BRPI0609493A2 - método para a análise de uma amostra de sangue e aparelho e reagente para implementar o dito método - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA A ANáLISE DE UMA AMOSTRA DE SANGUE E APARELHO E REAGENTE PARA IMPLEMENTAR O DITO MéTODO. Trata-se de um método para a análise de uma amostra de sangue, incluindo as seguintes etapas: formar, em um único vaso de diluição e análise, uma solução de análise contendo a dita amostra de sangue, um diluente e pelo menos um composto para realizar a lise das células vermelhas do sangue; pelo menos um composto para estabilizar a hemoglobina na forma de um complexo cromogênico; medir, na dita solução de análise no dito vaso, após a lise das células vermelhas do sangue, o nível de hemoglobina por espectrofotometria; e retirar uma quantidade apropriada da dita solução de análise no dito vaso, em que é realizada uma diferenciação de leucócitos por um meio óptico. A invenção é caracterizada pelo fato de que a solução de análise contém adicionalmente pelo menos um composto para proteger as células brancas do sangue, permitindo que pelo menos quatro subpopulações principais de leucócitos sejam discriminadas. A invenção também trata de um aparelho hematológico para a implementação do dito método.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara "MÉTODO PARA A ANÁLISE DE UMA AMOSTRA DESANGUE E APARELHO E REAGENTE PARAIMPLEMENTAR O DITO MÉTODO".
A presente invenção refere-se a um método paraa análise de uma amostra de sangue, assim como a um aparelho ereagente para sua implementação. Mais particularmente, ainvenção se refere ao campo da análise automática de amostras desangue.
A análise de uma amostra sangüínea buscadeterminar, em geral:
- o número total de leucócitos;
- mais especificamente, o número de leucócitospor sub-populações (basófilos, eosinófilos, neutrófilos, monócitose linfócitos);
- o número de eritrócitos e de plaquetas; e
- o nível de hemoglobina.
São conhecidas diversas técnicas de análise, emparticular:
- realiza-se o exame da hemoglobina após a lise dos eritrócitos,isto é, a destruição da membrana das células de eritrócitos, e pormeio da medição, por espectrofotometria, da hemoglobinaliberada no meio; o exame da hemoglobina também requer aestabilização da hemoglobina em uma forma complexada(oxiemoglobina ou cianometemoglobina) de modo a medir aabsorvência de um único composto no comprimento de ondaapropriado.
- a contagem total de leucócitos é realizada na amostra de sanguepor resistividade com lise específica dos eritrócitos e proteção dosleucócitos.
- diferenciação dos leucócitos e de sua contagem por sub-população é realizada.
- por medição volumétrica por resistividadeapós lise específica dos eritrócitos, proteção dos leucócitos eajuste do pH; isso no entanto não permite a diferenciação de todasas sub-populações em uma única análise;
- ou por meio óptico, em particular, porcitometria de fluxo; após lise específica dos eritrócitos e proteçãodos leucócitos, por meio da medição de diferentes parâmetros (emparticular, difração, fluorescência, absorvência), em um fluxo deleucócitos no eixo geométrico dos ângulos estreito, médio e largoe, opcionalmente, após a adição de um agente de identificação(por exemplo, clorazol negro ou um corante de identificação deDNA ou RNA ou um corante fluorescente) e por meio da mediçãoem diferentes comprimentos de onda; esta técnica permite adiferenciação das sub-populações de leucócitos.
- a contagem de eritrócitos e de plaquetas é realizada em umaamostra diluída sem a adição de reagente específico por meio demedição de resistividade.
Existem inúmeros analisadores automáticos decélulas sangüíneas que utilizam estas técnicas de modo a obteruma análise da amostra de sangue que seja tão completa quantopossível.
Nestes aparelhos automáticos, tradicionalmentecoexistem dois circuitos de análise diferentes:
- um primeiro circuito destinado a medir ahemoglobina e/ou a contagem total de leucócitos; e
- um segundo circuito destinado a realizar, naamostra de sangue, a diferenciação e/ou a contagem de leucócitospor citometria de fluxo.
Cada circuito é caracterizado por uma taxa dediluição da amostra de sangue adequada para o meio de mediçãousado, a adição de um ou mais reagentes e meios apropriados paraa implementação e medição.
Deste modo, para a medição de hemoglobina econtagem dos leucócitos, o circuito compreende tipicamente umassim chamado tanque de contagem em que a amostra de sangue édiluída, um reagente em particular compreendendo o composto delise dos eritrócitos, o composto de estabilização do complexoformado a partir da hemoglobina e o composto leuco-protetor éadicionado a ele e a seguir, são medidos diretamente nesta célula:hemoglobina por espectrofotometria e o número de leucócitos porresistividade. A taxa de diluição é escolhida de tal modo que asolução de análise é perfeitamente homogênea e de tal modo queo aparelho de detecção não é saturado. Esta taxa de diluiçãocompreende entre 1/100° e 1/500°, geralmente entre 1/160° e 1/180°.Para diferenciação leucocítica por citometria defluxo, o circuito utiliza um tanque para diluição da amostra desangue ao qual um ou mais reagentes, contendo um agente de lisede eritrócito, opcionalmente um agente de diferenciação (porexemplo, um corante fluorescente de leucócito de DNA ou RNA),são adicionados, então uma fração desta solução é tomada demodo a injetá-la em um tanque óptico de fluxo atravessante de umcitômetro de fluxo. A taxa de diluição usada é menor do que1/100°, permitindo que um tempo de análise ótimo seja obtidocom os citômetros atualmente disponíveis no mercado (do tipohidrofoco).
Assim, convencionalmente, pelo menos doisreagentes diferentes comumente têm que ser usados para os doiscircuitos de análise e duas diluições diferentes da amostra desangue são realizadas nestes dois circuitos de análise.
Os objetivos principais de fabricantes sãosimplificar os aparelhos automáticos existentes por meio daredução do número de componentes e de reagentes, permitindo aredução dos custos de produção e de manutenção e do tamanhodos aparelhos automáticos, no entanto sem reduzir o tempo deuma análise de amostra de sangue completa.
A presente invenção, em particular, visa aatingir estes objetivos.
O documento WO 2004/003517, para estafinalidade, propõe um método e equipamento em que os doiscircuitos de análise têm meios em comum. O princípio é realizaruma primeira diluição da amostra de sangue em um único tanquede diluição e transferir, sucessivamente, frações de volumesselecionados desta diluição para uma unidade de medição ou decontagem, de modo a, cada vez, medir ou contar elementosdiferentes contidos na amostra de sangue. De modo a realizar umaanálise completa, a saber, a contagem dos eritrócitos e dasplaquetas, a contagem dos leucócitos, a medição da hemoglobinae diferenciação leucocítica, o documento descreve a seguintesolução: usar uma primeira transferência para contar os eritrócitose plaquetas, adicionar um agente de lise ao tanque de diluição,realizar então uma segunda transferência para contar osleucócitos, realizar uma terceira transferência da solução dediluição que sofreu lise para medir o nível de hemoglobina,adicionar um reagente de diferenciação leucocítica e realizar umaquarta transferência para efetuar a diferenciação leucocítica naunidade de medição.
Este princípio pode permitir o uso de um únicoassim chamado, tanque de diluição, mas não permite umaeconomia de tempo de análise porque as medições ou contagemsão realizadas sucessivamente após cada transferência de umafração da diluição. Além do mais, isso requer o controle perfeitodos volumes sucessivos de reagentes e diluentes transferidos paraa unidade de medição. Além do mais, isso também requer o usode diversas seringas e reagentes de lise.
O objetivo da presente invenção também ésuperar tais inconvenientes.De acordo com um primeiro objetivo, a presenteinvenção refere-se a um método para a análise automática de umaamostra de sangue e a um aparelho para a implementação destemétodo.
No método, de acordo com a invenção:
- uma solução de análise contendo a dita amostra de sangue, umdiluente, e:
- pelo menos um composto para realizar a lisedos eritrócitos;
- pelo menos um composto para estabilizar ahemoglobina na forma de um complexo cromogênico; é formadoem um tanque de diluição e análise simples.
- o nível de hemoglobina é medido nesta solução de análise porespectrofotometria no dito tanque após a lise dos eritrócitos; e
- uma quantidade apropriada desta solução de análise é tirada dodito sangue em que uma diferenciação de leucócito é realizadapor um meio óptico.
O método, de acordo com a invenção, écaracterizado pelo fato de que a solução de análise tambémcontém pelo menos um composto para proteger os leucócitos,permitindo a distinção das cinco principais sub-populações deleucócitos.
A contagem dos leucócitos pode ser realizadajuntamente no tanque de análise e/ou com o meio óptico.
A contagem dos eritrócitos e, opcionalmente,das plaquetas, pode ser realizada, por exemplo, em um estágioanterior do método em uma amostra realizada no tanque deanálise e diluição.
Assim, a presente invenção é baseada noconceito de uma única solução de análise usada como está para os dois tipos de análises que, usualmente, eram realizadas em doiscircuitos separados, a saber, por um lado, a medição dahemoglobina e, opcionalmente, a contagem dos leucócitos e, poroutro lado, a diferenciação leucocítica por meio óptico, sendo quea dita solução de análise combina os compostos "reagentes"capazes de efetuar pelo menos estas análises em virtude de suanatureza e de sua quantidade. Os compostos reagentesintroduzidos são escolhidos para serem quimicamentecompatíveis entre si e em quantidades adequadas para a análisealvo. Eles podem ser escolhidos a partir dos compostostipicamente usados na técnica anterior. Também é possível usaruma formulação comercial que seja usada convencionalmentepara efetuar uma diferenciação leucocítica, isto é, contendo ocomposto para realizar a lise dos eritrócito s e o composto leuco-protetor, e adicionar a ele o terceiro composto reagente destinado a estabilizar a hemoglobina na forma de um complexocromogênico.
