BRPI0309730B1 - ANTIBODY MOLECULE HAVING SPECIFICITY FOR HUMAN CD22, DNA SEQUENCE, EXPRESSION OR CLONING VECTOR, HOST CELL, USE OF ANTIBODY MOLECULE OR DNA SEQUENCE, DIAGNOSTIC COMPOSITION OR THERAPEUTIC PROCESS, PREPARATION OF A DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC COMPOSITION - Google Patents
ANTIBODY MOLECULE HAVING SPECIFICITY FOR HUMAN CD22, DNA SEQUENCE, EXPRESSION OR CLONING VECTOR, HOST CELL, USE OF ANTIBODY MOLECULE OR DNA SEQUENCE, DIAGNOSTIC COMPOSITION OR THERAPEUTIC PROCESS, PREPARATION OF A DIAGNOSTIC OR THERAPEUTIC COMPOSITION Download PDFInfo
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Abstract
molécula de anticorpo, variante desta, seqüência de dna, vetor de expressão ou clonagem, célula hospedeira, uso da molécula de anticorpo ou da seqüência de dna, composição diagnóstica ou terapêutica, processo para a produção de uma molécula de anticorpo, processo para a preparação de uma composição diagnóstica ou terapêutica, e, polipeptídeo. são descritas moléculas de anticorpo contendo pelo menos uma cdr derivada de um anticorpo monoclonal de camundongo possuindo especificidade para cd22 humana. também é descrito um anticorpo enxertado com cdr no qual pelo menos uma das cdrs é uma cdr modificada. são adicionalmente descritas seqüências de dna codificadoras de cadeias de moléculas de anticorpo, vetores, células hospedeiras transformadas e usos das moléculas de anticorpo no tratamento de doenças mediadas por células expressando cd22.antibody molecule, variant thereof, DNA sequence, expression or cloning vector, host cell, use of the antibody molecule or DNA sequence, diagnostic or therapeutic composition, process for the production of an antibody molecule, process for the preparation of a diagnostic or therapeutic composition, and, polypeptide. antibody molecules containing at least one cdr derived from a mouse monoclonal antibody having specificity for human cd22 are described. also described is a cdr-grafted antibody in which at least one of the cdrs is a modified cdr. further described are DNA sequences encoding antibody molecule chains, vectors, transformed host cells and uses of the antibody molecules in the treatment of diseases mediated by cells expressing cd22.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo possuindo especificidade para determinantes antigênicos do antígeno de linfócito B, CD22. A presente invenção também refere-se aos usos terapêuticos da molécula de anticorpo e aos métodos para a produção da molécula de anticorpo.[0001] The present invention relates to an antibody molecule having specificity for antigenic determinants of the B lymphocyte antigen, CD22. The present invention also relates to therapeutic uses of the antibody molecule and methods for producing the antibody molecule.
[0002] Em uma molécula de anticorpo natural, há duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve possui em sua extremidade N-terminal um domínio variável. Cada domínio variável é composto de quatro regiões estruturais (FRs, framework regions) alternando com três regiões determinantes de complementaridade (CDRs, complementarity determining regions). Os resíduos nos domínios variáveis são convencionalmente numerados de acordo com um sistema desenvolvido por Kabat et al. Este sistema é descrito em Kabat et al., 1987, em "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, NIH, USA (daqui por diante "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo exceto onde indicado de outro modo.[0002] In a natural antibody molecule, there are two heavy chains and two light chains. Each heavy chain and each light chain has a variable domain at its N-terminal end. Each variable domain is composed of four framework regions (FRs) alternating with three complementarity determining regions (CDRs). Residues in the variable domains are conventionally numbered according to a system developed by Kabat et al. This system is described in Kabat et al., 1987, in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, NIH, USA (hereinafter "Kabat et al. (supra)"). This numbering system is used in this descriptive report except where otherwise indicated.
[0003] As designações de resíduo de Kabat nem sempre correspondem diretamente à numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos do que na estrita numeração de Kabat correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, um componente estrutural, seja região de molde seja CDR, da estrutura de domínio variável básica. A numeração de Kabat correta de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento dos resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão".[0003] Kabat residue designations do not always directly correspond to the linear numbering of amino acid residues. The actual linear amino acid sequence may contain fewer or more amino acids than in strict Kabat numbering corresponding to a shortening of, or insertion into, a structural component, either template region or CDR, of the basic variable domain structure. The correct Kabat numbering of residues can be determined for a given antibody by aligning the homology residues in the antibody sequence with a "standard" Kabat numbered sequence.
[0004] As CDRs do domínio de variável de cadeia pesada estão localizadas em resíduos 31-35 (CDR-H1), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com a numeração de Kabat.The heavy chain variable domain CDRs are located at residues 31-35 (CDR-H1), residues 50-65 (CDR-H2) and residues 95-102 (CDR-H3) according to the numbering of Kabat.
[0005] As CDRs do domínio variável de cadeia leve estão localizadas em resíduos 24-34 (CDR-L1), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3) de acordo com a numeração de Kabat.[0005] The light chain variable domain CDRs are located at residues 24-34 (CDR-L1), residues 50-56 (CDR-L2) and residues 89-97 (CDR-L3) according to Kabat numbering .
[0006] Construção de anticorpos enxertados com CDR é descrita no Pedido de Patente Européia EP-A-0239400, que descreve um processo no qual as CDRs de um anticorpo monoclonal de camundongo são enxertadas nas regiões estruturais dos domínios variáveis de uma imunoglobulina humana por mutagênese sítio- direcionada usando oligonucleotídeos longos. As CDRs determinam a especificidade de ligação de antígeno dos anticorpos e são sequências de peptídeo relativamente curtas transportadas sobre as regiões estruturais dos domínios variáveis.[0006] Construction of CDR-grafted antibodies is described in European Patent Application EP-A-0239400, which describes a process in which the CDRs of a mouse monoclonal antibody are grafted into the structural regions of the variable domains of a human immunoglobulin by mutagenesis site-directed using long oligonucleotides. CDRs determine the antigen binding specificity of antibodies and are relatively short peptide sequences carried over the framework regions of the variable domains.
[0007] O trabalho inicial sobre a humanização de anticorpos monoclonais pelo enxerto de CDR foi realizado sobre anticorpos monoclonais reconhecedores de antígenos sintéticos, tal como NP. Contudo, exemplos nos quais um anticorpo monoclonal de camundongo reconhecedor de lisozima e um anticorpo monoclonal de rato reconhecedor de um antígeno sobre células T humanas foram humanizados por enxerto de CDR têm sido descritos por Vehoeyen et al. (Science, 239, 15341536, 1988) e por Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.[0007] Early work on the humanization of monoclonal antibodies by CDR grafting was carried out on monoclonal antibodies recognizing synthetic antigens such as NP. However, examples in which a mouse monoclonal antibody recognizing lysozyme and a mouse monoclonal antibody recognizing an antigen on human T cells have been humanized by CDR grafting have been described by Vehoeyen et al. (Science, 239, 15341536, 1988) and by Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectively.
[0008] Riechmann et al., verificaram que a transferência de CDRs sozinhas (como definido por Kabat (Kabat et al. (supra)) e Wu et al., J. Exp. Med, 132, 211250, 1970)) não foi suficiente para se proporcionar atividade de ligação de antígeno satisfatória no produto enxertado com CDR. Foi verificado que numerosos resíduos de região de molde têm que ser alterados de modo que correspondam àqueles da região de molde doadora. Critérios propostos para seleção quais resíduos de região de molde necessitam ser alterados são descritos no Pedido de Patente Internacional WO 90/07861.[0008] Riechmann et al., found that the transfer of CDRs alone (as defined by Kabat (Kabat et al. (supra)) and Wu et al., J. Exp. Med, 132, 211250, 1970)) was not sufficient to provide satisfactory antigen binding activity in the CDR-grafted product. It has been found that numerous template region residues have to be altered to match those of the donor template region. Proposed criteria for selecting which template region residues need to be altered are described in International Patent Application WO 90/07861.
[0009] Numerosas revisões discutindo anticorpos enxertado com CDRs têm sido publicadas, incluindo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).[0009] Numerous reviews discussing antibodies grafted with CDRs have been published, including Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
[0010] Linfomas malignos são um grupo diverso de neoplasmas. A maioria dos casos ocorre em pessoas mais velhas. Linfoma de Não-Hodgkins (NHL) é uma doença que correntemente afeta 200.000 a 250.000 pacientes nos Estados Unidos. É o segundo câncer de crescimento mais rápido nos Estados Unidos, crescendo a uma taxa de cerca de 55.000 casos novos por ano. A incidência está crescendo a uma taxa que é maior do que a que pode ser responsável simplesmente pelo aumento da idade da população e exposição aos fatores de risco conhecidos.[0010] Malignant lymphomas are a diverse group of neoplasms. Most cases occur in older people. Non-Hodgkins Lymphoma (NHL) is a disease that currently affects 200,000 to 250,000 patients in the United States. It is the second fastest growing cancer in the United States, growing at a rate of about 55,000 new cases per year. The incidence is growing at a rate that is greater than what may simply be responsible for the population's increasing age and exposure to known risk factors.
[0011] A classificação de linfoma é complexa, e tem evoluído em décadas recentes. Em 1994 foi introduzida a classificação de Revised European-American Lymphoma (REAL). Esta classificação organiza os linfomas de célula B (a mais freqüentemente identificada), de célula T e de origem não classificável em subtipos acordados. Na prática diária, o agrupamento de NHLs em categorias de graus baixo, intermediário e alto na base de aparência histológica geral deles, reflete amplamente seu comportamento clínico.[0011] The classification of lymphoma is complex, and has evolved in recent decades. In 1994, the Revised European-American Lymphoma (REAL) classification was introduced. This classification organizes B-cell (most frequently identified), T-cell, and nonclassifiable origin lymphomas into agreed subtypes. In daily practice, the grouping of NHLs into low, intermediate, and high grade categories on the basis of their overall histological appearance largely reflects their clinical behavior.
[0012] NHL predominantemente afeta os linfonodos mas, em pacientes individuais, o tumor pode envolver outros sítios tais como o fígado, o baço, a medula óssea, os pulmões, o intestino e a pele. A doença comumente apresenta-se como um alargamento indolor dos linfonodos. Linfoma extranodal mais freqüentemente afeta o intestino, embora linfoma primário de virtualmente cada órgão tenha sido documentado. Sintomas sistêmicos incluem febre, sudorese, fadiga e perda de peso.NHL predominantly affects lymph nodes but, in individual patients, the tumor may involve other sites such as the liver, spleen, bone marrow, lungs, intestine, and skin. The disease commonly presents as a painless enlargement of the lymph nodes. Extranodal lymphoma most often affects the bowel, although primary lymphoma of virtually every organ has been documented. Systemic symptoms include fever, sweating, fatigue and weight loss.
[0013] Até recentemente, o sistema de estadiamento de Ann Arbor, baseado inteiramente na extensão anatômica da doença, foi o determinante principal de terapia em NHL. Esta informação pode ser refinada pela incorporação de apontadores de prognóstico adicionais, incluindo a idade, os níveis de lactato- desidrogenase sérica e o estado de desempenho. Mesmo assim, o conhecimento do sistema de estadiamento de Ann Arbor, junto com o subtipo histológico e imunológico do tumor, ainda é o determinante principal do tratamento.[0013] Until recently, the Ann Arbor staging system, based entirely on the anatomical extent of the disease, was the main determinant of therapy in NHL. This information can be refined by incorporating additional prognostic indicators, including age, serum lactate dehydrogenase levels, and performance status. Even so, knowledge of the Ann Arbor staging system, together with the histological and immunological subtype of the tumor, is still the main determinant of treatment.
