BR122021001361B1 - Molécula de ligação de antígeno multiespecífica - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas e usos destas. As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas compreendem um primeiro domínio de ligação de antígeno que liga especificamente uma molécula alvo, e um segundo domínio de ligação de antígeno que liga especificamente uma proteína efetora internalizante. As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção podem, em algumas modalidades, ser anticorpos biespecíficos que são capazes de ligar tanto uma molécula alvo quanto uma proteína efetora internalizante. Em certas modalidades da invenção, a ligação simultânea da molécula alvo e a proteína efetora internalizante pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica da presente invenção, resulta na atenuação da atividade da molécula alvo a um maior grau que a ligação da molécula alvo sozinha. Em outras modalidades da invenção, a molécula alvo é um antígeno associado a tumor, e a ligação simultânea do antígeno associado a tumor e a proteína efetora internalizante pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica da presente invenção, causa ou facilita a matança alvejada de células do tumor.

Description

Pedido dividido do BR112014022692-0 de 13/03/2013 CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo de proteínas terapêuticas e, em particular, ao campo de proteínas terapêuticas que são capazes de inativar, bloquear, atenuar, eliminar e/ou reduzir a concentração de uma ou mais moléculas alvos in vitro ou in vivo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Tratamentos terapêuticos frequentemente exigem a inativação ou bloqueio de uma ou mais moléculas alvos que agem em uma célula ou na sua vizinhança. Por exemplo, terapêuticas a base de anticorpo frequentemente funcionam ligando em um antígeno particular expresso na superfície de uma célula ou em um ligante solúvel, interferindo, por meio disso, na atividade biológica normal do antígeno. Anticorpos e outros construtos de ligação direcionados contra várias citocinas (por exemplo, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL- 22, IL-25, IL-33, etc.), ou seus respectivos receptores, por exemplo, têm se mostrado úteis no tratamento de um amplo arranjo de indisposições e doenças de humano. Agentes terapêuticos deste tipo tipicamente funcionam bloqueando a interação entre a citocina e seu receptor a fim de atenuar ou inibir sinalização celular. Em certos contextos, entretanto, seria terapeuticamente benéfico inativar ou inibir a atividade de uma molécula alvo de uma maneira que não envolva necessariamente bloquear sua interação física com um outro componente. Uma maneira na qual tal atenuação de não bloqueio de uma molécula alvo poderia ser obtida seria reduzir a concentração da superfície extracelular ou celular da molécula alvo. Embora estratégias genéticas e baseadas em ácido nucléico para reduzir a quantidade ou concentração de uma dada molécula alvo sejam conhecidas na tecnologia, tais estratégias são frequentemente repletas com complicações técnicas substanciais e efeitos colaterais involuntários em ambientes terapêuticos. Dessa maneira, estratégias de não bloqueio alternativas são necessárias para facilitar a inativação ou atenuação de várias moléculas alvos com propósitos terapêuticos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, no conceito de atenuar ou inativar uma molécula alvo facilitando ou realizando uma ligação física entre a molécula alvo e uma proteína efetora internalizante. Através deste tipo de ligação física intermolecular, a molécula alvo pode ser forçada a ser internalizada na célula junto com a proteína efetora internalizante, e processada pelo maquinário degradante intracelular, ou de outra forma atenuada, sequestrada, ou inativada. Este mecanismo representa uma estratégia inédita e inventiva para inativar ou atenuar a atividade de uma molécula alvo sem necessariamente bloquear a interação entre a molécula alvo e seus parceiros de ligação.

[004] Dessa maneira, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica que é capaz de ligar simultaneamente uma molécula alvo (T) e uma proteína efetora internalizante (E). Mais especificamente, a presente invenção fornece uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica compreendendo um primeiro domínio de ligação de antígeno (D1), e um segundo domínio de ligação de antígeno (D2), em que D1 liga especificamente T, e D2 liga especificamente E, e em que a ligação simultânea de T e E pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho. A maior atenuação da atividade de T pode ser devido a internalização/degradação forçada de T através de sua ligação física em E; entretanto, outros mecanismos de ação são possíveis e não são excluídos do escopo da presente invenção.

[005] Além do mais, a presente invenção fornece métodos de usar a molécula de ligação de antígeno multiespecífica para inativar ou atenuar a atividade de uma molécula alvo (T). Em particular, a presente invenção fornece um método para inativar ou atenuar a atividade de T colocando T e uma proteína efetora internalizante em contato (E) com uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica, em que a molécula de ligação de antígeno multiespecífica compreende um primeiro domínio de ligação de antígeno (D1) e um segundo domínio de ligação de antígeno (D2), em que D1 liga especificamente T, e em que D2 liga especificamente E; e em que a ligação simultânea de T e E pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho.

[006] Em certas modalidades da presente invenção, D1 e/ou D2 compreendem pelo menos uma região variável de anticorpo. Por exemplo, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode, em algumas modalidades, ser um anticorpo biespecífico, em que D1 compreende um par de região variável de cadeia leve e pesada do anticorpo (HCVR/LCVR) que liga especificamente T, e em que D2 compreende um par de HCVR/LCVR que liga especificamente E. Alternativamente, D1 e/ou D2 podem compreender um peptídeo ou polipeptídeo que interage especificamente com a molécula alvo (T) e/ou a proteína efetora internalizante (E). Por exemplo, se a molécula alvo for um receptor da superfície celular, então D1 pode compreender uma porção de um ligante que liga especificamente a molécula alvo do receptor da superfície celular. Similarmente, se a proteína efetora internalizante for um receptor de internalização da superfície celular, então D2 pode compreender uma porção de um ligante que liga especificamente o receptor de internalização da superfície celular. Em certas modalidades, D1 compreende uma região variável de anticorpo que liga especificamente T, e D2 compreende um peptídeo ou polipeptídeo que liga especificamente E. Ainda em outras modalidades, D1 compreende um peptídeo ou polipeptídeo que liga especificamente T, e D2 compreende uma região variável de anticorpo que liga especificamente E. Em qualquer configuração, entretanto, o resultado final é que T e E são capazes de ser fisicamente ligados, direta ou indiretamente, por meio da ligação simultânea de T e E por uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica.

[007] Outras modalidades ficarão aparentes a partir de uma revisão da descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[008] A Figura 1 (painéis A-D) fornece representações esquemáticas de quatro mecanismos de ação exemplares gerais para as moléculas multiespecíficas de ligação de antígeno da presente invenção. Em cada configuração ilustrada, D1 é um primeiro domínio de ligação de antígeno; D2 é um segundo domínio de ligação de antígeno; T é uma molécula alvo; E é uma proteína efetora internalizante; e R é um receptor que internaliza mediante ligação E. Painel A representa a situação na qual tanto T quanto E é associado a membrana. Painel B representa a situação na qual T é solúvel e E é associado a membrana. Painel C representa a situação na qual T é associado a membrana e E é uma proteína solúvel que interage com a célula, e é internalizada nela, por meio da interação de E e R. Painel D representa a situação na qual T é solúvel e E é uma proteína solúvel que interage com a célula, e é internalizada nela, por meio da interação de E e R.

[009] A Figura 2 mostra os resultados de um experimento de imunoprecipitação realizado em duas células diferentes (célula-1 que expressa FCYRI sozinha, e célula-2 que expressa Krm2 e FCYRI) após incubação para diferentes valores de tempo (0, 15, 30 e 60 minutos) com uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica DKK1-mFc.

[0010] A Figura 3 mostra a luminescência induzida por IL-4 relativa produzida por células HEK293 reportadoras de Stat6-luc na presença e ausência de uma proteína de ligação de antígeno multiespecífica anti-IL- 4R/anti-CD63 ("conjugado ab") ou construtos controles ("controle 1" e "controle 2") a várias concentrações de IL-4.

[0011] A Figura 4 mostra os resultados de um experimento realizado da mesma maneira do experimento mostrado na figura 3, exceto que expressão de CD63 foi significativamente reduzida na linhagem celular reportadora por um RNAsi direcionado contra CD63.

[0012] A Figura 5 mostra os resultados de um experimento realizado de uma maneira similar aos experimentos mostrados nas figuras 3 e 4, exceto que as células reportadoras foram incubadas com a proteína de ligação de antígeno multiespecífica ("conjugado Ab") ou construtos controles ("controle 1" e "controle 2") por 2 horas ou por toda a noite antes da adição de ligante de IL-4. A fileira superior dos gráficos de barra representa os resultados de experimentos conduzidos em células que expressam níveis normais de CD63 ("não transfectadas"), enquanto fileira inferior dos gráficos de barra representa os resultados de experimentos conduzidos em células nas quais expressão de CD63 foi significativamente reduzida na linhagem celular reportadora por um RNAsi direcionado contra CD63.

[0013] A Figura 6 mostra os resultados de um experimento realizado de uma maneira similar aos experimentos mostrados nas figuras 3 e 4, exceto que as células reportadoras foram incubadas com a proteína de ligação de antígeno multiespecífica anti-IL-4R/anti-CD63 ("conjugado Ab") ou construtos controles ("controle 1" e "controle 2") por 15 minutos, 30 minutos, 1 hora ou 2 horas antes da adição de ligante de IL-4.

[0014] A Figura 7 mostra os resultados de um experimento no qual células reportadoras Stat6-luc foram tratadas com IL-4 10 pM na presença de várias diluições de um anticorpo biespecífico anti-IL-4R x anti-CD63 ("biespecífico"), ou construtos controles (anti-IL-4R monoespecífico, ou falso biespecífico que liga somente IL-4R).