Devido a esta solução de análise simples, apresente invenção tem, em particular, as seguintes vantagens:
- o aparelho automático pode compreender um único tanque para a preparação da solução de análise,- a medição da hemoglobina pode ser realizadadiretamente neste tanque e também a contagem global dosleucócitos por medição da resistividade da solução de análise;
- é possível usar um mono-reagente combinandotodos os compostos "reagentes" necessários para a medição da
hemoglobina e para a diferenciação leucocítica por meio óptico;isso, em particular, permite a simplificação dos circuitoshidráulicos, conforme será visto abaixo;
- uma mono-diluição da amostra de sangue pode ser realizada diretamente no tanque de análise e diluição simples,
com uma taxa de diluição determinada como uma função dosmeios de medição e detecção usados. O mono-reagente podeservir como um diluente para realizar esta mono-diluição. Depreferência, uma taxa de diluição será escolhida entre 1/100° e1/500°, correspondendo à taxa de diluição requerida para umamedição do nível de hemoglobina, de preferência, também umataxa de aproximadamente 1/175° (1/173° na modalidade dadaabaixo).
Com a possibilidade de usar uma mono-diluiçãoe um mono-reagente, é possível, conseqüentemente, graças a esteprimeiro aspecto da invenção, simplificar bastante o equipamentode análise enquanto ainda se proporciona uma análise completa daamostra de sangue.
Meios para medição óptica que permitem uma análise dos leucócitos (contagem e diferenciação por sub-populações) a uma taxa de diluição maior do que 1/100° tambémsão propostos, de acordo com a invenção, e são definidos edescritos abaixo.
O mono-reagente usado no método, de acordocom a invenção, permite a medição, por meio deespectrofotometria, da concentração de hemoglobina de umaamostra de sangue e uma diferenciação leucocítica por meioóptico. Também permite a contagem resistiva e/ou óptica dosleucócitos. De preferência, ele é escolhido de modo a permitir adiferenciação de pelo menos 5 sub-populações. De preferência,ele é escolhido de tal modo que não contenha cianetos.
De acordo com a invenção, o composto pararealizar a lise dos eritrócitos é constituído, de preferência, porpelo menos um tenso-ativo catiônico. Em uma maneirapreferencial, que é conhecida por si, ele é escolhido de modo aformar um complexo de oxiemoglobina (já que ele é não tóxicoem comparação com um complexo de cianometemoglobina, queenvolve íons de cianeto). O tenso-ativo catiônico,conseqüentemente, também é escolhido de tal modo que ele oxidea hemoglobina liberada para formar apenas um complexo deoxiemoglobina. A quantidade de tenso-ativo catiônico éescolhida, conseqüentemente, de modo a realizar eficientemente ahemólise dos eritrócitos e oxidar a hemoglobina liberada. Ele éescolhido, de preferência, a partir de:
- sais de amônia quaternária, de preferência, saisde alquiltrimetilamônia e, ainda mais particularmente, brometos ecloretos de cetil-, dodecil-, tetradecil- e hexadeciltrimetilamônia;- sais de piridínio;
- aminas etoxilatadas de cadeia longa; e
- alquil sulfatos (SDS).
O composto leuco-protetor, de acordo com ainvenção, é um composto que retarda ou impede a destruição dosleucócitos. De preferência, é um tenso-ativo não iônico ouanfótero escolhido, de preferência, a partir de:
- álcoois etoxilatados, em particular, 2-fenoxietanol, polioxietilenalquilfenileteres, tais como os produtoscomerciais IPEGAL 990®, TERGITOL NP9®, TRITON® XI00ou XI14, plurafac® A 38 ou Brij35®;
- betaínas e sulfobetaínas de amôniasquaternárias, em particular, lauramidopropil betaína (LAB) edodecildimetil-3-amônio-l-propanosulfonato (DD APS) outetradecildimetil-3-amônio-l-propanosulfonato (TDAPS);
óxidos de amina terciária, tais como sulfonatode N,N-dimetilaurilamina-N-óxido (LDAO) ou 3-[(colamidopropil)-dimetilamina-]l-propano (CHAPS ouCHAPSO);
- compostos do tipo glicosídico e, maisparticularmente, um triterpeno saponina;
- compostos do tipo glucídico (manitol, D-glucose, trealose, sulfato de dextrano).
O composto que estabiliza a hemoglobina na forma de um complexo cromogênico é escolhido, de preferência,a partir de:- quelatos mono ou polidentatos que apresentem formas ligantes(pares não aglutinantes: O, N, S e grupos carbóxi COO-) emparticular:
• ácido etileno diamina tetra-acético (EDTA) ouácido etileno glicol-bis-(3-aminoetiléter)N-N'-tetra-acético(EGTA) e, em particular, seus sais de sódio ou di-potássio;
• oxalato de potássio K2OxOx = C2042";
• sais de hidroxilamina (de preferência,hidrocloritos); e
• ácidos orgânicos (em particular, fórmico ouacético).
- os compostos aromáticos (quelatos mono ou polidendatos)compreendendo átomos ligantes (tendo pares não aglutinantes: O,N, S, etc), em particular:
• Tiron®
• 8-hidroxiquinolina e seus derivados;
• piridina ou bi-piridina e seus derivados;
• 1,10-fenantrolina e seus derivados;
• os compostos fenólicos (mono ou bis e seus derivados);
• pirazol e/ou as pirazolonas e seus derivados;
• imidazol e seus derivados
• ácido sulfosalicílico; e
- saponinas, óxidos de amina terciária, betaínas e sulfobetaínas deamônias quaternárias (tais como DDAPS, TDAPS, LAB).Em adição aos três compostos definidos deacordo com a invenção, é possível adicionar ao(s) mono-reagente(s):
- pelo menos um corante (ou mistura) que identifiqueespecificamente certos leucócitos e, mais particularmente,eosinófilos (ou basófilos), de modo a permitir a distinção depelos menos 5 sub-populações principais de leucócitos,escolhidos a partir de:
• cianinas;
• Oxazine 750;
• reagentes de Wright e Romanowsky;
• DAPI;
• Clorazol negro E;
• azul de toluidino;
• Astra Azul;
• tiazol laranja G ou azul;
• outros reagentes fluorescentes.
- pelo menos um agente de fixação que permita o endurecimentoda membrana dos leucócitos, que, de preferência, é um aldeído e,mais particularmente, glutaraldeído ou formaldeído;
- pelo menos um agente de molhamento de modo a otimizar osfluídicos e impedir a formação de bolhas que também agem comosolubilizantes dos fragmentos, escolhido a partir de:
• álcoois (metanol etanol ou propan-2-ol);
• glicóis (etileno ou propileno glicol);• glicóis etoxilatados (particularmente TritonXI00® ou Brij35®;
• compostos glicosídicos TWEEN80® ou TWEEN20®;
a concentração do agente de fixação e do solubilizante sendoestritamente limitada, já que um excesso pode impedir a lise doseritrócitos e modificar as propriedades ópticas dos leucócitos; e
- um sistema tampão para ajustar o pH entre 5,0 e 10,0 e, depreferência, entre 6,0 e 8,0 e se aproximar otimamente daneutralidade (7,0 + 0,4). A escolha de tal pH visa a respeitar ascondições nativas das células. Além do mais, este pH permiteuma melhor dissolução dos constituintes usados de acordo com ainvenção. O dito tampão é constituído por um par de sais(inorgânicos ou orgânicos) ajustados ao pH mencionado acimapor ácido clorídrico ou soda (4-6N), escolhido a partir de:
• fosfato di-hidrogenado/fosfato hidrogenado desódio ou potássio H2PO4/HPO42";
• carbonato hidrogenado de sódio/carbonatoNaHC03/Na2C03
• um tampão de ácido cítrico/citrato de sódio (III)
• TRIS-HC1
• trietanolamina (TEA)
• imidazol
- um ácido escolhido a partir de:• ácidos orgânicos: itálico, sulfosalicílico oufórmico, que também contribuem para a formação e estabilizaçãodo complexo cromogênico da hemoglobina; e
• ácidos minerais: HC1, H3P04 etc.
- um sal fundamental que assegure uma condutividade da ordemde 10 a 50 ms/cm requerida para a medição de resistividade e umaosmolaridade da ordem de 120 a 500 mOsm e, de preferência,perto da isotonicidade (290 ±), escolhido a partir de:
• cloreto de sódio NaCl;
• cloreto de potássio KC1;
• cloreto de magnésio MgCl2;
• cloreto de cálcio CaCl2;
• sulfato de sódio anidro Na2S04;
sendo que este sal fundamental é capaz de estarcompreendido no sistema tampão;
- pelo menos um conservante, tendo propriedades anti-oxidantese/ou antibióticas, escolhido a partir de:
• 2-fenoxietanol;
• parabenos;
• BHT;
• isotiazolonas (Proclin® 150 ou 300);
• imidazol ou derivados de uréia;
• antibióticos;- um composto de penetração celular antibiótico natural(ionóforo) que também facilite a penetração do corante oucorantes, escolhido a partir de:
• ionóforo I para NH4+ (nonatina);
• ionóforo III para Ca2+ (calcimicina);
• ionóforo para Cl";
• ionóforo I para K+ (valinomicina).
Os constituintes, de acordo com a invenção, sãoresumidos na tabela abaixo, assim como faixas de concentraçõesapropriadas
Constituinte Quantidade
Tensoativo catiônico (agente de lise) 0,1 -50 g/L
Tenso-ativo leuco-protetor 0,1 -20 g/L
Quelato do complexo hemoglobina 0,0001 - 10 g/L
Corante 0,01 - 1 g/L
Agente de fixação 0,01 -2% w/v
Agente de molhamento 0 - 50% v/v
Tampão 0-6g/L
Sal fundamental 1-50 g/L
Ácido Quantidade apropriada para ajustar o pH
conservante Quantidade apropriada 0,1 - 3 g/L
Ionófero Quantidade efetiva 0 - 200 mg/L
Agua destilada qsf Qsf 1 L
A presente invenção também propõe umaparelho para a implementação do método de acordo com a
invenção, que é caracterizado por:
- um tanque de análise que é capaz de receber adita solução de análise;- um meio para medir o nível de hemoglobinapresente na dita solução de análise por espectrofotometria no ditotanque;
- um meio para fazer amostra da dita solução deanálise;
- um meio para medição óptica na dita amostrade modo a produzir uma análise de leucócito.
De acordo com um segundo objetivo, a presenteinvenção refere-se a um dispositivo óptico para um aparelhoautomático para a análise automática de uma amostra de sangue,particularmente vantajosamente também para a implementação dométodo de acordo com o primeiro objetivo da invenção.
