BR122020000909B1 - Método para derivar uma célula tronco pluripotente induzida (ips)humana sob condições definidas - Google Patents

Método para derivar uma célula tronco pluripotente induzida (ips)humana sob condições definidas Download PDF

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Abstract

são descritos meios completamente definidos que suportam viabilidade, proliferação, clonagem, e derivação da célula pluripotente, bem como métodos e composições incluindo esses meios. são também descritos métodos para derivar células ips de indivíduos adultos em condições sem xeno definidas.

Description

[001]Dividido do BR1120130028114, depositado em 05/08/2011.
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[002]Não aplicável Declaração Relativa a Pesquisa ou Desenvolvimento Patrocinado pelo Governo Federal
[003]Esta invenção foi feita com suporte governamental em ES017166 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
Antecedentes da Invenção
[004]Células pluripotentes, tais como células tronco embriônicas (ES) e células tronco (iPS) pluripotentes induzidas, têm o potencial para diferenciar em células de todas as três camadas de germe primário (Thomson, et al., Science 282, 11451147 (1998)). O notável potencial de desenvolvimento das células pluripotentes tem demonstrado adequado para pesquisa básica e aplicação clínica. Muitos métodos básicos para cultura celular pluripotente de humano, tais como meios de crescimento, revestimento de placa, e outras condições, têm sido desenvolvidos e refinados (Ludwig et al., Nat. Biotechnol 24, 185-187 (2006); Ludwig et al., Nat. Methods 3, 637-646 (2006)). Por exemplo, enquanto células ES de humano foram inicialmente cultivadas em meios contendo soro bovino fetal (FBS) nos meios completamente definidos das células alimentadoras de fibroblasto embrionário de murino (MEF), bem como matrizes de proteína definidas são agora disponíveis (Ludwig et al., Nat. Biotechnol 24, 185-187 (2006)).
[005]Nos últimos dez anos, os métodos de cultura celular pluripotente evoluíram consideravelmente. Diversos meios de crescimento foram desenvolvidos que fornecem nutrientes básicos e fatores de crescimento para sobrevivência e expan- são das células pluripotentes e determinam diretamente como as células cresceram e diferenciaram. TeSRTM foi um dos primeiros meios definidos que suporta manutenção da célula pluripotente em um estado não diferenciado na ausência das células alimentadoras ou meio condicionado através de múltiplas passagens de cultura (Ludwig et al., Nat. Methods 3, 637-646 (2006); patente US No. 7.449.334, cada um dos quais está incorporado aqui pela referência como se tivesse apresentado na sua íntegra). TeSRTM contém 18 componentes além do DMEM/F12 do meio basal que por si mesmo tem 52 componentes (Tabela 1).
[006]A variedade de diferentes meios de crescimento disponíveis para cultura celular pluripotente contribui para inconsistências nas descobertas da pesquisa. Os meios que são atualmente usados para derivação e crescimento de célula pluripotente, incluindo meios completamente definidos, contêm componentes que podem influenciar células pluripotentes de várias maneiras. Antes da invenção descrita aqui, não se co-nhecia como cada componente dos meios, sozinho ou em combinação com outros componentes, afeta várias funções da célula pluripotente, tais como viabilidade, plu- ripotência, ou diferenciação na cultura celular.
[007]Por exemplo, albumina, o componente de proteína mais abundante presente na maioria dos meios, é um veículo de lipídio e, como tal, pode afetar a diferenciação ou manutenção de pluripotência por meio de seus lipídios associados. As qualidades de albumina e de seus lipídios associados determinam se ela pode ser usada para cultura celular pluripotente de humano. Entretanto, a qualidade da albumina varia muito dependendo de sua fonte, mesmo quando produzida a partir de um material genético recombinante, contribuindo para variações entre experimentos conduzidos em condições de outra forma equivalentes. Também, embora albumina de soro de humano clonado seja disponível, ela é raramente usada para experimentação de rotina devido a seu custo comparativamente alto.
[008]Esforços para eliminar albumina do meio têm se mostrado mal sucedi- dos. Omissão de albumina, ou qualquer outro fator de crescimento presente em TeSR, leva a um declínio drástico no desempenho da cultura de ESC de humano, tais como menor viabilidade, proliferação, e pluripotência da célula (Ludwig et al., Nat. Biotechnol 24, 185-187 (2006)).
[009]Para explorar completamente o potencial das células pluripotentes para descoberta e teste de medicamento, e terapia de transplante, são desejáveis derivação e crescimento dessas células em condições completamente definidas e, idealmente, sem xeno. Existe assim uma necessidade não atendida na técnica de meios sem componentes que introduzem inconsistências para manter o controle sobre as condições de cultura celular pluripotente. Especificamente, existe uma necessidade na técnica de meios de cultura celular pluripotente contendo somente aqueles componentes que suportam funções da célula pluripotente importantes para um objetivo de cultura específica.
Sumário da Invenção
[0010]A invenção diz respeito no geral a meios, composições, e métodos para derivar e cultivar células pluripotentes e, mais particularmente, a meios completamente definidos para células pluripotentes.
[0011]Em um primeiro aspecto, a presente invenção é sumarizada como meios sem albumina que suportam viabilidade, crescimento e pluripotência das células pluripotentes.
[0012]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio contém selênio.
[0013]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio contém NODAL.
[0014]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio contém trans- ferrina.
[0015]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio contém fator de crescimento transformante beta (TGF-β).
[0016]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio contém somente água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, e um fator de crescimento do fibroblasto (FGF), cada qual em quantidades suficientes para suportar viabilidade da célula tronco pluripotente.
[0017]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio contém somente água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, um FGF, se- lênio, transferrina, e um de TGF-β e NODAL, cada qual em uma quantidade suficiente para suportar proliferação da célula tronco pluripotente.
[0018]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio suporta sobre-vivência depois da passagem, congelamento, proliferação, pluripotência, derivação, e clonagem das células pluripotentes.
[0019]Em algumas modalidades do primeiro aspecto, o meio é sem xeno.
[0020]Em um segundo aspecto, a presente invenção é sumarizada como um método para cultivar células tronco pluripotentes em um meio definido. Em algumas modalidades do segundo aspecto, o meio usado para cultivar células pluripotentes contém somente água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, e um FGF, cada qual em quantidades suficientes para suportar viabilidade da célula pluripotente. Em algumas modalidades do segundo aspecto, o meio usado para cultivar células pluripotentes contém somente água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, um FGF, selênio, transferrina, e um de TGF-β e NODAL, cada qual em uma quantidade suficiente para suportar proliferação da célula tronco pluripotente. Em algumas modalidades do segundo aspecto, o meio contém fatores definidos que suportam crescimento prolongado, pluripotência, clonagem, congelamento, ou derivação das células pluripotentes. Em algumas modalidades do segundo aspecto, o meio usado para cultivar células pluripotentes é sem xeno.
[0021]Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma compo-sição de cultura celular in vitro das células pluripotentes em um meio que é substanci- almente sem β-mercaptoetanol e albumina. Em algumas modalidades do terceiro aspecto, a composição da cultura é sem células alimentadoras de fibroblasto, meio condicionado, e contaminação de xeno.
