BR202021013864U2 - ALTERNATING CURRENT ELECTROSTIMULATION METHOD APPLIED TO BIOPROCESSES TO INCREASE AND IMPROVE THE FUNCTIONAL CHARACTERISTICS IN THE PRODUCTION OF BIOACTIVES, ETHANOL AND/OR BEVERAGES - Google Patents

Abstract

A presente invenção trata de um método de produção de etanol e/ou obtenção de produto cervejeiro estimulado por corrente elétrica alternada, ou seja, formas de ondas individuais com características sinusoidais com retificação de meia onda e apresenta baixa intensidade, que invertem periodicamente ã polaridade positiva e negativa, inversão a cada 3 segundos, na fermentação alcoólica por leveduras de Saccharomyces cerevisiae, de forma a aumentar carga microbiana, a produção de etanol e fornecer características próprias ao produto cervejeiro.

The present invention deals with a method of producing ethanol and/or obtaining a brewing product stimulated by alternating electric current, that is, individual waveforms with sinusoidal characteristics with half-wave rectification and low intensity, which periodically reverse to positive polarity. and negative, inversion every 3 seconds, in alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae yeasts, in order to increase microbial load, ethanol production and provide characteristics specific to the brewing product.

Description

MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO POR CORRENTE ALTERNADA APLICADO A BIOPROCESSOS PARA O AUMENTO E MELHORIA DAS CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS DA PRODUÇÃO DE BIOATIVOS, ETANOL E/OU BEBIDASALTERNATING CURRENT ELECTROSTIMULATION METHOD APPLIED TO BIOPROCESSES TO INCREASE AND IMPROVE THE FUNCTIONAL CHARACTERISTICS IN THE PRODUCTION OF BIOACTIVES, ETHANOL AND/OR BEVERAGES Campo da invençãofield of invention

[001] A presente invenção trata de um processo de eletroestimulação do metabolismo microbiano, pela passagem de corrente alternada de baixa amperagem em meio liquido, durante a fermentação por levedura Saccharomyces cerevisiae.[001] The present invention deals with a process of electrostimulation of microbial metabolism, by the passage of alternating current of low amperage in a liquid medium, during fermentation by yeast Saccharomyces cerevisiae.

[002] Mais particularmente a invenção refere-se ao processo de estimulação da Saccharomyces cerevisiae, podendo ser utilizada qualquer cepa, no processo biofermentativo utilizando corrente elétrica alternada na faixa dos microamperes, de forma a otimizar a produção de etanol e produto cervejeiro.[002] More particularly, the invention relates to the process of stimulating Saccharomyces cerevisiae, any strain can be used in the biofermentative process using alternating electric current in the range of microamperes, in order to optimize the production of ethanol and brewing product.

[003] Mais especificamente o processo trata da utilização de formas de ondas individuais com características sinusoidais com retificação de meia onda e apresenta baixa intensidade, que invertem periodicamente à polaridade positiva e negativa, inversão a cada 3 segundos, na fermentação alcoólica por leveduras de Saccharomyces cerevisiae, de forma a aumentar carga microbiana, a produção de etanol e fornecer características próprias ao produto cervejeiro.[003] More specifically, the process deals with the use of individual waveforms with sinusoidal characteristics with half-wave rectification and low intensity, which periodically reverse to positive and negative polarity, inversion every 3 seconds, in alcoholic fermentation by Saccharomyces yeasts cerevisiae, in order to increase microbial load, ethanol production and provide characteristics of the brewing product.

Fundamentos da invençãoFundamentals of the invention

[004] As células vivas desempenham uma ampla gama de processos de natureza eletroquímica, como na geração de ATP, a energia elétrica é armazenada sob a forma de energia química com os elétrons fluindo para o maior potencial. Naturalmente já existe uma relação íntima entre o comportamento eletrônico e as células.[004] Living cells perform a wide range of processes of an electrochemical nature, such as in the generation of ATP, electrical energy is stored in the form of chemical energy with electrons flowing to the highest potential. Of course, there already exists an intimate relationship between electronic behavior and cells.

[005] O estudo da interação de células microbianas com a corrente elétrica, eletromicrobiologia, abrange a otimização de bioprocessos catabólicos e fermentativos. Os fermentativos, no geral, são mantidos para a produção de bioativos de interesse para a indústria farmacêutica, petroquímica, de alimentos, entre outras (XIAO, Y., ZHAO, F., CHENG, H., eds. Electrochemically Active Microorganisms. Lausanne: Frontiers Media. 2018).[005] The study of the interaction of microbial cells with electric current, electromicrobiology, covers the optimization of catabolic and fermentative bioprocesses. Fermentatives, in general, are maintained for the production of bioactives of interest to the pharmaceutical, petrochemical, and food industries, among others (XIAO, Y., ZHAO, F., CHENG, H., eds. Electrochemically Active Microorganisms. Lausanne : Frontiers Media. 2018).

