BRPI0615958A2 - composition for enhancing the permeability of cell walls, cell membranes and nuclear membranes and method for detecting a target in a cell - Google Patents

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BRPI0615958A2 BRPI0615958-3A BRPI0615958A BRPI0615958A2 BR PI0615958 A2 BRPI0615958 A2 BR PI0615958A2 BR PI0615958 A BRPI0615958 A BR PI0615958A BR PI0615958 A2 BRPI0615958 A2 BR PI0615958A2
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Abstract

The present invention provides a method for allowing foreign particles to penetrate, very efficiently, the cell wall, cell membrane, organelle membrane and/or nuclear membrane of a cell and hybridizing or binding to the complimentary target in the cell. The cells may be from a culture or from specimens obtained from a patient. The foreign particle can be a probe consisting of, for example, either individually or in any combination of two or more of the following: DNA, RNA, peptide nucleic acids (PNA), glycopeptides, lipopeptides, glycolipids or prions. The target is a cell, a cell component or, preferably, a pathogen or pathogen component. The pathogen can be, for example, bacteria, fungi, yeast or viruses.

Description

"COMPOSIÇÃO PARA AUMENTAR A PERMEABILIDADE DE PAREDESCELULARES, MEMBRANAS CELULARES E MEMBRANAS NUCLEARES EMÉTODO PARA DETECTAR UM ALVO EM UMA CÉLULA" .Campo da invenção"COMPOSITION FOR INCREASING THE PERMEABILITY OF PAREDELES, CELL MEMBRANES AND NUCLEAR MEMBRANES AND METHOD TO DETECT A TARGET IN A CELL".

A presente invenção refere-se a composições e métodospara melhorar a permeabilidade celular para partículasexternas incluindo as sondas da presente invenção.Histórico da invençãoThe present invention relates to compositions and methods for improving cellular permeability to foreign particles including probes of the present invention.

As células são unidades básicas de todos os organismosvivos. Um atributo comum de quase todas as células é queelas são cercadas (ou delimitadas) por uma membranacitoplasmática. Esta membrana abriga o conteúdo internoda célula e regula o movimento de substâncias dentro efora da célula. Apenas aquelas moléculas que podemdifundir através da membrana ou são transportadas atravésdela podem mover-se dentro e fora da célula. Algumaspodem passar através do núcleo dos lipídios da membrana,mas outras devem passar através de poros. Outrasmoléculas devem ainda, cruzar a membrana ligada aos transportadores de maneira dependente de energia. Damesma forma, os núcleos e outras organelas celulares temmembranas para regular o fluxo de moléculas dentro e forada organela.Cells are basic units of all living organisms. A common attribute of almost all cells is that they are surrounded (or delimited) by a membranocytoplasmic membrane. This membrane houses the internal content of the cell and regulates the movement of substances inside and outside the cell. Only those molecules that can diffuse across or are transported through the membrane can move in and out of the cell. Some may pass through the membrane lipid nucleus, but others may pass through pores. Other molecules must also cross the membrane bound to the carriers in an energy dependent manner. In the same way, nuclei and other cell organelles have membranes to regulate the flow of molecules within and forced organelle.

Fixação é um processo químico que "coloca" moléculascelulares em. um lugar de modo que a célula ou o tecidopossa então ser estudado. Muitos agentes que sãoutilizados como fixadores/fixantes (por exemplo, álcooistais como etanol e aldeídos tais como paraformaldeídos)trabalham através da reticulação das moléculas celulares,especialmente proteínas. Este processo de reticulaçãoprevine a degradação da estrutura celular. Váriosfixantes são mais adequados para a preservação demoléculas e diferentes estruturas celulares ou paradiferentes métodos de detecção. A escolha do fixante paraqualquer propósito particular será determinada através danatureza daquele propósito.Fixation is a chemical process that "puts" cell molecules in. a place so that the cell or tissue can then be studied. Many agents that are used as fixatives / fixatives (e.g., alcohols such as ethanol and aldehydes such as paraformaldehydes) work by crosslinking cell molecules, especially proteins. This cross-linking process prevents the degradation of cell structure. Several fixatives are best suited for preserving demolecules and different cell structures or different detection methods. The choice of fixative for any particular purpose will be determined by the nature of that purpose.

Infelizmente, os métodos atuais de fixação confundem,freqüentemente, a capacidade subseqüente de umpesquisador ou de um médico em detectar componentescelulares internos. Em outras palavras, a ação completaque previne a degradação da célula, fixação, também podecolocar uma barreira para muitos tipos de pesquisas e dediagnósticos que contam com a detecção de moléculas comgrandes tamanhos. Devido a isto, esforços têm sido feitospara permeabilizar as células ou fazer canais após afixação.Unfortunately, current fixation methods often confuse the subsequent ability of a researcher or physician to detect internal cellular components. In other words, the complete action that prevents cell degradation, fixation, can also pose a barrier to many types of research and diagnostics that rely on the detection of large sized molecules. Due to this, efforts have been made to permeabilize the cells or make channels after affixing.

Métodos atuais de permeabilização da membrana celularapós a fixação não são eficazes para todas as espécies,são muito rigorosos (destruindo, assim, as estruturas aserem estudadas) e ou requerem equipamentos muito caros.Por exemplo, Hoffman, et al. (Patente U.S. No. 6,835,393)descreve o uso de polímeros de ácido policarboxílico e pHpara ruptura da membrana celular apenas para uso emamostras não fixadas. Connelly, et al., patentes U.S.Nos.: 5,597,688 e 5,422,277) descrevem o uso de umacomposição com o ácido sulfônico 2,4-dinitrobenzeno,ácido 2,4-dinitrobenzóico ou 2,4-dinitrofenol tanto parafixação quanto permeabilização da membrana celular, masestas composições limitam a escolha dos pesquisadores oudos médicos para o fixante e, assim, limitam aflexibilidade dos ensaios necessários. Os métodosmecânicos tais como sonicação, eletroporação, etc.,trabalham apenas usualmente, em amostras não fixadas erequerem equipamentos muito caros.Current cell membrane permeabilization methods after fixation are not effective for all species, are very stringent (thus destroying the structures being studied) or require very expensive equipment. For example, Hoffman, et al. (U.S. Patent No. 6,835,393) describes the use of polycarboxylic acid and pH polymers for cell membrane disruption only for use in unfixed samples. Connelly, et al., US Pat. Nos. 5,597,688 and 5,422,277) describe the use of a composition with 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid, 2,4-dinitrobenzoic acid or 2,4-dinitrophenol, both cell membrane fixation and permeabilization, However, these compositions limit the choice of medical researchers for the fixative and thus limit the flexibility of the required assays. Mechanical methods such as sonication, electroporation, etc., usually only work on unfixed samples and require very expensive equipment.

Além disso, os métodos de pesquisa e de diagnósticosdisponíveis da técnica anterior para muitos alvoscelulares, tais como patologias dependem das avaliaçõesmicroscópicas, parâmetros morfológicos celulares,características de coloração e da presença ou da ausênciade determinados alvos. Entretanto, muitos destes métodosde diagnóstico não são apurados ou suficientementesensíveis.In addition, prior art research and diagnostic methods available for many cellular targets, such as pathologies, depend on microscopic evaluations, cellular morphological parameters, staining characteristics, and the presence or absence of certain targets. However, many of these diagnostic methods are not accurate or sufficiently sensitive.

o que é necessário são composições e métodos para umapermeabilidade aperfeiçoada das membranas celulares dosespécimes para partículas externas, tais como moléculasde detecção marcadas. Além disso, o que é necessário sãocomposições e métodos para a detecção melhorada de alvoscelulares e de patógenos.What is needed are compositions and methods for improved permeability of the dose-specimen cell membranes to external particles, such as labeled detection molecules. In addition, what is needed are compositions and methods for improved detection of cell targets and pathogens.

Sumário da invençãoSummary of the invention

Em uma configuração, a invenção permite a detecção de umalvo ou de um fragmento de alvo, diretamente a partir dascélulas em uma cultura de célula ou em um espécime obtidode um paciente, através de hibridização in si tu. Em umaconfiguração preferida, a célula é um patógeno. 0 métodoé compreendido de várias etapas que são realizadas,preferivelmente, mas não necessariamente, em uma listaordenada. Uma amostra de cultura ou de espécime édepositada sobre uma lâmina. A amostra é fixada sobre alâmina tanto por aquecimento quanto por um fixadorpadrão. 0 fixador pode ser, por exemplo, metanol, ácidoacético de metanol, acetona, formaldeído ou formalina. Aamostra fixada é tratada com as soluções IDF (ver,infra), corada ou sondada e observada. Alternativamente,o espécime é misturado com a solução IDF, incubada, entãountada ou de outro modo colocada sobre uma lâmina devidro, seca ao ar e fixada. A solução IDF podecompreender qualquer combinação dos reagentes a seguir:sais caotrópicos (por exemplo, tiosulfato de guanidina ouhidrocloreto) , detergentes iônicos (por exemplo, SDS)e/ou detergentes não iônicos (por exemplo, IPGEL,deoxicolato, colato ou sais biliares) ou outros reagentescom propriedades similares, metanol e ácido acético. Aconcentração de cada reagente na solução IDF depende, porexemplo, da parede celular do patógeno a ser detectado.In one embodiment, the invention allows the detection of a target or target fragment directly from cells in a cell culture or in a patient-obtained specimen by in situ hybridization. In a preferred embodiment, the cell is a pathogen. The method is comprised of several steps which are performed, preferably, but not necessarily, on an orderly list. A culture or specimen sample is deposited on a slide. The specimen is fixed on a slide by heating as well as by a standard fixative. The fixative may be, for example, methanol, methanol acetic acid, acetone, formaldehyde or formalin. The fixed sample is treated with the IDF solutions (see below), stained or probed and observed. Alternatively, the specimen is mixed with the IDF solution, incubated, then weighed or otherwise placed on a glass slide, air dried and fixed. The IDF solution may comprise any combination of the following reagents: chaotropic salts (eg guanidine thiosulfate or hydrochloride), ionic detergents (eg SDS) and / or nonionic detergents (eg IPGEL, deoxycholate, cholate or bile salts) or other reagents with similar properties, methanol and acetic acid. The concentration of each reagent in the IDF solution depends, for example, on the cell wall of the pathogen to be detected.

