BR122020012978B1 - Método de quantificação de um produto específico em uma reação de amplificação por corte e extensão (near) - Google Patents

Abstract

A presente invenção apresenta composições e métodos para detecção por quantificação de um oligonucleotídeo- alvo em uma amostra em tempo real. Estes métodos são compatíveis com oligonucleotídeos-alvo amplificados usando uma reação NEAR.

Description

[0001] Dividido do BR112013004044-0, depositado em 09.08.2011.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0002] O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No 61/373.695, depositado em 13 de Agosto de 2010, a totalidade do conteúdo é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é uma técnica usada para amplificar DNA. Tipicamente, PCR envolve ciclos térmicos, os quais consistem em ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento da reação para fusão de DNA e replicação enzimática do DNA, usando DNA polimerase, a qual se estende a partir de iniciadores que se ligam à sequências complementares do DNA-alvo. PCR Quantitativa em Tempo Real (Real-Time Quantitative PCR - qPCR) é uma técnica que é comumente usada para quantificar o número de cópias de uma determinada sequência de ácido nucleico em uma amostra biológica. Atualmente, qPCR usa a detecção dos produtos de reação em tempo real durante a reação e compara o perfil de amplificação com a amplificação dos controles os quais contêm uma quantidade conhecida de ácidos nucleicos no início de cada reação (ou uma proporção relativa conhecida de ácidos nucleicos para o ácido nucleico desconhecido testado). Os resultados dos controles são usados para construir curvas padrão, para as quais uma linha limítrofe é esboçada através da porção logarítmica das curvas padrão. A linha limítrofe é, então, usada para interpolar a quantidade das amostras desconhecidas com base em onde sua curva de amplificação cruza a linha limítrofe que foi esboçada a partir das quantidades de controle padrão.

[0004] Amplificação NEAR tem similaridades com termociclagem em PCR. Como em PCR, amplificação NEAR emprega sequências de oligonucleotídeos que são complementares a uma sequência alvo. Além disso, amplificação NEAR de sequências-alvo resulta em um aumento logarítmico na sequência alvo, tal como em PCR padrão. Ao contrário de PCR padrão, a reação NEAR progride isotermicamente. Em PCR padrão, a temperatura é aumentada para permitir que as duas fitas de DNA se separem. Em uma reação NEAR, a sequência de ácido nucleico alvo é cortada em sítios de corte específicos presentes em uma amostra teste. A polimerase infiltra no sítio de corte e começa a síntese de fita complementar da sequência de nucleotídeo alvo cortada (o DNA exógeno adicionado), juntamente com o deslocamento da fita de DNA complementar existente. O processo de replicação por deslocamento de fita evita a necessidade de uma temperatura aumentada. Neste ponto, moléculas padrão se anelam à sequência complementar deslocada a partir do DNA exógeno adicionado. A polimerase agora se estende a partir da extremidade 3' do padrão, criando uma fita complementar à fita previamente deslocada. O segundo oligonucleotídeo padrão, então, hibridiza com a fita complementar sintetizada de novo e se estende, fazendo uma dupla de DNA a qual inclui a sequência de reconhecimento da enzima de corte. Esta fita é, então, passível de ser cortada com a subsequente extensão por deslocamento de fita pela polimerase, a qual leva à produção de uma dupla de DNA a qual tem sítios de corte sobre ambos os lados do DNA- alvo original. Uma vez que esta é sintetizada, a molécula pode continuar a ser amplificada exponencialmente mediante replicação das fitas deslocadas com novas moléculas padrão. Além disso, amplificação também se processa linearmente a partir de cada molécula resultante mediante a ação repetida da síntese de tradução por corte no padrão com novos sítios introduzidos.

[0005] O resultado é um aumento muito rápido na amplificação de sinal-alvo; muito mais rápido do que termociclagem em PCR, com resultados de amplificação em menos de dez minutos. Quantificação tem sido problemática. Iniciadores para NEAR são separados por uma região de nucleotídeos a qual é muito curta para conceber uma sonda de detecção. Métodos de detecção que funcionam para PCR Quantitativa em Tempo Real não são aplicáveis à NEAR porque as moléculas de detecção (ou seja, beacons moleculares) serão complementares a um dos oligonucleotídeos de iniciador/molde em virtude da curta separação dos oligonucleotídeos de iniciadores/NEAR. Como tal, as moléculas de detecção serão amplificadas de forma tão eficiente quanto o DNA-alvo.

[0006] Atualmente, a reação NEAR é usada como uma reação de endpoint que fornece uma resposta muito rápida, mas não quantitativa, quanto à presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeos-alvo. Em virtude da elevada taxa de reação, é difícil obter uma resposta quantitativa ao interromper a reação a qualquer ponto de tempo ou um conjunto de pontos de tempo definido. Seria desejável se um resultado quantitativo pudesse ser fornecido por meio de monitoramento do progresso da reação em tempo real.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Conforme descrito abaixo, a presente invenção apresenta composições e métodos para detecção de um oligonucleotídeo alvo em uma amostra em tempo real, permitindo a quantificação do oligonucleotídeo alvo na amostra. Estes métodos são compatíveis com oligonucleotídeos-alvo amplificados usando uma reação NEAR.

[0008] Em um aspecto, a invenção proporciona uma sonda de polinucleotídeo detectável não amplificável, a sonda contendo pelo menos cerca de 10 nucleotídeos que são complementares a uma sequência alvo, uma porção detectável e uma molécula de interrupção de polimerase. Em uma modalidade, a molécula de interrupção de polimerase impede que uma polimerase amplifique a sonda sob condições que, de outro modo, sustentam atividade de polimerase ou não sustentam extensão de polimerase. Em outra modalidade, a molécula de interrupção de polimerase é um aduto de polinucleotídeo, um espaçador C-3, timidina glicol ou uma substituição de base. Em ainda outra modalidade, a molécula de interrupção de polimerase é uma substituição de base que mantém o espaçamento de hibridização apropriado com uma molécula de polinucleotídeo complementar. Em ainda outra modalidade, a porção detectável é um fluoróforo. Em ainda outra modalidade, a sonda contém ainda uma molécula sequestrante separada do fluoróforo por pelo menos cerca de 10-25 bases. Em ainda outra modalidade, a sequência alvo é fita dupla ou fita simples. Em uma outra modalidade, a porção da sonda complementar à sequência alvo compreende um ou mais nucleotídeos modificados. Em uma outra modalidade, os nucleotídeos modificados são ácidos nucleicos bloqueados (Locked Nucleic Acids - LNA), 2' fluoro amiditas ou 2'OMe RNA amiditas. Em uma outra modalidade, a(s) base(s) modificada(s) aumenta(m) a afinidade de ligação à sequência alvo.

[0009] Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um método para monitoramento da produção de um produto específico de uma reação de amplificação por corte e extensão, o método envolvendo detecção de uma sonda de detecção não amplificável, a qual permite a quantificação de um produto específico.

[00010] Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um método de quantificação de um produto específico em uma reação de amplificação por corte e extensão, o método envolvendo contato de um molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte e a não sonda de polinucleotídeo detectável não amplificável do aspecto acima; geração de amplicons que contêm pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico alvo; e detecção de um sinal específico para hibridização da sonda de oligonucleotídeo à molécula de ácido nucleico alvo ou amplicon da mesma, onde o sinal indica que quantidade da molécula de ácido nucleico alvo presente na amostra ou um amplicon da mesma. Em uma modalidade, a etapa de detecção não detecta um amplicon de uma molécula não-alvo. Em outra modalidade, o método é realizado em tempo real. Em outra modalidade, o método constitui um método semi-quantitativo e/ou de quantidade limítrofe para determinação da quantidade de molécula de ácido nucleico presente em uma amostra biológica antes de amplificação. Em ainda outra modalidade, o método envolve ainda o uso de um modificador de taxa de amplificação para proporcionar maior decomposição de produtos de reação resultantes de diferentes quantidades de material de iniciação-alvo.