[0022]Em um quarto aspecto, a presente invenção é sumarizada como um método para derivar células iPS de um indivíduo adulto em condições completamente definidas. O método inclui as etapas de cultivar uma célula somática de um indivíduo adulto em um meio contendo água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, e um FGF, todos em quantidade suficiente para manter a viabilidade, e reprogramar a célula em condições definidas tal como para derivar células iPS.
[0023]Em algumas modalidades do quarto aspecto, o meio contém TGF-β durante todo o processo de reprogramação ou partes dele.
[0024]Em algumas modalidades do quarto aspecto, o meio contém butirato.
[0025]Em algumas modalidades do quarto aspecto, o meio contém hidrocor- tisona.
[0026]Em algumas modalidades do quarto aspecto, o meio é sem xeno.
[0027]Em um quinto aspecto, a presente invenção é sumarizada como um método para clonar uma célula tronco pluripotente em um meio sem albumina. O método inclui a etapa de plaquear células tronco pluripotentes em densidade de clonagem em um meio sem albumina que suporta clonagem de célula tronco pluripo- tente.
[0028]Em algumas modalidades do quinto aspecto, o meio contém um inibidor de ROCK.
[0029]Em algumas modalidades do quinto aspecto, o meio contém blebista- tina.
[0030]Em algumas modalidades do quinto aspecto, o meio contém somente água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, um FGF, selê- nio, transferrina, e um de TGF-β e NODAL, cada qual em uma quantidade suficiente para suportar clonagem de célula tronco pluripotente.
[0031]Em um sexto aspecto, a presente invenção é sumarizada como um método de criopreservar células tronco pluripotentes em um meio sem albumina. O método inclui a etapa de congelar células tronco pluripotentes em um meio sem albumina.
[0032]Em algumas modalidades do sexto aspecto, o meio contém somente água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, um FGF, selê- nio, transferrina, um de TGF-β e NODAL, e sulfóxido de dimetila (DMSO).
[0033]Em um sétimo aspecto, a invenção é sumarizada como uma célula iPS derivada em condições sem albumina. Células iPS derivadas na ausência de albumina são sem contaminações de albumina endógena.
[0034]Os métodos e composições descritos aqui são usados em uma variedade de aplicações para derivar, cultivar, e usar células pluripotentes. É um objetivo da presente invenção definir condições de cultura a curto prazo e a longo prazo para células pluripotentes limitadas aos fatores que suportam o objetivo da cultura visado.
[0035]É um outro objetivo da presente invenção fornecer condições de cultura para células pluripotentes que maximizam a porcentagem das células cultivadas em um estado não diferenciado.
[0036]É um outro objetivo da presente invenção fornecer meios que podem servir como a plataforma necessária para examinar como várias condições afetam células pluripotentes e comparar experimentos previamente reportados em diferentes fundos de meios.
[0037]Esses e outros recursos, objetivos, e vantagens da presente invenção ficarão mais bem entendidos a partir da descrição que se segue. Na descrição, referência é feita aos desenhos anexos, que formam uma parte desta e na qual foram mostradas a título de ilustração, mas sem limitação, modalidades da invenção. A descrição das modalidades preferidas não visa limitar a invenção para cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas. Referência, portanto, deve ser feita às reivindicações relacionadas aqui para interpretar o escopo da invenção.
Descrição Resumida dos Desenhos
[0038]A presente invenção será mais bem entendida e recursos, aspectos e vantagens sem ser aqueles apresentados anteriormente ficarão aparentes quando for feita consideração à descrição detalhada seguinte desta. Tal descrição detalhada faz referência aos desenhos seguintes, em que:
[0039]A figura 1 A-E ilustra elementos dos meios para sobrevivência da célula ES de humano e auto-renovação em cultura. A figura 1A ilustra índices de sobrevivência de 24 horas para células individualizadas plaqueadas nos vários meios. Abreviações dos meios são conforme listado na tabela 1. A presença de insulina e fator de crescimento do fibroblasto (SE), albumina do soro bovino (BSA), beta- mecaptoetanol (BME) é indicada por "+" e a ausência é indicada por "-." A figura 1B ilustra índices de sobrevivência de 24 horas ou 96 horas para células individualizadas plaqueadas nos vários meios. A adição de insulina e fator de crescimento do fibroblasto (FGF) é indicada por "+" e a remoção é indicada por "-". A figura 1C ilustra índices de sobrevivência de 24 horas ou 129 horas para células individualizadas cultivadas em meio TeSRTM com Vitamina C (TeSR), meio TeSRTM sem Vitamina C (TeSRTM-LAA), ou meio DF5. A figura 1D ilustra proliferação celular depois de cada qual das três passagens em DF5, DF5 com Selênio adicionado (DF5+Selênio), DF12, ou DF12 dos quais Selênio foi removido (DF12-Selênio). A figura 1E ilustra uma análise comparativa de doze diferentes meios de base.
[0040]A figura 2 A-F ilustra otimização de célula ES de humano e condições da cultura celular iPS com DF5S. A figura 2A mostra índices de sobrevivência para células individualizadas que foram semeadas a baixa densidade (~1.500 célu- las/cm2) tanto em DF5S (base) quanto TeSRTM (topo) e cultivadas em diferentes concentrações de O2 e CO2 (O15C5: 15 % de O2 e 5 % de CO2; O15C10: 15 % de O2 e 10 % de CO2; O5C10: 5 % de O2 e 10 % de CO2). Sobrevivência celular foi examinada em 24 horas e 124 horas. A figura 2B mostra a eficiência de clonagem das células H1 cultivadas em vários meios na presença (+HA100) ou ausência da molécula pequena HA100 (CM100: meio condicionado com 100 ng/mL FGF). A figura 2C mostra a eficiência de clonagem das células H1 e células iPS derivadas de fibroblastos de prepúcio em vários meios. A figura 2D mostra a eficiência de clonagem das células iPS derivadas de fibroblastos de prepúcio em vários meios. DF5S trFe indica meios DF5S nos quais holotransferrina foi adicionada. A figura 2E ilustra a eficiência de clonagem das células H1 cultivadas em vários meios na presença de HA100 (10 μM, 24 horas), blebistatina (10 μM, 4 horas), ou Y27632 (10 μM, 24 horas), comparada à eficiência de clonagem na ausência desses fatores (controle). Asteriscos indicam p<0,05. A figura 2F ilustra a eficiência de clonagem das células H1 em meio condicionado (CM), CM com inibidor de ROCK (HA100), TeSR com inibidor de ROCK, e E8 com inibidor de ROCK em condições normóxica (barras cinza escuro) ou hipóxico (barras cinza claro). Barras de erro indicam o erro padrão da média; asteriscos indicam p<0,05.
