BRPI0613123B1

BRPI0613123B1 - enxerto sem células

Info

Publication number: BRPI0613123B1
Application number: BRPI0613123A
Authority: BR
Inventors: Kaps Christian; Tánczos Eszter; Sittinger Michael
Original assignee: Biotissue Ag; Transtissue Tech Gmbh
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2018-10-30
Also published as: CA2606622C; JP4871356B2; US9125871B2; HK1117028A1; BRPI0613123B8; AU2006265361B2; BRPI0613123A2; AU2006265361A1; WO2007003324A2; ES2419160T3; EP1933767A2; CA2606622A1; CN101184450A; RU2404820C2; DE102005030614B4; IL188305A; RU2008103337A; CN101184450B; IL188305A0; US20080206302A1

Abstract

enxerto sem células. a presente invenção refere-se a um enxerto sem células, que compreende (i) uma matriz coesiva, formadora de estruturas com porosidade aberta feita a partir de material biologicamente e farmaceuticamente aceitável e (ii) soro. em uma das modalidades particularmente preferidas, a matriz contém adicionalmente um gel. em virtude de um segundo aspecto, é proposto um método de produzir tal enxerto sem células, pelo que a matriz e o gel, se um é provido, são colocados em contato com o soro. o enxerto pode, opcionalmente, ser secado com o soro. alternativamente, a matriz e o gel, se um é provido, estão em estado seco antes de serem colocados em contato com o soro. em virtude de um terceiro aspecto, finalmente, a invenção propõe o uso do enxerto sem células para a regeneração de tecidos e em particular para a regeneração cartilagem e/ou osso.

Description

(54) Título: ENXERTO SEM CÉLULAS (51) IntCI.: A61L 27/36; A61F 2/08.

(30) Prioridade Unionista: 30/06/2005 DE 10 2005 030 614.4.

(73) Titular(es): BIOTISSUE AG.

(72) lnventor(es): MICHAEL SITTINGER; ESZTER TÁNCZOS; CHRISTIAN KAPS.

(86) Pedido PCT: PCT EP2006006281 de 29/06/2006 (87) Publicação PCT: WO 2007/003324 de 1V01/2007 (85) Data do Início da Fase Nacional: 02/01/2008 (57) Resumo: ENXERTO SEM CÉLULAS. A presente invenção refere-se a um enxerto sem células, que compreende (i) uma matriz coesiva, formadora de estruturas com porosidade aberta feita a partir de material biologicamente e farmaceuticamente aceitável e (ii) soro. Em uma das modalidades particularmente preferidas, a matriz contém adicionalmente um gel. Em virtude de um segundo aspecto, é proposto um método de produzir tal enxerto sem células, pelo que a matriz e o gel, se um é provido, são colocados em contato com o soro. O enxerto pode, opcionalmente, ser secado com o soro. Alternativamente, a matriz e o gel, se um é provido, estão em estado seco antes de serem colocados em contato com o soro. Em virtude de um terceiro aspecto, finalmente, a invenção propõe o uso do enxerto sem células para a regeneração de tecidos e em particular para a regeneração cartilagem e/ou osso.

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para

ENXERTO SEM CÉLULAS.

[001] A presente invenção refere-se ao enxerto sem células para regenerar tecido e, em particular, para regenerar cartilagem, um método de produzir o mesmo e o uso do enxerto para regenerar tecido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A cartilagem é uma forma de tecido mesodérmico derivado do tecido conjuntivo, que é criado por células precursoras multipotentes, indiferenciadas, mesenquimais. É feita uma distinção entre três tipos de cartilagem, hialina, elástica e fibrocartilagem. Cartilagem hialina é sem dúvida a forma mais comum de cartilagem e é encontrada nas superfícies das articulações, por exemplo. Defeitos de cartilagem causados por desgaste ou lesão constituem um problema médico muito difundido. Devido à densidade da cartilagem da inflamação convencional do corpo e sistema de restauração, ela tem apenas uma baixa capacidade de autocura. Por ser este o caso, métodos e técnicas têm sido desenvolvidos no passado, e em particular durante os últimos poucos anos, como um meio de substituição de áreas condrais como também osteocondrais na cartilagem da articulação. Por exemplo, a cartilagem das articulações têm sido substituídas por perios, pericôndrio, enxertos osteocondrais alogênicos e autólogos, meniscos alogênicos ou próteses feitas de materiais sintéticos.

[003] Em situações que envolvem enxerto autólogo de condrócitos, os condrócitos retirados do paciente são cultivados em cultura de célula e devolvidos para o paciente novamente. Eles podem ser devolvidos na forma de vários tipos diferentes de transplantes. Exemplos desses são soluções de injeção que são injetadas na articulação, matrizes injetadas com células cartilaginosas e similares.

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2/22 [004] A especificação de Patente WO 97/15655, por exemplo, descreve tecidos artificiais que compreendem matrizes extracelulares tridimensionais e células manipuladas geneticamente, e as matrizes são capazes de liberar imunossupressores ou fatores de diferenciação de células. Essas matrizes preferivelmente tomam a forma de uma lã de polímero, através das quais uma suspensão de célula, que pode ser suspensa em uma solução de fibrinogênio, é distribuída. Fatores ou componentes da matriz extracelular correspondente, necessários para o processo de crescimento e / ou diferenciação, podem também ser adicionados à matriz. A fim de manter as células na matriz, as suspensões de células podem ser solidificadas adicionando trombina, dessa maneira resultando no enxerto acabado.

[005] A especificação de Patente DE 44 31 598 descreve um método de produzir um implante de culturas de células, por meio do qual as estruturas de apoio, tridimensionais, às quais as células são aplicadas, são primeiro encapsuladas e depois perfundidas com uma solução nutriente. Microcorpos reabsorvíveis são incorporados nas estruturas de apoio, que liberam fatores influenciando a formação do tecido à medida que são reabsorvidos.