Conforme foi mencionado acima, certas sub-populações de leucócitos só podem ser diferenciadas pormedições ópticas, por exemplo, uma medição da difração pelacélula em um ou mais ângulos ou uma medição da absorvência dacélula. Os sistemas ópticos para caracterização de uma célulasangüínea têm uma base comum em que uma fonte de luz estálocalizada emitindo um feixe de luz, um tanque óptico em que ascélulas sangüíneas cruzam o feixe de luz, um sistema para ajustedo feixe de luz ao fluxo de células e meios para a medição da luzoriginária do tanque óptico após a interceptação pelas células. Emparticular, no caso de caracterização de leucócitos, os leucócitosse movem em um fluxo no tanque. Eles são iluminados ali por umfeixe de luz focado sobre o fluxo, que é chamado fluxo deamostra.Tais dispositivos são dispendiosos: emparticular, os lasers usados como fontes de luz, que também sãovolumosos e geralmente requerem um sistema de dissipaçãotérmica; os diodos de luz, como os lasers, requerem sistemas dealinhamento caros. Os feixes de luz emitidos por estas fontes têmuma distribuição transversal de luz que tem formatoaproximadamente Gaussiano. Deste modo, a intensidade é apenasaproximadamente constante e máxima em uma parte estreita ecentral do raio. Os sistemas de alinhamento permitem que estaparte central esteja alinhada com o fluxo de amostra. Além domais, a largura do fluxo de amostra não pode exceder aquela destaparte central, e quanto mais próximas estas duas larguras forem,maior tem que ser a precisão do sistema de alinhamento. Comoresultado, é necessário reduzir a largura do fluxo de amostra tantoquanto possível.
O fluxo de amostra que contém as célulassangüíneas a serem contadas e/ou a serem diferenciadas, tem queser mais estreito quanto mais focada for a luz. Deste modo, éusado um fluxo em que a largura da seção é menor do que 50 um,que tem que cruzar o feixe de luz que, em si, está focado em umfeixe estreito com uma seção maior do que aquela do fluxo deamostra. Isso requer um sistema particularmente preciso e,conseqüentemente, caro, para a injeção do fluxo dentro do tanqueóptico. Na técnica anterior, tal resultado é obtido usando umsistema tipo hidrofoco (abreviação da expressão em inglês "focohidro-dinâmico"). O fluxo de amostra é circundado por um fluxoenvolvente. Um injetor para o fluxo de amostra é imerso nocentro do fluxo envolvente. O fluxo de amostra assim criado éalargado ou focado conforme ele se desloca a partir do injetor atéa zona iluminada pelo feixe de luz, de tal modo que ele tem, neste ponto, uma largura desejada de aproximadamente 5 a 50 um dediâmetro. Às vezes, é necessário um envoltório simples ou duplode modo a atingir este objetivo.
Além do mais, conforme mencionadoanteriormente, dado o nível de precisão requerido, um sistema deajuste é essencial de modo que o fluxo de células seja coincidentecom o feixe de luz. São possíveis duas abordagens: o fluxo decélulas ou o feixe de luz pode ser movido. Caso se escolha movero fluxo de células sangüíneas, toda a unidade de tanque ópticotem que ser movida. Quando esta opção é adotada, o tanque é montado sobre uma mesa de translação que assegura ummovimento preciso e uniforme ao longo de dois eixos devido aseus mancais esféricos. Tal conjunto mecânico de precisão ébastante caro. Também é possível mover o feixe de luz de modo atorná-lo coincidente com o fluxo de células sangüíneas. Issogeralmente é conseguido usando diversos prismas ajustáveis. Estasolução, que combina elementos ópticos com mecânica deprecisão, também envolve altos custos.
Além do mais, quando ela cruza o feixe de luz,a célula de sangue deflete a trajetória dos raios de luz. Aintensidade e o ângulo dos raios defletidos permitem que sejamobtidas informações sobre o tipo de célula. Duas faixas deângulos são geralmente usadas: ângulos estreitos menores do quedez graus com relação ao eixo geométrico óptico e ângulos largosaproximadamente perpendiculares ao eixo geométrico óptico. Nafaixa dos ângulos estreitos, dois itens de informações são úteis: asperdas no eixo e a difração. Perpendicular ao eixo geométricoóptico, geralmente são medidas a difusão e a fluorescência. Paraas duas faixas de ângulos, a luz, conseqüentemente, tem que serdistribuída em dois canais diferentes. Geralmente, isso éconseguido com espelhos dicróicos ou com filtros deinterferência. Os componentes ópticos são ambos produzidos pormeio da deposição de películas finas sobre um substrato de vidro.Eles têm boa eficiência, mas existe uma grande disparidade entreum filtro e um outro e seu tempo de vida é limitado. Logo, elestêm que ser regularmente substituídos.
Todos estes dispositivos geralmente volumosostambém são frágeis e requerem manutenção, o que também émuito caro. Tais dispositivo, por conseguinte, são muito restritosa laboratórios analíticos que são grandes o suficiente para seremcapazes de investir em tais aparelhos automáticos.
A finalidade da invenção é propor umdispositivo para diferenciação leucocítica e/ou contagem deleucócitos que seja mais simples e mais econômico tanto paraproduzir quanto para manter, permitindo o uso de aparelhosautomáticos equipados com o dispositivo, por laboratóriosmenores, ao mesmo tempo em que mantêm qualidade de mediçãoadequada.De acordo com o segundo objetivo da invenção,um dispositivo óptico para a contagem e/ou diferenciação deleucócitos em um analisador sangüíneo automático é proposto,caracterizado pelo fato de compreender uma fonte de luz do tipodiodo eletroluminescente, de modo a iluminar uma amostra desangue que circule no tanque óptico, de acordo com um eixo deinjeção, usando um feixe de luz fonte. Tal diodo permite que sejaobtido um feixe de luz que é mais homogêneo na largura de suaseção e, conseqüentemente, com uma zona de leitura maior e maishomogênea.
De preferência, o diodo emite luz cujocomprimento de onda é menor do que 600 nanômetros, e aindamais preferivelmente, menor do que 500 nanômetros. Talcomprimento de onda permite uma eficiência de difração melhor,conseqüentemente, melhor precisão para medições que usemdifração.
Além do mais, a largura do feixe emitido pelodispositivo óptico, isto é, o feixe fonte que ilumina o fluxo deamostra, está compreendida, vantajosamente, entre 50 e 200mícrons (um), próximo ao eixo de injeção, o que permite ailuminação de um fluxo de amostra mais largo, ao mesmo tempoem que permite precisão adequada nas medições realizadas.Ainda mais vantajosamente, esta largura está compreendida entre90 e 120 mícrons. Tal largura de fluxo é permitida, em particular,pelo uso de diodos eletroluminescentes.De preferência, o feixe de luz fonte é emitidoaproximadamente na direção do tanque, aproximadamentetransversalmente à direção de fluxo da amostra. Uma lâminatransparente, projetada de tal modo que o feixe fonte passe atravésdela, entre duas superfícies opostas, que é montada de maneirarotativa e disposta entre o diodo e o tanque, pode permitir que ofeixe de luz seja movido em uma direção transversal, graças à suadupla refração quando passa através da lâmina. A rotação dalâmina permite a modificação do ângulo de incidência do feixesobre a lâmina e, assim, o ajuste do valor do desvio transversal.De preferência, a lâmina transparente é montada de maneirarotativa em torno de um eixo que é aproximadamente paralelo aomovimento da amostra de sangue no tanque.
Além do tanque óptico, é vantajosamente usadoum meio para separação, por perdas de Fresnel, para um feixe deluz resultante incidente que tem origem no feixe de luz fonte,separando assim o dito feixe em um feixe axialmente resultante epelo menos um feixe resultante da perda constituída por perdas deFresnel, ao mesmo tempo em que passa através do meio deseparação. O meio de separação compreende pelo menos umasuperfície de separação que é uma superfície em um material deseparação transparente, o feixe axial tendo passado através domaterial transparente e o feixe tendo origem nas perdas de Fresnelrefletidas pela superfície de separação, sendo que a dita superfícieé inclinada com relação ao feixe de luz além do tanque. Umaúnica lâmina de vidro barata pode servir como um meio deseparação. Além do mais, ela tem tempo de vida virtualmenteilimitado e livre de manutenção, ao contrário de espelhosdicróicos ou filtros de interferência.
O dispositivo também pode compreender umaparelho para a medição da luz do feixe axialmente resultante epelo menos um outro aparelho para medir a luz de pelo menos umfeixe tendo origem nas perdas de Fresnel. Estes aparelhos demedição podem compreender, em particular, meios para amedição da fluorescência, das perdas de luz perto do eixo ou da difração perto do eixo. Podem compreender também meios paramedir a difração do feixe de luz em ângulos largos pela amostrano tanque. À guisa de exemplo, estes ângulos largos podem serângulos compreendidos entre 60° e 150°.
O dispositivo também pode compreender, natrajetória do feixe à frente do tanque, pelo menos um diafragmaque bloqueie luz espúria.
A invenção também se refere a um aparelho dehematologia, em particular, um analisador de sangue automáticoequipado com tal dispositivo.
De acordo com um terceiro objetivo , a presenteinvenção também se refere a um tanque óptico de passagem defluxo para um dispositivo óptico adequado para a contagem ediferenciação de leucócitos, por exemplo, um citômetro de fluxo,assim como a um aparelho de análise equipado com tal tanque. Oobjetivo da invenção é propor um tanque que seja mais simples emais econômico tanto para produzir quanto para manter,permitindo o uso de aparelhos automáticos equipados com estetanque por laboratórios menores, ao mesmo tempo em quemantém qualidade de medição adequada.
De acordo com a invenção, um tanque depassagem de fluxo para um dispositivo óptico para a contagem ediferenciação de leucócitos em um analisador sangüíneoautomático, é caracterizado pelo fato de que, em uma zona deanálise do tanque, a seção do tanque tem pelo menos umadimensão transversal compreendida entre 1 e 5 milímetros. Estaseção pode ser aproximadamente retangular e a direçãotransversal pode ser medida em um e/ou no outro lado doretângulo.
