BR122022020571B1 - Método para aumentar a citotoxicidade dependente de complemento - Google Patents

Abstract

São descritos aqui polipeptídeos e anticorpos relacionados que compreendem um domínio Fc variante. O domínio Fc variante fornece interações Fc:Fc estabilizadas quando os polipeptídeos, anticorpo ou anticorpos são ligados a seu alvo, antígeno ou antígenos na superfície de uma célula, desta maneira fornecendo citotoxicidade dependente de complemento melhorada (CDC).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos contendo domínio Fc, tais como anticorpos, tendo citotoxicidade dependente de complemento (CDC) aumentada e também podem ter outras funções atuadoras modificadas que resultam de uma ou mais modificações de aminoácido no domínio Fc.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As funções atuadoras mediadas pela região Fc de um anticorpo permitem a destruição de entidades estranhas, tais como a morte de patogênios e a liberação e a degradação de antígenos. A citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e a fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) é iniciada pela ligação da região de Fc às células que carregam o receptor de receptor de Fc, visto que a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) é iniciada pela ligação da região de Fc a C1q, que inicia a via clássica de ativação de complemento.

[003] Cada anticorpo IgG contém dois locais de ligação para C1q, um em cada região de constante de cadeia pesada (Fc). Uma molécula simples de IgG na solução, entretanto, não ativa o complemento quando a afinidade de IgG monomérico para C1q é muito fraca (Kd ~10-4 M) (Sledge et al., 1973 J. Biol. Chem. 248,2818-13; Hughes-Jones et al., 1979 Mol. Immunol. 16,697701). A associação conduzida por antígeno de IgG pode levar à ligação muito forte da molécula de multivalente C1q (Kd ~10-8 M) e ativação complementar (Burton et al., 1990 Mol. Immunol. 22, 161-206). Em contraste, o IgM existe naturalmente em penta- ou hexâmeros ligados covalentemente e na ligação de parâmtros de pentâmeros ou hexâmeros de antígeno expressado ou imobilizado celular podem evocar eficazmente o CDC. A ligação de antígeno é um requerimento para induzir uma mudança de conformação em IgM para exposr os locais de ligação de ligação de C1q (Feinstein et al., 1986, Immunology Today, 169-174).

[004] Também foi sugerido que a ativação de complemento de IgG pode atingir a ativação de complemento pela formação de estruturas de anel hexaméricas, através da interação dos domínios CH2/CH3 da região de Fc (Burton et al., 1990 Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69). Evidência suportando a existência de tais estruturas de IgG hexaméricas foram observadas em cristais bidimensionais (Reidler et al., 1986 I Handbook of Experimental Immunology 4th edit. (Weir, D. M. ed.), pp17.1-17.5. Blackwell, Edinburgh; Pinteric et al., 1971 Immunochem. 8, 1041-5) e tridimensionais, bem como para IgG1, IgG2a and IgG4 e F humano na solução (Kuznetsov et al., 2000 J Struct. Biol. 131, 108-115). Uma formação de anel hexamérico também foi observado na estrutura cristalina do anticorpo IgG1K b12 humano direcionado contra HIV-1 gp120 (1HZH em PDB) (Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293(5532),1155-9). No anel de hexâmero o anel de hexâmero b12, seis locais de ligação de C1q acessíveis foram apresentados na superfície de hexâmero, um de cada um dos seis anticorpos, enquanto os outros seis locais de ligação virados para baixo.

[005] C1q se parece com um feixe de tulipas com seis cabeças globulares, contendo as regiões de combinação de anticorpo, presas a seis hastes de colágeno (Perkins et al., 1985 Biochem J. 228, 13-26; Poon et al., 1983 J Mol Biol. 168, 563-77; Reid et al., 1983 Biochem Soc Trans 11, 1-12; Weiss et al., 1986 J. Mol. Biol. 189, 573-81). C1q foi observado adaptar-se na montagem hexamérica b12 da estrutura cristalina 1HZH, de modo que cada uma daquelas seis cabeças globulares estejam em contato com cada um dos seis locais de ligação de C1q (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co., 5-10 July 2010; “Crystal Structure of an intact human IgG: implications for HIV-1 neutralization and effector Function”, Thesis by Erica Ollmann Saphire, for the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November 2000). As mutações nos aminoácidos selecionados nas interfaces de Fc observadas entre os anticorpos b13 relacionados por simetria na estrutura cristalina foram observadas diminuir a avidez da ligação de C1q, indicando a contribuição destes aminoácidos à interação de Fc:Fc.

[006] O WO 2006/104989 descreve regiões de Fc de anticorpo alteradas e seus usos.

[007] O WO 2005/047327 descreve variantes de polipeptídeo de ligação de receptor de Fc neonatal, proteínas de ligação de Fc diméricas e métodos relacionados com estes.

[008] WO 2010/106180 descreve variantes de Fc tendo ligação aumentada ao receptor de Fc neonatal (FcRn).

[009] WO 2005/070963 descreve variantes de região Fc de polipeptídeo e usos destes.

[0010] O WO 2006/053301 descreve variantes Fc cm ligação alterada a FcRn.

[0011] O US 2011/0123440 descreve regiões Fc de anticorpo alteradas e os seus usos. As regiões de Fc alteradas têm uma ou mais substituições de aminoácido.

[0012] O US 2008/0089892 descreve variantes de região Fc do polipeptídeo e composições que compreendem estas variantes de região Fc.

[0013] O US 2010/0184959 descreve métodos de fornecer uma variante de polipeptídeo Fc com reconhecimento alterado de um ligante Fc e/ou uma função atuadora.

[0014] O US 2010/015133 descreve métodos de produzir polipeptídeo pela regulação da associação de polipeptídeo.

[0015] O US 2010/105873 descreve método integrado para gerar terapêuticos de proteína de domínio múltiplo.

[0016] O US 6,737,056 descreve variantes de polipeptídeo com função atuadora alterada.

[0017] Esforços prévios foram feitos para identificar variantes Fc de anticorpo com uma função atuiadora intensificada ou outras propriedades modificadas. Tais estudos focalizaram, por exemplo, em segmentos de troca entre os isotipos IgG para gerar as moléculas de IgG quiméricas (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72) ou substituições de aminoácido na região de junta (Dall’Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138) em ou próximo do local de ligação de C1q no domínio de CH2, centrado em torno dos resíduos D270, K322, P329 e P331 (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 e WO 99/51642). Por exemplo, Moore et al. (2010 mAbs 2(2), 181-189)) descreve testar várias combinações de S267E, H268F, S324T, S239D, I332E, G236A e I332E para a função atuadora intensificada por intermédio de CDC ou ADCC. Outras mutações de Fc que afetam a ligação aos receptores de Fc (WO 2006/105062, WO 00/42072, Patente U. S. 6,737,056 e Patente U. S. Patente 7,083,784) ou propriedades físicas dos anticorpos (WO 2007/005612 A1) também foi sugerido.

[0018] A despeito destes e outros avanços na técnica, entretanto, permanece uma necessidade para novos e melhorados terapêuticos com base em anticorpo melhorado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção fornece variantes de polipeptídeo e de anticorpo tendo citotoxicidade dependente de complemento intensificada (CDC) e também pode ter outras funções atuadoras intensificadas como em comparação com senso precursores/anticorpo de polipeptídeo. Sem estar limitado por teoria, acredita-se que as variantes são capazes de uma interação de ligação mais estável entre as regiões de Fc de duas moléculas de polipeptídeo/anticorpo, desse modo fornece uma superfície mais ávida leva a uma função atuadora intensificada, tal como uma resposta de CDC aumentada ou mais específica. As variantes particulares também são caracterizadas por uma resposta de ADCC melhorada, resposta de ADCP e/ou outras funções atuadoras intensificadas. Este mecanismo sutil de projeto de polipeptídeo/anticorpo pode ser aplicado, por exemplo, para aumentar a eficácia ou especificidade de terapêuticos com base em anticorpo, como descrito aqui.

[0020] Desta maneira, em um aspecto a presente invenção refere-se a um método de aumentar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, cujo método compreende introduzir uma mutação ao polipeptídeo precursor em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[0021] Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e contanto que a variante não contém quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a ligação da variante ao receptor de Fc neonatal (FcRn).

[0022] A invenção também fornece o uso de um ou mais tais mutações para aumentar citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada pelo polipeptídeo ou anticorpo quando ligado a seu antígeno, por exemplo, na superfície de uma célula que expressa antígeno, uma membrana celular ou um vírion.

[0023] Em um aspecto, referido aqui como “mutante simples”, uma variante tem CDC aumentado e também pode ter outras funções atuadoras aumentadas em comparação com o polipeptídeo precursor ou anticorpo.

[0024] Em um aspecto, referido aqui como “mutante duplo”, a variante compreende pelo menos duas mutações no dito segmento e tem CDC melhorado e pode ter outras funções atuadoras melhoradas como em comparação com uma variante que compreende apenas uma das ditas pelo menos duas mutações.

[0025] Em um aspecto, referido aqui como “mutante misto”, a variante fornece um CDC aumentado e também pode ter outras funções atuadoras aumentadas quando usada em combinação com uma segunda variante do mesmo polipeptídeo ou diferente ou anticorpo que compreende uma mutação em um resíduo de aminoácido diferente no dito segmento, como em comparação com um ou mais da variante, segunda variante e o polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor apenas.

[0026] Tipicamente, a mutação é uma substituição de aminoácido, tal como uma mutação que troca um resíduo de aminoácido precursor para um tendo um tamanho diferente e/ou propriedade fisicoquímica que promove a formação de uma nova ligação de Fc:Fc intermolecular ou aumenta a força da interação de um par existente. Os resíduos de aminoácido exemplares para a mutação de acordo com a invenção são mostrados nas Tabelas 1 e 2A e B, junto com as substituições de aminoácido exemplares. As ilustrações não limitantes de aspectos diferentes da invenção são fornecidos na Figura 1.

[0027] Estes e outros aspectos da invenção, particularmente, vários usos e aplicações terapêuticas para as variantes de polipeptídeo e anticorpo, são descritos em outros detalhes adicionais.

Breve Descrição dos Desenhos

[0028] Figura 1: (A) Representação esquemática de moléculas de IgG em formação de hexâmero. O círculo pontilhado ilustra dois pares de interação de Fc:Fc adjacentes de duas moléculas de IgG vizinhas. A seta na caixa ilustra a direção cujas ilustrações em B, C e D são vistos: as moléculas de Fc vizinhas são giradas 90° (no plano do desenho) e visto a partir dos membros Fab na diração dos domínios CH3. (B) efeito observado de mutações intensificadoras de oligomerização em CDC. A representação esquemática que ilustra os pares de interação de Fc:Fc com eficiência aumentada de acordo com o mutante simples e spectos de mutante duplo da invenção. (C) Efeito observado de mutações que inibem oligomerização em CDC. A representação esquemática que ilustra como pelo menos duas mutações que inibem a oligomerização que compensam uma à outra podem ser, combinadas em uma molécula (aspecto de mutante duplo) ou separadas em duas moléculas (aspecto de mutante misto), para restaurar ou aumentr a interação de Fc:Fc de acordo com o mutante duplo e aspectos de mutantes mistos da invenção. Os mutantes mistos atingem a ativação da função atuadora específica dependente da ligação de ambos os anticorpos, que podem reconhecer alvos diferentes. (D) Efeito teórico de ligação de mutações de inibição de C1q em CDC. Representação esquemática de interações de Fc:C1q, olistrando que se as mutações inibem a ligação de C1q, estes não podem ser combinados ou mistos para restaurar a atividade de CDC, porque o C1q não pode compensar os defeitos introduzidos no anticorpo.

[0029] Figura 2: alinhamento de sequência de segmentos de IgG1, IgG1f, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM Fc humanos correspondentes a esíduos P247 a K447 na cadeia pesada de IgG1, usando-se o software Clustal 2.1, como numerado pelo índice de EU como apresentado em Kabat. As sequências mostradas representam resíduos de 130 a 330 da região constante de cadeia pesada de IgG1 humana (SEQ ID N°: 1; Acessão UniProt N° P01857) e da variante alotípica IgG1m(f); resíduos 126 a 326 da região constante de cadeia pesada IgG2 (SEQ ID N°: 2; acessão UniProt N° P01859) e resíduos 177 a 377 da região constante de cadeia pesada de IgG3 (SEQ ID N°: 2; acessão UniProt N° P01860) e resíduos 127 a 327 da região constante de cadeia pesada de IgG4 (SEQ ID N°: 4; acessão UniProt N° P01861) e resíduos 225-428 da região constante de IgE (Acessão Uniprot N° P01854) e resíduos 133-353 da região constante de IgA1 (Acessão Uniprot N° P01876) e resíduos 120-340 da região constante de IgA2 (Acessão Uniprot N° P01877) e resíduos 230-452 da região constante de IgM (Acessão Uniprot N° P01871) e resíduos 176-384 da região constante de IgD (Acessão Uniprot N° P01880).

[0030] Figura 3A e B: Alinhamento de sequência de anticorpo anti- EGFr 2F8 em uma cadeia principal de IgG1 (SEQ ID N°: 3), IgG4 (SEQ ID N°: 5) e (partial) IgG3 (SEQ ID N°: 6). Numeração de aminoácido de acordo com Kabat e, de acordo com o índice EU são descritos (ambos descritos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5° Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).

[0031] Figura 4: Vista detalhada das interações de K439/S440 entre o Fc de moléculas adjacentes (Fc e Fc’, respectivamente) em uma disposição multimérica (por exemplo, hexamérica), que ilustra a interação entre moléculas de Fc e Fc’ não modificada do tipo selvagem.

[0032] Figura 5: Vista detalhada das interações de K439/S440 entre o Fc de moléculas adjacentes (Fc e Fc’, respectivamente) em uma disposição multimérica (por exemplo, hexamérica) que ilustra a interação entre moléculas de Fc e Fc’ variantes que compreendem mutações K439E e S440K.

[0033] Figura 6: Ligação de C1q ELISA com mutantes Fc:Fc 7D8. As séries de concentração dos anticorpos indicados foram revestidos aos reservatórios da placa microtituladora e incubada com uma concentração fixa C1q. A eficiência para ligar C1q foi comparável com 7D8 do tipo selvagem para todos os mutantes revestidos, exceto I253D. Um representativo de pelo menos 3 experimentos é mostrado.

[0034] Figura 7: CDC mediado por variantes de 7D8 em células Raji positivas CD20. As células Raji foram incubadas com os mutantes 7D8 (K439E, S440K, K439E/S440K Mutante duplo, mistura K439E + S440K) e uma série de concentração de C1q para testar a eficácia de CDC pela medição de lise celular. Um gráfico representativo de experimentos repetidos é mostrado.

[0035] Figura 8: CDC mediado por mutantes 7D8 (7D8-WT, K439E, S440K, mutante duplo K439E/S440K, mistura de K439E + S440K) em células Daudi positivas CD20. Uma série de concentração de mutantes 7D8 foi testada quanto à sua eficácia para induzir CDC.

[0036] Figura 9: CDC mediado pelos mutantes de anticorpo CD38 HuMAb 005 em células positivas CD38. (A) Eficácia de CDC em células Daudi por uma série de concentração de 005 mutants. (B) Eficácia de CDC em células Raji por uma série de concentração de mutantes HuMAb 005. (C) a eficácia de CDC do mutante E345R de HuMAb 005 com 20% ou 50% NHS em células Wien133. (D) Eficácia de CDC de mutantes E345R de HuMAb 005 e 7D8 com 20% ou 50% NHS em células Raji. As amostras de anticorpo não purificadas isoladas de transfecção transitória foram testadas. Como um controle negativo, o sobrenadante de células transfectadas por imitação foi usado.

[0037] Figura 10: CDC para mutantes tipo selvagem e E345R de anticorpo CD38 HuMAb 005, (A) e anticorpo CD20 HuMAb 7D8 (B) em um experimento de competição com um peptídeo de ligação de Fc. A lise celular foi medida após CDC em células Daudi opsonizadas por anticorpo incubadas com uma série de concentração do peptídeo DCAWHLGELVWCT de ligação de Fc (SEQ ID N°: 7). As amostras de anticorpo não purificada isoladas a partir de transfecções transitórias foram usadas. como um controle negativo, sobrenadante de células transfectadas por imitação foi usado.

[0038] Figura 11: ADCC de células Daudi que expressam CD38 pelo anticorpo do tipo selvagem CD38 HuMAb 005 e IgG1-005-E345R mutante. ADCC de PBMC de um doador é mostrado, descrito como% de lise.

[0039] Figura 12: Ligação de IgG1-7D8 tipo selvagem e IgG1-7D8- E345R mutante para FcRn humano, cinomolgo e de camundongo, como determinado pelo ELISA em pH 6.

[0040] Figura 13: Concentrações de plasma de IgG1-7D8 tipo selvagem e variantes de -E354R, -S440K e K322A que seguem a injeção intravenosa em camundongos SCID.

[0041] Figura 14A, B, C e D: CDC em células Wien133 positivas CD20 e CD38.

[0042] Figura 15A e B: Avaliação da eficácia in vivo de IgG1-7D8- E345R em um modelo de xenoenxerto subcutâneo com células de Raji-luc #2D1.

[0043] Figura 16A e B: Avaliação da eficácia in vivo de IgG1-005- E345R em um modelo de xenoenxerto subcutâneo com células de Raji-luc #2D1.

[0044] Figura 17: CDC em células Wien133 em CD38 positivo, EGFR negativo por anticorpo biespecífico CD38/EGFR com a mutação de E345R.

[0045] Figura 18A e B: CDC em células Wien133 ou células Raji positivas CD20, negativas CD38 por anticorpo biespecífico com CD20/CD38 com e sem a mutação de E345R.

[0046] Figura 19: CDC em células A431 positivas de EGFR pelo anticorpo EGFR 2F8 com a mutação de E345R.

[0047] Figura 20A e B: CDC mediado por anticorpos mutantes E345R.

[0048] Figura 21: Análise da colonização de anticorpos TF (FITC) com o marcador lisossomal LAMP1 (APC).

[0049] Figura 22A-D: Introdução de E345R resultou na morte mediada por CDC intensificada em comparação com rituximab tipo selvagem testado em linhas de célula B diferentes.

[0050] Figura 22E: Introdução de E345R resultou em morte mediada por CDC máxima aumentada em comparação com rituximab tipo selvagem, independente dos níveis de expressão das proteínas reguladoras de complemento CD46 (A), CD55 (B) ou CD59 (C) em linhas de célula B diferentes com níveis de expressão de CD20 comparável.

[0051] Figura 23: cinéticas de CDC. Anticorpos de E345R resultam em lise celular de alvo substancial mais rápido e mais substancial por CDC do que em comparação com anticorpos do tipo selvagem.

[0052] Figura 24: Cinéticas de CDC. Introdução da mutação de E345R no anticorpo CD38xCD20 biespecífico resulta em lise celular alvo mediada por CDC mais rápida e mais substancial.

[0053] Figura 25 A-B: Cinéticas de CDC. Introdução da mutação de E345R em anticorpo biespecífico CD38xEGFR (A) e CD20xEGFR (B) que ligam monovalentemente a células Raji negativas EGFR, resulta em lise celular alvo mediada por CDC mais rápida e mais substancial.

[0054] Figura 26A-F: CDC em células Wien133 por uma combinação de um anticorpo de um anticorpo do tipo selvagem com um anticorpo mutante contendo (A-C) E345R e Q386K ou (D-F) E345R, E430G e Q386K. Os mutantes IgG1-b12 não ligam as células Wien133 e foram usadas como anticorpos de controle negativo.

[0055] Figura 27: Eficácia de CDC de anticorpos de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 contendo a mutação de E345R.

[0056] Figura 28: Introdução da mutação de E345R estabilizadora de Fc-Fc no anticorpo do tipo selvagem CD38 005 resulta na morte intensificada de células CLL primárias em um ensaio de CDC ex vivo(média ± erro padrão da média).

[0057] Figura 29: Ligação de FcRn de mutantes IgG1-005 e IgG1- 005 do tipo selvagem a FcRn humano, camundongo e cinomolgo em pH 6,0, como determinado pelo ELISA.

[0058] Figura 30: Eficácia de CDC em 20% soro humano normal de vários mutantes de rituximab, rituximab tipo selvagem e anticorpo de controle negativo irrelevante IgG1-b12 em Ramos e linhas celulares de SU-DHL-4.

[0059] Figura 31: Geração de C4d em soro humano normal de IgG1- 005, IgG1-005-E345K, IgG1-005-E345Q, IgG1-005-E345Y, IgG1-005- E430G, IgG1-005-E430S e IgG1-005-S440Y do tipo selvagem e IgG agregado por calor (HAG) (controle positivo) como determinado pelo Micro Vue C4d-fragmento ELISA.

[0060] Figura 32A/B: Taxa de liberação de plasma de IgG1-005 tipo selvagem administrado e variantes de anticorpo IgG1-005-E345K, IgG1-005- E345Q, IgG1-005-E345R, IgG1-005-E345Y, IgG1-005-E430F, IgG1-005- E430G, IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430T e IgG1-005-S440Y em camundongos SCID como determinado pelo IgG ELISA humano total (Figura 32A) e por ELISA específico de CD38 humano (Figura 32B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0061] Como descrito aqui, surpreendentemente, as mutações em aminoácidos que não estão diretamente envolvidos na ligação de Fc:C1q pode, entretanto, aumentar o CDC de um anticorpo e também pode melhorar outras funções atuadoras mediadas por Fc do anticorpo. Isto suporta a hipótese que as moléculas de anticorpo, tais como anticorpos IgG1 podem formar estruturas oligoméricas que são ligadas por último por C1q. Além disso, enquanto algumas mutações foram observadas diminuir a indução de CDC, algumas combinações de tais mutações nas mesmas moléculas de anticorpo ou diferentes resultaram em indução de CDC restaurada e mostrou a especificidade adicional para a oligomerização de anticorpos e, desse modo, promovendo a indução de CDC mais específicas. As mutações particulares que aumentam a a resposta de CDC também foram caracterizados por uma resposta de ADCC melhorada, avidez melhorada, internalização melhorada e eficácia in vivo em um sistema de modelo tumoral de camundongo como mostrado nos Exemplos. Estas descobertas permitem novos terapêuticos com base em anticorpo com capacidade de indução de CDC intensificada, indução de CDC mais seletiva e/ou outras funções atuadoras melhoradas.

[0062] As variantes de polipeptídeo, incluindo as variantes de anticorpo, da invenção, todas compreendem uma região de ligação e um domínio Fc de comprimento total ou parcial de uma imunoglobulina que compreende uma ou mais mutações no segmento correspondente a os resíduos de aminoácido E345 a S440 em IgG1. Sem estar limitado por teoria, acredita- se que as mutações identificadas resultam em uma indução de CDC mais eficaz e/ou mais específica com base em três princípios diferentes, esquematicamente representado na Figura 1 e referido aqui como “mutante simples”, “mutante duplo” e “mutantes mistos”.

[0063] Os efeitos C1q e/ou CDC melhorados das variantres da invenção são primariamente apenas detectáveis em ensaios que permitem os oligômeros de anticorpo para formar, tal como em ensaios com base celular quando o antígeno não é fixado mas está presente em uma membrana de fluido. Além disso, isto pode ser verificado de acordo com os princípios mostrados na Figura 1C que estes efeitos resultam de um oligômero de anticorpo mais estáveis e não de uma modificação de um local de ligação direta C1q.

Definições

[0064] O termo “mutante simples”, deve ser entendido como uma variante da presente invenção tendo CDC aumentado e também pode ter outras funções atuadoras intensificadas em comparação com o polipeptídeo ou anticorpo precursor.

[0065] O termo “mutante duplo”, deve ser entendido como uma variante que compreende pelo menos duas mutações no dito segmento e tem CDC melhorado e também pode ter outras funções atuadoras intensificadas como em em comparação com uma variante que compreende apenas uma das ditas pelo menos duas mutações.

[0066] O termo “mutante misto”, deve ser entendido como uma variante fornecer um CDC aumentado e, opcionalmente também outras funções atuadoras intensificadas quando usadas em combinação com uma segunda variante do mesmo polipeptídeo ou diferente que compreende uma mutação em um resíduo de aminoácido diferente no dito segmento, como em comparação com um ou mais da variante, segunda variante e o polipeptídeo precursor ou anticorpos sozinho.

[0067] O termo “polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação” refere-se, no contexto da presente invenção a um polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação que é um capaz de ligar a qualquer molécula, tal como um polipeptídeo, por exemplo, presente em uma célula, bactéria ou vírion. O domínio Fc de uma imunoglobulina é definido como o fragmento de um anticorpo que dve ser tipicamente gerado após a digestão de um anticorpo com papaína (que é conhecido por alguém habilitado na técnica) que inclui as duas regiões de CH2-CH3 de uma imunogloubulina e uma região de conexão, por exemplo, uma região de junta. O domínio constante de uma cadeia pesada de anticorpo define o isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD ou IgE. O domínio Fc media as funções atuadoras de anticorpos com receptores de superfície celular denominaram os receptores de Fc e proteínas do sistema de complemento. A região de ligação pode ser uma sequência de polipeptídeo, tal como uma proteína ou ligante e proteína, receptor, uma região de ligação de antígeno ou uma região de ligação de ligante a uma célula, bactéria ou vírion. Se a região de ligação for, por exemplo, um receptor, o “polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação” pode ser preparado como uma proteína de fusão do domínio Fc de uma imunoglobulina e a dita região de ligação. Se a região de ligação for uma região de ligação de antígeno o “polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação” pode ser um anticorpo, como um anticorpo quimérico, humanizado ou humano ou um anticorpo apenas de cadeia pesada ou uma fusão de ScFv-Fc. O polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação pode compreender tipicamente uma região de conexão, por exemplo, uma região de junta e duas regiões de CH2-CH3 da cadeia pesada de uma imunoglobulina, desta maneira o “polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação” pode ser um “polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação”. O termo “domínio Fc de uma imunoglobulina” significa, no contexto da presente invenção, que uma região de conexão, por exemplo, junta depednente do subtipo do anticorpo e a região de CH2 e CH3 de uma imunoglobulina estão presentes, por exemplo, um IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgM ou IgE humano. O polipeptídeo não é limitado à origem humana mas pode ser de qualquer origem, tal como, por exemplo, origem em camundongo ou cinomolgo.

[0068] O termo “região de CH2” ou “domínio de CH2” como usado aqui é pretendido referir-se à região de CH2 de uma imunoglobulina. Desta maneira, por exemplo, a região de CH2 de um anticorpo de IgG1 humano corresponde aos aminoácidos 228-340 de acordo com o sistema de numeração EU. Entretanto, a região de CH2 pode ser de qualquer um dos outros subtipos como descrito aqui.

[0069] O termo “região de CH3” ou “domínio de CH3” como usado aqui é pretendido referir-se à região de CH3 de uma imunoglobulina. Desta maneira, por exemplo, a região de CH3 de um anticorpo de IgG1 humano corresponde a aminoácidos 341 a 447 de acordo com o sistema de numeração EU. Entretanto, a região de CH3 também pode ser de qualquer um dos outros subtipos como descrito aqui.

[0070] O termo “immunoglobulina” refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas que consistemd e dois pares de cadeias de polipeptídeo, um par de cadeias de peso molecular leve (L) e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro potencialmente interconectadas por ligações de bissulfito. A estrutura de imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Resumidamente, cada cadeia pesada é, tipicamente, compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada, tipicamente, é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. As cadeias pesadas são inter-conectadas por intermédio de ligações de bissulfito na denomianda “região de junta”. Cada cadeia leve é tipicamente compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve, tipicamente, é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL ainda podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis em sequência e/ou forma de arcos estruturalmente definidos), também denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FRs). Cada VH e VL é tipicamente composto de três CDRs e quatro FRs, dispostos a partir de terminal amino a terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)). A não ser que estabelecido ou contradito pelo contexto, os aminoácidos das sequências de região constante são numeradosaqui de acordo com o índice EU (descrito em Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5° Edição - US Department of HealtH e Human Services, publicação NIH N° 91 a 3242, pp 662,680,689 (1991)).

[0071] O termo “anticorpo” (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmente de uma molécula de imunoglobulina ou um derivado destes, tendo a capacidade de ligar especificamente a um antígeno sob condições fisiológicas típicas com uma vida média de períodos significantes de tempo, tal como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de oito horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de três, quatro, cinco, seis, sete ou mais dias, etc., ou qualquer outro período funcionalmente relevante definido (tal como um tempo suficiente para induzir, promover, intensificar e/ou modular uma resposta fisiológica associada com ligação de anticorpo ao antígeno e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade atuadora). O anticorpo da presente invenção compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno. Um anticorpo, em geral, contém duas regiões de CH2-CH3 e uma região de conexão, por exemplo, uma região de junta, por exemplo, pelo menos um domínio Fc. Desta maneira, o anticorpo da presente invenção pode compreender uma região de Fc e uma região de ligação de antígeno. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes ou “Fc” dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores de hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (tais como células atuadoras) e componentes do sistema de complemento, tal como C1q, o primeiro componente no caminho clássico de ativação de complemento. Um anticorpo também pode ser um anticorpo multiespecífico, tal como a anticorpo biespecífico ou molécula similar. O termo “anticorpo biespecífico” refere-se a um anticorpo tendo especificidades para pelo menos dois epítopos tipicamente de não sobreposição diferentes. Tais epítopos podem estar nos mesmos alvos ou diferentes. Se os epítopos estiverem em alvos diferentes, podem estar na mesma célula ou células ou tipos celulares ou diferentes. Como indicado acima, a não ser que estabelecido de outra maneira ou claramente contradito pelo contexto, o termo anticorpo aqui, inclui fragmento de um anticorpo que compreende pelo menos uma porção de uma região de Fce que retém a capacidade de ligação específica ao antígeno. Tais fragmentos podem ser fornecidos por qualquer técnica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de peptídeo e técnicas de expressão recombinante. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizado pelos fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Os exemplos e fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "Ab" ou “anticorpo” incluem, sem limitação, anticorpos monovalentes (descrito em WO2007059782 por Genmab); anticorpos de cadeia pesada, consistindo apenas de duas cadeias pesadas e de ocorrência natural em, por exemplo, camelídeos (por exemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), domínio projetado de troca de filamento (SEED ou corpo de semente) que são moléculas semelhantes de anticorpo assimétrico e biespecífico (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); Fc?Adp (Regeneron, WO2010151792), Estrutura azimétrica (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), imunoglobulina de domínio variável duplo (Abbott, DVD-Ig, Patente U. S. N° 7,612,181); anticorpos de cabeça dupla de domínio duplo (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di-diacorpo (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticorpo Knobs-into-holes (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); formatos de anticorpo de condução eletrostática (Amgen, EP1870459 e WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304A2); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), anticorpos de domínio de alvejamento duplo (GSK/Domantis), Anticorpos dois em um que reconhecem dois alvos (Genentech, NovImmune), Mabs reticulado (Karmanos Cancer Center), CovX-corpo (CovX/Pfizer), Biespecífico como IgG (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74) e DIG-corpo e PIG-corpo (Pharmabcine) e Moléculas realvejantes de afinidade dupla (Fc-DART ou Ig-DART, da Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), Zybodies (Zyngenia), métodos com cadeia leve comum (Crucell/ Merus, US7262028) ou cadeias pesadas comuns (KÀBodies da NovImmune), bem como proteínas de fusão que compreende uma sequência de polipeptídeo fundida a um fragmento de anticorpo contendo um domínio Fc como fusões de scFv, como BsAb da ZymoGenetics/BMS), HERCULES da Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS da Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusão de scFv da Novartis, fusão de scFv da Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb da Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 da f-Star (WO2008/003116) e fusões de scFv duplas. Também deve ser entendido que o termo anticorpo, a não ser que especificado de outra maneira, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais humanos), misturas de anticorpo (policlonais recombinantes) por exemplo, gerados por tecnologias exploradas por Symphogen and Merus (Oligoclonics) e polipeptídeos semelhantes a anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo como gerado pode possuir potencialmente qualquer isotipo.

[0072] O termo “anticorpo de comprimento total” quando usado aqui, refere-se a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo precursor ou anticorpo variante) contendo todos os domínios constantes e variáveis de cadeia pesada e leve e domínios variáveis correspondentes àqueles que são normalmente encontrados em um anticorpo do tipo selvagem daquele isotipo.

[0073] O termo “anticorpo humano”, como usado aqui, é pretendido incluir anticorpos tendo regiões variáveis e contantes derivadas das sequências de imunoglobulina de linha germinal humanas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados plas sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações, inserções ou anulações introduzidas pela mutagênese específica aleatória ou de local in vitro ou pela mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como usado aqui, não é pretendido incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humanas.

[0074] Os termos "anticorpo monoclonal", “Ab monoclonal”, "composição de anticorpo monoclonal", “mAb”, ou outros, como usado neste refere-se a uma preparação das moléculas Ab da composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação simples e afinidade para um epítopo particular. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a Abs que apresenta uma especificidade de ligação simples que tem regiões constantes e variáveis derivadas das sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. O mAbs humano pode ser gerado por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico ou transcromossomal, tal como um camundongo transgênico, tendo um genoma que compreende um repertório de transgene de cadeia pesada humana e um repertório de transgene de cadeia leve, redisposto para produzir um anticorpo humano funcional e fundido a uma célula imortalizada.

[0075] Como usado neste, "isotipo" refere-se a classe de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE, ou IgM ou quaisquer alotipos destes tais como IgG1m(za) e IgG1m(f)) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada. Ainda, cada isotipo de cadeia pesada pode ser combinado com uma cadeia leve capa (K) ou lambda (X).

[0076] O termo “anticorpo monovalente” significa no contexto da presente invenção que uma molécula de anticorpo é capaz de ligar-se apenas com um dos domínios de ligação do anticorpo a um antígeno, por exemplo, tem uma penetração de anticorpo-antígeno simples e desta maneira não é capaz de reticulação de antígeno.

[0077] Como usado neste, o termo “alvo” está no contexto da presente invenção a ser entendida como uma molécula no qual a região de ligação do polipeptídeo que compreende um domínio Fc e uma região de ligação, quando usada no contexto da ligação de um anticorpo inclui qualquer antígeno em direção o qual o anticorpo elevado é direcionado. O termo “antígeno” e “alvo” pode em relação a um anticorpo ser usado permutavelmente e consiste do mesmo significado e propósito com relação a qualquer aspecto ou forma de realização da presente invenção.

[0078] Como usado neste, o termo "ligação''no contexto da ligação de um anticorpo a um antígeno pré-determinado tipicamente é uma ligação com uma afinidade correspondente a um KD de cerca de 10-6 M ou menos, por exemplo, 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos, ou cerca de 10-11 M ou menos ainda quando determinado por exemplo, pela tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligante e o anticorpo como o analito e liga-se ao antígeno pré-determinado com uma afinidade correspondente a um KD que é pelo menos dez vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, por exemplo, pelo menos 1.000 vezes menor, tal como pelo menos 10.000 vezes menor, por exemplo, pelo menos 100.000 vezes menor do que sua afinidade para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) outro do que o antígeno pré-determinado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com que a afinidade é menor é dependente no KD do anticorpo, de modo que quando o KD do anticorpo é muito menor (isto é, o anticorpo é altamente específico), então a quantidade com que a afinidade para o antígeno é menor do que a afinidade para um antígeno não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes. O termo "KD" (M), como usado neste, refere-se a constante de equilíbrio de dissociação de uma interação de antígeno de anticorpo particular.

[0079] Uma “variante” ou “variante de anticorpo” ou “variante de um anticorpo precursor” da presente invenção é uma molécula de anticorpo que compreende uma ou mais mutações como em comparação com um “anticorpo precursor”. Os termos diferentes podem ser usados permutavelmente e constituem o mesmo significado e propósito com relação a qualquer aspecto ou forma de realização da presente invenção. Os formatos do anticorpo precursor exemplares incluem, sem limitação, um anticorpo de tipo selvagem, um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo contendo Fc, um anticorpo biespecífico, um anticorpo humano ou qualquer combinação deste. Similarmente, uma “variante” ou “uma variante de um polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação” ou “uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação” da presente invenção é um “polipeptídeo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação”, que compreende uma ou mais mutações como em comparação com um “polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação”. Os termos diferentes podem ser usados permutavelmente e constituem o mesmo significado e propósito com relação a qualquer aspecto ou forma de realização da presente invenção. As mutações exemplares incluem as anulações de aminoácido, inserções e substituições dos aminoácidos na sequência de aminoácido precursor. As substitições de aminoácido podem trocar um aminoácido natural por outro aminoácido de ocorrência natural, ou para um derivado de aminoácido de ocorrência não natural. A substituição de aminoácido pode ser conservativa ou não conservativa. No contexto da presente invenção, as substituições conservativas podem ser definidas pelas substituições dentro das classes dos aminoácidos refletidos em uma ou mais das seguintes três tabelas: Classes de Resíduo de aminoácido para as substituições conservativas Classes de substituição de resíduo de aminoácido conservativo alternative Classificações físicas e funcionais alternativas dos Resíduos de aminoácido

[0080] No contexto da presente invenção, uma substituição em uma variante é indicada como: Aminoácido original- posição- aminoácido substituído; O código de três letras, ou um código de uma letra, são usados, incluindo os códigos Xaa e X para indicar o resíduo de aminoácido. Consequentemente, a anotação “E345R” ou “Glu345Arg” significa, que uma variante compreende uma substituição do ácido glutâmico com Arginina em uma posição de aminoácido variante correspondente ao aminoácido na posição 345 no anticorpo precursor.

[0081] Onde uma posição tal como não está presente em um anticorpo, mas uma variante compreende uma inserção de um aminoácido, por exemplo: Posição- aminoácido substituído; a anotação, por exemplo, “448E” é usada.

[0082] Tal anotação é relevante particular em conexão com as modificações nas séries dos polipeptídeos homólogos ou anticorpos.

[0083] Similarmente quando a identidade da substituição dos resíduos de aminoácidos é secundário: Aminoácido original- posição; ou “E345”.

[0084] Para uma modificação onde os aminoácidos originais e/ou aminoácidos substituídos podem compreender mais do que um, mas não todos aminoácidos, a substituição do ácido glutâmico para Arginina, lisina ou Triptofano na posição 345: “Glu345Arg,Lys,Trp” ou “E345R,K,W” ou “E345R/K/W” ou “E345 a R, K ou W” Podem ser usados permutavelmente no contexto da invenção.

[0085] Além disso, o termo “uma substituição” abrange uma substituição em qualquer um dos outros dezenove aminoácidos naturais, ou em outros aminoácidos, tal como aminoácidos não naturais. Por exemplo, uma substituição do aminoácido E na posição 345 inclui cada uma das seguintes substituições: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 345I, 345K, 345L, 345M, 345N, 345Q, 345R, 345S, 345T, 345V, 345W e 345Y. Isto é, pela maneira, equivalente a indicação 345X, em que o X indica qualquer aminoácido. Estas substituições também podem ser indicadas E345A, E345C, etc, ou E345A,C,ect, ou E345A/C/ect. O mesmo aplica-se a analogia a cada e em cada posição mencionada acima, para incluir especificamente neste qualquer um de tais substituições.

[0086] Um aminoácido ou segmento em uma sequência que “corresponde a” um aminoácido ou segmento em outra sequência é um que (i) alinha com o outro aminoácido ou segmento usando um programa de alinhamento de sequência padrão tal como ALIGN, ClustalW ou similar, tipicamente nos ajustes padrão e (ii) tem uma identidade de sequência a SEQ ID N°: 1 de pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%. Por exemplo, os alinhamentos de sequência mostrados nas Figuras 2 e 3 podem ser usados para identificar qualquer aminoácido na sequência IgG2, IgG3 ou IgG4 Fc que corresponde a um aminoácido particular na sequência IgG1 Fc.

