BR122022006025B1 - Método para determinar eficiência alimentar ou produção de metano de animal ruminante - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para aumentar a eficiência alimentar ou diminuir a produção de metano de um animal ruminante que compreende administrar ao animal uma composição que compreende uma bactéria do gênero Megasphaera e uma bactéria de uma espécie selecionada do grupo que consiste em Coprococcus catus, Clostridium propionicum e Clostridium botulinum, em que a composição compreende entre 2-100 espécies microbianas, aumentando assim a eficiência alimentar ou diminuindo a produção de metano de um animal ruminante. Além disso, refere-se também a uma composição microbiana que compreende uma bactéria do gênero Megasphaera e uma bactéria de uma espécie selecionada do grupo que consiste em Coprococcus catus, Clostridium propionicum e Clostridium botulinum, em que a composição compreende entre 2-100 espécies microbianas.

Description

CAMPO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, refere-se a microflora ruminal e usos da mesma. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a microflora ruminal a fim de regular a eficiência alimentar e a produção de metano em animais ruminantes.

[002] Os ruminantes detêm uma enorme significância para o ser humano, pois convertem a energia armazenada em polímeros de biomassa vegetal, que são indigestos para os seres humanos, em produtos alimentares digestíveis. Os seres humanos domesticaram esses animais para esse fim na era Neolítica e os cultivam desde então para a produção e consumo de proteína animal sob a forma de carne e leite. Nos extensos regimes de produção de hoje, os ruminantes consomem 30% das culturas cultivadas na terra e ocupam outros 30% da massa terrestre do planeta. Esses animais também emitem metano - um gás de efeito estufa altamente potente - para a atmosfera e são considerados responsáveis por uma parcela considerável de sua emissão devido a atividades antropogênicas. Uma maneira de enfrentar esses problemas é aumentar a eficiência energética dos animais, ou seja, a eficiência com a qual os mesmos convertem energia de alimentos, aumentando assim a disponibilidade de alimentos e diminuindo a carga ambiental, pois esses animais produziriam mais e comeriam menos.

[003] São usados diferentes métodos para avaliar a eficiência energética de um animal; desses, o método do consumo residual de alimento (RFI) (Koch et al., 1963) é altamente aceito e amplamente usado por ser independente do crescimento e do tamanho corporal e, portanto, adequado para comparações entre animais. Esse parâmetro é uma estimativa da diferença entre a ingestão real de alimentos de um animal e sua ingestão de alimentos prevista com base em seu nível de produção e peso corporal. A eficiência energética varia consideravelmente entre diferentes indivíduos da mesma raça. Regiões genômicas específicas, como a que se sugere estar associada a um papel no controle do metabolismo energético, correlacionam- se à eficiência alimentar usando estudos de associação genômica ampla. No entanto, apenas um componente genético moderado (herdabilidade variando de 0,26 a 0,58) afeta a utilização de energia, como também foi demonstrado pela elevação da eficiência alimentar por meio da seleção de animais de acordo com sua RFI.

[004] Um fator importante que poderia contribuir muito para as variações na eficiência alimentar desses animais é o microbioma ruminal. A capacidade de esses animais digerir polímeros de biomassa vegetal é atribuída a esse complexo microbioma que reside no trato digestivo superior em um compartimento denominado rúmen (Mizrahi, 2013). O ambiente anaeróbico no rúmen e as teias alimentares altamente complexas sustentadas pelo microbioma ruminal permitem a fermentação de material vegetal em produtos finais metabólicos, como ácidos graxos de cadeia curta (SFCAs) e metano. Enquanto os SFCAs são absorvidos pela parede ruminal e servem para suprir as necessidades de energia do animal, o metano não é absorvido; o mesmo é emitido para a atmosfera juntamente com a sua energia retida, contribuindo assim para a perda de energia a partir da alimentação, bem para o aquecimento global (Mizrahi, 2011){Mizrahi, 2013 n° 2113}. Diferenças entre animais com RFI altas e baixas têm sido relatadas em termos de produção de metano, bem como de algumas diferenças na composição microbiana (Nkrumah et al., 2006, Mizrahi, 2011, Hernandez-Sanabria et al., 2012, Jami et al., 2014, Kittelmann et al., 2014, Shi et al., 2014, Wallace et al., 2015). No entanto, ainda não existe uma compreensão abrangente e completa dos padrões de estrutura do microbioma e como traduzi-los para a funcionalidade no nível animal.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficiência alimentar e a produção de metano de um animal ruminante que compreende analisar o número e/ou diversidade de um táxon bacteriano de um microbioma do animal ou de um conteúdo genético do microbioma, em que um número e/ou diversidade do táxon abaixo de um nível predeterminado é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano, ou um número de genes abaixo de um nível predeterminado é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[006] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficiência alimentar e/ou da produção de metano em um animal ruminante que compreende quantificar pelo menos uma espécie bacteriana conforme apresentado nas Tabelas 4 e 5 em um microbioma do animal, em que, quando o nível de pelo menos uma espécie bacteriana na Tabela 4 está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo de uma alta eficiência alimentar ou uma baixa produção de metano e, quando o nível de pelo menos uma espécie bacteriana apresentado na Tabela 5 está abaixo de um nível predeterminado, isso é indicativo de uma alta eficiência alimentar ou uma baixa produção de metano.

[007] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficiência alimentar e/ou da produção de metano em um animal ruminante que compreende quantificar pelo menos uma espécie bacteriana do gênero Megasphaera em um microbioma do animal, em que, quando o nível da pelo menos uma espécie bacteriana está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo de uma alta eficiência alimentar ou uma baixa produção de metano.

[008] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de qualificação de animais ruminantes que compreende: (a) determinar a eficiência alimentar ou a produção de metano dos animais ruminantes conforme descrito no presente documento; e (b) selecionar os animais que têm uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[009] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição anti-microbiana que compreende pelo menos um agente que especificamente regula de modo descendente pelo menos uma espécie bacteriana que é apresentada na Tabela 5.

[010] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficácia alimentar ou produção de metano de um animal ruminante que compreende analisar a quantidade ou composição de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) de um metaboloma do animal, em que a quantidade e/ou composição dos SCFAs é indicativo da eficácia alimentar ou produção de metano.

[011] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de aumento da eficácia alimentar ou de diminuição da produção de metano de um animal ruminante que compreende administrar ao animal um agente que aumenta a quantidade de pelo menos uma espécie bacteriana apresentada na Tabela 4 no microbioma ruminal do animal, aumentando assim a eficácia alimentar ou diminuindo a produção de metano de um animal ruminante.

[012] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de aumento da eficácia alimentar ou de diminuição da produção de metano de um animal ruminante que compreende administrar ao animal um agente que aumenta a quantidade do gênero bacteriano Megasphaera no microbioma ruminal do animal, aumentando assim a eficácia alimentar ou diminuindo a produção de metano de um animal ruminante.

[013] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método de aumento da eficácia alimentar ou de diminuição da produção de metano de um animal ruminante que compreende administrar ao animal uma composição que compreende pelo menos um agente que especificamente regula de maneira descendente uma quantidade de pelo menos uma bactéria apresentada na Tabela 5, aumentando assim a eficácia alimentar ou diminuindo a produção de metano de um animal ruminante.

[014] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição microbiana que compreende entre 2 a 100 espécies de bactérias, em que pelo menos uma das espécies é conforme apresentado na Tabela 4.

[015] De acordo com modalidades da presente invenção, a pelo menos uma espécie bacteriana é Megasphaera elsdenii ou Coprococcus catus.

[016] De acordo com modalidades da presente invenção, o microbioma é um microbioma não patogênico.

[017] De acordo com modalidades da presente invenção, o microbioma compreende um microbioma ruminal ou microbioma fecal.

[018] De acordo com modalidades da presente invenção, a determinação de uma quantidade é efetuada por meio da análise da expressão de pelo menos um gene do genoma da pelo menos uma bactéria.

[019] De acordo com modalidades da presente invenção, a pelo menos uma espécie bacteriana é Megasphaera elsdenii.

[020] De acordo com modalidades da presente invenção, quando a quantidade de propionato, butirato, valerato e/ou isovalerato no metaboloma do animal está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo do animal que tem uma alta eficácia alimentar e uma baixa produção de metano.

[021] De acordo com modalidades da presente invenção, o número do táxon é analisado até o nível de filo.

[022] De acordo com modalidades da presente invenção, a diversidade do táxon é analisada no nível de espécie.

[023] De acordo com modalidades da presente invenção, quando a quantidade de SCFAs totais no metaboloma do animal está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo do animal que tem uma alta eficácia alimentar e uma baixa produção de metano.

[024] De acordo com modalidades da presente invenção, quando a razão entre propionato:acetato no metaboloma do animal é maior que uma quantidade predeterminada, isso é indicativo do animal que tem uma alta eficácia alimentar e uma baixa produção de metano.

[025] De acordo com modalidades da presente invenção, o agente compreende a pelo menos uma espécie bacteriana.

[026] De acordo com modalidades da presente invenção, o agente compreende o gênero bacteriano.

[027] De acordo com modalidades da presente invenção, o agente não é um antibiótico.

[028] De acordo com modalidades da presente invenção, o animal ruminante tem nos que 6 meses de vida.

[029] De acordo com modalidades da presente invenção, a composição está compreendida em uma ração.

[030] De acordo com modalidades da presente invenção, a composição está compreendida em uma silagem.

[031] De acordo com modalidades da presente invenção, a composição está compreendida em um enema.

[032] De acordo com modalidades da presente invenção, o animal é tratado com uma composição antibiótica antes da administração.

[033] De acordo com modalidades da presente invenção, a composição é desprovida de material fecal.

[034] De acordo com modalidades da presente invenção, a composição é formulada como uma ração, uma silagem ou um enema.

[035] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme é comumente compreendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual essa invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo as definições, terá preferência. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são destinados a ser limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[036] A invenção é descrita no presente documento, apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência específica agora aos desenhos em detalhe, salienta-se que os pormenores mostrados são a título de exemplo e apenas para propósitos de discussão ilustrativa das modalidades preferenciais da presente invenção, e são apresentados na causa de proporcionar o que se acredita ser a descrição mais útil e prontamente compreendida dos princípios e aspectos conceituais da invenção. A este respeito, não é feita nenhuma tentativa para mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhe do que é necessário para uma compreensão fundamental da invenção, a descrição feita com os desenhos tornando evidente para os versados na técnica como as várias formas da invenção podem ser incorporados na prática.

[037] Nos desenhos: As Figuras 1A a 1G. Parâmetros comunitários de microbiomas de vacas eficientes e ineficientes. (A-B) Riqueza de Microbioma. As espécies (baseadas no sequenciamento de amplificação de 16S) (A) e o gene (com base na sequência de metagenômicos) (B) foram calculadas e expressas como riqueza simples. A densidade de Kernel dos histogramas eficiente e ineficiente enfatiza a distribuição diferente de contagens em cada grupo de microbioma. São mostrados os valores Pda diferença na riqueza entre vacas eficientes e ineficiente. (C) Riqueza do microbioma em diferentes níveis filogenéticos. (D-E) Medições da diversidade alfa (índice de Shannon) de acordo com as espécies (D) e genes (E). (F-G) Dominância do microbioma de acordo com as espécies (F) e genes (G). Os dados são expressos como média ± SEM. Wilcoxon rank-sum, *P < 0,05, **P < 0,01.

[038] As Figuras 2A a 2B. Previsões de eficiência alimentar de acordo com espécies e genes. Espécie (a) e genes (b) que diferiram em abundância entre vacas eficientes e ineficientes foram classificados de acordo com seus valores P e agrupados em bins de 100. Os bins foram usados como recursos preditivos para o parâmetro de eficiência de alimentação RFI usando o algoritmo k-Nearest Neighbors (KNN) com k = 3. Cada iteração usou um bin diferente como recursos preditivos, em ordem de valor P crescente. Inserção em ambos os gráficos representa os cinco primeiros valores de precisão de previsão (Permutações de embaralhamento de classes aleatórias, valor P = 0,009).

[039] Figura 3, Metaboloma e atividade microbiana de microbiomas ruminais de vacas eficientes e ineficientes. Métodos de digestibilidade in vivo e in vitro foram realizados no fluido ruminal de vacas eficientes e ineficientes, além da extração, identificação e quantificação de 41 metabólitos diferentes por GC e CG-EM. Esses metabólitos foram normalizados para o conteúdo de matéria orgânica do líquido ruminal de onde foram extraídos. Metabólitos são organizados de acordo com os níveis tróficos. Correção de múltiplas hipóteses com 9.999 permutações foi realizada individualmente para cada teste metabólico ou de atividade usando a estatística t (Métodos).

[040] Os dados são expressos como média ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,01.

[041] As Figuras 4A e 4B. Concentração de AGCC em fluidos ruminais de vacas eficientes e ineficientes. (A) Concentrações totais de AGCC em amostras ruminais eficientes e ineficientes. (B) Razão de propionato/acetato nas amostras ricas eficientes e ineficientes. Os dados são expressos como média ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,01.

[042] As Figuras 5A e 5B. Anotações taxonômicas de espécies e genes enriquecidos em cada grupo de microbioma. (A) Correlação de Spearman de espécies significativamente enriquecidas ao parâmetro de eficiência alimentar. As anotações são apresentadas no nível filogenético mais baixo obtido, bem como no nível de ordem entre parênteses. (B) A distribuição das anotações filogenéticas de genes enriquecidos em cada um dos grupos de microbioma. São apresentadas anotações filogenéticas acima de um limiar de 2%.

[043] As Figuras 6A e 6B. Recursos de microbioma enriquecidos em cada grupo de microbioma. (A) As leituras de cada amostra foram alinhadas aos genomas sequenciados de micro-organismos ruminais conhecidos usando a ferramenta BWA. As relações entre alinhamentos de amostras eficientes/ineficientes para cada genoma são apresentadas. A utilização e produção de metabolitos para cada microorganismo com base nas características de crescimento conhecidas (Holdman & Moore, 1974, Russell & Rychlik, 2001, Duncan et al., 2009) são coloridas em azul e laranja, respectivamente. (B) As leituras de cada amostra foram alinhadas às enzimas KEGG de diferentes vias metabólicas usando a ferramenta BWA. As vias do propanodiol, acrilato e succinato são diferentes vias de produção de propionato. As relações entre alinhamentos de amostras eficientes/ineficientes para cada via são apresentadas. Os dados são expressos como razão de médias. Teste t de permutações,*P < 0,05, **P < 0,01.

[044] As Figuras 7A e 7B. Modelo e resultados consolidados. (A) Consolidação dos resultados das análises de metabolômica, genoma e recrutamento de vias. Verde: vias e metabólitos que não foram significativamente diferentes ou que não foram avaliados. Vermelho: Enriquecido em microbiomas eficientes. Cinza: enriquecido em microbiomas ineficientes. (B) Modelo proposto. Da esquerda para a direita: metabólitos de entrada-chave idênticos são ingeridos pela vaca e apresentados a um microbioma eficiente (painel superior) com menor riqueza e diversidade, ou um microbioma ineficiente (painel inferior) com maior riqueza e diversidade. Diferenças na riqueza resultam na produção de diferentes metabólitos. O microbioma eficiente produz uma faixa menor de metabólitos de saída do que o microbioma ineficiente, porém com maiores quantidades de metabólitos de saída relevantes que estão disponíveis para as necessidades energéticas do animal.

[045] Figura 8, Distribuição da População de RFI do Coorte Experimental (146 vacas). Vacas com RFI extrema baixa (n = 40) e extrema alta (n = 38) são coloridas de vermelho e cinza, respectivamente, e representam os 25% mais e 25% menos eficientes de um coorte de 146 vacas. Essas 78 vacas foram escolhidas para amostragem ruminal e fecal.

