BRPI0706728A2

BRPI0706728A2 - composições detergentes

Info

Publication number: BRPI0706728A2
Application number: BRPI0706728-3A
Authority: BR
Inventors: Philip Frank Souter; John Allen Burdis; Kim Borch; Allan Svendsen; Mikael Mikkelsen; Jesper Vind; Neil Joseph Lant
Original assignee: Procter & Gamble
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2011-04-05
Also published as: CA2633798A1; JP2009523425A; EP1979455A2; EG25051A; WO2007087319A3; WO2007087319A2; AR059160A1

Abstract

COMPOSIçõES DETERGENTES. A presente invenção refere-se a composições detergentes compreendendo um ingrediente detergente e uma variante de lipase específica, com potencial reduzido para geração de odores e um bom desempenho relativo em comparação à lipase original.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES DETERGENTES".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições detergentes, parti-cularmente detergentes para lavagem de roupas, compreendendo enzimaslipolíticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A remoção otimizada de sujeiras gordurosas é um objetivo cons-tante para os fabricantes de detergente, especialmente no contexto de Iava-gem de roupas. Apesar do uso de muitos tensoativos eficazes e suas com-binações, especialmente quando usados a com água a baixa temperatura,muitos produtos baseados em tensoativo ainda não conseguem removercompletamente as sujeiras gordurosas ou oleosas. As enzimas Iipase têmsido usadas em detergentes desde os fins dos anos 80 para a remoção desujeiras gordurosas através da decomposição das mesmas em triglicerídeos.

Até recentemente, as principais enzimas Iipase disponíveis co-mercialmente, como a Lipolase (nome comercial, Novozymes) funcionavamde maneira particularmente eficaz nos níveis mais baixos de umidade dafase de secagem do processo de lavagem. Essas enzimas tendiam a produ-zir uma limpeza significativa somente na segunda etapa de lavagem, comuma decomposição significativa da gordura somente nas sujeiras restantesnas roupas lavadas durante a fase de secagem, sendo as gorduras decom-postas removidas, então, na próxima etapa de lavagem. Entretanto, maisrecentemente, foram desenvolvidas Iipases de maior eficiência que funcio-nam eficientemente também durante a fase de lavagem do processo de lim-peza, de modo que, do ponto de vista da limpeza na segunda etapa de lava-gem, uma melhora significativa no efeito de limpeza devido à enzima Iipasepoder ser encontrada no primeiro ciclo de lavagem. Exemplos dessas enzi-mas são conforme descrito em US 6.939.702B1, em W000/60063 e na Des-crição de Pesquisa IP6553D. Essas enzimas são referidas abaixo como Iipa-se de primeira lavagem.

Além do mais, os consumidores preferem que os artigos, comopeças de vestuário, estejam tão limpos quanto possível. Esses consumido-res tipicamente associam o odor de um artigo limpo ou tratado com o graude limpeza desse artigo. Portanto, a efetividade de uma composição de lim-peza e/ou tratamento, do ponto de vista de um consumidor, tipicamente estádiretamente ligada ao odor que essa composição confere a um artigo que élimpo ou tratado com a mesma. As Requerentes reconheceram que determi-nados materiais, como esterases e lipases, podem gerar odores desagradá-veis de ácidos graxos, particularmente odores de ácidos graxos de cadeiacurta, como o odor de ácido butírico. No entanto, esses materiais podem seragentes de limpeza particularmente eficazes. Infelizmente, os consumidorestipicamente associam os odores resultantes do uso desses agentes a umafalta de limpeza. Exemplos de variantes com odor reduzido com uma exten-são carbóxi-terminal são compartilhados em W002/062973, mas essas vari-antes de Iipase não demonstram o forte desempenho de lavagem das Iipa-ses de primeira lavagem, como aquelas apresentadas em W000/60063, in-clusive a variante disponível comercialmente sob o nome Lipex®.

Portanto, permanece uma necessidade por composições deter-gentes compreendendo enzimas lipolíticas para excelente remoção de sujei-ras gordurosas/oleosas que, ao mesmo tempo, não gera quaisquer odoresdesagradáveis de ácidos graxos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições detergentes com-preendendo um ingrediente detergente e uma variante de Iipase com umdesempenho relativo médio (DRmédio) de pelo menos 0,8 e uma relaçãorisco/benefício (RB) de pelo menos 1,1 sob as condições de teste apresen-tadas no relatório descritivo.

Listagem de seqüências

A SEQ ID NO 1 mostra a seqüência de DNA codificando Iipasede Thermomyces lanoginosus.

A SEQ ID NO 2 mostra a seqüência de aminoácidos de uma Ii-pase obtida de Thermomyces lanoginosus.

As SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4 mostram seqüências usadaspara o exemplo de alinhamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Atividade de lipase: O termo "atividade de lipase" é definido napresente invenção como uma atividade de hidrolase do éster carboxílico,que catalisa a hidrólise do triacil glicerol com a formação de diacil glicerol eum carboxilato. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de li-pase é determinada de acordo com o procedimento descrito em "Atividadede lipase" na seção "Materiais e métodos". Uma unidade de atividade delipase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1,0 micro-mol de ácido butírico por minuto, a 30°C e sob pH 7.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 70%,como pelo menos 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, com mais preferência pe-lo menos 95%, com mais preferência ainda 96% ou 97%, com a máxima pre-ferência 98% ou 99% e, com preferência ainda maior pelo menos 100% deatividade de lipase, medida como Desempenho Relativo do polipeptídeoconsistindo na seqüência de aminoácidos mostrada como o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO 2, com as substituições T231R + N233R.

Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado", para uso napresente invenção, refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro,de preferência pelo menos 40% puro, com mais preferência pelo menos 60%puro, com mais preferência ainda pelo menos 80% puro, com a máxima pre-ferência pelo menos 90% puro e, com preferência ainda maior pelo menos95% puro, conforme determinado em SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeo subs-tancialmente puro" denota, na presente invenção, uma preparação de poli-peptídeo que contém no máximo 10%, de preferência no máximo 8%, commais preferência no máximo 6%, com mais preferência no máximo 5%, commais preferência no máximo 4%, no máximo 3%, com mais preferência ain-da no máximo 2%, com a máxima preferência no máximo 1% e, com prefe-rência ainda maior, no máximo 0,5%, em peso, de outros materiais de poli-peptídeo aos quais está nativamente associado. Portanto, é preferencial queo polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, de prefe-rência pelo menos 94% puro, com mais preferência pelo menos 95% puro,com mais preferência pelo menos 96% puro, com mais preferência pelo me-nos 96% puro, com mais preferência pelo menos 97% puro, com mais prefe-rência pelo menos 98% puro, com mais preferência ainda pelo menos 99%,com a máxima preferência pelo menos 99,5% puro e, com preferência aindamaior, 100% puro, em peso do total de material de polipeptídeo presente napreparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão, de preferência,em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferencial que ospolipeptídeos estejam em uma "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação de polipeptídeo seja essencialmente isenta de outros materiaisde polipeptídeo aos quais o mesmo está nativamente associado. Isso podeser obtido, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo por meio de métodosrecombinantes bem conhecidos, ou mediante o uso de métodos de purifica-ção clássicos.

Na presente invenção, o termo "polipeptídeo substancialmentepuro" é sinônimo dos termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo sob formaisolada".

Identidade: O nível de relacionamento entre duas seqüências deaminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrito pelo parâ-metro "identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duasseqüências de aminoácido é determinado mediante o uso do programa Nee-dle, do pacote de software EMBOSS (http://emboss.org), Versão 2.8.0. Oprograma Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito emNeedleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matrizde substituição usadã é BLOSUM62, a penalidade por abertura de buraco éde 10, e a penalidade por ampliação de buraco é de 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácidos dapresente invenção ("seqüência da invenção", por exemplo aminoácidos de 1a 269 da SEQ ID NO 2) e uma seqüência de aminoácidos diferente ("se-qüência estranha") é calculado como o número de igualdades exatas em umalinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüênciada invenção" ou o comprimento da "seqüência estranha", aquela que formais curta. O resultado é expresso em porcentagem de identidade. Uma igualdade exata ocorre quando a "seqüência da invenção"e a "seqüência estranha" têm resíduos de aminoácido idênticos nas mesmasposições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo, isso é repre-sentado por O comprimento de uma seqüência é o número de resíduosde aminoácido presentes na mesma (por exemplo, o comprimento da SEQID NO 2 é 269).

No exemplo de alinhamento abaixo, a sobreposição é a seqüên-cia de aminoácidos "HTWGER-NL" da Seqüência A, ou a seqüência de ami-noácidos "HGWGEDANL" da Seqüência B. No exemplo, um buraco é indi-cado por um "-".

Exemplo de alinhamento

Fragmento de polipeptídeo: O termo "fragmento de polipeptídeo"é definido na presente invenção como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos deletados do terminal amino e/ou carboxila da SEQ ID NO 2,ou uma seqüência homóloga da mesma, sendo que o fragmento tem ativi-dade de lipase.

Subseaüência: O termo "subseqüência" é definido na presenteinvenção como uma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotí-deos deletados da extremidade 5' e/ou 3' da SEQ ID NO 1, ou uma seqüên-cia homóloga da mesma, sendo que a subseqüência codifica um fragmentode polipeptídeo com atividade de lipase.

Variante alélica: O termo "variante alélica" denota, na presenteinvenção, qualquer dentre duas ou mais formas alternativas de um gene o-cupando o mesmo Iocus cromossômico. A variação alélica surge natural-mente através de mutações, e pode resultar em polimorfismo dentro de po-pulações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma alteraçãono polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com seqüên-cias de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é umpolipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo substancialmente puro: Para uso na presenteinvenção, o termo "polinucleotídeo substancialmente puro" refere-se a umapreparação de polinucleotídeo isenta de outros nucleotídeos estranhos ouindesejados, e em uma forma adequada ao uso dentro de sistemas de pro-dução de proteínas geneticamente elaboradas. Portanto, um polinucleotídeosubstancialmente puro contém no máximo 10%, de preferência no máximo8%, com mais preferência no máximo 6%, com mais preferência no máximo5%, com mais preferência no máximo 4%, com mais preferência no máximo3%, com mais preferência ainda no máximo 2%, com a máxima preferênciano máximo 1% e, com preferência ainda maior, no máximo 0,5% em peso,de outro material de polinucleotídeo com o qual está nativamente associado.Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiõesnão-traduzidas 5' e 3' de ocorrência natural, como promotores e terminado-res. É preferencial que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelomenos 90% puro, de preferência pelo menos 92% puro, com mais preferên-cia pelo menos 94% puro, com mais preferência pelo menos 95% puro, commais preferência pelo menos 96% puro, com mais preferência pelo menos97% puro, com mais preferência ainda pelo menos 98% puro, com a máximapreferência pelo menos 99% e, com a máxima preferência, pelo menos99,5% puro, em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão, depreferência, em uma forma substancialmente pura. Em particular, é prefe-rencial que os polinucleotídeos apresentados na presente invenção estejamem uma "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação de polinucle-otídeo seja essencialmente isenta de outros materiais de polinucleotídeocom os quais está nativamente associada. Na presente invenção, o termo"polinucleotídeo substancialmente puro" é sinônimo dos termos "polinucleo-tídeo isolado" e "polinucleotídeo sob forma isolada". Os polinucleotídeos po-dem ser de origem genômica, de cDNA, de RNA, semi-sintética ou sintética,ou qualquer combinação dos mesmos.

cDNA: O termo "cDNA" é definido na presente invenção comouma molécula de DNA que pode ser preparada por meio de transcrição re-versa a partir de uma molécula de mRNA madura, submetida a splicing, ob-tida a partir de uma célula eucariótica. O cDNA não tem seqüências de intronque estão geralmente presentes no DNA genômico correspondente. Otranscrito de RNA primário inicial é um precursor de mRNA que é processa-do através de uma série de etapas, antes de aparecer como mRNA madurosubmetido a splicing. Essas etapas incluem a remoção das seqüências deintron por meio de urrí processo denominado "splicing". O cDNA derivado demRNA não tem, portanto, quaisquer seqüências de intron.

Constructo de ácido nucléico: O termo "constructo de ácido nu-cléico", para uso na presente invenção, refere-se a uma molécula de ácidonucléico, seja de filamento simples ou duplo, que é isolada a partir de umgene de ocorrência natural, ou que é modificada para conter segmentos deácidos nucléicos de tal maneira que, de outro modo, não existiria na nature-za. O termo "constructo de ácido nucléico" é sinônimo do termo "cassete deexpressão" quando o constructo de ácido nucléico contém as seqüências decontrole requeridas para expressão de uma seqüência de codificação da presente invenção.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" é defi-nido na presente invenção de modo a incluir todos os componentes que sãonecessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo codifi-cando um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controlepode ser nativa ou estranha à seqüência de nucleotídeo codificando o poli-peptídeo. Essas seqüências de controle incluem, mas não se limitam a, um aseqüência iniciadora, uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência depropeptídeo, um promotor, uma seqüência de peptídeo de sinalização e umterminador de transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluemum promotor, bem como sinais de interrupção transcricional e traducional.As seqüências de controle podem ser dotadas de ligações com o propósitode introduzir sítios de restrição específicos, facilitando a ligação das seqüên-cias de controle às regiões de codificação da seqüência de nucleotídeo codi-ficando um polipeptídeo.

Ligado de maneira funcional: O termo "ligado de maneira funcio-nal" denota, na presente invenção, uma configuração em que uma seqüên-cia de controle é colocada em uma posição adequada em relação à seqüên-cia de codificação da seqüência de polinucleotídeo, de modo que a seqüên-cia de controle dirija a expressão da seqüência de codificação de um poli-peptídeo.