[006] A especificação de Patente DE 43 06 661 descreve uma estrutura de apoio tridimensional, feita preferivelmente de uma lã de polímero, na qual as células são incorporadas. A estrutura de apoio é depois perfundida com solução nutriente a fim de promover o crescimento das células e a formação de uma matriz extracelular pelas células. A fim de evitar a migração das células ou extenuação, a estrutura de apoio é encapsulada com agarose.

[007] A especificação de Patente DE 10139 783 também descreve o uso de células mesenquimais em fluido sinovial. Se desejado, essa composição pode também ser aplicada para um apoio, tal como uma lã ou um plástico, e usada como um enxerto nessa

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3/22 forma. De outra maneira, a suspensão de células em fluido sinovial é injetada como tal na articulação relevante.

[008] Alternativamente, as estruturas da matriz são sintetizadas de modo a realmente não conterem nenhuma célula. Por exemplo, a especificação de patente US 2003/0003153 descreve membranas de matriz enrijecidas contendo uma ou mais proteínas de formação de estrutura apropriadas para crescimento de células. Proteínas apropriadas são o colágeno, por exemplo. As matrizes resultantes em forma de membrana podem ser injetadas com células, ou enxertadas como elas são. No último caso, supõe-se que as células do próprio tecido do corpo vão migrar para dentro da estrutura da matriz. Isso é feito por meio de uma perfuração ou microfragmentação Pridie convencional, por exemplo. Com essas técnicas, são feitas pequenas perfurações ou fraturas no osso da articulação até a medula óssea. O sangue flui através das perfurações no defeito, como resultado do que o defeito é preenchido com um enxerto de sangue. O enxerto contém células precursoras mesenquimais, que, estimuladas por ímpetos apropriados, são capazes de formar um tecido de substituição tipo uma cartilagem, a chamada fibrocartilagem. Se um material de matriz é colocado sobre a perfuração Pridie, as células do sangue são capazes de migrar para dentro desse material da matriz, onde elas ficam instaladas.

[009] As especificações de Patente DE 199 57 388 e WO 2005/014027 usam esse efeito e o aumentam, incorporando fatores de crescimento e diferenciação (DE 199 57 388) ou quimiocinas (WO 2005/014027), na estrutura da matriz como meio de recrutar. Todos os fatores se destinam a resultar em aumento do recrutamento das células precursoras mesenquimais de formação de cartilagem, sendo que o principal objetivo é regenerar a cartilagem mais rapidamente. [0010] As especificações de Patente WO 02/00272, finalmente,

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4/22 descrevem a possibilidade de produzir enxertos apropriados a partir do sangue e um componente de polímero. O problema subjacente abordado por esse documento é o fato de que o enxerto de sangue, que forma como padrão usar a técnica de perfuração Pridie, contrai sobre a coagulação e dessa maneira muda a forma. O polímero adicionado previne essa mudança de forma e, dessa maneira, permite verdadeira cura assumir uma forma. A fim de produzir o enxerto, um polímero é mixado com sangue ou um componente de sangue tal como eritrócitos, leucócitos, monócitos, plaquetas, fibrinogênio, trombina e plasma rico em plaquetas, e introduzido no defeito. Se usar um componente de sangue, entretanto, a presença de material capaz de coagular é um fator significativo em termos de alcançar o efeito desejado.

[0011] Enxertos feitos a partir de quitosana e condrócitos podem ser usados como uma alternativa. Uma vez que as células são introduzidas no defeito como descrito acima, a adição de substâncias com propósitos de atração e / ou fatores de diferenciação e crescimento pode ser dispensada.

[0012] As tecnologias descritas acima têm desvantagens porque, se o próprio enxerto contém células, elas são muitas vezes danificadas devido à manipulação durante o manuseio, e se células são usadas para o enxerto, em particular células autólogas, elas têm que ser produzidas por processo de cultura longo, e devem ser cuidadosamente controladas para evitar contaminação, e finalmente, não existe possibilidade de armazenamento. Em paralelo, o recrutamento de enxertos sem células de células mesenquimais através de uma purfuração Pridie, com ou sem as substâncias usadas para fins de atração, provou não ser satisfatório. A colonização é lenta, é iniciada por poucas células e é também não específica. Isto significa que diferentes tipos de células são descarregados no enxerto a partir

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5/22 do sangue saindo da prefuração Pridie e alí permanecendo. Entretanto, é somente a colonização por células precursoras mesenquimais que faz a diferenciação para condrócitos que é desejada. No caso de enxertos convencionais, entretanto, isto não é garantido.

[0013] Entre outras coisas, portanto, o objetivo da invenção é propor um enxerto que é simples de produzir, pode ser prontamente armazenado e é simples de aplicar. Além do mais, será desejável aumentar as taxas de recrutamento por meio do enxerto, obter melhor seletividade para o tipo de células recrutadas e dispostas no enxerto, e dispensar tanto quanto possível o uso de fatores de crescimento estranhos ao corpo e opcionalmente até fatores de crescimento recombinantes, que representam alérgenos em potencial.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0014] A invenção supera esses e outros problemas conhecidos da técnica anterior. Com essa finalidade, um enxerto sem circular é proposto, compreendendo (i) uma matriz formadora de estrutura coesiva com uma porosidade aberta feita de um material biologicamente e farmaceuticamente aceitável (ii) e soro. Em uma modalidade particularmente preferida, a matriz adicionalmente contém um gel.

[0015] Em virtude de um segundo aspecto, é proposto um método de produzir tal enxerto sem células, pelo que a matriz e o gel, se um é provido, são colocados em contato com o soro. Opcionalmente, o enxerto pode ser secado com o soro. Alternativamente, a matriz e o gel, se um é provido, pode estar no estado seco antes de ser colocado em contato com o soro.

