BR9506272B1 - proteÍna mutante isolada e purificada hin47 de haemophilus influenzae, molÉcula quimÉrica, molÉcula de Ácido nuclÉico, plasmÍdeo recombinante, cÉlula e. coli transformada, composiÇço imunogÊnica, processo para determinar a presenÇa de anticorpos, especificamente reativos com a proteÍna hin47 numa amostra, processo para determinar a presenÇa de proteÍna hin47 numa amostra e kit de diagnàstico para determinar a presenÇa de anticorpos numa amostra especificamente reativa com a proteÍna hin47. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente deInvenção de "PROTEÍNA MUTANTE ISOLADA E PURIFICADAHin47 DE Haemophilus influenzae, MOLÉCULA QUIMÉRICA,MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, PLASMÍDEO RECOMBINANTE,CÉLULA E. coli TRANSFORMADA, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA,PROCESSO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE ANTICORPOS,ESPECIFICAMENTE REATIVOS COM A PROTEÍNA Hin47 NUMAAMOSTRA, PROCESSO PARA DETERMINAR A PRESENÇA DEPROTEÍNA Hin47 NUMA AMOSTRA E KIT DE DIAGNÓSTICOPARA DETERMINAR A PRESENÇA DE ANTICORPOS NUMAAMOSTRA ESPECIFICAMENTE REATIVA COM A PROTEÍNAHin47".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo deimunologia e está particularmente relacionado comimunógenos e antígenos oriundos da espécie deHaemophilus.

Fundamentos da Invenção

Haemophilus influenzae é o organismo que éresponsável por uma variedade de doenças humanasgraves, tais como meningite, epiglotite, pneumoniae otite média. Haemophilus influenzae tipo b (Hib)é uma causa principal de meningite bacteriana emcrianças possuindo menos de cinco anos de idade.

Anticorpos protetores à doença são induzidos pelopolissacarídeo capsular do organismo e vacinas têmsido desenvolvidas que utilizam o fosfato ribitolpoliribosil purificado (FRP) como o antígeno. Estavacina proporciona 90% de proteção em adultos e emcrianças possuindo mais de vinte e quatro meses deidade, contudo não foi eficaz em crianças possuindomenos de vinte e quatro meses (Zangwi11 e outros,1993). (As referências são identificadas numa listade referências no final desta revelação, cada umadas referidas referências na lista é incorporadaaqui mediante referência, não possuindo referênciaadicional à mesma). Assim como outros antígenos depolissacarídeo, FRP não induz a proliferação decélulas ajudantes-T, e uma nova imunização falha emextrair tanto uma resposta de reforço como tambémum aumento em células de memória. A conjugação dopolissacarídeo de FRP com veículos de proteínaconfere características dependentes da célula-T àvacina e, substancialmente, intensifica a respostaimunológica ao antígeno de FRP. Atualmente,existem à disposição quatro, vacinas conjugadas deveículo-FRP. Estas são vacinas que são baseadas nopolissacarídeo capsular H. influenzae tipo b que éconjugado com o toxóide de difteria, o toxóide detétano, ou a proteína de membrana externa Neisseriameningitidis (examinado em Zangwill e outros,1993). Estas vacinas conjugadas de H. influenzaetipo b têm, dramaticamente, reduzido a incidênciade meningite bacteriana (Schoendorf e outros, 1994).

Existem seis sorotipos de H. influenzaedesignados de a até f, os quais estão definidospor seus polissacarídeos capsulares. Tais vacinasconjugadas atuais de Haemophilus não protegemcontra outras cepas tipificáveis invasivas (tiposa e c) e, de forma mais importante, não protegemcontra cepas não tipificáveis (NTHi) as quais sãouma causa comum de sepse pós-parto e neonatal,pneumonia e otite média. A otite média é a doençamais comum logo no início da infância apresentandoaproximadamente 70% de todas as crianças sofrendopelo menos de uma crise de otite média antes dealcançar os sete anos de idade. A otite médiaquando é crônica pode ainda levar ao debilitamentona audição, na fala e, adicionalmente, nocognitivo em crianças. É ocasionado por infecçãobacteriana com Streptococcus pneumoniae(aproximadamente 50%) , H. influenzae nãotipificável (aproximadamente 3 0%), e Moraxella(Branhamella) catarrhalis (aproximadamente 20%).

Apenas nos Estados Unidos, o tratamento de otitemédia custa entre 1 e 2 bilhões de dólares por anopara antibióticos e procedimentos cirúrgicos, taiscomo tonsilectomias, adenoidectomias e inserção detubos timpanostomia. Para obter proteçãouniversal contra as doenças relacionadas a H.influenzae, particularmente no grupo de idade dedois a seis meses, e certos grupos de alto risco,a provisão de imunógenos H. influenzae nãocapsulares reativos transversais é desejável.

Cepas não tipificáveis de H. influenzae também sãopatógenos importantes responsáveis por pneumonianos idosos e em outras pessoas que sãoparticularmente suscetíveis a infecçõesrespiratórias. Há, desse modo, necessidade deantígenos de H. influenzae que são úteis comocomponentes em preparações imunogênicas quefornecem proteção contra os muitos serotipos de H.influenzae. 0 Pedido PCT WO 92/10936, publicadoem 9 de julho de 1992 e incorporado aqui mediantereferência ao mesmo, descreve uma proteína demembrana externa com peso molecular de 47.000obtida de H. influenzae que é relatada como sendoadesina e foi denominada Hin47 que éimunologicamente conservada entre isoladosclínicos não-tipificáveis, tipo b e não-tipif içado, de H. influenzae. A seqüência deaminoácido de Hin47 e a seqüência de nucleotídeodo gene codificando Hin47 foram apresentados naconferência da American Society of Microbiology(ASM) realizada em Nova Orleans, 26-30 de maio deL992. Estas seqüências também foram publicadas nopedido PCT WO 94/00149, publicado em 6 de janeirode 1994 e incorporado aqui mediante referência aomesmo.

Uma vez que Hin47 é conservada dentre ascepas de Haemophilus influenzae, e é relatado comosendo adesina, a proteína tem utilidade nodiagnóstico de e vacinação contra doençaocasionada por H. influenzae ou outros patógenosbacterianos que produzem Hin47 ou uma proteínacapaz de criar anticorpos especificamente reativosa Hin4T.

Uma desvantagem de Hin47 para uso comoantígeno em diagnóstico, para a geração deanticorpos anti-Hin47 úteis no diagnóstico e comoum imunógeno em vacinação é a descobertainesperada pelos atuais requerentes de que Hin47tem atividade de protease a qual resulta na auto-digestão de Hin47 e a degradação proteolítica deoutros antígenos misturados com o mesmo.

Seria vantajoso fornecer análogos deproteína Hin47 (às vezes mencionado aqui comomutantes ou derivados), que são substancialmentereduzidos em atividade proteolítica para uso comoantígenos, preparados imunogênicos incluindovacinas, veículos para outros imunógenos e ageração de reagentes de diagnóstico.

Sumário da Invenção

A presente invenção é dirigida à provisãode análogos de proteína Hin47 Haemophilus tendoatividade de protease reduzida.

De acordo com um aspecto da invenção éfornecido um análogo isolado e purificado deproteína Hin47 Haemophilus influenzae tendo umaatividade de protease reduzida a qual é menor doque aproximadamente 10% de proteína Hin47 natural.Tal análogo Hin47 tem, preferivelmente,substancialmente as mesmas propriedadesimunogênicas de proteína Hin47 natural. O análogoda presente invenção pode ser produzido pormodificação química, bioquímica ou genética deHin47 natural.

Em uma modalidade da presente invenção,quando o análogo é produzido por modificaçãogenética, pelo menos um aminoácido do Hin47natural contribuindo para atividade de protease,pode ser eliminado ou substituído por umaminoácido diferente para produzir a atividade deprotease reduzida. Alternativamente, a atividadede protease reduzida pode ser obtida por inserçãoçle pelo menos um aminoácido na proteína Hin47natural. Pelo menos um aminoácido eliminado ousubstituído pode ser selecionado dentreaminoácidos 195 e 201 de Hin47, e especificamentepode ser Serina-197, que pode ser eliminada ousubstituída por alanina, cisteína ou treonina.

Além disso, pelo menos um aminoácido eliminado ousubstituído pode ser His-91 e pode ser eliminadoou substituído por alanina, lisina ou arginina.Adicionalmente, pelo menos um aminoácido eliminadoou substituído pode ser Asp-121 e pode sereliminado ou substituído por alanina.

Além disso, múltiplos aminoácidos namolécula Hin47 podem ser eliminados ousubstituídos. Tais aminoácidos múltiplos podemincluir His-91 e Serina-197 e podem ser eliminadosou substituídos por Ala-91 e Ala-197 para produzirum análogo Hin47 H91A/S197A. Adicionalmente, osmúltiplos aminoácidos podem incluir His-91, Asp-121 e Ser-197 e podem ser eliminados ousubstituídos por Ala-91, Ala-121 e Ala-197respectivamente para produzir um análogo Hin47H91A/D121A/S197A. Um resumo de algumas daspropriedades de alguns análogos Hin47 comofornecido aqui é mostrado na Tabela 3. Apenas ummutante Hin47 D121E foi verificado reter atividadede protease substancial.

Em um aspecto adicional, a presenteinvenção fornece uma molécula de ácido nucléicoisolada e purificada compreendendo um gene mutanteHaemophilus influenzae hin47 codificando umanálogo de proteína Hin47 Haemophilus influenzaetendo uma atividade de protease reduzida que émenor do que aproximadamente 10% de proteína Hin47natural. 0 gene mutante hin47 pode codificarqualquer dos análogos Hin47 discutido acima 0gene mutante é preferivelmente formado pormutagênese orientada para o sítio de um gene hin47do tipo selvagem. A molécula de ácido nucleicopode estar contida em um plasmídeo recombinanteadaptado para transformação de um hospedeiro epode ser plasmídeo DS-1011-l-l (depositado em 27de julho de 1994 -na American Type CultureCollectionf Rockville, Maryland, E.U.A. sob no. deAcesso 75845). A invenção também inclui umacélula transformada contendo um plasmídeorecombinante.

A presente invenção, em outro aspecto,inclui um processo para produzir um análogo deproteína Hin47 Haemophilus influenzae tendo umaatividade de protease reduzida que é menor do quecerca de 10% de proteína Hin47 natural, a qualcompreende identificar pelo menos um resíduo deaminoácido de proteína Hin47 que contribui parasua atividade de protease, efetuando mutagêneseorientada para o sítio do gene hinAl para removerou substituir uma seqüência de nucleotídeocodificando pelo menos um aminoácido e produzir umgene hin47 mudado, introduzindo o gene hin4 7mudado em- uma célula para produzir uma célulatransformada e cultivar a célula transformada paraproduzir o análogo Hin47. Pelo menos umaminoácido que é selecionado pode ser qualquer umdos especificamente identificados acima comrelação ao análogo Hin47.

A introdução do gene hin47 mudado produz,preferivelmente, uma célula transformada na qual ogene hin47 mudado está sob o controle do promotorT7 e o crescimento da célula transformada eexpressão do análogo Hin47 pelo promotor T7 é,então, efetuado, preferivelmente pelo cultivo emuma concentração de indução de lactose.Preferivelmente, a introdução do hin47 mudado éefetuada pela transformação da célula com oplasmídeo recombinante DS-1011-1-1, às vezesjnencionado de outro modo como plasmídeopT7/Hin47*.

Um aspecto adicional da invenção fornece umprocesso de prover análogo Hin47 isolado epurificado, que compreende efetuar o procedimentodescrito acima para a produção do análogo Hin47para produzir células transformadas, crescidasabrigando corpos de inclusão contendo o análogoHin47, rompendo as células transformadas,crescidas para produzir sobrenadante e os corposde inclusão, solubilizar os corpos de inclusãopara produzir uma solução contendo análogo Hin47,purificando cromatograficamente o análogo Hin47 dasolução isento de resíduos de células, e isolar oanálogo Hin47 purificado.

Os análogos de Hin47 fornecidos aqui comsua atividade proteolítica reduzida são úteis comoantígenos em composição imunogênica, veículos paraoutros imunógenos, agentes de diagnóstico e nageração de agentes diagnóstico. As moléculas deácido nucléico também são úteis como sondas parauso diagnóstico e também como composiçõesimunogênicas.

Em um aspecto adicional da invenção, éfornecida uma composição - imunogênica quecompreende uma quantidade imunoeficaz do análogoHin47 ou da molécula de ácido nucléico incluindo ogene que codifica o análogo Hin47. A composiçãoimunogênica pode ser formulada como uma vacinapara administração in vivo a um hospedeiro,incluindo um ser humano, para conferir proteçãocontra doenças ocasionadas por um patógenobacteriano que produz Hin47 ou uma proteína capazde induzir anticorpos no hospedeiroespecificamente reativo com Hin47. 0 patógenobacteriano pode ser uma espécie Haemophilus, talcomo Haemophilus influenzae. As composiçõesimunogênicas da invenção podem compreender aindapelo menos um outro material imunogênico ouimunoestimulante, tal como um adjuvante. Em umamodalidade adicional, a molécula de ácido nucléicoque compreende um gene codificando o análogo Hin47pode estar contido em ura vetor vivo, como um víruspox, Salmonella, poliovírus, adenovírus, vacíniaou BCG.

A invenção também se estende a um processode gerar uma resposta imune em um hospedeiro,incluindo um ser humano, compreendendo administrarao mesmo uma quantidade imunoeficaz dascomposições imunogênicas fornecida aqui.

Como mencionado acima, o análogo Hin47fornecido aqui é útil em aplicações dediagnóstico. Por conseguinte, em um aspectoadicional da invenção, é fornecido um processo dedeterminar a presença de anticorposespecificamente reativos com Hin47 em uma amostra,compreendendo as etapas de:

(a) contactar a amostra com o análogo Hin47tendo substancialmente as mesmas propriedadesimunogênicas que a proteína Hin47 natural comofornecida aqui para produzir complexos quecompreendem o análogo Hin47 e quaisquer anticorpospresentes na amostra especificamente reativa com amesma,· e(b) determinar a produção dos complexos.

A presente invenção também fornece umprocesso de determinar a presença de Hin47 em umaamostra, compreendendo as etapas de:

(a) imunizar uma pessoa com uma composiçãoimunogênica como previsto aqui para produziranticorpos específicos pára proteína Hin47;

(b) contãctar a amostra com os anticorpospara produzir complexos que compreendem qualquerHin47 presente na amostra e os anticorposespecíficos de Hin47; e

(c) determinar a produção dos complexos.

