BR122022022755A2 - MULTISPECIFIC HEAVY CHAIN ANTIBODIES WITH MODIFIED HEAVY CHAIN CONSTANT REGIONS - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a anticorpos multiespecíficos de cadeia pesada humana (por exemplo, UniAbsTM) que têm regiões constantes de cadeia pesada modificadas que conferem propriedades vantajosas. A invenção refere-se ainda a métodos de fabricação de tais anticorpos, composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo tais anticorpos e seu uso para tratar distúrbios que são caracterizados pela expressão de um ou mais dos alvos de ligação descritos neste documento.
Description
[0001] Este pedido reivindica benefício prioritário da data de depósito da data de depósito do Pedido de Patente Provisório U.S. N° de Série 63/017.589, depositado em 29 de abril de 2020, bem como do Pedido de Patente Provisório U.S. N° de Série 63/108.796, depositado em 2 de novembro de 2020, cujas divulgações estão incorporadas por referência neste documento em sua totalidade.[0001] This application claims priority benefit from the filing date of the filing date of the U.S. Provisional Patent Application. Serial No. 63/017,589, filed April 29, 2020, as well as U.S. Provisional Patent Application Serial No. 63/108,796, filed on November 2, 2020, the disclosures of which are incorporated by reference herein in their entirety.
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente em formato XML e é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia XML, criada em 14 de setembro de 2022, é denominada 60792_00035 WO01_ (TNO-0018-WO)_SL.xml e é de 141.442 bytes de tamanho.[0002] This application contains a Sequence Listing that has been submitted electronically in XML format and is hereby incorporated by reference in its entirety. Said XML copy, created on September 14, 2022, is named 60792_00035 WO01_(TNO-0018-WO)_SL.xml and is 141,442 bytes in size.
[0003] A presente invenção refere-se a anticorpos de cadeia pesada humana multiespecíficos (por exemplo, UniAbsTM) que têm regiões constantes de cadeia pesada modificadas que conferem propriedades vantajosas. A invenção refere-se ainda a métodos de fabricação de tais anticorpos, composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo tais anticorpos e seu uso para tratar distúrbios que são caracterizados pela expressão de um ou mais dos alvos de ligação descritos neste documento.[0003] The present invention relates to multispecific human heavy chain antibodies (eg UniAbsTM) that have modified heavy chain constant regions that confer advantageous properties. The invention further relates to methods of making such antibodies, compositions, including pharmaceutical compositions, comprising such antibodies and their use to treat disorders that are characterized by the expression of one or more of the binding targets described herein.
[0004] Os avanços na engenharia de proteínas levaram à fabricação bem-sucedida e à utilização clínica de anticorpos multiespecíficos com afinidade de ligação a dois ou mais alvos. No entanto, devido à sua natureza heterodimérica, medidas apropriadas devem ser utilizadas para facilitar o emparelhamento adequado da combinação desejada de sequências de ligação e, portanto, as subunidades de polipeptídeo, em um anticorpo multiespecífico. Wang et al., mAbs 10:8, 1226-1235 (2018).[0004] Advances in protein engineering have led to the successful manufacture and clinical use of multispecific antibodies with binding affinity to two or more targets. However, due to its heterodimeric nature, appropriate measures must be used to facilitate proper pairing of the desired combination of binding sequences, and therefore polypeptide subunits, in a multispecific antibody. Wang et al., mAbs 10:8, 1226-1235 (2018).
[0005] Uma abordagem para contornar o problema de subunidades de polipeptídeo mal pareadas é conhecida como "knobs-into-holes" (KiH), e visa forçar o emparelhamento de duas cadeias pesadas de anticorpos diferentes introduzindo mutações nos domínios CH2 e/ou CH3 para modificar a interface de contato. Em uma cadeia, aminoácidos volumosos são substituídos por aminoácidos com cadeias laterais curtas para criar um "hole". Por outro lado, aminoácidos com cadeias laterais grandes são introduzidos na outra cadeia pesada para criar um "knob". Ao coexpressar essas duas cadeias pesadas, observa-se um maior rendimento de formação de heterodímero ("knob-hole") versus formação de homodímero ("hole-knob" ou "knob-knob") devido á estabilidade mais favorável do par knob-hole (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; e WO 96/027011).[0005] One approach to circumventing the problem of mismatched polypeptide subunits is known as "knobs-into-holes" (KiH), and aims to force pairing of two different antibody heavy chains by introducing mutations in the CH2 and/or CH3 domains to modify the contact interface. In a chain, bulky amino acids are replaced with amino acids with short side chains to create a "hole". On the other hand, amino acids with large side chains are introduced into the other heavy chain to create a "knob". By co-expressing these two heavy chains, a greater yield of heterodimer formation ("knob-hole") versus homodimer formation ("hole-knob" or "knob-knob") is observed due to the more favorable stability of the knob-knob pair hole (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; and WO 96/027011).
[0006] Embora esta estratégia pareça atraente para alcançar um heterodímero desejado, outras propriedades dos anticorpos multiespe-cíficos resultantes são altamente dependentes da sequência de aminoácidos específica da região Fc, ou seja, funções efetoras, tais como, por exemplo, citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxi-cidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Além disso, a atividade da função efetora pode induzir a produção de citocinas, o que pode levar a uma "tempestade de citocinas" de respostas inflamatórias inde-sejadas. Gupta et al., Journal of Interferon & Cytokine Research 40:1, 19-23 (2019). Assim, em certas configurações, há a necessidade de reduzir ou eliminar completamente as funções efetoras, por exemplo, para evitar prejudicar ou matar uma célula imune (por exemplo, uma célula Τ) à qual um anticorpo multiespecífico se liga e/ou evitar produção de citocinas e as respostas inflamatórias indesejáveis resultantes.[0006] Although this strategy seems attractive to achieve a desired heterodimer, other properties of the resulting multispecific antibodies are highly dependent on the specific amino acid sequence of the Fc region, i.e., effector functions such as, for example, complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). In addition, effector function activity can induce cytokine production, which can lead to a "cytokine storm" of unwanted inflammatory responses. Gupta et al., Journal of Interferon & Cytokine Research 40:1, 19-23 (2019). Thus, in certain settings, there is a need to reduce or completely eliminate effector functions, for example, to avoid harming or killing an immune cell (e.g., a Τ cell) to which a multispecific antibody binds and/or to avoid production of cytokines and the resulting undesirable inflammatory responses.
[0007] Além disso, a introdução de modificações de aminoácidos em uma proteína pode ter sérios inconvenientes, a saber, induzir uma resposta imune do paciente contra a proteína com base na presença de sequências não nativas. Como tal, o desenvolvimento de anticorpos multiespecíficos requer a identificação de sequências que são muito semelhantes em estrutura geral àquelas de anticorpos naturais (como IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) com desvio mínimo das sequências nativas, mas que incorporam com sucesso modificações que podem atingir simultaneamente os objetivos de facilitar a heterodimerização desejada, enquanto também alcança uma redução ou eliminação de uma ou mais funções efetoras.[0007] Furthermore, introducing amino acid modifications into a protein can have serious drawbacks, namely, inducing a patient's immune response against the protein based on the presence of non-native sequences. As such, the development of multispecific antibodies requires the identification of sequences that are very similar in general structure to those of natural antibodies (such as IgA, IgD, IgE, IgG or IgM) with minimal deviation from native sequences, but which successfully incorporate modifications that can simultaneously achieve the goals of facilitating the desired heterodimerization, while also achieving a reduction or elimination of one or more effector functions.
[0008] Para equilibrar esses requisitos concorrentes, os inventores se concentraram em lgG4 Fc, cuja sequência nativa é conhecida por ter atividade de função efetora de nível relativamente baixo. Crescioli et al., Curr Allergy Asthma Rep 16:7 (2016). No entanto, apesar dessa aparente vantagem, a lgG4 é conhecida por sofrer uma reação de troca de cadeia In vivo devido à sua sequência de região de dobradiça particular, apresentando complicações adicionais para alcançar a heterodimerização desejada. Labrijn et al., Nature Biotechnology 27, 767-71 (2009). Como tal, há uma necessidade de sequências de região constante de cadeia pesada modificadas que atinjam a heterodimerização desejada, incorporem modificações que reduzam ou eliminem funções efetoras e, ao mesmo tempo, incorporem modificações que reduzam ou eliminem reações de troca de cadeia em lgG4. As moléculas descritas neste documento abordam esses e outros desafios.[0008] To balance these competing requirements, the inventors focused on lgG4 Fc, whose native sequence is known to have relatively low-level effector function activity. Crescioli et al., Curr Allergy Asthma Rep 16:7 (2016). However, despite this apparent advantage, IgG4 is known to undergo a chain exchange reaction in vivo due to its particular hinge region sequence, presenting additional complications in achieving the desired heterodimerization. Labrijn et al., Nature Biotechnology 27, 767-71 (2009 ). As such, there is a need for modified heavy chain constant region sequences that achieve the desired heterodimerization, incorporate modifications that reduce or eliminate effector functions, and at the same time incorporate modifications that reduce or eliminate chain switch reactions in IgG4. The molecules described in this document address these and other challenges.
[0009] Em um anticorpo IgG convencional, a associação da cadeia pesada e da cadeia leve se deve em parte a uma interação hidrofóbica entre a região constante da cadeia leve e o domínio constante CH1 da cadeia pesada. Existem resíduos adicionais nas regiões de framework 2 (FR2) e framework 4 (FR4) da cadeia pesada que também contribuem para essa interação hidrofóbica entre as cadeias pesada e leve.[0009] In a conventional IgG antibody, the heavy chain and light chain association is due in part to a hydrophobic interaction between the light chain constant region and the heavy chain CH1 constant domain. There are additional residues in the framework 2 (FR2) and framework 4 (FR4) regions of the heavy chain that also contribute to this hydrophobic interaction between the heavy and light chains.
[0010] Sabe-se, no entanto, que os soros de camelídeos (subor-dem Tylopoda que inclui camelos, dromedários e lhamas) contêm um tipo principal de anticorpos compostos apenas por cadeias H pareadas (anticorpos somente de cadeia pesada ou UniAbs™). Os UniAbs™ de Camelidae (Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca e Lama vicugna) possuem uma estrutura única composta por um único domínio variável (VHH), uma região de dobradiça e dois domínios constantes (CH2 e CH3), que são altamente homólogos aos domínios CH2 e CH3 de anticorpos clássicos. Estes UniAbs™ não possuem o primeiro domínio da região constante (CH1) que está presente no genoma, mas é separado durante o processamento do mRNA. A ausência do domínio CH1 explica a ausência da cadeia leve no UniAbs™, uma vez que este domínio é o sítio de ancoragem para o domínio constante da cadeia leve. Tal UniAbs™ evoluiu naturalmente para conferir especificidade de ligação ao antígeno e alta afinidade por três CDRs de anticorpos convencionais ou fragmentos dos mesmos (Muyldermans, 2001; J Blotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5:111- 124). Peixes cartilaginosos, como tubarões, também desenvolveram um tipo distinto de imunoglobulina, designada como IgNAR, que não possui as cadeias polipeptídicas leves e é composta inteiramente por cadeias pesadas. As moléculas de IgNAR podem ser manipuladas por engenharia molecular para produzir o domínio variável de um único polipeptídeo de cadeia pesada (vNARs) (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).[0010] It is known, however, that sera from camelids (suborder Tylopoda which includes camels, dromedaries and llamas) contain a major type of antibody composed only of paired H chains (heavy chain only antibodies or UniAbs™) . Camelidae UniAbs™ (Camelus dromedarius, Camelus bactrianus, Lama glama, Lama guanaco, Lama alpaca and Lama vicugna) have a unique structure composed of a single variable domain (VHH), a hinge region and two constant domains (CH2 and CH3 ), which are highly homologous to the CH2 and CH3 domains of classical antibodies. These UniAbs™ lack the first constant region domain (CH1) that is present in the genome, but is separated during mRNA processing. The absence of the CH1 domain explains the absence of the light chain in UniAbs™, as this domain is the anchoring site for the light chain constant domain. Such UniAbs™ have naturally evolved to confer antigen-binding specificity and high affinity for three CDRs of conventional antibodies or fragments thereof (Muyldermans, 2001; J Blotechnol 74:277-302; Revets et al., 2005; Expert Opin Biol Ther 5 :111-124). Cartilaginous fish such as sharks have also evolved a distinct type of immunoglobulin called IgNAR, which lacks the light polypeptide chains and is composed entirely of heavy chains. IgNAR molecules can be manipulated by molecular engineering to produce single heavy chain polypeptide variable domains (vNARs) ( Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003 ); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004 ); Dooley et al., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003 )).
[0011] A capacidade de anticorpos somente de cadeia pesada desprovidos de cadeia leve para se ligar ao antígeno foi estabelecida na década de 1960 (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). A imu-noglobulina de cadeia pesada fisicamente separada da cadeia leve reteve 80% da atividade de ligação ao antígeno em relação ao anticorpo tetramérico. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790 demonstraram que a remoção do domínio CH1 de um gene μ de camundongo rearranjado resulta na produção de um anticorpo somente de cadeia pesada, desprovido de cadeia leve, em cultura de células de mamífero. Os anticorpos produzidos retiveram a especificidade de ligação a VH e as funções efetoras.[0011] The ability of heavy-chain-only antibodies devoid of light chain to bind antigen was established in the 1960s (Jaton et al. (1968) Biochemistry, 7, 4185-4195). The heavy chain immunoglobulin physically separated from the light chain retained 80% of the antigen-binding activity relative to the tetrameric antibody. Sitia et al. (1990) Cell, 60, 781-790 demonstrated that removal of the CH1 domain from a rearranged mouse μ gene results in the production of a heavy chain-only antibody, devoid of light chain, in cultured mammalian cells. The antibodies produced retained VH binding specificity and effector functions.
[0012] Anticorpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem ser gerados contra uma variedade de antígenos por meio de imunização (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)) e a porção VHH pode ser prontamente clonada e expressa em levedura (Frenken, L.G.J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Os seus níveis de expressão, solubilidade e estabilidade são significativamente superiores aos dos fragmentos F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, M.A. et al. FEBS Lett 414, 521-526 (1997)).[0012] Heavy chain antibodies with high specificity and affinity can be generated against a variety of antigens through immunization (van der Linden, R.H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)) and the VHH portion can be readily cloned and expressed in yeast ( Frenken, L.G.J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000 )). Their expression levels, solubility and stability are significantly higher than those of classic F(ab) or Fv fragments ( Ghahroudi, M.A. et al. FEBS Lett 414, 521-526 (1997 )).
[0013] Os camundongos nos quais o locus da cadeia leve (L) λ (lambda) e/ou os loci da cadeia L λ e κ (kappa) foram funcionalmente silenciados e os anticorpos produzidos por esses camundongos são descritos nas Patentes U.S. 7.541.513 e 8.367.888. A produção recom-binante de anticorpos somente de cadeia pesada em camundongos e ratos foi relatada, por exemplo, em W02006008548; Publicação do Pedido U.S. N° 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology, 109(1), 93-101; Brüggemann et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90; e Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271-3283. A produção de camundongos knockout através de microinjeções embrionárias de nucleases de dedo de zinco é descrita em Geurts et al., 2009, Science, 325(5939): 433. Anticorpos solúveis somente de cadeia pesada e roedores trans-gênicos compreendendo um locus heterólogo de cadeia pesada que produz tais anticorpos são descritos nas Patentes U.S. N° 8.883.150 e 9.365.655. Estruturas CAR-T compreendendo anticorpos de domínio único como domínio de ligação (direcionamento) são descritas, por exemplo, em Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317: 2630-2641 e Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1840:378-386. Antígeno de Maturação de Células B (BCMA)[0013] Mice in which the light chain (L) λ locus (lambda) and/or the L chain loci λ and κ (kappa) have been functionally silenced and the antibodies produced by these mice are described in U.S. Pat. 7,541,513 and 8,367,888. Recombinant production of heavy-chain-only antibodies in mice and rats has been reported, for example, in WO2006008548; Publication of the U.S. No. 20100122358; Nguyen et al., 2003, Immunology, 109(1), 93-101; Brüggemann et al., Crit. Rev. Immunol.; 2006, 26(5):377-90; and Zou et al., 2007, J Exp Med; 204(13): 3271-3283. The production of knockout mice by embryonic microinjections of zinc finger nucleases is described in Geurts et al., 2009, Science, 325(5939): 433. Heavy chain-only soluble antibodies and transgenic rodents comprising a heterologous locus of heavy chain producing such antibodies are described in U.S. Pat. No. 8,883,150 and 9,365,655. CAR-T structures comprising single domain antibodies as binding (targeting) domain are described, for example, in Iri-Sofla et al., 2011, Experimental Cell Research 317: 2630-2641 and Jamnani et al., 2014, Biochim Biophys Minutes, 1840:378-386. B Cell Maturation Antigen (BCMA)
[0014] O BCMA, também conhecido como membro da superfamí-lia do fator de necrose tumoral 17 (TNFRSF17) (UniProt Q02223), é um receptor de superfície celular exclusivamente expresso em células plas-máticas e plasmablastos. O BCMA é um receptor para dois ligantes na superfamília do fator de necrose tumoral (TNF): APRIL (um ligante indutor de proliferação, também conhecido como TNFSF13; TALL-2 e TRDL-1; o ligante de alta afinidade para BCMA) e ativação de células B (BAFF) (também conhecido como BLyS; TALL-1; THANK; zTNF4; TNFSF20; e D8Ertd387e; o ligante de baixa afinidade para BCMA). APRIL e BAFF são fatores de crescimento que se ligam ao BCMA e promovem a sobrevivência das células plasmáticas. O BCMA também é altamente expresso em células plasmáticas malignas no mieloma múltiplo humano (MM). Os anticorpos que se ligam ao BCMA são descritos, por exemplo, em Gras et al., 1995, Int. Immunol. 7:1093-1106, WO200124811 e WO200124812. Anticorpos anti-BCMA que reagem de forma cruzada com TACI são descritos em WO2002/066516. Anticorpos biespecíficos contra BCMA e CD3 são descritos, por exemplo, em U.S. 2013/0156769 A1 e U.S. 2015/0376287 A1. Foi relatado que um conjugado anticorpo anti-BCMA-MMAE ou -MMAF induz seletivamente a morte de células de mieloma múltiplo (Tai et al., Blood 2014, 123(20): 3128-38). Ali et al., Blood 2016, 128(13): 1688-700, relataram que em um ensaio clínico (#NCT02215967) as células Τ do receptor de antígeno quimérico (CAR) visando BCMA resultaram na remissão de mieloma múltiplo em pacientes humanos.[0014] BCMA, also known as a member of the tumor necrosis factor 17 (TNFRSF17) superfamily (UniProt Q02223), is a cell surface receptor exclusively expressed on plasma cells and plasmablasts. BCMA is a receptor for two ligands in the tumor necrosis factor (TNF) superfamily: APRIL (a proliferation-inducing ligand, also known as TNFSF13; TALL-2 and TRDL-1; the high-affinity ligand for BCMA) and activation (BAFF) (also known as BLyS; TALL-1; THANK; zTNF4; TNFSF20; and D8Ertd387e; the low-affinity ligand for BCMA). APRIL and BAFF are growth factors that bind to BCMA and promote plasma cell survival. BCMA is also highly expressed in malignant plasma cells in human multiple myeloma (MM). Antibodies that bind BCMA are described, for example, in Gras et al., 1995, Int. Immunol. 7:1093-1106, WO200124811 and WO200124812. Anti-BCMA antibodies that cross-react with TACI are described in WO2002/066516. Bispecific antibodies against BCMA and CD3 are described, for example, in U.S. 2013/0156769 A1 and U.S. 2015/0376287 A1. An anti-BCMA-MMAE or -MMAF antibody conjugate has been reported to selectively induce multiple myeloma cell death ( Tai et al., Blood 2014, 123(20): 3128-38 ). Ali et al., Blood 2016, 128(13): 1688-700, reported that in a clinical trial (#NCT02215967) chimeric antigen receptor (CAR) Τ cells targeting BCMA resulted in remission of multiple myeloma in human patients.
[0015] O PSMA, também conhecido como Antígeno de Membrana Específica da Próstata e Glutamato Carboxipeptidase II (UniProt Q04609), é uma proteína transmembranar do tipo II que possui atividade de dipeptidase ácida N-acetilada-alfa-ligada, folato hidrolase e dipepti-dil-peptidase. Ele é codificado pelo gene FOLH1 em humanos e consiste em um domínio citoplasmático de 19 aminoácidos, uma porção transmembranar de 24 aminoácidos e uma porção extracelular de 707 aminoácidos. A proteína é enzimaticamente ativa como um homodímero não covalente. O PSMA é expresso no tecido do epitélio da próstata e é regulado positivamente no câncer de próstata e na neovasculatura de tumores sólidos. Ele também é expresso em níveis baixos em tecidos saudáveis, como cérebro, rim e glândulas salivares, mas sua superex-pressão no tecido maligno da próstata o torna um alvo atraente para o tratamento terapêutico do câncer de próstata. Também pode ser relevante para terapia ou imagem de tumores sólidos, dada sua alta expressão na neovasculatura maligna. Anticorpos monoclonais, conjugados anticorpo-droga e células T do receptor de antígeno quimérico visando PSMA foram descritos para o tratamento de câncer de próstata metas-tático (Hernandez-Hoyos et al 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al 2014, PMID: 25327986, Serganova et al 2016, PMID: 28345023). Além disso, conjugados de radionuclídeos específicos para PSMA estão sendo investigados para imagens e tratamento de câncer de próstata (por exemplo, Hofman et al., 2018 PMID: 29752180).[0015] PSMA, also known as Prostate-Specific Membrane Antigen and Glutamate Carboxypeptidase II (UniProt Q04609), is a type II transmembrane protein that has N-acetylated-alpha-linked acid dipeptidase, folate hydrolase, and dipeptide activity. dil-peptidase. It is encoded by the FOLH1 gene in humans and consists of a cytoplasmic domain of 19 amino acids, a transmembrane portion of 24 amino acids, and an extracellular portion of 707 amino acids. The protein is enzymatically active as a non-covalent homodimer. PSMA is expressed in prostate epithelial tissue and is upregulated in prostate cancer and solid tumor neovasculature. It is also expressed at low levels in healthy tissues such as the brain, kidney and salivary glands, but its overexpression in malignant prostate tissue makes it an attractive target for the therapeutic treatment of prostate cancer. It may also be relevant for therapy or imaging of solid tumors, given its high expression in malignant neovasculature. Monoclonal antibodies, antibody-drug conjugates, and chimeric antigen receptor T cells targeting PSMA have been described for the treatment of metastatic prostate cancer (Hernandez-Hoyos et al 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al 2014, PMID: 25327986, Serganova et al 2016, PMID: 28345023). Additionally, PSMA-specific radionuclide conjugates are being investigated for prostate cancer imaging and treatment (eg, Hofman et al., 2018 PMID: 29752180).
[0016] O CD19, também conhecido como Antígeno B4 de Superfície de Linfócito B (UniProt P15391), é um receptor de superfície celular que é expresso em todas as células B humanas, mas não é encontrado em células plasmáticas. O CD19 é uma proteína transmembrana que recruta proteínas de sinalização citoplasmáticas para a membrana e trabalha dentro do complexo CD19/CD21 para diminuir o limiar para as vias de sinalização do receptor de células B. O CD19 tem uma cauda citoplasmática relativamente grande de 240 aminoácidos. Os domínios extracelulares semelhantes a Ig são divididos por um domínio potencial não semelhante a Ig ligado a dissulfeto e sítios de adição de carboidratos ligados a N. A cauda citoplasmática contém peio menos nove resíduos de tirosina perto do terminal C, alguns dos quais mostraram ser fosforilados. Juntamente com CD20 e CD22, a expressão restrita de CD19 ã linhagem de células B o torna um alvo atraente para o tratamento terapêutico de malignidades de células B. Muitos anticorpos mo-noclonais e conjugados de droga de anticorpo específicos para CD19 foram descritos (por exemplo, Naddafi et al. 2015, PMC4644525). Além disso, as células T do receptor de antígeno quimérico anti-CD19 foram aprovadas para tratar a leucemia (por exemplo, Sadelain et al. 2017, PMID: 29245005).[0016] CD19, also known as B Lymphocyte Surface Antigen B4 (UniProt P15391), is a cell surface receptor that is expressed on all human B cells but is not found on plasma cells. CD19 is a transmembrane protein that recruits cytoplasmic signaling proteins to the membrane and works within the CD19/CD21 complex to lower the threshold for B cell receptor signaling pathways. CD19 has a relatively large cytoplasmic tail of 240 amino acids. The extracellular Ig-like domains are divided by a disulfide-linked potential non-Ig-like domain and N-linked carbohydrate addition sites. The cytoplasmic tail contains at least nine tyrosine residues near the C-terminus, some of which have been shown to be phosphorylated . Along with CD20 and CD22, the B-cell lineage-restricted expression of CD19 makes it an attractive target for the therapeutic treatment of B-cell malignancies. Many monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates specific for CD19 have been described (e.g. , Naddafi et al., 2015, PMC4644525). In addition, anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells have been approved to treat leukemia (eg, Sadelain et al. 2017, PMID: 29245005).
[0017] Aspectos da invenção incluem anticorpos multiespecíficos isolados compreendendo: uma primeira subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo uma região constante de lgG4 humana mutada compreendendo as mutações S228P, F234A, L235A e T366W; e uma segunda subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo uma região constante de lgG4 humana mutada compreendendo as mutações S228P, F234A, L235A, T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, a região constante de lgG4 humana mutada da primeira subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada ou a região constante de lgG4 humana mutada da segunda subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada não possui um domínio CH1. Em algumas mo-dalidades, a região constante de lgG4 humana mutada da primeira su-bunidade de polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 73 ou 55, e a região constante de lgG4 humana mutada da segunda subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma sequência de SEQ ID NO: 72 ou 54.[0017] Aspects of the invention include isolated multispecific antibodies comprising: a first heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG4 constant region comprising mutations S228P, F234A, L235A and T366W; and a second heavy chain polypeptide subunit comprising a mutated human IgG4 constant region comprising mutations S228P, F234A, L235A, T366S, L368A and Y407V. In some embodiments, the mutated human IgG4 constant region of the first heavy chain polypeptide subunit or the mutated human IgG4 constant region of the second heavy chain polypeptide subunit lacks a CH1 domain. In some embodiments, the mutated human IgG4 constant region of the first heavy chain polypeptide subunit comprises a sequence of SEQ ID NO: 73 or 55, and the mutated human IgG4 constant region of the second heavy chain polypeptide subunit heavy comprises a sequence of SEQ ID NO: 72 or 54.
[0018] Em algumas modalidades, os anticorpos multiespecíficos de acordo com as modalidades da invenção compreendem ainda uma primeira porção de ligação que tem especificidade de ligação a CD3, compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência CDR1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 36, uma sequência de CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 37 e uma sequência de CDR3 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 38; e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR1 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 39, uma sequência de CDR2 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 40 e uma sequência de CDR3 compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 41.[0018] In some embodiments, multispecific antibodies according to embodiments of the invention further comprise a first binding moiety that has CD3 binding specificity, comprising: a heavy chain variable domain comprising a CDR1 sequence comprising a SEQ ID sequence NO: 36, a CDR2 sequence comprising a sequence of SEQ ID NO: 37 and a CDR3 sequence comprising a sequence of SEQ ID NO: 38; and a light chain variable domain comprising a CDR1 sequence comprising a sequence of SEQ ID NO: 39, a CDR2 sequence comprising a sequence of SEQ ID NO: 40 and a CDR3 sequence comprising a sequence of SEQ ID NO: 41.
[0019] Em aigumas modalidades, as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 no domínio variável de cadeia pesada da primeira porção de ligação estão presentes em uma framework VH humana; e as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 no domínio variável da cadeia leve da primeira porção de ligação estão presentes em uma framework Vkappa humana. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada da primeira porção de ligação compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 42; e o domínio variável de cadeia leve da primeira porção de ligação compreende uma sequência com pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada da primeira porção de ligação compreende a sequência de SEQ ID NO: 42; e o domínio variável de cadeia leve da primeira porção de ligação compreende a sequência de SEQ ID NO: 43.[0019] In some embodiments, the CDR1, CDR2 and CDR3 sequences in the heavy chain variable domain of the first linker are present in a human VH framework; and the CDR1, CDR2 and CDR3 sequences in the light chain variable domain of the first linker are present in a human Vkappa framework. In some embodiments, the heavy chain variable domain of the first linker comprises a sequence having at least 95% identity with SEQ ID NO: 42; and the light chain variable domain of the first linking portion comprises a sequence having at least 95% identity with SEQ ID NO: 43. In some embodiments, the heavy chain variable domain of the first linking portion comprises the sequence of SEQ ID NO: 43. NO: 42; and the light chain variable domain of the first binding portion comprises the sequence of SEQ ID NO: 43.
[0020] Em algumas modalidades, os anticorpos multiespecíficos de acordo com as modalidades da invenção compreendem ainda uma segunda porção de ligação com especificidade de ligação a uma proteína diferente de CD3. Em algumas modalidades, a segunda porção de ligação compreende uma única região variável de cadeia pesada, em uma configuração monovalente ou bivalente. Em algumas modalidades, a primeira porção de ligação compreende uma subunidade de polipep-tídeo de cadeia leve e uma subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada, e em que a segunda porção de ligação compreende uma subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada. Em algumas modalidades, a subunidade de polipeptídeo de cadeia leve da primeira porção de ligação compreende um domínio constante de cadeia leve. Em algumas modalidades, a proteína diferente de CD3 é um antígeno associado a tumor (TAA) ou um antígeno específico de tumor (TSA). Em algumas modalidades, o TAA é o antígeno de maturação de células B (BCMA). Em algumas modalidades, o TAA é GD19. Em algumas modalidades, o TAA é 0 antígeno de membrana específico da próstata (PSMA).[0020] In some embodiments, multispecific antibodies according to embodiments of the invention further comprise a second binding moiety with binding specificity to a protein other than CD3. In some embodiments, the second linking moiety comprises a single heavy chain variable region, in a monovalent or bivalent configuration. In some embodiments, the first linking portion comprises a light chain polypeptide subunit and a heavy chain polypeptide subunit, and wherein the second linking portion comprises a heavy chain polypeptide subunit. In some embodiments, the light chain polypeptide subunit of the first linker comprises a light chain constant domain. In some embodiments, the non-CD3 protein is a tumor associated antigen (TAA) or a tumor specific antigen (TSA). In some embodiments, the TAA is B cell maturation antigen (BCMA). In some embodiments, the TAA is GD19. In some embodiments, the TAA is prostate-specific membrane antigen (PSMA).
[0021] Aspectos da invenção incluem composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo multiespecífico conforme descrito neste documento, polinucleotídeos que codificam um anticorpo multiespecífico conforme descrito neste documento, vetores compreendendo esses polinucleotídeos e células compreendendo esses vetores.[0021] Aspects of the invention include pharmaceutical compositions comprising a multispecific antibody as described herein, polynucleotides encoding a multispecific antibody as described herein, vectors comprising such polynucleotides, and cells comprising such vectors.
[0022] Aspectos da invenção incluem métodos de produção de um anticorpo multiespecífico conforme descrito neste documento, compreendendo o crescimento de uma célula conforme descrito neste documento sob condições permissivas para a expressão do anticorpo multiespecífico e isolamento do anticorpo multiespecífico da célula.[0022] Aspects of the invention include methods of producing a multispecific antibody as described herein, comprising growing a cell as described herein under conditions permissive for expression of the multispecific antibody, and isolating the multispecific antibody from the cell.
[0023] Aspectos da invenção incluem métodos de tratamento que compreendem a administração a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de um anticorpo multiespecífico, ou a composição farmacêutica aqui descrita.[0023] Aspects of the invention include methods of treatment comprising administering to a subject in need of an effective dose of a multispecific antibody, or the pharmaceutical composition described herein.
[0024] Aspectos da invenção incluem o uso de um anticorpo multiespecífico aqui descrito na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade.[0024] Aspects of the invention include the use of a multispecific antibody described herein in the preparation of a medicament for treating a disease or disorder in an individual in need thereof.
[0025] Aspectos da invenção incluem métodos para tratar uma doença ou condição caracterizada pela expressão de BCMA, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de um anticorpo multiespecífico, ou uma composição farmacêutica, aqui descrita. Em algumas modalidades, a doença é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, a doença é um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um mieloma. Em algumas modalidades, o mieloma é mieloma múltiplo.[0025] Aspects of the invention include methods of treating a disease or condition characterized by BCMA expression, comprising administering to a subject in need of an effective dose of a multispecific antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is an autoimmune disease. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a myeloma. In some embodiments, the myeloma is multiple myeloma.
[0026] Aspectos da invenção incluem métodos para tratar uma doença ou condição caracterizada pela expressão de PSMA, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de um anticorpo multiespecífico, ou uma composição farmacêutica, aqui descrita. Em algumas modalidades, a doença é um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de próstata.[0026] Aspects of the invention include methods of treating a disease or condition characterized by PSMA expression, comprising administering to a subject in need of it an effective dose of a multispecific antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is prostate cancer.
[0027] Aspectos da invenção incluem métodos para tratar uma doença ou condição caracterizada pela expressão de CD19, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de um anticorpo multiespecífico, ou uma composição farmacêutica, aqui descrita. Em algumas modalidades, o distúrbio é o linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). Em algumas modalidades, o distúrbio é leucemia linfoblástica aguda (ALL). Em algumas modalidades, o distúrbio é o linfoma não-Hodgkin (NHL). Em algumas modalidades, o distúrbio é lúpus eritematoso sistêmico (SLE). Em algumas modalidades, ο distúrbio é a artrite reumatoide (RA). Em algumas modalidades, o distúrbio é a esclerose múltipla (MS).[0027] Aspects of the invention include methods of treating a disease or condition characterized by CD19 expression, comprising administering to a subject in need of an effective dose of a multispecific antibody, or a pharmaceutical composition, described herein. In some embodiments, the disorder is diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). In some embodiments, the disorder is acute lymphoblastic leukemia (ALL). In some embodiments, the disorder is non-Hodgkin's lymphoma (NHL). In some embodiments, the disorder is systemic lupus erythematosus (SLE). In some embodiments, the disorder is rheumatoid arthritis (RA). In some embodiments, the disorder is multiple sclerosis (MS).