[0014] NHL de grau baixo possui um curso indolente, com uma sobrevivência média do paciente de 8 a 10 anos. Sobrevivência é pouco impactada pela terapia correntemente disponível, embora irradiação da doença local e quimioterapia para sintomas sistêmicos melhorem a qualidade de vida do paciente. Quimioterapia de combinação pode ser reservada para recaída na doença. Doença intermediária e, especificamente, doença de grau alto é extremamente agressiva e tende a se disseminar. Doença deste grau requer tratamento urgente. Radioterapia pode ser um componente útil do tratamento em pacientes com doença muito volumosa. Muitos regimes de quimioterapia diferentes têm sido empregados, e sobrevivência livre de doença de longa duração pode ser obtida em mais do que a metade dos pacientes. Terapia de dose alta com suporte de célula-tronco foi introduzida inicialmente para pacientes com recaída na doença ou doença refratária, mas está agora encontrando um lugar cada vez maior em terapia de primeira linha para pacientes com doença de risco baixo. A tendência em anos recentes para uma abordagem terapêutica crescentemente agressiva tem sido balanceada contra a idade geralmente idosa e a debilidade relativa de muitos pacientes com NHL, e pela necessidade de se combinar a toxicidade de tratamento com o prognóstico individual de cada doença de paciente.[0014] Low-grade NHL has an indolent course, with a median patient survival of 8 to 10 years. Survival is little impacted by currently available therapy, although irradiation of local disease and chemotherapy for systemic symptoms improve the patient's quality of life. Combination chemotherapy may be reserved for disease relapse. Intermediate disease, and specifically high-grade disease, is extremely aggressive and tends to spread. Disease of this degree requires urgent treatment. Radiotherapy can be a useful component of treatment in patients with very bulky disease. Many different chemotherapy regimens have been employed, and long-term disease-free survival can be achieved in more than half of patients. High-dose therapy with stem cell support was initially introduced for patients with disease relapse or refractory disease, but is now finding an increasing place in first-line therapy for patients with low-risk disease. The trend in recent years towards an increasingly aggressive therapeutic approach has been balanced against the generally elderly age and relative frailty of many patients with NHL, and the need to match treatment toxicity with the individual prognosis of each patient's disease.
[0015] Tratamentos melhorados, que são mais efetivos e melhor tolerados, são necessários. Agentes recentemente introduzidos incluem novas drogas citotóxicas, progressivamente incorporadas em combinações, e a introdução de terapias baseadas em anticorpo.[0015] Improved treatments, which are more effective and better tolerated, are needed. Newly introduced agents include new cytotoxic drugs, progressively incorporated in combinations, and the introduction of antibody-based therapies.
[0016] Linfoma de Não-Hodgkin inclui uma variedade de linfomas de célula B. Antígenos de célula B portanto representam alvos adequados para terapia de anticorpo.Non-Hodgkin's Lymphoma includes a variety of B cell lymphomas. B cell antigens therefore represent suitable targets for antibody therapy.
[0017] CD22 é uma glicoproteína de membrana de 135 kDa pertencente a uma família de proteínas ligadoras de ácido silícico chamadas de sialoadesinas. É detectada no citoplasma primeiro em desenvolvimento de célula B, parece sobre a superfície de célula B simultaneamente com IgD e é verificada sobre células B mais maduras. Expressão é aumentada após ativação de célula B. CD22 é perdida com diferenciação terminal e é em geral relatada em estar ausente sobre células plasmáticas. Assim este antígeno de internalização está presente sobre a superfície de pré-células B e de células B maduras mas não sobre células-tronco ou células plasmáticas.[0017] CD22 is a 135 kDa membrane glycoprotein belonging to a family of silicic acid binding proteins called sialoadesins. It is detected in the first developing B cell cytoplasm, appears on the B cell surface simultaneously with IgD, and is verified on more mature B cells. Expression is increased after B cell activation. CD22 is lost with terminal differentiation and is generally reported to be absent on plasma cells. Thus this internalizing antigen is present on the surface of pre-B cells and mature B cells but not on stem cells or plasma cells.
[0018] Duas isoformas de CD22 existem no homem. A forma predominante (CD22β) contém 7 domínios imunoglobulina-semelhantes (Ig-semelhantes) na região extracelular. A variante CD22α é faltante de domínio 4 Ig-semelhante e possui um domínio citoplásmico truncado. Tem sido mostrado que anticorpos que bloqueiam a adesão de CD22 em monócitos, neutrófilos, linfócitos e eritrócitos se ligam dentro do primeiro ou segundo domínio Ig-semelhante.[0018] Two isoforms of CD22 exist in man. The predominant form (CD22β) contains 7 immunoglobulin-like (Ig-like) domains in the extracellular region. The CD22α variant lacks the 4 Ig-like domain and has a truncated cytoplasmic domain. Antibodies that block CD22 adhesion on monocytes, neutrophils, lymphocytes and erythrocytes have been shown to bind within the first or second Ig-like domain.
[0019] O domínio citoplásmico de CD22 é tirosina-fosforilado sob ligação do receptor de antígeno de célula B e associa-se com Lyk, Syk e fosfatidil-inositol-3- quinase. A função de CD22 é para infra-modular o limite de ativação de célula B. Também pode mediar a adesão celular por intermédio de interação com células possuindo os sialoglicoconjugados apropriados.The cytoplasmic domain of CD22 is tyrosine phosphorylated upon binding to the B cell antigen receptor and associates with Lyk, Syk and phosphatidyl-inositol-3-kinase. The function of CD22 is to infra-modulate the B cell activation threshold. It can also mediate cell adhesion through interaction with cells having the appropriate sialoglycoconjugates.
[0020] CD22 é expressada na maioria de linfomas e leucemias de célula B, incluindo NHL, leucemia lifoblástica aguda (B-ALL), leucemia lifocítica crônica (B- CLL) e especialmente leucemia não-linfocítica aguda (ANLL).CD22 is expressed in most lymphomas and B-cell leukemias, including NHL, acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and especially acute non-lymphocytic leukemia (ANLL).
[0021] Anticorpos monoclonais contra CD22 têm sido descritos na arte anterior. WO 98/41641 descreve anticorpos anti-CD22 recombinantes com resíduos de cisteína em VH44 e VL100. WO 96/04925 descreve as regiões VH e VL de anticorpo LL2 anti-CD22. US 5686072 descreve combinações de imunotoxinas anti-CD22 e anti-CD19. WO 98/42378 descreve o uso de anticorpos anti-CD22 nus para o tratamento de malignidades de célula B.[0021] Monoclonal antibodies against CD22 have been described in the prior art. WO 98/41641 describes recombinant anti-CD22 antibodies with cysteine residues in VH44 and VL100. WO 96/04925 describes the VH and VL regions of anti-CD22 LL2 antibody. US 5686072 describes combinations of anti-CD22 and anti-CD19 immunotoxins. WO 98/42378 describes the use of naked anti-CD22 antibodies for the treatment of B cell malignancies.
[0022] Numerosas terapias baseadas em anticorpo têm sido quer recentemente licenciadas, por exemplo Rituxan (um y1 quimérico não marcado (região +mYlV) específico para CD20), quer estão em testes clínicos para esta doença. Estas contam com matança de célula B complemento- ou ADCC-mediada ou com o uso de radionuclídeos, tal como 131I ou 90Y, que têm preparação associada e problemas de uso para clínicos e pacientes. Há uma necessidade de uma molécula de anticorpo para tratar NHL que possa ser usada repetidamente e produzida fácil e eficientemente. Também há uma necessidade de uma molécula de anticorpo, que possua alta afinidade por CD22 e baixa imunogenicidade em humanos.Numerous antibody-based therapies have either been recently licensed, for example Rituxan (an unlabeled chimeric y1 (region +mYlV) specific for CD20), or are in clinical trials for this disease. These rely on complement- or ADCC-mediated B-cell killing or with the use of radionuclides, such as 131I or 90Y, which have associated preparation and usage issues for clinicians and patients. There is a need for an antibody molecule to treat NHL that can be used repeatedly and easily and efficiently produced. There is also a need for an antibody molecule, which has high affinity for CD22 and low immunogenicity in humans.
[0023] Sumário da invenção[0023] Summary of the invention
[0024] Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula de anticorpo possuindo especificidade para CD22 humana, compreendendo uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende uma CDR (como definida por Kabat et al., (supra)) possuindo a sequência dada como H1 na Figura 1 (SEQ ID NO: 1) para CDR-H1, como H2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 2) ou uma H2 da qual um sítio de glicosilação potencial tem sido removido, ou uma H2 na qual o resíduo lisina na posição 60 (de acordo com o sistema de numeração de Kabat) tem sido substituído por um aminoácido alternativo, ou uma H2 na qual ambos o sítio de glicosilação e a lisina reativa na posição 60 têm sido removidos para CDR-H2 ou como H2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 3) para CDR-H3.In a first aspect, the present invention provides an antibody molecule having specificity for human CD22, comprising a heavy chain in which the variable domain comprises a CDR (as defined by Kabat et al., (supra)) having the sequence given as H1 in Figure 1 (SEQ ID NO: 1) for CDR-H1, as H2 in Figure 1 (SEQ ID NO: 2) or an H2 from which a potential glycosylation site has been removed, or an H2 in which the lysine residue at position 60 (according to the Kabat numbering system) has been replaced by an alternative amino acid, or an H2 in which both the glycosylation site and the reactive lysine at
[0025] A molécula de anticorpo do primeiro aspecto da presente invenção compreende pelo menos uma CDR selecionada de H1, H2 e H3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e SEQ ID NO: 3) para o domínio variável de cadeia pesada. Preferivelmente, a molécula de anticorpo compreende pelo menos duas e com maior preferência todas as três CDRs no domínio variável de cadeia pesada.The antibody molecule of the first aspect of the present invention comprises at least one CDR selected from H1, H2 and H3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3) for the variable domain of heavy chain. Preferably, the antibody molecule comprises at least two and more preferably all three CDRs in the heavy chain variable domain.
[0026] Em um segundo aspecto da presente invenção, é proporcionada uma molécula de anticorpo possuindo especificidade para CD22 humana, compreendendo uma cadeia leve na qual o domínio variável compreende uma CDR (como definida por Kabat et al. (supra)) possuindo a sequência dada como L1 na Figura 1 (SEQ ID NO: 4) para CDR-L1, L2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 5) para CDR-L2 ou L3 na Figura 1 (SEQ ID NO: 6) para CDR-L3.In a second aspect of the present invention, there is provided an antibody molecule having specificity for human CD22, comprising a light chain in which the variable domain comprises a CDR (as defined by Kabat et al. (supra)) having the sequence given as L1 in Figure 1 (SEQ ID NO: 4) for CDR-L1, L2 in Figure 1 (SEQ ID NO: 5) for CDR-L2 or L3 in Figure 1 (SEQ ID NO: 6) for CDR-L3.
[0027] A molécula de anticorpo do segundo aspecto da presente invenção compreende pelo menos uma CDR selecionada de L1, L2 e L3 (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) para o domínio variável de cadeia leve. Preferivelmente, a molécula de anticorpo compreende pelo menos duas e com maior preferência todas as três CDRs no domínio variável de cadeia leve.The antibody molecule of the second aspect of the present invention comprises at least one CDR selected from L1, L2 and L3 (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) for the variable chain domain Light. Preferably, the antibody molecule comprises at least two and more preferably all three CDRs in the light chain variable domain.
[0028] As moléculas de anticorpo dos primeiro e segundo aspectos da presente invenção preferivelmente possuem uma cadeia leve complementar ou uma cadeia pesada complementar, respectivamente.The antibody molecules of the first and second aspects of the present invention preferably have a complementary light chain or a complementary heavy chain, respectively.