Seqüência de codificação: Para uso na presente invenção, otermo "seqüência de codificação" significa uma seqüência de nucleotídeoque especifica, diretamente, a seqüência de aminoácidos de seu produto deproteína. Os limites da seqüência de codificação são geralmente determina-dos por um quadro de leitura aberto, o qual geralmente começa com o códoninicial ATG ou com códons iniciais alternativos, como GTG e TTG. A se-qüência de codificação pode ser DNA, cDNA ou seqüência de nucleotídeorecombinante.

Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvidana produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição,modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-traducional e secreção.

Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é definido napresente invenção como uma molécula de DNA linear ou circular que com-preende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção, e queestá ligada de maneira funcional a nucleotídeos adicionais que resultam emsua expressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", para uso napresente invenção, inclui qualquer tipo de célula que seja suscetível a trans-formação, transfecção, transdução e similares, com um constructo de ácidonucléico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo "modificação" significa, na presente inven-ção, qualquer modificação química do polipeptídeo consistindo no polipeptí-deo maduro de SEQ ID NO 2, bem como na manipulação genética da codifi-cação de DNA desse polipeptídeo. As uma ou mais modificações podem sersubstituições, deleções e/ou inserções dos aminoácidos, bem como substitu-ições de cadeias laterais de aminoácidos.

Variante artificial: Para uso na presente invenção, o termo "vari-ante artificial" significa um polipeptídeo tendo atividade de Iipase produzidapor um organismo expressando uma seqüência de nucleotídeo modificadada SEQ ID NO 1. A seqüência de nucleotídeo modificada é obtida por meiode intervenção humana, mediante a modificação da seqüência de nucleotí-deo apresentada na SEQ ID NO 1.

Desempenho Relativo (PR): O termo "desempenho relativo" re-flete o desempenho da variante de enzima em comparação a uma enzimade referência, quando medido como o brilho da cor das amostras de produtotêxtil lavadas com aquela variante de enzima específica, conforme descritono Exemplo 2 do presente relatório descritivo.

Risco (R): Os termos "risco" e "fator de risco" são usados demaneira intercambiável no presente relatório descritivo e consistem na razãoentre a quantidade de ácido butírico liberado pela amostra lavada com a va-riante de Iipase e a quantidade de ácido butírico liberado por uma amostralavada com a parte madura da Iipase da SEQ ID NO 2, depois de ambos osvalores terem sido corrigidos para a quantidade de ácido butírico liberado apartir por uma amostra lavada sem lipase.

Fator risco/benefício (RB): O fator risco/benefício descreve o de-sempenho de lavagem em comparação ao risco para geração de odores.Portanto RB=DRmédio/R-

Convenções para a Designação de Variantes:

Na descrição das variantes de lipase de acordo com a presenteinvenção, é usada a seguinte nomenclatura, para facilidade de referência:aminoácidos originais:posições:aminoácidos substituídos.

De acordo com essa nomenclatura, por exemplo, a substituiçãodo ácido glutâmico por glicina na posição 195 é mostrada como G195E. Adeleção da glicina na mesma posição é mostrada como G195*, e a inserçãode um resíduo de aminoácido adicional, como lisina, é mostrada comoG195GK.

Nos casos em que uma Iipase específica contém uma "deleção"em comparação com outras Iipases e uma inserção é feita nessa posição,isso é indicado como *36D para a inserção de um ácido aspártico na posição36.

Mutações múltiplas são separadas por sinais de soma, isto é,R170Y+G195E, representando mutações nas posições 170 e 195, substitu-indo tirosina e ácido glutâmico por arginina e glicina, respectivamente.

X231 indica o aminoácido em um polipeptídeo original corres-pondente à posição 231, quando se aplica o procedimento de alinhamentodescrito. X231R indica que o aminoácido é substituído por R. Para SEQ IDNO 2, X é T1 e T231R indica, portanto, uma substituição de T na posição 231por R. Nos casos em que o aminoácido em uma posição (por exemplo 231)pode ser substituído por outro aminoácido selecionado de um grupo de ami-noácidos, por exemplo o grupo consistindo em R, P e Y, isso será indicadopor X231R/P/Y.

Em todos os casos, é empregada a abreviação IUPAC para a-minoácidos, de letra única ou tripla, comumente aceita.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Polipeptídeos com Atividade de Lipase

Os polipeptídeos isolados com atividade de lipase, da presenteinvenção, são selecionados a partir do grupo consistindo em Iipases com umDR de pelo menos 0,8 e um RB de pelo menos 1,1 sob as condições de tes-te apresentadas no relatório descritivo.

Em uma modalidade preferencial, a lipase tem um DR de pelomenos 0,9, como 1,0 ou 1,1. Ern uma modalidade ainda mais preferencial, alipase tem um DR de pelo menos 1,2, como 1,3 ou mesmo 1,4.

Em outra modalidade preferencial, a lipase tem um RB de pelomenos 1,2, como 1,3 ou mesmo 1,4. Em uma modalidade ainda mais prefe-rencial, a lipase tem um RB de pelo menos 1,5, como 1,6 ou mesmo 1,7.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo da presente invenção tem,ainda, um LU/A280 relativo menor que 1, como menor que 0,95, sob as con-dições de teste apresentadas no relatório descritivo. Em uma modalidadepreferencial, o LU/A280 relativo é menor que 0,90, como menor que 0,85 oumesmo menor que 0,80.

Em um outro aspecto, os polipeptídeos isolados da presente in-venção têm uma seqüência de aminoácidos que é compreendida pela SEQID NO 2 ou compreende a mesma, ou uma variante alélica da mesma, tendoainda um RB de pelo menos 1,1 e um DR de pelo menos 0,8. Em outro as-pecto, os polipeptídeos isolados da presente invenção, têm uma seqüênciade aminoácidos que é compreendida pela parte madura da SEQ ID NO 2 oucompreende a mesma, ou uma variante alélica da mesma, tendo ainda umRB de pelo menos 1,1 e um DR de pelo menos 0,8.

Em ainda um outro aspecto, os polipeptídeos isolados da pre-sente invenção têm uma seqüência de aminoácidos que tem um grau deidentidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO 2 (isto é, o polipeptí-deo maduro) de pelo menos 80%, como pelo menos 85% or 90%, ou pelomenos 95%, de preferência pelo menos 97%, com a máxima preferênciapelo menos 98% e, com preferência ainda maior, pelo menos 99%, e quetêm atividade de Iipase (citados, mais adiante neste documento, como "poli-peptídeos homólogos"). Em um aspecto preferencial, os polipeptídeos homó-logos têm uma seqüência de aminoácidos que difere em dez aminoácidos,de preferência em cinco aminoácidos, com mais preferência em quatro ami-noácidos, com mais preferência ainda em três aminoácidos, com a máximapreferência em dois aminoácidos e, com preferência ainda maior, em umaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO 2.

Em um outro aspecto, os polipeptídeos isolados com atividadede Iipase da presente invenção são codificados por polinucleotídeos que sehibridizam sob condições de muito baixa estringência, de preferência condi-ções de baixa estringência, com mais preferência condições de média es-tringência, com mais preferência condições de médio-alta estringência, commais preferência ainda condições de alta estringência e, com a máxima pre-ferência, condições de muito alta estringência com (i) nucleotídeos de 644 a732 da SEQ ID NO 1, (ii) a seqüência de cDNA contida nos nucleotídeos de644 a 732 da SEQ ID NO 1, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii), ou (iv) umfilamento complementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambrook1 E.F. Fritsch, e T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. Edição, ColdSpring Harbor, New York, EUA). Uma subseqüência da SEQ ID NO 1 con-tém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou, de preferência, pelo menos200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codificar umfragmento de polipeptídeo que tem atividade de lipase.

A seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO 1 ou uma subse-qüência da mesma, bem como a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO2 ou um fragmento da mesma, pode ser usado para criar uma sonda de áci-do nucléico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos com ati-vidade de lipase a partir de cepas de diferentes gêneros ou espécies, de a-cordo com métodos bem-conhecidos na técnica. Em particular, essas son-das podem ser usadas para hibridização com a genômica ou o cDNA do gê-nero ou da espécie de interesse, seguindo os procedimentos convencionaisde Southern blotting, de modo a identificar e isolar dentre os mesmos o genecorrespondente. Essas sondas podem ser consideravelmente mais curtasque a seqüência inteira, mas poderiam ter pelo menos 14, de preferênciapelo menos 25, com mais preferência pelo menos 35 e, com a máxima pre-ferência, pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. É preferencial, noentanto, que a sonda de ácido nucléico tenha pelo menos 100 nucleotídeosde comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucléico pode ter pelo me-nos 200 nucleotídeos, de preferência pelo menos 300 nucleotídeos, commais preferência pelo menos 400 nucleotídeos ou, com a máxima preferên-cia, pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Sondas ainda mais lon-gas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucléico que têm peiomenos 600 nucleotídeos, de preferência pelo menos 700 nucleotídeos ou,com mais preferência, pelo menos 800 nucleotídeos de comprimento. Po-dem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são, tipica-mente, marcadas para detecção do gene correspondente (por exemplo, com32P, 3H, 35S1 biotina ou avidina). Essas sondas são abrangidas pela presenteinvenção.Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA, preparada a partirdesses outros organismos pode, portanto, ser varrida em busca de DNA quese hibridize com as sondas acima descritas, e que codifique um pólipeptídeotendo atividade de lipase. DNA genômico ou de outro tipo desses outros or-ganismos pode ser separado por meio de eletroforese em gem de agaroseou poliacrilamida, ou mediante outras técnicas de separação. O DNA dasbibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em,nitrocelulose ou outro material carreador adequado. Para identificar um cloneou DNA que é homólogo com a SEQ ID NO 1 ou com uma subseqüência damesma, o material carreador é usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indicaque a seqüência de nucleotídeo se hibridiza em uma sonda de ácido nucléi-co marcada correspondente à seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQID NO 1, seu filamento complementar, ou uma subseqüência do mesmo, sobcondições de estringência de muito baixa a muito alta. As moléculas com asquais a sonda de ácido nucléico se hibridiza sob essas condições podem serdetectadas mediante o uso de filme para raios X.

Em ainda um outro aspecto, a variante da presente invençãopode consistir em variantes artificiais compreendendo uma substituição con-servativa, uma deleção e/ou uma inserção de um ou mais aminoácidos daSEQ ID NO 2, ou o polipeptídeo maduro da mesma, sendo que as ditas vari-antes tem um RB de pelo menos 1,1 e um DR de pelo menos 0,8. De prefe-rência, as alterações de aminoácido são de uma natureza menor, ou seja,substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam sig-nificativamente a dobragem e/ou a atividade da proteína, pequenas dele-ções, tipicamente de 1 a cerca de 30 aminoácidos, pequenas extensões doterminal amino ou carboxila, como um resíduo de metionina amino-terminal,um pequeno peptídeo de ligação de até cerca de 20 a 25 resíduos, ou umapequena extensão que facilite a purificação por alteração da carga líquida oude outra função, como um trato de poli histidina, um epítopo antigênico ouum domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupode aminoácidos básicos (arginina, Iisina e histidina), aminoácidos ácidos (á-cido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e aspara-gina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidosaromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (gli-cina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidoque geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técni-ca e são descritas, por exemplo, em H. Neurath e R.L. Hilll 1979, In, TheProteins, Academic Press, New York, EUA. As trocas de ocorrência maiscomum são Ala/Ser, Val/lle, Asp/GIu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, A-la/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Vai, Ala/GIue Asp/Gly.

Em adição aos 20 aminoácidos convencionais, os aminoácidosnão-convencionais (como 4-hidróxi prolina, 6-/V-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e alfa-metil serina) podem ser substituídos porresíduos de aminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um númerolimitado de aminoácidos não-conservativos, aminoácidos que não são codifi-cados pelo código genético, e aminoácidos não-naturais podem servir comosubstitutos para resíduos de aminoácido. Os "aminoácidos não-naturais" fo-ram modificados após a síntese de proteína, e/ou têm uma estrutura químicaem suas cadeias laterais que é diferente daquela dos aminoácidos conven-cionais. Os aminoácidos não-naturais podem ser quimicamente sintetizadose, de preferência, estão disponíveis comercialmente, incluindo ácido pipecó-lico, ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3 e 4-metilprolina, e 3,3-dimetil prolina.

Alternativamente, as alterações de aminoácido são de naturezatal que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Porexemplo, as alterações de aminoácido podem otimizar a estabilidade térmicado polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato, alterar o nível ótimo depH, e similares.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo original podem seridentificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, comomutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (Cunnin-gham e Wells1 1989, Science 244: 1081-1085). Nessa última técnica, muta-ções únicas de alanina são introduzidas em cada resíduo na molécula, e asmoléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade biológica(isto é, a atividade de lipase) para identificação dos resíduos de aminoácidoque são de importância crítica para a atividade da molécula. Vide, também,Hilton et ai, 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ououtra interação biológica pode, também, ser determinada pela análise físicada estrutura, conforme determinado por essas técnicas, como ressonânciamagnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por foto-afinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos com sítio de contatoputativo. Vide, por exemplo, de Vos et ai, 1992, Science 255: 306-312,Smith et ai., 1992, J. MoL Biol. 224: 899-904, Wlodaver et ai, 1992, FEBSLett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais podem, tam-bém, ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos queestão relacionados um polipeptídeo de acordo com a presente invenção.