Tal tanque pode ser produzido assim, pelomenos parcialmente, a partir de um material plástico injetado. Taltanque é produzido de uma maneira particularmente vantajosa emcomparação com os tanques da técnica anterior, geralmenteformados de paredes de quartzo montadas por colagem.
O tanque também pode compreender pelomenos uma lente moldada em uma peça com o tanque. Esta pelomenos uma lente pode compreender uma lente destinada a serdisposta lateralmente com relação a um eixo óptico. Tambémpode compreender uma lente semi-esférica.
O tanque pode compreender, ao longo de umeixo geométrico óptico, uma janela para a introdução de um feixede luz e uma janela para o feixe sair. Pelo menos uma janela podeser moldada em uma peça com o tanque e/ou ser uma inserção emum material transparente, por exemplo, quartzo ou vidro.
Vantajosamente, o tanque pode compreenderum injetor para um fluxo de amostra e um meio para formar umfluxo envolvente em torno do fluxo de injeção. O injetor podecompreender um orifício de saída cujo diâmetro estácompreendido entre 20 mícrons e 150 mícrons, permitindo queseja obtida um fluxo de amostra que é notadamente maior do queos fluxos da técnica anterior. Em contraste aos dispositivos datécnica anterior, não é o fluxo envolvente que dita a largura dofluxo de amostra por estiramento, mas o formato e a direção dasaída do injetor. Conseqüentemente, o fluxo envolvente nãodesempenha um papel ativo, mas meramente um papel passivo,em particular, por exemplo, para centralizar o fluxo de amostraem um tanque largo.
De acordo com uma primeira modalidade, esteinjetor pode ser formado em uma peça em um material mais oumenos rígido. Este material pode ser, por exemplo, um açoinoxidável, uma cerâmica, rubi sintético ou um material plástico ou diversos destes materiais.
De acordo com uma segunda modalidade, esteinjetor pode compreender um tubo estrutural rígido, por exemplo,feito de metal, por exemplo, feito de aço inoxidável e, dentro dotubo estrutural, um tubo plástico de revestimento terminando emum bocal formado em uma peça com o tubo de revestimento. Omaterial plástico do injetor pode ser um politetrafluoroetileno,que permite que a amostra circule mais facilmente no tubo ereduza o risco de estragar.
A invenção também se refere a um injetor paraum tanque, de acordo com a invenção, injetor este que éproduzido de acordo com uma destas modalidades.
A invenção também se refere a um aparelho dehematologia, em particular um analisador sangüíneo automático,equipado com um tanque de acordo com a invenção.
De acordo com um quarto objetivo, a presenteinvenção também se refere a um dispositivo hidráulico para umaparelho de análise hematológica que seja mais simples e maiseconômico tanto de produzir quanto de manter e que permita ouso de aparelhos automáticos, equipados com tal dispositivo, porlaboratórios menores, ao mesmo tempo em que mantém umaqualidade de medição adequada. A presente invenção também serefere a um método de análise adequado para tal dispositivo.
A presente invenção, deste modo, propõe umdispositivo hidráulico para um aparelho de análise sangüínea, emparticular um aparelho automático, compreendendo um meio parainjetar, sob pressão, um fluxo de amostra em um tanque óptico depassagem de fluxo e para criar um fluxo envolvente de líquido emtorno do fluxo de amostra, com um líquido envolvente,caracterizado pelo fato de compreender um meio para ajustar umataxa de fluxo do fluxo de amostra com relação à taxa de fluxo dolíquido envolvente. Tal ajuste pode tornar possível manter fluxoshomogêneos e aproximadamente não turbulentos no tanque.O meio de injeção pode compreender seringas,um circuito hidráulico e válvulas solenóides. Estes meios podemcompreender meios para a injeção da amostra sob pressão comrelação ao fluxo envolvente.
Este dispositivo pode, vantajosamente,compreender um meio para formar um pistão para a amostrainjetada com um líquido de deslocamento. Tal líquido dedeslocamento torna possível usar apenas uma pequena amostrasuficiente para a análise, o resto do líquido requerido para ainjeção sendo um líquido disponível no aparelho de análise e nãotão precioso quanto a amostra.
O envoltório é particularmente útil quando seusa um tanque com uma seção larga ao mesmo tempo em que semantém uma pequena seção para o fluxo de amostra. Como umdos meios para ajustar o fluxo de amostra em relação ao fluxoenvolvente, o dispositivo pode compreender, vantajosamente, ummeio para ajustar uma taxa de fluxo do líquido de deslocamentocom relação à taxa de fluxo do líquido envolvente. O meio deajuste pode compreender um meio para uma queda de pressão emum circuito derivado para o líquido de deslocamento e/ou umaqueda de pressão em um circuito derivado para o líquidoenvolvente. Por exemplo, o meio de queda de pressão pode serescolhido a partir de um comprimento conhecido de um tubocalibrado, uma resistência hidráulica fixa e uma resistência variável.O dispositivo hidráulico pode compreenderapenas uma motorização, por exemplo, um motor elétricosimples, para gerar o fluxo de amostra e o fluxo envolventesimultaneamente. Além do mais, pode compreender pelo menosduas seringas para gerar o fluxo de amostra e o fluxo envolvente,os pistões da seringa sendo formados firmemente presos um nooutro. Assim, eles têm um movimento comum e os fluxos deamostra e envolvente são, certamente, simultâneos.
Em particular, um tanque hidrofoco da técnicaanterior pode ser usado com um circuito, tal conforme descritoanteriormente, de acordo com a invenção,sendo que a injeção daamostra neste tanque pode acontecer sem pressão com relação aofluxo envolvente.
De acordo com a invenção, um método para aanálise de uma amostra de sangue em um citômetro de passagemde fluxo também é proposto, caracterizado pelo fato de que umaamostra de sangue é injetada, opcionalmente sob pressão, em umtanque de passagem de fluxo do citômetro, a amostra formandoum fluxo de amostra lá e um fluxo envolvente líquido é criado emtorno do fluxo de amostra, com um líquido envolvente,caracterizado pelo fato de que a taxa de fluxo do fluxo de amostraé ajustada com relação à taxa de fluxo do líquido envolvente.
Em particular, é possível introduzir a amostraem um ramal de injeção de um circuito hidráulico e introduzir amontante da amostra no ramal de injeção, um líquido dedeslocamento, sendo que o líquido de deslocamento serve paraempurrar a amostra durante sua injeção no tanque. Este líquido dedeslocamento pode ser escolhido a partir de um reagente e de umdiluente, de preferência um reagente. Conseqüentemente, nãoexiste razão em proporcionar outro líquido que não aquele que seja estritamente necessário para a preparação da amostra comvistas a sua análise ou análises.
Também é possível criar em torno do fluxo deamostra no tanque, um fluxo envolvente com um líquidoenvolvente. Este líquido envolvente também pode ser escolhido apartir de um reagente e um diluente, de preferência, um diluente.Neste caso, não existe razão em proporcionar um outro líquidoque não aquele que seja estritamente necessário para a preparaçãoda amostra com vistas a sua análise ou análises.
No caso em que é usado um método hidrofoco ou um tanque, de acordo com o terceiro objetivo da invenção, évantajoso ajustar a taxa de fluxo do líquido de deslocamento comrelação à taxa de fluxo do líquido envolvente, por exemplo, pormeio da introdução de uma queda de pressão em um circuitoderivado para um líquido de deslocamento e/ou meio de queda de pressão em um circuito derivado para um líquido envolvente.
Em um método de acordo com a invenção, emparticular para um tanque de acordo com o terceiro objetivo dainvenção, pode-se facilmente proporcionar que a amostra desangue tenha uma taxa de diluição de pelo menos 1/100°. Naverdade, em tal método, a amostra pode ser introduzida sobpressão com relação ao líquido envolvente, no tanque, a umavelocidade maior do que aquela dos métodos da técnica anterior ecom larguras de seção maiores para o fluxo de amostra no tanque.Assim, sem aumentar o tempo de análise, para uma diferenciaçãoe uma contagem dos leucócitos, pode ser usada uma taxa dediluição que seja idêntica àquela usada convencionalmente para amedição de hemoglobina, em particular taxas de diluição compreendidasentre 1/100° e 1/500°, particularmente entre 1/160° e 1/180°.
A invenção também se refere a um aparelho dehematologia, em particular um aparelho automático de análise de sangue, caracterizado pelo fato de compreender um dispositivohidráulico de acordo com a invenção.
A presente invenção será melhor compreendidae outras vantagens se tornarão aparentes à luz da descrição aseguir das modalidades, descrição esta que é feita com referência aos desenhos anexos em que:
- a Figura 1 ilustra, de maneira diagramática, um exemplo deequipamento de acordo com o primeiro objetivo da invenção;
- as Figuras 2a-2e são gráficos de testes de linearidade da mediçãode hemoglobina por espectrofotometria de acordo com o método da invenção;
- as Figuras 2f-2i são cito-gráficos correspondentes;
- a Figura 3 é uma vista diagramática de um aparelho automáticopara a análise de uma amostra de sangue usando um dispositivohidráulico de acordo com o quarto objetivo da presente invenção;- a Figura 4 é uma vista longitudinal diagramática de uma unidadede dispositivo óptico de acordo com o segundo objetivo dainvenção;
- a Figura 5 é uma vista longitudinal diagramática mais detalhada do dispositivo óptico da Figura 4, em um plano perpendicular
àquele da Figura 4;
- a Figura 6 é uma vista em perspectiva de um tanque óptico deacordo com o terceiro objetivo da invenção;
- a Figura 7 é uma vista em seção longitudinal de uma primeira modalidade de um injetor para um tanque óptico de acordo com ainvenção;
- a Figura 8 é uma vista em seção longitudinal de uma segundamodalidade de um injetor para um tanque óptico de acordo com ainvenção;
- a Figura 9 é uma vista em seção longitudinal de umaextremidade do injetor da Figura 8;
- a Figura 10 é uma vista em seção longitudinal de um tanqueilustrando um método da técnica anterior para injetar a amostra desangue no tanque; e
- as Figuras lla-llc são gráficos que ilustram resultados obtidoscom um aparelho automático usando o método da invenção eusando um cito-gráfico com o dispositivo óptico e tanque, deacordo com a invenção.