[0028] Aspectos da invenção incluem kits para tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, compreendendo um anticorpo multiespecífico ou uma composição farmacêutica, aqui descrita, e instruções de uso. Em algumas modalidades, um kit compreende ainda pelo menos um reagente adicional. Em algumas modalidades, o pelo menos um reagente adicional compreende um fármaco qui-mioterapêutico.[0028] Aspects of the invention include kits for treating a disease or disorder in an individual in need thereof, comprising a multispecific antibody or pharmaceutical composition, described herein, and instructions for use. In some embodiments, a kit further comprises at least one additional reagent. In some embodiments, the at least one additional reagent comprises a chemotherapeutic drug.
[0029] Aspectos da invenção incluem moléculas semelhantes a anticorpos de três cadeias biespecíficas compreendendo: uma primeira subunidade de polipeptídeo compreendendo: um domínio variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 43; e um domínio constante de cadeia leve (CL); uma segunda subunidade de polipeptídeo compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 42; e um domínio constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 72 ou 73; em que o domínio variável de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada juntos formam uma primeira porção de ligação que tem especificidade de ligação a CD3; e uma terceira subunidade de polipeptídeo compreendendo: uma região variável somente de cadeia pesada, em uma configuração monovalente ou biva-lente, que tem especificidade de ligação a uma proteína diferente de CD3; e um domínio constante de cadeia pesada (CH) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 54 ou 55. Em algumas modalidades, a terceira subunidade de polipeptídeo compreende uma região variável somente de cadeia pesada em uma configuração bivalente que tem especificidade de ligação a BCMA.[0029] Aspects of the invention include bispecific three-chain antibody-like molecules comprising: a first polypeptide subunit comprising: a light chain variable domain (VL) comprising a sequence of SEQ ID NO: 43; and a light chain constant domain (CL); a second polypeptide subunit comprising: a heavy chain variable domain (VH) comprising a sequence of SEQ ID NO: 42; and a constant heavy chain (CH) domain comprising a sequence of SEQ ID NO: 72 or 73; wherein the light chain variable domain and the heavy chain variable domain together form a first binding moiety that has CD3 binding specificity; and a third polypeptide subunit comprising: a heavy-chain-only variable region, in a monovalent or bivalent configuration, that has binding specificity to a protein other than CD3; and a constant heavy-chain (CH) domain comprising a sequence of SEQ ID NO: 54 or 55. In some embodiments, the third polypeptide subunit comprises a heavy-chain-only variable region in a bivalent configuration that has BCMA binding specificity .
[0030] Aspectos da invenção incluem moléculas semelhantes a anticorpos de três cadeias biespecíficas compreendendo: uma primeira subunidade de polipeptídeo compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 49; uma segunda subunidade de polipeptídeo compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 56; e uma terceira subunidade de polipeptídeo compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 58.[0030] Aspects of the invention include bispecific three-chain antibody-like molecules comprising: a first polypeptide subunit comprising a sequence of SEQ ID NO: 49; a second polypeptide subunit comprising a sequence of SEQ ID NO: 56; and a third polypeptide subunit comprising a sequence of SEQ ID NO: 58.
[0031] Aspectos da invenção incluem composições farmacêuticas compreendendo uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico aqui descrita, polinucleotídeos que codificam uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico aqui descrita, vetores compreendendo tais polinucleotídeos e células compreendendo tais vetores.[0031] Aspects of the invention include pharmaceutical compositions comprising a bispecific three-chain antibody-like molecule described herein, polynucleotides encoding a bispecific three-chain antibody-like molecule described herein, vectors comprising such polynucleotides, and cells comprising such vectors.
[0032] Aspectos da invenção incluem métodos de produção de uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico aqui descrita, compreendendo o crescimento de uma célula aqui descrita sob condições permissivas para a expressão da molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico e o isolamento da molécula de três cadeias biespecífica molécula semelhante a anticorpo da célula.[0032] Aspects of the invention include methods of producing a bispecific three-chain antibody-like molecule described herein, comprising growing a cell described herein under conditions permissive for expression of the bispecific three-chain antibody-like molecule and isolating the bispecific three-chain molecule antibody-like molecule of the cell.
[0033] Aspectos da invenção incluem métodos de tratamento, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico, ou uma composição farmacêutica, aqui descrita.[0033] Aspects of the invention include methods of treatment, comprising administering to a subject in need of an effective dose of a bispecific three-chain antibody-like molecule, or a pharmaceutical composition, described herein.
[0034] Aspectos da invenção incluem o uso de uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico aqui descrita na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade.[0034] Aspects of the invention include the use of a bispecific three-chain antibody-like molecule described herein in the preparation of a medicament for treating a disease or disorder in an individual in need thereof.
[0035] Aspectos da invenção incluem métodos para o tratamento de uma doença ou condição caracterizada pela expressão de BCMA, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma dose eficaz de uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico, ou uma composição farmacêutica, aqui descrita. Em algumas modalidades, a doença é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, a doença é um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um mieloma. Em algumas modalidades, o mieloma é mieloma múltiplo.[0035] Aspects of the invention include methods for treating a disease or condition characterized by BCMA expression, comprising administering to a subject in need of an effective dose of a bispecific three-chain antibody-like molecule, or a pharmaceutical composition, described here. In some embodiments, the disease is an autoimmune disease. In some embodiments, the disease is a cancer. In some embodiments, the cancer is a myeloma. In some embodiments, the myeloma is multiple myeloma.
[0036] Aspectos da invenção incluem kits para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade, compreendendo uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico, ou uma composição farmacêutica, aqui descrita, e instruções de uso. Em algumas modalidades, um kit compreende ainda pelo menos um reagente adicional. Em algumas modalidades, o pelo menos um reagente adicional compreende um fármaco quimioterapêutico.[0036] Aspects of the invention include kits for treating a disease or disorder in an individual in need thereof, comprising a bispecific three-chain antibody-like molecule, or a pharmaceutical composition, described herein, and instructions for use. In some embodiments, a kit further comprises at least one additional reagent. In some embodiments, the at least one additional reagent comprises a chemotherapeutic drug.
[0037] Estes e outros aspectos serão explicados no restante da divulgação, incluindo os Exemplos.[0037] These and other aspects will be explained in the remainder of the disclosure, including the Examples.
[0038] A FIG. 1, painéis A-C, fornece ilustrações de vários anticorpos multiespecíficos de acordo com modalidades da invenção.[0038] FIG. 1, panels A-C, provide illustrations of various multispecific antibodies in accordance with embodiments of the invention.
[0039] A FIG. 2, painéis A-B, mostra imagens de análises SDS-PAGE não redutoras de várias espécies de anticorpos purificadas por meio de cromatografia de proteína A.[0039] FIG. 2, panels A-B, shows images from non-reducing SDS-PAGE analyzes of various antibody species purified by protein A chromatography.
[0040] A FIG. 3, painel A, mostra uma imagem de análise SDS-PAGE não redutora de várias espécies de anticorpos purificadas por meio de cromatografia de proteína A. O painel B mostra uma imagem de uma análise SDS-PAGE redutora da mesma espécie de anticorpo mostrada no painel A.[0040] FIG. 3, Panel A, shows a non-reducing SDS-PAGE analysis image of several antibody species purified by protein A chromatography. Panel B shows a reducing SDS-PAGE analysis image of the same antibody species shown in panel A.
[0041] Na FIG. 4, os painéis A-D são gráficos que representam interações entre receptor gama Fc - anticorpo para várias espécies de anticorpos IgG1 de acordo com modalidades da invenção.[0041] In FIG. 4, Panels A-D are graphs depicting Fc receptor gamma - antibody interactions for various species of IgG1 antibodies in accordance with embodiments of the invention.
[0042] Na FIG. 5, os painéis A-E são gráficos que representam interações entre receptor gama Fc-anticorpo para várias espécies de anticorpos lgG4 de acordo com modalidades da invenção.[0042] In FIG. 5, Panels A-E are graphs depicting Fc receptor gamma-antibody interactions for various species of IgG4 antibodies in accordance with embodiments of the invention.
[0043] Na FIG. 6, os painéis A-D são gráficos que representam as interações receptor-gama Fc-anticorpo para várias espécies de anticorpos IgG1 de acordo com modalidades da invenção.[0043] In FIG. 6, Panels A-D are graphs depicting receptor-Fc gamma-antibody interactions for various species of IgG1 antibodies in accordance with embodiments of the invention.
[0044] Na FIG. 7, os painéis A-E são gráficos que representam interações entre receptor gama Fc - anticorpo para várias espécies de anticorpos lgG4 de acordo com modalidades da invenção.[0044] In FIG. 7 , Panels A-E are graphs depicting Fc receptor gamma - antibody interactions for various species of IgG4 antibodies in accordance with embodiments of the invention.
[0045] Na FIG. 8, o painel A é um gráfico que mostra a ligação celular ao PSMA humano. Na FIG. 8, o painel B é um gráfico que mostra a ligação celular ao PSMA de macaco cynomolgus.[0045] In FIG. 8, panel A is a graph showing cellular binding to human PSMA. In FIG. 8, panel B is a graph showing cellular binding to cynomolgus monkey PSMA.
[0046] A FIG. 9 é um gráfico que representa a lise mediada por células T de células positivas para PSMA usando células T não estimuladas.[0046] FIG. 9 is a graph depicting T cell mediated lysis of PSMA positive cells using unstimulated T cells.
[0047] A FIG. 10 é um gráfico que representa a lise mediada por células T de células positivas para PSMA usando células T pré-ativadas.[0047] FIG. 10 is a graph depicting T cell mediated lysis of PSMA positive cells using preactivated T cells.
[0048] A FIG. 11 é um gráfico que representa a porcentagem de lise específica de células DU145 negativas para PSMA em função da concentração de anticorpos multiespecíficos na presença de células T pré-ativadas.[0048] FIG. 11 is a graph depicting the percentage of specific lysis of PSMA-negative DU145 cells as a function of multispecific antibody concentration in the presence of preactivated T cells.
[0049] A FIG. 12 é um gráfico que mostra a ligação de anticorpos biespecíficos PSMA x CD3 a células positivas e negativas de PSMA.[0049] FIG. 12 is a graph showing binding of PSMA x CD3 bispecific antibodies to PSMA positive and negative cells.
[0050] A FIG. 13 é um gráfico que mostra a lise mediada por células T de células positivas para PSMA.[0050] FIG. 13 is a graph showing T cell mediated lysis of PSMA positive cells.
[0051] Na FIG. 14, o painel A, é um gráfico que representa a lise mediada por células T de células positivas para PSMA em função da concentração de anticorpos. O painel B é um gráfico que mostra a liberação de citocinas (IFNγ) em função da concentração de anticorpos. O painel C é um gráfico que mostra a liberação de citocinas (IL-2) em função da concentração de anticorpos.[0051] In FIG. 14, panel A, is a graph depicting T cell-mediated lysis of PSMA-positive cells as a function of antibody concentration. Panel B is a graph showing cytokine (IFNγ) release as a function of antibody concentration. Panel C is a graph showing cytokine (IL-2) release as a function of antibody concentration.
[0052] Na FIG. 15, o painel A, é um gráfico que representa a proliferação de células T em função da concentração de anticorpos. O painel B é um gráfico que representa a proliferação de células T em função da concentração de anticorpos. O painel C é um gráfico que representa a razão de CD8 para CD4 de células T proliferadas. O painel D é um gráfico que representa a razão de CD8 para CD4 de células T proliferadas.[0052] In FIG. 15, panel A, is a graph depicting T cell proliferation as a function of antibody concentration. Panel B is a graph plotting T cell proliferation as a function of antibody concentration. Panel C is a graph depicting the ratio of CD8 to CD4 of proliferating T cells. Panel D is a graph depicting the ratio of CD8 to CD4 of proliferating T cells.
[0053] A FIG. 16 é um gráfico que representa a inibição do crescimento do tumor 22Rv1 em um modelo de xenoenxerto de tumor.[0053] FIG. 16 is a graph depicting the inhibition of 22Rv1 tumor growth in a tumor xenograft model.
[0054] A FIG. 17 é um gráfico que representa a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos mostrados na legenda.[0054] FIG. 17 is a graph depicting % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibodies shown in the legend.
[0055] A FIG. 18 é um gráfico que representa a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos mostrados na legenda.[0055] FIG. 18 is a graph depicting % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibodies shown in the legend.
[0056] A FIG. 19 é um gráfico que representa a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos mostrados na legenda.[0056] FIG. 19 is a graph depicting % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibodies shown in the legend.
[0057] A FIG. 20 é um gráfico que representa a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos mostrados na legenda.[0057] FIG. 20 is a graph depicting % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibodies shown in the legend.
[0058] A FIG. 21, painéis A-D, fornece vários gráficos que representam a lise de células tumorais mediada por anticorpos biespecíficos. Anticorpos biespecíficos anti-CD3 x anti-BCMA foram testados quanto à capacidade de matar três células tumorais BCMA+ diferentes e uma linhagem de células negativa para BCMA através do redirecionamento de células T primárias ativadas. Neste experimento, as células tumorais foram misturadas com células pan T ativadas em uma razão E:T de 10:1 juntamente com a adição de anticorpo biespecífico. O painel A mostra a morte de células RPMI-8226, o painel B mostra a morte de células NCI-H929, 0 painel C mostra a morte de células U-266 e o painel D mostra a morte de células K562, um controle negativo. O eixo x mostra a concentração do anticorpo usado e o eixo y mostra a % de lise das células tumorais 6 horas após a adição do anticorpo.[0058] FIG. 21, panels A-D, provides several graphs depicting bispecific antibody-mediated lysis of tumor cells. Bispecific anti-CD3 x anti-BCMA antibodies were tested for their ability to kill three different BCMA+ tumor cells and a BCMA-negative cell line by redirecting activated primary T cells. In this experiment, tumor cells were mixed with activated pan T cells at an E:T ratio of 10:1 along with the addition of bispecific antibody. Panel A shows death of RPMI-8226 cells, panel B shows death of NCI-H929 cells, panel C shows death of U-266 cells, and panel D shows death of K562 cells, a negative control. The x-axis shows the concentration of antibody used and the y-axis shows the % lysis of tumor cells 6 hours after adding the antibody.
[0059] A FIG. 22, painéis A-D, fornece vários gráficos que representam a liberação de IL-2 mediada por anticorpos biespecíficos. O nível de liberação de citocina IL-2 foi medido após células T humanas em repouso terem sido cultivadas com várias linhagens de células tumorais e doses crescentes de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-BCMA. O painel A mostra a liberação de IL-2 estimulada por células RPMI-8226, 0 painel B mostra a liberação de IL-2 estimulada por células NCI-H929, 0 painel C mostra a liberação de IL-2 estimulada por células U-266 e o painel D mostra a liberação de IL-2 estimulado por células K562, um controle negativo.[0059] FIG. 22, Panels A-D, provides several graphs depicting bispecific antibody-mediated IL-2 release. The level of IL-2 cytokine release was measured after resting human T cells were cultured with various tumor cell lines and increasing doses of anti-BCMA anti-CD3x bispecific antibody. Panel A shows IL-2 release stimulated by RPMI-8226 cells, Panel B shows IL-2 release stimulated by NCI-H929 cells, Panel C shows IL-2 release stimulated by U-266 cells and panel D shows IL-2 release stimulated by K562 cells, a negative control.
[0060] A FIG. 23, painéis A-D, fornece vários gráficos que descrevem a liberação de IFN-γ mediada por anticorpos biespecíficos. O nível de liberação de citocina IFN-γ foi medido após células T humanas em repouso terem sido cultivadas com várias linhagens de células tumorais e doses crescentes de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-BCMA. O painel A mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células RPMI-8226, 0 painel B mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células NCI-H929, o painel C mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células U-266 e o painel D mostra a liberação de IFN-γ estimulado por células K562, um controle negativo.[0060] FIG. 23, panels A-D, provides several graphs depicting bispecific antibody-mediated IFN-γ release. The level of IFN-γ cytokine release was measured after resting human T cells were cultured with various tumor cell lines and increasing doses of anti-BCMA anti-CD3x bispecific antibody. Panel A shows IFN-γ release stimulated by RPMI-8226 cells, panel B shows IFN-γ release stimulated by NCI-H929 cells, panel C shows IFN-γ release stimulated by U-266 cells and panel D shows IFN-γ release stimulated by K562 cells, a negative control.
[0061] A FIG. 24 é uma imagem de uma análise SDS-PAGE não redutora de várias espécies de anticorpos purificadas por meio de cro-matografia de proteína A.[0061] FIG. 24 is an image from a non-reducing SDS-PAGE analysis of various antibody species purified by protein A chromatography.
[0062] A FIG. 25 é uma tabela que mostra a % de espécies HMW, a % de monômeros e a % de espécies LMW de amostras dos construtos indicados após purificação.[0062] FIG. 25 is a table showing % HMW species, % monomers, and % LMW species of samples of the indicated constructs after purification.
[0063] Na FIG. 26, os painéis A-D são gráficos que representam interações de receptor gama Fc-anticorpo para várias espécies de anticorpos lgG4 de acordo com modalidades da invenção.[0063] In FIG. 26, Panels A-D are graphs depicting Fc receptor gamma-antibody interactions for various species of IgG4 antibodies in accordance with embodiments of the invention.
[0064] Na FIG. 27, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xBCMA mostrados na legenda.[0064] In FIG. 27, panels A and B are graphs representing the % CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xBCMA bispecific antibodies shown in subtitle.
[0065] Na FIG. 28, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xBCMA mostrados na legenda.[0065] In FIG. 28, panels A and B are graphs plotting % CD4+CD69+ T cells (panel A) and % CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of bispecific antibody concentration for the CD3xBCMA bispecific antibodies shown in subtitle.
[0066] Na FIG. 29, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xBCMA mostrados na legenda.[0066] In FIG. 29, panels A and B are graphs plotting % CD4+CD69+ T cells (panel A) and % CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of bispecific antibody concentration for the CD3xBCMA bispecific antibodies shown in subtitle.
[0067] Na FIG. 30, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xPSMA mostrados na legenda.[0067] In FIG. 30, panels A and B are graphs representing the % CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xPSMA bispecific antibodies shown in subtitle.
[0068] Na FIG. 31, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xPSMA mostrados na legenda.[0068] In FIG. 31, panels A and B are graphs representing the % of CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % of CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xPSMA bispecific antibodies shown in subtitle.
[0069] Na FIG. 32, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xPSMA mostrados na legenda.[0069] In FIG. 32, panels A and B are graphs representing the % of CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % of CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xPSMA bispecific antibodies shown in subtitle.
[0070] Na FIG. 33, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xCD19 mostrados na legenda.[0070] In FIG. 33, panels A and B are graphs representing the % of CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % of CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xCD19 bispecific antibodies shown in the figure. subtitle.
[0071] Na FIG. 34, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xCD19 mostrados na legenda.[0071] In FIG. 34, panels A and B are graphs representing the % of CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % of CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xCD19 bispecific antibodies shown in the figure. subtitle.
[0072] Na FIG. 35, os painéis A e B são gráficos que representam a % de células T CD4+CD69+ (painel A) e a % de células T CD8+CD69+ (painel B) em função da concentração de anticorpos biespecíficos para os anticorpos biespecíficos CD3xCD19 mostrados na legenda.[0072] In FIG. 35, panels A and B are graphs representing the % of CD4+CD69+ T cells (panel A) and the % of CD8+CD69+ T cells (panel B) as a function of the concentration of bispecific antibodies for the CD3xCD19 bispecific antibodies shown in the figure. subtitle.
[0073] A prática da presente invenção utilizará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imuno-logia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são amplamente explicadas na literatura, tais como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Síntese de Oligonucleotídeos" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.l. Freshney, ed., 1987); "Métodos em Enzimologia" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. Μ. Ausubel et al., eds., 1987, e atualizações periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "Um Guia Prático de Clonagem Molecular" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane e Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); e Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).[0073] The practice of the present invention will utilize, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques), microbiology, cell biology, biochemistry and immunology, which are within the skill in the art. Such techniques are fully explained in the literature, such as, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Synthesis of Oligonucleotides" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.L. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. Μ. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).
[0074] Quando um intervalo de valores é fornecido, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro declarado ou o valor intermediário nessa faixa indicada está englobado na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser incluídos independentemente nas faixas menores também estão englobadas na invenção, sujeitas a qualquer limite especificamente excluído na faixa indicada. Quando a faixa indicada inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo um ou ambos os limites incluídos também estão incluídos na invenção.[0074] When a range of values is given, it is understood that each intermediate value, up to one tenth of a unit of the lower limit, unless the context clearly indicates otherwise, between the upper and lower limits of that range and any other stated or the intermediate value in this indicated range is included in the invention. The upper and lower limits of these minor ranges may independently be included in the minor ranges also encompassed by the invention, subject to any limits specifically excluded in the indicated range. When the indicated range includes one or both of the limits, ranges excluding one or both of the included limits are also included in the invention.
[0075] Salvo indicação em contrário, os resíduos de anticorpos neste documento são numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).[0075] Unless otherwise noted, antibody residues in this document are numbered according to the Kabat numbering system (eg, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[0076] Na descrição a seguir, vários detalhes específicos são apresentados para fornecer uma compreensão mais abrangente da presente invenção. No entanto, será evidente para um versado na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem um ou mais desses detalhes específicos. Em outros casos, características e procedimentos bem conhecidos dos especialistas na técnica não foram descritos para evitar obscurecer a invenção.[0076] In the following description, several specific details are presented to provide a more comprehensive understanding of the present invention. However, it will be apparent to one skilled in the art that the present invention can be practiced without one or more of these specific details. In other cases, features and procedures well known to those skilled in the art have not been described to avoid obscuring the invention.
[0077] Todas as referências citadas ao longo da divulgação, incluindo pedidos de patente e publicações, estão incorporadas por referência aqui em sua totalidade.[0077] All references cited throughout the disclosure, including patent applications and publications, are incorporated by reference herein in their entirety.
[0078] Por "compreendendo" entende-se que os elementos citados são necessários na composição/método/kit, mas outros elementos podem ser incluídos para formar a composiçâo/método/kit etc. dentro do escopo da reivindicação.[0078] By "comprising" it is understood that the aforementioned elements are necessary in the composition/method/kit, but other elements may be included to form the composition/method/kit etc. within the scope of the claim.
[0079] Por "consistindo essencialmente em", entende-se uma limitação do escopo da composição ou método descrito para os materiais ou etapas especificadas que não afetam materialmente as características básicas e novas da invenção em questão.[0079] By "consisting essentially of", it is meant a limitation of the scope of the described composition or method to the specified materials or steps that do not materially affect the basic and novel characteristics of the invention in question.
[0080] Por "consistindo em", entende-se a exclusão da composição, método ou kit de qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação.[0080] By "consisting of", it is meant the exclusion of the composition, method or kit of any element, step or ingredient not specified in the claim.
[0081] Os resíduos de anticorpos neste documento são numerados de acordo com o sistema de numeração Kabat e o sistema de numeração EU. O sistema de numeração Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Saúde, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo IgG1 EU humano. Salvo indicação em contrário neste documento, as referências a números de resíduos no domínio variável de anticorpos significam a numeração de resíduos pelo sistema de numeração Kabat. Salvo indicação em contrário neste documento, referências a números de resíduos no domínio constante de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de numeração EU.[0081] The antibody residues in this document are numbered according to the Kabat numbering system and the EU numbering system. The Kabat numbering system is generally used when referring to a residue in the variable domain (approximately residues 1-113 of the heavy chain) (eg, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). The "EU numbering system" or "EU index" is generally used when referring to a residue in an immunoglobulin heavy chain constant region (e.g., the EU index reported in Kabat et al., supra). The "EU index as in Kabat" refers to the residue numbering of the human IgG1 EU antibody. Unless otherwise indicated herein, references to residue numbers in the variable domain of antibodies mean residue numbering by the Kabat numbering system. Unless otherwise indicated herein, references to residue numbers in the constant domain of antibodies mean residue numbering by the EU numbering system.
[0082] Um "anticorpo" ou "imunoglobulina" refere-se a uma molécula compreendendo pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde o domínio amino terminal das cadeias pesada e leve ê variável em sequência, portanto, ê comumente referido como uma variável domínio de região, ou um domínio variável pesado (VH) ou variável leve (VH). Os dois domínios se associam convencionalmente para formar uma região de ligação específica, embora, como será discutido aqui, a ligação específica também possa ser obtida com sequências variáveis apenas de cadeia pesada, e uma variedade de configurações não naturais de anticorpos são conhecidas e usadas na técnica.[0082] An "antibody" or "immunoglobulin" refers to a molecule comprising at least one heavy chain and one light chain, where the amino terminal domain of the heavy and light chains is variable in sequence, hence it is commonly referred to as a variable region domain, or a variable heavy (VH) or variable light (VH) domain. The two domains associate conventionally to form a specific binding region, although, as will be discussed here, specific binding can also be achieved with heavy chain variable sequences only, and a variety of non-natural antibody configurations are known and used in technique.
[0083] Um anticorpo "funcional" ou "biologicamente ativo" ou molécula de ligação ao antígeno (incluindo anticorpos somente de cadeia pesada e moléculas semelhantes a anticorpos de três cadeias multies-pecíficas (por exemplo, biespecíficas) (TCAs), descritas neste documento) é um capaz de exercer uma ou mais de suas atividades naturais em eventos estruturais, regulatórios, bioquímicos ou biofísicos. Por exemplo, um anticorpo funcional ou outra molécula de ligação, por exemplo, um TCA, pode ter a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno e a ligação pode, por sua vez, induzir ou alterar um evento celular ou molecular, como transdução de sinal ou atividade enzimática. Um anticorpo funcional ou outra molécula de ligação, por exemplo, um TCA, também pode bloquear a ativação do ligante de um receptor ou atuar como agonista ou antagonista. A capacidade de um anticorpo ou outra molécula de ligação, por exemplo, um TCA, de exercer uma ou mais de suas atividades naturais depende de vários fatores, incluindo dobramento e montagem adequados das cadeias polipeptídicas.[0083] A "functional" or "biologically active" antibody or antigen-binding molecule (including heavy-chain-only antibodies and multispecific (e.g., bispecific) three-chain antibody-like molecules (TCAs), described herein ) is capable of exerting one or more of its natural activities in structural, regulatory, biochemical or biophysical events. For example, a functional antibody or other binding molecule, e.g., a TCA, may have the ability to specifically bind to an antigen, and the binding may, in turn, induce or alter a cellular or molecular event, such as gene transduction. enzymatic signal or activity. A functional antibody or other binding molecule, for example a TCA, can also block ligand activation of a receptor or act as an agonist or antagonist. The ability of an antibody or other binding molecule, for example a TCA, to exert one or more of its natural activities depends on several factors, including proper folding and assembly of polypeptide chains.
[0084] O termo anticorpo pode fazer referência a uma cadeia pesada de comprimento total, uma cadeia leve de comprimento total, uma molécula de imunoglobulina intacta; ou uma porção imunologicamente ativa de qualquer um desses polipeptídeos, ou seja, um polipeptídeo que compreende um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoes-pecificamente a um antígeno de um alvo de interesse ou parte dele, tais alvos incluindo, mas não limitado a, células cancerígenas ou células que produzem células autoimunes anticorpos associados a uma doença au-toimune. A imunoglobulina aqui divulgada pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina, incluindo subclasses projetadas com porções Fc alteradas que proporcionam atividade celular efetora reduzida ou aumentada. As cadeias leves dos anticorpos em questão podem ser cadeias leves kapa (Vkappa) ou cadeias leves lambda (VIambda). As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Em um aspecto, a imunoglobulina é em grande parte de origem humana.[0084] The term antibody can refer to a full-length heavy chain, a full-length light chain, an intact immunoglobulin molecule; or an immunologically active portion of any such polypeptide, i.e., a polypeptide comprising an antigen-binding site that immunospecifically binds to an antigen of a target of interest or part thereof, such targets including, but not limited to , cancer cells or cells that produce autoimmune antibodies associated with an autoimmune disease. The immunoglobulin disclosed herein may be of any type (e.g. IgG, IgE, IgM, IgD and IgA), class (e.g. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass of immunoglobulin molecule, including subclasses designed with altered Fc portions that provide reduced or increased effector cell activity. The light chains of the antibodies in question may be kappa light chains (Vkappa) or lambda light chains (VIambda). Immunoglobulins can be derived from any species. In one aspect, the immunoglobulin is largely of human origin.
[0085] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlo-nais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Os anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, e também pode ser feito através de métodos de produção de proteína recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4.816.567), por exemplo.[0085] The term "monoclonal antibody", as used herein, refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies comprising the population are identical, except for possible mutations of naturally occurring that may be present in smaller amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. Furthermore, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. Monoclonal antibodies according to the present invention can be produced by the hybridoma method first described by Kohler et al. (1975) Nature 256:495, and can also be made by recombinant protein production methods (see, for example, U.S. Patent No. 4,816,567), for example.
[0086] O termo "variável", conforme usado em conexão com anticorpos, refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis do anticorpo diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade nâo é distribuída uniformemente pelos domínios variáveis dos anticorpos. Ele está concentrado em três segmentos chamados regiões hipervariáveis tanto na cadeia leve quanto nos domínios variáveis da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de framework (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro FRs, adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam laços conectando e, em alguns casos, fazendo parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelos FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).[0086] The term "variable", as used in connection with antibodies, refers to the fact that certain portions of antibody variable domains differ extensively in sequence among antibodies and are used in the binding and specificity of each antibody specific to its specific antigen. However, the variability is not evenly distributed across the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called hypervariable regions in both the light chain and the heavy chain variable domains. The most highly conserved portions of variable domains are called framework regions (FRs). The variable domains of native heavy and light chains each comprise four FRs, largely adopting a β-sheet configuration, connected by three hypervariable regions, which form loops connecting and, in some cases, forming part of the β-sheet structure. The hypervariable regions on each chain are held together in close proximity by the FRs and, with the hypervariable regions on the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Constant domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit various effector functions, such as the antibody's participation in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC).
[0087] O termo "região hipervariável" quando usado neste documento refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al.. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "laço hipervariável" resíduos 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Em algumas modalidades, "CDR" significa uma região determinante de complementaridade de um anticorpo conforme definido em Lefranc, MP et al., IMGT, 0 banco de dados internacional ImMunoGeneTics, Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999). Resíduos de "Região de Framework" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não sejam a região hiper-variável/resíduos de CDR como aqui definidos.[0087] The term "hypervariable region" when used herein refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding. The hypervariable region generally comprises amino acid residues from a "complementarity determining region" or "CDR" (e.g., residues 31-35 (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3) in the chain variable domain Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) and/or those residues of a "hypervariable loop" residues 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the heavy chain variable domain; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). In some embodiments, "CDR" means a complementarity determining region of an antibody as defined in Lefranc, MP et al., IMGT, ImMunoGeneTics International Database, Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999). "Framework Region" or "FR" residues are those variable domain residues other than the hyper-variable region/CDR residues as defined herein.
[0088] As designações de CDR exemplificativass são mostradas neste documento, no entanto, um versado na técnica entenderá que várias definições das CDRs são comumente em uso, incluindo a definição de Kabat (ver "Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol Immunol. 2010;47:694-700), que é baseado na variabilidade de sequência e é o mais comumente usado. A definição de Chothia é baseada na localização das regiões de alças estruturais (Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989; 342:877-883). As definições alternativas de CDR de interesse incluem, sem limitação, aquelas divulgadas por Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool". J Mol Biol. 2001 ;309:657-670; Ofran et al. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes." J Immunol. 2008; 181:6230-6235; Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132-143; e Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995;9:133-139, cada um dos quais está aqui especificamente incorporado por referência.[0088] Exemplary CDR designations are shown in this document, however, one skilled in the art will understand that several definitions of CDRs are commonly in use, including Kabat's definition (see "Zhao et al. A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions." Mol Immunol. 2010;47:694-700), which is based on sequence variability and is the most commonly used. The definition of Chothia is based on the location of the structural loop regions (Chothia et al. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989; 342:877-883). Alternative CDR definitions of interest include, without limitation, those disclosed by Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool". J Mol Biol. 2001;309:657-670; Ofran et al. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B-cell epitopes." J Immunol. 2008; 181:6230-6235; Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires." J Mol Recognit. 2004;17:132-143; and Padlanet al. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995;9:133-139, each of which is specifically incorporated herein by reference.