[006] A estimulação por corrente elétrica exógena provoca o aparecimento de um potencial elétrico através da membrana que depende da força do campo externo, forma e raio das células e propriedades específicas das membranas celulares. A modulação do potencial de membrana endógena por um campo externo influencia a estrutura e função das proteínas/bicamada lipídica e vias metabólicas utilizadas (FOLOGEA, D.; VASSU-DIMOV, T.; STICA, I; CSUTAK, O.; RADU, M. Increase of Sacchamoryces cerevisiae plating efficiency after treatment with bipolar eletric pulses. Bioelectrochem. Bioenerg., 46: 285- 287, 1998). Estudos realizados por Binninger et al. (1997) demonstraram que ο número de RNAs mensageiros específicos (mRNAs) se alterou em células da levedura de Saccharomyces cerevisiae, após exposição a um campo magnético (BINNINGER, D.M.; UNGVICHIAN, V. Effects of 60 Hz AC magnetic fields on gene expression following exposure over multiple cell generations using Saccharomyces cerevisiae. Bioelectrochem. Bioenerg., 43: 83-89, 1997).[006] Stimulation by exogenous electrical current causes the appearance of an electrical potential across the membrane that depends on the strength of the external field, shape and radius of cells and specific properties of cell membranes. The modulation of the endogenous membrane potential by an external field influences the structure and function of proteins/lipid bilayer and metabolic pathways used (FOLOGEA, D.; VASSU-DIMOV, T.; STICA, I; CSUTAK, O.; RADU, M Increase of Sacchamoryces cerevisiae plating efficiency after treatment with bipolar electric pulses. Bioelectrochem. Bioenerg., 46: 285-287, 1998). Studies performed by Binninger et al. (1997) demonstrated that the number of specific messenger RNAs (mRNAs) changed in Saccharomyces cerevisiae yeast cells, after exposure to a magnetic field (BINNINGER, D.M.; UNGVICHIAN, V. Effects of 60 Hz AC magnetic fields on gene expression following exposure over multiple cell generations using Saccharomyces cerevisiae. Bioelectrochem. Bioenerg., 43: 83-89, 1997).

[007] Culturas de S. cerevisae respondem a alterações das condições ambientais que estabelecem condições de estresse, como por exemplo: o limite nutricional, temperatura, pH, oxigênio dissolvido, aeração, entre outras. A resposta normalmente se dá de forma sincronizada, em períodos simultâneos com as mudanças no meio, influenciando o tempo de divisão e a transição celular (SATROUTDINOV, A.D.; KURIYAMA, H.; KOBAYASHI, H. Oscillatory metabolism of Saccharomyces cerevisiae in continuous culture. FEMS Microbiol. Lett., 98: 261-268, 1992; HJORTSO, M.A.A.; NIELSEN, J. A conceptual model of autonomous oscillations in microbial cultures. Chem. Engng. Sci., 49(8): 1083- 1095, 1994).[007] Cultures of S. cerevisae respond to changes in environmental conditions that establish stress conditions, such as: nutritional limit, temperature, pH, dissolved oxygen, aeration, among others. The response normally occurs in a synchronized way, in simultaneous periods with changes in the environment, influencing the division time and cell transition (SATROUTDINOV, A.D.; KURIYAMA, H.; KOBAYASHI, H. Oscillatory metabolism of Saccharomyces cerevisiae in continuous culture. FEMS Microbiol. Lett., 98: 261-268, 1992; HJORTSO, M.A.A.; NIELSEN, J. A conceptual model of autonomous oscillations in microbial cultures. Chem. Engng. Sci., 49(8): 1083-1095, 1994) .

[008] O estresse promovido por um campo elétrico, também definido como estresse eletroquímico, apresenta vantagens industriais de não se adicionar produtos químicos e consequentemente eliminação das etapas de separação do produto e tratamento de resíduos. Apresenta a vantagem de uma dinâmica favorável visto não se estabelecerem fenômenos inerciais significativos (SRAVAN, J. S.; BUTTI,S. K.; SARKAR, O.; MOHANS. V. Electrofermentation: Chemicals and Fuels In Microbial electrochemical technology: Sustainable platform for fuels, chemicals and remediation. 2019. ed. MOHAN, S. V.; VARJANI, S.; PANDEY, A. Elsevier. United Kingdom ).[008] The stress promoted by an electric field, also defined as electrochemical stress, has industrial advantages of not adding chemicals and consequently eliminating the steps of product separation and waste treatment. It has the advantage of a favorable dynamics since significant inertial phenomena are not established (SRAVAN, J. S.; BUTTI, S. K.; SARKAR, O.; MOHANS. V. Electrofermentation: Chemicals and Fuels In Microbial electrochemical technology: Sustainable platform for fuels, chemicals and remediation 2019. ed. MOHAN, S. V.; VARJANI, S.; PANDEY, A. Elsevier. United Kingdom ).