A invenção também se estende a um estojo dediagnóstico para determinar a presença deanticorpos em uma amostra especificamente reativacom Hin47, compreendendo:

(a) o análogo Hin47 tendo substancialmenteas mesmas propriedades imunogênicas que a proteínaHin47 natural como previsto aqui;

(b) meio para contactar o análogo com aamostra para produzir um complexo que compreende oanálogo e quaisquer tais anticorpos presentes naamostra; e

(c) meio para determinar a produção docomplexo.Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1, folha 1, mostra os mapas derestrição de plasmídeos JB-1031-1-14 e JB-1068-2-2e a construção dos plasmídeos para análise deseqüência;

a figura 2, folhas 1 a 9, mostra aseqüência de nucleotídeo completa (SEQ ID NO: 1) ea de aminoácido deduzido (SEQ ID NO: 2) de Hin47proveniente da cepa H. influenzae SB33 bem comouma seqüência de nucleotídeo parcial (SEQ ID NO:3) e uma seqüência de aminoácido deduzida parcial(SEQ ID NO: 4) da mesma, a última sendoespecificamente copiada por um inventor aqui dosmateriais apresentados na conferência ASM comodescrito acima;

a figura 3, folhas 10 e 11, mostra umacomparação das seqüências de aminoácido de Hin47H.influenzae (SEQ ID NO: 2), htrA E. coli (SEQ IDNO: 5), e htrA Salmonella typhimurium (SEQ ID NO:6);

a figura 4, folhas 12 a 16, mostra umalinhamento de resíduos de aminoácido 57 a 256 deHin47 com certas proteases conhecidas (SEQ ID NOs:7 a 16) . Os códigos são como a seguir: ΤΟΝ,tonina de rato; PKAAB, kaillkrein,- PTN, tripsina;CHAA, quimotripsina; EST, elastase: RP2A, proteasede célula mastro de rato; SGT, tripsina deStreptomyces griseus; SGBE, proteinase A de S.griseus; SGA, proteinase B de S. griseus; ALP,protease alfa-lítico L. enzimogenes,· hin47, res.57-256 de Hin47. Os asteriscos (*) indicamregiões estruturalmente conservadas. Os resíduosdo trio catalíticos são indicados por uma marcacortada (#) . (con' se refere a regiões deconsenso estrutural, dentre as proteasesmamíferas;

a figura 5, folhas 17 e 18, mostra os mapasde restrição para plasmídeos DS-1011-l-l e DS-1048-1 que expressam um análogo Hin47 de E.coli eum esquema de construção para plasmídeo DS-1011-1-1 (plasmídeo pT7/Hin47*);

a figura 6, folha 19, mostra um processopara purificar o análogo Hin47 de E.coli de acordocom uma modalidade da presente invenção e análisede gel do produto purificado;

a figura 7, folha 20, mostra as atividadesde protease de Hin47 natural e análogo Hin47 emrelação a β-caseína,·

a figura 8, folha 21, mostra a estabilidadede Hin47 natural e análogo Hin47 em temperaturasdiferentes;

a figura 9, folha 22, mostra a degradaçãoenzimática de uma proteína recombinante H.influenzae por Hin47 natural e o análogo Hin47; e

a figura 10, folha 23, mostra aimunogenicidade comparativa de Hin47 natural e oanálogo Hin47 em camundongos;

a figura 11, folhas 24 e 25, mostra acomparação de aminoácido de proteína Hin47 isoladadas cepas H. influenzae SB33 e SB12; e

a figura 12, folha 26, mostra a purificaçãodo análogo Hin47 H91A a partir de E.coli.

Descrição Geral da Invenção

Quaisquer cepas Haemophilus que tenhamgenes Hin47 podem ser convenientemente utilizadaspara fornecer as moléculas de ácido nucléicopurificadas e isoladas (que podem estar na formade moléculas de DNA), compreendendo pelo menos umaporção codificando para Hin47 como tipificado pormodalidades da presente invenção. Tais cepas sãogeralmente disponíveis das fontes clínicas e decoleções de cultura bacteriana, tais como acoleção da American Type Culture. Tais cepasincluem cepas de H. influenzae e outras bactériasque produzem uma proteína capaz de geraranticorpos que especificamente reconhecemfragmento Hin47 ou seu análogo. As cepasapropriadas de Haemophilus podem incluir:

cepa tipo b H.influenzae MinnA;cepa tipo B H. influenzae Eagan;cepa não tipificável H. influenzae SB33;cepa não tipificável H. influenzae SB12; oucepa não tipificável H. influenzae PAK12085.

Com referência ã figura 1, são ilustradosmapas de restrição de plasmídeos JB-1031-1-14 etJB-1068-2-2 que contêm uma porção codificandoproteína Hin47 de H.influenzae não tipificávelSB33. A seqüência de nucleotídeo do gene Hin47foi determinada e é mostrada na figura 2juntamente com a seqüência de aminoácido deduzidada proteína Hin47. Com referência à figura 3, émostrado um alinhamento de seqüência de aminoácidode H.influenzae Hin47 e as proteases de serinahtrA de Escherichia coli e htrA da Salmonellatyphimurium. Este alinhamento pela primeira vezrevela a descoberta inesperada dos presentesrequerentes de que Hin47 está relacionado aproteases de serina bacteriana e que Hin47 tematividade de protease. Hin47 tinha sidopreviamente relatado como sendo adesina. A suaatividade de protease descoberta limita muito autilidade de Hin47 natural como um imunógeno paravacinação e como um antígeno em usos dediagnóstico. 0 alinhamento de seqüência mostradana figura 3 revelou que as proteínas htrA e Hin47contêm uma seqüência GNSGGAL (SEQ ID NO: 17) entreos resíduos 195 e 201 da proteína madura. Aseqüência de consenso do sítio ativo de proteasesde serina é GDSGGPK (SEQ ID NO: 18) (Brenner,1988) e o resíduo ativo é serina. Desse modo,Serina-197 em Hin47 foi mudada para produzir umanálogo de Hin47 reduzido em atividade deprotease, de acordo com uma modalidade dainvenção. Em uma modalidade específica, Serina-197 foi substituída por alanina. Os resíduos deaminoácido 57 a 256 de Hin47 foram adicionalmentealinhados com proteases conhecidas e os resíduosde sítio ativo identificados das homologias locaiscircundando os resíduos do trio catalítico (figura4). Há um sistema de numeração padrão paraproteases de serina em que os resíduos de triocatalítico são numerados como His-57, Asp-102 eSer-195. Estes correspondem a resíduos His-91,Asp-121 e Ser-197 no sistema de numeraçãoseqüencial. Desse modo, com referência à figura4, é mostrado um alinhamento com base em estruturade dez proteases de serina estruturalmentedeterminadas (SEQ ID NOS: 7 a 16) em que resíduoshomólogos são alinhados principalmente com base emlocais similares em espaço tridimensional. Alocalização de muitos dos resíduos no núcleohidrofóbico de Hin47, bem como resíduos em tornodo sítio ativo pode.ser alinhada razoavelmente bempara identificar aminoácidos funcionais daprotease Hin47. Desse modo, outros resíduos deaminoácido em Hin47 que contribuem para aatividade de protease da proteína incluem His-91 eAsp-121. Em modalidades específicas, His-91 podeser substituída por alanina, lisina ou arginina.

Em uma modalidade adicional, Asp-121 pode sersubstituída por alanina ou ácido glutâmico. Emuma modalidade adicional, Serina-197 pode sersubstituída por alanina, serina ou treonina.

Embora a provisão de um análogo de Hin47 tendoatividade de protease reduzida tenha sidoexemplificada aqui por substituição de aminoácidoespecífica dentro da proteína Hin47, a descobertada atividade de protease e os processos deexpressão de Hin47, purificação e análisefornecidos aqui, permitem a produção de outrosanálogos tendo pelo menos um outro aminoácidoeliminado ou substituído ou tendo pelo menos umaminoácido adicional inserido na proteína Hin47.

Em aplicações específicas e modalidades, pode serdesejável simultaneamente alterar váriosaminoácidos da proteína Hin47 para reduzirparticularmente a atividade de protease de Hin47.Os múltiplos aminoácidos podem ser His-91 e Ser-197 e podem ser eliminados ou substituídos poralanina. Em uma modalidade alternativa, osmúltiplos aminoácidos podem ser His-91, Asp-121 eSer-197 e podem ser eliminados ou substituídos poralanina. Por conseguinte, a presente invençãofornece análogos de proteína Hin47 tendo atividadede protease reduzida devido a eliminações,substituições de adições de aminoácido múltiplo ouindividual dentro da proteína Hin47.

Como discutido acima, Hin47 mostrahomologia com htrA E. coli ou htrA S. typhimurium,os quais são ambas proteínas de resposta a tensãocom atividade de protease de serina. htrA E.colié induzível pelo crescimento a 43,5°C (ref. 13).Mostramos que a proteína htrA E.coli também éinduzível por crescimento em etanol a 6%. Hin47também pode ser induzido por etanol a 6% e a umgrau menor por redução de temperatura a 43,50Ccomo descrito em detalhe abaixo. Esta análise daexpressão de Hin47 fornece evidência adicional darelação entre esta proteína e LtrA.

O gene hinAl também foi clonado da cepaH. influenzae não tipificável SB12 por amplificaçãoPCR. Com referência à figura 11, é mostrada umacomparação de aminoácido entre as proteínas Hin47de cepas H.influenzae SB12 e SB33. Isto mostra asproteínas como sendo quase idênticas em seqüênciade aminoácido.

Com referência à figura 5, são ilustradosplasmídeos DS-1011-1-1 e DS-1048-2 que expressamum análogo Hin47 serina-197 alanina em E.coli.

A figura 6 mostra um fluxograma de um método paraa purificação do análogo Hin47 a partir de corposde inclusão E.coli.

A figura 7 mostra a atividade de proteasereduzida do Hin47 serina-197 análogo alanina nosubstrato β-caseína e demonstra que o análogo temmenos de aproximadamente 10% da atividade deprotease de proteína Hin47 natural. Desse modo,em uma modalidade da invenção, é fornecido umanálogo de Hin47 tendo uma atividade de proteasemenor do que aproximadamente 10% da atividade deprotease de Hin47 natural e tal análogo podeespecificamente ter aminoácido Serina-197substituído por alanina.

Com referência à figura 8, é ilustrada umaanálise da estabilidade aumentada de um análogo deHin47 como previsto aqui. Desse modo, em umamodalidade da presente invenção, é fornecido umanálogo de proteína Hin47 tendo estabilidadetérmica aumentada, e tal análogo podeespecificamente ter aminoácido serina-197substituído por alanina.

Com referência à figura 9, é ilustrada adegradação proteolítica de um antígeno não Hin47Haemophilus por Hin47 e um análogo Hin47 comoprevisto aqui. Desse modo, de acordo com umamodalidade adicional ' da presente invenção, éfornecido um análogo de Hin47 compatível com umasegunda proteína não Hin47 e tal análogo pode terespecificamente aminoácido Serina-197 substituídopor alanina.

Com referência à figura 10 e Tabela 1, éilustrada a imunogenicidade comparativa de Hin47não modificado e um análogo Hin47 tendo atividadede protease reduzida em camundongos. A proteínaHin47 e análogos Hin47 S197A e H91A tinhamimunogenicidade comparável. Desse modo, em umamodalidade específica, é fornecido um análogo deHin4 7 tendo atividade de protease reduzida e tendo,substancialmente às mesmas propriedadesimunogênicas de proteína Hin47 natural. Talanálogo pode ter especificamente aminoácidoSerina-197 substituída por alanina.

Com referência às Tabelas 2 e 3, sãomostradas as propriedades imunoprotetoras deanálogos de Hin47 tendo atividade de proteasereduzida contra Hib no modelo de rato filhote debacteremia e no modelo de chinchila de imunizaçãoativa de otite média de acordo com modalidadesespecíficas da invenção, tal análogo pode terespecificamente aminoácido His-91 eliminado ousubstituído por alanina, lisina ou arsinina,- Asp-121 eliminado ou substituído por alanina ou ácidoglutâmico; Serina-197 substituída por alanina,cisteína ou treonina; ou sua combinação.

De acordo com outro aspecto da presenteinvenção, é fornecida uma vacina contraHaemophilus ou outros patógenos bacterianos queproduzem Hin47 ou uma proteína capaz de induziranticorpos que reconhecem especificamente Hin47,compreendendo uma quantidade imunogenicamenteeficaz de um análogo imunoprotetor de Hin47 comoprevisto aqui ou uma molécula de ácido nucléicotendo uma seqüência codificando um análogo Hin47como previsto aqui, e um veículo fisiologicamenteaceitável para o mesmo. Os análogos fornecidostambém podem ser utilizados como uma proteína deveículo para hapten, polissacarídeos ou peptídeospara fazer uma vacina conjugada contradeterminantes antigênicos não relacionados aHin47.

Como será evidente da revelação a seguir, apresente invenção fornece ainda plasmídeos e novascepas de bactérias para a produção de análogosHin47 como fornecido aqui.

As moléculas de DNA purificadas e isoladascompreendendo pelo menos uma porção codificandopara um análogo de proteína Hin47 Haemophilusinfluenzae tendo atividade de protease reduzida emcomparação com Hin47 natural tipificada pelasmodalidades descritas aqui, são vantajosos comosondas de ácido nucléico para a identificaçãoespecífica de cepas Haemophilus in vitro ou invivo. Os análogos Hin47 codificados pelasmoléculas de DNA fornecidas aqui são úteis comoreagentes de diagnóstico como antígenos ou para ageração de anticorpos anti-Hin47, antígenos para avacinação contra as doenças ocasionadas pelaespécie de Haemophilus e outros patógenosbacterianos que produzem uma proteína capaz deproduzir anticorpos que reconhecem,especificamente, Hin45 e para detectar infecçãopor Haemophilus e outras bactérias.

