BRPI0209483B1 - TyrA NUCLEIC ACID MOLECULA, CELL AND PLANT PRODUCTION METHODS WITH INCREASED TOCOFEROL LEVELS AND REDUCTION OF PLANT TOCOFEROL LEVELS - Google Patents

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(54) Título: MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO TYRA, CÉLULA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PLANTA TENDO NÍVEIS AUMENTADOS DE TOCOFEROL E DE REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE TOCOFEROL EM PLANTA (73) Titular: MONSANTO TECHNOLOGY LLC, Sociedade Norte-Americana. Endereço: 800 North Lindbergh Boulevard, St. Louis, Missouri 63167, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: HENRY E. VALENTIN; TIMOTHY A. MITSKY; MING HAO; BALASULOJINI KARUNANDAA; QUNGANG Ql(54) Title: TYRA NUCLEIC ACID MOLECULE, PLANT PRODUCTION CELL AND METHODS HAVING INCREASED LEVELS OF TOCOPHEROL AND REDUCING PLANT TOCOPHEROL LEVELS (73) Owner: MONSANTO TECHNOLOGY LLC, North American Company. Address: 800 North Lindbergh Boulevard, St. Louis, Missouri 63167, UNITED STATES OF AMERICA (US) (72) Inventor: HENRY E. VALENTIN; TIMOTHY A. MITSKY; MING HAO; BALASULOJINI KARUNANDAA; QUNGANG Ql

Código de Controle: 8FD0617A38BEAE03 16D99C20DA509445Control Code: 8FD0617A38BEAE03 16D99C20DA509445

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legaisValidity Term: 10 (ten) years from 10/02/2018, subject to legal conditions

Expedida em: 02/10/2018Issued on: 10/02/2018

Assinado digitalmente por:Digitally signed by:

Liane Elizabeth Caldeira LageLiane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos IntegradosDirector of Patents, Computer Programs and Topographies of Integrated Circuits

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO tyrA, CÉLULA E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PLANTA TENDO NÍVEIS AUMENTADOS DE TOCOFEROL E DE REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE TOCOFEROL EM PLANTA.Invention Patent Descriptive Report for tyrA NUCLEIC ACID MOLECULE, CELL AND PLANT PRODUCTION METHODS HAVING INCREASED LEVELS OF TOCOPHEROL AND REDUCING PLANT TOCOPHEROL LEVELS.

Campo da InvençãoField of the Invention

A presente invenção refere-se ao campo da genética e bioquímica das plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a genes associados com a via da biossíntese dos tocoferóis. A presente invenção fornece e inclui moléculas de ácido nucléico, proteínas e anticorpos associados com os genes da via da biossíntese dos tocoferóis. A presente invenção também fornece métodos para utilização de tais agentes, por exemplo em isolamento de genes, em análise de genes e na produção de plantas transgênicas. Além disso, a presente invenção inclui plantas transgênicas modificadas para expressar proteínas associadas com a via dos tocoferóis. Ademais, a presente invenção inclui métodos para a produção de produtos da via da biossíntese dos tocoferóis.The present invention relates to the field of plant genetics and biochemistry. More specifically, the invention relates to genes associated with the tocopherol biosynthesis pathway. The present invention provides and includes nucleic acid molecules, proteins and antibodies associated with the genes in the tocopherol biosynthesis pathway. The present invention also provides methods for using such agents, for example in gene isolation, in gene analysis and in the production of transgenic plants. In addition, the present invention includes transgenic plants modified to express proteins associated with the tocopherol pathway. Furthermore, the present invention includes methods for producing products from the tocopherol biosynthesis pathway.

Fundamentos da InvençãoFundamentals of the Invention

Tocoferóis são um componente essencial da dieta de mamíferos. A evidência epidemiológica indica que a suplementação com tocoferol pode resultar em risco reduzido para doenças cardiovasculares e câncer, pode ajudar a função imunológica, e está associada com a prevenção ou a retardação de inúmeros processos de doenças degenerativas no homem (Traber e Sies, Annu. Rev. Nutr. 16:321-347 (1996)). O tocoferol funciona, em parte, estabilizando a bicamada lipídica das membranas biológicas (Skrypin e Kagan, Biochim. Biophys. Acta 815: 209 (1995); Kagan, Ν. Y. Acad. Sei. pág. 121, (1989); Gomez-Fernandez et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. pág. 109 (1989)), reduzindo os radicais livres de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) gerados por oxidação de lipídios (Fukuzawa et al., Lipids 17: 511-513 (1982)), e seqüestrando radicais livres de oxigênio, radicais de peróxi lipídico e espécies de oxigênio singleto (Diplock et al. Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 570: 72 (1989); Fryer, Plant Cell Environ. 15(4): 381-392 (1992)).Tocopherols are an essential component of the mammalian diet. Epidemiological evidence indicates that supplementation with tocopherol may result in reduced risk for cardiovascular disease and cancer, may aid immune function, and is associated with the prevention or delay of numerous degenerative disease processes in man (Traber and Sies, Annu. Rev. Nutr. 16: 321-347 (1996)). Tocopherol works, in part, by stabilizing the lipid bilayer of biological membranes (Skrypin and Kagan, Biochim. Biophys. Acta 815: 209 (1995); Kagan, Ν. Y. Acad. Sci. P. 121, (1989); Gomez -Fernandez et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sci. P. 109 (1989)), reducing the free radicals of polyunsaturated fatty acids (PUFA) generated by lipid oxidation (Fukuzawa et al., Lipids 17: 511 -513 (1982)), and sequestering oxygen free radicals, lipid peroxide radicals and singlet oxygen species (Diplock et al. Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 570: 72 (1989); Fryer, Plant Cell Environ 15 (4): 381-392 (1992)).

O α-tocoferol, geralmente referido como vitamina E, pertence a uma classe de antioxidantes solúveis em lipídio que inclui α, β, γ e δtocoferóis e a, β, γ e δ-tocotrienóis. Embora os a, β, γ e δ-tocoferóis e os a,Α-tocopherol, generally referred to as vitamin E, belongs to a class of lipid-soluble antioxidants that includes α, β, γ and δtocopherols and a, β, γ and δ-tocotrienols. Although a, β, γ and δ-tocopherols and a,

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• · · ·· β, γ e δ-tocotrienóis sejam às vezes coletivamente referido como vitamina E, a vitamina E é quimicamente definida de forma mais apropriada como atocoferol. O α-tocoferol é significativo para a saúde do homem, em parte porque é facilmente absorvido e retido pelo corpo, e tem um grau de bioatividade mais alto que outras espécies de tocoferol (Traber e Sies, Annu. Rev. Nutr. 16: 321-347 (1996)). No entanto, outros tocoferóis tais como os β, γ e δ-tocoferóis, também trazem benefícios significativos para a saúde e em termos nutricionais.• · · ·· β, γ and δ-tocotrienols are sometimes collectively referred to as vitamin E, vitamin E is more chemically defined as atocopherol. Α-tocopherol is significant for human health, in part because it is easily absorbed and retained by the body, and has a higher degree of bioactivity than other species of tocopherol (Traber and Sies, Annu. Rev. Nutr. 16: 321 -347 (1996)). However, other tocopherols, such as β, γ and δ-tocopherols, also have significant health and nutritional benefits.

Os tocoferóis são essencialmente sintetizados somente por plantas e outros organismos fotossintéticos, inclusive cianobactérias. Por conseguinte, os tocoferóis dietéticos dos mamíferos são obtidos quase que exclusivamente dessas fontes. Os tecidos de plantas variam consideravelmente em termos de tocoferol total e composição de tocoferol, com o atocoferol sendo a espécie de tocoferol predominante encontrada nos tecidos de plantas fotossintéticos verdes. O tecido de folha pode conter 10 - 50 pg de tocoferóis totais por grama de peso fresco, mas a maioria das principais culturas básicas do mundo (por exemplo, arroz, milho, trigo, batata) produzem níveis baixos a extremamente baixos de tocoferóis totais, apenas uma pequena percentagem destes sendo α-tocoferol (Hess, Vitamin Ε, atocopherol, ln Antioxidants in Higher Plants, R. Alscher e J. Hess, Eds., CRC Press, Boca Raton, págs. 111-134 (1993)). Culturas de sementes oleaginosas geralmente contêm níveis muito mais altos de tocoferóis totais, mas o atocoferol só está presente como um componente ínfimo (Taylor e Barnes, Chemy Ind., outubro: 722-726 (1981)).Tocopherols are essentially synthesized only by plants and other photosynthetic organisms, including cyanobacteria. Therefore, mammalian dietary tocopherols are obtained almost exclusively from these sources. Plant tissues vary considerably in terms of total tocopherol and tocopherol composition, with atocopherol being the predominant tocopherol species found in green photosynthetic plant tissues. Leaf tissue may contain 10 - 50 pg of total tocopherols per gram of fresh weight, but most of the world's major staple crops (eg rice, corn, wheat, potatoes) produce low to extremely low levels of total tocopherols, only a small percentage of these are α-tocopherol (Hess, Vitamin Ε, atocopherol, Antioxidants in Higher Plants, R. Alscher and J. Hess, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 111-134 (1993)). Oilseed crops generally contain much higher levels of total tocopherols, but atocopherol is only present as a tiny component (Taylor and Barnes, Chemy Ind., October: 722-726 (1981)).

O consumo dietético diário recomendado de 15 - 30 mg de vitamina E é bastante difícil de ser atingido com a dieta americana média. Por exemplo, seriam necessários mais de 750 gramas de folhas de espinafre onde o α-tocoferol constitui 60% dos tocoferóis totais, ou 200 - 400 gramas de óleo de soja para satisfazer este consumo diário recomendado de vitamina E. Apesar de ser possível aumentar a dieta com suplementos, a maioria dos suplementos contêm essencialmente vitamina E sintética, tendo seis estereoisômeros, ao passo que a vitamina E natural é predominantementeThe recommended daily dietary intake of 15 - 30 mg of vitamin E is quite difficult to achieve with the average American diet. For example, more than 750 grams of spinach leaves would be needed where α-tocopherol constitutes 60% of total tocopherols, or 200 - 400 grams of soy oil to satisfy this recommended daily intake of vitamin E. Although it is possible to increase the supplement diet, most supplements essentially contain synthetic vitamin E, having six stereoisomers, whereas natural vitamin E is predominantly

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* · · • · · · · • · 4» · · • · · · · constituída de apenas um único isômero. Além disso, os suplementos tendem a ser relativamente dispendiosos, e a população em geral se sente desmotivada a tomar suplementos vitamínicos com regularidade. Portanto, são necessárias na técnica para composições e métodos que aumentam a produção de tocoferóis totais ou que aumentam a percentagem relativa de α-tocoferol produzido pelas plantas.* · · · · · · · · · 4 »· · · · · · · consisting of only a single isomer. In addition, supplements tend to be relatively expensive, and the general population feels discouraged from taking vitamin supplements on a regular basis. Therefore, they are necessary in the art for compositions and methods that increase the production of total tocopherols or that increase the relative percentage of α-tocopherol produced by plants.

Além dos benefícios que o α-tocoferol proporciona à saúde, níveis aumentados de α-tocoferol em culturas foram associados com estabilidade melhorada e vida útil prolongada dos produtos de plantas (Peterson, Cereal-Chem. 72(1): 21-24 (1995); Bali, Fat-soluble vitamin assays in food analysis. A comprehensive review, Londres, Elsevier Science Publishers Ltd. (1988)). Além disso, a suplementação de alimentos à base de carne suína, carne bovina e carne de ave com tocoferol mostrou aumentar significativamente a qualidade da carne e estender a vida útil dos produtos à base de carne pós-processada retardando a oxidação de lipídios pósprocessamento, o que contribui para os componentes de sabor indesejável (Sante e Lacourt, J. Sei. Food Agric. 65(4): 503-507 (1994); Buckley et al., J. of Animal Science 73: 3122-3130 (1995)).In addition to the health benefits of α-tocopherol, increased levels of α-tocopherol in crops have been associated with improved stability and extended life of plant products (Peterson, Cereal-Chem. 72 (1): 21-24 (1995 ); Bali, Fat-soluble vitamin assays in food analysis.A comprehensive review, London, Elsevier Science Publishers Ltd. (1988)). In addition, supplementation of pork, beef and poultry-based foods with tocopherol has been shown to significantly increase the quality of the meat and extend the shelf life of post-processed meat products by slowing the oxidation of post-processing lipids, which which contributes to the undesirable flavor components (Sante and Lacourt, J. Sei. Food Agric. 65 (4): 503-507 (1994); Buckley et al., J. of Animal Science 73: 3122-3130 (1995) ).

Biossíntese do tocoferolTocopherol biosynthesis

Os plastídios de plantas superiores apresentam vias bioquímicas interligadas que levam a metabólitos secundários que incluem os tocoferóis. A via biossintética dos tocoferóis nas plantas superiores envolve a condensação de ácido homogentísico e fitilpirofosfato para formar 2-metil-6fitilplastoquinol (Fiedler et al., Planta 155: 511-515 (1982); Soll et al., Arch. Biochem. Biophys. 204: 544-550 (1980); Marsall et al., Phytochem. 24: 1705-1711 (1985)). Esta via dos tocoferóis de plantas pode ser dividida em quatro partes: 1) síntese do ácido homogentísico, que contribui para o anel aromático do tocoferol; 2) síntese de fitilpirofosfato, que contribui para a cadeia lateral do tocoferol; 3) ciclização, que tem um papel na quiralidade e na subestrutura do cromanol da família da vitamina E; 4) e metilação Sadenosil metioninadependente de um anel aromático, que afeta a abundância relativa de cada espécie de tocoferol.Higher plant plastids have interconnected biochemical pathways that lead to secondary metabolites that include tocopherols. The biosynthetic pathway of tocopherols in higher plants involves the condensation of homogentisic acid and phytylpyrophosphate to form 2-methyl-6-phytoplastoquinol (Fiedler et al., Plant 155: 511-515 (1982); Soll et al., Arch. Biochem. Biophys. 204: 544-550 (1980); Marsall et al., Phytochem. 24: 1705-1711 (1985)). This pathway for plant tocopherols can be divided into four parts: 1) synthesis of homogentisic acid, which contributes to the aromatic ring of tocopherol; 2) phytylpyrophosphate synthesis, which contributes to the tocopherol side chain; 3) cyclization, which plays a role in the chirality and substructure of the cromanol of the vitamin E family; 4) and methionine-dependent Sadenosil methylation of an aromatic ring, which affects the relative abundance of each species of tocopherol.

Síntese do ácido homogentísicoSynthesis of homogentisic acid

O ácido homogentísico é o precursor comum dos tocoferóis e plastoquinonas. Foi relatado que em pelo menos algumas bactérias a síntese do ácido homogentísico ocorre via a conversão de corismato em prefenato e em seguida em p-hidroxifenilpiruvato via um prefenato desidrogenase bifuncional. Exemplos de enzimas do tipo prefenato desidrogenase bacteriana bifuncional incluem as proteínas codificadas pelos genes tyrA de Erwinia herbicola e Escherichia coli. O produto de gene tyrA catalisa a produção de prefenato a partir de corismato, e também a subsequente desidrogenação de prefenato para formar p-hidroxifenilpiruvato (p-HPP), o precursor imediato do ácido homogentísico. O p-HPP é então convertido em ácido homogentísico por hidroxifenilpiruvato disoxigenase (HPPD). Em contraste, acredita-se que as plantas não possuam atividade de prefenato desidrogenase, e em geral acredita-se que a síntese do ácido homogentísico a partir de corismato ocorre via a síntese e conversão do arogenato intermediário. Como as vias envolvidas na síntese do ácido homogentísico também são responsáveis pela formação de tirosina, quaisquer alterações nessas vias também pode resultar na alteração da síntese de tirosina e na síntese de outros aminoácidos aromáticos.Homogentisic acid is the common precursor to tocopherols and plastoquinones. It has been reported that in at least some bacteria the synthesis of homogentisic acid occurs via the conversion of chorismate to prefenate and then to p-hydroxyphenylpyruvate via a bifunctional prefenate dehydrogenase. Examples of bifunctional bacterial prefenate dehydrogenase type enzymes include proteins encoded by the tyrA genes of Erwinia herbicola and Escherichia coli. The tyrA gene product catalyzes the production of prephenate from the chorismate, and also the subsequent dehydrogenation of prephenate to form p-hydroxyphenylpyruvate (p-HPP), the immediate precursor to homogentisic acid. The p-HPP is then converted to homogeneous acid by hydroxyphenylpyruvate disoxygenase (HPPD). In contrast, it is believed that the plants do not have prefenate dehydrogenase activity, and in general it is believed that the synthesis of homogentisic acid from corismate occurs via the synthesis and conversion of the intermediate arogenate. As the pathways involved in the synthesis of homogentisic acid are also responsible for the formation of tyrosine, any changes in these pathways can also result in the alteration of tyrosine synthesis and the synthesis of other aromatic amino acids.

Síntese do fitilpirofosfatoPhytylpyrophosphate synthesis

Tocoferóis são membros da classe de compostos referidos como isoprenóides. Outros isoprenóides incluem carotenoides, giberelinas, terpenos, clorofila e ácido abscísico. Um intermediário central na produção de isoprenóides é o difosfato de isopentenila (IPP). Já foram relatadas vias baseadas em citoplasma e plastídio para gerar IPP. A via baseada em citoplasma envolve as enzimas acetoacetila CoA tiolase, HMGCoA sintase, HMGCoA redutase, mevalonato cinase, fosfomevalonato cinase e mevalonato pirofosfato descarboxilase.Tocopherols are members of the class of compounds referred to as isoprenoids. Other isoprenoids include carotenoids, gibberellins, terpenes, chlorophyll and abscisic acid. A central intermediary in the production of isoprenoids is isopentenyl diphosphate (IPP). Pathways based on cytoplasm and plastid to generate IPP have been reported. The cytoplasm-based pathway involves the enzymes acetoacetyl CoA thiolase, HMGCoA synthase, HMGCoA reductase, mevalonate kinase, phosphomevalonate kinase and mevalonate pyrophosphate decarboxylase.

Recentemente, evidências de uma via da biossintética de isoprenóide alternativa baseada em plastídio surgiram de estudos nos grupos de pesquisa de Rohmer e Arigoni (Eisenreich et al., Chem. Bio., 5: R221R233 (1998); Rohmer, Prog. Drug. Res., 50: 135-154 (1998); Rohmer, Com5Recently, evidence of an alternative plastid-based isoprenoid biosynthetic pathway has emerged from studies in the research groups of Rohmer and Arigoni (Eisenreich et al., Chem. Bio., 5: R221R233 (1998); Rohmer, Prog. Drug. Res. ., 50: 135-154 (1998); Rohmer, Com5

prehensive Natural Products Chemistry, vol. 2, págs. 45-68, Barton e Nakanishi (eds.), Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)), que perceberam que os padrões de marcação com isótopos observados em estudos de certos terpenóides eubacterianos e de plantas não podiam ser explicados em termos da via do mevalonato. Arigoni e colaboradores posteriormente mostraram que a 1-desoxixilulose, ou um derivado da mesma, serve como intermediário da nova via, agora referida via da MEP (Rohmer et al., Biochem. J., 295: 517-524 (1993); Schwarz, tese de Ph.D., Eudgenõssiche Technische Hochschule, Zurique, Suíça (1994)). Estudos recentes mostraram a formação de 1-desoxixilulose 5-fosfato (Broers, tese de Ph.D. (Eudgenõssiche Technische Hochschule, Zurique, Suíça) (1994)) a partir de cada uma molécula de gliceraldeido 3-fosfato (Rohmer, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 2, págs. 45-68, Barton e Nakanishi, eds., Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)) e de piruvato (Eisenreich et al., Chem. Biol., 5: R223-R233 (1998); Schwarz supra; Rohmer et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 2564-2566 (1996); e Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 1285712862 (1997)) por uma enzima codificada pelo gene dxs (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 2105-2110 (1997); e Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 2100-2104 (1998)). O 1-desoxixilulose 5-fosfato pode ser ainda convertido em 2-C-metileritritol 4-fosfato (Arigoni et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 10600-10605 (1997)) por uma redutoisomerase catalisada pelo gene dxr (Bouvier et al., Plant Physiol., 117: 1421-1431 (1998); e Rohdich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96: 11758-11763 (1999)).prehensive Natural Products Chemistry, vol. 2, pgs. 45-68, Barton and Nakanishi (eds.), Pergamon Press, Oxford, England (1999)), who realized that the isotope labeling patterns observed in studies of certain eubacterial and plant terpenoids could not be explained in terms of the pathway of mevalonate. Arigoni and colleagues later showed that 1-deoxyxylulose, or a derivative thereof, serves as an intermediary for the new pathway, now referred to as MEP pathway (Rohmer et al., Biochem. J., 295: 517-524 (1993); Schwarz , Ph.D. thesis, Eudgenõssiche Technische Hochschule, Zurich, Switzerland (1994)). Recent studies have shown the formation of 1-deoxyxylulose 5-phosphate (Broers, Ph.D. thesis (Eudgenõssiche Technische Hochschule, Zurich, Switzerland) (1994)) from each molecule of glyceraldehyde 3-phosphate (Rohmer, Comprehensive Natural Products Chemistry, vol. 2, pp. 45-68, Barton and Nakanishi, eds., Pergamon Press, Oxford, England (1999)) and pyruvate (Eisenreich et al., Chem. Biol., 5: R223-R233 ( 1998); Schwarz supra; Rohmer et al., J. Am. Chem. Soc., 118: 2564-2566 (1996); and Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 1285712862 (1997 )) by an enzyme encoded by the dxs gene (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2105-2110 (1997); and Lange et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2100-2104 (1998)). The 1-deoxyxylulose 5-phosphate can be further converted to 2-C-methyl-4-phosphate (Arigoni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10600-10605 (1997)) by a redutoisomerase catalyzed by dxr gene (Bouvier et al., Plant Physiol., 117: 1421-1431 (1998); and Rohdich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11758-11763 (1999)).

Os genes relatados na via da MEP também incluem ygbP, que catalisa a conversão de 2-C-metileritritol 4-fosfato em seu respectivo derivado citidil pirofosfato e ygbB, que catalisa a conversão de 4-fosfocitidil-2Cmetil-D-eritritol em 2C-metil-D-eritritol-3,4-ciclofosfato. Esses genes estão firmemente ligados no genoma de E. coli (Herz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97(6):2485-2490 (2000)).Genes reported in the MEP pathway also include ygbP, which catalyzes the conversion of 2-C-metileritritol 4-phosphate to its respective cytidyl pyrophosphate derivative and ygbB, which catalyzes the conversion of 4-phosphocitidyl-2Cmethyl-D-erythritol to 2C- methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphate. These genes are tightly linked in the E. coli genome (Herz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (6): 2485-2490 (2000)).

Depois de o IPP ser formado pela via da MEP, ele é convertido em GGDP pela GGDP sintase e em seguida em fitilpirofosfato, que é o constituinte central da cadeia lateral do tocoferol.After IPP is formed via the MEP pathway, it is converted into GGDP by GGDP synthase and then into phytylpyrophosphate, which is the central constituent of the side chain of tocopherol.

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Combinação e ciclizacãoCombination and cycling

O ácido homogentísico é combinado com fitilpirofosfato ou solanilpirofosfato por fitil/prenil transferase formando 2-metil-6-fitil pia toquinol ou 2-metil-6-solanil plastoquinol, respectivamente. O 2-metil-6-solanil plas5 toquinol é um precursor para a biossíntese de plastoquinonas, ao passo que o 2-metil-6-fitil plastoquinol é finalmente convertido em tocoferol.Homogeneous acid is combined with phytylpyrophosphate or solanylpyrophosphate by phylyl / prenyl transferase to form 2-methyl-6-phylylphoquinol or 2-methyl-6-solanyl plastoquinol, respectively. 2-methyl-6-solanyl plas5 toquinol is a precursor for the biosynthesis of plastoquinones, while 2-methyl-6-phylyl plastoquinol is finally converted to tocopherol.

Metilação do anel aromáticoAromatic ring methylation

A principal diferença estrutural entre cada um dos subtipos de tocoferol é a posição dos grupos metila em torno do anel fenila. Tanto o 210 metil-6-fitil plastoquinol quanto o 2-metil-6-solanil plastoquinol servem de substratos para a 2-metil-6-fitilplastoquinol/2-metil-6-solanilplastoquinol-9metiltransferase (metila transferase 1 ou MT1), que catalisa a formação de plastoquinol-9 e γ-tocoferol, respectivamente, por metilação da posição 7. Subseqüente metilação na posição 5 do γ-tocoferol pela γ-metil-transferase gera o α-tocoferol biologicamente ativo. A tocoferol metil transferase 2 (TMT2) apresenta atividade semelhante à da MT 1.The main structural difference between each of the tocopherol subtypes is the position of the methyl groups around the phenyl ring. Both 210 methyl-6-fityl plastoquinol and 2-methyl-6-solanyl plastoquinol serve as substrates for 2-methyl-6-fitylplastoquinol / 2-methyl-6-solanylplastoquinol-9 methyltransferase (methyl transferase 1 or MT1), which catalyzes the formation of plastoquinol-9 and γ-tocopherol, respectively, by methylation of position 7. Subsequent methylation in position 5 of γ-tocopherol by γ-methyl transferase generates biologically active α-tocopherol. Tocopherol methyl transferase 2 (TMT2) has activity similar to that of MT 1.

São necessárias na técnica moléculas de ácido nucléico codificando enzimas envolvidas na biossíntese do tocoferol, assim como enzimas e anticorpos relacionados para melhorar ou alterar a produção de tocoferol em plantas. São ainda necessários organismos transgênicos expressando as moléculas de ácido nucléico envolvidas na biossíntese do tocoferol, que sejam capazes de melhorar em termos nutricionais os alimentos ou suas fontes.Nucleic acid molecules encoding enzymes involved in tocopherol biosynthesis, as well as related enzymes and antibodies are needed in the art to improve or alter the production of tocopherol in plants. Transgenic organisms expressing the nucleic acid molecules involved in tocopherol biosynthesis are also needed, which are capable of nutritionally improving food or its sources.

ID do gene Gene ID Nome da enzima Enzyme name tyrA tyrA prefanato desidrogenase prefanate dehydrogenase slr1736 slr1736 fitilprenil transferase de Synechocystis Synechocystis fitylprenyl transferase ATPT2 ATPT2 fitiIprenil transferase de Arabidopsis thaliana fitiIprenyl transferase from Arabidopsis thaliana DXS DXS 1 -desoxixílulose-5-fosfato sintase 1 -deoxyxylulose-5-phosphate synthase DXR DXR 1 -desoxixilulose-5-fosfato redutoisomerase 1 -deoxyxylulose-5-phosphate reductisomerase GGPPS GGPPS geranilgeranil pirofosfato sintase geranylgeranyl pyrophosphate synthase HPPD HPPD p-hidroxifenilpiruvato disoxigenase p-hydroxyphenylpyruvate disoxygenase AANT1 AANT1 transportador de adenilato adenylate carrier

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slr1737 slr1737 tocoferol ciclase tocopherol cyclase IDI RDI isopentenil difosfato isomerase isopentenyl diphosphate isomerase GGH GGH geranilgeranil redutase geranylgeranyl reductase MT1 MT1 metil transferase 1 methyl transferase 1 tMT2 tMT2 tocoferol metil transferase 2 tocopherol methyl transferase 2 GMT GMT gama metil transferase gamma methyl transferase

Como aqui usado, homogentisato fitil transferase (HPT), fitilprenil transferase (PPT), slr1736 e ATPT2 cada um refere-se a proteínas ou genes codificando proteínas que possuem a mesma atividade enzimática.As used herein, fityl transferase homogentisate (HPT), fitylprenyl transferase (PPT), slr1736 and ATPT2 each refer to proteins or genes encoding proteins that have the same enzyme activity.

Sumário da InvençãoSummary of the Invention

A presente invenção inclui e fornece uma molécula de ácido nucléico purificada substancialmente compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) um região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico heteróloga que codifica uma enzima com ativi10 dades de corismato mutase e de prefenato desidrogenase ou um fragmento da mesma de pelo menos 20 aminoácidos adjacentes da referida enzima.The present invention includes and provides a substantially purified nucleic acid molecule comprising as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) a heterologous nucleic acid molecule encoding an enzyme with corismate mutase and prefenate dehydrogenase activities or a fragment thereof of at least 20 adjacent amino acids of said enzyme.

A presente invenção inclui e fornece uma molécula de ácido nucléico substancialmente purificada compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) um região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico heteróloga que codifica uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N⁹: 2, SEQ ID N⁹: 4 e fragmentos das mesmas de pelo menos 20 aminoácidos adjacentes.The present invention includes and provides a substantially purified nucleic acid molecule comprising as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) a heterologous nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID N ⁹ : 2, SEQ ID N ⁹ : 4 and fragments thereof from at least 20 adjacent amino acids.

A presente invenção inclui e fornece uma molécula de ácido nu20 cléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) um região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico heteróloga com um filamento transcrito e um filamento não transcrito, onde o referido filamento transcrito é complementar a uma molécula de ácido nu25 cléico codificando uma proteína com atividades de corismato mutase e deThe present invention includes and provides a molecule of nu20 cléico acid comprising as operably linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) a heterologous nucleic acid molecule with a transcribed strand and a non-transcribed strand, where said transcribed strand is complementary to a clonic nu25 acid molecule encoding a protein with corismate mutase and

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• · • 99 9 • 9 ··· prefenato desidrogenase.• · • 99 9 • 9 ··· prephenate dehydrogenase.

A presente invenção inclui e fornece uma molécula de ácido nucléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) um região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico heteróloga com um filamento transcrito e um filamento não transcrito, onde o referido filamento transcrito é complementar a uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 2 e 4.The present invention includes and provides a nucleic acid molecule comprising as operably linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) a heterologous nucleic acid molecule with a transcribed strand and a non-transcribed strand, where said transcribed strand is complementary to a nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: ^s : 2 and 4.

A presente invenção inclui e fornece uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico que compreende como componentes operacionalmente ligados: (A) um região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico exógena codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 2 e 4 ou fragmentos das mesmas codificando pelo menos 20 aminoácidos adjacentes, e (C) uma seqüência não-traduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA.The present invention includes and provides a transformed plant having a nucleic acid molecule comprising as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) an exogenous nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 2 and 4 or fragments thereof encoding at least 20 amino acids adjacent, and (C) a non - sequence -translated 3 'which functions in said plant cell to cause transcription to end and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3' end of the mRNA molecule.

A presente invenção inclui e fornece uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) um região promotora exógena que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; que está ligada a (B) uma molécula de ácido nucléico transcrita com um filamento transcrito e um filamento não transcrito, onde o referido filamento transcrito é complementar a uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N²: 2, SEQ ID N²: 4 e fragmentos das mesmas compreendendo pelo menos 20 aminoácidos adjacentes.The present invention includes and provides a transformed plant having a nucleic acid molecule comprising as operationally linked components: (A) an exogenous promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; which is linked to (B) a nucleic acid molecule transcribed with a transcribed strand and a non-transcribed strand, where said transcribed strand is complementary to a nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO ² : 2, SEQ ID NO ² : 4 and fragments thereof comprising at least 20 adjacent amino acids.

A presente invenção inclui e fornece um método de produção de uma planta tendo níveis aumentados de tocoferol compreendendo: (A) • · transformar a referida planta com uma molécula de ácido nucléico, onde a referida molécula de ácido nucléico compreende uma região promotora, onde a referida região promotora está ligada a uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 2 e 4; e desenvolver a referida planta.The present invention includes and provides a method of producing a plant having increased levels of tocopherol comprising: (A) • · transforming said plant with a nucleic acid molecule, where said nucleic acid molecule comprises a promoter region, where the said promoter region is linked to a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. ^s : 2 and 4; and develop said plant.

A presente invenção inclui e fornece um método para reduzir os níveis de tocoferol em uma planta compreendendo: (A) transformar a referida planta com uma molécula de ácido nucléico, onde a referida molécula de ácido nucléico compreende como componentes operacionalmente ligados uma região promotora exógena que funciona nas células de plantas para provocar a produção de uma molécula de mRNA, uma molécula de ácido nucléico transcrita tendo um filamento transcrito e um filamento não transcrito, onde o referido filamento transcrito é complementar a uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 1 e 3; e onde a referida molécula de ácido nucléico transcrita está ligada a uma seqüência não-traduzida 3’ que funciona nas células de plantas para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da seqüência de mRNA; e (B) desenvolver a referida planta transformada.The present invention includes and provides a method for reducing the levels of tocopherol in a plant comprising: (A) transforming said plant with a nucleic acid molecule, where said nucleic acid molecule comprises as operationally linked components an exogenous promoter region that works in plant cells to cause the production of a mRNA molecule, a transcribed nucleic acid molecule having a transcribed filament and an untranscribed filament, where said transcribed filament is complementary to a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. ^s : 1 and 3; and where said transcribed nucleic acid molecule is linked to a 3 'untranslated sequence that functions in plant cells to cause transcription to end and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3' end of the mRNA sequence; and (B) develop said transformed plant.

A presente invenção inclui e fornece um método para rastrear níveis aumentados de tocoferol em uma planta compreendendo interrogar o DNA genômico quanto à presença ou ausência de uma molécula marcadora que hibridiza especificamente para uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas; e detectar a referida presença ou ausência do referido marcador.The present invention includes and provides a method for screening increased levels of tocopherol in a plant comprising interrogating genomic DNA for the presence or absence of a marker molecule that hybridizes specifically to a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence selected from the group that consists of SEQ ID No. ^s : 1 and 3 and their complements; and detecting said presence or absence of said marker.

A presente invenção inclui e fornece um método para determinar um polimorfismo genômico em uma planta que é indicativo de um nível aumentado de tocoferol compreendendo as etapas de: (A) incubar uma molécula de ácido nucléico marcadora e uma molécula de ácido nucléico complementar obtida da referida planta em condições que permitem a hibridiza-The present invention includes and provides a method for determining a genomic polymorphism in a plant that is indicative of an increased level of tocopherol comprising the steps of: (A) incubating a marker nucleic acid molecule and a complementary nucleic acid molecule obtained therefrom. plant in conditions that allow hybridization

• · · · · ·······» * · · · · · · • · · · · · · • · · · · φ • · ·· * · »· ção do ácido nucléico, onde a referida molécula de ácido nucléico marcadora hibridiza especificamente para uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas; (B) permitir a hibridização entre a referida molécula de ácido nucléico marcadora e a referida molécula de ácido nucléico complementar obtida da referida planta; e (C) detectar a presença do referido polimorfismo.• · · · · ······· »* · · · · · · · · · · · · · · · · φ • · ·· * ·» · nucleic acid, where the said molecule marker nucleic acid specifically hybridizes to a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and complements thereof; (B) allowing hybridization between said marker nucleic acid molecule and said complementary nucleic acid molecule obtained from said plant; and (C) detecting the presence of said polymorphism.

A presente invenção inclui e fornece um método para determinar um nível ou padrão de expressão de uma proteína em uma célula de planta ou tecido de planta compreendendo; (A) incubar em condições que permitam a hibridização de ácidos nucléicos: uma molécula de ácido nucléico marcadora, a referida molécula de ácido nucléico marcadora tendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada de SEQ ID N⁹: 1 e SEQ ID N⁹: 3, complementos ou fragmentos das mesmas compreendendo pelo menos cerca de 20 nucleotídeos das referidas seqüências, com uma molécula de ácido nucléico complementar obtida de uma célula de planta ou tecido de planta, (b) permitir a hibridização entre a referida molécula de ácido nucléico marcadora e a referida molécula de ácido nucléico complementar obtida da referida célula de planta ou tecido de planta: e (C) detectar o referido nível ou padrão do referido ácido nucléico complementar, onde a detecção do referido ácido nucléico complementar é indicativa do referido nível ou padrão da referida expressão da referida proteína.The present invention includes and provides a method for determining a level or pattern of expression of a protein in a plant cell or plant tissue comprising; (A) incubate in conditions that allow hybridization of nucleic acids: a marker nucleic acid molecule, said marker nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence selected from SEQ ID N ⁹ : 1 and SEQ ID N ⁹ : 3, complements or fragments thereof comprising at least about 20 nucleotides of said sequences, with a complementary nucleic acid molecule obtained from a plant cell or plant tissue, (b) allow hybridization between said marker nucleic acid molecule and the said complementary nucleic acid molecule obtained from said plant cell or plant tissue: and (C) detecting said level or pattern of said complementary nucleic acid, where the detection of said complementary nucleic acid is indicative of said level or pattern of said expression of said protein.

A presente invenção inclui e fornece um método para determinar um nível ou padrão de expressão de uma proteína em uma célula de planta ou tecido de planta sendo avaliado, compreendendo: analisar uma concentração de uma molécula indicadora na referida célula de planta ou tecido de planta sendo avaliado, onde a referida concentração da referida molécula indicadora é dependente da expressão de um gene, e onde o referido gene hibridiza especificamente para uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas; e comparar a referida concentração da referida molécula indicadora com concentrações conhecidas daThe present invention includes and provides a method for determining a level or pattern of expression of a protein in a plant cell or plant tissue being evaluated, comprising: analyzing a concentration of an indicator molecule in said plant cell or plant tissue being rated, wherein said concentration of said indicator molecule is dependent on the expression of a gene, and wherein said hybridizing gene specifically to a nucleic acid molecule having a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and their complements; and comparing said concentration of said indicator molecule with known concentrations of

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• · • · • · · · • · ♦ • · · • · · ··· · • · ··· referida molécula indicadora que ocorrem em células de plantas ou tecidos de plantas com níveis ou padrões conhecidos de expressão da referida proteína.• · · · · · · · · ··· · • · ··· said indicator molecule that occur in plant cells or plant tissues with known levels or patterns of expression of said protein.

A presente invenção inclui e fornece uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico heteróloga, onde a referida molécula de ácido nucléico heteróloga codifica uma enzima com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase ou um fragmento da referida molécula de ácido nucléico compreendendo pelo menos 20 aminoácidos adjacentes.The present invention includes and provides a cell comprising a nucleic acid molecule comprising as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) a heterologous nucleic acid molecule, wherein said heterologous nucleic acid molecule encodes an enzyme with chorismate mutase and prefenate dehydrogenase activities or a fragment of said nucleic acid molecule comprising at least 20 adjacent amino acids.

A presente invenção inclui e fornece óleo derivado de uma semente de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico que compreende como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico exógena codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 2 e 4, e (C) uma seqüência não-traduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA.The present invention includes and provides oil derived from a seed of a transformed plant having a nucleic acid molecule comprising as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule ; (B) an exogenous nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID No. ^s : 2 and 4, and (C) a 3 'untranslated sequence that functions in said cell plant to cause transcription to end and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3 'end of the mRNA molecule.

A presente invenção inclui e fornece um método para preparar tocoferóis que compreende: transformar uma planta com um ácido nucléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico exógena codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N^Q: 2 e 4, e (C) uma seqüência não-traduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA; e desenvolver a referida planta.The present invention includes and provides a method for preparing tocopherols comprising: transforming a plant with a nucleic acid comprising as operably linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) an exogenous nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID N ^Q : 2 and 4, and (C) a 3 'untranslated sequence that functions in said plant cell to cause transcription to end and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3 'end of the mRNA molecule; and develop said plant.

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A presente invenção inclui e fornece um método para preparar ácido homogentísico que compreende transformar uma planta com um ácido nucléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico exógena codificando uma proteína compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N⁹: 2 e 4, e (C) uma seqüência não-traduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA.The present invention includes and provides a method for preparing homogentisic acid which comprises transforming a plant with a nucleic acid comprising as operably linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) an exogenous nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID N ⁹ : 2 and 4, and (C) a 3 'untranslated sequence that functions in said plant cell to cause transcription to end and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3 'end of the mRNA molecule.

A presente invenção inclui e fornece um método para preparar plastoquinonas que compreende transformar uma planta com um ácido nucléico compreendendo como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico exógena codificando uma proteína ou fragmento da mesma compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N⁹: 2 e 4, e (C) uma seqüência não-traduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA.The present invention includes and provides a method for preparing plastoquinones which comprises transforming a plant with a nucleic acid comprising as operably linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) an exogenous nucleic acid molecule encoding a protein or fragment thereof comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID N ⁹ : 2 and 4, and (C) a 3 'untranslated sequence that works in said plant cell to cause transcription to end and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3 'end of the mRNA molecule.

A presente invenção inclui e fornece um estoque de alimentação compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma, onde a referida planta transformada tem uma molécula de ácido nucléico exógena compreendendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 1 e 3.The present invention includes and provides feedstock comprising a transformed plant or part thereof, wherein said transformed plant has an exogenous nucleic acid molecule comprising a selected group sequence consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3.

A presente invenção inclui e fornece uma farinha compreendendo material de planta produzido de uma planta transformada, onde a referida planta transformada contém uma molécula de ácido nucléico exógena compreendendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID N°^s: 1 e 3.The present invention includes and provides a meal comprising plant produced from a transformed plant material, wherein said transformed plant containing an exogenous nucleic acid molecule comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3.

A presente invenção inclui e fornece uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma se-The present invention includes and provides a transformed plant having an exogenous nucleic acid molecule that comprises a

qüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N⁹: 2 ou 4.nucleic acid sequence encoding a protein having an amino acid sequence of SEQ ID N ⁹ : 2 or 4.

A presente invenção inclui e fornece uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos de SEQ ID N^e: 1 ou 3.The present invention includes and provides a transformed plant having an exogenous nucleic acid molecule that comprises a nucleic acid sequence of SEQ ID N ^e : 1 or 3.

A presente invenção inclui e fornece um método para produzir uma planta tendo sementes com nível aumentado de tocoferol compreendendo: (A) transformar a referida planta com uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase; e (B) desenvolver a referida planta transformada.The present invention includes and provides a method for producing a plant having seeds with an increased level of tocopherol comprising: (A) transforming said plant with a nucleic acid molecule that encodes a protein with corismate mutase and prefenate dehydrogenase activities; and (B) develop said transformed plant.

A presente invenção inclui e fornece um método para produzir uma planta tendo sementes com nível aumentado de tocoferol compreendendo: (A) transformar a referida planta com uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de ácidos nucléico que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N^e: 2 ou 4; e (B) desenvolver a referida planta transformada.The present invention includes and provides a method for producing a plant having seeds with increased level of tocopherol comprising: (A) transforming said plant with a nucleic acid molecule that comprises a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence ^and SEQ ID NO: 2 or 4; and (B) develop said transformed plant.

A presente invenção inclui e fornece uma semente derivada de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase, onde a referida semente tem um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a seed derived from a transformed plant having an exogenous nucleic acid molecule that encodes a protein with activities of chorismate mutase and prefenate dehydrogenase, where said seed has an increased level of tocopherol compared to the seeds of a plant having a similar genetic background but without the exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece uma semente derivada de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N^Q: 2 ou 4, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a seed derived from a transformed plant having an exogenous nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence of SEQ ID N ^Q : 2 or 4, where said plant transformed has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece óleo derivado de uma semente de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e ···The present invention includes and provides oil derived from a transformed plant seed having an exogenous nucleic acid molecule that encodes a protein with corismate mutase and ··· activities

prefenato desidrogenase, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.prefenate dehydrogenase, where the aforementioned transformed plant has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece óleo derivado de uma semente de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N-: 2 ou 4, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides oil derived from a transformed plant seed having an exogenous nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence of SEQ ID N-: 2 or 4, where the said transformed plant has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece um estoque de alimentação compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma, tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a feed stock comprising a transformed plant or part of it, having an exogenous nucleic acid molecule that encodes a protein with corismate mutase and prephenate dehydrogenase activities, where said transformed plant has a seed with a level increased tocopherol compared to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece um estoque de alimentação compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma, tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N²: 2 ou 4, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a feed stock comprising a transformed plant or part of it, having an exogenous nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence of SEQ ID N ² : 2 or 4, where said transformed plant has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece um estoque de alimentação compreendendo uma planta transformada ou parte da mesma, tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol emThe present invention includes and provides a feed stock comprising a transformed plant or part of it, having an exogenous nucleic acid molecule that encodes a protein with corismate mutase and prephenate dehydrogenase activities, where said transformed plant has a seed with a level increased tocopherol in

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relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece uma farinha compreendendo material de planta produzido a partir de uma planta transformada, tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a flour comprising plant material produced from a transformed plant, having an exogenous nucleic acid molecule that encodes a protein with activities of chorismate mutase and prefenate dehydrogenase, where said transformed plant has a seed with a increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece uma farinha compreendendo material de planta produzido a partir de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N^Q: 2 ou 4, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a flour comprising plant material produced from a transformed plant having an exogenous nucleic acid molecule that comprises a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence of SEQ ID N ^Q : 2 or 4, where said transformed plant has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece uma farinha compreendendo material de planta produzido de uma planta transformada, tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica uma proteína com atividades de corismato mutase e prefenato desidrogenase, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a flour comprising plant material produced from a transformed plant, having an exogenous nucleic acid molecule that encodes a protein with activities of chorismate mutase and prefenate dehydrogenase, where said transformed plant has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

A presente invenção inclui e fornece uma farinha compreendendo material de planta produzido de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico exógena que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID N^Q: 2 ou 4, onde a referida planta transformada tem uma semente com um nível aumentado de tocoferol em relação às sementes de uma planta tendo um histórico genético semelhante porém sem a referida molécula de ácido nucléico exógena.The present invention includes and provides a flour comprising plant material produced from a transformed plant having an exogenous nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence that encodes a protein having an amino acid sequence of SEQ ID N ^Q : 2 or 4, where the aforementioned transformed plant has a seed with an increased level of tocopherol in relation to the seeds of a plant having a similar genetic history but without the said exogenous nucleic acid molecule.

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A presente invenção inclui e fornece constructo de ácido nucléico, bem como plantas e organismos contendo esses constructo, tendo combinações de dois ou mais genes envolvidos na biossíntese do tocoferol e do tocotrienol. Qualquer combinação dos seguintes genes com tyrA é preferida: slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo antisentido para ácido homogentísico disoxigenase. Em uma modalidade particularmente preferida, tyrA é combinado com HPPD e também slr1736 ou ATPT2.The present invention includes and provides a nucleic acid construct, as well as plants and organisms containing these constructs, having combinations of two or more genes involved in the tocopherol and tocotrienol biosynthesis. Any combination of the following genes with tyrA is preferred: slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, and an antisense construct for homogeneous acid dysoxygenase. In a particularly preferred embodiment, tyrA is combined with HPPD and also slr1736 or ATPT2.

Descrição das seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidosDescription of the nucleic acid and amino acid sequences

A SEQ ID N⁹: 1 representa uma seqüência de ácidos nucléicos de uma moiécuia de DNA que codifica um prefenato desidrogenase bifuncional de Erwinia herbicola.SEQ ID NO ⁹ : 1 represents a nucleic acid sequence of a DNA moiécuia that encodes a bifunctional Erwinia herbicola prefenate dehydrogenase.

A SEQ ID N⁹: 2 representa uma seqüência de aminoácidos derivada de um prefenato desidrogenase bifuncional de Erwinia herbicola.SEQ ID NO: ⁹ : 2 represents an amino acid sequence derived from a bifunctional prefenate dehydrogenase from Erwinia herbicola.

A SEQ ID N⁹: 3 representa uma seqüência de ácidos nucléicos de uma molécula de DNA que codifica um prefenato desidrogenase bifuncional de Escherichia coli.SEQ ID NO: ⁹ : 3 represents a nucleic acid sequence of a DNA molecule encoding a bifunctional Escherichia coli prefenate dehydrogenase.