[0015] A Figura 8 mostra os resultados de experimentos nos quais células HEK293 foram tratadas com um construto SOST marcado com uma marca myc e uma etiqueta sensível a Ph (que produz um sinal fluorescente a baixo pH), junto com os vários anticorpos monoespecíficos e biespecíficos conforme mostrado. Resultados são expressos em termos de número de pontos fluorescentes (isto é, vesículas marcadas) por célula. Painel A mostra os resultados após incubação no gelo por 3 horas, painel B mostra os resultados após 1 hora de incubação a 37 °C, e painel C mostra os resultados após 3 horas de incubação a 37 °C.

[0016] A Figura 9 mostra os resultados de experimentos nos quais células HEK293 foram tratadas com lipopolissacarídeo fluorescentemente marcado (LPS) de E. coli (Painel A) ou S. minnesota (Painel B), junto com um anticorpo biespecífico anti-CD63 x anti-LPS, anticorpos controles, ou somente LPS, por várias vezes, seguido por finalização de fluoróforo não internalizado (isto é, ligado na superfície). Sinal fluorescente, portanto, reflete LPS internalizada nas várias condições mostradas. Resultados são expressos em termos de número de pontos fluorescentes (isto é, vesículas marcadas) por célula.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] Antes de a presente invenção ser descrita, deve-se entender que esta invenção não é limitada a métodos e condições experimentais particulares descritos, já que tais métodos e condições podem variar. Deve-se também entender que a terminologia usada aqui tem o propósito de descrever somente modalidades particulares, e não deve ser considerada limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[0018] A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na tecnologia a qual a invenção pertence. Da maneira aqui usada, a expressão "cerca de”, quando usada em referência a um valor numérico citado particular, significa que o valor pode variar do valor citado por não mais que 1 %. Por exemplo, da maneira aqui usada, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre estes (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0019] Embora qualquer método e material similar ou equivalente aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos serão agora descritos.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO MULTIESPECÍFICAS

[0020] Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que uma atividade da molécula alvo pode ser atenuada ligando a molécula alvo a uma proteína efetora internalizante por meio de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica.

[0021] Dessa maneira, a presente invenção fornece moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas compreendendo um primeiro domínio de ligação de antígeno (também referido aqui como "D1"), e um segundo domínio de ligação de antígeno (também referido aqui como "D2"). D1 e D2 cada qual ligam diferentes moléculas. D1 liga especificamente uma "molécula alvo". A molécula alvo é também referida aqui como "T". D2 liga especificamente uma "proteína efetora internalizante". A proteína efetora internalizante é também referida aqui como "E". De acordo com a presente invenção, a ligação simultânea de T e E pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho. Da maneira aqui usada, a expressão "ligação simultânea”, no contexto de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica, significa que a molécula de ligação de antígeno multiespecífica é capaz de entrar em contato tanto com uma molécula alvo (T) quanto uma proteína efetora internalizante (E) em pelo menos algum período de tempo em condições fisiologicamente relevantes para facilitar a ligação física entre T e E. Ligação da molécula de ligação de antígeno multiespecífica nos componentes T e E pode ser sequencial, por exemplo, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode primeiro ligar T e em seguida ligar E, ou ela pode primeiro ligar E e em seguida ligar T. De qualquer maneira, desde que T e E sejam ambos ligados pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica por algum período de tempo (independente da ordem sequencial de ligação), a molécula de ligação de antígeno multiespecífica será considerada T e E "simultaneamente ligados" com propósitos da presente revelação. Sem se ligar por teoria, acredita-se que a maior inativação de T é causada pela internalização e redirecionamento degradante de T em uma célula devido a sua ligação física em E. As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção são assim usadas para inativar e/ou reduzir a atividade e/ou concentração extracelular de uma molécula alvo sem bloquear ou antagonizar diretamente a função da molécula alvo.

[0022] De acordo com a presente invenção, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser um único polipeptídeo multifuncional, ou ela pode ser um complexo multimérico de dois ou mais polipeptídeos que são covalentemente ou não covalentemente associados um com o outro. Como ficará evidente pela presente revelação, qualquer construto de ligação de antígeno que tem a capacidade de ligar simultaneamente uma molécula T e uma E considerado uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica. Qualquer uma das moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da invenção, ou suas variantes, pode ser construída usando técnicas biológicas moleculares padrões (por exemplo, tecnologia de DNA recombinante e expressão de proteína), conforme versados na tecnologia perceberão.

DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO

[0023] As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção compreendem pelo menos dois domínios de ligação de antígeno separados (D1 e D2). Da maneira aqui usada, a expressão "domínio de ligação de antígeno" significa qualquer peptídeo, polipeptídeo, molécula de ácido nucléico, molécula tipo andaime, molécula de exibição de peptídeo, ou construto contendo polipeptídeo que é capaz de ligar especificamente um antígeno particular de interesse. A expressão "liga especificamente" ou similar, da maneira aqui usada, significa que o domínio de ligação de antígeno forma um complexo com um antígeno particular caracterizado por uma constante de dissociação (KD) de 500 pM ou menos, e não liga outros antígenos não relacionados em condições de teste ordinárias. "Antígenos não relacionados" são proteínas, peptídeos ou polipeptídeos que têm menos que 95 % de identidade de aminoácido um com o outro.

[0024] Categorias exemplares de domínios de ligação de antígeno que podem ser usadas no contexto da presente invenção incluem anticorpos, porções de ligação de antígeno de anticorpos, peptídeos que interagem especificamente com um antígeno particular (por exemplo, pepticorpos), moléculas receptoras que interagem especificamente com um antígeno particular, proteínas compreendendo uma porção de ligação do ligante de um receptor que liga especificamente um antígeno particular, andaimes de ligação de antígeno (por exemplo, proteínas de repetição DARPins, HEAT, proteínas de repetição ARM, proteínas de repetição tetratricopeptídeo, e outros andaimes baseados em proteínas de repetição de ocorrência natural, etc., [vide, por exemplo, Boersma and Pluckthun, 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857, e referências citadas nele]), e aptâmeros ou porções destes.

[0025] Em certas modalidades, nas quais a molécula alvo ou a proteína efetora internalizante é uma molécula receptora, um "domínio de ligação de antígeno”, com os propósitos da presente invenção, pode compreender ou consistir em um ligante ou porção de um ligante que é específico para o receptor. Por exemplo, se a molécula alvo (T) for IL-4R, o componente de D1 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode compreender o ligante de IL-4 ou uma porção do ligante de IL-4, que é capaz de interagir especificamente com IL-4R; ou, se a proteína efetora internalizante (E) for receptor de transferrina, o componente de D2 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode compreender transferrina ou uma porção de transferrina, que é capaz de interagir especificamente com o receptor de transferrina.

[0026] Em certas modalidades, nas quais a molécula alvo ou a proteína efetora internalizante é um ligante que é especificamente reconhecido por um receptor particular (por exemplo, uma molécula alvo solúvel), um "domínio de ligação de antígeno”, com os propósitos da presente invenção, pode compreender ou consistir no receptor ou uma porção de ligação do ligante do receptor. Por exemplo, se a molécula alvo (T) for IL-6, o componente de D1 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode compreender o domínio de ligação do ligante do receptor de IL-6; ou, se a proteína efetora internalizante (E) for uma proteína indiretamente internalizada (da maneira que este termo é definido em qualquer lugar aqui), o componente de D2 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode compreender um domínio de ligação do ligante de um receptor específico para E.

[0027] Métodos para determinar se duas moléculas ligam especificamente uma na outra são bem conhecidos na tecnologia e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plasmon de superfície, e similares. Por exemplo, um domínio de ligação de antígeno, da maneira usada no contexto da presente invenção, inclui polipeptídeos que ligam um antígeno particular (por exemplo, uma molécula alvo [T] ou uma proteína efetora internalizante [E]) ou uma porção destes com uma KD de menos que cerca de 500 pM, menos que cerca de 400 pM, menos que cerca de 300 pM, menos que cerca de 200 pM, menos que cerca de 100 pM, menos que cerca de 90 pM, menos que cerca de 80 pM, menos que cerca de 70 pM, menos que cerca de 60 pM, menos que cerca de 50 pM, menos que cerca de 40 pM, menos que cerca de 30 pM, menos que cerca de 20 pM, menos que cerca de 10 pM, menos que cerca de 5 pM, menos que cerca de 4 pM, menos que cerca de 2 pM, menos que cerca de 1 pM, menos que cerca de 0,5 pM, menos que cerca de 0,2 pM, menos que cerca de 0,1 pM, ou menos que cerca de 0,05 pM, conforme medido em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície.

[0028] A expressão "ressonância de plasmon de superfície", da maneira aqui usada, refere-se a um fenômeno ótico que permite a análise de interações em tempo real por detecção de alterações em concentrações de proteína em uma matriz biossensora, por exemplo, usando o sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[0029] O termo "KD", da maneira aqui usada, significa a constante de dissociação de equilíbrio de uma interação proteína-proteína particular (por exemplo, interação anticorpo-antígeno). A menos que indicado de outra forma, os valores de KD revelados aqui referem-se a valores de KD determinados por ensaio de ressonância de plasmon de superfície a 25 °C.

ANTICORPOS E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DE ANTICORPOS

[0030] Conforme indicado anteriormente, um "domínio de ligação de antígeno" (D1 e/ou D2) pode compreender ou consistir em um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo. O termo "anticorpo”, da maneira aqui usada, significa qualquer molécula de ligação de antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região determinante de complementariedade (CDR) que liga especificamente em um antígeno particular ou interage com ele (por exemplo, T ou E). O termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, bem como multímeros dessas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas nas regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs), dispersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas da terminação amino até a terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs dos anticorpos da invenção (ou sua porção de ligação de antígeno) podem ser idênticas às sequências da linha germinal de humano, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácido pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[0031] Os componentes D1 e/ou D2 das moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção podem compreender ou consistir em fragmentos de ligação de antígeno de moléculas de anticorpo total. As expressões "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo, e similares, da maneira aqui usada, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético, ou geneticamente produzido que liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo total usando qualquer técnica padrão adequada tal como digestão proteolítica ou técnicas de produção genética recombinantes envolvendo a manipulação e expressão de domínios variáveis e opcionalmente constantes do anticorpo que codificam o DNA. Tal DNA é conhecido e/ou é facilmente disponível, por exemplo, de fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para arranjar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.

