BRPI0619522A2

BRPI0619522A2 - conjugados de objetivação de vetor-fosfolipìdio

Info

Publication number: BRPI0619522A2
Application number: BRPI0619522-9A
Authority: BR
Inventors: Philippe Bussat; Samir Cherkaoui; Hong Helen Fan; Bernard Lamy; Palaniappa Nanjappan; Radhakrishna Pillai; Sibylle Pochon; Bo Song; Rolf E Swenson
Original assignee: Bracco Int Bv
Priority date: 2005-12-09
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2011-10-04
Also published as: RU2008127836A; JP2013136608A; EP2359864B1; CA2631716A1; WO2007067979A3; CA2947346A1; KR20140083052A; IL191850A0; EP2359864A3; CN103204911B; KR101658439B1; ES2428964T3; AU2006321613B2; EP1966388B1; DK1966388T3; BRPI0619522B8; JP5735993B2; DK2359864T3; IL191850A; KR20090009187A

Abstract

CONJUGADOS DE OBJETIVAçãO DE VETORFOSFOLIPìDIO. A presente invenção refere-se a vetores peptídicos que têm alta afinidade de ligação a KLDR e processos para fabricação de tais vetores são proporcionados. Os vetores peptídicos podem ser conjugados a fosfolipídios e incluídos em composições de agente de contraste para ultra-som. Tais agentes de contraste para ultra-som são particularmente úteis em métodos diagnósticos e terapêuticos, tal como em formação de imagem de tecido contendo KDR e na avaliação e tratamento de processos angiogênicos associados à condições neoplásicas. A presente invenção também refere-se a processos para a produção em larga escala de conjugados de peptídeo-fosfolipídio monoméricos e diméricos altamente puros, bem como materiais precursores usados para formar os conjugados. A presente invenção ainda refere-se a processos para a produção em larga escala de conjugados de peptídeo-fosfolipídio altamente puros os quais contêm níveis muito baixos de TFA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGA- DOS DE OBJETIVAÇÃO DE VETOR-FOSFOLIPÍDIO".

PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica prioridade e o benefício do Pedido Provisório U.S. N°. 60/833.342, depositado em 25 de Maio de 2006 e Pedido Provisório U.S. N°. 60/749.240, depositado em 9 de Dezembro de 2005, os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a conjugados de fosfolipídio-vetor de objetivação e particularmente conjugados de fosfolipídio-peptídeo de ob- jetivação, os quais são úteis em composições terapêuticas e diagnosticas e métodos de preparo dos mesmos. A invenção inclui agentes de contraste de ultra-som objetivados e particularmente microbolhas objetivadas as quais incluem tais conjugados de fosfolipídio-vetor de objetivação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Angiogênese, a formação de novos vasos sangüíneos, ocorre não apenas durante o desenvolvimento embriônico e crescimento e reparo de tecido normal, mas também está envolvida no ciclo reprodutivo femini- no,estabelecimento e manutenção de gravidez e reparo de ferimentos e fra- turas. Além da angiogênese que ocorre no indivíduo normal, eventos angio- gênicos estão envolvidos em uma série de processos patológicos, notavel- mente crescimento de tumor em metástase e outras condições nas quais proliferação de vaso sangüíneo é aumentada, tal como retinopatia diabética, psoríase e artropatias. Além disso, a angiogênese é importante na transição de um tumor de crescimento hiperplástico para neoplásico. Conseqüente- mente, iníbição de angiogênese se tornou um campo de pesquisa de terapia para o câncer ativo.

Acredita-se que angiogênese tumorinduzida seja dependente da produção de fatores de crescimento pró-angiogênicos por células tumoríge- nas, as quais superar outras fossas que tendem a manter os vasos existen- tes quiescentes e estáveis. O mais bem-caracterizado desses agentes pró- angiogênicos ou fatores de crescimento é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Cohen e outros, FASEB J., 13: 9-22 (1999)). O VEGF é produzido naturalmente por uma variedade de tipos de célula em resposta à hipóxia e alguns outros estímulos. Muitos tumores também produzem gran- des quantidades de VEGF e/ou induzem células estromais vizinhas a produ- zir VEGF (Fukumura e outros, Cell, 94: 715-725 (1998)). O VEGF, também referido como VEGF-A1 é sintetizado como cinco isoformas com "splicing" diferentes de 121, 145, 165, 189, e 206 aminoácidos. O VEGF121 e VEGFi65 são as principais formas produzidas, particularmente em tumores (vide Co- hen e outros, 1999, supra). O VEGF121 carece de um domínio básico codifi- cado pelos éxons 6 e 7 do gene de VEGF e não se liga à heparina ou matriz extra celular, diferente do VEGFi65 . Cada uma das referências citadas nes- se parágrafo é incorporada por referência em sua totalidade.

Membros da família VEGF atuam primariamente através de liga- ção à quinases. Em geral, quinases de tirosina de receptor são glicoproteí- nas tendo um domínio extracelular capaz de ligação a um ou mais fatores de crescimento específicos, um domínio transmembrana (usualmente uma alfa hélice), um domínio justa-membrana (onde o receptor pode ser regulado, por exemplo, através de fosforilação), um domínio de quinase de tirosina (o componente catalítico do receptor) e uma cauda carbóxi terminal a qual, em muitos receptores, está envolvida em reconhecimento e na ligação dos subs- tratos para a quinase de tirosina. Existem três quinases de tirosina de recep- tor célula endotelial-específicas conhecidas por se ligar ao VEGF: VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR ou Flk-1) e VEGFR-3 (Flt4). Flt-1 e KDR (também conhecida como VEGFR-2 ou Flk-1, as quais são usados permutavelmente aqui) foram identificadas como os receptores de VEGF de alta afinidade pri- mários. Enquanto que a Flt-1 tem maior afinidade pelo VEGF, a KDR mostra expressão endotelial mais abundante (Bikfalvi e outros, J. Cell. Physiol., 149: 50-59 (1991)). Além disso, acredita-se que a KDR domine a resposta angio- gênica e, portanto, é de maior interesse diagnóstico e terapêutico (vide Co- hen e outros, 1999, supra). Expressão de KDR é altamente super-regulada em vasos angiogênicos, especialmente em tumores que induzem a uma for- te resposta angiogênica (Veikkola e outros, Câncer Res., 60: 203-212 (2000)). O papel crucial da KDR em angiogênese é realçado pela completa falta de desenvolvimento vascular em embriões de camundongo knockout para KDR homozigótica (Folkman e outros, Câncer Medicine, 5a Edição (B.C. Decker Inc.; Ontário, Canadá, 2000) páginas 132-152).

A KDR (região de domínio de quinase) é composta de 1336 a- minoácidos em sua forma madura. A forma glicosilada de KDR migra sobre um gel de SDS-PAGE com um peso molecular aparente de cerca de 205 kDa. A KDR contém sete domínios semelhantes à imunoglobulina em seu domínio extracelular, dos quais os primeiros três são os mais importantes na ligação ao VEGF (Cohen e outros, 1999, supra). O VEGF em si é um homo- dímero capaz de ligação à duas moléculas de KDR simultaneamente. O re- sultado é que duas moléculas de KDR se tornam dimerizadas quando de ligação e autofosforilam, se tornando muito mais ativas. A atividade de qui- nase aumentada, por sua vez, inicia uma via de sinalização que media os efeitos biológicos KDR-específicos do VEGF.

Assim, não apenas a atividade de ligação ao VEGF da KDR in vivo é crítica para a angiogênese, mas a capacidade de detectar super- regulação de KDR sobre células endoteliais ou detectar complexos de liga- ção VEGF/KDR seria extremamente benéfica na detecção ou monitoramento de angiogênese.

É bem-sabido que agentes de contraste de ultra-som cheios de gás são refletores de ultra-som excepcionalmente eficientes para ecografia. Tais agentes de contraste de ultra-som incluem, por exemplo, microvesícu- las cheias de gás, tais como microbolhas cheias de gás e microbalões chei- os de gás. Microbolhas cheias de gás são agentes de contraste de ultra-som particularmente preferidos. (Na presente invenção, o termo "microbolhas" designa, especificamente, uma bolha gasosa circundada ou estabilizada por fosfolipídios). Por exemplo, injeção, na corrente sangüínea, de suspensões de corpos vivos de microbolhas cheias de ar ou gás em um líquido veículo reforçará fortemente a imagem por ecografia ultra-sônica, assim, auxiliando na visualização de estruturas anatômicas internas. A formação de imagem de vasos e órgãos internos pode ajudar fortemente em diagnóstico médico, por exemplo, para a detecção de doenças neoplásicas, cardiovasculares e outras.

Para fins diagnósticos e terapêuticos, seria particularmente be- néfico incorporar, em agentes de contraste de ultra-som cheios de gás, composições de vetor de objetivação o qual exibe alta afinidade de ligação por um alvo desejado (tal como, por exemplo, KDR ou o complexo VEGF/KDR). Por exemplo, conjugados de vetor de objetivação - fosfolipídio e, particularmente, conjugados de peptídeo de objetivação - fosfolipídio po- dem ser usados para preparar agentes de contraste de ultra-som cheios de gás objetivados. Além disso, seria particularmente benéfico ter métodos para a produção em larga escala de formas altamente purificadas de tais conju- gados de vetor de objetivação - fosfolipídio. Tais composições e métodos permitiram a produção de composições para uso em aplicações diagnosticas ou terapêuticas tais como, por exemplo, objetivação precisa de porções re- pórteres, agentes tumoricidas ou inibidores de angiogênese ao local alvo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona conjugados de vetor de objeti- vação - fosfolipídio e, particularmente, conjugados de peptídeo de objetiva- ção - fosfolipídio os quais são úteis no preparo de agentes de contraste de ultra-som cheios de gás. Em uma modalidade preferida, os conjugados de peptídeo de objetivação - fosfolipídio incluem peptídeos de objetivação os quais exibem alta afinidade de ligação à KDR e, assim, são componentes úteis de agentes de contraste para formação de imagem de processos de angiogênese.

A presente invenção também proporciona conjugados de fosfoli- pídio/peptídeo monoméricos e diméricos (também referidos aqui como Iipo- peptídeos) os quais são úteis no preparo de agentes de contraste de ultra- som cheios de gás e, particularmente, no preparo de agentes de contraste de ultra-som os quais objetivam a KDR e podem ser usados para formação de imagem de processos de angiogênese.

A presente invenção também proporciona métodos e processos para a produção em larga escala de conjugados de fosfolipídio/peptídeo mo- noméricos e diméricos altamente puros, particularmente conjugados de fos- folipídio de peptídeo monoméricos e diméricos tendo alta afinidade de liga- ção à KDR.

A presente invenção também proporciona métodos e processos para a produção em larga escala de conjugados de fosfolipídio/peptídeo di- méricos altamente puros tendo níveis mínimos de ácido trifluoroacético (TFA).

A presente invenção também proporciona métodos para a sínte- se de peptídeos monoméricos em alta pureza e a construção de conjugados de fosfolipídio/peptídeo a partir de múltiplas subunidades peptídicas.

A presente invenção também proporciona peptídeos monoméri- cos os quais se ligam à KDR ou ao complexo VEGF/KDR com alta afinidade, bem como a métodos de síntese e uso de tais peptídeos monoméricos.

A presente invenção também proporciona agentes de contraste de ultra-som objetivados preparados a partir de tais conjugados de vetor de objetivação - fosfolipídio. Tais agentes de contraste de ultra-som objetivados são úteis para formação de imagem de um tecido trazendo alvo. Em uma modalidade preferida, os agentes de contraste de ultra-som objetivados são microbolhas objetivadas e os conjugados de vetor de objetivação - fosfolipí- dio incluem peptídeos de objetivação os quais exibem alta afinidade de liga- ção à KDR e, assim, são componentes úteis de agentes de contraste para formação de imagem de tecido trazendo KDR e, particularmente, para a for- mação de imagem de tumores e processos de angiogênese. Métodos de preparo e uso de tais agentes de contraste de ultra-som objetivados também são proporcionados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 ilustra um método para a produção de um conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (1) a partir de um monômero peptídico linear (2).

A figura 2 ilustra um conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomé- rico (1) incluindo um peptídeo com alta afinidade de ligação pela KDR.

A figura 3 ilustra um método para a produção de um peptídeo dimérico precursor (16) a partir de monômeros peptídicos.

A figura 4 ilustra um método para a conjugação do peptídeo di- mérico precursor mostrado na figura 1 a DSPE-PEG2000-NH2 para formar um conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) contendo peptídeos os quais se ligam, com alta afinidade, à KDR.

A figura 5 ilustra um conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) contendo peptídeos os quais se ligam, com alta afinidade, à KDR.

A figura 6 ilustra um método para a produção de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos (tal como (21)) tendo níveis mínimos de TFA.

A figura 7 ilustra outro método para a produção de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos (tal como (21)) tendo níveis mínimos de TFA.

A figura 8 ilustra outro método para a produção de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos tendo níveis mínimos de TFA.

A figura 9 ilustra outro peptídeo monomérico representativo (32) tendo uma alta afinidade de ligação pela KDR.

A figura 10 ilustra outro conjugado de peptídeo/fosfolipídio mo- nomérico (31) o qual inclui o peptídeo monomérico mostrado na figura 9.

As figuras 11A-C mostram imagens obtidas através de uso do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) (mostrado na figura 52) em um agente de contraste a: 1) linha de base (figura 11A); 2) após 25 minutos (figura 11B); e 3) após subtração da linha de base e bolhas livres em circula- ção (figura 11C).

As figuras 12A-C mostram imagens obtidas através de uso do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) (mostrado na figura 2) em um agente de contraste na linha de base (figura 12A); após 25 minutos (figu- ra 12B); e após subtração da linha de base e bolhas livres em circulação (figura 12C).

DESCRIÇÃO DETALHADA

O requerentes descobriram, inesperadamente, conjugados de peptídeo/fosfolipídio os quais são úteis na produção de agentes de contraste de ultra-som objetivados e os quais têm excepcional eficiência de ligação à KDR. Dois desses compostos são conjugados de peptídeo/fosfolipídio mo- noméricos os quais incluem um monômero peptídico linear o qual se liga com alta afinidade à KDR1 enquanto que o outro é um conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico o qual inclui duas subunidades monoméricas distin- tas, cada uma se ligando à KDR. Além disso, métodos altamente eficientes para a produção em larga escala de formas purificadas desses conjugados e materiais precursores foram descobertos. Tais métodos incluem a produção de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos tendo níveis mínimos de TFA.

O fosfolipídio pode ser selecionado do grupo consistindo em: fosfatidil etanolaminas e fosfatidil etanolaminas modificadas. Fosfolipídios particularmente preferidos incluem fosfatidil etanolaminas modificadas atra- vés de ligação a um polímero hidrofílico à mesma, exemplos de fosfatidil e- tanolaminas modificadas são fosfatidil etanolaminas (PE) modificadas com polietileno glicol (PEG)1 em resumo "PE-PEGs", isto é, fosfatidil etanolami- nas onde a porção etanolamina hidrofílica é ligada a uma molécula de PEG de peso molecular variável (por exemplo, de 300 a 5000 dáltons), tal como DPPE-PEG, DSPE-PEG, DMPE-PEG ou DAPE-PEG. DSPE-PEG2000, DS- PE-PEG3400, DPPE- PEG2000 e DPPE-PEG3400 são preferidas, com DS- PE-PEG2000 particularmente preferida. Note que uma forma de sal do fosfo- lipídio pode ser usada tal como, por exemplo, o sal de trimetil amônio, o sal de tetrametilamônio, o sal de trietilamônio, o sal de sódio, etc..

Esses compostos podem ser incorporados em agentes de con- traste de ultra-som cheios de gás tais como, por exemplo, microbolhas chei- as de gás, para formar agentes de contraste que proporcionam excelente formação de imagem de tecido trazendo alvo. Em uma modalidade preferida, conjugados de vetor de objetivação-fosfolipídio os quais incluem peptídeos de objetivação os quais se ligam com alta afinidade à KDR são incorporados em microbolhas objetivadas. Conforme mostrado aqui, tais microbolhas obje- tivadas se localizam seletivamente no tecido trazendo KDR, permitindo a formação de imagem de tal tecido e, em particular, formação de imagem de tumores e processos angiogênicos, incluindo aqueles processos associados ao desenvolvimento neoplásico. Conjugados Monoméricos Geral

A Tabela 1 proporciona uma descrição para a identificação de legendas mostradas nas Figuras 1, 2, 9 e 10.

Tabela 1

<table>table see original document page 9</column></row><table>

Conforme mostrado nas Figuras 1 e 2, o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico (1) N-acetil-L-arginil-L-alanil-L-glutarninil-L-as- pa rti I - L-t ri ptof i I-L-t ri ptof i I-L- aspartil-L-isoleucil-L-glutamil-L-leucil-L-serinil-L- metionil-L-alanil-L-aspartil-L-glutaminil-L-leucil-L-arginil-L-histidil-L-alan fenilalanil-L-leucil-L-serinil-fosfoetanolaminocarbonilóxi-(PEG2000)-amino- glutaril]}-L-lisinamida, é um conjugado de fosfolipídio. Esse conjugado é também referido como Ac- RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)- NH2 (SEQ ID N°. 1) e Ac-Axg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser- Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly- Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2. Ele compreende um monômero peptídi- co linear de 29 aminoácidos (2) N-acetil-L-arginil-L-alanil-L-glutaminil-L- aspartil-L-triptofil-L-triptofil-L-aspartil-L-isoleucil-L-glutamil-L-leucil-L-serinil-L- metionil-L-alanil-L-aspartil-L-glutaminil-L-leucil-L1 -arginil-L-histidil-L-alanil-L- fenilalanil-L-leucil-L-serinil-glicil-glicil-glicil-glicil-glicil-L-li também

referido como Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NEb (SEQ ID N°. 2) e Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala- Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-GIy-GIy-GIy-GIy-GIy-Lys-NH2. Esse novo monômero peptídico se liga com alta afinidade à KDR. Deve ser com- preendido que análogos e derivados do conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (1) e do monômero peptídico linear (2) se destinam a estar in- cluídos dentro do escopo da presente invenção.

A figura 10 proporciona a estrutura de outro conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico (31), N-acetil-L-alanil-L-glutaminil-L-aspartil-L- triptofil-L-tirosil-L-tirosil-L-aspartil-L-glutamil-L-isoleucil-L-leucil-L-seril-L-me- tionil-L-alanil-L-aspartil-L-glutamil-L-leucil-L-arginil-L-histidil -L-alanil-L-fenila- lanil-L-leucil-L-seril-glicil-glicil-glicil-glicil-glicil-{N6-[1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfoetanolaminocarbonilóxi-(PEG2000)-aminoglutaril]}-L-lisina-amida, um conjugado de fosfolipídio. Esse conjugado é também referido como Ac- AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2 (SEQ ID N°. 4) e Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met- Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE- PEG2000-NH-Glut)-NH2. Conforme mostrado na figura 9, o conjugado com- preende um monômero peptídico linear de 28 aminoácidos (32), N- acetil-L- alanil-L-glutaminil-L-aspartil-L-triptofil-L-tirosil-L-tirosil-L-aspartil-L-glutamil-L- isoleucil-L-leucil-L-seril-L-inethionil-L-alanil-L-aspartil-L-glutamil-L-leucil-L- arginil-L-histidil-L-alanil-L-fenilalanil-L-leucil-L-seril-glicil-glicil-glici L-lisinamida, o qual também é referido como Ac-AQDWYYDEILSMADQLR Haflsgggggk-NH2 (SEQ ID Ν0. 5) e Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp- Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gen-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly- GIy-GIy-Lys-NH2. Conforme mostrado no pedido co-pendente U.S. N°. 10/661.156, depositado em 11 de Setembro de 2003, esse monômero peptí- dico se liga com alta afinidade à KDR. Deve ser compreendido que análogos e derivados do conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico e do monô- mero peptídico linear se destinam a estar incluídos dentro do escopo da pre- sente invenção.

Conforme mostrado nos Exemplos, agentes de contraste de ul- tra-som, tais como microbolhas cheias de gás, formulados com os conjuga- dos de peptideo/fosfolipídio monoméricos (1) e (31) mostraram alta ligação à KDR1 o que foi confirmado usando exame ecográfico de tumores VX2 em coelhos.

Idealmente, para facilitar a produção do conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico (1) ou (31), o monômero peptídico linear (2) ou (32) deverá ser preparado a granel. Então, conjugação do monômero peptí- dico linear purificado (2) ou (32) ao fosfolipídio tal como, por exemplo, um fosfolipídio peguilado na forma de sal, por exemplo, sal de amônio de fosfoli- pídio DSPE-PEG2000-NH2 (4) via o ligante glutarato de dissuccinimidila (DSG), pode ser usado para proporcionar conjugados de peptideo/fosfolipí- dio monoméricos (1) ou (31).

Métodos de preparação de conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos

Na preparação de conjugados de peptídeo/fosfolipídio (1) e (31), métodos de acordo com a presente invenção proporcionam pelo menos as seguintes vantagens: rendimento aumentado de síntese de peptídeo; exten- são reduzida de racemização; evitar formação de piperidina amida previa- mente observada durante síntese, purificação eficiente de monômeros pep- tídicos (2) e (32), desenvolvimento de um procedimento para conjugação de monômeros peptídicos (2) e (32) em larga escala; e desenvolvimento de pro- tocolos de purificação que permitiriam a pronta separação dos conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos (1) e (31) a partir do sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 de iniciação (4).

Conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos podem ser preparados conforme descrito abaixo. Será apreciado que os valores numé- ricos mencionados nessa descrição representativa da síntese de conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos são representativos.

Monômeros peptídicos lineares podem ser preparados através de SPPS. A seqüência dos monômeros peptídicos lineares pode ser constru- ída como uma carboxamida C-terminal sobre resina Pal-Peg-PS- (nível de substituição: 0,2 mmol/g). Síntese de peptídeo pode ser realizada usando química com Fmoc sobre um Sintetizador de Peptídeo SONATA®/Pilot. Pro- blemas anteriormente observados com esse processo foram racemização, acoplamentos incompletos e formação de piperidina amida, cada um dos quais contribui para rendimento e pureza subótimos. Uma diminuição dramá- tica na formação de piperidina amida pode ser obtida através do uso de pi- peridina a 25% em DMF contendo HOBt (0,1 M) como o reagente para remo- ção de Fmoc. Racemização pode ser consideravelmente reduzida usando DIC/HOBt como o ativador para a maioria dos acoplamentos; um tempo de acoplamento de 3 h usando um excesso de quatro vezes de Fmoc- aminoácido pré-ativado com uma lavagem interveniente com DMF anídrica (6x). Na-Fmoc aminoácidos podem ser dissolvidos exatamente antes de sua operação de acoplamento e pré-ativados com DIC/HOBt em DMF durante 4 min e transferidos para o vaso de reação. Isso pode ser realizado sobre o instrumento Sonata carregando os Fmoc-aminoácidos sólidos aos vasos de aminoácido do instrumento e, então, programando o instrumento para adi- cionar DMF, HOBt/DMF e DIC/DMF seqüencialmente com borbulhamento da solução.

Para otimizar o rendimento, o problema de agregação da resina durante a síntese de peptídeos mais longos, o que pode ser devastador mesmo quando reagentes de acoplamento ótimos são empregados, pode ser considerado. Para reduzir a agregação durante montagem de peptídeo, a estratégia de uso de dipeptídeos de pseudoprolina para incorporar X-Thr ou X-Ser como dipeptídeos ao invés de acoplamentos seqüenciais de X e Thr ou X e Ser, pode ser empregado. Para monômeros peptídicos lineares, acoplamentos seqüenciais de Leu1-Ser12 e Leu22-Ser23 podem ser substituí- dos pelo acoplamento simples do dipeptídeo de pseudoprolina, Fmoc-Leu- Ser(Me,MePro)-OH. Otimização adicional pode ser realizada através de re- dução do número de acoplamentos usando Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH e Fmoc- Gly-Gly-OH, em lugar de acoplamento serial de Fmoc-Gly-OH. Ativação de segmentos de -Gly-Gly-OH pode levar à ciclização da função ácido ativada com a função amida distai para produzir uma dicetopiperazina inativa; isso pode reduzir os rendimentos de uma maneira tempo-dependente. Esse pro- blema pode ser evitado através da adição de Fmoc-Gly"n-OH (n = 2, 3) ao vaso de reação e adição seqüencial de HOBt e DIC; o Fmoc-GIyn-OH ativa- do pode ser interceptado pelo grupo amino ligado a resina antes que cicliza- ção apreciável da dicetopiperazina ocorra. Com esses aperfeiçoamentos, a síntese de monômeros peptídicos lineares pode ser realizada sobre o Sinte- tizador de Peptídeo Sonata em uma escala de síntese de 10 mmols.

Após alongamento de cadeia, o Fmoc pode ser removido do N- término. O peptídeo e o grupo amino livre podem ser acetilados. Então, a seqüência peptídica pode ser clivada da resina e desprotegida usando "Re- agente B" (TFA:água:fenol:triisopropil-silano, 88:5:5:2, v/v/peso/v) durante 4 h. Após a reação de clivagem, o peptídeo bruto pode ser isolado como um sólido através de evaporação dos voláteis, trituração do resíduo com dietil éter e lavagem do sólido assim obtido usando o mesmo solvente. Em outra variação, o peptídeo pode ser precipitado da mistura através da adição de dietil éter à mistura de reação, coleta do sólido assim formado e lavagem com o mesmo solvente.

Monômeros peptídicos lineares podem ser purificados conforme descrito abaixo. Novamente, as referências numéricas são representativas. Monômeros peptídicos lineares brutos (0,5 g) podem ser dissolvidos em CH3CN (40 mL/g) e essa solução pode ser diluída para um volume final de 100 mL com água. A solução pode, então, ser filtrada. A solução filtrada po- de ser carregada sobre uma coluna de HPLC preparativa (Waters, XTerra® Prep MS C18, 10 μ, 300 Λ, 50 χ 250 mm) equilibrada com CH3CN a 10% em água (TFA a 0,1%). Após carregamento, a composição do eluente pode, en- tão, ser elevada para CTbCN a 20%-água (TFA a 0,1%) durante 1 min e um gradiente linear pode ser iniciado em uma taxa de 0,6%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) e operado durante 50 min. Frações eluídas podem ser verificadas com relação à pureza sobre uma coluna C18 de fase invertida analítica (Waters XTerra MS-C18, 10 μ, 120Λ, 4,6 χ 50 mm) e as frações contendo o produto em uma pureza >95% podem ser combinadas e liofilizadas. Para cada purificação de 0,5 g de peptídeo bruto, 0,12 g (24%) de monômero peptídico linear podem ser consistentemente isolados e pro- porcionarão o peptideo no mesmo rendimento e pureza.

Síntese de conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos pode ser realizada conforme descrito abaixo. As referências numéricas são, novamente, representativas. A última etapa na síntese pode ser a conjuga- ção do fosfolipídio tal como, por exemplo, um fosfolipídio peguilado, tal como sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2, a um monômero peptídi- co linear. A porção PEG2000 do sal de amônio de fosfolipídio DSPE- PEG2000-NH2 (4) é nominalmente compreendida de 45 unidades de etileno glicol. Deverá ser entendido, contudo, que esse material é uma distribuição de espécies contendo PEG cujo centróide é o composto nominal contendo 45 unidades de etilenóxi. A conjugação de um monômero peptídico linear com sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 pode ser realizada através de preparo de um monômero peptídico linear monoamida de mono NHS éster de ácido glutárico e reação desse com o grupo amino livre do sal de amônio de fosfolipídio. Assim, um monômero peptídico linear pode ser reagido com DSG (4 eq.) em DMF na presença de DIEA (5 eq.) durante 30 min. A mistura de reação pode ser diluída com acetato de etila, o que pode resultar em precipitação do peptideo monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico. O sobrenadante contendo DSG não reagido pode ser decan- tado e o peptideo mono-NHS éster intermediário pode ser lavado várias ve- zes com acetato de etila para remover traços de DSG. Dados espectrais de massa confirmam a formação do peptideo mono-NHS éster como um produ- to puro. O mono-NHS éster sólido pode ser dissolvido em DMF e reagido com sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (0,9 eq.) na presen- ça de DIEA (4 eq.) durante 24 h. O monômero peptídico linear monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico pode ser usado em excesso para ma- ximizar o consumo do sal de amônio de fosfolipídio porque o sal de amônio de fosfolipídio livre pode complicar o isolamento dos conjugados de peptí- deo/fosfolipídio monoméricos na forma altamente pura.

A mistura de reação pode ser diluída com uma mistura a 1:1 de água (TFA a 0,1%) e CH3CN-CH3OH (1:1, v/v) (TFA a 0,1%) (-100 mL), a- plicada a uma coluna C2 de fase invertida (Kromasil Prep C2, 10 μ, 30CM, 50 χ 250 mm, taxa de fluxo de 100 mL/min) e a coluna pode ser eluída com uma mistura a 3:1 de água (TFA a 0,1%) e CH3CN-CH3OH (1:1, v/v) (TFA a 0,1%) para remover impurezas hidrofílicas. Então, o produto pode ser eluído usando um gradiente de CH3CN-CH3OH (1:1) (TFA a 0,1 %) em água (TFA a 0,1%) (vide Seção Experimental para detalhes). As frações coletadas podem ser analisadas através de HPLC de fase reversa usando um detector ELS o quai permite a detecção do produto desejado e, freqüentemente, do fosfoli- pídio DSPE-PEG2000-NH2 difícil de separar o qual tem muito pouca absor- bância de UV. Isso indica a clara separação dos conjugados de peptí- deo/fosfolipídio monoméricos e do fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2. As fra- ções contendo produto puro podem ser coletadas, concentradas sobre um evaporador giratório (para reduzir o teor de metanol) e Iiofilizadas para pro- porcionar conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos como um líquido incolor. De forma a preparar a quantidade requerida dos conjugados de pep- tídeo/fosfolipídio monoméricos, várias operações podem ser conduzidas empregando 0,5 g a 1,0 g de monômero peptídico linear. Em todos os casos, os conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos alvo poderão ser isola- dos em alto rendimento e pureza (por exemplo, rendimento de 57-60% e pureza > 99%).

Conjugado Dimérico

Geral

A Tabela 2 proporciona uma descrição para a identificação de legendas mostradas nas Figuras 3, 4 e 5.

Tabela 2

<table>table see original document page 15</column></row><table> <table>table see original document page 16</column></row><table>

Conforme mostrado nessas figuras, o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico (11) acetil-L-alanil-glicil-L-prolil-L-treonil-L-triptofil-L- cistinil-L-glutamil-L-aspartil-L-aspartil-L-triptofil-L-tirosil-L-tirosil-L-cistinil-L- tri ptofil-l-leucil-L-fenilalanil-glicil-L-treonM-glicil-glicil-glicil-L-lisil[Acetil-L^ cistinil-L-triptofil-L-glutamil-L-aspartil-L-seril-L-triptofil-glicil-glicil-L-glutam valil-L-cistinil-L-fenilalanil-L-arginil-L-tirosil-L-aspartil-L-prolil-glicil-gli L-lisil(diestearilfosfoetanolaminocarbonóxi-PEG2000-amino-8-amino-3,6- dioxaoctanoil- 8-amino-3,6-dioxaoctanoil-glutaril-L-lisil)amida cíclica (2-12) dissulfeto]-amida cíclica (6-13) dissulfeto, consiste em duas cadeias peptídi- cas monoméricas as quais se ligam à KDR: um monômero peptídico de dis- sulfeto cíclico de 21 aminoácidos (13) Acetil-L-valil-L-cistinil-L-triptofil-L- glutamil-L-aspartil-L-seril-L-triptofil-glicil-glicil-L-glutamil-L-valil-L-cistini fenilalanil-L-arginil-L-tirosil-L-aspartil-L-prolil-glicil-glicil-glicil-L-N 3,6-dioxaoctanoil-8-amino-3,6-dioxaoctanoil)amida cíclica (2-12) dissulfeto e um monômero peptídico de dissulfeto cíclico de 22 aminoácidos (12) Acetil- L-alanil-glicil-L-prolil-L-treonil-L-triptofil-L-cistinil-L-glutamil-L-asparril-L- aspartil-L-triptofil-L-tyxosil-L-tirosil-L-cistinil-L-triptofil-L-leucil-L-fenN glicil-L-treonil-glicil-glicil-glicil-L-lisiriamida cíclica 6-13 dissulfeto unidos por um ligante de glutarila. Deverá ser entendido que análogos e derivados do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) e dos monômeros peptídi- cos de dissulfeto cíclico (12) e (13) se destinam a estar incluídos dentro do escopo da presente invenção.

Agentes de contraste de ultra-som (por exemplo, microbolhas cheias de gás) formulados com o conjugado de peptídeo/fosfolipídio diméri- co (11) mostraram alta ligação à KDR, o que foi confirmado usando exame ecográfico de tumores VX2 em coelhos.

Métodos de Preparação de conjugados de fosfolipídio diméricos

Para realizar a síntese do conjugado de peptídeo/fosfolipídio di- mérico (11), os monômeros usados para essa finalidade deverão ser otima- mente preparados a granel. Então, os monômeros podem ser unidos uns aos outros usando glutarato de dissuccinimidila como um Iigante para formar o peptídeo dimérico precursor (16), Acetil-L-alanil-glicil-L-prolil-L-treonil-L- triptofil-L-cistinil-L-glutamil-L-aspartil-L-aspartil-L-triptofil-L-tirosil-L-ti cistinil-L-triptofil-L-leucil-L-fenilalanil-glicil-L-treonil-glicil-glicil-glicil-L- lisil[Acetil-L-valil-L-cistinil-L-triptofil-L-glutamil-L-aspartil-L-seril-L-triptofi glicil-L-glutamií-L-valil-L-cistinil-L-fenilalanil-L-arginil-L-tirosil-L-aspartil-L- prolil-glicil-glicil-glicil-L-lisil(8-amino-3,6-dioxaoctanoil-8-amino-3,6- dioxaoctanoil-glutaril-L-lisil) amida cíclica (2-12) dissulfeto] -amida cíclica (6- 13) dissulfeto. Então, conjugação do peptídeo dimérico precursor purificado (16) a um sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (18), novamen- te via glutarato de dissuccinimidila, pode ser usada de forma a proporcionar o conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11).

No preparo do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11), métodos de acordo com a presente invenção proporcionam pelo menos as seguintes vantagens: rendimento aumentado de alongamento de cadeia au- tomático das seqüências peptídicas; extensão reduzida de racemização en- contrada durante síntese; evitar a formação de piperidina amida anterior- mente observada, durante a síntese de monômero peptídico (13); ciclização de precursores peptídicos contendo dicisteína de (12) e (13) usando proce- dimentos passíveis de escala em multigrama, ao mesmo tempo em que ain- da permite manipulação eficiente e prática de amostra; purificação eficiente de peptídeos monoméricos (12) e (13); rendimento e pureza maximizados do peptídeo dimérico precursor (16); desenvolvimento de um procedimento para conjugação do peptídeo dimérico precursor (16) em larga escala; e desen- volvimento de protocolos de purificação que permitiriam a pronta separação do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico alvo (11) do sal de amônio de fosfolipídio (18).

O conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) pode ser pre- parado através de síntese automática dos monômeros peptídicos (12), Ac- Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly- Thr-GIy-GIy-GIy-Lys(IvDde)-NH2 dissulfeto cíclico (6-13) e (13), Ac-Val-Cys- Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly- Lys(Adoa-Adoa)-NH2 dissulfeto cíclico (2-12), seu acoplamento eficiente usando glutarato de dissuccinimidila (DSG), para proporcionar um dímero ivDe-protegido, sua desproteção e subseqüente acoplamento a DSPE- PEG2000-NH2, também via uma ligação de glutarila. Usando procedimentos de acordo com a presente invenção, peptídeos monoméricos podem ser sin- tetizados em uma escala de 10 mmols sem complicação e, após purificação por HPLC, podem ser obtidos em um rendimento de cerca de 20% e pureza > 95%. Tais métodos permitem reações de formação de dímero e a subse- qüente conjugação ao componente fosfolipídio, permitindo que a formação do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) seja realizada em uma escala de grama. O peptídeo dimérico precursor (16) pode ser obtido dos peptídeos monoméricos rotineiramente em um rendimento de cerca de 32% e pureza > 95%. O conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) pode ser produzido a partir do peptídeo dimérico precursor (16) em um rendimento de 57-60% e pureza > 99%.

Os conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos podem ser preparados conforme descrito abaixo. Será apreciado que os valores numé- ricos mencionados nessa descrição representativa da síntese de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos são representativos.

É descrito abaixo um método representativo para a síntese em fase sólida e ciclização de dissulfeto de um monômero peptídico (12) Ac-Ala- Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Thr-Leu-Phe-Gly-Thr- GIy-GIy-GIy-Lys(IvDde)-NH2 cíclico (6- 13) dissulfeto e um monômero peptí- deo (13), Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg- Tyr-Asp-Pro-GIy-GIy-GIy-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 dissulfeto cíclico (2-12).

Os peptídeos podem ser construídos como suas carboxamidas C-terminais sobre resina PaI-Peg-PS- (nível de substituição: 0,2 mmol/g). Alongamento de cadeia pode ser realizado usando química com Fmoc em- pregando desproteção otimizada e protocolos de acoplamento sobre um Sin- tetizador de Peptídeo SONATA® /Pilot sobre uma escala de síntese de 10 mmols. A síntese otimizada dos peptídeos através de SPSS automático po- de ser desenvolvida através de estudo de impurezas peptídicas e do efeito de alterações dos elementos particulares dos protocolos sobre o rendimento global e pureza dos peptídeos obtidos.

Análise das impurezas obtidas de sínteses não otimizadas dos peptídeos monoméricos indica que os principais problemas são racemiza- ção, acoplamentos incompletos e formação de piperidina amida (presumi- velmente via um intermediário de aspartimida ou glutarimida), cada um dos quais contribui para o rendimento e pureza subótimos. Uma diminuição dra- mática na formação da piperidina amida pode ser obtida através do uso de piperidina a 25% em DMF contendo HOBt (0,1 M) como o reagente para re- moção de Fmoc. Racemização pode ser consideravelmente reduzida usan- do DIC/HOBt como o ativador para a maioria dos acoplamentos; e um tempo de acoplamento de 3 h usando um excesso de quatro vezes de Fmoc- aminoácido pré-ativado com uma lavagem interveniente com DMF anídrica (6x). Na-Fmoc aminoácidos podem ser dissolvidos exatamente antes de sua operação de acoplamento e pré-ativados com DIC/HOBt em DMF durante 4 min e transferidos para o vaso de reação. Isso pode ser realizado sobre o instrumento Sonata carregando os Fmoc-aminoácidos sólidos aos vasos de aminoácido do instrumento e, então, programando o instrumento para adi- cionar DMF1 HOBt/DMF e DIC/DMF seqüencialmente com borbulhamento da solução.

Para otimizar o rendimento, o problema de agregação da resina durante a síntese de peptídeos mais longos, o que pode ser devastador mesmo quando reagentes ótimos de acoplamento são empregados, pode ser considerado. Para reduzir agregação durante montagem do peptídeo, a estratégia de usar dipeptídeos de pseudoprolina para incorporar X-Thr ou X- Ser (X refere-se ao n-1 aminoácido da seqüência) como dipeptídeos ao in- vés de acoplamentos seqüenciais de X e Thr ou X e Ser, pode ser emprega- do. Assim, para o monômero (12), Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp- Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto, acoplamento seqüencial de Thr e Gly adequadamente pro- tegidas (mostradas em negrito acima) pode ser substituído pelo acoplamento simples do dipeptídeo de pseudoprolina, Fmoc-Gly-Thr^Me,Mepro)-OH. Simi- larmente, na síntese do monômero (13), Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Thr- Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Pro-Arg-Tyr-Asp-Pro-GIy-GIy-GIy-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 dissulfeto cíclico (2-12), o dipeptídeo de pseudoprolina, Fmoc-Asp(OtBu)- Ser(ijjMe,Mepro)-OH pode ser empregado para substituir o acoplamento se- qüencial de Ser e Asp adequadamente protegidas (mostradas em negrito acima). Otimização adicional pode ser obtida através de redução do número de acoplamentos usando Fmoc-GIy-GIy-GIy-OH e Fmoc-GIy-GIy-OH em lu- gar de acoplamento serial de Fmoc-Gly-OH. Ativação de segmentos de -GIy- GIy-OH pode levar à ciclização da função ácido ativada com a função amida distai para produzir uma dicetopiperazina inativa; isso pode reduzir os ren- dimentos de uma maneira tempo-dependente. Esse problema pode ser evi- tado através da adição de Fmoc-GIyn-OH (n = 2, 3) ao vaso de reação e adi- ção seqüencial de HOBt e DIC; o Fmoc-GIyn-OH ativado pode ser intercep- tado pelo grupo amino ligado a resina antes que ciclização apreciável da dicetopiperazina ocorra. Após alongamento de cadeia estar terminado, o grupo de proteção Fmoc N-terminal pode ser removido de cada um dos pep- tídeos e o grupo amino livre podem ser acetilado. O derivado pseudo-ortogonalmente protegido, Fmoc-Lys(ivDde)- OH1 pode ser usado para permitir o disfarce seletivo da ε-amina da Iisina C- terminal do monômero e peptídeos diméricos e sua subseqüente funcionali- zação, a qual também pode ser otimizada. O grupo ivDde sobre a ε-amina da lisina C-terminal de cada um dos monômeros peptídicos pode ser remo- vido usando hidrazina a 10% em DMF. Então, Fmoc-Adoa para o monômero (13) ou Lys(ivDde) para o monômero (12) podem ser anexados ao grupo ε- amina da lisina exposto usando 4 equivalentes do Fmoc aminoácido e 4 e- quivalentes de cada um de DIC e HOBt em DMF durante 10 h. Após término da síntese, a seqüência peptídica pode ser clivada da resina e desprotegida usando "Reagente B" (TFA:água:fenol:triisopropil-silano, 88:5:5:2, v/v/pe- so/v) durante 4 h. Após a reação de clivagem estar completa, o peptídeo pode ser precipitado, lavado com dietil éter e seco.

