BRPI0611879A2

BRPI0611879A2 - usos de um ácido nucleico, e de um primeiro ácido nucleico isolado que hibridiza sob condições estringentes para um segundo ácido nucleico, métodos para aumentar a toleráncia de uma planta transgênica contendo o ácido nucleico que codifica o polipeptìdeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteìna quinase, célula de planta transgênica, planta transgênica, semente, polipeptìdeo, e, seqüência de ácido nucleico

Info

Publication number: BRPI0611879A2
Application number: BRPI0611879-8A
Authority: BR
Inventors: Damian Allen; Lori V Mills; Pilar Puente; Thielen Nocha Van; Oswaldo Da Costa E Silva
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2012-08-28
Also published as: AU2006259019A1; CN101203603A; AR053638A1; US20090158454A1; MX2007015716A; AU2006259019B2; WO2006134162A2; WO2006134162A3; US7880055B2; CA2612016A1; EP1896575A2; CN101203603B; EP1896575B1

Abstract

USUS DE UM áCIDO NUCLEICO, E DE UM PRIMEIRO áCIDO NUCLEICO ISOLADO QUE HIBRIDIZA SOB CONDIçõES ESTRINGENTES PARA UM SEGUNDO áCIDO NUCLEICO, MéTODOS PARA AUMENTAR A TOLERáNCIA DE UMA PLANTA TRANSGêNICA A UM ESTRESSE AMBIENTAL, E PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGêNICA CONTENDO O áCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA O POLIPEPTìDEO RELACIONADO COM ESTRESSE DO TIPO LECTINA DE UMA PROTEìNA QUINASE, CéLULA DE PLANTA TRANSGêNICA, PLANTA TRANSGêNICA, SEMENTE, POLIPEPTìDEO, E, SEQUêNCIA DE áCIDO NUCLEICO. Uma planta transgênica transformada por ácido nucleico que codifica o polipeptídeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase (LPKSPR), em que a expressão da sequência de ácido nucleico na planta resulta em aumento do crescimento da planta e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental como comparado com uma variedade de tipo selvagem da planta. São também providos produtos agrícolas, incluindo sementes, produzidas pelas plantas transgênicas. Também são providos LPKSRPs isolados, e ácido nucleico isolado codificado LPKSRPs, e vetores e células hospedeiras contendo os últimos.

Description

"USOS DE UM ÁCIDO NUCLEICO, E DE UM PRIMEIRO ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO QUE HIBRIDIZA SOB CONDIÇÕES ESTRINGENTES PARA UM SEGUNDO ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODOS PARA AUMENTAR A TOLERÂNCIA DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA A UM ESTRESSE AMBIENTAL, E PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA CONTENDO O ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA O POLIPEPTÍDEO RELACIONADO COM ESTRESSE DO TIPO LECTINA DE UMA PROTEÍNA QUINASE, CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA, PLANTA TRANSGÊNICA, SEMENTE, POLIPEPTÍDEO, E, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se geralmente a seqüências de ácido nucleico codificando polipeptídeos que são associados com respostas de estresse biótico e tolerância a estresse abiótico em plantas. Em particular, esta invenção refere-se a seqüências de ácido nucleico codificando polipeptídeos que conferem à planta crescimento aumentado e/ou que conferem à planta aumentada tolerância à seca, frio, e/ou sal às plantas

ARTE ANTECEDENTE

Estresses ambientais abióticos, como estresse de seca, estresse de salinidade, estresse de calor, e estresse de frio, são fatores limitativos de crescimento e produtividade de plantas. As perdas de culturas e perdas na produção de culturas das culturas principais como soja, arroz, milho (milho), algodão, e trigo causadas por estes estresses representam um fator econômico e político significante e contribuem para a falta de alimentos em muitos países sub-desenvolvidos. As plantas são tipicamente expostas durante seu ciclo de vida a condições de reduzido teor de água ambiental. A maior parte das plantas tem evolvido estratégias para se proteger contra estas condições de dessecação. No entanto, se a severidade e duração das condições de seca foram muito elevadas, os efeitos do desenvolvimento, crescimento e rendimento da maior parte das plantas de cultura são profundos. A exposição contínua a condições de seca provoca alterações principais no metabolismo da planta, que por fim leva à morte das células e conseqüentemente perdas de rendimento.

O desenvolvimento de plantas tolerantes a estresse é uma estratégia que tem o potencial de resolver ou mediar pelo menos alguns destes problemas. No entanto, as estratégias de reprodução de plantas tradicionais para desenvolver novas linhagens de plantas que demonstram resistência (tolerância) a estes tipos de estresses são relativamente lentas e requerem linhagens resistentes específicas para o cruzamento com a linhagem desejadas. Os recursos de germoplasma limitados para tolerância ao estresse e incompatibilidade em cruzamentos entre espécies de plantas de parentesco distante representam significantes problemas encontrados em reprodução convencional. Adicionalmente, os processos celulares levando a tolerância a seca, frio e sal em plantas de modelo tolerantes a seca, frio e/ou sal, são complexos em natureza e envolvem mecanismos múltiplos de adaptação celular e numerosas vias metabólicas. Esta natureza de múltiplos componentes de tolerância a estresse não tornou somente a reprodução para tolerância de total insucesso, como também limitou a capacidade de engenheirar geneticamente as plantas tolerantes ao estresse usando métodos biotecnológicos.

Os estresses de seca, estresses de calor, estresses de frio e estresses de sal tem um tema comum importante para o crescimento de planta e que é a disponibilidade de água. Como discutido acima, a maior parte das plantas desenvolveu estratégias para se proteger contra condições de dessecação, no entanto, se a severidade e duração das condições de seca foram muito elevadas, os efeitos sobre o desenvolvimento da planta, crescimento e rendimento da maior parte das plantas de cultura são profundos. Além disso, a maior parte das plantas de cultura são muito susceptíveis a concentrações de sal maiores no solo. Porque o teor de sal elevado em alguns solos resulta em menor água sendo disponível para a entrada da célula, uma concentração de sal elevada tem um efeito em plantas similar ao efeito da seca nas plantas. Adicionalmente, sob temperaturas de congelamento, as células de plantas perdem água como um resultado de formação de gelo que começa no apoplasto e retira água do simplasto. Um mecanismo de resposta molecular da planta para cada uma destas condições de estresse é comum, e proteína quinases, como proteína quinase de tipo lectina, desempenham um papel essencial nestes mecanismos moleculares.

As proteína quinases representam uma superfamília, e os membros desta superfamília catalisam a transferência reversível de um grupo fosfato de ATP em cadeias laterais de aminoácidos serina, treonina e tirosina, em polipeptídeos de marcação. As proteína quinases são elementos primários nos processos de sinalização e foram relatadas como desempenhando papéis cruciais na percepção e transdução de sinais que permitem que uma célula (e a planta) respondam a estímulos ambientais.

Um tipo de proteína quinase é a proteína quinase de tipo lectina (LLPK) ou receptor quinase de lectina. Os aspectos estruturais deste tipo de proteína quinase incluem uma seqüência de sinal de marcação de membrana amino-terminal, um domínio extracelular de tipo lectina de legume, um domínio de espaço de membrana única, e um domínio catalítico de proteína quinase serina/treonina característico. Os membros desta família foram relatados como estando envolvidos em comunicação célula-célula, defesa contra predadores e patógenos, e desenvolvimento e reprodução de plantas.

(Barre et al., 2002, Crit. Rev. Planta Sci. 21:379-399). Quarenta e duas receptor quinases de lectina putativa e nove seqüências de lectina de legume, solúveis, foram identificados em Arabidopsis. Apesar de alguns genes que estão envolvidos em respostas ao estresse e eficiência de uso de água em plantas terem sido caracterizados, a caracterização e clonagem de genes de plantas que conferem tolerância ao estresse e eficiência de uso de água permanecem muito incompletas e fragmentadas. Por exemplo, alguns estudos indicaram que o estresse de seca e sal em algumas plantas pode ser devido a efeitos de genes aditivos, em contraste com outra pesquisa que indica genes específicos sendo transcripcionalmente ativados em tecido vegetativo de plantas sob condições de estresse osmótico. Apesar de ser geralmente considerado que as proteínas induzidas por estresse tem um papel em tolerância, a evidência direta ainda está faltando, e as funções de muitos genes respondentes a estresse são desconhecidas.

Existe uma questão limitada fisio-quimicamente fundamente, em todos os organismos fotossintéticos terrestres, entre a absorção de CO2 e perda de água (Taiz e Zeiger 1991 Planta Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co, p94). CO2 precisa estar em uma solução aquosa para a ação das enzimas de fixação de CO2 como Rubisco (Ribulose 1,5-bisfosfato Carboxilase/Oxigenase) e PEPC (Fosfoenolpiruvato carboxilase). Como uma superfície de células úmida é requerida para a difusão de CO2, a evaporação irá inevitavelmente ocorrer quando a umidade está abaixo de 100% (Taiz e Zeiger 1991 Planta Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co p257). Plantas tem numerosos mecanismos fisiológicos para reduzir a perda de água (por exemplo cutículas cerosas, fechamento estomatal, cabelos da folhas, pontos estomatais afundados). Todas estas barreiras não discriminam entre água e fluxo de CO2, estas medidas de conservação de água também irão atuar para aumentar a resistência à absorção de CO2 (Kramer 1983 Water Relations of Plants, Academic Press p305). A absorção de CO2 fotossintética é absolutamente requerida para no crescimento da planta e acúmulo de biomassa em plantas fotoautotróficas. A eficiência do uso de água (WUE) é um parâmetro freqüentemente usado para estimar o intercâmbio entre o consumo de água e a absorção de CO2 /crescimento (Kramer 1983 Water Relations of Plants, Academic Press p405). WUE tem sido definido e medido em múltiplos modos. Uma abordagem consiste em calcular a relação de peso seco da planta, para o peso de água consumida por um planta em toda a sua vida (Chu et al 1992 Oecologia 89:580). Outra variação é usar um intervalo de tempo mais curto quando o acúmulo de biomassa e uso de água são medidos (Mian et al 1998 Crop Sei. 38:390). Com freqüência medidas de partes limitadas da planta são usadas, por exemplo, medindo somente o crescimento aéreo e uso de água (Nienhuis et al 1994 Amer J Bot 81:943). WUE também foi definido como a relação de absorção de CO2 para perda de vapor d''agua de uma folha ou porção da folha, com freqüência medido em um período de tempo muito curto (segundos/minutos) (Kramer 1983 Water Relations of Plants, Academic Press p406). A relação de 13C/12C fixado em um tecido de planta, e medido como um espectrômetro de massa de relação de isótopo, também foi usada para estimar WUE em plantas usando fotossíntese de C3 (Martin et al 1999 Crop Sei. 1775).

Um aumento em WUE é informativo sobre a eficiência relativamente melhorada de crescimento e consumo de água, mas isto sozinho não descreve qual destes dois processos (ou ambos) mudou. Na seleção de traços para melhorar as culturas, um aumento em WUE devido a uma diminuição no uso de água, sem uma mudança no crescimento teria um mérito particular em um sistema agrícola irrigado onde os custos de entrada de água são elevados. Um aumento em WUE dirigido principalmente por um aumento em crescimento em um salto correspondente em uso de água teria uma aplicabilidade para todos os sistemas agrícolas, Em muitos sistemas agrícolas, onde o suprimento de água não é limitante, um aumento em crescimento, mesmo se for proveniente de um uso aumentado de água (isto sem mudança em WUE), também poderia aumentar o rendimento. Assim, novos métodos para aumentar tanto WUE como acúmulo de biomassa são requeridos para aumentar a produtividade agrícola. Como WUE integra muitos processos fisiológicos relacionados com o metabolismo primário e uso de água, ele é tipicamente um traço altamente poligênico com um genótipo grande por interação com o ambiente (Ríchards et al 2002 Crop Sci 42:111). Por estas e novas razões, novas tentativas para selecionar mudanças de WUE em programas de reprodução tradicionais obtiveram sucesso.

Assim, existe a necessidade de identificar os genes expressados em plantas tolerantes a estresse e plantas que são eficientes em uso de água que tem a capacidade de conferir tolerância a estresse e eficiência de uso de água a sua planta hospedeira e a outras espécies de plantas. As plantas tolerantes a estresse recentemente geradas terão muitas vantagens, como uma faixa aumentada em que as plantas de cultura podem ser cultivadas, por, por exemplo, diminuição das exigências de água de uma espécie de planta. Outras vantagens desejáveis incluem resistência aumentada a alojamentos, o dobramento dos brotos ou hastes em resposta a vento, chuva, pragas ou doenças.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção atende, em parte, à necessidade de identificar novas seqüências únicas capazes de conferir tolerância a plantas quando da Sapir -expressão. A presente invenção descreve um novo gênero de polipeptídeos relacionados com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase (LPKSRPs) e ácidos nucleicos codificando para PLKSRPs que são importantes para modular a resposta da planta a um estresse ambiental. Mais particularmente, superexpressão dos ácidos nucleicos codificando para PLKSRPs em uma planta resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada da planta a um estresse ambiental.

Assim, a presente invenção inclui uma célula de planta isolada compreendendo um ácido nucleico codificando para PLKSRP, em que expressão da seqüência de ácido nucleico na célula de planta resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da célula de planta. Preferivelmente, o LPKSRP é de Physcomitrella patens. Ou seja, é descrito aqui o tipo lectina de uma proteína quinase-1 de Physcomitrella patens (PpLLPK-1).

A invenção provê em algumas formas de realização que os ácido nucleicos codificando LPKSRP são os que são encontrados em membros do gênero Physcomitrella. Em outra forma de realização preferida, o ácido nucleico e polipeptídeo são de uma planta Physcomitrella patens. Em uma forma de realização, uma invenção provê que plantas superexpressando o LPKSRP demonstram um aumento em crescimento. Em uma forma de realização preferida, o aumento no crescimento da planta é devido ao aumento da planta na eficiência do uso de água (WUE), como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. Em outra forma de realização preferida, uma invenção provê que plantas superexpressando o LPKSRP demonstram aumentado peso seco da planta (DW), como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. Em outra forma de realização, uma invenção provê que plantas superexpressando o LPKSRP demonstram tolerância aumentada a um estresse ambiental, como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. A invenção provê que o estresse ambiental pode ser salinidade, seca, temperatura, metal, produto químico, estresses patogênicos e oxidativos, ou suas combinações. Em formas de realização preferidas, o estresse ambiental pode ser selecionado dentre um ou mais do grupo consistindo de seca, elevado teor de sal, e baixa temperatura.

A invenção ainda provê uma semente produzida por uma planta transgênica transformada por um ácido nucleico codificando para PLKSRP, em que a planta é uma reprodução em linhagem pura para crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. Em uma forma de realização preferida, o ácido nucleico codificando para PLKSRP é como descrito abaixo.

A invenção ainda provê um produto agrícola produzido por qualquer um dentre plantas transgênicas, partes de planta, ou sementes abaixo descritas. A invenção ainda provê um LPKSRP isolado como descrito abaixo.

A invenção ainda provê um LPKSRP isolado codificando ácido nucleico, em que o ácido nucleico codificando para PLKSRP codifica para um LPKSRP como descrito abaixo.

A invenção ainda provê um vetor de expressão recombinante isolado compreendendo um ácido nucleico codificando para PLKSRP como descrito abaixo, em que expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada da planta a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da célula hospedeira. A invenção ainda provê a célula hospedeira contendo o vetor e uma planta contendo a célula hospedeira.

A invenção ainda provê um método de produzir uma planta transgênica com um ácido nucleico codificando para PLKSRP, em que expressão do ácido nucleico em uma planta resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada da planta a um. estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta compreendendo: (a) transformar a célula de planta com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico codificando para PLKSRP; e (b) gerar a partir de uma célula de planta uma planta transgênica com crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. Em formas de realização preferidas, o LPKSRP e ácido nucleico codificando para PLKSRP são como descritos abaixo.

A presente invenção ainda provê um método de identificar um novo LPKSRP5 compreendendo (a) criar uma resposta de anticorpo específica a um LPKSRP, ou fragmento do mesmo, como descrito abaixo; (b) triar material de LPKSRP putativo com o anticorpo, em que a ligação específica do anticorpo ao material indica a presença de LPKSRP potencialmente novo; e (c) identificar do material ligado um novo LPKSRP em comparação com o conhecido LPKSRP. Alternativamente, hibridização com sondas de ácido nucleico como descrito abaixo pode ser usada para identificar novos ácidos nucleicos LPKSRP.

A presente invenção também provê métodos de modificar crescimento e/ou tolerância ao estresse de uma planta compreendendo, modificar a expressão de um ácido nucleico LPKSRP na planta, em que o LPKSRP é como descrito abaixo. A invenção provê que este método pode ser realizado de modo que o crescimento da planta e/ou tolerância ao estresse é ou aumentado ou diminuído. Preferivelmente, o crescimento da planta e/ou tolerância ao estresse é aumentado em uma planta via aumento da expressão de um ácido nucléico para LPKSRP.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a seqüência de cDNA de PpLLPK-I de Physcomitrella patens.

Figura 2 mostra a seqüência de aminoácido deduzida de PpLLPK-I de Physcomitrella patens.

Figura 3 mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido da proteína quinase de tipo lectina PpLLPK-I de Physcomitrella patens com as seqüências de aminoácido de cinco proteína quinases conhecidas. A figura também indica a seqüência de consenso de uma proteína quinase de tipo lectina com base em seqüências alinhadas. Fontes brancas em preto são resíduos de consenso derivados de um bloco de resíduos similares em uma dada posição. Fontes pretas em cinza são aminoácidos de consenso ou similares em uma posição com um consenso de resíduos em pelo menos 50% das seqüências. Resíduos não similares em uma dada posição são identificados como fontes preta em branco.

Figura 4 mostra um alinhamento da seqüência de aminoácido da proteína quinase de tipo lectina PpLLPK-I de Physcomitrella patens com cinco seqüências de aminoácido identificadas em uma busca de uma base de dados de seqüência de patentes. A figura também indica a seqüência de consenso de uma proteína quinase de tipo lectina com base em seqüências alinhadas. Fontes brancas em preto são resíduos de consenso derivados de um bloco de resíduos similares em uma dada posição. Fontes preta em cinza são aminoácidos de consenso ou similares em uma posição com um consenso de resíduos em pelo menos 50% da seqüências. Resíduos não similares em uma dada posição são identificados como fonte preta em branco.

Figura 5 mostra Tabela 7, o plantas de controle somente vetor sob condições de ciclos de bem aguadas e seca.

Figura 6 mostra a seqüência de DNA de promotor for expressão constitutiva em arroz.

Figura 7 mostra o vetor de expressão p074 para expressão constitutiva em arroz.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção deve ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada das formas de realização preferidas da invenção e Exemplos incluídos na mesma. No entanto, antes dos presentes compostos, composições, e métodos serem relatados e descrito, deve-se entender que os ácidos nucléicos específicos, polipeptídeos específicos de tipos de células específicos, células hospedeiras específicas, condições específicas o u métodos específicos, etc, como tal, podem, como evidente variar, e as numerosas modificações e variações nas mesmas serão evidentes para os versados. Deve-se entender também que a terminologia usada aqui é para fins de descrever formas de realização específicas apenas e não pretende- se ser limitativo. Em particular, um designação das seqüências de aminoácidos como polipeptídeo "polipeptídeos relacionados com estresse do tipo lectina-1 de uma proteína quinase" (sigla em inglês, LPKSRPs),não limita de nenhum modo a funcionalidade destas seqüências.

A presente invenção descreve um novo gênero de LPKSRPs e ácidos nucleicos codificando para LPKSRP que são importantes para modular o crescimento e/ou resposta da planta a um estresse ambiental. Mais particularmente, a superexpressão dos ácidos nucleicos codificando LPKSRP em uma planta resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada da planta a um estresse ambiental. Um número representativo do gênero LPKSRP é PpLLPK-1. Em uma forma de realização preferida, todos os membros do gênero são proteínas quinases de tipo lectina biologicamente ativas.

Assim, a presente invenção engloba seqüências de polinucleotídeo e polipeptídeo LPKSRP e seu uso para aumentar o crescimento e/ou tolerância da planta a um estresse ambiental. Em uma forma de realização, as seqüências de LPKSRP são de uma planta, preferivelmente uma planta Physcomitrella, e mais preferivelmente uma planta Physcomitrella patens. Em outra forma de realização, as seqüências de LPKSRP incluem PpLLPK-I (SEQ ID NOS:l e 2). A seqüência de aminoácidos de LPKSRP de Physcomitrella patens tem identidade percentual significante para o tipo lectina de uma proteína quinase conhecido, como é indicado abaixo.

A presente invenção provê uma célula de planta transgênica transformada por um ácido nucleico codificando para PLKSRP, em que a expressão da seqüência de ácido nucleico na célula de planta resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada da planta a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da célula de planta. A invenção ainda provê partes transgênicas de plantas e plantas transgênicas contendo células de planta descrita aqui. Partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, e outros. Em uma forma de realização, um planta transgênica é estéril masculina. Também é provida uma semente de planta produzida por uma planta transgênica transformada por um ácido nucleico codificando para PLKSRP, em que a semente contém o ácido nucleico codificando para PLKSRP, e em que a planta é uma reprodução em linhagem pura para crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. A invenção ainda provê uma semente produzida por uma planta transgênica expressando um LPKSRP, em que a semente contém o LPKSRP, e em que a planta é uma reprodução em linhagem pura para crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. A invenção também provê um produto agrícola produzido por qualquer uma das plantas transgênicas, partes de planta, e sementes de plantas abaixo-descritos. Produtos agrícolas incluem, mas não são limitadas a, extratos de plantas, proteínas, aminoácidos, carboidrato s, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas, e outros.

Como usado aqui, o termo "variedade" refere-se a um grupo de plantas dentro de uma espécie que compartinha caracteres constantes que separam as mesmas da forma típica e outras variedades possíveis dentro da espécie. Apesar de possuir pelo menos um traço distintivo, um variedade é também caracterizada por alguma variação entre indivíduos dentro da variedade, com base em primariamente a segregação mendeliana de traços dentre a progênie de gerações sucessivas. Uma variedade é considerada uma "criação verdadeira" para um traço particular se ela for geneticamente homozigótica para o traço na extensão que, quando variedade da reprodução em linhagem pura é auto-polinizada, uma quantidade significante de segregação independente do traço dentre a progênie não é observada. Na presente invenção, o traço surge da expressão transgênica de uma ou mais seqüências de DNA introduzidas em uma variedade de plantas.

