BRPI0621509A2 - modulation of glutamine synthetase phosphoryl transferase activity - Google Patents

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BRPI0621509A2
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Lyndon Carey Oldfield
Der Westhuysen Christiaan Wynand Van
Amanda Louise Rousseau
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Abstract

MODULAçãO DA ATIVIDADE DE FOSFORIL TRANSFERASE DE GLUTAMINA SINTETASE. A presente invenção refere-se a métodos de triar e projetar compostos como inibidores de glutamina sintetase, que incluiem glutamina sintetase adenililada, são fornecidos aqui. Compostos e composições úteis para o tratamento, prevenção, e/ou melhora de infecções bacterianas, incluindo Mycobacterium tuberculosis, são também fornecidos.MODULATION OF PHOSPHORYL GLUTAMINE SYNTHETASE TRANSFERASE ACTIVITY. The present invention relates to methods of screening and designing compounds such as glutamine synthetase inhibitors, which include adenylated glutamine synthetase, are provided herein. Compounds and compositions useful for the treatment, prevention, and / or amelioration of bacterial infections, including Mycobacterium tuberculosis, are also provided.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA- ÇÃO DA ATIVIDADE DE FOSFORIL TRANSFERASE DE GLUTAMINA SINTET ASE".Report of the Invention Patent for "MODULATION OF THE ACTIVITY OF PHOSFORIL TRANSFERASE OF GLUTAMINE SINTET ASE".

Campo TécnicoTechnical Field

A presente invenção refere-se a materiais e métodos para modu- lar atividade de fosforil transferase enzimática, incluindo atividade de fosforil transferase mediada por meio de um intermediário de carboxifosfato. Por exemplo, materiais e métodos para modular atividade de glutamina sinteta- se, incluindo materiais e métodos para modular um sítio de fosforil transfera- se de glutamina sintetase adenililada, são fornecidos.The present invention relates to materials and methods for modulating enzymatic phosphoryl transferase activity, including phosphoryl transferase activity mediated via a carboxyphosphate intermediate. For example, materials and methods for modulating glutamine activity are synthesized, including materials and methods for modulating a phosphoryl site transfer from adenylylated glutamine synthetase are provided.

AntecedentesBackground

A enzima glutamina sintetase (GS, EC 6.3.1.2) é uma enzima central envolvida no metabolismo de nitrogênio e catalisa a conversão rever- sível de L-glutamato, ATP e amônia em L-glutamina, ADP1 e fosfato inorgâni- co. A reação é mediada por meio de um intermediário de fosfato de γ- glutamila. Três formas distintas de glutamina sintetase ocorrem: GSI1 GSII, e GSIII. A forma de GSI é encontrada apenas em bactérias (eubactérias) e archaea (archaebactérias). GSII ocorre em eucariotos e certas bactérias do solo, enquanto genes de GSIII foram encontrados apenas em algumas es- pécies bacterianas.Glutamine synthetase enzyme (GS, EC 6.3.1.2) is a central enzyme involved in nitrogen metabolism and catalyzes the reversible conversion of L-glutamate, ATP and ammonia to L-glutamine, ADP1 and inorganic phosphate. The reaction is mediated through a γ-glutamyl phosphate intermediate. Three distinct forms of glutamine synthetase occur: GSI1 GSII, and GSIII. The form of GSI is found only in bacteria (eubacteria) and archaea (archaebacteria). GSII occurs in eukaryotes and certain soil bacteria, while GSIII genes have been found only in some bacterial species.

Há duas subdivisões de GSI significativas: GSI-α e GSI-β. Os genes de GSI-a são encontrados em bactérias termofílicas, bactérias gram- positivas de G+C baixo, e Euryarchaeota (incluindo metanógenos, halófilos e alguns termófilos), enquanto os genes de GSI-β são encontrados em todas as outras bactérias. A enzima de GSI-β e regulada por meio de uma cascata de adenililação/desadenililação, e também contém uma seqüência de inser- ção de 25 aminoácidos que não ocorre na forma GSI-α. Bactérias tendo um gene de GSI-β incluem Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoea- e, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio eholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brucella melitensis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Acti- nomyees israelii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor. Bactérias que tem o gene de GSI-α incluem Bacillus eereus, Bacillus subtilis, Bacillus anthraeis, Streptoeoceus pneumoniae, Streptoeoceus pyogenes, Staphyloeoeeus aereus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani e Clostridi- um perfringens.There are two significant GSI subdivisions: GSI-α and GSI-β. GSI-a genes are found in thermophilic bacteria, low G + C gram-positive bacteria, and Euryarchaeota (including methanogens, halophiles, and some thermophiles), while GSI-β genes are found in all other bacteria. The GSI-β enzyme is regulated by an adenylation / deadenylation cascade, and also contains a 25 amino acid insertion sequence that does not occur in the GSI-α form. Bacteria having a GSI-β gene include Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoea- and Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio eholerae aerogenis, Helicoptera pigenus, Helicobes Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brucella melitensis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema palidum. eoelieolor. Bacteria having the GSI-α gene include Bacillus eereus, Bacillus subtilis, Bacillus anthraeis, Streptoeoceus pneumoniae, Streptoeoceus pyogenes, Staphyloeoeeus aereus, Clostridium tulani, Clostridium tetani and Clostridium perfringens.

Em E. coli e outras bactérias que têm o gene de GSI-β, a ativi- dade de GS é regulada através de adenililação de entre 1 e 12 subunidades de GS. O sítio de adenililação (equivalente a Tyr397 em E. eoli) parece ser altamente conservado em todas as bactérias procarióticas, enquanto a ex- tensão de adenililação é uma função da disponibilidade de fonte de energia de nitrogênio e carbono nos meios de cultura. Glutamina sintetase com 10 a 12 subunidades adenililadas ocorre em células crescidas na presença de um excesso de nitrogênio e limitação de carbono. A adenililação de GS também altera a especificidade da enzima para íon de metal divalente de Mg2+ para Mn2+.In E. coli and other bacteria that have the GSI-β gene, GS activity is regulated by adenylation of between 1 and 12 GS subunits. The adenylation site (equivalent to Tyr397 in E. eoli) appears to be highly conserved in all prokaryotic bacteria, whereas adenylation extent is a function of the availability of nitrogen and carbon energy sources in the culture media. Glutamine synthetase with 10 to 12 adenylylated subunits occurs in cells grown in the presence of excess nitrogen and carbon limitation. GS adenylylation also alters enzyme specificity for divalent metal ion from Mg2 + to Mn2 +.

Dada a devastação social e econômica das infecções bacteria- nas tanto no mundo desenvolvido como subdesenvolvido, e o avanço alar- mante em cepas de bactérias resistentes a antibióticos, seria útil ter novas classes de antibióticos para o tratamento, prevenção, e melhoria das infec- ções bacterianas.Given the social and economic devastation of bacterial infections in both the developed and underdeveloped world, and the breakthrough in antibiotic resistant bacterial strains, it would be useful to have new classes of antibiotics for the treatment, prevention, and amelioration of infections. bacterial reactions.

Sumáriosummary

A menos que do contrário especificamente indicado, todos os números de resíduos de aminoácidos de GS identificados aqui referem-se aos resíduos de GS de E. coli. Dada a homologia entre as seqüências bacte- rianas de polipeptídeo de GS, alguém versado na técnica poderia determinar os resíduos correspondentes de interesse de GS em outras espécies usando métodos tais como alinhamentos de homologia ou modelagem molecular.Unless otherwise specifically stated, all GS amino acid residue numbers identified herein refer to E. coli GS residues. Given the homology between the bacterial GS polypeptide sequences, one skilled in the art could determine the corresponding residues of interest of GS in other species using methods such as homology alignments or molecular modeling.

Esta descrição é com base na descoberta que a forma adenilila- da de GS emprega um mecanismo de reação único que envolve um comple- xo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP para transferência do grupo γ-fosfato de ATP para o γ-carboxilato de glutamato na formação de um intermediário de fosfa- to de γ-glutamila. Desse modo, informação com relação a este complexo, seu sítio de ligação em GS, e o mecanismo de transferência de fosforila de intermediário de carboxifosfato proposto associado pode ser usada para pro- jetar compostos alvejados para a enzima de GSI-β adenililada. Tais compos- tos podem ser usados para inibir atividade de GS adenililada e por conse- guinte tratar, impedir, ou melhorar infecções bacterianas. Como as enzimas de GSI-β bacterianas são reguladas por meio de uma cascata de adenilila- ção/desadenililação, mas as enzimas de GSII mamíferas não são, os com- postos podem ser usados para seletivamente inibir o crescimento de células bacterianas enquanto minimamente impactando de forma negativa as célu- las mamíferas. Métodos assistidos por computador para projetar compostos de inibidor de teste e métodos para triagem in vitro e in vivo da atividade de inibidor das moléculas de teste são desse modo fornecidos. Compostos e composições para inibir a atividade de GS, incluindo atividade de fosforil transferase de GS adenililada; para inibir ou impedir crescimento bacteriano in vitro e in vivo-, e para tratar, impedir, ou melhorar infecções bacterianas em mamíferos, são fornecidos aqui.This description is based on the discovery that the adenylyl form of GS employs a unique reaction mechanism involving a complex of (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2ATP for transfer of the γ-phosphate group from ATP to γ Glutamate-carboxylate in the formation of a γ-glutamyl phosphate intermediate Thus, information regarding this complex, its binding site in GS, and the proposed proposed carboxyphosphate intermediate phosphoryl transfer mechanism can be used to design compounds targeted to the adenylylated GSI-β enzyme such compounds can be used to inhibit adenylylated GS activity and thereby treat, prevent, or ameliorate bacterial infections. Bacterial bacteria are regulated by means of an adenylation / deadenylation cascade, but mammalian GSII enzymes are not, compounds can be used to selectively inhibit bacterial cell growth while minimally negatively impacting mammalian cells. Computer-assisted methods for designing test inhibitor compounds and methods for in vitro and in vivo screening of inhibitor activity of test molecules are thus provided. Compounds and compositions for inhibiting GS activity, including adenylylated GS phosphoryl transferase activity; to inhibit or prevent bacterial growth in vitro and in vivo; and to treat, prevent, or ameliorate bacterial infections in mammals, are provided herein.

Conseqüentemente, em uma modalidade, fornecido aqui é um método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase (GS) adenililada, o método usando um computador programado compreen- dendo um processador e um dispositivo de entrada onde o método inclui:Accordingly, in one embodiment, provided herein is a computer-assisted method of generating a test inhibitor of phosphoryl transferase site activity of an adenylylated glutamine synthetase (GS) polypeptide, the method using a programmed computer comprising a processor and an input device where the method includes:

(a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS;(a) introducing into the input device data comprising a structure of a phosphoryl transferase site of a GS polypeptide;

(b) ancorar no sítio de fosforil transferase uma molécula de inibi- dor de teste usando o processador; e(b) anchoring at the phosphoryl site transfer a test inhibitor molecule using the processor; and

(c) determinar, com base na atracagem, se a molécula de inibi- dor de teste inibiria a atividade do sítio de fosforil transferase, por exemplo, inibindo a formação do intermediário de carboxifosfato. O método pode tam- bém incluir atracar no sítio de fosforil transferase um ou mais motivos estru- turais de um complexo de (Μη2+)3·(ΗC03")12'ΑΤΡ. O método pode incluir de- terminar, com base na atracagem, se a molécula de inibidor de teste inibiria a ligação do um ou mais motivos estruturais do complexo de (Mn2+)3-(HC03- )12. ATP no sítio de fosforil transferase, ou inibiria a formação do intermediário de carboxifosfato.(c) determining, based on mooring, whether the test inhibitor molecule would inhibit phosphoryl transferase site activity, for example by inhibiting the formation of the carboxyphosphate intermediate. The method may also include mooring at the phosphoryl site one or more structural motifs of a (Μη2 +) 3 · (ΗC03 ") 12'ΑΤΡ complex. The method may include determining, based on mooring, whether the test inhibitor molecule would inhibit the binding of one or more (Mn2 +) 3- (HC03-) 12. ATP complex structural motifs at the phosphoryl transferase site, or would inhibit the formation of the carboxyphosphate intermediate.

Em algumas modalidades, um método pode incluir compreende projetar um inibidor de teste determinado pela etapa (c) para inibir a ativida- de do sítio de fosforil transferase e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada in vitro. A avali- ação in vitro pode compreender uso de um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP, utilização de glutamato, ou formação de glutami- na.In some embodiments, a method may include comprising designing a test inhibitor determined by step (c) to inhibit phosphoryl transferase site activity and assessing the inhibitory activity of the test inhibitor on an in vitro adenylylated glutamine synthetase polypeptide. The in vitro evaluation may comprise use of an assay capable of measuring ATP hydrolysis, ADP formation, glutamate utilization, or glutamine formation.

Um método pode também incluir, em algumas modalidades, ava- liar a atividade inibidora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutami- na sintetase desadenililada in vitro para avaliar a atividade inibidora específi- ca do inibidor de teste para o polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada, e/ou produzir o inibidor de teste e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma bactéria compreendendo um Gene de glutami- na sintetase de GSI-β, por exemplo, uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Eseheri- chia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Haemo- philus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronchiseptia, Neisseria me- ningitides, Brucella melitensis, Mycobaeterium tubereulosis, Mycobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Actinomyees israelii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Ana- baena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees coelicolor.A method may also include, in some embodiments, assessing the inhibitory activity of the test inhibitor on an in vitro desadenylated glutamine synthetase polypeptide to assess the specific inhibitory activity of the test inhibitor for the adenylated glutamine synthetase polypeptide , and / or producing the test inhibitor and evaluating the inhibitory activity of the test inhibitor on the growth of a bacterium comprising a GSI-β glutamine synthase Gene, for example, a bacterium selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Eseheria coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae. meningitides, Brucella melitensis, Mycobaeterium tubereulosis, Mycobaeterium leprae, Tr epidome palidum, Leptospira interrogans, Actinomyees israelii, Noeardia steroids, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabena sp., Fremyella diplosiphon, and Streptomyees coelicolor.

Em algumas modalidades, o método inclui avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula mamífera.In some embodiments, the method includes evaluating the inhibitory activity of the test inhibitor on the growth of a eukaryotic cell, for example a mammalian cell.

Em outro aspecto, um método de gerar um composto que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sin- tetase adenililada é fornecido, onde o método inclui as etapas de:In another aspect, a method of generating a compound that inhibits the phosphoryl transferase site activity of an adenylylated glutamine synthetase polypeptide is provided, where the method includes the steps of:

(a) fornecer uma estrutura tridimensional de um polipeptídeo de glutamina sintetase; e(a) providing a three dimensional structure of a glutamine synthetase polypeptide; and

(b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de inibir a interação entre o sítio de fosforil transferase e um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3-(HC03")i2'ATP ou de inibir formação do intermediário de carboxifosfato. A estrutura tridimensional do polipeptídeo de glutamina sintetase pode incluir um ou mais motivos es- truturais de um complexo de (Mn2+)3 (HCCV)I2-ATP ligado no sítio de fosforil transferase.(b) design, based on the three-dimensional structure, a test compound capable of inhibiting the interaction between the phosphoryl transferase site and one or more structural motifs of a (Mn2 +) 3- (HC03 ") i2'ATP or inhibit formation of carboxyphosphate intermediate The three-dimensional structure of the glutamine synthetase polypeptide may include one or more structural motifs of a (Mn2 +) 3 (HCCV) I2-ATP complex bound at the phosphoryl transferase site.

Em outra modalidade, um método de gerar um composto de tes- te que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada é fornecido, que inclui:In another embodiment, a method of generating a test compound that inhibits phosphoryl transferase site activity of an adenylylated glutamine synthetase polypeptide is provided, which includes:

(a) fornecer uma estrutura tridimensional de um complexo de (Mn2+)3-(HC03-)i2-ATP; e(a) providing a three-dimensional structure of a (Mn2 +) 3- (HC03-) i2-ATP complex; and

(b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste tendo um ou motivos similares em estrutura ao complexo de (Mn2+)3-(HC03")i2-ATP.(b) designing, based on the three-dimensional structure, a test compound having one or similar motifs in structure to the (Mn2 +) 3- (HC03 ") i2-ATP complex.

Em ainda outro aspecto, um método de triar um composto de teste in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada é forneci- do que inclui:In yet another aspect, a method of screening an in vitro test compound to determine whether or not to inhibit phosphoryl transferase site activity of an adenylylated glutamine synthetase polypeptide is provided which includes:

(a) contatar um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada com um composto de teste sob condições eficazes para a atividade de fosfo- ril transferase e/ou formação de intermediário de carboxifosfato; e(a) contacting an adenylylated glutamine synthetase polypeptide with a test compound under conditions effective for phosphoryl transferase activity and / or carboxyphosphate intermediate formation; and

(b) determinar se ou não a atividade de fosforil transferase do polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada que não foi contatado com o composto de teste. O método pode também incluir determi- nar se ou não a atividade de fosforil transferase de um polipeptídeo de glu- tamina sintetase desadenililada é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase desadenililada que não foi contatado com o composto de teste.(b) determining whether or not the adenylylated glutamine synthetase polypeptide phosphoryl transferase activity is reduced with respect to the activity of an adenylylated glutamine synthetase polypeptide that has not been contacted with the test compound. The method may also include determining whether or not the phosphoryl transferase activity of a desadenylated glutamine synthetase polypeptide is reduced with respect to the activity of a desadenylated glutamine synthetase polypeptide that has not been contacted with the test compound.

Também fornecido é um método in vitro para inibir a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada, compreen- dendo contatar um polipeptídeo de GS adenililada com uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl OU Vll como descrito aqui.Also provided is an in vitro method for inhibiting the phosphoryl transferase site activity of an adenylylated GS polypeptide, comprising contacting an adenylylated GS polypeptide with a composition comprising a compound according to formula I, II, III, IV , V, V1 or V11 as described herein.

Um método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria que compreende um gene de GSI-β é também fornecido, onde o método com- preende contatar a bactéria com uma composição compreendendo um com- posto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl ou Vll como descrito aqui.An in vitro method for inhibiting growth of a bacterium comprising a GSI-β gene is also provided, wherein the method comprises contacting the bacterium with a composition comprising a compound according to formula I, II, III, IV, V, V1 or V11 as described herein.

Em outro aspecto, um método para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sintomas ou distúrbios associados a uma infecção bacteriana em um mamífero, ou em um mamífero em risco de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria que compreende um gene de GSI-β, é fornecido. O método pode incluir administrar ao mamífero uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl OU Vll como descrito aqui.In another aspect, a method for treating, preventing, or ameliorating one or more symptoms or disorders associated with a bacterial infection in a mammal, or in a mammal at risk of a bacterial infection, wherein the bacterial infection is from a bacterium comprising a GSI-β gene is provided. The method may include administering to the mammal a composition comprising a compound according to formula I, II, III, IV, V, V1 or V11 as described herein.

Também fornecido é um método in vivo para inibir a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase adeni- lilada, o método compreendendo:Also provided is an in vivo method for inhibiting the phosphoryl transferase site activity of an adenylated glutamine synthetase polypeptide, the method comprising:

(a) administrar uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, VI, OU Vll como descrito aqui a um mamífero que sofre de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteri- ana é de uma bactéria que compreende um gene de GSI-β.(a) administering a composition comprising a compound according to formula I, II, III, IV, V, VI, or V11 as described herein to a mammal suffering from a bacterial infection, wherein the bacterial infection is of a bacterium comprising a GSI-β gene.

Compostos, tais como compostos de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, VI, OU Vll são também fornecidos aqui, como seus sais farmaceu- ticamente aceitáveis e derivados, e composições farmacêuticas incluindo os mesmos. Uso dos compostos ou composições farmacêuticas para o trata- mento, prevenção, ou melhora de uma infecção bacteriana em um mamífero é também fornecido. Compostos particulares, por exemplo, tendo números de compostos de identificação particulares, são também fornecidos para uso nos mesmos métodos.Compounds, such as compounds according to formula I, II, III, IV, V, VI, or V11 are also provided herein as pharmaceutically acceptable salts and derivatives thereof, and pharmaceutical compositions including them. Use of the pharmaceutical compounds or compositions for treating, preventing, or ameliorating a bacterial infection in a mammal is also provided. Particular compounds, for example having numbers of particular identifying compounds, are also provided for use in the same methods.

A menos que do contrário definido, todos termos técnicos e cien- tíficos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém de habilidade usual na técnica ao qual esta invenção diz respeito. No caso de conflito, o documento presente, incluindo definições, comandará. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e ma- teriais similares ou equivalentes aqueles descritos aqui possam também ser usados na prática ou testagem da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Os materiais, métodos, e e- xemplos revelados aqui são ilustrativos apenas e não intencionados ser Iimi- tativos.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention pertains. In case of conflict, the present document, including definitions, will command. Preferred methods and materials are described below, although methods and materials similar or equivalent to those described herein may also be used in the practice or testing of the present invention. All publications, patent applications, patents, and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. The materials, methods, and examples disclosed herein are illustrative only and not intended to be limiting.

Outras características e vantagens da invenção, por exemplo, atividade inibidora de GS adenililada e desse modo métodos para tratamento de infecções bacterianas, serão evidentes da descrição a seguir, dos dese- nhos e das reivindicações.Other features and advantages of the invention, for example, adenylylated GS inhibitory activity and thus methods for treating bacterial infections, will be apparent from the following description, drawings and claims.

Descrição de DesenhosDescription of Drawings

Figura 1 expõem o mecanismo catalítico proposto no sítio de fosforil transferase de GS adenililada. As letras minúsculas referem-se às etapas propostas a seguir:Figure 1 show the proposed catalytic mechanism at the adenylylated GS phosphoryl transferase site. Lower case letters refer to the following proposed steps:

a. Seqüestro de dióxido de carbono;The. Carbon dioxide sequestration;

b. Transposição de carga;B. Cargo transposition;

c. Transferência de próton intramolecular;ç. Intramolecular proton transfer;

d. Modelação de metal;d. Metal shaping;

e. Formação de fosfato de carbamoíla;and. Carbamoyl phosphate formation;

f. Transferência de fosforila; ef. Phosphoryl transfer; and

g. Colapso Descrição Detalhadag. Collapse Detailed Description

Entre outras coisas, foi descoberto que um novo mecanismo de reação de transferência de ATP-fosforila de glutamina sintetase ocorre na forma adenililada da enzima de GS na presença de Mn2+, quando compara- da à forma desadenililada da enzima na presença de Mg2+. Este mecanismo de reação parece ter um requerimento pela presença de carbonato e Mn2+, com o funcionamento de ATP na forma de um complexo de (Mn2+)3.(HC03 )i2ATP. Como mostrado mais abaixo, a reação putativa inclui a carboxilação de N7 de ATP, formando uma espécie de imônio que permite a desprotona- ção do próton de Ce por meio de um HCO3" associado, com a formação con- comitante de um carbeno de Mn2+ e o ataque subseqüente do γ-fosfato pelo carboxilato de N7, formando um intermediário de carboxifosfato que depois facilita a transferência de fosforila para glutamato por meio de certas cadeias laterais de GS de aminoácidos fundamentais (a saber, His269 e His271). Vide figura 1.Among other things, it has been found that a new mechanism for transferring glutamine synthetase ATP-phosphorylase transfer occurs in the adenylylated form of the GS enzyme in the presence of Mn2 + when compared to the desadenylated form of the enzyme in the presence of Mg2 +. This reaction mechanism seems to be required by the presence of carbonate and Mn2 +, with ATP functioning as a (Mn2 +) 3 (HC03) i2ATP complex. As shown below, the putative reaction includes the carboxylation of ATP N7, forming a species of imonium that allows the deprotonation of the Ce proton by an associated HCO3 ", with the concomitant formation of a Mn2 + carbene. and the subsequent attack of the γ-phosphate by N7 carboxylate, forming a carboxyphosphate intermediate which then facilitates the transfer of phosphoryl to glutamate via certain fundamental amino acid GS side chains (namely His269 and His271). .

Desse modo, é proposto aqui que inibidores de GS adenililada específicos podem ser projetados com base na estrutura dos componentes complexos ou estruturais de (Mn2+)3.(HC03')i2.ATP desta estrutura e em uma análise de seus sítios de ligação em GS adenililada, e que estes inibi- dores ligariam a enzima no sítio de ligação de (Mn2+)3.(HC03")i2.ATP para inibir a enzima bacteriana; ou inibiria a ligação do (Mn2+)3.(HC03")i2-ATP no sítio de ligação; ou inibiria a formação do intermediário de carboxifosfato.Thus, it is proposed herein that specific adenylylated GS inhibitors may be designed based on the structure of the (Mn2 +) 3 (HC03 ') i2.ATP complex or structural components of this structure and an analysis of their GS binding sites. such inhibitors would bind the enzyme at the (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2.ATP binding site to inhibit the bacterial enzyme; or would inhibit (Mn2 +) 3. (HC03") i2-binding. ATP at the binding site; or would inhibit the formation of the carboxyphosphate intermediate.

DefiniçõesDefinitions

Os termos "polipeptídeo de GS" e "polipeptídeo de glutamina sintetase" são usados alternadamente aqui, e a menos que do contrário indi- cado, referem-se a um polipeptídeo de GSI bacteriana, por exemplo, de uma bactéria de GSI-α ou GSI-β. A menos que do contrário indicado, o termo a- brange o polipeptídeo de comprimento total e fragmentos do mesmo. Além disso, como será reconhecido por aqueles tendo habilidade na técnica, GS funciona como um dodecâmero in vivo e sítios ativos de GS podem ser compostos de aminoácidos mais de um monômero. Conseqüentemente, o termo também abrange multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâ- meros, pentâmeros, hexâmeros, heptâmeros, octâmeros, nonâmeros, de- câmeros, undecâmeros, e dodecâmeros) de GS de comprimento total, mul- tímeros de fragmentos de GS, um ou mais resíduos que fazem parte de um ou mais dos sítios ativos de GS (por exemplo, uma coletânea de resíduos que podem não ser contíguos na seqüência primária de GS, mas compõem pelo menos uma parte de um sítio ativo de GS), e multímeros de tais coletâ- neas.The terms "GS polypeptide" and "glutamine synthetase polypeptide" are used interchangeably herein, and unless otherwise indicated, refer to a bacterial GSI polypeptide, for example from a GSI-α bacterium or GSI-β. Unless otherwise indicated, the term encompasses the full length polypeptide and fragments thereof. In addition, as will be appreciated by those having skill in the art, GS functions as an in vivo dodecamer and active GS sites may be composed of amino acids more than one monomer. Accordingly, the term also encompasses full-length GS (e.g., dimers, trimers, tetramers, pentamers, hexamers, heptamers, octamers, non-dimers, dimers, undecamers, and dodecamers). GS, one or more residues that are part of one or more of the GS active sites (for example, a collection of residues that may not be contiguous in the primary GS sequence but make up at least a part of a GS active site) , and multimers from such collections.

"Polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente e signifi- cam qualquer cadeia de aminoácidos ligada a peptídeo, independente do comprimento ou modificação pós-translacional."Polypeptide" and "protein" are used interchangeably and mean any peptide-linked amino acid chain, regardless of length or post-translational modification.

O termo "isolado" pode referir-se a um polipeptídeo que ou não tem nenhuma contraparte de ocorrência natural ou foi separado ou purifica- do dos componentes que podem naturalmente acompanhá-lo, por exemplo, em tecidos tais como pâncreas, fígado, baço, ovário, testículos, músculo, tecido da junta, tecido neural, tecido gastrointestinal ou tecido tumoral (por exemplo, tecido de câncer de mama ou câncer de cólon); ou fluidos do corpo tais como sangue, soro, ou urina, ou culturas bacterianas ou fúngicas. Tipi- camente, um polipeptídeo é considerado "isolado" quando for pelo menos 70 %, em peso seco, livre das proteínas e outras moléculas orgânicas de ocor- rência natural com as quais se associa naturalmente.The term "isolated" may refer to a polypeptide that either has no naturally occurring counterpart or has been separated or purified from components that may naturally accompany it, for example, in tissues such as the pancreas, liver, spleen, ovaries, testicles, muscle, joint tissue, neural tissue, gastrointestinal tissue or tumor tissue (for example, breast cancer or colon cancer tissue); or body fluids such as blood, serum, or urine, or bacterial or fungal cultures. Typically, a polypeptide is considered "isolated" when it is at least 70% by dry weight free of proteins and other naturally occurring organic molecules with which it is naturally associated.

Preferivelmente, uma preparação de um polipeptídeo é pelo me- nos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, e o mais preferivelmente pelo menos 99 %, em peso seco, do polipeptídeo. Uma vez que um polipep- tídeo que é sintetizado quimicamente é, por sua natureza, separado dos componentes que naturalmente o acompanham, ele é um polipeptídeo sinté- tico "isolado".Preferably, a preparation of a polypeptide is at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 99% by dry weight of the polypeptide. Since a chemically synthesized polypeptide is, by its nature, separate from the components that naturally accompany it, it is an "isolated" synthetic polypeptide.

Um polipeptídeo isolado pode ser obtido, por exemplo, por ex- tração de uma fonte natural (por exemplo, de tecidos); por expressão de um ácido nucléico recombinante que codifica o polipeptídeo; ou através de sín- tese química. Um polipeptídeo que é produzido em um sistema celular dife- rente da fonte da qual naturalmente se origina é "isolado", porque estará ne- cessariamente livre dos componentes que naturalmente o acompanham. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método apro- priado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de polia- crilamida, ou análise de HPLC.An isolated polypeptide may be obtained, for example, by extraction from a natural source (e.g., from tissues); by expressing a recombinant nucleic acid encoding the polypeptide; or by chemical synthesis. A polypeptide that is produced in a cellular system other than the source from which it naturally originates is "isolated" because it will necessarily be free of the components that naturally accompany it. The degree of isolation or purity may be measured by any suitable method, for example column chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis.

Antes de testar, qualquer polipeptídeo pode sofrer modificação, por exemplo, adenililação, fosforilação ou glicosilação, por métodos conheci- dos na técnica e como descritos aqui.Prior to testing, any polypeptide may be modified, for example, adenylylation, phosphorylation or glycosylation, by methods known in the art and as described herein.

Como aqui usado, "derivados farmaceuticamente aceitáveis" de um composto incluem sais, ésteres, éteres de enol, ésteres de enol, acetais, cetais, ortoésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidra- tos ou pró-fármacos dos mesmos. Tais derivados podem ser facilmente pre- parados por aqueles versados na técnica usando métodos conhecidos para tal derivatização. Os compostos produzidos podem ser administrados em animais ou humanos sem efeitos tóxicos substanciais e ou são farmaceuti- camente ativos ou são pró-fármacos.As used herein, "pharmaceutically acceptable derivatives" of a compound include salts, esters, enol ethers, enol esters, acetals, ketals, orthoesters, hemiacetals, hemicetals, acids, bases, solvates, hydrates or prodrugs thereof. . Such derivatives can be readily prepared by those skilled in the art using known methods for such derivatization. The compounds produced may be administered to animals or humans without substantial toxic effects and are either pharmaceutically active or are prodrugs.

Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limita- dos a, sais de amina, tais como mas não limitados a N,N'- dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, amônia, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodiamina, N-metilglucamina, procaína, N- benzilfenetilamina, 1 -para-clorobenzil-2-pirrolidin-1 '-ilmetil-benzimidazol, die- tilamina e outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroximetil)aminometano; sais de metal alcalino, tais como mas não limitados a lítio, potássio e sódio; sais de metal alcalino terroso, tais como mas não limitados a bário, cálcio e magnésio; sais de metal de transição, tais como mas não limitados a zinco; e outros sais de metal, tais como mas não limitados a fosfato de hidrogênio de sódio e fosfato de dissódio; e também incluindo, mas não limitados a, nitrato, borato, metanossulfonatos, benzenossulfonatos, toluenossulfonatos, sais de ácidos minerais, tais como mas não limitados a cloridratos, bromidratos, hi- droiodetos e sulfatos; e sais de ácidos orgânicos, tais como mas não limita- dos a acetatos, trifluoroacetatos, maleatos, oxalatos, lactatos, malatos, tarta- ratos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos, succinatos, butiratos, vale- ratos e fumaratos. Ésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, ésteres de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, a- ralquila, heteroaralquila, cicloalquila e heterociclila de grupos acídicos, inclu- indo, mas não limitados a, ácidos carboxílicos, ácidos fosfóricos, ácidos fos- fínicos, ácidos sulfônicos, ácidos sulfínicos e ácidos borônicos. Éteres de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, deri- vados da fórmula C=C(OR) onde R é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, cicloalquila ou heterociclila. Este- res de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, derivados da fórmula C=C(OC(O)R) onde R é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, cicloalquila ou heteroci- clila. Solvatos e hidratos farmaceuticamente aceitáveis são complexos de um composto com uma ou mais moléculas de solvente ou de água, ou 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 10, ou uma a cerca de 2, 3 ou 4, moléculas de solvente ou de água.Pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, amine salts, such as but not limited to N, N'-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, choline, ammonia, diethanolamine and other hydroxyalkylamines, ethylenediamine, N-methylglucamine, procaine, N benzylphenethylamine, 1-para-chlorobenzyl-2-pyrrolidin-1'-methylmethylbenzimidazole, diethylamine and other alkylamines, piperazine and tris (hydroxymethyl) aminomethane; alkali metal salts, such as but not limited to lithium, potassium and sodium; alkaline earth metal salts, such as but not limited to barium, calcium and magnesium; transition metal salts, such as but not limited to zinc; and other metal salts, such as but not limited to sodium hydrogen phosphate and disodium phosphate; and also including, but not limited to, nitrate, borate, methanesulfonates, benzenesulfonates, toluenesulfonates, salts of mineral acids, such as but not limited to hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides and sulfates; and salts of organic acids, such as but not limited to acetates, trifluoroacetates, maleates, oxalates, lactates, malates, tartarates, citrates, benzoates, salicylates, ascorbates, succinates, butyrates, rattrates and fumarates. Pharmaceutically acceptable esters include, but are not limited to, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, heteroaralkyl, cycloalkyl and heterocyclyl esters of acidic groups, including but not limited to carboxylic acids, phosphoric acids , phosphinic acids, sulfonic acids, sulfinic acids and boronic acids. Pharmaceutically acceptable enol ethers include, but are not limited to, derivatives of the formula C = C (OR) where R is hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, heteroaralkyl, cycloalkyl or heterocyclyl. Pharmaceutically acceptable enol esters include, but are not limited to, derivatives of the formula C = C (OC (O) R) where R is hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, heteroaralkyl, cycloalkyl or heterocyclyl. - click. Pharmaceutically acceptable solvates and hydrates are complexes of a compound with one or more solvent or water molecules, or 1 to about 100, or 1 to about 10, or one to about 2, 3 or 4, solvent molecules or of water.

Como aqui usado, tratamento significa qualquer maneira em que um ou mais dos sintomas de uma infecção bacteriana, por exemplo, infecção de Mycobacterium tuberculosis, é melhorada ou do contrário vantajosamente alterada. Tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico das com- posições aqui, tais como usos para tratar doenças, distúrbios, ou doenças em que uma infecção bacteriana é suspeita ou está implicada, por exemplo, em um mamífero tal como um humano.As used herein, treatment means any manner in which one or more of the symptoms of a bacterial infection, for example Mycobacterium tuberculosis infection, is ameliorated or otherwise advantageously altered. Treatment also encompasses any pharmaceutical use of the compositions herein, such as uses to treat diseases, disorders, or diseases in which a bacterial infection is suspected or implicated, for example, in a mammal such as a human.

Como aqui usado, melhora dos sintomas de um distúrbio particu- lar por administração de um composto particular ou composição farmacêuti- ca refere-se a qualquer diminuição, quer permanente quer temporária, dura- doura ou passageira que pode ser atribuída ou associada à administração da composição.As used herein, amelioration of the symptoms of a particular disorder by administration of a particular compound or pharmaceutical composition refers to any decrease, whether permanent, temporary, lasting or transient that may be attributed to or associated with administration of the drug. composition.

Como aqui usado, IC50 refere-se a uma quantidade, concentra- ção ou dosagem de um composto de teste particular que alcança uma inibi- ção de 50 % de uma resposta máxima em um ensaio medindo tal resposta.As used herein, IC 50 refers to an amount, concentration or dosage of a particular test compound that achieves a 50% inhibition of a maximum response in an assay measuring such a response.

Como aqui usado, o termo Ki representa a constante de dissoci- ação de um complexo de enzima/inibidor. É teoricamente independente do substrato contra o qual o inibidor é testado. K, pode ser calculada de um IC50 usando a equação: Ki=IC5o*Km/(S+Km), onde S é a concentração do substra- to, e Km é a concentração do substrato (na ausência de inibidor) na qual a velocidade da reação é meia-máxima. A K, de um inibidor para inibição de um substrato particular (Km fixa) é constante. Como aqui usado, EC50 refere- se a uma concentração de fármaco que produz 50 % de inibição, e CC50 re- fere-se a uma concentração de fármaco que produz 50 % de toxicidade. Como aqui usado, um pró-fármaco é um composto que, sob ad- ministração in vivo, é metabolizado por uma ou mais etapas ou processos ou do contrário convertido biológica, farmacêutica ou terapeuticamente na for- ma ativa do composto. Para produzir um pró-fármaco, o composto farmaceu- ticamente ativo é modificado de modo que o composto ativo será regenerado através de processos metabólicos. O pró-fármaco pode ser projetado para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um fármaco, para mascarar os efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um fármaco ou alterar outras características ou propriedades de um fármaco. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e metabolismo de fármaco in vivo, aqueles de habilidade nesta técnica, uma vez um composto farmaceuticamente ativo é conhecido, podem projetar pró- fármacos do composto (vide, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Che- mistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova Iorque, pági- nas 388-392).As used herein, the term Ki represents the dissociation constant of an enzyme / inhibitor complex. It is theoretically independent of the substrate against which the inhibitor is tested. K can be calculated from an IC50 using the equation: Ki = IC50 * Km / (S + Km), where S is the substrate concentration, and Km is the substrate concentration (in the absence of inhibitor) at which reaction speed is half maximal. The K of an inhibitor for inhibition of a particular substrate (Fixed Km) is constant. As used herein, EC50 refers to a drug concentration producing 50% inhibition, and CC50 refers to a drug concentration producing 50% toxicity. As used herein, a prodrug is a compound which, under in vivo administration, is metabolized by one or more steps or processes or otherwise biologically, pharmaceutically or therapeutically converted to the active form of the compound. To produce a prodrug, the pharmaceutically active compound is modified so that the active compound will be regenerated through metabolic processes. The prodrug may be designed to alter the metabolic stability or transport characteristics of a drug, to mask side effects or toxicity, to improve the taste of a drug or to alter other characteristics or properties of a drug. Because of knowledge of pharmacodynamic processes and drug metabolism in vivo, those of skill in this art, once a pharmaceutically active compound is known, may design prodrugs of the compound (see, for example, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry). The Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392).

É para er entendido que os compostos fornecidos aqui podem conter centros de quiral. Tais centros de quiral podem ser da configuração (R) ou (S)1 ou podem ser uma mistura dos mesmos. Desse modo, os com- postos fornecidos aqui podem ser enantiomericamente puros, ou são mistu- ras estereoisoméricas ou diastereoméricas. No caso de resíduos de aminoá- cido, tais resíduos podem ser da forma L ou D. A configuração para os resí- duos de aminoácido ocorrência natural é em geral L. Quando não especifi- cado, o resíduo é a forma L. Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere- se a α-aminoácidos que são racêmicos, ou da configuração D ou L. A desig- nação "d" precedendo uma designação de aminoácido (por exemplo, dAla, dSer, dVal, etc.) refere-se ao isômero D do aminoácido. A designação "dl" precedendo uma designação de aminoácido refere-se a uma mistura dos isômeros L e D do aminoácido. É para ser entendido que os centros de quiral dos compostos fornecidos aqui podem sofrer epimerização in vivo. Como tal, alguém versado na técnica reconhecerá que administração de um composto em sua forma (R) é equivalente, para compostos que sofrem epimerização in vivo, para administração do composto em sua forma (S). Como aqui usado, "substancialmente puro" com respeito a um composto significa suficientemente homogêneo para parecer livre de impu- rezas facilmente detectáveis como determinado por métodos padrões de análise, tais como cromatografia de camada fina (TLC), eletroforese em gel, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e/ou espectrometria de massa (EM), usados por aqueles de versados na técnica para avaliar tal pu- reza, ou suficientemente puros de modo que purificação adicional de modo não detectável alterará as propriedades físicas e químicas, tais como ativi- dades enzimáticas e biológicas, da substância. Métodos para purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente de forma química pu- ros são conhecidos aqueles versados na técnica. Um composto substanci- almente de forma química puro pode, porém, ser uma mistura de estereoi- sômeros. Em tais circunstâncias, purificação adicional poderia aumentar a atividade específica do composto.It is to be understood that the compounds provided herein may contain chiral centers. Such chiral centers may be of the (R) or (S) 1 configuration or may be a mixture thereof. Thus, the compounds provided herein may be enantiomerically pure, or are stereoisomeric or diastereomeric mixtures. In the case of amino acid residues, such residues may be of the form L or D. The configuration for naturally occurring amino acid residues is generally L. When not specified, the residue is L-form. used, the term "amino acid" refers to α-amino acids that are racemic, either of the D or L configuration. The designation "d" preceding an amino acid designation (e.g., dAla, dSer, dVal, etc.) refers to the isomer D of the amino acid. The designation "dl" preceding an amino acid designation refers to a mixture of amino acid isomers L and D. It is to be understood that the chiral centers of the compounds provided herein may undergo epimerization in vivo. As such, one skilled in the art will recognize that administration of a compound in its (R) form is equivalent to compounds undergoing in vivo epimerization for administration of the compound in its (S) form. As used herein, "substantially pure" with respect to a compound means sufficiently homogeneous to appear free of easily detectable impurities as determined by standard analysis methods such as thin layer chromatography (TLC), gel electrophoresis, liquid chromatography. high performance (HPLC) and / or mass spectrometry (MS) used by those skilled in the art to assess such purity, or sufficiently pure that additional undetectable purification will alter physical and chemical properties such as enzymatic and biological activities of the substance. Methods for purifying compounds to produce substantially chemically pure compounds are well known to those skilled in the art. A substantially chemically pure compound may, however, be a mixture of stereoisomers. Under such circumstances further purification could increase the specific activity of the compound.

Como aqui usado, "alquila," "alquenila" e "alquinila" referem-se às cadeias de carbono que podem ser retas ou ramificadas. Grupos alquila, alquenila e alquinila exemplares aqui incluem, mas não são limitados a, meti- la, etila, propila, isopropila, isobutila, n-butila, sec-butila, terc-butila, isopenti- la, neopentila, terc-pentila, isoexila, alila (propenila) e propargila (propinila).As used herein, "alkyl," "alkenyl" and "alkynyl" refer to carbon chains that may be straight or branched. Exemplary alkyl, alkenyl and alkynyl groups herein include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, isobutyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, isoexyl, allyl (propenyl) and propargyl (propynyl).

Como aqui usado, "cicloalquila" refere-se a um sistema de anel mono ou multicíclico saturado, em certas modalidades de 3 a 10 átomos de carbono, em outras modalidades de 3 a 6 átomos de carbono. Os sistemas de anel dos grupos de cicloalquila podem ser compostos de um anel ou dois ou mais anéis que podem ser unidos em uma maneira fundida, ligada em ponte ou espiro-conectada. Exemplos incluem, mas não são limitados a, ci- clopropila, ciclobutila, ciclopentila, e cicloexila.As used herein, "cycloalkyl" refers to a saturated mono- or multicyclic ring system in certain embodiments of 3 to 10 carbon atoms, in other embodiments of 3 to 6 carbon atoms. Cycloalkyl group ring systems may be composed of one ring or two or more rings which may be joined in a fused, bridged or spiro-connected manner. Examples include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.

Como aqui usado, "arila" refere-se a grupos aromáticos monocí- clicos ou multicíclicos contendo de 6 a 19 átomos de carbono. Grupos arila incluem, mas não é limitados a grupos tais como fluorenila não-substituída ou substituída, fenila não-substituída ou substituída, e naftila não-substituída ou substituída.As used herein, "aryl" refers to monocyclic or multicyclic aromatic groups containing from 6 to 19 carbon atoms. Aryl groups include, but are not limited to groups such as unsubstituted or substituted fluorenyl, unsubstituted or substituted phenyl, and unsubstituted or substituted naphthyl.

Como aqui usado, "heteroarila" refere-se a um sistema de anel aromático monocíclico ou multicíclico, em certas modalidades, de cerca de 5 a cerca de 15 membros onde um ou mais, em uma modalidade 1 a 4, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo que é um elemento diferente de carbono, incluindo mas não limitados a, nitrogênio, oxigênio ou enxofre. O grupo heteroarila pode ser opcionalmente fundido a um anel de benzeno. Grupos heteroarila incluem, mas não são limitados a, furila, imidazolila, piri- midinila, tetrazolila, tienila, piridila, pirrolila, tiazolila, isotiazolila, oxazolila, isoxazolila, triazolila, quinolinila e isoquinolinila.As used herein, "heteroaryl" refers to a monocyclic or multicyclic aromatic ring system, in certain embodiments, from about 5 to about 15 members wherein one or more, in a mode 1 to 4, of atoms in the system. Ring is a heteroatom that is a different carbon element, including but not limited to, nitrogen, oxygen or sulfur. The heteroaryl group may optionally be fused to a benzene ring. Heteroaryl groups include, but are not limited to, furyl, imidazolyl, pyrimidinyl, tetrazolyl, thienyl, pyridyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, triazolyl, quinolinyl and isoquinolinyl.

Como aqui usado, "heterociclila" refere-se a um sistema de anel não-aromático monocíclico ou multicíclico, em uma modalidade de 3 a 10 membros, em outra modalidade de 4 a 7 membros, em uma outra modalida- de de 5 a 6 membros onde um ou mais, em certas modalidades, 1 a 3, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo é um elemento diferente de carbono, incluindo mas não limitados a, nitrogênio, oxigênio ou enxofre.As used herein, "heterocyclyl" refers to a monocyclic or multicyclic nonaromatic ring system, in a 3 to 10 membered mode, in another 4 to 7 membered mode, in another 5 to 6 membered modality. members wherein one or more, in certain embodiments, 1 to 3, of atoms in the ring system is a heteroatom is a different carbon element, including but not limited to nitrogen, oxygen or sulfur.

Como aqui usado, "halo", "halogênio" ou "haleto" refere-se a F, Cl, Br ou I.As used herein, "halo", "halogen" or "halide" refers to F, Cl, Br or I.

Como aqui usado, pseudo-haletos ou grupos pseudo-halo são grupos que se comportam substancialmente similares aos haletos. Tais compostos podem ser usados da mesma maneira e podem ser tratados da mesma maneira como haletos. Pseudo-haletos incluem, mas não são limita- dos a, cianeto, cianato, tiocianato, selenocianato, trifluorometóxi, e azida.As used herein, pseudohalides or pseudohalo groups are groups that behave substantially similar to halides. Such compounds may be used in the same manner and may be treated in the same manner as halides. Pseudohalides include, but are not limited to, cyanide, cyanate, thiocyanate, selenocyanate, trifluoromethoxy, and azide.

Como aqui usado, "haloalquila" refere-se a um grupo alquila em que um ou mais dos átomos de hidrogênio são substituídos por halogênio.As used herein, "haloalkyl" refers to an alkyl group wherein one or more of the hydrogen atoms are substituted by halogen.

Como aqui usado, "carbóxi" refere-se a um radical divalente, - C(O)O-.As used herein, "carboxy" refers to a divalent radical, -C (O) O-.

Como aqui usado, "aminocarbonila" refere-se a -C(O)NH2.As used herein, "aminocarbonyl" refers to -C (O) NH 2.

Como aqui usado, "aminoalquila" refere-se a -RNH2 em que R éAs used herein, "aminoalkyl" refers to -RNH2 where R is

alquila.alkyl.

Como aqui usado, "alcóxi" e "alquiltio" referem-se a RO- e RS-, em que R é alquila.As used herein, "alkoxy" and "alkylthio" refer to RO- and RS-, where R is alkyl.

Como aqui usado, "arilóxi" e "ariltio" referem-se a RO- e RS-, em que R é arila. Como aqui usado, "amido" refere-se ao grupo divalente - C(O)NH-.As used herein, "aryloxy" and "arylthio" refer to RO- and RS-, where R is aryl. As used herein, "starch" refers to the divalent group -C (O) NH-.

Como aqui usado, "hidrazida" refere-se ao grupo divalente - C(O)NHNH-.As used herein, "hydrazide" refers to the divalent group -C (O) NHNH-.

Onde o número de qualquer substituinte dado não for especifi- cado (por exemplo, haloalquila), pode haver um ou mais substituintes pre- sentes. Por exemplo, "haloalquila" pode incluir um ou mais dos mesmos ha- logênios ou diferentes.Where the number of any given substituent is not specified (eg haloalkyl), there may be one or more substituents present. For example, "haloalkyl" may include one or more of the same or different halogens.

Como aqui usado, as abreviações para qualquer grupo protetor, aminoácidos e outros compostos, é, a menos que do contrário indicado, de acordo com sua prática geral, abreviações reconhecidas, ou Comissão em Nomenclatura de Bioquímica IUPAC-IUB (vide, (1972) Biochem. 11:942- 944).As used herein, abbreviations for any protecting group, amino acids and other compounds are, unless otherwise indicated, in accordance with their general practice, recognized abbreviations, or IUPAC-IUB Committee on Biochemistry Nomenclature (see, (1972) Biochem 11: 942-944).

Métodos de Projetar Inibidores para o SftioAtivo de Fosforil TransferaseMethods of Designing Inhibitors for Phosphoryl Transferase Active Sodium

Fornecidos aqui são métodos, incluindo métodos com base em computador, para projetar compostos que ligam e/ou inibem o sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS, particularmente um polipeptídeo de GS adenililada, e até mesmo mais particularmente um polipeptídeo de GS adenililada de uma bactéria de GSI-β. Como descrito aqui, os inventores postularam que um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP liga ao sítio ativo de transferência de fosforila em GS adenililada, resultando em um mecanismo de reação único para transferência do γ-fosfato de ATP para o γ-carboxilato de glutamato para formar o intermediário de fosfato de γ-glutamila. Analisan- do a interação do complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP com o sítio ativo de transferência de fosforila, alguém versado na técnica saberia usar modela- gem molecular padrão ou outras técnicas para identificar peptídeos, pepti- domiméticos, e pequenas moléculas que ligariam ao sítio de fosforil transfe- rase de um polipeptídeo de GS adenililada para inibir a atividade de fosforil transferase. Por exemplo, uma molécula pequena poderia interagir direta- mente com certos aminoácidos no sítio de fosforil transferase para inibir o mecanismo de reação postulado (por exemplo, impedir formação do inter- mediário de carboxifosfato), ou poderia interagir em um sítio alostérico, isto é, uma região da molécula não diretamente envolvida com a atividade de fosforil transferase mas à qual ligação dos compostos resulta (por exemplo, pela indução em uma alteração conformacional na molécula) na inibição da atividade.Provided herein are methods, including computer-based methods, for designing compounds that bind and / or inhibit the phosphoryl transferase site of a GS polypeptide, particularly an adenylylated GS polypeptide, and even more particularly an adenylylated GS polypeptide. a bacterium of GSI-β. As described herein, the inventors postulated that an (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2ATP complex binds to the active phosphoryl transfer site in adenylylated GS, resulting in a unique reaction mechanism for ATP γ-phosphate transfer to Glutamate γ-carboxylate to form the γ-glutamyl phosphate intermediate. Analyzing the interaction of the (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2ATP complex with the active phosphoryl transfer site, one skilled in the art would know how to use models - standard molecular splicing or other techniques for identifying peptides, peptomimetics, and small molecules that would bind to the phosphoryl transfer site of an adenylylated GS polypeptide to inhibit phosphoryl transferase activity. For example, a small molecule could interact directly with certain amino acids at the phosphoryl transferase site to inhibit the postulated reaction mechanism (eg, prevent formation of the carboxyphosphate intermediate), or could interact at an allosteric site, ie. , a region of the molecule not directly involved with phosphoryl transferase activity but to which binding of the compounds results (for example, by inducing a conformational change in the molecule) in inhibiting activity.

Por "modelagem molecular" é significado análise quantitativa e/ou qualitativa da estrutura e função das interações físicas com base na informação estrutural tridimensional e modelos de interação. Isto inclui mo- delos de minimização de energia e dinâmicos moleculares com base numé- rica e modelos de minimização de energia, modelos gráficos interativos de computador, modelos de mecânicas moleculares modificadas, geometria de distância e outros modelos de restrição baseados em estrutura. Modelagem molecular tipicamente é executada usando um computador e pode ser tam- bém otimizada usando métodos conhecidos.By "molecular modeling" is meant quantitative and / or qualitative analysis of the structure and function of physical interactions based on three-dimensional structural information and interaction models. These include energy minimization models and number-based molecular dynamics and energy minimization models, interactive computer graphic models, modified molecular mechanics models, distance geometry, and other structure-based constraint models. Molecular modeling is typically performed using a computer and can also be optimized using known methods.

Métodos de projetar compostos que especificamente ligam (por exemplo, com afinidade alta) ao sítio de fosforil transferase, por exemplo, o sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada tal como um polipeptídeo de GSI-β adenililada, tipicamente é também com base em computador, e envolve o uso de um computador tendo um programa capaz de gerar um modelo atômico. Programas de computação que usam dados de cristalografia de raio X são particularmente úteis para projetar tais com- postos. Programas tais como RasMoI, por exemplo, podem ser usados para gerar um modelo tridimensional, por exemplo, GS adenililada, o sítio de fos- foril transferase de GS adenililada, ou o complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP. Programas de computação tais como INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), Auto-Dock (Accelrys), e Discovery Studio 1.5 (Accelrys) permitem manipula- ção adicional e a habilidade para introduzir estruturas novas.Methods of designing compounds that specifically bind (e.g., with high affinity) to the phosphoryl transferase site, for example, the phosphoryl transferase site of an adenylylated GS polypeptide such as an adenylylated GSI-β polypeptide, is typically also based. computer, and involves the use of a computer having a program capable of generating an atomic model. Computer programs that use x-ray crystallography data are particularly useful for designing such compounds. Programs such as RasMoI, for example, can be used to generate a three-dimensional model, for example, adenylylated GS, adenylylated GS phosphoryl transferase site, or the (Mn2 +) 3. (HC03 ') i2ATP complex. Computer programs such as INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), Auto-Dock (Accelrys), and Discovery Studio 1.5 (Accelrys) allow for additional manipulation and the ability to introduce new structures.

Os compostos podem ser projetados usando, por exemplo, hardware ou software, ou uma combinação de ambos. Porém, projeto é pre- ferivelmente implementado em um ou mais programas de computação que executam em um ou mais computadores programáveis, cada um contendo um processador e pelo menos um dispositivo de entrada. 0(s) computa- dores) preferivelmente também contém(êm) um sistema de armazenamento de dados (incluindo memória volátil e não-volátil e/ou elementos de armaze- namento) e pelo menos um dispositivo de saída. Código de programa é apli- cado para introduzir dados para executar as funções descritas acima e gerar informação de saída. A informação de saída é aplicada a um ou mais dispo- sitivos de saída em uma maneira conhecida. O computador pode ser, por exemplo, um computador pessoal, microcomputador, ou posto de trabalho de projeto convencional.Compounds can be designed using, for example, hardware or software, or a combination of both. However, design is preferably implemented in one or more computer programs that run on one or more programmable computers, each containing a processor and at least one input device. The computers preferably also contain a data storage system (including volatile and non-volatile memory and / or storage elements) and at least one output device. Program code is applied to enter data to perform the functions described above and generate output information. The output information is applied to one or more output devices in a known manner. The computer may be, for example, a personal computer, microcomputer, or conventionally designed workstation.

Cada programa é preferivelmente implementado em um nível alto processual ou linguagem de programação orientada a objeto para co- municar com um sistema de computador. Porém, os programas podem ser implementados em conjunto ou linguagem de máquina, se desejado. Em todo caso, a linguagem pode ser uma linguagem compilada ou interpretada.Each program is preferably implemented in a high-level procedural or object-oriented programming language to communicate with a computer system. However, programs can be implemented in either machine language or set if desired. In any case, the language can be a compiled or interpreted language.

Cada programa de computação é preferivelmente armazenado em um meio ou dispositivo de armazenamento (por exemplo, ROM ou dis- quete magnético) legível por um computador programável de propósito geral ou especial. O programa de computação serve para configurar e operar o computador para executar os procedimentos descritos aqui quando o pro- grama é lido pelo computador. O método da invenção pode também ser im- plementado por meio de um meio de armazenamento legível por computa- dor, configurado com um programa de computação onde o meio de armaze- namento assim configurado faz com que um computador opere em uma ma- neira específica e predefinida para executar as funções descritas aqui.Each computer program is preferably stored on a storage medium or device (eg, ROM or magnetic diskette) readable by a general purpose or special programmable computer. The computer program is for configuring and operating the computer to perform the procedures described herein when the program is read by the computer. The method of the invention may also be implemented by means of a computer readable storage medium configured with a computer program where the storage medium thus configured causes a computer to operate in a specific manner. and default to perform the functions described here.

Por exemplo, as etapas requerendo computador em um método de projetar um composto de teste podem envolver:For example, computer-requiring steps in a method of designing a test compound might involve:

(a) introduzir em um dispositivo de entrada, por exemplo, através de um teclado, um disquete, ou uma fita, dados (por exemplo coordenadas atômicas) que definem a estrutura tridimensional (3-D) de uma primeira mo- lécula ou complexo (por exemplo, um polipeptídeo de GS, um polipeptídeo de GS adenililada, um fragmento de um polipeptídeo de GS ou polipeptídeo de GS adenililada, uma coletânea de resíduos que compõem um sítio ativo de um polipeptídeo de GS ou um polipeptídeo de GS adenililada (por exem- plo, o sítio de fosforil transferase), qualquer um destes que poderia incluir uma ou mais moléculas ligadas de ATP, ADP, glutamina, ou glutamato) que liga a uma segunda molécula ou complexo (por exemplo, ATP, ADP, um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP; ou uma porção deste complexo); e(a) input into an input device, for example, via a keyboard, a floppy disk, or a tape, data (eg atomic coordinates) that defines the three-dimensional (3-D) structure of a first molecule or complex. (for example, a GS polypeptide, an adenylylated GS polypeptide, a fragment of a GS polypeptide or adenylated GS polypeptide, a collection of residues that make up an active site of a GS polypeptide or an adenylated GS polypeptide (e.g. phosphoryl transferase site), any of which could include one or more linked ATP, ADP, glutamine, or glutamate molecules) that binds to a second molecule or complex (e.g., ATP, ADP, a complex of (Mn2 +) 3. (HC03 ") 12 ATP; or a portion of this complex); and

(b) determinar, usando um processador, a estrutura 3-D (por e- xemplo, um modelo atômico) do sítio na primeira molécula ou complexo en- volvido na ligação à segunda molécula ou complexo.(b) determining, using a processor, the 3-D structure (for example, an atomic model) of the site on the first molecule or complex involved in binding to the second molecule or complex.

Da informação obtida desse modo, alguém versado na técnica poderá projetar e fazer compostos inibidores (por exemplo, peptídeos, molé- culas pequenas não-peptídicas, peptidomiméticos, e aptâmeros (por exem- pio, aptâmeros de ácido nucléico)) com a estrutura 3-D apropriada, por e- xemplo, em certos resíduos e que interajam em certos modos (por exemplo, ligação de hidrogênio, interações estéricas, e/ou interações de van der Wa- ais). Por exemplo, alguém versado na técnica poderia projetar compostos inibidores que poderiam interagir com certos resíduos da primeira molécula. Deveria ser observado que embora a estrutura 3-D original do polipeptídeo de GS possa ser tirada de uma espécie, alguém versado na técnica poderia, através de métodos padrões, por exemplo, alinhamentos de homologia ou modelagem molecular, estabelecer os resíduos correspondentes de interes- se de GS em outras espécies.From the information thus obtained, one skilled in the art may design and make inhibitory compounds (e.g. peptides, non-peptide small molecules, peptidomimetics, and aptamers (e.g. nucleic acid aptamers)) of structure 3. -D suitable, for example, in certain residues that interact in certain modes (eg, hydrogen bonding, steric interactions, and / or van der Wals interactions). For example, one skilled in the art could design inhibitory compounds that could interact with certain residues of the first molecule. It should be noted that while the original 3-D structure of the GS polypeptide may be taken from one species, one skilled in the art could, by standard methods, for example, homology alignments or molecular modeling, establish the corresponding residues of interest. of GS in other species.

Além disso, se os dados 3-D utilizáveis por computador (por e- xemplo, dados cristalográficos de raio X) para um composto candidato esti- verem disponíveis, uma ou mais das etapas baseadas em computador a se- guir podem ser executadas juntamente com as etapas com base em compu- tador (a) e (b) descritas acima:In addition, if computer usable 3-D data (eg, X-ray crystallographic data) for a candidate compound is available, one or more of the following computer-based steps can be performed in conjunction with the computer-based steps (a) and (b) described above:

(c) introduzir em um dispositivo de entrada, por exemplo, através de um teclado, um disquete, ou uma fita, dados (por exemplo coordenadas atômicas) que definem a estrutura tridimensional (3-D) de um composto candidato;(c) inputting into an input device, for example, via a keyboard, a floppy disk, or a tape, data (e.g. atomic coordinates) that defines the three-dimensional (3-D) structure of a candidate compound;

(d) determinar, usando um processador, a estrutura 3-D (por e- xemplo, um modelo atômico) do composto candidato;(d) determining, using a processor, the 3-D structure (for example, an atomic model) of the candidate compound;

(e) determinar, usando o processador, se o composto candidato liga ao sítio na primeira molécula ou complexo, ou inibe a formação de um intermediário de carboxifosfato, ou impede a ligação de por exemplo, um complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP; e(e) determining, using the processor, whether the candidate compound binds to the site on the first molecule or complex, or inhibits formation of a carboxyphosphate intermediate, or prevents the binding of for example a (Mn2 +) 3 complex. (HC03 -) 12ATP; and

(f) identificar o composto candidato como um composto que inibe a interação entre as primeiras e segundas moléculas ou complexos, ou inibe a formação de um intermediário de carboxifosfato, ou impede a ligação de por exemplo, um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP.(f) identifying the candidate compound as a compound that inhibits interaction between the first and second molecules or complexes, or inhibits the formation of a carboxyphosphate intermediate, or prevents the binding of for example a (Mn2 +) 3 complex. ( HC03 ") i2ATP.

O método pode envolver uma etapa adicional de produzir em um dispositivo de saída um modelo da estrutura 3-D do composto. Além disso, os dados 3-D dos compostos candidatos podem ser comparados a uma ba- se de dados de computador, por exemplo, de estruturas 3-D armazenadas em um sistema de armazenamento de dados.The method may involve an additional step of producing in an output device a model of the 3-D structure of the compound. In addition, 3-D data of candidate compounds can be compared to a computer database, for example of 3-D structures stored in a data storage system.

Por exemplo, em algumas modalidades, um método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada pode incluir:For example, in some embodiments, a computer-assisted method of generating a phosphoryl transferase site activity test inhibitor of an adenylylated GS polypeptide may include:

(a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP ligado ao sítio de fosforil transferase de um polipeptí- deo de GS (por exemplo, dados compreendendo a estrutura de uma coletâ- nea de resíduos que compõem o sítio de fosforil transferase);(a) inputting to the input device a structure comprising one or more structural motifs of a (Mn2 +) 3 (HC03 ") i2ATP complex bound to the phosphoryl transferase site of a GS polypeptide (e.g., data comprising the structure of a collection of residues that make up the phosphoryl transferase site);

(b) atracar no sítio de fosforil transferase uma molécula de inibi- dor de teste usando o processador; e(b) docking at the phosphoryl site transfer a test inhibitor molecule using the processor; and

(c) determinar, com base na atracagem, se a molécula de inibi- dor de teste inibiria a atividade do sítio de fosforil transferase.(c) determining, based on mooring, whether the test inhibitor molecule would inhibit phosphoryl transferase site activity.

Compostos da invenção também podem ser interativamente pro- jetados da informação estrutural dos compostos descritos aqui usando ou- tras técnicas de projeto/modelagem baseadas em estrutura (vide, por exem- plo, Jackson (1997) Seminars in Oncology 24:L164-172; e Jones et al. (1996) J. Med. Chem. 39:904-917). Compostos e polipeptídeos da invenção podem também ser identificados, por exemplo, identificando os compostos candidatos através de modelagem de computador como encaixando espaci- almente e de preferência (isto é, com afinidade alta) no sítio de fosforil trans- ferase. Compostos candidatos identificados como descrito acima podem depois ser testados em ensaios padrões de inibição celular, enzimática livre de células ou enzimática familiares aqueles versados na técnica. Ensaios exemplares são descritos aqui.Compounds of the invention may also be interactively designed from the structural information of the compounds described herein using other structure-based design / modeling techniques (see, for example, Jackson (1997) Seminars in Oncology 24: L164-172; and Jones et al (1996) J. Med. Chem. 39: 904-917). Compounds and polypeptides of the invention may also be identified, for example, by identifying candidate compounds by computer modeling as fitting spatially and preferably (i.e., with high affinity) at the phosphoryl transfer site. Candidate compounds identified as described above can then be tested in standard cell inhibition, cell free enzyme or enzyme inhibition assays familiar to those skilled in the art. Exemplary tests are described here.

A estrutura 3-D de macromoléculas biológicas (por exemplo, GS, GS adenililada, ácidos nucléicos, carboidratos, e lipídios) pode ser determi- nada dos dados obtidos por uma variedade de metodologias. Estas metodo- logias que foram eficazmente aplicadas na avaliação da estrutura 3-D de proteínas incluem: (a) cristalografia de raio X; (b) espectroscopia de resso- nância magnética nuclear (RMN); (c) análise de restrições de distância física formadas entre sítios definidos em uma macromolécula, por exemplo, reticu- lações químicas intramoleculares entre resíduos em uma proteína (por e- xemplo, Pedido de Patente Internacional Nq PCT/US00/14667, a revelação desta é incorporada aqui por referência em sua totalidade), e (d) métodos de modelagem molecular com base em um conhecimento da estrutura primária de uma proteína de interesse, por exemplo, técnicas de modelagem de ho- mologia, algoritmos de encadeamento, ou modelagem de estrutura ab initio usando programas de computação tais como MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints) (vide, por exemplo, Pedi- do de Patente Internacional N2 PCT/US99/11913, a revelação destes é in- corporada aqui por referência em sua totalidade). Outras técnicas de mode- lagem molecular podem também ser empregadas de acordo com esta in- venção [por exemplo, Cohen et al. (1990) J. Med. Chem. 33: 883-894; Navia et al (1992) Current Opinions in Structural Biology, 2, págs. 202-210, as re- velações desta são incorporadas aqui por referência em sua totalidade]. To- dos estes métodos produzem dados que são tratáveis por análise de compu- tador. Outros métodos espectroscópicos que podem também ser úteis no método da invenção, mas que correntemente não fornecem detalhe estrutu- ral do nível atômico acerca das biomoléculas, incluem espectroscopia por dicroísmo circular e fluorescência e de absorbância de luz ultravioleta/visível. Um método preferido de análise é cristalografia de raio X. Descrições deste procedimento e de espectroscopia de RMN são fornecidas abaixo. Cristalografia de Raio XThe 3-D structure of biological macromolecules (eg, GS, adenylylated GS, nucleic acids, carbohydrates, and lipids) can be determined from data obtained by a variety of methodologies. These methodologies that have been effectively applied in the evaluation of protein 3-D structure include: (a) X-ray crystallography; (b) nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR); (c) analysis of physical distance constraints formed between sites defined in a macromolecule, for example, intramolecular chemical cross-links between residues in a protein (for example, International Patent Application No. PCT / US00 / 14667, the disclosure of this is incorporated herein by reference in its entirety), and (d) molecular modeling methods based on a knowledge of the primary structure of a protein of interest, for example, homology modeling techniques, chaining algorithms, or ab initio framework using computer programs such as MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints) (see, for example, International Patent Application No. PCT / US99 / 11913, their disclosure is incorporated herein by reference). in its entirety). Other molecular modeling techniques may also be employed in accordance with this invention [e.g. Cohen et al. (1990) J. Med. Chem. 33: 883-894; Navia et al (1992) Current Opinions in Structural Biology, 2, p. 202-210, the disclosures thereof are incorporated herein by reference in their entirety]. All of these methods produce data that is treatable by computer analysis. Other spectroscopic methods which may also be useful in the method of the invention but which currently do not provide structural atomic level detail about the biomolecules include circular dichroism and fluorescence spectroscopy and ultraviolet / visible light absorbance. A preferred method of analysis is x-ray crystallography. Descriptions of this procedure and NMR spectroscopy are provided below. X-ray crystallography

Cristalografia de raio X é com base na difração de radiação χ de um comprimento de onda característico através de nuvens de elétrons cir- cundando os núcleos atômicos em um cristal da região de interesse. A técni- ca usa cristais purificados de macromoléculas biológicas (mas estas fre- qüentemente incluem componentes de solvente, co-fatores, substratos, ou outros ligandos) para determinar resolução quase atômica dos átomos que compõem a macromolécula biológica particular. Uma condição prévia para solucionar a estrutura 3-D da macromolécula através de cristalografia de raio X é um cristal bem regulado que difratará raios X fortemente. O método dire- ciona um feixe de raios X sobre um arranjo de repetição habitual de muitas moléculas idênticas de forma que os raios X são difratados do arranjo em um padrão do qual a estrutura de uma molécula individual pode ser recupe- rada. Cristais bem regulados, por exemplo, de moléculas de proteínas globu- lares são grandes, esféricas ou objetivas elipsoidais com superfícies irregu- lares. Os cristais contêm canais grandes entre as moléculas individuais. Es- tes canais, que normalmente ocupam mais que uma metade do volume do cristal, são enchidos com moléculas de solvente desordenadas, e as molé- culas de proteína entram em contato entre si em apenas algumas regiões pequenas. Esta é uma razão por que as estruturas de proteínas em cristais são em geral iguais às das proteínas em solução.X-ray crystallography is based on the diffraction of χ radiation of a characteristic wavelength through electron clouds surrounding the atomic nuclei in a crystal of the region of interest. The technique uses purified crystals of biological macromolecules (but these often include solvent components, cofactors, substrates, or other ligands) to determine quasi-atomic resolution of the atoms that make up the particular biological macromolecule. A prerequisite for solving the macromolecule 3-D structure by X-ray crystallography is a well-regulated crystal that will diffract strongly X-rays. The method directs an x-ray beam over a usual repeating array of many identical molecules so that x-rays are diffracted from the array into a pattern from which the structure of an individual molecule can be recovered. Well-regulated crystals, for example from globular protein molecules, are large, spherical or ellipsoidal objective with irregular surfaces. Crystals contain large channels between individual molecules. These channels, which typically occupy more than half the volume of the crystal, are filled with cluttered solvent molecules, and protein molecules come in contact with each other in only a few small regions. This is one reason why protein structures in crystals are generally the same as proteins in solution.

GS desadenililada foi cristalizada muitas vezes, por exemplo, de Salmonella typhimurium, Almassy, R. J. et. al. ( 1986) Nature (Londres) 323: 304-309, Liaw, S-H., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 90: 4996- 5000; com glicina, alanina e serina no sítio ativo, Liaw, S-H e D. Eisenberg (1994) J. Biol. Chem. 33: 675-681; com AMPPNP, glutamato, L-metionina-S- sulfoximina, glutamina e ADP no sítio ativo de 5 estruturas, Liaw, S-H., Jun, G. e D. Eisenberg (1993) Protrein Sciences, 2: 470-471; e com ATP no sítio ativo, Liaw, S-H., Jun, G. e D. Eisenberg (1994) Biochemistry 33: 11184- 11188. Métodos de obter GS ou fragmentos de GS, incluindo GS adenililada, são descritos abaixo ou são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. A formação de cristais é dependente de vários parâmetros diferentes, incluindo pH, temperatura, a concentração da macromolécula biológica, a natureza do solvente e precipitante, como também a presença de íons adicionados ou ligandos da proteína. Muitos experimentos rotineiros de cristalização podem ser necessários para triar todos estes parâmetros para as combinações que dão um cristal adequado para análise de difração de raio X. Robôs de crista- lização podem automatizar e acelerar o trabalho de reprodutibilidade mon- tando um número grande de experimentos de cristalização (vide, por exem- plo, Patente U. S. Nq 5.790.421).Desadenylated GS has often been crystallized, for example from Salmonella typhimurium, Almassy, R. J. et. al. (1986) Nature (London) 323: 304-309, Liaw, S-H., Et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Know. (USA) 90: 4996-5000; with active site glycine, alanine and serine, Liaw, S-H and D. Eisenberg (1994) J. Biol. Chem. 33: 675-681; with AMPPNP, glutamate, L-methionine-S-sulfoximin, glutamine and ADP at the 5-structure active site, Liaw, S-H., Jun, G. and D. Eisenberg (1993) Protrein Sciences, 2: 470-471; and with active site ATP, Liaw, SH., Jun, G. and D. Eisenberg (1994) Biochemistry 33: 11184-11188. Methods of obtaining GS or fragments of GS, including adenylylated GS, are described below or are well-known. those skilled in the art are known. Crystal formation is dependent on several different parameters including pH, temperature, biological macromolecule concentration, nature of solvent and precipitant, as well as the presence of added ions or ligands of the protein. Many routine crystallization experiments may be required to screen all these parameters for combinations that give a suitable crystal for X-ray diffraction analysis. Crystallization robots can automate and accelerate reproducibility work by assembling a large number of experiments. crystallization (see, for example, US Patent No. 5,790,421).

Cristalização de polipeptídeo ocorre em soluções em que a con- centração de polipeptídeo excede sua solubilidade máxima (isto é, a solução de polipeptídeo é supersaturada). Tais soluções podem ser restabelecidas pra equilíbrio reduzindo a concentração de polipeptídeo, preferivelmente a- través de precipitação dos cristais de polipeptídeo. Freqüentemente os poli- peptídeos podem ser induzidos a cristalizar-se de soluções supersaturadas adicionando agentes que alteram a superfície de carga do polipeptídeo ou desordenam a interação entre o polipeptídeo e água de volume para promo- ver associações que levam à cristalização.Polypeptide crystallization occurs in solutions in which the polypeptide concentration exceeds its maximum solubility (ie, the polypeptide solution is supersaturated). Such solutions may be restored to equilibrium by reducing the concentration of polypeptide, preferably by precipitation of polypeptide crystals. Often polypeptides may be induced to crystallize from supersaturated solutions by adding agents that alter the polypeptide loading surface or disrupt the interaction between the polypeptide and bulk water to promote associations that lead to crystallization.

Cristalizações são em geral realizadas entre 4eC e 209C. Subs- tâncias conhecidas como "precipitantes" são freqüentemente usadas para diminuir a solubilidade do polipeptídeo em uma solução concentrada for- mando uma camada de precipitação esvaziada energicamente desfavorável ao redor das moléculas de polipeptídeo [Weber (1991) Advances in protein Chemistry, 41:1-36]. Além dos precipitantes, outros materiais são adiciona- dos às vezes à solução de cristalização de polipeptídeo. Estes incluem tam- pões para ajustar o pH da solução e sais para reduzir a solubilidade do poli- peptídeo. Vários precipitantes são conhecidos na técnica e incluem os se- guintes: etanol, 3-etil-2-4 pentanodiol, e muitos do poliglicóis, tais como poli- etileno glicol (PEG). As soluções de precipitação podem incluir, por exemplo, 13-24 % PEG 4000, 5-41 % sulfato de amônio, e 1,0-1,5 M de cloreto de só- dio, e um pH variando de 5-7,5. Outros aditivos podem incluir 0,1 M de He- pes, 2-4 % de butanol, 0,1 M ou 20 mM de acetato de sódio, 50-70 mM de ácido cítrico, 120-130 mM de fosfato de sódio, 1 mM de ácido etileno diami- na tetraacético (EDTA), e 1 mM de ditiotreitol (DTT). Estes agentes são pre- parados em tampões e são adicionados a gotas em várias combinações ao tampão de cristalização.Crystallizations are generally performed between 4 ° C and 20 ° C. Substances known as "precipitants" are often used to decrease the solubility of polypeptide in a concentrated solution by forming an unfavorably depleted precipitation layer around the polypeptide molecules [Weber (1991) Advances in protein Chemistry, 41: 1. -36]. In addition to precipitants, other materials are sometimes added to the polypeptide crystallization solution. These include buffers for adjusting the pH of the solution and salts for reducing polypeptide solubility. Various precipitants are known in the art and include the following: ethanol, 3-ethyl-2-4 pentanediol, and many of the polyglycols, such as polyethylene glycol (PEG). Precipitation solutions may include, for example, 13-24% PEG 4000, 5-41% ammonium sulfate, and 1.0-1.5 M sodium chloride, and a pH ranging from 5-7, 5 Other additives may include 0.1 M Hepat, 2-4% butanol, 0.1 M or 20 mM sodium acetate, 50-70 mM citric acid, 120-130 mM sodium phosphate, 1 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), and 1 mM dithiothreitol (DTT). These agents are prepared in buffers and are added dropwise in various combinations to the crystallization buffer.

Métodos de cristalização de polipeptídeo comumente usados incluem as técnicas a seguir: batelada, gota suspensa, iniciação de semente, e diálise. Em cada um destes métodos, é importante promover cristalização continuada após nucleação mantendo uma solução supersaturada. No mé- todo de batelada, polipeptídeo é misturado com precipitantes para alcançar supersaturação, e o vaso é vedado e ajustado aparte até que os cristais apa- reçam. No método de diálise, o polipeptídeo é retido em uma membrana de diálise vedada que é colocada em uma solução contendo precipitante. Equi- libração ao longo da membrana aumenta as concentrações do polipeptídeo e do precipitante, assim fazendo o polipeptídeo alcançar níveis de supersa- turação.Commonly used polypeptide crystallization methods include the following techniques: batch, drop drop, seed initiation, and dialysis. In each of these methods, it is important to promote continued crystallization after nucleation while maintaining a supersaturated solution. In the batch method, polypeptide is mixed with precipitants to achieve supersaturation, and the vessel is sealed and adjusted apart until the crystals appear. In the dialysis method, the polypeptide is retained in a sealed dialysis membrane that is placed in a precipitant containing solution. Equilibrium across the membrane increases polypeptide and precipitant concentrations, thus making the polypeptide reach supersaturation levels.

Na técnica preferida de gota suspensa [McPherson (1976) J. Biol. Chem., 251:6300-6306], uma mistura de polipeptídeo inicial é criada acrescentando um precipitante a uma solução de polipeptídeo concentrada. As concentrações do polipeptídeo e precipitantes são tais que desta forma inicial, o polipeptídeo não se cristaliza. Uma gota pequena desta mistura é colocada em uma lâmina de vidro que é invertida e suspensa em um reser- vatório de uma segunda solução. O sistema é depois vedado. Tipicamente, a segunda solução contém uma concentração mais alta de precipitante ou ou- tro agente desidratante. A diferença nas concentrações de precipitante faz com que a solução de proteína tenha uma pressão de vapor mais alta que a segunda solução. Considerando que o sistema contendo as duas soluções é vedado, um equilíbrio é estabelecido, e água da mistura de polipeptídeo se transfere para a segunda solução. Este equilíbrio aumenta a concentração de polipeptídeo e precipitante na solução de polipeptídeo. Na concentração crítica de polipeptídeo e precipitante, um cristal do polipeptídeo pode se for- mar.In the preferred suspended drop technique [McPherson (1976) J. Biol. Chem., 251: 6300-6306], an initial polypeptide mixture is created by adding a precipitant to a concentrated polypeptide solution. The concentrations of the polypeptide and precipitants are such that in this way the polypeptide does not crystallize initially. A small drop of this mixture is placed on a glass slide that is inverted and suspended in a reservoir of a second solution. The system is then sealed. Typically, the second solution contains a higher concentration of precipitant or other dehydrating agent. The difference in precipitant concentrations causes the protein solution to have a higher vapor pressure than the second solution. Since the system containing the two solutions is sealed, an equilibrium is established, and water from the polypeptide mixture transfers to the second solution. This balance increases the concentration of polypeptide and precipitant in the polypeptide solution. At the critical concentration of polypeptide and precipitant, a crystal of the polypeptide may form.

Outro método de cristalização introduz um sítio de nucleação em uma solução de polipeptídeo concentrada. Em geral, uma solução de poli- peptídeo concentrada é preparada e um cristal de semente do polipeptídeo é introduzido nesta solução. Se as concentrações do polipeptídeo e quaisquer precipitantes estiverem corretas, o cristal de semente fornecerá um sítio de nucleação ao redor do qual um cristal maior se forma.Another crystallization method introduces a nucleation site into a concentrated polypeptide solution. In general, a concentrated polypeptide solution is prepared and a seed crystal of the polypeptide is introduced into this solution. If the polypeptide concentrations and any precipitants are correct, the seed crystal will provide a nucleation site around which a larger crystal forms.

Ainda outro método de cristalização é um método de eletrocrista- lização em que uso é feito dos momentos de dipolo das macromoléculas de proteína que se auto-alinham na camada de Helmholtz adjacente a um ele- trodo (vide patente U. S. N° 5.597.457).Still another method of crystallization is an electrocrystallization method in which use is made of the dipole moments of protein macromolecules that self-align in the Helmholtz layer adjacent to an electrode (see US Patent No. 5,597,457). .

Algumas proteínas podem ser recalcitrantes à cristalização. Po- rém, várias técnicas estão disponíveis ao artesão versado pra induzir crista- lização. Por exemplo, a remoção de segmentos de polipeptídeo flexíveis na terminação amino ou carboxila terminal da proteína pode facilitar a produção de amostras de proteínas cristalinas. Remoção de tais segmentos pode ser feita usando técnicas de biologia molecular ou tratamento da proteína com proteases tais como tripsina, quimiotripsina, ou subtilisina.Some proteins may be recalcitrant to crystallization. However, various techniques are available to the skilled artisan to induce crystallization. For example, removal of flexible polypeptide segments at the amino or carboxyl terminus of the protein may facilitate the production of crystalline protein samples. Removal of such segments may be done using molecular biology techniques or treatment of protein with proteases such as trypsin, chymotrypsin, or subtilisin.

Em experimentos de difração, um feixe estreito e paralelo de raios X é extraído da fonte de raio X e direcionado sobre o cristal para pro- duzir feixes difratados. Os feixes primários incidentes causam dano à ma- cromolécula e moléculas de solvente. Portanto, o cristal é esfriado (por e- xemplo, para -220°C a -50°C) para prolongar sua vida. O feixe primário tem que incidir o cristal de muitas direções para produzir todos possíveis pontos de difração, assim o cristal é girado no feixe durante o experimento. As man- chas difratadas são registradas em um filme ou por um detector eletrônico. Filme exposto tem que ser digitalizado e quantificado em um dispositivo de varredura, enquanto que os detectores eletrônicos alimentam os sinais que eles detectam diretamente para um computador. Detectores eletrônicos de área reduzem significativamente o tempo requerido para colher e medir os dados de difração. Cada feixe de difração que é registrado como um ponto em filme é definido através de três propriedades: a amplitude, que é medida da intensidade do ponto; o comprimento de onda, que é fixado pela fonte de raio X; e a fase, que é perdido em experimentos de raio X. Todas as três propriedades são necessárias para todos os feixes difratados para determi- nar as posições dos átomos que dão origem aos feixes difratados. Um modo de determinar as fases é chamado Substituição Isomorfa Múltipla (MIR) que requer a introdução de difratores de raio X exógenos (por exemplo, átomos pesados tais átomos de metal) na célula de unidade do cristal. Para uma descrição mais detalhada de MIR, vide patente U. S. N9 6.093.573, coluna 15.In diffraction experiments, a narrow, parallel X-ray beam is extracted from the X-ray source and directed over the crystal to produce diffracted beams. The incident primary beams cause damage to the macromolecule and solvent molecules. Therefore, the crystal is cooled (for example, to -220 ° C to -50 ° C) to prolong its life. The primary beam must focus the crystal from many directions to produce all possible diffraction points, so the crystal is rotated in the beam during the experiment. Diffracted spots are recorded on a film or by an electronic detector. Exposed film has to be digitized and quantified in a scanning device, while electronic detectors feed the signals they detect directly to a computer. Electronic area detectors significantly reduce the time required to collect and measure diffraction data. Each diffraction beam that is recorded as a point on film is defined by three properties: amplitude, which is measured from the point intensity; the wavelength, which is fixed by the x-ray source; and the phase, which is lost in X-ray experiments. All three properties are required for all diffracted beams to determine the positions of the atoms that give rise to the diffracted beams. One way of determining the phases is called Multiple Isomorph Substitution (MIR) which requires the introduction of exogenous X-ray diffractors (eg heavy atoms such metal atoms) in the crystal unit cell. For a more detailed description of MIR, see U.S. Patent No. 6,093,573, column 15.

Coordenadas atômicas referem-se às coordenadas cartesianas (posições x, y, e z) derivadas das equações matemáticas que envolvem sín- tese de Fourier de dados derivados dos padrões obtidos por meio de difra- ção de um feixe monocromático de raios X pelos átomos (centros de difra- ção) da macromolécula biológica de interesse em forma de cristal. Os dados de difração são usados para calcular os mapas de densidade de elétron das unidades de repetição no cristal (célula de unidade). São usados mapas de densidade de elétron para estabelecer as posições (coordenadas atômicas) de átomos individuais dentro da célula de unidade de um cristal. Os valores absolutos das coordenadas atômicas portam as relações espaciais entre os átomos porque os valores absolutos designados para as coordenadas atô- micas podem ser alterados por movimento rotacional e/ou translacional ao longo dos eixos x, y, e/ou z, junto ou separadamente, enquanto mantendo as mesmas relações espaciais relativas entre os átomos. Desse modo, uma macromolécula biológica (por exemplo, uma proteína), cujo conjunto de valo- res absolutos das coordenadas atômicas podem ser rotativamente ou de modo translacional ajustados para coincidir com um conjunto de valores an- teriormente determinados de uma análise de outra amostra, são considera- dos tendo as mesmas coordenadas atômicas como aquelas obtidas da outra amostra.Atomic coordinates refer to Cartesian coordinates (x, y, ez positions) derived from mathematical equations involving Fourier synthesis of data derived from the patterns obtained by diffraction of a monochrome X-ray beam by atoms (centers diffraction) of the biological macromolecule of interest in crystal form. Diffraction data is used to calculate the electron density maps of the repeating units in the crystal (unit cell). Electron density maps are used to establish the positions (atomic coordinates) of individual atoms within the unit cell of a crystal. Absolute values of atomic coordinates carry the spatial relationships between atoms because the absolute values assigned to atomic coordinates can be changed by rotational and / or translational movement along the x, y, and / or z axis, together or separately. while maintaining the same relative spatial relationships between atoms. Thus a biological macromolecule (eg a protein) whose set of absolute values of atomic coordinates can be rotationally or translationally adjusted to coincide with a set of values previously determined from an analysis of another sample, are considered to have the same atomic coordinates as those obtained from the other sample.

Outros detalhes em cristalografia de raio X podem ser obtidos na patente U. S. de Nq 6.093.573 e Pedidos de Patente Internacionais N9S PCT/US99/18441, PCT/US99/11913, e PCT/US00/03745.Further details on x-ray crystallography can be obtained from U.S. Patent No. 6,093,573 and International Patent Applications No. PCT / US99 / 18441, PCT / US99 / 11913, and PCT / US00 / 03745.

Espectroscopia de RMNNMR spectroscopy

Embora cristalografia de raio X requeira cristais simples de uma macromolécula de interesse, medições de RMN são realizadas em solução sob condições quase fisiológicas. Porém, as estruturas derivadas de RMN não são tão detalhadas quanto às estruturas derivadas de cristal.Although X-ray crystallography requires simple crystals of a macromolecule of interest, NMR measurements are performed in solution under quasi-physiological conditions. However, NMR-derived structures are not as detailed as crystal-derived structures.

Embora o uso de espectroscopia de RMN seja até relativamente de modo recente limitada à elucidação da estrutura 3-D de moléculas relati- vãmente pequenas (por exemplo, proteínas de 100-150 resíduos de aminoá- cido), recentes avanços incluindo marcação isotópica da molécula de inte- resse e espectroscopia otimizada de relaxamento transversal (TROSY) têm permitido estender a metodologia para análise de muitas moléculas maiores, por exemplo, proteínas com um peso molecular de 110 kDa [Wider (2000) BioTechniques, 29:1278-1294].Although the use of NMR spectroscopy has until recently been relatively limited to elucidating the 3-D structure of relatively small molecules (eg 100-150 amino acid residue proteins), recent advances including isotopic labeling of the molecule. interest and optimized cross-sectional relaxation spectroscopy (TROSY) have allowed us to extend the methodology for analysis of many larger molecules, eg proteins with a molecular weight of 110 kDa [Wider (2000) BioTechniques, 29: 1278-1294].

RMN usa radiação de radiofreqüência para examinar o ambiente dos núcleos atômicos magnéticos em um campo magnético homogêneo pul- sado com uma radiofreqüência específica. Os pulsos desordenam a magne- tização nuclear daqueles átomos com núcleos de giro não-zero. Sinais de domínio de tempo transiente são detectados quando o sistema retorna para o equilíbrio. Transformada de Fourier do sinal transiente em um domínio de freqüência rende um espectro de RMN unidimensional. Picos nestes espec- tros representam deslocamentos químicos dos vários núcleos ativos. O des- locamento químico de um átomo é determinado por seu ambiente eletrônico local. Experimentos de RMN bidimensionais podem fornecer informação a- cerca da proximidade de vários átomos na estrutura e em espaço tridimensi- onal. Estruturas de proteína podem ser determinadas executando vários ex- perimentos de RMN bidimensional (e às vezes 3 ou 4) e usando a informa- ção resultante como restrições em uma série de simulações de dobramento de proteína.NMR uses radiofrequency radiation to examine the environment of magnetic atomic nuclei in a homogeneous magnetic field pulsed with a specific radiofrequency. The pulses disrupt the nuclear magnetization of those atoms with nonzero spin nuclei. Transient time domain signals are detected when the system returns to equilibrium. Fourier transform of the transient signal in a frequency domain yields a one-dimensional NMR spectrum. Peaks in these spectra represent chemical displacements of the various active nuclei. The chemical displacement of an atom is determined by its local electronic environment. Two-dimensional NMR experiments can provide information about the proximity of various atoms in the structure and in three-dimensional space. Protein structures can be determined by performing various two-dimensional (and sometimes 3 or 4) NMR experiments and using the resulting information as constraints in a series of protein folding simulations.

Mais informação sobre espectroscopia de RMN, incluindo des- crições detalhadas de como os dados brutos obtidos de um experimento de RMN podem ser usados para determinar a estrutura 3-D de uma macromo- lécula, podem ser encontradas em: Espectroscopia de RMN de Proteína, Princípios e Prática, J., Protein NMR Spectroscopy, Principies and Practice, J. Cavanagh et al., Academic Press, San Diego, 1996; Gronenborn et al. (1990) Anal. Chem. 62(1):2-15; e Wider (2000), supra. Qualquer método disponível pode ser usado para a construção de um modelo 3-D de uma região de GS de interesse dos dados de raio X cristalográfico e/ou de RMN usando um computador como descrito acima. Um tal modelo construído pode ser de pontos de dados analíticos introduzi- dos no computador por um dispositivo de entrada e por meio de um proces- sador usando pacotes de software conhecidos, por exemplo, CATALYST (Accelrys), INSIGHT (AcceIrys) e Ceriusll1 HKL, MOSFILM, XDS1 CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR1 TNT1 NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIA- NA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, ou CHAIN. O modelo construído destes dados pode ser visuali- zado por meio de um dispositivo de saída de um computador, usando siste- mas disponíveis, por exemplo, Silicon Graphics, Evans e Sutherland, SUN, Hewlett Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM, ou Compaq. Projetar Compostos da InvençãoMore information on NMR spectroscopy, including detailed descriptions of how raw data obtained from an NMR experiment can be used to determine the 3-D structure of a macromolecule, can be found at: Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, J., Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, J. Cavanagh et al., Academic Press, San Diego, 1996; Gronenborn et al. (1990) Anal. Chem. 62 (1): 2-15; and Wider (2000), supra. Any available method can be used to construct a 3-D model of a GS region of interest from crystallographic X-ray and / or NMR data using a computer as described above. Such a constructed model may be of analytical data points entered into the computer by an input device and by a processor using known software packages, for example CATALYST (Accelrys), INSIGHT (AcceIrys) and Ceriusll1 HKL. , MOSFILM, XDS1 CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR1 TNT1 NMRCOMPASS, NMRPIPE, DAY, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, HOW MUCH, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, or CHAIN. The constructed model of this data can be viewed through a computer output device using available systems, for example, Silicon Graphics, Evans and Sutherland, SUN, Hewlett Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM, or Compaq Design Compounds of the Invention

Uma vez a estrutura 3-D de um composto que liga a uma região de interesse de polipeptídeo de GS (por exemplo, um Sítio de fosforil trans- ferase de GS, incluindo um sítio de Fosforil transferase de GS adenililada) foi estabelecida usando qualquer um dos métodos acima, um composto tendo substancialmente a mesma estrutura 3-D (ou contém um domínio tendo substancialmente a mesma estrutura) como o composto identificado pode ser feito. Neste contexto, "tem substancialmente a mesma estrutura 3-D" significa que o composto possui uma ligação de hidrogênio e caráter hidro- fóbico que é similar ao composto identificado. Em alguns casos, um compos- to tendo substancialmente a mesma estrutura 3-D que o composto identifi- cado pode incluir um sistema de anel heterocíclico e regiões que exibem caráter hidrofóbico em proximidade íntima a uma região de ligação de hidro- gênio, embora as regiões hidrofóbicas possam conter algum caráter de liga- ção de hidrogênio. Compostos desta classe incluiriam, sem limitação, substi- tuintes capazes de dar volume estérico em uma região espacial que do con- trário encapsularia o manganês e característica de cadeia principal de fosfa- to coordenada por carbonato de um composto identificado tal como (Mn2+)3.(HC03-)12ATP. Com os dados 3-D estruturais descritos acima em mão e saben- do a estrutura química (por exemplo, seqüência de aminoácido no caso de uma proteína) da região de interesse, aqueles versados na técnica saberiam fazer compostos com as propriedades acima descritas. Tais métodos inclu- em métodos sintéticos químicos e, no caso de proteínas, métodos recombi- nantes (vide acima). Por exemplo, resíduos de cisteína apropriadamente colocados em um composto para formar ligações de dissulfeto podem ser usados para restringir o composto ou um domínio do composto em uma es- trutura 3-D apropriada. Além disso, em um composto que é um polipeptídeo ou inclui um domínio que é um polipeptídeo, alguém versado na técnica sa- beria quais aminoácidos a incluir e em que seqüência os incluir para gerar, por exemplo, hélices a, estruturas β, ou voltas ou curvas aguçadas na ca- deia principal de polipeptídeo.Once the 3-D structure of a compound that binds to a GS polypeptide region of interest (for example, a GS phosphoryl transfer site, including an adenylylated GS Phosphoryl transferase site) has been established using either of the above methods, a compound having substantially the same 3-D structure (or contains a domain having substantially the same structure) as the identified compound can be made. In this context, "has substantially the same 3-D structure" means that the compound has a hydrogen bond and hydrophobic character that is similar to the identified compound. In some cases, a compound having substantially the same 3-D structure as the identified compound may include a heterocyclic ring system and regions exhibiting hydrophobic character in close proximity to a hydrogen bonding region, although hydrophobic regions may contain some hydrogen bonding character. Compounds of this class would include, without limitation, substituents capable of giving steric volume in a spatial region that would otherwise encapsulate the manganese and carbonate coordinated phosphate backbone characteristic of a compound identified as (Mn2 +) 3. (HC03-) 12ATP. With the 3-D structural data described above by hand and knowing the chemical structure (eg amino acid sequence in the case of a protein) of the region of interest, those skilled in the art would be able to make compounds with the properties described above. Such methods include chemical synthetic methods and, in the case of proteins, recombinant methods (see above). For example, cysteine residues appropriately placed in a compound to form disulfide bonds may be used to restrict the compound or a domain of the compound to an appropriate 3-D structure. Also, in a compound that is a polypeptide or includes a domain that is a polypeptide, one skilled in the art would know which amino acids to include and in what sequence to include them to generate, for example, α-helices, β structures, or loops. or sharp curves in the main polypeptide chain.

Embora não essencial, os métodos com base em computador podem ser usados para projetar os compostos da invenção. Programas de computação apropriados incluem: Insightll (Accelrys), CATALYST (Accelrys), LUDI (Accelrys., San Diego, CA), Aladdin (Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA); e LEGEND [Nishibata et al. (1985) J. Med. Chem. 36(20):2921 -2928].Although not essential, computer-based methods can be used to design the compounds of the invention. Suitable computer programs include: Insightll (Accelrys), CATALYST (Accelrys), LUDI (Accelrys., San Diego, CA), Aladdin (Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA); and LEGEND [Nishibata et al. (1985) J. Med. Chem. 36 (20): 2921-2928].

Compostos da invenção que são peptídeos também incluem a- queles descritos acima, mas modificados para o uso in vivo mediante a adi- ção, nas terminações amino e/ou carboxila-terminais, de um agente de blo- queio para facilitar a sobrevivência do polipeptídeo relevante in vivo. Isto po- de ser útil naquelas situações em que os términos do peptídeo tendem ser degradados através de proteases antes da absorção celular. Tais agentes de bloqueio podem incluir, sem limitação, seqüências de peptídeo relaciona- das ou não relacionadas adicionais que podem ser ligadas aos resíduos terminais de amino e/ou carboxila do peptídeo a ser administrado. Isto pode ser feito ou quimicamente durante a síntese do peptídeo ou por tecnologia de DNA recombinante através de métodos familiares aos artesãos versados.Compounds of the invention which are peptides also include those described above, but modified for in vivo use by the addition, at the amino and / or carboxy terminal termini, of a blocking agent to facilitate polypeptide survival. relevant in vivo. This may be useful in those situations where peptide termini tend to be degraded by proteases prior to cell absorption. Such blocking agents may include, without limitation, additional related or unrelated peptide sequences that may be linked to the amino and / or carboxyl terminal residues of the peptide to be administered. This can be done either chemically during peptide synthesis or by recombinant DNA technology by methods familiar to those skilled in the art.

Alternativamente, agentes de bloqueio tais como ácido piroglu- tâmico ou outras moléculas conhecidas na técnica podem ser ligados aos resíduos terminais de amino e/ou carboxila, ou o grupo amino ao término de amino ou grupo carboxila ao término de carboxila podem ser substituídos com uma metade diferente. Igualmente, os compostos de peptídeo podem ser covalente ou não-covalentemente acoplados às proteínas-veículo farma- ceuticamente aceitáveis antes da administração.Alternatively, blocking agents such as pyrogluamic acid or other molecules known in the art may be attached to the amino and / or carboxyl terminal residues, or the amino group at the amino terminus or carboxyl group at the carboxyl terminus may be substituted with one. Different half. Also, the peptide compounds may be covalently or non-covalently coupled to pharmaceutically acceptable carrier proteins prior to administration.