[046] Figura 9, Porcentagem de Leituras Mapeadas de Amostras de Vacas Eficientes e Ineficientes para os Genes Total de Microbiomas. Os dados são expressos como média ± SEM.

[047] Figura 10, Número de genes em uma amostra como uma função do número de leituras. As leituras de cada amostra foram alinhadas aos genes totais. O número de leituras alinhadas é plotado em relação ao número de genes obtidos para cada amostra. Nenhuma correlação foi encontrada entre as duas variáveis (valor P= 0,074).

[048] Figura 11, Abundâncias de Filo. Composição do microbioma dos dois grupos de eficiência ao nível do filo. Filos com abundância relativa acima de 0,001% são apresentados. Os dados são expressos como média ± SEM.

[049] As Figuras 12A e 12B. Diversidade de Shannon e Domínio de Microbiomas Eficientes e Ineficientes. (A) Diversidade de Shannon em diferentes níveis filogenéticos. (B) Domínio em diferentes níveis filogenéticos. Os dados são expressos como média ± SEM. Wilcoxon rank sum, *P < 0,05.

[050] As Figuras 13A a 13I. Previsão de Traços Fisiológicos e Metabólicos de acordo com Espécies. Espécies que diferiram em abundância entre vacas eficientes e ineficientes foram classificadas de acordo com seus valores P e agrupadas em grupos de 100. Os bins foram usados como recursos preditivos para os diferentes parâmetros fisiológicos usando o algoritmo k-Nearest Neighbors (KNN) com k = 3. Cada iteração usou um bin diferente como recursos preditivos, em ordem de valor P crescente. (A) Precisão de previsão da taxa de conversão (CR). (B) Precisão de predição da gordura do leite. (C) Precisão de previsão da ingestão de matéria seca (DMI). (D) Precisão de previsão de produção de leite. (E) Precisão da predição da lactose do leite. (F) Precisão de previsão de pH. (G) Precisão de previsão de proteína do leite. (H) Precisão de previsão de energia do leite. (I) precisão da predição de mudança do escore de condicionamento corporal (BCS).

[051] As Figuras 14A a 13I. Previsão de Traços Fisiológicos e Metabólicos de acordo com genes. Genes que diferiram em abundância entre vacas eficientes e ineficientes foram classificadas de acordo com seus valores P e agrupadas em grupos de 100. Os bins foram usados como recursos preditivos para os diferentes parâmetros fisiológicos usando o algoritmo k-Nearest Neighbors (KNN) com k = 3. Cada iteração usou um bin diferente como recursos preditivos, em ordem de valor P crescente. Gráficos diferentes representam previsões de diferentes parâmetros fisiológicos. (A) Precisão de previsão de CR. (B) Precisão de predição da gordura do leite. (C) Precisão de previsão de DMI. (D) Precisão de previsão de produção de leite. (E) Precisão da predição da lactose do leite. (F) Precisão de previsão de pH. (G) Precisão de previsão de proteína do leite. (H) Precisão de previsão de energia do leite. (I) Precisão de previsão de mudança de BCS.

[052] As Figuras 15A e 15J. Especificidade e Avaliação de Sensibilidade de Predições de Traços Fisiológicos e Metabólicos de Acordo com a Espécie. Foram obtidas curvas de Característica de Operação de Receptor (ROC) e medidas de Área sob a Curva (AUC) para os cinco primeiros bins de previsão (consulte as Figuras 2A e 11) com base na média de 1.000 KNN iterações de validação cruzada. (A) RFI. (B) Análise de ROC de CR. (C) Análise de ROC de gordura do leite. (D) análise de ROC de DMI. (E) análise de ROC de rendimento do leite. (F) análise de ROC de lactose do leite. (G) análise de ROC de pH. (H) análise de ROC de proteína do leite. (I) análise de ROC de energia do leite. (J) análise de ROC de mudança de BCS.

[053] As Figuras 16A e 15J. Especificidade e Avaliação de Sensibilidade de Predições de Traços Fisiológicos e Metabólicos de Acordo com o Gene. Foram obtidas curvas de Característica de Operação de Receptor (ROC) e medidas de Área sob a Curva (AUC) para os cinco primeiros bins de previsão (consulte as Figuras 2B e 12) com base na média de 1.000 KNN iterações de validação cruzada. (A) RFI. (B) Análise de ROC de CR. (C) Análise de ROC de gordura do leite. (D) análise de ROC de DMI. (E) análise de ROC de rendimento do leite. (F) análise de ROC de lactose do leite. (G) análise de ROC de pH. (H) análise de ROC de proteína do leite. (I) análise de ROC de energia do leite. (J) análise de ROC de mudança de BCS.

[054] As Figuras 17A a 17D. Digestibilidade In Vitro e Digestibilidade In Vivo. (A) Digestibilidade in vitro da matéria seca (MS) da ração após 24 h de incubação com o fluido ruminal de vacas eficientes e ineficientes. (B) Digestibilidade in vitro da fibra em detergente neutro (FDN) da ração após 24 h de incubação com o fluido ruminal de vacas eficientes e ineficientes. (C) Digestibilidade de DM in vivo de amostras de fezes eficientes e ineficientes. (D) Digestibilidade de NDF in vivo de amostras de fezes eficientes e ineficientes. Os dados são expressos como média ± SEM.

[055] Figura 18, Abundância Relativa de Espécies Significativamente Diferentes. Abundância relativa das 18 espécies que se mostraram significativamente diferentes entre os dois grupos de eficiência. Os dados são expressos como média ± SEM.

[056] Figura 19, A análise de Componentes Principais (PCA) de Genes Enriquecidos nos Dois Grupos de Eficiência - PCA foi realizada para os microbiomas de vacas eficientes e ineficientes usando os 34.166 genes que foram significativamente diferentes entre os dois grupos de eficiência.

[057] Figura 20, Ler Alinhamento aos Genomas Microbianos Ruminais Conhecidos. As leituras de cada amostra foram alinhadas aos genomas sequenciados de micro-organismos ruminais conhecidos usando a ferramenta BWA. As relações entre recrutamento de amostras eficientes/ineficientes para cada genoma são apresentadas. Os dados são expressos como média ± SEM. Teste t de permutações, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

[058] Figura 21, Distribuição de Via de Acrilato em Organismos do Microbioma Ruminal. Leituras de todas as amostras foram lançadas contra genes de subunidades alfa, beta e gama da lactoil-CoA desidratase (Reichardt et al. 2014). As leituras que passaram um limite de 60% de identidade foram reunidas e anotadas usando o banco de dados NR. A porcentagem de cada anotação nas leituras gerais é apresentada.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS

[059] A presente invenção, em algumas modalidades da mesma, refere-se a microflora ruminal e usos da mesma. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a microflora ruminal a fim de regular a eficiência alimentar e a produção de metano em animais ruminantes.

[060] Aprecia-se que certos recursos da invenção, que são, para maior clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidos em combinação em uma única modalidade. Inversamente, vários recursos da invenção, que são, por brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

[061] Os ruminantes são completamente dependentes de sua microbiota para a digestão dos alimentos e, consequentemente, sua viabilidade. Os presentes inventores especularam que pode existir uma ligação entre a composição e abundância de taxa de bactérias residentes no rúmen e os parâmetros fisiológicos do hospedeiro.

[062] A eficiência alimentar foi medida em 146 vacas de ordenha e análises da composição taxonômica, conteúdo gênico, atividade microbiana e composição metabolômica foram realizadas nos microbiomas ruminal dos 78 animais mais extremos. A menor riqueza do conteúdo genético e dos táxons do microbioma estava estreitamente relacionada à maior eficiência alimentar. Os genes e espécies do microbioma previram com precisão o fenótipo de eficiência alimentar dos animais. O enriquecimento específico de micróbios e vias metabólicas em cada um desses grupos de microbiomas resultou em melhor canalização de energia e carbono para o animal, enquanto reduziu as emissões de metano para a atmosfera. Esta compreensão ecológica e mecanicista do microbioma ruminal pode levar a um aumento nos recursos alimentares disponíveis e na agricultura pecuária ecológica.

[063] Dessa forma, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficiência alimentar ou produção de metano de um animal ruminante que compreende analisar o número e/ou diversidade de um táxon bacteriano de um microbioma do animal, em que um número e/ou diversidade do táxon abaixo de um nível predeterminado é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[064] Conforme discutido no presente documento, o termo “eficiência alimentar” se refere à capacidade de o animal extrair energia de seu alimento. A eficiência alimentar é a diferença entre a ingestão real de alimentos de um animal e sua ingestão de alimentos prevista com base em seu nível de produção e peso corporal. Dessa forma, um animal com “uma alta” eficiência alimentar é aquele que produz mais leite e pesa mais do que é esperado baseado em sua ingestão de alimentos. Um animal com uma eficiência alimentar “negativa” é aquele que produz menos leite e pesa menos do que é previsto baseado em sua ingestão de alimentos. Em uma modalidade, a eficiência energética é medida com o uso do método de ingestão de alimento residual (RFI) (Koch et al., 1963) e pode ser calculada de acordo com fórmulas do Conselho Nacional de Pesquisa 2001. Os valores esperados de RFI para cada vaca podem ser calculados com base em uma equação de regressão múltipla.

[065] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência alimentar) quanto tiver pelo menos 0,05 desvio padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[066] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 0,05 desvio padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[067] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 1 desvio padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[068] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 2 desvios padrão abaixo da RFI média do rebanho, com o rebanho tendo pelo menos 15 animais.

[069] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 3 desvios padrão abaixo da RFI média do rebanho, com o rebanho tendo pelo menos 15 animais.

[070] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 4 desvio padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[071] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 5 desvio padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[072] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quanto tiver pelo menos 6 desvio padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[073] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência alimentar) quanto tiver pelo menos 0,05 desvio padrão acima da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[074] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 0,05 desvio padrão acima da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[075] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 1 desvio padrão acima da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[076] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 2 desvios padrão acima da RFI média do rebanho, com o rebanho tendo pelo menos 15 animais.

[077] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 3 desvios padrão acima da RFI média do rebanho, com o rebanho tendo pelo menos 15 animais.

[078] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 4 desvio padrão acima da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[079] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 5 desvios padrão abaixo da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[080] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma alta RFI (ou baixa eficiência energética) quanto tiver pelo menos 6 desvio padrão acima da RFI média do rebanho (com o rebanho tendo pelo menos 15 animais).

[081] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando sua ingestão de matéria seca (DMI) for menor que 1 kg por dia do que previsto de acordo com sua ingestão alimentar esperada (calculada como uma função de peso e produção de leite, conforme descrito acima no presente documento).

[082] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando sua ingestão de matéria seca (DMI) for menor que 2 kg por dia do que previsto de acordo com sua ingestão alimentar esperada.

[083] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando sua ingestão de matéria seca (DMI) for menor que 4kg por dia do que previsto de acordo com sua ingestão alimentar esperada.

[084] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando sua ingestão de matéria seca (DMI) for menor que 8kg por dia do que previsto de acordo com sua ingestão alimentar esperada.

[085] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando sua ingestão de matéria seca (DMI) for menor que 16 kg por dia do que previsto de acordo com sua ingestão alimentar esperada.

[086] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando sua ingestão de matéria seca (DMI) for menor que 32 kg por dia do que previsto de acordo com sua ingestão alimentar esperada.

[087] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 1,5 vezes a quantidade de leite ou pesar 1,5 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[088] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 2 vezes a quantidade de leite ou pesar 2 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[089] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 2,5 vezes a quantidade de leite ou pesar 2,5 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[090] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 3 vezes a quantidade de leite ou pesar 3 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[091] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 3,5 vezes a quantidade de leite ou pesar 3,5 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[092] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 4 vezes a quantidade de leite ou pesar 4 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[093] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 4,5 vezes a quantidade de leite ou pesar 4,5 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[094] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como tendo uma baixa RFI (ou alta eficiência energética) quando produzir 5 vezes a quantidade de leite ou pesar 5 vezes o peso do que previsto de acordo com sua ingestão de alimentos.

[095] O termo “produção de metano” se refere a uma quantidade metano emitido pelos animais por si só ou produzido pelo microbioma. A mesma pode ser medida em unidades de g por dia ou g por kg de ingestão de matéria seca.

[096] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 0,05 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[097] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 0,5 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[098] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 1 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[099] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 2 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[0100] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 3 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[0101] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 4 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[0102] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 5 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[0103] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "grande produtor de metano” quanto tiver pelo menos 6 desvio padrão acima da produção média de metano do rebanho.

[0104] O termo “baixa produção de metano” se refere a uma quantidade menor que 100 g por dia ou 10g por kg por ingestão de matéria seca produzida no microbioma (por exemplo, microbioma ruminal/microbioma fecal) do animal.

[0105] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 0,05 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0106] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 0,5 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0107] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 1 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0108] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 2 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0109] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 3 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0110] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 4 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0111] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 5 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0112] De acordo com uma modalidade, um animal pode ser classificado como "pequeno produtor de metano” quanto tiver pelo menos 6 desvio padrão abaixo da produção média de metano do rebanho.

[0113] Os animais ruminantes contemplados pela presente invenção incluem, por exemplo, gado bovino (por exemplo, vacas), cabras, ovelhas, girafas, bisão- americano, bisões europeus, iaques, búfalos, veados, camelos, alpacas, lhamas, gnus, antílopes, pronghorn e nilgais.

[0114] De acordo com uma modalidade particular, o animal ruminante é uma vaca.

[0115] A presente invenção contempla a determinação da eficiência alimentar em animais ruminantes de todas as idades. De acordo com uma modalidade particular, os animais cujo fenótipo é alterado são recém-nascidos, tipicamente com não mais que um dia de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que dois dias de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que três dias de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 1 semanas de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 2 semanas de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 1 mês de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 3 meses de vida. De acordo com ainda uma outra modalidade, os animais são adultos.

[0116] O termo “microbioma” como usado no presente documento, se refere à totalidade de micróbios (bactérias, fungos, protistas), seus elementos genéticos (genomas) em um ambiente definido.

[0117] De acordo com uma modalidade particular, o microbioma é um microbioma ruminal.

[0118] De acordo com uma outra modalidade, o microbioma é derivado de um animal saudável (isto é, o microbioma é um microbioma não patogênico).

[0119] Uma amostra de microbiota compreende uma amostra de micróbios e/ou componentes ou produtos dos mesmos provenientes de um microbioma.

[0120] Em algumas modalidades, uma amostra de microbiota é coletada através de qualquer meio que permita a recuperação de micróbios ou componentes ou produtos dos mesmos de um microbioma e seja apropriada para a fonte de microbioma relevante, por exemplo, rúmen.

[0121] O rúmen pode ser coletado com o uso de métodos conhecidos na técnica e inclui, por exemplo, o uso de um tubo estomacal com um amostrador a vácuo de rúmen. Tipicamente, coleta-se o rúmen após a alimentação.

[0122] Em algumas modalidades, no lugar da análise de uma amostra ruminal, é usada uma amostra fecal que reflete o microbioma ruminal. Dessa forma, nesta modalidade, analisa-se um microbioma fecal.

[0123] De acordo com uma modalidade desse aspecto da presente invenção, analisa-se o número de táxons bacterianos na amostra de microbiota e/ou analisa-se o número de genes na amostra de microbiota. Essa análise corresponde à riqueza da amostra de microbiota.

[0124] Opcionalmente, a abundância de cada táxons/genes também é analisada de modo a obter uma medida da diversidade ou dominância da amostra.

[0125] Diversidade taxonômica consiste em dois componentes: riqueza de táxon (por exemplo, espécie) e uniformidade de táxon (por exemplo, espécie). A riqueza de espécies é uma simples contagem de espécies, enquanto que a uniformidade de espécies quantifica a igualdade das abundâncias das espécies.

