BRPI0620187A2

BRPI0620187A2 - a method for the expansion of cd4 + helper t lymphocytes and / or tumor reactive cd8 + t lymphocytes, tumor reactive t lymphocytes, pharmaceutical composition, methods for treating an individual suffering from a disease of neoplastic origin and for performing tumor regression in a individual, use of tumor-reactive t-lymphocytes, and kit

Info

Publication number: BRPI0620187A2
Application number: BRPI0620187-3A
Authority: BR
Inventors: Ola Winqvist; Magnus Thoern
Original assignee: Sentoclone Ab
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2011-11-01
Also published as: CN101346463B; DE602006017435D1; ATE483470T1; NZ569105A; CN101346463A

Abstract

MéTODO PARA A EXPANSãO DE LINFóCITOS T AUXILIARES CD4+ E/OU L1NFóCITOS T CD8+ REATIVOS A TUMOR, LINFóCITO- T REATIVO A TUMOR, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODOS PARA TRATAR UM INDIVIDUO SOFRENDO DE UMA DOENçA DE ORIGEM NEOPLáSICA E PARA REALIZAR A REGRESSãO DE TUMOR EM UM INDIVìDUO, USO DE L1NFóCITOS-T REATIVOS A TUMOR, E, KIT A presente invenção descreve um método aperfeiçoado para 5expansão e ativação de linfócitos reativos a tumor, em particular linfócitos-T auxiliar CD4+ e/ou CD8+, que podem ser usados para tratar e/ou evitar 5câncer. O método fornece elevados números de linfócitos-T reativos a tumor dentro de um curto intervalo de tempo e a possibilidade de direcionar o desenvolvimento de linfócitos-T auxiliar CD4+ e/ou CD8+ para 5subpopulaçóes específicas. O método compreende uma primeira fase de 5linfócitos-T auxiliares CD4+ T e/ou CD8+ com antígeno derivado de tumor, junto com pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, para promover a sobrevivência de linfócitos-T auxiliar CD4+ T e/ou CD8+; e uma segunda fase de ativar e promover o crescimento de linfócitos-T auxiliares CD4+ T e/ou CD8+, em que a segunda fase é iniciada quando o marcador da superficie de célula CD25 (ou marcador IL-2R) é regulado negativamente em linfócitos-T auxiliar CD4+ T e/ou CD8+.METHOD FOR THE EXPANSION OF CD4 + AND / OR L1NPHOCYTES T CDT + AERIAL LYMPHOCYTES, REACTIVE TO TUMOR, TYPE REACTIVE LYMPHOCYTES, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHODS OF TREATING A SUBJECT TO UNDERSTANDING A SUBSTANTIAL UNDERSTANDING INDIVIDUAL, USE OF TUMOR-REACTIVE L1NFOCYTES, E, KIT The present invention describes an improved method for the expansion and activation of tumor-reactive lymphocytes, in particular CD4 + and / or CD8 + helper T-lymphocytes, which can be used to treat and / or avoid 5cancer. The method provides high numbers of tumor-reactive T-lymphocytes within a short time and the possibility of directing the development of CD4 + and / or CD8 + helper T-lymphocytes to 5 specific subpopulations. The method comprises a first phase of 5 CD4 + T and / or CD8 + helper T-lymphocytes with tumor-derived antigen, along with at least one substance having agonist activity towards the IL-2 receptor, to promote the survival of CD4 + T-helper lymphocytes. T and / or CD8 +; and a second phase of activating and promoting the growth of CD4 + T and / or CD8 + helper T-lymphocytes, in which the second phase is initiated when the CD25 cell surface marker (or IL-2R marker) is down-regulated on lymphocytes- Auxiliary T CD4 + T and / or CD8 +.

Description

"MÉTODO PARA A EXPANSÃO DE LINFÓCITOS T AUXILIARES CD4+ E/OU LINFÓCITOS T CD8+ REATIVOS A TUMOR, LINFÓCITO- T REATIVO A TUMOR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA TRATAR UM INDIVÍDUO SOFRENDO DE UMA DOENÇA DE ORIGEM NEOPLÁSICA E PARA REALIZAR A REGRESSÃO DE TUMOR EM UM INDIVÍDUO, USO DE LINFÓCITOS-T REATIVOS A TUMOR, E, KIT""METHOD FOR EXPANDING CD4 + AUXILIARY T LYMPHOCYTES AND / OR TUMOR REACTIVE LYMPHOCYTES, TUMOR REACTIVE LYMPHOCYTE, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHODS FOR TREATING A NON-DEFERRED TREATEN INDICATE IN ORDER AN INDIVIDUAL, USE OF TUMOR REACTIVE T-LYMPHOCYTES, AND, "KIT"

Campo da InvençãoField of the Invention

A invenção refere-se a um método aperfeiçoado para expansão e ativação de linfócitos reativos a tumor, em particular linfócitos-T auxiliar CD4+ e/ou CD8+. Os linfócitos-T não são linfócitos CD4+ CD25+Hi, isto é, a presente invenção não cobre linfócitos-T reguladores. Os linfócitos podem ser usados para tratar e/ou evitar câncer.The invention relates to an improved method for expansion and activation of tumor reactive lymphocytes, in particular CD4 + and / or CD8 + helper T-lymphocytes. T-lymphocytes are not CD4 + CD25 + Hi lymphocytes, that is, the present invention does not cover regulatory T lymphocytes. Lymphocytes can be used to treat and / or prevent cancer.

Fundamentos da InvençãoBackground of the Invention

De acordo com a hipótese de vigilância imune, o sistema imune é continuamente sensibilizado contra o desenvolvimento de tumores, em que a evidência experimental apóia fortemente esta noção. A identificação de antígenos de tumor específicos criou novas possibilidades para imunoterapia de tumor e muitas abordagens imunoterapêuticas estão agora sendo transladadas para dentro de experimentos clínicos. Entre estes, a transferência adotiva de linfócitos específicos de antígeno de tumor parece particularmente promissora. Estas tentativas têm, até agora, sido usualmente baseados em células mononucleares do sangue periférico ou linfócitos de infiltração de tumor (TIL), separados de espécimes de tumor recente. Nos experimentos recentes, o tratamento de pacientes com melanoma maligno com transferência autóloga de TILs expandidos, taxas de respostas objetivas de até 51% têm sido relatadas. As células TIL são poucas, elas são freqüentemente não-responsivas (anérgicas) devido a mecanismos imunossupressivos dos longos períodos de criação do tumor para que ocorram expansões (diversos meses). Além disso, os protocolos têm sido dirigidos à expansão das células T citotóxicas CD8+ e as células têm sido reintroduzidas nos pacientes pré-condicionadas com quimioterapia e, além disso, os pacientes têm sido tratados com altas doses de interleucina-2, para prover a sobrevivência das células T CD8+.According to the hypothesis of immune surveillance, the immune system is continually sensitized against tumor development, where experimental evidence strongly supports this notion. Identification of specific tumor antigens has created new possibilities for tumor immunotherapy and many immunotherapeutic approaches are now being translated into clinical trials. Among these, the adoptive transfer of tumor antigen-specific lymphocytes looks particularly promising. These attempts have so far usually been based on peripheral blood mononuclear cells or tumor infiltrating lymphocytes (TIL), separated from recent tumor specimens. In recent experiments, treatment of malignant melanoma patients with autologous transfer of expanded TILs, objective response rates of up to 51% have been reported. TIL cells are few, they are often unresponsive (anergic) due to immunosuppressive mechanisms of long periods of tumor creation for expansions to occur (several months). In addition, protocols have been directed to CD8 + cytotoxic T-cell expansion and cells have been reintroduced in preconditioned chemotherapy patients, and patients have been treated with high doses of interleukin-2 to provide survival. CD8 + T cells.

Descrição da invençãoDescription of the invention

Os presentes inventores mostraram anteriormente que a ativação das células T não afetadas pode ocorrer dentro do microambiente altamente especializado dos órgãos linfóides secundários, tais como o linfonodo sentinela. Em outras palavras, o nodo sentinela pode ser considerado como o sítio primário para o sistema imune encontrar antígenos tumorais.The present inventors have previously shown that activation of unaffected T cells can occur within the highly specialized microenvironment of secondary lymphoid organs, such as the sentinel lymph node. In other words, the sentinel node can be considered as the primary site for the immune system to find tumor antigens.

Os inventores verificaram anteriormente um método geral para expansão de linfócitos-T reativos a tumor dos linfonodos sentinela, mostrando que é possível cultivar linfócitos-T obtidos de linfonodos sentinela, a fim de obter-se uma cultura de linfócitos-T reativos a tumor. O linfócitos-T reativos a tumor podem ser usados para tratar câncer, pela administração de uma quantidade eficaz de linfócitos-T reativos a tumor no paciente de que os nodos sentinela foram removidos.The inventors have previously verified a general method for expansion of sentinel-lymph node tumor-reactive T-lymphocytes, showing that it is possible to grow T-lymphocytes obtained from sentinel lymph nodes in order to obtain a culture of tumor-reactive T-lymphocytes. Tumor-reactive T-lymphocytes can be used to treat cancer by administering an effective amount of tumor-reactive T-lymphocytes to the patient from whom the sentinel nodes have been removed.

O sucesso de um tratamento de câncer, compreendendo a administração de linfócitos-T reativos a tumor, é determinado por fatores tais como, p. ex., a quantidade de linfócitos-T reativos a tumor obtida após a etapa de expansão, isto é, a quantidade de linfócitos-T reativos a tumor disponível para infusão no paciente, o tempo requerido para obter-se uma quantidade eficaz de linfócitos-T reativos a tumor e a concentração e proporção de subpopulações de linfócitos-T reativos a tumor, obtidas pelo método de expansão.The success of a cancer treatment comprising the administration of tumor reactive T-lymphocytes is determined by factors such as e.g. eg, the amount of tumor-reactive T-lymphocytes obtained after the expansion step, ie the amount of tumor-reactive T-lymphocytes available for patient infusion, the time required to obtain an effective amount of tumor-lymphocytes. Tumor-reactive T and the concentration and proportion of tumor-reactive T-lymphocyte subpopulations obtained by the expansion method.

Portanto, a presente invenção descreve um método aperfeiçoado para expansão de linfócitos-T auxiliar CD4+ e/ou CD8+, em que condições de cultura específicas foram determinadas e otimizadas e em que marcadores específicos nos linfócitos T- e no meio de cultura são monitorados por toda a fase de expansão, a fim de obter-se elevados números de linfócitos-T reativos a tumor no mais curto possível intervalo de tempo.Therefore, the present invention describes an improved method for CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocyte expansion, wherein specific culture conditions have been determined and optimized and wherein specific markers on T-lymphocytes and culture medium are monitored throughout. the expansion phase in order to obtain high numbers of tumor reactive T-lymphocytes in the shortest possible time frame.

Além disso, a invenção ao mesmo tempo fornece um método para dirigir o desenvolvimento de linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ para subpopulações específicas. Os linfócitos-T não são linfócitos CD4+ CD25+Hi, isto é, a presente invenção não abrange os linfócitos-T reguladores.In addition, the invention at the same time provides a method for directing the development of CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes for specific subpopulations. T-lymphocytes are not CD4 + CD25 + Hi lymphocytes, that is, the present invention does not cover regulatory T-lymphocytes.

Os linfócitos T CD4+CD25Hi, expressando o fator de transcrição FoxP3, são considerados células T reguladoras (Treg). As Tregs têm a propriedade de regular as células auxiliares T e citotóxicas T, pela inibição da ativação e proliferação e, além disso, as Treg inibem a produção e liberação de citocinas Th1 úteis, tais como IFN-gama. Assim, o método apresentado aqui é desenvolvido a fim de promover a expansão das células auxiliares T e Das células T citotóxicas e evitar a expansão das células Treg.CD4 + CD25Hi T lymphocytes, expressing the FoxP3 transcription factor, are considered regulatory T cells (Treg). Tregs have the property of regulating T helper and cytotoxic T cells by inhibiting activation and proliferation, and furthermore Tregs inhibit the production and release of useful Th1 cytokines such as IFN-gamma. Thus, the method presented herein is designed to promote the expansion of T helper cells and cytotoxic T cells and to prevent the expansion of Treg cells.

Os linfócitos-T reativos a tumor, muitíssimo freqüentemente gerados pelo presente método, são linfócitos-T auxiliares CD4+. Um dos objetivos do presente método de expansão é, em alguns aspectos, imitar o trajeto natural do sistema imune do próprio paciente e em um certo grau deixar os componentes do sistema imune do paciente determinar se, em primeiro lugar, os linfócitos auxiliares CD4+ ou CD8+ são gerados, dependendo de se o antígeno é apresentado por MCHI ou MCHII. Na maioria dos casos, os antígenos serão apresentados pela molécula MCH classe II, resultando na geração de linfócitos-T auxiliares CD4+. Entretanto, em alguns casos, os linfócitos-T CD8+ são gerados. Se os linfócitos-T auxiliares CD4+ forem gerados, eles serão mais expandidos, como descrito aqui, entretanto, o método pode também ser usado para expandir células CD8+. Os inventores verificaram que um método de expansão, compreendendo duas diferentes fases, são especialmente úteis para obter-se um elevado número de linfócitos- T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ em um intervalo de tempo relativamente curto, as duas fases sendoTumor-reactive T-lymphocytes, most often generated by the present method, are CD4 + helper T-lymphocytes. One of the purposes of the present expansion method is in some respects to mimic the patient's own immune system's natural pathway and to some extent let the patient's immune system components determine whether the CD4 + or CD8 + helper lymphocytes are primarily are generated depending on whether the antigen is presented by MCHI or MCHII. In most cases, antigens will be presented by the MCH class II molecule, resulting in generation of CD4 + helper T-lymphocytes. However, in some cases, CD8 + T-lymphocytes are generated. If CD4 + helper T-lymphocytes are generated, they will be further expanded, as described here, however, the method can also be used to expand CD8 + cells. The inventors have found that an expansion method comprising two different phases is especially useful for obtaining a high number of CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes in a relatively short time span, both phases being

i) uma primeira fase de estimular os linfócitos-T reativos a tumor com antígeno derivado de tumor, junto com pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor TL-2, para promover a sobrevivência dos linfócitos-T reativos a tumor e(i) a first phase of stimulating tumor-reactive tumor antigen-T-lymphocytes, together with at least one substance having TL-2 receptor agonist activity, to promote survival of tumor-reactive T-lymphocytes;

ii) uma segunda fase de ativar e promover o crescimento de linfócitos-T reativos a tumor, em que a segunda fase ii) é iniciada quando o marcador de superfície de célula CD25 (marcador IL-2R) é regulado negativamente nos linfócitos-T.ii) a second phase of activating and promoting tumor-reactive T-lymphocyte growth, wherein the second phase ii) is initiated when the CD25 cell surface marker (IL-2R marker) is down-regulated on T-lymphocytes.

Este método de expansão pode também ser realizado utilizando-se monócitos isolados do paciente como células específicas de antígeno. Os monócitos serão administrados ao paciente quando diferenciadas em células dendríticas pelo uso de citocinas de maturação, tais como IL-4, GM_CSF e IL-3, seguido pela ativação das células dentríticas pela adição de agências estimuladoras do receptor semelhante a Toll, tais como lipopolissacarídeo. O uso de células dendríticas ativadas maduras como a população específica de antígeno pode promover e aumentar a expansão das células auxiliares T e células T citotóxicas T.This expansion method can also be performed using patient isolated monocytes as antigen specific cells. Monocytes will be administered to the patient when differentiated into dendritic cells by the use of maturation cytokines such as IL-4, GM_CSF and IL-3, followed by activation of dentritic cells by the addition of Toll-like receptor stimulating agencies such as lipopolysaccharide. . The use of mature activated dendritic cells as antigen specific population can promote and increase the expansion of T helper cells and cytotoxic T cells.

DefiniçõesDefinitions

Pela expressão "linfócitos-T reativos a tumor" pretende-se significar linfócitos-T contendo um receptor de célula T específico para e reconhecendo um antígeno de tumor.By the term "tumor reactive T lymphocytes" is meant T lymphocytes containing a specific T cell receptor for and recognizing a tumor antigen.

Pela expressão "células auxiliares T" pretende-se significar linfócitos-T que promovem respostas imune adaptativas, quando ativadas.By the term "T helper cells" is meant T-lymphocytes that promote adaptive immune responses when activated.

Pela expressão "células Th" pretende-se significar células auxiliares T, que promovem as respostas imune mediadas por célula quando ativadas, utilizando-se citocinas tais como IFN-gama.By the term "Th cells" is meant T helper cells, which promote cell-mediated immune responses when activated, using cytokines such as IFN-gamma.

Pela expressão "células Th2" pretende-se significar células auxiliares T promovendo respostas imunes humorais quando ativadas, utilizando-se citocinas tais como IL-4.By the term "Th2 cells" is meant T helper cells promoting humoral immune responses when activated using cytokines such as IL-4.

Pela expressão "linfócitos-T auxiliares CD4+" pretende-se significar linfócitos-T que expressam CD4, porém não o fator de transcrição FoxP3.By the term "CD4 + helper T lymphocytes" is meant CD4-expressing T lymphocytes, but not the FoxP3 transcription factor.

Pela expressão "linfócitos-T CD8+" pretende-se significar linfócitos-T que expressam CD8.By the term "CD8 + T lymphocytes" is meant CD8-expressing T lymphocytes.

Pela expressão "linfócito-T regulador" pretende-se significar linfócitos-T que suprimem as respostas imunes adaptativas, expressando o fator de transcrição FoxP3.By the term "regulatory T lymphocyte" is meant T lymphocytes that suppress adaptive immune responses by expressing the transcription factor FoxP3.

Pela expressão "ativação específica" de linfócitos-T pretende- se significar ativação específica de antígeno e mediada por receptor de célula- T restringida por MHC. Ao contrário, a expressão "ativação inespecífica" de linfócitos-T é destinada a significar uma ativação geral de todas as células-T, independente da especificidade do receptor de célula-T.By the term "specific activation" of T-lymphocytes is meant MHC-restricted T cell receptor-mediated antigen-specific activation. In contrast, the term "non-specific activation" of T-lymphocytes is intended to mean general activation of all T-cells, regardless of T-cell receptor specificity.

A expressão "antígeno derivado de tumor" pretende cobrir células tumorais, um homogeneizado de um tumor, homogeneizado este podendo ser desnaturado, ou proteínas de tumor, polipeptídeos ou peptídeos, p. ex., na forma de proteína, polipeptídeo ou peptídeo purificado, natural, sintético e/ou recombinante. O antígeno derivado de tumor pode ser moléculas intactas, seus fragmentos ou multímeros ou agregados de moléculas intactas e/ou fragmentos. Exemplos de polipeptídeos e peptídeos adequados são aqueles que compreendem de cerca de 5 a cerca de 30 aminoácidos, tais como, p. ex., de cerca de 10 a 25 aminoácidos, de cerca de 10 a 20 aminoácidos ou de cerca de 12 a 18 aminoácidos. Se forem usados peptídeos, uma concentração molar na cultura de cerca de 0,1 a cerca de 5,0 μΜ, tal como, p. ex., de cerca de 0,1 a cerca de 4,0 μΜ, de cerca de 0,2 a cerca de 3,0 μΜ, de cerca de 0,3 a cerca de 2,0 μm ou de cerca de 0,3 a cerca de 1,0 μΜ, pode ser usada. O antígeno derivado de tumor pode ser autólogo ou heterólogo, isto é, originar-se do paciente a ser tratado ou ser obtido de outro indivíduo sofrendo de câncer. Nos presentes Exemplos, os inventores utilizam um extrato de tumor desnaturado autólogo. Entretanto, como mencionado acima, outras fontes do antígeno derivado de tumor podem também ser exeqüíveis para uso em um método de acordo com a presente invenção.The term "tumor-derived antigen" is intended to cover tumor cells, a homogenate of a tumor, which may be denatured, or tumor proteins, polypeptides or peptides, e.g. e.g., in the form of purified natural, synthetic and / or recombinant protein, polypeptide or peptide. The tumor derived antigen may be intact molecules, fragments or multimers thereof or aggregates of intact molecules and / or fragments. Examples of suitable polypeptides and peptides are those comprising from about 5 to about 30 amino acids, such as, e.g. e.g., from about 10 to 25 amino acids, from about 10 to 20 amino acids, or from about 12 to 18 amino acids. If peptides are used, a molar concentration in the culture of from about 0.1 to about 5.0 μΜ, such as, e.g. eg about 0.1 to about 4.0 μΜ, about 0.2 to about 3.0 μΜ, about 0.3 to about 2.0 μm or about 0, 3 to about 1.0 μΜ, can be used. The tumor-derived antigen may be autologous or heterologous, that is, originate from the patient being treated or obtained from another individual suffering from cancer. In the present Examples, the inventors use an autologous denatured tumor extract. However, as mentioned above, other sources of tumor derived antigen may also be feasible for use in a method according to the present invention.