Também de interesse são os compostos peptidomiméticos que são projetados com base nas seqüências de aminoácido dos compostos da invenção que são peptídeos. Compostos peptidomiméticos são compostos sintéticos tendo uma conformação tridimensional (isto é, um "motivo de pep- tídeo") que é substancialmente igual à conformação tridimensional de um peptídeo selecionado. Compostos peptidomiméticos podem ter característi- cas adicionais que intensificam sua utilidade in vivo, tais como permeabilida- de de célula aumentada e meia-vida biológica prolongada.Also of interest are peptidomimetic compounds which are designed based on the amino acid sequences of the compounds of the invention which are peptides. Peptidomimetic compounds are synthetic compounds having a three-dimensional conformation (i.e., a "peptide motif") that is substantially the same as the three-dimensional conformation of a selected peptide. Peptidomimetic compounds may have additional features that enhance their usefulness in vivo, such as increased cell permeability and prolonged biological half-life.

Os peptidomiméticos tipicamente têm uma cadeia principal que é parcial ou completamente não-peptídica, mas com grupos laterais que são idênticos aos grupos laterais dos resíduos de aminoácido que ocorrem no peptídeo no qual o peptidomimético é com base. Vários tipos de ligações químicas, por exemplo, ligações de éster, tioéster, tiomida, retroamida, car- bonila reduzida, dimetileno e cetometileno, são conhecidas na técnica ser em geral os substitutos úteis para ligações de peptídeo na construção de peptidomiméticos resistentes à protease.Peptidomimetics typically have a backbone that is partially or completely non-peptide, but with side groups that are identical to the side groups of amino acid residues that occur in the peptide on which the peptidomimetic is based. Various types of chemical bonds, for example ester, thioester, thiomide, retroamide, reduced carbon, dimethylene and ketomethylene bonds, are known in the art to be generally useful substitutes for peptide bonds in the construction of protease resistant peptidomimetics.

Compostos de molécula pequena que são análogos de um com- plexo de (Mn2+)3.(HC03*)i2ATP e/ou que podem ligar ao sítio de fosforil transferase são de interesse particular. Informação adicional sobre classes particulares de moléculas pequenas é fornecida abaixo, como também me- todologias sintéticas para preparação de tais moléculas.Small molecule compounds that are analogous to a (Mn2 +) 3. (HC03 *) i2ATP complex and / or which may bind to the phosphoryl transferase site are of particular interest. Additional information on particular classes of small molecules is provided below, as well as synthetic methodologies for preparing such molecules.

Ensaios de TriagemScreening Assays

Fornecidos aqui também são os métodos in vitro para identificar compostos que inibem a atividade de GS, incluindo atividade de GS adenili- lada, tal como a atividade de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada.Provided herein are also in vitro methods for identifying compounds that inhibit GS activity, including adenylated GS activity, such as the phosphoryl transferase activity of an adenylated GS polypeptide.

A especificidade da inibição de GS adenililada conta com o fato que os mecanismos de reação, a estrutura do sítio ativo, e a estrutura dos intermediários de reação diferem daqueles da GS desadenililada. Em méto- dos de triar para compostos que inibem a ligação de um complexo de (Mn2+)3.(HCO3-)12ATP, ou uma porção do mesmo, a um polipeptídeo de GS1 por exemplo, um polipeptídeo de GS adenililada, e em particular o sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada por meio de um intermediário de carboxifosfato, um polipeptídeo de GS, incluindo um poli- peptídeo de GS adenililada, pode ser contatado com um composto de teste sob condições de ensaio específicas eficazes para transferência de fosforila de um polipeptídeo de GS adenililada ocorrer.The specificity of inhibition of adenylylated GS relies on the fact that the reaction mechanisms, the structure of the active site, and the structure of the reaction intermediates differ from those of the deadenylated GS. In triad methods for compounds that inhibit the binding of a (Mn2 +) 3. (HCO3-) 12ATP complex, or a portion thereof, to a GS1 polypeptide for example, an adenylylated GS polypeptide, and in particular the phosphoryl transferase site of an adenylylated GS polypeptide via a carboxyphosphate intermediate, a GS polypeptide, including an adenylylated GS polypeptide, may be contacted with a test compound under specific assay conditions effective for transfer of phosphorylation of an adenylylated GS polypeptide occurs.

Ensaios para avaliar atividade para GS adenililada são tipica- mente diferentes daqueles para GS desadenililada. O ensaio de GS adenili- lada pode ser operado em pH 6,3 e uma razão de concentração de HCO3" para Mn2+ para ATP de 12:3:1, enquanto o ensaio de GS desadenililada po- de ser operado em pH 7,2 e uma razão de concentração de Mg2+ para ATP de 1:1. Condições de ensaio típicas para GS adenililada são 20 mM de tam- pão de Imidazol (pH 6,3), 1 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaH- CO3, 4 mM de NH4CI e 2 mM de glutamato de sódio; enquanto condições de ensaio típicas para GS desadenililada são 20 mM de tampão de Imidazol (pH 7,2), 1 mM de ATP, 1 mM de MgCI2, 12 mM de NaCI, 4 mM de NH4CI e 2 mM de glutamato de sódio. Os ensaios podem ser operados a 37QC.Assays for assessing activity for adenylated GS are typically different from those for desadenylated GS. The adenylated GS assay can be operated at pH 6.3 and a HCO3 "to Mn2 + to ATP concentration ratio of 12: 3: 1, while the desadenylated GS assay can be operated at pH 7.2 and a Mg2 + to ATP concentration ratio of 1: 1. Typical test conditions for adenylylated GS are 20 mM Imidazole buffer (pH 6.3), 1 mM ATP, 3 mM MnCl2, 12 mM NaH-CO 3, 4 mM NH 4 Cl and 2 mM sodium glutamate, while typical assay conditions for desadenylated GS are 20 mM Imidazole buffer (pH 7.2), 1 mM ATP, 1 mM MgCl 2, 12 mM NaCl, 4 mM NH 4 Cl and 2 mM sodium glutamate Assays can be operated at 37 ° C.

Hidrólise de ATP, produção de ADP e/ou utilização de glutamato e produção de glutamina podem ser medidas na presença e ausência do composto de teste. Por exemplo, em uma modalidade, um método de triar um composto de teste in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada inclui:ATP hydrolysis, ADP production and / or glutamate utilization and glutamine production can be measured in the presence and absence of the test compound. For example, in one embodiment, a method of screening an in vitro test compound to determine whether or not to inhibit the phosphoryl transferase site activity of an adenylylated GS polypeptide includes:

(a) contatar um polipeptídeo de GS adenililada com um compos- to de teste sob condições eficazes para atividade de fosforil transferase; e(a) contacting an adenylylated GS polypeptide with a test compound under conditions effective for phosphoryl transferase activity; and

(b) determinar se ou não a atividade de fosforil transferase do polipeptídeo de GS adenililada é reduzida com relação à atividade de um(b) determining whether or not adenylylated GS polypeptide phosphoryl transferase activity is reduced with respect to the activity of a

polipeptídeo de GS adenililada que não foi contatado com um composto de teste. A atividade do sítio de fosforil transferase pode ser mediada por um intermediário de carboxifosfato. Qualquer atividade de inibidor pode ser comparada com a inibição obtida para o composto de teste em um polipeptí- deo de GS desadenililada.adenylylated GS polypeptide that was not contacted with a test compound. Phosphoryl transferase site activity can be mediated by a carboxyphosphate intermediate. Any inhibitor activity can be compared to the inhibition obtained for the test compound in a deadenylated GS polypeptide.

Compostos e Composições FarmacêuticasPharmaceutical Compounds and Compositions

Fornecidos aqui também são compostos, por exemplo, compos- tos para inclusão em composições farmacêuticas e/ou para o uso nos méto- dos descritos aqui. Com base na informação estrutural e mecanística sobre o sítio de transferência de fosforila de GS, como demonstrado aqui e nos Exemplos abaixo, vários moléculas semelhantes a pirimidina e purina e aná- logos relacionados foram projetadas e preparadas para avaliar seu efeito inibidor na atividade de GS adenililada do sítio de fosforil transferase. Por exemplo, vários análogos foram considerados com base em adenina, com combinações variadas de características espaciais, redes de ligação de hi- drogênio, e padrões de polaridade ao redor do anel de 6 membros. Estes análogos incluíram tanto os compostos bicíclicos 5,6 fundidos, compostos bicíclicos 6,6 fundidos, compostos bicíclicos 6,6, e análogos de adenina com capacidade de coordenação de metal. Os compostos podem ser usados pa- ra inibir atividade de GS adenililada; inibir o crescimento de bactérias tendo um gene de GSI-β, incluindo Mycobacterium tuberculosis; e tratar, prevenir, ou melhorar mamíferos tendo, em risco de ter, ou suspeitos de ter, uma in- fecção bacteriana (por exemplo, infetado com Mycobacterium tuberculosis).Also provided herein are compounds, for example, compounds for inclusion in pharmaceutical compositions and / or for use in the methods described herein. Based on the structural and mechanistic information about the GS phosphoryl transfer site, as demonstrated here and in the Examples below, various pyrimidine and purine-like molecules and related analogs were designed and prepared to assess their inhibitory effect on GS activity. adenylylated phosphoryl transferase site. For example, various analogs were considered adenine-based, with varying combinations of spatial characteristics, hydrogen bonding networks, and polarity patterns around the 6-membered ring. These analogs included both fused bicyclic 5.6 compounds, fused bicyclic 6.6 compounds, bicyclic compounds 6.6, and metal coordinating adenine analogs. The compounds may be used to inhibit adenylylated GS activity; inhibit the growth of bacteria having a GSI-β gene, including Mycobacterium tuberculosis; and treating, preventing, or ameliorating mammals at risk of, or suspected of having, a bacterial infection (e.g., infected with Mycobacterium tuberculosis).

Conseqüentemente, em algumas modalidades, um composto para o uso nos métodos ou para inclusão em uma composição descrita aqui pode ser de acordo com a fórmula I:Accordingly, in some embodiments, a compound for use in the methods or for inclusion in a composition described herein may be according to formula I:

<formula>formula see original document page 32</formula><formula> formula see original document page 32 </formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein:

R1 é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R7;R1 is hydrogen, halo, OR5, or NR6R7;

R2 é hidrogênio, halo, ou NR7Re;R2 is hydrogen, halo, or NR7 Re;

R3 é hidrogênio, halo, ou NR6Ry', R4 é SR5, NR6R7 ou Η;R3 is hydrogen, halo, or NR6Ry ', R4 is SR5, NR6R7 or Η;

R5 é Η, C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila; eR 5 is Η, C 1 -C 2 substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl; and

R6, R7, e R8 são, cada independentemente, selecionados de H; acila; hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substitu- ída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; ou NR7R8 pode ser na forma de N = O,R6, R7, and R8 are each independently selected from H; acyl; hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together; or NR7R8 may be in the form of N = O,

em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted moiety whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5, keto, SH, and SO 3 H.

Em algumas modalidades, R6 e/ou R7 e/ou R8 podem ser um grupo alquila ou cicloalquila substituídas, por exemplo, um grupo cicloalquila substituída por hidroxila, tal como uma metade de carboidrato. Em algumas modalidades, Ri é cloreto. Em algumas modalidades, R2 é NR7R8. Em algumas modalidades, R4 é H.In some embodiments, R 6 and / or R 7 and / or R 8 may be a substituted alkyl or cycloalkyl group, for example, a hydroxyl substituted cycloalkyl group, such as a carbohydrate moiety. In some embodiments, Ri is chloride. In some embodiments, R2 is NR7R8. In some embodiments, R4 is H.

Em algumas modalidades, Ri é NR6R7 onde R6 é H e R7 são metila, benzila, 2-hidroxietila, 4-bromofenila ou 2-piridila.In some embodiments, R 1 is NR 6 R 7 where R 6 is H and R 7 are methyl, benzyl, 2-hydroxyethyl, 4-bromophenyl or 2-pyridyl.

Em algumas modalidades, R2 é nitroso, amino, bromo, aminoal- quila ou aminoarila, tal como benzilamino.In some embodiments, R 2 is nitrous, amino, bromine, aminoalkyl or aminoaryl, such as benzylamino.

Em algumas modalidades, R3 é cloro, dimetilamino, pirrolidino, morfolino ou 2-(pirrolidin-1-il)carboxilato.In some embodiments, R 3 is chloro, dimethylamino, pyrrolidino, morpholino or 2- (pyrrolidin-1-yl) carboxylate.

Em uma modalidade, R4 é H, R1 é NR6R7 onde R6 é H e R7 é benzila, R2 é nitroso e R3 é cloro. Em outra modalidade, R4 é H, R1 é NR6R7 onde R6 é H e R7 é 2-hidroxietila, R2 é amino e R3 é pirrolidino. Compostos 97, 105 e 111 como descritos mais abaixo são também modalidades particu- lares da fórmula I.In one embodiment, R 4 is H, R 1 is NR 6 R 7 where R 6 is H and R 7 is benzyl, R 2 is nitrous and R 3 is chloro. In another embodiment, R 4 is H, R 1 is NR 6 R 7 where R 6 is H and R 7 is 2-hydroxyethyl, R 2 is amino and R 3 is pyrrolidine. Compounds 97, 105 and 111 as described below are also particular embodiments of formula I.

Compostos de acordo com a fórmula I podem ser preparados usando métodos padrões de química sintética, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.Compounds according to formula I may be prepared using standard synthetic chemistry methods, for example as shown in the Examples below.

Em alguns casos, um composto pode ser de acordo com a fór- mula II:In some cases, a compound may be according to formula II:

<formula>formula see original document page 34</formula><formula> formula see original document page 34 </formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein:

Ri é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R?;R 1 is hydrogen, halo, OR 5, or NR 6 R ';

R4 é hidrogênio, SR5, NR6R?, ou OR5;R4 is hydrogen, SR5, NR6R ', or OR5;

R5 é H, C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila;R 5 is H, C 1 -C 2 substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl;

R6, R7, e R8 são, cada independentemente, selecionados de H; acila; hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substitu- ída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; ou NR7R8 pode ser na forma de N = O;R6, R7, and R8 are each independently selected from H; acyl; hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together; or NR7 R8 may be in the form of N = O;

Rg é H, halo, ou alquila substituída ou não-substituída, arila, he- terocíclico, heteroarila, OR5, ou NR6R7;Rg is H, halo, or substituted or unsubstituted alkyl, aryl, heterocyclic, heteroaryl, OR5, or NR6R7;

XeY podem ser, independentemente, N ou CH; e em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.XeY may independently be N or CH; and wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted moiety whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5, keto, SH, and SO 3 H.

Em algumas modalidades, R1 é OH ou NH2.In some embodiments, R1 is OH or NH2.

Em algumas modalidades, R4 é H, OH ou NH2.In some embodiments, R 4 is H, OH or NH 2.

Em algumas modalidades, R6 é H ou alquila. Em algumas modalidades, R9 é alquila substituída, alquenila, alquinila ou arila. Em algumas modalidades, Rg é alquila amino-substituída.In some embodiments, R 6 is H or alkyl. In some embodiments, R 9 is substituted alkyl, alkenyl, alkynyl or aryl. In some embodiments, Rg is amino-substituted alkyl.

Em uma modalidade, R4 é H, R6 é benzila e R9 é H e R1 é NR6R? onde R6 é metila e R7 é metila. Em outra modalidade, R4 é NH2, R1 é OH, R6 é H e Rg é fenila. Composto 81, descrito mais abaixo, é um exemplo de um composto de acordo com a fórmula II.In one embodiment, R4 is H, R6 is benzyl and R9 is H and R1 is NR6R? where R6 is methyl and R7 is methyl. In another embodiment, R 4 is NH 2, R 1 is OH, R 6 is H and R 6 is phenyl. Compound 81, described below, is an example of a compound according to formula II.

Compostos de acordo com a fórmula II podem ser preparados por alguém tendo habilidade usual na técnica usando métodos sintéticos padrões e/ou os protocolos detalhados nos Exemplos, abaixo. Em algumas modalidades, os compostos de acordo com a fórmula II podem ser derivados de compostos da fórmula I, por exemplo, por substituição apropriada e mé- todos de fechamento de anel.Compounds according to formula II may be prepared by one having ordinary skill in the art using standard synthetic methods and / or the protocols detailed in the Examples, below. In some embodiments, compounds according to formula II may be derived from compounds of formula I, for example, by appropriate substitution and ring closure methods.

Um composto, por exemplo para o uso nos métodos descritos aqui, pode também ser de acordo com a fórmula III:A compound, for example for use in the methods described herein, may also be according to formula III:

<formula>formula see original document page 35</formula><formula> formula see original document page 35 </formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein:

R1 é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R7;R1 is hydrogen, halo, OR5, or NR6R7;

R4 é hidrogênio, SR5, NR6R7, ou OR5;R4 is hydrogen, SR5, NR6R7, or OR5;

R5 é H, C1 -C20 alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila;R 5 is H, C 1 -C 20 substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl;

R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos;R6 and R7 are each independently selected from H; acyl, hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together;

X,Y pode ser independentemente CH ou N;X, Y may be independently CH or N;

em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH1 e SO3H.wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted moiety whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5, keto, SH 1 and SO 3 H.

Em algumas modalidades, R1 é OH ou H.In some embodiments, R1 is OH or H.

Em algumas modalidades, R4 é H, OH ou NH2.In some embodiments, R 4 is H, OH or NH 2.

Em algumas modalidades, R6 é OH ou H.In some embodiments, R6 is OH or H.

Em algumas modalidades, R7 é H ou alquila substituída.In some embodiments, R 7 is H or substituted alkyl.

Compostos de acordo com a fórmula III podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca. Em alguns casos, os compostos de acordo com a fórmula I podem ser convertidos em um composto da fórmula III, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.Compounds according to formula III may be prepared using standard synthetic methods known to those skilled in the art. In some cases, compounds according to formula I may be converted to a compound of formula III, for example, as shown in the Examples below.

Em algumas modalidades, um composto pode ser de acordo com a fórmula IV:In some embodiments, a compound may be according to formula IV:

<formula>formula see original document page 36</formula><formula> formula see original document page 36 </formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein:

R11 é hidrogênio ou C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila po- dem ser lineares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não- substituída ou heteroarila; em que 1-3 substituintes são permitidos em qual- quer metade substituída de R11 cujos substituintes podem ser independen- temente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H; eR11 is hydrogen or substituted or unsubstituted C1 -C20 alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl; wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted half of R 11 whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5, keto, SH, and SO3H; and

R12 é alquila não-substituída ou substituída ou alquenila, ou arila não-substituída ou substituída, em que os substituintes de R12 podem ser selecionados de NH2, OH, COOH, CHO, NCHO, CONH2, halo, OR5, CO2R5, e NR6R7, em que:R 12 is unsubstituted or substituted alkyl or alkenyl, or unsubstituted or substituted aryl, wherein R 12 substituents may be selected from NH 2, OH, COOH, CHO, NCHO, CONH 2, halo, OR 5, CO 2 R 5, and NR 6 R 7, on what:

R5 é H, C1-C20 alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila; eR 5 is H, C 1 -C 20 substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl; and

R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; eR6 and R7 are each independently selected from H; acyl, hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together; and

em que 1 -3 substituintes são independentemente permitidos em uma metade substituída de R5, R6, ou R7 cujos substituintes podem ser in- dependentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroa- rila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.wherein 1-3 substituents are independently allowed on a substituted moiety of R 5, R 6, or R 7 whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5 , keto, SH, and SO3H.

Em algumas modalidades, Rn é alquila ou H.In some embodiments, Rn is alkyl or H.

Em algumas modalidades, R12 é arila não-substituída ou substi- tuída ou alquenila, por exemplo, tendo de 1 a 10 átomos de C.In some embodiments, R 12 is unsubstituted or substituted aryl or alkenyl, for example having from 1 to 10 C atoms.

Compostos de acordo com a fórmula IV podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.Compounds according to formula IV may be prepared using standard synthetic methods known to those skilled in the art, for example, as shown in the Examples below.

Em algumas modalidades, um composto pode ser de acordo com a fórmula V:In some embodiments, a compound may be according to formula V:

<formula>formula see original document page 37</formula><formula> formula see original document page 37 </formula>

R1 é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R7; R5 é H, C1-C20 alquila substituída ou não-substituída, alquenila,R1 is hydrogen, halo, OR5, or NR6R7; R5 is H, C1 -C20 substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl,

ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila;or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl;

R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos;R6 and R7 are each independently selected from H; acyl, hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together;

R13 é independentemente alquila substituída ou não-substituída, arila, heteroarila, ou cicloalquila; R14 é H ou NHR15 onde R15 é independentemente alquila substi- tuída ou não-substituída, arila, heteroarila, ou cicloalquila;R 13 is independently substituted or unsubstituted alkyl, aryl, heteroaryl, or cycloalkyl; R 14 is H or NHR 15 where R 15 is independently substituted or unsubstituted alkyl, aryl, heteroaryl, or cycloalkyl;

X e Y podem ser, independentemente, N ou CH; eX and Y may independently be N or CH; and

em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted moiety whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5, keto, SH, and SO 3 H.

Em algumas modalidades, R1 é H.In some embodiments, R1 is H.

Em algumas modalidades, R13 é arila substituída ou não- substituída.In some embodiments, R 13 is substituted or unsubstituted aryl.

Em algumas modalidades, R14 é arila substituída ou não- substituída, alquila ou cicloalquila.In some embodiments, R 14 is substituted or unsubstituted aryl, alkyl or cycloalkyl.

Em algumas modalidades, X e Y são ambos CH.In some embodiments, X and Y are both CH.

Composto 117, como descrito mais abaixo, é um exemplo de um composto de acordo com a fórmula V.Compound 117, as described below, is an example of a compound according to formula V.

Compostos de acordo com a fórmula V podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca. Em alguns casos, os compostos de acordo com a fórmula V podem ser preparados em uma reação de acoplamento de 3 componentes usando uma amina heteroaromática, um aldeído e um isocianeto, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.Compounds according to formula V may be prepared using standard synthetic methods known to those skilled in the art. In some cases, compounds according to formula V may be prepared in a 3-component coupling reaction using a heteroaromatic amine, an aldehyde and an isocyanide, for example, as shown in the Examples below.

Em algumas modalidades, um composto pode ser de acordo com a fórmula VI:In some embodiments, a compound may be according to formula VI:

<formula>formula see original document page 38</formula><formula> formula see original document page 38 </formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein:

R13 é hidrogênio ou C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila po- dem ser lineares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não- substituída ou heteroarila; em que 1-3 substituintes são permitidos em qual- quer metade substituída de R13 cujos substituintes podem ser independen- temente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH1 e SO3H; eR13 is hydrogen or substituted or unsubstituted C1 -C20 alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl; wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted half of R 13 whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR7R8, OR5, keto, SH1 and SO3H ; and

R12 é alquila não-substituída ou substituída ou alquenila, ou arila não-substituída ou substituída, em que os substituintes de R12 podem ser selecionados de NH2, OH, COOH, CHO, NCHO, CONH2, halo, OR5, CO2R5, e NR6R7, em que:R 12 is unsubstituted or substituted alkyl or alkenyl, or unsubstituted or substituted aryl, wherein R 12 substituents may be selected from NH 2, OH, COOH, CHO, NCHO, CONH 2, halo, OR 5, CO 2 R 5, and NR 6 R 7, on what:

R5 é H, C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila; eR 5 is H, C 1 -C 2 substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, or alkynyl, wherein the alkyl, alkenyl, or alkynyl groups may be straight, branched, or cyclic; or substituted or unsubstituted aryl or heteroaryl; and

R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; eR6 and R7 are each independently selected from H; acyl, hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together; and

em que 1 -3 substituintes são independentemente permitidos em uma metade substituída de R5, R6, ou R7 cujos substituintes podem ser in- dependentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroa- rila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H. Em algumas modalidades, R13 é H.wherein 1-3 substituents are independently allowed on a substituted moiety of R 5, R 6, or R 7 whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5 , keto, SH, and SO3H. In some embodiments, R13 is H.

Em algumas modalidades, R12 é arila substituída ou não- substituída ou alquenila.In some embodiments, R 12 is substituted or unsubstituted aryl or alkenyl.

Compostos de acordo com a fórmula VI podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca. Em algumas modalidades, os compostos de acordo com a fórmula VI podem ser derivados dos compostos da fórmula IV, por exemplo, através de métodos hidrolíticos apropriados, como mostrado nos Exemplos abaixo.Compounds according to formula VI may be prepared using standard synthetic methods known to those skilled in the art. In some embodiments, compounds according to formula VI may be derived from compounds of formula IV, for example, by appropriate hydrolytic methods, as shown in the Examples below.

Um composto, por exemplo, para o uso nos métodos descritos aqui, pode também ser de acordo com a fórmula VII: <formula>formula see original document page 40</formula>A compound, for example for use in the methods described herein, may also be according to formula VII: <formula> formula see original document page 40 </formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein:

R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; eR6 and R7 are each independently selected from H; acyl, hydroxyl; and substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups; or R 6 and R 7 may form a substituted or unsubstituted cycloalkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl group together; and

Ri4 é H; acila, grupos alquila substituída ou não-substituída, ci- cloalquila, arila, ou heteroarila;R14 is H; acyl, substituted or unsubstituted alkyl, cycloalkyl, aryl, or heteroaryl groups;

em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.wherein 1-3 substituents are allowed on any substituted moiety whose substituents may be independently selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, halo, carboxylate, amide, NR 7 R 8, OR 5, keto, SH, and SO 3 H.

Em algumas modalidades, R6 é H.In some embodiments, R6 is H.

Em algumas modalidades, Ri4 é H.In some embodiments, Ri4 is H.

Compostos de acordo com a fórmula Vll podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.Compounds according to formula VII may be prepared using standard synthetic methods known to those skilled in the art, for example, as shown in the Examples below.

Preparação dos CompostosCompound Preparation

Os compostos para uso nas composições e métodos fornecidos aqui podem ser obtido de fontes comerciais (por exemplo, Sigma, Aldrich, Riedel de Hah, Merck, e Acros) ou podem ser preparados por métodos bem- conhecidos aqueles versados na técnica ou pelos métodos mostrados aqui. Alguém versado na técnica poderia preparar todos os compostos para uso aqui através de modificação rotineira destes métodos usando os materiais de partida apropriados.The compounds for use in the compositions and methods provided herein may be obtained from commercial sources (e.g., Sigma, Aldrich, Riedel de Hah, Merck, and Acros) or may be prepared by methods well known to those skilled in the art or by the methods shown. on here. One skilled in the art could prepare all compounds for use herein by routinely modifying these methods using the appropriate starting materials.

Formulação das Composições FarmacêuticasFormulation of Pharmaceutical Compositions

Uma composição farmacêutica fornecida aqui contém quantida- des terapeuticamente eficazes de um ou mais dos compostos fornecidos aqui que são úteis no tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais dos sintomas associados a uma infecção bacteriana (por exemplo, uma bactéria contendo o gene de GSI-β, tal como Mycobacterium tuberculosis), ou um distúrbio, condição, ou doença em que um tal infecção bacteriana está impli- cada ou suspeita, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos far- macêuticos adequados para administração dos compostos fornecidos aqui incluem quaisquer tais veículos conhecidos aqueles versados na técnica se- rem adequados para o modo particular de administração.A pharmaceutical composition provided herein contains therapeutically effective amounts of one or more of the compounds provided herein which are useful in treating, preventing, or ameliorating one or more of the symptoms associated with a bacterial infection (e.g., a bacterium containing the GSI-β, such as Mycobacterium tuberculosis), or a disorder, condition, or disease in which such bacterial infection is implicated or suspected, and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical carriers suitable for administration of the compounds provided herein include any such carriers known in the art to be suitable for the particular mode of administration.

Além disso, os compostos podem ser formulados farmaceutica- mente como o único componente ativo na composição ou podem ser combi- nados com outros componentes ativos. Por exemplo, os compostos podem ser formulados ou combinados com compostos antibacterianos conhecidos, compostos antiinflamatórios, esteróides, e/ou antivirais.In addition, the compounds may be formulated pharmaceutically as the sole active component in the composition or may be combined with other active components. For example, the compounds may be formulated or combined with known antibacterial compounds, anti-inflammatory, steroid, and / or antiviral compounds.

As composições contêm um ou mais compostos fornecidos aqui. Os compostos são, em uma modalidade, formulados em preparações farma- cêuticas adequadas tais como soluções, suspensões, tabletes, tabletes dis- persáveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação contínua ou elixi- res, para administração oral ou em soluções ou suspensões estéreis para administração parenteral, como também preparação de emplasto transdér- mico e inaladores de pó seco. Em uma modalidade, os compostos descritos acima são formulados em composições farmacêuticas usando técnicas e procedimentos bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ansel Intro- duction to Pharmaceutical Dosage Forms, Quarta Edição 1985, 126).The compositions contain one or more compounds provided herein. The compounds are, in one embodiment, formulated into suitable pharmaceutical preparations such as solutions, suspensions, tablets, disposable tablets, pills, capsules, powders, continuous release formulations or elixirs, for oral administration or in solutions or sterile suspensions for parenteral administration, as well as preparation of transdermal patch and dry powder inhalers. In one embodiment, the compounds described above are formulated into pharmaceutical compositions using techniques and procedures well known in the art (see, for example, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126).

Nas composições, concentrações eficazes de um ou mais com- postos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são mistu- radas com um veículo farmacêutico adequado. Os compostos podem ser derivatizados como os sais correspondentes, ésteres, éteres de enol ou és- teres, acetais, cetais, ortoésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidratos ou pró-fármacos antes da formulação, como descrito aci- ma. As concentrações dos compostos nas composições são eficazes para liberação de uma quantidade, sob administração, que trata, impede, ou me- lhora um ou mais dos sintomas de uma infecção bacteriana. Em uma modalidade, as composições são formuladas para ad- ministração de dosagem simples. Para formular uma composição, a fração em peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou do contrário mis- turada em um veículo selecionado a uma concentração eficaz de modo que a condição tratada é aliviada ou um ou mais sintomas são melhorados.In the compositions, effective concentrations of one or more pharmaceutically acceptable compounds or derivatives thereof are mixed with a suitable pharmaceutical carrier. The compounds may be derivatized as the corresponding salts, esters, enol ethers or esters, acetals, ketals, orthoesters, hemiacetals, hemicetals, acids, bases, solvates, hydrates or prodrugs prior to formulation as described above. . Concentrations of the compounds in the compositions are effective for releasing an amount under administration that treats, prevents, or ameliorates one or more of the symptoms of a bacterial infection. In one embodiment, the compositions are formulated for single dosage administration. To formulate a composition, the weight fraction of the compound is dissolved, suspended, dispersed or otherwise mixed in a selected vehicle at an effective concentration so that the treated condition is alleviated or one or more symptoms are ameliorated.

O composto ativo é incluído no veículo farmaceuticamente acei- tável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no paciente tratado. A con- centração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente tes- tando os compostos em sistemas in vitro, ex vivo e in vivo, e depois extrapo- lados desta para dosagens em seres humanos.The active compound is included in the pharmaceutically acceptable carrier in an amount sufficient to exert a therapeutically useful effect in the absence of undesirable side effects in the treated patient. The therapeutically effective concentration can be determined empirically by testing the compounds in in vitro, ex vivo and in vivo systems, and then extrapolated thereof to human dosages.

A concentração do composto ativo na composição farmacêutica dependerá das taxas de absorção, inativação e excreção do composto ativo, as características fisicoquímicas do composto, o horário de dosagem, e quantidade administrada como também outros fatores conhecidos aqueles versados na técnica.The concentration of active compound in the pharmaceutical composition will depend upon the absorption, inactivation and excretion rates of the active compound, the physicochemical characteristics of the compound, the dosing schedule, and amount administered as well as other known factors to those skilled in the art.

Formas de unidade de dosagem farmacêuticas são preparadas para fornecer de cerca de 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg a cerca de 500 mg, 1000 mg ou 2000 mg, e em uma modalidade de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg do componente ativo ou uma combinação de componentes essenciais para a forma de unidade de dosagem.Pharmaceutical unit dosage forms are prepared to provide from about 0.01 mg, 0.1 mg or 1 mg to about 500 mg, 1000 mg or 2000 mg, and in an embodiment from about 10 mg to about 500 mg. mg of the active ingredient or a combination of components essential to the unit dosage form.

O componente ativo pode ser administrado imediatamente, ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em inter- valos de tempo. É entendido que a dosagem precisa e duração do tratamen- to são uma função do distúrbio sendo tratado e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de testagem conhecidos ou através de extrapolação de dados de teste in vivo ou in vitro. É para ser observado que as concentrações e valores de dosagem podem também variar com a seve- ridade da condição a ser aliviada. É para ser também entendido que para qualquer sujeito particular, regimes de dosagem específicos deveriam ser ajustados com o passar do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições, e que a faixa de concentração exposta aqui é exemplar apenas e não é intencionado limitar o escopo ou prática das composições reivindicadas.The active ingredient may be administered immediately, or may be divided into several smaller doses to be administered over time intervals. It is understood that the precise dosage and duration of treatment is a function of the disorder being treated and may be determined empirically using known testing protocols or by extrapolating test data in vivo or in vitro. It is to be noted that concentrations and dosage values may also vary with the severity of the condition to be alleviated. It is also to be understood that for any particular subject, specific dosage regimens should be adjusted over time according to the individual need and professional judgment of the person administering or supervising the administration of the compositions, and that the exposed concentration range herein is exemplary only and is not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.

Em circunstâncias em que os compostos exibe solubilidade insu- ficiente, métodos para solubilizar os compostos podem ser usados. Tais mé- todos são conhecidos aqueles versados na técnica, e incluem, mas não são limitados a, usar co-solventes, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), usando tensoativos, tais como TWEEN®, ou dissolução em bicarbonato de sódio aquoso. Derivados dos compostos, tais como pró-fármacos dos compostos, podem também ser usados na formulação de composições farmacêuticas eficazes.In circumstances where the compounds exhibit insufficient solubility, methods for solubilizing the compounds may be used. Such methods are known to those skilled in the art, and include, but are not limited to, using co-solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO) using surfactants such as TWEEN® or dissolving in aqueous sodium bicarbonate. Derivatives of the compounds, such as prodrugs of the compounds, may also be used in the formulation of effective pharmaceutical compositions.

Sob mistura ou adição do(s) composto(s), a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou outras. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo intencionado de ad- ministração e a solubilidade do composto no carreador ou veículo seleciona- do. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, distúrbio ou condição tratada e pode ser determinada empiricamente.Upon mixing or addition of the compound (s), the resulting mixture may be a solution, suspension, emulsion or the like. The shape of the resulting mixture depends on a number of factors, including the intended mode of administration and the solubility of the compound in the selected carrier or carrier. Effective concentration is sufficient to ameliorate the symptoms of the disease, disorder or condition treated and can be determined empirically.

As composições farmacêuticas são providas para administração aos seres humanos e animais em formas de dosagem de unidade, tais como tabletes, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parente- rais estéreis, e soluções ou suspensões orais, e emulsões de óleo-água con- tendo quantidades adequadas dos compostos ou derivados farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos. O composto farmacêutica e terapeuticamente ativo, e derivados do mesmo, é, em uma modalidade, formulado e adminis- trado em formas de dosagem de unidade ou formas de dosagem múltipla. Forma de dose de unidade como aqui usado refere-se às unidades fisica- mente distintas adequadas para o ser humano e animais e empacotadas individualmente como é conhecido na técnica. Cada dose de unidade con- tém uma quantidade predeterminada do composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo, veículo ou diluente farmacêutico requerido. Exemplos de formas de dose de unidade incluem ampolas e seringas e tabletes ou cápsulas indivi- dualmente empacotados. As formas de dose de unidade podem ser adminis- tradas em frações ou múltiplos destas. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem de unidade idênticas empacotadas em um só recipiente a ser administrado em forma de dose de unidade segrega- da. Exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos, garrafas de table- tes ou cápsulas ou garrafas de quartilhos ou galões. Conseqüentemente, a forma de dose múltipla é um múltiplo de doses de unidade que não são se- gregadas no acondicionamento.Pharmaceutical compositions are provided for administration to humans and animals in unit dosage forms, such as tablets, capsules, pills, powders, granules, sterile parenteral solutions or suspensions, and oral solutions or suspensions, and oil-emulsions. water containing adequate amounts of the pharmaceutically acceptable compounds or derivatives thereof. The therapeutically active pharmaceutical compound, and derivatives thereof, is, in one embodiment, formulated and administered in unit dosage forms or multiple dosage forms. Unit dose form as used herein refers to physically distinct units suitable for humans and animals and individually packaged as known in the art. Each unit dose contains a predetermined amount of the therapeutically active compound sufficient to produce the desired therapeutic effect, in association with the required pharmaceutical carrier, vehicle or diluent. Examples of unit dose forms include ampoules and syringes and individually packaged tablets or capsules. Unit dose forms may be administered in fractions or multiples thereof. A multiple dose form is a plurality of identical unit dosage forms packaged in a single container to be administered in secreted unit dose form. Examples of multiple dose forms include vials, table bottles or capsules or pint or gallon bottles. Consequently, the multiple dose form is a multiple of unit doses that are not segregated in packaging.

Composições líquidas farmaceuticamente administráveis podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo, dispersando, ou do contrário mis- turando um composto ativo como definido acima e adjuvantes farmacêuticos opcionais em um veículo, tais como, por exemplo, água, solução salina de dextrose, aquosa, glicerol, glicóis, etanol, e similares, para assim formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser ad- ministrada pode também conter quantidades secundárias de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes umectantes, agentes emulsifican- tes, agentes solubilizantes, agentes tamponantes de pH e similares, por e- xemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, e ou- tros tais agentes.Pharmaceutically administrable liquid compositions may, for example, be prepared by dissolving, dispersing, or otherwise mixing an active compound as defined above and optional pharmaceutical adjuvants in a carrier, such as, for example, water, aqueous dextrose saline, glycerol, glycols, ethanol, and the like, to thereby form a solution or suspension. If desired, the pharmaceutical composition to be administered may also contain secondary amounts of non-toxic auxiliary substances such as wetting agents, emulsifying agents, solubilizing agents, pH buffering agents and the like, eg acetate, citrate. sodium, cyclodextrin derivatives, sorbitan monolaurate, triethanolamine sodium acetate, triethanolamine oleate, and other such agents.

Métodos atuais de preparar tais formas de dosagem são conhe- cidos, ou serão evidentes, aqueles versados na técnica; por exemplo, Re- mington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15ã Edição, 1975.Current methods of preparing such dosage forms are known or will be apparent to those skilled in the art; for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975.

Formas de dosagem ou composições contendo componente ati- vo na faixa de 0,005 % a 100 % com o equilíbrio composto de veículo não- tóxico podem ser preparadas. Métodos para preparação destas composições são conhecidos aqueles versados na técnica. As composições contempladas podem conter 0,001 %-100 % de componente ativo, ou em uma modalidade 0,1-95%.Dosage forms or compositions containing active component in the range 0.005% to 100% with the non-toxic carrier compound balance may be prepared. Methods for preparing these compositions are known to those skilled in the art. The contemplated compositions may contain 0.001% -100% active ingredient, or in a 0.1-95% embodiment.

1. Composições para Administração Oral1. Compositions for Oral Administration

Formas de dosagem farmacêutica orais são sólidas, em gel ou líquidas. As formas de dosagem sólidas são tabletes, cápsulas, grânulos, e pós de volume. Tipos de tabletes orais incluem pastilhas comprimidas, mas- tigáveis e tabletes que podem ser revestidos entéricos, revestidos com açú- car ou revestidos com filme. Cápsulas podem ser cápsulas de gelatina duras ou macias, enquanto grânulos e pós podem ser fornecidos na forma não- efervescente ou efervescente com a combinação de outros componentes conhecidos aqueles versados na técnica, a. Composições Sólidas para Administração OralOral pharmaceutical dosage forms are solid, gel or liquid. Solid dosage forms are tablets, capsules, granules, and bulk powders. Types of oral tablets include compressed, chewable tablets and tablets that may be enteric coated, sugar coated or film coated. Capsules may be hard or soft gelatin capsules, while granules and powders may be provided in non-effervescent or effervescent form with a combination of other known components to those skilled in the art, a. Solid Compositions for Oral Administration

Em certas modalidades, as formulações são formas de dosagem sólidas, em uma modalidade, cápsulas ou tabletes. Os tabletes, pílulas, cáp- sulas, trociscos e similares pode conter um ou mais dos componentes a se- guir, ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante; um lubrificante; um diluente; um deslizante; um agente desintegrante; um agente de colora- ção; um agente adoçante; um agente aromatizante; um agente umectante; um revestimento emético; e um revestimento de filme. Exemplos de agluti- nantes incluem celulose microcristalina, goma tragacanto, solução de glico- se, mucilagem de acácia, solução de gelatina, melados, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarose e pasta de amido. Lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou de cálcio, licopódio e ácido esteári- co. Diluentes incluem, por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato de dicálcio. Deslizantes incluem, mas não são limitados a, dióxido de silício coloidal. Agentes desintegrantes incluem croscarmelose sódica, glicolato de amido de sódio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metilcelulose, ágar e carboximetilcelulose. Agentes de co- loração incluem, por exemplo, quaisquer das tinturas FD e C solúveis em água certificadas aprovadas, misturas das mesmas; e tinturas de FD e C insolúveis em água suspensas em hidrato de alumina. Agentes adoçantes incluem sacarose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina, e qualquer número de agentes aromatizantes secados por pulveri- zação. Agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas tais como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sen- sação agradável, tais como, mas não limitados a, hortelã e salicilato de meti- la. Agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monoo- leato de sorbitan, monolaurato de dietileno glicol e éter de polioxietileno lau- ral. Revestimentos eméticos incluem ácidos graxos, gorduras, ceras, goma- laca, goma-laca amoniada e ftalatos de acetato de celulose. Revestimentos de filme incluem hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, polietileno glicol 4000 e ftalato de acetato de celulose.In certain embodiments, the formulations are solid dosage forms, in one embodiment, capsules or tablets. Tablets, pills, capsules, troches and the like may contain one or more of the following, or compounds of a similar nature: a binder; a lubricant; a diluent; a slider; a disintegrating agent; a coloring agent; a sweetening agent; a flavoring agent; a wetting agent; an emetic coating; and a film coating. Examples of binders include microcrystalline cellulose, gum tragacanth, glycoside solution, acacia mucilage, gelatin solution, molasses, polvinylpyrrolidine, povidone, crospovidones, sucrose and starch paste. Lubricants include talc, starch, magnesium or calcium stearate, lycopodium and stearic acid. Diluents include, for example, lactose, sucrose, starch, kaolin, salt, mannitol and dicalcium phosphate. Sliders include, but are not limited to, colloidal silicon dioxide. Disintegrating agents include croscarmellose sodium, sodium starch glycolate, alginic acid, cornstarch, potato starch, bentonite, methylcellulose, agar and carboxymethylcellulose. Bleaching agents include, for example, any of the approved certified water soluble FD and C dyes, mixtures thereof; and water insoluble FD and C dyes suspended in alumina hydrate. Sweetening agents include sucrose, lactose, mannitol and artificial sweetening agents such as saccharin, and any number of spray dried flavoring agents. Flavoring agents include natural flavors extracted from plants such as fruits and synthetic mixtures of compounds that produce a pleasant sensation, such as, but not limited to, mint and methyl salicylate. Wetting agents include propylene glycol monostearate, sorbitan monoolate, diethylene glycol monolaurate and lauryl polyoxyethylene ether. Emetic coatings include fatty acids, fats, waxes, shellac, ammonia shellac and cellulose acetate phthalates. Film coatings include hydroxyethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyethylene glycol 4000 and cellulose acetate phthalate.

O composto, ou derivado farmaceuticamente aceitável do mes- mo, poderia ser fornecido em uma composição que o protege do ambiente acídico do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada em um revestimento entérico mantendo sua integridade no estômago e libera o composto ativo no intestino. A composição pode também ser formulada em combinação com um antiácido ou outro tal componente.The compound, or pharmaceutically acceptable derivative thereof, could be provided in a composition that protects it from the acidic environment of the stomach. For example, the composition may be formulated in an enteric coating maintaining its integrity in the stomach and releasing the active compound in the intestine. The composition may also be formulated in combination with an antacid or other such component.

Quando a forma de unidade de dosagem for uma cápsula, pode conter, além de material do tipo acima, um veículo líquido tal como um óleo graxo. Além disso, as formas de unidade de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar e outros agentes entéricos. Os compostos podem também ser administrados como um componente de um elixir, sus- pensão, xarope, bolacha, chuvisco, chiclete ou similares. Um xarope pode conter, além dos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e certos conservantes, tinturas e colorações e aromas.When the dosage unit form is a capsule, it may contain, in addition to material of the above type, a liquid carrier such as a fatty oil. In addition, dosage unit forms may contain various other materials that modify the physical form of the dosage unit, for example sugar coatings and other enteric agents. The compounds may also be administered as a component of an elixir, suspension, syrup, cracker, drizzle, gum or the like. A syrup may contain, in addition to the active compounds, sucrose as a sweetening agent and certain preservatives, tinctures and colorings and flavors.

Os materiais ativos podem também ser misturados com outros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada, ou com materiais que suplementam a ação desejada. O componente ativo é um composto ou deri- vado farmaceuticamente aceitável do mesmo como descrito aqui. Concen- trações mais altas podem ser incluídas, até cerca de 98 % em peso do com- ponente ativo.Active materials may also be mixed with other active materials that do not impair the desired action, or with materials that supplement the desired action. The active component is a pharmaceutically acceptable compound or derivative thereof as described herein. Higher concentrations may be included, up to about 98% by weight of the active component.

Em todas as modalidades, tabletes e formulações de cápsulas podem ser revestidos como conhecido por aqueles versados na técnica a fim de modificar ou sustentar a dissolução do componente ativo. Desse modo, por exemplo, eles podem ser revestidos com um revestimento digestível en- tericamente convencional, tal como fenilsalicilato, ceras e ftalato de acetato de celulose.In all embodiments, tablets and capsule formulations may be coated as known to those skilled in the art to modify or sustain the dissolution of the active component. Thus, for example, they may be coated with an conventionally digestible coating such as phenylsalicylate, waxes and cellulose acetate phthalate.

Β. Composições Líquidas para Administração OralΒ Liquid Compositions for Oral Administration

Formas de dosagem orais líquidas incluem soluções aquosas, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões reconstituídas de grânu- Ios não-efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas de grânu- Ios efervescentes. Soluções aquosas incluem, por exemplo, elixires e xaro- pes. Emulsões são óleo-em-água ou água-em-óleo.Liquid oral dosage forms include aqueous solutions, emulsions, suspensions, reconstituted solutions and / or suspensions of non-effervescent granules and reconstituted effervescent granule preparations. Aqueous solutions include, for example, elixirs and syrups. Emulsions are oil-in-water or water-in-oil.

Elixires são preparações claras, adocicadas, hidroalcoólicas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em elixires incluem solven- tes. Xaropes são soluções aquosas concentradas de um açúcar, por exem- plo, sacarose, e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema de duas fases em que um líquido é disperso na forma de glóbulos pequenos em outro líquido. Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em emul- sões são líquidos não-aquosos, agentes emulsificantes e conservantes. Suspensões usam agentes de suspensão e conservantes farmaceuticamen- te aceitáveis. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânu- Ios não-efervescentes, a serem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem diluentes, adoçantes e agentes umectantes. Substân- cias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos efervescentes, a se- rem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Agentes corantes e aromati- zantes são usados em todas as formas de dosagem acima.Elixirs are clear, sweet, hydroalcoholic preparations. Pharmaceutically acceptable carriers used in elixirs include solvents. Syrups are concentrated aqueous solutions of a sugar, for example sucrose, and may contain a preservative. An emulsion is a two-phase system in which one liquid is dispersed as small globules in another liquid. Pharmaceutically acceptable carriers used in emulsions are non-aqueous liquids, emulsifying agents and preservatives. Suspensions use pharmaceutically acceptable suspending agents and preservatives. Pharmaceutically acceptable substances used in non-effervescent granules to be reconstituted in a liquid oral dosage form include diluents, sweeteners and wetting agents. Pharmaceutically acceptable substances used in effervescent granules to be reconstituted in a liquid oral dosage form include organic acids and a source of carbon dioxide. Coloring and flavoring agents are used in all of the above dosage forms.

Solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope. E- xemplos de conservante incluem glicerina, metila e propilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio e álcool. Exemplos de líquidos não-aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de caroço de algodão. Exemplos de agentes emulsificantes incluem gelatina, acácia, tragacanto, bentonita, e tensoativos tais como monooleato de sorbitan de polioxietileno. Agentes de suspensão incluem carboximetilcelulose de sódio, pectina, tra- gacanto, Veegum e acácia. Agentes adoçantes incluem sacarose, xaropes, glicerina e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina. Agentes umec- tantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitan, monolaurato de dietileno glicol e éter de Iaurila de polioxietileno. Ácidos or- gânicos incluem ácido cítrico e tartárico. Fontes de dióxido de carbono inclu- em bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Agentes de coloração inclu- em quaisquer das tinturas FD e C solúveis em água certificadas aprovadas, e misturas destas. Agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraí- dos de plantas tais frutas, e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação de gosto agradável.Solvents include glycerin, sorbitol, ethyl alcohol and syrup. Preservative examples include glycerin, methyl and propylparaben, benzoic acid, sodium benzoate and alcohol. Examples of non-aqueous liquids used in emulsions include mineral oil and cottonseed oil. Examples of emulsifying agents include gelatin, acacia, tragacanth, bentonite, and surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monooleate. Suspending agents include sodium carboxymethylcellulose, pectin, tragacanth, Veegum and acacia. Sweetening agents include sucrose, syrups, glycerin and artificial sweetening agents such as saccharin. Wetting agents include propylene glycol monostearate, sorbitan monooleate, diethylene glycol monolaurate and polyoxyethylene lauryl ether. Organic acids include citric and tartaric acid. Sources of carbon dioxide include sodium bicarbonate and sodium carbonate. Coloring agents including any of the approved certified water soluble FD and C dyes, and mixtures thereof. Flavoring agents include natural flavors extracted from plants such fruits, and synthetic mixtures of compounds that produce a pleasant taste sensation.

Para uma forma de dosagem sólida, a solução ou suspensão, por exemplo em carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerídeos, em uma modalidade é encapsulada em uma cápsula de gelatina. Tais soluções, e a preparação e encapsulação das mesmas, são reveladas nas patentes U. S. NsS 4.328.245; 4.409.239; e 4.410.545. Para uma forma de dosagem lí- quida, a solução, por exemplo, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um veículo líquido farmaceuti- camente aceitável, por exemplo, água, a ser facilmente medido para admi- nistração.For a solid dosage form, the solution or suspension, for example in propylene carbonate, vegetable oils or triglycerides, in one embodiment is encapsulated in a gelatin capsule. Such solutions, and the preparation and encapsulation thereof, are disclosed in U.S. Patent Nos. 4,328,245; 4,409,239; and 4,410,545. For a liquid dosage form, the solution, for example in a polyethylene glycol, may be diluted with a sufficient amount of a pharmaceutically acceptable liquid carrier, for example water, to be easily measured for administration. - administration.

Alternativamente, formulações orais líquidas ou semi-sólidas po- dem ser preparadas dissolvendo ou dispersando o composto ativo ou sal em óleos vegetais, glicóis, triglicerídeos, ésteres de propileno glicol (por exem- pio, carbonato de propileno) e outros tais veículos, e encapsulando estas soluções ou suspensões em invólucros de cápsula de gelatina dura ou ma- cia. Outras formulações úteis incluem aquelas expostas nas patentes U. S. N9S RE28.819 e 4.358.603. Brevemente, tais formulações incluem, mas não são limitados a, àquelas contendo um composto fornecido aqui, um mono ou polialquileno glicol dialquilado, incluindo, mas não limitados a, 1,2- dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, polietileno glicol-350-dimetil éter, polietileno glicol-550-dimetil éter, polietileno glicol-750-dimetil éter em que 350, 550 e 750 referem-se ao peso molecular médio aproximado do po- lietileno glicol, e um ou mais antioxidantes, tais como hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), gaiato de propila, vitamina E, hidroqui- nona, hidroxicumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, áci- do málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiônico e seus ésteres, e ditiocarbamatos.Alternatively, liquid or semi-solid oral formulations may be prepared by dissolving or dispersing the active compound or salt in vegetable oils, glycols, triglycerides, propylene glycol esters (e.g. propylene carbonate) and other such carriers, and encapsulating these solutions or suspensions in hard or soft gelatin capsule shells. Other useful formulations include those set forth in U.S. Patent Nos. RE28,819 and 4,358,603. Briefly, such formulations include, but are not limited to, those containing a compound provided herein, a dialkylated mono or polyalkylene glycol, including, but not limited to, 1,2-dimethoxymethane, diglyme, triglyme, tetraglyme, polyethylene glycol-350- dimethyl ether, polyethylene glycol-550-dimethyl ether, polyethylene glycol-750-dimethyl ether wherein 350, 550 and 750 refer to the approximate average molecular weight of polyethylene glycol, and one or more antioxidants such as butylated hydroxytoluene ( BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), propyl gallate, vitamin E, hydroquinone, hydroxycoumarins, ethanolamine, lecithin, cephalin, ascorbic acid, malic acid, sorbitol, phosphoric acid, thiodipropionic acid and its esters, and dithiocarbamates.

Outras formulações incluem, mas não são limitadas a, soluções alcoólicas aquosas incluindo um acetal farmaceuticamente aceitável. Alcoóis usados nestas formulações são qualquer solvente miscível em água farma- ceuticamente aceitável tendo um ou mais grupos hidroxila, incluindo, mas não limitados a, propileno glicol e etanol. Acetais incluem, mas não são limi- tados a, acetais de di(alquila inferior) de aldeídos de alquila inferior tais como dietil acetal de acetaldeído.Other formulations include, but are not limited to, aqueous alcoholic solutions including a pharmaceutically acceptable acetal. Alcohols used in these formulations are any pharmaceutically acceptable water miscible solvent having one or more hydroxyl groups, including, but not limited to, propylene glycol and ethanol. Acetals include, but are not limited to, di (lower alkyl) acetals of lower alkyl aldehydes such as diethyl acetaldehyde acetal.

2. Injectáveis. Soluções e Emulsões2. Injectables. Solutions and Emulsions

Administração parenteral, em uma modalidade caracterizada por injeção, ou subcutânea, intramuscular ou intravenosamente é também con- templada aqui. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Os injetáveis, soluções e emulsões também contêm um ou mais excipientes. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas podem também conter quantidades secundárias de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes intumescentes ou e- mulsificantes, agentes tamponantes de pH, estabilizantes, intensificadores de solubilidade, e outros tais agentes, tais como por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.Parenteral administration, in a mode characterized by injection, or subcutaneously, intramuscularly or intravenously is also contemplated here. Injectables may be prepared in conventional forms, either as liquid solutions or suspensions, solid forms suitable for solution or suspension in liquid prior to injection, or as emulsions. Injectables, solutions and emulsions also contain one or more excipients. Suitable excipients are, for example, water, saline, dextrose, glycerol or ethanol. In addition, if desired, the pharmaceutical compositions to be administered may also contain secondary amounts of non-toxic auxiliary substances such as swelling or emulsifying agents, pH buffering agents, stabilizers, solubility enhancers, and other such agents, such as for example sodium acetate, sorbitan monolaurate, triethanolamine oleate and cyclodextrins.

Implantação de um sistema de liberação lenta ou liberação con- tínua, de modo que um nível constante de dosagem seja mantido (vide, por exemplo, Patente U. S. Ng 3.710.795) é também contemplada aqui. Breve- mente, um composto fornecido aqui é disperso em uma matriz interna sólida, por exemplo, polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, polivinilcloreto plastici- zado ou não-plasticizado, náilon plasticizado, polietilenotereftalato plasticiza- do, borracha natural, poliisopreno, poliisobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno-vinilacetato, borrachas de silicone, polidimetilsiloxa- nos, copolímeros de carbonato de silicone, polímeros hidrófilos tais como hidrogéis de ésteres acrílicos e ácido metacrílico, colágeno, polivinilálcool reticulado e acetato de polivinila reticulado parcialmente hidrolisado, que é rodeado por uma membrana polimérica externa por exemplo, polietileno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etile- no/acrilato de etila, copolímeros de etileno/vinilacetato, borrachas de silico- ne, siloxanos de polidimetila, borracha de neopreno, polietileno clorado, poli- vinilcloreto, copolímeros de vinilcloreto com acetato de vinila, cloreto de vini- lideno, etileno e propileno, tereftalato de polietileno de ionômero, borrachas de epicloroidrina de borracha de butila, copolímero de etileno/álcool vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinila/álcool vinílico, e copolímero de etile- no/viniloxietanol, que é insolúvel nos fluidos do corpo. O composto difunde através da membrana polimérica externa em uma taxa de controla da taxa de liberação. A porcentagem de composto ativo contida em tais composições parenterais é altamente dependente da natureza específica das mesmas, como também a atividade do composto e as necessidades do sujeito.Implementation of a slow release or continuous release system so that a constant dosage level is maintained (see, for example, U.S. Patent No. 3,710,795) is also contemplated herein. Briefly, a compound provided herein is dispersed in a solid internal matrix, for example, polymethyl methacrylate, polybutyl methacrylate, plasticized or non-plasticized polyvinylchloride, plasticized nylon, polyethylene terephthalate, natural rubber, polyisoprene, polyisobutylene, polybutadiene, polybutadiene , ethylene vinylacetate copolymers, silicone rubbers, polydimethylsiloxanes, silicone carbonate copolymers, hydrophilic polymers such as acrylic ester hydrogels and methacrylic acid, collagen, partially hydrolyzed cross-linked polyvinyl acetate, which is surrounded by a outer polymeric membrane eg polyethylene, polypropylene, ethylene / propylene copolymers, ethylene / ethyl acrylate copolymers, ethylene / vinylacetate copolymers, silicon rubbers, polydimethyl siloxanes, neoprene rubber, chlorinated polyethylene, poly - vinylchloride, vinylchloride copolymers vinyl acetate orifice, vinylidene chloride, ethylene and propylene, ionomer polyethylene terephthalate, butyl rubber epichlorohydrin rubbers, ethylene / vinyl alcohol copolymer, ethylene / vinyl acetate / vinyl alcohol terpolymer, and copolymer of ethylene / vinyloxyethanol, which is insoluble in body fluids. The compound diffuses through the outer polymeric membrane at a rate of release rate control. The percentage of active compound contained in such parenteral compositions is highly dependent on their specific nature, as well as the activity of the compound and the needs of the subject.

Administração parenteral das composições inclui administrações intravenosas, subcutâneas e intramusculares. Preparações para administra- ção parenteral incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos so- lúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontos para serem combi- nados com um solvente logo antes do uso, incluindo tabletes hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo logos antes do uso e emul- sões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não-aquosas.Parenteral administration of the compositions includes intravenous, subcutaneous and intramuscular administrations. Preparations for parenteral administration include sterile injection-ready solutions, sterile dry soluble products such as lyophilised powders ready to be combined with a solvent just before use, including hypodermic tablets, sterile injection-ready suspensions, sterile dry insoluble ready to be combined with a vehicle logos before use and sterile emulsions. The solutions may be aqueous or non-aqueous.

Se administrados intravenosamente, os veículos adequados in- cluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada de fosfato (PBS), e soluções contendo agentes de engrossamento e solubilizantes, tais como glicose, polietileno glicol, e polipropileno glicol e misturas dos mesmos.If administered intravenously, suitable carriers include physiological saline or phosphate buffered saline (PBS), and solutions containing thickening and solubilizing agents such as glucose, polyethylene glycol, and polypropylene glycol and mixtures thereof.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados nas preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não-aquosos, agentes anti- microbianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestesias locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsificantes, agentes se- qüestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitá- veis. Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringers, Injeção de Dextrose Isotônica, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e Ringers Lactatada. Veículos parenterais não- aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de caroço de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Os agentes antimicro- bianos devem ser adicionados em concentrações bacteriostáticas ou fungis- táticas em preparações parenterais empacotadas em recipientes de dose múltipla que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobu- tanol, ésteres de ácido p-hidroxibenzóico de metila e propila, timerosal, clo- reto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem clo- reto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Anestesias locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersantes incluem carboximetilcelulose sódica, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsificantes inclu- em Polissorbato 80 (TWEEN® 80). Um agente seqüestrante ou quelante de íons de metal inclui EDTA. Veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis com água; e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajus- te de pH.Pharmaceutically acceptable carriers used in parenteral preparations include aqueous carriers, non-aqueous carriers, antimicrobial agents, isotonic agents, buffers, antioxidants, local anesthetics, suspending and dispersing agents, emulsifying agents, sequestering or chelating agents and other pharmaceutically acceptable substances. acceptable. Examples of aqueous vehicles include Sodium Chloride Injection, Ringers Injection, Isotonic Dextrose Injection, Sterile Water Injection, Dextrose Injection and Lactated Ringers. Non-aqueous parenteral vehicles include fixed oils of vegetable origin, cottonseed oil, corn oil, sesame oil and peanut oil. Antimicrobial agents should be added in bacteriostatic or fungistatic concentrations in parenteral preparations packaged in multi-dose containers including phenols or cresols, mercurials, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl and propyl p-hydroxybenzoic acid esters, thimerosal, benzalkonium chloride and benzethonium chloride. Isotonic agents include sodium chloride and dextrose. Buffers include phosphate and citrate. Antioxidants include sodium bisulfate. Local anesthetics include procaine hydrochloride. Suspending and dispersing agents include sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose and polyvinylpyrrolidone. Emulsifying agents included in Polysorbate 80 (TWEEN® 80). A sequestering or chelating agent of metal ions includes EDTA. Pharmaceutical vehicles also include ethyl alcohol, polyethylene glycol and propylene glycol for water miscible vehicles; and sodium hydroxide, hydrochloric acid, citric acid or lactic acid for pH adjustment.

A concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajusta- da de forma que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, peso e con- dição do paciente ou animal como é conhecido na técnica.The concentration of the pharmaceutically active compound is adjusted so that an injection provides an amount effective to produce the desired pharmacological effect. The exact dose depends on the age, weight and condition of the patient or animal as is known in the art.

As preparações parenterais de dose de unidade são acondicio- nadas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral deveriam ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica.Unit dose parenteral preparations are packaged in an ampoule, vial or syringe with a needle. All preparations for parenteral administration should be sterile as is known and practiced in the art.

De modo ilustrativo, infusão intravenosa ou intraarterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto ativo é um modo eficaz de administração. Outra modalidade é uma solução ou suspensão aquosa ou oleosa estéril contendo um material ativo injetado quando necessário para produzir o efeito farmacológico desejado. Os injetáveis são projetados para administração local e sistêmi- ca. Em uma modalidade, uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 % p/p até cerca de 90 % p/p ou mais, em certas modalidades mais de 1 % p/p do composto ativo para o(s) tecido(s) tratado(s).Illustratively, intravenous or intraarterial infusion of a sterile aqueous solution containing an active compound is an effective mode of administration. Another embodiment is a sterile aqueous or oily solution or suspension containing an injected active material when necessary to produce the desired pharmacological effect. Injectables are designed for local and systemic administration. In one embodiment, a therapeutically effective dosage is formulated to contain a concentration of at least about 0.1% w / w to about 90% w / w or more, in certain embodiments more than 1% w / w of the active compound. for the treated tissue (s).

O composto pode ser suspenso em forma micronizada ou outra adequada ou pode ser derivatizado para produzir um produto ativo mais so- lúvel ou produzir um pró-fármaco. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo intencionado de administração e a solubili- dade do composto no carreador ou veículo selecionado. A concentração efi- caz é suficiente para melhorar os sintomas da condição e pode ser determi- nada empiricamente.The compound may be suspended in micronized or other suitable form or may be derivatized to produce a more soluble active product or to produce a prodrug. The form of the resulting mixture depends on a number of factors, including the intended mode of administration and the solubility of the compound in the selected carrier or carrier. The effective concentration is sufficient to ameliorate the symptoms of the condition and can be determined empirically.

3. Pós Liofilizados3. Freeze Dried Powders

De interesse aqui são também os pós Iiofilizados que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões e outras mistu- ras. Eles podem também ser reconstituídos e formulados como sólidos ou géis.Of interest here are also lyophilized powders which may be reconstituted for administration as solutions, emulsions and other mixtures. They may also be reconstituted and formulated as solids or gels.

O pó estéril, Iiofilizado é preparado dissolvendo um composto fornecido aqui, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, em um solvente adequado. O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconsti- tuída, preparada do pó. Excipientes que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, dextrose, sorbital, frutose, xarope de milho, xilitol, glice- rina, glicose, sacarose ou outro agente adequado. O solvente pode também conter um tampão, tal como citrato, fosfato de sódio ou de potássio ou outro tal tampão conhecido aqueles versados na técnica, em uma modalidade, em cerca de pH neutro. Filtração estéril subseqüente da solução seguida por liofilização sob condições padrões conhecidas aqueles versados na técnica fornece a formulação desejada. Em uma modalidade, a solução resultante será aquinhoada em frascos para liofilização. Cada frasco conterá uma do- sagem simples ou dosagens múltiplas do composto. O pó Iiofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tais como em cerca de 49C à tem- peratura ambiente.Sterile, lyophilized powder is prepared by dissolving a compound provided herein, or a pharmaceutically acceptable derivative thereof, in a suitable solvent. The solvent may contain a stability enhancing excipient or other pharmacological component of the powder or prepared reconstituted solution of the powder. Excipients that may be used include, but are not limited to, dextrose, sorbital, fructose, corn syrup, xylitol, glycerin, glucose, sucrose or other suitable agent. The solvent may also contain a buffer such as citrate, sodium or potassium phosphate or other such buffer known to those skilled in the art in one embodiment at about neutral pH. Subsequent sterile filtration of the solution followed by lyophilization under known standard conditions to those skilled in the art provides the desired formulation. In one embodiment, the resulting solution will be filled into lyophilization bottles. Each vial will contain a single dose or multiple dosages of the compound. The lyophilized powder may be stored under appropriate conditions, such as at about 49 ° C at room temperature.

Reconstituição deste pó Iiofilizado com água para injeção provê uma formulação para o uso em administração parenteral. Para reconstitui- ção, o pó Iiofilizado é adicionado à água estéril ou outro veículo adequado. A quantidade precisa depende do composto selecionado. Tal quantidade pode ser determinada empiricamente. 4. Administração TópicaReconstitution of this lyophilized powder with water for injection provides a formulation for use in parenteral administration. For reconstitution, the lyophilized powder is added to sterile water or another suitable vehicle. The precise amount depends on the compound selected. Such amount may be determined empirically. 4. Topical Administration

Misturas tópicas são preparadas como descrito para a adminis- tração local e sistêmica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspen- são, emulsões ou outras e é formulada como cremes, géis, ungüentos, e- mulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, pulverizações, supositórios, bandagens, emplastos dérmicos ou qualquer outra formulação adequada para administração tópica.Topical mixtures are prepared as described for local and systemic administration. The resulting mixture may be a solution, suspension, emulsion or the like and is formulated as creams, gels, ointments, emulsions, solutions, elixirs, lotions, suspensions, tinctures, pastes, foams, aerosols, sprays, sprays, suppositories. , bandages, dermal patches or any other formulation suitable for topical administration.

Os compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos podem ser formulados como aerossóis para aplicação tópica, tais como através de inalação (vide, por exemplo, Patentes U. S. N9S 4.044.126, 4.414.209, e 4.364.923 que descrevem aerossóis para liberação de um este- róide útil para o tratamento de doenças inflamatórias particularmente asma). Estas formulações para administração para o trato respiratório podem ser na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó mi- crofino para insuflação, sozinho ou em combinação com um veículo inerte tal como lactose. Em um tal caso, as partículas da formulação, em uma modali- dade, terão diâmetros de menos de 50 mícrons, em uma modalidade menos de 10 mícrons.Pharmaceutically acceptable compounds or derivatives thereof may be formulated as aerosols for topical application, such as by inhalation (see, for example, U.S. Patent Nos. 4,044,126, 4,414,209, and 4,364,923 which disclose aerosols for the release of a steroid useful for the treatment of inflammatory diseases, particularly asthma). These formulations for administration to the respiratory tract may be in the form of an aerosol or solution for a nebulizer, or as a microfine insufflation powder, alone or in combination with an inert carrier such as lactose. In such a case, the particles of the formulation, in one embodiment, will have diameters of less than 50 microns, in a mode of less than 10 microns.

Os compostos podem ser formulados para aplicação local ou tópica, tais como para aplicação tópica à pele e membranas mucosas, tais como no olho, na forma de géis, cremes, e loções e para aplicação no olho ou para aplicação intracisternal ou intraespinhal. Administração tópica é con- templada para liberação transdérmica e também para administração para os olhos ou mucosa, ou para terapias de inalação. Soluções nasais do compos- to ativo sozinho ou em combinação com outros excipientes farmaceutica- mente aceitáveis podem também ser administradas. Estas soluções, particularmente aquelas intencionadas para o uso oftálmico, podem ser formuladas como 0,01 % -10 % de soluções isotô- nicas, pH de cerca de 5-7, com sais apropriados.The compounds may be formulated for local or topical application, such as for topical application to the skin and mucous membranes, such as in the eye, in the form of gels, creams, and lotions and for application to the eye or for intracisternal or intraspinal application. Topical administration is contemplated for transdermal release and also for administration to the eyes or mucosa, or for inhalation therapies. Nasal solutions of the active compound alone or in combination with other pharmaceutically acceptable excipients may also be administered. These solutions, particularly those intended for ophthalmic use, may be formulated as 0.01% -10% isotonic solutions, pH about 5-7, with appropriate salts.

5. Composições para Outras Rotas de Administração5. Compositions for Other Administration Routes

Outras rotas de administração, tais como emplastos transdérmi- cos, incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos, e administração retal, são também contempladas aqui.Other routes of administration, such as transdermal patches, including iontophoretic and electrophoretic devices, and rectal administration, are also contemplated herein.

Emplastos transdérmicos, incluindo dispositivos iotoforéticos e eletroforéticos, são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. Por e- xemplo, tais emplastos são revelados nas patentes U. S. N-s 6.267.983, 6.261.595, 6.256.533, 6.167.301, 6.024.975, 6.010.715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433, e 5.860.957.Transdermal patches, including iotophoretic and electrophoretic devices, are well known to those skilled in the art. For example, such patches are disclosed in U.S. Patent Nos. 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010,715, 5,985,317, 5,983,133, 5,948,433, and 5,860,957.

Por exemplo, formas de dosagem farmacêutica para administra- ção retal são supositórios retais, cápsulas e tabletes para efeito sistêmico. Supositórios retais são aqui usados significam corpos sólidos para inserção no reto que se funde ou amolece em temperatura do corpo liberando um ou mais componentes farmacológica ou terapeuticamente ativos. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas em supositórios retais são bases ou veículos e agentes para elevar o ponto de fundição. Exemplos de bases in- cluem manteiga de cacau (óleo de teobroma), glicerina-gelatina, carbocera (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono, di e triglicerídeos de ácidos graxos. Combinações podem ser usadas das várias bases. Agentes para elevar o ponto de fundição de supositórios incluem espermacete e cera. Supositórios retais podem ser preparados pelo método comprimido ou mol- dagem. O peso de um supositório retal, em uma modalidade, é cerca de 2 a 3 gm.For example, pharmaceutical dosage forms for rectal administration are rectal suppositories, capsules and tablets for systemic effect. Rectal suppositories used herein mean solid bodies for insertion into the rectum that melts or softens at body temperature releasing one or more pharmacologically or therapeutically active components. Pharmaceutically acceptable substances used in rectal suppositories are bases or vehicles and agents for raising the melting point. Examples of bases include cocoa butter (theobroma oil), glycerine gelatin, carbocera (polyoxyethylene glycol) and appropriate mixtures of fatty acid mono-, di- and triglycerides. Combinations can be used from various bases. Agents to raise the suppository melting point include sperm and wax. Rectal suppositories may be prepared by compressed or molding method. The weight of a rectal suppository, in one embodiment, is about 2 to 3 gm.

Tabletes e cápsulas para administração retal são fabricados u- sando a mesma substância farmaceuticamente aceitável e pelos mesmos métodos como para formulações para administração oral.Rectal administration tablets and capsules are manufactured using the same pharmaceutically acceptable substance and by the same methods as for oral administration formulations.

6. Formulações Alvejadas6. Targeted Formulations

Os compostos fornecidos aqui, ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem também ser formulados para serem alvos para um tecido particular, receptor, ou outra área do corpo do sujeito a ser tratado. Muitos tais métodos de alvejamento são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. Todos tais métodos de alvejamento são contemplados aqui para o uso nas composições imediatas. Para exemplos não-limitativos de métodos de alvejamento, vide, por exemplo, Patentes U. S. NQs 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 e 5.709.874.The compounds provided herein, or pharmaceutically acceptable derivatives thereof, may also be formulated to be targets for a particular tissue, receptor, or other body area of the subject to be treated. Many such bleaching methods are well known to those skilled in the art. All such bleaching methods are contemplated herein for use in immediate compositions. For non-limiting examples of targeting methods, see, for example, U.S. Patent Nos. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 and 5,709,874.

Em uma modalidade, suspensões lipossomais, incluindo Iipos- somas alvos para tecido, tais como Iipossomas alvos para tumor, podem também ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos aqueles ver- sados na técnica. Por exemplo, formulações de Iipossoma podem ser prepa- radas como descrito na patente U. S. N- 4.522.811. Brevemente, Iipossomas tais como vesículas multilamelares (MLVs) podem ser formadas secando a fosfatidil colina de ovo e fosfatidil serina de cérebro (razão molar 7:3) no lado de dentro de um frasco. Uma solução de um composto fornecido aqui em soluções salinas tamponadas de fosfato (PBS) carecendo de cátions diva- lentes é adicionada e o frasco agitado até que o filme de lipídio seja disper- so. As vesículas resultantes são lavadas para remover o composto não- capsulado, empelotadas através de centrifugação, e depois ressuspensas em PBS.In one embodiment, liposome suspensions, including tissue target liposomes, such as tumor target liposomes, may also be suitable as pharmaceutically acceptable carriers. These may be prepared according to methods known to those skilled in the art. For example, liposome formulations may be prepared as described in U.S. Patent No. 4,522,811. Briefly, liposomes such as multilamellar vesicles (MLVs) can be formed by drying egg phosphatidyl choline and brain serine phosphatidyl (7: 3 molar ratio) on the inside of a vial. A solution of a compound provided herein in phosphate buffered saline (PBS) solutions lacking divalent cations is added and the vial shaken until the lipid film is dispersed. The resulting vesicles are washed to remove uncapsulated compound, pelleted by centrifugation, and then resuspended in PBS.

7. Artigos de Fabricação7. Articles of Manufacture

Os compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis po- dem ser empacotados como artigos de fabricação (por exemplo, kits) con- tendo material de acondicionamento, um composto ou derivado farmaceuti- camente aceitável do mesmo fornecido aqui dentro do material de acondi- cionamento, e uma marcação que indica que o composto ou composição, ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, é útil para tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais sintomas ou distúrbios em que uma infecção bacteriana, incluindo uma infecção de Mycobacterium tuberculosis, está implicada. Os artigos de fabricação fornecidos aqui contêm materiais de acondicionamento. Materiais de acondicionamento para o uso nos produtos farmacêuticos de acondicionamento são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U. S. N°S 5.323.907, 5.052.558 e 5.033.252. Exemplos de materiais de acondicionamento farmacêuticos in- cluem, mas não são limitados a, pacotes de bolha, garrafas, tubos, inalado- res, bombas, sacos, frascos, recipientes, seringas, garrafas, e qualquer ma- terial de acondicionamento adequado para uma formulação selecionada e modo intencionado de administração e tratamento. 8. Formulações de Liberação SustentadaPharmaceutically acceptable compounds or derivatives may be packaged as articles of manufacture (e.g., kits) containing packaging material, a pharmaceutically acceptable compound or derivative thereof provided herein within the packaging material, and a marking indicating that the compound or composition, or pharmaceutically acceptable derivative thereof, is useful for treating, preventing, or ameliorating one or more symptoms or disorders in which a bacterial infection, including a Mycobacterium tuberculosis infection, is implicated. The articles of manufacture provided herein contain packaging materials. Packaging materials for use in packaging pharmaceuticals are well known to those skilled in the art. See, for example, U.S. Patent Nos. 5,323,907, 5,052,558 and 5,033,252. Examples of pharmaceutical packaging materials include, but are not limited to, blister packs, bottles, tubes, inhalers, pumps, bags, vials, containers, syringes, bottles, and any suitable packaging material for a selected formulation and intended mode of administration and treatment. 8. Sustained Release Formulations

Também fornecidas são formulações de liberação contínua para liberar os compostos para o alvo desejado em níveis circulantes altos (entre 10"9 e 10"4 M). Os níveis são circulantes no paciente sistemicamente, ou em uma modalidade, localizados em um local de, por exemplo, paralisia.Also provided are continuous release formulations for releasing compounds to the desired target at high circulating levels (between 10 "9 and 10" 4 M). Levels are circulating in the patient systemically, or in one embodiment, located at a site of, for example, paralysis.

É entendido que os níveis compostos são mantidos em um certo período de tempo, conforme for desejado, e podem ser facilmente determi- nados por alguém versado na técnica. Tais formulações de liberação contí- nua e/ou regulada podem ser feitas por meios de liberação contínua de dis- positivos de liberação que são bem-conhecidos aqueles versados na técni- ca, tais como aqueles descritos nas patentes US N9s 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3. 598.123; 4.008.719; 4.710.384; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556 e 5.733.566, as des- crições desta são, cada, incorporadas aqui por referência. Estas composi- ções farmacêuticas podem ser usadas para fornecer liberação lenta ou con- tínua de um ou mais dos compostos ativos usando, por exemplo, hidroxipro- pilmetil celulose, outras matrizes de polímero, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos de multicamadas, micropartículas, Iipos- somas, microesferas, ou outros. Formulações de liberação contínua ade- quadas conhecidas aqueles versados na técnica, incluindo aquelas descritas aqui, podem ser selecionadas facilmente para o uso com as composições farmacêuticas fornecidas aqui. Desse modo, formas de dosagem de unidade simples adequadas para administração oral, tais como, mas não limitados a, tabletes, cápsulas, cápsulas de gel, microcápsulas, pós e similares, que são adaptadas para liberação contínua são contempladas aqui.It is understood that compound levels are maintained over a period of time as desired and can be readily determined by one skilled in the art. Such continuous and / or regulated release formulations may be made by means of continuous release of release devices which are well known to those skilled in the art, such as those described in US Pat. Nos. 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 4,710,384; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556 and 5,733,566, the disclosures herein are each incorporated herein by reference. These pharmaceutical compositions may be used to provide slow or continuous release of one or more of the active compounds using, for example, hydroxypropylmethylcellulose, other polymer matrices, gels, permeable membranes, osmotic systems, multilayer coatings, microparticles, liposomes, microspheres, or the like. Suitable continuous release formulations known to those skilled in the art, including those described herein, may be readily selected for use with the pharmaceutical compositions provided herein. Accordingly, single unit dosage forms suitable for oral administration, such as, but not limited to, tablets, capsules, gel capsules, microcapsules, powders and the like, which are adapted for continuous release are contemplated herein.

Em uma modalidade, a formulação de liberação contínua contém composto ativo tal como, mas não limitados a, celulose microcristalina, mal- todextrina, etilcelulose, e estearato de magnésio. Como descrito acima, to- dos os métodos conhecidos para encapsulação que são compatíveis com propriedades dos compostos revelados são contemplados aqui. A formula- ção de liberação contínua é encapsulada revestindo as partículas ou grânu- Ios das composições farmacêuticas fornecidas aqui com espessura variada de polímeros lentamente solúveis ou através de microencapsulação. Em uma modalidade, a formulação de liberação contínua é encapsulada com um material de revestimento de espessura variada (por exemplo cerca de 1 mí- cron a 200 mícrons) que permite a dissolução da composição farmacêutica cerca de 48 horas a cerca de 72 horas após administração a um mamífero. Em outra modalidade, o material de revestimento é um aditivo alimentício aprovado.In one embodiment, the sustained release formulation contains active compound such as, but not limited to, microcrystalline cellulose, malodextrin, ethylcellulose, and magnesium stearate. As described above, all known encapsulation methods that are compatible with properties of the disclosed compounds are contemplated herein. The continuous release formulation is encapsulated by coating the particles or granules of the pharmaceutical compositions provided herein with varying thickness of slowly soluble polymers or by microencapsulation. In one embodiment, the continuous release formulation is encapsulated with a coating material of varying thickness (e.g., about 1 micron to 200 microns) that allows the pharmaceutical composition to dissolve about 48 hours to about 72 hours after administration. to a mammal. In another embodiment, the coating material is an approved food additive.

Em outra modalidade, a formulação de liberação contínua é um dispositivo de dissolução de matriz que é preparado comprimindo o fármaco com um veículo de polímero lentamente solúvel em um tabíete. Em uma modalidade, as partículas revestidas têm uma faixa de tamanho entre cerca de 0,1 a cerca de 300 mícrons, como revelado nas patentes U. S. Nes 4.710.384 e 5.354.556 que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Cada uma das partículas são na forma de uma micromatriz, com o componente ativo uniformemente distribuído ao longo do polímero.In another embodiment, the continuous release formulation is a matrix dissolution device that is prepared by compressing the drug with a slowly soluble polymer carrier in a tablet. In one embodiment, the coated particles have a size range from about 0.1 to about 300 microns, as disclosed in U.S. Patent Nos. 4,710,384 and 5,354,556 which are incorporated herein by reference in their entirety. Each of the particles is in the form of a microarray, with the active component evenly distributed throughout the polymer.

Formulações de liberação sustentada tais como aquelas descri- tas na patente U. S. Nq 4.710.384, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, tendo uma porcentagem relativamente alta de plasticizante no revestimento para permitir flexibilidade suficiente para impedir quebra substancial durante a compressão, são reveladas. A quantidade específica de plasticizante varia, dependendo da natureza do revestimento e do plasti- cizante particular usados. A quantidade pode ser determinada facilmente de modo empírico testando as características de liberação dos tabletes forma- dos. Se o medicamento for liberado muito rapidamente, então mais plastici- zante é usado. Características de liberação são também uma função da es- pessura do revestimento. Quando quantidades substanciais de plasticizante forem usadas, a capacidade de liberação contínua do revestimento diminui.Sustained release formulations such as those described in US Patent No. 4,710,384, which is incorporated herein by reference in their entirety, having a relatively high percentage of plasticizer in the coating to allow sufficient flexibility to prevent substantial breakage during compression, are revealed. The specific amount of plasticizer varies depending on the nature of the coating and the particular plasticizer used. The amount can be easily determined empirically by testing the release characteristics of the formed tablets. If the drug is released too quickly, then more plasticizer is used. Release characteristics are also a function of coating thickness. When substantial amounts of plasticizer are used, the continuous release ability of the coating decreases.

Desse modo, a espessura do revestimento pode ser aumentada ligeiramente para compensar um aumento na quantidade de plasticizante. Em geral, o plasticizante em uma tal modalidade estará presente em uma quantidade de cerca de 15 a 30 % do material de liberação contínuo no revestimento, em uma modalidade 20 a 25 %, e a quantidade de revestimento será de 10 a 25 % do peso do material ativo, e em outra modalidade, 15 a 20 % do peso de material ativo. Qualquer plasticizante farmaceuticamente aceitável conven- cional pode ser incorporado no revestimento.In this way the coating thickness may be slightly increased to compensate for an increase in the amount of plasticizer. In general, the plasticizer in such an embodiment will be present in an amount of about 15 to 30% of the continuous release material in the coating, in a 20 to 25% embodiment, and the amount of coating will be 10 to 25% by weight. of active material, and in another embodiment, 15 to 20% of the weight of active material. Any conventional pharmaceutically acceptable plasticizer may be incorporated into the coating.

Os compostos fornecidos aqui podem ser formulados como uma formulação de liberação contínua e/ou regulada. Toda os produtos farma- cêuticos de liberação contínua têm uma meta comum de melhorar a terapia de fármaco sobre à alcançada por suas contrapartes não-contínuas. Ideal- mente, o uso de uma preparação de liberação contínua otimamente projeta- da em tratamento médico é caracterizado por um mínimo de substância de fármaco, que é empregada para curar ou controlar a condição. Vantagens das formulações de liberação contínua podem incluir: 1) atividade estendida da composição, 2) freqüência de dosagem reduzida, e 3) complacência de paciente aumentada. Além disso, formulações de liberação contínua podem ser usadas para afetar o tempo de princípio de ação ou outras característi- cas, tais como níveis de sangue da composição, e desse modo pode afetar a ocorrência de efeitos colaterais.The compounds provided herein may be formulated as a continuous release and / or regulated formulation. All continuous release pharmaceuticals have a common goal of improving drug therapy over that achieved by their non-continuous counterparts. Ideally, the use of an optimally designed continuous release preparation in medical treatment is characterized by a minimum of drug substance, which is employed to cure or control the condition. Advantages of continuous release formulations may include: 1) extended composition activity, 2) reduced dosage frequency, and 3) increased patient compliance. In addition, sustained release formulations may be used to affect onset time or other characteristics, such as blood levels of the composition, and thus may affect the occurrence of side effects.

As formulações de liberação contínua fornecidas aqui são proje- tadas para inicialmente liberar uma quantidade da composição terapêutica que prontamente produz o efeito terapêutico desejado, e liberação gradual e continuamente de outras quantidades de composições para manter este ní- vel de efeito terapêutico em um período estendido de tempo. Para manter este nível constante no corpo, a composição terapêutica deve ser liberada da forma de dosagem a uma taxa que substituirá a composição que é meta- bolizada e excretar-se-á do corpo.The continuous release formulations provided herein are designed to initially release an amount of the therapeutic composition that readily produces the desired therapeutic effect, and gradually and continuously release other amounts of compositions to maintain this level of therapeutic effect over an extended period. of time. To maintain this constant level in the body, the therapeutic composition must be released from the dosage form at a rate that will replace the composition that is metabolized and excreted from the body.

A liberação contínua de um componente ativo pode ser estimu- lada através de vários indutores, por exemplo pH, temperatura, enzimas, água, ou outras condições fisiológicas ou compostos.Continuous release of an active component can be stimulated through various inducers, for example pH, temperature, enzymes, water, or other physiological conditions or compounds.

Preparações para administração oral podem ser formuladas a- dequadamente para dar liberação controlada do composto ativo. Em uma modalidade, os compostos são formulados como pós de liberação controla- da de micropartículas distintas que podem ser formuladas facilmente em forma líquida. O pó de liberação contínua compreende partículas contendo um componente ativo e opcionalmente, um excipiente com pelo menos um polímero não-tóxico.Preparations for oral administration may be formulated accordingly to give controlled release of the active compound. In one embodiment, the compounds are formulated as distinct microparticle controlled release powders which can be easily formulated in liquid form. The continuous release powder comprises particles containing an active component and optionally an excipient with at least one non-toxic polymer.

O pó pode ser disperso ou suspenso em um veículo líquido e manterá suas características de liberação contínua durante um período útil de tempo. Estas dispersões ou suspensões têm estabilidade química e esta- bilidade em termos de taxa de dissolução. O pó pode conter um excipiente que compreende um polímero que pode ser solúvel, insolúvel, permeável, impermeável, ou biodegradável. Os polímeros podem ser polímeros ou co- polímeros. O polímero pode ser um polímero natural ou sintético. Polímeros naturais incluem polipeptídeos (por exemplo, zeína), polissacarídeos (por exemplo, celulose), e ácido algínico. Polímeros sintéticos representativos incluem aqueles descritos, mas não limitados a, aqueles descritos na coluna 3, linhas 33-45 da patente U. S. N° 5.354.556, que é incorporada por refe- rência em sua totalidade. Polímeros particularmente adequados incluem a- queles descritos, mas não limitados àqueles descritos na coluna 3, linha 46- coluna 4, linha 8 da patente U. S. N° 5.354.556, que é incorporada por refe- rência em sua totalidade.The powder may be dispersed or suspended in a liquid vehicle and will maintain its continuous release characteristics over a useful period of time. These dispersions or suspensions have chemical stability and dissolution rate stability. The powder may contain an excipient comprising a polymer which may be soluble, insoluble, permeable, impermeable, or biodegradable. The polymers may be polymers or copolymers. The polymer may be a natural or synthetic polymer. Natural polymers include polypeptides (e.g., zein), polysaccharides (e.g., cellulose), and alginic acid. Representative synthetic polymers include those described, but not limited to, those described in column 3, lines 33-45 of U.S. Patent No. 5,354,556, which is incorporated by reference in its entirety. Particularly suitable polymers include those described, but not limited to those described in column 3, line 46- column 4, line 8 of U.S. Patent No. 5,354,556, which is incorporated by reference in its entirety.

As composições de liberação contínua fornecidas aqui podem ser formuladas para administração parenteral, por exemplo, por injeções in- tramusculares ou implantes para tecidos subcutâneos e várias cavidades do corpo e dispositivos transdérmicos. Em uma modalidade, injeções intramus- culares são formuladas como suspensões aquosas ou oleosas. Em uma suspensão aquosa, o efeito de liberação contínua é devido, em parte, a uma redução na solubilidade do composto ativo sob complexação ou uma diminu- ição na taxa de dissolução. Um método similar é tomado com suspensões e soluções de óleo, em que a taxa de liberação de um composto ativo é de- terminada dividindo o composto ativo fora do óleo para o meio aquoso cir- cunvizinho. Apenas compostos ativos que são solúveis em óleo e têm as características de partição desejadas são adequados. Óleos que podem ser usados para injeção intramuscular incluem, mas não são limitados a, gerge- lim, azeitona, araquis, milho, amêndoa, feijão-soja, caroço de algodão e óleo de rícino.The sustained release compositions provided herein may be formulated for parenteral administration, for example, by intramuscular injections or implants into subcutaneous tissues and various body cavities and transdermal devices. In one embodiment, intramuscular injections are formulated as aqueous or oily suspensions. In an aqueous suspension, the continuous release effect is due in part to a reduction in solubility of the active compound under complexation or a decrease in dissolution rate. A similar method is taken with suspensions and oil solutions, wherein the release rate of an active compound is determined by dividing the active compound out of the oil into the surrounding aqueous medium. Only active compounds that are oil soluble and have the desired partition characteristics are suitable. Oils that can be used for intramuscular injection include, but are not limited to, geranium, olive, arachis, corn, almond, soybean, cottonseed, and castor oil.

Uma forma altamente desenvolvida de liberação de fármaco que dá liberação contínua em períodos de tempo variando de dias a anos é im- plantar um dispositivo polimérico portando fármaco subcutaneamente ou em várias cavidades de corpo. O material de polímero usado em um implante que deve ser biocompatível e não-tóxico inclui mas não é limitado a hidro- géis, silicones, polietilenos, copolímeros de etileno-acetato de vinila, ou po- límeros biodegradáveis.A highly developed form of drug release that gives continuous release over time periods ranging from days to years is to implant a polymeric device carrying drug subcutaneously or in various body cavities. Polymer material used in an implant that must be biocompatible and non-toxic includes but is not limited to hydrogels, silicones, polyethylenes, ethylene vinyl acetate copolymers, or biodegradable polymers.

Avaliação da Atividade dos CompostosCompound Activity Evaluation

A atividade dos compostos fornecidos aqui como inibidores de atividade de GS, por exemplo, atividade de GS adenililada, incluindo uma atividade de fosforil transferase de GS adenililada mediada por intermediário de carboxifosfato; e/ou como compostos pra tratar, prevenir, ou melhorar um ou mais sintomas, condições, ou distúrbios associados a uma infecção bac- teriana (por exemplo, infecção de Mycobacterium tuberculosis), pode ser medida ou avaliada em ensaios padrões. Ensaios de inibição enzimática (por exemplo, ensaios de γ-glutamil transferase, ensaios de hidrólise de ATP, produção de ADP1 e utilização de glutamato e ensaios de formação de glu- tamina), inibição de crescimento de bactérias, e ensaios de citoproteção, viabilidade, e citotoxicidade das células, todos estes são bem-conhecidos aqueles versados na técnica e/ou são descritos abaixo, podem ser empre- gados.The activity of the compounds provided herein as inhibitors of GS activity, for example, adenylylated GS activity, including a carboxyphosphate intermediate mediated adenylylated GS phosphoryl transferase activity; and / or as compounds for treating, preventing, or ameliorating one or more symptoms, conditions, or disorders associated with a bacterial infection (e.g., Mycobacterium tuberculosis infection), may be measured or evaluated in standard assays. Enzyme inhibition assays (eg γ-glutamyl transferase assays, ATP hydrolysis assays, ADP1 production and glutamate utilization and glutamine formation assays), bacterial growth inhibition, and cytoprotection assays, viability , and cytotoxicity of cells, all of which are well known to those skilled in the art and / or described below, may be employed.

Métodos de uso dos Compostos e ComposiçõesMethods of Using Compounds and Compositions

Ambos métodos in vitro ou in vivo podem ser executados com os compostos e composições descritos aqui. Aplicação in vitro dos compostos da invenção pode ser útil, por exemplo, em estudos científicos básicos de mecanismos de reação de GS, ou para métodos in vitro de tratar, impedir, reduzir, ou inibir uma contaminação ou infecção bacteriana, ou para inibir uma atividade de fosforil transferase de GS. Os compostos podem também ser usados in vivo como agentes terapêuticos contra infecções bacterianas, incluindo bactérias patogênicas ou oportunísticas. Em particular, os compos- tos podem ser usados como agentes terapêuticos contra infecções de bacté- rias de GSI-β tais como Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoea- e, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio eholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobae- ter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehisep- tia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Aeti- nomyees israelii, Noeardia esteroides, Thiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor. Os compostos podem ser úteis na prevenção e/ou terapia de doenças que envolvem microorganismos intracelulares (isto é, agentes infecciosos que replicam dentro de uma célula), por exemplo, bactérias intracelulares tais como M. tubereulosis.Both in vitro or in vivo methods may be performed with the compounds and compositions described herein. In vitro application of the compounds of the invention may be useful, for example, in basic scientific studies of GS reaction mechanisms, or for in vitro methods of treating, preventing, reducing, or inhibiting bacterial contamination or infection, or for inhibiting an activity. of phosphoryl transferase from GS. The compounds may also be used in vivo as therapeutic agents against bacterial infections, including pathogenic or opportunistic bacteria. In particular, the compounds may be used as therapeutic agents against infections of GSI-β bacteria such as Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoea-, Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris. , Shigella dysenteriae, Vibrio eholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehisepthia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Aerepineum lepidoptera israelii, Noeardia steroids, Thiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, and Streptomyees eoelieolor. The compounds may be useful in the prevention and / or therapy of diseases involving intracellular microorganisms (i.e. infectious agents that replicate within a cell), for example intracellular bacteria such as M. tubereulosis.

Os métodos da invenção podem ser aplicados a uma gama ex- tensiva de espécies, por exemplo, mamíferos tais como seres humanos, primatas não-humanos (por exemplo, macacos), cavalos, gado, porcos, ove- lhas, cabras, cachorros, gatos, coelhos, cobaias, hamsters, ratos, e camun- dongos. Como enzimas de GSI-β bacterianas são reguladas por meio da cascata de adenililação/desadenililação, mas as enzimas de GSII mamíferas não são, e como os inibidores aqui são postulados seletivamente alvejar GS adenililada, os compostos e composições podem ser usados seletivamente para inibir crescimento de célula bacteriana enquanto minimamente impac- tando de forma negativa as células mamíferas.The methods of the invention may be applied to a wide range of species, for example mammals such as humans, non-human primates (e.g. monkeys), horses, cattle, pigs, sheep, goats, dogs, cats, rabbits, guinea pigs, hamsters, rats, and mice. Since bacterial GSI-β enzymes are regulated via the adenylation / deadenylation cascade, but mammalian GSII enzymes are not, and as inhibitors here are selectively postulated to target adenylated GS, the compounds and compositions can be selectively used to inhibit growth. bacterial cells while minimally negatively impacting mammalian cells.

Em um método in vivo, um composto ou uma composição far- macêutica descrita(o) aqui (por exemplo, de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl ou VII; ou como exposto nos Exemplos) é administrada(o) ao sujei- to, por exemplo, um mamífero, tal como um mamífero suspeito de sofrer, ou sofrendo, de uma infecção bacteriana. Em geral, os compostos da invenção serão suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina fisiológica) e administrados oral ou transdermicamente ou injetados (ou infusos) intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitone- al, intrarretal, intravaginal, intranasal, intragástrica, intratraqueana, ou intra- pulmonarmente. Eles podem ser liberados diretamente a um tecido afetado apropriado.In an in vivo method, a compound or pharmaceutical composition described herein (e.g., according to formula I, II, III, IV, V, VII or VII; or as set forth in the Examples) is administered (o) subjecting, for example, a mammal, such as a mammal suspected or suffering from a bacterial infection. In general, the compounds of the invention will be suspended in a pharmaceutically acceptable carrier (e.g., physiological saline) and administered orally or transdermally or injected (or infused) intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intraretally, intravaginal, intranasal, intragastric , intratracheal, or intra pulmonary. They can be released directly to an appropriate affected tissue.

As dosagens dos compostos inibidores e agentes adicionais a serem usados dependem da escolha da rota de administração; da natureza da formulação; da natureza da enfermidade do paciente; do tamanho do su- jeito, peso, área de superfície, idade, e sexo; outros fármacos que são admi- nistrados; e do julgamento do médico assistente. Dosagens adequadas são em geral na faixa de 0,0001-100,0 mg/kg. Amplas variações na dosagem necessária serão esperadas em vista da variedade dos compostos e agen- tes adicionais disponíveis e das eficiências divergentes de várias rotas de administração. Por exemplo, seria esperado que administração oral requeira dosagens mais altas que administração por injeção i.v. Variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas usando rotinas empíricas padrões para otimização, como é bem entendido na técnica. Administrações de com- postos e/ou agentes adicionais podem ser simples ou múltiplos (por exem- plo, 2-, 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, ou mais vezes).Dosages of inhibitory compounds and additional agents to be used depend on the choice of route of administration; the nature of the formulation; the nature of the patient's illness; subject size, weight, surface area, age, and gender; other drugs that are administered; and the judgment of the attending physician. Suitable dosages are generally in the range of 0.0001-100.0 mg / kg. Wide variations in the required dosage will be expected in view of the variety of additional compounds and agents available and the differing efficiencies of various routes of administration. For example, oral administration would be expected to require higher dosages than i.v. injection administration. Variations in these dosage levels may be adjusted using standard empirical routines for optimization, as is well understood in the art. Additional compound and / or agent administrations may be single or multiple (e.g., 2-, 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150- , or more often).