A presente invenção descreve pela primeira vez que PpLLPK- 1 de LPKSRP de Physcomitrella patens é utilizável para aumentar o crescimento e/ou tolerância a um estresse ambiental da planta. Como usado aqui, o termo polipeptídeo refere-se a uma cadeia de pelo menos quatro aminoácidos unidos por ligações peptídeo. A cadeia pode ser linear, ramificada, circular, ou suas combinações. Assim, a presente invenção provê LPKSRP isolados selecionados de PpLLPK-1, e seus homólogos. Em formas de realização preferidas, o LPKSRP inclui o polipeptídeo de tipo lectina-1 de uma proteína quinase de Physcomitrella patens (PpLLPK-I) como definido em SEQ ID NO:2; e homólogos e ortólogos do mesmo. Homólogos e ortólogos da seqüências de aminoácido são definidos abaixo.

Os LPKSRPs da presente invenção são preferivelmente produzidos por técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificando o polipeptídeo é clonada em um vetor de expressão (como descrito abaixo), o vetor de expressão é introduzido em uma célula hospedeira (como descrito abaixo), e o LPKSRP é expressado em uma célula hospedeira. O LPKSRP pode ser então isolado das células por um esquema de purificação apropriado usando técnicas de purificação de polipeptídeo padrões. Para os fins da invenção, o termo "polinucleotídeo recombinante" refere-se a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado, ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo clonado, e polinucleotídeos que são ligados ou unidos às seqüências heterólogas. O termo "recombinante" não se refere a alterações a polinucleotídeos que resultam de eventos de ocorrência natural, como mutações espontâneas. Alternativo à expressão recombinante, um LPKSRP, ou seu peptídeo, pode ser sintetizado quimicamente usando técnicas de síntese de peptídeo padrões. Além disso, LPKSRP nativo pode ser isolado de células (por exemplo células de Physcomitrella patens), por exemplo usando um anticorpo anti-LPKSRP, que pode ser produzido por técnicas padroes utilizando um LPKSRP ou fragmento do mesmo.

Como usado aqui, o termo "estresse ambiental" refere-se a condições sub-ótimas associadas com salinidade, seca, temperatura, metal, produto químico, patogênicos, e estresses oxidativos, ou suas combinações. Em formas de realização preferidas, o estresse ambiental pode ser selecionado dentre um ou mais do grupo consistindo de salinidade, seca, ou temperatura, ou suas combinações, e em particular, pode ser selecionado dentre um ou mais do grupo consistindo de elevada salinidade, baixo teor de água, ou baixa temperatura. Deve-se entender também que como usado no relatório e nas reivindicações "um" ou "uma" podem significar um ou mais, dependendo do contexto em que é usado. Assim, por exemplo, referência a "uma célula" pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada. Como também usado aqui, o termo "eficiência de uso de água" refere-se a quantidade de material orgânico produzido por uma planta dividido pela quantidade de água usada pela planta na sua produção, isto é, o peso seco de uma planta com relação ao uso de água da planta. Como usado aqui, o termo "peso seco" refere-se a tudo que ocorre em uma planta diferente de água, e inclui, por exemplo, carboidratos, proteínas, óleos e nutrientes minerais.

Como também usado aqui, o termo "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" referem-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de filamento único ou duplo, ou um híbrido dos mesmos. O termo também engloba híbridos de RNA/DNA. Estes termos também englobam seqüência não traduzida localizada em ambas as extremidades 3' e 5' a região de codificação do gene: pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos de seqüência a montante da extremidade 5' da região de codificação e pelo menos cerca de 200 nucleotídeos de seqüência a jusante da extremidade 3' da região de codificação do gene. As bases, menos comuns, como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina, e outros também podem ser usadas para anti- sentido, dsRNA, e formação de pares de ribozima. Por exemplo, polinucleotídeos que contém análogos C-5 propina de uridina

e citidina foram mostrados como ligando RNA com afinidade elevada e como sendo inibidores potentes anti-sentido de expressão de gene. Outras modificações, como modificação para a estrutura dorsal de fosfodiester, ou o 2'-hidróxi no grupo de açúcar ribose do RNA também podem ser feitas. Os polinucleotídeos e ribozimas anti-sentido podem consistir completamente de ribonucleotídeos, ou podem conter ribonucleotídeos e deoxirribonucleotídeos. Os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por qualquer meio, incluindo preparações genômicas, preparações de cDNA, síntese in vitro, RT-PCR5 e transcrição in vitro ou in vivo.

Uma molécula de ácido nucleico "isolado" é uma que é substancialmente separada de outras moléculas de ácido nucleico, que estão presentes na fonte natural do ácido nucleico (isto é, seqüências codificando outros polipeptídeos). Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado" é livre de algumas das seqüências, que naturalmente flanqueam o ácido nucleico (isto é seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) em seu replicon de ocorrência natural. Por exemplo, um ácido nucleico clonado é considerado isolado. Em várias formas de realização, a molécula LPKSRP de ácido nucleico isolada pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueam a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula em que o ácido nucleico é derivado (por exemplo, uma célula de Physcomitrella patens). O ácido nucleico é também considerado isolado se ele for alterado intervenção humana, ou colocado em uma locus ou local que não é seu sítio natural, ou se ele for introduzido em uma célula por agroinfecção. Além disso, uma molécula "isolada" de ácido nucleico, como molécula de cDNA, pode ser livre de algum outro material celular com que é naturalmente associada, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou precursores químicos ou outros produto químicos quando quimicamente sintetizada.

Especificamente excluídos da definição de "ácidos nucleicos isolados" são: cromossomos de ocorrência natural (como espalhados de cromossomo), bibliotecas de cromossomo artificial, bibliotecas genômicas, e bibliotecas de cDNA que existem ou como uma preparação in vitro de ácido nucleico ou com uma preparação de célula hospedeira transfectada /transformada, em que as células hospedeiras são ou uma preparação heterogênea in vitro ou colocadas em plantas como uma população heterogênea de colônias únicas. Também são especificamente excluídas as bibliotecas acima em que um ácido nucleico especificado chega a menos do que 5% do número de insertos de ácido nucleico nas moléculas do vetor. Ainda especificamente excluídos são o DNA genômico de célula completa ou preparações de RNA de células completas (incluindo preparações de células completas que são mecanicamente cisalhadas ou enzimaticamente digeridas). Ainda mais especificamente excluídas são as preparações de células completas encontradas como uma preparação in vitro ou como uma mistura heterogênea separada por eletroforese em que o ácido nucleico da invenção ainda não foi separado dos ácidos nucleicos heterólogos no meio de eletroforese. (por exemplo, ainda separando por excisão de uma banda única de uma população de banda heterogênea em um gel agarose ou blot de náilon).

Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo, um molécula de ácido nucleico tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0:1, ou a porção da mesma, pode ser isolada usando técnicas de biologia molecular padrões e a informação de seqüência provida aqui. Por exemplo, um cDNA LPKSRP de P. patens pode ser isolado de uma biblioteca de P. patens usando toda ou uma porção de uma das seqüências relatadas aqui. Além disso, uma molécula de ácido nucleico englobando toda ou uma porção da seqüência de SEQ ID NO:l, pode ser isolada por reação de cadeia polimerase usando iniciadores de oligonucleotídeo projetados com base nesta seqüência. Por exemplo, mRNA pode ser isolado de células de planta (por exemplo, pelo procedimento de extração de tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al.5 1979, Biochemistry 18:5294-5299), e cDNA pode ser preparado usando transcriptase reversa (por exemplo, Moloney MLV reverse transcriptase, disponível de Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase AMV reversa, disponível de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg5 FL). Os iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos para reação de amplificação de cadeia polimerase pode ser projetados com base em uma seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:l. A molécula de ácido nucleico da invenção pode ser amplificada usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um gabarito e iniciadores de oligonucleotídeos padrões de acordo com técnicas d amplificação PCR padrões. A molécula de ácido nucleico assim amplificada pode ser clonada em um vetor apropriado e caracterizada por análise da seqüência de DNA. Além disso, oligonucleotídeos correspondendo a uma seqüência LPKSRP de nucleotídeos podem ser preparados por técnicas sintéticas padrões, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.

Em uma forma de realização, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:l. As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem compreender seqüências codificando os LPKSRPs, (isto é, a "região de codificação"), assim como seqüências 5' seqüências não traduzidas e seqüências 3' não traduzidas. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem compreender somente a região de codificação da seqüência em SEQ ID NO:l, ou podem conter fragmentos genômicos completos isolados de DNA genômico. A presente invenção também inclui ácido nucleico codificando para PLKSRPs que codificam LPKSRPs como descrito aqui. Em uma forma de realização preferida, o ácido nucleico codificando para PLKSRP codifica um PpLLPK-I como definido em SEQID NO:2.

Além disso, a molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender uma porção da região de codificação de SEQ ID NO:l, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento codificando uma porção biologicamente ativa de um LPKSRP.

As seqüências de nucleotídeos determinadas da clonagem dos genes de gene de LPKSRPs de Physcomitrella patens permitem a geração de sondas e iniciadores projetados para uso em identificar e/ou clonar LPKSRP homólogos em outros tipos de célula e organismos, assim como homólogos de LPKSRP de outros musgos e espécies relacionadas. A porção da região de codificação também codifica um fragmento biologicamente ativo de um LPKSRP.

Como usado aqui, o termo "porção biologicamente ativa de" um LPKSRP se destina a incluir uma porção, por exemplo, um domínio/motivo, de um LPKSRP que participa em modulação no crescimento da planta e/ou tolerância ao estresse em uma planta. Para a fins da presente invenção, modulação de crescimento da planta e/ou tolerância ao estresse refere-se a pelo menos a 10% aumento ou diminuição no crescimento e/ou tolerância ao estresse de uma planta transgênica compreendendo um cassete de expressão de LPKSRP (ou vetor de expressão) como comparado ao crescimento e/ou tolerância ao estresse da planta de controle não transgênica.

Métodos para quantificar o crescimento e/ou tolerância ao estresse são providos pelo menos em Exemplo 7 abaixo. Em uma forma de realização preferida, a porção biologicamente ativa de um LPKSRP aumenta o crescimento da planta e/ou tolerância a um estresse ambiental.

As porções biologicamente ativas de um LPKSRP incluem peptídeos compreendendo seqüências de aminoácidos derivados da seqüência de aminoácido de um LPKSRP, por exemplo, uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, ou a seqüência de aminoácido do polipeptídeo idêntico a um LPKSRP, que incluem menos aminoácidos do que um LPKSRP de comprimento completo ou polipeptídeo de comprimento completo que é idêntico a um LPKSRP, e demonstra pelo menos uma atividade de um LPKSRP. Tipicamente, porções biologicamente ativas (por exemplo, peptídeos que são, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, ou mais aminoácidos em comprimento) compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de um LPKSRP. Além disso, outras porções biologicamente ativas, em que outras regiões do polipeptídeo são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas por uma ou mais das atividades aqui descritas. Preferivelmente, uma porção biologicamente ativa de um LPKSRP inclui um ou mais domínios/motivos selecionados, ou suas porções, tendo atividade biológica como o domínio quinase central conservado como é mostrado em Figura 3. Em uma forma de realização, o "domínio quinase central" compreende resíduos em posições 235-546 de SEQ ID NO:2. Em uma forma de realização preferida, o domínio quinase central conservado compreende quatro regiões conservadas, em que a primeira região começa com um resíduo tirosina na posição 1 e tem uma leucina na posição 3, um resíduo de glicina na posição 4, um resíduo de glicina na posição 8, um resíduo de glicina na posição 10, um resíduo de fenilalanina na posição 12, um resíduo de glicina na posição 13, e um resíduo de treonina na posição 15; a segunda região é a jusante de uma primeira região, começa com um resíduo de alanina na posição 1, e tem um resíduo de lisina na posição 3, um resíduo de isoleucina na posição 5, um resíduo de lisina na posição 7, um resíduo de ácido glutâmico na posição 17, um resíduo de ácido aspártico na posição 18, um resíduo de valina na posição 19, um resíduo de arginina na posição 21, um resíduo de ácido glutâmico na posição 22, um resíduo de isoleucina na posição 25, uma resíduo de leucina na posição 29, um resíduo de glicina na posição 31, um resíduo de asparagina na posição 34, um resíduo de valina na posição 36, um resíduo de ácido glutâmico na posição 43, um resíduo de ácido aspártico na posição 44, um resíduo de valina nas posições 48 e 51, um resíduo de metionina na posição 52, um resíduo de ácido glutâmico na posição 53, uma resíduo de leucina na posição 54, um resíduo de cisteína na posição 55, um resíduo de glicina na posições 57 e 58, um resíduo de ácido glutâmico na posição 59, uma resíduo de leucina na posição 60, um resíduo de ácido aspártico na posição 62, um resíduo de arginina na posição 63, e um resíduo de isoleucina na posição 64; a terceira região é a jusante da segunda região, começa com um resíduo tirosina na posição 1, e tem a resíduo de serina na posição 2, um resíduo de ácido glutâmico na posição 3, um resíduo de alanina na posição 6, um resíduo de arginina na posição 11, um resíduo de valina na posição 16, um resíduo de cisteína na posição 20, um resíduo de histidina na posição 21, um resíduo de glicina na posição 24, um resíduo de valina na posição 25, um resíduo de histidina na posição 27, um resíduo de arginina na posição 28, um resíduo de ácido aspártico na posição 29, um resíduo de lisina na posição 31, um resíduo de prolina na posição 32, um resíduo de ácido glutâmico na posição 33, um resíduo de asparagina na posição 34, um resíduo de fenilalanina na posição 35, um resíduo de leucina em posições 36 e 46, um resíduo de licina na posição 47, um resíduo de ácido aspártico na posição 50, um resíduo de fenilalanina na posição 51, um resíduo de glicina na posição 52, uma resíduo de leucina na posição 53, um resíduo de serina na posição 54, um resíduo de prolina na posição 59, um resíduo de ácido aspártico na posição 65, um resíduo de valina na posição 67, um resíduo de glicina na posição 68, um resíduo de serina na posição 69, um resíduo tirosina nas posições 71 e 72, um resíduo de valina na posição 73, um resíduo de alanina na posição 74, um resíduo de prolina na posição 75, um resíduo de ácido glutâmico na posição 76, um resíduo de valina na posição 77, uma resíduo de leucina na posição 78, um resíduo de ácido glutâmico na posição 85, um resíduo de ácido aspártico na posição 87, um resíduo de valina na posição 88, um de resíduo triptofano na posição 89, um resíduo de serina na posição 90, um resíduo de glicina na posição 92, um resíduo de valina na posição 93, um resíduo de isoleucina na posição 94, um resíduo de tirosina na posição 96, um resíduo de isoleucina na posição 97, uma resíduo de leucina nas posições 98 e 99, um resíduo de glicina na posição 101, um resíduo de prolina na posição 104, um resíduo de fenilalanina na posição 105, um resíduo de triptofano na posição 106, um resíduo de treonina na posição 109, um resíduo de ácido glutâmico na posição 110, um resíduo de isoleucina na posição 113, um resíduo de fenilalanina na posição 114, um resíduo de prolina na posição 128, um resíduo de triptofano na posição 129, um resíduo de prolina na posição 130, um resíduo de isoleucina na posição 132, um resíduo de serina na posição 133, um resíduo de alanina na posição 136, um resíduo de lisina na posição 137, um resíduo de ácido aspártico na posição 138, uma resíduo de leucina na posição 144, um resíduo de arginina na posição 151, um resíduo de alanina na posição 154, uma resíduo de leucina na posição 158, um resíduo de histidina na posição 160, um resíduo de prolina na posição 161, e um resíduo de triptofano na posição 162; e a quarta região é a jusante de terceira região, começa com um resíduo de prolina na posição 1, e tem um resíduo de ácido aspártico na posição 3, um resíduo de valina na posição 6, um resíduo de alanina na posição 23, uma resíduo de leucina nas posições 31 e 39, um resíduo de fenilalanina na posição 43, um resíduo de glicina na posição 52, uma resíduo de leucina na posição 63, e um resíduo de lisina na posição 65.

A invenção também provê polipeptídeos de fusão ou quiméricos de LPKSRP. Como usado aqui, um "polipeptídeo quimérico" ou "polipeptídeo de fusão " de LPKSRP compreende um LPKSRP ligado operativamente a um não LPKSRP. Um LPKSRP refere-se a um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido correspondendo a um LPKSRP5 enquanto um não LPKSRP refere-se a um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido correspondendo a um polipeptídeo que não é substancialmente idêntico ao LPKSRP, por exemplo, um polipeptídeo que é diferente do LPKSRP e é derivado do mesmo ou de um diferente organismo. Com relação aos polipeptídeos de fusão, o termo "ligado operativamente" se destina a indicar que o LPKSRP e o não LPKSRP são fundidos em cada outro de modo que ambas as seqüências atendem à função proposta atribuída para a seqüência usada. O não LPKSRP pode ser fundido no N-término ou Ο- término do LPKSRP. Por exemplo, em uma forma de realização, os polipeptídeos de fusão são polipeptídeos de fusão GST-LPKSRP em que as seqüências de LPKSRP são fundidas no Otérmino das seqüências GST. Estes polipeptídeos de fusão podem facilitar a purificação de LPKSRPs recombinantes. Em outra forma de realização, os polipeptídeos de fusão são um LPKSRP contendo uma seqüência de sinal heteróloga em seu N-término. Em algumas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamíferos), expressão e/ou secreção de um LPKSRP pode ser aumentada através do uso de seqüência de sinal heteróloga.

Preferivelmente, um polipeptídeo de fusão ou quimérico de LPKSRP da invenção é produzido por técnicas de DNA recombinantes padrões. Por exemplo, fragmentos de DNA codificando para diferentes seqüências de polipeptídeo são ligados juntos in-frame de acordo com técnicas convencionais, por exemplo por emprego de términos de terminação cega ou terminação escalonada para ligação, digestão de enzima de restrição para prover os términos apropriados, enchimento das extremidades coesivas como apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar a união e ligação enzimática indesejáveis. Em outra forma de realização, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, amplificação PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores de âncora que dão lugar a ganchos complementares dentre dois fragmentos de genes consecutivos que podem subseqüentemente ser anelados e re-amplificados para gerar uma seqüência de genes quimérica (Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Além disso, muitos vetores de expressão são comercialmente disponíveis que já codificam a porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucleico codificando LPKSRP pode ser clonado em tal vetor de expressão de modo que a porção de fusão é ligada in-frame com o LPKSRP.

Além dos fragmentos e polipeptídeos de fusão dos LPKSRPs descritos aqui, a presente invenção inclui homólogos e análogos de LPKSRPs de ocorrência natural e ácidos nucleicos codificando LPKSRP em uma planta. "Homólogos" são definidos aqui como dois ácidos nucleicos ou polipeptídeos que tem seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos, similares ou "idênticas", respectivamente. Homólogos incluem variantes alélicos, ortólogos, parálogos, agonistas, e antagonistas de LPKSRPs como definidos abaixo. O termo "homólogo" ainda engloba moléculas de ácido nucleicos que diferem da seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:l (e suas porções) devido à degenerescência do código genético e assim codificam o mesmo LPKSRP como o codificado por uma seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO:l. Como usado aqui, um LPKSRP "de ocorrência natural" refere-se a uma seqüência e aminoácido de LPKSRP que ocorre na natureza. Preferivelmente, um LPKSRP de ocorrência natural compreende uma seqüência de aminoácido como definida em SEQ ID NO:2.

Um agonista do LPKSRP pode reter substancialmente as mesmas, ou um sub-conjunto das atividades biológicas do LPKSRP. Um antagonista do LPKSRP pode inibir um ou mais atividades da forma de ocorrência natural do LPKSRP.

Moléculas de ácido nucléico correspondendo a variantes alélicos naturais e análogos, ortólogos, e parálogos de um cDNA de LPKSRP podem ser isoladas com base em sua identidade para os ácidos nucleicos de LPKSRP de Physcomitrella patens descritos aqui usando cDNAs de LPKSRP, ou uma sua porção, como uma sonda de hibridização de acordo com técnicas padrões de hibridização sob condições estringentes de hibridização. Em uma alternativa forma de realização, homólogos do LPKSRP podem ser identificados por triagem de bibliotecas combinatoriais de mutantes, por exemplo mutantes de truncagem, do LPKSRP para atividade de agonista ou antagonista de LPKSRP. Em uma forma de realização, uma biblioteca variegada de variantes de LPKSRP é gerada por mutagênese combinatorial no nível de ácido nucleico e é codificado por uma biblioteca de gene variegada. A biblioteca variegada de variantes de LPKSRP pode ser produzida por, por exemplo, ligação enzimática de uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em seqüências de gene de modo que um conjunto degenerado de seqüências de LPKSRP em potencial é expressível como polipeptídeos individuais, ou alternativamente como um conjunto de polipeptídeos de fusão maiores (por exemplo, para exibição de fagos) contendo o conjunto de seqüências de LPKSRP. Existe uma variedade de métodos que podem ser usados para produzir bibliotecas de homólogos de LPKSRP em potencial de uma seqüência de oligonucleotídeos degenerados. A síntese química de uma seqüência de gene degenerada pode ser realizada em um sintetizador de DNA automatizado, e o gene sintético é então ligado em um vetor de expressão apropriado. O uso de um conjunto degenerado de genes permite a provisão, em uma mistura, de todas as seqüências codificando o conjunto desejado de seqüências de LPKSRP em potencial. Métodos para sintetizar os oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na arte (ver, por exemplo, Narang, S.A., 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983, Nucleic Acid Res 11:477). Além disso, bibliotecas de fragmentos das regiões de codificação de LPKSRP podem ser usadas para gerar uma população variegada de fragmento de LPKSRP para triagem e subseqüente seleção de homólogos de um LPKSRP. Em uma forma de realização, uma biblioteca de fragmentos de seqüência de codificação podem ser gerados por tratamento de um fragmento de PCR de filamento duplo de uma seqüência codificando LPKSRP com uma nuclease sob condições em que ocorre nicking somente cerca de uma vez por molécula, desnaturando o DNA de filamento duplo, renaturando o DNA para formar DNA de filamento duplo, que podem incluir pares sentido/anti-sentido de diferentes produtos nicked, removendo as porções de filamento único de duplexes reformados por tratamento com Sl nuclease, e ligando a biblioteca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por este método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada que codifica fragmentos de N-terminal, C-terminal, e internos de vários tamanhos do LPKSRP.

