BR122019021594B1

BR122019021594B1 - Oleosina modificada célula hospedeira, corpo oleoso e seu método de produção, emulsão, ração animal, e método para produção de uma planta que acumula mais óleo que uma planta controle adequada

Info

Publication number: BR122019021594B1
Application number: BR122019021594-4A
Authority: BR
Inventors: Nicholas John Roberts; Richard William Scott; Somrutai Winichayakul; Marissa Roldan
Original assignee: Agresearch Limited
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2021-10-05
Also published as: AU2010313865B2; AR078858A1; EP2494051A1; AU2010313865A1; AR121305A2; WO2011053169A1; CA2778150A1; ES2574082T3; EP2494051B1; CN102741411B; JP2013509178A; CA2778150C; EP2494051A4; NZ599429A; BR112012011464A2; ZA201203085B; CL2012001068A1; MX2012004677A; UY32994A; JP5934101B2

Abstract

a invenção refere-se a oleosinas modificadas, incluindo pelo menos uma cisteína introduzida artificialmente. a invenção refere-se a métodos e composições para produzir oleosinas modificadas. a invenção refere-se a polinucleotídeos que codificam as oleosinas modificadas e as construções e as células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos. a invenção também se refere a métodos para produzir corpos oleosos, compreendendo as oleosinas modificadas, in vivo e in vitro. a invenção também se refere a métodos para produzir óleo nas células hospedeiras e nas plantas. a invenção também se refere à alimentação para animal e fontes de biocombustível compreendendo os corpos oleosos, as células hospedeiras ou as plantas da invenção.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] Dividido do BR112012011464-6, depositado em 29.10.2010.

[002] A invenção refere-se às composições e aos métodos para a produção e a modificação de corpos oleosos em vários tipos de células hospedeiras.

ANTECEDENTES

[003] Na natureza, as angiospermas armazenam energia de for ma eficiente em suas sementes através da acumulação de óleo, no-meadamente o triacilglicerol (TAG), e o armazena em corpos oleosos discretos incorporando uma monocamada de proteína fosfolipídica em torno dos corpos oleosos. Estas culturas de sementes têm sido usadas em uma variedade de aplicações agrícolas como alimentos e, mais recentemente, também como uma fonte de matéria-prima para bio- combustíveis. Em uma base por peso, os lipídios têm aproximadamente o dobro do teor de energia das proteínas ou dos carboidratos e como tal, o foco substancial tem sido colocado sobre o aumento do teor de óleo de várias espécies, mais notavelmente as plantas. Além do aspecto da energia, os próprios corpos oleosos também têm propriedades únicas e formam a base para um número de aplicações biotec- nológicas incluindo, mas não se limitando a, purificação de proteínas recombinantes, formação de complexos de proteínas multiméricas, emulsificação e a entrega de bioativos.

[004] Infelizmente, as sementes de plantas representam uma percentagem muito pequena da biomassa total das plantas e com a demanda para melhorar a produtividade agrícola e as energias alterna- tivas, é reconhecido que a produção atual de óleo de um número de culturas de sementes consagradas é insuficiente. Os esforços de pesquisa têm focalizado não só em aumentar a produtividade da produção de óleo dentro de sementes de plantas, mas também da produção de óleo em outros tipos de células e espécies.

[005] Cruzamento e mutagênese tradicional ofereceram sucessos incrementais nesta área, no entanto a engenharia genética tem feito progressos extensos na modificação de organismos para produzir níveis elevados de óleo. Embora certos grupos tenham trabalhado ao longo de várias partes da via de síntese de óleo para regular positivamente a produção de óleo no interior da semente, outros grupos têm focado no aumento de óleo em tipos de células que representam uma porção maior da biomassa.

[006] Enquanto a engenharia genética tem feito algum progresso no aumento do teor de óleo em certos alvos, desafios importantes ainda permanecem. O aumento adicional da produtividade pode ser feito ainda na produção de corpos oleosos na semente e os meios para produzir corpos oleosos semelhantes aos de uma semente de planta em outros tipos de células e espécies ainda tem de ser alcançados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção proporciona composições e métodos para produzir corpos oleosos com graus variados de estabilidade. A invenção envolve a produção de oleosinas modificadas com resíduos de cisteína introduzidos artificialmente. Os resíduos de cisteína introduzidos artificialmente são de preferência introduzidos nos braços hi- drofílicos N- e C- terminais das oleosinas modificadas.

[008] A expressão das oleosinas modificadas permite a criação de corpos oleosos estáveis para além do tecido reprodutivo das plantas vasculares em tipos de células novas e até mesmo outras espécies. Quando combinada com uma enzima de síntese de TAG, a in- venção leva à acumulação e ao armazenamento de TAG em células eucarióticas como corpos oleosos estáveis. Comparada com uma célula não modificada ou mesmo uma expressando apenas uma enzima de síntese TAG, a invenção permite a acumulação de TAG em níveis excessivos obtidos por outros meios. Por exemplo, a invenção tem mostrado que pode acumular níveis mais elevados de corpos oleosos estáveis para além da semente, na porção vegetativa de plantas vasculares.

[009] As plantas com aumento dos níveis de TAG em seus teci dos vegetativos fornecem uma fonte de energia valiosa, tanto para aplicações de matéria-prima animal como para matéria-prima biocom- bustível.

[0010] Além disso, as oleosinas modificadas recombinantes purifi cadas a partir de uma célula hospedeira (tais como E. coli, P. pastoris, S. ceriviseae, Dunaliella, C. reinhardtii) podem ser usadas para gerar corpos oleosos artificiais. As oleosinas modificadas em corpos oleosos artificiais, ou aquelas células transformadas de forma purificada, podem, opcionalmente, ser feitas para reticulação através dos resíduos de cisteína na oleosina modificada. O grau de reticulação pode ser controlado manipulando o ambiente redox. O grau de reticulação também pode ser adaptado pela alteração do número de cisteínas nas oleosinas modificadas.

[0011] Usando as combinações destas técnicas, os corpos oleo sos formados com as oleosinas modificadas podem ser adaptados para as suas propriedades de emulsificação, para regular a estabilidade térmica, a estabilidade química e a resistência à peptidase.

[0012] As oleosinas modificadas também podem ser fundidas com uma proteína de interesse, para formar uma proteína de fusão. A proteína de fusão (oleosina modificada mais proteína de interesse) pode ser expressada de forma recombinante em uma célula ou um orga- nismo. Desta forma, os corpos oleosos contendo as proteínas de fusão expressadas podem ser usados para purificar e distribuir a proteína de interesse, para uma variedade de aplicações.

[0013] Além disso, os corpos oleosos podem proteger, ou pelo menos atrasar, a degradação e/ou a bio-hidrogenação de TAG dentro do estômago e/ou no rúmen de um animal, permitindo que os lipídios individuais intactos do TAG sejam absorvidos pelo animal no intestino. Portanto, a invenção também é útil em termos de ingestão alimentar de um animal, particularmente através da expressão das oleosinas modificadas em plantas. Polinucleotídeos que codificam oleosinas modificadas com cisteínas introduzidas artificialmente

[0014] No primeiro aspecto, a invenção proporciona um polinucleo- tídeo codificando uma oleosina modificada, incluindo, pelo menos, uma cisteína introduzida artificialmente. O termo oleosina também inclui esteroleosina e caleosina. A oleosina modificada pode, portanto, ser selecionada a partir de uma oleosina modificada, uma caleosina modificada ou uma esteroleosina modificada. Em uma modalidade, a oleosina modificada é uma oleosina modificada. Em outra modalidade, a oleosina modificada é uma caleosina modificada. Em outra modalidade, a oleosina modificada é uma esteroleosina modificada. Exemplos de cada tipo de oleosina (oleosina, caleosina e esteroleosina) são descritos aqui.

[0015] Em uma modalidade, a oleosina modificada inclui pelo me nos duas cisteínas, pelo menos uma das quais é artificialmente introduzida. Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada inclui pelo menos de duas a pelo menos 13 (isto é, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12, 13, 14 ou mais) cisteínas artificialmente introduzidas. Em uma modalidade, as cisteínas são artificialmente introduzidas na região hidrofí- lica N-terminal da oleosina, ou na região hidrofílica C-terminal da oleo- sina. Em ainda uma modalidade, as oleosinas modificadas incluem pelo menos uma cisteína na região hidrofílica N-terminal e pelo menos uma cisteína na região hidrofílica C-terminal. Em outra modalidade, as cisteínas estão distribuídas substancialmente uniformes ao longo das regiões hidrofílicas N-terminal e C-terminal da oleosina.