Apesar da presente invenção não estar limitada a qualquerteoria ou mecanismo, acredita-se que a solução IDF faz"canais" na parede celular e/ou nas membranas (celular ounuclear) do patógeno. Estes canais permitem que uma sondapenetre na parede celular e na membrana celular e entremno citoplasma e/ou no núcleo do patógeno. A sonda dapresente invenção pode compreender DNA, RNA, PNA,peptídeo, glicopeptídeo, lipoproteína, ou glicolipídeo ouuma mistura de qualquer um dos acima. Os alvos dascélulas fixadas na amostra são contatados com um complexode sonda (o complexo de sonda compreende agentes deligação específicos para o alvo) específico para o alvosob condições apropriadas para hibridização ou paraligação (por exemplo: como descrito na patente U.S. No.:6,165,723 de Shah e Harris, a qual é incorporada aqui porreferência). Sondas não-hibridizadas ou não-ligadas podementão ser lavadas a partir da amostra. Em umaconfiguração, a amostra lavada pode então ser corada comum contra-corante apropriado (por exemplo, Evans Blue,DAPI, permanganato de potássio, etc..). 0 complexo desonda hibridizada ou ligada é visualmente detectado por,por exemplo, microscópio, com a presença do complexo desonda sendo uma indicação da presença da célula alvo. 0método pode ser realizado com tampão de hibridizaçãodiferente, vários exemplos não-limitantes, estãodescritos aqui e na patente U.S. No.: 6,165,724 de Shah eHarris, a qual é incorporada aqui por referência. 0tampão de hibridização utilizado é determinado através danatureza da sonda utilizada. 0 método da presenteinvenção é útil para detectar as células, osconstituintes celulares e, preferivelmente, patógenos emum espécime. Exemplos, de complexos de sonda específicosnão limitantes estão descritos aqui e são úteis paradetectar os patógenos das espécies de Mycobacteria.Os métodos da presente invenção são úteis, por exemplo,na detecção dos ácidos nucléicos, peptídeos,glicopeptídeos, lipopeptídeos e glicolipídios a partir deuma ampla variedade de espécimes. Exemplos dos espécimesincluem, por exemplo, células, tipos de célula, tecidosou um patógeno ou patógenos de interesse incluindo ouderivados de, por exemplo, soro, plasma, saliva, urina,fluidos espinal cerebral, tecidos e leite de peito. Ascomposições e os métodos da presente invenção podem serutilizados em qualquer espécime de organismo incluindo,mas não limitado a, mamíferos, répteis, peixes, pássaros,plantas e insetos.Although the present invention is not limited to any theory or mechanism, it is believed that the IDF solution makes "channels" in the cell wall and / or pathogen (cellular) cells. These channels allow a probe to penetrate the cell wall and cell membrane and enter the cytoplasm and / or nucleus of the pathogen. The probe of the present invention may comprise DNA, RNA, PNA, peptide, glycopeptide, lipoprotein, or glycolipid or a mixture of any of the above. Sample-fixed cell targets are contacted with a target-specific probe complex (the probe complex comprises target-specific targeting agents) under suitable conditions for hybridization or paralysis (for example: as described in Shah US Patent No.: 6,165,723 and Harris, which is incorporated herein by reference). Unhybridized or unbound probes may be washed from the sample. In one configuration, the washed sample may then be stained with a suitable counterstain (eg Evans Blue, DAPI, potassium permanganate, etc.). The hybridized or bound probes complex is visually detected by, for example, a microscope, with the presence of the probes complex being an indication of the presence of the target cell. The method may be carried out with different hybridization buffer, various nonlimiting examples, which are described herein and in U.S. Patent No. 6,165,724 to Shah and Harris, which is incorporated herein by reference. The hybridization buffer used is determined by the nature of the probe used. The method of the present invention is useful for detecting cells, cell constituents and preferably pathogens in a specimen. Examples of non-limiting specific probe complexes are described herein and are useful for detecting the pathogens of Mycobacteria species. The methods of the present invention are useful, for example, in detecting nucleic acids, peptides, glycopeptides, lipopeptides and glycolipids from a broad range. variety of specimens. Examples of specimens include, for example, cells, cell types, tissues or a pathogen or pathogens of interest including or derived from, for example, serum, plasma, saliva, urine, brain spinal fluids, tissues and breast milk. The compositions and methods of the present invention may be used on any organism specimen including, but not limited to, mammals, reptiles, fish, birds, plants and insects.

Em uma configuração, a presente invenção contempla umacomposição (solução IDF) para aumentar a permeabilidadeda parede celular, membranas celulares, membranas deorganelas e membranas nucleares, a referida composiçãocompreendendo em uma configuração: GuSCN (tiocianato deguanidina), Tris-HCL, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etileneoxi)etanol), ácido acético, metanol, colatode sódio e deoxicolato de sódio. A presente invençãocontempla ainda que o GuSCN está em uma concentração deaproximadamente 2,0 a 3,3 Μ; o Tris-HCL está em umaconcentração de aproximadamente 10 a 100 mM; o Tris-HCLtem um pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; o EDTA está emuma concentração de aproximadamente 5 a 50 mM; o IGEPAlestá em uma concentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 porcento; o ácido acético está em uma concentração deaproximadamente de 0,1 a 10,0 por cento; o metanol estáem uma concentração de aproximadamente 2 0 a 50 por cento;o colato de sódio está em uma concentração deaproximadamente 0,02 a 2,5 por cento e o deoxicolato desódio está em uma concentração de aproximadamente 0,02 a2,5 por cento.In one embodiment, the present invention contemplates a composition (IDF solution) for enhancing cell wall permeability, cell membranes, organelle membranes, and nuclear membranes, said composition comprising in one embodiment: GuSCN (guanidine thiocyanate), Tris-HCL, EDTA, IGEPAL ( octylphenoxypoly (ethyleneoxy) ethanol), acetic acid, methanol, sodium colate and sodium deoxycholate. The present invention further contemplates that GuSCN is at a concentration of approximately 2.0 to 3.3 Μ; Tris-HCL is at a concentration of approximately 10 to 100 mM; Tris-HCL has a pH of approximately 7.0 to 9.0; EDTA is at a concentration of approximately 5 to 50 mM; IGEPA is in a concentration of approximately 0.1 to 2.0 percent; acetic acid is in a concentration of approximately 0.1 to 10.0 percent; methanol is at a concentration of about 20 to 50 percent, sodium cholate at a concentration of about 0.02 to 2.5 percent and deoxycholate desodium at a concentration of about 0.02 to 2.5 percent .

Em uma outra configuração o tampão de GuSCN é recolocadocom o tampão GuHCL entre cerca de 2M a 6M. Ainda em umaoutra configuração IGEPAL é recolocado com SDS entrecerca de 0,01% a 2,0%. Ainda em uma outra configuraçãoGuSCN é utilizada em conjunto com GuHCL e/ou IGEPAL éutilizado em conjunto com SDS.In another embodiment the GuSCN buffer is replaced with the GuHCL buffer between about 2M to 6M. In yet another configuration IGEPAL is replaced with SDS between 0.01% and 2.0%. In yet another GuSCN configuration is used in conjunction with GuHCL and / or IGEPAL is used in conjunction with SDS.

Em uma configuração, a presente invenção contempla ummétodo para corar um alvo em uma célula, compreendendo:In one embodiment, the present invention contemplates a method for staining a target in a cell, comprising:

a) contatar a célula com uma composição compreendendoGuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL(octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol), ácido acético,metanol e deoxicolato de sódio para criar uma célulapermeabi1i zada;a) contacting the cell with a composition comprising GuSCN (guanidine thiocyanate), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL (octylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol), acetic acid, methanol and sodium deoxycollate to create a permeable cell;

b) contatar a célula permeabilizada da etapa (a) com umagente ligante específico para se ligar ao referido alvo;eb) contacting the permeabilized cell of step (a) with a specific binder to bind to said target;

c) detectar o referido agente ligante da etapa (b).Em outros aspectos, a invenção contempla que o alvo dométodo acima é selecionado de, por exemplo, ácidosnucléicos, ácidos nucléicos de peptídeos, peptídeos,glicoproteínas, lipídios, lipoproteínas, vírus, prions emicoplasma.c) detecting said binding agent from step (b). In other aspects, the invention contemplates that the above method target is selected from, for example, nucleic acids, peptide nucleic acids, peptides, glycoproteins, lipids, lipoproteins, viruses, prions. emicoplasma.

Em outras configurações, a presente invenção contemplaque os agentes de ligação são selecionados do grupoconsistindo de ácidos nucléicos, ácidos nucléicos depeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, glicoproteínas,anticorpos ou fragmentos de anticorpos e lipídios.In other embodiments, the present invention contemplates binding agents are selected from the group consisting of nucleic acids, depeptide nucleic acids, peptides, lipoproteins, glycoproteins, antibodies or antibody fragments and lipids.