[0016] Com base em um terceiro aspecto, a invenção finalmente refere-se ao uso do enxerto sem células para regenerar tecido e em particular para regenerar cartilagem e / ou osso.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0017] A figura 1 mostra o efeito quimiotático de CDMP1, CDMP2, SDFI-α e IL8 sobre as células tronco mesenquimais de seres humanos in vitro;

A figura 2 mostra o efeito quimiotático de soro humano do sangue sobre células tronco mesenquimais de seres humanos in vitro. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0018] Como explicado acima, a invenção refere-se a um enxerto sem células que compreende (i) uma matriz coesiva, de formação de estrutura com porosidade aberta feita de um material biologicamente e farmaceuticamente aceitável e (ii) soro. De maneira surpreendente, usar o soro no enxerto sem células, proposto pela invenção, permite a eficiência do recrutamento de células precursoras mesenquimais da medula óssea, através das quais o sangue flui, para ser aumentadas por diversos fatores. Esse aumento surpreendente na eficiência do recrutamento por sua vez torna óbvia a necessidade de introduzir células diferenciadas ou células precursoras no enxerto separadamente, o que facilita e diminui o manuseio do enxerto e também permite o armazenamento.

[0019] O soro do sangue pode ser facilmente obtido de uma maneira convencional. Por preferência, ele pode ser tirado diretamente do paciente durante o transplante. O material autólogo pode, portanto, ser implantado no paciente, mas não há necessidade de adicionar outro, potencialmente alergênico e / ou fatores imunoativos.

[0020] A matriz do enxerto sem células, proposto pela invenção, é uma matriz formadora de estrutura, coesiva, de porosidade aberta. A expressão coesiva neste contexto deverá ser interpretada como significando a matriz que permite o enxerto ser manuseado sem se desfazer em partes individuais ou bits. Não é necessário que todas as partes da matriz sejam ligadas umas às outras por ligações ou

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7/22 interações químicas. Uma articulação mecânica na forma de tecelagem, pisoagem, torção ou os similares é suficiente.

[0021] A expressão formação de estrutura neste contexto deverá ser interpretada como significando a propriedade da matriz funcionar como uma formadora de estrutura para as células migrarem para a matriz do tecido a fim de serem produzidas. A matriz também atua como uma armação ou rede que as células são capazes de colonizar e onde elas encontram ponto de apoio, de modo a não serem arrastadas para fora da matriz por fluido ou sangue sinovial, por exemplo.

[0022] Finalmente, porosidade aberta no contexto da invenção deverá ser interpretada como significando que os espaços entre as estruturas do arcabouço da matriz são accessíveis para uma substância e, em particular, para uma troca de fluído com a área em torno da matriz. O tamanho de poro dos poros é preferivelmente dimensionado de modo que a penetração ou circulação é também possível pelas células. Entretanto, a expressão porosidade aberta, como usada no contexto da invenção, destina-se também a significar uma estrutura tal como a predominante em géis. É aqui que as estruturas do arcabouço da matriz são providas pelo esqueleto da estrutura anterior. Dispostos entre elas estão bolsas e fluido de hidrato, em que as células podem penetrar e que permitem uma troca de fluido. Estruturas de gel apropriadas devem portanto também ser interpretadas como matrizes com porosidade aberta dentro do contexto da invenção.

[0023] As estruturas de arcabouço com porosidade aberta são preferivelmente selecionadas a partir de tecidos trançado ou não trançado (em particular estruturas de lã e feltro), membranas, esponjas, bucha, espumas de células abertas, lã, tranças, feixes de fibras ordenados ou aleatórios, materiais de cerâmica porosos, esponjosas e géis, como também combinações desses. A matriz

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8/22 preferivelmente tem uma estrutura de lã ou feltro. Combinações de estruturas diferentes, por exemplo em uma disposição em camadas, são também possíveis e estão incluídas no escopo da invenção.

[0024] Em princípio, o material da matriz pode ser qualquer material apropriado, biológicamente e farmaceuticamente aceitável. O material de origem usado na matriz proposta pela invenção pode ser reabsorvível ou não reabsorvível. Materiais reabsorvíveis são preferidos. A matriz é preferivelmente um material selecionado do grupo que compreende polímeros naturais e sintéticos, tais como colágeno, ácido hialurônico, quitosana, quitina, polissacarídeos, celuloses e seus derivados, proteínas, polipeptídeos, ácido poliglicólico, ácido polilático, poli (glicol ideo, lactato), caprolactam, materiais de cerâmica tais como óxidos, carbonetos, nitretos e carbonitretos de metais, em particular óxido de silicone, óxido de titânio e óxido de cálcio; minerais tais como halogenetos, em particular fluoretos, hidróxidos, sulfatos de metais, preferivelmente metais fisiologicamente inofensivos tais como fosfato de cálcio, apatita, hidroxila apatita; metais como titânio, alumínio, ouro, prata, aço inoxidável e misturas dos mesmos. Mais especificamente preferidos são ácido poliglicólico (PGA), ácido polilático, colágeno ou ácido hialurônico.

[0025] Com relação aos ácidos poliglicólicos, é preferível usar ácidos poliglicólicos puros com pesos moleculares de > 20.000, preferivelmente 3,000 a 70,000 g/mol, mais especialmente preferivelmente cerca de 50,000 g/mol. O material da matriz pode ser uma lã de ácido poliglicólico, tal como aquela vendida pela Alpha Research Switzerland GmbH sob a marca registrada PGA-Soft Felt7. No caso deste produto, o tempo de reabsorção in vivo é cerca de 40 a 60 dias. Depois de sete dias in vitro, a resistência mecânica é ainda cerca de 50% do valor inicial como resultado da hidrólise.