Pela expressão "dia 1 da primeira fase" ou, p. ex., "dia 5 da segunda fase" é para ser entendido o seguinte: O dia em que os linfócitos são colhidos é indicado dia O (zero). O dia 1 da primeira fase é definido como o dia em que a expansão é iniciada pela adição de pelo menos uma substância tendo atividade agonista com respeito ao receptor IL-2 e pode ser antígeno de meio de cultura e/ou derivado de tumor. A fase de expansão i) pode ser iniciada no dia O (zero) ou até 2 dias após colheita do dos linfócitos. O dia em que a segunda fase é iniciada pela adição de antígeno derivado de tumor é por todo o texto descrito como "dia 1 da segunda fase".By the expression "day 1 of the first phase" or, e.g. eg, "day 5 of the second phase" is to be understood as follows: The day on which lymphocytes are harvested is indicated day O (zero). Day 1 of the first phase is defined as the day on which expansion is initiated by the addition of at least one substance having agonist activity with respect to the IL-2 receptor and may be culture medium and / or tumor-derived antigen. Expansion phase i) may be initiated on day O (zero) or up to 2 days after lymphocyte collection. The day the second phase is initiated by the addition of tumor-derived antigen is throughout the text described as "second phase day 1".

A expressão "linfonodo sentinela" é destinada a significar o(s) primeiro(s) linfonodo(s) a receber drenagem linfática de um tumor. A expressão "linfonodo metinela" refere-se ao(s) primeiro(s) linfonodo(s) a receber drenagem linfática de uma metástase. Fase i)The term "sentinel lymph node" is intended to mean the first lymph node (s) to receive lymphatic drainage of a tumor. The term "metinella lymph node" refers to the first lymph node (s) to receive lymphatic drainage from a metastasis. Phase i)

A finalidade da primeira fase i) é obter uma cultura compreendendo uma proporção substancialmente elevada de linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+. A primeira fase é para ser considerada uma "fase de enfermagem", em que os linfócitos-T reativos a tumor são trazidos para sobreviver e dividirem-se. Dependendo da fonte dos linfócitos-T (material de partida para o método de expansão in vitró), eles podem ter condições faseadas relativamente severas, tais como, p. ex., supressão e inibição por fatores secretados pelas células de câncer.The purpose of the first step i) is to obtain a culture comprising a substantially high proportion of CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes. The first phase is to be considered a "nursing phase" in which tumor-reactive T-lymphocytes are brought in to survive and divide. Depending on the source of T-lymphocytes (starting material for the in vitro expansion method) they may have relatively severe staged conditions such as e.g. eg, suppression and inhibition by factors secreted by cancer cells.

O material de partida para uso no método de expansão de acordo com a presente invenção pode ser uma mistura de linfócitos obtida dos linfonodos drenarem um tumor primário e/ou uma metástase, tal como um linfonodo sentinela ou metinela. Estes podem ser identificados durante a cirurgia, p. ex., por injeção de um localizador de linfonodo, tal como, p. ex., uma substância traçadora, em torno ou dentro do tumor ou metástase. O localizador de linfonodo, tal como, p. ex., o traçador, é transportado nos capilares da linfa e acumula-se no(s) nodo(s) sentinela/metinela, assim identificando o(s) linfonodo(s) de drenagem de tumor ou metástase. Os inventores mostraram recentemente que o(s) primeiro(s) linfonodo(s) a receberem drenagem de um tumor são uma fonte rica potencial de linfócitos- T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ para expansão in vitro, visto que tais nodos podem conter uma quantidade substancial de linfócitos-T, que foram sensibilizados em relação aos antígenos de tumor e sofreram expansão in vivo nos linfonodos.The starting material for use in the expansion method according to the present invention may be a lymphocyte mixture obtained from the lymph nodes draining a primary tumor and / or metastasis such as a sentinel or metinel lymph node. These can be identified during surgery, e.g. by injection of a lymph node locator such as e.g. eg, a tracing substance, around or within the tumor or metastasis. The lymph node locator, such as e.g. eg, the tracer is transported in the lymph capillaries and accumulates in the sentinel / metinelle node (s), thus identifying the tumor drainage or metastasis lymph node (s). The inventors have recently shown that the first lymph node (s) to receive tumor drainage are a rich potential source of CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes for in vitro expansion, as such nodes may contain a substantial amount of T-lymphocytes, which were sensitized to tumor antigens and expanded in vivo in the lymph nodes.

Uma fonte alternativa de linfócitos-T auxiliares CD4+e/ou CD8+ pode ser o sangue de um indivíduo sofrendo de câncer, tal como, p. ex., sangue periférico. O indivíduo pode ser um paciente não tratado, que tenha tido a doença por um longo tempo ou um paciente já tratado, de onde os linfócitos-T periféricos sensibilizados em relação a um tumor podem ser obtidos. Outras fontes adequadas de linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ incluem medula óssea, tecido de baço, e tumores.An alternative source of CD4 + and / or CD8 + helper T-lymphocytes may be the blood of an individual suffering from cancer, such as e.g. eg peripheral blood. The subject may be an untreated patient who has had the disease for a long time or an already treated patient from which peripheral tumor-sensitized T-lymphocytes can be obtained. Other suitable sources of CD4 + and / or CD8 + helper T-lymphocytes include bone marrow, spleen tissue, and tumors.

Entretanto, em uma forma de realização preferida da invenção, o material de partida é obtido de linfonodos sentinela ou metinela.However, in a preferred embodiment of the invention, the starting material is obtained from sentinel or metinel lymph nodes.

Os linfócitos-T a serem expandidos em cultura podem ser obtidos do indivíduo a ser tratado, isto é, os linfócitos-T reativos a tumor específicos resultantes para administração podem ser autólogos. Entretanto, os linfócitos-T podem também ser obtidos de uma fonte que não o indivíduo a ser tratado, tal como, p. ex., outro indivíduo sofrendo de um câncer. Em tal caso, o receptor e os linfócitos-T reativos a tumor expandidos são preferivelmente imunologicamente compatíveis (ou o receptor é, de outro modo, tornado imuno-tolerante aos linfócitos-T reativos a tumor expandido).T lymphocytes to be expanded in culture may be obtained from the subject to be treated, that is, the resulting specific tumor reactive T lymphocytes for administration may be autologous. However, T-lymphocytes may also be obtained from a source other than the individual to be treated, such as e.g. eg, another individual suffering from cancer. In such a case, the receptor and expanded tumor-reactive T-lymphocytes are preferably immunologically compatible (or the receptor is otherwise rendered immune-tolerant to expanded tumor-reactive T-lymphocytes).

Dependendo da fonte do material de partida, ele compreenderá uma mistura de vários linfócitos, tais como, p. ex., linfócitos-T, linfócitos-B, células de apresentação de antígeno, linfócitos-T reativos a tumor e linfócitos- T não-ativados/não-reativos. A fim de promover sobrevivência especificamente dos linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ reativos a tumor, antígeno derivado de tumor e uma ou mais substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 são adicionados.Depending on the source of the starting material, it will comprise a mixture of various lymphocytes, such as e.g. T-lymphocytes, B-lymphocytes, antigen presenting cells, tumor-reactive T-lymphocytes, and non-activated / non-reactive T lymphocytes. In order to specifically promote survival of tumor-reactive CD4 + and / or CD8 + helper T-lymphocytes, tumor-derived antigen and one or more substances having IL-2 receptor agonist activity are added.

Como mencionado acima, a primeira fase i) é iniciada adicionando-se pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2. A função de tais substâncias é estimular os linfócitos-T via o receptor IL-2, para promover a divisão celular dos linfócitos-T, desse modo evitando a morte celular.As mentioned above, the first phase i) is initiated by adding at least one substance having IL-2 receptor agonist activity. The function of such substances is to stimulate T lymphocytes via the IL-2 receptor to promote cell division of T lymphocytes, thereby preventing cell death.

A ativação restringida de MHC específica de antígeno dos linfócitos-T promove a expansão clonal da população de linfócito-T útil, específica para o reconhecimento das células tumorais. Ao contrário, a ativação não-específica dos linfócitos-T resultará na expansão dos clones do linfócito T reconhecendo os peptídeos irrelevantes sem qualquer relação com o reconhecimento das células tumorais, assim a maioria dos linfócitos-T inespecificamente expandidos não reconhecendo o tumor.Restricted activation of T-lymphocyte antigen-specific MHC promotes clonal expansion of the useful T-lymphocyte population specific for tumor cell recognition. In contrast, nonspecific activation of T lymphocytes will result in the expansion of T lymphocyte clones recognizing irrelevant peptides unrelated to tumor cell recognition, so most nonspecifically expanded T lymphocytes do not recognize the tumor.

A invenção objetiva promover a ativação específica e crescimento dos linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ reativos a tumor. Uma ativação específica contra um certo antígeno de tumor possibilita os linfócitos-T terem efeito terapêutico quando administrados a um paciente com câncer com o mesmo tipo de tumor contra o qual os linfócitos-T são ativados.The invention aims to promote specific activation and growth of tumor reactive CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes. Specific activation against a certain tumor antigen enables T lymphocytes to have a therapeutic effect when administered to a cancer patient with the same type of tumor against which T lymphocytes are activated.

A administração de linfócitos-T inespecificamente ativados teria nenhuma ou muito pequena probabilidade de ter efeito terapêutico contra qualquer câncer, devido ao pequeno número de linfócitos-T pertinentes a tumor.Administration of nonspecifically activated T-lymphocytes would have no or very little likelihood of therapeutic effect against any cancer due to the small number of tumor-relevant T-lymphocytes.

Em uma forma de realização da invenção, as substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 são agonistas. Exemplos de tais substâncias incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, anticorpos, aficorpos e seus fragmentos, proteínas de fusão, moléculas sintéticas e/ou orgânicas, tais como, p. ex., moléculas pequenas e ligandos naturais. Em uma forma de realização preferida, a substância é o ligando natural do receptor EL- 2, isto é IL-2.In one embodiment of the invention, substances having IL-2 receptor agonist activity are agonists. Examples of such substances include proteins, polypeptides, peptides, antibodies, antibodies and fragments thereof, fusion proteins, synthetic and / or organic molecules, such as e.g. eg small molecules and natural ligands. In a preferred embodiment, the substance is the natural EL-2 receptor ligand, that is IL-2.

Se IL-2 for usado, ele é preferivelmente adicionado em uma baixa dose, a fim de reduzir a apoptose linfócita e aumentar a população de linfócitos-T reativos a tumor auxiliares positivos CD4. Em uma forma de realização específica da invenção, a baixa dose de IL-2 é de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 700 IU/ml de meio de cultura, tal como, p. ex., de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 600 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 500 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 400 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 300 IU/ml de meio de cultura e de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 2000 IU/ml de meio de cultura. Em uma forma de realização específica, a quantidade de IL-2 adicionada é de 250 IU/ml.If IL-2 is used, it is preferably added at a low dose to reduce lymphocyte apoptosis and increase the population of CD4 positive helper tumor-reactive T lymphocytes. In a specific embodiment of the invention, the low dose IL-2 is about 100 IU / ml culture medium to about 700 IU / ml culture medium, such as e.g. from about 100 IU / ml of culture medium to about 600 IU / ml of culture medium, from about 100 IU / ml of culture medium to about 500 IU / ml of culture medium. about 100 IU / ml of culture medium to about 400 IU / ml of culture medium, about 100 IU / ml of culture medium to about 300 IU / ml of culture medium and about 100 IU / ml culture medium to about 2000 IU / ml culture medium. In a specific embodiment, the amount of IL-2 added is 250 IU / ml.

No caso de outras substâncias, que não IL-2, tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 serem usadas, as doses específicas destas devem ser de modo a resultar em um efeito correspondendo ao efeito obtido pelas doses acima mencionadas de IL-2.In the case of substances other than IL-2 having IL-2 receptor agonist activity being used, the specific doses of these should be such as to result in an effect corresponding to the effect obtained by the above-mentioned doses of IL-2. .

Uma outra quantidade da pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 pode ser adicionada regularmente por toda a fase i), tal como, p. ex., cada 2°., 3o. ou 4o. dia da fase i), a fim de manter as condições ótimas para promover a divisão celular. Pela expressão cada 2o., 3o. ou 4o. pretende-se significar que pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 é adicionada por toda a fase i) cada 2o., 3o. ou 4o. dia, começando no 2o., 3o. ou 4o. dia após a primeira adição da pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, isto é, após iniciar a fase i).Another amount of the at least one substance having IL-2 receptor agonist activity may be added regularly throughout step i), such as e.g. eg every 2nd, 3rd. or 4th. phase i) in order to maintain optimal conditions for promoting cell division. By the expression every 2nd, 3rd. or 4th. It is meant that at least one substance having IL-2 receptor agonist activity is added throughout step i) every 20th. or 4th. day, starting on the 2nd, 3rd. or 4th. day after the first addition of at least one substance having IL-2 receptor agonist activity, ie after initiating phase i).

Em uma forma de realização, a substância a ser adicionada regularmente por toda a fase i) é um agonista de IL-2. Em uma forma de realização preferida, a substância é IL-2.In one embodiment, the substance to be added regularly throughout step i) is an IL-2 agonist. In a preferred embodiment, the substance is IL-2.

A outra dose de substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, tal como, p. ex., IL-2, a ser adicionada regularmente, tal como, p. ex., cada 2o., 3o. ou 4o. dia situa-se dentro das faixas mencionadas acima.The other dose of substances having IL-2 receptor agonist activity, such as e.g. IL-2, to be added regularly, such as e.g. eg every 2nd, 3rd. or 4th. day is within the ranges mentioned above.

Uma outra etapa importante da primeira fase i) de expansão é a adição de antígeno derivado de tumor, a fim de promover a divisão celular dos linfócitos-T expressão os receptores de linfócito T reconhecendo antígenos tumorais, isto é, linfócitos-T reativos a tumor.Another important step of the first expansion phase i) is the addition of tumor-derived antigen in order to promote T-lymphocyte cell division expression T-lymphocyte receptors recognizing tumor antigens, ie tumor-reactive T-lymphocytes .

O ponto ótimo de tempo para adicionar o antígeno de tumor é dependente da fonte dos linfócitos. Quando os linfócitos originam-se dos linfonodos, tais como, p. ex., linfonodos sentinela, ou de tumores, os linfócitos podem ter sido submetidos a estreita proximidade e supressão imuno pelas células tumorais e precisam de incubação com uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, tal como, p. ex., IL-2, por alguns dias, a fim de promover a capacidade dos linfócitos-T responderem com proliferação na apresentação de antígeno tumoral. Por conseguinte, em tal caso, o antígeno derivado de tumor é preferencialmente adicionado do dia 2 ao dia 5 inclusive da primeira fase i), tal como, por exemplo, no dia 2, no dia 3, no dia 4 ou no dia 5.The optimal time point for adding tumor antigen is dependent on the lymphocyte source. When lymphocytes originate from lymph nodes, such as e.g. sentinel or tumor lymph nodes, the lymphocytes may have been subjected to close proximity and immune suppression by the tumor cells and need incubation with a substance having agonist activity towards the IL-2 receptor, such as e.g. IL-2, for a few days, to promote the ability of T-lymphocytes to respond with proliferation in tumor antigen presentation. Therefore, in such a case, the tumor-derived antigen is preferably added from day 2 to day 5 inclusive of the first phase i), such as, for example, day 2, day 3, day 4 or day 5.

Se os linfócitos originarem-se do sangue, o antígeno derivado de tumor podem ser adicionados já quando a primeira fase i) é iniciada, isto é, junto com a substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, visto que os linfócitos-T não foram submetidos à imuno-supressão mencionada acima pelas células tumorais. Portanto, quando sangue é usado, o antígeno derivado de tumor é adicionado essencialmente ao mesmo tempo como quando a fase i) é iniciada ou no máximo até 2 dias a seguir.If the lymphocytes originate from the blood, the tumor-derived antigen may be added as early as stage i) is initiated, that is, together with the substance having IL-2 receptor agonist activity, as the lymphocytes- T were not subjected to the immunosuppression mentioned above by the tumor cells. Therefore, when blood is used, tumor-derived antigen is added at essentially the same time as when phase i) is started or up to 2 days thereafter.

O antígeno derivado de tumor, tal como, p. ex., um homogeneizado tumoral, é provável ser endocitosado e processado pelas células apresentando antígeno, presentes no material de partida, tal como, p. ex., linfócitos-B, células dendríticas e macrófagos. Na maioria dos casos, o antígeno derivado de tumor será apresentado pelas moléculas MCH classe II, resultando em divisão celular dos linfócitos-T reativos a tumor auxiliares CD4+. Entretanto, por apresentação cruzada os antígenos absorvidos pela endocitose podem ser processados e apresentados na bolsa classe I, resultando na ativação dos linfócitos-T CD8+. Como citado acima, um dos objetivos do método de expansão é, em alguns aspectos, imitar o trajeto natural do próprio sistema imune dos pacientes e, em um certo grau, permitir que os componentes do sistema imune dos pacientes determinem se os linfócitos CD4+ ou CD8+ são gerados, dependendo de se o antígeno é apresentado por MCHI ou MCHII. Na maioria dos casos, os antígenos serão apresentados pela molécula MCH classe II, resultando na geração de linfócitos-T CD4+; entretanto, em alguns casos, os linfócitos-T CD8+ são gerados. Fase ii)Tumor-derived antigen, such as e.g. eg, a tumor homogenate, is likely to be endocytosed and processed by antigen presenting cells present in the starting material such as e.g. B-lymphocytes, dendritic cells and macrophages. In most cases, tumor-derived antigen will be presented by MCH class II molecules, resulting in cell division of CD4 + helper-tumor-reactive T-lymphocytes. However, by cross-presentation endocytosis-absorbed antigens can be processed and presented in the class I pouch, resulting in activation of CD8 + T-lymphocytes. As noted above, one of the objectives of the expansion method is in some respects to mimic the natural pathway of patients 'own immune systems and, to some degree, allow patients' immune system components to determine whether CD4 + or CD8 + lymphocytes are generated depending on whether the antigen is presented by MCHI or MCHII. In most cases, antigens will be presented by the MCH class II molecule, resulting in the generation of CD4 + T-lymphocytes; however, in some cases, CD8 + T-lymphocytes are generated. Phase ii)

A finalidade da segunda fase ii) é ativar e expandir os linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+, obtidos pela fase i) e obter-se uma sub-população específica de linfócitos-T auxiliares CD4+ e/ou CD8+ direcionando-os para dentro de um trajeto desejado.The purpose of the second phase ii) is to activate and expand the CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes obtained by phase i) and obtain a specific subpopulation of the CD4 + and / or CD8 + helper T lymphocytes by directing them to within a desired path.

A presente invenção verificou que uma maneira de determinar o ponto ótimo do tempo pra iniciar a fase ii) é monitorando-se a expressão do marcador de superfície da célula CD25 nos linfócitos-T, a fim de determinar especificamente quando os linfócitos-T estão susceptíveis a re-estímulo. Os presentes inventores verificaram que a segunda fase ii) deve preferivelmente ser iniciada quando a expressão de CD25 nos linfócitos-T é regulada descendentemente. CD25 é um marcador de ativação, indicando que os linfócitos receberam um sinal de ativação. Se a segunda fase for iniciada quando a expressão de CD25 nos linfócitos-T for elevada, significando que os linfócitos já receberam um sinal, a morte celular ocorreria.The present invention has found that one way of determining the optimal time point for initiating phase ii) is by monitoring the expression of the CD25 cell surface marker in T lymphocytes to specifically determine when T lymphocytes are susceptible. the re-stimulus. The present inventors have found that second step ii) should preferably be initiated when T-lymphocyte CD25 expression is down-regulated. CD25 is an activation marker indicating that lymphocytes have received an activation signal. If the second phase is initiated when CD25 expression in T-lymphocytes is elevated, meaning that lymphocytes have already received a signal, cell death would occur.