ExemplosExamples

Exemplo 1 - Elucidação do Mecanismo Catalítico e Estrutura do Complexo de Mn(HCO3)2-ATPExample 1 - Elucidation of Catalytic Mechanism and Structure of Mn (HCO3) 2-ATP Complex

Base TeóricaTheoretical basis

A conformação de 5'-trifosfato de adenosina (ATP) em um com- plexo de manganês foi determinada usando técnicas de relaxamento magné- tico nuclear (vide abaixo). As distâncias do Mn2+ para os núcleos do ATP foram calculadas do termo de dipolar da equação de Solomon-Bleombergen: (Bloembergen, N., (1957) J. Chem. Phys. 27: (2), 572-596, Mildvan1 A. S. e Eagle1 J. L. (1972) Methods Enzymol. 26: 654-682, e Mildvan, A. S. e Cohn1 M. (1970) Adv. Enzymol. 33: 1-70):The conformation of adenosine 5'-triphosphate (ATP) in a manganese complex was determined using nuclear magnetic relaxation techniques (see below). Mn2 + distances to ATP nuclei were calculated from the dipolar term of the Solomon-Bleombergen equation: (Bloembergen, N., (1957) J. Chem. Phys. 27: (2), 572-596, Mildvan1 AS and Eagle JL (1972) Methods Enzymol 26: 654-682, and Mildvan, AS and Cohn M. (1970) Adv Enzymol 33: 1-70):

<formula>formula see original document page 63</formula><formula> formula see original document page 63 </formula>

Onde:Where:

S = Número quântico do giro do elétron (5/2 para Mn2+)S = Quantum number of electron spin (5/2 for Mn2 +)

γΙ = razão giromagnética nuclear (2,675 χ 104 rad.seg"1.gauss"1γΙ = nuclear gyromagnetic ratio (2,675 χ 104 rad.sec "1.gauss" 1

g = fator eletrônico "g" (2 para Mn2+) β = magneton de Bohr (8,795 χ 106 rad.seg"1.gauss"1) Xc = tempo de correlação dipolar (= 3,0 χ 10"11 para Mn-(H2O)6) u)| = freqüência de ressonância nuclear (6,28 χ 108 para 1H a 23,487 gauss)g = electronic factor "g" (2 for Mn2 +) β = Bohr magneton (8,795 χ 106 rad.seg "1.gauss" 1) Xc = dipolar correlation time (= 3,0 χ 10 "11 for Mn- ( H2O) 6) u) | = nuclear resonance frequency (6.28 χ 108 for 1H at 23.487 gauss)

GOs = freqüência de ressonância do giro do elétron (4,13 χ 1011 para 1H a 23,487 gauss)GOs = electron gyrus resonant frequency (4.13 χ 1011 for 1H to 23.487 gauss)

h = constante de acoplamento hiperfina r = distância elétron-nuclear média (centímetros) T1 = tempo de relaxamento longitudinal do próton T2 = tempo de relaxamento transversal do próton Xe = tempo de correlação do giro do elétron ρ = razão da concentração do íon paramagnético para ligando. A contribuição paramagnética para as taxas de relaxamento lon- gitudinais e transversais, 1/T1p e 1/T2p, é calculado subtraindo as contribui- ções diamagnéticas:h = hyperfine coupling constant r = mean electronuclear distance (centimeters) T1 = proton longitudinal relaxation time T2 = proton transverse relaxation time Xe = electron gyrus correlation time ρ = paramagnetic ion concentration ratio turning on. The paramagnetic contribution to longitudinal and transverse relaxation rates, 1 / T1p and 1 / T2p, is calculated by subtracting the diamagnetic contributions:

onde 1/T^obs) é a taxa de relaxamento na presença da espécie paramagnéti- ca e IZT1(O) é a taxa de relaxamento na ausência da espécie paramagnética. A contribuição paramagnética para a taxa de relaxamento, 1ZT1p é relaciona- da à taxa de relaxamento na primeira esfera de coordenação, IZT1M, por: <formula>formula see original document page 64</formula>where 1 / T ^ obs) is the relaxation rate in the presence of the paramagnetic species and IZT1 (O) is the relaxation rate in the absence of the paramagnetic species. The paramagnetic contribution to the relaxation rate, 1ZT1p, is related to the relaxation rate in the first coordination sphere, IZT1M, by: <formula> formula see original document page 64 </formula>

onde 1/T1(os) é a contribuição de esfera externa para a taxa de relaxamento, ρ é a razão da concentração do íon paramagnético na concentração de li- gando, e q é o número de Iigandos na esfera de coordenação. O valor de q é obtido da taxa de relaxamento de água e é indicado quantas moléculas de água, no íon paramagnético, foram substituídas pela coordenação de ligan- do. O tempo de permanência das espécies nucleares, xm, na primeira esfera de coordenação do íon paramagnético, leva em conta a taxa de permuta entre o ligado e a forma não-ligada. 1/T1p e 1/T2p são normalizados para a concentração multiplicando por ρ. O tempo de relaxamento na primeira esfe- ra de coordenação, T1M, do núcleo magnético de ATP ligado é igual a pqTip no limite de permuta rápida.where 1 / T1 (os) is the external sphere contribution to the relaxation rate, ρ is the ratio of the paramagnetic ion concentration to the ligand concentration, and q is the number of ligands in the coordination sphere. The q value is obtained from the water relaxation rate and is indicated how many water molecules in the paramagnetic ion have been replaced by ligand coordination. The residence time of the nuclear species, xm, in the first sphere of coordination of the paramagnetic ion, takes into account the exchange rate between bound and unbound form. 1 / T1p and 1 / T2p are normalized to concentration by multiplying by ρ. The relaxation time in the first coordination ball, T1M, of the bound ATP magnetic core is equal to pqTip at the rapid exchange limit.

Para interpretar a estrutura e propriedades dinâmicas dos com- plexos de metal-molécula orgânica paramagnética, os valores (ou os limites) de q, devem ser determinados r, e xc. O tempo de correlação, xc, caracteriza o processo da taxa que modula a interação dipolar e é definido por:To interpret the structure and dynamic properties of paramagnetic organic metal-molecule complexes, the values (or limits) of q must be determined r, and xc. The correlation time, xc, characterizes the rate process that modulates dipolar interaction and is defined by:

<formula>formula see original document page 64</formula><formula> formula see original document page 64 </formula>

e os parâmetros que contribuem para o tempo de correlação são xr que são a constante de tempo para o movimento rotacional do vetor de raio do nú- cleo do íon internuclear, xs o tempo de relaxamento do giro do elétron, e Xm o tempo de permanência das espécies nucleares na primeira esfera de co- ordenação do íon paramagnético. O valor 1/xm é a taxa de permuta de ligan- do entre a forma ligada e não-ligada. O tempo de correlação, xc, é determi- nado pelo processo de taxa mais rápido, ou quantas vezes for, xr, xs ou xm, é o mais curto. Uma estimação destes tempos é requerida para permitir 1/xc ser calculado.and the parameters that contribute to the correlation time are xr which are the time constant for the rotational motion of the internuclear ion nucleus ray vector, xs the electron gyrus relaxation time, and Xm the residence time. of nuclear species in the first sphere of coordination of the paramagnetic ion. The value 1 / xm is the rate of binding exchange between bound and unbound form. The correlation time, xc, is determined by the fastest rate process, or as often as xr, xs or xm is the shortest. An estimation of these times is required to allow 1 / xc to be calculated.

Os tempos de relaxamento Ti e T2 para os prótons de ATP H8, H2, H1 e H2O foram obtidos para o complexo de Mn(HC03")2-ATP e de Mn- CI2-ATP, a uma faixa de temperaturas de 25 a 46gC. Os valores de T1M e T2M para cada próton foram depois determinados como também as taxas de re- laxamento 1/T1p e 1/T2p. A dependência de freqüência nos tempos de rela- xamento T1 e T2 para os prótons H8, H2, H1 e H2O1 foram determinados a 200, 300, 400 e 500 MHz.Ti and T2 relaxation times for ATP protons H8, H2, H1 and H2O were obtained for the Mn (HC03 ") 2-ATP and Mn-CI2-ATP complex at a temperature range of 25 to 46gC. The T1M and T2M values for each proton were then determined as well as the 1 / T1p and 1 / T2p relaxation rates. The frequency dependence at T1 and T2 relay times for the H8, H2, H1 protons and H2O1 were determined at 200, 300, 400 and 500 MHz.

Temperatura e freqüência foram depois usadas para destrinçar as contribuições dos vários tempos de correlação para os valores de 1/pT-ip e os 1/pT2p.Temperature and frequency were then used to disentangle the contributions of the various correlation times to the 1 / pT-ip and 1 / pT2p values.

Intensificação da taxa de relaxamento com relação à do aquo- complexo, (Mn(H2O)62"1"), é antecipada. No aquo-complexo, xc é determinado por xr, o tempo rotacional. Se o tempo de permanência na primeira esfera de coordenação, xm, dominar a taxa de relaxamento longitudinal, 1/T1P, xm > T1M, e uma vez que T2M ^ T1M, xm deve também dominar 1/T2p, e 1/T1P ξ 1/T2p. Considerando que xm diminui com temperatura crescente, 1/T1P e 1/T2P têm que aumentar com temperatura crescente. Como xm é indepen- dente da freqüência 1/T1p e 1/T2p é independente da freqüência, portanto um diagrama de T1 ρ como varia-se a freqüência de RMN (ωι2) deveria indicar a dependência de T-1P em freqüência. Se T1P for independente da freqüência (ωI)2 então xm é o fator dominante. No diagrama de T1 versus ω2 a razão do declive para o interseção é xc2, permitindo xc ser calculado. Se as taxas de relaxamento diminuem com as temperaturas crescentes, então T1M e T2M (relaxamento de esfera externo) determinam 1/T-1p e 1/T2p. Além desta de- pendência de temperatura, se as taxas de relaxamento observadas também dependerem da freqüência, o processo de taxa diferente de permuta quími- ca, compõe uma contribuição significativa para T1P.Intensification of the relaxation rate relative to that of the aquaculture, (Mn (H2O) 62 "1"), is anticipated. In the aquo-complex, xc is determined by xr, the rotational time. If the residence time in the first coordination sphere, xm, dominates the longitudinal relaxation rate, 1 / T1P, xm> T1M, and since T2M ^ T1M, xm must also dominate 1 / T2p, and 1 / T1P ξ 1 / T2p. Since xm decreases with increasing temperature, 1 / T1P and 1 / T2P have to increase with increasing temperature. Since xm is independent of frequency 1 / T1p and 1 / T2p is independent of frequency, so a T1 ρ diagram of how the NMR frequency varies (ωι2) should indicate the frequency dependence of T-1P. If T1P is frequency independent (ωI) 2 then xm is the dominant factor. In the plot of T1 versus ω2 the slope to intersection ratio is xc2, allowing xc to be calculated. If relaxation rates decrease with increasing temperatures, then T1M and T2M (external sphere relaxation) determine 1 / T-1p and 1 / T2p. In addition to this temperature dependence, if the observed relaxation rates also depend on the frequency, the different rate of chemical exchange process makes a significant contribution to T1P.

Quando um diagrama de 1/T1P versus temperatura for positivo, este pode ser um resultado de 3 possibilidades:When a 1 / T1P versus temperature diagram is positive, this can be a result of 3 possibilities:

1. A taxa de permuta química 1/xm é suficientemente lenta para dominar 1/T1P.1. The 1 / xm chemical exchange rate is slow enough to dominate 1 / T1P.

2. Se permuta rápida ocorrer e xs dominar T1m, então xs tem um coeficiente de temperatura positivo sob estas condições.2. If rapid exchange occurs and xs dominates T1m, then xs has a positive temperature coefficient under these conditions.

3. Se xc ≥ 10"8 seg de forma que ω2χ02 (1, e /(xc) é uma função de 1/xc e aumenta à medida que xc fica mais curto com a temperatura cres- cente.3. If xc ≥ 10 "8 sec so that ω2χ02 (1, and / (xc) is a function of 1 / xc and increases as xc becomes shorter with increasing temperature.

O tempo de correlação, xe que caracteriza a interação de calor que é transmitida através das ligações químicas ao invés de pelo espaço, é dado por:The correlation time, x and which characterizes the interaction of heat that is transmitted through chemical bonds rather than space, is given by:

<formula>formula see original document page 66</formula><formula> formula see original document page 66 </formula>

Sob a maioria das condições xs é mais curto que xM. Em tempe- raturas altas para algum íons Xm pode ficar mais curto que xs.Under most conditions xs is shorter than xM. At high temperatures for some ions Xm may be shorter than xs.

O זc, é obtido da razão de declive para interceptar (= tc2) do dia- grama de T1 versus ωl2. Se o Tc for mais curto que o limite mais baixo de xs, então é improvável que permuta rápida ocorra e Ts domine T1M. Sob estas condições xc não terá um coeficiente de temperatura positivo provavelmente.ז c is obtained from the slope to intercept (= tc2) ratio of T1 versus ωl2. If Tc is shorter than the lower limit of xs, then fast switching is unlikely to occur and Ts dominates T1M. Under these conditions xc will probably not have a positive temperature coefficient.

Se nenhum efeito de freqüência de RMN em 1/T1P) na região do coeficiente de temperatura positivo de 1/T-ip for observado, então o meca- nismo de relaxamento dominante é devido a 1/TM, a taxa de permuta de li- gando.If no 1 / T1P NMR frequency effect) in the region of the positive temperature coefficient of 1 / T-ip is observed, then the dominant relaxation mechanism is due to 1 / TM, the rate of exchange of Gando.

As dependências de temperatura e de freqüência de 1/T1P e os espectros de EPR são portanto usados para decidir quais dos processos de taxa ou combinação de processos de taxa (tr, xs ou xm) são responsáveis pelo relaxamento do giro nuclear. Portanto, do espectro de EPR do comple- xo de Mn2+, é obtido um limite mais baixo para o tempo de relaxamento do giro do elétron xs.Temperature and frequency dependencies of 1 / T1P and EPR spectra are therefore used to decide which rate processes or rate process combination (tr, xs or xm) are responsible for nuclear spin relaxation. Therefore, from the EPR spectrum of the Mn2 + complex, a lower limit for the relaxation time of the electron gyrus xs is obtained.

A Dissociação de Bicarbonato e seu Efeito em Atp na Presença de íons deBicarbonate Dissociation and its Effect on Atp in the Presence of

Metal DivalentesMetal Divalents

A dissociação do íon de bicarbonato em solução é dependente de pH. O efeito da dissociação de HCCV na atividade de GS foi determinado na presença de Mn2+ e Mg2+. Isto é de importância fisiológica como GS tem duas ótimas de pH para a atividade, a saber pH 6,3 e pH 7,3, dependendo do estado de adenililação da enzima. Com base na teoria de dissociação clássica em pH 6,3, bicarbonato existe em uma razão de 50:50 com CO2 e pH 7,3 existe quase somente como HCO3" com uma quantidade desprezível que está na forma de CO32'. Entre pH 5,0 e pH 8,0, o equilíbrio da dissocia- ção de um sal de bicarbonato tal como NH4HCO3 ou NaHCO3 é: NH4HCO3 + H2O i=i NH4+ + HCO3" * NH4+ + CO2 + OH" i; NH3 + CO2 + H2O NaHCO3 25 Na+ + HCO3" U Na+ + CO2 + OΗ"Dissociation of bicarbonate ion in solution is pH dependent. The effect of HCCV dissociation on GS activity was determined in the presence of Mn2 + and Mg2 +. This is of physiological importance as GS has two optimum pH for activity, namely pH 6.3 and pH 7.3, depending on the enzyme's adenylation state. Based on the classical dissociation theory at pH 6.3, bicarbonate exists at a 50:50 ratio with CO2 and pH 7.3 exists almost only as HCO3 "with a negligible amount that is in the form of CO32 '. Between pH 5 And pH 8.0, the dissociation balance of a bicarbonate salt such as NH4HCO3 or NaHCO3 is: NH4HCO3 + H2O i = 1 NH4 + + HCO3 "* NH4 + + CO2 + OH" i; NH3 + CO2 + H2O NaHCO3 25 Na + + HCO3 "U Na + + CO2 + OΗ"

Em soluções aquosas de ácidos polibásicos pode ser difícil de obter uma interpretação simples das medições de condutância devido aos equilíbrios de dissociação de sobreposição. Dentro da faixa de pH de inte- resse dentro desta investigação, a saber pH 5,5 a 8,0, as únicas espécies postuladas serem de importância são NH4+, HCO3" e CO2. O C032" repre- senta pequeno papel ou nenhum no mecanismo de reação postulada.In aqueous solutions of polybasic acids it may be difficult to obtain a simple interpretation of conductance measurements due to overlap dissociation balances. Within the pH range of interest within this investigation, namely pH 5.5 to 8.0, the only species postulated to be of importance are NH4 +, HCO3 "and CO2. C032" plays little or no role in postulated reaction mechanism.

A constante de equilíbrio da reação de dissociação é dada por:The equilibrium constant of the dissociation reaction is given by:

<formula>formula see original document page 67</formula><formula> formula see original document page 67 </formula>

Porém, um segundo equilíbrio é fixado depender do pH da solu- ção:However, a second equilibrium is fixed depending on the pH of the solution:

<formula>formula see original document page 67</formula><formula> formula see original document page 67 </formula>

onde Fi denota os quocientes dos coeficientes da atividade:where Fi denotes the coefficients of the activity coefficients:

<formula>formula see original document page 67</formula><formula> formula see original document page 67 </formula>

As concentrações das várias espécies presentes na solução como definido pelo grau total de dissociação, a, e pelo pH da solução como prognosticado pela equação de Henderson-Hasselbach:Concentrations of the various species present in the solution as defined by the total degree of dissociation, a, and the pH of the solution as predicted by the Henderson-Hasselbach equation:

<formula>formula see original document page 67</formula><formula> formula see original document page 67 </formula>

Porém, entre as concentrações de 1 mM e 5 mM, em pH 5,5 em pH 8,0, a quantidade de NH4HCO3 não-associado é desprezível. Tipicamen- teHowever, between concentrations of 1 mM and 5 mM, at pH 5.5 at pH 8.0, the amount of unassociated NH4HCO3 is negligible. Typically

<formula>formula see original document page 67</formula><formula> formula see original document page 67 </formula>

Porém, no caso de NH4HCO3 ser postulado em concentrações baixas:However, if NH4HCO3 is postulated at low concentrations:

<formula>formula see original document page 67</formula> <formula>formula see original document page 68</formula><formula> formula see original document page 67 </formula> <formula> formula see original document page 68 </formula>

Portanto:Therefore:

<formula>formula see original document page 68</formula><formula> formula see original document page 68 </formula>

À medida que o pH de pH 5,5 aumenta para pH 8,0, a condutivi- dade da solução em uma faixa dos níveis de pH deveria ser indicativa da concentração de HCO3" e pela diferença a concentração de CO2 na solução.As the pH of pH 5.5 increases to pH 8.0, the conductivity of the solution over a range of pH levels should be indicative of the HCO3 "concentration and the difference in the CO2 concentration in the solution.

Na presença de 10 mM de tampão de Imidazol.HCI as concentrações relati- vas podem ser diferentes. Esta investigação foi fixa até determinar a exten- são pela qual a presença de Imidazol em uma solução com NH4HCO3 pode realizar a dissociação em HCO3" e CO2. Isto é importante para saber como as concentrações relativas de cada um podem afetar o funcionamento de GS adenililada na presença do complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP. É tam- bém acreditado que HCO3" e CO2 representem um papel na reação mediada por catálise de GS adenililada. Imidazol.HCI tem um pKa de 6.92 a 25SC. Sob solução com NH4HCO3, as espécies de imidazólio podem agir como o contraíon para HCO3". Em pH baixo, a dissociação do NH4HCO3 tende à formação de CO2 solúvel e NH3.In the presence of 10 mM Imidazole.HCI buffer the relative concentrations may differ. This investigation was fixed until the extent to which the presence of Imidazole in a NH4HCO3 solution can dissociate into HCO3 "and CO2 is important. It is important to know how the relative concentrations of each can affect the functioning of adenylyl GS. in the presence of the (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2ATP complex. It is also believed that HCO3 "and CO2 play a role in the catalyzed reaction mediated by adenylylated GS. Imidazole.HCI has a pKa of 6.92 to 25SC. Under NH4HCO3 solution, the imidazole species can act as the counterion to HCO3". . At low pH, dissociation of NH4HCO3 tends to form soluble CO2 and NH3.

<formula>formula see original document page 68</formula><formula> formula see original document page 68 </formula>

A dissociação de Imidazol.HCI em solução aquosa é:The dissociation of Imidazol.HCI in aqueous solution is:

<formula>formula see original document page 68</formula><formula> formula see original document page 68 </formula>

Em uma solução de 10 mM de Imidazol.HCI contendo 1 mM de NH4HCO3, em pH mais alto, o excesso de Imidazol na solução pode se tor- nar o contraíon para HCO3" criando uma espécie iônica adicional cuja pre- sença é mensurável por análise de condutividade.In a 10 mM Imidazole.HCI solution containing 1 mM NH4HCO3, at higher pH, excess Imidazole in the solution can become the HCO3 counterion "creating an additional ionic species whose presence is measurable by analysis. of conductivity.

<formula>formula see original document page 68</formula><formula> formula see original document page 68 </formula>

Portanto no caso sob consideração as condutividades molares observadas, Λ, para os vários níveis de pH são a soma das contribuições dos íons j que compõe o eletrólito, e Yj é a condutividade específica de cada íon.Therefore in the case under consideration the observed molar conductivities, Λ, for the various pH levels are the sum of the contributions of the ions that make up the electrolyte, and Yj is the specific conductivity of each ion.

<formula>formula see original document page 69</formula><formula> formula see original document page 69 </formula>

Análise de condutividade foi usada para determinar se a dissoci- ação deste NH4HCO3, em uma solução de tampão de Imidazol a uma razão de concentração de 10 mM Imidazol para 1 mM de NH4HCO3, ainda poderia ser quantificada. Soluções de Imidazol.HCI foram preparadas a uma faixa de valores de pH às quais foi adicionado 1 mM de NH4HCO3, para dar uma concentração final de Imidazol de 10 mm.Conductivity analysis was used to determine whether the dissociation of this NH4HCO3 in an Imidazole buffer solution at a concentration ratio of 10 mM Imidazole to 1 mM NH4HCO3 could still be quantified. Imidazole.HCl solutions were prepared over a range of pH values to which 1 mM NH4HCO3 was added to give a final Imidazole concentration of 10 mm.

Demonstração do Mecanismo Catalítico - Visão GeralCatalytic Engine Demo - Overview

A análise estrutural e modelagem molecular de um complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP indicou que o complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP re- presenta um papel significativo no mecanismo de reação. Foram usados dois métodos para demonstrar o mecanismo de reação. Mutagênese Ioco- dirigida (SDM) foi usada para demonstrar o papel que os aminoácidos fun- damentais representam no sítio ativo da enzima em um processo de transfe- rência de fosforila. SDM foi realizada em His269, His271, Glu207 e Arg356. Como previamente indicado, todos os números de resíduo de aminoácido correspondem aos resíduos de GS de E. colr, alguém versado na técnica poderia determinar os resíduos correspondentes em GS de outras espécies usando técnicas conhecidas, por exemplo, modelagem molecular ou alinha- mentos de homologia. A atividade da enzima de γ-glutamil transferase foi depois determinada para cada enzima mutada e comparada com à da enzi- ma não-mutada. Para obter enzima completamente desadenililada SDM foi realizada no sítio de adenililação da GS, a saber Tyr397 foi mutado para Val397. GS completamente adenililada ou desadenililada foi também obtida pela cultura contínua de E. coli sob condições de qualquer excesso de nitro- gênio e limitação de carbono ou limitação de nitrogênio e excesso de carbo- no como esboçado por Sênior, P. J. (1975) J. Bact. 123: (2), 407-418. A GS completamente adenililada funciona com uma preferência para Mn2+ en- quanto a GS desadenililada tem uma preferência para Mg2+. O segundo método usado para demonstrar o mecanismo de re- ação foi o uso de espectroscopia de RMN para demonstrar as diferenças funcionais que podem ocorrer em reações de transferência de fosforila cata- lisada por ATP usando Mg2+ ou Mn2+ como o íon de metal divalente. Estas reações foram realizadas na ausência da enzima. Dados de relaxamento de RMN de próton indicaram que no caso de Mn2+, o íon de metal divalente po- de estar em proximidade íntima ao anel de adenina e o postulado original foi que este pode desempenhar um papel na catálise. Foi subseqüentemente observado que sob certas condições o próton de Ce do ATP é lábil e que um mecanismo pelo qual este poderia ocorrer é se as ligações de Mn2+ ao C8 formassem um carbeno de metal. É proposto que possível carboxilação do N7 ou protonação do N7 por um HCO3" coordenado possa surgir durante a ligação enzimática dos substratos que induzem uma espécie de imônio em N7. Esta espécie de imônio também facilita a formação de ligação putativa entre o Mn2+ e C8 que formam um carbeno de metal. É proposto que a carga (próton eficaz) seja translocado de um HCO3" coordenado para N7. O mesmo efeito poderia ser mediado pela carboxilação de N7.Structural analysis and molecular modeling of a (Mn2 +) 3. (HC03 ') i2ATP complex indicated that the (Mn2 +) 3. (HC03') i2ATP complex plays a significant role in the reaction mechanism. Two methods were used to demonstrate the reaction mechanism. Ioco-directed mutagenesis (SDM) was used to demonstrate the role that fundamental amino acids play in the active site of the enzyme in a phosphoryl transfer process. SDM was performed on His269, His271, Glu207 and Arg356. As previously indicated, all amino acid residue numbers correspond to E. colr GS residues, one skilled in the art could determine corresponding GS residues of other species using known techniques, for example, molecular modeling or homology alignments. . The activity of the γ-glutamyl transferase enzyme was then determined for each mutated enzyme and compared with that of the unchanged enzyme. To obtain completely desadenylated enzyme SDM was performed at the GS adenylation site, namely Tyr397 was mutated to Val397. Completely adenylylated or deadenylated GS was also obtained by continuous culture of E. coli under conditions of any excess nitrogen and carbon limitation or nitrogen limitation and excess carbon as outlined by Senior, PJ (1975) J. Bact . 123: (2), 407-418. Fully adenylylated GS works with a preference for Mn2 + whereas desadenylated GS has a preference for Mg2 +. The second method used to demonstrate the reaction mechanism was the use of NMR spectroscopy to demonstrate the functional differences that can occur in ATP-catalyzed phosphoryl transfer reactions using Mg2 + or Mn2 + as the divalent metal ion. These reactions were performed in the absence of the enzyme. Proton NMR relaxation data indicated that in the case of Mn2 +, the divalent metal ion may be in close proximity to the adenine ring and the original postulate was that it may play a role in catalysis. It was subsequently observed that under certain conditions the ATP's Ce proton is labile and that one mechanism by which this could occur is if the Mn2 + to C8 bonds formed a metal carbene. It is proposed that possible carboxylation of N7 or protonation of N7 by a coordinated "HCO3" may arise during enzymatic binding of substrates that induce a species of N7 imonium. This species of imonium also facilitates the putative bond formation between Mn2 + and C8. form a metal carbene. It is proposed that the charge (effective proton) be translocated from a coordinated HCO3 "to N7. The same effect could be mediated by carboxylation of N7.

Uma vez o carbeno de metal é formado aquele grupo de carboxi- Ia em N7 poderia depois representar um papel na transferência de fosforila que forma um carbóxi-fosfato com o rompimento concomitante abaixo do carbeno de metal. Durante a catálise da enzima o grupo de fosforila é depois transferido por meio das cadeias laterais dos resíduos de aminoácido, His269 e His271, para o glutamato, formando fosfato de γ-glutamila, com Glu207 e Arg356 também desempenhando um papel na catálise. Para de- monstrar o C8-H lábil, os complexos de Mg-ATP, Mn(HC03)2-ATP e MnCI2- ATP foram preparados em D2O e a presença do C8-H foi monitorada através de 1H RMN. A reação inteira foi realizada em D2O porque se o próton de C8 for lábil, o deslocamento de 1H RMN para o próton de C8 desapareceria du- rante o curso da reação como haveria permuta deste próton do ATP com fase de volume, isto é no D2O. A hidrólise de ATP foi também monitorada durante o curso da reação. O papel do próton de C8 na reação foi também demonstrado usando ATP deuterado em C8 no ensaio de glutamina sinteta- se e determinando o efeito isótopo catalítico suscitado. O efeito de isótopo catalítico foi apenas observado operar na reação mediada pela glutamina sintetase adenililada usando Mn2+ e não a glutamina sintetase desadenililada usando Mg2+.Once metal carbene is formed that N7 carboxy group could then play a role in phosphoryl transfer which forms a carboxy phosphate with the concomitant disruption below the metal carbene. During enzyme catalysis the phosphoryl group is then transferred via the amino acid residue side chains, His269 and His271, to glutamate, forming γ-glutamyl phosphate, with Glu207 and Arg356 also playing a role in catalysis. To demonstrate labile C8-H, Mg-ATP, Mn (HC03) 2-ATP and MnCl2-ATP complexes were prepared in D2O and the presence of C8-H was monitored by 1 H NMR. The entire reaction was performed on D2O because if the C8 proton is labile, the 1 H NMR shift to the C8 proton would disappear during the course of the reaction as there would be exchange of this volume phase ATP proton, ie D2O. . ATP hydrolysis was also monitored during the course of the reaction. The role of the C8 proton in the reaction has also been demonstrated using C8 deuterated ATP in the glutamine assay is synthesized and determining the elicited catalytic isotope effect. The catalytic isotope effect was only observed to operate on the reaction mediated by adenylylated glutamine synthetase using Mn2 + and not to desadenylated glutamine synthetase using Mg2 +.

Demonstração do Mecanismo Catalítico - Materiais e Métodos Preparação dos Complexos de Mn(HCO3)2-ATP E MnCI2-ATPCatalytic Engine Demonstration - Materials and Methods Preparation of Mn (HCO3) 2-ATP and MnCI2-ATP Complexes

Na2ATP foi dissolvido em água a uma concentração de ξ 80 mm. Os íons de Na+ foram depois removidos do ATP passando a solução para em resina de permuta de cátion forte Dowex 50 WX2 na forma de ácido. A resina Dowex 50 WX2 foi convertida na forma de ácido passando 3 volumes de leito de 50 mM de HCI na coluna e depois lavando a coluna com 5 volu- mes de leito de H2O. Todas as amostras contendo o ácido-ATP foram agru- padas e reagidas com uma concentração molar equivalente de MnCO3, Mg(0H)2.3MgC03.3H20 ou misturadas com MnCI2. As soluções contendo Mg(0H)2.3MgC03.3H20 e MnCO3 foram agitadas até que fosse dissolvido todo o MnCO3 ou Mg(0H)2.3MgC03.3H20. O pH da solução de Mn(HCO3)- ATP foi depois ajustado para pH 6,3-7,0 com NaHCO3. O pH dos complexos de Mg2+ e MnCI2 de ATP foram ajustados com NaOH. Na4ATP foi preparado ajustando o pH de uma solução de 80 mM com NaOH para pH 7,0. A pre- sença dos complexos foi demonstrada usando espectroscopia de massa de eletropulverização (dados não mostrados). A estoiquimetria correta do Mn2+ foi determinada usando ICP (dados não mostrados). A estoiquimetria apro- ximada do HCO3" no complexo de Mn(HCO3 )2-ATP foi determinado mono- metricamente.Na2ATP was dissolved in water at a concentration of ξ 80 mm. The Na + ions were then removed from the ATP by passing the solution to Dowex 50 WX2 strong cation exchange resin in acid form. Dowex 50 WX2 resin was converted to acid form by passing 3 volumes of 50 mM HCI bed in the column and then washing the column with 5 volumes of H2O bed. All samples containing the ATP-acid were pooled and reacted with an equivalent molar concentration of MnCO3, Mg (OH) 2.3MgC03.3H20 or mixed with MnCl2. The solutions containing Mg (OH) 2.3MgCO3.3H20 and MnCO3 were stirred until all of the MnCO3 or Mg (OH) 2.3MgCO3.3H20 was dissolved. The pH of the Mn (HCO3) -ATP solution was then adjusted to pH 6.3-7.0 with NaHCO3. The pH of ATP Mg2 + and MnCl2 complexes were adjusted with NaOH. Na4ATP was prepared by adjusting the pH of an 80 mM solution with NaOH to pH 7.0. The presence of the complexes was demonstrated using electrospray mass spectroscopy (data not shown). Correct Mn2 + stoichiometry was determined using ICP (data not shown). The approximate stoichiometry of HCO3 "in the Mn (HCO3) 2-ATP complex was determined monometrically.

O Efeito da Concentração de ATP na Análise de RMN de Complexos de Na4ATP. MnfHCQ3 VATP. Mg-ATP E MnCIp-ATPThe Effect of ATP Concentration on NMR Analysis of Na4ATP Complexes. MnfHCQ3 VATP. Mg-ATP And MnCIp-ATP

Para determinar o impacto da pilha na 1H RMN de ATP o efeito da concentração de ATP de Na4ATP, Mn(HCO3 )2-ATP, Mg-ATP e MnCI2- ATP nos tempos de relaxamento Ti para os prótons de H8, H2, Ήι e H2O foi determinado. O Mn(HCO3 )2-ATP e MnCI2-ATP foram adicionado a Na4ATP e Mg-ATP em 10"3 a concentração. A ATP foi adicionada a uma faixa de concentrações variando de 5 a 120 mM. Análise de RMN de Complexos de Na4ATP, MN(HCO3-)2- ATP, Mg-ATP E MnCl2-ATPTo determine the impact of the cell on the 1 H NMR of ATP, the effect of Na4ATP, Mn (HCO3) 2-ATP, Mg-ATP and MnCI2-ATP ATP concentration on Ti relaxation times for H8, H2, Ήι and H2O was determined. Mn (HCO3) 2-ATP and MnCl2-ATP were added to Na4ATP and Mg-ATP at 10-3 concentration. ATP was added over a range of concentrations ranging from 5 to 120 mM. NMR Analysis of Na4ATP Complexes , MN (HCO3-) 2- ATP, Mg-ATP AND MnCl2-ATP

O efeito do complexo de Mn(HCO3-)2-ATP e o complexo de Mn- Cl2-ATP nos tempos de relaxamento T1 longitudinal e T2 transversal para os prótons H8, H2, 'H1 e H2O foi determinado. O complexo de Mn(HCO3 )2-ATP e o complexo de MnCI2-ATP foram adicionados a 60 mM de solução de Na4ATP ou Mg-ATP, para uma concentração de 60 μΜ. A solução de 60 mM de Na4ATP contendo complexos de Mn(HCO3 )2-ATP ou de MnCl2-ATP foi Iiofilizada e armazenada a -20°C e preparada como requerido dissolvendo em D2O. Experimentos de ressonância magnética nuclear para obter os tempos de relaxamento T1 e T2 foram realizados nos complexos de Na4ATP ou Mg-ATP na presença e ausência de Mn(HCO3 )2-ATP ou MnCl2-ATP em um espectrômetro de RMN Varian UNITYplus de 400 MHz. O complexo de Mn(HC03-)2-ATP é com base nas concentrações relativas de Na2HCO3 para MnCO3 para ATP adicionadas às soluções. Os tempos de relaxamento fo- ram determinados a uma faixa de temperaturas.The effect of the Mn (HCO3-) 2-ATP complex and the Mn-Cl2-ATP complex on the longitudinal T1 and transverse T2 relaxation times for the H8, H2, 'H1 and H2O protons was determined. Mn (HCO3) 2-ATP complex and MnCl2-ATP complex were added to 60 mM Na4ATP or Mg-ATP solution at a concentration of 60 μ. The 60 mM Na4ATP solution containing Mn (HCO3) 2-ATP or MnCl2-ATP complexes was lyophilized and stored at -20 ° C and prepared as required by dissolving in D2O. Nuclear magnetic resonance experiments to obtain T1 and T2 relaxation times were performed on Na4ATP or Mg-ATP complexes in the presence and absence of Mn (HCO3) 2-ATP or MnCl2-ATP on a 400 MHz Varian UNITYplus NMR Spectrometer The Mn (HC03-) 2-ATP complex is based on the relative concentrations of Na2HCO3 to MnCO3 for ATP added to the solutions. Relaxation times were determined over a range of temperatures.

O efeito da freqüência de RMN nos tempos de relaxamento T1 e T2 é determinado a 200 MHz, 300 MHz, 400 MHz e 500 MHz. Os instrumen- tos usados foram um Varion Gemini200/2000 (200 MHz), Varion Unity Inova 400 (400 MHz) Brüker ARX 300 (300 MHz) e Advance 500 (500 MHz).The effect of NMR frequency on T1 and T2 relaxation times is determined at 200 MHz, 300 MHz, 400 MHz and 500 MHz. The instruments used were a Varion Gemini200 / 2000 (200 MHz), Varion Unity Inova 400 (400 MHz) Brüker ARX 300 (300 MHz) and Advance 500 (500 MHz).

Efeito de pH na Dissociação de NH4HCO3 em Tampão de ImidazolEffect of pH on NH4HCO3 Dissociation in Imidazole Buffer

O efeito de pH na dissociação de NH4HCO3 em tampão de Imi- dazol foi determinado. Soluções de NH4HCO3 (1 mM) foi preparado no tam- pão de Imidazol.HCI (10 mM) a uma faixa de níveis de pH. A condutividade de apenas 10 mM de Imidazol.HCI e 10 mM de Imidazol.HCI mais 1 mM de NH4HCO3 nos vários níveis de pH foi também determinada. Todas as solu- ções foram preparadas em água com uma condutividade específica de 18 pS. A condutividade específica foi depois determinada usando um medidor de condutividade Jenway 4150. A diferença nas condutividades específicas das duas relações obtidas é, portanto, compreendida das contribuições das condutividades específicas dos íons, j, compondo a solução de eletrólito. As condutividades molares observadas, ^, nos vários níveis de pH são a soma das condutividades molares individuais.The effect of pH on dissociation of NH4HCO3 in Imidazole buffer was determined. NH4HCO3 solutions (1 mM) was prepared in Imidazole.HCl buffer (10 mM) at a range of pH levels. The conductivity of only 10 mM Imidazole.HCl and 10 mM Imidazole.HCI plus 1 mM NH4HCO3 at various pH levels was also determined. All solutions were prepared in water with a specific conductivity of 18 pS. The specific conductivity was then determined using a Jenway 4150 conductivity meter. The difference in the specific conductivities of the two relationships obtained is therefore comprised of the contributions of the specific ion conductivities, j, making up the electrolyte solution. The observed molar conductivities at various pH levels are the sum of the individual molar conductivities.

<formula>formula see original document page 73</formula><formula> formula see original document page 73 </formula>

A Taxa de Hidrólise de ATP e a Deuteração de Complexos de C- H8 em Na4ATP, MN(HCO3 )2-ATP1 Mg-ATP e MnCI2-ATP.ATP Hydrolysis Rate and Deuteration of C-H8 Complexes in Na4ATP, MN (HCO3) 2-ATP1 Mg-ATP and MnCl2-ATP.

Espectroscopia de RMN foi usada para demonstrar que sob cer- tas condições o próton de C8 do ATP é lábil e que este apenas ocorrerá se Mn2+ ligar ao C8. Para demonstrar o C8-H lábil os complexos de Mg-ATP, Mn(HCO3)2-ATP e MnCl2-ATP foram preparados em D2O e a presença do C8-H foi monitorada com o passar do tempo através de 1H RMN. A reação inteira foi realizada em D2O para determinar o efeito de Mn2+ ou Mg2+ na ta- xa de deuteração do próton de C8, porque o deslocamento de 1H RMN para o próton de C8 desapareceria durante o curso da reação como resultado da permuta deste próton com o D2O. A ATP depois será deuterada na posição de C8. A taxa de hidrólise de ATP foi também determinada durante o curso da reação. As reações foram também realizadas usando H2O como o sol- vente. Todas as reações foram realizadas em tampão de Imidazol em pH 6,3 ou pH 7,3. Os experimentos foram realizados a uma concentração de Imida- zol de 20 mM, e as concentrações de NaHCO3, MnCl2 e MgCl2 usadas foram variadas entre O e 12 mM para NaHCO3, e O e 4 mM para MnCI2 e MgCl2. Nos intervalos de tempo especificados 150 μl amostras foram tirados e diluí- dos a 730 μl com D2O ou H2O. EDTA (20 μl) foi adicionado a uma concen- tração de 2,0 mM e as amostras centrifugadas após 10 minutos para remo- ver o íon de metal divalente. A amostra foi depois analisada por 1H RMN e a concentração de ADP determinada por HPLC. Efeito da Concentração de M2+ na Atividade de GS Adenililada e Desadenili- ladaNMR spectroscopy was used to demonstrate that under certain conditions the ATP C8 proton is labile and that it will only occur if Mn2 + binds to C8. To demonstrate labile C8-H the Mg-ATP, Mn (HCO3) 2-ATP and MnCl2-ATP complexes were prepared in D2O and the presence of C8-H was monitored over time by 1 H NMR. The entire reaction was performed in D2O to determine the effect of Mn2 + or Mg2 + on the C8 proton deuteration rate because the 1H NMR shift to the C8 proton would disappear during the course of the reaction as a result of the exchange of this proton with C8 proton. the D2O. The ATP will later be deuterated at the C8 position. The hydrolysis rate of ATP was also determined during the course of the reaction. Reactions were also performed using H2O as the solvent. All reactions were performed in Imidazole buffer at pH 6.3 or pH 7.3. The experiments were performed at a concentration of 20 mM Imidazole, and the concentrations of NaHCO3, MnCl2 and MgCl2 used were varied between 0 and 12 mM for NaHCO3, and O and 4 mM for MnCl2 and MgCl2. At the specified time intervals 150 μl samples were taken and diluted to 730 μl with D2O or H2O. EDTA (20 μl) was added at a concentration of 2.0 mM and the samples centrifuged after 10 minutes to remove the divalent metal ion. The sample was then analyzed by 1 H NMR and the concentration of ADP determined by HPLC. Effect of M2 + Concentration on Adenylated and Desadenylated GS Activity

O efeito da concentração de Mn2+ e Mg2+ na atividade de Gs a- denililada e desadenililada foi determinada a uma faixa de concentrações de ATP e a uma faixa de M2+ para razões de ATP. As concentrações de ATP usadas foram 200 μΜ, 400 μΜ, 600 μΜ, 800 μΜ e 1000 μΜ. Em cada con- centração de ATP usada, ou MnCI2 ou MgCI2 foi adicionado a uma concen- tração de 1, 2, 3 ou 4 vezes a concentração de ATP. Os outros componentes do ensaio eram 20 mM de Imidazol.HCI, 12 mM de NaHCO3, 4 mM de NH4CI e 4 mM de L-glutamato NH4CI. Os ensaios realizados usando a glutamina sintetase adenililada foram executados em pH 6,3 enquanto os ensaios rea- lizado usando a glutamina sintetase desadenililada foram executados em pH 7,2. Soluções de ensaio foram imediatamente preparadas frescas antes do uso com NaHCO3 que é o último composto adicionado e o pH sendo ajusta- do imediatamente na adição.The effect of the concentration of Mn2 + and Mg2 + on the activity of α-denylated and desadenylated Gs was determined at a range of ATP concentrations and a range of M2 + for ATP ratios. The ATP concentrations used were 200 μΜ, 400 μΜ, 600 μΜ, 800 μΜ and 1000 μΜ. At each concentration of ATP used, either MnCl2 or MgCl2 was added at a concentration of 1, 2, 3, or 4 times the ATP concentration. The other assay components were 20 mM Imidazole.HCl, 12 mM NaHCO 3, 4 mM NH 4 Cl and 4 mM L-glutamate NH 4 Cl. Assays performed using adenylylated glutamine synthetase were performed at pH 6.3 while assays performed using desadenylated glutamine synthetase were performed at pH 7.2. Assay solutions were immediately prepared fresh prior to use with NaHCO3 which is the last compound added and the pH adjusted immediately upon addition.

Efeito da Concentração de HCO3" na Atividade de GS Adenililada e Desade- nililadaEffect of HCO3 "Concentration on Adenylylated and Desadenylated GS Activity

O efeito da concentração de HCO3" na atividade de GS adenili- lada foi determinado a uma faixa de concentrações de Mn2+. Os ensaios continham, 20 mM de Imidazol.HCI, 4 mM de NH4CI, 600 μΜ de ATP, 1.8 mM de MnCI2 e 4 mM dê L-glutamato e foram realizados em pH 6,3. A con- centração de NaHCO3 foi variada de 1 a 12 pmols de NaHCO3 por pmole de ATP. Os ensaios não foram realizados usando GS desadenililada visto que a precipitação de concentrações de carbonato alta do Mg2+ ocorreu. Efeito de ATP Deuterada na Posição C-8 e 13C HCO3- na Atividade Específi- ca de GS ADENILILADAThe effect of HCO3 "concentration on adenylated GS activity was determined over a range of Mn2 + concentrations. Assays contained, 20 mM Imidazole.HCI, 4 mM NH4CI, 600 μΜ ATP, 1.8 mM MnCI2 and 4 mM give L-glutamate and were performed at pH 6.3 NaHCO3 concentration ranged from 1 to 12 pmols NaHCO3 per pmole ATP Assays were not performed using desadenylated GS since precipitation of high carbonate of Mg2 + occurred Effect of Deuterated ATP at Position C-8 and 13C HCO3- on Specific Activity of ADENYLATED GS

Na2ATP foi deuterada pela adição de 20 mM de Na2ATP para uma solução de 50 mM de trietanloamina em D2O a 60SC durante 96 horas. A amostra foi depois Iiofilizada e armazenada a -202C e dissolvida em água quando requerido. A ATP deuterado foi depois purificada usando uma coluna de fase reversa Luna C18 (250 mm por 25,2 mm) usando acetato de amônio como a fase móvel a uma taxa de fluxo de 7,0 ml/minuto. As amostras foram depois agrupadas e secadas por refrigeração para remover a fase móvel. A ATP resultante foi depois verificada para deuteração completa na posição de C8.Na 2 ATP was deuterated by the addition of 20 mM Na 2 ATP to a 50 mM solution of triethanloamine in 60 ° C D 2 O for 96 hours. The sample was then lyophilized and stored at -20 ° C and dissolved in water when required. Deuterated ATP was then purified using a Luna C18 reverse phase column (250 mm by 25.2 mm) using ammonium acetate as the mobile phase at a flow rate of 7.0 ml / min. The samples were then pooled and refrigerated dried to remove the mobile phase. The resulting ATP was then checked for complete deuteration at the C8 position.

O efeito da concentração de ATP deuterado na posição C-8 na atividade de GS adenililada foi determinado. Os ensaios continham, 20 mM de Imidazol.HCI, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de L-glutamato e 4 mM de NH4CI e foram realizados em pH 6,3. Os ensaios não foram realizados u- sando GS desadenililada como nenhum efeito foi observado na atividade específica de GS desadenililada como resultado da deuteração de ATP na posição C-8 (dados não mostrados).The effect of deuterated ATP concentration at position C-8 on adenylylated GS activity was determined. The assays contained 20 mM Imidazole.HCl, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM L-glutamate and 4 mM NH 4 Cl and were performed at pH 6.3. Assays were not performed using desadenylated GS as no effect was observed on specific desadenylated GS activity as a result of ATP deuteration at position C-8 (data not shown).

O efeito de Nai3HC03 na atividade específica de glutamina sin- tetase foi também determinado na presença de ATP deuterados e não- deuterada. Os ensaios continham, 20 mM de Imidazol.HCI, 12 mM de NaH- CO3 (ou Nai3HCO3) e 4 mM de L-glutamato e 4 mM de NH4CI e foram reali- zados em pH 6,3. Os ensaios foram operados a 800 mM de ATP comparan- do ATP deuterado na posição Ce com ATP de abundância natural.The effect of Nai3HCO3 on specific glutamine synthetase activity was also determined in the presence of deuterated and non-deuterated ATP. The assays contained 20 mM Imidazole.HCl, 12 mM NaH-CO 3 (or NaI 3 HCO 3) and 4 mM L-glutamate and 4 mM NH 4 Cl and were performed at pH 6.3. The assays were operated at 800 mM ATP comparing deuterated ATP in the Ce position with naturally abundant ATP.

Cepas Bacterianas e MeiosBacterial Strains and Media

As cepas bacterianas e vetores usados são esboçados na TA- BELA 1. Todas as cepas bacterianas foram crio-preservadas a -70-C em uma solução de 38 % m/v de glicerol. Todas as culturas de E. coli foram mantidas em meio de LM (5 g/l de NaCI, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de triptona; pH 7,2) a menos que do contrário declarado. Ágar foi adicionado a uma concentração de 15 g/l quando requerido. O meio foi suplementado com 50 pg/ml de ampicilina ou 12,5 pg/ml de tetraciclina para pAlter-1, e com 100 pg/ml de ampicilina para pBluescript Il SK+.The bacterial strains and vectors used are outlined in TABLE 1. All bacterial strains were cryopreserved at -70 ° C in a 38% w / v glycerol solution. All E. coli cultures were maintained in LM medium (5 g / l NaCl, 10 g / l yeast extract, 10 g / l tryptone; pH 7.2) unless otherwise stated. Agar was added at a concentration of 15 g / l when required. The medium was supplemented with 50 pg / ml ampicillin or 12.5 pg / ml tetracycline for pAlter-1 and 100 pg / ml ampicillin for pBluescript Il SK +.

O crescimento das cepas mutantes em meios mínimos foi feito usando meios M9, contendo sais de traço. Os sais de traço foram prepara- dos em 0,1 N de HCI e compreendidos dos seguintes (expressos por litro de solução): 3,5 g de FeS04.7H20, 0,5 g de MnSO4-H2O, 0.11 g de Na2B4O7-IOH2O, 0,13 g de Na2Mo04.2H20, 1,1 g de ZnSO4, 0,1 g de Cu- S04.5H20 e FeCI3.6H20. Antes do uso, os sais de traço foram diluídos em um volume igual de 0,1 N de NaOH e adicionados a uma concentração de 20 mL por litro de meios M9. antibióticos de ampicilina e tetraciclina foram adicionados aos meios onde requerido a uma concentração de 50 pg.mL"1 e 12,5 pg.mL"1, respectivamente.Growth of mutant strains in minimal media was done using M9 media containing trace salts. Trace salts were prepared in 0.1 N HCl and comprised of the following (expressed per liter of solution): 3.5 g FeSO4.7H20, 0.5 g MnSO4-H2O, 0.11 g Na2B4O7- IOH 2 O, 0.13 g Na 2 Mo 4 O 2 H 2 O, 1.1 g ZnSO 4, 0.1 g Cu 2 SO 4 H 2 O and FeCl 3 H 6 O 2. Prior to use, the trace salts were diluted in an equal volume of 0.1 N NaOH and added to a concentration of 20 mL per liter of M9 media. ampicillin and tetracycline antibiotics were added to the media where required at a concentration of 50 pg.mL-1 and 12.5 pg.mL-1, respectively.

Tabela 1Table 1

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Isolamento do Gene de glnA e a Construção dos VetoresGlnA Gene Isolation and Vector Construction

DNA foi isolado em uma escala pequena usando QiaPrep Spin Miniprep Kit™ (Qiagen) ou através de Iise alcalina (Sambrook, J. Fritsch, E. F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed., Cold Spring Habor Laboratory). Amplos isolamentos de DNA foram executa- dos usando o kit de Isolamento de DNA Qiagen Midi (Qiagen). Digestão de DNA foi realizada usando enzimas de restrição compradas de Amersham Biosciences e usadas de acordo com as instruções do fabricante. Fosfatase alcalina foi obtida de Amersham Biosciences. T4 DNA Ligase foi obtida de Promega e usada como pelo protocolo provido com a enzima. Agarose usa- da para eletroforese de DNA foi do tipo de biologia molecular.DNA was isolated on a small scale using QiaPrep Spin Miniprep Kit ™ (Qiagen) or by alkaline lysis (Sambrook, J. Fritsch, EF and T. Maniatis (1989). In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed. Cold Spring Habor Laboratory). Extensive DNA isolations were performed using the Qiagen Midi DNA Isolation kit (Qiagen). DNA digestion was performed using restriction enzymes purchased from Amersham Biosciences and used according to the manufacturer's instructions. Alkaline phosphatase was obtained from Amersham Biosciences. T4 DNA Ligase was obtained from Promega and used as per the protocol provided with the enzyme. Agarose used for DNA electrophoresis was of the molecular biology type.

Taq polimerase (rTaq) foi obtida de TaKaRa Bio Inc. e foi usada para propósitos de triagem gerais. Taq polimerase de fidelidade alta (ExTaq) foi também obtida de TaKaRa Bio e foi usada para amplificar os genes para clonagem.Taq polymerase (rTaq) was obtained from TaKaRa Bio Inc. and was used for general screening purposes. High fidelity Taq polymerase (ExTaq) was also obtained from TaKaRa Bio and was used to amplify the genes for cloning.

Digestão de restrição e eletroforese em gel de agarose foram realizados usando procedimentos padrões (Sambrook, J. Fritsch, E. F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2a ed. Cold Spring Habor Laboratory Press). Uma escada de DNA de 1 kb foi usada para toda eletroforese.Restriction digestion and agarose gel electrophoresis were performed using standard procedures (Sambrook, J. Fritsch, E.F. and T. Maniatis (1989). In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2nd ed. Cold Spring Habor Laboratory Press). A 1 kb DNA ladder was used for all electrophoresis.

Mutagênese loco-dirigida foi realizada usando o Kit de Mutagê- nese in vitro de Sítios Alterados de Promega Corporation, ou o kit de Muta- gênese Loco-Direcionada QuikChange XL de Stratagene, como pelos proto- colos fornecidos com cada kit.Loco-directed mutagenesis was performed using the Promega Corporation In vitro Altered Site Mutagenesis Kit, or the Stratagene QuikChange XL Loco-Directed Mutagenesis Kit, as per the protocols provided with each kit.

Todas químicas foram de tipo de biologia analítica ou molecular e foram usadas sem outra purificação. Todas as químicas foram obtidas de Merck ou Sigma a menos que do contrário declarado.All chemicals were of analytical or molecular biology type and were used without further purification. All chemicals were obtained from Merck or Sigma unless otherwise stated.

Clonagem do Gene de Glutamina Sintetase de E. ColiE. coli Glutamine Gene Cloning Gene Cloning

Iniciadores foram projetados para a seqüência do gene de glnA de E. coli obtido de Genbank (Número de Acesso X05173). Os iniciadores foram projetados com sítios de restrição Nsil (mostrado em tipo negrito) nas terminações 5'. Os iniciadores são mostrados abaixo:Primers were designed for the E. coli glnA gene sequence obtained from Genbank (Accession Number X05173). Primers were designed with Nsil restriction sites (shown in bold type) at 5 'terminations. The initiators are shown below:

iniciador 5': 5' - GATATGCATCCGTCAAATGCG -3' (SEQ ID NO: 1) iniciador 3': 5' - GCGATGCATAAAGTTTCCACGG - 3' (SEQ ID N0:2)5 '' primer: 5 '- GATATGCATCCGTCAAATGCG -3' (SEQ ID NO: 1) 3 '' primer: 5 '- GCGATGCATAAAGTTTCCACGG - 3' (SEQ ID NO: 2)

PCR foi executada usando o DNA de pGLn6 como o modelo e os iniciadores acima. A mistura de PCR continha 1 μl de DNA de plasmídeo (50 ng), 5 μl de cada iniciador (2,5 pmol/μl), 4 μl de 2,5 mM de dNTP's, 5 μl de 10X tampão contendo 20 mM de MgCI2 e 0,5 μl de Taq polimerase de fidelidade alta (2,5 unidades).PCR was performed using pGLn6 DNA as the template and primers above. The PCR mix contained 1 μl of plasmid DNA (50 ng), 5 μl of each primer (2.5 pmol / μl), 4 μl of 2.5 mM dNTP's, 5 μl of 10X buffer containing 20 mM MgCl2 and 0.5 μl high fidelity Taq polymerase (2.5 units).

PCR foi conduzida com a desnaturação inicial do DNA modelo a 95°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C du- rante 5 minutos, anelamento a 55°C durante 1 minuto e alongamento a 72°C durante 2 minutos. Uma etapa de alongamento final de 72QC durante 10 mi- nutos foi também incorporada no perfil. Eletroforese em gel de agarose foi realizada para verificar o tamanho de fragmento produzido por PCR. O pro- duto de PCR foi purificado usando o Kit de Purificação de PCR HighPure (Roche Diagnostics), e submetido à digestão com Nsil.PCR was conducted with initial denaturation of the template DNA at 95 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 95 ° C for 5 minutes, annealing at 55 ° C for 1 minute and stretching at 72 ° C for 2 minutes. minutes A final stretching step of 72 ° C for 10 minutes was also incorporated into the profile. Agarose gel electrophoresis was performed to verify the size of the fragment produced by PCR. The PCR product was purified using the HighPure PCR Purification Kit (Roche Diagnostics), and subjected to Nsil digestion.

Para construção do modelo para SDM com o Sistema de Sítios Alterados, pAlter-1 foi Iinearizado com PstI e desfoforilado antes da ligação. Inserção e vetor foram ligados a uma razão de inserção:vetor de 3:1.In order to construct the SDM model with the Altered Site System, pAlter-1 was Iinearized with PstI and de-fluorinated before ligation. Insertion and vector were linked to an insertion: vector ratio of 3: 1.

A reação de ligação foi transformada em JM109 de E. coli atra- vés de eletroporação usando um Pulsador de Gene Bio-Rad, como pelas instruções do fabricante. Os transformantes foram selecionados em Ágar de LM suplementado com 12,5 pg/ml de tetraciclina, 80 pg/ml de X-Gal e 1 mM de IPTG.The ligation reaction was transformed into E. coli JM109 by electroporation using a Bio-Rad Gene Pulser as per the manufacturer's instructions. Transformants were selected on LM Agar supplemented with 12.5 pg / ml tetracycline, 80 pg / ml X-Gal and 1 mM IPTG.

Várias colônias brancas obtidas nas placas de transformação foram depois tríadas isolando o DNA usando Iise alcalina, seguido por diges- tão e eletroforese em gel de agarose. Seqüenciação foi realizada para con- firmar a presença e seqüência do gene de glnA de E. coli. Além do uso dos iniciadores universais M13/F e M13/R, iniciadores internos gene-específicos foram projetados da seqüência conhecida do gene. Estes estão mostrados na TABELA 2.Several white colonies obtained on the transformation plates were then screened by isolating the DNA using alkaline lysis, followed by digestion and agarose gel electrophoresis. Sequencing was performed to confirm the presence and sequence of the E. coli glnA gene. In addition to the use of the universal M13 / F and M13 / R primers, gene-specific internal primers were designed from the known gene sequence. These are shown in TABLE 2.

TABELA 2. INICIADORES SEQÜÊNCIA-ESPECÍFICOS USADOS PARA SEQÜENCIAÇÃO DO GENE CLONADO DE glnA DE E. ColiTABLE 2. SEQUENCE-SPECIFIC INITIATORS USED FOR SEQUENCING THE E. COLI GLOBAL CLONED GENE

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Para construção do modelo para SDM com o Sistema de Quik- Change™, o gene de glutamina sintetase foi subclonado da construção de pAlter como um fragmento de Sad-HincHW. A banda contendo o gene de gl- nA foi excisada do gel usando uma lâmina de escalpelo, e empurrada atra- vés de uma seringa de 2 ml para um tubo de Eppendorf, para esmagar a agarose. 1 ml de fenol (equilibrado em pH 8,0) foi adicionado ao tubo e a suspensão foi depois submetida a vórtice durante 1 minuto. A amostra foi congelada a -70QC durante pelo menos 30 minutos. Uma vez a amostra tinha descongelado, foi centrifugada a 13 000 rpm em um microcentrífuga de Ep- pendorf durante 15 minutos. A fase aquosa foi removida para um tubo limpo e depois extraída uma vez com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), e depois uma vez com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi preci- pitado de etanol e ressuspenso em tampão de TE. Este fragmento foi depois ligado em pBluescript Il SK+, também digerido com Sacl e Hind\II, a uma in- serção para razão de vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada em XL1 -BIue de E. coli através de eletroporação, e banhada em placas de ágar LM contendo 100 pg/ml de ampicilina. Colônias de transformantes simples foram triadas isolando DNA do plasmídeo usando Iise alcalina, digerindo o DNA com SamHI e subseqüentemente analisando os fragmentos através de eletroforese em gel de agarose.To construct the SDK model with the Quik-Change ™ System, the glutamine synthetase gene was subcloned from the pAlter construct as a Sad-HincHW fragment. The band containing the glnA gene was excised from the gel using a scalpel blade and pushed through a 2 ml syringe into an Eppendorf tube to crush the agarose. 1 ml phenol (equilibrated to pH 8.0) was added to the tube and the suspension was then vortexed for 1 minute. The sample was frozen at -70 ° C for at least 30 minutes. Once the sample had thawed, it was centrifuged at 13,000 rpm in an Eppendorf microfuge for 15 minutes. The aqueous phase was removed to a clean tube and then extracted once with phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), and then once with chloroform: isoamyl alcohol (24: 1). The DNA was precipitated from ethanol and resuspended in TE buffer. This fragment was then ligated into pBluescript II SK +, also digested with Sacl and Hind \ II, at an insertion to 3: 1 vector ratio. The ligation reaction was transformed into E. coli XL1-IBue by electroporation, and bathed in LM agar plates containing 100 pg / ml ampicillin. Single transformant colonies were screened by isolating plasmid DNA using alkaline lysis, digesting DNA with SamHI and subsequently analyzing the fragments by agarose gel electrophoresis.

Mutaqênese Loco-Diriqida (SDM)Loco-Directed Mutagenesis (SDM)

DNA do gene de glnA do tipo selvagem em pAlter-1 foi isolado de jm109 de E. coli usando o kit Qiagen Midi Prep. Os oligonucleotídeos pro- jetados para realizar a mutagênese do gene de glnA usando este sistema estão listados na TABELA 3. Mutações silenciosas que incorporam um sítio de restrição para facilitar a triagem primária para a mutação foram embutidas nos oligonucleotídeos de SDM. Estas estão também mostradas na TABELA 3.Wild-type glnA gene DNA in pAlter-1 was isolated from E. coli jm109 using the Qiagen Midi Prep kit. Oligonucleotides designed to perform glnA gene mutagenesis using this system are listed in TABLE 3. Silent mutations that incorporate a restriction site to facilitate primary screening for mutation were embedded in SDM oligonucleotides. These are also shown in TABLE 3.

Tabela 3. Mutações realizadas no gene de glnA de E.coli usando o Sistema de Altered Sites™. As mutações para alterar os resíduos de aminoácido es- tao mostradas em tipo negrito e os sitios de restricao estao sublinhados.Table 3. Mutations performed on the E.coli glnA gene using the Altered Sites ™ System. Mutations for altering amino acid residues are shown in bold type and restriction sites are underlined.

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Seguindo mutagênese, colônias simples foram triadas para a mutação de escolha isolando o DNA de uma cultura durante a noite, e exe- cutando análise de restrição com a enzima para a mutação particular sendo tríada.Following mutagenesis, single colonies were screened for the mutation of choice by isolating DNA from a culture overnight, and performing restriction analysis with the enzyme for the particular mutation being screened.

Expressão de Gene MutanteMutant Gene Expression

Genes mutantes foram isolados dos clones de pAlter-1 através de digestão com Sacl e HindIII. Os digestos foram depois submetidos à ele- troforese em gel de agarose para separar as bandas de vetor e de inserção. A banda contendo os genes foi excisada do gel e o DNA extraído usando fenol como descrito acima.Mutant genes were isolated from pAlter-1 clones by Sacl and HindIII digestion. The digests were then submitted to agarose gel electrophoresis to separate the vector and insertion bands. The gene-containing band was excised from the gel and DNA extracted using phenol as described above.

pBluescript II SK+ foi digerido com Sacl e HindIII, e cada gene mutante foi depois ligado neste vetor a uma razão de inserção:vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada na cepa auxotrófica de glutamina sinte- tase de YMC11 de E. coli por eletroporação e os transformantes foram sele- cionados em LM Ágar suplementado com 50 Mg/ml de ampicilina.pBluescript II SK + was digested with Sacl and HindIII, and each mutant gene was then ligated into this vector at an insertion: vector ratio of 3: 1. The ligation reaction was transformed into the E. coli YMC11 glutamine synthase auxotrophic strain by electroporation and the transformants were selected on LM Agar supplemented with 50 Mg / ml ampicillin.

Colônias simples obtidas nas placas de transformação foram submetidas a um procedimento de triagem usando PCR usando os iniciado- res universais M13/F e M13/R. Neste procedimento, as colônias simples fo- ram ressuspensas em 20 μl de água destilada. 1 μl desta suspensão de co- lônia foi adicionado a uma reação de PCR contendo 2,5 μl de cada iniciador (2,5 pmol/μΙ), 2 μl de 2,5 mM de dNTP's, 2,5 μl de 10X tampão, 2 μl de 25 mM de MgCI2 e 0.1 μl de Taq polimerase (0,5u). Os ciclos de PCR foram realizados como descrito acima. Os produtos de PCR foram subseqüente- mente separados através de eletroforese em gel de agarose, e transforman- tes positivos selecionados em base do tamanho de banda correto. Um con- trole positivo e um controle negativo foram incorporados no processo para verificar os resultados obtidos.Simple colonies obtained from the transformation plates were subjected to a screening procedure using PCR using the universal primers M13 / F and M13 / R. In this procedure, the simple colonies were resuspended in 20 μl of distilled water. 1 μl of this colony suspension was added to a PCR reaction containing 2.5 μl of each primer (2.5 pmol / μΙ), 2 μl of 2.5 mM dNTP's, 2.5 μl of 10X buffer, 2 μl of 25 mM MgCl2 and 0.1 μl Taq polymerase (0.5u). PCR cycles were performed as described above. The PCR products were subsequently separated by agarose gel electrophoresis, and positive transformants selected on the basis of the correct band size. A positive control and a negative control were incorporated into the process to verify the results obtained.

Mutaqênese de Quickchanqe™Quickchanqe ™ Mutagenesis

DNA dos modelos selecionados (construções de pBluescript) foi isolado de XLI-BIue de E. coli usando o kit de Qiagen MidiPrep. Os oligonu- cleotídeos projetados para realizar a SDM usando este sistema estão lista- dos na TABELA 4. Como este é um sistema baseado em PCR, dois oligonu- cleotídeos (sense e antissense) são requeridos para cada reação. Tabela 4. Mutações Realizadas no Gene de glnA de E.coli Usando o Siste- ma de Quikchange. As Mutações para Alterar os Resíduos de Aminoácido estão Mostradas em Tipo Negrito e Sítios de Restrição estão Sublinhados.DNA from the selected models (pBluescript constructs) was isolated from E. coli XLI-BIue using the Qiagen MidiPrep kit. Oligonucleotides designed to perform SDM using this system are listed in TABLE 4. Since this is a PCR-based system, two oligonucleotides (sense and antisense) are required for each reaction. Table 4. Mutations Performed in the E.coli GlnA Gene Using the Quikchange System. Mutations for altering amino acid residues are shown in bold type and restriction sites are underlined.

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Seguindo mutagênese, colônias simples foram tríadas para a mutação de escolha isolando o DNA de uma cultura durante a noite, e executando análi- se de restrição com a enzima para a mutação particular sendo triada. Mutan- tes positivos obtidos foram transformados com o Sistema de QuikChange™ em YMC11 de E. coli para propósitos de expressão.Following mutagenesis, single colonies were screened for the mutation of choice by isolating DNA from a culture overnight, and performing restriction analysis with the enzyme for the particular mutation being screened. Positive mutants obtained were transformed with the QuikChange ™ System into E. coli YMC11 for expression purposes.

Confirmação de MutaçãoMutation Confirmation

Seqüenciação para confirmar cada mutação foi terceirizada. Iniciadores ge- ne-específicos diretos e reveros foram projetados da seqüência conhecida do gene para este propósito. Estes estão mostrados na TABELA 5. Tabela 5. Iniciadores Seqüência-Específicos Usados para Confirmar a Pre- sença das Várias Mutações no Gene de glnA de E.coli_Sequencing to confirm each mutation has been outsourced. Direct genespecific primers and reverses were designed from the known gene sequence for this purpose. These are shown in TABLE 5. Table 5. Sequence-Specific Primers Used to Confirm the Presence of Various Mutations in the E.coli glnA Gene

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ResultadosResults

Clonagem do Gene de Glutamina Sintetase de E. coliCloning of E. coli Glutamine Gene Synthase

O gene de glnA do tipo selvagem de E. coli foi amplificado como um fragmento de 2,1 kb, codificando uma proteína de 471 aminoácidos em comprimento. O gene de glnA amplificado por PCR de 2124 bp contendo os sítios de restrição de flanqueamento de Nsil foi ligado no vetor de SDM pAl- ter-1 digerido com PstI a uma razão de inserção:vetor de 3:1. O DNA foi iso- lado de vários transformantes e submetido à análise de restrição usando BamHI e EcoRI. De acordo com a seqüência conhecida do gene e o vetor, restrição de uma construção (com o gene de glnA na orientação correta re- querida 5' para 3') com SamHI, deveria produzir fragmentos de 6012 bp e 1797 bp. Uma construção correta foi assim identificada, e nomeada pGln12.The E. coli wild-type glnA gene was amplified as a 2.1 kb fragment encoding a protein of 471 amino acids in length. The 2124 bp PCR amplified glnA gene containing the Nsil flanking restriction sites was ligated into the PstI digested pAlter-1 SDM vector at an insertion: vector ratio of 3: 1. DNA was isolated from various transformants and subjected to restriction analysis using BamHI and EcoRI. According to the known gene sequence and vector, constraining a construct (with the glnA gene in the correct orientation required 5 'to 3') with SamHI should produce 6012 bp and 1797 bp fragments. A correct construct was thus identified, and named pGln12.

Para construção do modelo do tipo selvagem para a mutagêne- se usando o Sistema de QuikChange™, o gene de glnA foi excisado de p- Gln12 como um fragmento de SacI-HindIII, e ligado em pBluescript similar- mente digerido II SK+ a uma razão de inserção:vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada em XL1 -BIue de E. coli e banhado em LM ágar su- plementado com 100 pg/ml de ampicilina, 80 μg/ml de X-Gal e 1 mM de IPTG. O DNA foi isolado de várias colônias brancas e submetido à análise de restrição com Sacl e HindIII e BamHI para identificar um subclone positi- vo. Uma construção correta foi identificada desse modo e nomeada pBSK- ECgln. Análise de seqüência foi executada em ambos os clones para verifi- car a integridade do gene do tipo selvagem antes de qualquer SDM fosse realizado.To construct the wild type model for mutagenesis using the QuikChange ™ System, the glnA gene was excised from p-Gln12 as a SacI-HindIII fragment, and ligated into similarly digested pBluescript II SK + at a ratio Insertion: 3: 1 vector. The ligation reaction was transformed into E. coli XL1-IBue and bathed in LM agar supplemented with 100 pg / ml ampicillin, 80 µg / ml X-Gal and 1 mM IPTG. DNA was isolated from several white colonies and subjected to restriction analysis with Sacl and HindIII and BamHI to identify a positive subclone. A correct construct was identified in this way and named pBSK-ECgln. Sequence analysis was performed on both clones to verify the integrity of the wild-type gene before any SDM was performed.

Mutaqênese Loco-Dirigida (SDM)Loco-Directed Mutagenesis (SDM)

Sistema de Altered Sites™Altered Sites ™ System

A mutagênese dirigida foi realizada como pelo protocolo descrito acima. DNA isolado dos mutantes foi digerido usando a enzima específica para a mutação, e fracionada em tamanho para confirmar a presença da mu- tação.Targeted mutagenesis was performed as per the protocol described above. DNA isolated from the mutants was digested using the mutation-specific enzyme, and fractionated in size to confirm the presence of the mutation.

Em todos os casos, a construção do tipo selvagem (pGln12) foi digerida com a mesma enzima como um controle comparativo. As mutações com seus respectivos sítios de restrição introduzidos e tamanhos de frag- mento esperados estão esboçadas na TABELA 6.In all cases, the wild-type construct (pGln12) was digested with the same enzyme as a comparative control. Mutations with their respective restriction sites introduced and expected fragment sizes are outlined in TABLE 6.

Tabela 6. Lista de Mutações Introduzidas em PGLN12 com o Sistema de Sitios Alterados, Mostrando os Fragmentos de Restricao Esperados.Table 6. List of mutations introduced in PGLN12 with the altered site system, showing the expected restriction fragments.

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Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das muta- ções, como os tamanhos de fragmento DNA esperados foram obtidos.Agarose gel electrophoresis confirmed the presence of mutations, as expected DNA fragment sizes were obtained.

Expressão de Gene MutanteMutant Gene Expression

Os genes mutantes (de pAlter) foram subclonados em pBlues- cript II SK+ e transformados em YMC11 de E. coli, para facilitar a purificação da proteína e estudos da enzima. A presença dos genes subclonados no vetor foi confirmada através de triagem de PCR. Colônias de transformantes contendo os genes de glnA mutante foram detectadas como uma banda de 2170 bp em um gel de agarose. Um controle negativo que consiste no vetor transformado em YMC11 de E. coli foi incluído nas triagens de PCR, e apa- receu no gel como uma banda no tamanho do sítio de clonagem de vetor múltiplo. Um controle positivo de DNA de pBSK-ECgln, também em YMC11 de E. coli, foi incluído. Este apareceu no gel como uma banda no mesmo tamanho que qualquer subclones mutantes positivos. O DNA de um subclo- ne simples de cada mutante identificado desse modo foi depois digerido com a enzima de restrição específica para a mutação para confirmar a presença da mutação específica.Mutant (pAlter) genes were subcloned into pBluescript II SK + and transformed into E. coli YMC11 to facilitate protein purification and enzyme studies. The presence of subcloned genes in the vector was confirmed by PCR screening. Transformant colonies containing the mutant glnA genes were detected as a 2170 bp band on an agarose gel. A negative control consisting of the E. coli transformed YMC11 vector was included in the PCR screens, and appeared on the gel as a band at the size of the multiple vector cloning site. A positive DNA control from pBSK-ECgln, also in E. coli YMC11, was included. This appeared on the gel as a band the same size as any positive mutant subclones. DNA from a single subclone of each mutant thus identified was then digested with the mutation-specific restriction enzyme to confirm the presence of the specific mutation.

Tabela 7. Esboço dos Fragmentos de Restrição Esperados dos Subclones Mutantes de glnA.Table 7. Outline of Expected Restriction Fragments of glnA Mutant Subclones.

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Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das muta- ções nos subclones, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados. Mutaaênese de "Quickchanae"Agarose gel electrophoresis confirmed the presence of mutations in subclones, as expected DNA fragment sizes. Mutation of "Quickchanae"

SDM usando o Sistema de "QuickChange" foi realizada confor- me o protocolo exposto acima. DNA foi isolado dos possíveis mutantes, di- gerido usando a enzima específica para a mutação, e fracionado em tama- nho para confirmar a presença da mutação. Um controle que consiste no modelo de origem foi digerido com a mesma enzima como um controle com- parativo. As mutações com seus respectivos sítios de restrição e tamanhos de fragmento esperados estão esboçadas na TABELA 8. pBSK-ECgln foi usado como o modelo para as mutações de E207T, H269N, H271N e ER355Q. Os mutantes duplos E207T Y397V, H269N Y397V, H271N Y397V e R355Q Y397V foram produzidos em pBSK-Y397V. Tabela 8. Lista de Mutações Introduzidas em Vários Modelos com o Sistema de Quikchange, Mostrando os Fragmentos de Restrição Esperados.SDM using the QuickChange System was performed according to the above protocol. DNA was isolated from possible mutants, digested using the mutation-specific enzyme, and fractionated to confirm the presence of the mutation. A control consisting of the source model was digested with the same enzyme as a comparative control. Mutations with their respective restriction sites and expected fragment sizes are outlined in TABLE 8. pBSK-ECgln was used as the template for the E207T, H269N, H271N and ER355Q mutations. The E207T Y397V, H269N Y397V, H271N Y397V and R355Q Y397V double mutants were produced in pBSK-Y397V. Table 8. List of mutations introduced in various models with the Quikchange system, showing expected restriction fragments.

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Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das muta- ções, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados foram obtidos. Ensaios da EnzimaAgarose gel electrophoresis confirmed the presence of mutations, as expected DNA fragment sizes were obtained. Enzyme Assays

A atividade da enzima de γ-glutamil transferase de GS foi deter- minada usando o método padrão como esboçado por Stadtman E. R., et al. (1970) Adv Enzyme Reg: 8: 99-118. Homogeneidade da enzima foi demons- trada usando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A taxa de rea- ção direta da atividade de GS foi determinada através de Cromatografia Lí- quida de Pressão Alta (HPLC) medindo a taxa de formação de glutamina e ADP. A reação direta de GS continha (a menos que do contrário definido): 11 mM de (NH4)HPO4, 1,0 mM de glutamato e 1,0 mM de complexo de M2+-GS γ-glutamyl transferase enzyme activity was determined using the standard method as outlined by Stadtman E. R., et al. (1970) Adv Enzyme Reg: 8: 99-118. Enzyme homogeneity was demonstrated using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The direct reaction rate of GS activity was determined by High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) measuring the rate of glutamine and ADP formation. GS direct reaction contained (unless otherwise defined): 11 mM (NH4) HPO4, 1.0 mM glutamate and 1.0 mM M2 + - complex

ATP (isto é Na2Mn(HCO3)2-ATP, Na2Mg-ATP ou Na2MnCI2-ATP). As reações foram realizadas em pH 6,3 ou pH 7,2. Purificação da Glutamina Sintetase de E. coli.ATP (ie Na2Mn (HCO3) 2-ATP, Na2Mg-ATP or Na2MnCl2-ATP). Reactions were performed at pH 6.3 or pH 7.2. Purification of E. coli Glutamine Synthase.

Todas as construções recombinantes usadas para o isolamento de GS foram cultivadas em um meio de M9 modificado (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCI) suplementado com 70 mM de L-glutamato, 5 mM de L-glutamina e 100 Mg/ml de ampicilina. Todas as culturas foram incu- badas a 37-C durante 48 horas com agitação a 220 rpm. As células foram colhidas do meio de cultura através de centrifugação a 10 000 rpm a 4QC. A biomassa foi depois usada fresca ou armazenada a -20gC até requerido. A- lém disso, a glutamina sintetase do tipo selvagem (de pBSK-ECgln de E. coli) foi purificada na forma adenililada e desadenililada, da biomassa obtida de cultura contínua como esboçado por (Sênior, P. J. (1975). J. Bact: 123. (2), 407-418).All recombinant constructs used for GS isolation were cultured in modified M9 medium (6 g / l Na2HPO4, 3 g / l KH2PO4, 0.5 g / l NaCl) supplemented with 70 mM L-glutamate 0.5 mM L-glutamine and 100 mg / ml ampicillin. All cultures were incubated at 37 ° C for 48 hours with shaking at 220 rpm. Cells were harvested from the culture medium by centrifugation at 10,000 rpm at 4 ° C. The biomass was then used fresh or stored at -20 ° C until required. In addition, wild-type glutamine synthetase (from E. coli pBSK-ECgln) was purified in the adenylylated and deadenylated form from the continuous culture biomass as outlined by (Senior, PJ (1975). J. Bact: 123. (2), 407-418).

Enzima adenililada foi produzida sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono, enquanto a enzima desadenililada foi pro- duzida sob condições de limitação de nitrogênio e excesso de carbono. As células obtidas foram colhidas através de centrifugação a 10.000 rpm duran- te 10 minutos a 49C, e armazenadas a -209C até requerido.Adenylylated enzyme was produced under conditions of nitrogen excess and carbon limitation, while the desadenylated enzyme was produced under conditions of nitrogen limitation and excess carbon. The obtained cells were harvested by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes at 49 ° C, and stored at -20 ° C until required.

O método usado para a purificação de glutamina sintetase foi desenvolvido do método de Shapiro e Stadtman (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922.The method used for glutamine synthetase purification was developed from the method of Shapiro and Stadtman (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922.

A biomassa de 1 litro de cultura, foi ressuspensa em 10 ml de Tampão de Ressuspensão A ou (RBA) (10 mM de Imidazol-HCI, 2 mM de β- mercaptoetanol, 10 mM de MnCI2.4H20; pH 7,0). As células foram sonicadas durante 10 minutos em um ciclo de trabalho de 50 % a 6eC. Esta solução sonicada foi centrifugada durante 10 minutos a 10 000 rpm, e o sobrenadan- te foi retido. Sulfato de estreptomicina foi adicionado (10 % de uns 10 % p/v), e a suspensão foi agitada a 4QC durante 10 minutos. Centrifugação foi de- pois realizada a 10.000 por 10 minutos e o sobrenadante foi retido. O pH do sobrenadante foi ajustado a 5,15 com ácido sulfúrico. Esta mistura foi agita- da a 4ÕC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. Novamente, o sobrenadante foi retido. Sulfato de amônio saturado (30 % em volume) foi adicionado e o pH foi ajustado a 4,6 com ácido sulfúri- co. A suspensão foi agitada a 4QC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. O precipitado obtido foi ressuspenso em 2-5 ml de RBA e o pH ajustado para 5,7 com ácido sulfúrico. Esta suspensão foi agitada durante a noite a 49C para permitir a glutamina sintetase ser res- suspensa, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. O sobre- nadante foi retido e o pH das suspensões foi ajustado para 7,0.The 1 liter biomass of culture was resuspended in 10 ml Resuspension Buffer A or (RBA) (10 mM Imidazole-HCI, 2 mM β-mercaptoethanol, 10 mM MnCl2.4H20; pH 7.0). The cells were sonicated for 10 minutes in a 50% duty cycle at 6 ° C. This sonicated solution was centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm, and the supernatant was retained. Streptomycin sulfate was added (10% to about 10% w / v), and the suspension was stirred at 4 ° C for 10 minutes. Centrifugation was then performed at 10,000 for 10 minutes and the supernatant was retained. The pH of the supernatant was adjusted to 5.15 with sulfuric acid. This mixture was stirred at 4 ° C for 15 minutes, and then centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. Again, the supernatant was retained. Saturated ammonium sulfate (30% by volume) was added and the pH was adjusted to 4.6 with sulfuric acid. The suspension was stirred at 4 ° C for 15 minutes, and then centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. The obtained precipitate was resuspended in 2-5 ml of RBA and the pH adjusted to 5.7 with sulfuric acid. This suspension was stirred overnight at 49 ° C to allow the glutamine synthetase to be resuspended, and then centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was retained and the pH of the suspensions was adjusted to 7.0.

Outra purificação do tipo selvagem foi alcançada através do uso de cromatografia de afinidade usando um AKTA Explorer (Amersham Bios- ciences). Separação foi alcançada com resina de 5ΆΜΡ Sepharose 4b (A- mersham Biosciences) com uma coluna de HR10/10 tendo um comprimento de 10 cm e um diâmetro interno de 10 mm. A preparação da enzima de glu- tamina sintetase parcialmente purificada (cerca de 2 ml) foi carregada sobre a coluna preparada que foi equilibrada com 10 mM de Imidazol (pH 7,0), 150 mM de NaCI e 10 mM de MnCI2.4H20. A glutamina sintetase ligada foi eluída da coluna com 2,5 mM de ADP ao longo de uns 40 ml de gradiente linear de 150 a 500 mM de NaCI, e 1 ml de frações foi colhido. As frações contendo glutamina sintetase pura foram depois agrupadas e dialisadas durante a noi- te junto de RBA.Further wild-type purification was achieved through the use of affinity chromatography using an AKTA Explorer (Amersham Biosciences). Separation was achieved with 5ΆΜΡ Sepharose 4b resin (A-mersham Biosciences) with an HR10 / 10 column having a length of 10 cm and an internal diameter of 10 mm. The partially purified glutamine synthetase enzyme preparation (about 2 ml) was loaded onto the prepared column which was equilibrated with 10 mM Imidazole (pH 7.0), 150 mM NaCl and 10 mM MnCl2.4H20. Bound glutamine synthetase was eluted from the column with 2.5 mM ADP over a 40 ml linear gradient of 150 to 500 mM NaCl, and 1 ml fractions were collected. Fractions containing pure glutamine synthetase were then pooled and dialyzed overnight with RBA.

Uma alíquota de cada suspensão de proteína foi submetida à eletroforese em um gel a 7,5 % de SDS PAGE de acordo com os protocolos padrões. Concentração da proteína foi determinada usando o método de determinação de proteína Lowry, e a concentração foi usada determinando todas as atividades específicas da enzima.One aliquot of each protein suspension was electrophoresed on a 7.5% SDS PAGE gel according to standard protocols. Protein concentration was determined using the Lowry protein determination method, and concentration was used to determine all enzyme specific activities.

Mutaqênese Loco-Dirigida de Glutamina Sintetase (GS) de Escherichia coli Análise de Seqüência de GS e Modelagem Molecular de ProteínaLoco-Directed Mutagenesis of Escherichia coli Glutamine Synthetase (GS) Sequence Analysis of GS and Molecular Protein Modeling

Comparações de homologia de seqüência de proteína foram realizadas usando DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canadá). O Accelrys Inc., software de modelagem molecular (MSI Inc., San Diego, USA), foi usa- do para toda a modelagem molecular da proteína usando um processador Silicon Graphics Octane.Protein sequence homology comparisons were performed using DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada). Accelrys Inc., molecular modeling software (MSI Inc., San Diego, USA), was used for all molecular modeling of the protein using a Silicon Graphics Octane processor.

Demonstração do mecanismo cataiítico - resultados e debate Análise estrutural de ATPCataitic mechanism demonstration - results and debate ATP structural analysis

O Efeito da Concentração de ATP na Análise de RMN de Complexos de NajATP. MnfHCO3VATP. Mg-ATP E MnCIp-ATPThe Effect of ATP Concentration on NMR Analysis of NajATP Complexes. MnfHCO3VATP. Mg-ATP And MnCIp-ATP

Para determinar o impacto do empilhamento de ATP na solução na 1H RMN de ATP, o efeito da concentração de ATP (Na4ATP ou Mg-ATP), na presença de Mn(HCO3)2-ATP ou MnCl2-ATP nos tempos de relaxamento Ti para os prótons de H8, H2, 'H1 e H2O foram determinados. O Mn(HCO3 )2- ATP e MnCI2-ATP foi adicionado a Na4ATP e Mg-ATP a 10"3 de concentra- ção do Na4ATP ou Mg-ATP. A ATP foi adicionada a uma faixa de concentra- ções que variam de 5 a 120 mm. Houve um aumento linear no 1/pT1p como resultado do aumento na concentração até uma concentração de ATP de 60 mmols. Destes dados foi decidido que todas as análises para determinar taxas de relaxamento T1 e T2 deveriam ser realizadas a uma concentração de ATP de 60 μmolarou Na4ATP e Mg-ATP e 60 pmolar de MnCI2-ATP ou Mn(HCO3)2-ATP.To determine the impact of ATP stacking on the solution on the 1 H NMR of ATP, the effect of ATP concentration (Na4ATP or Mg-ATP) in the presence of Mn (HCO3) 2-ATP or MnCl2-ATP on Ti relaxation times. H8, H2, 'H1 and H2O protons were determined. Mn (HCO3) 2-ATP and MnCl2-ATP were added to Na4ATP and Mg-ATP at 10-3 concentration of Na4ATP or Mg-ATP. ATP was added over a range of concentrations ranging from 5 120 mm There was a linear increase in 1 / pT1p as a result of the increase in concentration to an ATP concentration of 60 mm From these data it was decided that all analyzes to determine T1 and T2 relaxation rates should be performed at a concentration of 60 μm ATP or Na4ATP and Mg-ATP and 60 pmolar MnCl2-ATP or Mn (HCO3) 2-ATP.

Efeito da Temperatura e Freqüência nas Taxas de Relaxamento de PTip1 e PT2P"Effect of Temperature and Frequency on Relaxation Rates of PTip1 and PT2P "

Taxas de relaxamento Ti e T2 para o complexo de Mn(HCO3)2- ATP, o complexo de MnCI2-ATP e Na4ATP a 400 MHz com um espectrôme- tro de RMN Varian UNITYpIus de 400 MHz. Os experimentos foram feitos a uma faixa de temperaturas e as taxas de relaxamento de PT1P"1 e pT2p"1 para os prótons H8, H2, 'H1 e H2O foram representadas em gráfico contra 1000/K. Por definição, se as taxas de relaxamento diminuírem com temperatura crescente, então T1M e T2M ou relaxamento de esfera externa determinam pTip"1 e pT2p"1. Relaxamento de esfera externa pode ser regido pelos pró- tons H2 e H-i, tanto no complexo de Mn(HCO3)2-ATP com no complexo de MnCl2-ATP como a energia de ativação é maior que 4 kcal/mol e T1p > 7/6 T2P. Comportamento do próton de H8 para ambos os complexos de Mn(HCO3)2-ATP e de MnCI2-ATP parece ser diferente.Ti and T2 relaxation rates for the Mn (HCO3) 2-ATP complex, the 400 MHz MnCI2-ATP and Na4ATP complex with a 400 MHz Varian UNITYpIus NMR spectrometer. The temperatures and relaxation rates of PT1P "1 and pT2p" 1 for protons H8, H2, 'H1 and H2O were plotted against 1000 / K. By definition, if relaxation rates decrease with increasing temperature, then T1M and T2M or external sphere relaxation determine pTip "1 and pT2p" 1. External sphere relaxation can be governed by the H2 and Hi protons in both the Mn (HCO3) 2-ATP complex and the MnCl2-ATP complex as the activation energy is greater than 4 kcal / mol and T1p> 7 / 6 T2P. Proton behavior of H8 for both Mn (HCO3) 2-ATP and MnCI2-ATP complexes appears to be different.

Pareceu não haver nenhum efeito da temperatura no diagrama de Tip1 versus 1000/K para o próton de H8 do complexo de MnCI2-ATP entre 25°C e 35°C (1000/K entre 3,20 e 3,35). No caso do complexo de Mn(HCO3)2-ATP, o diagrama de H8 de T1P"1 versus 1000/K aumentou entre 25°C e 35°C e depois diminuiu. Para explicar este aumento, se a permuta de ligando dominar as taxas de relaxamento então 1/tm (a taxa de permuta de ligando entre a forma ligada e não-ligada) domina as taxas de relaxamento T1P"1 e T1P"2. Se Xm dominar TiP, então tM > T1M, e uma vez que T2M £ T1M, então Xm deve também dominar T2P, por conseguinte T1P'1 = T2p"1. Este não é o caso como T2P"1 / T1P"1 é significativamente menor que 1. Como Xm diminu- indo com temperatura crescente, T1P"1 e T2p"1 têm que aumentar com a tem- peratura crescente. Considerando que Xm é independente da freqüência em um diagrama de T1P"1 ou T2P'1 versus freqüência, T1P"1 e T2P"1 deveriam ser independentes da freqüência. Se as taxas de relaxamento observadas forem dependentes da freqüência, então os processos de taxa diferentes de per- muta química fazem uma contribuição significativa para T1p. A determinação de T1P e T2p versus freqüência para ambos os complexos de Mn(HCO3)2- ATP e de MnCI2-ATP indicou uma dependência da freqüência. A regressão linear dos dados foi usada para calcular a razão do declive para a interseção para calcular xc2. Processos de taxa diferentes de permuta química, portanto, compõem a contribuição principal para T1p.There appeared to be no effect of temperature on the Tip1 versus 1000 / K diagram for the H8 proton of the MnCl2-ATP complex between 25 ° C and 35 ° C (1000 / K between 3.20 and 3.35). In the case of the Mn (HCO3) 2-ATP complex, the T1P-1 versus 1000 / K H8 diagram increased between 25 ° C and 35 ° C and then decreased. To explain this increase, if ligand exchange dominates the relaxation rates then 1 / tm (the ligand exchange rate between bound and unbound form) dominates T1P "1 and T1P" 2 relaxation rates. If Xm dominates TiP, then tM> T1M, and since T2M £ T1M, so Xm must also master T2P, therefore T1P'1 = T2p "1. This is not the case as T2P "1 / T1P" 1 is significantly less than 1. As Xm decreasing with increasing temperature, T1P "1 and T2p" 1 have to increase with increasing temperature. Since Xm is frequency independent in a T1P "1 or T2P'1 versus frequency diagram, T1P" 1 and T2P "1 should be frequency independent. If the observed relaxation rates are frequency dependent, then the rate processes different chemical exchanges make a significant contribution to T1p. Determination of T1P and T2p versus frequency for both Mn (HCO3) 2- ATP and MnCI2-ATP complexes indicated a frequency dependence. used to calculate the slope to intersection ratio to calculate xc 2. Different rate processes of chemical exchange therefore make up the major contribution to T1p.

Ambos os prótons H2 e Hi no complexo de Mn(HCO3)2-ATP e de MnCI2-ATP exibiu dependência de freqüência como também uma diminuição na taxa de relaxamento T1P"1 com temperatura crescente. Esta dependência negativa do coeficiente de temperaturas indica que 1/xM não pode ser a taxa que limita o processo uma vez que as taxas de permuta química têm coefici- entes de temperatura positivos. Portanto Τ1Ρ'1 é determinado por T-im que por sua vez é determinado por xr, xs ou χμ. Em geral xr e Tm diminuem (1/xr e 1/xm aumentam) porém com a temperatura, xs para complexos de Mn2+ porém pode aumentar ou diminuir.Both H2 and Hi protons in the Mn (HCO3) 2-ATP and MnCl2-ATP complex exhibited frequency dependence as well as a decrease in T1P "1 relaxation rate with increasing temperature. This negative dependence on temperature coefficient indicates that 1 / xM cannot be the rate limiting the process since chemical exchange rates have positive temperature coefficients, so Τ1Ρ'1 is determined by T-im which in turn is determined by xr, xs or χμ. In general xr and Tm decrease (1 / xr and 1 / xm increase) but with temperature, xs for Mn2 + complexes may increase or decrease.

Como o diagrama de T1P"1 versus temperatura para o próton de H8 foi observado aumentar e depois diminuir e o Tim mostrou uma depen- dência de freqüência positiva, o efeito das temperaturas no tempo de rela- xamento do giro do elétron pelo complexo de Mn(HCO3)2-ATP e complexo de MnCl2-ATP foi determinado (dados não mostrados). Os tempos de rela- xamento do giro de elétron foram observados ser da ordem de 1,5 χ 10"9 seg. Se xc for mais curto que xs, então permuta rápida não está ocorrendo e T1M não é determinado por xs. Uma comparação dos tempos de correlação, calculados da dependência de freqüência de T1P por cada próton e o tempo de relaxamento do giro de elétron é esboçada na TABELA 9. Como T1p"1 é uma função de freqüência xc, q e r podem ser calculados das equações 1 e 3. É acreditado que a dinâmica molecular destes complexos de ATP seja percebida na faixa de temperatura usada e que como a temperatura tende para 35°C o manganês no complexo de Mn(HCO3)2-ATP alcança um ponto de proximidade mais íntima ao carbono de C8 do ATP. Isto é confirmado pe- las distâncias interatômicas que foram calculadas usando a equação de So- lomon-Bloemgergen. A presença de bicarbonato também parece representar um papel significativo na estrutura do complexo de ATP uma vez os dados obtidos para o comportamento do próton de C8 foram diferentes na presença de bicarbonato que na presença de cloreto. Isto é especialmente verdade no caso do pT2p"1. A distância interatômica de C8-H foi também mais próxima na presença de bicarbonato. O valor de T2M tem contribuições significativas de ambas as interações escalares transmitidas através das ligações químicas e das interações bipolares que operam por espaço. T1M apenas tem a contri- buição dipolar. T1M e T2M ficam quase iguais quando a constante hiperfina, A, é pequeno ou nenhuma ligação química existe entre o núcleo sob observa- ção e a espécie paramagnética. No caso do próton de C8 o valor de T2P"1 / Tip"1 é significativamente mais baixo para o complexo de Mn(HC03)2-ATP que o complexo de MnCI2-ATP. É proposto que este seja um resultado da interação íntima do Mn2+ e os orbitais π do anel de adenina no caso do com- plexo de Mn(HCO3)2-ATP.As the T1P "1 versus temperature diagram for the H8 proton was observed increasing and then decreasing, and Tim showed a positive frequency dependence, the effect of temperatures on the electron gyrus relay time by the Mn complex. (HCO3) 2-ATP and MnCl2-ATP complex were determined (data not shown). Electron gyrus relay times were observed to be of the order of 1.5 χ 10 "9 sec. If xc is shorter than xs, then fast exchange is not occurring and T1M is not determined by xs. A comparison of the correlation times calculated from the frequency dependence of T1P for each proton and the electron gyrus relaxation time is outlined in TABLE 9. Since T1p "1 is a frequency function xc, which can be calculated from equations 1 and 3. It is believed that the molecular dynamics of these ATP complexes are perceived in the temperature range used and that as the temperature tends to 35 ° C the manganese in the Mn (HCO3) 2-ATP complex reaches a closer proximity to This is confirmed by the interatomic distances that were calculated using the Soelomon-Bloemgergen equation.The presence of bicarbonate also appears to play a significant role in the structure of the ATP complex once the data obtained for the ATP C8 proton behavior were different in the presence of bicarbonate than in the presence of chloride. This is especially true for pT2p "1. The interatomic distance of C8-H was also closer in the presence of bicarbonate. The T2M value has significant contributions from both scalar interactions transmitted through chemical bonds and space-operated bipolar interactions. T1M only has the dipolar contribution. T1M and T2M are almost equal when the hyperfine constant, A, is small or no chemical bond exists between the nucleus under observation and the paramagnetic species. In the case of the C8 proton the value of T2P "1 / Tip" 1 is significantly lower for the Mn (HC03) 2-ATP complex than the MnCl2-ATP complex. It is proposed that this is a result of the intimate interaction of Mn2 + and the π orbitals of the adenine ring in the case of the Mn (HCO3) 2-ATP complex.

Dos dados de distância interatômica a presença de Mn2+ e HCO3" parece fazer uma diferença significativa no método do Mn2+ para o próton de Ce em todas as temperaturas testadas.From the interatomic distance data the presence of Mn2 + and HCO3 "seems to make a significant difference in the Mn2 + method for the Ce proton at all temperatures tested.

Tabela 9. O Efeito da Temperatura nos Tempos de Correlação Dipolar para o Complexo de Mn(HCO3)2-ATΡ e ο Complexo de MnCl2-ATP. <table>table see original document page 91</column></row><table>Table 9. The Effect of Temperature on Dipolar Correlation Times for the Mn Complex (HCO3) 2-AT Compl and ο MnCl2-ATP Complex. <table> table see original document page 91 </column> </row> <table>

Tabela 10. O efeito da temperatura nas distâncias interatômicas de próton de Mn2+ para o complexo de Mn(HCO3)2-ATP e o complexo de MnCI2-ATP.Table 10. The effect of temperature on interatomic proton distances from Mn2 + to the Mn (HCO3) 2-ATP complex and the MnCl2-ATP complex.