[0087] A presente invenção refere-se as variantes, viz. polipeptídeos precursores e anticorpos precursores, e/ou polipeptídeos variantes e anticorpos variantes, tendo um certo grau de identidade dos aminoácidos P247 a K447 da SEQ ID N°:1, 2, 3, 4 e 5, tais anticorpos precursores e/ou variantes sendo em seguida indicados “anticorpos homólogos”.

[0088] Para os propósitos da presente invenção o grau da identidade entre as duas sequências de aminoácido, bem como o grau da identidade entre duas sequências de nucleotídeo, é determinado pelo programa “align” que é um alinhamento Needleman-Wunsch (isto é um alinhamento global). O programa é usado pelo alinhamento do polipeptídeo, bem como nucleotídeo, sequências. A matriz de contagem padrão BLOSUM50 é usada pelos alinhamentos de polipeptídeo e a matriz de identidade padrão é usada pelos alinhamento de nucleotídeos, a penalidade do primeiro resíduo de uma fenda é -12 para polipeptídeos e -16 para nucleotídeos. As penalidades para os resíduos adicionais de uma fenda são -2 para polipeptídeos e -4 para nucleotídeos.

[0089] “Align” é parte da embalagem FASTA versão v20u6 (ver W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448 e W. R. Pearson (1990) “Rapid and Sensitive Sequence Comparaison with FASTP and FASTA”, Methods in Enzymology 183:63-98). Os alinhamentos de protéina FASTA usam o algorítmo Smith-Waterman com nenhuma limitação no tamanho da fenda (ver “Smith-Waterman algorithm”, T. F. SmitH e M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biolo. 147:195-197).

[0090] Como usado neste, o termo "célula atuadora" refere-se a uma célula imune que é envolvida na fase atuadora de uma resposta imune, como exposta as fases cognitivas e ativação de uma resposta imune. As células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (tal como células B e células T incluindo as células T citolíticas (CTLs)), células mortas, células mortas naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tal como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células atuadoras expressam os receptores Fc (FcRs) ou receptores de complemento e realizam as funções imunes específicas. Em algumas formas de realização, uma célula atuadora tal como, por exemplo, uma célula morta natural, é capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e células Kupffer que expressam FcRs, são envolvidas na morte específica das células alvos e apresenta os antígenos a outros componentes do sistema imune, ou ligação as células que apresentam os antígenos. Em algumas formas de realização o ADCC ainda pode ser intensificado pelo anticorpo conduzido pela atividade de complemento clássico resultando na deposição dos fragmentos C3 ativados na célula alvo. Os produtos de clivagem C3 são ligantes aos receptores complementares (CRs), tal como CR3, expressóide em célula mielóide. O reconhecimento dos fragmentos de complemento por CRs nas células atuadoras pode promover o ADCC mediado pelo receptor Fc intensificado. Em algumas formas de realização o anticorpo conduz a ativação do complemento clássico que leva aos fragmentos C3 na célula alvo. Estes produtos de clivagem C3 pode promover a citotoxicidade celular dependente do complemento direto (CDCC). Em algumas formas de realização, uma célula atuadora pode submeter o antígeno alvo à fagocitose, partícula alvo ou célula alvo. A expressão de um FcR particular ou receptor de complemento em uma célula efetiva pode ser regulada pelos fatores humorais tal como citocinas. Por exemplo, expressão de FCYRI foi observada ser super-regulada por interferon y (IFN Y) e/ou G-CSF. Esta expressão intensificada aumentada a atividade citotóxica das células que carregam FCYRI contra os antígenos. Uma célula atuadora pode submeter um antígeno alvo à fagocitose ou a célula alvo à fagocitose ou à lise célula alvo. Em algumas formas de realização o anticorpo que conduz a ativação de complemente clássico leva a um fragmento C3 na célula alvo. Estes produtos de clivagem C3 podem promover a fagocitose direta pelas células atuadoras ou indiretamente pela intensificação da fagocitose mediada pelo anticorpo.

[0091] O termo "vetor," como usado neste, é pretendido referir-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de introduzir a transcrição de um segmento do ácido nucléico ligado no vetor. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que está na forma de um arco de DNA filamentado duplo circular. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que o segmento do ácido nucléico pode ser ligado no genoma viral. Certos vetores são capazes da replicação autônoma em uma célula hospedeira no qual estes são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores (tal como vetores mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeira e portanto são replicadas junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão dos genes em que estes são operavelmente ligados. Tais vetores são referidos neste como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplismente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão da utilidade nas técnicas de DNA recombinantes são frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, o "plasmídeo"e "vetor" pode ser usado permutavelmente como o plasmídeo é a forma mais comumente usada do vetor. Entretanto, a presente invenção é pretendida incluir tais outras formas dos vetores de expressão, tal como vetores virais (tal como replicação de retrovírus defeituosos, adenovírus e adeno-vírus associado), que serve funções equivalentes.

[0092] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplismente "célula hospedeira"), como usado neste, é pretendida referir-se a célula no qual um vetor de expressão foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos são pretendidos referir-se não apenas a uma célula individual particular, mas também a progênie de um tal célula. Por causa de certas modificações pode ocorrer na realização das gerações devido as influências da mutação ou ambiental, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica a célula precursora, mas ainda são incluídos dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como usado neste. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tal como células CHO, células HEK-293, PER.C6, células NS0 e células linfocíticas e células procarióticas tal como E. coli e outras células eucarióticas tal como células vegetais e fungos.

[0093] O termo “transfectoma”, como usado neste, inclui as células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam o Ab ou um antígeno alvo, tal como células CHO, células PER.C6, NS0, células HEK-293, células vegetais, ou fungos, incluindo as células de levedura.

[0094] O termo “preparação” refere-se as preparações dos variantes de anticorpo e misturas das variantes de anticorpo diferentes podem ter uma capacidade aumentada para formar os oligômeros quando interagir com o antígeno associado com uma célula (por exemplo, um antígeno expressado na superfície da célula), uma membrana celular, um vírion ou outra estrutura, portanto capacitando uma ligação de C1q aumentada, ativação de complemento, CDC, ADCC, ADCP, outra função atuadora mediada por Fc, internalização, submodulação, apoptose, absorção do conjugado de medicamento de anticorpo (ADC), avidez ou uma combinação de qualquer um deste. Os ensaios exemplares são fornecidos nos Exemplos por, por exemplo, avidez de ligação C1q (Exemplo 4), CDC (Exemplos 5, 6 e 10, 16, 19, 22, 23, 24, 25 e 35); ADCC (Exemplo 12), eficácia in vivo (Exemplo 20, 21), taxas de liberação de plasma (Exemplo 37), ligação FcRn (Exemplo 34) e ativação de complemento de fase líquida independente do alvo (Exemplo 36). As variantes de acordo com os aspectos neste referidos como “mutante simples”, “mutante duplo” e “mutantes misturados”, são descritos em detalhes adicionais abaixo, junto com os processos exemplares para sua preparação e métodos de uso.

[0095] Como usado neste, o termo “afinidade” é a força da ligação de uma molécula, por exemplo, um anticorpo, a outro, por exemplo, um alvo ou antígeno, em um local simples, tal como a ligação monovalente de um local de ligação de antígeno individual de um anticorpo a um antígeno.

[0096] Como usado neste, o termo “avidez” refere-se a força combinada dos locais de ligação múltiplos entre as duas estruturas, tal como entre os locais de ligação de antígeno dos anticorpos que interagem simultaneamente com um alvo ou por exemplo, entre o anticorpo e C1q. Quando mais do que uma interação de ligação estão presentes, as duas estruturas apenas dissociarão quando todos os locais de ligação e desta maneira, a taxa de dissociação será menor do que para os locais de ligação individuais e portanto fornecer uma força de ligação total atuadora maior (avidez) em comparação com a força da ligação dos locais de ligação individuais (afinidade).

[0097] Como usado neste, o termo “oligômero” refere-se a uma molécula que consiste mais do que um mas um número limitado das unidades de monômero (por exemplo, anticorpos) em constraste a um polímero que, pelo menos em princípio, consiste de um número ilimitado de monômeros. Os oligômeros exemplares são dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros e hexâmeros. Os prefixos gregos são frequentemente usados para indicar o número das unidades de monômero no oligômero, por exemplo, um tetrâmero sendo composto de quatro unidades e um hexâmero de seis unidades.

[0098] O termo “oligomerização”, como usado neste, é pretendido referir-se ao processo que converte os monômeros a um grau limitado da polimerização. Neste, é observado que a oligomerização do domínio Fcs acontece após a ligação alvo pelos polipeptídeos contendo o domínio Fc, tal como anticorpos, preferivelmente, mas não limitado a, em uma superfície celular. A oligomerização dos anticorpos pode ser avaliada por exemplo, usando um ensaio de ligação C1q da superfície celular (como descrito nos Exemplos 4 e 9), eficácia do ensaio C1q (como descrito no Exemplo 5) e citotoxicidade dependente do complemento nos Exemplos 6, 10 e 19).

[0099] O termo “ligação de C1q”, como usado neste, é pretendido referir-se a ligação de C1q no contexto da ligação de C1q a um anticorpo ligado a seu antígeno. O anticorpo ligado a seu antígeno é entendido como acontecendo tanto in vivo quanto in vitro no contexto descrito neste. A ligação de C1q pode ser avaliada por exemplo, pelo uso do anticorpo imobilizado na superfície artificial (por exemplo, plástico nas placas para ELISA, como descrito no exemplo 3) ou pelo uso ligado a um antígeno pré- determinado em uma superfície celular ou vírion (como descrito nos exemplos 4 e 9). A ligação de C1q a um oligômero de anticorpo é entendido neste como uma interação multivalente resultando na ligação da avidez alta.

[00100] Como usado neste, o termo “ativação de complemento” refere- se a ativação do caminho de complemento clássico, que é disparado pela ligação do componente de complemento C1q a um anticorpo ligado a seu antígeno. O C1q é a primeira proteína nos eventos precoces da cascata de complemento clássico que envolve uma série de reações de clivagem que culminam na formação de uma atividade enzimática denominada convertase C3, que cliva o componente do complemento C3 em C3b e C3a. o C3b liga-se covalentemente a C5 na membrana para formar C5b que por sua vez dispara os últimos eventos da ativação do complemento no qual os componentes de complemento terminal C5b, C6, C7, C8 e C9 acumulam-se no complexo de ataque de membrana (MAC). A cascata de complemento resulta na criação dos poros devido o qual causa a lise celular, também conhecido como citotoxicidade dependente de complemento (CDC). A ativação do complemento pode ser avaliada pelo uso da eficácia de C1q (como descrito no exemplo 5), cinéticos CDC (como descrito nos exemplos 28, 29 e 30), ensaios CDC (como descrito nos exemplos 6, 10, 19, 25, 27, 33 e 35) ou pela deposição celular do método de C3b e C4b descrito em Beurskens et al April 1, 2012 vol. 188 no. 7 3532-3541.

[00101] O termo “citotoxicidade dependente de complemento” (“CDC”), como usado neste, é pretendido referir-se ao processo da ativação de complemento mediado pelo anticorpo levando a lise do anticorpo ligado a seu alvo em uma célula ou vírion como um resultado dos poros na membrana que são criados pela montagem MAC. O CDC pode ser avaliado pelo ensaio in vitro tal como um ensaio CDC em que o soro humano normal é usado como uma fonte de complemento, como descrito no exemplo 6, 10, 19, 25, 27, 33 e 35 ou na eficácia do ensaio C1q, como descrito no exemplo 5, no qual o soro humano normal foi limitado em C1q.

[00102] O termo “citotoxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo” (“ADCC”) como usado neste, é pretendido referir-se ao mecanismo de morte das células alvos ou vírions revestidos pelo anticorpo pelas células que expressam os receptores Fc que reconhecem a região constante ao anticorpo de ligação. O ADCC pode ser determinado usando métodos tal como, por exemplo, o ensaio ADCC descrito no exemplo 12.

[00103] O termo “fagocitose celular dependente do anticorpo” (“ADCP”) como usado neste é pretendido referir-se ao mecanismo de eliminação das célula alvos ou vírions revestidos pelo anticorpo pela internalização por fagócitos. As células alvos ou vírions revestidos pelo anticorpo internalizado são contidos em uma vesícula denominada um fagossomo, no qual então fundem-se com um ou mais lisossomos para formar um fagolisossomo. O ADCP pode ser avaliado pelo uso de um ensaio de citotoxicidade in vitro com macrófagos como células atuadoras e microscopia de vídeo como descrito por van Bij et al. in Journal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Páginas 677-685. Ou como descritos no exemplo 14 para por exemplo, fagócitos de S. aureus por PMN.

[00104] O termo “citotoxicidade celular dependente do complemento” (“CDCC”) como usado neste é pretendido referir-se ao mecanismo de morte das células alvos ou vírions pelas células que expressam os receptores de complemento que reconhecem os produtos de clivagem do complemento 3 (C3) que são covalentemente ligados as células alvos ou vírions como um resultado da ativação de complemento mediado pelo anticorpo. O CDCC pode ser avaliado em uma maneira similar como descrito pelo ADCC.

[00105] O termo “vida média de plasma” como usado neste indica o tempo que acontece para reduzir a concentração do polipeptídeo no plasma sanguíneo em uma metade de sua concentração inicial durante a eliminação (após a fase de distribuição). Para os anticorpos a fase de distribuição será tipicamente 1 - 3 dias durante no qual a fase existe cerca de 50% de diminuição da concentração de plasma sanguíneo devido a redistribuição entre plasma e tecidos. A vida média do plasma pode ser medida pelos métodos conhecidos na técnica.

[00106] O termo “taxa de liberação de plasma” como usado neste é uma medição quantitativa da taxa no qual um polipeptídeo é removido a partir do sangue na administração a um organismo vivo. A taxa de liberação e plasma podem ser calculados como a dosagem/AUC (ml/dia/kg), em que o valor AUC (área sob a curva) é determinado a partir das curvas de tempo de concentração de acordo com o Exemplo 37.

[00107] O termo “submodulação”, como usado neste, é pretendido referir-se ao processo que diminui o número de moléculas, tal como antígenos ou rceptores, em uma superfície celular, por exemplo, pela ligação de um anticorpo a um receptor.

[00108] O termo “internalização”, como usado neste, é pretendido referir-se a qualquer mecanismo pelo qual um anticorpo ou polipeptídeo contendo Fc é internalizado em uma célula que expressa alvo a partir da superfície celular e/ou do meio circundante, por exemplo, por intermédio da endocitose. A internalização de um anticorpo pode ser avaliada usando um ensaio direto medindo uma quantidade do anticorpo internalizado (tal como, por exemplo, o ensaio de co-localização lisossomal descrito no exemplo 26).

[00109] O termo “conjugado de medicamento de anticorpo”, como usado neste refere-se a um anticorpo ou polipeptídeo contendo Fc tendo a especificidade por pelo menos um tipo de célula maligna, um medicamento e um ligador ligante o medicamento a por exemplo, o anticorpo. O ligador é clivável ou não clivável na presença da célula maligna; em que o conjugado de medicamento de anticorpo mata a célula maligna.

[00110] O termo “absorção do conjugado de medicamento de anticorpo”, como usado neste refere-se ao processo em que os conjugados de medicamentos de anticorpos são ligados a um alvo em uma célula seguinda pela absorção/engolfamento da membrana celular e portanto é retirada da célula. A absorção do conjugado de medicamento de anticorpo pode ser avaliada como “internalização mediada pelo anticorpo e morte celular por anti-TF ADC em um ensaio de morte in vitro” como descrito em WO 2011/157741.

[00111] O termo “apoptose”, como usado neste refere-se ao processo da morte celular programada (PCD) que pode ocorrer em uma célula. Os eventos bioquímicos levam as mudanças da célula característica (morfologia) e morte. Estas mudanças incluem formação de bolha, contração celular, fragmentação nuclear, condensação de cromatina e fragmentação de DNA cromossomal. A ligação de um anticorpo a um certo receptor pode induzir apoptose.

[00112] A ligação do receptor Fc pode ser indiretamente medida como descrito no exemplo 12.

[00113] O termo “FcRn”, como usado neste é pretendido referir-se ao receptor de Fc neonatal que é um receptor Fc. Foi primeiro descoberto em roedor como um receptor único capaz de transportar IgG do leite materno através do epitélio do intestino do roedor recém nascido na corrente sanguínea dos recém nascidos. Ainda os estudos recevem um receptor similar nos humanos. Em humanos, entretanto, é observado na placenta para ajudar a facilitar o transporte dos IgG das mães ao desenvolvimento do feto e foi mostrado desempenhar um papel na monitoração da rotação de IgG. O FcRn liga IgG no pH ácido de 6,0-6,5 mas não no pH neutro ou maior. Portanto, FcRn pode ligar IgG a partir do lúmen intestinal (dentro do intestino) em um pH levemente ácido e garantir o transporte unidirecional eficiente ao local basolateral (dentro do corpo) onde o pH é neutro a básico (pH 7,0-7,5). Este receptor também desempenha um papel na recuperação de adulto de IgG através de sua ocorrência no caminho de endocitose nas células endoteliais. Os receptores FcRn nos endossomos ácidos ligam-se a pinocitose através de IgG internalizado, reciclando a superfície celular, liberando no pH básico do sangue, portanto evitando de sofrer a degradação lisossomal. Este mecanismo pode fornecer uma explicação para a vida média maior de IgG no sangue em comparação com outros isotipos. Exemplos 13 e 34 descrevem um ensaio que mostra a ligação IgG ao FcRn no pH 6,0 em ELISA.

[00114] O termo “Proteína A”, como usado neste é pretendido referir- se a proteína de superfície 56 kDa MSCRAMM originalmente observada na parede celular da bactéria de Staphylococcus aureus. É codificado pelo gene spa e sua regulação é controlada pela topologia de DNA, osmolaridade cellular e um sistema de dois componentes denominado ArlS-ArlR. Foi observado que na busca bioquímica de sua capacidade de ligar-se as imunoglobulinas. É composto de cinco domínios de ligação de Ig homólogos dobrado em um feixe de três hélices. Cada domínio é capaz de ligar as proteínas de muitas espécies de mamíferos, mas notavelmente IgGs. Este ligase a região Fc de cadeia pesada de mais imunoglobulinas (sobreposição do local de ligação conservado dos receptores FcRn) e também interage com a região Fab da família VH3 humana. Embora estas interações no soro, as moléculas IgG ligam-se a bactéria por intermédio da sua região Fc unicamente por intermédio de suas regiões Fab, pelo qual a bactéria interrompe a opsonização, ativação de complemento e fagocitose.

[00115] O termo “Proteína G”, como usado neste é pretendido referir- se uma proteína de ligação de imunoglobulina expressada no grupo C e G bactería Streptococcal muito semelhante a proteína A mas com diferenciação das especificidades. É uma proteína de superfície celular 65-kDa (proteína G G148 G) e 58 kDa (proteína G C40) que foi observada a aplicação na purificação dos anticorpo através de sua ligação a região Fc.

Métodos de afetar CDC de um polipeptídeo

[00116] É entendido que todas as formas de realização descritas neste com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00117] Em um aspecto a presente invenção refere-se a um método de aumentar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, cujo método compreende introduzir uma mutação ao polipeptídeo precursor em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00118] Em uma forma de realização o polipeptídeo precursor pode ser um anticorpo precursor que compreende um domínio Fc uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00119] Introduzir uma mutação a um polipeptídeo precursor de acordo com o método ou uso da presente invenção resulta em um polipeptídeo variante (que também pode ser referido como uma “variante” neste). Deste modo, os métodos da presente invenção podem ser realizados de modo a obter qualquer variante ou polipeptído variante como descrito neste.

[00120] Um polipeptídeo variante obtido a partir de um método ou uso da presente invenção tem um CDC aumentado comparado ao polipeptídeo precursor. Tipicamente, o efeito de um polipeptídeo em uma função efetiva pode ser determinado por um valor EC50, que é a concentração do polipeptídeo necessário para obter meia lise máxima.

[00121] A lise máxima é a lise obtida quando uma quantidade de saturação do polipeptídeo é usada no qual a saturação é pretendida referir a quantidade do polipeptídeo em que todos os alvos para o polipeptídeo são ligados pelo polipeptídeo.

[00122] O termo “aumento de CDC”, “melhoramento de CDC”, “aumento de uma função efetiva”, ou “melhoramento de uma função efetiva”, refere-se no contexto da presente invenção que existe uma diminuição no valor EC50 do polipeptídeo variante comparado ao polipeptídeo precursor. A diminuição no valor EC50 pode ser por exemplo, pelo menos ou cerca de 2 vezes, tal como pelo menos ou cerca de 3 vezes, ou pelo menos ou cerca de 5 vezes, ou pelo menos ou cerca de 10 vezes. Alternativamente, “aumento de CDC”, “melhoramento de CDC”, “aumento de uma função efetiva”, ou “melhoramento de uma função efetiva”, significa que existe um aumento na quantidade máxima das células lisadas (onde a quantidade total das células é apresentada em 100%) por por exemplo, de 10% a 100% de todas as células, tal como por cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% e cerca de 100% sob as condições onde as lises do polipeptídeo precursor menos do que 100% de todas as células.

[00123] Uma variante deve ser testada pela função efetiva aumentada ou melhorada pela clonagem do domínio variável da cadeia pesada IgG1-005 ou IgG1-7D8 em uma variante e testa sua eficácia nos ensaios CDC, tal como descritos por Daudi (exemplo 6) e Wien (exemplo 10). Usando um domínio variável IgG1-7D8 HC e células Daudi, um aumento seria definido por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-7D8 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes o valor EC50 menor, a concentração em que a meia lise máxima é observada. Usando um domínio variável IgG1-005 HC e células Daudi, um aumento seria definido por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-005 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes o valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada. Usando um domínio variável IgG1-7D8 HC e células Wien133, um aumento seria definido por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-7D8 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada. Usando um domínio variável IgG1-005 HC e células Wien133, um aumento seria definido por um aumento na lise máxima que varia de 10% a 100% de todas as células, tal como por cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% e cerca de 100%. Um aumento na eficácia de CDC também deve ser definido por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-005 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada sob as condições onde a lise das células Wien133 é detectável.

[00124] Os inventores da presente invenção de maneira surpreendente observado que as mutações nestas posição específicas tem um efeito melhorado no anticorpo de CDC da variante, que é obtido para introduzir uma ou mais mutações em um anticorpo precursor de acordo com o método da presente invenção (por exemplo, como mostrado no exemplo 19). Sem estar ligado por teoria, é acreditado que pela substituição de um ou mais aminoácidos do grupo mencionado acima da oligomerização das posições é estimulada. Os anticorpos ligam com avidez mais alta (exemplificado pelo exemplo 2; rotulação direta de IgG-7D8-E345R resulta na ligação aumentada das células Daudi em comparação a IgG-7D8-WT) que causa os anticorpos para ligar por um período de tempo mais longo as células e portanto as funções efetivas diferentes são capacitadas, por exemplo, ligação C1q aumentada, eficácia C1q CDC, ADCC, internalização, ADCP, e/ou eficácia in vivo. Estes efeitos foram exemplificados pelo exemplo 4 (ligação C1q nas células), exemplo 5 (eficácia C1q em um ensaio CDC), exemplo 6, 7, 27, 28, 29 e 35 (ensaio CDC), exemplo 12 (ADCC), exemplo 26 (internalização), exemplo 21 e 22 (eficácia in vivo), taxa de liberação de plasma (exemplo 37), ligação FcRn (exemplo 34) e ativação de complemento de fase líquida independente do alvo (exemplo 36).

[00125] Deste modo, a mutação de um resíduo de aminoácido selecionado daqueles correspondentes a E430X, tal como E430G, E430S, E430F, ou E430T, E345X, tal como E345K, E345Q, E345R, ou E345Y, S440Y e S440W na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana também pode ser referida como aspecto “mutante simples” ou “mutações que intensificam CDC” no contexto da presente invenção.

[00126] Desta maneira, em uma forma de realização, no método do aumento de CDC a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido são selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00127] Em uma forma de realização preferida, no método do aumento de CDC a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido são selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00128] Em uma forma de realização, o polipeptídeo precursor é um anticorpo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00129] Em um outro aspecto, a presente invenção também refere-se a um método de aumentar CDC e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, cujo método compreende introduzir uma mutação ao polipeptídeo precursor em um ou mais resíduos de aminoácido correspondentes a E430X, E345X e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, em que X é qualquer aminoácido, tal como um aminoácido de ocorrência natural.

[00130] Em uma forma de realização, a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido é selecionado do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00131] Em uma forma de realização preferida, a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido são selecionados do grupo correspondente às posições E345R, E430T e E430F na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00132] Em uma forma de realização, pelo menos uma outra função efetiva do anticorpo, tal como ativação de complemento da ligação de C1q, citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação do receptor de gama Fc, ligação de proteína A, ligação de proteína G, ADCP, citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), citotoxicidade intensificada pelo complemento, ligação ao receptor de complemento de um anticorpo opsonizado mediado pelo anticorpo, fagocitose mediada pelo anticorpo (ADCP), internalização, apoptose, e/ou ligação ao receptor de complemento de um anticorpo opsonizado, também é aumentado, tal como ADCC.

[00133] Em uma forma de realização, o polipeptídeo precursor é um anticorpo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00134] Em uma forma de realização, o CDC do anticorpo precursor é aumentado quando o anticorpo precursor está ligado ao seu antígeno em uma célula que expressa o antígeno, em uma membrana celular, ou em um vírion.

[00135] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo monoespecífico, biespecífico ou multiespecífico.

[00136] Ainda em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de aumentar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de um anticorpo precursor que é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende uma primeira região de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação de antígeno e um segundo polipeptídeo que compreende uma segunda região de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação de antígeno, em que a primeira e segunda regiões de ligação de antígeno ligam epítopos diferentes no mesmo antígeno ou antígenos diferentes e em que o método compreende introduzir uma mutação à primeira e/ou segunda região de CH2-CH3 em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a primeira região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição selecionada daquela correspondente a K409, T366, L368, K370, D399, F405 e Y407 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a segunda região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição selecionada daquela correspondente a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 e K409 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a mutação de aminoácido adicional na primeira região de CH2-CH3 é diferente da mutação de aminoácido adicional na segunda região de CH2-CH3.

[00137] Em uma forma de realização, a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido são selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00138] Em uma forma de realização preferida, a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido são selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00139] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir uma mutação em apenas um do primeiro ou segundo polipeptídeo do anticorpo específico.

[00140] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir uma mutação tanto no primeiro quanto no segundo polipeptídeo do anticorpo específico.

[00141] Em uma forma de realização preferida, a mutação de aminoácido adicional da primeira região de CH2-CH3 está na posição correspondente a K409, tal como K409R, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a mutação de aminoácido adicional da segunda região de CH2-CH3 está na posição correspondente a F405, tal como F405L, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00142] Os inventores da presente invenção também foram mostrados que introduzir uma mutação a um anticorpo precursor em um resíduo de aminoácido correspondente em K439 ou S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana diminui a função efetiva do anticorpo precursor (exemplos 5, 6 e 10).

[00143] Como mostrado no exemplo 6, a substituição de aminoácido da posição K439E ou S440K como “mutantes simples” CDC diminuídos como comparados em qualquer uma das primeiras mutações de acordo com o método da presente invenção.

[00144] Um anticorpo variante obtido do dito método da diminuição de uma função efetiva tem uma função efetiva diminuída comparado ao anticorpo precursor. Tipicamente, o efeito de um anticorpo em uma função efetiva pode ser medida pelo valor EC50, que é a concentração do anticorpo necessário para obter metade do valor da lise máxima.

[00145] A lise máxima é a lise obtida quando uma quantidade de saturação do anticorpo é usada no qual a saturação é pretendida referir a quantidade de anticorpo em que todos os antígenos para o anticorpo são ligados pelo anticorpo.

[00146] O termo “diminuir uma função efetiva” refere-se no contexto da presente invenção que existe um aumento no valor EC50 do anticorpo variante comparado ao anticorpo precursor. O aumento no valor EC50 pode ser por exemplo, pelo menos ou cerca de 2 vezes, tal como pelo menos ou cerca de 3 vezes, ou pelo menos ou cerca de 5 vezes, ou pelo menos ou cerca de 10 vezes. Alternativamente, “diminuição de uma função efetiva” significa que existe uma diminuição na quantidade máxima das células lisadas, por exemplo, de 10% a 100% de todas as células, tal como cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% e cerca de 100% sob as condições onde as lises do anticorpo precursor menos do que 100% de todas as células.

[00147] Uma variante deve ser testada pela função efetiva diminuída pela clonagem do domínio variável da cadeia pesada IgG1-005 ou IgG1-7D8 na variante e testa sua eficácia nos ensaios CDC, tal como descrito pelas células Daudi (exemplo 6) e células Wien133 (exemplo 10). Usando um domínio variável IgG1-7D8 HC e células Daudi, uma diminuição deve ser definida por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-7D8 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada. Usando um domínio variável IgG1-005 HC e células Daudi, uma diminuição seria definida por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-005 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada. Usando um domínio variável IgG1-7D8 HC e células Wien133, uma diminuição seria definida por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-7D8 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada. Usando um domínio variável IgG1-005 HC e células Wien133, uma diminuição seria definida pou uma diminuição na lise máxima que varia de 10% a 100% de todas as células, tal como por cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% e cerca de 100%. Uma diminuição na eficácia de CDC também deve ser definida por mais do que 2 vezes o EC50 menor do que o EC50 de IgG1-005 sob a condição estudada, tal como cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes ou mais do que 10 vezes valor EC50 menor, a concentração no qual a meia lise máxima é observada sob as condições onde a lise das células Wien133 é detectável.

[00148] Ainda em um aspecto, a invenção refere-se a um método de acordo com a invenção e as formas de realização descritas neste cujo método compreende introduzir a mutação em uma de mais outras posições que não S440Y e S440W e ainda introduzir uma mutação (i) em cada um dos resíduos de aminoácido correspondentes a K439 e S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W, (ii) em cada um dos resíduos de aminoácido correspondentes a K447 e 448 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, tal como K447K/R/H e 448E/D na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, preferivelmente K447K e 448E na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, ou (iii) em cada um dos resíduos de aminoácido correspondentes a K447, 448 e 449 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, tal como K447D/E, 448K/R/H e 449P na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, preferivelmente K447E, 448K e 449P na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00149] Com relação a forma de realização em que uma mutação adicional é introduzida como descrita na etapa (ii) ou (iii) acima deve ser notada que sob as circunstâncias normais a lisina na posição K447 é clivada durante a produção de anticorpo nas células. Este pode ser evitado pela proteção da posição K447 pela adição de um ou mais resíduos de aminoácido adicionais (tal como 448 ou 448/449). Este ainda é descrito em WO 2013/004841 (Genmab A/S).

[00150] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir a mutação em uma de mais outras posições que não S440Y e S440W e ainda introduzir uma mutação em cada um dos resíduos de aminoácido correspondentes a K439 e/ou S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação em in S440 não é S440Y ou S440W.

[00151] Em uma forma de realização preferida, a mutação na posição correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana é K439D/E, e/ou a mutação na posição correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana é S440K/R.

[00152] Em uma forma de realização, o polipeptídeo precursor é um anticorpo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00153] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo monoespecífico, biespecífico, ou multiespecífico. O anticorpo biespecífico pode ser qualquer uma das formas de realização descritas neste.

[00154] Além disso, qualquer uma das mutações listadas na tabela 1 pode ser introduzida pelo anticorpo biespecífico. O exemplo 24 mostra que introduzir a mutação E345R a um anticorpo CD20xEGFR biespecífico que intensifica a eficácia de CDC. Os exemplos 23, 29 e 30 também descrevem alguns dos anticorpos biespecíficos que compreendem uma mutaçãode acordo com o presente invenção.

[00155] A introdução das mutações tanto nos resíduos de aminoácido correspondentes a K439 e S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana em um anticorpo precursor, com a condição que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W também é referido neste como o aspecto “mutante duplo”. As mutações S440Y e S440W tem, como descrito em outras partes, foi observado aumentar CDC quando introduzido em um polipeptídeo precursor.

[00156] Também como descrito em toda parte os inventores da presente invenção foram observados introduzir uma mutação identificada em um resíduo de aminoácido correspondente a K439 ou S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana resulta em uma diminuição em uma função efetiva (exemplos 5, 6, 10). Entretanto, quando a inibição das mutações tanto nos resíduos de aminoácido correspondentes a K439 quanto S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana são introduzidos na diminuição da função efetiva é restaurada, tornando desse modo similar a função efetiva do anticorpo precursor sem uma mutação nas mutações K439 e S440. Entretanto, a presença das mutações K439 e S440 é, sem ser limitada por qualquer teoria, acreditado restringir a indução das funções efetivas aos complexos oligoméricos exclusivamente correspondentes aos anticorpos exclusivos que compreendem tanto as mutações K439 quanto S440. Deste modo, se as mutações tanto K439 quanto S440 são incluídas em um anticorpo terapêutico, é acreditado, sem estar ligado por qualquer teoria, que quando tais anticorpos terapêuticos são administrados a um paciente a indução das funções efetivas é limitada aos complexos de anticorpo oligoméricos contendo os anticorpos terapêuticos que compreende as mutações K439/S440 mas não contendo os anticorpos próprios aos pacientes, que não compreendem as mutações K439 e S440, portanto limitando quaisquer efeitos colaterais potenciais causados pela interação de um anticorpo terapêutico com os anticorpos dos próprios pacientes.

[00157] Quando a combinação das mutações da posição K439 e/ou S440 com a primeira mutação, intensificação de CDC é obtida e a especificidade de CDC é aumentada. Em uma maneira similar, especificidade de intensificação aumentada de CDC pode ser obtida pela introdução das mutações descritas nas formas de realização (ii) e (iii) acima.

[00158] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de aumentar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de uma combinação de pelo menos um primeiro e um segundo polipeptídeo precursor, em que o pelo menos primeiro e segundo polipeptídeo precursor cada um compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que o método compreende introduzir a pelo menos primeiro e/ou segundo polipeptídeos precursores uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00159] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir a pelo menos primeiro e/ou segundo polipeptídeos precursores uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00160] Em uma forma de realização preferida, o método compreende introduzir a pelo menos primeiro e/ou segundo polipeptídeos precursores uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00161] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir uma mutação que pode ser a mesma ou diferente tanto ao primeiro quanto ao segundo polipeptídeo precursor.

[00162] Ainda em uma forma de realização, o método compreende (i) introduzir uma mutação ao primeiro polipeptídeo precursor em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, (ii) fornecer o segundo polipeptídeo precursor que não compreende uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00163] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir ao primeiro polipeptídeo precursor ou uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K ou E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00164] Ainda em uma forma de realização, a mutação em uma ou mais posições é uma outra que não S440Y e S440W e em que o método ainda compreende as etapas de (i) introduzir ao primeiro polipeptídeo precursor ou uma segunda mutação no resíduo de aminoácido correspondente à posição K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e (ii) introduzir ao segundo polipeptídeo precursor ou uma segunda mutação no resíduo de aminoácido correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação não é S440Y ou S440W; em que as etapas (i) e (ii) podem ser, alternativamente; (iii) introduzir ao primeiro polipeptídeo precursor ou uma segunda mutação no resíduo de aminoácido correspondente à posição S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação não é S440Y ou S440W; (iv) introduzir ao segundo polipeptídeo precursor ou uma segunda mutação no resíduo de aminoácido correspondente à posição K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00165] O segundo polipeptídeo precursor pode ser qualquer polipeptídeo precursor que por si só não fornece resposta de CDC suficiente na ligação a célula alvo.

[00166] Portanto, sem estar ligado por teoria, é acreditado que o dito método fornece um primeiro polipeptídeo variante que compreende uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido de acordo com a lista acima e deste modo no qual o polipeptídeo variante tem resposta CDC aumentada e fornece um segundo polipeptídeo variante que não compreende tais mutações, uma resposta CDC do segundo polipeptídeo precursor é obtida.

[00167] O método de combinar um primeiro anticorpo que compreende uma das ditas mutações capazes do aumento de CDC com um segundo anticorpo que não é modificado de acordo com a invenção, como mostrado no exemplo 31 resulta em um CDC aumentado da combinação. Deste modo, este método pode em uma forma de realização ser usada para combinar um anticorpo terapêutico, como o segundo anticorpo, que tem sido provado para ser seguro mas não suficientemente eficiente (ou pelo qual uma eficiência aumentada é desejável) com um primeiro anticorpo que compreende uma mutação e portanto resultando em uma combinação que é eficaz.

