and blocks the activation of two different tyrosine kinase receptors involved in angiogenesis. In this embodiment, the antibody binds to PDGFR and a VEGF receptor such as VEGFR2 / Flk-1 / KDR. In another embodiment, the antibody binds to KDR and FLT-I.

Em outra forma de realização, um anticorpo da invenção liga-se a HER2 e EGFR. Ainda em uma outra forma de realização, um anticorpoda invenção liga-se a EGFR e IGFR.In another embodiment, an antibody of the invention binds to HER2 and EGFR. In yet another embodiment, an antibody to the invention binds to EGFR and IGFR.

Em outra forma de realização, uma proteína de ligação aantígeno da invenção liga-se a EGFR e VEGFR. Em uma forma de realizaçãopreferida, o VEGFR é VEGFR2. O anticorpo é utilizável para bloquear oestímulo de células epiteliais vasculares, bloqueando a transdução de sinalatravés de ambos EGFR e VEGFR. Isto é particularmente utilizável ondeangiogenese ocorre em resposta a ligandos de EGFR, particularmente TGFa,secretados por células de tumor.In another embodiment, an antigen binding protein of the invention binds to EGFR and VEGFR. In a preferred embodiment, VEGFR is VEGFR2. The antibody is useful for blocking stimulation of vascular epithelial cells by blocking signal transduction through both EGFR and VEGFR. This is particularly usable where angiogenesis occurs in response to EGFR ligands, particularly TGFÎ ±, secreted by tumor cells.

Anticorpos da invenção podem ser usados para reticularantígenos em células alvos com antígenos em células efetoras do sistemaimune. Isto pode ser utilizável, por exemplo, ao se promover respostas imunesdirigidas contra células que têm antígenos particulares de interesse sobre asuperfície de células. De acordo com a invenção, as células efetoras dosistema imune incluem células específicas de antígeno como células T queativam respostas imunes celulares e células não específicas como macrófagos,neutrófilos e células exterminadoras naturais (NK) que mediam respostasimunes celulares.Antibodies of the invention may be used to reticular antigens on target cells with antigens on immune system effector cells. This may be useful, for example, by promoting targeted immune responses against cells having particular antigens of interest on the cell surface. According to the invention, immune system effector cells include antigen-specific cells such as T cells that activate cellular immune responses and non-specific cells such as macrophages, neutrophils and natural killer (NK) cells that mediate cellular immune responses.

Anticorpos da invenção podem ter um sítio de ligação paraqualquer antígeno de superfície de células de uma célula efetora do sistemaimune. Estes antígenos de superfície de células incluem, por exemplo,receptores de citoquina e linfoquina, receptores Fc, CD3, CD16, CD28, CD32e CD64. Além dos sítios de ligação a antígeno providos por sVDs, osanticorpos biespecíficos podem incluir sítios de ligação providos por Fvs. OsFvs podem ser obtidos de anticorpos nos antígenos acima mencionados, apartir de bibliotecas combinatoriais, bem como por outros métodosconhecidos na técnica. Os anticorpos biespecíficos que são específicos parareceptores citoquina e linfoquina também podem incluir sítios de ligaçãocompreendendo seqüências de aminoácidos que correspondem a toda ou partedo ligando natural para o receptor. Por exemplo, quando o antígeno desuperfície de células é um receptor IL-2, um anticorpo biespecífico dainvenção pode ter um sítio de ligação a antígeno que compreende umaseqüência de aminoácidos correspondente ou IL-2. Outras citoquinas elinfoquinas incluem, por exemplo, interleucinas como interleucina-4 (IL-4) einterleucina-5 (IL-5), e fatores de estímulo de colônias (CSFs) como CSF degranulócito- macrófago (GM-CSF), e CSF de granulócito (G-CSF).Antibodies of the invention may have a binding site for any cell surface antigen of an immune system effector cell. Such cell surface antigens include, for example, cytokine and lymphokine receptors, Fc, CD3, CD16, CD28, CD32, and CD64 receptors. In addition to the antigen binding sites provided by sVDs, bispecific antibodies may include Fvs provided binding sites. Fvs can be obtained from antibodies to the above antigens from combinatorial libraries, as well as by other methods known in the art. Bispecific antibodies that are specific for cytokine and lymphokine receptors may also include binding sites comprising amino acid sequences that correspond to all or part of the natural ligand for the receptor. For example, when the cell surface antigen is an IL-2 receptor, an invention bispecific antibody may have an antigen binding site that comprises a corresponding amino acid sequence or IL-2. Other elymphokine cytokines include, for example, interleukins such as interleukin-4 (IL-4) and interleukin-5 (IL-5), and colony stimulating factors (CSFs) such as degranulocyte macrophage CSF (GM-CSF), and CSF of granulocyte (G-CSF).

Anticorpos da invenção são produzidos expressando duascadeias de polipeptídeo que, tomadas juntas, compreendem pelo menos umsítio de ligação a antígeno de domínio único. As duas cadeias de polipeptídeocompreendem cada uma pelo menos um domínio constante de cadeia pesadaque é capaz de dimerização (por exemplo, CH2 e/ou Ch3). Os anticorpos sãoconvenientemente produzidos em E. Coli usando construções de DNA quecompreendem seqüências de sinal de secreção bacteriana no início de cadacadeia de polipeptídeo. Uma variedade de seqüências de sinal bacterianas éconhecida na técnica. Uma seqüência de sinal preferida é do gene pelB deErwinina carotovora. Os fragmentos de DNA codificando os anticorpos aserem clonados, por exemplo, em vetores empregando melhoradores epromotores de citomegalovírus humanos (HCMV) para expressão em altonível em células de mamífero, como, por exemplo, células CHO, NSO, COS-7e PER.C6, e linhagens de células de origem linfóide como células de linfoma,mieloma e hibridoma. (Ver, por exemplo, Bendig et al., patente US5.840.299; Maeda et al. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-34).Antibodies of the invention are produced by expressing two strands of polypeptide which taken together comprise at least one single domain antigen binding site. The two polypeptide chains each comprise at least one heavy chain constant domain that is capable of dimerization (e.g., CH2 and / or Ch3). Antibodies are conveniently produced in E. coli using DNA constructs that comprise bacterial secretion signal sequences at the start of each polypeptide chain. A variety of bacterial signal sequences are known in the art. A preferred signal sequence is from the erBrin carotovora pelB gene. DNA fragments encoding the antibodies will be cloned, for example, into vectors employing human cytomegalovirus (HCMV) enhancers and enhancers for expression in mammalian cells such as CHO, NSO, COS-7and PER.C6 cells, and cell lines of lymphoid origin such as lymphoma, myeloma and hybridoma cells. (See, for example, Bendig et al., US Patent 5,840,299; Maeda et al. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-34).

Um marcador selecionável é um gene que codifica umaproteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de célulashospedeiras transformadas cultivadas em um meio de cultura seletivo. Osmarcadores selecionáveis típicos codificam proteínas que (a) conferemresistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina,neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiênciasauxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis de meioscomplexos, por exemplo, o gene codificando D-alanina racemase parabacilos. Um marcador selecionável particularmente utilizável confereresistência a metotrexato. Por exemplo, células transformadas com o gene deseleção DHFR são primeiro identificadas cultivando todos os transformantesem um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonistacompetitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR dotipo selvagem é empregado é a linhagem de células de ovário de hamsterchinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR, preparada e propagada comodescrito por Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4216. Ascélulas transformadas são então expostas a níveis aumentados de metotrexato.Isto leva à síntese de cópias múltiplas do gene DHFR, e, concomitantemente,cópias múltiplas de outro DNA compreendendo os vetores de expressão,como o DNA codificando o anticorpo ou fragmento de anticorpo.A selectable marker is a gene encoding a protein necessary for the survival or growth of transformed host cells grown in a selective culture medium. Typical selectable markers encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, for example ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) complement sauxotrophic deficiencies, or (c) provide critical nutrients not available from complex media, for example, the gene. encoding D-alanine racemase parabacilli. A particularly usable selectable marker provides methotrexate resistance. For example, cells transformed with the DHFR deletion gene are first identified by culturing all transformants in a culture medium containing methotrexate (Mtx), a DHFR-antagonist. An appropriate host cell when wild type DHFR is employed is the DHFR activity-deficient hamsterchinese ovary (CHO) cell line prepared and propagated as described by Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Know. USA 77, 4216. Transformed cell cells are then exposed to increased levels of methotrexate. This leads to the synthesis of multiple copies of the DHFR gene, and concomitantly multiple copies of other DNA comprising expression vectors, such as DNA encoding the antibody or fragment. of antibody.

Quando se deseja expressar uma construção de gene emlevedura, um exemplo de um gene de seleção apropriado para uso emlevedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7. Stinchcombet al. (1979) Nature, 282, 39; Kingsman et al. (1979) Gene 7, 141. O genetrpl provê um marcador de seleção para uma cepa mutante de leveduradeficiente da capacidade de cultura em triptofano, por exemplo, ATCC no.44076 ou PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85,12. A presença de lesão de trplno genoma de células hospedeiras de levedura então provê um ambienteefetivo para detectar a transformação por cultura na ausência de triptofano.Similarmente, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos contendo o geneLeu2.When it is desired to express a yeast gene construct, an example of a selection gene suitable for yeast use is the trpl gene present in yeast plasmid YRp7. Stinchcombet al. (1979) Nature, 282, 39; Kingsman et al. (1979) Gene 7, 141. Genetrpl provides a selection marker for a mutant strain of yeast that is deficient in tryptophan, for example, ATCC No. 4,476 or PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85, 12. The presence of triplet lesion in the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting culture transformation in the absence of tryptophan. Similarly, Leu2-deficient yeast strains (ATCC 20,622 or 38,626) are complemented by known plasmids containing the Leu2 gene. .

Células hospedeiras transformadas são cultivadas por métodosconhecidos na técnica em um meio líquido contendo fontes assimiláveis decarbono, por exemplo, carboidratos como glicose ou lactose, nitrogênio, porexemplo, aminoácidos, peptídeos, proteínas ou seus produtos de degradaçãocomo peptonas, sais de amônio ou outros, e sais inorgânicos, por exemplo,sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Omeio, além disso, contém, por exemplo, substâncias promotoras decrescimento, como elementos traço, por exemplo, ferro, zinco, manganês eoutros.Transformed host cells are cultured by methods known in the art in a liquid medium containing carbon-assimilable sources, for example carbohydrates such as glucose or lactose, nitrogen, for example, amino acids, peptides, proteins or their degradation products such as peptides, ammonium salts or others, and inorganic salts, for example sodium, potassium, magnesium and calcium sulfates, phosphates and / or carbonates. The medium furthermore contains, for example, growth promoting substances such as trace elements, for example iron, zinc, manganese and others.

Anticorpos que se ligam a receptores de fator de crescimentosão preferivelmente capazes de bloquear a inativação da atividade do receptortirosina quinase (RTK). A inibição de tirosina quinase pode ser determinadausando métodos bem conhecidos, por exemplo, medindo o nível deautofosforilação do receptor quinase recombinante, e/ou fosforilação desubstratos naturais ou sintéticos. Assim, testes de fosforilação são utilizáveisna determinação dos antagonistas de RTK da presente invenção. Afosforilação pode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo específicopara fosfotirosina em um teste ELISA ou em um western blot. Alguns testespara atividade de tirosina quinase são descritos em Panek et al., J. Pharmacol.Exp. Thera. (1997) 283: 1433-44 e Batley et al., Life Sei. (1998) 62: 143-50.Antibodies that bind to growth factor receptors are preferably capable of blocking the inactivation of receptortirosin kinase (RTK) activity. Inhibition of tyrosine kinase may be determined using well known methods, for example, by measuring the level of recombinant receptor kinase receptor phosphorylation, and / or phosphorylation of natural or synthetic substrates. Thus, phosphorylation assays are useful in determining the RTK antagonists of the present invention. Phosphorylation can be detected, for example, by using a phosphotyrosine-specific antibody in an ELISA or western blot. Some tests for tyrosine kinase activity are described in Panek et al., J. Pharmacol.Exp. Thera. (1997) 283: 1433-44 and Batley et al., Life Sci. (1998) 62: 143-50.

Além disso, métodos para detecção da expressão de proteínaspodem ser utilizados para determinar os antagonistas de RTK, onde aexpressão de proteínas sendo medidas é mediada pelo RTK. Estes métodosincluem imuno-histoquímica (IHC) para detecção da expressão de proteína,fluorescência, hibridização in situ (FISH) para detecção da amplificação dogene, testes de ligação a radioligandos competitivos, técnicas de blotting dematriz sólida, como Northern e Southern blot, reação de cadeia de polimerasede transcriptase reversa (RT-PCR) e ELISA. Ver, por exemplo, Grandis et al.,Câncer, (1996) 78: 1284-92; Shimizu et al., Japan J. Câncer Res., (1994) 85:567-71; Sauter et al., Am. J. Path., (1996) 148: 1047-53; Collins, Glia, (1995)15: 289-96; Radinsky et al., Clin. CancerRes., (1995) 1: 19-31; Petrides et al.,Câncer Res., (1990) 50: 3934-39; Hoffmann et al., Anticancer Res., (1997)17: 4419-26; Wikstrand et al., Câncer Res. (1995) 55: 3140-48.In addition, methods for protein expression detection can be used to determine RTK antagonists, where protein expression being measured is mediated by RTK. These methods include immunohistochemistry (IHC) for protein expression detection, fluorescence, in situ hybridization (FISH) for detection of dogene amplification, competitive radioligand binding assays, solid matrix blotting techniques such as Northern and Southern blot, reverse transcriptase polymerase chain (RT-PCR) and ELISA. See, for example, Grandis et al., Cancer, (1996) 78: 1284-92; Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., (1994) 85: 567-71; Sauter et al., Am. J. Path., (1996) 148: 1047-53; Collins, Glia (1995) 15: 289-96; Radinsky et al., Clin. Cancer Res. (1995) 1: 19-31; Petrides et al., Cancer Res., (1990) 50: 3934-39; Hoffmann et al., Anticancer Res., (1997) 17: 4419-26; Wikstrand et al., Cancer Res. (1995) 55: 3140-48.

A capacidade de um anticorpo bloquear a ligação ao ligandopode ser medida, por exemplo, por um teste competitivo in vitro. Neste teste,um ligando de RTK (por exemplo, EGF para EGFR) é imobilizado, e um testede ligação é realizado para determinar a efetividade do anticorpo para inibircompetitivamente a ligação de RTK ao ligando imobilizado.The ability of an antibody to block ligand binding can be measured, for example, by a competitive in vitro assay. In this test, an RTK ligand (e.g. EGF to EGFR) is immobilized, and a binding test is performed to determine the effectiveness of the antibody to competitively inhibit RTK binding to the immobilized ligand.

Testes in vivo também podem ser utilizados para determinarantagonistas de RTK. Por exemplo, a inibição do receptor tirosina quinasepode ser observada por testes mitogênicos usando linhagens de célulasestimuladas com ligando de receptor na presença ou ausência de inibidor. Porexemplo, células A431 (American Type Culture Collection (ATCC),Rockville, MD) estimuladas com EGF podem ser usadas para testar a inibiçãode EGFR. Um outro método envolve testar a inibição do crescimento decélulas de tumor expressando EGFR, usando, por exemplo, células de tumorhumanas injetadas em um camundongo. Ver patente US n°. 6.365.157(Rockwell et al.).In vivo tests may also be used to determine RTK antagonists. For example, receptor tyrosine kinase inhibition can be observed by mitogenic assays using receptor ligand-stimulated cell lines in the presence or absence of inhibitor. For example, EGF-stimulated A431 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) cells can be used to test for EGFR inhibition. Another method involves testing the inhibition of growth of EGFR-expressing tumor cells, using, for example, human tumor cells injected into a mouse. See US patent no. 6,365,157 (Rockwell et al.).

Anticorpos preferidos da presente invenção têm especificidadedual e são capazes de ligar-se a dois antígenos diferentes simultaneamente. Osantígenos diferentes podem estar localizados em células diferentes ou namesma célula. A reticulação do antígeno pode ser mostrada in vitro, porexemplo provendo uma superfície sólida à qual um primeiro antígeno éligado, adicionando anticorpos biespecíficos específicos para o primeiroantígeno e um segundo antígeno para o qual a proteína de ligação é tambémespecífica e detectando a presença do segundo antígeno ligado.Preferred antibodies of the present invention have specificity and are capable of binding to two different antigens simultaneously. Different antigens may be located in different cells or cell names. Antigen cross-linking can be shown in vitro, for example by providing a solid surface to which a first antigen is attached, adding bispecific antibodies specific for the first antigen and a second antigen for which the binding protein is also specific, and detecting the presence of the second bound antigen. .

Anticorpos preferidos da invenção são capazes de bloquear ainteração entre dois receptores e seus respectivos ligandos. Por exemplo, umanticorpo específico para KDR e Flt-I inibe a migração de células induzidapor VEGF bem como a migração de células induzida por PIGF. Acombinação de duas especificidades de ligação ao receptor em anticorposbiespecíficos pode ser mais eficaz na inibição da migração de células do quedos anticorpos parentais individuais (ver, por exemplo, Zhu, Z., WO2004/003211).Preferred antibodies of the invention are capable of blocking the interaction between two receptors and their respective ligands. For example, a KDR and Flt-I specific antibody inhibits VEGF-induced cell migration as well as PIGF-induced cell migration. Combination of two receptor binding specificities into specific antibodies may be more effective in inhibiting the migration of cells from individual parent antibodies (see, for example, Zhu, Z., WO2004 / 003211).

Comparados a anticorpos que são monoespecíficos, osanticorpos biespecíficos podem ser inibidores mais potentes da função celular.Por exemplo, funções celulares estimuladas por VEGF como, por exemplo, aproliferação de células endoteliais e a migração induzida por VEGF e PlGFde células de leucemia humanas podem ser mais eficientemente inibidas poranticorpos biespecíficos mesmo quando a afinidade para um ou ambos dosdois antígenos de alvo é reduzida. Um anticorpo específico (monovalente)para ambos KDR e Flt-I pode ser mais efetivo para inibir a migração decélulas induzida por VEGF ou PlGF do que um scFv monoespecífico dirigidoa qualquer um dos antígenos de alvo (WO 2004/003211).Compared to antibodies that are monospecific, bispecific antibodies may be more potent inhibitors of cell function. For example, VEGF-stimulated cell functions such as endothelial cell proliferation and VEGF and PlGF-induced migration from human leukemia cells may be more potent. efficiently inhibited by bispecific antibodies even when the affinity for one or both of the two target antigens is reduced. A specific (monovalent) antibody to both KDR and Flt-I may be more effective in inhibiting VEGF or PlGF-induced cell migration than a monospecific scFv directed to either target antigen (WO 2004/003211).

Em um outro exemplo, um anticorpo tendo especificidade dualpara ambos EGFR (ou Her2/neu) e IGFR que é capaz de ligar a ambos osreceptores e bloquear a interação com seus ligandos específicos é usado paraneutralizar a ativação do receptor estimulado tanto por EFG como por IGF etransdução de sinal a jusante. Observa-se que o estímulo de qualquer deEGFR ou IGFR resulta em ativação (por exemplo, fosforilação) de moléculasde transdução de sinal a jusante comuns, incluindo Akt e p44/42, embora emextensões diferentes. Em certas células de tumor, a inibição da função deEGFR pode ser compensada por regulação positiva de outras vias desinalização do receptor do fator de crescimento, e particularmente porestímulo de IGFR. Em contraste com tratamento com um anticorpo que seliga a um receptor, e não bloqueia completamente fosforilação tanto de Aktcomo p44/42, a incubação de células de tumor com um anticorpo que se liga atanto EGFR como IGFR bloqueia a fosforilação de tanto Akt como de p44/42.Conseqüentemente, a inibição da sinalização de IGFR resulta na inibição docrescimento de tumor e sensibilidade aumentada para células de tumor emdeterminados agentes terapêuticos.In another example, an antibody having dual specificity for both EGFR (or Her2 / neu) and IGFR that is capable of binding to both receptors and blocking interaction with their specific ligands is used to neutralize both EFG and IGF stimulated receptor activation. downstream signal transduction. Stimulation of either deEGFR or IGFR is observed to result in activation (e.g. phosphorylation) of common downstream signal transduction molecules, including Akt and p44 / 42, although in different extensions. In certain tumor cells, inhibition of deEGFR function may be offset by up-regulation of other growth factor receptor de-signaling pathways, and particularly by IGFR stimulation. In contrast to treatment with an antibody that selects a receptor, and does not completely block both Aktcomo p44 / 42 phosphorylation, incubating tumor cells with an EGFR-binding antibody like IGFR blocks both Akt and p44 phosphorylation. Consequently, inhibition of IGFR signaling results in inhibition of tumor growth and increased sensitivity to tumor cells in certain therapeutic agents.

A inibição de fosforilação de tais componentes da cascata detransdução de sinal comuns também é observada com anticorpos que se ligama outros RTKs, como, por exemplo, RON. Conseqüentemente, as proteínas deligação a antígeno são geralmente utilizáveis para tratar doenças neoplásicascaracterizadas pela transformação ou crescimento de células resultantes daativação de vias de transdução de sinal múltiplas.Inhibition of phosphorylation of such common signal transduction cascade components is also observed with antibodies that bind other RTKs, such as RON. Consequently, antigen-deletion proteins are generally useful for treating neoplastic diseases characterized by cell transformation or growth resulting from activation of multiple signal transduction pathways.

Os anticorpos da invenção são utilizáveis para tratamento deuma variedade de distúrbios proliferativos. Por exemplo, a presente invençãoprovê tratamento de tumores que expressam e são estimulados através de maisdo que um receptor tirosina quinase. O estímulo através de mais do que umreceptor pode resultar no crescimento descontrolado que é insensível aobloqueio de cada receptor sozinho. Além disso, o estímulo de um segundoreceptor pode aumentar a ativação observada em resposta a estímulo atravésde um primeiro receptor. Alternativamente, as contribuições de receptoresindividuais podem ser multiplicativas. Em cada um dos casos acima, ainibição significativamente melhorada de crescimento de tumor é observadana presença de uma proteína de ligação a antígeno que bloqueia ambos osreceptores.Antibodies of the invention are usable for treating a variety of proliferative disorders. For example, the present invention provides for treatment of tumors that express and are stimulated by more than one receptor tyrosine kinase. Stimulation through more than one receptor can result in uncontrolled growth that is insensitive to blocking each receptor alone. In addition, stimulus from a second receptor may increase the activation observed in response to stimulation through a first receptor. Alternatively, contributions from individual recipients may be multiplicative. In each of the above cases, significantly improved inhibition of tumor growth is observed in the presence of an antigen binding protein that blocks both receptors.

Os anticorpos da invenção são utilizáveis para o tratamento dedoenças em que o estímulo do receptor é através de uma ativação de EGFRparácrina e/ou autócrina. Por exemplo, tumores expressando EGFR sãocaracteristicamente sensíveis a EGF presente em seu ambiente, e podem aindaser estimulados por EGF ou TGF-α produzidos no tumor. Apesar de nãopretender estar limitado por qualquer mecanismo particular, as doenças econdições que podem ser tratadas ou prevenidas pelos presentes métodosincluem, por exemplo, as em que o crescimento de tumor é estimulado. Ométodo é, assim, efetivo para tratar um tumor sólido que não é vascularizado,ou ainda não está substancialmente vascularizado.Antibodies of the invention are useful for treating diseases in which receptor stimulation is via EGFR paracrine and / or autocrine activation. For example, tumors expressing EGFR are characteristically sensitive to EGF present in their environment, and may still be stimulated by EGF or TGF-α produced in the tumor. Although not intended to be limited by any particular mechanism, diseases and conditions that can be treated or prevented by the present methods include, for example, those in which tumor growth is stimulated. The method is thus effective for treating a solid tumor that is not vascularized or not yet substantially vascularized.

Alguns anticorpos da invenção são utilizáveis para inibir aangiogenese associada com uma doença hiperproliferativa. Por exemplo,bloqueando-se a angiogenese associada ao tumor, o crescimento do tumorpode ser inibido. Em uma forma de realização, o anticorpo liga-se a um RTKassociado ao tumor e inibe a produção de ligandos angiogênicos (isto é,VEGF) pelo tumor, e também liga-se a um receptor VEGF associado comcélulas da vasculatura para inibir a proliferação destas células. Em uma formade realização diferente, o anticorpo liga-se a receptores VEGF múltiplos, demodo que o ligando de VEGF ou outro ligando de VEGFR (por exemplo,PIGF) é impedido de se ligar a mais do que um tipo de receptor VEGF.Some antibodies of the invention are useful for inhibiting the angiogenesis associated with a hyperproliferative disease. For example, by blocking tumor-associated angiogenesis, tumor growth may be inhibited. In one embodiment, the antibody binds to a tumor-associated RTK and inhibits the production of angiogenic ligands (ie, VEGF) by the tumor, and also binds to a VEGF receptor associated with vasculature cells to inhibit their proliferation. cells In a different embodiment, the antibody binds to multiple VEGF receptors, such that the VEGF ligand or other VEGFR ligand (e.g. PIGF) is prevented from binding to more than one type of VEGF receptor.