O agente de ligação da presente invenção pode compreenderadicionalmente uma porção de detecção e, a porção dedetecção pode ser selecionada de um grupo compreendendo,por exemplo, marcadores fluorescentes, marcadoresradioativos, corantes, metais coloidais, biotina/avidina,peroxidase de rábano silvestre, etc.. Em uma configuraçãopreferida, a detecção é via um anticorpo marcado comafinidade para o antígeno alvo. Um agente de ligaçãocompreendendo uma porção de detecção é definida aqui comoum complexo de sonda.The binding agent of the present invention may additionally comprise a detection moiety and the detecting moiety may be selected from a group comprising, for example, fluorescent markers, radioactive markers, dyes, colloidal metals, biotin / avidin, horseradish peroxidase, etc. In a preferred embodiment, detection is via an antibody labeled with target antigen targeting. A binding agent comprising a detection moiety is defined herein as a probe complex.

Em uma configuração uma amostra clínica é tratada com asolução IDF no tubo, seguido por ebulição para liberar oácido nucléico na solução. Esta técnica é eficaz paraalvos tais como micobactérias, fungos e leveduras querequerem Iise mecânica (por exemplo, através desonicação) ou incubações longas com enzimas para digerira parede celular, por exemplo. 0 alvo de interesse podeser purificado adicionalmente por (1) técnicas depurificação de DNA padrão ou (2) por hibridizaçãosanduíche usando sondas específicas. O DNA e o RNA alvopurificado podem então ser amplificados por PCR ou RT-PCRrespectivamente, se necessário, antes da detecção.In one configuration a clinical sample is treated with the IDF solution in the tube, followed by boiling to release nucleic acid in the solution. This technique is effective for targets such as mycobacteria, fungi, and yeast that want mechanical lysis (e.g., by de-ionization) or long incubations with cell wall digesting enzymes, for example. The target of interest may be further purified by (1) standard DNA purification techniques or (2) by sandwich hybridization using specific probes. The alopopurified DNA and RNA can then be amplified by PCR or RT-PCR respectively, if necessary, prior to detection.

Em uma configuração mais preferida, o alvo é um ácidonucléico a partir do microorganismo Mycobacteriumtuberculosis e o agente de ligação é um oligonucleotídeo(ou sonda PNA) complementar aos ácidos nucléicos a partirdo microorganismo Mycobacterium tuberculosis.Em um outro aspecto, o método também compreende coloraçãoprofunda para melhor destacar ou visualizar a porção dedetecção. As colorações profundas e as técnicas decoloração são conhecidas daqueles técnicos no assunto.Descrição detalhada da invençãoIn a more preferred embodiment, the target is a nucleic acid from the Mycobacterium tuberculosis microorganism and the binding agent is an oligonucleotide (or PNA probe) complementary to the nucleic acids from the Mycobacterium tuberculosis microorganism. In another aspect, the method also comprises deep staining for better highlight or visualize the sensing portion. Deep stains and bleaching techniques are known to those skilled in the art. Detailed Description of the Invention

A presente invenção é baseada na descoberta de um métodomelhorado para permitir que a sonda penetre na paredecelular e/ou na membrana celular de uma célula (porexemplo, um patógeno) para detectar diretamente apresença de um ácido nucléico alvo, proteína, peptídeo,lipopeptídeo, glicopeptídeo, lipidio, etc., em células apartir da cultura ou a partir de espécimes obtidas apartir de um indivíduo (por exemplo, esfregaço de sangue,biópsia, tecidos e pintas embebidos em parafina), porhibridização in si tu. 0 método inventado é,particularmente, bem apropriado para detecção deseqüências de nucleotídeos específicas para os patógenosque são encontrados dentro, por exemplo, da saliva, todoo sangue, fluido da espinha central (CSF), outros fluidoscorpóreos ou tecidos infectados. Mais especificamente,novos melhoramentos de métodos de fixação/pré-tratamentotradicionais são descritos, os quais permitem que assondas, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos penetremdentro das células (por exemplo, de patógenos tais comobactérias, vírus, fungos, leveduras e protozoários), osquais podem estar localizados tanto dentro, quanto forade células hospedeiras infectadas. Em adição, umprocedimento com um contra-corante (por exemplo, DAPI,Evans Blue, permanganato de potássio) após a hibridizaçãocom sonda marcada fluorescente permite ao organismo queretém as sondas hibridizadas para serem facilmentevisualizadas em cultura ou em amostras clínicas.The present invention is based on the discovery of a method improved to allow the probe to penetrate the cell wall and / or cell membrane (e.g., a pathogen) to directly detect the presence of a target nucleic acid, protein, peptide, lipopeptide, glycopeptide. , lipid, etc., in cells from culture or from specimens obtained from an individual (e.g., blood smear, biopsy, paraffin-embedded tissues and moles), by in situ hybridization. The invented method is particularly well suited for detecting pathogen-specific nucleotide sequences that are found within, for example, saliva, whole blood, central spine fluid (CSF), other body fluids or infected tissues. More specifically, further improvements in traditional fixation / pretreatment methods are described which allow probes, for example, oligonucleotide probes to penetrate into cells (e.g., pathogens such as bacteria, viruses, fungi, yeast and protozoa), which they may be located both inside and outside infected host cells. In addition, a counterstain procedure (eg, DAPI, Evans Blue, potassium permanganate) following hybridization with a fluorescent labeled probe allows the organism to have the hybridized probes to be readily visualized in culture or clinical specimens.

Os novos procedimentos e único pré-tratamento dehibridização in si tu, a técnica de detecção e ascomposições da presente invenção, aqui descritos permitemo uso de DNA recombinante, RNAi PNA, peptídeo,glicoproteínas, lipídios e sondas de glicolipídios emcélulas, microorganismos ou secções de tecidos e écompatível com o exame microscópico rotineiramenterealizado em bacteriologia, parasitologia, histologia outécnicas de laboratório de patologia. A presente invençãoaplica, por exemplo, uma sonda de ácido nucléico daseqüência de nucleotídeo pré-determinada para a amostracelular (ou tecido) e para o exame da amostra por, porexemplo, microscopia, microscopia eletrônica, citometriade fluxo ou imagem radioativa (por exemplo, filme deraio-X, fósforo imagem), para determinar quais as células(ou tecidos) dentro da população contendo os alvosespecíficos (por exemplo, seqüências de ácido nucléicos)de interesse. Assim, em todo o esfregaço infectado ousecções de tecidos, organismos patogênicos tais comobactérias, vírus, protozoários ou fungos podem serdetectados dentro das células infectadas. Taisprotocolos provêem diagnósticos e informações científicasúteis, uma vez que a presença ou a ausência de um ácidonucléico específico pode correlacionar com um ou maiscélulas de estrutura e morfologia observáveis e, nestecaminho, provê uma base para o prognóstico e odiagnóstico clínico.The novel procedures and unique in situ hybridization pretreatment, detection technique and compositions of the present invention described herein allow the use of recombinant DNA, RNAi PNA, peptide, glycoproteins, lipids and glycolipid probes in cells, microorganisms or tissue sections. and is compatible with routine microscopic examination performed in bacteriology, parasitology, histology and pathology laboratory techniques. The present invention applies, for example, a nucleic acid probe of predetermined nucleotide sequence for sample (or tissue) and sample examination by, for example, microscopy, electron microscopy, flow cytometry or radioactive imaging (e.g. film X-ray, phosphorus imaging), to determine which cells (or tissues) within the population contain the specific alboses (eg nucleic acid sequences) of interest. Thus, throughout the infected swab or tissue sections, pathogenic organisms such as bacteria, viruses, protozoa or fungi can be detected within the infected cells. Such protocols provide useful scientific information and diagnostics, as the presence or absence of a specific nucleic acid can correlate with one or more cells of observable structure and morphology, and in this way provides a basis for prognosis and clinical diagnosis.

O método para detectar um fragmento de ácido nucléicoalvo diretamente a partir de um espécime é compreendidopor etapas que são realizadas, preferivelmente, na ordemlistada. Um espécime, usualmente obtido a partir de umindivíduo, é primeiro depositado sobre uma lâmina. Aamostra é fixada sobre a lâmina com um fixador (porexemplo, metanol, ácido acético-metanol fixador ou umácido acético-formalina fixador). Uma vez que a amostra éfixada, as amostras de células são permeabilizadas com ascomposiçoes e métodos da presente invenção.The method for detecting a target nucleic acid fragment directly from a specimen is comprised of steps which are preferably performed in the order listed. A specimen, usually obtained from an individual, is first deposited on a slide. The sample is fixed to the slide with a fixative (eg methanol, fixative acetic acid-methanol or fixative acetic acid-formalin). Once the sample is fixed, the cell samples are permeabilized with the compositions and methods of the present invention.

Alternativamente, a espécime é misturada com a solução deIDF em um tubo, incubada e então depositada sobre umalâmina, seca ao ar e fixada. Em seguida, as células sãocontatadas com uma sonda específica para o alvo sobcondições apropriadas para hibridização.Alternatively, the specimen is mixed with the IDF solution in a tube, incubated and then deposited on a slide, air dried and fixed. The cells are then contacted with a target-specific probe under appropriate conditions for hybridization.