Em modalidades adicionais da presenteinvenção, os análogos Hin47 tendo atividade deprotease reduzida como fornecido aqui podem serutilizados como moléculas de veículo para prepararmoléculas quiméricas e vacinas conjugadas(incluindo glicoconjugados) contra bactériaspatogênicas, incluindo bactérias encapsuladas.desse modo, por exemplo, glicoconjugados dapresente invenção podem ser aplicados a vacinaçõespara conferir proteção contra doença e infecçãoocasionada por qualquer bactéria tendo antígenosde polissacarídeos, incluindo lipooligossacarídeos(LOS) e PRP. Os patógenos bacterianos podemincluir, por exemplo, Haemophilus influenzae,Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli,Neisseria meningitidis, Salmonella typhi,Streptococcus mutans, Cryptoeoceus neoformans,Klebisiella, Staphylococcus aureus e Pseudomonasaeruginosa. Os antígenos específicos que podemser conjugados com análogos de Hin47 e processospara obter tais conjugações são descritos nopedido PCT publicado pelo requerente WO 94/12641que é aqui incorporado mediante referência.

Em outra modalidade, a função de veículo deanálogos Hin47 pode ser utilizada, por exemplo,para induzir imunidade em relação apolissacarídeos anormais de células de tumor, oupara produzir anticorpos anti-tumor que podem serconjugados com agentes bioativo ouquimioterapêuticos.

Por conseguinte, a presente invençãofornece a seqüência principal e a preparação deanálogos de Hin47 de H. influenzae que podem serutilizados na prevenção e diagnóstico de doençasocasionadas por H. influenzae. Em particular, osinventores descobriram que os análogos Hin47 podemocasionar respostas imunes protetoras contra odesafio bacteriano de H. influenzae do tipo b,vivo. Desse modo, as presentes invenções têmutilidade em vacinas. A invenção também revela asseqüências de nucleotídeo dos genes codificando osanálogos Hin47. Estes segmentos de DNA podem serutilizados para fornecer um imunogenoessencialmente isento de outros antígenos H.influenzae, tais como PRP e lipooligossacarídeos(LOS), através da aplicação de tecnologia de DNArecombinante. A proteína de análogo Hin47, podeser produzida em um sistema de expressão adequado,tal como E. coli, Haemophilus, Bacillus,Bordetella Fungos, Levedo, Baculovírus, Poxvirus,vacínia ou , sistemas de expressão mamífera. Apresente revelação fornece ainda técnicas novasque podem ser empregadas para preparar análogosHin47 essencialmente puros.

É claramente evidente para uma pessoaversada no estado da técnica, que as váriasmodalidades da presente invenção têm muitasaplicações nos campos de vacinação, diagnóstico,tratamento de, por exemplo, infecções porHaemophilus, e infecções com outros patógenosbacterianos que produzem proteínas capazes deproduzir anticorpos que especificamente reconhecemHin47 e a geração de reagentes imunológicos. Umadiscussão não limitadora adicional de tais usos éadicionalmente apresentada abaixo.

1. Preparo e Uso de Vacina

Composições imunogênicas, adequadas paraserem utilizadas como vacinas, podem serpreparadas de análogos Hin47 como revelado aqui.

A vacina ocasiona uma resposta imune em uma pessoaque produz anticorpos, incluindo anticorpos anti-Hin47 e anticorpos que são opsoninas oubactericidas. Caso a pessoa vacinada seja atacadapor Haemophilus ou outras bactérias que produzamproteínas capazes de produzir anticorpos queespecificamente reconhecem Hin47, os anticorpos seligam a e inativam a bactéria. Além disso,anticorpos anti-Hin47 bactericidas ou opsoninastambém podem fornecer proteção por mecanismosalternativos.

As composições imunogênicas incluindovacinas podem ser preparadas como injetáveis, comosoluções líquidas ou emulsões. Os análogos Hin47podem ser misturados com excipientesfarmaceuticamente aceitáveis que são compatíveiscom o. análogo Hin47. Tais excipientes podemincluir, água, solução salina, dextrose, glicerol,etanol e suas combinações. As composiçõesimunogênicas e vacinas podem conter aindasubstâncias auxiliares, tais como agentesumectantes ou emulsificantes, agentes detamponamento de pH, ou adjuvantes para aumentar asua eficácia. Os processos de obter efeitoadjuvante incluem o uso de agentes como hidróxidode alumínio ou fosfato (alum), comumente utilizadocomo 0,05 a 0,1 por cento de solução em soluçãosalina tamponada de fosfato. As composiçõesimunogênicas e vacinas podem ser administradasparenteralmente, por injeção subcutaneamente ouintramuscularmente. Alternativamente, ascomposições imunogênicas formadas de acordo com apresente invenção, podem ser formuladas efornecidas em um modo para ocasionar uma respostaimune nas superfícies de mucosa. Desse modo, acomposição imunogênica pode ser administrada asuperfícies de mucosa por exemplo, pelas viasnasais ou orais (intragástrica) .

Alternativamente, outros modos de administraçãoincluindo supositórios e formulações orais podemser desejáveis. Para supositórios, aglutinantes eveículos podem incluir, por exemplo, polialqualenoglicóis ou triglicerídeos. As formulações oraispodem incluir incipientes normalmente empregadostais como, por exemplo, tipos farmacêuticos desacarina, celulose e carbonato de magnésio. Estascomposições podem ter a forma de soluções,suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas,formulações de liberação contínua ou pós e contêmcerca de 1 a 95% dos análogos Hin47. Aspreparações imunogênicas e vacinas sãoadministradas em um modo compatível com aformulação de dosagem, e em tal quantidade queserá terapeuticamente eficaz, protetora eimunogênica. A quantidade a ser administradadepende da pessoa a ser tratada, incluindo, porexemplo, a capacidade do sistema imune da pessoaem sintetizar anticorpos, e se necessário,produzir uma resposta imune mediada por célula.

As quantidades precisas de ingrediente ativonecessárias serem administradas dependem dojulgamento do médico. Contudo, faixas de dosagemadequadas são facilmente determináveis por umapessoa versada no estado da técnica e podem ser daordem de microgramas dos análogos Hin47. Regimesadequados para administração inicial e doses dereforço também são variáveis, porém podem incluiruma administração inicial seguida poradministrações subseqüentes. A dosagem tambémpode depender da via de administração e variará deacordo com o tamanho do hospedeiro.

A concentração de antígeno em umacomposição imunogênica de acordo com a invenção éem geral cerca de 1 a 95%. Uma vacina que contémmaterial antigênico de apenas um patógeno é umavacina monovalente. As vacinas que contêmmaterial antigênico. de vários patógenos sãovacinas combinadas e também pertencem à presenteinvenção. Tais vacinas combinadas contêm, porexemplo, material de vários patógenos ou de váriascepas do mesmo patógeno, ou de combinações devários patógenos.

As moléculas de ácido nucléico codificandoo análogo Hin47 da presente invenção também podemser utilizadas diretamente para imunização poradministração diretamente do DNAf por exemplo, porinjeção para imunização genética ou por construçãode vetor vivo, tal como Salmonella, BCG,adenovirus, poxvírus, vacínia ou poliovírus. Umadiscussão de alguns vetores vivos que foramutilizados para carregar antígenos heterólogospara o sistema imune são discutidos, por exemplo,em 0'Hagan (1992). Os processos para a injeçãodireta de DNA em pessoas em teste para imunizaçãogenética são descritos, por exemplo, em Ulmer eoutros, 1993.

2. Imunoensaios

Os análogos Hin47 da presente invenção sãoúteis como imunógenos para a geração de anticorposanti-Hin47, como antígenos em imunoensaiosincluindo ensaios imunossorventes ligados porenzima (ELISA), RIAs e outros ensaios de ligaçãode anticorpo não ligados por enzima ouprocedimentos conhecidos no estado da técnica paraa detecção de Haemophilus anti-bacteriana, eanticorpos anti-Hin47. Em ensaios ELISA, osanálogos Hin47, são imobilizados sobre umasuperfície selecionada, por exemplo, umasuperfície capaz de ligar proteínas tais como ascavidades de uma placa de microtítulo depoliestireno. Após lavagem para remover análogosHin47 incompletamente adsorvidos, uma proteína nãoespecífica tal como uma solução de albumina desoro bovino (ASB) que é conhecida como sendoantigenicamente neutra com relação à amostra testepode ser ligada à superfície selecionada. Istopermite o bloqueio de sítios de adsorção nãoespecíficos na superfície de imobilização e dessemodo reduz o antecedente ocasionado por ligaçõesnão- específicas de antisoro sobre a superfície.

A superfície de imobilização é entãocontactada com uma amostra, tal como materiaisclínicos ou biológicos, para ser testada em ummodo condutivo à formação de complexoimune(antígeno/anticorpo). Isto pode incluirdiluir a amostra com diluentes, tais como soluçõesde ASB, globulina de gama bovina (GGB) e/ousolução salina tamponada com fosfato (STF)/Tween.

A amostra é então deixada incubar de 2 a 4 horas,em temperaturas tais como da ordem deaproximadamente 25° a 37°C. Após incubação, asuperfície contactada com a amostra é lavada pararemover material não imunocomplexado. 0procedimento de lavagem pode incluir lavagem comuma solução, tal como STF/Tween ou um tampão deborato. Após formação de imunocomplexosespecíficos entre a amostra teste e os análogosHin47 ligados, e subseqüente lavagem, aocorrência, e quantidade uniforme, de formação deimunocomplexo podem ser determinados submetendo oimunocomplexo a um segundo anticorpo tendoespecificidade para o primeiro anticorpo. Se aamostra teste for de origem humana, o segundoanticorpo é um anticorpo tendo especificidade paraimunoglobulinas humanas e em geral IgG. Parafornecer meios de detecção, o segundo anticorpopode ter uma atividade associada tal como. umaatividade enzimática que gerará, por exemplo, umdesenvolvimento de cor mediante incubação com umsubstrato cromogênico apropriado. A quantificaçãopode ser então obtida medindo-se o grau de geraçãode cor utilizando, por exemplo, umespectrofotômetro de espectro visível.

3. Uso de Seqüências como Sondas deHibridização

As moléculas de ácido nucléico da presenteinvenção, tendo a seqüência do gene análogo hin47,permitem a identificação e clonagem dos genesHin47 de quaisquer espécies de Haemophilus eoutras bactérias que produzem proteínas capazes deproduzir anticorpos que reconhecem especificamenteHin47.

As moléculas de ácido nucléico tendo aseqüência codificando o análogo Hin47 da presenteinvenção são úteis por sua capacidade emseletivamente formar moléculas dúplex com trechoscomplementares de outros genes hin47. Dependendoda aplicação, uma variedade de condições dehibridização pode ser empregada para obter grausvariados de seletividade da sonda em relação aoutros genes hin47. Para elevado grau deseletividade, condições relativamente rigorosassão utilizadas para formar os dúplex, tais comocondições de baixo teor de sal e/ou temperaturaelevada, tais como fornecidos por 0.02 M a 0.15MNaCl em temperaturas entre cerca de 50° e 70°C.Para algumas aplicações, condições de hibridizaçãomenos rigorosas são necessárias, tais como 0,15 Ma 0,9 de sal, a temperaturas que variam entrecerca de 20 0C e 55 °C. As condições dehibridização também podem ser tornadas maisrigorosas pela adição de quantidades crescentes deformamida, para desestabilizar o dúplex híbrido.

Desse modo, as condições de hibridizaçãoespecíficas podem ser facilmente manipuladas, egeralmente será um processo de escolha dependendodos resultados desejados.

Em uma modalidade de diagnóstico clínico,as moléculas de ácido nucléico codificando osgenes hin47 da presente invenção podem serutilizadas em combinação com um meio apropriado,tal como um rótulo, para determinar hibridização.

Uma ampla variedade de meios indicadoresapropriados são conhecidos no estado da técnica,incluindo ligantes radioativos, enzimáticos ououtros, tais como avidin/biotina, que são capazesde fornecer um sinal detectável. Em algumasmodalidades de diagnóstico, uma etiqueta deenzima, tal como urease, fosfatase alcalina ouperoxidase, ao invés de uma etiqueta radioativapode ser utilizada. No caso de etiquetas deenzima, substratos indicadores colorimétricos sãoconhecidos os quais podem ser empregados parafornecer um meio visível ao olho humano ouespectrofotometricamente, para identificarhibridização específica com amostras contendoseqüências de gene hin47.

As moléculas de ácido nucléicocompreendendo genes hin47 da presente invenção sãoúteis como sondas de hibridização em hibridizaçõesde solução e em modalidades empregandoprocedimentos de fase sólida. Em modalidadesenvolvendo procedimentos de fase sólida, o DNA deteste (ou RNA) das amostras, tais como amostrasclínicas, incluindo exsudatos, fluidos corpóreos(por exemplo, soro, fluido amniótico, efusão deouvido médio, saliva, fluido de lavagembronoalveolar) ou mesmo tecidos, é adsorvido ou deoutro modo afixado a uma matriz ou superfícieselecionada. O ácido nucléico de filamento único,fixo é então submetido à hibridização específicacom sondas selecionadas compreendendo asseqüências de ácido nucléico dos genes hin47 dapresente invenção sob condições desejáveis. Ascondições selecionadas dependerão dascircunstâncias específicas com base nos critériosespecíficos necessários dependendo, por exemplo,do teor G+C, tipo de ácido nucléico alvo, fonte deácido nucléico, tamanho de sonda de hibridizaçãoetc. Após lavagem da superfície de hibridizaçãode modo a remover moléculas de sonda nãoespecificamente ligadas, a hibridização específicaé detectada, ou mesmo quantificada, por intermédiodo rótulo.

4. Expressão dos genes codificando análogosde Hin47 tendo atividade de protease reduzida

Vetores talvez contendo seqüências decontrole e replicon que são derivadas da espéciecompatível com a célula hospedeira podem serutilizados para a expressão dos genes análogosHin47 como previsto aqui em sistemas de expressão.

O vetor porta, comumente, um sítio de replicação,bem como seqüências de marcação as quais sãocapazes de fornecer seleção fenotípica em célulastransformadas. Por exemplo, E.coli pode sertransformado utilizando pBR322 que contém genespra resistência a ampicilina e tetraciclina edesse modo fornece meio fácil para identificarcélulas transformadas. 0 plasmídeo pBR322, ououtro plasmídeo microbiano ou fago também deveconter, ou ser modificado para conter, promotoresos quais podem ser utilizados pela célulahospedeira para expressão de suas própriasproteínas.