[0016] Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo codifica uma proteína de fusão incluindo a oleosina modificada fundida com uma proteína de interesse. Construções

[0017] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção genética compreendendo um polinucleotídeo da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção de expressão compreendendo um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo na construção está operativamente ligado a uma sequência promotora. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em um tecido vegetativo de uma planta. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma semente de uma planta. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo no pólen de uma planta. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula de E. coli. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula de levedura. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a ex-pressão do polinucleotídeo em uma célula de algas.

[0018] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma construção que contém um polinucleotídeo que codifica uma proteína lipídica neutra modificada. Em uma modalidade, a construção também contém um segundo polinucleotídeo que codifica uma enzima de síntese de tria- cilglicerol (TAG). Em várias modalidades, a construção pode ser ligada a uma sequência promotora capaz de dirigir a sua expressão em diferentes células hospedeiras. Como tal, a invenção também proporciona o uso de construções para induzir uma célula hospedeira para expressar uma oleosina modificada e/ou uma enzima de síntese de TAG. Em várias modalidades, a construção expressando uma oleosina modificada e a construção expressando uma enzima de síntese de TAG podem ser dirigidos por promotores iguais ou diferentes. Em ainda outra modalidade, a construção está localizada em uma posição e orientação adequada de um promotor endógeno funcional adequado de tal modo que a expressão da construção ocorra. Em várias modalidades, a construção pode ser expressada em uma célula bacteriana, vegetal, fúngica ou de algas. Em uma modalidade em que a construção é expressada em uma célula vegetal, a célula pode ser vegetativa, de sementes, de pólen ou de tecido de fruta. Células hospedeiras

[0019] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula hos pedeira compreendendo uma construção da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira geneticamente modificada para compreender um polinucleotídeo da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira geneticamente modificada para expressar um polinucleotídeo da invenção. Célula hospedeira também expressa uma enzima de síntese de TAG

[0020] Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é tam bém geneticamente modificada para expressar uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG). Em outra modalidade, a célula hospedeira é geneticamente modificada para incluir uma sequência de ácido nuclei- co que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG). Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira compreende uma construção de expressão incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG).

[0021] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico está opera tivamente ligado a uma sequência promotora. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em um tecido vegetativo de uma planta. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em uma semente de uma planta. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico no pólen de uma planta.

[0022] Em uma modalidade adicional a sequência promotora é ca paz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula de E. coli. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula de levedura. Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula de algas. Tipos de célula hospedeira

[0023] A célula hospedeira pode ser qualquer tipo de célula. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é uma célula eucarióti- ca. Em uma modalidade, a célula hospedeira é selecionada a partir de uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula de fungo, uma célula de inseto, células de alga e uma célula de planta. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula bacteriana. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula fúngica. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de inseto. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de algas. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é uma célula de planta. Plantas

[0024] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta compreendendo uma célula de planta da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta compreendendo uma construção da presente invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta geneticamente modificada para compreender um polinucleotí- deo da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta geneticamente modificada para expressar um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade adicional, a planta expressa uma oleo- sina modificada codificada pelo polinucleotídeo da invenção.

[0025] Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada é ex pressada em um tecido vegetativo da planta. Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada é expressada em uma semente da planta. Em uma modalidade adicional a oleosina modificada é expressada no pólen da planta. Planta também expressa uma enzima TAG

[0026] Em uma modalidade adicional, a planta também é geneti camente modificada para expressar uma enzima de síntese de triacil- glicerol (TAG). Em uma modalidade adicional, a enzima se síntese de triacilglicerol (TAG) é expressada no mesmo tecido que a oleosina modificada.

[0027] Em uma modalidade adicional, a planta é geneticamente modificada para incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG). Em uma modalidade adicional, a planta compreende uma construção de expressão incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG).

[0028] Em uma modalidade adicional, o ácido nucleico está opera tivamente ligado a uma sequência promotora.

[0029] Em uma modalidade adicional, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em um tecido vegetativo de uma planta. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nu- cleico em uma semente de uma planta. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico no pólen de uma planta. Polipeptídeos de oleosina modificados com cisteínas introduzidas arti-ficialmente

[0030] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma oleosina modificada, incluindo, pelo menos, uma cisteína introduzida artificialmente. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma oleosina modificada codificada por um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, a oleosina modificada inclui pelo menos duas cisteínas, pelo menos uma das quais é introduzida artificialmente. Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada inclui pelo menos duas a, pelo menos, 13 (isto é, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12, 13, 14 ou mais) cisteínas introduzidas artificialmente.

[0031] Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada inclui pelo menos uma cisteína na região hidrofílica N-terminal, e pelo menos uma cisteína na região hidrofílica C-terminal. Em uma modalidade preferida, as cisteínas são artificialmente introduzidas na região hidrofílica N-terminal da oleosina, ou na região hidrofílica C-terminal da oleosina. Preferivelmente, as cisteínas estão distribuídas substancialmente uniformes entre a região hidrofílica N-terminal e C-terminal da oleosina. Proteínas de fusão com oleosinas modificadas, incluindo cisteínas in-troduzidas artificialmente

[0032] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo uma oleosina modificada da invenção e uma proteína de interesse. A proteína de fusão compreende assim uma porção oleosina modificada, e uma proteína da porção de interesse. Corpos oleosos compreendendo oleosinas modificadas

[0033] Em outro aspecto, a invenção proporciona um corpo oleoso compreendendo uma oleosina modificada da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona um corpo oleoso compreendendo pelo menos duas oleosinas modificadas da invenção. Em uma modalidade, pelo menos, duas das oleosinas modificadas são reticuladas umas às outras através de pontes de dissulfeto entre os resíduos de cisteína nas oleosinas modificadas. Em ainda outra modalidade, as oleosinas modificadas são reticuladas através dos resíduos de cisteína introduzidos artificialmente nas oleosinas modificadas.

[0034] Em uma modalidade adicional, o corpo oleoso compreende adicionalmente uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão inclui uma oleosina fundida com uma proteína de interesse. Nesta modalidade, a oleosina na proteína de fusão não necessita incluir uma cisteína introduzida artificialmente. De preferência, a oleosina na proteína de fusão não inclui uma cisteína introduzida artificialmente.

[0035] Os corpo oleoso desta modalidade são úteis para a purifi cação e distribuição da proteína de interesse, tal como discutido em Roberts et al., (2008).

[0036] No entanto, nesta modalidade, é possível tirar vantagem da opção para variar a estabilidade/integridade do corpo oleoso fornecido pela presença das oleosinas modificadas no corpo oleoso, permitindo assim uma purificação e procedimentos de distribuição mais rigorosos. Corpos oleosos compreendendo proteínas de fusão com oleosina modificada

[0037] Em outro aspecto, a invenção proporciona um corpo oleoso compreendendo uma proteína de fusão da invenção, a proteína de fusão compreendendo uma oleosina modificada da invenção e uma proteína de interesse. A proteína de fusão compreende assim uma porção oleosina modificada, e uma proteína da porção de interesse.

[0038] Em uma modalidade, o corpo oleoso compreende pelo me nos duas proteínas de fusão da presente invenção.

[0039] Em uma modalidade, pelo menos duas das proteínas de fusão são reticuladas umas às outras através de pontes de dissulfeto entre os resíduos de cisteína na porção oleosina modificada das proteínas de fusão. Em uma modalidade, as proteínas de fusão são reticuladas através dos resíduos de cisteína introduzidos artificialmente na porção oleosina modificada das proteínas de fusão.

[0040] Em uma modalidade adicional, o corpo oleoso compreen de pelo menos uma oleosina modificada da invenção. Em outra modalidade, pelo menos uma proteína de fusão é reticulada a pelo menos uma oleosina modificada, por meio de uma cisteína na porção oleosina modificada da proteína de fusão e uma cisteína na oleosina modificada.

[0041] Novamente, os corpos oleosos desta modalidade são úteis para a purificação e distribuição da proteína de interesse, tal como discutido em Roberts et al., (2008).

[0042] No entanto, nesta modalidade, é possível tirar vantagem da opção para variar a estabilidade/integridade do corpo oleoso fornecido pela presença das oleosinas modificadas no corpo oleoso, permitindo assim uma purificação e procedimentos de distribuição mais rigorosos. Emulsão

[0043] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma emulsão compreendendo uma oleosina modificada da invenção. Em uma modalidade, a emulsão compreende a oleosina modificada e um veículo adequado. O veículo pode ser tamponado com o ambiente redox adequado para reter o grau desejado de reticulação das oleosinas.

[0044] Para ressuspender a oleosina modificada no veículo pode exigir sonicação ou homogeneização de alta pressão, seguida pela exposição às condições oxidantes apropriadas. Composições

[0045] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo uma oleosina modificada da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende a oleosina modificada e um veículo adequado. O veículo pode ser tamponado com o ambiente redox adequado para atingir o grau desejado de reticulação das oleosinas modificadas.