[0032] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação de antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) de moléculas Fv cadeia única (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades reconhecimento minimal consistindo nos resíduos de aminoácido que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementariedade isolada (CDR) tal como um peptídeo de CDR3), ou um peptídeo de FR3-CDR3-FR4 restringido. Outras moléculas produzidas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de único domínio, anticorpos de domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados em CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), produtos imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), e domínios IgNAR variáveis de tubarão, são também englobados na expressão "fragmento de ligação de antígeno”, da maneira aqui usada.

[0033] Um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que é adjacente ou em posição correta de leitura com uma ou mais sequências de estrutura. Em fragmentos de ligação de antígeno com um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem ser situados relativos um com o outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros de VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.

[0034] Em certas modalidades, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado em pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser observadas em um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas anteriormente, os domínios variáveis e constantes podem ser tanto diretamente ligados um com o outro quanto podem ser ligados por uma região de dobradiça ou ligante total ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação de antígeno pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações do domínio variável e constante listadas anteriormente em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(s) de dissulfeto).

[0035] As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção podem compreender ou consistir em anticorpos de humano e/ou anticorpos recombinantes de humano, ou fragmentos destes. A expressão "anticorpo de humano", da maneira aqui usada, inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulina da linha germinal de humano. Anticorpos de humano podem, entretanto, incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinal de humano (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. Entretanto, a expressão "anticorpo de humano", da maneira aqui usada, não visa incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da espécie da linha germinal de um outro mamífero, tal como um camundongo, foram enxertados nas sequências de estrutura de humano.

[0036] As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção podem compreender ou consistir em anticorpos recombinantes de humano ou fragmentos de ligação de antígeno destes. A expressão "anticorpo recombinante de humano", da maneira aqui usada, visa incluir todos os anticorpos de humano que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectados para uma célula do hospedeiro (descrito adicionalmente a seguir), anticorpos isolados de uma biblioteca do anticorpo de humano combinatorial recombinante (descritos adicionalmente a seguir), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina de humano (vide, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve divisão de sequências do gene de imunoglobulina de humano em outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes de humano têm regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulina da linha germinal de humano. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos recombinantes de humano são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de Ig de humano é usado, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências de VH e VL de linha germinal de humano, não podem existir naturalmente no repertório do anticorpo da linha germinal de humano in vivo.

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[0037] De acordo com certas modalidades, as moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da invenção são anticorpos biespecíficos; por exemplo, anticorpos biespecíficos compreendendo um braço de ligação de antígeno que liga especificamente uma molécula alvo (T) e um braço de ligação de antígeno que liga especificamente uma proteína efetora internalizante (E). Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na tecnologia e podem ser usados para construir moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção. Formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitações, por exemplo, formatos baseados em scFv ou biespecíficos de diacorpo, fusões IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, saliências em furos, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com saliências em furos, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab de dupla ação (DAF)-IgG, e formatos biespecíficos de Mab2 (vide, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, e referências citadas nele, para uma revisão dos formatos anteriores).

COMPONENTES MULTIMERIZANTES

[0038] As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção, em certas modalidades, podem também compreender um ou mais componentes multimerizantes. Os componentes multimerizantes podem funcionar para manter a associação entre os domínios de ligação de antígeno (D1 e D2). Da maneira aqui usada, um "componente multimerizante" é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo, ou aminoácido que tem a capacidade de associar com um segundo componente multimerizante da mesma estrutura ou constituição ou similar. Por exemplo, um componente multimerizante pode ser um polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina. Um exemplo não limitante de um componente multimerizante é uma porção Fc de uma imunoglobulina, por exemplo, um domínio Fc de um IgG selecionado dos isotipos IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, bem como qualquer alotipo dentro de cada grupo de isotipo. Em certas modalidades, o componente multimerizante é um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácidos de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em outras modalidades, o componente multimerizante é um resíduo de cisteína, ou um peptídeo curto contendo cisteína. Outros domínios multimerizantes incluem peptídeos ou polipeptídeos compreendendo ou consistindo em um zíper de leucina, um motivo de hélice- laço, ou um motive bobina-bobinada.

[0039] Em certas modalidades, as moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção compreendem dois domínios multimerizantes, M1 e M2, em que D1 é anexado em M1 e D2 é anexado em M2, e em que a associação de M1 com M2 facilita a ligação física de D1 e D2 um com o outro em uma única molécula de ligação de antígeno multiespecífica. Em certas modalidades, M1 e M2 são idênticos um com o outro. Por exemplo, M1 pode ser um domínio Fc com uma sequência de aminoácidos particular, e M2 é um domínio Fc com a mesma sequência de aminoácidos de M1. Alternativamente, M1 e M2 podem diferir um do outro em uma ou mais posições de aminoácido. Por exemplo, M1 pode compreender um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e M2 pode compreender um segundo domínio CH3 de Ig, em que o primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do construto de alvejamento na proteína A comparado com um construto de referência com sequências M1 e M2 idênticas. Em uma modalidade, o domínio CH3 de Ig de M1 liga proteína A e o domínio CH3 de Ig de M2 contém uma mutação que reduz ou abole a ligação da proteína A tal como uma modificação de H95R (por numeração de IMGT éxon; por numeração de EU H435R). O CH3 de M2 pode compreender adicionalmente uma modificação de Y96F (por IMGT; por EU Y436F). Modificações adicionais que podem ser observadas no CH3 de M2 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I por EU) no caso de um domínio Fc de IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de um domínio Fc de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I por EU) no caso de um domínio Fc de IgG4.

PROTEÍNAS EFETORAS INTERNALIZANTES (E)

[0040] No contexto da presente invenção, o componente de D2 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica liga especificamente uma proteína efetora internalizante ("E"). Uma proteína efetora internalizante é uma proteína que é capaz de ser internalizada em uma célula ou, que de outra forma, participa ou contribui para retrogradar o tráfico de membrana. Em alguns exemplos, a proteína efetora internalizante é uma proteína que passa por transcitose; ou seja, a proteína é internalizada de um lado de uma célula e transportada para o outro lado da célula (por exemplo, apical para basal). Em muitas modalidades, a proteína efetora internalizante é uma proteína expressa na superfície celular ou uma proteína extracelular solúvel. Entretanto, a presente invenção também contempla modalidades nas quais a proteína efetora internalizante é expressa em um compartimento intracelular tal como o endossomo, retículo endoplásmico, Golgi, lisossomo, etc. Por exemplo, proteínas envolvidas na retrogradação do tráfico da membrana (por exemplo, caminhos de endossomos iniciais/de reciclagem para a rede trans-Golgi) podem servir como proteínas efetoras internalizantes em várias modalidades da presente invenção. De qualquer maneira, a ligação de D2 em uma proteína efetora internalizante faz com que toda a molécula de ligação de antígeno multiespecífica, e qualquer molécula associada com isso (por exemplo, uma molécula alvo ligada por D1), fique também internalizada na célula. Conforme explicado a seguir, proteínas efetoras internalizantes incluem proteínas que são diretamente internalizadas em uma célula, bem como proteínas que são indiretamente internalizadas em uma célula.

[0041] Proteínas efetoras internalizantes que são diretamente internalizadas em uma célula incluem moléculas associadas a membrana com pelo menos um domínio extracelular (por exemplo, proteínas de transmembrana, proteínas ancoradas por GPI, etc.), que passam por internalização celular, e são preferivelmente processadas por meio de um caminho intracelular degradante e/ou de reciclagem. Exemplos específicos não limitantes de proteínas efetoras internalizantes que são diretamente internalizadas em uma célula incluem, por exemplo, CD63, MHC-I (por exemplo, HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionado a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína-2 tipo proteína precursora de amilóide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), MAL (proteína do linfócito de mielina E, a.k.a. VIP17), IGF2R, vacuolar-tipo H+ ATPase, receptor de toxina de difteria, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores leptina, receptores de removedor (por exemplo, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36), etc.

[0042] Em modalidades nas quais E é uma proteína efetora diretamente internalizada, o componente de D2 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo que liga especificamente E, ou um ligante ou porção de um ligante que interage especificamente com a proteína efetora. Por exemplo, se E for Kremen-1 ou Kremen-2, o componente de D2 pode compreender ou consistir em um ligante Kremen (por exemplo, DKK1) ou porção de ligação de Kremen deste. Como um outro exemplo, se E for uma molécula receptora tal como ASGR1, o componente de D2 pode compreender ou consistir em um ligante específico para o receptor (por exemplo, asialo- orosomucóide [ASOR] ou Beta-GalNAc) ou uma porção de ligação do receptor deste.

[0043] Proteínas efetoras internalizantes que são indiretamente internalizadas em uma célula incluem proteínas e polipeptídeos que não internalizam por si próprios, mas ficam internalizados em uma célula depois de ligação em uma segunda proteína ou polipeptídeo, ou de outra forma, associados com ela, que é diretamente internalizada na célula. Proteínas que são indiretamente internalizadas em uma célula incluem, por exemplo, ligantes solúveis que são capazes de ligar em uma molécula receptora expressa na superfície celular internalizante. Um exemplo não limitante de um ligante solúvel que é (indiretamente) internalizado em uma célula por meio de sua interação com uma molécula receptora expressa na superfície celular internalizante é transferrina. Em modalidades em que E é transferrina (ou uma outra proteína indiretamente internalizada), a ligação de D2 em E, e a interação de E com receptor de transferrina (ou uma outra molécula receptora expressa na superfície celular internalizante), faz com que toda a molécula de ligação de antígeno multiespecífica, e qualquer molécula associado com ela (por exemplo, uma molécula alvo ligada por D1), fique internalizada na célula simultânea com a internalização de E e seu parceiro de ligação.