A regulação negativa de CD25 é definida como aquela que uma parte substancial da população de linfócitos-T expressa muito poucos ou essencialmente nenhum marcador CD25. Em uma forma de realização preferida, a regulação negativa de CD25 é definida como aquela que menos do que 5% da população de linfócitos-T expressa CD25, isto é, 95% ou mais dos linfócitos-T na cultura não expressam CD25 em absoluto. Os 5% ou menos dos linfócitos-T expressando CD25 são muitíssimo provavelmente linfócitos-T CD4+ reguladores, que têm uma expressão permanente elevada de CD25. Além disso, a população de linfócitos-T deve preferivelmente expressar muito poucos ou essencialmente nenhum marcador Foxp3, que são marcadores específicos dos linfócitos-T reguladores. Em uma forma de realização preferida, a regulação negativa de Foxp3 é definida como aquela que menos do que 5% da população de linfócitos-T expressa Foxp3, isto é, 95% ou mais dos linfócitos-T da cultura não expressam Foxp3 em absoluto.CD25 down-regulation is defined as that a substantial part of the T-lymphocyte population expresses very few or essentially no CD25 markers. In a preferred embodiment, down-regulation of CD25 is defined as less than 5% of the T-lymphocyte population expressing CD25, that is, 95% or more of the T-lymphocytes in culture do not express CD25 at all. The 5% or less of CD25-expressing T-lymphocytes are most likely regulatory CD4 + T-lymphocytes, which have a high permanent expression of CD25. In addition, the T-lymphocyte population should preferably express very few or essentially no Foxp3 markers, which are regulatory T-lymphocyte specific markers. In a preferred embodiment, downregulation of Foxp3 is defined as less than 5% of the T-lymphocyte population expressing Foxp3, that is, 95% or more of the culture T-lymphocytes do not express Foxp3 at all.

Além de CD25, há também outros marcadores, cuja expressão é pertinente ao monitor, a fim de determinar o ponto ótimo do tempo para iniciar a segunda fase. Exemplos de tais marcadores são o marcador de ativação prematura CD69 e MCHII, que é um marcador de ativação para os linfócitos-T. Quando a expressão de CD69 e MCHII indicar que o "programa de ativação" dos linfócitos-T já está ligado, significando que as células não são capazes de responder a estímulos adicionais, ambos estes marcadores devem preferivelmente ser regulados negativamente antes da segunda fase ser iniciada. O termo regulação negativa pode ser definido como que menos do que 5-10% da população de linfócitos-T expressam CD69 e/ou MCHII.In addition to CD25, there are also other markers, the expression of which is pertinent to the monitor, in order to determine the optimal point of time to start the second phase. Examples of such markers are the CD69 and MCHII premature activation marker, which is an activation marker for T-lymphocytes. When the expression of CD69 and MCHII indicates that the T-lymphocyte "activation program" is already bound, meaning that the cells are unable to respond to additional stimuli, both of these markers should preferably be down-regulated before the second phase is initiated. . The term down-regulation may be defined as less than 5-10% of the T-lymphocyte population expressing CD69 and / or MCHII.

Em outra forma de realização da presente invenção, os anticorpos anti-CD4 são usados para separar as células auxiliares T de possíveis células tumorais da cultura na expansão da fase ii) do método de expansão.In another embodiment of the present invention, anti-CD4 antibodies are used to separate T helper cells from possible culture tumor cells in the expansion of step ii) of the expansion method.

Em uma outra forma de realização da presente invenção, produtos tais como Dynabeads® com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 são usados para promover a expansão da fase ii) do método de expansão. O uso de Dynabeads® CD3/CD28 fornecerá linfócitos com sinais de ativação e poderia também ser para separação de possíveis células tumorais da cultura. Dynabeads® CD3/CD28 ligar-se-á ao antígeno expandido por linfócitos-T, especificamente durante a fase i), em que estas células agora podem ser enriquecidas magneticamente. Uma vez que a ativação específica de antígeno inicial foi iniciada e resultou em expansão de linfócitos-T clonais, a reestimulação por Dynabeads® CD3/CD28 promovera mais a expansao clonal, uma vez que a fase i) não suporta ativação de clones de linfócitos-T não-específicos.In another embodiment of the present invention, products such as Dynabeads® with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies are used to promote the expansion of step ii) of the expansion method. The use of Dynabeads® CD3 / CD28 will provide lymphocytes with activation signals and could also be for separation of possible tumor cells from the culture. Dynabeads® CD3 / CD28 will bind to T-lymphocyte-expanded antigen, specifically during phase i), where these cells can now be magnetically enriched. Since initial antigen-specific activation was initiated and resulted in clonal T-lymphocyte expansion, Dynabeads® CD3 / CD28 restimulation will further promote clonal expansion since phase i) does not support activation of lymphocyte-lymphocyte clones. Non-specific tees.

Mesmo embora o exato ponto de partida da fase ii) varie dependendo de quando os linfócitos adquiriram a expressão preferida de marcadores específicos, a segunda fase ii) é muitíssimo freqüentemente iniciada do dia 17 ao e incluindo dia 23 da primeira fase i), tal como, p. ex., no dia 17, no dia 18, no dia 19, no dia 20, no dia 21 ou no dia 22 ou no dia 23. Em outras palavras, o ponto do tempo, em que os linfócitos expressam a quantidade e combinação preferidas de marcadores, é muito freqüentemente vista como sendo do dia 17 ao dia 23 da primeira fase i).Even though the exact starting point of phase ii) varies depending on when lymphocytes acquired the preferred expression of specific markers, the second phase ii) is most often initiated from day 17 to and including day 23 of first phase i), as , P. e.g., the 17th, the 18th, the 19th, the 20th, the 21st or the 22th or the 23rd. In other words, the point of time at which lymphocytes express the preferred amount and combination of markers is most often viewed as being from day 17 to day 23 of the first phase i).

A expansão dos linfócitos-T, isto é fase i) e II), ocorrerá com muitíssima freqüência em um meio de cultura adequado. Preferivelmente, um meio livre de soro ou soro autólogo é usado a fim de evitar-se o risco de transmitir doenças para o paciente. Exemplos de meios padrão adequados incluem meio AIMV, RPMI 1640, DMEM e MEM. Entretanto, outros meios podem também ser usados, compreendendo uma mistura adequada de aminoácidos, esteróides, vitaminas, fatores de crescimento, citocinas e minerais.T-lymphocyte expansion, ie phase i) and II), will occur very often in a suitable culture medium. Preferably, a serum free medium or autologous serum is used in order to avoid the risk of transmitting disease to the patient. Examples of suitable standard media include AIMV, RPMI 1640, DMEM, and MEM media. However, other means may also be used, comprising a suitable mixture of amino acids, steroids, vitamins, growth factors, cytokines and minerals.

Durante as duas fases da expansão, as células podem ser divididas em diversos vasos de cultura, a fim de manter uma densidade celular adequada nas culturas. A densidade dos linfócitos T nas fases de expansão deve preferivelmente ser de cerca de 3 a cerca de 6 milhões de células/ml de meio de cultura.During the two expansion phases, cells can be divided into several culture vessels in order to maintain adequate cell density in the cultures. The density of T lymphocytes in the expansion stages should preferably be from about 3 to about 6 million cells / ml of culture medium.

Durante a expansão uma troca de meio de cultura com meio fresco, uma etapa que é denominada condicionamento do meio, pode também ser necessária. O ponto de tempo para dividir culturas e para condicionar o meio pode ser determinado com base na morfologia das células e na densidade da cultura de células (que não deve exceder cerca de 6 milhões de células/ml) ou o meio pode conter um indicador adequado, tal como, p. ex., um indicador fenol. No caso de um indicador ser incluído no meio, o ponto de tempo para dividir as culturas ou meio de condicionamento pode ser baseado na cor do meio. Se um indicador de vermelho de fenol for usado, as células devem ser divididas ou condicionadas, quando o meio tornar-se amarelo, indicando que o pH da cultura está se tornando ácido. Um programa adequado para condicionar o meio usado na presente invenção pode ser trocar de 1A para /4, tal como, p. ex., 1/3 do meio cada 3-9 dias, tal como, p. ex., uma vez por semana.During expansion an exchange of culture medium with fresh medium, a step which is called media conditioning, may also be required. The time point for dividing cultures and for conditioning the medium can be determined based on cell morphology and cell culture density (not to exceed about 6 million cells / ml) or the medium may contain an appropriate indicator. such as e.g. eg a phenol indicator. If an indicator is included in the medium, the time point for dividing crops or conditioning medium may be based on the color of the medium. If a phenol red indicator is used, cells should be split or conditioned when the medium turns yellow, indicating that the pH of the culture is becoming acidic. A suitable program for conditioning the medium used in the present invention may be to change from 1A to / 4, such as e.g. 1/3 of the medium every 3-9 days, such as e.g. eg once a week.

Exceto para condições especificas mencionadas aqui, para outros parâmetros condições padrão para cultivo de culturas de linfócitos serão usadas, tais como, p. ex., uma temperatura de 37°C e 5% CO2.Except for specific conditions mentioned here, for other parameters standard conditions for culturing lymphocyte cultures will be used, such as e.g. eg a temperature of 37 ° C and 5% CO2.

Como mencionado acima, a segunda fase ii) é iniciada pela adição de antígeno derivado de tumor, como definido acima, aos linfócitos-T para ativar os linfócitos-T negativos-CD25 reativos a tumor, a fim de promover a expansão clonal dos linfócitos-T reativos a tumor.As mentioned above, second phase ii) is initiated by the addition of tumor-derived antigen as defined above to T-lymphocytes to activate tumor-reactive CD25-negative T-lymphocytes to promote clonal expansion of T-lymphocytes. T-reactive to tumor.

Em uma forma de realização específica da invenção, as células apresentando antígeno (APCs) são adicionadas aos linfócitos-T junto com o antígeno derivado de tumor. As células apresentando antígeno (APCs) incluem leucócitos tais como, p. ex., monócitos, macrófagos e linfócitos, tais como, p. ex., células B. Estes diversos tipos de célula têm em comum a capacidade de apresentar antígeno em uma forma que é reconhecida pelos receptores de linfócito T específicos. A preparação de leucócito é isolada de, por exemplo, sangue, fluido de linfa, medula óssea, tecido de órgão linfático ou fluido de cultura de tecido obtidos do paciente a ser tratado. Em uma forma de realização preferida, as células APCs são leucócitos sangüíneos periféricos irradiados, contendo células-B e/ou monócitos apresentando antígeno. A quantidade de APCs adicionadas situa-se dentro da faixa de cerca de 0,5 milhões de APCs/ml cultura de linfócitos a cerca de 5 milhões de APCs/ml de cultura de linfócitos, tais como, p. ex., de cerca de 1 milhão de APCs/ml de cultura de linfócitos a cerca de 4 milhões APC/ml cultura de linfócitos, de cerca de 1 milhão de APCs/ml de cultura de linfócitos a cerca de 3 milhões de APCs/ml de cultura de linfócitos, ou de cerca de 1 milhão de APCs/ml de cultura de linfócitos a cerca de 2 milhões APCs/ml de cultura de linfócitos.In a specific embodiment of the invention, antigen presenting cells (APCs) are added to the T-lymphocytes along with the tumor derived antigen. Antigen presenting cells (APCs) include leukocytes such as, e.g. monocytes, macrophages and lymphocytes such as e.g. eg, B cells. These various cell types have in common the ability to present antigen in a form that is recognized by specific T lymphocyte receptors. The leukocyte preparation is isolated from, for example, blood, lymph fluid, bone marrow, lymphatic organ tissue or tissue culture fluid obtained from the patient to be treated. In a preferred embodiment, APCs cells are irradiated peripheral blood leukocytes containing B-cells and / or antigen-presenting monocytes. The amount of APCs added is within the range of about 0.5 million APCs / ml lymphocyte culture to about 5 million APCs / ml lymphocyte culture, such as e.g. from about 1 million APCs / ml lymphocyte culture to about 4 million APCs / ml lymphocyte culture, from about 1 million APCs / ml lymphocyte culture to about 3 million APCs / ml lymphocyte culture, or about 1 million APCs / ml lymphocyte culture to about 2 million APCs / ml lymphocyte culture.

Além da adição de antígeno derivado de tumor aos linfócitos- T, a fim de promover a expansão clonal dos linfócitos-T reativos a tumor, a segunda fase ii) compreende a adição de componentes específicos, cuja função é direcionar a expansão dos linfócitos-T reativos a tumor em direção à sub-população desejada.In addition to the addition of tumor-derived antigen to T lymphocytes in order to promote clonal expansion of tumor-reactive T lymphocytes, the second phase ii) comprises the addition of specific components whose function is to direct T lymphocyte expansion. reactive to the desired subpopulation.

Como mencionado acima, a presente invenção fornece um método para a geração de linfócitos-T auxiliares CD4+. Os linfócitos-T auxiliares CD4+ reconhecem e ligam-se a antígeno tumoral quando o antígeno é associado com uma molécula principal de classe II complexa de Wstocompatibilidade. Os linfócitos-T auxiliares CD4+ secretam citocinas, proteínas e/ou peptídeos que estimulam outras células do sistema imune, tais como outros linfócitos. A mais comum citocina secretada é a interleucina-2 (IL-2), que é um potente fator de cultivo de linfócito-T. Os linfócitos-T auxiliares CD4+ proliferantes podem diferenciar-se em dois principais subtipos de células, células Th1 e Th2, que são definidas com base em citocinas específicas produzidas. As células Th1 produzem interferon-gama e interleucina 12 (IL-12), enquanto as células Th2 produzem interleucina-4, interleucina-5 e interleucina-13. Os linfócitos-T Th1 acredita-se promoverem a ativação dos linfócitos-T citotóxicos (Tc), células NK, macrófagos e monócitos, todos podendo atacar as células cancerosas e geralmente defendem-se contra tumores.As mentioned above, the present invention provides a method for generating CD4 + helper T lymphocytes. CD4 + helper T-lymphocytes recognize and bind to tumor antigen when the antigen is associated with a complex class II Wstocompatibility main molecule. CD4 + helper T lymphocytes secrete cytokines, proteins and / or peptides that stimulate other cells of the immune system, such as other lymphocytes. The most common secreted cytokine is interleukin-2 (IL-2), which is a potent T-lymphocyte culture factor. Proliferating CD4 + helper T-lymphocytes can differentiate into two major cell subtypes, Th1 and Th2 cells, which are defined based on specific cytokines produced. Th1 cells produce interferon-gamma and interleukin 12 (IL-12), while Th2 cells produce interleukin-4, interleukin-5 and interleukin-13. Th1 T-lymphocytes are believed to promote activation of cytotoxic T-lymphocytes (Tc), NK cells, macrophages and monocytes, all of which can attack cancer cells and generally defend against tumors.

Os linfócitos (CD4+) auxiliares-T do tipo Th1 e Th2 podem diferenciar-se em células de memória e células efetoras. Os linfócitos auxiliares-T (CD4+) são específicos do antígeno que eles primeiro encontraram e podem ser convocados durante uma resposta imune secundária, evocando uma mais rápida e maior resposta aos antígenos tumorais. Há evidência nos humanos de que os linfócitos sobrevivem pelo menos 20 anos; talvez durante a vida. Os linfócitos-T CD4+ efetores são células ativas produzindo citocinas e INF-gama.Th1 and Th2 T-helper (CD4 +) lymphocytes may differentiate into memory cells and effector cells. T-helper lymphocytes (CD4 +) are antigen-specific that they first encountered and can be summoned during a secondary immune response, evoking a faster and greater response to tumor antigens. There is evidence in humans that lymphocytes survive at least 20 years; maybe during life. Effector CD4 + T-lymphocytes are active cells producing cytokines and INF-gamma.

Para um tratamento eficaz de câncer, a administração de linfócitos-T reativos a tumor do tipo thl é especialmente benéfica, visto que este tipo acredita-se promover a adição dos linfócitos-T citotóxicos (Tc), células NK, macrófagos e monócitos, todos podendo atacar células cancerosas e geralmente defender-se contra tumores. Isto é, em uma forma de realização específica, a invenção refere-se a um método para gerar linfócitos-T auxiliares CD4+ reativos a tumor e, em uma outra forma de realização, a percentagem dos linfócitos-T do tipo Th2 gerado pelo presente método é 30% ou menos, tal como, p. ex., 25% ou menos, 20% ou menos 15% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos ou 0%, isto é, pelo menos 70% dos linfócitos-T CD4+ reativos a tumor são do tipo Thl5 tal como, p. ex., pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%.For effective cancer treatment, administration of thl-type tumor-reactive T-lymphocytes is especially beneficial, as this type is believed to promote the addition of cytotoxic (Tc) T-lymphocytes, NK cells, macrophages and monocytes, all can attack cancer cells and usually defend against tumors. That is, in one specific embodiment, the invention relates to a method for generating tumor reactive CD4 + T-helper lymphocytes and, in another embodiment, the percentage of Th2-type T lymphocytes generated by the present method. is 30% or less, such as e.g. 25% or less, 20% or less 15% or less, 10% or less, 5% or less, or 0%, that is, at least 70% of tumor-reactive CD4 + T-lymphocytes are of the Thl5 type such as how, p. eg at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100%.

Por conseguinte, a segunda fase pode compreender a adição de uma substância capaz de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T. A supra-regulação do IL-12R aumenta a propensão das células T a receberem e otimizar a ativação da citocina IL-12, resultando em sinalização STAT-4 máxima e, assim, desviando-se dos linfócitos em direção às células Thl e produção de IFN-γ.Accordingly, the second step may comprise the addition of a substance capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R. IL-12R up-regulation increases the propensity of T cells to receive and optimize IL-12 cytokine activation, resulting in maximum STAT-4 signaling and thus shifting lymphocytes towards Thl cells and producing IFN-γ.

As substância(s) capazes de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T podem ser substância(s) tendo atividade agonista em relação ao receptor de interferon. Em uma forma de realização da invenção, as substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor de interferon são agonistas. Exemplos de tais substâncias incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, anticorpos, aficorpos e seus fragmentos, proteínas de fusão, moléculas sintéticas e/ou orgânicas, tais como, p. ex., moléculas pequenas e ligandos naturais. Em uma forma de realização específica, a substância é o ligando natural do receptor interferon, isto é, um interferon, tal como interferon-a.Substances (s) capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R may be substance (s) having interferon receptor agonist activity. In one embodiment of the invention, substances having interferon receptor agonist activity are agonists. Examples of such substances include proteins, polypeptides, peptides, antibodies, antibodies and fragments thereof, fusion proteins, synthetic and / or organic molecules, such as e.g. eg small molecules and natural ligands. In a specific embodiment, the substance is the natural interferon receptor ligand, that is, an interferon, such as interferon-a.

O ponto de tempo ótimo para adicionar substância(s) capazes de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T, tais como, p. ex., uma substância tendo atividade agonista em relação a um receptor de interferon, pode ser determinada medindo-se o nível de IL-12 no meio de cultura. A(s) substância(s) deve(m) preferivelmente ser adicionada(s) quando o nível de IL- 12 é pelo menos 1 vez, tal como, p. ex., pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo menos 5 vezes aumentado, em comparação com o nível de IL-12 no dia 1 da fase ii). Na maioria dos casos, tal aumento no nível de IL-12 será visto do dia 2 ao e incluindo dia 4 após iniciar a segunda fase ii), tal como no dia 2, no dia 3 ou no dia 4.The optimal time point for adding substance (s) capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R, such as e.g. For example, a substance having agonist activity towards an interferon receptor can be determined by measuring the level of IL-12 in the culture medium. The substance (s) should preferably be added when the IL-12 level is at least 1 time, such as e.g. at least 2, at least 3, at least 4 or at least 5-fold increased compared to IL-12 level on day 1 of phase ii). In most cases, such an increase in IL-12 level will be seen from day 2 to and including day 4 after starting phase II), such as on day 2, day 3 or day 4.

A fim de substancialmente evitar a geração de linfócitos-T reativos a tumor do tipo Th2, a segunda fase pode ainda compreender a adição de uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2. Exemplos de tais substâncias são substâncias capazes de neutralizar as interleucinas IL-4, IL-5, IL-IO e/ou TGF-beta (o último não sendo uma interleucina), todos os quatro sendo necessários para o estabelecimento do perfil da citocina Th2 e para a regulação negativa da produção de citocina Th 1.In order to substantially prevent the generation of Th2-type tumor-reactive T-lymphocytes, the second phase may further comprise the addition of one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes. Examples of such substances are substances capable of neutralizing interleukins IL-4, IL-5, IL-10 and / or TGF-beta (the latter not being an interleukin), all four being required for the establishment of the Th2 cytokine profile. and for down regulation of Th 1 cytokine production.