[009] Entre os processos que podem ser otimizados pela troca de elétrons, encontram-se os processos eletrofermentativos. Além destes podem ser citados processos de síntese tais como as sínteses de metano e ácidos graxos de cadeias curtas e médias, entre outras moléculas de caráter anfipático (KUMAR, R.; DAS, A. J. Rhamnolipid Biosurfactant: Recent Trends In Production And Application. Springer Nature Singapore Pte Ltd. Singapore, 2018).[009] Among the processes that can be optimized by the exchange of electrons are the electrofermentative processes. In addition to these, synthesis processes can be mentioned, such as the synthesis of methane and short and medium chain fatty acids, among other amphipathic molecules (KUMAR, R.; DAS, A. J. Rhamnolipid Biosurfactant: Recent Trends In Production And Application. Springer Nature Singapore Pte Ltd. Singapore, 2018).

[0010] Os microrganismos representam 85% das referências sobre produção de bioetanol, entre estes, destacam-se os fungos, principalmente quando refere-se a substratos lignocelulósicos. O aumento do rendimento deste processo fermentativo é de suma importância, uma vez que a utilização deste combustível reduz os impactos ambientais, como a geração de residuos e a diminuição da emissão de dióxido de carbono (MASSON, I. S.; COSTA, G. H. G.; ROVIERO, J. P.; FREITA, L. A.; MUTTON, M. A.; MUTTON, M. J. R. Bioethanol production from sweet sorghum broth and sugar cane fermentation. Ciência Rural, Santa Maria, Online, 2015).[0010] Microorganisms represent 85% of the references on bioethanol production, among which fungi stand out, especially when referring to lignocellulosic substrates. Increasing the yield of this fermentation process is of paramount importance, since the use of this fuel reduces environmental impacts, such as the generation of waste and the reduction of carbon dioxide emissions (MASSON, I. S.; COSTA, G. H. G.; ROVIERO, J. P. ; FREITA, L. A.; MUTTON, M. A.; MUTTON, M. J. R. Bioethanol production from sweet sorghum broth and sugar cane fermentation. Ciência Rural, Santa Maria, Online, 2015).

[0011] A aplicação de campos elétricos afeta diretamente a membrana plasmática promovendo pressão e acúmulo diferencial de cargas com consequente diminuição do potencial transmembrana, afetando a permeação através de canais iônicos, e interferindo nos momentos dipolares, podendo alterar a eletroestática e conformação através da indução de torque (MATTAR, J.; TURK M.; NONUS M.; LEBOVKA N.I.; EL ZAKHEM H.; VOROBIEVE. Electro-stimulation of S. cerevisiae wine yeasts by pulsed electric field and its effects on fermentation capacity. Bioelectrochemistry. 103:92-7. 2015).[0011] The application of electric fields directly affects the plasma membrane, promoting pressure and differential accumulation of charges with a consequent decrease in the transmembrane potential, affecting permeation through ion channels, and interfering with dipole moments, which can alter electrostatics and conformation through induction de torque (MATTAR, J.; TURK M.; NONUS M.; LEBOVKA N.I.; EL ZAKHEM H.; VOROBIEVE. Electro-stimulation of S. cerevisiae wine yeasts by pulsed electric field and its effects on fermentation capacity. Bioelectrochemistry. 103: 92-7. 2015).

[0012] Um dos principais mecanismos de ação da eletrossintese, está relacionada ao balanço de NAD, que impacta diretamente sobre as concentrações de acetil-CoA. Deste modo, seguindo as vias metabólicas é possivel aumentar a produção de acetato ou mesmo etanol, uma vez que as concentrações intracelulares de acetil-CoA aumentam. Portanto, é possível otimizar a produção de biocompostos utilizando processos de eletroestímulação microbiana (PANDIT A.V.; MAHADEVAN R. In silico characterization of microbial electrosynthesis for metabolic engineering of biochemicals. Microbial Cell Factories. 10:76, 2011).[0012] One of the main mechanisms of action of electrosynthesis is related to the balance of NAD, which directly impacts the concentrations of acetyl-CoA. In this way, following the metabolic pathways it is possible to increase the production of acetate or even ethanol, since the intracellular concentrations of acetyl-CoA increase. Therefore, it is possible to optimize the production of biocompounds using microbial electrostimulation processes (PANDIT A.V.; MAHADEVAN R. In silico characterization of microbial electrosynthesis for metabolic engineering of biochemicals. Microbial Cell Factories. 10:76, 2011).

[0013] A presente invenção desenvolve um método de eletroestímulação por corrente elétrica alternada capaz de estimular o bioprocesso fermentativo, interagindo na membrana plasmática, proliferação celular e desenvolvendo vias metabólicas da levedura, Sacchamoryces cerevisiae, obtendo-se um aumento da produção de etanol e concomitantemente fornecendo características organolépticas ao produto cervejeiro obtido.[0013] The present invention develops a method of electrostimulation by alternating electric current capable of stimulating the fermentation bioprocess, interacting in the plasma membrane, cell proliferation and developing metabolic pathways of the yeast, Sacchamoryces cerevisiae, obtaining an increase in ethanol production and concomitantly providing organoleptic characteristics to the brewing product obtained.