[0041]A figura 3 A-B ilustra crescimento de célula pluripotente e expressão genética em DMEM/F12 suplementado com insulina, transferrina, selênio, ácido L- ascórbico, FGF2, e TGF- β ou NODAL (referidos aqui como "E8 (TGF- β)" e "E8 (NODAL)," respectivamente). A figura 3A ilustra ampliação das células ES H1 (topo) e células iPS (base) mantidas em TeSRTM (linhas cinza escuro) ou E8 (TGF- β) (linhas cinza claro). A figura 3B ilustra expressão genética global das células ES H1 crescidas em E8 (TGF- β) e células ES H1 crescidas em TeSRTM. RNA das células H1 mantidas tanto em meio TeSR quanto E8 (TGFβ) para 3 passagens foi analisado por RNA-seq com Illumina Genome Analyzer GAIIX (correlação de expressão genética global R = 0,954 (Correlação Spearman)).
[0042]A figura 4A-F ilustra derivação de célula iPS em condições definidas. A figura 4A mostra proliferação de fibroblastos de prepúcio em meios a base de DF5SFe nos quais vários fatores de crescimento de fibroblasto (FGF) foram adicionados, comparados com a proliferação em meios contendo FBS. A figura 4B mostra crescimento do fibroblasto em vários meios suplementados com hidrocortisona. A figura 4C mostra expressão dos marcadores de pluripotência OCT4 (esquerda) e SSEA4 (direita). A figura 4D ilustra a expressão de genes selecionados por fibroblas- tos de prepúcio, células hES, células iPS derivadas nas células alimentadoras (Células iPS (Alimentadoras)), e células iPS derivadas em meio E8 (Células iPS (E8)). Todas as células foram mantidas em meio E8 (TGFβ) antes de análise RNA, exceto para fibroblastos, que foram mantidos em E8 com hidrocortisona. A figura 4E ilustra expressão genética global das células ES e iPS de humano derivadas em meio E8 (TGFβ)s (R = 0,955). A figura 4F é expressão genética global das células iPS derivadas em MEF e células iPS derivadas em meio E8 (TGFβ)s.
[0043]A figura 5A-C ilustra melhoria dos meios para derivação de célula iPS. A figura 5A mostra a proliferação de prepúcio (barras cinza escuro) e Fibroblastos adulto de PRPF8-2 (barras cinza claro) em meios DF5SFe suplementados com TGF- β, hidrocortisona, TGF-β e hidrocortisona, ou TGF-β e hidrocortisona sem FGF. A figura 5B ilustra o efeito de TGF-β e butirato na programação de fibroblastos de prepúcio. Quatro a cinco semanas depois da transfecção de reprogramação inicial, números de colônia para células transformadas e células iPS verdadeiras foram classificados e a razão de colônias iPS para colônias de célula não iPS foi calculada.
[0044]A figura 6A-B ilustra a derivação das células iPS dos fibroblastos de adulto em condições completamente definidas sem passagem secundária. A figura 6A ilustra um exemplo de um protocolo de reprogramação. A figura 6B ilustra a expressão dos marcadores de pluripotência OCT4 e SSEA4, conforme determinado por análise citométrica de fluxo de linhagens iPSC mantidas em DMEM/F12 suple- mentado com insulina, transferrina, selênio, ácido L-ascórbico, FGF2, e TGF- β ou NODAL ("E8") para 20 passagens. Pico sombreado: manchamento com anticorpos específicos para OCT4 (esquerda) e SSEA4 (direita); pico não sombreado: anticorpo de controle de IgG de camundongo.
[0045]A figura 7A-C ilustra a eficiência de reprogramação de fibroblastos de humano em vários meios. A figura 7A ilustra o número de colônias de célula iPS por 80.000 fibroblastos submetidos a reprogramação com células alimentadoras de fi- broblasto de camundongo (MEF) ou em meio a base de E8. Para aumentar a eficiência, 100 μM de butirato de sódio foram selecionados para ambas as condições. A figura 7B ilustra o número de colônias de célula iPS por 80.000 fibroblastos submetidos a reprogramação em TeSRTM ou em meio a base de E8. A figura 7C ilustra os efeitos de tempo de exposição de TGF-β e butirato na eficiência de programação de fibroblastos de prepúcio em condições completamente definidas. Fibroblastos foram reprogramados em DMEM/F12 suplementado com insulina, transferrina, selênio, ácido L-ascórbico, e FGF2 (E8 sem TGF- β) ou em E8, na presença ou ausência de 100 μM de butirato. Eficiência de reprogramação para todas as condições foi analisada depois de 30 dias após a reprogramação. Asteriscos indicam p<0,05.
[0046]Embora a presente invenção seja suscetível a várias modificações e formas alternativas, suas modalidades exemplares são mostradas a título de exemplo nos desenhos e são aqui descritas com detalhes. Entretanto, deve-se entender que a descrição das modalidades exemplares não visa limitar a invenção às formas particulares reveladas, mas, ao contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas que estão no espírito e escopo da invenção definidos pelas reivindicações anexas.
Descrição das Modalidades Exemplares
[0047]A presente invenção diz respeito a observação dos inventores de que certos componentes dos meios, uma vez considerados essenciais para cultivar célu- las pluripotentes, podem ser omitidos dos meios de cultura celular pluripotente for-mulados para obter certos objetivos da cultura.
[0048]Da maneira aqui usada, os termos "célula pluripotente" significam uma célula capaz de diferenciar nas células de todas as três camadas de germe. Exemplos de células pluripotentes incluem células tronco embriônicas e células tronco plu- ripotentes induzidas (iPS). Da maneira aqui usada, "células iPS" referem-se as células que são substancialmente geneticamente idênticas a sua respectiva célula somática diferenciada de origem e exibem características similares às células de mais alta potência, tais como células ES, da maneira descrita aqui. As células podem ser obtidas por reprogramação de células não pluripotentes (por exemplo, multipotentes ou somáticas).
[0049]A invenção diz respeito a meios inéditos sem os fatores não essenciais para um objetivo da cultura particular. Exemplos dos objetivos da cultura incluem, mas sem limitações, sobrevivência celular, passagem, proliferação, pluripotência, clonagem, e derivação de célula iPS. Especificamente, a invenção diz respeito a meios sem albumina.
[0050]Como um ponto de esclarecimento, "passagem" e "clonagem" são métodos distintos. "Passagem" descreve o processo de dividir células que foram cultivadas em um vaso de cultura até uma certa densidade nos agregados, que são então colocadas nos novos vasos de cultura. Esses agregados podem conter qualquer número de células, tipicamente entre 100 a 1.000 células, que inicia rapidamente o crescimento em cultura. Ao contrário, "clonagem" refere-se a colônias clonais de iniciação crescendo colônias de célula ES de humano das células ES individuais únicas. Da maneira aqui usada, "eficiência de clonagem" significa o número das células individualizadas que formam novas colônias de células divididas pelo número das células individualizadas plaqueadas em cultura. Eficiência de clonagem varia consideravelmente dependendo das condições de cultura. Por exemplo, a eficiência de clonagem das células ES de humano em condições definidas e sem xeno em MATRIGEL® é muito baixa (isto é, menos que cerca de 0,1 %), enquanto a eficiência de clonagem dessas células cultivadas com meio condicionado por fibroblasto, embora ainda baixa (isto é, menos que cerca de 2 %), é alta o bastante para iniciar as colônias de célula ES clonal.