[0029] Preferivelmente, a molécula de anticorpo do primeiro ou segundo aspecto da presente invenção compreende uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende uma CDR (como definida por Kabat et al. (supra)) possuindo a sequência dada como H1 na Figura 1 (SEQ ID NO: 1) para CDR-H1, como H2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 2) ou uma H2 da qual um sítio de glicosilação potencial tem sido removido, ou uma H2 na qual o resíduo lisina na posição 60 (de acordo com o sistema de numeração de Kabat) tem sido substituído por um aminoácido alternativo, ou uma H2 na qual ambos o sítio de glicosilação e a lisina reativa na posição 60 têm sido removidos para CDR-H2 ou como H2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 3) para CDR-H3 e uma cadeia leve na qual o domínio variável compreende uma CDR (como definida por Kabat et al. (supra)) possuindo a sequência dada como L1 na Figura 1 (SEQ ID NO: 4) para CDR-L1, como L2 na Figura 1 (SEQ ID NO: 5) para CDR-L2 ou como L3 na Figura 1 (SEQ ID NO: 6) para CDR-L3.Preferably, the antibody molecule of the first or second aspect of the present invention comprises a heavy chain in which the variable domain comprises a CDR (as defined by Kabat et al. (supra)) having the sequence given as H1 in Figure 1 (SEQ ID NO: 1) for CDR-H1, such as H2 in Figure 1 (SEQ ID NO: 2) or an H2 from which a potential glycosylation site has been removed, or an H2 in which the lysine residue at position 60 ( according to the Kabat numbering system) has been replaced by an alternative amino acid, or an H2 in which both the glycosylation site and the reactive lysine at
[0030] As CDRs dadas nas SEQ IDS NOS: 1 a 6 e na Figura 1 referidas acima são derivadas de um anticorpo monoclonal de camundongo 5/44.The CDRs given in SEQ IDS NOS: 1 to 6 and in Figure 1 referred to above are derived from a mouse
[0031] As sequências completas dos domínios variáveis do anticorpo 5/44 de camundongo são mostradas na Figura 2 (cadeia leve) (SEQ ID NO: 7) e na Figura 3 (cadeia pesada) (SEQ ID NO: 8). Este anticorpo de camundongo também é referido abaixo como "o anticorpo doador" ou o "anticorpo monoclonal murino".The complete sequences of the
[0032] Uma primeira modalidade alternativamente preferida do primeiro ou segundo aspecto da presente invenção é o anticorpo monoclonal de camundongo 5/44 possuindo as sequências de domínios variáveis de cadeias leve e pesada mostradas na Figura 2 (SEQ ID NO: 7) e na Figura 3 (SEQ ID NO: 8), respectivamente. A região constante de cadeia leve de 5/44 é kappa e a região constante de cadeia pesada é IgG1.An alternatively preferred first embodiment of the first or second aspect of the present invention is the mouse
[0033] Em uma segunda modalidade alternativamente preferida, o anticorpo de acordo quer com o primeiro quer com o segundo aspecto da presente invenção é uma molécula de anticorpo de humano/de camundongo quimérica, aqui referida como a molécula de anticorpo 5/44 quimérica. A molécula de anticorpo quimérica compreende os domínios variáveis de anticorpo monoclonal de camundongo 5/44 (SEQ ID NOS: 7 e 8) e os domínios constantes humanos. Preferivelmente, a molécula de anticorpo 5/44 quimérica compreende o domínio kappa C humano (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; número de acesso no Genebank J00241) na cadeia leve e os domínios gama 4 humanos (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713, 1982) na cadeia leve, opcionalmente com o resíduo de serina na posição 241 substituído por um resíduo de prolina.In a second alternatively preferred embodiment, the antibody according to either the first or second aspects of the present invention is a chimeric human/mouse antibody molecule, referred to herein as the chimeric 5/44 antibody molecule. The chimeric antibody molecule comprises the mouse monoclonal
[0034] Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definida por Kabat et al. (supra)) uma H2' na qual uma sequência de sítio de glicosilação potencial tem sido removida e que surpreendentemente aumentou a afinidade do anticorpo 5/44 quimérico pelo antígeno CD22 e que preferivelmente possui como CDR-H2 a sequência dada como H2' (SEQ ID NO: 13).Preferably, the antibody of the present invention comprises a heavy chain in which the variable domain comprises as CDR-H2 (as defined by Kabat et al. (supra)) an H2' in which a potential glycosylation site sequence has been removed and which surprisingly increased the affinity of the chimeric 5/44 antibody for the CD22 antigen and which preferably has as CDR-H2 the sequence given as H2' (SEQ ID NO: 13).
[0035] Alternativa ou adicionalmente, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definida por Kabat et al. (supra)) uma H2" na qual um resíduo de lisina na posição 60, que está localizado em uma posição exposta dentro de CDR- H2 e que é considerado em possuir o potencial de reagir com agentes de conjugação resultando em uma redução da finidade de ligação de antígeno, é substituído por um aminoácido alternativo para resultar em uma substituição conservada. Preferivelmente CDR-H2 possui a sequência dada como H2" (SEQ ID NO: 15).Alternatively or additionally, the antibody of the present invention may comprise a heavy chain in which the variable domain comprises as CDR-H2 (as defined by Kabat et al. (supra)) an H2" in which a lysine residue in
[0036] Alternativa ou adicionalmente, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definida por Kabat et al. (supra)) uma H2"' na qual tanto o sítio de glicosilação potencial quanto o resíduo de glicina na posição 60, são substituídos por aminoácidos alternativos. Preferivelmente CDR-H2 possui a sequência dada como H2"' (SEQ ID NO: 16).Alternatively or additionally, the antibody of the present invention may comprise a heavy chain in which the variable domain comprises as CDR-H2 (as defined by Kabat et al. (supra)) an H2"' in which both the glycosylation site potential as the glycine residue at
[0037] Em uma terceira modalidade alternativamente preferida, o anticorpo de acordo com qualquer um dos primeiro e segundo aspectos da presente invenção é uma molécula de anticorpo enxertada com CDR. O termo "uma molécula de anticorpo enxertada com CDR" como aqui usado refere-se a uma molécula de anticorpo na qual a cadeia pesada e/ou leve contém uma ou mais CDRs (incluindo, se desejada, uma CDR modificada) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal murino) enxertado em uma região de molde variável de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo aceptor (por exemplo um anticorpo humano).[0037] In a third alternatively preferred embodiment, the antibody according to either of the first and second aspects of the present invention is a CDR-grafted antibody molecule. The term "a CDR-grafted antibody molecule" as used herein refers to an antibody molecule in which the heavy and/or light chain contains one or more CDRs (including, if desired, a modified CDR) of a donor antibody. (eg, a murine monoclonal antibody) grafted onto a light and/or heavy chain variable template region of an acceptor antibody (eg, a human antibody).
[0038] Preferivelmente, um tal anticorpo enxertado com CDR possui um domínio variável compreendendo regiões estruturais aceptoras humanas bem como uma ou mais da CDRs doadoras referidas acima.Preferably, such a CDR-grafted antibody has a variable domain comprising human acceptor framework regions as well as one or more of the donor CDRs referred to above.
[0039] Quando as CDRs são enxertadas, qualquer sequência de região de molde variável aceptora apropriada pode ser usada possuindo relação com a classe/o tipo de anticorpo doador do qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões estruturais de humano, de primata e de camundongo. Exemplos de regiões estruturais humanas que podem ser utilizadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al. (supra)). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas para ambas a cadeia leve e a cadeia pesada. Alternativamente, sequências de linhagem germinativa humanas podem ser utilizadas. A região de molde preferida para a cadeia leve é a sequência de subgrupo de linhagem germinativa humana (DPK9+JK1) mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 17). A região de molde preferida para a cadeia pesada é a sequência de subgrupo humano (DP7+JH4) mostrada na Figura 6 (SEQ ID NO: 21).When the CDRs are grafted, any appropriate acceptor variable template region sequence can be used having regard to the class/type of donor antibody from which the CDRs are derived, including human, primate and mouse framework regions . Examples of human framework regions that can be used in the present invention are KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY and POM (Kabat et al. (supra)). For example, KOL and NEWM can be used for the heavy chain, REI can be used for the light chain and EU, LAY and POM can be used for both the light chain and the heavy chain. Alternatively, human germline sequences can be used. The preferred template region for the light chain is the human germline subgroup sequence (DPK9+JK1) shown in Figure 5 (SEQ ID NO: 17). The preferred template region for the heavy chain is the human subgroup sequence (DP7+JH4) shown in Figure 6 (SEQ ID NO:21).
[0040] Em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, é preferido o uso como o anticorpo aceptor de um possuindo cadeias que são homólogas às cadeias do anticorpo doador. As cadeias leve e pesada aceptoras não necessariamente precisam ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias compósitas possuindo regiões estruturais derivadas de cadeias diferentes.In a CDR-grafted antibody of the present invention, it is preferred to use as the acceptor antibody one having chains that are homologous to the chains of the donor antibody. The acceptor light and heavy chains need not necessarily be derived from the same antibody and may, if desired, comprise composite chains having framework regions derived from different chains.
[0041] Também, em um anticorpo enxertado com CDR da presente invenção, as regiões estruturais não precisam possuir exatamente a mesma sequência que aquelas do anticorpo aceptor. Por exemplo, resíduos incomuns podem ser mudados para resíduos de ocorrência mais comum para aquela classe ou aquele tipo de cadeia aceptora. Alternativamente, resíduos selecionados nas regiões estruturais aceptoras podem ser mudados de modo que correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador ou a um resíduo que é uma substituição conservativa para o resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador. Tais mudanças devem ser mantidas no mínimo necessário para se recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para a seleção de resíduos nas regiões estruturais aceptoras que podem precisar ser mudados é descrito em WO 91/09967.Also, in a CDR-grafted antibody of the present invention, the framework regions need not have exactly the same sequence as those of the acceptor antibody. For example, unusual residues can be changed to more commonly occurring residues for that class or type of acceptor chain. Alternatively, selected residues in the acceptor framework regions can be changed so that they correspond to the residue found at the same position in the donor antibody or to a residue that is a conservative substitution for the residue found at the same position in the donor antibody. Such changes should be kept to the minimum necessary to regain donor antibody affinity. A protocol for selecting residues in acceptor framework regions that may need to be changed is described in WO 91/09967.
[0042] Preferivelmente, em uma molécula de anticorpo enxertada com CDR de acordo com a presente invenção, se a cadeia leve aceptora possuir o sub-grupo humano DPK9+JK1 (mostrado na Figura 5) (SEQ ID NO: 17 (DPK9) e SEQ ID NO: 18 (JK1)) então as regiões estruturais aceptoras da cadeia leve compreenderão resíduos doadores nas posições 2, 3, 37, 38, 45 e 60 e poderão compreender adicionalmente um resíduo doador na posição 3 (de acordo com Kabat et al., (supra)).Preferably, in a CDR-grafted antibody molecule according to the present invention, if the acceptor light chain has the human subgroup DPK9+JK1 (shown in Figure 5) (SEQ ID NO: 17 (DPK9) and SEQ ID NO: 18 (JK1)) then the light chain acceptor framework regions will comprise donor residues at
[0043] Preferivelmente, em uma molécula anticorpo enxertada com CDR da presente invenção, se a cadeia pesada aceptora possuir a sequência humana DP7+JH4 (mostrada na Figura 6) (SEQ ID NO: 21 (DP7) e SEQ ID NO: 22 (JH4)), então as regiões estruturais aceptoras da cadeia pesada compreenderão, em adição a uma ou mais CDRs doadoras, resíduos doadores nas posições 1, 28, 48, 71 e 93 e poderão compreender adicionalmente resíduos nas posições 67 e 69 (de acordo com Kabat et al., (supra)).Preferably, in a CDR-grafted antibody molecule of the present invention, if the acceptor heavy chain has the human sequence DP7+JH4 (shown in Figure 6) (SEQ ID NO: 21 (DP7) and SEQ ID NO: 22 ( JH4)), then the acceptor framework regions of the heavy chain will comprise, in addition to one or more donor CDRs, donor residues at
[0044] Resíduos doadores são resíduos do anticorpo doador, isto é o anticorpo do qual as CDRs foram originalmente derivadas.Donor residues are residues of the donor antibody, i.e. the antibody from which the CDRs were originally derived.
[0045] Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende como CDR-H2 ((como definida por Kabat et al. (supra)) uma H2' na qual um sítio de glicosilação potencial tem sido removido com o propósito de se aumentar a afinidade do anticorpo 5/44 quimérico pelo antígeno CD22 e que preferivelmente possui como CDR-H2 a sequência dada como H2' (SEQ ID NO: 13).Preferably, the antibody of the present invention comprises a heavy chain in which the variable domain comprises as CDR-H2 ((as defined by Kabat et al. (supra)) an H2' in which a potential glycosylation site has been removed for the purpose of increasing the affinity of the chimeric 5/44 antibody for the CD22 antigen and which preferably has as CDR-H2 the sequence given as H2' (SEQ ID NO: 13).