Técnica relacionadaRelated technique

[0014] A partir da realização de buscas de anterioridade verificou-se que a patente de número BR 102016007240-9 A8 de 31/03/2016 refere-se a um processo empregado na recuperação do desempenho muscular de pacientes em geral, mais especificamente, de praticantes de atividades físicas e atletas, o processo prevendo a aplicação seriada de pulsos elétricos, de forma transcutânea, cujo protocolo prevê as seguintes fases de eletroestímulação: fase de vasodilatação, fase de recuperação e fase de descontratura. No entanto, o processo supracitado refere-se à estimulação muscular envolvendo um sistema multicelular, não se tratando da estimulação microbiana, levedura Saccharomyces cerevisiae, e consequente aumento de produção de álcool.[0014] From the performance of previous searches, it was verified that the patent number BR 102016007240-9 A8 of 03/31/2016 refers to a process used in the recovery of the muscular performance of patients in general, more specifically, of practitioners of physical activities and athletes, the process foresees the serial application of electrical pulses, transcutaneously, whose protocol foresees the following electrostimulation phases: vasodilation phase, recovery phase and decontracting phase. However, the aforementioned process refers to muscle stimulation involving a multicellular system, not microbial stimulation, yeast Saccharomyces cerevisiae, and consequent increase in alcohol production.

[0015] A patente de número FR2579627A1 de 29/03/1985 descreve o processo de eletrossintese de alcoóis por redução eletroquímica de halogênios orgânicos na presença de derivados de carbonil em um meio orgânico contendo um eletrólito indiferente. Apesar da invenção se basear na utilização da corrente elétrica para a síntese de álcoois, não abrange a utilização do método de eletroestimulação microbiana em um processo fermentativo.[0015] Patent number FR2579627A1 of 03/29/1985 describes the process of electrosynthesis of alcohols by electrochemical reduction of organic halogens in the presence of carbonyl derivatives in an organic medium containing an indifferent electrolyte. Although the invention is based on the use of electric current for the synthesis of alcohols, it does not cover the use of the microbial electrostimulation method in a fermentation process.

[0016] A patente de número CN102491516A de 25/11/2011, método de invenção empregando microrganismos eletrocatalisados e intensificados para redução e oxidação de águas residuais difíceis de serem biodegradadas e acoplando uma tecnologia de filtração por membrana. O método descrito utiliza corrente contínua e não corrente alternada, e um reator composto por uma área anaeróbica com placa negativa e uma outra aeróbia com Ti02 / filme de carbono com eletrodo positivo, trata-se de um processo de eletrocatálise e não de um método de eletroestimulação microbiana em uma única câmera, por outro lado, o objetivo é tratar águas residuais e não a otimização do método fermentativo.[0016] Patent number CN102491516A of 11/25/2011, method of invention employing electrocatalyzed and intensified microorganisms for reduction and oxidation of wastewater difficult to biodegrade and coupling a membrane filtration technology. The described method uses direct current and not alternating current, and a reactor composed of an anaerobic area with a negative plate and an aerobic area with Ti02 / carbon film with a positive electrode. microbial electrostimulation in a single chamber, on the other hand, the objective is to treat wastewater and not the optimization of the fermentation method.

[0017] A patente de número PI 1005279-8 A2 de 29/12/2010, reivindica a utilização de fontes de luz ou Lâmpadas Fluorescentes, como forma de acelerar o processo de fermentação do mosto cervejeiro, que posteriormente irá se transformar em cerveja ou chope, ficando apto para o consumo, diminuindo assim o tempo de produção, diminuindo também o custo de produção e aumentando a capacidade produtiva. O processo descrito utiliza a emissão de luz para acelerar a via fermentativa, enquanto este pedido de invenção utiliza-se a corrente elétrica alternada para ativar intermediários metabólicos microbianos que irão otimizar a produção de álcool e fornecer características próprias ao produto final cervejeiro.[0017] Patent number PI 1005279-8 A2 of 12/29/2010, claims the use of light sources or Fluorescent Lamps, as a way of accelerating the brewing wort fermentation process, which will later turn into beer or draft beer, being ready for consumption, thus reducing production time, also reducing production costs and increasing production capacity. The process described uses the emission of light to accelerate the fermentation process, while this application uses alternating electric current to activate microbial metabolic intermediates that will optimize alcohol production and provide characteristics to the final brewing product.