<table>table see original document page 91</column></row><table> A estrutura do complexo de Mn(HCO3)2-ATP é fundamentalmen- te diferente à estrutura do complexo de MgATP; especificamente, a co- ordenação do íon de metal sobre o carbono de C3. Esta estrutura foi usada no programa de projeto de fármaco racional baseado em ligando usando o software de conjunto de Accelrys.<table> table see original document page 91 </column> </row> <table> The structure of the Mn (HCO3) 2-ATP complex is fundamentally different from the structure of the MgATP complex; specifically, the coordination of the metal ion on the carbon of C3. This framework was used in the rational ligand-based drug design program using the Accelrys suite software.

O EFEITO DO [Mn2+], [Mg2+] E [HCO3"] NA DEUTERAÇÃO DO C8 DE ATP E NA HIDRÓLISE DEATPTHE EFFECT OF [Mn2 +], [Mg2 +] AND [HCO3 "] ON ATP C8 DEUTERATION AND DEATP HYDROLYSIS

Em pH 6,3, a taxa de hidrólise de ATP é dependente da concen- tração e presença de Mn2+. O Na2ATP, NaHCO3 e Na2ATP1 NaHCO3, MgCI2 e Na2ATP sozinhos todos pareciam ter as mesmas taxas de hidrólise. Na solução contendo MgCI2 e NaHCO3 um erro nos dados ocorreu ao término do experimento como resultado da precipitação do carbonato de magnésio. A adição de Mn2+ pareceu aumentar a taxa de hidrólise significativamente. A concentração de NaHCO3 também pareceu representar um papel visto que a taxa de hidrólise da solução contendo 2 NaHCO3 e 2 MnCI2 foi mais alta que a solução contendo 1 NaHCO3 e 2 MnCI2.At pH 6.3, the ATP hydrolysis rate is dependent on the concentration and presence of Mn2 +. Na2ATP, NaHCO3 and Na2ATP1 NaHCO3, MgCl2 and Na2ATP alone all appeared to have the same hydrolysis rates. In the solution containing MgCl2 and NaHCO3 an error in the data occurred at the end of the experiment as a result of the magnesium carbonate precipitation. Addition of Mn2 + appeared to increase the hydrolysis rate significantly. The NaHCO3 concentration also appeared to play a role as the hydrolysis rate of the solution containing 2 NaHCO3 and 2 MnCl2 was higher than the solution containing 1 NaHCO3 and 2 MnCl2.

O efeito de NaHCO3, MnCI2, MgCI2 e D2O na taxa de hidrólise de ATP em pH 6,3 e 7,3 a 37eC foi determinado por 336 horas. A taxa de hidró- lise foi calculada de uma análise de regressão dos dados (TABELAS 11 e 12). Os dados foram calculados de 5 pontos de dados e 4 amostras por pon- to de dados para cada concentração usada durante as 336 horas. Reações K e U em cada pH foram realizadas usando D2O como o solvente.The effect of NaHCO3, MnCl2, MgCl2 and D2O on the ATP hydrolysis rate at pH 6.3 and 7.3 at 37 ° C was determined for 336 hours. The hydrolysis rate was calculated from a regression analysis of the data (TABLES 11 and 12). Data were calculated from 5 data points and 4 samples per data point for each concentration used during 336 hours. K and U reactions at each pH were performed using D 2 O as the solvent.

O dobramento da concentração de Imidazol eficazmente dobrou a taxa de hidrólise. O efeito da concentração de Mn2+ na diferença da taxa de hidrólise é maior em pH 6,3 que em pH 7,3. A taxa de hidrólise na ausên- cia de íons de metal é maior em pH 7,3 que pH 6,3 devido à hidrólise por OH", porém o efeito de HCO3" e Mn2+ é reduzido no pH mais alto. O efeito de Mn2+ é evidente ao comparar as taxas de reação na presença de 3 íons de manganês. A taxa de hidrólise aumenta na presença de Mg2+ em pH 7,3 mais alto que em pH 6,3 na ausência de HCO3". A presença de HCO3" tam- bém aumenta a taxa de hidrólise na presença de Mg2+ em pH 7,3. O efeito de HCO3" na taxa de hidrólise na presença de Mg2+ em pH 6,3 não pôde ser apurado como resultado da precipitação de MgHCO3. A presença de D2O aumenta a taxa de hidrólise em pH 6,3.Doubling the concentration of Imidazole effectively doubled the hydrolysis rate. The effect of Mn2 + concentration on hydrolysis rate difference is greater at pH 6.3 than at pH 7.3. The hydrolysis rate in the absence of metal ions is higher at pH 7.3 than pH 6.3 due to hydrolysis by OH ", but the effect of HCO3" and Mn2 + is reduced at higher pH. The effect of Mn2 + is evident when comparing reaction rates in the presence of 3 manganese ions. The hydrolysis rate increases in the presence of Mg2 + at pH 7.3 higher than in pH 6.3 in the absence of HCO3 ". The presence of HCO3" also increases the hydrolysis rate in the presence of Mg2 + at pH 7.3. . The effect of HCO3 "on the hydrolysis rate in the presence of Mg2 + at pH 6.3 could not be determined as a result of MgHCO3 precipitation. The presence of D2O increases the hydrolysis rate at pH 6.3.

O dobramento da concentração de NaHCO3 aumenta a taxa de deuteração em cada concentração de Mn2+ equivalente. Em baixas concen- trações de carbonato, a taxa de hidrólise do ATP é claramente dependente da concentração de Mn2+. Deuteração é portanto dependente da concentração de carbonato. As concentrações de NaHCO3 altas na taxa de hidrólise do ATP não parece ser dependente da concentração de Mn2+; porém na razão de concentração de Mn2+ para ATP de menos que 3 a 1, isto é, 2Mn2+:ATP e 1 Mn2+:ATP, as taxas de hidrólise e taxas de deuteração não foram lineares. A razão de concentração de Mn2+ para ATP claramente tem um efeito.Doubling the NaHCO3 concentration increases the deuteration rate at each equivalent Mn2 + concentration. At low carbonate concentrations, the ATP hydrolysis rate is clearly dependent on the concentration of Mn2 +. Deuteration is therefore dependent on carbonate concentration. High NaHCO3 concentrations in ATP hydrolysis rate do not appear to be dependent on Mn2 + concentration; however at the Mn2 + to ATP concentration ratio of less than 3 to 1, ie 2Mn2 +: ATP and 1 Mn2 +: ATP, hydrolysis rates and deuteration rates were not linear. The concentration ratio of Mn2 + to ATP clearly has an effect.

Tabela 11. O efeito de concentrações de NaHCO3, MnCI2 e MgCI2 e D2O na 1taxa de hidrólise de ATP. Ensaios A-L continham 10 mM de Imidazol e 1 mM de ATP enquanto ensaios M-U continham 20 mM de Imidazol e 1 mM de ATP. Os ensaios foram realizados em pH 6,3 e 379C. Reações KeU conti- nham D2O como o solvente. Reações foram realizadas por 336 horas e os dados calculados em 5 pontos de dados. A cada ponto de dados 4 análises foram feitas por amostra. Precipitação ocorreu na reação J como resultado da presença de Mg2+ e carbonato. Concentrações de NaHCO3, MnCI2 ou MgCI2 usadas são como indicado.Table 11. The effect of NaHCO3, MnCl2 and MgCl2 and D2O concentrations on ATP hydrolysis rate. A-L assays contained 10 mM Imidazole and 1 mM ATP while M-U assays contained 20 mM Imidazole and 1 mM ATP. The assays were performed at pH 6.3 and 379C. KeU reactions contained D2O as the solvent. Reactions were performed for 336 hours and data calculated at 5 data points. At each data point 4 analyzes were performed per sample. Precipitation occurred in reaction J as a result of the presence of Mg2 + and carbonate. Concentrations of NaHCO3, MnCl2 or MgCl2 used are as indicated.

<table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table><table> table see original document page 93 </column> </row> <table> <table> table see original document page 94 </column> </row> <table>

Tabela 12. O efeito de NaHCO3, MnCI2, MgCI2 e D2O na taxa de hidrólise de ATP. Ensaio continha 10 mM de Imidazol e 1 mM de ATP e foi realizado em pH 7,3 e 37-C. Reações KeL continham D2O como o solvente. Reações foram realizadas por 336 horas e os dados calculados em 5 pontos de da- dos. A cada ponto de dados 4 análises foram feitas por amostra. Precipita- cao ocorreu em reacao J como resultado da presenca de Mg2+ e carbonatoTable 12. The effect of NaHCO3, MnCl2, MgCl2 and D2O on ATP hydrolysis rate. Assay contained 10 mM Imidazole and 1 mM ATP and was performed at pH 7.3 and 37-C. KeL reactions contained D2O as the solvent. Reactions were performed for 336 hours and data calculated at 5 data points. At each data point 4 analyzes were performed per sample. Precipitation occurred in reaction J as a result of the presence of Mg2 + and carbonate.

<table>table see original document page 94</column></row><table> Como resultado dos dados obtidos nos requerimentos da enzima de GS para Mn2+ e HCO3- (vide abaixo) o efeito do [Mn2+] e [HCO3-] na taxa de hidrólise e deuteração do ATP para o C8-H foi determinado em concentrações mais altas. Em uma estoiquiometria de 6 HCO3- para 3 Mn2+ para 1 ATP a taxa de hidrólise foi mais alta que na ausência de íon de metal; porém hidróli- se e deuteração foram ambas observadas não serem lineares. Em uma estoi- quiometria de 12 HCO3- para 3 Mn2+ para 1 ATP a taxa de hidrólise e as taxas de deuteração foram ambas observadas serem lineares. Os dados foram ob- servados não serem lineares a uma estoiquiometria de 12 HCO3- para 1 Mn2+ para 1 ATP novamente. Como esboçado nos dados da enzima de GS1 é a- creditado que um complexo estável pareça ser formado de Mn2+3(HC03-)i2- ATP. Isto foi também observado ser o caso na enzimologia de GS adenililada (vide abaixo). A taxa de deuteração e a taxa de hidrólise na ausência de HCO3- ou Mn2+ são iguais a na presença de HCO3- em si. A hidrólise de ATP ou poderia ser realizada por H2O ou por meio de outro mecanismo envolven- do um CO2 coordenado. É concebível que o CO2 coordenado forme um inter- mediário carboxilado em N7 e este intermediário carboxilado depois ataca o ?- fosfato, hidrolisando-o formando um carboxifosfato.<table> table see original document page 94 </column> </row> <table> As a result of the data obtained from GS enzyme requirements for Mn2 + and HCO3- (see below) the effect of [Mn2 +] and [HCO3- ] at the hydrolysis and deuteration rate from ATP to C8-H was determined at higher concentrations. At a 6 HCO3- to 3 Mn2 + to 1 ATP stoichiometry the hydrolysis rate was higher than in the absence of metal ion; however hydrolysis and deuteration were both observed not to be linear. At a 12 HCO3- to 3 Mn2 + to 1 ATP stiometry the hydrolysis rate and deuteration rates were both observed to be linear. Data were observed not to be linear at a stoichiometry of 12 HCO3- to 1 Mn2 + to 1 ATP again. As outlined in the GS1 enzyme data it is believed that a stable complex appears to be formed of Mn2 + 3 (HC03-) i2-ATP. This has also been observed to be the case in adenylylated GS enzymes (see below). The deuteration rate and hydrolysis rate in the absence of HCO3- or Mn2 + are equal to in the presence of HCO3- itself. ATP hydrolysis could either be performed by H2O or by another mechanism involving a coordinated CO2. It is conceivable that the coordinated CO2 forms a N7 carboxylated intermediate and this carboxylated intermediate then attacks the β-phosphate, hydrolyzing it to a carboxyphosphate.

Uma comparação da taxa de deuteração a 12 HCO3- e 3 Mn2+ e 6 HCO3- e 3 Mn2+ indicou que a taxa de deuteração foi mais alta na presença de 12 HCO3-. Em nenhum dos casos são as taxas de equivalente de hidróli- se equivalentes às taxas de deuteração, e em ambos os casos deuteração é mais rápida que hidrólise. O Mn2+ e HCO3- representam um papel em deute- ração e hidrólise obtendo taxas equivalentes porém depende de obter a es- tereoquímica exata da coordenação do Mn2+ e do HCO3- requerida para hi- drólise e deuteração. É proposto que isto seja facilitado pela presença de cadeias laterais fundamentais em glutamina sintetase. Efeito do pH na Dissociação de NH4HCQ3 em Tampão de ImidazolA comparison of the deuteration rate at 12 HCO3- and 3 Mn2 + and 6 HCO3- and 3 Mn2 + indicated that the deuteration rate was higher in the presence of 12 HCO3-. In neither case are hydrolysis equivalent rates equivalent to deuteration rates, and in both cases deuteration is faster than hydrolysis. Mn2 + and HCO3- play a role in deuteration and hydrolysis obtaining equivalent rates but it depends on obtaining the exact stereochemistry of the coordination of Mn2 + and HCO3- required for hydrolysis and deuteration. This is proposed to be facilitated by the presence of fundamental side chains in glutamine synthetase. Effect of pH on Dissociation of NH4HCQ3 in Imidazole Buffer

O efeito do pH na condutividade específica de 10 mM de Imida- zol.HCl e 10 mM de Imidazol.HCI contendo 1 mM de NH4HCO3 foi determi- nado. A diferença nas condutividades específicas entre os dois conjuntos de dados foi usada para calcular a contribuição da condutividade molar da dis- sociação do NH4HCO3 nos níveis de pH diferentes na condutividade e para determinar o efeito do Imidazol na conversão de HCO3" para CO2 como re- sultado do pH. Isto foi depois comparado às condutividades molares teóricas ou calculadas de:The effect of pH on the specific conductivity of 10 mM Imidazole.HCl and 10 mM Imidazole.HCl containing 1 mM NH4HCO3 was determined. The difference in specific conductivities between the two datasets was used to calculate the contribution of the molar conductivity of NH4HCO3 disassociation to different pH levels on conductivity and to determine the effect of Imidazole on the conversion of HCO3 "to CO2 as a result. This was then compared to the theoretical or calculated molar conductivity of:

<formula>formula see original document page 96</formula><formula> formula see original document page 96 </formula>

OUOR

<formula>formula see original document page 96</formula><formula> formula see original document page 96 </formula>

na base que a dissociação do NH4HCO3 foi para NH4+ e HCO3" ou NH4+, HCO3" e o íon de imidizólio, e que a dissociação e presença do íon de imidi- zólio não afetaram adversamente a dissociação de NH4CO3 a HCO3" e CO2. Os cálculos foram com base em uma concentração de HCO3" obtida da e- quação de Henderson-Hasselbach usada para gerar o efeito teórico do pH nas proporções relativas de [HCO3"] e [CO2]. As condutâncias molares de NH4"1" e HCO3", como também a formação do íon de imidizólio do NH4+ foram levadas em conta.on the basis that dissociation of NH4HCO3 was to NH4 + and HCO3 "or NH4 +, HCO3" and the imidizolium ion, and that dissociation and presence of the imidiolium ion did not adversely affect dissociation of NH4CO3 to HCO3 "and CO2. The calculations were based on a HCO3 "concentration obtained from the Henderson-Hasselbach equation used to generate the theoretical effect of pH on the relative proportions of [HCO3"] and [CO2]. The molar conductances of NH4 "1" and HCO3 ", as well as the formation of the NH4 + imidizole ion were taken into account.

<formula>formula see original document page 96</formula><formula> formula see original document page 96 </formula>

onde ApH = condutância molar em cada pH específico Yl = condutâncias específicas para cada íon [HCO3"]λ/η4+= concentração de HCO3" com o contraíon de NH4"1" [HCO3"]im/+= concentração de HCO3" com o contraíon de Imida- zóliowhere ApH = molar conductance at each specific pH Yl = specific conductances for each ion [HCO3 "] λ / η4 + = HCO3" concentration with NH4 "1" [HCO3 "] counter im / + = HCO3" concentration with Immunolium contraction

Quando o cálculo for realizado em termos assumindo apenas NH4+ como o contraíon para o HCO3", os dados teóricos não igualaram aos dados experimentais. Quando os contraíons para o HCO3" são assumidos para ser NH4"1" e o íon de imidizólio, os dados experimentais e os dados teó- ricos foram iguais. Destes dados, a dissociação do íon de imidizólio é ditada pela concentração do NH4+ e a pKa do Imidazol.HCI, com o contraíon de imi- dazólio de proporção mais alta ocorrendo nos valores de pH mais baixo. A proporção do íon de imidizólio sendo formado é ditada pela concentração de NH4HCO3 e não pela concentração de Imidazol.HCI na solução. A dissocia- ção de NH4HCO3 na presença de Imidazol1 portanto, segue a dissociação teórica e à medida que o pH diminui de pH 7,2 para pH 6,3 a concentração de CO2 da solução aumenta. Isto é de significação no mecanismo de reação de glutamina sintetase proposto como em pH 6,3, sob as condições do en- saio de enzima haveriam concentrações equimolares de HCO3" e CO2. No mecanismo de reação putativo é proposto que CO2 represente um papel in- tegral na transferência de fosforila quando a glutamina sintetase estiver na forma completamente adenililada.When the calculation is performed in terms assuming only NH4 + as the counterion for HCO3 ", the theoretical data did not match the experimental data. When the counterions for HCO3" are assumed to be NH4 "1" and the imidizole ion, the data and the theoretical data were the same. From these data, the dissociation of the imidizolium ion is dictated by the concentration of NH4 + and Imidazole pKa.HCI, with the highest proportion imidazole counterion occurring at the lowest pH values. The proportion of the imidizole ion being formed is dictated by the concentration of NH4HCO3 and not by the concentration of Imidazole.HCI in the solution. Dissociation of NH4HCO3 in the presence of Imidazole1 therefore follows theoretical dissociation and as pH decreases from pH 7.2 to pH 6.3 the CO2 concentration of the solution increases. This is of significance in the proposed glutamine synthetase reaction mechanism as at pH 6.3, under the enzyme assay conditions there would be equimolar concentrations of HCO3 "and CO2. In the putative reaction mechanism it is proposed that CO2 plays a role in - tegral in phosphoryl transfer when glutamine synthetase is in completely adenylylated form.

Efeito da Concentração de Mn2+ ou Mg2+ e Concentração de ATP na Ativi- dade de GS Adenililada e Desadenililada.Effect of Mn2 + or Mg2 + Concentration and ATP Concentration on Adenylated and Desadenylated GS Activity.

O efeito do [Mn2+] na atividade específica de GS adenililada, medi- do pela formação de ADP, aumentou para um ótimo de 3 Mn2+ por ATP na fai- xa de concentrações de ATP testada. Todos os ensaios foram realizados na presença de NaHC03 a uma concentração de 12 mmols. A atividade específica do GS adenililada quando medida pela formação de ADP não mostrou nenhum aumento na atividade com o aumento em [Mg2+]. Uma tendência similar foi vista ao comparar a atividade específica de GS adenililada, medida pela formação de glutamina. A atividade da GS adenililada na presença de [Mn2+] aumentou para um ótimo de 3 Mn2+ por ATP na faixa de concentrações de ATP testada, e na presença de [Mg2+] nenhum aumento na atividade da GS ocorreu na faixa de concentrações de ATP testada. Usando os dados para a atividade específica com base em ADP da GS adenililada, e assumindo que a cada concentração de ATP ensaiada um complexo estável de ATP e Mn2+ é formado compreen- dendo 3 íons de manganês a cada ATP. Por via de exemplo o complexo de Mn3-ATP "estável" formou-se ao acrescentar 200 μΜ de ATP a 200 μΜ de Mn- Cl2, seria 66,7 μΜ de Mn3-ATP. O efeito do [Mn2+3-ATP] na atividade específica de GS adenililada indicou, medido pela formação de ADP, que de fato um com- plexo "estável" é formado com o desvio de RMS dos dados sendo aproxima- damente 0,96. A curva resultante também pareceu ser sigmoidal em natureza, indicando cooperatividade (dados não mostrados).The effect of [Mn2 +] on adenylylated GS-specific activity, as measured by ADP formation, increased to an optimum of 3 Mn2 + per ATP in the range of tested ATP concentrations. All assays were performed in the presence of NaHCO3 at a concentration of 12 mmols. The specific activity of adenylylated GS when measured by ADP formation showed no increase in activity with increase in [Mg2 +]. A similar trend was seen when comparing specific adenylylated GS activity as measured by glutamine formation. Adenylated GS activity in the presence of [Mn2 +] increased to an optimum of 3 Mn2 + per ATP in the tested ATP concentration range, and in the presence of [Mg2 +] no increase in GS activity occurred in the tested ATP concentration range. Using data for adenylylated GS ADP-based specific activity, and assuming that at each ATP concentration assayed a stable complex of ATP and Mn2 + is formed comprising 3 manganese ions at each ATP. By way of example the "stable" Mn3-ATP complex formed by adding 200 μΜ ATP to 200 μΜ Mn-Cl2 would be 66.7 μΜ Mn3-ATP. The effect of [Mn2 + 3-ATP] on adenylylated GS specific activity indicated, as measured by ADP formation, that in fact a "stable" complex is formed with the RMS deviation of the data being approximately 0.96. . The resulting curve also appeared to be sigmoidal in nature, indicating cooperativity (data not shown).

Um diagrama de Eadie-Hofstee dos dados usando a [ATP] em cada [Mn2+] para calcular v/s indicou não-linearidade nos dados. O diagrama de Eadie-Hofstee usando o complexo de [Mn3-ATP] para calcular v/s tam- bém indicou não-linearidade nos dados porém os dados foram agrupados quando comparados ao diagrama usando o [Mn2+] para calcular v/s. A ca- rência de linearidade nos dados também indica o potencial para cooperativi- dade positiva. Os dados usados para calcular o [Mn2+-ATP] quando foram adicionados 1 e 2 equivalentes de Mn2+ por ATP seriam complicados pelas constantes de taxas adicionais para a formação do complexo de Mn2+-ATP. O diferencial para a curva de Eadie-Hofstee que define os dados obtidos para a atividade onde 3 equivalentes de Mn2+ por ATP foram adicionados 10 foram usados para calcular a Km a uma faixa de valores de v/s (TABELA 13). Destes dados parece que a concentração de Mn3-ATP aumenta na solução, a afinidade da enzima pelo Mn3-ATP aumenta, assim também indicando co- operatividade positiva.An Eadie-Hofstee diagram of the data using the [ATP] on each [Mn2 +] to calculate v / s indicated nonlinearity in the data. The Eadie-Hofstee diagram using the [Mn3-ATP] complex to calculate v / s also indicated nonlinearity in the data but the data was grouped when compared to the diagram using the [Mn2 +] to calculate v / s. The lack of linearity in the data also indicates the potential for positive cooperativity. Data used to calculate [Mn2 + -ATP] when 1 and 2 equivalents of Mn2 + by ATP were added would be complicated by the additional rate constants for the formation of the Mn2 + -ATP complex. The differential for the Eadie-Hofstee curve that defines the data obtained for the activity where 3 equivalents of Mn2 + per ATP were added 10 were used to calculate Km over a range of v / s values (TABLE 13). From these data it appears that the concentration of Mn3-ATP increases in solution, the affinity of the enzyme for Mn3-ATP increases, thus also indicating positive co-operability.

Tabela 13. A Km para glutamina sintetase adenililada como calculada do de- clive da curva que define o diagrama de Eadie-Hofstee para a atividade. 3 equivalentes de Mn2+ por ATP foram adicionados.Table 13. The Km for adenylylated glutamine synthetase as calculated from the slope of the curve defining the Eadie-Hofstee diagram for activity. 3 equivalents of Mn2 + per ATP were added.

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Como os dados indicaram cooperatividade homotrópica positiva entre os sítios de ligação de Mn3-ATP da enzima, a equação de Hill foi usa- da para representar graficamente os dados.Since the data indicated positive homotropic cooperativity between the enzyme Mn3-ATP binding sites, the Hill equation was used to graph the data.

<formula>formula see original document page 98</formula><formula> formula see original document page 98 </formula>

O coeficiente de Hill(h) obtido do declive do diagrama de Hill foi observado ser 2,0 indicando uma interação de 2 subunidades da enzima. Ne- nhuma correlação foi observada para o diagrama de Hill do efeito da atividade da GS adenililada usando Mg2+ como o contraíon para o ATP. Uma avaliação da estrutura de cristal de GS para manualmente adenililar o resíduo de T397 usando técnicas de modelagem moleculares indicaram que o cooperatividade positiva puderam de fato estar ocorrendo como resultado da adenililação da enzima por meio de duas subunidades. A cooperatividade positiva poderia ocorrer diagonalmente por meio dos dois resíduos de AMP na glutamina sinte- tase adenililada entre duas subunidades, por exemplo subunidades A e Η. A cooperatividade positiva poderia também apenas ocorrer entre 2 subunidades do sítio ativo e isto está fora dos dados do diagrama de Hill.The Hill coefficient (h) obtained from the slope of the Hill diagram was observed to be 2.0 indicating an interaction of 2 enzyme subunits. No correlation was observed for Hill's diagram of the effect of adenylylated GS activity using Mg2 + as the counterion for ATP. An evaluation of the GS crystal structure for manually adenylating the T397 residue using molecular modeling techniques indicated that positive cooperativity might in fact be occurring as a result of enzyme adenylation by two subunits. Positive cooperativity could occur diagonally through the two AMP residues in adenylylated glutamine synthase between two subunits, for example subunits A and Η. Positive cooperativity could also only occur between 2 subunits of the active site and this is outside the Hill diagram data.

Nenhum efeito significativo foi observado no aumento da razão de [Mg2+] para [ATP] de 1 para 4, na atividade específica de GS desadenili- lada, como medida pela formação de ADP. A atividade específica da GS de- sadenililada quando medida pela formação de ADP também não mostrou nenhum aumento na atividade com o aumento em [Mn2+], porém, as ativida- des específicas da GS desadenililada na presença de [Mn2+] foram significa- tivamente menores que as atividades medidas na presença de Mg2+. Uma tendência similar foi vista ao comparar a atividade específica de GS desade- nililada, medida pela formação de glutamina. Tendências similares foram também encontradas ao representar em gráfico o efeito-da [ATP] nas várias razões de concentração de [Mg2+] para [ATP] para a atividade de GS desa- denililada expressa tanto como atividade específica com base em ADP como também atividade específica com base em glutamina. A uma razão de con- centração de 1 [Mg2+] para [ATP] desvio de linearidade é observado que provavelmente seja devido à constante de equilíbrio para a formação de 1 [Mg2+] para [ATP] não sendo precisamente 1.No significant effect was observed in increasing the [Mg2 +] to [ATP] ratio from 1 to 4, in the desadenylated GS-specific activity as measured by ADP formation. Deprenylated GS-specific activity when measured by ADP formation also showed no increase in activity with the increase in [Mn2 +], however, the deadenylated GS-specific activities in the presence of [Mn2 +] were significantly lower. that the activities measured in the presence of Mg2 +. A similar trend was seen when comparing the specific desadenylated GS activity as measured by glutamine formation. Similar trends were also found by graphing the effect of [ATP] on the various concentration ratios of [Mg2 +] to [ATP] for deandenylated GS activity expressed as both ADP-based specific activity and specific activity. based on glutamine. At a concentration ratio of 1 [Mg2 +] to [ATP] linearity deviation is observed that is probably due to the equilibrium constant for the formation of 1 [Mg2 +] for [ATP] not being precisely 1.

O efeito da [ATP] na atividade específica tanto da atividade de GS desadenililada com base em ADP quanto com base em glutamina nas várias razões de concentração de [Mn2+] para [ATP] não mostraram nenhum aumento significativo na atividade com aumento de [ATP]; porém, em ambos os casos como a razão de concentração de [Mn2+] para [ATP] aumentou, a atividade diminuiu. O grau de adenililação da enzima usado foi da ordem de 8 %. A interação alostérica das subunidades não seria possivelmente evi- dente neste grau de adenililação.The effect of [ATP] on the specific activity of both ADP-based and glutamine-based desadenylated GS activity on the various concentration ratios of [Mn2 +] to [ATP] showed no significant increase in activity with increased [ATP]. ; however, in both cases as the concentration ratio of [Mn2 +] to [ATP] increased, the activity decreased. The degree of adenylation of the enzyme used was around 8%. The allosteric interaction of subunits would not possibly be evident in this degree of adenylation.

Efeito da Concentração de Bicarbonato na Atividade Específica de GS Ade- nililada Como a atividade e grau de adenililação de GS sejam ligados ao fluxo metabólico dentro da célula, o efeito do [NaHCO3] na atividade especí- fica de GS adenililada foi determinado. A atividade específica foi determina- da a uma concentração de ATP de 600 μΜ e uma concentração de Mn2+ de 1800 μΜ. Em uma razão de concentração de 12 NaHC03 para 1 ATP, uma ótima distinta na atividade ocorre. A ótima do complexo de Mn-ATP para a atividade de GS adenililada parece portanto compreender 12 HC03':3 Mn2+: 1 ATP. A uma razão de 8 NaHCOs para ATP e abaixo, a eficiência da reação quando medida pela conversão da razão de atividade de ATP para ADP pa- ra a atividade de glutamato para glutamina, parece ser afetada significativa- mente, como a eficiência da reação caindo de 100 % para 65 %. Em uma razão de 8 NaHCO3 para ATP houve também um aumento de cinco vezes na atividade específica como resultado do bicarbonato.Effect of Bicarbonate Concentration on Adenylated GS Specific Activity As the activity and degree of adenylation of GS are linked to metabolic flow within the cell, the effect of [NaHCO3] on adenylated GS specific activity has been determined. Specific activity was determined at an ATP concentration of 600 μΜ and a Mn2 + concentration of 1800 μΜ. At a concentration ratio of 12 NaHC03 to 1 ATP, a distinct optimum in activity occurs. The optimal Mn-ATP complex for adenylylated GS activity therefore appears to comprise 12 HC03 ': 3 Mn2 +: 1 ATP. At a ratio of 8 NaHCOs to ATP and below, the reaction efficiency as measured by converting the ATP to ADP activity ratio for glutamate to glutamine activity appears to be significantly affected, as the efficiency of the reaction decreases. from 100% to 65%. At a ratio of 8 NaHCO3 to ATP there was also a five-fold increase in specific activity as a result of bicarbonate.

Efeito de ATP Deuterada na POSIÇÃO Cg e 13C HCQa na Atividade Especí- fica de GS AdenililadaEffect of Deuterated ATP on Position Cg and 13C HCQa on Specific Adenylated GS Activity

O efeito da concentração de ATP deuterado na posição Ce na atividade de GS adenililada foi determinado e comparado com GS adenilila- da sob as mesmas condições usando ATP não-deuterada. Um efeito signifi- cativo de isótopo catalítico foi observado como resultado da deuteração do ATP na posição Ce- Destes dados é claramente evidente que a deuteração de ATP na posição C8 tem um impacto significativo na atividade catalítica da glutamina sintetase adenililada. A deuteração do ATP em C8 leva a um au- mento na atividade da enzima quando medido pela taxa de formação de ADP. A formação de glutamina é porém menos eficiente como indicado pela eficiência de conversão. É postulado que a reação de transferência de fosfo- rila de glutamina sintetase adenililada, realizada na presença de (Mn2+)3(HC03")i2-ATP, é mediada por meio de um carbeno de metal. Vide FIGURA 1. A primeira etapa na reação é a protonação ou carboxilação de N7 para formar um imônio em N7. A carboxilação de N7 é provavelmente carbo- xilada por um CO2 coordenado em um dos íons de Mn2+. Uma vez a espécie de imônio do ATP foi formada através de seqüestro de dióxido de carbono, o carboxilato coordenado ajuda a desprotonação em C8, gerando uma espécie de carbenóide capaz de Mn2+ ligado. A ligação de Mn2+ é dependente da vida das espécies de carbenóides IV (figura 1). A vida de uma tal espécie é provavelmente dependente da taxa de dissociação da ligação de carbamoíla - hidrogênio formada na etapa de transferência de próton intramolecular. Por conseguinte, substituindo hidrogênio com deutério deveriam resultar em uma estabilização de IV, facilitando a formação de espécies V que permite a transferência de fosforila para o resíduo de carbamoíla proximal. O fato que a enzima adenililada funciona otimamente em pH 6,3, ou seja o pH no qual NaHCO3 é dissociado em concentrações equimolares de HCO3" e CO2, pro- vavelmente ela representa um papel significativo na facilitação desta etapa da catálise mediada pela presença de HCO3" e CO2. Neste momento o grupo carboxila pode depois atacar o γ-fosfato do ATP, formando um carboxifosfa- to que depois fosforila a δ-carboxila de glutamato para fosfato de γ-glutamila.The effect of deuterated ATP concentration at the Ce position on adenylated GS activity was determined and compared with adenylated GS under the same conditions using undeuterated ATP. A significant catalytic isotope effect was observed as a result of ATP deuteration at the C-position. From these data it is clearly evident that ATP deuteration at the C8 position has a significant impact on the catalytic activity of adenylylated glutamine synthetase. ATP deuteration in C8 leads to an increase in enzyme activity when measured by the rate of ADP formation. Glutamine formation is however less efficient as indicated by conversion efficiency. It is postulated that the adenylylated glutamine synthetase phosphoryl transfer reaction carried out in the presence of (Mn2 +) 3 (HC03 ") i2-ATP is mediated by a metal carbene. See FIGURE 1. The first step in The reaction is the protonation or carboxylation of N7 to form an imonium in N7.Carboxylation of N7 is probably carbonylated by a coordinated CO2 on one of the Mn2 + ions. Once the ATP immonium species was formed through dioxide sequestration. coordinated carboxylate helps C8 deprotonation by generating a carbenoid species capable of bound Mn2 + The binding of Mn2 + is dependent on the life of the carbenoid species IV (Figure 1). carbamoyl-hydrogen bond dissociation rate formed at the intramolecular proton transfer step, therefore replacing hydrogen with deuterium should result in an IV stabilization that is easy by forming the formation of species V which allows the transfer of phosphoryl to the proximal carbamoyl residue. The fact that the adenylylated enzyme works optimally at pH 6.3, ie the pH at which NaHCO3 is dissociated into equimolar HCO3 "and CO2 concentrations, probably plays a significant role in facilitating this step of catalysis mediated by the presence of HCO3 "and CO2. At this point the carboxyl group can then attack ATP γ-phosphate, forming a carboxyphosphate which then phosphorylates the glutamate δ-carboxyl to γ-glutamyl phosphate.

Para demonstrar o papel de HCO3" na reação mediada pelo efei- to de 13C HCO3" foi determinado; vide TABELA 14. Em cada ponto de dados está claro que ambas as formas isótopas pesadas da glutamina sintetase têm um efeito na atividade específica de glutamina sintetase adenililada. Como um efeito isótopo catalítico é claramente evidente para 13C HCO3", o carbonato tem que estar representando um papel na reação acima e sob os efeitos solutos visto que o aumento em atividade é significativo.To demonstrate the role of HCO3 "in the reaction mediated by the effect of 13C HCO3" was determined; see TABLE 14. At each data point it is clear that both heavy isotope forms of glutamine synthetase have an effect on adenylylated glutamine synthetase specific activity. As a catalytic isotope effect is clearly evident for 13C HCO3 ", carbonate must be playing a role in the above reaction and under solute effects since the increase in activity is significant.

TABELA 14. O efeito de 13C HCO3 e 12C HCO3, e ATP deuterado e não- deuterada na atividade específica de glutamina sintetase adenililada.TABLE 14. The effect of 13C HCO3 and 12C HCO3, and deuterated and undeuterated ATP on the specific activity of adenylylated glutamine synthetase.

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Com a proposta que CO2 (ou uma forma hidratada do mesmo) es- teja mecanisticamente implicada na transferência de fosforila, é razoável proje- tar que a taxa de transferência de fosforila deveria estar sujeita a um efeito isó- topo cinético derivado da forma de dióxido de carbono utilizada. É provavel- mente que a taxa de seqüestro de dióxido de carbono que resulta na geração de Il seja lenta e o equilíbrio provavelmente exista em direção à esquerda - pa- ra a taxa de dissociação sendo alta. A montagem deste complexo é, portanto, determinativo da taxa. O uso de um isótopo de dióxido de carbono mais pesado deve, portanto, resultar em um retardamento de ambas as reações diretas ou reversas. Se a desprotonação subseqüente (e reação subseqüente) em Ce a - través das espécies de carbamoíla for rápida, então um isótopo pesado deveria aumentar a vida das espécies - aumentando a probabilidade das reações tam- bém na cascata sendo capaz de prosseguir. Isto foi, de fato observado quando a formação de glutamina e o consumo de ATP foram examinados utilizando a variante de 13C da fonte de dióxido de carbono.With the proposition that CO2 (or a hydrated form of it) is mechanistically implicated in phosphoryl transfer, it is reasonable to project that the phosphoryl transfer rate should be subject to a kinetic isometric effect derived from the dioxide form. of carbon used. It is likely that the carbon dioxide sequestration rate that results in the generation of Il is slow and the equilibrium is probably leftward - for the dissociation rate being high. The assembly of this complex is therefore determinative of the rate. Use of a heavier carbon dioxide isotope should therefore result in a delay of both direct or reverse reactions. If subsequent deprotonation (and subsequent reaction) in Ce a - through carbamoyl species is rapid, then a heavy isotope should extend the life of the species - increasing the likelihood of cascade reactions being able to proceed further. This was indeed observed when glutamine formation and ATP consumption were examined using the 13C variant of the carbon dioxide source.

Este efeito da taxa é uma indicação do envolvimento mecanísti- co de dióxido de carbono (ou um equivalente hidratado) no mecanismo de transferência de fosforila.This rate effect is an indication of the mechanistic involvement of carbon dioxide (or a hydrated equivalent) in the phosphoryl transfer mechanism.

Demonstração do Intermediário de Carbamato de ATP na Presença de HCOyATP Carbamate Intermediate Demonstration in Presence of HCOy

Os experimentos foram realizados em tampão de KH2HPO4/K2HPO4 a uma concentração de 20 mM em D2O, e as concentra- ções de ATP, NaHCO3, MnCI2 e MgCI2 usadas foram variadas entre O e 1 mM para ATP, Oe 12 mM para NaHCO3, e O e 3 mM para MnCI2 e MgCI2. Para demonstrar o papel de N7 do anel de adenina, os ensaios de reação foram também operados onde o ATP foi substituído pela adição de adenosina ou tubercidina. Em tubercidina o N7 é substituído por um átomo de carbono. Diti- onita de sódio (Na2S2O2) foi adicionada às amostras a uma concentração de 4 mM e o pD ajustado para pD 6,3. Após 48 horas EDTA foi adicionado a uma concentração de 4,0 mM e as amostras centrifugadas após 10 minutos para remover o íon de metal divalente. Os espectros de 1H RMN foram depois obti- dos porque se o intermediário de carbamato fosse formado, este seria reduzi- do para ácido fórmico que seria identificável através de RMN.The experiments were performed in KH2HPO4 / K2HPO4 buffer at a concentration of 20 mM in D2O, and the concentrations of ATP, NaHCO3, MnCl2 and MgCl2 used were varied between 0 and 1 mM for ATP, Oe 12 mM for NaHCO3, and O is 3 mM for MnCl 2 and MgCl 2. To demonstrate the role of adenine ring N7, reaction assays were also operated where ATP was replaced by the addition of adenosine or tubercidine. In tubercidine N7 is replaced by a carbon atom. Sodium dithionite (Na2S2O2) was added to the samples at a concentration of 4 mM and the pD adjusted to pD 6.3. After 48 hours EDTA was added at a concentration of 4.0 mM and the samples centrifuged after 10 minutes to remove the divalent metal ion. The 1 H NMR spectra were then obtained because if the carbamate intermediate was formed it would be reduced to formic acid which would be identifiable by NMR.

Demonstração do Intermediário de Carbamato de ATP na Presença de HCOr Contanto que HCO3" esteja presente na mistura de reação, ATP na presença de Na2S2O2 produz ácido fórmico. É proposto que este seja pro- duzido de um intermediário de carbamato que é formado na posição N7. A re- dução ocorre por meio de um mecanismo similar como esboçado por Powers e Meister (1976) Proc. Natl. Acad. Sei. 73: (9), 3020-3024), porém a redução do carbamato neste caso ocorre por meio de Na2S2O2 ao invés de KBH4.Demonstration of ATP Carbamate Intermediate in Presence of HCOr As long as HCO3 "is present in the reaction mixture, ATP in the presence of Na2S2O2 produces formic acid. It is proposed that it be produced from a carbamate intermediate which is formed at position N7. The reduction occurs through a similar mechanism as outlined by Powers and Meister (1976) (Proc. Natl. Acad. Sci. 73: (9), 3020-3024), but the reduction of carbamate in this case occurs through Na2S2O2 instead of KBH4.

Identificação de ATP Ligado ao Intermediário Carbamato de ATP de CO2Intermediate-Linked ATP Identification CO2 ATP Carbamate

A indução das espécies de imônio de ATP como o carbamato em N7 foi demonstrada reagindo ATP, HCO3", Mn2+ ou Mg2+ na presença de Na2S2O2 mostrando a formação de ácido fórmico como resultado da redução do intermediário de carbamato. Todos os ensaios foram executados em D2O em 20 mM de tampão de fosfato ajustado em pD 6,3 e todos os reagentes foram preparados em D2O. Os ensaios realizados são como esboçados na TABELA 15. A mistura de reação continha Na2S2O4 a uma concentração de 4 mm. Metanol foi adicionado a uma concentração de 2 mM como um pa- drão interno. Sob adição do Na2S2O4, o pD foi ajustado para pD 6,3 com 1M de DCI. A reação foi operada durante 48 horas cujo USB EDTA foi adiciona- do a uma concentração final de 4 mM de EDTA. As amostras foram centrifu- gadas a 10000 χ g para remover o Mn2+ e o espectro de 1H RMN foi obtido. A concentração de ácido fórmico produzido foi determinada pelas intensida- des de deslocamento relativo do ácido fórmico para o metanol padrão inter- no. Ensaios: (1)1 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (2) 0 mM de ATP, 0 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (3) 1 mM de ATP, 0 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (4) 0 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (5) 1 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaCI e 4 mM de Na2S2O4; (6) 1 mM de ATP, 3 mM de MgCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (7) 1 mM de Adenosina, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (8) 1 mM de Tubercidina, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaH- CO3 e 4 mM de Na2S2O4; (9) reação 1 com 2 mM de ácido fórmico adiciona- do; e (10) 2 mM de padrão de ácido fórmico. Tabela 15. Condições de ensaio. No ensaio 5, NaHCO3 foi substituído por 12 mM de NaCI; no ensaio 6, MnCI2 foi substituído por 3 mM de MgCI2; no en- saio 7, ATP foi substituída por 1 mM de Adenosina; e no ensaio 8, ATP foi substituída por 1 mM de tubercidina.Induction of ATP immonium species such as N7 carbamate was demonstrated by reacting ATP, HCO3 ", Mn2 + or Mg2 + in the presence of Na2S2O2 showing the formation of formic acid as a result of reduction of carbamate intermediate. All assays were performed on D2O in 20 mM phosphate buffer adjusted to pD 6.3 and all reagents were prepared in D 2 O. Assays performed are as outlined in TABLE 15. The reaction mixture contained Na 2 S 2 O 4 at a concentration of 4 mm. 2 mM concentration as an internal standard.With addition of Na2S2O4, the pD was adjusted to pD 6.3 with 1M DCI.The reaction was operated for 48 hours whose USB EDTA was added to a final concentration of 4 The samples were centrifuged at 10000 χ g to remove Mn2 + and the 1 H NMR spectrum was obtained The concentration of formic acid produced was determined by the relative displacement intensities of formic acid p for internal standard methanol Assays: (1) 1 mM ATP, 3 mM MnCl 2, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (2) 0 mM ATP, 0 mM MnCl 2, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (3) 1 mM ATP, 0 mM MnCl 2, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (4) 0 mM ATP, 3 mM MnCl 2, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (5) 1 mM ATP, 3 mM MnCl 2, 12 mM NaCl and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (6) 1 mM ATP, 3 mM MgCl 2, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (7) 1 mM Adenosine, 3 mM MnCl 2, 12 mM NaHCO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (8) 1 mM Tubercidine, 3 mM MnCl 2, 12 mM NaH-CO 3 and 4 mM Na 2 S 2 O 4; (9) reaction 1 with 2 mM added formic acid; and (10) 2 mM formic acid standard. Table 15. Test conditions. In assay 5, NaHCO 3 was replaced by 12 mM NaCl; in run 6, MnCl 2 was replaced by 3 mM MgCl 2; in assay 7, ATP was replaced by 1 mM Adenosine; and in assay 8, ATP was replaced by 1 mM tubercidine.

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O intermediário de carbamato se forma, como demonstrado, por sua redução para ácido fórmico (deslocamento de RMN a 8,55 ppm). A for- mação do ácido fórmico é dependente da presença de bicarbonato, ATP e Mn2+. Ensaios 7 e 8 continham adenosina e Tubercidina, respectivamente. Estes dois ensaios foram fixos até demonstrar a necessidade por nitrogênio na posição 7 para a formação do carbamato e sua redução para formar áci- do. Destes dados, pareceu que a coordenação do Mn2+ no polifosfato de ATP é requerida para a reação ocorrer. Uma quantidade pequena de ácido fórmico pareceu ter sido formada quando o Mn2+ foi substituído por Mg2+.The carbamate intermediate is formed, as shown, by its reduction to formic acid (NMR shift at 8.55 ppm). Formation of formic acid is dependent on the presence of bicarbonate, ATP and Mn2 +. Assays 7 and 8 contained adenosine and tubercidine, respectively. These two assays were fixed until they demonstrated the need for nitrogen at position 7 for carbamate formation and its reduction to form acid. From these data, it appeared that Mn2 + coordination in the ATP polyphosphate is required for the reaction to occur. A small amount of formic acid appeared to have been formed when Mn2 + was replaced by Mg2 +.

Exemplo 2 - Modelagem Molecular e Projeto de Fármaco RacionalExample 2 - Molecular Modeling and Rational Drug Design

Análise da Estrutura de Cristal De GSGS Crystal Structure Analysis

A estrutura de cristal de GS desadenililada de E. coli(Gill, H., S. e D. Eisenburg (1994) Biochemistry, 40: 1903-1912), foi obtida da Base de Da- dos de Proteína de Brookhaven (número de acesso 1f52.pdb). Esta estrutura foi usada porque a proteína tinha sido cristalizada com um resíduo de ADP em cada sítio ativo. Um tetrâmero de polipeptídeo de GS foi criado desta estrutura para produzir um sítio ativo simples. A forma "fechada" do complexo de (Mn2+)3.(HC03")12ATP foi proposta na análise estrutural de ATP com base na proximidade do Mn2+ dos dados de 1H RMN como também o requerimento de química de coordenação para o Mn2+ para fazer um papel na deuteração do C8. A estrutura de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP foi construída usando o software Insi- ghtll (AcceIrys) e minimizada. A estrutura modelada produziu 2 do Mn2+ acima e abaixo da cauda de fosfato e o terceiro Mn2+ coordenado perto do anel de adenina. A estrutura foi depois inserida no sítio ativo usando o software de Ac- celrys sobrepondo o anel de adenina do complexo de (Mn2+)3(HC03")i2-ATP sobre o anel de adenina da ADP no sítio ativo. O conjunto foi minimizado e as cadeias laterais de aminoácido associadas à ATP foram identificadas para permitir mutagênese loco-dirigida ser realizada nestes resíduos de forma que seu papel na catálise mediada pela glutamina sintetase poderia ser elucidado. Os resíduos de aminoácido identificados foram Glu129, Glu207, His269, His271, Arg224, e Arg355, e Lys47 da subunidade adjacente.E. coli desadenylated GS crystal structure (Gill, H., S. and D. Eisenburg (1994) Biochemistry, 40: 1903-1912) was obtained from the Brookhaven Protein Data Base (number of access 1f52.pdb). This structure was used because the protein had been crystallized with an ADP residue at each active site. A GS polypeptide tetramer was created from this structure to produce a simple active site. The "closed" form of the (Mn2 +) 3. (HC03 ") 12ATP complex was proposed in the ATP structural analysis based on the proximity of Mn2 + to the 1 H NMR data as well as the requirement for coordination chemistry for Mn2 + to make a role in C8 deuteration. The (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2ATP structure was constructed using Insightll (AcceIrys) software and minimized. The modeled structure produced 2 Mn2 + above and below the phosphate tail and the third coordinated Mn2 + near the adenine ring. The structure was then inserted into the active site using the Acellrys software by overlapping the (Mn2 +) 3 (HC03 ") i2-ATP complex adenine ring over the active site ADP adenine ring. The pool was minimized and ATP-associated amino acid side chains have been identified to allow loco-directed mutagenesis to be performed on these residues so that their role in glutamine synthetase-mediated catalysis could be elucidated. , and Arg355, and Lys47 of the adjacent subunit.

Mutagênese Loco-Diriqida de GS de Echerichia colie Ensaios EnzimáticosGS Loco-Directed Mutagenesis of Echerichia colie Enzyme Assays

Mutagênese loco-dirigida foi executada na GS da E. coli em Glu207, His269, His271, e Arg355. Quando a GS foi isolada e purificada de cada clone e a atividade da enzima específica determinada usando o ensaio de encima de γ-glutamil transferase de GS, estas mutações foram observa- das para destruir a funcionalidade da enzima. Estes resíduos de aminoácido parecem representar um papel crucial dentro do sítio ativo de GS1 e é postu- lado que os resíduos de His269 e de His271 representam um papel na trans- ferência de fosforila. Um efeito similar foi observado ao medir a atividade da enzima por HPLC em base da formação de ADP e de glutamina.Loco-directed mutagenesis was performed at E. coli GS in Glu207, His269, His271, and Arg355. When GS was isolated and purified from each clone and specific enzyme activity determined using the GS γ-glutamyl transferase assay, these mutations were observed to destroy the functionality of the enzyme. These amino acid residues appear to play a crucial role within the active site of GS1 and it is postulated that the residues of His269 and His271 play a role in phosphoryl transfer. A similar effect was observed when measuring enzyme activity by HPLC on the basis of ADP and glutamine formation.

Foram utilizados dois ensaios de enzima para avaliar a atividade de glutamina sintetase. O primeiro ensaio usado, o ensaio de γ-glutamil transferase, mede a reação "inversa" como atividade de glutamil transferase. Nesta reação reversa, hidroxilamina e glutamina reagem para formar γ- glutamil-hidroxamato e amônia livre na presença de ADP, arsenato e man- ganês ou magnésio (Shapiro e Stadtman (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922). Isto forma a base de um ensaio para a presença de atividade de glutamina sintetase. No pH correto, que é derivado de determinar o ponto de isoatividade da enzima as atividades de transferase da forma adenililada e desadenililada de glutamina sintetase são as mesmas. Porém, as duas for- mas podem ser distinguidas porque completamente no ponto de isoativida- de, glutamina sintetase adenililada é completamente inibida por 60 mM de Mg2+, enquanto que a enzima desadenililada é não afetada (Bender R A, K A Janssen, A D Resnick, M Blumberg, F Foor e B Magasanik, (1977) Journal of Bacteriology 129: 1001-1009). As atividades das duas formas da enzima po- dem ser diferenciadas portanto com base na diferença na atividade na pre- sença de Mn2+ ou Mg2+ em pH 7,15. Atividade de glutamina sintetase é me- dida em duas misturas de ensaio diferentes: uma contendo apenas Mn2+ e uma segunda contendo Mn2+ e Mg2+. Todos os reagentes são preparados em Tampão de Imidazol (pH 7,15). Ambos os ensaios foram operados em um volume total de 600 μΙ. O ensaio de Mn2+ foi estabelecido como mostrado na TABELA 16, e o ensaio de combinação como mostrado na TABELA 17.Two enzyme assays were used to evaluate glutamine synthetase activity. The first assay used, the γ-glutamyl transferase assay, measures the "reverse" reaction as glutamyl transferase activity. In this reverse reaction, hydroxylamine and glutamine react to form γ-glutamylhydroxamate and free ammonia in the presence of ADP, arsenate and manganese or magnesium (Shapiro and Stadtman (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922). This forms the basis of an assay for the presence of glutamine synthetase activity. At the correct pH, which is derived from determining the enzyme isoactivity point, the transferase activities of the adenylylated and desadenylated form of glutamine synthetase are the same. However, the two forms can be distinguished because completely at the point of isoactivity, adenylylated glutamine synthetase is completely inhibited by 60 mM Mg2 +, whereas the desadenylated enzyme is unaffected (Bender RA, KA Janssen, AD Resnick, M). Blumberg, F Foor and B Magasanik, (1977) Journal of Bacteriology 129: 1001-1009). The activities of the two forms of the enzyme can therefore be differentiated based on the difference in activity in the presence of Mn2 + or Mg2 + at pH 7.15. Glutamine synthetase activity is measured in two different assay mixtures: one containing only Mn2 + and a second containing Mn2 + and Mg2 +. All reagents are prepared in Imidazole Buffer (pH 7.15). Both assays were operated on a total volume of 600 μΙ. The Mn2 + assay was established as shown in TABLE 16, and the combination assay as shown in TABLE 17.

Tabela 16. Mistura de ensaio para o ensaio de glutamil transferase com base em Mn2+Table 16. Assay mix for Mn2 + based glutamyl transferase assay

<table>table see original document page 106</column></row><table><table> table see original document page 106 </column> </row> <table>

Uma reação em branco foi preparada da mesma maneira que a reação de Mn2+, mas substituindo a ADP e soluções de arsenato com um volume equivalente de água. A mistura de ensaio foi equilibrada por 5 mins a 379C, e depois iniciada pela adição de 50 μΙ de preparação de enzima. A reação foi deixada prosseguir por 30 min, e depois terminada pela adição de 900 μΙ de Mistura de Interrupção (1M de FeCI3.6H20, 0,2 M de ácido tricloro- acético e 7,1 % v/v HCI). As amostras foram depois centrifugadas a 13,000 rpm por 2 mins em um microcentrífuga de Eppendorf para remover qualquer precipitado que possa ter se formado, e a absorbância medida a 540 nm. Todos os resultados apresentaram como atividade específica em termos de μmols de complexo de hidroxamato de glutamila/min/mg de proteína. O grau de adenililação foi calculado da razão da atividade de γ-glutamil transferase desadenililada para a atividade de γ-glutamil transferase total (reação de Mn2+), levando em conta o número de subunidades.A blank reaction was prepared in the same way as the Mn2 + reaction, but replacing ADP and arsenate solutions with an equivalent volume of water. The assay mixture was equilibrated for 5 mins at 37 ° C, and then initiated by the addition of 50 μΙ enzyme preparation. The reaction was allowed to proceed for 30 min, and then terminated by the addition of 900 μΙ Interruption Mixture (1M FeCl3.6H20, 0.2 M trichloroacetic acid and 7.1% v / v HCl). The samples were then centrifuged at 13,000 rpm for 2 mins in an Eppendorf microcentrifuge to remove any precipitate that may have formed and the absorbance measured at 540 nm. All results showed as specific activity in terms of μmols of glutamyl hydroxamate complex / min / mg protein. The degree of adenylylation was calculated from the ratio of desadenylated γ-glutamyl transferase activity to total γ-glutamyl transferase activity (Mn2 + reaction), taking into account the number of subunits.

Além disso, a taxa de conversão de ATP, glutamato e amônia para glutamina e ADP foi avaliada usando HPLC. Esta é denominada a rea- ção "direta" ou "biossintética" e é ensaiada em dois ensaios diferentes: um medindo a habilidade da glutamina sintetase para converter glutamato em glutamina ná presença de ATP, e a segunda determina a conversão de ATP na ADP e AMP na mesma mistura de ensaio. Este ensaio foi desenvolvido para medir a reação direta da glutamina sintetase. O ensaio mede a quanti- dade de glutamina formada de L-glutamato na presença de MnHCOa-ATP (a base de uma reação) e MgATP (a base de uma segunda reação), e a quan- tidade de ATP, a ADP e AMP formados são também medidos. A mesma so- lução de mistura de ensaio é operada em 2 métodos de HPLC, um para o ensaio de glutamato/glutamina e um para o ensaio de ATP/ADP/AMP. O en- saio estabelecido é mostrado na TABELA 18.In addition, the conversion rate of ATP, glutamate and ammonia to glutamine and ADP was evaluated using HPLC. This is called the "direct" or "biosynthetic" reaction and is tested in two different assays: one measuring the ability of glutamine synthetase to convert glutamate to glutamine in the presence of ATP, and the second determining the conversion of ATP to ADP and AMP in the same assay mixture. This assay was designed to measure the direct reaction of glutamine synthetase. The assay measures the amount of glutamine formed of L-glutamate in the presence of MnHCOa-ATP (one reaction base) and MgATP (the second reaction base), and the amount of ATP, ADP and AMP. formed are also measured. The same assay mixture solution is operated in 2 HPLC methods, one for the glutamate / glutamine assay and one for the ATP / ADP / AMP assay. The established test is shown in TABLE 18.

Tabela 18. Componentes de ensaio para o ensaio de HPLC para determinarTable 18. Assay components for HPLC assay to determine

<table>table see original document page 107</column></row><table> O ensaio de Mn2+ foi realizado em um pH de 6,3, e o ensaio de Mg em um pH de 7,3. Todas as preparações da enzima foram adicionadas à mistura de ensaio em um volume de 50 μΙ. A adição da enzima iniciou a reação que foi depois deixada prosseguir durante 1 hora. A reação foi para- da pela adição de 6 μΙ de uma solução de ácido tricloroacético a 50 %. Cada ensaio foi depois aliquotado em 4 frascos de HPLC (150 μΙ por frasco) dois destes foram ensaiados para glutamato e glutamina e para a ADP e ATP, usando uma coluna de C18 de 5 μ Fenomenex Luna em um instrumento de HPLC Agilent 100. Todos os ensaios foram operados em triplicata.<table> table see original document page 107 </column> </row> <table> The Mn2 + assay was performed at a pH of 6.3, and the Mg assay at a pH of 7.3. All enzyme preparations were added to the assay mixture in a volume of 50 μΙ. Addition of the enzyme started the reaction which was then allowed to proceed for 1 hour. The reaction was stopped by the addition of 6 μΙ of a 50% trichloroacetic acid solution. Each assay was then aliquoted into 4 HPLC vials (150 μΙ per vial) two of which were assayed for glutamate and glutamine and for ADP and ATP using a Fenomenex Luna 5 μ C18 column on an Agilent 100 HPLC instrument. All the assays were operated in triplicate.

Destes dados, parece que H271 é ligado à forma adenililada da enzima, porque quando a mutação dupla foi incluída, Y397V, criando uma forma da enzima completamente desadenililada, toda a atividade foi eficaz- mente perdida. É proposto portanto que His271 represente um papel pivo- tante na reação de transferência de fosforila putativa na forma adenililada da enzima. Histidina 269 também parece ser crítica, porém o impacto é bem menos definido.From these data, it appears that H271 is bound to the adenylylated form of the enzyme, because when the double mutation was included, Y397V, creating a completely deadenylated form of the enzyme, all activity was effectively lost. It is therefore proposed that His271 plays a pivotal role in the putative phosphoryl transfer reaction in the adenylylated form of the enzyme. Histidine 269 also seems to be critical, but the impact is much less defined.

TABELA 19. Resultados do ensaio de glutamil transferase de WT de E. colie mutantes construídos. A enzima de WT refere-se à cepa crescida no meio M9 modificado, e a WT (AD) e a WT (DD) referem-se às enzimas adenilila-TABLE 19. Results of the constructed mutant E. colie WT glutamyl transferase assay. WT enzyme refers to the strain grown on the modified M9 medium, and WT (AD) and WT (DD) refer to adenylyl enzymes.

<table>table see original document page 108</column></row><table> <table>table see original document page 109</column></row><table><table> table see original document page 108 </column> </row> <table> <table> table see original document page 109 </column> </row> <table>

Tabela 20. Resultados do ensaio mostrando a taxa de conversão de gluta- mato e ATP para glutamina e ADP como determinado usando HPLC. A en- zima WT refere-se à cepa crescida no meio M9 modificado, e a WT (AD) e WT (DD) referem-se às enzimas adenililadas e desadenililadas produzidas em cultura contínua. Os valores apresentados representam a média de três ensaios diferentes em que a diferença nos valores foi menos que 5 %. (1- parte)Table 20. Assay results showing conversion rate of glutamate and ATP to glutamine and ADP as determined using HPLC. The enzyme WT refers to the strain grown on the modified M9 medium, and WT (AD) and WT (DD) refer to the adenylylated and deadenylylated enzymes produced in continuous culture. The values shown represent the average of three different assays where the difference in values was less than 5%. (1- part)

<table>table see original document page 109</column></row><table> <table>table see original document page 110</column></row><table><table> table see original document page 109 </column> </row> <table> <table> table see original document page 110 </column> </row> <table>

Tabela 20. (2ã parte)Table 20. (2nd part)

<table>table see original document page 110</column></row><table> Implicações Mecanísticas dos Dados<table> table see original document page 110 </column> </row> <table> Mechanical Implications of Data

A uma razão de ATP para enzima dada e concentração em pH 6,3, o conteúdo de manganês e o dióxido de carbono (ou forma hidratada dos mesmos) conteúdo do sistema foi identificado como parâmetros críticos. O efeito destes parâmetros na presença e ausência da enzima foi examina- do. Na ausência da enzima, os efeitos quantitativos associados à variação nos parâmetros cruciais com respeito à geração de ADP de ATP foram do- cumentados, como também os efeitos dos parâmetros em questão na incor- poração de deutério a C8 (onde os efeitos dos parâmetros foram examinados em D2O como a matriz de solvente de volume). Na presença da enzima, o exame da eficiência de transferência de fosforila (que pode ser visto como a probabilidade de formação de glutamina resultante da geração de ADP) po- de ser usado como uma sonda mecanística.At a given ATP to enzyme ratio and concentration at pH 6.3, the manganese content and the carbon dioxide (or hydrated form thereof) system content was identified as critical parameters. The effect of these parameters on the presence and absence of the enzyme was examined. In the absence of the enzyme, the quantitative effects associated with the variation in crucial parameters with respect to ATP ADP generation were documented, as were the effects of the parameters in question on the incorporation of deuterium to C8 (where the effects of the parameters were examined in D 2 O as the volume solvent matrix). In the presence of the enzyme, examination of phosphoryl transfer efficiency (which can be seen as the probability of glutamine formation resulting from ADP generation) can be used as a mechanistic probe.

Na ausência da enzima, a taxa de hidrólise de ATP para ADP é em grande parte dependente da razão de íon de manganês para ATP. Inver- samente, a taxa de geração de ADP (a um nível de manganês constante) é grandemente independente da estoiquiometria de carbonato. Uma tal obser- vação leva à conclusão que carbonato (ou dióxido de carbono) representa um papel insignificante na hidrólise de ATP. Uma vez que o pH é uma cons- tante de 6,3, a concentração absoluta de íon de hidróxido é constante, o úni- co determinante significativo da hidrólise de ATP é concentração de íon de metal - que, por sua vez, determina o nível do complexo de metal-oxo, (pro- vavelmente o Imidazol ligado ao metal neste exemplo), na redondeza da ca- deia principal de fosfato. Quando o estudo da hidrólise é realizado usando D2O como a matriz de solvente, o efeito adicional da incorporação de deuté- rio em Ce é observado. Em contraste com os dados relativos à hidrólise, a taxa de deuteração observada na concentração de íon de manganês cons- tante aumenta com a concentração de carbonato crescente (entradas OeR, P e S, Q e T, TABELA 11) sem aumento concomitante na taxa de hidrólise. Uma tal observação indica que incorporação de deutério é dependente de carbonato.In the absence of the enzyme, the hydrolysis rate from ATP to ADP is largely dependent on the ratio of manganese ion to ATP. Conversely, the ADP generation rate (at a constant manganese level) is largely independent of carbonate stoichiometry. Such an observation leads to the conclusion that carbonate (or carbon dioxide) plays an insignificant role in ATP hydrolysis. Since the pH is a constant of 6.3, the absolute hydroxide ion concentration is constant, the only significant determinant of ATP hydrolysis is metal ion concentration - which in turn determines the level of the metal-oxo complex, (probably the metal-bound Imidazole in this example), around the main phosphate chain. When the hydrolysis study is performed using D2O as the solvent matrix, the additional effect of deuterium incorporation into Ce is observed. In contrast to hydrolysis data, the deuteration rate observed at constant manganese ion concentration increases with increasing carbonate concentration (entries OeR, P and S, Q and T, TABLE 11) without concomitant increase in rate. hydrolysis. Such an observation indicates that deuterium incorporation is carbonate dependent.

Quando a transformação catalisada com enzima e mediada com ATP de ácido glutâmico para glutamina é examinada de uma maneira simi- lar, as implicações mecanísticas destas observações ficam evidentes. Gera- ção de ADP é agora derivada tanto de hidrólise (nenhuma glutamina é gera- da) como de transferência de fosforila (resultando em glutamina). A diferen- ça na taxa de formação de glutamina e formação de ADP ilustra a taxa de hidrólise. É evidente que a taxa de formação de glutamina é dependente de íon de manganês e estoiquiometria de carbonato. Por conseguinte, deve ser concluído que carbonato representa um papel crítico na geração de ADP onde a geração de ADP resulta em transferência com sucesso de fosforila (nenhum papel para carbonato tendo sido observado na hidrólise de base). Este fato é também afetado pelo efeito do isótopo catalítico positivo de 13C HCO3- na atividade da forma adenililada de glutamina sintetase. Implicita- mente, uma vez que a deuteração em Ce em uma matriz de D2O na ausên- cia de enzima segue uma tendência similar, é altamente provável que a deu- teração seja o resultado de um estado de transição similar que está implica- do na transferência com sucesso de fosforila. Isto sugeriria um grau de au- tomontagem rudimentar do complexo responsável pela fosforilação antes da incorporação no sítio ativo da enzima.When enzyme-catalyzed and ATP-mediated transformation from glutamic acid to glutamine is examined in a similar manner, the mechanistic implications of these observations are evident. ADP generation is now derived from both hydrolysis (no glutamine is generated) and phosphoryl transfer (resulting in glutamine). The difference in glutamine formation and ADP formation rate illustrates the hydrolysis rate. It is evident that the rate of glutamine formation is dependent on manganese ion and carbonate stoichiometry. Therefore, it should be concluded that carbonate plays a critical role in ADP generation where ADP generation results in successful transfer of phosphorylate (no carbonate paper having been observed in the base hydrolysis). This fact is also affected by the effect of the 13C HCO3- positive catalytic isotope on the activity of the adenylylated form of glutamine synthetase. Implicitly, since the deuteration in Ce in a D2O matrix in the absence of enzyme follows a similar trend, it is highly likely that the demeration is the result of a similar transition state that is implicated in the Successful transfer of phosphoryl. This would suggest a degree of rudimentary self-assembly of the phosphorylation complex prior to incorporation into the active site of the enzyme.

Considerando que carbonato é mecanisticamente implicado no mecanismo de transferência de fosforila, é razoável que um efeito isótopo cinético deveria ser observado com respeito ao uso de 13C CO2 (ou uma forma hidratada do mesmo). Um tal efeito na formação de glutamina é, de fato, observado. Um aumento correspondente no consumo de ATP, porém, é observado, sugerindo que, sob condições adequadas para transferência de fosforila, a enzima promove a ativação do resíduo de γ-fosforila através de um mecanismo similar àquele observado na ausência da enzima.Considering that carbonate is mechanistically implicated in the phosphoryl transfer mechanism, it is reasonable that a kinetic isotope effect should be observed with respect to the use of 13C CO2 (or a hydrated form thereof). Such an effect on glutamine formation is, in fact, observed. A corresponding increase in ATP consumption, however, is observed, suggesting that under appropriate conditions for phosphoryl transfer, the enzyme promotes activation of the γ-phosphoryl residue through a mechanism similar to that observed in the absence of the enzyme.

Em resumo, pode ser concluído que a concentração de íon de manganês (até a ótima ser alcançada) é grandemente responsável pela ati- vação do resíduo de γ-fosforila de ATP. O mecanismo de transferência de fosforila responsável pela formação de glutamina, porém, mecanisticamente implica carbonato e envolve a clivagem do resíduo de Cs-H. Na ausência do requerimento mecanístico de carbonato (mas com íon de manganês sufici- ente) a enzima é capaz de ativar o resíduo de γ-fosforila, mas carece da ca- pacidade de eficientemente transferir aquele resíduo para o ácido glutâmico.In summary, it can be concluded that the concentration of manganese ion (until optimum is reached) is largely responsible for the activation of the ATP γ-phosphoryl residue. The phosphoryl transfer mechanism responsible for glutamine formation, however, mechanistically implies carbonate and involves the cleavage of the Cs-H residue. In the absence of mechanistic carbonate requirement (but with sufficient manganese ion) the enzyme is capable of activating the γ-phosphoryl residue, but lacks the ability to efficiently transfer that residue to glutamic acid.

DebateDebate

O mecanismo de reação novo é postulado para ser mediado por um complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP putativo (figura 1). É proposto que uma espécie de imônio ou seja induzida em N7 através de protonação por meio de um HCO3- coordenado ou por carboxilação do N7. É acreditado que a ligação íntima do pH da reação e para a dissociação de HCO3- para CO2, em pH 6,3, que o intermediário carboxilado é mais provável. Os dados da captura de ácido fórmico das reações contendo HCO3" também sugerirão que o intermediário de carbamato crie as espécies de imônio. O seqüestro de dióxido de carbono (ou uma forma hidratada do mesmo tal como bicarbo- nato) em um tal maneira é análogo àquele descrito por Ashman, L. K. e D. B. Keech, (1975) J. Biol. Chem. 250: 14-21, durante um estudo da relação entre hidrólise de ATP e fixação de dióxido de carbono na piruvato carboxilase de rim de ovelha da enzima mediada por biotina em que um carbóxi fosfato foi proposto como um intermediário transitório. A formação das espécies de i- mônio em N7 depois permite a desprotonação de C8 por meio do ácido car- bâmico desprotonado assim formado ou outro HCO3- coordenado (desproto- nado) o intermediário (IV) assim gerado sendo estabilizado pela formação da ligação putativa entre o Mn2+ e C8. As espécies (V) assim formadas resultam no resíduo de fosforila terminal ficando proximal ao grupo carbamoíla e se- qüestro daquele resíduo de fosforila pelo resíduo de carbamoíla, gerando um anidrido de fosforila de carbamoíla ativado (VI) (a proximidade do β-fosfato do ATP original permitindo a reversibilidade desta etapa como sugerido por Kaziro et al. (1962) J. Biol. Chem. 237: (5), 1460-1468) em estudos relativos a propionil carboxilase). O CO2 requerido para carboxilação virá de um CO2 coordenado (ou uma forma hidratada do mesmo). A razão de 50:50 de HCO3- para CO2 em pH 6,3 é crítica para obter taxas de reação otimizadas para a glutamina sintetase adenililada. O pH otimizado de pH 6,3 dita que CO2 e HCO3- são facilmente disponíveis para este processo e que ambas as espécies representam um papel na catálise. O N7 carboxilado pode depois ser usado na formação de carboxifosfato pela hidrólise do γ-fosfato do ATP. O fosfato é depois translocado por meio do His271 e provavelmente His269 para a γ-carboxila do glutamato na reação, formando fosfato de γ-glutamila. O fosfato de γ-glutamila depois sofre ataque nucleofílico em outro mecanis- mo formando glutamina. Os resíduos de E207 e de Arg355 representam um papel na estabilização do intermediário de transferência de fosforila através de ligação de hidrogênio. A possível coordenação que ocorre no complexo de Mn2+3(HCO3-)12ATP poderia ser como segue: 2 dos íons de Mn2+ estão acima e abaixo do plano da cauda de fosfato e um é coordenado para o anel de adenina.The new reaction mechanism is postulated to be mediated by a putative (Mn2 +) 3. (HC03-) 12ATP complex (Figure 1). It is proposed that a species of imonium is either induced in N7 by protonation by means of a coordinated HCO3 or by carboxylation of N7. It is believed that the intimate binding of the reaction pH and for the dissociation of HCO3- to CO2 at pH 6.3, that the carboxylated intermediate is more likely. The formic acid capture data from HCO3-containing reactions will also suggest that the carbamate intermediate creates the species of imonium. Carbon dioxide sequestration (or a hydrated form thereof such as bicarbonate) in such a manner is analogous. that described by Ashman, LK and DB Keech, (1975) J. Biol. Chem. 250: 14-21, during a study of the relationship between ATP hydrolysis and carbon dioxide fixation in enzyme-mediated sheep sheep pyruvate carboxylase by a biotin in which a carboxy phosphate has been proposed as a transient intermediate.The formation of the immonium species at N7 then permits the deprotonation of C8 by the deprotonated carbamic acid thus formed or other coordinated (deprotonated) HCO3. the intermediate (IV) thus generated being stabilized by the formation of the putative bond between Mn2 + and C8.The species (V) thus formed result in the terminal phosphoryl residue becoming proximal to the carba group. moíla and sequestration of that phosphoryl residue by the carbamoyl residue, generating an activated carbamoyl phosphoryl anhydride (VI) (the proximity of the original ATP β-phosphate allowing the reversibility of this step as suggested by Kaziro et al. (1962) J. Biol. Chem. 237: (5), 1460-1468) in propionyl carboxylase studies). The CO2 required for carboxylation will come from a coordinated CO2 (or a hydrated form thereof). The 50:50 ratio of HCO3- to CO2 at pH 6.3 is critical to obtain optimal reaction rates for adenylylated glutamine synthetase. The optimized pH of pH 6.3 dictates that CO2 and HCO3- are readily available for this process and that both species play a role in catalysis. Carboxylated N7 can then be used in the formation of carboxyphosphate by hydrolysis of ATP γ-phosphate. The phosphate is then translocated via His271 and probably His269 to the glutamate γ-carboxyl in the reaction, forming γ-glutamyl phosphate. The γ-glutamyl phosphate then undergoes nucleophilic attack on another mechanism forming glutamine. The E207 and Arg355 residues play a role in stabilizing the phosphoryl transfer intermediate via hydrogen bonding. The possible coordination that occurs in the Mn2 + 3 (HCO3-) 12ATP complex could be as follows: 2 of the Mn2 + ions are above and below the phosphate tail plane and one is coordinated for the adenine ring.

Em suma, o mecanismo catalítico proposto é com base nos se- guintes:In short, the proposed catalytic mechanism is based on the following:

■ Na presença de Mn2+, a cadeia de fosfato de ATP parece coordenar para o Mn2+ que por sua vez coordena para o carbono de C8 do anel de a- denina.■ In the presence of Mn2 +, the ATP phosphate chain appears to coordinate for Mn2 + which in turn coordinates for the adenine ring C8 carbon.

■ A proximidade do Mn2+ ao próton de Ce é mais íntima quando HCCV estiver presente depois quando Cl- estiver presente.■ The proximity of the Mn2 + to the Ce proton is most intimate when HCCV is present later when Cl- is present.

■ Na ausência da enzima, a taxa de hidrólise do ATP é dependente da concentração e presença de Mn2+ e HCO3-.■ In the absence of the enzyme, the ATP hydrolysis rate is dependent on the concentration and presence of Mn2 + and HCO3-.

■ Na ausência da enzima, a taxa de hidrólise do ATP parece ser ligada ao Mn2+ e HCO3- que estão presente a uma razão de 12 HCO3- para 3 Mn2+ pa- ra 1 ATP.■ In the absence of the enzyme, the ATP hydrolysis rate appears to be bound to Mn2 + and HCO3- which are present at a ratio of 12 HCO3- to 3 Mn2 + for 1 ATP.

■ O mecanismo de reação usado para ATP adenililado requer Mn2+ en- quanto ATP desadenililado requer Mg2+ para a reação.■ The reaction mechanism used for adenylylated ATP requires Mn2 + while desadenylated ATP requires Mg2 + for the reaction.

■ A glutamina sintetase adenililada pode usar Mg2+ na reação, porém a eficiência da conversão hidrolisada de ATP para glutamina formada é com- prometida.■ Adenylylated glutamine synthetase may use Mg2 + in the reaction, but the efficiency of the hydrolysed conversion of ATP to formed glutamine is compromised.

■ Glutamina sintetase adenililada requer 3 íons de Mn2+ por ATP para ótima atividade.■ Adenylylated glutamine synthetase requires 3 Mn2 + ions per ATP for optimal activity.

■ Glutamina sintetase adenililada requer HCO3- e CO2 para atividade oti- mizada.■ Adenylylated glutamine synthetase requires HCO3- and CO2 for optimal activity.

O pH de 6,3 define a dissociação de bicarbonato para HCO3- e CO2. ■ A glutamina sintetase adenililada usa Mn2+, HCO3" e ATP a uma razão de 3:12:1.The pH of 6.3 defines the bicarbonate dissociation to HCO3- and CO2. ■ Adenylylated glutamine synthetase uses Mn2 +, HCO3 "and ATP at a ratio of 3: 12: 1.

■ O próton de C8 parece representar um papel catalítico na atividade de glutamina sintetase na forma adenililada.■ C8 proton appears to play a catalytic role in glutamine synthetase activity in adenylyl form.

Exemplo 3 - Síntese e Avaliação dos Inibidores de TesteExample 3 - Synthesis and Evaluation of Test Inhibitors

Análogos de purina e pirimidina foram preparados e investigados para seu efeito em atividade de GS fosforil transferase, incluindo hidrólise de ATP, formação de ADP, formação de glutamina, atividade de γ-glutamil transferase, e eficiência de conversão.Purine and pyrimidine analogs were prepared and investigated for their effect on GS phosphoryl transferase activity, including ATP hydrolysis, ADP formation, glutamine formation, γ-glutamyl transferase activity, and conversion efficiency.

Metodologias de Reação Sintética para Análogos de Purina e Pirimidina Al- vejando o Sítio de Fosforil TransferaseSynthetic Reaction Methodologies for Purine and Pyrimidine Analogues Targeting the Phosphoryl Transferase Site

A ligação de ATP para o sítio ativo de GS é extremamente de- pendente do arranjo de grupos de ligação de hidrogênio ao redor do seg- mento de purina da molécula, junto com várias interações hidrofóbicas. A característica posterior pode ser utilizada para aumentar a especificidade de qualquer molécula pequena dada com base em um esqueleto do tipo purina, uma vez que as regiões hidrofóbicas dos sítios de ligação de ATP conheci- dos são construídos de seqüências de aminoácido únicas. Sintetização de tais moléculas tendo metades hidrofóbicas projetando nestes sítios ou bol- sas tendo as características espaciais e eletrônicas corretas para interagir otimamente com os resíduos de aminoácido nas bolsas permitirá ligação mais firme da molécula pequena naquele sítio ativo da enzima específica, em grande parte para a exclusão de todas as bolsas de ligação de ATP simi- lares diferentes dos membros de família intimamente relacionados. Isto se aplicará igualmente às estruturas com base em não-purina, contanto que os grupos de ligação de hidrogênio possam interagir com os aminoácidos fun- damentais da bolsa de ligação de ATP.ATP binding to the GS active site is extremely dependent on the arrangement of hydrogen bonding groups around the molecule's purine segment, along with various hydrophobic interactions. The latter feature can be used to increase the specificity of any small molecule given based on a purine-like backbone, since the hydrophobic regions of known ATP binding sites are constructed of unique amino acid sequences. Synthesizing such molecules having hydrophobic halves projecting at these sites or pockets having the correct spatial and electronic characteristics to optimally interact with the amino acid residues in the pockets will allow a firmer binding of the small molecule at that specific enzyme active site, largely to the enzyme. exclusion of all similar ATP liaison grants other than closely related family members. This will also apply to non-purine based structures as long as hydrogen bonding groups can interact with the fundamental amino acids of the ATP binding pocket.

Para gerar tais compostos, vários grupos gerais de compostos foram investigados, o grupo inicial todo envolvendo grupos aromáticos ou heteroaromáticos com uma o/to-diamina característica como parte da substi- tuição do anel. Os sistemas de heteroarila foram todos com base no esque- leto de pirimidina. Foi visado que estes sistemas pudessem depois ser con- vertidos nas espécies de purinas (II, X1Y = N), quinoxalinas (III, X,Y = CH), pteridinas (III, Χ,Υ = N) ou carbenóides (II, Χ,Υ = N), dependendo da diamina particular usada. A espécie posterior foi implicada na inibição de ATPase [E. Piers e J. Y. Roberge, Tetrahedron Letters, 1992, 33, 6923-6926 e referên- cias dentro desta]. Sistemas que carecem de qualquer ligação de hidrogênio ao redor do anel de seis membros são também inclusos na forma de benzi- midazóis (II, Χ,Υ = CH) visto que estes são substâncias conhecidas serem biologicamente ativas apesar da carência de substituição de azo [Vide, por exemplo, V. Klimesová et al., Eur. J. Med. Chem., 2002, 37, 409-418].To generate such compounds, several general groups of compounds were investigated, the whole starting group involving aromatic or heteroaromatic groups having a characteristic o-to-diamine as part of ring replacement. The heteroaryl systems were all based on the pyrimidine scheme. It was envisaged that these systems could then be converted into the purine (II, X1Y = N), quinoxaline (III, X, Y = CH), pteridine (III, Χ, Υ = N) or carbenoid (II, Χ) species. , Υ = N), depending on the particular diamine used. Later species were implicated in ATPase inhibition [E. Piers and J. Y. Roberge, Tetrahedron Letters, 1992, 33, 6923-6926 and references therein]. Systems that lack any hydrogen bond around the six-membered ring are also included in the form of benzimidazoles (II, Χ, Υ = CH) as these are known to be biologically active despite the lack of azo substitution [ See, for example, V. Klimesová et al., Eur. J. Med. Chem., 2002, 37, 409-418].

<formula>formula see original document page 116</formula><formula> formula see original document page 116 </formula>

Outros sistemas também inclusos nesta investigação incluem as imidazo[1,2-a]piridinas relacionadas (V), e as estruturas de pirimidina satu- radas (IV). Ambos destes sistemas têm o padrão de ligação de hidrogênio requerido, como também o potencial de variações extensivas de substituinte necessárias para o projeto dos inibidores requeridos que poderiam potenci- almente ligar de uma maneira a inibir a transferência de fosforila requerida.Other systems also included in this research include related imidazo [1,2-a] pyridines (V), and saturated pyrimidine structures (IV). Both of these systems have the required hydrogen bonding pattern, as well as the potential for extensive substituent variations required to design the required inhibitors that could potentially bind in a manner that inhibits the required phosphoryl transfer.

<formula>formula see original document page 116</formula><formula> formula see original document page 116 </formula>

Moléculas com Base em (HETERO)ARIL-1,2-DIAMINAS(HETERO) ARIL-1,2-DIAMINE Based Molecules

As diaminas requeridas ou foram obtidas comercialmente, tais como 1,2-fenilenodiamina 1 e 6-hidróxi-2,4,5-triaminopirimidina 2, ou sinteti- zadas como detalhado doravante [J. A. Van Allen em Org. Synth. Coll. Voi VI, N. Rabjohn et al. (eds.), John Wiley and Sons, Inc. (Nova Iorque), 1963, págs. 245-246; W. R. Sherman e E. C. Taylor, ibid, págs. 247-249].The required diamines were either obtained commercially, such as 1,2-phenylenediamine 1 and 6-hydroxy-2,4,5-triaminopyrimidine 2, or synthesized as detailed hereinafter [J. A. Van Allen in Org. Synth. Coll. Voi VI, N. Rabjohn et al. (eds.), John Wiley and Sons, Inc. (New York), 1963, p. 245-246; W. R. Sherman and E. C. Taylor, ibid, p. 247-249].

<formula>formula see original document page 117</formula><formula> formula see original document page 117 </formula>

Uma síntese direta de 5 usando diidrocloreto de malondiamidina como o material de partida falhou em produzir a 4,6-diaminopirimidina 4 re- querida completamente [G. W. Kenner et al., J. Chem. Soc., 1943, 574]. Uma preparação alternativa de 4, envolvendo a reação de tiouréia com ma- lononitrila, forneceu 4,6-diamino-2-mercaptopirimidina 3 (ESQUEMA 1) [A. Bendich, J. F. Tinker e G. B. Brown, J. Chem. Soc., 1948, 3109]. Redução de níquel de Raney de mercaptano 3 provou ser uma alternativa melhor, e 4,6-diaminopirimidina 4 foi isolado em rendimento fino [D. J. Brown, J. Soc.A direct synthesis of 5 using malondiamidine dihydrochloride as the starting material failed to produce the completely required 4,6-diaminopyrimidine 4 [G. W. Kenner et al., J. Chem. Soc., 1943, 574]. An alternative preparation of 4, involving the reaction of thiourea with malonitrile, provided 4,6-diamino-2-mercaptopyrimidine 3 (SCHEME 1) [A. Bendich, J.F. Tinker and G.B. Brown, J. Chem. Soc., 1948, 3109]. Raney nickel reduction of mercaptan 3 proved to be a better alternative, and 4,6-diaminopyrimidine 4 was isolated in fine yield [D. J. Brown, J. Soc.

Chem. Ind., 1950, 69, 353].Chem. Ind., 1950, 69, 353].

<formula>formula see original document page 117</formula><formula> formula see original document page 117 </formula>

Esquema 1Scheme 1

Embora nitrozação de pirimidinas em ácido acético tenha sido bem documentada, nitrozação de 4 foi relatada ser rendimento baixo em par- ticular, e requer a presença de ácido mineral [a) B. Lythgoe, A. R. Todd e A. Topham, J. Chem. Soc., 1944, 315; b) J. Baddiley, B. Lythgoe, D. McNeiI e A. R. Todd, J. Chem. Soc., 1943, 383]. Embora nitrozação sob condições acídicas prosseguiram suavemente, produto nitroso 6 foi observado ser ins- tável sob isolamento. Redução de ditionita imediata de 6 úmido produziu tri- amina instável 5, que poderia porém, seja, isolado como o sal de sulfato de hidrogênio estável.Although pyrimidine nitrozation in acetic acid has been well documented, nitrozation of 4 has been reported to be particularly low yielding, and requires the presence of mineral acid [a) B. Lythgoe, A. R. Todd and A. Topham, J. Chem. Soc., 1944, 315; b) J. Baddiley, B. Lythgoe, D. McNei, and A. R. Todd, J. Chem. Soc., 1943, 383]. Although nitrozation under acidic conditions proceeded smoothly, nitrous product 6 was found to be unstable under isolation. Reduction of immediate dithionite from 6 wet produced unstable trimine 5, which could however be isolated as the stable hydrogen sulfate salt.

4,5-Diamino-6-hidroxipirimidina 10 foi sintetizada de uma manei- ra similar, desta vez tratando tiouréia com cianoacetato de etila para formar mercaptano 7 [W. Traube, Ann. Chem., 1904, 331, 64], seguido por nitroza- ção para nitrosomercaptano estável 9, redução de ditionita para diamino- mercaptano 8 [A. R. Pagano, W. M. Lajewski e R. A. Jones, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 11669] e dessulfurização com níquel de Raney em amônia aquosa para fornecer diamina 10. Tentativas para produzir 10 diretamente de mercaptano 9 através de redução de níquel de Raney não tiveram êxito [A. Laxer, D. T. Major, Η. E. Gottlieb e B. Fischer, J. Org. Chem., 2001, 66, 5463]. Similarmente, cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 foi obtido tratando uréia com cianoacetato de etila (fornecendo 6-aminouracila 11), nitrozação (para 12) e redução de ditionita para a diamina 13. A base livre é instável e facilmente oxida as pirimidopteridinas altamente coloridas.4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidine 10 was synthesized in a similar manner, this time treating thiourea with ethyl cyanoacetate to form mercaptan 7 [W. Traube, Ann. Chem., 1904, 331, 64], followed by stable nitrosomercaptan nitrozation 9, dithionite reduction to diaminoc mercaptan 8 [A. R. Pagano, W. M. Lajewski and R. A. Jones, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 11669] and Raney nickel desulphurization in aqueous ammonia to provide diamine 10. Attempts to produce 10 directly from mercaptan 9 through Raney nickel reduction were unsuccessful [A. Laxer, D.T. Major, Η. E. Gottlieb and B. Fischer, J. Org. Chem., 2001, 66, 5463]. Similarly, 5,6-diaminouracil hydrochloride 13 was obtained by treating urea with ethyl cyanoacetate (providing 6-aminouracil 11), nitrozation (to 12) and dithionite reduction to diamine 13. The free base is unstable and easily oxidizes pyrimidopteridines Highly colored.

Durante este tempo, 6-amino-1,3-dimetiluracila comercialmente disponível 14 foi usada para testar a reação de fechamento de anel para for- necer xantinas de uracilas N-substituídas, com a meta de aplicar os mesmos princípios depois aos derivados de N-benzila. Nitrozação de 14 com nitrito de sódio para 15, seguido por redução com ditionita de sódio deu 5,6- diamino-1,3-dimetiluracila 16 (ESQUEMA 2).During this time, commercially available 6-amino-1,3-dimethyluracil 14 was used to test the ring closure reaction to provide N-substituted uracil xanthines, with the goal of applying the same principles later to N-derivatives. -benzyl. Nitrozation from 14 with sodium nitrite to 15 followed by reduction with sodium dithionite gave 5,6-diamino-1,3-dimethyluracil 16 (SCHEME 2).

<formula>formula see original document page 118</formula><formula> formula see original document page 118 </formula>

Sistemas Bicíclicos 5.6-Fundidos: a) Derivados de benzimidazol (II, X1Y = CH, RilR4 = H) Vários benzimidazóis substituídos em N1 ou C2 foram preparados como a- nálogos de adenina simplificados com um anel de seis membros não-polar. <formula>formula see original document page 119</formula>5.6-Fused Bicyclic Systems: a) Benzimidazole derivatives (II, X1Y = CH, RilR4 = H) Several N1 or C2 substituted benzimidazoles were prepared as simplified adenine analogs with a non-polar six-membered ring. <formula> formula see original document page 119 </formula>

O método sintético mais direto para benzimidazóis substituídos em C-2 envolveu reação de fenilenodiamina 1 com um ácido carboxílico a- dequado (ESQUEMA 3).The most direct synthetic method for C-2 substituted benzimidazoles involved reaction of phenylenediamine 1 with a suitable carboxylic acid (Scheme 3).

<formula>formula see original document page 119</formula><formula> formula see original document page 119 </formula>

Esquema 3Scheme 3

Fusão dos dois componentes (fenilenodiamina e o ácido carboxí- lico correspondente) a 150eC em 85 % de ácido fosfórico, seguido por prote- ção apropriada dos grupos de amino para permitir isolamento e purificação dos compostos (excluindo o derivado de ácido 5-bromovalérico) forneceu os compostos 17-20 todos destes são sólidos em temperatura ambiente. Hidró- Iise dos produtos protegidos não foi tentada.Fusion of the two components (phenylenediamine and the corresponding carboxylic acid) at 150 ° C in 85% phosphoric acid, followed by appropriate protection of the amino groups to allow isolation and purification of the compounds (excluding 5-bromovaleric acid derivative) provided compounds 17-20 all of these are solid at room temperature. Hydrolysis of protected products has not been attempted.

<formula>formula see original document page 119</formula><formula> formula see original document page 119 </formula>

Benzimidazóis N1-substituídos foram obtidos, por exemplo, tratando benzi- midazol 21 com hidreto de sódio e alilbrometo em dimetilformamida seca a 60-1 OOqC durante 18h, produzindo alilbenzimidazol 22 (ESQUEMA 4) [K. -L. Yu et al., Bioorg. Meó. Chem. Lettersl 2003, 13, 2141-2144\. Um protocolo similar usando um procedimento de bisalquilação com dibromometano e ál- cool de furfurila forneceu o produto de glicosila 23 [A. Holy et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 2064-2086; A. Khalafi-Nezhad et al., Tetrahedron, 2002, 58, 10341-10344],N 1 -substituted benzimidazoles were obtained, for example, by treating benzimidazole 21 with sodium hydride and allylbromide in dry dimethylformamide at 60-110 ° C for 18h, yielding allylbenzimidazole 22 (SCHEME 4) [K. -L. Yu et al., Bioorg. Meó Chem. Letters 2003, 13, 2141-2144. A similar protocol using a dibromomethane and furfuryl alcohol bisalkylation procedure provided the glycosyl product 23 [A. Holy et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 2064-2086; A. Khalafi-Nezhad et al., Tetrahedron, 2002, 58, 10341-10344],

<formula>formula see original document page 119</formula><formula> formula see original document page 119 </formula>

Esquema 4Scheme 4

b) Derivados de purina substituídos: (II, Χ,Υ = N) Substituição de C-8:(b) Substituted purine derivatives: (II, Χ, Υ = N) Substitution of C-8:

Um método geral foi usado para preparar purinas 8-substituídas de diaminas 2, 5, 10 e 13 (ESQUEMA 5). Condições de Schotten-Baumann foram usadas a fim de acilar 2, 5, 10 e 13 no grupo de 5-amino mais básico seletivamente, fornecendo 5-amidopirimidinas 24 usando uma seleção de cloretos de ácido comercialmente obtidos. Em certas circunstâncias, sistemas de solventes modificados foram usados para realizar esta transformação. Ciclização das amidas de 2, 10 e 13 foi alcançada usando oxicloreto de fósforo ou metóxido de sódio, formando quaisquer fenóis (25, X = OH) ou cloretos (25, X = Cl) [G. B. Elion, E., Burgi e G. H. Hitchings, J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 5235- 5239]. Amidas de triamina 5 são apenas ciclizadas com metóxido, dando 6- aminopurinas (25, X = NH2) [B. Lucas, N., Rosen e G. Chiosis, J. Comb. Chem., 2001, 3, 518-520].A general method was used to prepare 8-substituted diamine 2, 5, 10 and 13 purines (Scheme 5). Schotten-Baumann conditions were used to acylate 2, 5, 10 and 13 in the most basic 5-amino group selectively, providing 5-amidopyrimidines 24 using a selection of commercially obtained acid chlorides. Under certain circumstances, modified solvent systems were used to perform this transformation. Cycling of amides 2, 10 and 13 was achieved using phosphorus oxychloride or sodium methoxide to form any phenols (25, X = OH) or chlorides (25, X = Cl) [G. B. Elion, E., Burgi and G. H. Hitchings, J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 5235-5239]. Triamin 5 amides are cyclized with methoxide only, giving 6-aminopurines (25, X = NH 2) [B. Lucas, N., Rosen and G. Chiosis, J. Comb. Chem., 2001, 3, 518-520].

<formula>formula see original document page 120</formula><formula> formula see original document page 120 </formula>

2 R1 = OH, R2 = NH2 24 25, X=Cl, OH ou NH2 5 R1 = NH2, R2 = H 10 R1 =OH, R2 = H 13 R1 =OH, R2 = OH2 R 1 = OH, R 2 = NH 2 24 25, X = Cl, OH or NH 2 5 R 1 = NH 2, R 2 = H 10 R 1 = OH, R 2 = H 13 R 1 = OH, R 2 = OH

Esquema 5Scheme 5

Os resultados para as acilações 2, 5, 10 e 13 e as ciclizações corresponden- tes estão dados na TABELA 21.Results for acylations 2, 5, 10 and 13 and the corresponding cyclizations are given in TABLE 21.

Tabela 21: Substituições e Fechamento de Anéis de 4,5-DiaminopirimidinasTable 21: 4,5-Diaminopyrimidine Ring Replacements and Closures

<table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table><table> table see original document page 120 </column> </row> <table> <table> table see original document page 121 </column> </row> <table>

Tabela 21: (2ã parte)Table 21: (2nd part)

<table>table see original document page 121</column></row><table><table> table see original document page 121 </column> </row> <table>

Tabela 21: Substituições e Fechamento de Anéis de 4,5-Diaminopirimidinas Substituídas (CONT.) (1a parte)Table 21: Replacements and Closure of Substituted 4,5-Diaminopyrimidines Rings (CONT.) (Part 1)

<table>table see original document page 122</column></row><table><table> table see original document page 122 </column> </row> <table>

Tabela 21: (CONT.) (2a parte)Table 21: (CONT.) (2nd part)

<table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table><table> table see original document page 122 </column> </row> <table> <table> table see original document page 123 </column> </row> <table>

Preparações alternativas de várias purinas 8-substituídas inclu- em a preparação de carbamato 55 da reação de 2 com sulfato de /sotiouréia de S-metila [P. R Shildneck e W. Windus, Org. Syn. Coll. Vol. II, A. H. Blatt (ed.), 1943, John Wiley and Sons (Nova Iorque), 411] (ESQUEMA 6).Alternative preparations of various 8-substituted purines include the preparation of carbamate 55 from the reaction of 2 with S-methyl / sothiourea sulfate [P. R Shildneck and W. Windus, Org. Syn. Coll. Vol. II, A. H. Blatt (ed.), 1943, John Wiley and Sons (New York), 411] (Scheme 6).

<formula>formula see original document page 123</formula><formula> formula see original document page 123 </formula>

Esquema 6Scheme 6

Xantina 48 foi também preparada tratando 5-nitroso-6-amino- 1,3-dimetiluracila 15 com benzilamina e ácido clorídrico aquoso concentrado (ESQUEMA 7) [C. E. Müller, M., Thorand, R., Qurishi, M., Diekmann, K. A.Xanthine 48 was also prepared by treating 5-nitrous-6-amino-1,3-dimethyluracil 15 with benzylamine and concentrated aqueous hydrochloric acid (Scheme 7) [C. E. Müller, M., Thorand, R., Qurishi, M., Diekmann, K. A.

Jacobson, W. L. Padgett e J. W. Daly, J. Med. Chem., 2002, 45, 3440].Jacobson, W.L. Padgett and J.W. Daly, J. Med. Chem., 2002, 45, 3440].

<formula>formula see original document page 123</formula><formula> formula see original document page 123 </formula>

Esquema 7Scheme 7

Substituição de N-6 e N-9N-6 and N-9 replacement

É bem-conhecido que a 4,6-dicloropirimidina 56 é em particular suscetível ao deslocamento nucleofílico por nucleófilos de nitrogênio e de oxigênio. O deslocamento do primeiro grupo de cloro é fácil, enquanto o se- gundo cloreto requer condições mais forçosas [C.W. Whitehead e J. J. Tra- verso, J. Am. Chem. Soc., 1958, 80, 2185-2189; Μ. H. Norman et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 4288-4312]. O anel de pirimidina pode ser ativado, porém. Isto é alcançado introduzindo um grupo de retirada de elétrons em C-5, tal como grupos nitro ou nitrosos através de substituição eletrofílica. O protoco- lo, permitindo mono deslocamento de um substituinte de cloro por uma ami- na, seguido por nitrozação e deslocamento subseqüente do segundo substi- tuinte de cloro, fornece um precursor de triaminopirimidina como resumido no (ESQUEMA 8). Redução do grupo nitroso, seguido por fechamento de anel forneceria os derivados de adenina desejados.It is well known that 4,6-dichloropyrimidine 56 is in particular susceptible to nucleophilic displacement by nitrogen and oxygen nucleophiles. The displacement of the first chlorine group is easy, while the second chloride requires stricter conditions [C.W. Whitehead and J. J. Traverse, J. Am. Chem. Soc., 1958, 80, 2185-2189; Μ H. Norman et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 4288-4312]. The pyrimidine ring can be activated, however. This is achieved by introducing a C-5 electron withdrawing group, such as nitro or nitros groups through electrophilic substitution. The protocol, allowing mono displacement of one chlorine substituent by an amine, followed by nitrozation and subsequent displacement of the second chlorine substituent, provides a triamine pyrimidine precursor as summarized in (Scheme 8). Reduction of the nitrous group followed by ring closure would provide the desired adenine derivatives.