A SEQ ID N⁹: 4 representa uma seqüência de aminoácidos derivada de um prefenato desidrogenase bifuncional de Escherichia coli.SEQ ID NO ⁹ : 4 represents an amino acid sequence derived from a bifunctional Escherichia coli prefenate dehydrogenase.

A SEQ ID N⁹: 5 representa um iniciador 5’ usado para amplificação de uma seqüência de tyrA de Erwinia herbicola.SEQ ID NO: ⁹ : 5 represents a 5 'primer used for amplification of an Erwinia herbicola tyrA sequence.

A SEQ ID N⁹: 6 representa um iniciador 3’ usado para amplificação de uma seqüência de tyrA de Erwinia herbicola.SEQ ID NO: ⁹ : 6 represents a 3 'primer used for amplification of an Erwinia herbicola tyrA sequence.

A SEQ ID N⁹: 7 representa um iniciador 5’ usado para amplificação de uma seqüência de tyrA de Escherichia coli.SEQ ID NO ⁹ : 7 represents a 5 'primer used for amplification of an Escherichia coli tyrA sequence.

A SEQ ID N⁹: 8 representa um iniciador 3’ usado para amplificação de uma seqüência de tyrA de Escherichia coli.SEQ ID NO: ⁹ : 8 represents a 3 'primer used for amplification of an Escherichia coli tyrA sequence.

A SEQ ID N⁹: 9 representa uma seqüência de iniciadores.SEQ ID NO ⁹ : 9 represents a sequence of primers.

A SEQ ID N⁹: 10 representa uma seqüência de iniciadores.SEQ ID NO ⁹ : 10 represents a sequence of primers.

A SEQ ID N⁹: 11 representa uma seqüência de iniciadores.SEQ ID NO ⁹ : 11 represents a sequence of primers.

A SEQ ID N⁹: 12 representa uma seqüência de iniciadores.SEQ ID NO ⁹ : 12 represents a sequence of primers.

Breve Descrição das Figuras ··· • · • · · • · · · ·· ·9· • · ·· ·Brief Description of the Figures ··· • · • · · • · · · ·· · 9 · • · ·· ·

A figura 1 é um gráfico comparando os níveis de tocoferóis totais na semente de linhagens de Arabidopsis thaliana ancorando um constructo de expressão de tyrA de Erwinia herbicola com uma seqüência alvo plastídica, uma planta selvagem, e uma planta com um controle vetorial.Figure 1 is a graph comparing the levels of total tocopherols in the seed of strains of Arabidopsis thaliana anchoring a tyrA expression construct of Erwinia herbicola with a plastid target sequence, a wild plant, and a plant with a vector control.

A figura 2 é um esquema do constructo pMON26588.Figure 2 is a schematic of the construct pMON26588.

A figura 3 é um esquema do constructo pMON26589.Figure 3 is a schematic of the construct pMON26589.

A figura 4 é um esquema do constructo pMON26591.Figure 4 is a schematic of the construct pMON26591.

A figura 5 é um esquema do constructo pMON26590.Figure 5 is a schematic of the construct pMON26590.

A figura 6 é um esquema do constructo pMON36510.Figure 6 is a schematic of the construct pMON36510.

A figura 7 é um esquema do constructo pMON36512.Figure 7 is a schematic of the pMON36512 construct.

A figura 8 é um esquema do constructo pMON36511.Figure 8 is a schematic of the pMON36511 construct.

A figura 9 é um esquema do constructo pMON36520.Figure 9 is a schematic of the pMON36520 construct.

A figura 10 é um esquema do constructo pCGN10822.Figure 10 is a schematic of the construct pCGN10822.

A figura 11 é um esquema do constructo pMON36528.Figure 11 is a schematic of the construct pMON36528.

A figura 12 é um esquema do constructo pMON69907.Figure 12 is a schematic of the construct pMON69907.

A figura 13 é um esquema do constructo pMON69909.Figure 13 is a schematic of the construct pMON69909.

A figura 14 representa o teor de tocoferóis e tocotrienóis totais de sementes de Arabidopsis de plantas selvagens e várias linhagens de plantas transformadas com o vetor de plasmídeo pMON69907.Figure 14 represents the content of tocopherols and total tocotrienols of Arabidopsis seeds from wild plants and several plant strains transformed with the plasmid vector pMON69907.

A figura 15 representa o teor de tocoferóis totais de sementes de Arabidopsis de plantas selvagens e várias linhagens de plantas transformadas com o vetor de plasmídeo pMON69907Figure 15 represents the total tocopherol content of Arabidopsis seeds from wild plants and several plant strains transformed with the plasmid vector pMON69907

A figura 16 representa o teor de tocoferóis e tocotrienóis totais de sementes de Arabidopsis thaliana de plantas selvagens e várias linhagens de plantas separadamente transformadas com os vetores de plasmídeo pCGN10822, pMON36528, pMON69907 e pMON69909.Figure 16 represents the content of tocopherols and total tocotrienols of Arabidopsis thaliana seeds from wild plants and several plant strains separately transformed with the plasmid vectors pCGN10822, pMON36528, pMON69907 and pMON69909.

A figura 17 representa uma análise detalhada do teor de tocoferol e de tocotrienol de sementes de Arabidopsis de linhagens de plantas transformadas com o vetor pMON69909 em relação a sementes de planta selvagens.Figure 17 represents a detailed analysis of the tocopherol and tocotrienol content of Arabidopsis seeds from plant lines transformed with the vector pMON69909 in relation to wild plant seeds.

As figuras 18a e 18b mostram constructos exemplificativos para transformação em plantas.Figures 18a and 18b show exemplary constructs for transformation into plants.

A figura 19 é um constructo esquemático de pMON36582.Figure 19 is a schematic construct of pMON36582.

A figura 20 é um exemplo de um vetor de transporte (pMON36586) ancorando um cassete de expressão da homogentisato fitiltransferase (HPT) de Arabidopsis como um cassete Bsp120 l/Not I. O promotor para napina e o terminador para napina são fundidos às extremidades 5’ e 3’, respectivamente, para induzir expressão específica para semente.Figure 20 is an example of a transport vector (pMON36586) anchoring an Arabidopsis homogentisate phytyltransferase (HPT) expression cassette as a Bsp120 l / Not I cassette. The napine promoter and the napine terminator are fused to the ends 5 'and 3', respectively, to induce specific expression for seed.

A figura 21 representa vários cassetes de expressão de gene mostrados em um vetor de transporte (A) ou em um vetor binário (B).Figure 21 represents several gene expression cassettes shown in a transport vector (A) or in a binary vector (B).

A figura 22 é um esquema do constructo pMON36596.Figure 22 is a schematic of the construct pMON36596.

A figura 23 é um esquema do constructo pMON36597.Figure 23 is a schematic of the construct pMON36597.

A figura 24 é um esquema do constructo pMON77601.Figure 24 is a schematic of the construct pMON77601.

A figura 25 é um esquema do constructo pMON77602.Figure 25 is a schematic of the construct pMON77602.

A figura 26 é um esquema do constructo pMON66657.Figure 26 is a schematic of the construct pMON66657.

A figura 27 é um esquema do constructo pMON66659.Figure 27 is a schematic of the construct pMON66659.

A figura 28 é um esquema do constructo pMON26541.Figure 28 is a schematic of the construct pMON26541.

A figura 29 é um esquema do constructo pMON26543.Figure 29 is a schematic of the construct pMON26543.

A figura 30 é um esquema do constructo pMON36176.Figure 30 is a schematic of the construct pMON36176.

A figura 31 é um gráfico padrão de LC/MS.Figure 31 is a standard LC / MS graph.

A figura 32 é um gráfico de LC/MS.Figure 32 is a graph of LC / MS.

A figura 33 é um cromatográfico de HPLC.Figure 33 is an HPLC chromatograph.

A figura 34 mostra um cromatográfico de HPLC.Figure 34 shows an HPLC chromatograph.

A figura 35 é um esquema do constructo pMON69915.Figure 35 is a schematic of the construct pMON69915.

A figura 36 é um esquema do constructo pMON69919.Figure 36 is a schematic of the construct pMON69919.

A figura 37 é um esquema do constructo pMON10098.Figure 37 is a schematic of the construct pMON10098.

A figura 38 é um esquema do constructo pMON36520.Figure 38 is a schematic of the pMON36520 construct.

A figura 39 é um esquema do constructo pMON43853.Figure 39 is a schematic of the construct pMON43853.

A figura 40 é um esquema do constructo pMON36525.Figure 40 is a schematic of the pMON36525 construct.

A figura 41 é um esquema do constructo pMON43861.Figure 41 is a schematic of the construct pMON43861.

A figura 42 é um esquema do constructo pCGN7770.Fig. 42 is a schematic of the construct pCGN7770.

A figura 43 é um esquema do constructo pMON69911.Figure 43 is a schematic of the construct pMON69911.

A figura 44 é um esquema do constructo pCGN11301.Figure 44 is a schematic of the construct pCGN11301.

A figura 45 é um esquema do constructo pCGN3223.Fig. 45 is a schematic of the construct pCGN3223.

A figura 46 é um esquema do constructo pMON36575.Figure 46 is a schematic of the pMON36575 construct.

A figura 47 é um esquema do constructo pMON38207R.Figure 47 is a schematic of the construct pMON38207R.

A figura 48 é um esquema do constructo pMON36571.Figure 48 is a schematic of the pMON36571 construct.

A figura 49 é um esquema do constructo pMON36576.Figure 49 is a schematic of the construct pMON36576.

A figura 50 é um esquema do constructo pMON69924.Figure 50 is a schematic of the construct pMON69924.

A figura 51 é um esquema do constructo pMON69943.Figure 51 is a schematic of the construct pMON69943.

A figura 52 é um esquema do constructo pMON69929.Figure 52 is a schematic of the construct pMON69929.

A figura 53 é um esquema do constructo pMON69936.Figure 53 is a schematic of the construct pMON69936.

A figura 54 é um esquema do constructo pMON36592.Figure 54 is a schematic of the construct pMON36592.

A figura 55 é um esquema do constructo pMON69945.Figure 55 is a schematic of the construct pMON69945.

A figura 56 é um esquema do constructo pMON16602.Figure 56 is a schematic of the construct pMON16602.

A figura 57 é um esquema do constructo pMON36525.Figure 57 is a schematic of the pMON36525 construct.

A figura 58 é um esquema do constructo pMON58171.Figure 58 is a schematic of the construct pMON58171.

A figura 59 é um esquema do constructo pMON58172.Fig. 59 is a schematic of the construct pMON58172.

A figura 60 é um esquema do constructo pMON58170.Fig. 60 is a schematic of the construct pMON58170.

A figura 61 é um esquema do constructo pMON36591.Fig. 61 is a schematic of the construct pMON36591.

A figura 62 é um esquema do constructo pMON36588.Fig. 62 is a schematic of the pMON36588 construct.

A figura 63 é um esquema do constructo pMON36592.Figure 63 is a schematic of the construct pMON36592.

A figura 64 é um esquema do constructo pMON58182.Figure 64 is a schematic of the construct pMON58182.

A figura 65 é um esquema do constructo pMON58176.Fig. 65 is a schematic of the construct pMON58176.

A figura 66 é um esquema do constructo pMON58183.Fig. 66 is a schematic of the construct pMON58183.

A figura 67 é um esquema do constructo pMON58185.Fig. 67 is a schematic of the construct pMON58185.

A figura 68 é um esquema do constructo pMON36593.Figure 68 is a schematic of the construct pMON36593.

A figura 69 é um esquema do constructo pMON36589.Fig. 69 is a schematic of the construct pMON36589.

A figura 70 é um esquema do constructo pMON36590.Figure 70 is a schematic of the pMON36590 construct.

A figura 71 é um esquema do constructo pMON67162.Fig. 71 is a schematic of the construct pMON67162.

A figura 72 é um esquema do constructo pMON58178.Fig. 72 is a schematic of the construct pMON58178.

A figura 73 é um esquema do constructo pMON58186.Figure 73 is a schematic of the construct pMON58186.

A figura 74 é um esquema do constructo pMON58188.Figure 74 is a schematic of the construct pMON58188.

A figura 75 mostra níveis de tocoferóis e tocotrienóis bem como de HGA em linhagens selecionadas.Figure 75 shows levels of tocopherols and tocotrienols as well as HGA in selected strains.

A figura 76 mostra níveis de tocotrienóis e 2M6PPQ em linha20 • · · gens selecionadas.Figure 76 shows levels of tocotrienols and 2M6PPQ in line20 • · · selected genes.

Descrição DetalhadaDetailed Description

Qualquer das moléculas de ácido nucléico descritas neste relatório pode ser aumentada ou superexpressa em uma variedade de organismos, tais como plantas, o que pode resultar em níveis mais altos de precursores de tocoferol tal como o ácido homogentísico (HGA) e finalmente em níveis aumentados de tocoferóis em tais organismos. Além disso, a expressão aumentada ou superexpressão de proteínas aqui representada também pode resultar na produção de níveis aumentados de plastoquinonas. Ademais, a presente invenção fornece inúmeros agentes, por exemplo, moléculas de ácido nucléico e proteínas associadas com a produção de tocoferóis, e fornece formas de uso de tais agentes.Any of the nucleic acid molecules described in this report can be increased or overexpressed in a variety of organisms, such as plants, which can result in higher levels of tocopherol precursors such as homogentisic acid (HGA) and ultimately increased levels of tocopherols in such organisms. In addition, the increased expression or overexpression of proteins depicted herein may also result in the production of increased levels of plastoquinones. Furthermore, the present invention provides numerous agents, for example, nucleic acid molecules and proteins associated with the production of tocopherols, and provides ways of using such agents.

A presente invenção inclui e fornece constructos de ácido nucléico para expressão de prefenato desidrogenases bifuncionais em organismos onde é desejável produzir um maior rendimento de ácido homogentísico, plastoquinonas ou tocoferóis. Estes constructos de ácido nucléico podem ser usadas em organismos em que é desejável um nível aumentado de atividade de prefenato desidrogenase. A invenção também inclui e fornece constructos de ácido nucléico para a expressão de fitil preniltransferases em organismos em que é desejável produzir um maior rendimento de plastoquinonas ou tocoferóis, e o uso de constructos que produzem ácidos nucléicos anti-sentido contra fitil preniltransferases em organismos em que é desejável produzir um maior rendimento de ácido homogentísico.The present invention includes and provides nucleic acid constructs for expression of bifunctional prefenate dehydrogenases in organisms where it is desirable to produce a higher yield of homogentisic acid, plastoquinones or tocopherols. These nucleic acid constructs can be used in organisms where an increased level of prefenate dehydrogenase activity is desirable. The invention also includes and provides nucleic acid constructs for the expression of phytyl prenyltransferases in organisms where it is desirable to produce a higher yield of plastoquinones or tocopherols, and the use of constructs that produce antisense nucleic acids against phenyl prenyltransferases in organisms in which it is desirable to produce a higher yield of homogeneous acid.

AgentesAgents

Os agentes da invenção de preferência vão ser biologicamente ativos em relação a um outro atributo estrutural, tal como a capacidade de um ácido nucléico para hibridizar para outra molécula de ácido nucléico ou a capacidade de uma proteína de ser ligada por um anticorpo (ou para competir com uma outra molécula por tal ligação). Alternativamente, tal atributo pode ser catalítico e dessa forma envolver a capacidade do agente para mediar uma reação química ou resposta. Os agentes serão de preferência substancialmente purificados. A expressão substancialmente purificado,The agents of the invention will preferably be biologically active with respect to another structural attribute, such as the ability of a nucleic acid to hybridize to another nucleic acid molecule or the ability of a protein to be bound by an antibody (or to compete with another molecule by such a bond). Alternatively, such an attribute can be catalytic and thus involve the agent's ability to mediate a chemical reaction or response. Preferably the agents will be substantially purified. The expression substantially purified,

conforme aqui usado, refere-se a uma molécula separada de substancialmente todas as outras moléculas normalmente associadas com ela em seu estado nativo. Mais preferivelmente uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada deve estar mais de 60% livre, de preferência 75% livre, mais preferivelmente 90% livre, e ainda mais preferivelmente 95% livre das outras moléculas (exclusive de solvente) presentes na mistura natural. A expressão substancialmente purificado não abranger moléculas presentes em seu estado nativo.as used herein, refers to a molecule separate from substantially all other molecules normally associated with it in its native state. Most preferably a substantially purified molecule is the predominant species present in a preparation. A substantially purified molecule must be more than 60% free, preferably 75% free, more preferably 90% free, and even more preferably 95% free of the other molecules (excluding solvent) present in the natural mixture. The substantially purified expression does not cover molecules present in its native state.

Os agentes da invenção também podem ser recombinantes. Como aqui usado, o termo recombinante significa qualquer agente (por exemplo, DNA, peptídio etc.), isto é, ou resultados, ainda que indiretamente, da manipulação humana de uma molécula de ácido nucléico.The agents of the invention can also be recombinant. As used herein, the term recombinant means any agent (e.g., DNA, peptide, etc.), that is, or results, albeit indirectly, from human manipulation of a nucleic acid molecule.

Fica entendido que os agentes da invenção podem ser marcados com reagentes que facilitem a detecção do agente (por exemplo, marcadores fluorescentes, Prober et al., Science 238: 336-340 (1987); Albarella et al., EP 144914; marcadores químicos, Sheldon et al., Patente U.S. 4.582.789; Albarella et al., Patente U.S. 4.563.417; bases modificadas, Miyoshi et al., EP 119448).It is understood that the agents of the invention can be labeled with reagents that facilitate detection of the agent (e.g., fluorescent labels, Prober et al., Science 238: 336-340 (1987); Albarella et al., EP 144914; chemical labels , Sheldon et al., US Patent 4,582,789; Albarella et al., US Patent 4,563,417; modified bases, Miyoshi et al., EP 119448).

Moléculas de ácido nucléicoNucleic acid molecules

Os agentes da invenção incluem moléculas de ácido nucléico que codificam um prefenato desidrogenase bifuncional, tendo atividades de corismato mutase e de prefenato desidrogenase. Em um aspecto preferido da presente invenção, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um homólogo bacteriano de um prefenato desidrogenase bifuncional. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nucléicos tendo a SEQ ID N^Q: 1 ou 3. Em uma outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico é um fragmento de qualquer seqüência de ácidos nucléicos aqui descrita codificando uma seqüência de aminoácidos com atividade de prefenato desidrogenase.The agents of the invention include nucleic acid molecules that encode a bifunctional prefenate dehydrogenase, having chorismate mutase and prefenate dehydrogenase activities. In a preferred aspect of the present invention, the nucleic acid molecule comprises a sequence of nucleic acids that encodes a bacterial homologue of a bifunctional prefenate dehydrogenase. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule comprises a sequence of nucleic acids having SEQ ID N ^Q : 1 or 3. In another preferred embodiment, the nucleic acid molecule is a fragment of any nucleic acid sequence described herein encoding a sequence of amino acids with prefenate dehydrogenase activity.

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Em um outro aspecto preferido da presente invenção a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas e fragmentos de qualquer uma delas. Em um outro aspecto da presente invenção a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de ácidos nucléicos codificando uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 2 e 4 e fragmentos das mesmas.In another preferred aspect of the present invention , the nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3, complements thereof and fragments of either. In another aspect of the present invention , the nucleic acid molecule comprises a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 2 and 4 and fragments thereof.

Em um outro aspecto preferido da presente invenção, as moléculas de ácido nucléico compreendem tanto uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um prefenato desidrogenase bifuncional como um cassete de expressão para expressar fitil preniltransferase. Em um outro aspecto da presente invenção, podem ser empregadas constructos de ácido nucléico codificando separadamente um prefenato desidrogenase bifuncional e uma fitil preniltransferase.In another preferred aspect of the present invention, the nucleic acid molecules comprise both a sequence of nucleic acids encoding a bifunctional prefenate dehydrogenase and an expression cassette to express phytyl prenyl transferase. In another aspect of the present invention, nucleic acid constructs can be employed encoding separately a bifunctional prefenate dehydrogenase and a phytyl prenyl transferase.

Em um outro aspecto preferido da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico compreende seqüências de nucleotídeos codificando um peptídio de trânsito de plastídio operacional mente fundido a uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína ou fragmento da presente invenção.In another preferred aspect of the present invention, a nucleic acid molecule comprises nucleotide sequences encoding a plastid transit peptide operably fused to a nucleic acid molecule encoding a protein or fragment of the present invention.

Fica entendido que, em um outro aspecto das seqüências de ácidos nucléicos da presente invenção, os ácidos nucléicos podem codificar uma proteína que difire de qualquer das proteínas pelo fato de um ou mais aminoácidos terem sido deletados, substituídos ou adicionados sem alterar a função. Por exemplo, fica entendido que códons capazes de codificar tais substituições conservadoras de aminoácidos são conhecidos na técnica.It is understood that, in another aspect of the nucleic acid sequences of the present invention, the nucleic acids can encode a protein that differs from any of the proteins in that one or more amino acids have been deleted, replaced or added without changing function. For example, it is understood that codons capable of encoding such conservative amino acid substitutions are known in the art.

Um subconjunto das moléculas de ácido nucléico da invenção é o de moléculas de ácido nucléico fragmentadas. Moléculas de ácido nucléico fragmentadas podem consistir em porção (ões) significativa(s) das ou de fato quase toas as moléculas de ácido nucléico da invenção, tais como aquelas particularmente descritas. Alternativamente, os fragmentos podem compreender oligonucleotídeos menores (tendo cerca de 15 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo e mais preferivelmente, cerca de 15 a cerca de 30 resíduos de nucleotídeo ou cerca de 50 a cerca de 100 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 100 a cerca de 200 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 200 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 275 a cerca de 350 resíduos de nucleotídeo).A subset of the nucleic acid molecules of the invention are fragmented nucleic acid molecules. Fragmented nucleic acid molecules can consist of a significant portion (s) of, or indeed almost all, the nucleic acid molecules of the invention, such as those particularly described. Alternatively, the fragments may comprise smaller oligonucleotides (having about 15 to about 400 nucleotide residues and more preferably, about 15 to about 30 nucleotide residues or about 50 to about 100 nucleotide residues, or about 100 to about 200 nucleotide residues, or about 200 to about 400 nucleotide residues, or about 275 to about 350 nucleotide residues).

Um fragmento de uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção pode ser uma sonda e especificamente uma sonda de PCR. Uma sonda de PCR é uma molécula de ácido nucléico capaz de iniciar uma atividade de polimerase enquanto em uma estrutura de filamento duplo com um outro ácido nucléico. Existem na técnica vários métodos para determinar a estrutura de sondas de PCR e técnicas de PCR. Buscas geradas em computador usando programas tais como Primer3 (www.genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi), STSPipeline (www.genome.wi.mit.edu/cgibin/www.STSJPipeline) ou GeneUp (Pesole et al., BioTechniques 25: 112123 (1998)), por exemplo, podem ser usadas para identificar iniciadores de PCR em potencial.A fragment of one or more of the nucleic acid molecules of the invention can be a probe and specifically a PCR probe. A PCR probe is a nucleic acid molecule capable of initiating a polymerase activity while in a double-stranded structure with another nucleic acid. There are several methods in the art for determining the structure of PCR probes and PCR techniques. Computer generated searches using programs such as Primer3 (www.genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi), STSPipeline (www.genome.wi.mit.edu/cgibin/www.STSJPipeline) or GeneUp ( Pesole et al., BioTechniques 25: 112123 (1998)), for example, can be used to identify potential PCR primers.

Um outro subconjunto das moléculas de ácido nucléico da invenção inclui moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína ou fragmento da mesma.Another subset of the nucleic acid molecules of the invention includes nucleic acid molecules that encode a protein or fragment thereof.

As moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das mesmas da presente invenção são capazes de hibridizar especificamente para outras moléculas de ácido nucléico em certas circunstâncias. As moléculas de ácido nucléico da presente invenção incluem aqueles que hibridizam especificamente para moléculas de ácido nucléico com uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas. As moléculas de ácido nucléico da presente invenção também incluem aquelas que hibridizam especificamente moléculas de ácido nucléico codificando uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 2, 4, complementados das mesmas e fragmentos de qualquer uma delas.Nucleic acid molecules or fragments thereof of the present invention are able to hybridize specifically to other nucleic acid molecules under certain circumstances. The nucleic acid molecules of the present invention include those which hybridize specifically to nucleic acid molecules having a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and complements thereof. The nucleic acid molecules of the invention also include those that specifically hybridize to nucleic acid molecules encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 2, 4, complemented thereof and fragments of any of them.

Como aqui usado, diz-se que duas moléculas de ácido nucléico são capazes de hibridizar especificamente de uma para a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura antiparalela de ácido nu-As used herein, two nucleic acid molecules are said to be able to specifically hybridize to each other if the two molecules are able to form an antiparallel nucleic acid structure

cléico de filamento duplo.double-stranded clinical trial.

Diz-se que uma molécula de ácido nucléico é o complemento de uma molécula de ácido nucléico se elas apresentarem complementaridade completa. Conforme aqui usado, diz-se que as moléculas apresentam complementaridade completa quando todo nucleotídeo de uma das moléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Diz-se que duas moléculas são minimamente complementares se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam combinadas uma à outra em pelo menos condições pouco rigorosas convencionais. De maneira similar, diz-se que as moléculas são complementares se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam combinadas uma à outra em condições muito rigorosas convencionais. As condições rigorosas convencionais foram descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^â ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), e por Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Desvios da complementaridade completa são portanto permissíveis desde que tais desvios não impossibilitem totalmente a capacidade das moléculas para formar uma estrutura de filamento duplo. Assim, para que uma molécula de ácido nucléico sirva como iniciador ou sonda ela precisa ser suficientemente complementar em seqüência para poder formar uma estrutura de filamento duplo estável nas concentrações particulares empregadas de solvente e sal.A nucleic acid molecule is said to be the complement of a nucleic acid molecule if they are completely complementary. As used herein, molecules are said to have complete complementarity when every nucleotide in one molecule is complementary to a nucleotide in the other. It is said that two molecules are minimally complementary if they can hybridize to each other with sufficient stability to allow them to remain combined with each other in at least unconventionally stringent conditions. Similarly, molecules are said to be complementary if they can hybridize to each other with sufficient stability to allow them to remain combined with each other under very stringent conventional conditions. Conventional stringency conditions are described by Sambrook et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), and by Haymes et al, Nucleic Acid Hybridization..: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Deviations from full complementarity are therefore permissible as long as such deviations do not entirely impede the ability of molecules to form a double-stranded structure. Thus, for a nucleic acid molecule to serve as a primer or probe, it must be sufficiently complementary in sequence to form a stable double-stranded structure at the particular concentrations of solvent and salt employed.

Condições rigorosas apropriadas que promovem a hibridização de DNA são, por exemplo, 6.0 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido de uma lavagem de 2.0 X SSC a 20 - 25°C, e são conhecidas dos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de pouco rigorosa de cerca de 2,0 X SSC a 50°C a muito rigorosa de cerca de 0,2 X SSC a 65°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições pouco rigorosas à temperatura ambiente, ··*Appropriate stringent conditions that promote DNA hybridization are, for example, 6.0 X sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C, followed by a 2.0 X SSC wash at 20 - 25 ° C, and are known to those skilled in the art or can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1.-6.3.6. For example, the concentration of salt in the washing step can be selected from a low level of about 2.0 X SSC at 50 ° C to a very high level of about 0.2 X SSC at 65 ° C. In addition, the temperature in the washing step can be increased under mild conditions at room temperature, ·· *

cerca de 22°C, até condições muito rigorosas a cerca de 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem, ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é alterada.about 22 ° C, until very severe conditions at about 65 ° C. Both the temperature and the salt can be varied, or the temperature or the salt concentration can be kept constant while the other variable is changed.

Em uma modalidade preferida, um ácido nucléico da presente invenção vai hibridizar especificamente para uma ou mais das moléculas de ácido nucléico mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas em condições moderadamente rigorosas, por exemplo cerca de 2,0 X SSC e cerca de 65°C.In a preferred embodiment, a nucleic acid of the present invention will specifically hybridize to one or more of the nucleic acid molecules shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and complements thereof under moderately stringent conditions, for example about 2.0 X SSC and about 65 ° C.

Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléico da presente invenção vai incluir as moléculas de ácido nucléico que vão hibridizar especificamente para uma ou mais das moléculas de ácido nucléico mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas em condições muito rigorosas, tal como 0,2 X SSC e cerca de 65°C.In a particularly preferred embodiment, a nucleic acid of the present invention will include those nucleic acid molecules that will specifically hybridize to one or more of the nucleic acid molecules shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and complements thereof under conditions very rigorous, such as 0.2 X SSC and about 65 ° C.

Em um aspecto da presente invenção, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção têm uma ou mais das seqüências de ácido nucléico mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção compartilham entre 100% e 90% de identidade de seqüência com uma ou mais das seqüências de ácidos nucléicos mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas e fragmentos de qualquer uma delas. Em um outro aspecto da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção compartilham entre 100% e 95% de identidade de seqüência com uma ou mais das seqüências de ácidos nucléicos mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3, complementos das mesmas e fragmentos de qualquer uma delas. Em um aspecto mais preferido da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção compartilham entre 100% e 98% de identidade de seqüência com uma ou mais das seqüências de ácidos nucléicos mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3, complementos das mesmas e fragmentos de qualquer uma delas. Em um aspecto ainda mais preferido da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da pre26 • ········· » · • · · · · · ·· ··· · · • · * · · · · ··· ♦·« · · · · * ·· · · sente invenção compartilham entre 100% e 99% de identidade de seqüência com uma ou mais das seqüências mostradas nas SEQ ID N°^s: 1 e 3, complementos das mesmas e fragmentos de qualquer uma delas.In one aspect of the present invention, the nucleic acid molecules of the present invention have one or more of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and complements thereof. In another aspect of the present invention, one or more of the nucleic acid molecules of the invention share between 100% and 90% sequence identity to one or more of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3 and complements of them and fragments of any of them. In another aspect of the present invention, one or more of the nucleic acid molecules of the invention share between 100% and 95% sequence identity to one or more of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3 , their complements and fragments of any of them. In a more preferred aspect of the present invention, one or more of the nucleic acid molecules of the invention share between 100% and 98% sequence identity to one or more of the nucleic acid sequences shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3, complements of them and fragments of any one of them. In an even more preferred aspect of the present invention, one or more of the nucleic acid molecules of the pre26 • ·········· »· • · · · · ····· · · • · * · · · · · · · · ♦ '* · · · · · · feel invention share between 99% and 100% sequence identity to one or more of the sequences shown in SEQ ID ^NOS: 1 and 3, complements of and fragments of any of them.

Em uma modalidade preferida, os cálculos de percentagem de identidade são realizados usando o programa Megalign da LASERGENE bioinformatics computing suite (parâmetros de default, DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin).In a preferred embodiment, percent identity calculations are performed using the LASERGENE bioinformatics computing suite Megalign program (default parameters, DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin).

Uma molécula de ácido nucléico da invenção também pode codificar uma proteína homóloga. Conforme aqui usado, uma molécula de proteína homóloga ou fragmento da mesma é uma molécula de proteína equivalente ou fragmento da mesma em uma segunda espécie (por exemplo, a subunidade pequena rubisco de milho é um homólogo da subunidade pequena rubisco de Arabidopsis). Um homólogo também pode ser gerado por técnicas de evolução molecular ou de embaralhamento de DNA, de modo que a molécula retenha pelo menos uma característica funcional ou estrutural da proteína original (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.811.238).A nucleic acid molecule of the invention can also encode a homologous protein. As used herein, a homologous protein molecule or fragment thereof is an equivalent protein molecule or fragment thereof in a second species (for example, the small rubisco subunit of corn is a homologue of the small rubisco subunit of Arabidopsis). A homologue can also be generated by molecular evolution or DNA shuffling techniques, so that the molecule retains at least one functional or structural characteristic of the original protein (see, for example, U.S. Patent 5,811,238).

Em uma outra modalidade, o homólogo é selecionado do grupo que consiste em alfafa, Arabidopsis, cevada, Brassica campestris, Brassica napus, brócolis, repolho, canola, cítricos, algodão, alho, aveia, cebola, linho, uma planta ornamental, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, cana-de-açúcar, beterraba, tomate, trigo, choupo, pinho, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilha, uva, banana, chá, turfa, girassol, soja, milho, Phaseolus, crambe (cranibe abyssinica), mostarda, mamona, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão e palmeira. Mais particularmente, os homólogos preferidos são selecionados de canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, crambe (cranibe abyssinica), mostarda, mamona, amendoim, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão, palmeira, linho e girassol. Em uma modalidade ainda mais preferida, o homólogo é selecionado do grupo que consiste em canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, girassol, açafrão, palmeira e amendoim. Em uma modalidade preferida, o homólogo é soja. Em uma modalidade preferida, o homólogo é canola. Em uma modalidade prefe-In another modality, the homologue is selected from the group consisting of alfalfa, Arabidopsis, barley, Brassica campestris, Brassica napus, broccoli, cabbage, canola, citruses, cotton, garlic, oats, onion, flax, an ornamental plant, peanuts, pepper, potato, rice, rye, sorghum, strawberry, sugar cane, beet, tomato, wheat, poplar, pine, fir, eucalyptus, apple, lettuce, lentil, grape, banana, tea, peat, sunflower, soy, corn, Phaseolus, crambe (cranibe abyssinica), mustard, castor, sesame, cottonseed, flaxseed, saffron and palm. More particularly, preferred counterparts are selected from canola, maize, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soybeans, crambe (cranibe abyssinica), mustard, castor bean, peanuts, sesame, cottonseed, flaxseed, saffron, palm, flax and sunflower . In an even more preferred modality, the homologue is selected from the group consisting of canola, corn, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soy, sunflower, saffron, palm and peanut. In a preferred embodiment, the counterpart is soy. In a preferred embodiment, the counterpart is canola. In a preferential modality

rida, o homólogo é Brassica napus.the counterpart is Brassica napus.

Em uma modalidade preferida, moléculas de ácido nucléico tendo as SEQ ID N°^s: 1 e 3, complementos das mesmas, e fragmentos de qualquer uma delas, ou mais preferivelmente as SEQ ID N²s: 1 e 3 e complementos das mesmas, podem ser utilizadas para obter tais homólogos.In a preferred embodiment, nucleic acid molecules having SEQ ID ^NOS: 1 and 3, complements thereof and fragments of either, or more preferably SEQ ID NO : ² are: 1 and 3 and complements thereof, can be used to obtain such counterparts.

Em ainda um outro aspecto da presente invenção, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem compreender seqüências que diferem daquelas codificando uma proteína ou fragmento da mesma nas SEQ ID N°^s: 2 e 4 devido ao fato de que uma proteína pode ter uma ou mais alterações conservadoras de aminoácidos, e portanto seqüências de ácidos nucléicos codificando a proteína podem ter diferenças na seqüência. Fica entendido que códons capazes de codificar tais substituições conservadoras de aminoácidos são conhecidos na técnica.In yet another aspect of the present invention, the nucleic acid molecules of the present invention can comprise sequences that differ from those encoding a protein or fragment thereof of SEQ ID ^NOS: 2, 4 were due to the fact that a protein may have a or more conservative amino acid changes, and therefore nucleic acid sequences encoding the protein may differ in sequence. It is understood that codons capable of encoding such conservative amino acid substitutions are known in the art.

Sabe-se na técnica que um ou mais aminoácidos em uma seqüência nativa podem ser substituídos por outro(s) aminoácido(s), cujas carga e polaridade são semelhantes àquelas do aminoácido nativo, isto é, uma substituição conservadora de aminoácidos. Substitutos conservadores para um aminoácido na seqüência de polipeptídios nativa, podem ser selecionados de outros membros da classe a que pertence o aminoácido. Os aminoácidos podem ser divididos nos quatros grupos a seguir: (1) aminoácidos ácidos, (2) aminoácidos básicos, (3) aminoácidos polares neutros, e (4) aminoácidos não-polares neutros. Aminoácidos representativos desses vários grupos incluem, porém sem limitação, (1) aminoácidos ácidos (com carga negativa) tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (com carga positiva) tais como arginina, histidina e lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina e glutamina; e (4) aminoácidos não-polares (hidrófobos) tais como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofânio e metionina.It is known in the art that one or more amino acids in a native sequence can be replaced by another (s) amino acid (s), whose charge and polarity are similar to those of the native amino acid, that is, a conservative amino acid substitution. Conservative substitutes for an amino acid in the native polypeptide sequence can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. Amino acids can be divided into the following four groups: (1) acidic amino acids, (2) basic amino acids, (3) neutral polar amino acids, and (4) neutral non-polar amino acids. Representative amino acids from these various groups include, but are not limited to, (1) acidic (negatively charged) amino acids such as aspartic acid and glutamic acid; (2) basic (positively charged) amino acids such as arginine, histidine and lysine; (3) neutral polar amino acids such as glycine, serine, threonine, cysteine, cystine, tyrosine, asparagine and glutamine; and (4) non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine.

Uma substituição conservadora de aminoácidos na seqüência de polipeptídios nativa pode ser feita por substituição de um aminoácido de um desses grupos por outro aminoácido do mesmo grupo. Em um aspecto ···A conservative substitution of amino acids in the native polypeptide sequence can be done by replacing an amino acid in one of these groups with another amino acid in the same group. In one aspect ···

preferido, equivalentes biologicamente funcionais das proteínas ou seus fragmentos da presente invenção podem ter dez ou menos alterações conservadoras de aminoácidos, mais preferivelmente sete ou menos alterações conservadoras de aminoácidos e ainda mais preferivelmente cinco ou menos alterações conservadoras de aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos codificadora vai, assim, ter substituições de base correspondentes, permitindo que ela codifique formas equivalentes biologicamente funcionais das proteínas ou fragmentos da presente invenção.preferred, biologically functional equivalents of the proteins or fragments thereof of the present invention can have ten or less conservative amino acid changes, more preferably seven or less conservative amino acid changes and even more preferably five or less conservative amino acid changes. The coding nucleotide sequence will thus have corresponding base substitutions, allowing it to encode biologically functional equivalent forms of the proteins or fragments of the present invention.

Fica entendido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos na estrutura de uma proteína sem perda considerável de capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões fixadoras de antígeno de anticorpos ou sítios de ligação em moléculas de substrato. Como é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que define a atividade funcional biológica daquela proteína, certas substituições na seqüência de aminoácidos podem ser feitas na seqüência de uma proteína e, naturalmente, sua seqüência codificadora de DNA subjacente e, não obstante, ainda pode ser obtida uma proteína com propriedades semelhantes. Os inventores consideram portanto que várias alterações podem ser feitas nas seqüências de peptídios das proteínas ou fragmentos da presente invenção, ou nas seqüências de DNA correspondentes que codificam os referidos peptídios, sem perda considerável de sua utilidade ou atividade biológica. Fica entendido que códons capazes de codificar tais alterações de aminoácidos são conhecidos na técnica.It is understood that certain amino acids can be replaced by other amino acids in the structure of a protein without considerable loss of ability to interact interactively with structures such as, for example, antibody antigen-fixing regions or binding sites on substrate molecules. As it is the interactive capacity and nature of a protein that defines the biological functional activity of that protein, certain substitutions in the sequence of amino acids can be made in the sequence of a protein and, of course, its underlying DNA coding sequence and, nevertheless, still a protein with similar properties can be obtained. The inventors therefore consider that various changes can be made to the peptide sequences of the proteins or fragments of the present invention, or to the corresponding DNA sequences encoding said peptides, without considerable loss of their usefulness or biological activity. It is understood that codons capable of encoding such amino acid changes are known in the art.

Quando se faz tais alterações deve-se levar em conta o índice hidropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropático dos aminoácidos para conferir função biológica interativa a uma proteína em geral é conhecida na técnica (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)). Admite-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e outros.When making such changes, the hydropathic index of amino acids must be taken into account. The importance of the hydropathic index of amino acids to confer interactive biological function to a protein in general is known in the art (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)). It is assumed that the relative hydropathic character of the amino acid contributes to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the protein's interaction with other molecules, for example, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens and others.

A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com baseEach amino acid was assigned a hydropathic index based on

• · ·· · em suas características de hidrofobicidade e carga (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)); estes são isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptofânio (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3.5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (-3,9) e arginina (-4,5).• · ·· · in its hydrophobicity and charge characteristics (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)); these are isoleucine (+4.5), valine (+4.2), leucine (+3.8), phenylalanine (+2.8), cysteine / cystine (+2.5), methionine (+1.9 ), alanine (+1.8), glycine (-0.4), threonine (-0.7), serine (-0.8), tryptophan (-0.9), tyrosine (-1.3), proline (-1.6), histidine (-3.2), glutamate (-3.5), glutamine (-3.5), aspartate (-3.5), asparagine (-3.5), lysine (-3 , 9) and arginine (-4.5).

Quando se faz tais substituições, é preferida a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão na faixa de ±2, aqueles na faixa de ±1 são particularmente preferidos, e aqueles na faixa de ±0.5 são ainda mais particularmente preferidos.When such substitutions are made, the substitution of amino acids whose hydropathic indices are in the range of ± 2 is preferred, those in the range of ± 1 are particularly preferred, and those in the range of ± 0.5 are even more particularly preferred.

Também se sabe na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. 4.554.101 ensina que a mais alta hidrofilicidade média local de uma proteína, regulada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, está correlacionada com uma propriedade biológica da proteína.It is also known in the art that the replacement of similar amino acids can be done effectively based on hydrophilicity. U.S. Patent 4,554,101 teaches that the highest average local hydrophilicity of a protein, regulated by the hydrophilicity of its adjacent amino acids, is correlated with a biological property of the protein.

Como detalhado na Patente U.S. 4.554.101, os índices de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos aos resíduos de aminoácido: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0 ±1), glutamato (+3,0 ±1), serina (+0,3), asparagina (+0.2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 ±1), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5) e triptofânio (-3,4).As detailed in US Patent 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0), lysine (+3.0), aspartate (+3.0 ± 1), glutamate ( +3.0 ± 1), serine (+0.3), asparagine (+0.2), glutamine (+0.2), glycine (0), threonine (-0.4), proline (-0.5 ± 1), alanine (-0.5), histidine (-0.5), cysteine (-1.0), methionine (-1.3), valine (1.5), leucine (-1.8), isoleucine (-1.8), tyrosine (-2.3), phenylalanine (-2.5) and tryptophan (-3.4).

Quando se faz tais substituições, é preferida a substituição de aminoácidos cujos índices hidrofilicidade estão na faixa de ±2, aqueles na faixa de ±1 são particularmente preferidos, e aqueles na faixa de ±0,5 são ainda mais particularmente preferidos.When such substitutions are made, substitution of amino acids whose hydrophilicity indexes are in the range of ± 2 is preferred, those in the range of ± 1 are particularly preferred, and those in the range of ± 0.5 are even more particularly preferred.

Em um outro aspecto da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção diferem em seqüência de ácidos nucléicos em relação àqueles para os quais uma seqüência específica é fornecida neste relatório porque um ou mais códons foram substituídos por um códon que codifica uma substituição conservadora do aminoácido originalmente codificado.In another aspect of the present invention, one or more of the nucleic acid molecules of the present invention differ in sequence from nucleic acids to those for which a specific sequence is provided in this report because one or more codons have been replaced by a codon that encodes a conservative substitution of the originally encoded amino acid.

♦ · · · ♦ · · • · · • · · · · • · · · • · · · • · · φ • · · • ·· ·♦ · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Os agentes da invenção incluem moléculas de ácido nucléico que codificam uma região de pelo menos cerca de 10 aminoácidos adjacentes de uma proteína da presente invenção, mais preferivelmente uma região de pelo menos cerca de 25, 40, 50, 100 ou 125 aminoácidos adjacentes de uma proteína da presente invenção.The agents of the invention include nucleic acid molecules that encode a region of at least about 10 adjacent amino acids from a protein of the present invention, more preferably a region of at least about 25, 40, 50, 100 or 125 adjacent amino acids from a protein of the present invention.

Em uma modalidade preferida, qualquer das moléculas de ácido nucléico da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA, onde a molécula de ácido nucléico que é ligada ao promotor é heteróloga em relação àquele promotor. Conforme aqui usado, heterólogo significa que naturalmente não ocorre junto. Moléculas de proteína e de peptídioIn a preferred embodiment, any of the nucleic acid molecules of the present invention can be operatively linked to a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule, where the nucleic acid molecule that is bound to the promoter is heterologous in relation to that promoter. As used here, heterologous means that it naturally does not occur together. Protein and peptide molecules

Uma classe de agentes inclui uma ou mais das proteínas ou seus fragmentos ou moléculas de peptídio codificadas por um agente de ácido nucléico da invenção. Uma classe preferida de proteínas é aquela que tem uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 2 e 4 e fragmentos das mesmas. Os agentes protéicos ou peptídicos podem ter extensões C terminais ou N terminais de seqüência de ácidos nucléicos. Uma classe de extensões N terminais empregadas em uma modalidade preferida são peptídios de trânsito de plastídio. Quando empregados, os peptídios de trânsito de plastídio podem ser operacionalmente ligados às seqüências N terminais, dessa forma permitindo a localização do agente peptídio ou proteínas em relação aos plastídios. Em uma modalidade preferida, a seqüência de direcionamento para plastídio é uma seqüência CTP1. Em uma outra modalidade, a seqüência é uma seqüência CTP2.A class of agents includes one or more of the proteins or their fragments or peptide molecules encoded by a nucleic acid agent of the invention. A preferred class of proteins is one that has a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 2 and 4 and fragments thereof. Protein or peptide agents can have C terminal or N terminal extensions of nucleic acid sequence. A class of N terminal extensions employed in a preferred embodiment are plastid transit peptides. When used, plastid transit peptides can be operationally linked to N terminal sequences, thereby allowing the location of the peptide agent or proteins in relation to plastids. In a preferred embodiment, the targeting sequence for plastid is a CTP1 sequence. In another embodiment, the sequence is a CTP2 sequence.

Conforme aqui usado, o termo proteína ou molécula de peptídio inclui qualquer molécula que compreende cinco ou mais aminoácidos. Sabe-se na técnica que as proteínas podem sofrer modificações, inclusive modificações pós-translacionais, tais como, porém sem limitação, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Assim, conforme aqui usado, o termo proteína ou molécula de peptídio inclui φ φ φ • · φAs used herein, the term protein or peptide molecule includes any molecule that comprises five or more amino acids. It is known in the art that proteins can undergo modifications, including post-translational modifications, such as, but without limitation, disulfide bond formation, glycosylation, phosphorylation or oligomerization. Thus, as used herein, the term protein or peptide molecule includes φ φ φ • · φ

φφ

Φ φ qualquer proteína que seja modificada por qualquer processo biológico ou não-biológico. Os termos aminoácido e aminoácidos referem-se a todos L-aminoácidos que ocorrem naturalmente. Esta definição inclui norleucina, norvalina, ornitina, homocisteína e homosserina.Φ φ any protein that is modified by any biological or non-biological process. The terms amino acid and amino acids refer to all naturally occurring L-amino acids. This definition includes norleucine, norvaline, ornithine, homocysteine and homoserine.

Uma ou mais das proteínas ou fragmentos das mesmas ou moléculas de peptídio podem ser produzidas via síntese química, ou mais preferivelmente por expressão em um hospedeiro bacteriano ou eucariótico adequado. Métodos adequados para expressão estão descritos por Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2~ edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ou textos similares.One or more of the proteins or fragments thereof or peptide molecules can be produced via chemical synthesis, or more preferably by expression in a suitable bacterial or eukaryotic host. Suitable methods for expression are described by Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) or similar texts.