[0046] Alternativa ou adicionalmente, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definida por Kabat et al. (supra)) uma H2" na qual um resíduo de lisina na posição 60, que está localizado em uma posição exposta dentro de CDR- H2 e que é considerado em possuir o potencial para reagir com agentes de conjugação resultando em uma redução da afinidade de ligação por antígeno, é substituído por um aminoácido alternativo. Preferivelmente CDR-H2 possui a sequência dada como H2" (SEQ ID NO: 15).Alternatively or additionally, the antibody of the present invention may comprise a heavy chain in which the variable domain comprises as CDR-H2 (as defined by Kabat et al. (supra)) an H2" in which a lysine residue in
[0047] Alternativa ou adicionalmente, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma cadeia pesada na qual o domínio variável compreende como CDR-H2 (como definida por Kabat et al. (supra)) uma H2"' na qual tanto a sequência do sítio de glicosilação potencial quanto o resíduo de lisina na posição 60, são substituídos por aminoácidos alternativos. Preferivelmente CDR-H2 possui a sequência dada como H2" (SEQ ID NO: 16).Alternatively or additionally, the antibody of the present invention may comprise a heavy chain in which the variable domain comprises as CDR-H2 (as defined by Kabat et al. (supra)) an H2"' in which both the site sequence of potential glycosylation at the lysine residue at
[0048] A molécula de anticorpo da presente invenção pode compreender: uma molécula de anticorpo completa, possuindo cadeias leve e pesada de comprimento total; um seu fragmento, tal como fragmento Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 ou Fv; um monômero ou dímero de cadeia pesada ou de cadeia leve;um anticorpo de cadeia única, por exemplo Fv de cadeia única no qual os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada são unidos por um ligador peptídico. Semelhantemente, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada podem ser combinadas com outros domínios de anticorpo se apropriado.The antibody molecule of the present invention may comprise: a complete antibody molecule, having full length light and heavy chains; a fragment thereof, such as Fab, modified Fab, Fab', F(ab')2 or Fv fragment; a heavy chain or light chain monomer or dimer; a single chain antibody, for example single chain Fv in which the light chain and heavy chain variable domains are joined by a peptide linker. Similarly, the light and heavy chain variable regions can be combined with other antibody domains if appropriate.
[0049] A molécula de anticorpo da presente invenção pode possuir uma molécula repórter ou efetora ligada na mesma. Por exemplo, pode possuir um macrociclo, para quelar um átomo de metal pesado, ou uma toxina, tal como ricina, ligada na mesma por uma estrutura de ponte covalente. Alternativamente, procedimentos de tecnologia de DNA recombinante podem ser utilizados para se produzir uma molécula de anticorpo na qual o fragmento Fc (domínios de dobradiça, CH2 e CH3), os domínios CH2 e CH3 ou o domínio CH3 de uma molécula de imunoglobulina completa tem (têm) sido substituído(s) por, ou tem (têm) sido ligado na mesma por ligação peptídica, uma proteína de não-imunoglobulina funcional, tal como uma molécula de toxina ou de enzima.The antibody molecule of the present invention may have a reporter or effector molecule attached thereto. For example, it can have a macrocycle, to chelate a heavy metal atom, or a toxin, such as ricin, linked thereto by a covalent bridging structure. Alternatively, recombinant DNA technology procedures can be used to produce an antibody molecule in which the Fc fragment (hinge, CH2 and CH3 domains), the CH2 and CH3 domains, or the CH3 domain of a complete immunoglobulin molecule has ( have) been replaced by, or have (have) been linked thereto by peptide bond, a functional non-immunoglobulin protein, such as a toxin or enzyme molecule.
[0050] A molécula de anticorpo da presente invenção preferivelmente possui uma afinidade de ligação de pelo menos 0,85 x 10-10 M, com maior preferência de pelo menos 0,75 x 10-10 M e mais preferivelmente de pelo menos 0,5 x 10-10 M.The antibody molecule of the present invention preferably has a binding affinity of at least 0.85 x 10-10 M, more preferably of at least 0.75 x 10-10 M and more preferably of at least 0. 5 x 10-10 M.
[0051] Preferivelmente, a molécula de anticorpo da presente invenção compreende o domínio variável de cadeia leve 5/44-gL1 (SEQ ID NO: 19) e o domínio variável de cadeia pesada 5/44-gH7 (SEQ ID NO: 27). As sequências dos domínios variáveis destas cadeias leve e pesada são mostradas nas Figuras 5 e 6, respectivamente.Preferably, the antibody molecule of the present invention comprises the light
[0052] A presente invenção também refere-se às variantes da molécula de anticorpo da presente invenção, que possuem uma afinidade melhorada por CD22. Tais variantes podem ser obtidas por numerosos protocolos de afinidade incluindo a mutação das CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), rearranjo de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de E. coli causadoras de mutação (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), rearranjo de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 724-733, 1997), exibição de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discute estes métodos de maturação de afinidade.The present invention also relates to variants of the antibody molecule of the present invention, which have an improved affinity for CD22. Such variants can be obtained by numerous affinity protocols including CDR mutation (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), chain rearrangement (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), use of mutation-causing E. coli strains (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA rearrangement (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 724-733, 1997), phage display (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) and sex PCR (Crameri et al., Nature, 391 , 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discusses these affinity maturation methods.
[0053] A presente invenção também proporciona uma sequência de DNA codificadora da(s) cadeia(s) leve e/ou pesada da molécula de anticorpo da presente invenção.The present invention also provides a DNA sequence encoding the light and/or heavy chain(s) of the antibody molecule of the present invention.
[0054] Preferivelmente, a sequência de DNA codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção.Preferably, the DNA sequence encodes the light chain or the heavy chain of the antibody molecule of the present invention.
[0055] A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido por processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos.[0055] The DNA sequence of the present invention may comprise synthetic DNA, for example produced by chemical processing, cDNA, genomic DNA or any combination thereof.
[0056] A presente invenção também refere-se a um vetor de expressão ou clonagem compreendendo uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Preferivelmente, o vetor de expressão ou clonagem compreende duas sequências de DNA, codificadoras de cadeia leve ou de cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção.[0056] The present invention also relates to an expression or cloning vector comprising one or more DNA sequences of the present invention. Preferably, the expression or cloning vector comprises two DNA sequences, encoding light chain or heavy chain of the antibody molecule of the present invention.
[0057] Métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte. Com respeito a estes, referência é feita a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e o Maniatis Manual produzido por Cold Spring Harbor Publishing.[0057] General methods by which vectors can be constructed, transfection methods and culture methods are well known to those skilled in the art. In this regard, reference is made to "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.
[0058] Sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção podem ser obtidas por métodos bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte. Por exemplo, as sequências codificadoras de parte das ou de todas as cadeia leve e pesada de anticorpo podem ser sintetizadas como desejado a partir de sequências de DNA determinadas ou baseando-se nas sequências de aminoácidos correspondentes.[0058] DNA sequences encoding the antibody molecule of the present invention can be obtained by methods well known to those skilled in the art. For example, sequences encoding part or all of the antibody light and heavy chains can be synthesized as desired from determined DNA sequences or based on the corresponding amino acid sequences.
[0059] DNA codificador de sequências região de molde aceptora está amplamente disponível para aquelas pessoas experientes na arte e pode ser prontamente sintetizado baseando-se em suas conhecidas sequências de aminoácidos.[0059] DNA encoding acceptor template region sequences is widely available to those skilled in the art and can be readily synthesized based on its known amino acid sequences.
[0060] Técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para se prepararem sequências de DNA codificadoras da molécula de anticorpo da presente invenção. Sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando-se as técnicas de síntese de oligonucleotídeo. Técnicas de mutagênese sítio-direcionada e de reação em cadeia da polimerase (PCR) podem ser utilizadas se apropriadas.[0060] Standard molecular biology techniques can be used to prepare DNA sequences encoding the antibody molecule of the present invention. Desired DNA sequences can be synthesized completely or in part using oligonucleotide synthesis techniques. Site-directed mutagenesis and polymerase chain reaction (PCR) techniques can be used if appropriate.
[0061] Qualquer sistema de vetor / célula hospedeira adequado pode ser empregado para a expressão das sequências de DNA codificadoras da molécula de anticorpo da presente invenção. Sistemas bacterianos, por exemplo E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser usados, em parte, para a expressão dos fragmentos de anticorpo tais como fragmentos Fab e F(ab')2, e especialmente de fragmentos Fv e fragmentos de anticorpo de cadeia única, por exemplo, FVs de cadeia única. Sistemas de expressão de célula hospedeira eucariótica, por exemplo, de mamífero, podem ser usados para a produção de moléculas de anticorpo maiores, incluindo moléculas de anticorpo completas. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, de mieloma ou células de hibridoma.[0061] Any suitable vector/host cell system can be employed for the expression of the DNA sequences encoding the antibody molecule of the present invention. Bacterial systems, for example E. coli, and other microbial systems can be used, in part, for the expression of antibody fragments such as Fab and F(ab')2 fragments, and especially Fv fragments and antibody chain fragments single, eg single-chain FVs. Eukaryotic, e.g., mammalian, host cell expression systems can be used for the production of larger antibody molecules, including whole antibody molecules. Suitable mammalian host cells include CHO cells, myeloma or hybridoma cells.
[0062] A presente invenção também proporciona um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira contendo um vetor da presente invenção sob condições adequadas para dar a expressão de proteína a partir do DNA codificador da molécula de anticorpo da presente invenção, e o isolamento da molécula de anticorpo.[0062] The present invention also provides a process for the production of an antibody molecule according to the present invention comprising culturing a host cell containing a vector of the present invention under conditions suitable to give protein expression from the DNA encoding the antibody molecule of the present invention, and isolating the antibody molecule.
[0063] A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia leve ou pesada, em cujo caso apenas uma sequência de polipeptídeo de cadeia leve ou de cadeia pesada necessita ser usada para se transfectarem as células hospedeiras. Para a produção de produtos compreendendo ambas as cadeias leve e pesada, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor codificador de um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificador de um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser empregado, o vetor incluindo as sequências codificadoras de polipeptídeos de cadeia pesada e de cadeia leve.The antibody molecule may comprise only one light or heavy chain polypeptide, in which case only one light chain or heavy chain polypeptide sequence need be used to transfect the host cells. For the production of products comprising both light and heavy chains, the cell line can be transfected with two vectors, a first vector encoding a light chain polypeptide and a second vector encoding a heavy chain polypeptide. Alternatively, a single vector can be employed, the vector including heavy chain and light chain polypeptide coding sequences.
[0064] A presente invenção também proporciona uma composição diagnóstica ou terapêutica compreendendo uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.[0064] The present invention also provides a diagnostic or therapeutic composition comprising an antibody molecule of the present invention in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
[0065] A presente invenção também proporciona um processo para a preparação de uma composição diagnóstica ou terapêutica compreendendo a misturação da molécula de anticorpo da presente invenção com um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.[0065] The present invention also provides a process for preparing a diagnostic or therapeutic composition comprising mixing the antibody molecule of the present invention with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
[0066] A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente ativo na composição diagnóstica ou terapêutica ou pode estar acompanhada por outros ingredientes ativos incluindo outros ingredientes de anticorpo, por exemplo anticorpos anti-célula T, anti-IFNY ou anti-LPS, ou ingredientes de não-anticorpo tal como xantinas.[0066] The antibody molecule may be the only active ingredient in the diagnostic or therapeutic composition or may be accompanied by other active ingredients including other antibody ingredients, for example anti-T cell, anti-IFNY or anti-LPS antibodies, or ingredients of non-antibody such as xanthines.
[0067] As composições farmacêuticas preferivelmente compreendem uma ate de anticorpo da invenção. O termo "quantidade terapeuticamente efetiva" como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma condição ou doença alvo, ou para exibir um efeito preventivo ou terapêutico detectável. Para qualquer anticorpo, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente quer em ensaios de cultura celular quer em modelos em animal, normalmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo em animal também pode ser utilizado para se determinar a faixa de concentração ótima e a rota de administração. Tal informação pode ser então usada para se determinarem doses e rotas úteis para a administração a humanos.The pharmaceutical compositions preferably comprise an antibody ate of the invention. The term "therapeutically effective amount" as used herein refers to an amount of a therapeutic agent necessary to treat, ameliorate or prevent a target condition or disease, or to exhibit a detectable preventive or therapeutic effect. For any antibody, the therapeutically effective dose can be estimated initially either in cell culture assays or in animal models, usually in rodents, rabbits, dogs, pigs or primates. The animal model can also be used to determine the optimal concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine useful doses and routes for administration to humans.