[00168] Os exemplos dos segundos anticorpos adequados que não compreendem uma mutação em um resíduo de aminoácido selecionado daquele correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana, imclui mas não são limitados a qualquer um dos seguintes; (90Y) clivatuzumab tetraxetan; (90Y) tacatuzumab tetraxetan; (99mTc) fanolesomab; (99mTc) nofetumomab Merpentan; (99mTc) pintumomab; 3F8; 8H9; abagovomab; abatacept; abciximab; Actoxumab; adalimumab; adecatumumab; afelimomab; aflibercept; Afutuzumab; alacizumab pegol; albiglutida; ALD518; alefacept; alemtuzumab; Alirocumab; altumomab; Altumomab pentetate; alvircept sudotox; amatuximab; AMG714/HuMax- IL15; anatumomab mafenatox; Anrukinzumab (= IMA-638); apolizumab; arcitumomab; aselizumab; atacicept; atinumab; Atlizumab (= tocilizumab); atorolimumab; baminercept; Bapineuzumab; basiliximab; bavituximab; bectumomab; belatacept; belimumab; benralizumab; bertilimumab; besilesomab; bevacizumab; Bezlotoxumab; biciromab; bifarcept; bivatuzumab; Bivatuzumab mertansina; blinatumomab; blosozumab; brentuximab vedotin; briakinumab; briobacept; brodalumab; canakinumab; cantuzumab mertansina; cantuzumab ravtansina; caplacizumab; capromab; Capromab pendetida; carlumab; catumaxomab; CC49; cedelizumab; certolizumab pegol; cetuximab; Ch.14.18; citatuzumab bogatox; cixutumumab; Clazakizumab; clenoliximab; Clivatuzumab tetraxetan; conatumumab; conbercept; CR6261; crenezumab; dacetuzumab; daclizumab; dalantercept; dalotuzumab; daratumumab; Demcizumab; denosumab; Detumomab; Dorlimomab aritox; drozitumab; dulaglutide; ecromeximab; eculizumab; edobacomab; edrecolomab; efalizumab; efungumab; elotuzumab; elsilimomab; enavatuzumab; enlimomab; enlimomab pegol; enokizumab; ensituximab; epitumomab; epitumomab cituxetan; epratuzumab; erlizumab; ertumaxomab; etanercept; etaracizumab; etrolizumab; exbivirumab; Fanolesomab; faralimomab; farletuzumab; Fasinumab; FBTA05; felvizumab; Fezakinumab; ficlatuzumab; figitumumab; flanvolumab; fontolizumab; foralumab; foravirumab; fresolimumab; fulranumab; galiximab; ganitumab; gantenerumab; gavilimomab; gemtuzumab; Gemtuzumab ozogamicin; gevokizumab; girentuximab; glembatumumab; Glembatumumab vedotin; golimumab; Gomiliximab; GS6624; anticorpos anti-CD74; anticorpos anti- cMet como descritos no WO 2011/110642; anticorpos anti-Her2 como descrito WO 2011/147986 ou WO 2011/147982; anticorpos anti-IL8 como descritos no WO 2004/058797; anticorpos anti-TAC como descritos no WO 2004/045512; anticorpos do fator anti-tecido (TF) como descritos no WO 2010/066803 ou WO 2011/157741; ibalizumab; ibritumomab tiuxetan; icrucumab; igovomab; Imciromab; inclacumab; indatuximab ravtansine; infliximab; inolimomab; inotuzumab ozogamicin; intetumumab; iodo (124I) girentuximab; ipilimumab; iratumumab; itolizumab; ixekizumab; keliximab; labetuzumab; lebrikizumab; lemalesomab; lenercept; lerdelimumab; lexatumumab; libivirumab; lintuzumab; lorvotuzumab mertansine; lucatumumab; lumiliximab; mapatumumab; maslimomab; matuzumab; mavrilimumab; mepolizumab; metelimumab; milatuzumab; minretumomab; mirococept; mitumomab; mogamulizumab; morolimumab; motavizumab; moxetumomab; pasudotox; muromonab-CD3; nacolomab tafenatox; namilumab; naptumomab estafenatox; narnatumab; natalizumab; nebacumab; necitumumab; nerelimomab; nimotuzumab; Nivolumab; Nofetumomab; merpentan; obinutuzumab; Ocaratuzumab; ocrelizumab; odulimomab; ofatumumab; olaratumab; olokizumab; omalizumab; onartuzumab; onercept; oportuzumab monatox; oregovomab; otelixizumab; oxelumab; ozoralizumab; pagibaximab; palivizumab; panitumumab; panobacumab; pascolizumab; pateclizumab; patritumab; pegsunercept; Pemtumomab; pertuzumab; pexelizumab; Pintumomab; Placulumab; ponezumab; priliximab; pritumumab; PRO 140; quilizumab; racotumomab; radretumab; rafivirumab; ramucirumab; ranibizumab; raxibacumab; regavirumab; reslizumab; RG1507/HuMax-IGF1R; RG1512/HuMax-pSelectin; rilonacept; rilotumumab; rituximab; robatumumab; roledumab; romosozumab; rontalizumab; rovelizumab; ruplizumab; samalizumab; sarilumab; satumomab; Satumomab pendetida; secukinumab; sevirumab; sibrotuzumab; sifalimumab; siltuximab; siplizumab; sirukumab; solanezumab; solitomab; Sonepcizumab; sontuzumab; sotatercept; stamulumab; sulesomab; suvizumab; tabalumab; Tacatuzumab tetraxetan; tadocizumab; talizumab; tanezumab; taplitumomab paptox; tefibazumab; telimomab aritox; tenatumomab; teneliximab; teplizumab; teprotumumab; TGN1412; Ticilimumab (= tremelimumab); tigatuzumab; TNX-650; Tocilizumab (= atlizumab); toralizumab; torapsel; tositumomab; tralokinumab; trastuzumab; trastuzumab emtansina; TRBS07; trebananib; tregalizumab; tremelimumab; tucotuzumab celmoleukin; tuvirumab; ublituximab; urelumab; urtoxazumab; ustekinumab; vapaliximab; vatelizumab; vedolizumab; veltuzumab; vepalimomab; vesencumab; visilizumab; volociximab; Vorsetuzumab mafodotin; votumumab; zalutumumab; zanolimumab; ziralimumab; e zolimomab aritox.

[00169] Os primeiros e os segundos anticorpos variantes terão preferência pela oligomerização com um outro comparado em qualquer anticorpo de ocorrência natural ou de tipo selvagem como mostrado no exemplo 10.

[00170] Em uma forma de realização, a mutação na posição correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana é K439D/E, e/ou a mutação na posição correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana é S440K/R.

[00171] Portanto, o aumento na especificidade é com relação a “indução de CDC”. Deste modo, o dito método está em uma forma de realização um método de aumentar a especificidade da indução de uma função efetiva pou uma combinação de pelo menos um primeiro e um segundo polipeptídeo precursor.

[00172] Para realizar o método de aumentar a especificidade, ou especificidade da indução de uma função efetiva, pou uma combinação de pelo menos um primeiro e um segundo polipeptídeo precursor, uma combinação de uma primeira variante e um segundo polipeptídeo variante é obtido.

[00173] Para introduzir uma mutação em K439 ou S440 de um polipeptídeo precursor, um polipeptídeo variante portanto obtido tem uma função efetiva diminuída comparado ao polipeptídeo precursor. Entretanto, como também descrito em toda parte neste, a mutação em K439 e S440 são capazes de complementar cada ou outro ou restaurar a função efetiva de um polipeptídeo que compreende ambas mutações. Esta capacidade das mutações em K439 e S440 para complementar cada outro pode ser similarmente utilizado em dois polipeptídeos. Deste modo, quando uma mutação em K439 é introduzida em um primeiro polipeptídeo precursor e uma mutação em S440 é introduzida em um segundo polipeptídeo precursor, ou vice versa, a diminuição na função efetiva não é mais vista como o primeiro e o segundo polipeptídeo variante são usados em combinação. O termo “aumento da especificidade” ou “melhoramento da especificidade” refere-se no contexto do fato que uma resposta efetiva induzida pou uma combinação de um primeiro polipeptídeo variante que compreende uma mutação em K439 e um segundo polipeptídeo variante que compreende uma mutação em S440 é maior do que a resposta efetiva induzida pelo primeiro polipeptídeo variante que compreende uma mutação em K439 ou o segundo polipeptídeo variante que compreende uma mutação em S440.

[00174] Pela introdução de uma substituição de aminoácido tanto em K439 quanto S440 na especificidade da oligomerização é aumentada.

[00175] Quando a combinação das mutações da posição K439 e/ou S440 com a primeira mutação, intensificação de CDC é obtida e a especificidade de CDC é aumentada.

[00176] Em uma forma de realização o pelo menos primeiro e segundo polipeptídeos precursores ligam-se ao mesmo local de ligação ou, com relação aos anticorpos, ao mesmo epítopo.

[00177] Em uma forma de realização o pelo menos primeiro e segundo polipeptídeos precursores ligam-se aos locais de ligação diferentes no memso alvo ou, com relação aos anticorpos, aos epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[00178] Em uma forma de realização o pelo menos primeiro e segundo polipeptídeos precursorss ligam-se aos epítopos diferentes nos alvos diferentes.

[00179] Em uma forma de realização o primeiro e o segundo polipeptídeos precursores são primeiro e segundo anticorpos precursores, que tem as mesmas ou swquências VL e VH diferentes.

[00180] Em uma forma de realização a combinação de pelo menos um primeiro e um segundo polipeptídeo precursor compreende um primeiro polipeptídeo precursor e um segundo polipeptídeo.

[00181] Em uma forma de realização, a especificidade é aumentada, quando uma combinação do primeiro e o segundo polipeptídeo precursor é ligado ao seu local de ligação ou antígeno em uma célula que expressa o antígeno, em uma membrana celular, ou em um vírion.

[00182] Visto que, em um outro aspecto a presente invenção também refere-se ao uso de uma mutação em dois ou mais resíduos de aminoácido de um polipeptídeo para aumentar a especificidade de, por exemplo, CDC induzido por, o polipeptídeo quando ligado a seu antígeno em uma célula que expressa o antígeno, em uma membrana celular, ou em um vírion, em que uma primeira mutação está em um resíduo de aminoácido correspondente a K439 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana; uma segunda mutação está em um resíduo de aminoácido correspondente a S440 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana.

[00183] Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo polipeptídeo precursor é um primeiro e um segundo anticorpo precursor cada um compreendendo um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00184] Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpo precursor é um anticorpo monoespecífico, biespecífico ou multiespecífico.

[00185] Em uma forma de realização, o primeiro e/ou o segundo anticorpo precursor é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende uma primeira região de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação de antígeno e um segundo polipeptídeo que compreende uma segunda região de CH2-CH3 e uma segunda região de ligação de antígeno, em que a primeira e segunda regiões de ligação de antígeno ligam epítopos diferentes no mesmo antígeno ou antígenos diferentes e em que a dita primeira região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição selecionada daquela correspondente a K409, T366, L368, K370, D399, F405 e Y407 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a segunda região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição selecionada daquela correspondente a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 e K409 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a mutação de aminoácido adicional na primeira região de CH2-CH3 é diferente da mutação de aminoácido adicional na segunda região de CH2-CH3.

[00186] Em uma forma de realização preferida, a primeira região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional na posição correspondente a K409, tal como K409R, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a segunda região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional na posição correspondente a F405, tal como F405L, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00187] Realizando-se este método, uma combinação de pelo menos um primeiro e um segundo anticorpo variante é obtido. O pelo menos primeiro e segundo anticorpo variante obtido ou este método combinou quando o CDC aumentado comparou a uma combinação do primeiro e do segundo anticorpo precursor.

[00188] O termo “CDC aumentado” deve ser entendido como descrito neste.

[00189] O primeiro e/ou o segundo anticorpo precursor pode ser qualquer anticorpo precursor como descrito neste.

[00190] Os métodos de aumento de CDC de uma combinação de um primeiro e um segundo anticorpo pode ser, em particular realizado a fim de obter um primeiro e/ou segundo anticorpo variante que tem qualquer uma das características de uma anticorpo variante como descrito neste.

[00191] Em uma forma de realização o pelo menos primeiro e segundo anticorpos precursores ligam-se ao mesmo epítopo.

[00192] Em uma forma de realização o pelo menos primeiro e segundo anticorpos precursores ligam-se aos epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[00193] Em uma forma de realização o pelo menos primeiro e segundo anticorpos precursores ligam-se aos epítopos diferentes em alvos diferentes.

[00194] Em uma forma de realização o primeiro e o segundo anticorpo precursor têm as mesmas sequências ou sequências VL e VH diferentes.

[00195] Em uma forma de realização a combinação de pelo menos um primeiro e um segundo anticorpo precursor compreende um primeiro anticorpo precursor e um segundo anticorpo.

[00196] Em uma forma de realização a combinação de pelo menos um primeiro e um segundo anticorpo precursor compreende outros anticorpos precursores, tal como um terceiro, quarto ou quinto anticorpo precursor.

[00197] Em uma forma de realização o primeiro e o segundo anticorpos precursores biespecíficos ou multiespecíficos são os mesmos anticorpos ou diferentes. Em uma forma de realização o primeiro e o segundo anticorpos precursores biespecíficos ou multiespecíficos ligam-se aos epítopos diferentes no mesmo antígeno ou diferente. Desta maneira, em uma forma de realização o dito pelo menos primeiro e segundo anticorpos precursores são anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos que ligam epítopos diferentes no mesmo antígeno ou antígenos diferentes.

[00198] Em uma forma de realização dos métodos e/ou usos da presente invenção o anticorpo precursor, este é um anticorpo precursor, um primeiro anticorpo precursor ou um segundo anticorpo precursor, pode conter outras mutações do que aquelas da presente invenção que foram observadas afetar uma função atuadora. Tais outras mutações podem ser introduzidas ao mesmo tempo como as mutações da presente invenção que afetam uma função efetiva ou estas podem ser introduzidas sequencialmente, os métodos ou usos da presente invenção não são limitados à introdução simultânea ou sequencial de mutações. Os anticorpos biespecíficos podem ser qualquer anticorpo biespecífico e os métodos e usos da presente invenção não são limitados a qualquer formato biespecífico particular uma vez que está previsto que diferentes formatos podem ser usados.

[00199] Em uma forma de realização, o método não altera a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor.

[00200] Em uma forma de realização, o método não altera a ligação do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor ao receptor de Fc neonatal (FcRn) como determinado pelo método descrito no Exemplo 34.

[00201] Em uma forma de realização, o método não aumenta ou diminui a ligação do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor ao receptor de Fc neonatal (FcRn) por mais do que 30%, tal como maior do que 20%, 10% ou 5% como medido pou uma mudança na absorvbância a OD405 nm como determinado pelo método descrito no Exemplo 34.

[00202] Em uma forma de realização, o método não aumenta a afinidade evidente do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor ao receptor de Fc neonatal de camundongo (FcRn) por mais do que um fator de 0,5 ou não diminui a afinidade evidente do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor ao FcRn de camundongo por mais do que um fator 2 como determinado pelo método descrito no Exemplo 34.

[00203] Em uma forma de realização, o método não altera a taxa de liberação e plasma do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor como determinado pelo método descrito no Exemplo 37.

[00204] Em uma forma de realização, o método não aumenta ou diminui a taxa de liberação e plasma do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor por mais do que um fator 3,0, tal como mais do que um fator 2,5, fator 2,0, fator 1,5, ou fator 1,2, como determinado pelo método descrito no Exemplo 37.

[00205] Em uma forma de realização, o método não altera ativação de complemento de fase líquida independente do alvo da variante como determinado pelo o método como determinado pelo método descrito no Exemplo 36.

[00206] Em uma forma de realização, o método não altera a vida média do plasma do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor.

[00207] Qualquer uma das suas mutações ou combinações descritas aqui podem ser introduzidas de acordo com o método da presente invenção.

[00208] As mutações selecionadas da substituição de aminoácidos exemplares ou preferidas podem ser testadas de maneiras apropriadas permitindo a formação de oligômero de anticorpos ligados por antígeno e que detectam a ativação de complemento da ligação de C1q intensificada, CDC, ADCC e/ou internalização, tal como aqueles descritos nos exemplos. Por exemplo, a avidez de ligação de C1q pode ser determinada de acordo com no ensaio similar a um descrito no exemplo 4, usando-se as células que expressam o antígeno para a variante do anticorpo. Os ensaios CDC exemplares são fornecidos nos exemplos 5, 6, 10, 16, 19, 22, 23, 24, 25 e 35. Um ensaio ADCC exemplar é fornecido no exemplo 12. Um ensaio de internalização exemplar é fornecido no exemplo 26. Finalmente, para a discriminação entre as mutações nos resíduos de aminoácido envolvida diretamente na ligação de C1q a partir das mutações que afetam a formação de oligômero, ligação de C1q em um ensaio de ELISA de acordo com, por exemplo, o exemplo 3 pode ser comparado com a ligação de C1q em um ensaio com base em célula de acordo com, por exemplo, exemplo 4, as taxas de liberação de plasma podem ser comparadas de acordo com um ensaio descrito no exemplo 37, comparação de ligação de FcRn de acordo com o exemplo 34 e ativação de complemento de fase líquida independente do alvo podem ser avaliados de acordo com o ensaio no exemplo 36.

[00209] Em uma forma de realização a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido podem ser uma substituição de aminoácido, uma anulação de aminoácido ou uma inserção de aminoácido.

[00210] Em uma forma de realização a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido é uma anulação de aminoácido.

[00211] Em uma forma de realização a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido é uma inserção de aminoácido.

[00212] Em uma forma de realização particular, a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido é uma substituição de aminoácido.

[00213] Em uma forma de realização a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido pode ser selecionado de qualquer uma da substituição de aminoácidos, anulações de aminoácido listadas na Tabela 1.

[00214] Desta maneira, em uma forma de realização E345X pode ser E345R, Q, N, K, Y, A, C, D, F, G, H, I, L, M, P, S, T, V, W ou Y; em particular E345A, D, G, H, K, N, Q, R, S, T, Y ou W ou mais particularmente E345D, K, N, Q, R ou W ou ainda mais particularmente E345R, Q, N, K ou Y. Em uma outra forma de realização preferida, E345X é E345K ou E345Q.

[00215] Em uma outra forma de realização adicional E430X pode ser E430T, S, G, F, H, A, C, D, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W ou Y; em particular E430T, S, G, F ou H. Em uma outra forma de realização preferida, E430X é E430G ou E430S. Em uma outra forma de realização, a mutação não está em um resíduo de aminoácido envolvida diretamente na ligação de C1q, opcionalmente como determinado pela comparação da ligação de C1q em um ensaio de ELISA de acordo com o exemplo 3 com a ligação de C1q em um ensaio com base em célula de acordo com o exemplo 4.

[00216] Em uma forma de realização, a uma ou mais mutações é uma muitação, isto e, não mais do que uma mutação é introduzida ao anticorpo precursor.

[00217] Em uma outra forma de realização, o método ou uso de acordo com o presente invenção compreende introduzir uma mutação em pelo menos dois, tal como, dois, três quatro, cinco ou mais dos resíduos de aminoácidos na Tabela 1.

[00218] Qualquer uma das combinações de mutações descritas aqui podem ser introduzidas de acordo com o método da presente invenção.

[00219] Em uma forma de realização, o método compreende introduzir ao polipeptídeo precursor mais do que uma mutação, tal como duas, três, quatro ou cinco, em particular duas ou três mutações nos resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E345X, E430X, S440Y e S440W na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana. Por exemplo, pelo menos mais do que um dos resíduos de aminoácido correspondentes a E345X, E430X, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, pode ser mutada, tal como dois ou todos de E345X, E430X, S440Y e S440W, opcionalmente em combinação com uma mutação em um ou mais outros aminoácidos listados na Tabela 1. As pelo menos duas mutações podem ser qualquer resíduo de substituição de aminoácido da posição E345 em combinação com qualquer substituição de resíduo de aminoácido da posição E430 ou S440Y ou S440W ou pode ser qualquer substituição de aminoácido da posição E430 em combinação com qualquer resíduo de aminoácido da posição S440Y ou S440W. Ainda em uma forma de realização as duas ou três mutações são introduzidas ao anticorpo precursor nos resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana.

[00220] Tal combinação de duas mutações nos resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E345X/E430X, E345X/S440Y, E345X/S440W, E430X/S440Y e E430X/S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00221] Nos métodos ou usos de acordo com o presente invenção, CDC é aumentada quando o anticorpo é ligado a seu antígeno.

[00222] Sem estar ligado a qualquer teoria acredita-se que a CDC é aumentada quando o anticorpo é ligado a seu antígeno, em que o antígeno está em uma célula que expressa o antígeno, membrana celular ou vírion. Em uma forma de realização, a região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 compreende a sequência dos resíduos 130 a 330 da SEQ ID N°: 1.

[00223] O polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor pode ser qualquer polipeptídeo precursor ou qualquer anticorpo precursor como descrito neste. O polipeptídeo precursor e o anticorpo precursor neste contexto também é pretendido ser o primeiro precursor e o segundo polipeptídeo precursor e o primeiro precursor e o segundo anticorpo precursor.

[00224] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM ou IgE humano.

[00225] Em uma forma de realização o anticorpo precursor é anticorpo de comprimento total humano, tal como um anticorpo de IgG1 de comprimento total humano.

[00226] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor e o segundo anticorpo precursor é um anticorpo de IgG1 humano, por exemplo, o Alotipo IgG1m(za) ou IgG1m(f), opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 1 ou 5.

[00227] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo IgG2 humano, opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 2.

[00228] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo IgG3 humano, opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 3.

[00229] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo IgG4 humano, opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 4.

[00230] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo biespecífico.

[00231] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é any antibody como descrito neste, por exemplo, um anticorpo fragment que compreende pelo menos parte de uma Região Fc, anticorpos monovalentes (descritos no WO2007059782 da Genmab); anticorpos de cadeia pesada, consistindo apenas de duas cadeias pesadas e de ocorrência natural em por exemplo, camelídeos (por exemplo, Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446); ThioMabs (Roche, WO2011069104), domínio projetado de troca de filamento (SEED ou corpo de semente) que são moléculas semelhantes a anticorpo assimétrico e biespecífico (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219); Fc?Adp (Regeneron, WO2010151792), Estrutura azimétrica (Zymeworks/Merck, WO2012/058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011/028952), imunoglobulina de domínio variável duplo (Abbott, DVD-Ig,Patente U. S. N° 7,612,181); anticorpos de cabeça dupla de domínio duplo (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Di-diacorpo (ImClone/Eli Lilly), formatos de anticorpo Knobs-into-holes (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); formatos de anticorpo de guia eletrostática (Amgen, EP1870459 e WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304A2); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAbs (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), anticorpos de domínio de alvejamento duplo (GSK/Domantis), Anticorpos dois em um que reconhecem dois alvos (Genentech, NovImmune), Mabs reticulado (Karmanos Cancer Center), CovX-corpo (CovX/Pfizer), biespecíficos semelhantes a IgG (ImClone/Eli Lilly, Shen, J., et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74) e DIG- corpo e PIG-corpo (Pharmabcine) e moléculas realvejantes de afinidade dupla (Fc-DART ou Ig-DART, da Macrogenics, WO/2008/157379, WO/2010/080538), Zybodies (Zyngenia), métodos com cadeia leve comum (Crucell/ Merus, US7262028) ou cadeias pesadas comuns (KÀBodies by NovImmune), bem como proteínas de fusão que compreende uma sequência de polipeptídeo fundida a um fragmento de anticorpo contendo um domínio Fc como fusões scFv, como BsAb da ZymoGenetics/BMS), HERCULES da Biogen Idec (US007951918), SCORPIONS da Emergent BioSolutions/Trubion, Ts2Ab (MedImmune/AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92), fusão de scFv da Novartis, fusão de scFv da Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb da Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb2 da f-Star (WO2008/003116) e fusões de scFv duplas. Também deve ser entendido que o termo anticorpos, a não ser que especificado de outra maneira, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais humanos), misturas de anticorpo (policlonais recombinantes) por exemplo, gerados por tecnologias exploradas por Symphogen and Merus (Oligoclonics) e polipeptídeos semelhantes a anticorpo, tal como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo como gerado pode possuir potencialmente qualquer isotipo.

[00232] Em uma outra forma de realização, o antígeno é expressado na superfície de uma célula.

[00233] Em uma outra forma de realização, a célula é uma célula tumoral humana.

[00234] Ainda em uma forma de realização, o antígeno é selecionado do grupo que consiste de erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de envelope de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, Fator Tecido (TF), CD74, EpCAM e MRP3.

[00235] Em uma outra forma de realização, o antígeno é associado com a membrana celular.

[00236] Em uma outra forma de realização, o antígeno é associado com a vírion, opcionalmente em que o antígeno está compreendido no revestimento de proteína ou um envelope de lipídeo do vírion.

[00237] Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo humano, opcionalmente ligante pelo menos um antígeno selecionado de CD20 e CD38.

[00238] Em uma outra forma de realização, o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo como pelo menos um de 7D8 e 005, opcionalmente que compreende uma região de cadeia pesada variável e/ou leve variável de pelo menos um de 7D8 e 005.

[00239] Em qualquer uso de acordo com a invenção descrita o anticorpo sem quaisquer mutações da presente invenção pode ser qualquer anticorpo precursor. Deste modo, o uso neste fornece quaisquer variantes de tais anticorpos precursores.

[00240] Em uma forma de realização a função efetiva é a ligação do receptor de Fc, por exemplo, incluindo ligação do receptor de gama Fc.

[00241] Em uma forma de realização a função efetiva é internalização de polipeptídeo contendo Fc.

[00242] Em uma forma de realização a função efetiva é uma combinação de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC).

[00243] Como usado aqui, o termo “ligação de C1q”, quando usado no contexto de uma variante ou anticorpo de um anticorpo precursor inclui qualquer mecanismo do primeiro componente no caminho clássico de ativação de complemento mediado pela ligação da variante ou anticorpo para tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (tais como células atuadoras). A ligação de C1q de um anticorpo pode ser avaliada usando um ELISA (tal como, por exemplo, ligação de C1q ELISA usandos nos exemplos 3 e 4) ou a eficácia de C1q pode ser avaliada por um ensaio de CDC (tal como, por exemplo, o ensaio de CDC usado no exemplo 5). Ainda em uma forma de realização, a avidez de ligação de C1q do anticorpo é determinado de acordo com um ensaio descrito no exemplo 4.

[00244] Em todos os métodos de acordo com a invenção descrita o anticorpo sem quaisquer mutações da presente invenção pode ser qualquer anticorpo precursor. Deste modo, o método aqui fornece quaisquer variantes de tais anticorpos precursores.

[00245] O anticorpo precursor, o primeiro anticorpo precursor, o segundo anticorpo precursor ou e as suas variantes obtidas pelos métodos e/ou usos da presente invenção may podem ligar qualquer alvo como descrito neste.

[00246] Os exemplos de antígenos ou alvos qu a invenção pode ser direcionada contra são; 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 antígeno antraz; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antígeno associado com o carcinoma CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; receptor de endotelina B; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gama RI; FCER2; FGFR3; cadeia de fibrina II beta; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 gangliosídeo; GDF2; GLP1R; Glypican-3; GPNMB; HBV (hepatitis B virus); HCMV (citomegalovírus humano); homólogo de proteína de choque por calor 90 [Candida albicans]; glicoproteína gD do vírus do hérpes simples; HGF; HIV-1; HIV-1 IIIB gp120 V3 loop; HLA-DRB (HLA-DR beta); vírus sincicial respiratório humano, glicoproteína F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 biespecífica; IgE Fc; IGF1R; região de conexão de IGHE; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; subunidade do bta do receptor de interleucina 2; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lipídeo A, domínio de lipopolissacarídeo LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 antígeno celular de granulócito; Nectin 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserine; PTK-7; Soro de Pseudomonas aeruginosa IATS O11; RSV (vírus sincicial respiratório humano, glicoproteína F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; subunidade II B da toxina semelhante a Shiga [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Staphylococcus epidermidis ácido lipotecóico; receptor de célula T alfa-beta; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1 e Vimentin.

[00247] No aspecto principal, a presente invenção refere-se a um método de induzir CDC contra uma célula, membrana celular ou vírion que expressa um alvo ao qual um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação liga, que compreende (i) fornecer a polipeptídeo precursor ou uma combinação de pelo menos um primeiro polipeptídeo precursor e um segundo polipeptídeo precursor que foi mutado de acordo com qualquer uma das formas de realização descritas aqui e (ii) contatar uma preparação do polipeptídeo precursor mutado da etapa (i) ou a combinação mutada de pelo menos um primeiro polipeptídeo precursor e um segundo polipeptídeo precursor da etapa (i) com a célula, membrana celular ou vírion que expressa um antígeno na presença de complemento humano ou uma célula atuadora.

[00248] Em uma forma de realização qualquer um ou todo precursor de polipeptídeo, primeiro polipeptídeo precursor e o segundo polipeptídeo precursor pode ser um anticorpo.

[00249] Em uma outra forma de realização, o método aumenta uma resposta efetiva adicional selecionado de ADCC, ligação do receptor de gama Fc, ligação de proteína A, ligação de proteína G, ADCP, citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), citotoxicidade intensificada pelo complemento, ligação ao receptor de complemento de um anticorpo opsonizado mediado pelo anticorpo e qualquer combinação destes.

[00250] Ainda em uma forma de realização o método também induz citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC).

[00251] Ainda em uma outra forma de realização o método também induz Internalização de polipeptídeo contendo Fc.

[00252] Em uma forma de realização, a célula é uma célula tumoral humana ou uma célula bacteriana.

[00253] Em uma outra forma de realização, o precursor do anticorpo de IgG1 é um anticorpo de IgG1 humano.

[00254] Em uma outra forma de realização, o primeiro e o segundo antígenos são separadamente selecionados do grupo que consiste de erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de envelope de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, Fator Tecido (TF), EpCAM e MRP3.

[00255] Em uma outra forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpos precursores são totalmente humanos, opcionalmente em que o primeiro e o segundo anticorpos precursores ligam os antígenos separadamente selecionados de CD20 e CD38.

[00256] Ainda em uma forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpos precursores são separadamente selecionados de 7D8 e 005.

[00257] Ainda em uma outra forma de realização, a célula é uma célula bacteriana.

[00258] Em uma outra forma de realização, a célula bacteriana é selecionada do grupo que consiste de S. aureus, S.Epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides e Mycobacterium tuberculosis.

[00259] Em uma outra forma de realização, o primeiro e/ou o segundo antígeno é ácido lipoteicóico (LTA), opcionalmente em que pelo menos um do primeiro e o segundo anticorpo precursor é pagibaximab.

[00260] Em uma outra forma de realização, o antígeno é expressado em um vírion.

[00261] Em uma outra forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpo ligam o mesmo antígeno.

[00262] Em uma outra forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpos compreendem a mesma sequência VH, sequência VL ou tanto sequência VH quanto sequência VL.

[00263] Para os propósitos da presente invenção, a célula alvo que expressa ou, d outra maneira é associada com um antígeno pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. A célula que expressa o antígenos exemplar inclui, mas não são limitadas a, células de mamíferos, particularmente células humanas, tais como células de câncer humano e organismos unicelulares, tais como bactérias, protozoários e fungos unicelulares, tais como células de levedura. As membranas celulares que compreendem ou de outra maneira associadas com um antígeno incluem membranas celulares parciais e/ou rompidas derivadas de uma célula que expressa o antígeno. Um antígeno associado com um vírion ou partícula viral pode ser compreendido ou, de outra maneira, associado com o revestimento de proteína e/ou um envelope de lipídeo do vírion.

[00264] A célula alvo pode, por exemplo, ser uma célula tumoral humana. Os antígenos tumorais adequados incluem qualquer alvo ou antígeno descrito, mas não são limitados a, erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de envelope de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFR, L1-CAM, AXL, Fator Tecido (TF), EpCAM e MRP3. Os antígenos preferidos incluem CD20, CD38, HER2, EGFR, IGFR, CD25, CD74 e CD32. Os anticorpos exemplares incluem anticorpo anti-CD20 7D8 como descritos no WO 2004/035607, anticorpo anti-CD38 005 como descritos no WO 06/099875, anticorpo anti-CD20 11B8 como descritos no WO 2004/035607, anticorpo anti-CD38 003 como descritos no WO 06/099875, anticorpo anti-EGFr 2F8 como descritos no WO 02/100348. Os exemplos de outros anticorpos particulares são fornecidos aqui.

[00265] Alternativamente, a célula alvo pode ser uma célula bacteriana, tal como, por exemplo, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides e Mycobacterium tuberculosis. Os antígenos exemplares incluem Ácido lipotecóico (LTA) e os anticorpos exemplares incluem pagibaximab.

[00266] Alternativamente, o alvo pode estar presente na superfície de um vírus, célula fúngica ou outra partícula, tal como, por exemplo, vírus do Nilo Ocidental, vírus da Dengue, vírus da hepatite C (HCV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), papilomavírus humano, vírus de Epstein- Barr, Herpesvírus, poxvírus, vírus do influenza aviário, RVS, Aspergillus, Candida albicans, Cryptococcus e Histoplasma.

[00267] Em uma forma de realização, a etapa de contato (ii) acontece in vitro.

[00268] Em uma forma de realização, a etapa de contato (ii) acontece in vivo.

[00269] Em uma outra forma de realização, etapa (ii) compreende as variantes a um paciente.

[00270] Ainda em uma forma de realização, o paciente sofre de câncer, uma infecção bacteriana ou uma infecção viral. A etapa de contato (ii) das formas de realização mencionadas acima pode acontecer in vitro ou in vivo. No último caso, a etapa (ii) ainda pode compreender a administração da preparação ou preparações a um paciente, opcionalmente um paciente que sofre de câncer ou uma infecção bacteriana. Detalhes adicionais em aplicações terapêuticas são fornecidas abaixo.

[00271] O primeiro e o segundo anticorpos compreendem regiões de ligação de antígeno que podem ligar-se ao mesmo epítopo ou diferente. Tais epítopos podem estar no mesmo alvo ou diferente.

[00272] Em uma forma de realização, o primeiro e segundo anticorpos ligam os epítopos diferentes em alvos diferentes. Tais alvos podem ser expressados na mesma célula ou tipo celular ou podem ser expressados em células ou tipos celulares diferentes. Em uma tal forma de realização, a intensificação de uma função efetiva é direcionada apenas com relação às células ou tipos celulares que expressam ambos os alvos e, desse modo, reduzem os riscos de qualquer dano colateral de células ou tipos celulares que não são a causa de uma doença a ser tratada.

[00273] Sem estar ligado por qualquer teoria, acredita-se que a intensificação de CDC pode ser restrita às células alvo que expressam dois alvos/antígenos específicos de maneira simultânea, contanto que o primeiro e o segundo anticorpo ligam os epítopos encontrados na mesma célula, desse modo, explorando a expressão combinada de alvos para melhorar a seletividade da indução de CDC intensificada.

[00274] Em casos onde os alvos são expressados em células ou tipos de células diferentes, acredita-se que sem estar ligado por teoria, que a administração em qualquer ordem do primeiro e do segundo anticorpo melhorará a intensificação de CDC e, possivelmente, também outras funções efetivas por “recrutamento” de uma segunda célula ou tipo celular que expressa o segundo alvo.

[00275] Em uma forma de realização em que uma combinação de um primeiro e um segundo anticorpo são usados, a etapa (ii) pode ser realizada de maneira simultânea, separada ou sequencial contatando a célula com o primeiro e segundo anticorpos precursores mutados na presença de complemento humano e/ou uma célula atuadora.

[00276] A invenção também fornece um método de induzir um CDC ou outra resposta efetiva, tal como ADCC, contra uma célula alvo, membrana celular, vírion ou a partícula associada com o antígeno ao qual um anticorpo IgG1 ou IgG3 liga-se, que compreende as etapas de (i) fornecer uma variante do anticorpo que compreende uma mutação em K439 que é K439E e uma mutação em S440 que é S440K ou S440R na região Fc do anticorpo e (ii) contatar uma preparação da variante com a célula na presença de um complemento humano e/ou uma célula atuadora

[00277] A invenção também fornece um método de induzir um CDC ou outra resposta efetiva, tal como a ADCC, contra uma célula alvo, membrana celular ou vírion que expressa um primeiro antígeno ao qual um primeiro anticorpo IgG1 liga e um segundo antígeno ao qual um segundo anticorpo liga-se, que compreende as etapas de (i) fornecer uma primeira variante que é o primeiro anticorpo que compreende uma mutação de um K439E e uma segunda variante que é o segundo anticorpo que compreende uma mutação S440K ou S440R e (ii) de maneira simultânea, separada ou sequencial contatando a célula com preparações do primeira e segunda variantes na presença de complemento humano ou uma célula atuadora.

[00278] Em formas de realização separadas e específicas, o primeiro e o segundo anticorpos ligam (i) antígenos diferente; (ii) epítopos diferentes no mesmo antígeno, (iii) o mesmo epítopo ou um antígeno e (iv) o mesmo epítopo ou um antígeno e compreende as mesmas sequências de VH e/ou VL. Outros métodos

[00279] Em um outro aspecto principal, a invenção refere-se a um método de identificar uma mutação em um anticorpo que intensifica a função efetiva do anticorpo para ligar C1q, que compreende as etapas de (i) preparar pelo menos um anticorpo que compreende uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana; (ii) avaliação da atividade C1q do anticorpo quando ligado à superfície de célula que expressa o antígeno as comparado ao anticorpo precursor e (iii) selecionar uma mutação de qualquer variante tendo uma avidez de C1q aumentada.

[00280] Em uma forma de realização, o pelo menos um anticorpo compreende uma ou mais substituição de aminoácido(s) selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00281] Ainda em um outro aspecto principal, a invenção refere-se a um método de identificar uma mutação em um anticorpo precursor que aumenta a capacidade do anticorpo para induzir uma resposta de CDC, que compreende as etapas de (i) preparar pelo menos uma variante do anticorpo precursor que compreende uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y ou S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana; (ii) avaliar a resposta de CDC induzido pela variante quando ligado à superfície de uma célula que expressa o antígeno, na presença de células atuadoras ou complemento, as comparado ao anticorpo precursor e (iii) selecionar uma mutação de qualquer variante tendo uma resposta aumentada de CDC.

[00282] Em uma forma de realização, o pelo menos um anticorpo compreende uma ou mais substituição de aminoácido(s) selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, tal como E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

Polipeptídeos da presente invenção Precursores de polipeptídeo

[00283] Como descrito neste, a presente invenção inter alia refere-se a variantes de polipeptídeos precursores que compreendem uma ou mais mutações na região de CH3 de uma imunoglobulina, por exemplo, na cadeia pesada do anticorpo. Os “polipeptídeos precursores” podem ser “anticorpos precursores”. Os anticorpos “precursores”, que podem ser anticorpos do tipo selvagem, a serem usados como o material de partida da presente invenção antes da modificação podem ser, por exemplo, produzidos pelo primeiro método do hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) ou podem ser produzidos pelos métodos de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando-se as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991). Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de uma fonte adequada. Deste modo, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos dos hibridomas preparados a partir de células B esplênicas de murino obtidas a partir de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo, na forma de células que expressam o antígeno na superfície ou um ácido nucléico que codifica um antígeno de interesse. Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos de hibridomas derivados de células que expressam anticorpo de mamíferos humanos ou não humanos imunizados, tais como coelhos, ratos, cães, primatas, etc.

[00284] Os anticorpos precursores podem ser, por exemplo, anticorpos quiméricos ou humanizados. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados usando-se camundongos transgênicos ou transcromossomais, por exemplo, camundongos HuMAb, que carregam partes do sistema imune humano em vez do sistema do camundongo. O camundongo HuMAb contém um minilocal de gene de imunoglobulina humano que codifica as sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (µ e y) e leve Khumana não redisposta, junto com as mutações alvejadas para inativas os locais de cadeia µ e K endógenos (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994)). Consequentemente, os camundongos apresentam expressão reduzida de IgM ou k de camundongo em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humana introduzida, passam pela troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais de IgG,k humano de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994) , Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995) e Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb é descrita em detalhes em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996). Ver também US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187. Os esplenócitos destes camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam os anticorpos monoclonais humanos de acordo com as técnicas bem conhecidas.

[00285] Além disso, os anticorpos humanos da presente invenção ou anticorpos da presente invenção para outras espécies podem ser identificados através de tecnologias tipo apresentação, incluindo, sem limitação, apresentação de fago, apresentação retroviral, apresentação ribossômica, apresentação de mamífero, apresentação de levedura e outras técnicas conhecidas na técnica e as moléculas resultantes pode ser submetido à maturação adicional, tal como maturação por afinidade, como tais técnicas são bem conhecidas na técnica. Uma estratégia particular, descrita no exemplo 17, pode ser aplicada a qualquer anticorpo para preparar e obter uma variante da invenção usando-se apresentação de fago.

[00286] O anticorpo precursor não é limitando a anticorpos tendo, por exemplo, um domínio Fc humano natural mas este também pode ser um anticorpo tendo outras mutações que não aquelas da presente invenção, tal como, por exemplo, mutações que afetam a glicosilação ou permite que o anticorpo seja um anticorpo biespecífico. Pelo termo “anticorpo natural” é entendido qualquer anticorpo que não compreende quaisquer mutações introduzidas geneticamente. Um anticorpo que compreende modificações ocorridas naturalmente, por exemplo, alotipos diferentes, deste modo, deve ser entendido como um “anticorpo natural” no sentido da presente invenção e pode, desse modo, ser entendido como um anticorpo precursor. Tais anticorpos podem servir como um padrão para a uma ou mais mutações de acordo com a presente invenção e, desse modo, fornecer os anticorpos variantes da invenção. Um exemplo de um anticorpo precursor que compreende outras mutações que não aquelas da presente invenção é o anticorpo biespecífico como descrito no WO2011/131746 (Genmab), utilizando-se condições de redução para promover a troca de meia molécula de dois anticorpos que compreendem regiões de CH3 semelhantes a IgG4, deste modo, formando anticorpo biespecíficos sem a formação concomitante de agregados. Outros exemplos de anticorpos precursores incluem mas não são limitados a anticorpos biespecíficos, tais como biespecíficos heterodiméricos: Triomabs (Fresenius); IgG1 e IgG2 biespecíficos (Rinat neurosciences Corporation); Fc?Adp (Regeneron); Knobs-into-holes (Genentech); Guia eletrostática (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbodies (Merck); estrutura Azimétrica (Zymeworks); mAb-Fv (Xencor) e LUZ-Y (Genentech). Outros formatos de precursores de anticorpo exemplares incluem, sem limitação, um fragmento de anticorpo do tipo selvagem, um anticorpo de comprimento total ou contendo Fc, um anticorpo humano ou qualquer combinação destes.