Várias técnicas são conhecidas na arte para triagem de produtos de genes de bibliotecas combinatoriais feitas por mutações por pontos ou truncagem, e para triagem de bibliotecas de cDNA para produtos de genes tendo uma propriedade selecionada. Estas técnicas são adaptáveis para a triagem rápida das bibliotecas de genes geradas pela mutagênese combinatorial de homólogos de LPKSRP. As técnicas mais amplamente usadas, que podem conduzir a análises de produção elevada, para triagem de bibliotecas de genes grandes tipicamente incluem clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, transformação das células apropriadas com a biblioteca de vetores resultantes, e expressão de genes combinatoriais sob condições em que detecção da atividade desejada facilita o isolamento do vetor codificando o gene cujo produto foi detectado. A mutagênese ensemble recursiva (REM), um técnica que melhora a freqüência de mutantes funcionais nas bibliotecas, pode ser usada em combinação com os testes de triagem para identificar homólogos de LPKSRP (Arkin e Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Polypeptide Engineering 6(3): 327-331). Em outra forma de realização, célula com base em testes podem ser exploradas para analisar uma biblioteca de LPKSRP variegada, usando métodos bem conhecidos na arte. A presente invenção ainda provê um método de identificar um novo LPKSRP, compreendendo (a) criar uma resposta de anticorpo específica a um LPKSRP, ou um fragmento do mesmo, como descrito aqui; (b) triar material de LPKSRP putativo com o anticorpo, em que a ligação específica do anticorpo para o material indica a presença de LPKSRP potencialmente novo; e (c) analisar o material ligado em comparação com o LPKSRP conhecido, para determinar sua novidade.

Como descrito acima, a presente invenção inclui LPKSRPs e homólogos dos mesmos. Para determinar a identidade percentual de seqüência de duas seqüências de aminoácidos (por exemplo, a seqüência de SEQ ID NO: 2, e a forma mutante do mesmo), as seqüências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo, espaços podem ser introduzidos na seqüência de um polipeptídeo para alinhamento ótimo com os outros polipeptídeo ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácido em posições de aminoácidos correspondentes são então comparados. Quantdo a posição em uma seqüência (por exemplo, a seqüência de SEQ ID NO: 2) é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido como a posição correspondente na outra seqüência (por exemplo, uma forma mutante da seqüência de SEQ ID NO :2), então as moléculas são idênticas nesta posição. O mesmo tipo de comparação pode ser feito entre duas seqüências de ácido nucleico.

A identidade percentual de seqüência entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, identidade percentual de seqüência = número s de posições idênticas / números totais de posições χ 100). Preferivelmente5 os homólogos isolados de aminoácido incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos a uma seqüência completa de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2. Em outra forma de realização, os homólogos isolados de aminoácido incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos a uma completa seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO: 1. Em outras formas de realização, os homólogos de aminoácidos de LPKSRP tem identidade de seqüência sobre pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, mais preferivelmente pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, e o mais preferivelmente pelo menos 35 resíduos de aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, os homólogos isolados de aminoácidos incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80- 85%, 85-90%, ou 90-95%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idêntico ao domínio de proteína quinase central das seqüências de aminoácidos relatadas, mostradas como resíduos 235 a 546 de SEQ ID NO: 2. Em outra forma de realização, o homólogo de aminoácido isolado da presente invenção é codificado pelo ácido nucleico como definidos por nucleotídeos em posições 736 to 1671 de SEQID NO: 1.

Em outra forma de realização preferida, um ácido nucleico isolado homólogo da invenção compreende a seqüência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 40-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85- 90%, ou 90-95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%), 99%», ou mais idêntica a uma seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1, ou a uma porção compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos da mesma. O comprimento preferível de comparação de seqüência para ácidos nucleicos é pelo menos de 75 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 100 nucleotídeos, e o mais preferivelmente o comprimento completo da região de codificação. Prefere-se mais que o ácido nucleico homólogos codifique polipeptídeos tendo homologia com SEQ ID NO: 2 sobre um domínio de quinase central.

É ainda preferido que o homólogo de ácido nucleico isolado da invenção codifique um LPKSRP, ou porção do mesmo, que é pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%», 98%, 99%, ou mais idêntico a uma seqüência completa de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 2 e que funciona como um modulador no crescimento da planta e/ou um resposta ao estresse ambiental em uma planta. Em uma forma de realização mais preferida, a superexpressão do homólogo de ácido nucleico em uma planta aumenta o crescimento da planta e/ou tolerância da planta a um estresse ambiental. Em uma forma de realização ainda preferida, o homólogo de ácido nucleico codifica um LPKSRP que funciona como um proteína quinase de tipo lectina.

Para fins da invenção, a identidade porcentual de seqüência entre duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo é determinada usando o pacote de software Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). A penalidade de abertura de espaço de 15 e a penalidade de extensão de espaço de 6.66 são usadas para a determinação da identidade percentual de dois ácidos nucleicos. A penalidade de abertura de espaço de IOea penalidade de extensão de espaço de 0,1 são usadas para a determinação da identidade percentual de dois polipeptídeos. Todos outros parâmetros são fixados como padrão. Para fins de alinhamento múltiplo (algoritmo Clustal W), a penalidade de abertura de espaço é 10, e a penalidade de extensão de espaço é 0.05 com matriz blosum62. Deve-se entender que para a fins de determinação da identidade de seqüência quando comparando uma seqüência de DNA com uma seqüência de um RNA, um nucleotídeo timidina é equivalente a um nucleotídeo uracila.

Em outro aspecto, a invenção provê um ácido nucleico isolado compreendendo um polinucleotídeo que hibridiza no polmucleotídeo de SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes. Mais particularmente, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção tem pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento e hibridiza sob condições estringentes na molécula de ácido nucleico compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em outras formas de realização, o ácido nucleico é pelo menos 30, 50, 100, 250, ou mais nucleotídeos em comprimento. Preferivelmente, um homólogo de ácido nucleico isolado da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições altamente estringentes para uma seqüência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 e funciona como um modulador de crescimento e/ou tolerância ao estresse em uma planta. Em uma forma de realização ainda preferida, a superexpressão do homólogo de ácido nucleico isolado em uma planta aumenta o crescimento da planta e/ou tolerância a um estresse ambiental. Em ainda outra forma de realização preferida, o homólogo de ácido nucleico isolado codifica um LPKSRP que funciona como um proteína quinase de tipo lectina.

Como usado aqui com relação à hibridização para DNA em um DNA blot, o termo "condições estringentes " refere-se à hibridização durante a noite a 60°C em 10X solução Denharfs, 6X SSC, 0,5% SDS, e 100μg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado. Blots são lavados seqüencialmente a 62°C durante 30 minutos cada vez em 3X SSC/0,1% SDS, seguido por IX SSC/0,1% SDS, e finalmente 0,1X SSC/0,1% SDS. Em outra forma de realização, a expressão "condições estringentes " refere-se a hibridização em uma solução 6X SSC a 650C. Como também usado aqui, "condições altamente estringentes " refere-se a hibridização durante a noite a 65°C em IOX solução Denharts, 6X SSC5 0,5% SDS, e ΙΟΟμ^ιηΙ DNA de esperma de salmão desnaturado. Blots são lavados seqüencialmente a 650C durante 30 minutos cada vez em 3X SSC/0,1% SDS, seguido por IX SSC/0,1% SDS5 e finalmente O5IX SSC/0,1% SDS. Métodos para hibridização de ácido nucleico são descritos em Meinkoth e Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; Current Protocols in Molecular Biology5 Cap. 2, Ausubel et al. Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience5 New York, 1995; e Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Acid Nucleic Probes5 Parte I, Cap. 2, Elsevier, New York, 1993. Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção que hibridiza sob condições estringentes ou altamente estringentes para uma seqüência de SEQ ID NO: 1 corresponde a uma molécula naturalmente ocorrendo molécula de ácido nucleico. Como usado aqui, uma molécula "ocorrendo naturalmente" de ácido nucleico refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos que ocorre na natureza (por exemplo, codifica um polipeptídeo natural). Em uma forma de realização, o ácido nucleico codifica um LPKSRP de Physcomitrella patens naturalmente ocorrendo.

Usando os acima descritos métodos, e outros conhecidos dos versados, um versado na arte pode isolar homólogos do LPKSRP de Physcomitrella patens compreendendo uma seqüência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 2. Um subconjunto destes homólogos é de variantes alélicos. Como usado aqui, o termo "variante alélica " refere-se a uma seqüência de nucleotídeos contendo polimorfísmos que leva a mudanças nas seqüências de aminoácido de um LPKSRP e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie de planta ou variedade). Estas variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1-5% variância em um LPKSRP de ácido nucleico. Variantes alélicas podem ser identificadas por seqüenciamento de uma seqüência de ácido nucleico de interesse em uma número de diferentes plantas, que podem ser prontamente realizadas usando sondas de hibridização para identificar o mesmo locus genético de LPKSRP nestas plantas. Qualquer uma e todas estas variações de ácido nucleico e polimorfismos de aminoácidos resultantes ou variações em um LPKSRP que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional de um LPKSRP, são destinados a estar no escopo da invenção.

Além disso, molécula de ácido nucleicos codificando LPKSRPs da mesma ou de outras espécies s como análogos, ortólogos, e parálogos de LPKSRPs, são destinadas a estar no escopo da presente invenção. Como usado aqui, o termo "análogos" refere-se a dois ácidos nucleicos que tem a mesma ou similar função, mas que evoluíram separadamente em organismos não relacionados. Como usado aqui, o termo "ortólogos" refere-se a dois ácidos nucleicos de diferentes espécies, mas que evoluíram de um gene ancestral comum por especialização normalmente, ortólogos codificam polipeptídeos tendo a mesma ou similares funções. Como também usado aqui, o termo "parálogos" refere-se a dois ácidos nucleicos que são relacionados por duplicação dentro de um genoma. Os parálogos geralmente tem funções diferentes mas estas funções podem estar relacionadas (Tatusov, R.L. et al., 1997, Science 278(5338): 631-637). Análogos, ortólogos, e parálogos de LPKSRP ocorrendo naturalmente podem diferir do LPKSRP ocorrendo naturalmente por modificações pós translacionais, por diferenças de seqüência de aminoácidos, ou por ambos. As modificações pos- translacionais incluem derivatização química em vivo e em vitro de polipeptídeos, por exemplo, acetilação, carboxilação, fosforilação, ou glicosilação, e estas modificações podem ocorrer durante a síntese ou processamento de polipeptídeos ou após tratamento com enzimas de modificação isoladas. Em particular, ortólogos da invenção geralmente demonstram pelo menos 80-85%, mais preferivelmente, 85-90% ou 90-95%, e o mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, ou mesmo 99% identidade, ou 100% de identidade de seqüência, com toda ou parte da seqüência de aminoácido de LPKSRP naturalmente ocorrendo, e irão demonstrar uma função similar a um LPKSRP. Preferivelmente, um ortólogo e LPKSRP da presente invenção funciona como um modulador de crescimento da planta e/ou uma resposta ao estresse ambiental em uma planta e/ou funciona como um proteína quinase de tipo lectina. Mais preferivelmente, um ortólogo de LPKSRP aumenta o crescimento sob condições limitadas de água e/ou aumenta a tolerância ao estresse da planta.

Além de variantes de ocorrência natural de uma seqüência de LPKSRP que pode existir na população, o versado irá notar que mudanças podem ser introduzidas por mutação em uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, assim levando a mudanças na seqüência de aminoácido do LPKSRP codificado, sem alterar a atividade funcional do LPKSRP. Por exemplo, substituições de nucleotídeo levando a substituições de aminoácidos para resíduos de aminoácidos "não essenciais" podem ser feitas em uma seqüência de SEQ ID NO: 1. Um resíduo de aminoácido não essencial é um aminoácido que pode ser alterado da seqüência de tipo selvagem de um dos LPKSRPs sem alterar a atividade de referido LPKSRP, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial é requerido para atividade de LPKSRP. Outros resíduos de aminoácido, no entanto, (por exemplo, os que não são conservados ou somente semi-conservados no domínio tendo atividade de LPKSRP) podem não ser essenciais para atividade e assim são provavelmente condutores a uma alteração sem alterar a atividade de LPKSRP.

Assim, outro aspecto da invenção pertence a molécula de ácido nucleicos codificando LPKSRPs que contém mudanças em resíduos de aminoácido que não são essenciais para a atividade de LPKSRP. Estes LPKSRPs diferem em seqüência de aminoácido de uma seqüência contida em SEQ ID NO: 2, ainda retém pelo menos uma das atividades de LPKSRP descritas aqui. Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico isolada compreende a seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido pelo menos cerca de 50% idêntico à região de proteína quinase central de uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. Preferivelmente, o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico é pelo menos cerca de 50-60% idêntico à região de proteína quinase central de uma das seqüências de SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60-70% idêntico à região de proteína quinase central de uma das seqüências de SEQ ID NO: 2, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95% idêntico à região de proteína quinase central de uma das seqüências de SEQ ID NO: 2, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à região de proteína quinase central de SEQ ID NO: 2.

Em outra forma de realização, o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico é pelo menos cerca de 50-60% idêntico à seqüência de SEQ ID NO: 2, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60- 70% idêntico à seqüência de SEQ ID NO: 2, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95% idêntico à seqüência de SEQ ID NO: 2, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico à seqüência de SEQ ID NO: 2. Os homólogos preferidos de LPKSRP da presente invenção preferivelmente participam no crescimento da planta e/ou a resposta de tolerância ao estresse em uma planta, ou mais particularmente, funciona como uma proteína quinase de tipo lectina.

Uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um LPKSRP tendo identidade de seqüência com um polipeptídeo seqüência de SEQ ID NO: 2 pode ser criada por introdução de uma ou mais substituições, adições, ou deleções de aminoácidos em uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, respectivamente, de modo que uma ou mais substituições, adições ou deleções de ou mais aminoácido são introduzidas no polipeptídeo codificado. Mutações podem ser introduzidas no seqüência de SEQ ID NO: 1 por técnicas padrões, como mutagênese dirigida ao sítio de mutagênese mediada por PCR. ,Preferivelmente5 as substituições conservativas de aminoácido são feitas em um ou mais dos resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que o resíduo de aminoácido é recolocado com um resíduo aminoácido tendo a cadeia lateral similar.

Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidína), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico ), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanína, resíduo de metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanína, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um LPKSRP é preferivelmente recolocado com outro aminoácido resíduo da mesma família de cadeia lateral.

Alternativamente, em outra forma de realização, mutações pode ser introduzidos aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência codificando LPKSRP, como por mutagênese de saturação, e os resultantes mutantes podem ser triados para uma atividade de LPKSRP descrita aqui para identificar mutantes que retém a atividade de LPKSRP. Após mutagênese de uma das seqüências de SEQ ID NO: 1, o polipeptídeo codificado pode ser expressado recombinantemente e a atividade do polipeptídeo pode ser determinada por análise do crescimento e/ou tolerância ao estresse de uma planta expressando o polipeptídeo como descrito em Exemplo 7.

Adicionalmente, ácidos nucléicos de LPKSRP otimizados podem ser criados. Preferivelmente, um ácido nucleico de LPKSRP otimizado codifica um LPKSRP que modula o crescimento da planta e/ou modula a tolerância da planta a um estresse ambiental, e mais preferivelmente aumenta o crescimento da planta e/ou aumenta a tolerância da planta a um estresse ambiental quando de sua superexpressão na planta. Como usado aqui, "otimizado" refere-se ao ácido nucleico que é geneticamente engenheirado para aumentar sua expressão em uma dada planta ou animal. Para prover ácidos nucléicos LPKSRP otimizados na planta, a seqüência de DNA do gene pode ser modificada para 1) compreender códons preferidos para expressar altamente genes de planta; 2) compreender um teor de A+T ema uma composição de base de nucleotídeo ao substancialmente encontrado em plantas; 3) formar uma seqüência de iniciação na planta; ou 4) eliminar as seqüências que causam a desestabilização, poliadenilação inapropriada, degradação e terminação de RNA, ou que formam estruturas de grampos de cabelo secundárias ou sítios de emenda de RNA. A expressão aumentada de ácidos nucléicos de LPKSRP em plantas pode ser obtida por utilização da freqüência de distribuição de uso de códons em plantas em geral ou em uma planta particular. Métodos para otimizar a expressão de ácido nucleico em plantas podem ser encontrados em EPA 0359472; EPA 0385962; Pedido PCT No. WO 91/16432; patente US No. 5,380,831; patente US No. 5,436,391; Perlack et ai, 1991, Proc. Natl Acad. Sei. USA 88:3324-3328; e Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Como usado aqui, "freqüência de uso de códons preferido" refere-se a preferência exibida por uma célula hospedeira específica em uso de códons de nucleotídeo para especificar um dado aminoácido. Para determinar a freqüência de uso do códon particular em um gene, o número de ocorrências em que o códon no gene é dividido pelo número total de ocorrência de todos os códons especificando o mesmo aminoácído no gene. Similarmente, a freqüência de uso preferido de códons demonstrada pela célula hospedeira pode ser calculada tirando a média da freqüência de preferido uso de códons em um número grande de genes expressados pela célula hospedeira. É preferível que esta análise seja limitada a genes que são altamente expressados pela célula hospedeira. O desvio percentual da freqüência de uso preferido de códons para um gene sintético do que empregado pela célula hospedeira é calculado primeiro por determinação do desvio percentual da freqüência de uso do códon único do que da célula hospedeira seguido por obtenção do desvio médio de todos os outros códons. Como definido aqui, este cálculo incluí códons únicos (isto é, ATG e TGG). Em termos gerais, o desvio médio global do uso de códons de um gene otimizado do da célula hospedeira é calculado usando a equação 1A = η = 1 Z Xn - Yn Xn vezes 100 Z onde Xn = freqüência de uso para o códon η em uma célula hospedeira; Yn = freqüência de uso para o códon η no gene sintético; η representa um códon individual que especifica um aminoácido; e o número total de códons é Ζ. O desvio global da freqüência de uso de códons, A, para todos os aminoácidos deve ser preferivelmente menos do que cerca de 25%, e mais preferivelmente menos do que cerca de 10%.

Assim, um ácido nucleico de LPKSRP pode ser otimizado de modo que sua freqüência de distribuição de uso de códons se desvia, preferivelmente, em não mais do que 25% dos genes de plantas altamente expressados e, mais preferivelmente, não mais do que cerca de 10%. Além disso, consideração é dada à porcentagem do teor de G+C para degenerar a terceira base (monocotilédones parecem favorecer G+C nesta posição, onde dicotilédones não parecem). Também é reconhecido que o nucleotídeo XCG (onde X é A5 T, C, ou G) é o códon menos preferido em dicotiledôneas enquanto o códon XTA é evitado em tanto as monocotiledôneas como as dicotiledôneas. Os ácidos nucleicos de LPKSRP otimizados desta invenção também preferivelmente tem índices de evitar dupleto CG e TA se aproximando intimamente dos da planta hospedeira selecionada (por exemplo, Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, ou Oryza sativa). Mais preferivelmente, estes índices se desviam do hospedeiro em não mais do que cerca de 10-15%.

Além das moléculas de ácido nucleico codificando os LPKSRPs descrito acima, outro aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucleico isolada que são anti-sentido para o mesmo. Pensa-se que os polinucleotídeos anti-sentido inibem a expressão de genes do polinucleotídeo de marcação por ligação específica ao polinucleotídeo de marcação e interferência com a transcrição, emendas, transporte, tradução, e/ou estabilidade do polinucleotídeo de marcação. Métodos são descritos na arte anterior para a marcação de polinucleotídeo anti-sentido para o DNA cromossômico, para um transcrito de RNA primário para um mRNA processado.. Preferivelmente, as regiões de marcação incluem sítios de emenda, códons de iniciação de tradução, códons de terminação de tradução, e outras seqüências dentro da matriz de leitura aberta.

O termo "anti-sentido, " para os fins da invenção, refere-se a ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que é suficientemente complementar a toda ou a uma porção da gene, transcrito primário, ou mRNA processado, de modo a interferir com a expressão do gene endógeno. Os polinucleotídeos "complementares" são os que são capazes de formar pares de bases de acordo com regras de complementaridade padrões de Watson-Crick.

Especificamente, purinas irão formar pares de bases com pirimidinas para formar um combinação de guanina em par com citosina (G:C) e adenina em par com ou timina (A:T) no case de DNA, ou adenina em par com uracila (A:U) no case de RNA. Deve-se entender que dos polinucleotídeos podem hibridizar um no outro mesmo se eles não forrem completamente complementares um a cada outro, desde que cada tenha pelo menos uma região que é substancialmente complementar à outra. O termo " ácido nucleico anti-sentido " inclui cassetes de expressão de RNA de filamento único assim como DNA de filamento duplo que pode ser transcrito para produzir um RNA anti-sentido. Os ácidos nucléicos anti-sentido "ativos" são moléculas RNA anti-sentido que são capazes de hibridizar seletivamente um transcrito primário ou mRNA codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

O ácido nucleico anti-sentido pode ser complementar um filamento completo codificando LPKSRP, ou somente uma porção do mesmo. Em uma forma de realização, uma molécula anti-sentido de ácido nucleico é anti-sentido para uma "região de codificação" do filamento de codificação da seqüência de nucleotídeos codificando um LPKSRP. O termo "região de codificação" refere-se a uma região da seqüência de nucleotídeos compreendendo códons que são traduzidos em resíduos de aminoácido. Em outra forma de realização, a molécula anti-sentido de ácido nucleico é anti- sentido para uma "região de não codificação" do filamento de codificação da seqüência de nucleotídeos codificando um LPKSRP. O termo "região de não codificação" refere-se a 5' e 3' seqüências que flanqueiam a região de codificação que não são traduzidas em aminoácidos (isto é, também referidas as regiões não traduzidas5' e 3'). A molécula anti-sentido de ácido nucleico pode ser complementar à região completa de codificação de mRNA de LPKSRP, mas mais preferivelmente é um oligonucleotídeo que é anti-sentido a somente uma porção de codificação ou região de não codificação de mRNA de LPKSRP. Por exemplo, o oligonucleotídeo anti-sentido pode ser complementar a uma região circundando o sítio de início de tradução de mRNA de LPKSRP. Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ter, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 nucleotídeos em comprimento. Tipicamente, as moléculas anti-sentido da presente invenção compreendem um RNA tendo 60-100% de identidade de seqüência com pelo menos 14 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1, ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Preferivelmente5 a identidade de seqüência será de pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 98%, e o mais preferivelmente 99%.