[00011] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para detecção de uma pluralidade de diferentes produtos de reação produzidos no curso de uma reação simples, o método envolvendo contato de uma molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte e a sonda de polinucleotídeo detectável não amplificável do aspecto acima; geração de amplicons contendo pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico alvo; e detecção de um sinal específico para hibridização da sonda de oligonucleotídeos à molécula de ácido nucleico alvo ou amplicon da mesma, onde o sinal indica a quantidade da molécula de ácido nucleico alvo presente na amostra ou um amplicon da mesma.

[00012] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para a quantificação de um produto específico de uma reação de amplificação por corte e extensão, o método envolvendo contato de um molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte e a sonda de oligonucleotídeos detectável do aspecto acima; geração de produtos específicos que contêm pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico alvo; e detecção de um sinal indicativo de hibridização da sonda de oligonucleotídeos aos produtos específicos, deste modo, quantificando os produtos específicos. Em uma modalidade, a etapa (c) é realizada em tempo real para determinar a quantidade de-alvo presente na reação.

[00013] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para monitoramento, em tempo real, de uma reação de amplificação por corte e extensão, o método envolvendo contato da amostra teste com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte e a sonda de oligonucleotídeo detectável do aspecto acima sob condições substancialmente isotérmicas; geração de amplicons contendo pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico alvo; e detecção de um sinal em tempo real, deste modo, permitindo a quantificação da(s) molécula(s) de ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, a amostra teste compreende um patógeno. Em uma outra modalidade, o patógeno é um vírus, bactéria, levedura ou fungo. Em outra modalidade, a amostra teste é uma amostra biológica. Em uma outra modalidade, a amostra biológica é uma amostra de fluido biológico, célula ou tecido. Em outra modalidade, o fluido biológico é urina, sêmen, secreções vaginais ou fezes. Em uma outra modalidade, a amostra teste é uma amostra ambiental. Em outra modalidade, a etapa (c) é realizada em tempo real.

[00014] Em outro aspecto, a invenção proporciona um oligonucleotídeo iniciador/molde detectável que contém uma molécula de ácido nucleico tendo uma região da haste fita dupla e uma região de alça fita simples, em que pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico é capaz de hibridizar com uma molécula de ácido nucleico alvo; um sítio de corte a montante da porção capaz de hibridizar com a molécula de ácido nucleico alvo; uma sítio de corte de RNA confiável dentro da extremidade 5' da região de hibridização-alvo que consiste em pelo menos cerca de 3-10 bases de RNA, das quais algumas podem ser resistentes à atividade de RNase e as quais são passíveis de atividade de RNase apenas quando presentes em uma heterodupla com uma molécula-alvo, uma molécula de capping na extremidade 3' da molécula de ácido nucleico a qual não permite extensão com polimerase; e uma porção detectável. Em uma modalidade, a molécula de capping é um espaçador C3. Em uma outra modalidade, o oligonucleotídeo contém também uma porção sequestrante. Em uma outra modalidade, o fluoróforo e o sequestrante estão separados por pelo menos cerca de 10-25 bases. Em uma outra modalidade, o fluoróforo e o sequestrante estão separados por não mais do que cerca de 4 bases e estão localizados sobre lados diferentes do sítio de corte. Em uma outra modalidade, o sítio de corte de RNA dentro da extremidade 5' da região de hibridização-alvo pode incluir 2'OMe RNA amiditas ou outras porções resistentes à RNase. Em outra modalidade, a região complementar compreende uma ou mais bases modificadas que têm afinidade de ligação aumentada por um nucleotídeo complementar.

[00015] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para monitoramento, em tempo real, de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma reação NEAR, o qual compreende contato de uma molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte, uma enzima de corte de heterodupla específica e um sonda de oligonucleotídeo detectável; geração de amplicons contendo uma sequência alvo que se liga à sonda de oligonucleotídeo detectável; e detecção de um sinal em tempo real, deste modo, quantificando a molécula de ácido nucleico alvo.

[00016] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para monitoramento, em tempo real, de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma amostra teste, o método envolvendo contato de um molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte, uma enzima de reparo ou enzima de leitura de prova e uma sonda de oligonucleotídeo detectável; geração de amplicons contendo uma sequência alvo que se liga à sonda de oligonucleotídeo detectável; e detecção de um sinal em tempo real, deste modo, quantificando a molécula de ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, a amostra teste compreende uma levedura (por exemplo, um vírus, bactéria, fungo ou patógeno). Em uma outra modalidade, a amostra teste é uma amostra biológica. Em uma outra modalidade, a amostra biológica é uma amostra de fluido biológico, célula ou tecido. Em uma outra modalidade, o fluido biológico é urina, sêmen, secreções vaginais ou fezes. Em outra modalidade, a amostra teste é uma amostra ambiental. Em outra modalidade, a etapa (c) é realizada em tempo real.

[00017] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma sonda de oligonucleotídeo de circularização detectável, onde uma porção da extremidade 5' da sonda de oligonucleotídeo é complementar a uma porção da extremidade 5' da molécula de ácido nucleico alvo e compreende uma porção fluorescente; a extremidade 3' da sonda de oligonucleotídeo é complementar a uma porção da extremidade 3' da molécula de ácido nucleico alvo e inclui uma porção sequestrante; as sequências complementares nas extremidades 5' e 3' da molécula são separadas por uma sequência ligante; e a sonda circulariza para manter suas extremidade 5' e 3' em aposição quando ligada a uma molécula de ácido nucleico alvo, deste modo, permitindo a emissão de um sinal detectável. Em uma modalidade, a sequência ligante é de um comprimento suficiente para permitir circularização.

[00018] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de detecção da presença e/ou quantidade de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma amostra, o método compreendendo contato de uma molécula de ácido nucleico alvo com a sonda de oligonucleotídeo de circularização detectável do aspecto acima; e detecção da ligação da sonda a uma molécula de ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, detecção de transferência de energia de ressonância de fluorescência (Fluorescent Resonant Energy Transfer - FRET) indica a ligação da sonda a uma sequência alvo. Em outra modalidade, a ausência de FRET indica que uma molécula de ácido nucleico alvo não está presente na amostra.

[00019] Em outro aspecto, a invenção proporciona um kit para quantificação de uma sequência alvo em uma reação NEAR, o kit contendo a sonda de oligonucleotídeo detectável do aspecto acima e instruções para uso da sonda em métodos da invenção.

[00020] Em outro aspecto, a invenção proporciona um kit para detecção de uma sequência alvo em uma reação NEAR, o kit contendo o oligonucleotídeo de iniciador/molde do aspecto acima e instruções para uso do oligonucleotídeo de iniciador/molde em métodos da invenção.

[00021] Em outro aspecto, a invenção proporciona um kit para detecção de uma sequência alvo em uma amostra, o kit contendo a sonda de oligonucleotídeo de circularização detectável do aspecto acima e instruções para uso da sonda em métodos da invenção.

[00022] A invenção proporciona composições e métodos para a detecção de uma molécula de ácido nucleico alvo amplificada usando uma reação NEAR. Composições e artigos definidos pela invenção foram isolados ou de outro modo fabricados com relação aos exemplos fornecidos abaixo. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações. Definições

[00023] Na presente descrição, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e similares podem ter o significado que lhes é atribuído na Lei de Patentes dos Estados Unidos da América e pode significar "inclui", "incluindo" e similares; "que consiste essencialmente em" ou "que consiste essencialmente" também tem o significado atribuído na Lei de Patentes dos Estados Unidos da América e o termo é aberto, permitindo a presença de mais de um daquilo que é mencionado, contanto que características básicas ou novas daquilo que é mencionado não sejam alteradas pela presença de mais de um daquilo que é mencionado, mas exclui modalidades da técnica anterior.

[00024] Por "não amplificável" entenda-se resistente à replicação. De preferência, uma sequência de polinucleotídeo que é não amplificável não pode ser reproduzida em um nível detectável. Em uma outra modalidade, uma sequência de polinucleotídeo que não é amplificável é reproduzida em um nível significativamente reduzido em relação a um polinucleotídeo de referência.