[0046] Para ressuspender as oleosinas modificadas no veículo po dem ser exigidas sonicação ou homogeneização de alta pressão, seguida pela exposição às condições oxidantes apropriadas.

[0047] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo um corpo oleoso da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende o corpo oleoso e um veículo adequado. O veículo pode ser tamponado com o ambiente redox adequado para atingir o grau desejado de reticulação das oleosinas modificadas. Em uma modalidade adicional, a invenção proporciona uma composição formulada para aplicação dérmica compreendendo um corpo oleoso da invenção. Plantas e suas partes compreendendo corpo oleosos da invenção

[0048] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta, ou parte desta, que compreende um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona um tecido vegetativo de uma planta, compreendendo um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma semente de uma planta, compreendendo um corpo oleoso da invenção. Alimentação para animal compreendendo corpos oleosos da invenção

[0049] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma alimentação para animais que compreende um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma alimentação para animais que compreende uma planta, ou parte dela, da invenção. Métodos para produzir corpos oleosos

[0050] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método pa ra produzir um corpo oleoso, o método compreendendo a etapa de combinar: a) pelo menos duas oleosinas modificadas, cada uma incluindo pelo menos uma cisteína introduzida artificialmente, b) triacilglicerol, e c) fosfolipídio.

[0051] Em uma modalidade, as oleosinas modificadas incluem ca da uma, pelo menos, duas cisteínas, pelo menos uma das quais é introduzida artificialmente. Em ainda uma modalidade, as oleosinas modificadas incluem cada uma, pelo menos uma cisteína na região hidro- fílica N-terminal da oleosina, e pelo menos uma cisteína na região hi- drofílica C-terminal da oleosina.

[0052] Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada inclui pelo menos de duas a, pelo menos, 13 (isto é, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12, 13, 14 ou mais) cisteínas introduzidas artificialmente.

[0053] Em uma modalidade, as cisteínas são artificialmente intro duzidas na região hidrofílica N-terminal das oleosinas, ou na região hidrofílica C-terminal das oleosinas. Em ainda uma modalidade, as cis- teínas estão distribuídas substancialmente uniformes entre a região hidrofílica N-terminal e C-terminal das oleosinas. Em ainda outra modalidade, as oleosinas modificadas são reticuladas por meio de pontes de dissulfeto entre os resíduos de cisteína nas oleosinas. Em ainda outra modalidade, as oleosinas modificadas são reticuladas entre os resíduos de cisteína introduzidos artificialmente nas oleosinas.

[0054] Em uma modalidade, as oleosinas modificadas são parte de proteínas de fusão em que as proteínas de fusão compreendem uma oleosina modificada e uma proteína de interesse.

[0055] Em uma modalidade, o método compreende a etapa adicional de regular o grau de reticulação das oleosinas modificadas no corpo oleoso ao controlar o ambiente redox do corpo oleoso produzido. Todos os componentes combinados in vivo (corpos oleosos in vivo)

[0056] Em uma modalidade, os componentes de a), b) e c) são combinados dentro de uma célula hospedeira. Nesta modalidade, as oleosinas modificadas são, de preferência, expressadas na célula hospedeira.

[0057] A célula hospedeira é preferivelmente geneticamente modi ficada para expressar as oleosinas modificadas.

[0058] A célula hospedeira preferivelmente compreende uma construção da presente invenção. A célula hospedeira é de preferência geneticamente modificada para compreender um polinucleotídeo da invenção. A célula hospedeira é preferivelmente geneticamente modificada para expressar um polinucleotídeo da invenção. Célula hospedeira também expressa uma enzima de síntese de TAG

[0059] Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é tam bém geneticamente modificada para expressar uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG). Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira compreende uma construção de expressão incluindo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de tria- cilglicerol (TAG).

[0060] Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico está operativamente ligada a uma sequência promotora. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em um tecido vegetativo de uma planta. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico em uma semente de uma planta. Em uma modalidade, a sequência promotora é capaz de dirigir a expressão da sequência de ácido nucleico no pólen de uma planta.

[0061] Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é tam bém geneticamente modificada para incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG). Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira é também geneticamente modificada para expressar uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG).

[0062] Será entendido pelos especialistas na técnica que o polinu- cleotídeo que codifica a oleosina modificada e a sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG) podem ser colocados na mesma construção ou em construções separadas para serem transformadas na célula hospedeira. A expressão de cada uma pode ser dirigida por promotores iguais ou diferentes, que podem ser incluídos na construção para ser transformada. Será também entendido pelos especialistas na técnica que, alternativamente, o polinucleotídeo e o ácido nucleico podem ser transformados para dentro da célula sem um promotor, mas a expressão do polinucleotídeo e do ácido nucleico pode ser dirigida por um promotor ou promotores endógenos para a célula transformada.

[0063] Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira faz par te de um organismo. Em uma modalidade preferida, o organismo é uma planta.

[0064] Em outra modalidade, o óleo é produzido nos tecidos vege- tativos da planta.

[0065] Em uma modalidade do método, a planta acumula cerca de 50% a cerca de 400% mais lipídios do que uma planta de controle adequada. Em uma modalidade adicional do método, a planta acumula cerca de 100% a cerca de 300% mais lipídios do que uma planta de controle adequada. Em uma modalidade adicional do método, a planta acumula cerca de 150% a cerca de 250% mais lipídio do que uma planta de controle adequada. As plantas de controle adequadas incluem versões não transformadas ou do tipo selvagem de planta da mesma variedade e ou espécies como a planta transformada usada no método da invenção.

[0066] Em uma modalidade adicional, a planta é processada em um alimento para animal.

[0067] Em uma modalidade adicional, a planta é transformada em um estoque de alimentação de biocombustível. Etapa adicional do método para purificar os corpos oleosos produzidos in vivo

[0068] Em uma modalidade, o método inclui a etapa adicional de purificação dos corpos oleosos a partir da célula ou organismo. Etapa adicional do método para variar o grau de reticulação de corpos oleosos purificados produzidos in vivo

[0069] Em ainda outra modalidade, o método compreende a etapa adicional de regular o grau de reticulação de oleosinas modificadas nos corpos oleosos purificados produzidos in vivo, ao controlar o ambiente redox dos corpos oleosos purificados. Em uma modalidade, o grau de reticulação é aumentado pelo uso de um ambiente oxidante. Em outra modalidade, o grau de reticulação é diminuído pelo uso de um ambiente redutor. Componentes combinados in vitro (corpos oleosos in vitro/ artificiais)

[0070] Em certas modalidades, os componentes de a), b) e c) po dem ser combinados in vitro.

[0071] Em uma modalidade, a oleosina modificada de a) foi expres sada de forma recombinante e purificada de uma célula hospedeira da invenção, antes de ser combinada com os componentes de b) e C). Etapa adicional do método para variar grau de reticulação de corpos oleosos in vitro/ artificiais

[0072] Em outra modalidade, o método compreende a etapa adici onal de regular o grau de reticulação, controlando o ambiente redox em que os componentes de a), b) e c) são combinados. Em uma modalidade, o grau de reticulação é aumentado pela combinação dos componentes de a), b) e c) em um ambiente oxidante. Em ainda outra modalidade, o grau de reticulação é diminuído pela combinação dos componentes de a), b) e c) em um ambiente redutor. O grau de reticu- lação também pode ser regulado depois de o corpo oleoso ser formado, através do controle do ambiente redox no qual o corpo oleoso está contido.

[0073] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para produzir uma planta que acumule mais óleo que uma planta de controle adequada, o método compreendendo proporcionar uma planta transformada com um polinucleotídeo da invenção que expressa uma oleosina modificada codificada pelo polinucleotídeo.

[0074] Em uma modalidade, a planta também é transformada com um polinucleotídeo que codifica uma enzima de síntese de TAG para expressar a enzima de síntese de TAG e, assim, sintetizar o TAG.

[0075] Em uma modalidade, a planta é produzida pela transforma ção de uma única planta, ou célula de planta, com o polinucleotídeo de qualquer uma da invenção e do polinucleotídeo codificando a enzima de síntese de TAG.

[0076] Em uma modalidade adicional, a planta é produzida pelo cruzamento de uma primeira planta transformada com um polinucleo- tídeo de qualquer uma da invenção, com a segunda planta transformando o polinucleotídeo codificando a enzima de síntese de TAG, para produzir a planta transformada com o polinucleotídeo da invenção e um polinucleotídeo que codifica a enzima de síntese de TAG.

[0077] Em uma modalidade adicional o óleo é TAG. Em ainda ou tra modalidade, o óleo é produzido nos tecidos vegetativos da planta.