[00287] O anticorpo precursor pode ligar qualquer alvo, os exemplos de tais alvos ou antígenos da invenção podem ser e não são limitados a, direcionados contra são; 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 antígeno antrax; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; antígeno associado com o carcinoma CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; Claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; receptor de endotelina B; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAP alfa; Fc gama RI; FCER2; FGFR3; cadeia de fibrina II beta; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 gangliosídeo; GDF2; GLP1R; Glypican-3; GPNMB; HBV (hepatitis B virus); HCMV (citomegalovírus humano); homólogo de proteína de choque por calor 90 [Candida albicans]; glicoproteína gD do vírus do hérpes simples; HGF; HIV-1; arco de HIV-1 IIIB gp120 V3; HLA-DRB (HLA-DR beta); vírus sincicial respiratório humano, glicoproteína F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 biespecífica; IgE Fc; IGF1R; região de conexão de IGHE; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; subunidade do bta do receptor de interleucina 2; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lipídeo A, domínio de lipopolissacarídeo LPS; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 antígeno celular de granulócito; Nectin 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; fosfatidilserine; PTK-7; Soro de Pseudomonas aeruginosa IATS O11; RSV (vírus sincicial respiratório humano, glicoproteína F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; subunidade II B da toxina semelhante a Shiga [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Staphylococcus epidermidis ácido lipotecóico; receptor de célula T alfa-beta; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1 e Vimentin.

[00288] O anticorpo precursor pode ser qualquer anticorpo humano de qualquer isotipo, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM e IgD, opcionalmente um anticorpo de comprimento total humano, tal como um anticorpo de IgG1 de comprimento total humano. O anticorpo precursor pode compreender uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 e 5.

[00289] Os anticorpos monoclonais, tais como os precursores e/ou variantes, para o uso na presente invenção, podem ser produzidos, por exemplo, pelo primeiro método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) ou pode ser produzido pelos métodos de DNA recombinantes. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando-se as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Os anticorpos monoclonais podem ser obtido a partir de qualquer fonte adequada. Deste modo, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados a partir de células esplênicas B de murino obtidas de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo, na forma de células que expressam o antígeno na superfície ou um ácido nucléico que codifica um antígeno de interesse. Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos de hibridomas derivados de células que expressam anticorpo de mamíferos humanos ou não humanos, tais como ratos, cães, primatas, etc.

[00290] Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo humano. Os anticorpos monoclonais humanos direcionados contra qualquer antígeno podem ser gerados usando-se camundongos transgênicos ou transcromossomais que carregam partes do sistema imune humano em vez do sistema do camundongo. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos podem incluir camundongos referidos aqui como camundongos HuMAb® e camundongos KM, respectivamente e são coletivamente referidos aqui como “camundongos transgênicos".

[00291] Os camundongos HuMAb®contêm minilocais de gene de imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (µ e Y) e cadeia leve K humanas não redispostas, junto com as mutações alvejadas que inativam os locais de cadeia µ e K endógena (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Consequentemente, os camundongos apresentam expressão reduzida de camundongos mouse IgM ou k e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia leve e pesada humana introduzidos, passam por uma troca de classe e mutação somática para a geração de anticorpos monoclonais IgG,k humanos de afinidade alta (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994) , Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb® é descrita em detalhes em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver também US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.

[00292] Os camundongos HCo7, HCo12, HCo17 e HCo20 têm uma interrupção de JKD em seus genes de cadeia leve endógenos (capa) (como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção de CMD em seus genes de cadeia pesada endógenos genes de cadeia pesada endógenos (como descrito no exemplo 1 de WO 01/14424) e um transgene de cadeia leve capa humano KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Adicionalmente, os camundongos Hco7 têm um transgene de cadeia pesada humano HCo7 (como descrito em US 5,770,429), os camundongos HCo12 têm um transgene de cadeia pesada humano HCo12 (como descrito no exemplo 2 do WO 01/14424), os camundongos HCo17 têm um transgene de cadeia pesada humano HCo17 (como descrito no exemplo 2 do WO 01/09187) e os camundongos HCo20 têm um transgene de cadeia pesada humano HCo20. Os camundongos resultantes expressam transgenes de cadeia pesada de imunoglobulina humana e cadeia leve capa em um homozigoto de base para a interrupção dos locais de cadeia pesada de camundongo endógeno e cadeia leve capa.

[00293] Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve de camundongo endógeno foi interrompido de maneira homozigota como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi interrompido de maneira homozigota como descrito no exemplo 1 do WO 01/09187. Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve de capa humano, KCo5, como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de camundongo também carrega um transcromossomo de cadeia pesada humana composta de fragmento de cromossomo 14 hCF (SC20) como descrito em WO 02/43478. Os camundongos HCo12-Balb/C podem ser gerados pelo cruzamento de HCo12 com KCo5 [J/K](Balb) como descrito em WO/2009/097006.

[00294] Os esplenócitos destes camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos de acordo com as técnicas bem conhecidas.

[00295] Além disso, quaisquer regiões de ligação de antígeno podem ser obtidas de anticorpos humanos ou anticorpos de outras espécies através de tecnologias tipo apresentação, incluindo, sem limitação, apresentação de fago, apresentação retroviral, apresentação ribossômica e outras técnicas, usando-se técnicas bem conhecidas na técnica e as moléculas resultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como maturação por afinidade, como tais técnicas são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (apresentação de fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (apresentação de fago), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (apresentação ribossômica), Parmley e Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (apresentação de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) e US 5,733,743). Se tecnologias de apresentação são utilizadas para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados.

[00296] Uma mutação de acordo com o presente invenção pode ser, mas não é limitado à anulação, inserção ou substituição de uma ou mais aminoácidos. Uma tal substituição de aminoácidos pode ocorrer com qualquer aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural.

“Mutantes simples”

[00297] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outros polipeptídeos precursor, primeiro precursor ou segundo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00298] Variantes de anticorpo ou de polipeptídeo de acordo com um aspecto “mutante simples” da presente invenção compreende uma mutação, tipicamente uma substituição de aminoácido, em um ou mais resíduos de aminoácido mostrado na Tabela 1, que lista cada resíduo de aminoácido, numerado de acordo com um índice EU em um anticorpo IgG1 humano, junto com o aminoácido na posição correspondente em um precursor de antígeno IgG2, IgG3 e IgG4 e substituição de aminoácidos “Exemplar” e “Preferido”. O segmento IgG2 correspondente a resíduos 126 a 326, o segmento IgG3 correspondente a resíduos 177 a 377 e o segmento IgG4 correspondente a resíduos 127 a 327 em IgG1 são mostrados na Figura 2. Tabela 1: Locais de mutação exemplares e substituição de aminoácidos par o aspecto de “mutante simples”

[00299] Como visto na Tabela 1, a substituição de aminoácidos que resultou em um aumento da lise celular de células Wien133 no exemplo 19 são incluídos como “Substituições preferidas”.

[00300] Em um aspecto a presente invenção refere-se a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e contanto que a variante não contém quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a ligação da variante ao receptor de Fc neonatal. (FcRn) pode ser determinado pelo método descrito no exemplo 34.

[00301] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e contanto que a variante não contém quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que aumenta ou diminui a ligação da variante ao receptor de Fc neonatal (FcRn) por mais do que 30%, tal como maior do que 20%, 10% ou 5% como medido por uma mudança na absorbância OD405 nm como determinado pelo método descrito no Exemplo 34.

[00302] Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e contanto que a variante não contém quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que aumenta a afinidade precursora do anticorpo precursor ao receptor de Fc neonatal de camundongo (FcRn) por mais do que um fator de 0,5 ou não diminui a afinidade evidente do polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor ao FcRn de camundongo por mais do que um fator 2, como determinado pelo método descrito no Exemplo 34.

[00303] Em uma forma de realização, a uma ou mais mutações são selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00304] Em uma forma de realização, a variante não contenha quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) da variante.

[00305] Em uma forma de realização, a variante não contenha quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a taxa de liberação e plasma da variante como determinado nos métodos descritos no exemplo 37.

[00306] Em uma outra forma de realização, a variante não contenha quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que aumenta ou diminui a taxa de liberação e plasma da variante por mais do que um fator 3,0, tal como por mais do que um fator 2,5, fator 2,0, fator 1,5, ou fator 1,2 como determinado pelos métodos descritos no exemplo 37.

[00307] Em uma forma de realização, a variante não contenha quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a vida média do soro da variante.

[00308] Em uma forma de realização, a variante não contenha quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera ativação de complemento de fase líquida independente do alvo da variante como determinado pelo método descrito no Exemplo 36.

[00309] Em uma forma de realização, a variante não contenha quaisquer mutações adicionais no domínio Fc.

[00310] Em uma forma de realização, a variante compreende apenas uma mutação.

[00311] Em uma forma de realização a polipeptídeo variante pode ser uma anticorpo variante que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00312] Em uma forma de realização específica, a substituição de aminoácido é E345R.

[00313] Como mostrado nos exemplos, as variantes de anticorpo anticorpo CD38 HuMab-005 e -003 (como descrito em WO WO 2006/099875) e/ou CD20 anticorpo HuMab-7D8 e -11B8 (como descrito em WO 2004/035607) e rituximab e/ou EGFR anticorpo HuMab-2F8 (como descrito em WO 2002/100348) que compreende uma destas substituições de aminoácidos tendo ativação de complemento da ligação mais alta de C1q e/ou CDC do que o HuMab 005 e 7D8 tipo selvagem, respectivamente.

[00314] Deve ser entendido que a variante também pode compreender uma das mutações das “Substituições exemplares” listadas na Tabela 1. A variante também pode compreender mais do que uma mutação, tal como duas, três, quatro, cinco ou seis de qualquer uma das mutações listadas na Tabela 1.

[00315] Além das mutações indicadas, a variante pode ter qualquer uma das características como descrito para o anticorpo precursor. Em particular, este pode ser um anticorpo humano. A variante ainda pode ser, além disso, as mutações, de qualquer subtipo de IgG.

[00316] Quando ligado a seu antígeno na superfície de uma célula que expressa o antígeno, em uma membrana celular, em um vírion ou em uma outra partícula ou o antígeno é associado com um vírion, opcionalmente em que o antígeno está compreendido no revestimento de proteína ou um envelope de lipídeo do vírion, uma tal variante de anticorpo pode ter comparado ao anticorpo precursor pelo menos um de um (i) CDC mediado pelo anticorpo, (ii) ativação de complemento mediado pelo anticorpo, (iii) ligação de C1q, (iv) formação de oligômero, (v) estabilidade de oligômero ou uma combinação de qualquer um de (i) a (v) aumentado. Em uma forma de realização de (iv) ou (v), o oligômero é um hexâmero. Em uma forma de realização a variante também aumentou ADCC comparado ao polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor. Ainda em uma forma de realização a variante retém a mesma taxa de liberação ou similar em comparação com o polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor. Ainda em uma forma de realização a variante não tem uma taxa de liberação de plasma que é aumentada ou diminuída por mais do que um fator de 3,0, tal como mais do que um fator 2,5, fator 2,0, fator 1,5, ou fator 1,2 como determinado no método como descritos no exemplo 37 quando comparado ao polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor.

[00317] Sem estar ligado por qualquer teoria específica, o efeito causado por aminoácidos de substituição nas posições indicadas, com os resíduos de aminoácido da presente invenção podem, por exemplo, causar o efeito por si só, estar envolvido em contato com o domínio Fc de uma outra molécula diretamente ou pode ser mutada para interagir com um outro domínio Fc direta ou indiretamente afeta a interação de Fc:Fc intermolecular. Deste modo, as substituições são acreditadas, sem estar ligado por teoria, intensificam direta ou indiretamente a ligação entre as moléculas de anticorpo na forma oligomérica, intensificam a estabilidade da estrutura oligomérica, tal como uma estrutura hexamérica, pentamérica, tetramérica, trimérica ou dimérica. Por exemplo, a substituição de aminoácido pode ser uma que promove ou fortalece a formação de novas ligações Fc:Fc intermoleculares, tal como, mas não limitado a, interações de Van der Waals, ligações de hidrogênio, interações carga-carga ou interações de emplilhamento aromático ou um que promove a entropia aumentada na interação com Fc:Fc pela liberação de moléculas de água. Além disso, com referência à Tabela 1, “Substituições exemplares” pode ser selecionadas com base nop tamanho e propriedades fisicoquímicas que engajam em ou promovem as interações Fc:Fc intermoleculares ou interações intramoleculares. As “Substituições preferidas” pode ser selecionadas com base em tamanho e propriedades fisicoquímicas ótimas para engajar em ou estimular as interações Fc:Fc intermoleculares ou interações intramoleculares.

[00318] Em uma forma de realização, a variante pode compreender mutações adicionais selecionadas de Tabela 1.

[00319] Em uma forma de realização, a variante compreende uma combinação de duas mutações nos resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E345X/E430X, E345X/S440Y, E345X/S440W, E430X/S440Y e E430X/S440W.

[00320] Em quaisquer formas de realização onde uma tal mutação em pelo menos dois aminoácidos está compreendida na variante, isto pode estar presente em cada uma das cadeias pesadas da variante ou um dos dois podem ser compreendidos em uma das cadeias pesadas e o outro pode estar compreendido na outra cadeia pesada, respectivamente ou vice versa.

[00321] Em uma forma de realização, a mutação em dois resíduos de aminoácido é uma anulação, inserção ou substituição. Uma tal substituição de aminoácidos pode ocorrer com quaisquer aminoácidos de ocorrência natural ou artificial.

[00322] As mutações de acordo com o presente invenção pode ser, cada uma, mas não limitada a, uma anulação, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos. Uma tal substituição de aminoácidos pode ocorrer com qualquer aminoácido de ocorrência natural ou não natural.

[00323] Desta maneira, em uma forma de realização, a mutação em pelo menos um resíduo de aminoácido é uma anulação.

[00324] Em uma outra forma de realização, a mutação em pelo menos um resíduo de aminoácido é uma inserção.

[00325] Em uma outra forma de realização, a mutação em pelo menos um resíduo de aminoácido é uma substituição.

[00326] As combinações específicas exemplares de uma mutação em dois resíduos de aminoácido são E345R/E430T, E345R/S440Y, E345R/S440W, E345R/E430G, E345Q/E430T, E345Q/S440Y, E345Q/S440W, E430T/S440Y e E430T/S440W.

[00327] À parte das mutações em um ou mais aminoácidos de acordo com as formas de realização da invenção a cadeia pesada de IgG pode compreender mutações adicionais conhecidas na técnica, por exemplo, mutações que ainda melhoram as funções efetivas. Tais mutações adicionais incluem CDC que intensifica mutações, ligação do receptor de Fc-gama ou ligação de FcRn e/ou melhora das funções efetivas mediadas pelo receptor de Fc-gama.

[00328] Em uma forma de realização, uma variante de acordo com a invenção ainda compreende uma modificação intensificadora de CDC conhecida, por exemplo, uma troca de segmentos entre os isotipos de IgG para gerar as moléculas de IgG quiméricas (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72); uma ou mais substituição de aminoácidos na região de junta (Dall’Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138), e/ou uma ou mais substituição de aminoácidos em ou próximo do local de ligação de C1q no domínio de CH2, centrado em torno dos resíduos D270, K322, P329 e P331 (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 and WO 99/51642). Por exemplo, em uma forma de realização, uma variante de acordo com a invenção ainda compreende uma combinação de qualquer uma da substituição de aminoácidos S267E, H268F, S324T, S239D, G236A e I332E, fornecer função efetiva intensificada por intermédio de CDC ou ADCC (Moore et al., 2010 mAbs 2(2), 181-189)). Outras mutações de Fc que afetam a ligação a receptores de Fc (descritos no WO 2006/105062, WO 00/42072, Patente U. S. 6,737,056 e Patente U. S. 7,083,784) ou propriedades físicas dos anticorpos (descrito no WO 2007/005612 A1) também podem ser usadas nas variantes da invenção.

[00329] Em uma forma de realização, uma variante de acordo com a invenção ainda compreende modificações que intensificam a função efetiva de de ligação de receptor Fc-gama e/ou mediado pelo receptor de Fc-gama. Tais modificações incluem (i) reduzir a quantidade de fucose na glicosilação ligada a CH2 (glico-engenharia) (Umana P, et al., Nat Biotechnol 1999; 17: 176-80; Niwa R, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 6248-55.)) e (ii) mutagênese direcionada ao local de aminoácidos na junta ou regiões de CH2 de anticorpos (engenharia de proteína) (Lazar GA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 4005-10).

[00330] Em uma forma de realização, uma variante de acordo com a invenção ainda é projetada no local de ligação de FcRn, por exemplo, para estender a vida média (t1/2) de anticorpos de IgG. Tais modificações incluem (i) mutações N434A e T307A/E380A/N434A (Petcova et al. Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759); (ii) uma substituição de um ou mais de Pro238, Thr256, Thr307,Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 e Asn434 em um resíudo de alanina que melhora a ligação de FcRn (Shields RL, et al. J. Biol. Chem. 2001;276:6591) e (iii) uma substituição de aminoácido ou combinação de substituição de aminoácidos selecionada de M252Y/S254T/T256E, M252W, M252Y, M252Y/T256Q, M252F/T256D, V308T/L309P/Q311S, G385D/Q386P/N389S, G385R/Q386T/P387R/N389P, H433K/N434F/Y436H, N434F/Y436H, H433R/N434Y/Y436H, M252Y/S254T/T256E-H433K/N434F/Y436H or M252Y/S254T/T256E- G385R/Q386T/P387R/N389P em IgG1, que aumenta a afinidade para FcRn (Dall’Acqua et al., supra).

“Mutante duplo”

[00331] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00332] Como descrito acima e ainda abaixo, a presente invenção também refere-se a um aspecto de “mutante duplo”, em que duas mutações, cada uma, individualmente, diminuem uma função efetiva mas restaura junto uma a função efetiva ao nível do anticorpo precursor. Quando usado junto com a especificidade da variante é aumentada. As variantes de anticorpo de acordo com um aspecto de “mutante duplo” compreendem duas mutações, tipicamente substituição de aminoácidos, no par de interação de resíduo de aminoácido específico K439 e S440, K447 e 448 ou K447, 448 e 449.

[00333] Deste modo, em um aspecto a presente invenção refere-se a uma variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a variante compreende um primeira mutação selecionada do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E345K ou E345Q, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e uma segunda mutação selecionados do grupo correspondente a (i) um resíduo de aminoácido correspondente a K439 e S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W e se a primeira mutação for S440Y ou S440W a segunda mutação estará no resíduo de aminoácido correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, (ii) um resíduo de aminoácido correspondente a K447D/E ou correspondente a K447K/R/H e 448P na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana ou (iii) um resíduo de aminoácido correspondente a K447D/E ou correspondente a K447K/R/H e 448K/R/H e 449P na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana. A Tabela 2A e B mostram “Substituições Exemplares” e “Substituições preferidas” para os aspectos de “mutante duplo” (Tabela A) e “mutante misto” (Tabela 2B). Tabela 2A: Locais de mutação exemplares e substituição de aminoácidos para o aspecto de “mutantes duplos” Tabela 2B: Locais de mutação exemplares e aspecto de substituição de aminoácidos para “mutantes mistos” (Ab1 + Ab2)

[00334] Em uma forma de realização a variante compreende um primeira mutação selecionada do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R e E345Y e uma segunda mutação em um resíduo de aminoácido correspondente a K439 e S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação em S440 não é S440Y e S440W.

[00335] É considerado pela presente invenção que a variante também pode compreender uma das substituições do resíduo de aminoácido, tal como K439E ou S440K, tal como a variante compreende uma mutação em K439, opcionalmente sem nenhuma mutação em S440.

[00336] Em uma forma de realização, a invenção refere-se à variante, em que a mutação em K439 é uma substituição de aminoácido em um aminoácido selecionado de E e D, tal como K439E.

[00337] Em uma outra forma de realização, a variante compreende uma mutação em S440, opcionalmente sem nenhuma mutação em K439.

[00338] Em uma forma de realização, a invenção refere-se à variante, em que a mutação em S440 é uma substituição de aminoácido em um aminoácido selecionado de K e R, tal como S440K.

[00339] Em uma forma de realização, a variante compreende mutações tanto em K439 quanto S440.

[00340] Em uma outra forma de realização, a mutação em K439 é selecionado de K439 a D, E ou R, tal como K439D/E e a mutação em S440 é selecionada de S440 a D, E, K e R, tal como S440K/R.

[00341] Em uma outra forma de realização, a mutação em K439 é selecionada de K439D e K439E e a mutação em S440 é selecionada de S440K e S440R.

[00342] Em uma outra forma de realização, a variante compreende mutações de K439E e S440K.

[00343] Em uma forma de realização, o polipeptídeo precursor é um anticorpo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00344] Como descrito nos exemplos 4 a 6, as variantes de anticorpo que compreendem apenas uma das mutações de K439E e S440K tiveram um KD drasticamente aumentado para C1q, refletindo uma ativação de complemento e/ou capacidade de CDC diminuída. Surpreendentemente, foi observado que as variantes de anticorpo de HuMAb 7D8 ou 005 que compreendem ambas as mutações tiveram uma ligação restaurada ou aumentada de C1q or CDC. Sem estar ligado por qualquer teoria específica, o mecanismo subjacente talvez possa ser explicado pelas mutações respectivas que compensam estericmente um ao outro, como ilustrado nas Figuras 4 e 5.

[00345] Em uma forma de realização o polipeptídeo precursor e, desse modo, uma variante deste, pode ser um anticorpo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00346] Em uma outra forma de realização, a variante que compreende uma mutação em ambas as posições K439 e S440 como descrito neste tem um aumento em uma função efetiva mediada por Fc selecionada de citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ativação de complemento da ligação de C1q, citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação do receptor de Fc incluindo ligação do receptor de gama Fc, ligação de proteína A, ligação de proteína G, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), citotoxicidade intensificada pelo complemento, opsonização, internalização de polipeptídeo contendo Fc, submodulação alvo, absorção de ADC, indução de apoptose, morte celular, impedimento do ciclo celular e qualquer combinação destes, como comparado com o anticorpo precursor ou um anticorpo variante que compreende uma mutação em apenas um de K439 e S440.

[00347] A invenção também fornece o uso de mutações de K439E e S440K em um anticorpo para restaurar um ou mais de (i) CDC mediado pelo anticorpo, (ii) ativação de complemento mediado pelo anticorpo, (iii) avidez de ligação de C1q , (iv) formação de oligômero, (v) estabilidade de oligômero ou uma combinação de qualquer um de (i) a (v), em comparação com o anticorpo precursor, que pode, por exemplo, se um anticorpo do tipo selvagem ou um anticorpo variante que compreende apenas uma das mutações de K439E ou S440K. Em uma forma de realização de (iv) ou (v), o oligômero é um hexâmero.

[00348] Em uma forma de realização, a variante é selecionada de um anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico.

Mutantes mistos

[00349] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00350] Como descrito acima, os inventores da presente invenção também observaram que existem mutações que, por si só, diminuem uma função efetiva mas quando usadas juntas, a função efetiva é restaurada, por exemplo, as mutações nas posições K439 e S440 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana. Este conceito também pode ser usado para garantir a formação de pares de dois anticorpos diferentes, deste modo, pela introdução de K439 em um anticorpo e S440 no outro. Deste modo, as variantes de anticorpo de acordo com um aspecto de “mutante misto” compreende uma mutação, mas um que leva tipicamente a uma interação Fc:Fc reduzida ou muito reduzida entre as moléculas Fc idênticas. Entretanto, quando as variantes de anticorpo “mutante misto” da invenção são capazes de formar pares um com o outro; fornecer um CDC restaurado ou ainda aumentado, ativação de complemento da ligação de C1q, formação de oligômero e/ou estabilidade de oligômero para o par de variantes de anticorpo específico, em comparação com, por exemplo, cada variante apenas ou uma mistura do anticorpo precursor ou anticorpos precursores. Em uma forma de realização da invenção, o oligômero é um hexâmero. Em uma forma de realização, o par de variante de anticorpo também ou alternativamente tem uma outra função efetiva retida ou melhorada, tal como ativação de complemento da ligação de C1q, citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC), ligação de FcRn, ligação do receptor de Fc incluindo ligação do receptor de gama Fc, ligação de proteína A, ligação de proteína G, fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), citotoxicidade celular dependente do complemento (CDCC), citotoxicidade intensificada pelo complemento , opsonização, internalização de polipeptídeo contendo Fc, submodulação alvo, absorção de ADC, indução de apoptose, morte celular, impedimento do ciclo celular e qualquer combinação destes. Este aspecto da invenção fornece diversas aplicações não apenas onde a força, mas também a seletividade na ativação de complemento da ligação de C1q, CDC ou outra função efetiva pode ser regulada.

[00351] Os locais de mutação exemplares para cada variante de anticorpo em um par “mutante misto” nãom ostrados na Tabela 2B. Especificamente, a invenção fornece uma variante de um anticorpo que compreende uma região de ligação de antígeno e um domínio Fc de uma imunoglobulina, cuja variante compreende uma mutação em um resíduo na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana correspondente a um de K439 e S440.

[00352] Em uma forma de realização, a mutação está em K439 e é uma substituição de aminoácido em um aminoácido selecionado de E ou D, tal como K439E. Em uma forma de realização, a mutação está em S440 e é uma substituição de aminoácido em um aminoácido selecionado de K ou R, tal como S440K.

[00353] Em uma forma de realização, a variante compreende uma mutação de aminoácido apenas na posição correspondente a K439 e não à posição S440 na região fc de uma cadeia pesada de IgG1.

[00354] Em uma forma de realização, a variante compreende uma mutação de aminoácido apenas na posição correspondente a S440 com a condição que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W e não compreende uma mutação de aminoácido na posição correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1.

[00355] Desta maneira, em uma forma de realização a presente invenção também refere-se a uma variante que compreende um primeira mutação selecionada do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e uma segunda mutação em um resíduo de aminoácido correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00356] Em uma outra forma de realização a presente invenção também refere-se a uma variante que compreende um primeira mutação selecionada do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R e E345Y na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e uma segunda mutação em um resíduo de aminoácido correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a segunda mutação não é S440Y ou S440W.

[00357] Em uma forma de realização, as duas formas de realização descritas acima podem ser combinadas no aspecto do par “mutante misto” de acordo com a presente invenção.

[00358] Cada variante em um par “mutante misto” ainda pode compreender uma mutação em um aminoácido listado na Tabela 1.

[00359] Em uma forma de realização da presente invenção, o par “mutante misto” compreende uma primeira variante de um anticorpo precursor e uma segunda segundo variante de um anticorpo precursor, em que a primeira variante compreende um primeiro domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno, em que a dita primeira variante compreende (i) uma primeira mutação em um ou mais outros resíduos de aminoácido que não uma mutação em K439 selecionada do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e uma segunda mutação na posição correspondente a K439 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana e em que a segunda variante compreende um segundo domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno, em que a dita segunda variante compreende (i) uma primeira mutação em um ou mais outros resíduos de aminoácido que não uma mutação em S440 selecionada do grupo correspondente a E430X e E345X, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R e E345Y, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e (ii) uma segunda mutação na posição correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1, com a condição que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W.

[00360] Outros pares “mistos-mutantes” exemplares ainda pode compreender e não é limitado a, qualquer um dos seguintes pares; uma primeira variante que compreende a mutação K447E e uma segunda variante compreende a mutação K447/P448; uma primeira variante que compreende a mutação K447E e uma segunda variante que compreende a mutação K447/K448/P449.

[00361] Em uma forma de realização, a mutação é uma anulação, inserção ou substituição. Uma tal substituição de aminoácidos pode ocorrer com quaisquer aminoácidos de ocorrência natural ou não natural.

[00362] Em uma forma de realização, a mutação é uma anulação.

[00363] Em uma outra forma de realização, a mutação é uma inserção.

[00364] Em uma outra forma de realização, a mutação é uma substituição de um aminoácido.

[00365] Em uma forma de realização particular, a primeira variante e/ou a segunda variante compreende uma mutação em um ou mais aminoácidos residue selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana.

[00366] Por exemplo, em uma forma de realização, uma variante em um par “mutante misto” compreende um de E430G, E430S, E345K ou E345Q junto com mutações K439E, enquanto a outra variante compreende um de E430G, E430S, E345K ou E345Q junto com as mutações S440K, deste modo fornece fornece avidez tanto aumentada quando mais específica de ligação de C1q, ativação de complemento, CDC, formação de oligômero, estabilidade de oligômero e/ou outra função relacionada com o atuador tal como ADCC, ligação do receptor de gama Fc, ligação de proteína A, ligação de proteína G, ADCP, CDCC, citotoxicidade intensificada pelo complemento, fagocitose mediada pelo anticorpo, internalização, apoptose, ligação ao receptor de complemento de um anticorpo opsonizado e/ou combinações destes.

[00367] O aspecto “mutante misto”, também pode compreender duas variantes que compreendem cada uma mais do que uma mutação listada na Tabela 2A, na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana, tal como uma primeira variante que compreende a mutações S440K/K447E e uma segunda variante que compreende a mutação K439E/K447/P448; tal como uma primeira variante que compreende a mutações K439E/K447E e uma segunda variante que compreende a mutação S440K/K447/P448.

[00368] As variantes em um par “mutante misto” como descrito neste pode derivar do mesmo ou de precursores de anticorpos diferentes. Além disso, o aspecto “mutante misto” também pode ser utilizado em anticorpos biespecíficos ou assimétricos. Além disso, o primeiro, segundo e terceiro anticorpos podem ligar epítopos diferentes, nos mesmos alvos ou diferentes.

[00369] Além disso, o aspecto “mutante misto” pode fornecer um CDC ou outra resposta efetiva que é mais especificamente direcionada a células tumorais que expressam dois antígenos tumorais específicos, pela utilização de um primeiro anticorpo contra o primeiro antígeno com uma mutação de um K439E e um segundo anticorpo contra o segundo antígeno com uma mutação S440K ou S440R. Pela utilização do aspecto “mutante misto” que compreende três variantes, opcionalmente sendo anticorpos biespecíficos, podem fornecer um CDC ou outra resposta efetiva que é mais especificamente direcionada a células tumorais que expressam pelo menos dois, tal como, dois, três quatro, cinco ou seis, antígenos específicos de tumor.

[00370] Em uma forma de realização de qualquer um dos aspectos “mutante simples”, “mutante duplo” e “mutante misto”, a variante é selecionada de um anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífica ou anticorpo multiespecífico.

[00371] Em qualquer forma de realização do aspecto “mutante misto”, a primeira, segunda e/ou terceira variante pode compreender a mesma mutação ou diferente de qualquer uma da substituição de aminoácidos listada na Tabela 1.

Anticorpos Multiespecíficos

[00372] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também podem ser aplicáveis a outroprecursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00373] Deve ser entendido que qualquer forma de realização dos aspectos “mutante simples”, “mutante duplo” e “mutante misto” descritos aqui podem ser usados no aspecto do anticorpo multiespecífico descrito abaixo.

[00374] Deste modo em uma forma de realização a variante is um anticorpo selecionado de um anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico.

[00375] Em uma forma de realização particular, o anticorpo biespecífico tem o formato descrito em WO 2011/131746.

[00376] Em um aspecto principal, a invenção refere-se a uma variante de um anticorpo precursor que é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende uma primeira região de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação de antígeno e um segundo polipeptídeo que compreende uma segunda região de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma segunda região de ligação de antígeno, em que a primeira e segunda regiões de ligação de antígeno ligam epítopos diferentes nos mesmos antígenos ou diferentes e em que a primeira e/ou a segunda regiões de CH2-CH3 compreendem uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que o primeiro polipeptídeo compreende a mutação adicional em um resíduo de aminoácido selecionado daqueles correspondentes a K409, T366, L368, K370, D399, F405 e Y407 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e o segundo polipeptídeo compreende a mutação adicional em um resíduo de aminoácido selecionado daqueles correspondentes a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 e K409 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a mutação adicional no primeiro polipeptídeo é diferente da mutação adicional no segundo polipeptídeo.

[00377] Em uma forma de realização, a mutação é uma anulação, inserção ou substituição. Uma tal substituição de aminoácidos pode ocorrer com quaisquer ácidos de ocorrência natural ou não natural.

[00378] O anticorpo biespecífico da presente invenção não é limitado a um formato particular e este pode ser qualquer um daqueles descritos a cima e aqui.

[00379] Em uma forma de realização particular da presente invenção, (i) o primeiro polipeptídeo compreende uma mutação adicional no resíduo de aminoácido correspondente a K409, tal como K409R, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e (ii) o segundo polipeptídeo compreende a mutação adicional no resíduo de aminoácido correspondente a F405, tal como F405L, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana; ou em que alternativamente (iii) o primeiro polipeptídeo compreende a mutação adicional no resíduo de aminoácido correspondente a F405, tal como F405L, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e (iv) o segundo polipeptídeo compreende a mutação adicional no resíduo de aminoácido correspondente a K409, tal como K409R, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00380] Em uma forma de realização particular, a mutação em um ou mais resíduos de aminoácido são selecionados do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00381] Tais anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser gerados como descritos no exemplo 22. Além disso, o efeito na morte de CDC pelas proteínas heterodiméricas geradas pode ser testado pelo uso de um ensaio como usado no exemplo 23.

[00382] O anticorpo biespecífico pode, por exemplo, compreender uma região de ligação de antígeno de um anticorpo CD20 e uma região de ligação de antígeno de um anticorpo CD38 e uma substituição de aminoácido em um ou mais aminoácidos listados nas Tabelas 1 e/ou 2A/B. As regiões de ligação CD20 exemplares incluem aqueles de ofatumumab (2F2), 7D8 e 11B8, descritos no WO2004/035607, que é incorporado neste por referência em sua totalidade e rituximab (WO 2005/103081). As regiões de ligação CD38 exemplares incluem aqueles de 003 e daratumumab (005), descritas no WO2006/099875, que é incorporado neste por referência em sua totalidade.

[00383] Em uma forma de realização, o anticorpo biespecífico liga-se aos epítopos diferentes do mesmo ou alvo diferente.

[00384] Em uma outra forma de realização, a primeira mutação no primeiro e o segundo polipeptídeo pode ser o mesmo ou diferente.

[00385] Em uma forma de realização do aspecto do anticorpo “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e multiespecífico, a variante é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM ou IgE humano, opcionalmente um anticorpo de comprimento total humano, tal como um anticorpo de IgG1 de comprimento total humano.

[00386] Em qualquer aspecto de “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e os aspectos de anticorpo multiespecíficos a ligação C1q do anticorpo é determinada de acordo com os ensaios descritos no exemplo 4, o CDC é determinado de acordo com os ensaios descritos no exemplo 5, 6 ou 10, a mutação não está em um resíduo de aminoácido envolvida diretamente na ligação de C1q, opcionalmente como determinado pela comparação da ligação de C1q em um ensaio de ELISA de acordo com o exemplo 3 com a ligação de C1q em um ensaio com base em célula de acordo com o exemplo 4 e o ADCC é determinado de acordo com os ensaios descritos no exemplo 12.

[00387] Adicionalmente, a invenção fornece para uma preparação de uma variante de qualquer aspecto de anticorpo “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e multiespecífico ou forma de realização descrita acima. A invenção também fornecida pela composição compreende uma variante de qualquer do aspecto “mutante duplo” e forma de realização descrito acima, por exemplo, composições farmacêuticas. A invenção também fornece o uso de qualquer tal variante, preparação ou composição como um medicamento.

[00388] As aspectos de anticorpo “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e multiespecífico acima da invenção são particularmente aplicáveis as moléculas de anticorpo humanas tendo uma cadeia pesada IgG1 que compreende o segmento relevante, P247 a K447, correspondente aos resíduos sublinhados 130 a 330 da região constante da cadeia pesada de IgG1 humana (Acessão UniProt N°. P01857; SEQ ID N°: 1): 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep 101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs 151 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk 201 eykckvsnka Ipapiektis kakgqprepq vytlppsrde Itknqvsltc 251 Ivkgfypsdi avewesngqp ennykttppv Idsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

[00389] A presente invenção também pode ser aplicada as moléculas de anticorpo tendo uma porção de cadeia pesada IgG2 humana. Os resíduos de aminoácido P247 a K447 da cadeia pesada IgG1 correspondem aos resíduos sublinhados 126 a 326 da região constante de cadeia pesada IgG2 (número de acessão P01859; SEQ ID N°: 2) 1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssnfgtqt ytcnvdhkps ntkvdktver 101 kccvecppcp appvagpsvf Ifppkpkdtl misrtpevtc vvvdvshedp 151 evqfnwyvdg vevhnaktkp reeqfnstfr vvsvltvvhq dwlngkeykc 201 kvsnkglpap iektisktkUUUg qprepqvytl ppsreemtkn qvsltclvkg 251 UUUfypsdiavew esngqpenny kttppmldsd gsfflysklt vdksrwqqgn 301 UUUvfscsvmhea Ihnhytqksl slspgk

[00390] A presente invenção também pode ser aplicada as moléculas de anticorpo tendo uma porção de cadeia pesada IgG3 humana. Os resíduos de aminoácido P247 a K447 da cadeia pesada IgG1 corresponde aos resíduos 177 a 377 da região constante da cadeia pesada IgG3 (Acessão UniProt N°. P01860, SEQ ID N°: 3), sublinhado no seguinte: 1 astkgpsvfp lapcsrstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt ytcnvnhkps ntkvdkrvel 101 ktplgdttht cprcpepksc dtpppcprcp epkscdtppp cprcpepksc 151 dtpppcprcp apellggpsv flfppkpkdt Imisrtpevt cvvvdvshed 201 pevqfkwyvd gvevhnaktk preeqynstf rvvsvltvlh qdwlngkeyk 251 ckvsnkalpa piektisktk gqprepqvyt lppsreemtk nqvsltclvk 301 gfypsdiave wessgqpenn ynttppmlds dgsfflyskl tvdksrwqqg 351 nifscsvmhe alhnrftqks lslspgk

[00391] A presente invenção também pode ser aplicada as moléculas de anticorpo tendo uma porção de cadeia pesada IgG4 humana. Os resíduos de aminoácido P247 a K447 da cadeia pesada IgG1 corresponde aos resíduos sublinhados 127 a 327 da região constante da cadeia pesada IgG4 (número de acessão P01859, SEQ ID N°: 4) 1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtkt ytcnvdhkps ntkvdkrves 101 kygppcpscp apeflggpsv flfppkpkdt Imisrtpevt cvvvdvsqed 151 pevqfnwyvd gvevhnaktk preeqfnsty rvvsvltvlh qdwlngkeyk 201 ckvsnkglps siektiskak gqprepqvyt Ippsqeemtk nqvsltclvk 251 gfypsdiave wesngqpenn ykttppvlds dgsfflysrl tvdksrwqeg 301 nvfscsvmhe alhnhytqks lslslgk

[00392] A presente invenção também pode ser aplicada como um anticorpo tendo uma porção de cadeia pesada de alotipo IgG1m(f) humana. A sequência de aminoácido do alotipo IgG1m(f) (a sequência CH3 é sublinhada) - SEQ ID N°: 5 1 astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep 101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs 151 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk 201 eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree mtknqvsltc 251 lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw 301 qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspgk

[00393] Um alinhamento dos segmentos respectivos das regiões constantes IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgG1m(f) é mostrado na Figura 2. Consequentemente, qualquer mutação em um aminoácido descrito na Tabela 1 ou Tabela 2A e B pode ser introduzido em sua posição equivalente em IgG2, IgG3, IgG4, e/ou IgG1m(f) como definido pelo alinhamento para obter uma variante de acordo com a invenção.