<formula>formula see original document page 124</formula><formula> formula see original document page 124 </formula>

Esquema 8Scheme 8

Uma variedade de aminas foi selecionada para substituir os gru- pos de cloro para cobrir tanto quanto possível o "espaço" molecular - incluin- do alquilaminas, arilaminas e heteroarilaminas. Uma combinação de uma amina primária e uma secundária foi usada para assegurar um produto sim- pies na ciclização para os compostos de purina.A variety of amines have been selected to replace chlorine groups to cover as much molecular space as possible - including alkylamines, arylamines and heteroarylamines. A combination of a primary and a secondary amine was used to ensure a simple cyclization product for the purine compounds.

As aminas a seguir foram selecionadas: Aminas primárias:The following amines were selected: Primary Amines:

<formula>formula see original document page 124</formula><formula> formula see original document page 124 </formula>

A reação de deslocamento inicial envolveu tratamento 56 com um excesso de duas vezes de amina em álcool /sopropílico fervente [C. Temple, C. L. Kussner e J. A. Montgomery, J. Med. Chem., 1962, 5, 866- 870; M. Israel et al., J. Med. Chem., 1964, 7, 792-799] ou, alternativamente, a reação poderia ser realizada usando apenas um equivalente da amina na presença de um equivalente de trietilamina [N. Baindur, N. Chadha e M. R. Player, J. Comb. Chem., 2003, 5, 653-659]. Nenhum produto dissubstituído foi isolado ou detectado nas misturas brutas ou produtos isolados das mo- noaminas 57-61. Os resultados para monossubstituição de 56 com aminas primárias estão resumidos na TABELA 22. Surpreendentemente, pirimidinaThe initial displacement reaction involved treatment with twice the excess of amine in boiling alcohol / sopropyl [C. Temple, C.L. Kussner and J.A. Montgomery, J. Med. Chem., 1962, 5, 866-870; M. Israel et al., J. Med. Chem., 1964, 7, 792-799] or, alternatively, the reaction could be performed using only one equivalent of the amine in the presence of one equivalent of triethylamine [N. Baindur, N. Chadha and M. R. Player, J. Comb. Chem., 2003, 5, 653-659]. No disubstituted product was isolated or detected in crude mixtures or isolated products of monamines 57-61. The results for monosubstitution of 56 with primary amines are summarized in TABLE 22. Surprisingly, pyrimidine

60 derivada de cloridrato de éster de metila de fenilalanina foi apenas forma- da em rendimento pobre, possivelmente devido à formação pobre do clori- drato de éster de intermediário. Como esperado, as arilaminas pobremente básicas requereram condições forçosas. 2-aminopiridina, porém, não reagiu com 56.60 derived from phenylalanine methyl ester hydrochloride was only formed in poor yield, possibly due to poor formation of intermediate ester hydrochloride. As expected, poorly basic arylamines required tough conditions. 2-aminopyridine, however, did not react with 56.

Nitrozação das aminas secundárias 57-59 ocorreu facilmente, fornecendo os produtos 62-64 em rendimentos bons [D. E. 0'Brien et al., J. Med. Chem., 1962, 5, 1085-1103]. De forma perplexa, o derivado de fenila- Ianinila 60 não reagiu sob estas condições. Similarmente, derivado de anilinaNitrozation of secondary amines 57-59 occurred easily, providing products 62-64 in good yields [D. E. O'Brien et al., J. Med. Chem., 1962, 5, 1085-1103]. Perplexedly, the phenylaninyl derivative 60 did not react under these conditions. Similarly, aniline derivative

61 provou muito pobremente ativado para nitrozação sob várias condições (TABELA 22). Os produtos nitrosos 62-64 foram depois tratados com aminas secundárias, sob a suposição que nitrozação tinha suficientemente ativado as pirimidinas. Tentativas para introduzir as aminas aromáticas pobremente reativas nestes compostos neste estágio são malsucedidas.61 proved very poorly activated for nitrozation under various conditions (TABLE 22). Nitrous products 62-64 were then treated with secondary amines on the assumption that nitrozation had sufficiently activated the pyrimidines. Attempts to introduce poorly reactive aromatic amines into these compounds at this stage are unsuccessful.

Tabela 22: Substituição de 56 com Aminas Primárias, Nitrosação e Depois Substituição com Aminas Secundárias (1a parte)Table 22: Replacement of 56 with Primary Amines, Nitration and Then Replacement with Secondary Amines (1st part)

<table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table><table> table see original document page 125 </column> </row> <table> <table> table see original document page 126 </column> </row> <table>

Tabela 22: (2g parteTable 22: (2g part

<table>table see original document page 126</column></row><table><table> table see original document page 126 </column> </row> <table>

a IPA, trietilamina, refluxo, 18h b Puro, 1509C, 1ha IPA, triethylamine, reflux, 18h b Pure, 150 ° C, 1h

C CH2CI2, temperatura ambiente, 1 hC CH 2 Cl 2, room temperature, 1 h

Os compostos nitrosos 65-71 foram reduzidos na presença de ditionita de sódio e ácido sulfúrico aquoso para fornecer as triaminopirimidi- nas substituídas 72-78 (TABELA 23). Ciclização das pirimidinas 72, 73, 75, 76 e 78 para fornecer as adeninas substituídas 79-83 respectivamente foi executada aquecendo a pirimidina em uma mistura 1:1 de anidrido acético e ortoformato de trietila [C. Templo, C. L. Kussner e J. A. Montgomery, J. Med. Chem., 1962, 5, 866-870]. Porém, pirimidinas 74 e 77, ambos substituídas com uma cadeia de hidroxietila, deu uma mistura complexa de produtos que pareciam conter o produto desejado junto com os intermediários da reação de ciclização.Nitrous compounds 65-71 were reduced in the presence of sodium dithionite and aqueous sulfuric acid to provide the substituted triamminopyrimidines 72-78 (TABLE 23). Cyclization of pyrimidines 72, 73, 75, 76 and 78 to provide the substituted adenines 79-83 respectively was performed by heating the pyrimidine in a 1: 1 mixture of acetic anhydride and triethyl orthoformate [C. Temple, C. L. Kussner and J. A. Montgomery, J. Med. Chem., 1962, 5, 866-870]. However, pyrimidines 74 and 77, both substituted with a hydroxyethyl chain, gave a complex mixture of products that appeared to contain the desired product along with the cyclization reaction intermediates.

Tabela 23: Reduções de Ditionita de Compostos Nitrosos 65 - 71, e Forma- cao de Purina (1a parte)Table 23: Dithionite Reductions of Nitrous Compounds 65 - 71, and Purine Formation (Part 1)

<table>table see original document page 127</column></row><table><table> table see original document page 127 </column> </row> <table>

Tabela 23: (2- parte)Table 23: (2-part)

<table>table see original document page 127</column></row><table> <table>table see original document page 128</column></row><table><table> table see original document page 127 </column> </row> <table> <table> table see original document page 128 </column> </row> <table>

De um modo similar ao usado para as aminas primárias, 56 foi tratado primeiro com as aminas secundárias, então o mesmo protocolo como antes foi seguido. Os resultados estão resumidos na TABELA 24.Similar to that used for primary amines, 56 was first treated with secondary amines, then the same protocol as before. The results are summarized in TABLE 24.

Tabela 24: Reação de 56 com Aminas Secundárias, Tentado Nitrosação e Segundos Deslocamentos com Aminas Primárias sob Condições ForçosasTable 24: 56 Reaction with Secondary Amines, Nitrous Tried and Secondary Displacements with Primary Amines under Forced Conditions

<table>table see original document page 128</column></row><table> <table>table see original document page 129</column></row><table><table> table see original document page 128 </column> </row> <table> <table> table see original document page 129 </column> </row> <table>

Tabela 24: (2ê parte)Table 24: (2nd part)

<table>table see original document page 129</column></row><table> <table>table see original document page 130</column></row><table><table> table see original document page 129 </column> </row> <table> <table> table see original document page 130 </column> </row> <table>

a Obtido de 57 através de fusãoa Obtained from 57 by fusion

b Obtido de 58 através de fusão d Obtido de 59 através de fusãob Obtained from 58 by fusion d Obtained from 59 by fusion

Nitrozação das quatro aminas terciárias 84-87 falhou, a reação do mecanismo requerendo uma amina secundária para formar um interme- diário de N-nitroso descarregado para a reação ocorrer com nitrozação na posição orto [J. H. Boyer em The Chemistry of the Nitro and Nitroso Groups, H. Feuer (ed.), John Wiley and Sons (Nova Iorque), 1969, pág. 223-225]. As aminas terciárias favorecem nitrozação direta na posição para que é desati- vada para substituição eletrofílica nestes circunstâncias [R. G. Coombes em Comprehensive Oroganic Chemistry, D. Barton e W. D. Ollis (eds.), Perga- mon Press (Oxford), 1979, págs. 308-309]. Desse modo, condições forçosas foram empregadas para introduzir as aminas primárias diretamente sobre os produtos 84-87, com graus variados de sucesso, como resumido na TABELA 24. Aminação direta do derivado de fenilalaninila 60 foi também com suces- so com pirrolidina e dimetilamina usando estas condições, para fornecer os produtos bisaminados respectivamente 100 e 101.Nitrozation of the four tertiary amines 84-87 failed, the reaction of the mechanism requiring a secondary amine to form a discharged N-nitrous intermediate for the reaction to occur with ortho nitrogenation [J. H. Boyer in The Chemistry of the Nitro and Nitrous Groups, H. Feuer (ed.), John Wiley and Sons (New York), 1969, p. 223-225]. Tertiary amines favor direct nitrogen in the position to which it is disabled for electrophilic substitution under these circumstances [R. G. Coombes in Comprehensive Oroganic Chemistry, D. Barton and W. D. Ollis (eds.), Pergamon Press (Oxford), 1979, p. 308-309]. Thus, stringent conditions were employed to introduce the primary amines directly onto products 84-87, with varying degrees of success, as summarized in TABLE 24. Direct amination of phenylalaninyl derivative 60 was also successful with pyrrolidine and dimethylamine using these conditions, to provide the bisaminated products 100 and 101 respectively.

<formula>formula see original document page 130</formula><formula> formula see original document page 130 </formula>

Para usar o derivado de 2-aminopiridina 99, foi nitrado ao invés de fornecer 102. Embora pudesse ser reduzido usando níquel de Raney, o produto provou instável e rapidamente decomposto.To use the 2-aminopyridine derivative 99, it was nitrated rather than providing 102. Although it could be reduced using Raney nickel, the product proved unstable and rapidly decomposed.

Bromação das diaminas 89-96 foi realizada em diclorometano com um excesso leve de bromo, e forneceu bromopirimidinas 103-110 (TA- BELA 25). Os brometos 105 e 108 foram submetidos em condições de ami- nação de Ullmann usando iodeto cuproso anidro em um excesso da amina para ser usado para inserção, todos dissolvidos em N,N-dimetiletanolamina (um solvente de quelação) contendo hidrato de fosfato de potássio como uma base [F. Y. Kwong e S. L. Buchwald1 Org. Letters, 2003, 5, 793-796, J. P. Wolfe, S. Wagaw, J.- F. Marcoux e S. L. Buchwald, Acc. Chem. Res., 1998, 31, 805-818]. As misturas foram aquecidas para 100°C sob atmosfera inerte por 18h. Das aminas testadas neste deslocamento, apenas benzilami- na teve êxito, fornecendo triaminopirimidinas 111 e 112.Bromination of the 89-96 diamines was performed in dichloromethane with a slight excess of bromine, and provided bromopyrimidines 103-110 (TA-BELA 25). Bromides 105 and 108 were subjected to Ullmann amination conditions using anhydrous cuprous iodide in an excess of amine to be used for insertion, all dissolved in N, N-dimethylethanolamine (a chelation solvent) containing potassium phosphate hydrate. as a base [F. Y. Kwong and S. L. Buchwald Org. Letters, 2003, 5, 793-796, J. P. Wolfe, S. Wagaw, J.-F. Marcoux and S. L. Buchwald, Acc. Chem. Res., 1998, 31, 805-818]. The mixtures were heated to 100 ° C under inert atmosphere for 18h. Of the amines tested at this displacement, only benzylamine was successful, providing triamminopyrimidines 111 and 112.

Tabela 25: Derivatisação de Pirimidinas 4,6-diaminadas 89-96. (1g parte)Table 25: Derivatisation of 4,6-diaminated Pyrimidines 89-96. (1g part)

<table>table see original document page 131</column></row><table> Tabela 25: (2ê parte)<table> table see original document page 131 </column> </row> <table> Table 25: (2nd part)

<table>table see original document page 132</column></row><table><table> table see original document page 132 </column> </row> <table>

Imidazo[1,2-a]piridinas (V, X, Y = CH, R1=H)Imidazo [1,2-a] pyridines (V, X, Y = CH, R 1 = H)

Imidazopiridinas, imidazopirazinas e imidazopirimidinas receberam atenção significativa da indústria farmacêutica devido a suas atividades biológicas interessantes exibidas em uma faixa vasta de classes terapêuticas [A. R. Katritzky, Y.- J Xu e H. Tu, J. Org. Chem., 2003, 68, 4935]. Enquanto houver várias rotas sintéticas para o sistema de anel de imidazo[1,2-a]piridina, o método mais comum envolve o acoplamento de 2-aminopiridinas com com- postos de σ-halocarbonila. Em uma investigação inicial, imidazopiridinas 113 e 114 foram respectivamente preparadas de 2-aminopiridina através de rea- ção com fenacilbrometo e p-bromofenacilbrometo.Imidazopyridines, imidazopyrazines and imidazopyrimidines have received significant attention from the pharmaceutical industry due to their interesting biological activities exhibited in a wide range of therapeutic classes [A. R. Katritzky, Y.-J Xu and H. Tu, J. Org. Chem., 2003, 68, 4935]. While there are several synthetic routes to the imidazo [1,2-a] pyridine ring system, the most common method involves coupling 2-aminopyridines with σ-halocarbonyl compounds. In an initial investigation, imidazopyridines 113 and 114 were respectively prepared from 2-aminopyridine by reaction with fenacylbromide and p-bromophenacylbromide.

<formula>formula see original document page 132</formula><formula> formula see original document page 132 </formula>

Um método mais versátil usa um acoplamento de três compo- nentes (3CC) [a) C. Blackburn, B., Guan, P., Fleming, K., Shiosaki e S. Tsai, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 3635; b) C. Blackburn, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5469; c) C. Blackburn e Β. Guan1 Tetrahedron Lett., 2000, 41, 1495] en- volvendo a condensação de aldeídos, 2-aminopiridina e isocianetos (ES- QUEMA 9).A more versatile method uses a three-component coupling (3CC) [a) C. Blackburn, B., Guan, P., Fleming, K., Shiosaki and S. Tsai, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 3635 ; b) C. Blackburn, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5469; c) C. Blackburn and Β. Guan Tetrahedron Lett., 2000, 41, 1495] involving the condensation of aldehydes, 2-aminopyridine and isocyanides (ES-CHEMA 9).

Esquema 9Scheme 9

A reação de 3CC é realizada na presença de um catalisador de ácido, usualmente triflato de escândio(lll) [a) C. Blackbum, B., Guan, P., Fle- ming, K., Shiosaki e S. Tsai, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 3635; b) C. Black- bum, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5469; c) C. Blackbum e B. Guan, Tetrahe- dron Lett., 2000, 41, 1495; d) S. M. Ireland, H., Tye e M. Whittaker, Tetrahe- dron Lett., 2003, 44, 4369; e) G. S. Mandair, M., Light, A., Russell, M., Hurs- thouse e M. Bradley, Tetrahedron Lett., 2002, 43, 4267], embora ácido glioxí- Iico de excesso [M. A. Lyon e T. S. Kercher, Org. Lett., 2004, 6, 4989] ou argila de montmorilonita [R. S. Varma e D. Kumar, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 7665] sejam também usados. O catalisador de ácido facilita a primeira etapa no 3CC, formação de imina. Reações puderam tipicamente ser feitas em temperatura ambiente em períodos longos de tempo (48 h) usando a- quecimento convencional ou em reatores de microonda.The 3CC reaction is carried out in the presence of an acid catalyst, usually scandium triflate (III) [a) C. Blackbum, B., Guan, P., Flaming, K., Shiosaki and S. Tsai, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 3635; b) C. Blackbum, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5469; c) C. Blackbum and B. Guan, Tetrahedron Lett., 2000, 41, 1495; d) S.M. Ireland, H., Tye and M. Whittaker, Tetrahedron Lett., 2003, 44, 4369; e) G.S. Mandair, M., Light, A., Russell, M., Hursthouse and M. Bradley, Tetrahedron Lett., 2002, 43, 4267], although excess glyoxylic acid [M. A. Lyon and T. S. Kercher, Org. Lett., 2004, 6, 4989] or montmorillonite clay [R. S. Varma and D. Kumar, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 7665] are also used. The acid catalyst facilitates the first step in 3CC, imine formation. Reactions could typically be performed at room temperature over long periods of time (48 h) using conventional heating or in microwave reactors.

Várias imidazo[1,2-a]piridinas 115-131 foram preparadas de 2- aminopiridina usando cloreto de zinco ou argila de montmorilonita K10 como o catalisador. Estes resultados estão resumidos na TABELA 26.Several imidazo [1,2-a] pyridines 115-131 were prepared from 2-aminopyridine using zinc chloride or montmorillonite K10 clay as the catalyst. These results are summarized in TABLE 26.

Tabela 26: REAÇÃO DE 3CC DE 2-AMINOPIRIDINA (1g parte)Table 26: 2-Aminopyridine 3CC REACTION (1g part)

<table>table see original document page 133</column></row><table> <table>table see original document page 134</column></row><table><table> table see original document page 133 </column> </row> <table> <table> table see original document page 134 </column> </row> <table>

Tabela 26: Í2â parte)Table 26: Part 2)

<table>table see original document page 134</column></row><table> <table>table see original document page 135</column></row><table><table> table see original document page 134 </column> </row> <table> <table> table see original document page 135 </column> </row> <table>

a Montmorilonita K10, refluxo, 5hto Montmorillonite K10, reflux, 5h

b ZnCl2, microonda, 2hb ZnCl2, microwave, 2h

c Montmorilonita K10, microonda, 2hc Montmorillonite K10, microwave, 2h

Sistemas Bicíclicos 6.6-Fundidos6.6-Fused Bicyclic Systems

Um conjunto pequeno de sistemas bicíclicos 6,6-fundidos com base na condensação de sistemas de 1,2-dicarbonila com diaminas 1, 2 e 13 foi alvejado, especificamente usando glioxal (fornecendo 132-134) [Η. B. Gil- lespie, F. Spano e S. Graff, J. Org. Chem., 1960, 25, 942-944; L. G. Frõlich et. al., J. Med. Chem., 1999, 42, 4108-4121] e sal de sódio de oxalacetato de dietila (fornecendo 135-137) [D. Farquhar e T. L. Loo, J. Med. Chem., 1972, 15, 567-568] como o componente de dicarbonila (TABELA 27). As reações com base em 1 provaram não singularmente cooperativas, principalmente devido ao contato pobre entre os reagentes, enquanto a triamina 2 forneceu triciclo interessante 133 em glioxal de excesso.A small set of 6,6-fused bicyclic systems based on condensation of 1,2-dicarbonyl systems with diameters 1, 2 and 13 was targeted, specifically using glyoxal (providing 132-134) [Η. B. Gilvespie, F. Spano and S. Graff, J. Org. Chem., 1960, 25, 942-944; L. G. Frolich et. al., J. Med. Chem., 1999, 42, 4108-4121] and diethyl oxalacetate sodium salt (providing 135-137) [D. Farquhar and T.L. Loo, J. Med. Chem., 1972, 15, 567-568] as the dicarbonyl component (TABLE 27). Reactions based on 1 proved not uniquely cooperative, mainly due to poor contact between reagents, while triamine 2 provided interesting tricyclic 133 in excess glyoxal.

Tabela 27: Formação de Quinoxalinas e Pteridinas Usando Glioxal ou Oxa- acetato de Dietila (1a parte)Table 27: Formation of Quinoxaline and Pteridines Using Glyoxal or Diethyl Oxacetate (Part 1)

<table>table see original document page 135</column></row><table><table> table see original document page 135 </column> </row> <table>

Tabela 27: (2ã parte) <table>table see original document page 136</column></row><table>Table 27: (2nd part) <table> table see original document page 136 </column> </row> <table>

aObtido como uma mistura do quinoxalina e o iminodiéster de intermediárioaObtained as a mixture of quinoxaline and intermediate iminodiester

Sistemas 6.6-Bicíclicos6.6-Bicyclic Systems

Para alvejar derivados de pirimidina de natureza não-aromática tendo uma rede de ligação de hidrogênio estendida, a reação de três- componentes primeiro descrita por Biginelli para preparar 3,4-diidropirimidin- 2(1H)-onas foi usada [J. C. Bussolari e P. A. McDonneII, J. Org. Chem., 2000, 65, 6777, e referências dentro deesta]. Esta reação de multicompo- nentes consistiu na reação de condensação de um aldeído aromático, uréia, e acetoacetato de etila em uma solução etanólica acídica produzindo pirimi- donas altamente funcionalizadas. Uma modificação da reação de Biginelli, relacionada a Bussolari e McDonneII, usando sal de sódio de oxalacetato de dietila com uréia, vários aldeídos e ácido trifluoroacético em 1,2-dicloroetano anidro foi usada, fornecendo pirimidonas 138-141 (TABELA 28).To target non-aromatic pyrimidine derivatives having an extended hydrogen bonding network, the three-component reaction first described by Biginelli to prepare 3,4-dihydropyrimidin-2 (1H) -ones was used [J. C. Bussolari and P. A. McDonneII, J. Org. Chem., 2000, 65, 6777, and references herein. This multicomponent reaction consisted of the condensation reaction of an aromatic aldehyde, urea, and ethyl acetoacetate in an acidic ethanolic solution yielding highly functionalized pyrimidines. A modification of Biginelli's reaction, related to Bussolari and McDonneII, using diethyl oxalacetate sodium salt with urea, various aldehydes and trifluoroacetic acid in anhydrous 1,2-dichloroethane was provided, providing pyrimidones 138-141 (TABLE 28).

Tabela 28: Ciclocondensaçãos de Sal de Sódio de Oxalacetato de Dietila e Hidrólise de 138Table 28: Cyclocondensations of Diethyl Oxalacetate Sodium Salt and Hydrolysis of 138

<table>table see original document page 136</column></row><table> <table>table see original document page 137</column></row><table><table> table see original document page 136 </column> </row> <table> <table> table see original document page 137 </column> </row> <table>

A hidrólise induzida por hidróxido dos ésteres de etila de 138 foi realizada por tratamento de uma suspensão de 138 em etanol absoluto com uma solução de hidróxido de potássio em etanol absoluto, fornecendo a pi- rimidinona desidratada 142.The hydroxide-induced hydrolysis of the 138 ethyl esters was performed by treating a suspension of 138 in absolute ethanol with a solution of potassium hydroxide in absolute ethanol to provide dehydrated pyrimidinone 142.

Adenosinas com Capacidade de Coordenação de MetalAdenosines with Metal Coordinating Capability

Em base mecanística e projeções estruturais sobre a natureza de transferência de fosforila de ATP para ácido glutâmico na forma adenilila- da de glutamina sintetase, foi proposto que a proximidade do metal a C-8 da adenina pudesse melhor ser modelada mediante a incorporação de um sítio de ligação de metal nesta região de moléculas potencialmente inibidoras. Foi proposto que um substituinte contendo dois ou mais heteroátomos proxi- mais, por exemplo uma metade de morfolino, nesta posição pudesse satisfa- zer o papel do sítio de coordenação e colocar um segundo heteroátomo em uma região de espaço que poderia ser um análogo ao ocupado pela cadeia principal de fosfato pseudo-cíclico do complexo de ATP. O íon de metal en- capsulado neste complexo depois poderá adquirir água ou dióxido de carbo- no (em forma hidratada) para completar a esfera de coordenação - presumi- velmente de uma maneira similar à ATP de origem.On a mechanistic basis and structural projections on the nature of the transfer of phosphorylate from ATP to glutamic acid in the adenylylated form of glutamine synthetase, it was proposed that the proximity of the adenine C-8 metal could be better modeled by incorporating a site of metal binding in this region of potentially inhibitory molecules. It has been proposed that a substituent containing two or more near heteroatoms, for example a morpholino half, at this position could satisfy the role of the coordinating site and place a second heteroatom in a region of space that could be analogous to the one occupied. by the pseudo-cyclic phosphate backbone of the ATP complex. The metal ion encapsulated in this complex can then acquire water or carbon dioxide (in hydrated form) to complete the coordination sphere - presumably in a similar way to the original ATP.

A síntese das espécies requeridas foi alçancada através de bromação de adenosina 143 (solução de água de bromo) para dar 8- bromoadenosina 144, seguido por proteção como o acetal de 2',3'- /sopropilideno 145 usando uma mistura de 2,2-dimetoxipropano e acetona (volumes iguais) e cinco equivalentes de ácido toluenossulfônico (ESQUE- MA 10). O haleto foi deslocado em um solvente de 1,4-dioxano utilizando irradiação de microonda na presença de morfolina de excesso, fornecendo 146. Desproteção prosseguiu em tetraidrofurano e ácido clorídrico concen- trado em temperatura ambiente para gerar as espécies 147 requeridas que foram submetidas à cromatografia líquida preparativa para obter uma amos- tra autêntica [T. Sasaki, K. Minamoto e H, Itoh, J. Org. Chem., 1978, 43, 2320-2325].Synthesis of the required species was accomplished by brominating adenosine 143 (bromine water solution) to give 8-bromoadenosine 144, followed by protection such as 2 ', 3'- / sopropylidene acetal 145 using a mixture of 2.2 dimethoxypropane and acetone (equal volumes) and five equivalents of toluenesulfonic acid (SCHEMA 10). The halide was displaced in a 1,4-dioxane solvent using microwave irradiation in the presence of excess morpholine, providing 146. Deprotection proceeded to tetrahydrofuran and concentrated hydrochloric acid at room temperature to generate the required species which were subjected to preparative liquid chromatography to obtain an authentic sample [T. Sasaki, K. Minamoto and H, Itoh, J. Org. Chem., 1978, 43, 2320-2325].

<formula>formula see original document page 138</formula><formula> formula see original document page 138 </formula>

Esquema 10Figure 10

Um protocolo similar poderia ser usado para incorporar substitu- intes alternativos na posição 8 para modificar tanto as características espa- ciais como ligantes.A similar protocol could be used to incorporate alternative substituents at position 8 to modify both spatial and ligand characteristics.

Materiais e Métodos para Protocolos SintéticosMaterials and Methods for Synthetic Protocols

Todos os materiais de partida usados comercialmente foram ob- tidos e usados como obtidos do provedor sem outra purificação.All commercially used starting materials were obtained and used as obtained from the supplier without further purification.

Cromatografia de coluna foi executada usando Kiesel gel 60 de Merck (tamanho de partícula 0,040 - 0,063 mm), enquanto cromatografia de camada fina foi feita em sílica-gel 60 suportado em alumínio de Merck F254.Column chromatography was performed using Merck Kiesel gel 60 (particle size 0.040 - 0.063 mm), while thin layer chromatography was performed on Merck F254 aluminum supported silica gel 60.

Os espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro de RMN Varian Gemini 200 operando a 200 MHz. Dados de deslocamento químico são registrados em ppm, e constantes de acoplamento são citados em Hertz.NMR spectra were recorded on a Varian Gemini 200 NMR spectrometer operating at 200 MHz. Chemical displacement data are recorded in ppm, and coupling constants are cited in Hertz.

Os dados de HPLC foram registrados em um sistema de Croma- tografia Líquida de Waters usando um detector de UV/VIS Varian 9050 ope- rando a 254 nm. Todas as separações foram feitas usando uma coluna de C-18(2) de 5 μ de 150 mm χ 4,60 mm de Fenomenex® Luna™ usando um sistema de elução isocrático. Solventes usados foram misturas de metanol e 25 mM de tampão de acetato de amônio aquoso em pH 4 como indicado, eluindo a uma taxa de fluxo de 1 cm3/min.HPLC data were recorded on a Waters Liquid Chromatography system using a Varian 9050 UV / VIS detector operating at 254 nm. All separations were made using a 150 µ χ 4.60 mm 5 μ C-18 (2) column of Fenomenex® Luna ™ using an isocratic elution system. Solvents used were mixtures of methanol and 25 mM aqueous ammonium acetate buffer at pH 4 as indicated, eluting at a flow rate of 1 cm 3 / min.

Processamento padrão refere-se à extração com um solvente orgânico, seguido secando com sulfato de magnésio, e destilação a vácuo do solvente em um evaporador rotativo.Standard processing refers to extraction with an organic solvent, followed by drying with magnesium sulfate, and vacuum distillation of the solvent on a rotary evaporator.

Pontos de fundição foram registrados em uma Chapa Aquecedo- ra de Reichert e não são corrigidos.Melting points were recorded on a Reichert Warming Plate and are uncorrected.

4,6-Diaminopirimidino-2-Tiol (3)4,6-Diaminopyrimidine-2-Thiol (3)

Metal de sódio (1,8 g, 0,078 mol) foi dissolvido em etanol absolu- to (40 cm3) sob atmosfera de nitrogênio. A este foi adicionada tiouréia (6,0 g, 0,079 mol) seguido por malononitrila (5,0 g, 0,076 mol). A mistura heterogê- nea resultante foi aquecida a refluxo por 2h e depois deixada esfriar para temperatura ambiente. Água (120 cm3) foi adicionada para facilitar dissolu- ção completa, e a mistura homogênea foi neutralizada com ácido acético glacial (para pH 6,0). A mistura foi esfriada para OeC e filtrada. O produto colhido foi secado sob vácuo para fornecer 4,6-diaminopirimidino-2-tiol 3 (7,80g, 69 %). <5h (200 MHz, Gf6-DMSO) 5,01 (1H, s, H-6), 6,4-6,7, (4H, br s, NH2); mp > 2809C.Sodium metal (1.8 g, 0.078 mol) was dissolved in absolute ethanol (40 cm3) under a nitrogen atmosphere. To this was added thiourea (6.0 g, 0.079 mol) followed by malononitrile (5.0 g, 0.076 mol). The resulting heterogeneous mixture was refluxed for 2h and then allowed to cool to room temperature. Water (120 cm3) was added to facilitate complete dissolution, and the homogeneous mixture was neutralized with glacial acetic acid (to pH 6.0). The mixture was cooled to 0 ° C and filtered. The harvested product was dried under vacuum to afford 4,6-diaminopyrimidine-2-thiol 3 (7.80g, 69%). δ 5h (200 MHz, Gf6-DMSO) 5.01 (1H, s, H-6), 6.4-6.7, (4H, br s, NH2); mp> 2809C.

Cloridrato de 4,6-diaminopirimidina (4)4,6-Diaminopyrimidine Hydrochloride (4)

4,6-Diaminopirimidino-2-tiol 3 (4,10 g, 0,029 mol) foi dissolvido em 2M de hidróxido de sódio aquoso (18 cm3) e esfriado para 10eC em um banho de gelo. Peróxido de hidrogênio aquoso (3 %, 62 cm3) foi adicionado a gotas com agitação a uma tal taxa a manter a temperatura abaixo de 15gC. Após adição completa (aprox. 20 min) a reação foi agitada por um adicional de 30 minutos sem esfriar. A mistura de reação ficou opaca durante este tempo, e foi depois acidificada para pH 4,0 com ácido acético glacial. A pas- ta resultante foi esfriada e o produto colhido através de filtração e secado sob vácuo para fornecer ácido 4,6-diaminopirimidino-2-sulfínico (3,48 g, 69 %), mp. 164-1709C (lit. 168-1709C). O ácido (3,40 g, 0,020 mol) foi adiciona- do em etano seco saturado a 59C com gás de cloreto de hidrogênio, e a mis- tura resultante agitada em temperatura ambiente por 30 min durante cujo tempo uma pasta grossa formou-se. Após formação desta pasta, a mistura foi esfriada para O9C e deixada agitar por 1h. O produto foi separado através de filtração, lavado com éter dietílico e secado sob vácuo para fornecer 2,78 g (97 %) de cloridrato de 4,6-diaminopirimidina 4, <5H (200 MHz, cfe- DMSO) 5,60 (1H, s, H-5), 7,40-7,81, (4H, br s, NH2), 8,20 (1H, s, H-2); mp. 194-196eC (lit. 196-1989C).4,6-Diaminopyrimidine-2-thiol 3 (4.10 g, 0.029 mol) was dissolved in 2M aqueous sodium hydroxide (18 cm 3) and cooled to 10 ° C in an ice bath. Aqueous hydrogen peroxide (3%, 62 cm3) was added dropwise with stirring at such a rate to keep the temperature below 15 ° C. After complete addition (approx. 20 min) the reaction was stirred for an additional 30 minutes without cooling. The reaction mixture was opaque during this time, and was then acidified to pH 4.0 with glacial acetic acid. The resulting pasture was cooled and the product collected by filtration and dried under vacuum to provide 4,6-diaminopyrimidine-2-sulfinic acid (3.48 g, 69%), mp. 164-170 ° C (lit. 168-170 ° C). The acid (3.40 g, 0.020 mol) was added in dry ethane saturated at 59 ° C with hydrogen chloride gas, and the resulting mixture stirred at room temperature for 30 min during which time a thick paste formed. . After formation of this paste, the mixture was cooled to 0 ° C and allowed to stir for 1h. The product was filtered off, washed with diethyl ether and dried under vacuum to provide 2.78 g (97%) of 4,6-diaminopyrimidine hydrochloride 4, <5H (200 MHz, cfe-DMSO) 5.60 ( 1H, s, H-5), 7.40-7.81, (4H, br s, NH 2), 8.20 (1H, s, H-2); mp 194-196 ° C (lit. 196-1989 ° C).

PREPARAÇÃO ALTERNATIVA DE 4,6-DIAMINOPIRIMIDINA (4)ALTERNATIVE PREPARATION OF 4,6-DIAMINOPYRIMIDINE (4)

4,6-Diamino-2-mercaptopirimidina 3 (24,85 g, 0,18 mol) foi sus- pensa em 5 % de amônia aquosa (1,2 L) e aquecida para 85gC para facilitar a dissolução. Níquel de Raney (50 g de pasta úmida) foi adicionado cautelo- samente em porções à mistura quente por 10 minutos. A mistura resultante foi aquecida a refluxo por 1h. A mistura de reação quente foi filtrada e o bolo de filtro lavado com água quente (200 cm3). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer 4,6-diaminopirimidina 4 (15,9 g, 83 %). δΗ (200 MHz, D2O) 7,82 (1H, s, H-2) e 5,55 (1H, s, H-5). <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 159,6 (C-4 e C-6), 149,9 (C-2) e 81,2 (C-5).4,6-Diamino-2-mercaptopyrimidine 3 (24.85 g, 0.18 mol) was suspended in 5% aqueous ammonia (1.2 L) and heated to 85 ° C to facilitate dissolution. Raney nickel (50 g wet paste) was cautiously added portionwise to the hot mixture for 10 minutes. The resulting mixture was heated at reflux for 1h. The hot reaction mixture was filtered and the filter cake washed with hot water (200 cm3). The filtrate was concentrated under reduced pressure to afford 4,6-diaminopyrimidine 4 (15.9 g, 83%). δΗ (200 MHz, D 2 O) 7.82 (1H, s, H-2) and 5.55 (1H, s, H-5). Δ C (50 MHz, cfe-DMSO) 159.6 (C-4 and C-6), 149.9 (C-2) and 81.2 (C-5).

HIDROGENOSSULFATO DE 4,5,6-TRIAMINOPIRIMIDINA (5)4,5,6-TRIAMINOPYRIMIDINE HYDROGENOSULFATE (5)

4,6-Diaminopirimidina 4 (15,90 g, 0,14 mol) foi suspensa em áci- do clorídrico aquoso (1M, 500 cm3) e esfriada para 2eC. Uma solução aquo- sa de nitrito de sódio (14,90 g, 0,22 mol) em água (35 cm3) foi adicionada a gotas à solução esfriada a uma tal taxa para manter a temperatura de rea- ção abaixo de 4eC (30 minutos nesta escala). A mistura foi deixada aquecer para temperatura ambiente em um período de 1h. Após este tempo, a mistu- ra de verde-marrom foi neutralizada para um pH de 7,0 com bicarbonato de sódio, adicionado como um sólido em porções. O precipitado azul-verde que se formou foi separado por filtração, mas não secado completamente. O composto nitroso instável foi empastado imediatamente em água (220 cm3) e tratado com ditionita de sódio (52,80 g, 0,25 mol) que foi adicionado em porções em temperatura ambiente. A mistura amarela foi tratada com 50 % de ácido sulfúrico aquoso (150 cm3, 1,4 mol) e aquecida para 80QC por 3 minutos, então esfriada para temperatura ambiente em um banho de gelo.4,6-Diaminopyrimidine 4 (15.90 g, 0.14 mol) was suspended in aqueous hydrochloric acid (1M, 500 cm3) and cooled to 2 ° C. An aqueous solution of sodium nitrite (14.90 g, 0.22 mol) in water (35 cm3) was added dropwise to the cooled solution at such a rate to keep the reaction temperature below 4 ° C (30 ° C). minutes on this scale). The mixture was allowed to warm to room temperature over a period of 1h. After this time, the brown-green mixture was neutralized to pH 7.0 with sodium bicarbonate, added as a portioned solid. The blue-green precipitate that formed was filtered off but not completely dried. The unstable nitrous compound was immediately slurried in water (220 cm3) and treated with sodium dithionite (52.80 g, 0.25 mol) which was added portionwise at room temperature. The yellow mixture was treated with 50% aqueous sulfuric acid (150 cm 3, 1.4 mol) and heated to 80 ° C for 3 minutes, then cooled to room temperature in an ice bath.

O precipitado que se formou foi separado por filtração e lavado com etanol aquoso (30 cm3) e secado para fornecer hidrogenossuIfato de 4,5,6- triaminopirimidina 5 (23,0 g, 71 %). δΗ (200 MHz, D2O) 7,61 (1H, s, H-2); <5C (50 MHz, de-DMSO) 148,1 (C-4 e C-6), 140,4 (C-2) e 105,9 (C-5). A amina livre poderia ser preparada dissolvendo o sal de sulfato de hidrogênio em um mínimo de 2M de hidróxido de sódio aquoso quente. A amina livre precipita ao esfriar, e pode ser recristalizada de água. 4-AMINO-6-HIDRÓXI-2-MERCAPTOPIRIMIDINA (7)The precipitate that formed was filtered off and washed with aqueous ethanol (30 cm 3) and dried to afford 4,5,6-triaminopyrimidine 5 hydrogen sulfate (23.0 g, 71%). δΗ (200 MHz, D 2 O) 7.61 (1H, s, H-2); ΔC (50 MHz, de-DMSO) 148.1 (C-4 and C-6), 140.4 (C-2) and 105.9 (C-5). The free amine could be prepared by dissolving the hydrogen sulfate salt in a minimum of 2M of hot aqueous sodium hydroxide. Free amine precipitates on cooling, and can be recrystallized from water. 4-AMINO-6-HYDROXY-2-MERCAPTOPYRIMIDINE (7)

Metal de sódio (4,60 g, 0,20 mol) foi dissolvido em etanol absolu- to (150 cm3) sob uma atmosfera de nitrogênio, e tratado com cianoacetato de etila (22,0 g, 0,19 mol) e tiouréia (16,0 g, 0,21 mol). A mistura resultante foi aquecida a refluxo sob uma atmosfera de nitrogênio por 2h. Após este tempo, a mistura foi esfriada para temperatura ambiente, e um precipitado branco formou-se, que foi filtrado. O bolo de filtro foi dissolvido em água (150 cm3) e acidificado para pH 4,0 com 50 % de ácido acético aquoso. O precipitado que se formou foi filtrado para render 4-amino-6-hidróxi-2- mercaptopirimidina 7 (28,0 g, 100 %) como um sólido branco, õh (200 MHz, D2O) 5,06 (1H, s, H-5); õc (50 MHz, D2O) 177,4 (C-6)a, 170,0 (C-2)a, 164,9 (C-4)a e 82,1 (C-5).Sodium metal (4.60 g, 0.20 mol) was dissolved in absolute ethanol (150 cm3) under a nitrogen atmosphere, and treated with ethyl cyanoacetate (22.0 g, 0.19 mol) and thiourea. (16.0 g, 0.21 mol). The resulting mixture was heated at reflux under a nitrogen atmosphere for 2h. After this time, the mixture was cooled to room temperature, and a white precipitate formed which was filtered. The filter cake was dissolved in water (150 cm 3) and acidified to pH 4.0 with 50% aqueous acetic acid. The precipitate that formed was filtered to yield 4-amino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidine 7 (28.0 g, 100%) as a white solid, δh (200 MHz, D 2 O) 5.06 (1H, s, H-5); δc (50 MHz, D 2 O) 177.4 (C-6) a, 170.0 (C-2) a, 164.9 (C-4) a and 82.1 (C-5).

4,5-DIAMINO-6-HIDRÓXI-2-MERCAPTOPIRIMIDINA (8)4,5-DIAMINO-6-HYDROXY-2-MERCAPTOPYRIMIDINE (8)

4-amino-6-hidróxi-2-mercapto-5-nitrosopirimidina 9 (17,60g, 0,10 mol) foi empastada em uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (400 cm3) e tratada com ditionita de sódio (42,7 g, 0,25 mol) que foi adicionada em porções por 10 minutos. A mistura amarela pálida foi deixada agitar a 5-C por 7h, e foi depois tratada com ácido acético (24 cm3). Um pre- cipitado branco começou a formar-se com tempo. O precipitado foi filtrado, lavado com etanol aquoso (30 cm3) e secado para fornecer a 4,5-diamino-6- hidróxi-2-mercaptopirimidina 8 (18,3 g, 100 %). õc (50 MHz1 D2O) 168,3 (C- 6)a, 158,7 (C-2)a, 142,3 (C-4)a e 103,1 (C-5). 4-AMINO-6-HIDRÓXI-2-MERCAPTO-5-NITROSOPIRIMIDINA (9)4-Amino-6-hydroxy-2-mercapto-5-nitrosopyrimidine 9 (17.60g, 0.10 mol) was slurried in a saturated aqueous sodium bicarbonate solution (400 cm3) and treated with sodium dithionite (42, 7 g, 0.25 mol) which was added portionwise over 10 minutes. The pale yellow mixture was allowed to stir at 5 ° C for 7h, and was then treated with acetic acid (24 cm 3). A white precipitate began to form over time. The precipitate was filtered, washed with aqueous ethanol (30 cm 3) and dried to afford 4,5-diamino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidine 8 (18.3 g, 100%). δc (50 MHz1 D 2 O) 168.3 (C-6) a, 158.7 (C-2) a, 142.3 (C-4) a and 103.1 (C-5). 4-AMINO-6-HYDROXY-2-MERCAPTO-5-NITROSOPYRIMIDINE (9)

4-amino-6-hidróxi-2-mercaptopirimidina 7 (16,80 g, 0,12 mol) foi suspensa em água (300 cm3) e tratada com ácido acético (60 cm3). A sus- pensão foi tratada com uma solução de nitrito de sódio (15,0 g, 0,22 mol) em água (35 cm3) que foi adicionado a gotas. A mistura laranja resultante foi deixada agitar para temperatura ambiente durante a noite. Após 16h, a mis- tura foi filtrada e o bolo de filtro lavado seqüencialmente com água (20 cm3) e etanol (20 cm3) e secado para render 4-amino-6-hidróxi-2-mercapto-5- nitrosopirimidina 9 (17,6 g, 87 %) como um tijolo sólido vermelho. O produto bruto foi usado em reações subseqüentes sem caracterização ou outra puri- ficação.4-Amino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidine 7 (16.80 g, 0.12 mol) was suspended in water (300 cm 3) and treated with acetic acid (60 cm 3). The suspension was treated with a solution of sodium nitrite (15.0 g, 0.22 mol) in water (35 cm 3) which was added dropwise. The resulting orange mixture was allowed to stir at room temperature overnight. After 16h, the mixture was filtered and the filter cake sequentially washed with water (20 cm3) and ethanol (20 cm3) and dried to yield 4-amino-6-hydroxy-2-mercapto-5-nitrosopyrimidine 9 (17 , 6 g, 87%) as a solid red brick. The crude product was used in subsequent reactions without characterization or other purification.

4,5-DIAMINO-6-HIDROXIPIRIMIDINA (10)4,5-DIAMINO-6-HYDROXYPYRIMIDINE (10)

4,5-Diamino-6-hidróxi-2-mercaptopirimidina 8 (16,20 g, 0,10 mol) foi dissolvida em 5 % de amônia aquosa (440 cm3) e tratada com níquel de Raney (45,3g de pasta úmida) que foi adicionado em porções em um perío- do de 5 minutos. A mistura resultante foi aquecida a refluxo por 1,5h. A mis- tura de reação quente foi filtrada e o filtrado concentrado sob pressão redu- zida para fornecer 4,5-diamino-6-hidroxipirimidina 10 (11,5g, 88 %). <5h (200 MHz, D2O) 7,54 (1H, s, H-2); <5C (50 MHz, D2O) 157,0 (C-6)a, 147,8 (C- 4)a, 138,7 (C-2)e 111,1 (C-5).4,5-Diamino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidine 8 (16.20 g, 0.10 mol) was dissolved in 5% aqueous ammonia (440 cm3) and treated with Raney nickel (45.3g wet paste). ) which was added in portions over a period of 5 minutes. The resulting mixture was refluxed for 1.5h. The hot reaction mixture was filtered and the filtrate concentrated under reduced pressure to afford 4,5-diamino-6-hydroxypyrimidine 10 (11.5g, 88%). Δ 5h (200 MHz, D 2 O) 7.54 (1H, s, H-2); Δ C (50 MHz, D 2 O) 157.0 (C-6) a, 147.8 (C-4) a, 138.7 (C-2) and 111.1 (C-5).

CLORIDRATO DE 5,6-DIAMINOURACILA (13)5,6-DIAMINOURACYL CHLORIDRATE (13)

Sódio (3,9 g, 0,17 mol) foi adicionado em pedaços pequenos a etanol absoluto (100 cm3) em um frasco de fundo redondo de multigargalos. Uma vez todo o sódio tinha desaparecido, cianoacetato de etila (9,8 g, 0,087 mol) e uréia (5,2 g, 0,087 mol) foram adicionados e a reação aquecida sob refluxo por 4h. A mistura de reação ficou bastante sólida nessa hora e água quente (100 cm3) foi adicionada para dissolver o material e a mistura foi aquecida para 80QC por 15 min. A reação foi neutralizada cuidadosamen- te com ácido acético glacial, ácido acético glacial adicional (7,5 cm3) foi adi- cionado e depois nitrito de sódio (6,5 g, 0,094 mol) em água (7 cm3). A solu- ção foi esfriada e o sólido rosa 12 removido através de filtração e lavado com água esfriada em gelo. Este material filtrado foi transferido de volta para o frasco original e água morna (40 cm3) foi adicionada. Enquanto agitando, esta pasta foi aquecida para 10OgC e ditionita de sódio sólido (aproximada- mente 20 g) foi adicionada até a cor vermelha do composto nitroso desapa- recesse. Poucos gramas adicionais de ditionita foram adicionados e aqueci- mento continuou por 15 min. A mistura foi deixada esfriar e o bissulfito de diaminouracila foi filtrado e lavado com água. Ao sal de bissulfito em um frasco cônico foi adicionado ácido clorídrico concentrado (20 cm3) e este foi aquecido em uma chapa elétrica com agitação durante 1h. Este foi filtrado e bem lavado com acetona pra fornecer cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 como um sólido cor de bronze (7,53 g, 49 %). õc (50 MHz, D20/Na0H) 96,0 (C-5), 158,0 (C-6), 159,3 (C-2) e 162,2 (C-4).Sodium (3.9 g, 0.17 mol) was added in small pieces to absolute ethanol (100 cm3) in a multi-neck round bottom flask. Once all sodium had disappeared, ethyl cyanoacetate (9.8 g, 0.087 mol) and urea (5.2 g, 0.087 mol) were added and the reaction heated under reflux for 4h. The reaction mixture became quite solid at this time and hot water (100 cm 3) was added to dissolve the material and the mixture was heated to 80 ° C for 15 min. The reaction was carefully neutralized with glacial acetic acid, additional glacial acetic acid (7.5 cm3) was added and then sodium nitrite (6.5 g, 0.094 mol) in water (7 cm3). The solution was cooled and the pink solid 12 removed by filtration and washed with ice-cold water. This filtered material was transferred back to the original flask and warm water (40 cm 3) was added. While stirring, this paste was heated to 100 ° C and solid sodium dithionite (approximately 20 g) was added until the red color of the nitrous compound disappeared. A few additional grams of dithionite were added and heating continued for 15 min. The mixture was allowed to cool and the diaminouracil bisulfite was filtered and washed with water. To the bisulfite salt in a conical flask was added concentrated hydrochloric acid (20 cm3) and it was heated on an electric plate with stirring for 1h. This was filtered and washed well with acetone to afford 5,6-diaminouracil hydrochloride 13 as a tan solid (7.53 g, 49%). δ (50 MHz, D 2 O / NaOH) 96.0 (C-5), 158.0 (C-6), 159.3 (C-2) and 162.2 (C-4).

6-AMINO-1,3-DIMETIL-5-NITROSOURACILA (15)6-AMINO-1,3-DIMETHYL-5-NITROSOURACYL (15)

6-amino-1,3-dimetiluracila 14 (5,0 g, 32 mmols) foi dissolvida em 50 % de ácido acético aquoso (150 cm3). Nitrito de sódio (4,4 g, 64 mmols) foi adicionado, dissolvido em água (20 cm3). A reação ficou púrpura brilhante quase imediatamente e foi agitada durante 1h em temperatura ambiente. A mistura foi esfriada e o precipitado foi colhido através de filtração e bem la- vado com água fria para render 6-amino-1,3-dimetil-5-nitrosouracila 15 como um sólido roxo luminoso (5,8 g, 98 %). <5H (200 MHz, CZ6-DMSO) 3,26 (3H, s, CH3N), 3,28 (3H, s, CH3N), 9,05 e 12,97(2H, 2 χ br s, NH2). SULFATO DE HIDROGÊNIO DE 5.6-DIAMINO-1,3-DIMETILURACILA (16)6-Amino-1,3-dimethyluracil 14 (5.0 g, 32 mmol) was dissolved in 50% aqueous acetic acid (150 cm 3). Sodium nitrite (4.4 g, 64 mmol) was added, dissolved in water (20 cm 3). The reaction turned bright purple almost immediately and was stirred for 1h at room temperature. The mixture was cooled and the precipitate was collected by filtration and washed well with cold water to yield 6-amino-1,3-dimethyl-5-nitrosouracil 15 as a luminous purple solid (5.8 g, 98%). . Δ 5H (200 MHz, CZ6-DMSO) 3.26 (3H, s, CH 3 N), 3.28 (3H, s, CH 3 N), 9.05 and 12.97 (2H, 2 χ br s, NH 2). 5.6-DIAMINO-1,3-DIMETHYLURECYL HYDROGEN SULFATE (16)

6-amino-1,3-dimetil-5-nitrosouracila 15 (3,5 g, 19 mmols) foi sus- penso em água morna e ditionita de sódio foi adicionada até que a cor roxa desaparecesse. Neste estágio, todo o material estava na solução. Água foi removida por evaporação até que uma pasta fosse obtida e o sólido foi filtra- do e lavado com água para fornecer hidrogenossuIfito de 5,6-diamino-1,3- dimetiluracila 16 como um sólido amarelo pálido (2,2 g, 46 %). <5H (200 MHz, de-DMSO) 3,14 (3H, s, CH3N), 3,30 (3H, s, CH3N), 3,36 (2H, br s, NH2) e 6,13 (2H, br s, NH2); <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 28,3 e 30,5 (2 χ CH3), 96,7 (C- 5), 145,6 (C-6), 150,5 (C-2) e 159,7 (C-4).6-Amino-1,3-dimethyl-5-nitrosouracil 15 (3.5 g, 19 mmol) was suspended in warm water and sodium dithionite was added until the purple color disappeared. At this stage all the material was in the solution. Water was removed by evaporation until a slurry was obtained and the solid was filtered off and washed with water to provide 5,6-diamino-1,3-dimethyluracil hydrogen sulfide 16 as a pale yellow solid (2.2 g, 46 %). Δ 5H (200 MHz, de-DMSO) 3.14 (3H, s, CH 3 N), 3.30 (3H, s, CH 3 N), 3.36 (2H, br s, NH 2) and 6.13 (2H, br s, NH 2); <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 28.3 and 30.5 (2 x CH3), 96.7 (C-5), 145.6 (C-6), 150.5 (C-2) and 159.7 (C-4).

MÉTODO GERAL PARA A CONDENSAÇÃO DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS PARA O-FENILENO-DIAMINA (1)GENERAL METHOD FOR CONDENSATION OF CARBOXYLIC ACIDS FOR PHENYLENE DIAMINE (1)

o-Fenilenodiamina 1 (1 eq.) e o ácido carboxílico requerido (1,2 eq.) foi introduzido em 2 cm3 de ácido fosfórico a 85 % em um frasco de fundo redondo sem um condensador. Esta mistura foi aquecida para 150- 200°C por um mínimo de 2h, usualmente 18h, fornecendo uma solução azul forte com o passar do tempo. A mistura quente é depois decantada em 100 cm3 de solução de carbonato de potássio aquosa saturada, fornecendo uma solução azul acima de pH 7, Invariavelmente, um volume equivalente de acetato de etila foi adicionado para extrair qualquer componente orgânico insolúvel em água. Procedimentos de processamentos individuais são como indicados abaixo.o-Phenylenediamine 1 (1 eq.) and the required carboxylic acid (1.2 eq.) were introduced into 2 cm3 of 85% phosphoric acid in a round bottom flask without a condenser. This mixture was heated to 150-200 ° C for a minimum of 2h, usually 18h, providing a strong blue solution over time. The hot mixture is then decanted into 100 cm3 of saturated aqueous potassium carbonate solution, providing a blue solution above pH 7. Invariably, an equivalent volume of ethyl acetate was added to extract any water insoluble organic component. Individual processing procedures are as indicated below.

(2S)-2-(1 H-BENZIMIDAZOL-2-il)PIRROLIDINO-1 -CARBOXILATO DE TERC-BUTILA (17)(2S) -2- (1H-BENZIMIDAZOL-2-yl) PYROLIDINE-1-TERC-BUTYL CARBOXYLATE (17)

o-Fenilenodiamina 1 (1,00 g, 9,21 mmols) e L-prolina (1,31 g, 11,35 mmols) foram tratados como esboçado no procedimento geral. A fase aquosa foi concentrada em uma pasta granular branca contendo placas vermelhas. A pasta branca foi dissolvida cuidadosamente com três porções de 10 cm3 de água fria, deixando para trás as placas. Esta foi dissolvida em 3:1 (v/v) metanokacetato de etila, qualquer sólido que resultou foi separado por filtração, e a solução vermelha concentrada em uma espuma vermelha. Este resíduo foi dissolvido em água (25 cm3, 0,4M) contendo hidróxido de sódio (1,36 g, 33,88 mmols) e pirocarbonato de di-íerc-butila (4,84 g, 22,19 mmols), e agitado durante 18h em temperatura ambiente. Extração com acetato de etila (2 x 25 cm3), secagem da camada orgânica (MgSO4) e concentração forneceram uma goma clara que triturou com 3:10 (v/v) aceta- to de etila:hexano para fornecer um pó branco fino, (2S)-2-(1H-benzimidazol- 2-il)-pirrolidino-1-carboxilato de terc-butila 17 (0,51 g, 19 % mais de 2 eta- pas). δΗ (200 MHz, CDCI3) 7,49-7,68 (2H, m, arila H-4 e H-7), 7,18-7,30 (2H, m, arila H-5 e H-6), 5,09-5,18 (1H, br dm, pirrol H-2, J 7,2), 3,36-3,57 (2H, br t, pirrol H-5), 2,98-3,21 (1H, br s, pirrol H-3a), 1,95-2,39 (3H, 2 x br m, pirrol H-3a e H-4) e 1,53 [9H, s, OC(CH3)3]; õc (50 MHz, CDCI3) 156,8 (NCO), 155,1 (benzimidazol C-2), 122,7 (arila C-4, C-5, C-6 e C-7), 115,5 (br s, arila quaternária C-3a e C-7a), 80,9 (pirrol C-2), 54,9 [OC(CH3)3], 47,6 (pirrol C-5), 28,8 [OC(CH3)3], 28,4 (pirrol C-3) e 25,2 (pirrol C-4). N-ACETIL-N-[(1-ACETIL-1 H-BENZIMIDAZ0L-2-IL)METIL]ACETAMIDA (18) Glicina (1,68 g, 22,08 mmols) e o-fenilenodiamina 1 (1,96 g, 18,11 mmols) foram tratadas como no procedimento geral por 18h. Após neutralização e adição de acetato de etila, a camada aquosa foi isolada e concentrada em uma goma bege. 0,31 g da goma foi tratado com 1:1 (v/v) anidrido acético em ácido acético (10 cm3) a 160SC por 18h. A solução foi decantada em 100 cm3 de solução de carbonato de potássio aquosa satura- da, extraída com acetato de etila (2 x 100 cm3), secada (MgSO4) e concen- trada em uma goma. Trituração desta em acetato de etila / hexano forneceu um pó branco, N-acetil-N-[(1-acetil-1H-benzimidazol-2-il)-metil]acetamida 18 (0,22 g, 4 %). δh (200 MHz, CDCI3) 7,29-7,80, 7,60-7,68 e 7,35-7,45 (4H, 3 x m, arila H), 5,38 (2H, s, CH2), 2,89 (3H, s, benzimidazol COCH3), 2,52 [6H, s, N(COCH3)2]; δC (50 MHz1 CDCI3) 173,4 [N(COCH3)2], 169,6 (benzimidazol COCH3), 152,8 (benzimidazol C-2), 143,1 (arila quaternária C-3a), 132,8 (ari- la quaternária C-7a), 125,1 e 124,8 (arila C-4 e C-7), 121,4 (arila C-6), 113,3 (arila C-5), 45,9 (CH2), 26,9 (benzimidazol COCH3) e 26,6 [N(COCH3)2].o-Phenylenediamine 1 (1.00 g, 9.21 mmol) and L-proline (1.31 g, 11.35 mmol) were treated as outlined in the general procedure. The aqueous phase was concentrated to a white granular paste containing red plates. The white paste was carefully dissolved with three 10 cm3 portions of cold water, leaving the plates behind. This was dissolved in 3: 1 (v / v) ethyl methanokacetate, any resulting solid was filtered off, and the red solution concentrated to a red foam. This residue was dissolved in water (25 cm 3, 0.4 M) containing sodium hydroxide (1.36 g, 33.88 mmol) and di-tert-butyl pyrocarbonate (4.84 g, 22.19 mmol), and stirred for 18h at room temperature. Extraction with ethyl acetate (2 x 25 cm3), drying of the organic layer (MgSO4) and concentration afforded a clear gum which was triturated with 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane to give a fine white powder, Tert-Butyl (2S) -2- (1H-benzimidazol-2-yl) -pyrrolidine-1-carboxylate 17 (0.51 g, 19% over 2 steps). δΗ (200 MHz, CDCl3) 7.49-7.68 (2H, m, aryl H-4 and H-7), 7.18-7.30 (2H, m, aryl H-5 and H-6) , 5.09-5.18 (1H, br dm, pyrrole H-2, J 7.2), 3.36-3.57 (2H, br t, pyrrole H-5), 2.98-3, 21 (1H, br s, pyrrole H-3a), 1.95-2.39 (3H, 2 x brm, pyrrole H-3a and H-4) and 1.53 [9H, s, OC (CH3) 3]; δc (50 MHz, CDCl3) 156.8 (NCO), 155.1 (C-2 benzimidazole), 122.7 (C-4 aryl, C-5, C-6 and C-7), 115.5 ( br s, C-3a and C-7a quaternary aryl), 80.9 (C-2 pyrrol), 54.9 [OC (CH3) 3], 47.6 (C-5 pyrrol), 28.8 [OC (CH 3) 3], 28.4 (pyrrole C-3) and 25.2 (pyrrole C-4). N-ACETIL-N - [(1-ACETIL-1 H-BENZIMIDAZOL-2-IL) METHYL] ACETAMIDE (18) Glycine (1.68 g, 22.08 mmols) and o-phenylenediamine 1 (1.96 g, 18.11 mmols) were treated as in the general procedure for 18h. After neutralization and addition of ethyl acetate, the aqueous layer was isolated and concentrated to a beige gum. 0.31 g of the gum was treated with 1: 1 (v / v) acetic anhydride in acetic acid (10 cm 3) at 160 ° C for 18h. The solution was decanted into 100 cm3 of saturated aqueous potassium carbonate solution, extracted with ethyl acetate (2 x 100 cm3), dried (MgSO4) and concentrated to a gum. Trituration of this in ethyl acetate / hexane provided a white powder, N-acetyl-N - [(1-acetyl-1H-benzimidazol-2-yl) methyl] acetamide 18 (0.22 g, 4%). δh (200 MHz, CDCl3) 7.29-7.80, 7.60-7.68 and 7.35-7.45 (4H, 3 xm, aryl H), 5.38 (2H, s, CH 2) 2.89 (3H, s, benzimidazole COCH 3), 2.52 [6H, s, N (COCH 3) 2]; δC (50 MHz1 CDCl3) 173.4 [N (COCH3) 2], 169.6 (benzimidazole COCH3), 152.8 (benzimidazole C-2), 143.1 (quaternary aryl C-3a), 132.8 ( quaternary aryl (C-7a), 125.1 and 124.8 (aryl C-4 and C-7), 121.4 (aryl C-6), 113.3 (aryl C-5), 45.9 (CH 2), 26.9 (benzimidazole COCH 3) and 26.6 [N (COCH 3) 2].

2-{[(TERC-BUTOXICARBONIL)AMINO]METIL}-1 H-BENZIMIDAZOL-1 - CARBOXILATO DE TERC-BUTILA (19)2 - {[(TERC-BUTOXICARBONYL) AMINO] METHAL} -1 H-BENZIMIDAZOL-1 - TERC-BUTYL CARBOXYLATE (19)

Uma porção da goma (1,04g) usada na preparação de 18 foi dissolvida em água (50 cm3) contendo hidróxido de sódio (4,51 g) e pirocar- bonato de diterc-butila (2,43 g, 11,14 mmols), e agitada durante 18h em temperatura ambiente. Extração com acetato de etila (2 x 25 cm3), secagem da camada orgânica (MgSO4) e concentração forneceram uma goma clara. Esta foi purificada através de cromatografia de coluna [1:10-1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] para fornecer um óleo amarelo pálido que se solidificou ao repousar em um sólido bege, 2-{[(ferc-butóxi- carbonil)amino]metil}-1H-benzimidazol-1-carboxilato de terc-butila 19 (1,20 g, 19 % com base em diamina de partida). δΗ (200 MHz, CDCI3) 7,92-7,98, 7,65-7,74 e 7,26-7,39 (4H, 3 x m, arila H), 5,85 (1H, br s, NH), 4,81 (2H, d, CH2, J 5,4), 1,73 [9H, s, benzimidazol OC(CH3)3] e 1,51 [9H, s, OC(CH3)3]. 2-(4-BROMOBUTIL)-1H-BENZIMIDAZOL (20)A portion of the gum (1.04g) used in the preparation of 18 was dissolved in water (50 cm3) containing sodium hydroxide (4.51 g) and diterc-butyl pyrocarbonate (2.43 g, 11.14 mmols). ), and stirred for 18h at room temperature. Extraction with ethyl acetate (2 x 25 cm3), drying of the organic layer (MgSO4) and concentration provided a clear gum. This was purified by column chromatography [1: 10-1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent] to afford a pale yellow oil which solidified upon standing on a beige solid, 2 - {[( tert-Butyl tert-butoxycarbonyl) amino] methyl} -1H-benzimidazol-1-carboxylate 19 (1.20 g, 19% based on starting diamine). δΗ (200 MHz, CDCl3) 7.92-7.98, 7.65-7.74 and 7.26-7.39 (4H, 3 xm, aryl H), 5.85 (1H, br s, NH ), 4.81 (2H, d, CH 2, J 5.4), 1.73 [9H, s, benzimidazole OC (CH 3) 3] and 1.51 [9H, s, OC (CH 3) 3]. 2- (4-BROMOBUTIL) -1H-BENZIMIDAZOL (20)

o-Fenilenodiamina 1 (1,00 g, 9,27 mmols) e ácido 5- bromovalérico (2,15 g, 11,85 mmols) foi colocado em um frasco de fundo redondo equipado com um condensador, e aquecido puro com agitação a 150°C durante 3h. O sólido roxo resultante foi esmagado e lavado com 10cm3 de acetato de etila para precipitar o pó roxo, 2-(4-bromobutil)-1H- benzimidazol 20 (1,28 g, 73 %). δΗ (200 MHz, CDCl3) 7,61-7,68 e 7,18-7,32 (4H, arila H), 6,26 (1H, br s, NH), 4,09 (2H, t, = CCH2, J 6,0), 3,11 (2H, t, CH2OH, J 6,3) e 1,95-2,22 [4H, m, (CH2)2CH2Br].o-Phenylenediamine 1 (1.00 g, 9.27 mmol) and 5-bromovaleric acid (2.15 g, 11.85 mmol) was placed in a round bottom flask equipped with a condenser, and heated neat with stirring at room temperature. 150 ° C for 3h. The resulting purple solid was crushed and washed with 10 cm @ 3 of ethyl acetate to precipitate the purple, 2- (4-bromobutyl) -1H-benzimidazole 20 powder (1.28 g, 73%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 7.61-7.68 and 7.18-7.32 (4H, aryl H), 6.26 (1H, br s, NH), 4.09 (2H, t, = CCH 2, J 6.0), 3.11 (2H, t, CH 2 OH, J 6.3) and 1.95-2.22 [4H, m, (CH 2) 2 CH 2 Br].

MÉTODO GERAL PARA A ALQUILAÇÃO MEDIADA POR BASE DE BEN- ZIMIDAZOL 21GENERAL METHOD FOR BENZIMIDAZOLE BASED ALKILATION 21

Uma mistura de benzimidazol 21 (1 eq.) e o(s) agente(s) de al- quilação (1,1-1,3 eq.) em N,N-dimetilformamida seca foi tratada com hidreto de sódio sob atmosfera de nitrogênio. A solução foi depois aquecida para 100°C durante 18h. A solução marrom resultante foi decantada em acetato de etila e extraída três vezes com uma quantidade equivalente de água. A- pós secagem e concentração, o resíduo foi purificado através de cromato- grafia de coluna [1:10 -1:2 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente]. 1 -ALIL-1H-BENZIMIDAZOL (22)A mixture of benzimidazole 21 (1 eq.) And the alkylating agent (s) (1,1-1,3 eq.) In dry N, N-dimethylformamide was treated with sodium hydride under a nitrogen. The solution was then heated to 100 ° C for 18h. The resulting brown solution was decanted into ethyl acetate and extracted three times with an equivalent amount of water. After drying and concentration, the residue was purified by column chromatography [1:10 -1: 2 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent]. 1-ALYL-1H-BENZIMIDAZOL (22)

Uma mistura de benzimidazol 21 (0,49 g, 4,15 mmols) e brometo de alila (0,40 cm3, 4,62 mmols) em N,N-dimetilformamida seca (10 cm3) foi tratada com hidreto de sódio (60 % em óleo, 0,23 g, 5,66 mmols) como pelo procedimento geral. Cromatografia de coluna forneceu um óleo bege, 1-alil- 1 H-benzimidazol 22 (0,56 g, 86 %). δH (200 MHz, CDCl3) 7,92 (1H, br s, H- 2), 7,77-7,89 e 7,24-7,45 (4H, 2 x m, arila H), 6,02 (1H, ddt, CH2CH =, J17,0, 10,0 e 5,8), 5,31 (1H, dq, CH=CHaHb, J 10,2 e 1,8), 5,21 (1H, dq, CH=CHaHb, J17,0 e 1,6) e 4,79 (2H, NCH2, J 5,4 e 1,8). 1 -[(2-FURILMETÓXI)METIL]-1 H-BENZIMIDAZOL (23)A mixture of benzimidazole 21 (0.49 g, 4.15 mmols) and allyl bromide (0.40 cm 3, 4.62 mmols) in dry N, N-dimethylformamide (10 cm 3) was treated with sodium hydride (60 % in oil, 0.23 g, 5.66 mmols) as per the general procedure. Column chromatography provided a beige oil, 1-allyl-1H-benzimidazole 22 (0.56 g, 86%). δH (200 MHz, CDCl 3) 7.92 (1H, br s, H-2), 7.77-7.89 and 7.24-7.45 (4H, 2 xm, aryl H), 6.02 ( 1H, ddt, CH2 CH =, J17.0, 10.0 and 5.8), 5.31 (1H, dq, CH = CHaHb, J 10.2 and 1.8), 5.21 (1H, dq, CH = CHaHb, J17.0 and 1.6) and 4.79 (2H, NCH2, J 5.4 and 1.8). 1 - [(2-FURYLMETOXY) METHYL] -1 H-BENZIMIDAZOL (23)

Benzimidazol 21 (0,51 g, 4,24 mmols), dibromometano (0,33 cm3, 4,6 mmols) e álcool de furfurila (0,40 cm3, 4,6 mmols) em N,N- dimetilformamida seca (10 cm3) foram tratados com hidreto de sódio (0,38 g, 9,25 mmols) como pelo procedimento geral. Cromatografia de coluna forne- ceu um óleo amarelo, 1-[(2-furilmetóxi)metil]-1H-benzimidazol 23 (0,39 g, 40 %). δh (200 MHz, CDCI3) 8,00 (1H, s, benzimidazol H-2), 7,79-7,88 e 7,47- 7,59 (2H, 2 χ m, benzimidazol H-4 e H-7), 7,43-7,47 (1H, m, furila H-5), 7,26- 7,40 (2H, m, benzimidazol H-5 e H-6), 6,38 (1H, ~dd, furila H-4, J 3,2 e 1,8), 6,33 (1H, br dd, furila H-3, J 3,0 e 1,8), 5,57 (2H, s, NCH2O) e 4,41 (2H, s, OCH2furila).Benzimidazole 21 (0.51 g, 4.24 mmol), dibromomethane (0.33 cm3, 4.6 mmol) and furfuryl alcohol (0.40 cm3, 4.6 mmol) in dry N, N-dimethylformamide (10 cm3) were treated with sodium hydride (0.38 g, 9.25 mmols) as per the general procedure. Column chromatography provided a yellow oil, 1 - [(2-furylmethoxy) methyl] -1H-benzimidazole 23 (0.39 g, 40%). δh (200 MHz, CDCl3) 8.00 (1H, s, benzimidazole H-2), 7.79-7.88 and 7.47- 7.59 (2H, 2 χ m, benzimidazole H-4 and H- 7), 7.43-7.47 (1H, m, furyl H-5), 7.26-7.40 (2H, m, benzimidazole H-5 and H-6), 6.38 (1H, ~ dd, furyl H-4, J 3.2 and 1.8), 6.33 (1H, br dd, furyl H-3, J 3.0 and 1.8), 5.57 (2H, s, NCH2 O ) and 4.41 (2H, s, OCH 2 furyl).

PROCEDIMENTO GERAL PARA PREPARAÇÃO DE PIRIMIDINAS ACILA- DASGENERAL PROCEDURE FOR PREPARING ACCILATED PYRIMIDINS

N-(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (26)N- (2,4-DIAMINO-6-HYDROXYPYRIMIDIN-5-IL) BENZAMIDE (26)

2,4,5-Triamino-6-hidroxipirimidina 2 (1,0 g, 4,2 mmols) foi dissol- vida em 2M de solução de hidróxido de sódio (25 cm3) e a solução foi esfria- da até O5C usando um banho de gelo. Cloreto de benzoíla (0,6 g, 4,2 mmols) foi depois adicionado por 5 minutos à solução usando uma seringa. A mistu- ra foi deixada agitar por 15 minutos a 0°C e outra porção de cloreto de ben- zoíla (0,6 g, 4,2 mmols) foi adicionada de uma maneira similar. A mistura foi deixada agitar durante uma hora adicional no banho de gelo. A mistura de reação foi depois removida do banho de gelo e deixada aquecer-se para temperatura ambiente. O pH da solução foi ajustado em 5 com ácido acético glacial em cujo ponto o produto precipitou-se da solução. O precipitado mar- rom claro foi filtrado em um funil de Buchner e lavado com água deionizada (3x10 cm3). O bolo de filtro foi secado inicialmente no funil por 3h e depois transferido para um frasco e secado a vácuo. N-(2,4-Diamino-6- hidroxipirimidin-5-il)benzamida 26 (0,78 g, 56 %) δΗ (200 MHz, D2O) 7,79 (2H, d, J6,6, 2 χ ArCΗ) e 7,35-7,58 (3H, m, 3 χ ArCΗ). Usado como se en- contra para a etapa subseqüente.2,4,5-Triamino-6-hydroxypyrimidine 2 (1.0 g, 4.2 mmols) was dissolved in 2M sodium hydroxide solution (25 cm3) and the solution was cooled to 0 ° C using a ice bath. Benzoyl chloride (0.6 g, 4.2 mmol) was then added for 5 minutes to the solution using a syringe. The mixture was allowed to stir for 15 minutes at 0 ° C and another portion of benzoyl chloride (0.6 g, 4.2 mmol) was added in a similar manner. The mixture was allowed to stir for an additional hour in the ice bath. The reaction mixture was then removed from the ice bath and allowed to warm to room temperature. The pH of the solution was adjusted to 5 with glacial acetic acid at which point the product precipitated from the solution. The light brown precipitate was filtered through a Buchner funnel and washed with deionized water (3x10 cm3). The filter cake was initially dried on the funnel for 3h and then transferred to a flask and vacuum dried. N- (2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidin-5-yl) benzamide 26 (0.78 g, 56%) δΗ (200 MHz, D 2 O) 7.79 (2H, d, J6,6, 2 χ ArCΗ ) and 7.35-7.58 (3H, m, 3 χ ArCΗ). Used as it is for the subsequent step.

Em uma maneira similar foi obtido os seguintes: N-(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIFENIL)OCTANAMIDA (28) (0,34 g, 35 %). δΗ (200 MHz, D2O) 2,36 (2H, t, J 7,7, COCH2), 1,45-1,70 (2H, m, COCH2CH2), 1,10-1,40 (8H, m, 4 χ CH2) e 0,82 (3H, brs, CH3).In a similar manner the following were obtained: N- (2,4-DIAMINO-6-HYDROXYPHENYL) OCTANAMIDE (28) (0.34 g, 35%). δΗ (200 MHz, D 2 O) 2.36 (2H, t, J 7.7, COCH 2), 1.45-1.70 (2H, m, COCH 2 CH 2), 1.10-1.40 (8H, m, 4 (CH 2) and 0.82 (3H, brs, CH 3).

N-(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIFENIL)-2,2-DIMETILPROPANAMIDA (29) (0,38 g, 43 %). <5h (200 MHz, D2O) 1,24 (9H, s, 3 χ CH3).N- (2,4-DIAMINO-6-Hydroxyphenyl) -2,2-DIMETHYLPROPANAMIDE (29) (0.38 g, 43%). <5h (200 MHz, D 2 O) 1.24 (9H, s, 3 χ CH 3).

N-(1-{[(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)AMINO]CARBONIL}-2- METILPROPIL)BENZ-AMIDA (30)N- (1 - {[(2,4-DIAMINO-6-HYDROXYPYRIMIDIN-5-IL) AMINO] CARBONY} -2-METTILPROPIL) BENZ-AMIDA (30)

Uma solução de L-valina (15,75 g, 0,13 mol) e hidróxido de po- tássio (12,00 g, 0,21 mol) em água (150 cm3) foi tratada com cloreto de ben- zoíla (18,7 cm3, 0,16 mol) em temperatura ambiente, e deixada agitar por 72h. Esta foi extraída com clorofórmio (200 cm3), então lavada com um vo- lume igual de 1M de ácido clorídrico seguido por carbonato de potássio a- quoso saturado. Após secagem (MgSO4) e concentração, o sólido bege foi dissolvido em clorofórmio (200 cm3). A solução foi tratada com cloreto de tionila (14,7 cm3, 0,21 mol) e três gotas de dimetilforrhamida sob atmosfera de nitrogênio. A mistura foi aquecida por 1h, então concentrada em uma massa amarela viscosa. Duas porções deste cloreto de ácido (4,01 g cada) foram adicionadas a uma solução de 13 (2,00 g, 8,38 mmols) em 1M de hi- dróxido de sódio aquoso (50 cm3) a O2C por 2h após as quais o pH foi ajus- tado para ~4 com ácido acético glacial. Um sólido bege, 30, vertido da solu- ção, que foi depois filtrado, secado e usado como se encontra sem caracte- rização.A solution of L-valine (15.75 g, 0.13 mol) and potassium hydroxide (12.00 g, 0.21 mol) in water (150 cm3) was treated with benzoyl chloride (18 , 7 cm @ 3, 0.16 mol) at room temperature, and allowed to stir for 72h. This was extracted with chloroform (200 cm 3), then washed with an equal volume of 1 M hydrochloric acid followed by saturated aqueous potassium carbonate. After drying (MgSO4) and concentration, the beige solid was dissolved in chloroform (200 cm3). The solution was treated with thionyl chloride (14.7 cm3, 0.21 mol) and three drops of dimethylforrhamide under nitrogen atmosphere. The mixture was heated for 1h, then concentrated to a viscous yellow mass. Two portions of this acid chloride (4.01 g each) were added to a solution of 13 (2.00 g, 8.38 mmols) in 1 M aqueous sodium hydroxide (50 cm3) at 0 ° C for 2h after which the pH was adjusted to ~ 4 with glacial acetic acid. A beige solid, 30, poured from the solution, which was then filtered, dried and used as is without characterization.

PROCEDIMENTO GERAL PARA A CICLIZAÇÃO MEDIADA DE METÓXIDO DE SÓDIO DAS PIRIMIDINAS ACILADASGENERAL PROCEDURE FOR MEDIUM SODIUM METHODIDE CYCLEIZATION OF ACYLED PYRIMIDINES

2-AMINO-8-FENIL-9H-PURIN-6-OL (31)2-AMINO-8-FENIL-9H-PURIN-6-OL (31)

N-(2,4-diamino-6-hidroxipirimidin-5-il)benzamida 26 (0,3 g, 1,2 mmol) foi adicionada à solução de metóxido de sódio em metanol (10 % m/m, 5 cm3). A mistura resultante foi aquecida a refluxo por 5h em um ba- nho de óleo. A mistura de reação foi depois esfriada para temperatura ambi- ente, água (5 cm3) adicionada, e o metanol foi evaporado no evaporador ro- tativo. A solução aquosa resultante foi acidificada em pH 5 com ácido acético glacial em cujo ponto um sólido precipitou-se da solução. O sólido foi filtrado e lavado com água (3x10 cm3). O bolo de filtro foi secado durante a noite no funil para render 2-amino-8-fenil-9H-purin-6-ol 31 (0,78 g, 60 %) <5H (200 MHz, D2O) 7,96 (2H, d, J7,0, 2 χ ArCΗ) e 7,28-7,46 (3H, m, 3 χ ArCΗ).N- (2,4-diamino-6-hydroxypyrimidin-5-yl) benzamide 26 (0.3 g, 1.2 mmol) was added to the sodium methoxide solution in methanol (10% w / w, 5 cm3) . The resulting mixture was heated at reflux for 5h in an oil bath. The reaction mixture was then cooled to room temperature, water (5 cm 3) added, and methanol evaporated on the rotary evaporator. The resulting aqueous solution was acidified to pH 5 with glacial acetic acid at which point a solid precipitated out of solution. The solid was filtered and washed with water (3x10 cm3). The filter cake was dried overnight on the funnel to yield 2-amino-8-phenyl-9H-purin-6-ol 31 (0.78 g, 60%) <5 H (200 MHz, D 2 O) 7.96 ( 2H, d, J7,0, 2 χ ArCΗ) and 7.28-7.46 (3H, m, 3 χ ArCΗ).

Em uma maneira similar, os seguintes foram preparados:In a similar manner, the following were prepared:

2-AMINO-8-HEPTIL-9H-PURlN-6-OL (33)2-AMINO-8-HEPTIL-9H-PURlN-6-OL (33)

(0,12 g, 46 %). <5h (200 MHz, D2O) 2,59 (2H, t, J 7,7, ArCH2), 1,52-1,70 (2Η, m, ArCH2CH2), 1,08-1,35 (8Η, m, 4 χ CH2) e 0,78 (3Η, br s, CH3).(0.12 g, 46%). <5h (200 MHz, D 2 O) 2.59 (2H, t, J 7.7, ArCH 2), 1.52-1.70 (2Η, m, ArCH 2 CH 2), 1.08-1.35 (8Η, m , 4 χ CH2) and 0.78 (3Η, br s, CH3).

2-AMINO-8-TERC-BUTIL-9H-PURIN-6-OL (34)2-AMINO-8-TERC-BUTIL-9H-PURIN-6-OL (34)

(0,11 g, 53 %). δh (200 MHz, D2O) 1,30 (9H, s, 3 χ CH3).(0.11 g, 53%). δh (200 MHz, D 2 O) 1.30 (9H, s, 3 χ CH 3).

PROCEDIMENTO GERAL PARA A CICLIZAÇÃO MEDIADA POR OXICLO- RETO FOSFOROSO DE PIRIMIDINAS ACILADAS 6-CLORO-8-FENIL-9H-PURIN-2-AMINA (35)GENERAL PROCEDURE FOR Phosphorous oxide-mediated cyclization of acylated 6-chlorine-8-phenyl-9H-purin-2-amine acylated pyrimidines (35)

Benzamida 26 (1,66 g, 6,75 mmols) em oxicloreto fosforoso (35 cm3) foi aquecida sob refluxo em atmosfera de nitrogênio por 18h. Sol- vente de excesso foi removido sob vácuo, e gelo esmagado adicionado ao resíduo, fornecendo uma suspensão preta sob agitaçaõ. Os sólidos foram filtrados, e o filtrado basificado com solução de amônia concentrada. Um sólido bege formou-se. O sólido foi separado por filtração, lavado com água, etanol e acetona, então secado para render 6-cloro-8-fenil-9H-purin-2-amina 15 35 (0,39 g, 24 %). δΗ (200 MHz, Gf6-DMSO) 8,02-7,95 e 7,62-7,38 (5H, 3 χ m, arila H), 7,12 (1H, brs, NH), 6,25 e 6,32 (2H, 2 χ br s, NH2); δC (50 MHz, Cl6- DMSO) 161,2 (C-6), 156,4 (C-4), 154,2 (C-8), 153,4 (C-2), 130,13 (arila qua- ternária C), 129,13, 128,7 e 125,9 (arila CH) e 108,5 (C-5). 6-CLORO-8-HEPTIL-9H-PURIN-2-AMINA (36)Benzamide 26 (1.66 g, 6.75 mmols) in phosphorus oxychloride (35 cm3) was heated under reflux under a nitrogen atmosphere for 18h. Excess solvent was removed under vacuum, and crushed ice added to the residue, providing a black stirring suspension. The solids were filtered, and the filtrate basified with concentrated ammonia solution. A beige solid formed. The solid was filtered off, washed with water, ethanol and acetone, then dried to yield 6-chloro-8-phenyl-9H-purin-2-amine (0.39 g, 24%). δΗ (200 MHz, Gf6-DMSO) 8.02-7.95 and 7.62-7.38 (5H, 3 χ m, aryl H), 7.12 (1H, brs, NH), 6.25 and 6.32 (2H, 2 χ br s, NH 2); δC (50 MHz, Cl6-DMSO) 163.2 (C-6), 156.4 (C-4), 154.2 (C-8), 153.4 (C-2), 130.13 (aryl quaternary C), 129.13, 128.7 and 125.9 (aryl CH) and 108.5 (C-5). 6-CHLORO-8-HEPTIL-9H-PURIN-2-AMINE (36)

Seguindo o procedimento geral, amida 28 (1,71 g, 6,38 mmols) foi tratada com POCI3 (35 cm3), fornecendo 6-cloro-8-heptil-9H-purin-2- amina 36 (0,19 g, 11 %) como um sólido laranja. δH (200 MHz, d6-DMSO) 6,39 (~1 H, br s, NH), 1,12 (12H, br s, 6 χ CH2) e 0,83 (3H, br m, CH3); δC (50 MHz, GfrDMSO) 160,2 (C-6), 150,6 (C-8), 146,1 (C-4), 144,3 (C-2), 112,7 (C-5), 31,4, 28,9, 28,7, 28,6, 27,6 e 22,3 (6 χ CH2) e 13,8 (CH3).Following the general procedure, amide 28 (1.71 g, 6.38 mmol) was treated with POCI3 (35 cm3), providing 6-chloro-8-heptyl-9H-purin-2-amine 36 (0.19 g, 11%) as an orange solid. δH (200 MHz, d6-DMSO) 6.39 (1H, br s, NH), 1.12 (12H, br s, 6 χ CH 2) and 0.83 (3H, br m, CH 3); δC (50 MHz, GfrDMSO) 160.2 (C-6), 150.6 (C-8), 146.1 (C-4), 144.3 (C-2), 112.7 (C-5) ), 31.4, 28.9, 28.7, 28.6, 27.6 and 22.3 (6 χ CH2) and 13.8 (CH3).

N-(4-AMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (37)N- (4-AMINO-6-HYDROXYPYRIMIDIN-5-IL) BENZAMIDE (37)

Seguindo o procedimento geral por acilação, diamina 10 (1,00 g, 7,93 mmols) em 2M NaOH aquoso (20 cm3) foi tratada com cloreto de ben- zoíla (1,84 cm3, 15,85 mmols) para render N-(4-amino-6-hidroxipirimidin-5- il)benzamida 37 (1,35 g, 74 %) como um pó amarelo. Usado como se encon- tra sem caracterização.Following the general procedure by acylation, diamine 10 (1.00 g, 7.93 mmols) in 2M aqueous NaOH (20 cm3) was treated with benzoyl chloride (1.84 cm3, 15.85 mmols) to yield N - (4-amino-6-hydroxypyrimidin-5-yl) benzamide 37 (1.35 g, 74%) as a yellow powder. Used as it is without characterization.

N-(4-AMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)OLEILAMIDA (38) Seguindo o procedimento geral por acilação, diamina 10 (1,00 g, 7,93 mmols) em 2M de NaOH aquoso (20 cm3) foi tratada com cloreto de oleíla (5,24 cm3, 15,85 mmols) para render N-(4-amino-6-hidroxipirimidin-5- il)oleilamida 38 (0,33 g, 11 %) como uma goma marrom. Usada como se en- contra sem caracterização.N- (4-AMINO-6-HYDROXYPYRIMIDIN-5-IL) OLEILAMIDE (38) Following the general procedure by acylation, diamine 10 (1.00 g, 7.93 mmols) in 2M aqueous NaOH (20 cm3) was treated. with oleyl chloride (5.24 cm 3, 15.85 mmol) to yield N- (4-amino-6-hydroxypyrimidin-5-yl) oleylamide 38 (0.33 g, 11%) as a brown gum. Used as it is without characterization.

N-(4-AMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)OCTANAMIDA (39)N- (4-AMINO-6-HYDROXYPYRIMIDIN-5-IL) OCTANAMIDE (39)

Seguindo o procedimento geral por acilação, diamina 10 (1,06 g, 8,43 mmols) em 2M de NaOH aquoso (20 cm3) foi tratada com cloreto de octanoíla (2,71 cm3, 15,88 mmols) para render N-(4-amino-6-hidroxipirimidin- 5-il)octanamida 39 (0,16 g, 8 %) como um pó bege. Usada como se encontra sem caracterização.Following the general procedure by acylation, diamine 10 (1.06 g, 8.43 mmols) in 2M aqueous NaOH (20 cm3) was treated with octanoyl chloride (2.71 cm3, 15.88 mmols) to yield N- (4-Amino-6-hydroxypyrimidin-5-yl) octanamide 39 (0.16 g, 8%) as a beige powder. Used as is without characterization.

8-HEPTIL-9H-PURIN-6-OL (40)8-HEPTIL-9H-PURIN-6-OL (40)

Seguindo o procedimento geral por fechamento de anel mediado por metóxido de sódio, amida 39 (0,18 g, 0,72 mmol) foi tratada com metóxi- do de sódio (1,97 g, 36,53 mmols) em metanol (15 cm3), fornecendo 8-heptil- 9H-purin-6-ol 40 (0,13 g, 77 %) como um pó branco. <5H (200 MHz, afe-DMSO) 8,54 (~1 H, br s, Ntf), 7,74 (~1H, br s, H-2), 6,02 (1H, br s, Otf), 2,17-2,41, 1,01 -1,82 e 0,75-1,12 [15H, 6 χ m, (CH2)5CH3]; õc (50 MHz, GfirDMSO) 171,6 (C-6), 159,2 (C-8), 158,5 (C-4); 146,9 (C-2), 98,9 (C-5), 35,3, 31,2, 28,7, 28,5, 27,4, 25,1 e 22,0 (6 χ CH2) e 13,9 (CH3).Following the general procedure for sodium methoxide-mediated ring closure, amide 39 (0.18 g, 0.72 mmol) was treated with sodium methoxide (1.97 g, 36.53 mmols) in methanol (15 cm 3), providing 8-heptyl-9H-purin-6-ol 40 (0.13 g, 77%) as a white powder. Δ 5H (200 MHz, afe-DMSO) 8.54 (1H, br s, Ntf), 7.74 (1HH, br s, H-2), 6.02 (1H, br s, Otf) , 2.17-2.41, 1.01 -1.82 and 0.75-1.12 [15H, 6 χ m, (CH 2) 5 CH 3]; δc (50 MHz, GfirDMSO) 171.6 (C-6), 159.2 (C-8), 158.5 (C-4); 146.9 (C-2), 98.9 (C-5), 35.3, 31.2, 28.7, 28.5, 27.4, 25.1 and 22.0 (6 χ CH2) and 13.9 (CH 3).

N-(6-AMIN0-2,4-DIIDR0XIPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (41)N- (6-AMIN0-2,4-DIIDR0XIPYRIMIDIN-5-IL) BENZAMIDE (41)

Usando o procedimento geral por acilação, cloridrato de 5,6- diaminouracila 13 (0,50 g, 2,8 mmols) foi dissolvido em 10 % de hidróxido de sódio aquoso (12 cm3), esfriado em um banho de gelo e tratado com duas porções de cloreto de benzoíla (0,33 cm3, 2,8 mmols) por 1,5h. O pH foi a- justado para 7-8 com ácido acético, o produto precipitou-se da solução e foi colhido através de filtração e lavado com água para render N-(6-amino-2,4- dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-il)benzamida 41 como um sólido amarelo (0,68 g, 99 %). δΗ (200 MHz, Gf6-DMSO) 10,37 (1H, s, Ntf), 10,19 (1H, s, Ntf), 8,79 (1H, s, NtfC=O), 7,94-8,00 (2H, m, arila H), 7,41-7,55 (3H, m, arila H) e 6,10 (2H, br s, Ntf2).Using the general acylation procedure, 5,6-diaminouracil hydrochloride 13 (0.50 g, 2.8 mmols) was dissolved in 10% aqueous sodium hydroxide (12 cm 3), cooled in an ice bath and treated with two portions of benzoyl chloride (0.33 cm 3, 2.8 mmol) for 1.5h. The pH was adjusted to 7-8 with acetic acid, the product precipitated from solution and was collected by filtration and washed with water to yield N- (6-amino-2,4-dioxo-1,2, 3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl) benzamide 41 as a yellow solid (0.68 g, 99%). δΗ (200 MHz, Gf6-DMSO) 10.37 (1H, s, Ntf), 10.19 (1H, s, Ntf), 8.79 (1H, s, NtfC = O), 7.94-8, O (2H, m, aryl H), 7.41-7.55 (3H, m, aryl H) and 6.10 (2H, br s, Ntf 2).

6-AMINO-5-{[(1 E,2E)-3-FENILPROP-2-ENILIDENO]AMINO}PIRIMIDINO- 2,4-DIOL (42)6-AMINO-5 - {[(1 E, 2E) -3-FENILPROP-2-ENYLIDENE] AMINO} Pyrimidine-2,4-DIOL (42)

Cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 (0,50 g, 2,8 mmols) foi dis- solvido em metanol (10 cm3), cinamaldeído (0,35 cm3, 2,8 mmols) foi adicio- nado e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 h. Água foi adi- cionada e um sólido pegajoso resultou que foi triturado com éter e depois colhido através de filtração para render 6-amino-5-{[(1E,2E)-3-fenilprop-2- enilideno]amino}pirimidino-2,4-diol 42 como um sólido laranja luminoso (0,64 g, 89 %). δΗ (200 MHz, Qf6-DMSO) 10,92 (1H, s, NH), 10,76 (1H, s, NH), 9,44 e 9,69 (1H, 2 χ d J 8, N=CH) e 7,10-7,80 (7H, m, arila H, CH=CH); δc (50 MHz, cfe-DMSO) 159,9 153,8, 152,7 e 149,2 (C-2, C-4, C-5 e C-6), 136,3, 130,5 e 131,9 (C=C e C=N), 129,8, 129,4, 129,2 e 128,3 (arila C). XANTINA (43)5,6-Diaminouracil 13 hydrochloride (0.50 g, 2.8 mmols) was dissolved in methanol (10 cm3), cinnamaldehyde (0.35 cm3, 2.8 mmols) was added and the reaction was added. Stir at room temperature for 2 h. Water was added and a sticky solid resulted which was triturated with ether and then collected by filtration to yield 6-amino-5 - {[(1E, 2E) -3-phenylprop-2-enylidene] amino} pyrimidine-2 4,4-diol 42 as a luminous orange solid (0.64 g, 89%). δΗ (200 MHz, Qf6-DMSO) 10.92 (1H, s, NH), 10.76 (1H, s, NH), 9.44 and 9.69 (1H, 2 χ d J 8, N = CH ) and 7.10-7.80 (7H, m, aryl H, CH = CH); δc (50 MHz, cfe-DMSO) 159.9 153.8, 152.7 and 149.2 (C-2, C-4, C-5 and C-6), 136.3, 130.5 and 131 .9 (C = C and C = N), 129.8, 129.4, 129.2 and 128.3 (aryl C). XANTINE (43)

Cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 (0,50 g, 2,8 mmols) foi aque- cido sob refluxo com trietilortoformato (5 cm3), trietilamina (0,39 cm3, 2,8 mmols) e N,N-dimetil-formamida (2 cm3) por 19h. O material sólido foi filtrado e lavado com éter para fornecer xantina 43 como um sólido bege (0,45 g, 90 %). <5h (200 MHz, CZ6-DMSO) 7,9 (1H, s, H-8); δc (50 MHz, Cl6- DMSO) 156,2 (C-6), 152,1 (C-2), 149,5 (C-4), 141,2 (C-8) e 107,4 (C-5).5,6-Diaminouracil 13 hydrochloride (0.50 g, 2.8 mmol) was heated under reflux with triethylortoformate (5 cm3), triethylamine (0.39 cm3, 2.8 mmol) and N, N-dimethyl -formamide (2 cm 3) for 19h. The solid material was filtered and washed with ether to afford xanthine 43 as a beige solid (0.45 g, 90%). δ 5h (200 MHz, CZ6-DMSO) 7.9 (1H, s, H-8); δc (50 MHz, Cl6-DMSO) 156.2 (C-6), 152.1 (C-2), 149.5 (C-4), 141.2 (C-8) and 107.4 (C -5).

6-CLORO-8-FENIL-9H-PURIN-2-OL (44) N-(6-amino-2,4-diidroxipirimidin-5-il)benzamida 41 (0,14 g,6-Chloro-8-phenyl-9H-PURIN-2-OL (44) N- (6-amino-2,4-dihydroxypyrimidin-5-yl) benzamide 41 (0.14 g,

0,057 mmol) foi fervida sob refluxo em POCl3 (5 cm3) por 4h. POCI3 de ex- cesso foi removido por evaporação rotativa em uma capela e ao resíduo foi adicionado gelo esmagado. Um precipitado foi colhido através de filtração e lavado com água para render 6-cloro-8-fenil-9H-purin-2-ol 44 como um sóli- do marrom (0,17 g, produto mais compostos fosforosos externos). Õh (200 MHz, C16-DMSO) 10,85 (1H, s, NH), 8,02-8,10 (2H, m, arila H) e 7,38- 7,60 (3H, m, arila H); õc (50 MHz, ci6-DMSO) 156,0 (C-6), 152,0 (C-2), 150,6 e 150,2 (C-4 e C-8), 130,8, 129,7, 129,5 e 126,9 (arila C) e 108,7 (C-5).0.057 mmol) was boiled under reflux in POCl3 (5 cm3) for 4h. Excess POCl3 was removed by rotary evaporation in a chapel and crushed ice was added to the residue. A precipitate was collected by filtration and washed with water to yield 6-chloro-8-phenyl-9H-purin-2-ol 44 as a brown solid (0.17 g, product plus external phosphorus). Δh (200 MHz, C16-DMSO) 10.85 (1H, s, NH), 8.02-8.10 (2H, m, aryl H) and 7.38-7.60 (3H, m, aryl H ); δc (50 MHz, C16-DMSO) 156.0 (C-6), 152.0 (C-2), 150.6 and 150.2 (C-4 and C-8), 130.8, 129, 7, 129.5 and 126.9 (aryl C) and 108.7 (C-5).