[0089] Os termos "anticorpo somente de cadeia pesada" e "anticorpo de cadeia pesada" são usados de forma intercambiável neste documento e referem-se, no sentido mais amplo, a anticorpos ou uma ou mais porções de um anticorpo, por exemplo, um ou mais braços de um anticorpo, sem a cadeia leve de um anticorpo convencional. Os termos incluem especificamente, sem limitação, anticorpos homodiméricos compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VH e os domínios constantes CH2 e CH3, na ausência do domínio CH1; variantes funcionais (ligação ao antígeno) de tais anticorpos, variantes VH solúveis, Ig-NAR compreendendo um homodímero de um domínio variável (V-NAR) e cinco domínios constantes semelhantes a C (C-NAR) e seus fragmentos funcionais; e anticorpos solúveis de domínio único (sUniDabsTM). Em uma modalidade, um anticorpo somente de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno de região variável composto por framework 1, CDR1, framework 2, CDR2, framework 3, CDR3 e framework 4. Em outra modalidade, uma estrutura somente de cadeia pesada o anticorpo é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e domínios CH2 e CH3. Em outra modalidade, um anticorpo somente de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio CH2. Em outra modalidade, um anticorpo somente de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio CH3. Anticorpos somente de cadeia pesada nos quais o domínio CH2 e/ou CH3 é truncado também estão incluídos neste documento. Em outra modalidade, uma cadeia pesada é composta por um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio CH (CH1, CH2, CH3 ou CH4), mas nenhuma região de dobradiça. O anticorpo somente de cadeia pesada pode estar na forma de um dímero, no qual duas cadeias pesadas são ligadas por dissulfeto ou de outra forma, covalentemente ou não covalentemente, ligadas uma à outra. O anticorpo somente de cadeia pesada pode pertencer à subclasse IgG, mas os anticorpos pertencentes a outras subclasses, como a subclasse IgM, IgA, IgD e IgE, também estão incluídos neste documento. Em uma modalidade particular, um anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4, em particular o subtipo IgG1. Em uma modalidade, os anticorpos apenas de cadeia pesada aqui são usados como um domínio de ligação (direcionamento) de um receptor de antígeno quimérico (CAR). A definição inclui especificamente anticorpos somente de cadeia pesada humana produzidos por ratos transgênicos de imunoglobulina humana (UniRatTM), chamados UniAbsTM. As regiões variáveis (VH) do UniAbsTM são chamadas de UniDabsTMe são blocos de construção versáteis que podem ser ligados a regiões Fc ou albumina sérica para o desenvolvimento de novas terapêuticas com multiespecificidade, potência aumentada e meia-vida estendida. Uma vez que o UniAbs™ homodimérico não possui uma cadeia leve e, portanto, um domínio VL, o antígeno é reconhecido por um único domínio, ou seja, o domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo de cadeia pesada (VH ou VHH).[0089] The terms "heavy-chain-only antibody" and "heavy-chain antibody" are used interchangeably herein and refer, in the broadest sense, to antibodies or one or more portions of an antibody, e.g. one or more arms of an antibody, without the light chain of a conventional antibody. The terms specifically include, without limitation, homodimeric antibodies comprising the VH antigen-binding domain and the CH2 and CH3 constant domains, in the absence of the CH1 domain; functional (antigen-binding) variants of such antibodies, soluble VH variants, Ig-NAR comprising a homodimer of one variable domain (V-NAR) and five C-like constant domains (C-NAR) and functional fragments thereof; and single domain soluble antibodies (sUniDabsTM). In one embodiment, a heavy-chain-only antibody is composed of a variable region antigen-binding domain composed of framework 1, CDR1,
[0090] Uma "cadeia de anticorpo intacta" como aqui utilizada é aquela que compreende uma região variável de comprimento total e uma região constante de comprimento total (Fc). Um anticorpo "convencional" intacto compreende uma cadeia leve intacta e uma cadeia pesada intacta, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, dobradiça, CH2 e CH3 para IgG secretada. Outros isotipos, como IgM ou IgA, podem ter diferentes domínios CH. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou suas variantes de sequência de aminoáci-dos. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais "funções efetoras" que se referem ás atividades biológicas atribuíveis á região constante Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação a C1q; citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; e regulação negativa dos receptores da superfície celular. Variantes de região constante incluem aquelas que alteram o perfil efetor, ligação a receptores Fc e similares.[0090] An "intact antibody chain" as used herein is one that comprises a full-length variable region and a full-length constant region (Fc). An intact "conventional" antibody comprises an intact light chain and an intact heavy chain, as well as a light chain constant domain (CL) and heavy chain constant domains, CH1, hinge, CH2 and CH3 for secreted IgG. Other isotypes, such as IgM or IgA, may have different CH domains. The constant domains can be native sequence constant domains (e.g., human native sequence constant domains) or amino acid sequence variants thereof. The intact antibody can have one or more "effector functions" which refer to the biological activities attributable to the constant Fc region (either a native sequence Fc region or amino acid sequence variant Fc region) of an antibody. Examples of antibody effector functions include binding to C1q; complement-dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; and downregulation of cell surface receptors. Constant region variants include those that alter the effector profile, binding to Fc receptors, and the like.
[0091] Dependendo da sequência de aminoácidos do Fc (domínio constante) de suas cadeias pesadas, anticorpos e várias proteínas de ligação ao antígeno podem ser fornecidos como classes diferentes. Existem cinco classes principais de regiões Fc de cadeia pesada: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes Fc que correspondem às diferentes classes de anticorpos podem ser referenciados como a, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. As formas de Ig incluem modificações de dobradiça ou formas sem dobradiça (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos, denominados κ (kappa) e λ (lambda), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Os anticorpos de acordo com as modalidades da invenção podem compreender sequências de cadeia leve kapa ou sequências de cadeia leve lambda.[0091] Depending on the amino acid sequence of the Fc (constant domain) of its heavy chains, antibodies and various antigen-binding proteins can be provided as different classes. There are five main classes of heavy chain Fc regions: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and several of these can be divided into "subclasses" (isotypes), for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, and IgA2 . The constant Fc domains that correspond to the different classes of antibodies can be referred to as a, δ, ε, γ and μ, respectively. The subunit structures and three-dimensional configurations of different classes of immunoglobulins are well known. Ig forms include hinge modifications or non-hinge forms (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/ 0048572; US 2004/0229310). The light chains of antibodies from any vertebrate species can be assigned to one of two types, called κ (kappa) and λ (lambda), based on the amino acid sequences of their constant domains. Antibodies according to embodiments of the invention may comprise kappa light chain sequences or lambda light chain sequences.
[0092] Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos não limitativos de funções efetoras incluem ligação C1q; CDC; ligação ao receptor Fc; ADCC; ADCP; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc interaja com um receptor, por exemplo, o FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIBI; FcγRIIB2; FcγRIIIA; receptores FcγRIIIB e o receptor FcRn de baixa afinidade; e pode ser avaliada usando vários ensaios conhecidos na técnica. Um Fc "morto" ou "silenciado" é aquele que foi mutado para reter atividade em relação a, por exemplo, prolongar a meia-vida sérica, mas que não ativa um receptor Fc de alta afinidade ou que tem uma afinidade reduzida a um receptor Fc.[0092] A "functional Fc region" has an "effector function" of a native sequence Fc region. Non-limiting examples of effector functions include C1q binding; CDC; Fc receptor binding; ADCC; ADCP; down regulation of cell surface receptors (eg B cell receptor), etc. Such effector functions generally require the Fc region to interact with a receptor, for example the FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIBI; FcγRIIB2; FcγRIIIIA; FcγRIIIB receptors and the low-affinity FcRn receptor; and can be evaluated using various assays known in the art. A "dead" or "silenced" Fc is one that has been mutated to retain activity with respect to, for example, prolonging serum half-life, but does not activate a high-affinity Fc receptor or has a reduced affinity for a receptor. Fc.
[0093] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica ã sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequência nativa incluem, por exemplo, uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alotipos não A e A); região Fc de lgG2 humana de sequência nativa: região Fc de lgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de lgG4 humana de sequência nativa, bem como suas variantes de ocorrência natural.[0093] A "native sequence Fc region" comprises an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of an Fc region found in nature. Native sequence human Fc regions include, for example, a native sequence human IgG1 Fc region (non-A and A allotypes); native sequence human IgG2 Fc region: native sequence human IgG3 Fc region; and native sequence human IgG4 Fc region, as well as naturally occurring variants thereof.
[0094] Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos, preferencialmente uma ou mais substituições de aminoácidos. Preferencialmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos, e preferencialmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante neste documento possuirá preferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de homologia com ela, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95 % de homologia com o mesmo.[0094] A "variant Fc region" comprises an amino acid sequence that differs from that of a native sequence Fc region by virtue of at least one amino acid modification, preferably one or more amino acid substitutions. Preferably, the variant Fc region has at least one amino acid substitution compared to a native sequence Fc region or the Fc region of a parent polypeptide, for example, from about one to about ten amino acid substitutions, such as 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acid substitutions, and preferably from about one to about five amino acid substitutions in a native sequence Fc region or in the Fc region of the parent polypeptide. The variant Fc region herein will preferably have at least about 80% homology to a native sequence Fc region and/or to an Fc region of a parent polypeptide, and more preferably at least about 90% homology thereto, plus preferably at least about 95% homology therewith.
[0095] A sequência de aminoácidos de lgG4 Fc humana (UniPro-tKB No. P01861) é fornecida aqui como SEQ ID NO: 45. A IgG1 silenciada é descrita, por exemplo, em Boesch, A.W., et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions." MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, cuja divulgação está aqui incorporada por referência em sua totalidade.[0095] The amino acid sequence of human IgG4 Fc (UniPro-tKB No. P01861) is provided here as SEQ ID NO: 45. Silenced IgG1 is described, for example, in Boesch, A.W., et al., "Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions." MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.
[0096] Outras variantes de Fc são possíveis, incluindo, sem limitação, uma na qual uma região capaz de formar uma ligação dissulfeto é deletada, ou na qual certos resíduos de aminoácidos são eliminados na extremidade N-terminal de um Fc nativo, ou um resíduo de metionina é adicionado ao mesmo. Assim, em algumas modalidades, uma ou mais porções Fc de um anticorpo podem compreender uma ou mais mutações na região de dobradiça para eliminar a ligação dissulfeto. Em ainda outra modalidade, a região de dobradiça de um Fc pode ser totalmente removida. Em ainda outra modalidade, um anticorpo pode compreender uma variante Fc.[0096] Other Fc variants are possible, including, without limitation, one in which a region capable of forming a disulfide bond is deleted, or in which certain amino acid residues are deleted at the N-terminus of a native Fc, or a methionine residue is added thereto. Thus, in some embodiments, one or more Fc portions of an antibody can comprise one or more mutations in the hinge region to eliminate the disulfide bond. In yet another embodiment, the hinge region of an Fc can be removed entirely. In yet another embodiment, an antibody can comprise an Fc variant.
[0097] Além disso, uma variante Fc pode ser construída para remover ou reduzir substancialmente as funções efetoras substituindo (mutando), deletando ou adicionando resíduos de aminoácidos para efetuar a ligação do complemento ou a ligação do receptor Fc. Por exemplo, e não limitação, uma deleção pode ocorrer em um sítio de ligação ao complemento, como um sítio de ligação a C1q. As técnicas para a preparação de tais sequências derivadas do fragmento Fc de imunoglobulina são divulgadas nas Publicações de Patentes Internacionais Nos. WO 97/34631 e WO 96/32478. Além disso, o domínio Fc pode ser modificado por fosforilação, sulfatação, acilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e semelhantes.[0097] Furthermore, an Fc variant can be constructed to remove or substantially reduce effector functions by substituting (mutating), deleting, or adding amino acid residues to effect complement binding or Fc receptor binding. For example, and not limitation, a deletion can occur at a complement binding site, such as a C1q binding site. Techniques for preparing such immunoglobulin Fc fragment-derived sequences are disclosed in International Patent Publication Nos. WO 97/34631 and WO 96/32478. Furthermore, the Fc domain can be modified by phosphorylation, sulfation, acylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, and the like.
[0098] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma sequência de domínio CH3 de lgG4 humana variante compreendendo uma mutação T366W, que pode ser opcionalmente referida neste documento como uma sequência de knob de CH3 de lgG4. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma sequência de domínio CH3 de lgG4 humana variante compreendendo uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V, que pode ser opcionalmente referida neste documento como uma sequência de holes CH3 de lgG4. As mutações de CH3 de lgG4 descritas neste documento podem ser utilizadas de qualquer maneira adequada de modo a colocar um "botão" em uma primeira região constante de cadeia pesada de um primeiro monômero em um dímero de anticorpo e um "buraco" em uma segunda região constante de cadeia pesada de um segundo monômero em um dímero de anticorpo, facilitando assim o emparelhamento adequado (heterodimerização) do par desejado de subunidades de polipeptídeo de cadeia pesada no anticorpo.[0098] In some embodiments, an antibody comprises a variant human IgG4 CH3 domain sequence comprising a T366W mutation, which may optionally be referred to herein as an IgG4 CH3 knob sequence. In some embodiments, an antibody comprises a variant human IgG4 CH3 domain sequence comprising a T366S mutation, an L368A mutation and a Y407V mutation, which may optionally be referred to herein as an IgG4 CH3 hole sequence. The IgG4 CH3 mutations described herein can be used in any suitable way to place a "button" in a first heavy chain constant region of a first monomer in an antibody dimer and a "hole" in a second region heavy chain constant of a second monomer into an antibody dimer, thereby facilitating proper pairing (heterodimerization) of the desired pair of heavy chain polypeptide subunits in the antibody.
[0099] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de lgG4 humana variante compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A e uma mutação T366W (knob). Em algumas modalidades, e o anticorpo compreende uma subunidade de polipeptídeo de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de lgG4 humana variante compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A, uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V (hole).[0099] In some embodiments, an antibody comprises a heavy chain polypeptide subunit comprising a variant human IgG4 Fc region comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation, and a T366W (knob) mutation. In some embodiments, and the antibody comprises a heavy chain polypeptide subunit comprising a variant human IgG4 Fc region comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation, a T366S mutation, an L368A mutation, and a Y407V (hole) mutation .
[00100] O termo "anticorpo compreendendo região Fc" refere-se a um anticorpo que compreende uma região Fc. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do anticorpo ou por engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica o anticorpo. Consequentemente, um anticorpo com uma região Fc de acordo com esta invenção pode compreender um anticorpo com ou sem K447.[00100] The term "antibody comprising Fc region" refers to an antibody comprising an Fc region. The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU numbering system) of the Fc region can be removed, for example, during antibody purification or by recombinant engineering of the nucleic acid encoding the antibody. Accordingly, an antibody with an Fc region according to this invention can comprise an antibody with or without K447.
[00101] Aspectos da invenção incluem anticorpos que compreendem uma região variável somente de cadeia pesada em uma configuração monovalente ou bivalente. Conforme usado neste documento, o termo "configuração monovalente" usado em referência a um domínio de região variável somente de cadeia pesada significa que apenas um domínio de região variável somente de cadeia pesada está presente, tendo um único sítio de ligação (ver FIG. 1, Painel A, braço direito do anticorpo). Em contraste, o termo "configuração bivalente" como usado em referência a um domínio de região variável somente de cadeia pesada significa que dois domínios de região variável somente de cadeia pesada estão presentes (cada um com um único sítio de ligação) e estão conectados por uma sequência de ligante (ver FIG. 1, Painéis B e C, braços direitos de anticorpos). Exemplos não limitativos de sequências ligantes são discutidos mais adiante e incluem, sem limitação, sequências ligantes GS de vários comprimentos. Quando uma região variável somente de cadeia pesada está em uma configuração bivalente, cada um dos dois domínios de região variável somente de cadeia pesada pode ter afinidade de ligação ao mesmo antígeno ou a antígenos diferentes (por exemplo, a diferentes epítopos na mesma proteína; para duas proteínas diferentes, etc.). No entanto, a menos que especificamente indicado de outra forma, uma região variável somente de cadeia pesada indicada como estando em uma "configuração bivalente" é entendida como contendo dois domínios de região variável somente de cadeia pesada idênticos, conectados por uma sequência ligante, em que cada um dos dois domínios de região variável idênticos domínios de região variável apenas de cadeia têm afinidade de ligação ao mesmo antígeno alvo.[00101] Aspects of the invention include antibodies comprising a heavy chain-only variable region in a monovalent or bivalent configuration. As used herein, the term "monovalent configuration" used in reference to a heavy chain-only variable region domain means that only one heavy chain-only variable region domain is present, having a single binding site (see FIG. 1 , Panel A, right antibody arm). In contrast, the term "bivalent configuration" as used in reference to a heavy chain-only variable region domain means that two heavy chain-only variable region domains are present (each with a single binding site) and are connected by a linker sequence (see FIG. 1, Panels B and C, antibody right arms). Non-limiting examples of linker sequences are discussed further below and include, without limitation, GS linker sequences of various lengths. When a heavy-chain-only variable region is in a bivalent configuration, each of the two heavy-chain-only variable region domains can have binding affinity for the same or different antigens (e.g., different epitopes on the same protein; for two different proteins, etc.). However, unless specifically noted otherwise, a heavy chain-only variable region indicated as being in a "bivalent configuration" is understood to contain two identical heavy-chain-only variable region domains, connected by a linker sequence, in that each of the two identical variable region domains single chain variable region domains have binding affinity to the same target antigen.
[00102] Aspectos da invenção incluem anticorpos com configurações multiespecíficas, que incluem, sem limitação, biespecíficas, tries-pecíficas, etc. Uma grande variedade de métodos e configurações de proteínas são conhecidas e usadas em anticorpos monoclonais biespe-cíficos (BsMAB), triespecíficos anticorpos, etc[00102] Aspects of the invention include antibodies with multispecific configurations, which include, without limitation, bispecific, trispecific, etc. A wide variety of methods and protein configurations are known and used in bispecific monoclonal antibodies (BsMAB), trispecific antibodies, etc.
[00103] Vários métodos para a produção de anticorpos artificiais multivalentes foram desenvolvidos por fusão recombinante de domínios variáveis de dois ou mais anticorpos. Em algumas modalidades, um primeiro e um segundo domínio de ligação ao antígeno em um polipeptí-deo são conectados por um ligante polipeptídico. Um exemplo não limitativo de tal ligante polipeptídico é um ligante GS, tendo uma sequência de aminoácidos de quatro resíduos de glicina, seguido por um resíduo de serina, e em que a sequência é repetida n vezes, onde n é um número inteiro variando de 1 a cerca de 10, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 (SEQ ID NO: 93). Exemplos não limitativos de tais ligantes incluem GGGGS (SEQ ID NO: 70) (n=1) e GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 71) (n=2). Outros ligantes adequados também podem ser usados e são descritos, por exemplo, em Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 15 de outubro; 65(10): 1357-69, cuja divulgação está aqui incorporada por referência em sua totalidade.[00103] Several methods for producing multivalent artificial antibodies have been developed by recombinant fusion of variable domains from two or more antibodies. In some embodiments, a first and a second antigen-binding domain in a polypeptide are connected by a polypeptide linker. A non-limiting example of such a polypeptide linker is a GS linker, having an amino acid sequence of four glycine residues, followed by a serine residue, and wherein the sequence is repeated n times, where n is an integer ranging from 1 to about 10, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 (SEQ ID NO: 93). Non-limiting examples of such linkers include GGGGS (SEQ ID NO: 70) (n=1) and GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 71) (n=2). Other suitable linkers can also be used and are described, for example, in Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, October 15th; 65(10): 1357-69, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety.
[00104] O termo "molécula semelhante a anticorpo de três cadeias" ou "TCA" é usado neste documento para se referir a moléculas semelhantes a anticorpo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em três subunidades de polipeptídeo, duas das quais compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal, ou fragmentos funcionais de ligação ao antígeno de tais cadeias de anticorpos, com-preendendo uma região de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio CH. Este par de cadeia pesada/cadeia leve tem especificidade de ligação a um primeiro antígeno. A terceira subunidade de polipeptídeo compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um anticorpo apenas de cadeia pesada compreendendo uma porção Fc compreendendo domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio CH1, e um ou mais domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, dois domínios de ligação ao antígeno) que se liga a um epítopo de um segundo antígeno ou um epítopo diferente do primeiro antígeno, onde tal domínio de ligação é derivado ou tem identidade de sequência com a região variável de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo. Partes de tal região variável podem ser codificadas por segmentos gênicos Vh e/ou Vl, segmentos gênicos D e Jh ou segmentos gênicos Jl. A região variável pode ser codificada por segmentos de genes VhDJh, VlDJh, VhJl ou VlJl rearranjados.[00104] The term "three-chain antibody-like molecule" or "TCA" is used herein to refer to antibody-like molecules comprising, consisting essentially of or consisting of three polypeptide subunits, two of which comprise, consist essentially of in or consisting of a heavy chain and a light chain of a monoclonal antibody, or functional antigen-binding fragments of such antibody chains, comprising an antigen-binding region and at least one CH domain. This heavy chain/light chain pair has binding specificity to a first antigen. The third polypeptide subunit comprises, consists essentially of, or consists of a heavy-chain-only antibody comprising an Fc portion comprising CH2 and/or CH3 and/or CH4 domains, in the absence of a CH1 domain, and one or more binding domains to an antigen (e.g., two antigen-binding domains) that binds to an epitope of a second antigen or a different epitope of the first antigen, where such binding domain is derived from or has sequence identity with the variable region of one chain heavy or light antibody. Parts of such a variable region may be encoded by Vh and/or Vl gene segments, D and Jh gene segments, or Jl gene segments. The variable region may be encoded by rearranged VhDJh, VlDJh, VhJl or VlJl gene segments.
[00105] Um composto de ligação a TCA faz uso de um "anticorpo somente de cadeia pesada" ou "anticorpo de cadeia pesada" ou "polipeptídeo de cadeia pesada" que, como usado neste documento, significa um anticorpo de cadeia simples compreendendo regiões constantes de cadeia pesada CH2 e/ou CH3 e/ou CH4 mas sem domínio CH1. Em uma modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e domínios CH2 e CH3. Em outra modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio CH2. Em outra modalidade, o anticorpo de cadeia pesada é composto por um domínio de ligação ao antígeno, pelo menos parte de uma região de dobradiça e um domínio CH3. Anticorpos de cadeia pesada em que o domínio CH2 e/ou CH3 é truncado também estão incluídos neste documento. Em outra modalidade, a cadeia pesada é composta por um domínio de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio CH (CH1, CH2, CH3 ou CH4), mas nenhuma região de dobradiça. O anticorpo somente de cadeia pesada pode estar na forma de um dímero, em que duas cadeias pesadas são ligadas por dissulfeto outras de outra forma ligadas de forma cova-lente ou não covalente uma à outra e podem opcionalmente incluir uma interface assimétrica entre um ou mais dos domínios CH para facilitar o emparelhamento adequado entre as cadeias polipeptídicas. O anticorpo de cadeia pesada pode pertencer à subclasse IgG, mas os anticorpos pertencentes a outras subclasses, como a subclasse IgM, IgA, IgD e IgE, também estão incluídos neste documento. Em uma modalidade particular, o anticorpo de cadeia pesada é do subtipo IgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4, em particular o subtipo IgG1 ou o subtipo lgG4. Exemplos não limitativos de um composto de ligação a TCA são descritos em, por exemplo, WO2017/223111 e WO2018/052503, cujas divulgações estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade.[00105] A TCA binding compound makes use of a "heavy chain only antibody" or "heavy chain antibody" or "heavy chain polypeptide" which as used herein means a single chain antibody comprising constant regions CH2 and/or CH3 and/or CH4 heavy chain but without CH1 domain. In one embodiment, the heavy chain antibody is composed of an antigen-binding domain, at least part of a hinge region, and CH2 and CH3 domains. In another embodiment, the heavy chain antibody is composed of an antigen-binding domain, at least part of a hinge region, and a CH2 domain. In another embodiment, the heavy chain antibody is composed of an antigen-binding domain, at least part of a hinge region, and a CH3 domain. Heavy chain antibodies in which the CH2 and/or CH3 domain is truncated are also included in this document. In another embodiment, the heavy chain is composed of an antigen-binding domain and at least one CH domain (CH1, CH2, CH3, or CH4), but no hinge region. The heavy-chain-only antibody may be in the form of a dimer, in which two heavy chains are disulfide-linked others otherwise covalently or non-covalently linked to each other, and may optionally include an asymmetric interface between one or more of CH domains to facilitate proper pairing between polypeptide chains. The heavy chain antibody may belong to the IgG subclass, but antibodies belonging to other subclasses such as the IgM, IgA, IgD and IgE subclass are also included in this document. In a particular embodiment, the heavy chain antibody is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 subtype, in particular the IgG1 subtype or the IgG4 subtype. Non-limiting examples of a TCA-binding compound are described in, for example, WO2017/223111 and WO2018/052503, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.
[00106] Os anticorpos de cadeia pesada constituem cerca de um quarto dos anticorpos IgG produzidos pelos camelídeos, por exemplo, camelos e lhamas (Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). Esses anticorpos são formados por duas cadeias pesadas, mas são desprovidos de cadeias leves. Como consequência, a parte variável de ligação ao antígeno é referida como o domínio VHH e representa o menor sítio de ligação ao antígeno natural, intacto, com apenas cerca de 120 aminoácidos de comprimento (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). Anticorpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem ser gerados contra uma variedade de an-tígenos por meio de imunização (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)) e a porção VHH pode ser prontamente clonado e expresso em levedura (Frenken, L.G.J., et al. J. Bio-technol. 78, 11-21 (2000)). Os seus níveis de expressão, solubilidade e estabilidade são significativamente superiores aos dos fragmentos F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, M.A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). Os tubarões também demonstraram ter um único domínio semelhante a VH em seus anticorpos, denominado VNAR. (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al.. Molecular Immunology 40, 25-33 (2003)).[00106] Heavy chain antibodies make up about a quarter of the IgG antibodies produced by camelids, for example, camels and llamas (Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). These antibodies are made up of two heavy chains but lack light chains. As a consequence, the variable antigen-binding part is referred to as the VHH domain and represents the smallest intact natural antigen-binding site, only about 120 amino acids long (Desmyter, A., et al. J. Biol. Chem 276, 26285-26290 (2001)). Heavy chain antibodies with high specificity and affinity can be generated against a variety of antigens through immunization (van der Linden, R.H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)) and the VHH portion can be readily cloned and expressed in yeast ( Frenken, L.G.J., et al. J. Bio-technol. 78, 11-21 (2000 )). Their expression levels, solubility and stability are significantly higher than those of classic F(ab) or Fv fragments ( Ghahroudi, M.A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997 )). Sharks have also been shown to have a single VH-like domain on their antibodies called VNAR. ( Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003 ); Nuttall et al. Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004 ); Dooley et al..
[00107] Ο termo "CD3" refere-se ao complexo de múltiplas subuni-dades da proteína CD3 humana. O complexo de múltiplas subunidades da proteína CD3 é composto por 6 cadeias polipeptídicas distintas. Estes incluem uma cadeia CD3γ (SwissProt P09693), uma cadeia CD3δ (SwissProtP04234), duas cadeias CD3c (SwissProt P07766) e um ho-modímero de cadeia ΟD3ζ (SwissProt 20963), e que está associado à cadeia α e β do receptor de células T. O termo "CD3" inclui qualquer variante, isoforma e homólogo de CD3 de espécie que é naturalmente expresso por células (incluindo células T) ou pode ser expresso em células transfectadas com genes ou cDNA que codificam esses polipeptí-deos, a menos que indicado.[00107] The term "CD3" refers to the complex of multiple subunits of the human CD3 protein. The multisubunit complex of the CD3 protein is composed of 6 distinct polypeptide chains. These include a CD3γ chain (SwissProt P09693), a CD3δ chain (SwissProtP04234), two CD3c chains (SwissProt P07766) and a homomodimer ΟD3ζ chain (SwissProt 20963), which is associated with the α and β chain of the cell receptor. T. The term "CD3" includes any CD3 variant, isoform and homolog of species that is naturally expressed by cells (including T cells) or can be expressed in cells transfected with genes or cDNA encoding such polypeptides, unless indicated.
[00108] Um "anticorpo BCMA x CD3" é um anticorpo multiespecí-fico somente de cadeia pesada, tal como um anticorpo biespecífico somente de cadeia pesada, que compreende duas regiões de ligação ao antígeno diferentes, uma das quais se liga especificamente ao antígeno BCMA e uma das que se liga especificamente ao CD3. Um "anticorpo PSMA X CD3" é um anticorpo multiespecífico somente de cadeia pesada, tal como um anticorpo biespecífico somente de cadeia pesada, que compreende duas regiões de ligação ao antígeno diferentes, uma das quais se liga especificamente ao antígeno PSMA e uma das quais se liga especificamente para CD3. Um "anticorpo GD19 x CD3" é um anticorpo multiespecífico somente de cadeia pesada, tal como um anticorpo biespecífico somente de cadeia pesada, que compreende duas regiões de ligação ao antígeno diferentes, uma das quais se liga especificamente ao antígeno CD19 e uma das quais se liga especificamente para CD3.[00108] A "BCMA x CD3 antibody" is a heavy-chain-only multispecific antibody, such as a heavy-chain-only bispecific antibody, which comprises two different antigen-binding regions, one of which specifically binds to the BCMA antigen and one that binds specifically to CD3. A "PSMA X CD3 antibody" is a heavy-chain-only multispecific antibody, such as a heavy-chain-only bispecific antibody, comprising two different antigen-binding regions, one of which specifically binds to the PSMA antigen and one of which binds to the PSMA antigen. binds specifically to CD3. A "GD19 x CD3 antibody" is a heavy-chain-only multispecific antibody, such as a heavy-chain-only bispecific antibody, that comprises two different antigen-binding regions, one of which specifically binds to the CD19 antigen and one of which binds specifically to the CD19 antigen. binds specifically to CD3.
[00109] O termo "BCMA", conforme usado neste documento, re-fere-se ao antígeno de maturação de células B humanas, também conhecido como BCMA, CD269 e TNFRSF17 (UniProt Q02223), que é um membro da superfamília de receptores de necrose tumoral que é preferencialmente expresso em células plasmáticas. O domínio extracelular de BCMA humano consiste, de acordo com UniProt, em aminoácidos 1-54 (ou 5-51).[00109] The term "BCMA", as used herein, refers to the human B cell maturation antigen, also known as BCMA, CD269 and TNFRSF17 (UniProt Q02223), which is a member of the receptor superfamily tumor necrosis that is preferentially expressed in plasma cells. The extracellular domain of human BCMA consists, according to UniProt, of amino acids 1-54 (or 5-51).
[00110] 0 termo "anticorpo somente de cadeia pesada anti-BCMA" e "anticorpo somente de cadeia pesada BCMA" são usados neste documento para se referir a um anticorpo apenas de cadeia pesada como definido acima, ligando-se imunoespecificamente a BCMA.[00110] The term "anti-BCMA heavy chain only antibody" and "BCMA heavy chain only antibody" are used herein to refer to a heavy chain only antibody as defined above immunospecifically binding to BCMA.
[00111] O termo "PSMA", conforme usado neste documento, re-fere-se a uma proteína transmembranar tipo II que possui atividade de depeptidase ácida ligada a N-acetilada, hidrolase de folato e atividade de dipeptidil-peptidase. O termo "PSMA" inclui uma proteína PSMA de qualquer espécie animal humana e não humana e inclui especificamente PSMA humano, bem como PSMA de mamíferos não humanos.[00111] The term "PSMA", as used herein, refers to a type II transmembrane protein that has N-acetylated linked acid depeptidase activity, folate hydrolase and dipeptidyl peptidase activity. The term "PSMA" includes a PSMA protein from any human and non-human animal species and specifically includes human PSMA as well as PSMA from non-human mammals.
[00112] O termo "PSMA humano", conforme usado neste documento, inclui quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécies de PSMA humano (UniProt Q04609), independentemente de sua fonte ou modo de preparação. Assim, "PSMA humano" inclui PSMA humano expresso naturalmente por células e PSMA expresso em células trans-fectadas com o gene PSMA humano.[00112] The term "human PSMA", as used herein, includes any variants, isoforms and species homologues of human PSMA (UniProt Q04609), regardless of their source or mode of preparation. Thus, "human PSMA" includes human PSMA naturally expressed by cells and PSMA expressed in cells transfected with the human PSMA gene.
[00113] Os termos "anticorpo somente de cadeia pesada anti-PSMA", "anticorpo somente de cadeia pesada PSMA", "anticorpo anti-PSMA de cadeia pesada" e "anticorpo de cadeia pesada PSMA" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a um anticorpo somente de cadeia pesada como definido acima, ligando-se imunoespeci-ficamente a PSMA, incluindo PSMA humano, como definido acima. A definição inclui, sem limitação, anticorpos de cadeia pesada humana produzidos por animais transgênicos, tais como ratos transgênicos ou camundongos transgênicos que expressam imunoglobulina humana, incluindo UniRats™ produzindo anticorpos humanos anti-PSMA UniAb™, conforme definido acima.[00113] The terms "anti-PSMA heavy-chain-only antibody", "PSMA heavy-chain-only antibody", "heavy-chain anti-PSMA antibody" and "PSMA heavy-chain antibody" are used interchangeably herein to refer to refers to a heavy-chain-only antibody as defined above, immunospecifically binding to PSMA, including human PSMA, as defined above. The definition includes, without limitation, human heavy chain antibodies produced by transgenic animals, such as transgenic mice or transgenic mice expressing human immunoglobulin, including UniRats™ producing human anti-PSMA UniAb™ antibodies, as defined above.
[00114] Os termos "GD19" e "grupo de diferenciação 19", conforme usados neste documento, referem-se a uma molécula expressa durante todas as fases do desenvolvimento de células B até a diferenciação terminal em células plasmáticas. O termo "GD19" inclui uma proteína GD19 de qualquer espécie animal humana e não humana e inclui especificamente GD19 humano, bem como GD19 de mamíferos não humanos.[00114] The terms "GD19" and "differentiation group 19", as used herein, refer to a molecule expressed during all stages of B cell development through terminal differentiation into plasma cells. The term "GD19" includes a GD19 protein from any human and non-human animal species and specifically includes human GD19 as well as GD19 from non-human mammals.
[00115] O termo "GD19 humano", conforme usado neste documento, inclui quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécies de GD19 humano (UniProt P15391), independentemente de sua fonte ou modo de preparação. Assim, "GD19 humano" inclui GD19 humano expresso naturalmente por células e GD19 expresso em células trans-fectadas com o gene GD19 humano.[00115] The term "human GD19", as used herein, includes any variants, isoforms and species homologs of human GD19 (UniProt P15391), regardless of their source or mode of preparation. Thus, "human GD19" includes human GD19 naturally expressed by cells and GD19 expressed in cells transfected with the human GD19 gene.
[00116] Os termos "anticorpo somente de cadeia pesada anti-GDI 9", "anticorpo somente de cadeia pesada GD19", "anticorpo de cadeia pesada anti-GD19" e "anticorpo de cadeia pesada GD19" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a uma cadeia pesada -anticorpo único como definido acima, ligando-se imunoespecificamente a GD19, incluindo GD19 humano, como definido acima. A definição inclui, sem limitação, anticorpos de cadeia pesada humana produzidos por animais transgênicos, tais como ratos transgênicos ou camundongos transgênicos que expressam imunoglobulina humana, incluindo UniRatsTM produzindo anticorpos UniAb™ anti-CD19TM humanos, conforme definido acima.[00116] The terms "anti-GDI 9 heavy chain-only antibody", "GD19 heavy chain-only antibody", "anti-GD19 heavy chain antibody" and "GD19 heavy chain antibody" are used interchangeably herein to shall refer to a heavy chain -single antibody as defined above, immunospecifically binding to GD19, including human GD19, as defined above. The definition includes, without limitation, human heavy chain antibodies produced by transgenic animals, such as transgenic mice or transgenic mice expressing human immunoglobulin, including UniRatsTM producing human anti-CD19TM UniAb™ antibodies, as defined above.