Após um período adequado de hibridização qualquer sondanão-hibridizada é lavada a partir da amostra. Em umaconfiguração preferida, a amostra é então contatada comum contra-corante (por exemplo, DAPI, Evans Blue,permanganato de potássio, etc.). Sem levar emconsideração se a amostra foi contra-corada, as sondasque são hibridizadas, ao alvo da amostra, são entãovisualmente detectadas por, por exemplo, microscopia. Apresença de sondas com a amostra é uma indicação dapresença do fragmento alvo. A contra-coloração daamostra ao mesmo tempo ou seqüencialmente com os ensaiosde hibridização in si tu da presente invenção melhora ométodo por permitir, por exemplo, uma determinaçãotransparente do local do alvo dentro da amostra. Talinformação auxilia, por exemplo, na provisão de umadeterminação nítida da hibridização antecedente.After a suitable period of hybridization any unhybridized probe is washed from the sample. In a preferred embodiment, the sample is then contacted as a common counterstain (eg DAPI, Evans Blue, potassium permanganate, etc.). Regardless of whether the sample was counterstained, the probes that are hybridized to the sample target are then visually detected by, for example, microscopy. Presence of probes with the sample is an indication of the presence of the target fragment. Counterstaining the sample at the same time or sequentially with the in situ hybridization assays of the present invention improves the method by allowing, for example, transparent determination of the target site within the sample. Such information assists, for example, in providing a clear determination of prior hybridization.

Este método é apropriado para uso com qualquer espécime,obtida a partir de um indivíduo. Isto inclui, semlimitação, todo o sangue, soro, plasma, saliva, urina,leite de peito, fluido espinal cerebral e tecidos. Estemétodo é também apropriado para a detecção de um patógenoou outro alvo dentro das células de um inseto de vetor,célula de inseto, células de planta, fungo ou bactéria.This method is suitable for use with any specimen obtained from an individual. This includes, without limitation, all blood, serum, plasma, saliva, urine, breast milk, cerebral spinal fluid and tissues. This method is also suitable for detecting a pathogen or other target within the cells of a vector insect, insect cell, plant cell, fungus or bacterium.

O propósito das células ou tecidos de fixação éimobilizar as células e preservar a morfologia dascélulas ou tecidos de modo que as células constituintestais como, por exemplo, RNA são retidos dentro da matrizcelular durante a hibridização in si tu. 0 métodopreferido utiliza assim um fixador que é capaz depreservar e reter ácidos nucléicos da célula e ao mesmotempo reticular e/ou precipitar as proteínas na matrizcelular de modo que a célula ou tecido permanecesubstancialmente em configuração aberta para a penetraçãoda sonda e subseqüente hibridização.Em uma configuração preferida, as sondas da presenteinvenção compreendem, por exemplo, ácidos nucléicosproduzidos biológica ou sinteticamente (DNA, RNA eequivalentes); ácidos nucléicos de peptídeos (PNA; eequivalentes); peptídeos (e equivalentes) que contémácido nucléico específico ou seqüências de peptídeos quehibridizam sob condições extremas para alvos celularesespecíficos. Em uma outra configuração, a sonda dapresente invenção compreende glicopeptídeos produzidossintética ou biologicamente, lipopeptídeos e prions oumoléculas do tipo prions (ou os equivalentes das mesmas)que se ligam sob condições extremas aos alvos específicosdentro da célula.The purpose of the attachment cells or tissues is to immobilize the cells and preserve the morphology of the cells or tissues so that the constituent cells such as RNA are retained within the cellular matrix during in situ hybridization. The preferred method thus utilizes a fixative that is capable of preserving and retaining nucleic acids from the cell and at the same reticular time and / or precipitating the proteins in the cell matrix so that the cell or tissue remains substantially open for probe penetration and subsequent hybridization. Preferably, the probes of the present invention comprise, for example, biologically or synthetically produced nucleic acids (DNA, RNA and equivalents); peptide nucleic acids (PNA; eequivalents); peptides (and equivalents) containing specific nucleic acid or peptide sequences that hybridize under extreme conditions to specific cellular targets. In another embodiment, the probe of the present invention comprises synthetically or biologically produced glycopeptides, lipopeptides and prions or prions-like molecules (or equivalents thereof) that bind under extreme conditions to specific targets within the cell.

O complexo de sondas é definido como uma sonda quecompreende uma porção marcadora apropriada para detecção.Se a sonda for um ácido nucléico, a porção marcadora éligada tanto na extremidade 5', na extremidade 3'internamente, quanto em qualquer combinação das mesmas. Aporção marcadora preferida é um marcador identificáveltal como um radio-marcador (por exemplo, ρ32, I125, H3) , ummarcador de biotina ou um marcador fluorescente.The probe complex is defined as a probe comprising a marker moiety suitable for detection. If the probe is a nucleic acid, the marker moiety is attached at both the 5 'end, 3' end internally and any combination thereof. Preferred labeling is a label identifiable as a radiolabel (e.g., ρ32, I125, H3), a biotin marker or a fluorescent marker.

Alternativamente, a sonda tem uma cauda poli-deoxinucleotídeo marcada, a qual é utilizada paradetecção de um complexo de sondas. 0 complexo de sondaspode também estar compreendido em uma pluralidade deseqüências de ácido nucléico diferentes, PNA, peptídeos,glicopeptídeos, lipopeptídeos ou prions ou qualquercombinação dos mesmos compreendendo um ou mais marcadorescom uma porção marcada. Se mais do que uma das porções desonda for marcada, ela pode ser benéfica ao marcador decada porção de sonda com uma porção marcadora diferente.Alternatively, the probe has a labeled polydeoxynucleotide tail which is used for detection of a probe complex. The probe complex may also be comprised of a plurality of different nucleic acid sequences, PNAs, peptides, glycopeptides, lipopeptides or prions or any combination thereof comprising one or more markers with a labeled moiety. If more than one of the probe portions is labeled, it may be beneficial to label each probe portion with a different marker portion.

A seqüência de nucleotídeos de uma sonda deoligonucleotídeos é substancialmente complementar a pelomenos uma porção do ácido nucléico alvo. 0 ácido nucléicoalvo é tanto um ácido nucléico normalmente presentedentro da célula fixada ou de um tecido, oualternativamente, um que não está presente normalmente nacélula ou no tecido e, está associado a um estado anormalou um estado patológico. Cada porção do complexo de sondaé, preferivelmente, compreendida em um DNA ou fragmentode RNA variando em um tamanho de cerca de 10-50nucleotídeos.The nucleotide sequence of a deoligonucleotide probe is substantially complementary to at least a portion of the target nucleic acid. Target nucleic acid is either a nucleic acid normally present within the fixed cell or tissue, or alternatively one that is not normally present in the cell or tissue and is associated with an abnormal or pathological state. Each portion of the probe complex is preferably comprised in a DNA or RNA fragment ranging in size from about 10-50 nucleotides.

As sondas de peptídeos incluem, por exemplo, anticorpos eoutras moléculas conhecidas de ligação com um alvodefinido ou uma faixa de alvos. Exemplos de sondas não-anticorpos incluem, por exemplo, enzimas e substratos deenzimas e porções efetoras das mesmas. Adicionalmente, osfármacos ou os químicos conhecidos podem se ligarseletivamente às proteínas alvo (por exemplo,antibióticos podem se ligar às bactérias). Oslipopeptídeos, por exemplo, são úteis para a detecção dasporções de lipídio em uma célula incluindo organelasespecíficas ou porções de organelas e de bactériasinternalizada na célula. Os glicopeptídeos, por exemplo,interferem com a agregação das plaquetas e, portanto,pode ser utilizado nas moléculas alvo necessárias nafunção das plaquetas auxiliando, desse modo, na pesquisae no diagnóstico de anormalidades na coagulação. Osprions, ou as porções dos mesmos podem ser utilizados,por exemplo, como sondas para tecidos neurológicos.Igualmente, os prions podem ser alvos nas amostrasfixadas.Peptide probes include, for example, antibodies and other known binding molecules to a defined target or range of targets. Examples of non-antibody probes include, for example, enzyme and enzyme substrates and effector moieties thereof. Additionally, known drugs or chemicals may selectively bind to target proteins (e.g., antibiotics may bind to bacteria). Lipopeptides, for example, are useful for detecting lipid portions in a cell including specific organelles or portions of organelles and internalized bacteria in the cell. Glycopeptides, for example, interfere with platelet aggregation and can therefore be used on target molecules necessary for platelet function, thereby aiding research and diagnosis of coagulation abnormalities. Prions, or portions thereof, may be used, for example, as probes for neurological tissues. Likewise, prions may be targets in the fixed samples.

Em uma configuração preferida, a sonda ê adicionada àsamostras no excesso do alvo (por exemplo, 10:1, 100:1 ou1000:1). Isto é dirigido à reação de hibridizaçãoeficiente e promove uma alta taxa de ligação sonda:alvo.In a preferred embodiment, the probe is added to samples in excess of the target (e.g. 10: 1, 100: 1 or 1000: 1). This is directed to the efficient hybridization reaction and promotes a high probe: target binding rate.

O complexo de sonda (compreendendo, por exemplo, DNA, RNAe ou PNA) é contatado com o alvo da amostra (por exemplo,ácidos nucléicos) da amostra fixada, geralmente atravésda adição de uma solução do complexo de sonda sob aamostra. As condições exemplificativas apropriadas paraa hibridização são àquelas nas quais as soluções provêemo meio de tamponamento apropriado. Alguns exemplos detampões hibridizações apropriados são:1) um tampão compreende entre cerca de 10% e 50% deformamida, 2X.SSC (pH 7,4), e 1% de NP40;The probe complex (comprising, for example, DNA, RNAe or PNA) is contacted with the sample target (e.g., nucleic acids) of the fixed sample, usually by adding a solution of the probe complex under the sample. Exemplary conditions suitable for hybridization are those in which solutions provide appropriate buffering medium. Examples of suitable hybridization buffers are: 1) a buffer comprises between about 10% and 50% deformamide, 2X.SSC (pH 7.4), and 1% NP40;

2) um tampão compreende entre cerca de 1,5 M e 4M dotampão GuSCN;2) a buffer comprises between about 1.5 M and 4 M with GuSCN buffer;

5 M do tampão de armazenamento de GuSCN são produzidos apartir de 5 M de GuSCN, 100 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 40mM de EDTA, 1% de NP40. Este tampão estoque é diluído emuma molaridade indicada de GusCN por adição de IxTE, umpH 7,8 para produzir molaridades do tampão de GuSCN acimareferenciadas.5 M GuSCN storage buffer is produced from 5 M GuSCN, 100 mM Tris-HCl (pH 7.8), 40 mM EDTA, 1% NP40. This stock buffer is diluted to an indicated GusCN molarity by addition of IxTE, umpH 7.8 to produce above-referenced GuSCN buffer molarities.