[00025] Por "molécula de interrupção de polimerase" entenda-se uma porção associada a um polinucleotídeo padrão que impede ou reduz significativamente a progressão de uma polimerase sobre o polinucleotídeo padrão. De preferência, a porção está incorporada no polinucleotídeo. Em uma modalidade preferida, a porção impede a polimerase de progredir sobre o padrão.

[00026] Por "extensão de polimerase" entenda-se a progressão de uma polimerase que corresponde a monômeros de entrada a seus parceiros de ligação sobre um polinucleotídeo padrão.

[00027] Por "aduto de nucleotídeo" entenda-se uma porção que é ligada covalentemente ou de outra forma fixada a uma base de nucleotídeo padrão.

[00028] Por "substituição de base" entenda-se um substituinte de um polímero de nucleobase que não causa alterações significativas da hibridização entre fitas de nucleotídeo complementares.

[00029] Por "produto específico" entenda-se um produto de polinucleotídeo resultante da hibridização de oligonucleotídeos padrão a uma sequência alvo complementar e subsequente extensão mediada por polimerase da sequência alvo.

[00030] Por "reação de amplificação por corte e extensão" entenda- se ciclos alternados de corte e extensão que levam à amplificação de um polinucleotídeo de interesse.

[00031] Por "estado substancialmente isotérmico" entenda-se a uma única temperatura ou dentro de uma faixa limitada de temperaturas que não variam significativamente. Em uma modalidade, uma reação realizada em condições substancialmente isotérmicas é realizada em uma temperatura que varia em apenas cerca de 1-5 °C (por exemplo, varia em 1, 2, 3, 4 ou 5 graus). Em uma outra modalidade, a reação é realizada em uma temperatura única dentro dos parâmetros de operação do instrumento usado.

[00032] Por "enzima de corte" entenda-se um polipeptídeo capaz de reconhecimento de moléculas de ácido nucleico fita dupla e que rompe as ligações covalentes entre nucleotídeos contíguos de uma fita simples.

[00033] Por "amplicon" entenda-se um polinucleotídeo gerado durante a amplificação de um polinucleotídeo de interesse. Em um exemplo, um amplicon é gerado durante a reação em cadeia da polimerase.

[00034] Por "semi-quantitativa" entenda-se fornecendo uma estimativa da quantidade relativa com base em um controle interno.

[00035] Por "método de quantidade limítrofe" entenda-se fornecendo uma estimativa da quantidade com base em exceder ou não exceder, em quantidade, um padrão comparativo.

[00036] Por "modificadores de taxa de amplificação" entenda-se um agente capaz de afetar a taxa de extensão de polimerase.

[00037] Por "monitoramento de uma reação" entenda-se detecção do progresso de uma reação. Em uma modalidade, monitoramento de progressão de reação envolve detecção de extensão de polimerase e/ou detecção de uma reação NEAR.

[00038] "Detecção" refere-se à identificação da presença, ausência ou quantidade do analito a ser detectado.

[00039] Por "porção detectável" entenda-se uma composição que, quando ligada a uma molécula de interesse, torna a última detectável, via meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos ou químicos. Por exemplo, marcadores úteis incluem isótopos radioativos, glóbulos magnéticos, glóbulos metálicos, partículas coloidais, corantes fluorescentes, reagentes densos em elétrons, enzimas (por exemplo, conforme comumente usado em um ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos.

[00040] Por "fragmento" entenda-se uma porção de uma molécula de ácido nucleico. Esta porção contém, de preferência, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de todo o comprimento da molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo de referência. Um fragmento pode conter 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucleotídeos.

[00041] "Hibridização" significa ligação de hidrogênio, a qual pode ser ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertida, entre nucleobases complementares. Por exemplo, adenina e timina são nucleobases complementares que emparelham mediante a formação de ligações de hidrogênio.

[00042] Por "polinucleotídeo isolado" entenda-se um ácido nucleico (por exemplo, um DNA) que está livre dos genes os quais, no genoma de ocorrência natural do organismo do qual a molécula de ácido nucleico da invenção é derivada, flanqueia o gene. O termo inclui, portanto, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor; em um plasmídeo de replicação autônoma ou vírus; ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota; ou que existe como uma molécula distinta (por exemplo, um cDNA ou um fragmento genômico ou cDNA produzido por meio de PCR ou digestão com endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Além disso, o termo inclui uma molécula de RNA que é transcrita a partir de uma molécula de DNA, bem como um DNA recombinante que é parte de um gene híbrido que codifica uma sequência polipeptídica adicional.

[00043] Conforme aqui usado, "obtenção", conforme em "obtenção de um agente", inclui síntese, compra ou de outro modo aquisição do agente.

[00044] Por "referência" entenda-se uma condição padrão ou de controle.

[00045] Por "hibridizar" entenda-se emparelhar para formar uma molécula fita dupla entre sequências de polinucleotídeo complementares (por exemplo, um gene aqui descrito) ou porções das mesmas, sob várias condições de estringência. (Vide, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507).

[00046] Por "indivíduo" entenda-se um mamífero incluindo, porém sem limitações, um mamífero humano ou não humano, tal como um bovino, equino, canino, ovino ou felino.

[00047] Por "molécula de ácido nucleico alvo" entenda-se um polinucleotídeo a ser analisado. Tal polinucleotídeo pode ser uma fita senso ou antissenso da sequência alvo. O termo "molécula de ácido nucleico alvo" refere-se também a amplicons da sequência alvo original.

[00048] As faixas fornecidas aqui deverão ser entendidas como sendo abreviadas para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, uma faixa de 1 a 50 deve ser entendido como incluindo qualquer número, combinação de números ou sub-faixa a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50.

[00049] A menos que especificamente indicado ou evidente a partir do contexto, conforme usado aqui, o termo "ou" deve ser entendido como sendo inclusivo. A menos que especificamente indicado ou evidente a partir do contexto, conforme usado aqui, os termos "uma", "um", "a" e "o" devem ser entendidos como sendo o singular ou plural.

[00050] A menos que especificamente indicado ou evidente a partir do contexto, conforme usado aqui, o termo "cerca de" deve ser entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrões da média. Cerca de pode ser entendido como menos de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado. A menos que de outro modo evidente a partir do contexto, todos os valores numéricos fornecidos aqui são modificados pelo termo cerca de.

[00051] A citação de uma lista de grupos químicos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições da variável como qualquer grupo único ou a combinação de grupos listados. A citação de uma modalidade para uma variável ou aspecto aqui inclui a modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou partes das mesmas.

[00052] Quaisquer composições ou métodos fornecidos aqui podem ser combinados com uma ou mais de qualquer uma das outras composições e métodos aqui fornecidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00053] A Figura 1A é um diagrama esquemático que ilustra padrão, sondas e produto na Reação NEAR em Tempo Real e padrão. Azul indica sequência de reconhecimento de enzima de corte, verde é sequência de reconhecimento alvo molde direto, roxo é sequência de reconhecimento alvo molde reversa, vermelho são bases na sequência alvo não incluídas nos moldes, estrela vermelha é o espaçador com três carbonos (C3) na sonda de detecção. A Figura 1B é um esquema que mostra que uma sonda de detecção padrão (Standard Detection Probe - SDP) pode atuar como um DNA-alvo se adicionada à reação NEAR no início da reação, portanto, nenhum controle padrão (NTC) produzirá produto específico na presença de sonda de detecção padrão e criará sinais falso positivos. Trev se liga à sonda de detecção padrão, polimerase estende, Tfor pode se ligar à fita recém-sintetizada, polimerase estende, Trev se liga à fita Tfor, polimerase estende, mais corte e amplificação ocorre. Produto específico (Specific Produce - SP) é produzido sem que DNA genômico esteja presente. Para tornar a NEAR um ensaio em tempo real, a sonda de detecção impede que a polimerase estenda, deste modo, assegurando que nenhum controle padrão será negativo e apenas as reações-alvo positivas continuarão via a reação NEAR, produzindo um produto específico (Specific Produce - SP). Na Figura 1, o termo Trev denota iniciador/molde inverso; Tfor denota iniciador/molde direto; SP denota produto específico; DP denota sonda de detecção; Pol denota polimerase; NE denota enzima de corte.