As substituições únicas ou múltiplas de aminoácidos podem serfeitas e testadas mediante o uso de métodos conhecidos de mutagênese,recombinação e/ou embaralhamento, seguido de um relevante procedimentode triagem, como aqueles apresentados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988,Science 241: 53-57, por Bowie e Sauer, 1989, Proc. Nati Acad. Sei. USA 86:2152-2156, WO 95/17413, ou em WO 95/22625. Outros métodos que podemser usados incluem PCR propenso a erro, exibição de fagos (por exemplo,Lowman et ai, 1991, Biochem. 30: 10832-10837, patente U.S. n° 5.223.409,WO 92/06204), e mutagênese dirigida por região (Derbyshire et ai, 1986,Gene 46: 145, Ner et ai, 1988, DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combi-nados com métodos de triagem automatizados de alto rendimento para de-tecção da atividade de clonado, polipeptídeos mutagenizados expressos pe-las células hospedeiras. As moléculas de DNA mutagenizadas que codificamos polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospe-deiras e rapidamente seqüenciadas mediante o uso de métodos-padrão natécnica. Esses métodos permitem a rápida avaliação da importância de resí-duos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse, e podemser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.

Em um aspecto, o número total de substituições e deleções deaminoácidos, e/ou de inserções de aminoácidos de 1 a 291 da SEQ ID NO 2é de 10, de preferência 9, com mais preferência 8, com mais preferência 7,com mais preferência no máximo 6, com mais preferência no máximo 5, commais preferência 4, com mais preferência ainda 3, com a máxima preferência2 e, com preferência ainda, mais de 1.

Identificação de Regiões e Substituições.

As posições mencionadas nas Regiões de I a IV, abaixo, sãoposições dos resíduos de aminoácido na SEQ ID NO 2. Para encontrar asposições correspondentes (ou homólogas) em uma Iipase diferente, é usadoo procedimento descrito em "Homologia e alinhamento".

Substituições na Região I

A Região I consiste em resíduos de aminoácido circundando oresíduo N-terminal E1. Nessa região, é preferencial substituir um aminoácidoda Iipase original por um aminoácido mais positivo. São compreendidos pelaRegião I os resíduos de aminoácido correspondentes às seguintes posições:de 1 a 11 e de 223 a 239. As seguintes posições são de particular interesse:1, 2, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234 e 236. Em particular foram identi-ficadas as seguintes substituições: X1N/*, X4V, X227G, X231R e X233R.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com SEQ ID N02. Em uma modalidade da máxima prefe-rência, a Iipase original é idêntica a SEQ ID NO 2.

Substituições na Região Il

A Região Il consiste em resíduos de aminoácido em contato como substrato em um lado da cadeia de acila e um lado da parte de álcool.

Nessa região, é preferencial substituir um aminoácido da Iipase original comum aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. Sãocompreendidos pela Região I os resíduos de aminoácido correspondentesàs seguintes posições: de 202 a 211 e de 249 a 269. As seguintes posiçõessão de particular interesse: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256 e 259. Em par-ticular, foram identificadas as seguintes substituições: X202G, X210K/W/A,X255Y/V/A, X256K/R e X259G/M/Q/V.

Substituições na Região Ill

A Região Ill consiste em resíduos de aminoácido que formamuma estrutura flexível permitindo, assim, que o substrato entre no sítio ativo.Nessa região, é preferencial substituir um aminoácido da Iipase original comum aminoácido mais positivo ou com um aminoácido menos hidrofóbico. Sãocompreendidos pela Região Ill os resíduos de aminoácido correspondentesàs seguintes posições: de 82 a 102. São de particular interesse ãs seguintesposições: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99. Em particular foram identificadas asseguintes substituições: X83T, X86V e X90A/R.

Substituições na Região IV

A Região IV consiste em resíduos de aminoácido que se ligameletrostaticamente a uma superfície. Nessa região, é preferencial substituirum aminoácido da Iipase original com um aminoácido mais positivo. Sãocompreendidos pela Região IV os resíduos de aminoácido correspondentesàs seguintes posições: 27 e de 54 a 62. São de particular interesse as se-guintes posições: 27, 56, 57, 58, 60. Em particular, foram identificadas asseguintes substituições: X27R, X58N/AG/T/P e X60V/S/G/N/R/K/A/L.

Em uma modalidade preferencial, a Iipase original tem pelo me-nos 80%, como 85% ou 90%, como pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com SEQ ID N02. Em uma modalidade da máxima prefe-rência, a Iipase original é idêntica a SEQ ID NO 2.Aminoácidos em Outras Posições

A Iipase original pode, opcionalmente, compreender a substitui-ção de outros aminoácidos, particularmente menos que 10 oü menos que 5dessas substituições. Os exemplos são substituições correspondentes auma ou mais das posições 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137,143, 147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 e 269 da Iipaseoriginal. Em uma modalidade específica, há uma substituição em pelo me-nos uma das posições correspondentes a 81, 143, 147, 150 e 249. Em umamodalidade preferencial, pelo menos uma substituição é selecionada dogrupo consistindo em X81Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K eX249R/I/L.

A variante pode compreender substituições fora das Regiões deI a IV definidas, sendo que o número dessas substituições é, de preferência,menor que seis, ou menor que cinco, ou menor que quatro, ou menor quetrês, ou menor que duas, como cinco, ou quatro, ou três, ou duas ou uma.Alternativamente, a variante não compreende qualquer substituição fora dasRegiões de I a IV definidas.

Além disso as substituições podem, por exemplo, ser feitas deacordo com os princípios conhecidos na técnica, por exemplo substituiçõesdescritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 eWO 97/07202.Variantes da Lipase Original

Em um aspecto a dita variante, quando comparada à dita Iipaseoriginal, compreende um total de pelo menos três substituições, as quais sãoselecionadas de um ou mais dos seguintes grupos de substituições:

a) pelo menos duas, ou pelo menos três, ou pelo menos quatro,ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como duas, três, quatro, cinco ouseis substituições na Região I,

b) pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três, oupelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como uma,duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região II,

c) pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três, oupelo menos quatro, òu pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como uma,duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região III,

d) e/ou pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três,ou pelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, como uma,duas, três, quatro, cinco ou seis substituições na Região IV,

A variante pode compreender substituições, em comparação àlipase original da variante, correspondentes àquelas listadas abaixo na Ta-bela 1.

Tabela 1: algumas variantes específicas.

<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

Em uma outra modalidade específica, a lipase original é idêntica à SEQ ID NO 2, e as variantes da Tabela 1 serão, portanto:

Tabela 2: alaumas variantes específicas da SEQ ID NO 2 <table>table see original document page 21</column></row><table>

Além disso, outras substituições podem, por exemplo, ser feitasde acordo com os princípios conhecidos na técnica, por exemplo substitui-ções descritas em WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO97/04079 e WO 97/07202.

Homologia e alinhamento

Para os propósitos da presente invenção, o grau de homologiapode ser adequadamente determinado por meio de programas de computa-dor conhecidos na técnica, como o GAP, fornecido no pacote de programasGCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, agosto de1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,EUA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of MolecularBiology, 48, 443-45), usando-se o dito GAP com as seguintes configuraçõespara comparação de seqüências de polipeptídeos: penalidade de 3,0 paraabertura de buraco e penalidade de 0,1 para ampliação de buraco.

Na presente invenção, as posições correspondentes (ou homó-logas) nas seqüências de Iipase de Absidia reflexa, Absidia corymbefera,Rhizmucor miehei, Rhizopus deiemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigen-sis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Peni-cilium carnembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces Ia-noginosus (sinônimo: Humicola lanuginosa) e Landerina penisapora são de-finidas pelo alinhamento mostrado na Figura 1.

Para encontrar as posições homólogas nas seqüências de Iipasenão mostradas no alinhamento, a seqüência de interesse é alinhada às se-qüências mostradas na Figura 1. A nova seqüência é alinhada ao presentealinhamento na Figura 1, mediante o uso de alinhamento GAP com a se-qüência mais homóloga encontrada pelo programa GAP.O programa GAP éfornecido no pacote de programas GCG (Program Manual for the WisconsinPackage, Versão 8, agosto 1994, Genetics Computer Group, 575 ScienceDrive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Needleman, S.B. e Wunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). São usadas as seguintesconfigurações para a comparação de seqüências de polipeptídeos: penali-dade de 3,0 para abertura de buraco e penalidade de 0,1 para ampliação deburaco.

A Iipase original tem uma homologia de pelo menos 50% com aIipase de Τ. Ianuginosus (SEQ ID NO 2), particularmente pelo menos 55%,pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, maisde 95% ou mais de 98%. Em uma modalidade específica, a Iipase original éidêntica à Iipase de T. Ianuginosus (SEQ ID NO 2).

- Relação risco/benefício

O fator risco/benefício descrevendo o desempenho em compa-ração ao risco reduzido para ocorrência de odores é definido como: RB =DRmédio / R- As variantes de Iipase aqui descritas podem ter RBs maioresque 1, maiores que 1,1, ou mesmo maiores que 1 até cerca de 1.000.

- Desempenho relativo médio

O procedimento para cálculo do desempenho relativo médio(DRmédio) é encontrado no Exemplo 5 do presente relatório descritivo. As va-riantes de Iipase aqui descritas podem ter um (DRmédio) de pelo menos 0,8,pelo menos 1,1, pelo menos 1,5, ou mesmo de pelo menos 2 a cerca de1.000.

- LU/A280 relativo

O LU/A280 relativo é determinado pelo teste de LU/A280 encon-trado no Exemplo 4 do presente relatório descritivo. As variantes de Iipaseaqui descritas podem ter um LU/A280 relativo menor que 1,00, menor que0,9, menor que 0,8 ou mesmo de menos que 1,00 a cerca de 0,1.

Fontes de polipeptídeos com atividade de Iipase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partirde microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presenteinvenção, o termo "obtido a partir de" usado em conexão com uma determi-nada fonte significa que o polipeptídeo codificado por uma seqüência de nu-cleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual foi inserida a se-qüência de nucleotídeo da fonte. Em um aspecto preferencial, o polipeptídeoobtido a partir de uma determinada fonte é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeobacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode um polipeptídeo bacterianoGram-positivo, como um polipeptídeo de Bacillus, por exemplo, um polipep-tídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis,Bacillus circulans, Bãcillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacil-Ius lieheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Baeillussubtilis ou Baeillus thuringiensis, ou um polipeptídeo de Streptomyees, porexemplo, um polipeptídeo de Streptomyees Iividans ou Streptomyees muri-nus, ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo, por exemplo, um poli-peptídeo de E. eoli ou de Pseudomonas sp.

Um polipeptídeo da presente invenção pode, também, ser umpolipeptídeo fúngico e, com mais preferência, um polipeptídeo de levedura,como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Piehia, Saecharomyees,Schizosaceharomyees ou Yarrowia ou, com mais preferência, um polipeptí-deo de fungo filamentoso como um polipeptídeo de Aeremonium, Aspergil-lus, Aureobasidium, Cryptoeoceus, Filobasidium, Fusarium, Humieola, Mag-naporthe, Mueor, Myeeliophthora, Neoeallimastix, Neurospora, Paecilomy-ees, Penieillium, Piromyces, Sehizophyllum, Talaromyees, Thermoaseus,Thielavia, Tolypocladium ou Triehoderma.

Em um aspecto preferencial, o polipeptídeo é um polipeptídeo deSaecharomyees earlsbergensis, Saecharomyees cerevisiae, Saecharomyeesdiastaticus, Saecharomyees douglasii, Saecharomyees kluyveri, Saecha-romyees norbensis ou Saecharomyces oviformis com atividade de lipase.

Em um outro aspecto preferencial, o polipeptídeo é um polipep-tídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,AspergiHus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger, Aspergillus oryzae, Aspergillus turbigensis, Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium ne-gundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusa-rium sambueinum, Fusarium sarcoehroum, Fusarium sporotrichioides, Fusa-rium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusariumvenenatum, Humieola insolens, Thermomyces Ianoginosus (sinônimo: Humi-cola lanuginose), Mucor miehei, Myeeliophthora thermophila, Neurosporacrassa, Penieillium purpurogenum, Triehoderma harzianum, Triehodermakoningii, Triehoderma longibrachiatum, Triehoderma reesei ou Triehodermaviride.

Em um outro aspecto preferencial, o polipeptídeo é um polipep-tídeo de Thermomyces.

Em um aspecto mais preferencial, o polipeptídeo é um polipeptí-deo de Thermomyces lanuginosus, por exemplo o polipeptídeo da SEQ IDNO 2 com mutações conforme apresentado no presente pedido.

Deve-se compreender que, para as espécies anteriormentemencionadas, a invenção abrange os estados tanto perfeitos como imperfei-tos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, indepen-dentemente do nome da espécie pelo qual são conhecidas. Os versados natécnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes adequados.

Cepas dessas espécies estão prontamente acessíveis ao públi-co em várias coleções de culturas, como a American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Rese-arch Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center(NRRL).

Além disso, esses polipeptídeos podem ser identificados e obti-dos a partir de outras fontes, inclusive microorganismos isolados a partir danatureza (por exemplo, terra, compostagem, água, etc.) mediante o uso dassondas acima mencionadas. As técnicas para isolar microorganismos á par-tir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeopode, então, ser obtido mediante a triagem similar de uma biblioteca genô-mica ou de cDNA de outro microorganismo. Uma vez que uma seqüência depolinucleotídeo codificando um polipeptídeo tenha sido detectada com assondas, o dito polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado mediante o usode técnicas que são bem conhecidas pelos versados na técnica (vide, porexemplo, Sambrook et ai, 1989, acima citado).