Um ácido nucleico anti-sentido da invenção pode ser construído usando síntese química e reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na arte. Por exemplo, um ácido nucleico anti- sentido (por exemplo, um oligonucleotídeo anti-sentido) pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos modificados de vários modos projetado para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado entre os ácidos nucleicos anti-sentido e sentido, por exemplo, nucleotídeos substituídos por derivados de fosforotioato e acridina podem ser usados. Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usado para gerar o ácido nucleico anti-sentido incluem 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5- clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidróxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina, Nó-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5- metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5- metoxiaminometÍl-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'- metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacetico (v), wibutoxosina, pseudouracil, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, éster metílico de ácido uracil-5- oxiacético, uracil-5-ácido oxiacético (v), 5-metil-2- tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, e 2,6- diaminopurina. Alternativamente, o ácido nucleico anti-sentido pode ser produzido biologicamente usando um vetor de expressão em que um ácido nucleico foi subclonado em uma orientação anti-sentido (isto é, RNA transcrito do ácido nucleico inserido será de uma orientação anti-sentido para um ácido nucleico alvo de interesse, descrito ainda na seguinte subseção).

Em ainda outra forma de realização, a molécula anti-sentido de ácido nucleico da invenção é uma molécula α-anomérica de ácido nucleico.

Uma molécula α-anomérica de ácido nucleico forma híbridos de filamento duplo específicos com RNA complementar em que, contrário às unidades β- comuns, os filamentos correm em paralelo uns aos outros (Gaultier et al., 1987, Acid Nucleic Res. 15:6625-6641). A molécula anti-sentido de ácido nucleico pode também compreender um 2'-o-metilríbonucleotídeo (Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) ou análogos de RNA-DNA quiméricos (Inoue et al., 1987, FEBS Lett 215:327-330).

As moléculas anti-sentido de ácido nucleicos da invenção são tipicamente administradas a uma célula ou geradas in situ de modo que elas hibridizam com ou ligam a mRNA celular e/ou DNA genômico codificando um LPKSRP para assim inibir a expressão do polipeptídeo, por exemplo, por inibição da transcrição e/ou tradução. A hibridização pode ser por complementaridade de nucleotídeos convencional para formar um duplex estável ou, por exemplo, no caso de uma molécula anti-sentido de ácido nucleico que liga a duplexes de DNA, através de interações específicas na ranhura principal da hélice dupla. A molécula anti-sentido pode ser modificada de modo que ela especificamente liga a um receptor ou um antígeno expressado em uma superfície de célula selecionada por exemplo, por ligação da molécula anti-sentido de ácido nucleico a um peptídeo ou um anticorpo que liga a um receptor de superfície de célula ou antígeno. A molécula anti-sentido de ácido nucleico também pode ser distribuída para as células usando os vetores descritos aqui. Para obter concentrações intracelulares suficientes das moléculas anti-sentido, construções de vetor em que a molécula anti-sentido de ácido nucleico é colocada sob o controle do promotor forte procariótico, viral, ou eucariótico (incluindo planta) são preferidas.

Como um polinucleotídeo anti-sentido alternativo, ribozimas, polinucleotídeos sentido, ou RNA de filamento duplo (dsRNA) podem ser usados para reduzir a expressão de um polipeptídeo de LPKSRP. Como usado aqui, o termo "ribozima" refere-se a uma enzima com base em RNA catalítico com atividade ribonuclease que é capaz de clivar um ácido nucléico de filamento único, como um mRNA, ao qual ele tem uma região complementar. Ribozimas (por exemplo, ribozimas hammerhead descritas em Haselhoff e Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) podem ser usadas para clivar cataliticamente transcritos de mRNA d eLPKSRP para assim inibir a tradução de mRNA de LPKSRP. Uma ribozima tendo especificidade para um ácido nucleico codificando LPKSRP pode ser projetada com base em uma seqüência de nucleotídeos de um cDNA de LPKSRP como relatado aqui (isto é, SEQ ID NO: 1) ou com base em seqüência heteróloga a ser isolada de acordo com métodos ensinados na invenção. Por exemplo, um derivado de RNA Tetrahymena L-19 IVS pode ser construído em que a seqüência de nucleotídeos do sítio ativo é complementar a uma seqüência de nucleotídeos a ser clivada em um mRNA codificando LPKSRP. Ver, por exemplo, patente US Nos. 4,987,071 e 5,116,742 para Cech et al. Alternativamente, mRNA de LPKSRP pode ser usado para selecionar um RNA catalítico tendo uma atividade de ribonuclease específica de um conjunto de moléculas de RNA. Ver, por exemplo, Bartel, D. e Szostak, J.W., 1993, Science 261:1411-1418. Em formas de realização preferidas, a ribozima irá conter uma porção tendo pelo menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20 nucleotídeos, e mais preferivelmente 7 ou 8 nucleotídeos, que tem 100% de complementaridade para uma porção do RNA de marcação. Métodos para fabricar ribozimas são conhecidos dos versados na arte. Ver, por exemplo, patente US Nos. 6,025,167; 5,773,260; e 5,496,698.

O termo "dsRNA," como usado aqui, refere-se a híbridos de RNA compreendendo dois filamentos de RNA. Os dsRNAs podem ser lineares ou circulares em estrutura. Em uma forma de realização preferida, dsRNA é específico para um polinucleotídeo codificando ou o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 sobre um domínio central de proteína quinase. Os RNAs de hibridização podem ser substancialmente ou completamente complementares. Por "substancialmente complementar," significa-se que quando os dois RNAs de hibridização são otimamente alinhados usando o programa BLAST como descrito acima, as porções de hibridização são pelo menos 95% complementares. Preferivelmente, os dsRNA terão pelo menos 100 pares de base em comprimento. Tipicamente, os RNAs de hibridização são de comprimento idêntico sem as extremidades de ganchos 5' ou 3' e sem espaços. No entanto, dsRNAs tendo ganchos 5' ou 3' de até 100 nucleotídeos podem ser usados nos métodos da invenção.

O dsRNA pode compreender ribonucleotídeos, análogos de ribonucleotídeo como resíduos de 2'-0-metil ribosil, ou suas combinações. Ver, por exemplo, patentes US Nos. 4.130.641 e 4.024.222. Um dsRNA ácido poliriboinosínico: ácido poliribocitidílico é descrito em patente US 4.283.393. Métodos para fazer e usar dsRNA são conhecidos na arte. Um método compreende a transcrição simultânea de dois filamentos complementares de DNA, ou in vivo, ou em uma mistura de reação in vitro única. Ver, por exemplo, patente US No. 5.795.715. Em uma forma de realização, dsRNA pode ser introduzido em uma planta ou célula de planta diretamente por procedimentos de transformação padrões. Alternativamente, dsRNA pode ser expressado em uma célula de planta por transcrição de dois RNAs complementares.

Outros métodos para a inibição de expressão de gene endógena, como formação de hélice tripla (Moser et al., 1987, Science 238:645-650 e Cooney et al, 1988, Science 241:456-459) e co-supressão (Napoli et al., 1990, The Plant Cell 2:279-289) são conhecidos na arte. cDNAs de comprimento parcial e total tem sido usados para a co-supressão de genes de plantas endógenos. Ver, por exemplo, patentes US Nos. 4.801.340, 5.034.323, 5.231.020, e 5.283.184; Van der Kroll et al., 1990, The Plant Cell 2:291-299; Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genetics 224:477-481; e Napoli et al., 1990, The Cell Plant 2:279-289.

Para a supressão de sentido, acredita-se que a introdução do polinucleotídeo sentido bloqueia a transcrição do gene de marcação correspondente. O polinucleotídeo sentido terá pelo menos 65% de identidade de seqüência com o gene de planta de marcação ou RNA. Preferivelmente, a identidade percentual é pelo menos 80%, 90%, 95%, ou mais. O polinucleotídeo sentido introduzido não precisa ser de comprimento completo com relação ao gene de marcação ou transcrito. Preferivelmente, o polinucleotídeo sentido terá pelo menos 65% de identidade de seqüência com pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 1. As regiões de identidade podem compreender introns e/ou exons e regiões não traduzidas. O polinucleotídeo sentido introduzido pode estar presente em uma célula de planta transientemente, ou pode ser estavelmente integrado em um cromossomo ou replicon extracromossômico de uma planta.

Alternativamente, expressão de gene LPKSRP pode ser inibida por marcação de seqüências de nucleotídeos complementares à região regulatória de uma seqüência de nucleotídeos de LPKSRP (por exemplo, um promotor de LPKSRP e/ou melhorador) para formar estruturas de hélice tripla, que evitam a transcrição de um gene de LPKSRP em células alvo. Ver geralmente, Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et ai, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; e Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15.

Além de ácidos nucleicos e polipeptídeos de LPKSRP descritos acima, a presente invenção engloba estes ácidos nucleicos e polipeptídeos fixados a uma porção. Estas porções incluem, mas não são limitadas a, porções de detecção, porções de hibridização, porções de purificação, porções de distribuição, porções de reação, porções de ligação, e outras. Um grupo típico de ácidos nucleicos tendo porções fixadas são sondas e iniciadores. Sondas e iniciadores tipicamente compreendem um oligonucleotídeo substancialmente isolado. O oligonucleotídeo tipicamente compreende uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes em pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca de 25, mais preferivelmente cerca de 40, 50, ou 75 nucleotídeos consecutivos do filamento sentido de uma das seqüências especificadas em SEQ ID NO: 1; uma seqüência anti-sentido de uma das seqüências especificadas em SEQ ID NO:l; ou mutantes naturalmente ocorrendo das mesmas. Os iniciadores com base em uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l podem ser usados em reações PCR para clonar os homólogos de LPKSRP. Sondas com base em seqüências de nucleotídeos de LPKSRP podem ser usadas para detectar transcritos ou seqüências genômicas codificando os mesmos ou polipeptídeos substancialmente idênticos. Em formas de realização preferidas, a sonda ainda compreende um grupo de rótulo fixado na mesma, por exemplo o grupo de rótulo pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Estas sondas podem ser usadas como uma parte do kit de teste de marcador genômico para identificar células que expressam um LPKSRP, como por medida de um nível de um ácido nucleico codificando LPKSRP, em uma amostra de células, por exemplo, detectando os níveis de mRNA de LPKSRP ou determinando se um gene de LPKSRP genômico foi mudado ou deletado. Em particular, um método utilizável para verificar o nível de transcrição do gene (um indicado da quantidade de mRNA disponível para tradução no produto de gene) é realizar um Northern blot (Para referência, Ver, por exemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). A informação de um Northern blot pelo menos parcialmente demonstra o grau de transcrição do gene transformado. O RNA celular RNA total pode ser preparado de células, tecidos, ou órgãos por vários métodos, todos bem conhecidos na arte, como que descrito em Bormann, E.R. et al., 1992, Mol. Microbiol. 6:317-326. Para avaliar a presença ou quantidade relativa de polipeptídeo traduzido deste mRNA, técnicas padrões, como Western blot, podem sem empregadas. Estas técnicas são bem conhecidas do versado na arte. (ver, por exemplo, Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).

A invenção ainda provê um vetor de expressão recombinante isolado compreendendo um ácido nucleico LPKSRP como descrito acima, em que a expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta em crescimento aumentado e/ou tolerância a estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem de uma célula hospedeira. Como usado aqui, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é a "plasmídeo," que refere-se a um laço de DNA circular de filamento duplo em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no vetor. Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais são integrados no genoma da célula hospedeira quando da introdução em uma célula hospedeira, e assim são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, alguns vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais eles são ligados operativamente. Estes vetores são referidos aqui como "vetor de expressão". Geralmente, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante não formam com freqüência plasmídeos. No presente relatório, "plasmídeo " e "vetor" podem ser usados de modo interpermutável como o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção se destina a incluir estas outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos na replicação, adenovírus, e vírus adeno-associado), que servem a funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem o ácido nucleico da invenção em uma forma apropriada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que é ligada operativamente para a seqüência de ácido nucleico a ser expressada. Como usado aqui com relação ao vetor de expressão recombinante, "ligado operativamente" se destina a significar que a seqüência de nucleotídeos de interesse é ligada à seqüência(s) regulatória em um modo que permite a expressão da seqüência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução em vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido em uma célula hospedeira). O termo "seqüência regulatória" se destina a incluir promotores, melhoradores, e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Estas seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Planta Biology molecular and Biotechnology, eds. Glick e Thompson, Cap. 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton5 Florida, incluindo as referências aqui. As seqüências regulatórias incluem as que dirigem expressão constitutiva da seqüência de nucleotídeos em muitos tipos de célula hospedeiras e as que dirigem expressão da seqüência de nucleotídeos somente em algumas células hospedeiras ou sob algumas condições. Será notado pelo versado na arte que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de polipeptídeo desejado, etc. O vetor de expressão da invenção pode ser introduzido em células hospedeiras para assim produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão ou peptídeos, codificados por ácidos nucleicos como descrito aqui (por exemplo, LPKSRPs, formas mutantes de LPKSRPs, polipeptídeos de fusão, etc.).

O vetor de expressão recombinante da invenção pode ser projetado para expressão de LPKSRPs em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, genes de LPKSRP podem ser expressados em células bacterianas como C. glutamicum, células de insetos (usando vetor de expressão de baculovirus), células de leveduras e outros fungos (ver Romanos, M.A. et al., 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.MJ.J. et al., 1991, expressão de genes heterólogos em fungos filamentosos, em: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure5 eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; e van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991, sistemas de transferência de genes e desenvolvimento de vetores para fungos filamentosos, em: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251), ciliatos do tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium5 Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, e Stylonychia, especialmente do gênero Stylonychia lemnae com vetores seguindo um método de transformação método como descrito em pedido PCT No. WO 98/01572, e células de planta multicelulares (ver Schmidt, R. e Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-meáiaied transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotiledone explants, Cell Planta Rep. 583-586; Planta Biology molecular and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Técnicas para transferência de genes, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. BioL 42:205- 225 e referencias citadas nos mesmos) ou células de mamíferos. Os hospedeiros apropriados são discutidos ainda em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido em vitro, por exemplo usando seqüências regulatórias T7 de promotor e polimerase de T7.

Expressão de polipeptídeos em procarióticos é realizada com maior freqüência com vetores contendo promotores constitutivos ou indutíveis dirigindo a expressão de polipeptídeos de fusão ou não fusão. Os vetores de fusão aumentam o número de aminoácidos para um polipeptídeo codificado aqui, geralmente no amino término do polipeptídeo recombinante mas também no C-término ou fundido dentro de regiões apropriadas nos polipeptídeos. Estes vetores de fusão tipicamente servem a três fins: 1) para aumentar a expressão do polipeptídeo recombinante; 2) para aumentar a solubilidade do polipeptídeo recombinante; e 3) para auxiliar na purificação do polipeptídeo recombinante por atuação como um ligando em purificação por afinidade. Com freqüência em vetores de expressão de fusão, o sítio de clivagem proteolítico é introduzido na junção da porção de fusão e o polipeptídeo recombinante para permitir a separação do polipeptídeo recombinante da porção de fusão subseqüente à purificação dos polipeptídeos de fusão. Estas enzimas, e suas seqüências de reconhecimento cognatas, incluem Fator Xa, trombina, e enteroquinase.

Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. e Johnson5 K.S., 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fundem glutationa S-transferase (GST)3 polipeptídeo de ligação a maltose E, ou polipeptídeo A, respectivamente, no polipeptídeo recombinante alvo. Em uma forma de realização, a seqüência de codificação do LPKSRP é clonada em um vetor de expressão pGEX para criar um vetor codificando um polipeptídeos de fusão compreendendo, do N-término ao Ο- término, sítio X de polipeptídeo de clivagem de GST-trombina. Os polipeptídeos de fusão pode ser purificados por cromatografia de afinidade usando resina glutationa-agarose. O LPKSRP recombinante não fundido em GST pode ser recuperado por clivagem dos polipeptídeos de fusão com trombina.

Exemplos de vetores de expressão de E. coli não de fusão apropriados incluem pTrc (Amann et al, 1988, Gene 69:301-315) e pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods em Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89). A expressão do gene alvo do vetor pTrc se baseia em transcrição de RNA polimerase de um promotor híbrido de fusão trp-lac. A expressão do gene de marcação do vetor pET 11d se baseia na transcrição de um promotor de fusão T7 gnlO-Iac mediado por uma RNA polimerase co-expressada viral (T7 gnl). Esta polimerase viral é suprida por células hospedeiras BL21(DE3) ou HMS174(DE3) de um gene residente λ profago abrigando um gene T7 gnl sob o controle transcripcional do promotor lacUV 5.

Uma estratégia para maximizar a expressão de polipeptídeo recombinante consiste em expressar o polipeptídeo em uma bactéria hospedeira com uma capacidade prejudicada para clivar proteoliticamente o polipeptídeo recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128). Outra estratégia consiste em alterar a seqüência do ácido nucleico a ser inserida em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cada aminoácido são os preferivelmente utilizados na bactéria selecionada para expressão, como C. glutamicum (Wada et ai, 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Esta alteração de seqüências de ácido nucleico da invenção pode ser realizada por técnicas padrões de síntese de DNA.

Em outra forma de realização, o vetor de expressão de LPKSRP é a vetor de expressão de levedura. Exemplos de vetores para expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari, et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vetores e métodos para a construção de vetores apropriados para uso em outros fungos, como fungos filamentosos, incluem os detalhados em: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, PJ., 1991, "Gene transfer sycaules and vector development for filamentous fungi," emn: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativamente, o LPKSRPs da invenção pode ser expressado em células de insetos usando vetores de expressão de baculovirus. Vetores de baculovirus disponíveis for expressão de polipeptídeos em células de insetos cultivadas (por exemplo, células Sf 9) incluem a série pAc (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow e Summers, 1989, Virology 170:31-39).

Em ainda outra forma de realização, um ácido nucleico de LPKSRP da invenção é expressado em células de mamíferos usando um vetor de expressão de mamíferos. Exemplos de vetores de expressão de mamíferos incluem pCDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329:840) e pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-195). Quando usado em células de mamífero, as funções de controle do vetor de expressão são com freqüência providas por elementos regulatórios virais. Por exemplo, promotores comumente usados são derivados de polioma, Adenovírus 2, citomegalovírus, e vírus Simianos 40. For outros sistemas de expressão apropriados para células procarióticas e eucarióticas, ver capítulos 16 e 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Última ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press9 Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Em outra forma de realização, o vetor de expressão recombinante de mamífero é capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico preferivelmente em um tipo de célula particular (por exemplo, elementos regulatórios específicos de tecido são usados para expressar o ácido nucleico). Os elementos regulatórios específicos de tecido são conhecidos na arte. Exemplos não limitativos promotores específicos de tecido incluem o promotor de albumina (específico de fígado; Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfóides (Calame e Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), em particular promotores de receptores de células T (Winoto e Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733), e imunoglobulinas (Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen e Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), promotores específicos de neurônios (por exemplo, o promotor de neurofilamentos; Byrne e Ruddle, 1989, PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de pâncreas (Edlund et al., 1985, Science 230:912-916), e promotores específicos de glândula mamária (por exemplo, promotor de soro de leite; Patente US No. 4,873,316 e Publicação de pedido europeu No. 264,166). Promotores regulados no desenvolvimento são também englobados, por exemplo, os promotores hox de murinos (Kessel e Gruss, 1990, Science 249:374-379) e o promotor de fetopolipeptídeo (Campes e Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546).

Para uma transfecção estável de células de mamíferos, conhece-se que dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usada, somente um fração pequena de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos ou herbicidas) é geralmente introduzido em uma célula hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos incluem os que conferem resistência a drogas, como G418, higromicina, metotrexato ou em plantas que conferem resistência para um herbicida como glofosato, glufosinato ou imidazolinona. Molécula de ácidos nucleicos codificando um marcador selecionável pode ser introduzida em uma célula hospedeira no mesmo vetor como que codificando um LPKSRP ou pode ser introduzida em um vetor separado. Células estavelmente transfectadas com as moléculas introduzidas de ácido nucleico podem ser identificadas por, por exemplo, seleção de herbicidas (por exemplo, células que foram incorporadas o gene do marcador selecionável irão sobreviver, enquanto as outras células morrem).

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, os LPKSRPs são expressados em plantas e células de plantas como células de plantas unicelulares (por exemplo algas) (ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 e referências no mesmo) e células de planta de plantas superiores (por exemplo, os espermatófitos como plantas de cultura) Um LPKSRP pode ser "introduzido" em uma célula de planta por quaisquer meios, incluindo transfecção, transformação ou transdução, electroporação, bombardeio de partículas, agroinfecção, e outros. Um método de transformação conhecido dos versados na arte é a imersão da planta florescendo em uma solução de Agrobacteria, em que Agrobacteria contém o ácido nucleico de LPKSRP, seguido por reprodução dos gametas transformados.

Outros métodos apropriados para transformar ou transfectar células hospedeiras incluindo células de planta podem ser encontrados em Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Última ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros manuais de laboratório como Methods em Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Um aumento no crescimento da planta e/ou tolerância biótica ou abiótica ao estresse são traços gerais desejados que seja herdados em uma ampla variedade de plantas como milho, trigo, cevada, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, semente de colza e canola, mandioca, pimentão, girassol e tagetes, plantas solanáceas como batata, tabaco, berinjela, e tomate, espécies Vicia, ervilha, alfafa, plantas de arbustos (café, cacau, cá), espécie Salix, árvores (palma de óleo, coco), gramíneas perenes, e culturas de ferragem, estas plantas de cultura são também preferidas plantas alvo para a engenharia genética como ainda outra forma de realização da presente invenção. As culturas de ferragem incluem, mas não são limitadas a, broto de trigo, alpiste, bromo, cuancao, poa pratense, gramíneas de pomar, alfafa, salfoin, cornichão, trevo Alsike trevo vermelho e trevo doce.