[00054] As Figuras 2A-2C são gráficos que mostram os resultados de uma reação em tempo real usando um beacon de detecção padrão (Figura 1A) versus um beacon modificado (Figura 1B). O beacon modificado mostrou uma separação do alvo que contém amostras de amostras de Controle Sem-alvo (No Target Control - NTC). Curvas de fusão de reações em tempo real (Figura 1C) que contêm o beacon modificado com alvo específico (linhas azuis); DNA estranho com sonda de detecção adicionada à reação e pós-reação (linhas douradas e amarelas, respectivamente) e controles NTC com sonda de detecção adicionada na reação e pós-reação são mostradas (linhas vermelhas e rosas, respectivamente).

[00055] As Figuras 3 A e 3B são gráficos que mostram uma reação em tempo real de Cms titulado em DNA de base Cmm de não- amplificação como diluições de 2 e 10 vezes (Figuras 2A & B, respectivamente). A reação foi realizada a 56 graus sobre um ESE Reader com intervalo de leitura de 20 segundos. Amplificação de DNA- alvo específico (Cms) forneceu uma separação detectável de controles não amplificados dentro de 2 minutos (Figura 2A). Cms e Cmm denotam espécies de bactérias Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, respectivamente. O termo postRX refere-se à pós-reação.

[00056] As Figuras 4A e 4B são gráficos que mostram uma reação em tempo real com padrões que contêm uma porção de interrupção de polimerase (espaçador C-3) e padrões padrão. Todas as reações foram realizadas com uma molécula de detecção amplificável padrão na reação. O espaçador C-3 estava localizado 5' aos nucleotídeos alvo complementares para evitar interferência com a ligação ao alvo. Amplificação estava presente em ambas as cavidades com alvo específico e NTC de padrões padrão. Em contraste, todas as cavidades que contêm a porção de interrupção de polimerase (espaçador C-3) dentro do padrão não suportam amplificação.

[00057] As Figuras 5A e 5B são gráficos que mostram a amplificação do RNA-alvo via Transcrição Reversa (Reverse Transcription - RT) NEAR em Tempo Real.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00058] A invenção apresenta composições e métodos que são úteis para quantificação de uma molécula de ácido nucleico alvo. Em modalidades particulares, a invenção fornece composições e métodos para quantificação de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma reação NEAR (por exemplo, em tempo real).

[00059] A reação NEAR tem sido usada como uma reação de endpoint que fornece a detecção não quantitativa de oligonucleotídeos alvo. O ensaio NEAR convencional compreende (1) uma molécula de ácido nucleico alvo; (2) duas moléculas de oligonucleotídeo padrão (similares, mas não devem ser confundidas com as moléculas de iniciadores de PCR) compreendendo um certo número de oligonucleotídeos que são complementares à molécula de ácido nucleico alvo e um sítio que pode ser clivado por uma enzima de corte; (3) dNTPs; (4) uma polimerase de deslocamento de fita; e (5) uma enzima de corte. Métodos atuais para quantificação da reação NEAR, particularmente em tempo real, são inadequados devido, em parte, à amplificação ilegítima de moléculas não-alvo presentes em uma amostra, a qual pode obscurecer a detecção de amplicons alvo em uma reação NEAR convencional. Por exemplo, há uma amplificação indesejável consistente em reações NEAR que incluem sondas de detecção convencionais, resultando em um sinal detectável na ausência de alvo ou sinais que não refletem com precisão a quantidade de alvo presente na molécula de ácido nucleico na reação. Atualmente, a única maneira de superar o problema de amplificação da molécula de detecção é a introdução de uma sonda de detecção após a conclusão da reação NEAR. Embora isto proporcione a detecção de um produto endpoint, falha em proporcionar monitoramento em tempo real da reação.

[00060] A presente invenção proporciona sondas de oligonucleotídeo detectáveis que superam o problema de quantificação precisa de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma reação NEAR. Isto é particularmente útil para quantificação de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma reação NEAR em tempo real. A invenção se baseia, pelo menos em parte, na descoberta de que sondas de oligonucleotídeo detectáveis conferem uma redução ou eliminação de amplificação ilegítima. As sondas de oligonucleotídeos detectáveis da invenção são úteis para em reações NEAR que compreendem um ou mais dos componentes NEAR acima mencionados.

[00061] Em uma modalidade, a reação NEAR utiliza uma sonda de polinucleotídeo detectável não amplificável a qual não é anormalmente amplificada no curso de uma reação NEAR. Para reduzir ou evitar amplificação anormal ou de outro modo aumentar a precisão de quantificação, uma sonda de oligonucleotídeo detectável da presente invenção pode incluir uma ou mais moléculas de bloqueio/interrupção de polimerase (por exemplo, C3-espaçador, O-2-Me RNAs, timidina glicol, AP-dC). As moléculas de bloqueio de polimerase a serem usadas em conjunto com molécula(s) de emparelhamento de base de nucleotídeo modificada(s) (por exemplo, ácidos nucleicos bloqueados (locked nucleic acids - LNAs), derivados C-5 propino, nucleosídeos de C-5 metil pirimidina, 1-[5'-O-(4,4'-Dimetóxitritil)-D-2'-deoxiribofuranosil]- 9-(2-trifluoroacetamidoetóxi)-1,3-diaza-2-oxofenoxazina-3'-[(2- cianoetil)-(N,N-diisopropil)] (AP-dC) e 2,6-diaminopurina- 2'deoxiribosídeo, dentre outros) que intensificam a ligação a um nucleotídeo alvo.

[00062] Onde uma porção detectável é integrada em um oligonucleotídeo de iniciador/molde, a molécula de interrupção de polimerase (por exemplo, C3-espaçador, timidina glicol) será sintetizada sobre a extremidade 3' do oligonucleotídeo de iniciador/molde para evitar ou reduzir a formação de homodímeros e heterodímeros de oligonucleotídeo de iniciador/molde, bem como extensão anormal de sequências complementares parciais em sequências de ácido nucleico alvo, os oligonucleotídeos de iniciador/molde detectáveis da invenção impedem ou reduzem a detecção de hetero e homodímeros, bem como produtos de base estranhos que interferem com a detecção de sequências de ácido nucleico alvo amplificadas. Isto permitirá a detecção de produtos de reação com "corantes" de ácido nucleico fita simples e dupla, em vez de pares de fluoróforo/sequestrante em algumas modalidades da invenção.

Moléculas de Ácido Nucleico alvo

[00063] Métodos e composições da invenção são úteis para a identificação de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma amostra teste. As sequências alvo são amplificadas a partir de virtualmente qualquer amostra que compreende uma molécula de ácido nucleico alvo incluindo, porém sem limitações, amostras contendo fungos, esporos, vírus ou células (por exemplo, procariotas, eucariotas). Em modalidades específicas, composições e métodos da presente invenção detectam Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pseudomonas syringae pv Tomato, Xanthomonas campestris pv vesicatoria, Alternaria spp, Cladosporium spp, Fusarium oxysporum, Verticilium dahlia, Pseudomonas currugata, Erwina carotovora e Ralstonia solanacearum. Amostras de teste exemplificativos incluem fluidos corporais (por exemplo, sangue, soro, plasma, fluido amniótico, saliva, urina, fluido cérebro-espinhal, linfa, fluido lacrimal, fezes ou fluido gástrico), extratos teciduais, meio de cultura (por exemplo, um líquido no qual uma célula, tal como uma célula de patógeno, tenha sido cultivada), amostras ambientais, produtos agrícolas ou outros gêneros alimentícios e seus extratos, marcadores de identificação de DNA. Se desejado, a amostra pode ser purificada antes de sua inclusão em uma reação NEAR usando qualquer método padrão normalmente usado para o isolamento de uma molécula de ácido nucleico de uma amostra biológica.