[00394] Em uma forma de realização, a invenção fornece uma variante de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de comprimento total, que compreende uma ou mais substituição de aminoácidos de acordo com um aspecto descrito acima.

[00395] Em qualquer aspectos de “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e anticorpo multiespecífico, a região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 pode compreender uma sequência dos resíduos 130 a 330 da SEQ ID N°: 1, resíduos 126 a 326 da SEQ ID N°: 2, resíduos 177 a 377 da SEQ ID N°: 3 ou resíduos 127 a 327 da SEQ ID N°: 4.

[00396] Em uma forma de realização, um anticorpo precursor compreende uma sequência selecionada de SEQ ID N°.: 1-5, tal como SEQ ID N°.:1, SEQ ID N°.:2, SEQ ID N°.:3, SEQ ID N°.:4 ou SEQ ID N°.:5.

[00397] Em uma forma de realização, a região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 compreende a sequência dos resíduos 130 a 330 da SEQ ID N°: 1.

[00398] O anticorpo precursor pode ser qualquer anticorpo precursor como descrito neste. O anticorpo precursor neste contexto também é pretendido ser o primeiro precursor e o segundo anticorpos precursores.

[00399] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM ou IgE humano.

[00400] Em uma forma de realização o anticorpo precursor é anticorpo de comprimento total humano, tal como um anticorpo de IgG1 de comprimento total humano.

[00401] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor e o segundo anticorpo precursor é um anticorpo de IgG1 humano, por exemplo, o Alotipo IgG1m(za) ou IgG1m(f), opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 1 ou 5.

[00402] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo IgG2 humano, opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 2.

[00403] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo IgG3 humano, opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 3.

[00404] Em uma forma de realização, o anticorpo precursor é um anticorpo IgG4 humano, opcionalmente que compreende uma região Fc que compreende SEQ ID N°: 4.

[00405] Nas formas de realização particulares de qualquer um dos aspectos de anticorpo “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e multiespecíficos, a variante compreende uma sequência de aminoácido no qual tem um grau de identidade aos aminoácidos P247 a K447 da SEQ ID N°: 1, 2, 3, 4 e 5 de pelo menos 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou de pelo menos cerca de 99%, exceto pelas mutações introduzidas de acordo com a presente invenção.

[00406] Deste modo, a variante pode compreender uma sequência de acordo com a SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5 exceto por qualquer mutação definida neste.

[00407] Em qualquer um dos aspectos “mutante simples”, “mutante duplo”, “mutante misturado” e multiespecíficos acima de acordo com a presente invenção pode ser entendida para incluir as seguintes formas de realização.

[00408] Em uma forma de realização, o primeiro e/ou o segundo anticorpo precursor é um fragmento de anticorpo, opcionalmente selecionado do grupo que consiste de um anticorpo monovalente, um anticorpo de cadeia pesada, um domínio projetado trocar de filamento (SEED), um triomab, uma imunonoglobulina de domínio variável dupla (DVD-Ig), um anticorpo knob- into-holes, um mini-anticorpo, uma molécula de realvejamento de afinidade dupla (Fc-DART ou Ig-DART); um anticorpo LUZ-Y, um anticorpo Biclonic, um anticorpo (DT)-Ig de alvejamento duplo, um anticorpo dois-em-um, um Mab reticulado, um mAb2, um corpo de CovX, um anticorpo biespecífico semelhante a IgG, um Ts2Ab, um BsAb, um anticorpo HERCULES, um TvAb, um anticorpo de fusão ScFv/Fc, um SCORPION, um fragmento scFv fundido a um domínio Fc e um fragmento scFv duplo fundido a um domínio Fc.

[00409] Ainda em uma forma de realização, tanto o primeiro quanto o segundo anticorpo precursor liga-se a um antígeno expressado na superfície de uma célula de tumor humano.

[00410] Ainda em uma forma de realização, os antígenos para o primeiro e o segundo anticorpo precursor são separadamente selecionados do grupo que consiste de erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, proteína de envelope de HERV, periostina, Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, L1-CAM, AXL, Fator Tecido (TF), CD74, EpCAM e MRP3.

[00411] Ainda em uma forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpos precursores são totalmente humanos.

[00412] Ainda em uma forma de realização, os antígenos para o primeiro e o segundo anticorpo precursor são, em qualquer ordem, selecionado de CD20 e CD38, opcionalmente em que o primeiro e o segundo anticorpos precursores são, em qualquer ordem, selecionado de 7D8 e 005.

[00413] Ainda em uma forma de realização, tanto o primeiro anticorpo quanto o segundo anticorpo liga-se aos antígenos expressados na superfície de uma célula bacteriana ou um vírion.

[00414] Em uma outra forma de realização, a célula bacteriana é selecionada do grupo que consiste de S. aureus, S. epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides e Mycobacterium tuberculosis.

[00415] Ainda em uma forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpo precursor ligam-se ao mesmo antígeno.

[00416] Em uma outra forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpos precursores é o mesmo anticorpo.

[00417] Em uma outra forma de realização, o anticorpo precursor é selecionado de 7D8 e 005.

Composições

[00418] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00419] A invenção também refere-se as composições que compreendem variantes e anticorpos precursores que podem ser qualquer variante e o anticorpo precursor como descrito neste. Os aspectos específicos e formas de realização serão descritos abaixo. Além disso, tais variantes podem ser obtidas de acordo com qualquer método descrito aqui.

[00420] Em um aspecto a presente invenção refere-se a uma composição que compreende uma primeira e uma segunda variante de um polipeptídeo precursor cada um compreendendo um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a primeira e/ou o segunda variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00421] Em uma forma de realização, a primeira e/ou a segunda variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00422] Em uma forma de realização preferida, a primeira e/ou a segunda variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430G, E430S, E345K e E345Q na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00423] Em uma forma de realização, tanto a primeira quanto a segunda variante compreende uma ou mais mutações que podem ser a mesma ou diferente.

[00424] Em uma outra forma de realização, a primeira variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a segunda variante não compreende uma ou mais mutações em um resíduo de aminoácido selecionado do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00425] Em uma forma de realização, a composição compreende pelo menos uma molécula que compreende pelo menos um domínio de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma variante de acordo com a invenção, em que a molécula compreende uma mutação em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E345K e E345Q, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00426] A molécula descrita na forma de realização pode ser referida como uma “molécula apenas Fc” e ainda pode compreender por exemplo, uma região de junta. Entretanto, tal região de junta não pode ser incluída.

[00427] Uma composição que compreende a molécula apenas Fc e qualquer variante de acordo com a invenção pode ser aplicada pelo uso nos métodos diagnósticos formadores de imagem ou para modular a avidez das variantes uma vez ligada a superfície celular.

[00428] A molécula apenas Fc ainda pode compreender a mutação adicional em um resíduo de aminoácido correspondente a K439 e/ou S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação está em S440 não está S440Y ou S440W e se a primeira mutação está S440Y ou S440W a mutação adicional está no resíduo de aminoácido correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00429] Em uma outra forma de realização, (i) a primeira variante ainda compreende uma mutação em uma posição correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e (ii) a segunda variante ainda compreende uma mutação em uma posição correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação não é S440Y ou S440W; ou em que (i) e (ii) pode ser, alternativamente (iii) a primeira variante ainda compreende uma mutação em uma posição correspondente a S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação não é S440Y ou S440W; e (iv) a segunda variante ainda compreende uma mutação em uma posição correspondente a K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00430] Em uma forma de realização, a mutação na posição K439 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana é K439D/E, e/ou a mutação na posição S440 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana é S440K/R..

[00431] Ainda em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a uma composição como definida neste, em que (i) a primeira variante ainda compreende um pró-medicamento e (ii) a segunda variante compreende um ativador para o pró- medicamento em uma primeira variante; ou em que (i) e (ii) pode ser, alternativamente (iii) a segunda variante compreende um pró-medicamento e (iv) a primeira variante compreende um ativador para o pró- medicamento em uma segunda variante.

[00432] O termo “pró-medicamento” deve ser entendido de acordo com a presente invenção, como um precursor de medicamento relativamente não citotóxico que deve sofrer a conversão química, por exemplo, pelos processo metabólicos, antes de tornar-se um agente farmacoclógico ativo (anticâncer). Os exemplos nos pró-medicamentos e métodos de preparação estes são bem conhecidos na técnica. Um exemplo é uma combinação de anticorpo que compreende um pró-medicamento-enzima em que a liberação de medicamento é fornecida pela ligação de um anticorpo conjugado com um pró-medicamento e a ligação de um anticorpo conjugado com um ativador para o dito pró-medicamento aos seus alvos de antígeno presentes na mesma célula. Este conduz o pró-medicamento e seu ativador na proximidade de cada outro e o medicamento é portanto liberado localmente, capaz de por exemplo, penetrar nas células circundantes e matar estas células. (Senter and Springer, 2001 Adv Drug Deliv Rev. 2001 Dec 31;53(3):247-64, Senter, 1994 FASEB J. 1990 Feb 1;4(2):188-93).

[00433] O termo “ativador de um pró-medicamento” deve ser entendido de acordo com a presente invenção, como uma molécula capaz de converter um pró-medicamento em um medicamento ativo. Os exemplos nos ativadores de um pró-medicamento e métodos de preparação destes são bem conhecidos na técnica. Um exemplo de um ativador pode ser enzimas que comportam-se como um catalisador para a conversão do pró-medicamento em um medicameto ativo. (Senter and Springer, 2001 Adv Drug Deliv Rev. 2001 Dec 31;53(3):247-64, Senter, 1994 FASEB J. 1990 Feb 1;4(2):188-93).

[00434] Em uma forma de realização o primeiro e/ou o segundo polipeptídeo precursor é um primeiro e um segundo anticorpo precursor cada um compreendendo um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00435] Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpo é cada anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM ou IgE humano, opcionalmente cada anticorpo de comprimento total humano, tal como cada anticorpo de IgG1 de comprimento total humano.

[00436] Em uma forma de realização, o primeiro e o segundo anticorpo é cada um selecionado de um anticorpo monoespecífico, biespecífico ou multiespecífico.

[00437] Ainda em uma forma de realização, o primeiro e/ou o segundo anticorpo precursor é cada anticorpo biespecífico que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende uma primeira região de CH2-CH3 de uma imunoglobulina e uma primeira região de ligação de antígeno e um segundo polipeptídeo que compreende uma segunda região de CH2-CH3 e uma segunda região de ligação de antígeno, em que a primeira e segunda regiões de ligação de antígeno ligam-se aos epítopos diferentes no mesmo antígeno ou antígenos diferentes e em que a dita primeira região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição selecionada daquela correspondente a K409, T366, L368, K370, D399, F405 e Y407 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a segunda região de CH2-CH3 compreende uma mutação de aminoácido adicional em uma posição selecionada daquela correspondente a F405, T366, L368, K370, D399, Y407 e K409 na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a mutação de aminoácido adicional na primeira região de CH2-CH3 é diferente da mutação de aminoácido adicional na segunda região de CH2-CH3.

[00438] Em uma forma de realização preferida, a mutação de aminoácido adicional da primeira região de CH2-CH3 está na posição correspondente a K409, tal como K409R, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e em que a mutação de aminoácido adicional da segunda região de CH2-CH3 está na posição correspondente a F405, tal como F405L, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00439] Em uma forma de realização, a primeira e a segunda variante da composição ligam-se aos epítopos diferentes no mesmo ou antígenos diferentes.

[00440] Em uma forma de realização, uma ou ambas da primeira e a segunda variantes são conjugadas a um medicamento, toxina ou radiorrótulo, tal como em que uma ou ambas da primeira e a segunda variantes são conjugadas a uma toxina por intermédio de um ligador.

[00441] Em uma forma de realização, uma ou ambas da primeira e a segunda variantes são partes de uma proteína de fusão.

[00442] Em uma forma de realização particular, a primeira e/ou a segunda variante da composição compreende apenas uma mutação.

[00443] Nas formas de realização, em que a segunda variante não compreende qualquer uma das mutações listadas neste e descritas, tal segunda variante pode incluir qualquer um dos exemplos do segundo anticorpo adequados listados acima em relação aos métodos de aumento de CDC.

[00444] Em uma forma de realização, a pelo menos uma primeira mutação na primeira e a segunda variantes são diferentes.

[00445] Em uma forma de realização, a primeira variante e segunda variante é cada anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM ou IgE humano, opcionalmente cada anticorpo de comprimento total humano, tal como cada anticorpo de IgG1 de comprimento total humano.

[00446] Em uma forma de realização, a primeira variante e segunda variante é cada uma selecionada de um anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou anticorpo multiespecífico.

[00447] Ainda em uma forma de realização, a primeira e a segunda variante ligam-se aos epítopos diferentes no mesmo antígeno ou antígenos diferentes. Deste modo, na forma de realização, em que o primeiro e o segundo anticorpo são anticorpos biespecíficos podem ligar-se em cada um dos epítopos diferentes. A pelo menos dois anticorpos biespecíficos podem ser o mesmo ou diferente. Se os anticorpos biespecíficos são diferentes, a composição, deste modo, compreende alvejamento a quatro epítopos diferentes no mesmo ou alvos diferentes.

[00448] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende qualquer variante, qualquer anticorpo biespecífico ou qualquer composição descrita aqui e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00449] É considerado que qualquer uma das formas de realização de acordo com um aspecto de “mutante misturado” pode ser compreendido em qualquer uma das formas de realização da composição.

[00450] Em uma forma de realização, os variantes do primeiro e o segundo anticorpos precursores ligam-se aos antígenos expressados na mesma célula.

[00451] Em uma outra forma de realização, a variante do primeiro anticorpo precursor compreende uma substituição de aminoácido de K439 em um aminoácido selecionado de E e D.

[00452] Em uma outra forma de realização, a substituição de aminoácido em uma variante do primeiro anticorpo precursor é K439E.

[00453] Em uma outra forma de realização, a variante do segundo anticorpo precursor compreende uma substituição de aminoácido de S440 em um aminoácido selecionado de K e R.

[00454] Em uma outra forma de realização, a substituição de aminoácido em uma variante da segunda variante do anticorpo precursor é S440K.

[00455] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma variante do primeiro polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor e uma variante do segundo polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor de qualquer uma das formas de realização listadas acima.

[00456] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com as técnicas convencionais tal como aquelas descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19° Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. A composição farmacêutica da presente invenção pode por exemplo, incluir os diluentes, enchedores, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween-80), estabilizadores (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteína), preservantes, agentes de isotonicidade, antioxidantes, fixadores de tecido, solubilizadores, e/ou outros materiais adequados para a inclusão na composição farmacêutica. Os exemplos dos carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada por fosfato, etanol, dextrose, polióis (tal como glicerol, propilene glicol, polietileno glicol).

[00457] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e modo adequado. Em uma forma de realização, a composição farmacêutica da presente invenção é parenteralmente administrada. O termo “parenteralmente administrado” como usado neste significa os modos de administração outro do que a administração tópica e enteral, usualmente pela injeção e incluem injeção epidermal, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, intracranial, intratorácica, epidural e intraesternal e infusão.

Kit de partes

[00458] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00459] A invenção também refere-se a kit de partes para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia que compreende variantes dos polipeptídeos precursores e anticorpos precursores, em que qualquer variante do polipeptídeo precursor e o anticorpo precursor pode ser como descrito neste. Os aspectos específicos e formas de realização serão descritos abaixo. Além disso, tais variantes podem ser obtidas de acordo com um método descrito aqui.

[00460] Em um aspecto a presente invenção refere-se a um kit de partes para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia que compreende uma primeira variante de um polipeptídeo precursor e uma segunda variante de um polipeptídeo precursor, em que a primeira variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W, na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e contanto que a variante não contém quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a ligação da variante ao receptor de Fc neonatal (FcRn) e em que (i) dita primeira variante compreende uma mutação em uma posição correspondente a K439 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana e dita segunda variante compreende uma mutação em uma posição correspondente a S440 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana, com a condição que a mutação em S440 não é S440Y ou S440W, (ii) dita primeira variante compreende uma mutação em uma posição correspondente a K447D/E na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e dita segunda variante compreende uma mutação em uma posição correspondente a K447K/R/H e 448P na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana ou (iii) dita primeira variante compreende uma mutação em uma posição correspondente a K447D/E na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e dita segunda variante compreende uma mutação em uma posição correspondente a K447K/R/H, 448K/R/H e 449P na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana.

[00461] Em uma forma de realização, a primeira ou ambas das variantes de um polipeptídeo precursor e a segunda variante de um polipeptídeo precursor pode ser um anticorpo que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação de antígeno.

[00462] Em uma forma de realização, a mutação na posição correspondente a K439 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana é K439D/E, e/ou a mutação na posição correspondente a S440 na região Fc da cadeia pesada de IgG1 humana é S440K/R.

[00463] Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a um kit de partes para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia, que compreende uma primeira variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação e uma segunda variante de um polipeptídeo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, em que a variante compreende uma ou mais mutações selecionadas do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana e contanto que a variante não contém quaisquer mutações adicionais no domínio Fc que altera a ligação da variante ao receptor de Fc neonatal (FcRn) e em que a segunda variante não compreende uma mutação em um resíduo de aminoácido selecionado do grupo correspondente a E430X, E345X, S440Y e S440W, tal como E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y e S440W na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana.

[00464] Nas formas de realização, em que a segunda variante não compreende qualquer uma das mutações listadas acima descritas, tal segunda variante pode incluir qualquer um dos exemplos do segundo anticorpo adequado listados acima em relação aos métodos das funções efetivas.

[00465] Em uma forma de realização, a pelo menos uma primeira mutação na primeira e a segunda variantes são diferentes.

[00466] Em uma forma de realização, a primeira variante e segunda variante é cada anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM ou IgE humano, opcionalmente cada anticorpo de comprimento total humano, tal como cada anticorpo de IgG1 de comprimento total humano.

[00467] Em uma forma de realização, a primeira variante e segunda variante é cada uma selecionada de um anticorpo monoespecífico, anticorpo biespecífico ou multiespecífico.

[00468] Ainda em uma forma de realização, a primeira e a segunda variante ligam-se aos epítopos diferentes no mesmo antígeno ou antígenos diferentes. Deste modo, na forma de realização, em que o primeiro e o segundo anticorpo são anticorpos biespecíficos podem ligar-se a cada dois epítopos diferentes. A pelo menos dois anticorpos biespecíficos podem ser o mesmo ou diferente. Se os anticorpos biespecíficos são diferentes, o kit de partes para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia, deste modo, compreende o alvejamento até quatro epítopos diferentes no mesmo ou alvos diferentes.

[00469] Ainda em uma forma de realização, uma ou ambas da primeira variante e segunda variante é conjugada a um medicamento, toxina ou radiorrótulo, tal como em que uma ou ambas da primeira variante e segunda variante é conjugada a uma toxina por intermédio de um ligador.

[00470] Ainda em uma forma de realização, uma ou ambas da primeira variante e segunda variante é parte de uma proteína de fusão.

[00471] É considerado que qualquer uma da formas de realização de acordo com um aspecto de “mutante misturado” também pode ser compreendido em qualquer um do kit de partes para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia, formas de realização.

[00472] Em uma forma de realização, as variantes do primeiro e o segundo anticorpos precursores ligam-se aos antígenos expressados na mesma célula.

[00473] Em uma outra forma de realização, a variante do primeiro anticorpo precursor compreende uma substituição de aminoácido de K439 em um aminoácido selecionado de E e D.

[00474] Em uma outra forma de realização, a substituição de aminoácido em uma variante do primeiro anticorpo precursor é K439E.

[00475] Em uma outra forma de realização, a variante do segundo anticorpo precursor compreende uma substituição de aminoácido de S440 em um aminoácido selecionado de K e R.

[00476] Em uma outra forma de realização, a substituição de aminoácido em uma variante da variante do segundo anticorpo precursor é S440K.

[00477] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit de partes farmacêuticos para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia, que compreende a variante do primeiro polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor e uma variante do segundo polipeptídeo precursor ou anticorpo precursor de qualquer uma das formas de realização listadas acima.

[00478] Os kit de partes farmacêuticos para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia pode ser administrado por qualquer via e modo adequados. Em uma forma de realização, um kit de partes farmacêuticos para o uso simultâneo, separado ou sequencial na terapia, da presente invenção é parenteralmente administrado. O termo “parenteralmente administrado” como usado neste significa os modos de administração outros do que a administração enteral e tópica, usualmente pela injeção e inclui injeção epidermal, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinóide, intraespinhal, intracranial, intratorácico, epidural e intrasternal e infusão.

Combinações

[00479] Adicionalmente, a invenção fornece para uma preparação de um aspecto da variante de qualquer “mutante simples” ou forma de realização descrito acima, isto é, preparações que compreendem as cópias múltiplas da variante. A invenção também fornece para uma composição que compreende um aspecto da variante de qualquer “mutante simples” e forma de realização descrito acima, por exemplo, a composição farmacêutica. A invenção também fornece para o uso de qualquer tal variante “mutante simples”, preparação ou composição como um medicamento.

[00480] A invenção também fornece para as combinações das variantes, em que uma variante compreende pelo menos uma mutação de acordo com a invenção e uma variante compreende pelo menos uma outra mutação de acordo com a invenção, bem como preparações e composições farmacêuticas de tais combinações variantes e seu uso como um medicamento. Preferivelmente, as duas variantes ligam-se o mesmo antígeno ou aos antígenos diferentes tipicamente expressados na superfície da mesma célula, membrana celular, vírion e/ou outra partícula.

Conjugados

[00481] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00482] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma variante, em que a dita variante é conjugada a um medicamento, toxina ou radiorrótulo, tal como em que a variante é conjugada a uma toxina por intermédio de um ligador.

[00483] Em uma forma de realização a dita variante é parte de uma proteína de fusão.

[00484] Em um outro aspecto, a variante da invenção não é conjugada no terminal C a outra molécula, tal como a toxina ou rótulo. Em uma forma de realização, a variante é conjugada a outra molécula a outro local, tipicamente em um local que não interfere com formação de oligômero. Por exemplo, a variante de anticorpo pode, no outro local, ser ligado a um composto selecionado do grupo que consiste de uma toxina (incluindo um radioisótopo) um pró-medicamento ou um medicamento. Um tal composto pode provocar a morte das células alvos mais efetivas, por exemplo, na terapia contra câncer. A variante resultante é deste modo um imunoconjugado.

[00485] Deste modo, ainda em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo ligado ou conjugado a uma ou mais porções terapêuticas, tal como a citotoxina, um medicamento quimioterapêutico, uma citocina, um imunosupressor, e/ou um radioisótopo. Tais conjugados são referidos neste como “imunoconjugados” ou “conjugados de medicamento”. Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas sao referidos como “imunotoxinas".

[00486] Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é nocivo às células (por exemplo, mata). Os agentes terapêuticos adequados para a formação dos imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, diidróxi antracin diona, maitansina ou um análogo ou derivado deste, antibióticos de enediieno antitumores incluindo neocarzinostatina, caliqueamicinas, esperamicinas, dinemicinas, lidamicina, kedarcidina ou análogos ou derivados destes, antracicinas, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, antimetabólitos (tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracila, decarbazina, hidroxiuréia, asparaginase, gemcitabina, cladribina), agentes de alquilação (tal como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina; bem como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC1065 (também conhecido como rachelmicina) ou análogos ou derivados de CC-1065), dolastatina, pirrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepinas (PDBs) ou análogos destes, antibióticos (tal como dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, daunorubicina (antigamente daunomicina), doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), agentes anti-mitóticos (por exemplo, inibidores de tubulina) tal como monometil auriestatinaa E, monometil auriestatinaa F ou outros análogos ou derivados de dolastatina 10; inibidores de Histona desacetilase tal como os ácidos hidroxâmicos de tricostatina A, vorinostat (SAHA), belinostat, LAQ824 e panobinostat bem como as benzamidas, entinostat, CI994, mocetinostat e compostos do ácido alifático tal como fenilbutirato e ácido valpróico, inibidores de proteassomo tal como Danoprevir, bortezomib, amatoxins tal como -amantina, toxina de difteria e moléculas relacionadas (tal como cadeia A de difteria e fragmentos ativos destes e moléculas híbridas); toxina de ricina (tal como ricina A ou uma toxina de cadeia de ricina A desglicosilada), toxina de cólera, uma toxina semelhante a Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina de coqueluche, toxina de têtano, inibidor de protease de soja Bowman-Birk, exotoxina Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidores de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e toxinas de enomicina. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem os peptídeos antimicrobianos/líticos tal como CLIP, Magainina 2, melitina, Cecropina e P18; ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina A de Staphylococcal, proteína antiviral uva-de-rato, toxina de difteria e endotoxina de Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) e Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Os agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com um anticorpo da presente invenção como descrito em outra parte neste, tal como, por exemplo, citocinas anti-câncer ou quimiocinas, também são candidatos para as porções terapêuticas úteis para a conjugação a um anticorpo da presente invenção.

[00487] Em uma forma de realização, os conjugados de medicamento da presente invenção compreendem um anticorpo como descrito neste conjugado as auriestatinas ou análogos de peptídeo de auriestatina e derivados (U.S.5635483; U.S.5780588). As auriestatinas foram mostradas para interferir com as dinâmicas de microtúbulo, hidrólise GTP e divisão celular e nuclear (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) e tem atividade anti-câncer (US5663149) e anti-fúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965. A porção de medicamento de auriestatina pode ser ligada ao anticorpo por intermédio de um ligador, através do terminal N (amino) ou o C (terminal) da porção de medicamento peptídico.

[00488] As formas de realização de auriestatina exemplares incluem as porções de medicamento de monometil auriestatina ligado pelo terminal N DE e DF, descrito em Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, número de resumo 623, apresentado em 28 de Março de 2004 e descrito no U.S. 2005/0238649).

[00489] Uma forma de realização de auriestatina exemplar é MMAE (monometil auriestatina E). Outra forma de realização de auriestatina exemplar é MMAF (monometil auriestatina F).

[00490] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende um ácido nucléico conjugado ou molécula associada pela ácido nucléico. Em uma tal forma de realização, o ácido nucléico conjugado é uma ribonuclease citotóxica, um ácido nucléico anti-sentido, uma molécula de RNA inibidor (por exemplo, uma molécula siRNA) ou um ácido nucléico imunoestimulador (por exemplo, uma molécula de DNA contendo o motivo CpG imunoestimulador). Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção é conjugado a um aptâmero ou uma ribozima.

[00491] Em uma forma de realização, os anticorpos compreendem um ou mais aminoácidos radiorrotulados são fornecidos. Uma variante radiorrotulada pode ser usada pelos propósitos tanto diagnósticos quanto terapêuticos (moléculas radiorrotuladas a conjugação é outra característica possível). Os exemplos não limitantes dos rótulos para os polipeptídeos incluem 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc e 125I, 131I e 186Re. Os métodos para a preparação dos aminoácidos radiorrotulados e derivados de peptídeo relacionados são conhecidos na técnica, (ver, por exemplo, Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2° Ed., Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e U.S. 4.681.581, U.S. 4.735.210, U.S. 5.101.827, U.S. 5.102.990 (US RE35.500), U.S. 5.648.471 e U.S. 5.697.902. Por exemplo. um radioisótopo pode ser conjugado pelo método T de cloramina.

[00492] Em uma forma de realização, a variante da presente invenção é conjugada a um radioisótopo ou a um quelado contendo radioisótopo. Por exemplo, a variante pode ser conjugada a um ligador quelante, por exemplo, DOTA, DTPA ou tiuxetano, que permite ao anticorpo seja complexado com um radioisótopo. A variante também pode ou alternativamente compreender ou é conjugado a uma ou mais aminoácidos radiorrotulados ou outra molécula radiorrotulada. Uma variante radiorrotulada pode ser usada tanto pelos propósitos diagnósticos quanto terapêuticos. Em uma forma de realização a variante da presente invenção é conjugada a um alfa-emissor. Os exemplos 3 14 15 35 90 99 125 11 -m 1 TQDT3C pr\c i-r»/¦» 111 ra-tvi ^1—I 1~' x -'-'x. y/ >> ¦ >-» não limitantes dos radioisótopos incluem H, C, N, S, Y, Tc, I, 111Ina, 131I, 186Re, 213Bs, 225Ac e 227Th.

[00493] Em uma forma de realização a variante da presente invenção pode ser conjugada a uma citocina selecionada do grupo que consiste de IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa, IFNß, IFNy, GM-CSF, CD40L, ligante Flt3, fator de célula tronco, ancestima e TNFa.

[00494] As variantes da presente invenção também pode ser quimicamente modificadas pela conjugação covalente a um polímero para aumentar por exemplo, a circulação de sua vida média. Os polímeros exemplares e métodos para ligá-los aos peptídeos, são ilustrados em por exemplo, U.S. 4.766.106, U.S. 4.179.337, U.S. 4.495.285 e U.S. 4.609.546. Os polímeros adicionais incluem polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, um PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000).

[00495] Qualquer método conhecido na técnica para a conjugação da variante da presente invenção ás moléculas conjugadas, tal como aquela descrita acima, pode ser utilizada, incluindo os métodos descritos por Hunter et al.,Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Tais variantes podem ser produzidas quimicamente pela conjugação de outra porção ao local do terminal N ou local do terminal C da variante ou fragmento deste (por exemplo, um anticorpo de cadeia H ou L) (ver, por exemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Tais derivados de variante conjugados também podem ser gerados pela conjugação nos resíduos internos ou açúcares, onde apropriado.

[00496] Os agentes podem ser ligados diretamente ou indiretamente a uma variante da presente invenção. Um exemplo da ligação indireta de um segundo agente é a ligação por intermédio de uma porção do espaçador ou ligador aos resíduos de cisteína ou lisina no anticorpo biespecífico. Em uma forma de realização, uma variante é conjugada a uma molécula de pró- medicamento que pode ser ativada in vivo a um medicamento terapêutico por intermédio de um espaçador ou ligador. Em algumas formas de realização, o ligador é clivável sob as condições intracelulares, tal que a clivagem do ligador libera a unidade de medicamento do anticorpo no ambiente intracelular. Em algumas formas de realização, o ligador é clivado por um agente clivável que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossomo ou endossomo ou caveola). Por exemplo, os espaçadores ou ligadores podem ser clivados pelas enzimas associadas pela célula de tumor ou outras condições especificas de tumor, pelo qual o medicamento ativo é formado. Os exemplos de tais tecnologias de pró- medicamento e ligadores são descritos no WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 e WO201062171 por Syntarga BV, et al. A tecnologia de pró-medicamento de anticorpo adequado e análogos de duocarmicina também podem ser observado na Patente U.S. N°. 6.989.452 (Medarex), incorporado neste por referência. O ligador também pode ou alternativamente ser, por exemplo, um ligador de peptidila que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima de protease, incluindo mas não limitado a, a protease lissosomal ou endossomal. E algumas formas de realização, o ligador de peptidila é pelo menos dois aminoácidos longos ou pelo menos três aminoácidos longos. Os agentes de clivagem podem incluir as catepsinas B e D e plasmina, todos de que são conhecidos para hidrolisar os derivados de medicamentos de dipeptídeo resultando na liberação do medicamento ativo dentro das células alvos (ver por exemplo, DubowchiK e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Em uma forma de realização específica, o ligador de peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligador Val-Cit (valina-citrulina) ou um ligador Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (ver por exemplo, US6214345, que descreve a síntese da doxorubicina com o ligador Val-Cit e exemplos diferentes dos ligadores de Phe-Lys). Os exemplos das estruturas de um ligador Val-Cit e Phe-Lys incluem mas não são limitados a MC-vc-PAB descrito abaixo, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys- PAB ou MC-Phe-Lys-GABA, em que MC é uma abreviação para caproil maleimido, vc é um abreviação para Val-Cit, PAB é uma abreviação para p- aminobenzilcarbamato e GABA é uma abreviação para ácido y- aminobutírico. Uma vantagem do uso da liberação proteolítica do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades do soro dos conjugados são tipicamente altos.

[00497] Ainda em outra forma de realização, a unidade do ligador não é clivável e o medicamento é liberado pela degradação de anticorpo (ver US 2005/0238649). Tipicamente, um tal ligador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Como usado neste, “não substancialmente sensível ao ambiente extracelular” no contexto do ligador significa que não mais do que 20%, tipicamente não mais do que cerca de 15%, mais tipicamente não mais do que cerca de 10% e ainda mais tipicamente não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 3% ou não mais do que cerca de 1% dos ligadores, em uma amostra do composto do conjugado de medicamento variável de anticorpo, são clivados quando um composto do conjugado de medicamento variável de anticorpo apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, plasma). Se um ligador não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado por exemplo, pela incubação de um composto do conjugado de medicamento variável de anticorpo com plasma por um período de tempo pré-determinado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e então quantificação da quantidade do medicamento livre presente no plasma. As formas de realização exemplares que compreendem MMAE ou MMAF e vários componentes do ligador tem as seguintes estruturas (em que Ab significa o anticorpo e p, representando o carregamento do medicamento (ou número médio dos medicamentos citostáticos ou citotóxicos por molécula de anticorpo), é 1 a cerca de 8, por exemplo, p pode ser de 4-6, tal como de 3-5 ou p pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8).

[00498] Os exemplos onde um ligador clivável é combinado com uma auriestatina inclui MC-vc-PAB-MMAF (também indicado como vcMMAF) e MC-vc-PAB-MMAF (também indicado como vcMMAE), em que MC é uma abreviação para caproil maleimido, vc é uma abreviação para o ligador com base em Val-Cit (valina-citrulina) e PAB é uma abreviação para p- aminobenzilcarbamato.

[00499] Outros exemplos incluem auriestatinas combinadas cim um ligador não clivável, tal como mcMMAF (mc (MC é o mesmo como mc neste contexto) é uma abreviação de caproil maleimido).

[00500] Em uma forma de realização, a porção do ligador de medicamento é vcMMAE. A porção do ligador de medicamento vcMMAE e métodos de conjugação são descritos no WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 e US 11/833,028 (Seattle Genetics, Inc.), (que são incorporados neste por referência) e a porção do ligador de medicamento vcMMAE é ligada aos anticorpos nas cisteínas usando um método similar aquele descrito neste.

[00501] Em uma forma de realização, a porção do ligador de medicamento é mcMMAF. A porção do ligador de medicamento mcMMAF e métodos de conjugação são descritos em US7498298, US 11/833,954 e WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), (que são incorporados neste por referência) e a porção do ligador de medicamento mcMMAF é ligada as variantes nas cisteínas usando um método similar aquele descrito neste.

[00502] Em uma forma de realização, a variante da presente invenção é ligada a um ligador quelante, por exemplo, tiuxetano, que permite para o anticorpo biespecífico ser conjugado a um radioisótopo.

[00503] Em uma forma de realização, cada membro (ou membro Fab) da variante é ligado diretamente ou indiretamente a mesma uma ou mais porções terapêuticas.

[00504] Em uma forma de realização, apenas um membro da variante é ligado diretamente ou indiretamente a uma ou mais porções terapêuticas.

[00505] Em uma forma de realização, cada membro da variante é ligado diretamente ou indiretamente as porções terapêuticas diferentes. Por exemplo, nas formas de realização onde a variante é um anticorpo biespecífico e é preparada pela troca de membro de Fab controlado de dois anticorpos monoespecíficos diferentes, por exemplo, um primeiro e um segundo anticorpo, como descrito neste, tais anticorpos biespecíficos podem ser obtidos pelo uso dos anticorpos monoespecíficos que são conjugados ou associados com porções terapêuticas diferentes.

Usos adicionais

[00506] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00507] Ainda em um aspecto, a invenção refere-se a uma variante da invenção como descrito acima para o uso como um medicamento, em particular para o uso como um medicamento para o tratamento das doenças ou distúrbios, em que a morte mediada por CDC de uma célula alvo (por exemplo, um tumor, célula bacteriana ou fúngica) ou organismo alvo (por exemplo, um vírus) é desejado ou uma célula infectada pelo vírus ou bactéria. Os exemplos de tais doenças e distúrbios incluem, sem limitação, câncer ou bactéria, infecções fúngicas ou virais.

[00508] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se as variantes, anticorpos biespecíficos, composições e kit de partes descritos aqui, para tratamento de uma doença, tal como câncer.

[00509] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratamento de um humano que compreende administração de uma variante, uma composição ou um kit de partes descritos aqui.

[00510] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratamento de câncer em um humano que compreende administração de uma variante, uma composição ou um kit de partes.

[00511] O “tratamento” refere-se a administração de uma quantidade efetiva de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com o propósito de facilitar, melhorar, impedir ou erradicar sintomas (cura) ou estatus da doença.

[00512] Uma "quantidade efetiva" ou “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade efetiva, nas dosagens e para os períodos de tempo necessários, para atingir um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo pode variar de acordo com os fatores tal como o status da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo para extrair uma resposta desejada no indivíduo. A quantidade terapeuticamente efetiva é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo ou porção de anticorpo são superados pelo efeitos terapeuticamente benéficos.

[00513] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma variante, uma composição ou kit de partes de acordo com qualquer uma das formas de realização descritas neste para o uso em um método diagnóstico.

[00514] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método diagnóstico que compreende administrar uma variante, uma composição ou um kit de partes de acordo com quaisquer formas de realização descritas neste a pelo menos do corpo de um humano ou outro mamífero.

[00515] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de uma variante, uma composição ou kit de partes de acordo com qualquer uma das formas de realização descritas neste não formou imagem de pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero.

[00516] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para formar imagem de pelo menos uma parte do corpo de um humano ou outro mamífero, que compreende administrar uma variante, uma composição ou um kit de partes de acordo com quaisquer formas de realização descritas neste.

[00517] Sem estar ligado pela teoria, a quantidade efetiva do composto terapeuticamente ativo pode ser diminuído quando qualquer aspecto de “mutante simples” ou forma de realização de acordo com a presente invenção é introduzida em um tal composto terapeuticamente ativo.

[00518] Os antígenos para os anticorpo contra o câncer podem ser o mesmo como descrito neste. Os exemplos 15 a 18 descrevem as aplicações específicas para fornecer um ativação de complemento intensificado e/ou mais específico ou CDC das células tumorais. Por exemplo, um anticorpo anti-tumor de acordo com um aspecto de “mutante simples”, que compreende, por exemplo, uma mutação E345R, pode fornecer para um CDC ou ADCC intensificado, resposta ADCP das células tumorais. Ainda, em uma variante deste método, uma mutaçãode acordo com um aspecto de “mutante simples”, tal como, por exemplo, E345R, E430, ou S440S/Wou qualquer outra mutação é listada na Tabela 1, pode ser adicionada em cada anticorpo, deste modo fornecendo para uma resposta CDC e/ou ADCC intensificada especificamente direcionada as células tumorais que expressam pelo menos dois antígenos.

[00519] Os anticorpos adequados para as infecções bacterianas incluem, sem limitação, aqueles que alvejam S. aureus, tal como o IgG1 pagibaximab monoclonal quimérico (BSYX-A110; Biosynexus), ácido Lipoteicóico de alvejamento (LTA) que é incorporado na parede celular de staphylococci e descrito no Baker (Nat Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1491-3) e Weisman et al. (Int Immunopharmacol. 2009 May;9(5):639-44), ambos de que são incorporados por referência em sua totalidade. O exemplo 14 descreve uma forma de realização específica usando variantes de anticorpo S. aureus que compreendem uma mutação E345R. Entretanto, outras mutações na Tabela 1, incluindo mas não limitado a E430G eS440W, pode ser aplicado em uma maneira similar para intensificar a capacidade que media CDC de um anticorpo contra um antígeno bacteriano.