Além disso, vetores de fago contendoseqüências de controle e replicon que sãocompatíveis com o hospedeiro podem ser utilizadoscomo um vetor de transformação em conexão a esteshospedeiros. Por exemplo, o fago em lambda GEM™-11 pode ser utilizado na fabricação de vetores defago recombinante que podem ser utilizados paratransformar células hospedeiras, tais como E.coliLE392.

Os promotores comumente utilizados emconstrução de DNA recombinante incluem β-lactamase(penicilinas) e sistemas promotores de lactose(Chang e outros, 1979,- Goeddel e outros, 1980) eoutros promotores microbianos, como o sistemapromotor T7 (Patente U.S. 4.952.496). Os detalhesreferentes às seqüências de promotores, denucleotídeo, são conhecidos, permitindo que umtécnico versado ligue os mesmos funcionalmente comvetores de plasmídeo. 0 promotor específicoutilizado será, em geral, uma questão de escolhadependendo dos resultados desejados. Hospedeirosque são apropriados para expressão dos análogosHin47 incluem E. coli, espécie Bacillus, fungosHaemophilus Bordetella, levedo, células mamíferasou o sistema de expressão baculovírus podem serutilizados.

Desse modo, de acordo com a invenção, podeser preferível fazer a proteína de análogo Hin47por processos recombinantes. Hospedeirosparticularmente desejáveis para expressão a esterespeito incluem bactérias Gram positivas que nãotêm LPS e são, portanto, isentas de endotoxina.Tais hospedeiros incluem espécies de Bacillus epodem ser particularmente úteis para a produção deanálogo Hin47 não pirogênico.

Depósitos Biológicos

O plasmídeo DS-1011-l-l (pT7/Hin47*) quecontém uma porção codificando para um análogoHin47 que é descrito e mencionado aqui foidepositado com a American Type Culture Collection(ATCC) localizada em Rockville, Maryland, EUA, deacordo com o Tratado de Budapeste e antes dodepósito deste pedido de continuação em parte em27 de junho de 1994 sob no. de Acesso 74845. Asamostras do plasmídeo depositado tornar-se-ãodisponíveis ao público mediante concessão de umapatente com base neste pedido de patente dosEstados Unidos. A invenção descrita ereivindicada aqui não deve ser limitada em âmbitopor plasmídeo depositado, uma vez que a modalidadedepositada é destinada apenas como uma ilustraçãoda invenção. Quaisquer plasmídeos equivalentes ousimilares que codificam antígenos similares ouequivalentes como descrito neste pedido estãocompreendidos no âmbito da invenção.

Exemplos

A revelação supra descreve, em geral, apresente invenção. Pode-se obter entendimentomais completo mediante referência aos seguintesExemplos específicos. Estes exemplos sãodescritos unicamente para fins de ilustração e nãose pretende que limitem o âmbito da invenção. Asmudanças em forma e substituição de equivalentessão consideradas, conforme circunstâncias possamsugerir ou tornar expedientes. Embora termosespecíficos tenham sido aqui empregados, taistermos são destinados a um sentido descritivo enão para fins de limitação.

Os processos de genética molecular,bioquímica de proteína, e imunologia utilizadosporém não descritos explicitamente nesta revelaçãoe estes Exemplos são amplamente relatados naliteratura científica e estão bem compreendidos-nacapacidade daqueles versados no estado da técnica.

Exemplo 1

Este exemplo ilustra a clonagem do genehin47 a partir da cepa H. influenzae nãotipificável SB33.

DNA cromossômico foi preparado da cepa H.influenzae SB33, e uma biblioteca EMBL3 foipreparada e selecionada com uma sonda deoligonucleotídeo rotulado específica para aextremidade-5' de hin47. A cepa H.influenzae nãotipificável SB33 foi cultivada em agar Mueller-Hinton ou em caldo de infusão cérebro coração comodescrito por Harkness e outros, 1992. DNAcromossômico foi preparado como a seguir: ascélulas de 50 ml de cultura foram formadas empelotas por centrifugação a 5000 rpm por I5 a 20mm., a 4°C, em uma centrífuga RC-3B Sorvall. Apelota de célula foi suspensa novamente em I0 mlde TE (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), pronasefoi adicionada a 500 μ9 ml'1 e SDS a 1%. A amostrafoi incubada a 37°C até que se obteve um lisadoclaro. 0 lisado foi suavemente extraído uma vezcom fenol saturado-Tris (pH 7,4) uma vez que comclorofórmio/fenol-saturado-Tris (1:1) e uma vezcom clorofórmio. A fase aquosa final foidialisada a 40C por 24 h. contra 1 M NaCl, seguidopor 24 h contra TE.

Uma biblioteca EMBL3 foi preparada pordigestão parcial de DNA cromossômico SB33 comSau3A I, seguido por fracionamento em tamanho emum gradiente de sacarose de 10 a 30% em TNE (20 mMTris/HCl, 5 mM NaClf 1 mM EDTA, pH 8,0) ou poreletroforese de gel preparativo. As fraçõescontendo fragmentos de DNA maiores do que 5 kb emcomprimento foram agrupados, precipitados eligados com braços BamH I de EMBL 3 (Promega) . Amistura de ligação foi acondicionada utilizando umestojo de acondicionamento Gigapack II e revestidasobre células E.coli LE392. As bibliotecas foramampliadas e armazenadas a 40C na presença declorofórmio a 0,3%.

As placas foram elevadas sobre filtros denitrocelulose para hibridização com uma sonda deoligonucleotídeo rotulado-32P (3026.SL). Aseqüência de oligonucleotídeo eraATGAAAAAAACACGTTTTGTATTAAATAGTATTGCACTTGG (SEQ IDNO: 3) correspondendo à seqüência de aminoácidoterminal-N MKKTRFVLNSIALG (SEQ ID NO: 19) . O DNAde fago foi preparado de placas putativas e o DNAde inserção foi excisado por digestão de Sal I eclonado em pUC8-BgXb digerido com Sal I. Osplasmídeos JB-1031-1-14 e JB-1068-2-2 (figura 1)foram selecionados para análise adicional.

Exemplo 2

Este Exemplo ilustra a caracterização eanálise de seqüência do gene hin47 e seqüência deaminoácido deduzida da proteína Hin47 da cepa NTHiSB33.

O mapeamento de restrição e análise demancha Southern de clones JB-1031-1-14 e JB-1068-2-2 localizaram o gene hin47 em um fragmento de4.7 kb BamH I/BamH I ou um fragmento de DNA 2.7 kbBamH I/Pst I. O fragmento de 4.7 kb Bamhl/BamH Ide JB-1068-2-2 foi subclonado no plasmídeo degeração de pUC8/BgXb DS-755-1. O fragmento 3.1 kbBamH I a Xba I de DS-755-1 foi subclonado emplasmídeo de geração pUC18 JB-1165-1 que temsítios de restrição adequados para o procedimentoErase-a-base (Promega) (figura 1) . Esta técnicagera clones sucessivos com truncamentos crescentesde DNA de inserção, com as eliminações ocorrendona mesma extremidade. O conjunto de clonesencaixado, resultante, pode ser seqüenciadorapidamente utilizando uma base universal.

DNA do plasmídeo JB-1165-1 foi digerido comBamH I e Sac I e submetido à digestão exoIIIutilizando um estojo Erase-a-Base. 0 conjuntoresultante de plasmídeos truncados foi analisadopor eletroforese de gel agarose e plasmídeosrepresentativos foram selecionados para análise deseqüência.

0 DNA de plasmídeo para seqüenciamento foipreparado por uma modificação do procedimento deHolmes e Quigley, 1981. Em resumo, a pelota decélula de 50 ml de cultura foi suspensa novamenteem 10 ml STET (8% de sacarose, 5% Triton X-100, 50mM EDTA, e 50 mM Tris/HCl, pH 8.0), lisozima (2,5mg) foi adicionado e a mistura foi posta emebulição por 2 min. A amostra foi girada a 14.000rpm em um Sorvall RC 5B por 20 minutos e osobrenadante foi precipitado com um volume igualde isopropanol, lavado com etanol a 70% a seguiretanol absoluto, e então seco em ar. A pelota foisuspensa novamente em 0,9 ml de TE, a seguir 20 μΐde 5 mg ml"1 RNAse A foram adicionados, e a misturafoi incubada a 370C por 15 min. Após a adição de500 μΐ de 1.5Μ NaCl/30% PEG, a mistura foiincubada em gelo por 3 0 min. e o DNA foi formadoem pelotas por centrifugação em um microfugoEppendorf por 10 min. A pelota foi suspensanovamente em 400 μΐ de TE e extraída duas vezescom fenol saturado-Tris (ph &.4), duas vezes comclorofórmio/fenol saturado-Tris (1:1) e duas vezescom clorofórmio. 0 DNA foi precipitado pelaadição de 40 μΐ de acetato de amônio 3M e 1 ml deetanol, lavado com etanol a 70% e suspensonovamente em água destilada.

As amostras de DNA foram seqüenciadasutilizando o seqüenciador de DNA ABI modelo 370A ea química de terminador de corante. A baseinversa universal foi utilizada com o conjuntoencaixado de clones para determinar a seqüência dofilamento de codificação hin47. As bases deoligonucleotídeo de aproximadamente 25 bases emcomprimento foram utilizadas para confirmar aseqüência do filamento de não codificação. Aseqüência de nucleotídeo do gene hin47 SB33 e aseqüência de aminoácido deduzida da proteína Hin47são mostradas na figura 2. As seqüências denucleotídeo e aminoácido terminal-N de Hin47apresentadas na reunião ASM, Nova Orleans, 26 a 30de maio de 1992 são indicadas em letra minúsculana figura 2. As seqüências de terminal amino doSB33 Hin47 e esta seqüência apresentada sãoidênticas, estabelecendo a identidade do geneclonado como hin47.

Exemplo 3

Este Exemplo descreve a descoberta deatividade de protease de serina de proteína Hin47.

A seqüência de aminoácido deduzida deproteína Hin47 determinada no Exemplo 2 acima foicomparada com todas as outras proteínas conhecidasna base de dados Genbank. Como descrito acima, aproteína Hin47 é descrita nos pedidos PCTpublicados WO 94/00149, WO 92/11367 e WO 92/10936como sendo uma molécula adesina de Haemophilus.

Portanto, foi uma descoberta surpreendente einesperada da presente invenção que a proteínaHin47 tem homologia de aminoácido significante(55%) com as proteases de serina htrA E. coli ehtrA S.typhimurium e outras proteases. Estashomologias de seqüência de aminoácido sãomostradas nas figuras 3 e 4. Além disso,verificou-se que a proteína Hin47 auto-digere amenos que seja armazenada na presença de uminibidor de protease de serina, como Pefablock.Exemplo 4

Este Exemplo ilustra a geração do genehinAl mutante por mutagênese orientada para osítio.

Como explicado acima, Hin 47 H. influenzae,htrA E. coli, e htrA S. typhimurium são todasproteases de serina. A seqüência de consenso dosítio ativo de proteases de serina é GDSGGPK (SEQID NO: 18 [Brenner, 1988] com serina sendo oresíduo ativo. As proteínas de htrA têm, ambas,uma seqüência GNSGGAL (SEQ ID NO: 17) e em Hin47H.influenzae, há a seqüência idêntica entreresíduos 195 e 201 da proteína madura. Dessemodo, o resíduo de serina na posição 197 foiselecionado para mutagênese orientada para osítio, para produzir um análogo de Hin47 comatividade de protease reduzida.

Um oligonucleotídeo CGCTCCACCAGCATTACCGCGG(SEQ ID NO: 20) foi sintetizado que mudaria oresíduo de serina em 197 para uma alanina. O genehin47 foi clonado em M13mpl8 gerando o clone DS-981-3 e a mutagênese foi realizada utilizando oestojo de Mutagênese Orientado em sítio In vitroAmersham. 0 clone DS-991-8 foi confirmado poranálise de seqüência para conter a mutação Serina-197 em Alanina. Este gene hin47 mutante édesignado hinAl*. Utilizando oligonucleotídeosapropriados, o resíduo de serina em 197 foi mudadopara uma cisteína (mutante S197C) e treonina(mutante S197T).

Além disso, uma comparação da seqüência deaminoácido de Hin47 com outras proteases (comomostrado na figura 4) revelou que aminoácidos His-91 e Asp-121 são sítios apropriados paramutagênese para produzir um análogo de Hin47 comatividade de protease reduzida.. Por métodos demutagênese análogos aqueles descritos acima, His-91 e/ou Asp-121 foram eliminados ou substituídospor diferentes aminoácidos. Tais substituições deaminoácido incluíam His-91 a Alanina (mutanteH91A) e Arginina (mutante H91R) e Asp-121 emAlanina (mutante D121A) e ácido glutâmico (mutanteD121E). Os oligonucleotídeos para efetuar talmutagênese incluíram:

His-91 Ala-91 5' ATCAATAACAGCATTATTGGT3' (SEQ ID NO: 21)Asp-121 -» Ala-121 5'TAATGCAATTGCTGATAGTTC3' (SEQ ID NO: 22).

Oligonucleotídeos correspondentes foramempregados para efetuar as outras mutações.Múltiplas mutações também foram efetuadas nasquais His-91 e serina-197 ambas foram substituídaspor Alanina (mutante H91A/S197A) e His-91, Alp-1-21e Ser-197 foram todas substituídas por Alanina(mutante H91A/D121A/S197A).

Estes mutantes adicionais foram produzidos,extraídos, purificados e testados em relação àatividade de protease como descrito para omaterial Hin47* nos exemplos seguintes.

Muitas proteases de serina são secretadasem uma forma inativa (zimogênio) , e exigem recortepara expor seus sítios ativos. A análise deseqüência terminal N de proteína Hin47 naturalmadura sugeriu que a clivagem da pré-proteínaocorra em KFFFG DRFAEQ (SEQ ID NO: 23). Asmodificações de aminoácidos que evitam clivagem damolécula para produzir a molécula de proteaseativa podem produzir um análogo de Hin47 tendoatividade de protease reduzida.

Exemplo 5

Este Exemplo ilustra a construção deplasmídeos expressando Hin47 Ser-197 -> análogo dealanina de E.coli.

0 gene hinAl* mudado do plasmídeo DS-991-8foi clonado no vetor de expressão pT-7-7 para gerarplasmídeo DS-1011-l-l (figura 5). A cepa E.coliBL21/DE3 foi transformada para gerar cepa E.coliDS-1018-3-1 que expressa Hin47 Ser-197 -» análogode alanina mediante indução.