[00064] Em uma modalidade, uma sonda de polinucleotídeo não amplificável detectável da invenção detecta a presença de um patógeno em uma amostra. Patógenos exemplificativos incluem fungos, bactérias, vírus e leveduras. Tais patógenos podem ser detectados mediante identificação de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína do patógeno, tal como uma toxina, em uma amostra teste. Toxinas exemplificativas incluem, porém sem limitações, aflatoxina, toxina do cólera, toxina de difteria, toxina de Salmonella, toxina Shiga, toxina de Clostridium botulinum, endotoxinas e micotoxinas. Para aplicações ambientais, amostras de teste podem incluir água, extratos líquidos de filtros de ar, amostras de solo, materiais de construção (por exemplo, azulejo, telhas, ladrilhos, tecidos, papel de parede e revestimentos para pavimentos), esfregaços ambientais ou qualquer outra amostra.

[00065] Moléculas de ácido nucleico alvo incluem moléculas de ácido nucleico fita dupla e fita simples (por exemplo, DNA, RNA e outros polímeros de nucleobase conhecidos na técnica capazes de hibridizar com uma molécula de ácido nucleico descrita aqui). Moléculas de RNA adequadas para detecção com uma sonda de oligonucleotídeo detectável ou oligonucleotídeo de iniciador/molde detectável da invenção incluem, porém sem limitações, moléculas de RNA fita dupla e fita simples que compreendem uma sequência alvo (por exemplo, RNA mensageiro, RNA viral, RNA ribossômico, RNA de transferência, microRNA e precursores de microRNA e siRNAs ou outros RNAs aqui descritos ou conhecidos na técnica). Moléculas de DNA adequadas para detecção com uma sonda de oligonucleotídeo detectável ou oligonucleotídeo de iniciador/molde da invenção incluem, porém sem limitações, DNA fita dupla (por exemplo, DNA genômico, DNA de plasmídeo, DNA mitocondrial, DNA viral e DNA fita dupla sintético). Moléculas de ácido nucleico alvo de DNA fita incluem, por exemplo, DNA viral, cDNA e DNA fita simples sintético ou outros tipos de DNA conhecidos na técnica.

[00066] Em geral, uma sequência alvo para detecção tem entre 10 e 100 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 nucleotídeos). O teor de GC da molécula de ácido nucleico alvo é selecionado para ser menos do que cerca de 45, 50, 55 ou 60%.

[00067] Desejavelmente, a sequência alvo e enzimas de corte são selecionadas de tal forma que a sequência alvo não contenha sítios de corte para quaisquer enzimas de corte que serão incluídas na mistura de reação. Sondas de Oligonucleotídeo Detectáveis

[00068] A presente invenção proporciona a detecção quantitativa de moléculas de ácido nucleico alvo ou amplicons das mesmas em uma reação usando NEAR usando sondas de polinucleotídeo não amplificáveis detectáveis compreendendo pelo menos uma molécula de interrupção de polimerase (por exemplo, modificação de nucleotídeos ou outra porção que torna o oligonucleotídeo capaz de ligação a uma molécula de ácido nucleico alvo, mas incapaz de suportar extensão de padrão utilizando a sonda de oligonucleotídeo detectável como um- alvo). Sem pretender estar limitado pela teoria, a presença de uma ou mais porções as quais não permitem progressão de polimerase provavelmente causa interrupção em adições no esqueleto de não- ácido nucleico ao oligonucleotídeo ou através de perda de uma polimerase replicativa (isto é, espaçador-C3, bases de DNA danificadas, bases de O-2-Me). Estes construtos, assim, evitam ou reduzem amplificação ilegítima da sonda durante o curso de uma reação NEAR. Isto os distingue das sondas de detecção convencionais, as quais devem ser adicionadas no final da reação NEAR para impedir sua amplificação.

[00069] Sondas de detecção convencionais provaram ser impraticáveis para quantificação em uma reação NEAR em tempo real. Se sondas de detecção convencionais são incorporadas na reação NEAR, estas sondas de detecção convencionais são amplificadas concorrentemente com o-alvo. A amplificação destas moléculas de detecção mascara a detecção amplicons alvo legítimos em virtude do número de moléculas de iniciação da sonda de detecção no início da reação.

[00070] A invenção fornece sondas de polinucleotídeo não amplificáveis detectáveis que compreendem pelo menos uma molécula de interrupção de polimerase. Uma molécula de interrupção de polimerase da invenção inclui, porém sem limitações, uma modificação de nucleotídeos ou outra porção que bloqueia a extensão de padrão por DNA polimerases replicativas, deste modo, impedindo a amplificação de moléculas de detecção; mas pode permitir hibridização ou espaçamento de nucleotídeos apropriado à molécula-alvo ou cópias amplificadas da molécula-alvo. Em uma modalidade, uma sonda de oligonucleotídeo detectável da invenção compreende um espaçador com 3 carbonos (C3-espaçador) que impede ou reduz a amplificação ilegítima de uma molécula de detecção.

[00071] Em uma modalidade, a sonda de oligonucleotídeo detectável da invenção é um oligonucleotídeo em formato de grampo de cabelo que compreende uma porção detectável. Em outra modalidade, a sonda de polinucleotídeo não amplificável detectável é um oligonucleotídeo em formato de grampo de cabelo que compreende um fluoróforo em uma extremidade e um corante sequestrante sobre a extremidade oposta. A alça do grampo de cabelo compreende uma sequência que é complementar a e capaz de hibridização com uma sequência alvo. A haste do grampo de cabelo é formada por anelamento de sequências de braços complementares localizados sobre qualquer lado da alça. Um fluoróforo e uma molécula sequestrante estão covalentemente ligados em extremidades opostas de cada braço. Quando a sonda de oligonucleotídeo detectável está na configuração de grampo de cabelo, as moléculas fluorescentes e sequestrantes estão próximas umas das outras, deste modo, levando à transferência de energia de ressonância de fluorescência (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET) e sequestrante de fluorescência do fluoróforo. Quando a sonda de oligonucleotídeo detectável encontra uma molécula-alvo, hibridização ocorre, a estrutura de alça é convertida para uma conformação de dupla com a molécula-alvo, causando separação do fluoróforo e das moléculas sequestrantes, resultando em fluorescência (Tyagi et al., Nature Biotechnology 14; Março de 1996, SOS-SOS).

[00072] As sondas de oligonucleotídeo detectáveis são específicas para a sequência alvo. Em uma modalidade, uma sonda de oligonucleotídeo detectável compreende uma ou mais bases de nucleotídeos modificadas com afinidade de ligação aumentada por um nucleotídeo complementar. Exemplos de bases incluem, porém sem limitações, ácidos nucleicos bloqueados (Locked Nucleic Acids - LNA), 2' fluoro amiditas e 2'OMe RNA amiditas (também funcionando como uma molécula de interrupção de polimerase). Sondas de oligonucleotídeo detectáveis da invenção podem ser sintetizadas com diferentes fluoróforos coloridos e podem ser concebidas para hibridização com virtualmente qualquer sequência alvo. Em vista de sua notável especificidade, uma sonda de polinucleotídeo não amplificável detectável da invenção é usada para detectar uma única molécula de ácido nucleico alvo em uma amostra ou é usada em combinação com sondas de oligonucleotídeo detectáveis, cada uma das quais se liga a uma molécula de ácido nucleico alvo diferente. Consequentemente, as sondas de polinucleotídeo não amplificáveis detectáveis da invenção podem ser usadas para detectar uma ou mais moléculas de ácido nucleico alvo na mesma reação, permitindo que estes alvos sejam quantificados simultaneamente. A presente invenção abrange o uso de tais fluoróforos em conjunto com as sondas de oligonucleotídeo detectáveis descritas aqui. Uso de Sondas de Polinucleotídeo Não Amplificáveis Detectáveis

[00073] Sondas de polinucleotídeo não amplificáveis detectáveis são úteis em métodos para quantificação de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma reação de amplificação por corte e extensão (Nicking and Extension Amplification Reaction - NEAR). O método envolve contato de uma molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos de iniciador/molde, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeo alvo, uma enzima de corte e a sonda de oligonucleotídeo detectável na presença de um tampão adequado e dNTPs; geração de amplicons que compreendem pelo menos uma parte da referida molécula de ácido nucleico alvo; e determinação do nível de-alvo presente na molécula de ácido nucleico da reação através por meio de quantificação da sonda de oligonucleotídeo que hibridiza com a molécula de ácido nucleico alvo em tempo real durante a reação com base na intensidade de fluorescência das moléculas de sonda na reação. Vantajosamente, tais métodos são úteis para monitoramento de NEAR em tempo real.