[00520] Os antígenos adequados para as infecções virais ou fúngicas podem ser qualquer uma das descritas neste.

[00521] Em uma forma de realização, o antígeno no qual uma variante liga-se não é EphA2 humano. Em uma outra forma de realização, a variante não é derivada de EphA2 mAb 12G3H11 humano (descrito no Dall’Acqua et al., supra, que é incorporado neste por referência em sua totalidade). Em uma outra forma de realização, o antígeno no qual uma variante liga-se não é IL-9. Em uma outra forma de realização, a variante não é derivada do anticorpo Fa- hG1 ou Fa-hG4 descrito no WO2007005612, portanto incorporado por referência em sua totalidade ou qualquer variante deste. Em uma forma de realização, o antígeno no qual a variante liga-se não é HIV-1 gp120. Em uma outra forma de realização, a variante não é derivada do anticorpo b12 IgG1K humano direcionado contra o gp120.

[00522] Em uma forma de realização particular, a variante deriv-ase de um precursor de anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico pode ser de qualquer isotipo, tal como, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 e pode ser um anticorpo de comprimento total ou um fragmento contendo Fc deste. Um método exemplar para a preparação de um anticorpo biespecífico é descrito no WO 2008/119353 (Genmab).

Dosagens

[00523] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação. As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para o anticorpo dependente da doença ou condição a ser tratada e pode ser determinada pelas pessoas habilitadas na técnica. Uma faixa não limitante exemplar para uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo da presente invenção é cerca de 0,1 a 100 mg/kg, tal como cerca de 0,1 a 50 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,1 a 20 mg/kg, tal como cerca de 0,1 a 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,5, cerca de tal como 0,3, cerca de 1, cerca de 3, cerca de 5, ou cerca de 8 mg/kg.

[00524] As variantes de anticorpo da presente invenção também podem ser administrados em combinação com um ou mais fatores de complemento ou componentes relacionados para intensificar a eficácia terapêutica da variante e/ou para compensar o consumo do complemento. Tais fatores de complemento e componentes relacionados incluem, mas não são limitados a, C1q, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9, MBL e fator B. A administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial. Em uma forma de realização particular, a invenção fornece para um kit que compreende a composição farmacêutica que compreende uma variante da invenção e pelo menos um fator de complemento ou componente relacionado no mesmo ou composição farmacêutica diferente, junto com as instruções para o uso.

[00525] As variantes de anticorpo da presente invenção também podem ser administradas na terapia de combinação, isto é, combinada com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Consequentemente, em uma forma de realização, o medicamento contendo anticorpo é para a combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou anti- angiogênicos. Tal administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial.

[00526] Ainda em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção da doença, tal como câncer, cujo método compreende administração a um paciente em necessidade deste da quantidade terapeuticamente efetiva de uma variante ou composição farmacêutica da presente invenção, em combinação com radioterapia e/ou cirurgia.

Método de preparação

[00527] Deve ser entendido que todas as formas de realização descritas aqui com referência a um anticorpo precursor, primeiro anticorpo precursor ou segundo anticorpo precursor também pode ser aplicável a outro precursor, primeiro precursor ou segundo polipeptídeos precursores que compreendem um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação.

[00528] A invenção também fornece os ácidos nucléicos isolados e vetores que codificam uma variante de acordo com qualquer um dos aspectos descritos acima, bem como vetores e sistemas de expressão que codificam as variantes. As construções do ácido nucléico adequadas, vetores e sistemas de expressão para os anticorpos e variantes destes são conhecidos na técnica e descritos nos exemplos. Nas formas de realização onde a variante compreende não apenas uma cadeia pesada (ou fragmento contendo Fc deste) mas também uma cadeia leve, as sequências de nucleotídeo que codificam as porções da cadeia leve e pesada podem estar presente no mesmo ou ácidos nucléicos ou vetores diferentes.

[00529] A invenção também fornece um método para produzir, em uma célula hospedeira, uma variante de anticorpo de acordo com qualquer um dos aspectos descritos acima, em que a dita variante compreende pelo menos a região Fc de uma cadeia pesada, o dito método que compreende as seguintes etapas: a) fornecer uma construção de nucleotídeo que codifica a dita região Fc da dita variante, b) expressar a dita construção de nucleotídeo em uma célula hospedeira, e c) recuperar a dita variante de anticorpo a partir da cultura celular da dita célula hospedeira.

[00530] E algumas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo de cadeia pesada. Em mais formas de realização, entretanto, o anticorpo também conterá uma cadeia leve e deste modo a dita célula hospedeira ainda expressa uma construção que codifica a cadeia leve, no mesmo ou um vetor diferente.

[00531] As células hospedeiras adequadas para a expressão recombinante dos anticorpos são bem conhecidos na técnica e incluem as células CHO, HEK-293, PER-C6, NS/0 e Sp2/0. Em uma forma de realização, a dita célula hospedeira é uma célula que é capaz da glicosilação ligada por Asndas proteínas, por exemplo, uma célula eucariótica, tal como uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de humano. Ainda em uma forma de realização, a dita célula hospedeira é uma célula não humana que é geneticamente projetada para produzir as glicoproteínas tendo glicosilação humana ou semelhante a humana. Os exemplos de tais células são Pichia pastoris geneticamente modificados (Hamilton et al., Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318-325) e Lemna minor geneticamente modificado (Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597).

[00532] Em uma forma de realização, a dita célula hospedeira é uma célula hospedeira que não é capaz de remover eficientemente os resíduos de lisina K447 de terminal C a partir das cadeias pesadas de anticorpo. Por exemplo, a tabela 2 em Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426 (incorporado neste por referência) lista um número de tais sistemas de produção de anticorpo, por exemplo, Sp2/0, NS/0 ou glândula mamária transgênica (cabra), em que apenas a remoção parcial das lisinas de terminal C é obtida. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula hospedeira com maquinário de glicosilação alterado. Tais células foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras no qual para expressar as variantes da invenção portanto para produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, bem como EP1176195; WO03/035835; e WO99/54342. Os métodos adicionais para gerar as glicoformas projetadas são conhecidos na técnica e incluem mas não são limitados aqueles descritos no Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473), US6602684, WO00/61739A1; WO01/292246A1; WO02/311140A1; WO 02/30954A1; Potelligent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnologia de engenharia de glicosilação de GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.

[00533] A invenção também refere-se a um anticorpo obtido ou obtenível pelo método da invenção descrito acima.

[00534] Ainda em um aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira capaz de produzir uma variante de anticorpo da invenção. Em uma forma de realização, a célula hospedeira foi transformada e transfectada com uma construção de nucleotídeo da invenção.

[00535] A presente invenção ainda é ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitantes adicionais.

EXEMPLOS Exemplo 1 Projeto e geração de mutantes 7D8

[00536] O anticorpo monoclonal humano HuMab-7D8 (descrito em WO 2004/035607) foi usado como um anticorpo modelo. Este pertence a um grupo de anticorpos IgG1 anti-CD20 humano, incluindo atumumab (HuMax- CD20, 2F2). Estes anticorpos alvejam um epítopo proximal de membrana única na molécula CD20 e mostrou CDC forte.

[00537] Para testar a relevância funcional de interações de Fc-Fc oligoméricas na ativação de complemento e CDC, aminoácidos no caminho hidrofóbico na interface Fc:Fc foram mutados para interromper potencialmente a interação no lado de Fc-Fc e a eficácia de CDC de 7D8. Em uma primeira série de mutantes (Tabela 3), as mutações foram introduzidas para mudar as cargas nas posições que foram escolhidas com base na estrutura de cristal 1HZH e descritas serem expostas em caminhos hidrofóbicos no domínio de CH2-domínio de CH3 (Burton Mol Immunol 1985 Mar;22(3):161-206)).

[00538] A partir da primeira série de mutações, I253D e H433A foram observados induzir o efeito mais forte na perda de CDC por 7D8 (por exemplo, Exemplo 5). A estrutura cristalina de 1HZH mostra que I253 e H433 ligam dois bolsos diferentes nas posições de abertura de Fc do anticorpo de associação. Com base nestes dados, uma segunda série de mutações foi sintetizada em torno das posições I253 e H433 na estrutura cristalina para ainda estudar a importância dos resíduos na interface do lado de Fc:Fc para CDC. A segunda série de mutações em torno das posições I253 e H433 que potencialmente desestabilizam a interface de Fc:Fc e consequentemente CDC são listados na Tabela 4.

[00539] Para excluir a possibilidade que a interrupção de locais de ligação diretos para C1q foram a causa dos efeitos observados em CDC, um mutante duplo foi gerado com base em dois mutantes simples que mostraram a perda de CDC, para testar sua capacidade de restaurar a perda de CDC pelos mutantes simples. Este princípio é quimicamente representado na Figura 1D. O mutante duplo é listado na Tabela 5 e uma representação estrutural é mostrada na Figura 4 e Figura 5.

[00540] Os mutantes foram preparados usando-se o kit de mutagênese direcionado ao local Quikchange (Stratagene, US). Resumidamente, um iniciador avançado e um reverso que codifica a mutação desejada foi usado para replicar o padrão de DNA de plasmídeo de comprimento total que codifica a cadeia pesada de 7D8 com o alotipo IgG1m(f). A mistura de DNA resultante foi digerida suando-se DpnI para remover o DNA de plasmídeo da fonte DNA e usado para transformar E. coli. O DNA de plasmídeo mutante isolado das colônias resultantes foi verificado pelo sequenciamento de DNA (Agowa, Germany). As misturas de DNA de plasmídeo que codificam tanto a cadeia pesada quanto a leve de anticorpos foram transitoriamente afetadas para as células Freestyle HEK293F (Invitrogen, US) usando-se 293fectin (Invitrogen, US) essencialmente como descrito pelo fabricante. Tabela 3: Mutações Série 1 introduzidas no domínio de CH2-CH3 de 7D8. Tabela 4: Mutações Série 2 introduzidas no Domínio CH2-CH3 de 7D8. Tabela 5: Mutações duplas introduzidas no domínio de CH2-CH3 de 7D8 para combinar duas mutações simples cada uma mostrando perda de CDC.

Exemplo 2 Ligação de CD20 nas células por mutantes 7D8

[00541] A ligação de amostras de anticorpo purificadas a células positivas CD20 foi analisada pela análise de FACS. A 1° série de mutações (Tabela 3) foi testada em células Daudi cells e a segunda série de mutações (Tabela 4) foi testada e células Raji. 105 células foram incubadas em 50 µl em placas de fundo redondo de 96 reservatórios de poliestireno (Greiner bio-one 650101) com diluições seriais de preparações de anticorpo (faixa de 0,04 a 10 µg/ml em diluições triplas para a 1° série em Daudi e faixa de 0,003 a 10 µg/ml em diluições triplas para a 2° série em Raji) em RPMI1640/0,1% de BSA a 4° C por 30 minutos. após lavar duas vezes em RPMI1640/0,1% de BSA, as células foram incubadas em 100 µl com anticorpo secundário a 4° C por 30 minutos. Como um anticorpo secundário, IgG anti-humano de coelho conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (F0056, Dako, Glostrup, Denmark; 1/100) foi usado para todos os experimentos em células Daudi e para os experimentos com anticorpos 7D8 em células Raji. Para os experimentos com anticorpos 7D8 em células Raji, cadeia leve de capa antihumana F(ab’)2 de cabra conjugada com R-ficoeritrina (R-PE) (2062-09, SouthernBiotech; 1/500) foi usada como um anticorpo secundário. A seguir, as células foram lavadas duas vezes em PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida, recolocadas em suspensão em 100 µl PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida e analisadas em um FACS Cantoll (BD Biosciences). As curvas de ligação foram analisadas usando-se regressão não linear (resposta de dose sigmoidal com inclinação variável) usando-se o software GraphPad Prism V5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

[00542] A ligação do anticorpo 7D8 às células Daudi não foi afetada pela introdução das mutações de ponto no domínio de CH2-CH3 e foi idêntico a todos os mutantes testados e 7D8 tipo selvagem. Além disso, a ligação de anticorpo 7D8 às células Raji não foi significantemente afetada pela introdução das mutações de ponto no domínio de CH2-CH3 em comparação com o 7D8 tipo selvagem, exceto para E345R. A ligação diminuída de IgG1-7D8-E345R foi detctado em células Raji positivas CD20 em concentrações testadas acima de 0,3 µg/ml. Também para H433D e H433R, a ligação diminuída foi detectada na concentração de anticorpo mais alta testada (10 µg/ml). A ligação diminuída por IgG1-7D8-E345R, H433D e H433R pode ser explicada pela proteção do anticorpo secundário, visto que a rotulação direta de E345R e H433R resultou na ligação similar ou ainda ligação aumentada às células Daudi. A avidez aumentada pode ser explicada pela ligação do lado Fc-Fc por E345R and H433R em comparação com o IgG1-7D8 tipo selvagem.

[00543] A combinação das mutações de K439E e S440K não afetaam a ligação do anticorpo 7D8 às células Raji e foi idêntica àquela dos mutantes simples e 7D8 tipo selvagem.

Exemplo 3 Ligação de C1q ELISA por mutantes 7D8

[00544] A ligação de C1q pelos mutantes 7D8 foi testada em um ELISA, em que os anticorpos purificados foram revestidos na superfície plástica, realizando a multimerização de anticorpo aleatória. O soro humano unido foi usado como uma fonte de C1q.

[00545] Placas Microlon ELISA de 96 reservatórios (Greiner, Germany) foram revestidos durante a noite a 4° C com uma diluição serial dos anticorpos em PBS (faixa de 0,58 a 10,0 µg/ml em diluições de 1,5 vez). As placas foram lavadas e bloqueadas com 200 µl/reservatório de 0,5x PBS suplementado com 0,025% de Tween 20 e 0,1% de gelatina. Com lavagens entre as incubações, as placas foram incubadas sequencialmente com soro humano unido a 3% (Sanquin, produto# M0008) por 1 hora a 37° C, com 100 µl/reservatório de C1q anti-humano de coelho C1q (DAKO, produto# A0136, 1/4.000) por 1 hora em temperatura ambiente e com 100 µl/reservatório de IgG-HRP anti-coelho suíno (DAKO, P0399, 1:10.000) quando detecta-se o anticorpo por 1 hora em temperatura ambiente. O desenvolvimento foi realizado por cerca de 30 minutos com 1 mg/ml de 2,2’-azino-bis (ácido 3- etilbenzotiazolino-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany). A reação foi interrompida pela adição de 100 µl de ácido oxálico a 2%. A absorbência foi medida a 405 nm em um leitor de microplaca (Biotek, Winooski, VT). Os dados transformados em Log foram analisados pelo ajuste pela adaptação das curvas de resposta de dose sigmoidal com inclinação variável usando-se o software GraphPad Prism. Os valores EC50 dos mutantes foram normalizados por placa contra o IgG1-7D8 do tpo selvagem e multiplicado pela média de todos os dados IgG1-7D8 do tipo selvagem.

[00546] Como mostrado na Figura 6 e Tabela 6, as mutações de ponto testadas têm efeito mínimo na ligação de C1q como medido por ELISA. Para o mutante IgG1-7D8-I253D, uma ligação levemente menos eficiente de C1q foi medido em ELISA (valor de EC50 mai alto). A eficácia de revestimento foi testada para todos os anticorpos e foi observada ser similar a todos os anticorpos. Tabela 6: EC50 para a ligação de C1q em ELISA

Exemplo 4 Ligação de C1q em células por mutantes 7D8

[00547] O revestimento de anticorpos em uma superfície plástica resulta em um sistema estático artificial de ligação de anticorpo e apresentação de cauda Fc. Portanto, a ligação de complemento também foi testada em um ensaio com base em células, em que a ligação de C1q às células B positivas de CD20 opsonizadas por anticorpo foi medido pela análise de FACS. No experimentos com os mutantes da série 1, células Daudi ou Raji foram colocados em suspensão em gelo em 90 µl de meio RPMI 1640 com 10% de FBS (2 x 106 células/ml). 10 µl de uma série de concentração de C1q (Complement Technologies, Tyler, TX) foi adicionado (a faixa de concentração final varia entre 0-60 µg/ml e 0-140 µg/ml dependendo da ligação máxima). Então, 10 µl de anticorpo purificado (concentração final de 10 µg/ml, isto é, consições de saturação) foram adicionados e as misturas de reação foram imediatamente transferidos a um banho de água a 37° C e incubado por 1 hora. Nos experimentos com mutantes série 2, o mAb do teste foi adicionados às células Daudi em volume, então, as concentrações variantes de C1q foram adicionadas a alíquotas e as misturas incubadas como acima. As células foram lavadas três vezes com PBS/1% de BSA e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com anticorpo anti-C1q rotulado com FITC de coelho (DakoCytomation, 10 ug/ml). As células foram lavadas com PBS/1%BSA e recolocadas em suspensão em PBS ou fixado em 2% de formaldeído em PBS. A citometria de fluxo foi realizada em um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences) e as intensidades de fluorescência médias foram convertidas a moléculas de fluorescência solúvel equivalente (MESF) usando-se pérolas calibradas (Spherotech).

[00548] As constantes de dissociação (valores KD) para a ligação de C1q às células positivas CD20 opsonizadas com os anticorpos 7D8 indicados foram calculadas usando-se o software SigmaPlot® (Systat Software Inc., Washington). Os valores de KD médios foram calculados a partir dos experimentos de ligação repetidos (4 vezes em células Daudi, 3 vezes em células Raji) e comparado com o valor KD para a ligação de C1q em células opsonized com 7D8 tipo selvagem (Tabela 7 e Tabela 8).

[00549] Os mutantes da série 1 foram testados tanto em células Daudi quanto Raji e deram os mesmos resultados. Em contrasto com os resultados de ELISA de C1q, a maioria dos mutantes testados mostraram avidez de ligação de C1q diminuída (KD aumentado) tanto em células de Daudi (Tabela 7A) e Raji (Tabela 8) opsonizadas com anticorpo. Em comparação com o 7D8 tipo selvagem, IgG1-7D8-Q311A e H435A mostoru pouca a nenhuma diminuição, I253A, I253Y e N434A uma diminuição mais pronunciada e I253D and H433A, uma diminuição muito drástica em avidez de ligação de C1q em células Daudi ou Raji opsonizadas. IgG1-7D8-H435R mostraram uma avidez levemente mais alta (KD menor) para a ligação de C1q do que o 7D8 do tipo selvagem em ambos os tipos celulares, que, entretanto, não foi significante.

[00550] Os mutantes da série 2 foram testados em células Daudi. Em comparação com 7D8 tipo sevagem, IgG1-7D8-E345R, E382R e H433R mostrou avidez de ligação aumentada em células Daudi opsonizadas, refletidas pelos valores KD inferiores (Tabela 7B). todos os outros mutantes da Série 2 mostraram avidez de ligação diminuída ao 7D8 tipo selvagem, com G385D, Y436D, Q438D, K439E e S440K mostrando valores de KD drasticamente aumentados (Tabela 7B) e H433D e Y436C que mostra uma tal ligação drasticamente reduzida que nenhum valor de KD confiável pode ser medido.

[00551] O mutante duplo IgG1-7D8-K439E/S440K mostrou a ligação de C1q restaurada em células Daudi opsonizada por anticorpo, enquanto ambos os mutantes simples mostraram ligação de C1q diminuída em comparação com o 7D8 do tipo selvagem. A avidez de ligação do mutante duplo K439E/S440K foi ainda levemente aumentada em comparação com 7D8 do tipo selvagem (Tabela 7C). As misturas de mutantes simples IgG1- 7D8-K439E e IgG1-7D8-K440E foram capazes de restaurar completamente a ligação de C1q que foi comparável com a ligação de C1q de 7D8 do tipo selvagem (Tabela 7C).

[00552] A discrepância entre a ligação de C1q não mudada no ELISA (Exemplo 3) e a ligação de C1q afetada no ensaio com base celular pelos IgG1-mutantes 7D8, mostram que as posições de CH3 testadas que estão envolvidas na interação de Fc:Fc entre as moléculas de anticorpo, não influenciam a ligação de C1q diretamente, mas são determinantes importantes que afetam o posicionamento de caudas de Fc de anticorpo quando ligado em células e, desse modo, também a força de ligação de C1q. Tabela 7A: Os valores KD para a ligação de C1q a células Daudi opsonizadas por anticorpo (mutantes série 1) Tabela 7B: Valores KD para a ligação de C1q às células Daudi opsonizadas por anticorpo (mutantes série 2) Tabela 7C: Valores KD para a ligação de C1q às células Daudi opsonizada por anticorpo (mutante duplo)

Exemplo 5 Eficácia de C1q para os mutantes 7D8 em um ensaio de CDC em células Raji positivas CD20

[00553] A eficácia de C1q usando-se células opsonizadas com os mutantes IgG1 7D8 foi testada em um ensaio de CDC para invetigar o impacto das mudanças observadas em avidez de ligação de C1q n atividade de CDC. Portanto, um ensaio de CDC foi realizado usando-se soro humano normal desprovido de C1q que foi suplementado com uma série de concentração definida de C1q. 0,1 x 106 células Raji foram pré-incubadas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo (Nunc, Rochester, NY) com anticorpo purificado com 10 µg/ml e uma série de concentração de C1q humano (0,005, 0,025, 0,1, 0,3, 1,0, 5,0, 30,0 µg/ml) em temperatura ambiente por 15 minutos em um volume total de 100 µL de meio RPMI1640, suplementado com 0,1% de BSA. A seguir, 25 µL de soro desprovido de C1q (Quidel, San Diego, CA) foi adicionado e incubado a 37° C em um banho de água por 30 minutos ou em uma incubadora por 45 minutos. Após a incubação, a reação foi interrompida pela colocação das amostras em gelo, a lise celular foi determinada em FACS usado-se ensaio de exclusão celular viável de iodeto de propídio (PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands). A% da lise foi determinada como segue:% da lise = (número de células PI pos / número total de células) x 100%.

[00554] A lise pory 7D8 do tipo selvagem na presença de 30 µg/ml C1q menos a lise quando nenhum C1q foi adicionado, foi fixado a 100%. Os valores CH50 (a concentração de C1q resultante em 50% de lise) foram calculados a partir da adaptação de curvas de resposta de dose sigmoidal em dados transformados em log Software GraphPad Prism. Os valores de CH50 dos mutantes foram normalizados para 7D8 do tipo selvagem (Tabela 9).

[00555] Os dados da Tabela 9 mostram que, de acordo com as medições de avidez de ligação de C1q, IgG1-7D8-Q311A, E382R e H435A não mostraram diminuição na eficácia de C1q; I253A, I253Y, G385D, N434A e Y436C uma diminuição significante na eficácia de C1q e I253D, H310K, K322A, H433A, H433D, Y436D, Q438D, K439E e S440K perdem quase completamente a capacidade de induzir CDC com todas as concentrações de C1q testadas.

[00556] IgG1-7D8-H435R e H433R usaram C1q mais levemente eficiente resultando em CDC mais eficiente do que 7D8 do tipo selvagem. IgG1-7D8-E345R mostrou uma diminuição drástica na eficácia de C1q, que resultou em lise de CDC significantemente mais alta em comparação com 7D8 do tipo selvagem (Tabela 9).

[00557] A Figura 7 mostra que a combinação da mutação de K439E e S440K, ambos resultando na perda de CDC como um mutante simples, CDC restaurado no ensaio de eficácia de C1q quando ambas as mutações foram combinadas em uma molécula (mutante duplo K439E/S440K) ou quando os ambos mutantes simples foram combinados (mistura K439E + S440K). Tabela 9: CH50 para a eficácia C1q em um ensaio de CDC em células Raji

Exemplo 6 CDC para mutantes 7D8 em um ensaio de CDC em células positivas CD20

[00558] 0,1 x 106 células foram pré-incubadas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo (Nunc, Rochester, NY) com séries de concentração de anticorpo (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em um volume total de 80 µL por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 20 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de C1q (concentração final a 20%) e incubado em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. a reação fo interrompida pela adição de 30 µl de meio de RPMI gelado, suplementado com 0,1% de BSA. A lise celular foi determinada em FACS usando-se iodeto de propídio.

[00559] Para os ensaios de CDC em células Daudi, os valores de EC50 (a concentração de anticorpo resultando em 50% de lise) foram calculadas a partir do ajuste de curvas de resposta de dose sigmoidal em dados transformados em log usando-se o Software GraphPad Prism. Os valores de EC50 dos mutantes foram normalizados a 7D8 do tipo selvagem (Tabela 10 e Tabela 11).

[00560] A Tabela 10 mostra que nas células Daudi, IgG1-7D8-I253A, Q311A, E382R, H433R e H435A não mostraram diferença em CDC em comparação com 7D8 do tipo selvagem; uma piora significante de CDC (EC50 maior) do que 7D8 do tipo selvagem foi observado para IgG1-7D8-I253D, I253Y, H310K, G385D, H433A, H433D, N434A, Y436C, Y436D, Q438D, K439E, S440K e I253D/H433A, que induziu apenas CDC em concentrações de anticorpo maiores; a ligação de mutante deficiente em C1q IgG1-7D8- K322A, que foi incluída como o controle, perde quase completamente a capacidade para induzir CDC e não atingir EC50 nas concentrações testadas; IgG1-7D8-H435R mostraram CDC mais eficiente do que 7D8 do tipo selvagem em células Daudi. Importantemente, de acordo com um ensaio de CDC com eficácia de C1q, E345R mostrou CDC drasticamente melhor CDC do que 7D8 do tipo selvagem com um valor de EC50 10 vezes menor de células Daudi (Tabela 10). A Figura 8 mostra que a combinação da mutação de K439E e S440K, ambos resultando na perda de CDC como um mutante simples, restaurou o CDC quando ambas as mutações foram combinadas em uma molécula (mutante duplo K439E/S440K) ou quando os ambos mutantes simples foram combinados (mistura de K439E + S440K).

[00561] A Tabela 11 mostra que os dados similares foram observados para os mutantes IgG1 7D8 em células Raji. Tabela 10: EC50 calculado a partir do ensaio de CDC em células Daudi Tabela 11: EC50 calculado a partir do ensaio de CDC em células Raji

Exemplo 7 Classificação de mutantes 7D8 de acordo com sua capacidade para induzir CDC

[00562] Para os mutantes de 7D8 testados 7D8, uma correlação foi observada entre ligação de C1q em células Daudi (descrito em Exemplo 4) e ensaios de eficácia de C1q em células Raji (descrito em Exemplo 5) e entre a ligação de C1q em células Daudi em ensaios de CDC em células de Daudi e Raji (descrito em Exemplo 6) (dados de correlação Tabela 13). Portanto, os valores KD da ligação de ensaios de C1q em células Daudi foram usadas para classificar todos os mutantes mutantes 7D8 testados de acordo com sua capacidade para induzir CDC, como mostrado nas Tabela 12. Tabela 12: Classificção de todos os mutantes 7D8 testados de acordo com os valores KD descendentes para a ligação de C1q em células Daudi, que serve como um representante para a sua capacidade para induzir CDC. Tabela 13: Correlação entre ligação de C1q em células Daudi (Exemplo 4) e ensaios de eficácia de C1q em células Raji (Exemplo 5) e entre a ligação de C1q em células Daudi e ensaios de CDC em células Daudi e Raji (Exemplo 06). Os dados foram transformados em log antes da correlação ser analisada.

Exemplo 8 Projeto e geração de mutantes 005 de anticorpo CD38

[00563] O anticorpo monoclonal humano HuMab 005 é um anticorpo IgG1,K totalmente humano9 descrito em WO/2006/099875. Aqui, foi usado como um anticorpo modelo para a validação das mutações Fc identificadas para intensificar a atividade de CDC. As mutações testadas são listadas na Tabela 14.

[00564] As construções de DNA para os mutantes diferentes foram preparados e transitoriamente transfectado como descrito no Exemplo 1, usando-se a cadeia pesada de HuMab 005 com o alotipo IgG1m(f) como um padrão para as reações de mutagênese. Tabela 14: Série de mutações que foram introduzidas no Domínio CH2-CH3 de 005 (HuMax-CD38).

Exemplo 9 Ligação de CD38 em células por mutantes de HuMab-005

[00565] A ligação de amostras de anticorpo não purificada a células Daudi e Raji positivas de CD38 foi analisado pela análise de FACS. 105 células foram incubadas em 100 µl em placas de fundo redondo de 96 reservatórios de poliestireno com diluições seriais de preparações de anticorpo (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em RPMI1640/0,1% de BSA a 4° C por 30 minutos. Após lavar duas vezes em RPMI1640/0,1% de BSA, as células foram incubadas em 50 µl com IgG anti-humano de coelho F(ab’)2 conjugado com FITC (cat. N°. F0056; DAKO; 1:150) a 4° C por 30 minutos. A seguir, as células foram lavadas duas vezes em PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida, recolocadas em suspensão em 100 µl PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida e analisadas em um FACS Cantoll (BD Biosciences). As curvas de ligação foram analisadas usando-se o software GraphPad Prism V5.01. como um controle negativo, o sobrenadante de células transfectadas com imitação foi usado.

[00566] A ligação de HuMab 005 às células Daudi não foi muito afetada pela introdução de mutações de ponto no domínio de CH2-CH3. Todos os anticorpos testados ligaram as células Daudi de uma maneira dependente de dose. A ligação foi similar ao HuMab-005 tipo selvagem para todos os mutantes testados, com a exceção de 005-E345R, que mostrou ligação levemente reduzida. Entretanto, sem estar ligado por qualquer teoria, a ligação inferior deve ser um resultado de ligação diminuída pelo anticorpo secundário, análogo a IgG1-7D8-E345 no Exemplo 2. A avidez de ligação real por 005-E345R deve ser similar ou ainda aumentada em comparação com 005-WT, entretanto não podemos confirmar isto por causa da perda de anticorpos diretamente rotulados.

[00567] A ligação de HuMab-005 a células Raji também não foi muito afetada pela introdução de mutações de ponto no domínio de CH2-CH3. Todas as células Raji ligadas aos anticorpos testados de uma maneira dependente de dose. A ligação máxima foi similar àquela do 005 tipo selvagem para os mutantes 005-I253D e H433A e menor para os mutantes 005-E435R, K439E, S440K e a combinação de 005-K439E + 005-S440K. Entretanto, sem estar ligado por qualquer teoria, a ligação inferior deve ser um resultado de ligação diminuída pelo anticorpo secundário, análogo a IgG1-7D8-E345R no exemplo 2 (proteção do epítopo).

Exemplo 10 Ensaio de CDC em células positivas CD38 pelos mutantes do anticorpo CD38 005

[00568] 0,1 x 106 células Daudi ou Raji foram pré-incubadas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos não purificados (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em um volume total de 100 µL por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de C1q (concentração final a 20%) e incubado em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. a reação foi interrompida pela colocação das placas em gelo. 10 µl de iodeto de propídio foram adicionados e a lise celular como determinado pelo FACS.

[00569] A capacidade intensificadora de CDC da mutação de E435R, que foi mostrado intensificar a atividade de CDC tanto em anticorpos 7D8 quanto 005 em células Daudi ou Raji, ainda foi analisada em células Wien133 com concentração diferente de soro humano normal (NHS). 0,1 x 106 de células Wien133 foram pré-incubadas por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente em placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos não purificados (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em um volume total de 50 µL. A seguir, NHS foi adicionada como uma fonte de C1q para atingir uma concentração final de 20% ou 50% NHS em um volume total de 100 µL. A mistura de reação foi incubada em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. A reação foi interrompida pela colocação das placas em gelo. 10 µl de iodeto de propídio foram adicionados e a lise celular como determinado pelo FACS.

[00570] As mutações identificadas na região de CH2-CH3 que resultou na perda ou atividade de CDC aumentada para o CD20 anticorpo 7D8, foram observadas terem o mesmo efeito no reconhecimento do anticorpo 005 CD38. A Figura 9 mostrou que 005-I253D, H443A, K439E e S440K mostrou a perda completa da atividade de CDC tanto em células Daudi (Figura 9A) quanto Raji (Figura 9B), visto que a atividade de CDC fortemente intensificada mostrou o mutante 005-E345R em ambas as linhas celulares. Comparável com os dados de 7D8, uma combinação de 005-K439E + 005-S440K, ambos resultando na perda de CDC como um mutante simples, resultou em CDC restaurado. Surpreendentemente, 005-E435R induziu ainda fornetemente CDC em células Wien133, para aquele 005 tipo selvagem não é capaz de induzir a morte por CDC (Figura 9C). A morte de CDC por 005-E345R em células Wien133 foi observada tanto com 20% quanto com 50% de concentrações de soro (Figura 9C). Também em células Raji, tanto 7D8- E345R quanto 005-E345R mostraram CDC intensificada in vitro em 50% de soro, com eficácia similar como em soro a 20% (Figura 9D).

[00571] Como a E345R mutação na região de CH2-CH3 resultou em atividade intensificada de CDC tanto no anticorpo CD20 7D8 quanto anticorpo CD38 005 testados, a mutação de E345R é considerada ser uma modificação de anticorpo geral que pode ser aplicada para induzir ou intensificar CDC.

Exemplo 11 Anticorpos IgG1 contendo a mutação intensificadora de CDC E345R são menos sensíveis à inibição de CDC pelo peptídeo de ligação Fc DCAWHLGELVWCT do que os anticorpos do tipo selvagem

[00572] Pela mutação em posições de aminoácido no caminho hidrofóbico na interface de Fc:Fc de IgG, a eficácia de CDC foi observada ser interrompida ou intensificada. O envolvimento das interações na interface de Fc-Fc e, desta maneira possivelmente a formação de uma estrutura oligomérica (por exemplo, anel hexamérico) como observado na estrutura cristalina de b12, na eficácia de CDC ainda foi explorado. portanto, um peptídeo de 13 resíduos (DCAWHLGELVWCT (SEQ ID N°: 7)) foi usado alvejando um local de ligação de consenso na região do caminho hidrofóbico na superfície de IgG Fc do tipo selvagem (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). De fato, a identificação do local de ligação do consenso na superfície de IgG Fc como uma região de adaptação que é iniciada para a interação com uma variedade de moléculas distintas (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83), é consistente com a identificação dos aminoácidos de núcleo no caminho hidrofóbico que estão envolvidos na interação de Fc-Fc na estrutura cristalina de IgG1 b12 (Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293(5532):1155-9). As interações que estão presentes em todas as interfaces de ligação são mediadas por uma série dividida de seis aminoácidos (Met-252, Ile-253, Ser-254, Asn-434,His-435 e Tyr-436), bm como contados de cadeia principal dividida (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Consequentemente, o peptídeo de ligação de Fc é esperado afetar a interação de Fc-Fc e consequentemente a eficácia de CDC.

[00573] 0,1 x 106 células Daudi foram pré-incubadas em 75 µL com 1,0 µg/ml de anticorpo não purificado em placas de 96 reservatórios de fundo redondo por 10 minutos em temperatura ambiente em um agitador. 25 µL de uma série de concentração (faixa 0,06 a 60 µg/ml de concentração final) do peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT foi adicionado às células opsonizadas e incubadas por 10 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 25 µL de NHS foi adicionada como uma fonte de complemento (concentração final a 20%) e incubada em uma incubadora a 37° C por 45 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 25 µl de meio de RPMI gelado, suplementado com 0,1% de BSA. 15 µl de iodeto de propídio foram adicionados e a lise celular como determinado pela análise de FACS.

[00574] CDC mediado por 005 (Figura 10A) ou 7D8 (Figura 10B) tipo selvagem foi observado ser inibido pelo peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT de uma maneira dependente de dose. Estes dados de competição sugerem novamente o envolvimento das interações de Fc-Fc no caminho hidrofóbico de IgG na eficácia de CDC. Os mutantes IgG1-005- E345R e IgG1-7D8-E345R intensificados por CDC foram ambos menos sensíveis para a competição pelo peptídeo de ligação por Fc em comparação com seus anticorpos do tipo selvagem correspondente, sugerindo que a mutação de E345R resulta na estabilidade aumentada da interação de Fc-Fc e CDC consequentemente aumentado.

Exemplo 12 Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) de células que expressam CD38 por variantes de anticorpo CD38 HuMAb 005

[00575] As células Daudi foram coletadas (5 x 106 células/ml), lavadas (duas vezes em PBS, 1200 rpm, 5 minutos) e coletadas em 1 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino cósmico (CCS) (HyClone, Logan, UT, USA), ao qual 200 µCi 51Cr (Cromo-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, The Netherlands) foi adicionado. A mistura foi incubada em um banho com água em agitação por 1 hora a 37° C. Após a lavagem das células (duas vezes em PBS, 1200 rpm, 5 min), as células foram recolocadas em suspensão em meio RPMI 1640 suplementado com 10% CCS, contado por exclusão de azul de triptano e diluído a uma concentração de 1 x 105 células/ml.

[00576] Entretanto, as células moleculares de sangue periférico (PBMCs) fora isoladas de revestimentos de buffy frescos (Sanquin, Amsterdam, The Netherlands) usando-se centrifugação de densidade Ficoll padrão de acordo com as instruções do fabricante (meio de separação de linfócito; Lonza, Verviers, France). Após a ressuspensão de células em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de CCS, as células foram contadas por exclusão de azul de tripano e concentrado a 1 x 107células/ml.

[00577] Para o experimento ADCC, 50 µL de células Daudi rotuladas com 51Cr (5.000 células) foram pré-incubadas com 15 µg/ml de anticorpo CD38 IgG1-005 ou mutante IgG1-005-E345R em um volume total de 100 µL meio RPMI suplementado com 10% CCS em uja placa microtituladora de 96 reservatórios. Após 10 minutos em temperatura ambiente, 50 µL de PBMCs (500.000 células) foram adicionados, resultando em um atuador para a razão alvo de 100:1. A quantidade máxima de lise celular como determinado pela incubação de 50 µL de células Daudi rotuladas com 51Cr (5.000 cells) com 100 µL de 5% de Triton-X100. A quantidade de lise espontânea como determinado pela incubação de 5.000 células Daudi rotuladas com 51Cr em 150 µL de meio sem qualquer anticorpo ou células atuadoras. O nível de lise celular dependente de anticorpo como determinado pela incubação de 5.000 células Daudi com 500.000 PBMCs sem anticorpo. Subsequentemente, as células foram incubadas 4 hoars a 37° C, 5% de CO2. Para determinar a quantidade de lise celular, as células foram centrifugadas (1200 rpm, 3 min) e 75 µL de sobrenadant e foi transferido a tubos micrônicos, após o que o 51Cr liberado foi contado usando-se um contador gama. As contagens emdidas por minuto (cpm) foram usadas para calcular a porcentagem de lise mediada por anticorpo como segue: (cpm amostra - cpm lise independente de Ab)/(cpm lise max. - cpm lise espontânea) x 100%

[00578] A Tabela 15 mostra os valores EC50 calculados de IgG1-005- wt e IgG1-005-E345R no ensaio de ADCC realizado. Quatro amostras foram testadas. O IgG1-005-E345R mostra um valor de EC50 significantemente menor do que IgG1-005-wt de todas as quatro amostras testadas. Tabela 15 Valores de EC50 calculados dos quatro experimentos realizados.

[00579] A Figura 11 mostra que, em comparação com o nticorpo do tipo selvagem HuMab-005, o IgG1-005-E345R mutante demonstrou eficácia intensificada de capacidade de ADCC, sendo capaz de induzir ADCC em concentrações menores.