Sumário da invençãoSummary of the invention

[0018] A requerente descobriu que ao aplicar uma corrente alternada na faixa de microamperes durante a fermentação alcoólica pela levedura, Saccharomyces cerevisiae, é possível aumentar a produção de etanol, bem como alterar propriedades organolépticas do produto cervejeiro, diminuindo os custos do bioprocesso.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 mostra concentração de etanol produzido em 48 horas de fermentação nos mostos controle e eletrofermentado (50Hz, 990uA, por 30minutos). *p< 0.05
A Figura 2 mostra a concentração de oxigênio dissolvido em 48 horas nos mostos controle e eletrofermentado (50Hz, 990uA, por 30minutos). *p< 0.05
A Figura 3 mostra o rendimento de etanol obtido, em 48 horas, nos mostos controle e eletrofermentado (50Hz, 990uA, por 30minutos). *p< 0.01
A Figura 4 mostra a produtividade de etanol, em 48 horas, nos mostos controle e eletrofermentado (50Hz, 990uA, por 30minutos). *p< 0.05
A Figura 5 mostra a concentração de células em suspensão, em 48 horas nos mostos controle e eletrofermentado (50Hz, 990uA, por 30minutos). 0.0001
A Figura 6 mostra os Cromatogramas obtidos com a coluna CarboPac PA1. A) Cromatograma padrão de etanol. B) Cromatograma padrão de glicose e Frutose. C) Cromatograma padrão de sacarose. D) Cromatograma de cerveja produzida através de fermentação convencional. E) Cromatograma de cerveja produzida através de eletrofermentação.[0018] The applicant discovered that by applying an alternating current in the range of microamperes during alcoholic fermentation by the yeast, Saccharomyces cerevisiae, it is possible to increase the production of ethanol, as well as alter the organoleptic properties of the brewing product, reducing the costs of the bioprocess.
Brief description of the drawings
Figure 1 shows the concentration of ethanol produced in 48 hours of fermentation in control and electrofermented musts (50Hz, 990uA, for 30 minutes). *p< 0.05
Figure 2 shows the dissolved oxygen concentration in 48 hours in the control and electrofermented musts (50Hz, 990uA, for 30 minutes). *p< 0.05
Figure 3 shows the ethanol yield obtained, in 48 hours, in control and electrofermented musts (50Hz, 990uA, for 30 minutes). *p< 0.01
Figure 4 shows the ethanol productivity, in 48 hours, in control and electrofermented musts (50Hz, 990uA, for 30 minutes). *p< 0.05
Figure 5 shows the concentration of cells in suspension, in 48 hours in control and electrofermented musts (50Hz, 990uA, for 30 minutes). 0.0001
Figure 6 shows the Chromatograms obtained with the CarboPac PA1 column. A) Standard ethanol chromatogram. B) Standard glucose and fructose chromatogram. C) Standard sucrose chromatogram. D) Chromatogram of beer produced through conventional fermentation. E) Chromatogram of beer produced through electrofermentation.

Descrição detalhada da invençãoDetailed description of the invention

[0019] O processo de produção de etanol e a produção de bebidas alcoólicas fermentadas possui um número 6 etapas. Assim na etapa 1, conhecida como brassagem ou mosturação, onde é preparada a solução de carboidratos fermentáveis. Podem ser utilizados diferentes grãos para a produção de bebidas, tais como grãos maltados e não maltados (cevada, trigo, arroz, sorgo, milho, entre outros), porém também podem ser utilizadas outras fontes de carboidratos como extrato de cana-de-açúcar, beterraba, batata ou mesmo sacarose industrializada. Nesta etapa podem ser realizadas diferentes rampas de mosturação, com temperatura entre 47°C-78°C por tempos de aquecimento que podem variar de 1-3 horas. A etapa 2, fervura e lupulagem (para a cerveja), onde a solução de carboidratos (mosto) é mantida entre 85°C a115°C por 1 hora e o lúpulo adicionado, a lupulagem pode variar de acordo com o estilo de cerveja a ser elaborado.
A etapa 3 Whirlpool, onde ο sedimento de lúpulo é decantado e o mosto resfriado, a temperaturas abaixo de 37°C. Na etapa 4 ocorre a fermentação efetuando-se a eletromudulação a cada 24 horas, as leveduras são inoculadas no mosto são eletromoduladas por um emissor de microcorrentes alternadas, por frequências que variam entre 1 Hz e 600Hz, e amperagem entre 10-1000uA. A corrente pode ainda estar nas modulações polarizadas ou não polarizadas. Durante esta etapa o etanol é produzido, quantificado por densidade (alcoolímetro) e o mesmo pode ser extraído por destilação. Na produção cervejeira poderá ocorrer a etapa 5, constituída pela maturação e clarificação, onde o mosto fermentado é resfriado entre 0-4° C por 4-10 dias para a redução de sedimentos (opcional). Etapa 6 envase e carbonatação (passiva ou ativa), na carbonatação passiva a cerveja é gaseificada com a introdução de CO2, enquanto na carbonatação ativa adiciona-se uma solução de 0,4-4 g/L de sacarose no processo de envase para a produção de CO2 pela Saccharomyces cerevisiae, durante 4 e 7 dias.[0019] The ethanol production process and the production of fermented alcoholic beverages has a number of 6 stages. So in step 1, known as mashing or mashing, where the fermentable carbohydrate solution is prepared. Different grains can be used for the production of beverages, such as malted and non-malted grains (barley, wheat, rice, sorghum, corn, among others), but other sources of carbohydrates such as sugarcane extract can also be used. , beet, potato or even industrialized sucrose. In this stage, different mashing ramps can be carried out, with temperature between 47°C-78°C for heating times that can vary from 1-3 hours. Step 2, boil and hop (for beer), where the carbohydrate solution (wort) is kept at 85°C to 115°C for 1 hour and hops are added, hopping can vary depending on the style of beer being be worked out.
Step 3 Whirlpool, where the hop sediment is decanted and the wort cooled down to temperatures below 37°C. In step 4, fermentation takes place, carrying out electromodulation every 24 hours, the yeasts are inoculated into the must and electromodulated by an alternating microcurrent emitter, at frequencies ranging from 1 Hz to 600Hz, and amperage between 10-1000uA. The current can still be in either polarized or non-polarized modulations. During this step, ethanol is produced, quantified by density (alcoholometer) and it can be extracted by distillation. In brewing production, stage 5 may occur, consisting of maturation and clarification, where the fermented must is cooled between 0-4° C for 4-10 days to reduce sediments (optional). Step 6 filling and carbonation (passive or active), in passive carbonation the beer is carbonated with the introduction of CO2, while in active carbonation a solution of 0.4-4 g/L of sucrose is added in the filling process for CO2 production by Saccharomyces cerevisiae, during 4 and 7 days.