A Figura 1 ilustra, de maneira diagramática, um tanquesimples de diluição e análise 1 ao qual pode se fornecer umaamostra de sangue 2 a ser analisada, um diluente 3 e um reagente4 que formam, juntos, uma solução de análise. Este tanque 1 éequipado com meios para medir, por fotometria 5, o nível dehemoglobina na dita solução de análise e um meio para medir 6, aresistividade da dita solução de análise de modo a contar onúmero total de leucócitos. Geralmente, os meios sãoproporcionados para tomar uma fração da solução de análise apartir do tanque de análise 1 e para injetá-la em um tanque óptico7 equipado com o meio de medição óptico 8 (por exemplo, umcitômetro de fluxo) para uma análise dos leucócitos. De acordocom o exemplo escolhido, também são proporcionados meiospara tomar uma fração de uma pré-solução constituída pelaamostra de sangue e diluente e introduzi-la em um tanque decontagem e diluição 9 equipado com meios para medir aresistividade 10 da dita fração para poder contar os eritrócitos eplaquetas. O equipamento é convencionalmente equipado commeio de aquecimento para obter uma temperatura controladatermostaticamente de aproximadamente 35°C. Esta temperaturapermite tempo e qualidade ótimos de reação de lise doseritrócitos.
O equipamento opera da seguinte maneira:
- uma alíquota de sangue (15,6 ul) é injetada no tanque de análise1 e é diluída com 2 ml de diluente de modo a formar uma pré-solução de análise; a taxa de diluição é 1/130°;
- uma fração muito pequena (aproximadamente 20 ul) é tiradadesta pré-solução de análise e depositada no tanque 9 paracontagem dos eritrócitos e plaquetas;- adiciona-se então 0,7 ml de reagente à pré-solução remanescenteno tanque de análise 1: a lise dura aproximadamente 10 segundos(de modo a destruir os eritrócitos, formar e estabilizar o complexode oxiemoglobina), a solução de análise assim formada tem umataxa de diluição final de aproximadamente 1/173°; uma fração dadita solução de análise é tirada e injetada no tanque óptico 7 ondea análise dos leucócitos pode acontecer (contagem e/oudiferenciação dos leucócitos por sub-populações);simultaneamente, no tanque de análise 1, os leucócitos sãocontados por uma medição de resistividade e a hemoglobina, poruma medição por absorvência no comprimento de onda docomplexo de oxiemoglobina formado.
Um dispositivo óptico, de acordo com ainvenção, particularmente adequado para uma análise deleucócitos de uma solução de análise tendo uma taxa de diluiçãomenor do que 1/100°, é descrito abaixo, mais particularmente,adequado para uma diluição compreendida entre 1/160° e 1/180°.Convencionalmente, uma taxa de diluição de 1/160° é consideradacomo sendo mais baixa do que uma taxa de 1/100°.
É óbvio que modalidades variantes do método edo equipamento descritos acima são possíveis:
- para o equipamento: podem ser proporcionados meios paraintroduzir separadamente o composto de lise, o composto leuco-protetor e o composto que estabiliza o complexo formado com a hemoglobina no tanque de análise 1 e, conseqüentemente, umtanto mais na forma de um mono-reagente; o meio 6 para medir aresistividade da solução de análise é opcional; sendo que onúmero total de leucócitos a ser obtido por análise óptica dasolução de análise; similarmente, o tanque de contagem 9 e omeio para medição 10 da resistividade neste tanque, podem serproporcionados apenas se uma análise completa da amostra desangue for desejada.
- do mesmo modo para o método: a introdução dos compostos dereação pode ser considerada independentemente ou coletivamenteno lugar de um mono-reagente, sendo que a introdução pode serrealizada simultaneamente ou sucessivamente; o estágio anteriorde contagem dos eritrócitos e de plaquetas e o estágio decontagem global dos leucócitos pode ser omitido; além do mais,duas diluições sucessivas da amostra de sangue podem serrealizadas: uma primeira diluição que é particularmente adequadapara uma diferenciação de leucócitos (aproximadamente até1/80°), conforme acontece no citômetro do tipo hidrofoco padrãoconhecido, a partir do qual a fração requerida para estadiferenciação de leucócitos é tirada, então, em um segundomomento no tempo, uma segunda diluição adequada paramedição da hemoglobina (compreendida entre 1/100° e 1/500°),conforme é possível com os espectrômetros conhecidos.
De acordo ainda com outra variante, o tanque 1pode servir em um segundo momento para realizar a contagemdos eritrócitos e das plaquetas após a limpeza, preenchendo-se otanque com uma amostra que esteja aguardando em uma agulhade seringa.Os resultados obtidos serão descritos agora comum exemplo específico de (mono)-reagente, de acordo com ainvenção.
Um mono-reagente é preparado usando aformulação Eosinofix® da companhia ABX, comercializada paradeterminação de leucócitos em citometria de fluxo e contendo,para esta finalidade, um composto para efetuar a lise doseritrócitos e um composto leuco-protetor (cf. patente EP0430750,da ABX). De acordo com a invenção, um composto que estabilizeo complexo de hemoglobina foi adicionado.
Medições da Hemoglobina por Espectrofotometria
Testes de linearidade foram realizados usandoum espectrofotômetro em 542 nm. Os gráficos são mostrados nasFiguras 2a-2e. Eles representam as concentrações de hemoglobinamedidas em relação às concentrações esperadas. Maisespecificamente:
- A Figura 2a corresponde a uma lise dereferência para medição da hemoglobina por espectrofotometria(LMG®, vendido por ORPHEE);
- as Figuras 2b, 2c e 2d correspondem ao mono-reagente, de acordo com a modalidade no. 4 com, como agente deestabilização do complexo de hemoglobina, respectivamente,Tiron, DDAPS e imidazol; e
- a Figura 2e corresponde ao método dainvenção implementado usando um mono-reagente Eosinofix®sozinho, isto é, não contendo agente de estabilização do complexode hemoglobina, de acordo com a presente invenção.
Para os três testes realizados de acordo com ainvenção, um teste de linearidade positivo é obtido para cada comum coeficiente de concentração R2 de 1 ± IO"4 (mostrado nafigura). Este resultado está de acordo com aquele obtido com alise de referência da Figura 2a. Isso significa que o método dainvenção realmente permite a medição de um nível dehemoglobina real em uma amostra de sangue.
Por contraste, conforme é visto na Figura 2e,com o reagente (Eosinofix) sem um estabilizante de hemoglobina,uma relação linear não é obtida. Isso significa que este reagentesozinho não pode ser usado para medir um nível de hemoglobina.
Diferenciação de Leucócitos por Citometria de Fluxo
As Figuras 2f a 2i são cito-gráficos obtidosusando um citômetro de fluxo BD FACScan®, correspondendorespectivamente ao Eosinofix sozinho e Eosinofix ao qualDDAPS, Tiron e imidazol são adicionados. Nestas figuras, vê-seque a diferenciação das sub-populações é conseguida e de umamaneira que é comparável a um reagente padrão paradiferenciação de leucócitos (matriz obtida com Eosinofix na Figura 2f).
Também se pode fazer referência ao cito-gráficoda Figura 11b (descrita abaixo) em particular, obtido com umcitômetro de acordo com a invenção.O dispositivo hidráulico de acordo com o quartoobjetivo da invenção, será descrito agora.
A Figura 3 representa parcialmente o diagramade um sistema hidráulico 100 e parte do equipamento de umanalisador de sangue automático 20, na medida em que elapermite uma compreensão do dispositivo hidráulico de acordocom a invenção.
O aparelho automático ilustrado na Figura 3compreende, em particular, uma agulha 101 para amostragem desangue a ser analisado em um tubo que foi usado para seuarmazenamento e seu transporte até o aparelho automático. Osangue tirado é derramado pela agulha na forma de uma amostraem um tanque 102. O tanque 102 é designado, em particular, paraa diluição e/ou lise dos eritrócitos da amostra de sangue. Toda aamostra ou parte da amostra, antes ou depois da diluição, pode sertirada com vistas a análise em uma outra parte do aparelhoautomático, por exemplo, em um dispositivo 120, descrito abaixo.Um dispositivo para análise da hemoglobina 110 (umespectrofotômetro, por exemplo) é disposto perto do tanque 102.
Um local de armazenamento 103 para um produto de diluição eum local de armazenamento 104 para um reagente, em particularum reagente de lise, são conectados ao tanque 102 via circuitohidráulico 100.
Um outro dispositivo de análise 120 é dedicadomais especificamente à contagem e diferenciação dos leucócitos,por exemplo, em toda ou em parte da amostra tirada do tanque102. A partir daqui, amostra também se referirá a este todo ouesta parte. O dispositivo para análise dos leucócitos 120compreende, em particular, um dispositivo óptico 200 e umtanque óptico 300. O tanque óptico é conectado ao tanque 102 viacircuito hidráulico.
Um conjunto de seringas permite o movimentodos líquidos no circuito hidráulico. Destas seringas, uma seringa105 dedicada ao diluente, e uma seringa 106 dedicada aoreagente, são representadas de tal modo que a invenção é bemcompreendida. Outras seringas que não estão representadasporque elas não são necessárias para a compreensão da invenção,podem completar o dispositivo.
Além dos tubos para a circulação dos líquidos, ocircuito hidráulico compreende válvulas solenóides para amudança de diferentes circuitos no circuito hidráulico 100, deacordo com seu uso em um dado momento da análise. Oitoválvulas solenóides 111-119 das válvulas solenóides do circuitohidráulico 100 estão ilustradas na Figura 3. Cada válvulasolenóide compreende duas posições, cada uma identificada,respectivamente, com a letra A ou B.
O desenho do circuito hidráulico, conforme serádescrito abaixo, permite o uso de apenas uma motorização M paraas seringas ilustradas. A mesma motorização também pode serusada para outras seringas. Assim, os pistões das seringas 105,106 são firmemente fixados um no outro. Seu movimento,conseqüentemente, é simultâneo, ou empurrando P, quando elessão acionados para dentro do respectivo cilindro de cada seringa,ou puxando, T, quando eles são retirados.