Os polipeptídeos da presente invenção incluem, também, os po-lipeptídeos fundidos ou os polipeptídeos de fusão cliváveis, em que um outropolipeptídeo é fundido ao amino-terminal ou ao carbóxi-terminal do polipep-tídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fundido é produzido median-te a fusão de uma seqüência de nucleotídeo (ou de uma porção da mesma)codificando outro polipeptídeo com uma seqüência de nucleotídeo (ou umaporção da mesma) da presente invenção. As técnicas para a produção dospolipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem a ligação dasseqüências de codificação codificando os polipeptídeos, de modo que este-jam no quadro e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob controledos mesmos promotores e terminador.

Polinucleotídeos

A Iipase da presente invenção é, de preferência, derivada de umpolinucleotídeo isolado com uma seqüência de nucleotídeo que codifia cumpolipeptídeo da presente invenção, com mais preferência com seqüênciasde nucleotídeo que codificam um polipeptídeo que é uma variante da se-qüência de aminoácidos da SEQ ID NO 2, ou o polipeptídeo maduro damesma, o que difere do polinucleotídeo de codificação devido à degeneres-cência do código genético. O polipeptídeo pode, também, ser derivado desubseqüências da SEQ ID NO 1, as quais codificam fragmentos da SEQ IDNO 2 que têm atividade de lipase, sendo que os ditos fragmentos têm umRB de pelo menos 1,1 e um DR de pelo menos 0,8.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo co-dificando um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem o isolamentoa partir de DNA genômico, a preparação a partir de cDNA, ou uma combina-ção dos mesmos. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção apartir desse tipo de DNA genômico pode ser obtida, por exemplo, mediante ouso da bem conhecida reação em cadeia de polimerase (PCR), ou mediantea triagem de anticorpos das bibliotecas de expressão para detectar os frag-mentos de DNA clonado com características estruturais compartilhadas. Vi-de, por exemplo, Innis et ai, 1990, PCR: A Guide to Methods and Applica-tion, Academic Press, New York, EUA. Podem ser usados outros procedi-mentos de amplificação de ácidos nucléicos, como reação em cadeia de Ii-gase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação à base de se-qüência de nucleotídeo (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados apartir de uma cepa de Thermomyces, ou outro organismo relacionado e as-sim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie do polipeptí-deo codificando a região da seqüência de nucleotídeo.

O polipeptídeo pode ser derivado de polinucleotídeos tendo se-qüências de nucleotídeo que têm um grau de identidade com uma seqüênciade codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO 1 de pelo menos 60%,de preferência pelo menos 65%, com mais preferência pelo menos 70%,com mais preferência pelo menos 75%, com mais preferência pelo menos80%, com mais preferência pelo menos 85%, com mais preferência pelomenos 90%, com mais preferência ainda pelo menos 95% e, com a máximapreferência, pelo menos 97% de identidade, o que codifica um polipeptídeoativo tendo atividade de lipase, RB de pelo menos 1,1 e DR de pelo menos 0,8.

A modificação de uma seqüência de nucleotídeo codificando umpolipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese depolipeptídeos substancialmente similares ao dito polipeptídeo. O termo"substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se a formas do polipeptí-deo que não têm ocorrência natural. Esses polipeptídeos podem ser diferen-tes em alguma forma elaborada a partir do polipeptídeo isolado de sua fontenativa, por exemplo, variantes artificiais que diferem quanto a atividade es-pecífica, estabilidade térmica, nível ótimo de pH ou similares. A seqüênciavariante pode ser construída com base na seqüência de nucleotídeo apre-sentada como a região codifiçadora de polipeptídeo da SEQ ID NO 1, porexemplo uma subseqüência da mesma, e/ou mediante a introdução de subs-tituições de nucleotídeo que não dão origem a uma outra seqüência de ami-noácidos do polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo, mas quecorrespondem ao uso do códon do organismo hospedeiro destinado à pro-dução da enzima; ou pela introdução de substituições de nucleotídeo quepodem dar origem a uma seqüência de aminoácidos diferente. Para obteruma descrição geral da substituição de nucleotídeo vide, por exemplo, Fordet ai, 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Ficará evidente aos versados na técnica que essas substituiçõespodem ser feitas fora das regiões de importância crítica à função da molécu-Ia e; ainda assim, resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoá-cido essenciais à atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeoisolado da invenção e, portanto, de preferência não sujeito à substituição,pode ser identificado de acordo com procedimentos conhecidos na técnica,como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina(vide, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085).Nessa última técnica, mutações são introduzidas em cada resíduo positiva-mente carregado presente na molécula, e as moléculas mutantes resultantessão testadas quanto à atividade de lipase para identificação dos resíduos deaminoácido que são de importância crítica para a atividade da molécula. Ossítios de interação substrato-enzima podem, também, ser determinados me-diante análise da estrutura tridimensional, conforme determinado por técni-cas como análise por ressonância magnética nuclear, cristalografia ou mar-cação por fotoafinidade (vide, por exemplo, de Vos etal., 1992, Science 255:306-312, Smith et ai, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904, Wlo-daver et ai, 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

O polipeptídeo pode ser derivado de polinucleotídeos isoladoscodificando um polipeptídeo da presente invenção, o qual se hibridiza sobcondições de muito baixa estringência, de preferência condições de baixaestringência, com mais preferência condições de média estringência, commais preferência condições de médio-alta estringência, com mais preferên-cia ainda condições de alta estringência e, com a máxima preferência, con-dições de muito alta estringência com (i) SEQ ID NO 1, (ii) a seqüência decDNA contida na SEQ ID NO 1, ou (iii) um filamento complementar de (i) oude (ii), ou variantes alélicas e subseqüências das mesmas (Sambrook et ai,1989, acima citado), conforme aqui definidos.

O polipeptídeo pode ser derivado de polinucleotídeos isoladosobtidos por meio de (a) hibridização de uma população de DNA sob condi-ções de estringência muito baixa, baixa, média, médio-alta, alta ou muito altade com (i) nucleotídeos da SEQ ID NO 1, (ii) a seqüência de cDNA contidanos nucleotídeos da SEQ ID NO 1, ou (iii) um filamento complementar de (i)ou de (ii), e (b) isolamento da polinucleotídeo de hibridização, que codificaum polipeptídeo tendo atividade de lipase.Constructos de Ácido Nucléico

Os constructos de ácido nucléico compreendendo um polinu-cleotídeo isolado da presente invenção podem estar ligados de maneira fun-cional a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a expressão daseqüência de codificação em uma célula hospedeira adequada, sob condi-ções compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo da pre-sente invenção pode ser manipulado de várias formas para produzir a ex-pressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência do polinucleotídeoantes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, de-pendendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de seqüên-cias de polinucleotídeo usando métodos de DNA recombinante são bem co-nhecidas na técnica.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotora a-dequada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célulahospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptí-deo da presente invenção. A seqüência promotora contém seqüências decontrole transcricional que mediam a expressão do polipeptídeo. A seqüên-cia promotora pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que demonstreatividade transcricional na célula hospedeira preferencial, inclusive promoto-res mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtida a partir de genes codi-ficando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares, sejam esses homólo-go ou heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcriçãodos constructos de ácido nucléico da presente invenção, especialmente emuma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos a partir do o-peron Iac de E. coli, do gene para agarase de Streptomyces coelicolor (da-gA), do gene para Ievansucrase de Bacillus subtilis (sacB), gene para alfaamilase de Bacillus Iicheniformis (amyL), gene para amilase maltogênica deBacHIus stearothermophilus (amyM), gene para alfa amilase de Bacillus am-yloliquefaeiens (amyQ), gene para penicilinase de Bacillus Iieheniformis{penP), genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene para beta-lactamaseprocariótico (ViHa-Kamaroff et ai, 1978, Proceedings of the National Aca-demy of Sciences USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoeret al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins from recombinantbactéria", Scientific American, 1980, 242: 74-94, e em Sambrook et al., 1989,acima citado.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcriçãodos constructos de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hos-pedeira fúngica filamentosa são aqueles obtidos a partir dos genes para TA-KA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor mie-hei, alfa amilase neutra de Aspergillus niger, alfa amilase estável em relaçãoa ácidos de Aspergillus niger, glico-amilase de Aspergillus niger ou Aspergil-lus awamori (glaA), Iipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de As-pergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidasede Aspergillus nidulans, amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO00/56900), protease semelhante à tripsina de Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) ou Fusariumoxysporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobi-oidrolase I de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei,endoglucanase Il de Trichoderma reesei, endoglucanase Ill de Triehodermareesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Tri-choderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase Il de Trieho-derma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotorNA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa amilase neutra deAspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae), bem co-mo promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis são obtidosa partir dos genes para enolase de Saecharomyces cerevisiae (ENO-1), ga-lactoquinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogena-se/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (A-DH1,ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae(TPI), metalotionina de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) e 3-fosfogliceratoquinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para célulashospedeiras de levedura são descritos por Romanos et ai, 1992, Yeast 8:423-488.

A seqüência de controle pode, também, ser uma seqüência ter-minadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora estáligada de maneira funcional à terminação 3' da seqüência de nucleotídeocodificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célulahospedeira preferencial pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicasfilamentosas são obtidos a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergil-Ius oryzae, glico-amilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Asper-gillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger e protease semelhante àtripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferenciais para células hospedeiras de leve-dura são obtidos a partir dos genes para enolase de Saccharomyees cerevi-siae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saecharomyces cerevisiae. Outros terminadoresúteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et ai,1992, acima citado.

A seqüência de controle pode, também, ser uma seqüência deiniciação adequada, uma região não-traduzida de um mRNA que é importan-te para a tradução pela célula hospedeira. A seqüência de iniciação está Ii-gada de maneira funcional à terminação 5' da seqüência de nucleotídeo co-dificando o polipeptídeo. Qualquer seqüência de iniciação que seja funcionalna célula hospedeira preferencial pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de iniciação preferenciais para células hospedei-ras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para TAKA amilasede Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

As seqüências de iniciação adequadas para células hospedeirasde levedura são obtidas a partir dos genes para enolase de Saccharomycescerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae,fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogena-se/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyees cerevisiae (A-DH2/GAP).

A seqüência de controle pode, também, ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência ligada de maneira funcional à terminação 3'da seqüência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pelacélula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosinaao mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que seja funcio-nal na célula hospedeira preferencial pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferenciais para células hos-pedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes de TAKA ami-Iase de Aspergillus oryzae, glico-amilase de AspergiHus niger, antranilatosintase de Aspergillus nidulans, protease semelhante a tripsina de Fusariumoxysporum e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

As seqüências de poliadenilação úteis para células hospedeirasde levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Bio-logy 15: 5983-5990.

A seqüência de controle pode, também, ser uma região de codi-ficação de peptídeo de sinalização, que codifica uma seqüência de aminoá-cidos ligada ao terminal amino de um polipeptídeo, e que direciona o poli-peptídeo codificado dentro da rota secretória da célula. A extremidade 5' naseqüência de codificação da seqüência de nucleotídeo pode conter, ineren-temente, uma região de codificação de peptídeo de sinalização naturalmenteligada, no quadro de leitura de tradução, ao segmento da região de codifica-ção que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade5' na seqüência de codificação pode conter uma região de codificação depeptídeo de sinalização que é estranha à seqüência de codificação. A regiãoestranha de codificação de peptídeo de sinalização pode ser necessária noscasos em que a seqüência de codificação não contém naturalmente umaregião de codificação de peptídeo de sinalização. Alternativamente, a regiãoestranha de codificação de peptídeo de sinalização pode simplesmentesubstituir a região natural de codificação de peptídeo de sinalização, de mo-do a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região decodificação de peptídeo de sinalização que dirija o polipeptídeo expresso narota secretória de uma célula hospedeira preferencial pode ser usada napresente invenção.

As regiões de codificação de peptídeo de sinalização eficazespara células hospedeiras bacterianas são aquelas obtidas a partir dos genespara amilase maltogênica NCIB 11837 de Bacillus, alfa-amilase de Bacillusstearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase deBacillus licheniformis, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stea-rothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinalizaçãosão descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões de codificação de peptídeo de sinalização eficazespara células hospedeiras fúngicas filamentosas são aquelas obtidas a partirdos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de As-pergillus niger, glico-amilase de Aspergillus níger, proteinase aspártica deRhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens e Iipase de Humicola Ia-nuginosa.

Os peptídeos de sinalização úteis para células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para fator alfa de Saccharomycescerevisiae e invertase de Saecharomyces cerevisiae. Outras regiões de codi-ficação de peptídeo de sinalização úteis são descritas por Romanos et ai,1992, acima citado.

A seqüência de controle pode, também, ser uma região de codi-ficação de propeptídeo que codifica para uma seqüência de aminoácidosposicionada no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou, em alguns casos,um zimogênio). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser conver-tido em um polipeptídeo ativo maduro mediante clivagem catalítica ou auto-catalítica do propeptídeo a partir do propolipeptídeo. A região de codificaçãode propeptídeo pode ser obtida a partir dos genes para protease alcalina{aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, fatoralfa de Saccharomyces eerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomueor mie-hei e Iacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Nos casos em que as regiões tanto de peptídeo de sinalizaçãocomo de propeptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo,a região de propeptídeo fica posicionada junto ao terminal amino de um poli-peptídeo, enquanto a região do peptídeo de sinalização fica posicionada jun-to ao terminal amino da região de propeptídeo.