[0078] Em uma modalidade do método, a planta acumula cerca de 50% a cerca de 400% mais lipídios do que uma planta de controle adequada. Em outra modalidade do método, a planta acumula cerca de 100% a cerca de 300% mais lipídios que uma planta de controle adequada. Em uma modalidade adicional do método, a planta acumula cerca de 150% a cerca de 250% mais lipídios que uma planta de controle adequada.

[0079] Em uma modalidade adicional, a planta é processada em uma alimentação para animal.

[0080] Em uma modalidade adicional, a planta é transformada em um estoque de alimentação de biocombustível.

[0081] Em um aspecto, a invenção proporciona ainda um método para produzir um corpo oleoso em uma célula hospedeira, o método compreendendo: a) introduzir em uma célula hospedeira pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica uma oleosina modificada da invenção; e b) a cultura da célula hospedeira a fim de expressar a oleo- sina modificada.

[0082] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um méto do para produzir um corpo oleoso em uma célula hospedeira, o método compreendendo: a) introduzir em uma célula hospedeira pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica uma oleosina modificada da invenção e uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de TAG; e b) a cultura da célula hospedeira a fim de expressar a oleo- sina modificada e a enzima de síntese de TAG.

[0083] A célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira, tal como descrito aqui. Corpos oleosos

[0084] Em um aspecto, a invenção proporciona ainda um corpo oleoso produzido por um método da invenção. Composições

[0085] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo um corpo oleoso da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende o corpo oleoso e um veículo adequado. O veículo pode ser tamponado para proporcionar um ambiente redox apropriado para reter o grau desejado de reticulação da oleosina modificada. Em uma modalidade adicional, a invenção proporciona uma composição formulada para aplicação dérmica compreendendo um corpo oleoso da invenção. Plantas e partes destas compreendendo corpos oleosos da invenção

[0086] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma planta, ou parte dela, que compreende um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona um tecido vegetativo de uma planta, compreendendo um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma semente de uma planta, compreendendo um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona o pólen de uma planta, compreendendo um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona um fruto ou corpo de frutificação, de uma planta, compreendendo um corpo oleoso da invenção. Alimentação animal compreendendo corpos oleosos da invenção

[0087] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma alimentação animal que compreende um corpo oleoso da invenção. Em outro aspecto, a invenção proporciona uma alimentação animal que compreende uma planta, ou parte dela, da invenção.

[0088] Em uma modalidade, a alimentação é adequada para um animal mamífero, incluindo seres humanos. Em uma modalidade adicional, a alimentação é adequada para mamíferos não humanos. Animais preferidos incluem animais de fazenda, tais como, mas não limitado a, vacas, ovelhas, cavalos, cabras, porcos, galinhas, e similares. Plantas

[0089] As oleosinas modificadas podem ser oleosinas modificadas de ocorrência natural. As plantas a partir das quais as sequências de oleosinas não modificadas são derivadas podem ser de qualquer espécie de planta que contém oleosinas e sequências polinucleotídicas que codificam oleosinas.

[0090] As células de plantas, em que as oleosinas modificadas são expressadas, podem ser de qualquer espécie de planta. As plantas, em que as oleosinas modificadas são expressadas, podem ser de qualquer espécie de planta.

[0091] Em uma modalidade, a célula de planta ou a planta é deri vada de uma espécie de planta gimnosperma.

[0092] Em uma modalidade adicional, a célula de planta ou a plan ta é derivada de uma espécie de planta angiosperma.

[0093] Em uma modalidade adicional, a célula de planta ou a plan ta é derivada de uma espécie de planta dicotiledônea.

[0094] Em uma adicional, a célula de planta ou a planta é derivada de uma espécie de plantas monocotiledônea.

[0095] Outras plantas preferidas são espécies de plantas forragei ras de um grupo constituído por, mas não se limitando, aos seguintes gêneros: Zea, Lolium, Hordium, Miscanthus, Saccharum, Festuca, Dactylis, Bromus, Thinopyrum, Trifolium, Medicago, Pheleum, Phalaris, Holcus, Glycine, Lotus, Plantago e Cichorium.

[0096] Outras plantas preferidas são as plantas leguminosas. A planta leguminosa ou parte dela pode abranger qualquer planta da família Leguminosae ou Fabaceae. Por exemplo, as plantas podem ser selecionadas a partir de leguminosas forrageiras, incluindo, alfafa, cravo-da-índia, leucena; leguminosas de grão incluindo feijão, lentilhas, tremoços, ervilhas, amendoim, soja; leguminosas floridas incluindo tremoço, legumes farmacêuticos ou industriais; e espécies de leguminosas de pousio ou de adubo.

[0097] Um gênero particularmente preferido é o Trifolium. As es- pécies de Trifolium preferidas incluem Trifolium repens; Trifolium arvense; Trifolium affine; e Trifolium occidentale. Uma espécie particularmente preferida do Trifolium é a Trifolium repens.

[0098] Outro gênero preferido é o Medicago. Espécies de Medica- go preferidas incluem Medicago sativa e Medicago truncatula. Uma espécie particularmente preferida do Medicago é a Medicago sativa, vulgarmente conhecida como alfafa.

[0099] Outro gênero preferido é o Glycine. Espécies preferidas de Glycine incluem Glycine max e Glycine wightii (também conhecido como Neonotonia wightii). Uma espécie particularmente preferida de Glycine é Glycine max, vulgarmente conhecida como soja. Uma espécie particularmente preferida de Glycine é Glycine wightii, vulgarmente conhecida como soja perene.

[00100] Outro gênero preferido é o Vigna. Uma espécie particularmente preferida de Vigna é a Vigna unguiculata, vulgarmente conhecida como feijão-fradinho.

[00101] Outro gênero preferido é o Mucana. Espécies preferidas de Mucana incluem Mucana pruniens. Uma espécie particularmente preferida de Mucana é Mucana pruniens vulgarmente conhecida como feijão-da-flórida.

[00102] Outro gênero preferido é o Arachis. A espécie Arachis particularmente preferida é a Arachis glabrata, comumente conhecida como amendoim forrageiro.

[00103] Outro gênero preferido é o Pisum. Uma espécie Pisum preferida é Pisum sativum vulgarmente conhecido como ervilha.

[00104] Outro gênero preferido é o Lotus. Espécies preferidas de Lotus incluem Lotus corniculatus, Lotus pedunculatus, Lotus glabar, Lotus tenuis e Lotus uliginosus. A espécie preferida de Lotus é a Lotus corniculatus, comumente conhecida como cornichão. Outra espécie de Lotus preferida é a Lotus glabar comumente conhecida como corni- chão de folha estreita. Outra espécie de Lotus preferida é a Lotus pe- dunculatus, comumente conhecida como cornichão grande. Outra espécie de Lotus preferida é a Lotus tenuis, comumente conhecida como cornichão magro.

[00105] Outro gênero preferido é o Brassica. Uma espécie de Brassica preferida é a Brassica oleracea, vulgarmente conhecida como couve e repolho.

[00106] Outras espécies preferidas são as culturas de óleo de semente, incluindo, mas não se limitando aos seguintes gêneros: Brassica, Carthumus, Helianthus, Zea e Sesamum.

[00107] Um gênero preferido do óleo de semente é o Brassica. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Brassica napus.

[00108] Um gênero preferido do óleo de semente é o Brassica. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Brassica oleraceae.

[00109] Um gênero preferido do óleo de semente é o Zea. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Zea mays.

[00110] Um gênero preferido do óleo de semente é o Carthamus. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Carthamus tinctorius.

[00111] Um gênero preferido do óleo de semente é o Helianthus. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Helianthus annuus.

[00112] Um gênero preferido do óleo de semente é o Zea. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Zea mays.

[00113] Um gênero preferido do óleo de semente é o Sesamum. Uma espécie de óleo de semente preferida é a Sesamum indicum.

[00114] Um gênero de silagem preferida é a Zea. Uma espécie de silagem preferida é Zea mays.

[00115] Um gênero produtor de grão preferido é o Hordeum. Uma espécie produtora de grão preferido é a Hordeum vulgare.

[00116] Um gênero de pastagem preferido é o Lolium. Uma espécie de pastagem preferida é a Lolium perenne.

[00117] Um gênero de pastagem preferido é o Lolium. Uma espécie de pastagem preferida é a Lolium arundinaceum.

[00118] Um gênero de pastagem preferido é o Trifolium. Uma espécie de pastagem preferida é a Trifolium repens.

[00119] Um gênero de pastagem preferido é o é Hordeum. Uma espécie de pastagem preferida é a Hordeum vulgare.

[00120] As plantas preferidas também incluem plantas forrageiras ou plantas de matéria-prima animal. Tais plantas incluem, mas não estão limitadas a, os seguintes gêneros: Miscanthus, Saccharum, Panicum.

[00121] Um gênero de biocombustível preferido é o Miscanthus. Uma espécie de biocombustível preferida é a Miscanthus giganteus.