3) um tampão compreendendo entre cerca de 2 a 5 M dotampão GuHCl.3) a buffer comprising from about 2 to 5 M with GuHCl buffer.

8 M do tampão estoque de GuHCl é feito a partir de 8 M deGuHCl, 200 mM de Tris-HCl, (pH 7,8), 40 mM de EDTA, 1% deNP40. Este tampão estoque é diluído para a molaridade deGuHCl através da adição de 1 xTE com pH 7,8 para produziras molaridades do tampão GuHCl acima referenciado.8 M GuHCl stock buffer is made from 8 M GuHCl, 200 mM Tris-HCl, (pH 7.8), 40 mM EDTA, 1% NP40. This stock buffer is diluted to the guHCl molarity by the addition of 1 xTE at pH 7.8 to produce the above referenced GuHCl buffer molarities.

4) um tampão compreendendo uma mistura de formamida (2 0-50%) e do tampão GuSCN (por exemplo, 0,5M a 3M).4) a buffer comprising a mixture of formamide (20-50%) and GuSCN buffer (e.g. 0.5M to 3M).

5) um tampão compreendendo uma mistura de tampão GuSCN(por exemplo, 0,5 M a 3M) e tampão GuHCl (por exemplo, IMa 5M) .5) a buffer comprising a mixture of GuSCN buffer (e.g. 0.5M to 3M) and GuHCl buffer (e.g. 5M IMa).

A composição específica e a concentração do tampão dehibridização variam com o tipo de sonda ou complexo desonda utilizado. A composição e a concentração do tampãoutilizado são, também, dependentes do Tm (ponto de fusão:temperatura na qual separa-se a fita dupla do DNAformando duas fitas simples complementares) da sonda,seqüência de sonda, comprimento de sonda e a temperaturade hibridização e pode ser determinado por um técnico noassunto, através do curso de não mais do que umexperimento de rotina de laboratório.The specific composition and concentration of the hybridization buffer vary with the type of probe or probe complex used. The composition and concentration of the buffer used are also Tm dependent (melting point: temperature at which the double strand of DNA is separated into two complementary single strands) of the probe, probe sequence, probe length and the hybridization temperature and temperature. It can be determined by a subject technician through the course of no more than a routine laboratory experiment.

A presente invenção não está limitada a qualquertemperatura de hibridização particular. Entretanto, deveser apreciado que o uso de formamida no tampão dehibridização permite que a hibridização seja conduzida emuma temperatura muito mais baixa do que os protocolos dehibridização padrões. Por exemplo, a hibridização de umcomplexo de sonda especificamente proporcional ao alvo (enão à célula hospedeira) em tampão de hibridizaçãoaquoso, tal como cloreto de sódio, requereria,geralmente, uma temperatura de cerca de 60-65°C. A mesmahibridização realizada a cerca de 420C em um fluido dehibridização (1) acima, proveria especificidadeequivalente.The present invention is not limited to any particular hybridization temperature. However, it should be appreciated that the use of formamide in the hybridization buffer allows hybridization to be conducted at a much lower temperature than standard hybridization protocols. For example, hybridization of a specifically target-proportional (rather than host cell) probe complex in aqueous hybridization buffer, such as sodium chloride, would generally require a temperature of about 60-65 ° C. The same hybridization performed at about 420 ° C in a hybridization fluid (1) above would provide equivalent specificity.

Igualmente, o uso de GuSCN também permite a hibridizaçãoa ser realizada em uma temperatura muito mais baixa doque os protocolos de hibridização padrões. Por exemplo,em um procedimento proporcional, à hibridização da sondaespecificamente ao alvo (e não à célula hospedeira) emtampão de hibridização aquoso tal como cloreto de sódiopoderia requerer temperaturas de aproximadamente 60-65°C.Entretanto, a mesma hibridização realizada no GuSCN outampão de hibridização GuHCl acima, em cerca de 37°Cproverá especificidade equivalente de hibridização.Equally, the use of GuSCN also allows hybridization to be performed at a much lower temperature than standard hybridization protocols. For example, in a proportional procedure, probe hybridization specifically to the target (rather than the host cell) in aqueous hybridization buffer such as sodium chloride could require temperatures of approximately 60-65 ° C. However, the same hybridization performed at the GuSCN out of buffer. GuHCl hybridization above at about 37 ° C will provide equivalent hybridization specificity.

Após a hibridização ser completada, a sonda não-hibridizada é lavada a partir da amostra, geralmenteatravés da aplicação de uma série de lavagens com umtampão de lavagem. Ela está dentro de meios conhecidosdos técnicos no assunto para determinar os tampões delavagem e tempos de lavagens apropriados. Em uma configuração, o tampão de lavagem compreende 0,3 M decloreto de sódio, 0,03 M de citrato de sódio, e 0,1% deSDS. Um outro tampão de lavagem apropriado compreendesalina de fosfato tamponada (PBS).After hybridization is completed, the unhybridized probe is washed from the sample, usually by applying a series of washes with a wash buffer. It is within the means known to those skilled in the art to determine appropriate wash buffers and wash times. In one embodiment, the wash buffer comprises 0.3 M sodium chloride, 0.03 M sodium citrate, and 0.1% SDS. Another suitable wash buffer comprises phosphate buffered saline (PBS).

Após a lavagem, a amostra pode ser contra-corada. Em umaconfiguração, a contra-coloração do fungo melhora avisualização da sonda hibridizada. As contra-coloraçõespreferidas, são, por exemplo, DAPI, Evans Blue epermanganato de potássio. Outras contra-coloraçõesapropriadas são conhecidas dos técnicos no assunto. Estaetapa de coloração é geralmente aplicada quando uma sondacom marcação fluorescente é utilizada para detectar osácidos nucléicos, proteínas, glicoproteínas elipoproteínas que são específicas para um alvo. Apesar deauxiliar, as contra-colorações não são requeridas para asconfigurações da presente invenção.After washing, the sample may be counterstained. In one configuration, fungal counterstaining improves the visualization of the hybridized probe. Preferred counterstains are, for example, DAPI, Evans Blue and potassium permanganate. Other appropriate counterstains are known to those skilled in the art. This staining step is generally applied when a fluorescently labeled probe is used to detect nucleic acids, proteins, and elipoprotein glycoproteins that are specific to a target. Despite being familiar, counterstains are not required for the settings of the present invention.

A sonda é detectada através de meios apropriados para aporção específica utilizada para marcar o complexo desonda. 0 método preferido para a detecção das sondasmarcadas com fluorescente, por exemplo, empregandofiltros microscópicos especiais, verde, vermelho e azul(ou seja, microscopia de fluorescência). As sondas radio-marcadas hibridizadas podem ser detectadas por,porexemplo, auto-radiografia e fósforo-imagem. As sondasmarcadas com biotina podem ser detectadas através desistemas de detecção enzimática e os referidos sistemasde detecção estão comercialmente disponíveis.The probe is detected by appropriate means for specific aporonization used to label the probe complex. The preferred method for detecting fluorescently labeled probes, for example by employing special green, red and blue microscopic filters (i.e. fluorescence microscopy). Hybridized radiolabelled probes can be detected by, for example, autoradiography and phosphor image. Biotin-labeled probes can be detected by enzymatic detection systems and said detection systems are commercially available.