Pode ser desejável, também, adicionar seqüências reguladorasque permitam a regulação da expressão do polipeptídeo quanto à prolifera-ção da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aquelesque fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em res-posta a um estímulo químico ou físico, inclusive a presença de um compostoregulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem ossistemas operadores lae, tae e trp. Em leveduras, pode ser usado o sistemaADH2 ou GAL1. Em fungos filamentosos, o promotor de TAKA alfa-amilase,o promotor de glico-amilase de Aspergillus niger, e o promotor de glico-amilase de Aspergillus oryzae podem ser usados como seqüências regula-doras. Outros exemplos de seqüências reguladoras são aqueles que permi-tem a amplificação de genes. Em sistemas eucarióticos, estes incluem o ge-ne para diidrofolato redutase, que é amplificado na presença de metotrexato,e os genes para metalotioneína, que são amplificados por metais pesados.Nesses casos, a seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo estarialigada de maneira funcional à seqüência reguladora.

Vetores de Expressão

Os vetores de expressão recombinantes geralmente compreen-dem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de in-terrupção transcricional e traducional. Os vários ácidos nucléicos e seqüên-cias de controle acima descritos podem ser unidos um ao outro para produzirum vetor de expressão recombinante, o qual pode incluir um ou mais sítiosde restrição convenientes para permitir a inserção ou a substituição da se-qüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo nesses sítios. Alternati-vãmente, uma seqüência de nucleotídeo da presente invenção pode ser ex-pressa mediante a inserção da seqüência de nucleotídeo ou de um construc-to de ácido nucléico compreendendo a seqüência em um vetor adequadopara expressão. Ao criar o vetor de expressão, a seqüência de codificaçãoestá situada no vetor, de modo que a seqüência de codificação fica ligada demaneira funcional às seqüências de controle adequadas para expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (porexemplo, um plasmídio ou um vírus), que pode ser convenientemente sub-metido a procedimentos com DNA recombinante, e que pode dar origem àexpressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor dependerá, tipi-camente, da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual omesmo se destina a ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídios linea-res ou circulares fechados.

O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, umvetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação éindependente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídio, umelemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo arti-ficial. O vetor pode conter quaisquer meios para garantir a auto-replicação.Alternativamente, o vetor pode ser tal que, quando introduzido na célulahospedeira, é integrado ao genoma e replicado juntamente com os cromos-somos aos quais foi integrado. Além disso, pode-se usar um único vetor ouplasmídio, ou dois ou mais vetores ou plasmídios que, juntos, contém o totaldo DNA a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou pode-se usarum transpóson.

Os vetores contêm, de preferência, um ou mais marcadores se-lecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas. Um mar-cador selecionável é um gene cujo produto oferece características biocidasou resistência viral, resistência a metais pesados, prototrofia para auxotro-fos, e similares.

Um gene condicionalmente essencial pode funcionar como mar-cador selecionável para não-antibiótico. Alguns exemplos não-limitadores demarcadores selecionáveis não-antibióticos condicionalmente essenciais bac-terianos são os genes dal de Bacillus subtilis, Bacillus Iicheniformis ou outrosBacilli, que só são essenciais quando a bactéria é cultivada na ausência deD-alanina. Além disso, os genes codificando enzimas envolvidas na renova-ção de UDP-galactose podem funcionar como marcadores condicionalmenteessenciais em uma célula, quando esta é cultivada na presença de galacto-se, ou em um meio que dê origem à presença de galactose. Alguns exem-plos não-limitadores desses genes são aqueles de B. subtilis ou B. Iicheni-formis codificando fosforilase dependente de UTP (EC 2.7.7.10), uridililtransferase dependente de UDP-glicose (EC 2.7.7.12), ou epimerase deUDP-galactose (EC 5.1.3.2). Além disso, um gene para xilose isomerase,como xylA de Bacilli, pode ser usado como marcador selecionável em célu-las cultivadas em meio mínimo, com xilose como única fonte de carbono. Osgenes necessários para o uso de gluconato, gntK e gntP, também podemser usados como marcadores selecionáveis em células cultivadas em meiomínimo, com gluconato como única fonte de carbono. Outros exemplos degenes condicionalmente essenciais são conhecidos na técnica. Os marcado-res selecionáveis para antibióticos conferem resistência a antibióticos comoampicilina, canamicina, cloranfenícol, eritromicina, tetraciclina, neomicina,higromicina ou metotrexato.

Os marcadores adequados para células hospedeiras de levedu-ra são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores se-lecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem,mas não se limitam a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoil transfe-rase), bar (fosfofinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransfera-se), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), sC(sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalen-tes dos mesmos. São preferenciais para uso em uma célula de Aspergillusos genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae, bemcomo o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores contêm, de preferência, um elemento que permite aintegração do vetor ao genoma da célula hospedeira, ou a replicação autô-noma do vetor na célula, independente do genoma.Para integração ao genoma da célula hospedeira, o vetor podecontar com a seqüência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ouqualquer outro elemento do vetor para integração ao genoma mediante re-combinação homóloga ou não-homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeo adicionais, para dirigir a integração pormeio de recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira, em umou mais locais precisos nos cromossomos. Para aumentar a probabilidadede integração em um local preciso, os elementos integracionais precisariam,de preferência, conter um número suficiente de ácidos nucléicos, como de100 a 10.000 pares básicos, de preferência de 400 a 10.000 pares básicose, com a máxima preferência, de 800 a 10.000 pares básicos, que têm a umalto grau de identidade com a seqüência-alvo correspondente, para acentuara probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionaispodem consistir em qualquer seqüência que seja homóloga à seqüência-alvono genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionaispodem ser seqüências de nucleotídeo não-codificadoras ou codificadoras.Por outro lado, o vetor pode ser integrado ao genoma da célula hospedeiramediante recombinação não-homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode compreender, aindauma origem de replicação capacitando o vetor a replicar-se autonomamentena célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquerreplicador de plasmídio que faça a mediação da replicação autônoma quefunciona em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador deplasmídio" é definido na presente invenção como uma seqüência de nucleo-tídeo que permite que o plasmídio ou o vetor se repliquem in vivo.

Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origensde replicação de plasmídios pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184, quepermitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e ρΑΜβΙ, quepermitem a replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para uso em uma célulahospedeira de levedura consiste na origem de replicação de 2 mícron,ARS1, ARS4, na combinação de ARS1 e CEN3, e na combinação de ARS4e CEN6.

Exemplos de origens de replicação úteis a uma célula fúngicafilamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al, 1991, Gene 98:61-67, Cullen etai, 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175, WO 00/24883). O isola-mento do gene AMA1, e a construção de plasmídios ou vetores compreen-dendo o gene, podem ser realizados de acordo com os métodos apresenta-dos em WO 00/24883.

Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invençãopode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção do produ-to de gene. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode serobtido mediante a integração de pelo menos uma cópia adicional da se-qüência no genoma da célula hospedeira, ou mediante a inclusão de um ge-ne marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, sendo que ascélulas contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e por-tanto as cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas medi-ante o cultivo das células na presença do agente selecionável adequado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos acima descri-tos para construir os vetores de expressão recombinantes da presente in-venção são bem conhecidos do versado na técnica (vide, por exemplo,Sambrook et ai, 1989, acima citado).

Células hospedeiras

As células hospedeiras recombinantes geralmente compreen-dem um polinucleotídeo da presente invenção, que é vantajosamente usadopara a produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendoum polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hos-pedeira, de modo que o vetor seja mantido como um integrante cromossô-mico ou como um vetor extracromossômico auto-replicante, conforme descri-to anteriormente. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer descendên-cia de uma célula progenitora que não seja idêntica a esta devido a muta-ções que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeiradependerá, em grande parte, do gene codificando o polipeptídeo e de suafonte.A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, porexemplo, um procariote, ou um microorganismo não-unicelular, por exemploum eucariote.

Os microorganismos unicelulares úteis consistem em célulasbacterianas, como bactérias Gram-positivas incluindo, mas não se limitandoa, uma célula de Bacillus, por exemplo Bacillus alkalophilus, Bacillus amylo-iiquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coa-gulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus mega-terium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis,ou uma célula de Streptomyces, por exemplo Streptomyces Iividans e Strep-tomyces murinus, ou bactérias Gram-negativas como E. colie Pseudomonassp. Em um aspecto preferencial, a célula hospedeira bacteriana é uma célulade Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Ba-cillus subtilis. Em um outro aspecto preferencial, a célula de Bacillus é umBacillus alcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacterianapode, por exemplo, ser obtida mediante a transformação do protoplasto (vi-de, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), mediante o uso de células competentes (vide, por exemplo, Younge Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (vi-de, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ouconjugação (vide, por exemplo, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacte-riology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira pode, também, ser um eucariote, como umacélula de mamífero, de inseto, de planta ou de fungo.

Em um aspecto preferencial, a célula hospedeira é uma célulafúngica. O termo "fungos", para uso na presente invenção, inclui os filos As-comycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (conforme definidopor Hawksworth et ai, In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a.Edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido),bem como o filo Oomycota (conforme citado em Hawksworth et ai, 1995,acima citado, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth etai, 1995, acima citado).

Em um aspecto mais preferencial, a célula hospedeira fúngica éuma célula de levedura. O termo "levedura", para uso na presente invenção,inclui leveduras ascosporógenas (Endomycetales), leveduras basidiosporó-genas e leveduras pertencentes ao filo Fungi Imperfecti (Blastomycetes).Como a classificação das leveduras pode mudar no futuro, para os propósi-tos desta invenção as leveduras serão definidas conforme descrito em Bio-Iogy and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport,R.R., Editores, Soe. App. BacterioL Symposium Series n° 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferencial, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Candida, Hansenuia, Kiuyveromyces, Pichia, Sae-charomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto da máxima preferência, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Saccharomyces earlsbergensis, Saccharomycescerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyees douglasii, Saceha-romyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyees oviformis.Em um outro aspecto da máxima preferência, a célula hospedeira de levedu-ra é uma célula de Kiuyveromyces lactis. Em um outro aspecto da máximapreferência, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia Iipoly-tica.

Em um outro aspecto mais preferencial, a célula hospedeira fún-gica é uma célula fúngica filamentosa. O termo "fungos filamentosos" inclu-em todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota(conforme definidas por Hawksworth et ai, 1995, acima citado). Os fungosfilamentosos são caracterizados, geralmente, por uma parede micelial com-posta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano e outros polissacarí-deos complexos. O crescimento vegetativo se dá por alongamento da hifa, eo catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, ocrescimento vegetativo de leveduras como Saccharomyces cerevisiae se dápor brotamento de um talo unicelular, e o catabolismo do carbono pode serfermentativo.Em um aspecto ainda mais preferencial, a célula hospedeirafúngica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidi-um, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasi-dium, Fusarium, Humicoia, Magnaporthe, Mucor, Myceiiophthora, Neocalli-mastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia,Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia,Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

Em um aspecto da máxima preferência, a célula hospedeira fún-gica filamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto da máxima preferência, acélula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioi-des, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusa-rium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fu-sarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fu-sarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioidesou Fusa-rium venenatum. Em um outro aspecto da máxima preferência, a célula hos-pedeira fúngica filamentosa é uma célula de cepa Bjerkandera adusta, Ceri-poriopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiop-sis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsissubrufa ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsu-tus, Humicoia insolens, Humicoia lanuginosa, Mucor miehei, Myceiiophthorathermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaetechrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trame-tes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma konin-gii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As células fúngicas podem ser transformadas por um processoenvolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, eregeneração da parede celular de maneira conhecida por si só. Os procedi-mentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Asper-gillus e de Trichoderma são descritos em EP 238 023 e em Yelton et al.,1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Os métodos adequados para a transformação de espécies de Fusari-um são descritos por Malardier et ai, 1989, Gene 78: 147-156, e em WO96/00787. As leveduras podem ser transformadas mediante o uso dos pro-cedimentos descritos em Becker e Guarente, In Abelson, J.N. e Simon, M.I.,Editores, Guide to Yeast Genétics and Molecular Biology, Methods in Enzy-mology, Volume 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., New York,EUA, Ito et ai, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163, e Hinnen et ai, 1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

O polipeptídeo da presente invenção pode ser produzido pormeio de um método compreendendo: (a) cultivo de uma célula que, em suaforma do tipo selvagem é capaz de produzir o polipeptídeo, sob condiçõesapropriadas à produção do polipeptídeo, e (b) recuperação do polipeptídeo.De preferência, a célula é do gênero Aspergillus e, com mais preferência, éAspergillus Oryzae.

Os métodos para a produção de um polipeptídeo da presenteinvenção podem, também, compreender: (a) cultivo de uma célula hospedei-ra sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo, e (b) recuperaçãodo polipeptídeo.