[00117] "Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoá-cidos" em relação a uma sequência polipeptídica de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento da sequências e introduzindo lacunas, se necessário, para atingir a identidade de sequência percentual máxima, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro do versado na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megaalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo em todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Para os propósitos aqui, no entanto, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2.[00117] "Percentage (%) of amino acid sequence identity" in relation to a reference polypeptide sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the reference polypeptide sequence , after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity, and not considering any conservative substitutions as part of the sequence identity. Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved in a number of ways that are within the skill in the art, for example, using publicly available computer software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, or Megaalign software ( DNASTAR). Those skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximum alignment over the entire length of the sequences being compared. For purposes here, however, % amino acid sequence identity values are generated using the ALIGN-2 sequence comparison computer program.
[00118] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam nos usos diagnósticos ou terapêuticos do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) a mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, e mais preferencialmente mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro das células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.[00118] An "isolated" antibody is one that has been identified and separated and/or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of its natural environment are materials that would interfere with the antibody's diagnostic or therapeutic uses and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In preferred embodiments, the antibody will be purified (1) to greater than 95% by weight of antibody as determined by the Lowry method, and more preferably greater than 99% by weight, (2) to a degree sufficient to obtain at least 15 residues of N-terminal or internal amino acid sequence by use of a spinning cup sequencer, or (3) homogeneity by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue or, preferably, silver staining. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells, since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. Typically, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.
[00119] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos multiespecí-ficos. Anticorpos multiespecíficos têm mais de uma especificidade de ligação. O termo "multiespecífico" inclui especificamente "biespecífico" e "triespecífico", bem como afinidades de ligação específicas independentes de ordem superior, como especificidade poliepitópica de ordem superior, bem como anticorpos tetravalentes e fragmentos de anticorpos. Os termos "anticorpo multiespecífico", "anticorpo multiespecífico somente de cadeia pesada", "anticorpo multiespecífico de cadeia pesada" e "multiespecífico UniAbTM" são usados neste documento no sentido mais amplo e abrangem todos os anticorpos com mais de uma especificidade de ligação.[00119] Antibodies of the invention include multispecific antibodies. Multispecific antibodies have more than one binding specificity. The term "multispecific" specifically includes "bispecific" and "trispecific", as well as higher order independent specific binding affinities such as higher order polyepitopic specificity, as well as tetravalent antibodies and antibody fragments. The terms "multispecific antibody", "heavy chain only multispecific antibody", "heavy chain multispecific antibody", and "UniAbTM multispecific" are used in this document in the broadest sense and encompass all antibodies with more than one binding specificity.
[00120] Os anticorpos multiespecíficos da presente invenção incluem especificamente anticorpos que se ligam imunoespecificamente a dois ou mais epítopos não sobrepostos em uma proteína BCMA, uma proteína PSMA ou uma proteína GD19, tal como uma proteína BCMA humana, uma proteína PSMA humana, ou uma proteína GD19 humana (ou seja, bivalente e biparatópica). Os anticorpos multiespecíficos de cadeia pesada da presente invenção também incluem especificamente anticorpos que se ligam imunoespecificamente a um epítopo em uma proteína BCMA, uma proteína PSMA ou uma proteína GD19, tal como uma proteína BCMA humana, uma proteína PSMA humana ou um GD19 humano proteína e a um epítopo em uma proteína diferente, como, por exemplo, uma proteína CD3, como CD3 humano (ou seja, bivalente e biparatópica). Os anticorpos multiespecíficos de cadeia pesada da presente invenção também incluem especificamente anticorpos que se ligam imunoespecificamente a dois ou mais epítopos não sobrepostos ou parcialmente sobrepostos em uma proteína BCMA, uma proteína PSMA ou uma proteína GD19, tal como uma proteína BCMA humana, um proteína PSMA humana, ou uma proteína GD19 humana, e a um epítopo em uma proteína diferente, tal como, por exemplo, uma proteína CD3, tal como proteína CD3 humana (isto é, trivalente e biparatópica).[00120] The multispecific antibodies of the present invention specifically include antibodies that immunospecifically bind to two or more non-overlapping epitopes on a BCMA protein, a PSMA protein, or a GD19 protein, such as a human BCMA protein, a human PSMA protein, or a human GD19 protein (ie, bivalent and biparatopic). The multispecific heavy chain antibodies of the present invention also specifically include antibodies that immunospecifically bind to an epitope on a BCMA protein, a PSMA protein or a GD19 protein, such as a human BCMA protein, a human PSMA protein or a human GD19 protein and to an epitope on a different protein, such as a CD3 protein such as human CD3 (ie bivalent and biparatopic). The multispecific heavy chain antibodies of the present invention also specifically include antibodies that immunospecifically bind to two or more non-overlapping or partially overlapping epitopes on a BCMA protein, a PSMA protein or a GD19 protein, such as a human BCMA protein, a PSMA protein protein, or a human GD19 protein, and to an epitope on a different protein, such as, for example, a CD3 protein, such as human CD3 protein (i.e., trivalent and biparatopic).
[00121] Um "epítopo" é o sítio na superfície de uma molécula de antígeno ao qual uma única molécula de anticorpo se liga. Geralmente um antígeno tem vários ou muitos epítopos diferentes e reage com muitos anticorpos diferentes. O termo inclui especificamente epítopos lineares e epítopos conformacionais.[00121] An "epitope" is the site on the surface of an antigen molecule to which a single antibody molecule binds. Usually an antigen has several or many different epitopes and reacts with many different antibodies. The term specifically includes linear epitopes and conformational epitopes.
[00122] "Mapeamento de epítopos" é o processo de identificação dos sítios de ligação, ou epítopos, de anticorpos em seus antígenos alvo. Os epítopos de anticorpo podem ser epítopos lineares ou epítopos conformacionais. Os epítopos lineares são formados por uma sequência contínua de aminoácidos em uma proteína. Os epítopos conformacionais são formados por aminoácidos que são descontínuos na sequência da proteína, mas que são reunidos ao dobrar a proteína em sua estrutura tridimensional.[00122] "Epitope mapping" is the process of identifying the binding sites, or epitopes, of antibodies on their target antigens. Antibody epitopes can be linear epitopes or conformational epitopes. Linear epitopes are formed by a continuous sequence of amino acids in a protein. Conformational epitopes are formed by amino acids that are discontinuous in the protein sequence, but which are brought together when folding the protein into its three-dimensional structure.
[00123] "Especificidade poliepitópica" refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo ou em alvo(s) diferente(s). Gonforme observado acima, a presente invenção inclui especificamente anticorpos de cadeia pesada com especificidades poliepitópicas, ou seja, anticorpos de cadeia pesada que se ligam a um ou mais epítopos não sobrepostos em uma proteína BGMA, uma proteína PSMA ou uma proteína GD19, tal como uma proteína BGMA humana, uma proteína PSMA humana ou uma proteína GD19 humana; e anticorpos de cadeia pesada que se ligam a um ou mais epítopos em uma proteína BCMA, uma proteína PSMA ou uma proteína CD19 e a um epítopo em uma proteína diferente, como, por exemplo, uma proteína CD3. O termo "epítopo(s) não sobreposto(s)" ou "epítopo(s) não competitivo(s)" de um antígeno é definido neste documento para significar epítopo(s) que são reconhecidos por um membro de um par de anticorpos específicos de antígeno, mas não o outro membro. Pares de anticorpos, ou regiões de ligação ao antígeno visando o mesmo antígeno em um anticorpo multiespecífico, reconhecendo epítopos não sobrepostos, não competem pela ligação a esse antígeno e são capazes de se ligar a esse antígeno simultaneamente.[00123] "Polyepitopic specificity" refers to the ability to specifically bind to two or more different epitopes on the same or different target(s). As noted above, the present invention specifically includes heavy chain antibodies with polyepitopic specificities, i.e., heavy chain antibodies that bind to one or more non-overlapping epitopes on a BGMA protein, a PSMA protein, or a GD19 protein, such as a human BGMA protein, a human PSMA protein or a human GD19 protein; and heavy chain antibodies that bind to one or more epitopes on a BCMA protein, a PSMA protein, or a CD19 protein and an epitope on a different protein, such as, for example, a CD3 protein. The term "non-overlapping epitope(s)" or "non-competitive epitope(s)" of an antigen is defined herein to mean epitope(s) that are recognized by a member of a specific antibody pair of antigen, but not the other member. Pairs of antibodies, or antigen-binding regions targeting the same antigen on a multispecific antibody, recognizing non-overlapping epitopes, do not compete for binding to that antigen and are capable of binding to that antigen simultaneously.
[00124] Um anticorpo se liga "essencialmente ao mesmo epítopo" como um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos. Os métodos mais usados e rápidos para determinar se dois epítopos se ligam a epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos são os ensaios de competição, que podem ser configurados em vários formatos diferentes, usando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Normalmente, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 poços, e a capacidade de anticorpos não marcados para bloquear a ligação de anticorpos marcados é medida usando marcadores radioativos ou enzimáticos.[00124] An antibody binds "essentially the same epitope" as a reference antibody when the two antibodies recognize identical or sterically overlapping epitopes. The most commonly used and rapid methods for determining whether two epitopes bind to identical or sterically overlapping epitopes are competition assays, which can be set up in several different formats using either labeled antigen or labeled antibody. Typically, the antigen is immobilized in a 96-well plate, and the ability of unlabeled antibodies to block binding of labeled antibodies is measured using radioactive or enzymatic markers.
[00125] O termo "valente", conforme usado neste documento, refere-se a um número especificado de sítios de ligação em uma molécula de anticorpo.[00125] The term "valent", as used herein, refers to a specified number of binding sites on an antibody molecule.
[00126] Um anticorpo "monovalente" tem um sítio de ligação. Assim, um anticorpo monovalente também é monoespecífico.[00126] A "monovalent" antibody has one binding site. Thus, a monovalent antibody is also monospecific.
[00127] Um anticorpo "multivalente" tem dois ou mais sítios de ligação. Assim, os termos "bivalente", "trivalente" e "tetravalente" referem-se à presença de dois sítios de ligação, três sítios de ligação e quatro sítios de ligação, respectivamente. Assim, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é pelo menos bivalente e pode ser trivalente, tetravalente ou multivalente. Um anticorpo bivalente de acordo com as modalidades da invenção pode ter dois sítios de ligação ao mesmo epí-topo (ou seja, bivalente, monoparatópico) ou a dois epítopos diferentes (ou seja, bivalente, biparatópico).[00127] A "multivalent" antibody has two or more binding sites. Thus, the terms "bivalent", "trivalent" and "tetravalent" refer to the presence of two binding sites, three binding sites and four binding sites, respectively. Thus, a bispecific antibody according to the invention is at least bivalent and may be trivalent, tetravalent or multivalent. A bivalent antibody according to embodiments of the invention can have two binding sites for the same epitope (i.e. bivalent, monoparatopic) or two different epitopes (i.e. bivalent, biparatopic).
[00128] Uma grande variedade de métodos e configurações de proteínas são conhecidas e usadas para a preparação de anticorpos mo-noclonais biespecíficos (BsMAB), anticorpos triespecíficos e semelhantes.[00128] A wide variety of methods and protein configurations are known and used for the preparation of bispecific monoclonal antibodies (BsMAB), trispecific antibodies, and the like.
[00129] O termo "molécula semelhante a anticorpo de três cadeias" ou "TCA" é usado neste documento para se referir a moléculas semelhantes a anticorpo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em três subunidades de polipeptídeo, duas das quais compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma cadeia pesada e uma cadeia leve de um anticorpo monoclonal, ou fragmentos funcionais de ligação ao antígeno de tais cadeias de anticorpos, compreendendo uma região de ligação ao antígeno e pelo menos um domínio CH. Este par de cadeia pesada/cadeia leve tem especificidade de ligação a um primeiro antígeno. A terceira subunidade de polipeptídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um anticorpo somente de cadeia pesada compreendendo uma porção Fc compreendendo domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio CH1 e um domínio de ligação ao antígeno que se liga um epítopo de um segundo antígeno ou um epítopo diferente do primeiro antígeno, em que tal domínio de ligação é derivado ou tem identidade de sequência com a região variável de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo. Partes de tal região variável podem ser codificadas por segmentos gênicos Vh e/ou Vl, segmentos gênicos D e Jh ou segmentos gênicos Jl. A região variável pode ser codificada por segmentos de genes VhDJh, VlDJh, VhJl ou VlJl rearranjados. Uma proteína TCA faz uso de um anticorpo somente de cadeia pesada como definido acima.[00129] The term "three-chain antibody-like molecule" or "TCA" is used herein to refer to antibody-like molecules comprising, consisting essentially of or consisting of three polypeptide subunits, two of which comprise, consist essentially of in or consisting of a heavy chain and a light chain of a monoclonal antibody, or functional antigen-binding fragments of such antibody chains, comprising an antigen-binding region and at least one CH domain. This heavy chain/light chain pair has binding specificity to a first antigen. The third polypeptide subunit comprises, consists essentially of, or consists of a heavy-chain-only antibody comprising an Fc portion comprising CH2 and/or CH3 and/or CH4 domains, in the absence of a CH1 domain and an antigen-binding domain that binds binds an epitope of a second antigen or a different epitope of the first antigen, wherein such binding domain is derived from or has sequence identity with the variable region of an antibody heavy or light chain. Parts of such a variable region may be encoded by Vh and/or Vl gene segments, D and Jh gene segments, or Jl gene segments. The variable region may be encoded by rearranged VhDJh, VlDJh, VhJl or VlJl gene segments. A TCA protein makes use of a heavy chain only antibody as defined above.
[00130] O termo "receptor de antígeno quimérico" ou "CAR" é usado neste documento no sentido mais ampio para se referir a um receptor manipulado, que enxerta uma especificidade de ligação desejada (por exemplo, a região de ligação ao antígeno de um anticorpo monoclonal ou outro ligante) para domínios de transposição de membrana e de sinalização intracelular. Normalmente, o receptor é usado para enxertar a especificidade de um anticorpo monoclonal em uma célula T para criar um receptor de antígeno quimérico (CAR). (J Natl Cancer Inst, 2015; 108(7):dvj439; e Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383). As células CAR-T são células Τ que foram geneticamente modificadas para produzir um receptor artificial de células T para uso em imunoterapia. Em uma modalidade, "célula CAR-T" significa uma célula T terapêutica que expressa um transgene que codifica um ou mais receptores de antígenos quiméricos compreendidos minimamente por um domínio extracelular, um domínio transmembranar e pelo menos um domínio citosólico.[00130] The term "chimeric antigen receptor" or "CAR" is used herein in the broadest sense to refer to an engineered receptor, which grafts a desired binding specificity (e.g., the antigen-binding region of a monoclonal antibody or other ligand) to membrane spanning and intracellular signaling domains. Typically, the receptor is used to graft the specificity of a monoclonal antibody onto a T cell to create a chimeric antigen receptor (CAR). ( J Natl Cancer Inst, 2015; 108(7):dvj439; and Jackson et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 2016; 13:370-383 ). CAR-T cells are Τ cells that have been genetically engineered to produce an artificial T cell receptor for use in immunotherapy. In one embodiment, "CAR-T cell" means a therapeutic T cell that expresses a transgene encoding one or more chimeric antigen receptors comprised minimally of an extracellular domain, a transmembrane domain, and at least one cytosolic domain.
[00131] O termo "anticorpo humano" é usado neste documento para incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos aqui podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana, por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo. O termo "anticorpo humano" inclui especificamente anticorpos apenas de cadeia pesada com sequências de região variável de cadeia pesada humana, produzidos por animais transgênicos, tais como ratos ou camundongos transgênicos, em particular UniAbsTM produzido por UniRatsTM, conforme definido acima.[00131] The term "human antibody" is used herein to include antibodies with variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies herein may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences, for example, mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo. The term "human antibody" specifically includes heavy chain only antibodies with human heavy chain variable region sequences, produced by transgenic animals, such as transgenic rats or mice, in particular UniAbsTM produced by UniRatsTM, as defined above.
[00132] Por um "anticorpo quimérico" ou uma "imunoglobulina quimérica" entende-se uma moiécuia de imunogiobuiina compreendendo sequências de aminoácidos de peio menos dois loci lg diferentes, por exemplo, um anticorpo transgênico compreendendo uma porção codificada por um locus Ig humano e uma porção codificada por um locus de Ig de rato. Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos transgênicos com regiões Fc não humanas ou regiões Fc artificiais e idiotipos humanos. Tais imunoglobulinas podem ser isoladas de animais da invenção que foram projetados para produzir tais anticorpos quiméricos.[00132] By a "chimeric antibody" or a "chimeric immunoglobulin" is meant an immunoglobulin molecule comprising amino acid sequences from at least two different lg loci, for example, a transgenic antibody comprising a portion encoded by a human Ig locus and a portion encoded by a mouse Ig locus. Chimeric antibodies include transgenic antibodies with non-human Fc regions or artificial Fc regions and human idiotypes. Such immunoglobulins can be isolated from animals of the invention that have been engineered to produce such chimeric antibodies.
[00133] Conforme usado neste documento, o termo "célula efetora" refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitiva e de ativação de uma resposta imune. Algumas células efetoras expressam receptores Fc específicos e realizam funções imunes específicas. Em algumas modalidades, uma célula efetora, como uma célula assassina natural, é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Por exemplo, monócitos e macrófagos, que expressam FcR, estão envolvidos na morte específica de células-alvo e na apresentação de antígenos a outros componentes do sistema imunológico ou na ligação a células que apresentam antígenos. Em algumas modalidades, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo ou célula alvo.[00133] As used herein, the term "effector cell" refers to an immune cell that is involved in the effector phase of an immune response, as opposed to the cognitive and activation phases of an immune response. Some effector cells express specific Fc receptors and carry out specific immune functions. In some embodiments, an effector cell, such as a natural killer cell, is capable of inducing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). For example, monocytes and macrophages, which express FcR, are involved in the specific killing of target cells and in presenting antigens to other components of the immune system or in binding to antigen-presenting cells. In some embodiments, an effector cell can phagocytose a target antigen or target cell.
[00134] "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam receptores, tais como receptores de células T ou FcRs e executam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam a função efetora ADCC. Exempios de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo as células NK preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, de sangue ou PBMCs conforme descrito neste documento.[00134] "Human effector cells" are leukocytes that express receptors, such as T cell receptors or FcRs, and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcyRIII and perform ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils; with NK cells being preferred. Effector cells can be isolated from a native source thereof, for example, blood or PBMCs as described herein.
[00135] Ο termo "célula imune" é usado aqui no sentido mais amplo, incluindo, sem limitação, células de origem mieloide ou linfoide, por exemplo, linfócitos (tais como células B e células T, incluindo células T citolíticas (CTLs)), células assassinas, células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tais como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos.[00135] The term "immune cell" is used herein in the broadest sense, including, without limitation, cells of myeloid or lymphoid origin, for example, lymphocytes (such as B cells and T cells, including cytolytic T cells (CTLs)) , killer cells, natural killer (NK) cells, macrophages, monocytes, eosinophils, polymorphonuclear cells such as neutrophils, granulocytes, mast cells and basophils.
[00136] As "funções efetoras" do anticorpo referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem ligação a C1q; ci-totoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.[00136] Antibody "effector functions" refer to the biological activities attributable to the Fc region (either a native sequence Fc region or amino acid sequence variant Fc region) of an antibody. Examples of antibody effector functions include binding to C1q; complement-dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; down regulation of cell surface receptors (eg, B cell receptor; BCR), etc.
[00137] "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecer o anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causar a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Rave-tch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente U.S. N° 5.500.362 ou 5.821.337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).[00137] "Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity" and "ADCC" refer to a cell-mediated reaction in which non-specific cytotoxic cells expressing Fc receptors (FcRs) (e.g., natural killer (NK) cells, neutrophils and macrophages) recognize bound antibody on a target cell and subsequently cause lysis of the target cell. The primary cells for mediating ADCC, NK cells, express FcyRIII only, whereas monocytes express FcγRI, FcγRII, and FcγRIII. FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Rave-tch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). To assess the ADCC activity of a molecule of interest, an in vitro ADCC assay can be performed, such as that described in U.S. Pat. No. 5,500,362 or 5,821,337. Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells. Alternatively, or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest can be evaluated in vivo, for example in an animal model as disclosed in Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
[00138] "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" re-fere-se à capacidade de uma molécula de lisar um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), podem ser realizados.[00138] "Complement-dependent cytotoxicity" or "CDC" refers to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement. The complement activation pathway is initiated by binding of the first component of the complement system (C1q) to a molecule (eg, an antibody) complexed with a cognate antigen. To assess complement activation, a CDC assay, for example, as described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), can be performed.
[00139] "Afinidade de ligação" refere-se ã força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar prontamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados.[00139] "Binding affinity" refers to the sum total strength of non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, an antigen). Unless otherwise noted, as used herein, "binding affinity" refers to intrinsic binding affinity that reflects a 1:1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of a molecule X for its partner Y can usually be represented by the dissociation constant (Kd). Affinity can be measured by common methods known in the art. Low-affinity antibodies generally bind antigen slowly and tend to dissociate readily, whereas high-affinity antibodies generally bind antigen more quickly and tend to remain bound.
[00140] Conforme usado neste documento, o "Kd" ou "valor Kd" refere-se a uma constante de dissociação determinada por Interferometria BioLayer, usando um instrumento Octet QK384 (Fortebio Inc., Menlo Park, CA) no modo cinético. Por exemplo, sensores Fc anti-camun-dongo são carregados com antígeno fundido Fc de camundongo e, em seguida, mergulhados em poços contendo anticorpos para medir as ta-xas de associação dependentes da concentração (kon). As taxas de dissociação de anticorpos (koff) são medidas na etapa final, onde os sensores são mergulhados em poços contendo apenas tampão. O Kd é a razão de koff/kon. (Para mais detalhes ver, Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009).[00140] As used herein, the "Kd" or "Kd value" refers to a dissociation constant determined by BioLayer Interferometry using an Octet QK384 instrument (Fortebio Inc., Menlo Park, CA) in kinetic mode. For example, anti-mouse Fc sensors are loaded with fused mouse Fc antigen and then dipped into wells containing antibodies to measure concentration-dependent association rates (kon). Antibody off-rates (koff) are measured in the final step, where the sensors are dipped into wells containing only buffer. Kd is the koff/kon ratio. (For more details see, Concepcion, J, et al., Comb Chem High Throughput Screen, 12(8), 791-800, 2009 ).
[00141] Os termos "tratamento", "tratando" e semelhantes são usados aqui para significar geralmente a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção completa ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", conforme usado neste documento, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero e inclui: (a) prevenir a ocorrência da doença em um sujeito que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo; (b) inibir a doença, isto é, deter o seu desenvolvimento; ou (c) aliviar a doença, isto é, causar a regressão da doença. O agente terapêutico pode ser administrado antes, durante ou após 0 início da doença ou lesão. O tratamento da doença em curso, onde 0 tratamento estabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, é de particular interesse. Tal tratamento é desejavelmente realizado antes da perda completa da função nos tecidos afetados. A terapia em questão pode ser administrada durante o estágio sintomático da doença e, em alguns casos, após o estágio sintomático da doença.[00141] The terms "treatment", "treating" and the like are used herein to generally mean achieving a desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and/or may be therapeutic in terms of partially or completely curing a disease and/or adverse effect attributable to the disease. "Treatment", as used herein, encompasses any treatment of a disease in a mammal and includes: (a) preventing the occurrence of the disease in a subject who may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having it; (b) inhibit the disease, i.e. arrest its development; or (c) relieving the disease, ie, causing the disease to regress. The therapeutic agent can be administered before, during or after the onset of the illness or injury. Treatment of ongoing disease, where treatment stabilizes or reduces the patient's undesirable clinical symptoms, is of particular interest. Such treatment is desirably performed before complete loss of function in the affected tissues. The therapy in question can be administered during the symptomatic stage of the disease and, in some cases, after the symptomatic stage of the disease.
[00142] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" destina-se a uma quantidade de agente ativo que é necessária para conferir benefício terapêutico a um sujeito. Por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que induz, melhora ou de outra forma causa uma melhora nos sintomas patológicos, progressão da doença ou condições fisiológicas associadas a uma doença ou que melhora a resistência a um distúrbio.[00142] A "therapeutically effective amount" means an amount of active agent that is necessary to confer therapeutic benefit on a subject. For example, a "therapeutically effective amount" is an amount that induces, ameliorates, or otherwise causes an amelioration in pathological symptoms, disease progression, or physiological conditions associated with a disease, or that improves resistance to a disorder.
[00143] Ο termo "câncer de próstata", conforme usado neste documento, refere-se a um tumor maligno de origem glandular na próstata.[00143] The term "prostate cancer", as used herein, refers to a malignant tumor of glandular origin in the prostate.
[00144] O termo "caracterizado pela expressão de PSMA" refere-se amplamente a qualquer doença ou distúrbio em que a expressão de PSMA está associada ou envolvida com um ou mais processos patológicos que são característicos da doença ou distúrbio. Tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a, câncer de próstata.[00144] The term "characterized by expression of PSMA" broadly refers to any disease or disorder in which PSMA expression is associated with or involved with one or more pathological processes that are characteristic of the disease or disorder. Such disorders include, but are not limited to, prostate cancer.
[00145] Os termos "neoplasias de células B" ou "neoplasias de células B maduras" no contexto da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, todas as leucemias e linfomas linfoides, leucemia lin-focítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia prolinfocítica, leucemia linfoblástica B precursora, leucemia de células ciliadas, lin-foma linfocítico pequeno, linfoma prolinfocítico de células B, leucemia linfocítica crônica de células B, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), mieloma múltiplo, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de zona marginal esplênica, neoplasias de células plasmáticas, como mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma, doença de deposição de imunoglobulina monoclonal, doença de cadeia pesada, linfoma MALT, linfoma marginal de células B nodais, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primária, granulomatose linfomatoide, linfoma não Hodgkin, linfoma Hodgkin, leucemia de células pilosas, linfoma de efusão primária e linfoma não Hodgkin relacionado com a AIDS.[00145] The terms "B-cell neoplasms" or "mature B-cell neoplasms" in the context of the present invention include, but are not limited to, all lymphoid leukemias and lymphomas, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, leukemia prolymphocytic, precursor B-lymphoblastic leukemia, hair cell leukemia, small lymphocytic lymphoma, prolymphocytic B-cell lymphoma, chronic B-cell lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, follicular lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), multiple myeloma, lymphoplasmacytic lymphoma, splenic marginal zone lymphoma, plasma cell neoplasms such as plasma cell myeloma, plasmacytoma, monoclonal immunoglobulin deposition disease, heavy chain disease, MALT lymphoma, marginal nodal B cell lymphoma , intravascular large B-cell lymphoma, primary effusion lymphoma, lymphomatoid granulomatosis, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, l hairy cell eukemia, primary effusion lymphoma, and AIDS-related non-Hodgkin's lymphoma.
[00146] O termo "caracterizado pela expressão de CD19" refere-se amplamente a qualquer doença ou distúrbio em que a expressão de CD19 está associada ou envolvida com um ou mais processos patológicos que são característicos da doença ou distúrbio. Tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a, neoplasias de células B.[00146] The term "characterized by expression of CD19" broadly refers to any disease or disorder in which CD19 expression is associated with or involved with one or more pathological processes that are characteristic of the disease or disorder. Such disorders include, but are not limited to, B-cell neoplasms.
[00147] O termo "caracterizado pela expressão de BGMA" refere-se amplamente a qualquer doença ou distúrbio em que a expressão de BCMA está associada ou envolvida com um ou mais processos patológicos que são característicos da doença ou distúrbio. Tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a, neoplasias de células B.[00147] The term "characterized by BGMA expression" broadly refers to any disease or disorder in which BCMA expression is associated with or involved with one or more pathological processes that are characteristic of the disease or disorder. Such disorders include, but are not limited to, B-cell neoplasms.
[00148] Os termos "sujeito", "indivíduo" e "paciente" são usados de forma intercambiável neste documento para se referir a um mamífero sendo avaliado para tratamento e/ou sendo tratado. Em uma modalidade, 0 mamífero é um humano. Os termos "sujeito", "indivíduo" e "paciente" abrangem, sem limitação, indivíduos com câncer, indivíduos com doenças autoimunes, com infecções por patógenos e semelhantes. Os sujeitos podem ser humanos, mas também incluem outros mamíferos, particularmente aqueles mamíferos úteis como modelos de laboratório para doenças humanas, por exemplo, camundongo, rato, etc.[00148] The terms "subject", "individual" and "patient" are used interchangeably herein to refer to a mammal being evaluated for treatment and/or being treated. In one embodiment, the mammal is a human. The terms "subject", "individual" and "patient" include, without limitation, individuals with cancer, individuals with autoimmune diseases, with pathogen infections and the like. Subjects may be humans, but also include other mammals, particularly those mammals useful as laboratory models for human disease, e.g., mouse, rat, etc.
[00149] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em tal forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito para o qual a formulação seria ser administrado. Tais formulações são estéreis. Excipi-entes "farmaceuticamente aceitáveis" (veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um mamífero em questão para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo utilizado.[00149] The term "pharmaceutical formulation" refers to a preparation that is in such a form that it allows the biological activity of the active ingredient to be effective and that does not contain additional components that are unacceptably toxic to a subject for whom the formulation would be be administered. Such formulations are sterile. "Pharmaceutically acceptable" excipients (carriers, additives) are those that can reasonably be administered to a mammal in question to provide an effective dose of the active ingredient used.
[00150] Uma formulação "estéril" é asséptica ou livre ou essencialmente livre de todos os microrganismos vivos e seus esporos. Uma formulação "congelada" é aquela a uma temperatura inferior a 0 °C.[00150] A "sterile" formulation is aseptic or free or essentially free of all living microorganisms and their spores. A "frozen" formulation is one at a temperature below 0°C.
[00151] Uma formulação "estável" é aquela em que a proteína nela retém essencialmente sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica após armazenamento. Preferencialmente, a formulação mantém essencialmente a sua estabilidade física e química, bem como a sua actividade biológica após armazenamento. O período de armazenamento é geralmente selecionado com base no prazo de validade pretendido da formulação. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade de proteínas estão disponíveis na técnica e são revisadas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones. A. Av. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. A estabilidade pode ser avaliada qualitativa e/ou quantitativamente de várias maneiras diferentes, incluindo avaliação da formação de agregados (por exemplo, usando cromatografia de exclusão de tamanho, medindo a turbidez e/ou por inspeção visual); avaliando a heterogeneidade de carga usando cromatografia de troca catiônica, focagem isoelétrica capilar de imagem (iclEF) ou eletroforese de zona capilar; análise da sequência amino-terminal ou carboxi-terminal; análise es-pectrométrica de massa; Análise SDS-PAGE para comparar anticorpo reduzido e intacto; análise do mapa peptídico (por exemplo tríptico ou LYS-C); avaliação da atividade biológica ou função de ligação ao antí-geno do anticorpo; etc. A instabilidade pode envolver qualquer um ou mais dentre: agregação, desamidação (por exemplo, desamidação de Asn), oxidação (por exemplo, oxidação de Met), isomerização (por exemplo, isomeriação de Asp), recorte/hidrólise/fragmentação (por exemplo, fragmentação da região de dobradiça), formação de succini-mida, cisteína(s) não pareada(s), extensão N-terminal, processamento C-terminal, diferenças de glicosilação, etc.[00151] A "stable" formulation is one in which the protein therein essentially retains its physical stability and/or chemical stability and/or biological activity after storage. Preferably, the formulation essentially maintains its physical and chemical stability, as well as its biological activity after storage. The storage period is generally selected based on the intended shelf life of the formulation. Various analytical techniques for measuring protein stability are available in the art and are reviewed in Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones. A. Av. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993), for example. Stability can be measured at a selected temperature for a selected period of time. Stability can be assessed qualitatively and/or quantitatively in a number of different ways, including assessment of aggregate formation (eg, using size exclusion chromatography, measuring turbidity, and/or by visual inspection); assessing charge heterogeneity using cation exchange chromatography, capillary isoelectric focusing imaging (iclEF) or capillary zone electrophoresis; amino-terminal or carboxy-terminal sequence analysis; mass spectrometry analysis; SDS-PAGE analysis to compare reduced and intact antibody; peptide map analysis (eg tryptic or LYS-C); evaluation of the biological activity or antigen-binding function of the antibody; etc. Instability can involve any one or more of: aggregation, deamidation (e.g. Asn deamidation), oxidation (e.g. Met oxidation), isomerization (e.g. Asp isomerization), trimming/hydrolysis/fragmentation (e.g. , hinge region fragmentation), succinimide formation, unpaired cysteine(s), N-terminal extension, C-terminal splicing, glycosylation differences, etc.
[00152] A presente invenção refere-se a várias famílias de anticorpos intimamente relacionados que se ligam ao BCMA humano. As regiões variáveis dos anticorpos destas famílias estão descritas nas Publicações de Patente U.S. N° US20190352412, US20200157232 e US 20200048348, e nas Publicações PCT WO2018237037 e WO2019 006072, cujas divulgações estão aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Uma seleção não limitativa de sequências de domínio variável de anticorpo de cadeia pesada anti-BCMA representativas é fornecida abaixo na Tabela 1.