O método descrito acima permite a detecção simultânea dediferentes patógenos em uma amostra clínica única,através da realização de uma reação com um complexo desonda que é compreendido de uma pluralidade de diferentesseqüências de ácido nucléico, cada um marcado com umaporção marcadora diferente. Para detecção simultânea,sondas diferentes de oligonucleotídeo, que sãoespecificas para os ácidos nucléicos diferentes, emdiferentes alvos, presentes comumente no espécime, podemser construídas de modo que o valor de Tm (ponto defusão) de toda a seqüência do complexo de sonda é muitosimilar. Cada um dos oligonucleotídeos específicos éentão marcado com uma porção detectável diferente (porexemplo, diferentes porções fluorescentes). Ahibridização é realizada com os componentes múltiplos docomplexo de sonda. A amostra hibridizada é processadacomo descrito acima e a amostra é observada através demeios apropriados para a detecção de diferentesoligonucleotídeos marcados do complexo de sonda (porexemplo, observado pelo uso de filtros apropriados sediferentes porções fluorescentes forem utilizadas) paradetectar qual dos alvos está presente na amostra.Será reconhecido pelos praticantes destes novosprotocolos de pré-tratamento para uso com o protocolo dehibridização in si tu descrito aqui é compatível com todosos métodos previamente conhecidos da detecção bem como osaqui descritos não são limitados pelo método de detecçãoutilizado. O protocolo de hibridização in si tu foieficiente de modo que manipulações mínimas sãonecessárias e podem, portanto, ser realizadas em um curtoperíodo de tempo. Configurações da presente invençãotambém abrangem kits compreendendo as composições dapresente invenção. As referidas composições quandoprovidas na forma de um kit permitirão a prática devárias configurações dos protocolos apresentados aquiincluindo àquelas que foram otimizadas para asimplicidade e para compatibilidade com uma amplavariedade de métodos de detecção. Também é esperado queos referidos kits preparados contenham reagentesespecificamente preparados e sondas que serão aplicáveisem laboratórios clínicos/de diagnóstico, onde acapacidade de detectar a presença ou a ausência dosácidos nucléicos específicos serve para identificarpositivamente ou negativamente estados patológicoscaracterizados pela presença de alvos específicos.The method described above allows simultaneous detection of different pathogens in a single clinical sample by performing a reaction with a probe complex which is comprised of a plurality of different nucleic acid sequences, each labeled with a different marker portion. For simultaneous detection, different oligonucleotide probes, which are specific for different nucleic acids, on different targets commonly present in the specimen, can be constructed so that the Tm (melting point) value of the entire probe complex sequence is very similar. Each of the specific oligonucleotides is then labeled with a different detectable moiety (e.g., different fluorescent moieties). Hybridization is performed with the multiple components of the probe complex. The hybridized sample is processed as described above and the sample is observed by appropriate means for detecting different labeled complex oligonucleotides (e.g., observed by the use of appropriate filters with fluorescent portions to be used) to determine which of the targets is present in the sample. Recognized by practitioners of these new pretreatment protocols for use with the in situ hybridization protocol described herein is compatible with all previously known detection methods as well as those described herein are not limited by the detection method employed. The in situ hybridization protocol is sufficient so that minimal manipulations are necessary and can therefore be performed over a short period of time. Embodiments of the present invention also encompass kits comprising the compositions of the present invention. Said compositions when provided in kit form will allow for the practice of various configurations of the protocols presented herein including those optimized for simplicity and compatibility with a wide range of detection methods. Said prepared kits are also expected to contain specifically prepared reagents and probes that will be applicable in clinical / diagnostic laboratories, where the ability to detect the presence or absence of specific nucleic acids serves to positively or negatively identify pathological conditions characterized by the presence of specific targets.

Os métodos de diagnósticos disponíveis da técnicaanterior para muitas patologias celulares dependem dasavaliações microscópicas, parâmetros morfológicoscelulares, características de coloração, e a presença oua ausência de determinados alvos. Entretanto, muitosdestes métodos de diagnósticos não são inteiramenteexatos ou suficientemente sensíveis. A hibridização insi tu, usando o protocolo descrito acima e as sondasespecíficas para patógenos permitirão facilitar aidentificação mais apurada dos alvos (incluindo, mas nãolimitado aos, patógenos) nas amostras.The available prior art diagnostic methods for many cell pathologies depend on microscopic evaluations, cell morphological parameters, staining characteristics, and the presence or absence of certain targets. However, many of these diagnostic methods are not entirely accurate or sensitive enough. In-situ hybridization using the protocol described above and pathogen-specific probes will facilitate more accurate identification of targets (including but not limited to pathogens) in the samples.

A presente invenção provê um protocolo de pré-tratamentosimples para uso nos protocolos de hibridização in si tu ecaracterísticas de detecção quando comparado comprotocolos descritos previamente. A melhora incluimaximizar a sensibilidade dos ensaios através do aumentoda eficiência de hibridização e detecção de "sinal"específico. Apesar da presente invenção não estarlimitada a qualquer mecanismo particular, acredita-se quea sensibilidade aumentada é devido ã melhora nahibridização devido à melhora na penetração da sondadentro das células e, ao mesmo tempo, da maximização daretenção do alvo (por exemplo, seqüências de ácidonucléico) na célula ou no tecido, e da maximização napreservação de outras características bioquímicas emorfológicas da amostra de célula ou de tecido.Experimental:The present invention provides a simple pre-treatment protocol for use in in situ hybridization protocols and detection characteristics when compared to previously described protocols. Improvement includes maximizing assay sensitivity through increased hybridization efficiency and specific "signal" detection. Although the present invention is not limited to any particular mechanism, it is believed that increased sensitivity is due to improved hybridization due to improved penetration of cell probe and at the same time maximization of target retention (e.g., nucleic acid sequences) in the cell or tissue, and maximizing the preservation of other emorphological biochemical characteristics of the cell or tissue sample.

Um uso preferido e não-limitativo do método acima está nadetecção de Mycobacterium tuberculosis, a partir de umacultura ou a partir da saliva. Deverá ser entendido eapreciado por um técnico no assunto, que a novametodologia é aplicável, igualmente, a uma amplavariedade de outros sistemas, de células, de culturas detecidos e de tecidos para hibridização de ácidosnucléicos específicos (ou detecção de outros componentescelulares das células alvos, tecidos ou patógenos) deinteresse com preservação concomitante da integridade emorfologia celular.A preferred and non-limiting use of the above method is the detection of Mycobacterium tuberculosis, from a culture or from saliva. It should be understood and appreciated by one of ordinary skill in the art that the new methodology is equally applicable to a wide range of other nucleic acid hybridized systems, cells, cultures and tissues (or detection of other cellular components of target cells, tissues). or pathogens) of interest with concomitant preservation of cellular integrity and morphology.

EXEMPLOEXAMPLE

A cultura ou a saliva processada do paciente foiesfregada sobre uma placa de vidro e ar seco. As célulascultivadas foram lavadas e concentradas através decentrifugação. As células lavadas foram suspensas emtampão fosfato com BSA. Para resultar em células inativasas células suspensas foram fervidas durante 15 minutos a100°C.The patient's processed culture or saliva was rubbed onto a glass plate and dried air. Cultured cells were washed and concentrated by decentrifugation. Washed cells were suspended in phosphate buffer with BSA. To result in inactive cells suspended cells were boiled for 15 minutes at 100 ° C.

Método 1 de preparação da amostra:Sample Preparation Method 1:

A saliva foi processada tanto por (1) NALC/NaOH quantopor (2) NALC/NaOH seguido por fervura da salivaprocessada durante 15 minutos a 100T8C para resultar emuma amostra inativa ou (3) com uma solução caotrópica talcomo hidrocloreto de guanidina ou tiosulfato(resumidamente, 2-3 volumes de 5M de GuSCN ou 8M de GuHClpara a saliva foram misturados). A amostra foi incubada a37°C durante 20 minutos. A amostra foi centrifugada paraempelotar as células. As células foram lavadas com salinafosfato tamponada. As células lavadas foram suspensas emsalina fosfata tamponada com 1% de BSA ou (4) uma soluçãocaotrópica tal como hidrocloreto de guanidina outiosulfato seguido por fervura (a mesma que na etapa 3,acima) exceto pelas células suspensas em salina tamponadacom 1% de BSA serem fervidas durante 15 minutos a IOO0Cpara matar a Mycobac terium. A cultura preparada ou aamostra de saliva foi então corada sobre a lâmina devidro e seca ao ar.Saliva was processed either by (1) NALC / NaOH quantopor (2) NALC / NaOH followed by boiling of the processed saliva for 15 minutes at 100T8C to yield an inactive sample or (3) with a chaotropic solution such as guanidine hydrochloride or thiosulfate (briefly). 2-3 volumes of 5M GuSCN or 8M GuHCl for saliva were mixed). The sample was incubated at 37 ° C for 20 minutes. The sample was centrifuged to accelerate the cells. Cells were washed with buffered saline phosphate. Washed cells were suspended in 1% BSA buffered saline phosphate or (4) a cocotropic solution such as guanidine hydrochloride outiosulfate followed by boiling (same as in step 3, above) except that cells suspended in 1% BSA buffered saline were boiled for 15 minutes at 100 ° C to kill Mycobacterium. The prepared culture or saliva sample was then stained on the glass slide and air dried.

A amostra foi fixada através do metanol ou do ácidoacético-metanol ou do etanol. 0 esfregaço corado foitratado com a solução IDF (como descrita Supra) durante10 minutos. Após 10 minutos o esfregaço foi lavado 3vezes com PBS e seco ao ar.The sample was fixed by methanol or acetic acid-methanol or ethanol. The stained smear was treated with the IDF solution (as described above) for 10 minutes. After 10 minutes the smear was washed 3 times with PBS and air dried.

Método 2 de preparação da amostra:Um volume de saliva não-processada de paciente foimisturada com dois volumes da solução IDF (supra) em umtubo e incubada a temperatura ambiente (20-25°C) durante15 minutos. A mistura IDF-saliva foi então esfregadasobre a lâmina de vidro, seca ao ar e fixada com metanol.Sample Preparation Method 2: One volume of unprocessed patient saliva was mixed with two volumes of IDF solution (supra) in a tube and incubated at room temperature (20-25 ° C) for 15 minutes. The IDF-saliva mixture was then rubbed over the glass slide, air dried and fixed with methanol.

O tratamento IDF do esfregaço fixado antes dahibridização foi omitido. Antes da hibridização da lâminafoi lavada com PBS três vezes.The IDF treatment of the fixed smear prior to hybridization was omitted. Prior to hybridization the slide was washed with PBS three times.

Método 3 de preparação da amostra:Sample Preparation Method 3:

A mistura IDF-saliva fixada com metanol em uma lâmina devidro foi tratada com 2% de glutaraldeído em PBS durante5 minutos a 20-25°c (temperatura ambiente) , então lavadacom PBS três vezes e seca ao ar. O tratamento IDF doesfregaço fixado antes da hibridização foi omitido.The methanol-fixed IDF-saliva mixture on a slide was treated with 2% glutaraldehyde in PBS for 5 minutes at 20-25 ° C (room temperature), then washed with PBS three times and air dried. The IDF smear treatment fixed prior to hybridization was omitted.