Os métodos para a produção de um polipeptídeo da presenteinvenção podem, também, compreender: (a) cultivo de uma célula hospedei-ra sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo, sendo que a célu-la hospedeira compreende uma seqüência de nucleotídeo mutante que tempelo menos uma mutação na região de codificação da SEQ ID NO 1 do poli-peptídeo maduro, e sendo que a seqüência de nucleotídeo mutante codificaum polipeptídeo que é uma Iipase compreendida pelo polipeptídeo da SEQID NO 2, ou compreendendo o mesmo, e (b) recuperação do polipeptídeo.Em uma modalidade preferencial, a seqüência de nucleotídeo codifica umpolipeptídeo que é uma Iipase compreendida pela parte madura do polipep-tídeo da SEQ ID NO 2, ou compreendendo o mesmo, e (b) recuperação dopolipeptídeo.Nos métodos de produção, as células são cultivadas em ummeio nutritivo adequado à produção do polipeptídeo, mediante o uso de mé-todos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivadaem frasco agitado e por fermentação em pequena ou grande escala (inclusi-ve fermentação contínua, por lote, por lote alimentado ou em estado sólido),em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em meio adequadoe sob condições que permitam que o polipeptídeo seja expresso e/ou isola-do. O cultivo se dá em meio nutritivo adequado, compreendendo fontes decarbono e de nitrogênio, bem como sais inorgânicos, mediante o uso de pro-cedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveisjunto a fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo comas composições publicadas (por exemplo, nos catálogos da American TypeCulture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutritivo, podeser recuperado diretamente a partir do mesmo. Se o polipeptídeo não forsecretado, pode ser recuperado a partir de Iisatos celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados mediante o uso de mé-todos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Es-ses métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, aformação de um produto enzimático, ou o desaparecimento de um substratoenzimático. Por exemplo, um teste de enzimas pode ser usado para deter-minar a atividade do polipeptídeo conforme descrito na presente invenção.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado mediante o usode métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode serrecuperado a partir do meio nutritivo mediante o uso de procedimentos con-vencionais incluindo, mas não se limitando a, centrifugação, filtração, extra-ção, secagem por atomização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos podem ser purificados por meio de vários pro-cedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, croma-tografia (por exemplo troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalizaçãoe exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo focali-zação isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipi-tação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (vide, por exemplo,Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, Editores, VCH Publishers,NewYork1 EUA, 1989).

Composições

De preferência, as composições são enriquecidas com o poli-peptídeo da presente invenção. O termo "enriquecido" indica que a atividadede Iipase da composição foi aumentada, por exemplo com um fator de enri-quecimento de 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presenteinvenção como o principal componente enzimático, por exemplo uma com-posição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compre-ender múltiplas atividades enzimáticas, como aminopeptidase, amilase, car-boidrase, carbóxi peptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodex-trina glicosil transferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase,beta-galactosidase, glico-amilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, halope-roxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolíti-ca, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenol oxidase, enzima proteo-lítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase. As enzimas adicionaispodem ser produzidas, por exemplo, por um microorganismo pertencente aogênero Aspergillus, de preferência Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamo-ri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Asper-gillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae, Fusarium, de prefe-rência Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense,Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticula-tum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fu-sarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides ou Fu-sarium venenatum, Humicola, de preferência Humicola insolens ou HumicolaIanuginosa ou Trichoderma, de preferência Trichoderma harzianum, Tricho-derma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ou Tricho-derma viride.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acor-do com métodos conhecidos na técnica e podem estar sob a forma de umacomposição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeopode estar sob a forma de um granulado ou microgranulado. O polipeptídeoa ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com os méto-dos conhecidos na técnica.

Ingredientes Detergentes

Para uso na presente invenção, composições detergentes inclu-em artigos e composições de limpeza e tratamento. Para uso na presenteinvenção, o termo "composição de limpeza e/ou tratamento" inclui, excetoonde indicado em contrário, agentes de lavagem para múltiplas finalidadesou para "tarefas pesadas" sob a foma de comprimidos, grânulos ou pó, es-pecialmente detergentes para lavagem de roupas, agentes de lavagem paramúltiplas finalidades sob a forma de líquido, gel ou pasta, especialmente oschamados tipos líquidos para tarefas pesadas, detergentes líquidos paratecidos delicados, agentes para lavagem manual de pratos ou agentes para15 lavagem de pratos para tarefas leves, especialmente aqueles do tipo comalta formação de espuma, agentes para lavagem de pratos à máquina, inclu-sive os vários tipos em comprimido, granulares, líquidos e de auxílio ao en-xágüe para uso doméstico e institucional. As composições podem, também,estar em embalagens de dose unitária, inclusive aquelas conhecidas na téc-nica e aquelas que são solúveis em água, insolúveis em água e/ou permeá-veis à água.

A composição detergente da presente invenção pode compre-ender uma ou mais variantes de Iipase da presente invenção. Em adição àvariantes de lipase, a composição detergente compreenderá, ainda, um in-grediente detergente. Os ingredientes detergentes na lista não-limitadorailustrada mais adiante neste documento são adequados ao uso nas compo-sições da presente invenção e podem ser desejavelmente incorporados adeterminadas modalidades da invenção, por exemplo para auxiliar ou inten-sificar o desempenho de limpeza, para tratamento do substrato a ser limpo,ou para modificar a estética da composição para limpeza tal como é o casocom colorantes, corantes ou similares. A natureza exata desses componen-tes adicionais, bem como seus níveis de incorporação, dependerá da formafísica da composição e da natureza da operação de limpeza em que seráutilizada. Os ingredientes detergentes adequados incluem, mas não se limi-tam a, tensoativos, builders, agentes quelantes, agentes inibidores de trans-ferência de pigmentos, dispersantes, enzimas e estabilizantes de enzimas,ativadores de alvejamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido dehidrogênio, perácidos preformados, agentes poliméricos dispersantes, clare-adores, supressores de espuma, corantes, agentes anti-corrosão, inibidoresde deslustre, perfumes, amaciantes de tecido, veículos, hidrótropos, elemen-tos auxiliares ao processamento, solventes e/ou pigmentos.

Os detergentes típicos compreenderiam, em peso, qualquercombinação dos seguintes ingredientes: de 5% a 30% de tensoativo, de pre-ferência tensoativos aniônicos como sulfonato de alquil benzeno linear e e-tóxi sulfato de álcool, de 0,005% a 0,1% de proteína ativa de protease, emque a protease é, de preferência, selecionada dentre Coronase®, FNA, FN4ou Savinase®, de 0,001% a 0,1% de proteína ativa de amilase, em que aamilase é, de preferência, selecionada dentre Termamyl®, Natalase®, Sta-inzyme® e Purastar®, e de 0,1% a 3% de quelantes, de preferência ácidodietileno triamina pentacético. Para produtos sob forma de grânulos e com-primidos, esses detergentes típicos seriam adicionalmente compreendidos,em peso, por: de 5% a 20% de alvejante, de preferência percarbonato desódio, de 1% a 4% de ativador de alvejamento, de preferência TAED, e/oude 0% a 30%, de preferência de 5% a 30%, com mais preferência menosque 10% de builder, como o zeólito de aluminossilicato A e/ou o tripolifosfato.

Agentes de alvejamento - as composições detergentes da pre-sente invenção podem compreender um ou mais agentes de alvejamento.

Em geral, quando é usado um agente de alvejamento, as com-posições da presente invenção podem compreender de cerca de 0,1% acerca de 50%, ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 25% de agente dealvejamento, em peso da presente composição para limpeza. Exemplos deagentes de alvejamento adequados incluem:

(1) fontes de peróxido de hidrogênio, por exemplo, sais de peri-drato inorgânicos, inclusive sais de metais alcalinos como sais sódicos deperborato (geralmente mono ou tetraidrato), sais de percarbonato, persulfa-to, perfosfato e persílicato, e combinações dos mesmos. Em um aspecto dainvenção, os sais de peridrato inorgânicos são selecionados a partir do gru-po consistindo em sais sódicos de perborato, de percarbonato, e combina-ções dos mesmos, sabões; e

(2) ativadores de alvejamento tendo R-(C=O)-L em que R é umgrupo alquila, opcionalmente ramificado tendo, quando o ativador de alveja-mento é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a 12 átomos decarbono e, quando o ativador de alvejamento é hidrofílico, menos de 6 áto-mos de carbono ou mesmo menos de 4 átomos de carbono, sendo que L éum grupo de saída. Exemplos de grupos de saída adequados são ácidobenzóico e derivados do mesmo, especialmente benzeno sulfonato. Os ati-vadores de alvejamento adequados incluem dodecanoil oxibenzeno sulfona-to, decanoil oxibenzeno sulfonato, ácido decanoil oxibenzóico ou seus sais,3,5,5-trimetil hexanoil oxibenzeno sulfonato, tetra acetil etileno diamina (TA-ED) e nonanoil oxibenzeno sulfonato (NOBS). Os ativadores de alvejamentoadequados são, também, apresentados em WO 98/17767. Embora qualquerativador de alvejamento adequado possa ser utilizado, em um aspecto dainvenção a presente composição para limpeza pode compreender NOBS,TAED ou misturas dos mesmos.

(3) Perácidos pré-formados.Quando presente, o perácido e/ou ativador de alvejamento estágeralmente presente na composição em uma quantidade de cerca de 0,1% acerca de 60%, de cerca de 0,5% a cerca de 40%, ou mesmo de cerca de0,6% a cerca de 10%, em peso, com base na composição. Um ou mais pre-cursores hidrofóbicos dos mesmos podem ser usados em combinação comum ou mais perácidos hidrofílicos ou precursores dos mesmos.

As quantidades de fonte de peróxido de hidrogênio e perácidoou ativador de alvejamento podem ser selecionadas de modo que a razãomolar entre oxigênio disponível (da fonte de peróxido) e perácido seja de 1:1a 35:1, ou mesmo de 2:1 a 10:1.Tensoativos - As composições detergentes de acordo com apresente invenção podem compreender um tensoativo ou um sistema tenso-ativo no qual o tensoativo pode ser selecionado de tensoativos não-iônicos,tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoa-tivos zwiteriônicos, tensoativos não-iônicos semipolares e combinações dosmesmos. Quando presente, o tensoativo está, tipicamente, presente em umteor de cerca de 0,1% a cerca de 60%, de cerca de 0,1% a cerca de 40%, decerca de 0,1% a cerca de 12%, de cerca de 1% a cerca de 50%, ou mesmode cerca de 5% a cerca de 40%, em peso da presente composição.

Quando incluído, o detergente geralmente conterá de cerca de1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico, como sulfonato de alquilbenzeno linear, sulfonato de alfa-olefina, sulfato de alquila (sulfato de álcoolgraxo), etóxi sulfato de álcool, alcano sulfonato secundário, metil éster dealfa-sulfo ácido graxo, ácido alquil ou alquenil succínico ou sabão.

O detergente pode, opcionalmente, conter de cerca de 0,2% acerca de 40% de um tensoativo não-iônico, como álcool etoxilato, fenol etoxi-Iato de nonila, alquil poliglicosídeo, oxido de alquil dimetil amina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanol amida de ácido graxo, amida depoliidróxi alquil ácido graxo, ou derivados N-acil N-alquila de glicosamina("glucamidas").

Builders - as composições detergentes da presente invençãopodem compreender um ou mais builders ou sistemas de builder detergen-tes. Quando um builder for usado, a presente composição compreenderá,tipicamente, ao menos cerca de 1%, de cerca de 5% a cerca de 60%, oumesmo de cerca de 10% a cerca de 40% de builder, em peso da presentecomposição. Os builders incluem, mas não se limitam a, sais de metal alcali-no, amônio e alcanol amônio de polifosfatos, silicatos de metal alcalino ousilicatos lamelares, carbonatos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, buil-ders à base de aluminossilicato e os diversos sais de metal alcalino, amônioe amônio substituído de ácidos poliacéticos como ácido etilenodiamino tetra-acético e ácido nitrilotriacético, bem como policarboxilatos como ácido melí-tico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidissuccínico, ácido polimaléico,ácido benzeno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carbóxi metil oxi succínico e seussais solúveis.

Agentes quelantes - as composições detergentes da presenteinvenção podem conter um agente quelante. Os agentes quelantes adequa-dos incluem agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês, e combina-ções dos mesmos. Quando um agente quelante é usado, a presente compo-sição pode compreender de cerca de 0,005% a cerca de 15%, ou mesmo decerca de 3,0% a cerca de 10% de agente quelante, em peso da presentecomposição.

Abrilhantadores - as composições detergentes da presente in-venção podem, também, conter componentes adicionais que podem alterara aparência dos artigos sendo limpos, como abrilhantadores fluorescentes.Esses abrilhantadores absorvem luz no espectro de UV e a emitem no es-pectro visível. Os teores adequados de abrilhantador fluorescente incluemdesde teores mais baixos, de cerca de 0,01, de cerca de 0,05, de cerca de0,1 ou mesmo de cerca de 0,2%, em peso, até teores mais altos de 0,5 oumesmo 0,75%, em peso.

Dispersantes - As composições da presente invenção podem,também, conter dispersantes. Os materiais orgânicos solúveis em água ade-quados incluem os ácidos homo- ou copoliméricos, ou seus sais, em que oácido policarboxílico contenha ao menos dois radicais carboxila separadosum do outro por não mais de dois átomos de carbono.

Enzimas - em adição às variantes de Iipase da presente inven-ção, a composição detergente pode compreender uma ou mais outras enzi-mas que ofereçam benefícios de desempenho de limpeza e/ou de tratamen-to de tecidos, como uma protease, outra lipase, uma cutinase, uma amilase,uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabi-nase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma Iaca-se e/ou uma peroxidase.

Em geral, as propriedades das enzimas escolhidas precisariamser compatíveis com os detergentes selecionados (isto é, ótimas quanto apH, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos,etc.), e as enzimas precisariam estar presentes em quantidades eficazes.