[00153] Uma sequência de anticorpo anti-BCMA pode ser selecionada daquelas fornecidas neste documento para desenvolvimento e uso terapêutico ou outro, incluindo, sem limitação, uso como um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos biespecíficos ou multies-pecíficos, que podem ter qualquer uma das configurações discutidas neste documento, incluindo, sem limitação, um TCA. Os anticorpos biespecíficos compreendem pelo menos a região variável da cadeia pesada de um anticorpo específico para uma proteína diferente de BCMA.[00153] An anti-BCMA antibody sequence may be selected from those provided herein for development and therapeutic or other use, including, without limitation, use as a multispecific antibody, e.g., a bispecific antibody. In some embodiments, bispecific or multispecific antibodies are provided, which can have any of the configurations discussed herein, including, without limitation, a TCA. Bispecific antibodies comprise at least the heavy chain variable region of an antibody specific for a protein other than BCMA.
[00154] Quando uma proteína da invenção é um anticorpo biespe-cífico, uma porção de ligação é específica para BCMA humano, enquanto 0 outro braço pode ser específico para células alvo, antígenos associados a tumor, antígenos de direcionamento, por exemplo, integri-nas, etc., antígenos de patógenos, proteínas de ponto de verificação e semelhantes. As células alvo incluem especificamente células cancerosas, tais como tumores hematológicos, por exemplo, tumores de células B, conforme discutido abaixo.[00154] When a protein of the invention is a bispecific antibody, one binding portion is specific for human BCMA, while the other arm may be specific for target cells, tumor-associated antigens, targeting antigens, e.g. nas, etc., pathogen antigens, checkpoint proteins, and the like. Target cells specifically include cancer cells, such as hematologic tumors, for example, B-cell tumors, as discussed below.
[00155] Vários formatos de anticorpos biespecíficos estão dentro do âmbito da invenção incluindo, sem limitação, polipeptídeos de cadeia simples, polipeptídeos de duas cadeias, polipeptídeos de três cadeias, polipeptídeos de quatro cadeias e múltiplos dos mesmos. Os anticorpos biespecíficos neste documento incluem especificamente anticorpos biespecíficos de células T que se ligam a BCMA, que é expresso seletivamente em células plasmáticas (PCs) e mieloma múltiplo (MM) e CD3 (anticorpos anti-BCMA χ anti-CD3). Tais anticorpos induzem a morte mediada por células T potentes de células portadoras de BCMA e podem ser usados para tratar tumores, em particular tumores hematológicos, tais como tumores de células B, conforme discutido mais adiante.[00155] Various formats of bispecific antibodies are within the scope of the invention including, without limitation, single-chain polypeptides, two-chain polypeptides, three-chain polypeptides, four-chain polypeptides, and multiples thereof. The bispecific antibodies herein specifically include T-cell bispecific antibodies that bind BCMA, which is selectively expressed on plasma cells (PCs) and multiple myeloma (MM) and CD3 (anti-BCMA χ anti-CD3 antibodies). Such antibodies induce potent T-cell mediated killing of BCMA-bearing cells and can be used to treat tumors, in particular hematologic tumors, such as B-cell tumors, as discussed further below.
[00156] Em uma modalidade preferida, um anticorpo biespecífico é um TCA compreendendo: um domínio VH anti-CD3 que é emparelhado com um domínio variável de cadeia leve (VL), em que o domínio VH e o domínio VL juntos têm afinidade de ligação a CD3; um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo somente de cadeia pesada com afinidade de ligação a BCMA, em uma configuração monovalente ou biva-lente; e um domínio Fc de lgG4 humana variante compreendendo uma primeira sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A e uma mutação T366W (knob) e uma segunda sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A, uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V (hole). Este domínio Fc de lgG4 variante ou modificado evita a troca indesejada de Fab, reduz a função efetora do anticorpo e também facilita a heterodimerização das subuni-dades de polipeptídeo de cadeia pesada para formar o anticorpo bies-pecífico.[00156] In a preferred embodiment, a bispecific antibody is a TCA comprising: an anti-CD3 VH domain that is paired with a light chain variable domain (VL), wherein the VH domain and the VL domain together have binding affinity to CD3; a heavy-chain variable domain from a heavy-chain-only antibody with BCMA binding affinity, in a monovalent or bivalent configuration; and a variant human IgG4 Fc domain comprising a first heavy chain constant region sequence comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation and a T366W mutation (knob) and a second heavy chain constant region sequence comprising a mutation S228P, one F234A mutation, one L235A mutation, one T366S mutation, one L368A mutation and one Y407V (hole) mutation. This variant or modified IgG4 Fc domain prevents unwanted Fab switching, reduces the effector function of the antibody, and also facilitates heterodimerization of the heavy chain polypeptide subunits to form the bispecific antibody.
[00157] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada de anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58.[00157] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain of anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 58.
[00158] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada de anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59.[00158] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain of anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 59.
[00159] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00159] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 58, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00160] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo i) SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00160] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising an anti-CD3 heavy chain comprising i) SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 59, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00161] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58.[00161] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and an anti-CD3 heavy chain. BCMA comprising SEQ ID NO: 58.
[00162] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59.[00162] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii ) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 59.
[00163] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00163] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 58, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00164] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59, em que 0 anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00164] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 59, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00165] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compre-endendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.[00165] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 , said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58.
[00166] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59.[00166] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, the said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59.
[00167] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, e em que o referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00167] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, the said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58, and wherein said second linking arm does not comprise a light chain.
[00168] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, e em que 0 referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00168] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, the said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59, and wherein said second linking arm does not comprise a light chain.
[00169] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TOA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58.[00169] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TOA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 58.
[00170] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TOA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59.[00170] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TOA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 59.
[00171] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TOA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58, em que ο anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00171] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TOA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 58, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00172] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TCA) compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo i) SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00172] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising an anti-CD3 heavy chain comprising i) SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 59, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00173] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58.[00173] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 58.
[00174] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo SEQ ID NO: 59.[00174] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain CD3 comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 59.
[00175] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 58, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00175] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) an anti-CD3 light chain CD3 comprising SEQ ID NO: 49 and an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 58, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00176] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias (TCA) bies-pecífico de lgG4 monoclonal humana compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 56, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 59, em que o anticorpo biespecí-fico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00176] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 56, ii) a light chain anti-CD3 comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 59, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00177] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 humano (TCA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.[00177] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human IgG4 three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58.
[00178] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 humano (TCA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoá-cidos de SEQ ID NO: 59.[00178] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human IgG4 three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59.
[00179] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 humano (TCA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, e em que o referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00179] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human IgG4 three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, said light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58, and wherein said second linking arm does not comprise a light chain.
[00180] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e 0 referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, e em que o referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00180] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds to human CD3. linker that binds to human BCMA, said first linker arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second linker arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59, and wherein said second arm of binding does not comprise a light chain.
[00181] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e ill) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76.[00181] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and ill) a heavy chain anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 76.
[00182] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77.[00182] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 77.
[00183] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00183] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 76, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00184] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo i) SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00184] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific antibody comprising an anti-CD3 heavy chain comprising i) SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) a heavy chain anti-BCMA comprising SEQ ID NO: 77, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00185] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76.[00185] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and an anti-CD3 heavy chain. BCMA comprising SEQ ID NO: 76.
[00186] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77.[00186] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 77.
[00187] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00187] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 76, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00188] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00188] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 77, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00189] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.[00189] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, the said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76.
[00190] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pe-sada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.[00190] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75 , said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77.
[00191] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, e em que o referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00191] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, the said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, and wherein said second linking arm does not comprise a light chain.
[00192] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende um anticorpo biespecífico de lgG4 monoclonal humano, compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, e em que 0 referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00192] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific antibody, comprising (i) a first binding arm that binds human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, the said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77, and wherein said second linking arm does not comprise a light chain.
[00193] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TCA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo SEQ ID NO: 76.[00193] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 76.
[00194] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TCA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77.[00194] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 77.
[00195] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TCA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00195] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 76, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00196] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico (TCA) compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo i) SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49, e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00196] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising an anti-CD3 heavy chain comprising i) SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49, and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 77, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00197] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76.[00197] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, an anti-CD3 light chain comprising SEQ ID NO: 49 and an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 76.
[00198] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TOA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77.[00198] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TOA) three-chain antibody-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain CD3 comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 77.
[00199] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 76, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00199] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain CD3 comprising SEQ ID NO: 49 and an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 76, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00200] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias (TCA) biespecífico de lgG4 monoclonal humano compreendendo i) uma cadeia pesada anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 75, ii) uma cadeia leve anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO: 49 e iii) uma cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a SEQ ID NO: 77, em que o anticorpo biespecífico não compreende uma cadeia leve anti-BCMA.[00200] In some embodiments, the present invention comprises a human monoclonal IgG4 bispecific three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising i) an anti-CD3 heavy chain comprising SEQ ID NO: 75, ii) an anti-CD3 light chain CD3 comprising SEQ ID NO: 49 and iii) an anti-BCMA heavy chain comprising SEQ ID NO: 77, wherein the bispecific antibody does not comprise an anti-BCMA light chain.
[00201] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 humano (TCA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende 0 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.[00201] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human IgG4 three-chain antibody (TCA)-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76.
[00202] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de igG4 humano (TOA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende o sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.[00202] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human IgG4 three-chain antibody (TOA)-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds human BCMA, said first binding arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second binding arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, said light chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77.
[00203] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TOA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende o sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, e em que o referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00203] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TOA) three-chain antibody-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds to human CD3. linker that binds to human BCMA, said first linker arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second linker arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, said light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, and wherein said second arm of binding does not comprise a light chain.
[00204] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende uma molécula semelhante a anticorpo de três cadeias biespecífico de lgG4 monoclonal humano (TCA) compreendendo (i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3 humano e (ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano, o referido primeiro braço de ligação compreendendo uma primeira cadeia pesada e uma cadeia leve, e o referido segundo braço de ligação compreendendo uma segunda cadeia pesada bivalente, em que a referida primeira cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, a referida cadeia leve compreende o sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, e a referida segunda cadeia pesada bivalente compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, e em que o referido segundo braço de ligação não compreende uma cadeia leve.[00204] In some embodiments, the present invention comprises a bispecific human monoclonal IgG4 (TCA) three-chain antibody-like molecule comprising (i) a first binding arm that binds to human CD3 and (ii) a second binding arm that binds to human CD3. linker that binds to human BCMA, said first linker arm comprising a first heavy chain and a light chain, and said second linker arm comprising a second bivalent heavy chain, wherein said first heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, said light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and said second bivalent heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77, and wherein said second arm of binding does not comprise a light chain.
[00205] A presente invenção fornece uma família de anticorpos intimamente relacionados que se ligam ao GD19 humano. As regiões variáveis dos anticorpos desta família são descritas na Publicação PCT No. W02020018922, cuja divulgação está aqui incorporada por referência na sua totalidade. Uma sequência de anticorpo anti-CD19 pode ser selecionada daquelas fornecidas neste documento para desenvolvimento e uso terapêutico ou outro, incluindo, sem limitação, uso como um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos, que podem ter qualquer uma das configurações discutidas neste documento, incluindo, sem limitação, um TCA. Os anticorpos biespecíficos compreendem pelo menos a região variável da cadeia pesada de um anticorpo específico para uma proteína diferente de GD19.[00205] The present invention provides a family of closely related antibodies that bind to human GD19. The variable regions of antibodies of this family are described in PCT Publication No. WO2020018922, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. An anti-CD19 antibody sequence may be selected from those provided herein for development and therapeutic or other use, including, without limitation, use as a multispecific antibody, e.g., a bispecific antibody. In some embodiments, bispecific or multispecific antibodies are provided, which can have any of the configurations discussed herein, including, without limitation, a TCA. Bispecific antibodies comprise at least the heavy chain variable region of an antibody specific for a protein other than GD19.
[00206] Quando uma proteína da invenção é um anticorpo biespecífico, uma porção de ligação é específica para CD19 humano, enquanto o outro braço pode ser específico para células alvo, antígenos associados a tumor, antígenos de direcionamento, por exemplo, integri-nas, etc., antígenos de patógenos, proteínas de ponto de verificação e semelhantes. As células alvo incluem especificamente células cancerosas, tais como tumores hematológicos, por exemplo, tumores de células B, conforme discutido abaixo.[00206] When a protein of the invention is a bispecific antibody, one binding portion is specific for human CD19, while the other arm may be specific for target cells, tumor-associated antigens, targeting antigens, e.g. integrins, etc., pathogen antigens, checkpoint proteins, and the like. Target cells specifically include cancer cells, such as hematologic tumors, for example, B-cell tumors, as discussed below.
[00207] Vários formatos de anticorpos biespecíficos estão dentro do âmbito da invenção, incluindo, sem limitação, polipeptídeos de cadeia simples, polipeptídeos de duas cadeias, polipeptídeos de três cadeias, polipeptídeos de quatro cadeias e múltiplos dos mesmos. Os anticorpos biespecíficos neste documento incluem especificamente anticorpos biespecíficos de células T que se ligam a CD19, que é expresso seletivamente em células B maduras e CD3 (anticorpos anti-CD19 χ anti-CD3). Tais anticorpos induzem a morte mediada por células T potentes de células que expressam CD19 e podem ser usados para tratar tumores, em particular tumores hematológicos, tais como tumores de células B, conforme discutido mais adiante.[00207] Various formats of bispecific antibodies are within the scope of the invention, including, without limitation, single-chain polypeptides, two-chain polypeptides, three-chain polypeptides, four-chain polypeptides, and multiples thereof. The bispecific antibodies herein specifically include T-cell bispecific antibodies that bind to CD19, which is selectively expressed on mature B cells and CD3 (anti-CD19 χ anti-CD3 antibodies). Such antibodies induce potent T-cell mediated killing of cells expressing CD19 and can be used to treat tumors, in particular hematologic tumors, such as B-cell tumors, as discussed further below.
[00208] Em uma modalidade preferida, um anticorpo biespecífico é um TCA compreendendo: um domínio VH anti-CD3 que é emparelhado com um domínio variável de cadeia leve (VL), em que o domínio VH e o domínio VL juntos têm afinidade de ligação a CD3; um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo somente de cadeia pesada com afinidade de ligação a CD19, em uma configuração monovalente ou biva-lente; e um domínio Fc de lgG4 humana variante compreendendo uma primeira sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A e uma mutação T366W (knob) e uma segunda sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A, uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V (hole). Este domínio Fc de lgG4 variante ou modificado evita a troca indesejada de Fab, reduz a função efetora do anticorpo e também facilita a heterodimerização das subuni-dades de polipeptídeo de cadeia pesada para formar o anticorpo bies-pecífico.[00208] In a preferred embodiment, a bispecific antibody is a TCA comprising: an anti-CD3 VH domain that is paired with a light chain variable domain (VL), wherein the VH domain and the VL domain together have binding affinity to CD3; a heavy-chain variable domain from a heavy-chain-only antibody with binding affinity to CD19, in a monovalent or bivalent configuration; and a variant human IgG4 Fc domain comprising a first heavy chain constant region sequence comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation and a T366W mutation (knob) and a second heavy chain constant region sequence comprising a mutation S228P, one F234A mutation, one L235A mutation, one T366S mutation, one L368A mutation and one Y407V (hole) mutation. This variant or modified IgG4 Fc domain prevents unwanted Fab switching, reduces the effector function of the antibody, and also facilitates heterodimerization of the heavy chain polypeptide subunits to form the bispecific antibody.
[00209] A presente invenção fornece uma família de anticorpos intimamente relacionados que se ligam ao PSMA humano. Os anticorpos desta família são exemplificados pelas sequências de região variável de cadeia pesada (VH) fornecidas de SEQ ID NOs: 24 a 54 apresentadas na Tabela 2. As famílias de anticorpos fornecem vários benefícios que contribuem para a utilidade como agente(s) clinicamente terapêutico(s). Os anticorpos incluem membros com uma gama de afinidades de ligação, permitindo a seleção de uma sequência específica com uma afinidade de ligação desejada.
[00210] Em uma modalidade preferida, um anticorpo biespecífico é um TCA compreendendo: um domínio VH anti-CD3 que é emparelhado com um domínio variável de cadeia leve (VL), em que o domínio VH e o domínio VL juntos têm afinidade de ligação a CD3; um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo somente de cadeia pesada com afinidade de ligação ao PSMA, em uma configuração monovalente ou bi-valente; e um domínio Fc de IgG4 humana variante compreendendo uma primeira sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A e uma mutação T366W (knob) e uma segunda sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A, uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V (hole). Este domínio Fc de IgG4 variante ou modificado evita a troca indesejada de Fab, reduz a função efetora do anticorpo e também facilita a heterodimerização das subuni-dades de polipeptídeo de cadeia pesada para formar o anticorpo bies-pecífico.[00210] In a preferred embodiment, a bispecific antibody is a TCA comprising: an anti-CD3 VH domain that is paired with a light chain variable domain (VL), wherein the VH domain and the VL domain together have binding affinity to CD3; a heavy-chain variable domain from a heavy-chain-only antibody with PSMA binding affinity, in a monovalent or bivalent configuration; and a variant human IgG4 Fc domain comprising a first heavy chain constant region sequence comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation and a T366W mutation (knob) and a second heavy chain constant region sequence comprising a mutation S228P, one F234A mutation, one L235A mutation, one T366S mutation, one L368A mutation and one Y407V (hole) mutation. This variant or modified IgG4 Fc domain prevents unwanted Fab switching, reduces the effector function of the antibody, and also facilitates heterodimerization of the heavy chain polypeptide subunits to form the bispecific antibody.
[00211] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos bies-pecíficos ou multiespecíficos, que podem ter qualquer uma das configurações discutidas neste documento incluindo, sem limitação, uma molécula semelhante a anticorpo biespecífico de três cadeias. Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico pode compreender um par de cadeia pesada/cadeía leve que tem especificidade de ligação a um primeiro antígeno (por exemplo, CD3) e uma cadeia pesada de um anticorpo somente de cadeia pesada. Em certas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo somente de cadeia pesada compreende uma porção Fc compreendendo domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio CH1. Em uma modalidade particular, um anticorpo biespecífico compreende um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem especificidade de ligação a um antígeno em uma célula efetora (por exemplo, uma proteína CD3 em uma célula T) e uma cadeia pesada de uma cadeia pesada somente anticorpo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que tem especificidade de ligação a BCMA, PSMA ou CD19.[00211] In some embodiments, bispecific or multispecific antibodies are provided, which can have any of the configurations discussed herein including, without limitation, a three-chain bispecific antibody-like molecule. In some embodiments, a multispecific antibody can comprise a heavy chain/light chain pair that has binding specificity to a first antigen (e.g., CD3) and a heavy chain from a heavy chain-only antibody. In certain embodiments, the heavy chain of the heavy-chain-only antibody comprises an Fc portion comprising CH2 and/or CH3 and/or CH4 domains, in the absence of a CH1 domain. In a particular embodiment, a bispecific antibody comprises a heavy chain/light chain pair that has binding specificity to an antigen on an effector cell (e.g., a CD3 protein on a T cell) and a heavy chain of a heavy chain only. antibody comprising an antigen-binding domain that has binding specificity for BCMA, PSMA, or CD19.
[00212] Em uma modalidade preferida, um anticorpo biespecífico é um TCA compreendendo: um domínio VH anti-CD3 que é emparelhado com um domínio variável de cadeia leve (VL), em que o domínio VH e o domínio VL juntos têm afinidade de ligação a CD3; um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo somente de cadeia pesada com afinidade de ligação a BCMA, PSMA ou CD19; e um domínio Fc de lgG4 humana variante compreendendo uma primeira sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A e uma mutação T366W (knob) e uma segunda sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A, uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V (hole). Este domínio Fc de lgG4 variante ou modificado evita a troca indesejada de Fab, reduz a função efetora do anticorpo e também facilita a heterodimerização das subunidades de polipeptídeo de cadeia pesada para formar o anticorpo biespecífico.[00212] In a preferred embodiment, a bispecific antibody is a TCA comprising: an anti-CD3 VH domain that is paired with a light chain variable domain (VL), wherein the VH domain and the VL domain together have binding affinity to CD3; a heavy-chain variable domain from a heavy-chain-only antibody with binding affinity for BCMA, PSMA, or CD19; and a variant human IgG4 Fc domain comprising a first heavy chain constant region sequence comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation and a T366W mutation (knob) and a second heavy chain constant region sequence comprising a mutation S228P, one F234A mutation, one L235A mutation, one T366S mutation, one L368A mutation and one Y407V (hole) mutation. This variant or modified IgG4 Fc domain prevents unwanted Fab switching, reduces the effector function of the antibody, and also facilitates heterodimerization of the heavy chain polypeptide subunits to form the bispecific antibody.
[00213] Em algumas modalidades, um anticorpo multiespecífico compreende um domínio VH de ligação a CD3 que é emparelhado com um domínio variável de cadeia leve. Em certas modalidades, a cadeia leve é uma cadeia leve fixa. Em algumas modalidades, o domínio VH de ligação a CD3 compreende uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 36, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 37 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 38, em uma framework de VH humana. Em algumas modalidades, a cadeia leve fixa compreende uma sequência CDR1 de SEQ ID NO: 39, uma sequência CDR2 de SEQ ID NO: 40 e uma sequência CDR3 de SEQ ID NO: 41, em uma framework de VL humana. Juntos, 0 domínio VH de ligação a CD3 e o domínio variável de cadeia leve têm afinidade de ligação a CD3. Em algumas modalidades, um domínio VH de ligação a CD3 compreende uma sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, um domínio VH de ligação a CD3 compreende uma sequência com pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% por cento de identidade com a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, uma cadeia leve fixa compreende uma sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, uma cadeia leve fixa compreende uma sequência com pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% por cento de identidade á sequência da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 43.[00213] In some embodiments, a multispecific antibody comprises a CD3-binding VH domain that is paired with a light chain variable domain. In certain embodiments, the light chain is a fixed light chain. In some embodiments, the VH CD3-binding domain comprises a CDR1 sequence of SEQ ID NO: 36, a CDR2 sequence of SEQ ID NO: 37, and a CDR3 sequence of SEQ ID NO: 38, in a human VH framework. In some embodiments, the fixed light chain comprises a CDR1 sequence of SEQ ID NO: 39, a CDR2 sequence of SEQ ID NO: 40, and a CDR3 sequence of SEQ ID NO: 41, in a human VL framework. Together, the VH CD3-binding domain and the light chain variable domain have CD3-binding affinity. In some embodiments, a CD3 binding VH domain comprises a heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 42. In some embodiments, a CD3 binding VH domain comprises at least about 80% sequence, at least at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, or at least about 99% percent identity with the heavy chain variable region sequence of SEQ ID NO: 42. In some embodiments, a fixed light chain comprises a light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 43. In some embodiments, a fixed light chain comprises a sequence of at least about 80%, at least about 85%, at least about 85% 90%, at least about 95%, or at least about 99% percent sequence identity to the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 43.
[00214] Anticorpos multiespecíficos compreendendo o domínio VH de ligação a CD3 descrito acima e o domínio variável da cadeia leve têm propriedades vantajosas, por exemplo, conforme descrito na Publicação PCT WO2018/052503, cuja divulgação está incorporada por referência neste documento sua totalidade. Qualquer um dos anticorpos multies-pecíficos e domínios de ligação ao antígeno descritos neste documento, tendo afinidade de ligação a BCMA, PSMA ou CD19, pode ser combinado com os domínios de ligação a CD3 e domínios de cadeia leve fixa descritos neste documento para gerar anticorpos multiespecíficos com ligação afinidade para um ou mais epítopos de BCMA, epítopos de PSMA ou epítopos de CD19, bem como CD3.
[00215] Em algumas modalidades, são fornecidos anticorpos bies-pecíficos ou multiespecíficos, que podem ter qualquer uma das configurações discutidas neste documento incluindo, sem limitação, uma molécula semelhante a anticorpo biespecífico de três cadeias. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode compreender pelo menos uma região variável de cadeia pesada com especificidade de ligação a BCMA, PSMA ou CD19 e pelo menos uma região variável de cadeia pesada com especificidade de ligação a uma proteína diferente, por exemplo, CD3. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico pode compreender um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem especificidade de ligação a um primeiro antígeno e uma cadeia pesada de um anticorpo somente de cadeia pesada, compreendendo uma porção Fc compreendendo domínios CH2 e/ou CH3 e/ou CH4, na ausência de um domínio CH1, e um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de um segundo antígeno ou um epítopo diferente do primeiro antígeno, em uma configuração monovalente ou bivalente. Em uma modalidade particular, um anticorpo biespecífico compreende um par de cadeia pesada/cadeia leve que tem especificidade de ligação a um an-tígeno em uma célula efetora (por exemplo, uma proteína CD3 em uma célula T) e uma cadeia pesada de uma cadeia pesada somente anti-corpo compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que tem especificidade de ligação a BCMA, PSMA ou CD19, em uma configuração monovalente ou bivalente.[00215] In some embodiments, bispecific or multispecific antibodies are provided, which can have any of the configurations discussed herein including, without limitation, a three-chain bispecific antibody-like molecule. In some embodiments, a bispecific antibody can comprise at least one heavy chain variable region with binding specificity for BCMA, PSMA, or CD19 and at least one heavy chain variable region with binding specificity for a different protein, e.g., CD3. In some embodiments, a bispecific antibody can comprise a heavy chain/light chain pair that has binding specificity to a first antigen and a heavy chain from a heavy chain-only antibody, comprising an Fc portion comprising CH2 and/or CH3 domains and /or CH4, in the absence of a CH1 domain, and an antigen-binding domain that binds an epitope of a second antigen or a different epitope of the first antigen, in a monovalent or bivalent configuration. In a particular embodiment, a bispecific antibody comprises a heavy chain/light chain pair that has binding specificity to an antigen on an effector cell (e.g., a CD3 protein on a T cell) and a heavy chain of a single chain. heavy-only antibody comprising an antigen-binding domain that has binding specificity for BCMA, PSMA, or CD19, in a monovalent or bivalent configuration.
[00216] Em algumas modalidades, onde um anticorpo da invenção é um anticorpo biespecífico, um braço do anticorpo (uma porção de ligação ou uma unidade de ligação) é específico para BCMA humano, PSMA humano ou CD19 humano, enquanto o outro braço pode ser específico para células alvo, antígenos associados a tumor, antígenos de direcionamento, por exemplo, integrinas, etc., antígenos de patógenos, proteínas de ponto de verificação e semelhantes. As células alvo incluem especificamente células cancerosas, incluindo, sem limitação, células de tumores sólidos, por exemplo, tumores de próstata, conforme discutido abaixo. Em algumas modalidades, um braço do anticorpo (uma porção de ligação ou uma unidade de ligação) é específico para BCMA humano, PSMA humano ou CD19 humano, enquanto o outro braço é específico para CD3.[00216] In some embodiments, where an antibody of the invention is a bispecific antibody, one arm of the antibody (a binding moiety or a binding moiety) is specific for human BCMA, human PSMA, or human CD19, while the other arm may be specific for target cells, tumor associated antigens, targeting antigens eg integrins etc., pathogen antigens, checkpoint proteins and the like. Target cells specifically include cancer cells, including, without limitation, cells from solid tumors, for example, prostate tumors, as discussed below. In some embodiments, one arm of the antibody (a binding moiety or a binding moiety) is specific for human BCMA, human PSMA, or human CD19, while the other arm is specific for CD3.
[00217] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende um polipeptídeo de cadeia leve anti-CD3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 43 ligada à sequência de SEQ ID NO: 48, um polipeptídeo de cadeia pesada anti-CD3 compreendendo a sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 56 ou 57, e um polipeptídeo de cadeia pesada anti-BCMA compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58, 59 ou 60. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 58, 59 ou 60. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 58. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA consistindo em um primeiro polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 49, um segundo polipep-tídeo consistindo na SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo peptídeo consistindo em SEQ ID NO: 58. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 59. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 59. Em uma modalidade, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 60. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA consistindo de um primeiro polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 60.[00217] In some embodiments, an antibody comprises an anti-CD3 light chain polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 43 linked to the sequence of SEQ ID NO: 48, an anti-CD3 heavy chain polypeptide comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 56 or 57, and an anti-BCMA heavy chain polypeptide comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 58, 59 or 60. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 58, 59 or 60. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 58. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting in SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 58. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO : 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 59. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 59. In one embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 60. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a tertiary third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 60.
[00218] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende um polipeptídeo de cadeia leve anti-CD3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 43 ligada à sequência de SEQ ID NO: 48, um polipeptídeo de cadeia pesada anti-CD3 compreendendo a sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 56 ou 57, e um polipeptídeo de cadeia pesada anti-PSMA compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 64, 65 ou 66. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 61. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 61. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 62. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA consistindo em um primeiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 62. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 64. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA consistindo em um primeiro polipeptídeo consistindo da SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 64. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 65. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 65. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 66. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 66.[00218] In some embodiments, an antibody comprises an anti-CD3 light chain polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 43 linked to the sequence of SEQ ID NO: 48, an anti-CD3 heavy chain polypeptide comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 56 or 57, and an anti-PSMA heavy chain polypeptide comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 61, 62, 63, 64, 65 or 66. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 61. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 61. an antibody is a TCA comprising a first polypeptide of comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 62. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 62. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO : 56 and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 63. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 63. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 64. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 64. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 65. In a preferred embodiment , an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 65. In a preferred embodiment, a antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 66. In a preferred embodiment , an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 66.
[00219] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende um polipeptídeo de cadeia leve anti-CD3 compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 43 ligada à sequência de SEQ ID NO: 48, um polipeptídeo de cadeia pesada anti-CD3 compreendendo a sequência de qualquer um das SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 56 ou 57, e um polipeptídeo de cadeia pesada anti-CD19 compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 67, 68 ou 69. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 67. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA consistindo em um primeiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo consistindo em SEQ ID NO: 67. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 68. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 68. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA compreendendo um primeiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 69. Em uma modalidade preferida, um anticorpo é um TCA que consiste em um primeiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 49, um segundo polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 56 e um terceiro polipeptídeo que consiste em SEQ ID NO: 69.[00219] In some embodiments, an antibody comprises an anti-CD3 light chain polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 43 linked to the sequence of SEQ ID NO: 48, an anti-CD3 heavy chain polypeptide comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 50, 51, 52, 53, 56 or 57, and an anti-CD19 heavy chain polypeptide comprising the sequence of any one of SEQ ID NOs: 67, 68 or 69. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 67. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 67. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56, and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 68. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49 , a second polypeptide consisting of SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 68. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA comprising a first polypeptide comprising SEQ ID NO: 49, a second polypeptide comprising SEQ ID NO: 56 and a third polypeptide comprising SEQ ID NO: 69. In a preferred embodiment, an antibody is a TCA consisting of a first polypeptide consisting of SEQ ID NO: 49, a second polypeptide consisting of SEQ ID NO : 56 and a third polypeptide consisting of SEQ ID NO: 69.
[00220] Vários formatos de anticorpos multiespecíficos estão dentro do âmbito da invenção, incluindo, sem limitação, polipeptídeos de cadeia simples, polipeptídeos de duas cadeias, polipeptídeos de três cadeias, polipeptídeos de quatro cadeias e múltiplos dos mesmos. Os anticorpos multiespecíficos neste documento incluem especificamente anticorpos multiespecíficos de células T (por exemplo, biespecíficos) que se ligam a BCMA, PSMA ou 19 e CD3 (anticorpos anti-BCMA x anti-CD3, anticorpos anti-PSMA x anti-CD3, anticorpos anti-CD19 x anti-CD3), e que contêm um domínio Fc de lgG4 humana variante compreendendo uma primeira sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A e uma mutação T366W (knob) e um segunda sequência de região constante de cadeia pesada compreendendo uma mutação S228P, uma mutação F234A, uma mutação L235A, uma mutação T366S, uma mutação L368A e uma mutação Y407V (hole). Este domínio Fc de lgG4 variante ou modificado evita a troca indesejada de Fab, reduz a função efetora do anticorpo e também facilita a heterodimerização das subunidades de polipeptídeo de cadeia pesada para formar o anticorpo biespecífico. Tais anticorpos induzem a morte mediada por células T potente de células que expressam BCMA, PSMA ou CD19, respectivamente.[00220] Various formats of multispecific antibodies are within the scope of the invention, including, without limitation, single-chain polypeptides, two-chain polypeptides, three-chain polypeptides, four-chain polypeptides, and multiples thereof. Multispecific antibodies herein specifically include T-cell multispecific (e.g., bispecific) antibodies that bind BCMA, PSMA, or 19, and CD3 (anti-BCMA vs. anti-CD3 antibodies, anti-PSMA vs. -CD19 x anti-CD3), and which contain a variant human IgG4 Fc domain comprising a first heavy chain constant region sequence comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation and a T366W mutation (knob) and a second heavy chain constant region sequence comprising an S228P mutation, an F234A mutation, an L235A mutation, a T366S mutation, an L368A mutation and a Y407V (hole) mutation. This variant or modified IgG4 Fc domain prevents unwanted Fab switching, reduces the effector function of the antibody, and also facilitates heterodimerization of the heavy chain polypeptide subunits to form the bispecific antibody. Such antibodies induce potent T-cell mediated killing of cells expressing BCMA, PSMA or CD19, respectively.