Exemplos de tais substâncias incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, receptores solúveis, anticorpos, aficorpos e seus fragmentos, proteínas de fusão, moléculas sintéticas e/ou orgânicas, tais como, p. ex., moléculas pequenas e ligandos naturais. Em uma forma de realização específica, os substratos são selecionados de anticorpos que se ligam às interleucinas, desse modo neutralizando-as, tais como, p.ex., anticorpo anti IL-4, anticorpo anti IL-5 e/ou anticorpo anti IL-10, junto com receptores solúveis (tais como, p. ex., receptor TGF-beta I e II) e proteínas de ligação para TGF-beta (tais como, p. ex., LAP e/ou LTBP).Examples of such substances include proteins, polypeptides, peptides, soluble receptors, antibodies, antibodies and fragments thereof, fusion proteins, synthetic and / or organic molecules, such as e.g. eg small molecules and natural ligands. In a specific embodiment, substrates are selected from antibodies that bind interleukins, thereby neutralizing them, such as, for example, anti IL-4 antibody, anti IL-5 antibody and / or anti IL antibody. -10, together with soluble receptors (such as, e.g., TGF-beta I and II receptor) and TGF-beta binding proteins (such as, for example, LAP and / or LTBP).

A uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento de linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL-IO e/ou TGF-beta, podem ser adicionadas no dia 1 da segunda fase ii). Entretanto, como os anticorpos são dispendiosos, a adição de anticorpos pode também ser realizada em uma etapa subseqüente, após a adição da substância capaz de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T, tais como, p. ex., um dia, dois dias ou três dias após a adição da substância capaz de regular ascendentemente IL- 12R dos linfócitos-T.One or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes, such as e.g. e.g., one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10 and / or TGF-beta may be added on day 1 of the second phase ii). However, as antibodies are expensive, antibody addition may also be performed at a subsequent stage, after addition of the substance capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R, such as e.g. one day, two days or three days after the addition of the substance capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R.

As substâncias neutralizadoras devem ser adicionadas em uma quantidade suficiente para neutralizar as interleucinas, tais como, p. ex., em um excesso (molar) de 10 - 100 vezes da quantidade de interleucina a ser neutralizada. Quando utilizando-se anticorpos, uma concentração final de cerca de 2 a cerca de 4 ng/ml de meio de cultura normalmente será necessária. Para outros tipos de substâncias neutralizantes, uma concentração final, fornecendo o mesmo efeito que a concentração mencionada para anticorpos, deve ser usada.Neutralizing substances should be added in an amount sufficient to neutralize interleukins such as e.g. eg, in a 10 - 100-fold (molar) excess of the amount of interleukin to be neutralized. When using antibodies, a final concentration of about 2 to about 4 ng / ml of culture medium will usually be required. For other types of neutralizing substances, a final concentration providing the same effect as the mentioned antibody concentration should be used.

A fim de manter a supressão do desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2, uma outra quantidade da uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar LL-4, IL-5, IL- 10 e/ou TGF-beta, pode(m) ser adicionada(s) regularmente por toda a fase ii), tal como, p. ex., cada 2o., 3o. ou 4o. dia da fase II). Deve ser entendido que, pela expressão cada 2o., 3o. ou 4o. pretende-se significar que pelo menos uma substância, capaz de antagonizar o desenvolvimento de linfócitos-T tipo Th2, é adicionada por toda a fase i) cada 2o., 3o. ou 4o. dia, começando no 2o., 3o. ou 4o. dia após a primeira adição da pelo menos uma substância capaz de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2.In order to maintain suppression of Th2-type T lymphocyte development, another amount of one or more substances capable of antagonizing Th2-type T lymphocyte development, such as e.g. For example, one or more substances capable of neutralizing LL-4, IL-5, IL-10 and / or TGF-beta may be added regularly throughout step ii), such as e.g. eg every 2nd, 3rd. or 4th. day of phase II). It should be understood that by the expression every 2nd, 3rd. or 4th. It is meant that at least one substance capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes is added throughout step i) every 20th. or 4th. day, starting on the 2nd, 3rd. or 4th. day after the first addition of at least one substance capable of antagonizing the development of Th2-type T lymphocytes.

Além disso, para a fase i) uma outra quantidade de uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, tal como, p. ex., um agonista, pode ser adicionada regularmente por toda a fase ii), tal como, cada 2o. a 4o. dia da fase ii), isto é, no 2o., 3o. ou 4o. dia, a fim de manterem-se as condições ótimas promovendo a divisão celular. A dose da substância a ser adicionada regularmente reside dentro das faixas ótimas mencionadas sob a fase i) para adição de substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, tal como, p. e., IL-2.In addition, for step i) another amount of a substance having IL-2 receptor agonist activity, such as e.g. eg an agonist, may be added regularly throughout step ii), such as every 2nd. the 4th. day of phase ii), that is, on the 2nd, 3rd. or 4th. day in order to maintain optimal conditions by promoting cell division. The dose of the substance to be added regularly lies within the optimal ranges mentioned under step i) for the addition of substances having IL-2 receptor agonist activity, such as e.g. e. IL-2.

A fim de favorecer a geração dos linfócitos-T reativos a tumor tipo Thl, a segunda fase ii) pode compreender adicionar uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th 1. Exemplos de tais substâncias são substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21. Substâncias mais específicas podem ser agonistas para o receptor IL-7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21. Exemplos de tais agonistas incluem proteínas, polipeptídeo, peptídeos, anticorpos, aficorpos e seus fragmentos, proteínas de fusão, moléculas sintéticas e/ou orgânicas, tais como, p. ex., moléculas pequenas e ligandos naturais. Em uma forma de realização específica, as substâncias são os ligandos naturais do receptor IL-7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21 receptor, respectivamente, tais como IL-7, IL-12, EL-15 e/ou IL-21.In order to favor the generation of Th1 tumor-reactive T-lymphocytes, second phase ii) may comprise adding one or more substances promoting the development of Th-1 T-lymphocytes. Examples of such substances are substances having agonist activity relative to IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 receptor. More specific substances may be agonists for the IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 receptor. Examples of such agonists include proteins, polypeptides, peptides, antibodies, antibodies and fragments thereof, fusion proteins, synthetic and / or organic molecules, such as e.g. eg small molecules and natural ligands. In one specific embodiment, the substances are the natural IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 receptor receptor ligands, respectively, such as IL-7, IL-12, EL-15 and / or IL-21.

O efeito do IL-12 é ativar o trajeto STAT indutor de IFN- gama, pelo estímulo do IL-12R, desse modo promovendo a ativação dos linfócitos-T tipo Th 1. A função de IL-2 é aumentar a proliferação, ativação e desenvolvimento em relação aos linfócitos-T tipo Th1.The effect of IL-12 is to activate the IFN-gamma-inducing STAT pathway by stimulating IL-12R, thereby promoting the activation of Th-1 T-lymphocytes. The function of IL-2 is to increase proliferation, activation and Th1 T-lymphocytes.

Tanto IL-7 como IL-15 funcionam promovendo a expansão homeostática dos linfócitos-T, aumentando a enumeração dos linfócitos-T programado Th1 ativados.Both IL-7 and IL-15 work by promoting homeostatic expansion of T-lymphocytes, increasing the enumeration of activated Th1 programmed T-lymphocytes.

O ponto de tempo ótimo para adicionar uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th1 é quando os linfócitos-T são susceptíveis a modificação. Se os substratos forem adicionados quando os linfócitos-T não forem susceptíveis a modificação, a adição não terá efeito, isto é, o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th1 não será favorecido. A fim de determinar o ponto de tempo ótimo para adicionar substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th1, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL- 7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21, a produção de INF-Y pelos linfócitos-T pode ser monitorada. Em uma forma de realização, a uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th1, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-7, IL-12, IL- 15 e/ou IL-21, deve ser adicionada quando o nível de IFN-gama for aumentado, em comparação com o nível de IFN-gama na iniciação da segunda fase ii).The optimal time point for adding one or more substances promoting the development of Th1 T-lymphocytes is when T-lymphocytes are susceptible to modification. If substrates are added when T-lymphocytes are not susceptible to modification, the addition will have no effect, ie the development of Th1-type T lymphocytes will not be favored. In order to determine the optimal time point for adding substances promoting the development of Th1 T-lymphocytes, such as e.g. For example, substances having IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 receptor agonist activity, T-lymphocyte production of INF-Y can be monitored. In one embodiment, one or more substances promoting the development of Th1 T-lymphocytes, such as, e.g. For example, substances having IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 receptor agonist activity should be added when the IFN-gamma level is increased compared to the IFN-γ level. gamma at the initiation of the second phase ii).

Em uma forma de realização específica, o aumento do nível do IFN-gama pode ser determinado como pelo menos um aumento de 1 vez no nível de IFN-gama, tal como, p. ex., um aumento de pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, em comparação com o nível de IFN- gama na iniciação da segunda fase ii). Com freqüência tal aumento poderá ser correlacionado com aquele do conteúdo de IFN-gama do meio de cultura de pelo menos 100 picograma/ml de meio de cultura, tal como, p. ex., pelo menos 150 picograma/ml de meio de cultura, pelo menos 200 picograma/ml de meio de cultura ou pelo menos 250 picogramas/ml de meio de cultura.In a specific embodiment, the increase in IFN-gamma level may be determined as at least a 1-fold increase in IFN-gamma level, such as e.g. e.g. at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold increase compared to IFN-gamma level at initiation of second phase ii). Often such an increase may be correlated with that of the culture media IFN-gamma content of at least 100 picogram / ml culture medium, such as e.g. eg at least 150 picogram / ml culture medium, at least 200 picogram / ml culture medium or at least 250 picogram / ml culture medium.

Quando determinando o ponto de tempo ótimo para adicionar substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Thl, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL- 7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21 receptor, pode-se olhar a expressão dos marcadores de ativação CD25 e CD69 dos linfócitos-T CD4+, marcadores estes devendo preferencialmente ser supra-regulados. Por supra regulagem entende-se que pelo menos cerca de 40% a cerca de 60% ou mais dos linfócitos-T CD4+ devem expressar CD25 e CD69, em comparação com a expressão de CD25 e CD69 dos linfócitos-T no dia 1 da fase ii), mostrando que os linfócitos-T receberam um sinal de ativação.When determining the optimal time point for adding substances promoting the development of Thl-type T-lymphocytes, such as e.g. For example, substances having IL-7 receptor, IL-12, IL-15, and / or IL-21 receptor agonist activity can look at the expression of CD4 + CD4 + T-lymphocyte activation markers, these should preferably be over-regulated. By over-regulation it is understood that at least about 40% to about 60% or more of CD4 + T-lymphocytes should express CD25 and CD69, compared to T-lymphocyte CD25 and CD69 expression on day 1 of phase ii. ), showing that T-lymphocytes received an activation signal.

Normalmente, o ponto de tempo ótimo para adicionar as substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Thl situar- se-á subseqüente às etapas de adicionar as substâncias capazes de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T e as substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2. Mais especificamente, o ponto de tempo ótimo para adicionar as substâncias promovendo o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Thl situar-se-á entre o dia 5 ao dia 8 após iniciação da segunda fase ii), tal como no dia 5, dia 6, dia 7 ou dia 8. No caso de IL-7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21 serem adicionados a concentração de cada uma destas substâncias no meio de cultura deve situar- se dentro da faixa de cerca de 150 IU/ml de meio de cultura a cerca de 300 IU/ml de meio de cultura, tais como, e.g. 250 IU/ml de meio de cultura. Quando outras substâncias que não as específicas mencionadas forem usadas, elas devem ser adicionadas à cultura na concentração final, o que resulta no mesmo efeito que a adição de IL-7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21, dentro das faixas específicas mencionadas, fornecerá.Typically, the optimal time point for adding substances promoting the development of Th-T-lymphocytes will be subsequent to the steps of adding substances capable of up-regulating T-lymphocytes IL-12R and substances capable of antagonizing T-lymphocytes. development of Th2 T-lymphocytes. More specifically, the optimal time point for adding the substances promoting the development of Thl-type T-lymphocytes will be from day 5 to day 8 after initiation of second phase ii), such as day 5, day 6, day 7 or day 8. In case IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 are added the concentration of each of these substances in the culture medium should be within the range of about 150 IU / ml culture medium to about 300 IU / ml culture medium, such as eg 250 IU / ml culture medium. When substances other than the specific ones mentioned are used, they should be added to the culture at the final concentration resulting in the same effect as adding IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 within of the specific ranges mentioned, will provide.

Como mencionado acima, o presente método é preferencialmente usado para a expansão dos linfócitos-T, a fim de obter linfócitos-T reativos a tumor CD4+ do tipo Th 1. Um outro aspecto da invenção é que, utilizando-se o método aqui descrito para expandir os linfócitos-T reativos a tumor, uma quantidade relativamente elevada de linfócitos-T do tipo de memória será obtida. No tratamento do câncer é naturalmente importante que o paciente seja tratado para receber uma alta quantidade de linfócitos-T CD4+ reativos a tumor, visto que estes, como mencionado acima - promovem a ativação dos linfócitos-T citotóxicos (Tc), células NK, macrófagos e monócitos, todos podendo atacar as células cancerosas e geralmente defendem-se contra tumores.As mentioned above, the present method is preferably used for T lymphocyte expansion in order to obtain Th1 type CD4 + tumor-reactive T lymphocytes. Another aspect of the invention is that, using the method described herein for expand tumor-reactive T lymphocytes, a relatively high amount of memory type T lymphocytes will be obtained. In the treatment of cancer it is naturally important that the patient be treated to receive a high amount of tumor reactive CD4 + T lymphocytes, as these, as mentioned above - promote the activation of cytotoxic T lymphocytes (Tc), NK cells, macrophages and monocytes, all of which can attack cancer cells and usually defend against tumors.

Entretanto, administrando-se ao mesmo tempo um quantidade substancial de linfócitos-T CD4+ reativos a tumor de memória, o paciente obtém até proteção de longa vida em relação a recorrência do tumor ou metástase do tumor primário.However, while administering a substantial amount of memory tumor-reactive CD4 + T-lymphocytes, the patient even obtains long-term protection against tumor recurrence or primary tumor metastasis.

Portanto, a presente invenção refere-se a um método para a preparação de linfócitos-T de memória. Normalmente, quando uma cultura dos linfócitos-T reativos a tumor é expandida de acordo com a presente invenção, cerca de 35% a cerca de 90% de linfócitos-T reativos a tumor do tipo de memória, tais como, p. ex. cerca de 40% a cerca de 90%, cerca de 50% a cerca de 80% ou cerca de 60% a cerca de 70% serão obtidos. Os presentes inventores especulam que o fato de que os linfócitos da fase i) serem permitidos regenerarem-se antes do antígeno de tumor ser adicionado, junto com a fase de expansão relativamente lenta, resulta na formação de uma elevada relação de linfócitos de memória para linfócitos efetores.Therefore, the present invention relates to a method for preparing memory T-lymphocytes. Typically, when a tumor-reactive T-lymphocyte culture is expanded according to the present invention, about 35% to about 90% of memory-type tumor-reactive T-lymphocytes, such as e.g. ex. about 40% to about 90%, about 50% to about 80% or about 60% to about 70% will be obtained. The present inventors speculate that the fact that phase i) lymphocytes are allowed to regenerate before tumor antigen is added, along with the relatively slow expansion phase, results in the formation of a high memory lymphocyte to lymphocyte ratio. effectors.

Como mencionado acima, a expressão dos marcadores de ativação de superfície de célula CD25 e CD69 dos linfócitos-T pode ser usada para determinar quando iniciar as etapas importantes do presente método, tais como, p. ex., quando iniciar a segunda fase ii). Portanto, pode ser benéfico monitorar continuamente a expressão de CD25 e CD69 por toda a fase i) e fase ii), tal como, p. ex., cada 2°., 3°. ou 4°. dia.As mentioned above, the expression of T-lymphocyte CD25 and CD69 cell surface activation markers can be used to determine when to begin the important steps of the present method, such as, e.g. eg when starting the second phase ii). Therefore, it may be beneficial to continuously monitor the expression of CD25 and CD69 throughout phase i) and phase ii), such as e.g. eg every 2nd, 3rd. or 4 °. day.

Como uma das finalidades do presente método é obter um elevado número de linfócitos-T reativos a tumor CD4+, que possam ser usados para administração em um paciente, os linfócitos-T reativos a tumor podem ser colhidos em algum ponto, resultando no término da etapa de expansão. O ponto de tempo ótimo para colher os linfócitos-T reativos a tumor é quando a expressão de CD25 dos linfócitos-T é regulada descendentemente, onde a regulação negativa é definida como aquela em que 5% da população de linfócitos-T CD4+ expressa CD25. O ponto de tempo ótimo para colher pode também ser determinado com base na medição da quantidade de IFN-gama produzida. A produção de IFN-gama deve ser de pelo menos 2 vezes aumentada, tal como, p. ex., pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes aumentada, em comparação com a produção de IFN-gama inicial, que normalmente corresponde a um nível de IFN-gama de pelo menos 100 pg/ml de meio de cultura.As one of the purposes of the present method is to obtain a high number of CD4 + tumor-reactive T-lymphocytes that can be used for administration to a patient, tumor-reactive T-lymphocytes may be harvested at some point, resulting in the completion of the stage. of expansion. The optimal time point for harvesting tumor-reactive T-lymphocytes is when T-lymphocyte CD25 expression is down-regulated, where down-regulation is defined as 5% of the CD4 + T-lymphocyte population expressing CD25. The optimal time point for harvesting can also be determined based on measuring the amount of IFN-gamma produced. IFN-gamma production should be at least 2-fold increased, such as e.g. at least 3 times, at least 4 times or at least 5 times increased compared to the initial IFN-gamma production, which normally corresponds to an IFN-gamma level of at least 100 pg / ml of medium. culture.

Normalmente, este evento ocorrerá do dia 10 ao e incluindo dia 14 após iniciar a segunda fase ii), isto é, normalmente as células serão cultivadas do dia 10 ao e incluindo dia 14 após iniciação da segunda fase ii).Typically, this event will occur from day 10 to and including day 14 after beginning of second phase ii), that is, normally cells will be cultured from day 10 to and including day 14 after initiation of second phase ii).

Por conseguinte, o inteiro processo para expansão dos linfócitos-T reativos a tumor de acordo com a presente invenção pode ser em geral levar de cerca de 25 dias a e incluindo 45 dias, tal como, p. ex., de cerca de 26 dias a e incluindo cerca de 44 dias, de cerca de 27 dias a e incluindo 43 dias, de cerca de 27 dias a e incluindo 42 dias, de cerca de 27 dias a e incluindo 41 dias e de cerca de 27 dias a e incluindo cerca de 40 dias.Accordingly, the entire process for tumor-reactive T-lymphocyte expansion according to the present invention may generally take from about 25 days to and including 45 days, such as e.g. e.g., about 26 days including 44 days, about 27 days including 43 days, about 27 days including 42 days, about 27 days including 41 days, and about 27 days including about 40 days.

Em vez de colher os linfócitos-T reativos a tumor quando o marcador CD25 é regulado negativamente, eles podem ser submetidos a um ou mais ciclos adicionais de fase ii). Isto poderia ser benéfico se a quantidade de linfócitos-T reativos a tumor obtida pelo método de expressão não for considerada uma quantidade eficaz a ser administrada a um paciente sofrendo de câncer, ou se o paciente estiver em um regime de tratamento de quimioterapia, quando pode ser benéfico adiar a administração dos linfócitos- T até o tratamento de quimioterapia ser terminado. A fim de determinar se os linfócitos-T reativos a tumor devem ser submetidos a um ou mais ciclos adicionais de fase ii), pode-se examinar o nível de IFN-gama produzido e/ou o número total de linfócitos-T reativos a tumor obtidos e/ou a expressão de CD25. No caso de os níveis de EFN-γ serem de 30 pg/ml de meio de cultura ou menos, tal como, p. ex., 20 pg/ml de meio de cultura e/ou o número total de células T for insatisfatório, ciclos adicionais de fase ii) podem ser iniciados, começando quando a maior parte das células T for CD25 negativo (isto é, menos do que 5% da população de linfócitos-T expressam CD25) e, desse modo, susceptíveis a reestimulação.Instead of harvesting tumor-reactive T-lymphocytes when the CD25 marker is down-regulated, they may undergo one or more additional phase ii) cycles. This could be beneficial if the amount of tumor-reactive T-lymphocytes obtained by the expression method is not considered to be an effective amount to be administered to a cancer patient, or if the patient is on a chemotherapy treatment regimen when It may be beneficial to postpone T-lymphocyte administration until chemotherapy treatment is terminated. In order to determine whether tumor-reactive T-lymphocytes should undergo one or more additional phase ii) cycles, the level of IFN-gamma produced and / or the total number of tumor-reactive T-lymphocytes can be examined. obtained and / or the expression of CD25. If EFN-γ levels are 30 pg / ml culture medium or less, such as e.g. 20 pg / ml culture medium and / or the total number of T cells is unsatisfactory, additional phase ii cycles can be started, starting when most T cells are CD25 negative (ie less than 5% of the T-lymphocyte population express CD25) and thus susceptible to restimulation.