[0044] Em modalidades nas quais E é uma proteína efetora indiretamente internalizada tal como um ligante solúvel, o componente de D2 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo que liga especificamente E, ou um receptor ou porção de um receptor que interage especificamente com a proteína efetora solúvel. Por exemplo, se E for uma citocina, o componente de D2 pode compreender ou consistir no receptor de citocina correspondente ou sua porção de ligação do ligante.

MOLÉCULAS ALVOS (T)

[0045] No contexto da presente invenção, o componente de D1 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica liga especificamente uma molécula alvo ("T"). Uma molécula alvo é qualquer proteína, polipeptídeo, ou outra macromolécula cuja atividade ou concentração extracelular se deseja atenuar, reduzir ou eliminar. Em muitos exemplos, a molécula alvo na qual D1 se liga é uma proteína ou polipeptídeo [isto é, uma "proteína alvo"]; entretanto, a presente invenção também inclui modalidades em que a molécula alvo ("T") é um carboidrato, glicoproteína, lipídio, lipoproteína, lipopolissacarídeo, ou outros polímeros não proteína ou molécula na qual D1 se liga. De acordo com a presente invenção, T pode ser uma proteína alvo expressa na superfície celular ou uma proteína alvo solúvel. Ligação alvo pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ocorrer em um contexto extracelular ou de superfície celular. Em certas modalidades, entretanto, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica liga uma molécula alvo dentro da célula, por exemplo, em um componente intracelular tal como o retículo endoplásmico, Golgi, endossomo, lisossomo, etc.

[0046] Exemplos de moléculas alvos expressas na superfície celular incluem receptores expressos na superfície celular, ligantes ligados na membrana, canais de íon, e qualquer outro componente de polipeptídeo ou monomérico multimérico com uma porção extracelular que é anexada em uma membrana celular ou associada com ela. Moléculas alvos exemplares expressas na superfície celular não limitantes que podem ser alvejadas pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica da presente invenção incluem, por exemplo, receptores de citocina (por exemplo, receptores para IL-1, IL-4, IL- 6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, etc.), bem como alvos da superfície celular incluindo outros receptores de transmembrana tipo 1 tal como PRLR, receptores acoplados na proteína G tal como GCGR, canais de íon tais como Nav1.7, ASIC1 ou ASIC2, proteínas de superfície não receptora tais como MHC-I (por exemplo, HLA-B*27), etc.

[0047] Em modalidades nas quais T é uma proteína alvo expressa na superfície celular, o componente de D1 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo que liga especificamente T, ou um ligante ou porção de um ligante que interage especificamente com a proteína alvo expressa na superfície celular. Por exemplo, se T for IL-4R, o componente de D1 pode compreender ou consistir em IL-4 ou uma porção de ligação do receptor deste.

[0048] Exemplos de moléculas alvos solúveis incluem citocinas, fatores de crescimento, e outros ligantes e proteínas de sinalização. Proteína alvo solúvel exemplar não limitante que pode ser alvejada pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica da presente invenção inclui, por exemplo, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, SOST, DKK1, etc. Moléculas alvos solúveis também incluem, por exemplo, moléculas alvos de não humano tais como alérgenos (por exemplo, Fel D1, Betv1, CryJ1), patógenos (por exemplo, Candida albicans, S. aureus, etc.), e moléculas patogênicas (por exemplo, lipopolissacarídeo [LPS], ácido lipotecóico [LTA], proteína A., toxinas, etc.). Em modalidades nas quais T é uma molécula alvo solúvel, o componente de D1 da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo que liga especificamente T, ou um receptor ou porção de um receptor que interage especificamente com a molécula alvo solúvel. Por exemplo, se T for IL-4, o componente de D1 pode compreender ou consistir em IL-4R ou uma sua porção de ligação do ligante.

[0049] Moléculas alvos também incluem antígenos associados a tumor, como descrito em qualquer lugar aqui.

LIGAÇÃO DEPENDENTE DE pH

[0050] A presente invenção fornece moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas compreendendo um primeiro domínio de ligação de antígeno (D1) e um segundo domínio de ligação de antígeno (D2), em que um ou ambos os domínios de ligação de antígeno (D1 e/ou D2) liga seu antígeno (T ou E) de uma forma dependente de pH. Por exemplo, um domínio de ligação de antígeno (D1 e/ou D2) pode exibir menor ligação no seu antígeno a pH acídico comparado com pH neutro. Alternativamente, um domínio de ligação de antígeno (D1 e/ou D2) pode exibir maior ligação no seu antígeno a pH acídico comparado com pH neutro. Domínios de ligação de antígeno com características de ligação dependente do pH podem ser obtidos, por exemplo, classificando uma população de anticorpos para ligação menor (ou maior) em um antígeno particular a pH acídico comparado com pH neutro.Adicionalmente, modificações do domínio de ligação de antígeno no nível de aminoácido pode produzir domínios de ligação de antígeno com características dependentes do pH. Por exemplo, substituindo um ou mais aminoácidos de um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, em uma CDR) com um resíduo de histidina, um domínio de ligação de antígeno com menor ligação de antígeno a pH acídico relativo ao pH neutro pode ser obtido.

[0051] Em certas modalidades, a presente invenção inclui moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas compreendendo um componente de D1 e/ou D2 que liga seu respectivo antígeno (T ou E) a pH acídico com uma KD que é pelo menos cerca de 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, ou mais vezes maior que a KD do componente de D1 e/ou D2 para ligação no seu respectivo antígeno a pH neutro. Ligação dependente do pH pode também ser expressa em termos do t/ do domínio de ligação de antígeno para seu antígeno a pH acídico comparado ao pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas compreendendo um componente de D1 e/ou D2 que liga seu respectivo antígeno (T ou E) a pH acídico com um t/ que é pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ou mais vezes menor que o t/ do componente de D1 e/ou D2 para ligação no seu respectivo antígeno a pH neutro.

[0052] Moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da presente invenção que compreendem um componente de D1 e/ou D2 com menor ligação de antígeno a pH acídico comparado com pH neutro, quando administradas em indivíduos animais, podem em certas modalidades exibir depuração mais lenta a partir da circulação comparadas com moléculas equiparáveis que não exibem características de ligação dependente do pH. De acordo com este aspecto da invenção, são fornecidas moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas com menor ligação de antígeno tanto em T e/quanto em E a pH acídico comparadas com pH neutro, que exibem pelo menos 2 vezes depuração mais lenta a partir da circulação em relação às moléculas equiparáveis de ligação de antígeno que não possuem menor ligação de antígeno a pH acídico comparado com pH neutro. Taxa de depuração pode ser expressa em termos da meia vida do anticorpo, em que uma depuração mais lenta correlaciona com uma meia vida maior.

[0053] Da maneira aqui usada, a expressão "pH acídico" significa um pH de 6,0 ou menos. A expressão "pH acídico" inclui valores de pH de cerca de 6,0, 5,95, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0, ou menos. Da maneira aqui usada, a expressão "pH neutro" significa um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4. A expressão "pH neutro" inclui valores de pH de cerca de 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 e 7,4.

ATENUAÇÃO DA ATIVIDADE DE MOLÉCULA ALVO

[0054] Conforme notado em qualquer lugar aqui, e conforme demonstrado pelos exemplos funcionais aqui a seguir, os presentes inventores descobriram que a ligação simultânea de uma molécula alvo (T) e uma proteína efetora internalizante (E) por uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de T, em um maior grau que a ligação de T pelo componente do primeiro domínio de ligação de antígeno (D1) da molécula de ligação de antígeno multiespecífica sozinha. Da maneira aqui usada, a expressão "atenua a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho" significa que, em um ensaio no qual a atividade de T pode ser medida usando células que expressam E, o nível de atividade de T medido na presença de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica é pelo menos 10 % menor que o nível de atividade de T medido na presença de um construto controle contendo D1 por si mesmo próprio (isto é, não fisicamente ligado no segundo domínio de ligação de antígeno (D2)). Por exemplo, o nível de atividade de T medido na presença da molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser cerca de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 100 % menor que o nível de atividade de T medido na presença de um construto controle contendo D1 por si mesmo próprio.

[0055] Um formato de ensaio ilustrativo não limitante para determinar se uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de uma molécula alvo, em um maior grau que a ligação da molécula alvo pelo domínio D1 sozinho, é mostrado nos exemplos funcionais 1 e 2, aqui a seguir. No exemplo 1, por exemplo, "T" é o receptor de interleucina-4 (IL-4R), e "E" é CD63. A molécula de ligação de antígeno multiespecífica do exemplo 1 é um conjugado de 2 anticorpos compreendendo um mAb anti-IL-4R ligado em um mAb anti-CD63 por meio de um ligante de estreptavidina/biotina. Assim, "D1" neste construto exemplar é o domínio de ligação de antígeno (HCVR/LCVR par) do anticorpo anti-IL-4R, e "D2" é o domínio de ligação de antígeno (HCVR/LCVR par) do anticorpo anti-CD63. Para os experimentos dos exemplos 1 e 2, um formato de ensaio baseado em célula foi usado que produzir um sinal reportador quando a atividade de IL-4R foi estimulada pela adição do ligante de IL-4 exógeno. O valor da atividade reportadora induzida por IL-4 detectada na presença da molécula de ligação de antígeno multiespecífica foi comparado com o valor da atividade reportadora induzida por IL-4 detectada na presença de construtos controles contendo o anticorpo anti-IL-4R, tanto conectado a uma imunoglobulina controle irrelevante (controle 1) quanto combinado com o anticorpo anti-CD63, mas não fisicamente conectado nele (controle 2). Os construtos controles assim produzem a condição na qual T é ligado por D1 sozinho (isto é, em que D1 não é uma parte da molécula de ligação de antígeno multiespecífica per se). Se o grau de atividade da molécula alvo (representado pelo sinal reportador) observado na presença da molécula de ligação de antígeno multiespecífica for pelo menos 10 % menos que o valor da atividade da molécula alvo na presença de um construto controle compreendendo o componente de D1 não fisicamente ligado no componente de D2 (por exemplo, controle 1 ou controle 2), então, com os propósitos da presente revelação, conclui-se que "a ligação simultânea de T e E pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho”.