Um fragmento de proteína é uma molécula de peptídio ou polipeptídio cuja seqüência de aminoácidos compreende um subconjunto da seqüência de aminoácidos daquela proteína. Uma proteína ou fragmento da mesma que compreende uma ou mais regiões peptídicas adicionais não derivadas daquela proteína é uma proteína de fusão. Tais moléculas podem ser derivatizadas de forma a conter carboidratos ou outras porções (tal como hemocianina de lapa com perfuração). As moléculas de proteína de fusão ou de peptídio da invenção são de preferência produzidas por meios recombinantes.A protein fragment is a peptide or polypeptide molecule whose sequence of amino acids comprises a subset of that protein's amino acid sequence. A protein or fragment thereof comprising one or more additional peptide regions not derived from that protein is a fusion protein. Such molecules can be derivatized to contain carbohydrates or other portions (such as keyhole limpet hemocyanin). The fusion protein or peptide molecules of the invention are preferably produced by recombinant means.

Uma outra classe de agentes compreende moléculas de proteína ou peptídio ou fragmentos ou fusões das mesmas compreendendo as SEQ ID N°^s: 2 e 4 e fragmentos das mesmas onde foram adicionados, substituídos ou deletados resíduos de aminoácido conservadores, não essenciais ou não relevantes. Meios computadorizados para criar modificações na estrutura de proteína são conhecidos na técnica (Dahiyat e Mayo, Science 278: 82-87(1997)).Another class of agents comprises protein molecules or peptide or fragments or fusions thereof comprising SEQ ID ^NOS: 2 and 4 and fragments thereof which have been added, replaced or deleted amino acid residues of conservative, non - essential or non - relevant. Computerized means for creating changes in protein structure are known in the art (Dahiyat and Mayo, Science 278: 82-87 (1997)).

Uma proteína da invenção também pode ser uma proteína homóloga. Conforme aqui usado, uma proteína homóloga ou fragmento da mesma é uma proteína equivalente ou fragmento da mesma em uma segunda espécie. Um homólogo também pode ser gerado por técnicas de evolução molecular ou de embaralhamento de DNA, de modo que a molécula re• · • « ♦ · ♦ · · · • · ·· • · · * ·«· • · β · • » • 1» • · • 9 ··· tenha pelo menos uma característica funcional ou estrutural da original (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.811.238).A protein of the invention can also be a homologous protein. As used herein, a homologous protein or fragment thereof is an equivalent protein or fragment thereof in a second species. A homologue can also be generated by techniques of molecular evolution or DNA shuffling, so that the molecule re • · • ♦ · ♦ · · · · ·· • · · * · · · · β · • » • 1 »• · • 9 ··· has at least one functional or structural feature of the original (see, for example, US Patent 5,811,238).

Em uma outra modalidade, o homólogo é selecionado do grupo que consiste em alfafa, Arabidopsis, cevada, brócolis, repolho, canola, cítricos, algodão, alho, aveia, cebola, linho, uma planta ornamental, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, cana-de-açúcar, beterraba, tomate, trigo, choupo, pinho, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilha, uva, banana, chá, turfa, girassol, soja, milho e Phaseolus. Mais particularmente, os homólogos preferidos são selecionados de canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, crambe (cranibe abyssinica), mostarda, mamona, amendoim, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão, palmeira, linho e girassol. Em uma modalidade ainda mais preferida, o homólogo é selecionado do grupo que consiste em canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, girassol, açafrão, palmeira e amendoim. Em uma modalidade preferida, o homólogo é soja. Em uma modalidade preferida, o homólogo é canola. Em uma modalidade preferida, o homólogo é Brassica napus.In another modality, the counterpart is selected from the group consisting of alfalfa, Arabidopsis, barley, broccoli, cabbage, canola, citrus, cotton, garlic, oats, onion, flax, an ornamental plant, peanuts, pepper, potatoes, rice, rye, sorghum, strawberry, sugar cane, beet, tomato, wheat, poplar, pine, fir, eucalyptus, apple, lettuce, lentil, grape, banana, tea, peat, sunflower, soy, corn and Phaseolus. More particularly, preferred counterparts are selected from canola, maize, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soybeans, crambe (cranibe abyssinica), mustard, castor bean, peanuts, sesame, cottonseed, flaxseed, saffron, palm, flax and sunflower . In an even more preferred modality, the homologue is selected from the group consisting of canola, corn, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soy, sunflower, saffron, palm and peanut. In a preferred embodiment, the counterpart is soy. In a preferred embodiment, the counterpart is canola. In a preferred embodiment, the counterpart is Brassica napus.

Em uma modalidade preferida, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção ou complementos e fragmentos das mesmas podem ser utilizados para obter tais homólogos.In a preferred embodiment, the nucleic acid molecules of the present invention or complements and fragments thereof can be used to obtain such homologues.

Os agentes da invenção incluem proteínas e fragmentos das mesmas compreendendo uma região de pelo menos 10 aminoácidos adjacentes de preferência compreendendo uma região de pelo menos 20 aminoácidos adjacentes, ainda mais preferivelmente compreendendo uma região de pelo menos 25, 35, 50, 75 ou 100 aminoácidos adjacentes de uma proteína da presente invenção. Em uma outra modalidade preferida, as proteínas da presente invenção incluem uma região tendo entre cerca de 10 e cerca de 25 aminoácidos adjacentes, mais preferivelmente uma região tendo entre cerca de 20 e cerca de 50 aminoácidos adjacentes e mais preferivelmente ainda uma região tendo entre cerca de 40 e cerca de 80 aminoácidos adjacentes.The agents of the invention include proteins and fragments thereof comprising a region of at least 10 adjacent amino acids preferably comprising a region of at least 20 adjacent amino acids, even more preferably comprising a region of at least 25, 35, 50, 75 or 100 amino acids adjacent to a protein of the present invention. In another preferred embodiment, the proteins of the present invention include a region having between about 10 and about 25 adjacent amino acids, more preferably a region having between about 20 and about 50 adjacent amino acids and most preferably a region having between about of 40 and about 80 adjacent amino acids.

Constructos de plantas e transformantes de plantas * · · • · · · · >····« » · ·9 99 > * · « • · • ·Plant constructs and plant transformers * · · • · · · ·> ···· «» · · 9 99> * · «• · • ·

Uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas em transformação ou transfecção de planta. Material genético exógeno pode ser transferido para uma célula de planta e a célula de planta regenerada como uma planta completa, fértil ou estéril. Material genético exógeno é qualquer material genético, seja de ocorrência natural ou não, de qualquer fonte que possa ser inserida em qualquer organismo. Em uma modalidade preferida, o material genético exógeno codifica um prefenato desidrogenase bifuncional ou fragmentos da mesma, mais preferivelmente um prefenato desidrogenase bifuncional de um organismo procariótico, e ainda mais preferivelmente um prefenato desidrogenase bifuncional de Erwinia herbicola ou Escherichia coli. Em uma modalidade preferida, o material genético exógeno inclui uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, e de preferência uma molécula de ácido nucléico tendo uma seqüência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°^s: 1 e 3, complementos e fragmentos das mesmas. Em uma outra modalidade, o material genético exógeno inclui uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, de preferência um ácido nucléico codificando uma proteína ou fragmento da mesma tendo atividade de fitil preniltransferase.One or more of the nucleic acid molecules of the invention can be used in plant transformation or transfection. Exogenous genetic material can be transferred to a plant cell and the plant cell regenerated as a complete, fertile or sterile plant. Exogenous genetic material is any genetic material, whether naturally occurring or not, from any source that can be inserted into any organism. In a preferred embodiment, the exogenous genetic material encodes a bifunctional prefenate dehydrogenase or fragments thereof, more preferably a bifunctional prefenate dehydrogenase from a prokaryotic organism, and even more preferably a bifunctional prefenate dehydrogenase from Erwinia herbicola or Escherichia coli. In a preferred embodiment, the exogenous genetic material includes a nucleic acid molecule of the present invention, preferably a nucleic acid molecule having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID ^NOS: 1 and 3, complements and fragments of same. In another embodiment, the exogenous genetic material includes a nucleic acid molecule of the present invention, preferably a nucleic acid encoding a protein or fragment thereof having phytyl prenyl transferase activity.

Em uma modalidade da presente invenção, o material genético exógeno compreendendo um homólogo de TyrA ou fragmento do mesmo é introduzido em uma planta com um ou mais genes adicionais. Em uma modalidade, combinações preferidas de genes incluem dois ou mais dos seguintes genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructto anti-sentido para ácido homogentísico dissoxigenase (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991); Keegstra, Cell 56(2): 247-53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 12760-12764 (1994); Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316 (1992); Cyanobase no site www.kazusa.or.jp/cyanobase; Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(5): 2105-2110 (1998); Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 (17): 9879-9884 (1998); Norris et al., Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998); Bartley e Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469-1470 (1994); Smith et ai., Plant 11: 83-92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; SaintIn one embodiment of the present invention, exogenous genetic material comprising a TyrA homolog or fragment thereof is introduced into a plant with one or more additional genes. In one embodiment, preferred combinations of genes include two or more of the following genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, and an antisense constructto for homogentisic acid thereofxigenase (Krindl et al., Seed Sci. Res. 1: 209-219 (1991); Keegstra, Cell 56 (2): 247-53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. USA 91: 12760-12764 (1994); Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316 (1992); Cyanobase at www.kazusa.or.jp/cyanobase; Lois et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 95 (5): 2105-2110 (1998); Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17): 9879-9884 (1998); Norris et al. , Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998); Bartley and Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469-1470 (1994); Smith et al., Plant 11: 83-92 (1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint

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Guily et al., Plant Physiol., 100(2): 1069-1071 (1992); Sato et al., J. DNA Res. 7(1): 31-63 (2000)). Em uma combinação particularmente preferida, o constructo ou constructos de ácido nucléico codificam, além do tyrA, HPPD eslr1736ou ATPT2.Guily et al., Plant Physiol., 100 (2): 1069-1071 (1992); Sato et al., J. DNA Res. 7 (1): 31-63 (2000)). In a particularly preferred combination, the nucleic acid construct or constructs encode, in addition to tyrA, HPPD eslr1736or ATPT2.

Nessas combinações, um ou mais dos genes produzidos podem ser direcionados para o plastídio pelo uso de uma seqüência de direcionamento para plastídio. Alternativamente, um ou mais dos genes produzidos podem ser localizados no citoplasma. Tais genes podem ser introduzidos, por exemplo, com o homólogo de TyrA ou fragmento do mesmo em um único constructo, introduzido em constructo diferentes porém com o mesmo evento de transformação ou introduzido em plantas separadas seguidas de um ou mais cruzamentos para gerar a combinação desejada de genes. Em tais combinações, um promotor preferido é um promotor para napina e uma seqüência de direcionamento para plastídio é uma seqüência CTP1.In these combinations, one or more of the genes produced can be targeted to the plastid by using a plastid targeting sequence. Alternatively, one or more of the genes produced can be located in the cytoplasm. Such genes can be introduced, for example, with the TyrA homologue or fragment thereof in a single construct, introduced in different constructs but with the same transformation event or introduced in separate plants followed by one or more crosses to generate the desired combination of genes. In such combinations, a preferred promoter is a napine promoter and a plastid targeting sequence is a CTP1 sequence.

Tal material genético pode ser transferido para monocotiledôneas e dicotiledôneas que incluem, porém sem limitação, canola, milho, soja, Arabidopsis phaseolus, amendoim, alfafa, trigo, arroz, aveia, sorgo, centeio, tritórdeo, milhete, festuca, azevém perene, cana-de-açúcar, oxicoco, mamão, banana, açafrão, palmeira, linho, melão almiscarado, maçã, pepino, dendóbrio, palma-de-santa-rita, crisântemo, lilás, algodão, eucalipto, girassol, Brassica campestris, Brassica napus, turfa, beterraba, café e dioscórea (Christou, In: Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit. Academic Press, San Diego, Califórnia (1996)), canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, crambe (cranibe abyssinica), mostarda, mamona, amendoim, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão, palmeira, linho e girassol sendo preferidas, e canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, girassol, açafrão, palmeira e amendoim sendo preferidas. Em uma modalidade mais preferida, o material genético é transferido para canola. Em uma outra modalidade preferida, o material genético é transferido para Brassica napus. Em uma outra modalidade mais preferida, o material genético é transferido para soja.Such genetic material can be transferred to monocotyledons and dicotyledons that include, but are not limited to, canola, corn, soybeans, Arabidopsis phaseolus, peanuts, alfalfa, wheat, rice, oats, sorghum, rye, tritoro, millet, fescue, perennial ryegrass, cane sugar, cranberry, papaya, banana, saffron, palm, flax, musk melon, apple, cucumber, dendrobium, santa-rita palm, chrysanthemum, lilac, cotton, eucalyptus, sunflower, Brassica campestris, Brassica napus, peat, beet, coffee and dioscórea (Christou, In: Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit. Academic Press, San Diego, California (1996)), canola, corn, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soy, crambe (cranibe abyssinica), mustard, castor bean, peanut, sesame, cottonseed, flax, saffron, palm, flax and sunflower being preferred, and canola, corn, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soy, sunflower, saffron the, peanuts and palm being preferred. In a more preferred embodiment, the genetic material is transferred to canola. In another preferred embodiment, the genetic material is transferred to Brassica napus. In another more preferred embodiment, the genetic material is transferred to soy.

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A transferência de um ácido nucléico que codifica uma proteína pode resultar na expressão ou superexpressão dessa proteína em uma célula transformada ou em uma planta transgênica. Uma ou mais das proteínas ou fragmentos das mesmas codificados por moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser superexpressos em uma célula transformada ou em uma planta transformada. Tal expressão ou superexpressão pode ser resultado de transferência temporária ou estável do material genético exógeno.The transfer of a nucleic acid that encodes a protein can result in the expression or overexpression of that protein in a transformed cell or transgenic plant. One or more of the proteins or fragments thereof encoded by nucleic acid molecules of the invention can be overexpressed in a transformed cell or a transformed plant. Such expression or overexpression may be the result of a temporary or stable transfer of exogenous genetic material.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, em relação a uma planta não transformada com histórico genético semelhante, um nível aumentado de tocotrienóis.In a preferred embodiment, the overexpression of a protein or fragment of the present invention in a plant provides that plant, compared to an untransformed plant with a similar genetic history, an increased level of tocotrienols.

Em uma modalidade preferida, a expressão ou superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, em relação a uma planta não transformada com histórico genético semelhante, um nível aumentado de tocoferóis.In a preferred embodiment, the expression or overexpression of a protein or fragment of the present invention in a plant provides that plant, in relation to an untransformed plant with a similar genetic history, an increased level of tocopherols.

Em uma modalidade preferida, a expressão ou superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, em relação a uma planta não transformada com histórico genético semelhante, um nível aumentado de a-tocoferóis.In a preferred embodiment, the expression or overexpression of a protein or fragment of the present invention in a plant provides that plant, in relation to an untransformed plant with a similar genetic history, an increased level of α-tocopherols.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, em relação a uma planta não transformada com histórico genético semelhante, um nível aumentado de γ-tocoferóis.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment of the present invention in a plant provides that plant, in relation to an untransformed plant with a similar genetic history, an increased level of γ-tocopherols.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, em relação a uma planta não transformada com histórico genético semelhante, um nível aumentado de ácido homogentísico.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment of the present invention in a plant provides that plant, in relation to an untransformed plant with a similar genetic history, an increased level of homogentisic acid.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, em relação a uma planta não transformada com histórico genético semelhante, um nível aumentado de plastoquinóis ou plastoqui36In a preferred embodiment, the overexpression of a protein or fragment thereof in a plant provides in that plant, compared to an untransformed plant with a similar genetic history, an increased level of plastoquinols or plastoqui36

nonas.nines.

Em algumas modalidades, os níveis de um ou mais produtos da via da biossíntese do tocoferol, incluindo qualquer um ou mais de tocotrienóis, tocoferóis, a-tocoferóis, γ-tocoferóis, plastoquinóis, plastoquinonas ou ácido homogentísico, são aumentados em 10%, ou mais preferivelmente 25%, 50%, 100%, 200%, 250%, 1.000%, 2.000% ou 2.500%. Os níveis dos produtos podem ser aumentados em todo um organismo tal como uma planta ou localizados em um ou mais órgãos ou tecidos específicos do organismo. Por exemplo, os níveis dos produtos podem ser aumentados em um ou mais dos tecidos e órgãos de uma planta que incluem sem limitação: raízes, tubérculos, caules, folhas, talos, frutos, bagas, nozes, casca, vagens, sementes e flores.In some embodiments, the levels of one or more products in the tocopherol biosynthesis pathway, including any one or more of tocotrienols, tocopherols, a-tocopherols, γ-tocopherols, plastoquinols, plastoquinones or homogentisic acid, are increased by 10%, or more preferably 25%, 50%, 100%, 200%, 250%, 1,000%, 2,000% or 2,500%. Product levels can be increased throughout an organism such as a plant or located in one or more specific organs or tissues in the organism. For example, product levels can be increased in one or more of the tissues and organs of a plant that include without limitation: roots, tubers, stems, leaves, stems, fruits, berries, nuts, bark, pods, seeds and flowers.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta proporciona nessa planta, ou em um tecido dessa planta, em relação a uma planta ou tecido de planta não transformado com histórico genético semelhante, um nível aumentado da proteína prefenato desidrogenase.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a plant provides that plant, or tissue in that plant, with respect to an unprocessed plant or plant tissue with a similar genetic history, an increased level of protein prefenate dehydrogenase.

Em uma outra modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma planta transformada pode proporcionar tolerância a uma variedade de estresses, por exemplo tolerância ao estresse oxidativo tal como a oxigênio ou ozônio, tolerância à UV, tolerância ao frio ou tolerância a um patógeno fúngico ou microbiano.In another preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a transformed plant can provide tolerance to a variety of stresses, for example tolerance to oxidative stress such as oxygen or ozone, UV tolerance, tolerance to cold or tolerance to a fungal or microbial pathogen.

Conforme aqui usado em um aspecto preferido, tolerância ou resistência ao estresse é determinada pela capacidade da planta, quando atacada por um estresse como frio para produzir uma planta com um rendimento maior que uma planta sem tolerância ou resistência ao estresse. Em um aspecto particularmente preferido da presente invenção, a tolerância ou resistência ao estresse é medida em relação a uma planta com histórico genético semelhante ao da planta tolerante ou resistente porém com a diferença que a planta expressa ou superexpressa uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção.As used here in a preferred aspect, tolerance or resistance to stress is determined by the ability of the plant, when attacked by stress such as cold to produce a plant with a higher yield than a plant without tolerance or resistance to stress. In a particularly preferred aspect of the present invention, tolerance or resistance to stress is measured in relation to a plant with a genetic history similar to that of the tolerant or resistant plant but with the difference that the plant expresses or overexpresses a protein or fragment thereof. invention.

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O material genético exógeno pode ser transferido para uma célula hospedeira pelo uso de um vetor ou constructo de DNA criado com tal finalidade. O versado na técnica de um modo geral sabe como criar tal vetor (vide, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, New York (1997)). Em algumas modalidades desta invenção, uma única seqüência de genes selecionada do grupo que consiste em tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo anti-sentido para ácido homogentísico dissoxigenase pode ser transferida para a planta alvo desejada. Em uma combinação preferida, o constructo ou constructos de ácido nucléico codificam, além do tyrA, HPPD e slr1736 ou ATPT2. Plantas alvo expressando a atividade desejada da seqüência de genes transferida podem ser submetidas a um ou mais cruzamentos com plantas que foram transformadas com uma ou mais outras seqüências de genes selecionadas do grupo que consiste em tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737 e um constructto anti-sentido para ácido homogentísico disoxigenase para obter plantas expressando duas ou mais das atividades desejadas da seqüência de genes transferida. Em uma combinação preferida, o constructo ou constructos de ácidos nucléicos codificam, além do tyrA, HPPD e slr1736 ou ATPT2. Em uma outra modalidade, constructos de vetor de DNA podem ser constructos de múltiplos genes que compreendem duas ou mais seqüências de genes selecionadas do grupo que consiste em tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737 e um constructo anti-sentido para ácido homogentísico disoxigenase, de modo que a transformação com um único constructo de vetor de DNA vai resultar na expressão de duas ou mais seqüências de genes. Em uma combinação preferida, a constructo ou constructos de ácido nucléico codificam, além do tyrA, HPPD e slr1736 ou ATPT2.The exogenous genetic material can be transferred to a host cell using a vector or DNA construct created for that purpose. The person skilled in the art generally knows how to create such a vector (see, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark (ed.), Springer, New York (1997)). In some embodiments of this invention, a single gene sequence selected from the group consisting of tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, and an antisense construct for homogentisic acidoxygenase can be transferred to the desired target plant. In a preferred combination, the nucleic acid construct or constructs encode, in addition to tyrA, HPPD and slr1736 or ATPT2. Target plants expressing the desired activity of the transferred gene sequence can be subjected to one or more crosses with plants that have been transformed with one or more other gene sequences selected from the group consisting of tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737 and an antisense constructto homogentisic acid disoxygenase to obtain plants expressing two or more of the desired activities of the transferred gene sequence. In a preferred combination, the nucleic acid construct or constructs encode, in addition to tyrA, HPPD and slr1736 or ATPT2. In another embodiment, DNA vector constructs can be multiple gene constructs that comprise two or more gene sequences selected from the group consisting of tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737 and an antisense construct for homogentisic acid deoxygenase, so that transformation with a single DNA vector construct will result in the expression of two or more gene sequences. In a preferred combination, the nucleic acid construct or constructs encode, in addition to tyrA, HPPD and slr1736 or ATPT2.

Um constructo ou vetor pode incluir um promotor de planta para expressar a proteína ou um fragmento de proteína a escolher. Em uma modalidade preferida, quaisquer moléculas de ácido nucléico descritas neste relatório podem ser operacionalmente ligadas a uma região promotora queA construct or vector can include a plant promoter to express the protein or a protein fragment to choose from. In a preferred embodiment, any nucleic acid molecules described in this report can be operationally linked to a promoter region that

funcione em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA. Por exemplo, pode-se utilizar, sem limitação, qualquer promotor que funcione em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA, tal como os promotores descritos nesta invenção. Em uma modalidade preferida, o promotor é um promotor de planta.function in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule. For example, any promoter that works in a plant cell can be used without limitation to cause the production of an mRNA molecule, such as the promoters described in this invention. In a preferred embodiment, the promoter is a plant promoter.

Inúmeros promotores que são ativos em células de plantas foram descritos na literatura. Estes incluem o promotor para nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84: 5745-5749 (1987)), o promotor para octopina sintase (OCS) (que é transportado em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), os promotores para caulimovírus como o promotor 19S para o vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9: 315-324 (1987)) e o promotor 35S para o CaMV (Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985)), o promotor 35S para o vírus do mosaico da escrofulária, o promotor induzível por luz da pequena subunidade de ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), o promotor para Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84: 66246628 (1987)), o promotor para sacarose sintase (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 87: 4144-4148 (1990)), o promotor para o complexo do gene R (Chandler et al., The Plant Cell 1: 1175-1183 (1989)) e o promotor para o gene da proteína fixadora de clorofila a/b, etc. Estes promotores foram usados para criar constructos de DNA que foram expressos em plantas; vide, por exemplo, a publicação PCT WO 84/02913. Os promotores 35S para CaMV são preferidos para uso em plantas. Promotores que se sabe ou que se verificou provocar a transcrição de DNA em células de plantas podem ser usados na invenção.Numerous promoters that are active in plant cells have been described in the literature. These include the promoter for nopaline synthase (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 5745-5749 (1987)), the promoter for octopine synthase (OCS) (which is transported in tumor-inducing plasmids of Agrobacterium tumefaciens), the promoters for kaolinimovirus as the 19S promoter for the cauliflower mosaic virus (CaMV) (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9: 315-324 (1987)) and the 35S promoter for CaMV (Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985)), the 35S promoter for the scrofular mosaic virus, the light-inducible promoter of the small ribulose-1,5-bis subunit -phosphate carboxylase (ssRUBISCO), the promoter for Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 66246628 (1987)), the promoter for sucrose synthase (Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 87: 4144-4148 (1990)), the promoter for the R gene complex (Chandler et al., The Plant Cell 1: 1175-1183 (1989)) and the promoter for the gene chlorophyll a / b fixing protein, etc. These promoters were used to create DNA constructs that were expressed in plants; see, for example, PCT publication WO 84/02913. 35S promoters for CaMV are preferred for use in plants. Promoters known or found to cause DNA transcription in plant cells can be used in the invention.

Para fins de expressão em tecidos fonte da planta, tal como a folha, semente, raiz ou caule, prefere-se que os promotores utilizados tenham expressão relativamente alta nesses tecidos específicos. Expressão específica para tecido de uma proteína da presente invenção é uma modalidade particularmente preferida. Para tal, pode-se escolher entre inúmeros promotores para genes com expressão melhorada ou específica para tecido ou célula. Exemplos de tais promotores relatados na literatura incluem oFor the purpose of expression in plant source tissues, such as the leaf, seed, root or stem, it is preferred that the promoters used have relatively high expression in those specific tissues. Fabric-specific expression of a protein of the present invention is a particularly preferred embodiment. To this end, one can choose from a number of promoters for genes with improved or tissue-specific or cell-specific expression. Examples of such promoters reported in the literature include the

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promotor GS2 para cloroplasto glutamina sintetase da ervilha (Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 3459-3463 (1990)), o promotor para cloroplasto frutose-1,6-bifosfatase (FBPase) do trigo (Lloyd et al., Mol. Gen. Genet. 225: 209-216 (1991)), o promotor ST-LS1 fotossintético nuclear da batata (Stockhaus et al., EMBO J., 8: 2445-2451 (1989)), o promotor para serina/treonina cinase (PAL) e o promotor para glicoamilase (CHS) da Arabidopsis thaliana. Também relatados como ativos em tecidos fotossinteticamente ativos são o promotor para ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RbcS) do lariço oriental (Larix laricina), o promotor para o gene cab, cab6, do pinho (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778 (1994)), o promotor para o gene Cab-1 do trigo (Fejes et al., Plant Mol. Biol. 15: 921-932 (1990)), o promotor para o gene CAB-1 do espinafre (Lubberstedt et al., Plant Physiol. 104: 997-1006 (1994)), o promotor para o gene cab1 R do arroz (Luan et al., Plant Cell, 4: 971-981 (1992)), o promotor para piruvato, ortofosfato diquinase (PPDK) do milho (Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 95869590 (1993)), o promotor para o gene Lhcb1*2 do tabaco (Cerdan et al., Plant Mol. Biol., 33: 245-255 (1997)), o promotor para SUC2 sacarose-H+ symporter de Arabidopsis thaliana (Truernit et al., Planta 196: 564-570 (1995)) e o promotor para as proteínas da membrana tilacóide do espinafre (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS). Outros promotores para as proteínas fixadoras de clorofila a/b também podem ser utilizados na invenção, tais como os promotores para o LhcB e para o gene PsbP da mostarda branca (Sinapis alba, Kretsch et al., Plant Mol. Biol. 28: 219-229 (1995)).GS2 promoter for pea chloroplast glutamine synthetase (Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 3459-3463 (1990)), the promoter for fructose-1,6-bisphosphatase chloroplast (FBPase) from wheat (Lloyd et al., Mol. Gen. Genet. 225: 209-216 (1991)), the nuclear photosynthetic ST-LS1 promoter of potato (Stockhaus et al., EMBO J., 8: 2445-2451 (1989) ), the serine / threonine kinase (PAL) promoter and the Arabidopsis thaliana glycoamylase (CHS) promoter. Also reported as active in photosynthetically active tissues are the promoter for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RbcS) from the eastern larch (Larix laricina), the promoter for the cab, cab6, gene from pine (Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778 (1994)), the promoter for the wheat Cab-1 gene (Fejes et al., Plant Mol. Biol. 15: 921-932 (1990)), the promoter for the CAB-gene 1 from spinach (Lubberstedt et al., Plant Physiol. 104: 997-1006 (1994)), the promoter for the rice cab1 R gene (Luan et al., Plant Cell, 4: 971-981 (1992)), the promoter for pyruvate, corn orthophosphate dichinase (PPDK) (Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 95869590 (1993)), the promoter for the tobacco Lhcb1 * 2 gene (Cerdan et al., Plant Mol. Biol., 33: 245-255 (1997)), the promoter for SUC2 sucrose-H + symporter from Arabidopsis thaliana (Truernit et al., Planta 196: 564-570 (1995)) and the promoter for spinach thylakoid membrane proteins (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, c ab, rbcS). Other promoters for a / b chlorophyll-fixing proteins can also be used in the invention, such as promoters for LhcB and the white mustard PsbP gene (Sinapis alba, Kretsch et al., Plant Mol. Biol. 28: 219 -229 (1995)).

Com a finalidade de expressão em tecidos submersos (sink tissues) da planta, tal como o tubérculo da planta de batata, o fruto do tomate ou a semente de milho, trigo, arroz e cevada, é preferível que os promotores utilizados na invenção tenham expressão relativamente alta nesses tecidos específicos. São conhecidos inúmeros promotores para genes com expressão específica para tubérculo ou expressão aumentada para tubérculo, incluindo o promotor para patatina classe I (Bevan et al., EMBO J. 8: 1899-1906 (1986); Jefferson et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)), oFor the purpose of expression in submerged tissues (sink tissues) of the plant, such as the tuber of the potato plant, the fruit of the tomato or the seed of corn, wheat, rice and barley, it is preferable that the promoters used in the invention have expression relatively high in those specific tissues. Numerous promoters are known for genes with specific expression for tuber or increased expression for tuber, including the promoter for patatin class I (Bevan et al., EMBO J. 8: 1899-1906 (1986); Jefferson et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006 (1990)), the

• · · · ♦ · · ·· ···· • ······ ·· ··· · · · • · · · · · · ····· ··· · · ·· » · · · · · promotor para os genes ADPGPP do tubérculo da batata, as grande e pequena subunidades, o promotor para sacarose sintase (Salanoubat e Belliard, Gene 60: 47-56 (1987), Salanoubat e Belliard, Gene 84: 181-185 (1989)), o promotor para as principais proteínas de tubérculo incluindo os complexos protéicos de 22 kd e inibidores da protease (Hannapel, Plant Physiol. 101: 703-704 (1993)), o promotor para o gene da sintase de amido de grânulo ligado (GBSS) (Visser et al., Plant Mol. Biol. 17: 691-699 (1991)) e outros promotores para patatina classe I e II (Koster-Topfer et al., Mol. Gen. Genet. 219: 390-396 (1989); Mignery et al., Gene, 62: 27-44 (1988)).• · · · ♦ · · ·· ···· • ······ ·· ··· · · · · · · · · · · ···· · ··· · ··· · · · · · · · Promoter for the potato tuber ADPGPP genes, the large and small subunits, the promoter for sucrose synthase (Salanoubat and Belliard, Gene 60: 47-56 (1987), Salanoubat and Belliard, Gene 84: 181-185 ( 1989)), the promoter for major tuber proteins including 22 kd protein complexes and protease inhibitors (Hannapel, Plant Physiol. 101: 703-704 (1993)), the promoter for the granule starch synthase gene bound (GBSS) (Visser et al., Plant Mol. Biol. 17: 691-699 (1991)) and other promoters for class I and II patatin (Koster-Topfer et al., Mol. Gen. Genet. 219: 390 -396 (1989); Mignery et al., Gene, 62: 27-44 (1988)).

Outros promotores também podem ser usados para expressar uma proteína ou fragmento da mesma em tecidos específicos, tais como sementes ou frutos. De fato, em uma modalidade preferida, o promotor usado é um promotor específico para semente. Exemplos de tais promotores incluem as regiões reguladoras 5’ de genes tais como napina (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991)), faseolina (Bustos et al., Plant Cell, 1(9): 839-853 (1989)), inibidor da tripsina da soja (Riggs et al., Plant Cell 1(6): 609-621 (1989)), ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2): 255-267 (1993)), estearoil-ACP desaturase (Slocombe et al., Plant Physiol. 104(4): 167-176 (1994), subunidade a’ de b-conglicinina da soja (soy 7s, (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 83: 8560-8564 (1986))), e oleosina (vide, por exemplo, Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3): 549-555 (1997)). Outros exemplos incluem o promotor para β-conglicinina (Chen et al., Dev. Genet. 10: 112-122 (1989)). Também estão incluídas as zeínas, que constituem um grupo de proteínas de armazenamento encontradas no endosperma do milho. Foram isolados clones genômicos para genes de zeína (Pedersen et al., Cell 29: 1015-1026 (1982), e Russell et al., Transgenic Res. 6(2): 157-168) e os promotores desses clones, incluindo os 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e genes, também puderam ser usados. Outros promotores que se sabe funcionarem, por exemplo, em milho incluem os promotores para os seguintes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, enzimas ramificadoras I e II, sintases de amido, enzimas desramificadoras, oleosinas, glutelinas e sacarose sintases. Um promotor particularmente preferido para expressão em endos-Other promoters can also be used to express a protein or fragment thereof in specific tissues, such as seeds or fruits. In fact, in a preferred embodiment, the promoter used is a seed-specific promoter. Examples of such promoters include the 5 'regulatory regions of genes such as napine (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991)), phasolin (Bustos et al., Plant Cell, 1 (9) : 839-853 (1989)), soybean trypsin inhibitor (Riggs et al., Plant Cell 1 (6): 609-621 (1989)), ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22 ( 2): 255-267 (1993)), stearoyl-ACP desaturase (Slocombe et al., Plant Physiol. 104 (4): 167-176 (1994), a 'subunit of soy b-conglycinin (soy 7s, ( Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8560-8564 (1986))), and oleosin (see, for example, Hong et al., Plant Mol. Biol., 34 (3): 549 -555 (1997)). Other examples include the β-conglycinin promoter (Chen et al., Dev. Genet. 10: 112-122 (1989)). Also included are zeins, which constitute a group of storage proteins found in the corn endosperm, genomic clones for zein genes were isolated (Pedersen et al., Cell 29: 1015-1026 (1982), and Russell et al., Transgenic Res. 6 (2): 157- 168) and the promoters of these clones, including the 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD and genes, could also be used. Other promoters known to work, for example, on maize include promoters for the following genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, branching enzymes I and II, starch synthases, debranching enzymes, oleosins, glutellins and sucrose synthases. A particularly preferred promoter for expression in endoscopes

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perma de milho é o promotor para o gene de glutelina do arroz, mais particularmente o promotor Osgt-1 (Zheng et al., Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842 (1993)). Exemplos de promotores adequados para expressão em milho incluem os promotores para as subunidades de ADPglicose pirossintase (ADPGPP), a sintase de amido de grânulo ligado e outras sintases de amido, as enzimas ramificadoras e desramificadoras, as proteínas abundantes em embriogênese, as gliadinas e as gluteninas. Exemplos de tais promotores em arroz incluem os promotores para as subunidades de ADPGPP, a sintase de amido de grânulo ligado e outras sintases de amido, as enzimas ramificadoras, as enzimas desramificadoras, sacarose sintases e as glutelinas. Um promotor particularmente preferido é o promotor para a glutelina do arroz, Osgt-1. Exemplos de tais promotores para a cevada incluem aqueles para as subunidades de ADPGPP, a sintase de amido de grânulo ligado e outras sintases de amido, as enzimas ramificadoras, as enzimas desramificadoras, sacarose sintases, as hordeínas, as globulinas de embrião e as proteínas específicas para aleurona. Um promotor específico para expressão na semente é um promotor para napina.Corn perma is the promoter for the rice glutelin gene, more particularly the Osgt-1 promoter (Zheng et al., Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842 (1993)). Examples of suitable promoters for expression in maize include promoters for the ADPglucose pyrosyntase (ADPGPP) subunits, bound granule starch synthase and other starch synthases, branching and debranching enzymes, abundant proteins in embryogenesis, gliadins and glutenins. Examples of such promoters in rice include promoters for the ADPGPP subunits, bound granule starch synthase and other starch synthases, branching enzymes, debranching enzymes, sucrose synthases and glutellins. A particularly preferred promoter is the promoter for rice glutelin, Osgt-1. Examples of such promoters for barley include those for ADPGPP subunits, granule-bound starch synthase and other starch synthases, branching enzymes, debranching enzymes, sucrose synthases, hordeins, embryo globulins and specific proteins for aleurone. A specific promoter for expression in the seed is a promoter for napine.

Promotores específicos para raiz também podem ser usados. Um exemplo de tal promotor é o promotor para o gene de quitinase ácida (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25: 587-596 (1994)). A expressão em tecido radicular também pode ser feita utilizando-se os subdomínios específicos para raiz do promotor CaMV35S que foram identificados (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86: 7890-7894 (1989)). Outros promotores específicos para célula de raiz incluem aqueles relatados por Conkling et al. (Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203-1211 (1990)).Root specific promoters can also be used. An example of such a promoter is the promoter for the acid chitinase gene (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25: 587-596 (1994)). Expression in root tissue can also be done using the root-specific subdomains of the CaMV35S promoter that have been identified (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 7890-7894 (1989)). Other root cell-specific promoters include those reported by Conkling et al. (Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203-1211 (1990)).

Promotores adicionais que podem ser utilizados estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°^s 5.378.619, 5.391.725, 5.428.147, 5.447.858; 5.608.144, 5.608.144, 5.614.399, 5.633.441, 5.633.435 e 4.633.436. Além disso, pode-se usar um intensificador específico para tecido (Fromm et al., The Plant Cell 1: 977-984 (1989)).Additional promoters which may be used are described for example in US Patents ^Nos 5,378,619, 5,391,725, 5,428,147, 5,447,858; 5,608,144, 5,608,144, 5,614,399, 5,633,441, 5,633,435 and 4,633,436. In addition, a tissue-specific enhancer can be used (Fromm et al., The Plant Cell 1: 977-984 (1989)).

Constructos ou vetores também podem incluir, com a região codificadora de interesse, uma seqüência de ácidos nucléicos que age, total *···· · · · · · ··· • ······ ·· ··· · · · • ··· · · · · · · · · ··· · ··· · ·· · · · ou parcialmente, para terminar a transcrição daquela região. Inúmeras dessas seqüências já foram isoladas, incluindo a seqüência Tr7 3’ e a seqüência NOS 3’ (Ingelbrecht et al., The Plant Cell, 1: 671-680 (1989); Bevan et al., Nucleic Acid Res. 11: 369-385 (1983)). Regiões reguladoras de término de transcrição também podem ser fornecidas nos constructos de expressão em plantas desta invenção. As regiões de término de transcrição podem ser fornecidas pela seqüência de DNA codificando o gene de interesse ou uma região de término de transcrição conveniente derivada de uma fonte diferente de genes, por exemplo a região de término de transcrição que está naturalmente associada com a região de início de transcrição. O versado na técnica vai perceber que qualquer região de término de transcrição conveniente capaz de terminar a transcrição em uma célula de planta pode ser empregada nos constructos da presente invenção.Constructs or vectors can also include, with the coding region of interest, a sequence of nucleic acids that acts, total * ···· · · · · · ··· • ······ ·· ··· · · · • ··· · · · · · · · ··· · ··· · ·· · · · or partially, to end the transcription of that region. Numerous of these sequences have been isolated, including the Tr7 3 'sequence and the NOS 3' sequence (Ingelbrecht et al., The Plant Cell, 1: 671-680 (1989); Bevan et al., Nucleic Acid Res. 11: 369 -385 (1983)). Regulatory transcription termination regions can also be provided in the plant expression constructs of this invention. The transcription termination regions can be provided by the DNA sequence encoding the gene of interest or a convenient transcription termination region derived from a different source of genes, for example the transcription termination region that is naturally associated with the transcription region. beginning of transcription. The person skilled in the art will realize that any suitable transcription termination region capable of terminating transcription in a plant cell can be employed in the constructs of the present invention.

Um vetor ou constructo também pode incluir elementos reguladores. Exemplos destes incluem o intron Adh 1 (Callis et al., Genes and Develop. 1: 1183-1200 (1987)), o intron de sacarose sintase (Vasil et al., Plant Physiol. 91: 1575-1579 (1989)) e o elemento TMV ômega (Gallie et al., The Plant Cell 1: 301-311 (1989)). Estes e outros elementos reguladores podem ser incluídos quando apropriado.A vector or construct can also include regulatory elements. Examples of these include the Adh 1 intron (Callis et al., Genes and Develop. 1: 1183-1200 (1987)), the sucrose synthase intron (Vasil et al., Plant Physiol. 91: 1575-1579 (1989)) and the omega TMV element (Gallie et al., The Plant Cell 1: 301-311 (1989)). These and other regulatory elements can be included where appropriate.

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador selecionável. Marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionadas plantas ou células de plantas que contêm o material genético exógeno. Exemplos destes incluem, porém sem limitação, um gene neo (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183-188 (1985)), que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionado para usar canamicina, Rptll, G418, hpt etc.; um gene bar que codifica a resistência ao bialaphos; um gene mutante de EPSP sintase (Hinchee et al., Bio/Technology 6: 915-922 (1988); Reynaerts et al., Selectable and Screenable Markers, In Gelvin e Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988); Reynaerts et al., Selectable and screenable markers, In Gelvin e Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988)), aadA (Jones et al., Mol. Gen. Genet. (1987)), que codifica a resistência ao glifosato; um gene deA vector or construct can also include a selectable marker. Selectable markers can also be used for selected plants or plant cells that contain exogenous genetic material. Examples of these include, but are not limited to, a neo gene (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183-188 (1985)), which codes for kanamycin resistance and can be selected to use kanamycin, Rptll, G418 , hpt etc .; a bar gene that codes for resistance to bialaphos; a mutant EPSP synthase gene (Hinchee et al., Bio / Technology 6: 915-922 (1988); Reynaerts et al., Selectable and Screenable Markers, In Gelvin and Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988) ; Reynaerts et al., Selectable and screenable markers, In Gelvin and Schilperoort, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988)), aadA (Jones et al., Mol. Gen. Genet. (1987)), which codes for glyphosate resistance; a gene of

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nitrilase que confere resistência ao bromoxynil (Stalker et al., J. Biol. Chem., 263: 6310-6314 (1988); um gene mutante de acetolactato sintase (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou à sulfoniluréia (Pedido de Patente Européia 154.204 (11 de setembro de 1985)), ALS (D’Halluin et al., Bio/Technology 10: 309-314 (1992)), e um gene DHFR resistente ao metotrexato (Thillet et al., J. Biol. Chem. 263: 12500-12508 (1988)). Um vetor ou constructo também pode incluir um peptídio de trânsito.nitrilase that confers resistance to bromoxynil (Stalker et al., J. Biol. Chem., 263: 6310-6314 (1988); a mutant acetolactate synthase (ALS) gene that confers resistance to imidazolinone or sulfonylurea (European Patent Application) 154,204 (September 11, 1985)), ALS (D'Halluin et al., Bio / Technology 10: 309-314 (1992)), and a methotrexate-resistant DHFR gene (Thillet et al., J. Biol. Chem 263: 12500-12508 (1988)) A vector or construct can also include a transit peptide.

A incorporação de um peptídio de trânsito para cloroplasto adequado também pode ser empregada (Publicação do Pedido de Patente Européia N° 0218571). Intensificadores translacionais também podem ser incorporados como parte do DNA do vetor. As constructos de DNA podem conter uma ou mais seqüências líderes não-traduzidas 5’ que podem servir para melhorar a expressão dos genes produzidos das transcrições de mRNA resultantes. Tais seqüências podem ser derivadas do promotor selecionado para expressar o gene ou podem ser especificamente modificadas para aumentar a translação do mRNA. Tais regiões também podem ser obtidas de RNAs virais, de genes eucarióticos adequados ou de uma seqüência de genes sintética. Para uma revisão sobre a otimização da expressão de transgenes vide Koziel et al., Plant Mol. Biol. 32: 393-405 (1996). Um peptídio de trânsito preferido é o CTP1. Em uma outra modalidade, o peptídio de trânsito é uma seqüência de CTP2.The incorporation of a transit peptide for suitable chloroplast can also be employed (European Patent Application Publication No. 0218571). Translational enhancers can also be incorporated as part of the vector's DNA. DNA constructs can contain one or more 5 'untranslated leader sequences that can serve to improve the expression of the genes produced from the resulting mRNA transcripts. Such sequences can be derived from the promoter selected to express the gene or they can be specifically modified to increase mRNA translation. Such regions can also be obtained from viral RNAs, from suitable eukaryotic genes or from a synthetic gene sequence. For a review on the optimization of transgenic expression see Koziel et al., Plant Mol. Biol. 32: 393-405 (1996). A preferred transit peptide is CTP1. In another embodiment, the transit peptide is a CTP2 sequence.

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador rastreável. Marcadores rastreáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Marcadores rastreáveis exemplificativos incluem: um gene de βglicuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual se conhecem vários substratos cromogênicos (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405 (1987); Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (de cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al., Stadler Symposium 11: 263-282 (1988)); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 75: 3737-3741 (1978)), um gene que codifica uma enzima para a qual se conhecem vários substratos cromogênicosA vector or construct can also include a traceable marker. Traceable markers can be used to monitor the expression. Exemplary traceable markers include: a βglycuronidase or uidA (GUS) gene that encodes an enzyme for which several chromogenic substrates are known (Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405 (1987); Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987); an R locus gene, which encodes a product that regulates the production of anthocyanin pigments (red in color) in plant tissues (Dellaporta et al., Stadler Symposium 11: 263 -282 (1988)); a β-lactamase gene (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 3737-3741 (1978)), a gene that encodes an enzyme for which know several chromogenic substrates

(por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al., Science 234: 856-859 (1986)); um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 80: 1101-1105 (1983)) que codifica uma catecol disoxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikatu et al., Bio/Technol. 8: 241-242 (1990)); um gene de tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714 (1983)) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa para melanina; uma α-galactosidase, que se transformará em um substrato de α-galactose cromogênica.(for example, PADAC, a chromogenic cephalosporin); a luciferase gene (Ow et al., Science 234: 856-859 (1986)); an xylE gene (Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 1101-1105 (1983)) that encodes a catechol disoxygenase that can convert chromogenic catechols; an α-amylase gene (Ikatu et al., Bio / Technol. 8: 241-242 (1990)); a tyrosinase gene (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714 (1983)) that encodes an enzyme capable of oxidizing tyrosine to DOPA and dopaquinone which in turn condenses to melanin; an α-galactosidase, which will become a substrate for chromogenic α-galactose.

Incluídos na expressão genes marcadores selecionáveis ou rastreáveis também são genes que codificam um marcador secretável cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificar ou selecionar células transformadas. Exemplos incluem marcadores que codificam um antígeno secretável que pode ser identificado por interação com anticorpo, ou ainda enzimas secretáveis que podem ser detectadas cataiiticamente. Proteínas secretáveis se enquadram em inúmeras classes que incluem proteínas difusíveis pequenas que são detectáveis (por exemplo por ELISA), enzimas ativas pequenas que são detectáveis em solução extracelular (por exemplo, a-amilase, β-lactamase, fosfinotricina transferase), ou proteínas que são inseridas ou aprisionadas na parede celular (tais como proteínas que incluem uma seqüência líder tal como aquela encontrada na unidade de expressão de extensão ou tabaco PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis e/ou rastreáveis possíveis tornar-se-ão aparentes para o versado na técnica.Included in the expression selectable or traceable marker genes are also genes that encode a secretable marker whose secretion can be detected as a means of identifying or selecting transformed cells. Examples include markers that encode a secretible antigen that can be identified by interaction with the antibody, or secretible enzymes that can be detected catalytically. Secretible proteins fall into a number of classes that include small diffusible proteins that are detectable (for example by ELISA), small active enzymes that are detectable in extracellular solution (for example, a-amylase, β-lactamase, phosphinothricin transferase), or proteins that they are inserted or trapped in the cell wall (such as proteins that include a leader sequence such as that found in the extension or tobacco expression unit PR-S). Other possible selectable and / or traceable marker genes will become apparent to the person skilled in the art.