As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, ve-getal ou microbiana. É preferencial a origem microbiana. Estão incluídos osmutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de pro-teínas. A protease pode ser uma protease de serina ou uma metaloprotease,de preferência uma protease microbiana alcalina, ou uma protease seme-lhante à tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas, espe-cialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisiná Novo, sub-tilisina Carlsberg1 subtilisiná 309, subtilisiná 147 e subtilisiná 168 (descritaem WO 89/06279), SEQ ID NO 4 e SEQ ID NO 7 em WO 05/103244. Outrasproteases de serina adequadas incluem aquelas de Micrococcineae spp,especialmente Cellulonas spp e variantes da mesma, conforme descrito emW02005052146. Exemplos de proteases semelhantes à tripsina são a tripsi-na (por exemplo de origem porcina ou bovina) e a protease de Fusariumdescrita em WO 89/06270 e WO 94/25583.

Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas em WO92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946, especialmente asvariantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36,57, 68, 76, 87, 97, 101, 104, 106, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222,224, 235, 245, 252 e 274, e dentre outras variantes com as seguintes muta-ções: (K27R, V104Y, N123S, T124A), (N76D, S103A, V104I), ou (S101G,S103A, V104I, G159D, A232V, Q236H, Q245R, N248D, N252K). Outros e-xemplos de proteases úteis são as variantes descritas em WO 05/052146,especialmente aquelas com substituições em uma ou mais das seguintesposições: 14, 16, 35,65, 75, 76,79, 123, 127, 159 e 179

As enzimas protease preferenciais disponíveis comercialmenteincluem Alcalase®, Savinase®, Primase®, Duralase®, Esperase®, Coronase®,Polarzyme® e Kannase® (Novozymes A/S), Maxatase®, Maxacal®, Maxa-pem®, Properase®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect OxP®, FNA1 FN2,FN3 e FN4 (Genencor International Inc.).

As Iipases incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Es-tão incluídos os mutantes quimicamente modificados ou obtidos medianteengenharia de proteínas. Exemplos de Iipases úteis incluem aquelas obtidasa partir de Humicola (sinônimo: Thermomyces), por exemplo obtida de H.Ianuginosa (sinônimo: T. lanuginosus), conforme descrito em EP 258 068 eEP 305 216, ou obtida de H. insolens conforme descrito em WO 96/13580,uma Iipase obtida de Pseudomonas, por exemplo obtida de P. alcaligenes ouP. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 eWO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma Iipase obtida a partirde Bacillus, por exemplo obtida de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Bio-chemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

Outros exemplos são variantes de Iipase como aquelas descritasem WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381,WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615,WO 97/04079 e WO 97/07202.

Outras enzimas Iipase disponíveis comercialmente incluem Lipo-lase®, Lipolase Ultra® e Lipex® (Novozymes A/S).

As amilases (a e/ou β) adequadas incluem aquelas de origembacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamente modifica-dos ou obtidos mediante engenharia de proteínas. As amilases incluem, porexemplo, α-amílases obtidas a partir de Bacillus, por exemplo uma cepa es-pecial de B. licheniformis, descrita com mais detalhes em GB 1.296.839.

Exemplos de amilases úteis são as variantes descritas em WO94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 e WO 97/43424, especialmente asvariantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23,105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243,264, 304, 305, 391, 408 e 444.

As amilases disponíveis comercialmente são Duramyl®, Ter-mamyl®, Stainzyme®, Stainzyme Ultra®, Fungamyl® e ΒΑΝ® (NovozymesA/S), bem como Rapidase® e Purastar® (Genencor International Inc.).

As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacterianaou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamente modificados ou obti-dos mediante engenharia de proteínas. As celulases adequadas incluemcelulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium1 Thiela-via, Acremonium, por exemplo as celulases fúngicas produzidas a partir deHumicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum, a-presentadas em US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757e WO 89/09259.

As celulases especialmente adequadas são as celulases alcali-nas ou neutras oferecendo benefícios de cuidado das cores. Exemplos des-sas celulases são aquelas descritas em EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO96/11262, WO 96/29397 e WO 98/08940. Outros exemplos são as variantesde celulase, como aqueles descritos em WO 94/07998, EP 0 531 315, US5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 ePCT/DK98/00299.

As celulases disponíveis comercialmente incluem Renozyme®,Celluclean®, Endolase®, Celluzyme® e Carezyme® (Novozymes A/S), Clazi-nase® e Puradax HA® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (KaoCorporation).

Peroxidases/Oxidases:

As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origemvegetal, bacteriana ou fúngica. Estão incluídos os mutantes quimicamentemodificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas. Exemplos de pe-roxidases úteis incluem aquelas de Coprinus, por exemplo de C. cinereus, evariantes das mesmas, como aquelas descritas em WO 93/24618, WO95/10602 e WO 98/15257.

As peroxidases disponíveis comercialmente incluem Guardzy-me® (Novozymes A/S).

Quando presentes em uma composição para limpeza, as enzi-mas anteriormente mencionadas podem estar em teores na faixa de cercade 0,00001% a cerca de 2%, de cerca de 0,0001% a cerca de 1% ou mesmode cerca de 0,001% a cerca de 0,5% de proteína de enzima, em peso dacomposição.

Estabilizantes de enzimas - As enzimas para uso em detergen-tes podem ser estabilizadas por meio de várias técnicas. As enzimas empre-gadas neste caso podem ser estabilizadas pela presença de fontes solúveisde água de íons de cálcio e/ou magnésio nas composições finais que forne-cem tais íons às enzimas. Outros agentes estabilizantes convencionais, porexemplo um poliol como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou um álcoolde açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, porexemplo um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenilborôni-co como ácido 4-formilfenil borônico, também podem ser usados, e a com-posição pode ser formulada conforme descrito, por exemplo, em WO92/19709 e WO 92/19708.

Solventes - Os solventes adequados incluem água e outros sol-ventes como fluidos lipofílicos. Exemplos de fluidos lipofílicos adequadosincluem siloxanos, outros silicones, hidrocarbonetos, éteres de glicol, deriva-dos de glicerina como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventesperfluorados e à base de éter hidrofluorado, solventes orgânicos não-fluorados de baixa volatilidade, solventes à base de diol, outros solventesambientalmente amigáveis e misturas desses itens.

Método de Lavagem

A presente invenção inclui um método para limpeza e/ou trata-mento de um local entre outros uma superfície ou um tecido. Esse métodoinclui as etapas de colocar uma modalidade da composição de limpeza dasRequerentes, em sua forma pura ou diluída em um líquido de lavagem, emcontato com pelo menos uma porção de uma superfície ou tecido e então,opcionalmente, enxaguar essa superfície ou esse tecido. Pode-se submetera superfície ou o tecido a uma etapa de lavagem antes da etapa de enxágüemencionada acima. Para as finalidades da presente invenção, a lavageminclui, porém não se limita a, esfregamento e agitação mecânica. Como seráapreciado por um elemento versado na técnica, as composições de limpezada presente invenção são idealmente adequadas para uso em aplicações delavagem de roupas. Conseqüentemente, a presente invenção inclui um mé-todo de lavagem de um tecido. O método inclui as etapas de colocar um te-cido a ser lavado em contato com a dita solução de limpeza para lavanderiacontendo ao menos uma modalidade das Requerentes para composição delimpeza, aditivo de limpeza ou uma mistura desses itens. O tecido pode con-ter praticamente qualquer tecido que possa ser lavado em condições de usonormais pelo consumidor. A solução tem, de preferência um pH na faixa decerca de 8 a cerca de 10,5. As composições podem ser usadas em concen-trações de cerca de 100 ppm, de preferência de 500 ppm a cerca de 15.000ppm em solução. As temperaturas da água situam-se, tipicamente, na faixade cerca de 5°C a cerca de 90°C. A invenção pode ser particularmente be-néfica sob condições de baixa temperatura da água, por exemplo, abaixo de30°C ou abaixo de 25 ou 20°C. A razão entre a água e o tecido é, tipicamen-te, de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.Exemplos de variantes de Iipase

Os produtos químicos usados como tampões e substratos sãoprodutos comercialmente disponíveis pelo menos com grau de reagente.

- Meios e soluções: LAS (Surfac PS®) e Zeolite A (Wessalith P®).Outros ingredientes usados são reagentes para laboratório convencionais.

- Materiais: EMPA221, disponível junto à EMPA St. Gallen, Ler-chfeldstrasse 5, CH-9014 St. Gallen, Suíça

Exemplo 1: Produção de enzima

Um plasmídio contendo o gene que codifica a Iipase é construí-do e transformado em uma célula hospedeira adequada, mediante o uso demétodos-padrão da técnica.

A fermentação é realizada sob a forma de fermentação por lotealimentado, mediante o uso de um meio com temperatura constante de34°C, e um volume inicial de 1,2 litro. O pH inicial do meio é ajustado para6,5. Uma vez que o pH tenha aumentado para 7,0, esse valor é mantido me-diante a adição de H3P04 a 10%. O teor de oxigênio dissolvido no meio écontrolado mediante a variação da taxa de agitação, usando-se uma taxa deaeração fixa de 1,0 litro de ar por litro de meio, por minuto. A taxa de adiçãode alimento é mantida a um teor constante durante toda a fase de lote ali-mentado. O meio do lote contém xarope de maltose como fonte de carbono,uréia e extrato de levedura como fonte de nitrogênio, e uma mistura de oli-goelementos metálicos e sais. O alimento adicionado de maneira contínuadurante a fase de lote alimentado contém xarope de maltose como fonte decarbono, enquanto extrato de levedura é uréia são adicionados para assegu-rar um suprimento suficiente de nitrogênio.

A purificação da Iipase pode ser feita mediante o uso de méto-dos-padrão conhecidos na técnica, por exemplo mediante a filtração do so-brenadante da fermentação, e a subseqüente cromatografia hidrofóbica etroca de ânions, por exemplo conforme descrito em EP 0 851 913 EP, Exemplo 3.

Exemplo 2: TEMA (Teste de Esforço Mecânico Automatizado) para cálculo do RP.

As variantes de enzima do presente pedido são testadas medi-ante o uso de Teste de Esforço Mecânico Automatizado (TEMA). Com o tes-te TEMA, pode-se examinar o desempenho de lavagem de uma grandequantidade de soluções enzimáticas detergentes em pequenos volumes. Aplaca de TEMA tem um certo número de fendas para soluções de teste, euma tampa que comprime firmemente a amostra de produto têxtil a ser lava-da contra as aberturas em fenda. Durante o tempo de lavagem, a placa, assoluções de teste, o produto têxtil e a tampa são vigorosamente agitadospara colocar a solução de teste em contato com o produto têxtil, e para apli-car esforço mecânico. Para uma descrição mais detalhada, vide WO02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments", naspáginas 23 a 24. Os recipientes, que contêm a solução de teste do detergen-te, consistem em orifícios cilíndricos (6 de diâmetro, 10 mm de profundidade)em uma placa de metal. O tecido manchado (material de teste) fica no topoda placa de metal e é usado como tampa e lacre nos recipientes. Uma outraplaca de metal fica no topo do tecido manchado para evitar qualquer derra-mamento de cada um dos recipientes. As duas placas de metal, juntas como tecido manchado, são vibradas para cima e para baixo a uma freqüênciade 30 Hz, com uma amplitude de 2 mm.

O ensaio é conduzido sob as condições experimentais abaixoespecificadas:Tabela 3

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Amostras com creme e turmérico são preparadas mediante amisturação de 5 g de turmérico (Santa Maria, Dinamarca) com 100 g decreme (38% de gordura, Arla, Dinamarca) a 50°C, sendo que a mistura édeixada a essa temperatura durante cerca de 20 minutos e filtrada (50°C)para remover quaisquer partículas não dissolvidas. A mistura é resfriada até20°C, e amostras de tecido de algodão, EMPA221, são imersas na misturade creme e turmérico, sendo então deixadas secar à temperatura ambientede um dia para outro e congeladas até o uso. A preparação das amostras decreme-turmérico são apresentadas no Pedido de Patente PA 2005 00775,depositado em 27 de maio de 2005.O desempenho da variante de enzima é medido como o brilhoda cor das amostras de produto têxtil lavadas com aquela variante de enzi-ma específica. O brilho pode, também, ser expresso como a intensidade daluz refletida a partir da amostra de produto têxtil quando iluminada com luzbranca. Quando o produto têxtil está manchado, a intensidade da luz refleti-da é mais baixa que aquela de um produto têxtil limpo. Portanto, a intensida-de da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem deuma variante de enzima.

As medições de cor são feitas em uma scanner de base planade uso profissional (PFU DLpro), a qual é usada para capturar uma imagemdas amostras de produto têxtil lavadas. As digitalizações são feitas com umaresolução de 200 dpi e com uma profundidade de cor na saída de 24 bits.Para a obtenção de resultados acurados, a scanner é calibrada freqüente-mente com um alvo reflexivo Kodak IT8.

Para extrair um valor da intensidade de luz das imagens digitali-zadas, é usado um aplicativo de software especialmente projetado (No-vozymes Color Vector Analyzer). O programa recupera os valores de pixelem 24 bits da imagem, e os converte em valores para vermelho, verde e azul(RGB, ou Red, Green, Blue). O valor da intensidade (Int) é calculado medi-ante a adição dos valores RGB como vetores e, então, tomando-se o com-primento do vetor resultante:

<formula>formula see original document page 57</formula>

O desempenho de lavagem (D) das variantes é calculado de a-cordo com a fórmula abaixo: P = Int(v) - Int(r) em que:

Int(v) é o valor de intensidade de luz da superfície do produtotêxtil lavada com a enzima de teste, e

Int(r) é o valor de intensidade de luz da superfície do produtotêxtil lavada sem a enzima de teste.

É dada uma pontuação de desempenho relativo como resultadoda lavagem TEMA, de acordo com a definição: as pontuações de Desempe-nho Relativo (DR) são a somatória dos desempenhos (D) das variantes deenzima testadas contra a enzima de referência:DR = D(énzima de teste) / D(enzima de referência).