[0056] A ligação de T por D1 sozinho pode, em algumas modalidades, resultar em atenuação parcial da atividade de T (como no caso do exemplo 1 onde o tratamento de células reportadoras com um anticorpo anti-IL-4R sozinho [isto é, controles 1 e 2] causou um pequeno nível de atenuação de sinalização de IL-4 em relação a células não tratadas). Em outras modalidades, a ligação de T por D1 sozinho não resultará em nenhuma atenuação da atividade de T detectável; o seja, a atividade biológica de T pode não ser afetada pela ligação de T por D1 sozinho. De qualquer maneira, entretanto, a ligação simultânea de T e E por uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica da invenção atenuará a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho.

[0057] Formatos e variações de ensaio alternativos no(s) formato(s) de ensaio exemplificado(s) aqui ficarão aparentes aos versados na tecnologia, levando em conta a natureza da molécula alvo específica e proteínas efetoras para as quais qualquer dada molécula de ligação de antígeno multiespecífica pode ser direcionada. Qualquer formato como esse pode ser usado no contexto da presente invenção para determinar se a ligação simultânea de T e E por uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica atenua a atividade de T em um maior grau que a ligação de T por D1 sozinho.

ALVEJAMENTO DO TUMOR

[0058] Em um outro aspecto da invenção, as moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas são usadas para alvejar células do tumor. De acordo com este aspecto da invenção, a molécula alvo "T" na qual D1 se liga é um antígeno associado ao tumor. Em certos exemplos, o antígeno associado ao tumor é um antígeno que não é ordinariamente internalizado. A proteína efetora internalizante "E" na qual D2 se liga pode ser tumor específico, ou ela pode ser expressa tanto em células de tumor quanto não tumor de um indivíduo. Qualquer uma das proteínas efetoras internalizantes mencionadas em qualquer lugar aqui pode ser alvejada para aplicações anti-tumor da invenção.

[0059] Da maneira aqui usada, a expressão "antígeno associado ao tumor" inclui proteínas ou polipeptídeos que são preferencialmente expressos na superfície de uma célula tumoral. A expressão "preferencialmente expresso”, da maneira usada neste contexto, significa que o antígeno é expresso em uma célula tumoral a um nível que é pelo menos 10 % maior (por exemplo, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 150 %, 200 %, 400 %, ou mais) que o nível de expressão do antígeno em células não tumorais. Em certas modalidades, a molécula alvo é um antígeno que é preferencialmente expresso na superfície de uma célula tumoral selecionada do grupo que consiste em uma célula de tumor renal, uma célula de tumor de cólon, uma célula de tumor de mama, uma célula de tumor de ovário, uma célula de tumor da pele, uma célula de tumor do pulmão, uma célula de tumor da próstata, uma célula de tumor pancreático, uma célula de glioblastoma, uma célula de tumor da cabeça e pescoço e uma célula de melanoma. Exemplos não limitantes de antígenos específicos associados a tumor incluem, por exemplo, proteínas AFP, ALK, BAGE, β-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anidrase carbônico IX, caspase-8, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por exemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipican-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por exemplo, MAGE-1, - 2, -3, -4, -6, e -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinase, e uroplacina-3.

[0060] A molécula de ligação de antígeno multiespecífica, de acordo com este aspecto da invenção, pode ser conjugada com um medicamento, toxina, radioisótopo, ou outra substância que é detrimental para a viabilidade de uma célula. Alternativamente, o medicamento ou toxina pode ser uma substância que não mata diretamente uma célula, mas torna uma célula mais suscetível a matança por outros agentes externos. Ainda em outras modalidades envolvendo alvejamento do tumor, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica da invenção não é por si própria conjugada com um medicamento, toxina ou radioisótopo, mas, ao contrário, é administrada em combinação com uma segunda molécula de ligação de antígeno específico para o alvo (T) (aqui referido como uma "molécula cúmplice"), em que a molécula cúmplice é conjugada com um medicamento, toxina ou radioisótopo. Em tais modalidades, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica preferivelmente ligará em um epítopo na molécula alvo (T) que é distinta e/ou não sobreposta com o epítopo reconhecido pela molécula cúmplice (isto é, para permitir ligação simultânea da molécula de ligação de antígeno multiespecífica e da molécula cúmplice no alvo).

[0061] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção também inclui combinações anti-tumor, e métodos terapêuticos, compreendendo: (a) uma molécula de ligação de antígeno conjugada com toxina ou medicamento que liga especificamente um antígeno associado ao tumor; e (b) uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica compreendendo (i) um primeiro domínio de ligação que liga especificamente uma proteína efetora internalizante (por exemplo, com baixa afinidade) e (ii) um segundo domínio de ligação que liga especificamente a molécula de ligação de antígeno conjugada com toxina ou medicamento. Nesta modalidade, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica funciona para ligar a molécula de ligação de antígeno conjugada com toxina ou medicamento na proteína efetora internalizante, que, por meio disso, funciona para ligar fisicamente o antígeno associado a tumor na proteína efetora internalizante. Internalização do anticorpo do antígeno associado ao anti-tumor marcado com toxina por meio de sua conexão com a proteína efetora internalizante resultaria consequentemente em matança de célula tumoral alvejada.

[0062] De acordo com certas modalidades dos aspectos de alvejamento de tumor da invenção, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica (ou anticorpo cúmplice) pode ser conjugada com um ou mais medicamentos citotóxicos selecionados do grupo que consiste em: calicamicina, esperamicina, metotrexato, doxorubicina, melfalano, clorambucil, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platina, etoposídeo, bleomicina, 5-fluoruracila, estramustina, vincristina, etoposídeo, doxorubicina, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, orataxel, docetaxel, dolastatin a10, auristatina E, auristatina PHE e compostos baseados em maitansina (por exemplo, DM1, DM4, etc.). A molécula de ligação de antígeno multiespecífica (ou anticorpo cúmplice) pode também, ou alternativamente, ser conjugada com uma toxina tal como toxina da difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana, etc. A molécula de ligação de antígeno multiespecífica (ou anticorpo cúmplice) pode também, ou alternativamente, ser conjugada com um ou mais radioisótopo selecionado do 225 211 212 213 186 188 177 90 131 grupo que cons ste em c, t, , , , , u, , ,67 125 123 77 153 166 64 121 224 223 Cu, I, I, Br, Sm, Ho, Cu, Pb, Ra e Ra. Assim, este aspecto da invenção inclui moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas que são conjugados anticorpo-medicamento (ADCs) ou conjugados anticorpo- radioisótopo (ARCs).

[0063] No contexto de aplicações matança de tumor, o componente de D2 pode, em certas circunstâncias, ligar com baixa afinidade na proteína efetora internalizante "E". Assim, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica alvejará preferencialmente células do tumor que expressam o antígeno associado ao tumor. Da maneira aqui usada, ligação de "baixa afinidade" significa que a ligação afinidade do componente de D2 com a proteína efetora internalizante (E) é pelo menos 10 % mais fraca (por exemplo, 15 % mais fraca, 25 % mais fraca, 50 % mais fraca, 75 % mais fraca, 90 % mais fraca, etc.) do que a afinidade de ligação do componente de D1 com a molécula alvo (T). Em certas modalidades, ligação de "baixa afinidade" significa que o componente de D2 interage com a proteína efetora internalizante (E) com uma KD maior que cerca de 10 nM a cerca de 1 μM, conforme medido em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície a cerca de 25 °C.

[0064] A ligação simultânea de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica em uma proteína efetora internalizante e um antígeno associado ao tumor resultará em internalização preferencial da molécula de ligação de antígeno multiespecífica nas células do tumor. Se, por exemplo, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica for conjugada com um medicamento, toxina ou radioisótopo (ou se a molécula de ligação de antígeno multiespecífica for administrada em combinação com um anticorpo cúmplice que é conjugado com um medicamento, toxina ou radioisótopo), a internalização alvejada do antígeno associado ao tumor na célula tumoral por meio de sua ligação na molécula de ligação de antígeno multiespecífica, resultará em matança extremamente específica de célula tumoral.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[0065] A presente invenção inclui composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica. As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas com veículos, excipientes adequados, e outros agentes que fornecem melhor transferência, distribuição, tolerância, e similares.

[0066] A presente invenção também inclui métodos para inativar ou atenuar a atividade de uma molécula alvo (T). Os métodos da presente invenção compreendem colocar uma molécula alvo em contato com uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica da maneira descrita aqui. Em certas modalidades, os métodos de acordo com este aspecto da invenção, compreendem administrar uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica em um paciente para o qual é desejável e/ou benéfico inativar, atenuar, ou de outra forma diminuir a concentração extracelular de uma molécula alvo.