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9/22 [0026] Em uma modalidade particularmente preferida, o enxerto de célula livre contém um gel em adição à matriz. O gel é aplicado em pelo menos um lado da matriz e / ou pelo menos parcialmente penetra nela. Por preferência, o gel penetra nela totalmente. Se a matiz contém tal gel, a própria matriz preferivelmente tem uma estrutura diferente daquela de um gel. Mais especialmente preferivelmente são usadas estruturas mais rígidas, como explicitamente especificado acima, com a exceção dos géis. Dessa maneira, o gel é preferivelmente de uma rigidez menor do que a da matriz. Mais preferivelmente, estruturas de lã e feltro são usadas, nas quais um gel é introduzido.

[0027] O gel pode ser um hidro-gel natural ou sintético. É preferivelmente de uma rigidez menor do que a da matriz. Por exemplo, o gel pode ser selecionado de polissacarídeos, polipeptídeos, ácido hialurônico, fibrina, colágeno, alginato, agarose e quitosana, como também sais, derivados e misturas dos mesmos. Sais apropriados são os sais de álcale e alcalinos-terrosos dos ditos géis, por exemplo. Os mais preferidos são: ácido hialurônico ou um sal de ácido hialurônico tal como Na hialuronato.

[0028] Em termos de qualidade do ácido hialurônico, as qualidades produzidas por fermentação podem ser usadas. Alternativamente, é também possível usar o ácido hialurônico obtido de animais. A média de peso molecular das qualidades usadas é geralmente entre 250 e 6.000 kDa, preferivelmente 1.000 a 2.000 kDa, mais preferivelmente aproximadamente 1.200 kDa. Produtos de ácido hialurônico apropriados estão comercial mente disponíveis. Uma qualidade de ácido hialurônico apropriada é TRB Chemedika AG vendida sob a marca registrada Ostenil®, por exemplo. Esse material é certificado pela EC e portanto apropriado para fins farmacêuticos.

[0029] Os géis podem ser obtidos de fontes, precipitações ou polimerização de um formador de gel apropriado em uma solução

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10/22 fisiologicamente apropriada. Exemplos de tais soluções apropriadas são a água, tal como soluções aquosas de sais (por exemplo halogeneto de álcale e alcalino-terroso (Cl, Br, I), carbonatos, fosfatos, citratos, acetatos e os similares), ácidos orgânicos, substâncias de tampão e misturas das mesmas. Alternativamente, soluções mais complexas podem ser usadas, tais como meios de cultura ou fluidos do corpo, ou soluções derivadas deles tais como fluido sinovial ou soro. A quantidade de formador de gel usada é selecionada de modo que uma viscosidade adequada do gel seja obtida. No caso do ácido hialurônico, essa está usualmente dentro da faixa de 0,5-50 mg/ml, preferivelmente 0,5-20 mg/ml, mais preferivelmente 10 mg/ml.

[0030] O enxerto mais preferido é aquele com uma matriz feita de lã ou feltro PGA, em que o gel de ácido hialurônico é incorporado. [0031] As dimensões do enxerto sem células proposto pela invenção, geralmente depende das dimensões da faixa a ser tratada e do requisito de tamanho do enxerto. As dimensões podem ser adaptadas como requerido pelo médico que está administrando o tratamento. Para lesões no tecido de cartilagem, especialmente na articulação do joelho, essas dimensões são usualmente na faixa de 10 a 50 mm de comprimento, 10 a 50 mm de largura e 0,5 a 3 mm de espessura, preferivelmente 10 a 30 mm de comprimento, 10 a 30 mm de largura e 1 a 2 mm de espessura. Mais preferivelmente seriam tamanhos de 20 x 20 mm de largura e comprimento 1,1 a 2 mm de espessura. As dimensões podem ser adaptadas para formatos nãoquadrados, por exemplo, retangular, redondo, oval, poliédrico etc. [0032] A vantagem da combinação de matriz e gel no enxerto sem células proposto pela invenção é que o gel forma uma barreira mecânica com respeito às células de maneira diferente dos precursores mesenquimais, ou células do sangue que penetram a perfuração Pridie ou fraturas similares. Isso permite uma migração

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11/22 seletiva das células precursoras mesenquimais no enxerto. Somente esses se estabelecem na matriz, portanto, e se diferenciam das células do tecido desejado. O crescimento de outras células sobre as células formadoras de tecido desejadas é portanto evitado ou significativamente reduzido.

[0033] Ao mesmo tempo, o gel promove a retenção das células desejadas sob estresse mecânico antes das formas da biomatriz natural da cartilagem ao redor da última. Isso permite que o estresse seja aliviado mais cedo, desde que o paciente tenha recebido o enxerto.

[0034] O segundo elemento necessário para o enxerto sem células proposto pela invenção é o soro, usualmente soro de ser humano. Este pode ser autólogo, alogênico ou heterológico. Por soro, para a finalidade da invenção, entende-se uma parte do sangue que permanece líquida uma vez que o sangue tenha coagulado. O soro não contém nenhuma célula de sangue e, ao contrário do plasma sangüíneo, nenhum fibrinogênio. Os outros elementos do plasma sangüíneo são também encontrados no soro. Esses são: gordura, ácidos graxos, glicerina, açúcar, sais, metais e proteínas do plasma. As proteínas do plasma incluem, por exemplo, proteínas de transporte, enzimas, proenzimas, inibidores de enzimas, o sistema de complemento, imunoproteínas, mediadores de inflamação e os similares.

[0035] O soro a ser usado para a finalidade da invenção pode ser modificado adicionando pelo menos um elemento e/ou removendo pelo menos um componente do soro. Em uma modalidade preferida, o soro não é modificado. Mais especialmente preferido é um soro autólogo. Este pode ser obtido tirando o sangue do paciente e obtendo o soro usando os métodos convencionais. Obtido dessa maneira, o soro pode ser colocado em contato com a matriz e com o gel, se um

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12/22 for provido, e assim incorporado no enxerto, opcionalmente pelo médico que está administrando o tratamento, diretamente no sítio do enxerto.