[0051]Certos componentes dos meios atualmente usados podem ser danosos às células cultivadas ou induzir diferenciação. Por exemplo, β-mercaptoetanol pode danificar e mesmo matar as células pluripotentes cultivadas. Aditivos de meios séricos, tal como albumina do soro bovino (BSA) ou soro de bezerro fetal (FCS), pode induzir diferenciação das células pluripotentes cultivadas. Também, componentes de soro comercialmente disponíveis podem diferir significativamente em sua composição, mesmo quando supridos da mesma fonte, introduzindo variabilidade de cultura imprevisível. Os meios descritos aqui são substancialmente sem fatores de danos, diferenciação e indefinidos presentes na maioria meios de cultura celular pluripoten- te convencionais. Os meios revelados foram usados com sucesso para vários objetivos da cultura, tais como suportar viabilidade das células pluripotentes a curto prazo, por exemplo, 24 horas, proliferação a curto prazo, por exemplo, 4-5 dias, manter as células pluripotentes por períodos de cultura prolongados, por exemplo, mais que 25 passagens em 3 meses, e derivar células iPS tanto de fibroblastos fetal quanto de adulto com vetores lentivirais e epissomais.
[0052]Meios mínimos inéditos especificamente tolerados para certos objetivos de cultura celular foram desenvolvidos. Vários componentes dos meios, tais como sais, vitaminas, fontes de glicose, minerais, e aminoácidos foram testados, sozinhos ou em combinação, para determinar seu efeito individual na viabilidade, proliferação, ou pluri- potência. Um ensaio de sobrevivência inédito foi desenvolvido e usado para determinar quais componentes são essenciais para sobrevivência de célula pluripotente depois de dissociação. Meios inéditos foram testados quanto a sua capacidade de suportar proli- feração e sustentar pluripotência. Esses meios foram também usados em ensaios de clonagem para determinar como cada meio afeta células únicas e sua eficiência de clonagem. Uma lista completa de ingredientes para cada meio inédito descrito aqui é apresentada na tabela 1 (campos sombreados claros e escuros indicam presença de um componente no meio, campos quadriculados indicam componentes intercambiá- veis, campos limpos indicam ausência de um componente no meio). Tabea 1. Composições dos meios.
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[0053]Os vários meios descritos aqui podem ser preparados a partir dos in-gredientes básicos. Alternativamente, versados na técnica apreciam a eficiência van-tajosa de usar um meio basal como material de partida para preparar os meios inéditos revelados. Os termos "meio basal" da maneira aqui usados significam um meio que suporta crescimento de certos organismos unicelulares e células que não exigem aditivos de meios especiais. Componentes do meio basal típico são conhecidos na técnica e incluem sais, aminoácidos, vitaminas, e uma fonte de carbono (por exemplo, glicose). Outros componentes que não mudam a característica básica do meio, mas são de outra forma desejáveis, podem também ser incluídos, tal como o vermelho de fenol indicador de pH. Por exemplo, Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) é um meio basal comumente usado para tornar meios de crescimento adequados para cultura celular de mamífero. Uma lista completa de ingredientes de DMEM/F12 é apresentada na tabela 2. Tabela 2. DMEM : F-12 Formulação do Meio (Catálogo ATCC No. 30-2006).
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[0054]A menos que de outra forma definidos, todos os termos técnicos e ci-entíficos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na técnica aos quais a invenção diz respeito. Embora quaisquer métodos e materiais similar ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos aqui.
[0055]Na descrição das modalidades e reivindicações da invenção, a termi-nologia seguinte será usada de acordo com as definições apresentadas a seguir.
[0056]Da maneira aqui usada, "cerca de" significa dentro de 5 % de uma faixa de concentração estabelecida ou dentro de 5 % de um quadro de tempo estabelecido.
[0057]Da maneira aqui usada, "essencialmente sem soro" significa que um meio não contém soro ou substituição de soro, ou que ele não contém essencialmente nenhum soro ou substituição de soro. Por exemplo, um meio essencialmente sem soro pode conter menos que cerca de 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % de soro, em que a capacidade de cultura do meio é ainda observada.
[0058]Os termos "meio de cultura definido" ou "meio definido," da maneira aqui usada, significam que a identidade e quantidade de cada ingrediente do meio são conhecidas.
[0059]Da maneira aqui usada, "um meio que consiste essencialmente em" significa um meio que contém os ingredientes especificados e, opcionalmente, outros ingredientes que não afetam materialmente suas características básicas.
[0060]Da maneira aqui usada, "quantidade efetiva" significa uma quantidade de um agente suficiente para evocar um efeito celular especificado de acordo com a presente invenção.
[0061]Da maneira aqui usada, "viabilidade" significa o estado de ser viável. Células pluripotentes que são viáveis anexam na superfície da placa celular e não mancham com a ruptura de membrana sem o corante iodeto de propídio. A viabilidade a curto prazo diz respeito às primeiras 24 horas depois do plaqueamento das células em cultura. Tipicamente, as células não proliferam neste tempo.
[0062]Da maneira aqui usada, "crescimento a curto prazo" significa proliferação celular por 4-5 dias em cultura.
[0063]Da maneira aqui usada, "crescimento prolongado" significa crescimento por pelo menos cinco passagens. Tipicamente, os meios são testados quanto a sua capacidade de suportar crescimento de célula pluripotente por mais que vinte passagens (aproximadamente 2-3 meses).
[0064]Da maneira aqui usada, "cultura a longo prazo" significa mais que 15 passagens (aproximadamente dois meses em cultura).
[0065]Da maneira aqui usada, "pluripotência" significa uma capacidade de a célula diferenciar em células de todas as três camadas de germe.
[0066]Da maneira aqui usada, "clonagem" significa um processo de iniciar uma cultura celular a partir de uma cultura de partida, idealmente, de uma única célula pluripotente ou pelo menos muito poucas células. Condições de cultura que permitem cultura clonal das células pluripotentes não diferenciadas podem ser as condições mais exigentes de todas as exigidas em cultura celular pluripotente e proliferação normal.
[0067]Da maneira aqui usada, "derivação de célula iPS" significa reprogramação de uma célula que não é pluripotente para se tornar pluripotente.
[0068]Da maneira aqui usada, "sem xeno" significa condições de cultura celular sem nenhuma célula ou produto de célula de espécie sem ser aquela da célula cultivada.
[0069]Da maneira aqui usada, "condição normóxica" significa condições com cerca de 20 % de oxigênio.
[0070]Da maneira aqui usada, "condição hipóxica" significa condições com menos que cerca de 20 % de oxigênio, por exemplo, cerca de 5 % de oxigênio.
[0071]A invenção será mais completamente entendida mediante consideração dos exemplos não limitantes seguintes. Exemplos Exemplo 1: Ensaio de sobrevivência da célula pluripotente.