[0067] Vários sistemas de distribuição são conhecidos na tecnologia e podem ser usados para administrar as composições farmacêuticas da presente invenção em um paciente. Métodos de administração que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, mas sem limitações, vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolo, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.), e podem ser administradas junto com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistêmica ou local. Por exemplo, uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser distribuída subcutânea ou intravenosamente com uma agulha e seringa padrão. Além do mais, com relação a distribuição subcutânea, um dispositivo de distribuição pena pode ser usado para administrar uma composição farmacêutica da presente invenção em um paciente.

EXEMPLOS

[0068] Os exemplos seguintes são apresentados de maneira a prover os versados na tecnologia com uma revelação e descrição completas de como fabricar e usar os métodos e composições da invenção, e não visam limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Foram feitos esforços para garantir precisão com ralação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios deverão ser considerados. A menos que indicado de outra forma, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados, e pressão é atmosférica ou próxima a ela.

Exemplo 1. Uso de uma Molécula de Ligação de Antígeno Multiespecífica para Induzir Degradação de um Receptor da Superfície Celular por meio de Ligação com uma Proteína Efetora Internalizante

[0069] Como um experimento de prova de conceito inicial, foi criada uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica que é capaz de ligar (a) uma molécula efetora internalizante e (b) uma molécula alvo do receptor da superfície celular. Neste exemplo, a proteína efetora internalizante é Kremen- 2 (Krm2), e a molécula alvo do receptor da superfície celular é um receptor Fc (FCYRI [Fc-gama-R1]).

[0070] Moléculas Kremen (Krm1 e Krm2) são proteínas da superfície celular conhecidas por mediar sinalização de WNT direcionando a internalização e degradação das moléculas de sinalização LRP5 e LRP6 do caminho de WNT. Internalização de LRP5/6 é realizada por meio da proteína de interação solúvel DKK1. Em particular, DKK1 liga Kremen em LRP5/6 na superfície celular, e em virtude desta ligação, a internalização de Kremen aciona a internalização e degradação de LRP5 e LRP6. (Vide Li et al., PLoS One 5(6):e11014).

[0071] Os presentes inventores procuraram explorar as propriedades de ligação de Kremen de DKK1 e as propriedades de internalização de Kremen para induzir a internalização de FCYRI. Para facilitar internalização/degradação mediada por Kremen de FCYRI, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica foi construída consistindo em DKK1 fundido com um Fc de camundongo (DKK1-mFc, tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1). Conforme explicado em qualquer lugar aqui, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica é definida como uma molécula compreendendo um primeiro domínio de ligação de antígeno (D1) que liga especificamente uma molécula alvo, e um segundo domínio de ligação de antígeno (D2) que liga especificamente uma proteína efetora internalizante. Neste exemplo de prova de conceito, o "primeiro domínio de ligação de antígeno" é o componente de mFc que liga especificamente a molécula alvo FCYRI, e o "segundo domínio de ligação de antígeno" é o componente de DKK1 que liga especificamente a proteína efetora internalizante Kremen.

[0072] Um experimento foi primeiro conduzido para determinar se DKK1-mFc pode ser endocitosado nas células de uma maneira dependente de Kremen. Para este experimento, duas linhagens celulares foram usadas: Célula- 1, um linhagem celular HEK293 produzida para expressar FCYRI mas não Kremen-2, e célula-2, um linhagem celular HEK293 produzida para expressar tanto FcyR1 quanto Kremen-2. Uma diluição 1:10 de meio condicionado com DKK1-mFc foi adicionada nas respectivas linhagens celulares e deixada incubar a 37 °C por 90 minutos. Depois de 90 minutos de incubação, as células foram manchadas com anti- anticorpo IgG camundongo marcado com Alexa- 488 para detectar a molécula DKK1-mFc. Usando microscopia de fluorescência, observou-se que virtualmente não foi localizado nenhum DKK1- mFc dentro da célula-1 (que não tem Kremen); entretanto, quantidades substanciais de DKK1-mFc foram detectadas na Célula-2 que expressa Kremen-2. Assim, esses resultados mostram que a molécula de ligação de antígeno multiespecífica DKK1-mFc pode ser internalizada nas células de uma maneira dependente de Kremen.

[0073] Em seguida, um experimento foi conduzido ao longo do tempo para determinar se DKK1-mFc pode induzir degradação de FcyR1 de uma maneira dependente de Kremen. Uma descrição resumida do protocolo experimental é da maneira a seguir: Célula-1 (que expressa somente FcyR1) e célula-2 (que expressa Kremen-2 e FcyR1) foram tratadas com 2 mg/mL de NHS-Sulfo-Biotina por 15 minutos no gelo para marcar todos os proteínas expressas na superfície celular. Células foram então lavadas e ressuspensas em 400 μL do meio e divididas em quatro alíquotas de 100 μL que foram tratados com DKK1-mFc por quantidades variadas de tempo (0 minuto, 15 minutos, 30 minutos e 60 minutos) a 37 °C. Após incubação de DKK1-mFc, as células foram pelotizadas e tratadas com inibidores de protease. Lisatos das células dos diferentes pontos de tempo de incubação foram submetidos a imunoprecipitação de FCYRI. Para a imunoprecipitação de FCYRI, anticorpo anti-FcYR1 camundongo foi adicionado nos lisatos de célula e incubado por 1 hora a 4 °C. Em seguida microesferas da proteína G foram adicionadas e a mistura foi incubada por 1 hora a 4 °C. As microesferas foram então lavadas e as proteínas eluídas e submetidas a SDS-PAGE. Proteínas foram transferidas para a membrana e colocadas em sonda com estreptavidina marcada com HRP para revelar quantidades relativas de proteína FcyR1 exposta na superfície restante em cada amostra. Resultados são mostrados na figura 2.

[0074] Conforme ilustrado na figura 2, a quantidade de proteína FcyR1 exposta na superfície em amostras da Célula-1 (que expressa FcyR1, mas não Kremen-2) permaneceu relativamente constante independente da quantidade de tempo que as células foram exposta a DKK1-mFc. Ao contrário, a quantidade de proteína FcyR1 exposta na superfície nas amostras da Célula-2 (que expressa tanto Kremen-2 quanto FcyR1) diminuiu substancialmente com aumento de tempo de incubação com DKK1-mFc. Assim, este experimento demonstra que DKK1-mFc induz degradação de FcyR1 expressa na superfície celular de uma maneira dependente de Kremen-2-.

[0075] Considerados juntos, os resultados anteriores mostram que uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica que simultaneamente liga uma molécula alvo da superfície celular (FcyR1) e uma proteína efetora internalizante (Kremen-2) pode induzir degradação da molécula alvo de uma maneira dependente da proteína efetora.

Exemplo 2. Atividade de IL-4R é Atenuada Usando uma Molécula de Ligação de Antígeno Multiespecífica com Especificidade para IL-4R e CD63

[0076] Em um conjunto adicional de experimento de prova de conceitos, foi construída uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica que é capaz de ligar simultaneamente uma molécula alvo expressa pela superfície celular (isto é, IL-4R) e uma proteína efetora internalizante expressa na superfície celular (isto é, CD63). O propósito desses experimentos foi determinar se a atividade de IL-4R em uma célula pode ser atenuada a um maior grau ligando fisicamente IL-4R em uma molécula efetora que é internalizada e alvejada para degradação no lisossomo (neste caso, CD63). Em outras palavras, este Exemplo foi projetado para testar se a internalização e degradação normais de CD63 podem ser usadas para forçar o redirecionamento de internalização e degradação de IL-4R em uma célula.

[0077] Primeiro, foi construída uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica que é capaz de ligar tanto IL-4R quanto CD63. Especificamente, um anticorpo anti-IL-4R conjugado com estreptavidina e um anticorpo anti-CD63 biotinilado foram combinados em uma razão 1:1 para produzir um conjugado anti-IL-4R:anti-CD63 (isto é, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica que liga especificamente tanto IL-4R quanto CD63). O anticorpo anti-IL-4R usado neste exemplo é um mAb totalmente humano surgiu contra o domínio extracelular de IL-4R. (O anticorpo anti-IL- 4R compreendeu uma região variável de cadeia pesada com a SEQ ID NO:3 e uma região variável de cadeia leve com a SEQ ID NO:4). O anticorpo anti- CD63 usado neste exemplo é o clone MEM-259 de mAb de CD63 camundongo anti-humano, obtido de Biolegend (San Diego, CA), catálogo No. 312002.

[0078] Dois construtos controles foram também criados: Controle-1 = anticorpo anti-IL-4R conjugado com estreptavidina combinado em uma razão 1:1 com IgG1kapa de anticorpo de camundongo controle biotinilado; e Controle-2 = anticorpo anti-IL-4R conjugado com estreptavidina combinado em uma razão 1:1 com anticorpo anti-CD63 não biotinilado. O anticorpo anti- IL-4R usado nos construtos experimentais e controles para este Exemplo é um anticorpo que é conhecido por ligar especificamente IL-4R e bloquear somente parcialmente sinalização mediada por IL-4.

[0079] A linhagem celular experimental usada neste exemplo é uma linhagem celular HEK293 contendo um construto reportador STAT6-luciferase e STAT6 adicional ("células HEK293/STAT6-luc"). As células usadas neste experimento expressam tanto IL-4R quanto CD63 na sua superfície. Quando tratada com IL-4 na ausência de qualquer inibidor, esta linhagem celular produz um sinal de quimioluminescência detectável dependente da dose que reflete a extensão de sinalização mediada por IL-4.

[0080] Em um experimento inicial, a molécula multiespecífica de anti- IL-4R/anti-CD63 experimental, ou os construtos controles, foram adicionados nas células HEK293/STAT6-luc de forma que a concentração final de anticorpo anti-IL-4R nos meios foi 12,5 nM. Sinal reportador foi medido a maiores concentrações de IL-4 na presença e ausência dos construtos experimentais e controles (Figura 3). Conforme visto na figura 3, a molécula multiespecífica de anti-IL-4R/anti-CD63 ("ab conjugado") inibiu a sinalização mediada por IL-4 a um grau significativamente maior do que qualquer construto controle.