Método 4 de preparação da amostra:Sample Preparation Method 4:

Um volume de uma saliva não-processada de paciente foimisturada com dois volumes de uma solução IDF ((supra) emum tubo e incubada a cerca de 20-25°C (temperaturaambiente) durante 15 minutos. A mistura IDF-saliva foientão fervida durante 15 minutos para liberar os ácidosnucléicos na solução e ao mesmo tempo render uma amostranão-infecciosa. Os ácidos nucléicos podem ser purificadosatravés de técnicas padrões a partir da amostra fervidaou do ácido nucléico alvo de interesse que pode serselecionado pela hibridização sanduíche usando sondasespecíficas e contas magnéticas como descrito por Shah etal., (Ahah J. S., King W., Liu J., Smith J., Serpe G., ePopoff S., e (1997). Ensaios melhorados, patente norte-americana No.: U.S. 5,629,156), a qual é incorporada aquipor referência). 0 alvo purificado pode ser amplificadopor PCR (para o DNA alvo) ou RT-PCR (para um RNA alvo).Sondagem das amostrasOne volume of unprocessed patient saliva was mixed with two volumes of an IDF solution ((supra) in a tube and incubated at about 20-25 ° C (room temperature) for 15 minutes.) The IDF-saliva mixture was then boiled for 15 minutes. minutes to release the nucleic acids into the solution while rendering a non-infectious sample.Nucleic acids can be purified by standard techniques from the boiled or target nucleic acid sample of interest which can be selected by sandwich hybridization using specific probes and magnetic beads as described. by Shah et al., (Ahah JS, King W., Liu J., Smith J., Serpe G., and Popoff S., and (1997). Enhanced Assays, U.S. Patent No. 5,629,156), which incorporated herein by reference). The purified target can be amplified by PCR (for the target DNA) or RT-PCR (for a target RNA). Sample Probe

Uma sonda de oligonucleotídeo compreendendo de umaseqüência de DNA que hibridiza especificamente ao Rnaribossomal 2 3 S de Mycobacterium tuberculosis comodescrito por Shah, Nietupski e Liu (Patente U.S. No.5,521,3 00) são preferivelmente utilizadas na detecção dapresença de M. tuberculosis nas células. Os exemplos deum complexo de sonda apropriado são:Pl. Sonda TBAn oligonucleotide probe comprising a DNA sequence that specifically hybridizes to Shah, Nietupski and Liu Rnaribosomal 23 S as described by U.S. Patent No. 5,521,300) is preferably used in detecting the presence of M. tuberculosis in cells. Examples of an appropriate probe complex are: Pl. TB probe

5'-Rhodamin Green - AGA-ACA-CGC-CAC-TAT-TCA-CAC-GCG-CGT-ATG-C-3' [SEQ.ID.NO:1] 66,5cP2- Tb-I 51-2c5'-Rhodamin Green - AGA-ACA-CGC-CAC-TAT-TCA-CAC-GCG-CGT-ATG-C-3 '[SEQ.ID.NO:1] 66,5cP2-Tb-I 51-2c

5'-Rhodamin Green - TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3 '[SEQ.ID.N0:2]5'-Rhodamin Green - TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3 '[SEQ.ID.N0: 2]

P3. Sonda de MycobacteriumP3. Mycobacterium Probe

5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-3' [SEQ.ID.N0:3] 68,7c5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-3 '[SEQ.ID.N0: 3] 68.7c

P4 - gênero Myeobaeterium - 54.1c5'-Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ.ID.NO.:4]P5 - Sonda de BurkholderiaP4 - genus Myeobaeterium - 54.1c5'-Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3 '[SEQ.ID.NO.:4[P5 - Burkholderia Probe

5'-FAM-CTT-GGC-TCT-AAT-ACA-GTC-GG-3' [SEQ.ID.NO.:5] tm52cSonda de PNA5'-FAM-CTT-GGC-TCT-AAT-ACA-GTC-GG-3 '[SEQ.ID.NO.:5] tm52cPNA Probe

Em uma configuração, este complexo de sonda foi contatadocom os ácidos nucléicos da amostra fixada/pré-tratada emum tampão de hibridização de 2,5 M GusSCN, 50 mM de Tris(ph 7,8), 20 mM de EDTA e 1% de NP40 a 37°C. Em umaconfiguração alternativa, este complexo de sonda foicontatado com os ácidos nucléicos da amostra fixada em umtempão de hibridização de 50% de formamida, 2X SSC (pH7,4), 20 mM de EDTA, 1% de NP40 a 42°C.In one embodiment, this probe complex was contacted with nucleic acids from the fixed / pretreated sample in a 2.5 M GusSCN hybridization buffer, 50 mM Tris (ph 7.8), 20 mM EDTA and 1% NP40 at 37 ° C. In an alternative embodiment, this probe complex was contacted with the sample nucleic acids fixed in a 50% formamide hybridization time, 2X SSC (pH7.4), 20 mM EDTA, 1% NP40 at 42 ° C.

Exemplos de uma seqüência de oligonucleotídeo apropriadopara uso em um complexo de sonda alternativo para adetecção de espécies de Micobacteria são:P2 - Tb-I 51-2cExamples of an appropriate oligonucleotide sequence for use in an alternative probe complex for the detection of Mycobacteria species are: P2 - Tb-I 51-2c

5'-Rhodamin Green - TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3 '[SEQ.ID.NO:2]5'-Rhodamin Green - TTC-GAG-GTT-AGA-TGC-CC-3 '[SEQ.ID.NO:2]

P3. Sonda de MycobacteriumP3. Mycobacterium Probe

5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-15 3' [SEQ.ID.N0:3] 68,7c5'-Tamra-ATC GCC CGC ACG CTC ACA GTT AAG CCG TGA GAT TTC-15 3 '[SEQ.ID.N0: 3] 68.7c

P4 - gênero Mycobaeterium - 54.1c5' -Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ.ID.NO. :4]P4 - genus Mycobaeterium - 54.1c5 '-Tamra-GCA-TTA-CCC-GCT-GGC-3' [SEQ.ID.NO. : 4]

SEQ. ID. Nos.: 3 e 4 e os complementos das mesmas sãoapropriadas para a detecção de Myeobaeterium sp.SEQ ID Nos .: 3 and 4 and their supplements are appropriate for the detection of Myeobaeterium sp.

SEQ.ID.Nos.: 1 e 2 e complementos das mesmas sãoapropriados para a detecção de M. tubereulosis.SEQ.ID.No .: 1 and 2 and supplements thereof are appropriate for the detection of M. tubereulosis.

SEQ.ID.NO: 5 é apropriada para a detecção de Burkholderiasp.SEQ.ID.NO: 5 is suitable for Burkholderiasp detection.

A seqüência de RNA ribossomal é escolhida para uso nadetecção dos patógenos Myeobaeterium devido à altaabundância do rRNA em células bacterianas (1,000-10,000cópias). Preferivelmente o oligonucleotídeo do complexode sonda é um DNA com uma seqüência complementar ao rRNAde M. tubereulosis. 0 oligonucleotídeo é preferivelmentemarcado nas extremidades 3' e 5' com fluoresceína. Seráreconhecido que uma sonda de oligonucleotídeo de RNA podeser utilizada bem como.The ribosomal RNA sequence is chosen for use in the detection of Myeobaeterium pathogens due to the high abundance of rRNA in bacterial cells (1,000-10,000 copies). Preferably the probe complex oligonucleotide is a DNA with a sequence complementary to the M. tubereulosis rRNA. The oligonucleotide is preferably labeled at the 3 'and 5' ends with fluorescein. It will be recognized that an RNA oligonucleotide probe may be used as well.

Como discutido acima, a quantidade de sonda total é umaquantidade predeterminada que excederia a quantidadeestimada do rRNA disponível acreditado estar dentro daamostra (cerca de 100:1) de modo a dirigir a reação dehibridização eficientemente e para promover uma alta taxade sonda/anelamento alvo. Em termos quantitativos, istorequer que uma sonda compreendida de um oligonucleotídeolongo de 3 0 nucleotídeos a ser utilizado em concentraçõesvariando de 1-10 μg/ml para produzir um sinal confiávelanteriormente descrito.As discussed above, the total probe amount is a predetermined amount that would exceed the estimated amount of available rRNA believed to be within the sample (about 100: 1) so as to direct the hybridization reaction efficiently and to promote a high probe / target annealing rate. In quantitative terms, it is intended that a probe comprised of a 30 nucleotide long oligonucleotide to be used in concentrations ranging from 1-10 μg / ml to produce a reliable signal described above.

Deveria ser apreciado que o uso de GuSCN também permite ahibridização a ser realizada em uma temperatura muitomais baixa do que os protocolos de hibridização padrões.A hibridização da sonda especificada especificamente aoalvo (e não à célula hospedeira) em fluido dehibridização aquoso tal como cloreto de sódio seriarequerer uma temperatura de cerca de 60-65°C. Entretanto,a hibridização realizada no tampão de hibridização GuSCNou GuHCl acima, em cerca de 3 7 0C assegurando aespecificidade.It should be appreciated that the use of GuSCN also allows hybridization to be performed at a much lower temperature than standard hybridization protocols. Hybridization of the target-specific (rather than host cell) probe into aqueous hybridization fluid such as sodium chloride would require a temperature of about 60-65 ° C. However, hybridization performed in the GuSCN or GuHCl hybridization buffer above at about 37 ° C ensuring specificity.