Os tumores que podem ser tratados incluem tumores primáriose tumores metastáticos, bem como tumores refratários. Os tumores refratáriosincluem tumores que falham em responder ou são resistentes a tratamentocom agentes quimioterapêuticos sozinhos, anticorpos sozinhos, radiaçãosozinha ou combinações dos mesmos. Os tumores refratários tambémenglobam tumores que parecem ser inibidos por tratamento com tais agentes,mas reaparecem em até cinco anos, algumas vezes em até dez anos ou maisapós o tratamento ser descontinuado. Os tumores podem expressar EGFR ououtro RTK em níveis normais ou podem superexpressar o RTK em níveis, porexemplo, que são pelo menos 10, 100, ou 1000 vezes os níveis normais.Tumors that can be treated include primary tumors and metastatic tumors as well as refractory tumors. Refractory tumors include tumors that fail to respond or are resistant to treatment with chemotherapeutic agents alone, antibodies alone, radiation alone, or combinations thereof. Refractory tumors also include tumors that appear to be inhibited by treatment with such agents, but recur within five years, sometimes up to ten years or more after treatment is discontinued. Tumors may express EGFR or other RTK at normal levels or may overexpress RTK at levels, for example at least 10, 100, or 1000 times normal levels.

Exemplos de tumores que expressam EGFR e são estimuladospor um ligando de EGFR incluem carcinomas, gliomas, sarcomas,adenocarcinomas, adenosarcomas, e adenomas. Estes tumores podem ocorrervirtualmente em todas as partes do corpo, incluindo, por exemplo, mama,coração, pulmão, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, cabeça epescoço, ovário, próstata, cérebro, pâncreas, pele, osso, medula óssea, sangue,timo, útero, testículos, colo do útero ou fígado. Alguns tumores que foramobservados como superexpressando EGFR que podem ser tratados de acordocom a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, tumores colo-retais e de cabeça e pescoço, especialmente carcinoma de células escamosasde cabeça e pescoço, tumores do cérebro como glioblastomas, e tumores dopulmão, mama, pâncreas, esôfago, bexiga, rim, ovário, colo do útero epróstata. Exemplos não limitativos de tumores que tem, como observado,atividade de receptor tirosina quinase constitutivamente ativa (isto é, nãoregulados) incluem gliomas, carcinomas de pulmão de células não pequenas,carcinomas de ovário e carcinomas de próstata. Outros exemplos de tumoresincluem sarcoma de Kaposi, neoplasmas do sistema nervoso central,neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas e metástasecerebral, melanoma, carcinomas gastrintestinal e renal e sarcomas,rabdomiosarcoma, glioblastoma, preferivelmente glioblastoma multifòrme, eleiomiosarcoma. A superexpressão de outros RTKs pode produzir defeitos decrescimento similares. Por exemplo, cânceres ósseos mais metastáticossurgem a partir de tumores primários de próstata, mama, ou pulmão. Tumoresde próstata inicialmente podem ser dependentes de hormônio, mas a perdadesta dependência coincide com estímulo mediado por IGFR de células quemigram para os ossos.Examples of EGFR-expressing tumors that are stimulated by an EGFR ligand include carcinomas, gliomas, sarcomas, adenocarcinomas, adenosarcomas, and adenomas. These tumors can occur virtually all over the body, including, for example, breast, heart, lung, small intestine, colon, spleen, kidney, bladder, head and neck, ovary, prostate, brain, pancreas, skin, bone, bone marrow. , blood, thymus, uterus, testes, cervix or liver. Some tumors that have been observed as EGFR overexpressing that can be treated according to the present invention include, but are not limited to, colorectal and head and neck tumors, especially head and neck squamous cell carcinoma, brain tumors such as glioblastomas, and tumors of the lung, breast, pancreas, esophagus, bladder, kidney, ovary, cervix and prostate. Non-limiting examples of tumors that have, as noted, constitutively active (i.e. non-regulated) receptor tyrosine kinase activity include gliomas, non-small cell lung carcinomas, ovarian carcinomas and prostate carcinomas. Other examples of tumors include Kaposi's sarcoma, central nervous system neoplasms, neuroblastomas, capillary hemangioblastomas, meningiomas and cerebrospinal metastases, melanoma, gastrointestinal and renal carcinomas and sarcomas, rhabdomyosarcoma, glioblastoma, preferably glioblastoma multifomiosomal. Overexpression of other RTKs may produce similar decreasing defects. For example, more metastatic bone cancers emerge from primary prostate, breast, or lung tumors. Prostate tumors may initially be hormone dependent, but the loss of this dependence coincides with IGFR-mediated stimulation of bone-migrating cells.

Os anticorpos também são utilizáveis para tratamento dasdoenças hiperproliferativas diferentes de tumores compreendendo aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz do anticorpo dapresente invenção. Como descrito aqui, "doença hiperproliferativa" é definidacomo uma condição causada por crescimento excessivo de células nãocancerosas que expressam um membro da família EGFR ou outros receptorescitosina quinase. O excesso de células geradas por uma doençahiperproliferativa expressa o RTK em níveis normais ou podemsuperexpressar o RTK.Antibodies are also usable for treating hyperproliferative diseases other than tumors comprising administering to the mammal an effective amount of the antibody of the present invention. As described herein, "hyperproliferative disease" is defined as a condition caused by overgrowth of non-cancerous cells expressing an EGFR family member or other receptor cytosine kinase. Excess cells generated by a hyperproliferative disease express RTK at normal levels or may overexpress RTK.

Exemplos de doença hiperproliferativa incluem psoríase,queratoses actínicas e queratoses seborreicas, verrugas, cicatrizes quelóides, eeczema. Também estão incluídas as doenças hiperproliferativas causadas porinfecções virais, como infecção com papilomavírus. Por exemplo, psoríaseocorre em variações e graus de severidade muito diferentes. Tipos diferentesde psoríase exibem características como bolhas com pus (psoríase pustular),escara severa da pele (psoríase eritrodérmica), pontos semelhantes gotas(psoríase gutata) e lesões inflamadas lisas (psoríase inversa). O tratamento detodos os tipos de psoríase (por exemplo, psoríase vulgaris, psoríase pustulosa,psoríase eritrodérmica, psoríase artropática, parapsoríase, pustulosepalmoplantar) é contemplado pela invenção.Examples of hyperproliferative disease include psoriasis, actinic keratoses and seborrheic keratoses, warts, keloid scars, and eczema. Also included are hyperproliferative diseases caused by viral infections such as papillomavirus infection. For example, psoriasis occurs in very different variations and degrees of severity. Different types of psoriasis exhibit features such as blisters with pus (pustular psoriasis), severe skin eschar (erythrodermic psoriasis), drop-like spots (guttate psoriasis), and smooth inflamed lesions (reverse psoriasis). Treatment of all types of psoriasis (e.g., psoriasis vulgaris, pustular psoriasis, erythrodermic psoriasis, arthropathic psoriasis, parapsoriasis, pustulosepalmoplantar) is contemplated by the invention.

De acordo com a invenção, os anticorpos podem serquimicamente ou biossinteticamente conjugados a outros agentes comoagentes antineoplásicos ou antiangiogênicos para tratamento de doença.Agentes antitumor ligados a um anticorpo incluem quaisquer agentes quedestroem ou danificam um tumor ao qual o anticorpo se ligou ou no meio dacélula em que o anticorpo se ligou. Por exemplo, um agente antitumor é umagente tóxico como um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo. Osagentes quimioterapêuticos são conjugados ao anticorpo usando métodosconvencionais (Ver, por exemplo, Hermentin e Seiler (1988) Behring Inst.Mitt. 82, 197-215), incluindo ligadores peptídeo e não peptídeo.In accordance with the invention, antibodies may be chemically or biosynthetically conjugated to other agents such as antineoplastic or antiangiogenic agents for treating disease. Antitumor-linked antitumor agents include any agents that destroy or damage a tumor to which the antibody has bound or in the cell medium in that the antibody bound. For example, an antitumor agent is toxic as a chemotherapeutic agent or a radioisotope. Chemotherapeutic agents are conjugated to the antibody using conventional methods (See, for example, Hermentin and Seiler (1988) Behring Inst.Mitt. 82, 197-215), including peptide and non-peptide linkers.

Anticorpos da invenção também podem ser ligados a agentesprodutores de sinal detectável utilizáveis in vivo e in vitro para fins dediagnóstico. O agente produtor de sinal produz um sinal mensurável que édetectável por meios externos, geralmente a medição de radiaçãoeletromagnética. Para a maior parte, o agente produtor de sinal é uma enzimaou cromóforo, ou emite luz por fluorescência, fosforescência ouquimiluminescência. Os cromóforos incluem corantes que absorvem luz naregião de ultravioleta ou visível, e podem ser substratos ou produtos dedegradação de reações catalisadas por enzima.Antibodies of the invention may also be linked to detectable signal producing agents usable in vivo and in vitro for diagnostic purposes. The signal producing agent produces a measurable signal that is detectable by external means, usually electromagnetic radiation measurement. For the most part, the signal producing agent is an enzyme or chromophore, or emits light by fluorescence, phosphorescence or chemiluminescence. Chromophores include dyes that absorb ultraviolet or visible light in the region, and may be substrates or degradation products of enzyme-catalyzed reactions.

A invenção ainda contempla o uso de anticorpos com agentesdiagnósticos ou tratamento incorporados em reagentes secundários. Porexemplo, um membro de um par de ligação é ligado ao anticorpo da invenção.Agentes antineoplásicos, por exemplo, são conjugados a segundos membrosdestes pares e são, assim, dirigidos ao sítio onde o anticorpo é ligado. Em umaforma de realização preferida, biotina é conjugada a um anticorpo dainvenção, e deste modo prove um alvo para um agente antineoplásico ou outraporção que é conjugada a avidina ou estreptavidina. Além disso, biotina ouuma outra tal porção é ligada a um anticorpo da invenção e usada como umrepórter, por exemplo em um sistema diagnóstico onde um agente produtor desinal detectável é conjugado a avidina ou estreptavidina.The invention further contemplates the use of antibodies with diagnostic agents or treatment incorporated in secondary reagents. For example, a member of a binding pair is bound to the antibody of the invention. Antineoplastic agents, for example, are conjugated to second members of these pairs and are thus directed to the site where the antibody is bound. In a preferred embodiment, biotin is conjugated to an invention antibody, and thus provides a target for an antineoplastic or other evaporation agent that is conjugated to avidin or streptavidin. In addition, biotin or another such moiety is bound to an antibody of the invention and used as a reporter, for example in a diagnostic system where a detectable disinfectant producing agent is conjugated to avidin or streptavidin.

Anticorpos podem ser administrados em combinação com umou mais adjuvantes apropriados, como, por exemplo, citoquinas (IL-10 e IL-13, por exemplo) ou outros estimulantes imunes, como, mas não limitados aquimioquina, antígenos associados a tumor, e peptídeos. Deve-se notar, noentanto, que a administração de um anticorpo sozinho é suficiente paraprevenir, inibir ou reduzir a progressão do tumor de um modoterapeuticamente efetivo.Antibodies may be administered in combination with one or more appropriate adjuvants, such as cytokines (IL-10 and IL-13, for example) or other immune stimulants such as, but not limited to, aquimokine, tumor-associated antigens, and peptides. It should be noted, however, that administration of an antibody alone is sufficient to prevent, inhibit or reduce tumor progression from a therapeutically effective modulator.

Em algumas formas de realização, pode ser desejáveladministrar um anticorpo da invenção que se liga a um RTK e bloqueia aligação ao ligando em combinação com uma outra proteína de ligação aantígeno que se liga ao ligando. Os anticorpos de ligação ao ligando são bemconhecidos na técnica e incluem, por exemplo, anti-VEGF (Avastin®;bevacizumab).In some embodiments, it may be desirable to administer an antibody of the invention that binds to an RTK and blocks ligand binding in combination with another ligand-binding antigen binding protein. Ligand binding antibodies are well known in the art and include, for example, anti-VEGF (Avastin®; bevacizumab).

Os anticorpos da invenção também devem ser usados emmétodos de tratamento combinado por administração com um agenteantineoplásico como um agente quimioterapêutico ou um radioisótopo.Agentes quimioterapêuticos apropriados são conhecidos dos versados natécnica e incluem irinotecan (CPT-11), antraciclinas (por exemplo,daunomicina e doxorrubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina,cisplatina, clorambucila, citosina arabinosida, 5-fluorouridina, melfalan,ricina e calicheamicina. Um anticorpo e um agente antiangiogênico ouantineoplásico são administrados a um paciente em quantidades eficazes parainibir a angiogenese e/ou reduzir o crescimento de tumor. Os anticorpostambém devem ser administrados em combinação com outros regimes detratamento, por exemplo, com tratamentos como terapia de radiação. Paraexemplos de terapias em combinação, ver, por exemplo, patente US6.217.866 (Schlessinger et al.) (anticorpos anti-EGFR em combinação comagentes antineoplásicos); WO 99/60023 (Waksal et al.) (anticorpos anti-EGFR em combinação com radiação).Antibodies of the invention should also be used in combination treatment methods by administration with an antineoplastic agent such as a chemotherapeutic agent or a radioisotope. Suitable chemotherapeutic agents are known to those skilled in the art and include irinotecan (CPT-11), anthracyclines (eg, daunomycin and doxorubicin). ), methotrexate, vindesine, neocarzinostatin, cisplatin, chlorambucil, cytosine arabinoside, 5-fluorouridine, melfalan, ricin and calicheamicin. An antibody and an antiangiogenic or antineoplastic agent are administered to a patient in amounts effective to inhibit angiogenesis and / or reduce tumor growth. Antibodies should also be administered in combination with other treatment regimens, for example with treatments such as radiation therapy. For examples of combination therapies, see, for example, US 6,217,866 (Schlessinger et al.) (Anti-EGFR antibodies in combination with antineoplastic agents); WO 99/60023 (Waksal et al.) (Anti-EGFR antibodies in combination with radiation).

Qualquer agente antineoplásico apropriado pode ser usado,como um agente quimioterapêutico, radiação ou combinação dos mesmos. Osagentes antineoplásicos conhecidos na técnica ou sendo avaliados podem seragrupados em classes com base em seu alvo ou modo de ação. Por exemplo,agentes alquilantes incluem, mas não estão limitados a cisplatina,ciclofosfamida, melfalan e dacarbazina. Exemplos de antimetabólitosincluem, mas não estão limitados a doxorrubicina, daunorrubicina epaclitaxel, gencitabina, e inibidores de topoisomerase irinotecan (CPT-11),aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, e topotecan (topoisomerase I) eetoposida (VP-16) e tenoposida (VM-26) (topoisomerase II). Para a radiação,a fonte pode ser tanto externa (terapia de radiação de feixe externo - EBRT)ou interna (braquiterapia - BT) ao paciente sendo tratado. Estas classificaçõespodem ser utilizáveis para escolher um uso do agente antineoplásico. Porexemplo, observa-se que os anticorpos que ligam IGFR podem serparticularmente efetivos quando administrados com um inibidor detopoisomerase.Any suitable antineoplastic agent may be used, such as a chemotherapeutic agent, radiation or a combination thereof. Antineoplastic agents known in the art or being evaluated may be grouped into classes based on their target or mode of action. For example, alkylating agents include, but are not limited to cisplatin, cyclophosphamide, melphalan and dacarbazine. Examples of antimetabolites include, but are not limited to, doxorubicin, epaclitaxel daunorubicin, gemcitabine, and irinotecan topoisomerase inhibitors (CPT-11), aminocamptothecin, camptothecin, DX-8951f, and topotecan (topoisomeride I-10) and topoisomeride I (10) VM-26) (topoisomerase II). For radiation, the source can be either external (external beam radiation therapy - EBRT) or internal (brachytherapy - BT) to the patient being treated. These classifications may be usable for choosing an antineoplastic agent use. For example, it is noted that IGFR-binding antibodies may be particularly effective when administered with a detopoisomerase inhibitor.

A dose do agente antioneoplásico administrado depende denumerosos fatores, incluindo, por exemplo, o tipo de agente, o tipo eseveridade do tumor sendo tratado e a via de administração do agente. Deveser enfatizado, no entanto, que a presente invenção não está limitada aqualquer dose particular.The dose of the antioneoplastic agent administered depends on a number of factors, including, for example, the type of agent, the type and severity of the tumor being treated, and the route of administration of the agent. It should be emphasized, however, that the present invention is not limited to any particular dose.

Em uma terapia de combinação, o anticorpo é administradoantes, durante, ou após o início da terapia com um outro agente, bem comoqualquer combinação do mesmo, isto é, antes e durante, ante e após, durante aapós, ou antes, durante e após iniciar a terapia com agente antioneoplásico.Por exemplo, para tratamento de um tumor ou doença neoplásica, o anticorpopode ser administrado entre 1 e 30 dias, preferivelmente 3 e 20 dias, maispreferivelmente entre 5 e 12 dias antes de iniciar a terapia de radiação. Emuma forma de realização preferida da invenção, quimioterapia é administradasimultaneamente com, antes de, ou subseqüente à terapia com anticorpo.In a combination therapy, the antibody is administered before, during or after initiation of therapy with another agent as well as any combination thereof, that is, before and during, before and after, after, or before, during and after Initiate therapy with an anioneoplastic agent. For example, for treatment of a tumor or neoplastic disease, the antibody may be administered from 1 to 30 days, preferably 3 to 20 days, more preferably from 5 to 12 days before starting radiation therapy. In a preferred embodiment of the invention, chemotherapy is administered concurrently with, prior to or subsequent to antibody therapy.

Na presente invenção, qualquer via ou método apropriadopode ser usado para administrar os anticorpos da invenção e, opcionalmente,co-administrar os agentes antineoplásicos, antagonistas de receptor, ou outracomposição farmacêutica. Por exemplo, regimes de agentes antineoplásicosutilizados de acordo com a invenção incluem qualquer regime que se acreditaser otimamente apropriado para o tratamento de uma condição neoplásica dopaciente. Malignidades diferentes podem requerer o uso de anticorposantitumor específicos e agentes antineoplásicos específicos que serãodeterminados em uma base de paciente para paciente. As vias deadministração incluem, por exemplo, administração oral, intravenosa,intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A dose do agente antineoplásicoadministrado depende de numerosos fatores, incluindo, por exemplo, o tipo deagente neoplásico, o tipo e severidade do tumor sendo tratado e da via deadministração do agente antineoplásico. Deve ser enfatizado, no entanto, quea presente invenção não está limitada a qualquer método ou via particular deadministração.In the present invention, any suitable route or method may be used to administer the antibodies of the invention and optionally co-administer the antineoplastic agents, receptor antagonists, or other pharmaceutical composition. For example, antineoplastic agent regimens used in accordance with the invention include any regimen believed to be optimally suited for the treatment of a patient neoplastic condition. Different malignancies may require the use of specific antitumor antibodies and specific antineoplastic agents that will be determined on a patient to patient basis. Routes of administration include, for example, oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular administration. The dose of the antineoplastic agent administered depends on a number of factors, including, for example, the type of neoplastic agent, the type and severity of the tumor being treated, and the route of antineoplastic agent administration. It should be emphasized, however, that the present invention is not limited to any particular method or route of administration.

Entende-se que os anticorpos da invenção, quando usados emum mamífero para o fim de profilaxia ou tratamento, serão administrados naforma de uma composição compreendendo adicionalmente um veículofarmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveisapropriados incluem, por exemplo, um ou mais de água, solução salina,solução salina tamponada com fosfato, glicerol, etanol e outros, bem comocombinações dos mesmos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podemainda compreender quantidades menores de substâncias auxiliares comoagentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, quemelhoram a vida em prateleira ou efetividade das proteínas de ligação. Ascomposições da invenção podem, como conhecido na técnica, ser formuladasde modo a prover uma liberação sustentada ou retardada, rápida, doingrediente ativo após a administração ao mamífero.It is understood that the antibodies of the invention, when used in a mammal for purposes of prophylaxis or treatment, will be administered in the form of a composition further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, for example, one or more of water, saline, phosphate buffered saline, glycerol, ethanol and the like, as well as combinations thereof. Pharmaceutically acceptable carriers may further comprise minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers, which enhance the shelf life or effectiveness of the binding proteins. The compositions of the invention may, as known in the art, be formulated to provide sustained or delayed, rapid, active ingredient release following administration to the mammal.

A presente invenção também inclui kits para inibir ocrescimento de tumor e/ou angiogenese, ou tratar outras doenças,compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo dainvenção. Anticorpos humanos ou humanizados são preferidos. Os kits podemainda conter qualquer antagonista apropriado de, por exemplo, um outroreceptor de fator de crescimento envolvido em tumorigenese ou angiogenese(por exemplo, EGFR, VEGFR, VEGFR-I/Flt-1, VEGFR-2/Flk-l/KDR,IGFR, PDGFR, NGFR, FGFR, etc., como descrito acima). Alternativamente,ou além disso, os kits da presente invenção podem ainda compreender umagente antinéoplásico. Exemplos de agentes antineoplásicos apropriados nocontexto da presente invenção são descritos aqui. Os kits da presente invençãopodem ainda compreender um adjuvante; exemplos também são descritosacima.The present invention also includes kits for inhibiting tumor growth and / or angiogenesis, or treating other diseases, comprising a therapeutically effective amount of an invention antibody. Human or humanized antibodies are preferred. The kits may further contain any appropriate antagonist of, for example, another growth factor receptor involved in tumorigenesis or angiogenesis (e.g. EGFR, VEGFR, VEGFR-I / Flt-1, VEGFR-2 / Flk-1 / KDR, IGFR , PDGFR, NGFR, FGFR, etc., as described above). Alternatively, or in addition, the kits of the present invention may further comprise an antineoplastic agent. Examples of suitable anti-neoplastic agents in the context of the present invention are described herein. The kits of the present invention may further comprise an adjuvant; Examples are also described above.

Também está incluído dentro do escopo da presente invençãoo uso dos anticorpos da presente invenção in vivo e in vitro para métodos deinvestigação ou de diagnóstico, que são bem conhecidos na técnica. Osmétodos de diagnóstico incluem kits que contêm os anticorpos da presenteinvenção.Also included within the scope of the present invention is the use of the antibodies of the present invention in vivo and in vitro for research or diagnostic methods which are well known in the art. Diagnostic methods include kits containing the antibodies of the present invention.

Portanto, os presentes anticorpos de ligação a receptor podem,assim, ser usados in vivo e in vitro para métodos de investigação, dediagnóstico, de profilaxia ou de tratamento, que são bem conhecidos natécnica. Naturalmente, deve ser entendido e esperado que variações dosprincípios da invenção aqui descrita podem ser feitas por um versado natécnica e pretende-se que estas modificações devem ser incluídas dentro doescopo da presente invenção. Todas as referências mencionadas aqui sãoincorporadas por referência em sua totalidade.Therefore, the present receptor binding antibodies can thus be used in vivo and in vitro for research, diagnostic, prophylaxis or treatment methods which are well known in the art. Of course, it should be understood and expected that variations of the principles of the invention described herein may be made by a person skilled in the art and it is intended that such modifications should be included within the scope of the present invention. All references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety.

EXEMPLOSEXAMPLES

Os seguintes exemplos ainda ilustram a invenção, mas nãodevem ser considerados como limitando o escopo da mesma de modo algum.Descrições detalhadas de métodos convencionais, como os empregados naconstrução de vetores e plasmídeos, a inserção de genes codificandopolipeptídeos em tais vetores e plasmídeos, a introdução de plasmídeos emcélulas hospedeiras, e a expressão e determinação dos mesmos de genes eprodutos de genes podem ser obtidos a partir de numerosas publicações,incluindo Sambrook , J. et ai., (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2a. Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Coligan, J. et al.(1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated.The following examples further illustrate the invention, but should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. Detailed descriptions of conventional methods such as those employed in vector and plasmid construction, insertion of genes encoding polypeptides into such vectors and plasmids, introduction of plasmids in host cells, and the expression and determination thereof of genes and gene products can be obtained from numerous publications, including Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2a. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Coligan, J. et al. (1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated.