Existem muitos métodos para introduzir moléculas de ácido nucléico transformantes em células de plantas. Acredita-se que os métodos adequados incluam virtualmente todos os métodos pelos quais moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em uma célula, tal como por infecção em Agrobacterium ou distribuição direta das moléculas de ácido nucléico tal como, por exemplo, transformação mediada por PEG, eletroporação ou aceleração de partículas revestidas com DNA etc. (Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225 (1991); Vasil, Plant Mol. Biol. 25:There are many methods for introducing transforming nucleic acid molecules into plant cells. Suitable methods are believed to include virtually all methods by which nucleic acid molecules can be introduced into a cell, such as by Agrobacterium infection or direct distribution of the nucleic acid molecules such as, for example, PEG-mediated transformation, electroporation or acceleration of particles coated with DNA etc. (Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225 (1991); Vasil, Plant Mol. Biol. 25:

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925-937 (1994)). Por exemplo, eletroporação vem sendo usada para transformar protoplastos de milho (Fromm et al., Nature 312: 791-793 (1986)).925-937 (1994)). For example, electroporation has been used to transform corn protoplasts (Fromm et al., Nature 312: 791-793 (1986)).

Outros sistemas vetoriais adequados para introduzir DNA transformante em uma célula de planta hospedeira incluem, porém sem limitação, vetores binários de cromossomas artificiais (BIBAC) (Hamilton et al., Gene 200: 107-116 (1997)); e transfecção com vetores virais de RNA (Della-Cioppa et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. (1996), 792 (Engineering Plants for Commercial Products and Applications), 57-61). Sistemas vetoriais adicionais também incluem vetores de plantas YAC selecionáveis tais como aqueles descritos em Mullen et al., Molecular Breeding 4: 449-457 (1988).Other vector systems suitable for introducing transforming DNA into a host plant cell include, but are not limited to, binary artificial chromosome vectors (BIBAC) (Hamilton et al., Gene 200: 107-116 (1997)); and transfection with RNA viral vectors (Della-Cioppa et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. (1996), 792 (Engineering Plants for Commercial Products and Applications), 57-61). Additional vector systems also include selectable YAC plant vectors such as those described in Mullen et al., Molecular Breeding 4: 449-457 (1988).

A tecnologia para introdução de DNA em células é bastante conhecida pelos versados na técnica. Foram descritos quatro métodos gerais para distribuição de um gene em células: (1) métodos químicos (Graham e van der Eb, Virology 54: 536-539 (1973)); (2) métodos físicos tais como microinjeção (Capecchi, Cell 22: 479-488 (1980)), eletroporação (Wong e Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584-587 (1982); Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82: 5824-5828 (1985); Patente U.S. N° 5.384.253); a pistola genética (Johnston e Tang, Methods Cell Biol. 43: 353365 (1994)); e infiltração a vácuo (Bechtold et al., C.R. Acad. Sei. Paris, Life Sei. 316: 1194-1199 (1993)); (3) vetores virais (Clapp, Clin. Perinatol. 20:155-168 (1993); Lu et al., J. Exp. Med. 178: 2089-2096 (1993); Eglitis e Anderson, Biotechniques 6: 608-614 (1988)); e (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3: 147-154 (1992), Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89: 6099-6103 (1992)).The technology for introducing DNA into cells is well known to those skilled in the art. Four general methods for delivering a gene to cells have been described: (1) chemical methods (Graham and van der Eb, Virology 54: 536-539 (1973)); (2) physical methods such as microinjection (Capecchi, Cell 22: 479-488 (1980)), electroporation (Wong and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584-587 (1982); Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 5824-5828 (1985); US Patent No. 5,384,253); the genetic pistol (Johnston and Tang, Methods Cell Biol. 43: 353365 (1994)); and vacuum infiltration (Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316: 1194-1199 (1993)); (3) viral vectors (Clapp, Clin. Perinatol. 20: 155-168 (1993); Lu et al., J. Exp. Med. 178: 2089-2096 (1993); Eglitis and Anderson, Biotechniques 6: 608- 614 (1988)); and (4) receptor-mediated mechanisms (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3: 147-154 (1992), Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 6099-6103 (1992)).

Métodos de aceleração que podem ser utilizados incluem, por exemplo, bombardeamento de microprojéteis e outros. Um exemplo de um método para distribuir moléculas de ácido nucléico transformantes em células de plantas é o bombardeamento de microprojéteis. Este método foi revisto por Yang e Christou (eds.), Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Inglaterra (1994)). Partículas não biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidas com ácidos nucléicos e distribuídas em células por uma força propulsora. Partículas exemplificativas incluemAcceleration methods that can be used include, for example, bombardment of microprojectiles and others. An example of a method for distributing transforming nucleic acid molecules into plant cells is the bombardment of microprojectiles. This method was reviewed by Yang and Christou (eds.), Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, England (1994)). Non-biological particles (microprojectiles) that can be coated with nucleic acids and distributed in cells by a propelling force. Exemplary particles include

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aquelas constituídas de tungstênio, ouro, platina e outros.those consisting of tungsten, gold, platinum and others.

Uma vantagem particular do bombardeamento de microprojéteis, além de ser um meio eficaz de transformar monocotiledôneas de forma reproduzível, é que nem o isolamento de protoplastos (Cristou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)), nem a suscetibilídade à infecção por Agrobacterium se faz necessária. Uma modalidade ilustrativa de um método para distribuir DNA em células de milho por aceleração é um sistema de distribuição de α-partículas biolíticas, que pode ser usado para propelir partículas revestidas com DNA por um anteparo, tal como um anteparo de aço inoxidável ou de Nytex, e dali para uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. Gordon-Kamm et al. descrevem o procedimento básico para revestir partículas de tungstênio com DNA (GordonKramm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)). O anteparo dispersa as partículas de ácido nucléico com tungstênio para que elas não sejam distribuídas para as células receptoras em grandes agregados. Um sistema de distribuição de partículas adequado para uso na invenção é a pistola de aceleração com hélio PDS-1000/He, que se encontra disponível no Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad, Hercules, Califórnia) (Sanford et al., Technique 3: 3-16 (1991)).A particular advantage of microprojectile bombardment, in addition to being an effective means of transforming monocots in a reproducible way, is that neither the isolation of protoplasts (Cristou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)), nor the susceptibility Agrobacterium infection is necessary. An illustrative embodiment of a method for distributing DNA in corn cells by acceleration is a distribution system for α-biolitic particles, which can be used to propel particles coated with DNA through a screen, such as a stainless steel or Nytex screen. , and from there to a filter surface covered with maize cells grown in suspension. Gordon-Kamm et al. describe the basic procedure for coating tungsten particles with DNA (GordonKramm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)). The bulkhead disperses the nucleic acid particles with tungsten so that they are not distributed to the recipient cells in large aggregates. A particle distribution system suitable for use in the invention is the PDS-1000 / He helium acceleration gun, which is available from Bio-Rad Laboratories (Bio-Rad, Hercules, California) (Sanford et al., Technique 3 : 3-16 (1991)).

Para o bombardeamento, células em suspensão podem ser concentradas em filtros. Os filtros contendo as células a serem bombardeadas são posicionados a uma distância apropriada abaixo da placa de paralisação dos microprojéteis. Se desejado, um ou mais anteparos também são posicionados entre a pistola e as células a serem bombardeadas.For bombardment, cells in suspension can be concentrated on filters. The filters containing the cells to be bombarded are positioned at an appropriate distance below the microprojectile stop plate. If desired, one or more bulkheads are also positioned between the pistol and the cells to be bombed.

Alternativamente, embriões imaturos ou outras células alvo podem ser dispostas em um meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas a uma distância apropriada abaixo da placa de paralisação dos microprojéteis. Se desejado, um ou mais anteparos também podem ser posicionados entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Usando-se as técnicas aqui descritas pode-se obter 1000 ou mais loci de células expressando temporariamente um gene marcador. O número de células em um foco que expressa o gene exógeno produzido 48 horas após o bombardeamento geralmente varia de um a dez, eAlternatively, immature embryos or other target cells can be arranged in a solid culture medium. The cells to be bombarded are positioned at an appropriate distance below the microprojectile stop plate. If desired, one or more bulkheads can also be positioned between the acceleration device and the cells to be bombed. Using the techniques described here, 1000 or more cell loci can be obtained by temporarily expressing a marker gene. The number of cells in a focus that expresses the exogenous gene produced 48 hours after the bombing generally ranges from one to ten, and

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em média de um a três.on average from one to three.

Na transformação por bombardeamento, pode-se otimizar as condições de cultura antes do bombardeamento e os parâmetros de bombardeamento para produzir o número máximo de transformantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos quanto os parâmetros biológicos para o bombardeamento são importantes nesta tecnologia. Fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação do precipitado de DNA/microprojéteis ou aqueles que afetam a trajetória e a velocidade dos macroprojéteis ou microprojéteis. Fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente depois do bombardeamento, o ajuste osmótico de células alvo para ajudar a aliviar o trauma associado com o bombardeamento e também a natureza do DNA transformante, tal como DNA linearizado ou plasmídeos superespiralados intatos. Acredita-se que manipulações antes do bombardeamento são especialmente importantes para o sucesso da transformação de embriões imaturos.In bombardment transformation, culture conditions prior to bombardment and bombardment parameters can be optimized to produce the maximum number of stable transformers. Both physical and biological parameters for bombing are important in this technology. Physical factors are those that involve the manipulation of the DNA / microprojectile precipitate or those that affect the trajectory and speed of macroprojectiles or microprojectiles. Biological factors include all the steps involved in manipulating cells before and immediately after bombardment, osmotic adjustment of target cells to help alleviate the trauma associated with the bombardment and also the nature of the transforming DNA, such as linearized DNA or intact superpirated plasmids . Manipulations before the bombing are believed to be especially important for the successful transformation of immature embryos.

Em uma outra modalidade alternativa, plastídios podem ser transformados de forma estável. Os métodos descritos para a transformação de plastídios em plantas superiores incluem a distribuição de DNA contendo um marcador selecionável por pistola de partículas e o direcionamento do DNA para o genoma de plastídio por recombinação homóloga (Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 87: 8526-8530 (1990); Svab e Maliga, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 90: 913-917 (1993); Staub e Maliga, EMBO J. 12: 601-606 (1993); Patentes U.S. 5.451.513 e 5.545.818).In another alternative embodiment, plastids can be transformed in a stable manner. The methods described for transforming plastids into higher plants include distributing DNA containing a selectable marker by particle gun and targeting the DNA to the plastid genome by homologous recombination (Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 87: 8526-8530 (1990); Svab and Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 913-917 (1993); Staub and Maliga, EMBO J. 12: 601-606 ( 1993); US Patents 5,451,513 and 5,545,818).

Por conseguinte, considera-se que se pode desejar ajustar vários aspectos dos parâmetros de bombardeamento em estudos de pequena escala para otimizar totalmente as condições. Pode-se desejar particularmente ajustar os parâmetros físicos tais como distância de afastamento, distância da trajetória, distância do tecido e pressão de hélio. Também se pode minimizar os fatores de redução de trauma modificando-se as condições que influenciam o estado fisiológico das células receptoras e que portanto podem influenciar a eficácia de transformação e de integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação do tecido e o estágio de subeultu-Therefore, it is considered that it may be desired to adjust various aspects of the bombing parameters in small-scale studies to fully optimize conditions. It may be particularly desirable to adjust the physical parameters such as distance away, path distance, tissue distance and helium pressure. Trauma reduction factors can also be minimized by modifying the conditions that influence the physiological state of the recipient cells and therefore can influence the efficiency of transformation and integration. For example, the osmotic state, tissue hydration and the sub-cultured stage

ra ou o ciclo celular das células receptoras podem ser ajustados para transformação ótima. A execução de outros ajustes de rotina ficará clara para os versados na técnica à luz do presente relatório.the cell cycle of the recipient cells can be adjusted for optimal transformation. The execution of other routine adjustments will be clear to those skilled in the art in the light of this report.

Transferência mediada por Agrobacterium é um sistema amplamente aplicável para introduzir genes em células de plantas porque o DNA pode ser introduzido em tecidos de plantas inteiros, dessa forma superando a necessidade de regeneração de uma planta intacta a partir de um protoplasto. O uso de vetores de integração de plantas mediados por Agrobacterium para introduzir DNA em células de plantas é bastante conhecido na técnica. Vide, por exemplo, os métodos descritos por Fraley et al., Bio/Technology 3: 629-635 (1985) e Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253-277 (1987). Ainda, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso que resulta em poucos rearranjos. A região de DNA a ser transferida é definida pelas seqüências de borda e um DNA interveniente geralmente é inserido na genoma da planta da maneira descrita (Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 34 (1986)).Agrobacterium-mediated transfer is a widely applicable system for introducing genes into plant cells because DNA can be introduced into whole plant tissues, thereby overcoming the need for regeneration of an intact plant from a protoplasty. The use of Agrobacterium-mediated plant integration vectors to introduce DNA into plant cells is well known in the art. See, for example, the methods described by Fraley et al., Bio / Technology 3: 629-635 (1985) and Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253-277 (1987). Still, the integration of Ti-DNA is a relatively precise process that results in few rearrangements. The DNA region to be transferred is defined by the border sequences and an intervening DNA is usually inserted into the plant's genome in the manner described (Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 34 (1986)).

Os vetores de transformação de Agrobacterium modernos são capazes de replicar em E. coli e também em Agrobacterium, possibilitando manipulação convenientes, como descrito (Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn e Schell (eds.), Springer-Verlag, New York, págs. 179-203 (1985)). Além disso, os avanços tecnológicos em vetores para transferência de genes mediada por Agrobacterium melhoraram o arranjo dos genes e dos sítios de restrição nos vetores para facilitar a constructo de vetores capazes de expressar vários genes codificadores de polipeptídios. Os vetores descritos possuem regiões de ligantes múltiplos convenientes, flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para expressão direta dos genes codificadores de polipeptídios inseridos e são adequados para os propósitos da presente invenção (Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253277 (1987)). Além disso, Agrobacterium contendo genes Ti armados e desarmados pode ser usado para as transformações. Nas cepas de plantas onde a transformação mediada por Agrobacterium é eficiente, este é o método preferido por causa da natureza simples e definida da transferência deModern Agrobacterium transformation vectors are able to replicate in E. coli and also in Agrobacterium, enabling convenient manipulation, as described (Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell (eds.), Springer-Verlag , New York, pp. 179-203 (1985)). In addition, technological advances in vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer have improved the arrangement of genes and restriction sites in vectors to facilitate the construction of vectors capable of expressing various polypeptide encoding genes. The described vectors have convenient multiple ligand regions, flanked by a promoter and a polyadenylation site for direct expression of the inserted polypeptide encoding genes and are suitable for the purposes of the present invention (Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253277 ( 1987)). In addition, Agrobacterium containing armed and disarmed Ti genes can be used for the transformations. In strains of plants where Agrobacterium-mediated transformation is efficient, this is the preferred method because of the simple and defined nature of

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genes.genes.

Uma planta transgênica formada usando-se métodos de transformação com Agrobacterium tipicamente contém um único gene em um cromossoma. Tais plantas transgênicas podem ser ditas como sendo heterozigoto para o gene adicionado. Mais preferida é uma planta transgênica que é homozigoto para o gene estrutural adicionado, isto é, uma planta transgênica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada cromossoma de um par de cromossomas. Uma planta transgênica homozigoto pode ser obtida por acasalamento sexuado (autopolinização) de uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene adicionado, germinação de algumas das sementes produzidas e análise das plantas resultantes produzidas quanto ao gene de interesse.A transgenic plant formed using Agrobacterium transformation methods typically contains a single gene on a chromosome. Such transgenic plants can be said to be heterozygous for the added gene. Most preferred is a transgenic plant that is homozygous for the added structural gene, i.e., a transgenic plant that contains two added genes, one gene at the same locus on each chromosome of a chromosome pair. A homozygous transgenic plant can be obtained by sexually mating (self-pollinating) an independent segregating transgenic plant that contains a single added gene, germinating some of the seeds produced and analyzing the resulting plants produced for the gene of interest.

Também deve ficar entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser acasaladas para produzir descendentes que contenham dois genes exógenos independentemente segregantes. Autopolinização da progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotos para os dois genes exógenos adicionados que codificam um polipeptídio de interesse. Cruzamento reversível para a planta matriz e cruzamento externo com uma planta não-transgênica também são considerados, assim como a propagação vegetativa.It should also be understood that two different transgenic plants can also be mated to produce offspring that contain two independently segregating exogenous genes. Self-pollination of the appropriate progeny can produce plants that are homozygous for the two added exogenous genes that encode a polypeptide of interest. Reversible crossing to the parent plant and external crossing with a non-transgenic plant are also considered, as well as vegetative propagation.

A transformação de plantas pode ser obtida usando-se métodos baseados em precipitação de fosfato de cálcio, tratamento com polietileno glicol, eletroporação e combinações destes tratamentos (vide, por exemplo, Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986); Lorz et al., Mol. Gen. Genet. 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature 319: 791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet. 204: 204 (1986); Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988)).Plant transformation can be achieved using methods based on calcium phosphate precipitation, treatment with polyethylene glycol, electroporation and combinations of these treatments (see, for example, Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 205: 193- 200 (1986); Lorz et al., Mol. Gen. Genet. 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature 319: 791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet. 204: 204 (1986); Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988)).

A aplicação desses sistemas a diferentes cepas de plantas depende da capacidade para regenerar aquela cepa de planta específica a partir de protoplastos. Estão descritos métodos ilustrativos para a regeneração de cereais a partir de protoplastos (Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters 2: 74 (1985); Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34 (1986);The application of these systems to different plant strains depends on the ability to regenerate that specific plant strain from protoplasts. Illustrative methods for regenerating cereals from protoplasts are described (Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters 2: 74 (1985); Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34 (1986);

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Yamada et al., Plant Cell Rep. 4:85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology 4: 1087(1986)).Yamada et al., Plant Cell Rep. 4:85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology 4: 1087 (1986)).

Para transformar cepas de plantas que não podem ser regeneradas com sucesso a partir de protoplastos, podem ser utilizadas outras maneiras de introduzir DNA em células ou tecidos intactos. Por exemplo, a regeneração de cereais a partir de embriões imaturos ou explantes pode ser efetuada da maneira descrita (Vasil, Biotechnology 6: 397 (1988)). Além disso, pode-se utilizar a tecnologia da pistola de partículas’ ou de microprojéteis em alta velocidade (Vasil et al., Bio/Technology 10: 667 (1992)).To transform strains of plants that cannot be successfully regenerated from protoplasts, other ways of introducing DNA into intact cells or tissues can be used. For example, the regeneration of cereals from immature embryos or explants can be carried out in the manner described (Vasil, Biotechnology 6: 397 (1988)). In addition, one can use particle gun technology or microprojectiles at high speed (Vasil et al., Bio / Technology 10: 667 (1992)).

Usando-se esta última tecnologia, o DNA é transportado através da parede celular e então para o citoplasma na superfície de pequenas partículas metálicas como descrito (Klein et al., Nature 328: 70 (1987); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85: 8502-8505 (1988); McCabe et al., Bio/Technology 6: 923 (1988)). As partículas metálicas penetram através das várias camadas das células e assim possibilitam a transformação das células em explantes de tecido.Using this latest technology, DNA is transported through the cell wall and then into the cytoplasm on the surface of small metal particles as described (Klein et al., Nature 328: 70 (1987); Klein et al., Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 85: 8502-8505 (1988); McCabe et al., Bio / Technology 6: 923 (1988)). The metallic particles penetrate through the various layers of the cells and thus enable the transformation of the cells into tissue explants.

Outros métodos de transformação de células também podem ser usados e incluem, porém sem limitação, a introdução de DNA em plantas por transferência direta de DNA para o pólen (Hess et al., Intern Rev. Cytol. 107: 367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Repórter 6: 165 (1988)), por injeção direta de DNA nos órgãos reprodutores de uma planta (Pena et al., Nature 325: 274 (1987)), ou por injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos seguida da reidratação de embriões desidratados (Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987)).Other methods of transforming cells can also be used and include, but are not limited to, introducing DNA into plants by direct transfer of DNA to pollen (Hess et al., Intern Rev. Cytol. 107: 367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Reporter 6: 165 (1988)), by direct DNA injection into the reproductive organs of a plant (Pena et al., Nature 325: 274 (1987)), or by direct DNA injection in the cells of immature embryos followed by rehydration of dehydrated embryos (Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987)).

A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes de um único protoplasto da planta ou de vários explantes transformados são bastante conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA, (1988)). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas, cultivo dessas células individualizadas através dos estágios usuais do desenvolvimento embriônico através do estágio de plantícula com raiz. Embriões e sementesThe regeneration, development and cultivation of plants from transformants of a single plant protoplast or of several transformed explants are well known in the art (Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA , (1988)). This process of regeneration and growth typically includes the stages of selection of transformed cells, cultivation of these individualized cells through the usual stages of embryonic development through the root planticle stage. Embryos and seeds

transgênicos são regenerados de maneira semelhante. Os brotos transgênicos com raiz resultantes são depois plantados em um meio de crescimento de planta apropriado tal como solo.GMOs are regenerated in a similar way. The resulting transgenic rooted shoots are then planted in an appropriate plant growth medium such as soil.

O desenvolvimento ou a regeneração de plantas contendo o gene exógeno estranho que codifica uma proteína de interesse são bastante conhecidos na técnica. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para produzir plantas transgênicas homozigotos. Senão, pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas desenvolvidas de sementes de linhagens agronomicamente importantes. Ou então, pólen de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da invenção contendo um polipeptídio desejado é cultivada usando-se métodos bastante conhecidos pelos versados na técnica.The development or regeneration of plants containing the foreign exogenous gene encoding a protein of interest is well known in the art. Preferably, the regenerated plants are self-pollinated to produce homozygous transgenic plants. Otherwise, pollen obtained from regenerated plants is crossed with plants developed from seeds of agronomically important strains. Or, pollen from plants of these important strains is used to pollinate regenerated plants. A transgenic plant of the invention containing a desired polypeptide is grown using methods well known to those skilled in the art.

Existem vários métodos para a regeneração de plantas a partir de tecido de planta. O método de regeneração específico vai depender do tecido de planta inicial e da espécie de planta específica a ser regenerada.There are several methods for plant regeneration from plant tissue. The specific regeneration method will depend on the initial plant tissue and the specific plant species to be regenerated.

Métodos para transformar dicotiledôneas, principalmente usando Agrobacterium tumefaciens, e obter plantas transgênicas foram publicados para algodão (Patente U.S. N° 5.004.863, Patente U.S. N° 5.159.135, Patente U.S. N° 5.518.908); soja (Patente U.S. N° 5.569.834, Patente U.S. N° 5.416.011, McCabe et al., Biotechnology 6: 923 (1988), Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)); Brassica (Patente U.S. N° 5.463.174); amendoim (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653-657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14: 699-703 (1995)); mamão, ervilha (Grant et al., Plant Cell Rep. 15: 254-258 (1995)); e Arabidopsis thaliana (Bechtold et al., C.R. Acad. Sei. Paris, Life Sei. 316: 1194-1199 (1993)). Este último método para transformar Arabidopsis thaliana é comumente chamado de imersão ou infiltração a vácuo ou transformação de germoplasma.Methods for transforming dicots, mainly using Agrobacterium tumefaciens, and obtaining transgenic plants have been published for cotton (U.S. Patent No. 5,004,863, U.S. Patent No. 5,159,135, U.S. Patent No. 5,518,908); soy (U.S. Patent No. 5,569,834, U.S. Patent No. 5,416,011, McCabe et al., Biotechnology 6: 923 (1988), Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)); Brassica (U.S. Patent No. 5,463,174); peanuts (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653-657 (1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14: 699-703 (1995)); papaya, peas (Grant et al., Plant Cell Rep. 15: 254-258 (1995)); and Arabidopsis thaliana (Bechtold et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316: 1194-1199 (1993)). This latter method for transforming Arabidopsis thaliana is commonly called vacuum immersion or infiltration or transformation of germplasm.

A transformação de monocotiledôneas usando eletroporação, bombardeamento de partículas e Agrobacterium também já foi relatada. Transformação e regeneração de plantas já foi conseguida em aspargo (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84: 5354 (1987)); cevada (WanThe transformation of monocots using electroporation, particle bombardment and Agrobacterium has also been reported. Transformation and regeneration of plants has already been achieved in asparagus (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 5354 (1987)); barley (Wan

e Lemaux, Plant Physiol. 104: 37 (1994)); milho (Rhodes et al., Science 240: 204 (1988); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990); Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990); Koziel et al., Bio/Technology 11: 194 (1993); Armstrong et al., Crop Science 35: 550-557 (1995)); aveia (Somers et al., Bio/Technology 10: 1589 (1992)); gramínea de pomar (Horn et al., Plant Cell Rep. 7: 469 (1988); arroz (Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34 (1986); Part et al., Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148 (1996); Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24: 133-141 (1997); Zhang e Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988); Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379 (1988); Battraw e Hall, Plant Sei. 86: 191-202 (1992); Christou et al., Bio/Technology 9: 957 (1991)); centeio (De Ia Pena et al., Nature 325: 274 (1987)); cana-de-açúcar (Bower e Birch, Plant J. 2: 409 (1992)); festuca alta (Wang et al., Bio/Technology 10: 691 (1992)) e trigo (Vasil et al., Bio/Technology 10: 667 (1992); Patente U.S. N° 5.631.152).and Lemaux, Plant Physiol. 104: 37 (1994)); corn (Rhodes et al., Science 240: 204 (1988); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990); Fromm et al., Bio / Technology 8: 833 (1990); Koziel et al., Bio / Technology 11: 194 (1993); Armstrong et al., Crop Science 35: 550-557 (1995)); oats (Somers et al., Bio / Technology 10: 1589 (1992)); orchard grass (Horn et al., Plant Cell Rep. 7: 469 (1988); rice (Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205: 34 (1986); Part et al., Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148 (1996); Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24: 133-141 (1997); Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988); Zhang et al. ., Plant Cell Rep. 7: 379 (1988); Battraw and Hall, Plant Sci. 86: 191-202 (1992); Christou et al., Bio / Technology 9: 957 (1991)); rye (De Ia Pena et al., Nature 325: 274 (1987)); sugar cane (Bower and Birch, Plant J. 2: 409 (1992)); tall fescue (Wang et al., Bio / Technology 10: 691 (1992 )) and wheat (Vasil et al., Bio / Technology 10: 667 (1992); US Patent No. 5,631,152).

Ensaios para expressão de gene baseados na expressão temporária de constructos de ácido nucléico clonados foram desenvolvidos introduzindo-se moléculas de ácido nucléico em células de plantas por tratamento com polietileno glicol, eletroporação ou bombardeamento de partículas (Marcotte et al., Nature 335: 454-457 (1988); Marcotte et al., Plant Cell 1: 523-532 (1989); McCarty et al., Cell 66: 895-905 (1991); Hattori et al., Genes Dev. 6: 609-618 (1992); Goff et al., EMBO J. 9: 2517-2522 (1990)). Sistemas de expressão temporária podem ser usados para dissecar funcionalmente constructos de gene (vide Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press 1995)).Gene expression assays based on the temporary expression of cloned nucleic acid constructs have been developed by introducing nucleic acid molecules into plant cells by treatment with polyethylene glycol, electroporation or particle bombardment (Marcotte et al., Nature 335: 454- 457 (1988); Marcotte et al., Plant Cell 1: 523-532 (1989); McCarty et al., Cell 66: 895-905 (1991); Hattori et al., Genes Dev. 6: 609-618 ( 1992); Goff et al., EMBO J. 9: 2517-2522 (1990)). Temporary expression systems can be used to functionally dissect gene constructs (see Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press 1995).

Qualquer das moléculas de ácido nucléico da invenção pode ser introduzida em uma célula de planta de forma permanente ou temporária em combinação com outros elementos genéticos como vetores, promotores, intensificadores etc. Ainda, qualquer das moléculas de ácido nucléico da invenção pode ser introduzida em uma célula de planta de maneira que permita a expressão ou superexpressão da proteína codificada pela molécula de ácido nucléico, ou do fragmento da mesma.Any of the nucleic acid molecules of the invention can be introduced into a plant cell permanently or temporarily in combination with other genetic elements such as vectors, promoters, enhancers, etc. In addition, any of the nucleic acid molecules of the invention can be introduced into a plant cell in a way that allows the expression or overexpression of the protein encoded by the nucleic acid molecule, or the fragment thereof.

Co-supressão é a redução nos níveis de expressão, geralmente • · · ·· ····( * · · φ · · · <Co-suppression is the reduction in expression levels, usually • · · ·· ···· (* · · φ · · · <

a nível de RNA, de um gene endógeno particular ou de uma família de genes pela expressão de um constructo homólogo de sentido normal que é capaz de transcrever o mRNA com o mesmo trançado que a transcrição do gene endógeno (Napoli et al., Plant Cell 2: 279-289 (1990); van der Krol et al., Plant Cell 2: 291-299 (1990)). A co-supressão pode resultar de transformação estável com uma única cópia de uma molécula de ácido nucléico que seja homóloga a uma seqüência de ácidos nucléicos encontrada com a célula (Prolls e Meyer, Plant J. 2: 465-475 (1992)) ou com cópias múltiplas de uma molécula de ácido nucléico que seja homóloga a uma molécula de ácido nucléico encontrada com a célula (Mittlesten et al., Mol. Gen. Genet. 244: 325-330 (1994)). Genes, ainda que diferentes, ligados a promotores homólogos podem resultar na co-supressão dos genes ligandos (Vaucheret, C.R. Acad. Sei. III 316: 1471-1483 (1993); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 91: 3490-3496 (1994); van Blokland et al., Plant J. 6: 861-877 (1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8: 340-344 (1990); Meins e Kunz, In: Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants, Paszkowski (ed.), págs. 335-348, Kluwer Academic, Países Baixos (1994)).at the level of RNA, a particular endogenous gene or a family of genes by expressing a normal sense homologous construct that is capable of transcribing the mRNA with the same strand as the transcription of the endogenous gene (Napoli et al., Plant Cell 2: 279-289 (1990); van der Krol et al., Plant Cell 2: 291-299 (1990)). Co-suppression can result from stable transformation with a single copy of a nucleic acid molecule that is homologous to a sequence of nucleic acids found with the cell (Prolls and Meyer, Plant J. 2: 465-475 (1992)) or with multiple copies of a nucleic acid molecule that is homologous to a nucleic acid molecule found with the cell (Mittlesten et al., Mol. Gen. Genet. 244: 325-330 (1994)). Genes, albeit different, linked to homologous promoters can result in the co-suppression of ligand genes (Vaucheret, CR Acad. Sci. III 316: 1471-1483 (1993); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91: 3490-3496 (1994); van Blokland et al., Plant J. 6: 861-877 (1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8: 340-344 (1990); Meins and Kunz, In: Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants, Paszkowski (ed.), Pp. 335-348, Kluwer Academic, Netherlands (1994)).

Fica entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta e transcritos usandose um promotor apropriado, tal transcrição resultando na co-supressão de uma proteína endógena.It is understood that one or more of the nucleic acids of the invention can be introduced into a plant cell and transcribed using an appropriate promoter, such a transcription resulting in the co-suppression of an endogenous protein.

Abordagens anti-sentido constituem uma maneira de prevenir ou reduzir a função do gene por direcionamento do material genético (Mol et al., FEBS Lett. 268: 427-430 (1990)). O objetivo da abordagem anti-sentido é utilizar uma seqüência complementar ao gene alvo para bloquear sua expressão e criar uma linhagem celular ou organismo mutante no qual o nível de uma única proteína escolhida é seletivamente reduzido ou eliminado. As técnicas de anti-sentido apresentam várias vantagens em relação a outras abordagens ‘de genética invertida’. O sítio de inativação e seu efeito no desenvolvimento podem ser manipulados pela escolha de um promotor para genes anti-sentido ou pela cronometragem de aplicação externa ou microinjeção. O anti-sentido pode manipular sua especificidade pela seleçãoAntisense approaches are a way to prevent or reduce gene function by targeting genetic material (Mol et al., FEBS Lett. 268: 427-430 (1990)). The purpose of the antisense approach is to use a sequence complementary to the target gene to block its expression and create a cell line or mutant organism in which the level of a single chosen protein is selectively reduced or eliminated. Antisense techniques have several advantages over other ‘inverted genetics’ approaches. The inactivation site and its effect on development can be manipulated by choosing a promoter for antisense genes or by timing for external application or microinjection. The antisense can manipulate its specificity by selecting

seja de regiões únicas do gene alvo ou de regiões onde ele compartilha de homologia com outros genes relacionados (Hiatt et al., ln: Genetic Engineering, Setlow (ed.), vol. 11, New York, Plenum 49-63 (1989)).either from single regions of the target gene or from regions where it shares homology with other related genes (Hiatt et al., ln: Genetic Engineering, Setlow (ed.), vol. 11, New York, Plenum 49-63 (1989) ).

Técnicas de RNA anti-sentido envolvem introdução de RNA que seja complementar ao mRNA alvo em células, o que resulta em dúplexes RNA: RNA específicos sendo formados por pareamento de bases entre o substrato anti-sentido e mRNA alvo (Green et al., Annu. Rev. Biochem. 55: 569-597 (1986)). Em uma modalidade, o processo envolve a introdução e expressão de uma seqüência de genes anti-sentido. Tal seqüência é uma seqüência na qual parte das seqüências de genes normais ou todas elas são colocadas sob um promotor com orientação invertida para o filamento ‘errado’ ou complementar seja transcrito em um RNA anti-sentido nãocodificador que hibridiza com o mRNA alvo e interfere em sua expressão (Takayama e Inouye, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25: 155-184 (1990)). Um vetor anti-sentido é construído por procedimentos tradicionais e introduzido em células por transformação, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção etc. O tipo de transformação e a escolha do vetor vão determinar se a expressão é temporária ou estável. O promotor usado para o gene antisentido pode influenciar o nível, a cronometragem, o tecido, a especificidade ou a capacidade de ser induzida da inibição anti-sentido.Antisense RNA techniques involve introducing RNA that is complementary to the target mRNA in cells, which results in specific RNA: RNA duplexes being formed by base pairing between the antisense substrate and target mRNA (Green et al., Annu Rev. Biochem. 55: 569-597 (1986)). In one embodiment, the process involves the introduction and expression of a sequence of antisense genes. Such a sequence is a sequence in which part of the normal gene sequences, or all of them, are placed under a promoter with inverted orientation for the 'wrong' or complementary strand to be transcribed into a noncoding antisense RNA that hybridizes to the target mRNA and interferes with its expression (Takayama and Inouye, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25: 155-184 (1990)). An antisense vector is constructed by traditional procedures and introduced into cells by transformation, transfection, electroporation, microinjection, infection, etc. The type of transformation and the choice of the vector will determine whether the expression is temporary or stable. The promoter used for the antisense gene can influence the level, timing, tissue, specificity or inducibility of antisense inhibition.

Fica entendido que a atividade de uma proteína em uma célula de planta pode ser reduzida ou abaixada desenvolvendo-se uma célula de planta transformada contendo uma molécula de ácido nucléico cujo filamento não transcrito codifica uma proteína ou fragmento da mesma.It is understood that the activity of a protein in a plant cell can be reduced or lowered by developing a transformed plant cell containing a nucleic acid molecule whose non-transcribed strand encodes a protein or fragment thereof.

Silenciamento pós-transcricional do gene (PTGS) pode resultar em imunidade a vírus ou silenciamento do gene nas plantas. O PTGS é induzido por dsRNA e é mediado por uma RNA polimerase dependente de RNA, presente no citoplasma, que requer um gabarito de dsRNA. O dsRNA é formado por hibridização de mRNAs de transgenes complementares ou regiões complementares da mesma transcrição. A formação de dúplex pode ser realizada usando-se transcrições de um gene de sentido normal e um gene anti-sentido colocados no genoma da planta, uma transcrição simplesPost-transcriptional gene silencing (PTGS) can result in virus immunity or gene silencing in plants. PTGS is induced by dsRNA and is mediated by an RNA-dependent RNA polymerase, present in the cytoplasm, which requires a dsRNA template. DsRNA is formed by hybridization of mRNAs from complementary transgenes or complementary regions of the same transcription. Duplex formation can be performed using transcripts of a normal sense gene and an antisense gene placed in the plant genome, a simple transcription

ΓΓ · ···· 9 · · ,ΓΓ · ···· 9 · ·,

Oo · ··· · ··· · ·· que possui autocomplementaridade, ou transcrições de sentido normal e anti-sentido de genes unidos por cruzamento. O RNA polimerase dependente de dsRNA faz um filamento complementar a partir das moléculas de mRNA e RNAse de transgene presas a este filamento complementar (cRNA). Estas moléculas de cRNA-RNase hibridizam para o mRNA endógeno e clivam o RNA de filamento simples adjacente ao híbrido. Os RNAs de filamento simples clivados são ainda degradados por outros RNases hospedeiros porque um deles não terá uma extremidade 5’ capeada e outro não terá uma cauda de poli(A) (Waterhouse et al., PNAS 95: 13959-13964 (1998)).Oo · ··· · ··· · ·· that has self-complementarity, or normal sense and antisense transcripts of genes joined by crossing. The dsRNA-dependent RNA polymerase forms a complementary strand from the transgene mRNA and RNAse molecules attached to this complementary strand (cRNA). These cRNA-RNase molecules hybridize to the endogenous mRNA and cleave the single-stranded RNA adjacent to the hybrid. The cleaved single-stranded RNAs are further degraded by other host RNases because one will not have a capped 5 'end and the other will not have a poly (A) tail (Waterhouse et al., PNAS 95: 13959-13964 (1998)) .

Fica entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta e transcritos usandose um promotor apropriado, tal transcrição resultando no silenciamento póstranslacional do gene de uma transcrição endógena.It is understood that one or more of the nucleic acids of the invention can be introduced into a plant cell and transcribed using an appropriate promoter, such a transcription resulting in post-translational silencing of the gene for an endogenous transcription.

Anticorpos foram expressos em plantas (Hiatt et al., Nature 342: 76-78 (1989); Conrad e Fielder, Plant Mol. Biol. 26: 1023-1030 (1994)). A expressão citoplasmática de um scFv (anticorpo Fv de cadeia simples) foi reportada para retardar a infecção pelo vírus da prega malhada da alcachofra (artichoke mottled crinkle virus). Plantas transgênicas que expressam anticorpos direcionadas contra proteínas endógenas podem apresentar um efeito fisiológico (Philips et al., EMBO J. 16: 4489-4496 (1997); Marion-Poll, Trends in Plant Science 2: 447-448 (1997)). Por exemplo, foi relatado que anticorpos anti-abscísicos expressos resultam em uma perturbação geral do desenvolvimento das sementes (Philips et al., EMBO J. 16: 4489-4496 (1997)).Antibodies have been expressed in plants (Hiatt et al., Nature 342: 76-78 (1989); Conrad and Fielder, Plant Mol. Biol. 26: 1023-1030 (1994)). The cytoplasmic expression of a scFv (single chain Fv antibody) has been reported to delay infection by the artichoke mottled crinkle virus. Transgenic plants that express antibodies directed against endogenous proteins can have a physiological effect (Philips et al., EMBO J. 16: 4489-4496 (1997); Marion-Poll, Trends in Plant Science 2: 447-448 (1997)). For example, expressed anti-abscisic antibodies have been reported to result in a general disturbance of seed development (Philips et al., EMBO J. 16: 4489-4496 (1997)).

Anticorpos que são catalíticos também podem ser expressos em plantas (abzimas). O princípio por trás das abzimas é que uma que se podem criar anticorpos contra muitas moléculas, esta capacidade de reconhecimento pode ser direcionada para gerar anticorpos que se ligam a estados de transição para forçar uma reação química futura (Persidas, Nature Biotechnology 15: 1313-1315 (1997); Baca et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 461-493 (1997)). As habilidades catalíticas das abzimas podemAntibodies that are catalytic can also be expressed in plants (abzymes). The principle behind abzymes is that one can create antibodies against many molecules, this recognition capability can be directed to generate antibodies that bind to transition states to force a future chemical reaction (Persidas, Nature Biotechnology 15: 1313- 1315 (1997); Baca et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 461-493 (1997)). The catalytic abilities of abzymes can

• · · * · · · »···«· · · ·· ······· · ser melhoradas por mutagênese direcionada para o sítio. Exemplos de abzimas estão mostrados, por exemplo, na Patente U.S. N° 5.658.753, Patente U.S. N° 5.632.990, Patente U.S. N° 5.631.137, Patente U.S. N° 5.602.015, Patente U.S. N° 5.559.538, Patente U.S. N° 5.576.174, Patente• · · * · · · · ··· «· · · ········· · · be improved by site-directed mutagenesis. Examples of abzymes are shown, for example, in US Patent No. 5,658,753, US Patent No. 5,632,990, US Patent No. 5,631,137, US Patent No. 5,602,015, US Patent No. 5,559,538, US Patent No. 5,576,174, Patent

U.S. N° 5.500.358, Patente U.S. N° 5.318.897, Patente U.S. N° 5.298.409, Patente U.S. N° 5.258.289 e Patente U.S. N° 5.194.585.No. 5,500,358, U.S. Patent No. 5,318,897, U.S. Patent No. 5,298,409, U.S. Patent No. 5,258,289 and U.S. Patent No. 5,194,585.

Fica entendido que qualquer dos anticorpos da invenção pode ser expresso em plantas e que tal expressão pode resultar em um efeito fisiológico. Também fica entendido que todo anticorpo expresso pode ser catalítico.It is understood that any of the antibodies of the invention can be expressed in plants and that such expression can result in a physiological effect. It is also understood that any antibody expressed can be catalytic.

As alterações dos fenótipos de plantas da presente invenção podem ser relativas a uma planta tendo histórico genético semelhante porém sem o ácido nucléico de interesse introduzido. Em um aspecto preferido, um histórico genético semelhante é um histórico em que os organismos que são comparados compartilham 50% ou mais de seu material genético nuclear. Em um aspecto mais preferido, um histórico genético semelhante é um histórico em que os organismos que são comparados compartilham 75% ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais de seu material genético nuclear. Em um aspecto ainda mais preferível, um histórico genético semelhante é um histórico em que os organismos que são comparados são plantas, e as plantas são isogênicas à exceção de qualquer material genético originalmente introduzido usando-se técnicas de transformação de plantas.The alterations in the plant phenotypes of the present invention can be related to a plant having a similar genetic history but without the nucleic acid of interest introduced. In a preferred aspect, a similar genetic background is a history in which the organisms being compared share 50% or more of their nuclear genetic material. In a more preferred aspect, a similar genetic background is one in which the organisms being compared share 75% or more, even more preferably 90% or more of their nuclear genetic material. In an even more preferable aspect, a similar genetic background is a history in which the organisms being compared are plants, and plants are isogenic except for any genetic material originally introduced using plant transformation techniques.

A presente invenção também fornece partes das plantas, parti25 cularmente partes reprodutoras ou de armazenamento, da presente invenção. Partes de plantas, sem limitação, incluem sementes, endosperma, óvulo e pólen. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente. Em uma modalidade, a modalidade é um constituinte de ração animal.The present invention also provides parts of the plants, particularly breeding or storage parts, of the present invention. Plant parts, without limitation, include seeds, endosperm, egg and pollen. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the part of the plant is a seed. In one embodiment, the modality is a constituent of animal feed.

Em uma outra modalidade, a parte da planta é um fruto, mais preferivelmente um fruto com vida de prateleira melhorada. Em uma outra modalidade preferida, o fruto tem níveis aumentados de um tocoferol.In another embodiment, the plant part is a fruit, more preferably a fruit with improved shelf life. In another preferred embodiment, the fruit has increased levels of a tocopherol.

• · • · • · • · • · · • · · • · « ······ • · «······ • • » • • » • · • · · • · • · · « · · • «· · • • · • · • • • · · · · • · · · · • · • · ··· · · ··· · · • • • • • · · • · · » · · ♦ · »· · ♦ · • · • · • · • · • •

A presente invenção também fornece um contêiner com mais de 10.000, mais preferivelmente 20.000, e ainda mais preferivelmente 40.000 sementes onde mais de 10%, mais preferivelmente 25%, mais preferivelmente 50% e ainda mais preferivelmente 75% ou 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção.The present invention also provides a container with more than 10,000, more preferably 20,000, and even more preferably 40,000 seeds where more than 10%, more preferably 25%, more preferably 50% and even more preferably 75% or 90% of the seeds are seeds derived from a plant of the present invention.

A presente invenção também fornece um contêiner com mais de 10 kg, mais preferivelmente 25 kg, e ainda mais preferivelmente 50 kg de sementes onde mais de 10%, mais preferivelmente 25%, mais preferivelmente 50% e ainda mais preferivelmente 75% ou 90% das sementes são sementes derivadas de uma planta da presente invenção.The present invention also provides a container of more than 10 kg, more preferably 25 kg, and even more preferably 50 kg of seeds where more than 10%, more preferably 25%, more preferably 50% and even more preferably 75% or 90% of the seeds are seeds derived from a plant of the present invention.

Todas as plantas ou partes das mesmas da presente invenção podem ser processadas para produzir uma preparação alimentícia, farinácea, protéica ou oleosa. Uma parte de planta particularmente preferida para isso é a semente. Em uma modalidade preferida, a preparação alimentícia, farinácea, protéica ou oleosa destina-se a animais ruminantes. Métodos para produzir preparações alimentícias, farináceas, protéicas ou oleaginosas são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. 4.957.748, 5.100.679, 5.219.596, 5.936.069, 6.005.076, 6.146.669 e 6.156.227. Em uma modalidade preferida, a preparação protéica é uma preparação com alto teor de proteínas. Tal preparação com alto teor de proteínas tem um teor de proteínas maior que 5% p/v, mais preferivelmente 10% p/v, e ainda mais preferivelmente 15% p/v. Em uma preparação oleosa preferida, a preparação oleosa é uma preparação com alto teor de óleo com um teor de óleo derivado de uma planta ou de uma parte da planta da presente invenção maior que 5% p/v, mais preferivelmente 10% p/v, e ainda mais preferivelmente 15% p/v. Em uma modalidade preferida, a preparação oleosa é líquida e tem um volume maior que 1,5, 10 ou 50 litros. A presente invenção fornece óleo produzido das plantas da presente invenção ou gerado por um método da presente invenção. Tal óleo pode ser um componente secundário ou principal de qualquer produto resultante. Além do mais, tal óleo pode ser combinado com outros óleos. Em uma modalidade preferida, o óleo produzido das plantas da presente invenção ou gerado por um méto58 • · ·All or part of the plants of the present invention can be processed to produce a food, flour, protein or oily preparation. A particularly preferred plant part for this is the seed. In a preferred embodiment, the food, flour, protein or oily preparation is intended for ruminant animals. Methods for producing food, flour, protein or oil preparations are known in the art. See, for example, U.S. Patents 4,957,748, 5,100,679, 5,219,596, 5,936,069, 6,005,076, 6,146,669 and 6,156,227. In a preferred embodiment, the protein preparation is a preparation with a high protein content. Such a high protein preparation has a protein content greater than 5% w / v, more preferably 10% w / v, and even more preferably 15% w / v. In a preferred oily preparation, the oily preparation is a high oil content preparation with an oil content derived from a plant or part of the plant of the present invention greater than 5% w / v, more preferably 10% w / v , and even more preferably 15% w / v. In a preferred embodiment, the oil preparation is liquid and has a volume greater than 1.5, 10 or 50 liters. The present invention provides oil produced from the plants of the present invention or generated by a method of the present invention. Such oil can be a secondary or major component of any resulting product. Furthermore, such oil can be combined with other oils. In a preferred embodiment, the oil produced from the plants of the present invention or generated by a method58 • · ·

do da presente invenção constitui mais de 0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 90% em volume ou peso do componente oleoso de qualquer produto. Em uma outra modalidade, a preparação oleosa pode ser combinada e pode constituir mais de 10%, 25%, 35%, 50% ou 75% em volume da combinação. O óleo produzido de uma planta da presente invenção pode ser misturado com um ou mais solventes orgânicos ou destilados de petróleo.of the present invention constitutes more than 0.5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% or 90% by volume or weight of the oily component of any product. In another embodiment, the oily preparation may be combined and may constitute more than 10%, 25%, 35%, 50% or 75% by volume of the combination. The oil produced from a plant of the present invention can be mixed with one or more organic solvents or petroleum distillates.