Para utilizar a seleção de tetracicliria, ogene hinAl* foi clonado em pBR328. 0 fragmento degene Bgl II/Cla I T7/hin47* de DS-1011-1-1 foiclonado em pEVvrfl (Young e Davis, 1985) paragerar um fragmento Bgl 11/BamH I que poderia serclonado em pUC-4K (Pharmacia) digerido com BamH I.

0 clone resultante DS-1034-3 foi digerido com EcoRIeo fragmento de gene T7/hin47* clonado empBR328 (Boehringer Mannheim Corporation) paragerar plasmídeos DS-1048-2 e DS-1067-2. Aeletroporação de DNA de plasmídeo em cepa E.coliBL21/DE3 resultou em cepas DS-1071-1-1 e DS-1071-3-1 que expressam o análogo Hin47 Ser-197 -»alanina.

Exemplo 6

Este exemplo ilustra a expressão de análogoHin47 Ser-197 -» alanina de E.coli.

Uma cultura durante a noite de cepas DS-1018-3-1, DS-1071-1-1, ou DS-1071-3-1 foramcultivadas durante a noite em meios NZCYM + 3%dextrose + antibióticos (ampicilina a 25μg ml"1 outetraciclina a IOiig ml"1), a 37°C com agitação.Uma diluição de 1:40 da cultura durante a noitefoi inoculada no mesmo meio e cultivada a 370C comagitação até que a absorvência foi de A578aproximadamente 0,3. Um volume 1/10 de lactose a10% foi então adicionado para induzir expressão dopromotor T7. As amostras de célula foram colhidascerca de 4 horas após indução por centrifugação deamostras de cultura a 5000 rpm por 10 min. em umSorvall RC-3B, a 4°C.

Exemplo 7

Este Exemplo ilustra a extração epurificação de Hin47.

Hin47 foi expresso como proteína solúvel emE.coli. A pelota de célula de uma cultura de 250ml, preparada como descrito no Exemplo 6, foisuspensa novamente em 40 ml de 50 mM Tris-HCl, pH8,0, e rompida por sonicação (3 χ 10 min, 70% decírculo de carga). 0 extrato foi centrifugado a20.000 χ g e o sobrenadante resultante quecontinha > 95% da proteína Hin47 solúvel foiretido. Esta fração foi denominada "extratoHin47".

Este extrato Hin47 foi adicionalmentepurificado em uma coluna DEAE Sephacel. Quarentaml do extrato Hin47 foram aplicados sobre umacoluna DEAE Sephacel de 20 ml. equilibrada em 50 mMTris-HCl, pH 8,0. Hin47 ligou-se à coluna sobestas condições. A coluna foi lavada com 100 mlde 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, e então lavada com 100ml de 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 contendo 20 mM NaCl.Hin47 foi então eluído com 50 mM Tris-HCl, pH 8,0,contendo 40 mM de NaCl. A quantidade de Hin47 nasfrações foi determinada pelo ensaio de proteínaBCA. A pureza de Hin47 foi avaliada por. análiseSDS-PAGE. As frações contendo Hin47 foramcombinadas e armazenadas a -20°C.

Apenas o mutante H91A era tão solúvelquanto a proteína Hin47 do tipo selvagem, amaioria dos outros mutantes sendo produzidos comocorpos de inclusão.

Exemplo 8

Este exemplo ilustra a extração epurificação de Hin47 Ser-197 -»· análogo de alanina.

O análogo de Hin47 Ser-197 -»· alanina foiexpresso em corpos de inclusão em E. coli. Apelota- de célula de uma cultura de 250 ml,preparada como descrito no Exemplo 6, foi suspensanovamente em 40 ml de 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, erompida por sonicação (3 χ 10 min, 70% de círculode carga). O extrato foi centrifugado a 20.000 χg e a pelota resultante foi poupada. A pelota foiextraída novamente com 40 ml de 50 mM Tris-HCl,0,5% Triton X-100, 10 mM EDTA, pH 8,0. Asuspensão foi sonicada 20 min. a 70% de círculo decarga. 0 extrato foi centrifugado a 300 χ g por 5min. 0 sobrenadante resultante foi centrifugadonovamente a 20.000 χ g por 30 min. e a pelotaresultante foi poupada. A pelota foi suspensanovamente em 50 mM TrisO-HCl, 0,5% Triton X-100,10 mM EDTA, pH 8,0. A suspensão foi entãomisturada com 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 contendo 8 Mde uréia. A concentração final de uréia namistura foi ajustada para 2 com 50 mM Tris-HCl,pH 8,0. 0 análogo Hin47 Ser-197 -» alanina foitotalmente solubilizado sob estas condições. 0volume final da solução foi de 20 ml. Esta fraçãoé denominada "extrato de análogo Hin47". 0extrato de análogo Hin47 foi adicionalmentepurificado em uma coluna DEAE Sephacel. Vinte mlde extrato de análogo Hin47 foram aplicados sobreuma coluna DEAE Sephacel de 10 ml equilibrada em50 mM Tris-HCl, pH 8,0. 0 análogo de Hin47 Ser-197 -> alanina ligou-se à coluna sob estascondições. A coluna foi lavada com 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, e ο análogo Hin47 foi eluído com 50mM Tris-HCl, pH 8,0, contendo 30 raM Nacl. Aquantidade de análogo Hin47 nas frações foideterminada pelo ensaio de proteína BCA. A purezado análogo Hin47 foi avaliada por análise SDS-PAGE(figura 6) . As frações contendo análogo Hin47foram combinadas e armazenadas a -20°C.

Exemplo 9

Este Exemplo ilustra a atividade deprotease de Hin47 e análogo de Hin47 Ser-197 -»alanina.

A atividade enzimática de Hin47 e análogoHin47 Ser-197 -> alanina foi analisada utilizandoβ-caseína como um substrato (figura 7). Asmisturas de reação continham 5 μg de β-caseína eHin47 ou análogo Hin47. A reação foi realizada a370C por duas horas, e a seguir parada por adiçãodo tampão de amostra SDS e aquecendoinstantaneamente a amostra a 100°C por 5 min. Asalíquotas foram analisadas por SDS-PAGE. Comomostrado na figura 7, a digestão de β-caseína porHin47 era mais óbvio após duas horas (painel A,faixa 1) em comparação com as frações contendoanálogo Hin47 (painel A, faixa 2) ou sem quaisquerproteínas exógenas (painel A, faixa 3) . Apresença de Hin 47 ou análogo Hin47 nestasmisturas foi confirmada por imuno-manchautilizando um anticorpo monoclonal para Hxn47(figura 7, painel C, faixas 1 e 2).

As atividades de protease de Hin47 eanálogo Hin47 Ser-197 -» alanina também foramcomparadas por análise da auto-digestão de Hin47ou análogo Hin47 a 4°C e -20°C. 0 Hin47 ouanálogo purificado foram armazenados a 40C ou -20°C por até 20 dias. As alíquotas foram tiradasnos dias 0, 10 e 20 e a estabilidade de Hin47 ouanálogo foi analisada por imuno-mancha utilizandoum anticorpo monoclonal Hin47 (figura 8). 0análogo era tem mais estável do que Hin47 até 20dias quando armazenado em 4°C ou -20°C.

Para examinar ainda mais a atividade deprotease do análogo Hin47 Ser-197 alanina, acapacidade de Hin47 ou análogo em degradar umantigeno recombinante H. influenzae 80-kDa foiexaminada. Desse modo, um estudo de antigenomisturado foi realizado para determinar o efeitoproteolítico de Hin47 ou análogo Hin47 em outroantigeno. Uma proteína recombinante H. influenzae80 kDa (TBPl) foi escolhida para este estudo paradistinguir a mesma de Hin47 ou proteína de análogo(47 kDa). Cinco misturas foram formuladas comoseguir: proteína 80-kDa individualmente; proteína80-kDa + Hin47: proteína 80-kDa + análogo: Hin47individualmente; e análogo individualmente. Aquantidade de cada proteína na mistura era de 5μg. As misturas foram armazenadas a 40C por atéquatro semanas. As alíquotas foram tiradas nosdias 0, 7, 14, e 28 para análise por SDS-PAGE(figura 9). Ambas a proteína 80 kDa e Hin47 foramamplamente degradadas após uma semana (faixas 2 e4). Em contraste, a proteína 80 kDa em combinaçãocom análogo Hin47 permaneceu intacta após umasemana, e mostrou apenas leve degradação mesmoapós quatro semanas (faixa 3).

A atividade de protease residual de outrosanálogos Hin47 foi avaliada utilizando a digestãode β-caseína como descrito por Lipinska e outros(ref. 13) e cujos resultados estão mostrados naTabela 3. Apenas um mutante (D121E) foiverificado reter a atividade de protease deserina.

Exemplo 10

Este Exemplo ilustra a imunogenicidadecomparativa de Hin47 e análogo Hin47 emcamundongos.Os resultados de um estudo para determinara imunogenicidade comparativa de Hin47 e análogoHin47 Ser-197 alanina são mostrados na figura10. Desse modo, grupos de cinco camundongosBalb/c foram injetados três vezes (como indicadopor setas) s.c. nos dias 1, 29 e 43 com dose de 1μg de Hin47 ou análogo Hin47 na presença de AlPO4(1,5 mg por dose) . Amostras de sangue foramretiradas nos dias 14, 28, 42 e 56 (como indicadopor sangrias 1, 2, 3 e 4, respectivamente) paraanalisar os títulos de anticorpo anti-Hin47 porEIAs. A determinação de anticorpos anti-Hin47 emsoro de camundongo foi realizada como descrito porPanezutti e outros (1993) . Poços de microtítuloforam revestidos com 1 μg de Hin47 ou análogoHin47 por 16 horas em temperatura ambiente. Asplacas foram então bloqueadas com 0,1%(peso/volume) de albumina de soro bovino em PBS.

Os soros de gamundongo foram diluídos em série,adicionados aos poços, a seguir incubados por umahora em temperatura ambiente. Os fragmentosF(ab')2 de afinidade purificada de anticorpo IgG(específico Fc) anti-camundongo de cabra conjugadocom peroxidase de rábano silvestre foramutilizados como o segundo anticorpo. As reaçõesforam desenvolvidas utilizando tetrametilbenzidina(TMB/ H2O2) e absorvências foram medidas a 450 nm(utilizando 540 nm como um comprimento de onda dereferência) em uma leitora de microplaca FlowMultiskan MCC. 0 título reativo de um antisorofoi definido como a recíproca da diluiçãocompativelmente mostrando um aumento de duas vezesem absorvência em relação àquele obtido com aamostra de soro pré-sangria. Como pode ser vistoda figura 10, tanto Hin47 como o análogo Hin47ocasionaram títulos IgG comparáveis em camundongosindependente de se Hin47 ou mutante foi utilizadocomo um antígeno em EIAs.

Os estudos de imunogenicidade também foramrealizados utilizando o análogo Hin47 H91A. Esteanálogo foi verificado produzir uma resposta imuneequivalente àquela do análogo S197A Hin47.

Para examinar adicionalmente a repostaimune a' Hin47 ou ao análogo Hin47 Ser-197alanina, as subclasses de IgG anti-Hin47 em sorode camundongo foram determinadas. Os poços demicrotítulb foram revestidos com 1 μg de Hin47purificadò ou análogo. A sangria final deamostras de soro de camundongo do estudo deimunogenicidade comparativo (como descrito acima)foi agrupada e estada em EIAs. Anticorpos IgG1,IgG2a, IgG2b anti-camundongo de rato, conjugados comperoxidase de rábano silvestre e IgG3 anti-camundongo de coelho conjugado com peroxidase derábano silvestre foram utilizados como reagentesem E IAs. A diluição de elaboração de cadaconjugado foi determinada utilizando subclasses deanticorpo purificado para evitar reatividadetransversal. Os títulos reativos foramdeterminados como descrito acima. Como mostradona Tabela 1 abaixo, o perfil de subclasse IgGinduzido em camundongos por Hin47 ou análogo Hin47eram idênticos, independente de se Hin47 ouanálogo foi utilizado como um antígéno sólido nosEIAs. A resposta IgG predominante nos dois gruposde soro de camundongo foi do isótipo IgG1.Conseqüentemente, o análogo Hin47 apresentousubstancialmente as mesmas propriedadesimunogênicas que a proteína natural.

Exemplo 11

Este Exemplo ilustra as propriedadesimunoprotetoras de Hin47 e análogo Hin47 Ser-197 -»alanina.

As propriedades imunoprotetoras de Hin47 eanálogo Hin47 Ser-197 ->■ alanina foram analisadaspela capacidade de antisoro específico de Hin47proteger ratos filhotes contra cepa H. influenzaedo tipo B MinnA em um modelo de bacteremia. Osresultados deste estudo são mostrados na Tabela 2abaixo. Os grupos de nove ratos filhotes Wistarcom 6 dias de idade foram inoculadossubcutaneamente (s.c.) no dòrso próximo ao pescoçocom 0,1 mL de um antisoro análogo anti-Hin47 decoelho ou o soro pré-sangria correspondente.

Vinte e quatro horas após, os animais foramatacados intraperitoneamente (i.p.) com 700 cfu decepa Hib recentemente cultivada MinnA. Asamostras de sangue foram coletadas 20 horas pós-ataque e revestidas sobre placas de ágar dechocolate. As colônias bacterianas foram contadasapós 24 horas. Como mostrado na Tabela 2, trêsdentre nove animais no grupo inoculado comantisoro de análogo anti-Hin47 não mostraramqualquer bacteremia em seu sangue. Apenas umcamundongo no grupo inoculado com antisoro análogoanti-Hin47 (11%) tinha uma recuperação de bactériamais elevada da amostra de sangue em comparaçãocom camundongos inoculados com soro pré-sangria.Em contraste, as bactérias foram recuperadas detodos os nove camundongos inoculados com soro pré-sangria. Quatro dentre nove animais (44%) nogrupo inoculado com soro de pré-sangria mostraramníveis elevados (500 a 1.000) de bactériarecuperada em amostras de sangue.

O modelo de bacteremia, de rato filhote ,foi utilizado para avaliar a proteçãoproporcionada por anti-Hin47 ou antisoro mutanteanti-Hin47 contra bacteremia ocasionada porinfecção H. influenzae do tipo b. 6/10 ratosfilhotes foram protegidos por antisoro criadocontra cada um dentre Hin47 do tipo selvagem,Hin47 H91A, e análogos Hin47 S197A.