[0126] Dominância: Mede a probabilidade de que dois indivíduos selecionados aleatoriamente de uma amostra pertencerão ao mesmo táxon, varia de 0 (todos os táxons estão igualmente presentes) a 1 (um táxon domina completamente a comunidade).

[0127] Dominância: soma((ni/n)2), em que ni é o número de indivíduos de táxon i.

[0128] A microflora ruminal pode ser analisada em nível quantitativo e/ou qualitativo.

[0129] Métodos de quantificação dos níveis de genes e micróbios (por exemplo, bactérias) de vários táxons são descritos abaixo.

[0130] Em algumas modalidades, determinar um nível ou um conjunto de níveis de um ou mais tipos de micróbios ou componentes ou produtos dos mesmos compreende determinar um nível ou um conjunto de níveis de uma ou mais sequências de DNA. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências de DNA compreendem qualquer sequência de DNA que pode ser usada para diferenciar entre diferentes tipos microbianos. Em certas modalidades, uma ou mais sequências de DNA compreendem sequências de gene de rRNA 16s. Em certas modalidades, uma ou mais sequências de DNA compreendem sequências de gene de rRNA 18s. Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1.000, 5.000 ou mais sequências são amplificadas.

[0131] A atribuição de taxonomia de espécies pode ser realizada com o uso de um programa de computador adequado (por exemplo, BLAST) contra a base de dados de referência apropriada (por exemplo, base de dados de referência de rRNA 16S).

[0132] Ao determinar se um ácido nucleico ou proteína é substancialmente homóloga ou compartilha um certo percentual de identidade de sequência com uma sequência da invenção, a similaridade de sequência pode ser definida por algoritmos convencionais, que tipicamente permitem a introdução de um pequeno número de lacunas a fim de alcançar o melhor ajuste. Em particular, "percentual de identidade" de dois polipeptídeos ou duas sequências de ácidos nucleicos é determinado com o uso do algoritmo de Karlin e Altschul. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2.264 a 2.268, 1993). Tal algoritmo é incorporado aos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403 a 410, 1990). Pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma molécula de ácido nucléico da invenção. De igual modo, as pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX para obter sequências de aminoácidos que são homólogas a um polipeptídeo da invenção. Para obter alinhamentos com lacuna para fins de comparação, o Gapped BLAST é utilizado conforme descrito em Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25:3.389 a 3.402, 1997). Ao utilizar programas BLAST e BLAST com Lacunas, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) são empregados.

[0133] De acordo com uma modalidade, a fim de classificar um micróbio como pertencendo a um gênero particular, o mesmo deve compreender pelo menos 90% de homologia de sequência, pelo menos 91% de homologia de sequência, pelo menos 92% de homologia de sequência, pelo menos 93% de homologia de sequência, pelo menos 94% de homologia de sequência, pelo menos 95% de homologia de sequência, pelo menos 96% de homologia de sequência, pelo menos 97% de homologia de sequência, pelo menos 98% de homologia de sequência, pelo menos 99% de homologia de sequência com um micróbio de referência conhecido por pertencer ao gênero particular. De acordo com uma modalidade particular, a homologia de sequência é pelo menos 95 %.

[0134] De acordo com uma outra modalidade, a fim de classificar um micróbio como pertencendo a uma espécie particular, o mesmo deve compreender pelo menos 90% de homologia de sequência, pelo menos 91% de homologia de sequência, pelo menos 92% de homologia de sequência, pelo menos 93% de homologia de sequência, pelo menos 94% de homologia de sequência, pelo menos 95% de homologia de sequência, pelo menos 96% de homologia de sequência, pelo menos 97% de homologia de sequência, pelo menos 98% de homologia de sequência, pelo menos 99% de homologia de sequência com um micróbio de referência conhecido por pertencer à espécie particular. De acordo com uma modalidade particular, a homologia de sequência é pelo menos 97 %.

[0135] Em algumas modalidades, uma amostra de microbiota é diretamente analisada para um nível ou conjunto de níveis de uma ou mais sequências de DNA. Em algumas modalidades, o DNA é isolado de uma amostra de microbiota e o DNA isolado é analisado para um nível ou conjunto de níveis de uma ou mais sequências de DNA. São bem conhecidos na técnica métodos de isolamento de DNA microbiano. Os exemplos incluem, sem limitação, extração com fenol-clorofórmio e uma grande variedade de kits disponíveis comercialmente, incluindo o Mini Kit de Fezes de DNA QJAamp (Qiagen, Valencia, CA, EUA).

[0136] Em algumas modalidades, um nível ou conjunto de níveis de uma ou mais sequências de DNA é determinado por meio da amplificação de sequências de DNA com o uso de PCR (por exemplo, PCR padrão, PCR semiquantitativa ou quantitativa). Em algumas modalidades, um nível ou conjunto de níveis de uma ou mais sequências de DNA é determinado por meio da amplificação de sequências de DNA com o uso de PCR quantitativa. Esses e outros procedimentos básicos de amplificação de DNA são bem conhecidos pelos versados na técnica e são descritos em Ausebel et al. (Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova York, EUA).

[0137] Em algumas modalidades, as sequências de DNA são amplificadas usando iniciadores específicos para uma ou mais sequências que diferenciem tipos microbianos individuais de outros tipos microbianos diferentes. Em algumas modalidades, as sequências do gene de rRNA 16S ou fragmentos do mesmo são amplificadas com o uso de iniciadores específicos para as sequências do gene de rRNA16S. Em algumas modalidades, sequências de DNA 18S são amplificadas com o uso de iniciadores específicos para sequências de DNA 18S.

[0138] Em algumas modalidades, um nível ou conjunto de níveis de um ou mais sequências de gene de rRNA 16S é determinado com o uso de tecnologia de filochip. O uso de filochips é bem conhecido na técnica e é descrito em Hazen et al. ("Deep-sea oil plume enriches indigenous oil-degrading bacteria." Science, 330, 204 a 208, 2010), cuja totalidade está aqui incorporada a título de referência. Em suma, as sequências de gene de rRNA 16S são amplificadas e etiquetadas a partir de DNA extraído de uma amostra de microbiota. O DNA amplificado é, então, hibridizado para um arranjo contendo sondas para genes 16S de rRNA microbiano. O nível de ligação a cada sonda é, então, quantificado, fornecendo um nível de amostra de tipo microbiano correspondente à sequência do gene 16S de rRNA sondada. Em algumas modalidades, a análise de filochip é realizada por um fornecedor comercial. Exemplos incluem, sem limitação, Second Genome Inc. (São Francisco, Califórnia, EUA).

[0139] Em algumas modalidades, determinar um nível ou um conjunto de níveis de um ou mais tipos de micróbios ou componentes ou produtos dos mesmos compreende determinar um nível ou um conjunto de níveis de uma ou mais moléculas de RNA microbiano (por exemplo, transcritos). Métodos de quantificação dos níveis de transcritos de RNA são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, a análise de Northern, PCR de transcriptase reversa semiquantitativa, PCR de transcriptase reversa quantitativa e análise de microarranjo. Esses e outros procedimentos básicos de detecção de transcritos de RNA são descritos em Ausebel et al. (Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova York, EUA).

[0140] Em algumas modalidades, determinar um nível ou um conjunto de níveis de um ou mais tipos de micróbios ou componentes ou produtos dos mesmos compreende determinar um nível ou um conjunto de níveis de uma ou mais proteínas microbianas. Os métodos de quantificação dos níveis de proteína são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, a análise western e espectrometria de massa. Esses e todos os outros procedimentos básicos de detecção de proteína são descritos em Ausebel et al. (Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Smith J A, Struhl K (eds). 1998, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova York, EUA). Em algumas modalidades, determinar um nível ou um conjunto de níveis de um ou mais tipos de micróbios ou componentes ou produtos dos mesmos compreende determinar um nível ou um conjunto de níveis de uma ou mais metabólitos microbianos. Em algumas modalidades, os níveis de metabólitos são determinados por espectrometria de massa. Em algumas modalidades, os níveis de metabólitos são determinados por espectroscopia por ressonância magnética nuclear. Em algumas modalidades, os níveis de metabólitos são determinados por ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Em algumas modalidades, os níveis de metabólitos são determinados por colorimetria. Em algumas modalidades, os níveis de metabólitos são determinados por espectrofotometria.

[0141] Em algumas modalidades, o que é determinado é a distribuição de famílias microbianas dentro do microbioma. Contudo, a caracterização pode ser levada a níveis mais detalhados, por exemplo, ao nível do gênero e/ou espécie, e/ou ao nível de tensão ou variação (por exemplo, variantes) dentro de uma espécie, se desejado (incluindo a presença ou ausência de vários elementos genéticos, como genes, a presença ou ausência de plasmídeos, etc.). Alternativamente, designações taxonômicas mais altas podem ser usadas como Filo, Classe ou Ordem. O objetivo é identificar quais micróbios (geralmente bactérias, mas também opcionalmente fungos (por exemplos, leveduras), protistas, etc.) estão presentes na amostra do animal ruminante e as distribuições relativas desses micróbios, por exemplo, expresso como um percentual do número total de micróbios que estão presentes, estabelecendo assim um padrão floral micro ou assinatura para o animal a ser testado.

[0142] Em outras modalidades da invenção, quando muitos táxons estão sendo considerados, o padrão geral da microflora é avaliado, ou seja, não apenas são identificados táxons específicos, mas o percentual de cada táxon constituinte é levado em consideração, em comparação com todos os táxons detectados e, geralmente, ou opcionalmente, uns aos outros. Os versados na técnica reconhecerão que existem muitas formas possíveis de expressar ou compilar esses dados, todas abrangidos pela presente invenção. Por exemplo, um formato "gráfico circular" pode ser usado para representar uma assinatura microfloral; ou as relações podem ser expressas numérica ou graficamente como razões ou percentuais de todos os táxons detectados, etc. Além disso, os dados podem ser manipulados de forma que apenas subconjuntos selecionados dos táxons sejam considerados (por exemplo, indicadores-chave com fortes correlações positivas). Os dados podem ser expressos, por exemplo, como um percentual do número total de micróbios detectados, ou como um percentual de peso, etc.

[0143] Em uma modalidade, um teste multivariado não paramétrico como Metastats, Análise de Similaridade, Análise de Componentes Principais, MANOVA Não Paramétrico (Kruskal-Wallace), etc. pode ser usado para associar uma assinatura de microbioma a um fenótipo particular com uma significância estatística (valor P) menor que 0,05. Tais testes são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por White JR, Nagarajan N, Pop M (2009) Statistical Methods for Detecting Differentially Abundant Features in Clinical Metagenomic Samples. PLoS Computational Biology 5(4): 1 a 11; e Clarke KR, Gorley RN (2001) PRIMER v5: User Manual and Tutorial, PRIMER-E Ltd. Plymouth Marine Laboratory, RU.

[0144] Em outras modalidades, métodos filogenéticos, como o Unifrac, podem ser usados para associar a assinatura de microbioma a um fenótipo específico com um valor estatisticamente significativo (valor P) inferior a 0,05. Consulte, por exemplo, Lozupone C, Knight R (2005) UniFrac: a new phylogenetic method for comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol 71:8.228 a 8.235.

[0145] Em outras modalidades, máquinas de vetores de suporte podem ser usadas para associar a assinatura de microbioma a um fenótipo particular com uma medida de classificação suficientemente alta (medida F) e sensibilidade e especificidade apropriadas que são aceitas no estado da técnica. Consulte, por exemplo, Yang C, Mills D, Mathee K, Wang Y, Jayachandran K, Sikaroodi M, Gillevet P, Entry J, Narasimhan G (2006). An ecoinformatics tool for microbial community studies: Supervised classification of Amplicon Length Heterogeneity (ALH) profiles of 16S rRNA. Journal of Microbiological Methods 65(l ):49 a 62.

[0146] Em outras modalidades, métodos de rede de correlação e rede de diferença de correlação podem ser usados para associar a assinatura de microbioma a um fenótipo específico com um valor estatístico significativo (valor P) inferior a 0,05. Consulte, por exemplo, Weckwerth W, Loureiro ME, Wenzel, Fiehn O (2004) Differential metabolic networks unravel the effects of silent plant phenotypes. PNAS 101(20):7.809 a 7.814.

[0147] Conforme mencionado, quando o número de um táxon bacteriano de um microbioma do animal ruminante está abaixo de um nível predeterminado, isso é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[0148] O termo “indicativo”, conforme usado no presente documento, se refere à probabilidade de estar associado a um fenótipo particular que está acima de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais.

[0149] O número de táxon bacteriano pode ser analisado no nível de espécie, gênero, família, ordem, classe ou filo.

[0150] Ademais, quando o número de genes de um microbioma do animal ruminante está abaixo de um nível predeterminado, isso é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[0151] Em uma modalidade, quando o número de espécies bacterianas presentes na amostra de microbioma está abaixo de 6.000, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0152] Em uma outra modalidade, quando o número de espécies bacterianas presentes na amostra de microbioma está abaixo de 5.000, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0153] Em ainda uma outra modalidade, quando o número de espécies bacterianas está abaixo de 4000, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0154] Em uma modalidade, quando o número de genes bacterianos presentes na amostra de microbioma está abaixo de 4X106, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0155] Em uma outra modalidade, quando o número de genes bacterianos presentes na amostra de microbioma está abaixo de 3,5X106, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0156] Em uma outra modalidade, quando o número de gêneros bacterianos presentes na amostra de microbioma está abaixo de 120, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0157] Em ainda uma outra modalidade, quando o número de gêneros bacterianos está abaixo de 100, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0158] Em uma outra modalidade, quando o número de famílias bacterianas presentes na amostra de microbioma está abaixo de 70, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0159] Em ainda uma outra modalidade, quando o número de famílias bacterianas está abaixo de 60, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0160] Em ainda uma outra modalidade, quando o número de ordens bacterianas está abaixo de 35, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0161] Em ainda uma outra modalidade, quando o número de classes bacterianas está abaixo de 25, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0162] Em ainda uma outra modalidade, quando o número de filos bacterianos está abaixo de 14, isso é indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar.

[0163] Ademais, quando a diversidade de um táxon (por exemplo, espécie) e/ou genes está abaixo de um nível predeterminado, isso é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[0164] Além disso, quando a dominância de um táxon (por exemplo, espécie) e/ou genes está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo de um animal que tem uma alta eficiência alimentar e baixa produção de metano.

[0165] Com o uso de técnicas sofisticadas de sequenciamento e rastreio, os presentes inventores revelaram populações bacterianas que podem ser usadas para prever parâmetros incluindo a eficiência alimentar (por exemplo, medida por RFI), que é inversamente proporcional à produção de metano no micróbio ruminal.

[0166] Dessa forma, se acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficiência alimentar e/ou da produção de metano em um animal ruminante que compreende quantificar pelo menos uma espécie bacteriana conforme apresentado nas Tabelas 4 e 5 em um microbioma do animal, em que, quando o nível de pelo menos uma espécie bacteriana na Tabela 4 está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo de uma alta eficiência alimentar ou uma baixa produção de metano e, quando o nível de pelo menos uma espécie bacteriana apresentado na Tabela 5 está abaixo de um nível predeterminado, isso é indicativo de uma alta eficiência alimentar ou uma baixa produção de metano.

[0167] As Tabelas 4 e 5 aparecem no final da seção dos Exemplos abaixo no presente documento.

[0168] Será apreciado que, em alguns casos, determinadas cepas de bactérias aparecem nas Tabelas 4 e 5. No entanto, a presente invenção contempla a análise de todas as cepas das espécies às quais pertence. A menção de uma cepa particular não deve ser de forma alguma limitante.

[0169] Assim, por exemplo, no caso de Methanobrevibacter smithii ATCC 35061, embora apenas o número da cepa apareça na Tabela 4, os presentes inventores contemplam a análise de qualquer cepa de espécies de Methanobrevibacter smithii.