[0036] Alternativamente, um soro modificado é usado. Se a modificação envolve adicionar pelo menos um constituinte, pode ser preferível selecionar o último a partir do grupo que compreende os fatores do crescimento, fatores de diferenciação (sobre este assunto veja a especificação de patente DE 199 57 388, que é incorporada aqui a seguir por referência), hormônios, citocinas, moléculas de adesão celular, quimiocinas inevitáveis de fatores quimiotáticos, tais como descrito na especificação de patente WO 2005/014027, que é incorporada aqui a seguir a título de referência, enzimas, inibidores de enzimas, coenzimas, minerais, gorduras, lipídeos, sacarídeos, substâncias farmacêuticas tais como antibióticos, analgésicos, inibidores de inflamação e imunossupressores, substâncias de tampão, estabilizadores, em particular estabilizadores criogênicos, e vitaminas, preferivelmente hormônios, quimiocinas, fatores de crescimento e fatores de diferenciação. Os hormônios, as quimiocinas, os fatores de crescimento e diferenciação são preferivelmente selecionados a partir de insulina, PDGF, IGF, GMCSF, GDF5, GDF6, FGF, BMP2, BMP4, BMP7, IL8, SDFI-α e EGF. Mais preferido é insulina. A matriz e / ou o gel podem também ser modificados pela incorporação dos elementos listados acima ou misturas dos mesmos. [0037] Alternativamente, elementos específicos tais como enzimas, imunoproteínas, proenzimas, açúcares etc., por exemplo, podem ser seletivamente removidos por meio de cromatografia de afinidade, por exemplo. O soro pode também ser diluído. Para este fim, o soro é misturado com a quantidade desejada de líquido fisiologicamente aceitável, tal como tampão de citrato, PBS ou os similares.

[0038] O enxerto sem células descrito acima pode ser produzido

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13/22 por um método em que a matriz e, se um for provido, o gel, é posto em contato com o soro. Esse contato pode ser feito por aplicação em gotas, amolecimento, impregnação ou saturação. Por preferência, se o gel é provido, ele é incorporado na matriz primeiro que tudo e / ou aplicado nela, depois do que o processo de fazer contato com o soro ocorre. Se o enxerto de célula livre contém outros elementos tais como listado acima, esses podem ser incorporados em uma ou mais da matriz, gel e soro.

[0039] O método proposto pela invenção pode incluir uma etapa de secagem. A vantagem de se usar uma etapa de secagem é que o enxerto pode ser armazenado por mais tempo em forma seca. Se a matriz e o gel, caso um seja fornecido, são secados antes de ser postos em contato com o soro, esta estrutura pode ser reconstituída embebendo-se ou amaciando-se quando colocada em contato com o soro, transformando-se desse modo em um estado pronto para uso. Alternativamente, se a estrutura incluindo a matriz, o gel, se um for fornecido, e o soro for secada, pode ser reconstituída embebendo-se ou amaciando-se no soro ou alguma outra solução adequada farmaceuticamente e fisiologicamente aceitável, como descrito acima em relação à formação do gel, por exemplo solução salina fisiologicamente aceitável, e assim transformada em um estado pronto para uso. Se o enxerto proposto pela invenção contém outros elementos, estes também podem ser incorporados na solução usada para reconstituir o enxerto sem células ao estado pronto para uso. Isto pode ser desejável em particular se os outros elementos são proteínas ou co-fatores não-estáveis.

[0040] No caso das modalidades preferidas feitas a partir de lã de ácido poliglicólico com gel de ácido hialurônico descrito acima, lã com tamanho de 20 mm x 20 mm x 1,1 mm são usadas com cerca de 400 μΙ de solução de ácido hialurônico (10 mg/ml) incorporada ao material

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14/22 em uma solução fisiologicamente adequada ou já incorporada no soro. No caso de lãs de 20 nim. x 20 mm x 2 mm, cerca de 730 pi de ácido hialurônico solução são usadas. Se enxertos destas dimensões são desidratados por liofilização, por exemplo, eles podem ser reconstituídos embebendo-os em 1 a 2 ml de solução. No caso de matrizes secadas sem soro, elas são preferivelmente reconstituídas com soro ou soro diluído, enquanto que matrizes secadas contendo soro são preferivelmente reconstituídas em solução salina fisiológica. [0041] Concentrações adequadas de soro são de 1 a 100% em volume do volume de gel e fluido contidos na matriz. Preferivelmente, no caso de matrizes sem gel, concentrações de soro de 10 a 100%, preferivelmente 50 a 100% e mais preferivelmente 100% do volume fluido são usadas, incorporadas dentre outras coisas por forças capilares. A fim de reduzir a concentração do soro abaixo de 100%, pode ser usado soro diluído com uma solução salina fisiologicamente aceitável.

[0042] No caso de matrizes com gel, conteúdos do soro de 0,01 a 50% em volume, ou mais forte, preferivelmente 0,5 a 20% em volume, e mais preferivelmente 1 a 10% em volume de soro podem ser usados com referência ao volume total de gel, soro e opcionalmente líquido farmaceuticamente aceitável.