Seleção de anticorpos anti-mPDGFRa humano debiblioteca Fab de exibição de fago. Uma biblioteca de exibição de fagos Fabhumano nativo extensa de Dyax (contendo 3,7 χ IO10 clones) foi usada paraselecionar anticorpos dirigidos contra proteína mPDGFRa-Fc (R&D Systems(Minneapolis, MN). O lote da biblioteca (100 μΐ) foi cultivado na fase Iog em20 ml de meio 2YTAG, recuperado com fago auxiliar M13K07, e amplificadadurante a noite em meio 2YTAK (2YT contendo 100 μg/ml de ampicilina e50 μg/ml de canamicina) a 3 O0C. As preparações de fago foram precipitadasem 4% de PEG, NaCl 0,5 M. As preparações de fago foram recolocadas emsuspensão em 1 ml de leite desnatado a 3%/PBS contendo 240 μg de IgG nãorelacionada e incubadas a 37°C durante 1 h para bloquear a ligação nãoespecífica e a ligação à etiqueta Fc da proteína mPDGFRa.Selection of human anti-mPDGFRα antibodies from the phage display Fab library. An extensive native Dyax Fabhuman phage display library (containing 3.7 χ 10 10 clones) was used to select antibodies directed against mPDGFRa-Fc protein (R&D Systems (Minneapolis, MN). The library lot (100 μΐ) was grown in Phase Iog in 20 ml 2YTAG medium, recovered with M13K07 helper phage, and amplified overnight in 2YTAK medium (2YT containing 100 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin) at 30 ° C. Phage preparations were precipitated at 4% of PEG, 0.5 M NaCl. Phage preparations were resuspended in 1 ml 3% skimmed milk / PBS containing 240 µg of unrelated IgG and incubated at 37 ° C for 1 h to block non-specific binding and binding to Fc label of mPDGFRa protein.

Três ciclos de seleção foram realizados em mPDGFRa-Fccom quantidades decrescentes de proteína (50, 10 e 2 μg, respectivamente)revestidas em tubos de seleção. Para cada ciclo de seleção, tubos MaxisorpStar revestidos com mPDGFRa-Fc (Nunc, Rosklide, DenMark) foramprimeiro bloqueados com 3% de leite/PBS a 37 0C durante 1 h, e entãoincubados com a preparação de fago em temperatura ambiente durante 1 h. Ostubos foram lavados 15 vezes com PBST (PBS contendo 0,1% de Tween 20)seguido por 15 lavagens com PBS. O fago ligado foi eluído em temperaturaambiente durante 10 min com 1 ml de uma solução recentemente preparadade trietilamina 100 mM (Sigma). O fago eluído foi incubado com 10 ml decélulas TGl de fase meio-log a 37 0C durante 30 min estacionários e 30 minem agitação. As células TGl infectadas foram granuladas, depositadas em trêsplacas 2YTAG, e incubadas durante a noite a 3 O0C. Todas as colôniascultivadas nas placas foram raspadas em 3-5 ml de meio 2YTA, misturadascom glicerol (concentração final: 10%), divididas em alíquotas e armazenadasa -80°C. Para ciclos subseqüentes de seleção, o lote de fagos (100 μΐ) do cicloanterior de seleção foi amplificado e usado para seleção após o procedimentodescrito acima com quantidade diminuída de mPDGFRa/Fc para revestir ostubos Maxisorp Star.Three rounds of selection were performed on mPDGFRa-Fc with decreasing amounts of protein (50, 10 and 2 μg, respectively) coated in selection tubes. For each round of selection, mPDGFRa-Fc coated MaxisorpStar tubes (Nunc, Rosklide, DenMark) were first blocked with 3% milk / PBS at 37 ° C for 1 h, and then incubated with the phage preparation at room temperature for 1 h. Ostubes were washed 15 times with PBST (PBS containing 0.1% Tween 20) followed by 15 washes with PBS. Bound phage were eluted at room temperature for 10 min with 1 ml of a freshly prepared 100 mM triethylamine solution (Sigma). The eluted phage was incubated with 10 ml half-log phase TG1 cells at 37 ° C for 30 min stationary and 30 min with shaking. The infected TG1 cells were granulated, deposited in three 2YTAG plates, and incubated overnight at 30 ° C. All colonies cultured on the plates were scraped in 3-5 ml 2YTA medium, mixed with glycerol (final concentration: 10%), aliquoted and stored at -80 ° C. For subsequent selection cycles, the phage lot (100 μ) from the previous selection cycle was amplified and used for selection after the procedure described above with decreased amount of mPDGFRa / Fc to coat the Maxisorp Star tubes.

Para estimar os fagos de entrada, 10 μΐ de fagos antes daseleção foram usados para infectar as células TG1, e então titulados em placas2YTAG. Para estimar a recuperação de fago da seleção, 10 μΐ de célulasinfectadas TGl com fago eluído, do procedimento de seleção acima, foramtitulados em placas 2YTAG. Os rendimentos de recuperação para cada ciclode seleção foram calculados e aumentados nos ciclos sucessivos (primeirociclo, 1x10%; segundo ciclo, 4xl0"6%; terceiro ciclo, 2 χ 10"4%) apesar de serdiminuído o revestimento com mPDGFRa/Fc.To estimate incoming phages, 10 μΐ of phages prior to selection were used to infect TG1 cells, and then titrated onto 2YTAG plates. To estimate phage recovery from selection, 10 μΐ of eluted phage TG1-infected cells from the above selection procedure were titrated in 2YTAG plates. Recovery yields for each selection cycle were calculated and increased in successive cycles (first cycle, 1x10%; second cycle, 4x10 "6%; third cycle, 2 χ 10" 4%) although mPDGFRa / Fc coating was decreased.

Triagem ELISA para anticorpos com atividades de ligaçãoe de bloqueio. Após os 2° e 3° ciclos de seleção, 190 clones de cada cicloforam selecionados aleatoriamente e testados para atividades de ligação e debloqueio por tanto ELISA de fagos como ELISA de Fabs. Brevemente, osclones de TGl recuperados após os 2° e 3a ciclos de seleção foramselecionados aleatoriamente e cultivados a 37 0C em placas de 96 cavidades.Para produzir os fagos, as células foram resgatadas com o fago auxiliarM13K07 como descrito acima. Para produzir Fab solúvel, as células foramincubadas em meio 2YTA contendo 1 mM de IPTG. Para o ELISA deligação, as preparações de fagos e os sobrenadantes de cultura de célulascontendo Fab solúvel foram bloqueadas com 1/6 volume de 18% de leite/PBSem temperatura ambiente durante 1 h. A preparação de fagos bloqueados ousobrenadantes de cultura de células foram então adicionados a placas demicrotitulação de 96 cavidades (Nunc) revestidas com mPDGFRa/Fc (1μg/ml, 50 μΐ, a 4°C durante a noite), e incubados em temperatura ambientedurante 1 h. Após incubação em temperatura ambiente durante 1 h, as placasforam lavadas 3 vezes com PB ST.ELISA screening for antibodies with binding and blocking activities. After the 2nd and 3rd rounds of selection, 190 clones from each cyclophores were randomly selected and tested for binding and deblocking by both phage ELISA and Fab ELISA. Briefly, TG1 clones recovered after the 2nd and 3rd rounds of selection were randomly selected and cultured at 37 ° C in 96-well plates. To produce phages, cells were rescued with the M13K07 helper phage as described above. To produce soluble Fab, cells were incubated in 2YTA medium containing 1 mM IPTG. For the ELISA deletion, phage preparations and soluble Fab-containing cell culture supernatants were blocked with 1/6 volume of 18% milk / PBS at room temperature for 1 h. The preparation of blocked or cell culture supernatant phages were then added to 96-well mPDGFRa / Fc coated (Nunc) demicrotiter plates (1μg / ml, 50 μΐ at 4 ° C overnight) and incubated at room temperature 1 H. After incubation at room temperature for 1 h, the plates were washed 3 times with PB ST.

Para o ELISA de fagos, as placas foram incubadas com umconjugado anticorpo-HRP de fago anti-M13 (Amersham Biosciences). Para oELISA de Fab, as placas foram incubadas com um conjugado anticorpo-HRPde Fab anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratory). Após trêslavagens, a cor foi revelada pela adição de substrato TMB peroxidase (KPL,Gaithersburg, MD), e a absorbância foi medida a 450 nM usando uma leitorade microplaca (Molecular Device, Sunnyvale, CA). ELISAs para ligação aIgG ICll também foram realizados para eliminar os anticorpos específicosFc identificados como aglutinantes na triagem de biblioteca. Mais do que 77%dos clones selecionados após a 2~ seleção, e 99% dos clones recuperados apósa 3~ edição eram positivos em teste de ligação a mPDGFRa, sugerindo umaalta eficiência do processo de seleção.For phage ELISA, the plates were incubated with an anti-M13 phage antibody-HRP conjugate (Amersham Biosciences). For Fab ELISA, plates were incubated with an anti-human Fab antibody-HRP conjugate (Jackson ImmunoResearch Laboratory). After three washings, color was revealed by the addition of TMB peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD), and absorbance was measured at 450 nM using a microplate reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA). IgG IC11 binding ELISAs were also performed to eliminate Fc-specific antibodies identified as binding agents in library screening. More than 77% of clones selected after 2nd selection, and 99% of clones recovered after 3rd edition were positive in mPDGFRα binding test, suggesting a high efficiency of the selection process.

Para o ELISA de bloqueio, preparações de 50 μΐ de fagos ousobrenadantes de cultura de Fabs foram misturadas com uma quantidade fixade mPDGFRa-Fc (0,5 μg/ml) e incubadas em temperatura ambiente durantemin. A mistura foi então transferida para placas de 96 cavidades pré-revestidas com rhPDGF-AA (0,5 μg/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN) eincubada em temperatura ambiente durante 1 h. Para quantificar a proteína demPDGFRa-Fc ligada, as placas foram então incubadas em temperaturaambiente durante 1 h com um conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc decoelho, seguido por três lavagens e adição do substrato de TMS peroxidase. Aproteína mPDGFRa-Fc ligada foi quantificada por leitura da absorbância a450 nM. A atividade de bloqueio foi indicada por sinal de ELISA diminuídodetectado por conjugado anticorpo-HRP anti-humano-Fc. Cerca de 4,2% dosclones que ligaram mPDGFRa mostraram atividade de bloqueio de PDGF-AA.For the blocking ELISA, 50 μ prepar phage preparations or Fabs culture supernatants were mixed with a fixed amount of mPDGFRa-Fc (0.5 μg / ml) and incubated at room temperature durantemin. The mixture was then transferred to rhPDGF-AA pre-coated 96-well plates (0.5 μg / ml; R&D Systems, Minneapolis, MN) and incubated at room temperature for 1 h. To quantify the bound DemPDGFRa-Fc protein, the plates were then incubated at room temperature for 1h with an antibody-HRP anti-human-Fc horseradish conjugate, followed by three washes and addition of the TMS peroxidase substrate. The bound mPDGFRa-Fc protein was quantified by reading the absorbance at 450 nM. Blocking activity was indicated by decreased ELISA signal detected by antibody-HRP anti-human-Fc conjugate. About 4.2% of the clones that bound mPDGFRa showed PDGF-AA blocking activity.

Com base nos resultados de testes de bloqueio, 14 clones,incluindo um aglutinante de não-bloqueio como um clone de controle (3F3),foram inicialmente selecionados para outro estudo. DNAs de fagemídio foramisolados e as seqüências de DNA foram determinadas por sequenciamento dedideoxinucleotídeos. A classificação e alinhamentos de genes VH e VL foramrealizados usando o sítio da web Bioinformatics de Andrew C.R. Martin'sBioinformatics Group (www.bioinf.org.uk) e MagAlign de DNAstar.Based on blocking test results, 14 clones, including a non-blocking binder as a control clone (3F3), were initially selected for another study. Phagemid DNAs were isolated and DNA sequences were determined by dideoxynucleotide sequencing. VH and VL gene sorting and alignments were performed using the Andrew C.R. Martin's Bioinformatics Group (www.bioinf.org.uk) and MagAlign DNAstar's Bioinformatics website.

Análise de anticorpos anti- mPDGFRa selecionados.Dentre os 14 clones, 9 anticorpos distintos foram revelados (Tabela 1). Alémde IClO e IF2, não foram encontrados VHs ou V|Ls idênticos.Interessantemente, quatro dos anticorpos com atividade de bloqueio maisforte tinham cadeias leves incompletas. Os clones IF2 e IF9 tinham deleçõesde Vl na armação (seqüência de peptídeos líder seguida por seqüência de Cl).Os clones IClO e 1F2 compartilharam o mesmo gene Vh- No entanto, umavez que a seqüência de IClO codificando Vl incluía um códon de parada, esteCl não foi expressado. O clone 3G7 incluindo um códon de parada apareceuna extremidade 5' do gene VL. Tanto IClO como 3G7 demonstraram um fortebloqueio. A expressão de Fab e atividade de ligação pareceram ser muitobaixas, mas podem ser levadas em conta pela fraca ligação do reagentesecundário de Fab anti-humano.Tabela 1 - Anticorpos anti- mPDGFRa de uma biblioteca de exibição de fagos FabsAnalysis of selected anti-mPDGFRα antibodies. Among 14 clones, 9 distinct antibodies were revealed (Table 1). In addition to IC10 and IF2, no identical VHs or V | Ls were found. Interestingly, four of the antibodies with stronger blocking activity had incomplete light chains. Clones IF2 and IF9 had deletions of V1 in the frame (leader peptide sequence followed by Cl sequence). Clones IC10 and 1F2 shared the same Vh gene. However, since the IC10 coding sequence V1 included a stop codon, ThisCl was not expressed. Clone 3G7 including a stop codon appears at the 5 'end of the VL gene. Both IC10 and 3G7 demonstrated a strong lock. Fab expression and binding activity appeared to be very low, but can be accounted for by poor binding of anti-human Fab secondary reagents. Table 1 - Anti-mPDGFRa Antibodies from a Fabs Phage Display Library

<table>table see original document page 41</column></row><table><table> table see original document page 41 </column> </row> <table>

Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para os Fabs sãocomo a seguir: domínio Vh de 1E10: SEQ ID Nos: 51 e 52; domínio Vl de1E10: SEQ ID Nos: 53 e 54; domínio Vh de 1A12: SEQ ID Nos: 55 e 56;domínio Vl de 1A12: SEQ ID Nos: 57 e 58; domínio Vh de 3B2: SEQ IDNos: 59 e 60; domínio Vl de 3B2: SEQ ID Nos: 61 e 62; domínio Vh de1C10: SEQ ID Nos: 63 e 64; domínio Vl de 1C10: SEQ ID Nos: 65 e 66;domínio Vh de 3G7: SEQ ID Nos: 67 e 68; seqüência de nucleotídeos dodomínio Vl de 3G7: SEQ ID No: 69; domínio Vl de 3G7: QAW; domínio Vhde 1F9: SEQ ID Nos: 70 e 71; domínio Vl de 1F9: SEQ ID Nos: 72 e 73;domínio Vh de 1F2: SEQ ID Nos: 74 e 75; domínio Vl de 1F2: SEQ ID Nos:76 e 77. A figura 15 mostra cada um dos domínios (incluindo as truncagensde Vl ou deleções de 3G7, 1F9 e 1F2) e as localizações das regiões de CDR.Nucleotide and amino acid sequences for Fabs are as follows: 1E10 Vh domain: SEQ ID Nos: 51 and 52; E10 V1 domain: SEQ ID Nos: 53 and 54; 1A12 Vh domain: SEQ ID Nos: 55 and 56; 1A12 V1 domain: SEQ ID Nos: 57 and 58; 3B2 Vh domain: SEQ IDNs: 59 and 60; 3B2 V1 domain: SEQ ID Nos: 61 and 62; 1C10 Vh domain: SEQ ID Nos: 63 and 64; 1C10 V1 domain: SEQ ID Nos: 65 and 66 3G7 Vh domain: SEQ ID Nos: 67 and 68; 3G7 dodomain V1 nucleotide sequence: SEQ ID No: 69; 3G7 V1 domain: QAW; Vhde domain 1F9: SEQ ID Nos: 70 and 71; 1F9 V1 domain: SEQ ID Nos: 72 and 73; 1F2 Vh domain: SEQ ID Nos: 74 and 75; 1F2 V1 domain: SEQ ID Nos: 76 and 77. Figure 15 shows each of the domains (including the V1 truncations or 3G7, 1F9 and 1F2 deletions) and the locations of the CDR regions.

Os fragmentos Fab de seis clones foram expressados emcélulas hospedeiras HB2151 de E. Coli, e purificados pela coluna G deproteína por cromatografia de afinidade. Os fagemídeos dos clonesselecionados individuais foram usados para transformar uma HB2151 dehospedeiro de E. Coli não supressor. A expressão de fragmentos Fabs emHB2151 foi induzida cultivando as células em meio 2YTA contendo 1 mM deIPTG a 3O0C. Um extrato periplasmático das células foi preparado comodescrito por Lu (χ). A proteína de Fab solúvel foi purificada usando umacoluna de proteína G seguindo o protocolo do fabricante (AmershamBiosciences). Para examinar a pureza e o peso molecular da preparação, osanticorpos purificados foram submetidos a eletroforese em 4-12% de gel Bis-Tris NuPAGE™ (Invitrogen) e visualizados por coloração com a solução deSimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen).Fab fragments of six clones were expressed in E. coli HB2151 host cells, and purified by the G-protein column by affinity chromatography. Phagemids from the individual selected cloners were used to transform a non-suppressing E. coli host HB2151. Expression of Fabs fragments in HB2151 was induced by culturing the cells in 2YTA medium containing 1 mM deIPTG at 30 ° C. A periplasmic extract of the cells was prepared as described by Lu (χ). Soluble Fab protein was purified using a protein G column following the manufacturer's protocol (AmershamBiosciences). To examine the purity and molecular weight of the preparation, purified antibodies were electrophoresed on 4-12% Bis-Tris NuPAGE ™ gel (Invitrogen) and visualized by staining with the SimplyBlue ™ SafeStain solution (Invitrogen).

As proteínas de ligação purificadas foram analisadas por SDS-PAGE (figura 2). Fabs com cadeias leves completas aparecem na figura 2Acom pesos moleculares de cerca de 50.000. Em contraste, fragmentos nãoreduzidos de 1F2 e 1F9 deram bandas pequenas (-DTT: MW ~ 37.500) comocomparado com um Fab de controle padrão (figura 2B). Em condições deredução (+DTT), duas bandas foram evidentes, a banda superior consistentecom o tamanho normal de fragmentos VH=CHl, e as bandas inferioresconsistentes com cadeias leves tendo fragmentos CL (MW ~ 12.500) masfaltando os domínios variáveis.Purified binding proteins were analyzed by SDS-PAGE (Figure 2). Full light chain Fabs appear in Figure 2A with molecular weights of about 50,000. In contrast, unreduced fragments of 1F2 and 1F9 gave small bands (-DTT: MW ~ 37,500) as compared to a standard control Fab (Figure 2B). Under deduction conditions (+ DTT), two bands were evident, the upper band consistent with the normal size of VH = CH1 fragments, and the lower band consistent with light chains having CL fragments (MW ~ 12,500) masking the variable domains.

Ligação de mPDGFRa e bloqueio de mPDGFRa / PDGF-AA por anticorpos anti-mPDGFRa. Fragmentos Fabs solúveis de seisclones anti- mPDGFRa foram comparados quantitativamente em suaeficiência de ligação a antígeno e potência par bloquear a interação demPDGFRa/ PDGF-AA. No teste de ligação, o Fab foi primeiro incubado emuma placa de 96 cavidades pré-revestida com proteína de fusãomPDGFRa/Fc (1 μg/ml) em temperatura ambiente durante 1 h, seguido porincubação com um conjugado anticorpo-HRP Fab anti-anti-humano de coelhodurante mais 1 h. O anticorpo-HRP ligado à placa foi então quantificado pelaadição de substrato de peroxidase. Consistente com o resultado da triageminicial (tabela 1), Fab 1F2 liga-se muito mais eficientemente a mPDGFRa doque todas as outras proteínas Fab (figura 3A).Binding of mPDGFRa and blocking mPDGFRa / PDGF-AA by anti-mPDGFRa antibodies. Soluble Fab fragments of six anti-mPDGFRa clones were quantitatively compared in their antigen binding efficiency and potency to block the demPDGFRa / PDGF-AA interaction. In the binding assay, Fab was first incubated in a 96-well plate coated with PDGFRa / Fc fusion protein (1 μg / ml) at room temperature for 1 h, followed by incubation with an anti-anti-HRP Fab antibody conjugate. human coelhodurant for 1 h more. The plate-bound HRP antibody was then quantified by the addition of peroxidase substrate. Consistent with the triageminitial result (Table 1), Fab 1F2 binds much more efficiently to mPDGFRa than all other Fab proteins (Figure 3A).

A cinética de ligação de vários anticorpos anti- mPDGFRa foideterminada por ressonância de plasmon de superfície usando um biossensorBIAcore 3000 e avaliada usando o programa BIA Evaluation 2.0 (Biacore,Inc., Uppsala, Suécia). A constante de afinidade, Kd, foi calculada a partir darelação da taxa de dissociação (^desligado)/ taxa de associação (Migado). Osvalores descritos representam a média ± desvio padrão, de pelo menos duasdeterminações para Fabs e três determinações para IgG. (Tabela 2).Consistente com os testes de ligação, o anticorpo sVD 1F2 tem afinidademuito maior (Kd) de cerca de 0,5 nM, mais do que 23 vezes mais alta do que oFab normal selecionado, IEl0.Binding kinetics of various anti-mPDGFRα antibodies were determined by surface plasmon resonance using a BIAcore 3000 biosensor and evaluated using the BIA Evaluation 2.0 program (Biacore, Inc., Uppsala, Sweden). The affinity constant, Kd, was calculated from the dissociation rate (Δ off) / association rate (Migrate) correlation. The values described represent the mean ± standard deviation of at least two determinations for Fabs and three determinations for IgG. (Table 2). Consistent with the binding assays, the sVD 1F2 antibody has a much higher affinity (Kd) of about 0.5 nM, more than 23 times higher than the selected normal Fab, IE10.

Na tabela 2, Fab 1F2-2H é um Fab divalente engenheiradocontendo um segundo domínio VH idêntico expressado como uma fusão paraCL. O Fab divalente foi expressado em E. coli e purificado por cromatografiade proteína G. Análise SDS-PAGE do Fab 1F2-2H purificado demonstrouuma banda de proteína única de aproximadamente 50 kD, similar à dofragmento Fab padrão (figura 5). A afinidade do Fab divalente é 79,5 pM,comparado a 418 pM para o Fab 1F2 mono valente, indicando uma melhora de5,2 vezes (tabela 2).In Table 2, Fab 1F2-2H is an engineered divalent Fab containing a second identical VH domain expressed as a paraCL fusion. The divalent Fab was expressed in E. coli and purified by protein G chromatography. SDS-PAGE analysis of purified 1F2-2H Fab demonstrated a single protein band of approximately 50 kD, similar to standard Fab defragment (Figure 5). The affinity of the divalent Fab is 79.5 pM, compared to 418 pM for the monovalent 1F2 Fab, indicating a 5.2-fold improvement (Table 2).

<table>table see original document page 43</column></row><table><table> table see original document page 43 </column> </row> <table>

No teste de bloqueio, várias quantidades de anticorpos foramincubadas com uma quantidade fixa de fusão mPDGFRa/Fc em solução,durante 30 min, e as misturas foram então transferidas para placas de 96cavidades revestidas com rhPDGF-AA e incubadas durante 1 h. mPDGFRaligado foi então quantificado por quantificação de Fc-Ab anti-humano ligado.O Fb 1F2 bloqueou fortemente a interação de mPDGFRa/PDGF-AA (figura-3B), com o valor IC50 de 12 nM, comparado com 57, 140 e 220 nM para 1F9,IElO e IAl 1, respectivamente. Em uma base molar igual, o Fab divalentemostrou uma atividade moderadamente melhorada tanto na ligação amPDGFRa como no bloqueio da interação receptor/ligando (figura 6).In the blockade test, various amounts of antibodies were incubated with a fixed amount of mPDGFRa / Fc fusion in solution for 30 min, and the mixtures were then transferred to rhPDGF-AA coated 96-well plates and incubated for 1 h. Linked mPDGFR was then quantified by quantification of bound anti-human Fc-Ab. Fb 1F2 strongly blocked the interaction of mPDGFRa / PDGF-AA (figure-3B) with an IC50 value of 12 nM compared with 57, 140 and 220 nM for 1F9, IE10 and IA1, respectively. On an equal molar basis, divalent Fab showed moderately improved activity in both amPDGFRα binding and blocking receptor / ligand interaction (Figure 6).