[0072]Quinhentos microlitros de vários meios de teste foram carregados em cada poço de placas de 12 poços antes da adição das células. Células pluripotentes aderentes foram dissociadas com TrypLE (Invitrogen) por 5 minutos ou até completamente desanexadas das placas de cultura. TrypLE foi neutralizado adicionando um volume igual de meios na cultura. As células foram contadas, lavadas, e ressuspen- sas em meios frescos a uma concentração de 300.000 a 1.000.000 de células/mL. Aproximadamente 100 μL desta solução celular foram adicionados em cada poço das placas de 12 poços e as células foram incubadas a 37°C com 5 % de O2 e 10 % de CO2. Células foram novamente dissociadas em vários pontos de tempo usando 0,4 mL de TrypLE, que foi subsequentemente neutralizado com volumes iguais de 10 % de FBS em DMEM. As células foram contadas por citometria de fluxo. 5.000 contagens de microesferas brilhantes foram adicionadas em cada amostra como controle interno (aproximadamente 200 microesferas foram contadas para cada amostra). Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Exemplo 2: Fatores de crescimento para sobrevivência e crescimento a curto prazo.
[0073]MeioTeSR contém seis fatores de crescimento, além daqueles presentes no meio basal, fator de crescimento do fibroblasto (FGF), fator de crescimento transformante beta (TGF-β), ácido y-aminobutírico (GABA), ácido pipecólico, cloreto de lítio (LiCl), e insulina (Tabela 1). Um meio de nutriente básico (NM) foi criado contendo todos os componentes TeSRTM com a exceção desses seis fatores de cresci- mento. Cerca de 2 x 105 células ES H1 foram dissociadas e plaqueadas em Matrigel. O índice de sobrevivência foi determinado depois de 24 horas. NM sozinho não pode suportar sobrevivência celular depois da dissociação. A adição de insulina a NM resultou em sobrevivência celular similar à observada com TeSRTM, mas, não suportou crescimento celular (figura 1A). A adição tanto de insulina (20 ug/mL) quanto FGF2 (100 ng/mL) suportou sobrevivência celular e adicionalmente levou a crescimento celular em 96 horas que foi comparável com aquele observado usando meio TeSRTM (figura 1B). Assim, NM suplementado com FGF e insulina suporta cultura celular de ES de humano. Doze diferentes meios de nutriente basais suplementados da maneira descrita anteriormente foram capazes de suportar sobrevivência e crescimento celular (figura 1E). Exemplo 3: ácido L-ascórbico suporta proliferação a curto prazo.
[0074]NM contém 11 componentes nutricionais, isto é, DMEM/F12, elementos traços B, elementos traços C, ácido L-ascórbico, tiamina, selênio, L-glutamina, BSA, BME, bicarbonato de sódio (NaHCO3), e transferrina (Tabela 1). DMEM/F12 serve como meio basal e NaHCO3 é usado para modificar o pH. Para determinar quais outros componentes nutricionais foram essenciais quando insulina e FGF estavam presentes, cada fator foi adicionado individualmente para DMEM/F12, NaHCO3, insulina, e FGF. Nenhum dos fatores nutricionais foi essencial para sobrevivência depois da passagem, mas ácido L-ascórbico (64 mg/L) foi necessário para proliferação celular depois da passagem (figura 1C). Ácido L-ascórbico, conhecido como Vitamina C, é um principal antioxidante e cofator de diversas enzimas. Hidro- xiprolina pôde ser parcialmente usada em substituição a ácido L-ascórbico. Células ES plaqueadas de humano em DMEM/F12, NaHCO3, ácido L-ascórbico, insulina, e FGF (Fatores definidos 5, "DF5," Tabela 1) mantiveram morfologia similar às células ES de humano plaqueadas em TeSR. Exemplo 4: Componente dos meios para passagem prolongada.
[0075]DF5 suportou crescimento celular para somente uma passagem. Depois da segunda passagem, as células anexaram fracamente e eventualmente morreram (figura 1C). As células puderam ser passadas em NM+Insulina+FGF (dados não mostrados) e DF12 (Fig. 1D, Tabela 1), sugerindo que um ou mais fatores presentes em NM+Insulina+FGF e DF12 são importantes para passagem prolongada. Cada fator nutricional presente em NM foi adicionado individualmente ao DF5 para determinar sua capacidade de suportar expansão celular depois de múltiplas passagens. Adição de selênio sozinho foi suficiente para suportar proliferação celular através de múltiplas passagens (figura 1D, DF5+Selênio, "DF5S," Tabela 1).
[0076]DF5S foi usado para expandir células H1. Células crescidas em DF5S foram mais propensas a diferenciar do que células crescidas em TeSRTM. Entretanto, células H1 puderem crescer por diversas semanas (mais que 15 passagens), durante as quais as células mantiveram a morfologia da célula ES de humano e altos níveis de expressão de OCT4 (figura 1E, figura 1F). As células H1 crescidas em DF5S das quais tanto NODAL (100 ng/mL) quanto TGF- β (2 ng/mL) foi adicionado expressaram níveis significativamente mais altos de NANOG mRNA, comparados com as células H1 cultivadas em DF5S. DF5S +NODAL também suportaram pluripo- tência das duas linhagens celulares iPS de humano testadas, conforme determinado por alta expressão do marcador de pluripotência OCT4. Todas as células (células hES e células iPS) cresceram em DF5S tanto com NODAL quanto TGF- β mantiveram um cariótipo normal depois da passagem a longo prazo. Exemplo 5: Hipóxia melhora o crescimento e clonagem celular.
[0077]As células H1 cresceram mais rapidamente no meio DF5S comparadas com as células crescidas em TeSRTM (Figura 1C e 2A). Para otimizar as condições do crescimento de célula pluripotente, células foram crescidas em DF5S com osmolaridade, pH, nível de oxigênio, e nível de CO2 variados. Para aumentar sensibilidade do ensaio somente 5.000 células foram semeadas em cada poço e analisa- das com relação a sobrevivência (24 horas) e proliferação (124 horas). As melhorias maiores foram notadas quando níveis de O2 e CO2 foram variados. Condições de cultura ordinárias usam oxigênio a ~15 % e CO2 a 5 % (O15C5). CO2 mais alto frequentemente leva a sobrevivência ligeiramente maior depois de 24 horas. Níveis de oxigênio mais baixos aumentaram o crescimento celular tanto em DF5S quanto em TeSRTM. Oxigênio a 15 % de CO2 a 10 % (O15C10), e oxigênio a 5 % de CO2 a 10 % (O5C10) aumentaram a sobrevivência celular (figura 2A). Células não puderam prosperar a níveis mais altos de O2 (O15C5 e O15C10), enquanto elas proliferaram a níveis de oxigênio mais baixos (O5C10) (figura 2A). As células em DF5S cresceram mais rapidamente que aquelas crescidas em TeSRTM, e cresceram ainda mais rapidamente a 5 % de O2 e 10 % de CO2 (figura 2A). Adicionalmente, diminuição no nível de oxigênio para 2 % reduziu o crescimento celular comparado a 5 % de O2.
[0078]Para determinar a eficiência de clonagem em várias concentrações de oxigênio e CO2, 500 células foram semeadas em cada poço. Mesmo a baixo oxigênio, a eficiência de clonagem foi muito baixa (<2 %) para determinar efeitos de várias condições na clonagem. HA100, um inibidor de ROCK conhecido para aumentar a eficiência de clonagem, foi usado para aumentar a eficiência de clonagem para teste concentrações de oxigênio e CO2. Meio condicionado (CM), considerado o melhor meio para clonagem, foi usado como controle. A adição de HA100 melhorou significativamente a eficiência de clonagem em CM tanto O5C10 quanto em O15C5 e a eficiência de clonagem foi maior no O5C10 do que O15C5 (figura 2B). Eficiência de clonagem das células em DF5S foi comparável com a das células em CM em ambas as condições (figura 2B).