Os procedimentos a seguir para ciclização dos peptídeos con- tendo dicisteína linear podem ser usados para proporcionar escalonamento ótimo de peptídeos monoméricos. Geralmente, a oxidação aérea de peptí- deos de dicisteína lineares pode ser realizada a uma concentração de apro- ximadamente 0,5-5 mg/mL (para os monômeros peptídicos descritos, -0,18- 1,8 mM em peptídeo, -0,36-3,6 mM em cisteína tiol). De forma a funcionar em concentrações significativamente maiores, ciclização DMSO-assistida de peptídeos de dicisteína permite a ciclização de -10 g dos peptídeos lineares em bons rendimentos em tão pouco quanto -50 mL de solução. Portanto, os peptídeos de dicisteína lineares brutos podem ser ciclizados em DMSO a 95%- H2O (5 mL/g) em um pH de 8,5 em temperatura ambiente. O progresso da ciclização pode ser rotineiramente acompanhado através de espectrome- tria de massa e HPLC. Embora ciclização possa estar essencialmente com- pleta em -36 h, a mistura de reação pode ser geralmente agitada durante até 48 h. Os peptídeos de dissulfeto cíclico podem ser precipitados da mistu- ra de reação através de diluição com CH3CN e os peptídeos sólidos brutos acinzentados resultantes podem ser coletados através de filtração. Esse é um método conveniente para remoção de DMSO do peptídeo cíclico bruto.

Purificação e isolamento do peptídeo monomérico (12), Ac- AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK [K(ivDde)]-NH2, podem ser realizados conforme descrito abaixo. Note que, conforme usado aqui, a designação "C*" refere-se a um resíduo de cisteína que contribui para uma ligação de dissulfeto. Tentativas de dissolver 0,5 g do peptídeo bruto em até 300 ml_ de CH3CN a 30% em água (TFA a 0,1%) não obtiveram sucesso. Portanto, co- mo uma alternativa, o peptídeo bruto (0,5 g) pode ser dissolvido em DMSO (5 mL/g) e essa solução pode ser diluída para um volume final de 100 mL com CH3CN a 20%-água. A solução pode ser filtrada. A solução filtrada pode ser carregada sobre uma coluna de HPLC preparativa (Waters, XTerra® Prep MS C18, 10 μ, 300 A, 50 χ 250 mm) equilibrada com CH3CN a 10% (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) e a coluna foi eluída com CH3CN a 10% (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) para lavar o DMSO da coluna. A composição do eluente, então, pode ser elevada para CH3CN a 35%-água (TFA a 0,1%) durante 1 min e um gradiente linear pode ser iniciado em uma taxa de 0,5%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) e operado durante 50 min. As frações eluídas podem ser verificadas com relação à pu- reza sobre uma coluna C18 de fase invertida analítica (Waters XTerra MS- C18, 10 μ, 120 A, 4,6 χ 50 mm) e as frações contendo o produto em uma pureza >95% podem ser combinadas e liofilizadas. Para cada purificação de 0,5 de peptídeo bruto, 0,1 g (20%) para (12), Ac-AGPTWC*EDDWYYC*W LFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2, podem ser isolados. Descobriu-se que purifica- ções repetidas proporcionam o peptídeo consistentemente no mesmo ren- dimento e pureza.

Para o monômero peptídico (13), Ac-VC*WEDSWGGE VC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 pode ser purificado e isolado conforme descrito para o monômero peptídico (12), exceto que o peptídeo em questão pode ser dissolvido em CH3CN a 20% (TFA a 0,1%) em TFA aquoso a 0,1% (0,5 g de peptídeo/100 mL) ao invés de um diluente contendo DMSO. A so- lução resultante de peptídeo bruto pode ser carregada sobre uma coluna de HPLC preparativa (Waters, XTerra® Prep MS C 18, 10 μ, 300 A, 50 χ 250 mm, taxa de fluxo de 100 mL/min) equilibrada com CH3CN a 10% em água (TFA a 0,1%). A coluna pode ser eluída com CH3CN a 10% (TFA a 0,1%)/água (TFA a 0,1%) a 100 mL/min durante 5 min. Então, a composição do eluente pode ser elevada para CH3CN a 30% (TFA a 0,1%)/água (TFA a 0,1%) durante 1 min e uma taxa de gradiente linear de 0,5%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) pode ser iniciada e mantida até que o peptídeo desejado seja completamente eluído da coluna. Frações contendo produto podem ser analisadas sobre uma coluna C-18 de fase invertida ana- lítica Waters XTerra (10 μ, 120 A) e frações contendo o produto em uma pu- reza >95% podem ser empoçadas e Iiofiiizadas para proporcionar o monô- mero peptídico de dissulfeto cíclico (13) (0,12 g, rendimento de 24%) em uma pureza >95%. Os 10 g de monômero peptídico bruto podem ser purifi- cados serialmente dessa maneira.

É descrito abaixo um método representativo para preparo do peptídeo dimérico precursor (16), AC-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGG K[AC-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2 dissulfeto cíclico (2-12)]-NH2 dissulfeto cíclico (6-13). A preparação do peptídeo dimé- rico precursor pode ser realizado através de união dos peptídeos monoméri- cos em um procedimento em duas etapas. Primeiro, Ac-AGPTWC*EDDWYY C*WLFGTGGGK-[K(ivDde)]-NH2 (12) pode ser reagido com glutarato de dis- succinimidila (DSG, 5 eq.) em DMF na presença de DIEA (5 eq.) durante 30 min. A mistura de reação pode ser diluída com acetato de etila, o que resulta em precipitação da monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico do peptídeo. O sobrenadante, contendo DSG não reagido, pode ser decantado e o mono-NHS éster pode ser lavado várias vezes com acetato de etila para remover traços de DSG. Dados espectrais de massa confirmam a formação do mono-NHS éster como um produto puro. Esse pode ser redissolvido em DMF e reagido com o peptídeo monomérico Ac- VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 (13) na presença de DIEA (5 eq). Resultados de HPLC e MS indicam a formação do dímero tra- zendo ivDDe, como um único produto principal. O grupo de proteção ivDde sobre a ε-amina de Lys do dímero pode ser removido através de agitação da mistura de reação com hidrazina (10%) em DMF durante 20 min. A solução, então, pode ser acidificada com TFA e diluída com CH3CN a 10% (TFA a 0,1%)-água (TFA a 0,1%), aplicada a uma coluna de HPLC C18 de fase re- versa preparativa e purificada através de uma eluição em gradiente de ace- tonitrila (TFA a 0,1%) em TFA aquoso a 0,1%. De forma a proporcionar a quantidade necessária do peptídeo dimérico precursor, a reação pode ser conduzida empregando de 0,5 g a tanto quanto 1 g de cada um dos monô- meros peptídicos. Em cada caso, o peptídeo dimérico precursor requerido pode ser isolado em um rendimento de -32% e uma pureza >95%, confir- mando a reprodutibilidade e capacidade de escalonamento dos procedimen- tos.

A etapa final na síntese pode ser a conjugação de sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (18) ao peptídeo dimérico precursor. Conforme mencionado anteriormente, a porção PEG2000 do DSPE- PEG2000-NH2 é nominalmente compreendida de 45 unidades de etileno gli- col. Deverá ser entendido, contudo, que esse material é uma distribuição de espécies contendo PEG cujo centróide é o composto nominal contendo 45 unidades de etilenóxi.

Conjugação do DSPE-PEG2000-NH2 ao peptídeo dimérico pre- cursor pode ser realizada através de preparo de uma monoamida de mono- NHS éster de ácido glutárico do dímero precursor e reação dessa com o grupo amino livre do sal de amônio de fosfolipídio. Assim, o peptídeo diméri- co precursor trazendo ivDde (16) pode ser reagido com DSG (4 eq.) em DMF na presença de DIEA (5 eq.) durante 30 min. Conforme na preparação do peptídeo dimérico precursor, a solução pode ser diluída com acetato de etila para precipitar a monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico do dímero (17), como um sólido. O sobrenadante pode ser decantado para re- mover o DSG não reagido. A monoamida de mono-NHS éster de ácido glu- tárico sólida do peptídeo dimérico (17) pode, então, ser lavada várias vezes com acetato de etila para remover traços de DSG. Resultados espectrais de massa confirmam a formação da monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico do dímero peptídico como um produto puro.

A monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico dimérica (17) pode ser dissolvida em DMF-CH2CI2 (8:2) e reagida com sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (0,9 eq.) na presença de DIEA (4 eq.) durante 24 h. O NHS éster (17) pode ser usado em excesso para maximizar o consumo do sal de amônio de fosfolipídio porque qualquer fosfolipídio livre pode complicar a purificação e isolamento do produto final. A mistura de rea- ção pode ser diluída com água (TFA a O,1%)-CH3CN-CH3OH (1:1) (TFA a 0,1%) (-100 mL), aplicada a uma coluna C4 de fase invertida (Kromasil® Prep C4, 10 μ, 300 A, 50 χ 250 mm, taxa de fluxo de 100 mL/min) e a coluna pode ser eiuíaa com uma mistura de solvente de água (TFA a 0,1%)- CH3CN-CH3OH (1:1) (TFA a 0,1%) para remover as impurezas hidrofílicas. Então, o produto pode ser eluído usando um gradiente de CH3CN-CH3OH (1:1) (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%). As frações coletadas podem ser analisadas através de HPLC em fase reversa usando um detector ELIS o qual permite a detecção do produto desejado e o sal de amônio de fosfolipí- dio DSPE-PEG2000-NH2 freqüentemente difícil de separar, o qual não tem forte cromóforo por UV. Isso indica a separação clara do conjugado de pep- tídeo/fosfolipídio dimérico e do sal de amônio de fosfolipídio DSPE- PEG2000-NH2. As frações contendo produto puro podem ser coletadas, concentradas sobre um evaporador giratório (para reduzir o teor de metanol) e Iiofilizadas para proporcionar o conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico como um sólido incolor.

De forma a preparar a quantidade requerida do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico, várias operações podem ser conduzidas em- pregando 0,5 g a 1,0 g do peptídeo dimérico precursor. Em todos os casos, o conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico alvo pode ser isolado em um rendimento de 57-60% e em uma pureza >99%. A quantidade volumétrica do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico, obtido das operações seriais descritas acima, pode ser obtida através de dissolução do produto das ope- rações individuais em t-butanol-acetonitrila-água (1:1:3), seguido por Iiofiliza- ção. O procedimento de Ellman para estimativa quantitativa de tiol livre pode ser aplicado à amostra bruta do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico; tiol livre, se presente, estará abaixo do limite de detecção. Análise de com- posição de aminoácido proporciona resultados dentro dos limites aceitáveis, sustentando a estrutura atribuída do derivado peptídico. Análise espectral de massa MALDI-TOF também sustenta a estrutura presumida do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico.

Métodos de preparação de conjugados de fosfolipídio-dímero tendo níveis baixos ou negligenciáveis de TFA

A presente invenção também proporciona métodos para produ- ção de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos tendo níveis muito bai- xos de TFA. Embora determinados métodos proporcionem a síntese e purifi- cação de tais conjugados em uma escala de grama, formação de uma Iiso- versão dos conjugados foi observada guando de armazenamento do materi- al Iiofilizado a 5°C ou guando de armazenamento de soluções aguosas dos conjugados. Acredita-se gue o Iisocomposto é formado através de hidrólise ácida promovida por TFA de um dos ésteres de ácido graxo de fosfolipídio em conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos.

Para obter o peptídeo/fosfolipídio como um material estável tra- zendo um contra-íon farmaceuticamente aceitável, métodos altamente efici- entes para obtenção de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos foram descobertos os guais convertem os sais de TFA do conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico ou guaisguer precursores adeguados em sal(is) de acetato farmacêuticos. Modalidades representativas desses métodos são proporcionadas abaixo.

A Tabela 3 proporciona uma descrição para a identificação de legendas mostradas nas Figuras 6, 7 e 8.

Tabela 3

<table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table>

Onde m, n, x, y, x são variáveis, dependendo das condições de liofilização.

Fazendo referência agora às Figuras 6 e 7, em determinadas modalidades, os componentes peptídeo monomérico do peptídeo heterodi- mérico (27), isto é, compostos de sais de TFA (22) e (25), são submetidos à cromatografia de troca de íons sobre a resina de troca de cátions de ácido sulfônico macroporosa AG MP-50 usando um gradiente de etapa de acetato de amônio para converter os mesmos a seus sais de acetato. Então, os dois acetatos de monômero peptídico (23) e (26) podem ser unidos através de um ligante de glutarila para formar o dímero (27) como um sal de acetato. Purificação do sal de acetato dimérico bruto de (27), através de HPLC prepa- rativa C-18 usando um método com gradiente linear empregando CH3CN/H20, cada um contendo NH4OAc a 10 mM, proporciona o acetato dimérico puro (27). Conjugação desse dimérico a DSPE-PEG2000-NH2 (29) e purificação final da mistura bruta através de HPLC preparativa C-3 usando CH3CN/H20/NH4OAc proporciona o composto (21) como o sal de acetato.

Mais especificamente, os compostos (22), (25) e (27) trazem todos grupos ácido carboxílico e amino na cadeia lateral. AG MP-50, uma resina de troca de cátions macroporosa, pode ser usada para permitir pene- tração completa da resina pelos peptídeos e explorar a imobilização dos peptídeos via seus grupos básicos (amino e guanidina). Sais de TFA dos peptídeos podem ser adsorvidos a uma coluna AG MP-50 (forma de ácido sulfônico) e a coluna pode ser lavada com água e, então, eluída com um gradiente em etapa de NH4OAc em CH3CN/H2O a O ou 30%, dependendo da solubilidade dos peptídeos. Os peptídeos podem ser eluídos em NH4OAc a cerca de 600 mívl e a forma de acetato dos peptídeos pode, então, ser obtida na forma pura. Análise por flúor TC e análise de contra-íon de TFA CE mos- tra consistentemente um teor muito baixo de TFA dos peptídeos.

Métodos preferidos também incluem redissolução/reliofilização dos peptídeos finais várias vezes para remover o NH4OAc residual. De outro modo, traços residuais de NH4OAc presentes nos peptídeos podem dar ori- gem à amônia livre na presença de DIEA. Isso pode resultar na formação de peptídeo-Glut-amida indesejado como um produto principal no subseqüente preparação de (27) a partir dos monômeros (23) e (26) ou conjugado de fos- folipídio/peptídeo final (21) a partir do sal de acetato de (27).

Fazendo referência agora à figura 7, outra modalidade propor- ciona a conversão do sal de TFA do dímero (27) a seu sal de acetato análo- go através de cromatografia de troca de íons sobre a resina de troca de cá- tions de ácido sulfônico macroporosa AG MP-50. Esse acetato dimérico, en- tão, pode ser conjugado com DSPE-PEG2000-NH2, seguido por purificação do material bruto através de coluna preparativa C-3 usando CH3CN/H20/NH40AC para proporcionar o composto final (12) como um sal de acetato.

Embora os métodos descritos acima e nas Figuras 6 e 7 propor- cionem excelentes resultados, a segunda abordagem tem a vantagem de requerer menos etapas. Detalhes adicionais são proporcionados abaixo na seção Exemplos.

Voltando à figura 8, outra modalidade proporciona métodos para proporcionar conjugados diméricos tendo quantidades mínimas de TFA utili- zando o diferencial de tamanho entre o conjugado de fosfolipídio/peptídeo (21) e íons de TFA. Nessa modalidade, o aduto 21»*nTFA pode ser eluído em uma coluna de exclusão de tamanho na presença de tampão de bicar- bonato de amônio. O 21 *nTFA bruto inicialmente pode ser liberado do Iiso- composto através de HPLC preparativa sobre uma coluna C-3 Zorbax usan- do um gradiente linear de acetonitrila em água. Ambas as fases podem ser tamponadas com acetato de amônio a 10 mM. Isso proporciona separação do lisocomposto, conforme indicado através de HPLC analítica.

Para reduzir adicionalmente a quantidade de TFA, o material pode ser aplicado a uma coluna Sephadex G-25 e eluído com solução de bicarbonato de amônio aquosa. O eluato pode ser monitorado através de HPLC. Frações contendo produto podem ser empoçadas e Iiofilizadas para proporcionar o material desejado (21) essencialmente livre de TFA e com altas taxas de recuperação. Detalhes adicionais são proporcionados abaixo na seção Exemplos.

Os conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos e monoméri- cos descritos aqui podem ser incorporados em agentes de contraste de ul- tra-som tais como, por exemplo, micro vesículas cheias de gás. Tais micro- vesículas cheias de gás incluem, por exemplo, microbolhas cheias de gás, microbalões cheios de gás, microcápsulas cheias de gás, etc.. Em uma mo- dalidade preferida, os conjugados de peptídeo/fosfolipídio podem ser incor- porados em agentes de contraste de ultra-som compreendendo microbolhas cheias de gás. Métodos de preparo de microbolhas cheias de gás a partir de fosfolipídio e conjugados de fosfolipídio são conhecidos por aqueles versa- dos na técnica. Por exemplo, microbolhas de acordo com a presente inven- ção podem ser preparadas através de métodos descritos em qualquer uma das seguintes patentes: EP 554213, WO 04/069284, Patente U.S. N° 5.413.774, Patente U.S. N° 5.578.292, EP 744962, EP 682530, Patente U.S. N° 5.556.610, Patente U.S. N° 5.846.518, Patente U.S. N° 6.183.725, EP 474833, Patente U.S. N° 5.271.928, Patente U.S. N° 5.380.519, Patente 30 U.S. N° 5.531.980, Patente U.S. N° 5.567.414, Patente U.S. N° 5.658.551, Patente U.S. N° 5.643.553, Patente U.S. N° 5.911.972, Patente U.S. N° 6.110.443, Patente U.S. N° 6.136.293, EP 619743, Patente U.S. N° 5.445.813, Patente U.S. N0 5.597.549, Patente U.S. N0 5.686.060, Patente U.S. N0 6.187.288, e Patente U.S. N0 5.908.610, as quais são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Os métodos descritos no WO 04/069284 são particularmente preferidos.

Fosfolipídios adequados incluem ésteres de glicerol com uma ou duas moléculas de ácidos graxos (os mesmos ou diferentes) e ácido fosfóri- co, em que o resíduo de ácido fosfórico é, por sua vez, ligado a um grupo hidrofílico, tal como colina, serina, inositol, glicerol, etanol amina e grupos semelhantes. Ácidos graxos presentes nos fosfolipídios são, em geral, áci- dos alifáticos de cadeia longa, tipicamente contendo de 12 a 24 átomos de carbono, de preferência de 14 a 22, que podem ser saturados ou podem conter uma ou mais insaturações. Exemplos de ácidos graxos adequados são ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido ara- quídico, ácido beênico, ácido oleico, ácido linoléico e ácido linolênico. Mono- ésteres de fosfolipídios são conhecidos na técnica como as formas "liso" do fosfolipídio.

Outros exemplos de fosfolipídios são ácidos fosfatídicos, isto é, os diésteres de glicerol-ácido fosfórico com ácidos graxos, esfingomielinas, isto é, aqueles análogos de fosfatidil colina onde o resíduo de glicerol diéster com ácidos graxos é substituído por uma cadeia de ceramida, cardiolipinas, isto é, os ésteres de 1,3-difosfatidil glicerol com um ácido graxo, gangliosí- deos, cerebrosídeos, etc..

Conforme usado aqui, o termo fosfolipídios inclui produtos que ocorrem naturalmente, semi-sintéticos ou sinteticamente preparados que podem ser empregados unicamente ou como misturas.

Exemplos de fosfolipídios que ocorrem naturalmente são Ieciti- nas naturais (derivados de fosfatidil colina (PC)) tais como, tipicamente, Ieci- tinas de semente de soja ou gema de ovo. Exemplos de fosfolipídios semi- sintéticos são os derivados parcial ou totalmente hidrogenados das Iecitinas que ocorrem naturalmente.

Exemplos de fosfolipídios sintéticos são, por exemplo, dilauriloil- fosfatidil colina ("DLPC"), dimiristoilfosfatidil colina ("DMPC"), dipalmitoil- fosfatidil colina ("DPPC"), diaraquidoilfosfatidil colina ("DAPC"), diestearoil- fosfatidil colina (nDSPCn)1 1 -mirístoil-2-palmitoilfosfatidil colina ("MPPC"), 1- palmitoil-2-miristoilfosfatidil colina ("PMPC"), 1-palmitoil-2-estearoilfosfatidil colina ("PSPC"), 1-estearoil-2-palmitoil-fosfatidil colina ("SPPC"), dioleoilfos- fatidil colina ("DOPC"), 1,2 Diestearoil-sn-glicero-3-Etilfosfocolina (Etil- DSPC), dilauriloil-fosfatidil glicerol ("DLPG") e seus sais de metal alcalino, diaraquidoilfosfatidil glicerol ("DAPG") e seus sais de metal alcalino, dimiris- toilfosfatidil glicerol ("DMPG") e seus sais de metal alcalino, dipalmitoil- fosfatidil glicerol ("DPPG") e seus sais de metal alcalino, diestearoilfosfatidil glicerol ("DSPG") e seus sais de metal alcalino, dioleoilfosfatidil glicerol ("DOPG") e seus sais de metal alcalino, ácido dimiristoil fosfatídico ("DMPA") e seus sais de metal alcalino, ácido dipalmitoil fosfatídico ("DPPA") e seus sais de metal alcalino, ácido diestearoil fosfatídico ("DSPA"), ácido diaraqui- doil fosfatídico ("DAPA") e seus sais de metal alcalino, dimiristoil fosfatidil- etanolamina e ("DMPE"), dipalmitoil fosfatidil etanolamina ("DPPE"), diestea- roil fosfatidil-etanolamina ("DSPE"), dimiristoil fosfatidil serina ("DMPS"), dia- raquidoil fosfatidil serina ("DAPS"), dipalmitoil fosfatidil serina ("DPPS"), dies- tearoilfosfatidil serina ("DSPS"), dioleoilfosfatidil serina ("DOPS"), dipalmitoil esfingomielina ("DPSP") e diestearoil esfingomielina ("DSSP").