[00122] Um gênero de biocombustível preferido é o Saccharum. Uma espécie de biocombustível preferida é a Saccharum officinarum.

[00123] Um gênero de biocombustível preferido é o Panicum. Uma espécie de biocombustível preferida é a Panicum virgatum.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00124] Neste relatório onde referência foi feita às especificações de patentes, a outros documentos externos, ou a outras fontes de informação, isto é, geralmente, para a finalidade de proporcionar um contexto para a discussão das características da invenção. A menos que indicado em contrário, referência a tais documentos externos não é para ser interpretada como uma admissão de que tais documentos, ou tais fontes de informação, em qualquer jurisdição, são técnica anterior, ou fazem parte do conhecimento geral comum na técnica.

[00125] O termo "compreendendo" usado nesta especificação significa "que consiste pelo menos em parte". Ao interpretar cada afirmação nesta especificação que inclui o termo "compreendendo", outras características deste ou daqueles prefaciados pelo termo também podem estar presente. Termos relacionados, tais como "compreender" e "compreende" devem ser interpretados da mesma maneira.

[00126] Em um peso para base de peso de lipídios tem aproximadamente o dobro do teor de energia de proteínas ou carboidratos. A maior parte dos lipídios do mundo é produzida pelas plantas e a forma mais densa de lipídios é um triacilglicerol (TAG). As plantas dicotiledô- neas podem acumular até aproximadamente 60% do seu peso de semente como TAG que é subsequentemente usado como uma fonte de energia para a germinação. Como tal, tem havido uma série de esforços orientados para o uso de sementes ricas em óleos para produzir sustentavelmente lipídios suficientes para matéria-prima animal e de biocombustível.

[00127] Dado que existe apenas uma quantidade limitada de TAG capaz de ser produzida por sementes, abordagens alternativas estão sendo feitas para produzir lipídio adicional (preferencialmente TAG) em tecidos vegetativos. A maioria destas abordagens tem seguido a regulação positiva ou a hiperexpressão de uma ou várias enzimas na via de Kennedy nas folhas de plantas a fim de sintetizar o TAG. Tipicamente, no entanto, a maioria dos lipídios adicionais produzidos por este método é remobilizada dentro da planta por uma combinação de lipases e e-oxidação, resultando em um aumento limitado no conteúdo lipídico (normalmente 2-4% de DM).

[00128] O TAG produzido em sementes em desenvolvimento é tipicamente contido dentro de estruturas discretas chamadas de corpos oleosos (OBs), que são altamente estáveis e permanecem como discretas organelas hermeticamente embaladas sem coalescência mesmo quando as células desidratam ou sofrem condições de congelamento (Siloto et al., 2006;. Shimada et al., 2008). Os OBs consistem em um núcleo TAG cercado por uma monocamada de fosfolipídios incorporada com emulsionantes proteináceos. O último compõe 0,53,5% do OB; deste, 80-90% é oleosina com o restante predominantemente constituído pelas proteínas de ligação de cálcio (caleosina) e de ligação de esterol (esteroleosina) (Lin e Tzen, 2004). As propriedades de emulsificação das oleosinas derivam de seus três domínios funcionais que consistem em um braço N-terminal anfipático, um núcleo hi- drofóbico central altamente conservado (~ 72 resíduos) e um braço C- terminal anfipático. Da mesma forma, tanto a caleosina como a estero- leosina possuem braços hidrofóbicos N e C-terminais e seu próprio núcleo hidrofóbico conservado.

[00129] Foi anteriormente especulado que a expressão constitutiva da oleosina ou da polioleosina (fusões em tandem cabeça à cauda de oleosinas) com as enzimas de síntese de TAG nas folhas resultaria na formação de corpos oleosos estáveis levando à acumulação do TAG. Foi subsequentemente descoberto, no entanto, que a oleosina e a po- lioleosina são ineficazes e promovem a acumulação de TAG quando coexpressadas com DGAT1 em folhas de plantas (Roberts et al., dados não publicados).

[00130] A presente invenção proporciona oleosinas modificadas que contêm um ou mais resíduos de cisteína introduzidos artificialmente. O encapsulamento dos lipídios neutros por oleosinas contendo cis- teínas modificadas fornece um mecanismo alternativo para acumular quantidades apreciáveis de TAG em folhas sem o requisito para esperar até a senescência e sem produzir fenótipos extremos. Além disso, a oleosina modificada tem um número de outras aplicações envolvendo a modificação da estabilidade do OB, propriedades de emulsão, bem como a geração e purificação de proteínas recombinantes. Corpos oleosos

[00131] Os OBs geralmente variam de 0,5-2,5 μm de diâmetro e são constituídos por um núcleo TAG cercado por uma monocamada fosfolipídica incorporada com emulsionantes proteináceos - predominantemente oleosinas (Tzen et al., 1993; Tzen, et al 1997). Os OBs consistem apenas de 0,5-3,5% de proteína; deste, 80-90% é oleosina com o restante predominantemente constituído pelas proteínas de ligação de cálcio (caleosina) e de ligação de esterol (esteroleosina) (Lin e Tzen, 2004). A proporção de oleosina para TAG no interior da célula da planta influencia o tamanho e o número de corpos oleosos no interior da célula (Sarmiento et al., 1997; Siloto et al., 2006).

[00132] Enquanto os OBs são produzidos naturalmente predominantemente nas sementes e no pólen de muitas plantas, eles também são encontrados em alguns outros órgãos (por exemplo, tubérculos específicos).

[00133] As oleosinas são proteínas relativamente pequenas (15 24 kDa) que são embebidas na superfície dos OBs. Estabilidade do corpo oleoso

[00134] A adequação dos corpos oleosos e dos corpos oleosos artificiais para as aplicações discutidas acima, entre outros, é limitada pelo menos, em parte, pela sua estabilidade. Uma abordagem para tratar a estabilidade do corpo oleoso foi gerar corpos oleosos compreendendo a assim chamada polioleosina. A polioleosina é a fusão cabeça à cauda de duas ou mais unidades de oleosinas (Roberts et al., 2008). Alterando o número de unidades de oleosinas permite que as propriedades (estabilidade térmica e taxa de degradação) dos corpos oleosos sejam adaptadas. A expressão da polioleosina na planta leva a incorporação de unidades de polioleosina aos corpos oleosos como por unidades de oleosinas simples (Scott et al., 2007). Várias unidades de oleosina em arranjos tandem cabeça à cauda foram usadas para criar polioleosina. Construções separadas (contendo de uma a seis repetições de oleosina) foram especificamente concebidas para a expressão em planta e em E. coli. A maioria das polioleosinas recombinantes acumulou nos corpos oleosos de plantas transgênicas e nos corpos de inclusão de E. coli. A polioleosina produzida procarioticamente purificada foi usada para gerar corpos oleosos artificiais. A integridade es- trutural e a estabilidade térmica dos corpos oleosos e dos os corpos oleosos artificiais em proteinase-K foram criadas por polioleosina.

[00135] No entanto, existem vários fatores limitantes que determinam o grau de proteção/ estabilidade que a polioleosina pode fornecer; esses referem-se ao número de repetições em tandem que podem ser unidas antes do processo de tradução e o direcionamento do corpo oleoso torna-se limitado (Scott et al., 2007); enquanto outra limitação vem da natureza da fusão da oleosina que é conseguida através da geração de uma transcrição com um arranjo de fusão cabeça à cauda. Esta é essencialmente uma proteína linear de repetições de oleosinas multiméricas que tem um número de ligações covalentes e posição de ligações covalentes por repetição de oleosina individual (isto é, um máximo de uma em cada extremidade). Além disso, este arranjo apenas confere proteção contra as proteínas de degradação N-terminais, mas não fornece qualquer proteção adicional contra outras enzimas proteolíticas que reconhecem sequências de peptídeos específicas internas. Além disso, a ligação entre as unidades de oleosina em uma molécula de polioleosina formada pela repetição em tandem cabeça à cauda não é prontamente alterada in situ. Embora os sítios específicos de protease específica possam ser projetados para as regiões de ligação, a fim de quebrar as moléculas de polio- leosina fundidas embutidas em um corpo oleoso ou corpo oleoso artificial, eles não poderiam ser refundidos facilmente.