Após colheita, os linfócitos-T reativos a tumor podem ser purificados por qualquer meio convencional, tal como, p. ex., utilizando-se gradiente de densidade, tal como, p. ex., um meio Ficoll. Uma parte dos linfócitos-T reativos a tumor pode ser armazenada por congelamento em um meio de congelamento adequado, após colher e purificar os linfócitos-T reativos a tumor. Método de tratamentoAfter harvesting, tumor-reactive T-lymphocytes may be purified by any conventional means, such as e.g. using density gradient such as e.g. eg a Ficoll medium. A portion of tumor-reactive T-lymphocytes may be stored by freezing in a suitable freezing medium after harvesting and purifying tumor-reactive T-lymphocytes. Treatment method

Os linfócitos-T reativos a tumor, obtidos por um método de expansão aperfeiçoado como descrito acima, podem ser usados em um método para tratar um indivíduo sofrendo de uma doença de origem neoplásica ou para realizar a regressão do tumor em um indivíduo tendo um tumor, o método compreendendo administrar ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de linfócitos-T reativos a tumor de acordo com a presente invenção.Tumor-reactive T-lymphocytes, obtained by an improved expansion method as described above, may be used in a method to treat an individual suffering from a disease of neoplastic origin or to perform tumor regression in an individual having a tumor, the method comprising administering to the individual in need an effective amount of tumor reactive T-lymphocytes according to the present invention.

O método descrito aqui pode ser usado para tratamento de qualquer neoplasma sólido de origem epitelial, mesenquimal ou embriológica em qualquer local anatômico, tal como, p. ex., para neoplasmas epiteliais, p. ex., carcinomas da mama, cólon, pâncreas, bexiga, intestino delgado, próstata, cerviz, vulva, ovários; para neoplasmas mesenquimais, p. ex., sarcomas das juntas, ossos, músculos e tendões e alguns hematológicos, tais como linfomas; para neoplasmas embriológicos, p. ex., teratomas.The method described herein may be used for treating any solid neoplasm of epithelial, mesenchymal or embryological origin at any anatomical site, such as e.g. for epithelial neoplasms, e.g. eg, carcinomas of the breast, colon, pancreas, bladder, small intestine, prostate, cervix, vulva, ovaries; for mesenchymal neoplasms, e.g. eg, sarcomas of the joints, bones, muscles and tendons and some haematological diseases such as lymphomas; for embryological neoplasms, p. e.g., teratomas.

A definição de uma quantidade eficaz de linfócitos-T reativos a tumor depende do tipo específico de linfócitos, da proporção de memória para linfócitos-T efetores e da severidade da doença. Entretanto, em média, um mínimo de pelo menos 10 milhões, tal como pelo menos 20 milhões, pelo menos 30 milhões, pelo menos 40 milhões, pelo menos 50 milhões, pelo menos 60 milhões, pelo menos 70 milhões ou pelo menos 80 milhões de linfócitos-T reativos a tumor podem ser administrados. Os presentes inventores não identificaram qualquer limite com respeito à quantidade de linfócitos-T reativos a tumor a ser administrada em uma única dose. Em uma forma de realização preferida, os linfócitos-T reativos a tumor para administração compreendem uma combinação de linfócitos-T efetores e linfócitos-T de memória. Mais especificamente, a quantidade de linfócitos-T reativos a tumor do tipo de memória pode ser de cerca de 35% a cerca de 90%, tal como, p. ex. de cerca de 40% a cerca de 90%, de cerca de 50% a cerca de 80% ou de cerca de 60% a cerca de 70%, e a percentagem dos linfócitos-T efetores de cerca de 10% a cerca de 65%, tal como, p. ex., de cerca de 20% a cerca de 50% ou de cerca de 30%) a cerca de 40%. Os linfócitos-T reativos a tumor podem ser formulados como uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral ao paciente, tal como, p. ex., intravenosa, intra-arterial, intratecal ou intraperitoneal.The definition of an effective amount of tumor-reactive T-lymphocytes depends on the specific type of lymphocytes, the ratio of memory to effector T-lymphocytes and the severity of the disease. However, on average, a minimum of at least 10 million, such as at least 20 million, at least 30 million, at least 40 million, at least 50 million, at least 60 million, at least 70 million or at least 80 million. Tumor-reactive T-lymphocytes may be administered. The present inventors have not identified any limit regarding the amount of tumor-reactive T-lymphocytes to be administered in a single dose. In a preferred embodiment, tumor-reactive T-lymphocytes for administration comprise a combination of effector T-lymphocytes and memory T-lymphocytes. More specifically, the amount of memory-type tumor-reactive T-lymphocytes may be from about 35% to about 90%, such as e.g. ex. from about 40% to about 90%, from about 50% to about 80% or from about 60% to about 70%, and the percentage of effector T-lymphocytes from about 10% to about 65%. %, such as, e.g. from about 20% to about 50% or about 30%) to about 40%. Tumor-reactive T-lymphocytes may be formulated as a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration to the patient, such as e.g. intravenous, intraarterial, intrathecal or intraperitoneal.

Quando os linfócitos-T reativos a tumor são administrados parenteralmente, eles podem ser formulados em um meio isotônico, isto é, em um meio tendo a mesma tonicidade que o sangue e compreendendo uma ou mais substâncias compreendendo a agregação das células. Um exemplo específico de um meio adequado é uma solução de 0,9% de NaCl, compreendendo até 3% de albumina de soro humana, tal como, p. ex., até 2% de albumina de soro humano ou até 1% de albumina de soro humano. Para administração intravenosamente, a concentração dos linfócitos-T reativos a tumor na composição a ser administrada normalmente situa-se dentro da faixa de cerca de 0,5 milhões linfócitos/ml de meio a cerca de 4 milhões linfócitos/ml de meio, tal como, p. ex., de cerca de 0,5 milhões linfócitos/ml de meio a cerca de 3 milhões linfócitos/ml de meio, de cerca de 0,5 milhões linfócitos/ml de meio a cerca de 2 milhões linfócitos/ml de meio ou de cerca de 1 milhões linfócitos/ml de meio a cerca de 2 milhões linfócitos/ml de meio.When tumor-reactive T-lymphocytes are administered parenterally, they may be formulated in an isotonic medium, that is, in a medium having the same tonicity as blood and comprising one or more substances comprising cell aggregation. A specific example of a suitable medium is a 0.9% NaCl solution comprising up to 3% human serum albumin, such as e.g. up to 2% human serum albumin or up to 1% human serum albumin. For intravenous administration, the concentration of tumor-reactive T-lymphocytes in the composition to be administered is usually within the range of about 0.5 million lymphocytes / ml medium to about 4 million lymphocytes / ml medium, as , P. from about 0.5 million lymphocytes / ml medium to about 3 million lymphocytes / ml medium, from about 0.5 million lymphocytes / ml medium to about 2 million lymphocytes / ml medium or about 1 million lymphocytes / ml medium to about 2 million lymphocytes / ml medium.

A composição compreendendo linfócitos-T reativos a tumor pode ser administrada como uma única dose ou múltiplas doses. Ela pode ser infundida através de 1 a 2 horas.The composition comprising tumor reactive T lymphocytes may be administered as a single dose or multiple doses. It can be infused over 1 to 2 hours.

O método de tratamento pode ser realizado uma vez ou repetido, dependendo da severidade da doença. Além disso, o tratamento pode ser reiterado na recorrência da doença.The treatment method may be performed once or repeated, depending on the severity of the disease. In addition, treatment may be reiterated in the recurrence of the disease.

O tratamento de acordo com a presente invenção pode ser suplementado com qualquer outro tratamento pertinente para câncer. Tal tratamento suplementar pode ser dado antes, na mesma ocasião ou após a administração dos linfócitos e pode ser dado em freqüências normalmente usadas para tais tratamentos. Um exemplo adequado de tratamento suplementar é quimioterapia e similares.Treatment according to the present invention may be supplemented with any other pertinent cancer treatment. Such supplemental treatment may be given before, at the same time or after administration of lymphocytes and may be given at frequencies normally used for such treatments. A suitable example of supplemental treatment is chemotherapy and the like.

KitsKits

A invenção refere-se ainda a kits para uso em um método de acordo com a presente invenção, o kit compreendendo um meio para cultivo dos linfócitos-T. O meio pode ser qualquer meio livre de soro adequado, tal como, p. ex., AIMVj RPMI 1640, DMEM ou MEM.The invention further relates to kits for use in a method according to the present invention, the kit comprising a medium for culturing T-lymphocytes. The medium may be any suitable serum free medium such as e.g. AIMVj RPMI 1640, DMEM or MEM.

O kit pode ainda compreender uma ou mais substâncias para estimular, ativar e direcionar os linfócitos-T reativos a tumor. Exemplos de tais substâncias podem ser antígeno derivado de tumor, substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, substâncias capazes de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T, substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2 e/ou substâncias promovendo o desenvolvimento de linfócitos-T tipo Thl.The kit may further comprise one or more substances for stimulating, activating and targeting tumor reactive T lymphocytes. Examples of such substances may be tumor-derived antigen, substances having IL-2 receptor agonist activity, substances capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R, substances capable of antagonizing the development of Th2-type T lymphocytes and / or substances promoting the development of Thl-type T-lymphocytes.

Mais especificamente, tais substâncias podem ser IL-2, interferon-alfa, anticorpo anti-IL-4, anticorpo anti-IL-5, anticorpo anti-IL-10, IL-7, IL-12, IL-15 e/ou IL-21.More specifically, such substances may be IL-2, interferon-alpha, anti-IL-4 antibody, anti-IL-5 antibody, anti-IL-10 antibody, IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21.

O kit pode também compreender uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa. A composição farmacêutica pode ser misturada com a população de linfócitos-T reativos a tumor antes administração.The kit may also comprise a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration. The pharmaceutical composition may be mixed with the tumor-reactive T-lymphocyte population prior to administration.

O kit pode também compreender uma ou mais seringas, compreendendo um localizador de linfonodo, tal como, p. ex., os mencionados acima.The kit may also comprise one or more syringes, comprising a lymph node locator, such as e.g. eg those mentioned above.

Os kits podem também compreender instruções para uso, tais como, p. ex., instruções na forma de software de computador. Legendas das FigurasThe kits may also comprise instructions for use such as e.g. eg instructions in the form of computer software. Picture's description

A Figura 1 ilustra que o nodo sentinela é o sítio primário natural para a apresentação e ativação da reatividade da célula T em relação ao antígeno de tumor. A Figura 2 mostra que, inicialmente, os linfócitos de nodo sentinela são ativados com antígeno tumoral e baixa dose de EL-2, resultando em ativação e expressão do marcador de ativação CD25 (Painel de topo). O final da fase de ativação da fase I é definida pelo número diminuído de células T CD4+ expressando CD25 (Painel de base). Quando menos do que 5% das células T CD4+ expressam CD25, a fase II é iniciada com reestimulação com antígeno.Figure 1 illustrates that the sentinel node is the natural primary site for the presentation and activation of T cell reactivity to tumor antigen. Figure 2 shows that, initially, sentinel node lymphocytes are activated with tumor antigen and low EL-2 dose, resulting in activation and expression of the CD25 activation marker (Top Panel). The end of the phase I activation phase is defined by the decreased number of CD25 + CD4-expressing T cells (Base Panel). When less than 5% of CD4 + T cells express CD25, phase II is initiated with antigen restimulation.

A Figura 3 ilustra que a ativação da Fase I e Fase II resulta em expansão e enriquecimento das células auxiliares CD4+ T.Figure 3 illustrates that activation of Phase I and Phase II results in expansion and enrichment of CD4 + T helper cells.

A Figura 4 ilustra que, na Fase I, a maior parte das células são células CD62L+ não afetadas ou células CD69+CD62L+ ativadas. Após a Fase II, a maioria das células são CD62L- e são compostas células auxiliares CD4+ T de memória e efetoras. As células CD62L não estão expressando a molécula de retorno de linfonodo preferida; assim elas estão procurando áreas inflamatórias e órgãos não-linfáticos.Figure 4 illustrates that in Phase I, most cells are unaffected CD62L + cells or activated CD69 + CD62L + cells. After Phase II, most cells are CD62L- and are composed of memory and effector CD4 + T helper cells. CD62L cells are not expressing the preferred lymph node return molecule; so they are looking for inflammatory areas and non-lymphatic organs.

A Figura 5 mostra células primárias estimuladas na Fase I por tumor (linfócitos de infiltração de tumor), nodos sentinela (SN) e um linfonodo irrelevante (LN) resulta em não pouca produção de IFN-γ.Figure 5 shows Phase I tumor-stimulated primary cells (tumor infiltrating lymphocytes), sentinel nodes (SN), and an irrelevant lymph node (LN) results in no small IFN-γ production.

A Figura 6 ilustra que, após expansão após a fase ii), há um aumento dependente da dose na produção de IFN-γ dependente de antígeno.Figure 6 illustrates that after expansion after phase ii), there is a dose dependent increase in antigen dependent IFN-γ production.

A Figura 7 ilustra que o protocolo de expansão e ativação promove a expansão dos clones de célula T especifica de antígeno, pelo enriquecimento da expressão νβ TCR.Figure 7 illustrates that the expansion and activation protocol promotes the expansion of antigen-specific T cell clones by enriching the νβ TCR expression.

A Figura 8 A-D são varreduras CT do paciente # 5. Após transfusão dos linfócitos reativos a tumor, o paciente teve regressão total de metástases do fígado localizadas em ambos os lóbulos (que tinham sido declaradas incuráveis por cirurgia do fígado), normalização dos níveis de CEA, desaparecimento de ascite e ficou fisicamente em boa forma, exercitando-se regularmente. A Figura 9 A-F são varreduras CT do paciente # 10. Após transfusão, o paciente teve regressão de metástases do fígado e fluido ascítico. Ele estava com boa saúde e formação de imagem adicional mostrou doença estável.Figure 8 AD are CT scans of patient # 5. After transfusion of tumor reactive lymphocytes, the patient had complete regression of liver metastases located in both lobes (which had been declared incurable by liver surgery), normalization of blood levels. CEA, ascites disappearance and was physically in good shape, exercising regularly. Figure 9 A-F are CT scans of patient # 10. After transfusion, the patient had regression of liver metastases and ascites fluid. He was in good health and additional imaging showed stable disease.

A Figura 10 A-H são varreduras CT do paciente # 12. Três meses após transfusão, ele teve regressão de metástases do fígado e pulmões com nível de CEA quase normalizado a 5,9 (Normal < 4,0), desaparecimento de ascite e ele parecia clinicamente saudável.Figure 10 AH are CT scans of patient # 12. Three months after transfusion, he had regression of liver and lung metastases with near-normalized CEA level at 5.9 (Normal <4.0), ascites disappearance and he appeared clinically healthy.

A Figura 11 mostra linfócitos T ativados para a expressão de CD4+, que foram tingidos para a expressão de CD25 e o fator de transcrição FoxP3 no início (A) e no final (B) de uma expansão. Inicialmente (painel A), 4,8% dos linfócitos-T CD4+ expressavam FoxP3 e altos níveis de CD25, assim identificados como Treg. No final da expansão, um número muito pequeno de Tregs estavam presentes 0,3% (painel B).Figure 11 shows CD4 + expression-activated T lymphocytes that were stained for CD25 expression and the FoxP3 transcription factor at the beginning (A) and end (B) of an expansion. Initially (panel A), 4.8% of CD4 + T-lymphocytes expressed FoxP3 and high levels of CD25, thus identified as Treg. At the end of the expansion, a very small number of Tregs were present 0.3% (panel B).

ExemplosExamples

Exemplo 1Example 1

Expansão de linfócitos-T reativos a tumorTumor-reactive T-lymphocyte expansion

A identificação de diversos nodos sentinela foi realizada pré- operativamente empregando-se a técnica de nodo sentinela. Resumidamente, 1 ml de corante azul patente foi injetado (Guerbet, Pris) e distribuído superficialmente na serosa em torno do tumor. Dentro de cinco a dez minutos, um a três linfonodos mesentéricos foram coloridos azul, estes nodos sentinela foram marcados com suturas e removidos (vide Figura 1). Um linfonodo mesentérico não-sentinela, distante do tumor, foi também identificado e removido como um controle.The identification of several sentinel nodes was performed preoperatively using the sentinel node technique. Briefly, 1 ml of patent blue dye was injected (Guerbet, Pris) and distributed superficially into the serosa around the tumor. Within five to ten minutes, one to three mesenteric lymph nodes were colored blue, these sentinel nodes were marked with sutures and removed (see Figure 1). A non-sentinel mesenteric lymph node, distant from the tumor, was also identified and removed as a control.

Os linfonodos sentinela e não-sentinelas foram cortados pela metade e fatias de 1 mm de espessura foram retiradas do centro e da periferia. O resto dos linfonodos foram remetidos para exame histopatológico, de acordo com o procedimento de rotina. Uma parte do tumor, incluindo uma amostra da margem invasiva, foi também removida para fins de pesquisa. Cultura de CélulasThe sentinel and non-sentinel lymph nodes were cut in half and 1 mm thick slices were removed from the center and periphery. The rest of the lymph nodes were sent for histopathological examination according to the routine procedure. A part of the tumor, including a sample of the invasive margin, was also removed for research purposes. Cell Culture

Fase I, ativação inicialPhase I, Initial Activation

O material do nodo sentinela foi mantido sobre gelo e imediatamente tomou-se cuidado utilizando-se AIM V® Media (Invitrogen) em todas as ocasiões. Suspensões de célula única de linfócitos de nodo sentinela foram obtidas através de homogeneização suave em um homogeneizador de vidro de adaptação folgada e as células de homogeneização a seguir foram lavadas duas vezes em meio. Os linfócitos de nodo sentinela foram colocados em frascos de cultura de célula a 4 milhões de células/ml e interleucina-2 (IL-2) (Proleukin®, Chiron) foi adicionada a uma concentração de 240 IU/ml meio.Sentinel node material was kept on ice and care was taken immediately using AIM V® Media (Invitrogen) at all times. Single cell suspensions of sentinel node lymphocytes were obtained by gentle homogenization in a loose fitting glass homogenizer and the following homogenization cells were washed twice in medium. Sentinel node lymphocytes were placed in cell culture flasks at 4 million cells / ml and interleukin-2 (IL-2) (Proleukin®, Chiron) was added at a concentration of 240 IU / ml medium.

Extrato de tumor autólogo foi preparado por homogeneização com um Ultra Turrax em 5 volumes (p/v) 2 χ PB S, seguido por desnaturação por 5 minutos a 97°C. Três a quatro dias após iniciação o extrato de tumor autólogo de cultura de célula foi adicionado em uma concentração de 1/100. Para cultura de longo termo, as células foram mantidas em um incubador de célula a 37°C e 5% CO2 e 250 IU IL-2/ml meios adicionados cada 3-4 dias. Fase II, ativação e expansãoAutologous tumor extract was prepared by homogenization with an Ultra Turrax in 5 volumes (w / v) 2 χ PB S, followed by denaturation for 5 minutes at 97 ° C. Three to four days after initiation the autologous cell culture tumor extract was added at a concentration of 1/100. For long term culture, cells were kept in a cell incubator at 37 ° C and 5% CO 2 and 250 IU IL-2 / ml media added every 3-4 days. Phase II, Activation and Expansion

Após 18-22 dias, as culturas de células foram monitoradas para a expressão de CD25. Quando o número de células expressando CD25 foi diminuído abaixo de 5%, as células foram re-estimuladas na Fase II (Figura 2) pela adição de extrato de tumor autólogo em uma concentração de 1/100. Para apresentação de antígeno eficiente, PBMC autólogas foram coletadas usando-se Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), irradiadas com 2500 rd e adicionadas às culturas de célula. Três dias após reestimulação, interferon-α (Introna) na conc. de 100 - 500 IU/ml e anticorpo anti IL-4 foram adicionados a uma concentração de 2 μg/ml. Após 5 a 8 dias, IL-12 (4 ng/ml) foi adicionado à expansão, a fim de promover a indução de IFN-γ produzindo as células Th1.After 18-22 days, cell cultures were monitored for CD25 expression. When the number of CD25 expressing cells was decreased below 5%, the cells were restimulated in Phase II (Figure 2) by the addition of autologous tumor extract at a concentration of 1/100. For efficient antigen presentation, autologous PBMC were collected using Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), irradiated with 2500 rd and added to cell cultures. Three days after restimulation, interferon-α (Introna) in conc. 100 - 500 IU / ml and anti-IL-4 antibody were added at a concentration of 2 μg / ml. After 5 to 8 days, IL-12 (4 ng / ml) was added to the expansion to promote IFN-γ induction producing Th1 cells.