Fosfolipídios adequados ainda incluem fosfolipídios modificados através de ligação de um polímero hidrofílico aos mesmos, exemplos de fos- folipídios modificados são fosfatidil etanolaminas (PE) modificadas com poli- etileno glicol (PEG), em resumo "PE-PEG", isto é, fosfatidil etanolaminas onde a porção etanolamina hidrofílica é ligada a uma molécula de PEG de peso molecular variável (por exemplo, de 300 a 5000 dáltons), tais como DPPE-PEG, DSPE-PEG, DMPE-PEG ou DAPE-PEG (onde DAPE é 1,2- diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina). As composições também podem conter outros compostos anfifílicos incluindo, por exemplo, ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquidônico ou ácido olei- co; esteróis, tais como colesterol ou ésteres de esteróis com ácidos graxos ou com ácidos de açúcar; glicerol ou glicerol ésteres, incluindo tripalmitato de glicerol, diestearato de glicerol, triestearato de glicerol, dimiristato de gli- cerol, trimiristato de glicerol, dilaurato de glicerol, trilaurato de glicerol, dipal- mitato de glicerol; sais de alquil amônio terciários ou quaternários, tais como 1,2-diestearoil-3-trimetilamônio-propano (DSTAP), 1,2-dipalmitoil-3-trimetila- mônio-propano (DPTAP) e misturas ou combinações dos mesmos.

De preferência, a formulação compreende pelo menos um com- ponente trazendo uma carga líquida global tal como, por exemplo, ácido fos- fatídico, PE-PEG, ácido palmítico, ácido esteárico, EtiI-DSPC ou DSTAP, de preferência em uma quantidade molar de menos de cerca de 50%. Formula- ções particularmente preferidas podem incluir misturas de dois ou mais dos seguintes componentes: DSPC, DPPG, DPPA1 DSPE-PEG1000, DSPE- PEG2000, ácido palmítico e ácido esteárico. Alguns fosfolipídios preferidos e formulações são apresentados nos exemplos. Qualquer um dos gases des- critos aqui ou conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser em- pregados; contudo, gases inertes, tal como SF6 ou perfluorocarbonetos, tais como CF4, C3F8 e C4F10, são preferidos, opcionalmente em mistura com ou- tros gases tais como ar, nitrogênio, oxigênio ou dióxido de carbono.

As suspensões de microbolha preferidas da presente invenção podem ser preparadas a partir de fosfolipídios usando processos conheci- dos, tais como liofilização ou secagem-pulverização de soluções dos fosfoli- pídios brutos em um solvente adequado ou usando o processo apresentado no EP 554213; WO 04/069284; Patente U.S. N0 5.413.774; Patente U.S. N0 5.578.292; EP 744962; EP 682530; Patente U.S. N0 5.556.610; Patente U.S. N0 5.846.518; Patente U.S. N0 6.183.725; EP 474833; Patente U.S. N0 5.271.928; Patente U.S. N0 5.380.519; Patente U.S. N0 5.531.980; Patente U.S. N0 5.567.414; Patente U.S. N0 5.658.551; Patente U.S. N0 5.643.553; Patente U.S. N0 5.911.972; Patente U.S. N0 6.110.443; Patente U.S. N0 6.136.293; EP 619743; Patente U.S. N0 5.445.813; Patente U.S. N0 5.597.549; Patente U.S. N0 5.686.060; Patente U.S. N0 6.187.288; e Patente U.S. N0 5.908.610, as quais são incorporadas por referência aqui em sua totalidade. De preferência, conforme descrito no pedido de patente interna- cional WO 04/069284, uma microemulsão pode ser preparada, a qual con- tém os fosfolipídios (por exemplo, DSPC e/ou DSPA) em mistura com um agente de lioproteção (tal como, por exemplo, carboidratos, álcoois de açú- car, poliglicóis e misturas dos mesmos, conforme indicado em detalhes aqui depois) e opcionalmente outros materiais anfifílicos (tal como ácido esteári- co), dispersos em uma emulsão de água e de um solvente orgânico imiscível em água. Solventes orgânicos preferidos são aqueles tendo solubilidade em água de 1,0 g/l ou menor, de preferência menor do que cerca de 0,01 g/l e incluem, por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, 1-penteno, 2-penteno, 1-octeno, ciclopentano, ciclohexano, ciclooctano, 1- metil-ciclohexano, benzeno, tipicamente, etilbenzeno, 1,2-dimetilbenzeno, 1,3-dimetilbenzeno, dibutil éter e diisopropilcetona, clorofórmio, tetracloreto de carbono, 2-cloro-1-(difluorometóxi)-1,1,2-trifluoroetano (enflurano), 2- cloro-2-(difluorometóxi)-1,1,1-trifluorooctano (isoflurano), tetracloro-1,1- difluoroctano, perfluoropentano, perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluo- rononano, perfluorobenzeno, perfluorodecalina, metilperfluorobutiléter, metil- perfluoroisobutiléter, etilperfluorobutiléter, etilperfluoroisobutiléter e misturas dos mesmos. O conjugado de peptídeo/fosfolipídio da invenção pode ser misturado junto com o fosfolipídio que forma o envoltório da microvesícula, na microemulsão. De preferência, uma suspensão aquosa do conjugado de peptídeo/fosfolipídio e de um PE-PEG (por exemplo, DSPE-PEG2000) é primeiro preparada a qual é, então, misturada junto com uma emulsão orgâ- nica aquosa compreendendo o fosfolipídio e o agente de lioproteção. De pre- ferência, a referida mistura é realizada sob aquecimento, por exemplo, de cerca de 40°C a 80°C.

Antes de formação da suspensão de microbolhas através de dispersão em um veículo aquoso, os pós de fosfolipídio liofilizados ou secos por pulverização são contatados com ar ou outro gás. Quando contatados com o veículo aquoso, os fosfolipídios em pó cuja estrutura foi rompida, for- marão segmentos lamelarizados ou Iaminarizados que estabilizarão as mi- crobolhas do gás disperso nos mesmos. Esse método permite produção de suspensões de microbolhas que são estáveis mesmo quando armazenadas durante períodos prolongados e são obtidas através de dissolução simples dos fosfolipídios Iaminarizados (os quais foram armazenados sob um gás desejado) sem agitação ou qualquer agitação violenta.

Alternativamente, microbolhas podem ser preparadas através de suspensão de um gás em uma solução aquosa em alta velocidade de agita- ção conforme descrito, por exemplo, no WO 97/29783. Um outro processo para preparo de microbolhas é descrito no WO 2004/069284, aqui incorpo- rado por referência, o qual compreende preparo de uma emulsão de um sol- vente orgânico em um meio aquoso na presença de um fosfolipídio e subse- qüentemente iiofiiização da referida emulsão, após etapas opcionais de la- vagem e/ou filtração. Alguns métodos de preparação preferidos são descri- tos nos exemplos.

A formulação para a preparação das microbolhas cheias de gás pode, vantajosamente, ainda compreender um aditivo de Iiofiiização, tal co- mo um agente com efeito crioprotetor e/ou Iioprotetor e/ou um agente de composição de volume, por exemplo, um aminoácido, tal como glicina; um carboidrato, por exemplo, um açúcar, tal como sacarose, manitol, maltose, trealose, glicose, Iactose ou uma ciclodextrina ou um polissacarídeo, tal co- mo dextrano; ou um poliglicol, tal como polietileno glicol (por exemplo, PEG- 4000).

Qualquer uma dessas composições de ultra-som também pode- rá ser, na medida do possível, isotônica com o sangue. Conseqüentemente, antes de injeção, pequenas quantidades de agentes isotônicos podem ser adicionadas a qualquer uma das suspensões de agente de contraste de ul- tra-som. Os agentes isotônicos são soluções fisiológicas comumente usadas em medicina e eles compreendem solução salina aquosa (NaCl a 0,9%), solução de glicerol a 2,6%, solução de dextrose a 5%, etc.. Adicionalmente, as composições de ultra-som podem incluir aditivos padrões farmaceutica- mente aceitável incluindo, por exemplo, agentes de emulsificação, modifica- dores de viscosidade, crioprotetores, lioprotetores, agentes de composição de volume, etc..

Qualquer gás biocompatível pode ser usado nos agentes de contraste de ultra-som da invenção. O termo "gás", conforme usado aqui, inclui quaisquer substâncias (incluindo misturas) substancialmente na forma gasosa na temperatura do corpo humano normal. O gás pode, assim, incluir, por exemplo, ar, nitrogênio, oxigênio, CO2, argônio, xenônio ou criptônio, gases fluorados (incluindo, por exemplo, perfluorocarbonetos, SF6, SeFe), um hidrocarboneto de baixo peso molecular (por exemplo, contendo de 1 a 7 átomos de carbono), por exemplo, um alcano, tal como metano, etano, um propano, um butano ou um pentano, um cicloalcano, tal como ciclopropano, ciclobutano ou ciclopenteno, um alceno, tal como etileno, propeno, propadi- eno ou um buteno ou um alcino, tai como acetileno ou propino e/ou misturas dos mesmos. Contudo, gases fluorados são preferidos. Gases fluorados in- cluem materiais que contém, pelo menos um átomo de flúor, tal como SF6, freons (compostos orgânicos contendo um ou mais átomos de carbono e flúor, isto é, CF4, C2F6, C3F8, C4F8, C4Fi0, CBrF3l CCI2F2, C2CIF5 e CBrCIF2) e perfluorocarbonetos. O termo perfluorocarboneto refere-se a compostos contendo apenas átomos de carbono e flúor e inclui, em particular, perfluo- rocarbonetos saturados, insaturados e cíclicos. Os perfluorocarbonetos satu- rados, os quais são usualmente preferidos, têm a fórmula CnFn+2, onde η é de 1 a 12, de preferência, de 2 a 10, mais preferivelmente de 3 a 8 e, ainda mais preferivelmente, de 3 a 6. Perfluorocarbonetos adequados incluem, por exemplo, CF4, C2F6l C3F8, C4F8, C4Fi0l C5F12, COF2, C7Fi4, C8Fi8, e C9F20. Mais preferivelmente, o gás ou mistura de gás compreende SF6 ou um per- fluorocarboneto selecionado do grupo consistindo em C3F8, C4F8, C4Fi0, C5F2, C6Fi2, C7Fi4, C8Fi8 com C4Fi0 sendo particularmente preferido. Vide também WO 97/29783, WO 98/53857, WO 98/18498, WO 98/18495, WO 98/18496, WO 98/18497, WO 98/18501, WO 98/05364, WO 98/17324. Em uma modalidade preferida, o gás compreende C4Fi0 ou SF6, opcionalmente em mistura com ar, nitrogênio, oxigênio ou dióxido de carbono.

Em determinadas circunstâncias, pode ser desejável incluir um precursor a uma substância gasosa (por exemplo, um material que é capaz de ser convertido a um gás in vivo, freqüentemente referido como um "pre- cursor de gás"). De preferência, o precursor de gás e o gás que ele produz são fisiologicamente aceitáveis. O precursor de gás pode ser ph-ativado, fotoativado, temperatura-ativado, etc. Por exemplo, determinados perfluoro- carbonetos podem ser usados como precursor de gás temperatura-ativados. Esses perfluorocarbonetos, tal como perfluoropentano, têm uma temperatura de transição de fase líquida/gasosa acima da temperatura ambiente (ou a temperatura na qual os agentes são produzidos e/ou armazenados), mais abaixo da temperatura corporal; assim, eles sofrem um desvio de fase e são convertidos a um gás dentro do corpo humano.

Conforme discutido acima, o gás pode compreender uma mistu- ra de gases. As seguintes combinações são misturas de gás particularmente preferidas: uma mistura de gases (A) e (B) na qual pelo menos um dos ga- ses (B) presente em uma quantidade de entre 0,5 - 41 % em volume, tem um peso molecular maior do que 80 dáltons e é um gás fluorado e (A) é selecio- nado do grupo consistindo em ar, oxigênio, nitrogênio, dióxido de carbono e misturas dos mesmos, o equilíbrio da mistura sendo o gás A.

A menos que ele contenha um gás hiperpolarizado, conhecido por requerer condições de armazenamento especiais, o produto Iiofilizado pode ser armazenado e transportado sem a necessidade de controle de temperatura de seu ambiente e, em particular, pode ser fornecido a hospitais e médicos para formulação no local em uma suspensão administrável pronta para uso sem requerer que tais usuários tenham unidades de armazena- mento especiais. De preferência, em tal caso, ele pode ser fornecido na for- ma de um kit com dois componentes, o qual pode incluir dois recipientes dis- tintos ou um recipiente com câmara dupla. No primeiro caso, de preferência, o recipiente é um frasco vedado com septo convencional, em que o frasco contendo o resíduo Iiofilizado da etapa b) é vedado com um septo através do qual o líquido veículo pode ser injetado usando uma seringa opcionalmente pré-enchida. Em tal caso, a seringa usada com o recipiente do segundo componente é também usada, então, para injeção do agente de contraste. No último caso, de preferência, o recipiente com câmara dupla é uma serin- ga com câmara dupla e, uma vez que o Iiofilizado tenha sido reconstituído e, então, adequadamente, misturado ou gentilmente agitado, o recipiente pode ser usado diretamente para injeção do agente de contraste. Em ambos os casos, meios para direcionar ou permitir a aplicação de energia de formação de bolha suficiente nos conteúdos do recipiente são proporcionados. Contu- do, conforme notado acima, nos agentes de contraste estabilizados de acor- do com a invenção, o tamanho das microbolhas de gás é substancialmente independente da quantidade de energia de agitação aplicada ao produto se- co reconstituído. Conseqüentemente, não mais do que ligeira agitação ma- nual geralmente é requerida para proporcionar produtos reproduzíveis com um tamanho de microbolha consistente.

Pode ser apreciado por aqueles versados na técnica que outros sistemas de reconstituição com duas câmaras capazes de combinação do pó seco com a solução aquosa de uma maneira estéril também estão dentro do escopo da presente invenção. Em tais sistemas, é particularmente vanta- joso se a fase aquosa pode ser interposta entre o gás insolúvel em água e o ambiente, para aumentar a vida útil do produto. Onde um material necessá- rio para a formação do agente de contraste já não está presente no recipien- te (por exemplo, um Iigante de objetivação a ser ligado ao fosfolipídio duran- te reconstituição), ele pode ser embalado com outros componentes do kit, de preferência, em uma forma ou recipiente adaptado para facilitar pronta com- binação com os outros componentes do kit.

Nenhum recipiente, frasco ou sistemas de conexão específicos são requeridos; a presente invenção pode usar recipientes, frascos e adap- tadores convencionais. O único requisito é uma boa vedação entre a rolha e o recipiente. A qualidade da vedação, portanto, se torna um assunto de pre- ocupação primária; qualquer degradação da integridade da vedação poderia permitir que substâncias indesejáveis entrem no frasco. Além de assegurar esterilidade, retenção de vácuo é essencial para produtos vedados em pres- sões ambiente ou reduzida para assegurar reconstituição segura e apropria- da. A rolha pode ser um composto ou formulação com múltiplos componen- tes baseada em um elastômero, tal como uma borracha de butila ou (po- li)isobutileno.

Em aplicações de ultra-som, os agentes de contraste formados por microbolhas estabilizadas de fosfolipídio podem ser administrados, por exemplo, em doses de modo que a quantidade de fosfolipídio injetado esteja na faixa de 0,1 a 200 μ9/Ι<9 de peso corporal, de preferência, de cerca de 0,1 a 30 μg/kg.

Técnicas de formação de imagem por ultra-som que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem técnicas conhecidas, tais como Doppler colorido, Doppler de pó, amplitude de Doppler, formação de imagem acústica estimulada e técnicas de formação de imagem bi- ou tridimensional. Formação de imagem pode ser feita nos modos harmônico (freqüência ressonante) ou fundamental, com a segunda harmônica preferi- da.

Os agentes de contraste de ultra-som da presente invenção po- dem ainda ser usados em uma variedade de métodos de formação de ima- gem terapêutica. O termo formação de imagem terapêutica inclui, dentro de seu significado, qualquer método para o tratamento de uma doença em um paciente, o qual compreende o uso de um agente de formação de imagem por contraste (por exemplo, para a distribuição de um agente terapêutico a um receptor ou tecido selecionado) e o qual é capaz de exercer ou é res- ponsável por exercer um efeito biológico in vitro e/ou in vivo. Formação de imagem terapêutica pode, vantajosamente, estar associada à destruição lo- calizada controlada das microvesículas cheias de gás, por exemplo, por meio de uma explosão de ultra-som em alta pressão acústica (tipicamente, maior do que uma geralmente empregada em métodos de formação de ima- gem diagnostica não destrutivos). Essa destruição controlada pode ser usa- da, por exemplo, para o tratamento de coágulos sangüíneos (uma técnica também conhecida como sonotrombólise), opcionalmente em combinação com a liberação localizada de um agente terapêutico adequado. Alternativa- mente, a referida formação de imagem terapêutica pode incluir a distribuição de um agente terapêutico em células, como um resultado de uma permeabi- lização transitória da membrana a nível celular induzida pela explosão locali- zada das microvesículas. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, para uma distribuição eficaz de material genético; opcionalmente um fármaco po- de ser localmente distribuído localmente em combinação com material gené- tico, assim, permitindo uma terapia genética/farmacêutica combinada do pa- ciente (por exemplo, no caso de tratamento de tumor).

O termo "agente terapêutico" inclui, dentro de seu significado, qualquer substância, composição ou partícula a qual pode ser usada em qualquer aplicação terapêutica, tal como em métodos para o tratamento de uma doença em um paciente, bem como qualquer substância a qual é capaz de exercer ou responsável por exercer um efeito biológico in vitro e/ou in vivo agentes terapêuticos, assim, incluem qualquer composto ou material capaz de ser usado no tratamento (incluindo diagnóstico, prevenção, alívio, alívio de dor ou cura) de qualquer estado patológico em um paciente (inclu- indo enfermidade, aflição, lesão doentia ou ferimento). Exemplos de agentes terapêuticos são fármacos, produtos farmacêuticos, agentes bioativos, agen- tes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes radioterapêuticos, pro- teínas, peptídeos naturais ou sintéticos, incluindo oligopeptídeos e polipeptí- deos, vitaminas, esteróides e material genético, incluindo nucleosídeos, nu- cleotídeos, oligonucleotídeos, polinucleotídeos e plasmídeos. Materiais e métodos analíticos

Solventes para reações, purificação cromatográfica e análises por HPLC eram solventes de grau E. Merck Omni da VWR Corporation (West Chester, PA). N-Metilpirrolidinona (NMP) e N,N-dimetilformamida (DMF) foram obtidas da Pharmco Products Inc. (Brookfield, CT) e eram de grau para síntese de peptídeo ou qualidade de grau Biotech sem á- gua/amina. Piperidina (grau para seqüenciamento, redestilada 99 +%) e áci- do trifluoroacético (TFA) (grau espectrofotométrico ou grau para seqüencia- mento) foram obtidos da Sigma-Aldrich Corporation (Milwaukee, Wl) ou da Fluka Chemical Division of Sigma-Aldrich Corporation. N,N'-Diisopropilcar- bodiimida (DIC), fenol (99%), Ν,Ν-diisopropiletilamina (DIEA) e triisopropil- silano (TIS) foram adquiridos da Sigma- Aldrich Corporation. Aminoácidos Fmoc-protegidos, dipeptídeos de pseudoprolina, Fmoc-Asp(O-tBu)- Ser(4JMeMepro)-OH e Fmoc-Gly-Thr(itJMeMepro)-OH e N-hidroxibenzotriazol (HOBt) foram obtidos da Novabiochem (San Diego, CA). Ácido Fmoc-8- amino-3,6-dioxaoctanóico (Adoa) foi obtido da NeoMPS Corp (San Diego, CA) ou Suven Life Sciences (Hyderabad, índia). Glutarato de dissuccinimidi- la (DSG) e sal de amônio de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina- N-[amino (polietileno glicol) 2000], [DSPE-PEG2000-NH2] foram obtidos da Pierce Chemical Co. (Rockford, TL.) e Avanti® Polar Lipids (Alabaster, AL), respectivamente. Fmoc-GIy-GIy-GIy-OH e Fmoc-GIy-GIy-OH foram prepara- dos no local a partir da triglicina ou diglicina correspondente através de rea- ção com Fmoc-OSu. Resina de troca de íons AG MP-50 foi obtida da Bio- Rad (Hercules, CA).

Os dados de HPLC analítica foram geralmente obtidos usando um sistema de gradiente como uma dupla Shimadzu LC-10AT VP empre- gando uma coluna Waters XTerra MS-C18, 4,6 χ 50 mm, (tamanho de partí- cula: 5 μ; tamanho de poro de 120 Â) e sistemas de eluição em gradiente ou isocrático usando água (TFA a 0,1%) como eluente A e CH3CN (TFA a 0,1%) ou CH3CN-CH3OH (1:1, v/v) (TFA a 0,1%) como eluente B. Detecção de compostos foi realizada usando UV a 220 e 254 nm. A pureza dos deri- vados de fosfolipídio-PEG-peptídeo foi determinada sobre uma coluna YMC C-4 (5 μΜ, 300 A, 4,6 χ 250 mm) ou sobre uma coluna Zorbax 300 SB-C3 (3,5 μΜ; 300 A, 3 χ 150 mm) usando um Detector por Dispersão de Luz SE- DEX 55 (LSD) e com um detector de UV.