[0170] Quando as ordens mais altas que as espécies são recitadas nas Tabelas 4 e 5, o identificador 16S é recitado, de modo que as espécies exatas devem ser consideradas como totalmente reveladas.

[0171] O nível predeterminado pode ser determinado com o uso de amostras de controle derivadas de animais que foram pré-classificados como grandes produtores de metano/pequenos produtores de metano ou RFI alta/RFI baixa. Assim, por exemplo, quando a quantidade de uma espécie bacteriana da Tabela 4 é pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou mais do que a quantidade que está presente em um microbioma de um animal pré-classificado como um animal de RFI média, então o animal pode ser classificado como um animal de RFI baixa (alta eficiência energética). Quando a quantidade de uma espécie bacteriana da Tabela 4 é pelo menos 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou menos do que a quantidade que está presente em um microbioma de um animal pré- classificado como um animal de RFI média, então o animal pode ser classificado como um animal de RFI alta (baixa eficiência energética).

[0172] Será apreciado que a classificação não precisa de ser limitada a uma classificação binária (alta/baixa), uma vez que os presentes inventores mostraram que a quantidade de bactérias está correlacionada com a RFI. Assim, o animal pode ser classificado com o uso de muitos sistemas não binários também.

[0173] Os métodos de quantificação do nível de espécies bacterianas são conhecidos pelos versados na técnica, incluindo métodos de sequenciamento e quantificação de genes específicos de espécies como descrito acima.

[0174] Ao comparar genes e perfis taxonômicos entre os microbiomas de animais eficientes e ineficientes, os presentes inventores verificaram que genes pertencentes à via do acrilato foram enriquecidos nos animais eficientes quando comparados aos animais ineficientes.

[0175] Dessa forma, de acordo com um outro aspecto da presente invenção, a espécie bacteriana que é analisada é uma que utiliza a via de acrilato.

[0176] Conforme discutido no presente documento, a expressão “bactéria que utiliza a via de acrilato” se refere a uma bactéria que tem a capacidade de gerar ácido propiônico a partir de ácido láctico. Assim, as bactérias expressam genes que codificam enzimas com os seguintes números EC: EC 1.3.8.7, 2.8.3.1 e 4.2.1.54.

[0177] Espécies exemplificadoras que utilizam a via de acrilato incluem, sem limitação, Megasphaera. elsdenii, Coprococcus catus, Clostridium propionicum e Clostridium botulinum.

[0178] Os presentes inventores contemplam a classificação de animais com base no nível de pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100 ou todas as espécies descritas nas Tabelas 4 e 5.

[0179] De acordo com uma modalidade particular, uma pluralidade de espécies bacterianas é analisada de modo a obter uma assinatura bacteriana. A assinatura é, então, comparada com a assinatura derivada de um animal que já foi classificado de acordo com a sua eficiência alimentar/produção de metano. Por exemplo, se a assinatura do teste é estatisticamente significativa semelhante à assinatura de controle conhecida como sendo um grande produtor de metano, esse animal pode, então, ser classificado como grande produtor de metano. Se a assinatura do teste é estatisticamente significativa semelhante à assinatura de controle conhecida como sendo um pequeno produtor de metano, esse animal pode, então, ser classificado como pequeno produtor de metano. Se a assinatura do teste é estatisticamente significativa diferente à assinatura de controle conhecida como sendo um pequeno produtor de metano, esse animal pode, então, ser classificado como grande produtor de metano. Se a assinatura do teste é estatisticamente significativa diferente à assinatura de controle conhecida como sendo um grande produtor de metano, esse animal pode, então, ser classificado como pequeno produtor de metano.

[0180] De acordo com uma modalidade desse aspecto da presente invenção, duas assinaturas de microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando compreendem pelo menos 50% da mesma espécie, pelo menos 60% da mesma espécie, pelo menos 70% da mesma espécie, pelo menos 80% da mesma espécie, pelo menos 90% da mesma espécie, pelo menos 91% da mesma espécie, pelo menos 92% da mesma espécie, pelo menos 93% da mesma espécie, pelo menos 94% da mesma espécie, pelo menos 95% da mesma espécie as mesmas espécies, pelo menos 96% da mesma espécie, pelo menos 97% da mesma espécie, pelo menos 98% da mesma espécie, pelo menos 99% da mesma espécie ou 100% da mesma espécie.

[0181] Adicional ou alternativamente, os microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a quantidade (por exemplo, ocorrência) no microbioma de pelo menos uma das espécies bacterianas apresentadas nas Tabelas 4 e 5 é idêntica. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 10% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 20% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 30% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 40% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 50% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 60% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 70% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 80% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. De acordo com uma outra modalidade, microbiomas podem ter uma assinatura similar estatisticamente significativa quando a razão relativa no microbioma de pelo menos 90% das bactérias apresentadas nas Tabelas 4 e 5 são idênticas. Assim, o percentual fraccionado de micróbios (por exemplo, quantidade relativa, razão, distribuição, frequência, percentual, etc.) do total pode ser estatisticamente similar.

[0182] Os presentes inventores observaram ainda que a análise do gênero completo de Megasphaera pode ser usada para prever a emissão de metano e/ou RFI.

[0183] Dessa forma, de acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de determinação da eficiência alimentar e/ou da produção de metano em um animal ruminante que compreende quantificar pelo menos uma espécie bacteriana do gênero Megasphaera em um microbioma do animal, em que, quando o nível da pelo menos uma espécie bacteriana está acima de um nível predeterminado, isso é indicativo de uma alta eficiência alimentar ou uma baixa produção de metano.

[0184] O método desse aspecto da presente invenção pode ser executado com o uso de métodos conhecidos na técnica para quantificar bactérias (conforme detalhado acima no presente documento) ou por meio da análise das sequências de DNA, conforme discutido acima no presente documento.

[0185] O nível predeterminado desse aspecto da presente invenção pode ser determinado conforme descrito acima no presente documento.

[0186] Kits de PCR para a detecção de Megasphaera elsdenii são revelados em Advanced kit handbook HB10.03.07 - Quantification of Megasphaera cerevisiae/Megasphaera elsdenii genomes. 7.

[0187] Como mencionado, bem como medindo bactérias e genes presentes no microbioma, os presentes inventores também mostraram que a medição dos metabolitos presentes no microbioma (isto é, o metaboloma) também pode fornecer uma indicação quanto ao estado da eficiência alimentar e à produção de metano do microbioma do animal ruminante.

[0188] Mais especificamente, os presentes inventores mostraram que os níveis de ácidos graxos de cadeia curta no metaboloma do animal ruminante podem ser usados para avaliar a eficiência alimentar e a produção de metano dos animais.

[0189] Em uma modalidade, o metaboloma ruminal é medido. Em uma outra modalidade, o metaboloma das fezes do animal é medido.

[0190] Conforme discutido no presente documento, um "metabólito" é um intermediário ou produto do metabolismo. O termo “metabólito” é geralmente restrito a moléculas pequenas e não inclui compostos poliméricos como DNA ou proteínas com mais de 100 aminoácidos de comprimento. Um metabólito pode servir como substrato para uma enzima de uma via metabólica, um intermediário de tal via ou o produto obtido pela via metabólica.

[0191] Em uma modalidade, não mais que 5 metabólitos são analisados. Em uma outra modalidade, não mais que 10 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 15 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 20 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 30 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 40 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 50 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 60 metabólitos são medidos. Em ainda uma outra modalidade, não mais que 100 metabólitos são medidos.

[0192] De acordo com uma modalidade particular, o metabólito é aquele que altera a composição ou função do microbioma.

[0193] Em modalidades preferenciais, metabólitos incluem, sem limitação, açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, hormônios, vitaminas, bem como os fragmentos iônicos dos mesmos. Em uma outra modalidade, o metabólito é um oligopeptídeo (menos que cerca de 100 aminoácidos de comprimento).

[0194] Em particular, os metabólitos são menos que cerca de 3.000 Daltons em peso molecular e, mais particularmente, de cerca de 50 a cerca de 3.000 Daltons.

[0195] De preferência, o metabólito está presente nos micróbios do microbioma ou secretado dos micróbios do microbioma.

[0196] O metabólito desse aspecto da presente invenção pode ser um metabolito primário (isto é, essencial para o micróbio para o crescimento) ou um metabolito secundário (um que não desempenha um papel no crescimento, desenvolvimento ou reprodução, e é formado durante o final ou perto da fase estacionária de crescimento).

[0197] Exemplos representativos de vias metabólicas em que os metabolitos da presente invenção estão envolvidos incluem, sem limitação, ciclo do ácido cítrico, cadeia respiratória, fotossíntese, fotorrespiração, glicólise, gliconeogênese, via hexose monofosfato, via oxidativa de pentose fosfato, via do acrilato, via succinato, via da metanogênese, via do propanodiol, produção e e-oxidação de ácidos graxos, ciclo da ureia, vias de biossíntese de aminoácidos, vias de degradação proteica como degradação proteossômica, vias de degradação de aminoácidos, biossíntese ou degradação de: lipídeos, policetidos (incluindo, por exemplo, flavonoides e isoflavonoides), isoprenoides (incluindo, por exemplo, terpenos, esterois, esteroides, carotenoides, xantofilas), carboidratos, fenilpropanoides e derivados, alcaloides, benzenoides, indóis, compostos indol-enxofre, porfirinas, antocianinas, hormônios, vitaminas, cofatores como grupos protéticos ou transportadores de elétrons, lignina, glucosinolatos, purinas, pirimidinas, nucleosídeos, nucleotídeos e moléculas relacionadas como tRNAs, microRNAs (miRNA) ou mRNAs.

[0198] De acordo com uma modalidade particular, o metabólito é um ácido graxo de cadeia curta (por exemplo, selecionado do grupo que consiste em proprionato, butirato, valerato e isovalerato).

[0199] De acordo com essa modalidade, quando pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou todos os proprionato, butirato, valerato e isovalerato são superiores a um nível predeterminado, é indicativo que o animal tem uma alta eficiência alimentar e uma baixa produção de metano.

[0200] Os presentes inventores verificaram ainda que a medição do número total de ácidos gordos de cadeia curta (AGCC) no metaboloma do animal pode ser usada para avaliar a eficiência alimentar. Dessa forma, quando a quantidade de todos os SCFAs está acima de um nível predeterminado (por exemplo, 0,05 ppm), isso é indicativo do animal que tem uma alta eficiência alimentar e uma baixa produção de metano.

[0201] Ademais, quando a razão entre propionato:acetato no metaboloma do animal é maior que uma quantidade predeterminada (por exemplo, 1,1 ou 1,2), isso é indicativo do animal que tem uma alta eficácia alimentar e uma baixa produção de metano.

[0202] Em uma modalidade, os metabólitos são identificados com o uso de um método de separação física.

[0203] O termo "método de separação física" conforme usado no presente documento se refere a qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica suficiente para produzir um perfil de mudanças e diferenças em pequenas moléculas produzidas em hSLCs, em contato com um composto químico tóxico, teratogênico ou de teste de acordo com os métodos desta invenção. Em uma modalidade preferencial, métodos de separação física permitem a detecção de metabólitos celulares incluindo, sem limitação, açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, ácidos graxos, hormônios, vitaminas e oligopeptídeos, bem como fragmentos iônicos dos mesmos e compostos de baixo peso molecular (de preferência, com um peso molecular inferior a 3.000 Daltons e, mais particularmente, entre 50 e 3.000 Daltons). Por exemplo, pode-se usar espectrometria de massa. Em modalidades particulares, essa análise é realizada por tempo de ionização por cromatografia líquida/eletroaspersão de espectrometria de massa de voo (LC/ESI-TOF-MS), no entanto, será entendido que os metabólitos apresentados não podem ser detectados com o uso de métodos alternativos de espectrometria ou outros métodos conhecidos na técnica de análise desses tipos de compostos nessa faixa de tamanho.

[0204] Certos metabólitos podem ser identificados, por exemplo, por análise de expressão gênica, incluindo PCR em tempo real, RT-PCR, análise Northern e hibridização in situ.

[0205] Além disso, os metabólitos podem ser identificados com o uso de Espectrometria de Massa como MALDI/TOF (tempo de voo), SELDI/TOF, cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), cromatografia gasosa- espectrometria de massa (GC-MS), alta cromatografia líquida de alta performance- espectrometria de massa (HPLC-MS), espectrometria de massa por eletroforese capilar, espectrometria de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa em tandem (por exemplo, MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS etc.), espectrometria de massa de íon secundário (SIMS), ou espectrometria de mobilidade iônica (por exemplo, GC-IMS, IMS-MS, LC-IMS, LC-IMS-MS, etc.).

[0206] Os métodos de espectrometria de massa são bem conhecidos na técnica e têm sido usados para quantificar e/ou identificar biomoléculas, como proteínas e outros metabolitos celulares (consulte, por exemplo, Li et al., 2000; Rowley et al., 2000; e Kuster and Mann, 1998).

[0207] Em certas modalidades, usa-se um espectrofotômetro iônico de fase gasosa. Em outras modalidades, usa-se espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser para identificar metabólitos. A moderna espectrometria de massa por dessorção/ionização a laser ("LDI-MS") pode ser praticada em duas variações principais: espectrometria de massa por dessorção/ionização por laser assistida por matriz ("MALDI") e dessorção/ionização por laser de superfície intensificada ("SELDI").

[0208] Em MALDI, o metabólito é misturado com uma solução contendo uma matriz, e uma gota do líquido é colocada na superfície de um substrato. A solução matricial cocristaliza com os biomarcadores. O substrato é inserido no espectrômetro de massa. A energia do laser é direcionada para a superfície do substrato, onde a mesma desabsorve e ioniza as proteínas sem fragmentá-las significativamente. No entanto, MALDI tem limitações como uma ferramenta analítica. A mesma não fornece meios para o fracionamento do fluido biológico, e o material da matriz pode interferir na detecção, especialmente para analitos de baixo peso molecular.

[0209] No SELDI, a superfície do substrato é modificada para que seja um participante ativo no processo de dessorção. Em uma variante, a superfície é derivatizada com adsorventes e/ou reagentes de captura que se ligam seletivamente ao biomarcador de interesse. Em uma outra variante, a superfície é derivatizada com moléculas absorvedoras de energia que não são dessorvidas quando atingidas pelo laser. Em uma outra variante, a superfície é derivatizada com moléculas que se ligam ao biomarcador de interesse e que contêm uma ligação fotolítica que é quebrada após a aplicação do laser. Em cada um destes métodos, o agente de derivatização está geralmente situado em uma localização específica na superfície do substrato onde a amostra é aplicada. Os dois métodos podem ser combinados, por exemplo, com o uso de uma superfície de afinidade de SELDI para capturar um analito (por exemplo, biomarcador) e com a adição de líquido contendo matriz ao analito capturado para fornecer o material absorvente de energia.

[0210] Para informações adicionais sobre espectrômetros de massa, consulte, por exemplo, Principles of Instrumental Analysis, 3a edição, Skoog, Saunders College Publishing, Filadélfia, EUA, 1985; e Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4.sup.th ed. Vol. 15 (John Wiley & Sons, Nova York, EUA 1995), páginas 1.071 a 1.094.

[0211] Em algumas modalidades, os dados da espectrometria de massa são representados como um cromatograma de massa. Um "cromatograma de massa" é uma representação de dados de espectrometria de massa como um cromatograma, onde o eixo geométrico x representa o tempo e o eixo geométrico y representa a intensidade do sinal. Em um aspecto, o cromatograma de massa é um cromatograma de corrente de íon total (TIC). Em um outro aspecto, o cromatograma de massa é um cromatograma de pico de base. Em outras modalidades, o cromatograma de massa é um cromatograma de monitoramento de íons selecionado (SIM). Em ainda uma outra modalidade, o cromatograma de massa é um cromatograma de monitoramento de reação selecionado (SRM). Em uma modalidade, o cromatograma de massa é um cromatograma de íons extraídos (EIC).