As plantas da presente invenção podem fazer parte de um programa de reprodução ou ser gerada a partir desse programa. A escolha do método de reprodução depende do modo de reprodução da planta, da hereditariedade do(s) traço(s) sendo melhorado(s), e do tipo de cultivar usado comercial mente (por exemplo, cultivar do híbrido Fi, cultivar de linhagem pura etc.). Abordagens não limitativas selecionadas para a reprodução das plantas da presente invenção estão descritas abaixo. Um programa de reprodução pode ser melhorado usando-se seleção assistida por marcador da progênie de qualquer cruzamento. Fica ainda entendido que qualquer cultivar comercial e não-comercial pode ser utilizado em um programa de reprodução. Fatores tais como, por exemplo, vigor na emergência, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência a doenças, ramificação, florescência, tipo de semente tamanho da semente, massa específica da semente, sustentabilidade e facilidade de debulha etc. geralmente vão ditar a escolha.The plants of the present invention can be part of a breeding program or generated from that program. The choice of reproduction method depends on the plant's reproduction mode, the heritability of the trait (s) being improved, and the type of cultivar used commercially (for example, Fi hybrid cultivar, lineage cultivar pure etc.). Non-limiting approaches selected for the reproduction of the plants of the present invention are described below. A breeding program can be improved using marker assisted selection of the progeny of any cross. It is further understood that any commercial and non-commercial cultivar can be used in a breeding program. Factors such as, for example, emergence vigor, vegetative vigor, stress tolerance, disease resistance, branching, flowering, seed type, seed size, specific seed mass, sustainability and threshing ease etc. will usually dictate the choice.

Para traços altamente hereditários, a escolha de plantas individuais superiores avaliadas em uma única localização será eficaz, ao passo que para traços pouco hereditários, a seleção deve ser feita com base em valores médios obtidos de repetidas avaliações de famílias de plantas relacionadas. Métodos populares de seleção normalmente incluem seleção de pedigree, seleção de pedigree modificado, seleção em massa e seleção recorrente. Em uma modalidade preferida, utiliza-se um programa de cruzamento reversível ou de reprodução recorrente.For highly hereditary traits, the choice of higher individual plants evaluated in a single location will be effective, whereas for low hereditary traits, the selection should be made based on average values obtained from repeated evaluations of related plant families. Popular selection methods usually include pedigree selection, modified pedigree selection, mass selection and recurrent selection. In a preferred embodiment, a reversible breeding or recurring breeding program is used.

A complexidade da hereditariedade influencia a escolha do método de reprodução. Cruzamento reversível pode ser usado para transferir um ou alguns genes favoráveis a um traço altamente hereditário para um cultivar desejado. Esta abordagem vem sendo bastante utilizada para des♦ · • · ♦ envolver cultivares resistentes a doenças. Várias técnicas de seleção recorrente são usadas para melhorar os traços quantitativamente herdados controlados por numerosos genes. O uso de seleção recorrente em culturas autopolinizantes depende da facilidade de polinização, da freqüência de híbridos bem-sucedidos de cada polinização e do número de descendentes híbridos de cada cruzamento bem-sucedido.The complexity of heredity influences the choice of reproduction method. Reversible crossing can be used to transfer one or a few genes favorable to a highly inherited trait to a desired cultivar. This approach has been widely used to ♦ · • · ♦ involve disease-resistant cultivars. Several recurrent selection techniques are used to improve the quantitatively inherited traits controlled by numerous genes. The use of recurrent selection in self-pollinating crops depends on the ease of pollination, the frequency of successful hybrids from each pollination and the number of hybrid offspring from each successful cross.

Linhagens de reprodução podem ser testadas e comparadas com padrões apropriados em ambientes representativos da(s) área(s) comercial alvo para duas ou mais gerações. As melhores linhagens são candidatas a novos cultivares comerciais; aquelas ainda deficientes em traços podem ser usadas como matrizes para produzir novas populações para seleção posterior.Breeding lines can be tested and compared to appropriate standards in environments representative of the target commercial area (s) for two or more generations. The best strains are candidates for new commercial cultivars; those still deficient in traits can be used as matrices to produce new populations for later selection.

Um método de identificar uma planta superior é para observar seu desempenho em relação a outras plantas experimentais e em relação a um cultivar padrão bastante cultivado. Se apenas uma observação não for conclusiva, repetidas observações podem oferecer uma estimativa melhor de seu valor genético. Um produtor pode selecionar e cruzar duas ou mais linhagens matrizes, seguido de repetidas autopolinizações e seleção, produzindo muitas combinações genéticas novas.One method of identifying a superior plant is to observe its performance in relation to other experimental plants and in relation to a widely cultivated standard cultivar. If only one observation is not conclusive, repeated observations can offer a better estimate of its genetic value. A producer can select and cross two or more breeding lines, followed by repeated self-pollinations and selection, producing many new genetic combinations.

O desenvolvimento de novos cultivares requer o desenvolvimento e a seleção de variedades, o cruzamento dessas variedades e a seleção de cruzamentos híbridos superiores. A semente híbrida pode ser produzida por cruzamentos manuais entre genitores machos selecionados ou usando-se sistemas de esterilidade do macho. Os híbridos são selecionados quanto a determinados traços do gene simples como cor da vagem, cor das flores, rendimento da semente, cor da pubescência ou resistência a herbicidas, que indicam se a semente é realmente um híbrido. Dados adicionais sobre as linhagens matrizes, assim como o fenótipo do híbrido, a influência da decisão do produtor se vai continuar com o cruzamento híbrido específico.The development of new cultivars requires the development and selection of varieties, the crossing of these varieties and the selection of superior hybrid crosses. The hybrid seed can be produced by manual crosses between selected male parents or using male sterility systems. The hybrids are selected for certain traits of the simple gene such as pod color, flower color, seed yield, pubescence color or herbicide resistance, which indicate whether the seed is really a hybrid. Additional data on the breeding lines, as well as the phenotype of the hybrid, the influence of the decision of the producer will continue with the specific hybrid crossing.

Os métodos de reprodução de pedigree ou de reprodução por seleção recorrente também podem ser usados para desenvolver cultivares a • · • · · · ·*♦··· · >Pedigree breeding or recurrent selection breeding methods can also be used to develop cultivars a • · • · · · · * ♦ ··· ·>

partir de populações de reprodução. Os programas de reprodução combinam traços desejáveis de dois ou mais cultivares ou várias fontes genéricas em combinações de reprodução das quais cultivares são desenvolvidos por autopolinização e seleção dos fenótipos desejados. Os cultivares novos podem ser avaliados para determinar quais deles possuem potencial comercial.from breeding populations. Breeding programs combine desirable traits from two or more cultivars or several generic sources in breeding combinations of which cultivars are developed by self-pollination and selection of the desired phenotypes. New cultivars can be evaluated to determine which ones have commercial potential.

A reprodução de pedigree é normalmente usada para melhorar as culturas autopolinizantes. Duas matrizes que possuem traços complementares favoráveis são cruzadas para produzir um Fv Uma população F₂ é produzida por autopolinização de um ou vários FiS. É feita a seleção dos melhores indivíduos das melhores famílias. Repetidos testes com as famílias podem dar início à geração de F₄ para melhorar a eficácia da seleção dos traços com pouca hereditariedade. Em um estágio avançado da reprodução (isto é, F₆ e F₇), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente semelhantes são testadas quanto à potencial distribuição como cultivares novos.Pedigree breeding is usually used to improve self-pollinating cultures. Two matrices that have favorable complementary traits are crossed to produce an Fv An F ₂ population is produced by self-pollination of one or more FiS. The selection of the best individuals from the best families is made. Repeated tests with families can start the generation of F ₄ to improve the efficiency of the selection of traits with little heredity. At an advanced stage of reproduction (ie, F ₆ and F ₇ ), the best strains or mixtures of phenotypically similar strains are tested for potential distribution as new cultivars.

Reprodução por cruzamento reversível vem sendo usada para transferir genes de um traço altamente hereditário e simplesmente herdado para um cultivar homozigoto ou linhagem endógama desejável, que é a matriz recorrente. A fonte do traço a ser transferido é denominada de matriz doadora. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos da matriz recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido da matriz doadora. Depois do cruzamento inicial, os indivíduos com o fenótipo da matriz doadora são selecionados e cruzados repetidas vezes (cruzamento reversível) com a matriz recorrente. Espera-se que a matriz resultante tenha os atributos da matriz recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido da matriz doadora.Reversible cross breeding has been used to transfer genes from a highly inherited and simply inherited trait to a homozygous cultivar or desirable endogenous strain, which is the recurrent matrix. The source of the trace to be transferred is called the donor matrix. The resulting plant is expected to have the attributes of the recurrent matrix (for example, cultivar) and the desirable trait transferred from the donor matrix. After the initial crossing, individuals with the donor matrix phenotype are selected and crossed repeatedly (reversible crossing) with the recurrent matrix. The resulting matrix is expected to have the attributes of the recurrent matrix (for example, cultivar) and the desirable trait transferred from the donor matrix.

O procedimento de descendência de uma única semente no sentido restrito refere-se ao plantio de população segregante, colheita de uma amostra de uma semente por planta, e o uso da amostra de uma semente para plantar a geração seguinte. Quando a população já tiver progredido de F₂ para o nível de endogamia desejado, as plantas de cujas linha-The single seed descent procedure in the strict sense refers to planting a segregating population, harvesting a sample of one seed per plant, and using a seed sample to plant the next generation. When the population has already progressed from F ₂ to the desired level of inbreeding, the plants whose

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gens a população deriva vão levar a diferentes indivíduos de F₂. O número de plantas em uma população diminui a cada geração devido ao fato de algumas sementes não germinarem ou algumas plantas não produzirem pelo menos uma semente. Como resultado, nem todas as plantas F₂ originalmente amostradas na população vão estar representadas por uma progênie depois de terminada a progressão da geração.the drift population will lead to different F ₂ individuals. The number of plants in a population decreases with each generation due to the fact that some seeds do not germinate or some plants do not produce at least one seed. As a result, not all F ₂ plants originally sampled in the population will be represented by a progeny after generation progression has ended.

Em um procedimento com múltiplas sementes, os produtos normalmente colhem uma ou mais vagens de cada planta em uma população e debulham as mesmas para formar uma massa. Parte dessa massa é usada para plantar a geração seguinte e parte é reservada. O procedimento é chamado de técnica de massa de vagens ou descendência de uma única semente, modificada.In a multi-seed procedure, products typically harvest one or more pods from each plant in a population and thresh them to form a mass. Part of this mass is used to plant the next generation and part is reserved. The procedure is called the modified pod mass or single seed seed technique.

O procedimento com múltiplas sementes vem sendo usado para poupar trabalho na colheita. É consideravelmente mais rápido debulhar vagens com uma máquina do que retirar manualmente uma semente de cada vagem para o procedimento com uma única semente. O procedimento com múltiplas sementes também torna possível plantar o mesmo número de sementes de uma população a cada geração de endogamia.The multi-seed procedure has been used to save labor in the harvest. It is considerably faster to thresh pods with a machine than to manually remove a seed from each pod for the single seed procedure. The multi-seed procedure also makes it possible to plant the same number of seeds in a population for each generation of inbreeding.

Descrições de outros métodos de reprodução comumente usados para traços e culturas diferentes podem ser encontradas em vários livros de referência (por exemplo Fehr, Principies of Cultivar Development, vol. 1, págs. 2-3 (1987)).Descriptions of other methods of reproduction commonly used for different traits and cultures can be found in several reference books (eg Fehr, Principies of Cultivar Development, vol. 1, pp. 2-3 (1987)).

Uma planta transgênica da presente invenção também pode ser reproduzida usando-se apomixia. Apomixia é um método geneticamente controlado de reprodução em plantas onde o embrião é formado sem a união de um ovo e um esperma. Existem três tipos básicos de reprodução apomítica: 1) aposporia onde o embrião se desenvolve de um ovo cromossomicamente não-reduzido em um saco embrionário derivado do nucelo, 2) diplosporia onde o embrião se desenvolve de um ovo não-reduzido em um saco embrionário derivado da célula-mãe do megaspório, e 3) embrionia casual onde o embrião se desenvolve diretamente de uma célula somática. Na maioria das formas de apomixia, pseudogamia ou fertilização dos núcle• · · • · · · • · ·A transgenic plant of the present invention can also be reproduced using apomixis. Apomixis is a genetically controlled method of reproduction in plants where the embryo is formed without the union of an egg and a sperm. There are three basic types of apomictic reproduction: 1) apposia where the embryo develops from a chromosomally unreduced egg in an embryo sac derived from the nucleus, 2) diplosporia where the embryo develops from an unreduced egg in an embryo derived bag from the megaspore parent cell, and 3) casual embryonic where the embryo develops directly from a somatic cell. In most forms of apomixis, pseudogamy or fertilization of the nuclei • · · · · · · · · ·

• · · • · · * * · · · • · · · · * · ·· · • · · os polares para produzir endosperma é necessária para a viabilidade da semente. Na aposporia, pode-se utilizar um broto de cultivar como a fonte de pólen para a formação de endosperma em sementes. O broto de cultivar não afeta a genética do cultivar apomítico aposporoso contanto que o ovo não-reduzido do cultivar se desenvolva partenogeneticamente, mas torna possível a produção de endosperma. A apomixia é economicamente importante, especialmente em plantas transgênicas, porque faz com que qualquer genótipo, não importante quanto heterozigoto, se desenvolva como verdadeiro. Assim, com a reprodução apomítica, plantas transgênicas heterozigotos podem manter sua fidelidade genética por repetidos ciclos de vida. Métodos para a produção de plantas apomíticas são conhecidos na técnica. Vide a Patente U.S. N° 5.811.636.· · · · · · · * * · · · · · · The polar to produce endosperm is necessary for the viability of the seed. In the apportion, a bud of cultivar can be used as the pollen source for the formation of endosperm in seeds. The cultivar shoot does not affect the genetics of the apomitic cultivar apporous as long as the cultivar's unreduced egg develops parthenogenetically, but makes endosperm production possible. Apomixis is economically important, especially in transgenic plants, because it causes any genotype, no matter how heterozygous, to develop as true. Thus, with apomitic reproduction, heterozygous transgenic plants can maintain their genetic fidelity for repeated life cycles. Methods for producing apomitic plants are known in the art. See U.S. Patent No. 5,811,636.

Outros organismosOther bodies

Um ácido nucléico da presente invenção pode ser introduzido em qualquer célula ou organismo tal como uma célula de mamífero, um mamífero, uma célula peixe, um peixe, uma célula de pássaro, um pássaro, uma célula de alga, uma alga, uma célula fúngica, um fungo ou uma célula bacteriana. Uma proteína da presente invenção pode ser produzida em qualquer célula ou organismos apropriado. Células e transformantes preferidos incluem: células fúngicas tal como Aspergillus, leveduras, mamíferos, particularmente bovinos e suínos, insetos, bactérias e algas. Métodos para transformar tais células ou organismos são conhecidos na técnica (EP 0 238 023; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 81: 1470-1474 (1984); Malardier et al., Gene, 78: 147-156 (1989); Becker e Guarente, In: Abelson e Simon (eds.), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Method Enzymol., vol. 194, págs. 182-187, Academic Press, Inc. New York; Ito et al., J. Bacteriology, 153: 163 (1983); Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 75: 1920 (1978); Bennett e LaSure (eds.), More Gene Manipuationins in fungi, Academic Press, CA (1991)). Métodos para produzir as proteínas da presente invenção também são conhecidos (Kudla et al., EMBO, 9: 13551364 (1990); Jarai e Buxton, Current Genetics, 26: 2238-2244 (1994); Verdier, Yeast, 6: 271-297 (1990); MacKenzie et al., Journal of Gen. Microbiol.,A nucleic acid of the present invention can be introduced into any cell or organism such as a mammalian cell, a mammal, a fish cell, a fish, a bird cell, a bird, an algae cell, an algae, a fungal cell , a fungus or a bacterial cell. A protein of the present invention can be produced in any appropriate cell or organism. Preferred cells and transformants include: fungal cells such as Aspergillus, yeast, mammals, particularly bovine and porcine, insects, bacteria and algae. Methods for transforming such cells or organisms are known in the art (EP 0 238 023; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81: 1470-1474 (1984); Malardier et al., Gene, 78: 147-156 (1989); Becker and Guarente, In: Abelson and Simon (eds.), Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Method Enzymol., Vol. 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc. New York; Ito et al., J. Bacteriology, 153: 163 (1983); Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75: 1920 (1978); Bennett and LaSure (eds.) , More Gene Manipuationins in fungi, Academic Press, CA (1991)). Methods for producing the proteins of the present invention are also known (Kudla et al., EMBO, 9: 13551364 (1990); Jarai and Buxton, Current Genetics, 26: 2238-2244 (1994); Verdier, Yeast, 6: 271- 297 (1990); MacKenzie et al., Journal of Gen. Microbiol.,

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139: 2295-2307 (1993); Hartl et al., TIBS, 19: 20-25 (1994); Bergenron et al., TIBS, 19: 124-128 (1994); Demolder et al., J. Biotechnology, 32: 179-189 (1994); Craig, Science, 260: 1902-1903 (1993); Gething e Sambrook, Nature, 355: 33-45 (1992); Puig e Gilbert, J. Biol. Chem., 269: 7764-7771 (1994); Wang e Tsou, FASEB Journal, 7: 1515-1517 (1993); Robinson et al., Bio/Technology, 1: 381-384 (1994); Enderlin e Ogrydziak, Yeast, 10: 67-79 (1994); Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 1434-1438 (1989); Julius et al., Cell, 37: 1075-1089 (1984); Julius et al., Cell 32: 839-852 (1983).139: 2295-2307 (1993); Hartl et al., TIBS, 19: 20-25 (1994); Bergenron et al., TIBS, 19: 124-128 (1994); Demolder et al., J. Biotechnology, 32: 179-189 (1994); Craig, Science, 260: 1902-1903 (1993); Gething and Sambrook, Nature, 355: 33-45 (1992); Puig and Gilbert, J. Biol. Chem., 269: 7764-7771 (1994); Wang and Tsou, FASEB Journal, 7: 1515-1517 (1993); Robinson et al., Bio / Technology, 1: 381-384 (1994); Enderlin and Ogrydziak, Yeast, 10: 67-79 (1994); Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Know. (USA), 86: 1434-1438 (1989); Julius et al., Cell, 37: 1075-1089 (1984); Julius et al., Cell 32: 839-852 (1983).

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou organismo proporciona nessa célula ou organismo, em relação a uma célula ou organismo com histórico genético semelhante, um nível aumentado de tocotrienóis.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a cell or organism provides that cell or organism, in relation to a cell or organism with a similar genetic history, an increased level of tocotrienols.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou organismo proporciona nessa célula ou organismo, em relação a uma célula ou organismo não-transformado com histórico genético semelhante, um nível aumentado de tocoferóis.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a cell or organism provides that cell or organism, in relation to an untransformed cell or organism with a similar genetic history, an increased level of tocopherols.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou organismo proporciona nessa célula ou organismo, em relação a uma célula ou organismo não-transformado com histórico genético semelhante, um nível aumentado de a-tocoferóis.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a cell or organism provides that cell or organism, in relation to an untransformed cell or organism with a similar genetic history, an increased level of α-tocopherols .

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou organismo proporciona nessa célula ou organismo, em relação a uma célula ou organismo não-transformado com histórico genético semelhante, um nível aumentado de γ-tocoferóis.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a cell or organism provides that cell or organism, in relation to an untransformed cell or organism with a similar genetic history, an increased level of γ-tocopherols .

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou organismo proporciona nessa célula ou organismo, em relação a uma célula ou organismo não transformado com histórico genético semelhante, um ní• · ·In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment of the present invention in a cell or organism provides that cell or organism, in relation to an untransformed cell or organism with a similar genetic history, a level •

vel aumentado de ácido homogentísico.increased level of homogentisic acid.

Em uma modalidade preferida, a superexpressão de uma proteína ou fragmento da mesma da presente invenção em uma célula ou organismo proporciona nessa célula ou organismo, em relação a uma célula ou organismo não transformado com histórico genético semelhante, um nível aumentado de plastoquinóis ou plastoquinonas.In a preferred embodiment, overexpression of a protein or fragment thereof in a cell or organism provides that cell or organism, in relation to an untransformed cell or organism with a similar genetic history, an increased level of plastoquinols or plastoquinones.

AnticorposAntibodies.

Um aspecto da invenção refere-se a anticorpos, moléculas fixadoras de antígeno de cadeia simples ou outras proteínas que se ligam especificamente a uma ou mais das moléculas de proteína ou de peptídio da invenção e seus homólogos, fusões ou fragmentos. Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°^s: 2 e 4 ou um fragmento das mesmas. Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína de fusão compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada da seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID N°^s: 2 ou 4 ou um fragmento das mesmas. Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína de fusão compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada da seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID N°^s: 2 ou 4 ou um fragmento das mesmas. Os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar quantitativa ou qualitativamente as moléculas de proteína ou peptídio da invenção, ou para detectar modificações pós-translacionais das proteínas. Conforme aqui usado, diz-se que um anticorpo ou peptídio se liga especificamente a uma molécula de proteína ou peptídio da invenção se tal ligação não for competitivamente inibida pela presença de moléculas não-relacionadas.One aspect of the invention relates to antibodies, single-chain antigen-fixing molecules or other proteins that specifically bind to one or more of the protein or peptide molecules of the invention and their counterparts, fusions or fragments. In a particularly preferred embodiment, the antibody specifically binds to a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID ^NOS: 2 and 4 or a fragment thereof. In another embodiment, the antibody specifically binds to a fusion protein comprising an amino acid sequence selected from the amino acid sequence shown in SEQ ID ^NOS: 2 or 4 or a fragment thereof. In another embodiment, the antibody specifically binds to a fusion protein comprising an amino acid sequence selected from the amino acid sequence shown in SEQ ID ^NOS: 2 or 4 or a fragment thereof. The antibodies of the invention can be used to detect quantitatively or qualitatively the protein or peptide molecules of the invention, or to detect post-translational modifications of proteins. As used herein, an antibody or peptide is said to specifically bind to a protein or peptide molecule of the invention if such binding is not competitively inhibited by the presence of unrelated molecules.

Moléculas de ácido nucléico que codifica toda a proteína da invenção ou parte dela podem ser expressas, por meios recombinantes, para produzir proteínas ou peptídios que por sua vez podem ser usados para criar anticorpos que sejam capazes de se ligar à proteína ou peptídio expresso. Tais anticorpos podem ser usados em imunoensaios para aquela proteína. Tais moléculas codificadoras de proteína, ou seus fragmentos, podem φ φ φNucleic acid molecules encoding all or part of the protein of the invention can be expressed, by recombinant means, to produce proteins or peptides which in turn can be used to create antibodies that are capable of binding the expressed protein or peptide. Such antibodies can be used in immunoassays for that protein. Such protein coding molecules, or fragments thereof, can φ φ φ

Φ φΦ φ

Φ Φ φφφ ser uma molécula de fusão (isto é, uma parte de uma molécula de ácido nucléico maior) de modo que, com a expressão, é produzida uma proteína de fusão. Fica entendido que qualquer das moléculas de ácido nucléico da invenção pode ser expressa, por meios recombinantes, para produzir proteínas ou peptídios codificados por essas moléculas de ácido nucléico.Φ Φ φφφ be a fusion molecule (that is, a part of a larger nucleic acid molecule) so that, with expression, a fusion protein is produced. It is understood that any of the nucleic acid molecules of the invention can be expressed, by recombinant means, to produce proteins or peptides encoded by those nucleic acid molecules.

Os anticorpos que se ligam especificamente a proteínas e fragmentos de proteínas da invenção podem ser policlonais ou monoclonais e podem compreender imunoglobulinas intactas, ou porções fixadoras de antígeno de fragmentos de imunoglobulinas (tais como F(ab’), F(ab’)₂) ou imunoglobulinas de cadeia simples produzíveis, por exemplo, por meios recombinantes. Fica entendido que os profissionais da área estão familiarizados com as obras convencionais que descrevem condições e procedimentos específicos para a constructo, manipulação e isolamento de anticorpos (vide, por exemplo, Harlow e Lane, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)).Antibodies that specifically bind to proteins and protein fragments of the invention can be polyclonal or monoclonal and can comprise intact immunoglobulins, or antigen-fixing portions of immunoglobulin fragments (such as F (ab '), F (ab') ₂ ) or single-chain immunoglobulins that can be produced, for example, by recombinant means. It is understood that professionals in the field are familiar with conventional works that describe specific conditions and procedures for the construction, manipulation and isolation of antibodies (see, for example, Harlow and Lane, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press , Cold Spring Harbor, New York (1988)).

Como discutido abaixo, tais moléculas de anticorpo ou seus fragmentos podem ser usadas com fins de diagnóstico. Quando os anticorpos destinam-se para fins de diagnóstico, pode ser desejável derivatizá-los, por exemplo com um grupo ligando (tal como biotina) ou um grupo marcador detectável (tal como um grupo fluorescente, um radioisótopo ou uma enzima).As discussed below, such antibody molecules or fragments thereof can be used for diagnostic purposes. When antibodies are intended for diagnostic purposes, it may be desirable to derivatize them, for example with a ligand group (such as biotin) or a detectable marker group (such as a fluorescent group, a radioisotope or an enzyme).

A capacidade de produzir anticorpos que se ligam a moléculas de proteína ou de peptídio da invenção permite a identificação de compostos miméticos derivados dessas moléculas. Esses compostos miméticos podem conter um fragmento da proteína ou do peptídio ou simplesmente uma região estruturalmente semelhante e não obstante apresentar capacidade para se ligar especificamente a anticorpos direcionados contra aquele composto.The ability to produce antibodies that bind to protein or peptide molecules of the invention allows the identification of mimetic compounds derived from these molecules. These mimetic compounds may contain a fragment of the protein or peptide or simply a structurally similar region and despite the ability to specifically bind to antibodies directed against that compound.

Usos exemplificativosExemplary uses

As moléculas de ácido nucléico e seus fragmentos da invenção podem ser empregados para obter outras moléculas de ácido nucléico da mesma espécie (moléculas de ácido nucléico de milho podem ser utilizadas • · · • · • · • · · · • * • » • · · ··· ♦Nucleic acid molecules and fragments of the invention can be used to obtain other nucleic acid molecules of the same species (corn nucleic acid molecules can be used • · · · · · · · · · • * • »• · · ··· ♦

outras moléculas de ácido nucléico de milho). Tais moléculas de ácido nucléico incluem as moléculas de ácido nucléico que codificam a seqüência codificadora completa de uma proteína e promotores e seqüências de flanqueamento de tais moléculas. Além disso, tais moléculas de ácido nucléico incluem moléculas de ácido nucléico que codificam outras isozimas ou membros da família do gene. Tais moléculas podem ser facilmente obtidas usando-se as moléculas de ácido nucléico acima descritas ou seus fragmentos para rastrear bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para formar tais bibliotecas são conhecidos na técnica.other corn nucleic acid molecules). Such nucleic acid molecules include nucleic acid molecules that encode the complete coding sequence for a protein and promoters and flanking sequences for such molecules. In addition, such nucleic acid molecules include nucleic acid molecules that encode other isozymes or members of the gene family. Such molecules can be easily obtained using the nucleic acid molecules described above or their fragments to screen cDNA libraries or genomic libraries. Methods for forming such libraries are known in the art.

As moléculas de ácido nucléico e seus fragmentos da invenção também podem ser empregados para obter homólogos de ácido nucléico. Tais homólogos incluem as moléculas de ácido nucléico de plantas e outros organismos, incluindo bactérias e fungos, que incluem as moléculas de ácido nucléico que codificam, total ou parcialmente, homólogos de proteína de outras espécies de plantas e outros organismos, seqüências de elementos genéticos, tais como promotores e elementos reguladores de transcrição. Tais moléculas podem ser facilmente obtidas usando-se as moléculas de ácido nucléico acima descritas ou seus fragmentos para rastrear bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas obtidas de tais espécies de plantas. Métodos para formar tais bibliotecas são bastante conhecidos na técnica. Tais moléculas homólogas podem diferir em suas seqüências de nucleotídeos daquelas encontradas em uma ou mais das SEQ ID N°^s: 1 e 3 e complementos das mesmas porque complementaridade completa não é necessária para hibridização estável. Portanto, as moléculas de ácido nucléico da invenção também incluem moléculas que, embora capazes de hibridizar especificamente com as moléculas de ácido nucléico, podem não ter complementaridade completa.Nucleic acid molecules and fragments of the invention can also be used to obtain nucleic acid homologues. Such homologs include nucleic acid molecules from plants and other organisms, including bacteria and fungi, which include nucleic acid molecules that encode, in whole or in part, protein homologs from other plant species and other organisms, sequences of genetic elements, such as promoters and transcription regulatory elements. Such molecules can be easily obtained using the nucleic acid molecules described above or their fragments to screen cDNA libraries or genomic libraries obtained from such plant species. Methods for forming such libraries are well known in the art. These homologous molecules may differ in their nucleotide sequences from those found in one or more of SEQ ID ^Nos: 1 and 3 and complements thereof because complete complementarity is not needed for stable hybridization. Therefore, the nucleic acid molecules of the invention also include molecules that, although capable of specifically hybridizing to the nucleic acid molecules, may not have complete complementarity.

Qualquer um de vários métodos pode ser usado para obter uma ou mais das moléculas de ácido nucléico acima descritas (Zamechik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 4143-4146 (1986); Goodchild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5507-5511 (1988); Wickstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 1028-1032 (1988); Holt et al. Molec. Cell. Biol. 8: 963• · · • · · * * · ···»»····Any of several methods can be used to obtain one or more of the nucleic acid molecules described above (Zamechik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 4143-4146 (1986); Goodchild et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5507-5511 (1988); Wickstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 1028-1032 (1988); Holt et al. Molec. Cell Biol. 8: 963 • · · • · · * * · ··· »» ····

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973 (1988); Gerwirtz et al., Science 242: 1303-1306 (1988); Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86: 3379-3383 (1989); Becker et al., EMBO J. 8;3685-3691 (1989)). Sintetizadores automáticos de ácido nucléico podem ser empregados para tal. No lugar de tal síntese, as moléculas de ácido nucléico descritas podem ser usadas para definir um par de iniciadores que pode ser usado com a reação de cadeia de polimerase (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich et al., Patente Européia 50.424; Patente Européia 84.796; Patente Européia 258.017; Patente Européia 237.362; Mullis, Patente Européia 201.184; Mullis et al., Patente U.S. 4.683.202; Erlich, Patente U.S. 4.582.788; e Saiki et al., Patente U.S. 4.683.194) para amplificar e obter qualquer molécula de ácido nucléico ou fragmento desejado.973 (1988); Gerwirtz et al., Science 242: 1303-1306 (1988); Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Know. (USA) 86: 3379-3383 (1989); Becker et al., EMBO J. 8; 3685-3691 (1989)). Automatic nucleic acid synthesizers can be used for this. In place of such synthesis, the described nucleic acid molecules can be used to define a pair of primers that can be used with the polymerase chain reaction (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 -273 (1986); Erlich et al., European patent 50,424; European patent 84,796; European patent 258,017; European patent 237,362; Mullis, European patent 201,184; Mullis et al., US patent 4,683,202; Erlich, US patent 4,582. 788; and Saiki et al., US Patent 4,683,194) to amplify and obtain any desired nucleic acid molecule or fragment.

Seqüências promotoras ou outros elementos genéticos, que incluem, porém sem limitação, seqüências flanqueadoras reguladoras de transcrição, associadas com uma ou mais das seqüências de ácidos nucléicos descritas também podem ser obtidas usando-se a seqüência de ácidos nucléicos descrita neste relatório. Em uma modalidade, tais seqüências são obtidas por incubação de moléculas de ácido nucléico da presente invenção com membros de bibliotecas genômicas e recuperação dos clones que hibridizam para tais moléculas de ácido nucléico. Em uma segunda modalidade, métodos de deslocamento de cromossoma ou PCR inversa podem ser usados para obter tais seqüências (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85: 8998-9002 (1988); Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86: 5673-5677 (1989); Pang et al., Biotechniques 22: 1046-1048 (1977); Huang et al., Methods Mol. Biol. 69: 89-96 (1997); Huang et al., Method Mol. Biol. 67: 287-294 (1997); Benkel et al., Genet. Anal. 13: 123-127 (1996); Hartl et al., Methods Mol. Biol. 58: 293-301 (1996)). A expressão deslocamento de cromossoma significa um processo de extensão de uma mapa genético por sucessivas etapas de hibridização.Promoter sequences or other genetic elements, which include, but are not limited to, transcriptional flanking sequences associated with one or more of the nucleic acid sequences described can also be obtained using the nucleic acid sequence described in this report. In one embodiment, such sequences are obtained by incubating nucleic acid molecules of the present invention with members of genomic libraries and recovering the clones that hybridize to such nucleic acid molecules. In a second embodiment, chromosome displacement methods or inverse PCR can be used to obtain such sequences (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 8998-9002 (1988); Ohara et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 5673-5677 (1989); Pang et al., Biotechniques 22: 1046-1048 (1977); Huang et al., Methods Mol. Biol. 69: 89- 96 (1997); Huang et al., Method Mol. Biol. 67: 287-294 (1997); Benkel et al., Genet. Anal. 13: 123-127 (1996); Hartl et al., Methods Mol. Biol. 58: 293-301 (1996)). The term chromosome displacement means a process of extending a genetic map by successive stages of hybridization.

As moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas para isolar promotores de perfis de expressão evolucional ou ambientalmente regulada melhorados para célula, específicos para célula, melhora68The nucleic acid molecules of the invention can be used to isolate promoters of cell-specific, cell-specific, evolutionary or environmentally regulated expression profiles, improvement68

« · • · > * · • · · · ·· · dos para tecido, específicos para tecido. Isolamento e análise funcional das seqüências promotoras flanqueadoras 5’ desses genes de bibliotecas genômicas, por exemplo, usando métodos de rastreamento genômico e técnicas de PCR resultariam no isolamento de promotores e elementos reguladores de transcrição úteis. Esses métodos são conhecidos pelos versados na técnica e já foram descritos (vide, por exemplo, Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Os promotores obtidos utilizando-se as moléculas de ácido nucléico da invenção também poderíam ser modificados para afetar suas características de controle. Exemplos de tais modificações incluem, porém sem limitação, seqüências intensificadoras. Tais elementos genéticos podem ser usados para melhorar a expressão genética de traços novos e existentes para melhorar a cultura.«· • ·> * · · · · · · · for fabrics, specific for fabric. Isolation and functional analysis of the 5 'flanking promoter sequences of these genes from genomic libraries, for example, using genomic screening methods and PCR techniques would result in the isolation of promoters and useful transcriptional regulatory elements. These methods are known to those skilled in the art and have already been described (see, for example, Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). The promoters obtained using the nucleic acid molecules of the invention could also be modified to affect their control characteristics. Examples of such modifications include, but are not limited to, intensifier sequences. Such genetic elements can be used to improve the gene expression of new and existing traits to improve culture.

Um outro subconjunto das moléculas de ácido nucléico da invenção inclui moléculas de ácido nucléico que são marcadores. Os marcadores podem ser usados de inúmeras convencionais no campo da genética molecular. Tais marcadores incluem moléculas de ácido nucléico de SEQ ID N°^s: 1 e 3, seus complementos e fragmentos que podem agir como marcadores e outras moléculas de ácido nucléico da presente invenção que podem agir como marcadores.Another subset of the nucleic acid molecules of the invention includes nucleic acid molecules that are markers. Markers can be used in a number of conventional ways in the field of molecular genetics. Such markers include nucleic acid molecules of SEQ ID ^Nos: 1 and 3, complements thereof and fragments thereof that can act as markers and other nucleic acid molecules of the invention that can act as markers.

Os marcadores genéticos da invenção incluem marcadores dominantes ou codominantes. Marcadores codominantes revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diplóide) em um locus. Marcadores dominantes revelam a presença de um único alelo por locus. A presença do fenótipo do marcador dominante (por exemplo, uma banda de DNA) é indicativa de que um alelo está na condição de homozigoto ou de heterozigoto. A ausência do fenótipo do marcador dominante (por exemplo, ausência de uma banda de DNA) é mera evidência da presença de que algum outro alelo não-definido. No caso de populações em que os indivíduos são predominantemente homozigotos e os loci são predominantemente dimórficos, marcadores dominantes e codominantes podem ser igualmente valiosos. À medida em que populações ficam mais heterozigotos e multi69 • · · · · · ········· · _β J vi ·· ······· · » • · · · · ·· ··· te · ♦ · · ·· · · a * a « • ·· · alélicas, os marcadores codominantes acabam se tornando mais informativos do genótipo do que os marcadores dominantes. Moléculas marcadoras podem ser, por exemplo, capazes de detectar polimorfismos tais como polimorfismos de um nucleotídeo (SNPs).The genetic markers of the invention include dominant or codominant markers. Codominant markers reveal the presence of two or more alleles (two per diploid individual) in a locus. Dominant markers reveal the presence of a single allele per locus. The presence of the dominant marker phenotype (for example, a DNA band) is indicative that an allele is in the condition of homozygous or heterozygous. The absence of the dominant marker phenotype (for example, absence of a DNA band) is mere evidence of the presence of some other undefined allele. In the case of populations in which individuals are predominantly homozygous and loci are predominantly dimorphic, dominant and codominant markers can be equally valuable. As populations become more heterozygous and multi69 • · · · · · ········· · _β J vi ·· ······· · · »• · · · ·· ··· te · ♦ · · ·· · · a * a «• ·· · allelic, codominant markers end up becoming more informative of the genotype than dominant markers. Marker molecules may, for example, be able to detect polymorphisms such as nucleotide polymorphisms (SNPs).

Os genomas de animais e plantas sofrem naturalmente mutação espontânea durante sua constante evolução (Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55: 831-854 (1986)). Um polimorfismo é uma variação ou diferença na seqüência do gene ou suas regiões flanqueadoras que surge em alguns dos membros de uma espécie. A seqüência variante e a seqüência original co10 existem na população da espécie. Em alguns casos, tal co-existência está em equilíbrio estável ou quase estável.The genomes of animals and plants naturally undergo spontaneous mutation during their constant evolution (Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55: 831-854 (1986)). A polymorphism is a variation or difference in the sequence of the gene or its flanking regions that appears in some of the members of a species. The variant sequence and the original co10 sequence exist in the population of the species. In some cases, such co-existence is in a stable or almost stable equilibrium.

Dessa forma considera-se que um polimorfismo é alélico pelo fato de, devido à existência do polimorfismo, alguns membros de uma população poderem ter a seqüência original (isto é, o alelo original) ao passo que outros membros podem ter a seqüência variante (isto é, o alelo variante). No caso mais simples, só pode haver uma seqüência variante e o polimorfismo é assim denominado dialélico. Em outros casos, a população da espécie pode conter múltiplos alelos e o polimorfismo é denominado trialélico etc. Um único gene pode ter múltiplos polimorfismos não-relacionados diferentes. Por exemplo, ele pode ter um polimorfismo dialélico em um sítio e um polimorfismo multialélico em um outro sítio.Thus, it is considered that a polymorphism is allelic because, due to the existence of the polymorphism, some members of a population may have the original sequence (that is, the original allele) whereas other members may have the variant sequence (this is, the variant allele). In the simplest case, there can be only one variant sequence and the polymorphism is so called diallelic. In other cases, the population of the species may contain multiple alleles and the polymorphism is called trialelic, etc. A single gene can have multiple different unrelated polymorphisms. For example, it can have a diallelic polymorphism in one place and a multialelic polymorphism in another place.

A variação que define o polimorfismo pode variar de uma única variação de nucleotídeo até a inserção ou deleção de regiões estendidas em um gene. Em alguns casos, as variações de seqüência de DNA ocorrem em regiões do genoma que se caracterizam por repetições em série curtas (STRs) que incluem motivos repetidos de di- ou trinucleotídeo em série de nucleotídeos. Os polimorfismos caracterizados por tais repetições em série são denominados polimorfismos de repetição em série de número variado (VNTR). VNTRs vêm sendo usados em análise de identidade (Weber,The variation that defines the polymorphism can vary from a single variation of nucleotide to the insertion or deletion of extended regions in a gene. In some cases, DNA sequence variations occur in regions of the genome that are characterized by short series repeats (STRs) that include repeated di- or trinucleotide motifs in a series of nucleotides. The polymorphisms characterized by such series repetitions are called multiple number series repetition polymorphisms (VNTR). VNTRs have been used in identity analysis (Weber,

Patente U.S. 5.075.217; Armour et al., FEBS Lett. 307: 113-115 (1992); Jones et al., Eur. J. Haematol. 39: 144-147 (1987); Horn et al., Pedido de Patente PCT WO 91/14003; Jeffreys, Pedido de Patente Européia 370.719;U.S. Patent 5,075,217; Armor et al., FEBS Lett. 307: 113-115 (1992); Jones et al., Eur. J. Haematol. 39: 144-147 (1987); Horn et al., PCT Patent Application WO 91/14003; Jeffreys, European Patent Application 370,719;

Jeffreys, Patente U.S. 5.175.082; Jeffreys et al., Amer. J. Hum. Genet. 39: 11-24 (1986); Jeffreys et al., Nature 316: 76-79 (1985); Gray et al., Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243: 241-253 (1991); Moore et al., Genomics 10: 654-660 (1991); Jeffreys et al., Anim. Genet. 18: 1-15 (1987); Hillel et al., Anim. Genet. 20: 145-155 (1989); Hillel etal., Genet. 124: 783-789 (1990)).Jeffreys, U.S. Patent 5,175,082; Jeffreys et al., Amer. J. Hum. Genet. 39: 11-24 (1986); Jeffreys et al., Nature 316: 76-79 (1985); Gray et al., Proc. R. Acad. Soc. Lond. 243: 241-253 (1991); Moore et al., Genomics 10: 654-660 (1991); Jeffreys et al., Anim. Genet. 18: 1-15 (1987); Hillel et al., Anim. Genet. 20: 145-155 (1989); Hillel et al., Genet. 124: 783-789 (1990)).

A detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA pode ser facilitada pelo uso de métodos de amplificação de ácidos nucléicos. Tais métodos aumentam especificamente a concentração de polinucleotídeos que atravessam o sítio polimórfico, ou incluem aquele sítio e seqüências localizadas distais ou proximais a ele. Tais moléculas amplificadas podem ser facilmente detectadas por eletroforese em gel ou outros meios.The detection of polymorphic sites in a DNA sample can be facilitated by the use of nucleic acid amplification methods. Such methods specifically increase the concentration of polynucleotides that cross the polymorphic site, or include that site and sequences located distal or proximal to it. Such amplified molecules can be easily detected by gel electrophoresis or other means.

Em uma modalidade alternativa, tais polimorfismos podem ser detectados pelo uso de uma molécula de ácido nucléico marcadora que seja fisicamente ligada a tal (tais) polimorfismo(s). Para tal, podem ser empregadas moléculas de ácido nucléico marcadoras compreendendo uma seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo localizado a uma distância de 1 mb do(s) polimorfismo(s) e mais preferivelmente a uma distância de 1 kb do(s) polimorfismo(s) e ainda mais preferivelmente a uma distância de 10 kb do(s) polimorfismo(s).In an alternative embodiment, such polymorphisms can be detected by the use of a marker nucleic acid molecule that is physically linked to such (such) polymorphism (s). For this purpose, marker nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence of a polynucleotide located at a distance of 1 mb from the polymorphism (s) and more preferably at a distance of 1 kb from the polymorphism (s) can be used. ) and even more preferably at a distance of 10 kb from the polymorphism (s).

A identificação de um polimorfismo pode ser determinada de várias maneiras. Correlacionando-se a presença ou ausência do mesmo em uma planta com a presença ou ausência de um fenótipo, é possível prever o fenótipo daquela planta. Se um polimorfismo criar ou destruir um sítio de divagem de endonuclease de restrição, ou se ele resultar na perda ou inserção de DNA (por exemplo, um polimorfismo de VNTR), ele vai alterar o tamanho ou o perfil dos fragmentos de DNA que forem gerados por digestão com aquela endonuclease de restrição. Assim, organismos que possuem uma seqüência variante podem ser distinguidos daqueles que possuem uma seqüência original por análise dos fragmentos de restrição. Polimorfismos que podem ser identificados dessa maneira são denominados polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs) (Glassberg, Pedido de Patente UK 2135774; Skolnick et al., Cytogen. Cell Genet. 32: 58-67 • · • ·The identification of a polymorphism can be determined in several ways. By correlating the presence or absence of it in a plant with the presence or absence of a phenotype, it is possible to predict the phenotype of that plant. If a polymorphism creates or destroys a restriction endonuclease dividing site, or if it results in the loss or insertion of DNA (for example, a VNTR polymorphism), it will change the size or profile of the DNA fragments that are generated by digestion with that restriction endonuclease. Thus, organisms that have a variant sequence can be distinguished from those that have an original sequence by analyzing the restriction fragments. Polymorphisms that can be identified in this way are called restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) (Glassberg, UK Patent Application 2135774; Skolnick et al., Cytogen. Cell Genet. 32: 58-67 • · • ·

(1982); Botstein et al., Ann. J. Hum. Genet. 32: 314-331 (1980); Fischer et al., (Pedido PCT WO 90/13668; Uhlen, Pedido PCT WO 90/11369).(1982); Botstein et al., Ann. J. Hum. Genet. 32: 314-331 (1980); Fischer et al., (PCT Application WO 90/13668; Uhlen, PCT Application WO 90/11369).