Será descrito agora o arranjo e então, a operaçãohidráulica do aparelho automático.
O tanque 300 compreende um corpo externo301 e um injetor 302, dentro do corpo 301, um volume deenvolvimento 303 é formado entre o corpo e o injetor.
O circuito hidráulico 100 compreende:
- um ramal de injeção 131 que se estende amontante do injetor, entre o injetor e a válvula 111;
- um ramal de amostra 132 que é conectado aum ponto de ramificação de amostra 142 até o ramal de injeção ese estende até o tanque 102;
- um ramal de sucção 133 que é conectado emum ponto de ramificação de sucção 143 até o ramal de injeção, amontante do ponto de ramificação de amostra 142, via válvula113 e se estende até uma fonte de vácuo 107, por exemplo, umaseringa ou uma bomba peristáltica;
- um ramal de descarga 134 que é conectado emum ponto de ramificação de descarga 144 até o ramal de injeção,a montante do ponto de ramificação de sucção 143 e se estendeaté o local de armazenamento de produto reagente 104;
- um ramal de revestimento 135 que se estende amontante do corpo 301 e conecta o volume de envolvimento e aválvula 115;- um ramal de diluição 136 que se estende entrea válvula 116 e um uso 108 para o diluente via válvula 115;
- um ramal diluente 137 que se estende entre olocal de armazenamento de diluente 103 e a válvula 116;
- um ramal de reagente 140 que se estende entreo local de armazenamento de reagente 104 e a válvula 117;
- um ramal de reação 141 que se estende entre aválvula 117 e um uso 109 para o reagente via válvula 111;
- um ramal de drenagem 138 para o tanque 102que se estende entre o tanque 102 e a fonte de vácuo 107 viaválvula 118, sendo que o ramal de amostragem 132 é conectadoao ramal de drenagem entre o tanque 102 e a válvula 118 e sendoque o ramal de sucção é conectado ao ramal de saída 132 além daválvula 118 em relação ao tanque; e
- um ramal de saída 139 que conecta a jusantedo tanque 300, via válvula 119, a um tanque de refugo, porexemplo, a pressão atmosférica ou via uma fonte de sucção, umaseringa ou uma bomba peristáltica.
Em uma primeira posição 116A da válvula 116,a seringa de diluição 105 está em comunicação com o local dearmazenamento de diluente, tal que um movimento de puxar Tpermite que a seringa 105 seja preenchida co diluente.
Em um primeiro caso, a seringa de diluição quecontém diluente, com a válvula 116 estando em sua segundaposição 116B, que conecta a seringa 105 ao ramal de diluição 136e a válvula 115 estando em sua primeira posição 115A, queconecta o ramal de diluição ao uso 108 para o diluente, ummovimento de empurrar P permite que o diluente seja movidopara este uso 108, por exemplo, no tanque 102, por exemplo, parauma diluição de toda a amostra.
Em um segundo caso, com a válvula 116estando em sua segunda posição 116B e a válvula 115 estando emsua segunda posição 115B, que conecta o ramal de diluição aoramal de revestimento 135, um movimento de empurrar P permiteque o diluente seja movido para dentro do tanque óptico 300, demodo a formar um fluxo envolvente ali. A utilidade deste fluxoenvolvente no contexto da invenção será analisada em umadescrição do tanque 300 abaixo.
A válvula 117 estando em uma primeira posição117A que conecta a seringa do reagente ao local dearmazenamento de reagente 104, e a válvula 114 estando em umaprimeira posição 114A, que fecha o ramal de descarga 134, ummovimento de puxar T permite que a seringa de reagente 106 sejapreenchida com reagente.
Em um primeiro caso, a seringa de reagentecontendo reagente, com a válvula 117 estando em sua segundaposição 117B que conecta a seringa de reagente 104 ao ramal dereação 141 e a válvula 111 estando em uma primeira posição11 IA, que conecta o ramal de reação ao uso 109 para o reagente,um movimento de empurrar P permite que o reagente seja movidopara este uso 109, por exemplo, no tanque 102, por exemplo, parauma lise de toda a amostra.Em um segundo caso, a válvula 117 estando emsua segunda posição 117B e a válvula 111 estando em suasegunda posição 111B, que conecta o ramal de reação 141 aoramal de injeção 131, a seringa de reagente 106 é conectadadiretamente ao injetor 302.
A válvula 118 estando em uma primeira posição118A que isola o ramal de sucção 133 do ramal de amostra 132através do ramal de drenagem, a válvula 112 estando em umaprimeira posição 112A que conecta a parte a montante à parte ajusante do ramal de amostra 132, a válvula 113 estando em umaprimeira posição 113A que conecta a parte a jusante à parte amontante do ramal de sucção 133, conseqüentemente à fonte devácuo 107, a amostra a ser analisada é sugada para dentro doramal de injeção 131, entre o ponto de ramificação de amostra142 e o ponto de ramificação de sucção 143.
O ramal de descarga 134 compreende umaresistência de fluido variável ou calibrada 150.
Quando a seringa de diluente 105 contémdiluente, a seringa de reagente 106 contém reagente e umaamostra de sangue a ser analisada está no ramal de injeção 131; equando as válvulas 112, 113 estão em suas segundas posições112B, 113B, que isolam a parte a montante e a parte a jusante deseus respectivos braços; e quando as válvulas 115, 116 estão emsuas segundas posições 115B, 116B, que conectam a seringa dediluente 105 ao volume envolvente 303; quando finalmente asválvulas 111, 117 estão em suas segundas posições 111B, 117B,que conectam a seringa de reagente 106 ao injetor 302 e a válvula114 está em sua segunda posição 114B; um simples movimentode empurrar P gerado pela motorização M, permite o acionamentodo diluente, do reagente e da amostra de sangue na direção de eatravés do tanque 300, enquanto uma parte do reagente, que éuma função da resistência do fluido 150, é retornada para o localde armazenamento de reagente 104.
A resistência 150 permite, em particular, oajuste das taxas de fluxo dos líquidos de envolvimento e dedeslocamento um com relação ao outro. Isso permite que estastaxas de fluxo sejam adaptadas para as diferentes funções desteslíquidos. Em particular, isso permite que sejam obtidasvelocidades de fluxo similares para o envoltório e a amostra nazona de análise 304 quando é usado um tanque hidrofoco padrão.
Em particular, o ramal de descarga 134 e osarranjos descritos anteriormente, tornam possível usar umamotorização simples e conseqüentemente, reduzir, em particular,o custo de um aparelho de análise automático, assim como seuvolume.
O diluente forma, em uma zona de análise 304do tanque 300, um fluxo envolvente para a amostra (veja emparticular as Figuras 4 e 5). O reagente, situado a montante daamostra no ramal de injeção 131, serve como um líquido dedeslocamento, isto é, permite que o movimento do pistão daseringa de reagente seja transmitido para a amostra. Assim, nãoexiste razão em preencher a seringa de reagente com a amostra demodo a ser capaz de realizar sua análise. Assim, mesmo umaamostra de pequeno volume pode ser analisada e toda estaamostra pode ser injetada e analisada, sem que uma parte delapermaneça no ramal de injeção 131 ou na seringa 106.
É óbvio que outras seringas, válvulas e ramais,não representados na Figura 3, pode constituir o circuitohidráulico 100, para o aparelho de análise automático 20 operarbem e totalmente.
O dispositivo óptico 200, de acordo com ainvenção, será descrito agora, em particular no que diz respeito àsFiguras 4 e 5.
O dispositivo óptico compreende uma fonte deluz aproximadamente monocromática 201. Esta fonte de luz é umdiodo eletroluminescente. A luz é emitida principalmente aolongo de um eixo óptico X200. O eixo óptico X200 é dispostoaproximadamente perpendicular a um eixo de injeção X300 paramovimento da amostra no tanque óptico 300. Os dois eixos X200e X300 definem, juntos, um plano óptico.
De modo a impedir que o feixe de luz fonte 311produzido pela fonte 201 seja poluído por luz espúria, umconjunto de três diafragmas é disposto, cada um perpendicular, natrajetória do feixe. Os diafragmas 202 são perfurados por orifícioscujo diâmetro é aproximadamente igual ao feixe e éprogressivamente aumentado em cada diafragma de modo aadaptá-lo ao diâmetro do feixe de medição à medida que estediâmetro aumenta ao afastar-se da fonte 201. Então, o feixe passaatravés de um dispositivo de foco 203 constituído por uma oumais lentes.
Além do dispositivo de foco, o feixe encontraum dispositivo de ajuste que permite que o eixo óptico sejamovido em um plano perpendicular ao eixo de injeção X300, istoé, em uma direção transversal em relação ao movimento daamostra no tanque. Um desvio lateral do feixe pode levar a umailuminação parcial ou nenhuma iluminação da amostra, o que temuma influência direta sobre o resultado da análise.
No contexto do exemplo descrito, o dispositivode ajuste é constituído por uma lâmina transparente 220 montadade maneira rotativa em torno de um eixo X220. O) eixo 221 éaproximadamente paralelo ao eixo de injeção X300. Se a lâminafor disposta perpendicular ao eixo óptico X200, o feixe passaatravés dela sem ser defletido. Por outro lado, se a lâmina formarum ângulo com o eixo óptico, uma refração dupla, na entrada ena saída da lâmina, desvia o feixe em um plano perpendicular aoeixo de ajuste X220. O eixo de ajuste X220, sendoaproximadamente paralelo ao eixo de injeção X300, apenas umdesvio transversal é gerado pela refração na lâmina. Quanto maiora espessura e/ou o índice de refração da lâmina e quanto mais alâmina for inclinada com relação ao eixo óptico, maior é o desvio.Assim, para uma lâmina com uma espessura escolhida e índice derefração, é suficiente girar a lâmina 220 em torno de seu eixoX220 de modo a ajustar a posição do feixe com relação à amostraque se move na zona de análise 304 do tanque óptico 300. Taldispositivo de ajuste é particularmente econômico em comparaçãoaos dispositivos da técnica anterior, especialmente já que umarotação precisa é geralmente mais fácil de realizar do que umatranslação precisa, usando mecânica de alta precisão.