[00074] Em geral, sondas de polinucleotídeo não amplificáveis detectáveis da invenção são incluídas em uma reação NEAR que compreende (1) uma molécula de ácido nucleico alvo; (2) duas moléculas de oligonucleotídeo padrão que compreendem um certo número de oligonucleotídeos que são complementares à molécula de ácido nucleico alvo e um sítio que pode ser clivado por uma enzima de corte; (3) dNTPs; (4) uma polimerase de deslocamento de fita; e (5) uma enzima de corte.

[00075] Consequentemente, a presente invenção fornece um método de uso destes componentes para quantificar uma molécula de ácido nucleico alvo.

Design Padrão

[00076] Os oligonucleotídeos padrão da invenção se assemelham aos oligonucleotídeos padrão para NEAR padrão, mas os oligonucleotídeos padrão da invenção são concebidos de tal modo que o padrão, o qual é complementar a uma parte da sonda de detecção, seja pelo menos uma base curta tendo sua base 3' final oposta àquela da porção de bloqueio de polimerase da sonda de detecção.

[00077] Em um exemplo de trabalho, pares de iniciador/molde são construídos com uma configuração de haste e alça. A extremidade 5' do oligonucleotídeo de iniciador/molde compreende uma região auto- complementar que forma pelo menos uma parte da haste. A haste abrange ainda pelo menos uma parte ou toda a sequência de reconhecimento de enzima de corte. Este sítio de reconhecimento de enzima de corte está ligado, na extremidade 3', a um sítio de estrutura livre secundário compreendendo um sítio de corte que está ligado, na extremidade 3', a uma sequência que é complementar a uma sequência alvo. Se desejado, a sequência que é complementar à sequência alvo pode compreender uma estrutura secundária ou pode estar livre de estrutura secundária. A presença ou ausência de estrutura secundária, a qual pode compreender uma região auto-complementar, será determinada para otimizar o ensaio NEAR em particular.

[00078] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção proporcionam uma reação NEAR que compreende os componentes NEAR padrões, mas também compreende uma enzima capaz de corte de um nucleotídeo de RNA quando presente em uma heterodupla com uma fita de DNA complementar. Em um exemplo, o nucleotídeo de RNA clivado estará presente em um trecho de 4-15 nucleotídeos de RNA não cliváveis (isto é, O-2-Me-RNAs) na direção da extremidade 5' da região complementar alvo do PTO e a extremidade 3' do oligonucleotídeo padrão terá uma "cap" 3' terminal. Somente quando de hibridização apropriada completa do oligonucleotídeo padrão, com a molécula de clivagem de heterodupla (isto é, RNase H) sendo capaz de clivar a base de RNA, criação de uma extremidade 3' para a enzima de tradução de corte para extensão; e permitindo que a reação NEAR progrida até conclusão. Ligação anormal de padrão (dímeros de iniciador, hibridização não-alvo parcial, etc.) não levará à formação de heterodupla de RNA-DNA e, assim, impede a progressão da reação NEAR. Estes padrões só serão amplificados após ligação a uma sequência de nucleotídeos complementar mediante remoção da extremidade 3' da "cap" de extensão de polimerase. Isto levará a um aumento do nível de especificidade e sensibilidade da reação NEAR.

[00079] Os oligonucleotídeos padrão da invenção são incluídos em uma reação NEAR que compreende (1) uma molécula de ácido nucleico alvo; (2) duas moléculas de oligonucleotídeo padrão compreendendo um certo número de oligonucleotídeos que são complementares à molécula de ácido nucleico alvo e um sítio que pode ser clivado por uma enzima de corte e composto de 4-15 nucleotídeos de RNA, um dos quais é sensível à RNase; (3) dNTPs; (4) uma polimerase de deslocamento de fita; (5) uma enzima de corte; e (6) uma enzima de corte de RNA de heterodupla de RNA-DNA e uma "cap" de extensão de polimerase 3' terminal. Consequentemente, a invenção fornece um método de uso destes componentes para quantificar uma molécula de ácido nucleico alvo.

[00080] O método envolve o contato de uma molécula de ácido nucleico alvo sob condições substancialmente isotérmicas com uma polimerase, dois oligonucleotídeos padrão, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeos-alvo, uma enzima de corte e uma enzima de corte de heterodupla de DNA-RNA (por exemplo, RNase H) com uma "cap" de extensão de polimerase 3' terminal; geração de um amplicon detectável que compreende pelo menos uma parte de um oligonucleotídeo padrão que se liga a uma sequência alvo.

Ensaios NEAR

[00081] A invenção proporciona a detecção de moléculas de ácido nucleico alvo amplificadas em um ensaio NEAR. Tais ensaios são conhecidos na técnica e descritos aqui. Vide, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. 2009/0081670, Pedido PCT 2009/012246 e Patentes U.S. N°s 7.112.423 e 7.282.328, cada um dos quais é aqui incorporado na íntegra.

[00082] Polimerases úteis nos métodos aqui descritos são capazes de catalisar a incorporação de nucleotídeos para estender um 3' hidroxila término de um oligonucleotídeo (por exemplo, um oligonucleotídeo de iniciador/molde ou outro iniciador) ligado a uma molécula de ácido nucleico alvo. Tais polimerases incluem aquelas que são termofílicas e/ou aquelas capazes de deslocamento de fita. Em uma modalidade, uma polimerase carece ou tem atividade de exonuclease 5'-3' reduzida. Em outras modalidades, uma polimerase também possui atividade de transcriptase reversa (por exemplo, Bst (fragmento grande), Therminator, Therminator II). Polimerases exemplificativas incluem, porém sem limitações, BST (fragmento grande), DNA polimerase I (E. coli), DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow), fragmento Klenow (3'-5'-exo), DNA polimerase T4, DNA polimerase T7, DNA polimerase Deep VentR. (exo-), DNA polimerase Deep VentR, DyNAzyme, DNA polimerase High-Fidelity, Therminator, DNA polimerase Therminator II, DNA polimerase AmpliTherm, DNA polimerase Taq, DNA polimerase Tth, DNA polimerase Tfl, DNA polimerase Tgo, DNA polimerase SP6, DNA polimerase Tbr. Os exemplos não limitativos a seguir de transcriptase reversa (RT) podem ser usados nas reações do presente método para aprimorar o desempenho quando de detecção de uma sequência de RNA: OmniScript (Qiagen), SensiScript (Qiagen), MonsterScript (Epicentre), Transcriptor (Roche), HIV RT (Ambion), Superscript III (Invitrogen), ThermoScript (Invitrogen), Thermo-X (Invitrogen), ImProm II (Promega).

[00083] A enzima de corte se liga ao DNA fita dupla e cliva uma fita de uma dupla fita dupla. A enzima de corte pode clivar a montante ou a jusante dos sítios de ligação ou sítio de reconhecimento da enzima de corte. Em modalidades exemplificativas, a reação compreende o uso de uma enzima de corte que cliva ou corta a jusante do sítio de ligação, de tal forma que a sequência resultante não contenha o sítio de corte. Uso de uma enzima que cliva a jusante do sítio de ligação permite que a polimerase estenda mais facilmente sem ter de deslocar a enzima de corte. De modo ideal, a enzima de corte é funcional sob as mesmas condições de reação que a polimerase. Enzimas de corte exemplificativas incluem, porém sem limitações, Nt.BspQI (NEB), Nb.BbvCI (NEB), Nb.Bsml (NEB), Nb.BsrDI (NEB), Nb.BtsI (NEB), Nt.AlwI (NEB ), Nt.BbvCI (NEB), Nt.BstNBI (NEB), Nt.CviPII (NEB), Nb.BpulOI (Fermantas), e Nt.BpulOI (Fermentas).