No dia antes da transfusão no paciente, as culturas de célula foram submetidas a purificação, usando-se um Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), a fim de recuperar as células viáveis da cultura. No dia de transfusão, as células foram lavadas duas vezes com solução Salina (Natriumklorid Baxter Viaflo 9 mg/ml, Baxter) e então transferidas para um saco de transferência contendo 200 - 200 ml de solução salina e 1% de albumina de soro humano (Baxter). As investigações quanto à presença microbiana foram realizadas antes da transfusão. As infusões das células foram realizadas durante 1-2 horas sob supervisão médica profissional.On the day before transfusion in the patient, cell cultures were subjected to purification using a Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare) to recover viable cells from the culture. On the day of transfusion, cells were washed twice with Saline (Natriumklorid Baxter Viaflo 9 mg / ml, Baxter) and then transferred to a transfer bag containing 200 - 200 ml saline and 1% human serum albumin ( Baxter). Investigations for microbial presence were performed prior to transfusion. Cell infusions were performed for 1-2 hours under professional medical supervision.

Avaliação ImunológicaImmunological Evaluation

Mais avaliação imunológica foi realizada usando-se ensaios de proliferação de incorporação de timidina rotulada com trítio. Uma alíquota de linfócitos de nodo Sentinela foi posta de lado para esta finalidade, uma única suspensão de célula de linfócitos de nodo não-sentinela foi obtida por pressão suave em um homogeneizador de vidro de ajuste solto e os leucócitos de sangue periférico foram purificados por Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Heathcare).Further immunological evaluation was performed using tritium labeled thymidine incorporation proliferation assays. An aliquot of Sentinel node lymphocytes was set aside for this purpose, a single non-sentinel node lymphocyte cell suspension was obtained by gentle pressure in a loose-fitting glass homogenizer and peripheral blood leukocytes were purified by Ficoll. -PACK PLUS (Amersham Biosciences, GE Heathcare).

As células foram ressuspensas e lavadas duas vezes em RPMI 1640 (Life Technologies) contendo 2,5% de soro de bezerro fetal (FCS) (Life Technologies). Finalmente, as células foram ressuspensas em meio de proliferação RPMI 1640 contendo 10% de soro AB humano (Sigma), 1% de penicilina-estreptomicina (Sigma) e 1% de glutamina (Sigma). Células de linfonodo e PBL purificado foram usadas a 3 χ IO5 células/poço em uma placa de 96-poços e estimulados com homogeneizado de tumor diluído 1/100, 1/10 ou Con AlO μg/ml (Signa) em triplicatas. A proliferação foi medida no dia 5, 6 e 7 pela adição de 1 μΟ de 3H-Timidina/poço (Amersham) 18 horas antes da colheita. As amostras foram submetidas a contagem de cintilação. No início da cultura de célula, estímulos das células de linfonodo e PBL5 para a medição da secreção de EFN- γ, foram realizados em placas e 96 poços com 3 χ IO5 células/poço em triplicata, com homogeneizado de tumor diluído 1/10 e 1/100, ou Con A 10 μ§/πι1 (Signa). A quantidade de IFN- γ secretado foi medida com ELISA (IFN-γ Humano Duoset, R&D Systems) nos sobrenadantes de cultura em amostras reunidas das triplicatas (Figura 5). No final das culturas de células, amostras do sobrenadante foram removidas e a secreção de IFN-γ e IL-4 medida em triplicata com ELISA (IFN-Duoset Humano e Duoset-IL-4 Humano, R&D Systems) (Figura 6A e 6B).Cells were resuspended and washed twice in RPMI 1640 (Life Technologies) containing 2.5% fetal calf serum (FCS) (Life Technologies). Finally, cells were resuspended in RPMI 1640 proliferation medium containing 10% human AB serum (Sigma), 1% penicillin-streptomycin (Sigma) and 1% glutamine (Sigma). Purified PBL and lymph node cells were used at 3 x 105 cells / well in a 96-well plate and stimulated with diluted tumor homogenate 1/100, 1/10 or Con AlO μg / ml (Signa) in triplicates. Proliferation was measured on day 5, 6 and 7 by the addition of 1 μΟ of 3H-Thymidine / well (Amersham) 18 hours before harvest. The samples were subjected to scintillation counting. At the beginning of cell culture, lymph node and PBL5 cell stimuli for measurement of EFN-γ secretion were performed in plates and 96 wells with 3 x 105 cells / well in triplicate with 1/10 diluted tumor homogenate and 1/100, or Con A 10 μ§ / πι1 (Signa). The amount of secreted IFN-γ was measured with ELISA (Human IFN-γ Duoset, R&D Systems) in culture supernatants in pooled triplicate samples (Figure 5). At the end of cell cultures, supernatant samples were removed and IFN-γ and IL-4 secretion measured in triplicate with ELISA (Human IFN-Duoset and Human Duoset-IL-4, R&D Systems) (Figure 6A and 6B) .

Análises de citometria de fluxoFlow cytometry analyzes

A caracterização das células foi realizada usando-se citometria de fluxo inicialmente nas células do nodo sentinela, nodo não-sentinela, PBMC e do tumor. Do nodo sentinela, linfócitos adquiridos em amostras de cultura foram retirados cada duas a três semanas para análises de citometria de fluxo. As células foram incubadas por 30 minutos em PBS suplementado com 2% FCS e 0,05% NaN3 (tampão FACS) com anticorpos contra marcadores para subpopulações de célula imune e para ativação de linfócito (Figura 3, 4 e 5). Anticorpos conjugados com isotiocianato de Fluoresceína (FITC) contra os seguintes marcadores foram usados: CD89, HLA-DR, CD45RA, CD25, conjugados com ficoeritrina (PE): CD62L, CD19, CD45RO, CD56, conjugados com Peridinina-Clorofil-Proteina (PerCP): CD8, CD3 conjugados com aloficocianina (APC): CD4, CD14, CD8.Cell characterization was performed using flow cytometry initially on sentinel, non-sentinel, PBMC, and tumor cells. From the sentinel node, lymphocytes acquired from culture samples were taken every two to three weeks for flow cytometric analysis. Cells were incubated for 30 minutes in PBS supplemented with 2% FCS and 0.05% NaN3 (FACS buffer) with antibodies against markers for immune cell subpopulations and lymphocyte activation (Figures 3, 4 and 5). Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated antibodies against the following markers were used: CD89, HLA-DR, CD45RA, CD25, Phycoerythrin (PE) conjugates: CD62L, CD19, CD45RO, CD56, Peridinine-Chlorofil-Protein (PerCP) conjugated ): CD8, allophyllocyanine (APC) conjugated CD3: CD4, CD14, CD8.

O repertório-νβ foi examinado usando-se o kit de marca Beta (Beckman Coulter), 5 χ IO5 células/tubo foram tingidas em 10 μΐ dos 8 diferentes frascos contendo misturas de FITC, PE e anticorpos νβ TCR conjugados FITC-PE de dupla cor e com a adição de CD8 PerCP e CD4 APC em cada tubo (Figura 7).The νβ-repertoire was examined using the Beta Brand Kit (Beckman Coulter), 5 χ 10 5 cells / tube were stained in 10 μΐ of the 8 different vials containing mixtures of FITC, PE and FITC-PE conjugated double-tcr antibody. CD8 PerCP and CD4 APC in each tube (Figure 7).

Exemplo 2 Tratamento de câncer de cólon pela administração de linfócitos-T reativos a tumorExample 2 Treatment of colon cancer by administering tumor reactive T-lymphocytes

Identificação e remoção dos línfonodos sentinela e metinela de pacientes com câncer de cólonIdentification and removal of sentinel and methinel lymph nodes from colon cancer patients

Dezesseis pacientes diagnosticados com câncer de cólon, seis mulheres e dez homens com uma idade média de 62 anos, foram estudados. Os pacientes foram histopatologicamente classificados como Duke's C ou D. Houve também 5 pacientes com Duke's B com características de tumor agressivo, tais como ulcerações, invasão vascular ou perineural. Os pacientes 7 e 14, entretanto, foram anteriormente cirurgicamente tratados devido a câncer do cólon e agora tinham doença recorrente com metástases para o fígado. O comitê ético local aprovou o estudo e cada paciente forneceu consentimento informal.Sixteen patients diagnosed with colon cancer, six women and ten men with an average age of 62 years were studied. Patients were histopathologically classified as Duke's C or D. There were also 5 Duke's B patients with aggressive tumor characteristics such as ulceration, vascular or perineural invasion. Patients 7 and 14, however, were previously surgically treated for colon cancer and now had recurrent disease with liver metastases. The local ethics committee approved the study and each patient provided informal consent.

A identificação dos nodos sentinela ou metinela foi realizada intraoperativãmente. A mobilização do sítio do tumor colônico foi conseguida pela divisão das adesões peritoneais, a fim de facilitar a inspeção do tumor e mesentério. Injeções de corante azul Patente (Guerbet, Paris) foram distribuídas superficialmente na serosa em torno do tumor. Dentro de cinco minutos, um a três linfonodos mesentéricos foram coloridos azul, estes nodos sentinela foram marcados com suturas e removidos quando a ressecção estava completa. Um linfonodo mesentérico não-sentinela, distante do tumor, foi manipulado da mesma maneira.The identification of sentinel or metinel nodes was performed intraoperatively. Mobilization of the colonic tumor site was achieved by dividing the peritoneal adhesions to facilitate tumor and mesentery inspection. Patent blue dye injections (Guerbet, Paris) were distributed superficially in the serosa around the tumor. Within five minutes, one to three mesenteric lymph nodes were colored blue, these sentinel nodes were marked with sutures and removed when resection was complete. A non-sentinel mesenteric lymph node, distant from the tumor, was manipulated in the same manner.

Os linfonodos sentinela e não-sentinela foram cortados pela metade e fatias de 1 mm de espessura foram retiradas do centro e da periferia. O resto dos linfonodos foi remetido para exame hispatológico de acordo com o procedimento de rotina. Um pedaço do tumor, incluindo uma parte da margem invasiva, foi usado para preparação antígena.The sentinel and non-sentinel lymph nodes were cut in half and 1 mm thick slices were removed from the center and periphery. The rest of the lymph nodes were sent for hispatological examination according to the routine procedure. A piece of the tumor, including a portion of the invasive margin, was used for antigen preparation.

Os linfócitos obtidos dos linfonodos foram então expandidos como descrito no Exemplo 1. Administração de linfócitos-T reativos a tumor pacientes foram tratados com infusão de linfócitos autólogos expandidos como descrito no Exemplo 1. Em média 74,7 milhões ativados e clonalmente expandidos de células T foram administrados como uma transfusão. Não foram observados efeitos colaterais tóxicos, como febre, calafrios, mal-estar, retenção severa de fluido, edema pulmonar ou angústia respiratória.Lymphocytes obtained from lymph nodes were then expanded as described in Example 1. Administration of tumor-reactive T-lymphocytes patients were treated with autologous expanded lymphocyte infusion as described in Example 1. On average 74.7 million activated and clonally expanded T cells were administered as a transfusion. No toxic side effects such as fever, chills, malaise, severe fluid retention, pulmonary edema or respiratory distress were observed.

Avaliações de acompanhamentoFollow-up Evaluations

O acompanhamento incluiu exame clínico cada terceiro a sexto mês e controle de níveis de CEA. Todos os pacientes do estágio III e IV foram além disso investigados com tomografia computadorizada do tórax e abdome. Os pacientes foram acompanhados em visitas regulares em média por 13 meses (faixa de 5 - 20), o tempo de acompanhamento médio foi de 13 V2 meses. De cada 16 pacientes que tinham sido tratados com infusão de linfócitos autólogos, oito tiveram conhecimento no diagnóstico. Quatro pacientes receberam suas transfusões devido a recorrências conhecidas e deles três estão ainda sem sinais de recorrências. Um paciente foi operado devido a metástases do fígado solitárias e estiveram desde então sem recaídas. Como manifesta-se pela Figura 8 e Figura 9, um paciente com metástases de fígado localizadas em ambos os lóbulos (que tinham sido declarados incuráveis pela cirurgia de fígado), tiveram total regressão das metástases de fígado após transfusão de linfócitos reativos a tumor e, além disso, tiveram normalização dos níveis de CEA, desaparecimento de ascite e está fisicamente bem e exercitando-se regularmente. Um outro paciente com metástases de fígado tiveram regressão de metástases de fígado e fluído ascético após transfusão (vide Figura 10, 11 e 12). Um paciente teve, três meses após transfusão, regressão das metástases do fígado e pulmões (vide figura 13, 14, 15 e 16) com um nível de CEA quase normalizado a 5,9 (Normal < 4,0), desaparecimento de ascite e ele mostra-se clinicamente saudável. ResultadosFollow-up included clinical examination every third to sixth month and control of CEA levels. All stage III and IV patients were further investigated with computed tomography of the chest and abdomen. Patients were followed at regular visits on average for 13 months (range 5 - 20), mean follow-up time was 13 V2 months. Of every 16 patients who had been treated with autologous lymphocyte infusion, eight were aware of the diagnosis. Four patients received their transfusions due to known recurrences and three of them are still without signs of recurrences. One patient underwent surgery due to solitary liver metastases and have since been relapsed. As shown in Figure 8 and Figure 9, a patient with liver metastases located in both lobes (who had been declared incurable by liver surgery) had complete regression of liver metastases following tumor reactive lymphocyte transfusion and, In addition, they have normalized CEA levels, disappearance of ascites and are physically well and exercising regularly. Another patient with liver metastases had regression of liver metastases and ascetic fluid after transfusion (see Figures 10, 11 and 12). One patient had, three months after transfusion, regression of liver and lung metastases (see figures 13, 14, 15 and 16) with a nearly normalized CEA level of 5.9 (Normal <4.0), ascites disappearance and He is clinically healthy. Results

Dezesseis pacientes com câncer de cólon ou metástases de fígado colo-retais solitárias foram operados no South Stockholm General Hospital e incluídos no estudo. Os locais primários dos tumores eram três no ceco, 4 no cólon ascendente, 1 no cólon descendente, 7 no cólon sigmóide e 1 no reto. Sete hemicolectomias laterais direitas, 1 hemicolectomia lateral esquerda, 7 ressecções sigmóides e 1 retoamputação foram realizadas. Dois pacientes tinham sido anteriormente operados com retoamputação e ressecção sigmóide; eles agora sofreram ressecções parciais do fígado devido a metástases do fígado. Um paciente teve recorrências em dois locais abdominais e tinham sido anteriormente operados devido a um tumor no ceco. Em nossa operação, dois nodos sentinela drenando a metástase foram identificados, um no mesentério colônico e um no mesentério do intestino delgado. Uma ressecção prolongada da região ileocolônica anastomótica com mesenteria foi realizada.Sixteen patients with colon cancer or solitary colorectal liver metastases were operated on at the South Stockholm General Hospital and included in the study. Primary tumor sites were three in the cecum, 4 in the ascending colon, 1 in the descending colon, 7 in the sigmoid colon, and 1 in the rectum. Seven right lateral hemicolectomies, 1 left lateral hemicolectomy, 7 sigmoid resections and 1 retraining were performed. Two patients had previously undergone surgery with retraining and sigmoid resection; they have now suffered partial liver resections due to liver metastases. One patient had recurrences at two abdominal sites and had previously been operated on for a caecum tumor. In our operation, two sentinel nodes draining metastasis were identified, one in the colonic mesentery and one in the small intestine mesentery. A prolonged resection of the anastomotic ileocolonic region with mesentery was performed.

Em todos os pacientes, um a três (média 2,1) nodo(s) sentinelas foram identificados intraoperativamente por injeções de azul patente peritumorais. Entre os pacientes com ressecção colônica primária, em média 15,8 linfonodos foram recuperados de cada espécime. Após investigação histopatológica destes linfonodos, cinco pacientes foram classificados como pacientes Duke's C e 5 pacientes como Duke's B, todos eles foram classificados como tumores de alto risco, devido a crescimento de células tumorais ao longo dos nervos e nos vasos em investigação anatômica patológica. Cinco pacientes tiveram metástases distantes e foram em uma ocasião de ressecção metastática classificados como Duke's D. Dois pacientes deles tiveram metástase de fígado solitárias. Além disso, nodos sentinela foram também analisados por FACS (classificador de célula ativada por Fluorescência) e anticorpos contra citoceratina 20, que é expressa por tumores de câncer do cólon, para fins de detectar micrometástases. As avaliações da citoceratina 20 dos linfonodos por citometria de fluxo estavam de acordo com o diagnóstico anatômico patológico (não mostrado), exceto em um caso em que um nodo sentinela negativo falso (de acordo com análise histopatológica) era positivo na análise FACS de citoceratina 20.In all patients, one to three (mean 2.1) sentinel nodes were identified intraoperatively by peritumoral patent blue injections. Among patients with primary colonic resection, an average of 15.8 lymph nodes were recovered from each specimen. Following histopathological investigation of these lymph nodes, five patients were classified as Duke's C patients and 5 patients as Duke's B, all of which were classified as high-risk tumors due to tumor cell growth along nerves and vessels in pathological anatomical investigation. Five patients had distant metastases and were on one occasion metastatic resection classified as Duke's D. Two of them had solitary liver metastases. In addition, sentinel nodes were also analyzed by FACS (Fluorescence-Activated Cell Classifier) and antibodies against cytokine 20, which is expressed by colon cancer tumors, for the purpose of detecting micrometastases. Flow cytometry cytoceratin 20 assessments of lymph nodes were in accordance with the pathological anatomical diagnosis (not shown), except in one case where a false negative sentinel node (according to histopathological analysis) was positive on the cytoceratin 20 FACS analysis. .

O nodo sentinela é o primeiro linfonodo drenando o tumor e é, portanto, o primeiro sítio de metástase de linfonodo (Dahl et al.), porém o nodo sentinela é também o sítio primário para a ativação do sistema imune. As células tumorais, escombros, células necróticas e células apresentando antígeno acumulam-se no nodo sentinela, onde ocorrem a apresentação, ativação e expansão clonal das células T direcionadas contra o tumor. Os presentes inventores aproveitaram esta população de células T expandidas in vivo de linfócitos adquiridos de nodo sentinela para cultura, expansão e transfusão de célula in vitro.The sentinel node is the first lymph node draining the tumor and is therefore the first lymph node metastasis site (Dahl et al.), But the sentinel node is also the primary site for immune system activation. Tumor cells, debris, necrotic cells, and antigen-bearing cells accumulate in the sentinel node, where T-cell presentation, activation, and expansion against the tumor occur. The present inventors took advantage of this in vivo expanded T cell population of sentinel node acquired lymphocytes for in vitro cell culture, expansion and transfusion.