Após ter penetrado no tanque e passado atravésda amostra, o feixe fonte 211 se torna, pelo menos parcialmente,um feixe axialmente resultante 212, que sai do tanqueaproximadamente ao longo do eixo óptico. O feixe axialmenteresultante 212 carrega informação sobre a amostra através da qualele passou.
De modo a permitir medições simultâneas dediversos destes itens de informação, tem que ser possível analisaro feixe com diversos aparelhos de medição 222, 223. Emparticular, a análise óptica se baseia na detecção da luz difratadade acordo com duas faixas de ângulos: ângulos estreitos e ânguloslargos. Em cada uma destas faixas de ângulo, dois itens diferentesde informações são usados. Logo, é necessário distribuir a luz emdois canais diferentes para cada faixa. Logo, o meio 205 paraseparar o feixe resultante 212 em dois feixes resultantes 213, 214,é usado. O meio de separação é constituído principalmente porum divisor de feixe 205. Este divisor de feixe é uma lâmina devidro transparente. Ela é disposta a 45 graus com relação ao eixoóptico. Um feixe axialmente resultante secundário 213, formadopela luz que passou através do divisor de feixe, e um feixeresultante da perda 214, formado pelas perdas de Fresnel, isto é,pela luz refletida pelo divisor de feixe, são assim produzidos.Tal divisor de feixe tem um custo muito baixoem comparação ao meio de separação usado na técnica anteriorem dispositivos de análise óptica deste tipo. Em particular, pornão compreender qualquer revestimento refletor adicional, ele évirtualmente resistente ao envelhecimento e praticamente, nãorequer manutenção. Dadas as múltiplas reflexões dentro da lâminae a polarização da radiação incidente do feixe axialmenteresultante, entre 5 e 15% da energia é refletida, sendo que o restoé transmitido na forma do feixe axialmente resultante secundário.
Entre o tanque e o divisor de feixe, o feixeaxialmente resultante 212 é tornado paralelo por meios adequados206. Além do divisor de feixe, os feixes resultantes 213, 214 sãonovamente focados por respectivos meios adequados 207, 208,com vista a sua análise pelos respectivos aparelhos de medição222, 223.
No exemplo descrito, o aparelho de medição222, que analisa o feixe secundário axialmente resultante 213 éum aparelho para medição da difração perto do eixo óptico pelascélulas sangüíneas (chamada uma medição FSC). No exemplodescrito, o aparelho de medição 223, que analisa o feixeproduzido pelas perdas de Fresnel 214 é um aparelho para amedição das perdas de luz no eixo (chamada uma medição ALL),isto é, o obscurecimento da luz pelas células na amostra.
A Figura 5 representa, de maneira diagramática,uma seção do tanque em um plano perpendicular ao eixo deinjeção X300 e contendo o eixo óptico X200. Conforme estáparticularmente ilustrado nesta figura, a luz re-emitidalateralmente pela amostra em um fluxo lateralmente resultante315, focado além do tanque em um aparelho de medição 224,também é analisada.
Um tanque óptico, de acordo com a invenção,em particular considerado para uso com um circuito hidráulico,tal conforme descrito anteriormente, será descrito agora, emparticular com referência à Figura 6. A operação deste tanquepode ser comparada a uma operação tipo hidrofoco da técnicaanterior, que é representada de modo muito diagramático naFigura 10.
O tanque 350 da Figura 10 compreende umcorpo 351, um injetor 302 e uma zona de análise 354. Umadimensão transversal interna D354 do tanque temaproximadamente 250 mícrons. Esta dimensão pode ser umdiâmetro, se o tanque tiver uma seção circular, ou um lado, se eletiver uma seção quadrada ou retangular. Conforme está ilustradopelas linhas pontilhadas, um fluxo de envolvimento 362 é usadopara reduzir, em particular, o diâmetro de um fluxo de amostra361, tal que na zona de análise 354, o fluxo de amostra tem, natécnica anterior, um diâmetro D361 de menos de 50 mícrons.
O tanque 300, de acordo com a invenção,ilustrado nas Figuras 4 a 6, compreende o corpo 301 e o injetor302, disposto aproximadamente coaxialmente ao longo de umeixo de injeção X300. A zona de análise 304 é disposta a jusantedo injetor.O corpo é produzido a partir de um materialinjetado, de preferência, a partir de um material plástico. Talmétodo de produção permite que sejam obtidos formatoscomplexos. Em particular, uma lente 305 é moldada no corpo.Esta lente permite que a luz, que é obscurecida, difratada oudifusa, pelas células sangüíneas, seja coletada.
Esta lente tem que ter dimensões, em particular,diâmetro suficiente, para que as possíveis heterogeneidades locaisno material injetado possam ser desconsideradas com relação aestas dimensões. No exemplo ilustrado, a lente 305 tem umdiâmetro de cerca de 3 mm. Esta lente injetada é uma lente lateral305 através da qual o feixe lateralmente resultante 315 passa.Além do mais, a lente lateral tem que permitir que a luz sejacoletada em tantas direções quanto forem possíveis, isto é, comum campo direcional que seja tão largo quanto possível. Assim,quanto mais perto a lente estiver da amostra, maior o campodirecional. No exemplo ilustrado, a lente é uma lente semi-esférica, chamada uma lente de 90°. Além do mais, a lente sendouma parte da parede do tanque, existe contato direto com olíquido no tanque, isto é, não existe espaço de ar, com um baixoíndice de refração, entre a amostra e a lente. Isso melhora amedição.
De modo a superar as deficiências dehomogeneidade, é usado vidro onde a luz é particularmentefocada, por exemplo, um vidro do tipo BK7. Este é o caso emparticular para as janelas axiais 306, onde o feixe fonte 211penetra no tanque e onde o feixe axialmente resultante 212 saidele.
De modo a ser capaz de produzir uma lenteinjetada com tais dimensões, é necessário, na zona de análise, queo tanque 300 tenha dimensões pelo menos comparáveis. Além domais, estas grandes dimensões permitem que as janelas de vidrosejam integradas nas paredes de plástico, enquanto os tanques datécnica anterior, tendo pequenas dimensões, são feitos comparedes totalmente de vidro ou quartzo. No exemplo ilustrado emparticular nas Figuras 5 e 6, a seção inferior do tanque tem 4,5mm ao longo do eixo óptico por 33 mm na direção perpendicular.Esta seção retangular com grandes dimensões, associada a umpequeno volume da amostra, que transporta as células de sangue aserem analisadas, requer o uso de um envoltório hidrodinâmico daamostra. À guisa de comparação, um tanque da técnica anteriortem uma dimensão transversal interna D354 da zona de análiseperto de 250 mícrons.
A montante da zona de análise 304, o corpo 301do tanque circunda o injetor 302 e forma, em torno do injetor, ovolume envolvente 303. As paredes do injetor separam um fluxo311 formado pela amostra dentro do injetor, de um fluxoenvolvente 312 no volume envolvente. O fluxo de amostra temorigem no ramal de injeção 131 do circuito hidráulico 100. Nazona de análise, os dois fluxos estão em contato, permanecemconcêntricos e fluem simultaneamente no tanque.De modo a reduzir os custos de produção doaparelho automático, pode ser vantajoso reduzir a precisão daprodução das partes. Conforme mencionado acima, tal objetivopode ser atingido criando-se um fluxo de amostra com uma seçãomaior.
No entanto, se uma técnica da arte anterior forusada quando o fluxo de amostra for estirado por um fluxoenvolvente, um fluxo de amostra com uma seção grande seráturbulento, o que afeta, em particular, de maneira adversa aprecisão de medições. Além do mais, a seção do fluxo de amostraserá progressivamente reduzida, que é o oposto do efeitodesejado, que é ter um fluxo de amostra com uma grande seção.Tal objetivo é atingido usando o circuito hidráulico 100 de acordocom a invenção, descrito anteriormente com referência à Figura 1.
Tal circuito torna possível obter velocidades escolhidasindependentemente para o fluxo envolvente e para aquele dofluxo de amostra de modo que apareça pouca turbulência no fluxode amostra e que esta turbulência não tenha efeito notável sobre oresultado da análise. Os dois fluxos podem ser, cada um,aproximadamente uniformes, opcionalmente laminares em certasfaixas de velocidades apropriadas.
Além do mais, um injetor 302, conforme estáilustrado na Figura 7 ou Figura 8, também permite a limitação daturbulência no fluxo de amostra. Além do mais, ele permite umaalta velocidade de injeção da amostra no tanque óptico, enquantomantém seu fluxo aproximadamente uniforme.Um injetor 302, conforme está ilustrado naFigura 7, compreende um tubo estrutural 320, por exemplo, feitode aço inoxidável, o que assegura a rigidez do injetor. O tuboestrutural é revestido no lado de dentro por um tubo 321 feito deum plástico, por exemplo, um politetrafluoroetileno (PTFE). Noexemplo ilustrado, os tubos estrutural e de revestimento sãocilíndricos. O tubo de revestimento é estendido a jusante do tuboestrutural, por um bocal feito do mesmo material plástico. O fatode diferenciar a função estrutural do tubo estrutural e a função deinjeção do bocal, associado ao uso de um material plástico,permite que formatos suficientemente precisos sejam obtidos aum baixo custo.
O bocal tem uma seção que é progressivamenteestreitada a partir de um diâmetro interno D321 do tubo derevestimento até um diâmetro interno D323 de um orifício desaída 323 em uma extremidade a jusante 324 do bocal 322. Noexemplo descrito, a extremidade a jusante 324 é um cilindro comum comprimento L324. A parede do bocal é inicialmente côncavapara dentro, então sofre uma inflexão de modo a se tornarconvexa para dentro, sendo que a seção do bocal éprogressivamente estreitada a partir de a montante até a jusante, apartir do diâmetro D321 até o diâmetro D324. A superfíciecôncava é tangente à superfície interna do tubo de revestimentocilíndrico. A superfície convexa é tangente à superfície interna daextremidade cilíndrica 324. No exemplo descrito, o diâmetroD323 do orifício 323 tem aproximadamente 60 mícrons, odiâmetro interno D321 do tubo de revestimento temaproximadamente 1 milímetro, o comprimento L322 do bocal temaproximadamente 2,5 milímetros, L320 do tubo estrutural temaproximadamente 6 milímetros e a extremidade cilíndrica L324tem aproximadamente 200 mícrons.