Uma das vantagens do método de hibridização in si tu é queo número relativamente pequeno de células compreende umaamostra e um grande número de amostras idênticas pode serprocessado durante um curto período de tempo. 0 únicométodo de hibridização in si tu descrito é extremamentesimples. Os métodos da presente invenção também podemser aplicados em qualquer tipo de amostra, incluindo, semlimitação, secções de tecidos embebidos em parafina,amostras fixadas em acetona.One of the advantages of the in situ hybridization method is that the relatively small number of cells comprises a sample and a large number of identical samples can be processed over a short period of time. The only in situ hybridization method described is extremely simple. The methods of the present invention may also be applied to any type of sample, including, without limitation, paraffin-embedded tissue sections, acetone-fixed samples.

Os resultados destes experimentos mostram que a detecçãodo alvo (DNA patógeno) nas amostras testadas e a nãodetecção do alvo nas amostras controle. A detecção doalvo é consistentemente melhor nas amostras tratadas comas soluções IDF da presente invenção. Um técnico noassunto irá apreciar, entendimento e conhecimento dassoluções IDF da presente invenção pode ser utilizado emqualquer situação requerendo a entrada efetiva de umasonda (ou outro objeto similar) dentro de uma célula,patógeno (por exemplo, localizado em uma célula) ou emuma organela sem uma experimentação indevida.The results of these experiments show that the target detection (pathogen DNA) in the tested samples and the non detection of the target in the control samples. Target detection is consistently better in samples treated with IDF solutions of the present invention. One of ordinary skill in the art will appreciate, understand and know the IDF solutions of the present invention may be used in any situation requiring the effective entry of a probe (or other similar object) into a cell, pathogen (for example, located in a cell) or an organelle without an improper experimentation.

Deverá ser evidente a partir do produzido que a presenteinvenção provê composições e métodos para aumentar apermeabilidade de células, paredes celulares, membranascelulares, organelas e membranas de organelas paraauxiliar, por exemplo, na detecção de componentescelulares e/ou patógenos.It should be apparent from the disclosure that the present invention provides compositions and methods for enhancing the permeability of cells, cell walls, cell membranes, organelles and para-auxiliary organelle membranes, for example in the detection of cell components and / or pathogens.

Claims (30)

1. Composição para aumentar a permeabilidade de paredescelulares, membranas celulares e membranas nucleares,caracterizada pelo fato de compreender: GuSCN (tiocianatode guanidina), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL (octilfenoxipoli(etilenooxi)etanol), ácido acético, metanol, colatode sódio e deoxicolato de sódio.1. Composition for enhancing the permeability of cell wall, cell membranes and nuclear membranes, comprising: GuSCN (guanidine thiocyanate), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL (octylphenoxypoly (ethyleneoxy) ethanol), acetic acid, methanol, sodium colate and sodium deoxycholate. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido GuSCN estar em umaconcentração de aproximadamente 2,0 a 3,3 M.Composition according to Claim 1, characterized in that said GuSCN is in a concentration of approximately 2.0 to 3.3 M. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido Tris-HCl estar emuma concentração de aproximadamente 10 a 100 mM.Composition according to Claim 1, characterized in that said Tris-HCl is in a concentration of approximately 10 to 100 mM. 4. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido Tris-HCl estar emum pH de aproximadamente 7,0 a 9,0.Composition according to Claim 1, characterized in that said Tris-HCl is at a pH of approximately 7.0 to 9.0. 5. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido EDTA estar em umaconcentração de aproximadamente 5 a 50 mM.Composition according to Claim 1, characterized in that said EDTA is at a concentration of approximately 5 to 50 mM. 6. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido IGEPAL estar em umaconcentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 por cento.Composition according to Claim 1, characterized in that said IGEPAL is in a concentration of approximately 0.1 to 2.0 percent. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido ácido acético estarem uma concentração de aproximadamente 1,0 a 10 porcento.Composition according to Claim 1, characterized in that said acetic acid is a concentration of approximately 1.0 to 10 percent. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido metanol estar emuma concentração de aproximadamente 2 0 a 50 por cento.Composition according to Claim 1, characterized in that said methanol is in a concentration of approximately 20 to 50 percent. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido colato de sódioestar em uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5por cento.Composition according to Claim 1, characterized in that said sodium cholate is in a concentration of approximately 0.02 to 2.5 percent. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o referido deoxicolato estarem uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 porcento.Composition according to Claim 1, characterized in that said deoxycholate is in a concentration of approximately 0.02 to 2.5 percent. 11. Método para detectar um alvo em uma célula,caracterizado pelo fato de compreender:a) contatar a célula com uma composição compreendendoGuSCN (tiocianato de guanidina), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL(octilfenoxi poli (etilenooxi)etanol), ácido acético,metanol, colato de sódio e deoxicolato de sódio paracriar uma célula permeabilizada;b) contatar a célula permeabilizada da etapa (a) com umagente ligante específico para se ligar ao referido alvo;ec) detectar o referido agente ligante da etapa (b).A method for detecting a target in a cell, comprising: a) contacting the cell with a composition comprising GuSCN (guanidine thiocyanate), Tris-HCl, EDTA, IGEPAL (octylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol), acetic acid , methanol, sodium cholate and sodium deoxycholate to create a permeabilized cell b) contacting the permeabilized cell of step (a) with a specific binder to bind to said target and c) detecting said binder of step (b). 12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o alvo ser selecionado dogrupo consistindo de ácidos nucléicos, ácidos nucléicospeptídicos, peptídeos, glicoproteínas, lipídeos,lipoproteínas, glicoproteínas, vírus, e prions.Method according to claim 11, characterized in that the target is selected from the group consisting of nucleic acids, nucleic acid peptides, peptides, glycoproteins, lipids, lipoproteins, glycoproteins, viruses, and prions. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o alvo ser selecionado dogrupo consistindo de ácidos nucléicos, ácidos nucléicospeptídicos, peptídeos, lipoproteínas, glicoproteínas elipídeos.Method according to claim 11, characterized in that the target is selected from the group consisting of nucleic acids, nucleic acid peptides, peptides, lipoproteins, ellipid glycoproteins. 14. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido agente ligantecompreender adicionalmente uma porção de detecção.A method according to claim 11, characterized in that said binding agent further comprises a detection portion. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de a porção de detecção serselecionada do grupo consistindo de marcadoresfluorescentes, marcadores radioativos, corantes, metaiscoloidais, biotina/avidina e peroxidase de raiz forte.A method according to claim 14, characterized in that the selectable detection portion of the group consisting of fluorescent markers, radioactive markers, dyes, colloidal metals, biotin / avidin and strong root peroxidase. 16. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de a dita detecção ser via umanticorpo marcado com afinidade pelo referido agenteligante.Method according to claim 11, characterized in that said detection is via an affinity-labeled antibody to said binding agent. 17. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido GuSCN estar em umaconcentração de aproximadamente 2,0 a 3,3 M.Method according to claim 11, characterized in that said GuSCN is at a concentration of approximately 2.0 to 3.3 M. 18. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido Tris-HCl estar emuma concentração de aproximadamente 10 a 100 mM.Method according to claim 11, characterized in that said Tris-HCl is in a concentration of approximately 10 to 100 mM. 19. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido Tris-HCl estar emum pH de aproximadamente 7,0 a 9,0.A method according to claim 11, wherein said Tris-HCl is at a pH of approximately 7.0 to 9.0. 20. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido EDTA estar em umaconcentração de aproximadamente 5 a 50 mM.Method according to claim 11, characterized in that said EDTA is at a concentration of approximately 5 to 50 mM. 21. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido IGEPAL estar em umaconcentração de aproximadamente 0,1 a 2,0 por cento.Method according to claim 11, characterized in that said IGEPAL is in a concentration of approximately 0.1 to 2.0 percent. 22. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido ácido acético estarem uma concentração de aproximadamente 1,0 a 10 porcento.Method according to claim 11, characterized in that said acetic acid is a concentration of approximately 1.0 to 10 percent. 23. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido metanol estar emuma concentração de aproximadamente 2 0 a 50 por cento.Method according to claim 11, characterized in that said methanol is in a concentration of approximately 20 to 50 percent. 24. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido colato de sódioestar em uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5por cento.A method according to claim 11 wherein said sodium cholate is in a concentration of approximately 0.02 to 2.5 percent. 25. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido deoxicolato estarem uma concentração de aproximadamente 0,02 a 2,5 porcento.Method according to claim 11, characterized in that said deoxycollate is a concentration of approximately 0.02 to 2.5 percent. 26. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido alvo ser um ácidonucléico do microorganismo Mycobacterium tuberculosis.Method according to claim 11, characterized in that said target is a nucleic acid of the microorganism Mycobacterium tuberculosis. 27. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o referido agente ligante serum oligonucleotídeo complementar ao ácido nucléico domicroorganismo Mycobacterium tuberculosis.Method according to claim 11, characterized in that said binding agent is an oligonucleotide complementary to the nucleic acid of the Mycobacterium tuberculosis organism. 28. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente umcorante de fundo.A method according to claim 11, further comprising a background dye. 29. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o agente ligante ser umoligonucleotídeo complementar a um ácido nucléico aomicroorganismo de Mycobacterium sp.Method according to claim 11, characterized in that the binding agent is a complementary oligonucleotide to a nucleic acid of Mycobacterium sp. 30. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o agente de ligação ser umoligonucleotídeo complementar a um ácido nucléico defungo.Method according to claim 11, characterized in that the binding agent is a complementary oligonucleotide to a defunct nucleic acid.
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