Exemplos de concretização da invenção (descrição específica da metodologia e resultados obtidos)Examples of implementation of the invention (specific description of the methodology and results obtained)

[0020] Para execução da eletroestimulação das leveduras foram preparados mostos cervejeiros. Estes mostos foram preparados utilizando grãos maltados de cevada, que foram inseridos em água filtrada à 71°C. Após a inserção do malte na água a temperatura foi reduzida para 65°C, esta temperatura foi mantida por 1 hora. Após este período, a temperatura foi elevada a 78°C por 10 minutos e em seguida, na etapa de lupulagem a temperatura foi elevada a 100°C por uma hora. Vale ressaltar que existem outras formas de brassagem, que envolvem diferentes rampas de temperaturas que podem ser utilizadas para a produção de mosto, estes tipos de rampas de brassagem podem alterar o perfil de carboidratos fermentáveis do mosto, portanto devem ser considerados antes da produção da cerveja.[0020] To carry out the electrostimulation of the yeasts, brewing worts were prepared. These worts were prepared using malted barley grains, which were inserted in filtered water at 71°C. After inserting the malt into the water, the temperature was reduced to 65°C, this temperature was maintained for 1 hour. After this period, the temperature was raised to 78°C for 10 minutes and then, in the hopping stage, the temperature was raised to 100°C for one hour. It is noteworthy that there are other forms of mashing, which involve different temperature ramps that can be used for the production of wort, these types of mashing ramps can alter the fermentable carbohydrate profile of the wort, so they must be considered before producing the beer .

[0021] Após a etapa de lupulagem existe a etapa de “wirpool” que consiste na formação de um vórtice, por um período de 3 minutos, no mosto para a redução de sedimentos de lúpulo na cerveja. Em seguida o mosto livre de sedimentos de lúpulo é aerado, com o auxílio de um sistema de recirculação, e tem sua temperatura reduzida a pelo menos 37°C.[0021] After the hopping stage, there is the “wirpool” stage, which consists of forming a vortex, for a period of 3 minutes, in the wort to reduce hop sediments in the beer. Then the wort free of hop sediment is aerated, with the aid of a recirculation system, and has its temperature reduced to at least 37°C.

[0022] Nesta temperatura (37°C) foram inoculadas as leveduras. Para as produções dos fermentados foram utilizadas leveduras, Saccharomyces cerevisiae, comerciais liofilizadas, cada sachê continha 11g. Para cada 10L de mosto foram utilizados 11g de leveduras liofilizadas.[0022] At this temperature (37°C) the yeasts were inoculated. For the production of fermented products, yeasts were used, Saccharomyces cerevisiae, commercially lyophilized, each sachet contained 11g. For each 10L of must, 11g of lyophilized yeast were used.

[0023] Após homogeneizar o mosto contendo a cultura microbiana foi realizada a primeira aplicação da corrente elétrica em microamperagem. Nos ensaios de eletromodulação utilizaram-se aparelhos emissores de microcorrente (corrente alternada, de baixa intensidade) com frequência de 50 Hz e intensidade de corrente de 990μΑ, durante 30 minutos. Este estímulo foi realizado uma vez a cada 24 horas durante um período de 96 horas, sendo que o tempo padrão para fermentação no processo convencional é de 120 horas. O primeiro estímulo ocorreu no tempo o horas, sendo realizados 5 estímulos.[0023] After homogenizing the must containing the microbial culture, the first application of electric current in microamperage was performed. In the electromodulation tests, microcurrent emitting devices (alternating current, low intensity) were used with a frequency of 50 Hz and current intensity of 990μΑ, for 30 minutes. This stimulus was performed once every 24 hours for a period of 96 hours, and the standard time for fermentation in the conventional process is 120 hours. The first stimulus occurred at time o hours, with 5 stimuli being performed.