[00136] As oleosinas incorporadas em corpos oleosos foram anteriormente covalentemente reticuladas pela adição de agentes de reticu- lação, tais como o glutaraldeído ou a genepina (Peng et al., 2004 e 2006), no entanto, esta reticulação aleatória requer a adição de agentes de reticulação para as preparações de corpo oleosos e não é fácil de reverter. Corpos oleosos artificiais

[00137] As oleosinas recombinantes expressadas procarioticamente podem ser usadas para gerar os corpos oleosos artificiais (AOBs) cujas propriedades são muito semelhantes aos OBs derivados de planta (Peng et al. 2004; Roux et al. 2004; Chiang et al. 2005; Chiang et al. 2007). Aplicações de corpos oleosos e corpos oleosos artificiais

[00138] As propriedades únicas dos corpos oleosos e suas oleosi- nas constituintes formam a base de um número de aplicações biotec- nológicas incluindo: purificação de proteínas recombinantes; formação de complexos de proteínas multiméricas; emulsificação; distribuição de bioativos; geração de bioativos multivalentes e até mesmo como um intensificador de sabor potencial (para revisões ver Capuano et al., 2007 e Roberts et al., 2008). Emulsões

[00139] As emulsões são produzidas quando um ou mais líquidos que são imiscíveis em outro líquido, geralmente devido a diferentes polaridades e assim hidrofobicidades diferentes, são uniformemente suspensos no interior desse líquido. Os exemplos incluem gotículas de óleo dispersas uniformemente em água, ou gotículas de água uniformemente dispersas no óleo. A geração de uma emulsão relativamente estável requer o uso de um emulsionante, o que reduz a tensão interfacial entre os líquidos. A estabilidade de uma emulsão é geralmente medida em termos de duração que a dispersão uniforme persiste sob condições especificadas. Os emulsionantes são comumente usados na indústria alimentar e cosmética, então precisam ter alta estabilidade de emulsão e ser seguros para o consumo e a aplicação tópica.

[00140] Os corpos oleosos intactos contendo oleosina formam naturalmente uma emulsão água em óleo livre de surfactante. Descobriu- se que os corpos oleosos intactos ou corpos oleosos em que a maioria de TAG foi removida têm uma ampla gama de aplicações de emulsifi- cação em alimentos, cuidados pessoais tópicos (cremes para a pele) e formulações farmacêuticas (Harada et al., 2002;. Deckers et al., 2003; Hou et al., 2003). Bio-hidrogenação

[00141] Tem sido demonstrado que o perfil lipídico dos alimentos para animais ruminantes, por sua vez, influencia o perfil lipídico de carnes e laticínios (Demeyer e Doreau, 1999). Diferentes plantas têm perfis lipídicos diferentes; ao alimentar seletivamente os animais apenas plantas com o perfil lipídico desejado é possível influenciar positivamente o perfil lipídico e jusante da carne e laticínios. Em ruminantes, o lipídio final constituído de carne e leite não é apenas influenciado pelos lipídios da dieta, mas também é fortemente influenciado pela bio- hidrogenação (Jenkins e McGuire 2006; Firkins et al., 2006; Lock e Bauman, 2004). A bio-hidrogenação é a hidrogenação de compostos não reduzidos (como gorduras insaturadas) pelo biota presente no rú- men. A bio-hidrogenação pode ser prevenida/ retardada, pelo encapsulando dos lipídios em uma proteína ou proteínas que fornecem resistência à degradação microbiana (Jenkins e Bridges 2007). A prevenção da bio-hidrogenação pelo encapsulando dos triacilglicerídeos em polioleosina ou oleosinas na planta foi relatada por Scott et al. (2007), Cookson et al. (2009) e Roberts et al. (2008). Oleosinas

[00142] As oleosinas são proteínas comparativamente pequenas (15 a 24 kDa) que permitem que os OBs se tornem organelas distintas hermeticamente embaladas sem coalescência enquanto as células se desidratam ou sofrem condições de congelamento (Leprince et al. 1998;. Siloto et al. 2006;. Slack et al.1980; Shimada et al.2008).

[00143] As oleosinas têm três domínios funcionais constituídos por um braço anfipático N-terminal, um núcleo hidrofóbico central altamente conservado (~ 72 resíduos) e um braço anfipático C-terminal. O modelo topológico aceitado é um em que os braços anfipáticos N- e C- terminais estão localizados do lado de fora dos OBs e o núcleo hidro- fóbico central está localizado no interior do OB (Huang, 1992; Loer e Herman, 1993; Murphy, 1993). Os resíduos carregados negativamente dos braços anfipáticos N- e C-terminais estão expostos ao exterior aquoso enquanto os resíduos carregados positivamente estão expostos ao interior do OB e de frente para os lipídios carregados negativamente. Assim, os braços anfipáticos com a sua carga negativa virada para fora são responsáveis pela manutenção dos OBs como entidades individuais através de impedimento estérico e repulsão eletrostática in vivo e na preparação isolada (Tzen et al., 1992). O braço anfipático N- terminal é altamente variável e, como tal, nenhuma estrutura secundária específica pode descrever todos os exemplos. Em comparação, o braço C-terminal contém um domínio α-helicoidal de 30-40 resíduos (Tzen et al., 2003). O núcleo central é altamente conservado e consi-derado a maior região hidrofóbica conhecida por ocorrer na natureza; no centro é um motivo de laço da prolina de 12 resíduos conservados que inclui três resíduos de prolina espaçados (para revisões ver Fran- dsen et al., 2001; Tzen et al., 2003). A estrutura secundária, terciária e quaternária do domínio central ainda é incerta. Modelagem, infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) e evidência de dicroísmo circular (CD) existem para um número de diferentes arranjos (para revisão ver Roberts et al., 2008).

[00144] As propriedades das principais oleosinas são relativamente conservadas entre as plantas e é caracterizada pelo seguinte:

[00145] • proteína de 15-25 kDa correspondendo a cerca de 140 230 resíduos de aminoácidos.

[00146] • a sequência da proteína pode ser dividida quase igual mente ao longo do seu comprimento em 4 partes que correspondem a uma região hidrofílica N-terminal, duas regiões hidrofóbicas centrais (unidas por um laço ou maçaneta de prolina) e uma região hidrofílica C-terminal.

[00147] • a topologia da oleosina é atribuída às suas propriedades físicas, que inclui um núcleo hidrofóbico dobrado flanqueado pelos domínios hidrofílicos. Este arranjo confere uma natureza anfipática para a ole- osina resultando no domínio hidrofóbico sendo incorporado na monoca- mada fosfolipídica (Tzen et al., 1992), enquanto que os domínios hidrofí- licos flanqueados são expostos ao ambiente aquoso do citoplasma.

[00148] • normalmente as oleosinas não contêm cisteínas

[00149] As oleosinas preferidas para o uso na invenção são aquelas que contêm um domínio central de aproximadamente 70 resíduos de aminoácidos não polares (incluindo um laço de prolina) ininterrupto por quaisquer resíduos carregados, flanqueados por dois braços hidrofílicos.

[00150] O termo "oleosina" como usado aqui também inclui estero- leosina e caleosina. Esteroleosinas

[00151] As esteroleosinas compreendem um segmento N-terminal de ancoragem compreendendo duas a-hélices anfipáticas de 912 resíduos em cada hélice ligadas por uma região hidrofóbica de ancoragem de 14 resíduos. O domínio de desidrogenase solúvel contém um subdomínio de ligação NADP+- e um subdomínio de ligação esterol. A distinção aparente entre esteroleosinas -A e -B ocorre em seus diversos subdomínios de ligação esterol (Lin e Tzen, 2004). As esteroleosinas têm uma maçaneta de prolina em seu domínio hidrofóbico e contém uma desidrogenase de ligação esterol em um dos seus braços hidrofílicos. Caleosinas

[00152] As caleosinas (Frandsen et al., 2001) têm um laço ligeiramente diferente da prolina do que as oleosinas básicas e contêm um motivo de ligação de cálcio e vários sítios de fosforilação potenciais nos braços hidrofílicos. Semelhante à oleosina, a caleosina propõe-se a ter três domínios estruturais, em que os braços N- e C-terminais são hidrofílicos, enquanto o domínio central é hidrofóbico e atua como ân- cora do corpo oleoso. O domínio hidrofílico N-terminal consiste em um motivo “EF-mão” de ligação de cálcio hélice-giro-hélice de 28 resíduos, incluindo um resíduo de glicina invariável como um ponto de giro estrutural e cinco resíduos conservados contendo oxigênio como ligantes de ligação de cálcio (Chen et al., 1999; Frandsen et al., 2001). O domínio hidrofílico C-terminal contém vários sítios de fosforilação e perto do terminal-C é uma cisteína invariável que não está envolvida em quaisquer ligações intra- ou interdissulfeto (Peng, 2004). O N- e C- terminais hidrofílicos da caleosina são aproximadamente 3 vezes maiores do que os da oleosina (Lin e Tzen, 2004). O domínio hidrofóbico é considerado como consistindo uma a-hélice anfipática e uma região de ancoragem (que inclui um laço de prolina).