Em uma forma de realização da presente invenção, transfecção de um LPKSRP em uma planta é obtida por transferência de genes mediada por Agrobacterium. A transformação da planta mediada por Agrobacterium pode ser realizada usando por exemplo GV3101(pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) ou cepa LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens. Transformação pode ser realizada por técnicas padrões de transformação e regeneração (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A, Plant Biology molecular Manual, 2a Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - em Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BTll-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Planta Biology molecular and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493- 5164-2). Por exemplo, semente de colza pode ser transformada via transformação de cotilédone ou hipocótile (Moloney et al., 1989, Cell Planta Report 8:238-242; De Block et al., 1989, Planta Physíol. 91:694-701). Uso de antibióticos para Agrobacterium e seleção de plantas depende do vetor binário e a cepa de Agrobacterium usada para transformação. A seleção de semente de colza é normalmente realizada usando canamicina como marcador de planta apropriado. A transferência de genes mediada por Agrobacterium em linho pode ser realizada usando, por exemplo, um técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Cell Planta Report 13:282-285. Adicionalmente, transformação de soja pode ser realizada usando por exemplo a técnica descrita em patente européia No. 0424 047, patente US No. 5,322,783, patente européia No. 0397 687, patente US No. 5,376,543, ou patente US No. 5,169,770. Transformação de milho pode ser obtida por bombardeio de partículas, absorção de DNA mediada por polietileno glicol, ou via técnica de fibra de carboneto de silício, (ver, por exemplo, Freeling e WalbofThe corn handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específica de transformação de milho é encontrado em patente US No. 5,990,387, e um exemplo específica de transformação de trigo pode ser encontrado em Pedido PCT No. WO 93/07256.

De acordo com a presente invenção, o LPKSRP introduzido pode ser mantido em uma célula de planta estavelmente se ele for incorporado em um replicon autônomo não cromossomo ou integrado no cromossomo da planta. Alternativamente, o LPKSRP introduzido pode estar presente em um vetor não replicante extra-cromosomo e pode ser transientemente expressado ou transientemente ativo.

Em uma forma de realização, um homólogo de microorganismo recombinante pode ser criado em que o LPKSRP é integrado em um cromossomo, um vetor é preparado que contém pelo menos uma porção de um gene de LPKSRP em que a deleção, adição, ou substituição foi introduzida para assim, alterar, por exemplo, romper funcionalmente o gene LPKSRP. Preferivelmente, o gene de LPKSRP é um gene LPKSRP de Physcomitrella patens, mas pode ser um homólogo de uma planta relacionada ou mesmo de uma fonte de mamífero, levedura ou inseto. Em uma forma de realização, o vetor é projetado de modo que, quando da recombinação de homólogos, o gene de gene de LPKSRP é funcionalmente rompido (isto é, não mais codifica um polipeptídeo funcional; também referido um vetor de nocaute). Alternativamente, o vetor pode ser projetado de modo que, quando da recombinação de homólogos, o gene de LPKSRP homólogo é mudado ou de outra forma alterado, mas ainda codifica um polipeptídeo funcional (por exemplo, região regulatória a montante pode ser alterada para assim alterar a expressão do LPKSRP endógeno). Para criar uma mutação por pontos via recombinação homóloga, híbridos de DNA-RNA podem ser usados em uma técnica conhecida como chimeraplasty (Cole-Strauss et al., 1999, ácido Nucleic Research 27(5): 1323-1330 e Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientist 87(3):240-247). Procedimentos de recombinação de homólogos em Physcomitrella patens são também bem conhecidos na arte e são contemplados para uso aqui.

Enquanto no vetor de recombinação homólogo a porção alterada do gene de LPKSRP é flanqueada em suas extremidades 5' e 3' por uma molécula de ácido nucleico adicional do gene de LPKSRP para permitir a recombinação homóloga ocorrer entre o gene exógeno do LPKSRP transportado pelo vetor e um gene endógeno de LPKSRP, em uma microorganismo ou planta. A molécula de ácido nucleico de LPKSRP de flanco adicional é de comprimento suficiente para a recombinação de homólogos com sucesso com o gene endógeno. Tipicamente, várias centenas de pares de base de até kilobases de DNA de flanco (em ambas as extremidades 5' e 3') são incluídos no vetor (ver por exemplo, Thomas, K.R., e Capecchi, M.R., 1987, Cell 51:503 para uma descrição de vetores homólogos de recombinação ou Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8):4368-4373 para cDNA com base em recombinação em Physcomitrella patens). O vetor é introduzido em um microorganismo ou célula de planta (por exemplo, via DNA mediado por polietileno glicol), e células em que os genes introduzidos de LPKSRP recombinaram de modo homólogo com os gene de LPKSRP endógeno são selecionadas usando técnicas bem conhecidas na arte.

Em outra forma de realização, microorganismos recombinantes podem ser produzidos que contém sistemas que permitem a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão de um gene de LPKSRP em um vetor colocando o mesmo sob o controle do operon Iac permite a expressão do gene de LPKSRP somente na presença de IPTG. Estes sistemas regulatórios são bem conhecidos na arte.

Quando presente em um vetor não replicante extra- cromossômico não replicante ou um vetor que é integrado em um cromossomo, o polinucleotídeo de LPKSRP preferivelmente reside em um cassete de expressão de planta. Um cassete de expressão de planta preferivelmente contém seqüências regulatórias capazes de dirigir a expressão de genes em células de planta que são ligadas operativamente de modo que cada seqüência podem preencher sua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Os preferidos sinais de poliadenilação são os se originando de t-DNA de A grobacterium tumefaciens como o gene 3 conhecido como octopina sintase do Ti-plasmídeo pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou equivalentes funcionais do mesmo, mas também todos os outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são apropriados. Como a expressão do gene de planta é com muita freqüência não limitada em níveis de transcrição, um cassete de expressão de planta preferivelmente contém outras seqüências ligadas operativamente como melhoradores de tradução como a seqüência over-drive contendo a seqüência de líder 5'-não traduzida de vírus do mosaico do tabaco melhorando o polipeptídeo por relação de RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Exemplos de vetores de expressão de planta incluem os detalhados em: Becker, D., Kemper, E., Schellj J. e Masterson, R., 1992, New plant binaiy vectors with seletable markers located proximal to the Ieft border, Planta Mol. Biol. 20: 1195-1197; e Bevan, M.W., 1984, Binaiy Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711- 8721; Vectors for Gene Transfer em Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

A expressão de genes de plantas deve estar ligada operativamente a um promotor apropriado conferindo expressão de gene em um modo sincronizado, específico para célula ou específico para tecido. Promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem qualquer promotor que é capaz de iniciar a transcripção em uma célula de planta. Estes promotores incluem, mas não são limitadas aos que podem ser obtidos de plantas, vírus de plantas, e bactéria que contém genes que são expressados em plantas, como Agrobacterium e Rhizobium.

O promotor pode ser constitutivo, indutível, preferido no estágio de desenvolvimento, preferido de tipo de célula, preferido de tecido, ou preferido de órgão. Os promotores constitutivos são ativos na maior parte das condições. Exemplos de promotores constitutivos incluem promotores CaMV 19S e 35 S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302) o promotor Sepl, o promotor de actina de arroz (McElroy et al., 1990, Cell Plant 2:163-171), promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de ubiquitana (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689), pEmu (Last et al, 1991, Theor. Appl. Genet 81:581-588), o promotor do virus 35S do mosaico da escrofulária, o promotor de Smas (Velten et al., 1984, EMBO J 3:2723-2730), o promotor de GRP1-8 o promotor de cinnamil álcool desidrogenase (patente US No. 5,683,439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, como mannopina sintase, nopalina sintase, e octopina sintase, promotor de subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO), e outros.

Os promotores indutíveis são preferivelmente ativos sob algumas condições ambientais, como a presença ou ausência de nutrientes ou metabólitos, calor ou frio, luz, ataque de patógenos, condições anaeróbicas e outros. Por exemplo, o promotor hsp80 de Brassica é induzido por choque térmico, o promotor PPDK é induzido por luz; o promotor PR-I de tabaco, Arabidopsis, e milho são indutíveis por infecção com um patógeno; e o promotor Adhl é induzido por hipoxia e estresse de frio. A expressão de genes de plantas pode também ser facilitada via um promotor indutível ( Para estudo, ver Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Planta MoL Biol. 48:89- 108). Os promotores quimicamente indutíveis são especialmente apropriado se a expressão de genes for desejada para ocorrer em um modo específica para o tempo. Exemplos destes promotores são um promotor indutível de ácido salicílico (Pedido PCT No. WO 95/19443), um promotor indutível de tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404), e um promotor indutível por etanol (Pedido PCT No. WO 93/21334).

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o promotor indutível é um promotor indutível por estresse. Para a fins da invenção, promotores indutíveis por estresse são preferivelmente ativos sob um ou mais dos seguintes estresses: condições sub-ótimas associadas com salinidade, seca, temperatura, metal, produto químico, patogênicos, e estresses oxidativos. Os promotores indutíveis por estresse incluem, mas não são limitadas a, Cor78 (Chak et ai., 2000, Plant 210:875-883; Hovath et al., 1993, Planta Physiol. 103:1047-1053), Corl 5a (Artus et al., 1996, PNAS 93(23): 13404-09), Rci2A (Medina et al., 2001, Plant Physiol. 125:1655-66; Nylander et al, 2001, Plant Mol. Biol. 45:341-52; Navarre e Goffeau, 2000, EMBO J. 19:2515-24; Capei et al., 1997, Plant Physiol. 115:569-76), Rd22 (Xiong et al., 2001, Plant Cell 13:2063-83; Abe et al., 1997, Plant Cell 9:1859-68; Iwasaki et al., 1995, MoL Gen. Genet. 247:391-8), cDet6 (Lang e Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20:951-62), ADHl (Hoeren et al., 1998, Genetics 149:479-90), KATl (Nakamura et al., 1995, PlantPhysioL 109:371- 4), KSTl (Müller-Rõber et al., 1995, EMBO 14:2409-16), Rhal (Terryn et al., 1993, Cell Plant 5:1761-9; Terryn et al., 1992, FEBS Lett 299(3):287-90), ARSKl (Atkinson et al., 1997, GenBank acesso # L22302, e pedido PCT No. WO 97/20057), PtxA (Plesch et al., GenBank Acesso # X67427), SbHRGP3 (Ahn et al, 1996, Cell Plant 8:1477-90), GH3 (Liu et al, 1994, Cell Plant 6:645-57), o promotor do gene PRPlindutivel por patógeno, (Ward et al, 1993, Plant. MoL Biol. 22:361-366), o promotor de tomate hsp80 indutível por - (patente US No. 5187267), promotor de batata alfa-amilase indutível por frio (Pedido PCT No. WO 96/12814), ou o promotor pinll indutível por ferida - (patente européia No. 375091). Para outros exemplos de promotores indutíveis por seca, frio e sal, como o promotor RD29A, ver Yamaguchi- Shinozalei et al, 1993, MoL Gen. Genet. 236:331-340.

Os promotores preferidos no estágio de desenvolvimento são preferivelmente expressados em alguns estágios de desenvolvimento. Os promotores preferidos de tecido e órgãos incluem os que são preferivelmente expressados em alguns tecidos ou órgãos, como folhas, raízes, sementes, ou xilemo. Exemplos de promotores preferidos de tecido e preferidos de órgãos incluem, mas não são limitados a promotores a preferidos de frutas, preferidos de óvulos, preferidos de tecido masculino, preferidos de semente, preferidos de integumentos, preferidos de tubérculos, preferido de talos, preferidos de pericarpo, preferidos de folha, preferidos de estigma, preferidos de pólen, preferidos de antero, preferidos de pétalas, preferidos de pétalas, preferidos de sépalas, preferidos de pedicelos, preferidos de sílicos, preferidos de hastes, preferidos de raízes e outros. Promotores preferidos de semente são preferivelmente expressados durante o desenvolvimento da semente e/ou germinação. Por exemplo, promotores preferidos de semente podem ser preferidos de embrião, preferidos de endosperma, e preferidos da capa da

semente Ver Thompson et al., 1989, BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferidos de semente incluem, mas não são limitadas a, celulose sintase (celA), Ciml, gama-zeina, globulina-1, zeína de milho 19 kD (cZ19Bl), e outros.

Outros promotores apropriados preferido de tecido ou preferido de órgãos incluem promotor de gene napina de semente de colza (patente US No. 5,608,152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3): 459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (pedido PCT No. WO 98/45461), promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente US No. 5,504,200), o -promotor Bce4de Brassica (pedido PCT No. WO 91/13980), ou o promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9), assim como promotores conferindo expressão específica de semente em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, cevada, arroz, etc. Os promotores apropriado de notar são o promotor de cevada de genes lpt2 ou Iptl (pedido PCT No. WO 95/15389 e PCT No. WO 95/23230) ou os descritos em pedido PCT No. WO 99/16890 (promotores do gene hordeina de cevada, gene glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene prolamina de arroz, gene, gliadina de trigo, gene glutelina de trigo, gene glutelina de aveia, gene kasirina de sorgo, e gene secalina de cevada).

Outros promotores utilizáveis nos cassetes de expressão da invenção incluem, mas não são limitadas a, promotor de proteína de ligação de clorofila a/b, promotores de histona, o promotor Ap3, o promotor β- conglicina, o promotor de napina, o promotor de lectina de soja, o promotor de zeína de milho 15kD, o promotor de zeína 22kD, o promotor de zeína 27kD, o promotor de g-zeína, os promotor cerosos, shrunken 1, shrunken 2, e bronze, o promotor Zml3 (patente US No. 5,086,169), o promotor de poligalacturonase de milho (PG) (patente US Nos. 5,412,085 e 5,545,546), e o promotor SGB6 (patente US No. 5,470,359), assim como outros promotores sintéticos e naturais.

A flexibilidade adicional no controle de expressão de genes heterólogos em plantas pode ser obtida por uso de domínios de ligação de DNA e elementos de resposta de fontes heterólogas (isto <?, domínios de ligação de DNA de fontes não de planta). Um exemplo deste domínio de ligação de DNA heterólogo é o domínio de ligação de LexA DNA (Brent e Ptashne, 1985, célula 43:729-736).

A invenção ainda provê um vetor de expressão recombinante compreendendo uma molécula de DNA de LPKSRP da invenção clonada em vetor de expressão em uma orientação anti-sentido. Isto é, a molécula de DNA é ligado operativamente a uma seqüência regulatoria em um modo que permite a expressão (por transcripção da molécula de DNA) de uma molécula de RNA que é anti-sentido a um mRNA de LPKSRP. As seqüências regulatórias ligadas operativamente a uma molécula de ácido nucleico clonada na orientação anti-sentido podem ser selecionadas que dirigem a expressão contínua de molécula de RNA anti-sentido em uma variedade de tipos de célula. Por exemplo, promotores e/ou melhoradores virais ou seqüências regulatórias podem ser selecionadas que dirigem uma expressão constitutiva direta, específica para tecido, ou de tipo de célula de RNA anti- sentido. O vetor anti-sentido de expressão pode estar na forma de plasmídeo recombinante, fagemídeo ou vírus atenuado em que os ácidos nucleicos anti-sentido são produzidos sob o controle de região regulatoria de eficiência elevada. A atividade da região regulatoria pode ser determinada pelo tipo de célula, em que o vetor é introduzido. Para uma discussão da regulação de expressão de gene usando genes anti-sentido, ver Weintraub, H. et al., 1986, Anti-sense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), e Mol et al., 1990, FEBS Letters 268:427-430.

Outro aspecto da invenção pertence a células hospedeiras em que o vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados de modo interpermutável aqui. Entende-se que estes termos não se referem somente à célula particular mas que também se aplicam à progênie ou progênie potencial desta célula. Porque algumas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido ou a mutação ou influências ambientais, esta progênie pode, de fato, ser idêntica à célula parental, mas ainda estão incluídos dentro do escopo do termo como usado aqui. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um LPKSRP pode ser expressado em células bacterianas como C. glutamicum, células de insetos, células de fungos, ou células de mamíferos(como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS), algas, ciliatos, células de planta, fungos, ou outros microorganismos como C. glutamicum. Outras células hospedeiras apropriadas são conhecidas do versado na arte.

A célula hospedeira da invenção, como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser usada para produzir (isto é, expressar) um LPKSRP. Assim, um invenção ainda provê métodos para produzir LPKSRPs usando as células hospedeiras da invenção. Em uma forma de realização, o método compreende cultivar a célula hospedeira de invenção (em que um vetor de expressão recombinante codificando um LPKSRP foi introduzido, ou em que genoma foi introduzidos um e codificando um LPKSRP de tipo selvagem ou alterado) em um meio apropriado até o LPKSRP ser produzido. Em outra forma de realização, o método ainda compreende isolar LPKSRPs do meio ou da célula hospedeira. Outro aspecto da invenção pertence isolados de LPKSRP, e suas porções biologicamente ativas. Um polipeptídeo "isolado" ou "purificado" ou porção biologicamente ativa porção do mesmo é livre de algum do material celular quando produzido por técnicas de DNA recombinantes, ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. A expressão "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de LPKSRP em que o polipeptídeo é separado de alguns dos componentes celular das células em que ele é produzido naturalmente ou recombinantemente. Em uma forma de realização, a expressão "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um LPKSRP tendo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de material não LPKSRP (também referido aqui as a "polipeptídeo contaminar!te"), mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de material não LPKSRP, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de material não LPKSRP, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% material não LPKSRP.

Quando o LPKSRP ou porção biologicamente ativa do mesmo é produzido recombinantemente, ele é também preferivelmente substancialmente livre de meio de cultura, isto é, meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de 10%, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% do volume da preparação de polipeptídeo. A expressão "substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos" inclui preparações de LPKSRP em que o polipeptídeo é separado de precursores químicos ou outros químicos que estão envolvidos na síntese do polipeptídeo. Em uma forma de realização, a expressão "substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos" inclui preparações de um LPKSRP tendo menos do que cerca de 30% em peso seco) de precursores químicos ou LPKSRP não químicos, mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou LPKSRP não químicos, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de precursores químicos ou LPKSRP não químicos, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% precursores químicos ou LPKSRP não químicos. Em formas de realização preferidas, polipeptídeos isolados, ou suas porções biologicamente ativas, faltam polipeptídeos contaminantes do mesmo organismo do qual o LPKSRP é derivado. Tipicamente, estes polipeptídeos são produzidos por expressão recombinante de, por exemplo, um LPKSRP de Physcomitrella patens em uma planta diferente de Physcomitrella patens, ou microorganismos como C. glutamicum, ciliatos, algas, ou fungos.

As moléculas de ácido nucleicos, polipeptídeos, homólogos de polipeptídeo, polipeptídeos de fusão, iniciadores, vetores, e célula hospedeiras descritos aqui podem ser usados em um ou mais dos seguintes métodos: identificação de Physcomitrella patens e organismos relados; mapeamento de genomas de organismos relacionados com Physeomitrella patens; identificação e localização de seqüências de interesse de Physcomitrella patens; estudos evolucionários; determinação de regiões de LPKSRP requeridos para função; modulação de uma atividade de LPKSRP; modulação do metabolismo de uma ou mais funções de célula; modulação no crescimento da planta ou eficiência de uso de água de planta; modulação de resistência ao estresse; e modulação de expressão de ácidos nucleicos de LPKSRP. Em uma forma de realização destes métodos, o LPKSRP funciona como um proteína quinase de tipo lectina.

O musgo Physcomitrella patens é relacionado com outros musgos, como Ceratodon purpureus, que são capazes de crescimento na ausência de luz. Musgos como Ceratodon e Physeomitrella compartilham um grau elevado de identidade de seqüência no nível de seqüência de polipeptídeo e DNA permitindo o uso da triagem heteróloga de moléculas de DNA com sondas evoluindo de outros musgos ou organismos, assim permitindo a derivação da seqüência de consenso apropriada para triagem heteróloga ou anotação funcional e previsão das funções de genes em terceiras espécies. A capacidade para identificar estas funções pode, assim, ter lima significante relevância, por exemplo, previsão da especificidade do substrato de enzimas. Além disso, estas moléculas de ácido nucleico podem servir como pontos de referência para o mapeamento de genomas de musgos ou de genomas de organismos relacionados.

As moléculas de ácido nucleico de LPKSRP da invenção tem uma variedade de usos. O mais importante, as seqüências de ácido nucleico e de aminoácido da presente invenção podem ser usadas para transformar plantas, assim induzindo tolerância a estresses como seca, salinidade elevada, e frio. A presente invenção provê assim uma planta transgênica transformada por um ácido nucleico de LPKSRP, em que a expressão da seqüência de ácido nucleico na planta resulta em tolerância aumentada a estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. A planta transgênica pode ser uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. A invenção ainda provê que a planta transgênica pode ser selecionada de milho, trigo, cevada, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, semente de colza, canola, mandioca, pimentão, girassol, tagetes, plantas solanáceas, batata, tabaco, berinjela, tomate, espécies Vicia, ervilha, alfafa, café, cacau, chá, espécie Salix, palma de óleo, coco, gramínea perene, e cultura de forragens, por exemplo.

Em particular, a presente invenção descreve usar a expressão de PpLLPK-Ide Physcomitrella patens para engenheirar plantas com eficiência aumentada de uso de água e ou plantas tolerantes a seca tolerantes a sal e/ou tolerantes a frio. Esta estratégia foi aqui demonstrada para Arabidopsis thaliana, mas sua aplicação não é limitada a esta planta. Assim, a invenção provê uma planta transgênica contendo um LPKSRP como o PpLLPK-I como definido em SEQ ID NO: 2, em que a planta tem crescimento aumentado e/ou um tolerância aumentada a um estresse ambiental selecionado dentre um ou mais do grupo consistindo de estresses de seca, sal, calor, ou de congelamento. Em uma forma de realização preferida, o estresse ambiental é seca.