[0079]Devido ao impacto positivo de hipóxia na sobrevivência celular, alguns dos exemplos subsequentes empregam condições hipóxicas quando células foram mantidas a baixa densidade. Entretanto, quando as células não foram cultivadas a baixa densidade celular, experimentos foram conduzidos tanto nas condições nor- móxicas quanto hipóxicas (figura 2B). Exemplo 6: Melhor eficiência de clonagem de célula iPS.
[0080]Para determinar como DF5S afeta a eficiência de clonagem, duas li-nhagens celulares iPS foram crescidas em DF5S e plaqueadas a densidade de clo-nagem (aproximadamente 500 células por poço de placa de 12 poços) na presença de HA100. A eficiência de clonagem das células iPS crescidas em DF5S foi mais baixa que aquela das células iPS crescidas tanto em TeSRTM quanto em CM (figura 2C), sugerindo que um fator que melhora a eficiência de clonagem está presente no meio TeSRTM, mas ausente de DF5S. Para identificar tal fator, componentes TeSRTM individuais foram adicionados individualmente ao DF5S e testados quanto ao efeito na eficiência de clonagem. A adição de halo-transferrina em DF5S (DF5SFe) resultou em eficiência de clonagem comparável com aquela que usa TeSRTM (figura 2D). Transferrina também leva a melhorias notáveis de eficiência de clonagem das células H1 em meio DF5S.
[0081]Os inibidores de ROCK HA100 e Y27632, e blebistatina em DMEM/F12 suplementados com insulina, transferrina, selênio, ácido L-ascórbico, FGFs, e TGF- β (ou NODAL; "E8"), aumentaram a eficiência de clonagem das células H1 (figura 2E), que foi adicionalmente aumentada pela adição de transferrina e por cultura em condições hipóxicas (figura 2F)). As células mantiveram um cariótipo normal depois de mais que 25 passagens. Exemplo 7: NODAL e TGF-β suportam manutenção a longo prazo de pluri- potência de célula H1 e iPS em meios sem albumina.
[0082]Da maneira descrita no exemplo 3, células pluripotentes de humano, tais como células H1, H9, e iPS, poderiam ser crescidas e passadas por 15 vezes em DF5S, mas foram propensas a diferenciar, de maneira tal que cuidado extra é necessário para sustentar pluripotência em DF5S. Devido a pluripotência poder ser mantida mais facilmente em TeSRTM, fatores de crescimento presentes em TeSRTM foram adicionados individualmente a DF5SFe usado para crescer células H1 que foram previamente cultivadas em DF5S sem diferenciação para identificar fatores suportando pluripotência a longo prazo. As células foram passadas aproximadamente um dia depois de atingir confluência, facilitando a diferenciação celular, e expressão de Oct4, avaliado por citometria de fluxo, foi usada como indicador de pluripo- tência.
[0083]Células pluripotentes de humano crescidas em DF5SFe alongadas e alinhadas para cima uma ao longo da outra, semelhante a uma forma de "eixo" ime-diatamente antes da diferenciação. Este fenótipo é frequentemente observado no início de ação de diferenciação neural que é normalmente suprimido pelo caminho TGF-β/BMP. Assim, proteínas recombinantes do caminho TGF-β foram testadas quanto a sua capacidade de suportar pluripotência a longo prazo. DF5SFe suplementado com NODAL ("E8 (NODAL)") usado a concentração de TeSRTM sustentou alta expressão de Oct4. DF5SFe suplementado com TGF-β ("E8 (TGF-β)") usado a concentração de TeSRTM (0,6 ng/mL) suportou baixos níveis de expressão de Oct4, mas foi capaz de manter alta expressão de Oct4 quando usado a concentração mais alta (1 ng/mL).
[0084]Linhagens celulares de ES de humano, tais como H1 e H9 têm um his-tórico de cultura que inclui exposição a vários componentes de cultura complexos, tais como FBS, células alimentadoras, e substituto de soro de knockout. Exposição a esses componentes pôde criar dependência concebível nesses componentes e, consequentemente, alterar a resposta celular aos meios simplificados. O histórico de cultura pode desempenhar um papel menor para células iPS, derivadas das células somáticas reprogramadas, uma vez que as condições de derivação são menos complexas. Portanto, diferentes fatores foram testados com duas linhagens celulares iPS lentivirais originais (Yu, et al., Science 318:1917 (2007)) crescidas em DF5SFe. As células foram transferidas de placas MEF diretamente para o meio DF5SFe para uma passagem e então passadas nas várias condições do fator de crescimento. A adição tanto de TGF-β (2 ng/mL) quanto NODAL (100 ng/mL) em DF5SFe ("E8 (TGF-β)" e "E8 (NODAL)," respectivamente) suportou pluripotência a longo prazo das células iPS. Marcadores superficiais de pluripotência SSEA4, SSEA3, Tra-1-60, e Tra-1-81 foram também expressos. As células com cariótipos normais foram continuamente mantidas por mais que 20 passagens. As células foram capazes de formar teratomas 5-7 semanas depois da injeção em camundongos imunodeficientes (SCID) combinados severos.
[0085]E8 (TGF-β) e E8 (NODAL) suportaram pluripotência de cada linhagem celular pluripotente testada, isto é, duas célula ES de linhagem de humano (H1 e H9) e cinco linhagens iPSC por mais que 25 passagens (aproximadamente 3 meses) sem nenhum sinal de diferenciação (figura 3). As células ES H1 crescidas em meio E8s têm um perfil de expressão genética similar comparado com as células ES H1 crescidas em TeSRTM (figura 3B). Exemplo 8: Derivação das células iPS em meios sem albumina.
[0086]Os protocolos de reprogramação disponíveis incluem incubação das células em FBS nos primeiros diversos dias depois da transdução ou eletroporação viral, antes de trocar as células para UM100 (patente US No. 7.439.064, incorporada aqui como se fosse apresentado na sua íntegra) ou CM. Os meios simplificados descritos em exemplos anteriores foram testados quanto a sua capacidade de suportar reprogramação. Células somáticas derivadas de ES poderiam ser reprogramadas eficientemente em meio DF5S usando vetores lentivírus ou epissomais com ou sem uma cultura inicial de 2 dias em meios contendo FBS. Entretanto, DF5S não suportou reprogramação das células do prepúcio primário usando Nanog, Oct4, Sox2 e Lin28. DF5SFe suportou reprogramação de células de prepúcio e adulto em Matrigel ou MEFs usando lentivírus melhorado (Ebert et al., Nature 457(7227):277- 280 (2009), incorporado aqui pela referência como se fosse apresentado na sua ín- tegra) quando as células foram inicialmente incubadas em meio contendo FBS. Embora DF5SFe tenha sido tão efetivo quanto CM no suporte de reprogramação, exposição inicial a FBS pareceu importante para a reprogramação.