8-[(E)-2-FENILVINIL]-9H-PURINO-2,6-DIOL (45) 6-amino-5-{[(1 E,2£)-3-fenilprop-2-enilideno]amino}pirimidino-2,4- diol 42 (0,27 g, 1,1 mmol) foi dissolvido em cloreto de tionila (10 cm3) e a- quecido sob refluxo por 6,5h, o curso da reação sendo seguida por HPLC. Após desaparecimento do pico do material de partida, a reação foi esfriada e cloreto de tionila de excesso foi removido sob pressão reduzida para render 8-[(E)-2-fenilvinil]-9H-purino-2,6-diol bruto 45, <5C (50 MHz1 Gf6-DMSO) 155,8 e 152,0 (C-6 e C-2), 150,0 (co-incidente C-8 e C-4), 136,1 e 135,6 (CH=CHPh e arila C), 129,8, 129,7 e 127,8 (arila C), 116,4 (CH=CHPh) e 108,1 (C-5). N-(6-AMINO-1,3-DIMETIL-2,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAIDROPIRIMIDIN-5- IL)BENZAMIDA (46)8 - [(E) -2-Phenylvinyl] -9H-PURINO-2,6-DIOL (45) 6-amino-5 - {[(1 E, 2 ') -3-phenylprop-2-enylidene] amino} pyrimidine-2,4-diol 42 (0.27 g, 1.1 mmol) was dissolved in thionyl chloride (10 cm 3) and heated under reflux for 6.5h, the reaction course being followed by HPLC. After disappearance of the starting material peak, the reaction was cooled and excess thionyl chloride was removed under reduced pressure to yield crude 8 - [(E) -2-phenylvinyl] -9H-purine-2,6-diol 45, <5C (50 MHz1 Gf6-DMSO) 155.8 and 152.0 (C-6 and C-2), 150.0 (co-incident C-8 and C-4), 136.1 and 135.6 ( CH = CHPh and aryl C), 129.8, 129.7 and 127.8 (aryl C), 116.4 (CH = CHPh) and 108.1 (C-5). N- (6-AMINO-1,3-DIMETHYL-2,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAHYDROPYRIMIDIN-5-IL) BENZAMIDE (46)

Bissulfito de 5,6-diamino-1,3-dimetiluracila 16 (0,25 g, 0,99 mmol) foi suspenso em 10 % de hidróxido de sódio (4 cm3) e esfriado para O-C em um banho de gelo. Cloreto de benzoíla (1 eq., 0,12 cm3) foi adi- cionado e após 15 min agitando, um equivalente adicional foi adicionado. A reação foi deixada aquecer-se para temperatura ambiente e agitação duran- te a noite. A mistura de reação foi acidificada com ácido acético e o precipi- tado foi colhido através de filtração e lavado com água para render N-(6- amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidro-pirimidin-5-il)benzamida 46 co- mo um sólido amarelo (0,10 g, 37 %). <5H (200 MHz, cfe-DMSO) 8,90 (1H, s, NHC=O), 7,95-8,02 (2H, m, arila H), 7,42-7,55 (3H, m, arila H), 3,35 (3H, s, CH3N) e 3,15 (3H,s, CH3N).5,6-Diamino-1,3-dimethyluracil 16 bisulfite (0.25 g, 0.99 mmol) was suspended in 10% sodium hydroxide (4 cm3) and cooled to O-C in an ice bath. Benzoyl chloride (1 eq., 0.12 cm 3) was added and after 15 min stirring, an additional equivalent was added. The reaction was allowed to warm to room temperature and stir overnight. The reaction mixture was acidified with acetic acid and the precipitate was collected by filtration and washed with water to yield N- (6-amino-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3, 4-Tetrahydropyrimidin-5-yl) benzamide 46 as a yellow solid (0.10 g, 37%). Δ 5H (200 MHz, cfe-DMSO) 8.90 (1H, s, NHC = O), 7.95-8.02 (2H, m, aryl H), 7.42-7.55 (3H, m , aryl H), 3.35 (3H, s, CH 3 N) and 3.15 (3H, s, CH 3 N).

N-(6-AMINO-1,3-DIMETIL-2,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAIDROPIRIMIDIN-5- IL)OCTANAMIDA (47)N- (6-AMINO-1,3-DIMETHYL-2,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAHYDROPYRIMIDIN-5-IL) OCTANAMIDE (47)

Bissulfito de 5,6-diamino-1,3-dimetiluracila 16 (0,25 g, 0,99 mmol) foi dissolvido em piridina (2 cm3) e a solução foi esfriada para 0-C. Cloreto de octanoíla (1 eq., 0,17 cm3) foi adicionado e a reação foi dei- xada aquecer-se para temperatura ambiente e agitação durante a noite. Um volume pequeno de ácido acético foi adicionado e a mistura de reação foi dividida entre acetato de etila e água. A camada de água foi removida e a camada orgânica lavada duas vezes com 1M de ácido clorídrico. A camada orgânica foi secada em MgS04 e o solvente removido para render N-(6- amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetra-hidropirimidin-5-il)octanamida bruta 47 como um sólido amarelo (0,05 g, 17 %). <5H (200 MHz, Cf6-DMSO) 8,91 (1H, s, NHC=O), 8,24 e 6,47 (2H, 2 χ s, NH2), 3,31 (3H, s, CH3N), 3,12 (3H, s, CH3N), 2,14-2,30 [2H, m, CH3(CH2)5CH2C=O], 1,40-1,61 e 1,17-1,38 [10H, 2 χ m, CH3(CH2)5CH2C=O], e 0,80-0,92 [3Η, m, CH3(CH2)6].5,6-Diamino-1,3-dimethyluracil bisulfite 16 (0.25 g, 0.99 mmol) was dissolved in pyridine (2 cm 3) and the solution was cooled to 0 ° C. Octanoyl chloride (1 eq., 0.17 cm 3) was added and the reaction was allowed to warm to room temperature and stir overnight. A small volume of acetic acid was added and the reaction mixture was partitioned between ethyl acetate and water. The water layer was removed and the organic layer washed twice with 1 M hydrochloric acid. The organic layer was dried over MgSO4 and the solvent removed to yield crude N- (6-amino-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl) octanamide 47 as a yellow solid (0.05 g, 17%). Δ 5H (200 MHz, Cf 6 -DMSO) 8.91 (1H, s, NHC = O), 8.24 and 6.47 (2H, 2 χ s, NH 2), 3.31 (3H, s, CH 3 N) , 3.12 (3H, s, CH 3 N), 2.14-2.30 [2H, m, CH 3 (CH 2) 5 CH 2 C = O], 1.40-1.61 and 1.17-1.38 [10H , 2 χ m, CH 3 (CH 2) 5 CH 2 C = O], and 0.80-0.92 [3Η, m, CH 3 (CH 2) 6].

1,3-DIMETIL-8-FENIL-3,9-DIIDRO-1 H-PURINO-2,6-DIONA (48)1,3-Dimethyl-8-phenyl-3,9-DIIDRO-1 H-PURINO-2,6-DIONA (48)

N-(6-amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5- il)benzamida 46 (0,10 g, 0,36 mmol) foi suspensa em 2M de hidróxido de sódio (2 cm3) e metanol (1 cm3). A reação foi fervida sob refluxo por 3h. Du- rante o curso da reação todo o material dissolveu, seguido por formação de um precipitado branco. A mistura de reação foi esfriada e água (1 cm3) foi adicionada, seguido por acidificação em pH 5 com ácido acético. O precipi- tado foi colhido através de filtração e lavado com água para render 1,3- dimetil-8-fenil-3,9-diidro-1H-purino-2,6-diona 48 como um sólido branco (0,06 g, 65 %). <5h (200 MHz, cfe-DMSO) 8,12-8,19 (2H, m, arila H), 7,48-7,57 (3H, m, arila H), 7,28 (1H, s, NH), 3,52 (3H, s, CH3N) e 3,28 (3H, s, CH3N). PREPARAÇÃO ALTERNATIVA: 6-amino-1,3-dimetil-5-nitrosouracila 15 (0,50 g, 2,7 mmols) foi aquecido para 1759C por 3h com benzilamina (2 cm3) que tinha sido tratada com ácido clorídrico concentrado (0,16 g, 4,3 mmols). A reação foi esfriada, o material solidificado e suspenso em etanol (5 cm3). Este foi filtrado e o sólido agitado com água (2 cm3) para 2 h. Coletânea do sólido através de filtração e lavagem com água forneceu 48 como um sólido branco (0,12 g, 17 %).N- (6-amino-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl) benzamide 46 (0.10 g, 0.36 mmol) was suspended in 2M of sodium hydroxide (2 cm3) and methanol (1 cm3). The reaction was boiled under reflux for 3h. During the course of the reaction all material dissolved, followed by formation of a white precipitate. The reaction mixture was cooled and water (1 cm 3) was added, followed by acidification to pH 5 with acetic acid. The precipitate was collected by filtration and washed with water to yield 1,3-dimethyl-8-phenyl-3,9-dihydro-1H-purine-2,6-dione 48 as a white solid (0.06 g , 65%). <5h (200 MHz, cfe-DMSO) 8.12-8.19 (2H, m, aryl H), 7.48-7.57 (3H, m, aryl H), 7.28 (1H, s, NH), 3.52 (3H, s, CH 3 N) and 3.28 (3H, s, CH 3 N). ALTERNATIVE PREPARATION: 6-Amino-1,3-dimethyl-5-nitrosouracil 15 (0.50 g, 2.7 mmols) was heated to 1759 ° C for 3h with benzylamine (2 cm3) which had been treated with concentrated hydrochloric acid (0 , 16 g, 4.3 mmol). The reaction was cooled, the material solidified and suspended in ethanol (5 cm3). This was filtered and the solid stirred with water (2 cm 3) for 2 h. Collecting the solid by filtration and washing with water provided 48 as a white solid (0.12 g, 17%).

1,3-DIMETIL-8-HEPTIL-3,9-DIIDRO-1 H-PURINO-2.6-DIONA (49)1,3-DIMETHYL-8-HEPTIL-3,9-DIIDRO-1 H-PURINO-2.6-DIONA (49)

N-(6-amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5- il)octanamida 47 (0,29 g, 0,99 mmol) foi fervida sob refluxo em 2M de hidró- xido de sódio (3 cm3) e metanol (1,5 cm3) por 4h. Após esfriar, água (1 cm3) foi adicionada seguido por algumas gotas de ácido acético. O precipitado branco resultante foi filtrado e lavado com água e acetona para render 1,3- dimetil-8-heptil-3,9-diidro-1H-purino-2,6-diona 49 como um sólido branco (0,19 g, 70 %). <5h (200 MHz1 Gf6-DMSO) 3,41 (3H, s, CH3N), 3,22 (3H, s, CH3N), 1,60-1,73 e 1,17-1,35 [12H, 2 χ m, CH3(CH2)6] e 0,82-0,90 [3H, m, CH3(CH2)6].N- (6-amino-1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-yl) octanamide 47 (0.29 g, 0.99 mmol) was boiled under reflux. in 2M sodium hydroxide (3 cm3) and methanol (1.5 cm3) for 4h. After cooling, water (1 cm 3) was added followed by a few drops of acetic acid. The resulting white precipitate was filtered and washed with water and acetone to yield 1,3-dimethyl-8-heptyl-3,9-dihydro-1H-purine-2,6-dione 49 as a white solid (0.19 g, 70%). <5h (200 MHz1 Gf6-DMSO) 3.41 (3H, s, CH3N), 3.22 (3H, s, CH3N), 1.60-1.73 and 1.17-1.35 [12H, 2 χ m, CH 3 (CH 2) 6] and 0.82-0.90 [3H, m, CH 3 (CH 2) 6].

PROCEDIMENTO GERAL PARA AMIDAÇÃO DE 4,5,6- TRIAMINOPIRIMIDINAS:GENERAL PROCEDURE FOR 4,5,6- TRIAMINOPYRIMIDINE AMIDATION:

N-(4,6-DIAMINOPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (50) 4,5,6-Triaminopirimidina 5 (0,36 g, 2,88 mmols) foi empastada em tetraidrofurano/água [1:1 (v/v), 30 cm3] e tratada com trietilamina (1,2 μl, 8,63 mmols). A mistura foi esfriada para OqC em um banho de gelo, e cloreto de benzoíla (0,33 cm3, 2,88 mmols) foi adicionado a gotas como uma solu- ção em tetraidrofurano (5 cm3). Após adição completa, a mistura foi aqueci- da para temperatura ambiente durante a noite. Tetraidrofurano foi removido sob pressão reduzida e o precipitado resultante foi filtrado para fornecer N- (4,6-diaminopirimidin-5-il)benzamida 50 (97 mg, 15 %). <5H (200 MHz, Of6- DMSO) 9,20 (1H, br s, NH), 8,03 (2H, dd, J 8,2 e 1,8, 2 χ arila CH), 7,82 (1H, s, H-2), 7,44-7,56 (3H, m, 3 χ arila CH), 6,23 (2H, br s, NH2) e 6,04 (2H, s, NH2); <5C (50 MHz, d^DMSO) 166,3 (PhCONH), 160,5 (C-4 e C-6), 156,1 (C- 2), 135,1 (arila C), 131,8, 128,9 e 128,6 (arila CH) e 96,1 (C-5). ES-EM m/z 230,1 (M+H), 212,1 e 104,9.N- (4,6-DIAMINOPYRIMIDIN-5-IL) BENZAMIDE (50) 4,5,6-Triaminopyrimidine 5 (0.36 g, 2.88 mmols) was slurried in tetrahydrofuran / water [1: 1 (v / v ), 30 cm3] and treated with triethylamine (1.2 μl, 8.63 mmols). The mixture was cooled to 0 ° C in an ice bath, and benzoyl chloride (0.33 cm 3, 2.88 mmols) was added dropwise as a solution in tetrahydrofuran (5 cm 3). After complete addition, the mixture was warmed to room temperature overnight. Tetrahydrofuran was removed under reduced pressure and the resulting precipitate was filtered to afford N- (4,6-diaminopyrimidin-5-yl) benzamide 50 (97 mg, 15%). Δ 5H (200 MHz, Of6-DMSO) 9.20 (1H, br s, NH), 8.03 (2H, dd, J 8.2 and 1.8, 2 aryl CH), 7.82 (1H , s, H-2), 7.44-7.56 (3H, m, 3 (aryl CH)), 6.23 (2H, br s, NH 2) and 6.04 (2H, s, NH 2); ΔC (50 MHz, d 2 DMSO) 166.3 (PhCONH), 160.5 (C-4 and C-6), 156.1 (C-2), 135.1 (aryl C), 131.8 , 128.9 and 128.6 (aryl CH) and 96.1 (C-5). ES-MS m / z 230.1 (M + H), 212.1 and 104.9.

Os compostos a seguir foram preparados por este método geral: N-(4,6-DIAMINOPIRIMIDIN-5-IL)OLEAMIDA (51)The following compounds were prepared by this general method: N- (4,6-DIAMINOPYRIMIDIN-5-IL) OLEAMIDE (51)

(0,26 g, 17 %), <5H (200 MHz, Qf6-DMSO) 8,55 (1H, brs, NH), 7,76 (1H, s, H-2), 5,77 (4H, br s, 2 χ NH2), 5,25-5,38 (2H, m, CH=CH), 2,32 (2H, t, J7,5, NHCOCH2), 1,88-2,09 (4H, m, 2 χ CH2CH=C), 1,48-1,63 (2H, m, CH2), 1,15-1,46 (20H, m, 10 χ CH2) e 0,86 (3H, t, J 6,6, CH3); <5C (50 MHz, Gf6- DMSO) 173,0 (CONH), 159,5 (C-4 e C-6), 154,4 (C-2), 130,3 (CH=CH), 96,2 (C-5), 35,9, 32,0, 29,8, 29,6, 29,3, 27,3, e 25,4 (7 χ CH2), 22,8 (CH2CH3) e 14,6 (CH3).(0.26 g, 17%), δ 5H (200 MHz, Q6-DMSO) 8.55 (1H, brs, NH), 7.76 (1H, s, H-2), 5.77 (4H, br s, 2 χ NH 2), 5.25-5.38 (2H, m, CH = CH), 2.32 (2H, t, J7,5, NHCOCH 2), 1.88-2.09 (4H, m, 2 χ CH 2 CH = C), 1.48-1.63 (2H, m, CH 2), 1.15-1.46 (20H, m, 10 χ CH 2) and 0.86 (3H, t, J 6.6, CH3); ΔC (50 MHz, Gf6-DMSO) 173.0 (CONH), 159.5 (C-4 and C-6), 154.4 (C-2), 130.3 (CH = CH), 96, 2 (C-5), 35.9, 32.0, 29.8, 29.6, 29.3, 27.3, and 25.4 (7 χ CH2), 22.8 (CH2CH3) and 14, 6 (CH 3).

N-(4,6-DIAMINOPIRIMIDIN-5-IL)OCTANAMIDA (52)N- (4,6-DIAMINOPYRIMIDIN-5-IL) OCTANAMIDE (52)

(0,37 g, 36 %). δΗ (200 MHz, cfe-DMSO) 8,59 (1H, br s, NH), 7,82 (1H, s, H-2), 5,99 (4H, br s, 2 χ NH2), 2,33 (2H, t, J 7,4, NHCOCH2), 1,50- 1,68 (2H, m, CH2), 1,13-1,40 (8H, m, 4 χ CH2) e 0,84 (3H, t, J 6,6, CH3); <5C (50 MHz, Gf6-DMSO) 173,0 (CONH), 158,2 (C-4 e C-6), 151,8 (C-2), 95,8 (C- 5),36,0 (COCH2), 31,9, 29,6, 29,3, 25,4 e 22,8 (5 χ CH2) e 14,6 (CH3); (ES) m/z 252,2 (M+H), 234,2 e 126,0.(0.37 g, 36%). δΗ (200 MHz, cfe-DMSO) 8.59 (1H, br s, NH), 7.82 (1H, s, H-2), 5.99 (4H, br s, 2 χ NH 2), 2, 33 (2H, t, J 7.4, NHCOCH 2), 1.50-1.68 (2H, m, CH 2), 1.13-1.40 (8H, m, 4 χ CH 2) and 0.84 ( 3H, t, J 6.6, CH3); ΔC (50 MHz, Gf6-DMSO) 173.0 (CONH), 158.2 (C-4 and C-6), 151.8 (C-2), 95.8 (C-5), 36, O (COCH 2), 31.9, 29.6, 29.3, 25.4 and 22.8 (5 χ CH2) and 14.6 (CH3); (ES) m / z 252.2 (M + H), 234.2 and 126.0.

PROCEDIMENTO GERAL PARA FECHAMENTO DE ANEL MEDIADO POR METÓXIDO DE SÓDIO DE 4,5,6-TRIAMINOPIRIMIDINAS:GENERAL PROCEDURE FOR 4,5,6-TRIAMINOPYRIMIDINE SODIUM MEASURED RING CLOSURE:

8-FENIL-9H-PURIN-6-AMINA (53) Uma solução de /V-(4,6-diaminopirimidin-5-il)benzamida 50 (0,17 g, 0,72 mmol) em metanol (0,5 cm3) foi adicionada a uma solução me- tanólica de metóxido de sódio (25 %, 6 cm3). A mistura foi aquecida a reflu- xo, e deixada agitar neste temperatura sob uma atmosfera de nitrogênio por 16h. A mistura foi esfriada para temperatura ambiente e o pH ajustado para 4 com 1M de ácido clorídrico aquoso. Um precipitado formou-se que foi fil- trado e secado para fornecer 8-fenil-9H-purin-6-amina 53 (0,12 g, 77 %). <5H (200 MHz, Gf6-DMSO) 9,13 (2H, br s, NH2), 8,55 (1H, s, H-2), 8,20-8,25 (2H, m, 2 χ arila CH) e 7,60-7,63 (3H, m, 3 χ arila CH). <5C (50 MHz, CfrDMSO) 153,5 (C-6), 152,1 (C-4), 150,8 (C-8), 146,3 (C-2), 132,2 e 130,0 (cada arila CH), 128,7 (arila C), 127,5 (arila CH) e 110,1 (C-5). ES-EM m/z 212,2 (M+H). 8-HEPTIL-9H-PURIN-6-AMINA (54)8-FENYL-9H-PURIN-6-AMINE (53) A solution of / V- (4,6-diaminopyrimidin-5-yl) benzamide 50 (0.17 g, 0.72 mmol) in methanol (0.5 cm3) was added to a mechanical solution of sodium methoxide (25%, 6 cm3). The mixture was heated to reflux and allowed to stir at this temperature under a nitrogen atmosphere for 16h. The mixture was cooled to room temperature and adjusted to pH 4 with 1 M aqueous hydrochloric acid. A precipitate formed which was filtered and dried to afford 8-phenyl-9H-purin-6-amine 53 (0.12 g, 77%). <5H (200 MHz, Gf6-DMSO) 9.13 (2H, br s, NH 2), 8.55 (1H, s, H -2), 8.20-8.25 (2H, m, 2 χ aryl CH) and 7.60-7.63 (3H, m, 3 χ aryl CH). ΔC (50 MHz, CfrDMSO) 153.5 (C-6), 152.1 (C-4), 150.8 (C-8), 146.3 (C-2), 132.2 and 130, O (each aryl CH), 128.7 (aryl C), 127.5 (aryl CH) and 110.1 (C-5). ES-MS m / z 212.2 (M + H). 8-HEPTIL-9H-PURIN-6-AMINE (54)

Preparado dé acordo com o procedimento geral descrito acima. (82 mg, 65 %). δΗ (200 MHz, ck-DMSO) 8,87 (2H, br s, NH2), 8,46 (1H, s, H- 2), 2,87 (2H, t, J 7,6, CH2(CH2)5CH3), 1,70-1,87 (2H, m, CH2), 1,17-1,23 (8H, m, 4xCH2) e 0,86 (3H, t, J 6,6, CH3); <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 157,7 (C-6), 151,3 (C-4), 150,2 (C-8), 145,4 (C-2), 110,0 (C-5), 31,8, 29,3, 29,2, 29,0, 27,7, e 22,8 (6 χ CH2) e 14,6 (CH3).Prepared according to the general procedure described above. (82 mg, 65%). δΗ (200 MHz, ck-DMSO) 8.87 (2H, br s, NH 2), 8.46 (1H, s, H -2), 2.87 (2H, t, J 7.6, CH 2 (CH 2 ) 5CH 3), 1.70-1.87 (2H, m, CH 2), 1.17-1.23 (8H, m, 4xCH 2) and 0.86 (3H, t, J 6.6, CH 3); ΔC (50 MHz, cfe-DMSO) 157.7 (C-6), 151.3 (C-4), 150.2 (C-8), 145.4 (C-2), 110.0 ( C-5), 31.8, 29.3, 29.2, 29.0, 27.7, and 22.8 (6 χ CH2) and 14.6 (CH3).

METIL 2-AMINO-6-HIDRÓXI-9H-PURIN-8-ILCARBAMATO (55)METHYL 2-AMINO-6-HYDROXY-9H-PURIN-8-ILCARBAMATE (55)

Uma mistura de sulfato de /'sotiouréia de S-metila (0,97 g, 3,48 mmols) e metilcloroformato (0,36 cm3, 4,7 mmols) em água (2 cm3) foi esfriada para O9C em um banho de gelo, e o pH ajustado para 8,0 pela adi- ção em gotas de uma solução de hidróxido de sódio aquosa a 25 %. A mis- tura foi deixada agitar durante dez minutos nesta temperatura após o qual o pH foi ajustado de volta para 5,0 com ácido acético glacial. Uma pasta de 2,4,5-tri-amino-6-hidroxipirimidina 2 (1,00 g, 4,18 mmols) em água (2 cm3) foi depois adicionada, seguido por acetato de sódio sólido (0,29 g, 4,18 mmols). A mistura de reação foi aquecida para 85QC durante 1,5h. Após este tempo a mistura foi esfriada para temperatura ambiente e o produto filtrado e secado sob vácuo para fornecer 2-amino-6-hidróxi-9H-purin-8-ilcarbamato de metila 55 (0,90 g, 96 %). <5H (200 MHz, D2O) 3,61 (3H, s, CO2CH3). MÉTODO GERAL PARA A MONOAMINAÇÃO DE 4,6- DICLOROPIRIMIDINA (56)A mixture of S-methyl / Sothiurea sulfate (0.97 g, 3.48 mmols) and methylchloroformate (0.36 cm3, 4.7 mmols) in water (2 cm3) was cooled to 0 ° C in a water bath. ice, and the pH adjusted to 8.0 by the dropwise addition of a 25% aqueous sodium hydroxide solution. The mixture was allowed to stir for ten minutes at this temperature after which the pH was adjusted back to 5.0 with glacial acetic acid. A slurry of 2,4,5-tri-amino-6-hydroxypyrimidine 2 (1.00 g, 4.18 mmol) in water (2 cm 3) was then added, followed by solid sodium acetate (0.29 g, 4.18 mmols). The reaction mixture was heated to 85 ° C for 1.5h. After this time the mixture was cooled to room temperature and the product filtered and dried under vacuum to afford methyl 2-amino-6-hydroxy-9H-purin-8-ylcarbamate (0.90 g, 96%). Δ 5H (200 MHz, D 2 O) 3.61 (3H, s, CO 2 CH 3). GENERAL METHOD FOR 4,6-DICHLOROPYRIMIDINE MONOAMINATION (56)

Uma solução de 56 em álcool isopropílico (1,0M) ou contendo a amina (2,1 eq.), ou uma mistura da amina (1,2 eq.) e trietilamina (1,2 eq.) foi fervida sob refluxo por 1-5h, até que todo o material de partida fosse consu- mido. O solvente foi tirado sob vácuo, e a massa viscosa resultante dividida entre água e acetato de etila ou diclorometano. Extração e processamento padrão, seguido por cromatografia de coluna forneceu os produtos puros.A solution of 56 in isopropyl alcohol (1.0 M) or containing the amine (2.1 eq.), Or a mixture of the amine (1.2 eq.) And triethylamine (1.2 eq.) Was boiled under reflux for 1-5h until all starting material is consumed. The solvent was removed under vacuum and the resulting viscous mass partitioned between water and ethyl acetate or dichloromethane. Extraction and standard processing followed by column chromatography provided the pure products.

6-CLORO-N-METILPIRIMIDIN-4-AMINA (57)6-Chlorine-N-methylpyrimidine-4-amine (57)

Seguindo o método geral, 56 (10,03 g, 67,12 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com cloridrato de metilamina (5,06 g, 74,97 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols), seguido por processa- mento e cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para fornecer um sólido cristalino branco, 6-cloro-N- metilpirimidin-4-amina 57 (7,26 g, 75,2 %, 99,9 % puro por HPLC). δH (200 MHz, CDCI3) 8,33 (1H, s, H-2), 6,35 (1H, s, H-5), 5,72 (1H, br s, NH) e 2,94 (3H, d, NHMe, J 5,2); <5C (50 MHz, CDCI3) 164,0 (C-6), 160,8 (C-4), 158,2 (C-2), 101,3 (br, C-5) e 28,2 (NH/We); fR 3,10 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 116 (93), 119 (32), 144 (100, M+. C5H635CIN3 requer 144) e 146 (42, M+. C5H637CIN3 requer 146).Following the general method, 56 (10.03 g, 67.12 mmols) in isopropyl alcohol (168 cm3) was treated with methylamine hydrochloride (5.06 g, 74.97 mmols) and triethylamine (10.3 cm3, 73). , 8 mmol), followed by processing and column chromatography using 1:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to afford a white crystalline solid, 6-chloro-N-methylpyrimidin-4-amine 57 ( 7.26 g, 75.2%, 99.9% pure by HPLC). δH (200 MHz, CDCl3) 8.33 (1H, s, H-2), 6.35 (1H, s, H-5), 5.72 (1H, br s, NH) and 2.94 (3H , d, NHMe, J 5.2); ΔC (50 MHz, CDCl3) 164.0 (C-6), 160.8 (C-4), 158.2 (C-2), 101.3 (br, C-5) and 28.2 ( NH / We); R 3.10 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 116 (93), 119 (32), 144 (100, M +. C5H635CIN3 requires 144) and 146 (42, M +. C5H637CIN3 requires 146).

N-BENZIL-6-CLOROPIRIMIDIN-4-AMINA (58)N-BENZYL-6-CHLOROPYRIMIDIN-4-AMINE (58)

Usando o método geral, 56 (10,04 g, 67,36 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com benzilamina (8,07 cm3, 73,84 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols), seguido por processamento e cromato- grafia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente pa- ra fornecer um sólido laranja, N-benzil-6-cloro-pirimidin-4-amina 58 (12,66 g, 85,5 %, 99,7 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCI3) 8,09 (1H, s, H-2), 7,19-7,43 (5H, m, arila H), 6,42 (1H, br s, NH), 6,36 (1H, s, H-5) e 4,50 (2H, d, PhCH2, J 5,4); δc (50 MHz, CDCI3) 163,2 (C-6), 159,7 (C-4), 158,2 (C-2), 136,8 (arila quaternária C), 128,8, 127,9 e 127,4 (arila C), 101,9 (br, C-5) e 45,6 (PhCH2); ír 14,28 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 141 (10), 201 (12), 220 (100, M+. ChH1035CIN3 requer 220), 221 (15) e 222 (30, M+. C11H1037CIN3 requer 222). 2-[(6-CLOROPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (59)Using the general method, 56 (10.04 g, 67.36 mmols) in isopropyl alcohol (168 cm3) was treated with benzylamine (8.07 cm3, 73.84 mmols) and triethylamine (10.3 cm3, 73.8). mmols) followed by work up and column chromatography using 1:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to provide an orange solid, N-benzyl-6-chloro-pyrimidin-4-amine 58 (12.66 g, 85.5%, 99.7% pure by HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCl3) 8.09 (1H, s, H-2), 7.19-7.43 (5H, m, aryl H), 6.42 (1H, br s, NH), 6.36 (1H, s, H-5) and 4.50 (2H, d, PhCH2, J 5.4); δc (50 MHz, CDCl 3) 163.2 (C-6), 159.7 (C-4), 158.2 (C-2), 136.8 (quaternary aryl C), 128.8, 127.9 and 127.4 (aryl C), 101.9 (br, C-5) and 45.6 (PhCH 2); 14.28 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 141 (10), 201 (12), 220 (100, M +. ChH1035CIN3 requires 220), 221 (15) and 222 (30, M +. C11H1037CIN3 requires 222). 2 - [(6-CHLOROPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (59)

Usando o método geral, 56 (10,08 g, 67,64 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com etanolamina (4,25 cm3, 70,48 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols), seguido por processamento e cromato- grafia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente pa- ra fornecer um sólido bege, 2-[(6-cloropirimidin-4-il)amino]etanol 59 (9,19 g, 78,3 %, 98,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCI3 + d6-DMSO) 8,22 (1H, s, H-2), 6,45 (1H, br s, NH), 6,35 (1H, s, H-5), 3,70 (2H, t, OCH2, J 5,0) e 3,41 (3H, br s, OHe NHCH2); <5C (50 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 163,8 (C-6), 158,4 (C-2 e C-4), 103,3 (br, C-5), 61,1 (OCH2) e 44,2 (NHCH2); fR 2,40 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 110 (64), 128 (100), 129 (43), 130 (32), 132 (17), 156 (100, M+ - H2O), 158 (36, M+ - H2O), 174 (68, M+. C6H835CIN3O requer 174) e 176 (23, M+. C6H837CIN3O requer 176). (2R)-2-[(6-CLOROPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]-3-FENILPROPANOATO DE ME- TILA (60)Using the general method, 56 (10.08 g, 67.64 mmols) in isopropyl alcohol (168 cm3) was treated with ethanolamine (4.25 cm3, 70.48 mmols) and triethylamine (10.3 cm3, 73.8). mmols), followed by work up and column chromatography using 1:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to provide a beige solid, 2 - [(6-chloropyrimidin-4-yl) amino] ethanol 59 (9.19 g, 78.3%, 98.9% pure by HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCl3 + d6-DMSO) 8.22 (1H, s, H-2), 6.45 (1H, br s, NH), 6.35 (1H, s, H-5), 3, 70 (2H, t, OCH 2, J 5.0) and 3.41 (3H, br s, OH and NHCH 2); ΔC (50 MHz, CDCl3 + d6-DMSO) 163.8 (C-6), 158.4 (C-2 and C-4), 103.3 (br, C-5), 61.1 (OCH2 ) and 44.2 (NHCH 2); R f 2.40 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 110 (64), 128 (100), 129 (43), 130 (32), 132 (17), 156 (100, M + - H 2 O), 158 (36, M + - H 2 O), 174 (68, M + .C6H835CIN3O requires 174) and 176 (23, M + .C6H837CIN3O requires 176). (2R) -2 - [(6-CHLOROPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] -3-METHYL PROPYROPANOATE (60)

Usando o método geral, 56 (10,04 g, 67,38 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com cloridrato de éster de metila de L- fenilalanina [recentemente preparado de L-fenilalanina (12,32 g, 74,57 mmols) em metanol (75 cm3) que foi tratado com gás de cloreto de hidrogênio] e trietilamina (19,6 cm3, 0,14 mol), seguido por processamento e cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como elu- ente para fornecer um óleo laranja, (2R)-2-[(6-cloropirimidin-4-il)amino]-3- fenilpropanoato de metila 60 (2,08 g, 11,0 %, 99,5 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCl3) 8,35 (1H, s, H-2), 7,01-7,35 (5H, m, arila H), 6,36 (1H, s, H-5), 5,79 (1H, br d, NH, J 7,6), 4,68-5,21 (1H, br m, CHCO), 3,75 (3H, s, OCH3) 3,24 (1H, dd, PhCHaHb, J 5,6 e 13,8) e 3,41 (1H, dd, PhCHaHb, J 6,4 e 14,0); <5C (50 MHz, CDCl3) 172,0 (CO), 162,1 (C-6), 159,1 (C-4), 158,3 (C- 2), 135,5 (arila quaternária C), 129,1, 128,5 e 127,1 (arila C), 103,9 (br, C-5), 54,6 (OCH3), 52,3 (PhCH2) e 37,8 (CHCO); fo 1,87 min (metanol); (ES) m/z 120 (13), 169 (17), 205 (21), 232 (100, M+ - CO2Me), 233 (28), 234 (73, M+ - CO2Me), 292 (45, M+. C14H1435CIN3O2 requer 292) e 294 (18, M+. C14H1437CIN3O2 requer 294). N-(4-BROMOFENIL)-6-CLOROPIRIMIDIN-4-AMINA (61)Using the general method, 56 (10.04 g, 67.38 mmols) in isopropyl alcohol (168 cm3) was treated with L-phenylalanine methyl ester hydrochloride [freshly prepared from L-phenylalanine (12.32 g, 74 , 57 mmols) in methanol (75 cm3) which was treated with hydrogen chloride gas] and triethylamine (19.6 cm3, 0.14 mol), followed by processing and column chromatography using 1:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to afford an orange oil, methyl (2R) -2 - [(6-chloropyrimidin-4-yl) amino] -3-phenylpropanoate 60 (2.08 g, 11.0% 99.5% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.35 (1H, s, H-2), 7.01-7.35 (5H, m, aryl H), 6.36 (1H, s, H-5), 5.79 (1H, br d, NH, J 7.6), 4.68-5.21 (1H, br m, CHCO), 3.75 (3H, s, OCH3) 3.24 (1H, dd PhCHaHb, J 5.6 and 13.8) and 3.41 (1H, dd, PhCHaHb, J 6.4 and 14.0); ΔC (50 MHz, CDCl 3) 172.0 (CO), 162.1 (C-6), 159.1 (C-4), 158.3 (C-2), 135.5 (quaternary aryl C) , 129.1, 128.5 and 127.1 (aryl C), 103.9 (br, C-5), 54.6 (OCH3), 52.3 (PhCH2) and 37.8 (CHCO); mp 1.87 min (methanol); (ES) m / z 120 (13), 169 (17), 205 (21), 232 (100, M + - CO2 Me), 233 (28), 234 (73, M + - CO2 Me), 292 (45, M +. C14H1435CIN3O2 requires 292) and 294 (18, M +. C14H1437CIN3O2 requires 294). N- (4-BROMOPHENYL) -6-CHLOROPYRIMIDIN-4-AMINE (61)

Usando o método geral, 56 (9,98 g, 67,01 mmols) em álcool iso- propílico (168 cm3) foi tratado com 4-bromoanilina (12,10 g, 69,50 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols). Após aquecer, foi adicionado um volume igual de água e acetato de etila, e a suspensão resultante filtrada para ren- der um pó bege, /V-(4-bromo-fenil)-6-cloropirimidin-4-amina 61 (12,73 g, 67,0 %, > 99,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,11 (1H, br s, H-2), 8,05 (1H, s, NH), 7,17 (2H, d, arila H, J 8,8), 7,05 (2H, d, arila H, J 9,0) e 6,40 (1H, s, H-5); <5C (50 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 169,4 (C-6), 161,9 (C-4), 158,1 (Ο- 2), 137,6 (arila quaternária C), 131,7 e 122,7 (arila C), 116,3 (arila quaterná- ria C) e 104,6 (C-5); tR 2,15 min (metanol); (ES) m/z 204 (80), 205 (100, M+ - Br), 206 (42), 207 (35), 210 (10), 213 (10), 259 (10), 284 (78, M+. CioH779Br35CIN3 requer 284), 286 (100, M+. Ci0H78IBr35CIN3 requer 286) e 288 (29).Using the general method, 56 (9.98 g, 67.01 mmols) in isopropyl alcohol (168 cm3) was treated with 4-bromoaniline (12.10 g, 69.50 mmols) and triethylamine (10.3 cm3). , 73.8 mmol). After heating, an equal volume of water and ethyl acetate was added, and the resulting suspension filtered to yield a beige, N- (4-bromo-phenyl) -6-chloropyrimidin-4-amine 61 powder (12, 73 g, 67.0%,> 99.9% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 9.11 (1H, br s, H-2), 8.05 (1H, s, NH), 7.17 (2H, d, aryl H, J 8.8), 7 0.05 (2H, d, aryl H, J 9.0) and 6.40 (1H, s, H-5); ΔC (50 MHz, CDCl3 + d6-DMSO) 169.4 (C-6), 161.9 (C-4), 158.1 (δ-2), 137.6 (quaternary aryl C), 131, 7 and 122.7 (aryl C), 116.3 (quaternary aryl C) and 104.6 (C-5); t R 2.15 min (methanol); (ES) mlz 204 (80), 205 (100, M + - Br), 206 (42), 207 (35), 210 (10), 213 (10), 259 (10), 284 (78, M + C10H779Br35CIN3 requires 284), 286 (100, M + .C10H78IBr35CIN3 requires 286) and 288 (29).

6-CLORO-N-METIL-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-AMINA (62)6-CHLORINE-N-METHYL-5-NITROSOPYRIMIDIN-4-AMINE (62)

Seguindo o método geral, cloreto 57 (7,26 g, 50,58 mmols) em ácido acético (25 cm3) foi tratado com uma solução de nitrito de sódio (6,31 g, 91,38 mmols) em água (84 cm3) a gotas por 30 minutos. O sólido que formou após 2h foi isolado para fornecer um pó amarelo, 6-cloro-N- metil-5-nitrosopirimidin-4-amina 62 (7,68 g, 88 %, 97,4 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,83 (1H, s, H-2), 8,06 (1H, s, NH) e 3,45 (3H, s, NHMe)] <5C (50 MHz, CDCI3) 161,9 (C-4 e C-6), 158,4 (C-2), 107,9 (C-5) e 27,6 (NH- Me)] íR 9,10 min (50 % de metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 130 (18, C4H435CIN3), 143 (39), 144 (100, M+ -NO), 145 (21), 146 (33, M+ - NO) e 173 (1, M+. C5H535CIZV4O requer 173)Following the general method, chloride 57 (7.26 g, 50.58 mmols) in acetic acid (25 cm3) was treated with a solution of sodium nitrite (6.31 g, 91.38 mmols) in water (84 cm3). ) drops for 30 minutes. The solid formed after 2h was isolated to give a yellow powder, 6-chloro-N-methyl-5-nitrosopyrimidin-4-amine 62 (7.68 g, 88%, 97.4% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.83 (1H, s, H-2), 8.06 (1H, s, NH) and 3.45 (3H, s, NHMe)] ≤ 5C (50 MHz, CDCl3) 161.9 (C-4 and C-6), 158.4 (C-2), 107.9 (C-5) and 27.6 (NH-Me)] R 9.10 min (50% methanol : 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 130 (18, C4H435CIN3), 143 (39), 144 (100, M + -NO), 145 (21), 146 (33, M + - NO) and 173 (1, M +. C5H535CIZV4O requires 173 )

N-BENZIL-6-CLORO-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-AMINA (63)N-BENZYL-6-CHLORINE-5-NITROSOPYRIMIDIN-4-AMINE (63)

Usando o método geral, cloreto 58 (12,48 g, 56,82 mmols) em ácido clorídrico concentrado (28 cm3) foi tratado com uma solução de nitrito de sódio (7,11 g, 0,10 mol) em água (95 cm3) a gotas por 30 minutos. O sóli- do que depositou por 18h foi isolado para fornecer um pó bege pálido, N- benzil-6-cloro-5-nitrosopirimidin-4-amina 63 (12,75 g, 90,2 %, 96,3 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,91 (1H, br s, H-2), 8,08 (1H, s, NH), 7,29 (5Η, br s, arila Η) e 5,37 (2H, s, PhCH2); <5C (50 MHz1 CDCI3) 162,1 (C-4 e C- 6), 158,4 (C-2), 134,2 (arila quaternária C), 128,6, 128,3 e 127,9 (arila C), 108,0 (C-5) e 43,6 (PhCH2); fo 2,12 min (metanol); (ES) m/z 106 (12), 218 (80, ChH935CIN3), 219 (65), 220 (100, ChH937CIN3), 221 (26) e 222 (23). No M+ (C11H935CIAfo requer 249).Using the general method, 58 chloride (12.48 g, 56.82 mmols) in concentrated hydrochloric acid (28 cm3) was treated with a solution of sodium nitrite (7.11 g, 0.10 mol) in water (95 cm3) to drops for 30 minutes. The solid deposited for 18h was isolated to give a pale beige powder, N-benzyl-6-chloro-5-nitrosopyrimidin-4-amine 63 (12.75 g, 90.2%, 96.3% pure by HPLC). <5h (200 MHz, CDCl 3) 8.91 (1H, br s, H-2), 8.08 (1H, s, NH), 7.29 (5 (, br s, aryl Η) and 5.37 ( 2H, s, PhCH 2); ΔC (50 MHz1 CDCl3) 162.1 (C-4 and C-6), 158.4 (C-2), 134.2 (quaternary aryl C), 128.6, 128.3 and 127.9 ( aryl C), 108.0 (C-5) and 43.6 (PhCH 2); mp 2.12 min (methanol); (ES) m / z 106 (12), 218 (80, ChH935CIN3), 219 (65), 220 (100, ChH937CIN3), 221 (26) and 222 (23). No M + (C11H935CIAfo requires 249).

2-[(6-CLORO-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (64)2 - [(6-CHLOR-5-NITROSOPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (64)

Usando o método geral, cloreto 59 (9,19 g, 52,96 mmols) em ácido acético (26 cm3) foi tratado com uma solução de nitrito de sódio (6,65 g, 96,32 mois) em água (132 cm3) a gotas por 30 minutos. Os sólidos que formaram por 18h foram isolados, e a solução extraída com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com 2 M de hidróxido de sódio aquoso e parcialmente concentrada em um óleo laranja. Esta foi semeada, e combi- nada com os sólidos filtrados para fornecer um pó laranja pálido, 2-{(6-cloro- 5-nitroso-pirimidin-4-il)amino]etanol 64 (8,54 g, 79,6 %, 86,0 % puro por H- PLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,86 (1H, br s, H-2), 8,05 (1H, s, NH), 4,36 (2H, t, OCH2, J 5,5), 3,73 (2H, t, NHCH2, J 5,6) e 2,25 (1H, br s, OH)\ õc (50 MHz, CDCI3) 162,5 (C-6), 158,2 (C-2 e C-4), 108,1 (C-5), 59,6 (OCH2) e 42,7 (NH- CH2); /r 4,52 min (metanol); (ES) m/z 130 (24), 142 (95), 143 (100, C5H635CIN3), 144 (36), 145 (32), 156 (10, C6H735CIN3), 172 (29), 174 (64, C6H837CIN3O), 176 (16) e 203 (13, M+. C6H735CIZV4O2 requer 203). MÉTODO GERAL PARA A NITROZAÇÃO DE PIRIMIDINASUsing the general method, chloride 59 (9.19 g, 52.96 mmols) in acetic acid (26 cm3) was treated with a solution of sodium nitrite (6.65 g, 96.32 mo) in water (132 cm3). ) drops for 30 minutes. The solids that formed for 18h were isolated, and the solution extracted with ethyl acetate. The organic phase was washed with 2 M aqueous sodium hydroxide and partially concentrated to an orange oil. This was seeded, and combined with the filtered solids to afford a pale orange, 2 - {(6-chloro-5-nitroso-pyrimidin-4-yl) amino] ethanol 64 (8.54 g, 79.6 %, 86.0% pure by H-PLC). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.86 (1H, br s, H-2), 8.05 (1H, s, NH), 4.36 (2H, t, OCH2, J 5.5), 3 , 73 (2H, t, NHCH 2, J 5.6) and 2.25 (1H, br s, OH) δc (50 MHz, CDCl 3) 162.5 (C-6), 158.2 (C-2 and C-4), 108.1 (C-5), 59.6 (OCH 2) and 42.7 (NH-CH 2); δ 4.52 min (methanol); (ES) m / z 130 (24), 142 (95), 143 (100, C5H635CIN3), 144 (36), 145 (32), 156 (10, C6H735CIN3), 172 (29), 174 (64, C6H837CIN3O ), 176 (16), and 203 (13, M + .C6H735CIZV4O2 requires 203). GENERAL METHOD FOR PYRIMIDINE NITROZATION

Uma solução da pirimidina em ácido acético ou ácido clorídrico (2M) foi tratada a gotas com uma solução de nitrito de sódio (1,8 eq.) em água (6,3M). Evolução de um gás marrom ocorre durante adição, e um pre- cipitado sólido formou-se com o passar do tempo. O sólido é separado por filtração, lavado com água e secado sob sucção. N,N,N'-TRIMETIL-5-NITROSOPIRIMIDINO-4,6-DIAMINA (65)A solution of pyrimidine in acetic acid or hydrochloric acid (2M) was treated dropwise with a solution of sodium nitrite (1.8 eq.) In water (6.3M). Evolution of a brown gas occurs during addition, and a solid precipitate has formed over time. The solid is filtered off, washed with water and dried under suction. N, N, N'-TRIMETHYL-5-NITROSOPYRIMIDINE-4,6-DIAMINE (65)

Uma mistura de pirimidina 62 (0,97 g, 5,65 mmols) em dicloro- metano (2,9 cm3) foi tratada com dimetilamina (33 % em álcool, 1,74 cm3, 12,75 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada durante 18h em temperatura ambiente. A solução laranja resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo, N,N,N'-trimetil-5-nitroso-pirimidino-4,6-diamina 65 (0,60 g, 59,0). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,52 (1H, s, H-2), 7,02 (1H, s, NH), 3,47 (3H, s, NCH3) e 3,18 [H, s, N(CH3)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 163,1 (C-6), 160,1 (C-4), 157,4 (C- 2), 87,4 (C-5), 37,5 [N(CH3)2] e 28,0 (NHCH3).A mixture of pyrimidine 62 (0.97 g, 5.65 mmol) in dichloromethane (2.9 cm3) was treated with dimethylamine (33% in alcohol, 1.74 cm3, 12.75 mmols) resulting in in spontaneous heating. The mixture was stirred for 18h at room temperature. The resulting orange solution was purified by column chromatography using 1:10 - 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to yield a yellow solid, N, N, N'-trimethyl-5-nitroso- pyrimidine-4,6-diamine 65 (0.60 g, 59.0). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.52 (1H, s, H-2), 7.02 (1H, s, NH), 3.47 (3H, s, NCH3) and 3.18 [H, s , N (CH 3) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 163.1 (C-6), 160.1 (C-4), 157.4 (C-2), 87.4 (C-5), 37.5 [N ( CH3) 2] and 28.0 (NHCH3).

N-BENZIL-N',N'-DIMETIL-5-NITROSOPIRIMIDIN-4,6-DIAMINA (66)N-BENZYL-N ', N'-DIMETHYL-5-NITROSOPYRIMIDIN-4,6-DIAMINE (66)

Em um método similar a 65, uma mistura de pirimidina 63 (0,51 g, 2,04 mmols) em diclorometano (1 cm3) foi tratada com dimetilamina (33 % em álcool, 1,00 cm3, 7,32 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada por 2h em temperatura ambiente. A solu- ção laranja resultante foi purificada através de cromatografia de coluna u- sando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo pálido, 4-benzilamino-6-dimetilamino-5-nitrosopirimidina 66 (0,48 g, 90,7 %, 99,6 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,57 (1H, s, H-2), 7,21-7,31 (5H, m, arila H), 7,05 (1H, s, NH), 5,39 (2H, s, PhCH2) e 3,18 [6H, s, N(CH3)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 163,2 (C-6), 159,9 (C-4), 157,5 (C-2), 135,1 (arila quaternária C), 128,3, 128,2 e 127,4 (arila C), 87,6 (C-5), 43,7 (PhCH2) e 37,5 [N(CH3)2]; fR 2,17 min (metanol); (ES) m/z 105 (12), 123 (31), 151 (11), 199 (12), 227 (94), 228 (100, C13Hi6ZV*), 229 (83) e 258 (1, MH+. Ci3H16N5O requer 258).In a method similar to 65, a mixture of pyrimidine 63 (0.51 g, 2.04 mmol) in dichloromethane (1 cm3) was treated with dimethylamine (33% in alcohol, 1.00 cm3, 7.32 mmol) at drops resulting in spontaneous heating. The mixture was stirred for 2h at room temperature. The resultant orange solution was purified by column chromatography using 1:10 - 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to yield a pale yellow solid, 4-benzylamino-6-dimethylamino. 5-nitrosopyrimidine 66 (0.48 g, 90.7%, 99.6% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.57 (1H, s, H-2), 7.21-7.31 (5H, m, aryl H), 7.05 (1H, s, NH), 5, 39 (2H, s, PhCH 2) and 3.18 [6H, s, N (CH 3) 2]; Δ C (50 MHz, CDCl 3) 163.2 (C-6), 159.9 (C-4), 157.5 (C-2), 135.1 (quaternary aryl C), 128.3, 128, 2 and 127.4 (aryl C), 87.6 (C-5), 43.7 (PhCH 2) and 37.5 [N (CH 3) 2]; R f 2.17 min (methanol); (ES) m / z 105 (12), 123 (31), 151 (11), 199 (12), 227 (94), 228 (100, C 13 H 16 ZV *), 229 (83) and 258 (1, MH +. C13 H16 N5 O requires 258).

2-{[6-(DIMETILAMINO)-5-NITROSO-PIRIMIDIN-4-IL]AMINO}ETANOL (67)2 - {[6- (DIMETHYLAMINO) -5-NITROSO-PYRIMIDIN-4-IL] AMINO} ETHANOL (67)

Em um método similar a 65, uma mistura de pirimidina 64 (1,02 g, 5,03 mmols) em diclorometano (2,5 cm3) foi tratada com dimetilami- na (33 % em álcool, 1,48 cm3, 10,86 mmols) a gotas, resultando em aqueci- mento espontâneo. A mistura foi agitada durante 18h em temperatura ambi- ente. A solução laranja resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo, 2-{[6-(dimetilamino)-5-nitroso-pirimidin-4- il]amino}etanol 67 (0,76 g, 72,0 %, 99,5 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,48 (1H, s, H-2), 6,97 (1H, s, NH), 4,30 (2H, t, OCH2, J 4,9), 3,69 (2H, t, NHCH2, J 4,9) e 3,19 [6H, s, N(CH3)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 163,1 (C- 6), 159,9 (C-4), 157,0 (C-2), 88,0 (C-5), 60,3 (OCH2), 44,1 (NHCH2) e 37,5 [N(CH3)2]; tr 3,87 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 151 (100, C7H11N4), 152 (14), 182 (10, C8H14Afo) e 183 (25). No M+ (C8H13N5O2 requer 211).In a method similar to 65, a mixture of pyrimidine 64 (1.02 g, 5.03 mmol) in dichloromethane (2.5 cm3) was treated with dimethylamine (33% in alcohol, 1.48 cm3, 10, 86 mmoles) in drops, resulting in spontaneous heating. The mixture was stirred for 18h at room temperature. The resulting orange solution was purified by column chromatography using 1:10 - 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to yield a yellow, 2 - {[6- (dimethylamino) -5-nitrous solid -pyrimidin-4-yl] amino} ethanol 67 (0.76 g, 72.0%, 99.5% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.48 (1H, s, H-2), 6.97 (1H, s, NH), 4.30 (2H, t, OCH2, J 4.9), 3.69 (2H, t, NHCH 2, J 4.9) and 3.19 [6H, s, N (CH 3) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 163.1 (C-6), 159.9 (C-4), 157.0 (C-2), 88.0 (C-5), 60.3 (OCH2) , 44.1 (NHCH 2) and 37.5 [N (CH 3) 2]; RT 3.87 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 151 (100, C7H11N4), 152 (14), 182 (10, C8H14Afo) and 183 (25). No M + (C8H13N5O2 requires 211).

N-METIL-5-NITROSO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (68)N-METHYL-5-NITROSO-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (68)

Uma mistura de pirimidina pura 62 (0,97 g, 5,61 mmols) e pirroli- dina (1,16 cm3, 13,91 mmols) foi aquecida para 1509C por 1h. A solução pre- ta resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido ama- relo, N-metil-5-nitroso-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 68 (0,97 g, 83,1 %, 99,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,44 (1H, s, H-2), 6,80 (1H, s, NH), 3,48 [4H, br s, N(CH2)2], 3,40 (3H, s, NHCH3) e 1,78-2,13 [4H, br m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 160,7 (C-6), 159,5 (C-4), 157,8 (C-2), 88,1 (C- 5), 46,5 [N(CH2)2], 27,8 (NHCH3) e 25,1 [(CH2)2]; tR 11,57 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 123 (12), 149 (15), 150 (51), 177 (49, M+ -NO), 178 (89, MH+ -NO), 179 (100), 180 (10) e 208 (1, MH+. C9H13N5O requer 208).A mixture of pure pyrimidine 62 (0.97 g, 5.61 mmol) and pyrrolidine (1.16 cm 3, 13.91 mmol) was heated to 150 ° C for 1h. The resulting black solution was purified by column chromatography using 1:10 - 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to yield a yellow solid, N-methyl-5-nitrous-6. -pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 68 (0.97 g, 83.1%, 99.9% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.44 (1H, s, H-2), 6.80 (1H, s, NH), 3.48 [4H, br s, N (CH2) 2], 3.40 (3H, s, NHCH 3) and 1.78-2.13 [4H, br m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz, CDCl 3) 160.7 (C-6), 159.5 (C-4), 157.8 (C-2), 88.1 (C-5), 46.5 [N (CH 2 ) 2], 27.8 (NHCH 3) and 25.1 [(CH 2) 2]; t R 11.57 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) mlz 123 (12), 149 (15), 150 (51), 177 (49, M + -NO), 178 (89, MH + -NO), 179 (100), 180 (10) and 208 (1, MH +. C 9 H 13 N 5 O requires 208).

N-BENZIL-5-NITROSO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (69)N-BENZYL-5-NITROSO-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (69)

Uma mistura de pirimidina 63 (0,50 g, 2,00 mmols) em dicloro- metano (1 cm3) foi tratada com pirrolidina (0,34 cm3, 4,02 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada durante 10 minutos em temperatura ambiente. A solução marrom resultante foi purifi- cada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo pálido, N-benzil-5- nitroso-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 69 (0,53 g, 94,1 %, 96,6 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,56 (1H, s, H-2), 7,15-7,31 (5H, m, arila H), 6,90 (1H, s, NH), 5,39 (2H, s, PhCH2), 3,53 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,87-2,21 [4H, br m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 160,9 (C-6), 159,4 (C-4), 157,7 (C-2), 135,1 (arila quaternária C), 128,3, 128,1 e 127,3 (arila C), 88,5 (C-5), 46,7 [N(CH2)2], 43,6 (PhCH2) e 25,2 [(CH2)2]; fR 2,28 min (metanol); (ES) m/z 149 (17), 226 (22), 253 (78, M+ -NO), 254 (100, MH+ -NO), 255 (86), 256 (14) e 284 (1, MH+. C15H18N5O requer 284).A mixture of pyrimidine 63 (0.50 g, 2.00 mmol) in dichloromethane (1 cm3) was treated with pyrrolidine (0.34 cm3, 4.02 mmol) dropwise, resulting in spontaneous heating. The mixture was stirred for 10 minutes at room temperature. The resulting brown solution was purified by column chromatography using 1:10 - 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to yield a pale yellow solid, N-benzyl-5-nitrous-6- pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 69 (0.53 g, 94.1%, 96.6% pure by HPLC). <5h (200 MHz, CDCl 3) 8.56 (1H, s, H-2), 7.15-7.31 (5H, m, aryl H), 6.90 (1H, s, NH), 5, 39 (2H, s, PhCH 2), 3.53 [4H, br s, N (CH 2) 2] and 1.87-2.21 [4H, br m, (CH 2) 2]; Δ C (50 MHz, CDCl 3) 160.9 (C-6), 159.4 (C-4), 157.7 (C-2), 135.1 (quaternary aryl C), 128.3, 128, 1 and 127.3 (aryl C), 88.5 (C-5), 46.7 [N (CH 2) 2], 43.6 (PhCH 2) and 25.2 [(CH 2) 2]; R f 2.28 min (methanol); (ES) mlz 149 (17), 226 (22), 253 (78, M + -NO), 254 (100, MH + -NO), 255 (86), 256 (14) and 284 (1, MH +. C15H18N5O requires 284).

2-[(5-NITROSO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (70) Em um procedimento similar a 68, uma mistura de pirimidina pu- ra 64 (0,96 g, 4,76 mmols) e pirrolidina (0,98 cm3, 11,85 mmols) foi aquecida para 150°C durante 1h. A solução preta resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para fornecer um sólido bege, 2-[(5-nitroso-6-pirrolidin-1- ilpirimidin-4-il)amino]etanol 70 (0,41 g, 36,6 %, 99,7 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,49 (1H, s, H-2), 6,84 (1H, s, NH), 4,31 (2H, ~t, OCH2, J 4,8), 3,70 (2H, ~t, NHCH2, J 4,9), 3,11-3,85 [4H, br m, N(CH2)2] e 1,82-2,23 [4H, br m, (CH2)2]; δC (50 MHz, CDCI3) 160,9 (C-6), 159,5 (C-4), 157,3 (C-2), 89,0 (C-5), 60,4 (OCH2), 46,8 [br, N(CH2)2], 44,1 (NHCH2) e 25,3 [br, (CH2)2]; ír 6,43 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).2 - [(5-NITROSO-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (70) In a procedure similar to 68, a mixture of pyrimidine pure 64 (0.96 g, 4.76 mmols) and pyrrolidine (0.98 cm 3, 11.85 mmols) was heated to 150 ° C for 1h. The resulting black solution was purified by column chromatography using 1:10 - 3:10 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent to afford a beige solid, 2 - [(5-nitrous-6-pyrrolidin-1 - ylpyrimidin-4-yl) amino] ethanol 70 (0.41 g, 36.6%, pure 99.7% by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.49 (1H, s, H-2), 6.84 (1H, s, NH), 4.31 (2H, t, OCH2, J 4.8), 3, 70 (2H, t, NHCH 2, J 4.9), 3.11-3.85 [4H, br m, N (CH 2) 2] and 1.82-2.23 [4H, br m, (CH 2 )2]; δC (50 MHz, CDCl3) 160.9 (C-6), 159.5 (C-4), 157.3 (C-2), 89.0 (C-5), 60.4 (OCH2), 46.8 [br, N (CH 2) 2], 44.1 (NHCH 2) and 25.3 [br, (CH 2) 2]; 6.43 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate).

N-BENZIL-6-MORFOLIN-4-ÍI-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-AMINA (71)N-BENZYL-6-MORFOLIN-4-HI-5-NITROSOPYRIMIDIN-4-AMINE (71)

Em um método similar a 66, uma mistura de pirimidina 58 (1,46 g, 5,87 mmols) em diclorometano (10 cm3) foi tratada com morfolina (1,23 g, 14,1 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A solução a- marela profunda resultante foi vertida em acetato de etila (20 cm3) e lavada com um volume igual de água. O solvente foi removido para gerar um sólido pegajoso que foi triturado em hexano. N-benzil-6-morfolin-4-il-5- nitrosopirimidin-4-amina 71 foi colhida como um sólido amarelo através de filtração [1,42g, 85 %, Rf 0,43 em 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano]. δH (200 MHz, CDCI3) 8,60 (1H, s, H-2), 7,26 (5H, br s, arila H), 7,14 (1H, s, NH), 5,39 (2H, s, PhCH2), 3,80 (4H, m, 2 χ OCH2) e 3,72 (4H, m, 2 χ NCH2); δC (50 MHz, CDCI3) 163,5 (C-6), 161,0 (C-4), 157,5 (C-2), 135,0 (arila quaterná- ria C), 128,7, 128,5 e 127,7 (arila C), 87,8 (C-5), 66,5 (2 χ OCH2), 45,0 (2 χ NCH2) e 43,5 (PhCH2).In a method similar to 66, a mixture of pyrimidine 58 (1.46 g, 5.87 mmols) in dichloromethane (10 cm3) was treated with morpholine (1.23 g, 14.1 mmols) dropwise, resulting in heating. spontaneous. The mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting deep yellow solution was poured into ethyl acetate (20 cm 3) and washed with an equal volume of water. The solvent was removed to give a sticky solid which was triturated in hexane. N-Benzyl-6-morpholin-4-yl-5-nitrosopyrimidin-4-amine 71 was collected as a yellow solid by filtration [1.42g, 85%, Rf 0.43 in 1: 1 (v / v) ethyl acetate: hexane]. δH (200 MHz, CDCl3) 8.60 (1H, s, H-2), 7.26 (5H, br s, aryl H), 7.14 (1H, s, NH), 5.39 (2H, s, PhCH 2), 3.80 (4H, m, 2 χ OCH 2) and 3.72 (4H, m, 2 χ NCH 2); δC (50 MHz, CDCl 3) 163.5 (C-6), 161.0 (C-4), 157.5 (C-2), 135.0 (quaternary aryl C), 128.7, 128 , 5 and 127.7 (aryl C), 87.8 (C-5), 66.5 (2 χ OCH2), 45.0 (2 χ NCH2) and 43.5 (PhCH2).

PROCEDIMENTO GERAL PARA REDUÇÃO DE NITROSO: N4-BENZIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (76) N-benzil-5-nitroso-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 69 (0,41 g, 1,45 mmol) foi suspensa em água (1,45 cm3) e tratada com ditionita de sódio sólido (0,53 g, 3,04 mmols) que foi adicionada em porções. Ácido sulfúrico aquoso (50 % v/v, 4,08 g) foi adicionado a gotas, e a mistura resultante foi aquecida para 130°C com agitação durante 5 minutos. A mistura de reação ficou incolor de novo nesta hora, e foi esfriada em gelo. O pH da mistura foi ajustado para > 10 com 2M de róxido de sódio aquoso, e extraído com diclorometano (3 χ 50 cm3). Os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida, e o produto bruto recristalizado de diclorometano/hexano para ren- der A^-benzil-6-pirrolidin-1-ilpirimidino-4,5-diamina 76 (0,34 g, 87 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,10 (1H,s,H-2),7,25-7,35 (5H, m, arila H), 5,35 (1H, br s, NH2), 5,14 (1H, s, NH2), 4,41 (2H, d, J 5,8, CH2Ph), 3,36 (4H, br s, 2 χ CH2N) e 1,90-1,96 (4H, m, 2 χ CH2CH2N); <5C (50 MHz1 CDCI3) 162,5 (C-4)a, 160,9 (C-6)a, 157,9 (C-2), 138,7 (arila quaternária C), 128,7, 127,6 e 127,5 (arila C), 80,9 (C-5), 46,4 (2 χ CH2N), 46,1 (CH2Ph) e 25,5 (2 χ CH2CH2N); (ES) m/z 255,2 [(M-N)+H], 228,2 163,1 e 138,0.GENERAL NITROUS REDUCTION PROCEDURE: N4-BENZYL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDINE-4,5-DIAMINE (76) N-Benzyl-5-nitrous-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 69 (0, 41 g, 1.45 mmol) was suspended in water (1.45 cm 3) and treated with solid sodium dithionite (0.53 g, 3.04 mmol) which was added portionwise. Aqueous sulfuric acid (50% v / v, 4.08 g) was added dropwise, and the resulting mixture was heated to 130 ° C with stirring for 5 minutes. The reaction mixture was colorless again at this time, and was cooled in ice. The pH of the mixture was adjusted to> 10 with 2M aqueous sodium oxide, and extracted with dichloromethane (3 χ 50 cm3). The combined organic extracts were concentrated under reduced pressure, and the crude product recrystallized from dichloromethane / hexane to yield N-benzyl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidine-4,5-diamine 76 (0.34 g, 87%). ). <5h (200 MHz, CDCl 3) 8.10 (1H, s, H-2), 7.25-7.35 (5H, m, aryl H), 5.35 (1H, br s, NH 2), 5 , 14 (1H, s, NH 2), 4.41 (2H, d, J 5.8, CH 2 Ph), 3.36 (4H, br s, 2 χ CH 2 N) and 1.90-1.96 (4H, m, 2 (CH 2 CH 2 N); ΔC (50 MHz1 CDCl3) 162.5 (C-4) α, 160.9 (C-6) α, 157.9 (C-2), 138.7 (quaternary aryl C), 128.7, 127 , 6 and 127.5 (aryl C), 80.9 (C-5), 46.4 (2 χ CH 2 N), 46.1 (CH 2 Ph) and 25.5 (2 χ CH 2 CH 2 N); (ES) m / z 255.2 [(M-N) + H], 228.2 163.1 and 138.0.

Os compostos a seguir foram preparados por este método: N4,N4,N6,-TRIMETILPIRIMIDINO-4,5,6-TRIAMINA (72) (31 mg, 81 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 5,28 (1H,The following compounds were prepared by this method: N4, N4, N6, -TRIMETHYLPYRIMIDINE-4,5,6-TRIAMINE (72) (31 mg, 81%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.16 (1H, s, H-2), 5.28 (1H,

s, NH2), 4,82 (1H, br s, NH2), 3,09 [6H, s, N(CH3)2] e 2,89 [H, d, J 5,4, N(CH3)2].s, NH 2), 4.82 (1H, br s, NH 2), 3.09 [6H, s, N (CH 3) 2] and 2.89 [H, d, J 5.4, N (CH 3) 2 ].

N6-BENZIL-N4,N4-DIMETILPIRIMIDINO-4,5,6-TRIAMINA (73) (91,9 mg, 80 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 7,26- 7,35 (5H, m, arila H), 5,30 (1H, s, NH2), 5,10 (1H, br s, NH2), 4,45 (2H, d, J 5,8, CH2Ph), 3,01 (6H, s, 2 χ NCH3) e 1,78 (1H, br s, NH); õc (50 MHz1 CD- Cl3) 163,0 (C-4 e C-6), 157,6 (C-2), 138,7 (arila quaternária C), 128,8 e 127,5 (arila C), 80,2 (C-5), 46,0 (CH2Ph) e 37,4 (2 χ NCH3); (ES) m/z 229,2 [(M- N)+H], 202,1, 137,1 e 138,0.N6-BENZYL-N4, N4-DIMETHYLPYRIMIDINE-4,5,6-TRIAMINE (73) (91.9 mg, 80%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.16 (1H, s, H-2), 7.26-7.35 (5H, m, aryl H), 5.30 (1H, s, NH2), 5.10 (1H, br s, NH 2), 4.45 (2H, d, J 5.8, CH 2 Ph), 3.01 (6H, s, 2 χ NCH 3) and 1.78 (1H, br s, NH); δc (50 MHz1 CD-Cl3) 163.0 (C-4 and C-6), 157.6 (C-2), 138.7 (quaternary aryl C), 128.8 and 127.5 (aryl C) 80.2 (C-5), 46.0 (CH 2 Ph) and 37.4 (2 χ NCH 3); (ES) m / z 229.2 [(M-N) + H], 202.1, 137.1 and 138.0.

2-[5-AMINO-6-(DIMETILAMINO)PIRIMIDIN-4-IL]AMINOETANOL (74) (0,29 g, 54 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,15 (1H, s, H-2), 5,36 (1H, s, NH2), 5,00 (1H, br s, NH2), 3,80 (2H, t, J 4,9, CH2OH), 3,42-3,50 (2H, m, CH2NH), 3,05 (6H, s, 2 χ NCH3) e 2,87 (1H, br s, NH); <5C (50 MHz, CDCI3) 162,9 (C-4)a, 162,0 (C-6)a, 157,3 (C-2), 80,9 (C-5), 62,9 (CH2OH), 44,8 (CH2NH) e 37,5 (2 χ NCH3); (ES) m/z 183,1 [(M-N)+H], 165,1, 139,0 e 110,9. -METIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (75)2- [5-AMINO-6- (DIMETHYLAMINO) PYRIMIDIN-4-IL] AMINOETHANOL (74) (0.29 g, 54%). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.15 (1H, s, H-2), 5.36 (1H, s, NH 2), 5.00 (1H, br s, NH 2), 3.80 (2H, t, J 4.9, CH 2 OH), 3.42-3.50 (2H, m, CH 2 NH), 3.05 (6H, s, 2 χ NCH 3) and 2.87 (1H, br s, NH); Δ 5C (50 MHz, CDCl 3) 162.9 (C-4) a, 162.0 (C-6) a, 157.3 (C-2), 80.9 (C-5), 62.9 ( CH 2 OH), 44.8 (CH 2 NH) and 37.5 (2 x NCH 3); (ES) m / z 183.1 [(M-N) + H], 165.1, 139.0 and 110.9. -METHYL-6-PYROLIDIN-1-LYPYRIMIDINE-4,5-DIAMINE (75)

(0,66 g, 86 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,11 (1H, s, H-2), 5,13 (1H, s, NH2), 4,76 (1 x, br s, NH2), 3,36-3,48 (4H, m, 2 x CH2N), 2,85 (3H, d, J 5,4, NCH3) e 1,94-2,00 (4H, m, 2 x CH2CH2N); õc (50 MHz, CDCl3) 163,4 (C-4)a, 161,8 (C-6)a, 157,8 (C-2), 79,9 (C-5), 46,5 (2 x CH2N), 28,7 (NCH3)b e 25,5 (2 x CH2CH2N)b; (ES) m/z 179,1 [(M-N)+H], 137,0 e 120,9.(0.66 g, 86%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.11 (1H, s, H-2), 5.13 (1H, s, NH 2), 4.76 (1 x, br s, NH 2), 3.36-3, 48 (4H, m, 2 x CH 2 N), 2.85 (3H, d, J 5.4, NCH 3) and 1.94-2.00 (4H, m, 2 x CH 2 CH 2 N); δc (50 MHz, CDCl 3) 163.4 (C-4) a, 161.8 (C-6) a, 157.8 (C-2), 79.9 (C-5), 46.5 (2 x CH 2 N), 28.7 (NCH 3) b and 25.5 (2 x CH 2 CH 2 N) b; (ES) m / z 179.1 [(M-N) + H], 137.0 and 120.9.

2-[(5-AMINO-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (77) (0,23 g, 71 %). dx (200 MHz, CDCl3) 8,12 (1H, s, H-2), 5,22 (1x, s, NH2), 5,06 (1H, br s, NH2), 3,79 (2H, t, J 4,9, CH2OH), 3,30-3,48 (7H, m, CH2NH, 2 x CH2N e NH) e 1,94-2,01 (4H, m, 2 x CH2CH2N); <5C (50 MHz, CDCl3) 162,6 (C-4)a, 160,7 (C-6)a, 157,5 (C-2), 81,4 (C-5), 62,5 (CH2OH), 46,5 (2 x CH2N), 44,7 (CH2NH) e 25,5 (2 x CH2CH2N); (ES) m/z 209,1 [(M- N)+H], 191,1, 182,1, 165,1 e 138,0.2 - [(5-AMINO-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (77) (0.23 g, 71%). dx (200 MHz, CDCl 3) 8.12 (1H, s, H-2), 5.22 (1x, s, NH 2), 5.06 (1H, br s, NH 2), 3.79 (2H, t , 4.9 (CH 2 OH), 3.30-3.48 (7H, m, CH 2 NH, 2 x CH 2 N and NH) and 1.94-2.01 (4H, m, 2 x CH 2 CH 2 N); Δ C (50 MHz, CDCl 3) 162.6 (C-4) a, 160.7 (C-6) a, 157.5 (C-2), 81.4 (C-5), 62.5 ( CH 2 OH), 46.5 (2 x CH 2 N), 44.7 (CH 2 NH) and 25.5 (2 x CH 2 CH 2 N); (ES) m / z 209.1 [(M-N) + H], 191.1, 182.1, 165.1 and 138.0.

N4-BENZIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (78)N4-BENZYL-6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDINE-4,5-DIAMINE (78)

Em um método similar a 76, composto nitroso 71 (1,35 g, 4,63 mmols) foi suspenso em água (50 cm3) e tratado com ditionita de sódio sólido (1,70 g, 9,74 mmols) que foi adicionado em porções. Ácido sulfúrico aquoso (50 % p/p, 9,09 g) foi adicionado por 3 minutos a gotas, e a mistura resultante foi aquecida para 140eC com agitação durante 5 minutos. A mistu- ra de reação ficou incolor de novo nesta hora, e foi deixada esfriar para 409C. O pH da mistura foi ajustado para > 10 com 2M de hidróxido de sódio aquoso, e a solução resultante foi extraída com acetato de etila (2 x 50 cm3). Os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzi- da, e o produto bruto recristalizado de diclorometano/hexano para render N4- benzil-6-morfolin-4-ilpirimidino-4,5-diamina 87 (0,90 g, 70 %) como um sólido branco. dH(200 MHz, CDCl3) 8,20 (1H, s, H-2), 7,35 (5H, br s, arila H), 5,41 (1H, s, NH), 5,35 (br, NH2), 4,48 (2H, d, J 5,8 Hz, CH2Ph), 3,75 (4H, m, 2 x CH2O) e 3,51 (4H, m, 2 x NCH2); õc (50 MHz, CDCl3) 164,5 (C-6), 163,0,0 (C-4), 157,5 (C-2), 138,5 (arila quaternária C), 129,0, 128,0 e 127,5 (arila C), 81,5 (C-5), 66,5 (2 x OCH2), 46,0 (PhCH2) e 44,5 (2 x NCH2).In a method similar to 76, nitrous compound 71 (1.35 g, 4.63 mmol) was suspended in water (50 cm3) and treated with solid sodium dithionite (1.70 g, 9.74 mmol) which was added. in portions. Aqueous sulfuric acid (50% w / w, 9.09 g) was added dropwise over 3 minutes, and the resulting mixture was heated to 140 ° C with stirring for 5 minutes. The reaction mixture was colorless again at this time, and was allowed to cool to 40 ° C. The pH of the mixture was adjusted to> 10 with 2M aqueous sodium hydroxide, and the resulting solution was extracted with ethyl acetate (2 x 50 cm3). The combined organic extracts were concentrated under reduced pressure, and the crude product recrystallized from dichloromethane / hexane to yield N4-benzyl-6-morpholin-4-ylpyrimidine-4,5-diamine 87 (0.90 g, 70%). as a white solid. dH (200 MHz, CDCl 3) 8.20 (1H, s, H-2), 7.35 (5H, br s, aryl H), 5.41 (1H, s, NH), 5.35 (br, NH 2), 4.48 (2H, d, J 5.8 Hz, CH 2 Ph), 3.75 (4H, m, 2 x CH 2 O) and 3.51 (4H, m, 2 x NCH 2); δc (50 MHz, CDCl 3) 164.5 (C-6), 163.0.0 (C-4), 157.5 (C-2), 138.5 (quaternary aryl C), 129.0, 128 , 0 and 127.5 (C-aryl), 81.5 (C-5), 66.5 (2 x OCH 2), 46.0 (PhCH 2) and 44.5 (2 x NCH 2).

PROCEDIMENTO GERAL PARA FECHAMENTO DE ANEL DE TRIAMINO- PIRIMIDINAS 72-78:GENERAL PROCEDURE FOR TRIAMINO-PYRIMIDINE RING CLOSURE 72-78:

9-BENZIL-6-PIRROLIDIN-1-IL-9H-PURINA (82)9-BENZYL-6-PYROLIDIN-1-IL-9H-PURINE (82)

5-amino-4-benzilamino-6-(pirrolidin-1-il)pirimidina 76 (39,6 mg, 0,15 mmol) foi suspensa em uma mistura de anidrido acético (5 masseq., 143 mg, 130 μΙ) e ortoformato de trietila (5 mass eq., 143 mg, 160 μΙ) e a - quecida a refluxo com agitação. Todo o material de partida dissolve ao a- quecer. Após 4h a refluxo, a mistura foi esfriada e anidrido acético de exces- so e ortoformato de trietila foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica-gel (usando acetato de etila como eluente) para render 9-benzil-6-pirrolidin-1 -il-9H-purina 82 (32,8 mg, 80 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,45 (1H, s, H-2), 7,24-7,28 (5H, m, arila H), 6,19 (1H, s, H-8), 5,11 (1H, s, CH2Ph), 3,18-3,62 (4H, br s, 2 χ CH2N) e 1,90-2,06 (4H, m, 2 χ CH2CH2N); <5C (50 MHz1 CDCI3) 171,2 (C-6)a, 161,3 (C-4)a, 158,4 (C-8)a, 158,4 (C-2), 138,0 (arila quaternária C), 128,7, 127,7 e 127,4 (arila C), 98,1 (C-5), 50,5 (2 χ CH2N), 46,7 (CH2Ph) e 25,5 (2 χ CH2CH2N); (ES) m/z 297,2 [M+NH4+], 255,2, 205,1 e 166,1.5-Amino-4-benzylamino-6- (pyrrolidin-1-yl) pyrimidine 76 (39.6 mg, 0.15 mmol) was suspended in a mixture of acetic anhydride (5 masseq., 143 mg, 130 μΙ) and triethyl orthoformate (5 mass eq., 143 mg, 160 μΙ) and heated to reflux with stirring. All starting material dissolves on heating. After 4h at reflux, the mixture was cooled and excess acetic anhydride and triethyl orthoformate were removed under reduced pressure. The crude residue was purified by silica gel column chromatography (using ethyl acetate as eluent) to yield 9-benzyl-6-pyrrolidin-1-yl-9H-purine 82 (32.8 mg, 80%). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.45 (1H, s, H-2), 7.24-7.28 (5H, m, aryl H), 6.19 (1H, s, H-8), 5.11 (1H, s, CH 2 Ph); 3.18-3.62 (4H, br s, 2 x CH 2 N) and 1.90-2.06 (4H, m, 2 x CH 2 CH 2 N); ΔC (50 MHz1 CDCl3) 173.2 (C-6) a, 161.3 (C-4) a, 158.4 (C-8) a, 158.4 (C-2), 138.0 ( quaternary aryl C), 128.7, 127.7 and 127.4 (aryl C), 98.1 (C-5), 50.5 (2 χ CH2N), 46.7 (CH2Ph) and 25.5 ( 2 (CH 2 CH 2 N); (ES) m / z 297.2 [M + NH 4 +], 255.2, 205.1 and 166.1.

Os compostos a seguir foram preparados por este método: N,N,9-TRIMETIL-9H-PURIN-6-AMINA (79)The following compounds were prepared by this method: N, N, 9-TRIMETHYL-9H-PURIN-6-AMINE (79)

(0,12 g, 100 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,47 (1H, s, H-2), 6,50, (1H, s, H-8), 3,36 (3H, s, NCH3) e 3,13 [6H, s, N(CH3)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 171,3 (C-6)a, 163,5 (C-4)a, 161,7 (C-8), 157,8 (C-2), 96,1 (C-5), 37,6 (2 x NCH3) e 35,0 (NCH3).(0.12 g, 100%). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.47 (1H, s, H-2), 6.50, (1H, s, H-8), 3.36 (3H, s, NCH3) and 3.13 [ 6H, s, N (CH 3) 2]; δc (50 MHz, CDCl 3) 171.3 (C-6) α, 163.5 (C-4) α, 161.7 (C-8), 157.8 (C-2), 96.1 (C -5), 37.6 (2 x NCH 3) and 35.0 (NCH 3).

9-BENZIL-N,N-DIMETIL-9H-PURIN-6-AMINA (80) (46,0 mg, 88 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 7,26- 7,35 (5H, m, arila H), 6,33 (1H, s, H-8), 5,30 (1H, s, NH2), 5,10 (1H, br s, NH2), 4,45 (2H, d, J 5,8, CH2Ph), 3,01 (6H, s, 2 χ NCH3) e 1,78 (1H, br s, NH); (ES) m/z229,2 [(M-N)+H], 202,1, 137,1 e 138,0. 9-METIL-6-PIRROLIDIN-1-IL-9H-PURINA (81)9-BENZYL-N, N-DIMETHYL-9H-PURIN-6-AMINE (80) (46.0 mg, 88%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.16 (1H, s, H-2), 7.26-7.35 (5H, m, aryl H), 6.33 (1H, s, H-8), 5 , 30 (1H, s, NH 2), 5.10 (1H, br s, NH 2), 4.45 (2H, d, J 5.8, CH 2 Ph), 3.01 (6H, s, 2 χ NCH 3) and 1.78 (1H, br s, NH); (ES) m / z 229.2 [(M-N) + H], 202.1, 137.1 and 138.0. 9-METHYL-6-PYROLIDIN-1-IL-9H-PURINE (81)

(47,1 mg, 67 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,41 (1H, s, H-2), 6,29, (1H, s, H-8), 3,34-3,56 (4H, m, 2 χ CH2N), 3,31, (3H, s, NCH3), e 1,92-2,04 (4H, m, 2 χ CH2CH2N). <5C (50 MHz, CDCI3) 171,2 (C-6)a, 161,3 (C-4)a, 158,4 (C-8), 158,1 (C-2), 96,9 (C-5), 46,8 (2 χ CH2N), 35,0 (NCH3) e 25,4 (2 χ CH2CH2N). (ES) m/z 221,2 [M+NH/], 179,1 e 166,1. 9-BENZIL-6-MORFOLIN-4-il-9H-PURINA (83)(47.1 mg, 67%). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.41 (1H, s, H-2), 6.29, (1H, s, H-8), 3.34-3.56 (4H, m, 2 χ CH 2 N ), 3.31, (3H, s, NCH 3), and 1.92-2.04 (4H, m, 2 χ CH 2 CH 2 N). ΔC (50 MHz, CDCl3) 173.2 (C-6) α, 161.3 (C-4) α, 158.4 (C-8), 158.1 (C-2), 96.9 ( C-5), 46.8 (2 χ CH 2 N), 35.0 (NCH 3) and 25.4 (2 χ CH 2 CH 2 N). (ES) m / z 221.2 [M + NH3], 179.1 and 166.1. 9-BENZYL-6-MORFOLIN-4-yl-9H-PURINE (83)

(59,7 mg, 68 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,49 (1H, s, H-2), 7,21- 7,35 (5Η, m, arila Η), 6,66 (1Η, s, Η-8), 5,18 (2Η, s, CH2Ph), 3,74-3,80 (4Η, m, 2 χ CH2O), 3,56-3,61 (4Η, π, 2 χ CH2N) e 1,78 (1 Η, br s, NH); <5C (50 MHz, CDCI3) 171,6 (C-6)a, 163,5 (C-4)a, 161,35 (C-8), 158,0 (C-2), 137,9 (arila quaternária C), 128,8, 127,5 e 127,4 (arila C), 96,9 (C-5), 66,6 (2 χ CH2O), 50,4 (CH2Ph) e 44,6 (2 χ CH2N); (ES) m/z 221,2 [M+NH4+], 312,1, 268,9 e 91,1.(59.7 mg, 68%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.49 (1H, s, H-2), 7.21-7.35 (5Η, m, aryl Η), 6.66 (1Η, s, Η-8), 5 , 18 (2Η, s, CH 2 Ph), 3.74-3.80 (4Η, m, 2 χ CH 2 O), 3.56-3.61 (4Η, π, 2 χ CH 2 N) and 1.78 (1 Η , br s, NH); Δ C (50 MHz, CDCl 3) 171.6 (C-6) a, 163.5 (C-4) a, 161.35 (C-8), 158.0 (C-2), 137.9 ( quaternary aryl C), 128.8, 127.5 and 127.4 (aryl C), 96.9 (C-5), 66.6 (2 χ CH 2 O), 50.4 (CH 2 Ph) and 44.6 ( 2 (CH 2 N); (ES) m / z 221.2 [M + NH 4 +], 312.1, 268.9 and 91.1.

6-CLORO-N.N-DIMETILPIRIMIDIN-4-AMINA (84)6-Chlorine-N.N-Dimethylpyrimidine-4-AMINE (84)

Uma solução de 56 (15,03 g, 0,10 mol), dimetilamina (60 % em água, 9,20 cm3, 0,12 mol) e trietilamina (17,07 cm3, 0,12 mol) em álcool iso- propílico (100 cm3) foi tratada como pelo método geral. Cromatografia [u- sando 1:10-1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu cristais beges de 6-cloro-N,N-dimetilpirimidin-4-amina 84 (16,73 g, quant.; 99,1 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,38 (1H, s, H-2), 6,39 (1H, s, H-5) e 3,14 (6H, s, NMe2); <5C (50 MHz, CDCI3) 159,2 (C-6), 158,9 (C-4), 158,0 (Ο- 2), 101,3 (C-5) e 37,8 (NMe2); fa 4,48 min (50 % de metanol: 25 mM de ace- tato de amônio); (TSP) m/z 158 (100, M+. C6H835CIN3 requer 157,6) e 160 (35, C6H837CIN3).A solution of 56 (15.03 g, 0.10 mol), dimethylamine (60% in water, 9.20 cm3, 0.12 mol) and triethylamine (17.07 cm3, 0.12 mol) in isopropyl alcohol. Propylene (100 cm3) was treated as by the general method. Chromatography [using 1: 10-1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent] provided beige crystals of 6-chloro-N, N-dimethylpyrimidin-4-amine 84 (16.73 g, quant. 99.1% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.38 (1H, s, H-2), 6.39 (1H, s, H-5) and 3.14 (6H, s, NMe2); δ 5C (50 MHz, CDCl3) 159.2 (C-6), 158.9 (C-4), 158.0 (Î ± 2), 101.3 (C-5) and 37.8 (NMe2) ; fa 4.48 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (TSP) m / z 158 (100, M +. C6H835CIN3 requires 157.6) and 160 (35, C6H837CIN3).

6-CLORO-4-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDINA (85)6-Chlorine-4-pyrrolidine-1-ylpyrimidine (85)

Uma solução de 56 (15,00g, 0,10 mol), pirrolidina (9,37 cm3, 0,112 mol) e trietilamina (17,1 cm3, 0,12 mol) em álcool /'sopropílico (100 cm3) foi tratada como pelo método geral. Cromatografia [usando 1:10 - 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu cristais beges de 6- cloro-4-pirrolidin-1-ilpirimidina 85 (17,85 g, 98,3 %; 98 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,36 (1H, s, H-2), 6,25 (1H, s, H-5), 3,58 e 3,31 [4H, 2 so- brepondo br s, N(CH2)2] e 2,12 [4H, br s, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 160,9 (C-6), 158,9 (C-4), 158,0 (C-2), 101,0 (C-5), 46,3 [N(CH2)2] e 25,3 [(CH2)2]; fR 7,13 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (TSP) m/z 184 (100, M+. C8H1035CIN3 requer 184) e 186 (28, M+. C8H1037CIN3). 1-(6-CLOROPIRIMIDIN-4-il)PIRROLIDINO-2-CARBOXILATO DE METILA(86)A solution of 56 (15.00g, 0.10 mol), pyrrolidine (9.37 cm3, 0.112 mol) and triethylamine (17.1 cm3, 0.12 mol) in sopropilic alcohol (100 cm3) was treated as by the general method. Chromatography [using 1:10 - 1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent] afforded beige crystals of 6-chloro-4-pyrrolidin-1-ylpyrimidine 85 (17.85 g, 98.3%; 98% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.36 (1H, s, H-2), 6.25 (1H, s, H-5), 3.58 and 3.31 [4H, 2 over br s , N (CH 2) 2] and 2.12 [4H, br s, (CH 2) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 160.9 (C-6), 158.9 (C-4), 158.0 (C-2), 101.0 (C-5), 46.3 [N ( CH2) 2] and 25.3 [(CH2) 2]; fR 7.13 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (TSP) m / z 184 (100, M +. C8H1035CIN3 requires 184) and 186 (28, M + .C8H1037CIN3). 1- (6-CHLOROPYRIMIDIN-4-yl) METHYL PYROLIDINE-2-CARBOXYLATE (86)

Uma solução de L-prolina (14,26 g, 0,12 mol) em metanol (100 cm3) foi tratada com gás de cloreto de hidrogênio por 30 min, então deixada agitar por 1h. A solução foi depois concentrada até secar, e o clori- drato de éster de metila usado sem caracterização. Uma solução do éster de metila, 56 (15,01 g, 0,10mol) e trietilamina (31,3 cm3, 0,23 mol) em álcool 'sopropílico (100 cm3) foi tratada como pelo método geral. Cromatografia [usando 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu um óleo laranja viscoso, 1-(6-cloropirimidin-4-il)pirrolidino-2-carboxilato de metila 86 (19,74 g, 81 %; 89,3 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,39 (1H, s, H- 2), 6,39 (1H, br s, H-5), 4,63 (1H, br s, COCH), 3,73 (3H, s, OMe), 3,81-3,28 (2H,2 sobrepondo br s, NCH2) e 2,41-1,95 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 172,8 (CO), 160,9 (C-6), 159,8 (C-4), 158,0 (C-2), 101,2 (C-5), 59,8 (OMe), 52,2 (COCH), 46,5 (NCH2), 30,1 e 24,1 [(CH2)2]; íR 5,27 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (TSP) m/z 242 (100, M+. C10H1435CIN3O2 requer 241,7), 243 (10) e 244 (25, M+. C10H1437CIN3O2). 4-(6-CLOROPIRIMIDIN-4-il)MORFOLINA (87)A solution of L-proline (14.26 g, 0.12 mol) in methanol (100 cm3) was treated with hydrogen chloride gas for 30 min, then allowed to stir for 1h. The solution was then concentrated to dryness and the methyl ester hydrochloride used without characterization. A solution of methyl ester 56 (15.01 g, 0.10 mol) and triethylamine (31.3 cm3, 0.23 mol) in sopropyl alcohol (100 cm3) was treated as by the general method. Chromatography [using 1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluant] provided a viscous orange oil, methyl 1- (6-chloropyrimidin-4-yl) pyrrolidine-2-carboxylate 86 (19.74 g, 81%; 89.3% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.39 (1H, s, H-2), 6.39 (1H, br s, H-5), 4.63 (1H, br s, COCH), 3.73 ( 3H, s, OMe), 3.81-3.28 (2H, 2 overlapping br s, NCH 2) and 2.41-1.95 [4H, m, (CH 2) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 172.8 (CO), 160.9 (C-6), 159.8 (C-4), 158.0 (C-2), 101.2 (C-5) , 59.8 (OMe), 52.2 (COCH), 46.5 (NCH2), 30.1 and 24.1 [(CH2) 2]; R 5.27 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (TSP) m / z 242 (100, M +. C10H1435CIN3O2 requires 241.7), 243 (10) and 244 (25, M +. C10H1437CIN3O2). 4- (6-Chloropyrimidin-4-yl) MORPHOLINE (87)

Uma solução de 56 (15,00 g, 0,10 mol) e morfolina (18,00 g, -0,21 mol) em álcool /sopropílico (100 cm3) foi tratada como pelo método ge- ral. Concentração do extrato forneceu um sólido cristalino. Este foi lavado em um funil de Büchner com bicarbonato de sódio aquoso saturado, seguido pelo mínimo de acetato de etila para remover água para render cristais be- ges de 4-(6-cloropirimidin-4-il)morfolina 87 (18,30 g, 92 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,39 (1H, s, H-2), 6,48 (1H, s, H-5), 3,91-3,72 [4H, m, O(CH2)2] e 3,70-3,41 [4H, m, N(CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 162,6 (C-6), 160,2 (C-4), 158,0 (C-2), 101,4 (C-5), 66,3 [O(CH2)2] e 44,2 [N(CH2)2]. N-METIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (89)A solution of 56 (15.00 g, 0.10 mol) and morpholine (18.00 g, -0.21 mol) in alcohol / sopropilic (100 cm3) was treated as by the general method. Concentration of the extract provided a crystalline solid. This was washed in a Büchner funnel with saturated aqueous sodium bicarbonate, followed by minimal ethyl acetate to remove water to yield 4- (6-chloropyrimidin-4-yl) morpholine 87 (18.30 g) , 92%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.39 (1H, s, H-2), 6.48 (1H, s, H-5), 3.91-3.72 [4H, m, O (CH 2) 2 ] and 3.70-3.41 [4H, m, N (CH 2) 2]; δc (50 MHz, CDCl 3) 162.6 (C-6), 160.2 (C-4), 158.0 (C-2), 101.4 (C-5), 66.3 [O (CH 2 ) 2] and 44.2 [N (CH 2) 2]. N-Methyl-6-pyrrolidine-1-ylpyrimidine-4-amine (89)

Cloreto 85 (1,45 g, 10,11 mmols) e pirrolidina (1,86cm3, 22,24 mmols) foi fundido a 250eC durante 1h. Este foi absorvido em acetato de etila (50 cm3), lavado com água (50 cm3), secado (MgSO4) e concentrado em uma goma marrom. Cromatografia de coluna [1:9 (v/v) metanohacetato de etila como eluente] forneceu um sólido marrom pálido, N-metil-6-pirrolidin- 1-ilpirimidin-4-amina 89 (0,63 g, 35 %, 99 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCI3) 8,11 (1H, s, H-2), 5,13 (1H, s, H-5), 4,89 (1H, br s, NH), 3,52-3,28 [4H, m, O(CH2CH2)2N], 2,85 (3H, d, NHCH3, J 5,2) e 2,09-1,81 [4H, m, O(CH2CH2)2N]; sC (50 MHz, CDGI3) 162,8 e 160,7 (C-4 e C-6), 157,2 (C-2), 79,5 (C-5), 46,3 [(CH2CH2)2N], 28,5 (NHCH3) e 25,3 [(CH2CH2)2N]; fa 2,25 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).Chloride 85 (1.45 g, 10.11 mmol) and pyrrolidine (1.86 cm 3, 22.24 mmol) was melted at 250 ° C for 1h. This was taken up in ethyl acetate (50 cm3), washed with water (50 cm3), dried (MgSO4) and concentrated to a brown gum. Column chromatography [1: 9 (v / v) ethyl metanohacetate as eluent] provided a pale brown solid, N-methyl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 89 (0.63 g, 35%, 99 pure% by HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCl3) 8.11 (1H, s, H-2), 5.13 (1H, s, H-5), 4.89 (1H, br s, NH), 3.52-3, [4H, m, O (CH 2 CH 2) 2 N], 2.85 (3H, d, NHCH 3, J 5.2) and 2.09-1.81 [4H, m, O (CH 2 CH 2) 2 N]; sC (50 MHz, CDCl3) 162.8 and 160.7 (C-4 and C-6), 157.2 (C-2), 79.5 (C-5), 46.3 [(CH2 CH2) 2 N ], 28.5 (NHCH 3) and 25.3 [(CH 2 CH 2) 2 N]; fa 2.25 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate).

N-METIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (90)N-Methyl-6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (90)

Cloreto 87 (1,45 g, 10,11 mmols) e morfolina (2,28 cm3, 22,23 mmols) foram fundidos a 2509C durante 1h. Este foi absorvido em acetato de etila (50 cm3), lavado com água (50 cm3), secado (MgSO4) e con- centrado a uma goma marrom. Cromatografia de coluna [1:9 (v/v) meta- nol:acetato de etila como eluente] forneceu um pó amarelo, N-metil-6- morfolin-4-ilpirimidin-4-amina 90 (1,51 g, 77 %, 96 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,14 (1H, s, H-2), 5,37 (1H, s, H-5), 5,05 (1H, br s, NH), 3,77 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9], 3,54 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9] e 2,87 (3H, d, NHCH3, J 5,2); õc (50 MHz, CDCI3) 163,7 e 163,1 (C-4 e C-6), 157,2 (C-2), 79,9 (C-5), 66,5 [O(CH2CH2)2N], 44,5 [O(CH2CH2)2N] e 28,4 (NHCH3); tr 2,11 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).Chloride 87 (1.45 g, 10.11 mmol) and morpholine (2.28 cm 3, 22.23 mmol) were melted at 25 ° C for 1h. This was taken up in ethyl acetate (50 cm3), washed with water (50 cm3), dried (MgSO4) and concentrated to a brown gum. Column chromatography [1: 9 (v / v) methanol: ethyl acetate as eluent] provided a yellow powder, N-methyl-6-morpholin-4-ylpyrimidin-4-amine 90 (1.51 g, 77 %, 96% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.14 (1H, s, H-2), 5.37 (1H, s, H-5), 5.05 (1H, br s, NH), 3.77 [4H , t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.9], 3.54 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.9] and 2.87 (3H, d, NHCH 3, J 5.2) ; δc (50 MHz, CDCl 3) 163.7 and 163.1 (C-4 and C-6), 157.2 (C-2), 79.9 (C-5), 66.5 [O (CH 2 CH 2) 2N], 44.5 [O (CH 2 CH 2) 2 N] and 28.4 (NHCH 3); RT 2.11 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate).

N-BENZIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (91)N-BENZYL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (91)

Uma mistura de cloreto 85 (0,98 g, 5,35 mmols), benzilamina (1,24 cm3, 11,4 mmols) e tolueno (5 cm3) foi colocada em um tubo de vidro, vedada e aquecida para 130SC durante 18h. Dentro de 30 min, uma crosta de cristais tinha formado na solução. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e trabalhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um sólido bege, N-benzil-6-pirrolidin-1- ilpirimidin-4-amina 91 (0,62 g, 46 %, 97,5 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,15 (1H, s, H-2), 7,21-7,40 (5H, m, arila H), 5,30 (1H, brt, NH), 5,18 (1H, s, H-5), 4,46 (2H, d, PhCH2, J 5,6), 3,39 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,90-2,05 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 162,1 (C-6), 160,6 (C-4), 157,5 (C-2), 138,4 (arila quaternária C), 128,6, 127,3 e 127,2 (arila C), 80,6 (C-5), 46,2 [N(CH2)2], 45,9 (PhCH2) e 25,3 [(CH2)2]; fo 10,13 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 138 (38), 163 (51), 228 (22), 255 (100, MH+. C16H18N^4 requer 255) e 256 (27).A mixture of chloride 85 (0.98 g, 5.35 mmols), benzylamine (1.24 cm 3, 11.4 mmols) and toluene (5 cm 3) was placed in a glass tube, sealed and heated to 130 ° C for 18h. . Within 30 min, a crust of crystals had formed in the solution. After cooling, the solution was extracted from water using ethyl acetate and worked up to provide an orange oil. Column chromatography [ethyl acetate - 1:10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] provided a beige solid, N-benzyl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 91 (0.62 g , 46%, 97.5% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.15 (1H, s, H-2), 7.21-7.40 (5H, m, aryl H), 5.30 (1H, brt, NH), 5, 18 (1H, s, H-5), 4.46 (2H, d, PhCH 2, J 5.6), 3.39 [4H, br s, N (CH 2) 2] and 1.90-2.05 [4H, m, (CH 2) 2]; Δ C (50 MHz, CDCl 3) 162.1 (C-6), 160.6 (C-4), 157.5 (C-2), 138.4 (quaternary aryl C), 128.6, 127, 3 and 127.2 (aryl C), 80.6 (C-5), 46.2 [N (CH 2) 2], 45.9 (PhCH 2) and 25.3 [(CH 2) 2]; mp 10.13 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 138 (38), 163 (51), 228 (22), 255 (100, MH +. C 16 H 18 N 4 requires 255) and 256 (27).