[0068] A quantidade efetiva precisa para um indivíduo humano dependerá da severidade do estado da doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso e do sexo do indivíduo, da dieta, do tempo e da freqüência de administração, da(s) combinação(ões) de droga, das sensibilidades de reação e da tolerância / resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação rotineira e estás dentro do julgamento do clínico. Em geral, uma dose efetiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferivelmente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg, com maior preferência de cerca de 15 mg/kg.[0068] The effective amount needed for a human subject will depend on the severity of the disease state, the subject's general health, the subject's age, weight and sex, diet, time and frequency of administration, ) drug combination(s), reaction sensitivities and tolerance/response to therapy. This amount can be determined by routine experimentation and is within the judgment of the clinician. In general, an effective dose will be from 0.01 mg/kg to 50 mg/kg, preferably from 0.1 mg/kg to 20 mg/kg, more preferably from about 15 mg/kg.
[0069] Composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação com outros agentes, drogas ou hormônios.[0069] Compositions may be administered individually to a patient or may be administered in combination with other agents, drugs or hormones.
[0070] A dose na qual a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada depende da natureza da condição a ser tratada, do grau do linfoma maligno ou da leucemia e de se a molécula de anticorpo está sendo usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente.The dose at which the antibody molecule of the present invention is administered depends on the nature of the condition being treated, the degree of malignant lymphoma or leukemia and whether the antibody molecule is being used prophylactically or to treat an existing condition .
[0071] A frequência de dose dependerá da meia-vida da molécula de anticorpo e da duração de seu efeito. Se a molécula de anticorpo tiver uma meia-vida curta (por exemplo de 2 hora a 10 horas) pode ser necessário que sejam dadas uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se a molécula de anticorpo, tiver uma meia-vida longa (por exemplo 2 dias a 15 dias) pode ser necessário que seja dada uma dose uma vez por dia, uma dose por semana ou até mesmo uma dose a cada 1 mês ou 2 meses.The dose frequency will depend on the half-life of the antibody molecule and the duration of its effect. If the antibody molecule has a short half-life (
[0072] Uma composição farmacêutica também pode conter um carreador farmaceuticamente aceitável para a administração do anticorpo. O próprio carreador não deve induzir a produção de anticorpos danosos para o indivíduo recebendo a composição e não deve ser tóxico. Carreadores apropriados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, polímeros de ácido lático, polímeros de ácido glicólico, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inativas.[0072] A pharmaceutical composition may also contain a pharmaceutically acceptable carrier for the administration of the antibody. The carrier itself must not induce the production of antibodies harmful to the individual receiving the composition and must not be toxic. Suitable carriers can be large, slowly metabolized macromolecules such as proteins, polypeptides, liposomes, polysaccharides, lactic acid polymers, glycolic acid polymers, polymeric amino acids, amino acid copolymers and inactive viral particles.
[0073] Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo sais de ácido mineral, tais como cloridretos, bromidretos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.[0073] Pharmaceutically acceptable salts can be used, for example mineral acid salts such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates and sulphates, or salts of organic acids such as acetates, propionates, malonates and benzoates.
[0074] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis nas composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificadores ou substâncias tamponantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais carreadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, elixires e suspensões, para ingestão por um paciente.[0074] Pharmaceutically acceptable carriers in therapeutic compositions may additionally contain liquids such as water, saline, glycerol and ethanol. Additionally, auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents or pH buffering substances, can be present in such compositions. Such carriers allow pharmaceutical compositions to be formulated as tablets, pills, pills, capsules, liquids, gels, syrups, elixirs and suspensions, for ingestion by a patient.
[0075] Formas preferidas para administração incluem formas adequadas para administração parenteral, por exemplo por injeção ou infusão, por exemplo por infusão contínua ou injeção de bolo. Se o produto for para injeção ou infusão, ele poderá tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um carreador aquoso ou oleoso e poderá conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizadores e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.Preferred forms for administration include forms suitable for parenteral administration, for example by injection or infusion, for example by continuous infusion or bolus injection. If the product is for injection or infusion, it may take the form of a suspension, solution or emulsion in an aqueous or oily carrier and may contain formulatory agents such as suspending agents, preservatives, stabilizers and/or dispersing agents. Alternatively, the antibody molecule can be in dry form, for reconstitution before use with an appropriate sterile liquid.
[0076] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. Contudo, é preferido que as composições sejam adaptadas para a administração a indivíduos humanos.[0076] Once formulated, the compositions of the invention can be administered directly to the individual. The individuals to be treated can be animals. However, it is preferred that the compositions are adapted for administration to human subjects.
[0077] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer uma de numerosas rotas incluindo, mas não se limitando a, rotas oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, transcutânea (por exemplo, veja WO98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hipopulverizações também podem ser usadas para a administração das composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições farmacêuticas podem ser preparadas como injetáveis quer como suspensões quer como soluções líquidas. Formas sólidas adequadas para solução em, ou para suspensão em, carreadores líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.The pharmaceutical compositions of this invention may be administered by any of a number of routes including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, transcutaneous routes (e.g., see WO98/ 20734), subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, intravaginal or rectal. Hyposprays can also be used for administering the pharmaceutical compositions of the invention. Typically, pharmaceutical compositions can be prepared as injectables either as suspensions or as liquid solutions. Solid forms suitable for solution in, or suspension in, liquid carriers prior to injection can also be prepared.
[0078] Liberação direta da composição em geral será realizada por injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou liberada ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas para dentro de uma lesão. Tratamento de dosagem pode ser um planejamento de dose única ou um planejamento de dose múltipla.[0078] Direct release of the composition will generally be performed by injection, subcutaneously, intraperitoneally, intravenously or intramuscularly, or released into the interstitial space of a tissue. The compositions can also be administered into a lesion. Dosing treatment can be a single dose schedule or a multiple dose schedule.
[0079] Será reconhecido que o ingrediente ativo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, ela será suscetível à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição for para ser administrada por uma rota usando o trato gastrointestinal, será preciso que a composição contenha agentes que protegem o anticorpo da degradação mas que liberem o anticorpo uma vez tendo sido ele absorvido do trato grastrointestinal.[0079] It will be recognized that the active ingredient in the composition will be an antibody molecule. As such, it will be susceptible to degradation in the gastrointestinal tract. Thus, if the composition is to be administered by a route using the gastrointestinal tract, the composition would need to contain agents which protect the antibody from degradation but which release the antibody once it has been absorbed from the gastrointestinal tract.
[0080] Uma discussão completa de carreadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J., 1991).A full discussion of pharmaceutically acceptable carriers is available in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J., 1991).
[0081] Também é previsto que o anticorpo da presente invenção seja administrado pelo uso de uma terapia genética. Com o propósito de se obter isto, as sequências de DNA codificadoras de cadeias leve e pesada da molécula de anticorpo sob o controle de componentes de DNA apropriados são introduzidas em um paciente de tal modo que as cadeias de anticorpo sejam expressadas das sequências de DNA e montadas in situ.[0081] It is also envisioned that the antibody of the present invention is administered by use of a gene therapy. In order to achieve this, DNA sequences encoding light and heavy chains of the antibody molecule under the control of appropriate DNA components are introduced into a patient in such a way that the antibody chains are expressed from the DNA sequences and assembled in situ.
[0082] A presente invenção também proporciona a molécula de anticorpo da presente invenção para uso no tratamento de uma doença mediada por células expressando CD22.The present invention also provides the antibody molecule of the present invention for use in treating a disease mediated by cells expressing CD22.
[0083] A molécula de anticorpo da presente invenção pode ser utilizada em qualquer terapia onde ela for desejada para reduzir o nível de células expressando CD22 que estão presentes no corpo animal ou humano. Estas células que expressam CD22 podem estar circulando no corpo ou estar presentes em um nível indesejavelmente elevado em um sítio específico no corpo. Por exemplo, níveis altos de célula expressando CD22 estarão presentes em linfomas de célula B e leucemias. A molécula de anticorpo da presente invenção pode ser utilizada na terapia de doenças mediadas por células expressando CD22.[0083] The antibody molecule of the present invention can be used in any therapy where it is desired to reduce the level of cells expressing CD22 that are present in the animal or human body. These cells that express CD22 may be circulating in the body or present at an undesirably high level at a specific site in the body. For example, high levels of cells expressing CD22 will be present in B cell lymphomas and leukemias. The antibody molecule of the present invention can be used in the therapy of diseases mediated by cells expressing CD22.
[0084] A molécula de anticorpo da presente invenção é preferivelmente usada para o tratamento de linfomas malignos e leucemias, mais preferivelmente de NHL.[0084] The antibody molecule of the present invention is preferably used for the treatment of malignant lymphomas and leukemias, more preferably of NHL.
[0085] A presente invenção também proporciona um método para o tratamento de indivíduos humanos ou animas sofrendo de ou sob risco de um distúrbio mediado por células expressando CD22, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade efetiva de molécula de anticorpo da presente invenção.[0085] The present invention also provides a method for treating human or animal subjects suffering from or at risk of a disorder mediated by cells expressing CD22, the method comprising administering to the subject an effective amount of antibody molecule of the present invention .
[0086] A molécula de anticorpo da presente invenção também pode ser utilizada em diagnose, por exemplo no diagnóstico in vivo e na formação de imagem de estados de doença envolvendo as células que expressam CD22.[0086] The antibody molecule of the present invention can also be used in diagnosis, for example in in vivo diagnosis and in imaging of disease states involving cells expressing CD22.
[0087] A presente invenção é adicionalmente descrita por meio de ilustração apenas nos seguintes exemplos, que se referem às Figuras acompanhantes, nas quais:[0087] The present invention is further described by way of illustration only in the following examples, which refer to the accompanying Figures, in which:
[0088] A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos das CDRs de anticorpo monoclonal de camundongo 5/44 (SEQ ID NOS: 1 a 6);Figure 1 shows the amino acid sequence of the mouse
[0089] A Figura 2 mostra a sequência completa do domínio variável de cadeia leve de anticorpo monoclonal de camundongo 5/44;[0089] Figure 2 shows the complete sequence of the light chain variable domain of mouse
[0090] A Figura 3 mostra a sequência completa do domínio variável de cadeia pesada de anticorpo monoclonal de camundongo 5/44;[0090] Figure 3 shows the complete sequence of the heavy chain variable domain of mouse
[0091] A Figura 4 mostra a estratégia para a remoção do sítio de glicosilação e a lisina reativa em CDR-H2;[0091] Figure 4 shows the strategy for removing the glycosylation site and reactive lysine in CDR-H2;
[0092] A Figura 5 mostra o projeto de enxerto para a sequência de cadeia leve de 5/44;[0092] Figure 5 shows the graft design for the 5/44 light chain sequence;
[0093] A Figura 6 mostra o projeto de enxerto para a sequência de cadeia pesada de 5/44;[0093] Figure 6 shows the graft design for the 5/44 heavy chain sequence;
[0094] A Figura 7 mostra os vetores pMRR14 e pMRR10.1;[0094] Figure 7 shows the vectors pMRR14 and pMRR10.1;
[0095] A Figura 8 mostra os resultados do ensaio Biacore de mutantes de 5/44 quiméricos;[0095] Figure 8 shows the results of the Biacore assay of chimeric 5/44 mutants;
[0096] A Figura 9 mostra os oligonucleotídeos para montagens de genes gL1 e gH1 de 5/44;[0096] Figure 9 shows the oligonucleotides for 5/44 gL1 and gH1 gene assemblies;
[0097] A Figura 10 mostra os vetores intermediários pCR2.1(544gH1) e pCR2.1(544gL1);[0097] Figure 10 shows the intermediate vectors pCR2.1(544gH1) and pCR2.1(544gL1);
[0098] A Figura 11 mostra os cassetes de oligonucleotídeo usados para se prepararem outros enxertados;[0098] Figure 11 shows the oligonucleotide cassettes used to prepare other grafts;
[0099] A Figura 12 mostra o ensaio de competição entre anticorpo 5/44 de camundongo fluorescentemente marcado e variantes enxertadas; e[0099] Figure 12 shows the competition assay between fluorescently labeled
[00100] A Figura 13 mostra a sequência de proteína e o DNA total das cadeias leve e pesada enxertadas.[00100] Figure 13 shows the protein sequence and the total DNA of the grafted light and heavy chains.
[00101] Descrição detalhada da invenção[00101] Detailed description of the invention
[00102] Exemplo 1: Geração de anticorpos candidatos[00102] Example 1: Generation of Candidate Antibodies
[00103] Um painel de anticorpos contra CD22 foi selecionado de hibridomas usando os seguintes critérios de seleção: ligação em células Daudi, internalização sobre células Daudi, ligação em células monoclonares de sangue periférico (PMBC), internalização sobre PBMC, afinidade (maior do que 10-9 M), taxa de produção e y1 de camundongo. 5/44 foi selecionado como o anticorpo preferido.[00103] A panel of antibodies against CD22 was selected from hybridomas using the following selection criteria: binding on Daudi cells, internalization on Daudi cells, binding on peripheral blood monoclonal cells (PMBC), internalization on PBMC, affinity (greater than 10-9 M), mouse production rate and y1. 5/44 was selected as the preferred antibody.