HPLC preparativa foi conduzida sobre um sistema de gradiente com bomba dupla Shimadzu LC-8A equipado com um detector de UV SPD- 10AV adaptado com uma célula de fluxo preparativa. Geralmente, a solução contendo o peptídeo bruto foi carregada sobre uma coluna de fase reversa C18, C3 ou C4, dependendo das características do composto, usando uma terceira bomba presa ao sistema de gradiente com bomba dupla Shimadzu LC-8A preparativo. Após a solução da mistura de produto bruto ser aplicada à coluna de HPLC preparativa, os solventes de reação e os solventes em- pregados como diluentes, tais como DMF ou DMSO, foram eluídos da colu- na em uma composição de baixa fase orgânica. Então, o produto desejado foi eluído usando uma eluição em gradiente de eluente B em eluente A. As frações contendo produto foram combinadas baseado em sua pureza, con- forme determinado através de HPLC analítica e análise espectral de massa. As frações combinadas foram Iiofilizadas para proporcionar o produto dese- jado.

Análises de composição de aminoácido foram realizadas no Keck Biotechnology Resource Laboratory na Yale University, New Haven, CT. Dados espectrais de massa foram obtidos da MSean Inc. (606 Brandy- wine Parkway, West Chester PA 19380) ou obtidas no laboratório sobre um Espectrômetro de Massa Agilent LC-MSD 1100. Para fins de seleção de fra- ção e caracterização dos produtos, os valores espectrais de massa foram usualmente obtidos usando API-ES no modo de íons negativo. Geralmente, o peso molecular dos peptídeos alvo era de -3000; os espectros de massa usualmente exibiam valores de massa de íon dupla ou triplamente carrega- dos negativamente ao invés de [M-H]". Esses foram geralmente empregados para seleção de frações para coleta e combinação para obter o peptídeo puro durante purificação por HPLC. Em alguns casos, as frações exibiam picos dominantes atribuíveis a [M-2H]/2 + 57 ou [M-2H]/2 + 114 no espectro de massa. Esses picos são em virtude da formação de adutos de uma ou duas moléculas de ácido trifluoroacético por molécula do peptídeo. Após co- leta cuidadosa das frações comparando os resultados de MS e purezas por HPLC e processo de liofilização, uma pequena quantidade do sólido fofo isolado foi dissolvida em água (0,5 mg/mL) e tratada com uma gota de N- metil-D-glucamina aquosa (~ 0,5 M). Essa solução foi analisada através de HPLC e MS com relação aos resultados de pureza final do peptídeo purifica- do. Soluções de peptídeo na presença de N-metil-D-glucamina não exibem picos em um valor de massa de [M-2H]/2 + 57 ou [M-2H]/2 + 114 no espec- tro de massa, antes, os picos [M-2H]/2 ou [M-3H]/3 esperados foram obser- vados.

Os Exemplos não Iimitativos a seguir proporcionam detalhes a- dicionais sobre processos eficientes usados para obtenção de grandes quantidades de formas altamente purificadas dos conjugados de peptí- deo/fosfolipídio monoméricos e diméricos. Esses Exemplos não Iimitativos também descrevem o preparo de microbolhas objetivadas representativas as quais incluem esses conjugados de peptídeo/fosfolipídio monoméricos e di- méricos. Esses Exemplos também descrevem o uso de tais microbolhas ob- jetivadas em testes de ligação estática sobre células KDR-transfectadas e testes de ligação dinâmica sobre a proteína quimérica rh VEGF-R2/Fc. Os Exemplos ainda descrevem a avaliação de agentes de contraste de ultra- som contendo lipopeptídeos de ligação à KDR em um modelo de tumor VX2 de coelho. EXEMPLOS

Os Exemplos 1-2 abaixo referem-se ao conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico mostrado na figura 2. Um processo para síntese desse composto é mostrado na figura 1. Embora esses Exemplos se refiram mais especificamente para a síntese do composto mostrado na figura 2, um processo similar pode ser usado para preparar o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico mostrado na figura 10 e o monômero peptídico linear (32) mostrado na figura 9, bem como outros conjugados de peptí- deo/fosfolipídio monoméricos. Adicionalmente, o Pedido U.S. co-pendente N°. 10/661.156, depositado em 11 de Setembro de 2003, apresenta métodos para o preparo dos monômeros peptídicos e é incorporado por referência aqui em sua totalidade. EXEMPLO 1

Síntese em Fase Sólida (SPPS) e Purificação de Monômero Peptídico Linear (2) Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2, (SEQ ID N°. 2) Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met- Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-GIy-GIy-GIy-GIy-GIy-Lys-NH2; N- acetil-L-alanil-L-glutaminil-L-aspartil-L-triptofil-L-tirosil-L-tirosil-L-aspartil-L- glutamil-L-isoleucil-L-leucil-L-seril-L-metionil-L- alanil-L-aspartil-L-glutamil-L- leucil-L-arginil-L-histidil-L-alanil-L-fenilalanil-L-leucil-L-seril-glicil-glici glicil-glicil-L-lisinamida

O monômero peptídico linear (2) foi sintetizado através do proto- colo automático estabelecido sobre um Sintetizador de Peptídeo SONA- TA®/Pilot usando resina Fmoc-PaI-Peg-PS (0,2 mmol/g), aminoácidos Fmoc- protegidos e ativação de éster HOBt DIC-mediada em DMF. A seqüência peptídica foi sintetizada de um modo gradual através de métodos de SPPS sobre resina Fmoc-Pal-Peg-PS, tipicamente sobre uma escala de 10 mmol. Os acoplamentos de aminoácido foram realizados com um excesso de 4 vezes de cada aminoácido e o par de reagente DIC-HOBt em DMF.

Em um acoplamento típico de um aminoácido, 5 mL de DMF se- ca por grama de resina foram usados. O volume total de DMF, calculado com base na resina usada, foi alocado entre aminoácido, HOBt e DIC para preparo de solução. Por exemplo, para a síntese envolvendo 50 g (escala de 10 mmols) de resina, o volume calculado de 250 mL de DMF foi distribuído entre aminoácido (150 mL), HOBt (50 mL) e DIC (50 mL). O vaso de amino- ácido sobre o Sintetizador de Peptídeo Sonata Pilot foi carregado com o a- minoácido sólido seco (excesso de 4 vezes com relação à resina). No início da etapa de acoplamento, o software do instrumento foi empregado para distribuir sucessivamente o volume escolhido de DMF (para diluição do ami- noácido) e HOBt (4 eq.) em DMF e DTC (4 eq.) em DMF e mistura através de borbulhamento de nitrogênio foi iniciada durante 4 min. Isso serviu para pré-ativar o aminoácido e assegurar dissolução completa de todos os com- ponentes da mistura. Após ativação, o software mediou a transferência da solução do Fmoc-aminoácido ativado para o vaso de reação contendo a re- sina. Após a transferência estar completa, o vaso foi agitado durante 3 h com borbulhamento recorrente de nitrogênio. Após o tempo de acoplamento de 3 h, a resina foi lavada totalmente com DMF (5 mL/g, 6x) e a clivagem do grupo Fmoc foi realizada com piperidina a 25% em DMF (5 mL/g) contendo HOBt (0,1 M) (2x10 mm). A resina foi totalmente lavada com DMF (5 mL/g, 6x) para assegurar remoção completa de piperidina da resina em preparo para assegurar acoplamento de aminoácido. No caso de Fmoc-Gly-Gly-Gly- OH e Fmoc-Gly-Gly-OH, a pré-ativação na garrafa de aminoácido não foi conduzida de forma a minimizar a formação de dicetopiperazina durante o tempo de ativação, conforme discutido no texto. Portanto, nesses dois ca- sos, as soluções de aminoácido, HOBt e DIC, foram adicionadas ao vaso de reação seqüencialmente e o processo de acoplamento foi conduzido com ativação in situ.

Após o alongamento de cadeia estar completo, o grupo Fmoc do aminoácido N-terminal foi removido da maneira padrão, seguido pela lava- gem padrão com DMF (vide supra). O aminoácido N-terminal foi, então, re- vestido através de tratamento com mistura de acetilação recentemente pre- parada (anidrido acético a 0,5 M1 DIEA a 0,125 M e HOBt a 0,015 M em DMF/6 mL/g de resina), 2 χ 20 min. Após término da síntese de peptídeo, a resina foi tratada com o coquetel de clivagem, "Reagente B" (TFA:água:fe- no!:triisopropil-silano, 88:5:5:2, v/v/peso/v) (10 mL/g de resina) durante 4 h. Os voláteis foram removidos e a pasta assim obtida foi triturada com éter para proporcionar um sólido o qual foi lavado com éter (3x) com centrifuga- ção interveniente (para compactar os sólidos suspensos de forma a permitir decantação do sobrenadante) e, então, secos sob vácuo para proporcionar o peptídeo requerido como um sólido acinzentado. Uma síntese em escala de 10 mmols do monômero peptídico linear (2) proporcionou 33,82 g (103% da teoria) do peptídeo bruto. O rendimento maior do que o teórico foi provavel- mente em virtude de umidade e solventes residuais.

Purificação de monômero peptídico linear (2) Ac-RAQDW YY- DEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2 (SEQ ID N°. 2); Ac-Arg-Ala-Gln-Asp- Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Lea-Arg-His-Ala-Phe-Leu- Ser-GIy-GIy-GIy-GIy-GIy-Lys-NH2; N-acetil-L-alanil-L-glutaminil-L-aspartil-L- triptofil-L-tirosil-L-tirosil-L-aspartil-L-glutamil-L-isoleucil-L-leucil-L-seril-L- metionil-L- alanil-L-aspartil-L-glutamil-L-leucil-L-arginil-L-histidil-L-alanil-L- fenilalanil-L-leucil-L-seril-glicil-glicH-glicil-glicil-glicil-L-lisinamida

Uma porção de -0,5 g do monômero peptídico linear bruto (2) foi dissolvida em uma quantidade mínima de CH3CN (-20 mL). O volume da solução foi ajustado para -100 mL com água e, empregando uma terceira bomba, a solução foi carregada sobre uma coluna preparativa C18 de fase reversa (Waters, XTerra® Prep MS C18, 10 μ, 300 Â, 50 χ 250 mm, taxa de fluxo de 100 mL/min) a qual tinha sido pré-equilibrada com CH3CN a 10% em água (TFA a 0,1%). A coluna não foi eluída com o eluente de equilíbrio durante aplicação da solução de amostra. Após a solução de amostra ser aplicada à coluna, a composição do eluente foi elevada para CH3CN a 20%- água (TFA a 0,1%) durante 1 min e um gradiente linear em uma taxa de 0,6%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) foi iniciado e man- tido durante 50 min. Frações (15 mL) foram manualmente coletadas usando UV a 220 nm como um indicador de eluição de produto. As frações coleta- das foram analisadas sobre uma coluna C-18 de fase reversa analítica Wa- ters XTerra (partícula de 5 μ, poro de 120 A) e frações contendo produto com pureza >95% foram empoçadas e Iiofilizadas para proporcionar o mo- nômero peptídico linear puro correspondente (2). Tipicamente, a purificação de 0,5 g de (2) bruto proporcionou 0,12 g (rendimento de 24%) do produto desejado (pureza >95%).

EXEMPLO 2

Preparação do conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico

(1) Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH- Glut)-NH2 (SEQ ID N°. 1); Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu- Ser-Met-Ala-Asp-Gly-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys- (DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2; N-acetil-L-arginil-L-alanil-L-glutaminil-L- aspartil-L-triptofil-L-triptofil-L-aspartil-L-isoleucil-L-glutamil-L-leucil-L-serinil-L- metionil-L-alanil-L-aspartil-L-glutaminil-L-leucil-L-arginil-L-histidil-L-alanil-L- fenilalanil-L-leucil-L-serinil-glicil-glicil-glicil-glicil-glicil-L-lisinamida

O conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (1), Ac- RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)- NH2 (SEQ ID N°. 1), foi preparado através de conjugação de (3), a monoa- mida de mono-NHS éster de ácido glutárico do monômero peptídico (2), com sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2(4).

Um frasco de fundo redondo equipado com barra de agitação magnética e tampa com septo foi carregado seqüencialmente com dimetil- formamida anídrica (7,5 mL), glutarato de dissuccinimidila (DSG, 0,25 g, 0,75 mmol) e diisopropiletilamina (0,10 g, 0,78 mmol) com agitação. O monômero peptídico linear sólido (2) (0,5 g, 0,152 mmol) foi adicionado aos poucos à solução acima durante um período de 2 min; então, a solução foi agitada durante 30 min em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída para ~ 50 mL com acetato de etila anídrico; isso resultou em precipitação do mono-NHS éster (3) intermediário, a monoamida de mono-NHS éster de áci- do glutárico de monômero peptídico (2). A solução foi centrifugada para levar ao mono-NHS éster (3) como um sólido incolor. O sobrenadante contendo DSG em excesso foi decantado do mono-NHS éster (3) compactado sólido, o qual foi novamente disperso em acetato de etila, centrifugado e lavado mais duas vezes para remover os traços restantes de DSG. O mono-NHS éster (3) intermediário sólido assim obtido foi dissolvido em DMF anídrica (10,0 mL); diisopropiletilamina (0,10 g, 0,78 mmol) foi adicionada; e a mistura foi agitada.

Enquanto isso, sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000- NH2 (4) (0,38 g, 0,14 mmol, 0,9 eq.) foi suspenso em diclorometano seco (2 mL) em um frasco separado e ácido trifluoroacético (2 gotas) foi adicionado para protonar o oxigênio de fosfodiéster, facilitando a solubilização de sal de amônio de fosfolipídio em diclorometano. A solução clara foi, então, evapo- rada sobre um evaporador giratório para remover os voláteis e seca adicio- nalmente sob vácuo.

O sal de amônio de fosfolipídio sólido (4) foi dissolvido em DMF (5 mL) e transferido para a solução agitada de mono-NHS éster (3) e a mis- tura resultante foi agitada durante 24 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída para 100 mL com uma mistura a 1:1 de CH3OH e CH3CN-água (1:1, v/v) e os insolúveis foram filtrados. Metade da solução filtrada foi carregada sobre uma coluna preparativa C2 de fase reversa (Kromasil® Prep C2, 10 μ, 300 Â, 50 χ 250 mm) a qual tinha sido pré- equilibrada com uma mistura a 3:1 (v/v) de água (TFA a 0,1%) e CH3OH- CH3CN (1:1, v/v, TFA a 0,1%) em uma taxa de fluxo de 100 mL/min. Note que a coluna não foi eluída com o eluente de equilíbrio durante carregamen- to da amostra. Após a solução de amostra ser carregada, a coluna foi lavada com o eluente de equilíbrio até que o tampão de DMF fosse eluído. A com- posição do eluente foi elevada para CH3OH a 70%-CH3CN (1:1, TFA a 0,1%) durante 9 min e um gradiente linear de 0,75%/min de CH3OH- CH3CN (1:1, TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) foi iniciado e operado durante 40 min. Frações (15 mL) foram coletadas usando UV (220 nm) como um indicador de eluição de produto. Frações foram verificadas com relação à pureza so- bre um sistema de HPLC analítico (coluna: YMC C-4, 5 μ, 300 A, 4,6 χ 250 mm) usando UV a 220 nm e um detector de dispersão de luz evaporativo (ELSD). O último detector (ELSD) foi empregado para detectar sal de amô- nio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (4) o qual tinha muito pouca absor- bância de UV a 220 nm. Frações contendo produto com pureza >98% e desprovidas de sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (4) foram combinadas e concentradas sobre um evaporador giratório para reduzir o teor de CH3OH. A solução concentrada foi, então, diluída com CH3CN a 10% em água até que um precipitado floculento desbotado se formasse. A solu- ção resultante foi Iiofilizada para proporcionar o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico (1) como um sólido incolor. A segunda porção do conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico bruto (1) foi purificada conforme descrito acima. O rendimento combinado do conjugado de peptí- deo/fosfolipídio monomérico (1) alvo foi 0,40 g (rendimento de 47%).

Os Exemplos 3-5 abaixo referem-se ao conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico mostrado na figura 5. Métodos representativos de síntese do conjugado dimérico são mostrados nas Figuras 3, 4, 6, 7 e 8. EXEMPLO 3

Síntese em Fase Sólida (SPPS)1 Ciclização e Purificação de peptídeos monoméricos (12) Ac- AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K (ivDde)]-NH2 e (13) Ac- VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)- NH2

Os peptídeos lineares foram sintetizados através de um protoco- lo automático estabelecido sobre um Sintetizador de Peptídeo SONATA® /Pilot usando resina Fmoc-PaI-Peg-PS (0,2 mmol/g), aminoácidos Fmoc- protegidos e ativação de éster HOBt DCI-mediada em DMF. A seqüência peptídica sobre a resina Fmoc-PaI-Peg-PS foi sintetizada de modo gradual através de métodos SPPS tipicamente em uma escala de 10 mmols. O aco- plamento de aminoácido foi realizado com um excesso de 4 vezes de ami- noácido e reagente DIC-HOBt em DMF.

Em um acoplamento típico de um aminoácido na seqüência, 5 mL de DMF seca por grama de resina foram usados. O volume total de DMF, calculado com base na resina usada, foi alocado entre aminoácido, HOBt e DIC para preparo de solução. Por exemplo, para a síntese envol- vendo 50 g de resina, o volume calculado de 250 ml_ de DMF foi distribuído entre aminoácido (150 mL), HOBt (50 mL) e DIC (50 mL). O vaso de amino- ácido no Sintetizador de Peptídeo Sonata® Pilot foi carregado com o amino- ácido seco sólido (excesso de 4 vezes com relação à resina). No início da etapa de acoplamento, o volume escolhido de DMF e HOBt (4 eq.) em DMF e DIC (4 eq.) em DMF foi distribuído sucessivamente e, após cada distribui- ção, mistura através de borbuihamenío com nitrogênio foi conduzida. Após o último reagente ser distribuído, borbulhamento com nitrogênio foi iniciado e conduzido durante 4 min. Isso serviu para pré-ativar o aminoácido e assegu- rar dissolução completa de todos os componentes da mistura.

Após ativação, a solução do Fmoc-aminoácido ativado foi trans- ferida para o vaso de reação contendo a resina. Após transferência estar completa, o vaso foi agitado durante 3 h com borbulhamento recorrente de nitrogênio. Após o tempo de acoplamento de 3 h, a resina foi totalmente la- vada com DMF (5 mL/g, 6x) e a clivagem do grupo Fmoc foi realizada com piperidina a 25% em DMF (5 mL/g) contendo HOBt (0,1 M) (2 χ 10 min). A resina foi totalmente lavada com DMF (5 mL/g, 6x) para assegurar remoção completa da piperidina da resina no preparado para assegurar acoplamento de aminoácido. No caso de Fmoc-GIy-GIy-GIy-OH e Fmoc-Gly-Gly-OH, a pré-ativação na garrafa de aminoácido não foi conduzida de forma a minimi- zar a formação de dicetopiperazina durante o tempo de ativação, conforme discutido no texto. Portanto, nesses dois casos, a solução do aminoácido, HOBt e DIC foi adicionada ao vaso de reação seqüencialmente e o processo de acoplamento foi conduzido com ativação in situ. Após alongamento de cadeia ter terminado, o grupo Fmoc do aminoácido N-terminal foi removido da maneira padrão, seguido por lavagem padrão com DMF (vide supra). O aminoácido N-terminal foi, então, revestido através de tratamento com uma mistura acetilação recentemente preparada (anidrido acético a 0,5M, DIEA a 0,125M e HOBt a 0,015M em DMF - 6 mL/g de resina), 2 χ 20 min.

Funcionalização do grupo ε-amino das porções de Iisina C- terminais dos peptídeos monoméricos (com Fmoc-Adoa ou com Fmoc- Lys(ivDde) conforme requerido) foi realizada primeiro através de remoção do grupo ivDde do grupo ε-amino com hidrazina a 10% em DMF recentemente preparada (5 mL/g de resina - 2 χ 10 min). Para anexar Fmoc-Adoa ou Fmoc-Lys(ivDde), o tempo de acoplamento foi aumentado para 10 h. Após término da síntese de peptídeo, a resina foi tratada com o coquetel de cliva- gem, "Reagente B" (TFA:água:fenol:triisopropil-silano, 88:5:5:2, v/v/peso/v) (10 mL/g de resina) durante 4 h. Após evaporação dos voláteis sob vácuo, a pasta foi triturada com éter para proporcionar um sólido o qual foi coletado através de filtração, lavado com dietil éter e seco. Uma síntese em escala de 10 mmol de (12), Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2 proporcionou 30 g (103% da teoria) do peptídeo bruto. No caso de (13) Ac- VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2, uma síntese em es- cala de 10 mmol pp proporcionou 28 g (107% da teoria) de peptídeo bruto. Os rendimentos maiores do que o teórico são, mais provavelmente, em vir- tude de umidade e solventes residuais.