[00153] Exemplos de sequências de oleosina (oleosina, esteroleosina e caleosina) adequadas para serem modificadas para o uso na invenção pela adição de pelo menos uma cisteína introduzida artificialmente são mostrados na Tabela 1 abaixo. As sequências (ambos polinucleotídeo e polipeptídeo são fornecidos na Listagem de Sequências) Tabela 1

[00154] Oleosina, esteroleosina e caleosina são bem conhecidas dos especialistas na técnica. As sequências adicionais de muitas espécies diferentes podem ser prontamente identificadas por métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, as sequências complementares podem ser facilmente identificadas pelo banco de dados NCBI Entrez Cross-Database Search (disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery) usando qualquer um dos termos oleosina, esteroleosina e caleosina. Biossíntese de lipídios de planta

[00155] Todas as células de plantas produzem ácidos graxos do actetil-CoA por uma via comum localizada em plastídios. Embora uma porção das cadeias de acil recentemente sintetizadas seja então usada para a biossíntese de lipídios dentro do plastídeo (via procariota), uma porção principal é exportada para o citosol para a montagem de glicerolipídio no retículo endoplasmático (RE) ou outros locais (via eu- cariótica). Além disso, alguns dos glicerolipídios extraplastidial retornam ao plastídeo, que resulta na mistura considerável entre os plastí- deos e os pools lipídicos no RE (Ohlrogge e Jaworski 1997).

[00156] A descrição mais simples da via plastidial de biossíntese de ácido graxo consiste de dois sistemas de enzimas: acetil-CoA carboxi- lase (ACCase) e a ácido graxo sintase (FAS). A ACCase catalisa a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, e a FAS transfere a metade malonil para a proteína carreadora de acil (ACP) e catalisa a extensão da cadeia de acil crescente com malonil-ACP.

[00157] A reação de síntese inicial de ácido graxo é catalisada por 3-cetoacil-ACP III (KAS III) que resulta na condensação de acetil-CoA e malonil-ACP. Condensações subsequentes são catalisadas por KAS I e Kas II. Antes de um ciclo subsequente de síntese de ácidos graxo começar, o intermediário 3-cetoacil-ACP é reduzido ao acil-ACP saturado nas reações de FAS restantes, catalisado, sequencialmente, pela 3-cetoacil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP dehidrase e enoil-ACP re- dutase.

[00158] Os produtos finais de FAS são geralmente 16:0 e 18:00- ACP, e a composição final de ácido graxo de uma célula de planta é em grande parte determinada pela atividade de várias enzimas que usam essas acil-ACPs na fase de terminação de síntese de ácido gra- xo. Estearoil-ACP desaturase modifica o produto final de FAS por inserção de uma ligação dupla cis na posição 9 do C18:0-ACP. As reações de síntese de ácidos graxos são terminadas por hidrólise ou pela transferência da cadeia de acil da ACP. A hidrólise é catalisada pelas acil-ACP tioesterases, das quais existem dois tipos principais: uma tio- esterase relativamente específica para 18:1-ACP e uma segunda mais específica para acil-ACP saturada. Os ácidos graxos que foram liberados a partir de ACPs por tioesterases deixam o plastídeo e entram na via de lipídios eucarióticos, onde eles são primeiramente esterificados em glicerolipídios no RE. A acil transferase no plastídeo, em contraste com a tioesterase, termina a síntese de ácidos graxos por transesteri- ficação de metades acil de ACP para o glicerol, e eles são uma parte essencial da via de lipídios procarióticos levando à montagem glicero- lipídio plastídeo. Biossíntese de triacilglicerol

[00159] A única etapa comprometida na biossíntese de TAG é a última, isto é, a adição de um terceiro ácido graxo a um diacilglicerol existente, gerando assim o TAG. Em plantas esta etapa é predominantemente (mas não exclusivamente) realizada por uma de cinco (predominantemente localizado no RE) enzimas de síntese de TAG incluindo: acil CoA: diacilglicerol aciltransferase (DGAT1); um acil CoA não relacionado: diacilglicerol acil transferase (DGAT2); um DGAT solúvel (DGAT3), que tem menos de 10% de identidade com DGAT1 ou DGAT2 (Saha et al., 2006); fosfatidilcolina-esterol O-aciltransferase (PDAT); e uma cera sintase (WSD1, Li et al., 2008.). As proteínas DGAT1 e DGAT2 são codificadas por duas famílias de genes distintos, com DGAT1 contendo aproximadamente 500 aminoácidos e 10 domínios transmembranares previstos e DGAT2 tem apenas 320 aminoáci- dos e dois domínios transmembranares (Shockey et al., 2006).

[00160] O termo “enzima de síntese de triacilglicerol” ou “enzima de síntese de TAG” como usado aqui, significa uma enzima capaz de catalisar a adição de um terceiro ácido graxo em um diacilglicerol existente, gerando assim o TAG. A enzima de síntese de TAG preferida inclui, mas não está limitada a: acil CoA: diacilglicerol aciltransferase1 (DGAT1); diacilglicerol acil transferase2 (DGAT2); fosfatidilcolina- esterol O-aciltransferase (PDAT) e a forma solúvel citosólica de DGAT (DGAT ou DGAT3 solúvel).

[00161] Dado que DGAT1 e DGAT2 endógenos parecem desempenhar papéis em folhas maduras e de senescência (Kaup et al. 2002; Shockey et al. 2006), é provável que as plantas possuam um número de mecanismos de retroação para controlar a sua atividade. De fato, Zou et al. (2008) identificaram recentemente uma sequência de consenso (X-Leu-X-Lys-XX-Ser-XXX-Val) dentro das sequências de Tro- paeolum majus (cinco-chagas) DGAT1 (TmDGAT1) como um motivo de segmentação típico dos membros da proteína quinase-1 relacionada a SNF1 (SnRK1) com Ser sendo o resíduo para fosforilação. As proteínas SnRK1 são uma classe de proteínas quinases Ser/Thr que têm sido cada vez mais implicadas na regulação global do metabolismo de carbono nas plantas, por exemplo, a inativação de sacarose fosfato sintase por fosforilação (Halford e Hardie 1998). Zou et al. (2008) continuaram demonstrando que a obliteração de um sítio de fosforilação potencial SnRK1 em DGAT1 por mutação de ponto único (Ser197Ala de TmDGAT1) levou à acumulação de níveis significativamente mais elevados de TAG na semente. Esta mutação aumentou a atividade por 38-80%, o que levou a um aumento de 20-50% no teor de óleo em uma base por sementes em Arabidopsis.

[00162] Fosfolipídio:DGA aciltransferase (PDAT) forma TAG a partir de uma molécula de fosfolipídio e uma molécula de diaciglicerol. PDAT é bastante ativa quando expressada em levedura, mas não aumenta substancialmente o rendimento de TAG quando expressada em sementes de plantas. PDAT e uma DAG:DAG transacilase proposta são enzimas de síntese de lipídio neutro que produzem TAG, mas não são consideradas parte da via de Kennedy.

[00163] Uma combinação de éster de cera sintase e enzima DGAT (WS/ DGAT) tem sido encontrada em todos os procarióticos produtores de lipídio neutro estudados até agora. WS/DAGAT tem atividade ampla extraordinária em uma variedade de ácidos graxos incomuns, alcoóis e até mesmo tióis. Esta enzima tem uma região putativa atravessada por membrana, mas não mostra nenhuma homologia de sequência com as famílias DGAT1 e DGAT2 de eucariotas ou a WE sin- tase de jojoba (Jojoba é o único eucariota que foi encontrado a acumular éster de cera).

[00164] Deve ser observado que a lecitina-colesterol aciltransferase (LCAT) e acil-coenzima:colesterol aciltransferase (ACAT) são enzimas que produzem ésteres de esterol (uma forma de lipídio neutro) não TAGs.

[00165] Em aplicações que requerem o aumento de lipídios neutros, evidência sugere que a maior atividade e mais ampla especificidade de DGAT1 em relação ao DGAT2 é preferencial. Sempre que um ácido graxo específico é preferido, tal como um PUFA de cadeia longa, DGAT1 é ainda aplicável, desde que aceite o ácido graxo de escolha. As plantas geralmente incorporam PUFAs de cadeia longa na posição sn-2. Não se sabe se é devido à elevada atividade de LPAT ou baixa atividade de DGAT1 sobre este substrato. Para a especificidade melhorada para PUFAs, uma DGAT2 que prefere estes ácidos graxos pode ser preferível, ou as propriedades de DGAT1 poderiam ser alte-radas usando evolução dirigida ou um processo equivalente.