[0212] Em um EIC, um único recurso é monitorado durante toda a execução. A intensidade total ou a intensidade do pico da base dentro de uma janela de tolerância de massa em torno de uma relação massa/carga específica do analito é plotada em cada ponto da análise. O tamanho da janela de tolerância de massa normalmente depende da precisão da massa e da resolução de massa do instrumento que coleta os dados. Conforme discutido no presente documento, o termo "recurso" se refere a um único metabólito pequeno, ou um fragmento de um metabólito. Em algumas modalidades, o termo recurso também pode incluir ruído após uma investigação mais aprofundada.

[0213] A detecção da presença de um metabólito envolverá tipicamente a detecção da intensidade do sinal. Isso, por sua vez, pode refletir a quantidade e o caráter de um biomarcador ligado ao substrato. Por exemplo, em certas modalidades, a intensidade do sinal dos valores de pico dos espectros de uma primeira amostra e de uma segunda amostra pode ser comparada (por exemplo, visualmente, por análise computacional, etc.) para determinar as quantidades relativas de metabolitos particulares. Programas de software, como o programa Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Califórnia, EUA), podem ser usados para auxiliar na análise de espectros de massa. São bem conhecidos os espectrômetros de massa e suas técnicas.

[0214] Um versado na técnica compreende que qualquer um dos componentes de um espectrômetro de massa, por exemplo, fonte de dessorção, analisador de massa, detectar, etc., e preparações de amostra variadas pode ser combinado com outros componentes ou preparações adequados descritos aqui, ou àqueles conhecidos na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, uma amostra de controle pode conter átomos pesados, por exemplo, 13C, permitindo assim que a amostra de teste seja misturada com a amostra de controle conhecida na mesma execução de espectrometria de massa. Inclui-se boa rotulagem isotópica estável.

[0215] Em uma modalidade, usa-se um espectrômetro de massa de tempo de voo (TOF) de dessorção por laser. Na espectrometria de massa de dessorção a laser, um substrato com um marcador ligado é introduzido em um sistema de entrada. O marcador é dessorvido e ionizado na fase gasosa por laser a partir da fonte de ionização. Os íons gerados são coletados por um conjunto ótico de íons e, então, em um analisador de massa de tempo de voo, os íons são acelerados através de um curto campo de alta tensão e deixados entrar em uma câmara de alto vácuo. Na extremidade mais distante da câmara de alto vácuo, os íons acelerados atingem uma superfície do detector sensível em um horário diferente. Como o tempo de voo é uma função da massa dos íons, o tempo decorrido entre a formação de íons e o impacto do detector de íons pode ser usado para identificar a presença ou ausência de moléculas de razão específica entre massa e carga.

[0216] Em uma modalidade da invenção, os níveis de metabólitos são detectados por espectrometria de massa MALDI-TOF.

[0217] Métodos de detecção de metabólitos também incluem o uso de ressonância plasmônica de superfície (SPR). A tecnologia de biodetecção de SPR foi combinada com espectrometria de massa MALDI-TOF para a dessorção e identificação de metabólitos.

[0218] Os dados para análise estatística podem ser extraídos de cromatogramas (espectros de sinais de massa) com o uso de softwares para métodos estatísticos conhecidos na técnica. "Estatística" é a ciência de fazer uso efetivo de dados numéricos relacionados a grupos de indivíduos ou experimentos. Os métodos para análise estatística são bem conhecidos na técnica.

[0219] Em uma modalidade, usa-se um computador para a análise estatística.

[0220] Em uma modalidade, o software Agilent MassProfiler ou MassProfilerProfessional é usado para a análise estatística. Em uma outra modalidade, o software Agilent MassHunter Qual software é usado para a análise estatística. Em outras modalidades, podem ser usados métodos alternativos de análises estatísticas. Esses outros métodos estatísticos incluem o teste de Análise de Variância (ANOVA), teste do Chi-quadrado, teste de Correlação, teste de Análise Fatorial, teste U de Mann-Whitney, derivação média ponderada quadrada (MSWD), coeficiente de correlação produto-momento de Pearson, análise de regressão, Coeficiente de correlação de postos de Spearman, teste T de Student, teste T de Welch, teste de Tukey e análise de séries temporais.

[0221] Em diferentes modalidades, os sinais da espectrometria de massa podem ser transformados de diferentes maneiras para melhorar o desempenho do método. Sinais individuais ou resumos das distribuições de sinais (como média, mediana ou variância) podem ser transformados. Possíveis transformações incluem tomar o logaritmo, tomando alguma potência positiva ou negativa, por exemplo, a raiz quadrada ou inversa, ou tomando o arco seno (Myers, Classical and Modern Regression with Applications, 2a edição, Duxbury Press, 1990).

[0222] Será apreciado que uma vez que o animal tenha sido classificado com um fenótipo particular (por exemplo, alta eficiência alimentar, baixo produtor de metano), o mesmo pode ser selecionado (por exemplo, separado do resto do rebanho) e classificado como tendo esse fenótipo. De acordo com uma modalidade, é evidente que o animal marcado de tal forma compreende esse fenótipo.

[0223] Em uma modalidade, o animal é selecionado como sendo um candidato para reprodução. Em uma outra modalidade, o animal é selecionado como candidato à produção de carne. No caso em que o animal é encontrado como tendo um fenótipo não desejável (por exemplo, baixa eficiência de alimentação, alto produtor de metano), o animal pode ser selecionado como sendo um candidato para terapia.

[0224] Dessa forma, de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de aumento da eficácia alimentar ou de diminuição da produção de metano de um animal ruminante que compreende administrar ao animal um agente que aumenta a quantidade de pelo menos uma espécie bacteriana apresentada na Tabela 4 no microbioma ruminal do animal, aumentando assim a eficácia alimentar ou diminuindo a produção de metano de um animal ruminante. Alternativamente, a fim de aumentar a eficiência alimentar (ou diminuir a produção de metano), pode ser fornecido um agente que aumenta a quantidade de pelo menos uma espécie do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos duas espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos três espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos quatro espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos cinco espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos seis espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos sete espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos oito espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos nove espécies do gênero bacteriano Megasphaera, pelo menos dez ou mais espécies do gênero bacteriano Megasphaera.

[0225] A presente invenção contempla aumentar a energia alimentar ou diminuir a produção de metano de animais ruminantes de todas as idades. De acordo com uma modalidade particular, os animais cuja energia alimentar é alterada são recém- nascidos, tipicamente com não mais que um dia de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que dois dias de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que três dias de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 1 semanas de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 2 semanas de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 1 mês de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 3 meses de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 6 meses de vida. De acordo com uma outra modalidade, os animais não têm mais do que 1, 2 ou 3 anos de vida. De acordo com ainda uma outra modalidade, os animais são adultos.

[0226] Em uma modalidade, o agente é uma composição que compreende bactérias (composição microbiana). O mesmo compreender pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17 ou todas as espécies microbianas mencionadas na Tabela 4.

[0227] De preferência, as composições microbianas desse aspecto compreendem pelo menos duas espécies microbianas. Em uma modalidade, as composições microbianas desse aspecto da invenção compreendem menos de 100 espécies microbianas, menos de 500 espécies microbianas, menos de 400 espécies microbianas, menos de 300 espécies microbianas. Faixas exemplificativas de espécies microbianas incluem 2 a 1.000, 2 a 500, 2 a 250, 2 a 200, 2 a 150, 2 a 100, 2 a 90, 2 a 80, 2 a 70, 2 a 60, 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 2 a 25, 2 a 20, 2 a 15, 2 a 10.

[0228] De preferência, a composição compreende pelo menos uma espécie de Megasphaera (por exemplo, M. elsdenii) e/ou a espécie que tem uma sequência de genes de rRNA 16S conforme apresentado na SEQ ID NO: 4 ou 12.

[0229] As quantidades relativas de cada população bacteriana na composição podem ser determinadas com o uso de sistemas apropriados de ensaio. Em uma modalidade, a quantidade relativa de bactéria Megasphaera é maior que aquela que existe em um microbioma fecal ou ruminal de um animal de alta eficiência energética/baixo produtor de metano.

[0230] A composição microbiana pode ser derivada diretamente de uma amostra de microbiota do animal de alta eficiência energética. Alternativamente, a composição microbiana pode ser criada artificialmente adicionando quantidades conhecidas de micróbios diferentes. Será apreciado que a composição microbiana que é derivada da amostra de microbiota de um animal pode ser manipulada antes da administração aumentando a quantidade de uma espécie particular (por exemplo aumentando a quantidade de/ou esgotando a quantidade de uma espécie particular como Megasphaera). Em uma outra modalidade, as composições microbianas não são tratadas de qualquer modo que serve para alterar o equilíbrio relativo entre as espécies microbianas e os táxons contidos na mesma. Em algumas modalidades, a composição microbiana é expandida ex vivo com o uso de métodos de cultura conhecidos antes da administração. Em outras modalidades, a composição microbiana não é expandida ex vivo antes da administração.

[0231] De acordo com uma modalidade, a composição microbiana não é derivada de material fecal.

[0232] De acordo com ainda uma outra modalidade, a composição microbiana é desprovida (ou compreende apenas quantidades vestigiais) de material fecal (por exemplo, fibra).

[0233] Os presentes inventores contemplam outros agentes que não os próprios micróbios que aumentam a razão de qualquer uma das bactérias benéficas apresentadas na Tabela 4. Tais agentes podem ser metabólitos. Os metabólitos podem incluir lactato ou succinato ou ácidos graxos de cadeia curta, que podem ser um subgrupo de ácidos graxos com 6 ou menos carbonos em suas caudas alifáticas, por exemplo, acetato, propionato, isobutirato, ácido isovalérico, ácido 3- metilbutanoico, ácido valérico, ácido pentanoico, ácido delfínico, ácido isopentanoico e butirato. De preferência, o ácido graxo de cadeia curta é propionato, butirato, valerato e/ou isovalerato. Agentes adicionais que são contemplados incluem glicanos como amido, celulose, hemicelulose, pectina, cartilagem derivada de animal, tecido (glicosaminoglicanos e glicanos ligados em N), e glicanos endógenos de muco hospedeiro (glicanos ligados em O).

[0234] Após a administração dos agentes da presente invenção, a ingestão de alimento residual/produção de metano pode ser medida de modo a monitorar a mudança. Deste modo, a dose do agente pode ser calibrada/regulada de acordo com as necessidades do animal. Outros parâmetros que podem ser revistos incluem metabólitos, ácidos graxos voláteis.

[0235] Antes da administração, o animal pode ser pré-tratado com um agente que reduz o número de microbiomas ruminal que ocorrem naturalmente (por exemplo, por tratamento com antibiótico). De acordo com uma modalidade particular, o tratamento elimina significativamente a microflora ruminal que ocorre naturalmente, pelo menos 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mesmo 90%.

[0236] Além de aumentar as populações bacterianas acima mencionadas no microbioma ruminal dos animais, os presentes inventores contemplam ainda a diminuição de qualquer uma das espécies bacterianas apresentadas na Tabela 5 abaixo no presente documento.

[0237] Dessa forma, de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de aumento da eficácia alimentar ou de diminuição da produção de metano de um animal ruminante que compreende administrar ao animal uma composição que compreende pelo menos um agente que especificamente regula de maneira descendente uma quantidade de pelo menos uma bactéria apresentada na Tabela 5, aumentando assim a eficácia alimentar ou diminuindo a produção de metano de um animal ruminante.

[0238] De acordo com uma modalidade particular, o agente não é um agente antibiótico.

[0239] De acordo com uma outra modalidade, o agente é um peptídeo antimicrobiano.

[0240] De acordo com ainda uma outra modalidade, o agente é um bacteriófago.

[0241] De acordo com ainda uma outra modalidade, o agente tem a capacidade de regular de modo descendente um gene essencial de pelo menos uma das espécies bacterianas descritas no presente documento abaixo.

[0242] Dessa forma, por exemplo, os presentes inventores contemplam o uso de meganucleases, como nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetivas de ativador de transcrição(TALENs) e sistema CRISPR/Cas para a regulação descendente do gene essencial.

[0243] Sistema CRISPR-Cas - Muitas bactérias e archaea contêm sistemas imunes adaptativos endógenos baseados em RNA que podem degradar os ácidos nucleicos de fagos e plasmídeos invasores. Esses sistemas consistem em genes de repetição palindrômica curta agrupados regularmente interespaceados (CRISPR) que produzem componentes de RNA e genes associados a CRISPR (Cas) que codificam componentes proteicos. Os RNAs de CRISPR (crRNAs) contêm pequenos trechos de homologia com vírus e plasmídeos específicos e atuam como guias para dirigir nucleases de Cas para degradar os ácidos nucléicos complementares do patógeno correspondente. Estudos do sistema de CRISPR/Cas do tipo II de Streptococcus pyogenes demonstraram que três componentes formam um complexo RNA/proteína e juntos são suficientes para a atividade nuclease específica da sequência: a nuclease Cas9, um crRNA contendo 20 pares de bases de homologia com a sequência alvo, e um crRNA trans-ativador (tracrRNA) (Jinek et al. Science (2012) 337: 816-821.). Foi demonstrado ainda que um RNA guia sintético quimérico (gRNA) composto por uma fusão entre o crRNA e o tracrRNA poderia direcionar Cas9 a clivar alvos de DNA que são complementares ao crRNA in vitro. Também foi demonstrado que a expressão transitória de Cas9 em conjunto com gRNAs sintéticos pode ser usada para produzir quebras de fita dupla direcionados em uma variedade de espécies diferentes. (Cho et al., 2013; Cong et al., 2013; DiCarlo et al., 2013; Hwang et al., 2013a,b; Jinek et al., 2013; Mali et al., 2013).

[0244] O sistema CRIPSR/Cas para edição de genoma contém dois componentes distintos: um gRNA e uma endonuclease, por exemplo, Cas9.

[0245] O gRNA é tipicamente uma sequência de 20 nucleotídeos que codifica uma combinação da sequência homóloga alvo (crRNA) e o RNA bacteriano endógeno que liga o crRNA à nuclease Cas9 (tracrRNA) em um único transcrito quimérico. O complexo gRNA/Cas9 é recrutado para a sequência-alvo pelo emparelhamento de bases entre a sequência de gRNA e o DNA genômico do complemento. Para uma ligação bem sucedida de Cas9, a sequência-alvo genômica deve também conter a sequência Motivo Adjacente ao Protoespaçador (PAM) correta imediatamente após a sequência-alvo. A ligação do complexo gRNA/Cas9 localiza a Cas9 na sequência-alvo genômica, de modo que a Cas9 possa cortar ambos os filamentos do DNA, causando uma quebra de fita dupla. Assim como com ZFNs e TALENs, as quebras de fita dupla produzidas por CRISPR/Cas podem sofrer recombinação homóloga ou NHEJ.

[0246] A nuclease Cas9 possui dois domínios funcionais: RuvC e HNH, em que ada um corte um filamento de DNA diferente. Quando ambos os domínios estão ativos, o Cas9 causa quebras de fita dupla no DNA genômico.

[0247] Uma vantagem significativa do CRISPR/Cas é que a alta eficiência desse sistema, juntamente com a capacidade de criar facilmente gRNAs sintéticos, permite que vários genes sejam alvos simultaneamente. Além disso, a maioria das células portadoras da mutação apresenta mutações bialélicas nos genes-alvo.

[0248] No entanto, a flexibilidade aparente nas interações de emparelhamento de bases entre a sequência de gRNA e a sequência-alvo de DNA genômico permite que correspondências imperfeitas à sequência-alvo sejam cortadas por Cas9.