[00104] Exemplo 2: Clonagem de gene e expressão de uma molécula de anticorpo 5/44 quimérica[00104] Example 2: Gene Cloning and Expression of a
[00105] Preparação de células de hibridoma 5/44 e preparação de RNA das mesmas[00105] Preparation of 5/44 hybridoma cells and RNA preparation thereof
[00106] Hibridoma 5/44 foi gerado por tecnologia de hibridoma convencional após imunização de camundongos com proteína CD22 humana. RNA foi preparado a partir de células de hibridoma 5/44 usando um RNEasy kit (Qiagen, RU; número de catálogo 74106). O RNA obtido foi reversamente transcrito para cDNA, como descrito abaixo.[00106]
[00107] Distribuição de CD22 sobre tumores de NHL[00107] Distribution of CD22 on NHL tumors
[00108] Um estudo de imuno-histoquímica foi realizado para se examinarem a incidência e a distribuição de coloração usando os anticorpos monoclonais 5/44 anti- CD22. Anticorpos de controle anti-CD20 e anti-CD79a foram incluídos no estudo para a confirmação das áreas de célula B dos tumores.[00108] An immunohistochemistry study was performed to examine the incidence and distribution of staining using the 5/44 anti-CD22 monoclonal antibodies. Anti-CD20 and anti-CD79a control antibodies were included in the study for confirmation of B cell areas of tumors.
[00109] Um total de 50 tumores foi estudado e estes foram categorizados como segue pelo emprego de sistemas de classificação REAL e Working Formulation: • 7 linfomas / leucemias linfoblásticas B (Alto/l) • 4 linfomas linfocíticos pequenos / B-CLL (Baixo/A) • 3 Imunocistomas / linfoplasmacitoides (Baixo/A) • 1 célula de manto (Int/F) • 14 linfomas de folículo central (Baixo a Int/D) • 13 linfomas de célula grande difusa (Int a Alto/G,H) • 6 não-classificáveis (K) • 2 linfomas de célula T[00109] A total of 50 tumors were studied and these were categorized as follows by employing the REAL and Working Formulation classification systems: • 7 lymphomas / B lymphoblastic leukemias (High/l) • 4 small lymphocytic lymphomas / B-CLL (Low /A) • 3 Immunocystomas / lymphoplasmacytoid (Low/A) • 1 mantle cell (Int/F) • 14 central follicle lymphomas (Low to Int/D) • 13 diffuse large cell lymphomas (Int to High/G, H) • 6 non-classifiable (K) • 2 T-cell lymphomas
[00110] 40 Linfomas de célula B foram positivos para antígeno CD22 com o anticorpo 5/44 a 0,1 μ g/mL e uns outros 6 se tornaram positivos quando a concentração foi aumentada para 0,5 μ g/mL. Para os restantes 2 tumores de célula B que foram negativos a 0,1 μ g/mL, houve tecido insuficiente restante para o teste em concentração maior. Contudo, teste paralelo com outro anticorpo 6/13 ant-CD22 Celltech, que deu coloração mais forte do que 5/44, resultou em todos os 44 linfomas de célula B corando positivo para CD22.[00110] 40 B cell lymphomas were positive for CD22 antigen with the 5/44 antibody at 0.1 μg/ml and another 6 became positive when the concentration was increased to 0.5 μg/ml. For the remaining 2 B cell tumors that were negative at 0.1 μg/mL, there was insufficient tissue remaining to test at the higher concentration. However, parallel testing with another
[00111] Assim, é possível concluir que o antígeno CD22 é amplamente expressado sobre linfomas de célula B e, portanto, proporciona um alvo adequado para imunoterapia em NHL.[00111] Thus, it can be concluded that the CD22 antigen is widely expressed on B cell lymphomas and therefore provides a suitable target for immunotherapy in NHL.
[00112] Clonagem por PCR de VL e VH de 5/44[00112] PCR Cloning of 5/44 VL and VH
[00113] Sequências de cDNA codificadoras de domínios variáveis de cadeias leve e pesada de 5/44 foram sintetizadas usando transcriptase reversa para a produção de cópias de cDNA de fita única a partir do mRNA presente no RNA total. Este foi então usado como o modelo para amplificação das sequências de região V murina usando iniciadores oligonucleotídeos específicos pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). a) Síntese de cDNA[00113] cDNA sequences encoding 5/44 light and heavy chain variable domains were synthesized using reverse transcriptase to produce single-stranded cDNA copies from the mRNA present in the total RNA. This was then used as the template for amplifying the murine V region sequences using Polymerase Chain Reaction (PCR) specific oligonucleotide primers. a) cDNA synthesis
[00114] cDNA foi sintetizado em um volume de reação de 20 μ L contendo os seguintes reagentes: Tris-HCl a 50 mM, pH 8,3, KCl a 75 mM, ditiotreitol a 10 mM, MgCl2 a 3 mM, desóxi-ribonucleosídeo-trifosfato cada um a 0,5 mM, 20 unidades de RNAsin, 75 ng de iniciador hexanucleotídeo randômico, 2 μ g de RNA de 5/44 e 200 unidades de transcriptase reversa de Vírus da Leucemia Murina de Moloney. Após incubação a 42oC por 60 minutos, a reação foi terminada por aquecimento a 95oC por 5 minutos.[00114] cDNA was synthesized in a reaction volume of 20 μ L containing the following reagents: 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 10 mM dithiothreitol, 3 mM MgCl2, deoxy-ribonucleoside -triphosphate each at 0.5 mM, 20 units sinRNA, 75 ng random hexanucleotide primer, 2
[00115] b) PCR[00115] b) PCR
[00116] Alíquotas do cDNA foram submetidas à PCR usando combinações de iniciadores específicos para as cadeias leve e pesada. Ferramentas de iniciador degenerado projetadas para se anelarem com as sequências conservadas do peptídeo de sinal foram utilizadas como iniciadores diretos. Todas estas sequências contêm, na ordem, um sítio de restrição (VL SfuI; VH HindIII) partindo de 7 nucleotídeos de suas extremidades 5', a sequência GCCGCCACC (SEQ ID NO: 50), para permitir a tradução ótima dos mRNAs resultantes, um códon de iniciação e 2030 nucleotídeos baseados nas sequências de peptídeo líder de anticorpos de camundongo conhecidos (Kabat et al., 1987, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).[00116] Aliquots of the cDNA were submitted to PCR using specific primer combinations for the light and heavy chains. Degenerate primer tools designed to anneal with the conserved signal peptide sequences were used as forward primers. All these sequences contain, in order, a restriction site (VL SfuI; VH HindIII) starting from 7 nucleotides from their 5' ends, the sequence GCCGCCACC (SEQ ID NO: 50), to allow the optimal translation of the resulting mRNAs, a initiation codon and 2030 nucleotides based on the leader peptide sequences of known mouse antibodies (Kabat et al., 1987, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Edition, 1991, US Department of Health and Human Services, Public Health Service , National Institutes of Health).
[00117] Os iniciadores 3' são projetados para alargarem a junção 4 J-C de região de molde do anticorpo e conterem um sítio de restrição para a enzima BsiW1 para facilitar a clonagem do fragmento Vl PCR. Os iniciadores 3' de cadeia pesada são uma mistura planejada para alargar a junção J-C do anticorpo. O iniciador 3' inclui um sítio de restrição ApaI para facilitar a clonagem. A região 3' dos iniciadores contém uma sequência mista baseada naquelas encontradas em anticorpos de camundongo conhecidos (Kabat et al., 1991, supra).The 3' primers are designed to extend the 4 J-C junction of the antibody template region and contain a restriction site for the BsiW1 enzyme to facilitate cloning of the V1 PCR fragment. The heavy chain 3' primers are a mixture designed to widen the J-C junction of the antibody. The 3' primer includes an ApaI restriction site to facilitate cloning. The 3' region of the primers contains a mixed sequence based on those found in known mouse antibodies (Kabat et al., 1991, supra).
[00118] As combinações de iniciadores descritas acima permitem que os produtos de PCR para VH e V1 sejam clonados diretamente em um sistema de expressão apropriado (veja abaixo) para se produzirem cadeias leve e pesada quiméricas (camundongo-humano) e para estes genes serem expressados em células de mamífero para a produção de anticorpos quiméricos de isotipo desejado.[00118] The primer combinations described above allow the PCR products for VH and V1 to be cloned directly into an appropriate expression system (see below) to produce chimeric (mouse-human) light and heavy chains and for these genes to be expressed in mammalian cells to produce chimeric antibodies of the desired isotype.
[00119] Incubações (100 μ L) para a PCR foram configuradas como segue. Cada reação continha Tris-HCl a 10 mM, pH 8,3, MgCl2 a 1,5 mM, KCl a 50 mM, gelatina a 0,01% p/v, desoxirribonucleosídeo-trifosfato cada um a 0,25 mM, 10 pmoles de mistura de iniciador 5', 10 pmoles de iniciador 3', 1 μ L de cDNA e 1 unidade de Taq polimerase. Reações foram incubadas a 95oC por 5 minutos e depois submetidas ao ciclo a 94oC por 1 minuto, a 55oC por 1 minuto e a 72oC por 1 minuto. Após 30 ciclos, alíquotas de cada reação foram analisadas por eletroforese sobre um gel de agarose.[00119] Incubations (100 μL) for the PCR were set up as follows. Each reaction contained 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5
[00120] Para a região V de cadeia pesada, um produto de DNA amplificado foi obtido apenas quando um de conjunto de iniciadores anelando dentro do início de região de molde I substituiu o conjunto de iniciadores de peptídeo de sinal. Os fragmentos foram clonados em vetores de sequenciamento de DNA. A sequência de DNA foi determinada e traduzida para dar uma sequência de aminoácidos deduzida. Esta sequência deduzida foi verificada pela referência à sequência de proteína N- terminal determinada de modo experimental. Figuras 2 e 3 mostram a sequência de proteína/DNA das regiões V de cadeia pesada e leve maduras de 5/44 monoclonal de camundongo respectivamente.[00120] For heavy chain V region, an amplified DNA product was obtained only when one of set of primers looping within the beginning of template I region replaced the set of signal peptide primers. Fragments were cloned into DNA sequencing vectors. The DNA sequence was determined and translated to give a deduced amino acid sequence. This deduced sequence was verified by reference to the experimentally determined N-terminal protein sequence. Figures 2 and 3 show the protein/DNA sequence of the mature heavy and light chain V regions of mouse monoclonal 5/44 respectively.
[00121] c) Clonagem molecular dos fragmentos da PCR[00121] c) Molecular cloning of PCR fragments
[00122] As sequências de região v de murina foram então clonadas nos vetores de expressão pMRR10.1 e pMRR14 (Figura 1). Estes são vetores para a expressão de cadeia leve e pesada respectivamente contendo DNA codificador de regiões constantes de cadeia leve kappa humana e de cadeia pesada gama-4 humana. A região VL foi sub-clonada no vetor de expressão por digestão de restrição e ligação do vetor de seqüenciamento, usando os sítios de restrição SfuI e BsiWI, formando o plasmídeo pMRR10(544cL). O DNA de cadeia pesada foi amplificado por PCR usando um iniciador 5' para introduzir um peptídeo de sinal, visto que este não foi obtido na estratégia de clonagem - um líder de anticorpo de cadeia pesada de camundongo de um hibridoma local diferente (chamado de 162) foi empregado. O iniciador 5' teve a seguinte sequência:[00122] The murine v region sequences were then cloned into the expression vectors pMRR10.1 and pMRR14 (Figure 1). These are light and heavy chain expression vectors respectively containing DNA encoding human kappa light chain and human gamma-4 heavy chain constant regions. The VL region was sub-cloned into the expression vector by restriction digestion and ligation of the sequencing vector, using the SfuI and BsiWI restriction sites, forming plasmid pMRR10(544cL). Heavy chain DNA was amplified by PCR using a 5' primer to introduce a signal peptide, as this was not obtained in the cloning strategy - a mouse heavy chain antibody leader from a different local hybridoma (called 162 ) has been employed. The 5' primer had the following sequence:
[00123] 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGT TCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCT GG3' (SEQ ID NO: 51).[00123] 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGT TCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCT GG3' (SEQ ID NO:51).