Clonagem, expressão e purificação de IgG completa. Fabsde clones selecionados foram convertidos em IgGs de comprimento completoclonando os domínios VH e VL no vetor de expressão de cadeia pesada,pDFc, e vetor de expressão de cadeia leve, pLCk, respectivamente. O pDFctem sítios de clonagem Hind III e Nhe I entre os genes de codificação de umaseqüência de peptídeo líder e CHl. O pLCk tem sítios de clonagem Hind III eBsiW I entre uma seqüência de peptídeo líder e CL. Brevemente, os genes decodificação de VH e VL foram amplificados por PCR de transcrição reversade DNAs fagemídeos e clonados em seus respectivos vetores de expressão.Os vetores de expressão de cadeia pesada e cadeia leve (VH-pDFc e VL-pLCk) foram então co-transfectados em células COS-7 para expressãotransiente como anteriormente descrito. Os meios de cultura de células foramcoletados em 48 e 96 horas após a transfecção, e reunidos. Os anticorposforam purificados do sobrenadante de culturas de células por cromatografia deafinidade usando colunas de proteína A seguindo o protocolo do fabricante(Amersham Biosciences). Após a função de IgG ser confirmada, os paresexpressados de genes VH e VL foram clonados em vetores de expressãoúnicos e transfectados em células COS-7. A purificação dos anticorpos foicomo descrito acima.Cloning, expression and purification of complete IgG. Fabs from selected clones were converted to full length IgGs by cloning the VH and VL domains into the heavy chain expression vector, pDFc, and light chain expression vector, pLCk, respectively. PDFc have Hind III and Nhe I cloning sites between the leader peptide and CH1 sequence encoding genes. PLCk has Hind III eBsiW I cloning sites between a leader peptide sequence and CL. Briefly, the VH and VL decoding genes were amplified by reverse transcription PCR phagemid DNAs and cloned into their respective expression vectors. The heavy and light chain expression vectors (VH-pDFc and VL-pLCk) were then co-coded. transfected into COS-7 cells for transient expression as previously described. Cell culture media were collected at 48 and 96 hours after transfection, and pooled. Antibodies were purified from cell culture supernatant by affinity chromatography using protein A columns following the manufacturer's protocol (Amersham Biosciences). After IgG function was confirmed, the expressed pairs of VH and VL genes were cloned into single expression vectors and transfected into COS-7 cells. Purification of antibodies has been described above.

Três construções de tipo IgG foram produzidas a partir de Ig1F2 que contém somente um VH (ver figura 7), incluindo IgG de IF2-2Htetravalente com quatro VHs (A), e IF2 divalente com Vh de 1F2 expressadocomo uma fusão tanto a Ch como a Cl (B e C). Os plasmídeos para expressaras cadeias leves e pesadas foram usados para co-transfectar as células COS-7para expressão transiente. Os níveis de expressão dos anticorpos forammonitorados por ELISA usando os sobrenadantes de culturas de células. Aexpressão de 1F2-2H foi consistentemente menor do que ambos os anticorpos1F2 divalentes, cerca de um quarto de anticorpos 1F2 divalentes. Osanticorpos do sobrenadante de culturas de células foram purificados porcromatografia de afinidade usando uma coluna de proteína A.Three IgG-like constructs were produced from Ig1F2 containing only one VH (see Figure 7), including four VHs tetravalent IF2-2H IgG (A), and 1F2 Vh divalent IF2 expressed as a fusion to both Ch and Cl (B and C). Plasmids to express light and heavy chains were used to co-transfect COS-7 cells for transient expression. Antibody expression levels were monitored by ELISA using cell culture supernatants. 1F2-2H expression was consistently lower than both divalent 1F2 antibodies, about one quarter of divalent 1F2 antibodies. Cell culture supernatant antibodies were purified by affinity chromatography using a protein A column.

Clone IElO, um bloqueador com componentes de anticorposnormais, também foram convertidos em uma IgG de comprimento completo.Os genes de Vh e Vl de IElO foram primeiro clonados em pDFc e pLCk,respectivamente. Como acima, após sequenciamento de DNA e confirmaçãoda atividade de ligação a IgG de IE10, o par VH/VL expressado foi clonadoem um vetor de expressão único que foi então usado para transfectar ascélulas COS-7 seguido por purificação de anticorpos.Clone IE10, a blocker with abnormal antibody components, was also converted to a full length IgG. The IE10 Vh and V1 genes were first cloned into pDFc and pLCk, respectively. As above, after DNA sequencing and confirmation of IE10 IgG binding activity, the expressed VH / VL pair was cloned into a single expression vector which was then used to transfect COS-7 cells followed by antibody purification.

Anticorpos purificados foram analisados por SDS-PAGE paradeterminar a pureza e o peso molecular da preparação. Os anticorposdivalentes 1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH, com MW ~ 125.000, migraram maisrápido do que a IgG normal (1E10 e 2B4; painel à esquerda da figura 8).Quando os anticorpos foram tratados com DTT antes de eletroforese (painel àdireita da figura 8), os componentes de cadeias pesadas e leves foramresolvidos. O anticorpo 1F2-CH/CL tinha uma banda superior correlacionadacom uma cadeia pesada similar à de IElO e 2B4, e uma banda inferiormigrando rápido com uma mobilidade próxima à antecipada (MW ~ 12.500,somente CL). O anticorpo 1F2-CL/CH, por outro lado, mostrou que a bandainferior representa uma cadeia leve com mobilidade similar à de IElO e 2B4,e a banda superior correlaciona com o polipeptídeo ChI-Fc somente (MW ~37.500).Purified antibodies were analyzed by SDS-PAGE to determine the purity and molecular weight of the preparation. Different antibodies 1F2-CH / CL and 1F2-CL / CH, with MW ~ 125,000, migrated faster than normal IgG (1E10 and 2B4; left panel of Figure 8). When antibodies were treated with DTT before electrophoresis ( right panel of figure 8), the heavy and light chain components have been resolved. The 1F2-CH / CL antibody had a higher band correlated with a heavy chain similar to that of IE10 and 2B4, and a fast migrating lower band with near-anticipated mobility (MW ~ 12,500, CL only). Antibody 1F2-CL / CH, on the other hand, showed that the lower band represents a light chain with mobility similar to that of IE10 and 2B4, and the upper band correlates with the ChI-Fc polypeptide only (MW ~ 37,500).

Atividades de ligação e de bloqueio dos anticorpos anti-mPDGFRa de comprimento completo. Todos os três anticorpos variantesde 1F2 purificados, 1F2-2H, 1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH e o anticorpo IElOforam comparados para sua afinidade de ligação a mPDGFRa por ELISA.Várias quantidades de anticorpos foram incubadas na placa de ELISArevestida com mPDGFRa/Fc, anticorpos ligados a mPDGFRa foram entãodetectados por um conjugado anticorpo HRP anti-humano-κ. O resultado deELISA indica que ainda que IgG 1F2-2H tenha quatro sítios de ligação, aatividade de ligação de IF2-2H foi ~ 8x mais baixa do que ambos os IgGs de1F2 divalentes (1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH (figura 9A). Por outro lado, ambosos 1F2 divalentes (1F2-CH/CL) e 1F2-CL/CH) tiveram afinidade de ligaçãomuito similar mostrada por ELISA (figura 9A) e análise BIAcore (tabela 2).A afinidade de IgG 1F2 divalente aumentou em cerca de uma grandeza apartir de Fab de 1F2 parental e IgG de IElO aumentou 20 vezes de seu Fab(tabela 2). No todo, as afinidades de ligação de ambos IgGs de 1F2 divalentesem mPDGFRa foram cerca de uma grandeza maior do que IgG de IElO(figura 9A e tabela 2).Binding and blocking activities of full-length anti-mPDGFRa antibodies. All three purified 1F2 variant antibodies, 1F2-2H, 1F2-CH / CL and 1F2-CL / CH and the IE10 antibody were compared for their binding affinity to mPDGFRa by ELISA. Various amounts of antibodies were incubated in the ELIS plate coated with mPDGFRa. / Fc, antibodies bound to mPDGFRα were then detected by an anti-human HRP-κ antibody conjugate. The ELISA result indicates that although 1F2-2H IgG has four binding sites, the IF2-2H binding activity was ~ 8x lower than both divalent 1F2 IgGs (1F2-CH / CL and 1F2-CL / CH (Figure 1). On the other hand, both divalent 1F2 (1F2-CH / CL) and 1F2-CL / CH) had very similar binding affinity shown by ELISA (Figure 9A) and BIAcore analysis (Table 2). increased by about one magnitude from parental 1F2 Fab and IE10 IgG increased 20-fold from its Fab (Table 2). Overall, the binding affinities of both divalent 1F2 IgGs in mPDGFRa were about a greater magnitude than IE10 IgG (Figure 9A and Table 2).

Testes de bloqueio quantitativos também foram realizados paraavaliar os anticorpos anti- mPDGFRa. Como descrito acima, váriasquantidades de anticorpos foram incubadas com uma quantidade fixa de fusãode mPDGFRa/Fc em solução, durante 30 min, e as misturas foram entãotransferidas para placas de 96 cavidades revestidas com rhPDGF-AA eincubadas durante 1 h. mPDGFRa ligado foi então quantificado porquantificação de Fc-Ab anti-humano ligado. Consistente com os dados deligação, os 1F2-CH/CL e 1F2-CL/CH divalentes foram melhoresbloqueadores do que IgG de 1F2-2H e IgG de 1E10: os valores IC50 foram3,2, 2,7, 17, e 9,6 nM, para 1F2-CH/CL, 1F2-CL/CH, IgG de 1F2-2H e IgGde IEl0, respectivamente (figura 9B).Quantitative blocking tests were also performed to evaluate anti-mPDGFRa antibodies. As described above, various amounts of antibodies were incubated with a fixed amount of mPDGFRa / Fc fusion in solution for 30 min, and the mixtures were then transferred to rhPDGF-AA coated 96-well plates and incubated for 1 h. Bound mPDGFRα was then quantified by quantification of bound anti-human Fc-Ab. Consistent with the deletion data, the divalent 1F2-CH / CL and 1F2-CL / CH were better blockers than 1F2-2H IgG and 1E10 IgG: IC50 values were 3.2, 2.7, 17, and 9.6 nM for 1F2-CH / CL, 1F2-CL / CH, 1F2-2H IgG and IE10 IgG, respectively (Figure 9B).

Anticorpos biespecíficos. Um anticorpo anti-Flk-1, 2B4,também foi isolado da biblioteca de fagos Fab Dyax usando o mesmoprocedimento descrito acima, exceto que os tubos Maxisorp Star foramrevestidos com proteína de fusão mVEGFR2-Fc. O Fab de 2B4 foi específicopara Flk-I e bloqueou a interação Flk-IATEGFi65. Os domínios Vh e Vl deFab de 2B4 são providos pelas SEQ ID Nos: 79 e 81, respectivamente. Afigura 15 mostra cada um dos domínios e as localizações das regiões de CDR.O Fab de 2B4 foi convertido em IgGl completo como descrito acima. Acinética de ligação de Fab de 2B4 e IgG foi determinada por análise BIA core.As afinidades de ligação de Fab de 2B4 e IgG para mVEGFR2 são 6,7 ±3,0nM e 0,39 ±0,1 nM, respectivamente. IgG de 2B4 bloqueia a interaçãoVEGFR2/VEGFi65 com um valor IC50 de aproximadamente 3,5 nM (figura13B).Bispecific antibodies. An anti-Flk-1 antibody, 2B4, was also isolated from the Fab Dyax phage library using the same procedure described above except that Maxisorp Star tubes were coated with mVEGFR2-Fc fusion protein. The 2B4 Fab was Flk-I specific and blocked the Flk-IATEGFi65 interaction. The 2B4 DeFab Vh and Vl domains are provided by SEQ ID Nos: 79 and 81, respectively. Figure 15 shows each of the domains and regions of the CDR regions. The 2B4 Fab was converted to complete IgG1 as described above. 2B4 and IgG Fab binding kinetics were determined by BIA core analysis. The 2B4 and IgG Fab binding affinities for mVEGFR2 are 6.7 ± 3.0nM and 0.39 ± 0.1 nM, respectively. 2B4 IgG blocks the VEGFR2 / VEGFi65 interaction with an IC50 value of approximately 3.5 nM (Figure 13B).

Construção de anticorpos biespecíficos com base nosdomínios (anti- mPDGFRa χ anti-Flt-1) - Anticorpos biespecíficos combase nos domínios foram construídos em dois formatos, o formato scFv e oformato Fab (figura 10, A e B). No formato scFv, os fragmentos PCRcodificando os genes VH e VL de 2B4 foram primeiro reunidos usando PCRde sobreposição. O término COOH de VL de 2B4 foi ligado ao término NH2de VH 2B4 via um ligador de 5 aminoácidos (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly, obtidosdo terminal N de um domínio CL) (figura 10A). O gene resultante,codificando VL-VH de 2B4, foi então clonado no vetor pDFc via ligaçãoHindIII/ Nhe I para expressão da fusão scFv2B4-CH (consistindo de 2B4 VL-2B4 VH - CHl - CH2 - CH3). O vetor de expressão scFv2B4-CH foi entãoformado em pares com o vetor de expressão 1F2VH-CL como descrito acimapor co-transfecção de células COS-7 para expressão transiente.Construction of Domain-Based Bispecific Antibodies (Anti-FlP-1 mPDGFRα χ) - Domain-specific bispecific antibodies were constructed in two formats, the scFv format and the Fab format (Figure 10, A and B). In scFv format, PCR fragments encoding the 2B4 VH and VL genes were first assembled using overlapping PCR. The 2B4 VL COOH terminus was linked to the VH 2B4 NH2 terminus via a 5 amino acid linker (Ala-Ser-Thr-Lys-Gly, obtained from the N-terminus of a CL domain) (Figure 10A). The resulting gene encoding 2B4 VL-VH was then cloned into the pDFc vector viaHindIII / Nhe I binding for expression of the scFv2B4-CH fusion (consisting of 2B4 VL-2B4 VH - CH1 - CH2 - CH3). The scFv2B4-CH expression vector was then paired with the 1F2VH-CL expression vector as described above by co-transfecting COS-7 cells for transient expression.

No formato Fab, o gene Vh de 1F2 e o Vl de 2B4 foramprimeiro reunidos usando PCR de sobreposição. Nesta fusão, o términoCOOH de Vh 1F2 foi ligado ao término amino de L de 2B4 via um ligador de5 aminoácidos da extremidade 5' de Ch- O gene codificando VH-2B4 VL 1F2foi então clonado no vetor pLCk via os sítios HindIII/BsiWpara expressão daproteína de fusão 1F2 VH-2B4 VL-CL. O gene Vh de 2B4 foi clonado novetor pDFc como descrito acima para expressão de VH. Os plasmídeos paraexpressar cadeias leves e pesadas, formadas em pares como descrito na figura10B, foram usados para co-transfectar células COS-7 para expressãotransiente.In Fab format, the 1F2 Vh gene and 2B4 Vl were first pooled using overlap PCR. In this fusion, the Vh 1F2 COOH terminus was linked to the 2B4 L amino terminus via a 5 amino acid linker of the 5 'end of Ch. The gene encoding VH-2B4 VL 1F2 was then cloned into the pLCk vector via the HindIII / BsiW sites for protein expression. Melting Point 1F2 VH-2B4 VL-CL. The 2B4 Vh gene was cloned into pDFc primer as described above for VH expression. Plasmids for expressing light and heavy chains, paired as described in Figure 10B, were used to co-transfect COS-7 cells for transient expression.

Após os clores serem testados por ELISA para atividades deligação dual, as construções de expressão de Ig foram combinadas em umvetor de expressão único que foi então usado para transfectar as células COS-7 para expressão transiente do IgG projetado. Os anticorpos foram purificadosdo sobrenadante de culturas de células como descrito acima.After the chlorins were tested by ELISA for dual deletion activities, the Ig expression constructs were combined into a single expression vector which was then used to transfect COS-7 cells for transient expression of engineered IgG. Antibodies were purified from cell culture supernatant as described above.

Expressão e purificação de anticorpos biespecíficos combase nos domínios. Os anticorpos 1F2/scFv2B4 e 1F2-2B4 foram produzidospor transfecção e expressão transiente em células COS-7 (100-200 ml deculturas de células). Os anticorpos foram purificados dos sobrenadantes deculturas de células por cromatografia de afinidade usando colunas de proteína A.Expression and purification of bispecific antibodies combase in the domains. Antibodies 1F2 / scFv2B4 and 1F2-2B4 were produced by transfection and transient expression in COS-7 cells (100-200 ml cell cultures). Antibodies were purified from cell culture supernatants by affinity chromatography using protein A columns.

Anticorpos biespecíficos purificados (1F2/scFv e 1F2-2B4) eseus anticorpos parentais 1F2 e 2B4 foram analisados por SDS-PAGE (figura8). A mobilidade inferior dos anticorpos biespecíficos não tratados (-DTT)estava correlacionada com seu pelo molecular alto (~ 175,000), comocomparado a IgG de 2B4 e 1F2-CH/CL divalente que migraram na posição depeso molecular ~ 125.000. Os dois componentes de cada um de quatroanticorpos foram separadamente resolvidos após tratamento com DTT.Comparando com uma IgG padrão (2B4), a banda inferior do anticorpobiespecífico 1F2/scFv2B4 (a fusão VH-CL) é comparável a uma cadeia levede IgG padrão. A banda superior está correlacionada com uma proteína defusão de cadeia pesada de scFv (MW ~ 62.500). Por outro lado, a bandasuperior de 1F2-2B4 corresponde à cadeia pesada de uma IgG padrão (2B4) ea banda inferior é observada em uma posição esperada para uma fusão deVH-cadeia leve (MW ~ 37.500).Purified bispecific antibodies (1F2 / scFv and 1F2-2B4) and their parental antibodies 1F2 and 2B4 were analyzed by SDS-PAGE (Figure 8). The lower mobility of untreated bispecific antibodies (-DTT) correlated with their high molecular hair (~ 175,000), as compared to dB-2B4 and divalent 1F2-CH / CL IgG that migrated at the molecular weight position ~ 125,000. The two components of each of four antibodies were resolved separately after DTT treatment. Comparing to a standard IgG (2B4), the lower band of the 1F2 / scFv2B4 antibody (the VH-CL fusion) is comparable to a standard IgG yeast chain. The upper band correlates with a scFv heavy chain fusion protein (MW ~ 62,500). On the other hand, the upper band of 1F2-2B4 corresponds to the heavy chain of a standard IgG (2B4) and the lower band is observed at an expected position for an HCV-light chain fusion (MW ~ 37,500).

Especificidade dual de anticorpos biespecíficos com baseem domínios. Em um teste de reticulação, o anticorpo 1F2-2B4 biespecífico eos anticorpos 1F2-CH/CL e 2B4 monoespecíficos foram primeiro incubadoscom mPDGFRa ou mVEGFR2 em solução e então transferidos para umaplaca de microtitulação revestida com o segundo receptor (mVEGFR2 oumPDGFRa, respectivamente), seguido por incubação com um anticorpopoliclonal rotulado com biotina para o primeiro receptor. Somente o BsAb,mas não IgG de 2B4 monoespecífica parental e 1F2-CH/CL, foi capaz dereticular os dois receptores de alvo.Dual specificity of bispecific domain based antibodies. In a cross-linking test, bispecific 1F2-2B4 antibody and monospecific 1F2-CH / CL and 2B4 antibodies were first incubated with mPDGFRa or mVEGFR2 in solution and then transferred to a second receptor-coated microtiter plate (mVEGFR2 or mPDGFRa, respectively), followed, by incubation with a biotin-labeled anti-polyclonal to the first receptor. Only BsAb, but not parental monospecific 2B4 IgG and 1F2-CH / CL, was able to derectulate both target receptors.

A eficiência de ligação a antígeno dos anticorpos biespecíficoscom base nos domínios foi determinada em mPDGFRa imobilizado e Flk-1.ELISA mostrou que o anticorpo biespecífico, 1F2/scFv2B4 e 1F2-2B4, ligou-se a mPDGFRa e Flk-1, mas não tão eficientemente quanto o anticorpo 1F2parental e 2B4 (figura 12). No entanto, em ambos os casos, a ligação doanticorpo 1F2-2B4 foi levemente mais eficiente comparado com1F2/scFv2B4. Como esperado, o 2B4 do anticorpo específico de Flk-I não seliga a mPDGFRa (figura 12A), nem o 1F2 do anticorpo específico demPDGFRa liga-se a Flk-I (figura 12B). A cinética de ligação dos anticorposbiespecíficos para mPDGFRa e Flk-I foi determinada por ressonância deplasmon de superfície usando um instrumento BIAcore (tabela 3). Consistentecom as observações de ELISA, o anticorpo 1F2-2B4 tem maior afinidade paratanto mPDGFRa como Flk-I em comparação com o anticorpo 1F2/scFv2B4.The antigen binding efficiency of domain-based bispecific antibodies was determined in immobilized mPDGFRa and Flk-1.ELISA showed that bispecific antibody, 1F2 / scFv2B4 and 1F2-2B4, bound to mPDGFRa and Flk-1, but not as well. efficiently as the 1F2 parental and 2B4 antibody (Figure 12). However, in both cases, binding of the 1F2-2B4 antibody was slightly more efficient compared to 1F2 / scFv2B4. As expected, FlB-I-specific antibody 2B4 does not bind to mPDGFRa (Fig. 12A), nor is 1F2 of demPDGFRa-specific antibody binding to Flk-I (Fig. 12B). Binding kinetics of specific antibodies for mPDGFRa and Flk-I were determined by surface deplasmon resonance using a BIAcore instrument (Table 3). Consistent with ELISA observations, 1F2-2B4 antibody has higher affinity for mPDGFRa as Flk-I compared to 1F2 / scFv2B4 antibody.

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table> table see original document page 49 </column> </row> <table> <table> table see original document page 50 </column> </row> <table>

A figura 13 mostra que ambos os anticorpos específicosinibem mPDGFRa de se ligar a PDGF-AA imobilizado (figura 13 A) comIC50 estimado de 9,9 nM e 25,3 nM para 1F2/scFv2B4 e 1F2-2B4,respectivamente. Os anticorpos também bloqueiam Flk-I de se ligar aVEGF165 imobilizado (figura 13B) com o valor IC50 de 9,5 nM e 19,5 nM,respectivamente. Como esperado, 2B4 não teve nenhum efeito sobre ainteração de mPDGFRa/PDGF-AA, enquanto 1F2 não teve nenhum efeitosobre a interação Flk-I/VEGFi65.Figure 13 shows that both specific antibodies inhibit mPDGFRα from binding to immobilized PDGF-AA (Figure 13A) with an estimated IC50 of 9.9 nM and 25.3 nM for 1F2 / scFv2B4 and 1F2-2B4, respectively. Antibodies also block Flk-I from binding to immobilized aVEGF165 (Figure 13B) with an IC50 value of 9.5 nM and 19.5 nM, respectively. As expected, 2B4 had no effect on mPDGFRa / PDGF-AA interaction, while 1F2 had no effect on Flk-I / VEGFi65 interaction.

Apesar da afinidade de ligação do anticorpo biespecífico sermenor na ligação a mPDGFRa e ligação a VEGFR2 comparado a moléculasbivalentes monoespecíficas respectivas, 1F2-CH/CL e IgG de 2B4 (tabela 3),quando examinados para ligação a receptores expressados na superfície decélulas em células eEnd. 1 (as células que expressam tanto mPDGFRa comomVEGFR2), o BsAb demonstrou eficiência mais elevada do que qualquer umdos anticorpos bivalentes monoespecíficos parentais. A intensidade defluorescência média (MFI) nas células foi de 15,7, 31 e 36,9, para 1F2-CH/CL(ligação a mPDGFRa), IgG de 2B4 (ligação a mVEGFR2) e lF2-2B4IgG(ligação a mPDGFRa e nVEGFR2), respectivamente.Although the bispecific antibody binding affinity is minor in mPDGFRα binding and VEGFR2 binding compared to respective monospecific divalent molecules, 1F2-CH / CL and 2B4 IgG (table 3) when examined for binding to cell-expressed receptors on eEnd cells . 1 (the cells expressing both mPDGFRα and mVEGFR2), BsAb demonstrated higher efficiency than either parent monospecific bivalent antibodies. The mean defluorescence intensity (MFI) in cells was 15.7, 31 and 36.9 for 1F2-CH / CL (mPDGFRa binding), 2B4 IgG (mVEGFR2 binding) and 1F2-2B4IgG (mPDGFRa binding and nVEGFR2), respectively.