[0043] O enxerto sem células proposto pela invenção pode ser usado para regenerar tecidos e, em particular, para regenerar cartilagens e/ou ossos. É usado preferivelmente para regenerar tecidos mesenquimais. Mais preferivelmente, é usado para regenerar cartilagens e/ou ossos, em particular usando o método de perfuração de Pridie ou microfratura. O enxerto atua como uma capa inteligente que é introduzida nas cartilagens exatamente sob medida após a perfuração Pridie ou microfratura a fim de restaurar a superfície da articulação. O material da matriz, preferivelmente material de feltro,

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15/22 confere estabilidade mecânica e atua como uma estrutura condutora, a qual promove uma distribuição homogênea e tridimensional das células dos pacientes migrando a partir da medula óssea e dos ossos esponjosos. O gel, tal como o ácido hialurônico, atua como uma barreira de modo a evitar a migração interna de células de glóbulos vermelhos e leucócitos. O soro, preferivelmente soro autólogo, promove a migração das células, especialmente células precursoras mesenquimais, no enxerto e conseqüentemente no defeito. A maturação ou diferenciação das células precursoras mesenquimais que migraram para o enxerto para formar condrócitos e daí construir um tecido regenerativo cartilaginoso, é induzida pelo ácido hialurônico, soro e o fluido sinovial presentes na articulação. De maneira supreendente, descobriu-se que o uso do soro aumenta o número de recuperação significativamente.

[0044] Os exemplos fornecidos abaixo pretendem meramente ilustrar a invenção e não devem ser interpretados como sendo restritivos de forma alguma.

EXEMPLO 1 [0045] Recrutamento de células tronco mesenquimais de seres humanos através de fatores de crescimento e diferenciação, quimiocinas e soro humano in vitro.

[0046] A Isolamento e cultivo de células tronco mesenquimais de seres humanos através de meios de cultura e fatores de diferenciação, quimiocinas e soro humano in vitro.

[0047] O modo pelo qual as células tronco mesenquimais de seres humanos (MSC) são isoladas da medula óssea já foi descrito [DE 103 33 9011. Um máximo de 3 ml de pontilhado de medula óssea são misturados com 10 ml de PBS e centrifugados por 10 min e a 310 g a temperatura ambiente. A plaqueta das células é ressuspensa e lavada de novo com PBS. As células são colocadas em 20 ml de meio DME

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16/22 (com 10-20% FBS, 2% HEPES, 4 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina). Cada 5 ml dessa suspensão de células é introduzido em 20 ml de um gradiente de densidade Percoll com uma densidade de 1,073 g/ml. As células são centrifugadas a 900 g por 32 min. A fase superior é transferida para um novo tubo centrífugo. Essa é centrifugada a 310 g por 6 minutos depois de se adicionar 2,5 vezes o volume de PBS. A plaqueta de células é colocada em um meio DME. 1,5* 10^ -3.5* 10^ células/cm 2 são transferidas para uma cultura em um frasco de cultura de células e incubadas a 37Ό, 5% CO 2. O meio é trocado pela primeira vez depois de 72 horas, e depois a cada 3-4 dias. Isoladas desta forma, as células crescem confluentemente depois de 2-3 semanas e são depois transferidas para um novo vaso de cultura através de tripsinização em uma densidade celular de 6.000 células/cm2 de superfície de cultura (passagem 1). Após cerca de uma semana, as células são tripsinizadas de novo (passagem 2). A homogeneidade dessa cultura de células tronco mesenquimais humanas é verificada através de análise de FACS, na qual a conexão de endoglina de antígenos de superfície e ALCAM deve ser indentificada e os antígenos de superfície CD34, CD 45 e CD 14 não são identificados.

[0048] B Testando a atividade quimioestática dos fatores de crescimento e diferenciação (CDMP 1, CDMP2) e quimiocinas (SDF 1-a, IL8) em células tronco mesenquimais humanas in vitro [0049] O efeito quimioestático dos fatores de crescimento e diferenciação, tal como proteína- 1 morfogenética derivada de cartilagens (CDNP I ou fator-5 de crescimento e diferenciação, GDF5) e proteína-2 morfogenética derivada de cartilagens (SDNP2 ou fator-6 de crescimento e diferenciação, GDF6) em células tronco mesenquimais e precursoras já foi descrito [DE 199 57 388]. O efeito quimioestático ou uso de quimiocinas, tal como fator-1a derivado do

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17/22 estroma (SDF1-a) ou interleucina-8 (IL8) para recrutar células tronco mesenquimais e precursoras também foi descrito [DE 103 33 901 ]. [0050] A atividade quimioestática é testada nas assim chamadas placas de quimiotaxia de 96 cavidades (ChemoTx system, Neuroprobe, USA). O princípio do teste está baseado na transferência da solução a ser testada, na solução, em uma quantidade e concentração definidas para uma cavidade. A cavidade é depois coberta por meio de uma membrana com poros (o tamanho dos poros nesse caso é de 8 pm), de modo que a face inferior da membrana é molhada pela solução contendo a solução quimioestática.

[0051] Uma quantidade definida da suspensão celular que não contém a substância a ser testada é colocada na face superior da membrana remota da cavidade. Depois de poucas horas, uma concentração gradiente da substância a ser testada se desenvolve, começando a partir da cavidade mais baixa até a membrana. Se a substância a ser testada é quimioestaticamente ativa, as células da suspensão celular migram através dos poros da membrana até a face mais baixa da membrana e até a cavidade inferior. As células migradas são tingidas e seu número é determinado com a ajuda de um microscópio.

[0052] Para fins de controle, as cavidades inferiores são providas com o solvente da substância a ser testada, coberta com a membrana e revestida com a suspensão de células. Contando-se microscópicamente as células na face mais baixa da membrana (superfície: 25 mm²) e na cavidade inferior, as células que migraram espontaneamente, devido à substância quimioestática sem estímulo, são determinadas. A fim de determinar a contagem de células recrutadas pela substância quimioestática, o número de células migradas espontaneamente é subtraído.

[0053] Antes de iniciar o teste dos fatores de crescimento e

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18/22 diferenciação e quimiocinas mencionados acima, células tronco mesenquimais humanas de medula óssea foram deslocadas por 24 horas com meio dietético (meio DME + 1% de penicilina / estreptomicina + 0,5% de albumina de soro bovino (BSA). Os fatores de crescimento e diferenciação e as quimiocinas foram colocados em um meio dietético em quantidades diferentes para se obter soluções definidas respectivamente de 250 nM, 500 nM, 750 nM e 1000 nM dos fatores. 36 pl das respectivas soluções foram colocados em triplicata em cavidades inferiores das placas de quimiotaxia de 96 cavidades, e cobertas com a membrana de modo que a membrana da face mais baixa foi molhada pelas soluções. O meio dietético foi usado como o controle.