Os linfócitos adquiridos de nodo sentinela é uma população de células T ativadas e clonalmente expandidas contra antígenos tumorais, que podem eficientemente ser colhidas durante o procedimento cirúrgico. Ao contrário dos recentes experimentos de imunoterapia focalizando-se em células T citotóxicas, o objetivo dos presentes inventores foi criar um protocolo para intensificação in vitro da expansão clonal iniciada in vivo de células auxiliares T. As células auxiliares T parecem ser necessárias para a função eficaz das células T citotóxicas e para a criação das células de memória. Além disso, em um sistema transgênico de receptor de célula-T objetivando um antígeno de células das ilhotas, a transfusão das células Thl foi constatada ser suficiente para a destruição das células β e desenvolvimento do diabete melito. Cultura in vitro de linfócitos adquiridos de nodo sentinela resultou em uma ativação de Thl e expansão clonal de células auxiliares T, como indicado pela produção dominante do IFN-γ de citocina Thl de marca de autenticidade e o enriquecimento de um repertório νβ TCR restringido. O homogeneizado tumoral usado para expandir as células T é provável ser endocitosado e processado pelas células apresentando antígeno para apresentação de classe II resultando na ativação das células auxiliares T CD4+, resultando na expansão favorecendo as células auxiliares T. Por apresentação cruzada, os antígenos absorvidos por endocitose podem ser processados e apresentados na bolsa classe I, resultando em ativação de células T citotóxicas CD8+. Interessantemente, em alguns casos os inventores constataram expansão clonal de células tanto CD4+ como CD8+.Sentinel node acquired lymphocytes are a population of activated and clonally expanded T cells against tumor antigens that can be efficiently harvested during the surgical procedure. Contrary to recent immunotherapy experiments focusing on cytotoxic T cells, the aim of the present inventors was to create a protocol for in vitro intensification of clone-initiated in vivo T helper cell expansion. T helper cells appear to be necessary for effective function. cytotoxic T cells and for the creation of memory cells. Moreover, in a transgenic T-cell receptor system targeting an islet cell antigen, Thl cell transfusion was found to be sufficient for the destruction of β cells and the development of diabetes mellitus. In vitro culture of sentinel node acquired lymphocytes resulted in Th1 activation and clonal expansion of T helper cells, as indicated by the dominant production of the authenticity-tagged Thl cytokine IFN-γ and the enrichment of a restricted νβ TCR repertoire. Tumor homogenate used to expand T cells is likely to be endocytosed and processed by class II presenting antigen presenting cells resulting in activation of CD4 + T helper cells, resulting in expansion favoring T helper cells. Endocytosis can be processed and presented in the class I pouch, resulting in activation of CD8 + cytotoxic T cells. Interestingly, in some cases the inventors have found clonal expansion of both CD4 + and CD8 + cells.

O número médio de linfócitos adquiridos de nodo sentinela no início da expansão foi de 107,4 milhões de células (faixa 3,6 - 509 milhões, média 70 milhões). As células foram caracterizadas por citometria de fluxo. A relação entre as células CD4+ e CD8+ no início foi na média de 4,9 (faixa de 0,36 - 10, média 5,4) indicando uma expansão de células auxiliares CD4+ nos nodos sentinela comparada com a relação de CD4/CD8 no sangue periférico (faixa normal 1,0 - 2,5) (figura 2A). Além disso, linfócitos B (CD 19) e células matadoras naturais (NK) (CD 56) estavam presentes nos nodos sentinela (não mostrados). As células foram mantidas em cultura em média 36,1 dias (faixa de 23 - 58 dias), média de 33 dias. As células foram monitoradas rigorosamente por citometria de fluxo pelo menos semanalmente. Inicialmente, o número total de células diminuiu. As células B e células NK desapareceram quase completamente e o número de células matadoras T CD8+ foi diminuído. O procedimento de cultura usado promoveu principalmente a expansão das células auxiliares, uma vez que a relação média de CD4/CD8 foi de 92,5. O re-estímulo com antígeno de tumor autólogo resultou em expansão clonal das células T reativas a tumor, como avaliado investigando-se o repertório νβ do receptor de célula-T dos linfócitos adquiridos do nodo sentinela, antes e após cultura in vitro.The average number of sentinel node acquired lymphocytes at the beginning of the expansion was 107.4 million cells (range 3.6 - 509 million, average 70 million). The cells were characterized by flow cytometry. The relationship between CD4 + and CD8 + cells at baseline was an average of 4.9 (range 0.36 - 10, mean 5.4) indicating an expansion of CD4 + helper cells at sentinel nodes compared with the CD4 / CD8 ratio at peripheral blood (normal range 1.0 - 2.5) (Figure 2A). In addition, B lymphocytes (CD 19) and natural killer cells (NK) (CD 56) were present in sentinel nodes (not shown). Cells were maintained in culture on average 36.1 days (range 23 - 58 days), average 33 days. Cells were closely monitored by flow cytometry at least weekly. Initially, the total number of cells decreased. B cells and NK cells disappeared almost completely and the number of CD8 + T killer cells was decreased. The culture procedure used mainly promoted the expansion of helper cells, since the average ratio of CD4 / CD8 was 92.5. Re-stimulation with autologous tumor antigen resulted in clonal expansion of tumor-reactive T cells, as assessed by investigating the T cell receptor repertoire of sentinel node acquired lymphocytes before and after in vitro culture.

Antes da transfusão, as células T expandidas foram funcionalmente testadas contra antígenos de tumor autólogos medindo-se a ativação e a produção de citocina do IFN-γ de citocina Thl e IL-4 da citocina Th2. Os linfócitos adquiridos do nodo sentinela expandido in vitro responderam no re-estímulo com antígeno tumoral com a produção de IFN-g e nenhum ou muito pouco IL-4, indicando que as células T expandidas eram funcionais e responsivas a Th 1.Prior to transfusion, expanded T cells were functionally tested against autologous tumor antigens by measuring cytokine IFN-γ Th1 and IL-4 cytokine IFN-γ activation and production. Lymphocytes acquired from the in vitro expanded sentinel node responded by re-stimulating tumor antigen with IFN-g production and no or very little IL-4, indicating that the expanded T cells were functional and responsive to Th 1.

Seis pacientes com Duke's D foram tratados no estudo. Dois pacientes estagiados como Duke's D na cirurgia com metástases para o fígado e para os pulmões e fígado, respectivamente, exibiram regressão marcante da doença (pat 5 e 12). Após transfusão dos linfócitos, o primeiro paciente teve regressão total das metástases do fígado localizadas em ambos os lóbulos (que tinham sido declaradas incuráveis pela cirurgia do fígado) (figura 3), normalização dos níveis de CEA, desaparecimento do ascite e mostrou-se saudável. O Paciente 12 mostrou regressão das metástases do fígado e pulmões com um nível de CEA quase normalizado a 5,9 (Normal < 4,0), desaparecimento do ascite e mostrou-se clinicamente saudável. O paciente 1 exibiu uma regressão do tamanho da metástase do fígado e inicialmente uma diminuição dos níveis de CEA, desaparecimento do ascite e estava em excelente forma quando repentinamente morreu (dia 191), o que parece ter sido um embolia pulmonar. Dois pacientes de Duke's D exibiram doença estável, sem progressão da metástase ou aumento dos níveis de CEA. A paciente mais idosa no. 7 do estudo apresentou doença estável por cinco meses, porém em seguida, os níveis de CEA começaram a aumentar e morreu na idade de 83. Não foi realizada autópsia. Um paciente estagiou como Duke's C na cirurgia, porém logo desenvolveu metástase para o fígado e pulmões (Duke's D), porém em seguida a transfusão e quimioterapia uma regressão das metástases do pulmão e fígado foram vistas com somente níveis de CEA ligeiramente elevados. Os pacientes classificados como Duke's C todos tinham níveis normais de CEA e mostraram-se sem quaisquer sinais de recorrência radiológica ou clínica da doença. Quatro dos pacientes Duke's B são saudáveis, com níveis de CEA normais e não têm sinais de doença recorrente. O paciente no. 9, classificado como Duke's B, porém com um tumor de crescimento agressivo, mostra sinais de doença recorrente com elevados níveis de CEA (67) e sinais de metástases de fígado.Six patients with Duke's D were treated in the study. Two staged Duke's D patients undergoing liver and lung and liver metastasis surgery, respectively, exhibited marked regression of the disease (pat 5 and 12). After lymphocyte transfusion, the first patient had complete regression of liver metastases located in both lobes (which had been declared incurable by liver surgery) (Figure 3), normalization of CEA levels, disappearance of ascites, and healthy. . Patient 12 showed regression of liver and lung metastases with a nearly normalized CEA level of 5.9 (Normal <4.0), ascites disappearance, and was clinically healthy. Patient 1 exhibited a regression of liver metastasis size and initially decreased CEA levels, disappearance of ascites and was in excellent shape when he suddenly died (day 191), which appears to have been a pulmonary embolism. Two Duke's D patients exhibited stable disease without metastasis progression or increased CEA levels. The oldest patient no. 7 of the study had stable disease for five months, but then CEA levels began to rise and died at the age of 83. No autopsy was performed. One patient interned as Duke's C at surgery, but soon developed liver and lung metastasis (Duke's D), but after transfusion and chemotherapy a regression of lung and liver metastases were seen with only slightly elevated CEA levels. The patients classified as Duke's C all had normal CEA levels and showed no signs of radiological or clinical recurrence of the disease. Four of Duke's B patients are healthy, with normal CEA levels and have no signs of recurrent disease. The patient no. 9, classified as Duke's B, but with an aggressive growth tumor, shows signs of recurrent disease with high levels of CEA (67) and signs of liver metastases.

Para investigar o fato de células T transfundidas, os presentes inventores analisaram a proliferação das células T em relação ao extrato de tumor no sangue periférico. Como mencionado antes, eles não puderam demonstrar qualquer reatividade de célula T no sangue periférico contra antígenos de tumor autólogos em quaisquer dos pacientes antes da transfusão. Entretanto, fomos capazes de detectar a proliferação de células T contra os antígenos de tumor autólogos no sangue periférico em todos os pacientes investigados até 10 meses após a transfusão, indicando a presença de células T reativas a tumor circulantes clonalmente expandidas. Resumo das características dos pacientesTo investigate the fact of transfused T cells, the present inventors analyzed the proliferation of T cells in relation to peripheral blood tumor extract. As mentioned before, they could not demonstrate any peripheral blood T cell reactivity against autologous tumor antigens in any of the patients prior to transfusion. However, we were able to detect T cell proliferation against autologous peripheral blood tumor antigens in all patients investigated within 10 months after transfusion, indicating the presence of clonally expanded circulating tumor reactive T cells. Summary of patient characteristics

Embaixo é apresentada uma tabela de todos os participantes do estudo, escolhidos após a classificação de Duke na cirurgia: Características dos participantesBelow is a table of all study participants chosen after Duke's classification in surgery: Characteristics of the participants

<table>table see original document page 40</column></row><table> 65/M O 270 82/15 ND 36 CR 42/F D 80 65/11 NO 33 CR &2/F D 40 98/0.1 ND 6 SD 74/M O 130 73/22 142 30 CR 33/M D 72 72/15 908 12 PR 66/M D 25 37/27 764 26 PR<table> table see original document page 40 </column> </row> <table> 65 / M O 270 82/15 ND 36 CR 42 / F D 80 65/11 NO 33 CR & 2 / F D 40 98 / 0.1 ND 6 SD 74 / M O 130 73/22 142 30 CR 33 / M D 72 72/15 908 12 PR 66 / M D 25 37/27 764 26 PR

a) Os números representam a percentagem de células positivas CD4 e CD8, detectadas com FACS.a) The numbers represent the percentage of CD4 and CD8 positive cells detected with FACS.

ExameExam

Do conhecimento dos presentes inventores, a imunoterapia baseado em nodo sentinela ou metinela, em pacientes com câncer de cólon, nunca foi apresentada antes. Assim, esta é a primeira tentativa de utilizarem- se linfócitos adquiridos de nodos sentinela ou metinela para terapia. Há algumas diferenças principais entre o presente estudo e, p. ex., o tratamento com IL-2 de alta dose (Rosenberg). Primeiramente, o uso de linfócitos adquiridos de nodo sentinela, que foram estimulados in vitro por homogeneizado de tumor autólogo e APCs, provoca uma resposta imune celular altamente específica em relação ao tumor. Somente as células T com alta afinidade para o tumor primário sobreviverão até a transfusão. Em um tratamento generalizado sistêmico com alta dose de IL-2 intravenosamente em pacientes, todos os linfócitos serão igualmente estimulados e razoavelmente somente uma muito pequena fração deles são específicos de tumor. Os presentes inventores acreditam que, uma vez que o(s) nodo(s) sentinela são os primeiros drenando linfonodos para um tumor, haverá um excessivo acúmulo de linfócitos específicos de tumor. A proliferação e transfusão de células T verdadeiras reconhecendo tumor deve criar uma reação específica de tumor maciço. Em segundo lugar, o regime de IL-2 de alta dose provoca alta toxicidade e severas complicações, longos períodos de tratamento e altos custos. As transfusões de acordo com o presente método foram feitas sem complicações durante cerca de uma hora e os pacientes foram com freqüência descarregados no mesmo dia. Em terceiro lugar, o presente protocolo aponta em direção à expansão das células auxiliares T dos nodos sentinela, ao contrário da expansão das células T citotóxicas, colhidas como linfócitos de infiltração de tumor.To the knowledge of the present inventors, sentinel or metinel node-based immunotherapy in colon cancer patients has never been presented before. Thus, this is the first attempt to use sentinel or metinel node lymphocytes for therapy. There are some major differences between the present study and, e.g. treatment with high dose IL-2 (Rosenberg). First, the use of acquired sentinel node lymphocytes, which were stimulated in vitro by autologous tumor homogenate and APCs, elicits a highly tumor-specific cellular immune response. Only T cells with high affinity for the primary tumor will survive until transfusion. In a generalized systemic treatment with high dose IL-2 intravenously in patients, all lymphocytes will be equally stimulated and reasonably only a very small fraction of them are tumor specific. The present inventors believe that since the sentinel node (s) are the first ones draining lymph nodes to a tumor, there will be an excessive accumulation of tumor-specific lymphocytes. The proliferation and transfusion of true tumor-recognizing T cells should create a massive tumor-specific reaction. Second, the high-dose IL-2 regimen causes high toxicity and severe complications, long treatment periods and high costs. Transfusions according to the present method were uncomplicated for about one hour and patients were often discharged on the same day. Thirdly, the present protocol points toward the expansion of sentinel node T helper cells, as opposed to the expansion of cytotoxic T cells harvested as tumor infiltrating lymphocytes.

Este estudo mostra que os linfócitos adquiridos de nodo sentinela recentemente isolados possuem uma capacidade proliferativa in vitro em relação ao homogeneizado de tumor autólogo e podem, sem complicações, ser transfundidos no paciente como imunoterapia adotiva. Há uma forte indicação que o tratamento com linfócitos adquiridos de nodo sentinela expandido pode melhorar o resultado de pacientes com alto risco de câncer de cólon disseminado, bem como pacientes sofrendo de tipos de sólido de câncer.This study shows that newly isolated sentinel node acquired lymphocytes have an in vitro proliferative capacity relative to the autologous tumor homogenate and can, without complications, be transfused into the patient as adoptive immunotherapy. There is a strong indication that treatment with expanded sentinel node acquired lymphocytes may improve the outcome of patients at high risk of disseminated colon cancer, as well as patients suffering from solid cancer types.

Claims

1. Método para a expansão de linfócitos T auxiliares CD4+ e/ou linfócitos T CD8+ reativos a tumor, caracterizado pelo fato de compreender i) uma primeira fase de estimular linfócitos T auxiliares CD4+ e/ou linfócitos T CD8+ reativos a tumor com antígeno derivado de tumor, junto com pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, para promover a sobrevivência de linfócitos T auxiliares CD4+ e/ou linfócitos T CD8+; e ii) uma segunda fase de ativar e promover o crescimento de linfócitos T auxiliares CD4+ e/ou linfócitos T CD8+ reativos a tumor, em que a segunda fase ii) é iniciada quando o marcador de superfície das células CD25 (ou marcador IL-2R) é regulado negativamente nos linfócitos T auxiliares CD4+ e/ou linfócitos T CD8+.1. Method for the expansion of tumor-reactive CD4 + helper T lymphocytes and / or CD8 + T lymphocytes, comprising (i) a first step of stimulating tumor-reactive antigen-derived CD4 + helper T lymphocytes and / or CD8 + T-reactive tumor, together with at least one substance having IL-2 receptor agonist activity, to promote survival of CD4 + helper T lymphocytes and / or CD8 + T lymphocytes; and ii) a second phase of activating and promoting growth of CD4 + helper T lymphocytes and / or tumor reactive CD8 + T lymphocytes, wherein second phase ii) is initiated when the CD25 cell surface marker (or IL-2R marker ) is down-regulated on CD4 + helper T lymphocytes and / or CD8 + T lymphocytes.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a regulação negativa ser definida como aquela que 5% ou menos da população de linfócitos-T expressa CD25.Method according to claim 1, characterized in that the down-regulation is defined as that which 5% or less of the T-lymphocyte population expresses CD25.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de os linfócitos-T estarem presentes em um meio de cultura.Method according to claim 1 or 2, characterized in that the T-lymphocytes are present in a culture medium.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o meio de cultura ser um meio livre de soro, tal como, p. ex., meio AIMV.Method according to claim 3, characterized in that the culture medium is a serum free medium, such as e.g. eg, AIMV medium.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a primeira fase i) ser iniciada adicionando-se a pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the first step i) is initiated by adding to at least one substance having IL-2 receptor agonist activity.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 é IL-2.Method according to claim 5, characterized in that the substance having IL-2 receptor agonist activity is IL-2.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de IL-2 ser adicionado em uma baixa dose, tal como, p. ex., de cerca de -100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 700 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 600 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 500 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 400 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de -300 IU/ml de meio de cultura e de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 200 IU/ml de meio de cultura.Method according to claim 6, characterized in that IL-2 is added at a low dose, such as e.g. from about -100 IU / ml culture medium to about 700 IU / ml culture medium, from about 100 IU / ml culture medium to about 600 IU / ml culture medium, from about 100 IU / ml of culture medium to about 500 IU / ml of culture medium, from about 100 IU / ml of culture medium to about 400 IU / ml of culture medium, from about 100 IU / ml culture medium to about -300 IU / ml culture medium and about 100 IU / ml culture medium to about 200 IU / ml culture medium.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de mais uma quantidade da pelo menos uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 ser adicionada regularmente por toda a fase i), tal como, p. ex., cada 2o., 3o. ou -4o. dia de fase i).Method according to any one of the preceding claims, characterized in that a further amount of the at least one substance having IL-2 receptor agonist activity is added regularly throughout step i), such as, e.g. eg every 2nd, 3rd. or -4o. phase day i).

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de a substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 ser IL-2.A method according to claim 8, characterized in that the substance having IL-2 receptor agonist activity is IL-2.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a concentração de IL-2 adicionado ser de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 700 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 600 IU/ml de meio de cultura, de cerca de -100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 500 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 400 IU/ml de meio de cultura, de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 300 IU/ml de meio de cultura e de cerca de 100 IU/ml de meio de cultura a cerca de 200 IU/ml de meio de cultura.Method according to claim 9, characterized in that the concentration of IL-2 added is from about 100 IU / ml of culture medium to about 700 IU / ml of culture medium, from about 100 IU. / ml of culture medium to about 600 IU / ml of culture medium, from about -100 IU / ml of culture medium to about 500 IU / ml of culture medium, from about 100 IU / ml of culture medium to about 400 IU / ml culture medium, about 100 IU / ml culture medium to about 300 IU / ml culture medium and about 100 IU / ml culture medium to about 200 IU / ml culture medium.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser adicionado do dia 2 ao e incluindo dia 5 da primeira fase i), tal como, p. ex., no dia 2, no dia 3, no dia 4 ou no dia 5.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the tumor-derived antigen is added from day 2 to and including day 5 of the first phase i), such as, e.g. eg on day 2, day 3, day 4 or day 5.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 10, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser adicionado essencialmente ao mesmo tempo que quando a fase i) é iniciada ou no máximo até 3 dias após.Method according to any one of claims 1 - 10, characterized in that the tumor-derived antigen is added at essentially the same time as when phase i) is started or up to 3 days thereafter.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser um homogeneizado desnaturado de um tumor.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the tumor-derived antigen is a denatured homogenate of a tumor.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser autólogo.Method according to claim 13, characterized in that the tumor-derived antigen is autologous.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the tumor-derived antigen is a protein, polypeptide or peptide.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a segunda fase ii) ser iniciada do dia -17 ao e incluindo dia 23 da primeira fase i), tal como, p. ex., no dia 17, no dia -18, no dia 19, no dia 20, no dia 21, no dia 22 ou no dia 23.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second phase ii) is started from day 17 to 17 and includes day 23 of the first phase i), such as e.g. eg on the 17th, the -18th, the 19th, the 20th, the 21st, the 22nd or the 23rd.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a segunda fase ser iniciada pela adição de antígeno derivado de tumor aos linfócitos-T, para ativar os linfócitos-T negativos-CD25, reativos a tumor.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second phase is initiated by the addition of tumor-derived antigen to T-lymphocytes to activate tumor-reactive CD25-negative T-lymphocytes.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser autólogo.Method according to claim 17, characterized in that the tumor-derived antigen is autologous.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser um homogeneizado desnaturado de um tumor.Method according to claim 17 or 18, characterized in that the tumor-derived antigen is a denatured homogenate of a tumor.

20. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de o antígeno derivado de tumor ser uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo de tumor.Method according to claim 17 or 18, characterized in that the tumor-derived antigen is a tumor protein, polypeptide or peptide.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -17 - 20, caracterizado pelo fato de compreender ainda a adição aos linfócitos- T de células apresentando antígeno, junto com o antígeno derivado de tumor.A method according to any one of claims 17 further comprising adding to T-lymphocytes antigen-bearing cells together with the tumor-derived antigen.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de as células apresentando antígeno serem leucócitos sangüíneos periféricos irradiados, contendo células-B e/ou monócitos apresentando antígeno.The method according to claim 21, wherein the antigen presenting cells are irradiated peripheral blood leukocytes containing B-cells and / or antigen presenting monocytes.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a segunda fase ii) compreender adicionar pelo menos uma substância capaz de regular ascendentemente IL- -12R dos linfócitos-T.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second step (ii) comprises adding at least one substance capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de a(s) substância(s) capaz(es) de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T ser(em) substância(s) tendo atividade agonista em relação a um receptor de interferon.The method according to claim 23, wherein the substance (s) capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R is substance (s) having agonist activity with respect to an interferon receptor.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de a(s) substância(s) tendo atividade agonista em relação a um receptor de interferon ser um interferon.The method of claim 24, wherein the substance (s) having agonist activity with respect to an interferon receptor is an interferon.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de a(s) substância(s) tendo atividade agonista em relação a um receptor de interferon ser interferon-a.A method according to claim 25, wherein the substance (s) having agonist activity with respect to an interferon receptor is interferon-a.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -23 - 26, caracterizado pelo fato de a(s) substância(s) capaz(es) de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T, tais como, p. ex., uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor de interferon, ser adicionada(s) quando o nível de IL-12 for de pelo menos 1 vez, tal como, p. ex., pelo menos 2, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes aumentado, em comparação com o nível de IL-12 no dia 1 da fase ii).A method according to any one of claims 23 to 26, characterized in that the substance (s) capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R, such as, e.g. eg, a substance having interferon receptor agonist activity, will be added when the IL-12 level is at least 1 time, such as e.g. at least 2, at least 3 times, at least 4 times, or at least 5 times increased compared to IL-12 level on day 1 of phase ii).

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -23 - 27, caracterizado pelo fato de a substância capaz de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T, tal como, p. ex., uma substância tendo atividade agonista em relação a um receptor de interferon, ser adicionada do dia 2 ao e incluindo dia 4 após iniciar a segunda fase ii), tal como, p. ex. no dia 2, no dia 3 ou no dia 4.A method according to any one of claims 23 to 27, characterized in that the substance capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R, such as e.g. e.g., a substance having agonist activity towards an interferon receptor, be added from day 2 to and including day 4 after starting the second phase ii), such as e.g. ex. on day 2, day 3 or day 4.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a segunda fase ii) compreender adicionar uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento de linfócitos-T tipo Th2.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second step (ii) comprises adding one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2 ser(em) uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL-IO e/ou TGF-beta.Method according to claim 29, characterized in that one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes are (in) one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL- IO and / or TGF-beta.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de a uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL- -10, e/ou TGF-beta serem anticorpo anti IL-5 e/ou anticorpo anti IL-10.The method according to claim 30, wherein one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10, and / or TGF-beta are anti-IL-5 and / or anti IL-10 antibody.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -29 — 31, caracterizado pelo fato de a uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento de linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL-10, e/ou TGF- beta ser(em) adicionada(s) no dia 1 da segunda fase ii).Method according to any one of claims 29 to 31, characterized in that one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes, such as, e.g. one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10, and / or TGF-beta will be added on day 1 of the second phase (ii).

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -29 - 31, caracterizado pelo fato de a uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL-IO e/ou TGF- beta, ser(em) adicionada(s) em uma etapa subseqüente após a adição da substância capaz de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T.Method according to any one of claims 29 to 31, characterized in that one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes, such as, e.g. one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10 and / or TGF-beta, are added at a subsequent stage after the addition of the substance capable of upwardly regulating IL -12R of T-lymphocytes.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de a uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, EL-10 e/ou TGF-beta, ser adicionada um dia após a adição da substância capaz de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T.A method according to claim 33, characterized in that one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes, such as, e.g. For example, one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, EL-10 and / or TGF-beta may be added one day after the addition of the substance capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de uma outra quantidade da uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL-10, e/ou TGF-beta ser(em) adicionada(s) regularmente através da fase ii).A method according to any one of the preceding claims, characterized in that another amount of one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes, such as, e.g. e.g., one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10, and / or TGF-beta will be added regularly through step ii).

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de uma outra quantidade da uma ou mais substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2, tais como, p. ex., uma ou mais substâncias capazes de neutralizar IL-4, IL-5, IL-10, e/ou TGF- beta, ser(em) adicionadas em cada 2°, 3° ou 4° dia de fase ii).A method according to claim 35, characterized in that another amount of one or more substances capable of antagonizing the development of Th2-type T-lymphocytes, such as, e.g. e.g., one or more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10, and / or TGF-beta, to be (em) added every 2nd, 3rd or 4th day of phase ii).

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de uma outra quantidade de uma substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 ser(em) adicionada(s) regularmente através da fase ii).A method according to any one of the preceding claims, characterized in that another amount of a substance having IL-2 receptor agonist activity is regularly added through step ii).

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato da substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 ser(em) adicionadas em cada 2°, 3° ou 4° dia de fase ii), tais como, p. ex., cada 3° dia.A method according to claim 37, characterized in that the substance having IL-2 receptor agonist activity is (em) added at every 2nd, 3rd or 4th day of phase ii), such as, e.g. . eg every 3rd day.

39. Método de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato da substância tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2 ser IL-2.A method according to claim 37 or 38, characterized in that the substance having IL-2 receptor agonist activity is IL-2.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato da segunda fase ii) compreender adicionar uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Thl.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second step (ii) comprises adding one or more substances promoting the development of Th1-type T-lymphocytes.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Thl ser(em) substâncias tendo atividade agonista em relação a IL-7, IL-12, IL-15 e/ou Receptor IL-2LA method according to claim 40, wherein one or more substances promoting the development of Th1-type T-lymphocytes are (in) substances having agonist activity with respect to IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-2L Receiver

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias ser(em) selecionada(s) de IL-7, IL-12, IL-15 eIL-21.Method according to claim 41, characterized in that one or more substances are selected from IL-7, IL-12, IL-15 and IL-21.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -40-42, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Thl, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação a IL-7, IL-12, IL-15 e/ou Receptor IL-21 ser(em) adicionada(s) quando o nível de IFN-gama for aumentado, em comparação com o nível de IFN-gama no início da segunda fase ii).A method according to any one of claims -40-42, characterized in that one or more substances promote the development of Th1-type T-lymphocytes, such as, e.g. substances having agonist activity in relation to IL-7, IL-12, IL-15 and / or IL-21 Receptor are added when the IFN-gamma level is increased compared to IFN-gamma level at the beginning of the second phase ii).

44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato do nível aumentado de IFN-gama ser determinado como pelo menos um aumento de 1 vez no nível de IFN-gama, tais como, p. ex., pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, em comparação com o nível de IFN-gama no início da segunda fase ii).The method according to claim 43, characterized in that the increased level of IFN-gamma is determined as at least a 1-fold increase in the level of IFN-gamma, such as e.g. eg at least 2 times, at least 3 times, at least 4 times compared to the IFN-gamma level at the beginning of the second stage ii).

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -40-44, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Thl, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação a IL-12, IL-15 e/ou Receptor IL-21 ser(em) adicionada(s) quando CD25 e/ou CD69 forem regulados negativamente.A method according to any one of claims -40-44, characterized in that one or more substances promote the development of Th1-type T-lymphocytes, such as, e.g. substances having agonist activity with respect to IL-12, IL-15 and / or IL-21 Receptor are added when CD25 and / or CD69 are down-regulated.

46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -40-45, caracterizado pelo fato de a concentração de cada uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Thl, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação a IL-7, IL-12, EL-15 e/ou Receptor IL-21 adicionadas, ser de cerca de 150 IU/ml de meio de cultura a cerca de 300 IU/ml de meio de cultura, tais como, p. ex. 250 IU/ml de meio de cultura.A method according to any one of claims -40-45, characterized in that the concentration of each or more substances promotes the development of Th1-type T-lymphocytes, such as, e.g. substances having agonist activity with respect to IL-7, IL-12, EL-15 and / or IL-21 Receptor added, should be about 150 IU / ml of culture medium to about 300 IU / ml of culture medium such as e.g. ex. 250 IU / ml culture medium.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -40-46, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Th 1, tais como, p. ex., substâncias tendo atividade agonista em relação a IL-12, IL-15 e/ou Receptor IL-21, ser(em) adicionada(s) do dia 5 ao e incluindo dia 8 após iniciar a segunda fase ii), tais como, no dia 5, dia 6, dia 7 ou dia 8.A method according to any one of claims -40-46, characterized in that one or more substances promote the development of Th1 T-lymphocytes, such as, e.g. substances having agonist activity with respect to IL-12, IL-15 and / or IL-21 Receptor, be added from day 5 to and including day 8 after starting the second phase ii), such as like on day 5, day 6, day 7 or day 8.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a preparação dos Linfócitos-T auxiliares CD4+.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is for the preparation of the helper CD4 + T-lymphocytes.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a preparação dos linfócitos-T efetores.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is for the preparation of effector T-lymphocytes.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de linfócitos-T da memória.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is for the preparation of memory T-lymphocytes.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de Linfócitos-T tipo Th 1.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that it is for the preparation of Th-1 T-lymphocytes.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de compreender ainda monitorar a expressão dos marcadores de superfície de célula, tais como, p. ex., CD25 e/ou CD69 dos linfócitos-T continuamente durante a primeira fase i) e segunda fase ii).A method according to any preceding claim, further comprising monitoring the expression of cell surface markers, such as, e.g. T-lymphocyte CD25 and / or CD69 continuously during first phase i) and second phase ii).

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de os linfócitos-T serem colhidos quando CD25 dos linfócitos-T da segunda fase ii) forem regulados negativamente.A method according to claim 52, characterized in that the T-lymphocytes are harvested when CD25 from the second phase T-lymphocytes (ii) are down-regulated.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato dos linfócitos-T serem submetidos a pelo menos um ciclo adicional de fase ii), quando CD25 dos linfócitos-T for regulado negativamente.A method according to claim 53, characterized in that the T-lymphocytes undergo at least one additional phase ii) cycle when the T-lymphocytes CD25 is down-regulated.

55. Método de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizado pelo fato de a regulação negativa ser definida como aquela em que 5% ou menos da população de linfócitos-T positivos CD4 expressa CD25.A method according to claim 53 or 54, wherein the down-regulation is defined as one in which 5% or less of the CD4-positive CD4 T-lymphocyte population expresses CD25.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato dos linfócitos-T reativos a tumor serem colhidos do dia 10 ao e incluindo dia 14 após iniciar a segunda fase ii).Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the tumor-reactive T-lymphocytes are harvested from day 10 to and including day 14 after starting the second phase ii).

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato dos linfócitos-T reativos a tumor serem purificados após colheita.A method according to claim 56, characterized in that the tumor-reactive T-lymphocytes are purified after collection.

58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapa de congelar os linfócitos-T reativos a tumor obtidos na segunda fase ii).A method according to any one of the preceding claims, further comprising a step of freezing the tumor reactive T-lymphocytes obtained in the second stage ii).

59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato dos linfócitos-T serem derivados de nodos de linfa drenando um tumor primário e/ou uma metástase, ou serem derivados de sangue.A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the T-lymphocytes are derived from lymph nodes draining a primary tumor and / or metastasis, or are derived from blood.

60. Linfócito-T reativo a tumor, caracterizado pelo fato de ser preparado de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 59.Tumor-reactive T-lymphocyte, characterized in that it is prepared according to the method as defined in any one of claims 1 - 59.

61. Linfócito-T reativo a tumor de acordo com a reivindicação -60, caracterizado pelo fato de ser um linfócito-T CD4+.Tumor-reactive T-lymphocyte according to claim -60, characterized in that it is a CD4 + T-lymphocyte.

62. Linfócito-T reativo a tumor de acordo com a reivindicação -60 ou 61, caracterizado pelo fato de ser um linfócito-T efetor.Tumor-reactive T-lymphocyte according to claim -60 or 61, characterized in that it is an effector T-lymphocyte.

63. Linfócito-T reativo a tumor de acordo com qualquer uma das reivindicações 60-62, caracterizado pelo fato de ser um linfócito-T de memória.Tumor-reactive T-lymphocyte according to any one of claims 60-62, characterized in that it is a memory T-lymphocyte.

64. Linfócito-T reativo a tumor de acordo com qualquer uma das reivindicações 60-63, caracterizado pelo fato de ser um Linfócito-T tipo Thl.Tumor-reactive T-lymphocyte according to any one of claims 60-63, characterized in that it is a Th1-type T-lymphocyte.

65. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender linfócitos-T reativos a tumor como definidos em qualquer uma das reivindicações 60-64.Pharmaceutical composition comprising tumor-reactive T-lymphocytes as defined in any one of claims 60-64.

66. Método para tratar um indivíduo sofrendo de uma doença de origem neoplásica, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de linfócitos-T reativos a tumor como definidos em qualquer uma das reivindicações 60-65.A method for treating an individual suffering from a disease of neoplastic origin, comprising administering to the individual in need an effective amount of tumor reactive T-lymphocytes as defined in any one of claims 60-65.

67. Método para realizar a regressão de tumor em um indivíduo tendo um tumor, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo em necessidade uma quantidade eficaz de linfócitos- T reativos a tumor, como definidos em qualquer uma das reivindicações 60- -65.A method for performing tumor regression in an individual having a tumor, comprising administering to the individual in need an effective amount of tumor reactive T-lymphocytes as defined in any one of claims 60-65.

68. Método de acordo com a reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo fato dos linfócitos-T reativos a tumor serem administrados intravenosa, intra-arterial, intratecal ou intraperitonealmente.Method according to claim 66 or 67, characterized in that the tumor-reactive T-lymphocytes are administered intravenously, intraarterially, intrathecally or intraperitoneally.

69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -66-68, caracterizado pelo fato de a quantidade de linfócitos-T reativos a tumor administrada ser de pelo menos 10 milhões, tal como, p. ex. pelo menos 20 milhões, pelo menos 30 milhões, pelo menos 40 milhões, pelo menos 50 milhões, pelo menos 60 milhões, pelo menos 70 milhões ou pelo menos 80 milhões.A method according to any one of claims -66-68, characterized in that the amount of tumor-reactive T-lymphocytes administered is at least 10 million, such as e.g. ex. at least 20 million, at least 30 million, at least 40 million, at least 50 million, at least 60 million, at least 70 million or at least 80 million.

70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -66-69, caracterizado pelo fato de os linfócitos-T reativos a tumor administrados serem uma combinação de linfócitos-T efetores e linfócitos-T de memória.A method according to any of claims -66-69, characterized in that the administered tumor-reactive T-lymphocytes are a combination of effector T-lymphocytes and memory T-lymphocytes.

71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de a percentagem de linfócitos-T efetores ser de cerca de 10% a cerca de 65%, tal como, p. ex., de cerca de 20% a cerca de 50% ou de cerca de 30% a cerca de 40%.71. The method of claim 70, wherein the percentage of effector T-lymphocytes is from about 10% to about 65%, such as e.g. from about 20% to about 50% or from about 30% to about 40%.

72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -66-71, caracterizado pelo fato de os linfócitos-T reativos a tumor serem autólogos.Method according to any one of claims -66-71, characterized in that the tumor-reactive T-lymphocytes are autologous.

73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 66-71, caracterizado pelo fato de os linfócitos-T reativos a tumor não serem autólogos.A method according to any one of claims 66-71, characterized in that the tumor-reactive T-lymphocytes are not autologous.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações -66-73, caracterizado pelo fato de a doença neoplásica ser selecionada de qualquer neoplasma sólido de origem epitelial, mesenquimal ou embriológica de qualquer local anatômico, tais como para neoplasmas epiteliais, p. ex., carcinomas da mama, cólon, pâncreas, bexiga, intestino delgado, próstata, cerviz, vulva, ovários; para neoplasmas mesenquimais, p. ex., sarcomas das juntas, ossos, músculos e tendões e alguns hematológicos, tais como linfomas; para neoplasmas embriológicos, p. ex., teratomas.Method according to any of claims -66-73, characterized in that the neoplastic disease is selected from any solid neoplasm of epithelial, mesenchymal or embryological origin from any anatomical site, such as for epithelial neoplasms, e.g. eg, carcinomas of the breast, colon, pancreas, bladder, small intestine, prostate, cervix, vulva, ovaries; for mesenchymal neoplasms, e.g. eg, sarcomas of the joints, bones, muscles and tendons and some haematological diseases such as lymphomas; for embryological neoplasms, p. e.g., teratomas.

75. Uso de linfócitos-T reativos a tumor, preparados de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 59, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de doença de origem neoplásica.Use of tumor-reactive T-lymphocytes prepared according to any one of claims 1-59, characterized in that they are for the preparation of a medicament for the treatment of disease of neoplastic origin.

76. Kit para uso no método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 59 ou 66 - 74, caracterizado pelo fato de compreender um meio para cultivo de linfócitos-T.A kit for use in the method as defined in any one of claims 1 - 59 or 66 - 74, characterized in that it comprises a medium for culturing T-lymphocytes.

77. Kit de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma ou mais substâncias para estimular, ativar e direcionar os linfócitos-T reativos a tumor.A kit according to claim 76, further comprising one or more substances for stimulating, activating and targeting tumor-reactive T-lymphocytes.

78. Kit de acordo com a reivindicação 76 ou 77, caracterizado pelo fato de os meios serem um meio livre de soro, tais como, p. ex., AIMY, RPMI 1640, DMEM ou MEM.Kit according to Claim 76 or 77, characterized in that the means are a serum-free medium, such as, e.g. e.g. AIMY, RPMI 1640, DMEM or MEM.

79. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-78, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias para estimular, ativar e direcionar linfócitos-T reativos a tumor serem selecionadas de antígeno derivado de tumor, substâncias tendo atividade agonista em relação ao receptor IL-2, substâncias capazes de regular ascendentemente IL-12R dos linfócitos-T, substâncias capazes de antagonizar o desenvolvimento dos linfócitos-T tipo Th2 e substâncias promovendo o desenvolvimento dos Linfócitos-T tipo Th1.Kit according to any one of claims 76-78, characterized in that one or more substances for stimulating, activating and directing tumor-reactive T-lymphocytes are selected from tumor-derived antigen, substances having receptor agonist activity. IL-2, substances capable of up-regulating T-lymphocyte IL-12R, substances capable of antagonizing the development of Th2-type T lymphocytes and substances promoting the development of Th1-type T-lymphocytes.

80. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-79, caracterizado pelo fato da uma ou mais substâncias para estimular, ativar e direcionar os linfócitos-T reativos a tumor serem selecionadas do grupo compreendendo IL-2, interferon-alfa, anticorpo anti-IL-4, anticorpo anti-IL-5, anticorpo anti- IL-10, IL-7, IL-12, IL-15 e IL-21.Kit according to any one of claims 76-79, characterized in that one or more substances for stimulating, activating and directing tumor-reactive T-lymphocytes are selected from the group comprising IL-2, interferon-alpha, anti-antibody. -IL-4, anti-IL-5 antibody, anti-IL-10 antibody, IL-7, IL-12, IL-15 and IL-21.

81. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-80, caracterizado pelo fato de compreender uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa.Kit according to any one of claims 76-80, characterized in that it comprises a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration.

82. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-81, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma seringa compreendendo um localizador de linfonodo.A kit according to any one of claims 76-81, further comprising a syringe comprising a lymph node locator.

83. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-82, caracterizado pelo fato de compreender instruções para uso.A kit according to any one of claims 76-82, characterized in that it comprises instructions for use.

84. Kit de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de as instruções serem na forma de software de computador.A kit according to claim 83, characterized in that the instructions are in the form of computer software.