Ciclização dos peptídeos lineares de dicisteína em peptídeos de dissulfeto cíclico

Peptídeos de dissulfeto cíclico foram preparados a partir dos peptídeos de dicisteína lineares através de oxidação DMSO-assistida usan- do DMSO/água (95/5, v/v). O peptídeo linear bruto foi dissolvido na mistura de solvente (5 mL/g) em um béquer de boca larga e o pH da solução foi a- justado para 8,5 através da adição de N-metil-D-glucamina sólida em por- ções. A mistura resultante foi agitada durante 36 h em temperatura ambien- te. A solução foi, então, diluída com acetonitrila (50 mL/g) e a mistura foi agi- tada durante 2 min. O peptídeo de dissulfeto cíclico sólido foi coletado atra- vés de filtração, lavado com dietil éter e seco. Purificação de peptídeos monoméricos

Peptídeo monomérico (12) Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFG TGGGK[K(ivDde)]-NH2; Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr- Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Lys(ivDde)]-NH2 dissulfeto cíclico (6-13)

Uma porção de -0,5 g do monômero peptídico de dissulfeto cí- clico bruto (12) foi dissolvida em uma quantidade mínima de DMSO (~3 mL). 0 volume da solução foi ajustado para -100 mL com CH3CN a 20%-água e, empregando uma terceira bomba, a solução foi carregada sobre uma coluna preparativa C18 de fase reversa (Waters, XTerra® Prep MS C18, 10 μ, 300 A, 50 χ 250 mm, taxa de fluxo 100 mL/min), a qual tinha sido pré-equilibrada com CH3CN a 10% em água (TFA a 0,1%). Durante aplicação da mesma solução à coluna, o fluxo do eluente de equilíbrio do sistema de HPLC pre- parativo foi cessado. Após a solução de amostra ser aplicada à coluna, o fluxo de eluente de equilíbrio do sistema de HPLC em gradiente foi reiniciado e a coluna foi eluída com CH3CN a 10%-água (TFA a 0,1%) até que o DM- SO fosse eluído. Então, a composição de eluente foi elevada para CH3CN a 35%- água (TFA a 0,1%) durante 1 min, após o que um gradiente linear em uma taxa de 0,5%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) foi iniciado e mantido durante 50 min. Frações (15 mL) foram manualmente co- letadas usando UV a 220 nm como um indicador de eluição de produto. As frações coletadas foram analisadas sobre uma coluna C-18 de fase reversa analítica Waters XTerra (partícula de 5 μ, poro de 120 Â) e frações contendo produto com pureza >95% foram empoçadas e Iiofilizadas para proporcionar o monômero peptídico de dissulfeto cíclico (12) correspondente. Tipicamen- te, a purificação de 0,5 g de monômero peptídico bruto (12) proporcionou 0,1 g (rendimento de 20%) do produto desejado (pureza >95%).

Monômero peptídico (13) Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPG GGK(Adoa-Adoa)-NH2; Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val- Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly- Lys(Adoa-Adoa)-NH2 dissulfeto cícli- co (2-12)

Seguindo o procedimento empregado para a purificação por H- PLC do monômero peptídico (12), o monômero peptídico de dissulfeto cíclico bruto (13) Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 (0,5 g) dissolvido em uma mistura de CH3CN a 20%- água (100 mL) foi carregada sobre uma coluna preparativa C18 de fase reversa (Waters, XTerra® Prep MS C18, 50 χ 250 mm, partícula de 10 μ, poro de 300 A, taxa de fluxo de 100 mL/min), a qual tinha sido pré-equilibrada com CH3CN a 10% (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%). Durante aplicação da mesma solução à colu- na, a taxa de fluxo do eluente de equilíbrio do sistema de HPLC preparativa foi cessada. Após a solução de amostra ser aplicada à coluna, o fluxo de eluente de equilíbrio do sistema de HPLC em gradiente foi reiniciado e a co- luna foi eluída com CH3CN a 10%-água (TFA a 0,1%) durante 5 min. Então, a composição de eluente foi elevada para CH3CN a 30% (TFA a 0,1%)-água (TFA a 0,1%) durante 1 min e uma eluição em gradiente linear em uma taxa de 0,5%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) foi iniciada e mantida durante 50 min. Frações (15 mL) foram manualmente coletadas u- sando UV a 220 nm como um indicador de eluição de produto. As frações foram analisadas sobre uma coluna C-18 de fase reversa analítica Waters XTerra (d.i. 4,6 mm χ 50 mm, partícula de 5 μ, poro de 120 A) e frações con- tendo produto com pureza >95% foram empoçadas e Iiofilizadas para pro- porcionar o monômero peptídico de dissulfeto cíclico (13) correspondente.

Tipicamente, a purificação de 0,5 g de monômero peptídico bruto (13) pro- porcionou 0,12 g (rendimento de 24%) do produto desejado (pureza >95%).

EXEMPLO 4

Preparação e purificação de peptídeo dimérico precursor (16) Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGG

GK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2 dissulfeto cíclico (2-12)]-NH2 dissulfeto cíclico (6-13); Ac-Ala-Gly-Pro-ThT-TrP-CyS-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu- lle-Gly-Trp-Gly-Gly-Gly-Lys[Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu- Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(-Adoa-Adoa-Glut-Lys)]-NH2 dissulfeto cíclico (2-12) ]-NH2 dissulfeto cíclico (6-13)

Conforme mostrado na figura 3, glutarato de dissuccinimidila (DSG, 0,28 g, 0,86 mmol) foi dissolvido em dimetilformamida anídrica agita- da (2,0 mL) e diisopropiletilamina (0,11 g, 0,85 mmol) foi adicionada em uma porção. Então, o monômero peptídico sólido (12) Ac-AGPTWC*EDDWY YC*WLFGTGGGK-[K(ivDde)]-NH2 (0,50 g, 0,17 mmol) foi adicionado em porções à solução agitada de DSG durante um período de dois min. Após agitação durante 30 min em temperatura ambiente, a solução foi diluída com acetato de etila anídrico para ~ 50 mL, (isso serviu para precipitar o mono- NHS éster intermediário (14)). A mistura toda foi centrifugada e o sobrena- dante foi decantando, deixando o moho-NHS éster intermediário (14) como um sólido incolor. O sólido foi ressuspenso com acetato de etila; a solução contendo o mono-NHS éster sólido (14) suspenso foi centrifugada para se- parar o sólido e o sobrenadante foi novamente decantado. Esse processo de lavagem foi repetido duas vezes para remover completamente o DSG em excesso.

O mono-NHS éster (14) sólido foi dissolvido em dimetilformami- da anídrica agitada (2,0 mL) e diisopropiletilamina (0,11 g, 0,85 mmol) foi adicionada. Então, monômero peptídico sólido (13), Ac-VC*WEDSWG GEVCTRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2, (0,50 g, 0,19 mmol, 1,12 eq.) foi a- dicionado em porções à solução agitada durante um período de três min e a mistura resultante foi agitada durante 18 h. A reação foi monitorada através de espectrometria de massa; após o consumo completo do peptídeo mono- mérico monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico (14) ser confirma- do, hidrazina pura (0,1 mL) foi adicionada para remover o grupo de proteção ivDde do dímero trazendo ivDde (15) e a mistura foi agitada durante 20 min em temperatura ambiente.

A solução foi, então, acidificada através da adição gota a gota de TFA e a mistura foi diluída para 100 mL com CH3CN a 10% (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%). A solução foi filtrada para remover as partículas e metade da solução clarificada foi carregada sobre a coluna preparativa C18 de fase reversa (Waters, XTerra® Prep MS C18, 10 μ, 50 χ 250 mm, taxa de fluxo de 100 mL/min) pré-equilibrada com CH3CN a 10% em água (TFA a 0,1%). Durante aplicação da mesma solução à coluna, o fluxo do eluente de equilíbrio do sistema de HPLC preparativa foi cessado. Após a solução de amostra ser aplicada à coluna, o fluxo de eluente de equilíbrio do sistema de HPLC em gradiente foi reiniciado e a coluna foi eluída com CH3CN a 10%- água (TFA a 0,1%) de forma a remover a DMF da coluna. Após eluição do tampão de DMF ter terminado, a composição de eluente foi aumentada para CH3CN a 20% durante um min e a eluição foi continuada com uma taxa de gradiente linear de 0,6%/min de CH3CN (TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%). Frações (15 mL) foram coletadas usando UV (220 nm) como um indi- cador de eluição de produto. As frações foram analisadas sobre uma coluna C18 de fase reversa (Waters MS C18, d.i. 4,6 mm χ 50 mm, partícula de 5 μ, poro de 120 A) e as frações contendo produto com pureza >95% foram em- poçadas e Iiofilizadas para proporcionar peptídeo dimérico precursor (16) como um sólido fofo incolor. O peptídeo dimérico precursor (16) bruto restan- te foi purificado da mesma maneira. De 0,5 g de peptídeos monoméricos (12) e (13), 320 mg (rendimento global de 33%) do dímero desejado (16) foram obtidos (pureza > 95%).

EXEMPLO 5

Preparação de Conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) de ligação à KDR, Acetil-L-alanil-glicil-L-prolil-L-threonil-L-triptofil-L-cistinil-L- glutamil-L-aspartil-L-aspartil-L-triptofil-L-tirosil· lcucil-L-phcnylalanil-glicil-L-treonil-glicil-glicil-glicil-L-lisil[Acetil-L-valil-L- cistinil-L-triptofil-L-glutamil-L-aspattil-L-seril-L-triptofil-glicil-glicil-L-glutami valil-L-cistinil-L-fenilalanil-L-arginil-L-tirosil-L-aspartil-L-prolil-glicil-glici L-lisil(diestearilfosfoetanolaminocarbonóxi-PEG2000-amino-8-amino-3,6- dioxaoctanoil-8-amino-3,6-dioxaoctanoil-glutaril-L-lisil) amida cíclica (2-12) dissulfeto]-amida cíclica (6-13) dissulfeto; Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTG G G K{Ac-VCW E DSWGG E VC F RYDP-G G G K[-Adoa-Adoa-G I ut-K( DS P E- PEG2000-NH-Glut)]-NH2 dissulfeto cíclico (2-12)}-NH2 dissulfeto cíclico (6- 13); Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe- Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys{Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Thr-Gly-Gly-Glu-Val- Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys[-Adoa-Adoa-Glut-Lys(DSPE- PEG2000-NH-Glut)-]-NH2 dissulfeto cíclico (2-12)}-NH2 dissulfeto cíclico (6- 13).

O dímero de ligação à KDR (11) pode ser preparado através de conjugação do peptídeo dimérico precursor (16), Ac-AGPTWCEDDWYY CWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[- NH2 dissulfeto cíclico (2-12)]-NH2 dissulfeto cíclico (6-13), com sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000-NH2 (18) conforme mostrado na figura 4.

Peptídeo dimérico precursor sólido (16) (0,5 g, 0,092 mmol) foi adicionado aos poucos a uma solução de glutarato de dissuccinimidila (DSG, 0,15 g, 0,46 mmol) e diisopropiletilamina (0,06 g, 0,47 mmol) em DMF aní- drica (3,0 mL) com agitação durante um período de 3 min. Então, a solução foi agitada em temperatura ambiente durante 30 min. A mistura de reação foi diluída para ~ 50 ml_ com acetato de etila anídrico; isso resultou em precipi- tação da monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico dimérico (17), a monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico do peptídeo dimérico precursor (16). A solução foi centrifugada para o pélete 6 {m/z, íons neg., 1887,3 (M-3H)/3, 1415,1 (M-4H)/4, 1131,9 (M-5H)/5) como um sólido incolor. A camada de acetato de etila sobrenadante contendo DSG em excesso foi decantada da monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico (17) dimé- rica sólida compactada, a qual foi novamente ressuspensa em acetato de etila, centrifugada e lavada mais duas vezes para remover traços restantes de DSG. O derivado dimérico monoamida de mono-NHS éster de ácido glu- tárico intermediário sólido (17) assim obtido foi dissolvido em DMF anídri- ca/CH2CI2 (8:2, v/v) (3,0 mL); diisopropiletilamina (0,06 g, 0,47 mmol) foi adi- cionada e a solução foi agitada.

Enquanto isso, sal de amônio de fosfolipídio DSPE-PEG2000- NH2 (18) (0,235 g, 0,084 mmol, 0,9 eq.) foi suspenso em diclorometano seco (2 mL) em um frasco separado e TFA (2 gotas) foi adicionado para protonar o oxigênio de fosfodiéster, facilitando a solubilização do sal de amônio de fosfolipídio (18) em diclorometano. A solução clara foi concentrada para re- mover os voláteis e seca adicionalmente sob vácuo.

O sal de amônio de fosfolipídio (18) sólido foi dissolvido em DMF (2 mL) e transferido para a solução agitada do derivado dimérico monoamida de mono-NHS éster de ácido glutárico (17) e a mistura resultante foi agitada durante 24 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com uma solução de CH3OH a 50%, CH3CN a 25% e 25% de água (1:1) para ~ 100 mL e os insolúveis foram filtrados. Metade da solução filtrada foi carre- gada sobre uma coluna preparativa C4 de fase reversa (Kromasil® Prep C4, 10 μ, 300 A, 50 x 250 mm) a qual tinha sido pré-equilibrada com uma mistu- ra a 1:1 de CH3OH e CH3CN (1:1 , TFA a 0,1%) e água (TFA a 0,1%) em uma taxa de fluxo de 100 mL/min. Durante aplicação da mesma solução à coluna, o fluxo do eluente de equilíbrio do sistema de HPLC preparativa foi cessado. Após a solução de amostra ser carregada, o fluxo do eluente de equilíbrio foi reiniciado e a coluna foi lavada até que o tampão de DMF fosse eluído.

A composição do eluente foi, então, elevada para CH3OH a 70%-CH3CN (1:1, TFA a 0,1%)-água (TFA a 0,1%) durante 1 min e um gra- diente linear de 0,75%/min de CH3OH- CH3CN (1:1, TFA a 0,1%) em água (TFA a 0,1%) foi iniciado. A eluição foi continuada após atingir 100% de B de forma a obter eluição completa do produto da coluna. Frações (15 ml) foram coletadas usando UV (220 nm) como um indicador de eluição de produto e, após o produto principal ser eluição, coleta da fração foi continuada durante vários minutos de forma a assegurar eluição de quantidades vestigiais do sal de amônio de fosfolipídio (18) de iniciação. Frações foram verificadas com relação à pureza sobre um sistema de HPLC analítico (coluna: YMC C4, 5 μΜ, 300 A, 4,6 χ 250 mm) usando UV a 220 nm e um detector de dispersão de luz evaporativo (ELSD). O último detector é empregado para detectar DSPE-PEG2000-NH2, o qual tem um fraco cromóforo a 220 nm. Frações contendo produto com pureza >98% e desprovidas de sal de amônio de fos- folipídio DSPE-PEG2000-NH2 (8) foram combinadas e concentradas para reduzir o teor de CH3OH. A solução foi, então, diluída com CH3CN a 10% em água, até que um precipitado floculento desbotado se formasse. A solução resultante foi Iiofilizada para proporcionar o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico (11) como um sólido incolor. A segunda porção de conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) bruto foi purificada confor- me descrito acima. O rendimento combinado do conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico (11) alvo foi de 0,39 g (rendimento de 57%). As amostras do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) feitas a partir de diferentes operações de purificação foram empoçadas juntas, dissolvidas em uma mistura de terc-butanol-acetonitrila-água e reliofilizadas para pro- porcionar o conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) como um sólido fofo incolor, o qual foi ainda seco sob vácuo. Os Exemplos 6-8 abaixo referem-se a preparação do conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico mostrado na figura 5, em que o conjugado dimérico contém níveis muito baixos de TFA. As Figuras 6-8 ilustram os mé- todos descritos nos Exemplos abaixo.

EXEMPLO 6

Preparação de conjugado dimérico tendo baixos níveis de TFA via o uso de um ligante de glutarila

Preparo de (23), (26) e sal de acetato de peptídeo dimérico (27) através de conversão de (22), (25) e peptídeo dimérico 27.sais de nTFA aos sais de acetato através de resina de troca de íons AG MP-50

Para o composto (23), uma resina de troca de íons AG MP-50 (1,5 meq/mL de leito de resina) foi suspensa em 20% de CH3CN/H20. A suspensão foi empacotada em uma coluna de vidro de 3 χ 30 cm e o volume final foi de 150 mL. A coluna foi conectada a uma bomba e um medidor de condutividade. Ela foi lavada com 20% de CH3CN/H20 em uma taxa de fluxo de 17 mL/min até que a condutividade estivesse abaixo de 1 ps/cm. Com- posto (22) (210 mg) foi dissolvido em 20% de CH3CN/H20 (80 mL) e a solu- ção resultante foi carregada à coluna. A coluna foi lavada novamente com o mesmo eluente até que sua condutividade estivesse abaixo de 1 ps/cm. Um gradiente de NH4OAc em 20% de CH3CN/H20 foi aplicado a 200 mM, 400 mM, 600 mM e 800 mM, 250 mL cada. O composto apareceu em NH4OAc a 600 mM. As frações foram analisadas através de HPLC e aquelas contendo o composto foram combinadas e Iiofilizadas várias vezes, até que o peso do material fosse constante. 176 mg do material puro (23) foram obtidos como um sólido fofo branco. O rendimento foi de 83,8%.

Parâmetros e resultados adicionais foram como segue: HPLC: Tempo de Ret.: 5,6 min; Ensaio > 98% (área%); Coluna: Waters XTerra MS- C 18, 4,6 χ 50 mm, partícula de 5 μ, poro de 120 Â; Eluente: A: H2O (TFA a 0,1%), B: CH3CN (TFA a 0,1%); Eluição: condição inicial: 15% de B, gradien- te linear de 15-50% de B durante 8 min; Taxa de fluxo: 3 mL/min; Detecção: UV a 220 nm; Espectro de Massa: API-ES; Modo: íons Negativos; 1441,7 [M-2H]/2, 960,9 [M-3H]/3; Análise CE (contra-íons% peso/peso): TFA esti- mado como sendo 0,3%; acetato 1,1%.

Para o composto (26), seguindo o mesmo procedimento confor- me para o composto (23), 300 mg do sal de TFA do peptídeo (25) em 80 mL de água foram carregados a 17 mL/min. a 150 mL de uma coluna com AG MP-50, a qual foi lavada com H2O para uma condutividade de 1 ps/cm. A coluna foi, então, lavada com H2O novamente após carregamento e o mes- mo gradiente de etapa de NH4OAc aquoso em H2O conforme empregado para a troca de íons do composto (23) foi aplicado. Liofilização das frações combinadas até um peso composto proporcionou 200 mg do acetato (26) como um sólido fofo branco. O rendimento foi de 66,7%.

Parâmetros e resultados adicionais foram como segue: HPLC: Tempo de Ret.: 5,6 min; Ensaio 97,0% (área%); Coluna: Waters XTerra MS- C18, 4,6 χ 50 mm, partícula de 5 μ, Poro de 120 A; Eluente: A: H2O (TFA a 0,1%), B: CH3CN (TFA a 0,1%); Eluição: condição inicial: 15% de B, gradien- te linear de 15-50% de B durante 8 min; Taxa de fluxo: 3 mL/min; Detecção: UV a 220 nm; Espectro de Massa: API-ES; Modo: íons Negativos; 1336,9 [M-2H]/2, 890,8 [M- 3H]/3; análise CE (contra-íons% peso/peso): TFA esti- mado como sendo 0,4%; acetato 4,2%; Análise IC (F%): 0,26.

Para o peptídeo dimérico (27), sal de acetato, similar ao proce- dimento para o composto (23), uma coluna AG MP-50 (volume úmido de 100 mL) foi lavada com CH3CN a 30%/H20 até que a condutividade estivesse abaixo de 1 ps/cm. Composto (27) como o sal de TFA, (120 mg em 80 mL de CH3CN a 30%/H20) foi carregado sobre a coluna e a coluna foi lavada com o mesmo eluente até que a condutividade estivesse estável a 1 ps/cm.

Um gradiente em etapa de NH4OAc a CH3CN a 30%/H20 em CH3CN a 30%/H20 foi realizado para o composto (23) e o composto foi eluído em NH4OAc a aproximadamente 600 nM. As frações combinadas foram Iiofiliza- das e, então, reliofilizadas várias vezes até que o material mostrasse um peso constante para proporcionar 104 mg do material puro (27) como um sal de acetato. O rendimento foi de 86,7%.

Parâmetros adicionais e resultados foram como segue: HPLC:

Tempo de Ret.: 5,2 min; Ensaio >99% (área%); Coluna: Waters XTerra MS- C18, 4,6 χ 50 mm, partícula de 5 μ, poro de 120 A; Eluente: A: H2O (TFA a 0,1%), B: CH3CN (TFA a 0,1%); Eluição: Condições iniciais: 20% de B, gra- diente linear de 20-60% de B durante 8 min; Taxa de fluxo: 3 mL/min; Detec- ção: UV a 220 nm; Espectro de Massa: API-ES; Modo: íons Negativos; 1816,3 [M-3HJ/3, 1362,0 [M-4H]/4, 1089,2 [M-5H]/5; análise CE (contra- íons% peso/peso): TFA estimado como sendo de 0,2%; acetato 0,15%. Preparação e purificação do peptídeo dimérico (27), sal de acetato, a partir do composto (23) e composto (26)

A uma solução de dissuccinimidila (18 mg, 0,055 mmol) em DMF anídrica (0,1 mL) foi adicionada uma solução de composto (23) (0,1 mg, 0,021 mmol) em 0,2 mL de DMF anídrica gota a gota (pH de 8, neutralizada com DIEA). A solução clara foi agitada em TA durante 0,5h. HPLC e MS mostraram o término da reação. O solvente foi removido in vácuo e EtOAc (8 mL) foi adicionado para precipitar o intermediário (24). A mistura foi centrifu- gada e decantada para remover o glutarato em excesso. Essa lavagem com EtOAc foi repetida mais 3 vezes e o sólido resultante foi seco usando uma corrente de nitrogênio seco. Ele foi, então, dissolvido em 0,3 mL de DMF anídrica. Composto (26), (56 mg, 0,021 mmol) foi adicionado e o pH da solu- ção foi ajustado para 8 através da adição de DIEA. A solução foi agitada du- rante 16 h em temperatura ambiente, após o que análise por HPLC e MS indicaram término da reação. Uma alíquota de 30 μί de NH2NH2 foi adicio- nada e a mistura foi agitada durante 5 min para clivar o grupo ivDde. A mis- tura de reação foi analisada através de HPLC e MS, as quais indicaram re- moção completa do grupo ivDde.