[00221] Os anticorpos multiespecíficos da presente invenção podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade preferida, os anticorpos de cadeia pesada aqui são produzidos por animais transgênicos, incluindo camundongos e ratos transgênicos, preferencialmente ratos, nos quais os genes de imunoglobulina endógenos são eliminados ou desativados. Em uma modalidade preferida, os anticorpos de cadeia pesada aqui são produzidos em UniRat™. UniRat™ tem seus genes de imunoglobulina endógenos silenciados e usa um translocus de cadeia pesada de imunoglobulina humana para expressar um repertório diversificado e naturalmente otimizado de HCAbs totalmente humanos. Embora os loci de imunoglobulina endógenos em ratos possam ser eliminados ou silenciados usando uma variedade de tecnologias, no UniRat™ a tecnologia de dedo de zinco (endo)nuclease (ZNF) foi usada para inativar o locus J de cadeia pesada de rato endógeno, locus Ck de cadeia leve e locus Cλ da cadeia leve. Os construtos de ZNF para microinjeção em oócitos podem produzir linhas de eliminação de IgH e IgL (KO). Para detalhes ver, por exemplo, Geurts et al., 2009, Science 325:433. A caracterização de ratos knockout de cadeia pesada de Ig foi relatada por Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941. As vantagens da tecnologia de ZNF são que a junção de extremidades não homólogas para silenciar um gene ou locus por meio de deleções de até vários kb também pode fornecer um sítio alvo para integração homóloga (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64-67). Os anticorpos de cadeia pesada humana produzidos no UniRat™ são chamados UniAbs™ e podem ligar-se a epítopos que não podem ser atacados com anticorpos convencionais. Sua alta especificidade, afinidade e tamanho pequeno os tornam ideais para aplicações mono e poliespecíficas.[00221] The multispecific antibodies of the present invention can be prepared by methods known in the art. In a preferred embodiment, the heavy chain antibodies herein are produced by transgenic animals, including transgenic mice and rats, preferably rats, in which endogenous immunoglobulin genes are deleted or inactivated. In a preferred embodiment, the heavy chain antibodies herein are produced in UniRat™. UniRat™ has its endogenous immunoglobulin genes silenced and uses a human immunoglobulin heavy chain translocus to express a diverse and naturally optimized repertoire of fully human HCAbs. While endogenous immunoglobulin loci in mice can be knocked out or silenced using a variety of technologies, in UniRat™ zinc finger (endo)nuclease (ZNF) technology was used to inactivate the endogenous mouse heavy chain J locus, locus Light chain ck and light chain Cλ locus. ZNF constructs for microinjection into oocytes can produce both IgH and IgL knockout lines (KO). For details see, for example, Geurts et al., 2009, Science 325:433. The characterization of Ig heavy chain knockout mice was reported by Menoret et al., 2010, Eur. J. Immunol. 40:2932-2941. The advantages of ZNF technology are that the joining of non-homologous ends to silence a gene or locus through deletions of up to several kb can also provide a target site for homologous integration (Cui et al., 2011, Nat Biotechnol 29:64 -67). The human heavy chain antibodies produced in the UniRat™ are called UniAbs™ and can bind to epitopes that cannot be targeted with conventional antibodies. Their high specificity, affinity and small size make them ideal for mono and polyspecific applications.
[00222] Além de UniAbsTM, especificamente incluídos neste documento estão anticorpos apenas de cadeia pesada sem a framework e mutações de VHH de camelídeo e suas regiões VH funcionais. Tais anticorpos somente de cadeia pesada podem, por exemplo, ser produzidos em ratos ou camundongos transgênicos que compreendem loci de genes somente de cadeia pesada totalmente humanos como descrito, por exemplo, em WO2006/008548, mas outros mamíferos transgênicos, como coelho, cobaia, rato também pode ser usado, sendo preferidos ratos e camundongos. Anticorpos somente de cadeia pesada, incluindo seus fragmentos funcionais VHH ou VH, também podem ser produzidos por tecnologia de DNA recombinante, pela expressão do ácido nucleico codificante em um hospedeiro eucariótico ou procariótico adequado, incluindo, por exemplo, células de mamífero (por exemplo, células CHO), E. coli ou levedura.[00222] In addition to UniAbsTM, specifically included in this document are heavy chain only antibodies lacking the framework and mutations of camelid VHH and their functional VH regions. Such heavy-chain-only antibodies can, for example, be produced in transgenic mice or rats comprising fully human heavy-chain-only gene loci as described, for example, in WO2006/008548, but other transgenic mammals such as rabbit, guinea pig, rat can also be used, with rats and mice being preferred. Heavy chain-only antibodies, including functional VHH or VH fragments thereof, can also be produced by recombinant DNA technology, by expression of the encoding nucleic acid in a suitable eukaryotic or prokaryotic host, including, for example, mammalian cells (e.g., CHO cells), E. coli or yeast.
[00223] Domínios de anticorpos somente de cadeia pesada combinam vantagens de anticorpos e drogas de moléculas pequenas: podem ser mono ou multivalentes; apresentam baixa toxicidade; e são rentáveis para fabricar. Devido ao seu pequeno tamanho, esses domínios são de fácil administração, incluindo administração oral ou tópica, são caracterizados por alta estabilidade, incluindo estabilidade gastrointestinal; e sua meia-vida pode ser adaptada ao uso ou indicação desejada. Além disso, os domínios VH e VHH de HCAbs podem ser fabricados de maneira econômica.[00223] Heavy chain-only antibody domains combine advantages of antibodies and small molecule drugs: they can be mono or multivalent; have low toxicity; and are cost effective to manufacture. Due to their small size, these domains are easy to administer, including oral or topical administration, are characterized by high stability, including gastrointestinal stability; and its half-life can be adapted to the desired use or indication. Furthermore, the VH and VHH domains of HCAbs can be fabricated cost-effectively.
[00224] Em uma modalidade particular, os anticorpos de cadeia pesada da presente invenção, incluindo UniAbs™, têm o resíduo de ami-noácido nativo na primeira posição da região FR4 (posição de aminoá-cido 101 de acordo com o sistema de numeração Kabat), substituído por outro resíduo de aminoácido, que é capaz de romper um adesivo hidrofóbico exposto á superfície compreendendo ou associado ao resíduo de aminoácido nativo nessa posição. Tais manchas hidrofóbicas são normalmente enterradas na interface com a região constante da cadeia leve do anticorpo, mas tornam-se expostas ã superfície em HCAbs e são, pelo menos parcialmente, para a agregação indesejada e associação de cadeia leve de HCAbs. O resíduo de aminoácido substituído é preferencialmente carregado, e mais preferencialmente é carregado positivamente, tal como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) ou histidina (His, Η), preferencialmente arginina (R). Em uma modalidade preferida, os anticorpos somente de cadeia pesada derivados de animais transgêni-cos contêm uma mutação de Trp para Arg na posição 101. Os HCAbs resultantes preferencialmente têm alta afinidade de ligação ao antígeno e solubilidade sob condições fisiológicas na ausência de agregação.[00224] In a particular embodiment, the heavy chain antibodies of the present invention, including UniAbs™, have the native amino acid residue in the first position of the FR4 region (
[00225] Como parte da presente invenção, foram identificados anticorpos de cadeia pesada humana com sequências únicas de animais UniRat™ (UniAb™) que se ligam a CD3, BCMA, PSMA ou CD19 humanos em proteínas ELISA e ensaios de ligação celular. As sequências de região variável de cadeia pesada (VH) identificadas (ver, por exemplo, Tabelas 1 e 2) são positivas para ligação a proteínas e/ou para ligação a células que expressam a proteína alvo (por exemplo, CD3, BCMA, PSMA ou CD19) e são todas negativas para a ligação a células que não expressam a proteína alvo.[00225] As part of the present invention, human heavy chain antibodies have been identified with unique sequences from UniRat™ animals (UniAb™) that bind to human CD3, BCMA, PSMA or CD19 in protein ELISA and cell binding assays. The heavy chain variable region (VH) sequences identified (see, for example, Tables 1 and 2) are positive for protein binding and/or for binding to cells expressing the target protein (for example, CD3, BCMA, PSMA or CD19) and are all negative for binding to cells that do not express the target protein.
[00226] Anticorpos de cadeia pesada que se ligam a epítopos não sobrepostos em uma proteína alvo, por exemplo, UniAbs™ podem ser identificados por ensaios de ligação de competição, como imunoensaios ligados a enzimas (ensaios ELISA) ou ensaios de ligação competitiva por citometria de fluxo. Por exemplo, pode-se usar a competição entre anticorpos conhecidos que se ligam ao antígeno alvo e o anticorpo de interesse. Usando esta abordagem, pode-se dividir um conjunto de anticorpos entre aqueles que competem com o anticorpo de referência e aqueles que não competem. Os anticorpos não concorrentes são identificados como se ligando a um epítopo distinto que não se sobrepõe ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência. Muitas vezes, um anticorpo é imobilizado, o antígeno é ligado e um segundo anticorpo marcado (por exemplo, biotinilado) é testado em um ensaio ELISA quanto à capacidade de se ligar ao antígeno capturado. Isso também pode ser realizado usando plataformas de ressonância plasmõnica de superfície (SPR), incluindo ProteOn XPR36 (BioRad, Inc), Biacore 2000 e Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences) e MX96 SPR imager (Ibis technologies B.V.), bem como em plataformas de interferometria de biocamada, como Octet Red384 e Octet HTX (ForteBio, Pall Inc). Para mais detalhes veja os exemplos aqui.[00226] Heavy chain antibodies that bind to non-overlapping epitopes on a target protein, e.g. UniAbs™ can be identified by competitive binding assays such as enzyme-linked immunoassays (ELISA assays) or cytometric competitive binding assays flow. For example, one could use competition between known antibodies that bind to the target antigen and the antibody of interest. Using this approach, one can divide a set of antibodies into those that compete with the reference antibody and those that do not. Non-competing antibodies are identified as binding a distinct epitope that does not overlap with the epitope bound by the reference antibody. Often, one antibody is immobilized, the antigen is bound, and a second labeled antibody (eg, biotinylated) is tested in an ELISA assay for its ability to bind the captured antigen. This can also be performed using surface plasmon resonance (SPR) platforms, including ProteOn XPR36 (BioRad, Inc),
[00227] Normalmente, um anticorpo "compete" com um anticorpo de referência se causar cerca de 15-100% de redução na ligação do anticorpo de referência ao antígeno alvo, conforme determinado por técnicas padrão, como pelos ensaios de ligação de competição descritos acima. Em várias modalidades, a inibição relativa é de pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50% pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou superior.[00227] Typically, an antibody "competes" with a reference antibody if it causes about a 15-100% reduction in binding of the reference antibody to the target antigen, as determined by standard techniques, such as the competition binding assays described above . In various embodiments, the relative inhibition is at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%, at least about 35%, at least about 40% at least about 45%, at least about 50% at least about 55%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 75% at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95% or greater.
[00228] É outro aspecto da presente invenção fornecer composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos de ligação multiespecífica da presente invenção em mistura com um carreador far-maceuticamente aceitável adequado. Os carreadores farmaceutica-mente aceitáveis como usados neste documento são exemplificados, mas não limitados a, adjuvantes, carreadores sólidos, água, tampões ou outros carreadores usados na técnica para reter componentes terapêuticos ou combinações dos mesmos.[00228] It is another aspect of the present invention to provide pharmaceutical compositions comprising one or more multispecifically binding compounds of the present invention in admixture with a suitable pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers as used herein are exemplified, but not limited to, adjuvants, solid carriers, water, buffers or other carriers used in the art to retain therapeutic components or combinations thereof.
[00229] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de cadeia pesada (por exemplo, UniAb™) que se liga a uma proteína alvo (por exemplo, CD3, BCMA, PSMA ou CD19). Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de cadeia pesada multiespecífico (incluindo biespecífico) (por exemplo, UniAb™) com especificidade de ligação a dois ou mais epítopes não sobrepostos em uma proteína alvo (por exemplo, CD3, BCMA, PSMA ou CD19). Em uma modalidade preferida, uma composição farmacêutica compreende um anticorpo de cadeia pesada multiespecífico (incluindo biespecífico) (por exemplo, UniAb™) com especificidade de ligação a uma proteína alvo (por exemplo, BCMA, PSMA ou CD19) e com especificidade de ligação a um alvo de ligação em uma célula efe-tora (por exemplo, um alvo de ligação em uma célula T, tal como, por exemplo, uma proteína CD3 em uma célula T).[00229] In one embodiment, a pharmaceutical composition comprises a heavy chain antibody (e.g., UniAb™) that binds to a target protein (e.g., CD3, BCMA, PSMA, or CD19). In another embodiment, a pharmaceutical composition comprises a multispecific (including bispecific) heavy chain antibody (e.g., UniAb™) with binding specificity for two or more non-overlapping epitopes on a target protein (e.g., CD3, BCMA, PSMA, or CD19). In a preferred embodiment, a pharmaceutical composition comprises a multispecific (including bispecific) heavy chain antibody (e.g., UniAb™) with binding specificity to a target protein (e.g., BCMA, PSMA, or CD19) and with binding specificity to a binding target on an effector cell (eg, a binding target on a T cell, such as, for example, a CD3 protein on a T cell).
[00230] As composições farmacêuticas dos anticorpos utilizados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando proteínas com o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A Ed. (1980)), tal como na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos: antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil pa-rabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); poli-péptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como gli-cina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarí-deos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas: agentes quelantes tais como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-prote-ína): e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).[00230] Pharmaceutical compositions of antibodies used in accordance with the present invention are prepared for storage by mixing proteins of the desired degree of purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, Ed. (1980)), such as in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used and include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids: antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens, such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3- pentanol; and m-cresol); low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues); proteins, such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins: chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes): and/or non-ionic surfactants such as TWEEN™, PLURONICS™ or polyethylene glycol (PEG).
[00231] As composições farmacêuticas para administração parenteral são preferencialmente estéreis e substancialmente isotônicas e fabricadas sob condições de Boas Práticas de Fabricação (GMP). As composições farmacêuticas podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária (isto é, a dosagem para uma única administração). A formulação depende da via de administração escolhida. Os anticorpos aqui podem ser administrados por injeção intravenosa ou infusão ou por via subcutânea. Para administração por injeção, os anticorpos descritos neste documento podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis para reduzir o desconforto no local da injeção. A solução pode conter carreadores, ex-cipientes ou estabilizadores conforme discutido acima. Alternativamente, os anticorpos podem estar na forma liofilizada para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio, antes do uso.[00231] Pharmaceutical compositions for parenteral administration are preferably sterile and substantially isotonic and manufactured under Good Manufacturing Practice (GMP) conditions. Pharmaceutical compositions may be provided in unit dosage form (i.e., dosage for a single administration). The formulation depends on the chosen route of administration. Antibodies here can be administered by intravenous injection or infusion or subcutaneously. For administration by injection, the antibodies described herein can be formulated in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers to reduce discomfort at the injection site. The solution may contain carriers, excipients or stabilizers as discussed above. Alternatively, the antibodies may be in lyophilized form for constitution with a suitable vehicle, eg sterile pyrogen-free water, before use.
[00232] As formulações de anticorpos são divulgadas, por exemplo, na Patente U.S. N° 9.034.324. Formulações semelhantes podem ser usadas para os anticorpos de cadeia pesada, incluindo UniAbs™, da presente invenção. As formulações de anticorpos subcutâneos são descritas, por exemplo, em US20160355591 e US20160166689.[00232] Antibody formulations are disclosed, for example, in U.S. Pat. No. 9,034,324. Similar formulations can be used for the heavy chain antibodies, including UniAbs™, of the present invention. Subcutaneous antibody formulations are described, for example, in US20160355591 and US20160166689.
[00233] Os anticorpos somente de cadeia pesada, anticorpos mul-tiespecíficos e composições farmacêuticas descritos neste documento podem ser usados para o tratamento de doenças e condições caracterizadas pela expressão de uma proteína alvo (por exemplo, CD3, BCMA, PSMA ou CD19), incluindo, sem limitação, as condições e doenças descritas mais adiante.[00233] The heavy chain-only antibodies, multi-specific antibodies and pharmaceutical compositions described in this document can be used for the treatment of diseases and conditions characterized by the expression of a target protein (for example, CD3, BCMA, PSMA or CD19), including, without limitation, the conditions and diseases described below.
[00234] As composições farmacêuticas neste documento compreendendo anticorpos anti-BCMA podem ser usadas para o tratamento de distúrbios relacionados a células B, incluindo malignidades de células B e plasmócitos e distúrbios autoimunes caracterizados pela expressão ou superexpressão de BCMA.[00234] Pharmaceutical compositions herein comprising anti-BCMA antibodies can be used for the treatment of B-cell related disorders, including B-cell and plasma cell malignancies and autoimmune disorders characterized by BCMA expression or overexpression.
[00235] Tais distúrbios relacionados a células B incluem malignidades de células B e plasmócitos e distúrbios autoimunes incluindo, sem limitação, plasmocitoma, linfoma de Hodgkins, linfomas foliculares, lin-fomas de células pequenas não clivadas, linfoma de Burkitt endêmico, linfoma de Burkitt esporádico, linfoma de zona marginal, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa extranodal, linfoma de células B mo-nocitóides nodais, linfoma esplênico, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma misto difuso de células, linfoma imu-noblástico, linfoma primário de células B do mediastino, angiocêntrico de células B pulmonar linfoma, linfoma linfocítico pequeno, proliferações de células B de potencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, distúrbio imunorregulatório, artrite reumatoide, miastenia gravis, púrpura trombocitopênica idiopá-tica, síndrome antifosfolípide, doença de Chagas, doença de Graves, Granulomatose de Wegener, poliarterite nodosa, síndrome de Sjogren, pênfigo vulgar, esclerodermia, esclerose múltipla, síndrome antifosfolípide, vasculite associada a ANCA, doença de Goodpasture, doença de Kawasaki, anemia hemolítica autoimune e glomerulonefrite rapidamente progressiva, doença de cadeia pesada, amiloidose primária ou associada a imunocitos ou gamopatia monoclonal.[00235] Such B-cell related disorders include B-cell and plasma cell malignancies and autoimmune disorders including, without limitation, plasmacytoma, Hodgkins lymphoma, follicular lymphomas, small non-cleaving cell lymphomas, endemic Burkitt's lymphoma, Burkitt's lymphoma sporadic, marginal zone lymphoma, extranodal mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma, nodal monocytoid B-cell lymphoma, splenic lymphoma, mantle cell lymphoma, large cell lymphoma, diffuse mixed cell lymphoma, immunoblastic lymphoma, primary mediastinal B-cell lymphoma, angiocentric pulmonary B-cell lymphoma, small lymphocytic lymphoma, B-cell proliferations of uncertain malignant potential, lymphomatoid granulomatosis, post-transplant lymphoproliferative disorder, immunoregulatory disorder, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, idiopathic thrombocytopenic purpura tica, antiphospholipid syndrome, Chagas disease, Graves disease, Granulomatosis d and Wegener, polyarteritis nodosa, Sjogren's syndrome, pemphigus vulgaris, scleroderma, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome, ANCA-associated vasculitis, Goodpasture's disease, Kawasaki disease, autoimmune hemolytic anemia and rapidly progressive glomerulonephritis, heavy chain disease, primary amyloidosis or associated with immunocytes or monoclonal gammopathy.
[00236] Os distúrbios de células plasmáticas caracterizados pela expressão de BCMA incluem Mieloma Múltiplo (MM). O MM é uma malignidade de células B caracterizada por uma expansão monoclonal e acúmulo de plasmócitos anormais no compartimento da medula óssea. As terapias atuais para MM geralmente causam remissões, mas quase todos os pacientes acabam recaindo e morrem. Há evidências substanciais de uma eliminação imunomediada de células de mieloma no contexto do transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas; no entanto, a toxicidade dessa abordagem é alta e poucos pacientes são curados. Embora alguns anticorpos monoclonais tenham se mostrado promissores para o tratamento de MM em estudos pré-clínicos e ensaios clínicos iniciais, a eficácia clínica consistente de qualquer terapia de anticorpos monoclonais para MM não foi demonstrada de forma conclusiva. Há, portanto, uma grande necessidade de novas terapias, incluindo imunoterapias para MM (ver, por exemplo, Carpenter et al., Clin Cancer Res 2013, 19(8):2048-2060).[00236] Plasma cell disorders characterized by BCMA expression include Multiple Myeloma (MM). MM is a B-cell malignancy characterized by monoclonal expansion and accumulation of abnormal plasma cells in the bone marrow compartment. Current therapies for MM usually cause remissions, but nearly all patients eventually relapse and die. There is substantial evidence for an immune-mediated clearance of myeloma cells in the context of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; however, the toxicity of this approach is high and few patients are cured. Although some monoclonal antibodies have shown promise for the treatment of MM in preclinical studies and early clinical trials, the consistent clinical efficacy of any monoclonal antibody therapy for MM has not been conclusively demonstrated. There is therefore a great need for new therapies, including immunotherapies for MM (see, for example, Carpenter et al., Clin Cancer Res 2013, 19(8):2048-2060).
[00237] A superexpressão ou ativação de BCMA pelo seu ligante indutor de proliferação, APRIL, é conhecido por promover a progressão do Mieloma Múltiplo (MM) humano in vivo. O BCMA também demonstrou promover o crescimento in vivo de células MM xenoenxertadas que abrigam a mutação p53 em camundongos. Uma vez que a atividade da via APRIL/BCMA desempenha um papel central na patogênese do MM e na resistência a drogas por meio de interações bidirecionais entre as células tumorais e seu microambiente de suporte da medula óssea, o BCMA foi identificado como um alvo para o tratamento do MM. Para mais detalhes ver, por exemplo, Yu-Tsu Tai et al., Blood 2016; 127(25): 3225-3236.[00237] Overexpression or activation of BCMA by its proliferation-inducing ligand, APRIL, is known to promote the progression of human Multiple Myeloma (MM) in vivo. BCMA has also been shown to promote in vivo growth of xenografted MM cells harboring the p53 mutation in mice. Since APRIL/BCMA pathway activity plays a central role in MM pathogenesis and drug resistance through bidirectional interactions between tumor cells and their bone marrow support microenvironment, BCMA has been identified as a target for the MM treatment. For more details see, for example, Yu-Tsu Tai et al., Blood 2016; 127(25): 3225-3236.
[00238] Outro distúrbio de células B envolvendo células plasmáti-cas, ou seja, expressando BCMA é lúpus eritematoso sistêmico (SLE), também conhecido como lúpus. O SLE é uma doença sistêmica e au-toimune que pode afetar qualquer parte do corpo e é representada com o sistema imunológico atacando as próprias células e tecidos do corpo, resultando em inflamação crônica e dano tecidual. É uma reação de hi-persensibilidade tipo III na qual os complexos anticorpos-imunes precipitam e causam uma resposta imune adicional (Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337).[00238] Another B-cell disorder involving plasma cells, ie expressing BCMA is systemic lupus erythematosus (SLE), also known as lupus. SLE is a systemic and autoimmune disease that can affect any part of the body and is represented with the immune system attacking the body's own cells and tissues, resulting in chronic inflammation and tissue damage. It is a type III hypersensitivity reaction in which antibody-immune complexes precipitate and cause an additional immune response ( Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337 ).
[00239] Os anticorpos somente de cadeia pesada anti-BCMA (UniAb) da presente invenção podem ser usados para desenvolver agentes terapêuticos para o tratamento de MM, SLE e outros distúrbios de células B ou distúrbios de células plasmáticas caracterizados pela expressão de BCMA, como os listados acima. Em particular, os anticorpos apenas de cadeia pesada anti-BCMA (UniAb) da presente invenção são candidatos para o tratamento de MM, sozinhos ou em combinação com outros tratamentos de MM.[00239] The anti-BCMA heavy chain-only antibodies (UniAb) of the present invention can be used to develop therapeutic agents for the treatment of MM, SLE and other B cell disorders or plasma cell disorders characterized by BCMA expression, such as those listed above. In particular, the anti-BCMA heavy chain only antibodies (UniAb) of the present invention are candidates for the treatment of MM, alone or in combination with other treatments of MM.
[00240] PSMA é uma proteína transmembranar tipo II que é expressa no tecido do epitélio da próstata e é regulada positivamente no câncer de próstata e na neovasculatura de tumores sólidos. Ela também é expressa em níveis baixos em tecidos saudáveis, como cérebro, rim e glândulas salivares, mas sua superexpressão no tecido maligno da próstata o torna um alvo atraente para o tratamento terapêutico do câncer de próstata. Ela também pode ser relevante para terapia ou imagem de tumores sólidos, dada sua alta expressão na neovasculatura maligna. Anticorpos monoclonais, conjugados de anticorpo-fármaco e células T do receptor de antígeno quimérico visando PSMA foram descritos para o tratamento de câncer de próstata metastático (Hernandez-Hoyos et al., 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al., 2014, PMID: 25327986, Serganova et al., 2016, PMID: 28345023). Além disso, conjugados de radionuclídeos específicos para PSMA estão sendo investigados para imagens e tratamento de câncer de próstata (por exemplo, Hofman et al., 2018 PMID: 29752180).[00240] PSMA is a type II transmembrane protein that is expressed in prostate epithelial tissue and is upregulated in prostate cancer and in the neovasculature of solid tumors. It is also expressed at low levels in healthy tissues such as the brain, kidney and salivary glands, but its overexpression in malignant prostate tissue makes it an attractive target for the therapeutic treatment of prostate cancer. It may also be relevant for therapy or imaging of solid tumors, given its high expression in malignant neovasculature. Monoclonal antibodies, antibody-drug conjugates, and chimeric antigen receptor T cells targeting PSMA have been described for the treatment of metastatic prostate cancer (Hernandez-Hoyos et al., 2016, PMID: 27406985, DiPippo et al., 2014, PMID : 25327986, Serganova et al., 2016, PMID: 28345023). Additionally, PSMA-specific radionuclide conjugates are being investigated for prostate cancer imaging and treatment (eg, Hofman et al., 2018 PMID: 29752180).
[00241] Em um aspecto, os anticorpos de cadeia pesada de PSMA (por exemplo, UniAbsTM) e composições farmacêuticas neste docu-mento podem ser usados para tratar distúrbios caracterizados pela expressão de PSMA, incluindo, sem limitação, câncer de próstata e tumores sólidos.[00241] In one aspect, PSMA heavy chain antibodies (e.g., UniAbsTM) and pharmaceutical compositions herein can be used to treat disorders characterized by PSMA expression, including, without limitation, prostate cancer and solid tumors .
[00242] O CD19 é um receptor de superfície celular que é expresso em todas as células B humanas, mas não é encontrado em células plas-máticas. Ele tem uma cauda citoplasmática relativamente grande, de 240 aminoácidos. Os domínios extracelulares semelhantes a Ig são divididos por um domínio potencial não semelhante a Ig ligado a dissulfeto e sítios de adição de carboidratos ligados a N. A cauda citoplasmática contém pelo menos nove resíduos de tirosina perto do terminal C, alguns dos quais mostraram ser fosforilados. Juntamente com CD20 e CD22, a expressão restrita de CD19 à linhagem de células B o torna um alvo atraente para o tratamento terapêutico de malignidades de células B. Devido à sua expressão observada em várias malignidades hematológicas, o CD19 é um alvo promissor para terapias baseadas em anticorpos.[00242] CD19 is a cell surface receptor that is expressed on all human B cells, but is not found on plasma cells. It has a relatively large cytoplasmic tail of 240 amino acids. The extracellular Ig-like domains are divided by a disulfide-linked potential non-Ig-like domain and N-linked carbohydrate addition sites. The cytoplasmic tail contains at least nine tyrosine residues near the C-terminus, some of which have been shown to be phosphorylated . Along with CD20 and CD22, the B-cell lineage-restricted expression of CD19 makes it an attractive target for the therapeutic treatment of B-cell malignancies. Due to its observed expression in various hematological malignancies, CD19 is a promising target for therapies based on in antibodies.
[00243] Em um aspecto, os anticorpos de cadeia pesada CD19 (por exemplo, UniAbsTM) e composições farmacêuticas neste documento podem ser usados para tratar malignidades hematológicas caracterizadas pela expressão de CD19, incluindo, sem limitação, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), linfoma não Hodgkin, leucemia linfocílica crônica de células B (CLL) e leucemia linfoblástica aguda de células B (ALL).[00243] In one aspect, the CD19 heavy chain antibodies (e.g., UniAbsTM) and pharmaceutical compositions herein can be used to treat hematologic malignancies characterized by expression of CD19, including, without limitation, diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL ), non-Hodgkin's lymphoma, B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) and B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL).
[00244] O linfoma difuso de grandes células B (DLBCL ou DLBL) é a forma mais comum de linfoma não-Hodgkin entre adultos (Blood 1997 89 (11): 3909-18), com uma incidência anual estimada de 7 a 8 casos por 100.000 pessoas por ano nos EUA e no Reino Unido. Ele se caracteriza como um câncer agressivo que pode surgir em praticamente qualquer parte do corpo. As causas do DLBCL não são bem compreendidas e podem surgir de células B normais, bem como de transformação maligna de outros tipos de linfoma ou células de leucemia. As abordagens de tratamento geralmente envolvem quimioterapia e radiação e resultaram em uma taxa média de sobrevida global de cinco anos de aproximadamente 58% para adultos. Embora alguns anticorpos monoclonais tenham se mostrado promissores para o tratamento de DLBCL, a eficácia clínica consistente ainda não foi demonstrada de forma conclusiva. Existe, portanto, uma grande necessidade de novas terapias, incluindo imunoterapias, para DLBCL.[00244] Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL or DLBL) is the most common form of non-Hodgkin lymphoma among adults (Blood 1997 89(11):3909-18), with an estimated annual incidence of 7 to 8 cases per 100,000 people a year in the US and UK. It is characterized as an aggressive cancer that can arise in virtually any part of the body. The causes of DLBCL are not well understood and can arise from normal B cells as well as from malignant transformation of other types of lymphoma or leukemia cells. Treatment approaches usually involve chemotherapy and radiation and have resulted in an average five-year overall survival rate of approximately 58% for adults. Although some monoclonal antibodies have shown promise for the treatment of DLBCL, consistent clinical efficacy has yet to be conclusively demonstrated. There is therefore a great need for new therapies, including immunotherapies, for DLBCL.
[00245] Em outro aspecto, os anticorpos de cadeia pesada CD19 (por exemplo, UniAbsTM) e composições farmacêuticas neste documento podem ser usados para tratar distúrbios autoimunes caracterizados por células B patogênicas que expressam CD19, incluindo, sem limitação, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide (RA) e esclerose múltipla (MS).[00245] In another aspect, the CD19 heavy chain antibodies (e.g., UniAbsTM) and pharmaceutical compositions herein can be used to treat autoimmune disorders characterized by pathogenic B cells that express CD19, including, without limitation, systemic lupus erythematosus (SLE ), rheumatoid arthritis (RA) and multiple sclerosis (MS).
[00246] As doses eficazes das composições da presente invenção para o tratamento de doenças variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, local alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um humano, mas os mamíferos não humanos também podem ser tratados, por exemplo, animais de companhia, como cães, gatos, cavalos, etc., mamíferos de laboratório, como coelhos, camundongos, ratos, etc. e semelhantes. As dosagens de tratamento podem ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia.[00246] Effective doses of the compositions of the present invention for the treatment of diseases vary depending on many different factors, including means of administration, target site, physiological state of the patient, whether the patient is human or animal, other drugs administered, and whether treatment is prophylactic or therapeutic. Usually the patient is a human, but non-human mammals can also be treated, for example companion animals such as dogs, cats, horses, etc., laboratory mammals such as rabbits, mice, rats, etc. and the like. Treatment dosages can be titrated to optimize safety and efficacy.
[00247] Os níveis de dosagem podem ser prontamente determinados pelo médico normalmente versado e podem ser modificados conforme necessário, por exemplo, conforme necessário para modificar a resposta de um sujeito à terapia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais veiculares para produzir uma única forma de dosagem varia dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. As formas de unidade de dosagem geralmente contêm entre cerca de 1 mg e cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.[00247] Dosage levels can be readily determined by the physician of ordinary skill and can be modified as needed, for example, as needed to modify a subject's response to therapy. The amount of active ingredient that can be combined with the carrier materials to produce a single dosage form varies depending on the host treated and the particular mode of administration. Dosage unit forms generally contain between about 1 mg and about 500 mg of an active ingredient.
[00248] Em algumas modalidades, a dosagem terapêutica do agente pode variar de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplificativo envolve a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. As entidades terapêuticas da presente invenção são normalmente administradas em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado pela medição dos níveis sanguíneos da entidade terapêutica no paciente. Alternativamente, as entidades terapêuticas da presente invenção podem ser administradas como uma formulação de liberação sustentada, caso em que é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do polipeptídeo no paciente.[00248] In some embodiments, the therapeutic dosage of the agent can range from about 0.0001 to 100 mg/kg, and more generally 0.01 to 5 mg/kg, of the host's body weight. For example, dosages can be 1 mg/kg body weight or 10 mg/kg body weight or within the range of 1-10 mg/kg. An exemplary treatment regimen involves administration once every two weeks or once a month or once every 3 to 6 months. The therapeutic entities of the present invention are typically administered on multiple occasions. Intervals between single dosing can be weekly, monthly, or yearly. Intervals may also be irregular, as indicated by measuring blood levels of the therapeutic entity in the patient. Alternatively, the therapeutic entities of the present invention can be administered as a sustained release formulation, in which case less frequent administration is required. Dosage and frequency vary depending on the half-life of the polypeptide in the patient.
[00249] Normalmente, as composições são preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. As composições farmacêuticas deste documento são adequadas para administração intravenosa ou subcutânea, diretamente ou após a reconstituição de composições sólidas (por exemplo, liofilizadas). A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micropartículas, tais como polilactídeo, poliglicólido ou copolímero para efeito adjuvante aprimorado, conforme discutido acima. Langer, Science 249: 1527, 1990 e Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de uma injeção de depósito ou preparação de implante que pode ser formulada de tal maneira que para permitir uma liberação sustentada ou pulsátil do ingrediente ativo. As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas e em total conformidade com todos os regulamentos de Boas Práticas de Fabricação (GMP) da Food and Drug Administration dos EUA.[00249] Typically, the compositions are prepared as injectables, either as liquid solutions or suspensions; solid forms suitable for solution or suspension in liquid vehicles prior to injection can also be prepared. The pharmaceutical compositions of this document are suitable for intravenous or subcutaneous administration, directly or after reconstitution of solid compositions (for example, lyophilized). The preparation can also be emulsified or encapsulated in liposomes or microparticles such as polylactide, polyglycolide or copolymer for enhanced adjuvant effect, as discussed above. Langer, Science 249: 1527, 1990 and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. The agents of this invention can be administered in the form of a depot injection or implant preparation which can be formulated in such a way that to allow a sustained or pulsatile release of the active ingredient. Pharmaceutical compositions are generally formulated as sterile, substantially isotonic and in full compliance with all Good Manufacturing Practice (GMP) regulations of the US Food and Drug Administration.