[0054] 40 μΙ de meio dietético com 30.000 células tronco mesenquimais humanas foram colocadas na face superior da membrana. Depoisde 20 horas de cultivo no gabinete de procriação a 37Ό, 5% de CO 2, a membrana foi removida e colocada em etanol/acetona gelado (1:1 v/v) por 3 minutos, a fim de fixar as células. A membrana da face superior foi completamente limpa por meio de um chumaço de algodão para remover as células aderentes. As células na face mais baixa da membrana foram tingidas com solução de Hemacolor (Merck, Darmstadt). Nenhuma célula pôde ser detectada no reservatório inferior.

[0055] As células dispostas na face mais baixa da membrana foram contadas contando-as sob o microscópio. O número de células tronco recrutadas por CDMP1, CDMP2, SDF1-a e IL8, em diferentes concentrações, foi determinado depois de se subtrair as células migradas no conjunto de controle (sem o fator quimioestático). Os valores médios da contagem de células com desvios padrões são exibidos na Fig. 1 para os respectivos fatores. A CDMP1 foi capaz de induzir um máximo de 156 MSC (750 nM CDMP1) por 25 mm² para

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19/22 migrar. CDMP2 recrutou um máximo de 38 MSC (500 nM CDMP2) por 25 mm2, SDF1- α um máximo de 79 MSC (750 nM SDF1- a) por 25 mm² e IL8 um máximo de 814 MSC (500 nM IL8) por 25 mm² .

[0056] CTestando a atividade quimioestática do soro humano do sangue em células tronco mesenquimais de seres humanos in vitro [0057] Supreendentemente, o teste do soro humano através do método de teste descrito em B mostrou que o soro humano tem um efeito quimioestático significativamente mais forte em células precursoras e células tronco mesenquimais de seres humanos in vitro do que fatores de crescimento e diferenciação e quimiocinas. A contagem de células precursoras e células tronco mesenquimais de seres humanos recrutadas em média pelo soro humano, em diferentes formulações (em meio dietético ou em ácido hialurônico), junto com desvios padrão correspondentes, são exibidos na Fig. 2. Dependendo da formulação, um mínimo de 2.135 (PGA - HA lyo. + HS) e um máximo de 10.332 (5% de HS-HA - meio) de células precursoras e células tronco mesenquimais de seres humanos foram recrutadas pelo soro humano. Testes em ácido hialurônico sem soro humano no meio dietético como um fator quimioestático exibiram em média 24 (HA meio) e em média 48 (PGA - Ha lyo. + NaCI) de células precursoras e células tronco mesenquimais de seres humanos as quais foram recrutadas.

[0058] As diferentes formulações de soro humano a seguir foram usadas no método de teste descrito para recrutar células precursoras e tronco mesenquimais de seres humanos. O soro humano foi obtido a partir de amostras de sangue completas (n=5) sem anticoagulantes, baseado em coagulação natural, misturado em partes iguais e usado para produzir as diferentes formulações de soro. A fim de produzir os conjuntos de teste 5% de meio HS e 10% de meio HS, o meio dietético foi deslocado com soro humano, resultando em 5 % e 10% de

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20/22 soluções. O conjunto de teste meio HA compreende o meio dietético e o ácido hialurônico obtidos por fermentação (Ostenil®, TRB Chemedica AG) com um peso molecular médio de 1,200 kDa em partes iguais. Os conjuntos de teste 1% de meio HS-HA, 5% de meio HS-HA e 20% de meio HS-HA contêm meio HA ao qual o soro humano foi adicionado, resultando em soluções de 1%, 5% e 10% de força.

[0059] A fim de obter o conjunto de teste PGA - 10% Hs-HA, lyo., 270 pl de ácido hialurônico obtido por fermentação (Osternil®, TRB Chemedica AG) foram misturados com 30 pl de soro humano e aplicados a uma lã (PGA-Soft Feltro®, Alpha Research Switzerland GmbH) incluindo ácido poliglicólico (PGA) com dimensões de 20 mm x 15 mm x 1,1 mm. A lã embebida com a mistura de soro - ácido hialurônico foi congelada por 1 hora a -20Ό e depois congelada secada por 16 horas no liofilizador. Para reconstituí-la, a lã congelada secada foi colocada em 1 ml de solução salina fisiológica por 10 minutos, de modo a obter-se aproximadamente 80-100 μΙ de solução de soro - ácido hialurônico através da centrifugação por 10 minutos a 2.000 rpm. Diluindo a solução com o meio dietético em partes iguais, foi produzida a formulação PGA - 10% de HS-HA, lyo. e usada diretamente para testar a atividade quimioestática.

[0060] A fim de formar o conjunto de teste PGA-Ha, lyo. + HS, 300 μΙ de ácido hialurônico obtido por fermentação (Ostenil®, TRB Chemedica AG) foram aplicados em uma lã (PGA-Soft FeltroO, Alpha Research Switzerland Gmb11) compreendendo ácido poliglicólico (PGA) com dimensões de 20 mm x 15 mm x 1,1 mm. A lã embebida com o ácido hialurônico foi congelada por 1 hora a -20Ό e depois congelada -secada por 16 horas no liofilizador. Para reconstituir, a lã congelada - secada foi colocada em 1 ml de soro humano por 10 minutos, de modo a obter-se aproximadamente 80-100 μΙ solução de

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21/22 soro de ácido hialurônico por meio de centrifugação por 10 minutos a 2.000 rpm. Diluindo a solução com meio dietético em partes iguais, a formulação PGA - HA, lyo.+ HS foi produzida e usada diretamente para testar a atividade quimioestática.