Antes de purificação do acetato de peptídeo dimérico (27), cui- dado foi tomado para lavar cuidadosamente todo o sistema de HPLC prepa- rativa, incluindo a coluna com eluentes sem TFA, CH3CN/H20/NH40Ac a 10 mM. A mistura de reação bruta foi, então, aplicada a uma coluna preparativa C-18 de fase reversa (Atlantis C-18, partícula de 5 μιτι, poro de 100 A, 30 χ 150 mm, taxa de fluxo 30 mL/min), pré-equilibrada com 15% de B (A: NH4OAc a 10 mM em H2O; B: NH4OAc a 10 mM em CH3CN/H20, 9/1, v/v). A coluna foi lavada com o mesmo eluente até que o tampão de DMF fosse elu- ido. A composição de eluente foi aumentada para 25% de B durante 2 min e, então, elevada para 65% de B durante 40 min. As frações foram analisadas sobre uma coluna C-18 de fase reversa analítica (Waters MS C-18, 4,6 χ 50 mm, partícula de 5 μm, poro de 100 Â, taxa de fluxo de 3 mL/min) e as fra- ções contendo produto com pureza >95% foram empoçadas e Iiofilizadas para proporcionar 25 mg do peptídeo dimérico (27) como seu sal de acetato como um sólido branco fofo. O rendimento foi de 21,8%.

Parâmetros adicionais e resultados foram como segue: HPLC: Tempo de Ret.:

5,2 min; Ensaio > 99% (área%); Coluna: Waters XTerra MS-C18, 4,6 χ 50 mm, partícula de 5 μ, poro de 120 A; Eluente: A: H2O (TFA a 0,1%), B: CH3CN (TFA a 0,1%); Eluição: condições iniciais: 20% de B, gradiente linear de 20-60% de B durante 8 min; Taxa de fluxo: 3 mL/min; Detecção: UV a 220 nm; Espectro de Massa: API-ES; Modo: íons Negativos; [M-3H]/3, 1362,0 [M-4H]/4, 1089,2 [M-5H]/5; análise CE (contra-íon% peso/peso): TFA estimado como sendo menos de 0,2%; acetato 1,1%.

EXEMPLO 7 - figura 7

Preparação de conjugados de peptídeo/fosfolipídio diméricos tendo baixos níveis de TFA via resina de troca de íons

Preparação e purificação do conjugado de peptídeo/fosfolipídio (21) como seu sal de acetato a partir do sal de acetato de peptídeo dimérico (27)

A uma solução de glutarato de dissuccinimidila-DSG (3,7 mg, 11,3 pmols) em DMF anídrica (0,1 mL) foi adicionada uma solução de peptí- deo dimérico neutralizado (27), sal de acetato, (15 mg, 2,75 pmols) em DMF anídrica (0,2 mL), gota a gota. A solução de reação foi agitada em TA duran- te 0,5 h. Análise por HPLC com uma coluna C-18 Waters Xterra e MS mos- trou o término da reação. O solvente foi evaporado e EtOAc (8 mL) foi adi- cionado para precipitar o intermediário (28). O vaso contendo o intermediário (28) precipitado foi centrifugado e a camada líquida foi decantada. Esse pro- cedimento foi repetido 3 vezes para remover o excesso de DSG. O sólido foi seco com uma corrente de nitrogênio seco e, então, dissolvido em 0,3 mL de DMF anídrica. Sal de amônio DSPE-PEG2000-NH2 (29) (6,5 mg, 2,33 pmols) foi adicionado na forma sólida e o pH da mistura foi ajustado para (28). A mistura de reação foi agitada em TA durante 16 h. A mistura foi ana- lisada através de MS e HPLC com uma coluna Zorbax 300 SB-C3 e isso in- dicou que a reação estava completa.

Para minimizar a contaminação potencial do produto com TFA1 a mistura de reação bruta foi purificada através de HPLC preparativa equipada usando uma nova coluna Zorbax 300SB-C3 (21,2 χ 150 mm, partícula de 5 μ), a qual nunca tinha sido exposta ao TFA. O sistema de HPLC foi pré- lavado com CH3CN/H20/NH40AC extensivamente para remover traços de TFA. A mistura de reação foi carregada sobre a coluna, a qual foi pré- equilibrada com 20% de B (A: NH4OAc a 10 mM em H2O; B: NH4OAc a 10 mM em CH3CN/H20, 9/1 v/v) em uma taxa de fluxo de 30 mL/min. A coluna foi eluída a 30 mL/min com o mesmo eluente, até que o tampão de DMF fos- se eluído. A composição de eluente foi, então, aumentada para 40% de B durante 3 min e, então, elevada para 90% de B durante 50 min. As frações coletadas foram analisadas sobre uma coluna C-3 de fase reversa analítica (Zorbax 300SB-C3, 3 χ 150 mm, partícula de 3,5 pm, poro de 300 A, taxa de fluxo: 0,5 mL/min), onde detecção foi realizada usando UV a 220 nm e um detector de dispersão de luz evaporativo (ELSD). As frações contendo o produto puro foram empoçadas e liofilizadas. Uma porção de 6,5 mg do pro- duto final (21), sal de acetato, foi obtida. O rendimento foi de 33,0%.

Parâmetros adicionais e resultados foram como segue: HPLC: Tempo de Ret.: 13,3 min; Ensaio >99% (área%); Coluna: Zorbax 300SB-C3, 3 χ 150 mm, 3,5 pm, poro de 300 Á; Eluente: A: H2O (TFA a 0,1%), B: CH3CN/MeOH 1/1 (TFA a 0,1%); Eluição: Condição inicial: 60% de B, gradi- ente linear de 60-90% de B durante 3 min; Taxa de fluxo: 0,5 mL/min; Detec- ção: UV a 220 nm e ELSD; análise CE (contra-íon% peso/peso):% peso de TFA: 0,3%;% peso de acetato 0,4%. EXEMPLO 8 - figura 8

Preparação de conjugado dimérico tendo baixos níveis de TFA via purificação seqüencial usando HPLC preparativa Zorbax C-3 RP e cro- matografia por permeação em gel Sephadex G-25

Materiais e condições usados para o sistema de HPLC analítica incluem os seguintes: Coluna: Zorbax 300SB C-3; d.i. 3 mm x 150 mm; par- tícula de 3,5 pm; Eluente A : H2O (Grau HPLC com TFA a 0,1% em volume);

Eluente B: CH3CN (TFA a 0,1% em volume). Eluição: condição inicial: 50% de B, então, um gradiente linear de 50-90% de B durante 3 min, manter a 90% de B durante 11 min; Taxa de fluxo: 0,5 mL/min; Detecção: UV a 220 nm. Tempo de Ret.: (Composto (21)): 6,77 min, TR (liso): 4,06 min. HPLC preparativa usando coluna Zorbax C-3 preparativa para remover o lisocomposto de (21)

O composto bruto foi carregado em uma concentração de 30% de eluente B. Materiais e condições usados incluem: Condições: Coluna: Waters Zorbax 300SB C-3; d.i. 21,2 mm x 150 mm; partícula de 3,5 pm; Elu- entes: Eluente A: H2O (Grau HPLC com NH4OAc a 10 mM); Eluente B: CH3CN/H20, 9/1 (concentração final de NH4OAc: 10 mM ).

A composição do eluente foi, então, trocada para 45% de B du- rante 2 min, então, a coluna foi eluída com um gradiente linear de 45-100% de B durante 40 min; Taxa de fluxo: 30 mL/min; Detecção: UV a 220 nm.

O composto bruto (100 mg) foi dissolvido em 25 mL de uma so- lução a 30% de Β. O sistema de HPLC preparativa foi equilibrado a 30% de Β. O composto foi carregado sobre a coluna Zorbax C-3. A composição da fase móvel foi elevada para 45% de B durante 2 min. Um gradiente linear de 45-100% de B durante 40 min foi usado para a eluição de (21). O produto eluiu entre 26,5-33 min.

As frações que continham (21) foram combinadas e liofilizadas para proporcionar um sólido fofo branco. Esse foi dissolvido em água- acetonitrila, então, liofilizado novamente. Isso proporcionou 70 mg de produ- to desprovido do lisocomposto. A recuperação foi cerca de 70%. Após cro- matografia ter terminado, o sistema foi lavado com 95% de B durante 15 min em uma taxa de fluxo de 30 mL/min. A coluna foi, então, lavada com CH3CN/H20 (50/50, sem TFA ou tampão) durante 30 min em uma taxa de fluxo de 15 mL/min. A coluna foi, então, armazenada em temperatura ambi- ente para futuro uso. HPLC analítica confirmou a ausência do Iisocomposto no material isolado. Análise adicional confirmou que nenhum Iisocomposto se formou após 5 dias em temperatura ambiente. O material ainda continha quantidades significativas (4,2% em peso) de TFA.

Remoção de TFA de (21) através de cromatografia por permeação em gel sobre Sephadex G-25

Uma coluna Sephadex G-25 (100 g de resina, tamanho de conta de 20-80 μηι, volume total de gel - 500 ml_, altura da coluna: 27 cm) foi equi- librada com 4L de bicarbonato de amônio a 50 mM. Então, (21) (70 mg) foi dissolvido em 30 mL (volume final) de bicarbonato de amônio a 60 mM em acetonitrila aquoso a 10%. A solução foi filtrada e, então, carregada sobre a coluna Sephadex G-25. A coluna foi eluída com tampão de bicarbonato de amônio a 50 mM com coleta de frações de 10 mL. As frações coletadas fo- ram monitoradas através de HPLC analítica (detecção por UV a 220 nm). Os resultados são proporcionados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4

<table>table see original document page 62</column></row><table> As Frações 20-28 foram empoçadas e liofilizadas. O material Iiofilizado obtido foi redissolvido em um pequeno volume de água e a solu- ção foi congelada e Iiofilizada para remover quantidades residuais de bicar- bonato de amônio. O peso final do material desejado era de 58 mg. A recu- peração foi de 83%.

Para determinar a remoção eficaz de TFA1 a amostra foi subme- tida à análise CE para TFA e íons de acetato. O TFA está claramente pre- sente no material de iniciação (4,2%) de acordo com o ensaio anterior, en- quanto que ele é dificilmente detectado (0,2%) após o procedimento de per- meação em gel. Nenhum íon de acetato foi detectado.

Dados analíticos para (21) obtidos através de HPLC preparativa serial Zor- bax C-3 e cromatoqrafia de permeação de gel em Sephadex G-25

Os materiais usados e condições para coleta de dados analíticos incluem: análise de flúor (IC através de QTI): 751 ppm (TFA a 0,15% pe- so/peso); Espectro de Massa: Método: MALDI- TOF; Modo: íons Positivos; peso molecular médio detectado foi de 8461, a curva de distribuição de massa para PEG2000 típica foi observada. HPLC: Sistema A: Coluna: Zor- bax 300SB C-3 ; d.i. 3 mm χ 150 mm; partícula de 3,5 pm; Eluente A : Água (Grau HPLC com TFA a 0,1% em volume); Eluente B: Acetonitrila (TFA a 0,1% em volume). Condição inicial: 50% de B; Eluição: gradiente linear de 50-90% de B durante 3 min, manter a 90% de B durante 11 min; Taxa de fluxo: 0,5 mL/min; Detecção: UV a 220 nm. Tempo de Ret.: 6,77 min; Área%: 99,6%. Sistema B: Coluna: Zorbax 300SB C-3; d.i. 3 mm χ 150 mm; partícula de 3,5 pm; Eluente A : Água (grau HPLC com TFA a 0,1% em volume); Elu- ente B: Acetonitrila (TFA a 0,1% em volume). Condição inicial: 50% de B; Eluição: gradiente linear de 50 - 90% de B durante 3 min, então, elevar para 100% de B durante 12 min. Taxa de fluxo: 0,5 mL/min; Detecção: LSD. Tempo de Ret.: 13,98 min. Área%: 99,3%.

A Tabela 5 abaixo proporciona definições para as abreviações usadas e as fontes de materiais mencionados nos Exemplos 9-12. Tabela 5

<table>table see original document page 64</column></row><table>

*a forma ácida, isto é, ácido esteárico, também pode ser usadas em qual- quer um dos preparados de microbolha aqui.

EXEMPLO 9

Preparação de microbolhas objetivadas com envoltório de DSPC/DPPG Exemplo 9A

383 mg de uma mistura de DSPC/DPPG e o conjugado de pep- tídeo/fosfolipídio dimérico (11) mostrado na figura 5 (proporção molar de 49,75/49,75/0,5, correspondendo a 187,1, 176,4 e 19,8 mg dos três compo- nentes, respectivamente) e PEG-4000 (22,6 g) foram solubilizados em 120 g de álcool t-butílico a 60°C, em um banho de água. A solução foi enchida em frascos com 0,8 ml_ de solução cada. As amostras foram congeladas a - 45°C e liofilizadas. O ar no headspace foi substituído por uma mistura de C4F10/nitrogênio (50/50) e os frascos tampados e vedados. As amostras liofi- lizadas foram reconstituídas com 5 mL de H2O por frasco.

Exemplo 9B

O Exemplo 9A foi repetido usando uma mistura de DSPC/DPPG e o conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (31) mostrado na figura 10 (proporção molar de 49,5/49,5/1, correspondendo a 182,8, 172,3 e 28,2 mg dos três componentes, respectivamente).

EXEMPLO 10

Preparação de microbolhas objetivadas com envoltório de DP- PE/DPPG

Exemplo 10A

Uma suspensão aquosa de DSPE-PEG1000 (0,43 mg - 0,24 pmol) e o conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (31) mostrado na figura 10 (3,0 mg — 0,5 pmol) foi preparado em 500 μΙ_ de água destilada a 60°C para obter uma suspensão micelar.

Separadamente, DPPE (15,8 mg - 22,8 pmols) e DPPG (4,2 mg - 5,7 pmols) foram dispersos em uma solução de manitol a 10% em água destilada (20 mL) a 70°C durante 20 minutos. A dispersão foi, então, resfria- da para a temperatura ambiente. Perfluoroheptano (1,6 mL) foi emulsificado na fase aquosa usando um homogeneizador de alta velocidade (Polytron PT3000, diâmetro de sonda de 3 cm) durante 1 minuto a 10500 rpm para obter uma emulsão.

A suspensão micelar foi adicionada à emulsão e a mistura resul- tante foi aquecida a 60°C durante 1 hora sob agitação. Após resfriar para a temperatura ambiente (1 hora), a emulsão obtida foi dividida em frações de 4 mL em frascos de fundo redondo de 50 mL. A emulsão foi congelada a - 45°C durante 5 minutos e Iiofilizada a 0,02 Kpa (0,2mBar) durante 24 horas (Freeze-Drier Christ Beta 1-8K).

Antes de redispersão, o Iiofilizado foi exposto a uma atmosfera contendo C4F10/nitrogênio (50/50 em volume). O produto Iiofilizado foi, então, disperso em um volume de água duas vezes aquele inicial através de ligeira agitação manual. Exemplo 10B

Uma suspensão aquosa de DSPE-PEG 1000 (0,5 mg - 0,27 µmol) e conjugado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) mostrado na figura 5(5,3 mg - 0,63 µmol) foi preparada em 500 μL de água destilada a 60°C para obter uma suspensão micelar.

Separadamente, DPPE (15,8 mg - 22,8 μιηοίε) e DPPG (4,2 mg - 5,7 µmol) foram dispersos em uma solução de PEG4000 a 10% em água destilada (20 ml_) a 70°C durante 20 minutos. A dispersão foi, então, resfria- da para a temperatura ambiente. Perfluoroheptano (1,6 mL) foi emulsificado na fase aquosa usando um homogeneizador de alta velocidade (Polytron PT3000, diâmetro de sonda de 3 cm) durante 1 minuto a 10000 rpm para obter uma emulsão.

A suspensão micelar foi adicionada à emulsão e a mistura resul- tante foi aquecida a 80°C durante 1 hora sob agitação. Após esfriar para a temperatura ambiente (1 hora), a emulsão obtida foi lavada uma vez através de centrifugação (200 g/10 min — Centrífuga Sigma 3K10) para eliminar o excesso de fosfolipídio. O pélete separada (contendo microgotículas emulsi- ficadas de solvente) foi recuperada e ressuspensa com o volume inicial de uma solução aquosa de PEG4000 a 10%.

A emulsão obtida foi coletada em frascos DIN8R (1 mL/frasco).

Então, os frascos foram resfriados a -50°C (Christ Epsilon 2-12DS Freeze Dryer) e liofilizados a -25°C e 0,02 KPa (0,2 mBar) durante 12 horas com uma etapa final de secagem a 30°C e 0,01 Kpa (0,1 mBar) durante 7 horas. Os frascos foram expostos a uma atmosfera contendo C4F-10/nitrogênio (35/65 em volume) e vedados. O produto liofilizado foi re-disperso em um volume de água duas vezes aquele inicial através de ligeira agitação manu- al.

EXEMPLO 11

Preparação de microbolhas objetivadas com envoltório de

DSPC/DSPA

Exemplo 11A

Uma suspensão aquosa de DSPE-PEG1000 (2,5 mg - 1,4 µmol) e conjugado de peptídeo dimérico (11) mostrado na figura 5 (7,0 mg - 0,84 pmol) foi preparada em 1 mL de água destilada a 60°C para obter uma sus- pensão micelar.

Separadamente, DSPC (16,3 mg - 20,6 pmols) e DSPA (3,7 mg - 5,15 pmols) foram dissolvidos em ciclooctano (1,6 mL) a 80°C. Essa fase orgânica foi adicionada a uma solução de PEG4000 a 10% em água (20 mL) usando um homogeneizador de alta velocidade (Polytron T3000, diâmetro de sonda de 3 cm) durante 1 minuto a 8000 rpm, para obter uma emulsão.

A suspensão micelar foi misturada com a emulsão e a mistura resultante foi aquecida a 80°C durante 1 hora sob agitação. Após esfriar pa- ra a temperatura ambiente (1 hora), a emulsão obtida foi lavada uma vez através de centrifugação (1500 g/10 min - Centrífuga Sigma 3K10) para eli- minar o excesso do fosfolipídio. O sobrenadante separado (contendo micro- gotículas emulsificadas de solvente) foi recuperado e ressuspenso em duas vezes o volume inicial de uma solução aquosa de PEG 4000 a 10%.

A suspensão obtida foi coletada em frascos DIN8R (1 mL/frasco). Então, os frascos foram resfriados para -50°C (Christ Epsilon 2- 12DS Freeze Dryer) e Iiofilizados a -25°C e 0,02 KPa (0,2 mBar) durante 12 horas, com uma etapa final de secagem a 30°C e 0,01 KPa (0,1 mBar) du- rante 7 horas.

Os frascos foram expostos a uma atmosfera contendo C4Fio/nitrogênio (35/65 em volume) e vedados. O produto Iiofilizado foi, en- tão, disperso em um volume de água duas vezes aquele inicial através de ligeira agitação manual.

Exemplo 11B

O Exemplo 11A foi repetido, mas usando 0,7 mg de DSPE- PEG2000 (0,26 μηιοΙ) e 1,6 mg de conjugado de peptídeo/fosfolipídio mo- nomérico (1) mostrado na figura 2 (0,26 pmol) para preparar a suspensão micelar.

Exemplo 11 C

DSPC (16,3 mg - 20,6 pmols), DSPA (3,7 mg - 5,15 pmols) e conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (1) mostrado na figura 1 (1,6 mg - 0,26 μmol) foram dissolvidos em ciclooctano (1,6 mL) a 80°C. Essa fase orgânica foi emulsificada em uma fase aquosa de PEG4000 a 10% (20 mL) usando um homogeneizador de alta velocidade (Polytron PT3000, diâmetro de sonda de 3 cm) durante 1 minuto a 8000 rpm para obter uma emulsão.

A emulsão resultante foi aquecida a 80°C durante 1 hora sob agitação. Após esfriar para a temperatura ambiente (1 hora), a emulsão obti- da foi diluída com 20 ml de uma solução aquosa de PEG4000 a 10%.

A emulsão foi coletada em frascos DIN8R (1 mL/frasco). Então, os frascos foram resfriados a -50°C (Christ Epsilon 2-12DS Freeze Dryer) e liofilizados a -25°C e 0,2 0,02 KPa (0,2 mBar) durante 12 horas com uma etapa final de secagem a 30°C e 0,01 KPa (0,1 mBar) durante 7 horas.

Os frascos foram expostos a uma atmosfera contendo C4F10/nitrogênio (35/65 em volume) e vedados. O produto liofilizado foi re- disperso em um volume de água duas vezes aquele inicial através de ligeira agitação manual.