[0249] Versões modificadas da enzima Cas9 contendo um único domínio catalítico inativo, seja RuvC- ou HNH-, são chamadas de "nickases". Com apenas um domínio de nuclease ativo, a nickase Cas9 corta apenas um filamento do DNA- alvo, criando uma quebra de filamento simples ou 'nick'. Uma quebra de fita simples, ou nick, é normalmente reparada rapidamente através da via HDR, com o uso de um filamento de DNA complementar intacto como modelo. No entanto, dois cortes proximais, de cadeia oposta, introduzidos por uma nickase Cas9, são tratados como uma quebra de filamento duplo, no que é frequentemente referido como um sistema CRISPR de 'nick duplo'. Um nick-duplo pode ser reparado por NHEJ ou por HDR dependendo do efeito desejado no alvo do gene. Assim, se a especificidade e redução dos efeitos fora do alvo forem cruciais, usar uma nickase Cas9 para criar um nick-duplo projetando dois gRNAs com sequências-alvo próximos e em cadeias opostas do DNA genômico diminuiria o efeito fora-do-alvo como gRNA sozinho resultará em nicks que não alterarão o DNA genômico.

[0250] Versões modificadas da enzima Cas9 contendo dois domínios catalíticos inativos (Cas9 morto ou dCas9) não têm atividade de nuclease enquanto ainda são capazes de se ligar ao DNA com base na especificidade do gRNA. O dCas9 pode ser utilizado como uma plataforma para reguladores transcricionais de DNA para ativar ou reprimir a expressão gênica através da fusão da enzima inativa com domínios reguladores conhecidos. Por exemplo, a ligação de dCas9 sozinho a uma sequência-alvo no DNA genômico pode interferir com a transcrição do gene.

[0251] Há uma série de ferramentas publicamente disponíveis para ajudar a escolher e/ou projetar sequências-alvo, bem como listas de gRNAs únicos e bioinformaticamente determinados para diferentes genes em diferentes espécies, como o Target Finder do laboratório de Feng Zhang, -CRISP), as ferramentas RGEN: Cas-OFFinder, o algoritmo CasFinder: Flexible para identificar alvos de Cas9 específicos em genomas e o CRISPR Optimal Target Finder.

[0252] Para usar o sistema CRISPR, tanto o gRNA quanto a Cas9 devem ser expressos em uma célula-alvo. O vector de inserção pode conter ambos os cassetes em um único plasmídeo ou os cassetes são expressos a partir de dois plasmídeos separados. Os plasmídeos CRISPR estão comercialmente disponíveis, como o plasmídeo px330 de Addgene.

[0253] A composição microbiana pode ser administrada por si só (por exemplo, com o uso de um catéter ou seringa) ou pode ser administrada em conjunto na alimentação (por exemplo, como um aditivo alimentar) do animal ou da bebida do animal.

[0254] Esses ruminantes podem ser alimentados com a composição de aditivo de ração para animais da presente invenção a qualquer momento e em qualquer quantidade durante a sua vida. Ou seja, o ruminante pode ser alimentado com a composição de aditivo de ração da presente invenção por si só ou como parte de uma dieta que inclua outros alimentos para animais. Além disso, os ruminantes podem ser alimentados com a composição de aditivo de ração da presente invenção a qualquer momento durante sua vida. O ruminante pode se alimentar continuamente com a composição de aditivo de ração da presente invenção, em intervalos regulares ou intermitentes. O ruminante pode ser alimentado com a composição de aditivo de ração da presente invenção em quantidade tal que seja responsável por todos, uma maioria ou uma minoria da ração na dieta dos ruminantes por qualquer porção de tempo na vida do animal. De acordo com uma modalidade, os ruminantes são alimentados com a composição de aditivo de ração da presente invenção em uma quantidade tal que seja responsável pela maioria da alimentação na dieta do animal por uma porção significativa da vida do animal.

[0255] Exemplos de aditivos de ração adicionais ativos no rúmen que podem ser fornecidos juntamente com o aditivo de ração da presente invenção incluem tampões, solúveis de fermentação, óleos essenciais, agentes tensoativos, monensina de sódio, ácidos orgânicos e enzimas suplementares.

[0256] Também contempla-se a encapsulação dos micróbios em nanopartículas ou micropartículas com o uso de métodos conhecidos na técnica incluindo aqueles revelados nos documentos EP085805, EP1742728 A1, WO2006100308 A2 e US 8.449.916, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência

[0257] As composições podem ser administradas oral, retalmente ou de qualquer outro modo que seja benéfico para o animal, de modo que os micróbios atinjam o rúmen do animal.

[0258] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece novos processos para criar um ruminante alimentando o ruminante com uma composição de aditivo de ração.

[0259] Antes de explicar, pelo menos, uma modalidade da invenção em pormenor, é para ser entendido que a invenção não está limitada na sua aplicação aos detalhes apresentados na descrição seguinte ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras modalidades ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Além disso, é para ser entendido que a fraseologia e terminologia empregadas aqui é para o propósito de descrição e não deve ser considerada como limitativa.

[0260] Objetivos adicionais, vantagens e recursos inovadores da presente invenção se tornarão evidentes para uma pessoa versada na técnica após análise dos exemplos seguintes, que não se destinam a ser limitativos. Adicionalmente, cada uma das várias modalidades e aspectos da presente invenção, como aqui delineados e como reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontra suporte experimental nos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

[0261] Faz-se agora referência aos exemplos seguintes, que, juntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de uma forma não limitativa.

[0262] Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Consulte, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes IIII Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nova York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nova York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Volumes 1 a 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (1998); metodologias como apresentado nas Patentes n° US 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Terceira Edição; "Current Protocols in Immunology" Volumes I a III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nova York (1980); imunoensaios disponíveis são amplamente descritos na literatura científica e de patente, consulte, por exemplo, Patentes n° US 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência como se fossem totalmente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos são bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Toda as informações aqui contidas são aqui incorporadas por referência.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0263] Modelo de teste: Um total de 146 vacas Holstein Friesian foram selecionadas para o experimento. Vacas com histórico de doenças, abortos espontâneos e gestações gemelares ou que estavam acima do primeiro trimestre não foram incluídas no experimento. A fazenda leiteira experimental está equipada com uma instalação especialmente concebida para monitorar individualmente todas as funções do animal, a ingestão de alimentos e os diferentes parâmetros fisiológicos. Os animais foram divididos em 7 grupos de acordo com o período de lactação, de modo que cada vaca estava entre 50 e 150 d de lactação quando monitorada. Cada grupo continha entre 19 e 21 vacas que foram monitoradas por 42 a 49 d. Os animais foram alimentados à vontade com uma dieta padrão de vacas em lactação, consistindo em 30% de forragem e 70% de concentrado e livre acesso à água. As vacas estavam habituadas com a dieta acima mencionada durante 3 semanas antes do início da experiência, para que se acostumassem à sua estação de alimentação individual.

[0264] Os seguintes parâmetros foram monitorados automaticamente três vezes ao dia durante o experimento: ingestão de matéria seca (DMI; kg), peso (kg), produção de leite (kg), lactose do leite, gordura e proteína (g) e contagem de células somáticas com o uso do programa Afimilk (Afimilk Ltd., Kibbutz Afikim, Israel). As amostras de leite foram enviadas para um laboratório autorizado de qualidade do leite (Serviço Nacional de Saúde e Qualidade do Leite do Útero, Cesareia, Israel) três vezes para cada grupo para verificar a análise do programa Afimilk. O escore de condicionamento corporal (ECC) foi medido uma vez por semana pelo mesmo indivíduo durante todo o experimento.

[0265] Parâmetros de eficiência alimentar, ingestão de alimento residual (RFI) e taxa de conversão (CR) foram calculados de acordo com as fórmulas do National Research Council (2001). A fim de aumentar o poder estatístico em comparação com a amostragem aleatória, aplicou-se a abordagem de amostragem de fenótipos extremos (Li et al., 2011). Doze vacas com os valores de RFI mais extremos e estáveis foram selecionadas de cada grupo para amostragem de fluido ruminal, seis com valores baixos e seis com valores altos de RFI. O teste de Tukey foi usado para verificar se o valor de RFI de cada vaca era estável ao longo do experimento e significativamente diferente das vacas no grupo de eficiência recíproca. No total, 78 vacas foram escolhidas para amostragem e representaram os 25% mais eficientes e 25% mais ineficientes de todo o coorte. (P < 0,0001; Figura 8).

[0266] Coleta de amostra: Amostras de rúmen foram coletadas 3 dias consecutivos. As vacas foram amostradas 6 h após a alimentação em que não foram oferecidos alimentos; recolheram-se 500 ml de conteúdo ruminal com o uso de um tubo estomacal de aço inoxidável com um amostrador a vácuo ruminal e determinou- se o pH imediatamente. As amostras para extração de DNA e metabólitos foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C até a análise. Amostras de rúmen para ensaios metabólicos foram filtradas através de seis camadas de pano queijeiro para remover grandes partículas de alimento, transferidas para frascos contendo CO2 e lavadas com CO2 para manter condições anaeróbicas. Imediatamente após a coleta, as amostras ruminal foram mantidas a 39 °C até 1 h até o uso, e processadas em laboratório, a 100 m de distância.

[0267] Amostras fecais frescas foram obtidas 3 vezes ao dia por 4 dias consecutivos. As amostras foram imediatamente congeladas a -20 °C.

[0268] Ensaio de digestibilidade in vitro: A digestibilidade in vitro das fibras da parede celular vegetal, representada pela fibra de detergente neutro (FDN) ou pelos polímeros totais de alimentação (em matéria seca), foi determinada de acordo com a técnica de dois estágios por Tilley e Terry (Tilley & Terry, 1963). Resumidamente, a ração das vacas foi seca por 72 h em um forno arejado a 60 °C e, então, moída para passar por uma tela de 1 mm. A ração foi incubada com líquido ruminal e tampão artificial ruminal, em tubos de vidro vedados.

[0269] O tampão ruminal artificial foi formulado conforme descrito anteriormente (McDougall, 1948, Tilley & Terry, 1963). Brevemente, 100 ml de tampão A [98 g de NaHCO3, 93 g de NaHPO4d2H2O, 5,7 g de KCl, 4,7 g de NaCI, 1,2 g de MgSO4^7H2O, adicionado a DDW a um volume final de 1 litro], foi adicionado a 800 ml de DDW. A solução foi lavada com CO2 para reduzir o pH para 6,8 a 7,0. Então, 1 ml de tampão B [40 g de CaCl2 adicionado a DDW a um volume final de 1 litro], 50 ml de tampão C [30 g de NH4HCO3 adicionado a DDW a um volume final de 1 litro] e 100 μl de tampão D [10 g de MnC^4H2O, 1 g de CoC^6H2O, 8 g de FeC^6H2O adicionado a DDW a um volume final de 1 litro] foram adicionados e o tampão foi colocado a um volume final de 1 litro com DDW.

[0270] Os tubos foram lavados com CO2 e fechado com uma tampa de válvula unidirecional que permitiu somente a emissão do gás do tubo. Os tubos foram incubados por 24 ou 48 h a 39 °C e foram agitados cinco vezes ao dia, seguido de incubação com ácido pepsina. No final desse procedimento, os sólidos não digeridos foram precipitados por centrifugação a 1.000 g por 10 min e secos em estufa aerada a 60 °C por 72 h. Os precipitados foram usados para determinação da matéria seca residual (DM) por pesagem ou para determinação residual de NDF seguindo o procedimento de Van Soest et al. (Van Soest et al., 1991). Os resultados são expressos como média de digestibilidade dos alimentos no rúmen de dois dias consecutivos de amostragem.

[0271] Digestibilidade in-vivo: Amostras de fezes foram agrupadas para cada vaca, secas a 60 °C por 72 h em um forno de ar forçado e moídas para passar por uma tela de 1 mm. O teor de NDF indigerível foi determinado na ração e nas amostras fecais de acordo com um método previamente relatado (Lippke et al., 1986) após a incubação com o líquido ruminal por 72 horas e usado como marcador interno para a análise de digestibilidade de DM do trato total aparente. A digestibilidade de MS e FDN in vivo de cada vaca da ração foi calculada pela ingestão média de MS e produção fecal.

ENSAIO DE EMISSÃO DE METANO IN vitro

[0272] As amostras foram diluídas 1:2 (em v/v) com tampão ruminal artificial. Duplicatas de alíquotas de 5 ml de cada amostra diluída foram transferidas para tubos de vidro com tampa de rosca (ISI, Israel Scientific Instruments Ltd., Petah- Tikva, Israel) adequadas para medição de metano com o uso de um sistema GC (HP-5890 série II, detector FID) . As amostras foram incubadas a 39 °C por 24 h com 0,5 g de MS e analisadas por CG para emissão de metano. Amostras de 0,5 ml de gás do espaço livre do tubo foram injetadas em uma coluna de filtração molecular analítica-45/60 de 182,88 cm x 0,3175 cm x 2,1 mm (Sigma-Aldrich) com gás portador de hélio regulada para uma taxa de fluxo de 10 ml/min e uma temperatura de forno de 200 °C. A temperatura de forno permaneceu estável durante um tempo total de funcionamento de 5 min. Uma curva padrão foi gerada usando gás metano puro.

[0273] A produção de metano foi quantificada para 36 amostras de microbioma ruminal dos animais mais extremos dos grupos de eficiência alimentar (18 eficientes e 18 ineficientes), com duas repetições biológicas de cada animal.

[0274] Identificação e quantificação de metabólitos de fluido ruminal: Amostras de fluido ruminal congeladas foram descongeladas a 25 °C e centrifugadas a 10.000g por 15 min. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro estéril de 0,45 μm (EMD Millipore). As amostras de fluido ruminal foram mantidas em gelo durante a extração do metabólito nos dutos de identificação e quantificação de metabólitos de GC-MS e CG, para minimizar a degradação do metabólito.

[0275] As amostras ruminal foram analisadas por GC-MS para metabólitos polares e por GC com um detector FID para SCFAs. O protocolo de extração e derivatização para a análise de GC-MS foi adaptado de um método previamente descrito (Saleem et al., 2013). Os extratos derivados foram analisados usando um GC Agilent 5975C e um Agilent 7890A MS operando em modo de ionização por impacto de elétrons (EI). Alíquotas (1 μl) foram injetadas (sem divisão) em uma coluna HP-5MS Ultra Inert de 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm (Agilent Technologies) com gás carreador de hélio ajustado para uma taxa de fluxo de 1 ml/min e temperatura inicial do forno de 70 °C. A temperatura do forno foi mantida constante à temperatura inicial por 2 min e, a partir de então, aumentada 10 °C/min até uma temperatura final de 310 °C, e um tempo final de execução de 45 min. As amostras foram analisadas usando varredura completa em uma faixa de massa de 50 a 500 m/z (1,7 varredura/s) com um atraso de detecção de 4 min. Os índices de retenção foram calculados com o uso de uma solução padrão de alcano C8-C20 (Sigma-Aldrich) como padrão externo. A quantificação e a identificação de metabólitos trimetilsililados foram realizadas com o uso dos padrões de base de dados NIST e de grau de HPLC.

[0276] Para identificação e quantificação de SCFA, misturaram-se 400 μl de fluido ruminal filtrado com 100 μl de solução de ácido metafosfórico a 25% (em p/v em água bidestilada) e agitou-se em vórtice durante 1 min. As amostras foram incubadas a 4 °C por 30 min e posteriormente centrifugadas por 15 min a 10.600g. O sobrenadante foi decantado em novos tubos, depois foram adicionados 250 de éter metílico terc-butílico (MTBE) (Sigma-Aldrich) e os tubos foram vortexados durante 30 s. Outro ciclo de centrifugação foi realizado por 1 min a 10.600g. A fase superior, que continha MTBE + SCFAs, foi analisada com o uso de um sistema Agilent 7890B GC com um detector FID. As temperaturas na entrada e no detector foram de 250 °C e 300 °C, respectivamente. Alíquotas (1 μl) foram injetadas com uma razão de divisão de 1:25 em uma coluna ZB-FFAP de 30 m x 0,32 mm x 0,25 μm (ZEBRON) com gás carreador de hélio ajustado para uma taxa de fluxo de 2,4 ml/min e temperatura inicial do forno de 100 °C. A temperatura do forno foi mantida constante à temperatura inicial por 5 min e, a partir de então, aumentou 10 °C/min até uma temperatura final de 125 °C, e um tempo final de operação de 12,5 min.