Inibição da ativação induzida por ligando de mV£GFR2 emPDGFR. A expressão de mVEGFR2 e mPDGFRa foi demonstrada emcélulas eEnd.l via análise FACS. As células foram incubadas com IgG de2B4, 1F2-CH/CL ou IgG de 1F2-2B4 (10 μ^πιΐ) a 4°C, durante 1 h, seguidopor incubação com um anticorpo Fc anti-humano de cabra rotulado com PE(Jackson ImmunoResearch Lab.) durante mais 1 h, e análise em um sistemaGuava Easycyte (Guava Technologies, Inc,,. Hayward, CA).Inhibition of ligand-induced activation of mV? GFR2 inPDGFR. Expression of mVEGFR2 and mPDGFRa was demonstrated in eEnd.l cells via FACS analysis. Cells were incubated with 2B4 IgG, 1F2-CH / CL or 1F2-2B4 IgG (10 μ ^ πιΐ) at 4 ° C for 1 h, followed by incubation with a PE labeled goat anti-human Fc antibody (Jackson ImmunoResearch Lab.) For an additional 1 h, and analysis on a Guava Easycyte system (Guava Technologies, Inc ,,. Hayward, CA).

Para examinar a fosforilação no receptor, células eEnd. 1 foramdepositadas em placas de 6 cm e cultivadas a 70-80% de confluência, após oque as células foram lavadas duas vezes em PBS e cultivadas durante a noiteem meio isento de soro. As células foram primeiro incubadas com váriosanticorpos a 37 °C durante 30 min, seguido por estímulo com VEGF ouPDGF-AA a 37 °C durante 15 min. As células foram lisadas em tampão delise (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 nM, 1% de Triton X-100, EDTA 1mM, fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM, Na3VO4 0,5 nM, 1 μg/ml deleupeptina, 1 μg/ml de pepstatina e 1 μg/ml de aprotinina) durante 1 h,seguido por centrifugação do lisado a 12.000 rpm durante 10 min a 4°C. Osreceptores foram imunoprecipitados do sobrenadante do lisado de célulasusando o anticorpo anti- mPDGFRa (eBioscience, San Diego, CA) ou anti-mVEGFR2 (Santa Cruz, Biotech, Santa Cruz, CA), seguido pela adição de 20μl de pérolas de Pro-A/G-Sepharose (Santa Cruz Biotech). As proteínas dereceptor precipitadas foram resolvidas em um gel Nupage Bis-Tris a 4-12%(Invitrogen) e transferidas para uma membrana de difluoreto depolivinilideno. Fosfo-mVEGFR2 e fosfo- mPDGFRa foram detectados noblot usando um conjugado anticorpo - HRP anti-fosfo-tirosina (Santa CruzBiotech). As proteínas de receptor totais carregadas no gel foram testadas comanticorpos em mPDGFRa ou mVEGFR2 (ambos de Santa Cruz Biotech).To examine receptor phosphorylation, eEnd cells. 1 were deposited on 6 cm plates and cultured at 70-80% confluence, after which the cells were washed twice in PBS and cultured overnight in serum free medium. Cells were first incubated with various antibodies at 37 ° C for 30 min, followed by stimulation with VEGF or PDGF-AA at 37 ° C for 15 min. Cells were lysed in delysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 nM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.5 nM Na3VO4, 1 µg / ml delaupeptin, 1 μg / ml pepstatin and 1 μg / ml aprotinin) for 1 h, followed by centrifugation of the lysate at 12,000 rpm for 10 min at 4 ° C. Receptors were immunoprecipitated from cell lysate supernatant using either anti-mPDGFRa (eBioscience, San Diego, CA) or anti-mVEGFR2 (Santa Cruz, Biotech, Santa Cruz, CA) antibody, followed by the addition of 20μl of Pro-A / G-Sepharose (Santa Cruz Biotech). Precipitated receptor proteins were resolved on a 4-12% Nupage Bis-Tris gel (Invitrogen) and transferred to a depolyvinylidene difluoride membrane. Phospho-mVEGFR2 and phospho-mPDGFRa were detected in the noblot using an anti-phospho-tyrosine HRP antibody conjugate (Santa CruzBiotech). Gel-loaded total receptor proteins were tested with antibodies in either mPDGFRa or mVEGFR2 (both from Santa Cruz Biotech).

Como mostrado na figura 14, o BsAb inibiu a fosforilaçãoestimulada por tanto PDGF como VEGF de receptores mPDGFRa emVEGFR2, enquanto anticorpos parentais monoespecíficos somentebloquearam a ativação de um receptor único estimulado por seu ligandocognato. Como um controle, o anticorpo anti-EGFR, C225, não teve qualquerefeito sobre a ativação estimulada por ligando de qualquer receptor.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAAs shown in Figure 14, BsAb inhibited both PDGF and VEGF stimulated phosphorylation of mPDGFRa receptors in VEGFR2, while monospecific parental antibodies only blocked activation of a single receptor stimulated by its ligandocognate. As a control, the anti-EGFR antibody, C225, had no effect on ligand-stimulated activation of any receptor. SEQUENCE LISTING

<110> ImClone Systems, Inc.Zhenping, Zhu<110> ImClone Systems, Inc.Zhenping, Zhu

<120> Anticorpos Funcionais<120> Functional Antibodies

<130> 11245/54376<130> 11245/54376

<140> PCT/US07/04 051<140> PCT / US07 / 04 051

<141> 2007-02-15<141> 2007-02-15

<150> 60/773,994<150> 60 / 773.994

<151> 2006-02-15<151> 2006-02-15

<160> 81<160> 81

<170> PatentIn versão 3.3<170> PatentIn version 3.3

<210> 1<210> 1

<211> 351<211> 351

<212> DNA<212> DNA

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(351)<221> CDS <222> (1) .. (351)

<400> 1<400> 1

cag gtc aag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg ggg tca ggg gcc 48cag gtc aag ctg cag cag tct ggg gca gag ct gtg ggg tca ggg gcc 48

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gly Ser Gly AlaGln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Wing Glu Leu Val Gly Ser Gly Wing

1 5 10 151 5 10 15

tca gtc aaa ttg tcc tgc aca act tct ggc ttc aac att aaa gac ttc 96tca gtc aaa ttg tcc tgc aca act tct ggc ttc aac att aaa gac ttc 96

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp PheBe Val Lys Read Be Cys Thr Thr Be Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe

20 25 3020 25 30

tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144tat atg cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

gga tgg att gat cct gag aat ggt gat tct ggt tat gcc ccg aag ttc 192gg tgg att gat cct gag aat ggt gat tct ggt tat gcc ccg aag ttc 192

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Pro Lys Phe50 55 60Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Wing Pro Lys Phe50 55 60

cag ggc aag gcc acc atg act gca gac tca tcc tcc aac aca gcc tac 240cag ggc aag gcc acc atg act gca gac tca tcc tcc aac aca gcc tac 240

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Lys Wing Thr Met Thr Wing Asp Ser Be Ser Asn Thr Wing Tyr65 70 75 80

ctg cag ctc age age ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288ctg cag ctc age act ctg aca tct gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Read Gln Read Read Ser Be Read Thr Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

aat gca tac tat ggt gac tac gaa ggc tac tgg ggc caa ggg acc acg 336ag gca tac ggt tac gac tac gaa ggc tac tgg ggc caa ggg acc acg 336

Asn Ala Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Asn Wing Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly

gtc acc gtc tcc tca 351gtc acc gtc tcc tca 351

Val Thr Val Ser Ser115<210> 2Val Thr Val Ser Ser115 <210> 2

<211> 117<211> 117

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 2<400> 2

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gly Ser Gly Ala1 5 10 15Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Wing Glu Leu Val Gly Ser Gly Wing1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe20 25 30Be Val Lys Read Be Cys Thr Thr Be Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Ala Pro Lys Phe50 55 60Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Wing Pro Lys Phe50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Lys Wing Thr Met Thr Wing Asp Ser Be Ser Asn Thr Wing Tyr65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Read Gln Read Read Ser Be Read Thr Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Asn Ala Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Asn Wing Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly

Val Thr Val Ser Ser115Val Thr Val Ser Ser115

<210> 3<210> 3

<211> 324<211> 324

<212> DNA<212> DNA

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(324)<221> CDS <222> (1) .. (324)

<4 00> 3<4 00> 3

gac ate gag ctc act cag tet cca geaAsp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala1 5gac by gag ctc act cag tet cca geaAsp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala1 5

ate atg tet gea tet cca ggg 48until atg tet gea tet cca ggg 48

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly10 15Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly10 15

gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc age tca agt gta agt tac atg 96gag aag gtc acc ata acc tgc agt gcc age tca agt gta agt tac atg 96

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Be Wing Be Ser Be Val Ser Tyr Met20 25 30

cac tgg ttc cag cag aag cca ggc act tet ccc aaa ctc tgg att tat 144cac tgg ttc cag cag aag cg ggc act tet ccc aaa ctc tgg att tat 144

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile TyrHis Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Be Pro Lys Read Trp Ile Tyr

35 40 45age aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt 19235 40 45age aca tcc aac ctg gct tet gga gtc cct gct cgc ttc agt

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly SerBe Thr Be Asn Leu Wing Gly Val Pro Wing Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 6050 55 60

gga tet ggg acc tet tac tet ctc aca ato age cga atg gag gct gaa 240gga tet ggg acc tet tac tet ctc act act cga atg gag gct gaa 240

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala GluGly Be Gly Thr Be Tyr Be Leu Thr Ile Be Arg Met Glu Wing Glu

65 70 75 8065 70 75 80

gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg agt agt tac cca ttc acg 288gat gct gcc act tat tac tgc cag caa agg agt agt tac cca ttc acg 288

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe ThrAsp Wing Wing Thr Thr Tyr Cys Gln Gln Arg Be Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 9585 90 95

ttc ggc tcg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg gcg 324ttc ggc tcg ggg acc aag ctg gaa aaa cgg gcg 324

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg AlaPhe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Wing

100 105100 105

<210> 4<210> 4

<211> 108<211> 108

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<4 00> 4<4 00> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly15 10 15Asp Ile Glu Read Thr Gln Be Pro Wing Ile Met Be Wing Be Pro Gly15 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Be Wing Be Ser Be Val Ser Tyr Met20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr35 40 45His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Be Pro Lys Leu Trp Ile Tyr35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Thr Ser Asn Leu Wing Be Gly Val Pro Wing Arg Phe Be Gly Ser50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu65 70 75 80Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Wing Glu65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr85 90 95Asp Wing Wing Thr Thr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105

<210> 5<210> 5

<211> 348<211> 348

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<221> CDS

<222> (1)..(348)<222> (1) .. (348)

<4 00> 5gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48<4 00> 5gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt age tat 96tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt age tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Wing Be Gly Phe Thr Phe Be Tyr20 25 30

age atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144age atg aac tgg gtc cg cg gct cca ggg aag ggg ctg

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Be Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg 192tca tcc att agt agt agt agt tac atta tac tac gca gac tca gtg 192

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Be Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Wing Asp Ser Val50 55 60

aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240aag ggc cga ttc acc up to tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Wing Lys Asn Be Read Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Met AsnSer Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysRead Gln Met AsnSer Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys

85 90 9585 90 95

gcg aga gtc aca gat gct ttt gat ate tgg ggc caa ggg aca atg gtc 336gcg aga gtc aca gat gct ttt gat till tgg ggc caa ggg aca atg gtc 336

Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110Wing Arg Val Thr Asp Wing Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110

acc gtc tca age 348acc gtc tca age 348

Thr Val Ser Ser115Thr Val Ser Ser115

<210> 6<210> 6

<211> 116<211> 116

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 6<4 00> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Wing Be Gly Phe Thr Phe Be Tyr20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Be Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Be Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Wing Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Lys Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Wing Lys Asn Be Read Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110Read Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Thr Asp Wing Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110

Thr Val Ser Ser115Thr Val Ser Ser115

<210> 7<210> 7

<211> 321<211> 321

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(321)<221> CDS <222> (1) .. (321)

<4 00> 7<4 00> 7

gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Ile Val Met Thr Gln Be Pro Wing Thr Read Be Read Be Pro Gly15 10 15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Glu Arg Wing Thr Read Le Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Ser Be Tyr20 25 30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate 144tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc up to 144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Leu Trp Wing Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

tat gat tca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc aga ttc agt ggc 192tat gat tca tcc aac agg gcc act ggc until cca gcc aga ttc agt ggc 192

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Tyr Asp Ser Be Asn Arg Wing Thr Gly Ile Pro Wing Arg Phe Be Gly50 55 60

agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc until age age cta gag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

gaa gat ttt gea act tat tac tgt cta cag cat aac act ttt cct ccg 288gaa gat ttt gea act tat tac tgt cta cag cat aac act ttt cct ccg 288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro85 90 95Glu Asp Phe Wing Thr Tyr Tyr Cys Read Gln His Asn Thr Phe Pro85 90 95

acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa until aaa 321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 8<210> 8

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 8<400> 8

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Ile Val Met Thr Gln Be Pro Wing Thr Read Be Read Be Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Glu Arg Wing Thr Thr Read Cys Arg Wing Be Gln Be Val Be Ser Tyr20 25 30Leu Wing Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Read Ile35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Tyr Asp Ser Be Asn Arg Wing Thr Gly Ile Pro Wing Arg Phe Be Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro85 90 95Glu Asp Phe Wing Thr Tyr Tyr Cys Read Gln His Asn Thr Phe Pro85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 9<210> 9

<211> 321<211> 321

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(321)<221> CDS <222> (1) .. (321)

<4 00> 9<4 00> 9

gac ate cag atg acc cag tet cca tet tcc gtg tet gea tet ata gga 48gac till cag atg acc cag tet cca tet tcc gtg tet gea tet ata gga 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly15 10 15Asp Ile Gln Met Thr Gln Be Pro Be Ser Val Be Wing Ser Ile Gly15 10 15

gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att gac aac tgg 96gac aga gtc acc till act tgt cgg gcg agt cag ggt att gac aac tgg 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Wing Be Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30

tta ggc tgg tat cag cag aaa cct ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg ate 14 4tta ggc tgg tat cag cag aaa cct ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg until 14 4

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile.35 40 45Read Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Wing Pro Lys Read Leu Ile.35 40 45

tac gat gea tcc aat ttg gac aca ggg gtc cca tca agg ttc agt gga 192tac gat gea tcc aat ttg gac aca ggg gtc cca tca agg ttc agt gga 192

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Tyr Asp Wing Ser Asn Read Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

agt gga tet ggg aca tat ttt act ctc acc ate agt age ctg caa gct 240agt gga tet ggg aca tat ttt act ctc acc until agt age ctg caa gct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Read Thr Ile Be Ser Read Gln Ala65 70 75 80

gaa gat ttt gea gtt tat ttc tgt caa cag gct aaa gct ttt cct ccc 288gaa gat ttt gea gtt tat ttc tgt caa cag gct aaa gct ttt cct ccc 288

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro85 90 95Glu Asp Phe Wing Val Tyr Phe Cys Gln Gln Wing Lys Wing Phe Pro Pro 90 90 95

act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gac ate aaa 321act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gac until aaa 321

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105

<210> 10<211> 107<212> PRT<210> 10 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 10<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly1 5 10 15Asp Ile Gln Met Thr Gln Be Pro Be Ser Val Be Wing Be Ile Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Wing Be Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Gly Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Wing Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Tyr Asp Wing Ser Asn Read Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Read Thr Ile Be Ser Read Gln Ala65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro85 90 95Glu Asp Phe Wing Val Tyr Phe Cys Gln Gln Wing Lys Wing Phe Pro Pro 90 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105

<210> 11<210> 11

<211> 348<211> 348

<212> DNA<212> DNA

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(348)<221> CDS <222> (1) .. (348)

<400> 11<400> 11

cag gtc aaa ctg cag cag tct ggg gcaGln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala1 5cag gtc aaa ctg cag cag tct ggg gcaGln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala1 5

gag ctt gtc aag cca ggg gcc 48gag ctt gtc aag cca ggg gcc 48

Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala10 15Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala10 15

tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aaa gac acc 96tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aaa gac acc 96

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Be Val Lys Read Be Cys Thr Wing Be Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30

tat ata cac tgg gtg aag cag age cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144tat ata cac tgg gtg aag cag age cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

gga agg ate gat cct ccg aat gat aat act aaa tat gac ccg aag ttc 192gga agg till gat cct ag gat aat act aaa tat gac ccg aag ttc 192

Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60

cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aat aca gcc tac 240cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aat aca gcc tac 240

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80atg cag ctc cgc age ctg aca tet gag gac act gcc gtc tat tac tgt 288Gln Gly Lys Wing Thr Ile Thr Wing Asp Thr Be Ser Asn Thr Wing Tyr65 70 75 80atg cag ctc cgc age ctg aca

Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Gln Read Arg Be Read Thr Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcc ctc cca ccg ttc tac ttt gac tac tgg ggc cat ggc acc acg gtc 336gcc ctc cca ccg ttc tac tt gac tac tgg ggc cat ggc acc acg gtc 336

Ala Leu Pro Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr Val100 105 110Wing Pro Le Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr Val100 105 110

acc gtc tcc tca 348acc gtc tcc tca 348

Thr Val Ser Ser115Thr Val Ser Ser115

<210> 12<210> 12

<211> 116<211> 116

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<4 00> 12<4 00> 12

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala15 10 15Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Wing Glu Leu Val Lys Pro Gly Wing 10 15 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Be Val Lys Read Be Cys Thr Wing Be Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gly Arg Ile Asp Pro Pro Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Lys Wing Thr Ile Thr Wing Asp Thr Be Ser Asn Thr Wing Tyr65 70 75 80

Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Gln Read Arg Be Read Thr Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Leu Pro Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr Val100 105 110Wing Pro Le Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr Thr Val100 105 110

Thr Val Ser Ser115Thr Val Ser Ser115

<210> 13<210> 13

<211> 327<211> 327

<212> DNA<212> DNA

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<220><220>

<221> CDS<222> (1) .. (327)<4 00> 13<221> CDS <222> (1) .. (327) <4 00> 13

gac ate gag ctc act cag tet cca aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48gac till gag ctc act cag tet cca aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Ile Glu Read Thr Gln Be Pro Lys Phe Met Be Thr Be Val Gly1 5 10 15

gac agg gtc age gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg gat act aat 96gac agg gtc age gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg gat act aat 96

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn20 25 30Asp Arg Val Be Val Thr Cys Lys Wing Be Gln Asn Val Asp Thr Asn20 25 30

gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa gea ctg att 144gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tet cct aaa gea ctg att 144

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45Val Wing Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Wing Leu Ile35 40 45

tac tcg gea tcc tac cgg tac agt gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192tac tcg gea tcc tac cgg tac agt gga gtc cct gat cgc ttc aca ggc 192

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60

agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc ate age aat gtg cag tet 240agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc until age aat gtg cag tet 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65, ■ 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65, ■ 70 75 80

gaa gac ttg gea gag tat ttc tgt cag caa tat aac age ttt cct tac 288gaa gac ttg gea gag tat ttc tgt cag caa tat aac acts ttt cct tac 288

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr85 90 95Glu Asp Read Wing Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr85 90 95

acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg gcg 327acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa cgg gcg 327

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105

<210> 14<210> 14

<211> 109<211> 109

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 14<400> 14

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly15 10 15Asp Ile Glu Read Thr Gln Be Pro Lys Phe Met Be Thr Be Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn20 25 30Asp Arg Val Be Val Thr Cys Lys Wing Be Gln Asn Val Asp Thr Asn20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45Val Wing Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Wing Leu Ile35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr85 90 95Glu Asp Read Wing Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105<210> 15Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 <210> 15

<211> 357<211> 357

<212> DNA<212> DNA

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(357)<221> CDS <222> (1) .. (357)

<400> 15<400> 15

cag gtg cag ctg aag cag tca gga cct ggc cta gtg cag ccc tca cag 48cag gtg cag ctg aag cag tca gga cct ggc cta

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln1 5 10 15Gln Val Gln Leu Lys Gln Be Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Be Gln1 5 10 15

age ctg tcc ate acc tgc aca gtc tet ggt ttc tca tta act aac tat 96age ctg tcc until acc tgc aca gtc tet ggt ttc tca tta act aac tat 96

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30

ggt gta cac tgg gtt cgc cag tet cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144ggt gta cac tgg gtt cgc cag tet cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45

gga gtg ata tgg agt ggt gga aac aca gac tat aat aca cct ttc aca 192gga gtg ata tgg agt ggt gga aac aca gac tat aat aca cct ttc aca 192

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr50 55 60Gly Val Ile Trp Being Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr50 55 60

tcc aga ctg age ate aac aag gac aat tcc aag age caa gtt ttc ttt 240tcc aga ctg age till aac aag gac aat tcc aag age caa gtt ttc ttt 240

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe65 70 75 80Ser Arg Read Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe65 70 75 80

aaa atg aac agt ctg caa tet aat gac aca gcc ata tat tac tgt gcc 288aaa atg aac agt ctg caa tet aat gac aca gcc ata tat tac tgt gcc 288

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys Met Asn Be Read Gln Be Asn Asp Thr Wing Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

aga gcc ctc acc tac tat gat tac gag ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336ag gcc ctc acc tac tat gat tac gag ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Arg Wing Read Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Wing Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

act ctg gtc act gtc tet gea 357act ctg gtc act gtc tet gea 357

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115

<210> 16<210> 16

<211> 119<211> 119

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 16<400> 16

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln1 5 10 15Gln Val Gln Leu Lys Gln Be Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Be Gln1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr50 55 60Gly Val His Trp Val Arg Gln Be Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Val Ile Trp Be Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe65 70 75 80Ser Arg Read Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys Met Asn Be Read Gln Be Asn Asp Thr Wing Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Arg Wing Read Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Wing Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115

<210> 17<210> 17

<211> 321<211> 321

<212> DNA<212> DNA

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(321)<221> CDS <222> (1) .. (321)

<4 00> 17<4 00> 17

gac ate ttg ctg act cag tet cca gtc ate ctg tet gtg agt cca gga 48gac by ttg ctg act by cag tet cca gtc by ctg tet gtg by agt cca gga 48

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly15 10 15Asp Ile Leu Read Le Gln Ser Pro Val Ile Leu Read Val Ser Pro Gly15 10 15

gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agt att ggc aca aac 96gaa aga gtc agt ttc tcc tgc agg gcc agt cag agt att ggc aca aac 96

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Glu Arg Val Be Phe Be Cys Arg Wing Be Gln Be Ile Gly Thr Asn20 25 30

ata cac tgg tat cag caa aga aca aat ggt tet cca agg ctt ctc ata 144aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 144

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Read Leu Ile35 40 45

aag tat gct tet gag tet ate tet ggg ate cct tcc agg ttt agt ggc 192aag tat gct tet gag tet till tet ggg till cct tcc agg ttt agt ggc 192

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Lys Tyr Wing Be Glu Be Ile Be Gly Ile Pro Be Arg Phe Be Gly50 55 60

agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt age ate aac agt gtg gag tet 240agt gga tca ggg aca gat ttt act ctt age till aac agt gtg gag tet 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Read Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser65 70 75 80

gaa gat att gea gat tat tac tgt caa caa aat aat aac tgg cca acc 288gaa gat att gea gat tat tac tgt caa caa aat aat aac tgg cca acc 288

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr85 90 95Glu Asp Ile Asp Wing Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Asn Asp Trp Pro Thr85 90 95

acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321acg ttc ggt ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105Thr Phe Gly Wing Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105

<210> 18<211> 107<212> PRT<213> Mus musculus<210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 18<400> 18

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly1 5 10 15Asp Ile Leu Read Thr Gln Be Pro Val Ile Leu Be Val Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn20 25 30Glu Arg Val Be Phe Be Cys Arg Wing Be Gln Be Ile Gly Thr Asn20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Read Leu Ile35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Lys Tyr Wing Be Glu Be Ile Be Gly Ile Pro Be Arg Phe Be Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Read Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr85 90 95Glu Asp Ile Asp Wing Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Asn Asp Trp Pro Thr85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105Thr Phe Gly Wing Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105