[0024] A avaliação destes estímulos se deu através da aferição da densidade do meio, por auxílio de um densímetro analógico. A densidade foi aferida a cada 24 horas, nestas análises foram retirados 100mL de amostra e os mesmos foram reservados em proveta. Em seguida o densímetro, sanitizado com álcool 70%, foi inserido na solução e gentilmente o mesmo foi rotacionado para que a densidade fosse anotada. Deste modo a concentração de etanol foi determinada pela seguinte fórmula matemática: Concentração de etanol = (densidade inicial — densidade final) * 131,25[0024] The evaluation of these stimuli was done by measuring the density of the medium, using an analog densimeter. The density was measured every 24 hours, in these analyzes 100mL of sample were taken and they were reserved in a test tube. Then, the densimeter, sanitized with 70% alcohol, was inserted into the solution and gently rotated so that the density could be noted. Thus, the ethanol concentration was determined by the following mathematical formula: Ethanol concentration = (initial density — final density) * 131.25

[0025] Outras medidas como oxigênio dissolvido (OD), condutividade, pH, pEh, foram realizadas usando um aparelho multiparamétrico (sympHony, VWR Internatinal Radnor, PA 19087) com os eletrodo de referência (89231-586, 89231-624 e 89231-618), Grau Brix foi obtido através da observação de 700uL em refratomentro analogico. Para a determinação da concentração de glicose utilizou-se um glicômetro eletrônico (G-tech free). Para tanto, tiras teste serão utilizadas uma vez por teste e serão aplicados 50 μL de amostra sobre cada tira com o auxílio de um micropipetador.[0025] Other measurements such as dissolved oxygen (DO), conductivity, pH, pH, were performed using a multiparameter device (sympHony, VWR International Radnor, PA 19087) with reference electrodes (89231-586, 89231-624 and 89231- 618), Degree Brix was obtained by observing 700uL in an analog refractometer. An electronic glucometer (G-tech free) was used to determine the glucose concentration. For this purpose, test strips will be used once per test and 50 μL of sample will be applied on each strip with the aid of a micropipettor.

[0026] O produto final foi analisado por cromatografia no equipamento Dionex ICS-3000 (Thermofisher, USA), equipado com detector PAD140 e sistema pós-coluna Dionex PC10 (Thermofisher, USA). Com eluição isocrática 5mM NaOH a 1ml/min pré-coluna, pós-coluna solução de NaOH a 50mM a 1ml/min totalizando 27,5mM de NaOH a 2ml/min no detector amperométrico. A análise cromatográfica permitiu observar a composição dos açúcares presentes e perfil de etanol produzido e os impactos da estimulação elétrica na composição do produto.[0026] The final product was analyzed by chromatography on the Dionex ICS-3000 equipment (Thermofisher, USA), equipped with a PAD140 detector and Dionex PC10 post-column system (Thermofisher, USA). With isocratic elution 5mM NaOH at 1ml/min pre-column, post-column solution of 50mM NaOH at 1ml/min totaling 27.5mM NaOH at 2ml/min in the amperometric detector. The chromatographic analysis allowed observing the composition of the sugars present and the profile of the ethanol produced and the impacts of electrical stimulation on the product composition.

[0027] Demonstrou-se experimentalmente que as diferenças encontradas entre os grupos controle e tratados eram obtidas nas primeiras 48 horas. Após este tempo as diferenças entre os grupos tratados e controle basicamente se mantinham.[0027] It was experimentally demonstrated that the differences found between the control and treated groups were obtained in the first 48 hours. After this time, the differences between the treated and control groups basically remained unchanged.

[0028] Com estes estímulos foi possível aumentar a concentração de etanol no meio, quando comparamos os grupos controle e tratados com a corrente elétrica. Vale ressaltar que a qualidade e quantidade dos açúcares disponíveis para fermentação, bem como a temperatura da fermentação também podem influenciar no processo.[0028] With these stimuli it was possible to increase the concentration of ethanol in the medium, when comparing the control groups and those treated with electric current. It is noteworthy that the quality and quantity of sugars available for fermentation, as well as the fermentation temperature can also influence the process.

[0029] Um ponto importante neste processo foi que os grupos estimulados reduzem a concentração de oxigênio dissolvido mais rapidamente que os grupos controle, além de apresentar concentrações de oxigênio dissolvidos menores que os grupos controle durante todo o processo. Este fato pode se associar à maior eficiência fermentativa descrita anteriormente, uma vez que a fermentação ocorre em anaerobiose.[0029] An important point in this process was that the stimulated groups reduced the dissolved oxygen concentration faster than the control groups, in addition to presenting lower dissolved oxygen concentrations than the control groups throughout the process. This fact may be associated with the greater fermentation efficiency described above, since fermentation occurs anaerobically.