Polimorfismos também podem ser identificados pela análise de Polimorfismo de Conformação de Filamento Simples (SSCP) (Elles, Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press (1996)); Orita et al., Genomics 5: 874-879 (1989)). Inúmeros protocolos foram descritos para SSCP incluindo, porém sem limitação, Lee et al., Anal. Biochem. 205: 289-293 (1992); Suzuki et al., Anal. Biochem. 192: 82-84 (1991); Lo et al., Nucleic Acids Research 20: 1005-1009 (1992); Sarkar et al., Genomics 13: 441-443 (1992). Fica entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser utilizados como marcadores ou sondas para detectar polimorfismos por análise de SSCP.Polymorphisms can also be identified by the Simple Filament Conformation Polymorphism (SSCP) analysis (Elles, Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press (1996)); Orita et al., Genomics 5: 874-879 (1989)). Numerous protocols have been described for SSCP including, but not limited to, Lee et al., Anal. Biochem. 205: 289-293 (1992); Suzuki et al., Anal. Biochem. 192: 82-84 (1991); Lo et al., Nucleic Acids Research 20: 1005-1009 (1992); Sarkar et al., Genomics 13: 441-443 (1992). It is understood that one or more of the nucleic acids of the invention can be used as markers or probes to detect polymorphisms by SSCP analysis.

Polimorfismos também podem ser encontrados usando-se uma técnica de impressão digital de DNA chamada polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), que se baseia na amplificação seletiva por PCR de fragmentos de restrição de uma digestão total de DNA genômico para traçar o perfil daquele DNA (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23: 44074414 (1995)). Este método permite a co-amplificação específica de grandes números de fragmentos de restrição, que podem ser visualizados por PCR sem que se saiba a seqüência de ácidos nucléicos. Fica entendido que um ou mais dos ácidos nucléicos da invenção podem ser utilizados como marcadores ou sondas para detectar polimorfismos por análise de AFLP ou para impressão digital de RNA.Polymorphisms can also be found using a DNA fingerprinting technique called amplified fragment length polymorphism (AFLP), which is based on the selective PCR amplification of restriction fragments from a total digestion of genomic DNA to profile that DNA (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23: 44074414 (1995)). This method allows for the specific co-amplification of large numbers of restriction fragments, which can be visualized by PCR without knowing the sequence of nucleic acids. It is understood that one or more of the nucleic acids of the invention can be used as markers or probes to detect polymorphisms by AFLP analysis or for RNA fingerprint.

Polimorfismos também podem ser encontrados usando-se DNA polimórfico amplificado aleatório (RAPD) (Williams et al., Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535 (1990)) e seqüências polimórficas amplificadas cliváveis (CAPS) (Lyamichev et al., Science 260: 778-783 (1993)). Fica entendido que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser utilizadas como marcadores ou sondas para detectar polimorfismos por análise de RAPD ou CAPS.Polymorphisms can also be found using random amplified polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al., Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535 (1990)) and cleavable amplified polymorphic sequences (CAPS) (Lyamichev et al., Science 260 : 778-783 (1993)). It is understood that one or more of the nucleic acid molecules of the invention can be used as markers or probes to detect polymorphisms by RAPD or CAPS analysis.

Polimorfismos de um nucleotídeo (SNPs) geralmente ocorrem a uma freqüência maior que outros marcadores polimórficos e estão espaça-Nucleotide polymorphisms (SNPs) generally occur at a higher frequency than other polymorphic markers and are spaced apart.

dos em todo um genoma com maior uniformidade que outras formas relatadas de polimorfismo. A maior freqüência e uniformidade de SNPs significa que há uma maior probabilidade de que tal polimorfismo seja encontrado perto de um locus genético de interesse do que seria o caso para outros polimorfismos. SNPs ficam localizados em regiões codificadoras e nãocodificadoras de proteínas de um genoma. Alguns desses SNPs podem resultar em expressão de proteína defeituosa ou variante (por exemplo, como resultado de mutações ou fixação defeituosa). A análise (genotipificação) de SNPs caracterizados por requerer apenas um ensaio mais/menos do que uma medição demorada, permitindo maior automação.across a genome with greater uniformity than other reported forms of polymorphism. The greater frequency and uniformity of SNPs means that there is a greater likelihood that such a polymorphism will be found near a genetic locus of interest than would be the case for other polymorphisms. SNPs are located in protein coding and noncoding regions of a genome. Some of these SNPs can result in expression of defective or variant protein (for example, as a result of mutations or defective fixation). The analysis (genotyping) of SNPs characterized by requiring only one test more / less than a lengthy measurement, allowing greater automation.

Os SNPs podem ser caracterizados usando-se qualquer um de vários métodos. Tais métodos incluem o seqüenciamento direto ou indireto do sítio, o uso de enzimas de restrição (Botstein et al., Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331 (1980); Konieczny e Ausubel, Plant J. 4: 403-410 (1993)), ensaios de combinação enzimática ou química imperfeita (Myers et al., Nature 313: 495-498 (1985)), PCR específica para alelo (Newton et al., Nucl. Acids Res. 17: 2503-2516 (1989); Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 27572760 (1989)), reação da cadeia de ligase (Barany, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 189-193 (1991)), análise de polimorfismo de conformação de filamento simples (Labrune et al., Am. J. Hum. Genet. 48: 1115-1120 (1991)), extensão de iniciador de base simples (Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1143-1147 (1991), Goelet U.S. 6.004.744; Goelet 5.888.819), ensaios de ligação de oligonucleotídeos à base de ELISA de fase sólida (Nikiforov et al., Nucl. Acids Res. 22: 4167-4175 (1994), impressão digital de didesóxi (Sarkar et al., Genomics 13: 441-443 (1992)), ensaios de extinção fluorescente de oligonucleotídeos (Livak et al., PCR Methods Appl. 4: 357362 (1995a)), ensaio TaqMan™ de hibridização específica para 5-nuclease alelo (Livak et al., Nature Genet. 9: 341-342 (1995)), ensaio de incorporação de terminador corante direcionado para o gabarito (TDI) (Chen e Kwok, Nucl. Acids Res. 25: 347-353 (1997), ensaio de baliza molecular específico para alelo (Tyagi et al., Nature Biotech. 16: 49-53 (1998)), ensaio PinPoint (Haff e Smirnov, Genome Res. 7: 378-388 (1997)), análise de dCAPS (Neff ······♦ · • · · · · · • · · · • · · et al., Plant J. 14: 387-392 (1998)), pirosseqüenciamento (Ronaghi et al., Analytical Biochemistry 267: 65-71 (1999); Ronaghi et al., pedido PCT WO 98/13523; Nyren et al., pedido PCT WO 98/28440; http//www.pyrosequencing.com), uso de espectrometria de massa, por exemplo o sistema Masscode™ (Howbert et al., WO 99/05319; Howber et al., WO 97/27331; http//www.rapigene.com; Becker et al., pedido PCT WO 98/26095; Becker et al., pedido PCT WO 98/12355; Becker et al., pedido PCT WO 97/33000; Monforte et al., U.S. 5.965.363), clivagem invasiva de sondas de oligonucleotídeo (Lyamichev et al., Nature Biotechnology 17: 292-296; http//www.twt.com), e uso de arranjos de oligonucleotídeos de alta densidade (Hacia et al., Nature Genetics 22: 164-167;SNPs can be characterized using any of several methods. Such methods include direct or indirect site sequencing, the use of restriction enzymes (Botstein et al., Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331 (1980); Konieczny and Ausubel, Plant J. 4: 403 -410 (1993)), enzymatic or imperfect chemical combination assays (Myers et al., Nature 313: 495-498 (1985)), allele-specific PCR (Newton et al., Nucl. Acids Res. 17: 2503- 2516 (1989); Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 27572760 (1989)), ligase chain reaction (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193 ( 1991)), single-strand conformation polymorphism analysis (Labrune et al., Am. J. Hum. Genet. 48: 1115-1120 (1991)), single-base primer extension (Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1143-1147 (1991), Goelet US 6,004,744; Goelet 5,888,819), oligonucleotide binding assays based on solid phase ELISA (Nikiforov et al., Nucl. Acids Res 22: 4167-4175 (1994), didesoxy digital printing (Sarkar et al., Genomi cs 13: 441-443 (1992)), fluorescent extinction assays of oligonucleotides (Livak et al., PCR Methods Appl. 4: 357362 (1995a)), TaqMan ™ specific hybridization assay for 5-nuclease allele (Livak et al., Nature Genet. 9: 341-342 (1995)), template-directed dye terminator incorporation assay (TDI ) (Chen and Kwok, Nucl. Acids Res. 25: 347-353 (1997), allele-specific molecular beacon assay (Tyagi et al., Nature Biotech. 16: 49-53 (1998)), PinPoint assay (Haff and Smirnov, Genome Res. 7: 378-388 (1997)), dCAPS analysis (Neff ······· ♦ · · · · · · · · · · · · · et al., Plant J. 14 : 387-392 (1998)), pyro-sequencing (Ronaghi et al., Analytical Biochemistry 267: 65-71 (1999); Ronaghi et al., PCT application WO 98/13523; Nyren et al., PCT application WO 98/28440 ; http // www.pyrosequencing.com), use of mass spectrometry, for example the Masscode ™ system (Howbert et al., WO 99/05319; Howber et al., WO 97/27331; http // www.rapigene .com; Becker et al., PCT application WO 98/26095; Becker et al., PCT application WO 98/12355; Becker et al., PCT application WO 97/33000; Monforte et al., U.S. 5,965,363), invasive cleavage of oligonucleotide probes (Lyamichev et al., Nature Biotechnology 17: 292-296; http // www.twt.com), and use of high density oligonucleotide arrays (Hacia et al., Nature Genetics 22: 164-167;

http//www.affymetrix.com).http // www.affymetrix.com).

Polimorfismos também podem ser detectados usando-se oligonucleotídeos específicos para alelo (ASO), que podem ser, por exemplo, usados em combinação com tecnologia baseada em hibridização incluindo hibridizações da mancha do sul, do norte e pontual, hibridizações da mancha pontual invertida e hibridizações feitas em tecnologia de microarranjo e tecnologia relacionada.Polymorphisms can also be detected using allele-specific oligonucleotides (ASO), which can, for example, be used in combination with hybridization-based technology including southern, northern and spot spot hybridization, inverted spot hybridization and hybridization made in microarray technology and related technology.

O rigor da hibridização para detecção de polimorfismo é altamente dependente de vários fatores que incluem o comprimento do oligonucleotídeo específico para alelo, a composição da seqüência, o grau de complementaridade (isto é, a presença ou ausência de combinações imperfeitas de bases), a concentração de sais e outros fatores tais como formamida e temperatura. Estes fatores são importantes tanto durante a hibridização quanto durante as subseqüentes lavagens realizadas para remover o polinucleotídeo alvo que não foi especificamente hibridizado. Na prática, as condições da lavagem final mais rigorosa são mais críticas. Além disso, a quantidade de polinucleotídeo alvo que é capaz de hibridizar para o oligonucleotídeo específico para alelo também é governada por fatores tais como a concentração de ASO e de polinucleotídeo alvo, a presença e a concentração de fatores que agem para amarrar moléculas de água, de modo a concentrar eficientemente os reagentes (por exemplo, PEG, dextrano, sul-The stringency of hybridization for polymorphism detection is highly dependent on several factors including the length of the allele-specific oligonucleotide, the sequence composition, the degree of complementarity (that is, the presence or absence of imperfect base combinations), the concentration salts and other factors such as formamide and temperature. These factors are important both during hybridization and during subsequent washes performed to remove the target polynucleotide that was not specifically hybridized. In practice, the conditions of the most stringent final wash are more critical. In addition, the amount of target polynucleotide that is able to hybridize to the allele-specific oligonucleotide is also governed by factors such as the concentration of ASO and target polynucleotide, the presence and concentration of factors that act to tie water molecules, in order to efficiently concentrate the reagents (for example, PEG, dextran,

fato de dextrano etc.), se os ácidos nucléicos estão imobilizados ou em solução, e a duração da hibridização e das etapas de lavagem.fact of dextran, etc.), whether the nucleic acids are immobilized or in solution, and the duration of hybridization and washing steps.

As hibridizações são de preferência realizadas abaixo da temperatura de fusão (T_m) do ASO. Quanto mais próxima a hibridização e/ou a etapa de lavagem estiver da T_m maior o rigor. A T_m de um oligonucleotídeo pode ser aproximada, por exemplo, de acordo com a seguinte fórmula: T_m = 81,5 + 16,6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%G+C) - 675/n; onde [Na+] é a concentração molar de sal de Na+ ou qualquer outro cátion adequado e n = número de bases no oligonucleotídeo. Outras fórmulas para aproximar a T_m estão disponíveis e são conhecidos pelos versados na técnica.Hybridizations are preferably performed below the melting temperature (T _m ) of the ASO. The closer the hybridization and / or the washing step is to T _{m, the} greater the accuracy. The AT _m of an oligonucleotide can be approximated, for example, according to the following formula: T _m = 81.5 + 16.6 x (log10 [Na +]) + 0.41 x (% G + C) - 675 / n; where [Na +] is the molar concentration of Na + salt or any other suitable cation and n = number of bases in the oligonucleotide. Other formulas for approximating T _m are available and are known to those skilled in the art.

O rigor é de preferência ajustado de modo a permitir que um dado ASO hibridize de formas diferentes para um polinucleotídeo alvo do alelo correto e um polinucleotídeo alvo do alelo incorreto. De preferência, haverá pelo menos um diferencial duplo entre o sinal produzido pelo ASO hibridizando para um polinucleotídeo alvo do alelo correto e o nível do sinal produzido pelo ASO hibridizando cruzadamente para um polinucleotídeo alvo do alelo incorreto (por exemplo, um ASO específico para um alelo mutante hibridizando cruzadamente para um alelo do tipo selvagem). Em modalidades mais preferidas da presente invenção, há pelo menos um diferencial de sinal quíntuplo. Em modalidades altamente preferidas da presente invenção, há pelo menos um diferencial de sinal de ordem de grandeza entre o ASO hibridizando para um polinucleotídeo alvo do alelo correto e o nível do sinal produzido pelo ASO hibridizando cruzadamente para um polinucleotídeo alvo do alelo incorreto.The stringency is preferably adjusted to allow a given ASO to hybridize in different ways to a target polynucleotide of the correct allele and a target polynucleotide of the incorrect allele. Preferably, there will be at least a double differential between the signal produced by the ASO hybridizing to a target polynucleotide of the correct allele and the level of the signal produced by the ASO hybridizing crosswise to a target polynucleotide of the incorrect allele (for example, an ASO specific to an allele mutant cross hybridizing to a wild type allele). In more preferred embodiments of the present invention, there is at least a five-fold differential. In highly preferred embodiments of the present invention, there is at least one order of magnitude signal differential between the ASO hybridizing to a target polynucleotide of the correct allele and the level of the signal produced by the ASO hybridizing crosswise to a target polynucleotide of the incorrect allele.

Apesar de alguns métodos de detecção de polimorfismos estarem descritos neste relatório, podem ser utilizadas outras metodologias de detecção. Por exemplo, metodologias adicionais são conhecidas e foram descritas por Birren et al., Genome Analysis, 4: 135-186, A Laboratory Manual. Mapping Genomes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1995); Paterson, Biotechnology Intelligence Unit: Genome Ma75Although some methods of detecting polymorphisms are described in this report, other detection methodologies can be used. For example, additional methodologies are known and have been described by Birren et al., Genome Analysis, 4: 135-186, A Laboratory Manual. Mapping Genomes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1995); Paterson, Biotechnology Intelligence Unit: Genome Ma75

pping in Plants, R. G. Landes Co., Georgetown, TX, e Academic Press, San Diego, CA (1996); The Maize Handbook, Freeling e Walbot, eds., SpringerVerlag, New York, NY (1994); Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Elles, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1996); Clark, ed., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, ed., Springer-Verlag, Berlim, Alemanha (1997).pping in Plants, R. G. Landes Co., Georgetown, TX, and Academic Press, San Diego, CA (1996); The Maize Handbook, Freeling and Walbot, eds., SpringerVerlag, New York, NY (1994); Methods in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Elles, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1996); Clark, ed., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, ed., Springer-Verlag, Berlin, Germany (1997).

As exigências para seleção assistida por marcador em um programa de reprodução de plantas são: (1) o(s) marcador(es) deve(m) cosegregar ou estar intimamente ligados ao traço desejado; (2) deve-se ter disponível um meio eficiente de rastrear populações grandes para o(s) marcador(es) molecular(es); e (3) a técnica de rastreamento deve ter alta reprodutibilidade em laboratórios e de preferência ser de uso econômico e inofensiva para o usuário.The requirements for marker-assisted selection in a plant breeding program are: (1) the marker (s) must cosegregate or be closely linked to the desired trait; (2) an efficient means of tracking large populations for the molecular marker (s) must be available; and (3) the tracking technique must have high reproducibility in laboratories and preferably be economical and harmless to the user.

A ligação genética de moléculas marcadoras pode ser estabelecida por um modelo de mapeamento genético tal como, sem limitação, o modelo de marcador flanqueador descrito por Lander e Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) e o mapeamento de intervalos, baseado em métodos de probabilidade máxima descritos por Lander e Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) e implementados no aplicativo MAPMAKER/QTL (Lincoln e Lander, Mapping Genes Controlling Quantitatíve Traits Using MAPMAKER/QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990). Um aplicativo adicional inclui Qgene, Versão 2.23 (1996), Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY). A utilização do aplicativo Qgene é uma abordagem particularmente preferida.The genetic linkage of marker molecules can be established by a genetic mapping model such as, without limitation, the flanking marker model described by Lander and Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) and interval mapping, based on methods maximum probabilities described by Lander and Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) and implemented in the MAPMAKER / QTL application (Lincoln and Lander, Mapping Genes Controlling Quantitatíve Traits Using MAPMAKER / QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990 An additional application includes Qgene, Version 2.23 (1996), Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY). Using the Qgene app is a particularly preferred approach.

Uma estimativa de probabilidade máxima (MLE) para a presença de um marcador é calculada, junto com uma MLE presumindo nenhum efeito QTL, para evitar falsos positivos. Um log₁₀ de uma proporção de chances (LOD) é então calculado da seguinte maneira: LOD = log₁₀ (MLE para a presença de uma QTL/MLE dado nenhum QTL ligado).A maximum probability estimate (MLE) for the presence of a marker is calculated, along with an MLE assuming no QTL effect, to avoid false positives. A log ₁₀ of a odds ratio (LOD) is then calculated as follows: LOD = log ₁₀ (MLE for the presence of a QTL / MLE given no linked QTL).

O escore da LOD indica essencialmente se é mais provável os dados serem obtidos presumindo-se a presença de um QTL do que em sua • · • · • · · · · «The LOD score essentially indicates whether the data is more likely to be obtained assuming the presence of a QTL than in your • · • · • · · · · «

·· · ausência. O valor limítrofe da LOD para evitar um falso positivo com certa segurança, digamos 95%, depende do número de marcadores e do comprimento do genoma. Gráficos indicando limites de LOD foram mostrados por Lander e Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) e também foram descritos por Arús e Moreno-González, Plant Breeding, Hayward et al., (eds.) Chapman & Hall, Londres, págs. 314-331 (1993).·· · absence. The borderline value of the LOD to prevent a false positive with certainty, say 95%, depends on the number of markers and the length of the genome. Graphs indicating LOD limits were shown by Lander and Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) and were also described by Arús and Moreno-González, Plant Breeding, Hayward et al., (Eds.) Chapman & Hall, London, p. 314-331 (1993).

Em uma modalidade da presente invenção, o marcador de ácido nucléico apresenta um escore de LOD maior que 2,0, mais preferivelmente 2,5, ainda mais preferivelmente maior que 3,0 ou 4,0 com o traço ou fenótipo de interesse. Em uma modalidade preferida, o traço de interesse é níveis ou composições alterados de tocoferol.In one embodiment of the present invention, the nucleic acid marker has an LOD score greater than 2.0, more preferably 2.5, even more preferably greater than 3.0 or 4.0 with the trait or phenotype of interest. In a preferred embodiment, the trait of interest is altered tocopherol levels or compositions.

Podem-se utilizar modelos adicionais. Muitas modificações e abordagens alternativas para o mapeamento de intervalos já foram relatadas, e incluem o uso de métodos não-paramétricos (Krulgyak e Lander, Genetícs 139: 1421-1428 (1995)). Também podem ser utilizados métodos ou modelos de regressões múltiplas, onde o traço é regredido em um grande número de marcadores (Jansen, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen e Jansen (eds.), Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Países Baixos, págs. 116-124 (1994); Weber e Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlim, 16 (1994)). Procedimentos combinando mapeamento de intervalos com análise de regressão, onde o fenótipo é regredido em um único suposto QTL a um dado intervalo do marcador e ao mesmo tempo em inúmeros marcadores que servem de ‘co-fatores’, foram relatados por Jansen e Stam, Genetics 136: 1447-1455 (1994), e Zeng, Genetics 136: 1457-1468 (1994). Em geral, o uso de cofatores reduz a influência e o erro de amostragem das posições estimadas do QTL (Utz e Melchinger, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen e Jansen (eds.), Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Países Baixos, págs. 195-204 (1994), dessa forma aumentando a precisão e a eficiência do mapeamento de QTL (Zeng, Genetics 136: 1457-1468 (1994)). Estes modelos podem estender-se a experiências de ambientes múltiplos para analisar as interações genótipo-ambiente (Jan77Additional models can be used. Many modifications and alternative approaches to mapping intervals have already been reported, and include the use of nonparametric methods (Krulgyak and Lander, Genetícs 139: 1421-1428 (1995)). Multiple regression methods or models can also be used, where the trace is regressed in a large number of markers (Jansen, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen and Jansen (eds.), Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pp. 116-124 (1994); Weber and Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlin, 16 (1994)). Procedures combining interval mapping with regression analysis, where the phenotype is regressed in a single supposed QTL to a given marker interval and at the same time in numerous markers that serve as 'co-factors', have been reported by Jansen and Stam, Genetics 136: 1447-1455 (1994), and Zeng, Genetics 136: 1457-1468 (1994). In general, the use of cofactors reduces the influence and sampling error of the estimated positions of the QTL (Utz and Melchinger, Biometrics in Plant Breeding, van Oijen and Jansen (eds.), Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, The Netherlands, pages 195-204 (1994), thereby increasing the accuracy and efficiency of QTL mapping (Zeng, Genetics 136: 1457-1468 (1994)). These models can be extended to experiments of multiple environments to analyze genotype-environment interactions (Jan77

sen et al., Theo. Appl. Gent. 91: 33-37 (1995)).sen et al., Theo. Appl. Gent. 91: 33-37 (1995)).

Fica entendido que uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas como marcadores moleculares. Fica entendido que uma ou mais das moléculas de proteína da invenção podem ser usadas como marcadores moleculares.It is understood that one or more of the nucleic acid molecules of the invention can be used as molecular markers. It is understood that one or more of the protein molecules of the invention can be used as molecular markers.

Em uma modalidade preferida, o polimorfismo está presente e é rastreado em uma população de mapeamento, por exemplo uma coleção de plantas que podem ser usadas com marcadores tais como marcadores polimórficos para mapear a posição genética de traços. A escolha da população de mapeamento apropriada geralmente depende do tipo de sistemas de marcadores empregados (Tanksley et al., J. P. Gustafson e R. Appels (eds.), Plenum Press, New York, págs. 157-173 (1988)). Deve-se levar em consideração a fonte das matrizes (adaptada vs. exótica) usadas na população de mapeamento. Os índices de pareamento de cromossomas e recombinação podem ser fortemente perturbados (suprimidos) em cruzamentos amplos (adaptado x exótico) e geralmente produzem distâncias de ligação bastante reduzidas. Cruzamentos amplos em geral fornecem populações segregantes com um número relativamente grande de polimorfismos quando comparado com a progênie em um cruzamento estreito (adaptado x adaptado).In a preferred embodiment, the polymorphism is present and is tracked in a mapping population, for example a collection of plants that can be used with markers such as polymorphic markers to map the genetic position of traits. The choice of the appropriate mapping population generally depends on the type of marker systems employed (Tanksley et al., J. P. Gustafson and R. Appels (eds.), Plenum Press, New York, pp. 157-173 (1988)). The source of the matrices (adapted vs. exotic) used in the mapping population must be taken into account. Chromosome matching and recombination indices can be severely disturbed (suppressed) at wide crossings (adapted vs. exotic) and generally produce very short binding distances. Broad crosses in general provide segregating populations with a relatively large number of polymorphisms when compared to the progeny in a narrow cross (adapted vs. adapted).

Uma população F₂ é a primeira geração de autopolinização depois de produzida a semente híbrida. Normalmente uma única planta Fi é autopolinizada para gerar uma população segregante para todos os genes com padrão mendeliano (1:2:1). Informações genéticas máximas são obtidas de uma população F₂ completamente classificada usando-se um sistema de marcadores codominantes (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen and Co., (1938)). No caso de marcadores dominantes, são requeridos testes com a progênie (por exemplo, F₃, BCF₂) para identificar os heterozigotos, para classificar a população. No entanto, este procedimento geralmente é proibitivo por causa dos custos e tempo envolvidos em testar a progênie. Testar a progênie dos indivíduos F₂ geralmente é usado na constructo do mapa onde os fenótipos não refletem consistentemente o genótipoAn F ₂ population is the first generation of self-pollination after hybrid seed is produced. Usually a single Fi plant is self-pollinated to generate a segregating population for all genes with a Mendelian pattern (1: 2: 1). Maximum genetic information is obtained from a completely classified F ₂ population using a system of codominant markers (Mather, Measurement of Linkage in Heredity: Methuen and Co., (1938)). In the case of dominant markers, tests with the progeny (for example, F ₃ , BCF ₂ ) are required to identify the heterozygotes, to classify the population. However, this procedure is generally prohibitive because of the costs and time involved in testing the progeny. Testing the progeny of F ₂ individuals is often used in constructing the map where phenotypes do not consistently reflect the genotype

(por exemplo resistência a doenças) ou onde a expressão de traços é controlada por um QTL. Os dados de segregação das populações de teste de progênie por exemplo F₃ ou BCF₂) podem ser usados na constructo do mapa. Seleção assistida por marcadores pode ser então aplicada à progênie cruzada com base em associação do mapa de marcador-traço (F_2i F₃), onde os grupos de ligação não foram completamente dissociados por eventos de recombinação (isto é, desequilíbrio máximo).(for example disease resistance) or where the expression of traits is controlled by a QTL. The segregation data of progeny test populations (eg F ₃ or BCF ₂ ) can be used in constructing the map. Marker-assisted selection can then be applied to the crossed progeny based on association of the marker-trace map (F _2i F ₃ ), where the linker groups have not been completely dissociated by recombination events (ie, maximum imbalance).

Linhagens naturais recombinantes (RIL) (linhagens geneticamente relacionadas; usualmente > F₅, desenvolvidas de linhagens F₂ continuamente autopolinizantes com respeito à homozigosidade) podem ser usadas como população de mapeamento. As informações obtidas dos marcadores dominantes podem ser maximizadas usando RIL porque todos os loci são homozigotos ou quase homozigotos. Em condições de ligação firme (isto é, cerca de < 10% de recombinação), marcadores dominantes e codominantes avaliados em populações de RIL oferecem mais informações por indivíduo do que qualquer dos tipos de marcador em populações de cruzamento reversível (Reiter, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89: 1477-1481 (1992)). No entanto, à medida em que a distância entre os marcadores fica maior (isto é, os loci ficam mais independentes), as informações nas populações de RIL diminuem drasticamente quando comparadas com marcadores codominantes.Recombinant natural lines (RIL) (genetically related lines; usually> F ₅ , developed from continuously self-pollinating F ₂ lines with respect to homozygosity) can be used as a mapping population. The information obtained from the dominant markers can be maximized using RIL because all loci are homozygous or almost homozygous. Under tightly bound conditions (ie, about <10% recombination), dominant and codominant markers evaluated in RIL populations offer more information per individual than any of the marker types in reversible crossover populations (Reiter, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 89: 1477-1481 (1992)). However, as the distance between the markers becomes greater (that is, the loci become more independent), the information in RIL populations decreases dramatically when compared to codominant markers.

Populações de cruzamento reversível (por exemplo, geradas de um cruzamento entre uma variedade bem-sucedida (matriz recorrente) e uma outra variedade (matriz doadora) contendo um traço não presente na primeira) podem ser utilizadas como população de mapeamento. Pode-se fazer uma série de cruzamentos reversíveis com a matriz recorrente para recuperar o máximo de seus traços desejáveis. Assim, cria-se uma população consistindo em indivíduos quase idênticos à matriz recorrente mas cada indivíduo contém quantidades variáveis ou um mosaico de regiões genômicas da matriz doadora. Populações de cruzamentos reversíveis podem ser úteis para o mapeamento de marcadores dominantes se todos os loci na matriz recorrente forem homozigotos e as matrizes doadora e recorrenteReversible cross populations (for example, generated from a cross between a successful variety (recurrent matrix) and another variety (donor matrix) containing a trait not present in the first) can be used as a mapping population. A series of reversible intersections with the recurrent matrix can be made to recover the maximum of its desirable features. Thus, a population is created consisting of individuals almost identical to the recurrent matrix, but each individual contains varying amounts or a mosaic of genomic regions of the donor matrix. Reversible crossing populations can be useful for mapping dominant markers if all loci in the recurrent matrix are homozygous and the donor and recurrent matrices

tiverem alelos de marcador polimórficos contrastantes (Reiter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89: 1477-1481 (1992)). Menos informações são obtidas de populações de cruzamentos reversíveis usando-se marcadores codominantes ou dominantes do que as que são obtidas de populações F₂ porque só é amostrado um, ao invés de dois, gameta recombinante por planta. As populações de cruzamentos reversíveis, no entanto, são mais informativas (a uma baixa saturação de marcador) quando comparadas com RILs porque a distância entre os loci ligados aumenta nas populações de RIL (isto é, cerca de 0,15% de recombinação). Recombinação aumentada pode ser benéfica para a resolução de ligações firmes, mas pode ser indesejável na constructo de mapas com baixa saturação de marcador.have contrasting polymorphic marker alleles (Reiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 1477-1481 (1992)). Less information is obtained from reversible crossover populations using codominant or dominant markers than that obtained from F ₂ populations because only one, rather than two, recombinant gamete per plant is sampled. Reversible crossing populations, however, are more informative (at low marker saturation) when compared to RILs because the distance between linked loci increases in RIL populations (ie, about 0.15% recombination). Increased recombination may be beneficial for resolving firm bonds, but may be undesirable in the construction of maps with low marker saturation.

Linhagens quase isogênicas (NIL) (criadas por muitos cruzamentos reversíveis para produzir uma coleção de indivíduos que é de composição genética quase idêntica exceto quanto ao traço ou região genômica com interrogação) podem ser usadas como população de mapeamento. No mapeamento com NILs, espera-se que somente uma porção dos loci polimórficos mapeie uma região selecionada.Quasi-isogenic strains (NIL) (created by many reversible crosses to produce a collection of individuals that is of almost identical genetic makeup except for the trait or genomic region with interrogation) can be used as a mapping population. In mapping with NILs, it is expected that only a portion of the polymorphic loci will map a selected region.

Análise de segregantes por volume (BSA) é um método desenvolvido para a rápida identificação de ligação entre marcadores e traços de interesse (Michelmore et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 9828-9832 (1991)). Na BSA, duas amostras de DNA avolumadas são retiradas de uma população segregante originando de um único cruzamento. Esses volumes contêm indivíduos que são idênticos em um traço particular (resistentes ou suscetíveis a uma doença particular) ou em uma região genômica porém arbitrários em regiões não-ligadas (isto é, heterozigotos). Regiões não ligadas a regiões alvo não vão ser diferentes entre as amostras avolumadas de muitos indivíduos em BSA.Volume segregation analysis (BSA) is a method developed for the rapid identification of the link between markers and traits of interest (Michelmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9828-9832 (1991)). In the BSA, two swollen DNA samples are taken from a segregating population originating from a single cross. These volumes contain individuals that are identical in a particular trait (resistant or susceptible to a particular disease) or in a genomic region but arbitrary in unrelated (that is, heterozygous) regions. Regions not linked to target regions will not be different among the swarmed samples of many individuals in BSA.

Em um aspecto da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção são usadas para determinar o nível (isto é, a concentração de mRNA em uma amostra etc.) em uma planta (de preferência canola, milho, Brassica campestris, Brassica napus, soja, crambe (crariibe abyssinica), mostarda, mamona, amendoim, gergelim, se-In one aspect of the present invention, one or more of the nucleic acid molecules of the present invention are used to determine the level (i.e., the concentration of mRNA in a sample etc.) in a plant (preferably canola, corn, Brassica campestris , Brassica napus, soy, crambe (crariibe abyssinica), mustard, castor bean, peanut, sesame,

mente de algodão, linhaça, açafrão, palmeira, linho ou girassol) ou o padrão (isto é, cinética de expressão, taxa de decomposição, perfil de estabilidade etc.) da expressão de uma proteína codificada parcial ou totalmente por uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção (coletivamente, resposta de expressão de uma célula ou tecido).cotton, flaxseed, saffron, palm, flax or sunflower) or the pattern (ie, expression kinetics, decomposition rate, stability profile etc.) of the expression of a protein encoded partially or totally by one or more of the molecules of nucleic acid of the present invention (collectively, cell or tissue expression response).

Conforme aqui usado, a resposta de expressão manifestada por uma célula ou tecido é considerada alterada se for diferente da resposta de expressão de células ou tecidos de plantas que não apresentam o fenótipo. Para determinar se uma resposta de expressão está alterada, a resposta de expressão manifestada pela célula ou tecido da planta que apresenta o fenótipo é comparada com aquela de uma amostra celular ou tecidual semelhante de uma planta que não apresenta o fenótipo. Como será observado, não é necessária determinar novamente a resposta de expressão da amostra celular ou tecidual de plantas que não apresentam o fenótipo toda vez que for feita tal comparação; ao contrário, a resposta de expressão de uma planta particular pode ser comparada os valores anteriormente obtidos de plantas normais. Conforme aqui usado, o fenótipo do organismo é qualquer de uma ou mais características de um organismo (por exemplo resistência a doenças, tolerância a pragas, tolerância ao ambiente tal como tolerância ao estresse abiótico, esterilidade da planta macho, melhora da qualidade ou do rendimento etc.). Uma alteração no genótipo ou fenótipo pode ser temporária ou permanente. Também conforme aqui usado, uma amostra de tecido é qualquer amostra que compreende mais de uma célula. Em um aspecto preferido, uma amostra de tecido compreende células que compartilham características comuns (por exemplo derivadas de raiz, semente, flor, folha, caule ou pólen etc.).As used herein, the expression response manifested by a cell or tissue is considered altered if it differs from the expression response of cells or tissues from plants that do not show the phenotype. To determine whether an expression response is altered, the expression response manifested by the cell or tissue of the plant showing the phenotype is compared to that of a similar cell or tissue sample from a plant that does not show the phenotype. As will be noted, it is not necessary to determine again the expression response of the cell or tissue sample of plants that do not present the phenotype every time such a comparison is made; on the contrary, the expression response of a particular plant can be compared to the values previously obtained from normal plants. As used herein, the organism's phenotype is any one or more characteristics of an organism (for example disease resistance, tolerance to pests, tolerance to the environment such as tolerance to abiotic stress, male plant sterility, improvement of quality or yield etc.). A change in the genotype or phenotype can be temporary or permanent. Also as used herein, a tissue sample is any sample that comprises more than one cell. In a preferred aspect, a tissue sample comprises cells that share common characteristics (for example derived from root, seed, flower, leaf, stem or pollen, etc.).

Em um aspecto da presente invenção, pode-se conduzir uma avaliação para determinar se uma molécula de mRNA específica está presente. Uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção são utilizadas para detectar a presença ou a quantidade da espécie de mRNA. Tais moléculas são então incubadas com extratos de célula ou tecido de uma planta em condições suficientes para permitir hibridização deIn one aspect of the present invention, an evaluation can be conducted to determine whether a specific mRNA molecule is present. One or more of the nucleic acid molecules of the present invention are used to detect the presence or quantity of the mRNA species. These molecules are then incubated with cell or tissue extracts from a plant in sufficient conditions to allow hybridization of

• · · · · · · · · · · · · • · ·♦♦······ ·· · • ···«··*· ··· · · · • · · · · « · · · · · · ··» » ··· · ·· · · · ácido nucléico. A detecção de moléculas híbridas de sonda-mRNA de filamento duplo (double-stranded probe-mRNA hybrid molecules) é indicativa da presença do mRNA; a quantidade de tal híbrido formado é proporcional à quantidade de mRNA. Assim, tais sondas podem ser usadas para verificar o nível e a extensão da produção de mRNA nas células ou tecidos de uma planta. Tal hibridização de ácidos nucléicos pode ser conduzida em condições quantitativas (fornecendo assim um valor numérico da quantidade de mRNA presente). Alternativamente, o ensaio pode ser conduzido como um ensaio qualitativo que indica ou que o mRNA está presente ou que se nível ultrapassa um valor predefinido fixado pelo usuário.· · · · · · · · · · ······ ·· · · ··· · ·· * · ··· · ·· * · ··· · · · • · · · · · · · · · · · ·· »» ··· · ·· · · · nucleic acid. The detection of hybrid double-stranded probe-mRNA hybrid molecules is indicative of the presence of the mRNA; the amount of such a hybrid formed is proportional to the amount of mRNA. Thus, such probes can be used to check the level and extent of mRNA production in the cells or tissues of a plant. Such hybridization of nucleic acids can be conducted under quantitative conditions (thus providing a numerical value of the amount of mRNA present). Alternatively, the assay can be conducted as a qualitative assay that indicates either that the mRNA is present or that the level exceeds a predefined value set by the user.

Inúmeros métodos podem ser usados para comparar a resposta de expressão entre duas ou mais amostras de células ou tecido. Esses métodos incluem ensaios de hibridização, tais como os ensaios da mancha do norte (northerns), ensaios de proteção de RNAse e hibridização in situ. Alternativamente, os métodos incluem ensaios tipo PCR. Em um método preferido, a resposta de expressão é comparada por hibridização de ácidos nucléicos das duas ou mais amostras para um conjunto de ácidos nucléicos. O conjunto contém uma pluralidade de seqüências suspeitas que se sabe ou se suspeita estarem presentes nas células ou tecido das amostras.Numerous methods can be used to compare the expression response between two or more samples of cells or tissue. These methods include hybridization assays, such as northern spot assays, RNAse protection assays and in situ hybridization. Alternatively, the methods include PCR-like assays. In a preferred method, the expression response is compared by hybridizing nucleic acids from the two or more samples to a set of nucleic acids. The set contains a plurality of suspicious sequences that are known or suspected to be present in the cells or tissue of the samples.

Uma vantagem da hibridização in situ em relação a técnicas mais convencionais para a detecção de ácidos nucléicos é que ela permite ao pesquisador determinar a população espacial precisa (Angerer et al., Dev. Biol. 101: 477-484 (1984); Angerer et al., Dev. Biol. 112: 157-166 (1985); Dixon et al., EMBO J. 10: 1317-1324 (1991)). A hibridização in situ pode ser usada para medir o nível de acumulação de RNA no estado estacionário (Hardin et al., J. Mol. Biol. 202: 417-431 (1989)). Foram criados inúmeros protocolos para hibridização in situ, cada um com condições de preparação, hibridização e lavagem do tecido (Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 242-250 (1987); Cox e Goldberg, in: Plant Molecular Biology: A Practical Approach, Shaw (ed.), págs. 1-35, IRL Press, Oxford (1988); Raikhel et al., In situ RNA hybridization in plant tissues, In: Plant Molecular Biology Manual, vol. B9:1-32, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Bélgi82 ····· 9 · · · · · * · • · « a • a 99 9999999 9 9An advantage of in situ hybridization over more conventional techniques for detecting nucleic acids is that it allows the researcher to determine the precise spatial population (Angerer et al., Dev. Biol. 101: 477-484 (1984); Angerer et al., Dev. Biol. 112: 157-166 (1985); Dixon et al., EMBO J. 10: 1317-1324 (1991)). In situ hybridization can be used to measure the level of RNA accumulation at steady state (Hardin et al., J. Mol. Biol. 202: 417-431 (1989)). Numerous protocols for in situ hybridization have been created, each with conditions for tissue preparation, hybridization and washing (Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 242-250 (1987); Cox and Goldberg, in: Plant Molecular Biology: A Practical Approach, Shaw (ed.), Pp. 1-35, IRL Press, Oxford (1988); Raikhel et al., In situ RNA hybridization in plant tissues, In: Plant Molecular Biology Manual, vol. B9: 1- 32, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, Bélgi82 ····· 9 · · · · · * · • · «a • to 99 9999999 9 9

9 9 9 9 9 9 99 999 9 9 9 « 9 · t · · «···· • 9 9 9 99 9 9 99 9 9 9 ca (1989)).9 9 9 9 9 9 99 999 9 9 9 «9 · t · ·« ···· • 9 9 9 99 9 9 99 9 9 9 ca (1989)).

A hibridização in situ também permite a localização de proteínas em um tecido ou célula (Wilkinson, In Situ Hybridization, Oxford University Press, Oxford (1992); Langdale, In Situ Hybridization In: The Maize Handbook, Freeling & Walbot (eds.), págs. 165-179, Springer-Verlag, New York (1994)). Fica entendido que uma ou mais das moléculas da invenção, de preferência uma ou mais das moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das mesmas da invenção ou um ou mais dos anticorpos da invenção podem ser utilizados para detectar o nível ou o padrão de uma proteína ou mRNA da mesma por hibridização in situ.In situ hybridization also allows the localization of proteins in a tissue or cell (Wilkinson, In Situ Hybridization, Oxford University Press, Oxford (1992); Langdale, In Situ Hybridization In: The Maize Handbook, Freeling & Walbot (eds.), pp. 165-179, Springer-Verlag, New York (1994)). It is understood that one or more of the molecules of the invention, preferably one or more of the nucleic acid molecules or fragments thereof, or one or more of the antibodies of the invention can be used to detect the level or pattern of a protein or mRNA of it by in situ hybridization.

A hibridização in situ fluorescente permite a localização de uma seqüência de DNA específica em um cromossoma, que é útil, entre outras coisas, para o mapeamento genético, o acompanhamento de cromossomas em linhagens híbridas ou a detecção de cromossomas com translocações, transversões ou deleções. A hibridização in situ vem sendo utilizada para identificar cromossomas em várias espécies de plantas (Griffor et al., Plant Mol. Biol. 17: 101-109 (1991); Gustafson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1899-1902 (1990); Mukai e Gill, Genome 34: 448-452 (1991); Schwarzacher e Heslop-Harrison, Genome 34: 317-323 (1991); Wang et al., Jpn. J. Genet. 66: 313-316 (1991); Parra e Windle, Nature Genetics 5: 17-21 (1993)). Fica entendido que as moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser usadas como sondas ou marcadores para localizar seqüências em um cromossoma.Fluorescent in situ hybridization allows the localization of a specific DNA sequence on a chromosome, which is useful, among other things, for genetic mapping, the monitoring of chromosomes in hybrid strains or the detection of chromosomes with translocations, transversions or deletions. In situ hybridization has been used to identify chromosomes in various plant species (Griffor et al., Plant Mol. Biol. 17: 101-109 (1991); Gustafson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA ) 87: 1899-1902 (1990); Mukai and Gill, Genome 34: 448-452 (1991); Schwarzacher and Heslop-Harrison, Genome 34: 317-323 (1991); Wang et al., Jpn. J. Genet 66: 313-316 (1991); Parra and Windle, Nature Genetics 5: 17-21 (1993)). It is understood that the nucleic acid molecules of the invention can be used as probes or markers to locate sequences on a chromosome.

Um outro método para localizar a expressão de uma molécula é a impressão do tecido. A impressão do tecido oferece uma maneira de rastrear, ao mesmo tempo na mesma membrana, muitas seções do tecido de diferentes plantas ou diferentes estágios de desenvolvimento (Yomo e Taylor, Planta 112: 35-43 (1973); Harris e Chrispeels, Plant Physiol. 56: 292-299 (1975); Cassab e Varner, J. Cell. Biol. 105: 2581-2588 (1987); Spruce et al., Phytochemistry 26: 2901-2903 (1987); Barres et al., Neuron 5: 527-544 (1990); Reid e Pont-Lezica, Tissue Printing: Tools for the Study of Anatomy, Histochemistry and Gene Expression, Academic Press, New York,Another method for locating the expression of a molecule is to print the tissue. Tissue printing offers a way of tracking, at the same time on the same membrane, many sections of tissue from different plants or different stages of development (Yomo and Taylor, Plant 112: 35-43 (1973); Harris and Chrispeels, Plant Physiol 56: 292-299 (1975); Cassab and Varner, J. Cell. Biol. 105: 2581-2588 (1987); Spruce et al., Phytochemistry 26: 2901-2903 (1987); Barres et al., Neuron 5: 527-544 (1990); Reid and Pont-Lezica, Tissue Printing: Tools for the Study of Anatomy, Histochemistry and Gene Expression, Academic Press, New York,

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New York (1992); Reid et al., Plant Physiol. 93: 160-165 (1990); Ye et al., Plant J. 1: 175-183 (1991)).New York (1992); Reid et al., Plant Physiol. 93: 160-165 (1990); Ye et al., Plant J. 1: 175-183 (1991)).

O versado na técnica pode consultar textos de referência em geral sobre descrições de técnicas conhecidas discutidas neste relatório ou técnicas equivalentes. Esses textos incluem Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, N. Y. (1989), e suplementos até setembro (1998), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 2^ã ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), Genome Analysis: A Laboratory Manual 1: Analyzing DNA, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1997); Genome Analysis: A Laboratory Manual 2: Detecting Genes, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1998); Genome Analysis: A Laboratory Manual 3: Cloning Systems, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1999); Genome Analysis: A Laboratory Manual 4: Mapping Genomes, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1999); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Springer-Verlag, Berlim (1997), Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1995). Naturalmente estes textos também podem ser consultados quando se faz ou se usa um aspecto da invenção. Fica entendido que qualquer dos agentes da invenção pode ser substancialmente purificado e/ou ser biologicamente ativo e/ou recombinante.The person skilled in the art can consult reference texts in general on descriptions of known techniques discussed in this report or equivalent techniques. These texts include Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds, John Wiley & Sons, NY (1989), and supplements through September (1998), Molecular Cloning:... A Laboratory Manual, Sambrook et al, 2nd ed ., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), Genome Analysis: A Laboratory Manual 1: Analyzing DNA, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1997); Genome Analysis: A Laboratory Manual 2: Detecting Genes, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1998); Genome Analysis: A Laboratory Manual 3: Cloning Systems, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1999); Genome Analysis: A Laboratory Manual 4: Mapping Genomes, Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1999); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Springer-Verlag, Berlin (1997), Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1995). Naturally, these texts can also be consulted when an aspect of the invention is made or used. It is understood that any of the agents of the invention can be substantially purified and / or be biologically active and / or recombinant.

Tendo descrito genericamente a invenção, a mesma será mais facilmente entendido com referências aos exemplos a seguir que são fornecidos a título ilustrativo e não pretendem limitar a presente invenção, a menos que especificado.Having generally described the invention, it will be more readily understood with reference to the following examples which are provided by way of illustration and are not intended to limit the present invention, unless specified.