Exemplo 12

Este exemplo ilustra a indução de Hin47 sobcondições de tensão.

A cepa H. influenzae Eagan foi cultivada a37°C para um A590 « 0,3 em um caldo de infusãocérebro coração (BHI) contendo hemin (2μg ml~l) eNAD (2μg ml"l) . A amostra foi formada em alíquotase cultivada a 37°C, 42°C, 43,5°C, ou na presençade etanol a 6%, 0,2 M NaCl, ou 0,3 M NaCl. A cepaE. coli JM109 foi cultivada a 37°C para um A590 « 0,3em meio YT e formada em alíquotas como descrito.As amostras foram coletadas a 0 min, 20 min, 40min, 60 min, e 90 min e analisadas por OD e manchaWestern/SDS PAGE. O antisoro de porquinho daíndia que reconheceu hin47 H. influenzae e htrAE. coli foi utilizado para análise de manchaWestern. A proteína htrA E.coli foi produzida em.grandes quantidades quando o organismo foicultivado a 43,50C e uma pequena quantidade daproteína Hin47 H. influenzae pode ser observada.Com crescimento em meio contendo etanol a 6%,ambas htrA E.coli e proteínas Hin47 H.influenzaesão induzidas. As condições de elevado teor desal foram insuficientes para induzir qualquerproteína. Estes resultados indicam que Hin47 éuma proteína de resposta a tensão em H. influenzaeinduzível sob condições similares à proteína htrAE.coli.

Exemplo 13

Este Exemplo ilustra a purificação daproteína Hin47 H91A.

O mutante H91A solúvel foi, purificadoessencialmente como descrito para o Hin47 do tiposelvagem no Exemplo 7, com a adição de uma colunade hidroxilapatite (HAP). A coluna HAP foi -equilibrada em tampão de fosfato de sódio 10 mM(pH 8,0) e a passagem através da coluna DEAE foicarregada. 0 hin47 H91A ligado à coluna HAP eproteínas contaminadoras foram removidas porlavagem da coluna com tampão de fosfato de sódio175 mM. A proteína Hin47 H91A foi eluída com300mM de tampão de fosfato de sódio (pH 8,0) earmazenada a -20°C.

Exemplo 14

Este Exemplo ilustra os estudos de proteçãocom Hin47 e mutantes Hin47 no modelo de otitemédia, de chinchila.

O modelo de otite média, de chinchila (ref.14) foi utilizado para avaliar a. proteção induzidapor imunização ativa com Hin47 do tipo selvagem,Hin47 H91A, ou Hin47 S197A.

Chinchilas (-500 g em peso) foramimunizadas i.m. três vezes com 30ng/dose de Hin47ou mutante Hin47 (H91A ou S197A) feito adjuvanteem AIP04, nos dias 1, 28 e 42. Os animais foramatacados no dia 56, através da bolha, com 50-1000cfu de organismos de cepa NTHi virulento SB12. Osanimais foram monitorados por timpanometria eexame otoscópico e nos 4 dias após ataque, fluidosde ouvido médio foram aspirados e revestidos emagar de chocolate. Colônias bacterianas foramcontadas após 24h. As proteínas Hin47 do tiposelvagem e Hin47 H91A proporcionaram proteção a-50% dos animais, porém o Hin47 S197A era nãoprotetor neste modelo (Tabela 3).

Sumário da Revelação

Em resumo desta revelação, a presente,invenção fornece análogos novos de proteína Hin47Haemophilus influenzae que têm uma atividade deprotease reduzida menor do que aproximadamente 10%daquela da proteína Hin47 natural bem comomoléculas de DNA isoladas e purificadascodificando a mesma. As modificações sãopossíveis compreendidas no escopo da presenteinvenção.Tabela 1

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Grupo #1: Soros imunes foram agrupados emum grupo de cinco camundongos que receberamimunização Hin47.

Grupo #2: soros imunes foram agrupados deum grupo de cinco camundongos que receberamimunização mutante Hin47.As placas foram revestidas com Hin47 ouproteína mutante.

Tabela 2

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Os grupos de nove ratos filhotes com 6 diasde idade foram imunizados s.c. com um antisoromutante anti-Hin47 de coelho ou o soro de pré-sangria correspondente. Os animais foram atacadosi.p. com 700 cpu cepa H. influenzae MinnA após 24horas. As amostras de sangue foram tiradas a 20horas após o ataque.

Anticorpo anti-Hin47*: soro imune de coelhocriado contra mutante Hin47 purificado em CFA/IFA.

Recuperação média de bactérias do grupoimunizado: 100 cfu por 2,5 uL de sangue; do grupode controle: 290 cfu por 2,5 uL de sangue.<table>table see original document page 69</column></row><table>aA atividade de protease é medida pelacapacidade de digerir o substrato β-caseína.

b A solubilidade indica a produção como umaproteína solúvel (+) ou corpos de inclusão (-).

c Proteína no modelo passivo de bacteremia,de ratos filhotes.

d Proteção no modelo de otite média, dechinchila.

e ND é não determinadoLista de Referência

1. Zangwill e outros, 1993 MMWR 42:1-15.

2. Schoendorf e outros, 1994 Pediatrics93:663-8.

3. Brenner e outros, 1988 Nature 334:528-530.

4. 0' Hagan, 1992 Clin. Pharmokinet. 22:1-10.

5. Ulmer e outros, 1993 Curr. Opinion.Invest. Drugs 2:983-989.

6. Chang e outros, 1978 Nature 275:617.

7. Goeddel e outros 1980 Nucl. Acid. Rés.8:4057.

8. Harkenss e outros, 1992 J. Bacteriol.174 :2425-2430.

9. Loeb e outros, 1987 Infee. Immun.55:2612-2618.

10. Holmes e Quigley 1981. Analyt.Bioehem. 114:193-197.

11. Young e Davis 1985 Gene 38:31-38.

12. Panezutti e outros, 1993 Infee. Immun.61:1867-72.

13. Lipinska e outros, 1985 Baeteriol.171:1574-1584.14. Barenkamp e outros, 1986 Infect. Itnmun.52:572-578.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 23

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 28 94 pares de base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: úllico

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico)

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:1:

GGATCCGTTA ATACTGAAAT AAATGGCACA CCTTTTTCAC GCATTTGGGC AAGTACAGCA 60

CTGGTTTTTG CCATTTGCAT TAAAGAGAAT AATGCTTCCT GCATACGAGC ACCACCACTC 120

GCAGAGAAAC ATACAAACGG ACAATTCATT TCCATCGCTT TTTCAGCCGC TTTAACAAAT 180

TTTGCACCAA CTACAGAACC CATTGAACCG CCCATAAAAG CAAAGTTCGA TGCAGCCACA 240

ACAATTGGCA TATCATAAAG TGTACCTGTC ATAGTAATTA GCGCATCTTT CTCGCCCGTT 300

TCTTTTTGTG CCGCATTGAT ACGATCTTTA TATTTCTTTA AATCTTTAAA TTTTAAAATA 360

TCTTTTGGTT CTAAATCTGC CGCAATTTCT TGGCTTGAAT CTTCGTCCAA TAAATTTAAT 420

AAACGCTCAC GAGCATCAAT ACGCATATGA TGACCACATT TCGGGCAAAC ATACAGATTA 480

CGTTTGAGTT CTTCACTATA AAGTACTTGT TCACAAGCAG TACATTTTGT CCATACGCCT 540

TCTGGCACAT TGGCTTTTCG AGTGGAAGAA GAAGGACTTT TACTAAAAAT TCGGTTAATC 600

CAGCTCATTT TTTGACCTTT TTATTGACTA GAAAATTGCG CGTATTAGAA CATAAATTTA 660

TAGAATTTGC TACTTGTAAG ACCGTTTTTG TACTGCTCCG ATTTCCTTTT AAACAAGATA 720

ATTTGCTCTC CTCTTATTGA ACATTTTTTT TATTTTTTTG TCTTACTGAC CACGTTATCT 780

GAAATTTATT TTGGAGTATT TATGAAAAAA ACACGTTTTG TACTAAATAG TATTGCACTT 840

GGATTAAGTG TATTAAGCAC ATCATTTGTT GCTCAAGCCA CTTTGCCAAG TTTTGTTTCG 900

GAACAAAACA GTCTTGCACC AATGTTAGAA AAAGTACAAC CTGCCGTTGT CACTCTTTCC 960

GTTGAAGGAA AAGCTAAAGT AGATTCTCGT TCTCCTTTCC TAGACGATAT TCCTGAAGAA 1020

TTTAAATTCT TCTTTGGCGA TCGTTTTGCC GAACAATTTG GTGGACGTGG AGAATCAAAG 1080

CGTAACTTCC GTGGTTTAGG TTCTGGTGTC ATTATTAATG CAAGCAAAGG CTATGTTTTA 1140ACCAATAATC ATGTTATTGA TGAAGCTGAT AAAATTACCG TGCAATTACA AGATGGGCGT 1200

GAATTTAAAG CAAAATTAGT GGGTAAAGAT GAACTATCAG ATATTGCATT AGTACAGCTT 1260

GAAAAACCAA GTAATTTAAC AGAAATCAAA TTTGCTGATT CCGACAAATT ACGCGTAGGC 1320

GATTTCACTG TTGCAATCGG TAATCCATTT GGTTTAGGTC AAACTGTGAC ATCAGGTATT 1380

GTTTCTGCAT TGGGTCGTTC AACAGGTTCT GACAGTGGCA CTTATGAAAA CTATATTCAA 1440

ACCGATGCAG CAGTAAACCG CGGTAATTCG GGTGGAGCGT TAGTAAACTT AAATGGCGAA 1500

CTTATTGGAA TTAATACCGC AATTATTTCT CCAAGCGGTG GCAATGCAGG AATTGCCTTT 1560

GCGATTCCAA GTAATCAAGC AAGCAATTTA GTGCAACAAA TTTTAGAATT TGGTCAAGTG 1620

CGTCGCGGAT TGCTTGGTAT TAAAGGTGGC GAACTCAATG CTGATTTAGC CAAAGCCTTT 1680

AATGTAAGCG CGCAACAAGG CGCATTTGTA AGTGAAGTTT TACCGAAATC TGCTGCTGAA 1740

AAAGCAGGAC TTAAAGCGGG CGATATTATC ACGGCGATGA ACGGTCAAAA AATCTCAAGT 1800

TTCGCTGAAA TTCGTGCAAA AATCGCAACC ACTGGTGCAG GCAAAGAGAT TAGCTTGACT 1860

TACTTACGTG ATGGCAAATC CCACGACGTT AAAATGAAAT TACAAGCGGA TGATAGTAGC 1920

CAACTTTCCT CAAAAACTGA GTTGCCTGCA TTAGATGGTG CAACATTGAA AGACTACGAT 1980

GCTAAAGGCG TTAAAGGAAT TGAAATCACA AAAATTCAAC CTAATTCGCT GGCTGCACAA 2040

CGTGGTTTAA AATCGGGCGA TATTATTATT GGTATTAATC GTCAAATGAT CGAAAACATT 2100

CGTGAATTAA ATAAAGTGCT TGAAACTGAA CCGTCAGCAG TTGCACTTAA TATTTTACGA 2160

GGTGACAGTA ATTTCTATTT ATTAGTGCAA TAATCTGCTT GATATATTTA AGAAAAAAGT 2220

CCGATCACAA TGATCGGGCT TCTTTTTATG CAGCAATCGT TCTTAACAAA TCCACCACAA 2280

ATTCTAACCG CACTTTGTTA TCAGATAAAT CTTTCATGAA CTTAAATTTT AATGGGCCAT 2340

CAAATCGATA CACAATAGGT TCTTTTTGAA TTAATTGAAT AAATTTATCT GGATTCACTT 2400

GTGCTTTTGC TGAAAACTCA ATAAAACCGC CTTGTGTTCC TGCATCAATT CGCACAACTT 2460

TCAACGGCTC AACCAACAAA CGCAATTCTG CAATTTGCAG TAAATTTTTT GTTGCATCAG 2520

GCAATAATCC GAATCGATCT ATTAACTCAA CTTTTAATTC ATCTAATTCT GCTTTACTCT 2580

CTGCTGCAGC AATGCGTTTA TAAAAGGATA AACGCATATT CACGTCTCCT AGATAATCAT 2640

CAGGCAGTAA AGCAGGCACA CGCAATTCAA TATCCGCTTG TTGTTGCGTC AATTCTTCTA 2700

ATGATGGTTC ACGCCCTTCT TTTAACGCTT TAACCGCTGC ATCCAATAAT TCCATATAAA 2760

GCGAAAAACC GATGCTTTCA ATTTGTCCAC TTTGTTCGTT TCCAAGTAAT TCGCCGGCAC 2820CACGAATCTC TAAATCGTGG GTTGCCAAGA TAAAACCAGC CCCAAGATTA TCAAGATTTT 2 88 0CCAAGGCATC TAGA 2 8 94

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 463 aminoãcidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Lys Lys Thr Arg Phe Val Leu Asn Ser Ile Ala Leu Gly Leu Ser1 5 10 15

Val Leu Ser Thr Ser Phe Val Ala Gln Ala Thr Leu Pro Ser Phe Val20 25 30

Ser Glu Gln Asn Ser Leu Ala Pro Met Leu Glu Lys Val Gln Pro Ala35 40 45

Val Val50

Pro Phe65

Arg Phe

Arg Gly

Leu Thr

Leu Gln130

Leu Ser145

Glu Ile

Val Ala

Ile Val

Glu Asn210

Thr Leu

Leu Asp

Ala Glu

Leu Gly100

Asn Asn115

Asp Gly

Asp Ile

Lys Phe

Ile Gly180

Ser Ala

195 Vf

Tyr Ile

Ser Val

Asp Ile70

Gln Phe85

Ser Gly

His Val

Arg Glu

Ala Leu150

Ala Asp165

Asn ProLeu GlyGln Thr

Glu Gly55

Pro Glu

Gly Gly

Val Ile

Ile Asp120

Phe Lys135

Val Gln

Ser Asp

Phe Gly

Arg Ser200

Asp Ala

215 ),

Lys Ala

Glu Phe

Arg Gly90

Ile Asn105

Glu Ala

Ala Lys

Leu Glu

Lys Leu170

Leu Gly185

Thr GlyAla Val

Lys Val60

Lys Phe75

Glu Ser

Ala Ser

Asp Lys

Leu Val140

Lys Pro155

Arg Val

Gln Thr

Ser Asp

Asn Arg220

Asp Ser

Phe Phe

Lys Arg

Lys Gly110

Ile Thr125 '