Assim, a invenção provê um método de produzir uma planta transgênica com um ácido nucleico codificando para PLK SRP, em que expressão do ácido(s) nucleico(s) em uma planta resulta em tolerância aumentada a estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta um vetor de expressão compreendendo um ácido nucléico de LPKSRP, e (b) gerar a partir de uma célula de planta uma planta transgênica com crescimento aumentado e/ou tolerância aumentada a um estresse ambiental como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta. A célula de planta inclui, mas não é limitada a um protoplasto, célula produzindo gameta e a célula que regenera em uma planta completa. Como usado aqui, o termo "transgênica" refere-se a qualquer planta, planta célula, calo, tecido de planta, ou parte da planta que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante é estavelmente integrado em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de modo que ele é passado a gerações sucessivas. Em formas de realização preferidas, o ácido nucleico de LPKSRP codifica uma proteína compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também provê um método de modular o crescimento da planta e/ou tolerância a um estresse ambiental compreendendo, modificar a expressão de um ácido nucleico codificando para PLKSRP na planta. O crescimento da planta e/ou tolerância ao estresse ambiental pode ser aumentado ou diminuído como obtido por aumento ou diminuição da expressão de um LPKSRP, respectivamente. Preferivelmente, o crescimento da planta e/ou tolerância ao estresse ambiental é aumentado por aumento da expressão de um LPKSRP. Expressão de um LPKSRP pode ser modificada por qualquer método conhecido do versado na arte. Os métodos de aumento da expressão de LPKSRPs podem ser usados em que a planta é ou transgênica ou não transgênica. Em casos quando a planta é transgênica, uma planta pode ser transformada com um vetor contendo qualquer um dos acima descritos ácidos nucleicos codificando para PLKSRPs, ou uma planta pode ser transformada com um promotor que dirige expressão de LPKSRP nativo na planta, por exemplo. A invenção provê que este promotor pode ser preferido de tecido, regulado no desenvolvimento, indutível por estresse, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, plantas não transgênicas podem tem a expressão de LPKSRP nativo modificado por indução de um promotor nativo. A expressão de PpLLPK-I como definido em SEQ ID NO: 2 em plantas alvo pode ser obtida mas não é limitada a um dos seguintes exemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor indutível por estresse, (c) promotor induzido por produto químico, e (d) superexpressão de promotor engenheirada com, por exemplo, fatores de transcripção derivados de dedo de zinco (Greisman e Pabo, 1997, Science 275:657).

Em uma forma de realização preferida, transcripção do LPKSRP é modulada usando fatores de transcripção derivados de dedo de zinco (ZFPs) como descrito em Greisman e Pabo, 1997, Science 275:657 e fabricados por Sangamo Biosciences, Inc. Estes ZFPs compreendem tanto um domínio de DNA reconhecimento como um domínio funcional que causa ativação ou repressão do ácido nucleico de marcação como um ácido nucléico de LPKSRP. Assim, a ativação e repressão de ZFPs podem ser criadas que especificamente reconhecem os promotores de LPKSRP descritos acima e usados para aumentar ou diminuir a expressão de LPKSRP em uma planta, assim modulando o crescimento e/ou a tolerância ao estresse da planta. A presente invenção também inclui identificação dos homólogos de PpLLPK-I como definido em SEQ ID NO: 2 em uma planta alvo, assim como o promotor do homólogo. A invenção também prove um método de aumento da expressão do gene de interesse dentro de uma célula hospedeira como comparado a uma variedade de tipo selvagem de uma célula hospedeira, em que o gene de interesse é transcrito em resposta a um LPKSRP compreendendo: (a) transformar a célula hospedeira com um vetor dj expressão compreendendo um ácido nucleico codificando para PLKSRP e (b) expressando o LPKSRP denfro de uma célula hospedeira, assim aumentando a expressão da gene transcrito em resposta a um LPKSRP, como comparado com uma variedade de tipo selvagem de uma célula hospedeira.

Além de introduzir as seqüências de ácido nucleico de LPKSRP em plantas transgênicas, estas seqüências podem também ser usadas para identificar um organismo como sendo Physcomitrella patens, ou um parente próximo do mesmo. Também, eles podem ser usados para identificar a presença de Physcomitrella patens, ou um parente do mesmo em uma população mista de microorganismos. A invenção provê as seqüências de fado nucleico dos vários genes d e Physcomitrella patens-, por sondagem do DNA genômico extraído da cultura da população única ou mista de microorganismos sob condições estringentes com uma sonda se estendendo na região do gene de Physcomitrella patens que é singular para este organismo, podendo-se assim verificar se este organismo está presente.

Além disso, as moléculas de ácido nucleico e polipeptídeo da invenção podem servir como marcadores para regiões específicas do genoma Isto tem utilidade não somente no mapeamento do genoma, mas também em estudos funcionais de polipeptídeos de Physcomitrella patens. Por exemplo para identificar a região do genoma em que um polipeptídeo de ligação J DNA de Physcomitrella patens liga, o genoma de Physcomitrella patens pode ser digerido, e os fragmentos incubados com o polipeptídeo de ligação a DNA. Estes fragmentos que ligam o polipeptídeo podem ser adicionalmente sondados com as moléculas de ácido nucleico da invenção, preferivelmente com rótulos prontamente detectáveis. A ligação desta molécula de ácido nucleico para o fragmento do genoma permite a localização do fragmento para o mapa do genoma de Physcomitrella patens, e, quando realizada múltiplas vezes com diferentes enzimas, facilita a determinação rápida da seqüência de ácido nucleico á qual o polipeptídeo liga. Além disso, as moléculas de ácido nucleicos da invenção podem ser suficientemente idênticas às seqüências de espécies relacionadas de modo que estas moléculas de ácido nucleico pode servir como marcadores para a construção do mapa genômico em musgos relacionados.

As moléculas de ácido nucleico de LPKSRP da invenção são também utilizáveis para estudos estruturais evolucionários e de polipeptídeos.

Os processos em que as moléculas da invenção participam são utilizados por uma ampla variedade de células procaríóticas e eucarióticas; por comparação das seqüências das moléculas de ácido nucléico da presente invenção para as codificando enzimas similares de outros organismos, o parentesco evolucionário dos organismos pode ser avaliado. Similarmente, esta comparação permite uma avaliação de que as regiões da seqüência são conservadas e as que não são, pode ajudar na determinação das regiões do polipeptídeo que são essenciais para o funcionamento da enzima. Este tipo de determinação é de valor para os estudos de engenharia de polipeptídeos e pode dar uma indicação de qual polipeptídeo pode tolerar em termos de mutagênese sem perder a função.

A manipulação das moléculas de ácido nucléico de LPKSRP da invenção pode resultar na produção de LPKSRPs tendo diferenças funcionais dos LPKSRPs de tipo selvagem. Estes polipeptídeos podem ser melhorados em eficiência ou atividade, podem estar presentes em maiores números na célula do que é comum ou podem ser diminuídos em eficiência ou atividade.

O efeito da modificação genética em plantas, C. glutamicum, fungos, algas ou ciliatos sobre o crescimento da planta e/ou tolerancia ao estresse pode ser avaliado por crescimento do microorganismo ou planta modificado sob condições menores do que as apropriadas e então analisando as características de e crescimento e/ou metabolismo da planta. Estas técnica, de anahse são bem conhecidas de um versado na arte, e incluem peso seco peso úmido, síntese de polipeptídeo, síntese de carboidrato, síntese de lipideos, taxas de evapotranspiração, rendimento geral da planta e/ou cultura florescência, reprodução, fixação das sementes, crescimento da raiz, taxas de respiração, taxas de fotossíntese, etc. (Applications of HPLC in Biochemistry em: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology vol 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, vol. 3, Cap. III: Product recovery and purification, página 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A et al 1988 Bioseparation: upstream processing for biotechnology, John Wiley é Sons- Kennedy, J.F. e CabraI, J.M.S., 1992, Reeoveiy processes for biologicai materiais, John Wiley e Sons; Shaeiwitz, J.A. e Henly, J.D ,988 Biochemical separations, em: Umann's Encyclopedia of Idustrial Chemistry, vol. B3, Cap. 11, página 1-27, VCH: Weinheim; e Dechow FJ., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por exemplo, vetores de expressão de levedura compreendendo os ácidos nucleicos relatados aqui, ou seus fragmentos podem ser construídos e transformadas em Saccharomyces cerevisiae usando protocolos padrões. As resultantes células transgênieas podem ser então testadas para falha ou alteração de seu crescimento e/ou tolerância a estresses de seca, sal, e temperatura. Similarmente, vetores de expressão de planta compreendendo os ácidos nucleicos relatados aqui, ou seus fragmentos podem ser construídos e transformados em uma célula de planta apropriada, como Arabidopsis, soja, colza, milho, trigo, Medicago truncatula, etc., usando protocolos padrões. As resultantes células transgênieas e/ou plantas' derivadas das mesmas podem ser então testadas para falha ou alteração de sen crescimento e/ou tolerância estresses de seca, sal, e temperatura.

A engenharia de um ou mais gene de LPKSRPs da invenção pode também resultar em LPKSRPs tendo atividades alteradas, que indiretamente impactam o crescimento, resposta ao estresse e/ou tolerância ao estresse de algas, plantas, ciliatos, ou fungos, ou outros microorganismos como C glutamicum. Por exemplo, os processos bioquímicos normais de metabolismo resultam na produção de uma variedade de produtos (por exemplo, peróxido de hidrogênio e outras espécies de oxigênio relacionadas ), que podem interferir ativamente com estes mesmos processos metabólicos.. Por exemplo, peroxinitrita é conhecida para cadeias laterais de nitrato tirosina, assim inativando algumas enzimas tendo tirosina no sítio ativo (Groves, J.T., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235). Apesar destes produtos serem tipicamente excretados, as células pode ser geneticamente alteradas para transportar mais produtos do que é típico para uma célula de tipo selvagem. Por otimização da atividade de um ou mais LPKSRPs da invenção que são envolvidos na exportação de moléculas específicas, como moléculas de sal, pode ser possível melhorar a tolerância ao estresse da célula.

Adicionalmente, as seqüências relatadas aqui, ou seus fragmentos, podem ser usadas para gerar mutações de nocaute nos genomas de vários organismos, como bactérias, células de mamíferos, células de levedura, e células de planta (Girke, T., 1998, A plant Journal 15:39-48). As resultantes células de abate podem ser então avaliadas por sua capacidade ou habilidade de tolerar as condições de estresse, sua resposta a várias condições de estresse e seu efeito sobre o fenótipo e/ou genótipo da mutação. Para outros métodos de inativação de genes, ver patente US No. 6,004,804 "Non- Chimeric Mutational Vetores" e Puttaraju et al., 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17:246- 252. As estratégias de mutagênese acima mencionadas para LPKSRPs resultando em crescimento aumentado e/ou aumentada tolerância ao estresse não significam ser limitativas; variações nestas estratégias são prontamente evidentes para o versado. Usando estas estratégias e incorporando os mecanismos relatados aqui, as moléculas de ácido nucleico e polipeptídeo da invenção podem ser usadas para gerar algas, ciliatos, plantas, fungos ou outros microorganismos como C. glutamicum expressando moléculas de ácido nucleico de LPKSRP e polipeptídeo mudadas, de modo que o crescimento e/ou tolerância ao estresse é melhorado.

A presente invenção também provê anticorpos que especificamente ligam a um LPKSRP, ou a sua porção, com codificado pelo ácido nucleico descrito aqui. Anticorpos podem ser feitos por muitos métodos bem conhecidas (ver, por exemplo, Harlow e Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Brevemente, o antígeno purificado pode ser injetado em um animal em uma quantidade e em intervalos suficientes para elicitar uma resposta imune. Anticorpos podem ser ou purificados diretamente, ou células de baço podem ser obtidas do animal. As células podem então fundidas com uma linhagem de célula imortal e tríadas para secreção do anticorpo. Os anticorpos podem ser usados para triar bibliotecas de clones de ácido nucleico para as células secretarem o antígeno. Estes clones positivos podem ser então sequenciados (ver, por exemplo, Kelly et al., 1992, Bio/Technology 10:163- 167; Bebbingtonetal., 1992, Bio/Technology 10:169-175).

As expressões "liga seletivamente" e "liga especificamente" com o polipeptídeo referem-se a uma reação de ligação que é determinativa da presença do polipeptídeo em uma população heterogênea de polipeptídeos e outros biológicos. Assim, sob condições de imunotestes projetadas, os anticorpos especificados ligados a um polipeptídeo particular não ligam em uma quantidade significante para outros polipeptídeos presentes na amostra. A ligação seletiva de um anticorpo sob estas condições pode requerer um anticorpo que é selecionado por sua especificidade para um polipeptídeo particular. Vários formatos de imunoteste podem ser usados para selecionar anticorpos que seletivamente ligam com um polipeptídeo particular. Por exemplo, os imunotestes ELISA em fase sólida são usados como rotina para selecionar anticorpos seletivamente imunorreativos com um polipeptídeo. Ver Harlow e Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988), para uma descrição de formatos de imunoteste e condições que podem ser usadas para determinar a ligação seletiva.

Em alguns casos, é desejável preparar os anticorpos monoclonais de vários hospedeiros. Uma descrição de técnicas para preparar estes anticorpos monoclonais pode ser encontrada em Stites et al., eds., "Basic and Clinicai Immunology," (Lange Medicai Publications, Los Altos, Calif., 4a. Ed.) e referências citadas no mesmo, e em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988.

Em todo este pedido, várias publicações são mencionadas. As descrições de todas estas publicações e as referências citadas nestas publicações em suas totalidades são aqui incorporadas por referência neste pedido a fim de descrever mais completamente o estado da arte à qual esta invenção pertence.

Deve-se entender também que o acima refere-se às formas de realização preferidas da presente invenção e que numerosas mudanças podem ser feitas sem sair do escopo da invenção. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não devem ser construídos em qualquer modo como impondo limitações sobre o seu escopo. Ao contrário, será claramente entendido que pode-se fazer referência a várias outras formas de realização, modificações, e seus equivalentes, que, após leitura da descrição aqui, podem se apresentar para os versados na arte sem sair do espírito da presente invenção e/ou o escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Crescimento de culturas de Physcomitrellapatens.

Para este estudo, plantas da espécie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. da coleção da seção de estudos genéticos da University de Hamburg foram usadas. Elas se originam da cepa 16/14 coletada por H.L.K. Whitehouse em Gransden Wood, Huntingdonshire (England), que foi subcultivada de uma esporo por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). Proliferação das plantas foi realizada por meio de esporos e por meio de regeneração dos gametófitos. O protonema desenvolvido do esporo haplóide como um cloronema rico em cloroplasto e caulonema de baixo teor de cloroplastos, sobre os brotos se formaram após aproximadamente 12 dias. Estes cresceram para dar gametóforos contendo anteridias e arquegônias. Após fertilização, o esporófito diplóide com a seta curta e a cápsula do esporo resultou, em que os meio esporos maturaram.

O cultivo foi realizada em uma câmara climatizada a uma temperatura do ar de 25 0C e intensidade da luz de 55 micromols"ltn2 (luz branca; Philips TL 65W/25 tubo fluorescente) e a mudança de luz/escuro de 16/8 horas. O musgo foi ou modificado em cultura de líquido usando meio Knop de acordo com Reski e Abel (1985, Plant 165:354-358) ou cultivado no meio sólido de

Knop usando 1% agar oxoid (Unipath, Basingstoke, England). Os protonemas usados para isolamento de RNA e DNA foram cultivados em culturas de líquido aeradas. Os protonemas foram cominuídos a cada 9 dias e transferidos para meio de cultura novo.

Exemplo 2: Isolamento de DNA Total de plants.

Os detalhes para o isolamento de DNA total referem-se ao trabalho de Ig de peso fresco de material de planta. Os materiais usados incluem os seguintes tampões: CTAB tampão: 2% (p/v) brometo de N-cetil- Ν,Ν,Ν-trimetilamônio (CTAB); IOOmM Tris HCl pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20mM EDTA; tampão N-Laurilsarcosina: 10% (p/v) N-laurilsarcosina; 100mM Tris HCl pH 8,0; e 20mM EDTA.

Um material de planta foi triturado sob nitrogênio líquido em um almofariz para dar um pó fino e transferido para vasos de 2ml Eppendorf. O material de planta congelado foi então coberto com uma camada de Iml de tampão de decomposição (lml tampão CTAB, 100μ1 de tampão N- laurilsarcosina, 20μ1 de β-mercaptoetanol, e 10μ1 de solução de proteinase K, 10mg/ml) e incubados a 60°C durante um hora com agitação contínua. O homogenado obtido foi distribuído em dois vasos de Eppendorf (2 ml) e extraído duas vezes por agitação com o mesmo volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Para separação de fase, centrifugação foi realizada a 8000 χ g e temperatura ambiente durante 15 minutos em cada caso. O DNA foi então precipitado a -70°C durante 30 minutos usando isopropanol resinado com gelo. O DNA precipitado foi sedimentado a 4°C e 10,000g durante 30 minutos e recolocado em suspensão em 180μ1 de TE tampão (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para outra purificação, o DNA foi tratado com NaCl (1,2 M concentração final) e precipitado novamente a -70°C durante 30 minutos usando duas vezes o volume de etanol absoluto. Após uma etapa de lavagem com 70% etanol, o DNA foi secado e subseqüentemente tomado em 50μ1 de H20 + RNAse (50mg/ml concentração final). O DNA foi dissolvido durante a noite a 4°C, e a digestão com RNAse foi subseqüentemente realizada a 37°C durante 1 hora. O armazenamento do DNA ocorreu a 4°C.

Exemplo 3: Isolamento de RNA total e poli-(A)+ RNA e construção de biblioteca de cDNA de Physcomitrellapatens.

Para a investigação de transcritos, tanto total RNA como poli- (A)+ RNA foram isolados. O RNA total foi obtido de protonemata de tipo selvagem de 9 dias de idade seguindo o método GTC- (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359). O Poli(A)+ RNA foi isolado usando Dyna BeadsR (Dynal, Oslo, Norway) de acordo com as instruções do protocolo do fabricante. Após a determinação da concentração do RNA ou do poli(A)+ RNA, o RNA foi precipitado por adição de 1/10 volumes de 3 M acetato de sódio, pH 4,6 e 2 volumes de etanol e armazenado a -70°C.

Para a construção da biblioteca de cDNA, a síntese do primeiro filamento foi obtida usando transcriptase reversa de vírus de leucemia de murinos (Roche, Mannheim, Alemanha) e oligo-d(T)-iniciadores, a síntese do segundo filamento por incubação com DNA polimerase I, enzima Klenow e digestão de RNAseH a 12°C (2 horas), 16°C (1 hora), e 22°C (1 hora). A reação foi parada por incubação a 65°C (10 minutos) e subseqüentemente transferido para gelo. As moléculas de DNA de filamento duplo foram tornadas obtusas por T4-DNA-polimerase (Roche, Mannheim) a 37°C (30 minutos). Nucleotídeos foram removidos por extração com fenol/clorofórmio e colunas Sephadex G50. Os adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemanha) foram ligados nas extremidades de cDNA por T4-DNA-ligase (Roche, 12°C, durante a noite ) e fosforilados por incubação com polinucleotídeo quinase (Roche, 37°C, 30 minutos). Esta mistura foi submetida à separação em um gel agarose de baixa fusão. As moléculas de DNA maiores do que 300 pares de base foram eluídas do gel, extraídas com fenol, concentradas em colunas Elutip-D- (Schleicher e Schuell, Dassel, Alemanha), e foram ligadas aos braços do vetor e embaladas em fagos de lambda ZAPII ou fagos lambda ZAP-Express usando o kit Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Holanda) usando material e seguindo as instruções do fabricante.

Exemplo 4: Sequenciamento e anotação da função de Physcomitrellapatens ESTs.

As bibliotecas de cDNA como descrito em Exemplo 3 foram usadas para o seqüenciamento de DNA de acordo com padrões métodos, e em particular, pelo método de terminação de cadeia usando o kit denominado ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin- Elmer, Weiterstadt, Alemanha). O seqüenciamento aleatório foi realizado subseqüente à recuperação preparativa de plasmídeo de bibliotecas de cDNA via excisão de massa in vivo, retransformação, e subseqüente colocação em placas de agarDHIOB (detalhes de material e protocolo de Stratagene, Amsterdam, Holanda). DNA Plasmídeo foi preparado de uma cultura noturna de E, coli cultivada em meio de caldo Luria contendo ampicilina (ver Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969- 309-6) em um robô de preparação de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden) de acordo com os protocolos do fabricante. Os iniciadores de seqüenciamento com as seguintes seqüências de nucleotídeos foram usados:

5 -CAGGAAACAGCTATGACC-3' SEQ ID NO:

3

5 '-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3r SEQ ID NO:

4

5 '-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' SEQ ID NO:

5

Seqüências foram processadas e anotadas usando o software EST-MAX comercialmente providos por Bio-Max (Munich, Alemanha). O programa incorpora praticamente todos os métodos de bioinformática importantes para a caracterização funcional e estrutural de seqüências de proteína. Para referência, ver o website pedant.mips.biochem.mpg.de. Os algoritmos mais importantes incorporado em EST-MAX são: FASTA (Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance; Pearson W.R., 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enxymol. 183:63-98); BLAST (Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Altschul S.F. et al., Basic local alignment search tool, Journal of Biology molecular 215:403-10); PREDATOR (High-accuracy secondary structure prediction of single and multiple sequences. Frishman, D. e Argos, P., 1997, 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27:329-335); CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J.D. et al., 1994, CLUSTAL W (improving the sensitivity of progressive multiple sequence alinhamento through sequence weighting, positions specific of gap penalties and weight matrix choice, Acid Nucleic Research, 22:4673-4680); TMAP (Transmembrane region prediction of multiply aligned sequences. Persson, B. e Argos, P., 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. BioL 237:182-192); ALOM2 (Transmembrane region prediction of single sequences. Klein, P. et al., Prediction of protein function of sequence properties: A discriminate analysis of database. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Version 2 por Dr. K. Nakai); PROSEARCH (Detection of PROSITE protein sequence patterns. Kolakowski L.F. Jr., Leunissen J.A. M., Smith J.E., 1992, ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921); BLIMPS (Simílarity searches against a database of ungapped blocks, J.C. Wallace e Henikoff S., 1992); PATMAT (a searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8:249-254. Escrito por Bill Alford).

Exemplo 5: Identificação de ORFs de Physcomitrella patens correspondendo a PpLLPK-1.

O cDNA parcial de Physcomitrella patens para PpLLPK-I parcial foi identificado no programa de seqüenciamento EST de Physcomitrella patens usando o programa EST-MAX através de análise BLAST. A seqüência prevista de PpLLPK-I de aminoácido compartilhou uma significante identidade de seqüência com proteína quinase de tipo lectina, como mostrado em Tabela 1. Tabela 1

Grau de identidade de aminoácido e similaridade de PpLLPK- 1 e proteínas homólogas.