[0087]Células do prepúcio cresceram significativamente mais lento em meios DF5SFe do que em FBS. Para determinar fatores de crescimento que podem ajudar crescimento celular do prepúcio primário, fatores de crescimento individuais contidos em FBS foram testados. A família FGF de fatores de crescimento tem diversos elementos, um ou mais dos quais é comumente usado para cultura de fibroblasto. DF5SFe contém 100 ng/mL de FGF2 recombinante de peixe-zebra. Cada membro da família FGF foi testado quanto a sua capacidade de suportar crescimento celular do prepúcio. As células do prepúcio foram separadas em alíquotas no poço de placas de cultura e incubadas por 24 horas em DF5SFe menos FGF. Tipos de FGF individuais foram adicionados a 100 ng/mL por 96 horas. FGF1, zFGF2, FGF4, FGF6, e FGF9 suportaram crescimento celular do prepúcio mais efetivamente, mas nenhum suportou crescimento celular bem como meios contendo FBS (figura 4A). Para identificar se um fator de crescimento do elemento da família não FGF poderia promover crescimento celular do prepúcio comparável com o visto com FBS, diversos fatores de promoção de crescimento do fibroblasto conhecidos foram testados. Hi- drocortisona (figura 4B), seus derivados, e dexametasona adicionado a DF5SFe para substituir FBS melhorou o crescimento celular significativamente. DF5SFe+hidrocortisona ("DF5SFeC") também melhorou a eficiência de clonagem da célula iPS.
[0088]Para determinar se meios a base de DF5S podem ser usados para de-rivação de célula iPS sem viral, células do prepúcio foram reprogramadas usando um vetor epissomal sem viral, da maneira descrita em Yu et al., Science 324:797 (2009), incorporado aqui pela referência como se fosse apresentado na sua íntegra, em condições hipóxicas (O5C10). Combinações de plasmídeo #4 (pEP4EP2SCK2MEN2L e pEP4EO2SET2K, Tabela 3), #6 (pEP4EO2SEN2L, pEP4EO2SET2K e pEP4EO2SEM2K, Tabela 3), e #19 (pEP4EO2SEN2K, pEP4EO2SET2K, e pCEP4-M2L, Tabela 3) foram usadas, e 2 clones foram isolados de 106 células depois da passagem secundária. Tabela 3. Componentes do vetor de reprogramação e combinações do vetor
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Figure img0006
[0089]Combinações de plasmídeo #6 e #19 foram usadas para a reprogramação. A fim de aumentar a entrada de plasmídeo no núcleo, RNAm ENBA foi ele- troporado junto com DNA de plasmídeo. Cerca de um milhão das células foram transferidas para duas placas de 6 poços em DF5SFeC por 5 dias. O meio foi então trocado por DF5SFe por mais 18-25 dias. As células de alguns dos poços foram passadas por uma segunda vez usando uma razão 1:6 em diferentes pontos de tempo. Combinação de plasmídeo #19 gerou mais colônias do que a combinação de plasmídeo #6, mas a maioria delas não pareceu morfologia de célula ES de humano típica. Depois de aproximadamente 25 dias, colônias tipo célula ES de humano apareceram na placa primária tanto para combinações de plasmídeo, com 24 células reprogramadas estimadas por milhão das células do prepúcio usando a combinação de plasmídeo #19, e 8 células reprogramadas por milhão das células do prepúcio usando a combinação de plasmídeo #6. O número de colônias de célula ES tipo humanas aumentou significativamente depois das placas secundárias de passagem, com >500/milhão das células do prepúcio estimadas para cada combinação de plasmídeo. O aumento nas colônias de célula iPS nas placas secundárias de passagem é provavelmente devido à divisão das células iPS na placa primárias. Em al- guns exemplos, placas primárias não tiveram nenhuma morfologia semelhante de colônias de célula ES de humano típica, mas muitas células iPS apareceram depois da passagem secundária, sugerindo que algumas células iPS não puderam ser iden-tificadas, possivelmente devido a elas estarem misturadas com células somáticas.
[0090]Células das colônias de célula iPS derivadas em DF5SFe começaram a diferenciar somente depois de duas passagens. Seis colônias de célula iPS foram coletadas da placa primária e transferidas diretamente para DF5SFeN contendo Nodal (E8 (NODAL)). Essas células puderem ser mantidas em E8 (Nodal) por mais que 15 passagens, mantendo sua morfologia tipo célula ES similar àquela observada usando TeSRTM. As células tiveram cariótipos normais, Oct4 e SSEA4 expressos (figura 4C), e formaram teratomas em camundongos SCID 5-7 semanas depois da injeção.
[0091]Fibroblastos de prepúcio foram também reprogramados em meio E8. A expressão genética global das células iPS derivadas em meio E8 foi similar àquela das células H1 (figura 4D e E) ou células iPS derivadas nas células alimentadoras (figura 4D e F). Marcadores de pluripotência foram altamente expresso tanto em células ES quanto iPS, enquanto genes do marcador específico de fibroblasto não foram expressos (figura 4D). Também, célula iPS poderiam ser derivadas em meio E8s usando várias estratégias, por exemplo, usando vetores lentivirais ou episso- mais. Exemplo 9: Derivação das células iPS de linhagens celulares de paciente em meios sem albumina.
[0092]Para determinar se células de doadores adultos poderiam ser repro-gramadas usando vetores epissomais sem viral nos meios simplificados, dois milhões de células das linhagens celulares de paciente OAT ou PRPT8 foram eletropo- rados com combinações de plasmídeo #4 ou #6, junto com EBNA RNAm, e transferidas para duas placas de 10 cm. Para maximizar a reprogramação, meios contendo FBS foram usados para os primeiros 6 dias. As células foram mantidas a O15C5 para casar com as condições de manutenção célula de adulto regular. O meio foi então trocado de DF5SFe por mais 14-21 dias. As células de uma placa foram passadas a uma razão 1:2 em diferentes pontos de tempo. Combinação de plasmídeo #6 gerou mais colônias (aproximadamente 5 por um milhão de células) do que #4, mas a maioria das células não pareceu morfologia de célula ES de humano típica. Depois de aproximadamente 22 dias, de colônias tipo célula ES de humano apareceram na placa primária para a combinação de plasmídeo #4. Muito mais colônias tipo célula ES de humano apareceram nas placas secundárias de passagem quando a combinação de plasmídeo #6 foi usada, com uma estimativa de aproximadamente 40 colônias por milhões de células. Não foi produzida nenhuma célula iPS durante o uso de combinação de plasmídeo #4. As colônias de célula iPS emergiram no meio de outras células densamente povoadas na placa primária e não puderam crescer além de seu limite. Entretanto, colônias nas placas secundárias expandiram até grandes tamanhos adequados para isolamento da colônia. Colônias foram coletadas e diretamente transferidas para TeSRTM, e 32 colônias coletadas sobreviveram e exibiram morfologia de célula ES. Análise genética confirmou que essas colônias foram derivadas da linhagem celular OAT e exibiram um cariótipo normal.