N-BENZIL-1-[6-(BENZILAMINO)PIRIMIDIN-4-il]PIRROLIDINO-2- CARBOXAMIDA (92)N-BENZYL-1- [6- (BENZYLAMINO) PYRIMIDIN-4-yl] PYRROLIDINE-2-CARBOXAMIDE (92)

Em um procedimento similar a 91, cloreto 86 (1,67 g, 6,92 mmols), benzilamina (2,17 cm3, 20,0 mmols) e tolueno (20 cm3) foram colocados em um tubo de vidro, vedados e aquecidos para 130gC durante 18h. Dentro de 30 min, uma crosta de cristais tinha se formado na solução. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e traba- lhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um sólido bege, N-benzil-1 -[6-(benzilamino)pirimidin-4-il]pirrolidino-2-carboxamida 92 (1,73 g, 62 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,12 (1H, s, H-2), 7,15-7,44 (5H, m, ari- Ia H), 5,30 (2H, br m, H-5 e NH), 4,53-4,66 (1H, m, NCHCO), 5,27-4,52 (4H, m, 2 χ PhCH2), 3,42-3,56 (1H, dd de ~br, NCHaHb, J 6,8 e 9,4), 3,19-3,38 (1H, ~br q, NCHaHb, J 9,0), 2,38-2,52 e 1,94-2,20 [4H, 2 χ m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 172,2 (CO), 162,7 (C-6), 161,3 (C-4), 157,5 (C-2), 138,3 e 138,1 (2 χ arila quaternária C), 128,7, 128,5, 127,5, 127,4, 127,3 e 127,2 (ari- la C), 81,7 (C-5), 61,1 (NCHCO), 47,5 (PhCH2), 45,8 (NCH2), 43,3 (PhCH2), 29,2 e 24,3 [(CH2)2]; (ES) m/z 201 (19), 205 (13), 253 (100, C11H19N5O2), 254 (52), 281 (100, C13H23N5O2), 282 (22), 361 (18), 388 (80, MH+. C23H25N5O2 requer 388) e 389 (28).In a procedure similar to 91, chloride 86 (1.67 g, 6.92 mmols), benzylamine (2.17 cm3, 20.0 mmols) and toluene (20 cm3) were placed in a glass tube, sealed and heated. to 130 ° C for 18h. Within 30 min, a crust of crystals had formed in the solution. After cooling, the solution was extracted from water using ethyl acetate and worked up to provide an orange oil. Column chromatography [ethyl acetate - 1:10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] provided a beige solid, N-benzyl-1- [6- (benzylamino) pyrimidin-4-yl] pyrrolidine-2 carboxamide 92 (1.73 g, 62%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.12 (1H, s, H-2), 7.15-7.44 (5H, m, aryl-H), 5.30 (2H, br m, H-5 and NH), 4.53-4.66 (1H, m, NCHCO), 5.27-4.52 (4H, m, 2 χ PhCH2), 3.42-3.56 (1H, dd of br , NCHaHb, J 6.8 and 9.4), 3.19-3.38 (1H, brq, NCHaHb, J 9.0), 2.38-2.52 and 1.94-2.20 [4H, 2 χ m, (CH 2) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 172.2 (CO), 162.7 (C-6), 161.3 (C-4), 157.5 (C-2), 138.3 and 138.1 ( Quaternary aryl C), 128.7, 128.5, 127.5, 127.4, 127.3 and 127.2 (aryl C), 81.7 (C-5), 61.1 ( NCHCO), 47.5 (PhCH2), 45.8 (NCH2), 43.3 (PhCH2), 29.2 and 24.3 [(CH2) 2]; (ES) m / z 201 (19), 205 (13), 253 (100, C11H19N5O2), 254 (52), 281 (100, C13H23N5O2), 282 (22), 361 (18), 388 (80, MH + C23H25N5O2 requires 388) and 389 (28).

N-BENZIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (93)N-BENZYL-6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (93)

Cloreto 87 (2,29 g, 10,44 mmols) e morfolina (2,00 cm3, 23,00 mmols) na presença de íerc-butóxido de potássio (1,28 g, 11,48 mmols) foram fundidas a 250SC durante 1h. Este foi absorvido em acetato de etila (50 cm3), lavado com água (50 cm3), secado (MgSO4) e concentrado em uma goma marrom. Cromatografia de coluna [1:9 (v/v) metanohacetato de etila como eluente] forneceu um sólido amarelo brega. Este foi dissolvido em acetona, e o sólido precipitou com hexano para fornecer um pó amarelo, N-benzil-6-morfolin-4-il-pirimidin-4-amina (93) (1,56 g, 55 %, 95 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 7,48-7,05 (5H, m, arila H), 5,39 (2H, br m, H-5 e NH), 4,46 (2H, d, PhCH2, J 6,0), 3,74 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9] e 3,48 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9]; <5C (50 MHz, CDCI3) 162,9 e 162,8 (C-4 e C-6), 157,3 (C-2), 138,0 (fenila quaternária C), 128,8, 127,5 e 127,2 (fenila CH), 81,0 (C-5), 66,5 [O(CH2CH2)2N], 45,8 (PhCH2) e 44,5 [O(CH2CH2)2N]; fR 6,82 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amô- nio).Chloride 87 (2.29 g, 10.44 mmols) and morpholine (2.00 cm3, 23.00 mmols) in the presence of potassium ether-butoxide (1.28 g, 11.48 mmols) were melted at 250 ° C for 1am This was taken up in ethyl acetate (50 cm3), washed with water (50 cm3), dried (MgSO4) and concentrated to a brown gum. Column chromatography [1: 9 (v / v) ethyl metanohacetate as eluent] provided a tacky yellow solid. This was dissolved in acetone, and the solid precipitated with hexane to give a yellow, N-benzyl-6-morpholin-4-yl-pyrimidin-4-amine powder (93) (1.56 g, 55%, 95% pure HPLC). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.16 (1H, s, H-2), 7.48-7.05 (5H, m, aryl H), 5.39 (2H, br m, H-5 and NH), 4.46 (2H, d, PhCH 2, J 6.0), 3.74 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.9] and 3.48 [4H, t, O (CH 2 CH 2 ) 2N, J 4.9]; Δ C (50 MHz, CDCl3) 162.9 and 162.8 (C-4 and C-6), 157.3 (C-2), 138.0 (quaternary phenyl C), 128.8, 127.5 and 127.2 (phenyl CH), 81.0 (C-5), 66.5 [O (CH 2 CH 2) 2 N], 45.8 (PhCH 2) and 44.5 [O (CH 2 CH 2) 2 N]; R f 6.82 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate).

2-[(6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (94)2 - [(6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (94)

Uma mistura de cloreto 85 (1,95 g, 5,10mmols), etanolamina (1,89 cm3, 31,37 mmols) e tolueno (20 cm3) foi colocada em um tubo de vi- dro, vedada e aquecida para 1309C durante 18h. Um óleo marrom formou-se ao fundo do tubo enquanto o tempo progredia. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e trabalhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um sólido de bege-marrom, 2-[(6- pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-il)amino]-etanol 94 (1,10 g, 50,6 %, 94,1 % puro por HPLC). δh (200 MHz, CDCl3) 8,07 (1H, s, H-2), 5,30 (1H, br t, NH), 5,18 (1H, s, H-5), 4,08 (1H, br s, OH), 3,78 (24H, t, CH2OH, J 4,6), 3,22-3,49 [6H, br m, N(CH2)2 e CH2OH], e 1,90-2,05 [4H, m, (CH2)2]; δC (50 MHz, CDCl3) 162,2 (C-6), 160,4 (C-4), 157,1 (C-2), 80,8 (C-5), 61,6 (CH2OH), 46,3 [N(CH2)2], 44,3 (CH2NH) e 25,2 [(CH2)2]; íR 2,17 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 110 (15), 121 (13), 165 (15), 191 (85), 209 (100, MH+. C11H16N4O requer 209) e 210 (22).A mixture of chloride 85 (1.95 g, 5.10 mmol), ethanolamine (1.89 cm 3, 31.37 mmol) and toluene (20 cm 3) was placed in a sealed glass tube and heated to 1309 ° C for 6pm A brown oil formed at the bottom of the tube as time progressed. After cooling, the solution was extracted from water using ethyl acetate and worked up to provide an orange oil. Column chromatography [ethyl acetate - 1:10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] provided a beige-brown solid, 2 - [(6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-yl) amino] -ethanol 94 (1.10 g, 50.6%, pure 94.1% by HPLC). δh (200 MHz, CDCl 3) 8.07 (1H, s, H-2), 5.30 (1H, br t, NH), 5.18 (1H, s, H-5), 4.08 (1H , br s, OH), 3.78 (24H, t, CH 2 OH, J 4.6), 3.22-3.49 [6H, br m, N (CH 2) 2 and CH 2 OH], and 1.90- 2.05 [4H, m, (CH 2) 2]; δC (50 MHz, CDCl 3) 162.2 (C-6), 160.4 (C-4), 157.1 (C-2), 80.8 (C-5), 61.6 (CH 2 OH), 46.3 [N (CH 2) 2], 44.3 (CH 2 NH) and 25.2 [(CH 2) 2]; R 2.17 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 110 (15), 121 (13), 165 (15), 191 (85), 209 (100, MH +. C 11 H 16 N 4 O requires 209) and 210 (22).

N-(2-HIDROXIETIL)-1 -{6-[(2-HIDROXIETIL)AMINO]PIRIMIDIN-4- ILJPIRROLIDINO-2-CARBOXAMIDA (95)N- (2-HYDROXYETHYL) -1 - {6 - [(2-HYDROXYETHYL) AMINO] PYRIMIDIN-4-ILJPYROLIDINE-2-CARBOXAMIDE (95)

Em um procedimento similar a 91, cloreto 86 (1,61 g, 6,67 mmols), etanolamina (1,21 cm3, 20,0 mmols) e tolueno (20 cm3) foram colocados em um tubo de vidro, vedado e aquecido para 130°C durante 18h. Um óleo marrom formou-se ao fundo do tubo enquanto o tempo progredia. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e traba- lhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila -1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um óleo mar- rom, N-(2-hidroxietil)-1-{6-[(2-hidroxietil)-amino]pirimidin-4-il}pirrolidino-2- carboxamida 95 (1,02 g, 54 %, 99,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl3) 7,97 (1H, s, H-2), 7,43 (1H, br t, CONH, J 5,0), 5,90 (1H, br t, NH, J 5,6), 5,27 (1H, s, H-5), 4,20-4,35 (1H, br m, NCHCO), 3,18-3,38 e 3,39-3,75 [10H, 2 χ m, 2 χ NH(CH2)2OH e NCH2] e 1,74-2,20 [4Η, m, (CH2)2]; õc (50 MHz1 CDCI3) 172,5 (CO), 162,1 (C-6), 160,1 (C-4), 156,4 (C-2), 81,3 (C-5), 60,4 (NCHCO), 60,2 [2 χ (CH2)2OH], 46,6 (NCH2), 45,0 [NH(CH2)2], 41,3 [NH(CH2)2], 29,4 e 23,2 [(CH2)2]; fa 1,77 min (50 % metanol: 25 mM de ace- tato de amônio); (ES) m/z 207 (10), 235 (52, C11H15A^), 269 (11), 296 (100, MH+. C13H21N5O3 requer 295) e 297 (19). 2-[(6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (96)In a procedure similar to 91, chloride 86 (1.61 g, 6.67 mmols), ethanolamine (1.21 cm3, 20.0 mmols) and toluene (20 cm3) were placed in a sealed, heated glass tube. to 130 ° C for 18h. A brown oil formed at the bottom of the tube as time progressed. After cooling, the solution was extracted from water using ethyl acetate and worked up to provide an orange oil. Column chromatography [ethyl acetate -1: 10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] provided a brown oil, N- (2-hydroxyethyl) -1- {6 - [(2-hydroxyethyl) -amino] pyrimidin-4-yl} pyrrolidine-2-carboxamide 95 (1.02 g, 54%, 99.9% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 7.97 (1H, s, H-2), 7.43 (1H, br t, CONH, J 5.0), 5.90 (1H, br t, NH, J 5 , 6.), 5.27 (1H, s, H-5), 4.20-4.35 (1H, br m, NCHCO), 3.18-3.38 and 3.39-3.75 [10H , 2 χ m, 2 χ NH (CH 2) 2 OH and NCH 2] and 1.74-2.20 [4Η, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz1 CDCl3) 172.5 (CO), 162.1 (C-6), 160.1 (C-4), 156.4 (C-2), 81.3 (C-5), 60 , 4 (NCHCO), 60.2 [2 χ (CH 2) 2 OH], 46.6 (NCH 2), 45.0 [NH (CH 2) 2], 41.3 [NH (CH 2) 2], 29.4 and 23.2 [(CH 2) 2]; fa 1.77 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 207 (10), 235 (52, C 11 H 15 A 4), 269 (11), 296 (100, MH +. C 13 H 21 N 5 O 3 requires 295) and 297 (19). 2 - [(6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (96)

Seguindo um procedimento similar a 91, cloreto 59 (1,88 g, 10,84 mmols) e morfolina (2,08 cm3, 23,84 mmols) foram aquecidos para 250°C durante 1h, então extraídos de uma mistura de cloreto de sódio aquo- so saturado (50 cm3) e metanol (10 cm3) com acetato de etila (3 χ 50 cm3). Os extratos foram concentrados e purificados através de cromatografia de coluna [1:9 - 2:8 (v/v) metanohacetato de etila como eluente]. Isto forneceu um sólido bege céreo, 2-[(6-morfolin-4-ilpirimidin-4-il)amino]etanol (96) (1,82 g, 75 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 7,96 (1H, s, H-2), 5,65 (1H, br m, NH), 5,35 (1H, s, H-5), 4,68 (1H, br s, OH), 3,59 [6H, t e obscureceu m, O(CH2CH2)2N, J 4,8 e CH2OH], 3,34 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9] e 3,24 (2H, q, NHCH2, J 5,0); <5C (50 MHz, CDCI3) 169,2 e 162,4 (C-4 e C-6), 156,8 (C- 2), 81,2 (C-5), 66,1 [O(CH2CH2)2N], 61,0 (CH2OH), 44,1 [O(CH2CH2)2N] e 43,8 (NHCH2).Following a similar procedure to 91, chloride 59 (1.88 g, 10.84 mmols) and morpholine (2.08 cm3, 23.84 mmols) were heated to 250 ° C for 1h, then extracted from a mixture of saturated aqueous sodium (50 cm 3) and methanol (10 cm 3) with ethyl acetate (3 x 50 cm 3). The extracts were concentrated and purified by column chromatography [1: 9 - 2: 8 (v / v) ethyl methanehacetate as eluent]. This provided a beige beige solid, 2 - [(6-morpholin-4-ylpyrimidin-4-yl) amino] ethanol (96) (1.82 g, 75%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 7.96 (1H, s, H-2), 5.65 (1H, br m, NH), 5.35 (1H, s, H-5), 4.68 (1H , br s, OH), 3.59 [6H, darkened m, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.8 and CH 2 OH], 3.34 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.9] and 3.24 (2H, q, NHCH 2, J 5.0); Δ 5C (50 MHz, CDCl 3) 169.2 and 162.4 (C-4 and C-6), 156.8 (C-2), 81.2 (C-5), 66.1 [O (CH 2 CH 2 ) 2N], 61.0 (CH 2 OH), 44.1 [O (CH 2 CH 2) 2 N] and 43.8 (NHCH 2).

N-4-BROMOFENIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (97) Uma mistura de cloreto 85 (1,93 g, 10,50 mmols) e 4- bromoanilina (2,73 g, 15,87 mmols) em tolueno (20 cm3) foi tratada com terc- butóxido de potássio (3,52 g, 31,37 mmols) em temperatura ambiente em um tubo de reação. Aquecimento imediato ocorreu, com a formação de um pre- cipitado marrom denso. O tubo foi vedado e tratado como para 93, seguido por cromatografia de coluna [acetato de etila -1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] para render um pó marrom. Este foi dissolvido parci- almente em uma pequena acetona e precipitado com hexano. O sólido foi isolado através de filtração para fornecer um pó bege, N-4-bromofenil-6- pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 97 (1,24 g, 37,1 %, 98,2 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 8,15 (1H, s, H-2), 7,58 (1H, br s, NH), 7,31 (2Η, ~d, arila H1 J 6,6), 7,20 (2H, ~d, arila H, J 6,7), 5,55 (1H, s, H-5), 3,32 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,88-1,98 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 160,4 (C- 6), 159,7 (C-4), 157,4 (C-2), 138,8 (arila quaternária C), 131,8 e 122,5 (arila C), 115,2 (arila quaternária C), 82,8 (C-5), 46,1 [N(CH2)2] e 25,0 [(CH2)2]; fo 2,23 min (metanol); (ES) m/z 319 (100, M+. Ci5H16TgBrN4 requer 319), 320 (12), 321 (100, M+. C15H16S1BrN4 requer 321) e 322 (13).N-4-BROMOPHENYL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (97) A mixture of chloride 85 (1.93 g, 10.50 mmols) and 4-bromoaniline (2.73 g, 15.87 mmols) ) in toluene (20 cm3) was treated with potassium tert-butoxide (3.52 g, 31.37 mmols) at room temperature in a reaction tube. Immediate warming occurred with the formation of a dense brown precipitate. The tube was sealed and treated as for 93 ° C, followed by column chromatography [ethyl acetate -1: 10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] to yield a brown powder. This was dissolved portionwise in a small acetone and precipitated with hexane. The solid was isolated by filtration to afford a beige powder, N-4-bromophenyl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 97 (1.24 g, 37.1%, 98.2% pure by HPLC) . <5H (200 MHz, CDCl3 + d6-DMSO) 8.15 (1H, s, H-2), 7.58 (1H, br s, NH), 7.31 (2Η, ~ d, aryl H1 J 6 6.20, 7.20 (2H, d, aryl H, J 6.7), 5.55 (1H, s, H-5), 3.32 [4H, br s, N (CH 2) 2] and 1.88-1.98 [4H, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz, CDCl3) 160.4 (C-6), 159.7 (C-4), 157.4 (C-2), 138.8 (quaternary aryl C), 131.8 and 122.5 (aryl C), 115.2 (quaternary aryl C), 82.8 (C-5), 46.1 [N (CH 2) 2] and 25.0 [(CH 2) 2]; mp 2.23 min (methanol); (ES) m / z 319 (100, M + .C15H16TgBrN4 requires 319), 320 (12), 321 (100, M + .C15H16S1BrN4 requires 321) and 322 (13).

ÁCIDO 1 -{6-[(4-BROMOFENIL)AMINO]PIRIMIDIN-4-IL}PIRROLIDINO-2- CARBOXÍLICO (98)1 - {6 - [(4-BROMOPHENYL) AMINO] PYRIMIDIN-4-IL} PYROROLIDINE-2-CARBOXYLIC ACID (98)

Em um método similar a 97, uma mistura de cloreto 86 (1,61 g, 6,66 mmols) e 4-bromoanilina (1,75 g, 10,18 mmols) em tolueno (20 cm3) foi tratada com ferc-butóxido de potássio (2,26 g, 20,14 mmols) em temperatura ambiente em um tubo de reação. Aquecimento imediato ocorreu, com a for- mação de um precipitado marrom denso. O tubo foi vedado e tratado como para 91, seguido por cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] para render um pó bege, ácido 1 - {6-[(4-bromofenil)-amino]pirimidin-4-il}pirrolidino-2-carboxílico 98 (0,47 g, 19,5 %, 99,2 % puro por HPLC). δH (200 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 9,73 (1H, br s, NH), 7,67 (~1H, m, H-2), 7,46 (2H, m, arila H), 7,28 (2H, m, arila H), 5,07 (1H, ~d, H-5, J 3,2), 4,23-4,61 (1H, br m, NCHCO), 3,18-3,39 e 3,39- 3,62 (2H, 2 x br m, NCH2) e 1,82-2,25 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 170,3 (CO), 161,6 (C-6), 159,6 (C-4), 147,2 (C-2), 137,0 (arila quaternária C), 130,3 e 120,4 (arila C), 114,6 (arila quaternária C), 85,7 (C-5), 60,3 (N- CHCO), 46,5 (NCH2), 29,4 e 22,7 [(CH2)2]; tR 11,30 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 164 (88), 192 (100), 363 (87, M+. C15H1579BrN402 requer 363), 364 (14), 365 (86, M+. C15H1581BrN4O2 requer 365) e 366 (15).In a method similar to 97, a mixture of chloride 86 (1.61 g, 6.66 mmol) and 4-bromoaniline (1.75 g, 10.18 mmol) in toluene (20 cm 3) was treated with ferbutoxide of potassium (2,26 g, 20,14 mmols) at room temperature in a reaction tube. Immediate warming occurred with the formation of a dense brown precipitate. The tube was sealed and treated as at 91 ° C, followed by column chromatography [ethyl acetate - 1:10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] to yield a beige, 1 - {6 - [( 4-bromophenyl) amino] pyrimidin-4-yl} pyrrolidine-2-carboxylic 98 (0.47 g, 19.5%, 99.2% pure by HPLC). δH (200 MHz, CDCl3 + d6-DMSO) 9.73 (1H, br s, NH), 7.67 (δ 1H, m, H-2), 7.46 (2H, m, aryl H), 7 28 (2H, m, aryl H), 5.07 (1H, d, H-5, J 3.2), 4.23-4.61 (1H, br m, NCHCO), 3.18- 3.39 and 3.39-3.62 (2H, 2 x br m, NCH 2) and 1.82-2.25 [4H, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz, CDCl 3) 170.3 (CO), 161.6 (C-6), 159.6 (C-4), 147.2 (C-2), 137.0 (quaternary aryl C), 130.3 and 120.4 (aryl C), 114.6 (quaternary aryl C), 85.7 (C-5), 60.3 (N-CHCO), 46.5 (NCH2), 29.4 and 22.7 [(CH 2) 2]; t R 11.30 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 164 (88), 192 (100), 363 (87, M +. C15H1579BrN402 requires 363), 364 (14), 365 (86, M +. C15H1581BrN4O2 requires 365) and 366 (15).

N-PIRIDIN-2-IL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (99)N-PYRIDIN-2-IL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (99)

Em um método similar a 97, uma mistura de cloreto 85 (1,91 g, 10,40 mmols) e 2-aminopiridina (1,51 g, 16,07 mmols) em tolueno (20 cm3) foi tratada com íerc-butóxido de potássio (3,54 g, 31,51 mmols) em tempera- tura ambiente em um tubo de reação. Aquecimento imediato ocorreu, com a formação de um precipitado marrom denso. O tubo foi vedado e tratado co- mo para 91, seguido por cromatografia de coluna [acetato de etila -1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] para render um pó bege, N- piridin-2-il-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 99 (0,38 g, 15,3 %, 94,0 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,35 (1H, s, H-2), 8,30 (1H, dd, piridina H-6, J 2,0 e 7,0), 7,60 (1H, ~ddd, piridina H-4, J 1,8, 6,8 e 7,2), 7,32 (1H, d, piridi- na H-3, J 8,2), 6,87 (1H, dd, piridina H-5, J 6,0 e 7,2), 6,78 (1H, s, H-5), 3,52 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,90-2,18 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 161,0 (C- 6), 158,1 (C-4), 157,5 (C-2), 153,8 (piridina C-2), 147,7 (piridina C-6), 137,6 (piridina C-4), 116,7 (piridina C-3), 112,6 (piridina C-5), 86,7 (C-5), 46,4 [N(CH2)2] e 25,3 [(CH2)2]; fR 5,17 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 138 (65), 146 (11), 171 (15), 242 (100, M+. Ci3H15N5 re- quer 242) e 243 (31).In a method similar to 97, a mixture of chloride 85 (1.91 g, 10.40 mmols) and 2-aminopyridine (1.51 g, 16.07 mmols) in toluene (20 cm3) was treated with ether-butoxide. of potassium (3.54 g, 31.51 mmols) at room temperature in a reaction tube. Immediate warming occurred with the formation of a dense brown precipitate. The tube was sealed and treated as 91 ° C, followed by column chromatography [ethyl acetate -1: 10 (v / v) methanol in ethyl acetate as eluent] to yield a beige powder, N-pyridin-2. yl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 99 (0.38 g, 15.3%, 94.0% pure by HPLC). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.35 (1H, s, H-2), 8.30 (1H, dd, pyridine H-6, J 2.0 and 7.0), 7.60 (1H, ddd, pyridine H-4, J 1.8, 6.8 and 7.2), 7.32 (1H, d, pyridine H-3, J 8.2), 6.87 (1H, dd , pyridine H-5, J 6.0 and 7.2), 6.78 (1H, s, H-5), 3.52 [4H, br s, N (CH2) 2] and 1.90-2 .18 [4H, m, (CH 2) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 161.0 (C-6), 158.1 (C-4), 157.5 (C-2), 153.8 (C-2 pyridine), 147.7 (pyridine C-6), 137.6 (C-4 pyridine), 116.7 (C-3 pyridine), 112.6 (C-5 pyridine), 86.7 (C-5), 46.4 [N ( CH2) 2] and 25.3 [(CH2) 2]; Rf 5.17 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 138 (65), 146 (11), 171 (15), 242 (100, M +. C13 H15 N5 requires 242) and 243 (31).

N-(1 -BENZIL-2-OXO-2-PIRROLIDIN-1 -ILETIL)-6-PIRROLIDIN-1 - ILPIRIMIDIN-4-AMINA (100)N- (1-BENZYL-2-OXO-2-PYROLIDIN-1-ILETIL) -6-PYROLIDIN-1 - ILPYRIMIDIN-4-AMINE (100)

Seguindo um procedimento similar a 97, cloreto 60 (1,00 g, 3,43 mmols) foi aquecido em tolueno (7 cm3) em um tubo de vidro vedado na presença de pirrolidina (0,57 cm3, 6,89 mmols) a 130QC durante 72h. Após concentração, cromatografia de coluna [usando 2:8 (v/v) metanohacetato de etila como eluente] forneceu um sólido laranja, N-(1-benzil-2-oxo-2-pirrolidin- 1 -iletil)-6-pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-amina 100 (0,33 g, 26 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,18 (1H, br s, H-2), 7,41-7,09 (5H, m, arila H), 5,45 (1H, br d, NH, J 8,8), 5,25 (1H, s, H-5), 5,03 (1H, dt, NHCH, J 14,2 e 6,0), 3,62-3,19 [3H, m, CONCHaHb(CH2)-], 3,38 [4H, t, N(CH2)2-, J 7,0], 3,13 (1H, dd, PhCHaHb, J 13,2 e 7,2), 3,02 (1H, dd, PhCHaHb, J 13,0 e 9,2), 2,80-2,42 [1H, m, CON- CHaHb(CH2)-], 2,13-1,82 e 1,82-1,44 [8h, 2 χ m, 2 χ N(CH2CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 170,6 (CO), 161,2 e 160,2 (C-4 e C-6), 157,5 (C-2), 137,0 (fenila quaternária C), 129,4, 128,2 e 126,7 (fenila CH), 82,9 (C-5), 53,8 (NHCH), 46,3 e 45,7 [CON(CH2)2], 46,2 [N(CH2)2], 39,7 (PhCH2), 25,1 e 24,0 [CON(CH2CH2)2] e 25,3 [N(CH2CH2)2].Following a similar procedure to 97, chloride 60 (1.00 g, 3.43 mmols) was heated in toluene (7 cm3) in a sealed glass tube in the presence of pyrrolidine (0.57 cm3, 6.89 mmols) to 130 ° C for 72h. After concentration, column chromatography [using ethyl 2: 8 (v / v) methane-acetate as eluent] provided an orange solid, N- (1-benzyl-2-oxo-2-pyrrolidin-1-ethyl) -6-pyrrolidin -1-ylpyrimidin-4-amine 100 (0.33 g, 26%). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.18 (1H, br s, H-2), 7.41-7.09 (5H, m, aryl H), 5.45 (1H, br d, NH, J 8.8), 5.25 (1H, s, H-5), 5.03 (1H, dt, NHCH, J 14.2 and 6.0), 3.62-3.19 [3H, m, CONCHaHb (CH 2) -], 3.38 [4H, t, N (CH 2) 2-, J 7.0], 3.13 (1H, dd, PhCHaHb, J 13.2 and 7.2), 3, 02 (1H, dd, PhCHaHb, J 13.0 and 9.2), 2.80-2.42 [1H, m, CON-CHaHb (CH2) -], 2.13-1.82 and 1.82 -1.44 [8h, 2 χ m, 2 χ N (CH 2 CH 2) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 170.6 (CO), 161.2 and 160.2 (C-4 and C-6), 157.5 (C-2), 137.0 (quaternary phenyl C), 129.4, 128.2 and 126.7 (phenyl CH), 82.9 (C-5), 53.8 (NHCH), 46.3 and 45.7 [CON (CH2) 2], 46.2 [N (CH 2 CH 2) 2], 39.7 (PhCH 2), 25.1 and 24.0 [CON (CH 2 CH 2) 2] and 25.3 [N (CH 2 CH 2) 2].

2-{[6-(DIMETILAMINO)PIRIMIDIN-4-IL]AMINO}-3-FENILPROPANOATO DE METILA (101)2 - {[6- (DIMETHYLAMINE) PYRIMIDIN-4-IL] AMINO} -3-METHYLPROPANOATE (101)

Seguindo um procedimento similar a 100, cloreto 60 (0,98 g, 3,37 mmols) foi aquecido em tolueno (7 cm3) em um tubo de vidro vedado na presença de dimetilamina (33 % em etanol, 3,0 cm3, 22,0 mmols) a 130°C durante 72h. Após concentração, cromatografia de coluna [usando 1:9 - 2:8 (v/v) metanol:acetato de etila como eluente] forneceu um sólido laranja, 2- {[6-(dimetilamino)pirimidin-4-il]amino}-3-fenilpropanoato de metila 101 (0,21 g, 17 %). <5h (200 MHz1 CDCl3) 8,20 (1H, br s, H-2), 7,38-7,11 (5H, m, arila H), 5,47 (1H, br d, NH1 J 8,4), 5,38 (1H, s, H-5), 5,31 (1H, dt, NHCH, J 8,2 e 6,0), 3,10 (1H, dd, PhCHaHb, J 13,2 e 5,8), 3,08 3H, s, OCH3), 3,02 (1H, obscurecido ?dd, PhCHaHb, J 13,2 e 3,4), 2,08 e 2,73 (6H, 2xs, 2 χ CH3); δC (50 MHz, CDCl3) 172,3 (CO), 162,5 e 161,6 (C-4 e C-6), 157,3 (C-2), 136,9 (fenila quaternária C), 129,4, 128,3 e 126,7 (fenila CH), 82,5 (C- 5), 51,4 (OCH3), 39,8 (NHCH), 37,1 (PhCH2), 36,9 e 35,6 [N(CH3)2].Following a similar procedure to 100, chloride 60 (0.98 g, 3.37 mmol) was heated in toluene (7 cm3) in a sealed glass tube in the presence of dimethylamine (33% in ethanol, 3.0 cm3, 22 0.0 mmole) at 130 ° C for 72h. After concentration, column chromatography [using 1: 9 - 2: 8 (v / v) methanol: ethyl acetate as eluent] provided an orange solid, 2- {[6- (dimethylamino) pyrimidin-4-yl] amino} Methyl 3-phenylpropanoate 101 (0.21 g, 17%). Δ5h (200 MHz1 CDCl3) 8.20 (1H, br s, H-2), 7.38-7.11 (5H, m, aryl H), 5.47 (1H, br d, NH 1 J 8, 4), 5.38 (1H, s, H-5), 5.31 (1H, dt, NHCH, J 8.2 and 6.0), 3.10 (1H, dd, PhCHaHb, J 13.2 and 5.8), 3.08 3H, s, OCH 3), 3.02 (1H, obscured? dd, PhCHaHb, J 13.2 and 3.4), 2.08 and 2.73 (6H, 2xs, 2 (CH3); δC (50 MHz, CDCl 3) 172.3 (CO), 162.5 and 161.6 (C-4 and C-6), 157.3 (C-2), 136.9 (quaternary phenyl C), 129 , 4, 128.3 and 126.7 (phenyl CH), 82.5 (C-5), 51.4 (OCH3), 39.8 (NHCH), 37.1 (PhCH2), 36.9 and 35 .6 [N (CH 3) 2].

MÉTODO GERAL PARA A NITRAÇÃO DE PIRIMIDINASGENERAL METHOD FOR NITRATION OF PYRIMIDINES

Uma suspensão rapidamente agitada da pirimidina em ácido sul- fúrico concentrado (3-4 eq.) em um frasco cônico foi esfriada para -10°C em um banho de gelo-sal. Ácido nítrico (65 %, 1-2 eq.) foi depois adicionado a gotas à mistura, fornecendo uma mistura amarela brilhante com o passar do tempo que gradualmente ficou laranja profunda. Esta foi depois deixada a- quecer-se para temperatura ambiente por 18h. A mistura é depois decantada sobre gelo esmagado, e ou trabalhada por filtração ou extração, como pode ser a necessidade.A rapidly stirred suspension of pyrimidine in concentrated sulfuric acid (3-4 eq.) In a conical flask was cooled to -10 ° C in an ice-salt bath. Nitric acid (65%, 1-2 eq.) Was then added dropwise to the mixture, providing a bright yellow mixture over time that gradually turned deep orange. This was then allowed to warm to room temperature for 18h. The mixture is then decanted over crushed ice, and either worked by filtration or extraction as may be required.

5-NITRO-N-PIRIDIN-2-IL-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (102)5-NITRO-N-PYRIDIN-2-IL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (102)

Usando o método geral por nitração, pirimidina 99 (0,28 g, 1,16 mmol), ácido nítrico (65 %, 0,24 cm3, 2,4 mmols) e ácido sulfúrico con- centrado (2,3 cm3) foram misturados a O9C, fornecendo uma solução amare- lo-laranja. Após processamento, cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano forneceu um sólido amarelo, 5-nitro-N-piridin-2-il-6- pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-amina 102 (0,28 g, 83,1 %). δH (200 MHz, CDCl3) 10,2 (1H, br s, NH), 8,42 (1H, dd, piridina H-6, J 0,8 e 8,4), 8,35 (1H, dt, piri- dina H-4, J 1,0 e 4,8), 8,23 (1H, s, H-2), 7,71 (1H, ddd, H-5, J 1,9, 7,8 e 8,8), 7,04 (1H, dd, H-3, J 4,8 e 7,2), 3,47 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,96-2,05 [4H, m, (CH2)2]; δC (50 MHz, CDCl3) 156,9 (piridina C-2), 153,5 (C-6), 151,5 (C-4), 148,2 (piridina C-6), 137,8 (piridina C-4), 119,6 (C-2), 115,8 (piridina C-5), 109,7 (piridina C-3), 80,2 (C-5), 50,0 [N(CH2)2] e 25,2 [br, (CH2)2]; (ES) m/z 213 (10), 241 (65), 242 (125), 287 (100, MH+. Ci3H15N6O2 requer 287) e 288 (18).Using the general nitration method, pyrimidine 99 (0.28 g, 1.16 mmol), nitric acid (65%, 0.24 cm 3, 2.4 mmols) and concentrated sulfuric acid (2.3 cm 3) were mixed with O9C to provide a yellow-orange solution. After work up, column chromatography using 1:10 (v / v) ethyl acetate: hexane provided a yellow solid, 5-nitro-N-pyridin-2-yl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 102 ( 0.28 g, 83.1%). δH (200 MHz, CDCl 3) 10.2 (1H, br s, NH), 8.42 (1H, dd, pyridine H-6, J 0.8 and 8.4), 8.35 (1H, dt, pyridine H-4, J 1.0 and 4.8), 8.23 (1H, s, H-2), 7.71 (1H, ddd, H-5, J 1.9, 7.8 and 8.8), 7.04 (1H, dd, H-3, J 4.8 and 7.2), 3.47 [4H, br s, N (CH 2) 2] and 1.96-2, [4H, m, (CH 2) 2]; δC (50 MHz, CDCl 3) 156.9 (C-2 pyridine), 153.5 (C-6), 151.5 (C-4), 148.2 (C-6 pyridine), 137.8 (pyridine C-4), 119.6 (C-2), 115.8 (C-5 pyridine), 109.7 (C-3 pyridine), 80.2 (C-5), 50.0 [N (CH 2 ) 2] and 25.2 [br, (CH 2) 2]; (ES) m / z 213 (10), 241 (65), 242 (125), 287 (100, MH +. C13 H15 N6 O2 requires 287) and 288 (18).

MÉTODO GERAL PARA A BROMAÇÃO DE 4,6-DIAMINOPIRIMIDINASGENERAL METHOD FOR 4,6-DIAMINOPYRIMIDINE BROMATION

Uma solução da pirimidina em diclorometano em temperatura ambiente foi tratada com bromo (1,5-2 eq.), usualmente resultando em um exotérmico e a ebulição rápida concomitante da solução de diclorometano se esta operação for feita muito rapidamente, rendendo uma solução vermelha para preta. A mistura é deixada, parada, por 18h, então decantada em 1M de hidróxido de sódio aquoso e extraída com diclorometano. Processamento padrão e cromatografia de coluna fornecem os brometos como sólidos ou óleos.A solution of pyrimidine in dichloromethane at room temperature was treated with bromine (1.5-2 eq.), Usually resulting in an exothermic and concomitant rapid boiling of the dichloromethane solution if this operation was done too quickly, yielding a red solution to Black The mixture is left standing for 18h, then decanted into 1M aqueous sodium hydroxide and extracted with dichloromethane. Standard processing and column chromatography provide bromides as solids or oils.

5-BROMO-N-METIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (103)5-BROMO-N-METHYL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (103)

Uma solução da pirimidina 89 (0,50 g, 2,78 mmols) em dicloro- metano (7,0 cm3) foi tratada com bromo (0,17 cm3, 3,33 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 - 1:1 (v/v) acetato de etila.hexano como eluente] forneceu um sólido bege, 5-bromo-N-metil-6- pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-amina 103 (0,54 g, 75 %; 100 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,09 (1H, s, H-2), 5,31 (1H, br s, NH), 3,72 [4H, t, (- CH2)2N, J 6,7], 3,01 (3H, d, NHCH3, J 4,8) e 2,02-1,75 [4H, m, O(CH2)2 -]; <5C (50 MHz, CDCI3) 160,0 e 158,1 (C-4 e C-6), 154,8 (C-2), 83,2 (C-5), 50,0 [(CH2CH2)2N], 28,7 (NHCH3) e 25,7 [(CH2CH2)2N]; íR 2,15 min (metanol). 5-BROMO-N-METIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (104)A solution of pyrimidine 89 (0.50 g, 2.78 mmol) in dichloromethane (7.0 cm 3) was treated with bromine (0.17 cm 3, 3.33 mmol) according to the general procedure. Column chromatography [1: 4 - 1: 1 (v / v) ethyl acetate.hexane as eluent] provided a beige solid, 5-bromo-N-methyl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 103 ( 0.54 g, 75%; 100% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.09 (1H, s, H-2), 5.31 (1H, br s, NH), 3.72 [4H, t, (-CH 2) 2 N, J 6, 7], 3.01 (3H, d, NHCH 3, J 4,8) and 2,02-1,75 [4H, m, O (CH 2) 2 -]; Δ 5C (50 MHz, CDCl 3) 160.0 and 158.1 (C-4 and C-6), 154.8 (C-2), 83.2 (C-5), 50.0 [(CH 2 CH 2) 2N], 28.7 (NHCH 3) and 25.7 [(CH 2 CH 2) 2 N]; R 2.15 min (methanol). 5-BROMO-N-METHYL-6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (104)

Uma solução da pirimidina 90 (1,51 g, 7,78 mmols) em dicloro- metano (19,5 cm3) foi tratada com bromo (0,48 cm3, 9,34 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 - 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu um sólido bege, 5-bromo-N-metil-6- morfolin-4-ilpirimidin-4-amina 104 (1,66 g, 78 %, 99 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,22 (1H, s, H-2),5,39 (1H, br s, NH), 3,79 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J4,6], 3,44 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J4,7] e 3,03 (3H, d, NHCH3, J 5,0); õc (50 MHz, CDCI3) 162,3 e 160,5 (C-4 e C-6), 157,3 (C-2),90,6(C- 5), 66,8 [O(CH2CH2)2N ], 49,1 [O(CH2CH2)2N] e 28,6 (NHCH3); tR 1,97 min (metanol).A solution of pyrimidine 90 (1.51 g, 7.78 mmols) in dichloromethane (19.5 cm3) was treated with bromine (0.48 cm3, 9.34 mmols) according to the general procedure. Column chromatography [1: 4 - 1: 1 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent] provided a beige solid, 5-bromo-N-methyl-6-morpholin-4-ylpyrimidin-4-amine 104 ( 1.66 g, 78%, 99% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.22 (1H, s, H-2), 5.39 (1H, br s, NH), 3.79 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J4.6 ], 3.44 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J4.7] and 3.03 (3H, d, NHCH 3, J 5.0); δc (50 MHz, CDCl 3) 162.3 and 160.5 (C-4 and C-6), 157.3 (C-2), 90.6 (C-5), 66.8 [O (CH 2 CH 2) 2N], 49.1 [O (CH 2 CH 2) 2 N] and 28.6 (NHCH 3); t R 1.97 min (methanol).

N-BENZIL-5-BROMO-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (105)N-BENZYL-5-BROMO-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (105)

Aplicando o método geral por bromação, pirimidina 91 (0,55 g, 2,17mmols) e bromo (0,17 cm3, 3,26 mmols) em diclorometano (4,4 cm3) renderam, após processamento e cromatografia de coluna [1:10 - 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano], um óleo laranja, N-benzil-5-bromo-6-pirrolidin-1- ilpirimidin-4-amina 105 (0,59 g, 81,8 %, 92,4 % puro por HPLC). <5H (200 MHz1 CDCI3) 8,12 (1H, s, H-2), 7,25-7,39 (5H, m, arila H), 5,65 (1H, br m, NH), 4,72 (2H, d, PhCH2, J 5,4), 3,72-3,82 [4H, m, N(CH2)2] e 1,85-1,98 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 159,4 (C-6), 158,2 (C-4), 154,8 (C-2), 139,1 (arila quaternária C), 128,6, 127,5 e 127,5 (arila C), 83,1 (C-5), 50,1 [N(CH2)2], 45,6 (PhCH2) e 25,7 [br, (CH2)2]; fR 2,38 min (metanol); (ES) m/z 241 (41), 243 (42), 333 (100, M+. C15H1779BrN4 requer 333), 334 (14), 335 (100, M+. Ci5Hi78IBrN4 requer 335) e 366 (15).Applying the general method by bromination, pyrimidine 91 (0.55 g, 2.17 mmol) and bromine (0.17 cm 3, 3.26 mmol) in dichloromethane (4.4 cm 3) yielded, after processing and column chromatography [1 : 10 - 1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane], an orange oil, N-benzyl-5-bromo-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-amine 105 (0.59 g, 81, 8%, 92.4% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz1 CDCl3) 8.12 (1H, s, H-2), 7.25-7.39 (5H, m, aryl H), 5.65 (1H, br m, NH), 4, 72 (2H, d, PhCH 2, J 5.4), 3.72-3.82 [4H, m, N (CH 2) 2] and 1.85-1.98 [4H, m, (CH 2) 2] ; ΔC (50 MHz, CDCl3) 159.4 (C-6), 158.2 (C-4), 154.8 (C-2), 139.1 (quaternary aryl C), 128.6, 127, 5 and 127.5 (aryl C), 83.1 (C-5), 50.1 [N (CH 2) 2], 45.6 (PhCH 2) and 25.7 [br, (CH 2) 2]; R f 2.38 min (methanol); (ES) m / z 241 (41), 243 (42), 333 (100, M +. C15H1779BrN4 requires 333), 334 (14), 335 (100, M + .C15H1778BrN4 requires 335) and 366 (15).

N-BENZIL-1-[6-(BENZILAMINO)-5-BROMOPIRIMIDIN-4-il]PIRROLIDINO-2- CARBOXAMIDA (106)N-BENZYL-1- [6- (BENZYLAMINO) -5-BROMOPYRIMIDIN-4-yl] PYROLIDINO-2-CARBOXAMIDE (106)

Seguindo o procedimento geral por bromação, produto 92 (1,69 g, 4,35 mmols) e bromo (0,27 cm3, 5,2 mmols) em diclorometano (4,5 cm3) renderam, após cromatografia de coluna com 1:10-1:5 (v/v) ace- tato de etila:hexano como eluente, um óleo de amarelo-laranja, N-benzil-1- [6-(benzilamino)-5-bromopirimidin-4-il]pirrolidino-2-carboxamida 106 (1,52 g, 75 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,01 (1H, s, H-2), 7,02-7,34 (10H, m, arila H), 6,65 (1H, br t, CONH, J 5,8), 5,69 (1H, br t, arila NH, J 5,7), 4,88 (1H, dd, NCHCO, J 6,2 e 7,4), 4,63 (2H, d, PhCH2, J 5,8), 4,37 (2H, dd, PhCH2, J 2,0 e 5,8), 4,02 (1H, ddd, NCHaHb, J 7,2, 9,2 e 16,2), 3,68 (1H, ddd, NCHaHb, J 7,6, 10,2 e 13,4) e 1,70-2,31 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 172,8 (CO), 159,6 (C-6), 158,9 (C-4), 154,8 (C-2), 138,6 e 138,3 (arila quaternária C), 128,5, 128,4, 127,3, 127,2, 127,2 e 127,1 (arila C), 85,2 (C-5), 63,1 (N- CHCO), 52,0 (NCH2), 45,4 e 43,0 (2 χ PhCH2), 29,8 e 25,3 [(CH2)2]; (ES) m/z 255 (11), 283 (10), 345 (100, Ci6Hi779BrN4), 346 (15), 347 (98, C16H1781BrN4), 348 (16), 373 (58, C16H1679BrN5O), 375 (58, C16H1681BrN5O), 376(12) e 388(1, M+ - Br). No M+(C23H2479BrN5O requer 466).Following the general procedure by bromination, product 92 (1.69 g, 4.35 mmols) and bromine (0.27 cm 3, 5.2 mmols) in dichloromethane (4.5 cm 3) yielded after 1 column chromatography: 10-1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent, an orange-yellow oil, N-benzyl-1- [6- (benzylamino) -5-bromopyrimidin-4-yl] pyrrolidine-1 2-carboxamide 106 (1.52 g, 75%). <5h (200 MHz, CDCl 3) 8.01 (1H, s, H-2), 7.02-7.34 (10H, m, aryl H), 6.65 (1H, br t, CONH, J 5 8.69 (1H, br t, aryl NH, J 5.7), 4.88 (1H, dd, NCHCO, J 6.2 and 7.4), 4.63 (2H, d, PhCH2, J 5.8), 4.37 (2H, dd, PhCH2, J 2.0 and 5.8), 4.02 (1H, ddd, NCHaHb, J 7.2, 9.2 and 16.2 ), 3.68 (1H, ddd, NCHaHb, J 7.6, 10.2 and 13.4) and 1.70-2.31 [4H, m, (CH 2) 2]; ΔC (50 MHz, CDCl3) 172.8 (CO), 159.6 (C-6), 158.9 (C-4), 154.8 (C-2), 138.6 and 138.3 ( quaternary aryl C), 128.5, 128.4, 127.3, 127.2, 127.2 and 127.1 (aryl C), 85.2 (C-5), 63.1 (N-CHCO) , 52.0 (NCH 2), 45.4 and 43.0 (2 χ PhCH 2), 29.8 and 25.3 [(CH 2) 2]; (ES) m / z 255 (11), 283 (10), 345 (100, C16 H1779 BrN4), 346 (15), 347 (98, C16H1781BrN4), 348 (16), 373 (58, C16H1679BrN5 O), 375 (58 , C 16 H 1681 BrN 5 O), 376 (12) and 388 (1, M + - Br). No M + (C23H2479BrN5O requires 466).

N-BENZIL-5-BROMO-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (107)N-BENZYL-5-BROMO-6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDIN-4-AMINE (107)

Uma solução da pirimidina 93 (1,37 g, 5,05 mmols) em dicloro- metano (13,0 cm3) foi tratada com bromo (0,31 cm3, 6,06 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 - 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu um óleo laranja, N-benzil-5-bromo-6- morfolin-4-ilpirimidin-4-amina 107 (1,07g, 61 %, 99 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCl3) 8,23 (1H, s, H-2), 7,48-7,12 (5H, m, arila H), 5,70 (1H, br m, NH), 4,71 (2H, d, PhCH2, J 5,8), 3,81 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,6] e 3,48 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,6]; õc (50 MHz, CDCI3) 162,7 e 159,9 (C-4 e C-6), 155,4 (C-2), 138,5 (fenila quaternária C), 128,7, 127,5 e 127,4 (fenila CH), 90,4 (C-5), 66,8 [O(CH2CH2)2N], 49,1 (PhCH2) e 45,5 [O(CH2CH2)2N]; fR 2,10 min (metanol).A solution of pyrimidine 93 (1.37 g, 5.05 mmol) in dichloromethane (13.0 cm3) was treated with bromine (0.31 cm3, 6.06 mmol) according to the general procedure. Column chromatography [1: 4 - 1: 1 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent] provided an orange oil, N-benzyl-5-bromo-6-morpholin-4-ylpyrimidin-4-amine 107 ( 1.07g, 61%, 99% pure by HPLC). Δ 5H (200 MHz, CDCl 3) 8.23 (1H, s, H-2), 7.48-7.12 (5H, m, aryl H), 5.70 (1H, br m, NH), 4 , 71 (2H, d, PhCH 2, J 5.8), 3.81 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.6] and 3.48 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4.6]; δc (50 MHz, CDCl 3) 162.7 and 159.9 (C-4 and C-6), 155.4 (C-2), 138.5 (quaternary phenyl C), 128.7, 127.5 and 127.4 (phenyl CH), 90.4 (C-5), 66.8 [O (CH 2 CH 2) 2 N], 49.1 (PhCH 2) and 45.5 [O (CH 2 CH 2) 2 N]; R f 2.10 min (methanol).

2-[(5-BROMO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (108)2 - [(5-BROMO-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (108)

Usando o método geral por bromação, pirimidina 94 (0,96 g, 4,96 mmols) e bromo (0,26 cm3, 5,1 mmols) em diclorometano (23 cm3) ren- deram, após processamento e cromatografia de coluna [1:10 - 1:5 (v/v) ace- tato de etila:hexano como eluente], um óleo amarelo, 2-[(5-bromo-6- pirrolidin-1-ilpirimidin-4-il)amino]etanol 108 (1,04g, 79,0 %, 99 % puro por 20 HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 7,93 (1H, s, H-2), 5,74 (1H, br m, NH), 4,49 (1H, br s, OH), 3,42-3,76 [8H, 2 χ m, HO(CH2)2NH e N(CH2)2] e 1,82-1,97 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 159,7 (C-6), 158,0 (C-4), 154,1 (C-2), 82,6 (C-5), 62,9 (OCH2), 49,9 [N(CH2)2], 44,7 (CH2NH) e 25,5 [(CH2)2]; tfí 8,40 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 162 (12), 25 189 (79), 190 (18), 207 (27), 269 (47, M+ - H2O), 271 (48, M+ - H2O), 287 (100, M+. Ci0H1SygBrN4O requer 287) e 289 (96, M+. Ci0Hi58IBrN4O requer 289).Using the general brominating method, pyrimidine 94 (0.96 g, 4.96 mmols) and bromine (0.26 cm 3, 5.1 mmols) in dichloromethane (23 cm 3) yielded, after processing and column chromatography [ 1:10 - 1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent], a yellow oil, 2 - [(5-bromo-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-yl) amino] ethanol 108 (1.04g, 79.0%, 99% pure by 20 HPLC). <5h (200 MHz, CDCl 3) 7.93 (1H, s, H-2), 5.74 (1H, br m, NH), 4.49 (1H, br s, OH), 3.42-3 , 76 [8H, 2 χ m, HO (CH 2) 2 NH and N (CH 2) 2] and 1.82-1.97 [4H, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz, CDCl 3) 159.7 (C-6), 158.0 (C-4), 154.1 (C-2), 82.6 (C-5), 62.9 (OCH2), 49.9 [N (CH 2) 2], 44.7 (CH 2 NH) and 25.5 [(CH 2) 2]; 8.40 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 162 (12), 25 189 (79), 190 (18), 207 (27), 269 (47, M + - H 2 O), 271 (48, M + - H 2 O), 287 (100, M + (C10H1SygBrN4O requires 287) and 289 (96, M + .C10H158IBrN4O requires 289).

N-(2-HIDROXIETIL)-1-{6-[(2-HIDROXIETIL)AMINO]-5-BROMOPIRIMIDIN-4- ILJPIRROLIDINO-2-CARBOXAMIDA (109)N- (2-HYDROXYETHYL) -1- {6 - [(2-HYDROXYETHYL) AMINO] -5-BROMOPYRIMIDIN-4-ILJPYROLIDINE-2-CARBOXAMIDE

Usando o método geral por bromação, pirimidina 95 (0,968 g, 4,96 mmols) e bromo (0,26 cm3, 5,17 mmols) em diclorometano (23 cm3) renderam, após processamento e cromatografia de coluna [1:10 - 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente], um óleo amarelo, N-(2-hidroxietil)-1- {6-[(2-hidroxietil)amino]-5-bromopirimidin-4-il}pirrol-idino-2-carboxamida 109 (1,04 g, 79,0 %). <5H (200 MHz1 CDCI3) 7,93 (1H, s, H-2), 5,74 (1H, br m, NH), 4,49 (1H, br s, OH), 3,42-3,76 [8H, 2 x m, HO(CH2)2NH e N(CH2)2] e 1,82- 1,97 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 159,7 (C-6), 158,0 (C-4), 154,1 (C- 2), 82,6 (C-5), 62,9 (OCH2), 49,9 [N(CH2)2], 44,7 (CH2NH) e 25,5 [(CH2)2]. 2-[(5-BROMO-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (110)Using the general bromination method, pyrimidine 95 (0.968 g, 4.96 mmols) and bromine (0.26 cm3, 5.17 mmols) in dichloromethane (23 cm3) yielded, after processing and column chromatography [1:10 - 1: 5 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent], a yellow oil, N- (2-hydroxyethyl) -1- {6 - [(2-hydroxyethyl) amino] -5-bromopyrimidin-4-yl } pyrrolidine-2-carboxamide 109 (1.04 g, 79.0%). ΔH (200 MHz1 CDCl3) 7.93 (1H, s, H-2), 5.74 (1H, br m, NH), 4.49 (1H, br s, OH), 3.42-3, 76 [8H, 2 xm, HO (CH 2) 2 NH and N (CH 2) 2] and 1.82-1.97 [4H, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz, CDCl 3) 159.7 (C-6), 158.0 (C-4), 154.1 (C-2), 82.6 (C-5), 62.9 (OCH2), 49.9 [N (CH 2) 2], 44.7 (CH 2 NH) and 25.5 [(CH 2) 2]. 2 - [(5-BROMO-6-MORFOLIN-4-ILPYRIMIDIN-4-IL) AMINO] ETHANOL (110)

Uma solução da pirimidina 96 (1,57 g, 6,98 mmols) em dicloro- metano (17,0 cm3) foi tratada com bromo (0,43 cm3, 8,37 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 (v/v) acetato de eti- la:hexano para 1:9 (v/v) metanokacetato de etila como eluente] forneceu um sólido bege, 2-[(5-bromo-6-morfolin-4-ilpirimidin-4-il)amino]etanol 110 (1,04 g, 49 %, 98 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,12 (1H, s, H-2), 5,81 (1H, br m, NH), 3,90-3,67 (7H, br t e m obscurecido, OH, O(CH2CH2)2N, J 4,0 e CH2OH), 3,63 (2H, ~dt, NHCH2, J 5,5 e 4,2) e 3,46 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 162,5 e 160,3 (C-4 e C-6), 154,9 (C-2), 90,1 (C-5), 66,8 [O(CH2CH2)2N], 62,8 (CH2OH), 49,0 [O(CH2CH2)2N] e 44,7 (NHCH2); fR 3,87 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).A solution of pyrimidine 96 (1.57 g, 6.98 mmol) in dichloromethane (17.0 cm3) was treated with bromine (0.43 cm3, 8.37 mmol) according to the general procedure. Column chromatography [1: 4 (v / v) ethyl acetate: hexane to 1: 9 (v / v) ethyl methanokacetate as eluent] provided a beige solid, 2 - [(5-bromo-6-morpholin -4-ylpyrimidin-4-yl) amino] ethanol 110 (1.04 g, 49%, 98% pure by HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 8.12 (1H, s, H-2), 5.81 (1H, br m, NH), 3.90-3.67 (7H, br has obscured, OH, O ( CH 2 CH 2) 2 N, J 4.0 and CH 2 OH), 3.63 (2H, dt, NHCH 2, J 5.5 and 4.2) and 3.46 [4H, t, O (CH 2 CH 2) 2 N, J 4, 2]; δ 5 (50 MHz, CDCl3) 162.5 and 160.3 (C-4 and C-6), 154.9 (C-2), 90.1 (C-5), 66.8 [O (CH2 CH2 ) 2N], 62.8 (CH 2 OH), 49.0 [O (CH 2 CH 2) 2 N] and 44.7 (NHCH 2); R f 3.87 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate).

MÉTODO GERAL PARA AMINAÇÃO CATALÍTICA DE 5- BROMOPIRIMIDINASGENERAL METHOD FOR CATALYTIC AMINATION OF 5-BROMOPYRIMIDINS

A 5-bromopirimidina a ser usada foi colocada em um tubo de reação, junto com a amina requerida (4 eq.), hidrato de fosfato de potássio (2 eq.) e N,N-di-metiletanolamina comercial (0,1 M) em temperatura ambien- te. A mistura foi depois purgada com um fluxo de gás de nitrogênio durante cerca de 15 minutos após os quais iodeto cuproso branco anidro (Cul, 1,1 eq.) foi adicionado, em geral fornecendo uma mistura verde. O tubo foi vedado sob atmosfera de nitrogênio, e depois aquecido para 100°C durante 18h. A mistura assume uma cor roxo-preta gradualmente à medida que a reação prossegue. Após esfriar, a mistura é tratada com solução de amônia concentrada para remover os resíduos de cobre, e extraída com diclorome- tano. Concentração e cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) meta- nohacetato de etila como eluente, usando uma pequena amônia conforme necessário, fornece o produto purificado.The 5-bromopyrimidine to be used was placed in a reaction tube, along with the required amine (4 eq.), Potassium phosphate hydrate (2 eq.) And commercial N, N-dimethylethanolamine (0.1 M). ) at room temperature. The mixture was then purged with a nitrogen gas stream for about 15 minutes after which anhydrous white cuprous iodide (Cul, 1.1 eq.) Was added, generally providing a green mixture. The tube was sealed under a nitrogen atmosphere, and then heated to 100 ° C for 18h. The mixture gradually turns purple-black in color as the reaction proceeds. After cooling, the mixture is treated with concentrated ammonia solution to remove copper residue, and extracted with dichloromethane. Concentration and column chromatography using 1:10 (v / v) ethyl methanohacetate as eluent, using a small ammonia as required, provides the purified product.

N4,N5-DIBENZIL-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (111)N4, N5-DIBENZYL-6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDINE-4,5-DIAMINE (111)

Usando o procedimento geral, brometo 105 (0,19 g, 0,58 mmol), benzilamina (0,26 cm3, 2,4 mmols), hidrato de fosfato de potássio (0,29 g, 1,28 mmol), iodeto cuproso (0,15 g, 0,78 mmol) e N,N-dimetiletanolamina (1 cm3) foi fervido junto, resultando em uma solução marrom. Processamen- to e cromatografia forneceram um sólido amarelo, dibenzil-6-pirrolidin- 1-ilpirimidino-4,5-diamina 111 (0,15 g, 69 %, 78,0 % puro por HPLC). δH (200 MHz, CDCI3) 8,15 (1H, s, H-2), 7,12-7,45 (10H, m, arila H), 5,17 e 5,42 (2H, br s e br m, 2 χ NH), 4,44 (2H, d, PhCH2, J4,8), 3,89 (2H, br s, PhCH2), 3,39 [4H, br m, N(CH2)2] e 1,75-2,05 [4H, m, (CH2)2]; δc (50 MHz1 CDCI3) 162,2 (C-6), 160,6 (C-4), 157,6 (C-2), 138,4 (arila quaternária C), 128,6, 128,5, 127,3, 127,2, 127,0 e 126,8 (arila C), 80,6 (C-5), 46,2 [N(CH2)2], 45,8 (2 χ PhCH2) e 25,2 [br, (CH2)2]; tr 9,78 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 138 (29), 163 (48, C8H12N4), 228 (21), 255 (100, C15HI8N4) e 256 (25). No M+ (C22H25N5 requer 360).Using the general procedure, bromide 105 (0.19 g, 0.58 mmol), benzylamine (0.26 cm3, 2.4 mmols), potassium phosphate hydrate (0.29 g, 1.28 mmol), iodide Cuprous (0.15 g, 0.78 mmol) and N, N-dimethylethanolamine (1 cm3) were boiled together, resulting in a brown solution. Processing and chromatography afforded a yellow solid, dibenzyl-6-pyrrolidin-1-ylpyrimidine-4,5-diamine 111 (0.15 g, 69%, 78.0% pure by HPLC). δH (200 MHz, CDCl3) 8.15 (1H, s, H-2), 7.12-7.45 (10H, m, aryl H), 5.17 and 5.42 (2H, br se br m , 2 χ NH), 4.44 (2H, d, PhCH2, J4.8), 3.89 (2H, br s, PhCH2), 3.39 [4H, br m, N (CH2) 2] and 1 , 75-2.05 [4H, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz1 CDCl3) 162.2 (C-6), 160.6 (C-4), 157.6 (C-2), 138.4 (quaternary aryl C), 128.6, 128.5, 127.3, 127.2, 127.0 and 126.8 (aryl C), 80.6 (C-5), 46.2 [N (CH2) 2], 45.8 (2 χ PhCH2) and 25 , 2 [br, (CH 2) 2]; R t 9.78 min (50% methanol: 25 mM ammonium acetate); (ES) m / z 138 (29), 163 (48, C 8 H 12 N 4), 228 (21), 255 (100, C 15 H 18 N 4) and 256 (25). No M + (C22H25N5 requires 360).

2-{[5-(BENZILAMINO)-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL]AMINO}ETANOL (112)2 - {[5- (BENZYLAMINO) -6-PYROLIDIN-1-ILPYRIMIDIN-4-IL] AMINO} ETHANOL (112)

Usando o procedimento geral, brometo 108 (0,30 g, 1,04 mmol), benzilamina (0,47 cm3, 4,32 mmols), hidrato de fosfato de potássio (0,59 g, 2,57 mmols), iodeto cuproso (0,23 g, 1,21 mmol) e N,N-dimetiletanolamina (1,8 cm3) foram fervidos juntos, resultando em uma solução de roxo-marrom. Processamento e cromatografia forneceram um sólido amarelo, 2-{[5- (benzilamino)-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-il]amino}etanol 112 (0,30 g, 92,3 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,10 (1H, br s, H-2), 7,12-7,40 (5H, m, arila H), 4,41 e 5,13 (4H, 2 χ br s, 2 χ NHe PhCH2), 3,80 (1H, br s, OH), 3,54-3,68 (2H, m, OCH2), 3,19-3,42 [4H, br m, N(CH2)2], 2,05 (2H, s, NHCH2) e 1,86-1,95 [4H, m, (CH2)2]; δc (50 MHz1 CDCI3) 162,3 (C-6), 160,3 (C-4), 157,2 (C-2), 140,1 (arila quaternária C), 128,2, 127,6 e 126,4 (arila C), 80,8 (C-5), 61,1 (OCH2), 55,3 (PhCH2), 46,1 [N(CH2)2], 44,1 (CH2NH) e 25,1 [(CH2)2]. 2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA (113)Using the general procedure, 108 bromide (0.30 g, 1.04 mmol), benzylamine (0.47 cm 3, 4.32 mmols), potassium phosphate hydrate (0.59 g, 2.57 mmols), iodide Cuprous (0.23 g, 1.21 mmol) and N, N-dimethylethanolamine (1.8 cm3) were boiled together, resulting in a purple-brown solution. Processing and chromatography afforded a yellow solid, 2 - {[5- (benzylamino) -6-pyrrolidin-1-ylpyrimidin-4-yl] amino} ethanol 112 (0.30 g, 92.3%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.10 (1H, br s, H-2), 7.12-7.40 (5H, m, aryl H), 4.41 and 5.13 (4H, 2 χ br s, 2 χ NHe PhCH 2), 3.80 (1H, br s, OH), 3.54-3.68 (2H, m, OCH 2), 3.19-3.42 [4H, br m, N ( CH 2) 2], 2.05 (2H, s, NHCH 2) and 1.86-1.95 [4H, m, (CH 2) 2]; δc (50 MHz1 CDCl3) 162.3 (C-6), 160.3 (C-4), 157.2 (C-2), 140.1 (quaternary aryl C), 128.2, 127.6 and 126.4 (aryl C), 80.8 (C-5), 61.1 (OCH 2), 55.3 (PhCH 2), 46.1 [N (CH 2) 2], 44.1 (CH 2 NH) and 25 , 1 [(CH 2) 2]. 2-PHENYLIMIDATION [1,2-a] PYRIDINE (113)

Cloreto de fenacila (2,03 g, 13,1 mmols) e 2-aminopiridina (1,24g, 13,1 mmols) foram aquecidos para 1205C em dimetilformamida (25 cm3) durante 5h. A mistura foi depois deixada esfriar e agitada em tem- peratura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em água (50 cm3) e extraída em acetato de etila (2 x 50 cm3). O solvente foi removido da fase orgânica gerando um óleo escuro que foi submetido à cromatografia instan- tânea [1:2 a 2:1 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente]. Um material cristalino marrom pálido foi isolado [Rf0,23, 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano] que foi identificado como o composto do título 113 (0,79 g, 31 %). δΗ (CDCI3, 200 MHz) 8,13 (1H, d, H-5, J 6,6), 7,98 (2H, d, fenila H, J 6,8), 7,87 (1H, s, H-3), 7,67 (1H, d, H-8, J 9,0), 7,43 (3H, m, fenila H), 7,19 (1H, dd, H-7, J 9,0 e 7,8) e 6,79 (1H, dd, H-6, J 7,8 e 6,6).Phenacyl chloride (2.03 g, 13.1 mmol) and 2-aminopyridine (1.24 g, 13.1 mmol) were heated to 120 ° C in dimethylformamide (25 cm 3) for 5h. The mixture was then allowed to cool and stirred at room temperature overnight. The mixture was poured into water (50 cm 3) and extracted into ethyl acetate (2 x 50 cm 3). The solvent was removed from the organic phase affording a dark oil which was flash chromatographed [1: 2 to 2: 1 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent]. A pale brown crystalline material was isolated [Rf0.23, 1: 1 (v / v) ethyl acetate: hexane] which was identified as the title compound 113 (0.79 g, 31%). δΗ (CDCl3, 200 MHz) 8.13 (1H, d, H-5, J 6.6), 7.98 (2H, d, phenyl H, J 6.8), 7.87 (1H, s, H-3), 7.67 (1H, d, H-8, J 9.0), 7.43 (3H, m, phenyl H), 7.19 (1H, dd, H-7, J 9, 0 and 7.8) and 6.79 (1H, dd, H-6, J 7.8 and 6.6).

2-(4-BROMOFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA (114)2- (4-BROMOPHENYL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDINE (114)

Cloreto de 4-bromofenacila (2,44 g, 10,9 mmols) e 2- aminopiridina (1,03 g, 10,9 mmols) foram aquecidas para 1209C em dimetil- formamida (20 cm3) por 5 h. A mistura foi depois deixada esfriar e agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em água (40 cm3) e extraída em acetato de etila (2 χ 40 cm3). O solvente foi removido da fase orgânica gerando um óleo escuro que foi submetido à cromatografia instantânea [(2:3 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente]. Um material cristalino amarelo foi isolado [R^ 0,35, 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano] que foi identificado como o composto do título 114 (2,14 g, 72 %). <5H (CDCI3, 200 MHz) 8,15 (1H, d, H-5, J 6,7), 7,87 (1H, s, H-3), 7,85 (2H, d, fenila H-3 e H-5, J 8,5), 7,66 (1H, d, H-8, J 9,1), 7,57 (2H, d, fenila H-2 e H-6, J 8,5), 7,22 (1H, dd, H-7, J9,1 e 7,1) e 6,80 (1H, dd, H-6, J6,7 e 7,1).4-Bromophenacyl chloride (2.44 g, 10.9 mmol) and 2-aminopyridine (1.03 g, 10.9 mmol) were heated to 120 ° C in dimethylformamide (20 cm3) for 5 h. The mixture was then allowed to cool and stirred at room temperature overnight. The mixture was poured into water (40 cm3) and extracted into ethyl acetate (2 x 40 cm3). The solvent was removed from the organic phase affording a dark oil which was flash chromatographed [(2: 3 (v / v) ethyl acetate: hexane as eluent].) A yellow crystalline material was isolated [Rf 0.35.1 : 1 (v / v) ethyl acetate: hexane] which was identified as the title compound 114 (2.14 g, 72%). <5 H (CDCl3, 200 MHz) 8.15 (1H, d, H- 5, J 6.7), 7.87 (1H, s, H-3), 7.85 (2H, d, phenyl H-3 and H-5, J 8.5), 7.66 (1H, d, H-8, J 9.1), 7.57 (2H, d, phenyl H-2 and H-6, J 8.5), 7.22 (1H, dd, H-7, J9.1 and 7.1) and 6.80 (1H, dd, H-6, J6.7 and 7.1).

PROCEDIMENTO GERAL PARA A PREPARAÇÃO DE IMIDAZO[1,2- a]PIRIDINAS USANDO CLORETO DE ZINCOGENERAL PROCEDURE FOR PREPARATION OF IMIDAZO [1,2- a] PYRIDINES USING ZINC CHLORIDE

2-Aminopiridina (0,13 mg, 1,33 mmol) foi dissolvida em dioxano, e tratada com cloreto de zinco (5 mois %, 0,07 mmol), aldeído (1,0eq., 1,33 mmol) e isocianeto (1,0 eq., 1,328 mmol) e vedados em um reator de microonda. A mistura foi irradiada a 40 % de potência (de 600W) por 1,5h. Após este tempo, a mistura de reação foi concentrada e a mistura bruta tra- tada com acetato de etila/hexano para fornecer o produto como um precipi- tado.2-Aminopyridine (0.13 mg, 1.33 mmol) was dissolved in dioxane, and treated with zinc chloride (5 mois%, 0.07 mmol), aldehyde (1.0eq., 1.33 mmol) and isocyanide. (1.0 eq., 1.328 mmol) and sealed in a microwave reactor. The mixture was irradiated at 40% power (600W) for 1.5h. After this time, the reaction mixture was concentrated and the crude mixture was treated with ethyl acetate / hexane to provide the product as a precipitate.

PROCEDIMENTO GERAL PARA A PREPARAÇÃO DE IMIDAZO[1,2- a]PIRIDINAS USANDO ARGILA DE MONTMORILONITA K10GENERAL PROCEDURE FOR PREPARING IMIDAZO [1,2- a] PYRIDINES USING MONTMORILONITE K10 CLAY

2-Aminopiridina (0,13 mg, 1,33 mmol) foi dissolvida em dioxano, e tratada com argila de montmorilonita K10 (1 equivalente de massa, 0,13 mg), aldeído (1,0 eq., 1,33 mmol) e isocianeto (1,0 eq., 1,33 mmol) e vedada em um reator de microonda. A mistura foi irradiada a 40 % de potên- cia (de 600W) por 1,5 h. Após este tempo a mistura de reação foi filtrada e a argila lavada várias vezes com metanol ou diclorometano. O filtrado foi con- centrado sob pressão reduzida e a mistura bruta tratada com acetato de eti- la/hexano para fornecer o produto como um precipitado.2-Aminopyridine (0.13 mg, 1.33 mmol) was dissolved in dioxane, and treated with montmorillonite K10 clay (1 mass equivalent, 0.13 mg), aldehyde (1.0 eq., 1.33 mmol) ) and isocyanide (1.0 eq., 1.33 mmol) and sealed in a microwave reactor. The mixture was irradiated at 40% power (from 600 W) for 1.5 h. After this time the reaction mixture was filtered and the clay washed several times with methanol or dichloromethane. The filtrate was concentrated under reduced pressure and the crude mixture treated with ethyl acetate / hexane to afford the product as a precipitate.

Alternativamente, a mistura de reação pode ser aquecida atra- vés de métodos convencionais com agitação durante 5 horas.Alternatively, the reaction mixture may be heated by conventional methods with stirring for 5 hours.

Os compostos a seguir foram preparados por um dos dois méto- dos descritos acima, ou usando aquecimento convencional:The following compounds were prepared by either of the two methods described above, or using conventional heating:

N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (115) (0,29 g, 72 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,12 (2H, d, 2 χ arila H), 7,61 (2H, d, 2 χ arila H), 7,24-7,41 (3H, m, 3 χ arila H), 7,16 (1H, m, arila H), 7,00 (2H, d, J 7,6, 2 χ arila H), 6,78-6,86 (2H, m, 2 χ arila H), 6,67-6,74 (2H, m, 2 χ arila H), 5,43 (1H, br s, NH) e 2,02 (6H, s, 2 χ CH3); δ0 (50 MHz, CD- Cl3) 141,5 (C-8)a, 140,5 (C-3)a, 133,8 (C-2), 130,1 (2 χ xilila C-3), 128,6 (2 χ fenila C-2), 127,8 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 125,7 (C-4), 124,5 (C- 5), 122,6 (2 χ xilila C-2), 121,3 (xilila C-4), 117,8 (C-6), 112,5 (C-7) e 18,5 (2 XCH3); (El) m/z 313,2, 220,1, 194,0 e 79,1. N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3- AMINA (116)N- (2,6-dimethylphenyl) -2-phenylimidazo [1,2-a] pyridine-3-amine (115) (0.29 g, 72%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.12 (2H, d, 2 χ aryl H), 7.61 (2H, d, 2 χ aryl H), 7.24-7.41 (3H, m, 3 χ aryl H), 7.16 (1H, m, aryl H), 7.00 (2H, d, J 7.6, 2 χ aryl H), 6.78-6.86 (2H, m, 2 χ aryl H ), 6.67-6.74 (2H, m, 2 χ aryl H), 5.43 (1H, br s, NH) and 2.02 (6H, s, 2 χ CH3); δ0 (50 MHz, CD-Cl3) 141.5 (C-8) α, 140.5 (C-3) α, 133.8 (C-2), 130.1 (2 χ xylyl C-3), 128.6 (2 χ phenyl C-2), 127.8 (phenyl C-4), 127.3 (2 χ phenyl C-3), 125.7 (C-4), 124.5 (C-5 ), 122.6 (2 x C-2 xylyl), 121.3 (C-4 xylyl), 117.8 (C-6), 112.5 (C-7) and 18.5 (2 XCH3); (EI) m / z 313.2, 220.1, 194.0 and 79.1. N- (2,6-dimethylphenyl) -2- (4-methoxyphenyl) imidazo [1,2-a] pyridine-3-amine (116)

(0,20g, 48 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,04 (2H, d, J 8,4, arila H), 7,58 (2H, d, J 1,0, arila H), 7,16-6,63 (7H, m, 7 χ arila H), 5,41 (1H, s, NH), 3,82 (3H, s, OCH3) e 2,01 (6H, s, 2 χ CH3); <5C (50 MHz, CDCI3) 149,2 (piridi- Ia C-2' e C-6'), 141,3 (C-8)a, 140,6 (arila C)a, 138,5 (C-3), 137,5 (piridila C- 4'), 130,1 (2 χ xilila C-3'), 128,5 (2 χ fenila C-2), 125,4 (C-4), 124,3 (C-5), 122,4 (2 χ xilila C-2'), 121,1 (xilila C-4'), 117,3 (C-6), 112,3 (C-7) 55,4 (OCH3) e 18,7 (2 χ CH3); (El) m/z 343,4, 224,9, 210,9, 79,0 e 77,7. N-(TERC-BUTIL)-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (117)(0.20g, 48%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.04 (2H, d, J 8.4, aryl H), 7.58 (2H, d, J 1.0, aryl H), 7.16-6.63 (7H m, 7 (aryl H), 5.41 (1H, s, NH), 3.82 (3H, s, OCH3) and 2.01 (6H, s, 2 CH3); ΔC (50 MHz, CDCl3) 149.2 (pyridyl C-2 'and C-6'), 141.3 (C-8) at, 140.6 (aryl C) at, 138.5 (C -3), 137.5 (C-4 'pyridyl), 130.1 (2-C'-xylylyl), 128.5 (2-C'-phenyl), 125.4 (C-4), 124 1.3 (C-5), 122.4 (2 x C-2 'xylyl), 121.1 (C-4' xylyl), 117.3 (C-6), 112.3 (C-7) 55 , 4 (OCH3) and 18.7 (2 χ CH3); (EI) m / z 343.4, 224.9, 210.9, 79.0 and 77.7. N- (TERC-BUTYL) -2-PHENYLIMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (117)

(0,25 g, 60 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,55 (1H, d, J 9,2, arila H), 8,15(1 H, d, J 6,6 arila H), 7,47 (2H, br d, 2 χ arila H), 7,28 (1H, br t, arila H), 6,89-7,04 (4H, m, 4 χ arila H) e 0,79 (9H, s, 3 χ CH3); <5C (50 MHz, CDCI3) 142,0 (C-8)a, 137,9 (C-3)a, 131,4 (C-2), 129,9 (2 χ fenila C-2), 127,7 (fenila C-4), 127,4 (2 x fenila C-3), 127,0 (C-4), 124,7 (fenila C-1), 123,4 (C-5), 118,0 (C-6), 113,5 (C-7), 56,6 [C(CH3)3] e 30,2 [C(CH3)3]; (El) m/z 265,1, 208,1, 181,0 e 78,1.(0.25 g, 60%). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.55 (1H, d, J 9.2, aryl H), 8.15 (1H, d, J 6.6 aryl H), 7.47 (2H, br d , 2 χ aryl H), 7.28 (1H, br t, aryl H), 6.89-7.04 (4H, m, 4 χ aryl H) and 0.79 (9H, s, 3 χ CH3) ; ΔC (50 MHz, CDCl3) 142.0 (C-8) α, 137.9 (C-3) α, 131.4 (C-2), 129.9 (2 χ phenyl C-2), 127 , 7 (C-4 phenyl), 127.4 (2 x C-3 phenyl), 127.0 (C-4), 124.7 (C-1 phenyl), 123.4 (C-5), 118 .0 (C-6), 113.5 (C-7), 56.6 [C (CH 3) 3] and 30.2 [C (CH 3) 3]; (EI) m / z 265.1, 208.1, 181.0 and 78.1.

N-(TERC-BUTIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA(118) (0,14g, 28 %). ÕH (200 MHz, CDCI3) 8,05 (1H, br m, arila H), 7,61 -7,70 (1H, br m, arila H), 7,29 (2H, br d, J 7,2, 2 χ arila H), 7,16 (1H, br t, J 7,1, arila H), 6,72-7,00 (4H, m, 4 χ arila H) ,5,42 (1H, br s, NH), 3,828 (3H, s, OCH3) e 2,01 (9H, s, 3 χ CH3); <5C (50 MHz, DMSO) 159,2 (C-3), 158 (C-2), 148,20 (2 χ fenila C-2), 127,7 (fenila C-4), 137,40 (2 χ fenila C-3), 135,26 (C- 4), 128,49 (fenila C-1), 114,22 (C-5), 113,02 (C-6), 109,11 (C-7), 61,63 [C(CH3)3] e 55,84 (OCH3); (El) m/z 295,0, 238,9, 237,8, 210,9, 212,2, 94,0, 77,9, 66,9, 55,6 e 50,7,.N- (TERC-BUTYL) -2- (4-METOXYPHENYL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (118) (0.14g, 28%). ΔH (200 MHz, CDCl3) 8.05 (1H, br m, aryl H), 7.61-7.70 (1H, br m, aryl H), 7.29 (2H, br d, J 7.2 , 2 χ aryl H), 7.16 (1H, br t, J 7.1, aryl H), 6.72-7.00 (4H, m, 4 χ aryl H), 5.42 (1H, br s, NH), 3.828 (3H, s, OCH 3) and 2.01 (9H, s, 3 χ CH 3); ΔC (50 MHz, DMSO) 159.2 (C-3), 158 (C-2), 148.20 (2 χ phenyl C-2), 127.7 (phenyl C-4), 137.40 ( 2 (phenyl C-3), 135.26 (C-4), 128.49 (C-1 phenyl), 114.22 (C-5), 113.02 (C-6), 109.11 (C -7), 61.63 [C (CH3) 3] and 55.84 (OCH3); (EI) m / z 295.0, 238.9, 237.8, 210.9, 212.2, 94.0, 77.9, 66.9, 55.6 and 50.7.

N-(2-MORFOLIN-4-ILETIL)-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (119) (0,12 g, 14%). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,11 (1H, d, J 7,0, arila H), 8,03 (2H, d, J 8,4 2 χ arila H), 7,56 (2H, d, J 9,2, 2 χ arila H), 7,34-7,48 (3H, m, 3 χ arila H), 7,18 (1H, br t, arila H), 6,79 (1H, br t, arila H), 4,08 (1H, br s, NH), 3,72 (4H, t, J4,5, 2 χ CH2O), 3,07-3,10 (2H, m, CH2NH), 2,52-2,58 (2H, m, CH2N) e 2,44 (4H, t, J 4,5, 2 χ CH2N); <5C (50 MHz, CDCI3) 141,6 (C-8)a, 135,17 (C-3)a, 134,7 (C-2), 128,8 (2x fenila C-2), 127,5 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 126,7 (fenila C-1), 123,9 (C-4), 122,6 (C-5), 117,8 (C-6), 111,8 (C-7), 67,2 (2 χ CH2O), 58,5 (CH2N), 53,9 (2 χ CH2N) e 44,4 (CH2NH); (El) m/z 322,1, 220,0, 99,9 e 78,1.N- (2-MORFOLIN-4-ILLETIL) -2-PHENYLIMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (119) (0.12 g, 14%). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.11 (1H, d, J 7.0, aryl H), 8.03 (2H, d, J 8.4 2 χ aryl H), 7.56 (2H, d , J 9.2, 2 aryl H), 7.34-7.48 (3H, m, 3 aryl H), 7.18 (1H, br t, aryl H), 6.79 (1H, br t, aryl H), 4.08 (1H, br s, NH), 3.72 (4H, t, J4.5, 2 χ CH 2 O), 3.07-3.10 (2H, m, CH 2 NH), 2.52-2.58 (2H, m, CH 2 N) and 2.44 (4H, t, J 4.5, 2 χ CH 2 N); Δ C (50 MHz, CDCl 3) 141.6 (C-8) a, 135.17 (C-3) a, 134.7 (C-2), 128.8 (2x phenyl C-2), 127, 5 (C-4 phenyl), 127.3 (2 x C-3 phenyl), 126.7 (C-1 phenyl), 123.9 (C-4), 122.6 (C-5), 117, 8 (C-6), 111.8 (C-7), 67.2 (2 χ CH 2 O), 58.5 (CH 2 N), 53.9 (2 χ CH 2 N) and 44.4 (CH 2 NH); (EI) m / z 322.1, 220.0, 99.9 and 78.1.

N-(2-MORFILIN-4-ILETIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3- AMINA (120)N- (2-MORFILIN-4-ILETIL) -2- (4-METOXYPHENYL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (120)

(0,10 g, 20 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,30 (1H, d, J 6,6, arila H), 8,10 (2Η, d, J 8,4, 2 χ arila Η), 7,60 (2H, d, J 9,2, 2 χ arila Η), 7,14-7,32 (3H, m, 3 χ arila Η), 6,93 (2H, br t, J8,6, arila H), 4,14 (1H, br s, NH), 3, 92 (3H, d, J 8,4, CH3O), 3,76 (4H, t, J 4,1, 2 χ CH2O), 3,07-3,10 (2H, m, CH2NH), 2,52- 2,58 (2H, m, CH2N) e 2,44 (4H, t, J 4,0, 2 χ CH2N); δC (50 MHz, CDCI3) 133,1 (C-8)a, 128,5 (C-3)a, 127,5 (C-2), 122,0 (2 χ fenila C-2), 127,5 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 126,7 (fenila C-1), 123,9 (C-4), 122,6 (C-5), 118,9 (C-6), 116,4 (C-7), 71,9 (2 χ CH2O), 60,3 (CH2N), 58,7 (2 χ CH2N), 49,1 (OCH3) e 45,0 (CH2NH); (El) m/z 352,2, 251,9, 225,0, 224,0, 211,0, 128,0, 114,0, 113,0, 101,0, 99,7, 78,9, 77,9, 55,7 e 50,6.(0.10 g, 20%). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.30 (1H, d, J 6.6, aryl H), 8.10 (2Η, d, J 8.4, 2 χ aryl Η), 7.60 (2H, d, J 9.2, 2 χ arila Η), 7.14-7.32 (3H, m, 3 χ arila Η), 6.93 (2H, br t, J8.6, arila H), 4, 14 (1H, br s, NH), 3.92 (3H, d, J 8.4, CH 3 O), 3.76 (4H, t, J 4.1, 2 χ CH 2 O), 3.07-3, 10 (2H, m, CH 2 NH), 2.52-2.58 (2H, m, CH 2 N) and 2.44 (4H, t, J 4.0, 2 χ CH 2 N); δC (50 MHz, CDCl3) 133.1 (C-8) α, 128.5 (C-3) α, 127.5 (C-2), 122.0 (2 χ phenyl C-2), 127, 5 (C-4 phenyl), 127.3 (2 x C-3 phenyl), 126.7 (C-1 phenyl), 123.9 (C-4), 122.6 (C-5), 118, 9 (C-6), 116.4 (C-7), 71.9 (2 χ CH 2 O), 60.3 (CH 2 N), 58.7 (2 χ CH 2 N), 49.1 (OCH 3) and 45, O (CH 2 NH); (El) m / z 352.2, 251.9, 225.0, 224.0, 211.0, 128.0, 114.0, 113.0, 101.0, 99.7, 78.9, 77.9, 55.7 and 50.6.

N-CICLOEXIL-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (121)N-CYCLEEXYL-2-PHENYLIMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (121)

(0,60 g, 78 %). õc (50 MHz, CDCI3) 141,7 (C-8)a, 136,7 (C-3)a, 134,6 (C-2), 129,6 (fenila C-1), 128,7 (2 χ fenila C-2), 127,5 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 124,1 (C-4), 122,9 (C-5), 117,6 (C-6), 111,8 (C-7), 57,2 (CHNH), 34,4 (2 χ cicloexila C-2'), 26,0 (2 χ cicloexila C-3') e 25,1 (ci- cloexila C-4'); (El) m/z 290,9, 208,0, 180,9 e 78,2.(0.60 g, 78%). δc (50 MHz, CDCl 3) 141.7 (C-8) a, 136.7 (C-3) a, 134.6 (C-2), 129.6 (phenyl C-1), 128.7 ( 2 χ phenyl C-2), 127.5 (phenyl C-4), 127.3 (2 χ phenyl C-3), 124.1 (C-4), 122.9 (C-5), 117, 6 (C-6), 111.8 (C-7), 57.2 (CHNH), 34.4 (2 χ C-2 'cyclohexyl), 26.0 (2 χ C-3' cyclohexyl) and 25 0.1 (C-4 'cyclohexyl); (EI) m / z 290.9, 208.0, 180.9 and 78.2.

N-(CICLOEXIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (122) (0,18g, 42 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,11 (2H, d, J 6,8, arila H), 8,02 (2H, d, J 8,6, arila H), 7,16-7,08 (1H, m, arila H), 7,02-6,98 (2H, d, J 8,6, arila H), 6,80-6,73 (1H, m, arila H), 3,87 (3H, s, OCH3) e 1,80-1,59 (10H, br m, 5 χ cicloexila CH2); δc (50 MHz, CDCI3) 141,6 (C-8), 134,6 (C-2), 128,6 (2 χ fenila C-2), 127,3 (fenila C-4), 124,3 (2 χ fenila C-3), 123,9 (C-4), 122,9 (C- 5), 117,3 (C-6), 111,7 (C-7), 57,1 (CHNH), 55,5 (OCH3), 34,4 (2x cicloexila C-2'), 26,0 (2 χ cicloexila C-3') e 25,1 (cicloexila C-4'); (El) m/z 231,2, 237,8, 210,8 e 78,0.N- (CYCLOEXYL) -2- (4-METOXYPHENYL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (122) (0.18g, 42%). <5h (200 MHz, CDCl3) 8.11 (2H, d, J 6.8, aryl H), 8.02 (2H, d, J 8.6, aryl H), 7.16-7.08 ( 1H, m, aryl H), 7.02-6.98 (2H, d, J 8.6, aryl H), 6.80-6.73 (1H, m, aryl H), 3.87 (3H , s, OCH 3) and 1.80-1.59 (10H, br m, 5 χ cyclohexyl CH 2); δc (50 MHz, CDCl3) 141.6 (C-8), 134.6 (C-2), 128.6 (2 χ phenyl C-2), 127.3 (phenyl C-4), 124.3 (2 χ phenyl C-3), 123.9 (C-4), 122.9 (C-5), 117.3 (C-6), 111.7 (C-7), 57.1 (CHNH ), 55.5 (OCH 3), 34.4 (2x C-2 'cyclohexyl), 26.0 (2'C-3' cyclohexyl) and 25.1 (C-4 'cyclohexyl); (EI) m / z 231.2, 237.8, 210.8 and 78.0.

N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (123)N- (2,6-dimethylphenyl) -2-pyridine-3-ylimidazo [1,2-a] pyridine-3-amine (123)

(0,22 g, 54 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,29 (1H, d J 1,6, piridila H- 2'), 8,48 (1H, dd, J 5 e 1,6, piridila H-6'), 8,33 (1H, dt, J 8 e 1,8, H-4), 7,59- 7,69 (2H, m, 2 χ arila H), 7,15-7,30 (2H, m, 2 χ arila H), 6,98 (2H, d, J7,4, 2 χ 30 xilila H-3'), 6,72-6,86 (2H, m, 2 χ arila H), 5,49 (1H, br s, NH) e 2,01 (6H, s, 2 χ CH3); δc (50 MHz, CDCI3) 148,5 (piridila C-2' e C-6'), 141,9 (C-8)a, 140,1 (arila C)a, 134,7 (C-3), 134,5 (piridila C-4'), 130,1 (2 χ xilila C-3'), 129,8 (C-2), 125,9 (C-4), 125,0 (C-5), 123,5 (piridila C-5'), 122,6 (2 χ xilila C-2'), 122,1 (piridila C-3'), 121,8 (xilila C-4'), 117,8 (C-6), 112,9 (C-7) e 18,7 (2 χ CH3); (El) m/z 314,1, 221,0, 194,9 e 78,0.(0.22 g, 54%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 9.29 (1H, d J 1.6, pyridyl H-2 '), 8.48 (1H, dd, J 5 and 1.6, pyridyl H-6'), 8, 33 (1H, dt, J 8 and 1.8, H-4), 7.59-7.69 (2H, m, 2 χ aryl H), 7.15-7.30 (2H, m, 2 χ H), 6.98 (2H, d, J7,4, 2 χ 30 x-silyl H-3 '), 6.72-6.86 (2H, m, 2 χ aryl H), 5.49 (1H, br s, NH) and 2.01 (6H, s, 2 χ CH 3); δc (50 MHz, CDCl 3) 148.5 (C-2 'and C-6' pyridyl), 141.9 (C-8) a, 140.1 (C-aryl) a, 134.7 (C-3) 134.5 (C-4 'pyridyl), 130.1 (2-C-3' xylylyl), 129.8 (C-2), 125.9 (C-4), 125.0 (C-5 ), 123.5 (C-5 'pyridyl), 122.6 (2-C-2' xylyl), 122.1 (C-3 'pyridyl), 121.8 (C-4' xylyl), 117, 8 (C-6), 112.9 (C-7) and 18.7 (2 χ CH3); (EI) m / z 314.1, 221.0, 194.9 and 78.0.

N-(TERC-BUTIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (124) (0,21 g, 57 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,23 (1H, d J 1,6, piridila H- 2'), 8,56 (1H, dd, J 5 e 1,6, piridila H-6'), 8,31 (1H, dt, J 8 e 1,6, piridila H-4'), 8,23 (1H, dt, J 7,0 e 1,2, H-4), 7,56 (1H, dd, J 9,0 e 1,1, H-7), 7,38 (1H, ddd, J 8,0, 5,0 e 1,0, piridila H-5'), 7,17 (1H, ddd, J 9,0, 7,0 e 1,2, H-6), 6,81 (1H, dt, J 7,0 e 1,1, H-5), 3,09 (1H, br s, NH) e 1,02 (9H, s, 3 χ CH3); δ0 (50 MHz, CDCI3) 149,3 (piridila C-2')a, 148,5 (piridila C-6')a, 142,80 (C-8)a, 135,6 (C-3), 135.5 (piridila C-4'), 131,6 (C-2), 124,7 (C-4), 123,7 (C-5), 123,6 (piridila C- 5'), 122,5 (piridila C-3'), 117,8 (C-6), 111,9 (C-7), 55,7 [C(CH3)3] e 30,7 [C(CH3)3]; (El) m/z266,1, 210,0, 181,9 e 78,0.N- (TERC-BUTYL) -2-PYRIDIN-3-ILIMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (124) (0.21 g, 57%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 9.23 (1H, d J 1.6, pyridyl H-2 '), 8.56 (1H, dd, J 5 and 1.6, pyridyl H-6'), 8, 31 (1H, dt, J 8 and 1.6, pyridyl H-4 '), 8.23 (1H, dt, J 7.0 and 1.2, H-4), 7.56 (1H, dd, J 9.0 and 1.1, H-7), 7.38 (1H, ddd, J 8.0, 5.0 and 1.0, pyridyl H-5 '), 7.17 (1H, ddd, J 9.0, 7.0 and 1.2, H-6), 6.81 (1H, dt, J 7.0 and 1.1, H-5), 3.09 (1H, br s, NH ) and 1.02 (9H, s, 3 χ CH 3); δ0 (50 MHz, CDCl3) 149.3 (C-2 'pyridyl) a, 148.5 (C-6' pyridyl) a, 142.80 (C-8) a, 135.6 (C-3), 135.5 (C-4 'pyridyl), 131.6 (C-2), 124.7 (C-4), 123.7 (C-5), 123.6 (C-5' pyridyl), 122.5 (C-3 'pyridyl), 117.8 (C-6), 111.9 (C-7), 55.7 [C (CH 3) 3] and 30.7 [C (CH 3) 3]; (EI) m / z 266.1, 210.0, 181.9 and 78.0.

N-(2-MORFOLIN-4-ILETIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (125)N- (2-MORFOLIN-4-ILLETIL) -2-PYRIDIN-3-ILIMIDAZO [1,2-a] Pyridin-3-amine (125)

(49,5 mg, 11 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,30 (1H, d J 1,0, piridila H-2'), 8,56 (1H, dd, J 5,0 e 1,6, piridila H-6'), 8,38 (1H, dt, J 7,9 e 1,6, piridila H-4'), 8,16 (1H, d, J 6,8, H-4), 7,58 (1H, d, J 9,4, H-7), 7,38 (1H, dd, J 7,9, 5,0, piridila H-5'), 7,18 (1H, br t, J 8,0, H-6), 6,84 (1H, br t, J 6,8, H-5), 4,01 (1H, br s, NH), 3,76 (4H, t, J 4,6, 2 χ CH2O), 3,14 (2H, br d, J 5,7, CH2NH), 2,60 (2H, t, J 5,7, CH2N) e 2,50 (4H, t, J 4,6, 2 χ CH2N); <5C (50 MHz, CDCI3) 148,4 (piridila C-2')a, 148,3 (piridila C-6')a, 142,07 (C-8), 140,4 (C-2)a, 134,5 (piridila C-4')a, 130,7 (C-3)a, 127,1 (piridila C-3'), 124,4 (C-4), 123,8 (C-5),(49.5 mg, 11%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 9.30 (1H, d J 1.0, pyridyl H-2 '), 8.56 (1H, dd, J 5.0 and 1.6, pyridyl H-6'), 8.38 (1H, dt, J 7.9 and 1.6, pyridyl H-4 '), 8.16 (1H, d, J 6.8, H-4), 7.58 (1H, d, J 9.4, H-7), 7.38 (1H, dd, J 7.9, 5.0, pyridyl H-5 '), 7.18 (1H, br t, J 8.0, H- 6), 6.84 (1H, br t, J 6.8, H-5), 4.01 (1H, br s, NH), 3.76 (4H, t, J 4.6, 2 χ CH 2 O ), 3.14 (2H, br d, J 5.7, CH 2 NH), 2.60 (2H, t, J 5.7, CH 2 N) and 2.50 (4H, t, J 4,6, 2 χ CH 2 N); Δ 5C (50 MHz, CDCl 3) 148.4 (C-2 'pyridyl) a, 148.3 (C-6' pyridyl) a, 142.07 (C-8), 140.4 (C-2) a 134.5 (C-4 'pyridyl) a, 130.7 (C-3) a, 127.1 (C-3' pyridyl), 124.4 (C-4), 123.8 (C-5) ),

122.6 (piridila C-5'), 118,0 (C-6), 112,2 (C-7), 67,1 (2 χ CH2O), 58,5 (CH2N), 53,9 (2 χ CH2N) e 44,5 (CH2NH); (El) m/z 323,3, 223,2, 100,0 e 78,2. N-(CICLOEXIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (126) (0,23 g, 59 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,33 (1H, J de dd 1,8 e 0,8, piridila H-2'), 8,55 (1H, dd, J 4,7 e 1,8, piridila H-6'), 8,41 (1H, dt, J 7,9 e 1,8, piridila H-4'), 8,10 (1H, dt, J 6,8 e 1,1, H-4), 7,56 (1H, dt, J 9,1 e 1,1, H-7), 7,38 (1H, ddd, J 7,9, 4,7 e 0,8, piridila H-5'), 7,17 (1H, ddd, J 9,1, 6,8, e 1,1, H-6), 6,82 (1H, dt, J 6,8 e 1,1, H-5), 3,11 (1H, br s, NH), 2,86-3,08 (1H, m, CHNH), 1,46-1,92 e 1,00-1,40 (10H, 2 χ m, 5 x cicloexila CH2); <5C (50 MHz, CDCl3) 148,4 (piridila C-2')a, 148,3 (piridila C-6')a, 142,3 (C-8)a, 134,7 (piridila C-4')a, 134,6 (C-3)a, 130,9 (C-2), 125,6 (piridila C-3'), 124,6 (C-4), 123,7 (C- 5), 122,9 (piridila C-5'), 117,8 (C-6), 112,1 (C-7), 57,2 (CHNH), 34,5 (2 χ ci- cloexila C-2'), 25,9 (2 χ cicloexila C-3') e 25,1 (cicloexila C-4'); (El) m/z 292,1, 209,0, 181,9 e 78,0.122.6 (C-5 'pyridyl), 118.0 (C-6), 112.2 (C-7), 67.1 (2 χ CH2O), 58.5 (CH2N), 53.9 (2 χ CH2N) ) and 44.5 (CH 2 NH); (EI) m / z 323.3, 223.2, 100.0 and 78.2. N- (CYCLOEXYL) -2-PYRIDIN-3-ILIMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (126) (0.23 g, 59%). δΗ (200 MHz, CDCl 3) 9.33 (1H, J of dd 1.8 and 0.8, pyridyl H-2 '), 8.55 (1H, dd, J 4.7 and 1.8, pyridyl H -6 '), 8.41 (1H, dt, J 7.9 and 1.8, pyridyl H-4'), 8.10 (1H, dt, J 6.8 and 1.1, H-4) 7.56 (1H, dt, J 9.1 and 1.1, H-7), 7.38 (1H, ddd, J 7.9, 4.7 and 0.8, pyridyl H-5 ') 7.17 (1H, ddd, J 9.1, 6.8, and 1.1, H-6), 6.82 (1H, dt, J 6.8 and 1.1, H-5), 3.11 (1H, br s, NH), 2.86-3.08 (1H, m, CHNH), 1.46-1.92 and 1.00-1.40 (10H, 2 χ m, 5 x cyclohexyl CH2); Δ C (50 MHz, CDCl 3) 148.4 (C-2 'pyridyl) a, 148.3 (C-6' pyridyl) a, 142.3 (C-8) a, 134.7 (C-4 pyridyl) ') a, 134.6 (C-3) a, 130.9 (C-2), 125.6 (C-3 pyridyl), 124.6 (C-4), 123.7 (C-5) ), 122.9 (C-5 'pyridyl), 117.8 (C-6), 112.1 (C-7), 57.2 (CHNH), 34.5 (2 χ C-cyclohexyl C-2). '), 25.9 (2 χ C-3' cyclohexyl) and 25.1 (C-4 'cyclohexyl); (EI) m / z 292.1, 209.0, 181.9 and 78.0.