Um injetor 302 tal como aquele ilustrado nasFiguras 8 e 9, está em uma única peça e é feito de um materialúnico substancialmente rígido. Este material pode ser, porexemplo, aço inoxidável, um cerâmico, um rubi sintético ou ummaterial plástico. O material plástico pode ser, vantajosamente,um politetrafluoroetileno. O injetor compreende um tuboaproximadamente cilíndrico 331 que é estendido a jusante por umbocal 332.
O bocal estreita progressivamente para dentro, apartir de um diâmetro interno D331 para o tubo 331, até umdiâmetro interno D333, de um orifício de saída 333 para aamostra, em uma extremidade a jusante 334 do bocal 332. Noexemplo ilustrado, o estreitamento acontece de acordo com umcone truncado aberto a um ângulo, de preferência, compreendidoentre 9 e 10 graus. Além do cone truncado e acima do orifício desaída 333, o diâmetro permanece constante em uma partecilíndrica 335, com um comprimento L335 e um diâmetro D333.
No exterior do bocal, seu diâmetro externo éprogressivamente maior de acordo com um cone truncado aberto em um ângulo compreendido entre aproximadamente 8 e 9 graus,então, na extremidade notadamente mais reduzida, de acordo comum cone truncado aberto, a um ângulo A334, compreendido entreaproximadamente 35 e 45 graus, até um diâmetro externo D334em torno do orifício de saída 333, D334 é aproximadamente 3 a 4vezes maior do que D333.
À guisa de exemplo, D333 = 60 um e A334 =40°.
Graças aos diferentes arranjos descritosanteriormente, é possível obter uma alta velocidade de injeção.Assim, no exemplo descrito, é possível injetar uma amostra demais de 200 microlitros em menos de 10 segundos. Em particular,tal taxa de injeção torna possível usar uma alta taxa de diluição daamostra de sangue, sem aumentar a duração da análise emcomparação com os aparelhos automáticos da técnica anterior.Em particular, a mesma diluição, por exemplo, 1/160°, pode serusada para a análise da hemoglobina pelo dispositivo 110 (veja aFigura 3) e para a análise dos leucócitos pelo dispositivo óptico120, ao invés de 1/80°, geralmente usada para a análise dosleucócitos.
As Figuras lla-c ilustram os resultados obtidosusando o método e o equipamento, de acordo com o primeiroobjetivo da invenção, o dito equipamento usando um tanqueóptico 7 de acordo com o terceiro objetivo da invenção e umdispositivo óptico 8 de acordo com o segundo objetivo dainvenção. A Figura 1 la mostra um teste de linearidade positivo damedição de hemoglobina e, conseqüentemente, demonstra amedição possível e confiável do nível de hemoglobina de umaamostra de sangue de acordo com a invenção. A Figura 11bmostra uma matriz óptica obtida a partir de um amostra de sanguede teste com 30% de eosinófilos, a que a formulação, de acordocom a invenção, foi adicionada. Nesta matriz, as cinco sub-populações estão presentes e diferenciadas (grupos delimitados nacitografia: E para eosinófilos, N para neutrófílos, M paramonócitos, B para basófilos e L para linfócitos). A Figura 11cmostra o teste de linearidade positivo da medição porresistividade do nível de leucócitos.
Estas figuras mostram que, graças à invenção, épossível realizar uma análise pelo menos do nível de hemoglobinae do nível de leucócitos e uma diferenciação de leucócitos usandoa formulação de acordo com a invenção, em particular na formade um mono-reagente.
É óbvio que a invenção não está limitada aosexemplos que acabaram de ser descritos e inúmeras modificaçõespodem ser aplicadas a estes exemplos sem que se exceda o escopoda invenção.
Por exemplo, produtos outros que não o diluenteou o reagente podem ser usados de modo a formar,respectivamente, o fluxo envolvente e o pistão de fluido,particularmente se eles estiverem disponíveis no aparelhoautomático para outros usos.
Em adição, ao invés de estar disposto apenas nocircuito de injeção, uma resistência de fluido pode ser disposta nocircuito envolvente ou em ambos simultaneamente. Isso podeocorrer como uma função da dada taxa de fluxo máxima via meiopara deslocamento dos líquidos destinados respectivamente adeslocamento ou envolvimento.
Diversas ou todas as lentes do tanque ópticoe/ou do dispositivo óptico podem ser assim produzidas porinjeção com o corpo do tanque, ao invés de uma única, conformeestá ilustrado anteriormente. Em particular, as janelas de vidropodem ser injetadas. Particularmente, se as heterogeneidades nomaterial injetado forem mais ou menos desconsideráveis no quediz respeito à precisão desejada para as medições.
Um dispositivo de ajuste e/ou o meio deseparação descrito anteriormente, pode ser usadoindependentemente um do outro e opcionalmente com uma fontede luz outra que não um diodo eletroluminescente.
Claims (24)
1. Método para a análise automática de umaamostra de sangue em que:- uma solução de análise contendo a dita amostra de sangue, umdiluente, e:- pelo menos um composto para realizar a lise dos eritrócitos;- pelo menos um composto para estabilizar a hemoglobina naforma de um complexo cromogênico, é formado em um tanque dediluição e análise simples;- o nível de hemoglobina é medido nesta solução de análise porespectrofotometria no dito tanque após a lise dos eritrócitos; e- uma quantidade apropriada desta solução de análise é tirada dodito tanque em que uma diferenciação leucocítica é realizada porum meio óptico;caracterizado pelo fato de que a solução de análise tambémcontém pelo menos um composto para proteger os leucócitos,permitindo a distinção de pelo menos quatro sub-populaçõesprincipais de leucócitos
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a solução de análise contém pelomenos um composto para estabilizar a hemoglobina na forma deoxiemoglobina.
3. Método, de acordo com uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um coranteou mistura de corantes, que identificam especificamente pelomenos uma sub-população de leucócitos, também é adicionado àsolução de análise.
4. Método, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que, como os ditoscompostos são quimicamente compatíveis, eles são adicionadosde modo a formar a solução de análise na forma de um mono-reagente.
5. Método, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o mono-reagente é adequado para realizar a função de diluente de modo aproduzir uma mono-diluição da amostra de sangue.
6. Método, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a solução deanálise tem uma taxa de diluição da amostra de sangue adequadapara a medição da hemoglobina por espectrofotometria.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que a taxa de diluição da solução deanálise está compreendida entre 1/100° e 1/500° e, de preferência,entre 1/160° e 1/180°.
8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o númerode leucócitos na dita solução de medição no dito tanque é contadopor resistividade.
9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o númerode leucócitos na dita solução de medição no dito tanque é contadousando o meio óptico.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a amostragem de uma quantidadeapropriada de solução de análise para realizar a diferenciação deleucócitos, é feita antes da medição da hemoglobina no ditotanque, sendo que a taxa de diluição da solução de mediçãoamostrada é adequada para a dita medição pelo dito meio óptico,e pelo fato de que o diluente é adicionado à dita solução deanálise remanescente de modo a aumentar a diluição no ditotanque para obter uma diluição adequada para uma medição dahemoglobina por espectrofotometria.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio óptico é um citômetrode fluxo do tipo hidrofoco e a taxa de diluição da solução deanálise amostrada para medição por citometria é menor do que 1/100°.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio óptico é um citômetrocom envolvimento passivo e a taxa de diluição da soluçãoamostrada para medição por citometria é maior do que 1/100°.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a taxa de diluição dasolução de medição para a medição da hemoglobina por espectrofotometria está compreendida entre 1/100° e 1/500°.
14. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, em umestágio antes da adição dos ditos compostos, uma fração de umapré-solução é tirada, constituída pela amostra de sangue ediluente, em que a contagem dos eritrócitos e/ou plaquetas érealizada por resistividade.
15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ocomposto de lise é um tenso-ativo iônico escolhido a partir de:- sais de amônia quaternária, de preferência, sais dealquilmetilamônia e ainda mais particularmente, brometos ecloretos cetil-, dodecil-, tetradecil- e hexadeciltrimetilamônia;- sais de piridínio;- aminas etoxilatadas de cadeia longa; e- sulfatos de alquil (SDS).
16. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ocomposto que estabiliza a hemoglobina na forma de um complexocromogênico é escolhido, de preferência, a partir de:- quelatos mono ou polidentatos que apresentemformas ligantes (pares não aglutinantes: O, N, S e grupos carbóxiCOO-, etc),- os compostos aromáticos (quelatos mono oupolidendatos) compreendendo átomos ligantes (tendo pares nãoaglutinantes: O, N, S, etc), e- saponinas, óxidos de amina terciária, betaínase sulfobetaínas de amônias quaternárias.
17. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ocomposto de proteção do leucócito é um tenso-ativo não iônico ouanfótero escolhido, de preferência, a partir de: álcooisetoxilatados, betaínas e sulfobetaínas de amônias quaternárias,óxidos de amina terciária, compostos do tipo glicosídico e oscompostos do tipo glucídico.
18. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que umagente de fixação da membrana do leucócito também éadicionado à solução de análise.
19. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que umtampão de pH, capaz de ajustar o pH da solução de análise entre 5,0 e 8,0, de preferência, a um pH de 7, também é adicionado à solução de análise.
20. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que um salfundamental também é adicionado à solução de análise paraassegurar sua condutividade.
21. Aparelho de análise hematológica para aimplementação do método, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 20, caracterizado pelo fato de:- um único tanque de diluição e análise (1),adequado para receber a dita solução de análise;um meio para medição (5) porespectrofotometria no dito tanque do nível de hemoglobina nadita solução de análise;- um meio de amostragem da dita solução deanálise; e- um meio para a medição óptica (7, 8) da ditaamostra de modo a realizar uma análise de leucócito.
22. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de compreender um meio para a contagemdos leucócitos (6) por resistividade no dito tanque (1).
23. Aparelho, de acordo com a reivindicação 21ou 22, caracterizado pelo fato de compreender um meio pararealizar a contagem de eritrócitos e de plaquetas (9, 10).
24. Aparelho, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de compreenderum tanque de contagem 99) para os eritrócitos e plaquetas e ummeio para medição (10) da resistividade no dito tanque decontagem.
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