[0093]Para melhorar a eficiência de reprogramação de célula de adulto, TGF-β foi adicionado aos meios de reprogramação. Clones de iPS não foram aumentados significativamente, entretanto, o número total de colônias aumentou significativamente. Quando TGF-β foi removido dos meios no momento da remoção de hidrocortisona, o número de colônias de célula iPS aumentou significativamente, sugerindo que TGF-β suporta reprogramação nos primeiros poucos dias do processo.
[0094]Muitos clones não iPS aparentemente podem gerar clones iPS depois da passagem secundária, sugerindo que derivação de célula iPS pode ser inibida por células em volta. Diversos reagentes foram testados quanto a sua capacidade para superar este efeito. Butirato melhorou a eficiência de reprogramação. Um aumento aproximadamente 10 vezes na eficiência de reprogramação das células do prepúcio foi observado tanto quando TGF-β quanto butirato foram adicionados aos meios (figura 5B). TGF-β pareceu exibir seus efeitos positivos durante estágios iniciais de reprogramação, enquanto butirato teve um papel positivo no estágio posterior. Adição de TGF-β levou a maiores números de colônias durante a reprogramação, mas o número de colônias de célula iPS verdadeira permaneceu baixo. Butirato não aumentou o número de colônias, mas melhorou a razão de célula iPS verdadeira para colônias de célula significativamente não iPS (figura 5C).
[0095]O uso de TGF-β e butirato permitiu reprogramação bem sucedida das células somáticas de um indivíduo adulto em condições completamente definidas usando o sistema de vetor epissomal. As células iPS foram derivadas de três linhagens de célula de adulto somática independente (OAT, GRC M1-29, e PRPF8-2) a uma eficiência de 1-100 de 1 x 106 PRPF8-2 células e 1 de 100.000 células (GRC 129). Exemplo 10. Derivação das células iPS de um indivíduo adulto em condições completamente definidas.
[0096]Uma biópsia foi feita da pele de um doador adulto macho, lavada diversas vezes com solução salina tamponada de Hank (HBSS) contendo agentes antibióticos e antimicóticos, e incubada em 2 mL de 0,25 % de tripsina/EDTA (Tabela 4) ou TrypLE selecionado a 4 °C por toda a noite. A amostra foi enxaguada três vezes, usando inibidor de tripsina (Tabela 4) depois da segunda rinsagem. A derme e epiderme foram separadas usando fórceps estéril. A derme foi cortada em pequenas peças e incubada em 0,75 mL de solução de enzima (Tabela 4) com enzimas definidas à temperatura ambiente (placa de 12 poços ou 24 poços) por 3 horas. Depois de aproximadamente 35 minutos, estruturas do tecido começaram a quebrar. Um volume igual de meio com 10 ug/mL polivinilpirrolidona (PVP) foi selecionado e o tecido foi mecanicamente dissociado pipetando para cima e pra baixo cerca de 10 vezes. A amostra foi centrifugada a 400 g por 10 minutos à temperatura ambiente e lavada duas vezes com meios frescos/PVP. O sobrenadante foi descartado, o precipitado ressuspenso em 3 mL de meio completo, e 1 mL da suspensão da célula foi transferido para os poços de placas de 6 poços revestidas com 3 μg/poço de vitro- nectina. As placas foram incubadas com 5 % de CO2 a 37°C e o meio foi trocado a cada dia. Fibroblastos aderiram nas placas enquanto células não aderentes e fragmentos foram removidos quando o meio foi trocado. Tabela 4. Reagentes e procedimentos para digestão de espécime
Figure img0007
[0097]Depois de 20 dias, os plasmídeos de reprogramação foram introduzidos nos fibroblastos usando eletroporação. Nos próximos 25 dias, múltiplas colônias iPS emergiram e foram coletadas para análise adicional. Eficiência de reprogramação foi cerca de 10 de 1 milhão fibroblastos eletroporados, sem passagem secundária. As células iPS foram adicionalmente passadas para isolar linhagens celulares sem vetor. Exemplo 11. Derivação das células iPS de um indivíduo adulto em meios sem albumina sem passagem secundária.
[0098]Fibroblastos de adulto foram reprogramados em E8 (DMEM/F12 su-plementado com insulina, transferrina, selênio, ácido L-ascórbico, FGF2, e TGF- β (ou NODAL)) seguindo o protocolo geral ilustrado na figura 6A. As linhagens celulares iPS reprogramados mantidas em E8 por mais que 20 passagens continuaram a expressar marcadores de pluripotência OCT4 e SSEA4 (figura 6B).
[0099]O meio E8 melhorou significativamente a eficiência de reprogramação comparada com as eficiências de reprogramação usando células alimentadoras de fibroblasto de camundongo (MEF) (figura 7A) ou TeSRTM (figura 7B). Butirato (100 μM) adicionalmente melhorou a eficiência de reprogramação na presença de TGF-β (E8) ou na ausência de TGF-β (E8 sem de TGF-β, isto é, DF5SFe ) (figura 7C). Exemplo 12. Criopreservação das células tronco pluripotentes em um meio sem albumina.
[00100]Células pluripotentes foram cultivadas em placas de 6 poços em meio E8, essencialmente da maneira descrita anteriormente. O meio de cultura foi aspirado de cada poço e as células foram lavadas duas vezes com 1,0 mL de EDTA/PBS (0,5 mM de EDTA em PBS, osmolaridade 340). As células foram então incubadas a 37 °C em EDTA/PBS por 5 minutos. O PBS/EDTA foi removido, e as células foram rapidamente rinsadas com 1 mL de meio E8. As células foram então ressuspensas em um volume igual de 20 % de sulfóxido de dimetila (DMSO) e meio E8 (concentração final: 10 % de DMSO em meio E8), separadas em alíquotas em frascos criogênicos, e congeladas a -80 °C usando um CRYOBOXTM. As células foram subsequentemente levadas para um tanque de nitrogênio líquido.
[00101]A invenção foi descrita junto com o que é atualmente considerado as modalidades mais práticas e preferidas. Entretanto, a presente invenção foi apresentada a título de ilustração e não deve ser limitada às modalidades reveladas. Dessa maneira, versados na técnica perceberão que a invenção deve englobar todas as modificações e arranjos alternativos no espírito e escopo da invenção conforme apresentado nas reivindicações anexas.

Claims (9)

1. Método para derivar uma célula tronco pluripotente induzida (iPS) humana sob condições definidas, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de: reprogramar uma célula somática em um meio definido sem albumina que compreende água, sais, aminoácidos, vitaminas, glicose, insulina, um FGF, selênio, transferrina e um de TGF-β e NODAL, cada qual em uma quantidade suficiente para suportar a reprogramação de células somáticas para derivar uma célula iPS humana.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de reprogramação compreende colocar a célula em contato com TGF-β por 5 a 10 dias.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente as etapas de: remover o TGF-β depois de 5 a 10 dias; e colocar a célula em contato com um meio que consiste essencialmente em: água, sais, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carbono, insulina, um FGF, selênio e transferrina.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de reprogramação compreende colocar a célula em contato com hidro- cortisona.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de reprogramação compreende colocar a célula em contato com butira- to.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula iPS humana é derivada sob condições sem xeno.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de reprogramação compreende usar um vetor viral.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de reprogramação compreende usar um vetor epissomal.
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