<210> 19<211> 363<210> 19 <211> 363

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(363)<221> CDS <222> (1) .. (363)

<4 00> 19<4 00> 19

cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc ccacag gtg cag ctg

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro1 5Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro1 5

acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tctacc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val SerThr Leu Be Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 2520 25

gga ctg gtg aag cct tca cag 48gga ctg gtg aag cct tca cag 48

Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln10 15Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln10 15

ggt ggc tcc ate age agt ggt 96ggt ggc tcc till age agt ggt 96

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly30Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly30

gat tac tac tgg agt tggAsp Tyr Tyr Trp Ser Trp35gat tac tac tgg agt tggAsp Tyr Tyr Trp Ser Trp35

tgg att ggg tac ate tatTrp Ile Gly Tyr Ile Tyr50tgg att ggg tac till tatTrp Ile Gly Tyr Ile Tyr50

ctc aag agt cga gtc accLeu Lys Ser Arg Val Thrctc aag agt cga gtc accLeu Lys Ser Arg Val Thr

ate cgc cag ccc cca gggIle Arg Gln Pro Pro Gly40till cgc cag ccc cca gggIle Arg Gln Pro Pro Gly40

tac agt ggg age acc gacTyr Ser Gly Ser Thr Asp55 60tac agt ggg age acc gacTyr Ser Gly Ser Thr Asp55 60

atg tcc gta gac acg tccMet Ser Val Asp Thr Seratg tcc gta gac acg tccMet Ser Val Asp Thr Ser

aag ggc ctg gag 144aag ggc ctg gag 144

Lys Gly Leu Glu45Lys Gly Leu Glu45

tac aac ccg tcc 192tac aac ccg tcc 192

Tyr Asn Pro SerTyr Asn Pro Ser

aag aat cag ttt 240aag aat cag ttt 240

Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Lys Asn Gln Phe65 70 75 80

tcc ctg aag gtc aac tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288tcc ctg aag gtc aac tct gtg acc gcc gca gac acg gct gtg tat tac 288

Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Wing Asp Wing Thr Val Wing Tyr Tyr85 90 95

tgt gcg aga gtg tcg att ttt gga gtg ggg aca ttt gac tac tgg ggc 336tgt gcg aga gtg tcg att ttt gga gtg ggg aca ttt gac tac tgg ggc 336

Cys Ala Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Cys Wing Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110

cag ggc acc ctg gtc acc gtc tca age 363cg ggc acc cg gtc acc gtc tca age 363

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gln Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 20<210> 20

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 20<4 00> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15Gln Val Gln Leu Gln Glu Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Gln15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Thr Val Be Gly Gly Be Ile Be Gly20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Asp Tyr Tyr Trp Being Trp Ile Arg Gln Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser50 55 60Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Leu Lys Be Arg Val Thr Met Be Val Asp Thr Be Lys Asn Gln Phe65 70 75 80

Ser Leu Lys Val Asn Ser Vai. Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Ser Leu Lys Val Asn Ser Will. Thr Wing Asp Wing Thr Wing Val Tyr Tyr85 90 95

Cys Ala Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Cys Wing Arg Val Ser Ile Phe Gly Val Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gln Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 21<210> 21

<211> 321<211> 321

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(321)<400> 21<221> CDS <222> (1) .. (321) <400> 21

gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 4 8gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 4 8

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Ile Val Met Thr Gln Be Pro Wing Thr Read Be Read Pro Gly1 5 10 15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age tac 96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Glu Arg Wing Thr Read Le Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Ser Be Tyr20 25 30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate 144tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc up to 144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Leu Trp Wing Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

tat gat gea tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192tat gat gea tcc aac agg gcc act ggc till cca gcc agg ttc agt ggc 192

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Tyr Asp Wing Ser Asn Arg Wing Thr Gly Ile Pro Wing Arg Phe Ser Gly50 55 60

agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc until age age cta gag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cac cag tat ggt age aca cct ctc 288gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cac cag tat ggt age aca cct ctc 288

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu85 90 95Glu Asp Phe Wing Val Tyr Cyr His Gln Tyr Gly Ser Thr Thr Leu85 90 95

act ttc ggc gga ggg acc aag gcg gag ate aaa 321act ttc ggc gga ggg acc

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys100 105Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Wing Glu Ile Lys100 105

<210> 22<210> 22

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 22<4 00> 22

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Ile Val Met Thr Gln Be Pro Wing Thr Read Be Read Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30Glu Arg Wing Thr Read Le Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Ser Be Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Leu Trp Wing Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Tyr Asp Wing Ser Asn Arg Wing Thr Gly Ile Pro Wing Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu85 90 95Glu Asp Phe Wing Val Tyr Cyr His Gln Tyr Gly Ser Thr Thr Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys100 105Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Wing Glu Ile Lys100 105

<210> 23<210> 23

<211> 390<211> 390

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(390)<221> CDS <222> (1) .. (390)

<4 00> 23<4 00> 23

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tccgag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc age age tatSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc age act tatSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

gct ate age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atgAla Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gct till age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atgAla Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly

gga ggg ate ate cct ate ttt ggt aca gea aac tac gea cag aag ttcGly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60gga ggg up to cct till ttt ggt aca gea aac tac gea cag aag ttcGly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Phe50 55 60

cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gcc tacGln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gcc tacGln Gly Arg Val Ile Thr Thr Wing Asp Lys Ser Thr Be Thr Wing Tyr65 70 75 80

atg gag ctg age age ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgtMet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95atg gag ctg age age ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgtMet Glu Leu Be Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tacAla Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr100 105 110gcg aga gcg cca tta cga ttt ttg gag tgg tcc acc caa gac cac tacAla Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr100 105 110

tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtcTyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val115 120 125tac tac tac tac atg gac tgg tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtcTyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Thr Val115 120 125

tca ageSer Ser130tca ageSer Ser130

<210> 24<210> 24

<211> 130<211> 130

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 24<4 00> 24

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser TyrAla Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Be Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Gly Thr Phe Be Be TyrAla Ile Be Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Asp Wing Lys Be Thr Be Thr Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Ser Read Ar Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr100 105 110Arg Wing Pro Wing Read Arg Phe Read Glu Trp Be Thr Gln Asp His Tyr100 105 110

Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val115 120 125Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val115 120 125

Ser Ser130Ser Ser30

<210> 25<210> 25

<211> 327<211> 327

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(327)<221> CDS <222> (1) .. (327)

<4 00> 25<4 00> 25

tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag 48tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln15 10 15Be Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Val Wing Be Val Wing Leu Gly Gln15 10 15

aca gtc agg ate aca tgc caa gga gac age ctc aga age tat tat gea 96aca gtc agg till aca tgc caa gga gac age ctc aga age tat tat gea 96

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Be Read Arg Be Tyr Tyr Ala20 25 30

age tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc ate tat 144age tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc until tat 144

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Ser Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Pro Wing Val Leu Val Ile Tyr35 40 45

ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg ate cca gac cga ttc tct ggc tcc 192ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg to cca gac cga ttc tct ggc tcc 192

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Lys Asn Asn Arg Pro Be Gly Ile Asn Arg Pro Phe Be Gly Ser50 55 60

age tca gga aac aca gct tcc ttg acc ate act ggg gct cag gcg gaa 240age tca gga aac aca gct tcc ttg acc till act ggg gct cag gcg gaa 240

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Be Ser Gly Asn Thr Wing Be Read Thr Ile Thr Gly Wing Gln Wing Glu65 70 75 80

gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg85 90 95gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac aac agt gat aac cgt 288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg85 90 95

ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 327ctg ata ttt ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctc agt 327

Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser100 105Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser100 105

<210> 26<210> 26

<211> 109<211> 109

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 26<400> 26

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Be Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Val Wing Be Val Wing Leu Gly Gln1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Be Read Arg Be Tyr Tyr Ala20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Ser Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Pro Wing Val Leu Val Ile Tyr35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Lys Asn Asn Arg Pro Be Gly Ile Asn Arg Pro Phe Be Gly Ser50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Be Ser Gly Asn Thr Wing Be Read Thr Ile Thr Gly Wing Gln Wing Glu65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Asn Ser Asp Asn Arg85 90 95Asp Glu Wing Asp Tyr Tyr Cys Asn Be Arg Asp Asn Be Asp Asn Arg85 90 95

Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser100 105Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser100 105

<210> 27<210> 27

<211> 378<211> 378

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(378)<221> CDS <222> (1) .. (378)

<400> 27<400> 27

cag gcg cag gtg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag tct ggg agg 48cag gcg cag gtg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag tct ggg agg 48

Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg1 5 10 15Gln Wing Gln Val Val Glu Be Gly Gly Gly Val Val Gln Be Gly Arg1 5 10 15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc gcc ttc agt age tac 96tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc gcc ttc agt age tac 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Be Gly Phe Wing Be Phe Be Tyr20 25 30

ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

gca gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192gca gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg 192

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ValWing Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Wing Asp Ser Val

50 55 6050 55 60

agg ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc gag aac acg ctg tat 240agg ggc cga ttc acc till tcc aga gac aat tcc gag aac acg ctg tat 240

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Arg Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Glu Asn Thr Read Tyr65 70 75 80

ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acc gct gtg tat tac tgt 288ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acc gct gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Read Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcc aga gat cac tat ggt tcg ggg gtg cac cac tat ttc tac tac ggt 336gcc aga gat cac tat ggt tcg ggg gtg cac cac tat ttc tac tac ggt 336

Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Val His His Tyr Phe Tyr Tyr Gly100 105 110Arg Asp Wing His Tyr Gly Ser Gly Val His His Tyr Phe Tyr Tyr Gly100 105 110

ctg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 378ctg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 378

Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 125Read Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120 125

<210> 28<210> 28

<211> 126<211> 126

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 28<4 00> 28

Gln Ala Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg15 10 15Gln Wing Gln Val Val Glu Be Gly Gly Gly Val Val Gln Be Gly Arg15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Be Gly Phe Wing Be Phe Be Tyr20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Val Ile Wing Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Wing Asp Ser Val50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Arg Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Glu Asn Thr Read Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Read Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Val His His Tyr Phe Tyr Tyr Gly100 105 110Arg Asp Wing His Tyr Gly Ser Gly Val His His Tyr Phe Tyr Tyr Gly100 105 110

Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210> 29Read Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120 125 <210> 29

<211> 324<211> 324

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1) .. (324)<221> CDS <222> (1) .. (324)

<4 00> 29<4 00> 29

gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca gggGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttt tct cca gggGlu Ile Val Leu Thr Pro Gly Thr Leu Ser Leu Pro Pro Gly15 10 15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age ageGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age ageGlu Arg Wing Thr Read Le Ser Cys Arg Wing Ser Gln Ser Val Ser Ser 25 25 30

tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc'cag gct ccc agg ctc ctcTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45tac tta gcc tgg tac cag aaa cct ggc'cag gct ccc agg ctc ctcTyr Leu Wing Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45

ate tat ggt gea tcc age agg gcc act ggc ate cca gac agg ttc agtIle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60till ggt gea tcc age agg gcc act ggc till cca gac agg ttc agtIle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age aga ctg gagGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc till age aga ctg gagGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80

cct gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cag cag tat ggt age tca ccgPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95cct gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cag cag tat ggt age tca ccgPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95

ctc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaaLeu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105ctc act ttc ggg ggg ggg acc aag gtg gag until aaaLeu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 30<210> 30

<211> 108<211> 108

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 30<4 00> 30

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Ile Val Leu Thr Gln Be Pro Gly Thr Read Leu Be Read Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Glu Arg Wing Thr Read Le Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Be Ser20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Tyr Leu Wing Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Ile Tyr Gly Ala Be Being Arg Wing Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Thr

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Pro Glu Asp Phe Wing Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105Read Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 31<211> 363<210> 31 <211> 363

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(363)<221> CDS <222> (1) .. (363)

<4 00> 31<4 00> 31

gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 10 15 15

tca gtg aag gtt tcc tgc aag gtt tct gga tac acc ttc acc gac tac 96tca gtg aag gtt tcc tgc aag gtt tct gga tac acc ttc acc gac tac 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Val Be Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

tac atg cac tgg gtg caa cag gcc cct gga aaa ggg ctt gag tgg atg 144tac atg cac tgg gtg caa cag gcc cct gga aaa ggg ctt gag tgg atg 144

Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Tyr Met His Trp Val Gln Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

gga ctt gtt gat cct gaa gat ggt gaa aca ate tac gea gag aag ttc 192gga ctt gtt gat cct gaa gat ggt gaa aca until tac gea gag aag ttc 192

Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe50 55 60Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Wing Glu Lys Phe50 55 60

cag ggc aga gtc acc ata acc gcg gac acg tct aca gac aca gcc tac 240cag ggc aga gtc acc ata acc gcg gac acg tct aca gac aca gcc tac 240

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Wing Asp Thr Be Asp Thr Wing Tyr65 70 75 80

atg gag ctg age age ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288atg gag ctg age age ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Ser Read Ar Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gat gac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggc acc ctg gtc acc 336gcg aga gat gac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggc acc ctg gtc acc 336

Ala Arg Asp Asp Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Wing Asp Asp Asp Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Read Val Thr100 105 110

gtc tca age gcc tcc acc aag ggc cca 363gtc tca age gcc tcc acc

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120

<210> 32<210> 32

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 32Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15<4 00> 32Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Val Be Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30

Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Tyr Met His Trp Val Gln Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe50 55 60Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Wing Glu Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Wing Asp Thr Be Asp Thr Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Ser Read Ar Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Wing Asp Asp Asp Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Read Val Thr100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120

<210> 33<211> 330<212> DNA<210> 33 <211> 330 <212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(330)<221> CDS <222> (1) .. (330)

<4 00> 33<4 00> 33

gaa acg aca ctc acg cag tct cca gac acc ctg tct ttg tct cca ggagaa acg aca ctc acg cag tct cca gac acc ctg tct ttg tct cca

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Thr Thr Read Thr Gln Be Pro Asp Thr Read Be Read Pro Gly15 10 15

gaa gga gcc acc ctc tcc tgt agg gcc agt cag agt gtt age ggc agtGlu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser20 25 30gga gcc gcc acc ctc tcc tgt agg gcc agt cag agt gtt age ggc agtGlu Gly Wing Thr Leu Ser Cys Arg Wing Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser20 25 30

gcg ttg gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc aga ctc ctcAla Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45gcg ttg gcc tgg tac cag aaa cct ggc cag gct ccc aga ctc ctcAla Leu Wing Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45

ate tat gat gea tcc agt agg gcc act ggc gtc cca gac agg ttc agtIle Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60until tat gat gea tcc agt agg gcc act ggc gtc cca gac agg ttc agtIle Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

ggc agt ggg tct ggg gea gac ttc agt ctc acc ate age aga ctg gagGly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80cct gaa gat ttt gca gtg tat tcc tgt cag caa tat ggt age tca cct 288ggc agt ggg tcg ggg gea gac ttc agt ctc acc up aga ctg gagGly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80cct gaa gat ttt gca gtg tat tcc tgt cag caa tat ggt age tca cct 28

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser ProPro Glu Asp Phe Wing Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser

85 90 9585 90 95

ctc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat gtc aaa cga act 330ctc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat

Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Val Lys Arg ThrRead Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp

100 105 110100 105 110

<210> 34<210> 34

<211> 110<211> 110

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 34<400> 34

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Thr Thr Read Thr Gln Be Pro Asp Thr Read Be Read Pro Gly1 5 10 15

Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Ser20 25 30Glu Gly Wing Thr Read Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Ser Gly Ser20 25 30

Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Wing Leu Wing Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Ile Tyr Asp Wing Ser Be Arg Wing Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Gly Ser Gly Ser Gly Wing Asp Phe Be Read Thr Ile Be Arg Read Glu65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Ser Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Pro Glu Asp Phe Wing Val Tyr Ser Cys Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95

Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Val Lys Arg Thr100 105 110Read Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Val Lys Arg Thr100 105 110

<210> 35<210> 35

<211> 334<211> 334

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(333)<221> CDS <222> (1) .. (333)

<400> 35<400> 35

cag gtc cag ctg gtg cag tet ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48cag gtc cag ctg gtg cag tet ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly SerGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 151 5 10 15

tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tet gga tcg acc ttc acc ggc tac 96tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tet gga tcg acc ttc acc ggc tac 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

gga agg ate ate cct ate ctt ggt ata gea aac tac gea cag aag ttc 192gga agg till cct till ctt ggt ata gea aac tac gea cag aag ttc 192

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gly Arg Ile Ile Pro Ile Read Gly Ile Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Phe50 55 60

cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gcc tac 240cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac aaa tcc acg age aca gcc tac 240

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala TyrGln Gly Arg Val Thr Ile Thr Wing Asp Lys Be Thr Be Thr Wing

65 70 75 8065 70 75 80

atg gag ctg age age ctg aga tet gag gac acg gcc gtg tac tac tgt 288atg gag ctg age age ctg aga tet gag gac acg gcc gtg tac tac tgt 288

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Ser Read Ar Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gga gga gat ctg ggc ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg a 334ggg aga gga gga gat ctg ggc ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg a 334

Ala Arg Gly Gly Asp Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly100 105 110Wing Arg Gly Gly Asp Read Gly Gly Met Met Asp Val Trp Gly Gln Gly100 105 110

<210> 36<210> 36

<211> 111<211> 111

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 36<4 00> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Be Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gly Arg Ile Ile Pro Ile Read Gly Ile Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Asp Wing Lys Be Thr Be Thr Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Ser Read Ar Be Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly100 105 110Wing Arg Gly Gly Asp Read Gly Gly Met Met Asp Val Trp Gly Gln Gly100 105 110

<210> 37<210> 37

<211> 342<211> 342

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><221> CDS<222> (1)..(342)<220> <221> CDS <222> (1) .. (342)

<400> 37<400> 37

gaa att gtg ctg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48gaa att gtg ctg act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc acc cct gga 48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Ile Val Leu Thr Gln Ile Pro Leu Be Valu Pro Gly1 5 10 15

gag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg tct agt cag age ctc cgg cat agt 96gag ccg gcc tcc to tcc tgc agg tct agt cag age ctc cgg cat agt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Arg His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Gln Be Read Arg His Ser20 25 30

aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 14 4aat gga tac aac tat ttg cat tgg tac cg cag aag cca ggg cag tct 14 4

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Asn Gly Tyr Asn Tyr Read Asp Trp Tyr Read Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

cca cag ctc ctg ate tat ttg gct tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192cca cag ctc ctg until tat ttg gct tct aat cgg gcc

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Wing Be Asn Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa ate 240gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa until 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Read Lys Ile65 70 75 80

age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95

cta caa att cct ccg act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa 336cta caa att cct ccg act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat by aaa 336

Leu Gln Ile Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110Read Gln Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

cga act 342cga act 342

Arg ThrArg thr

<210> 38<210> 38

<211> 114<211> 114

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 38<400> 38

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15Glu Ile Val Leu Thr Gln Ile Pro Leu Be Valu Pro Gly15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Arg His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Gln Be Read Arg His Ser20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Asn Gly Tyr Asn Tyr Read Asp Trp Tyr Read Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Wing Be Asn Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Thr Read Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Wing Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95

Leu Gln Ile Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110Read Gln Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

Arg ThrArg thr

<210> 39<210> 39

<211> 372<211> 372

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(372)<221> CDS <222> (1) .. (372)

<400> 39<400> 39

cag gtg cag ctg gtg gag ttt ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48cag gtg cag ctg gtg gag tt ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48

Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc ate agt agt tac 96acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc to agt agt tac 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Thr Val Be Gly Gly Be Ile Be Ser Tyr20 25 30

tac tgg age tgg ate cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg att 144tac tgg age tgg till cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg att 144

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Trp Being Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

ggg tat ate tat tac agt ggg age acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192ggg tat till tat tac agt ggg age acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Gly Tyr Ile Tyr Tyr Being Gly Being Thr Asn Tyr Asn Pro Being Read Lys50 55 60

agt cga gtc gcc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240agt cga gtc gcc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240

Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Ser Arg Val Wing Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

aag ctg age tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288aag ctg age tct gtg acc gcc gcg gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg 288

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys Leu Ser Ser Val Thr Wing Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

aga gag tat tac tat gat agt agt ggt tat tac ttt tat gct ttt gat 336aga gag tat tat tat gat agt agt ggt tat tac ttt tat gct ttt gat 336

Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Phe Tyr Ala Phe Asp100 105 110Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Phe Tyr Ala Phe Asp100 105 110

ate tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tca age 372till tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tca age 372

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Thr Thr Ser Ser 120

<210> 40<210> 40

<211> 124<211> 124

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 40Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15<400> 40Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Thr Val Be Gly Gly Be Ile Be Ser Tyr20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Trp Being Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Tyr Ile' Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Gly Tyr Ile 'Tyr Tyr Be Gly Be Thr Asn Tyr Asn Pro Be Read Lys50 55 60

Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Ser Arg Val Wing Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys Leu Ser Ser Val Thr Wing Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Phe Tyr Ala Phe Asp100 105 110Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Phe Tyr Ala Phe Asp100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Thr Thr Ser Ser 120

<210> 41<210> 41

<211> 333<211> 333

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(333)<221> CDS <222> (1) .. (333)

<4 00> 41<4 00> 41

ctg cct gtg ctg act cag ccc ccc tcaLeu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser1 5ctg cct gtg ctg act cag ccc tcLeu Pro Val Leu Thr Pro Gln Pro Ser1 5

gcg tct ggg acc ccc ggg cag 4 8gcg tct ggg acc ccc ggg cag 4 8

Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln10 15Wing Gly Thr Pro Gly Gln10 15

agg gtc tcc ate tct tgt tct gga age age tcc aac ate gga agt aat 96agg gtc tcc to tct tgt tct gga age age tcc aac to gga agt aat 96

Arg Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser AsnArg Val Be Ile Be Cys Be Gly Be Be Asn Ile Gly Be Asn

20 25 3020 25 30

tat gta tac tgg tac cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc 144tat gta tac tgg tac cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc 144

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu LeuTyr Val Tyr Trp Tyr Gln Glu Leu Pro Gly Thr Wing Pro Lys Leu Leu

35 40 4535 40 45

ate ttt agg aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192until ttt agg aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192

Ile Phe Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerIle Phe Arg Asn Asn Gln Arg Pro Be Gly Val Pro Asp Arg Phe Be

50 55 6050 55 60

ggc tcc aag tct ggc act tca gcc tcc ctg gcc ate agt ggg ctc cggGly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg65 70 75 80ggc tcc aag tct ggc act tca gcc tcc ctg gcc until agt ggg ctc cggGly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ile Ser Gly Leu Arg65 70 75 80

240tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac age ctg 288240tcc gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac age ctg 288

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Be Glu Asp Glu Wing Asp Tyr Tyr Cys Wing Wing Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95

agt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 333agt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 333

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

<210> 42<210> 42

<211> 111<211> 111

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 42<400> 42

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln1 5 10 15Leu Pro Val Leu Thr Pro Gln Pro Pro Wing Be Gly Thr Pro Gly Gln1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn20 25 30Arg Val Be Ile Be Cys Be Gly Be Be Asn Ile Gly Be Asn20 25 30

Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Glu Leu Pro Gly Thr Wing Pro Lys Leu Leu35 40 45

Ile Phe Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Ile Phe Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg65 70 75 80Gly Be Lys Be Gly Thr Be Wing Be Read Wing Wing Ile Be Gly Read Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Be Glu Asp Glu Wing Asp Tyr Tyr Cys Wing Wing Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

<210> 43<210> 43

<211> 381<211> 381

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(381)<221> CDS <222> (1) .. (381)

<400> 43<400> 43

cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Gln Val Gln Leu Gln Glu Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Glu1 5 10 15

ate ctg tcc ctc acc tgc act gtc tet ggt ggc tcc ate agt agt cac 96by ctg tcc ctc acc tgc act gtc tet ggt ggc tcc by agt agt cac 96

Ile Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser His20 25 30tac tgg agt tgg gtc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gag tgg att 144Ile Leu Be Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Be Ser His His20 25 30tac tgg agt tgg gtc cgg cag ccc ggg aag gga ctg gag tgg att 144

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Trp Being Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

ggg tac ate tat tac agt ggg age acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192ggg tac till tat tac agt ggg age acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Gly Tyr Ile Tyr Tyr Being Gly Being Thr Asn Tyr Asn Pro Being Read Lys50 55 60

agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuBe Arg Val Thr Ile Be Val Asp Thr Be Lys Asn Gln Phe Be Leu

65 70 75 8065 70 75 80

aac ctg age tet gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat tat tgt gcg 288aac ctg age tet gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat tat tgt gcg

Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AlaAsn Leu Be Ser Val Thr Wing Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys Wing