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Exemplo 6: Clonagem de cDNA de Physcomitrella patens de comprimento completo codificando para PpLLPK-I - Amplificação de comprimento completo.

Como descrito abaixo, uma seqüência de comprimento completo correspondendo a PpLLPK-I (SEQ ID NO: 1) foi obtida por realização de uma reação de cadeia polimerase (PCR) com gene específico de EST como o DNA gabarito.

Os iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos (MWG-Biotech) para a reação foram: CCCGGGCACCACCAGTACCTTTGCGTATGTG (SEQ ID NO: 6) e GTTAACAGCTCAAAGTAATCTTGCCGTTCC (SEQ ID NO: 7). Os iniciadores projetados contém um sítio Xmal na região 5' e um sítio Hpal na região 3' para fins de cloning. As condições para a reação foram condições padrões com DNA polimerase PWO (Roche). PCR foi realizado de acordo com condições padrões de acordo com as instruções do fabricante (Sambrook et ai., 1989, Biometra T3 Thermocycler). Os parâmetros para a reação foram: cinco minutos a 94°C seguido por cinco ciclos de um minuto a 94°C, um minuto a 50°C, e 4 minutos a 72°C. Isto foi seguido por vinte e cinco ciclos de um minuto a 94°C, um minuto a 65 °C, e 4 minutos a 12°C. Estes parâmetros geraram um fragmento de 4,0 kilobases de comprimento. O fragmento foi extraído de agarose gel com um kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) e ligado no vetor TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) seguindo as instruções dos fabricantes. Os vetores recombinantes foram transformados em células ToplO (Invitrogen) usando condições padrões (Sambrook et al., 1989). As células transformadas foram selecionadas em um agar de LB contendo 100 μg/ml carbenicilina, 0,8 mg X-gal (5-bromo-4- cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo), e 0,8 mg IPTG (isopropiltio-p-D- galactosídeo) cultivados durante a noite a 37°C. As colônias brancas foram selecionadas e usadas para inocular 3 ml de LB líquido contendo 100 μg/ml ampicilina e cultivadas durante a noite a 37°C. DNA Plasmídeo foi extraído usando o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) seguindo as instruções dos fabricantes. Análise de subseqüentes clones, e mapeamento de restrição foram realizados de acordo com técnicas padrões de biologia molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2as. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Tabela 2

Esquema e iniciadores usados para a clonagem de clones de comprimento completo

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A seqüência de comprimento completo de cDNA de PpLLPK- 1 de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 1) é mostrada em Figura 1. A seqüência de aminoácido deduzida do PpLLPK-I de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 2) é mostrada em Figura 2. PpLLPK-I foi analisado com Biomax e Vetor NTI. A seqüência de aminoácido de PpLLPK-I tem homologia com a proteína quinase de tipo lectina ou receptor quinases de lectina (Tabela 1 e Figura 3). Uma busca blast da seqüência de proteína PpLLPK-I contra uma base de dados de seqüência de patente usando Pedant Pro (<e-50) identificou numerosas seqüências com significante homologia para a seqüência PpLLPK-1. A similaridade percentual e identidade das cinco seqüências as mais similares para a seqüência de PpLLPK-I são mostradas em Tabela 3, e um alinhamento destas seqüências é mostrado em Figura 4.

Tabela 3

Grau de Identidade de Aminoácido e Similaridade de PpLLPK-I e seqüências homólogas em pedidos de patente publicados

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Exemplo 7: Engenharia de plantas de Arabidopsis por superexpressão do gene PpLLPK-L Subclonagem de PpLLPK-I no vetor binário.

O fragmento contendo a seqüência PpLLPK-I de Physcomitrella patens foi subclonado do vetor TOPO PCR2.1 recombinante por digestão dupla com enzimas de restrição (ver Tabela 4) de acordo com instruções dos fabricantes. O subseqüente fragmento foi excisado de agarose gel com um Kit QIAquick Gel Extraction (QIAgen) de acordo com instruções dos fabricantes e ligado no vetor binário, que foi clivado com Xmal e Hpal e fosforilado antes da ligação. O vetor recombinante resultante continha o fator de transcrição correspondente na orientação sentido sob o promotor constitutivo

Tabela 4

São listados os nomes das construções usadas para as transformações de plantas

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Transformação de Agrobacterium. Os vetores recombinantes foram transformados em Agrobacterium tumefaciens C58C1 e PMP90 de acordo com condições padrões (Hoefgen e Willmitzer, 1990).

Transformação de plantas. Arabidopsis thaliana ecotipo C24 foram cultivadas e transformadas de acordo com condições padrões (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265:1856- 1860).

Triagem do crescimento. As plantas Tl foram triadas para resistência ao agente de seleção conferido pelo gene marcador selecionável, e sementes foram coletadas. As sementes T2 e T3 foram triadas para resistência ao agente de seleção conferido pelo gene marcador selecionável em placas e as plantas positivas foram transplantadas em solo e cultivadas em uma câmara de crescimento durante 3 semanas. A umidade do solo foi mantida durante o tempo todo em aproximadamente 50% da capacidade máxima de retenção de água do solo.

A perda de água total (transpiração) para uma planta durante este tempo foi medida. Após três semanas, todo o material de planta acima da terra foi coletado, secado a 65°C durante 2 dias e pesado. Os resultados são mostrados em Tabela 5. A relação de peso seco da planta acima da terra para uso de água da planta é eficiência do uso de água (WUE). Tabela 5 mostra WUE médio, erros padrões para WUE, peso seco médio da planta (DW), e erros padrões para DW por plantas superexpressando PpLLPK-1, controle de tipo selvagem, e vetores somente de controle transgênico. Os dados são de aproximadamente 50 plantas por genótipo, 5 plantas de cada de 10 linhagens transgênicas independentes, e 2 experimentos independentes.

Tabela 5

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Os dados acima são resumidos em Tabela 6 abaixo por apresentação da diferença percentual de somente vetor e controles de tipo selvagem para as plantas superexpressando PpLLPK-1. Os dados mostram que plantas PpLLPK-I tem um aumento signifícante em DW e WUE, como comparado com os controles. As plantas expressando PpLLPK-I demonstraram um aumento em peso seco de aproximadamente 29-42% como comparado aos controles, e um aumento em eficiência de uso de água de aproximadamente 10-17% como comparado com os controles.

Tabela 6

<table>table see original document page 84</column></row><table> As plantas superexpressando PpLLPK-1, plantas de controle tipo selvagem, e plantas transgênicas de controle somente vetor também foram submetidas ou a condições bem aguadas ou a vários ciclos de estresse de seca, e a biomassa acima da terra da planta foi medida. Os valores de peso seco médio e erros e padrões para as plantas superexpressando PpLLPK-1, as plantas de controle de tipo selvagem, e as plantas de controle somente vetor são dados na Tabela 7, que está apresentada como Figura 5, sob condições de ciclos de bem aguadas e seca.

Este dado de DW data é expressado em Tabela 8 como a diferença percentual de controle tipo selvagem e isto demonstra que a superexpressão de PpLLPK-I aumentou DW por 25% sob ciclos repetidos de estresse de bem aguada e de seca.

Tabela 8

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Triagem de tolerância a seca. Mudinhas Tl são transferidas para um papel de filtro estéril seco em um disco de petri e deixadas dessecar durante r duas horas a 80% RH (umidade relativa) em uma cabine de crescimento Sanyo MLR-350H, micromols-lm2 (luz branca; Philips TL 65W/25 fluorescente). RH é então diminuída a 60%, e as mudinhas são dessecadas ainda durante oito horas. Mudinhas são então removidas e colocadas em placas agar a 0,6% 1/2 MS suplementadas com 2μg/ml benomil (Sigma-Aldrich) e classificadas após 5 dias. As plantas transgênicas são então tríadas pó sua tolerância a seca melhorada, demonstrando que o transgene confere tolerância a seca.

Triagem de tolerância ao congelamento. Mudinhas são movidas para discos de petri contendo 1A MS 0,6% agar suplementado com 2% sacarose e 2 μg/ml benomil. Após quatro dias, as mudinhas são incubadas a 4°C durante 1 hora e então cobertas com gelo raspado. As mudinhas são então colocadas em uma câmara ambiental da Environmental Specialist ES2000 e incubadas durante 3,5 horas começando a -1,0°C, e diminuindo - 1°C a cada hora. As mudinhas são então incubadas a -5,0°C durante 2 4 horas e então deixadas descongelar a 5°C durante 12 horas. A água é despejada e as mudinhas são classificadas após 5 dias.

As plantas transgênicas são triadas para sua melhorada tolerância ao frio, demonstrando que a expressão do transgene confere tolerância ao frio.

Triagem de tolerância ao sal. Mudinhas são transferidas para papel de filtro embebido em V2 MS e colocado em agar ½ MS 0,6% suplementado com 2μg/ml benomil no dia anterior à triagem de tolerância ao sal. Para a triagem de tolerância ao sal, o papel de filtro com as mudinhas é movido para pilhas de papel de filtro estéril, embebido em 50 mM NaCl, em um disco de petri. Após duas horas, o papel de filtro com as mudinhas é movido para pilhas de papel de filtro estéril, embebido com 200mM NaCl, em um disco de petri. Após duas horas, o papel de filtro com as mudinhas é movido para pilhas de papel de filtro estéril, embebido com 600 mM NaCl5 em um disco de petri. Após 10 horas, as mudinhas são movidas para discos de petri contendo agar ½ MS 0,6% suplementado com 2μg/ml benomil. As mudinhas são classificadas após 5 dias.

Exemplo 8: Detecção dos transgenes PpSCL na linhagem transgênica de Arabidopsis. Uma folha de uma planta de tipo selvagem e uma planta transgênica de Arabidopsis é homogenizada em 250μ1 de tampão de brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) (2% CTAB, 1,4 M NaCl, 8mM EDTA5 e 20 mM Tris, pH 8,0) e 1μl β-mercaptoetanol. As amostras são incubadas a 60-65°C durante 30 minutos, e 250μ1 de Clorofórmio são então adicionados a cada amostra. As amostras são submetidas a vórtice durante 3 minutos e centrifugadas durante 5 minutos a 18,000 χ g. O sobrenadante é tomado de cada amostra e 150μl isopropanol são adicionados. As amostras são incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos, e centrifugadas durante 10 minutos a 18,000 χ g. Cada pelota é lavada com 70% etanol, secada e recolocada em suspensão em 20μ1 TE. Então, 2,5μl da suspensão acima são usados em uma reação PCR de 50μ1 usando Taq DNA polimerase (Roche Molecular Biochemicals) de acordo com instruções dos fabricantes. O plasmídeo de vetor binário com cada gene clonado pode ser usado como controle positivo, e o DNA genômico de tipo selvagem C24 usado como controle negativo nas reações de PCR. Então, 10μl de cada reação PCR são analisados em 0,8% agarose/ gel brometo de etídeo.

O programa PCR pode ser como a seguir: 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 30 segundos a 62°C, e 1 minuto a 72°C, seguido por 5 minutos a 72°C. Iniciadores específicos de genes de são listados abaixo.

Exemplo 9: Detecção do mRNA transgene de PpLLPK-I em linhagens transgênicas de Arabidopsis. 15 A expressão do transgene é detectada usando RT-PCR. RNA

Total é isolado de plantas tratadas por estresse usando um procedimento adaptado (Verwoerd et al., 1989, NAR 17:2362). Amostras de folhas (50-100 mg) são coletadas e trituradas em um pó fino em nitrogênio líquido. O tecido triturado é recolocado em suspensão em 500μ1 de uma mistura a 80°C, 1:1, de 20 fenol para tampão de extração (100 mM LiCl, IOOmM Tris pH8, 10 mM EDTA, 1% SDS), seguido por breve vórtice para misturar. Após adição de 250μ1 de clorofórmio, cada amostra é submetida a breve vórtice. As amostras são então centrifugadas durante 5 minutos a 12,000 χ g. A fase aquosa superior é removida para um tubo eppendorf novo. RNA foi precipitado por adição de 1/10° de volume 3 M acetato de sódio e 2 volumes 95% etanol. Amostras são misturadas por inversão e colocadas em gelo durante 30 minutos. RNA é pelotizado por centrifugação a 12,000 χ g durante 10 minutos. O sobrenadantes é removido e as pelotas brevemente secadas ao ar. As pelotas de amostra de RNA são recolocadas em suspensão em 10μk água tratada com DEPC.

Para remover o DNA contaminante das amostras, cada uma pode ser tratada com RNase-free DNase (Roche) de acordo as recomendações do fabricante. O cDNA é sintetizado de RNA total usando o sistema de síntese de cDNA de primeiro filamento Superscript para RT-PCT (Gíbco- BRL) de acordo com as recomendações dos fabricantes. A amplificação específica de genes PCR de fragmentos do cDNA sintetizado é realizada usando Taq DNA polimerase (Roche) e iniciadores específicos de gene (ver Tabela 13 para iniciadores) na seguinte reação: IX tampão PCR5 1,5 mM MgCl2, 0,2 μΜ cada iniciador, 0,2μΜ dNTPs, 1 unidade polimerase, 5μ1 cDNA de reação de síntese. Amplificação é realizada sob as seguintes condições: Desnaturação, 95°C, 1 minuto; anelamento, 62°C, 30 segundos; extensão, 72°C, 1 minuto, 35 ciclos; extensão, 12°C, 5 minutos; manutenção 4°C, o tempo todo. Os produtos de PCR são ciclados em um gel 1% agarose, coloridos com brometo de etídeo, e visualizados sob luz UV usando o sistema de documentação Quantity-One gel (Bio-Rad).

Exemplo 10: Engenharia de plantas de soja tolerantes ao estresse por super expressando o PpSCL-I gene.

Sementes de soja são esterilizadas na superfície com 70% etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente com agitação contínua, seguido por 20% (v/v) Clorox suplementado com 0,05% (v/v) Tween durante 20 minutos com agitação contínua. Então as sementes são enxaguadas 4 vezes com água destilada e colocadas em papel de filtro estéril úmido em um disco de Petri em temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. As capas das sementes são destacadas e os cotilédones são destacados do eixo do embrião. O eixo é examinado para se certificar que a região meristematica não foi danificada. Os eixos excisados são coletados em um disco de Petri estéril meio aberto e secados ao ar a um teor de umidade menos do que 20% (peso fresco) em um disco de Petri selado até outro uso. Cultura de Agrobacterium tumefaciens é preparada de uma colônia única em meio sólido LB mais antibióticos apropriados (por exemplo 100mg/l estreptomicina, 50mg/l canamicina) seguido por crescimento da colônia única em meio líquido LB a uma densidade óptica de 600 nm de 0,8.

Então, a cultura de bactérias é pelotizada a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente e colocada em suspensão em meio MS (Murashige e Skoog, 1962) suplementado com ΙΟΟμΜ acetosiringona. As culturas são incubadas neste meio de pré-indução durante 2 horas a temperatura ambiente antes do uso. O eixo de embriões de semente zigóticos de soja em aproximadamente 15% teor de umidade são embebidas durante 2 horas a temperatura ambiente com a cultura em suspensão pre-induzida de Agrobacterium. Os embriões são removidos da cultura de embebimento e foram transferidos para discos de Petri contendo Meio MS sólido suplementado com 2% sacarose e incubados durante 2 dias no escuro em temperatura ambiente. Alternativamente, os embriões são colocados no topo de papel de filtro estéril umedecido (meio MS líquido) em um disco de petri incubado sob as mesmas condições descritas acima. Após este período, os embriões são transferidos para meio MS sólido ou líquido suplementado com 500mg/L carbenicilina ou 300mg/L cefotaxima para matar as agrobactérias. O meio líquido é usado para umedecer o papel de filtro estéril. Os embriões são incubados durante 4 semanas a 25°C, sob 150μmol m-2sec-1 e 12 horas de fotoperíodo. Uma vez que as mudinhas produziram raízes, elas são transferidas para solo metromix estéril. O meio das plantas in vitro é lavado antes de transferir as plantas para o solo. As plantas são mantidas sob uma cobertura de plástico durante 1 semana para favorecer o processo de aclimatização. Então, as plantas são transferidas para uma sala de crescimento onde elas foram incubadas a 25°C, sob 150μmol m-2sec-1 intensidade da luz e fotoperíodo de 12 horas durante cerca de 80 dias.

As plantas transgênicas são então tríadas para seu crescimento e/ou tolerância a seca, sal, e/ou frio melhorados de acordo com triagem método descrito em Exemplo 7 demonstrando que a expressão do transgene confere crescimento aumentado e/ou aumentada tolerância ao estresse.

Exemplo 11 - Engenharia de plantas de semente de colza/canola tolerantes a estresse por superexpressão do gene PpLLPK-I

O método de transformação de planta descrito aqui também é aplicável a Brassica e outras culturas. Sementes de canola são esterilizadas na superfície com 70% de etanol durante 4 minutos, em temperatura ambiente, com agitação contínua, seguido por 20% (v/v) de Clorox suplementado com 0,05% (v/v) de Tween 20 durante 20 minutos, em temperatura ambiente, com agitação contínua. Então, as sementes são enxaguadas 4 vezes com água destilada e colocadas em papel de filtro estéril umedecido em um prato Petri, em temperatura ambiente, durante 18 horas. Então, os revestimentos das sementes são removidos e as sementes são secadas em ar durante a noite em um prato Petri estéril aberto pela metade. Durante este período, as sementes perdem aproximadamente 85% de seu teor de água. As sementes são então armazenadas em temperatura ambiente em um prato Petri vedado até outro uso. As construções de DNA e inibição de embrião são como descrito no exemplo 10. Amostras de plantas transgênicas primárias (TO) são analisadas por PCR para confirmar a presença de T-DNA. Estes resultados são confirmados por hibridização Southern em que o DNA é eletroforado em um gel agarose a 1% e transferido para uma membrana de náilon positivamente carregada (Roche Diagnostics). O kit PCR DIG Probe Synthesis (Roche Diagnostics) é usado para preparar uma sonda rotulada com digoxigenina por PCR, e usado como recomendado pelo fabricante.

As plantas transgênicas são então tríadas para seu crescimento melhorado e/ou tolerância ao estresse de acordo com o método descrito no exemplo 7, demonstrando que a expressão do transgene confere crescimento aumentado e/ou tolerância ao estresse aumentada. Exemplo 12: Engenharia de plantas de milho tolerantes ao estresse por superexpressão do gene PpLLPK-I

A transformação de milho (Zea Mays L.) é realizada com o método descrito por Ishida et ai. 1996. Nature Biotch 14745-50. Embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens que dirigem vetores "super binários", e plantas transgênicas são recuperadas através de organogênese. Este procedimento provê uma eficiência de transformação de entre 2,5% e 20%. As plantas transgênicas são então tríadas para seu crescimento melhorado e/ou tolerância à seca, sal e frio de acordo com o método de triagem descrito no exemplo 7, demonstrando que a expressão de transgenes confere crescimento aumentado e/ou tolerância ao estresse aumentada.

Exemplo 13: Triagem em estufa para plantas de milho tolerantes ao estresse — Triagem de desempenho em seca com alta produção

Sementes de milho transgênicas segregantes para um evento de transformação são plantadas em vasos pequenos. Cada uma destas plantas é unicamente rotulada, amostrada e analisada para número de cópias de transgenes. Plantas com transgenes positivo e negativo são marcadas e colocadas em pares com tamanhos similares para transplante junto em vasos grandes. Isto provê um ambiente uniforme e competitivo para as plantas com transgenes positivo e negativo. Os vasos grandes são aguados em uma certa porcentagem da capacidade de água do campo do solo dependendo da severidade do estresse de água desejado. O nível de água no solo é mantido aguando dia sim dia não. Os traços de crescimento da planta e fisiológicos como altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, murchamento da planta, taxa de extensão da folha, estado da água na folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante o período de crescimento. Após um período de crescimento, a porção da terra das plantas é coletada, e o peso novo e peso seco de cada planta são tomados. Uma comparação de fenótipo entre as plantas com transgenes positivo e negativo é então feita. Teste de Eficiência de Uso de água (WUE)

Arbustos de milho com transgenes positivo e negativo para um evento de transformação são transplantados em um vaso com uma dada quantidade de solo e água. Os vasos são cobertos com tampas que permitem que os arbustos cresçam através mas minimizam a perda de água. Cada vaso é pesado periodicamente e água adicionada para manter o teor de água inicial.

Ao término da experiência, os pesos novo e seco de cada planta são medidos, a água consumida por cada planta é calculada e o WUE de cada planta é computado. Os traços de crescimento de planta e fisiológicos como WUE, altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, murchamento da planta, taxa de extensão da folha, estado de água na folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante a experiência. Uma comparação de fenótipo entre as planta transgênicas e plantas de controle é então feita.

Teste de díssecação

Sementes de milho transgênicas segregantes para um evento de transformação são plantadas em vasos pequenos. Estes vasos são mantidos em uma área na estufa que tem condições ambientais uniformes, e cultivaram otimamente. Cada uma destas plantas é unicamente rotulada, amostrada e analisada para número de cópias de transgenes. As plantas são deixadas crescer nestas condições até alcançarem um estágio de crescimento pré- definido. A água é então retida. Os traços de crescimento de planta e fisiológicos como altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, murchamento da planta, taxa de extensão da folha, estado de água na folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante a experiência.

Uma comparação de fenótipo entre as planta com transgenes positivo e negativo é então feita.

Teste de ciclos de seca

Sementes de milho transgênicas segregantes para um evento de transformação são plantadas em vasos pequenos. Estes vasos são mantidos em uma área na estufa que tem condições ambientais uniformes, e cultivaram otimamente. Cada uma destas plantas é unicamente rotulada, amostrada e analisada para número de cópias de transgenes. As plantas são deixadas crescer nestas condições até alcançarem um estágio de crescimento pré- definido. As plantas são então aguadas repetidamente até saturação em um intervalo fixado de tempo. Este ciclo de água/seca é repetido durante a duração da experiência. Os traços de crescimento de planta e fisiológicos como altura, diâmetro do caule, enrolamento da folha, murchamento da planta, taxa de extensão da folha, estado de água na folha, teor de clorofila e taxa de fotossíntese são medidos durante o período de crescimento. Ao término da experiência, as plantas são coletadas para pesos novo e seco do solo. Uma comparação do fenótipo entre plantas com transgenes positivo e negativo é então feita.