[0277] A quantificação e identificação de metabolitos foram realizadas com o uso de padrões de grau HPLC. Todos os metabólitos foram normalizados para o conteúdo de matéria orgânica do líquido ruminal de onde foram extraídos. As amostras de rúmen foram filtradas através de um filtro de membrana Supor estéril de 0,45 μm (PALL Life Sciences). O C orgânico nas amostras ruminal foi analisado com um Formacs, analisador de Carbono Orgânico Total (TOC) de combustão (Skalar, De Breda, Holanda).

[0278] Extração de DNA microbiano: A fração microbiana ruminal foi separada de acordo com Stevenson e Weimer (Stevenson & Weimer, 2007), com pequenas modificações para atender às necessidades desses experimentos, como descrito em Jami et al. (Jami et al., 2013). A extração de DNA foi realizada conforme descrito por Stevenson e Weimer (Stevenson & Weimer, 2007).

[0279] Sequenciamento e Análise de DNA Shotgun : As bibliotecas de DNA metagenômico foram construídas com o kit TruSeq DNA Sample Prep (Illumina). As bibliotecas foram agrupadas e sequenciadas em duas faixas por 151 ciclos de cada extremidade em um HiSeq2500 (Illumina) e processadas com Casava 1.8.2 (Illumina). Em média, 35.581.041 ± 6.899.269 leituras finais pareadas foram obtidas de cada amostra e 2.775.321.186 leituras finais pareadas foram obtidas globalmente. 18,6% das leituras não passaram na filtragem e recorte de artefatos usando o duto MOCAT (Kultima et al., 2012).

[0280] Para obter um metagenoma mais abrangente, foi criada uma montagem conjunta de todos os dados das 78 vacas. Isso compensou a menor profundidade de sequenciamento de cada amostra individual e qualquer viés causado pela montagem de amostras individuais. Leituras de todas as amostras foram reunidas e montadas em um metagenoma usando o pacote CLC Bio, CLC Assembly Cell versão 3.2.2 com K-mer = 21 e parâmetros padrão; 16.784.830 contigs foram obtidos. Um duto QC de derreplicação e varredura para leituras Bos taurus foi realizado com o uso do duto MG-RAST. Não foram encontradas redundâncias e 0,43% dos contigs foi descartado após remover contaminantes de Bos taurus. A origem filogenética de cada contig foi anotada com base de dados RefSeq(Pruitt et al., 2007)_( E < 10-5) com o uso do duto MG-RAST (Meyer et al., 2008).

[0281] A chamada genética foi realizada nos contigs com o uso de FragGeneScan (Rho et al., 2010); 21.531.511 genes foram identificados no geral. As leituras de cada amostra foram recrutadas contra os genes gerais usando BWA (Li & Durbin, 2009) com 98% de identidade e parâmetros padrão; um limiar de uma leitura para identificação de genes foi escolhido para incluir genes raros na análise. Em média, 52,4% das leituras de cada amostra foram mapeadas para os genes obtidos, sem diferenças entre os grupos de eficiência (Figura 9). Uma média de 4.079.212 genes foram identificados em cada amostra, a abundância de um gene específico foi calculada pelo número de leituras unicamente recrutadas, normalizadas ao comprimento do gene e total de leituras obtidas da amostra. O número de genes detectados não tinha dependência do número de leituras mapeadas (Figura 10).

SEQUENCIAMENTO E ANÁLISE DE RDNA 16S

[0282] A região V3 16S foi amplificada usando os iniciadores 357F CCTACGGGAGGCAGCAG (SEQ ID NO: 20) e 926R CCGTCAATTCMTTTRAGT (SEQ ID NO: 21) (Peterson et al., 2009). As bibliotecas foram agrupadas e sequenciadas em uma célula de fluxo MiSeq (Illumina) por 251 ciclos de cada extremidade dos fragmentos e analisadas com Casava 1.8. No geral, 49.760.478 leituras de extremidade emparelhada foram obtidas para todos os 3 dias de amostragem, com uma média de 212.652 leituras por amostra por dia.

[0283] O controle de qualidade de dados e análises foi realizado com o uso do tubo QIIME versão 1.7.0 (Caporaso et al., 2010). Espécies foram definidas a 97% de identidade com o uso de UCLUST (Edgar, 2010). A atribuição de taxonomia de espécies foi realizada usando o BLAST contra o banco de dados de referência de rRNA 16S RDP (versão 10) (Cole et al., 2003). Todos os singletons e doubletons foram removidos do conjunto de dados, resultando em 81.000 espécies com uma média de 5.039 por amostra. Espécies foram colocadas em diferentes níveis taxonômicos para receber abundância de táxons para cada nível filogenético (Figura 11).

[0284] Análise de biodiversidade: A diversidade dentro da amostra (alfa) foi calculada usando o índice de Shannon e a dominância foi determinada de acordo com o índice de 1 - Simpson (Harper, 1999). Os índices dos perfis dos genes rRNA 16S foram calculados com o uso de bootstrapping com 9.999 réplicas. A riqueza de genes e táxons são apresentados como simples contagens de genes e táxons.

[0285] Identificação de genes e espécies diferenciais: A significância estatística das diferenças em espécies e abundância de genes entre os grupos de eficiência foi testada pelo teste de Wilcoxon Rank-Soma juntamente com uma abordagem de bootstrapping adotada de Le Chatelier. et al. (Le Chatelier et al., 2013): 70% de todo o coorte amostrado foi escolhido aleatoriamente 30 vezes e a significância foi determinada a P <0,05 com bootstrap = 0,8 como um limiar. Esse processo foi repetido com outras 30 iterações nas 48 vacas mais extremas (24 eficientes e 24 ineficientes). No total, 18 espécies significativamente diferentes e 34.166 genes significativamente diferentes comuns a todos os 60 testes foram posteriormente analisados (P < 0,05). Espécies e genes que foram significativamente diferentes foram correlacionados com o parâmetro RFI usando correlação de Spearman. Anotação funcional de genes significativos foi alcançada com o uso de BLASTP com E < 10-6 contra bases de dados KEGG PATHWAY, MODULE, BRITE, GENES e ORTHOLOGY (2014; 46% de anotação) (Kanehisa et al., 2011). Esses genes também foram atacados contra a base de dados NR (Pruitt et al., 2007), e sua anotação filogenética foi determinada de acordo com o melhor resultado (BLASTP com E < 10-6; 89% de anotação).

[0286] Testes estatísticos e estimativa de taxa de falsa descoberta: Os testes de Tukey, Student t e Wilcoxon foram conduzidos dependendo da normalidade de distribuição dos dados de entrada. Todos os testes foram corrigidos para taxa de falsa descoberta com o uso do método descrito por Benjamini et al. (Benjamini & Hochberg, 1995) exceto onde especificado em contrário. No teste t de permutação, a significância da diferença entre as médias foi inferida pela realização do teste t entre os dois grupos e pela comparação da estatística t resultante com a estatística t resultante de 9.999 permutações de atribuições aleatórias de grupo (duas caudas, P < 0,05) (Davis, 1986). Para correção de hipóteses múltiplas, a distribuição dos valores P do teste t foi comparada com a menor distribuição de valores P resultante de 9.999 permutações de atribuições de grupos aleatórios de acordo com Westfall & Young (Westfall & Young, 1993). Esse procedimento foi realizado com o uso do multitestes do pacote biocondutor R (K. S. Pollard et al., 2005), função mt.maxT, individualmente para cada teste metabólico ou atividade, ou seja, polímeros, AGCCs, metano e todos os outros metabólitos medidos. A similaridade de variância foi testada onde exigido pelo teste estatístico.

[0287] Previsões de diferentes parâmetros fisiológicos: A seleção de características de espécies microbianas e genes foi conduzida através da escolha de espécies ou genes que foram significativamente diferentes na sua presença/ausência, como uso do teste exato de Fisher. Espécies e genes foram classificados separadamente de acordo com seu valor P em ordem crescente e agrupados em grupos de 100 recursos. Cada bin foi usado como recursos preditivos para o fenótipo de eficiência alimentar com o uso do algoritmo KNN (Aha, 1997) com k=3. A exatidão média da previsão foi calculada com o uso de validação cruzada de 1.000 iterações para cada bin, em que 70% das amostras foram usadas como um conjunto de treinamento e os 30% restantes foram usados como um conjunto de teste para medir a precisão da predição. Alterar o tamanho do bin (os bins variam de 50 a 1.000 recursos por bin) não afetou a precisão da previsão. Para verificar a significância da precisão das classificações, foi empregada uma técnica de permutações. O procedimento de classificação foi repetido 100 vezes, cada vez após o embaralhamento aleatório (permutação) dos rótulos de amostra. O valor P para cada precisão de classificação foi, então, obtido pelo percentual de execuções de permutação nas quais a precisão alcançada foi maior que a precisão de classificação obtida com os dados originais não permutados. A mesma metodologia de predição, precisão e determinação do valor P foi aplicada a vários outros parâmetros metabólicos - produção de leite CR, energia do leite, lactose do leite, gordura do leite, proteína do leite, BCS, pH e DMI. Para cada teste de predição de parâmetros metabólicos, as vacas foram separadas em dois grupos, pelo valor médio dos parâmetros fisiológicos.

[0288] Para cada índice fisiológico, as curvas de Característica de Operação de Receptor (ROC) e medidas de Área sob a Curva (AUC) foram obtidas com base na média de 1.000 KNN de iterações de validação cruzada. A análise foi realizada com a classe Metrics que faz parte da estrutura de aprendizado de máquina do SKLEARN Python.

[0289] Recrutamento para genomas microbianos e vias metabólicas: As leituras de cada amostra foram subamostradas de acordo com a amostra com menor número de leituras (21.000.000). As leituras de cada amostra foram alinhadas com o uso do programa BWA para um conjunto de dados de 59 genomas microbianos transferidos por download do NCBI usando BWA com 98% de identidade e parâmetros padrão. As leituras também foram recrutadas para as vias metabólicas dos metabólitos significativamente diferentes (P <0,05) com o uso do mesmo método. O presente banco de dados consistia em todas as enzimas KEGG possíveis para cada via metabólica. Os números de EC usados para cada via metabólica estão descritos na Tabela 1 abaixo.

[0290] A existência da via de acrilato de produção de propionato nos genomas dos isolados de lactato examinados Selenomonas ruminantium e Anaerovibrio lipolyticus foi adicionalmente testada por detonação contra todas as possíveis enzimas KEGG pertencentes à via do acrilato (EC 1.3.8.7, 2.8.3.1 e 4.2.1.54 ) usando um limiar acima de 70% de identidade, 70% de comprimento de alinhamento do gene e E < 10-5.

RESULTADOS CONSTRUÇÃO DE UM CONJUNTO DE DADOS DE REFERÊNCIA DE METAGENOMA RUMINAL

[0291] Para determinar se há recursos do microbioma que estão associados à eficiência energética da vaca, a eficiência alimentar individual de 146 vacas Holstein Friesian foi determinada pela primeira vez. Cada animal foi monitorado automaticamente quanto a múltiplos parâmetros usados para calcular a eficiência da alimentação (usando a abordagem de RFI). Para análises adicionais, os 25% superiores e inferiores dos animais que exibiram valores extremos de eficiência alimentar foram escolhidos, para um total de 78 animais - 40 eficientes e 38 ineficientes (Figura 8). Amostras de DNA metagenômico dos microbiomas ruminal desses animais foram submetidas ao sequenciamento do gene 16S rRNA e sequenciamento shotgun de genoma completo. As leituras metagenômicas de todas as amostras foram agrupadas e montadas, e os genes previstos serviram como um conjunto de dados de referência (Materiais e Métodos). O metagenoma continha 96,72% de sequências bacterianas, 1,73% de sequências de caracteres archaeais e 1,34% de sequências eucarióticas, semelhante ao descrito anteriormente para os metagenomas do microbioma ruminal. (Brulc et al., 2009). Nenhuma das sequências eucarióticas mostrou significância nas análises.

AS CARACTERÍSTICAS DO MICROBIOMA DIFEREM E PODEM PREVER O FENÓTIPO DE EFICIÊNCIA ALIMENTAR

[0292] Uma comparação da riqueza de microbiomas entre os animais revelou uma riqueza significativamente menor nos microbiomas eficientes das vacas em ambas as espécies (P = 0,0049) e no conteúdo gênico (P = 0,0023; Figuras 1A e 1B). As diferenças na riqueza de táxon foram aparentes até o nível de filo (Figura 1C), enfatizando ainda mais a intensidade desse fenômeno. A composição do táxon e o conteúdo gênico foram derivados de dois procedimentos diferentes de sequenciamento e análise e, portanto, a concordância entre essas constatações destaca a robustez da observação. As diferenças na riqueza também foram acompanhadas por uma diversidade significativamente menor e maior dominância nos microbiomas dos animais eficientes nos níveis de espécie e gene (P < 0,01 e P < 0,05 respectivamente, tanto para diversidade como dominância; Figuras 1D e 1G e Tabela 2).

[0293] Essas diferenças eram aparentes até o nível da família (Figuras 12A e 12B). Essas diferenças nos microbiomas de vacas eficientes e ineficientes levaram à questão de se os recursos do microbioma poderiam ser usados como marcadores para o traço de eficiência alimentar.

[0294] Em seguida, as espécies e a composição genética dos microbiomas ruminal foram usadas para prever com sucesso os fenótipos de eficiência alimentar dos animais com até 91% de precisão com o uso do algoritmo k-Nearest Neighbors (KNN) (Aha, 1997). Para o processo de seleção de características, foi usado o teste Exato de Fisher para medir as diferenças de presença/ausência entre os microbiomas de animais eficientes e ineficientes. As espécies e os genes foram classificados separadamente de acordo com seus valores P em ordem crescente e divididos em bins de 100 recursos serem usados para predição. Cada bin foi testado por sua capacidade de prever alta ou baixa eficiência alimentar. A precisão média de predição foi calculada com o uso de validação cruzada para cada bin (1.000 iterações). A precisão de predição do bin da primeira espécie era de 80%, enquanto o primeiro bin de genes alcançou uma precisão de 91% (Figuras 2A a 2B). A precisão de predição da espécie declinou para 50% (precisão de um palpite aleatório) após o quinto bin, enquanto o declínio na precisão da predição para os genes seguiu uma inclinação muito mais moderada, com os primeiros quatro bins preditivos acima de 90% de precisão com valores P altamente significativos. Essas diferenças na inclinação da exatidão da predição poderiam se originar do fato de que cada espécie representa um único genoma contendo milhares de genes, declinando, portanto, mais rapidamente, em comparação com grupos compostos de centenas de genes únicos.

[0295] Os recursos do microbioma também foram altamente preditivos de outros parâmetros fisiológicos, como o teor de lactose do leite e a produção de leite (Figuras 13A a 13I e 14A a 13I). A sensibilidade e especificidade dos bins preditivos foram avaliadas através da análise ROC (Característica de Operação de Receptor) para os primeiros cinco bins, para os dados de espécies e genes de cada parâmetro fisiológico (Figuras 15A a 15J e 16A a 16J). Essa análise mostrou alta sensibilidade e especificidade das predições dos traços fisiológicos do hospedeiro com base nas características desses microbiomas, uma vez que o índice de área sob a curva (AUC) apresentou valores altos que são considerados bons para os dados de espécies e excelentes para os dados de genes. (AUC> 0,8, AUC> 0,9, respectivamente). Essa alta precisão de predição indicou que as diferenças no conteúdo gênico e na composição taxonômica do microbioma poderiam ser usadas para classificar e predizer a eficiência energética da vaca.