[00084] Uma reação NEAR compreende, tipicamente, nucleotídeos tais como, por exemplo, trifosfatos de dideoxiribonucleosídeo (dNTPs). A reação também pode ser realizada na presença de dNTPs que compreendem uma porção detectável incluindo, porém sem limitações, um marcador radioativo (por exemplo, 32P, 33P, 125I, 35S), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina), um marcador fluorescente (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC)), biotina, avidina, digoxigenina, antígenos, haptenos ou fluorocromos. A reação NEAR compreende ainda determinados sais e tampões que conferem atividade à enzima de corte e polimerase.

[00085] Vantajosamente, a reação NEAR é realizada sob condições substancialmente isotérmicas, onde a temperatura da reação é mais ou menos constante durante o curso da reação de amplificação. Em virtude do fato de a temperatura não precisar ser trocada entre uma temperatura máxima e uma temperatura mínima, a reação NEAR pode ser realizada sob condições onde seria difícil realizar PCR convencional. Tipicamente, a reação é realizada em torno de entre 35°C e 90°C (por exemplo, 35, 37, 42, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85 °C). De forma vantajosa, não é essencial que a temperatura seja mantida com um grande grau de precisão. Alguma variabilidade na temperatura é aceitável.

[00086] A temperatura de fusão (Tm) e modificadores de taxa de reação podem também ser usados para diminuir a temperatura de fusão dos oligonucleotídeos, tal como (porém sem limitações) etileno glicol e glicerol. Além disso, modificadores da taxa de reação de DNA polimerase (por exemplo, concentração de dNTP e magnésio) podem ser usados para alterar a taxa de reação para levar a uma maior precisão de quantificação.

[00087] A presente invenção proporciona métodos de monitoramento de uma reação NEAR em tempo real, utilizando a estratégia de amplificação NEAR conforme descrito acima e nas Patentes US007112423B2 e US20090017452A1. Em uma modalidade, NEAR quantitativa utiliza amplificação de ácidos nucleicos-alvo juntamente com uma amplificação de controle de quantidade conhecida. A quantidade de ácido nucleico alvo pode ser calculada como uma quantificação absoluta ou uma quantificação relativa (semi-quantitativa) com base na fonte do controle (controle exógeno ou endógeno).

[00088] Quantificação da sequência de nucleotídeos desconhecida pode ser obtida através de comparação de amplificação limítrofe logarítmica do desconhecido com uma série de sequências-alvo conhecidas em um conjunto distinto de reações ou na mesma reação ou como um produto de co-amplificação endógeno ou exógeno interno o qual produz um valor limítrofe, indicativo de um resultado positivo (se o desconhecido excede o limite) ou resultado negativo (se o desconhecido não excede o limite).

Aplicações

[00089] A presente invenção proporciona o monitoramento, em tempo real, da reação de amplificação isotérmica NEAR, a qual pode proporcionar uma medida quantitativa do material de iniciação-alvo. Composições e métodos da invenção são úteis em diagnósticos humanos, onde uma resposta quantitativa rápida é desejada. Em modalidades particulares, a invenção proporciona o uso de ensaios de reação NEAR em diagnóstico humano em ambientes clínicos. Em outras modalidades, a invenção proporciona o uso de ensaios de reação NEAR em trabalho diagnóstico de campo, onde acesso ao equipamento de termociclagem não está disponível ou seria proibitivamente caro. Em ainda outras modalidades, a invenção proporciona o uso de ensaios de reação NEAR em um ambiente acadêmico, onde respostas quantitativas rápidas são desejadas. Kits

[00090] A prática da presente invenção emprega, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, as quais estão bem dentro do âmbito daqueles versados no campo. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tais como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller e Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas técnicas são aplicáveis à produção dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção e, como tal, podem ser consideradas na realização e prática da invenção. Técnicas particularmente úteis para realizações em particular serão discutidas nas seções que seguem.

[00091] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer, àqueles versados no campo, uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar o ensaio, triagem e métodos terapêuticos da invenção e não se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como sua invenção.

EXEMPLOS

[00092] Atualmente, a reação NEAR é usado para detectar, rápida e isotermicamente, a presença ou ausência de um oligonucleotídeo alvo em uma amostra. Em virtude de limitações técnicas, métodos NEAR convencionais são inadequados para a quantificação de oligonucleotídeos-alvo em tempo real devido, pelo menos em parte, à amplificação ilegítima de moléculas não-alvo presentes na amostra, a qual obscurece a detecção e quantificação precisas de amplicons alvo. A presente invenção proporciona composições e métodos que superam estas limitações fornecendo sondas de oligonucleotídeos e iniciadores/padrões detectáveis que não são susceptíveis à amplificação ilegítima. Em uma modalidade, um ensaio NEAR quantificável emprega uma sonda de oligonucleotídeo detectável compreendendo uma ou mais modificações que impedem ou reduzem a amplificação ilegítima de moléculas não-alvo durante a reação NEAR. Exemplo 1: Monitoramento em Tempo Real de uma Reação NEAR Hot Start

[00093] Reações foram realizadas em um volume total de reação de 50 μL que foi preparado em um formato de 50 μL/96 cavidades. As reações foram preparadas como uma reação em duas partes para obter uma "partida a quente" (Hot Start) manual. Se desejado, uma "Hot Start" inclusiva pode ser usada. A Mistura de Reação Parte 1 continha uma concentração final de reação de 1000 nM de iniciador molde direto e 100 nM de iniciador molde reverso, DNA-alvo (ou controle de água e DNA não-alvo) e um oligonucleotídeo de detecção em uma concentração final de 200 nM. O volume total para estes reagentes foi de 5 μL. Foram adicionados à Mistura de Reação Parte 1 5 μL de solução contendo alvo por reação. A Mistura de Reação Parte 2 contém o tampão IB2 (concentração final de Tris HCl de 50 mM; (NH4)2SO4 a 30 mM, Na2SO4 a 30 mM; MgSO4 a 15 mM; DTT a 1 mM; e Triton X-100 a 0,1%); dNTPs (concentração final de 0,3 mM); Polimerase Bst (19,2 unidades/reação) e enzima de corte N.BstNBI (15 unidades/reação); diluída com água para um volume total de 40 μL. Os componentes da reação foram aquecidos para uma temperatura de 56 °C durante 3 minutos para pré-aquecer os componentes de reação. Após pré- aquecimento, 40 μL da Mistura de Reação Parte 2 foram adicionados a 10 μL da Mistura de Reação Parte 1. A reação foi deixada prosseguir a 56 °C durante 10 minutos, seguido por uma etapa de aquecimento de 2 minutos a 96 °C para inativar a atividade enzimática e parar a reação. A intensidade de fluorescência foi medida dentro de 20 segundos da transferência e em intervalos de 10 segundos depois. Curvas de intensidade de fluorescência foram analisadas via medições de fluorescência subtraída da base nos intervalos de tempo coletados; com representação gráfica de dados realizada com o software Microsoft Excel.

[00094] Um gráfico subtraído de base de reação NEAR em tempo real mostra a separação, por amplificação, de amostras que contêm- alvo (Figura 2A) com relação à amostras NTC. Linhas azul escuro, azul médio e azul claro (Figura 2A) são reações que começaram com 104, 103 e 102 cópias de DNA genômico-alvo, respectivamente, na presença de 106 cópias de DNA genômico não-alvo que contém a molécula de detecção em tempo real contendo um C3-espaçador interno, conforme descrito aqui acima. Reações que contêm esta sonda de detecção em tempo real, mas nenhum-alvo, são representadas pelas linhas vermelhas e douradas (0 cópias e 106 cópias de DNA genômico não- alvo, respectivamente) na Figura 2A. A titulação de DNA-alvo com gradações mais finas (10 x 103, 5 x 103, 2,5 x 103) pode ser encontrada na Figura 3B, mantendo a capacidade de discernir entre diluições e controles NTC (linhas azuis e vermelhas, respectivamente). Linhas vermelhas e rosas (Figura 2B) representam reações com 5 x 103 cópias e 0 cópias de DNA-alvo, respectivamente, contendo sonda de detecção padrão. Houve uma separação significativa entre o "controle sem-alvo" (NTC) e as reações contendo DNA-alvo (Figura 2A); enquanto que a sonda de detecção padrão não apresentou esta separação discernível (Figura 2B). Essa mesma tendência foi observada em um instrumento diferente (ESE Reader), o qual utiliza frequências de varredura fluorescentes a cada 20 segundos (Figura 3A).