Gly Lys

Ser Asn

Gly Asp

Val Thr190

Ser Gly205

Gly Asn

Arg Ser

Gly Asp80

Asn Phe95

Tyr Val

Val Gln

Asp Glu

Leu Thr160

Phe Thr175

Ser GlyThr TyrSer GlyGly Ala Leu Val Asn Leu Asn Gly Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala225 230 235 240

Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Ala Gly Ile Ala Phe Ala Ile Pro245 250 255

Ser Asn Gln Ala Ser Asn Leu Val Gln Gln Ile Leu Glu Phe Gly Gln260 265 270

Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Ile Lys Gly Gly Glu Leu Asn Ala Asp275 280 285

Leu Ala Lys Ala Phe Asn Val Ser Ala Gln Gln Gly Ala Phe Val Ser290 295 300

Glu Val Leu Pro Lys Ser Ala Ala Glu Lys Ala Gly Leu Lys Ala Gly305 310 315 320

Asp Ile Ile Thr Ala Met Asn Gly Gln Lys Ile Ser Ser Phe Ala Glu325 330 335

Ile Arg Ala Lys Ile Ala Thr Thr Gly Ala Gly Lys Glu Ile Ser Leu340 345 350

Thr Tyr Leu Arg Asp Gly Lys Ser His Asp Val Lys Met Lys Leu Gln355 360 365

Ala Asp Asp Seir Ser- Gln Leu Seir Seir Lys Thir Glu. Leu Puro Ais. Leu370 375 380

Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asp Tyr Asp Ala Lys Gly Val Lys Gly Ile385 390 395 400

Glu Ile Thr Lys Ile Gln Pro Asn Ser Leu Ala Ala Gln Arg Gly Leu405 410 415

Lys Ser Gly Asp Ile Ile Ile Gly Ile Asn Arg Gln Met Ile Glu Asn420 425 430

Ile Arg Glu Leu Asn Lys Val Leu Glu Thr Glu Pro Ser Ala Val Ala435 440 445

Leu Asn Ile Leu Arg Gly Asp Ser Asn Phe Tyr Leu Leu Val Gln450 455 460

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 41 pares de base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:3:ATGAAAAAAA CACGTTTTGT ATTAAATAGT ATTGCACTTG G

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 37 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: Único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Met Lys Lys Thr Arg Phe Val Leu1 5

Val Leu Ser Thr Ser Phe Val Ala20

Ser Glu Gln Asn Ser35

Asn Ser Ile Ala Leu Gly Leu Ser

10 15

Gln Ala Thr Leu Pro Ser Phe Val25 30

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 472 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: Único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Met Lys Lys Thr Thr Leu Ala Leu Ser Arg Leu Ala Leu Ser Leu Ser1 5 10 15

Leu Ala Leu Ser Pro Leu Ser Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ser Ala20 25 30

Thr Thr Ala Gln Gln Met Pro Ser Leu Ala Pro Met Leu Glu Lys Val35 40 45

Met Pro Ser Val Val Ser Ile Asn Val Glu Gly Ser Thr Thr Val Asn50 55 60

Thr Pro Arg Met Pro Arg Asn Phe Gln Gln Phe Phe Gly Asp Asp Ser65 70 75 80

Pro Phe Cys Gln Glu Gly Ser Pro Phe Gln Ser Ser Pro Phe Cys Gln85 90 95

Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gln Gln Gln Lys Phe Met Ala100 105 110

Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile Asp Ala Asp Lys Gly Tyr Val Val Thr115 120 125

Asn Asn His Val Val Asp Asn Ala Thr Val Ile Lys Val Gln Leu Ser130 135 140Asp Gly Arg Lys Phe Asp Ala Lys Met Val Gly Lys Asp Pro Arg Ser145 150 155 160

Asp Ile Ala Leu Ile Gln Ile Gln Asn Pro Lys Asn Leu Thr Ala Ile

165 170 175

Lys Met Ala Asp Ser Asp Ala Leu Arg Val Gly Asp Tyr Thr Val Gly180 185 190

Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu Gly Glu Thr Val Thr Ser Gly Ile Val195 200 205

Ser Ala Leu Gly Arg Ser Gly Leu Asn Ala Glu Asn Tyr Glu Asn Phe210 215 220

Ile Gln Thr Asp Ala Ala Ile Asn Arg Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu225 230 235 240

Val Asn Leu Asn Gly Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Leu Ala245 250 255

Pro Asp Gly Gly Asn Ile Gly Ile Gly Phe Ala Ile Pro Ser Asn Met260 265 270

Val Lys Asn Leu Thr Ser Gln Met Val Glu Tyr Gly Gln Val Lys Arg275 280 285

Gly Glu Leu Gly Ile Met Gly Thr Glu Leu Asn Ser Glu Leu Ala Lys290 295 300

Ala Met Lys Val Asp Ala Gln Arg Gly Ala Phe Val Ser Gln Val Leu305 .310 315 320

Pro Asn Ser Ser Ala Ala Lys Ala Gly Ile Lys Ala Gly Asp Val Ile325 330 335

Thr Ser Leu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Ser Phe Ala Ala Leu Arg Ala340 345 350

Gln Val Gly Thr Met Pro Val Gly Ser Lys Leu Thr Leu Gly Leu Leu355 360 365

Arg Asp Gly Lys Gln Val Asn Val Asn Leu Glu Leu Gln Gln Ser Ser370 375 380

Gln Asn Gln Val Asp Ser Ser Ser Ile Phe Asn Gly Ile Glu Gly Ala385 390 395 400

Glu Met Ser Asn Lys Gly Lys Asp Gln Gly Val Val Val Asn Asn Val405 410 415

Lys Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gln Ile Gly Leu Lys Lys Gly Asp Val420 425 430

Ile Ile Gly Ala Asn Gln Ile Ala Val Lys Asn Ile Ala Glu Ile Arg435 440 445Lys Val Leu Asp Ser Lys Pro Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Gln Arg450 455 460

Gly Asp Arg His Leu Pro Val Asn465 470

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 475 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Met Lys Lys Thr Thr Leu Ala Met Ser Ala Leu Ala Leu Ser Leu Gly1 5 10 15

Leu Ala Leu Ser Pro Leu Ser Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ser Ser20 25 30

Ala Met Thr Ala Gln Gln Met Pro Ser Leu Ala Pro Met Leu Glu Lys35 40 45

Val Met Pro Ser Val Val Ser Ile Asn Val Glu Gly Ser Thr Thr Val50 55 60

Asn Thr Pro Arg Met Pro Arg Asn Phe Gln Gln Phe Phe Gly Asp Asp65 70 75 80

Ser Pro Phe Cys Gln Asp Gly Ser Pro Phe Gln Asn Ser Pro Phe Cys85 90 95

Gln Gly Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Gln Gln Gln Lys Phe Met100 105 110

Ala Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile Asp Ala Asp Lys Gly Tyr Val Val115 120 125

Thr Asn Asn His Val Val Asp Asn Ala Ser Val Ile Lys Val Gln Leu130 135 140

Ser Asp Gly Arg Lys Phe Asp Ala Lys Val Val Gly Lys Asp Pro Arg145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Leu Ile Gln Ile Gln Asn Pro Lys Asn Leu Thr Ala165 170 175

Ile Lys Leu Ala Asp Ser Asp Ala Leu Arg Val Gly Asp Tyr Thr Val180 185 190

Ala Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu Gly Glu Thr Val Thr Ser Gly Ile195 200 205

Val Ser Ala Leu Gly Arg Ser Gly Leu Asn Val Glu Asn Tyr Glu Asn210 215 220Phe Ile225

Leu Val

Ala Pro

Met Val

Arg Gly290

Lys Ala305

Met Pro

Ile Thr

Ala Gln

Leu Arg370

Ser Gln385

Ala GluVal LysVal Ile

Gln Thr

Asn Leu

Asp Gly260

Lys Asn275

Glu Leu

Met Lys

Asn Ser

Ser Leu34

Val Gly355

Glu Gly

Ser Gln

Met Ser

Ala Asn420

Ile Gly435

Asp Ala230

Asn Gly245

Gly Asn

Leu Thr

Gly Ile

Val Asp310

Ser Ala325

Asn Gly

ι

Thr Met

Lys Ala

Val Asp.390

Asn Lys405

Ser Pro

Ala Asn

Ala Ile

Glu Leu

Ile Gly

Ser Gln280

Met Gly295

Ala Gln

Ala Lys

Lys Pro

Pro Val360

Ile Thr375

Ser Ser

Gly Gln

Ala Ala

Gln Ile440

Asn Arg

Ile Gly250

Ile Gly265

Met Val

Thr Glu

Arg Gly

Ala Gly330

Ile Ser345

Gly Ser

Val Asn

Thr Ile

Asp Lys410

Gln Ile425

Pro Val

Gly Asn235

Ile Asn

Phe Ala

Glu Tyr

Leu Asn300

Ala Phe315

Ile Lys

Ser Phe

Lys Ile

Leu Glu380

Phe Ser395

Gly ValGly LeuLys Asn

Ser Gly

Thr Ala

Ile Pro270

Gly Gln285

Ser Glu

Val Ser

Ala Gly

Ala Ala350

Ser Leu365

Leu Gln

Gly Ile

Val Val

Lys Lys430

Ile Ala445

Gly Ala240

Ile Leu255

Ser Asn

Val Arg

Leu Ala

Gln Val320

Asp Val335

Leu Arg

Gly Leu

Gln Ser

Glu Gly400

Ser Ser415

Gly AspGlu Ile

Arg Lys Ile Leu Asp Ser Lys Pro Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Gln450 455 460

Arg Gly Asp Ser Ser Ile Tyr Leu Leu Met Gln465 470 475

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 22 8 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Ile Val Gly Gly Tyr Lys Cys Glu Lys Asn Ser Gln Pro Trp Gln Val15 10 15

Ala Val Ile Asn Glu Tyr Leu Cys Gly Gly Val Leu Ile Asp Pro Ser20 25 30

Trp Val Ile Thr Alá Ala His Cys Tyr Ser Asn Asn Tyr Gln Val Leu35 40 45

Leu Gly Arg Asn Asn Leu Phe Lys Asp Glu Pro Phe Ala Gln Arg Arg50 55 60

Leu Val Pro Gln Ser Phe Arg His Pro Asp Tyr Ile Pro Leu Ile Pro65 70 75 80

Val His Asp His Ser Asn Asp Leu Met Leu Leu His Leu Ser Glu Pro85 90 95

Ala Asp Ile Thr Gly Gly Val Lys Val Ile Asp Leu Pro Thr Lys Glu100 105 110

Pro Lys Val Gly Ser Thr Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Thr Asn115 120 125

Pro Ser Glu Met Val Val Ser His Asp Leu Gln Cys Val Asn Ile His130 135 140

Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Ile Glu Thr Tyr Lys Asp Asn Val Thr145 150 155 160

Asp Val Met Leu Cys Ala Gly Glu Met Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys165 170 175

Ala Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly180 185 190

Ile Thr Ser Gly Gly Ala Thr Pro' Cys Ala Lys Pro Lys Thr Pro Ala195 200 205

Ile Tyr Ala Lys Leu Ile Lys Phe Thr Ser Trp Ile Lys Lys Val Met210 215 220

Lys Glu Asn Prb225

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 232 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:8:

Ile Ile Gly Gly Arg Glu Cys Glu Lys Asn Ser His Pro Trp Gln Val1 5 10 15

Ala Ile Tyr His Tyr Ser Ser Phe Gln Cys Gly Gly Val Leu Val Asn20 25 30

Pro Lys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Asn Asp Asn Tyr Glu35 40 45

Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Asn Glu Asn Thr Ala Gln50 55 60

Phe Phe Gly Val Thr Ala Asp Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Leu Ser65 70 75 80

Ala Asp Gly Lys Asp Tyr Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Léu Gln85 90 95

Ser Pro Ala Lys Ile Thr Asp Ala Val Lys Val Leu Glu Leu Pro Thr100 105 110

Gln Glu Pro Glu Leu Gly Ser Thr Cys Glu Ala Ser Gly Trp Gly Ser115 120 125

Ile Glu Pro Gly Pro Asp Asp Phe Glu. Phe Pro Asp Glu Ile Gln Cys130 135 140

Val Gln Leu Thr Leu Leu Gln Asn Thr Phe Cys Ala Asp Ala His Pro145 .150 155 160

Asp Lys Val Thr Glu Ser Met Leu Cys Ala Gly Tyr Leu Pro Gly Gly165 170 175

Lys Asp Thr Cys Met Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly180 185 190

Met Trp Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly His Thr Pro Cys Gly Ser Ala195 200 205

Asn Lys Pro Ser Ile Tyr Thr Lys Leu Ile Phe Tyr Leu Asp Trp Ile210 215 220

Asp Asp Thr Ile Thr Glu Asn Pro225 230

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 223 aminoácidos

(B) TIPO: aminoãcido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: Único

(D) TOPOLOGIA: linear(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val35 40 45

Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe50 55 60

Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr65 70 75 80

Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala100 105 110

Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly115 120 125

Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met145 150 155 160

Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser180 185 190

Trp Gly Ser Gly Cys. Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn210 215 220

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 22 8 aminoãcidos

(B) TIPO: aminoãcido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Ile Val Asn Gly Glu Glu Ala Val Pro Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val1 5 10 15Ser Leu Gln Asp Lys Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile20 25 30

Asn Glu Asn Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Thr Thr Ser35 40 45

Asp Val Val Val Ala Gly Glu Phe Asp Gln Gly Ser Ser Ser Glu Lys50 55 60

Ile Gln Lys Leu Lys Ile Ala Lys Val Phe Lys Asn Ser Lys Tyr Asn65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Asn Asn Asp Ile Thr Leu Leu Lys Leu Ser Thr Ala85 90 95

Ala Ser Phe Ser Gln Thr Val Ser Ala Val Cys Leu Pro Ser Ala Ser100 105 110

Asp Asp Phe Ala Ala Gly Thr Thr Cys Val Thr Thr Gly Trp Gly Leu115 120 125

Thr Arg Tyr Ala Asn Thr Pro Asp Arg Leu Gln Gln Ala Ser Leu Pro130 135 140

Leu Leu Ser Asn Thr Asn Cys Lys Lys Tyr Trp Gly Thr Lys Ile Lys145 150 155 160

Asp Ala Met Ile Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ser Cys Met Gly165 170 175