Exemplo 13 Ligação de FcRn e análise de farmacocinética de mutantes 7D8 em comparação com 7D8 do tipo selvagem

[00580] O receptor de Fc neonatal (FcRn) é responsável pela vida média de plama longa de IgG pela proteção de IgG da degradação. Após a internalização do, o FcRn liga-se às regiões de Fc do anticorpo em endossomas, onde a interação é estável no ambiente moderadamente ácido (pH 6,0). Na reciclagem à membrana de plama, onde o ambiente é neutro (pH 7,4), a interação não é perdida e o anticorpo é liberado novamente à circulação. Isto influencia a vida média do plasma de IgG.

[00581] A capacidade do mutante 7D8 IgG1-7D8-E354R interagir com FcRn do camundongo, macaco cinomolgo e humano foi testada em um ELISA. Todas as incubações foram realizadas em temperatura ambiente. As placas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/ml (100 µL/reservat0rio) domínio extacelular biotinilado produzido de maneira reecombinante de FcRn (camundongo, humano, cinomolgo) (FcRnECDHis- B2M-BIO), diluído em PBST mais 0,2% de BSA; 1 horas. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST e diluídas serialmente 3 vezes (em PBST/0,2% de BSA, pH 6,0) IgG1-7D8 ou IgG1-7D8-E354R tipo selvagem foram adicionados e as placas foram incubadas por 1 hora. As placas foram lavadas com PBST/0,2% de BSA, pH 6,0. IgG anti-humano de cabra (Fab'2)-HRP (Jackson Immuno Research, cat n°:109-035-097) diluído em PBST/0,2% de BSA, pH 6,0 foi adicionado e as placas foram incubadas por 1 hora. Após a lavagem, ABTS foi adicionado como o substrato e as placas foram incubadas no escuro por 30 minutos. A absorbância foi lida em 405, usando-se um leitor de ELISA EL808.

[00582] Os camundongos neste estudo foram alojados em uma unidade de barreira da Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, The Netherlands) e mantidos em gaiolas com filtro superior com água e alimento fornecidos ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética animal da Utrecht University.

[00583] Para analisar a farmaccinética dos mutantes 7D8 in vivo, os camundongos SCID (C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles-River) foram injetados intravenosamente com 100 µg (5 mg/kg) 7D8 do tipo selvagem, IgG1-7D8- E354R, -S440K or K322A; 3 camundongos por grupo.

[00584] Amostras de sangue de 50 µL foram coletadas a partir da veia safena em 10 minutos, 4 horas, 24 horas, 2 dias, 7 dias, 14 dias e 21 dias após a administração do anticorpo. O sangue foi coletado em frascos contendo heparina e centrifugados por 5 minutos em 10.000 g. Plasma foi armazenado a - 20° C até a determinação de concentrações de mAb.

[00585] As concentrações de IgG humano foram determinadas usando- se um sanduíche ELISA. O clone de IgG-capa anti-humano de mAB de camundongo MH16 (#M1268, CLB Sanquin, The Netherlands), revestido nas placas de ELISA Microlon de 96 reservatórios (Greiner, Germany) em uma concentração de 2 µg/ml foi usado como anticorpo de captura. Após bloquear as placas com PBS suplementado com soro de galinha a 2%, as amostras foram adicionadas, serialmente diluídas em tampão de ELISA (PBS suplementado com 0,05% de Tween 20 e soro de galinha a 2%) e incubado em um agitador de placa por 1 h em temperatura ambiente (RT). As placas foram subsequentemente incubadas com imunoglobulina de IgG anti-humano de cabra (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) e desenvolvido com 2,2’- azino-bis (ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany). A absorbância foi medida em um leitor de microplaca (Biotek, Winooski, VT) em 405 nm.

[00586] Os camundongos SCID foram escolhidos porque estes têm concentrações de IgG de plasma baixas e, portanto, liberação relativamente baixa de IgG. Isto fornece um modelo de PK que é muito sensível para detectar mudanças na liberação devido à ligação diminuída da parte de FcY-ao receptor Fc neonatal (FcRn).

[00587] Os testes estatísticos foram realizados usando-se GraphPad PRISM versão 4 (Graphpad Software).

[00588] A Figura 12 mostra que tanto HuMab-7D8 quanto IgG1-7D8- E345R selvagens ligaram-se bem ao FcRn de camundongo, humano e cinomolgo. A ligação de IgG1-7D8-E345R foi levement melhor do que aquela de 7D8 do tipo selvagem.

[00589] A Figura 13 mostra as concentrações de plasma durante o tempo. Não houve diferença na mudança de concentrações de plasma (liberação) durante o tempo de HuMab-7D8 tipo selvagem versus um de IgG1-7D8-E345R, -S440K ou K322A.

Exemplo 14 Uso da mutação estabilizadora de Fc-Fc E345R contra atividade bactericida aumentada de anticorpos IgG contra bactérias que expressam proteínas de superfície de ligação de Fc

[00590] O sistema de cascata de complemento é um mecanismo de defesa de hospedeiro importante contra patogênios e podem ser divididos em três vias de ativação diferentes para reconhecer os patogênios: i) o caminho clássico mediado por anticorpo, que é ativado na ligação de C1q ao anticorpo ligado por patogênio, ii) a lectina e iii) o caminho alternativo, em que o sistema de complemento que reconhece diretamente e é disparado pelo patogênio na ausência de anticorpo. Os três caminhos convergem na etapa de clivagem de C3 e deposição de C3b. Os microorganismos desenvolveram mecanismos múltiplos de evasão de complemento, um dos quais é mediado pela Proteína A (Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:201-30; Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12):948-58). A Proteína foi primeiro identificada na parede celular de Staphylococcus aureus e é bem conhecido para esta ligação à região Fc do IgG (Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70; Uhlen et al., J. Biol. Chem (1984) 259,1695-1702). Até agora, o efeito antifagocítico da proteína A e seu papel na patogênese de S. aureus foi expliCado pela interação entre a Proteína A e o IgG, que resulta em uma orientação de anticorpo incorreta sendo reconhecida pelo receptor Fc de neutrófilo (Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12):948-58).

[00591] O Exemplo 11 mostra que o CDC mediado pelos anticorpos de IgG1 específicos de célula B foi inibido pela competição do peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT. Ó peptídeo alveja o local de ligação de consenso em IgG Fc que coincide com o local de ligação para a Proteína A, Proteína G e fator reumatóide (Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83). Com base nestes dados, acredita-se que o mecanismo de evasão de complemento bacteriano mediado por Proteína A pode trabalhar por competição com a ligação de Fc, resultando na desestabilização da interação de Fc-Fc de um anticorpo específico de micróbio e consequentemente inibição de ativação de complemento mediada por anticorpo. Além disso, o Exemplo 11 também mostra que os anticorpos de IgG1 específico de célula B contendo a mutação E345 de intensificação de CDC foi menos sensível à inibição de CDC pela competição do peptídeo de ligação de Fc DCAWHLGELVWCT do que os anticorpos do tipo selvagem. Pela extrapolação destes resultado a proteínas de ligação de Fc expressadas em micróbios, estabilização aumentada das interações de Fc-Fc de IgG1 pela mutação de E345R deve tornar os anticorpos específicos de micróbios menos propensos à inibição de complemento por uma estratégia de escape do patogênio por intermédio da competição de ligação de Fc pelas proteínas de superfície microbiana, tais como Proteína A. Consequentemente, a introdução da mutação de E345R em anticorpos de IgG direcionados contra uma bactéria deve resultar em uma deposição de C3b aumentada nas bactérias e atividade bacteriana aumentada em em comparação com os anticorpos do tipo selvagem precursores.

[00592] Como uma medida in vitro para a morte bacteriana mediada por complemento, tanto a fagocitose por neutrófilos quando a geração de C3a no plasma, que coincide com a deposição de C3b nas bactérias, pode ser determinado como descrito abaixo. De fato, foi descrito que a deposição de C3b em S. aureus resulta na fagocitose intensificada e correlaciona com a morte bacteriana (Rooijakkers et. al., Nature Immunology 2005: 6,920-927).

[00593] S. aureusserá rotulado com FITC pela incubação de uma cultura bacteriana que se desenvolve de maneira exponencial com 100 µg/ml de FITC por 1 hora a 37° C em 0,1 M de tampão de carbonato (pH 9,6). As células nucleres de polimorfo humano (PMN) serão isoladas usando-se um gradiente de Ficoll. As bactérias rotuladas com FITCserão opsonizadas com uma série de concentração de anticorpos específicos com ou sem a mutação E345R. A fagocitose será realizada in vitropela incubação de 1 x 108 bactérias rotuladas com FITC opsonizadas com PMN humano na presença de 25% de soro desprovido de IgG como fonte de complemento por 25 minutos a 37° C em um volume total de 200 µL sob agitação vigorosa. As células serão fixadas e os eritrócitos lisado pela incubação com solução de lise de FACS por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem, a fagocitose será medida por FACS. A população de neutrófilos será selecionada do gating de dispersão adiantada e lateral e a fagocitose será expressada como a fluorescência média na população de neutrófilo. Alternativamente, a geração de C3a será medida nas amostras por ELISA como uma medição para a ativação de complemento e deposição de C3b.

[00594] É esperado que os anticorpos contendo anticorpos específicos de S. Aureus contendo a mutação de E345R induzirá mais ativação de complemento e fagocitose por neutrófilos do que os anticorpos dio tipo selvagem precursores. Um exemplo de um anticorpo que pode ser usado em tais experimentos é o IgG1 pagibaximab monoclonal quimérico (BSYX- A110; Biosynexus), alvejando o ácido lipoteicóico (LTA) que está incluído na parede celular de estafilicocos (Baker, Nat Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1491-3; Weisman et al., Int Immunopharmacol. 2009 May;9(5):639-44).

Exemplo 15 Uso de mutações de inibição de CDC que restringem a ativação de CDC para alvejar as células de maneira simultânea ligada por uma mistura de dois anticorpos monoclonais terapêuticos diferentes

[00595] Como descrito no Exemplo 6, mutações de 7D8 de anticorpo CD20 K439E e S440K diminuíram a eficácia de CDC como anticorpos monoclonais. A mistura de anticorpos 7D8 contendo estas mutações restauraram CDC. O CDC eficiente foi, desta maneira, restrito à celulas ligadas por ambos os anticorpos mutantes de maneira simultânea. Como descrito no Exemplo 10, a mutações de anticorpo CD38 005 K439E e S440K dimimuíram a eficácia de CDC como anticorpos monoclonais. A mistura de anticorpos 005 contendo estas mutações restauraram CDC. O CDC eficiente foi, desta maneira, restrito às células ligadas por ambos os anticorpos mutantes de maneira simultânea.

[00596] Pode ser vantajoso restringir a indução de CDC eficiente às células alvo que expressam dois antígenos específicos de maneira simultânea, que explora sua expressão combinada para melhorar a seletividade de indução de CDC. Paraa indução de CDC às células ligadas tanto por anticorpo CD20 quanto CD38 de maneira simultânea, o par de 7D8-K439E e 005-S440K ou o par de 7D8-S440K e 005-K439E será adicionado ou misturado 1:1 em experimentos CDC como segue. 0,1 x 106células Daudi ou Raji serão pré- incubadas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos não purificados ou mistura de anticorpo (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em um volume total de 100 µL por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 25 µL soro humano normal será adicionado como uma fonte de complemento (concentração final a 20%) e incubado em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. A reação será interrompida pela colocação das placas em gelo. 10 µl de iodeto de propídio serão adicionados e a lise celular será determinada por FACS. Será esperado que, 7D8-K439E, 005-S440K, 7D8-S440K e 005- K439E apresentarão eficácia melhorada de CDC. É esperado, que a adição simultânea de 7D8-K439E e 005-S440K restaurarão o CDC eficiente especificamente em células que expressam tanto CD20 quanto CD38. Da mesma maneira, é esperado que a mistura de 7D8-S440K e 005-K439E restaurarão o CDC eficiente em células que expressam tanto CD20 quanto CD38.

Exemplo 16

[00597] A especificidade de CDC intensificado pela combinação de mutações de inibição complementares de E345R com as mutaçõs de inibição complementar K439E e S440K em uma mistura de dois anticorpos monoclonais diferentes

[00598] Como descrito em Exemplo 6, as mutações de anticorpo CD20 7D8 K439E e S440K diminuiram a eficiência de CDC como anticorpos monoclonais. A mistura de anticorpos 7D8 contendo estas mutações restauraram CDC. O CDC eficiente foi, desta maneira restrito às células ligadas por ambos os anticorpos mutante de maneira simultânea. Como descrito no Exemplo 10, mutações 005 de anticorpo CD38 K439E e S440K diminuiu a eficácia de CDC como anticorpos monoclonais. A mistura de anticorpos 005 contendo estas mutações restauraram CDC. O CDC eficiente foi desta maneira restrito às células ligadas por anticorpos mutantes de maneira simultânea.

[00599] Pode ser vantajoso restringir a intensificação da indução de CDC às células alvo que expressam dois antígenos específicos de maneira simultânea, que exploram sua expressão combinada para melhorar a seletividade de indução de CDC intensificada. Também pode ser vantajoso restringir a intensificação da indução de CDC a células alvo que são ligadas pelas misturas de pelo menos dois anticorpos diferentes simultaneamente, os ditos anticorpos que ligam um antígeno de superfície celular idêntica em dois epítopos diferentes de maneira simultânea ou em duas competições cruzadas, epítopos similares ou idênticos.

[00600] Portanto, para restringir a indução de CDC intensificada às células ligadas tanto por anticorpos CD20 quanto CD38 de maneira simultânea, a mutação que intensifica CDC E345R foi combinada com as mutações que inibem CDC nos anticorpos 7D8-E345R/K439E, 7D8- E345R/S440K, 005-E345R/S440K e 005-E345R/K439E. Estes anticorpos foram adicionados separadamente ou misturados 1:1 em experimentos CDC como segue. 0,1 x 106células Wien133 (outros tipos celulares, tais como células Daudi ou Raji também podem ser usados) foram pré-incubadas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos não purificados (concentração final de 0,056 a 10.000 ng/ml em diluições triplas para 7D8-E345R/K439E, 7D8-E345R/S440K, 005- E345R/S440K ou 005-E345R/K439E) ou misturas de anticorpo (concentrações finais de 0,01 µg/ml e anticorpo CD20 misturado com 0 a 333 ng/ml em diluições triplas de anticorpo CD38 ou 3,3 µg/ml de anticorpo CD38 misturado com 0,0056 a 1.000 ng/ml em diluições triplas de anticorpos CD20) em um volume total de 100 µL por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 25 µL soro humano normal foi adicionada como uma fonte de complemento (concentração final a 20%) e incubado em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. A reação foi interrompida pela colocação das placas em gelo. 10 µl de iodeto de propídio foram adicionados e a lise celular como determinado pelo FACS.

[00601] Uma série de concentração de anticorpo 005-E345R/K439E ou 005-E345R/S440K foi misturado com uma concentração fixa de 0,01 µg/ml de anticorpos duplo mutante 7D8 (concentração máxima com CDC mínimo em células Wien133 como um agente simples como determinado a partir da Figura 14A) para realizar as combinações complementares 005- E345R/K439E + 7D8-E345R/S440K ou 005-E345R/S440K + 7D8- E345R/K439E. A Figura 14C mostra que o anticorpos CD38 de mutante duplo 005 induziu a dose de CDC dependente da presença de concentração fixa de anticorpo CD20 de 7D8-E345R/K439E ou 7D8-E345R/S440K complementar, respectivamente. A eficácia de CDC por estas combinações complementares (Figura 14C) foi comparável com o anticorpo mutante simples de 005-E345R (intensificador) como um agente simples (Figura 14B). Em contraste, na presença de anticorpo irrelevante b12, tanto 005- E345R/K439E quanto 005-E345R/S440K mostrou dficilmente qualquer CDC nas séries de concentração testadas (comparável com 005-E345R/K439E ou 005-E345R/S440K como agentes simples mostrados na Figura 14B).

[00602] Uma série de concentração de anticorpo 7D8-E345R/K439E ou 7D8-E345R/S440K foi misturado com uma concentração fixa de 3,3 µg/ml de anticorpo duplo mutante 005 (que mostra um CDC pequeno mas limitado em células Wien133 como um agente simples como determinado a partir da Figura 14B) para realizar as combinações complementares 7D8- E345R/K439E + 005-E345R/S440K ou 7D8-E345R/S440K + 005- E345R/K439E. A Figura 14D mostra que os anticorpos CD20 de mutante duplo 7D8 induziram CDC muito eficientemente na presença do anticorpo CD38 de 005-E345R/K439E ou 005-E345R/S440K complementar respectivamente, mesmo em concentrações mais baixas testadas, semelhantes a não mais do que algumas moléculas de anticorpo duplo mutante 7D8 por célula. Para eliminar a contribuição de densidade de cauda de Fc aumentada na membrana celular ao CDC observado pela mistura de anticorpos 7D8 e 005 com mutações K439E e S440K complementares, também, combinações de anticorpo com mutações não complementares foram testados. A Figura 14D mostra que as combinações não complementares mostraram eficácia de CDC muito menor do que as combinações complementares, como um resultado da interação Fc-Fc menos eficiente do que as combinações complementares.

[00603] Estes dados sugerem que a indução de CDC (intensificada) por anticorpos terapêuticos podem ser limitados às células que ligam uma mistura simultânea de dois anticorpos complementares, neste caso com as especificidades de antígeno diferentes, desse modo aumentando a especificidade de célula alvo requerendo a co-expressão de ambos os antígenos.

[00604] Como pode ser visto na Figura 14A e 14B, 7D8- E345R/K439E, 005-E345R/S440K, 7D8-E345R/S440K e 005-E345R/K439E apresentaram eficiência de CDC limitada em comparação com 7D8-E345R sozinho. Ainda é visto, que a mistura de 7D8-E345R/K439E e 7D8- E345R/S440K permitido CDC com eficiência intensificada em comparação com anticorpos 7D8 tipo selvagem como o agente simples. Da mesma maneira, foi observado que a mistura de 005-E345R/K439E e 005- E345R/S440K permitiu o CDC com eficiência intensificada em comparação com o anticorpo 005 do tipo selvagem como oagente simples (dados não mostrados).

Exemplo 17 Uso de mutações de inibição de CDC que restringem a ativação eficiente de CDC a complexos de anticorpo que consistem exclusivamente de anticorpos terapeuticamente administrados

[00605] Como descrito em Exemplo 6, o mutante duplo 7D8 de anticorpo CD20 K439E/S440K restaurou a eficiência de CDC diminuída por mutantes de ponto simples K439E ou S440K. Como descrito no Exemplo 10, o mutante duplo 005 de anticorpo CD38 K439E/S440K restaurou a eficiência de CDC inibida por Mutantes de ponto simples K439E ou S440K. Como observado, as mutações de ponto simples interrompem a interação de Fc:Fc com o aminoácido não mutado no lado de faceamento da interface de Fc:Fc. A introdução da mutação compensatória no lado de faceamento da interface de Fc:Fc restaurou a eficiência de CDC. O CDC foi, desta maneira, aparentemente restrito aos complexos de anticorpo que consistem exclusivamente de anticorpos contendo ambas as mutações.

[00606] Em um outro exemplo, a indução de CDC é restrita a complexos de anticorpo que consistem exclusivamente de anticorpos terapeuticamente administrados. Para restringir a indução de CDC às células ligadas terapeuticamente por CD20 u por anticorpos CD38 exclusivamente, as mutações de inibição de CDC K439E e S440K serão combinadas nos anticorpos 7D8-K439E/S440K ou 005-K439E/S440K. Estes anticorpos serão adicionados separadamente em experimentos de CDC na ausência ou presença de IgG específico não alvo como segue. 0,1 x 106 células Daudi ou Raji serão pré-incluídas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos não purificados ou mistura de anticorpo (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em um volume total de 100 µL por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 25 µL soro humano normal será adicionado como uma fonte de complemento (concentração final a 20%) e incubado em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. A reação será interrompida pela colocação das placas em gelo. 10 µl de iodeto de propídio será adicionado e a lise celular será determinada pelos FACS.

[00607] É esperado que 7D8-K439E/S440K induza o CDC com eficiência similar ao anticorpo 7D8 do tipo selvagem. Além do IgG não específico, o 7D8-K439E/S440K é esperado não afetar a eficiência da indução de CDC para este anticorpo. Da mesma maneira, é esperado que 005- K439E/S440K o permitirá o CDC com eficiência similar ao HuMAb 005 tipo selvagem. Além do IgG não específico a 005-K439E/S440K é esperado não afetar a eficiência da indução de CDC para este anticorpo.

Exemplo 18 Uso de mutações de inibição de CDC que restringem a ativação de CDC intensificada a complexos de anticorpo que consistem exclusivamente de anticorpos terapeuticamente administrados

[00608] Como descrito no Exemplo 6, o mutante 7D8 de anticorpo CD20 duplo K439E/S440K restaurou a eficiência de CDC diminuída pelos mutantes de ponto simples K439E ou S440K. Como descrito no Exemplo 10, o anticorpo CD38 HuMAb 005 mutante duplo K439E/S440K restaurou a eficiência de CDC inibida por mutantes de ponto simples K439E ou S440K. Como observado, as mutações de ponto simples interrompem a interação de Fc:Fc com o aminoácido não mutado na lateral de faceamento da interface de Fc:Fc. A introdução da mutação compensatória na lateral de faceamento da interface de Fc:Fc restaurou a eficiência de CDC. O CDC eficiente foi, desta maneira, aparentemente restrito aos anticorpos complexos consistindo exclusivamente de anticorpos contendo ambas as mutações.

[00609] Em um outro exemplo, a intensificação da indução de CDC é restrita aos complexos e anticorpo que consistem exclusivamente de anticorpos terapeuticamente administrados. Pela avaliação e seleção de mutações que estimulam a interação de Fc:Fc explorada para a estimulação de CDC, pode-se identificar as mutações que pode formar os complexos de anticorpo de indução de CDC com anticorpos de soro não específicos para o antígeno alvo de interesse. Para restringir a indução de CDC intensificada às células ligadas pelo complexo de CD20 ou por anticorpos CD38 exclusivamente, a mutação intensificadora de CDC E345R será combinada com as mutações inibidoras de CDC nos anticorpos 7D8- E345R/K439E/S440K ou 005-E345R/K439E/S440K. Estes anticorpos serão adicionados de maneira separada em experimentos de CDC na ausência ou presença de IgG específico não específico de alvo. 0,1 x 106células Daudi ou Raji serão pré-incubadas em placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos não purificados ou mistura de anticorpo (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0 µg/ml) em um volume total de 100 µL por 15 minutos em um agitador em temperatura ambiente. A seguir, 25 µL soro humano será normalmente adicionado como uma fonte de complemento (concentração final a 20%) e incubado em uma incubadora em 37° C por 45 minutos. A reação será interrompida pela colocação das placas em gelo. 10 µl de iodeto de propídio serão adicionados e a lise celular será determinada por FACS.

[00610] É esperado que 7D8-E345R/K439E/S440K induzirá CDC com eficiência intensificada em em comparação com HuMAb 7D8 do tipo selvagem. A adição de IgG não específico a 7D8-E345R/K439E/S440K é esperada não afetar a eficiência da indução de CDC em comparação com o anticorpo 7D8 do tipo selvagem. Da mesma maneira, é esperado que o 005- E345R/K439E/S440K permitirá CDC com eficiência intensificada em comparação com o anticorpo 005 do tipo selvagem. A adição de IgG não específico a 005-E345R/K439E/S440K é esperada não afetar a eficiência da indução de CDC com relação ao anticorpo 005 do tipo selvagem.

Exemplo 19 Uso de um método de avaliação de mutante para identificar mutações que estimulam a oligomerização do anticorpo mediado pela interação Fc:Fc detectada pelo ensaio CDC

[00611] Como descrito nos Exemplos 6 e 10, as mutações de aminoácido foram identificadas estimulando CDC para anticorpos que reconhecem dois antígenos alvos diferentes, CD20 e CD38, nas linhas das células múltiplas que expressam os níveis variáveis dos ditos antígenos. De maneira surpreendente, a mutação de ponto simples E345R mostrou-se suficiente para dotar a lise da célula dependente de CDC das células Wien133 ao anticorpo anti-CD38 005, que falhou em lisar estas células por CDC no formato IgG1 de tipo selvagem.

[00612] Outras mutações em ou na periferia da interface Fc:Fc deve estimular a oligomerização e CDC em uma maneira análoga. Alternativamente, as mutações devem indiretamente estimular a oligomerização, por exemplo, pelas interações Fc:Fc que induz alostericamente.

[00613] Para determinar se outras mutações de aminoácido devem estimular a oligomerização do anticorpo medido por Fc, uma biblioteca de mutantes anti-CD38 IgG1-005 foi avaliada usando os ensaios CDC, tanto individualmente quanto misturado em uma maneira em pares para selecionar por exemplo, pares de aminoácido que interage cruzado a interface Fc:Fc. Entretanto, a mesma estratégia pode ser aplicada a outros anticorpos, tal como outro anticorpo IgG1 ou IgG3.

[00614] Uma biblioteca focou nas mutações nas posições indicadas na tabela 16 foi gerada. As mutações foram introduzidas na região IgG1-005 Fc usando o kit de mutagênese direcionado ao local Quikchange (Stratagene, US). Brevemente, para cada posição de mutação desejada, um iniciador reverso e avançado que codifica um códon degenerado na localização desejado foram usados para replicar o padrão de DNA de plasmídeo de comprimento total da cadeia pesada 005 com alotipo IgG1m(f). As misturas de DNA resultante foram digeridas usando DpnI para remover a fonte de DNA de plasmídeo e usado para transformar E. coli. As colônias resultantes foram agrupadas e cultivadas e DNA de plasmídeo foi isolado a partir dos grupos e transformados novamente em E. coli para obter as colônias clonais. O DNA de plasmídeo mutante isolado a partir das colônias resultantes foi checado pelo sequenciamento DNA (LGC genomics, Berlin, Germany). Os cassetes de expressão foram amplificados a partir do DNA de plasmídeo por PCR e misturas de DNA contendo tanto a cadeia leve quanto pesada de tipo selvagem deIgG1-005 foram aleatoriamente transfectadas pelas células Freestyle HEK293F (Invitrogen, US) usando 293fectin (Invitrogen, US) essencialmente como descrito pelo fabricante. Os sobrenandantes das células transfectadas contendo os mutantes de anticorpo foram coletados. Os sobrenadantes de anticorpo mutante foram avaliados nos ensaios CDC tanto nas misturas individualmente quanto em pares como seguem.

[00615] As células 0,1 x 106 Daudi ou Wien-133 (outros tipos celulares tal como as células Raji podem ser usados) foram pré-incubados nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com 1,0 ug/ml dos anticorpos não purificados em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 30 µL do soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (30% da concentração final) e incubada em uma incubadora a 37° C por 45 minutos. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µl de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00616] As mutações descritas na tabela 16, tabela 17 e tabela 18 foram selecionadas para sua capacidade de intensificar a oligomerização como detectado pela eficiência CDC, como um mutante simples ou quando misturado com outros mutantes, por exemplo, diante de uma mutação através da interface Fc:Fc. As mutações podem ser opcionalmente adicionais avaliadas por sua capacidade de não compreender FcRn, proteína-A ou ligação de proteína-G, ADCC, ADCP ou outras funções efetivas mediadas pelo domínio Fc. A combinação de tal estimulação das mutações de ponto em um domínio Fc pode estimular a oligomerização e eficiência CDC ainda mais.

[00617] As mutações na região de CH2-CH3 incorporadas no anticorpo CD38 005 foram testadas por sua capacidade de inibir a oligomerização como determinado pelo CDC nas células Daudi. A lise do anticorpo mutante foi comparada ao 005 de tipo selvagem, pelo qual a lise foi apresentada a 100%. O corte para a inibição foi apresentada a < 66% de lise. Medido nesta maneira, mais das mutações testadas inibem CDC (ver tabela 16).

[00618] As mutações na região de CH2-CH3 incorporadas no anticorpo CD38 005 foram testadas por sua capacidade de intensificar a oligomerização como determinado pelo CDC nas células Wien133 (Tabela 17). O anticorpo CD38 005 de tipo selvagem não é capaz de induzir CDC nas células Wien133. Os mutantes que apresentam >39% da lise celular foram contados como intensificação. Completamente inesperado, virtualmente todas as substituições obtidas dos aminoácidos E345 e E430 estimulam a lise celular por CDC. Para verificar este resultado, os aminoácidos E345, E430 e S440 foram substituídos com cada mutação possível pela mutagênese direcionada ao local e testada por sua capacidade de intensificar a oligomerização como determinado pelo CDC das células Wien133 usando uma batelada de soro humano, produzindo a lise eficiente mais lenta (Tabela 18). Novamente, todas as substituições de E345 e E430 induz o CDC eficiente das células Wien133.

[00619] As seguintes mutações preferidas causaram >39% de lise celular das células Wien133: P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N, E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D/E356G, D/E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M, E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y e S440W. Tabela 16 Porcentagem da lise das células Daudi na presença de 1,0 µg/ml das mutações de ponto de anticorpo IgGl-005. O IgGl-005 de tipo selvagem lisam 66% das células sob estas condições. Para cada uma das posições no qual foram substituídas por outro aminoácido são dados na coluna externa esquerda. O aminoácido substituído para cada posição particular é dada seguido pela porcentagem da lise medida indicada nos parânteses () nas linhas horizontais das posições individuais. Tabela 17 Porcentagem de lise das células Wien-133 na presença de 1,0 µg/ml de mutantes de ponto de anticorpo IgGl-005. IgGl-005 de tipo selvagem lisam 3% das células sob estas condições. Para cada uma das posições individuais que foram substituídas por outro aminoácido são dados na coluna externa esquerda. O aminoácido substituído para cada posição particular é dado seguido pela porcentagem de lise medida indicado nos parêntesis () na linha horizontal das posições individuais. Tabela 18 Porcentagem de lise das células Wien-133 na presença de 1,0 µg/ml de mutantes de ponto de anticorpo IgGl-005. IgGl-005 de tipo selvagem lisam 12% das células sob estas condições. Cada uma das posições individuais que foram sibstituídas por outro aminoácido são dadas na coluna externa esquerda. O aminoácido substituído para cada posição particular é dado seguido pela porcentagem de lise medida indicado nos parêntesis () na linha horizontal das posições individuais.

Exemplo 20 Eficácia in vivo de IgG1-7D8-E345R em um modelo de xenoenxerto de linfoma de célula B subcutânea

[00620] A eficácia anti-tumor in vivo do anticorpo IgG1-7D8-E345R foi avaliada em um modelo subcutâneo com as células Raji-luc #2D1. Estas células mostram ~300.000 das moléculas CD20 por célula (determinado pela análise QIFIKIT, dados não mostrados) e expressão do receptor de defesa do complemento alto. As células foram cultivadas em RPMI com 10% do soro de bezerro cósmico (HyClone, Logan, UT), penicilina e estreptomicina, 1% de piruvato de sódio (v/v) e 1 µg/mL de puromicina (P-8833, Sigma, Zwijndrecht). As células foram coletadas em fase log (aproximadamente 70% de confluência). Os camundongos SCID fêmeas de seis a onze semanas de idade (C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL) foram usados (Charles-River). No dia 0,5 x 106 das células Raji-luc #2D1 em 200 µL DE PBS foram subcutaneamente injetadas no flanco direito de cada camundongo. O desenvolvimento do tumor foi monitorado pela medição com paquímetro. Quando o volume do tumor médio foi de 100 mm3 (em torno do dia 7), os camundongos foram classificados em grupos (n=9) e tratados pela injeção intraperitoneal (i.p.) de uma dosagem simples de 50 µg de anticorpo por camundongo (2,5 mg/kg). Todas as amostras de anticorpo foram suplementadas com anticorpo irrelevante b12 para obter uma concentração de anticorpo total de 0,5 mg/mL. Os grupos de tratamento são mostrados na Tabela 18. Sete dias após o tratamento, as amostras sanguíneas foram obtidas para determinar os níveis de soro de IgG humano para checar a adminitração do anticorpo correto. Os tumores foram medidos pelo menos duas vezes por semana usando o paquímetro (PLEXX) até um volume do tumor de ponto final de 1500 mm3, os tumores mostraram ulcerações ou até sinais clínicos sérios serem observados. Tabela 18: Grupos de tratamento e dosagem.

[00621] A Figura 15A mostra desenvolvimento do tumor médio no dia 22, quando todos os grupos ainda estavam completos. O anticorpo de tipo selvagem IgG1-7D8 lentamente inibiu o desenvolvimento de tumor comparado ao anticorpo IgG1-b12 de controle negativo, embora este não seja estatisticamente significante. Apenas IgG1-7D8-E345R inibiu o desenvolvimento do tumor significantemente comparado ao anticorpo IgG1- b12 de controle negativo (análise ANOVA de uma via p< 0,01).

[00622] A Figura 15B mostra uma plotagem Kaplan-Meier da porcentagem dos camundongos com tamanhos de tumor menores do que 700 mm3. Comparado aos camundongos tratados com anticorpo IgG1-b12 de controle negativo, a formação de tumor foi significantemente atrasada nos camundongos tratados com anticorpo IgG1-7D8-E345R (análise Mantel-Cox p< 0,01), mas não em camundongos tratados com IgG1-7D8 de tipo selvagem.

[00623] Estes dados mostram que a mutação E345R intensifica a eficácia anti-tumor in vivo do anticorpo CD20 7D8.

Exemplo 21 Eficácia in vivo de IgG1-005-E345R em um modelo de xenoenxerto de linfoma de célula B subcutânea

[00624] A eficácia anti-tumor in vivo do anticorpo IgG1-005-E345R foi avaliada em um modelo subcutâneo com células Raji-luc #2D1. Estas células mostram ~150.000 moléculas CD38 por célula (determinado pela análise QIFIKIT, dados não mostrados) e expressão do receptor de defesa de complemento alto. O protocolo para inoculação do tumor e mediação é basicamente o mesmo como descrito no Exemplo 20. No dia as 0, 5x106 das células Raji-luc #2D1 em 200 µL DE PBS foram injetadas s.c. no flanco direito dos camundongos SCID. Quando o volume de tumor médio foi 100 mm3 (em torno do dia 7), os camundongos foram classificados nos grupos (n=7) e tratados pela injeção i.p. de uma dosagem simples de 500 µg do anticorpo por camundongo (25 mg/kg). Os grupos de tratamento são mostrados na Tabela 19. Os tumores foram medidos até um volume de tumor de ponto final de 1500 mm3 ou até os tumores mostrarem ulcerações ou sérios sinais clínicos foram observados para evitar maior desconforto.

[00625] A Figura 16A mostra desenvolvimento do tumor médio no dia 21, quando todos os grupos ainda estavam completados. O Anticorpo de tipo selvagem IgG1-005 lentamente inibe o desenvolvimento do tumor, embora este não seja estatisticamente significante. Apenas IgG1-005-E345R significantemente inibe o desenvolvimento do tumor comparado ao controle de anticorpo irrelevante no dia 21 (ANOVA de uma via p< 0,05).

[00626] A Figura 16B mostra uma plotagem Kaplan-Meier da porcentagem dos camundongos com os tamanhos de tumor menores do que 500 mm3. A formação de tumor foi significantemente atrasada nos camundongos tratados com anticorpo IgG1-005-E345R comparados aos camundongos tratados com anticorpo de controle negativo IgG1-b12 (análise Mantel-Cox p<0,001) ou IgG1-005 de tipo selvagem (p<0,05).

[00627] Estes dados mostra que a introdução da mutação E345R no anticorpo CD38 005 resulta na atividade anti-tumor in vivo intensificada. Tabela 19: Grupos de tratamento e dosagem.

Exemplo 22 Ligação alvo monovalente ainda intensifica a eficácia CDC dos anticorpos E345R

[00628] Uma superfície molecular do anel hexamérico IgG1 observado na estrutura do cristal b12 demonstra que para cada IgG no anel hexamérico, um dos dois locais de ligação C1q está virado para cima e o outro local está virado para baixo da estrutura do anel e também um membro Fab de cada anticorpo está orientado para acima e um está orientado para baixo, resultando apenas em um membro Fab por anticorpo para tomar parte na ligação do antígeno, sugerindo a ligação monovalente por molécula de anticorpo no anel de anticorpo hexamérico. A monovalência pode trazer anticorpos na ligação do antígeno em uma orientação compatível de hexamerização. Para testar esta hipótese, a eficácia CDC de um anticorpo CD38/EGFR biespecífico com a mutação E345R foi testado nas células CD38-positivas, EGFR-negativas Wien133, no qual este anticorpo biespecífico pode ligar-se apenas monovalentemente por intermédio de CD38 e comparado a eficácia CDC do anticorpo CD38 de ligação bivalente, também com a mutação E345R. O anticorpo monoclonal humano HuMax-EGFr (2F8, descrito no WO 2004/056847) foi usado como uma base para os anticorpos EGFR descritos neste exemplo.

[00629] Os anticorpos biespecíficos foram gerados in vitro de acordo com a plataforma DuoBody™, isto é trocador de membro Fab induzido por 2- MEA como descrito no WO 2011/147986. A base para este método é o uso dos domínios CH3 complementares, que promovem a formação dos heterodímeros sob as condições do ensaio específico. Para capacitar a produção dos anticorpos biespecíficos por este método, moléculas IgG1 que realizam certas mutações no domínio de CH3 foram geradas: em um do anticorpo IgG1 parenteral a mutação F405L, no outro anticorpo IgG1 parenteral a mutação K409R. Para gerar os anticorpos biespecíficos, estes dois anticorpos parenterais, cada anticorpo em uma concentração final de 0,5 mg/mL, foram incubados com 25 mM de 2-mercaptoetilamina-HCl (2-MEA) em um volume total de 100 µL de TE a 37° C por 90 min. A reação de redução é interrompida quando o agente de redução 2-MEA é removido pelo uso das colunas de rotação (filtros de centrífuga Microcon, 30k, Millipore) de acordo com um protocolo dos fabricantes.

[00630] Para o ensaio CDC, 0,1 x 106 das células Wien133 foram pré- incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpos (0,01 a 10,0 µg/mL) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL do soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00631] A Figura 17 mostra que, como esperado, anticorpos CD38 sem a mutação E345R (tipo selvagem IgG1-005 e IgG-b12-K409R x IgG1-005- F405L) não induz a morte das células Wien133. Também o anticorpo EGFR IgG1-2F8-E345R/F405L, que não liga-se as células EGFR-negativas Wien133 (dados não mostrados), não induzem CDC, como esperado. A introdução da mutação K409R não influencia a capacidade do anticorpo IgG1-005-E345R induzir ~60% de morte nas células Wien133 (descrito no Exemplo 10). De maneira interessante, o anticorpo biespecífico CD38/EGFR IgG1-005-E345R/K409R x IgG1-2F8-E345R/F405L, que podem apenas ligar-se monovalentemente às células CD38-positivas, EGFR-negativas Wien133, mostrou a morte CDC máxima aumentada (de ~60% a ~100% de morte).

[00632] Estes dados mostram que o alvejamento monovalente ainda pode intensificar a capacidade de morte máxima dos anticorpos contendo a mutação E345R que intensifica CDC. Além disso, estes dados mostra que a mutação que intensifica a oligomerização E345R, como medido pela intensificação da atividade CDC, pode ser aplicada a outros formatos de anticorpo, tal como DuoBody.

Exemplo 23 A oligomerização que intensifica a mutação E345R pode ser aplicada a outros formatos de anticorpo tal como DuoBody™

[00633] O efeito da mutação E345R foi testado em um anticorpo biespecífico do formato DuoBody. Os ensaios CDC foram realizados com anticorpos biespecíficos CD20/CD38 nas células CD20-positivas, CD38- positivas Wien133 e Raji.