N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-(2-FURIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (127)N- (2,6-Dimethylphenyl) -2- (2-FURIL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (127)

(99,4 mg, 25 %). 5H (200 MHz, CDCI3) 7,65 (1H, d, J 7,0, H-4), 7,55 (1H, d, J 9,0, H-7), 7,43 (1H, br s, furila H-5'), 7,06-7,18 (1H, m, H-6), 6,99 (2H, d, J 6,9, 2 χ xilila H-3'), 6,80-6,91 (1H, m, H-5), 6,70 (1H, d, J 6,9, xilila H-4'), 6,59 (1H, d, J3,3, furila H-3'), 6,42 (1H, dd, J3,3 e 1,6, furila H-4') e 2,03 (6H, s, 2 χ CH3).(99.4 mg, 25%). 5H (200 MHz, CDCl 3) 7.65 (1H, d, J 7.0, H-4), 7.55 (1H, d, J 9.0, H-7), 7.43 (1H, br s, furyl H-5 '), 7.06-7.18 (1H, m, H-6), 6.99 (2H, d, J 6.9, 2 xylyl H-3'), 6, 80-6.91 (1H, m, H-5), 6.70 (1H, d, J 6.9, H-4 'xylyl), 6.59 (1H, d, J3.3, furyl H- 3 '), 6.42 (1H, dd, J3,3 and 1,6, furyl H-4') and 2,03 (6H, s, 2 χ CH 3).

N-(TERC-BUTIL)-2-(2-FURIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (128)N- (TERC-BUTIL) -2- (2-FURIL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (128)

(0,20 g, 60 %). δh (200 MHz1 CDCI3) 8,27 (1H1 d, J 6,8, H-4), 7,44-7,58 (2H, m, H-7 e furila H-5'), 7,06-7,22 (1H, m, H-6), 6,93 (1H, d, J 15 3,4, furila H-3'), 6,78 (1H, t, J 6,8, H-5), 6,53 (1H, dd, J 3,4 e 1,6, furila H-4'), 3,54 (1H, br s, NH) e 1,18 [9H, s, C(CH3)3].(0.20 g, 60%). δh (200 MHz1 CDCl3) 8.27 (1H1 d, J 6.8, H-4), 7.44-7.58 (2H, m, H-7 and furyl H-5 '), 7.06- 7.22 (1H, m, H-6), 6.93 (1H, d, J 15 3.4, furyl H-3 '), 6.78 (1H, t, J 6.8, H-5 ), 6.53 (1H, dd, J 3.4 and 1.6, furyl H-4 '), 3.54 (1H, br s, NH) and 1.18 [9H, s, C (CH3) 3].

N-(CICLOEXIL)-2-(2-FURIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (129)N- (CYCLOEXYL) -2- (2-FURYL) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-3-AMINE (129)

(0,27 g, 73 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,07 (1H, dd, J 6,7 e 1,2, H- 4), 7,53 (1H, d, J 9,0, H-7), 7,51 (1H, d, J 1,6, furila H-5'), 7,15 (1H, ddd, J 20 9,0, 6,7 e 1,2, H-6), 6,91 (1H, d, J 3,3, furila H-3'), 6,79 (1H, td, J 6,7 e 1,0, H-5), 6,55 (1H, dd, J 3,3 e 1,6, furila H-4'), 3,62 (1H, brs, NH) 2,85-3,10 (1H, m, CHNH), 1,50-2,00 e 1,05-1,45 (1OH, m, 5 χ cicloexila CH2). 4-{3-[(2,6-DIMETILFENIL)AMINO]IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-2-IL}BENZENO- 1,3-DIOL (130)(0.27 g, 73%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.07 (1H, dd, J 6.7 and 1.2, H-4), 7.53 (1H, d, J 9.0, H-7), 7.51 (1H, d, J 1.6, furyl H-5 '), 7.15 (1H, ddd, J 20 9.0, 6.7 and 1.2, H-6), 6.91 (1H, d, J 3.3, furyl H-3 '), 6.79 (1H, td, J 6.7 and 1.0, H-5), 6.55 (1H, dd, J 3.3 and 1 , 6, furyl H-4 '), 3.62 (1H, brs, NH) 2.85-3.10 (1H, m, CHNH), 1.50-2.00 and 1.05-1.45 (1OH, m, 5 χ cyclohexyl CH 2). 4- {3 - [(2,6-Dimethylphenyl) AMINO] IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-2-IL} BENZENO-1,3-DIOL (130)

(0,11 g, 23 %). δH (200 MHz, CDCI3) 8,04 (1H, d, J 8,6, H-4), 7,69 (1H, d, J 7,0, H-6'), 7,56 (1H, d, J 9,4, H-7), 7,15-7,28 (1H, m, H-6), 7,02 (2H, d, J 7,4, 2 χ xilila H-3'), 6,72-6,92 (2H, m, H-5 e xilila H-4'), 6,53 (1H, d, J1,7, H-3'), 6,33 (1H, dd, J 8,2 ei ,7, H-5'), 5,36 (1H, br s, NH) e 2,04 (6H, s, 2 χ CH3).(0.11 g, 23%). δH (200 MHz, CDCl3) 8.04 (1H, d, J 8.6, H-4), 7.69 (1H, d, J 7.0, H-6 '), 7.56 (1H, d, J 9.4, H-7), 7.15-7.28 (1H, m, H-6), 7.02 (2H, d, J 7.4, 2 xylyl H-3 ') 6.72-6.92 (2H, m, H-5 and xylyl H-4 '), 6.53 (1H, d, J1.7, H-3'), 6.33 (1H, dd, J 8.2 ei, 7, H-5 '), 5.36 (1H, br s, NH) and 2.04 (6H, s, 2 χ CH3).

4-(3-ClCLOEXILAMINO)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-2-IL)BENZENO-1,3-DIOL (131)4- (3-ClCLOEXYLAMINO) IMIDAZO [1,2-a] PYRIDIN-2-IL) BENZENO-1,3-DIOL (131)

(0,13 g, 26 %). δh (200 MHz, CDCI3) 8,04 (1H, d, J 6,8, H-4), 7,76 (1H1 d, J 8,0, H-6'), 7,28-7,38 (1H, m, H-7), 6,96-7,10 (1H, m, H-5'), 6,71 (1H, t, J 6,8, H-5), 6,21-6,38 (2H, m, H-6 e H-3'), 3,51 (1H, br s, NH), 2,71- 2,95 (1H, m, CHNH), 1,30-1,75 e 0,85-1,28 (10H, 2 χ m, 5 χ cicloexila CH2).(0.13 g, 26%). δh (200 MHz, CDCl3) 8.04 (1H, d, J 6.8, H-4), 7.76 (1H1 d, J 8.0, H-6 '), 7.28-7.38 (1H, m, H-7), 6.96-7.10 (1H, m, H-5 '), 6.71 (1H, t, J 6.8, H-5), 6.21- 6.38 (2H, m, H-6 and H-3 '), 3.51 (1H, br s, NH), 2.71-2.95 (1H, m, CHNH), 1.30-1 , 75 and 0.85-1.28 (10H, 2 χ m, 5 χ cyclohexyl CH2).

PROCEDIMENTO GERAL PARA A CONDENSAÇÃO DAS DIAMINAS COM GLIOXAL AQUOSOGENERAL PROCEDURE FOR THE CONDENSATION OF WATER GLIOXAL DIAMINS

A quantidade requerida de 1,2-diamina foi colocada em 3 cm3 de água à qual 40 % de glioxal aquoso (na quantidade indicada) foram adicio- nados. Hidróxido de potássio (2,1-3,1 eq.) foi depois adicionado (com exce- ção de o-fenilenodiamina 1, que não requerer base), causando dissolução imediata da diamina. A mistura foi deixada agitar durante um tempo especifi- cado em temperatura ambiente, durante o qual precipitação ocorreu. O pH foi vertido para cerca de 5 com ácido acético glacial, e os sólidos foram co- lhidos através de filtração de vácuo. Estes foram lavados com água e aceta- to de etila ou acetona, e depois secados a vácuo.The required amount of 1,2-diamine was placed in 3 cm3 of water to which 40% aqueous glyoxal (in the amount indicated) was added. Potassium hydroxide (2.1-3.1 eq.) Was then added (with the exception of o-phenylenediamine 1, which requires no base), causing immediate dissolution of the diamine. The mixture was allowed to stir for a specified time at room temperature during which precipitation occurred. The pH was poured to about 5 with glacial acetic acid, and the solids were collected by vacuum filtration. These were washed with water and ethyl acetate or acetone, and then vacuum dried.

2-AMINO-4-HIDROXIPTERIDINA (132)2-AMINO-4-HYDROXIPTERIDINE (132)

Sulfato de 4-hidróxi-2,5,6-triaminopirimidina 2 (1,06 g, 4,43 mmols) foi tratado com glioxal (0,68 cm3, 4,66 mmols) e hidróxido de potássio (0,52 g, 9,31 mmols) de acordo com o procedimento geral. Em adi- ção do glioxal, uma quantidade pequena de sólido marrom caiu fora de solu- ção. Este foi filtrado da solução amarela que gradualmente formou um preci- pitado amarelo fino no período de reação de 18 h. Após acidificação, um pó amarelo foi separado por filtração, lavado com água e acetona e secado a vácuo para render 2-amino-4-hidroxipteridina 132 (0,49 g, 67 %). <5H (200 MHz, D20/Na0D) 8,47 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,4) e 8,27 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,4); <5C (50 MHz, D20/Na0D) 173,4 (C-4), 156,7 (C-2), 148,6 (C-7), 138,7 (C-8) e 129,6 (C-10).4-Hydroxy-2,5,6-triaminopyrimidine sulfate 2 (1.06 g, 4.43 mmol) was treated with glyoxal (0.68 cm 3, 4.66 mmol) and potassium hydroxide (0.52 g, 9.31 mmols) according to the general procedure. In addition to glyoxal, a small amount of brown solid fell out of solution. This was filtered from the yellow solution which gradually formed a fine yellow precipitate over the 18 h reaction period. After acidification, a yellow powder was filtered off, washed with water and acetone and vacuum dried to yield 2-amino-4-hydroxypteridine 132 (0.49 g, 67%). Δ 5H (200 MHz, D 20 / NaOH) 8.47 (1H, d, N = CHaCHb = N, J 2.4) and 8.27 (1H, d, N = CHaCHb = N, J 2.4); ΔC (50 MHz, D 20 / NaOH) 173.4 (C-4), 156.7 (C-2), 148.6 (C-7), 138.7 (C-8) and 129.6 ( C-10).

8,9-DIIDRÓXI-8,9-DIIDROIMIDAZO[1,2-a]PTERIDIN-5(7H)-ONA (133)8,9-DIHYDROXY-8,9-DIHYDROIMIDAZO [1,2-a] PTERIDIN-5 (7H) -ON (133)

Sulfato de 4-hidróxi-2,5,6-triaminopirimidina 2 (0,23 g, 0,99 mmol) foi tratado com glioxal (2 cm3) e hidróxido de potássio (0,11 g, 1,97 mmol) de acordo com o procedimento geral. Uma solução rosa persistiu durante a reação de 18h, fornecendo um pó rosa após acidificação. Quando o sólido foi isolado, secado, e submetido à mesma rotina novamente, um pó amarelo foi separado por filtração, lavado com água e acetona e secado a vácuo para fornecer 8,9-diidróxi-8,9-diidroimidazo[1,2-a]pteridin-5(7H)-ona 133 (0,16 g, 77 %). δΗ (200 MHz1 drDMSO) 9,34 (1H, br s, D2O trocável, NH), 8,72 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 1,8), 8,48 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,0), 7,48 [1H, d, D2O trocável, NariIHCHa(OH), J 6,8], 6,59 [1H, d, D2O trocável, NHCHb(OH), J 7,8], 5,58 [1H, d, NariIHCHa(OH), J 6,8] e 4,97 [1H, d, NH- CHb(OH)1 J 8,0]; δC (50 MHz, Gf6-DMSO) 159,1 (C-5), 158,2 (C-6a), 155,2 (C- 4a), 150,1 (C-3), 140,3 (C-2), 130,8 (C-9b), 85,5 (C-8) e 84,1 (C-9).4-Hydroxy-2,5,6-triaminopyrimidine 2 sulfate (0.23 g, 0.99 mmol) was treated with glyoxal (2 cm3) and potassium hydroxide (0.11 g, 1.97 mmol) according to with the general procedure. A pink solution persisted during the 18h reaction, providing a pink powder after acidification. When the solid was isolated, dried, and subjected to the same routine again, a yellow powder was filtered off, washed with water and acetone and vacuum dried to provide 8,9-dihydroxy-8,9-dihydroimidazo [1,2- a] pteridin-5 (7H) -one 133 (0.16 g, 77%). δΗ (200 MHz1 drDMSO) 9.34 (1H, br s, exchangeable D2O, NH), 8.72 (1H, d, N = CHaCHb = N, J 1.8), 8.48 (1H, d, N = CHaCHb = N, J 2.0), 7.48 [1H, d, exchangeable D2O, NariIHCHa (OH), J 6.8], 6.59 [1H, d, exchangeable D2O, NHCHb (OH), J 7.8], 5.58 [1H, d, NariIHCHa (OH), J 6.8] and 4.97 [1H, d, NH-CHb (OH) 1 J 8.0]; δC (50 MHz, Gf6-DMSO) 159.1 (C-5), 158.2 (C-6a), 155.2 (C-4a), 150.1 (C-3), 140.3 (C -2), 130.8 (C-9b), 85.5 (C-8) and 84.1 (C-9).

PTERIDINO-2,4(1 H,3H)-DIONA (134)PTERIDINO-2,4 (1 H, 3H) -DIONA (134)

Sulfato de 5,6-diaminouracila 13 (0,22 g, 0,91 mmol) foi tratado com glioxal (2 cm3) e hidróxido de potássio (0,11 g, 1,90 mmol) de acordo com o procedimento geral por 18 h. Um precipitado amarelo formou neste tempo. Após a adição de ácido acético, um precipitado amarelo denso foi separado por filtração, lavado com água e acetona e secado a vácuo para fornecer um pó amarelo, pteridino-2,4(1H,3H)-diona 134 (89,0 mg, 60 %). δH (200 MHz, Gf6-DMSO) 11,73 (2H, br s, NH), 8,64 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,2) e 8,52 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,2).5,6-Diaminouracil sulphate 13 (0.22 g, 0.91 mmol) was treated with glyoxal (2 cm3) and potassium hydroxide (0.11 g, 1.90 mmol) according to the general procedure for 18 minutes. H. A yellow precipitate formed at this time. After addition of acetic acid, a dense yellow precipitate was filtered off, washed with water and acetone and vacuum dried to afford a yellow powder, pteridine-2,4 (1H, 3H) -dione 134 (89.0 mg, 60%). δH (200 MHz, Gf6-DMSO) 11.73 (2H, br s, NH), 8.64 (1H, d, N = CHaCHb = N, J 2.2) and 8.52 (1H, d, N = CHaCHb = N, J 2.2).

(2-AMINO-4,7-DIIDROXIPTERIDIN-6-il)ACETATO DE ETILA (136) 6-Hidróxi-2,4,5-triaminopirimidina 2 (0,25 g, 1,03 mmol) foi colo- cada em ácido acético glacial (7 cm3) que tinha sido preaquecido para 90QC, seguido imediatamente pelo sal de sódio de oxalacetato de dietila (0,27 g, 1,27 mmol). A solução foi depois rapidamente aquecida a refluxo, e a mistu- ra fervida por 18 h. Uma suspensão particulada fina resultou. Após esfriar para 5eC, o sólido precipitado foi colhido através de filtração, lavado com água e secado a vácuo para fornecer um pó fino cor de bronze, (2-amino- 4,7-diidróxi-pteridin-6-il)acetato de etila 136 (0,22 g, 79 %). δH (200 MHz, Gf6- DMSO) 7,01 (1H, br s, OH), 6,39 e 6,29 (1H, 2 x br s), 4,09 (2H, q, O- CH2CH3, J 7,0), 3,61 (2H, s, CH2CO) e 1,18 (3H, t, OCH2CH3, J 7,0); δC (50 MHz, CZ6-DMSO) 170,2 (CO), 166,1 e 159,3 (C-4 e C-7), 157,5 (C-6), 155,6 (C-8a), 152,1 (C-4a), 146,0 (C-6), 61,0 (OCH2CH3)1 40,1 (CH2CO) e 14,8 (OCH2CH3).(2-AMINO-4,7-DIIDROXIPTERIDIN-6-yl) ETHYL ACETATE (136) 6-Hydroxy-2,4,5-triaminopyrimidine 2 (0.25 g, 1.03 mmol) was placed in acid glacial acetic acid (7 cm 3) which had been preheated to 90 ° C, followed immediately by the diethyl oxalacetate sodium salt (0.27 g, 1.27 mmol). The solution was then rapidly heated to reflux, and the mixture boiled for 18 h. A fine particulate suspension resulted. After cooling to 5 ° C, the precipitated solid was collected by filtration, washed with water and vacuum dried to afford a fine bronze colored powder, ethyl (2-amino-4,7-dihydroxy-pteridin-6-yl) acetate 136 (0.22 g, 79%). δH (200 MHz, Gf6-DMSO) 7.01 (1H, br s, OH), 6.39 and 6.29 (1H, 2 x br s), 4.09 (2H, q, O-CH 2 CH 3, J 7.0), 3.61 (2H, s, CH 2 CO) and 1.18 (3H, t, OCH 2 CH 3, J 7.0); δC (50 MHz, CZ6-DMSO) 170.2 (CO), 166.1 and 159.3 (C-4 and C-7), 157.5 (C-6), 155.6 (C-8a) , 152.1 (C-4a), 146.0 (C-6), 61.0 (OCH 2 CH 3) 1 40.1 (CH 2 CO) and 14.8 (OCH 2 CH 3).

(7-HIDRÓXI-2,4-DIOXO-1 ^,S^-TETRAIDROPTERIDIN-e-iOACETATO DE ETILA (137)(ETHYL (7-HYDROXY-2,4-DIOXO-1 H, S-Tetrahydro-terterin-e-iOACETATE) (137)

Sulfato de 4,5-diaminouracila 13 (0,31 g, 1,30 mmol) foi colocado em ácido acético glacial (25 cm3) que tinha sido preaquecido para 90eC, se- guido imediatamente pelo sal de sódio de oxalacetato de dietila (0,35 g, 1,65 mmol). A solução foi depois rapidamente aquecida a refluxo, e a mistu- ra fervida durante 5 h. Uma suspensão particulada fina resultou. Após esfriar para 59C, o sólido precipitado foi colhido através de filtração, lavado com 10 cm3 de etanol quente e secado a vácuo para fornecer um pó fino cor de bronze, (7-hidróxi-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidro-pteridin-6-il)acetato de etila 137 (0,21 g, 71 %). <5H (200 MHz, Gf6-DMSO) 11,23 (1H, br s, OH), 4,10 (2H, q, OCH2CH3, J 7,0), 3,72 (2H, s, CH2CO) e 1,19 (3H, t, OCH2CH3, J 7,0); õc (50 MHz, GfrDMSO) 170,2 (CO), 160,9 e 160,7 (C-2 e C-4), 150,8 (C-7), 148,2 (C-6), 61,1 (OCH2CH3), 39,3 (CH2CO) e 14,8 (OCH2CH3). 2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(4-NITROFENIL)-3,4,5,6-4,5-Diaminouracil sulphate 13 (0.31 g, 1.30 mmol) was placed in glacial acetic acid (25 cm3) which had been preheated to 90 ° C, followed immediately by the diethyl oxalacetate sodium salt (0 35 g, 1.65 mmol). The solution was then rapidly heated to reflux, and the mixture boiled for 5 h. A fine particulate suspension resulted. After cooling to 59 ° C, the precipitated solid was collected by filtration, washed with 10 cm @ 3 of hot ethanol and vacuum dried to provide a fine bronze-colored powder, (7-hydroxy-2,4-dioxo-1,2,3). Ethyl 4,4-tetrahydro-pteridin-6-yl) acetate (0.21 g, 71%). Δ 5H (200 MHz, Gf 6 -DMSO) 11.23 (1H, br s, OH), 4.10 (2H, q, OCH 2 CH 3, J 7.0), 3.72 (2H, s, CH 2 CO) and 1 19 (3H, t, OCH 2 CH 3, J 7.0); δc (50 MHz, GfrDMSO) 170.2 (CO), 160.9 and 160.7 (C-2 and C-4), 150.8 (C-7), 148.2 (C-6), 61 , 1 (OCH 2 CH 3), 39.3 (CH 2 CO) and 14.8 (OCH 2 CH 3). 2,4-DIIDROXY-4,5- (DIETOXYCARBONYL) -6- (4-NITROPHENYL) -3,4,5,6-

TETRAIDRO-PIRIMIDINA (138)TETRAHYDROPYRIMIDINE (138)

Ácido trifluoroacético (3,2 cm3, 41,54 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (4,17 g, 99,37 mmols) e 4-nitrobenzaldeído (7,84 g, 51,91 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (92 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 10,23 g, 46,24 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 23 h. A mistura de reação foi esfri- ada para temperatura ambiente e subseqüentemente concentrada a vácuo para fornecer um óleo viscoso marrom. O resíduo foi absorvido em acetato de etila (150 cm3) e lavado com água (3 x 150 cm3). As lavagens aquosas combinadas foram extraídas com acetato de etila (200 cm3). Os extratos or- gânicos foram combinados e concentrados a vácuo a ca. 150 cm3 do volume original. A mistura resultante contendo um precipitado insolúvel foi transferi- da para um frasco de Erlenmeyer e aquecida a refluxo até que todas as par- tículas insolúveis tivessem sido dissolvidas. À solução quente hexano sufici- ente foi adicionado para induzir precipitação. A mistura foi deixada esfriar para temperatura ambiente por 15 min. com agitação. O precipitado foi co- lhido através de filtração para fornecer um sólido céreo que foi empastado em hexano. O precipitado foi colhido através de filtração e lavado com hexa- no. O bolo de filtro foi secado sob pressão reduzida e ca. 20,31 g pesada. O sólido foi recristalizado das misturas de acetato de etila-hexano para forne- cer um sólido amorfo bege que foi atribuído por análise espectral ser 2,4- diidróxi-4,5-(dietoxicarbonil)-6-(4-nitro-fenil)-3,4,5,6-tetraidropirimidina 138 (11,61 g, 66 %) como uma mistura 6:1,4:1 de diastereômeros (através de espectroscopia de RMN; vide infra; δΗ (50 MHz; DMSO-d6) 8,26-8,18 e 8,20 (3 χ 2H, m e d, J ca. 8,5, 6 χ arila H), 7,71-7,57 (3 χ 2H, m e d, J ca. 8,5, 6 χ arila H), 7,37, 7,06, 6,94, 6,71, 6,63 e 6,52 (6 χ 1 Η, 6 χ s, 6 χ NH), 5,20 (1 Η, d, J 5,2, Η-6), 4,95-4,89 e 4,92 (2 χ 1Η, dois sobrepondo d, J 11,5, H-6), 4,28-4,04 (3 χ 2H, dois sobrepondo q, J ca. 7,0, 3 χ OCH2CH3), 4,00-4,62 (3 χ 2H, dois sobrepondo q, J ca. 7,0, 3 χ OCH2CH3), 3,25-3,10 e 3,20 (3 χ 1H, três sobreposição d, J11,5, H-5), 1,30-1,22, 1,27 e 1,26 (2 χ 3H, dois sobre- pondo t, J ca. 7,1, 2 χ OCH2CH3), 1,67 (3H, t, J ca. 7,2, OCH2CH3), 1,02- 0,93, 0,98 e 0,96 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J 7,0 e 7,1, 2 χ OCH2CH3), 0,747 (3H, t, J 7,2, OCH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 169,8 (CO2Et), 167,7 (CO2Et), 154,2 (NHCONH), 148,7, 147,8, 130,5 e 124,0 (arila C), 81,7 (C-4), 62,4 (C-5), 61,3 (C-6), 52,9 e 52,7 (OCH2CH3), 14,6 e 14,2 (OCH2CH3). 2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(3,5-DIMETÓXI-4- HIDROXIFENIL)-3,4,5,6-TETRAIDROPIRIMIDINA (139)Trifluoroacetic acid (3.2 cm3, 41.54 mmol) was added to a mixture of urea (4.17 g, 99.37 mmol) and 4-nitrobenzaldehyde (7.84 g, 51.91 mmol) in 1.2 anhydrous dichloroethane (92 cm3). Diethyl oxalacetate sodium salt (95%, 10.23 g, 46.24 mmol) was added to the reaction mixture, and the reaction was heated at reflux for 23 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and subsequently concentrated in vacuo to afford a viscous brown oil. The residue was taken up in ethyl acetate (150 cm3) and washed with water (3 x 150 cm3). The combined aqueous washes were extracted with ethyl acetate (200 cm3). The organic extracts were combined and concentrated in vacuo at ca. 150 cm3 of the original volume. The resulting mixture containing an insoluble precipitate was transferred to an Erlenmeyer flask and heated to reflux until all insoluble particles had dissolved. To the hot enough hexane solution was added to induce precipitation. The mixture was allowed to cool to room temperature for 15 min. with agitation. The precipitate was collected by filtration to afford a cereal solid which was slurried in hexane. The precipitate was collected by filtration and washed with hexane. The filter cake was dried under reduced pressure and ca. 20.31 g heavy. The solid was recrystallized from ethyl acetate-hexane mixtures to provide a beige amorphous solid which was assigned by spectral analysis to be 2,4-dihydroxy-4,5- (diethoxycarbonyl) -6- (4-nitro-phenyl) -3,4,5,6-tetrahydropyrimidine 138 (11.61 g, 66%) as a 6: 1.4: 1 mixture of diastereomers (by NMR spectroscopy; vide infra; δΗ (50 MHz; DMSO-d6 ) 8.26-8.18 and 8.20 (3 χ 2H, med, J ca 8.5, 6 χ aryl H), 7.71-7.57 (3 χ 2H, med, J ca. 8 , 5.6 χ aryl H), 7.37, 7.06, 6.94, 6.71, 6.63 and 6.52 (6 χ 1 Η, 6 χ s, 6 χ NH), 5.20 (1 Η, d, J 5.2, Η-6), 4.95-4.89 and 4.92 (2 χ 1Η, two overlapping d, J 11.5, H-6), 4.28- 4.04 (3 χ 2H, two overlapping q, J ca 7.0, 3 χ OCH2CH3), 4.00-4.62 (3 χ 2H, two overlapping q, J ca 7.0, 3 χ OCH2CH3 ), 3.25-3.10 and 3.20 (3 χ 1H, three overlapping d, J11.5, H-5), 1.30-1.22, 1.27 and 1.26 (2 χ 3H , two overlapping t, J ca 7.1, 2 χ OCH 2 CH 3), 1.67 (3H, t, J ca 7.2, OCH 2 CH 3), 1.02-0.93, 0.98 and 0 , 96 (2 χ 3H, two overlapping t , J 7.0 and 7.1, 2 (OCH2 CH3), 0.747 (3H, t, J 7.2, OCH2 CH3); δc (50 MHz; DMSO-d 6) 169.8 (CO2Et), 167.7 (CO2Et), 154.2 (NHCONH), 148.7, 147.8, 130.5 and 124.0 (aryl C), 81.7 (C-4), 62.4 (C-5), 61.3 (C-6), 52.9 and 52.7 (OCH2CH3), 14.6 and 14.2 (OCH2CH3). 2,4-DIHYDROXY-4,5- (DIETOXYCARBONYL) -6- (3,5-DIMETOXY-4-HYDROXYPHYL) -3,4,5,6-TETRAHYDROPYRIMIDINE (139)

Ácido trifluoroacético (2,1 cm3, 27,26 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (2,66 g, 44,29 mmols) e siringaldeído (6,04 g, 32,48 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (62 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 6,53 g, 29,53 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 19 h. Um óleo marrom viscoso insolúvel foi evidente durante o curso do processo de aquecimento. A mistu- ra de reação foi esfriada para temperatura ambiente e o solvente decantado do óleo insolúvel. A mistura de reação decantada foi lavada com água, se- cada (MgSO4) e concentrada a vácuo para fornecer um óleo marrom bruto que consistiu predominantemente em siringaldeído não-reagido conforme estabelecido por análise de TLC. O óleo viscoso marrom restante foi tratado com uma mistura de água (50 cm3) e acetato de etila (50 cm3) e agitado vi- gorosamente por poucos minutos até que o óleo estivesse completamente dissolvido na mistura de água-acetato de etila. A mistura foi transferida para um funil de separação no qual três camadas resultaram. A fase aquosa do fundo foi separada do acetato de etila restante e da fases de emulsão. As duas fases foram transferidas para um frasco de Erlenmeyer ao qual hexano suficiente foi adicionado para induzir precipitação. A pasta foi agitada duran- te alguns minutos após os quais o precipitado foi colhido através de filtração. O bolo de filtro foi secado sob pressão reduzida para fornecer 2,4-diidróxi- 4,5-(dietoxicarbonil)-6-(3)5-dimetóxi-4-hidroxifenil)-3,4,5,6-tetraidropirimidina 139 como uma mistura 6:1 de diastereômeros (3,57 g, 29 %); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 8,30 (1H, br s, PhOH), 7,81 (1H, br d, J 3,3, NH), 7,46 (1H, br d, J 1,6, NH), 6,73 (1H, s, NH), 6,82 (1H, s, NH), 6,58 (2 χ 1H, s, arila H), 6,54 (2 χ 1H, s, arila H), 6,44 (1H, br s, OH), 5,10 (1H, br d, J 3,0, H-6), 4,70 (1H, d, J 11,5, H-6), 4,28-3,78 (4 χ 2H, quatro sobrepondo q, OCH2CH3), 3,78 e 3,77 (2 χ 3H, 2 χ s, 2 χ arila OCH3), 3,10 (1H, d, J 11,5, H-5), 1,31-1,22, 1,28 e 1,26 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J 7,0 e 7,2, OCH2CH3), 1,11 (3H, t, J 7,0, OCH2CH3), 0,98 (3H, t, J 7,2, OCH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 170,1 (CO2Et), 168,3 (CO2Et), 154,4 (NHCONH), 148,3, 136,1, 130,7 e 106,2 (arila C), 81,7 (C-4), 62,3 (C-5), 60,9 (C-6), 56,8 (arila OCH3), 53,4 (OCH2CH3), 14,6 e 14,4 (OCH2CH3).Trifluoroacetic acid (2.1 cm3, 27.26 mmols) was added to a mixture of urea (2.66 g, 44.29 mmols) and syringaldehyde (6.04 g, 32.48 mmols) in 1,2-dichloroethane. anhydrous (62 cm 3). Diethyl oxalacetate sodium salt (95%, 6.53 g, 29.53 mmols) was added to the reaction mixture, and the reaction was heated at reflux for 19 h. An insoluble viscous brown oil was evident during the course of the heating process. The reaction mixture was cooled to room temperature and the solvent decanted from the insoluble oil. The decanted reaction mixture was washed with water, dried (MgSO4) and concentrated in vacuo to afford a crude brown oil which consisted predominantly of unreacted syringaldehyde as established by TLC analysis. The remaining brown viscous oil was treated with a mixture of water (50 cm3) and ethyl acetate (50 cm3) and stirred vigorously for a few minutes until the oil was completely dissolved in the water-ethyl acetate mixture. The mixture was transferred to a separatory funnel which resulted in three layers. The bottom aqueous phase was separated from the remaining ethyl acetate and the emulsion phases. The two phases were transferred to an Erlenmeyer flask to which sufficient hexane was added to induce precipitation. The slurry was stirred for a few minutes after which the precipitate was collected by filtration. The filter cake was dried under reduced pressure to provide 2,4-dihydroxy-4,5- (diethoxycarbonyl) -6- (3) 5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) -3,4,5,6-tetrahydropyrimidine 139 as a 6: 1 mixture of diastereomers (3.57 g, 29%); δΗ (50 MHz; DMSO-d6) 8.30 (1H, br s, PhOH), 7.81 (1H, br d, J 3.3, NH), 7.46 (1H, br d, J 1, 6, NH), 6.73 (1H, s, NH), 6.82 (1H, s, NH), 6.58 (2 χ 1H, s, aryl H), 6.54 (2 χ 1H, s , aryl H), 6.44 (1H, br s, OH), 5.10 (1H, br d, J 3.0, H-6), 4.70 (1H, d, J 11.5, H -6), 4.28-3.78 (4 χ 2H, four overlapping q, OCH2CH3), 3.78 and 3.77 (2 χ 3H, 2 χ s, 2 χ aryl OCH3), 3.10 (1H , d, J 11.5, H-5), 1.31-1.22, 1.28 and 1.26 (2 χ 3H, two overlapping t, J 7.0 and 7.2, OCH2CH3), 1 11.11 (3H, t, J 7.0, OCH2 CH3); 0.98 (3H, t, J 7.2, OCH2 CH3); δc (50 MHz; DMSO-d 6) 170.1 (CO2Et), 168.3 (CO2Et), 154.4 (NHCONH), 148.3, 136.1, 130.7 and 106.2 (aryl C), 81.7 (C-4), 62.3 (C-5), 60.9 (C-6), 56.8 (aryl OCH3), 53.4 (OCH2CH3), 14.6 and 14.4 ( OCH2CH3).

2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(4-BROMO-FENIL)-3,4,5,6- TETRAIDROPIRIMIDINA (140)2,4-DIHYDROXY-4,5- (DIETOXYCARBONYL) -6- (4-BROMO-PHENYL) -3,4,5,6-TETRAIDROPYRIMIDINE (140)

Ácido trifluoroacético (3,2 cm3, 41,54 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (4,09 g, 68,02 mmols) e 4-bromobenzaldeído (9,32 g, 49,88 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (90 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 10,03 g, 45,34 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 41 h. A mistura de reação foi esfri- ada para temperatura ambiente e subseqüentemente concentrada a vácuo para fornecer um óleo laranja viscoso. O resíduo foi absorvido em acetato de etila (100 cm3) e água (100 cm3) com agitação vigorosa. A mistura foi subse- qüentemente separada em fases e a fase orgânica lavada com água (2 χ 100 cm3). As lavagens aquosas combinadas foram extraídas com acetato de etila (2 χ 100cm3). Os extratos orgânicos foram combinados, secados e concentrados a vácuo para fornecer um sólido laranja bruto que foi dissolvi- do em acetato de etila fervente. A solução foi deixada esfriar para temperatu- ra ambiente seguido por adição de hexano para induzir precipitação. A pasta resultante foi deixada agitar por 15 min. após os quais o precipitado foi filtra- do e lavado com hexano. O bolo de filtro foi secado sob pressão reduzida para fornecer 2,4-diidróxi-4,5-(dietóxi-carbonil)-6-(4-bromofenil)-3,4,5,6- tetraidro-pirimidina 140 como uma mistura 4:1 de diastereômeros (4,92 g, 26 %); δΗ (50 MHz; DMSO-d6) 7,61-7,51 e 7,53 (4 χ 1H, dois sobrepondo m e d, J 8,4, arila H), 7,35-7,20 e 7,33 (4 χ 1H, dois sobrepondo m e d, J 8,4, arila H), 7,09 (1H, s, NH), 6,91 (1H, br d, J 1,4, NH), 6,58 (1H, br d, J 1,0, NH), 6,50 (1H, s, NH), 5,03 (1H, br d, J 4,5, H-6), 4,76 (1H, d, J 11,5, H-6), 4,25- 4,05 (2 χ 2H, dois sobrepondo q, OCH2CH3), 3,93-3,65 (2 χ 2H, dois sobre- pondo q, OCH2CH3), 3,20-3,10 e 3,13 (2 χ 1H, sobrepondo d e brdd, J 11,5 e 0,8, 2 χ H-5), 1,26 (3H, t, J ca. 7,1, OCH2CH3) 1,16 (3H, t, J 7,0, Ο- CH2CH3), 0,97 (3H, t, J ca. 7,1, OCH2CH3) e 0,78 (3H, t, J ca. 7,1, O- CH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 169,9 (CO2Et), 167,8 (CO2Et), 154,9 (NH- CONH), 154,2 (NHCONH), 140,5, 131,8, 131,1, 129,6 e 121,6 (arila C), 81,7 e 80,3 (C-4), 62,4 (C-5), 61,1 e 60,5 (C-6), 53,0 e 52,8 (OCH2CH3), 14,6 e 14,4 (OCH2CH3).Trifluoroacetic acid (3.2 cm3, 41.54 mmol) was added to a mixture of urea (4.09 g, 68.02 mmol) and 4-bromobenzaldehyde (9.32 g, 49.88 mmol) in 1.2 anhydrous dichloroethane (90 cm 3). Diethyl oxalacetate sodium salt (95%, 10.03 g, 45.34 mmol) was added to the reaction mixture, and the reaction was heated at reflux for 41 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and subsequently concentrated in vacuo to provide a viscous orange oil. The residue was taken up in ethyl acetate (100 cm3) and water (100 cm3) with vigorous stirring. The mixture was subsequently separated into phases and the organic phase washed with water (2 χ 100 cm3). The combined aqueous washes were extracted with ethyl acetate (2 x 100cm3). The organic extracts were combined, dried and concentrated in vacuo to afford a crude orange solid which was dissolved in boiling ethyl acetate. The solution was allowed to cool to room temperature followed by addition of hexane to induce precipitation. The resulting slurry was allowed to stir for 15 min. after which the precipitate was filtered off and washed with hexane. The filter cake was dried under reduced pressure to provide 2,4-dihydroxy-4,5- (diethoxycarbonyl) -6- (4-bromophenyl) -3,4,5,6-tetrahydropyrimidine 140 as a mixture 4: 1 diastereomers (4.92 g, 26%); δΗ (50 MHz; DMSO-d6) 7.61-7.51 and 7.53 (4 χ 1H, two overlapping med, J 8.4, aryl H), 7.35-7.20 and 7.33 ( 4 χ 1H, two overlapping med, J 8.4, aryl H), 7.09 (1H, s, NH), 6.91 (1H, br d, J 1.4, NH), 6.58 (1H br d, J 1.0, NH), 6.50 (1H, s, NH), 5.03 (1H, br d, J 4.5, H-6), 4.76 (1H, d, J 11.5, H-6), 4.25- 4.05 (2 χ 2H, two overlapping q, OCH2CH3), 3.93-3.65 (2 χ 2H, two overlapping q, OCH2CH3), 3.20-3.10 and 3.13 (2 χ 1H, overlapping brdd, J 11.5 and 0.8, 2 χ H-5), 1.26 (3H, t, J ca. 7.1 , OCH 2 CH 3) 1.16 (3H, t, J 7.0, δ-CH 2 CH 3), 0.97 (3H, t, J ca 7.1, OCH 2 CH 3) and 0.78 (3H, t, J ca. 7.1, O-CH 2 CH 3); δc (50 MHz; DMSO-d 6) 169.9 (CO2Et), 167.8 (CO2Et), 154.9 (NH-CONH), 154.2 (NHCONH), 140.5, 131.8, 131.1 129.6 and 121.6 (C-aryl), 81.7 and 80.3 (C-4), 62.4 (C-5), 61.1 and 60.5 (C-6), 53, 0 and 52.8 (OCH2CH3), 14.6 and 14.4 (OCH2CH3).

2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(TRANS-2-FENILETENO)- 3,4,5,6-TETRAIDRO-PIRIMIDINA (141)2,4-DIHYDROXY-4,5- (DIETOXYCARBONYL) -6- (TRANS-2-PHENILETENE) - 3,4,5,6-TETRAHYDRO-PYRIMIDINE (141)

Ácido trifluoroacético (3,2 cm3, 41,54 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (4,10 g, 68,31 mmols) e trans-cinamaldeído (6,62 g, 50,09 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (91 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 10,07 g, 45,54 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 22 h. A mistura de reação foi esfri- ada para temperatura ambiente e subseqüentemente concentrada a vácuo para fornecer um óleo laranja viscoso. O resíduo foi absorvido em acetato de etila (150 cm3) e lavado com água (2 χ 100 cm3). As lavagens aquosas com- binadas foram extraídas com acetato de etila (2 χ 150 cm3). Os extratos or- gânicos foram combinados, secados e concentrados a vácuo para fornecer um óleo viscoso laranja bruto que foi submetido à purificação através de cromatografia de coluna uma vez que tentativas de cristalização direta das misturas de acetato de etila-hexano foram malsucedidas. Obteve-se um sóli- do de laranja céreo bruto que foi recristalizado de acetato de etila e um vo- lume mínimo de hexano para dar. um pó branco sujo de 2,4-diidróxi-4,5- (dietoxicarbonil)-6-(trans-2-fenileteno)-3,4,5,6-tetraidropirimidina 141 como uma mistura 4:1 de diastereômeros (1,82 g, 11 %); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 7,50-7,25 (2 χ 5H, m, arila H), 6,96 (1H, br s, NH), 6,77 (1H, br s, NH), 6,63 (2 χ 1H, d, J ca. 16,0, PhCH=CH), 6,47 (1H, br s, NH), 6,18 (2 χ 1 Η, dd, J ca. 16,0 e 8,0, PhCH=CH), 4,64-4,56 (1H, m, H-6), 4,38 (1H, dd, Jca 11,0 e 8,0, H-6), 4,24-4,07 (2 χ 2H, dois sobrepondo q, OCH2CH3), 4,07-3,90 (2 χ 2H, dois sobrepondo q, OCH2CH3), 6,05 (1H, br d, J ca. 4,0, H-5), 2,97 (1H, d, J ca. 11,0, H-5), 1,30-1,16, 1,27 e 1,19 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J ca 7,1 e 7,0, OCH2CH3), 1,11-1,07, 1,07 e 1,06 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J 7,0, OCH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 170,0 (CO2Et), 168,2 (CO2Et), 154,2 (NHCONH), 137,0, 133,0, 131,7, 128,4 e 127,4 (arila C), 129,3 (CH=CHPh)1 128,9 (CH=CHPh), 127,1 (CH=CHPh), 127,0 (CH=CHPh), 81,6 (C-4), 62,3 (C-5), 61,1 (C-6), 51,4 e 51,2 (OCH2CH3), 14,6 e 14,5 (OCH2CH3). ÁCIDO 6-(4-NITROFENIL)-2-OXO-1,2,3,4-TETRAIDROPIRIDINO-4,5- DICARBOXIÍLICO (142)Trifluoroacetic acid (3.2 cm3, 41.54 mmol) was added to a mixture of urea (4.10 g, 68.31 mmol) and trans-cinnamaldehyde (6.62 g, 50.09 mmol) in 1.2 anhydrous dichloroethane (91 cm 3). Diethyl oxalacetate sodium salt (95%, 10.07 g, 45.54 mmols) was added to the reaction mixture, and the reaction was heated at reflux for 22 h. The reaction mixture was cooled to room temperature and subsequently concentrated in vacuo to provide a viscous orange oil. The residue was taken up in ethyl acetate (150 cm3) and washed with water (2 x 100 cm3). The combined aqueous washes were extracted with ethyl acetate (2 χ 150 cm3). The organic extracts were combined, dried and concentrated in vacuo to afford a crude orange viscous oil which was subjected to purification by column chromatography as attempts to direct crystallization of the ethyl acetate-hexane mixtures were unsuccessful. A crude cereal orange solid was obtained which was recrystallized from ethyl acetate and a minimum volume of hexane to give. an off-white powder of 2,4-dihydroxy-4,5- (diethoxycarbonyl) -6- (trans-2-phenylethylene) -3,4,5,6-tetrahydropyrimidine 141 as a 4: 1 mixture of diastereomers (1, 82 g, 11%); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 7.50-7.25 (2 χ 5H, m, aryl H), 6.96 (1H, br s, NH), 6.77 (1H, br s, NH) 6.63 (2 χ 1H, d, J ca. 16.0, PhCH = CH), 6.47 (1H, br s, NH), 6.18 (2 χ 1 Η, dd, J ca. 16 , 0 and 8.0, PhCH = CH), 4.64-4.56 (1H, m, H-6), 4.38 (1H, dd, Jca 11.0 and 8.0, H-6) , 4.24-4.07 (2 χ 2H, two overlapping q, OCH2CH3), 4.07-3.90 (2 χ 2H, two overlapping q, OCH2CH3), 6.05 (1H, br d, J ca 4.0, H-5), 2.97 (1H, d, J ca. 11.0, H-5), 1.30-1.16, 1.27 and 1.19 (2 χ 3H, two overlapping t, J ca 7.1 and 7.0, OCH2 CH3), 1.11-1.07, 1.07 and 1.06 (2 χ 3H, two overlapping t, J 7.0, OCH2CH3); δc (50 MHz; DMSO-d 6) 170.0 (CO2Et), 168.2 (CO2Et), 154.2 (NHCONH), 137.0, 133.0, 131.7, 128.4 and 127.4 ( aryl C), 129.3 (CH = CHPh) 11 128.9 (CH = CHPh), 127.1 (CH = CHPh), 127.0 (CH = CHPh), 81.6 (C-4), 62 , 3 (C-5), 61.1 (C-6), 51.4 and 51.2 (OCH 2 CH 3), 14.6 and 14.5 (OCH 2 CH 3). 6- (4-NITROPHENYL) -2-OXO-1,2,3,4-TETRAIDROPYRIDINE-4,5-DICARBOXYLIC ACID (142)

A uma suspensão da dietoxicarbonil-tetraidropirimidina 138 (0,22 g, 0,56 mmol) em etanol absoluto (3 cm3) foi adicionada uma solução de hidróxido de potássio (0,13 g, 2,24 mmols) em etanol absoluto (2 cm3). A mistura de reação foi aquecida a refluxo por 10 min. durante os quais um precipitado quase sempre estava presente. A mistura de reação marrom es- cura foi deixada esfriar para temperatura ambiente e ao esfriar, a mistura foi acidificada com ácido clorídrico aquoso (10 %) para pH ca. 1-2 que resultou em alteração em cor para laranja brilhante. O produto foi simplesmente co- lhido através de filtração e lavado com várias porções pequenas de etanol absoluto seguido secagem sob pressão reduzida para dar ácido 6-(4- nitrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetraidropiridino-4,5-dicarboxílico 142 (0,16 g, 90 %); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 11,26 (2 χ 1 Η, br s, 2 χ CO2H), 8,31 (2H, d, J ca. 8,5, arila H), 8,18 (1H, brs, NH), 7,99 (2H, d, J ca. 8,5, arila H), 5,95 (1H, s, H-6). 8-MORFOLINOADENOSINA (147)To a suspension of diethoxycarbonyl tetrahydropyrimidine 138 (0.22 g, 0.56 mmol) in absolute ethanol (3 cm3) was added a solution of potassium hydroxide (0.13 g, 2.24 mmol) in absolute ethanol (2 cm3). The reaction mixture was heated at reflux for 10 min. during which a precipitate was almost always present. The dark brown reaction mixture was allowed to cool to room temperature and upon cooling the mixture was acidified with aqueous hydrochloric acid (10%) to pH ca. 1-2 which resulted in a color change to bright orange. The product was simply collected by filtration and washed with several small portions of absolute ethanol followed by drying under reduced pressure to give 6- (4-nitrophenyl) -2-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyridine-4 acid. , 5-dicarboxylic 142 (0.16 g, 90%); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 11.26 (2 χ 1 Η, br s, 2 χ CO2H), 8.31 (2H, d, J ca 8.5, aryl H), 8.18 (1H , brs, NH), 7.99 (2H, d, J ca 8.5, aryl H), 5.95 (1H, s, H-6). 8-MORPHOLINOADENOSINE (147)

Morfolina (2,0 cm3) foi adicionada a uma solução de dioxano (5 cm3) de 8-bromoadenosina protegido de isopropilideno 145 (0,15 g, 0,43 mmol) e a solução resultante foi submetida à irradiação de microonda (50 % potência de 600W) durante 40 minutos. O precipitado de bromidrato de morfolínio foi removido por filtração e o solvente foi removido do filtrado. A solução resultante foi triturada com éter (2x5 cm3) para gerar a 8- morfolino adenosina protegida de isopropilideno 146 como um sólido cor de creme (0,12 mg, 71 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,18 (1H, s, H-2), 5,90 (1H, d, H-1', J 5,6), 5,27 (1H, dd, H-2', J 5,6 e 5,4), 5,08 (1H, d, H-3', J 5,4), 4,42 (1H, s, H-4'), 3,90 (2H, m, H-5'), 3,78 [4H, m, O(CH2CH2)2N], 3,39 [2H, m, 0(CH2CHaHb)2N], 3,15 [2H, m, 0(CH2CHaHb)2N], 1,60 e 1,38 [6H, 2 χ s, C(CH3)2]; (El) m/z 392 (Ci7H24N6O5 requer 392). O material resultante (10 mg) foi desprotegido em tetraidrofurano agitando durante a noite em áci- do clorídrico aquoso (2M, 5 gotas) em cujo tempo nenhum material de parti- da permaneceu por HPLC após neutralização da amostra. Após remoção de solvente, 147 bruto foi usado em estudos de inibição.Morpholine (2.0 cm3) was added to an isopropylidene-protected 8-bromoadenosine dioxane (5 cm3) solution (0.15 g, 0.43 mmol) and the resulting solution was subjected to microwave irradiation (50% 600W) for 40 minutes. The morpholine hydrobromide precipitate was removed by filtration and the solvent was removed from the filtrate. The resulting solution was triturated with ether (2x5 cm 3) to give isopropylidene-protected 8-morpholine adenosine 146 as a cream colored solid (0.12 mg, 71%). δΗ (200 MHz, CDCl3) 8.18 (1H, s, H-2), 5.90 (1H, d, H-1 ', J 5.6), 5.27 (1H, dd, H-2) ', J 5.6 and 5.4), 5.08 (1H, d, H-3', J 5.4), 4.42 (1H, s, H-4 '), 3.90 (2H , m, H-5 '), 3.78 [4H, m, O (CH2 CH2) 2 N], 3.39 [2H, m, 0 (CH2 CHaHb) 2 N], 3.15 [2H, m, 0 (CH2 CHaHb ) 2N], 1.60 and 1.38 [6H, 2 χ s, C (CH3) 2]; (EI) m / z 392 (C 17 H 24 N 6 O 5 requires 392). The resulting material (10 mg) was deprotected in tetrahydrofuran by stirring overnight in aqueous hydrochloric acid (2M, 5 drops) at which time no starting material remained by HPLC after sample neutralization. After solvent removal, crude 147 was used in inhibition studies.

EXEMPLO 4 - AVALIAÇÃO DE INIBIDORES IN VITROEXAMPLE 4 - EVALUATION OF IN VITRO INHIBITORS

Enzima de GS foi produzida na forma adenililada e desadenilila- da usando cultura contínua de E. coli sob condições de qualquer excesso de nitrogênio e limitação de carbono (forma adenililada) ou condições de limita- ção de nitrogênio e excesso de carbono (desadenililada). As enzimas foram purificadas em ambas as formas usando cromatografia de afinidade de AMP-Sepharose e os ensaios foram operados para testar para a inibição da glutamina sintetase. A atividade da enzima foi medida pela hidrólise de ATP para ADP e pela formação de glutamina de glutamato.GS enzyme was produced in the adenylylated and de-adenylated form using continuous E. coli culture under conditions of any nitrogen excess and carbon limitation (adenylated form) or nitrogen and excess carbon (deadenylated) conditions. Enzymes were purified in both forms using AMP-Sepharose affinity chromatography and the assays were operated to test for glutamine synthetase inhibition. Enzyme activity was measured by ATP hydrolysis to ADP and glutamate glutamine formation.

MATERIAIS E MÉTODOSMATERIALS AND METHODS

Ambas as formas da enzima foram produzidas da construção de glutamina sintetase recombinante pBSK-ECgln na cepa hospedeira auxotró- fica de glutamina sintetase YMC11 de E. Coli. O organismo foi crescido em cultura contínua sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de car- bono para a enzima adenililada ou condições de limitação de nitrogênio e excesso de carbono para a enzima desadenililada, como esboçado por (Sê- nior, P. J. (1975). J. Bact: 123, (2), 407-418). As fermentações crescidas sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono foram crescidas a uma taxa de crescimento inicial de 0,07 hora"1, após 5 tempos de retenção a taxa de crescimento foi reduzida para 0,01 hora'1 para permitir alcançar estado fixo. Todas as fermentações foram crescidas a 379C, pH 7,15 a uma taxa de fluxo de ar de 1 v/v/m e uma taxa de agitação de 600 rpm em um fermentador New Brunswick 3000 (N.J., USA). A biomassa foi colhida conti- nuamente e mantida em 6-C após o qual foi centrifugada a 10,000 xg duran- te 20 minutos e congelada a -209C. As fermentações foram monitoradas continuamente para assegurar que o estado firme foi mantido determinando a absorbância da cultura (600 nm), viabilidade celular através das contagens de placa com ágar de contagem de placa e determinando a concentração da biomassa. Em intervalos durante o curso da fermentação, isolados de colô- nia simples foram removidos da fermentação e a integridade do plasmídeo contendo o gene de GS foi validada por triagem de PCR e isolamento de plasmídeo.Both forms of the enzyme were produced from the recombinant glutamine synthetase pBSK-ECgln construct in the E. coli YMC11 glutamine synthetase auxotrophic host strain. The organism was grown in continuous culture under conditions of excess nitrogen and carbon limitation for the adenylylated enzyme or conditions of nitrogen limitation and excess carbon for the deadenylated enzyme, as outlined by (Senior, PJ (1975)). J. Bact: 123, (2), 407-418). Fermentations grown under conditions of excess nitrogen and carbon limitation were grown at an initial growth rate of 0.07 hours' 1, after 5 retention times the growth rate was reduced to 0.01 hours'1 to allow to reach All fermentations were grown at 37 ° C, pH 7.15 at an air flow rate of 1 v / v / m and a stir rate of 600 rpm in a New Brunswick 3000 fermenter (NJ, USA). was continuously harvested and maintained at 6-C after which it was centrifuged at 10,000 xg for 20 minutes and frozen at -20 ° C. Fermentations were continuously monitored to ensure steady state was maintained by determining the absorbance of the culture (600 nm), cell viability by plaque counting with plaque counting agar and determining biomass concentration At intervals during the course of the fermentation, single colony isolates were removed from the fermentation and the integrity of The plasmid containing the GS gene was validated by PCR screening and plasmid isolation.

A biomassa foi ressuspensa em Tampão de ressuspensão A ou RBA (10 mM de Imidazol-HCI, 2 mM de β-mercaptoetanol, 10 mM de Mn- CI2.4H20; pH 7,0). As células foram sonicadas durante 10 minutos em um ciclo de trabalho de 50 %. Esta solução sonicada foi centrifugada durante 10 minutos a 12 000 χ g, e o sobrenadante foi retido. Sulfato de estreptomicina foi adicionado (10 % de uns 10 % p/v), e a suspensão foi agitada a 4eC du- rante 10 minutos. Centrifugação foi depois realizada a 12 000 χ g por 10 mi- nutos e o sobrenadante foi retido. O pH do sobrenadante foi ajustado em 5,15 com ácido sulfúrico. Esta mistura foi agitada a 4QC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 20 000 χ g durante 10 minutos. Novamente, o so- brenadante foi retido. Sulfato de amônio saturado (30 % de volume) foi adi- cionado e o pH foi ajustado em 4,6 com ácido sulfúrico. A suspensão foi agi- tada a 4 e C durante 15 minutos, e depois centrifugada a 20 000 χ g durante 10 minutos. O precipitado obtido foi ressuspenso em RBA e o pH ajustado para 5,7 com ácido sulfúrico. Esta suspensão foi agitada durante a noite a 4ºC para permitir a glutamina sintetase ressuspender-se, e depois centrifu- gada a 20,000 χ g durante 10 minutos. O sobrenadante foi retido e o pH das suspensões foi ajustado para 7,0.The biomass was resuspended in Resuspension Buffer A or RBA (10 mM Imidazole-HCl, 2 mM β-mercaptoethanol, 10 mM Mn-Cl2.4H20; pH 7.0). The cells were sonicated for 10 minutes in a 50% duty cycle. This sonicated solution was centrifuged for 10 minutes at 12,000 χ g, and the supernatant was retained. Streptomycin sulfate was added (10% to about 10% w / v), and the suspension was stirred at 4 ° C for 10 minutes. Centrifugation was then performed at 12,000 χ g for 10 minutes and the supernatant was retained. The pH of the supernatant was adjusted to 5.15 with sulfuric acid. This mixture was stirred at 4 ° C for 15 minutes, and then centrifuged at 20,000 χ g for 10 minutes. Again, the supervisor was retained. Saturated ammonium sulfate (30% by volume) was added and the pH was adjusted to 4.6 with sulfuric acid. The suspension was stirred at 4 ° C for 15 minutes, and then centrifuged at 20,000 χ g for 10 minutes. The obtained precipitate was resuspended in RBA and the pH adjusted to 5.7 with sulfuric acid. This suspension was stirred overnight at 4 ° C to allow glutamine synthetase to resuspend, and then centrifuged at 20,000 χ g for 10 minutes. The supernatant was retained and the pH of the suspensions adjusted to 7.0.

Outra purificação das duas formas da enzima foi alcançada atra- vés do uso de cromatografia de afinidade usando um AKTA Explorer (Amer- sham Biosciences). Separação foi alcançada com resina de 5ΆΜΡ Sepha- rose com uma coluna de HR10/10 tendo um comprimento de 10 cm e um diâmetro interno de 10 mm. A preparação da enzima glutamina sintetase (aproximadamente 2 ml) foi carregada para a coluna preparada que foi equi- librada com 10 mM Imidazol (pH 7,0), 150 mM NaCI e 10 mM MnCI2.4H20. A glutamina sintetase ligada foi eluído da coluna com 2,5 mM de ADP ao longo de um gradiente linear de 40 ml de 150 a 500 mM de NaCI, e as frações de 1 ml foram colhidas. As frações contendo glutamina sintetase pura foram depois agrupadas e dialisadas durante a noite contra RBA.Further purification of both forms of the enzyme was achieved through the use of affinity chromatography using an AKTA Explorer (Amer shampoo Biosciences). Separation was achieved with 5ΆΜΡ Sepha rosin resin with a HR10 / 10 column having a length of 10 cm and an internal diameter of 10 mm. The glutamine synthetase enzyme preparation (approximately 2 ml) was loaded onto the prepared column which was equilibrated with 10 mM Imidazole (pH 7.0), 150 mM NaCl and 10 mM MnCl2.4H20. Bound glutamine synthetase was eluted from the column with 2.5 mM ADP over a 40 ml linear gradient of 150 to 500 mM NaCl, and 1 ml fractions were collected. Fractions containing pure glutamine synthetase were then pooled and dialyzed overnight against RBA.

Uma alíquota de cada suspensão de proteína foi submetida à eletroforese em um gel de SDS PAGE a 7,5 % de acordo com os protocolos padrões. Concentração da proteína foi determinada usando o método de determinação de proteína de Lowry e a concentração foi usada determinan- do todas atividades específicas para a enzima.One aliquot of each protein suspension was electrophoresed on a 7.5% SDS PAGE gel according to standard protocols. Protein concentration was determined using Lowry's protein determination method and concentration was used to determine all enzyme-specific activities.

Cada inibidor foi avaliado por seu efeito na atividade da enzima de glutamina sintetase, usando um ensaio desenvolvido para medir a reação direta da enzima. Em cada circunstância, a forma da enzima adenililada e desadenililada foi testada para cada inibidor. Todos os ensaios foram reali- zados em duplicata. A triagem primária foi realizada a uma concentração de inibidor de 1 mm. Os componentes de ensaio estão mostrados na TABELA 29.Each inhibitor was evaluated for its effect on glutamine synthetase enzyme activity using an assay designed to measure the direct reaction of the enzyme. Under each circumstance, the form of the adenylylated and desadenylated enzyme was tested for each inhibitor. All assays were performed in duplicate. Primary screening was performed at an inhibitor concentration of 1 mm. The test components are shown in TABLE 29.

TABELA 29. COMPONENTES DE ENSAIOTABLE 29. TEST COMPONENTS

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Todos os inibidores foram preparados em Dimetil Sulfóxido (DMSO) como 10 mM de soluções de matéria-prima. O ensaio da enzima adenililada foi realizado a um pH de 6,3, e o ensaio da enzima desadenilila- da a um pH de 7,2. Todas as preparações da enzima foram adicionadas à mistura de ensaio em um volume de 50 μΙ. A adição da enzima iniciou a rea- ção que foi depois deixada prosseguir por 2,5 horas para a enzima adenilila- da e 45 minutos para a enzima desadenililada. A reação foi interrompida pe- la adição de ácido tricloroacético a uma concentração de 0,5 % m/v. Cada ensaio foi depois aliquotado em frascos de HPLC, dois destes foram ensaia- dos para glutamato e glutamina e dois para ADP e ATP, usando uma coluna de C18 de 5 μ Fenomenex Luna em um instrumento de HPLC Agilent 100.All inhibitors were prepared in Dimethyl Sulfoxide (DMSO) as 10 mM of raw material solutions. The adenylylated enzyme assay was performed at a pH of 6.3, and the de-adenylated enzyme assay at a pH of 7.2. All enzyme preparations were added to the assay mixture in a volume of 50 μΙ. Addition of the enzyme initiated the reaction which was then allowed to proceed for 2.5 hours for the adenylylated enzyme and 45 minutes for the desadenylated enzyme. The reaction was stopped by the addition of trichloroacetic acid at a concentration of 0.5% w / v. Each assay was then aliquoted into HPLC flasks, two of which were assayed for glutamate and glutamine and two for ADP and ATP using a Fenomenex Luna 5 µ C18 column on an Agilent 100 HPLC instrument.

ANÁLISE DE INIBIÇÃO DA ENZIMAEnzyme Inhibition Analysis

Atividades específicas para enzima foram calculadas para cada ensaio de inibidor em termos de pmols/min/mg de proteína. Cada ensaio de inibidor foi depois comparado a um ensaio de enzima não-inibida, isto é um ensaio de controle não contendo nenhum inibidor, resultando em um cálculo de uma redução na atividade da enzima que foi depois relatado como uma porcentagem. As faixas selecionadas foram 80-100 %, 60-80 %, 30-60 % e 0-30 % de redução na atividade. Estes resultados estão mostrados na TA- BELA 30. TABELA 30. NÍVEIS DE INIBIÇÃO RELATIVA PRODUZIDOS PARA AMBAS AS FORMAS ADENILILADA E DESADENILILADA DA ENZIMA PARA OS COMPOSTOS DE INIBI DOR TESTADOS.Enzyme specific activities were calculated for each inhibitor assay in terms of pmols / min / mg protein. Each inhibitor assay was then compared to an uninhibited enzyme assay, that is a control assay containing no inhibitor, resulting in a calculation of a reduction in enzyme activity which was then reported as a percentage. The selected ranges were 80-100%, 60-80%, 30-60% and 0-30% reduction in activity. These results are shown in TABLE 30. TABLE 30. RELATIVE INHIBITION LEVELS PRODUCED FOR BOTH ADENILYLED AND DEADENILILIZED FORMS OF THE ENZYME FOR TESTED INHIBITOR COMPOUNDS.

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Com base nos resultados apresentados na TABELA 30, vários compostos de inibidor foram selecionados para outra testagem. Estes estão mostrados, com seus níveis de inibição relativa, na TABELA 31.Based on the results presented in TABLE 30, several inhibitor compounds were selected for further testing. These are shown, with their relative inhibition levels, in TABLE 31.

TABELA 31. COMPOSTOS DE INIBIDOR SELECIONADOS PARA OUTRA TESTAGEMTABLE 31. INHIBITOR COMPOUNDS SELECTED FOR ANOTHER TEST

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Inibidores úteis podem ser selecionados com base na porcenta- gem de inibição da atividade de GS. Inibição seletiva da atividade de forma- ção de ADP ou de Glutamina de GS adenililada GS com relação à GS desa- denililada pode ser particularmente útil. Além disso, inibidores que demons- tram inibição mais alta da síntese de ADP com relação à Glutamina podem ser úteis.Useful inhibitors may be selected based on the percentage inhibition of GS activity. Selective inhibition of adenylylated GS ADP or Glutamine formation activity with respect to desadenylated GS may be particularly useful. In addition, inhibitors that demonstrate higher inhibition of ADP synthesis with respect to Glutamine may be useful.

EXEMPLO 5 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE INIBIDOR COM RESPEITO ÀS CÉLULAS DE M. tuberculosis E Mammalian MATERIAIS E MÉTODOSEXAMPLE 5 - ASSESSMENT OF INHIBITOR ACTIVITY REGARDING M. tuberculosis and Mammalian CELLS MATERIALS AND METHODS

O sistema de BACTEC foi inventado para monitorar o cresci- mento micobacteriano de espécies de crescimento lento. As bactérias são crescidas em um substrato radioativo e o dióxido de carbono radioativo pro- duzido é diretamente proporcional à taxa de crescimento micobacteriano (Siddiqi, S. H., sistema de BACTEC 460 TB, Product and procedure manual (1995)). Leitura dos valores é expressa como índice de crescimento (Gl). Cepa de referência de M. tuberculosis H37Rv (ATCC 25618) foi cultivada em meio micobacteriano 7H9 (Difco) enriquecido com ADC (técnica de Biolab C70), com agitação contínua a 37eC. Crescimento de fase de registro foi a- ceito em valores de A600 nm entre 0,4 e 0,6. Quando as culturas alcança- ram uma densidade de aproximadamente 0,16 em A600 nm (um McFar- land), 0,1 ml foi inoculado em um frasco Bactec. Estas culturas primárias foram incubadas a 379C até um índice de crescimento de 500 (+/- 50) fosse alcançado. Estes culturas primárias foram usadas para testagem de inibidor.The BACTEC system was invented to monitor mycobacterial growth of slow growing species. Bacteria are grown on a radioactive substrate and the produced radioactive carbon dioxide is directly proportional to the mycobacterial growth rate (Siddiqi, S. H., BACTEC 460 TB system, Product and procedure manual (1995)). Reading of values is expressed as growth index (Gl). M. tuberculosis H37Rv reference strain (ATCC 25618) was cultured in ADC-enriched 7H9 (Difco) mycobacterial medium (Biolab C70 technique) with continuous shaking at 37 ° C. Registration phase growth was accepted at A600 nm values between 0.4 and 0.6. When the cultures reached a density of approximately 0.16 at A600 nm (one McFarland), 0.1 ml was inoculated into a Bactec vial. These primary cultures were incubated at 37 ° C until a growth index of 500 (+/- 50) was reached. These primary cultures were used for inhibitor testing.

Compostos de teste, providos em dimetil sulfóxido (DMSO), fo- ram esterilizados através de um filtro de seringa resistente de solvente orgâ- nico de 13 mm com tamanho de poro de 0,22 mícron (Millex-LG). As amos- tras não diluídas foram testadas para atividade de inibidor de crescimento. Aqueles mostrando atividade foram seqüencialmente diluídos em DMSO estéril para determinar o fator de diluição para atividade de inibidor de cres- cimento continuado. Os inibidores testados estão esboçados na TABELA 32.Test compounds, provided in dimethyl sulfoxide (DMSO), were sterilized through a 0.22 micron pore size resistant organic solvent syringe filter (Millex-LG). Undiluted samples were tested for growth inhibitor activity. Those showing activity were sequentially diluted in sterile DMSO to determine the dilution factor for continued growth inhibitor activity. The inhibitors tested are outlined in TABLE 32.

TABELA 32. INIBIDORES TESTADOS NO ENSAIO DE BACTECTABLE 32. TEST INHIBITORS IN BACTEC TEST

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0,1 ml de cultura primária e composto de inibidor foi adicionado a um frasco BACTEC, os frascos incubados a 379C, e o crescimento monito- rado a cada 24 horas. Controles incluíram culturas com e sem inibidor e com e sem solvente. As leituras de Gl foram continuadas até que os controles alcançassem o valor de Gl máximo de 999.0.1 ml of primary culture and inhibitor compound was added to a BACTEC vial, the vials incubated at 37 ° C, and growth monitored every 24 hours. Controls included cultures with and without inhibitor and with and without solvent. Gl readings were continued until the controls reached the maximum Gl value of 999.

Para testar as amostras para citotoxicidade in vitro contra uma linha de célula mamífera o ensaio de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazoliobrometo (MTT) em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) foi usado.To test the samples for in vitro cytotoxicity against a mammalian cell line the 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliobromide (MTT) assay on Chinese Hamster Ovary (CHO) cells was performed. used.

Todas as amostras foram testadas em triplicata em uma ocasi- ão. O ensaio de MTT é usado como um ensaio colorimétrico para crescimen- to e sobrevivência celulares, e compara o poço com outros ensaios disponí- veis (Mosman et aí., 1983 e Rubinstein et ai., 1990). O sal de tetrazólio MTT foi usado para medir todo o crescimento e quimiossensibilidade.All samples were tested in triplicate on one occasion. The MTT assay is used as a colorimetric assay for cell growth and survival, and compares the well with other available assays (Mosman et al., 1983 and Rubinstein et al., 1990). MTT tetrazolium salt was used to measure all growth and chemosensitivity.

Soluções de matéria-prima preparadas a 10 mM em 100 % de DMSO foram recebidas de CSIR. As amostras foram testadas como uma suspensão se não corretamente dissolvida e armazenada a -209C até o uso. Todas as amostras de teste foram triadas a 50 μΜ. Esta concentração foi selecionada para assegurar que a concentração de solvente usada no en- saio não afetaria a viabilidade das células. A concentração mais alta de sol- vente à qual as células foram expostas não teve nenhum efeito mensurável na viabilidade das células (dados não mostrados). Emetina foi usada como o fármaco de referência em todos os experimentos. A concentração de partida de emetina foi 100 pg/ml que foi serialmente diluída em meio completo com diluições de 10 vezes para dar seis concentrações, a mais baixa sendo 0,001 Mg/ml.Raw material solutions prepared at 10 mM in 100% DMSO were received from CSIR. Samples were tested as a suspension if not properly dissolved and stored at -20 ° C until use. All test samples were screened at 50 μΜ. This concentration was selected to ensure that the solvent concentration used in the assay would not affect cell viability. The highest concentration of solvent to which cells were exposed had no measurable effect on cell viability (data not shown). Emetin was used as the reference drug in all experiments. The starting emetine concentration was 100 pg / ml which was serially diluted in complete medium with 10-fold dilutions to give six concentrations, the lowest being 0.001 Mg / ml.

Os valores de 50 % de concentração inibidor (IC5o) para estas amostras foram obtidos de curvas de dose-resposta, usando uma análise própria de curva de dose-resposta não-linear por meio de software Graph- Pad Prism v.4.The 50% inhibitory concentration (IC 50) values for these samples were obtained from dose-response curves using proprietary nonlinear dose-response curve analysis using Graph-Pad Prism v.4 software.

RESULTADOS E DEBATERESULTS AND DEBATE

As curvas de resposta de crescimento Bactec de M. tuberculosis na presença dos vários inibidores foram executadas. Aqueles inibidores tes- tados que foram observados inibir M. tuberculosis foram depois testados pa- ra suas concentrações de LC50 determinando o efeito da concentração de inibidor no crescimento Bactec de M. tuberculosis. As concentrações de LC5O estão esboçadas na TABELA 33.Bactec growth response curves of M. tuberculosis in the presence of the various inhibitors were performed. Those inhibitors tested that were observed to inhibit M. tuberculosis were then tested for their LC50 concentrations by determining the effect of inhibitor concentration on M. tuberculosis Bactec growth. LC50 concentrations are outlined in TABLE 33.

TABELA 33. CONCENTRAÇÕES DE LC50 (μΜ) DE INIBIDORES DE M. tu- berculosisTABLE 33. LC50 (μΜ) CONCENTRATIONS OF M. tuberculosis inhibitors

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Todos os inibidores foram depois testados quanto sua citotoxici- dade para células mamíferas (por exemplo, células CHO). Todas as amos- tras foram inicialmente testadas a uma concentração de 50 μΜ. Dos resulta- dos obtidos, todas as amostras não mostraram nenhuma citotoxicidade sig- nificativa nesta concentração contra a linha de célula CHO (TABELA 34). TABELA 34. PORCENTAGEM DE VIABILIDADE CELULAR A 50 μΜAll inhibitors were then tested for their cytotoxicity to mammalian cells (eg CHO cells). All samples were initially tested at a concentration of 50 μΜ. From the results obtained, all samples showed no significant cytotoxicity at this concentration against the CHO cell line (TABLE 34). TABLE 34. PERCENTAGE OF CELL VIABILITY AT 50μΜ

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Várias modalidades da invenção foram descritas. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção. Conseqüentemente, outras modalidades es- tão dentro do escopo das reivindicações a seguir.Various embodiments of the invention have been described. However, it will be understood that various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, other embodiments are within the scope of the following claims.

Claims (36)

1. Método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada (GSI-β) bacteriana, o método usando um computa- dor programado compreendendo um processador e um dispositivo de entra- da, o método compreendendo: (a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GSI- β adenililada bacteriana; (b) atracar no sítio de fosforil transferase uma molécula de inibi- dor de teste usando o processador; e (c) determinar, com base na atracagem, se a molécula de inibi- dor de teste inibiria a atividade do sítio de fosforil transferase.1. Computer-assisted method of generating a test inhibitor of phosphoryl transferase site activity of a bacterial adenylylated β-β-glutamine synthetase (GSI-β) polypeptide, the method using a programmed computer comprising a processor and a device the method comprising: (a) introducing into the input device a structure of a phosphoryl transferase site of a bacterial adenylylated GSI-β polypeptide; (b) docking at the phosphoryl site transfer a test inhibitor molecule using the processor; and (c) determining, based on mooring, whether the test inhibitor molecule would inhibit phosphoryl transferase site activity. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo atracar no sítio de fosforil transferase um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2.ATP ou um intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifosfato.A method according to claim 1, further comprising mooring at the phosphoryl transferase site one or more structural motifs of a (Mn2 +) 3. (HC03 ") i2.ATP complex or a transition state intermediate of a carboxyphosphate-based phosphoryl transfer reaction. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, adicionalmente compreendendo determinar, com base na atracagem, se a molécula de ini- bidor de teste inibiria a ligação do um ou mais motivos estruturais do com- plexo de (Mn2+)3.(HC03")i2.ATP ou o intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em car- boxifosfato ao sítio de fosforil transferase.The method of claim 2, further comprising determining, based on mooring, whether the test inhibitor molecule would inhibit the binding of one or more (Mn2 +) 3 (HCO 3 ") complex motifs. ) i2.ATP or the transition state intermediate of a carboxyphosphate-based phosphoryl transfer reaction intermediate to the phosphoryl transferase site. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo projetar um inibidor de teste determinado pela etapa (c) pa- ra inibir a atividade do sítio de fosforil transferase e avaliar a atividade inibi- dora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β ade- nililada bacteriana in vitro.A method according to claim 1, further comprising designing a test inhibitor determined by step (c) to inhibit phosphoryl transferase site activity and assess the inhibitory activity of the test inhibitor on a glutamine polypeptide. bacterial adenylated Ι-β synthetase in vitro. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita avali- ação in vitro compreende uso de um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.The method of claim 4, wherein said in vitro assay comprises use of an assay capable of measuring ATP hydrolysis, ADP formation, glutamate use, or glutamine formation. 6. Método de acordo com a reivindicação 4, adicionalmente compreendendo avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste em um poli- peptídeo de glutamina sintetase desadenililada in vitro para avaliar a ativida- de inibidora específica do inibidor de teste para o polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana.A method according to claim 4, further comprising evaluating the inhibitory activity of the test inhibitor on an in vitro desadenylated glutamine synthetase polypeptide to assess the specific inhibitor activity of the glutamine synthetase β test inhibitor bacterial adenylylated beta. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo produzir o inibidor de teste e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma bactéria que compreende um gene de glutamina sintetase de GSI-β.The method of claim 1, further comprising producing the test inhibitor and evaluating the inhibitory activity of the test inhibitor on the growth of a bacterium comprising a GSI-β glutamine synthase gene. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a dita bac- téria é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmoriella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigel- la dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes fae- ealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus infIuenzae, Bordetella pertussis, Bor- della bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brucella melitensis, Myeobaete- rium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Actinomyces israelii, Nocardia esteroides, Tiobacillus ferrooxi- dans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Strep- tomyees eoelieolor.The method according to claim 7, wherein said bacterium is selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmoriella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigel- la dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus infIuenzae, Bordetella pertussis, Borella della bronehiseptia, Neuceria meningitides, Brucella melitensis, Myeobaeteirium tuberulosis, Myeobaeteerium lepeaeumiiiii , Nocardia steroids, Tiobacillus ferrooxydans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, and Strep tomyees eoelieolor. 9. Método da reivindicação 5, em que o dito ensaio compreende contatar o dito polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana com o dito inibidor de teste sob condições tendo um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5.The method of claim 5, wherein said assay comprises contacting said bacterial adenylylated β-β glutamine synthetase polypeptide with said test inhibitor under conditions having a pH of from about 6.0 to about 6.5. 10. Método de gerar um composto que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenili- lada bacteriana, o método compreendendo: (a) fornecer uma estrutura tridimensional de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de inibir a interação entre o sítio de fosforil transferase e um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP ou um intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de trans- ferência de fosforila com base em carboxifosfato.A method of generating a compound that inhibits the phosphoryl transferase site activity of a bacterial adenylated Ι-β glutamine synthetase polypeptide, the method comprising: (a) providing a three-dimensional structure of a Ι-β glutamine synthetase polypeptide bacterial adenylylated; and (b) design, based on the three-dimensional structure, a test compound capable of inhibiting the interaction between the phosphoryl transferase site and one or more structural motifs of a (Mn2 +) 3. (HC03-) 12ATP complex or an intermediate transition state of a carboxyphosphate-based phosphoryl transfer reaction intermediate. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a estrutu- ra tridimensional do polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β bacteriana inclui um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Μn2+)3.(Η003")ΐ2ΑΤΡ ligado no sítio de fosforil transferase.The method of claim 10, wherein the three-dimensional structure of the bacterial Ι-β glutamine synthetase polypeptide includes one or more structural motifs of a (Ηn2 +) 3. (Η003 ") ΐ2ΑΤΡ complex bound at the phosphoryl transferase. 12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, adicional- mente compreendendo produzir o composto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste em um polipeptídeo de GSI-β ade- nililada bacteriana in vitro.A method according to claim 10 or 11 further comprising producing the test compound of step (b) and evaluating the inhibitory activity of the test compound on a bacterial adenylated GSI-β polypeptide in vitro. 13. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, adicional- mente compreendendo produzir o composto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste no crescimento de uma bactéria compreendendo um gene de glutamina sintetase de GSI-β.The method of claim 10 or 11 further comprising producing the test compound of step (b) and evaluating the inhibitory activity of the test compound on the growth of a bacterium comprising a GSI-β glutamine synthase gene. . 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a dita bactéria é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphthe- riae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coii, Salmonella typhinurium, Sal- monella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Myeo- baeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptos- pira interrogans, Aetinomyees israelii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferro- oxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor.The method of claim 13, wherein said bacterium is selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coii, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alkaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Myeo-baeterium tubereulosis, Myaeideaeumiii, Aeumideae steroids, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, and Streptomyees eoelieolor. 15. Método de gerar um composto de teste que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana, o método compreendendo: (a) fornecer uma estrutura tridimensional de um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP ou um intermediário de estado de transição de um in- termediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifos- fato; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste tendo um ou mais motivos similares na estrutura ao complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP ou ao intermediário de estado de transição de um in- termediário de estado de transição de um intermediário de reação de trans- ferência de fosforila com base em carboxifosfato.A method of generating a test compound that inhibits the phosphoryl transferase site activity of a bacterial adenylylated Ι-β glutamine synthetase polypeptide, the method comprising: (a) providing a three-dimensional structure of a (Mn2 +) 3 complex. (HC03 ") i2ATP or a transition state intermediate of a carboxyphosphate-based phosphoryl transfer reaction intermediate; and (b) design, based on the three-dimensional structure, a test compound having one or more similar motifs in structure to the (Mn2 +) 3. (HC03 ') i2ATP complex or to the transition state intermediate of a transition state intermediate of a carboxyphosphate-based phosphoryl transfer reaction intermediate. 16. Método de triar um composto de teste in vitro para determi- nar se ou não inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipep- tídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana (GSI-β), o método compreendendo: (a) contatar um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana com um composto de teste sob condições eficazes para atividade de fosforil transferase; e (b) determinar se ou não a atividade de fosforil transferase do polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana é reduzida com relação à ativi- dade de um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana que não foi conta- tado com o composto de teste.16. Method of screening an in vitro test compound to determine whether or not to inhibit the phosphoryl transferase site activity of a bacterial adenylylated Ι-β glutamine synthetase (GSI-β) polypeptide, the method comprising: ( (a) contacting a bacterial adenylylated GSI-β polypeptide with a test compound under conditions effective for phosphoryl transferase activity; and (b) determining whether or not the bacterial adenylated GSI-β polypeptide phosphoryl transferase activity is reduced with respect to the activity of a bacterial adenylated GSI-β polypeptide that was not contacted with the test compound. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, adicionalmente compreendendo determinar se ou não a atividade de fosforil transferase de um polipeptídeo de GSI-β desadenililada bacteriana é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de GSI-β desadenililada bacteriana que não foi contatado com o composto de teste.The method of claim 16, further comprising determining whether or not the phosphoryl transferase activity of a bacterial desadenylated GSI-β polypeptide is reduced with respect to the activity of a bacterial desadenylated GSI-β polypeptide that has not been contacted with the test compound. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a dita atividade de fosforil transferase é medida usando um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.The method of claim 17, wherein said phosphoryl transferase activity is measured using an assay capable of measuring ATP hydrolysis, ADP formation, glutamate utilization, or glutamine formation. 19. Método in vitro para inibir a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana, compreen- dendo contatar um polipeptídeo de GSI-β adenililada com uma composição compreendendo um composto de acordo com Fórmula 1: <formula>formula see original document page 209</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ido por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 209</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e XeY são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 209</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxii ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Formula IV: <formula>formula see original document page 210</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11éalquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 210</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; X e Y são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 210</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou19. In vitro method for inhibiting the phosphoryl transferase site activity of a bacterial adenylylated GSI-β polypeptide, comprising contacting an adenylated GSI-β polypeptide with a composition comprising a compound according to Formula 1: <formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 1 is chloro, amino, aminosubstituted, a nitrogen-linked heterocycle and amides thereof, or hydroxyl; R 2 is hydrogen, bromine, nitrous, nitro, amino, or aminosubstituted by alkyl or acyl; R 3 is amino, amino substituted by alkyl or aryl, or an N-linked heterocycle; R4 is hydrogen, SH or OH; or Formula II: <formula> formula see original document page 209 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydrogen, chlorine, hydroxyl, amino, a substituted amino or a nitrogen linked heterocycle; R4 is hydrogen, hydroxyl, or amino; R6 is hydrogen, alkyl or acyl; R 9 is hydrogen, alkyl, C-attached heterocycle or amino acid; and XeY are equivalent and are CH or N; or Formula III: <formula> formula see original document page 209 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydroxyl; R4 is hydroxy or amino; R6 is hydroxyl; R7 is substituted methyl; X and Y are N; or Formula IV: <formula> formula see original document page 210 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 11 is alkyl; R12 is aryl; or Formula V: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, R1 is hydrogen, R13 is aryl; R14 is aminosubstituted; X and Y are equivalent and are CH; or Formula VI: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 12 is substituted aryl; R13 is hydrogen; or 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.The method of claim 19, wherein the compound is selected from the numbered compounds 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91 , 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142. 21. Método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria com- preendendo um gene de GSI-β, o método compreendendo contatar a bacté- ria com uma composição compreendendo um composto de acordo com Fórmula I. <formula>formula see original document page 211</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ído por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e XeY são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 212</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 212</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 213</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; XeY são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 213</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou21. In vitro method for inhibiting growth of a bacterium comprising a GSI-β gene, the method comprising contacting the bacterium with a composition comprising a compound according to Formula I. <formula> formula see original document page 211 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 1 is chloro, amino, amino substituted, a nitrogen-linked heterocycle and amides thereof, or hydroxyl; R2 is hydrogen, bromine, nitrous, nitro, amino, or aminosubstituted by alkyl or acyl; R 3 is amino, amino substituted by alkyl or aryl, or an N-linked heterocycle; R4 is hydrogen, SH or OH; or Formula II: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 1 is hydrogen, chlorine, hydroxyl, amino, a substituted amino or a nitrogen-linked heterocycle R 4 is hydrogen, hydroxyl, or amino; R6 is hydrogen, alkyl or acyl; R 9 is hydrogen, alkyl, C-attached heterocycle or amino acid; and XeY are equivalent and are CH or N; or Formula III: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydroxyl; R4 is hydroxy or amino; R6 is hydroxyl; R7 is substituted methyl; X and Y are N; or Formula IV: <formula> formula see original document page 212 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R11 is alkyl; R12 is aryl; or Formula V: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, R1 is hydrogen, R13 is aryl; R14 is aminosubstituted; XeY are equivalents and are CH; or Formula VI: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 12 is substituted aryl; R13 is hydrogen; or 22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.The method according to claim 21, wherein the compound is selected from numbered compounds 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 45, 48, 53. , 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93 , 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142. 23. Método para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sinto- mas ou distúrbios associados a uma infecção bacteriana em um mamífero, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β, o método compreendendo administrar ao mamífero uma composi- ção compreendendo um composto de acordo com Fórmula I: <formula>formula see original document page 214</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ido por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 214</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e X e Y são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 214</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; XeY são N; ou ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 215</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, Fórmula IV: <formula>formula see original document page 215</formula> R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; X e Y são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 215</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou23. Method for treating, preventing, or ameliorating one or more symptoms or disorders associated with a bacterial infection in a mammal, wherein the bacterial infection is from a bacterium comprising a GSI-β gene, the method comprising administering to the mammal. a composition comprising a compound according to Formula I: <formula> formula see original document page 214 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is chloro, amino, aminosubstituted, a bonded heterocycle nitrogen and amides thereof, or hydroxyl; R 2 is hydrogen, bromine, nitrous, nitro, amino, or aminosubstituted by alkyl or acyl; R 3 is amino, amino substituted by alkyl or aryl, or an N-linked heterocycle; R4 is hydrogen, SH or OH; or Formula II: <formula> formula see original document page 214 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydrogen, chlorine, hydroxyl, amino, a substituted amino or a nitrogen-linked heterocycle; R4 is hydrogen, hydroxyl, or amino; R6 is hydrogen, alkyl or acyl; R 9 is hydrogen, alkyl, C-attached heterocycle or amino acid; and X and Y are equivalent and are CH or N; or Formula III: <formula> formula see original document page 214 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydroxyl; R4 is hydroxy or amino; R6 is hydroxyl; R7 is substituted methyl; X and Y are N; or or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 11 is alkyl; R12 is aryl; or Formula V: <formula> formula see original document page 215 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, Formula IV: <formula> formula see original document page 215 </formula> R1 is hydrogen, R13 is aryl ; R14 is aminosubstituted; X and Y are equivalent and are CH; or Formula VI: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 12 is substituted aryl; R13 is hydrogen; or 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.The method of claim 23, wherein the compound is selected from the numbered compounds 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91 , 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142. 25. Método in vivo para inibir a atividade do sítio de fosforil trans- ferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana, o método compreendendo administrar uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I: <formula>formula see original document page 216</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ído por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 216</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e X e Y são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 217</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 217</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 218</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; XeY são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 218</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou como descrito aqui para um mamífero sofrendo de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β.25. In vivo method for inhibiting the phosphoryl transfer site activity of a bacterial adenylylated Ι-β glutamine synthetase polypeptide, the method comprising administering a composition comprising a compound according to formula I: <formula> formula see original </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is chloro, amino, substituted amino, a nitrogen-linked heterocycle and amides thereof, or hydroxyl; R2 is hydrogen, bromine, nitrous, nitro, amino, or aminosubstituted by alkyl or acyl; R 3 is amino, amino substituted by alkyl or aryl, or an N-linked heterocycle; R4 is hydrogen, SH or OH; or Formula II: <formula> formula see original document page 216 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydrogen, chlorine, hydroxyl, amino, a substituted amino or a nitrogen-linked heterocycle; R4 is hydrogen, hydroxyl, or amino; R6 is hydrogen, alkyl or acyl; R 9 is hydrogen, alkyl, C-attached heterocycle or amino acid; and X and Y are equivalent and are CH or N; or Formula III: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydroxyl; R4 is hydroxy or amino; R6 is hydroxyl; R7 is substituted methyl; X and Y are N; or Formula IV: <formula> formula see original document page 217 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R11 is alkyl; R12 is aryl; or Formula V: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, R1 is hydrogen, R13 is aryl; R14 is aminosubstituted; XeY are equivalents and are CH; or Formula VI: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 12 is substituted aryl; R13 is hydrogen; or as described herein for a mammal suffering from a bacterial infection, wherein the bacterial infection is from a bacterium comprising a GSI-β gene. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -15 37, 39, 40, 42, 45,48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.The method of claim 25, wherein the compound is selected from the numbered compounds 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, 15 37, 39, 40, 42, 45.48. , 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142. 27. Método assistido por computador de projetar uma molécula de inibidor de teste que contém um ou mais motivos estruturais similares ao complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP ou a um intermediário de estado de tran- sição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifosfato, o método usando um computador programado compre- endendo um processador e um dispositivo de entrada, o método compreen- dendo: (a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glu- tamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana (GSI-β); (b) projetar a dita molécula de inibidor de teste que contém um ou mais motivos estruturais similares ao complexo de (Mn2+J3l(HCO3 )12ATP ou ao intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifosfato usando métodos as- sistidos por computador; (c) usar um protocolo de atracagem assistido por computador para determinar se ou não a molécula de inibidor de teste projetada inibiria uma atividade de fosforil transferase com base em carboxifosfato ou interagi- ria com um ou mais aminoácidos no polipeptídeo de GSI-β adenililada bacte- riana.27. Computer-aided method of designing a test inhibitor molecule containing one or more structural motifs similar to the (Mn2 +) 3. (HC03-) 12ATP complex or a transition intermediate of a reaction intermediate carboxyphosphate-based phosphoryl transfer method, the method using a programmed computer comprising a processor and an input device, the method comprising: (a) inputting to the input device a structure of a phosphoryl transferase site a bacterial adenylylated β-β glutamine synthetase (GSI-β) polypeptide; (b) designing said test inhibitor molecule that contains one or more structural motifs similar to the (Mn2 + J3l (HCO3) 12ATP) complex or the transition state intermediate of a carboxyphosphate-based phosphoryl transfer reaction intermediate (c) use a computer assisted docking protocol to determine whether or not the designed test inhibitor molecule would inhibit a carboxyphosphate-based phosphoryl transferase activity or would interact with one or more amino acids in the bacterial adenylylated GSI-β polypeptide. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que a intera- ção com o um ou mais aminoácidos é por meio de uma ou mais ligações de hidrogênio ou interações de van Der Waal com um ou mais aminoácidos no sítio ativo.The method of claim 27, wherein the interaction with one or more amino acids is by one or more hydrogen bonds or van der Waal interactions with one or more amino acids at the active site. 29. Método de acordo com a reivindicação 27, adicionalmente compreendendo avaliar a atividade inibidora da molécula de inibidor de teste projetada in vitro em um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana usan- do um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ÁDP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.A method according to claim 27, further comprising evaluating the inhibitory activity of the in vitro engineered test inhibitor molecule on a bacterial adenylylated GSI-β polypeptide using an assay capable of measuring ATP hydrolysis, APD formation, use of glutamate, or glutamine formation. 30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 29 inclusiva, em que a dita composição compreende um composto sele- cionado dos compostos 97, 105, 111, e 117.A method according to any one of claims 19 to 29 inclusive, wherein said composition comprises a selected compound of compounds 97, 105, 111, and 117. 31. Método de acordo com as reivindicações 21 ou 23, em que a bactéria compreendendo um gene de GSI-β é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escheri- chia coli, Salmoriella typhinurium, Salmoriella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Haemo- philus infiuenzae, Bordetella pertussis, Bordeila bronchiseptia, Neisseria me- ningitides, Brucella melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Aetinomyees israeiii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Ana- baena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor.The method of claims 21 or 23, wherein the bacterium comprising a GSI-β gene is selected from the group consisting of Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmoriella typhinurium, Salmoriella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Haemophilus infiuenzae, Bordetella pertussis, Bordeila bronchiseptia, Neisseria meeningitides, Brucella mypitheae, Leucideae myefereum, interrogans, Aetinomyees israeiii, Noeardia steroids, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabena sp., Fremyella diplosiphon, and Streptomyees eoelieolor. 32. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 23, em que a composição resulta em uma redução da atividade de um polipeptídeo de GSI-β desadenililada bacteriana em uma quantidade de cerca de 0 % a cer- ca de 30%.The method of claim 21 or 23, wherein the composition results in a reduction in activity of a bacterial deadenylated GSI-β polypeptide in an amount from about 0% to about 30%. 33. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 23, em que a bactéria compreendendo um gene de GSI-β é Myeobaeterium tubereulosis.The method of claim 21 or 23, wherein the bacterium comprising a GSI-β gene is Myeobaeterium tubereulosis. 34. Composição farmacêutica para o tratamento, prevenção ou melhora, em um mamífero, de uma infecção bacteriana de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β, a composição farmacêutica compreen- dendo um composto de acordo com Formula 1: <formula>formula see original document page 220</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ído por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 220</formula> <formula>formula see original document page 221</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- XeY são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 221</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; XeY são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 221</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 222</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; XeY são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 222</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.A pharmaceutical composition for treating, preventing or ameliorating, in a mammal, a bacterial infection of a bacterium comprising a GSI-β gene, the pharmaceutical composition comprising a compound according to Formula 1: <formula> formula see or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 1 is chlorine, amino, substituted amino, a nitrogen-linked heterocycle and amides thereof, or hydroxyl; R2 is hydrogen, bromine, nitrous, nitro, amino, or aminosubstituted by alkyl or acyl; R 3 is amino, amino substituted by alkyl or aryl, or an N-linked heterocycle; R4 is hydrogen, SH or OH; or Formula II: <formula> formula see original document page 220 </formula> <formula> formula see original document page 221 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydrogen, chlorine, hydroxyl amino, a substituted amino or a nitrogen-linked heterocycle; R4 is hydrogen, hydroxyl, or amino; R6 is hydrogen, alkyl or acyl; R 9 is hydrogen, alkyl, C-attached heterocycle or aminoacyl; and Y are equivalent and are CH or N; or Formula III: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydroxyl; R4 is hydroxy or amino; R6 is hydroxyl; R7 is substituted methyl; X and Y are N; or Formula IV: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R11 is alkyl; R12 is aryl; or Formula V: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, R1 is hydrogen, R13 is aryl; R14 is aminosubstituted; XeY are equivalents and are CH; or Formula VI: <formula> formula see original document page 222 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 12 is substituted aryl; R13 is hydrogen; or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. 35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 34, em que o composto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, -21, 23, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, -66, 67, 68, 69, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, -103, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, -142.The pharmaceutical composition of claim 34, wherein the compound is selected from the numbered compounds 5, 8, 17, 18, -21, 23, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 45, 48, 53. , 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, -66, 67, 68, 69, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, -103, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, -142. 36. Uso de um composto de acordo com Fórmula I: <formula>formula see original document page 223</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ido por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 223</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou arila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e X e Y são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 224</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 224</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 224</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; X e Y são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 225</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou para a fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção, ou melhora, em um mamífero, de uma infecção bacteriana de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β.Use of a compound according to Formula I: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 1 is chloro, amino, aminosubstituted, a heterocycle attached to nitrogen and amides thereof, or hydroxyl; R 2 is hydrogen, bromine, nitrous, nitro, amino, or aminosubstituted by alkyl or acyl; R 3 is amino, amino substituted by alkyl or aryl, or an N-linked heterocycle; R4 is hydrogen, SH or OH; or Formula II: <formula> formula see original document page 223 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydrogen, chlorine, hydroxyl, amino, a substituted amino or a nitrogen-linked heterocycle; R4 is hydrogen, hydroxyl, or amino; R6 is hydrogen, alkyl or aryl; R 9 is hydrogen, alkyl, C-attached heterocycle or amino acid; and X and Y are equivalent and are CH or N; or Formula III: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R1 is hydroxyl; R4 is hydroxy or amino; R6 is hydroxyl; R7 is substituted methyl; X and Y are N; or Formula IV: <formula> formula see original document page 224 </formula> or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R11 is alkyl; R12 is aryl; or Formula V: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, R1 is hydrogen, R13 is aryl; R14 is aminosubstituted; X and Y are equivalent and are CH; or Formula VI: or a pharmaceutically acceptable salt or derivative thereof, wherein: R 12 is substituted aryl; R13 is hydrogen; or for the manufacture of a medicament for treating, preventing, or ameliorating, in a mammal, a bacterial infection of a bacterium comprising a GSI-β gene.
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