[00095] Dados da curva de fusão indicaram pouca ou nenhuma produção de produto específico em reações contendo apenas NTC e DNA não-alvo com sonda de detecção adicionada na reação, bem como pós-reação (Figura 2C, linhas dourada, vermelha, amarela e rosa). Estas características são a marca registrada de uma sonda de não- amplificação. Para mostrar adicionalmente a capacidade do construto de interromper a extensão polimerase através de modificação com C3- espaçador, um conjunto de experimentos foi executado, onde um C3- espaçador foi introduzido em cada construto padrão imediatamente 5' da região-alvo complementar, mas 3' ao sítio de corte. Isto permitiria que o construto se ligasse ao-alvo, mas não amplificasse nada se a polimerase fosse interrompida pela modificação. As Figuras 4A e 4B mostram que não houve amplificação dos padrões que contêm a modificação, enquanto que os construtos normais amplificaram o DNA normalmente (bem como produziram outros produtos de amplificação no NTC, os quais se ligam à sonda de detecção na reação).

Exemplo 2: Quantificação para Otimização de um Ensaio NEAR

[00096] Resultados quantitativos contam com a capacidade de diferenciar entre concentrações de substâncias que estão sendo testadas. As Figuras 3A e 3B mostram os resultados de titulações de DNA-alvo. Estas titulações foram realizadas por meio de diluição serial de um estoque de iniciação de DNA purificado. A Figura 3 mostra uma clara diferenciação entre as concentrações de DNA-alvo nas amostras serialmente diluídas. A partir destes resultados, uma curva padrão pode ser calculada e a quantidade de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma amostra pode ser determinada com base no tempo necessário para amplificar o-alvo até um limite traçado entre as concentrações de DNA conhecido na porção logarítmica do gráfico de amplificação da amostra. Quantificações mais precisas podem ser obtidas alterando-se o tempo de reação. Por exemplo, diminuição da taxa de reação pode intensificar a capacidade do ensaio de discriminar entre quantidades de moléculas de ácido nucleico alvo. Em uma modalidade, a precisão é aumentada alterando o tempo para amplificação logarítmica. Isto permite separação aprimorada do tempo para cruzar o limite logarítmico.

[00097] Se desejado, a temperatura de fusão (Tm) e modificadores de taxa de reação são usados para diminuir a temperatura de fusão dos oligonucleotídeos. Estes incluem, porém sem limitações, etileno glicol e glicerol. Se desejado, modificadores de taxa de reação de DNA polimerase, tal como concentração de dNTP e magnésio, são usados para alterar a taxa de reação e aprimorar a precisão da quantificação.

Exemplo 3: Amplificação de RNA-alvo via NEAR em Tempo Real com Transcriptase Reversa (RT)

[00098] As Figuras 5A e 5B são gráficos que mostram os resultados de rt-NEAR em tempo real utilizando padrões padrão, um-alvo de RNA e um sistema de detecção de beacon molecular modificado. Além dos componentes enzimáticos para NEAR padrões, uma transcriptase inversa foi adicionada a todas as reações (Figura 5A) para converter o RNA-alvo para um DNA-alvo que permite progressão da reação NEAR. As reações continham 0 (Controle Sem-alvo), 105, 104 ou 103 cópias de um oligonucleotídeo de RNA sintético (Figura 5A). Reações carecendo de componentes enzimáticos NEAR ou a transcriptase reversa não suportam a detecção de um produto específico via o beacon de detecção (Figura 5B) na presença de 105 cópias.

Exemplo 4: Detecção Específica de um alvo Complementar

[00099] A presente invenção proporciona, adicionalmente, uma sonda de detecção que circulariza para levar suas extremidades 5' e 3' em aposição, quando ligada a uma molécula de ácido nucleico alvo, em que a extremidade 5' é complementar a uma porção da extremidade 5' da molécula de ácido nucleico alvo e compreende uma porção fluorescente; a extremidade 3' é complementar a uma porção da extremidade 3' da molécula de ácido nucleico alvo e compreende uma porção sequestrante e as extremidades 5' e 3' emitem um sinal detectável quando mantidas em proximidade. As extremidades 5' e 3' são separadas por uma sequência ligante de comprimento suficiente para permitir hibridização com as sequências complementares pela sonda de detecção circularizada. Mais especificamente, quando a sonda de oligonucleotídeo se liga a uma sequência alvo complementar, transferência de energia de ressonância de fluorescência (Fluorescent Resonant Energy Transfer - FRET) resulta. Esta configuração requer que o comprimento de espaçador seja igual ao comprimento das regiões de hibridização mais um mínimo de 6 pares de base de distância. Detecção desta transferência de energia de ressonância de fluorescência identifica a presença e/ou quantidade de uma molécula de ácido nucleico alvo em uma amostra. Caso a sonda de oligonucleotídeo se ligue de forma não específica, FRET não ocorrerá. Isto resultará na ausência de FRET e/ou emissão de fluorescência de um comprimento de onda diferente que se distingue do comprimento de onda emitido quando de ligação específica de uma molécula de ácido nucleico alvo. Outras Modalidades

[000100] A partir da descrição precedente, será evidente que variações e modificações podem ser feitas na invenção descrita aqui para se adaptar aos vários usos e condições. Tais modalidades também estão dentro do âmbito das reivindicações que seguem.

[000101] A citação de uma lista de elementos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições desta variável como qualquer elemento único ou combinação (ou sub-combinação) de elementos listados. A citação de uma modalidade aqui inclui esta modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou partes das mesmas.

[000102] Todas as patentes e publicações mencionadas no presente relatório descritivo são aqui incorporadas por referência até o mesmo ponto como se cada patente e publicação independente fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

Claims (9)

1. Método de quantificação de um produto específico em uma reação de amplificação por corte e extensão (NEAR), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar uma molécula de ácido nucleico alvo com uma polimerase, dois iniciadores/moldes de oligonucleotídeos, cada um dos quais se liga especificamente a uma sequência complementar sobre a molécula de nucleotídeo alvo, uma enzima de corte e uma sonda de polinucleotídeo detectável não amplificável compreendendo uma extremidade terminal 5' e uma extremidade terminal 3', pelo menos 10 nucleotídeos que são complementares a uma sequência alvo, um repórter fluorescente na extremidade terminal 5' e uma molécula supressora na extremidade terminal 3' da sonda e um molécula de captura de polimerase em uma porção 5' da região complementar, em que o repórter fluorescente e a molécula supressora são separados por mais de 10 bases; (b) gerar amplicons que compreendem pelo menos uma parte da referida molécula de ácido nucleico alvo; e (c) detectar um sinal específico para a hibridização da sonda de oligonucleotídeo à molécula de ácido nucleico alvo ou amplicon da mesma, em que o sinal indica a quantidade de molécula de ácido nucleico alvo presente na amostra ou um amplicon da mesma.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a detecção de uma pluralidade de produtos de reação distintos produzidos no decorrer da reação de amplificação de corte e extensão.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal é detectado em tempo real.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é uma amostra ambiental ou uma amostra biológica selecionada do grupo que consiste em fluido biológico, célula ou amostra de tecido compreendendo um patógeno que é um vírus, bactéria, levedura ou fungo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende ainda o contato da molécula de ácido nucleico alvo com uma enzima de corte específica de heterodúplex.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os amplicons compreendem uma sequência alvo que se liga à sonda oligonucleotídica detectável.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende ainda o contato da molécula de ácido nucleico alvo com uma enzima de reparo ou enzima de leitura de prova.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é uma amostra ambiental ou uma amostra biológica selecionada do grupo que consiste em fluido biológico, célula ou amostra de tecido, compreendendo um patógeno que é um vírus, bactéria, levedura ou fungo.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda monitorar a produção de um produto específico de uma reação de amplificação de corte e extensão.

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