85 90 9585 90 95

aga att ccc aac tac tat gat aga agt ggt tat tat ccc ggt tac tgg 336aga att ccc aac tac tat gat agt ggt tat tat ccc ggt tac tgg 336

Arg Ile Pro Asn Tyr Tyr Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Pro Gly Tyr TrpArg Ile Pro Asn Tyr Tyr Asp Arg Be Gly Tyr Tyr Pro Gly Tyr Trp

100 105 110100 105 110

tac ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc acc gtc tca age 381tac ttc gat cg tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc acc gtc tca age 381

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125Tyr Phe Asp Read Trp Gly Arg Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120 125

<210> 44<210> 44

<211> 127<211> 127

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 44<4 00> 44

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu15 10 15Gln Val Gln Leu Gln Glu Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Glu15 10 15

Ile Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser His20 25 30Ile Read Be Read Thr Cys Thr Val Be Gly Gly Be Ile Be Be His20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Tyr Trp Being Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Gly Tyr Ile Tyr Tyr Being Gly Being Thr Asn Tyr Asn Pro Being Read Lys50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80

Asn Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Asn Leu Be Ser Val Thr Wing Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Ile Pro Asn Tyr Tyr Asp Arg Ser Gly Tyr Tyr Pro Gly Tyr Trp100 105 110Arg Ile Pro Asn Tyr Tyr Asp Arg Be Gly Tyr Tyr Pro Gly Tyr Trp100 105 110

Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210> 45Tyr Phe Asp Read Trp Gly Arg Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser115 120 125 <210> 45

<211> 345<211> 345

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(345)<221> CDS <222> (1) .. (345)

<400> 45<400> 45

cag gct gtg ctg act cag ccg tct tcc ctc tct gca cct cct gga gca 48cag gct gtg ctg act cag ccg tct tcc ctc tct gca cct cct gga gca 48

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Pro Pro Gly Ala15 10 15Gln Wing Val Leu Thr Gln Pro Be Being Read Be Wing Pro Pro Gly Wing 10 15 15

tca gcc agt ctc acc tgc acc ttg cgc agt ggc ttc aat gtt gat tcc 96tca gcc agt ctc acc tgc acc ttg cgc agt gtc ttc aat gtt gat tcc 96

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Phe Asn Val Asp Ser20 25 30Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Phe Asn Val Asp Ser20 25 30

tac agg ata tcc tgg tac cag cag aag cca ggg agt cct ccc cag tat 144tac agg ata tcc tgg tac cag cag aag cca ggg agt cct ccc cag tat 144

Tyr Arg Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln TyrTyr Arg Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

35 40 4535 40 45

ctc ctg agg tac aaa tca gac tca gat aag cag cag ggc tct gga gtc 192ctc ctg agg tac aaa tca gac tca gat aag cag cag ggc tct gga gtc 192

Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val50 55 60Leu Leu Arg Tyr Lys Be Asp Be Asp Lys Gln Gln Gly Be Gly Val50 55 60

ccc age cgc ttc tct gga tcc aaa gat gct tcg gcc aat gca ggg att 240ccc age cgc ttc tct gga tcc aaa gat gct tcg gcc aat gca ggg att 240

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile65 70 75 80Pro Be Arg Phe Be Gly Be Lys Asp Wing Be Wing Asn Wing Gly Ile65 70 75 80

tta ctc ate tct ggg ctc cag tct gag gat gag gct gac tat tac tgt 288tta ctc up to tct ggg ctc cag tct gag gat gag gct gac tat tac tgt 288

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr CysLeu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Wing Asp Tyr Tyr Cys

85 90 9585 90 95

atg att tgg cac age age gct tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg 336atg att tgg cac age age gct tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg 336

Met Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu100 105 110Met Ile Trp His Ser Be Trp Wing Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu100 105 110

acc gtc cta 345acc gtc cta 345

Thr Val Leu115Thr Val Leu115

<210> 46<210> 46

<211> 115<211> 115

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 46<4 00> 46

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Pro Pro Gly Ala15 10 15Gln Wing Val Leu Thr Gln Pro Be Being Read Be Wing Pro Pro Gly Wing 10 15 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Phe Asn Val Asp Ser20 25 30Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Phe Asn Val Asp Ser20 25 30

Tyr Arg Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr35 40 45Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val50 55 60Tyr Arg Ile Be Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Be Pro Pro Gln Tyr35 40 45Leu Read Arg Tyr Lys Be Asp Ser Asp Lys Gln Gly Ser Gly Val50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile65 70 75 80Pro Be Arg Phe Be Gly Be Lys Asp Wing Be Wing Asn Wing Gly Ile65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys85 90 95Leu Leu Ile Be Gly Leu Gln Be Glu Asp Glu Wing Asp Tyr Tyr Cys85 90 95

Met Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu100 105 110Met Ile Trp His Ser Be Trp Wing Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu100 105 110

Thr Val Leu115Thr Val Leu115

<210> 47<210> 47

<211> 372<211> 372

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1) .. (372)<221> CDS <222> (1) .. (372)

<400> 47<400> 47

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg ggaGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly1 5gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg ggaGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly1 5

ggc ttg gtc aag cct gga ggg 48ggc ttg gtc aag cct gga ggg 48

Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly10 15Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly10 15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt age tat 96tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt age tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Wing Be Gly Phe Thr Phe Be Tyr20 25 30

gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144ggt atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Wing Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ValWing Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Wing Asp Ser Val

50 55 6050 55 60

aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240aag ggc cga ttc acc up to tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Lys Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Lys Asn Thr Read Tyr65 70 75 80

ctg caa atg aac age ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288ctg caa atg aac age ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysRead Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys

85 90 9585 90 95

gcg agg ttc agt ggc tgg ccc aac aac tac tac tac tac ggt atg gac 336gcg agg ttc agt ggc tgg cc aac aac tac tac tac tac ggt atg gac 336

Ala Arg Phe Ser Gly Trp Pro Asn Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110Wing Arg Phe Ser Gly Trp Pro Asn Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110

gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tca age 372gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tca age 372

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

120120

<210> 48<210> 48

<211> 124<211> 124

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 48<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Wing Be Gly Phe Thr Phe Be Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Wing Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Wing Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Wing Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Lys Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Lys Asn Thr Read Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Read Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Phe Ser Gly Trp Pro Asn Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110Wing Arg Phe Ser Gly Trp Pro Asn Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 49<210> 49

<211> 339<211> 339

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(339)<221> CDS <222> (1) .. (339)

<4 00> 49<4 00> 49

gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48gat gtt gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15Asp Val Val Met Thr Gln Be Pro Read Be Read Pro Val Thr Pro Gly15 10 15

gag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg tctGlu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser20 25gag ccg gcc tcc to tcc tgc agg tctGlu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser20 25

aat gga ttc aac tat gtg gat tgg tacAsn Gly Phe Asn Tyr Val Asp Trp Tyraat gga ttc aac gtg gat tgg tacAsn Gly Phe Asn Tyr Val Asp Trp Tyr

agt cag age ctc ctg cat agt 96agt cag age ctc ctg cat agt 96

Ser Gln Ser Leu Leu His Ser30Ser Gln Ser Read Leu His Ser30

ctg cag aag cca ggg cag tct 144ctg cag aag cca ggg cag tct 144

Leu Gln Lys Pro Gly Gln Sercca cac ctc ttg ate tat ttc ggt tet tat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192Read Gln Lys Pro Gly Gln Sercca cac ctc ttg up to ttc ggt tet tat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro His Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro His Leu Read Ile Tyr Phe Gly Be Tyr Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa ate 240gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa until 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Read Lys Ile65 70 75 80

age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa gct 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95

ctg caa act cct ccc tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate 336ctg caa act cct ccc tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg

Leu Gln Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Read Gln Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110

aga 339now 339

ArgArg

<210> 50<210> 50

<211> 113<211> 113

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 50<4 00> 50

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15Asp Val Val Met Thr Gln Be Pro Read Be Read Pro Val Thr Pro Gly15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Gln Be Read His Read20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Asn Gly Phe Asn Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro His Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro His Leu Read Ile Tyr Phe Gly Be Tyr Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Read Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95

Leu Gln Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110Read Gln Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile100 105 110

ArgArg

<210> 51<211> 369<212> DNA<213> Homo sapiens<210> 51 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(369)<221> CDS <222> (1) .. (369)

<4 00> 51<4 00> 51

cag gta cag ctg cag cag tca ggt cca gga ctg gtg aag ccc tcg cag 48cag gta cag ctg cag cag tca ggt cca gga ctg

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15Gln Val Gln Leu Gln Gln Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Gln15 10 15

acc ctc tca ctc acc tgt gcc ate tcc ggg gac aat gtc tet age aac 96acc ctc tca ctc acc tgt gcc until tcc ggg gac aat gtc tet age aac 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Asn Val Ser Ser Asn20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Wing Ile Be Gly Asp Asn Val Be Ser Asn20 25 30

agt gct act tgg aat tgg ate agg cag tcc cca tcg aga ggc ctt gag 144agt gct act tgg aat tgg until agg cag tcc cca tcg aga ggc ctt gag 144

Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu35 40 45Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Be Arg Gly Leu Glu35 40 45

tgg ctg gga agg aca tac tac agg tcc aag tgg tat aat gag tat gea 192tgg ctg gga agg tac tac agg tcc aag tgg tat aat gag tat gea 192

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala50 55 60Trp Read Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Be Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala50 55 60

gta tet gtg aaa agt cga ata acc ate aac gga gac aca tcc aag aac 240gta tet gtg aaa agt cga ata acc till aac gga gac aca tcc aag aac 240

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Gly Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Gly Asp Thr Be Lys Asn65 70 75 80

cag ttc tcc ctg cag ttg aac tet gtg act ccc gac gac acg gct gta 288cag ttc tc ctg cag ttg aac tet gtg act ccc gac gac acg gct gta 288

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Asp Asp Thr Ala Val85 90 95Gln Phe Be Read Gln Read Asn Be Val Thr Pro Asp Asp Thr Wing Val85 90 95

tat tat tgt gea aga gga tat aga gag age cac tgg acc tat gac tac 336tat tat tgt gea aga gga tat aga gag age cac tgg acc tat gac tac 336

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Glu Ser His Trp Thr Tyr Asp Tyr100 105 110Tyr Tyr Cys Arg Wing Gly Tyr Arg Glu Be His Trp Thr Tyr Asp Tyr100 105 110

tgg ggc ctg gga acc ctg gtc acc gtc tca age 369tgg ggc ctg gg acc ctg gtc acc gtc tca age 369

Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 52<210> 52

<211> 123<211> 123

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 52<4 00> 52

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln15 10 15Gln Val Gln Leu Gln Gln Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Gln15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Asn Val Ser Ser Asn20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Wing Ile Be Gly Asp Asn Val Be Ser Asn20 25 30

Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu35 40 45Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Be Arg Gly Leu Glu35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala50 55 60Trp Read Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Be Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Gly Asp Thr Ser Lys Asn65 70 75 80Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Gly Asp Thr Be Lys Asn65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Asp Asp Thr Ala Val85 90 95Gln Phe Be Read Gln Read Asn Be Val Thr Pro Asp Asp Thr Wing Val85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Arg Glu Ser His Trp Thr Tyr Asp Tyr100 105 110Tyr Tyr Cys Arg Wing Gly Tyr Arg Glu Be His Trp Thr Tyr Asp Tyr100 105 110

Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 53<210> 53

<211> 327<211> 327

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1) . . (327)<221> CDS <222> (1). . (327)

<4 00> 53<4 00> 53

gaa acg aca ctc acg cag tct cca ggc acc ctg tca ttg tct cca ggg 48gaa acg aca ctc acg cag tct cca ggg acc ctg tca ttg tct cca ggg 48

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Thr Thr Read Thr Gln Be Pro Gly Thr Read Le Be Pro Gly15 10 15

gaa aga ggc acc ctc tcc tgc agg tcc agt cag agt gtt acc aga aac 96gaa agg ggc acc ctc tcc tgc agg tcc agt cag agt gtt acc aga aac 96

Glu Arg Gly Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Thr Arg Asn20 25 30Glu Arg Gly Thr Read Be Cys Arg Be Be Gln Be Val Thr Arg Asn20 25 30

tac ttg gcc tgg tac cag cag aaa gct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144tac ttg gcc tgg tac cag cg aaa gct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Tyr Leu Wing Trp Tyr Gln Gln Lys Wing Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu35 40 45

ate tat ggt gea tcc age agg gcc act ggc ate cca ctc agg ttc agt 192till ggt gea tcc act agg gcc act ggc till cca ctc agg ttc agt 192

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Leu Arg Phe Ser50 55 60Ile Tyr Gly Wing Ser Be Arg Wing Thr Gly Ile Pro Read Arg Phe Ser50 55 60

ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age gga ctg gag 240ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc till age gga ctg gag 240

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu65 70 75 80Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu65 70 75 80

cct gaa gat ttt gea gtg tat ttc tgt cag cag tat gag ate tca ccg 288cct gaa gat tt gea gtg tat ttc tgt cag cag tat gag till tca ccg 288

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Glu Ile Ser Pro85 90 95Pro Glu Asp Phe Wing Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Glu Ile Ser Pro85 90 95

ccc act ttc ggc gga ggg acc aag gtc gag ate aaa cga 327ccc act ttc ggc gga ggg acc aag gtc gag until aaa cga 327

Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 54<210> 54

<211> 109<211> 109

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 54<213> Homo sapiens <400> 54

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Thr Thr Read Thr Gln Be Pro Gly Thr Read Le Be Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Gly Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Thr Arg Asn20 25 30Glu Arg Gly Thr Read Be Cys Arg Be Be Gln Be Val Thr Arg Asn20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Tyr Leu Wing Trp Tyr Gln Gln Lys Wing Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Leu Arg Phe Ser50 55 60Ile Tyr Gly Wing Ser Be Arg Wing Thr Gly Ile Pro Read Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu65 70 75 80Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Glu Ile Ser Pro85 90 95Pro Glu Asp Phe Wing Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Glu Ile Ser Pro85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 55<210> 55

<211> 360<211> 360

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(360)<221> CDS <222> (1) .. (360)

<400> 55<400> 55

cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48cag gtg cag ctg cag gag tcc ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Gln Val Gln Leu Gln Glu Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Glu1 5 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc ate age age agt 96acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc until age age agt 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Thr Val Be Gly Gly Be Ile Be Ser20 25 30

tat tac tac tgg ggc tgg ate cga cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144tat tac tac tgg ggc tgg till cga cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag 144

Tyr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Tyr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45

tgg att ggg agt ate tat tat act ggg age age tac tac aac ccg tca 192tgg att ggg agt till tat tat act ggg age age tac tac aac ccg tca 192

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60

ctc aag agt cga gtc acc ata tcc tta gac acg tcc aag aat gag ttc 240ctc aag agt cga gtc acc ata tcc tta gac acg tcc aag aat gag ttc 240

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Glu PheRead Lys Be Arg Val Thr Ile Be Read Asp Thr Be Lys Asn Glu Phe

65 70 75 8065 70 75 80

tcc ctc aag ctg age tct gtg acc gcc gea gac acg gcc gtg tat tac 288Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95tcc ctc aag ctg age tct gtg acc gcc gea gac acg gcc gtg tat tac 288Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95

tgt gcg aga gcg ggt ggc agt tcg acc tgg ttc gac ccc tgg ggc cag 336tgt gcg aga gcg ggt ggc agt tcg acc tgg ttc gac ccc tgg ggc cag 336

Cys Ala Arg Ala Gly Gly Ser Ser Thr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110Cys Wing Arg Wing Gly Gly Be Being Thr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110

ggc acc ctg gtc acc gtc tca age 360ggc acc ctg gtc acc

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 56<211> 120<212> PRT<213> Homo<210> 56 <211> 120 <212> PRT <213> Homo

<400> 56<400> 56

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Gln Val Gln Leu Gln Glu Be Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Be Glu1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser20 25 30Thr Read Be Read Thr Cys Thr Val Be Gly Gly Be Ile Be Ser20 25 30

Tyr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45Tyr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Tyr Tyr Asn Pro Ser50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Glu Phe65 70 75 80Read Lys Be Arg Val Thr Ile Be Read Asp Thr Be Lys Asn Glu Phe65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Be Leu Lys Leu Be Ser Val Thr Wing Asp Thr Wing Val Tyr Tyr85 90 95

Cys Ala Arg Ala Gly Gly Ser Ser Thr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110Cys Wing Arg Wing Gly Gly Be Being Thr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 57<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens<210> 57 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(339)<221> CDS <222> (1) .. (339)

<400> 57<400> 57

gat gtt gtg atg act cag tet cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cet gga 48Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Glygat gtt gtg atg act cag tet cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cet gga 48Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Pro Le Val Pro Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

gag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg tet agt cgg age ctc ctg cat agt 96gag ccg gcc tcc to tcc tgc agg tet agt cgg age ctc ctg cat agt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Leu His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Arg Be Read Leu His Ser20 25 30

aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tet 144aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln SerAsn Gly Tyr Asn Tyr Read Asp Trp Tyr Read Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 4535 40 45

cca cag ctc ctg ate tat ttg ggt tet aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192cca cag ctc ctg until tat ttg ggt tet aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Be Asn Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa ate 240gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa until 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys IleAsp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Gly Read Lys Ile

65 70 75 8065 70 75 80

age aga gtg gag gct gag gat gtt gga gtt tat tac tgc atg caa gct 288age aga gtg gag gct gag gat gtt gga gtt tat tac tgc atg caa gct 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln AlaSer Arg Val Glu Wing Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Wing

85 90 9585 90 95

cta cga act cct ctg act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa 336cta cga ctg act ctg act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat by aaa 336

Leu Arg Thr Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110Read Arg Thr Pro Read Le Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

cga 339cga 339

ArgArg

<210> 58<210> 58

<211> 113<211> 113

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 58<400> 58

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15Asp Val Val Met Thr Gln Be Pro Read Be Read Pro Val Thr Pro Gly15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Leu His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Arg Be Read Leu His Ser20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Asn Gly Tyr Asn Tyr Read Asp Trp Tyr Read Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Be Asn Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Read Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Leu Arg Thr Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Leu Arg Thr Pro Read Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

ArgArg

<210> 59<210> 59

<211> 351<211> 351

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(351)<221> CDS <222> (1) .. (351)

<400> 59<400> 59

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc gtc agt age aac 96tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc gtc

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn20 25 30Be Read Arg Read Be Cys Wing Wing Be Gly Phe Thr Val Be Asn20 25 30

tac gtg age tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144tac gtg age tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg

Tyr Val Ser Trp Val Arg, Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Tyr Val Ser Trp Val Arg, Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

tca gtt att tat age ggt ggt age aca tac tac gca gac tcc gtg aag 192tca gtt att tat age ggt ggt age aca tac tac gca gac tcc gtg aag 192

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Wing Asp Ser Val Lys50 55 60

ggc aga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat ctt 240ggc aga ttc acc until tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat ctt 240

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80

caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85. 90. 95Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys Ala85. 90. 95

ggc ca<? tgg ctg ggg ggg ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg 336ggc ca <? tgg ctg ggg ggg ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg 336

Arg Gly Gln Trp Leu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Arg Gly Gln Trp Read Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

gtc acc gtc tca age 351gtc acc gtc tca age 351

Val Thr Val Ser Ser115Val Thr Val Ser Ser115

<210> 60<210> 60

<211> 117<211> 117

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 60<4 00> 60

Pro Gly Gly15Pro Gly Gly15

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln1 5 10Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn20 25 30Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln1 5 10Ser Leu Arg Leu Ser Cys Wing Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Wing Asp Ser Val Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Gly Gln Trp Leu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Arg Gly Gln Trp Read Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115Val Thr Val Ser Ser115

<210> 61<210> 61

<211> 327<211> 327

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(327)<221> CDS <222> (1) .. (327)

<4 00> 61<4 00> 61

gaa acg aca ctc acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48gaa acg aca ctc acg cg tct cca ggg acc ctg tct ttg tct cca

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 .10 15Glu Thr Thr Read Thr Gln Be Pro Gly Thr Read Le Be Pro Gly1 5 .10 15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age age 96gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age age 96

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Glu Arg Wing Thr Read Le Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Be Ser20 25 30

aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144aac tta gcc tgg tac cag c aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144

Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Asn Leu Wing Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu35 40 45

ate tat ggt gea tcc age agg gcc act ggc ate cca gac agg ttc agt 192till ggt gea tcc act agg gcc act ggc till cca gac agg ttc agt 192

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Ile Tyr Gly Ala Ser Be Arg Wing Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age aga ctg gag 240ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc until age aga ctg gag 240

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Be Arg Leu Glu65 70 75 80

cct gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt cag cag tat ggt age tca ctt 288cct gaa gat ttt gea gtg tac tac tgt cag cag tat ggt age tca ctt 288

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu85 90 95tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa cga 327Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu85 90 95tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa aaa cga 327

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 62<210> 62

<211> 109<211> 109

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 62<400> 62

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15Glu Thr Thr Read Thr Gln Be Pro Gly Thr Read Le Be Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Glu Arg Wing Thr Read Le Be Cys Arg Wing Be Gln Be Val Be Ser20 25 30

Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Asn Leu Wing Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Wing Pro Arg Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Ile Tyr Gly Ala Ser Be Arg Wing Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Be Arg Leu Glu65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu85 90 95Pro Glu Asp Phe Wing Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 63<210> 63

<211> 360<211> 360

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(360)<221> CDS <222> (1) .. (360)

<4 00> 63<4 00> 63

gag gtc cag ctg gta cag tet gga gctGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala1 5gag gtc cag ctg gta cag tet gga gctGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala1 5

gag gtg aag aag cct ggg gcc 48gag gtg aag aag cct ggg gcc 48

Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala10 15Glu Val Lys Pro Lys Gly Ala10 15

tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tet ggt tac acc ttt acc age tat 96tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tet ggt tac acc ttt acc age tat 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Be Tyr20 25 30

ggt ate age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144ggt till age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga tgg ate age gct tac aat ggt aac aca aac tat gea cag aag ctc 192Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga tgg till age gct tac ag ggt aac aac tat gea cag aag ctc 192

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60Gly Trp Ile Be Wing Tyr Asn Gly Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Leu50 55 60

cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg age aca gcc tac 240cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg age aca gcc tac 240

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Be Thr Be Wing Tyr65 70 75 80

atg gag ctg agg age ctg aga tet gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288atg gag ctg agg age ctg aga tet gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Arg Be Read Arg Be Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gga tac ggg age tac caa aaa cgt ttt gac tac tgg ggc cag 336ggg aga gga tac ggg age tac caa aaa cgt ttt gac tac tgg ggc cag 336

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Wing Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

ggc acc ctg gtc acc gtc tca age 360ggc acc ctg gtc acc

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 64<210> 64

<211> 120<211> 120

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 64<4 00> 64

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 10 15 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Be Tyr20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60Gly Trp Ile Be Wing Tyr Asn Gly Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Leu50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Be Thr Be Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Arg Be Read Arg Be Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Wing Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 65<211> 384<212> DNA<213> Homo sapiens<210> 65 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(384)<221> CDS <222> (1) .. (384)

<400> 65<400> 65

gat att gtg atg acc cac act cca ctc tct ctg tcc gtc acc cct gga 48gat att gtg atg acc cac act cca ctc tct ctg tcc gtc acc cct gga 48

Asp Ile Val Met Thr His Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly1 5 10 15Asp Ile Val Met Thr His Thr Pro Read Be Read Be Val Thr Pro Gly1 5 10 15

cag ccg gcc tcc ate tcc tgc aag tct agt cag age ctc ctg cat agt 96cag ccg gcc tcc to tcc tgc aag tct agt cag age ctc ctg cat agt 96

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30Gln Pro Wing Be Ile Be Cys Lys Be Be Gln Be Read His Read Ser20 25 30

gat gga aag acc tat ttg tat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag cct 144gat gga aag acc ttg tat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag cct 144

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45

cca cag ctc ctg ate tat gaa gtt tcc aac cgg ttc tct gga gtg cca 192cca cag ctc ctg until tat gaa gtt tcc aac cgg ttc tct gga gtg cca 192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Pro Gln Read Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60

gag agg ttc agt ggc age ggg tca ggg aca gct ttc aca ctg aaa ate 240gag agg ttc agt ggc age ggg tca ggg aca gct ttc aca ctg aaa to 240

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Glu Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Wing Phe Thr Read Lys Ile65 70 75 80

age agg gtg gag gct gag gat gtt gga gtt tat tac tgc atg caa cgt 288age agg gtg gag gct gag gat gtt gga gtt tat tac tgc atg caa cgt 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg85 90 95Ser Arg Val Glu Wing Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg85 90 95

ata gag ttt ccg ccc cct cac ttt cgg cgg agg gac caa ggt gga gat 336ata gag ttt ccg ccc cct cac ttt cgg cgg agg gac caa ggt gga gat 336