O DRmédio indica o desempenho relativo médio em compara-ção ao da enzima de referência em todas as quatro concentrações de enzi-mas (0,125, 0,25, 0,5, 1,0 mg ep/l)

DRmédio = média(DR(0,125), DR(0,25), DR(0,5), DR(1,0))

Considera-se que a variante exibe desempenho de lavagem oti-mizado se tiver um desempenho melhor que o da referência.

No contexto da presente invenção, a enzima de referência é aIipase da SEQ ID NO 2, com as substituições T231R + N233R.

Exemplo 3: CG (cromatoqrafia qasosa) para cálculo do fator de risco.

A liberação de ácido butírico a partir das amostras lavadas comIipase é medida por meio de cromatografia a gás por microextração em fasesólida (MEFS-CG), utilizando-se o método exposto a seguir. Quatro peçasde produto têxtil (com 5 mm de diâmetro), lavadas na solução especificadana Tabela 1, contendo 1 mg/L de lipase, são transferidas para um frasco decromatografia gasosa (CG). As amostras são analisadas em um cromatógra-fo gasoso Varian 3800 GC equipado com uma coluna de proteção Stabilwax-DA w/Integra (30 m, 0,32 mm ID e 0,25 micro-m df) e uma fibra CarboxenPDMS para MEFS (75 micro-m). Cada amostra é pré-incubada durante 10min a 40°C, seguido de 20 min de amostragem com a fibra para MEFS noespaço livre sobre as peças de produto têxtil. A amostra é, subseqüente-mente, injetada na coluna (temperatura do injetor = 250°C). Fluxo da coluna= 2 ml_ de hélio/min. Gradiente de temperatura do forno de coluna: 0 min =40°C, 2 min = 40°C, 22 min = 240°C, 32 min = 240°C. O ácido butírico é de-tectado por meio de detecção FID, sendo sua quantidade calculada com ba-se em uma curva padrão para ácido butírico.

O desempenho de risco para odor, R, de uma variante de lipaseé a razão entre a quantidade de ácido butírico liberado pela amostra lavadacom a variante de lipase e a quantidade de ácido butírico liberado por umaamostra lavada com a parte madura da lipase da SEQ ID NO 2, depois deambos os valores terem sido corrigidos para a quantidade de ácido butíricoliberado por uma amostra lavada sem lipase. O risco (R) das variantes é cal-culado de acordo com a fórmula abaixo:

Odor = medido em pg de ácido butírico desenvolvido a 1 mg deproteína de enzima /1 corrigido para a amostra de controle

Clenzimadeteste = Odor enzima de teste " amOStra de COntrOle

Qenzima de referência = OdOT enzima de referência " amOStrâ de ControleR = Qenzima de teste / Qenzima de referência

Considera-se que a variante exibe odor reduzido, em compara-ção à referência, se o fator R for menor que 1.

Exemplo 4: atividade (LU) em relação a absorbância á 280 nm

A atividade de uma Iipase em relação à absorbância a 280 nm édeterminada por meio do ensaio LU/A280. apresentado a seguir:

Um substrato para a Iipase é preparado mediante a emulsifica-ção de tributirina (tributirato de glicerina), usando-se goma arábica comoemulsificante. A hidrólise de tributirina a 30°C e a um pH de 7 ou 9 é seguidaem um experimento de titulação pH-stat. Uma unidade de atividade de Iipase(1 LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 micro mol de ácidobutírico/min sob pH 7.

A absorbância da Iipase a purificada 280 nm é medida (A280), ea razão LU/A280 é calculada. A LU/A280 relativa é calculada como aLU/A280 da variante dividida pela LU/A280 de uma enzima de referência. Nocontexto da presente invenção, a enzima de referência é a parte madura daSEQ ID NO 2, com as mutações T231R e N233R.

Exemplo 5: RB - relação risco/benefício

O fator risco/benefício descrevendo o desempenho em compa-ração ao risco reduzido para ocorrência de odores é, portanto, definido co-mo: RB = DRmédio / R-

Considera-se que a variante exibe desempenho de lavagem oti-mizado e odor reduzido, se o fator RB for mais alto que 1.

Mediante a aplicação dos métodos acima descritos, são obtidosos seguintes resultados:Tabela 4

<table>table see original document page 60</column></row><table>

A Iipase de referência e as variantes 7 e 8 na Tabela 4 são des-critas em WO 2000/060063.

Exemplo 6

RB - Relação risco/benefício

A relação risco/benefício foi medida para as variantes relaciona-das na Tabela 5. O fator risco/benefício foi medido da mesma forma descritano Exemplo 5, e descobriu-se que o mesmo estava acima de 1 para todasas variantes relacionadas.<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>

A Iipase de referência é descrita em WO 2000/060063.

Exemplos de Detergente

As identificações abreviadas de componentes para os exemplossão conforme exposto a seguir:

LAS Sulfonato sódico de alquil benzeno Cn-13 linear.

CxyAS Alquil sulfato de sódio C1x - C1y.

CxyEzS Alquil sulfato de sódio C1x -C1y, condensado com uma mé-dia de z moles de óxido de etileno.

CxyEy Álcool C1x - C1y com uma média de etoxilação de z

QAS R2.-N+(CH3)2(C2H4OH) with R2 = C10-C12

Silicato Silicato de sódio amorfo (razão Si02:Na20 de 1,6 a 3,2:1)

Zeólito A Aluminossilicato de sódio hidratado, de fórmulaNa12(AIO2SiO2)12. 27H20 tendo um tamanho de partículaprincipal na faixa de 0,1 a 10 micrômetros (peso expressoem uma base anidra).

(Na-)SKS-6 Silicato cristalino lamelar, de fórmula õ-Na2Si205.

Citrato Citrato diidrato trisódico.

Cítrico Ácido cítrico anidro.

Carbonato Carbonato de sódio anidro.

Sulfato Sulfato de sódio anidro

MA/AA Copolímero aleatório de acrilato/maleato a 4:1, com pesomolecular médio de cerca de 70.000 a 80.000.

Polímero AA Polímero de poliacrilato de sódio, com peso molecular mé-dio de 4.500.

PB1 / PB4 Monoidrato/tetraidrato perborato de sódio anidro.

PC3 Percarbonato de sódio anidro [2,74 Na2C03.3H202 ]

TAED Tetra acetil etileno diamina

NOBS Oxibenzeno sulfonato de nonanoíla, sob a forma do salsódico.

DTPA Ácido dietileno triamina pentaacético.

HEDP Difosfonato de hidroxietano

EDDS Sal de Na de ácido etilenodiamino-N,N'-dissuccínico, isô-mero (S,S)<table>table see original document page 65</column></row><table>

Exemplo A

Composições detergentes alvejantes sob a forma de detergentesgranulados para lavagem de roupas são exemplificados pelas formulaçõesexpostas a seguir.

<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table>

Qualquer das composições no Exemplo A é usada para lavartecidos a uma concentração de 600 a 10.000 ppm em água, com as condi-ções típicas médias de 2.500 ppm, 25°C e uma razão água:pano de 25:1. OpH típico é de cerca de 10, mas pode ser ajustado alterando-se a proporçãode ácido para a forma de sal sódico do sulfonato de alquil benzeno.

Exemplo B

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>

Qualquer das composições acima, no Exemplo B1 é usada paralavagem de tecidos a uma concentração de 10.000 ppm em água, a umatemperatura de 20 a 90°C e a uma razão água:tecido de 5:1. O pH típico éde cerca de 10, mas pode ser ajustado alterando-se a proporção de ácidopara a forma de sal sódico do sulfonato de alquil benzeno.Exemplo C

<table>table see original document page 68</column></row><table>

* Números dados em mg de enzima/100 g

1 conforme descrito em US 4.597.898.

2 disponível sob o nome comercial LUTENSIT® junto à BASF1 e conformeaqueles descritos em WO 01/05874

Todos os documentos citados na Descrição Detalhada da Inven-ção são, em sua parte relevante, aqui incorporadas por referência, e a cita-ção de qualquer documento não deve ser interpretada como admissão deque este represente técnica anterior com respeito à presente invenção. Sequalquer significado ou definição de um termo presente neste documentoentrar em conflito com algum significado ou definição do mesmo termo emum documento incorporado a título de referência, terá precedência o signifi-cado ou a definição desse termo neste documento.

Embora modalidades particulares da presente invenção tenhamsido ilustradas e descritas, deve ficar evidente aos versados na técnica quevárias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desviedo espírito e escopo da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindi-cações anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram noescopo da presente invenção.LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> The Procter & Gamble Company

<120> Composições detergente

<130> CM3050ML

<160> 4

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1<211> 873

<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (873)

<220>

<221> sig_peptídeo

<222> (1) . . (51)

<220>

<221> propep

<222> (52).. (66)

<220>

<221> mat_peptídeo

<222> (67).. ()

<400> 1

atg agg age tcc ctt gtg ctg ttc ttt gtc tet gcg tgg acg gcc ttgMet Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

-20 -15 -10

gcc agt cct att cgt cga gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttcAla Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe

-5 -1 15 10

aat ctc ttt gea cag tat tet gea gcc gea tac tgc gga aaa aac aatAsn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25gat gcc cca gct ggt aca aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc 192

Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

30 35 40

gag gta gag aag gcg gat gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct

Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

45 50 55

gga gtg ggc gat gtc acc ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa

Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

60 65 70

ttg ate gtc ctc tct ttc cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg ate 336

Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile

75 80 85 90

ggg aat ctt aac ttc gac ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc

Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

9.5 . 100 105

tgc agg gga cat gac ggc ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat

Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

110 115 120

acg tta agg cag aag gtg gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat

Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

125 130 135

cgc gtg gtg ttt acc gga cat age ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140 145 150

gcc gga gca gac ctg cgt gga aat ggg tat gat ate gac gtg ttt tca 576

Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser

155 160 165 170

tat ggc gcc ccc cga gtc gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

175 180 185

gta cag acc ggc gga aca ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att

Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile<table>table see original document page 72</column></row><table>Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90

Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

95 100 105

Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

110 115 120

Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

125 130 135

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

140 145 150

Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

175 180 185

Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

190 195 200

Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

205 210 215

Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp

220 225 230

Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240 245 250

Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly255 260 265

Thr Cys Leu<210> 3

<211> 12<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência usada para exemplo de alinhamento

<400> 3Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência usada para exemplo de alinhamento

<400> 4

His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser1 5 10

Claims

1. Composição detergente, compreendendo um ingrediente de-tergente e um polipeptídeo com atividade de lipase, tendo ainda um desem-penho relativo médio de pelo menos 0,8 e uma relação risco/benefício depelo menos 1,1 sob as condições de teste apresentadas no relatório descritivo.

2. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque o polipeptídeo tem um LU/A280 relativo menor que 1,00 sob as condi-ções de teste apresentadas no relatório descritivo.

3. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque o polipeptídeo é um polipeptídeo bacteriano.

4. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque o polipeptídeo é um polipeptídeo fúngico.

5. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 4, emque o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermomyces.

6. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 5, emque o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermomyces lanuginosus.

7. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque o polipeptídeo é uma variante de uma lipase compreendida pelo polipep-tídeo de SEQ ID NO 2.

8. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque o polipeptídeo é uma variante de uma lipase compreendida pela partemadura do polipeptídeo de SEQ ID NO 2.

9. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1, emque o polipeptídeo é uma variante de uma lipase compreendendo o polipep-tídeo de SEQ ID NO 2.

10. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que o polipeptídeo é uma variante de uma lipase compreendendo a partemadura do polipeptídeo de SEQ ID NO 2.

11. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que o polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo que se hibridizasob condições de estringência pelo menos altas com nucleotídeos de 644 a-732 da SEQ ID NO 1, ou um filamento complementar do mesmo.

12. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que o ingrediente detergente é de 0,1 a 40%, de preferência de 0,1% a-12% de tensoativo aniônico.

13. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 12,em que o tensoativo aniônico é um sulfato de alquila alcoxilado.

14. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que o ingrediente detergente é de 5% a 30% builder à base de aluminos-silicato e/ou de fosfato.

15. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 1,em que o ingrediente detergente é uma fonte de peróxido e um ativador dealvejamento, preferencialmente tetraacetil etileno diamina.

16. Detergente, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditodetergente é uma composição detergente líquida ou uma composição deter-gente sólida.

17. Detergente, de acordo com a reivindicação 16, em que o ditodetergente é uma composição detergente granular.

18. Detergente, de acordo com a reivindicação 1, em que o ditodetergente é um comprimido sólido ou de um líquido encapsulado em umacomposição de dose unitária sob a forma de um filme solúvel.

19. Processo de lavagem, compreendendo a lavagem de artigostêxteis em uma solução aquosa compreendendo a composição detergentecomo definida na reivindicação 1.

20. Processo de lavagem, de acordo com a reivindicação 19, emque o processo compreende as etapas de:(a) opcionalmente, pré-tratar as sujeiras e as manchas com ascomposições da reivindicação 1, para formar uma superfície opcionalmentepré-tratada;(b) adicionar à água uma quantidade eficaz das composições dareivindicação 1, para formar a partir de uma solução aquosa para lavagemcompreendendo de cerca de 500 a cerca de 10.000 ppm da composição;(c) colocar a solução aquosa para lavagem em contato com asuperfície opcionalmente pré-tratada, e(d) opcionalmente, aplicar agitação à solução aquosa para lava-gem e à superfície opcionalmente pré-tratada.

21. Processo de lavagem, de acordo com a reivindicação 19, emque a solução aquosa está a uma temperatura inferior a 30°C.