Cada periódico, patente e outro documento ou referência aqui mencionado está aqui incorporado em sua integridade a título de referência. EXEMPLO 1Each journal, patent and other document or reference mentioned herein is hereby incorporated in its entirety by way of reference. EXAMPLE 1

Clonagem de tyrA de Erwinia herbicolaCloning of tyrA from Erwinia herbicola

São obtidos os vetores pJX1, pJX181 e pJX184 (Zhao e Jensen, Molecular Evolution 36(2): 107-20 (1993)). O gene tyrA é amplificado porVectors pJX1, pJX181 and pJX184 are obtained (Zhao and Jensen, Molecular Evolution 36 (2): 107-20 (1993)). The tyrA gene is amplified by

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PCR usando-se os iniciadores tyrA5’ (ACT GCC ATG GTG GCT GAA CTG ACC G (SEQ ID N⁹: 5)) e tyrA3’ (ACT GGA ATT CTT ATT ATG GGC GGC TGT CAT TG (SEQ ID N⁹: 6)) e DNA de plasmídeo dos vetores pJX1, pJX181 e pJX184 como molde de DNA. Reações de PCR usando o kit de PCR de alta fidelidade Expand™ da Boehringer Mannheim são feitas em um volume total de 50 μΙ de acordo com o protocolo do fabricante. O gene tyrA é amplificado por 30 ciclos de PCR nas seguintes condições: 10 min de incubação a 95°C, seguidos de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de combinação a 56°C e 1,5 min de extensão a 72°C. A estas reações seguiram-se 5 min de incubação a 72°C. O produto de PCR do vetor pJX184 é escolhido para clonagem do gene e digerido com Ncol e EcoRI. O fragmento de restrição purificado em gel é ligado em pSE280 digerido com Ncol/EcoRI e purificado em gel (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) resultando na formação de pMON26588 (figura 2). A inserção de tyrA em pMON26588 é verificada por seqüenciamento de DNA.PCR using primers tyrA5 '(ACT GCC ATG GTG GCT GAA CTG ACC G (SEQ ID NO ⁹ : 5)) and tyrA3' (ACT GGA ATT CTT ATT ATG GGC GGC TGT CAT TG (SEQ ID NO ⁹ : 6) ) and plasmid DNA from vectors pJX1, pJX181 and pJX184 as DNA template. PCR reactions using the Boehringer Mannheim Expand ™ high-fidelity PCR kit are performed in a total volume of 50 μΙ according to the manufacturer's protocol. The tyrA gene is amplified by 30 cycles of PCR under the following conditions: 10 min incubation at 95 ° C, followed by 30 cycles of 1 min at 95 ° C, 1 min of combination at 56 ° C and 1.5 min of extension at 72 ° C. These reactions were followed by a 5 min incubation at 72 ° C. The PCR product of the vector pJX184 is chosen for cloning the gene and digested with Ncol and EcoRI. The gel-purified restriction fragment is ligated into NcoI / EcoRI-digested pSE280 and gel-purified (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) resulting in the formation of pMON26588 (Figure 2). The insertion of tyrA in pMON26588 is verified by DNA sequencing.

EXEMPLO 2EXAMPLE 2

Clonagem de tyrA de Escherichia coliCloning of Escherichia coli tyrA

O gene tyrA de E. coli é amplificado por PCR usando-se os iniciadores tyrAecoli5’ (ACT GCC ATG GTT GCT GAA TTG ACC G (SEQ ID N⁹: 7)) e tyrAecoli3’ (ACT GGA ATT CTT ATT ACT GGC GAT TG (SEQ ID N⁹: 8)) e DNA genômico total de E. coli DH5a como molde de DNA. DNA genômico total de E. coli é isolado usando-se o kit Qiaamp Tissue da Qiagen (Qiagen Inc., Valencia, CA). Reações de PCR usando o kit de PCR de alta fidelidade Expand™ da Boehringer Mannheim são feitas em um volume total de 50 μΙ de acordo com o protocolo do fabricante. O gene tyrA é amplificado por 30 ciclos de PCR nas seguintes condições: 10 min de incubação a 95°C, seguidos de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min de combinação a 56°C e 1,5 min de extensão a 72°C. A estas reações seguiram-se 5 min de incubação a 72°C. O produto de PCR é digerido com Ncol e EcoRI. O fragmento de restrição purificado em gel é ligado em pSE280 digerido com Ncol/EcoRI e purificado em gel (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) resultando na formação de pMON26589 (figura 3). A inserção de tyrA em pMON26589 é verificadaThe E. coli tyrA gene is amplified by PCR using the primers tyrAecoli5 '(ACT GCC ATG GTT GCT GAA TTG ACC G (SEQ ID NO: ⁹ : 7)) and tyrAecoli3' (ACT GGA ATT CTT ATT ACT GGC GAT TG (SEQ ID NO ⁹ : 8)) and total E. coli DH5a genomic DNA as DNA template. Total E. coli genomic DNA is isolated using Qiagen's Qiaamp Tissue kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). PCR reactions using the Boehringer Mannheim Expand ™ high-fidelity PCR kit are performed in a total volume of 50 μΙ according to the manufacturer's protocol. The tyrA gene is amplified by 30 cycles of PCR under the following conditions: 10 min incubation at 95 ° C, followed by 30 cycles of 1 min at 95 ° C, 1 min of combination at 56 ° C and 1.5 min of extension at 72 ° C. These reactions were followed by a 5 min incubation at 72 ° C. The PCR product is digested with Ncol and EcoRI. The gel-purified restriction fragment is ligated into NcoI / EcoRI-digested pSE280 and gel-purified (Invitrogen Co., Carlsbad, CA) resulting in the formation of pMON26589 (Figure 3). The insertion of tyrA in pMON26589 is verified

• · 9 · · · · por seqüenciamento de DNA. EXEMPLO 3• · 9 · · · · by DNA sequencing. EXAMPLE 3

Expressão de prefenato desidrogenase bifuncional em E. coliExpression of bifunctional prefenate dehydrogenase in E. coli

Os vetores pMON26588 e pMON26589 são transformados emThe vectors pMON26588 and pMON26589 are transformed into

E. coli DH5a e células são cultivadas em 15 ml de uma cultura de LB até uma densidade ótica a 600 nm de cerca de 0,6, e induzidas pela adição de IPTG até uma concentração final de 0,66 μΜ. Depois de incubação por 2 a 3 horas, as células são colhidas. O pélete de células é ressuspendida em 0,5 ml de Tris/HCl 25 mM, pH 8,2 e as células são rompidas por sonicação. As membranas e os fragmentos de células são sedimentados por centrifugação a 100.000 x g por três horas. O sobrenadante é usado em ensaios de enzimas como um extrato de células bruto. A atividade de prefenato desidrogenase é medida em um volume final de 1,5 ml contendo EDTA 1 mM, DTE 1 mM, NAD 1 mM e prefenato (sal de Ba) 1 mM em Tris/HCl 25 mM pH 8,2. A atividade específica de prefenato desidrogenase é determinado por monitoramento da conversão de NAD⁺ em NADH como descrito em Methods in Enzymology vol. 17 (Parte A) páginas 564-574 (1970). Os resultados estão mostrados na Tabela 1 abaixo.E. coli DH5a and cells are cultured in 15 ml of a LB culture to an optical density at 600 nm of about 0.6, and induced by the addition of IPTG to a final concentration of 0.66 μΜ. After incubation for 2 to 3 hours, the cells are harvested. The cell pellet is resuspended in 0.5 ml of 25 mM Tris / HCl, pH 8.2 and the cells are disrupted by sonication. The membranes and cell fragments are pelleted by centrifugation at 100,000 xg for three hours. The supernatant is used in enzyme assays as a crude cell extract. Prephenate dehydrogenase activity is measured in a final volume of 1.5 ml containing 1 mM EDTA, 1 mM DTE, 1 mM NAD and 1 mM prephenate (Ba salt) in 25 mM Tris / HCl pH 8.2. The specific activity of prefenate dehydrogenase is determined by monitoring the conversion of NAD ⁺ to NADH as described in Methods in Enzymology vol. 17 (Part A) pages 564-574 (1970). The results are shown in Table 1 below.

Tabela 1Table 1

Designação do vetor Vector designation Gene Gene Atividade específica Specific activity μιτιοΙ/mg x min μιτιοΙ / mg x min Controle do tipo selvagem Wild-type control 2x 10⁵ 2x 10 ⁵ pMON26588 pMON26588 tyrA Erwinia herbicola tyrA Erwinia herbicola 5,75 5.75 pMON26589 pMON26589 tyrA Escherichia coli tyrA Escherichia coli 3,44 3.44

EXEMPLO 4EXAMPLE 4

Colocando o gene tyrA sob o controle do promotor T7Putting the tyrA gene under the control of the T7 promoter

Os genes tyrA de E. coli e E. herbicola são clivados como fragmentos Ncol / EcoRI de pMON26589 e pMON26588, purificados em gel e 25 clonados em pMON26541 digerido com Ncol / EcoRI e purificado em gel (figura 28), resultando na formação de pMON26591 e pMON26590, respec-The E. coli and E. herbicola tyrA genes are cleaved as Ncol / EcoRI fragments from pMON26589 and pMON26588, gel purified and 25 cloned into Ncol / EcoRI digested and gel purified pMON26541 (figure 28), resulting in the formation of pMON26591 and pMON26590, respectively

tivamente (figuras 4 e 5). Estes vetores colocam o gene tyrA sob o controle do promotor T7.tively (Figures 4 and 5). These vectors place the tyrA gene under the control of the T7 promoter.

EXEMPLO 5EXAMPLE 5

Preparação de um vetor de expressão em planta com tyrAPreparation of a plant expression vector with tyrA

O gene tyrA de E. herbicola é escolhido para expressão em planta. O gene é clivado de pMON26590 por digestão de restrição com Ncol / EcoRI, purificado em gel e ligado em pMON26541 digerido com Ncol / EcoRI e purificado em gel, resultando na formação de um vetor de transporte pMON36510 (figura 6). Estas ligações fundem o gene tyrA bacteriano ao CTP1, que é o peptídio de direcionamento para cloroplasto da subunidade pequena da ribulose bifosfato carboxilase de Arabidopsis, e o coloca sob o controle do promotor e35S.The E. herbicola tyrA gene is chosen for plant expression. The gene is cleaved from pMON26590 by restriction digest with Ncol / EcoRI, purified on gel and ligated into pMON26541 digested with Ncol / EcoRI and purified on gel, resulting in the formation of a pMON36510 transport vector (figure 6). These bonds fuse the bacterial tyrA gene to CTP1, which is the targeting peptide for chloroplast of the small subunit of the Arabidopsis ribulose bisphosphate carboxylase, and puts it under the control of the e35S promoter.

Para colocar o gene tyrA sob o controle do promotor para Napina, o pMON36510 é digerido com EcoRI, as extremidades são preenchidas usando-se o fragmento de Klenow (Maniatis), e o vetor purificado em gel é digerido com BglII. O fragmento menor codificando o gene tyrA fundido ao CTP1 é purificado em gel e ligado para ligação em pCGN3223 digerido e purificado em gel (figura 45). Para efetuar esta ligação, o pCGN3224 é digerido com Pstl, as extremidades são preenchidas com o fragmento de Klenow (Maniatis) e em seguida o vetor é digerido com Bgl II e purificado em gel. A ligação do vetor purificado e a fusão CTP1 purificado::tyrA resulta na formação de pMON36512 (figura 7).To place the tyrA gene under the control of the promoter for Napina, pMON36510 is digested with EcoRI, the ends are filled using the Klenow fragment (Maniatis), and the gel-purified vector is digested with BglII. The minor fragment encoding the tyrA gene fused to CTP1 is gel purified and ligated for ligation into digested and gel purified pCGN3223 (figure 45). To make this connection, pCGN3224 is digested with Pstl, the ends are filled with the Klenow fragment (Maniatis) and then the vector is digested with Bgl II and purified on gel. The binding of the purified vector and the purified CTP1 :: tyrA fusion results in the formation of pMON36512 (Figure 7).

Para transferir o gene tyrA de E. herbicola para um vetor binário de Arabidopsis pMON36510 é digerido com Hindlll e Sac I e o fragmento contendo o promotor e35S, purificado em gel, é fundido ao GTP1 e tyrA é ligado em pMON26543 digerido com Hindlll / Saci e purificado em gel (figura 29), o que resulta na formação de pMON36511 (figura 8). Este vetor contém tyrA sob o controle do promotor e35S. O vetor de expressão binário pNapina é obtido por ligação do fragmento Notl purificado em gel ancorando o cassete de expressão pNapina::CTP1::tyrA::napina 3’ em pMON36176 digerido com Notl (figura 30), o que resulta na formação de pMON36520 (figura 9).To transfer the E. herbicola tyrA gene to an Arabidopsis binary vector pMON36510 is digested with Hindlll and Sac I and the fragment containing the gel-purified e35S promoter is fused to GTP1 and tyrA is ligated into Hindlll / Saci-digested pMON26543 and gel purified (figure 29), which results in the formation of pMON36511 (figure 8). This vector contains tyrA under the control of the e35S promoter. The binary expression vector pNapina is obtained by ligating the gel-purified Notl fragment anchoring the expression cassette pNapina :: CTP1 :: tyrA :: napina 3 'in pMON36176 digested with Notl (figure 30), which results in the formation of pMON36520 (figure 9).

EXEMPLO 6EXAMPLE 6

Transformação de Arabidopsis com pMON36520 e pMON36511Transformation of Arabidopsis with pMON36520 and pMON36511

Agrobacterium que fora transformada com pMON36520 e pMON36511 são preparados da seguinte maneira. 100 μΙ de uma cultura de uma noite são espalhados sobre uma placa de ágar LB com antibióticos. A placa é colocada voltada para baixo em uma câmara a 30°C por uma noite. As placas são retiradas depois de as colônias crescerem (24 - 48 horas).Agrobacterium that has been transformed with pMON36520 and pMON36511 are prepared as follows. 100 μΙ of an overnight culture is spread on an LB agar plate with antibiotics. The plate is placed face down in a chamber at 30 ° C for one night. Plates are removed after colonies have grown (24 - 48 hours).

Uma cultura em pequena escala é iniciada colocando-se 10 ml de meio LB líquido em um tubo de 50 ml. São adicionados 10 μΙ de canamicina (50 μο/μΙ), 10 μΙ de espectinomicina (75 - 100 μο/μΙ) e 10 μΙ de cloranfenicol (25 μg/μl). Agrobacterium é adicionada de uma placa, e o tubo é agitado e colocada em um agitador a 30°C por uma noite.A small-scale culture is initiated by placing 10 ml of liquid LB medium in a 50 ml tube. 10 μΙ of kanamycin (50 μο / μΙ), 10 μΙ of spectinomycin (75 - 100 μο / μΙ) and 10 μΙ of chloramphenicol (25 μg / μl) are added. Agrobacterium is added to a plate, and the tube is shaken and placed on a shaker at 30 ° C for one night.

Depois de os 10 ml de cultura crescerem por uma noite, a cultura é removida e colocada em um balão de 500 ml. 200 ml de LB líquido são colocados em um balão, 200 μΙ de canamicina (50 μg/μl), 200 μΙ de espectinomicina (75 - 100 pg/μΙ) e 200 μΙ de cloranfenicol (25 μg/μl) são adicionados, e os 10 ml de cultura de uma noite são então adicionados.After the 10 ml of culture has grown overnight, the culture is removed and placed in a 500 ml flask. 200 ml of liquid LB are placed in a flask, 200 μΙ of kanamycin (50 μg / μl), 200 μΙ of spectinomycin (75 - 100 pg / μΙ) and 200 μΙ of chloramphenicol (25 μg / μl), and the 10 ml overnight culture is then added.

Os 200 ml de cultura são colocados em um tubo centrífuga e centrifugados por 25 minutos a 3.750 rpm a 19°C. Depois da centrifugação, o líquido é decantado e o pélete é ressuspendida em 25 ml de solução de sacarose a 5% (0,05% Silwet).The 200 ml of culture is placed in a centrifuge tube and centrifuged for 25 minutes at 3,750 rpm at 19 ° C. After centrifugation, the liquid is decanted and the pellet is resuspended in 25 ml of 5% sucrose solution (0.05% Silwet).

900 μΙ da solução de sacarose e 100 μΙ dos 25 ml da cultura bacteriana são colocados em uma cubeta, e a cubeta é agitada com um invólucro de parafilme. Uma leitura em branco da OD é feita com um 1 ml de solução de sacarose, e em seguida são feitas leituras de todas as soluções bacterianas. A OD (a um comprimento de onda de 600) de cada cultura é registrada. Em seguida são feitos os seguintes cálculos:900 μΙ of the sucrose solution and 100 μΙ of the 25 ml of the bacterial culture are placed in a cuvette, and the cuvette is shaken with a parafilm wrapper. A blank OD reading is made with 1 ml of sucrose solution, and then all bacterial solutions are read. The OD (at a wavelength of 600) for each culture is recorded. Then the following calculations are made:

C^i = C₂V₂; C1V1 = (0,8)(200 ml); CM = 160; V! = 160/Cú e V, = X ml/10 para determinar a OD₆oo= 0,8 de uma cultura de Agrobacterium.C ^ i = C ₂ V ₂ ; C1V1 = (0.8) (200 ml); CM = 160; V! = 160 / Cú and V, = X ml / 10 to determine the OD ₆ oo = 0.8 of an Agrobacterium culture.

As plantas são maceradas em água por pelo menos 30 minutos antes da imersão. A solução bacteriana é despejada em um recipiente de plástico raso, e partes da planta acima do solo (dardos, rosetas) são imergi88 das na solução por 3 - 5 segundos com agitação suave. As plantas imersas são colocadas em uma badeja escura revestida com tecido de algodão e cobertas com um domo por uma noite (16-24 horas) para manter a umidade alta. A tampa é removida e as condições normais de crescimento da planta são recuperadas e continuam por 4 semanas.The plants are soaked in water for at least 30 minutes before immersion. The bacterial solution is poured into a shallow plastic container, and parts of the plant above the ground (darts, rosettes) are immersed in the solution for 3 - 5 seconds with gentle agitation. The immersed plants are placed in a dark whiting covered with cotton fabric and covered with a dome for one night (16-24 hours) to keep the humidity high. The cover is removed and the plant's normal growing conditions are restored and continue for 4 weeks.

Depois da transformação e do tratamento com alto teor de umidade, as plantas são mantidas a 22°C, 60% de umidade relativa e um fotoperíodo de 16 horas por 4 semanas. 5 - 7 dias depois da transformação as plantas produzem pinhas. A fertilização é feita semanalmente com um fertilizante 20-20-20 fraco. Depois de 4 semanas de crescimento, as plantas são colocadas na estufa e a rega é interrompida para forçar a planta a ressecar para que as sementes sejam colhidas. As plantas ficam prontas para a colheita das sementes depois de 1 -1,5 semana sem água.After transformation and treatment with high moisture content, the plants are maintained at 22 ° C, 60% relative humidity and a photoperiod of 16 hours for 4 weeks. 5 - 7 days after transformation the plants produce pine cones. Fertilization is done weekly with a weak 20-20-20 fertilizer. After 4 weeks of growth, the plants are placed in the greenhouse and watering is stopped to force the plant to dry out so that the seeds are harvested. The plants are ready to harvest the seeds after 1 -1.5 weeks without water.

As sementes são colhidas cortando-se a base da planta abaixo das pinhas, colocando-se a planta sobre uma peneira de sementes e um pedaço de papel branco, passando-se os dardos pelo orifício das pinhas, e colhendo-se as sementes limpas por peneiração.The seeds are harvested by cutting the base of the plant below the pine cones, placing the plant on a seed sieve and a piece of white paper, passing the darts through the hole in the pine cones, and harvesting the clean seeds by sifting.

As sementes são esterilizadas conectando-se a mangueira de um dessecador a vácuo a um vácuo em um exaustor de gases/plataforma de escoamento 100 ml de alvejante são colocados em um béquer de 250 ml, e 3 ml de HCl concentrado são adicionados ao alvejante. O béquer é colocado no dessecador e as sementes em tubos de semente em um suporte para tubos de ensaio são colocados no dessecador. Uma tampa é colocada sobre o dessecador, e o vácuo é operado. O dessecador é deixado por uma noite porém não mais de 16 horas.The seeds are sterilized by connecting the hose of a vacuum desiccator to a vacuum in a gas extractor / drain platform 100 ml of bleach is placed in a 250 ml beaker, and 3 ml of concentrated HCl is added to the bleach. The beaker is placed in the desiccator and the seeds in seed tubes in a test tube holder are placed in the desiccator. A cover is placed over the desiccator, and the vacuum is operated. The desiccator is left for one night but not more than 16 hours.

Uma vez esterilizadas, as sementes são plaqueadas em meio de seleção (preparado por adição de 10 g (2 g/l) de phyta-gel, 10,75 g (2,15 g/l) de sais basais de MS (M-5524 da Sigma), 50 g (10 g/l de sacarose e 6 ml (1,2 ml/l) de solução de canamicina (950 mg/ml), 5 ml (1 ml/l) de solução de cefotaxima (250 mg/ml) e 5 ml (1 ml/l) de solução de carbenecilina (250 mg/ml) para um volume total de 5 litros a um pH de 5,7). Pancadas suaves são dadas nos tubos de semente para distribuir esparsamente as sementes.Once sterilized, the seeds are plated in a selection medium (prepared by adding 10 g (2 g / l) of phyta-gel, 10.75 g (2.15 g / l) of basal salts of DM (M- 5524 from Sigma), 50 g (10 g / l of sucrose and 6 ml (1.2 ml / l) of kanamycin solution (950 mg / ml), 5 ml (1 ml / l) of cefotaxime solution (250 mg / ml) and 5 ml (1 ml / l) of carbenecillin solution (250 mg / ml) for a total volume of 5 liters at a pH of 5.7). Gentle strokes are given on the seed tubes to distribute sparingly the seeds.

As placas são envolvidas em parafilme e colocadas em um refrigerador a 4°C por 1-2 dias de tratamento criogênico. Depois deste tratamento criogênico as placas são colocadas em uma câmara a 28°C para germinação.The plates are wrapped in parafilm and placed in a refrigerator at 4 ° C for 1-2 days of cryogenic treatment. After this cryogenic treatment, the plates are placed in a chamber at 28 ° C for germination.

As plantículas selecionadas são verdes e possuem folhas secundárias em desenvolvimento. As plantículas selecionadas são plantadas em terra depois de as folhas secundárias terem se desenvolvido.The selected plants are green and have secondary leaves in development. The selected seedlings are planted on land after the secondary leaves have developed.

As plantículas são plantadas em potes com terra e cobertas com um domo por 5 dias para manter a umidade alta. As plantículas são levadas para uma estufa depois que as síliquas inferiores começam a amarelar.The seedlings are planted in pots with soil and covered with a dome for 5 days to keep the humidity high. The seedlings are taken to a greenhouse after the lower silica begins to yellow.

As sementes das plantículas selecionadas crescem em vasos de 6,35 cm (2,5 polegadas) com terra (mistura ¹/2 Metro-200; ¹/2 PGX). A terra é adubada (mounded) e o vaso é coberto com uma tela de malha. A tela é presa ao vaso com um elástico. As sementes são semeadas e cobertas com um domo de germinação.Seeds of selected plantículas grow in pots of 6.35 cm (2.5 inches) with earth (mixture ^1/2 Metro-200; ^1/2 PGX). The soil is fertilized (mounded) and the pot is covered with a mesh screen. The canvas is attached to the vase with an elastic band. The seeds are sown and covered with a germination dome.

As mudas são cultivadas com um período de luz de 12 horas em 70% de umidade relativa a 22°C. Elas recebem água em dias alternados, conforme necessário, e o fertilizante 20-20-20 de Peter é aplicado por baixo, quinzenalmente.The seedlings are grown with a 12-hour light period at 70% relative humidity at 22 ° C. They receive water on alternate days, as needed, and Peter's 20-20-20 fertilizer is applied from below, fortnightly.

EXEMPLO 7EXAMPLE 7

As plantas de sementes transformadas do exemplo 6 representando 20 eventos de transformação independentes são cultivadas e as sementes são colhidas para produzir sementes T₂. As sementes T₂ são cultivadas e testadas quanto aos níveis de tocoferóis. Na figura 1, os níveis de tocoferóis estão expressos em nanogramas de tocoferol total por miligrama de semente. Os níveis de tocoferóis são determinados adicionando-se 10 a 15 mg de semente de Arabidopsis a um microtubo de 2 ml. Uma massa de 1 g de microcontas de 0,5 mm (Biospecifics Technologies Corp., Lynbrook, NY) e 500 μΙ de pirogalol 1% (Sigma Chem., St. Louis, MO) em etanol contendo 5 μg/ml de tocol são adicionados ao tubo. A amostra é agitada duas vezes por 45 segundos em um FastPrep (Bio101/Savant) a uma velocidade de 6,5. O extrato é filtrado (acrodisco de PTFE Gelman, filtros-seringa de 13 mm, Pall Gelman Laboratory Inc., Ann Arbor, Ml) em um tubo auto30The transformed seed plants of example 6 representing 20 independent transformation events are grown and the seeds are harvested to produce T ₂ seeds. T ₂ seeds are grown and tested for tocopherol levels. In figure 1, the levels of tocopherols are expressed in nanograms of total tocopherol per milligram of seed. Tocopherol levels are determined by adding 10 to 15 mg of Arabidopsis seed to a 2 ml microtube. A mass of 1 g of 0.5 mm microcounts (Biospecifics Technologies Corp., Lynbrook, NY) and 500 μΙ of 1% pyrogallol (Sigma Chem., St. Louis, MO) in ethanol containing 5 μg / ml of tocol are added to the tube. The sample is shaken twice for 45 seconds in a FastPrep (Bio101 / Savant) at a speed of 6.5. The extract is filtered (PTFE Gelman acrodisk, 13 mm filter syringe, Pall Gelman Laboratory Inc., Ann Arbor, Ml) in an auto tube30

amostrador. HPLC é realizada em uma coluna de HPLC de sílica Zorbax, 4,6 mm x 250 mm (5 μΜ) com uma detecção fluorescente usando uma HPLC Hewlett Packard (Agilent Technologies, Paio Alto, CA). A excitação da amostra é feita a 290 nm, e a emissão é monitorada a 336 nm. Os tocoferóis são separados com um gradiente de hexano metil-t-butil éter usando um volume de injeção de 20 μΙ, uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min, e um tempo de operação de 12 min (40°C). A concentração e a composição de tocoferóis são calculadas com base em curvas padrão para α, β, δ e γ-tocoferol e a, β, δ e γ-tocotrienóis usando o aplicativo Chemstation (Agilent Technologies, Paio Alto, CA).sampler. HPLC is performed on a 4.6 mm x 250 mm (5 μΜ) Zorbax silica HPLC column with fluorescent detection using a Hewlett Packard HPLC (Agilent Technologies, Paio Alto, CA). The excitation of the sample is done at 290 nm, and the emission is monitored at 336 nm. Tocopherols are separated with a gradient of hexane methyl-t-butyl ether using an injection volume of 20 μΙ, a flow rate of 1.5 ml / min, and an operating time of 12 min (40 ° C). Tocopherol concentration and composition are calculated based on standard curves for α, β, δ and γ-tocopherol and a, β, δ and γ-tocotrienols using the Chemstation application (Agilent Technologies, Paio Alto, CA).

EXEMPLO 8EXAMPLE 8

Plantas transformadas com tyrA e outros genes da biossíntese dos tocoferóisPlants transformed with tyrA and other tocopherol biosynthesis genes

Plantas de canola, Brassica napus, Arabidopsis e soja são transformadas com uma variedade de constructos de DNA usando uma abordagem de bombardeamento de partículas essencialmente da maneira descrita por Christou, In Particle Bombardment for the Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, Califórnia (1996) ou usando transformação mediada por Agrobacterium. São produzidos dois grupos de constructos de DNA. O primeiro grupo de constructos é constituído dos constructos de um único gene. Cada um dos seguintes genes é inserido em um constructto de DNA de planta distinta sob o controle de um promotor para napina (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209219 (1991)) e os produtos dos genes podem ser direcionados para o plastídio por um peptídio de direcionamento para plastídio codificado tal como CTP1 (Keegstra, Cell 56(2): 247-53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 12760-12764 (1994)) ou CTP2: um gene tyrA de E. herbicola (Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316 (1992)), um gene slr1736 (em Cyanobase no site kazusa.or.jp/cyanobase), um gene ATPT2 de planta (Smith et al., Plant J. 11: 83-92 (1997)), um gene dxs (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(5): 2105-2110 (1998)), um gene dxr (Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(17): 9879-9884 (1998)), um gene HPPD deCanola, Brassica napus, Arabidopsis and soybean plants are transformed with a variety of DNA constructs using a particle bombardment approach essentially as described by Christou, In Particle Bombardment for the Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, California (1996) or using Agrobacterium-mediated transformation. Two groups of DNA constructs are produced. The first group of constructs consists of the constructs of a single gene. Each of the following genes is inserted into a distinct plant DNA constructto under the control of a napine promoter (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209219 (1991)) and the gene products can be targeted to plastid by a targeting peptide for encoded plastid such as CTP1 (Keegstra, Cell 56 (2): 247-53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12760-12764 (1994 )) or CTP2: an E. herbicola tyrA gene (Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316 (1992)), a slr1736 gene (in Cyanobase on the website kazusa.or.jp/cyanobase) , a plant ATPT2 gene (Smith et al., Plant J. 11: 83-92 (1997)), a dxs gene (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (5): 2105- 2110 (1998)), a dxr gene (Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17): 9879-9884 (1998)), a HPPD gene from

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Arabidopsis thaliana (Norris et al., Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998)), um gene GGH (Keller et al., Eur. J. Biochem. 251: 413-417 (1998)), um gene GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley e Scolnik, Plant Physiol. 104: 14691470 (1994)), um gene AANT1 (Saint Guily et al., Plant Physiol., 100(2): 1069-1071 (1992)), um gene MT1 (a seqüência de Synechocystis MT1 (Número de Identificação Geral NCBI 1653572) foi usada em uma busca rápida (blast search) contra ESTs de Anabaena sp. cepa PCC 7120 (Kaneko 2001). Foi encontrada uma seqüência com homologia substancial ao Synechocystis MT1 em uma busca rápida (blast search) contra ESTs de Anabaena sp. cepa PCC 7120 (Kaneko et al., DNA Research 8(5): 205-213 (2001)), um gene TMT2 (descrito no Pedido U.S. Série N° 60/330.563, depositado em 25 de outubro de 2001, aqui incorporada em sua integridade a título de referência), um gene GMT (descrito no Pedido U.S. Série N° 60/312.758, depositado em 17 de agosto de 2001, aqui incorporada em sua integridade a título de referência); WO 00/32757, WO 00/10380), e um gene slr1737 (em Cyanobase (no site kazusa.or.jp/cyanobase), e um constructo anti-sentido para ácido homogentísico disoxigenase (Sato et al., J. DNA Res. 7(1): 31-63 (2000))). Cada constructo é transformado em pelo menos uma planta de canola, Brassica napus, Arabidopsis e soja. As plantas expressando cada um destes genes são selecionadas para participar de cruzamentos adicionais. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método descrito no exemplo 7. Os cruzamentos são realizados para cada espécie para gerar plantas transgênicas tendo uma ou mais das seguintes combinações de genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructto anti-sentido para ácido homogentísico disoxigenase. Em uma modalidade preferida, o constructo ou constructo de ácido nucléico codificam, além de tyrA, HPPD e slr1736 ou ATPT2.Arabidopsis thaliana (Norris et al., Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998)), a GGH gene (Keller et al., Eur. J. Biochem. 251: 413-417 (1998)), a GGPPS gene Arabidopsis thaliana (Bartley and Scolnik, Plant Physiol. 104: 14691470 (1994)), an AANT1 gene (Saint Guily et al., Plant Physiol., 100 (2): 1069-1071 (1992)), an MT1 gene (a Synechocystis MT1 sequence (NCBI General Identification Number 1653572) was used in a blast search against ESTs of Anabaena sp. strain PCC 7120 (Kaneko 2001). A sequence with substantial homology to Synechocystis MT1 was found in a quick search (blast search) against ESTs of Anabaena sp. strain PCC 7120 (Kaneko et al., DNA Research 8 (5): 205-213 (2001)), a TMT2 gene (described in US Order No. 60 / 330,563, deposited on October 25, 2001, hereby incorporated in its entirety as a reference), a GMT gene (described in US Order No. 60 / 312,758, filed on August 17, 2001, hereby incorporated into integrity as a reference); WO 00/32757, WO 00/10380), and a slr1737 gene (in Cyanobase (on the website kazusa.or.jp/cyanobase), and an antisense construct for homogentisic acid dysoxygenase (Sato et al., J. DNA Res 7 (1): 31-63 (2000))). Each construct is transformed into at least one canola plant, Brassica napus, Arabidopsis and soy. Plants expressing each of these genes are selected to participate in additional crosses. The composition and level of tocopherol in each plant are also analyzed using the method described in example 7. Crosses are performed for each species to generate transgenic plants having one or more of the following combinations of genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, and an antisense construct for homogentisic acid deoxygenase. In a preferred embodiment, the nucleic acid construct or construct encodes, in addition to tyrA, HPPD and slr1736 or ATPT2.

A composição e o nível de tocoferol em cada planta gerada pelos cruzamentos (incluindo todos os cruzamentos intermediários) também são analisados usando o método descrito no exemplo 7. Os descendentes dos transformantes destes constructos serão cruzados entre si para acu30 • « · · · • · • · mular (stack) genes adicionais para atingir o nível desejado de tocoferol.The composition and the level of tocopherol in each plant generated by the crosses (including all intermediate crosses) are also analyzed using the method described in example 7. The descendants of the transformants of these constructs will be crossed with each other to acu30 • «· · · • · • · mule (stack) additional genes to achieve the desired level of tocopherol.

Um segundo grupo de constructos de DNA é gerado e denominado constructos de genes múltiplos. Os constructos de genes múltiplos contêm múltiplos genes, cada um sob o controle de um promotor para napina (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991), e os produtos de cada gene são direcionados para o plastídio por um peptídio de direcionamento para plastídio codificado. O constructo de genes múltiplos pode ter dois ou mais dos seguintes genes: tyrA, siri 736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructto anti-sentido para ácido homogentísico disoxigenase. Em um modalidade preferida, o constructo ou constructo de ácido nucléico codificam, além de tyrA, HPPD e slr1736 ou ATPT2.A second group of DNA constructs is generated and called multiple gene constructs. Multiple gene constructs contain multiple genes, each under the control of a napine promoter (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991), and the products of each gene are targeted to the plastid by a targeting peptide for encoded plastid. The multiple gene construct can have two or more of the following genes: tyrA, siri 736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737 , and an antisense construct for homogentisic acid deoxygenase In a preferred embodiment, the nucleic acid construct or construct encodes, in addition to tyrA, HPPD and slr1736 or ATPT2.

Cada constructo é então transformado em pelo menos uma planta de canola, Brassica napus, Arabidopsis e soja. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método descrito no exemplo 7. Os descendentes dos transformantes destes constructos serão cruzados entre si para acumular (stack) genes adicionais para atingir o nível desejado de tocoferol.Each construct is then transformed into at least one canola plant, Brassica napus, Arabidopsis and soy. The composition and level of tocopherol in each plant are also analyzed using the method described in example 7. The descendants of the transformants of these constructs will be crossed with each other to accumulate (stack) additional genes to achieve the desired level of tocopherol.

EXEMPLO 9EXAMPLE 9

Plantas de Arabidopsis transformadas com tyrA, ATPT2 e outros genes da biossíntese dos tocoferóisArabidopsis plants transformed with tyrA, ATPT2 and other tocopherol biosynthesis genes

Plantas de Arabidopsis do tipo selvagem e linhagens de plantas de Arabidopsis são transformadas com o vetor de plasmídeo pMON69907 (figura 12), são cultivadas e as sementes são colhidas da maneira descrita nos exemplos acima, e as sementes são analisadas quanto ao teor de tocoferóis e tocotrienóis da maneira descrita acima. O plasmídeo pMON69907 codifica um prefenato desidrogenase bifuncional (tyrA) e uma fitil preniltransferase (ATPT2). A figura 14 mostra o teor de tocoferóis e tocotrienóis totais de sementes de Arabidopsis de plantas do tipo selvagem e várias linhagens da planta transformadas com o vetor de plasmídeo pMON69907. A figura 15 mostra o teor de tocoferóis totais de sementes de Arabidopsis de uma planta do tipo selvagem e várias linhagens da planta transformadas • · com o vetor de plasmídeo pMON69907. A figura 31 mostra padrões de LC/MS para tocoferol e tocotrienol. A figura 32 mostra os resultados de LC/MS para linhagens selecionadas, mostrando a presença de tocotrienóis. A figura 33 mostra um cromatograma de HPLC/FLD de extrato de semente de controle mostrando a ausência de tocotrienóis. A figura 34 mostra um cromatograma de HPLC/FLD de extrato de semente de controle mostrando a presença de tocotrienóis nas linhagens selecionadas.Arabidopsis wild-type plants and Arabidopsis plant lines are transformed with the plasmid vector pMON69907 (figure 12), are grown and the seeds are harvested in the manner described in the examples above, and the seeds are analyzed for the content of tocopherols and tocotrienols in the manner described above. Plasmid pMON69907 encodes a bifunctional prefenate dehydrogenase (tyrA) and a phytyl prenyl transferase (ATPT2). Figure 14 shows the content of tocopherols and total tocotrienols of Arabidopsis seeds from wild type plants and various plant strains transformed with the plasmid vector pMON69907. Figure 15 shows the total tocopherol content of Arabidopsis seeds from a wild-type plant and several strains of the plant transformed • with the plasmid vector pMON69907. Figure 31 shows LC / MS standards for tocopherol and tocotrienol. Figure 32 shows the LC / MS results for selected strains, showing the presence of tocotrienols. Figure 33 shows an HPLC / FLD chromatogram of control seed extract showing the absence of tocotrienols. Figure 34 shows an HPLC / FLD chromatogram of control seed extract showing the presence of tocotrienols in the selected strains.

EXEMPLO 10EXAMPLE 10

Plantas de Arabidopsis transformadas com tyrA e outros genes da biossíntese dos tocoferóisArabidopsis plants transformed with tyrA and other tocopherol biosynthesis genes

São preparadas os constructos de expressão pCGN10822, pMON36528, pMON69907 e pMON69909, mostradas nas figuras 10-13, respectivamente.The expression constructs pCGN10822, pMON36528, pMON69907 and pMON69909, shown in figures 10-13, respectively, are prepared.

Plantas de Arabidopsis são transformadas com os vetores indicados usando-se as técnicas de transformação descritas no exemplo 8. Transformantes são isolados e cultivados em linhagens individuais por autopolinização e são colhidas sementes de cada linhagem. A composição de tocoferóis e tocotrienóis totais das sementes de cada linhagem é analisada usando-se o método descrito no exemplo 7. A figura 16 mostra os níveis de tocoferóis e tocotrienóis totais para linhagens da planta ancorando os constructos descritos ou um controle. Uma análise de sementes T2 de linhagens da planta derivadas por transformação com o vetor pMON69909 em relação ao tipo selvagem está mostrada na figura 17. Linhagens da planta transformadas com pMON69909 demonstram um aumento significativo em tocoferóis totais e em tocotrienóis totais, os maiores aumentos ocorrendo em delta tocoferol, alfa tocotrienol, delta tocotrienol e gama tocotrienol. Algumas sementes de plantas ancorando o vetor pMON69909 mostram uma coloração escura como resultado de acumulação de ácido homogentísico, o que é confirmado por análise de LC/MS (vide figuras 31 e 32).Arabidopsis plants are transformed with the indicated vectors using the transformation techniques described in example 8. Transformants are isolated and grown in individual lines by self-pollination and seeds from each line are harvested. The composition of tocopherols and total tocotrienols from the seeds of each strain is analyzed using the method described in example 7. Figure 16 shows the levels of tocopherols and total tocotrienols for plant strains anchoring the described constructs or a control. An analysis of T2 seeds of plant lines derived by transformation with the vector pMON69909 in relation to the wild type is shown in figure 17. Plant lines transformed with pMON69909 demonstrate a significant increase in total tocopherols and total tocotrienols, the largest increases occurring in delta tocopherol, alpha tocotrienol, delta tocotrienol and gamma tocotrienol. Some plant seeds anchoring the pMON69909 vector show a dark color as a result of homogentisic acid accumulation, which is confirmed by LC / MS analysis (see figures 31 and 32).

A expressão heteróloga de tyrA em sementes de plantas de Arabidopsis transgênicas produz um aumento de 1,6 vezes nos níveis de tocoferol nas sementes em comparação com linhagens de controle. UmaThe heterologous expression of tyrA in seeds of transgenic Arabidopsis plants produces a 1.6-fold increase in the levels of tocopherol in the seeds compared to control strains. An

outra enzima chave essencial para a biossíntese de tocoferol é HPT, que está envolvida na condensação de fitil pirofosfato (PPP) e homogentisato (HGA) para produzir 2-metil-6-fitilplastoquinol (2M6PPQ), um precursor para a síntese de quatro isoformas diferentes de tocoferóis. A superexpressão de HPT_Arabidopsis (ATPT2) e de HPTsynechocystis (slr1736) independentemente em sementes de A. thaliana transgênica resulta em um aumento de 1,6 vezes nos níveis de tocoferol nas sementes. Um suposto transportador de adenilato de A. thaliana (AANT1) expresso como gene único mostrou aumentar em 1,4 vezes os níveis de tocoferóis nas sementes de A. thaliana. Para testar se uma combinação desses genes resultaria em efeito sinergístico sobre a biossíntese do tocoferol, várias combinações foram testadas em A. thaliana.another key enzyme essential for tocopherol biosynthesis is HPT, which is involved in the condensation of phytyl pyrophosphate (PPP) and homogentisate (HGA) to produce 2-methyl-6-phytylplastoquinol (2M6PPQ), a precursor for the synthesis of four different isoforms of tocopherols. Overexpression of HPT _Ar abidopsis (ATPT2) and HPTsynechocystis (slr1736) independently in seeds of transgenic A. thaliana results in a 1.6-fold increase in the levels of tocopherol in the seeds. A supposed A. thaliana adenylate transporter (AANT1) expressed as a single gene has been shown to increase the levels of tocopherols in A. thaliana seeds by 1.4 times. To test whether a combination of these genes would result in a synergistic effect on tocopherol biosynthesis, several combinations were tested in A. thaliana.

Sementes de Arabidopsis T2 ancorando constructos de dois genes ATPT2 e tyrA (pMON69907), constructos de três genes ATPT2, tyrA e HPPD (pMON69909), constructos de três genes ATPT2, tyrA e GGPPS (pMON69915 (figura 35)), e constructos de três genes ATPT2, tyrA e AANT1 (pMON69919 (figura 36)) são analisadas quanto ao teor e quanto à composição de tocoferol nas sementes. O teor de tocoferóis e tocotrienóis totais aumenta em aproximadamente 2,4 vezes nas linhagens transformadas com pMON69907 (vetor de dois genes) e até 5 vezes nas linhagens contendo o vetor de três genes (pMON69909) (vide as figuras 16 e 17). HPPD expresso como um único gene em A. thaliana resulta em um aumento dificilmente detectável dos níveis de tocoferóis. A combinação de HPPD e ATPT2 não resulta em novo aumento dos níveis de tocoferóis comparados com linhagens ancorando apenas ATPT2 (dados não mostrados). Em contraste, quando HPPD é combinado com tyrA e ATPT2, os níveis de tocoferóis e tocotrienóis dobram comparados com a combinação de tyrA e ATPT2. Sementes ancorando a constructo de três genes pMON69909 parecem ter a cor mais escura que a das sementes de controle.Arabidopsis T2 seeds anchoring constructs of two genes ATPT2 and tyrA (pMON69907), constructs of three genes ATPT2, tyrA and HPPD (pMON69909), constructs of three genes ATPT2, tyrA and GGPPS (pMON69915 (figure 35)), and constructs of three ATPT2, tyrA and AANT1 genes (pMON69919 (figure 36)) are analyzed for the content and the composition of tocopherol in the seeds. The content of tocopherols and total tocotrienols increases by approximately 2.4 times in the strains transformed with pMON69907 (vector of two genes) and up to 5 times in the lines containing the vector of three genes (pMON69909) (see figures 16 and 17). HPPD expressed as a single gene in A. thaliana results in an hardly detectable increase in tocopherol levels. The combination of HPPD and ATPT2 does not result in a further increase in the levels of tocopherols compared to strains anchoring only ATPT2 (data not shown). In contrast, when HPPD is combined with tyrA and ATPT2, the levels of tocopherols and tocotrienols double compared to the combination of tyrA and ATPT2. Seeds anchoring the construct of three genes pMON69909 appear to have a darker color than that of control seeds.

Além disso, sabe-se que plantas dicotiledôneas do tipo selvagem não acumulam tocotrienóis. No entanto, as sementes de A. thaliana transgênica ancorando todas os quatro constructos acumulam níveis subs-In addition, it is known that dicotyledonous plants of the wild type do not accumulate tocotrienols. However, the seeds of transgenic A. thaliana anchoring all four constructs accumulate sub-levels

• ··· · · · · · · ··· • · ········· · · · • · · · ♦ ······ · · • ········ ··· · · · • · · * · · · ····· • · · · · · · ♦ · · · · · tanciais de tocotrienóis (confirmado por HPLC, e para amostras selecionadas por LC-MS (vide figuras 31, 32, 33 e 34). O teor de tocoferóis e tocotrienóis de sementes ancorando o constructo de expressão de três genes, pMON69909, consiste em 60% de tocotrienóis e 40% de tocoferóis. Guando a disponibilidade de HGA endógeno é elevada por superexpressão das enzimas biossintéticas de HGA (tyrA e HPPD) junto com HPT, o HPT utiliza geranilgeranil pirofosfato (GGPP) e HGA para produzir tocotrienóis ao invés de tocoferóis em condições limitadas pela disponibilidade do nível endógeno de geranilgeranil redutase (GGH). A GGH funciona hidrogenando o GGPP para PPP, um substrato para HPT na síntese dos tocoferóis. Por isso, a acumulação de níveis aumentados de tocotrienóis vista nas constructos testados pode ser superada pela superexpressão de GGH em combinação com tyrA, HPPD e HPT.• ··· · · · · · ··· • · ········· · · · • · · · ♦ ······ · · • ········ · · ·· · · · · · · * · · · ····· • · · · · · · ♦ · · · · · tocotrienol tanks (confirmed by HPLC, and for samples selected by LC-MS (see figures 31 , 32, 33 and 34). The content of tocopherols and tocotrienols in seeds anchoring the expression construct of three genes, pMON69909, consists of 60% tocotrienols and 40% tocopherols. biosynthetic HGA enzymes (tyrA and HPPD) together with HPT, HPT uses geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) and HGA to produce tocotrienols instead of tocopherols under conditions limited by the availability of the endogenous level of geranylgeranil reductase (GGH). GGH works by hydrogenating GGPP for PPP, a substrate for HPT in the synthesis of tocopherols, so the accumulation of increased levels of tocotrienols seen in the tested constructs can be overcome by overexpression of GGH in combination with tyrA, HP PD and HPT.