A ATIVIDADE METABÓLICA DO MICROBIOMA VARIA EM VACAS COM DIFERENTES EFICIÊNCIAS ALIMENTARES

[0296] Diversidade, riqueza e dominância são determinantes ecológicos chave que, quando alterados em um dado ecossistema, devem ter um efeito marcante em sua funcionalidade (Hooper et al., 2005). Assim, seguindo as constatações de diferenças evidentes nesses parâmetros (Figura 1, Figuras 12A e 12B e Tabela 2), a funcionalidade do ecossistema ruminal foi investigada. Diversos ensaios de atividade microbiana e uma série de 41 metabólitos foram direcionados e medidos, representando os processos e produtos de diferentes níveis tróficos do microbioma ruminal de vacas eficientes e ineficientes, a partir da degradação da fibra vegetal ingerida até os produtos finais (Figura 3).

[0297] Diferenças significativas foram constatadas na maioria dos AGCCs. Dos seis AGCCs medidos, quatro - propionato, butirato, valerato e isovalerato - estavam em concentrações mais altas no rúmen de vacas eficientes (Figura 3, produtos finais metabólicos e Tabela 3).

[0298] Além disso, a concentração total de AGCCs foi maior nos animais eficientes, mostrando um aumento de 10% entre os dois grupos de eficiência (P <0,01; Figura 4A). Considera-se que estas diferenças têm um efeito evidente na produtividade de animal, dado que aproximadamente 70% das necessidades energéticas líquidas do animal são fornecidas pelos SCFAs. (Seymour et al., 2005).

[0299] Curiosamente, a razão entre propionato e acetato nos animais eficientes também foi significativamente maior do que nos ineficientes (P <0,05; Figura 4B); um aumento nessa razão está associado a um declínio na produção de metano e ao aumento da retenção de energia pelo gado (Russell, 1998). Essa constatação foi congruente com as medições do potencial de metanogênese dos microbiomas, onde ficou evidente que os microbiomas de vacas eficientes produzem significativamente menos metano do que suas contrapartes ineficientes (P <0,01; Figura 3, produtos finais metabólicos). A constatação de maiores concentrações de AGCCs e menor emissão de metano dos microbiomas ruminais eficientes é consistente com a noção de que a produção de propionato e butirato compete com a metanogênese pelo hidrogênio e apresenta um mecanismo alternativo que serve como trocador de elétrons (Ungerfeld, 2015). A produção de mais AGCC e menor quantidade de metano pelos eficientes microbiomas das vacas está de acordo com a maior eficiência energética.

[0300] A análise não revelou nenhuma diferença significativa na capacidade de os microbiomas degradar a parede celular da planta na dieta, in vitro ou in vivo (Figura 3, polímeros e Figuras 17A a 17D).

ABUNDÂNCIA DIFERENCIAL DE MICRÓBIOS RUMINAIS E VIAS METABÓLICAS

[0301] A menor diversidade e maior dominância no conteúdo gênico e composição taxonômica aparente no microbioma de vacas eficientes, juntamente com mudanças nos sortimentos de metabólitos, sugeriram que o fluxo através das vias metabólicas coletivas é diferente nesse grupo de microbioma. Isso levantou a hipótese de que isso pode ser devido a mudanças na ocupação de nichos microbianos ruminais específicos, definidos por características metabólicas e físicas, por grupos funcionais que diferem em suas demandas de recursos ou produtos de saída.

[0302] Para explorar essa hipótese, foi realizado um teste de rank-sum Wilcoxon permutador, no qual os perfis genético e taxonômico foram comparados entre os microbiomas de animais eficientes e ineficientes (Materiais e Métodos). No total, 18 espécies e 34.166 genes diferenciaram os microbiomas de vacas eficientes e ineficientes (Figuras 18 e 19); desses, 2 espécies e 227 genes eram mais abundantes em vacas eficientes. Essas espécies e genes não eram apenas diferentemente abundantes em vacas com diferentes valores de RFI, mas também eram significativamente correlacionados com a intensidade do fenótipo (Figura 5A). O menor número de espécies e genes mais abundantes nos microbiomas de vacas eficientes é compatível com maior dominância e menor riqueza em espécies e composição genética desses microbiomas. A anotação e análise dos genes de diferenciação contra o banco de dados KEGG (Kanehisa et al., 2011) também estavam de acordo com essas constatações, bem como com a análise metabolômica. Entre as vias KEGG e os metabólitos resultantes que foram enriquecidos nos microbiomas de vacas ineficientes estavam as enzimas da categoria de digestão e absorção de proteína, biossíntese de aminoácido e a categoria de metabolismo de metano.

[0303] Além disso, um número significativamente menor de vias KEGG foi enriquecido nos microbiomas eficientes das vacas, resultando em um número significativamente menor de produtos potenciais.

[0304] Essas constatações sugerem que há um uso mais diversificado de compostos de recursos, como proteínas dietéticas, piruvato, acetil-CoA e hidrogênio, nos microbiomas de vacas ineficientes, resultando em uma faixa mais diversificada de metabólitos produzidos, alguns dos quais afetam a colheita de energia do animal de uma maneira negativa ou não podem ser utilizados pelo animal para suas necessidades energéticas. Nos microbiomas eficientes das vacas, o uso desses compostos é dominado por um número limitado de vias metabólicas que são mais relevantes e valiosas para as necessidades energéticas do animal.

[0305] As anotações filogenéticas de genes que foram enriquecidos nos microbiomas das vacas eficientes foram dominadas pela espécie bacteriana ruminal Megasphaera elsdenii, uma utilizadora altamente potente do lactato para a produção de butirato e propionato (Figura 5B). Essa anotação, ou qualquer outra anotação relacionada, não apareceu nos genes enriquecidos dos microbiomas de vacas ineficientes. No geral, os microbiomas de vacas ineficientes foram menos dominados por um táxon específico exclusivo para esse grupo de microbiomas (Figura 5B), apoiando ainda mais a hipótese de maior dominância de grupos funcionais específicos nos microbiomas de vacas eficientes. Isso também foi reforçado pela anotação das duas espécies que foram significativamente mais abundantes nos microbiomas das vacas eficientes na análise de gene 16S rRNA. Uma anotação que apareceu exclusivamente nesse grupo foi do gênero Megasphaera. As outras espécies abundantes pertenciam à família Lachnospiraceae, que também tinha um representante nas espécies mais abundantes nos microbiomas de vacas ineficientes (Figura 5A).

[0306] M. elsdenii também foi altamente enriquecido em microbiomas de vacas eficientes usando uma análise genômica diferente, na qual leituras de todas as amostras foram alinhadas a um banco de dados de 59 genomas microbianos ruminais e intestinais sequenciados que são conhecidos por estarem envolvidos em vários processos metabólicos e também foram identificados na análise anterior. Aqui, novamente, os microbiomas ineficientes foram significativamente enriquecidos em vários genomas microbianos, entre eles Methanobrevibacter ruminantium (P <0,01), um archaeon metanogênico do gênero mais abundante no rúmen (Figuras 6A e 20). Essa exploração foi ampliada ainda mais, perguntando se essas observações são verdadeiras não apenas para genomas de micróbios específicos, mas para todas as possíveis enzimas KEGG pertencentes às vias metabólicas do produto final ruminal usando a mesma abordagem de alinhamento de leitura (Materiais e Métodos). De acordo com os resultados anteriores, a via de metanogênese foi significativamente enriquecida nos microbiomas de vacas ineficientes (P < 0,01). De todas as vias examinadas para produção de propionato, apenas a via do acrilato que utiliza lactato para propionato foi enriquecida nos microbiomas eficientes das vacas. (P < 0,01; Figure 6B). Deve-se notar que esta via está codificada no genoma de M. elsdenii (Prabhu et al., 2012) e Coprococcus catus (Reichardt et al., 2014) que ambos foram encontrados pelas análises para ser significativamente enriquecidos em microbiomas de animais eficientes (Figuras 5, 6A, 20), e não no outro lactato examinado utilizando genomas microbianos (S. ruminantium e A. lipolyticus). Além disso, as leituras alinhadas a esse caminho são predominantemente anotadas como M. elsdenii e C. catus, contudo, anotações de Clostridium propionicum e Clostridium botulinum também foram detectadas (Figura 21). Isso destaca a via do acrilato como principal contribuinte para o aumento do propionato e diminuição do lactato observado na análise metabolômica do grupo microbiota eficiente de vacas (Figura 3).

[0307] A Tabela 4 fornece uma lista de bactérias que se correlacionam positivamente com a alta eficiência energética, baixa produção de metano, conforme adquirido a partir das experiências descritas acima.

[0308] A Tabela 5 fornece uma lista de bactérias que se correlacionam positivamente com a baixa eficiência energética, alta produção de metano, conforme adquirido a partir das experiências descritas acima.

CONCLUSÃO

[0309] As análises de múltiplos animais alimentando-se da mesma dieta e mantidos nas mesmas condições mostraram que há grandes variações na capacidade de cada animal de extrair energia de sua alimentação. Essas variações estão intimamente ligadas a vários recursos do microbioma que incluem uma diminuição na riqueza e aumento na dominância da capacidade taxonômica e de codificação no microbioma da vaca eficiente. As mesmas são refletidas como mudanças na funcionalidade desse ecossistema, onde mudanças no domínio de componentes funcionais específicos afetam a disponibilidade geral de bens ecossistêmicos que são de alto valor para o animal hospedeiro. Maior riqueza de microbiomas e mudanças em grupos funcionais específicos têm sido descritas recentemente para afetar a produtividade do hospedeiro em plantas (Wagg et al., 2014) bem como seres humanos, onde menor diversidade e riqueza têm sido associadas com maior consumo de energia de alimentos em seres humanos obesos (Turnbaugh et al., 2009, Le Chatelier et al., 2013). Uma possível explicação para esse fenômeno poderia derivar de um uso mais diversificado de compostos de recursos nos microbiomas ineficientes das vacas, que são enriquecidos em espécies, genes e vias KEGG, resultando em uma faixa mais ampla de metabólitos de saída (Figuras 3, 6 e 7); isso também foi confirmado por metabólitos de saída KEGG significativamente mais altos. Por outro lado, no microbioma da vaca eficiente, redes de vias metabólicas mais simples resultam em maior dominância de componentes funcionais específicos, o que leva a maiores concentrações de bens ecossistêmicos que são relevantes para o hospedeiro (Figura 7B). Portanto, os microbiomas eficientes são menos complexos, porém mais especializados para suportar as necessidades energéticas do hospedeiro.

[0310] Essa noção é exemplificada pela constatação de maiores concentrações de SCFAs que são valiosas para o animal hospedeiro, os AGCCs são absorvidos através da parede ruminal para suprir as necessidades energéticas dos animais; o propionato, por exemplo, é o principal precursor da gliconeogênese em animais (Russell & Wilson, 1996, Mizrahi, 2011, Mizrahi, 2013). Esse não é o caso do metano, pois a energia retida no mesmo não pode ser absorvida pelos animais e é perdida para a atmosfera. Tais alterações metabólicas são geralmente obtidas através do uso de promotores de crescimento antibióticos que aumentam a eficiência alimentar do animal. (Duffield et al., 2012). É o caso da monensina, um ionóforo de poliéter carboxílico que afeta seletivamente alguns dos micróbios ruminal, alterando a estrutura do microbioma ruminal e, subsequentemente, a razão de AGCCs no rúmen, aumentando o ácido propiônico e diminuindo a produção de metano (Thornton & Owens, 1981, Callaway et al., 2003, Weimer et al., 2008, Duffield et al., 2012). Foi demonstrado que, quando administrada oralmente, a monensina melhora a eficiência alimentar em bovinos de uma maneira dependente da dose. Por isso, a mesma tem sido usado extensivamente para esse propósito desde sua aprovação para a pecuária em meados da década de 1970. (Duffield et al., 2012). Este efeito da manipulação do microbio ruminal obtido via antibióticos suporta ainda a conexão do microbioma ruminal com a eficiência alimentar do animal.

[0311] Aqui, foi demonstrado que essas mudanças metabolômicas são o resultado de estruturas de microbiomas que ocorrem naturalmente e estão altamente correlacionadas com e preditivas do fenótipo de eficiência alimentar. Portanto, essas constatações podem ser aproveitadas para reduzir o uso de promotores de crescimento de antibióticos na agricultura.

[0312] Do ponto de vista ecológico, a menor abundância de vias de metanogênese e archaeas metanogênicas no microbioma de baixa riqueza de vacas eficientes coincide com a noção de que processos são realizados por pequenos grupos taxonômicos, como as archaeas metanogênicas, que ocupam apenas pequenas porcentagens do microbioma ruminal, são mais sensíveis a mudanças na diversidade e riqueza (Hooper et al., 1995). Essas mudanças são geralmente acompanhadas pela ocupação e domínio do nicho disponível por diferentes espécies usando os mesmos recursos (Grime, 1998). Esse é o caso com M. elsdenii e C. catus, independentemente encontrado para ser enriquecido nos microbiomas dos animais eficientes em diferentes análises (Figuras 5, 6A e 20), que usam elétrons para a produção do valioso propionato de AGCC e butirato, desviando-os assim da redução de CO2 para metano (Prabhu et al., 2012, Ungerfeld, 2015). Um princípio semelhante foi mostrado para aplicar em Tammar wallabies, em que foi sugerido que bactérias Succinivibrio utilizassem hidrogênio para a produção de succinato, diminuindo assim sua disponibilidade para a metanogênese (Pope et al., 2011). Também é possível que as Lachnospiraceae detectadas nos microbiomas eficientes dos animais sejam produtores de butirato (Figura 5) e contribuam ainda mais para esse efeito (Louis & Flint, 2009, Meehan & Beiko, 2014). No entanto, como outros SCFAs são enriquecidos nesse grupo de microbiomas e a maior parte do fluxo de carbono no sistema vai para acetil-CoA, formato ou hidrogênio e dióxido de carbono, é provável que mais genes e vias estejam envolvidos nesse efeito.

[0313] Um ponto cardinal que emerge dos resultados é que as características funcionais de um pequeno número de espécies podem ter um grande impacto na estrutura da comunidade e no funcionamento do ecossistema. Isso, por sua vez, pode alterar a produtividade do supraorganismo - o hospedeiro e seu microbioma ruminal residente.

[0314] Essas constatações poderiam potencialmente ser aproveitadas para aumentar a produção de recursos alimentares para a humanidade de uma maneira mais sustentável, bem como para compreender os mecanismos ecológicos subjacentes que governam comunidades microbianas complexas e suas interações com seus hospedeiros.

[0315] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com modalidades específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os versados na técnica. Consequentemente, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados na sua totalidade a título de referência, na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser aqui incorporado por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior à presente invenção.

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Claims (6)

1. Método para determinar uma eficiência alimentar ou produção de metano de um animal ruminante caracterizado por compreender analisar a quantidade ou composição de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) em uma amostra de rúmen do animal, em que a quantidade e/ou composição dos SCFAs é indicativa de uma eficiência alimentar ou produção de metano.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, quando a quantidade de propionato, butirato, valerato e/ou isovalerato no rúmen do animal estiver acima de um nível predeterminado, isso ser indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar e uma baixa produção de metano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, quando a quantidade de SCFAs total no metaboloma do animal estiver acima de um nível predeterminado, isso ser indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar e uma baixa produção de metano.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método compreender analisar a quantidade de propionato na dita amostra de rúmen.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda analisar a quantidade de acetato na dita amostra de rúmen, em que quando a razão entre propionato:acetato no metaboloma do animal for superior a uma quantidade predeterminada, isso ser indicativo de que o animal tem uma alta eficiência alimentar e uma baixa produção de metano.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o dito animal ser uma vaca.

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