EXEMPLO 12

Preparação de microbolhas objetivadas com envoltório de DSPC/Estearato Exemplo 12A

Uma suspensão aquosa de DSPE-PEG2000 (2,5 mg - 0,9 pmol) e o conjugado de fosfolipídio dimérico (11) mostrado na figura 5 (2,5 mg — 0,3 μmol) foi preparado em 660 μL de água destilada a 60°C para obter a suspensão micelar.

Separadamente, DSPC (18,2 mg - 23,1 μmol) e estearato (1,8 mg - 5,8 μmol) foram dissolvidos em ciclooctano (1,6 mL) a 80°C. Essa fase orgânica foi adicionada a uma solução de PEG4000 a 10% em água (20 mL) usando um homogeneizador de alta velocidade (Polytron T3000, diâme- tro de sonda de 3 cm) durante 1 minuto a 9000 rpm, a fim de obter uma e- mulsão.

A solução micelar foi misturada com a emulsão e a mistura re- sultante foi aquecida a 80°C durante 1 hora sob agitação. Após esfriar para a temperatura ambiente (1 hora), a emulsão obtida foi lavada uma vez através de centrifugação (1500 g/10 min - Centrífuga Sigma 3K10) para eliminar o excesso de fosfolipídios. O sobrenadante separado (contendo microgotículas emulsificadas de solvente) foi recuperado e ressuspenso com duas vezes o volume inicial de uma solução aquosa de PEG 4000 a 105.

A suspensão obtida foi coletada em frascos D1N8R (1 mL/frasco). Então, os frascos foram resfriados para -50°C (Christ Epsilon 2- 12DS Freeze Dryer) e Iiofilizados a -25°C e 0,2 0,02 KPa (0,2 mBar) durante 12 horas, com uma etapa final de secagem a 30°C e 0,01 KPa (0,1 mBar) durante 7 horas.

Os frascos foram expostos a uma atmosfera contendo C4F-io/nitrogênio (35/65 em volume) e vedados.

O produto Iiofilizado foi disperso em um volume de água duas vezes aquele inicial através de ligeira agitação manual. Exemplo 12B

O Exemplo 12A foi repetido substituindo o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico (11) mostrado na figura 5 pela mesma quantidade molar relativa do conjugado de peptídeo/fosfolipídio monomérico (1) mostra- do na figura 2. Exemplo 12C

O Exemplo 11C foi repetido com DSPC (18,2 mg - 23,1 pmols), estearato de sódio (1,.8 mg - 5,8 pmols) e o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico (11) mostrado na figura 5 (2,.2 mg — 0,26 pmol). A velocidade de agitação para emulsificação foi fixada em 9000 rpm. Após es- friar para a temperatura ambiente (1 hora), a emulsão obtida foi lavada uma vez através de centrifugação (1500 g/10 min - Centrífuga Sigma 3K10) para eliminar o excesso do fosfolipídio. O sobrenadante separado (contendo mi- crogotículas emulsificadas de solvente) foi recuperado e re-suspenso em duas vezes o volume inicial de uma solução aquosa de PEG 4000 a 10%.

EXEMPLO 13

Teste de ligação estática sobre células KDR-transfectadas Produção de plasmídeo e purificação

KDR de comprimento total foi clonada no vetor pcDNA6 e o plasmídeo foi amplificado em E. coli DH5a competente. Amplificação de plasmídeo e purificação foram realizadas usando E. coli JM 109 e um kit da Quiagen.

Transfecção de células 293H sobre lamínulas Thermanox®

Células foram crescidas sobre lamínulas circulares Thermanox® revestidas com poli-D-lisina em uma lâmina com 24 cavidades. A transfec- ção foi feita conforme recomendado no protocolo Lipofectamine 2000 (Invi- trogen, cat n° 11668-019) usando 1 pg de DNA (pc-DNA6-fKDR) /por lamí- nula (1,3 cm2) em 0,1 mL. Transfecção foi feita em meio isento de soro, a mistura de reagente de transfecção foi removida das células após 2 horas e substituída por meio contendo soro regular. Algumas das lamínulas revesti- das com célula foram transfectadas com placebo (sem DNA). No dia seguin- te, expressão do receptor de KDR foi avaliada através de imunocitoquímica e o ensaio de ligação foi realizado.

Ensaio de ligação de bolha

As células transfectadas foram incubadas com microbolhas KDR-objetivadas ressuspensas em plasma humano a 50% em PBS. Para a incubação com as células transfectadas, uma pequena tampa plástica foi enchida com uma suspensão contendo 1,3 χ 108 bolhas e a tampa foi cober- ta com uma lamínula Thermanox® invertida de modo a colocar as células transfectadas em contato com as microbolhas objetivadas. Após 30 min de incubação em TA, a lamínula foi levantada com pinças, enxaguada três ve- zes em PBS e examinada sob um microscópio para avaliar ligação das mi- crobolhas objetivadas.

Determinação de % de superfície coberto por microbolhas

Imagens foram adquiridas com uma câmera digital DC300F (Lei- ca) e o percentual de superfície coberto por microbolhas ligadas na área na imagem foi determinado usando o software QWin versão 3.1 (Leica Mi- crosystem AG, Basel, Suíça). Quadros foram tomados de cada lamínula Thermanox®. Para cada preparado dos Exemplos 9 e 10, o ensaio de liga- ção foi repetido um mínimo de duas vezes, assim, obtendo um valor médio da superfície coberta. Nas tabelas 6 e 7 a seguir, a atividade de ligação das microbo- Ihas preparadas de acordo com os Exemplos 9 e 10 acima é registrada.

Conforme indicado pelas Tabelas, o mesmo peptídeo pode mos- trar diferentes atividades de ligação quando incluído (como um lipopeptídeo) em diferentes formulações de fosfolipídio que foram o envoltório de estabili- zação da microbolha. Microbolhas contendo lipopeptídeos de ligação à KDR da invenção se ligam especificamente à células expressando KDR1 ao mes- mo tempo em que elas não se ligam apreciavelmente à células transfectadas com placebo.

EXEMPL014

Teste de ligação dinâmica sobre proteína quimérica rh VEGF-R2/Fc Preparação de lamínulas revestidas com Fc-VEGF-R2

Lamínulas de vidro (40 mm de diâmetro, Bioptechs Inc., Butler1 PA, EUA) foram revestidas com proteína quimérica humana recombinante VEGF-R2/Fc (R&D Systems) de acordo com a metodologia a seguir.

Uma superfície de dimensões de 14 χ 25 mm foi delimitada so- bre a lamínula de vidro usando um marcador especial (Dako Pen) e 400 μΐ_ de solução de Fc-VEGF-R2 a 4 pg/mL em PBS foram depositados sobre essa superfície. Após uma incubação durante a noite a 4°C, a solução foi aspirada, substituída por 0,5 mL de uma solução de BSA a 1% peso/v em PBS-Tween 80 a 0,05%, pH de 7,4 e incubada durante 3 horas em TA. En- tão, a lamínula foi lavada três vezes com 5 ml de PBS-Tween 80 a 0,05%.

Ensaio de ligação

Estudos de ligação das bolhas objetivadas foram realizados u- sando uma camada de fluxo com placa paralela (FCS2, Bioptech Inc., Butler, PA, EUA) com uma gaxeta de câmara de 0,25 mm de espessura, com um adaptador padronizado para inversão da câmara para baixo. A lamínula re- vestida foi inserida como uma placa da câmara de fluxo. Microbolhas (5 χ 106 bolhas/mL em plasma humano a 50% em PBS) foram retiradas através da câmara de fluxo usando uma bomba de infusão ajustável (Auto Syringe® AS50 Infusion Pump, Baxter, Deerfield, IL, EUA) com uma seringa de 60 mL (Terumo). A taxa de fluxo da bomba foi ajustada para 1 mL/min a fim de ob- ter a taxa de cisalhamento desejada de cerca de 114 s"1. Após 10 minutos, o fluxo foi cessado e os quadros foram tomados aleatoriamente em diferentes posições sobre a lamínula (sobre áreas de cerca de 0,025 mm2) usando uma objetiva de 40 χ e uma câmara monocromática de CCD (F-View II, Soft Ima- ging Systems, Alemanha) conectada a um microscópio Olympus 1X 50 in- vertido.

O número de microbolhas sobre cada quadro foi determinado, a média com relação ao número total de quadros e o valor obtido foram, então, divididos por dez (para obter o "declínio", isto é, a quantidade média de mi- crobolhas ligadas por minuto).

Para cada preparação dos Exemplos 11 e 12, o ensaio de liga- ção foi repetido quatro vezes, assim, obtendo um valor médio do declínio.

O declínio representa a taxa de ligação da bolha sobre o subs- trato alvo. Por exemplo, um valor de declínio de 8 indica que uma média de oitenta (80) microbolhas foram ligadas sobre a lamínula revestida em dez minutos. Um declínio maior indica uma melhor capacidade das bolhas de se ligar ao alvo sob condições de fluxo.

Nas Tabelas 8 e 9 a seguir, a atividade de ligação das microbo- lhas preparadas de acordo com os Exemplos 11 e 12 acima é ilustrada. Conforme depreendido a partir das tabelas, o mesmo peptídeo pode mostrar diferentes atividades de ligação quando incluído (como um conjugado de peptídeo/fosfolipídio ou lipopeptídeo) em diferentes formulações de fosfolipí- dio que formam o envoltório de estabilização da microbolha.

Tabela 6

<table>table see original document page 72</column></row><table> Tabela 8

<table>table see original document page 73</column></row><table>

Tabela 9

<table>table see original document page 73</column></row><table>

EXEMPLO 15

Avaliação in vitro de agentes de contraste de ultra-som objetivados à KDR

A capacidade dos agentes de contraste de ultra-som contendo lipopeptídeos de ligação à KDR da invenção de se ligar a tecido expressan- do KDR in vitro foi avaliada usando um modelo conhecido de angiogênese: o modelo de tumor VX2 de coelho.

Um modelo conhecido de tecido angiogênico foi usado para e- xaminar a capacidade das microbolhas de ultra-som KDR-objetivadas de se localizar e proporcionar uma imagem de tecido angiogênico. O carcinoma VX2 de coelho foi serialmente implantado no músculo dorsal de coelhos New Zealand (Charles River Laboratories, França) pesando 2,5/3 kg.

Preparação de homogenato de tumor

Tumor foi cirurgicamente removido, colocado em meio de cultura de McCoy contendo soro fetal de bezerro a 10%, antibióticos, Glutamax 1 a 1,5 mM e cortado em pequenos pedaços que foram enxaguados para remo- ver o sangue e resíduos. Então, pedaços de tumor (3 a 5 cm3) foram coloca- dos em um tubo Falcon de 50 ml contendo 5 mL de meio completo. O tecido tumorígeno foi triturado (PoIytron) até que mais nenhum pedaço fosse visí- vel. O fluido turvo foi centrifugado durante 5 minutos a 300 g e o sobrena- dante descartado. Sete mL de meio fresco foram adicionados por 5 mL de pelota.

Implante de tumor

Os coelhos receberam primeiro 0,3 mL de Vetranquil (Acepro- mazina, Sanofi, injetada intramuscularmente) e foram, então, anestesiados com uma injeção intramuscular de uma mistura de Ketaminol®5/Xilazina (Veterinaria AG/Sigma) (50/10 mg/mL, 0,7 mL/kg). Cem microlitros de ho- mogenato de tumor VX2 foram injetados intramuscularmente. Quinze dias após implante de tumores VX2, os animais foram anestesiados com a mes- ma mistura, mais injeção subcutânea de Uretano a 50% (2mL/kg, s.c.) (Sig- ma) para experimentos de formação de imagem. Formação de imagem por ultra-som in vivo

Formação de imagem do tumor VX2 foi realizada usando um aparelho de sistema de formação de imagem por ultra-som ATL HDI 5000 equipado com uma sonda linear L7-4. Inversão de pulso no modo B em alta energia acústica (Ml = 0,9) foi usada para avaliar o acúmulo de microbolhas objetivadas sobre o receptor de KDR expresso sobre o endotélio de neova- sos. A sonda linear foi fixada sobre a pele diretamente sobre os tumores im- plantados.

Após injeção da bolha (0,1 μL/kg de gás) usando os preparados do Exemplo 16 ou Exemplo 17, o ultra-som foi cessado, permitindo que as bolhas se acumulassem durante 25 minutos. Então, ultra-som foi reativado em alta energia acústica (Ml 0,9), destruindo todas as bolhas presentes no tumor. A quantidade de bolhas livres em circulação foi, então, avaliada regis- trando o sinal obtido após um acúmulo de 20 seg sem ultra-som. Quadros de vídeo de experimentos de formação de imagem de tumor VX2 foram captu- rados com vídeo-captura e analisados com o software Image-Pro Plus 2.0. A imagem representando as bolhas livres em circulação foi subtraída da ima- gem obtida a 25 min, para proporcionar uma imagem representando bolhas ligadas.

Fazendo referência à figura 11 (a qual mostra os resultados com o preparado do Exemplo 16) e figura 12 (a qual mostra os resultados com o preparado do Exemplo 17), as Figuras 11A e 12A mostram uma imagem antes de injeção de bolha (linha de base); as Figuras 11B e 12B mostram a retenção do contraste de bolha no tumor 25 minutos pós-injeção; e as Figu- ras 11C e 12C mostram o resultado obtido após subtração da linha de base e das bolhas livres em circulação e representam microbolhas ligadas con- tendo lipopeptídeos de KDR de acordo com a presente invenção. Os Exem- plos 15-17 e Figuras 11 e 12 confirmam que agentes de contraste de ultra- som trazendo tais porções de ligação à KDR se localizam em tecido expres- sando KDR (e, assim, angiogênico) em modelos com animais.

EXEMPLO 16

O Exemplo 12A foi repetido substituindo DSPE-PEG2000 por DSPE-PEG1000 (2,7 mg, 1,54 μmol) e usando 2,5 mg (0,31 μmol) de conju- gado de peptídeo/fosfolipídio dimérico (11) mostrado na figura 5.

EXEMPLO 17

O Exemplo 16 foi repetido substituindo o conjugado de peptí- deo/fosfolipídio dimérico pela mesma quantidade molar do conjugado de fos- folipídio monomérico (1) mostrado na figura 2.

Claims

1. Conjugado de peptídeo-fosfolipídio selecionado do grupo con- sistindo em: <formula>formula see original document page 76</formula>

2. Composição de agente de contraste em ultra-som compreen- dendo um conjugado como definido na reivindicação 1.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que o agen- te de contraste compreende uma microvesícula cheia de gás.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a mi- crovesícula cheia de gás compreende um fosfolipídio.

5. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a mi- crovesícula cheia de gás ainda compreende dois ou mais componentes se- lecionados do grupo consistindo em: DSPC, DPPG, DPPA1 DSPA, DPPE, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, ácido palmítico e ácido esteárico.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSW GGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto}-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e o agente de contraste ainda compreende DSPC e DPPG.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende SEQ ID NO: 4 e o agente de contraste ainda compreen- de DSPC e DPPG.

8. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende SEQ ID NO: 4 e o agente de contraste ainda compreen- de DSPE-PEG1000, DPPE e DPPG.

9. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSW GGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto}-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e o agente de contraste ainda compreende DSPE-PEG1000, DPPE e DPPG.

10. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDS WGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]- NH2 cíclico (2-12) dissulfeto}-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e o agente de con- traste ainda compreende DSPE-PEG1000, DSPC e DSPA.

11. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende SEQ ID NO: 1 e o agente de contraste ainda compreen- de DSPE-PEG1000, DSPC e DSPA.

12. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende SEQ ID NO: 1 e o agente de contraste ainda compreen- de DSPC e DSPA.

13. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSW GGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto}-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e o agente de contraste ainda compreende DSPE-PEG2000, DSPC e estearato.

14. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende SEQ ID N°. 1 e o agente de contraste ainda compreen- de DSPE-PEG2000, DSPC e estearato.

15. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSW GGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto}-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e o agente de contraste ainda compreende DSPC e estearato.

16. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSW GGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto}-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e o agente de contraste ainda compreende DSPE-PEG1000, DSPC e estearato.

17. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que o con- jugado compreende SEQ ID N°. 1 e o agente de contraste ainda compreen- de DSPE-PEG1000, DSPC e estearato.

18. Composição de acordo com a reivindicação 5, ainda com- preendendo um componente selecionado do grupo consistindo em: açúca- res, polissacarídeos e polióis.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, em que o referido componente é selecionado de manitol, dextrano e polietilenoglicol.

20. Composição de acordo com a reivindicação 18, em que o referido gás compreende um gás fluorado.

21. Composição da reivindicação 3, em que o gás compreende C3F8, C4F-I0 ou SFe, opcionalmente em mistura com ar, nitrogênio, oxigênio ou dióxido de carbono.

22. Monômero peptídico compreendendo Ac-Arg-Ala-Gln-Asp- Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu- Ser-GIy-GIy-GIy-GIy-GIy-Lys-NH2.

23. Composição de agente de contraste para ultra-som compre- endendo um ou mais monômeros selecionados do grupo consistindo em Ac- Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg- His-Ala-Phe-Leu-Ser-GIy-GIy-GIy-GIy-GIy-Lys-NH2; Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr- Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe- Leu-Ser- Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2; Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Thr- Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thx-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto e Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Thr-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg- Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, em que o agente de contraste compreende uma microvesícula cheia de gás.

25. Composição de acordo com a reivindicação 24, em que o referido gas compreende un gas fuorado.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, ainda com- preendendo um fosfolipídio.

27. Composição de acordo com a reivindicação 26, ainda com- preendendo dois ou mais componentes selecionados do grupo consistindo em: DSPC, DPPG, DPPA, DSPA, DPPE, DPPG, DSPE-PEG1000, DSPE- PEG2000, ácido palmítico e ácido esteárico.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27, em que o gás compreende C3F8, C4F10 ou SFe, opcionalmente em mistura com ar, ni- trogênio, oxigênio ou dióxido de carbono.

29. Conjugado de peptídeo-fosfolipídio compreendendo um ou mais monômeros peptídicos como definidos na reivindicação 22.

30. Conjugado de peptídeo-fosfolipídio de acordo com a reivindi- cação 29, em que o fosfolipídio é selecionado do grupo consistindo em: fos- fatidil etanolaminas, fosfatidil etanolaminas modificadas e DSPE-PEG2000.

31. Método para preparo de uma microvesícula cheia de gás compreendendo um fosfolipídio o qual compreende as etapas de: a. preparo de uma emulsão aquosa orgânica compreendendo i) um meio aquoso incluindo água, ii) um solvente orgânico substancialmente imiscível com água, iii) um fosfolipídio, iv) um conjugado de peptídeo-fosfo- lipídio de acordo com a reivindicação 1 e v) um agente de lioproteção; b. liofilização da referida emulsão para obter uma matriz Iiofiliza- da compreendendo o referido fosfolipídio; c. contato da referida matriz Iiofilizada com um gás biocompatí- vel; d. reconstituição da referida matriz Iiofilizada através de dissolu- ção da mesma em um líquido veículo aquoso fisiologicamente aceitável para obter uma suspensão das referidas microvesículas cheias de gás.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a etapa a compreende as etapas de: a. preparo de uma suspensão aquosa compreendendo um fosfo- lipídio peguilado e o conjugado como definido na reivindicação 1; b. preparo de uma emulsão aquosa orgânica compreendendo o meio aquoso, o solvente orgânico, o fosfolipídio e o agente de lioproteção; e c. mistura da referida suspensão aquosa da etapa a1 com a e- mulsão da etapa a2.

33. Método de fabricação de um conjugado de peptídeo- fosfolipídio compreendendo conjugação de um peptídeo selecionado do gru- po consistindo em SEQ ID N°. 2, Ac- AGPTWCEDDWYYCWLFGT GGGK[K(ivDde)]-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto, Ac- VCWEDSWGGEVCFRYD PGGGK(AdOa-AdOa)-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto, SEQ ID N°. 5 e Ac- AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPG GGK(- Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto]-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto com um fosfolipídio.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o fosfoli- pídio é DSPE-PEG2000-NH2.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a conju- gação compreende reação de um mono NHS éster do peptídeo com um grupo amino livre do sal de fosfolipídio.

36. Método de fabricação de um conjugado de peptídeo- fosfolipídio tendo baixos níveis de TFA compreendendo as etapas de: conversão de sais de TFA de dímero peptídico em um sal de acetato via troca de ânions; e conjugação do dímero peptídico a um fosfolipídio.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o peptí- deo compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDS WG- GEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto]-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto.

38. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o fosfoli- pídio é DSPE-PEG2000-NH2.

39. Método de fabricação de um conjugado de peptídeo- fosfolipídio tendo baixos níveis de TFA compreendendo eluição de um con- jugado de peptídeo-fosfolipídio e íons de TFA em uma coluna de exclusão de tamanho.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a referida eluição é na presença de bicarbonato de amônio.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o conju- gado de peptídeo-fosfolipídio compreende DSPE- PEG2000-NH2.

42. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o dímero peptídico compreende Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-CWEDSW GGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2 cíclico (2-12) dissulfeto]-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto.

43. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o conju- gado de peptídeo-fosfolipídio compreende um monômero selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID NO.2, Ac- AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2 cíclico (6-13) dissulfeto, Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2 cíclico (2-12) dissul- feto e SEQ ID N0. 5.