[00124] O iniciador reverso foi idêntico àquele usado na clonagem de gene VH original. O produto da PCR resultante foi digerido com as enzimas HindIII e ApaI, foi sub-clonado, e sua sequência de DNA foi confirmada, formando o plasmídeo pMRR14(544cH). Co-transfecção transiente de ambos os vetores de expressão em células CHO gerou anticorpo c5/44 quimérico. Isto foi conseguido usando o reagente Lipofectamine de acordo com os protocolos do fabricante (inVitrogen:Life Technologie, Groningen, Países-Baixos, número de catálogo 11688-027).[00124] The reverse primer was identical to that used in cloning the original VH gene. The resulting PCR product was digested with HindIII and ApaI enzymes, subcloned, and its DNA sequence confirmed, forming plasmid pMRR14(544cH). Transient co-transfection of both expression vectors into CHO cells generated chimeric c5/44 antibody. This was achieved using the Lipofectamine reagent according to the manufacturer's protocols (inVitrogen:Life Technologie, Groningen, Netherlands, catalog number 11688-027).
[00125] Remoção do sítio de glicosilação e da lisina reativa[00125] Removal of the glycosylation site and reactive lysine
[00126] Uma sequência de sítio de glicosilação N-ligada potencial foi observada em CDR-H2, possuindo a sequência de aminoácidos N-Y-T (Figura 3). SDS-PAGE, Western blotting e coloração de geles com carboidrato de 5/44 e de seus fragmentos (incluindo Fab) indicaram que este sítio estava de fato glicosilado (não mostrado). Em adição, um resíduo de lisina foi observado em uma posição exposta dentro de CDR-H2, que tinha o potencial de reduzir a afinidade de ligação pelo anticorpo pela provisão de um sinal adicional para a conjugação com um agente com o qual o anticorpo pode ser conjugado.A potential N-linked glycosylation site sequence was observed in CDR-H2, having the amino acid sequence N-Y-T (Figure 3). SDS-PAGE, Western blotting and staining of gels with 5/44 carbohydrate and its fragments (including Fab) indicated that this site was indeed glycosylated (not shown). In addition, a lysine residue was observed at an exposed position within CDR-H2, which had the potential to reduce the binding affinity for the antibody by providing an additional signal for conjugation with an agent with which the antibody can be conjugate.
[00127] Uma estratégia de PCR foi empregada para introduzir substituições de aminoácido na sequência de CDR-H2 em uma tentativa para remover o sítio de glicosilação e/ou a lisina reativa, como mostrado na Figura 4. Iniciadores diretos codificadores de mutações N55Q, T57A ou T57V foram usados para remover o sítio de glicosilação (Figura 4) e um quarto iniciador direto contendo a substituição K60R, foi gerado para remover o resíduo de lisina reativa (Figura 4). Um iniciador reverso de região de molde 4 foi usado em cada uma destas amplificações por PCR. Os produtos da PCR foram digeridos com as enzimas XbaI e ApaI e foram inseridos em pMRR14(544cH) (também clivado com XbaI e ApaI) para gerar os plasmídeos de expressão codificadores destes mutantes. As mutações N55Q, T57A e T57V removem o sítio de glicosilação pela mudança da sequência de aminoácidos para longe do consenso N-X-T/S enquanto que a mutação K60R substitui a lisina potencialmente reativa pelo resíduo semelhantemente positivamente carregado arginina. Os plasmídeos variantes cH resultantes foram co-transfectados com o plasmídeo cL para gerarem as variantes de anticorpo quimérico expressado.[00127] A PCR strategy was employed to introduce amino acid substitutions into the CDR-H2 sequence in an attempt to remove the glycosylation site and/or the reactive lysine, as shown in Figure 4. Forward primers encoding mutations N55Q, T57A or T57V were used to remove the glycosylation site (Figure 4) and a fourth forward primer containing the K60R substitution was generated to remove the reactive lysine residue (Figure 4). A reverse primer from
[00128] Avaliação das atividades de genes quiméricos[00128] Evaluation of the activities of chimeric genes
[00129] As atividades dos genes quiméricos foram avaliadas após a transfecção transiente em células CHO.[00129] The activities of the chimeric genes were evaluated after transient transfection in CHO cells.
[00130] c) Determinação das constantes de afinidade por análise BioCore[00130] c) Determination of affinity constants by BioCore analysis
[00131] As afinidades de 5/44 quimérico ou de suas variantes, que haviam tido seu sítio de glicosilação ou sua lisina reativa removidos, foram investigadas usando a tecnologia BIA para ligação em constructos CD22-mFc. Os resultados são mostrados na Figura 8. Todas as medições de ligação foram realizadas no instrumento BiacoreTM 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Suécia). O ensaio foi conduzido pela captura de CD22mFc via Fc anti-camundongo imobilizado. O anticorpo estava na fase solúvel. Amostras, padrão, e controles (50 μ L) foram injetados sobre Fc anti-camundongo imobilizado seguidas pelo anticorpo na fase solúvel. Após cada ciclo a superfície foi regenerada com 50 μ L de HCl a 40 mM a 30 μ L/min. A análise cinética foi realizada usando o programa de computador BIAevaluation 1.3 (Pharmacia).[00131] The affinities of chimeric 5/44 or its variants, which had had their glycosylation site or their reactive lysine removed, were investigated using BIA technology for binding to CD22-mFc constructs. The results are shown in Figure 8. All binding measurements were performed on the BiacoreTM 2000 instrument (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Sweden). The assay was conducted by capturing CD22mFc via immobilized anti-mouse Fc. The antibody was in the soluble phase. Samples, standard, and controls (50 μL) were injected onto immobilized anti-mouse Fc followed by antibody in the soluble phase. After each cycle the surface was regenerated with 50 µL of 40 mM HCl at 30 µL/min. Kinetic analysis was performed using the BIAevaluation 1.3 computer program (Pharmacia).
[00132] Remoção do sítio de glicosilação no constructo T57A resultou em uma associação (on-rate) ligeiramente mais rápida e em uma dissociação (off-rate) significativamente mais lenta comparada com 5/44 quimérico, dando uma melhoria de afinidade de aproximadamente 5 vezes. A mutação N55Q não teve efeito sobre a afinidade. Este resultado foi surpreendente visto que ele sugere que a remoção do próprio carboidrato aparentemente não tem qualquer efeito sobre a ligação (como com a mudança N55Q). A afinidade melhorada foi observada apenas com a mudança T57A. Uma explicação possível é que, independente da presença de carboidrato, a treonina na posição 57 exerce um efeito negativo sobre a ligação que é removida sob conversão da treonina para alanina. A hipótese de que o tamanho pequeno da alanina é importante, e de que o efeito negativo da treonina está relacionado com o seu tamanho, é confirmada pelo resultado obtido usando a mutação T57V: que a substituição por valina na posição 57 não é benéfica (resultados não mostrados).[00132] Removal of the glycosylation site in the T57A construct resulted in a slightly faster on-rate and a significantly slower off-rate compared to chimeric 5/44, giving an affinity improvement of approximately 5 times. The N55Q mutation had no effect on affinity. This result was surprising as it suggests that removing the carbohydrate itself apparently has no effect on binding (as with the N55Q switch). Improved affinity was seen only with the T57A change. One possible explanation is that, regardless of the presence of carbohydrate, threonine at position 57 exerts a negative effect on the bond that is removed upon conversion of threonine to alanine. The hypothesis that alanine's small size is important, and that the negative effect of threonine is related to its size, is confirmed by the result obtained using the T57V mutation: that valine substitution at position 57 is not beneficial (results not shown).
[00133] Remoção de lisina pela mutação K60R teve um efeito neutro sobre a afinidade, isto é a introdução de arginina remove o sítio reativo potencial sem comprometer a afinidade.[00133] Removal of lysine by the K60R mutation had a neutral effect on affinity, ie the introduction of arginine removes the potential reactive site without compromising affinity.
[00134] As mutações para a remoção do sítio de glicosilação e para a remoção da lisina reativa foram portanto ambas incluídas no projeto de humanização.Mutations for the removal of the glycosylation site and for the removal of the reactive lysine were therefore both included in the humanization project.
[00135] Exemplo 2: Enxerto de CDR de 5/44[00135] Example 2: 5/44 CDR Graft
[00136] A clonagem molecular de genes para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 5/44 e seu uso para a produção de anticorpos 5/44 quiméricos (camundongo/humano) tem sido descrita acima. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos dos domínios VH e VB de 5/44 de camundongo são mostradas nas Figuras 2 e 3 (SEQ ID NOS: 7 e 8), respectivamente. Este exemplo descreve a enxerto de CDR de anticorpo 5/44 sobre regiões estruturais humanas para reduzir a imunogenicidade potencial em humanos, de acordo com o método de Adair et al., (WO91/09967).[00136] The molecular cloning of genes for the variable regions of the heavy and light chains of the 5/44 antibody and their use for the production of chimeric 5/44 antibodies (mouse/human) has been described above. The nucleotide and amino acid sequences of the
[00137] Enxerto de CDR de cadeia leve de 5/44[00137] 5/44 Light Chain CDR Graft
[00138] O alinhamento de sequência de proteína com as sequências de consenso de região V de cadeia leve kappa de sub-grupo I humana indicou identidade de sequência de 64%. Conseqüentemente, para a construção da cadeia leve enxertada com CDR, as regiões estruturais aceptoras escolhidas corresponderam àquelas de sequência O12,DPK9 de linhagem germinativa de sub-grupo i de VK humana. A sequência aceptora de região de molde 4 foi derivada da sequência de linhagem germinativa de região J humana JK1.Protein sequence alignment with the human subgroup I kappa light chain V region consensus sequences indicated 64% sequence identity. Consequently, for the construction of the CDR-grafted light chain, the acceptor framework regions chosen corresponded to those of the human VK subgroup i germline germline sequence O12,DPK9.
[00139] Uma comparação das sequências de aminoácidos das regiões estruturais de 5/44 murino e da sequência aceptora é dada na Figura 5 e mostra que há 27 diferenças entre as cadeias aceptora e doadora. Em cada posição, uma análise foi feita do potencial do resíduo murino de contribuir para a ligação em antígeno, quer direta quer indiretamente, por meio de efeitos sobre o empacotamento ou na interface de VH/VL. Se um resíduo murino foi considerado importante e suficientemente diferente do resíduo humano em termos de tamanho, polaridade ou carga, então aquele resíduo de murino foi retido. Baseando-se nesta análise, duas versões da cadeia leve enxertada com CDR, possuindo as sequências em SEQ ID NO: 19 e em SEQ ID NO: 20 (Figura 5), foram construídas.[00139] A comparison of the amino acid sequences of the murine 5/44 framework regions and the acceptor sequence is given in Figure 5 and shows that there are 27 differences between the acceptor and donor chains. At each position, an analysis was made of the potential of the murine residue to contribute to antigen binding, either directly or indirectly, through effects on packaging or at the VH/VL interface. If a murine residue was considered important and sufficiently different from the human residue in terms of size, polarity or charge, then that murine residue was retained. Based on this analysis, two versions of the CDR-grafted light chain, having the sequences in SEQ ID NO: 19 and in SEQ ID NO: 20 (Figure 5), were constructed.
[00140] Enxerto de CDR de cadeia pesada de 5/44[00140] 5/44 Heavy Chain CDR Graft
[00141] Enxerto de CDR de cadeia pesada de 5/44 foi realizada usando a mesma estratégia que a descrita para a cadeia leve. Foi verificado que o domínio V da cadeia pesada de 5/44 é homólogo às cadeias pesadas humanas pertencentes ao sub-grupo I (identidade de sequência de 70%) e portanto a sequência de região de molde de linhagem germinativa de sub-grupo I humana VH1-3,DP7 foi usada como uma região de molde aceptora. As sequências aceptoras de região de molde 4 foram derivadas da sequência de linhagem germinativa de região J humana JH4.5/44 heavy chain CDR grafting was performed using the same strategy as described for the light chain. The 5/44 heavy chain V domain was found to be homologous to the human heavy chains belonging to subgroup I (
[00142] Uma comparação da cadeia pesada de 5/44 com as regiões estruturais é mostrada na Figura 6 onde pode ser visto que a cadeia pesada de 5/44 difere da sequência aceptora nas posições 22. Análise da contribuição que qualquer uma dessas pode ter para a ligação em antígeno acarretou na construção de 5 versões de cadeias pesadas enxertada com CDRs, possuindo as sequências dadas em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 (Figura 6).[00142] A comparison of the 5/44 heavy chain with the framework regions is shown in Figure 6 where it can be seen that the 5/44 heavy chain differs from the acceptor sequence at positions 22. Analysis of the contribution that any of these can have for antigen binding resulted in the construction of 5 versions of heavy chains grafted with CDRs, having the sequences given in SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO : 27 (Figure 6).