EXEMPLO 11EXAMPLE 11

Plantas transformadas com tyrA e outros genes da biossíntese dos tocoferóisPlants transformed with tyrA and other tocopherol biosynthesis genes

Plantas são transformadas com os constructos de DNA mostrados nas tabelas 2 e 3 abaixo, empregando as técnicas descritas no exemplo 8. Os constructos contêm um ou mais genes sob o controle de um promotor para napina (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991)), o promotor 7Sa’ (Chen et al., PNAS 83(22): 8560-8564 (1998)) ou o promotor Arc5 (Goossens et al., Plant Physiol. 120: 1095-1104 (1999)). Os produtos dos genes podem ser direcionados para o plastídio por um peptídio de direcionamento para plastídio codificado, tal como CTP1 (Keegstra, Cell 56(2): 247-53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 12760-12764 (1994)) ou CTP2. São usados um ou mais dos seguintes genes: gene tyrA de E. herbicola (Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316 (1992)), um gene slr1736 (em Cyanobase no site kazusa.org.jp/cyanobase), um gene ATPT2 (Smith et al., Plant J. 11: 83-92 (1997)), um gene dxs de E. coli (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(5): 2105-2110 (1998)), um gene dxr (Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(17): 9879-9884 (1998)), um gene HPPD (Norris et al., Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998)), um genePlants are transformed with the DNA constructs shown in tables 2 and 3 below, using the techniques described in example 8. The constructs contain one or more genes under the control of a napine promoter (Krindl et al., Seed Sei. Res. 1: 209-219 (1991)), the 7Sa 'promoter (Chen et al., PNAS 83 (22): 8560-8564 (1998)) or the Arc5 promoter (Goossens et al., Plant Physiol. 120: 1095- 1104 (1999)). Gene products can be targeted to the plastid by an encoded plastid targeting peptide, such as CTP1 (Keegstra, Cell 56 (2): 247-53 (1989); Nawrath et al., Proc. Natl. Acad. USA 91: 12760-12764 (1994)) or CTP2. One or more of the following genes are used: E. herbicola tyrA gene (Xia et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316 (1992)), a slr1736 gene (in Cyanobase at kazusa.org.jp / cyanobase), an ATPT2 gene (Smith et al., Plant J. 11: 83-92 (1997)), an E. coli dxs gene (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 ( 5): 2105-2110 (1998)), a dxr gene (Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17): 9879-9884 (1998)), an HPPD gene (Norris et al. , Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998)), a gene

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GGH (Keller et al., Eur. J. Biochem. 251: 413-417 (1998)), um gene GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley e Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469-1470 (1994)), um gene AANT1 (Saint Guily et al., Plant Physiol., 100(2): 10691071 (1992)), um gene MT1 (como acima para o exemplo 8), um gene TMT2 (como acima para o exemplo 8), um gene GMT (como acima para o exemplo 8, e WO 00/32757, WO 00/10380), um gene slr1737 (em Cyanobase no site kazusa.or.jp/cyanobase), e um constructto anti-sentido para ácido homogentísico disoxigenase (representada por HGD_As) (Sato et al., J. DNA Res. 7(1): 31-63 (2000)). Cada constructo é transformado em pelo menos uma planta de canola, Brassica napus, Arabidopsis e soja. A composição e o nível de tocoferol em cada planta também são analisados usando o método descrito no exemplo 7. Exemplos de plantas transformadas com tyrA e outros genes da biossíntese dos tocoferóis incluem plantas de Arabidopsis transformadas com os constructos mostrados na Tabela 2 e plantas de soja transformadas com os constructos mostrados na Tabela 3.GGH (Keller et al., Eur. J. Biochem. 251: 413-417 (1998)), a GGPPS gene from Arabidopsis thaliana (Bartley and Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469-1470 (1994)), an AANT1 gene (Saint Guily et al., Plant Physiol., 100 (2): 10691071 (1992)), an MT1 gene (as above for example 8), a TMT2 gene (as above for example 8), a GMT gene ( as above for example 8, and WO 00/32757, WO 00/10380), a slr1737 gene (in Cyanobase on the website kazusa.or.jp/cyanobase), and an antisense construct for homogeneous acid dysoxygenase (represented by HGD _A s) (Sato et al., J. DNA Res. 7 (1): 31-63 (2000)). Each construct is transformed into at least one canola plant, Brassica napus, Arabidopsis and soy. The composition and level of tocopherol in each plant are also analyzed using the method described in example 7. Examples of plants transformed with tyrA and other tocopherol biosynthesis genes include Arabidopsis plants transformed with the constructs shown in Table 2 and soybean plants transformed with the constructs shown in Table 3.

As plantas com características desejadas podem ser submetidas a outros cruzamentos para gerar plantas transgênicas tendo uma ou mais das seguintes combinações de genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, e um constructo anti20 sentido para ácido homogentísico disoxigenase. Alternativamente, as plantas podem ser cruzadas para acumular múltiplas cópias de um ou mais dos genes acima mencionados em uma planta transgênica.Plants with desired characteristics can be subjected to other crosses to generate transgenic plants having one or more of the following gene combinations: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, sir 1737, and an anti-sense construct for homogentisic acid disoxygenase. Alternatively, the plants can be crossed to accumulate multiple copies of one or more of the aforementioned genes in a transgenic plant.

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Tabela 3Table 3

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EXEMPLO 12EXAMPLE 12

Constructo de vetores binários de plantas ancorando combinações de tyrA com outros genes da síntese de tocoferóisConstruct of binary plant vectors anchoring combinations of tyrA with other genes for the synthesis of tocopherols

Os componentes de cada cassete de expressão de gene incluem um promotor, neste exemplo o promotor para napina, um terminador, um peptídio de direcionamento para plastídio (que pode ser o peptídio de direcionamento para plastídio nativo ou um peptídio de direcionamento para cloroplasto fundido N terminal) e um gene de interesse, como mostrado nas figuras 18a e 18b. Os cassetes de expressão podem ser orientados cabeça para cauda, cabeça para cabeça ou a orientação pode variar.The components of each gene expression cassette include a promoter, in this example the napine promoter, a terminator, a plastid targeting peptide (which can be the native plastid targeting peptide or a N terminal fused chloroplast targeting peptide ) and a gene of interest, as shown in figures 18a and 18b. Expression cassettes can be oriented head to tail, head to head or the orientation can vary.

A clonagem é realizada usando-se cassetes de expressão flanqueados pelos sítios de restrição Bsp120 I e Not I. Um vetor de transporte (pMON36582 (figura 19)) é construído por combinação dos iniciadores SV MCS 1AeSV MCS 1B:The cloning is performed using expression cassettes flanked by the restriction sites Bsp120 I and Not I. A transport vector (pMON36582 (figure 19)) is constructed by combining the SV MCS 1AeSV MCS 1B primers:

Xma I Bspl20 I Bag Xba I EcoRI SV MCS IA GATCT CCCGGG AA GGGCCC CGGCCG TCTAGA GAATTCXma I Bspl20 I Bag Xba I EcoRI SV MCS IA GATCT CCCGGG AA GGGCCC CGGCCG TCTAGA GAATTC

Not I Asc I Age Iv GCGGCCGC GGCGCGCC ACCGGT (SEQ ID NO:9)Not I Asc I Age Iv GCGGCCGC GGCGCGCC ACCGGT (SEQ ID NO: 9)

Xma I Bspl20 I Eag Xba I EcoRI SV MCS 1B TCGA ACCGGT GGCGCGCC GCGGCCGC GAATTC TCTAGAXma I Bspl20 I Eag Xba I EcoRI SV MCS 1B TCGA ACCGGT GGCGCGCC GCGGCCGC GAATTC TCTAGA

Not I Asc I Age I CGGCCG GGGCCC TT CCCGGG A (SEQ ID NO: 10) e ligação dos mesmos em pSP72 digerido com Bgl II e Xho I e purificado em gel (Promega, www.promega.com). O vetor resultante é denominado pMON36582 (figura 19). O vetor é confirmado por seqüenciamento de DNA.Not I Asc I Age I CGGCCG GGGCCC TT CCCGGG A (SEQ ID NO: 10) and binding in pSP72 digested with Bgl II and Xho I and purified on gel (Promega, www.promega.com). The resulting vector is called pMON36582 (figure 19). The vector is confirmed by DNA sequencing.

Todos os cassetes de expressão de gene são construídos para serem flanqueados por sítios de restrição Not I. Estes cassetes são isolados por digestão dos vetores anteriores com Not I, seguida de purificação em gel dos cassetes de expressão. O pMON36582 é digerido com Eag I, que corta duas vezes esse vetor, e uma vez 19 bp a montante do sítio Not I. Ambas as projeções são compatíveis com Not I. Os cassetes de expressão de Not I são ligados em pMON36582 digerido com Eagl e purificado em gel,All gene expression cassettes are constructed to be flanked by Not I restriction sites. These cassettes are isolated by digesting the previous vectors with Not I, followed by gel purification of the expression cassettes. PMON36582 is digested with Eag I, which cuts this vector twice, and once 19 bp upstream from the Not I. site. Both projections are compatible with Not I. The expression cassettes of Not I are linked in pMON36582 digested with Eagl. and gel purified,

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resultando em um vetor com um único sítio Not l. O cassete de expressão está, portanto, disponível como um cassete de Bsp120 I / Not I. Um exemplo de um cassete de expressão para a homogentisato fitiltransferase de Arabidopsis disponível como um cassete de Bsp120 Ι/Not I está mostrado como pMON36586 na figura 20. Este vetor é obtido da maneira descrita acima.resulting in a vector with a single Not 1 site. The expression cassette is therefore available as a Bsp120 I / Not I cassette. An example of an expression cassette for the Arabidopsis phytyltransferase homogentisate available as a Bsp120 Ι / Not I cassette is shown as pMON36586 in figure 20. This vector is obtained in the manner described above.

A montagem de cassetes de expressão é realizada em um vetor de transporte, tal como pMON36586. Cassetes de expressão de genes são liberados de outros vetores de transporte por digestões com Bsp120 I / Not I, e ligados em um vetor de transporte tal como pMON36586, que fora digerido com Not I. O vetor resultante ancora um cassete de expressão de gene adicional e um único sítio Not I. Este procedimento pode ser repetido sempre que necessário. Terminada a montagem do gene, os cassetes de expressão combinados podem ser liberados por digestão com Bsp120 I / Not I (pMON10098 (figura 37)). O fragmento resultante contendo o cassete de expressão é, então, purificado e ligado em um único sítio Not I de um vetor binário. Alternativamente, a montagem de cassetes de expressão de gene pode ser realizada diretamente em um vetor binário (figura 21). Um vetor binário é definido pela presença das seqüências de borda direita e esquerda, que são necessários para transferência de DNA de Agrobacterium para células de plantas. Todos os reagentes químicos e enzimas para esta manipulação são de grau molecular. Esses reagentes e enzimas são utilizados de acordo com as instruções do fabricante. São usadas técnicas padrão de clonagem molecular.The assembly of expression cassettes is performed in a transport vector, such as pMON36586. Gene expression cassettes are released from other transport vectors by digestions with Bsp120 I / Not I, and ligated into a transport vector such as pMON36586, which has been digested with Not I. The resulting vector anchors an additional gene expression cassette and a single Not I site. This procedure can be repeated whenever necessary. Once the gene assembly is complete, the combined expression cassettes can be released by digestion with Bsp120 I / Not I (pMON10098 (figure 37)). The resulting fragment containing the expression cassette is then purified and ligated at a single Not I site in a binary vector. Alternatively, the assembly of gene expression cassettes can be performed directly on a binary vector (figure 21). A binary vector is defined by the presence of the right and left border sequences, which are necessary for the transfer of Agrobacterium DNA to plant cells. All chemical reagents and enzymes for this manipulation are molecular grade. These reagents and enzymes are used according to the manufacturer's instructions. Standard molecular cloning techniques are used.

Estão apresentados vários exemplos de constructos binários de plantas, seus componentes e mapas de plasmídeos. Os exemplos apresentados que contêm combinações de tyrA com outros genes de interesse para a constructo da via de tocoferóis estão listados nas figuras 18a e 18b. Os componentes desses constructos também estão mostrados na Tabela 4. Os mapas de vetores mostrados nas figuras 22-27 representam vários constructos.Several examples of binary plant constructs, their components and plasmid maps are presented. The examples presented that contain combinations of tyrA with other genes of interest for the construction of the tocopherol pathway are listed in figures 18a and 18b. The components of these constructs are also shown in Table 4. The vector maps shown in figures 22-27 represent several constructs.

101 ···101 ···

Tabela 4. Lista de vetores binários a serem transformados em Arabidopsis thaliana para construir a biossíntese de tocoferóisTable 4. List of binary vectors to be transformed into Arabidopsis thaliana to build tocopherol biosynthesis

Nota: Onde se lêNote: Where it reads

Cyclase = ciclase; Napin = napina e Native CTPs = CTPs nativos • · ·Cyclase = cyclase; Napin = napina and Native CTPs = native CTPs • · ·

102 : ........102: ........

EXEMPLO 13EXAMPLE 13

Constructo de vetores codificando múltiplas enzimasVector construct encoding multiple enzymes

Este exemplo descreve o uso de prefenato desidrogenase (tyrA) tal como o tyrA de Erwinia herbicola em combinação com outras enzimas chave na via da biossíntese dos tocoferóis para aumentar a produção de tocoferóis em sementes de plantas transgênicas, tais como sementes de Arabidopsis thaliana. As enzimas combinadas com tyrA incluem ATPT2, phidroxifenilpiruvato disoxigenase (HPPD_Arabidopsis) θ geranilgeranilpirofosfato sintase (GGPPSArabidopsis) de Arabidopsis thaliana. Além disso, tyrA também foi testado em combinação com ATPT2 e um transportador de adenilato aceito (AANT1 Arabidopsis) de Arabidopsis thaliana.This example describes the use of prefenate dehydrogenase (tyrA) such as Erwinia herbicola tyrA in combination with other key enzymes in the tocopherol biosynthesis pathway to increase the production of tocopherols in seeds of transgenic plants, such as Arabidopsis thaliana seeds. Enzymes combined with tyrA include ATPT2, phydroxyphenylpyruvate disoxygenase (HPPD _A rabidopsis) θ geranylgeranylpyrophosphate synthase (GGPPSArabidopsis) from Arabidopsis thaliana. In addition, tyrA has also been tested in combination with ATPT2 and an accepted adenylate carrier (AANT1 Arabidopsis) from Arabidopsis thaliana.

A constructo de um vetor de dois genes ancorando cassetes de expressão de tyrA e ATPT2 específicos para semente é feita da seguinte maneira. DNA de plasmídeo purificado de pMON36520 (figura 38) é submetido a uma digestão parcial com Kpnl e ligado com um fragmento Κρη I de 4,2 kbp purificado em gel, isolado do pMON43853 (figura 39). A inserção de 4,2 kb do pMON43853 contém o cassete de expressão do gene PPT (pNapina::ATPT2::Napina 3’). O vetor binário de planta resultante pMON69907 (figura 12) é usado para transformação de Arabidopsis thaliana para testar o efeito combinatorial da expressão específica para semente de tyrA e ATPT2.The construct of a vector of two genes anchoring seed-specific tyrA and ATPT2 expression cassettes is done as follows. Purified plasmid DNA from pMON36520 (figure 38) is subjected to partial digestion with Kpnl and ligated with a 4.2 kbp gel-purified Κρη I fragment isolated from pMON43853 (figure 39). The 4.2 kb insert of pMON43853 contains the expression cassette of the PPT gene (pNapina :: ATPT2 :: Napina 3 '). The resulting plant binary vector pMON69907 (figure 12) is used for transformation of Arabidopsis thaliana to test the combinatorial effect of the specific expression for tyrA and ATPT2 seeds.

Para aumentar ainda mais a biossíntese de tocoferóis, além do tyrA e ATPT2, o HPPDArabidopsis também é expresso em semente de Arabidopsis thaliana. Isto foi obtido por adição de um cassete de expressão específico para semente para HPPD Arabidopsis ao pMON69907 resultando na formação do pMON69909. O vetor binário pMON69909 é construído por digestão parcial do pMON69907 com Kpnl. O pMON69907 com um único corte por Kpnl é purificado em gel e ligado com uma inserção de Kpnl/Kpnl de 4,6 kb isolada do pMON36525 (figura 40). A inserção de Kpnl/Kpnl de 4,6 kb do pMON36525 contém o cassete de expressão do gene HPPD, pNapina::CTP2::HPPD_Arabidopsis::Napina 3’ para direcionar a expressão direcionada para plastídio específica para semente de HPPD. O CTP2 é um sinal de direcionamento para cloroplasto do gene da 5-enolpiruvilshiquimato-3• φ .· ··· • ·To further increase the biosynthesis of tocopherols, in addition to tyrA and ATPT2, HPPDArabidopsis is also expressed in Arabidopsis thaliana seed. This was achieved by adding an HPPD Arabidopsis seed-specific expression cassette to pMON69907 resulting in the formation of pMON69909. The binary vector pMON69909 is constructed by partial digestion of pMON69907 with Kpnl. PMON69907 with a single Kpnl cut is gel purified and ligated with a 4.6 kb Kpnl / Kpnl insert isolated from pMON36525 (figure 40). The 4.6 kb Kpnl / Kpnl insertion of pMON36525 contains the HPPD gene expression cassette, pNapina :: CTP2 :: HPPD _Ara bidopsis :: Napina 3 'to target plastid-specific expression for HPPD seed. CTP2 is a targeting signal for the chloroplast of the 5-enolpyruvylshiquime-3 gene • φ. · ··· • ·

.. ».. »

103 fosfato sintase (EPSPS) de Arabidopsis.103 Arabidopsis phosphate synthase (EPSPS).

O vetor binário pMON69915 (figura 35) é construído para testar o efeito de combinações de três genes, tyrA, ATPT2 e GGPPS_Arabidopsis sobre a produção de tocoferóis em sementes. O vetor pMON69907 é parcialmente digerido com Kpnl. O pMON69907 com um único corte por Kpnl é purificado em gel e ligado com um fragmento Kpnl/Kpnl de 4,3 kb do pMON43861 (figura 41) para criar o pMON69915. O fragmento Kpnl do pMON43861 contém o cassete de expressão do gene para a geranilgeranildifosfato sintase de Arabidopsis da Arabidopsis thaliana (pNapina::GGPPSArabidopsi_S::Napina 3’). O cDNA de GGPPS é identificado como um clone EST, por uma busca feita em um banco de dados EST com informações de seqüência disponíveis na técnica (Okada et al., Plant Physiol. 122: 1045-1056 (2000)). O clone EST é digerido com Ncol e tem a extremidade plana por enchimento da projeção 5’ com o fragmento de Klenow. Depois disso, o clone é digerido com BamHI e para excisar o fragmento de cDNA. O fragmento BamHI purificado em gel/cDNA plano é ligado com Bglll/Sall digerido e o vetor pCGN7770 (de extremidade plana com Sall) (figura 42) para criar o pMON43861.The binary vector pMON69915 (figure 35) is constructed to test the effect of combinations of three genes, tyrA, ATPT2 and GGPPS _A rabidopsis on the production of tocopherols in seeds. The vector pMON69907 is partially digested with Kpnl. PMON69907 with a single Kpnl cut is gel purified and ligated with a 4.3 kb Kpnl / Kpnl fragment from pMON43861 (figure 41) to create pMON69915. The Kpnl fragment of pMON43861 contains the gene expression cassette for Arabidopsis thaliana geranylgeraniliphosphate synthase (pNapina :: GGPPSArabidopsi _S :: Napina 3 '). The GGPPS cDNA is identified as an EST clone, by searching a EST database with sequence information available in the technique (Okada et al., Plant Physiol. 122: 1045-1056 (2000)). The EST clone is digested with Ncol and has the flat end by filling the 5 'projection with the Klenow fragment. After that, the clone is digested with BamHI and to excise the cDNA fragment. The gel-purified BamHI / flat cDNA fragment is ligated with digested Bglll / SalI and the vector pCGN7770 (flat-ended with SalI) (figure 42) to create pMON43861.

O vetor binário de planta pMON69919 (figura 36) é construído para testar a expressão combinada de tyrA, ATPT2 e AANT1 Arabidopsis sobre os níveis de tocoferóis em sementes. Para gerar este vetor, pMON69907 é parcialmente digerido com Kpnl. O pMON69907 com um único corte por Kpnl é purificado em gel e ligado com um fragmento Kpnl/Kpnl de 4,2 kb do pMON69911 (figura 43). O fragmento de 4,2 kb contém um cassete de expressão específico para semente para o transportador de adenilato de Arabidopsis AANT1 (pNapina::AANT1 Arabidopsis:capina 3’). O pMON69911 é gerado por excisão do fragmento AANT1 do pCGN11301 (figura 44) com Sall e Pstl (o sítio Pstl é plano por remoção da projeção 3’ com Klenow) e, em seguida, ligado ao pCGN7770 digerido com Sall/Xhol (extremidade plana com Xhol).The plant binary vector pMON69919 (figure 36) is constructed to test the combined expression of tyrA, ATPT2 and AANT1 Arabidopsis on the levels of tocopherols in seeds. To generate this vector, pMON69907 is partially digested with Kpnl. PMON69907 with a single Kpnl cut is gel purified and ligated with a 4.2 kb Kpnl / Kpnl fragment from pMON69911 (figure 43). The 4.2 kb fragment contains a seed-specific expression cassette for the Arabidopsis adenylate transporter AANT1 (pNapina :: AANT1 Arabidopsis: weeding 3 '). PMON69911 is generated by excising the AANT1 fragment from pCGN11301 (figure 44) with Sall and Pstl (the Pstl site is flat by removing the 3 'projection with Klenow) and then attached to the pCGN7770 digested with Sall / Xhol (flat end with Xhol).

Usando a seqüência parcial publicada de AANT1 (Saint-Guily et al., Plant Physiol. 100(2): 1069-1071 (1992)), vários clones de comprimento • · ·Using the published partial sequence of AANT1 (Saint-Guily et al., Plant Physiol. 100 (2): 1069-1071 (1992)), several clones of length • · ·

104 integral são identificados nos bancos de dados EST. A região codificadora de AANT1 é amplificada por PCR usando-se os iniciadores, AANT1F 5’GGATCCGCGGCCGCACCATGGTTGATCAAGTTCAGCA (SEQ ID N⁹: 11) e AANT1R 5’-GAGCTCCTGCAGGAAGCTT7~7AGGCACCTCCTGATCCGT5 3’ (SEQ ID N⁹: 12). O sítio Notl (sublinhado) é colocado a montante do códon inicial (em itálico) no iniciador AANT1F ao passo que o sítio Sse8387l (sublinhado) foi colocado a jusante do códon de terminação (em itálico) no AANT1R. Os produtos de PCR são clonados primeiro em pCR2.1 e as inserções são verificadas por seqüenciamento de ambos os filamentos. Em seguida, os fragmentos Notl/Sse8387l são inseridos nos sítios Notl/Sse8387l do cassete de expressão de napina em pCGN9979 na orientação normal em relação ao promotor para napina para gerar o pCGN11301. Os constructos de expressão de plantas são usadas para transformação de Arabidopsis thaliana por transformação mediada por Agrobacterium como descrito acima.104 integral are identified in the EST databases. The AANT1 coding region is PCR amplified using primers, AANT1F 5'GGATCCGCGGCCGCACCATGGTTGATCAAGTTCAGCA ⁽⁹ SEQ ID NO: 11) and 5'-AANT1R GAGCTCCTGCAGGAAGCTT7 ~ 7AGGCACCTCCTGATCCGT5 3 '(SEQ ID NO: ^9: 12). The Notl site (underlined) is placed upstream of the initial codon (in italics) in the AANT1F primer while the Sse8387l site (underlined) was placed downstream of the termination codon (in italics) on the AANT1R. PCR products are cloned first in pCR2.1 and insertions are checked by sequencing both filaments. Then, the Notl / Sse8387l fragments are inserted into the Notl / Sse8387l sites of the napine expression cassette in pCGN9979 in the normal orientation relative to the napine promoter to generate pCGN11301. Plant expression constructs are used for transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium-mediated transformation as described above.

EXEMPLO 14EXAMPLE 14

Expressão de vetores codificando múltiplas enzimas em plantasExpression of vectors encoding multiple enzymes in plants

Usando a técnica de transformação dada no exemplo 8, plantas de Arabidopsis thaliana são transformadas com os vetores do exemplo 13.Using the transformation technique given in example 8, Arabidopsis thaliana plants are transformed with the vectors in example 13.

Os resultados para pMON69909 estão dados nas figuras 14, 15, 16, 17, 3134. Outros resultados estão dados na tabela abaixo e nas figuras 75 e 76, que mostram níveis de tocoferóis, tocotrienóis, homogentisato e 2metilfitilplastoquinol para plantas transformadas tendo pMQN69909.The results for pMON69909 are given in figures 14, 15, 16, 17, 3134. Other results are given in the table below and in figures 75 and 76, which show levels of tocopherols, tocotrienols, homogentisate and 2-methylphylplastoquinol for transformed plants having pMQN69909.

• · ·• · ·

105105

ο ωο ω

φ +-. ο ο ο +—» φφ + -. ο ο ο + - »φ

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οο οοο ο

ϊ_ φϊ_ φ

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C0C0

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XX

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ο +4 <φ Ω φ 03) CZ3 Ο +—» Ω φ Ε φ LU <ηο +4 <φ Ω φ 03) CZ3 Ο + - »Ω φ Ε φ LU <η

II

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Φ οο φΦ οο φ

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XX

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Ω 'cl φCl 'cl φ

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Ω 'cl φCl 'cl φ

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II

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CL φCL φ

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Τ3Τ3

00 φ00 φ

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033033

ΟΟΟΟ

XX

ΟΟ

Ω.Ω.

• ·• ·

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106 ► ·· · · • · ·106 ► ·· · · • · ·

EXEMPLO 15EXAMPLE 15

Expressão de constructos em sojaExpression of constructs in soy

Este exemplo descreve o método envolvido na presença de vetores binários de plantas para testar o tyrA isolado e em combinação com 5 outras enzimas chave na via da biossíntese dos tocoferóis para aumentar a produção de tocoferóis em sementes de Glycine max transgênica.This example describes the method involved in the presence of plant binary vectors to test tyrA alone and in combination with 5 other key enzymes in the tocopherol biosynthesis pathway to increase the production of tocopherols in transgenic Glycine max seeds.

A tabela abaixo descreve os vetores binários de plantas preparados para transformação de G. max com seus respectivos cassetes de expressão do gene de interesse para expressão específica para sementes dos transgenes.The table below describes the plant binary vectors prepared for transformation of G. max with their respective expression cassettes of the gene of interest for specific expression for transgenic seeds.

Lista de constructos transformados para G. maxList of constructs transformed to G. max

Constructo número Construct number Elementos genéticos Genetic elements PMON36575 PMON36575 p7Sa’::CTPl::tyrA£:í_e^íc_Oz_fl::E9 3’p7Sa ':: CTPl :: tyrA £: í _e ^ íc _O z _fl :: E9 3' pMON69924 pMON69924 p7Sa’::CTP2::HPPD_z(rati/_Cip_f£_J::E9 37 p7Sct’::CTPl::tyrA_£ Aer6ico/ff”E9 3p7Sa ':: CTP2 :: HPPD _{z (ra} ti / _Ci p _f £ _J :: E9 37 p7Sct' :: CTPl :: tyrA _£ Aer6ico / ff ”E9 3 pMON69943 pMON69943 p7Sa’: :CTP2 ::IÍPPD^R5í<fc/M«: :E9 37 p7Sa’ ::CTP 1: :tyrA£ fteròico/a **E9 37 pArcelin-5::CTPl::slrl736::Arcelm 3’ p7Sa ’:: CTP2 :: IPPD ^ R5í <fc / M«:: E9 37 p7Sa ’:: CTP 1:: tyrA £ fteròico / a ** E9 37 pArcelin-5 :: CTPl :: slrl736 :: Arcelm 3 ’ pMON69945 pMON69945 p7Sa’::CTP2.-:HPPD^_ret£í_Op_s£5::E937p7Sa’::Cn^,l::tyrA£ Aerft£coZe:-E9 37 pArcelin-5::CTPl::slrl736::ArceIin 37 pNapin ::GGHyí_rfló,'_rfo^ú.::napin 3’p7Sa ':: CTP2 .-: HPPD _re ^ £ t _{s £} i _o p ₅ E937p7Sa ::' :: ^Tn, TYRA :: l £ £ Aerft Bake: 37 -E9 pArcelin-5 CTPL :: :: :: slrl736 ArceIin 37 pNapin :: GGHyí _rfl ó, ' _rfo ^ ú. :: napin 3'

Nota:note:

Onde lê-se:Where it reads:

pArcelin = pArcelina pNapin = pNapina napin = napinapArcelin = pArcelina pNapin = pNapina napin = napina

O pMON36575 (figura 46) é preparado por ligação do fragmento Notl de 3 kb purificado em gel do pMON38207R (figura 47) ao sítio Notl do pMON36571 (figura 48) que contém o cassete de expressão p7Sa’::CTP1::tyrA_E. herbicoi_a::E9 3’. O CTP1 codifica o sinal de direcionamento para cloroplasto da subunidade pequena RUBISCO de Arabidopsis. O fragmento Notl de 3 kb contém o cassete marcador selecionável pFMV::CTP2::C4syn::E9 3’. O CTP2 codifica a seqüência do sinal de direci• · · ·PMON36575 (figure 46) is prepared by binding the gel-purified 3 kb Notl fragment of pMON38207R (figure 47) to the pMON36571 Notl site (figure 48) containing the expression cassette p7Sa ':: CTP1 :: tyrA _E. herbicoi _a :: E9 3 '. CTP1 encodes the chloroplast targeting signal of the small RUBISCO subunit of Arabidopsis. The 3 kb Notl fragment contains the selectable marker cassette pFMV :: CTP2 :: C4syn :: E9 3 '. The CTP2 encodes the direction signal sequence • · · ·

• ·• ·

107 onamento para cloroplasto da 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) de Arabidopsis. O CP4syn é um gene sintético EPSPS. O vetor pMON36575 é ainda digerido com Hindlll para liberar um fragmento de 3 kb contendo o cassete de expressão p7Sa’::CTP1::tyrA_E. herbicoia·':E9 3’. O fragmento tem sua extremidade plana por enchimento das projeções 5’ com o fragmento de Klenow, é purificado em gel e ligado ao sítio Pmel do pMON36576 (figura 49) que contém o cassete de expressão de p7Sa’::CTP2::HPPD_Arabidopsis::E9 3’ para gerar o pMON69924 (figura 50).107 onid for chloroplast of Arabidopsis 5-enolpyruvylshiquimate-3-phosphate synthase (EPSPS). CP4syn is a synthetic EPSPS gene. The pMON36575 vector is further digested with Hindlll to release a 3 kb fragment containing the expression cassette p7Sa ':: CTP1 :: tyrA _E. herbicoia · ': E9 3'. The fragment has its flat end by filling the 5 'projections with the Klenow fragment, is purified on gel and attached to the Pmel site of pMON36576 (figure 49) containing the expression cassette of p7Sa' :: CTP2 :: HPPD _A rabidopsis :: E9 3 'to generate pMON69924 (figure 50).

O vetor binário de planta pMON69943 (figura 51) é preparado por digestão de pMON69929 (figura 52), contendo o cassete de expressão p7Sa’::CTP2::HPPD_Arabidopsis::E9 3’, com Notl e ligando com um fragmento de 7,3 kb purificado em gel gerado por digestão de pMON69936 (figura 53) com Bsp120l e Notl. Este fragmento contém o cassete de expressão de p7Soc’::CTP1::tyrA_E. herbicoi_a::E9 3’ e pArcelina-5::CTP1 ::slr1736::Arcelina 3’. O vetor pMON69943 é ainda digerido com Notl e ligado com um fragmento Bsp 1201/Notl de 4,5 kb purificado em gel do pMON36592 (figura 54) para gerar pMON69945 (figura 55). O fragmento do pMON36592 contém o cassete de expressão pNapina::GGH_Arabidopsi_S::napina 3’.The plant binary vector pMON69943 (figure 51) is prepared by digesting pMON69929 (figure 52), containing the expression cassette p7Sa ':: CTP2 :: HPPD _A rabidopsis :: E9 3', with Notl and ligating with a fragment of 7.3 kb purified on gel generated by digestion of pMON69936 (figure 53) with Bsp120l and Notl. This fragment contains the expression cassette of p7Soc ':: CTP1 :: tyrA _E. herbicoi _a :: E9 3 'and pArcelina-5 :: CTP1 :: slr1736 :: Arcelina 3'. The pMON69943 vector is further digested with Notl and ligated with a 4.5 kb gel-purified Bsp 1201 / Notl fragment from pMON36592 (figure 54) to generate pMON69945 (figure 55). The pMON36592 fragment contains the expression cassette pNapina :: GGH _Ara bidopsi _S :: napina 3 '.

Glycine max é transformada com os vetores descritos de acordo com o procedimento descrito na publicação WO 00/61771 A3 nas páginas 99-100.Glycine max is transformed with the vectors described according to the procedure described in publication WO 00/61771 A3 on pages 99-100.

EXEMPLO 16EXAMPLE 16

Combinações de genes múltiplos expressas em canolaCombinations of multiple genes expressed in canola

Todos os cassetes de expressão de gene usados para expressão em canola são preparados como cassetes Not I contendo o promotor para napina, um gene de interesse e o terminador para napina. Os genes de interesse são fundidos pelo terminal N a um peptídio de direcionamento para cloroplasto, a menos que um peptídio de direcionamento para cloroplasto esteja presente. Todas as combinações de genes são montadas em único vetor com múltiplos genes.All gene expression cassettes used for canola expression are prepared as Not I cassettes containing the napine promoter, a gene of interest and the terminator for napine. The genes of interest are fused by the N-terminus to a chloroplast targeting peptide, unless a chloroplast targeting peptide is present. All combinations of genes are assembled in a single vector with multiple genes.

Para facilitar a constructos de vetores com múltiplos genes, os cassetes de expressão de Not I são isolados por digestão com Not I doTo facilitate vector constructs with multiple genes, Not I expression cassettes are isolated by digestion with Not I from

• ·• ·

108 ·· • ·108 ·· • ·

pMON16602 (figura 56), ρΜΟΝ36525 (figura 57), ρΜΟΝ36520 (figura 38) e clonados em pMON36582 digerido com Eag I e purificado em gel (figura 19), resultando na formação de pMON58171 (figura 58) (cassete de expressão de slr1736), pMON58172 (figura 59) (cassete de expressão de HPPD_Arabidopsis) θ pMON58170 (figura 60) (cassete de expressão de tyrA_E. herbicoia)· Todos os cassetes de expressão resultantes são flanqueados por Bsp120 I e Not I.pMON16602 (figure 56), ρΜΟΝ36525 (figure 57), ρΜΟΝ36520 (figure 38) and cloned in pMON36582 digested with Eag I and purified in gel (figure 19), resulting in the formation of pMON58171 (figure 58) (slr1736 expression cassette) , pMON58172 (figure 59) (HPPD _A rabidopsis expression cassette) θ pMON58170 (figure 60) (tyrA _E. herbicide expression cassette) · All resulting expression cassettes are flanked by Bsp120 I and Not I.

Um cassete de expressão induzido por napina para o GGH de Arabidopsis é obtido por isolamento e purificação em gel de um fragmento Not I / Hind III de 3191 bp do pMON36591 (figura 61) e um fragmento Not I / Hind III de 5612 bp do pMON36588 (figura 62). Estes dois fragmentos purificados são ligados, resultando na formação de pMON36592 (figura 63). O vetor pMON36592 é digerido com Bsp120l e Not I, o cassete de expressão de GGH é purificado em gel e ligado em pMON36582 digerido com Eag I e purificado em gel (figura 19), resultando na formação de pMON58182 (figura 64).A napine-induced expression cassette for Arabidopsis GGH is obtained by isolation and gel purification of a 3191 bp Not I / Hind III fragment from pMON36591 (figure 61) and a 5612 bp Not I / Hind III fragment from pMON36588 (figure 62). These two purified fragments are ligated, resulting in the formation of pMON36592 (figure 63). The pMON36592 vector is digested with Bsp120l and Not I, the GGH expression cassette is gel purified and ligated into Eag I digested pMON36582 and gel purified (figure 19), resulting in the formation of pMON58182 (figure 64).

Vetores de múltiplos genes combinando esses quatro genes são obtidos por digestão dos vetores pMON58171, pMON58172, pMON58170 e pMON58182 com Bsp120l e Not I, seguida de purificação em gel dos fragmentos maiores de cada constructo. Estes fragmentos contêm os cassetes de expressão de slr1736, HPPD, tyrA e GGH, respectivamente. O cassete de expressão de tyrA do pMON58170 é ligado no pMON58171 digerido com Not I e tratado com fosfatase alcalina, resultando na formação do vetor de dois genes pMON58176 (figura 65) contendo cassetes de expressão de gene para tyrA e slr1736, respectivamente. Este vetor é novamente digerido com Not I, tratado com fosfatase alcalina e ligado com o cassete de expressão de HPPD do pMON58172. O vetor de três genes resultante pMON58183 (figura 66) contém os cassetes de expressão de HPPD, tyrA e slr1736. Também o pMON58183 é digerido com Bsp120 I, tratado com fosfatase alcalina e ligado com o cassete de expressão de GGH purificado em gel (vide purificação acima), resultando na formação do pMON58185 (figura 67).Multiple gene vectors combining these four genes are obtained by digesting the vectors pMON58171, pMON58172, pMON58170 and pMON58182 with Bsp120l and Not I, followed by gel purification of the larger fragments of each construct. These fragments contain the expression cassettes of slr1736, HPPD, tyrA and GGH, respectively. The pMON58170 tyrA expression cassette is ligated into Not I digested pMON58171 and treated with alkaline phosphatase, resulting in the formation of the two gene vector pMON58176 (figure 65) containing gene expression cassettes for tyrA and slr1736, respectively. This vector is again digested with Not I, treated with alkaline phosphatase and ligated with the HPMD expression cassette of pMON58172. The resulting three gene vector pMON58183 (Figure 66) contains the HPPD, tyrA and slr1736 expression cassettes. PMON58183 is also digested with Bsp120 I, treated with alkaline phosphatase and ligated with the gel purified GGH expression cassette (see purification above), resulting in the formation of pMON58185 (figure 67).

• ·• ·

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O vetor de transporte pMON36593 (figura 68) (contendo cassetes de expressão de tyrA e HPPD) é preparado por ligação de um cassete de expressão de tyrA digerido com Bsp120l / Not I e purificado em gel do pMON36589 (figura 69) ao pMON36590 digerido com Notl e tratado com fosfatase alcalina (figura 70).The transport vector pMON36593 (figure 68) (containing tyrA and HPPD expression cassettes) is prepared by attaching a Bsp120l / Not I digested tyrA expression cassette and gel purified from pMON36589 (figure 69) to the digested pMON36590 Notl and treated with alkaline phosphatase (figure 70).

Os cassetes de expressão de gene combinados são excisados pela digestão de Bsp120 I / Not I do pMON36593 (HPPD/tyrA), pMON58183 (HPPD/tyrA/srl1736) e pMON58185 (HPPD, tyrA, slr1736, GGH). Estes cassetes de expressão de gene combinados são purificados em gel e ligados ao pMON67162 digerido com Not I e tratado com fosfatase alcalina (figura 71), resultando na formação dos vetores binários pMON58178 (figura 72), pMON58186 (figura 73) e pMON58188 (figura 74), respectivamente. Estes últimos vetores binários são usados para transformação de canola.The combined gene expression cassettes are excised by digestion of Bsp120 I / Not I from pMON36593 (HPPD / tyrA), pMON58183 (HPPD / tyrA / srl1736) and pMON58185 (HPPD, tyrA, slr1736, GGH). These combined gene expression cassettes are gel purified and linked to pMON67162 digested with Not I and treated with alkaline phosphatase (figure 71), resulting in the formation of binary vectors pMON58178 (figure 72), pMON58186 (figure 73) and pMON58188 (figure 74), respectively. These latter binary vectors are used for canola transformation.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido polinucléico heteróloga à (A), a molécula de ácido polinucléico codificando uma enzima com atividades de corismato mutase e de prefenato desidrogenase; em que a molécula de ácido nucléico compreende ainda dois ou mais cassetes de expressão, cada qual expressa um membro selecionado de fitilprenil transferase de Synechocystis (slr1736), fitilprenil transferase de Arabidopsis thaliana (ATPT2), 1-desoxixilulose-5-fosfato sintase (dxs), 1-desoxixilulose-5-fosfato redutoisomerase (dxr), geranilgeranil redutase (GGH), geranilgeranil pirofosfato sintase (GGPPS), p-hidroxifenilpiruvato disoxigenase (HPPD), metil transferase 1 (MT1), tocoferol metil transferase 2 (TMT2), gama metil transferase (GMT), transportador de adenilato (AANT1), tocoferol ciclase (sir 1737) e um construto anti-senso para ácido homogentísico disoxigenase, em que a enzima codificada pela molécula de ácido polinucléico heteróloga apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.1. Nucleic acid molecule, characterized by the fact that it comprises as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of an mRNA molecule; (B) a polynucleic acid molecule heterologous to (A), the polynucleic acid molecule encoding an enzyme with chorismate mutase and prefenate dehydrogenase activities; wherein the nucleic acid molecule further comprises two or more expression cassettes, each expressing a selected member of Synechocystis phytylprenyl transferase (slr1736), Arabidopsis thaliana (ATPT2) phytylprenyl transferase (ATPT2), 1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase (dxs ), 1-deoxyxylulose-5-phosphate reductisomerase (dxr), geranylgeranyl reductase (GGH), geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS), p-hydroxyphenylpyruvate deoxygenase (HPPD), methyl transferase 1 (MT1), tocopherol (TM1), tocopherol gamma methyl transferase (GMT), adenylate transporter (AANT1), tocopherol cyclase (sir 1737) and an antisense construct for homogentisic acid dysoxygenase, in which the enzyme encoded by the heterologous polynucleic acid molecule presents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico heteróloga compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized in that said heterologous nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência nãotraduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA.Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized by the fact that it further comprises an untranslated 3 'sequence that functions in said plant cell to cause the termination of transcription and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3' end of mRNA molecule. 4. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico heteróloga compreende ainda um cassete de expressão que expressa fitil preniltransferase, em particular um cassete de expressão que expressa hidroxifenilpiruvato desidrogenase.Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized in that said heterologous nucleic acid molecule further comprises an expression cassette that expresses phytyl prenyl transferase, in particular an expression cassette that expresses hydroxyphenylpyruvate dehydrogenase. 5. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os referidos dois ou mais cassetes de expressão expressam HPPD e slr1736 ou ATPT2.Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized in that said two or more expression cassettes express HPPD and slr1736 or ATPT2. 6. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucléico heteróloga é uma molécula de ácido nucléico de fita dupla.6. Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized in that the heterologous nucleic acid molecule is a double-stranded nucleic acid molecule. 7. Método de produção de uma planta tendo níveis aumentados de tocoferol, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:7. Method of production of a plant having increased levels of tocopherol, characterized by the fact that it comprises the steps of: (A) transformar a referida planta com a molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 1; e (B) desenvolver a referida planta.(A) transforming said plant with the nucleic acid molecule, as defined in claim 1; and (B) develop said plant. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico compreende ainda um cassete de expressão que expressa fitil preniltransferase, em particular um cassete de expressão que expressa hidroxifenilpiruvato desidrogenase.Method according to claim 7, characterized in that said nucleic acid molecule further comprises an expression cassette that expresses phytyl prenyl transferase, in particular an expression cassette that expresses hydroxyphenylpyruvate dehydrogenase. 9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os referidos dois ou mais cassetes de expressão expressam HPPD e slr1736 ou ATPT2.Method according to claim 7, characterized in that said two or more expression cassettes express HPPD and slr1736 or ATPT2. 10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ácido nucléico é ligada a uma sequência não-traduzida 3’ que funciona na referida planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA e, em que a expressão da referida molécula de ácido nucléico resulta em superexpressão da referida proteína.10. Method according to claim 7, characterized in that said nucleic acid molecule is linked to an untranslated 3 'sequence that works in said plant to cause the termination of transcription and the addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3 'end of the mRNA molecule and, wherein the expression of said nucleic acid molecule results in overexpression of said protein. 11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida planta é selecionada do grupo que consiste em canola, milho, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soja, crambe (cranibe abyssinica), mostarda, mamona, amendoim, gergelim, semente de algodão, linhaça, açafrão, palmeira, linho e girassol, em particular em que a referida planta é soja, canola ou Brassica napus.11. Method according to claim 7, characterized by the fact that said plant is selected from the group consisting of canola, corn, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus, soy, crambe (cranibe abyssinica), mustard, castor bean , sesame, cottonseed, flaxseed, saffron, palm, flax and sunflower, in particular in which the referred plant is soy, canola or Brassica napus. 12. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado a referida planta apresenta níveis aumentados de tocoferol, α-tocoferol, γtocoferol e/ou tocotrienol em relação a uma planta com histórico genético semelhante, porém sem a referida molécula de ácido nucléico.12. Method according to claim 7, characterized in that said plant has increased levels of tocopherol, α-tocopherol, γtocopherol and / or tocotrienol in relation to a plant with a similar genetic history, but without the said nucleic acid molecule. 13. Método para reduzir os níveis de tocoferol em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:13. Method to reduce the levels of tocopherol in a plant, characterized by the fact that it comprises the steps of: (A) transformar a referida planta com a molécula de ácido nucléico, onde a molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 3, a molécula de ácido nucléico tendo uma fita transcrita e uma fita não transcrita, em que a referida uma fita transcrita é complementar a molécula de ácido nucléico tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; e (B) desenvolver a referida planta transformada.(A) transforming said plant with the nucleic acid molecule, where the nucleic acid molecule, as defined in claim 3, the nucleic acid molecule having a transcribed tape and a non-transcribed tape, wherein said transcribed tape is complement the nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and (B) develop said transformed plant. 14. Célula incapaz de gerar uma planta ou animal, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 1,4 ou 5.14. Cell unable to generate a plant or animal, characterized by the fact that it comprises the nucleic acid molecule, as defined in claim 1.4 or 5. 15. Célula de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a referida célula é uma bactéria ou uma célula de alga verdeazulada.15. Cell according to claim 14, characterized by the fact that said cell is a bacterium or a cell of blue-green algae. 16. Óleo, caracterizado pelo fato de ser derivado de uma semente de uma planta transformada tendo uma molécula de ácido nucléico que compreende como componentes operacionalmente ligados: (A) uma região promotora que funciona em uma célula de planta para provocar a produção de uma molécula de mRNA; (B) uma molécula de ácido nucléico exógena codificando uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (C) uma sequência não-traduzida 3’ que funciona na referida célula de planta para provocar o término da transcrição e a adição de ribonucleotídeos poliadenilados a uma extremidade 3’ da molécula de mRNA.16. Oil, characterized by the fact that it is derived from a seed of a transformed plant having a nucleic acid molecule that comprises as operationally linked components: (A) a promoter region that functions in a plant cell to cause the production of a molecule mRNA; (B) an exogenous nucleic acid molecule encoding a protein comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and (C) an untranslated 3 'sequence that functions in said plant cell to cause transcription to end and addition of polyadenylated ribonucleotides to a 3 'end of the mRNA molecule. 4 · · • 44 · · • 4 4 44 4 4 44 4 4 44 4 1/77 • 9'1/77 • 9 ' 4 <4 < • < • ·• <• · 4 4 4 · • · ·4 4 4 · • · · 4 4 44 4 4 4 4 44 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4 4 44 4 4 4 44 444 444 444 4 4 4 44 4 4 2SgB888íS>&BS&í&B88®&2SgB888íS> & BS & í & B88® & ΡΜΟΝ36611 ρΜΟΝ36520 (e35S::CTP1 ::tyrA) (pNapin::CTP1 ::tyrA) oΡΜΟΝ36611 ρΜΟΝ36520 (e35S :: CTP1 :: tyrA) (pNapin :: CTP1 :: tyrA) o LO heaBa6t^saagaKaaB5aBBBgggigs^^^e3asKa^8iLO heaBa6t ^ saagaKaaB5aBBBgggigs ^^^ e3asKa ^ 8i ÉSSS^ãBSBS^iÉSSS ^ ãBSBS ^ i 5SSS®BS«gSS!W8KSS8SSm8&®aS5SSS®BS «gSS! 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