[0081] Para confirmar que o efeito observado na figura 3 dependeu de CD63, o mesmo experimento descrito anteriormente foi realizado, exceto que expressão de CD63 foi significativamente reduzida na linhagem celular reportadora, usando um RNAsi direcionado contra CD63. Com expressão de CD63 significativamente reduzida, a maior atividade inibitória da molécula multiespecífica de anti-IL-4R/anti-CD63 não foi mais observada (Figura 4). Este resultado sugere que a capacidade de a molécula multiespecífica de anti- IL-4R/anti-CD63 atenuar a sinalização mediada por IL-4 é devido à ligação simultânea da molécula multiespecífica em IL-4R e CD63 e a internalização e degradação consequentes de todo o complexo anticorpo-IL-4R-CD63.

[0082] Experimentos similares foram em seguida realizados nos quais a molécula multiespecífica de anti-IL-4R/anti-CD63, ou os construtos controles, foram incubados naturalmente com a linhagem celular reportadora de HEK293/STAT6-luc para várias valores de tempo antes da adição de IL-4. Em um primeiro conjunto de tais experimentos, as moléculas foram incubadas naturalmente com a linhagem celular reportadora por 0 hora (isto é, adicionada simultaneamente com IL-4), 2 horas, ou por toda a noite antes da adição de 50 pM IL-4. Atividade de luciferase foi medida seis horas depois da adição de IL- 4. Resultados são mostrados na figura 5, painel superior ("não transfectada"). Em um conjunto adicional de experimentos, um protocolo similar foi realizado, exceto que as moléculas experimentais ou controles foram incubadas naturalmente com a linhagem celular reportadora por 15 minutos, 30 minutos, 1 hora ou 2 horas antes da adição de 50 pM IL-4. Resultados são mostrados na figura 6.

[0083] Os resultados sumarizados nas figuras 5 e 6 mostram que a molécula multiespecífica de anti-IL-4R/anti-CD63 é capaz de inibir sinalização mediada por IL-4, e que este efeito inibitório é aumentado com maiores tempos de incubação. Como com o conjunto inicial de experimentos, confirmou-se usando CD63 RNAsi que o efeito inibitório da molécula multiespecífica de anti-IL-4R/anti-CD63 dependeu de expressão de CD63 (Figura 5 painel inferior ["CD63 RNAsi"]).

[0084] Resumidamente, este exemplo fornece adicionalmente prova de conceito para a inibição de uma atividade da molécula alvo através do uso de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica, que é capaz de ligar simultaneamente tanto a molécula alvo (neste caso IL-4R) quanto uma proteína efetora internalizante (neste caso CD63) para causar por meio disso o redirecionamento de internalização e degradação da molécula alvo em uma célula. Diferentemente estabelecido, a ligação simultânea de IL-4R e CD63 pela molécula de ligação de antígeno multiespecífica exemplar atenuou a atividade de IL-4R a um grau substancialmente maior (isto é, > 10 %) do que a ligação de IL-4R pelos construtos controles sozinhos.

Exemplo 3. Um Anticorpo Biespecífico Anti-IL-4R x Anti-CD63 Atenua Atividade de IL-4R de uma Maneira Dependente de CD63

[0085] Os experimentos do exemplo 2 mostram aqui que uma molécula multiespecífica de anti-IL-4R/anti-CD63 inibe sinalização mediada por IL-4 de uma maneira dependente de CD63. Naqueles experimentos, a molécula de ligação de antígeno multiespecífica consistiu em dois anticorpos monoclonais separados (anti-IL-4R e anti-CD63) que foram conectados por meio de uma ligação biotina-estreptavidina. Para confirmar que os resultados observados com esta molécula de ligação de antígeno multiespecífica de prova de conceito são generalizáveis para outros formatos de molécula de ligação de antígeno multiespecífica, um anticorpo biespecífico verdadeiro foi construído.

[0086] Tecnologia de anticorpo biespecífico padrão foi usada para construir um anticorpo biespecífico consistindo em um primeiro braço específico para IL-4R e um segundo braço específico para CD63. O braço específico para IL-4R conteve uma cadeia pesada de anti-IL-4R pareada com uma cadeia leve específica para CD63. A cadeia leve específica para CD63 foi pareada com a cadeia pesada específica para IL-4R somente com os propósitos de conveniência de construção; no entanto, o pareamento da cadeia pesada de anti-IL-4R com a cadeia leve de anti-CD63 reteve especificidade total para IL- 4R e não exibiu ligação em CD63. O braço específico para CD63 conteve uma cadeia pesada de anti-CD63 pareada com uma cadeia leve de anti-CD63 (a mesma cadeia leve da maneira usada no braço de IL-4R). A cadeia pesada de anti-IL-4R (compreendendo SEQ ID NO:3) foi derivada do anticorpo anti-IL- 4R total da maneira usada no exemplo 2; entretanto, as cadeias leve e pesada de anti-CD63 foram derivadas do anticorpo anti-CD63 designado H5C6, obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank (University of Iowa Department of Biology, Iowa City, IA). Como com o anticorpo anti-IL-4R total usado no exemplo 2, o componente do anticorpo biespecífico anti-IL-4R usado neste exemplo exibiu atividade de bloqueio de IL-4R somente moderada por si mesmo.

[0087] Um ensaio luciferase de IL-4 foi realizado para avaliar a atividade de bloqueio do anticorpo biespecífico anti-IL-4R x anti-CD63. Resumidamente, diluições seriais de anticorpo biespecífico anti-IL-4R x anti- CD63 ou moléculas controles foram adicionadas nas células reportadoras HEK293/STAT6-luc (vide exemplo 2). Em condições normais, essas células produzem um sinal luciferase detectável quando tratadas com IL-4. Para este experimento, IL-4 10 pM foi então adicionado nas células, e a atividade de luciferase foi quantificada para cada diluição de anticorpo usada. Os controles usados neste ensaio foram: (a) falso anticorpo biespecífico que liga IL-4R com um braço e tem um não braço de anti-CD63 funcional (isto é, contendo uma cadeia pesada de anti-IL-4R e um cadeia pesada de anti-CD63, ambas pareadas com a cadeia leve de anti-IL-4R); (b) anticorpo monoespecífico anti- IL-4R; e (c) tampão (PBS) somente (sem anticorpo). Resultados são mostrados na figura 7. Conforme mostrado na figura 7, para as amostras controles usadas, atividade de luciferase permaneceu relativamente alta mesmo nas concentrações mais altas do anticorpo, enquanto que para o anticorpo biespecífico, atividade de luciferase diminuiu significativamente a medida que a concentração do anticorpo aumentou. Esses resultados confirmam que ligação simultânea de IL- 4R e CD63 por um anticorpo biespecífico causa inibição substancial de atividade de IL-4R.

Exemplo 4. Internalização de SOST Usando uma Molécula de Ligação de Antígeno Multiespecífica Que Liga Simultaneamente SOST e CD63

[0088] Neste exemplo, foi avaliada a capacidade de as moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas promoverem a internalização da molécula alvo solúvel SOST (esclerostina). Para esses experimentos, a molécula alvo foi uma proteína de fusão consistindo em uma proteína SOST de humano marcada com uma fração de pHrodo™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) e uma marca myc. A fração de pHrodo™ é um corante sensível ao pH que é virtualmente não fluorescente a pH neutro e fluorescente brilhante em um ambiente acídico tal como o endossomo. O sinal fluorescente, portanto, pode ser usado como um indicador de internalização celular da proteína de fusão SOST. As moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas para esses experimentos foram anticorpos biespecíficos com especificidade de ligação tanto para CD63 (uma proteína efetora internalizante) quanto para a proteína de fusão SOST (uma molécula alvo solúvel), conforme descrito com mais detalhes a seguir.

[0089] Os experimentos foram conduzidos da maneira a seguir: resumidamente, células HEK293 foram plaqueadas a 10.000 células/poço em placas de 96 poços revestidas com poli-D-lisina (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Depois que as células assentaram naturalmente por toda a noite, os meios foram substituídos com meios contendo anticorpo (5 μg/mL, da maneira descrita a seguir), SOST marcada com pHrodo™-myc- (5 μg/mL), heparina (10 μg/mL), e Hoechst 33342. As células foram então incubadas tanto por 3 horas no gelo quanto por 3 horas a 37 °C. Todas as células foram lavadas duas vezes antes de imageamento em PBS, e o número de pontos fluorescentes por célula, bem como a intensidade de fluorescência correspondente, foram contados para estabelecer a extensão de internalização celular de SOST marcada com pHrodo-myc-na presença dos vários construtos do anticorpo.

[0090] Os anticorpos usados neste exemplo foram da maneira a seguir: (1) anticorpo monoespecífico anti-CD63 (clone H5C6, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa Department of Biology, Iowa City, IA); (2) anticorpo anti-myc (clone 9E10, Schiweck et al., 1997, FEBS Lett. 414(1):33-38); (3) anticorpo anti-SOST (um anticorpo tendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo designadas "Ab-B" na patente US No. 7.592.429); (4) anticorpo biespecífico anti-CD63 x anti-myc (isto é, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica compreendendo um braço de anti-CD63 derivado do anticorpo H5C6 e um braço de anti-myc derivado de 9E10); (5) anticorpo biespecífico anti-CD63 x anti-SOST #1 (isto é, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica compreendendo um braço de anti-CD63 derivado do anticorpo H5C6 e um braço de anti-SOST derivado de "Ab-B"); e (6) anticorpo biespecífico anti-CD63 x anti-SOST #2 (isto é, uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica compreendendo um braço de anti-CD63 derivado do anticorpo H5C6 e um braço de anti-SOST derivado do anticorpo designado "Ab-20" na patente US No. 7.592.429). Os anticorpos biespecíficos usados nesses experimentos foram montados usando a assim chamada metodologia “saliências em furos” (vide, por exemplo, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621).