[00143] Construção de genes para as sequências enxertadas[00143] Construction of genes for the grafted sequences
[00144] Genes foram projetados para codificarem as sequências enxertadas gH1 e gL1, e uma série de oligonucleotídeos de recobrimento foi projetada e construída (Figura 9). Uma técnica de montagem de PCR foi empregada para a construção de genes de região V enxertada com CDR. Volumes de reação de 100 μ L foram configurados contendo Tris-HCl a 10 mM, pH 8,3, MgCl2 a 1,5 mM, KCl a 50 mM, 0,001% de gelatina, desoxirribonucleosídeo-fosfato cada um a 0,25 mM, 1 pmol de cada um dos iniciadores 'internos' (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmoles de cada um dos iniciadores 'externos' (F1, R1), e 1 unidade de Taq polimerase (AmpliTaq, Applied BioSystems, número de catálogo N808-0171). Parâmetros de ciclo de PCR foram 94oC por 1 minuto, 55oC por 1 minuto e 72oC por 1 minuto, para 30 ciclos. Os produtos de reação foram então corridos sobre um gel de agarose a 1,5%, excisados e recuperados usando colunas QIAGEN spin (QIAquick gel extraction kit, número de catálogo 28706). O DNA foi eluído em um volume de 30 μ L. Alíquotas (1 μ L) de gH1 e gL1 DNA foram então clonadas no vetor pCR2.1 TOPO de clonagem InVitrogen TOPO TA (número de catálogo K4500-01) de acordo com as instruções do fabricante. Este vetor de não expressão serviu como um intermediário de clonagem para facilitar o seqüenciamento de um grande número de clones. Seqüenciamento de DNA usando iniciadores vetor-específicos foi usado para identificar os clones corretos contendo gH1 e gL1, formando plasmídeos pCR2.1 (544gH1) e pCR2.1(544gL1) (Figura 10).[00144] Genes were designed to encode the grafted sequences gH1 and gL1, and a series of overlay oligonucleotides was designed and constructed (Figure 9). A PCR assembly technique was employed to construct CDR-grafted V region genes. Reaction volumes of 100 μL were set up containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.001% gelatin, 0.25 mM deoxyribonucleoside-phosphate each, 1 pmole of each of the 'inner' primers (T1, T2, T3, B1, B2, B3), 10 pmole of each of the 'outer' primers (F1, R1), and 1 unit of Taq polymerase (AmpliTaq, Applied BioSystems, catalog number N808-0171). PCR cycle parameters were 94oC for 1 minute, 55oC for 1 minute and 72oC for 1 minute for 30 cycles. The reaction products were then run over a 1.5% agarose gel, excised and recovered using QIAGEN spin columns (QIAquick gel extraction kit, catalog number 28706). The DNA was eluted in a volume of 30 μL. Aliquots (1 μL) of gH1 and gL1 DNA were then cloned into the InVitrogen TOPO TA cloning vector pCR2.1 TOPO (catalog number K4500-01) according to the instructions from the manufacturer. This non-expression vector served as a cloning intermediate to facilitate the sequencing of a large number of clones. DNA sequencing using vector-specific primers was used to identify the correct clones containing gH1 and gL1, forming plasmids pCR2.1 (544gH1) and pCR2.1(544gL1) (Figure 10).
[00145] Um método de substituição de cassete de oligonucleotídeo foi utilizado para formar os enxertados humanizados gH4,5,6 e 7, e gL2. Figura 11 mostra o desenho dos cassetes de oligonucleotídeo. Para se construir cada variante, o vetor (pCR2.1(544gH1) ou pCR2.1(544gL1)) foi cortado com as enzimas de restrição mostradas (XmaI/SacII para a cadeia pesada, XmaI/BstEII para a cadeia leve). O fragmento de vetor grande foi purificado em gel a partir de agarose e foi usado na ligação com o cassete de oligonucleotídeo. Estes cassetes são compostos de 2 oligonucleotídeos complementares (mostrados na Figura 11), misturados em uma concentração de 0,5 pmol/μ L em um volume de 200 μ L de Tris-HCl a 12,5 mM, pH 7,5, MgCl2 a 2,5 mM, NaCl a 25 mM, ditioeritritol a 0,25 mM. Anelamento foi conseguido pelo aquecimento a 95oC por 3 minutos em um banho de água (volume de 500 mL) depois permitindo que a reação esfriasse lentamente para a temperatura ambiente. O cassete de oligonucleotídeo anelado foi então diluído dez vezes em água antes da ligação no vetor apropriadamente cortado. O seqüenciamento de DNA foi usado para confirmar a sequência correta, formando os plasmídeos pCR2.1 (5/44-gH4-7) e pCR2.1 (5/44-gL2). As sequências enxertadas verificadas foram então sub-clonadas nos vetores de expressão pMRR14 (cadeia pesada) e pMR10.1 (cadeia leve).[00145] An oligonucleotide cassette replacement method was used to form the humanized grafts gH4,5,6 and 7, and gL2. Figure 11 shows the design of the oligonucleotide cassettes. To construct each variant, the vector (pCR2.1(544gH1) or pCR2.1(544gL1)) was cut with the restriction enzymes shown (XmaI/SacII for heavy chain, XmaI/BstEII for light chain). The large vector fragment was gel purified from agarose and used in ligation with the oligonucleotide cassette. These cassettes are composed of 2 complementary oligonucleotides (shown in Figure 11), mixed at a concentration of 0.5 pmol/μL in a 200 μL volume of 12.5 mM Tris-HCl, pH 7.5, MgCl2 2.5 mM, 25 mM NaCl, 0.25 mM dithioerythritol. Annealing was achieved by heating at 95oC for 3 minutes in a water bath (500 mL volume) then allowing the reaction to cool slowly to room temperature. The annealed oligonucleotide cassette was then diluted ten-fold in water prior to ligation into the appropriately cut vector. DNA sequencing was used to confirm the correct sequence, forming plasmids pCR2.1 (5/44-gH4-7) and pCR2.1 (5/44-gL2). The verified grafted sequences were then subcloned into the expression vectors pMRR14 (heavy chain) and pMR10.1 (light chain).
[00146] Atividade de ligação em CD22 das sequências enxertada com CDRs[00146] CD22 binding activity of CDR-grafted sequences
[00147] Os vetores codificadores de variantes enxertadas foram co-transfectados em células CHO em uma variedade de combinações, juntos com as cadeias de anticorpo quimérico original. A atividade de ligação foi comparada em um ensaio de competição, competindo a ligação do anticorpo de camundongo original 5/44 para a ligação em células Ramos (obtidas de ATCC, uma linhagem celular humana de linfoblasto de linfoma de Burkitt expressando CD22 de superfície). Este ensaio foi considerado o melhor modo de se compararem os enxertados em sua capacidade de se ligarem em CD22 de superfície celular. Os resultados são mostrados n Figura 8. Como pode ser visto, há muito pouca diferença entre qualquer um dos enxertados, todos desempenhando mais efetivamente do que o quimérico em competição contra o parental murino. A introdução de 3 resíduos humanos adicionais na extremidade de CDR-H3 (gH5 e gH7) não parece ter afetado a ligação.Vectors encoding grafted variants were co-transfected into CHO cells in a variety of combinations, together with the original chimeric antibody chains. The binding activity was compared in a competition assay, competing the binding of the original 5/44 mouse antibody for binding in Ramos cells (obtained from ATCC, a human Burkitt lymphoma lymphoblast cell line expressing surface CD22). This assay was considered the best way to compare grafts in their ability to bind to cell surface CD22. The results are shown in Figure 8. As can be seen, there is very little difference between any of the grafts, all performing more effectively than the chimeric in competition against the murine parent. The introduction of 3 additional human residues at the end of CDR-H3 (gH5 and gH7) does not appear to have affected binding.
[00148] A combinação de enxerto com o menor número de resíduos murinos foi selecionada, gL1gH7. O enxerto de cadeia leve gL1 possui 6 resíduos doadores. Resíduos V2, V4, L37 e Q45 são resíduos de empacotamento potencialmente importantes. Resíduo H38 está na interface VH/VL. Resíduo D60 é um resíduo de superfície próximo de CDR-L2 e pode contribuir diretamente para a ligação em antígeno. Destes resíduos, V2, L37, Q45 e D60 são verificados em sequências de linhagem germinativa de genes kappa humanos de outros sub-grupos. O enxertado de cadeia pesada gH7 possui 4 resíduos de região de molde doadoras (Resíduo R28 é considerado parte de CDR-H11 sob a definição estrutural usada na Enxerto de CDR (veja Adair et al. (1991 WO91/09967)). Resíduos E1 e A71 são resíduos de superfície próximos de CDR's. Resíduo 148 é um resíduo de empacotamento potencial. Resíduo T93 está presente na interface VH/VL. Destes resíduos, E1 e A71 são encontrados em outros genes de linhagem germinativa de sub-grupo I humano. Resíduo I48 é encontrado no sub-grupo 4 de linhagem germinativa humana, e T73 é encontrado em sub-grupo 3 de linhagem germinativa humana.[00148] The graft combination with the lowest number of murine residues was selected, gL1gH7. The gL1 light chain graft has 6 donor residues. Residues V2, V4, L37 and Q45 are potentially important packaging residues. Residue H38 is at the VH/VL interface. Residue D60 is a surface residue close to CDR-L2 and may directly contribute to antigen binding. Of these residues, V2, L37, Q45 and D60 are found in germline sequences of human kappa genes from other subgroups. The gH7 heavy chain graft has 4 donor template region residues (Residue R28 is considered part of CDR-H11 under the structural definition used in CDR Graft (see Adair et al. (1991 WO91/09967)) Residues E1 and A71 are surface residues close to CDR's. Residue 148 is a potential packaging residue. Residue T93 is present at the VH/VL interface. Of these residues, E1 and A71 are found in other human subgroup I germline genes. I48 is found in
[00149] As sequências de proteína e de DNA total de ambas a cadeia leve e a cadeia pesada, incluindo a posição aproximada de íntrons dentro dos genes de região constante proporcionados pelos vetores, são mostradas na Figura 13 e são dadas na SEQ ID NO: 29 e na SEQ ID NO: 28 respectivamente para a cadeia leve e na SEQ ID NO: 31 e na SEQ ID NO: 30 respectivamente para a cadeia pesada.[00149] The protein and total DNA sequences of both the light chain and the heavy chain, including the approximate position of introns within the constant region genes provided by the vectors, are shown in Figure 13 and are given in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO:28 respectively for light chain and SEQ ID NO:31 and SEQ ID NO:30 respectively for heavy chain.
[00150] DNA codificador destes genes de cadeias pesada e leve foi excisado destes vetores. DNA de cadeia pesada foi digerido no sítio 5' HindIII, então foi tratado com o fragmento Klenow de DNA polimerase I de E. coli para formar uma extremidade 5' cega. Clivagem no sítio 3' EcoRI resultou no fragmento de cadeia pesada que foi purificado em geles de agarose. Na mesma maneira, um fragmento de cadeia leve foi produzido, cegado no sítio 5' SfuI e com um sítio 3' EcoRI. Ambos os fragmentos foram clonados em vetores de expressão baseados em DHFR e usados para a geração de linhagens celulares estáveis em células CHO.[00150] DNA encoding these heavy and light chain genes was excised from these vectors. Heavy chain DNA was digested at the 5' HindIII site, then treated with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I to form a blunt 5' end. Cleavage at the 3' EcoRI site resulted in the heavy chain fragment which was purified on agarose gels. In the same way, a light chain fragment was produced, blinded at the 5' SfuI site and with a 3' EcoRI site. Both fragments were cloned into DHFR-based expression vectors and used to generate stable cell lines in CHO cells.
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