Ile Glu Phe Pro Pro Pro His Phe Arg Arg Arg Asp Gln Gly Gly Asp100 105 110Ile Glu Phe Pro Pro Pro His Phe Arg Arg Arg Asp Gln Gly Gly Asp100 105 110

caa acg aac tgt ggc tgc acc ate tgt ctt cat ctt ccc gcc ate tga 384caa acg aac tgt ggc tgc acc up to tgt ctt cat ctt ccc gcc up to tga 384

Gln Thr Asn Cys Gly Cys Thr Ile Cys Leu His Leu Pro Ala Ile115 120 125Gln Thr Asn Cys Gly Cys Thr Ile Cys Read His Read Pro Ala Ile115 120 125

<210> 66<210> 66

<211> 127<211> 127

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 66<4 00> 66

Asp Ile Val Met Thr His Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly1 5 10 15Asp Ile Val Met Thr His Thr Pro Read Be Read Be Val Thr Pro Gly1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30Gln Pro Wing Be Ile Be Cys Lys Be Be Gln Be Read His Read Ser20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Pro Gln Read Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Be Gly Val Pro50 55 60Glu Arg Phe Ser Gly Be Gly Ser Gly Thr Wing Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg85 90 95Ser Arg Val Glu Wing Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg85 90 95

Ile Glu Phe Pro Pro Pro His Phe Arg Arg Arg Asp Gln Gly Gly Asp100 105 110Ile Glu Phe Pro Pro Pro His Phe Arg Arg Arg Asp Gln Gly Gly Asp100 105 110

Gln Thr Asn Cys Gly Cys Thr Ile Cys Leu His Leu Pro Ala Ile115 120 125Gln Thr Asn Cys Gly Cys Thr Ile Cys Read His Read Pro Ala Ile115 120 125

<210> 67<210> 67

<211> 360<211> 360

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(360)<221> CDS <222> (1) .. (360)

<400> 67<400> 67

gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 4 8gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 4 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 5 10 15

tca gtg aag gtc ttc tgc aag gct tct gga tac acc ttc acc ggc tac 96tca gtg aag gtc ttc tgc aag gct ttc gga tac acc ttc acc ggc tac 96

Ser Val Lys Val Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30Be Val Lys Val Phe Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30

tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144tat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

gga tgg ate aac cct aac agt ggt ggc aca aac tat gea cag aag ttt 192gga tgg until aac cct aac agt ggt ggc aca aac tat gea cag aag ttt 192

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Wing Gln Lys Phe50 55 60

cag ggc agg gtc acc atg acc agg gac acg tcc ate age aca gcc tac 240cag ggc agg gtc acc atg acc agg gac acg tcc until age aca gcc tac 240

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Be Ile Be Thr Wing Tyr65 70 75 80

atg gag ctg age agg ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288atg gag ctg age agg ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Arg Read Be Arg Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gct cct tgg agt ggt cgc aga cgc ttt gac tac tgg ggc cag 336gcg aga gct cct tgg agt ggt cgc aga cgc ttt gac tac tgg ggc cag 336

Ala Arg Ala Pro Trp Ser Gly Arg Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Wing Arg Wing Pro Trp Be Gly Arg Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

gga acc ctg gtc acc gtc tca age 360gga acc ctg gtc acc gtc tca age 360

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 68<211> 120<212> PRT<210> 68 <211> 120 <212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 68<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 5 10 15

Ser Val Lys Val Phe Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30Be Val Lys Val Phe Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Tyr Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Wing Gln Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Be Ile Be Thr Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Be Arg Read Be Arg Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Ala Pro Trp Ser Gly Arg Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Wing Arg Wing Pro Trp Be Gly Arg Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 69<210> 69

<211> 12<211> 12

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<221> CDS

<222> (1)..(12)<222> (1) .. (12)

<4 00> 69cag gcg tgg tgaGln Ala Trp1<4 00> 69cag gcg tgg tgaGln Wing Trp1

<210> 70<210> 70

<211> 360<211> 360

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(360)<4 00> 70<221> CDS <222> (1) .. (360) <4 00> 70

gag gtc cag ctg gtg cag tct gag gct gag gtg aag aag cct ggg gccgag gtg cag ctg gtg cag tct gag gct gag gtg

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Glu Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act age tatSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30tca gtg aag gtt tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc act age tatSer Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

gct atg cat tgg gtg cgc cag gcc ccc gga caa agg ctt gag tgg atgAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45gct atg cat tgg gtg cgc cag gcc ccc gga caa agg ctt gag tgg atgAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45

gga tgg ate aac gct ggc aat ggt aac aca aaa tat tca cag aag ttcGly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60gga tgg till aac gct ggc aat ggt aac aca aaa tat tca cag aag ttcGly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60

cag ggc aga gtc acc att acc agg gac acg tcc ate age aca gcc tacGln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80cag ggc aga gtc acc att acc agg gac acg tcc till age aca gcc tacGln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

atg gag ctg age agg ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgtMet Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95atg gag ctg age agg ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgtMet Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gga tac ggg age tac caa aaa cgt ttt gac tac tgg ggc cagAla Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110ggg aga gga tac ggg age tac caa aaa cgt ttt gac tac tgg ggc cagAla Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

ggc acc ctg gtc acc gtc tca ageGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120ggc acc ctg gtc acc gtc tca ageGly Thr

<210> 71<210> 71

<211> 120<211> 120

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 71<4 00> 71

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Glu Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Be Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45Wing Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gly Trp Ile Asn Wing Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Be Gln Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Thr Ile Thr Thr Asp Thr Be Ile Be Thr Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Met Glu Leu Be Arg Leu Arg Be Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Gly Be Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 72<210> 72

<211> 33<211> 33

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(33)<221> CDS <222> (1) .. (33)

<4 00> 72<4 00> 72

cag gtc caa ctg cag gag ctc gag ate aaa cgt 33cag gtc caa ctg cag gag ctc gag until aaa cgt 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10

<210> 73<210> 73

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 73<4 00> 73

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg15 10Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg15 10

<210> 74<210> 74

<211> 360<211> 360

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(360)<221> CDS <222> (1) .. (360)

<4 00> 74<4 00> 74

gag gtc cag ctg gta cag tet gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48gag gtc cag ctg gta cag tet gga gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 10 15 15

tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tet ggt tac acc ttt acc age tat 96tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tet ggt tac acc ttt acc age tat 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser TyrBe Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Be Tyr

20 25 3020 25 30

ggt ate age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg 144ggt till age tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

gga tgg ate age gct tac aat ggt aac aca aac tat gea cag aag ctc 192gga tgg till age gct tac ag ggt aac aca aac tat gea cag aag ctc 192

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg age aca gcc tac 240Gly Trp Ile Ser Wing Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Wing Gln Lys Leu50 55 60cag ggc aga gtc acc atg acc aca gac aca tcc acg age aca gcc tac 240

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Be Thr Be Wing Tyr65 70 75 80

atg gag ctg agg age ctg aga tet gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288atg gag ctg agg age ctg aga tet gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Arg Be Read Arg Be Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

gcg aga gga tac ggg age tac caa aaa cgt ttt gac tac tgg ggc cag 336ggg aga gga tac ggg age tac caa aaa cgt ttt gac tac tgg ggc cag 336

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Wing Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

ggc acc ctg gtc acc gtc tca age 360ggc acc ctg gtc acc

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 75<210> 75

<211> 120<211> 120

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 75<4 00> 75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Wing Glu Val Lys Lys Pro Gly Wing 10 15 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Be Val Lys Val Be Cys Lys Wing Be Gly Tyr Thr Phe Thr Be Tyr20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu50 55 60Gly Trp Ile Be Wing Tyr Asn Gly Wing Asn Tyr Wing Gln Lys Leu50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Be Thr Be Wing Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Met Glu Read Arg Be Read Arg Be Asp Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Wing Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Gln Lys Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120Gly Thr Read Val Val Val Ser Ser 120 120

<210> 76<210> 76

<211> 33<211> 33

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<220><213> Homo sapiens <220>

<221> CDS<222> (1)..(33)<221> CDS <222> (1) .. (33)

<400> 76<400> 76

cag gtc caa ctg cag gag ctc gag ate aaa cgt 33cag gtc caa ctg cag gag ctc gag until aaa cgt 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg1 5 10

<210> 77<210> 77

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 77<4 00> 77

Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg15 10Gln Val Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ile Lys Arg15 10

<210> 78<210> 78

<211> 351<211> 351

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<221> CDS

<222> (1)..(351)<222> (1) .. (351)

<4 00> 78<4 00> 78

cag ctg cag ctg cag gag tcg ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48cag ctg cag ctg cag gag tcg ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg 48

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15 10 1515 10 15

tcc ctg aaa ctc tcc tgt gea gcg tet gga ttc acc ttc agt age tat 96tcc ctg aaa ctc tcc tgt gea gcg tet gga ttc acc ttc agt age tat 96

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Leu Lys Leu Be Cys Wing Ala Be Gly Phe Thr Phe Be Tyr20 25 30

ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 14 4ggc atg cac tgg gtc cg cg gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 14 4

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

gea gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gea gac tcc gtg 192gea gtt ata tgg tat gat gga agt aat aaa tac tat gea gac tcc gtg 192

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser ValWing Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Wing Asp Ser Val

50 55 6050 55 60

aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc agg aac acg ctg tat 240aag ggc cga ttc acc up to tcc aga gac aat tcc agg aac acg ctg tat 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Lys Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Arg Asn Thr Read Tyr65 70 75 80

ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288ctg caa atg aac age ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysRead Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys

85 90 9585 90 95

gcg act tat cct ttt gga gtg gtt cac aac tgg ggc cag ggc acc ctg 336gcg act tat cct tt gga gtg gtt cac aac tgg ggc cag ggc acc ctg 336

Ala Thr Tyr Pro Phe Gly Val Val His Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Tyr Pro Wing Phe Gly Val Val His Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

gtc acc gtc tca age 351gtc acc gtc tca age 351

Val Thr Val Ser Ser115<210> 79Val Thr Val Ser Ser115 <210> 79

<211> 117<211> 117

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<4 00> 79<4 00> 79

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Be Leu Lys Leu Be Cys Wing Ala Be Gly Phe Thr Phe Be Tyr20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Wing Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Val Ile Wing Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Wing Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Lys Gly Arg Phe Thr Ile Be Arg Asp Asn Be Arg Asn Thr Read Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Read Gln Met Asn Be Read Arg Wing Glu Asp Thr Wing Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Thr Tyr Pro Phe Gly Val Val His Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Tyr Pro Wing Phe Gly Val Val His Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110

Val Thr Val Ser Ser115Val Thr Val Ser Ser115

<210> 80<210> 80

<211> 339<211> 339

<212> DNA<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<220><220>

<221> CDS<222> (1)..(339)<221> CDS <222> (1) .. (339)

<400> 80<400> 80

gaa att gtg ctg act cag tct cca ctc tcc ctg ccc gtc acc cct gga 48gaa att gtg ctg act cag tct cca ctc tcc ctg cct gtc acc cct gga 48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15Glu Ile Val Leu Thr Gln Ile Pro Leu Be Valu Pro Gly15 10 15

gag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg tct agt cag age ctc ctg cat agt 96gag ccg gcc tcc to tcc tgc agg tct agt cag age ctc ctg cat agt 96

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Gln Be Read His Read20 25 30

aat gga ttc aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144aat gga ttc aac ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca cac ctc ttg ate tat ttc ggt tet tat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45cca cac ctc ttg till tat ttc ggt tet tat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192

Pro His Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro His Leu Read Ile Tyr Phe Gly Be Tyr Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa ate 240gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa until 240

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Read Lys Ile65 70 75 80

age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg att tat tac tgc atg caa aat 288age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg att tat tac tgc atg caa aat 288

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn85 90 95Ser Arg Val Glu Wing Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn85 90 95

ctt caa act ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gat ate aaa 336ctt caa act ccg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gat by aaa 336

Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110Read Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

cga 339cga 339

ArgArg

<210> 81<210> 81

<211> 113<211> 113

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 81<400> 81

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly15 10 15Glu Ile Val Leu Thr Gln Ile Pro Leu Be Valu Pro Gly15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30Glu Pro Wing Be Ile Be Cys Arg Be Be Gln Be Read His Read20 25 30

Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro His Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Pro His Leu Read Ile Tyr Phe Gly Be Tyr Arg Wing Be Gly Val Pro50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Asp Arg Phe Be Gly Be Gly Be Gly Thr Asp Phe Be Read Lys Ile65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn85 90 95Ser Arg Val Glu Wing Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn85 90 95

Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110Read Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105 110

Arg- 45 -NYOl 1314242 vlArg- 45 -NYOl 1314242 vl

- 1 -NY01 1314242 ν1- 1 -NY01 1314242 ν1

Claims (37)

1. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato decompreender um complexo de dois primeiros polipeptídeos e dois segundospolipeptídeos,cada primeiro polipeptídeo tendo um primeiro sítio de ligaçãoa antígeno localizado no término N de um domínio constante de cadeia levede imunoglobulina (domínio CL), referido domínio Cl capaz de associaçãoestável com um primeiro domínio constante de cadeia pesada deimunoglobulina (domínio CrI ),cada segundo polipeptídeo tendo um segundo sítio de ligação aantígeno localizado no término N de um domínio Ch 1, referido domínio ChIseguido por um ou mais domínios constantes de cadeia pesada capazes deuma auto-associação estável;em que pelo menos um referido primeiro sítio de ligação aantígeno e referido segundo sítio de ligação a antígeno é um domínio variávelúnico (sVD).Antigen-binding protein, characterized in that it comprises a complex of two first polypeptides and two second polypeptides, each first polypeptide having a first antigen-binding site located at the N-terminus of an immunoglobulin yeast chain constant domain (CL domain) referred to in Cl domain capable of stable association with a first immunoglobulin heavy chain constant domain (CrI domain), each second polypeptide having a second antigen binding site located at the N-terminus of a Ch 1 domain, said Ch domain Followed by one or more chain constant domains heavy cells capable of stable self-association, wherein at least one said first antigen binding site and said second antigen binding site is a single variable domain (sVD). 2. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto o referido primeiro comoo segundo sítios de ligação a antígeno são domínios variáveis únicos (sVDs).Antigen binding protein according to claim 1, characterized in that both said first and second antigen binding sites are unique variable domains (sVDs). 3. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um dentre referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é um domínio variável único (sVD) e ooutro dos referidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é umacadeia única Fv (scFv).Antigen-binding protein according to claim 1, characterized in that one of said first and second antigen-binding sites is a single variable domain (sVD) and the other of said first and second antigen-binding sites is a chain. single Fv (scFv). 4. Proteína de ligação a antígeno, caracterizada pelo fato decompreender um complexo de dois primeiros polipeptídeos e dois segundospolipeptídeos;cada primeiro polipeptídeo compreendendo uma cadeia pesadade imunoglobulina composta de um domínio variável e domínios constantes;cada segundo polipeptídeo compreendendo uma cadeia leve deimunoglobulina composta de um domínio variável e um domínio constante;em que os dois primeiros polipeptídeos e os dois segundospolipeptídeos se associam estavelmente para formar uma molécula de tipo deimunoglobulina;em que os domínios variáveis das cadeias pesadas deimunoglobulina se associam estavelmente com os domínios variáveis dascadeias leves de imunoglobulina para formar primeiros sítios de ligação aantígeno; e em que um ou ambos dentre os referidos primeiro e segundopolipeptídeos ainda compreende um segundo sítio de ligação a antígeno dedomínio variável de cadeia única (sVD) no término N ou término C.Antigen-binding protein, characterized in that it comprises a complex of two first polypeptides and two second polypeptides, each first polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain composed of a variable domain and constant domains, each second polypeptide comprising a deimmunoglobulin light chain composed of one. variable domain and constant domain, wherein the first two polypeptides and the second second polypeptides stably associate to form a deimmunoglobulin-like molecule, wherein the variable domains of the immunoglobulin heavy chains stably associate with the light chain variable domains of immunoglobulin to form first antigen binding sites; and wherein one or both of said first and second polypeptides further comprises a second single chain variable domain (sVD) antigen binding site at the N-terminus or C-terminus. 5. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que referidos primeirossítios de ligação a antígeno e referidos segundos sítios de ligação a antígenotem diferentes especificidades.Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said first antigen binding sites and said second antigen binding sites have different specificities. 6. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que referidas especificidadesdiferentes são para epítopos que residem em diferentes antígenos.Antigen-binding protein according to claim 5, characterized in that said different specificities are for epitopes residing on different antigens. 7. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as referidas diferentesespecificidades são para epítopos que residem no mesmo antígeno.Antigen-binding protein according to claim 5, characterized in that said different specificities are for epitopes residing on the same antigen. 8. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que referidos primeirossítios de ligação a antígeno de referidos segundos sítios de ligação a antígenotem a mesma especificidade.Antigen binding protein according to either of Claims 1 and 2, characterized in that said first antigen binding sites of said second antigen binding sites have the same specificity. 9. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que referidos domíniosconstantes são domínios constantes humanos.Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said constant domains are human constant domains. 10. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que referido domíniovariável único é humano.Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said single variable domain is human. 11. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que liga a umreceptor de Fc.Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it binds to an Fc receptor. 12. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que influencia acitotoxicidade dependente de complemento (CDC).Antigen-binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it influences complement-dependent cytotoxicity (CDC). 13. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que influencia acitotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it influences antibody-dependent cell-mediated acitotoxicity (ADCC). 14. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é ligada a umagente anti-tumor.Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it is bound to an anti-tumor agent. 15. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é ligada a umagente de produção de sinal detectável.An antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it is bound to a detectable signal production agent. 16. Proteína de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos umdos referidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraum receptor de tirosina quinase (RTK).Antigen binding protein according to any one of claims 1 to 4, characterized in that at least one of said first and second antigen binding sites is specific for a tyrosine kinase receptor (RTK). 17. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que bloqueia a ligação de ligandoao receptor de tirosina quinase.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that it blocks the binding of tyrosine kinase receptor binding. 18. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que neutraliza a ativação doreceptor de tirosina quinase.Antigen-binding protein according to claim 16, characterized in that it neutralizes doreceptor tyrosine kinase activation. 19. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que inibe a transdução de sinalpelo receptor de tirosina quinase.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that it inhibits tyrosine kinase receptor signal transduction. 20. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o receptor de tirosina quinaseé humano.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that the tyrosine kinase receptor is human. 21. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o receptor de tirosina quinaseé selecionado dentre o grupo consistindo de PDGFRa, VEGFRl, VEGFR2,VEGFR3, EGFR, HER2, IGFR, FGFR, NGFR, RON, Tek e Tie2.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that the tyrosine kinase receptor is selected from the group consisting of PDGFRα, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, EGFR, HER2, IGFR, FGFR, NGFR, RON, Tek. and Tie2. 22. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que um dos referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é específico para PDGFRa e o outro dosreferidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraVEGFR2.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that one of said first and second antigen binding sites is specific for PDGFRα and the other of said first and second antigen binding sites is specific for VEGFR2. 23. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que um dos referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é específico para VEGFRl e o outro dosreferidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraVEGFR2.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that one of said first and second antigen binding sites is specific for VEGFR1 and the other of said first and second antigen binding sites is specific for VEGFR2. 24. Proteína de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que um dos referidos primeiro esegundo sítios de ligação a antígeno é específico para IGFR e o outro dereferidos primeiro e segundo sítios de ligação a antígeno é específico paraEGFR ou HER2.Antigen binding protein according to claim 16, characterized in that one of said first and second antigen binding sites is IGFR specific and the other said first and second antigen binding sites are specific for EGFR or HER2. 25. Método de neutralização da ativação de um receptor detirosina quinase, caracterizado pelo fato de compreender o tratamento de umacélula com uma proteína de ligação a antígeno como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 4 específico para referido receptor de tirosinaquinase em uma quantidade suficiente para neutralizar a ativação do receptor.A method of neutralizing the activation of a receptor tyrosine kinase comprising treating a cell with an antigen binding protein as defined in any one of claims 1 to 4 specific for said tyrosine kinase receptor in an amount sufficient to neutralize it. the activation of the receiver. 26. Método de inibição de angiogênese, caracterizado pelo fatode compreender o tratamento de um mamífero com uma proteína de ligação aantígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em umaquantidade suficiente para neutralizar a ativação do receptor.Angiogenesis inhibition method, characterized in that it comprises treating a mammal with an antigen-binding protein as defined in any one of claims 1 to 4, in an amount sufficient to neutralize receptor activation. 27. Método de redução de crescimento de tumor, caracterizadopelo fato de compreender o tratamento de um mamífero com uma proteína deligação a antígeno como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4,em uma quantidade suficiente para reduzir o crescimento do tumor.Tumor growth reduction method, characterized in that it comprises treating a mammal with an antigen deletion protein as defined in any one of claims 1 to 4, in an amount sufficient to reduce tumor growth. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-26 e 27, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se ligaa PDGFRa e a VEGFR2 e inibe a ativação induzida por ligando de PDGFRae a ativação induzida por ligando de VEGFR2.A method according to any one of claims 26 and 27, characterized in that the antigen binding protein binds PDGFRα and VEGFR2 and inhibits ligand-induced activation of PDGFRae ligand-induced activation of VEGFR2. 29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-26 e 27, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se ligaa VEGFRl e a VEGFR2 e inibe a ativação induzida por ligando de VEGFRle ativação induzida por ligando de VEGFR2.A method according to any one of claims 26 and 27, characterized in that the antigen binding protein binds VEGFR1 and VEGFR2 and inhibits VEGFR2 ligand-induced activation and VEGFR2 ligand-induced activation. 30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se liga a EGFR e a IGFR einibe a ativação induzida por ligando de EGFR e ativação induzida porligando de IGFR.The method according to claim 27, characterized in that the antigen binding protein binds to EGFR and IGFR inhibits both EGFR ligand-induced activation and IGFR ligand-induced activation. 31. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se liga a HER2 e a IGFR einibe a ativação induzida por ligando de HER2 e ativação induzida porligando de IGFR.The method of claim 27, characterized in that the antigen binding protein binds HER2 and IGFR inhibits HER2 ligand-induced activation and IGFR ligand-induced activation. 32. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de ainda compreender a administração de uma quantidade eficaz deum agente anti-neoplásico.The method of claim 27, further comprising administering an effective amount of an antineoplastic agent. 33. Método de produção de uma proteína de ligação aantígeno, caracterizado pelo fato de compreender:a) co-expressar em uma célula hospedeirauma construção de DNA recombinante codificando umprimeiro polipeptídeo tendo um primeiro sítio de ligação a antígenolocalizado no término N de um domínio constante de cadeia leve deimunoglobulina (domínio CL), referido domínio Cl capaz de associaçãoestável com um primeiro domínio constante de cadeia pesada deimunoglobulina (domínio ChI), euma construção de DNA recombinante codificando umsegundo polipeptídeo tendo um segundo sítio de ligação a antígeno localizadono término N de um domínio Ch 1, referido domínio ChI seguido por um oumais domínios constantes de cadeia pesada capazes de auto-associaçãoestável;em que pelo menos um de referido primeiro sítio de ligação aantígeno e referido segundo sítio de ligação a antígeno é um domínio variávelúnico (sVD);durante um tempo e em um modo suficiente para permitir aexpressão dos polipeptídeos e a formação do anticorpo; eb) recuperar a proteína de ligação a antígeno.33. An antigen-binding protein production method comprising: a) co-expressing in a host cell a recombinant DNA construct encoding a first polypeptide having a first N-terminal antigen-binding site of a C-constant. immunoglobulin light chain (CL domain), said Cl domain capable of stable association with a first immunoglobulin heavy chain constant domain (ChI domain), a recombinant DNA construct encoding a second polypeptide having a second antigen binding site located at the N-terminus of a domain Ch 1, said ChI domain followed by one or more self-stable heavy chain constant domains, wherein at least one of said first antigen binding site and said second antigen binding site is a single variable domain (sVD); a while and in a mode sufficient for pe allow polypeptide expression and antibody formation; and b) recovering the antigen binding protein. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que as construções são no mesmo vetor de expressão de DNA.The method of claim 33, characterized in that the constructs are in the same DNA expression vector. 35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que as construções são em diferentes vetores de expressão deDNA.A method according to claim 33, characterized in that the constructs are in different DNA expression vectors. 36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, uma célula delevedura ou uma célula de mamífero.The method according to claim 33, characterized in that the host cell is a bacterial cell, a yeast cell or a mammalian cell. 37. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é secretado da célula hospedeira.A method according to claim 33, characterized in that the antibody is secreted from the host cell.