[00250] A toxicidade dos anticorpos e estruturas de anticorpos descritos neste documento pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, determinando o LD50 (a dose letal para 50% da população) ou o LD100 (a dose letal a 100% da população). A razão de dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os dados obtidos a partir desses ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem que não seja tóxica para uso em humanos. A dosagem dos anticorpos descritos neste documento situa-se preferencialmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a dose eficaz com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual tendo em vista a condição do paciente.[00250] The toxicity of the antibodies and antibody structures described in this document can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals, for example, determining the LD50 (the lethal dose for 50% of the population) or the LD100 (the lethal dose to 100% of the population). The dose ratio between toxic and therapeutic effect is the therapeutic index. The data obtained from these cell culture assays and animal studies can be used in formulating a dosage range that is non-toxic for human use. The dosage of the antibodies described herein preferably falls within a range of circulating concentrations that include the effective dose with little or no toxicity. The dosage can vary within this range depending on the dosage form used and the route of administration used. The exact formulation, route of administration and dosage can be chosen by the individual physician in view of the patient's condition.
[00251] As composições para administração geralmente compreenderão um anticorpo ou outro agente (por exemplo, outro agente ablativo) dissolvido em um carreador farmaceuticamente aceitável, preferencialmente um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria indesejá-vel. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar as condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste de pH e tampáo, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração de agente ativo nestas formulações pode variar amplamente e será selecionada principalmente com base em volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e semelhantes de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do paciente (por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., 1980) e Goodman & Gill-man, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)).[00251] Compositions for administration will generally comprise an antibody or other agent (e.g., another ablative agent) dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. A variety of aqueous carriers can be used, for example, buffered saline and the like. These solutions are sterile and generally free of undesirable matter. These compositions can be sterilized by well known conventional sterilization techniques. The compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as needed to approximate physiological conditions, such as pH and buffering agents, toxicity adjusting agents, and the like, for example, sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, chloride calcium, sodium lactate and the like. The concentration of active agent in these formulations can vary widely and will be selected primarily based on fluid volumes, viscosities, body weight and the like according to the particular mode of administration selected and the needs of the patient (e.g., Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., 1980) and Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., eds., 1996)).
[00252] Também dentro do escopo da invenção estão kits que compreendem os agentes ativos e suas formulações, da invenção e instruções de uso. O kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional, por exemplo, um fármaco quimioterapêutico, etc. Os kits normalmente incluem uma etiqueta indicando o uso pretendido do conteúdo do kit. O termo "etiqueta", conforme usado neste documento, inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido em ou com um kit, ou que de outra forma acompanhe um kit.[00252] Also within the scope of the invention are kits comprising the active agents and their formulations, of the invention and instructions for use. The kit may further contain at least one additional reagent, for example, a chemotherapeutic drug, etc. Kits typically include a label indicating the intended use of the kit contents. The term "label", as used in this document, includes any written or recorded material provided in or with a kit, or that otherwise accompanies a kit.
[00253] A invenção agora sendo totalmente descrita, será evidente para um versado na técnica que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou escopo da invenção.[00253] The invention now being fully described, it will be apparent to one skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit or scope of the invention.
[00254] A formação de heterodímeros foi analisada por análises de SDS-PAGE não redutoras e redutoras para determinar se os anticorpos de acordo com as modalidades da invenção, compreendendo várias mutações em suas regiões de dobradiça e Fc, bem como mutações knobs-in-holes, poderiam ser expressos com sucesso e montado em combinações de heterodímeros desejadas. Para testar isso, os constru-tos de anticorpos foram expressos em culturas de células CHO recom-binantes. O fluido de cultura de células colhido foi então purificado por meio de cromatografia de afinidade de proteína A para analisar os diferentes fragmentos de anticorpos produzidos. Os agrupados de eluição de Proteína A foram então analisados em géis redutores e não redutores para visualizar as diferentes espécies.[00254] Heterodimer formation was analyzed by non-reducing and reducing SDS-PAGE analyzes to determine whether antibodies according to the embodiments of the invention, comprising various mutations in their hinge and Fc regions, as well as knobs-in- holes, could be successfully expressed and assembled into desired heterodimer combinations. To test this, antibody constructs were expressed in recombinant CHO cell cultures. The harvested cell culture fluid was then purified by protein A affinity chromatography to analyze the different antibody fragments produced. The Protein A elution pools were then run on reducing and non-reducing gels to visualize the different species.
[00255] Os resultados destas análises são mostrados na FIG. 2, painéis A e B, na FIG. 3, painéis A e B, e na FIG. 24, e demonstram que a porcentagem de formação de heterodímero para as espécies de anticorpos que incluem mutações knobs-in-holes é superior, mesmo quando mutações silenciosas de função efetora (F234A, L235A) e mutações de prevenção de troca de braço Fab (S228P) também estão presentes em as sequências de cadeia pesada. Conforme fornecido na FIG. 25, os construtos de CD19 purificados foram avaliados para analisar a porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMW) e baixo peso molecular (LMW), bem como a porcentagem de monômeros.[00255] The results of these analyzes are shown in FIG. 2, panels A and B, in FIG. 3, panels A and B, and in FIG. 24, and demonstrate that the percentage of heterodimer formation for antibody species that include knobs-in-holes mutations is higher, even when silent effector function mutations (F234A, L235A) and Fab arm switch prevention mutations (S228P ) are also present in the heavy chain sequences. As provided in FIG. 25, purified CD19 constructs were evaluated to analyze the percentage of high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) species, as well as the percentage of monomers.
[00256] As interações receptor Fc gama -IgG foram analisadas na plataforma Octet usando um biossensor Ni-NTA (ForteBio). Os biossen-sores Ni-NTA têm Tris-NTA da QIAGEN carregado com níquel (Ni2+) pré-imobilizado na ponta. Ni-NTA irá ligar-se a um marcador HIS ligado a proteínas recombinantes. Neste formato, a proteína do receptor Fc gama é carregada no biossensor como o ligante, seguido de associação com IgG. Os anticorpos de acordo com as modalidades da invenção foram investigados para analisar a extensão das interações entre suas regiões Fc e as proteínas do receptor Fc gama imobilizadas no biossensor.[00256] Fc gamma receptor -IgG interactions were analyzed on the Octet platform using a Ni-NTA biosensor (ForteBio). Ni-NTA biosensors have QIAGEN's Tris-NTA loaded with nickel (Ni2+) pre-immobilized on the tip. Ni-NTA will bind to an HIS tag linked to recombinant proteins. In this format, the Fc gamma receptor protein is loaded into the biosensor as the ligand, followed by association with IgG. Antibodies according to embodiments of the invention were investigated to analyze the extent of interactions between their Fc regions and Fc gamma receptor proteins immobilized on the biosensor.
[00257] Aqui, ο receptor Fc gama foi o receptor Fc gama humano I/CD64 (Acro Biosystems). As concentrações de anticorpos testadas incluíram uma diluição em série de 2x de 100 nM a 1,6 nM. Os resultados destes estudos são mostrados na FIG. 4, painéis A-D, FIG. 5, painéis A-E, FIG. 6, painéis A-D, FIG. 7, painéis A-E e FIG. 26, painéis A-D, e demonstram que a ligação dos anticorpos do receptor Fc silenciado ao Fc gama R1 humano é suprimida significativamente, mesmo quando mutações de botões em holes e mutações de troca de braço Fab também estão presentes na região Fc.[00257] Here, the Fc gamma receptor was the human Fc gamma receptor I/CD64 (Acro Biosystems). Antibody concentrations tested included a 2x serial dilution from 100 nM to 1.6 nM. The results of these studies are shown in FIG. 4, panels A-D, FIG. 5, panels A-E, FIG. 6, panels A-D, FIG. 7, panels A-E and FIG. 26, panels A-D, and demonstrate that the binding of silenced Fc receptor antibodies to human Fc gamma R1 is significantly suppressed, even when hole button mutations and Fab arm switch mutations are also present in the Fc region.
[00258] Especificamente, na FIG. 4, o painel A mostra os resultados de um anticorpo IgG1 CD3 x BCMA biespecífico (monovalente) que não compreende mutações KiH ou mutações silenciosas. Os dados demonstram que 0 anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor. Na FIG. 4, o painel B mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel A, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas. Na FIG. 4, o painel C mostra os resultados de um anticorpo IgG1 CD3 x BCMA biespecífico (monovalente) que inclui mutações KiH, mas não inclui mutações silenciosas. Estes dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor de uma maneira que é muito semelhante ao que foi observado com o anticorpo no painel A. A FIG. 4, o painel D mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel C, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando as mutações KiH são incluídas.[00258] Specifically, in FIG. 4, Panel A shows the results of a bispecific (monovalent) IgG1 CD3 x BCMA antibody that does not comprise KiH mutations or silent mutations. The data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor. In FIG. 4, panel B shows results from the same bispecific antibody used in panel A, but now including silent mutations in the CH2 domain. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations. In FIG. 4, Panel C shows the results of a bispecific (monovalent) IgG1 CD3 x BCMA antibody that includes KiH mutations but does not include silent mutations. These data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor in a manner that is very similar to what was observed with the antibody in Panel A. FIG. 4, panel D shows results from the same bispecific antibody used in panel C, but now including silent mutations in the CH2 domain. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when KiH mutations are included.
[00259] Na FIG. 5, ο painel A mostra os resultados de um anticorpo lgG4 CD3 x BCMA biespecífico (monovalente) que não compreende mutações KiH ou mutações silenciosas, mas que inclui uma mutação S228P para evitar a troca do braço Fab. Os dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor. A FIG. 5, o painel B mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel A, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2 (F234A, L235A). Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando a mutação S228P está presente. Na FIG. 5, o painel C mostra os resultados de um anticorpo lgG4 CD3 x BCMA (monovalente) biespecífico que inclui mutações KiH e a mutação S228P, mas não inclui mutações silenciosas. Estes dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor de uma maneira que é muito semelhante ao que foi observado com o anticorpo no painel A. A FIG. 5, o painel D mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel C, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2 (F234A, L235A), além das mutações S228P e KiH. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando as mutações S228P e KiH são incluídas. O painel E mostra os resultados de um anticorpo lgG4 biespecífico CD3 x BCMA (bivalente) que inclui a mutação S228P, as mutações silenciosas F234A e L235A, bem como as mutações KiH no domínio CH3. Esses dados demonstram que a interação entre este anticorpo e o receptor gama Fc imobilizado no biossensor foi significativamente reduzida, mesmo com S228P e as mutações KiH presentes.[00259] In FIG. 5, ο Panel A shows the results of a bispecific (monovalent) IgG4 CD3 x BCMA antibody that does not comprise KiH mutations or silent mutations, but does include an S228P mutation to prevent Fab arm switching. The data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor. FIG. 5, panel B shows results from the same bispecific antibody used in panel A, but now including silent mutations in the CH2 domain (F234A, L235A). These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when the S228P mutation is present. In FIG. 5, Panel C shows the results of a bispecific IgG4 CD3 x BCMA (monovalent) antibody that includes KiH mutations and the S228P mutation, but does not include silent mutations. These data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor in a manner that is very similar to what was observed with the antibody in Panel A. FIG. 5, panel D shows results from the same bispecific antibody used in panel C, but now including silent mutations in the CH2 domain (F234A, L235A) in addition to the S228P and KiH mutations. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when S228P and KiH mutations are included. Panel E shows the results of a CD3 x BCMA (bivalent) bispecific IgG4 antibody that includes the S228P mutation, the silent mutations F234A and L235A, as well as the KiH mutations in the CH3 domain. These data demonstrate that the interaction between this antibody and the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor was significantly reduced, even with S228P and KiH mutations present.
[00260] Na FIG. 6, o painel A mostra os resultados de um anticorpo IgG1 CD3 x PSMA biespecífico (monovalente) que não compreende mutações KiH ou mutações silenciosas. Os dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor. Na FIG. 6, o painel B mostra os resultados do mesmo anticorpo biespe-cífico usado no painel A, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas. A FIG. 6, o painel C mostra os resultados de um anticorpo IgG1 CD3 x PSMA biespecífico (monovalente) que inclui mutações KiH, mas não inclui mutações silenciosas. Estes dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor de uma maneira que é muito semelhante ao que foi observado com o anticorpo no painel A. Na FIG. 6, 0 painel D mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel C, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando as mutações KiH são incluídas.[00260] In FIG. 6, Panel A shows the results of a bispecific (monovalent) IgG1 CD3 x PSMA antibody that does not comprise KiH mutations or silent mutations. The data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor. In FIG. 6, panel B shows results from the same bispecific antibody used in panel A, but now including silent mutations in the CH2 domain. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations. FIG. 6, Panel C shows the results of a bispecific (monovalent) IgG1 CD3 x PSMA antibody that includes KiH mutations but does not include silent mutations. These data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor in a manner that is very similar to what was observed with the antibody in Panel A. In FIG. 6, Panel D shows results from the same bispecific antibody used in Panel C, but now including silent mutations in the CH2 domain. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when KiH mutations are included.
[00261] Na FIG. 7, o painel A mostra os resultados de um anticorpo lgG4 CD3 x PSMA biespecífico (monovalente) que não compreende mutações KiH ou mutações silenciosas, mas que inclui uma mutação S228P para evitar a troca do braço Fab. Os dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor. Na FIG. 7, o painel B mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel A, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2 (F234A, L235A). Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando a mutação S228P está presente. Na FIG. 7, o painel C mostra os resultados de um anticorpo lgG4 CD3 x PSMA biespecífico (monovalente) que inclui mutações KiH e a mutação S228P, mas não inclui mutações silenciosas. Estes dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor de uma maneira que é muito semelhante ao que foi observado com o anticorpo no painel A. Na FIG. 7, o painel D mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel C, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2 (F234A, L235A), além das mutações S228P e KiH. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando as mutações S228P e KiH são incluídas. O painel E mostra os resultados de um anticorpo lgG4 biespecífico CD3 x PSMA (bivalente) que inclui a mutação S228P, as mutações silenciosas F234A e L235A, bem como as mutações KiH no domínio CH3. Esses dados demonstram que a interação entre este anticorpo e o receptor Fc gama imobilizado no biossensor foi significativamente reduzida, mesmo com as mutações S228P e KiH presentes.[00261] In FIG. 7, Panel A shows the results of a bispecific (monovalent) CD3 x PSMA IgG4 antibody which does not comprise KiH mutations or silent mutations, but which includes a S228P mutation to prevent Fab arm switching. The data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor. In FIG. 7, panel B shows results from the same bispecific antibody used in panel A, but now including silent mutations in the CH2 domain (F234A, L235A). These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when the S228P mutation is present. In FIG. 7, Panel C shows the results of a bispecific (monovalent) IgG4 CD3 x PSMA antibody that includes KiH mutations and the S228P mutation, but does not include silent mutations. These data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor in a manner that is very similar to what was observed with the antibody in Panel A. In FIG. 7, panel D shows results from the same bispecific antibody used in panel C, but now including silent mutations in the CH2 domain (F234A, L235A) in addition to the S228P and KiH mutations. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when S228P and KiH mutations are included. Panel E shows the results of a CD3 x PSMA (bivalent) bispecific IgG4 antibody that includes the S228P mutation, the silent mutations F234A and L235A, as well as the KiH mutations in the CH3 domain. These data demonstrate that the interaction between this antibody and the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor was significantly reduced, even with the S228P and KiH mutations present.
[00262] A FIG. 26, painel A, mostra os resultados de um anticorpo lgG4 biespecífico CD3 x CD19 (monovalente) que não compreende mutações KiH ou mutações silenciosas, mas que inclui uma mutação S228P para evitar a troca de braço Fab. Os dados demonstram que o anticorpo interage com o receptor Fc gama imobilizado no biossensor. A FIG. 26, painel B, mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel A, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2 (F234A, L235A). Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando a mutação S228P está presente. A FIG. 26, painel C, mostra os resultados de um anticorpo lgG4 biespecífico CD3 x CD19 (monovalente) que inclui mutações KiH e a mutação S228P, mas não inclui mutações silenciosas. Estes dados demonstram que o anticorpo interage com ο receptor Fc gama imobilizado no biossensor de uma maneira que é muito semelhante ao que foi observado com o anticorpo no painel A. A FIG. 26, painel D, mostra os resultados do mesmo anticorpo biespecífico usado no painel C, mas agora incluindo mutações silenciosas no domínio CH2 (F234A, L235A), além das mutações S228P e KiH. Esses resultados demonstram que a interação entre o anticorpo e o receptor Fc gama no biossensor é significativamente reduzida devido à presença das mutações silenciosas, mesmo quando as mutações S228P e KiH são incluídas.[00262] FIG. 26, panel A, shows the results of a CD3 x CD19 bispecific IgG4 antibody (monovalent) that does not comprise KiH mutations or silent mutations, but that includes an S228P mutation to prevent Fab arm switching. The data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor. FIG. 26, panel B, shows the results of the same bispecific antibody used in panel A, but now including silent mutations in the CH2 domain (F234A, L235A). These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when the S228P mutation is present. FIG. 26, Panel C, shows the results of a CD3 x CD19 (monovalent) bispecific IgG4 antibody that includes KiH mutations and the S228P mutation, but does not include silent mutations. These data demonstrate that the antibody interacts with the Fc gamma receptor immobilized on the biosensor in a manner that is very similar to what was observed with the antibody in panel A. FIG. 26, panel D, shows the results of the same bispecific antibody used in panel C, but now including silent mutations in the CH2 domain (F234A, L235A) in addition to the S228P and KiH mutations. These results demonstrate that the interaction between the antibody and the Fc gamma receptor in the biosensor is significantly reduced due to the presence of silent mutations, even when S228P and KiH mutations are included.
[00263] Juntos, os dados fornecidos nas FIGS. 4, 5, 6, 7 e 26 demonstram que a sequência da região VH de um anticorpo biespecífico não tem impacto nas propriedades funcionais das mutações Fc de lgG4 descritas neste documento. Como tal, as modificações de Fc de lgG4 descritas neste documento (S228P; F234A, L235A; T366W, T366S, L368A e Y407V) podem ser implementadas em anticorpos com diferentes sequências de VH (ou seja, diferentes alvos de ligação) para alcançar a troca de braço Fab reduzida (S228P), atividade da função efetora reduzida (F234A, L235A) e heterodimerização adequada (T366W; T366S, L368A e Y407V).[00263] Together, the data provided in FIGS. 4, 5, 6, 7 and 26 demonstrate that the sequence of the VH region of a bispecific antibody does not impact the functional properties of the IgG4 Fc mutations described herein. As such, the IgG4 Fc modifications described herein (S228P; F234A, L235A; T366W, T366S, L368A, and Y407V) can be implemented in antibodies with different VH sequences (i.e., different binding targets) to achieve the switch reduced Fab arm (S228P), reduced effector function activity (F234A, L235A) and adequate heterodimerization (T366W; T366S, L368A and Y407V).
[00264] A ligação a células positivas para PSMA foi avaliada por citometria de fluxo (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) usando a linhagem de células LNCaP (ATCC: CRL-1740), linhagem de células 22Rv1 (ATCC CRL-2505), uma linhagem de células PC3 (ATCC CRL-1435) transfectada de forma estável para expressar PSMA humano, ou a linhagem de células DU-145 (ATCC HTB-81). Resumidamente, 50.000 células alvo foram coradas com uma série de diluições de UniA-bs™ purificado por 30 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo (1X PBS, 1% de BSA, 0,1% de NaN3) e coradas com IgG anti- humana de F(ab')2 de cabra conjugada com R-ficoeritrina (PE) (Southern Biotech, cat. #2042-09) para detectar anticorpos ligados a células. Após uma incubação de 20 minutos a 4°C, as células foram lavadas duas vezes com tampão de citometria de fluxo e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi medida por citometria de fluxo. A MFI de células coradas apenas com anticorpo secundário foi usada para determinação do sinal de fundo e a ligação de cada anticorpo foi convertida para dobrar sobre o fundo. A ligação a células positivas para PSMA de cinomolgo foi determinada usando o mesmo protocolo com as seguintes modificações: as células alvo eram de células Freestyle 293-F (ThermoFisher R79007) transfectadas transitoriamente para expressar o domínio extracelular de PSMA de cinomolgo. Em alguns experimentos, os valores de EC50 foram calculados usando GraphPad Prism 7.[00264] Binding to PSMA-positive cells was assessed by flow cytometry (Guava easyCyte 8HT, EMD Millipore) using the LNCaP cell line (ATCC: CRL-1740), 22Rv1 cell line (ATCC CRL-2505), a stably transfected PC3 cell line (ATCC CRL-1435) to express human PSMA, or the DU-145 cell line (ATCC HTB-81). Briefly, 50,000 target cells were stained with a dilution series of purified UniA-bs™ for 30 minutes at 4°C. After incubation, cells were washed twice with flow cytometry buffer (1X PBS, 1% BSA, 0.1% NaN3) and stained with goat F(ab')2 anti-human IgG conjugated with R-phycoerythrin (PE) (Southern Biotech, cat. #2042-09) to detect cell-bound antibodies. After a 20 minute incubation at 4°C, the cells were washed twice with flow cytometry buffer and the mean fluorescence intensity (MFI) was measured by flow cytometry. MFI from cells stained with secondary antibody only was used for background signal determination and each antibody binding was converted to fold over background. Binding to cynomolgus PSMA-positive cells was determined using the same protocol with the following modifications: target cells were Freestyle 293-F cells (ThermoFisher R79007) transiently transfected to express the cynomolgus PSMA extracellular domain. In some experiments, EC50 values were calculated using GraphPad Prism 7.
[00265] A Tabela 8 resume a atividade de ligação ao alvo dos anticorpos de cadeia pesada anti-PSMA (HCAb) descritos neste documento. A coluna 1 indica o ID do clone do HCAb. A coluna 2 indica a ligação às células LNCaP medida como número de vezes sobre o sinal MFI de fundo. Tabela 8: Ligação à linha cellular que expressa PSMA
[00266] As diferenças na ligação ao PSMA de cinomolgo, como mostrado na FIG. 8, painéis A e B, suporta a diferença no epítopo PSMA humano reconhecido pelos HCAbs 346181 e 345497.[00266] Differences in PSMA binding of cynomolgus, as shown in FIG. 8, panels A and B, supports the difference in the human PSMA epitope recognized by
[00267] Como mostrado na Tabela 9, o clone anti-PSMA ID 350123 é composto pela sequência do ID do clone 346181 ligada à sequência do ID do clone 345497 com a sequência de ponte GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 71). A ID do clone 350122 é composta por duas repetições do ID do clone 346181 unidas pela mesma sequência de ligação. A ID do clone 350123 é biparatópica, pois é composta por dois domínios anti-PSMA que reconhecem diferentes epítopos no PSMA. A ID do clone 350122 é bivalente, mas não biparatópica, pois é composta pelo mesmo domínio anti-PSMA em conjunto. As ilustrações esquemáticas de várias moléculas semelhantes a anticorpos de três cadeias (TCAs) estão representadas na FIG. 1, painéis A-C.
[00268] As células alvo foram semeadas a 15.000 células por poço em uma placa de 96 poços e cultivadas durante a noite a 37°C. Após a incubação, quantidades crescentes de anticorpos multiespecíficos foram adicionados juntamente com células T humanas em repouso em uma razão de efetor para célula alvo de 10:1 e incubadas por mais 48 ou 72 horas a 37°C (48 horas para ensaios com LNCaP, MDA- células PCa-2b e PC3-PSMA e 72 horas para ensaios com células 22Rv1). A morte celular foi medida usando o reagente de proliferação celular WST-1 (Sigma Cat No.: 11644807001) ou citometria de fluxo. Em alguns experimentos, uma pequena amostra de cada sobrenadante foi coletada após a incubação, mas antes da análise da viabilidade da célula alvo e guardada para análise da produção de citocinas. Quando a viabilidade ceiuiar foi analisada com reagente WST-1, o estoque de reagente foi adicionado a cada poço na diluição de 1:10 e incubado por 90 minutos a 37°C. A absorbãncia foi então medida a 450 nm (referência 690 nm), e a porcentagem de lise específica foi calculada.[00268] Target cells were seeded at 15,000 cells per well in a 96-well plate and grown overnight at 37°C. After incubation, increasing amounts of multispecific antibodies were added along with resting human T cells at an effector to target cell ratio of 10:1 and incubated for an additional 48 or 72 hours at 37°C (48 hours for LNCaP assays, MDA-PCa-2b and PC3-PSMA cells and 72 hours for 22Rv1 cell assays). Cell death was measured using WST-1 Cell Proliferation Reagent (Sigma Cat No.: 11644807001) or flow cytometry. In some experiments, a small sample of each supernatant was collected after incubation but before analysis of target cell viability and saved for analysis of cytokine production. When cell viability was analyzed with WST-1 reagent, reagent stock was added to each well at 1:10 dilution and incubated for 90 minutes at 37°C. Absorbance was then measured at 450 nm (reference 690 nm), and the percentage of specific lysis was calculated.
[00269] Se a viabilidade da célula alvo foi analisada por citometria de fiuxo, então as células alvo foram marcadas antes de iniciar o ensaio com o corante de membrana DiR (ThermoFisher D12731). Após a incubação com células T e anticorpo, os sobrenadantes foram guardados para análise de citocinas ou eliminados. Os poços foram então lavados uma vez para coletar células tumorais mortas e células T, que foram transferidas para uma placa de citometria de fluxo. As restantes células tumorais ligadas foram tripsinizadas e depois adicionadas aos poços correspondentes na placa de citometria de fluxo. O reagente Anexina-V foi usado para corar as células mortas e a citometria de fluxo foi conduzida (BD FACSCelesta) para quantificar a porcentagem de células tumorais mortas em cada amostra, delimitadas por coloração DiR. Poços contendo células alvo não tratadas foram usados para normalizar a morte celular espontânea. Em alguns experimentos, um anticorpo de controle negativo foi usado, consistindo no mesmo braço de direcionamento de CD3 que nas moléculas multiespecíficas de PSMAxCD3, mas substituindo ο braço de direcionamento de tumor por um VH específico para a proteína gp120 do HIV.[00269] If the viability of the target cell was analyzed by flow cytometry, then the target cells were labeled before starting the assay with DiR membrane dye (ThermoFisher D12731). After incubation with T cells and antibody, supernatants were saved for cytokine analysis or discarded. The wells were then washed once to collect dead tumor cells and T cells, which were transferred to a flow cytometry plate. The remaining bound tumor cells were trypsinized and then added to the corresponding wells in the flow cytometry plate. Annexin-V reagent was used to stain dead cells and flow cytometry was conducted (BD FACSCelesta) to quantify the percentage of dead tumor cells in each sample, gated by DiR staining. Wells containing untreated target cells were used to normalize spontaneous cell death. In some experiments, a negative control antibody was used, consisting of the same CD3 targeting arm as the multispecific PSMAxCD3 molecules, but replacing the tumor targeting arm with a VH specific for the HIV gp120 protein.
[00270] A FIG. 9 mostra a lise mediada por células T de células positivas para PSMA usando células T não estimuladas. As células T humanas não estimuladas foram incubadas com células que expressam PSMA (LNCaP) e diferentes concentrações de anticorpos multiespecífi-cos. O anticorpo biparatópico anti-PSMAxCD3 (350123xCD3) superou o anticorpo monoparatópico PSMAxCD3 (346181xCD3).[00270] FIG. 9 shows T cell mediated lysis of PSMA positive cells using unstimulated T cells. Unstimulated human T cells were incubated with cells expressing PSMA (LNCaP) and different concentrations of multispecific antibodies. The anti-PSMAxCD3 biparatopic antibody (350123xCD3) outperformed the PSMAxCD3 monoparatopic antibody (346181xCD3).
[00271] As células pan T humanas foram pré-ativadas com OKT3 e IL-2 ligadas à placa por três dias, seguidos por um dia adicional de incubação em IL-2 fresco. As células alvo foram tripsinizadas, carregadas com Calcein-AM (ThermoFisher C3100MP), misturadas com células T ativadas a uma razão E:T de 20:1 e adicionadas aos poços de uma placa de 96 poços. Diluições em série de diferentes anticorpos multies-pecíficos foram adicionadas, seguidas de incubação por 4 horas a 37°C. Os sobrenadantes foram então transferidos para placas pretas de 96 poços e a absorbãncia foi medida a 480 nm/520 nm ex/em para quantificar a liberação de calceína. As células alvo incubadas sem células T foram usadas para normalizar a liberação espontânea de calceína de células tumorais intactas. A adição de 2% de Triton-X aos poços de controle contendo células-alvo permitiu o cálculo do sinal de calceína correspondente ã lise celular máxima. Usando este valor, cada poço experimental foi relatado como porcentagem de lise celular máxima. A análise dos dados foi realizada usando o GraphPad prisma 7.[00271] Human pan T cells were preactivated with OKT3 and IL-2 attached to the plate for three days, followed by an additional day of incubation in fresh IL-2. Target cells were trypsinized, loaded with Calcein-AM (ThermoFisher C3100MP), mixed with activated T cells at an E:T ratio of 20:1 and added to the wells of a 96-well plate. Serial dilutions of different multispecific antibodies were added, followed by incubation for 4 hours at 37°C. Supernatants were then transferred to black 96-well plates and absorbance was measured at 480 nm/520 nm ex/em to quantify calcein release. Target cells incubated without T cells were used to normalize spontaneous calcein release from intact tumor cells. Addition of 2% Triton-X to control wells containing target cells allowed calculation of the calcein signal corresponding to maximum cell lysis. Using this value, each experimental well was reported as percentage of maximum cell lysis. Data analysis was performed using GraphPad prism 7.
[00272] A FIG. 10 mostra a lise mediada por células T de células positivas para PSMA usando células T pré-ativadas. As células T humanas pré-ativadas foram incubadas com células expressando PSMA humano (LNCaP) e diferentes concentrações de anticorpos multiespecífi-cos. A morte de células tumorais foi medida por liberação de calceína e normalizada para liberação espontânea de células tumorais na ausência de células T. O anticorpo biparatópico anti-PSMAxCD3 (350123xCD3) superou ambos os anticorpos monoparatópicos de PSMAxCD3.[00272] FIG. 10 shows T cell mediated lysis of PSMA positive cells using preactivated T cells. Preactivated human T cells were incubated with cells expressing human PSMA (LNCaP) and different concentrations of multispecific antibodies. Tumor cell death was measured by calcein release and normalized to spontaneous tumor cell release in the absence of T cells. The anti-PSMAxCD3 biparatopic antibody (350123xCD3) outperformed both PSMAxCD3 monoparatopic antibodies.
[00273] A FIG. 11 mostra que os anticorpos multiespecíficos não lisam células negativas para PSMA. As células T humanas pré-ativadas foram incubadas com células de câncer de próstata negativas para PSMA (DU145) e diferentes concentrações de anticorpos multiespecíficos. Não ocorreu lise destas células por nenhum dos anticorpos testados.[00273] FIG. 11 shows that multispecific antibodies do not lyse PSMA-negative cells. Pre-activated human T cells were incubated with PSMA negative prostate cancer cells (DU145) and different concentrations of multispecific antibodies. No lysis of these cells occurred by any of the tested antibodies.
[00274] A FIG. 12 mostra a ligação de anticorpos multiespecíficos de PSMAxCD3 a células positivas e negativas para PSMA. Anticorpos anti-PSMA x anti-CD3 multiespecíficos mostram ligação a células tumorais da próstata positivas para PSMA (22Rv1), mas nenhuma ligação a células tumorais da próstata negativas para PSMA (DU145). A molécula biparatópica (350123) mostrou a ligação celular mais forte no alvo.[00274] FIG. 12 shows the binding of PSMAxCD3 multispecific antibodies to PSMA positive and negative cells. Multispecific anti-PSMA x anti-CD3 antibodies show binding to PSMA-positive prostate tumor cells (22Rv1), but no binding to PSMA-negative prostate tumor cells (DU145). The biparatopic molecule (350123) showed the strongest cellular binding on the target.
[00275] A FIG. 13 representa a lise mediada por células T de células positivas para PSMA. Os dados na FIG. 13 demonstra que a ligação ao PSMA através de dois epítopos diferentes resulta no aumento da morte celular em comparação com uma versão bivalente mas monoes-pecífica do anticorpo.[00275] FIG. 13 depicts T-cell mediated lysis of PSMA-positive cells. The data in FIG. 13 demonstrates that binding to PSMA via two different epitopes results in increased cell killing compared to a bivalent but monospecific version of the antibody.
[00276] A produção de citocinas foi analisada em ensaios de citoto-xicidade tumoral com células T em repouso. O projeto desses ensaios é detalhado em outro lugar. Os sobrenadantes foram coletados após a conclusão dos ensaios (após 72 horas de incubação para ensaios usando células 22Rv1, 48 horas para todas as outras linhas celulares). Os kits ELISA foram usados para detecção de IL-2 (Biolegend 431804) e IFNγ (Biolegend 430104) de acordo com o protocolo do fabricante. Os sobrenadantes experimentais foram diluídos antes da análise nos ELI-SAs de modo que os níveis de citocinas caiam dentro da porção linear da curva padrão fornecida com cada kit. Em alguns casos, nenhuma citocina pôde ser detectada nos poços do experimento e os valores foram relatados como menores ou iguais ao limite inferior de quantificação para o ensaio.[00276] Cytokine production was analyzed in tumor cytotoxicity assays with resting T cells. The design of these essays is detailed elsewhere. Supernatants were collected after completion of the assays (after 72 hours of incubation for assays using 22Rv1 cells, 48 hours for all other cell lines). ELISA kits were used for detection of IL-2 (Biolegend 431804) and IFNγ (Biolegend 430104) according to the manufacturer's protocol. Experimental supernatants were diluted prior to analysis on the ELI-SAs so that cytokine levels fall within the linear portion of the standard curve provided with each kit. In some cases, no cytokines could be detected in the experiment wells and values were reported as less than or equal to the lower limit of quantitation for the assay.