[0030] É importante salientar que no caso da produção de cervejas altas temperaturas na fermentação, geralmente, são acompanhadas pela esterificação acentuada de componentes do meio, gerando portanto “off flavors” (sabores relacionados ao estresse das leveduras e/ou desagradáveis ao paladar). A presença de esterificação acentuada, no entanto, como característica negativa, só foi percebida nos grupos controle. Assim foi possível, através da eletrofermentação com microcorrentes, produzir uma bebida alcoólica com maior teor de etanol e menores quantidades de “off flavors”.[0030] It is important to note that in the case of the production of beers, high temperatures in fermentation are usually accompanied by a strong esterification of components in the medium, thus generating “off flavors” (flavors related to yeast stress and/or unpleasant taste). . The presence of accentuated esterification, however, as a negative characteristic, was only noticed in the control groups. Thus, it was possible, through electrofermentation with microcurrents, to produce an alcoholic beverage with a higher ethanol content and lower amounts of “off flavors”.

Claims (11)

MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL caracterizado por compreender as seguintes etapas:
Etapa A - Preparação de meio de produção a partir de diferentes fontes de carboidratos, tais como grãos maltados e não maltados, sacarose, dentre outros Etapa B - Preparo de inoculo microbiano e inoculação de microrganismos em meio de produção utilizando a cepa Saccharomyces cerevisiae;
Etapa C - Aplicação de corrente elétrica alternada no meio de produção contendo a levedura;
Etapa D - Extração de etanol por destilação do meio fermentado e posterior resfriamento do material evaporado para do etanol condensação.
ETAPA E - Maturação e clarificação do mosto fermentado;
ETAPA F - Adição de CO2 no mosto fermentado.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION characterized by comprising the following steps:
Step A - Preparation of production medium from different sources of carbohydrates, such as malted and unmalted grains, sucrose, among others. Step B - Preparation of microbial inoculum and inoculation of microorganisms in production medium using the Saccharomyces cerevisiae strain;
Step C - Application of alternating electric current in the production medium containing the yeast;
Step D - Ethanol extraction by distillation of the fermented medium and subsequent cooling of the evaporated material for ethanol condensation.
STAGE E - Maturation and clarification of the fermented must;
STAGE F - Addition of CO2 to the fermented must. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a Etapa C de eletroestimulação ocorrer por corrente alternada de frequência 1 -600Hz e microamperagem 10-1000uA no meio de produção contendo a levedura.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized in that Step C of electrostimulation occurs by alternating current of frequency 1 -600Hz and microamperage 10-1000uA in the production medium containing the yeast. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a Etapa C do processo de produção ocorrer em biorreator, frascos Erlenmeyer ou matrizes microbianas imobilizadas.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized in that Step C of the production process takes place in a bioreactor, Erlenmeyer flasks or immobilized microbial matrices. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a Etapa D, ser opcional, do processo de produção para obtenção de produto não cervejeiro, tal como etanol ou bebida destilada.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized in that Step D, is optional, of the production process to obtain a non-brewery product, such as ethanol or distilled beverage. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a Etapa D do processo de destilação ocorrer em temperatura de 60°C a 90 °C, sendo a temperatura ótima de 78,4 °C.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized in that Step D of the distillation process occurs at a temperature of 60°C to 90°C, with the optimum temperature being 78.4°C. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a Etapa E ser opcional para obtenção de produto cervejeiro.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized in that Step E is optional to obtain a brewing product. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a Etapa E do processo de maturação e clarificação do mosto fermentado por resfriamento, 0-6°C, até por 120 horas.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized by Step E of the process of maturation and clarification of the fermented must by cooling, 0-6°C, for up to 120 hours. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a Etapa F podendo ser passiva, carbonatação forçada, pela adição de CO2 comprimido a uma pressão 0.5-1,5 Kg/cm2, enquanto a carbonatação ativa adiciona-se uma solução Primer, com concentração de 0,4-4 g/L de sacarose, ao mosto para após 96-144 horas haver formação de CO2 na cerveja.ELECTROSTIMULATION METHOD OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 1, characterized in that Step F can be passive, forced carbonation, by adding compressed CO2 at a pressure of 0.5-1.5 Kg/cm2, while carbonation active, a Primer solution is added, with a concentration of 0.4-4 g/L of sucrose, to the wort so that after 96-144 hours there is formation of CO2 in the beer. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com reinvidicação 2 caracterizado por maior produção de etanol e levedura em suspensão.METHOD OF ELECTRIC STIMULATION OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 2 characterized by greater production of ethanol and yeast in suspension. MÉTODO DE ELETROESTIMULAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com reinvidicação 2 caracterizado por eletroestimulação pode ser utilizado em processo de fermentação em batelada quanto em processo de fermentação contínua.METHOD OF ELECTROSTIMULATION OF THE FERMENTATIVE PROCESS FOR ETHANOL PRODUCTION, according to claim 2 characterized by electrostimulation, can be used in both batch and continuous fermentation processes. FORMULAÇÃO CERVEJEIRA PARA ALIMENTAÇÃO caracterizada por consistir uma solução etanólica contendo maior teor alcoólico.FOOD BREWING FORMULATION characterized by consisting of an ethanolic solution containing higher alcohol content.

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