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Lys Asn Gly Ala Trp Thr Leu180 185 190

Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Ser Thr Cys Ser Thr Ser Thr Pro195 200 205

Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Ala Leu Val Asn Trp Val Gln Gln Thr210 215 220

Leu Ala Ala Asn225

(2) INFORMAÇÃO' PARA SEQ ID NO:11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 0 aminoãcidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:11:

Val Val Gly Gly Thr Glu Ala Gln Arg Asn Ser Trp Pro Ser Gln Ile1 5 10 15Ser Leu Gln Tyr Arg Ser Gly Ser Ser Trp Ala His Thr Cys Gly Gly20 25 30

Thr Leu Ile Arg Gln Asn Trp Val Met Thr Ala Ala His Cys Val Asp35 40 45

Arg Glu Leu Thr Phe Arg Val Val Val Gly Glu His Asn Leu Asn Gln50 55 60

Asn Asn Gly Thr Glu Gln Tyr Val Gly Val Gln Lys Ile Val Val His65 70 75 80

Pro Tyr Trp Asn Thr Asp Asp Val Ala Ala Gly Tyr Asp Ile Ala Leu85 90 95

Leu Arg Leu Ala Gln Ser Vai. Thr Leu Asn Ser Tyr Val Gln Leu Gly100 105 110

Val Leu Pro Arg Ala Gly Thr Ile Leu Ala Asn Asn Ser Pro Cys Tyr115 120 125

Ile Thr Gly Trp Gly Leu Thr Arg Thr Asn Gly Gln Leu Ala Gln Thr130 135 140

Leu Gln Gln Ala Tyr Leu Pro Thr Val Asp Tyr Ala Ile Cys Ser Ser145 150 155 160

Ser Ser Tyr Trp Gly Ser Thr Val Lys Asn Ser Met Val Cys Ala Gly165 170 175

Gly Asp Gly Val Arg Ser Gly Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu180 185 190

His Cys Leu Val Asn Gly Gln Tyr Ala Val His Gly Val Thr Ser Phe195 200 205

Val Ser Arg Leu Gly Cys Asn Val Thr Arg Lys Pro Thr Val Phe Thr210 215 220

Arg Val Ser Ala Tyr Ile Ser Trp Ile Asn Asn Val Ile Ala Ser Asn225 230 235 240

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 224 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Ile Ile Gly Gly Val Glu Ser Ile Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala1 5 10 15

His Leu Asp Ile Val Thr Glu Lys Gly Leu Arg Val Ile Cys Gly Gly20 25 30Phe Leu Ile35

Ser Arg Gln Phe Val Leu40

Thr Ala Ala His Cys Lys Gly45

Arg Glu Ile50

Thr Val Ile Leu Gly Ala55

His Asp Val Arg Lys Arg Glu60

Ser Thr Gln65

Gln Lys Ile Lys Val Glu70

Lys Gln Ile Ile His Glu Ser75 80

Tyr Asn SerLys Lys Val

Val Pro85

Glu Leu100

Asn Leu His Asp

Thr Pro Ala Val105

Ile Met Leu Leu Lys Leu Glu90 95

Asn Val Val Pro Leu Pro Ser110

Pro Ser Asp Phe Ile His Pro Gly Ala115 120

Met Cys Trp Ala Ala Gly Trp125

Gly Lys Thr130

Gly Val Arg Asp Pro Thr135

Ser Tyr Thr Leu Arg Glu Val140

Glu Leu Arg145

Ile Met Asp Glu Lys Ala150

Cys Val Asp Tyr Arg Tyr Tyr155 160

Glu Tyr Lys

Phe Gln165

Val Cys Val Gly

Ser Pro Thr Thr Leu Arg Ala170 175

Ala Phe Met

Gly Asp Ser Gly Gly Pro180 185

Leu Leu Cys Ala Gly Val Ala190

His Gly Ile195

Val Ser Tyr Gly His Pro200

Asp Ala Lys Pro Pro Ala Ile205

Phe Thr Arg210

Val Ser Thr Tyr Val Pro215

Trp Ile Asn Ala Val Ile Asn220

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 223 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:13:

Val Val Gly Gly Thr Arg Ala Ala Gln Gly Glu Phe Pro Phe Met Val15 10 15

Arg Leu Ser Met Gly Cys Gly Gly Ala Leu Tyr Ala Gln Asp Ile Val20 25 30

Leu Thr Ala Ala His Cys Val Ser Gly Ser Gly Asn Asn Thr Ser Ile35 40 45Thr Ala Thr Gly Gly Val Val Asp Leu Gln Ser Gly Ala Ala Val Lys50 55 60

Val Arg Ser Thr Lys Val Leu Gln Ala Pro Gly Tyr Asn Gly Thr Gly65 70 75 80

Lys Asp Trp Ala Leu Ile Lys Leu Ala Gln Pro Ile Asn Gln Pro Thr85 90 95

Leu Lys Ile Ala Thr Thr Thr Ala Tyr Asn Gln Gly Thr Phe Thr Val100 105 110

Ala Gly Trp Gly Ala Asn Arg Glu Gly Gly Ser Gln Gln Arg Tyr Leu115 120 125

Leu Lys Ala Asn Val Pro Phe Val Ser Asp Ala Ala Cys Arg Ser Ala130 135 140

Tyr Gly Asn Glu Leu Val Ala Asn Glu Glu Ile Cys Ala Gly Tyr Pro145 150 155 160

Asp Thr Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met165 170 175

Phe Arg Lys Asp Asn Ala Asp Glu Trp Ile Gln Val Gly Ile Val Ser180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Thr Glu195 200 205

Val Ser Thr Phe Ala Ser Ala Ile Ala Ser Ala Ala Arg Thr Leu210 215 220

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 185 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: Único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:14:

Ile Ser Gly Gly Asp Ala Ile Tyr Ser Ser Thr Gly Arg Cys Ser Leu1 5 10 15

Gly Phe Asn Val Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Leu Thr Ala Gly20 25 30

His Cys Thr Asp Gly Ala Thr Thr Trp Trp Ala Asn Ser Ala Arg Thr35 40 45

Thr Val Leu Gly Thr Thr Ser Gly Ser Ser Phe Pro Asn Asn Asp Tyr50 55 60Gly Ile Val Arg Tyr Thr Asn Thr Thr Ile Pro Lys Asp Gly Thr Val65 70 75 80

Gly Gly Gln Asp Ile Thr Ser Ala Ala Asn Ala Thr Val Gly Met Ala85 90 95

Val Thr Arg Arg Gly Ser Thr Thr Gly Thr His Ser Gly- Ser Val Thr100 105 110

Ala Leu Asn Ala Thr Val Asn Tyr Gly Gly Gly Asp Val Val Tyr Gly115 120 125

Met Ile Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro130 135 140

Leu Tyr Ser Gly Thr Arg Ala Ile Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly145 150 155 160

Asn Cys Ser Ser Gly Gly Thr Thr Phe Phe Gln Pro Val Thr Glu Ala165 170 175

Leu Val Ala Tyr Gly Val Ser Val Tyr180 185

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 181 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Ile Ala Gly Gly Glu Ala Ile Thr Thr Gly Gly Ser Arg Cys Ser Leu1 5 10 15

Gly Phe Asn Val Ser Val Asn Gly Val Ala His Ala Leu Thr Ala Gly20 25 30

His Cys Thr Asn Ile Ser Ala Ser Trp Ser Ile Gly Thr Arg Thr Gly35 40 45

Thr Ser Phe Pro Asn Asn Asp Tyr Gly Ile Ile Arg His Ser Asn Pro50 55 60

Ala Ala Ala Asp Gly Arg Val Tyr Leu Tyr Asn Gly Ser Tyr Gln Asp65 70 75 80

Ile Thr Thr Ala Gly Asn Ala Phe Val Gly Gln Ala Val Gln Arg Ser85 90 95

Gly Ser Thr Thr Gly Leu Arg Ser Gly Ser Val Thr Gly Leu Asn Ala100 105 110Thr Val Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Ile Val Tyr Gly Met Ile Gln Thr115 120 125

Asn Val Cys Ala Gln Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu Phe Ala Gly130 135 140

Ser Thr Ala Leu Gly Leu Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr145 150 155 160

Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Pro Val Thr Glu Ala Leu Ser Ala Tyr165 170 175

Gly Ala Thr Val Leu180

(2) INFORMAÇÃO PARÁ SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 198 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Ala Asn Ile Val Gly Gly Ile Glu Tyr Ser Ile Asn Asn Ala Ser Leu1 5 10 15

Cys Ser Val Gly Phe Ser Val Thr Arg Gly Ala Thr Lys Gly Phe Val20 25 30

Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Asn Ala Thr Ala Arg Ile Gly Gly35 40 45

Ala Val Val Gly Thr Phe Ala Ala Arg Val Phe Pro Gly Asn Asp Arg50 55 60

Ala Trp Val Ser Leu Thr Ser Ala Gln Thr Leu Leu Pro Arg Val Ala65 70 75 80

Asn Gly Ser Ser Phe Val Thr Val Arg Gly Ser Thr Glu Ala Ala Val85 90 95

Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly Arg Thr Thr Gly Tyr Gln Cys Gly100 105 110

Thr Ile Thr Ala Lys His Val Thr Ala Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Val115 120 125

Arg Gly Leu Thr Gln Gly Asn Ala Cys Met Gly Arg Gly Asp Ser Gly130 135 140

Gly Ser Trp Ile Thr Ser Ala Gly Gln Ala Gln Gly Val Met Ser Gly145 150 155 160Gly Asn Val Gln Ser Asn Gly Asn Asn Cys Gly Ile Pro Ala Ser Gln165 170 175

Arg Ser Ser Leu Phe Glu Arg Leu Gln Pro Ile Leu Ser Gln Tyr Gly180 185 190

Leu Ser Leu Val Thr Gly195

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:17:

Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:18:

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Lys1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:19:

Met Lys Lys Thr Arg Phe Val Leu Asn Ser Ile Ala Leu Gly1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 22 pares de base

(B) TIPO: ácido nucléico(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:20:CGCTCCACCA GCATTACCGC GG 22

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: Único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO.-21:ATCAATAACA GCATTATTGG T 21

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de base

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:22:TAATGCAATT GCTGATAGTT C 21

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) QUALIDADE DE SER COMPOSTA DE FILAMENTO: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Lys Phe Phe Phe Gly Asp Arg Phe Ala Glu Gln1 5 10

Claims (15)

1. Proteína mutante isolada e purificada Hin47 deHaemophilus influenzae, caracterizada pelo fato de:(a) possuir uma atividade de protease reduzida que émenor do que 10% daquela da proteína Hin4 7 natural; e(b) pelo menos um aminoácido da proteína Hin47 naturalcontribuindo para atividade de protease ter sido eliminadoou substituído por um aminoácido diferente para produzir areferida atividade de protease reduzida, em que pelo menosum referido aminoácido é selecionado a partir de 195-201,His-91 ou Asp-121 (aminoácidos 221-227, His-117 ou Asp-147da SEQ ID NO: 2) da proteína Hin4 7 natural.

2. Proteína mutante, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que pelo menos um aminoácido daproteína Hin47 natural é Ser-197 (Ser-223 da SEQ ID NO: 2).

3. Proteína mutante, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de Ser-197 (Ser-223 da SEQ ID NO: 2)ser substituído por alanina, cisteína ou treonina.

4. Proteína mutante, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de His-91 (His-117 da SEQ ID NO: 2)ser substituído por alanina, lisina ou arginina.

5. Proteína mutante, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de pelo menos um aminoácido ser Asp-121 (Asp-147 da SEQ ID NO: 2) que é substituído por alanina.

6. Proteína mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato deque His-91 e Ser-197 (His-117 e Ser-223 da SEQ ID NO: 2) ouHis-91, Asp-121 e Ser-197 (His-117, Asp-147 e Ser 223 daSEQ ID NO: 2) são, cada um deles, eliminado ou substituídopor alanina.

7. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fatode compreender um gene hinAl mutante de Haemophilus influenzaecodificador para uma proteína mutante conforme definida emqualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

8. Molécula de ácido nucléico, de acordo com areivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referidogene hin41 mutante possui pelo menos um códon que codificapara um aminoácido que contribui para atividade de proteaseter sido eliminado ou substituído, ou que pelo menos um códontenha sido inserido no gene hin47 tipo selvagem originandoo referido gene hin^l mutante.

9. Molécula de ácido nucléico, de acordo com qualqueruma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de queo gene que sofreu a mutação é formado por mutagênese sítiodirigida de um gene hin41 tipo selvagem.

10. Plasmídeo recombinante, adaptado para transformaçãode um hospedeiro, caracterizado pelo fato de compreender umvetor de plasmídeo no qual foi inserido a molécula de ácidonucléico conforme definida em qualquer uma das reivindicações- 7, 8 ou 9.

11. Plasmídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato do plasmídeo ser DS-1011-1-1(pT7/Hin47*) depositado sob a designação ATCC no. 75845.

12. Célula E. coli transformada, caracterizada pelofato de conter o plasmídeo recombinante conforme definidona reivindicação 10 ou 11.

13. Processo para determinar a presença de anticorpos,especificamente reativos com a proteína Hin47 numa amostra,caracterizado pelo fato de compreender a etapa de:(a) contatar a amostra com o mutante Hin47 conformedefinido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5ou 6 para produzir complexos compreendendo o mutante Hin4 7 equalquer um dos referidos anticorpos presentes na amostraespecificamente reativos com a mesma; e(b) determinar a produção dos complexos.

14. Processo para determinar a presença de proteínaHin4 7 numa amostra, caracterizado pelo fato de compreenderas etapas de:(a) contactar a' amostra com os anticorpos para produzircomplexos compreendendo qualquer proteína Hin47 presente naamostra e nos referidos anticorpos específicos da proteínaHin4 7; e(b) determinar a produção dos complexos.

15. Kit de diagnóstico para determinar a presença deanticorpos numa amostra especificamente reativa com a proteínaHin47, caracterizado pelo fato de compreender:(a) a proteína mutante Hin47 definida em qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6;(b) condições apropriadas para o contato da proteínamutante com a amostra para produzir complexos compreendendoa proteína mutante e quaisquer um dos referidos anticorpospresentes na amostra; e(c) condições apropriadas para determinar a produçãodos complexos.