[00277] A FIG. 14 (Painéis A, B e C) mostra a lise mediada por células T de células positivas para PSMA e comparação com a produção de citocinas. Anticorpos multiespecíficos de PSMAxCD3 induzem lise mediada por células T da linhagem de células de câncer de próstata positiva para PSMA LNCaP. A molécula biparatópica (350123) estimulou a morte de células tumorais mais potente em comparação com a molécula monoparatópica (346181), mas também causou a produção de níveis mais altos das citocinas interferon gama (ΙFΝγ) e interleucina 2 (IL-2), conforme exemplificado pela FIG. 14, painéis B e C.[00277] FIG. 14 (Panels A, B and C) shows T cell-mediated lysis of PSMA-positive cells and comparison with cytokine production. Multispecific PSMAxCD3 antibodies induce T cell-mediated lysis of the PSMA LNCaP positive prostate cancer cell line. The biparatopic molecule (350123) stimulated tumor cell death more potently compared to the monoparatopic molecule (346181), but also caused the production of higher levels of the cytokines interferon gamma (ΙFΝγ) and interleukin 2 (IL-2), as exemplified by FIG. 14, panels B and C.
[00278] A Tabela 10 mostra a lise mediada por células T e a produção de citocinas contra quatro linhas celulares de tumor de próstata positivas para PSMA. Os anticorpos multiespecíficos PSMAxCD3 foram testados em ensaios de citotoxicidade de células tumorais in vitro usando células T não estimuladas e uma série de dose de anticorpo contra um painel de quatro linhas celulares tumorais positivas para PSMA. Após 72 horas (22Rv1) ou 48 horas (MDA-PCa-2b, LNCAP, PC3-PSMA) a porcentagem de morte de células tumorais foi calculada e relatada por EC50, bem como a maior porcentagem de morte alcançada. Os sobrenadantes desses poços de experimento foram coletados e analisados por ELISA para as citocinas interferon-gama (IFNγ) ou in-terleucina-2 (IL-2). A molécula monoparatópica (3461881) induziu níveis aproximadamente equivalentes de citotoxicidade tumoral contra todas as quatro linhagens celulares testadas em comparação com a molécula biparatópica, mas teve EC50s mais altas para produção de citocinas e na maioria dos casos estimulou níveis mais baixos de produção máxima de citocinas.
[00279] As células tumorais positivas para PSMA foram semeadas em 25.000 células por poço em uma placa de 96 poços e cultivadas durante a noite a 37°C. As células T pan humanas isoladas de PBMCs em repouso (Miltenyi 130-096-535) foram marcadas com o corante de rastreamento de linhagem CFSE de acordo com as instruções do fabricante (ThermoFisher C34554). 100.000 células pan T marcadas foram então adicionadas aos poços contendo as células tumorais, seguidas por uma série de diluição de anticorpos e incubadas a 37°C, 8% de CO2. Após 5 dias de incubação, as células foram misturadas suavemente e transferidas para uma placa de citometria de fluxo. As células foram pe-letizadas e o sobrenadante removido, seguido de coloração com anti-CD8 conjugado com APC (Biolegend 301049) e anti-CD4 conjugado com PE (Biolegend 317410) por 20 minutos em gelo. As células foram então lavadas e ressuspensas em tampão de citometria de fluxo para análise (BD FACSCelesta). As células foram bloqueadas na dispersão direta e lateral e na expressão de CD4 ou CD8. A porcentagem de células T que proliferaram, conforme indicado pela coloração positiva de CD4 ou CD8 e sinal CFSE baixo ou negativo, foi calculada para toda a população de células T, bem como os subconjuntos de CD4 e CD8. Os dados de citometria de fluxo foram analisados usando FlowJo e plotados no GraphPad Prism 7.[00279] PSMA-positive tumor cells were seeded at 25,000 cells per well in a 96-well plate and grown overnight at 37°C. Pan-human T cells isolated from resting PBMCs (Miltenyi 130-096-535) were stained with the CFSE lineage tracing dye according to the manufacturer's instructions (ThermoFisher C34554). 100,000 labeled pan T cells were then added to the wells containing the tumor cells, followed by an antibody dilution series and incubated at 37°C, 8% CO2. After 5 days of incubation, the cells were mixed gently and transferred to a flow cytometer plate. The cells were pelletized and the supernatant removed, followed by staining with APC-conjugated anti-CD8 (Biolegend 301049) and PE-conjugated anti-CD4 (Biolegend 317410) for 20 minutes on ice. Cells were then washed and resuspended in flow cytometry buffer for analysis (BD FACSCelesta). Cells were blocked in forward and side scatter and CD4 or CD8 expression. The percentage of T cells that proliferated, as indicated by positive CD4 or CD8 staining and low or negative CFSE signal, was calculated for the entire T cell population as well as the CD4 and CD8 subsets. Flow cytometry data were analyzed using FlowJo and plotted on GraphPad Prism 7.
[00280] A FIG. 15 (Painéis A, B, C e D) mostra que os anticorpos multiespecíficos PSMAxCD3 estimularam a proliferação de células T na presença de células tumorais positivas para PSMA e que os anticorpos biespecíficos PSMA monoparatópicos ativam preferencialmente as células T CD3. Anticorpos multiespecíficos foram incubados em conjunto com células tumorais expressando PSMA e células T marcadas com o corante de rastreamento de linhagem CFSE. Após 5 dias de incubação, a proliferação de células T e a composição de células T proliferadas (CD8+ versus CD4+) foram analisadas por citometria de fluxo. Os painéis A e B mostram a proliferação total de células T, enquanto os painéis C e D indicam a razão de células T CD8+ para CD4+ nos poços proliferados. Uma linha horizontal tracejada indica que a razão CD8:CD4 das células T não estimuladas e é de aproximadamente 1:2 (valor real = 0,64). O anticorpo biespecífico PSMAxCD3 monoparatópico (346181) ativa preferencialmente as células T CD8 (relação CD8:CD4 após expansão de aproximadamente 2:1), enquanto o anticorpo multiespecífico PSMAxCD3 biparatópico (350123) ativa menos preferencialmente as células T CD8+ (relação CD8:CD4 de cerca de 1:1).[00280] FIG. 15 (Panels A, B, C and D) shows that PSMAxCD3 multispecific antibodies stimulated T cell proliferation in the presence of PSMA-positive tumor cells and that monoparatopic PSMA bispecific antibodies preferentially activate CD3 T cells. Multispecific antibodies were incubated together with tumor cells expressing PSMA and T cells labeled with CFSE lineage tracing dye. After 5 days of incubation, T cell proliferation and proliferating T cell composition (CD8+ versus CD4+) were analyzed by flow cytometry. Panels A and B show the total proliferation of T cells, while Panels C and D indicate the ratio of CD8+ to CD4+ T cells in the proliferated wells. A dashed horizontal line indicates that the CD8:CD4 ratio of unstimulated T cells is approximately 1:2 (actual value = 0.64). The monoparatopic PSMAxCD3 bispecific antibody (346181) preferentially activates CD8 T cells (CD8:CD4 ratio after expansion of approximately 2:1), whereas the biparatopic PSMAxCD3 multispecific antibody (350123) less preferentially activates CD8+ T cells (CD8:CD4 ratio of about 1:1).
[00281] Camundongos CIEA-NOG imunodeficientes machos de 56 semanas de idade (Taconic) foram implantados com 10 milhões de células 22Rv1 por via subcutânea em seus flancos inferiores direito, seguido pela adição de 10 milhões de PBMCs humanas por meio de injeção na veia da cauda um dia após a implantação do tumor. Os animais receberam tratamento com 100 μg de anticorpo multiespecífico ou veículo por injeção na veia da cauda começando um dia após a implantação do tumor nos dias 1, 5, 9 e 13. O volume do tumor foi quantificado com paquímetro e registrado por 25 dias.[00281] 56-week-old male immunodeficient CIEA-NOG mice (Taconic) were implanted with 10 million 22Rv1 cells subcutaneously in their lower right flanks, followed by the addition of 10 million human PBMCs via injection into the vein of the tail one day after tumor implantation. Animals received treatment with 100 µg of multispecific antibody or vehicle by injection into the tail vein starting one day after tumor implantation on
[00282] A FIG. 16 mostra os resultados do modelo de xenoenxerto de tumor 22Rv1. A molécula biparatópica PSMAxCD3 (350123) mostrou inibição do crescimento tumoral 22Rv1 em um modelo de xenoenxerto tumoral. Três camundongos foram testados para cada grupo de tratamento e a mudança no volume do tumor para cada animal foi plotada em milímetros cúbicos. Os animais receberam PBMCs no dia 1 após a implantação do tumor e foram tratados com anticorpo nos dias 1, 5, 9 e 13. Dois dos três animais tratados com anticorpo multiespecífico apresentaram atraso na progressão do tumor.[00282] FIG. 16 shows the results of the 22Rv1 tumor xenograft model. The biparatopic molecule PSMAxCD3 (350123) showed inhibition of 22Rv1 tumor growth in a tumor xenograft model. Three mice were tested for each treatment group and the change in tumor volume for each animal was plotted in cubic millimeters. Animals received PBMCs on day 1 after tumor implantation and were treated with antibody on
[00283] O CD69 é um marcador de superfície celular em células T que é regulado positivamente após estimulação, servindo assim como um indicador de ativação de células T. Neste experimento, a ativação de CD69 foi avaliada em 3 condições diferentes: 1) células mononucle-ares de sangue periférico total (PBMCs) sem revestimento de BCMA; 2) Células T pan com revestimento BCMA; e 3) Células T pan sem revestimento BCMA. As PBMCs foram isoladas de revestimentos leucocitá-rios usando Ficoll (densidade de 1,077 g/ml) e PBMCs criopreservadas foram descongeladas e descansadas por 24 horas a 2x106 células/mL em RPMI1640 suplementado com 10% de FBS a 37oC. No dia 2, as células pan T foram isoladas das PBMCs em repouso usando um kit de seleção negativa Miltenyi e as células isoladas foram usadas nas 2a e 3a condições de ensaio. Para a primeira condição de ensaio, as PBMCs foram contadas e plaqueadas nas placas de ensaio.[00283] CD69 is a cell surface marker on T cells that is upregulated after stimulation, thus serving as an indicator of T cell activation. In this experiment, CD69 activation was evaluated under 3 different conditions: 1) mononuclear cells -whole peripheral blood airs (PBMCs) without BCMA coating; 2) pan T cells with BCMA coating; and 3) pan T cells without BCMA coating. PBMCs were isolated from buffy coats using Ficoll (density 1.077 g/ml) and cryopreserved PBMCs were thawed and rested for 24 hours at 2x10 6 cells/ml in RPMI1640 supplemented with 10% FBS at 37oC. On
[00284] Para células que foram avaliadas sob condições de revestimento de antígeno, placas de 96 poços foram revestidas com proteína BCMA recombinante a uma concentração de 1 μg/mL (Proteína BCMA Humana, Marca Fc, Acro Biosystems, N° de Catálogo - BC7-H5254), proteína PSMA recombinante a uma concentração de 1 μg/mL (Proteína PSMA/FOLH1 Humana Recombinante, de sistemas RND, N° de Catálogo - 4234-ZN-0101)), ou proteína CD19 recombinante a uma concentração de 10 μg/mL (Proteína CD19 Humana, His Tag, Acro Biosystems, N° de Catálogo - CD9-H52H2). Os anticorpos biespecíficos foram analisados usando uma curva de dose de 12 pontos com diluições de 3 vezes, sendo a dose mais alta 300 nM. Anticorpos biespecíficos e células T foram ressuspensos em RPMI1640 suplementado com 10% de FBS e incubados por 18 horas. As células T Pan foram as células efe-toras e foram plaqueadas a 100K células/poço.[00284] For cells that were evaluated under antigen coating conditions, 96-well plates were coated with recombinant BCMA protein at a concentration of 1 μg/mL (Human BCMA Protein, Fc Brand, Acro Biosystems, Catalog No. - BC7 -H5254), recombinant PSMA protein at a concentration of 1 μg/mL (Recombinant Human PSMA/FOLH1 Protein, from RND systems, Catalog No. - 4234-ZN-0101)), or recombinant CD19 protein at a concentration of 10 μg /ml (Human CD19 Protein, His Tag, Acro Biosystems, Catalog No. - CD9-H52H2). Bispecific antibodies were analyzed using a 12-point dose curve with 3-fold dilutions, the highest dose being 300 nM. Bispecific antibodies and T cells were resuspended in RPMI1640 supplemented with 10% FBS and incubated for 18 hours. Pan T cells were the effector cells and were plated at 100K cells/well.
[00285] Para células que foram avaliadas sem condições de revestimento de antígeno, anticorpos biespecíficos foram incubados com as células usando uma curva de dose de 12 pontos com diluições de 3 vezes. 300 nM de anticorpo biespecífico foi a concentração mais alta testada neste ensaio. As amostras foram incubadas por 18 horas em RPMI1640 suplementado com 10% de FBS a 37°C. As células T Pan isoladas de PBMCs foram as células efetoras que foram plaqueadas a 100K células/poço.[00285] For cells that were evaluated without antigen coating conditions, bispecific antibodies were incubated with the cells using a 12-point dose curve with 3-fold dilutions. 300 nM of bispecific antibody was the highest concentration tested in this assay. Samples were incubated for 18 hours in RPMI1640 supplemented with 10% FBS at 37°C. Pan T cells isolated from PBMCs were the effector cells that were plated at 100K cells/well.
[00286] Para todas as condições experimentais, as células foram lavadas e marcadas com anticorpos de células T de superfície celular. Os seguintes anticorpos foram usados para marcar (1) células T CD4 positivas (anticorpo FITC anti-CD4 humano), (2) células T CD8 positivas (anticorpo PE anti-CD8a humano), (3) ativação de CD69 (Alexa Fluor 647 anticorpo anti-CD69 humano) (Biolegend). As células foram então analisadas em um BD Celesta usando os modelos apropriados para medir a ativação de CD69.[00286] For all experimental conditions, cells were washed and stained with cell surface T cell antibodies. The following antibodies were used to label (1) CD4 positive T cells (FITC anti-human CD4 antibody), (2) CD8 positive T cells (PE anti-human CD8a antibody), (3) CD69 activation (Alexa Fluor 647 antibody anti-human CD69) (Biolegend). Cells were then analyzed on a BD Celesta using the appropriate templates to measure CD69 activation.
[00287] Os resultados dos estudos de ativação de células T são mostrados nas seguintes figuras: FIGS. 17-18, FIG. 27, painéis A-B (sem revestimento de antígeno BCMA, usando PBMCs); FIG. 30, painéis A-B (sem revestimento de PSMA); e FIG. 33, painéis A-B (sem revestimento CD19).[00287] The results of T cell activation studies are shown in the following figures: FIGS. 17-18, FIG. 27, Panels A-B (no BCMA antigen coating, using PBMCs); FIG. 30, panels A-B (no PSMA coating); and FIG. 33, panels A-B (no CD19 cladding).
[00288] A FIG. 17 é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Em geral, os anticorpos biespecíficos contendo sequências Fc de IgG1 exibiram ativação de céiuias T CD4+ em concentrações mais baixas de anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos contendo sequências Fc de lgG4 exibiram ativação de células T CD4+ em concentrações mais altas de anticorpo biespecífico. Notavelmente, a ativação de células T CD4+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi baixa, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de BCMA das células T por esses anticorpos biespecíficos.[00288] FIG. 17 is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In general, bispecific antibodies containing IgG1 Fc sequences exhibited activation of CD4+ T cells at lower bispecific antibody concentrations. Bispecific antibodies containing IgG4 Fc sequences exhibited activation of CD4+ T cells at higher bispecific antibody concentrations. Notably, the activation of CD4+ T cells achieved by the IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was low, demonstrating that the introduction of the PAA and KiH mutations reduces the BCMA-independent activation of T cells by these bispecific antibodies.
[00289] A FiG. 18 é um gráfico que mostra a % de céiuias T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Como foi 0 caso das céiuias T CD4+, os anticorpos biespecíficos contendo sequências Fc de IgG1 exibiram ativação de células T CD8+ em concentrações mais baixas de anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos contendo sequências Fc de IgG4 exibiram ativação de céiuias T CD8+ em concentrações mais altas de anticorpo biespecífico. Notavelmente, a ativação de células T CD8+ alcançada pelos anticorpos bies-pecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KlH foi baixa, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de BCMA das células T por esses anticorpos biespe-cíficos.[00289] Fig. 18 is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. As was the case with CD4+ T cells, bispecific antibodies containing IgG1 Fc sequences exhibited CD8+ T cell activation at lower concentrations of bispecific antibody. Bispecific antibodies containing IgG4 Fc sequences exhibited activation of CD8+ T cells at higher concentrations of bispecific antibody. Notably, the activation of CD8+ T cells achieved by the IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KlH mutations was low, demonstrating that the introduction of the PAA and KiH mutations reduces BCMA-independent activation of T cells by these bispecific antibodies. cifics.
[00290] A FIG. 27, painel A, é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. A ativação das células T CD4+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi semelhante ao controle negativo (gp120, CD3 (F2B)), demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de BCMA das células T por estes anticorpos biespecíficos. A FIG. 27, painel B, é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Como foi o caso das células T CD4+, a ativação das células T CD8+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de IgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi semelhante ao controle negativo, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de BCMA das células T por esses anticorpos biespecíficos.[00290] FIG. 27, panel A, is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. Activation of CD4+ T cells achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was similar to the negative control (gp120, CD3 (F2B)), demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations reduces BCMA-independent activation of T cells by these bispecific antibodies. FIG. 27, panel B, is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. As was the case with CD4+ T cells, activation of CD8+ T cells achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was similar to the negative control, demonstrating that the introduction of the PAA and KiH mutations reduces BCMA-independent activation of T cells by these bispecific antibodies.
[00291] A FIG. 30, painel A, é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. A ativação das células T CD4+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi semelhante ao controle negativo (gp120, CD3 (F2B)), demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de PSMA das células T por estes anticorpos biespecíficos. A FIG. 30, painel B, é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespe-cífico mostrados na legenda. Assim como para as células T CD4+, a ativação das células T CD8+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi semelhante ao controle negativo, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de PSMA das células T por esses anticorpos biespecíficos.[00291] FIG. 30, panel A, is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. Activation of CD4+ T cells achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was similar to the negative control (gp120, CD3 (F2B)), demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations reduces PSMA-independent activation of T cells by these bispecific antibodies. FIG. 30, panel B, is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. As with CD4+ T cells, activation of CD8+ T cells achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was similar to the negative control, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations reduces PSMA-independent activation of T cells by these bispecific antibodies.
[00292] A FIG. 33, painel A, é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. A ativação de células T CD4+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi muito menor do que o observado de outros construtos de anticorpos que não continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de CD19 das células T por esses anticorpos biespecíficos. A FIG. 33, painel B, é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Como foi o caso das células T CD4+, a ativação das células T CD8+ alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH foi muito menor do que o observado em outros construtos de anticorpos que não continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH reduz a ativação independente de CD19 das células T por esses anticorpos biespecíficos.[00292] FIG. 33, panel A, is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. The activation of CD4+ T cells achieved by the IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was much lower than that observed for other antibody constructs that did not contain the PAA and KiH mutations, demonstrating that the introduction of the PAA and KiH mutations reduces CD19-independent activation of T cells by these bispecific antibodies. FIG. 33, panel B, is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. As was the case with CD4+ T cells, CD8+ T cell activation achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations was much lower than that seen in other antibody constructs that did not contain the PAA and KiH mutations, demonstrating that the introduction of PAA and KiH mutations reduces CD19-independent activation of T cells by these bispecific antibodies.
[00293] Os resultados da ativação de células T CD8+ com revestimento de antígeno usando células T pan isoladas de PBMCs em repouso são fornecidos na FIG. 19, FIG. 28, painel B, FIG. 31, painel B, e a FIG. 34, painel B. Os resultados da ativação de células T CD4+ com revestimento de antígeno usando células T pan isoladas de PBMCs em repouso são fornecidos na FIG. 28, painel A, FIG. 31, painel A, e FIG. 34, painel A. A concentração de revestimento de antígeno para BCMA e PSMA foi de 1 μg/mL, enquanto a concentração de revestimento de antígeno para CD19 foi de 10 μg/mL.[00293] The results of activation of antigen-coated CD8+ T cells using pan T cells isolated from resting PBMCs are provided in FIG. 19, FIG. 28, panel B, FIG. 31, panel B, and FIG. 34, panel B. Results of activation of antigen-coated CD4+ T cells using pan T cells isolated from resting PBMCs are provided in FIG. 28, panel A, FIG. 31, panel A, and FIG. 34, panel A. Antigen coating concentration for BCMA and PSMA was 1 µg/mL, while antigen coating concentration for CD19 was 10 µg/mL.
[00294] A FIG. 19 é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de BCMA, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD8+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas com antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD8+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD8+ dessas moléculas.[00294] FIG. 19 is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without BCMA coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD8+ T cells at similar concentrations of bispecific antibody to the antigen-coated cells. Remarkably, CD8+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD8+ T cell activation activity of these molecules.
[00295] A FIG. 28, painel B, é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de BCMA, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD8+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas com antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD8+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD8+ dessas moléculas.[00295] FIG. 28, panel B, is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without BCMA coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD8+ T cells at similar concentrations of bispecific antibody to the antigen-coated cells. Remarkably, CD8+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD8+ T cell activation activity of these molecules.
[00296] A FIG. 31, painel B, é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de PSMA, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD8+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas com antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD8+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD8+ dessas moléculas.[00296] FIG. 31, panel B, is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without PSMA coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD8+ T cells at similar bispecific antibody concentrations to the antigen-coated cells. Remarkably, CD8+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD8+ T cell activation activity of these molecules.
[00297] A FIG. 34, painel B, é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de CD19, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD8+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas de antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD8+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD8+ dessas moléculas.[00297] FIG. 34, panel B, is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without CD19 coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD8+ T cells at similar concentrations of bispecific antibody to antigen-coated cells. Remarkably, CD8+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD8+ T cell activation activity of these molecules.
[00298] A FIG. 28, painel A, é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de BCMA, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD4+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas de antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD4+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de lgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD4+ dessas moléculas.[00298] FIG. 28, panel A, is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without BCMA coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD4+ T cells at similar concentrations of bispecific antibody to the antigen-coated cells. Remarkably, CD4+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD4+ T cell activation activity of these molecules.
[00299] A FIG. 31, painel A, é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de PSMA, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD4+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas com antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD4+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de IgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD4+ dessas moléculas.[00299] FIG. 31, panel A, is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without PSMA coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD4+ T cells at similar bispecific antibody concentrations to the antigen-coated cells. Remarkably, CD4+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD4+ T cell activation activity of these molecules.
[00300] A FIG. 34, painel A, é um gráfico que mostra a % de células T CD4+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Ao contrário do caso para os experimentos sem revestimento de CD19, todos os anticorpos biespecíficos exibiram ativação de células T CD4+ em concentrações semelhantes de anticorpo biespecífico para as células revestidas de antígeno. Notavelmente, a ativação das células T CD4+ foi alcançada pelos anticorpos biespecíficos Fc de IgG4 que continham as mutações PAA e KiH, demonstrando que a introdução das mutações PAA e KiH não eliminou a atividade de ativação das células T CD4+ dessas moléculas.[00300] FIG. 34, panel A, is a graph showing % CD4+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. In contrast to the case for the experiments without CD19 coating, all bispecific antibodies exhibited activation of CD4+ T cells at similar concentrations of bispecific antibody to antigen-coated cells. Remarkably, CD4+ T cell activation was achieved by IgG4 Fc bispecific antibodies that carried the PAA and KiH mutations, demonstrating that introduction of the PAA and KiH mutations did not eliminate the CD4+ T cell activation activity of these molecules.
[00301] Os resultados da ativação de células T CD8+ sem revestimento de antígeno usando células T pan isoladas de PBMCs em repouso são fornecidos na FIG. 20, FIG. 29, painel B, FIG. 32, painel B, e FIG. 35, painel B. Os resultados da ativação de células T CD4+ sem revestimento de antígeno usando células T pan isoladas de PBMCs em repouso são fornecidos na FIG. 29, painel A, FIG. 32, painel A, e FIG. 35, painel A.[00301] The results of activating CD8+ T cells without antigen coating using pan T cells isolated from resting PBMCs are provided in FIG. 20, FIG. 29, panel B, FIG. 32, panel B, and FIG. 35, panel B. Results of activation of antigen-coated CD4+ T cells using pan T cells isolated from resting PBMCs are provided in FIG. 29, panel A, FIG. 32, panel A, and FIG. 35, panel A.
[00302] A FIG. 20 é um gráfico que mostra a % de células T CD8+CD69+ em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Estes resultados demonstram que a ativação de CD69 em células T CD8+ é dependente de BCMA para todas as moléculas de anticorpo biespecífi-cas testadas.[00302] FIG. 20 is a graph showing % CD8+CD69+ T cells as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. These results demonstrate that CD69 activation on CD8+ T cells is BCMA-dependent for all bispecific antibody molecules tested.
[00303] A FIG. 29, painéis A e B, são gráficos que mostram a % de células T CD4+CD69+ e %CD8+CD69+, respectivamente, em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Estes resultados demonstram que a ativação de CD69 em células T CD4+ e CD8+ é dependente de BCMA para todas as moléculas de anticorpo biespecíficas testadas. A ativação de CD69 foi ligeiramente aumentada em células T CD4+ e CD8+ em concentrações mais altas dos construtos de anticorpos bies-pecíficos que não incluíam mutações silenciosas.[00303] FIG. 29, panels A and B, are graphs showing % CD4+CD69+ and %CD8+CD69+ T cells, respectively, as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. These results demonstrate that CD69 activation on CD4+ and CD8+ T cells is BCMA-dependent for all bispecific antibody molecules tested. CD69 activation was slightly increased on CD4+ and CD8+ T cells at higher concentrations of the bispecific antibody constructs that did not include silent mutations.
[00304] A FIG. 32, painéis A e B, são gráficos que mostram a % de células T CD4+CD69+ e %CD8+CD69+, respectivamente, em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Estes resultados demonstram que a ativação de CD69 em células T CD4+ e CD8+ é dependente de PSMA para todas as moléculas de anticorpo biespecíficas testadas.[00304] FIG. 32, panels A and B, are graphs showing % CD4+CD69+ and %CD8+CD69+ T cells, respectively, as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. These results demonstrate that CD69 activation on CD4+ and CD8+ T cells is PSMA-dependent for all bispecific antibody molecules tested.
[00305] A FIG. 35, painéis A e B, são gráficos que mostram a % de células T CD4+CD69+ e % de células T CD8+CD69+, respectivamente, em função da concentração de anticorpo biespecífico para os construtos de anticorpo biespecífico mostrados na legenda. Estes resultados demonstram que a ativação de CD69 em células T CD4+ e CD8+ é dependente de CD19 para todas as moléculas de anticorpo biespecíficas testadas. A ativação de CD69 foi ligeiramente aumentada em células T CD4+ e CD8+ em concentrações mais altas dos construtos de anticorpos biespecíficos que não incluíam mutações silenciosas.[00305] FIG. 35, panels A and B, are graphs showing % CD4+CD69+ T cells and % CD8+CD69+ T cells, respectively, as a function of bispecific antibody concentration for the bispecific antibody constructs shown in the legend. These results demonstrate that CD69 activation on CD4+ and CD8+ T cells is CD19-dependent for all bispecific antibody molecules tested. CD69 activation was slightly increased on CD4+ and CD8+ T cells at higher concentrations of the bispecific antibody constructs that did not include silent mutations.
[00306] Anticorpos biespecíficos anti-CD3 x anti-BCMA foram testados quanto à capacidade de matar três células tumorais BCMA+ diferentes e uma linhagem de células negativas para BCMA através do re-direcionamento de células T primárias ativadas. Neste experimento, as células tumorais foram misturadas com células T pan ativadas em uma razão E:T de 10:1 juntamente com a adição de anticorpo biespecífico. Os resultados são mostrados na FIG. 21, Painéis A-D. O painel A mostra a morte de células RPMI-8226, o painel B mostra a morte de células NCI-H929, 0 painel C mostra a morte de células U-266 e o painel D mostra a morte de células K562, um controle negativo. O eixo x mostra a concentração do anticorpo utilizado e o eixo y mostra a % de lise das células tumorais 6 horas após a adição do anticorpo.[00306] Bispecific anti-CD3 x anti-BCMA antibodies were tested for their ability to kill three different BCMA+ tumor cells and a BCMA-negative cell line by re-targeting activated primary T cells. In this experiment, tumor cells were mixed with pan activated T cells in an E:T ratio of 10:1 along with the addition of bispecific antibody. The results are shown in FIG. 21, Panels A-D. Panel A shows death of RPMI-8226 cells, panel B shows death of NCI-H929 cells, panel C shows death of U-266 cells, and panel D shows death of K562 cells, a negative control. The x-axis shows the concentration of the antibody used and the y-axis shows the % lysis of the tumor cells 6 hours after the addition of the antibody.
[00307] O nível de liberação de citocina IL-2 foi medido após células T humanas em repouso serem cultivadas com várias linhagens de células tumorais e doses crescentes de anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-BCMA. A FIG. 22, o painel A mostra a liberação de IL-2 estimulada por células RPMI-8226, FIG. 22, o painel B mostra a liberação de IL-2 estimulada por células NCI-H929. A FIG. 22, o painel C mostra a liberação de IL-2 estimulada por células U-266, e a FIG. 22, o painel D mostra a liberação de IL-2 estimulada por células K562, um controle negativo.[00307] The level of IL-2 cytokine release was measured after resting human T cells were cultured with various tumor cell lines and increasing doses of bispecific anti-CD3 x anti-BCMA antibody. FIG. 22, Panel A shows IL-2 release stimulated by RPMI-8226 cells, FIG. 22, Panel B shows IL-2 release stimulated by NCI-H929 cells. FIG. 22, Panel C shows IL-2 release stimulated by U-266 cells, and FIG. 22, panel D shows IL-2 release stimulated by K562 cells, a negative control.
[00308] O nível de liberação de citocina IFN-γ foi medido após células T humanas em repouso serem cultivadas com várias linhagens de células tumorais e doses crescentes de anticorpo biespecífico anti-CD3 X anti-BCMA. A FIG. 23, o painel A mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células RPMI-8226, FIG. 23, o painel B mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células NCI-H929, FIG. 23, o painel C mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células U-266, e a FIG. 23, o painel D mostra a liberação de IFN-γ estimulada por células K562, um controle negativo.[00308] The level of IFN-γ cytokine release was measured after resting human T cells were cultured with various tumor cell lines and increasing doses of anti-BCMA anti-CD3X bispecific antibody. FIG. 23, Panel A shows IFN-γ release stimulated by RPMI-8226 cells, FIG. 23, panel B shows IFN-γ release stimulated by NCI-H929 cells, FIG. 23, Panel C shows IFN-γ release stimulated by U-266 cells, and FIG. 23, panel D shows IFN-γ release stimulated by K562 cells, a negative control.
[00309] Embora as modalidades preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas neste documento, será óbvio para os versados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo. Inúmeras variações, mudanças e substituições ocorrerão agora para os versados na técnica sem se afastar da invenção. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades da invenção descritas neste documento podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as reivindicações a seguir definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam cobertos por elas.[00309] While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Countless variations, changes and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents are covered by them.
Claims (30)
(i) uma primeira subunidade polipeptídica compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:49;
(ii) uma segunda subunidade polipeptídica compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:56,
em que a primeira e a segunda subunidades de polipeptídeo juntas formam uma primeira fração de ligação que se liga a CD3□δε humana; e
(iii) uma terceira subunidade polipeptídica que se liga ao BCMA humano, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58.A bispecific monoclonal antibody that binds to human CD3□δε and human BCMA, characterized in that it comprises:
(i) a first polypeptide subunit comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49;
(ii) a second polypeptide subunit comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56,
wherein the first and second polypeptide subunits together form a first binding moiety that binds human CD3□δε; It is
(iii) a third polypeptide subunit which binds human BCMA, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58.
(i) uma primeira subunidade polipeptídica compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:49;
(ii) uma segunda subunidade polipeptídica compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:75,
em que a primeira e a segunda subunidades de polipeptídeo juntas formam uma primeira fração de ligação que se liga a CD3□δε humana; e
(iii) uma terceira subunidade polipeptídica que se liga ao BCMA humano, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:76.A bispecific monoclonal antibody that binds to human CDS□δε and human BCMA, characterized in that it comprises:
(i) a first polypeptide subunit comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49;
(ii) a second polypeptide subunit comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75,
wherein the first and second polypeptide subunits together form a first binding moiety that binds human CD3□δε; It is
(iii) a third polypeptide subunit which binds human BCMA, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76.
(i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3□δε humano; e
(ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano,
em que o primeiro braço de ligação compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:56 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:49; e
em que o segundo braço de ligação compreende uma segunda cadeia pesada bivalente compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:58.A human monoclonal IgG4 bispecific antibody, characterized in that it comprises:
(i) a first binding arm that binds to human CD3□δε; It is
(ii) a second binding arm that binds to human BCMA,
wherein the first linking arm comprises a first heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:56 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49; It is
wherein the second linking arm comprises a second bivalent heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58.
(i) um primeiro braço de ligação que se liga ao CD3□δε humano; e
(ii) um segundo braço de ligação que se liga ao BCMA humano,
em que o primeiro braço de ligação compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:75 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de ami-noácidos de SEQ ID NO:49; e
em que o segundo braço de ligação compreende uma segunda cadeia pesada bivalente compreendendo a sequência de amino-ácidos de SEQ ID NO:76.A human monoclonal IgG4 bispecific antibody, characterized in that it comprises:
(i) a first binding arm that binds to human CD3□δε; It is
(ii) a second binding arm that binds to human BCMA,
wherein the first linking arm comprises a first heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:75 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:49; It is
wherein the second linking arm comprises a second bivalent heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:76.
Uso do anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, na fabricação de um medicamento para 0 tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição de saúde.Invention in any form of its embodiments or in any applicable category of claim, for example, product or process or use, or any other type of claim encompassed by the matter initially described, disclosed or illustrated in the patent application;
Use of the bispecific antibody as defined in any one of claims 1 to 20, in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of a disease, disorder or health condition.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/017,589 | 2020-04-29 | ||
| US63/108,796 | 2020-11-02 | ||
| BR112022021690-4 | 2021-04-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR122022022755A2 true BR122022022755A2 (en) | 2023-01-03 |
Family
ID=
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