[0091] Resultados dos experimentos de internalização são mostrados na figura 8. A figura 8 mostra o número de pontos (vesículas marcadas) por célula, nas várias condições de tratamento testadas. Considerados juntos, os resultados desses experimentos demonstram que os construtos biespecíficos, quem ligam simultaneamente CD63 e SOST (tanto diretamente quanto por meio da marca myc), causaram a máxima quantidade de internalização de SOST refletida pela intensidade de fluorescência e número de pontos fluorescentes por célula com o tempo a 37 °C. Assim, as moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas usadas neste exemplo são capazes de direcionar efetivamente a internalização de uma molécula alvo solúvel.

Exemplo 5. Mudanças em Densidade Mineral Óssea em Camundondos Tratados com Uma Molécula de Ligação de Antígeno Multiespecífica que Liga CD63 e SOST

[0092] Uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica de anti- CD63 x anti-SOST, descrita no exemplo 4, é em seguida testada quanto a sua capacidade e aumentar densidade mineral óssea em camundongos. Cinco grupos de camundongos (cerca de 6 camundongos por grupo) são usados nesses experimentos. Os grupos de tratamento são da maneira a seguir: (I) camundongos controle negativo não tratados; (II) camundongos tratados com um anticorpo monoespecífico anti-SOST de bloqueio que é conhecido por aumentar a densidade mineral óssea por si mesmo (controle positivo); (III) camundongos tratados com um anticorpo biespecífico que liga especificamente CD63 e SOST mas não inibe atividade de SOST por si mesmo ou somente inibe ligeiramente atividade de SOST por si mesmo; (IV) camundongos tratados com um anticorpo parental anti-CD63 (isto é, um anticorpo monoespecífico contendo o mesmo domínio de ligação de antígeno de anti-CD63 do anticorpo biespecífico); e (V) camundongos tratados com um anticorpo parental anti- SOST (isto é, um anticorpo monoespecífico contendo o mesmo domínio de ligação de antígeno de anti-SOST do anticorpo biespecífico). A quantidade de anticorpo administrada nos camundongos em cada grupo é cerca de 10 a 25 mg/kg.

[0093] Espera-se que os camundongos no grupo III (tratados com um anticorpo biespecífico anti-SOST x anti-CD63) apresentem um aumento na densidade mineral óssea que é pelo menos equiparável a que é observada nos camundongos do grupo II (tratados com um anticorpo anti-SOST de bloqueio conhecido), mesmo que o componente do anticorpo biespecífico anti-SOST não apresente atividade de SOST por si mesmo (confirmado pelos camundongos no Grupo V que espera-se não apresentem um aumento na densidade mineral óssea). Acredita-se que o aumento na densidade mineral óssea que é esperado nos camundongos do grupo III seja acionado por internalização de SOST mediada por CD63, conforme observado anteriormente nos experimentos celulares do exemplo 4.

Exemplo 6. Internalização Celular de Lipopolissacarídeo (LPS) Mediada por uma Molécula de Ligação de Antígeno Multiespecífica Que Liga Simultaneamente LPS e CD63

[0094] Este Exemplo ilustra o uso de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica da invenção para direcionar a internalização de uma molécula alvo não proteína, a saber, lipopolissacarídeo (LPS). LPS é um componente da membrana externa de bactérias Gram-negativas e é conhecido por contribuir com choque séptico. Anticorpos anti-LPS foram investigados como possíveis agentes de tratamento para sepsia. Os experimentos do presente Exemplo foram designados para avaliar a capacidade de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica promover a internalização de LPS.

[0095] A molécula de ligação de antígeno multiespecífica usada neste exemplo foi um anticorpo biespecífico com um braço direcionado para LPS (alvo) e o outro braço direcionado para CD63 (proteína efetora internalizante). O braço de anti-LPS foi derivado do anticorpo conhecido como WN1 222-5. (DiPadova et al., 1993, Infection and Immunidadey 61(9):3863-3872; Muller- Loennies et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(28):25618-25627; Gomery et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci USA 109(51):20877-20882; US 5,858,728). O braço de anti-CD63 foi derivado do anticorpo H5C6 (vide exemplo 4). O anticorpo biespecífico anti-LPS x anti-CD63 (isto é, molécula de ligação de antígeno multiespecífica) foi montado usando a assim chamada metodologia “saliências em furos” (vide, por exemplo, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621).

[0096] Duas espécies de LPS foram usadas nesses experimentos: LPS de E. coli e LPS de Salmonella minnesota. Ambas as versões foram obtidas como moléculas marcadas fluorescentes (LPS marcado com ALEXA- FLUOR®-488-, Life Technologies, Carlsbad, CA).

[0097] Experimentos foram conduzidos da maneira a seguir: células HEK293 foram plaqueadas em placas de 96 poços de imageamento revestidas com PDL. Depois toda a noite, meios foram substituídos com meio fresco. LPS fluorescentemente marcado (tanto derivado de E. coli- quanto de S. minnesota) foi adicionado em meio regular. Em seguida, o anticorpo biespecífico anti-LPS x anti-CD63, ou metade dos anticorpos controles pareada com Fc simulado, foi adicionado nas amostras. Após vários tempos de incubação a 37 °C (1 hora e 3 horas) ou no gelo (3 horas), células das amostras tratadas com LPS foram processadas da maneira a seguir: lavadas - finalizadas com anticorpo anti- ALEXA-FLUOR®-488- lavadas & fixadas. O anticorpo anti-ALEXA- FLUOR®-488 finaliza fluorescência do fluoróforo não internalizado (isto é, ligado na superfície). Assim, qualquer fluorescência observada nas amostras tratadas com anticorpo de finalização é devido a LPS internalizado. O nível de fluorescência de cada amostra nos vários pontos de tempo foi medido.

[0098] A figura 9 expressa os resultados desses experimentos em termos do número de vesículas marcadas por célula. Conforme mostrado na figura 9, somente células tratadas com o anticorpo biespecífico anti-CD63 x anti-LPS demonstraram números significantes de vesículas marcadas que aumentaram com o tempo. Células tratadas com LPS marcado e os anticorpos controles não apresentaram números apreciáveis de vesículas fluorescentes, indicando que LPS foi não internalizado naquelas condições de tratamento.

[0099] Este exemplo demonstra, portanto, que um anticorpo biespecífico anti-LPS x anti-CD63 causa internalização de LPS nas células de uma maneira que exige ligação simultânea de LPS e CD63. Dessa maneira, esses resultados suportam o uso de moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas da invenção para promover internalização celular de moléculas alvos tal como LPS, para o tratamento de doenças e distúrbios tal como sepsia.

[00100] A presente invenção não deve ser limitada ao escopo pelas modalidades específicas descritas aqui. Certamente, várias modificações da invenção além daquelas descritas aqui ficarão aparentes aos versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras em anexo. Tais modificações devem cair no escopo das reivindicações anexas.

Claims (7)

1. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno (D1) e um segundo domínio de ligação ao antígeno (D2), em que: D1 liga-se especificamente a uma molécula alvo (T) em que T é uma proteína ou polipeptídeo associado a um tumor expresso preferencialmente na superfície de uma célula tumoral; D2 se liga a uma proteína efetora de internalização (E) que é expressa na superfície de células tumorais e não tumorais, e E sofre internalização celular e é processada por meio de uma via degradativa intracelular; D2 se liga a E com baixa afinidade, de modo que a molécula de ligação ao antígeno multiespecífica tenha como alvo preferencial as células tumorais que expressam T e a ligação simultânea da molécula de ligação ao antígeno multiespecífica a T e E resulta na internalização forçada e degradação de T nas células tumorais através de sua ligação física com E; e E é receptor de transferrina, ASGR1 ou proteína precursora de amilóide semelhante à proteína 2 (APLP2).

2. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é conjugada a um fármaco, toxina ou radioisótopo.

3. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que T é selecionado do grupo que consiste em: IL-4R, IL-6R, PRLR, HLA-B27, AFP, ALK, proteínas BAGE, β-catenina, brc abl, BRCA1, BORIS, CA9, anidrase carbônica IX, caspase-8, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EphA2, Fra- 1, FOLR1, proteínas GAGE (por exemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano- 3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3 , hTERT,LMP2, proteínas MAGE (por exemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 e -12), MART- 1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART 3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinase e uroplaquina-3.

4. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: (a) D1 e/ou D2 exibem ligação dependente de pH ao seu antígeno; (b) D1 e/ou D2 compreendem pelo menos uma região variável de anticorpo; (c) D1 é derivado de uma molécula de ligação ao antígeno que se liga, mas não inativa substancialmente T por conta própria; ou (d) D1 compreende um ligante, ou porção de um ligante, que se liga especificamente a T.

5. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, de acordo com a reivindicação 4(a), caracterizada pelo fato de D1 se ligar a T com menor afinidade em pH ácido em comparação com pH neutro; e/ou em que D2 se liga a E com menor afinidade em pH ácido em comparação com pH neutro.

6. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, de acordo com a reivindicação 4(b), caracterizada pelo fato de que D1 e/ou D2 compreendem uma região variável de cadeia pesada (HCVR) e uma região variável de cadeia leve (LCVR), preferencialmente em que a molécula de ligação ao antígeno multiespecífica é um anticorpo biespecífico.

7. Molécula de ligação ao antígeno multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que D2 interage com E com um KD de 10 nM a 1 μM conforme medido em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície a 25°C.