[00634] Os anticorpos biespecíficos foram gerados como descritos no Exemplo 22. Para o ensaio CDC, 0,1 x 106 das células Wien133 ou Raji foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração dos anticorpos (0,01 a 30,0µg/mL) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL do soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00635] A Figura 18 mostra que a introdução da mutação E345R que intensifica CDC do anticorpo IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R biespecífico nas células Wien 133 (Figura 18A) e Raji (Figura 18B). Estes dados mostram que a mutação que intensifica a oligomerização E345R pode ser aplicada a outros formatos de anticorpo para intensificar a atividade CDC.

Exemplo 24 E345R resgata CDC pelo anticorpo EGFR 2F8, que ainda pode ser intensificado pela ligação do alvo monovalente

[00636] Como descrito nos Exemplos 6, 10 e 26, CDC intensificado ou resgatado de E345R para os anticorpos que reconhecem os alvos de tumor hematológicos diferentes (CD20 e CD38). Para extender a análise a um antígeno de tumor de sólido, o efeito de E345R na capacidade CDC do anticorpo EGFR 2F8 foi testado nas células de carcinoma epidermóides A431. Além disso, o efeito de alvejamento EGFR monovalente na indução CDC mediada por E345R foi testada usando um anticorpo EGFRxCD20 biespecífico (IgG1-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R) nas células EGFR-positivas, CD20-negativas A431.

[00637] Os anticorpos biespecíficos foram gerados como descritos no Exemplo 22. Para o ensaio CDC, 5 x 106 das células A431/mL poram rotuladas com 100 µCi 51Cr por 1h a 37° C. As células foram lavadas três vezes com PBS e recolocadas em suspensão no meio em uma concentração de 1 x 105 células/mL. 25.000 das células rotuladas foram incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração dos anticorpos não purificados (0-30 µg/mL em 3 vezes a diluição) em um volume total de 100 µL por 15 min em temperatura ambiente. Em seguida, 50 µL da diluição do soro humano normal foi adicionada como uma fonte de complemento (25% da concentração final) e incubada em uma incubadora a 37° C por 1h. As células foram centrifugadas (3 min a 300 xg) e 25 µL de sobrenadante foi adicionado a 100 µL de microscint em uma optiplaca de 96 reservatórios branca (PerkinElmer) para incubação em um agitador (750 rpm) por 15 min. A liberação 51Cr foi determinada como contagens por minuto (cpm) em um contador de cintilação. A lise máxima (100%) foi determinada pelo nível 51Cr medido no sobrenadante das células tratadas com Triton X-100. A lise espontânea foi determinada pelo nível 51Cr medido no sobrenadante das células incubadas sem anticorpo. A lise da célula específica foi calculada de acordo com a fórmula: lise específica = 100 x (amostra cpm- cpm spont) / (cpm max - cpm spont).

[00638] A Figura 19 mostra que IgG1-2F8-E345R/F405L é capaz de lisar as células A431 por CDC, considerando que o tipo selvagem 2F8 não é capaz de matar as células A431. Estes dados mostram que a atividade CDC pode ser resgatada no anticorpo EGFR 2F8 pela introdução da mutação E345R. Este extende-se potencialmente a aplicabilidade de CDC que intensifica a mutação E345R aos antígenos de tumor de sólido de alvejamento de anticorpos.

[00639] O anticorpo EGFRxCD20 biespecífico IgG-2F8-E345R/F405L x IgG1-7D8-E345R/K409R, mostrou ainda a intensificação de CDC nas células EGFR-positivas, CD20-negativas A431.

[00640] Estes dados ainda suportam a hipótese que a monovalência facilita a formação das interações Fc-Fc e indução CDC subsequente como postulado por um anticorpo de ligação CD38 descrito no Exemplo 22.

Exemplo 25 CDC intensifica ou regasta E345R pelo anticorpo CD38 003 e anticorpos CD20 11B8 e rituximab

[00641] Como descrito nos Exemplos 6, 10 e 24, atividade de CDC intensifica ou induz E345R de diversos anticorpos com especificidade alvos diferentes (CD20, CD38 e EGFR), como foi testado nas linhas celulares múltiplas que expressam os níveis variáveis dos ditos antígenos. Portanto, a introdução da mutação E345R foi considerada ser o mecanismo geral para intensificar ou resgatar CDC para os anticorpos existentes. Ainda para suportar este, o efeito da mutação E345R em CDC foi testado por muitos anticorpos com eficácia CDC intrínseca variável nas células Daudi e Wien133: anticorpo CD38 003, descrito no WO 2006/099875 e anticorpos CD20 rituximab (tipo I) e 11B8 (tipo II), descrito no WO 2005/103081. Os anticorpos CD20 podem ser divididos em dois subgrupos (Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114). Os anticorpos de tipo I CD20 apresentaram uma capacidade notável para ativar o complemento e extrair CDC pela redistribuição das moléculas CD20 na membrana de plasma nos punhados de lipídeo, que agrupam as regiões Fc de anticorpo e capacitam a ligação C1q melhorada. Os anticorpos de tipo II CD20 não mudam estimavelmente a distribuição CD20 e sem agrupamento concomitante, estes são relativamente ineficientes em CDC.

[00642] 0,1 x 106 das células Daudi ou Raji foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração dos anticorpos não purificados (0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0 µg/mL) em um volume total de 70 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 30 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de C1q (30% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00643] A Figura 20 mostra que o CDC que intensifica a mutação E345R para todos os anticorpos testados tanto nas células (A) Daudi quanto células (B) Wien133. De maneira interessante, nas concentrações usadas todos os anticorpos que não induzem CDC no formato de tipo selvagem, CDC induz eficientemente após a introdução da mutação E345R: CD38 mAb 003 e CD20 tipo II mAb 11B8 nas células Daudi e CD38 mAbs 005 e 003 e CD20 tipo II mAb 11B8 nas células Wien133. Estes dados sugerem que a intensificação da oligomerização de anticorpo, mais especificamente pela introdução de uma mutação E345R, é um mecanismo geral para intensificar ou resgatar CDC pelos anticorpos existentes.

Exemplo 26 Internalização que intensifica E345R doa anticorpos de fator de tecido

[00644] Para testar se a oligomerização intensificada pode induzir a internalização de anticorpo aumentada, estudos de colocalização dos anticorpos de fator de tecido mutado (TF) de tipo selvagem e E345R no marcador lisssomal LAMP1 foram realizados pela microscopia confocal.

[00645] As células SK-OV-3 foram desenvolvidas em tampas de vidro (espessura 1,5 mícron, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Germany) no meio de cultura de tecido padrão a 37° C por 1 dia. As Células foram pré- incubadas por 1 hora com 50 µg/mL de leupeptina (Sigma) para bloquear a atividade lisossomal, após o qual 10 µg/mL do anticorpo de fator de tecido (TF) (WO 2010/066803) foi adicionado. As células foram incubadas por 1, 3 ou 16 horas adicionais a 37° C. Depois, as células foram lavadas com PBS e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente (RT) com 4% de formaldeído (Klinipath). Os lâminas foram lavadas com tampão de bloqueio (PBS suplementado com 0,1% de saponina [Roche] e 2% de BSA [Roche]) e incubadas por 20 minutos com bloqueio de tampão contendo 20 mM de NH4Cl para extinguir formaldeído. As lâminas foram lavadas novamente com tampão de bloqueio e incubadas por 45 minutos em temperatura ambiente com um coquetel de camundongo-anti-humano CD107a-APC (BD Pharmingen) para indentificar LAMP1 lisossomal e IgG-FITC cabra-anti- humano (Jackson) para indentificar os anticorpos TF. As lâminas foram lavadas novamente com tampão de bloqueio e montadas durante a noite nas lâminas de microscópio usando 20 µL do meio de montagem (6 gramas de glicerol [Sigma] e 2,4 gramas de Mowiol 4-88 [Omnilabo] foi dissolvido em 6 mL de água destilada no qual 12 mL de 0,2M de Tris [Sigma] pH8,5 foi adicionado seguido pela incubação por 10 minutos a 50-60°C; meio de montagem foi submetido a alíquota e armazenado a -20°C). As lâminas foram formadores de imagem com um microscópio confocal Leica SPE-II (Leica Microsystems) equipado com lentes objetivas de imersão de óleo 63x 1,32-0,6 e software LAS-AF.

[00646] As imagens TIFF de escala em cinza 12-bit foram analisadas pela colocação usando o software MetaMorph®(versão Meta Series 6.1, Molecular Devices Inc, Sunnyvale California, USA). As imagens foram importadas como pilhas e o fundo foi subtraído. Os ajustes de limiares idênticos foram usados (manualmente apresentados) para todas as imagens FITC e todas as imagens APC. A colocalização foi descrita como a intensidade de pixel de FITC na região de interesse (ROI), onde o ROI é composto de todas as regiões APC positivas. Para comparar as lâminas diferentes tingidas com os anticorpo TF diferentes, as imagens foram normalizadas usando a intensidade de pixel de APC. O CD107a-APC camundongo-anti-humano foi usado para tingir o marcador lisossomal LAMP1 (CD107a). A intensidade de pixel de LAMP1 não deve diferir entre vários anticorpos TF formadores de imagem.

[00647] Os valores normalizados para a colocalização de FITC e APC são expressados como unidades arbitrárias de acordo com a fórmula [(TPI FITC x porcentagem da colocalização)/100] x [1/TPI APC] Porcentagem de colocalização = TPI FITC que colocaliza com um APC pixel / TPI APC TPI, intensidade de pixel total

[00648] A Figura 21 descreve a quantidade da intensidade de FITC pixel dos anticorpos TF de tipo selvagem e E345R mutados que sobrepoem com o marcador lisossomal rotulado por APC. Para cada anticorpo ou condição testado, três imagens diferentes foram analisadas a partir de uma lâmina contendo ~ 1, 3 ou >5 células. A variação foi osbervada entre as imagens diferentes dentro de cada lâmina. Ainda foi evidente que a mutação E345R para os anticorpos 011 e 098 resultou na colocalização lisossomal aumentada após 1 hora de incubação, quando comparado com o tipo selvagem 011 e 98. Estes resultados indicam que a mutação E345R induz a internalização mais rápida e colocalização lisossomal e deve portanto potencializar os conjugados de medicamento de anticorpo.

Exemplo 27 CDC intensificado pela mutação E345R em rituximab nas linhas das células B diferentes com a expressão CD20 similar mas os níveis diferentes das proteínas reguladoras de complemento ligados pela membrana

[00649] Os exemplos 25 e 28 mostra que a eficácia CDC do rituximab de tipo selvagem nas células Daudi e Wien133 foi intensificada para introduzir a mutação E345R. Esta eficácia CDC intensificada resulta a partir da estabilização mediada por E345R das interações Fc-Fc. A estrutura do anel de anticorpo hexamérico concomitantemente formado na membrana de célula alvo pode então promover a geração eficiente do complexo de ataque de membrana para facilitar a captura e concentração dos componentes de complemento ativos próximos a membrana da célula. Como um resultado desta ativação de complemento eficiente, a inibição dos efeitos das proteínas reguladoras de complemento de ligação de membrana (mCRP) deve ser parcialmente superada. A superexpressão de mCRPs, tal como CD55, CD46 e CD59, é considerada como uma barreira para a imunoterapia bem sucedida com anticorpos anti-tumor monoclonais (Jurianz et al., Mol Immunol 1999 36:929-39; Fishelson et al. Mol Immunol 2003 40:109-23, Gorter et al., Immunol Today 1999 20:576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. 2007 Dec 150(3):576-84). Portanto, a eficácia de rituximab-E345R foi comparada aquele do rituximab de tipo selvagem em uma série de linhas celulares B com níveis diferentes dos mCRPs CD46, CD55 e CD59, mas níveis comparáveis da expressão alvo CD20.

[00650] As linhas da célula B Daudi, WIL2-S, WSU-NHL, MEC-2 e ARH-77 expressam as quantidades comparáveis das moléculas CD20 (~250.000 capacidade de ligação de anticorpo específico - sABC) como determinado pela análise QIFIKIT (dados não mostrados). Para comparar os níveis de expressão das proteínas reguladoras de complemento entre estas linhas celulares, a análise QIFIKIT foi realizada para determinar os níveis de CD46 (anti-humano de camundongo CD46, CBL488, clone J4.48 Chemicon), CD55 (anti-humano de camundongo CD55, CBL511, Clone BRIC216, Chemicon) e CD59 (anti-humano de camundongo CD59, MCA1054x, clone MEM-43, Serotec).

[00651] Para o ensaio CDC, 0,1 x 106 das células foram pré-incubados nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpo de saturação (0,002-40,0 µg/mL na diluição de 4 vezes) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS. A morte mediada por CDC máximo foi calculada a partir de dois experimentos independentes usando a parte superior dos melhores valores de ajuste de um ajuste não linear em GraphPad PRISM 5.

[00652] A Figura 22A-D mostra que a introdução de E345R no rituximab de tipo selvagem resultou na eficácia CDC intensificada como observado por uma lise máxima aumentada e EC50 diminuído para todas as linhas celulares B testadas.

[00653] A Figura 22E mostra que a morte mediada por CDC máximo induzida pelo mutante rituximab-E345R sempre foi maior do que pelo rituximab de tipo selvagem, independente dos níveis de expressão das proteínas reguladoras de complemento de ligação de membrana. Estes dados indicam que a introdução de E345R intensifica o potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais como as células tumorais são menos efetivas na evasão do ataque do complemento mediado pelo anticorpo pelo anticorpos contendo E345R.

Exemplo 28 Comparação de CDC cinético para anticorpos E345R e tipo selvagem

[00654] A introdução da mutação que estabiliza a interação Fc:Fc E345R foi mostrada para intensificar ou resgatar CDC como observado pelos valores EC50 diminuídos e lise máxima aumentada para os anticorpos diferentes nas linhas celulares diferentes descritas no Exemplo 6 (anticorpo CD20 7D8 em Daudi e Raji), Exemplo 10 (anticorpo CD38 005 em Daudi, Raji e Wien133) e Exemplo 25 (anticorpo CD38 003 e anticorpos CD20 rituximab e 11B8 em Daudi e Wien133). Em seguida, os cinéticos das reações CDC foram analisados ainda para esclarecer a diferença na eficácia CDC entre os anticorpos de tipo selvagem e E345R.

[00655] 0,1 x 106 das células Raji foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com anticorpo em uma concentração de saturação (10,0 µg/mL) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por períodos diferentes de tempo, variando entre 0 e 60 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00656] A Figura 23A mostra que o anticorpo CD20 IgG1-7D8 de tipo selvagem mostrou a morte mediada por CDC máxima de 80% das células Raji, que já atingiu após 5 min sob as condições testadas. Entretanto, para IgG-7D8-E345R, 80% da morte das células Raji foi observada ainda mais rápida, após 3 min. A lise máxima por IgG-7D8-E345R (95%) também foi atingida após 5 minutos.

[00657] A Figura 23B mostra que também para o anticorpo CD20 rituximab de tipo selvagem, que é menos potente do que 7D8 induz CDC nas células Raji usadas, introdução da mutação E345R resultou na morte mais rápida das células alvos. Rituximab de tipo selvagem mostrou uma morte mediada por CDC máxima de 32%, atingida após 20 minutos. O Rituximab- E345R atingiu 32% da morte já após aproximadamente 3 minutos e notavelmente, lise máxima por rituximab-E345R (85%) também foi atingido após 20 minutos.

[00658] A Figura 23C+D mostra que as células Raji usadas, que são resistentes para morte mediada por CDC para os anticorpos CD38 IgG1-003 de tipo selvagem e IgG1-005, devem ser mortos rápido para introduzir a mutação E345R. IgG1-003-E345R e IgG1-005-E345R mostraram CDC máximo (50% e 60%, respectivamente) já após 5 min.

[00659] Em resumo, os anticorpos E345R são mais potentes do que duas contrapartes de tipo selvagem, que resultam a partir de uma combinação da eficácia mais alta (EC50 inferior), lise máxima aumentada e um cinético mais rápido da reação CDC.

Exemplo 29 Comparação de cinéticos CDC para os anticorpos biespecíficos com ou sem a mutação E345R

[00660] No exemplo 23 é descrito que a mutação E345R pode ser aplicada ao anticorpo biespecífico CD38xCD20 IgG1-005-F405L x IgG1- 7D8-K409R que foi gerado pela plataforma DuoBody, resultando em uma capacidade da morte intensificada como observado por um EC50 diminuído nos ensaios CDC nas células Raji e Wien133. Em seguida, os cinéticos da reação CDC foram analisados ainda para esclarecer a diferença na eficácia CDC entre os anticorpos biespecíficos CD38xCD20 com e sem E345R.

[00661] 0,1 x 106 das células Raji foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com anticorpo em uma concentração de saturação (10,0 µg/mL) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma 37°C incubator por períodos de tempo diferentes, variando entre 0 e 60 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00662] A Figura 24 mostra que o anticorpo biespecífico IgG1-005- F405L x IgG1-7D8-K409R induz uma morte mediada por CDC máxima de 83%, que foi atingida após 10 minutos. A introdução de E345R resultou na morte máxima aumentada por IgG1-005-E345R-F405L x IgG1-7D8-E345R- K409R (98%), que já foi atingida após 2 minutos. Estes dados indicam que introduzir a mutação que estabiliza Fc-Fc E345R no anticorpo biespecífico resulta em uma morte mediada por CDC acelerada das células alvos.

Exemplo 30 Comparação dos cinéticos CDC para os anticorpos de ligação monovalentes com e sem E345R

[00663] O exemplo 22 mostra que a ligação de alvo monovalente ainda intensifica a eficácia CDC dos anticorpos E345R como observado pela lise máxima aumentada com um anticorpo biespecífico CD38xEGFR nas células CD38-positivas, EGFR-negativas Wien133. Em seguida, os cinéticos da reação CDC foram analisados ainda para esclarecer a diferença na capacidade de matar mediado por CDC entre anticorpos de ligação monovalentes com e sem E345R.

[00664] Os anticorpos CD38xEGFR e CD20xEGFR biespecíficos, com ou sem a mutação E345R, foram gerados in vitro de acordo com uma plataforma DuoBody como descritos no Exemplo 22. A eficácia CDC dos anticorpos biespecíficos CD38xEGFR foi testada nas células CD38-positivas, EGFR-negativas Raji, no qual os anticorpos biespecíficos podem ligar-se apenas monovalentemente por intermédio de CD38. 0,1 x 106 das células Raji foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com anticorpo em uma concentração de saturação (10,0 µg/mL) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma 37° C incubator por períodos de tempo diferentes, variando entre 0 e 60 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00665] A Figura 25 mostra que o anticorpo biespecífico CD38xEGFR (IgG1-005-K409R x IgG1-2F8-F405L) induz uma morte mediada por CDC máxima de 55%, que foi atingida após aproximadamente 10 minutos. A introdução de E345R resultou na morte máxima aumentada (96%), que já atingiu dentro de 5 minutos.

[00666] A Figura 25 mostra que o anticorpo biespecífico CD20xEGFR (IgG1-7D8-K409R x IgG1-2F8-F405L) induz uma morte mediada por CDC máxima de 85%, que foi atingida após aproximadamente 5 minutos. Entretanto, com o anticorpo CD20xEGFR com E345R introduzido, 85% de lise foi observado mais rápido, após 2 minutos. A lise máxima pelo anticorpo E345R CD20xEGFR (97%) também foi atingido após 5 minutos.

[00667] Em resumo, a introdução da mutação E345R nestes anticorpos de ligação monovalentes resultou nos anticorpos mais potentes, que resultaram da combinação da lise máxima aumentada e um cinético mais rápido da reação CDC.

Exemplo 31 CDC para uma combinação de terapêuticos e anticorpos E345R/Q386K

[00668] Como descrito no Exemplo 19, os anticorpos CD38 mutantes derivados de IgG1-005 devem induzid o CDC eficiente nas células Wien133 quando a posição E345 do anticorpo de tipo selvagem foi substituído em qualquer aminoácido outro do que Glutamato (E). Este sugere que a oligomerização, como um pré-requisito de CDC, é impedido pela presença da cadeia secundária de glutamato na posição 345 do anticorpo. Visto que E345 em um Fc está próximo a Q386 na segunda porção Fc de revestimento na estrutura de anel de anticorpo hexamérico, o impedimento mediado por E345 da oligomerização em um primeiro anticorpo deve ser possivelmente removido pelas substituições na posição Q386 de um segundo anticorpo. Este então capacitaria E345 no primeiro anticorpo interagir melhor com a posição 386 mutada no segundo anticorpo no caso de ambos anticorpos serem combinados. Para testar esta hipótese, os ensaios CDC foram realizados no Wien133, no qual os anticorpos de tipo selvagem (IgG1-003, IgG1-005 ou IgG1-11B8) foram misturados com IgG1-005-E345R/Q386K ou IgG1-005- E345R/Q386K/E430G como um exemplo.

[00669] 0,1 x 106 das células Wien133 foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de IgG1-005-E345R/Q386K, IgG1-005-E345R/Q386K/E430G não purificado ou anticorpo de controle (0,0001-20,0 µg/mL na diluição de 3,33 vezes) na presença ou ausência de 1,0 ou 10,0 µg/mL anticorpo IgG1-003, IgG1-005 ou IgG1-11B8 de tipo selvagem em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00670] A Figura 26A/B/C mostra que o anticorpo CD38 IgG1-005- E345R/Q386K induz a lise mediada por CDC das células Wien133 em uma maneira dependente da dosagem (linha tracejada). A combinação IgG1-005- E345R/Q386K com 1 ou 10 µg/mL do anticorpo CD38 IgG1-003 de tipo selvagem (Figura 26A) ou anticorpo CD20 IgG1-11B8 de tipo selvagem (Figura 26B) resultou em uma lise celular máxima aumentada. A combinação de IgG1-005-E345R/Q386K com IgG1-005 de tipo selvagem inibiu CDC em uma maneira dependente da dosagem, possivelmente para competir pelo local de ligação (Figura 26C).

[00671] A Figura 26D/E/F mostra os resultados similares para o anticorpo CD38 IgG1-005-E345R/Q386K/E430G.

[00672] Estes dados indicam que os anticorpos IgG1-003 e IgG1-11B8 tipo selvagem participaram na oligomerização do anticorpo e ativação CDC quando combinado com IgG1-005-E345R/Q386K ou IgG1-005- E345R/Q386K/E430G. Em tais combinações, o impedimento da oligomerização pela posição E345 que está presente no anticorpo de tipo selvagem deve ser, pelo menos parcialmente, removido pela substituição Q386K no anticorpo mutante. Esta aplicação está em interesse particular para melhorar as terapias com os anticorpos que são tipo selvagem na posição E345, tal como rituximab, ofatumumab, daratumumab ou trastuzumab. Também, tais anticorpos que induzem a oligomerização devem promover a formação dos complexos de ligação celular com os anticorpos do próprio paciente direcionado contra as células alvos semelhantes as células tumorais ou bactéria.

[00673] O exemplo 19 descreve os aminoácidos múltiplos em adição ao E345 que intensifica CDC na mutação, por exemplo, E430 e S440, do qual as mutações específicas induzem CDC eficiente nas células Wien133 quando incorporados no anticorpo CD38 IgG1-005. Com a exceção dos mutantes I253 e Y436, as mutações que intensificam a oligomerização identificada contatam o aminoácidos não mutados na segunda porção Fc de revestimento na estrutura de anel hexamérico. Portanto, as mutações que intensificam a oligomerização identificadas, tanto sozinhas quanto combinadas, podem ser esperadas também para promover a oligomerização com os anticorpos não mutados e otimização adicional de tais mutantes devem ser atingidos pela estratégia de seleção similar aquela aplicada no exemplo 19.

Exemplo 32 CDC induzido por E345R nos isotipos de anticorpos IgG2, IgG3 e IgG4

[00674] Para testar se a introdução das mutações que promovem a oligomerização podem estimular a atividade CDC de isotipos de anticorpo não-IgG1, variantes isotípicas do anticorpo CD38 IgG1-005 foram geradas com os domínios constantes de IgG2, IgG3 ou IgG4 humanos que produzem IgG2-005, IgG3-005 e IgG4-005 pelos métodos conhecidos na técnica. Além disso, a mutação que intensifica a oligomerização E345R foi introduzida em todos estes anticorpos, produzindo IgG2-005-E345R, IgG3-005-E345R e IgG4-005-E345R. Em uma maneira similar, também IgG2-003 e IgG2-003- E345R foram gerados a partir do anticorpo CD38 IgG1-003. A eficácia CDC dos isotipos diferentes foi comparada em um ensaio in vitro CDC.

[00675] 0,1 x 106 das células Wien133 foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com 10 µg/mL dos anticorpos não purificados em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. IgG1-005-E345R foi adicionado a 3,0 µg/mL. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS.

[00676] A Figura 27 mostra que IgG2-005, IgG2-003, IgG3-005 e IgG4-005 foram incapaz de lisar as células (A) Daudi ou (B) Wien133 eficientemente sob as condições testadas (observado ~20% da lise foi considerada como fundamento). A introdução da mutação E345R capacita o CDC potente nas células Daudi por todos os isotipos IgG testados. Estes resultados foram confirmados usando CDC nas células Wien133, embora que IgG3-005-E345R apresentou a atividade de CDC limitada relativa a outras variantes isotípicas. Estes dados indicam que além de IgG1, uma oligomerização que intensifica a mutação tal como E345R também pode ser aplicada para promover a atividade CDC dos anticorpos IgG2, IgG3 e IgG4.

Exemplo 33 CDC por IgG1-005 e IgG1-005-E345R em um ensaio EX VIVO CDC nas células de leucemia linfocíticas crônicas de célula B positiva-CD38 derivados do paciente (CLL).

[00677] As células primárias criopreservadas das amostras do paciente CLL foram obtidas a partir do biobanco de hematopatologia do CDB- IDIBAPS-Hospital Clínic (Dr. Elias Campo, Hematopathology Unit, Department of Pathology, Hospital Clínic, Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), University of Barcelona, Barcelona, Spain), ou dos estudos clínicos pelo National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) (Dr. Adrian Wiestner, NHLBI, Hematology Branch of the National Institutes of Health (NIH), Bethesda). O consentimento informado foi obtido a partir dos pacientes de acordo com o Institutional Ethics Committee of the Hospital Clinic (Barcelona, Spain) ou o Institutional Review Board of the NIH e the Declaration of Helsinki. Todas as amostras foram geneticamente e imunofenotipicamente caracterizadas.

[00678] As amostras CLL foram categorizadas em dois groups de acordo com a expressão CD38 de ar como determinado pelo FACS: cinco amostras foram incluídas no grupo alto CD38 (entre 50% e 98% da expressão CD38 nas células Daudi) e quatro amostras foram incluídas no grupo baixo CD38 (entre 0,5% e 3% da expressão CD38 nas células Daudi).

[00679] As células CLL fluorescentemente rotuladas (rotulação com 5 µM de calceína AM) foram incubadas com uma série de concentração do anticorpo (0,01-10 µg/mL nas diluições de 10 vezes). Em seguida, soro humano normal foi adicionado as células opsonizadas pelo anticorpo (100.000 células/reservatório) como uma fonte de complemento (10% da concentração final) e incubadas por 45 min a 37° C. Os sobrenandantes foram recuperados e a fluorescência foi lida em um fluorômetro Synergy™ HT como uma medicação para a lise celular. A morte celular foi calculada como seguem:

[00680] Lise específica = 100 x (lise espontânea de amostra)/(lise máxima- lise espontânea) onde a lise máxima é determinada por uma amostra das células tratadas com 1% de Triton e lise espontânea é determinada a partir da amostra onde as células foram incubadas na presença de 10% de NHS sem anticorpo.

[00681] A Figura 28 mostra que a eficácia CDC IgG1-005-E345R fortemente intensificada comparada ao IgG1-005 de tipo selvagem em ambas as células CLL primárias com a expressão CD38 alta e células primárias CLL com expressão CD38 baixa.

Exemplo 34 Ligação FcRn dos mutantes IgG1-005 comparados ao IgG1-005

[00682] O receptor neonatal Fc (FcRn) é responsável pela vida média do plasma longo de IgG pela proteção de IgG a partir da degradação. Após a internalização do anticorpo, FcRn liga-se a região Fc de anticorpo no endossomos, onde a interação é estável no ambiente suavemente ácido (pH 6,0). Na reciclagem a membrana de plasma, onde o ambiente é neutro (pH 7,4), a interação é perdida e o anticorpo é liberado novamente na circulação. Esta influencia a vida média do plasma de IgG.

[00683] A capacidade dos mutantes IgG1-005 E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430F, E430G, E430S, E430T, S440Y, K439E e S440K para interagir com FcRn a partir do camundongo, macaco cinomólgo e humano foi testada em um ELISA. Nos mutantes FcRn ELISA de camundongo P247G e I253D também foram testados. I253D foi usado como um controle negativo para a ligação a FcRn. Todas as incubações foram feitas em temperatura ambiente. As placas de 96 reservatórios foram revestidas com 5 µg/mL (100 µL/reservat0rio) recombinantemente produz o domínio biotinilado extracelular de FcRn (camundongo, humano ou cinomólgo) (FcRnECDHis- B2M-BIO), diluído em PBST mais 0,2% de BSA e incubadas por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBST e 3 vezes periodicamente diluída (em PBST/0,2% de BSA, pH 6,0) mutantes IgG1-005 ou 005 de tipo selvagem foram adicionados e as placas foram incubadas por 1 hora. As placas foram lavadas com PBST/0,2% de BSA, pH 6,0. IgG(Fab'2)-HRP anti-humano de cabra (Jackson Immuno Research, cat n°:109-035-097) diluído em PBST/0,2% de BSA, pH 6,0 foi adicionado e as placas foram incubadas por 1 hora. Após lavagem, ABTS foi adicionado como substrato e placas foram incubadas no escuro por 30 minutos. A absorbância foi lida a 405 nm, usando um leitor EL808 ELISA. Os dados gerados no FcRn ELISA de camundongo foram analisados usando os melhores valores de ajuste de um ajuste de resposta de dosagem agonista não linear usando concentrações transformadas por logno GraphPad PRISM 5 e a afinidade evidente (EC50) foi calculada (Tabela 20). O experimento mostra que a ligação FcRn não foi alterada por qualquer um dos mutantes IgG1-005 comparados ao IgG1-005 de tipo selvagem. Tabela 20 Afinidade evidente (EC50) em µg/ml de IgG1-005 e mutantes ao FcRn de camundongo

[00684] A Figura 29 mostra que o IgG1-005 de tipo selvagem e todos os mutantes testados de IgG1-005 do reservatório ligado ao FcRn de camundongo, humano e cinomólgo a pH 6,0. Nenhuma ligação significante a FcRn foi detectada a pH 7,4 (dados não mostrados).

Exemplo 35 CDC intensificado pelas mutações diferentes em rituximab nas células da célula B Ramos e SU-DHL-4

[00685] Como descritos no Exemplo 19, a oligomerização e atividade CDC do anticorpo anti-CD38 IgG1-005 pode ser estimado pelas mutações simples nos resíduos específicos em ou na periferia da interface Fc:Fc. A oligomerização também pode ser indiretamente estimulada por outro tipo de mutações nos resíduos fora da interface Fc:Fc que alostericamente fortalece as interações Fc:Fc. Este também foi testado pelo anticorpo IgG1 anti-CD20 rituximab em duas linhas celulares B (Ramos e SU-DHL-4). As seguintes mutações foram testadas: E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430G, E430S, E430T e S440Y (essencialmente como descritos no Exemplo 19).

[00686] Para o ensaio CDC, 0,1 x 106 das células (Ramos ou SU-DHL- 4) foram pré-incubadas nas placas de 96 reservatórios de fundo redondo com uma série de concentração de anticorpo de saturação (0,0001-10,0 µg/mL em 3 vezes a diluição) em um volume total de 100 µL por 15 min em um agitador em temperatura ambiente. Em seguida, 25 µL de soro humano normal foi adicionado como uma fonte de complemento (20% da concentração final) e incubado em uma incubadora a 37° C por 45 min. A reação foi interrompida pela colocação das placas no gelo. 10 µL de iodeto de propídio foi adicionado e lise celular foi determinada por FACS. Os dados foram analisados usando os melhores valores de ajuste de um ajuste de resposta de dosagem agonista não linear usando as concentrações transformadas por log em GraphPad PRISM 5.

[00687] A Figura 30 mostra que todos os mutantes rituximab testados foram capazes de aumentar a eficácia CDC em ambas as linhas da célula B.

Exemplo 36 Ativação de complemento de fase líquida independente do alvo: mutantes IgG1-005 comparados ao IgG1-005 de tipo selvagem

[00688] A ativação de complemento independente alvo pode constituir uma questão de segurança quando um anticorpo ativa o complemento em por exemplo, a corrente sanguínea ou no tecido do órgão. Este pode resultar nos produtos de ativação do complemento não desejado ou deposição do complemento não desejado. Para testar a ativação de complemento de fase líquida independente do alvo 100 µg/ml dos mutantes igG1-005 E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430F, E430G, E430S, E430T, S440Y, IgG1-005 de tipo selvagem ou IgG agregado por calor (HAG, controle positivo) foram incubados em 90% de soro humano normal por 1 hora a 37° C. As amostras foram então transferidas a um kit ELISA para medir a geração C4d (Micro Vue C4d-fragment, Quidel, San Diego, CA, USA). O C4d é um fragmento de ativação de C4 que é um marcador pela ativação do caminho de componente clássico.

[00689] A Figura 31 mostra que IgG1-005, IgG1-005-E345K, IgG1- 005-E345Q, IgG1-005-E345Y, IgG1-005-E430G, IgG1-005-E430S e IgG1- 005-S440Y de tipo selvagem apresenta a ativação C4 mínima, considerando IgG1-005-E345R, IgG1-005-E430F e IgG1-005-E430T que apresenta a geração C4d aumentada (ativação C4) em comparação ao IgG1-005 de tipo selvagem.

Exemplo 37 Taxas de de liberação de plasma dos mutantes IgG1-005 comparados ao IgG1-005 de tipo selvagem

[00690] Os camundongos neste estudo foram alojados em uma unidade de barreira da Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, The Netherlands) e mantidos nas gaiolas com filtros superior e alimentos fornecidos ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados por Utrecht University animal ethics committee. Os camundongos SCID (C.B-17/Icr-Prkdc<Scid>/IcrIcoCrl, Charles-River) foram injetados intravenosamente com 500 µg de anticorpo usando 3 camundongos por grupo.

[00691] 50 µL das amostras sanguíneas foram coletadas a partir da veia safena em 10 minutos, 4 horas, 1 dia, 2 dias, 7 dias, 14 dias e 21 dias após a administração de anticorpo. O sangue foi coletado na heparina contendo os frascos e centrifugados por 5 minutos a 10.000 g. O plasma foi armazenado a-20° C até a determinação das concentrações de anticorpo.

[00692] As concentrações de IgG humano específicos foram determinadas usando um hIgG total e sanduíche ELISA específico para CD38.

[00693] Para o hIgG ELISA total, IgG mAb anti-humano de camundongo -clone capa MH16 (#M1268, CLB Sanquin, The Netherlands), rebestido pelas placas de 96 reservatórios Microlon ELISA (Greiner, Germany) em uma concentração de 2 µg/mL foi usado como anticorpo de captura. Após o bloqueio das placas com PBS suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino, as amostras foram adicionadas, periodicamente diluídas ao tampão ELISA (PBS suplementado com 0,05% de Tween 20 e 0,2% de albumina de soro bovino) e incubado em um agitador de placa por 1 h em temperatura ambiente (RT). As placas foram subsequentemente incubadas com imunoglobulina IgG anti-humano de cabra (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) e desenvolvido com 2,2’-azino-bis (ácido 3- etilbenztiazolino-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany). A absorbância foi medida em um leitor de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm.

[00694] Para o CD38 ELISA específico, domínio extracelular CD38 rotulado por His foi revestido as placas de 96 reservatórios Microlon ELISA (Greiner, Germany) em uma concentração de 2 µg/mL. Após o bloqueio das placas com tampão de ELISA, as amostras periodicamente diluídas com tampão ELISA foram adicionadas e incubadas em um agitador de placa por 1 h em temperatura ambiente (RT). As placas foram subsequentemente incubadas com 30 ng/ml de IgG1-HRP anti-humano de camundongo, (Sanquin M1328, clone MH161-1) e desenvolvido com 2,2’-azino-bis (ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Germany). A absorbância foi medida em um leitor de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm

[00695] A Figura 32A mostra as taxas de liberação de IgG do anticorpo de referência de tipo selvagem IgG1-005 e das variantes de anticorpo IgG1- 005-E345K, IgG1-005-E345Q, IgG1-005-E345R, IgG1-005-E345Y, IgG1- 005-E430F, IgG1-005-E430G, IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430T, IgG1- 005-S440Y. Os mutantes IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430G e IgG1-005- S440Y, IgG1-005-E430T, IgG1-005-E345K, IgG1-005-E345Q e IgG1-005- E345Y mostraram as taxas de liberação similares aquele de IgG1-005 de tipo selvagem. Os mutantes IgG1-005-E430F e IgG1-005-E345R apresentaram uma taxa de liberação mais rápida. A taxa de liberação e plasma foi calculada como a dosagem/AUC (mL/dia/kg). O valor AUC (área sob a curva) foi determinado a partir das curvas de tempo de concentração.

[00696] A Figura 32B mostra as taxas de liberação IgG como determinado pelo ELISA específica para CD38 do anticorpo de referência de tipo selvagem IgG1-005 e das variantes de anticorpo IgG1-005-E345K, IgG1- 005-E345R, IgG1-005-E430G, IgG1-005-E430S e IgG1-005-S440Y quando injetadas intravenosamente um dia após a administração intraperitoneal de 8,0 mg do anticorpo de controle IgG1-B12 irrevelante. O anticorpo de referência de tipo selvagem IgG1 na ausência do controle b12 irrelevante foi incluído como controle. Os mutantes IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430G, IgG1-005- S440Y e IgG1-005-E345K mostraram as taxas de liberação similares aqueles do tipo selvagem. O IgG1-005-E345R mutante apresentou uma liberação mais rápida.

EQUIVALENTES

[00697] Aquela pessoa habilitada na técnica reconhecerá, ou será capaz de determinar usando não mais do que o experimento de rotina, muitos equivalentes das formas de realização específicas da invenção descritas neste. Tais equivalentes são pretendidos ser abrangidos pe,las seguintes reivindicações. Qualquer e toda a combinação das formas de realização descritas nas reivindicações dependentes também são consideradas estar dentro do escopo da invenção.

Claims (2)

1. Método para aumentar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) IN VITRO sem alterar a ativação do complemento de fase fluida independente do alvo de um anticorpo precursor que compreende um domínio Fc de uma imunoglobulina e uma região de ligação, caracterizado pelo fato de que o método compreende introduzir uma mutação ao anticorpo precursor em um resíduo de aminoácido correspondente a E345K ou E345R na região Fc de uma cadeia pesada de IgG1 humana, em que a região Fc compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO 1 ou 5, avaliando a resposta CDC induzida pelo anticorpo variante quando ligado à superfície de uma célula que expressa antígeno na presença de células efetoras ou complemento em comparação com o anticorpo precursor; avaliar a atividade do complemento de fase fluida independente do alvo do anticorpo variante em comparação com o anticorpo precursor incubando o anticorpo em soro humano normal e determinando a geração de C4d em comparação com o anticorpo precursor; e selecionar um anticorpo variante com uma resposta CDC aumentada e ativação inalterada do complemento de fase independente do alvo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo precursor é um anticorpo monoespecífico, biespecífico ou multiespecífico.