[0061] A fim de formar o conjunto de teste PGA-Ha, lyo. + NaCP, 300 pl de ácido hialurônico obtido por fermentação (Ostenil®, TRI3 Chemedica AG) foram aplicados a uma lã (PGA-Soft Felt®, Alpha Research Switzerland GmbH) compreendendo ácido poliglicólico (PGA) com dimensões de 20 mm x 15 mm x 1,1 mm. A lã embebida com o ácido hialurônico foi congelada por 1 hora a -20Ό e depois congelada - secada por 16 horas no liofilizador. Para reconstituir, a lã congelada - secada foi colocada em 1 ml de solução salina fisiológica por 10 minutos, a fim de obter aproximadamente 80-100 μΙ de solução de ácido hialurônico por meio de centrifugação durante 10 minutos a 2.000 rpm. Diluindo-se a solução com meio dietético em partes iguais, a formulação PGA -HA, lyo.+ NaCI foi produzida e usada diretamente para testar a atividade quimioestática.

EXEMPLO DA MODALIDADE 2 [0062] A lã de ácido poliglicólico comercial mente disponível sob a marca registrada PDA-Soft Felt® vendida por Alpha Research Switzerland GmbH foi cortada até as dimensões de 20 mm x 15 mm x 1,1 mm. O material foi impregnado com uma mistura de ácido hialurônico contendo 10% de soro como descrito no exemplo 1 e depois secado. A secagem ocorreu inicialmente a -20Ό e depois, durante por 16 horas, no liofilizador. A lã foi reconstituída embebendo com 1 a 2 ml de solução salina fisiológica por 10 min.

[0063] Em um conjunto de teste alternativo, a lã foi impregnada com ácido hialurônico puro, 10 mg/ml dissolvidos em solução salina fisiológica. Preparado desta forma, o material foi secado como descrito acima. Ele foi reconstituído embebendo em 1 a 2 ml de soro por 10

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22/22 min. Ambas as lãs podem ser usadas diretamente para enxertos.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Enxerto sem células, caracterizado por compreender (i) uma matriz coesiva, formadora de estruturas com porosidade aberta de um material biológicamente e farmacêuticamente aceitável e (ii) soro sanguíneo.
2. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material da matriz é reabsorvível ou não reabsorvível.
3. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a matriz tem uma estrutura selecionada de tecidos ou não-tecidos (particularmente estruturas de lã e feltro), membranas, esponjas, chumaços, espuma de células abertas, lã, tranças, feixes de fibras ordenados ou aleatórios, materiais de cerâmica porosos, esponjosos e gel, como também combinações dos mesmos.
4. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a matriz é um material selecionado a partir do grupo que consiste em polímeros naturais e sintéticos, tais como colágeno, ácido hialurônico, quitosana, quitina, polissacarídeos, celuloses e seus derivados, proteínas, polipeptídeos, ácido poliglicóico, ácido polilático, poli (glicol ideo, lactato), caprolactam, materiais de cerâmica tais como óxidos, carbonetos, nitretos e carbonitretos de metais, em particularóxido de silicone, óxido de titânio e óxido de cálcio; minerais tais como halogenideos, em particular fluoretos, hidróxidos, fosfatos, sulfatos de metais, fosfato de cálcio, apatita, apatita de hidroxila; metais tais como titânio, alumínio, ouro, prata, aço inoxidável e suas misturas.
5. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que adicionalmente contém um gel, o qual é aplicado a pelo menos um

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2/3 lado da matriz e/ou penetra nela ao menos parcialmente.
6. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gel é um hidrogel natural ou sintético.
7. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o gel é de uma firmeza menor que a matriz.
8. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o gel é selecionado a partir de polissacarídeos, polipeptídeos, ácido hialurônico, fibrina, colágeno, alginato, agarose e quitosana, como também misturas dos mesmos, e preferivelmente é ácido hialurônico.
9. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o soro sanguíneo é autólogo, alogênico ou heterólogo e é opcionalmente modificado adicionando pelo menos um elemento e/ou removendo pelo menos um componente do soro sanguíneo.
10. Enxerto sem células de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que adicionalmente contém um ou mais elementos selecionados do grupo compreendendo fatores de crescimento, fatores de diferenciação, hormônios, quimiocinas, citosinas, moléculas de adesão celular, fatores quimioestáticos, enzimas, inibidores enzimáticos, coenzimas, minerais, gorduras, lipídios, sacarídeos, substâncias farmacêuticas tais como antibióticos, analgésicos, antiinflamatórios e imunossupressores, substâncias de tampão, estabilizadores, em particular estabilizadores criogênicos, e vitaminas, preferivelmente hormônios, fatores de crescimento e fatores de diferenciação.
11. Enxerto sem células de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os hormônios, fatores de crescimento e diferenciação são insulina, PDGF, IGF, GMCSF, GDF5, GDF6, FGF,

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ΒΜΡ2, ΒΜΡ4, ΒΜΡ7, IL8, SDF1-a e EGF e combinações dos mesmos.
12. Método de produção de um enxerto sem células como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a matriz e o gel, se fornecidos, são colocados em contato com o soro sanguíneo.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a colocação em contato é efetuada pela aplicação de gotas, amaciamento, impregnação ou embebendo-se.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o gel é inicialmente incorporado na matriz e/ou aplicado a ela, e depois colocado em contato com o soro sanguíneo.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a combinação de gel, se provido, e a matriz, assim como outros constituintes, é secada antes ou depois da colocação em contato.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o enxerto é reconstituído a partir do estado secado.
17. Uso de um enxerto sem células como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser para regeneração de tecido.
18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por ser para a regeneração do tecido mesenquimal, em particular cartilagem e/ou osso.

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