Triagem em campo para plantas de milho - Triagem de tolerância a seca de milho segregante em condições isentas de chuva

O estresse a seca controlado em um único local ou múltiplos locais é usado. A disponibilidade de água da cultura é controlada por uma fita de gotejamento ou irrigação aérea em um local que tem menos do que 10 cm de queda de chuva e temperaturas mínimas maiores do que 5°C esperadas durante uma temporada de 5 meses em média, ou um local com precipitação em-temporada esperada interceptada por um "abrigo sem chuva" automático que retrai para prover condições de campo aberto quando não requerido. Práticas agronômicas padrão na área são seguidas para preparação do solo, plantio, fertilização e controle de pragas. Cada lote é semeado com segregação de semente para a presença de um evento de inserção transgênica único. Um teste de número de cópias de transgenes Taqman é usado nas amostras de folhas para diferenciar as transgênicas de plantas de controle de segregação nula. Plantas que são genotipadas deste modo também são classificadas para uma faixa de fenótipos relacionados a tolerância à seca, crescimento e campo. Estes fenótipos incluem peso da planta, peso de grão por planta, número de grãos por planta, número de espigas por planta, peso seco acima do solo, condutância da folha em vapor de água, absorção de CO2 pela planta, teor de clorofila na folha, parâmetros de fluorescência de clorofila relacionados a fotossíntese, eficiência do uso de água, potencial de água na folha, teor de água relativo à folha, taxa de fluxo da seiva do caule, condutividade hidráulica do caule, temperatura da folha, refletância da folha, absorção de luz pela folha, área da folha, dias de florescimento, intervalo de formação de seda de antese, duração do enchimento dos grãos, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamanho da raiz, taxa de extensão da folha, ângulo da folha, enrolamento da folha e sobrevivência. Todas as medições são feitas com instrumentação comercialmente disponível para fisiologia de campo, usando os protocolos padrão providos pelos fabricantes. Vasos individuais são usados como a unidade de replicata por evento.

Triagem de tolerância a seca de milho não segregante sob condições isentas de chuva

Estresse de seca controlado em um único local ou em múltiplos locais é usado. A disponibilidade de água na cultura é controlada por fita de gotejamento ou irrigação aérea em um local que tem menos do que 10 cm de queda de chuva e temperaturas mínimas maiores do que S0C esperadas durante uma temporada de 5 meses em média, ou um local com precipitação em-temporada esperada interceptada por um "abrigo fora da chuva" automático que retrai para prover condições de campo aberto quando não requerido. Práticas agronômicas padrão na área são seguidas para preparação do solo, plantio, fertilização e controle de pragas. O projeto da experiência é projetado para unir um lote contendo um evento transgênico não-segregante com um lote adjacente de controles de segregação nula. Um segregante nulo é progênie (ou linhagens derivadas da progênie) de uma planta transgênica que não contém o transgene devido à segregação mendeliana. Lotes unidos replicados adicionais para um evento particular são distribuídos em torno da experiência. Uma faixa de fenótipos relacionados a tolerância à seca, crescimento e rendimento é classificada nos lotes unidos e estimada como o nível do lote. Quando a técnica de medição pode somente ser aplicada a plantas individuais, estas são selecionadas em cada tempo aleatório de dentro do lote. Estes fenótipos incluem altura da planta, peso dos grãos por planta, número de grãos por planta, número de espigas por planta, peso seco acima do solo, condutância da folha em vapor de água, absorção de CO2 pela folha, teor de clorofila da folha, parâmetros de fluorescência de clorofila relacionados a fotossíntese, eficiência do uso de água, potencial de água na folha, teor de água relativo à folha, taxa de fluxo da seiva do caule, condutividade hidráulica do caule, temperatura da folha, refletância da folha, absorção de luz pela folha, área da folha, dias de florescimento, intervalo de formação de seda de antese, duração do enchimento dos grãos, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamanho da raiz, taxa de extensão da folha, ângulo da folha, enrolamento da folha e sobrevivência. Todas as medições são feitas com instrumentação comercialmente disponível para fisiologia de campo, usando protocolos padrão providos pelos fabricantes. Vasos individuais são usados como a unidade de replicata por evento.

Tolerância à seca de milho em múltiplos locais Cinco a vinte locais englobando regiões de crescimento de milho maiores são selecionados. Estes são amplamente distribuídos para prover uma faixa de disponibilidades de água na cultura esperadas baseada na temperatura média, umidade, precipitação e tipo de solo. A disponibilidade de água na cultura não é modificada além das práticas agronômicas padrão. Projeto da experiência é projetado para unir um lote contendo um evento transgênico não-segregante com um lote adjacente de controles de segregação nula. Uma faixa de fenótipos relacionada a tolerância à seca, crescimento e rendimento é classificada nos lotes unidos e estimada como o nível do lote. Quando a técnica de medição pode somente ser aplicada a plantas individuais, estas são selecionadas em cada tempo aleatório de dentro do lote. Estes fenótipos incluem altura da planta, peso dos grãos por planta, número de grãos por planta, número de espigas por planta, peso seco acima do solo, condutância da folha em vapor de água, absorção de CO2 pela folha, teor de clorofila na folha, parâmetros de fluorescência de clorofila relacionados a fotossíntese, eficiência do uso de água, potencial de água na folha, teor de água relativo à folha, taxa de fluxo da seiva do caule, condutividade hidráulica do caule, temperatura da folha, refletância da folha, absorção de luz pela folha, área da folha, dias de florescimento, intervalo de formação de seda de antese, duração do enchimento dos grãos, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamanho da raiz, taxa de extensão da folha, ângulo da folha, enrolamento da folha e sobrevivência. Todas as medições são feitas com instrumentação comercialmente disponível para fisiologia de campo, usando os protocolos padrão providos pelos fabricantes. Vasos individuais são usados como a unidade de replicata por evento.

Exemplo 14: Engenharia de plantas de trigo tolerantes ao estresse por superexpressão do gene PpLLPK-I

A transformação de trigo é realizada com o método descrito por Ishida et al. 1996 Nature Biotech. 14745-50. Embriões imaturos são co- cultivados com Agrobacterium tumefaciens que dirige vetores "super binários", e plantas transgênicas são recuperadas através de organogênese. Este procedimento provê uma eficiência de transformação entre 2,5% e 20%. As plantas transgênicas são então tríadas para seu crescimento melhorado e/ou tolerância ao estresse de acordo com o método descrito no exemplo 7, demonstrando que a expressão do transgene confere crescimento aumentado e/ou tolerância ao estresse aumentada.

Exemplo 15: Engenharia de plantas de arroz com tolerância ao estresse por superexpressão do gene PpLLPK-I.

O clone de entrada contendo um cDNA de Physcomitrella patens codificando PpLLPK-I é subseqüentemente usado em uma reação LR com p0831, um vetor de destinação usado para transformação de Oryza sativa. Este vetor contém como elementos funcionais dentro das bordas do T- DNA: um marcador de planta selecíonável, um cassete de expressão de marcador visual; e um cassete Gateway pretendido para recombinação in vivo de LR com a seqüência de interesse já clonada no vetor de entrada. Um promotor de arroz para expressão constitutiva (SEQ ID NO: 11 - ver figura 6 anexada) está localizado a montante do cassete Gateway.

Após a etapa de recombinação de LR, o vetor de expressão resultante (figura 7 fixada) é transformado na cepa LBA4404 de Agrobacterium e subseqüentemente em plantas Oryza sativa. As plantas de arroz transformadas são cultivadas e são então examinadas para crescimento aumentado e/ou tolerância ao estresse.

Aproximadamente 15 a 20 transformantes de PpLLPK-I independentes (TO) são gerados. Os transformantes primários são transferidos de câmaras de cultura de tecido para uma estufa para crescimento e coletados de semente de TL Cinco eventos dos quais a progênie de T1 segregou 3:1 para presença/ausência do transgene são retidos. Para cada um destes eventos, 10 arbustos de T1 contendo o transgene (hetero- e homozigotos) e 10 arbustos de T1 desprovidos do transgene (nulizigotos) são selecionados por triagem de marcador visual. As plantas T1 selecionadas são transferidas para uma estufa. Cada planta recebe um único rótulo de código de barra para ligar inambiguamente os dados de fenotipagem à planta correspondente. As plantas Tl selecionadas são cultivadas em solo em vasos de 10 cm de diâmetro nos seguintes ajustes ambientais: fotoperíodo = 11,5 h, intensidade à luz do dia = 30,000 Iux ou mais, temperatura do tempo no dia = 28°C ou maior, temperatura do tempo à noite = 22°C, umidade relativa = 60-70%. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes são cultivados lado-a-lado em posições aleatórias. Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade as plantas são passadas várias vezes através de um armário de formação de imagem digital Em cada ponto de tempo, as imagens digitais (2048x1536 pixéis, 16 milhões de cores) são tomadas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

Os dados obtidos para PpLLPK-I na primeira experiência são confirmados em uma segunda experiência com plantas T2. As linhagens que têm o padrão de expressão correto são selecionadas para outras análises. As bateladas de sementes das plantas positivas (ambas hetero- e homozigóticas) em TI, são triadas monitorando a expressão do marcador. Para cada evento escolhido, as bateladas de sementes são então retidas para avaliação de T2. Em cada batelada de sementes, um número igual de plantas positivas e negativas é cultivado na estufa para avaliação.

Plantas transgênicas são triadas para seu crescimento melhorado e/ou tolerância ao estresse de acordo com o método de triagem descrito no exemplo 7, demonstrando que a expressão transgênica de PpLLPK-I confere crescimento aumentado e/ou tolerância ao estresse em plantas de arroz.

Exemplo 16: Identificação de genes homólogos e heterólogos.

Seqüências de genes podem ser usadas para identificar genes homólogos ou heterólogos de bibliotecas de cDNA ou genômicas. Genes homólogos (por exemplo, clones de cDNA de comprimento completo) podem ser isolados via hibridização com ácido nucleico usando, por exemplo, bibliotecas de cDNA. Dependendo da abundância do gene de interesse, 100.000 até 1.000.000 bacteriófagos recombinantes são depositados em placas e transferidos para membranas de náilon. Após desnaturação com álcali, o DNA é imortalizado na membrana, por exemplo, por reticulação com UV. A hibridização é realizada em condições de alta estringência. Em solução aquosa, hibridização e lavagem são realizadas em uma resistência iônica de NaCl IM e uma temperatura de 68°C. As sondas de hibridização são geradas, por exemplo, por rotulação de transcrição de entalhe radioativo (32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemanha). Sinais são detectados por auto- radiografia. Genes parcialmente homólogos ou heterólogos que estão relacionados mas não idênticos podem ser identificados de um modo análogo ao procedimento acima descrito usando condições de lavagem e hibridização de baixa estringência. Para hibridização aquosa, a resistência iônica é normalmente mantida em NaCl IM enquanto a temperatura é progressivamente diminuída de 68 para 42°C.

O isolamento de seqüências de genes com homologias (ou identidade/similaridade de seqüência) somente em um domínio distinto de (por exemplo, 10-20 aminoácidos) pode ser realizado usando sondas de oligonucleotídeos rotulados com rádio sintéticos. Os oligonucleotídeos radiorrotulados são preparados por fosforilação da extremidade 5' de dois oligonucleotídeos complementares com polínucleotídeo T4 quinase. Os oligonucleotídeos complementares são recombinados e ligados para formar concatêmeros. Os concatêmeros padrão duplos são então radiorrotulados, por exemplo, por transcrição de entalhe. A hibridização é normalmente realizada em duas condições de baixa estringência usando altas concentrações de oligonucleotídeos.

Solução de hibridização de oligonucleotídeos:

6 χ SSC

fosfato de sódio M

RDTA mM (pH 8)

0,5% de SDS

100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado

% de leite em pó não gorduroso

Durante a hibridização, a temperatura é diminuída em etapas a 5-10°C abaixo dado Tm de oligonucletídeos estimado, ou para baixo em temperatura ambiente, seguido por etapas de lavagens e auto-radiografia. A lavagem é realizada com baixa estringência, como 3 etapas de lavagem usando 4 χ SSC. Outros detalhes são descritos por Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press ou Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols em Molecular Biology," John Wiley & Sons.

Exemplo 17: Identificação de genes homólogos triando bibliotecas de expressão com anticorpos.

Clones de cDNA podem ser usados para produzir proteína recombinante por exemplo, em E. coli (por exemplo, sistema Qiagen QIAexpress pQE); As proteínas recombinantes são então normalmente purificadas por afinidade via cromatografia de afinidade Ni-NTA (Qiagen). As proteínas recombinantes são então usadas para produzir anticorpos específicos, por exemplo, usando técnicas padrão para imunização de coelho. Os anticorpos são purificados por afinidade usando uma coluna Ni-NTA saturada com o antígeno recombinante como descrito por Gu et al., 1994, BioTechniques 17: 257-262. O anticorpo pode ser usado para triar bibliotecas de cDNA de expressão para identificar genes homólogos ou heterólogos via uma triagem imunológica (Sambrook, J. et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press ou Ausubel, F.M. et al., 1994, "Current Protocols em Molecular Biology," John Wiley & Sons).

Exemplo 18: Mutagênese in vivo.

Mutagênese in vivo de microorganismos pode ser realizada por passagem do DNA de plasmídeo (ou outro vetor) através de E. coli ou outros microorganismos (por exemplo, Bacillus spp, ou leveduras como Saccharomyces cerevisiae), que são prejudicadas em suas capacidades para manter a integridade de sua informação genética. As cepas de mutação típicas têm mutações nos genes para o sistema de reparo de DNA (por exemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referência, ver Rupp, W.D., 1996, DNA repair mecanismos, em: Escherichia coh e Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington). Estas cepas são bem conhecidas dos versados na arte. O uso destas cepas é ilustrado, por exemplo, em Greener, A. e Callahan, M., 1994, Strategies 7:32-34. A transferência de moléculas de DNA mudadas em plantas é preferivelmente feita após seleção e teste em microorganismos. Plantas transgênicas são geradas de acordo com vários exemplos dentro da exemplificação deste documento.

Exemplo 19: Purificação do produto desejado de organismos transformados.

A recuperação do produto desejado do material de planta (isto é, Physcomitrella patens ou Arabidopsis thaliana), fungos, algas, ciliatos, células de C glutamieum, ou outras células bacterianas transformadas com as seqüências de ácido nucleico descritas aqui, ou o sobrenadante das culturas descritas acima pode ser realizada por vários métodos bem conhecidos na arte. Se o produto desejado não é secretado das células, as células podem ser coletadas da cultura por centrifugação em baixa velocidade, e as células podem ser lisadas por técnicas padrões, como força mecânica ou sonicação.

Os órgãos das planas podem ser separados mecanicamente de outro tecido ou órgãos. Após homogeneização, os resíduos celulares são removidos por centrifugação, e a fração de sobrenadante contendo as proteínas solúveis é retida para outra purificação do composto desejado. Se o produto é secretado das células desejadas, então as células são removidas da cultura por centrifugação em baixa velocidade, e a fração de sobrenadante é retida para outra purificação. A fração de sobrenadante de outro método de purificação é submetida a cromatografia com uma resina apropriada, em que a molécula desejada tanto é retida em uma resina de cromatografia enquanto muitas das impurezas na amostra não são, como quando as impurezas são retidas pela resina, enquanto a amostra não é. Estas etapas de cromatografia podem ser repetidas como necessário, usando as resinas de cromatografia iguais ou diferentes. Um versado na arte pode ser bem versado na seleção de resinas de cromatografia apropriadas e em sua aplicação mais eficaz para uma molécula particular a ser purificada. O produto purificado pode ser concentrado por filtração ou ultrafiltração, e armazenado em uma temperatura em que a estabilidade do produto é maximizada.

Existe um amplo arranjo de métodos de purificação conhecidos na arte e o método precedente de purificação não pretende ser limitante. Estas técnicas de purificação são descritas, por exemplo, em Bailey, J.E. & Ollis, 1986, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais, McGraw- Hill: New York. Além disso, a identidade e pureza dos compostos isolados podem ser avaliadas pelas técnicas padrão na arte. Estas incluem cromatografia líquida de alto desempenho (HLPC), métodos espectroscópicos, métodos de coloração, cromatografia de camada fina, NIRS, teste enzimático, ou microbiologicamente. Estes métodos de análises são estudados em: Patek et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996, Biotekhnologiya 11:27-32; e Schmidt et al., 1998, Bioprocess Engineer. 19:67-70; Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1996, vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540- 547, p. 559-566, 575-581, e p. 581-587; Michal, G, 1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley e Sons; Fallon, A. et al., 1987, Applications of HPLC in Biochemistry em: Laboratoiy Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> polipeptídeos relacionados com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase

<130> 2063015075

<140> PCT/EP2006/063270

<141> 2006-06-16

<160> 11

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 2049

<212> DNA

<213> Physcomitrella patens

<220>

<221> CDS

<222> (34)..(2049)

<400> 1

tttctaagct attcaacctg gattgatttc agt atg cag att aac aac ggt ttc 54

Met Gln Ile Asn Asn Gly Phe 1 5

ttg cac ttg gtg tct acc ctc cta ggt tta ctt cat tta gca act ttt 102

Leu His Leu Val Ser Thr Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Ala Thr Phe 10 15 20

gcc aca gct gaa ttg aaa act att gaa ttt agt ttt cct aat ttt aag 150

Ala Thr Ala Glu Leu Lys Thr Ile Glu Phe Ser Phe Pro Asn Phe Lys 25 30 35

agt ccg gag aat gat ggt aca ate aac att ccg aat gca aca gat gtg 198

Ser Pro Glu Asn Asp Gly Thr Ile Asn Ile Pro Asn Ala Thr Asp Val 40 45 50 55

cct agt ggt agg aac gtc ctc ttc ctt ccc aag gaa aag aac gcc atg 246

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agt gtt ggg tgg gtt att tat gaa gag aaa gtt caa ttc tgg gac aac 294

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tcc gat gac gct gct tct ttt agt aca gag ttt acc ttc agt act tca 342

Ser Asp Asp Ala Ala Ser Phe Ser Thr Glu Phe Thr Phe Ser Thr Ser 90 95 100

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440 445 450 455

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Claims

1. Uso de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma planta transgênica com tolerância aumentada a estresse ambiental selecionado dentre o grupo consistindo de seca e baixa temperatura, em que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo de SEQID NO:l; b) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de SEQ ID NO:2; c) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre a) ou b) acima; d) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l sobre a região de codificação; e e) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido mostrada em SEQID NO:2;

2. Uso de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de SEQID NO:2.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência de aminoácido mostrada em SEQID NO:2.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos de a) ou b) como definido na reivindicação 1.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polínucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO: 1 sobre a região de codificação.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico está presente em um vetor.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superexpressão do ácido nucleico em uma planta aumenta a tolerância da planta ao estresse ambiental.

8. Uso de um primeiro ácido nucleico isolado que hibridiza sob condições estringentes para um segundo ácido nucleico, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma planta transgênica com tolerância aumentada a estresse ambiental selecionado dentre o grupo consistindo de seca e baixa temperatura, o segundo ácido nucleico selecionado do grupo consistindo de: (a) um segundo ácido nucleico compreendendo um polínucleotídeo de SEQID NO:l; e (b) um segundo ácido nucleico codificando um polipeptídeo de SEQ ID NO:2, em que o primeiro ácido nucleico codifica um polipeptídeo que funciona como um modulador de um resposta ao estresse ambiental em uma planta.

9. Método para aumentar a tolerância de uma planta transgênica a um estresse ambiental selecionado dentre o grupo consistindo de seca e baixa temperatura, caracterizado pelo fato de compreender aumentar a expressão do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo relacionado com estresse do tipo Iectma-1 de uma proteína quinase na planta, em que o ácido nucleico é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polínucleotídeo de SEQID NO:1; (b) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de SEQ ID NO :2; (c) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre a) ou b) acima; (d) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO:l sobre a região de codificação; e (e) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido mostrada em SEQID NO:2.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de SEQID NO:2.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência de aminoácido mostrada em SEQID NO:2.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que ácido nucleico compreende pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos de a) ou b) como definido na reivindicação 9.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO:l sobre a região de codificação.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é transformada com um promotor que dirige expressão do ácido nucleico.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o promotor é específico para tecido.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o promotor é regulado no desenvolvimento.

17. Método para produzir uma planta transgênica contendo o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase em que uma planta tem um tolerância aumentada a um estresse ambiental selecionado dentre o grupo consistindo de seca e baixa temperatura como comparado a uma variedade de tipo selvagem da planta, caracterizado pelo fato de compreender transformar a célula de planta com um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico e gerar a partir de uma célula de planta a planta transgênica, em que o ácido nucleico é selecionado do grupo consistindo de: (a) um polinucleotídeo de SEQID NO: 1; (b) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de SEQ ID NO:2; (c) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre a) ou b) acima; (d) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 sobre a região de codificação; e (e) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácido mostrada em SEQID NO:2.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de milho, trigo, cevada, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, semente de colza, canola, mandioca, pimentão, girassol, cravos tagetes, plantas solanáceas, batata, tabaco, berinjela, tomate, espécies Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau, chá, espécie Salix, palma de óleo, coco, gramínea perene e safra de forragem.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de SEQID NO:2.

22. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO:2.

23. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polipeptídeos de a) ou b) como definido na reivindicação 17.

24. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos de SEQID NO:1 sobre a região de codificação.

25. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a tolerância ao estresse da planta é aumentada por aumento da expressão do ácido nucleico na planta.

26. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a planta é transformada com um promotor que dirige a expressão do ácido nucleico.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o promotor é específico para tecido.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o promotor é regulado no desenvolvimento.

29. Célula de planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser transformada com o ácido nucleico como definido em SEQID NO:l.

30. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser transformada com o ácido nucleico como definido em SEQ ID NO:l.

31. Semente, caracterizada pelo fato de ser produzida por uma planta transgênica compreendendo uma célula de planta como definida na reivindicação 29, em que a semente é uma reprodução real para um tolerância aumentada ao estresse da seca como comparado com uma variedade de tipo selvagem da célula de planta.

32. Polipeptídeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase isolado, caracterizado pelo fato de ser como definido em SEQ ID NO:2 e seqüências que são pelo menos 60% homólogos à seqüência de aminoácido completa mostrada em SEQID NO:2.

33. Seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo relacionado com estresse do tipo lectina de uma proteína quinase, caracterizada pelo fato de ser como definida em SEQ ID NO:l.