[00166] Exemplos destas enzimas de síntese de TAG, adequados para uso nos métodos e composições da invenção, de membros de várias espécies de plantas são fornecidos na Tabela 2 abaixo. As sequências (polinucleotídeo e polipeptídeo são fornecidos na Listagem de Sequências) Tabela 2

[00167] As invenções também contempla o uso de enzimas de síntese de TAG modificadas, que são modificadas (por exemplo, na sua sequência por substituições, inserções ou adições e similares) para alterar a sua especificidade e ou atividade. Acúmulo de TAG em folhas

[00168] Uma pesquisa de campo recente de 302 espécies de an- giospermas, no centro-norte dos EUA, descobriu que 24% têm evidentes gotículas citossólicas de óleo em folhas, com geralmente uma gota grande de óleo por célula do mesófilo (Lersten et al., 2006 [de Slo- combe et al. 2009]). O papel do TAG na folha citosólica foi achado envolvido no armazenamento de carbono e/ou remodelagem da membrana de lipídio (para revisão ver Slocombe et al., 2009). De fato, em senescência de folhas, os ácidos graxos plastidiais são divididos em TAG previamente para posterior mobilização, e DGAT1 é pensado para ser um instrumento para esse processo (Kaup et al., 2002).

[00169] Houve várias tentativas para modificar as plantas para acumular elevados níveis de TAG em suas folhas. O sucesso destas foi um pouco limitado pelo nível relativamente baixo de TAG que acumulou e, em alguns casos, a maioria dos TAG acumulados na senescência das folhas apenas, limitando assim a flexibilidade da colheita e a proporção de TAG acumulado na cultura a qualquer momento (Bouvier-Nave et al., 2001; Xu et al., 2005; Winichayakul et al., 2008; Andrianov et al., 2010; Slocombe et al., 2009 e referências dos mesmos).

[00170] Até hoje, as tentativas de acumular TAG em folhas têm sido predominantemente centradas em três candidatos de genes específicos, incluindo a hiperexpressão de DGAT (biossíntese de TAG), a mutação de TGD1 ou CTS (resultando na prevenção da remobilização lipídica), e a hiperexpressão de LEC1, LEC2 e WRI1 (fatores de transcrição envolvidos no armazenamento de óleo e acúmulo de proteína no desenvolvimento de sementes). A hiperexpressão de TAG e de outras enzimas de síntese de lipídios neutros baseia-se na presença de substrato suficiente, na folha de expansão e ou madura presume- se ser fornecida pelo plastídeo (cloroplasto, no caso da folha), que sintetiza lipídios para as membranas. Em folhas fotossintéticas de Arabi- dopsis estima-se que a rotatividade de lipídeos da membrana seja de 4% do total de ácidos graxos por dia (Bao et al., 2000). Em senescên- cia de folhas, as membranas plastidais existentes fornecem o volume de ácidos graxos para o particionamento em TAG antes da mobilização adicional.

[00171] A hiperexpressão do gene DGAT1 da Arabidopsis em folhas de tabaco resulta em um acúmulo de TAG aprimorada (Bouvier- Nave et al., 2001), isso foi mais tarde repetido e quantificado por Andrianov et al., (2010). Eles calcularam o nível de TAG aumentado 20 vezes e levou a uma duplicação do teor de lipídios de ~ 3% para ~ 6% de matéria seca em folhas maduras. Um aumento adicional a 6,8% foi obtido pela hiperexpressão de LEC2 (um regulador mestre de maturação da semente e armazenamento de óleo de semente) em folhas maduras, usando o promotor indutível Alc (Andrianov et al., 2010). Nenhuma estimativa do TAG extraível foi dada, nem houve qualquer cálculo sobre o acúmulo de TAG em folhas em expansão.

[00172] Mutações em uma proteína TRIGALACTOSILDIACILGLO- CEROL do tipo permease (TGD1), em Arabidopsis thaliana causaram a acumulação de TAGs, oligogalactolipídios e fosfatidato; isto foi acompanhado por uma elevada incidência de aborto do embrião e crescimento da planta comparativamente fraca em geral (Xu et al., 2005.).

[00173] Winichayakul et al., (2008) hiperexpressaram Arabidopsis thaliana DGAT1 nas folhas de azevém (Lolium perenne) e isso levou a uma elevação de 50% de lipídio foliar extraível total (de ~ 4% a 6% de matéria seca). Além disso, o nível elevado de lipídios estava presente nas folhas novas geradas por colheitas repetidas espaçadas de 2-3 semanas de intervalo, indicando que as novas folhas emergentes foram também capazes de acumular lipídio adicional. No entanto, o nível elevado de lipídios nestas folhas tipicamente começou a descer para níveis de tipo selvagem, quando as folhas tinham mais de 2 semanas de idade, indicando que os lipídios foram sendo remobilizados através de catabolismo (libertação do esqueleto de glicerol pela lipase seguido de e-oxidação).

[00174] Slocombe et al., (2009) demonstraram que as mutações no transportador ABC peroxissomal CTS (cts-2) levaram à acumulação de até 1,4% de TAG em folhas, particularmente durante o início da se- nescência. Eles também expressaram ectopicamente o LEC2 durante a senescência no fundo do cts-2, enquanto isto não elevou a acumulação global de TAG no mutante cts-2, aumentou o acúmulo de espécies oleaginosas de sementes de TAG em senescência dos tecidos. Enquanto o cts-2 bloqueia a quebra de ácidos graxos, ele também levou a um fenótipo severo. Slocombe et al., (2009) concluíram que os ácidos graxos de membrana recicláveis podem ser capazes de ser redirecionados para o TAG expressando o programa de sementes em se- nescência de tecido ou por um bloco na quebra do ácido graxo.

[00175] Scott et al., (2007) afirmaram que a coexpressão de uma enzima de síntese de triacilglicerídeo e da polioleosina (duas ou mais unidades de oleosina fundidas em um arranjo em tandem cabeça à cauda) permitiria o armazenamento de lipídios em uma célula de planta. Do mesmo modo, Cookson et al., (2009) afirmaram que produzindo uma única oleosina e uma enzima de síntese de TAG dentro de porções vegetativas de uma planta levaria ao aumento do número de corpos oleosos e TAG no tecido vegetativo. Usando qualquer uma destas técnicas leva a um aumento máximo em teor de lipídios (não necessariamente sob a forma de TAG) de até cerca de 50%. Além disso, este nível começa a cair quando as folhas ficam maduras, normalmente em folhas superior a 2 semanas de idade (dados não publicados).

[00176] Assim, o grau em que o TAG pode ser acumulado em tecidos vegetativos parece ser limitado em certo ponto pelo fato de que a máquina de recuperação endógena de carbono fixado cataboliza o TAG. Senescência foliar - reciclagem de lipídios via intermediários de TAG

[00177] A senescência foliar é uma sequência altamente controlada de eventos que levam, por fim, à morte de células, tecidos e, finalmente, todo o órgão. Isto implica em recrutamento regulado de nutrientes junto com a sua translocação a partir da senescência do tecido para outros tecidos que ainda estão em crescimento e desenvolvimento. O cloroplasto é a primeira organela de células do mesófilo a mostrar sintomas de senescência e, apesar de a quebra de membranas tilacoides ser iniciada cedo na cascata de senescência foliar, o envelope do clo- roplasto permanece relativamente intacto até os estágios muito avançados de senescência. DGAT1 é regulada positivamente durante a senescência de folhas de Arabidopsis e isto é temporalmente correlacionado com altos níveis de ácidos graxos contendo TAG normalmente encontrados em galactolípidios dos cloroplastos. O recrutamento de membrana de carbono das folhas de senescência, particularmente se- nescência de cloroplastos, para as partes crescentes da planta é uma característica chave da senescência foliar, e envolve desesterificação dos lipídios tilacoides e conversão dos ácidos graxos livres resultantes em sacarose no floema móvel. A desesterificação de lipídios tilacoides parece ser mediada por uma ou mais galactolipases induzidas por se- nescência. A formação de TAG parece ser uma etapa intermediária na mobilização de membrana de carbono lipídio para sacarose no floema móvel durante a senescência (Kaup et al., 2002). Oleosinas modificadas geneticamente para incluir cisteínas introduzidas artificialmente

[00178] As oleosinas modificadas da invenção, ou para uso nos métodos da invenção, são modificadas para conter pelo menos um resíduo de cisteína introduzido artificialmente. De preferência, as oleosi- nas modificadas contendo pelo menos duas cisteínas.

[00179] A encapsulação dos lipídios neutros pelas oleosinas con- tendo cisteínas modificadas fornece um mecanismo alternativo para acumular quantidades apreciáveis de TAG nas folhas sem o requisito de esperar até a senescência e sem produzir fenótipos extremos.

[00180] Vários métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser usados na produção das oleosinas modificadas com cis- teínas introduzidas artificialmente.

[00181] Tais métodos incluem metagênese dirigida (EUA 6.448.048), em que o polinucleotídeo codificando uma oleosina é modificado para introduzir uma cisteína na proteína oleosina codificada.

[00182] Alternativamente, o polinucleotídeo que codifica as oleosi- nas modificadas pode ser sintetizado na sua totalidade.

[00183] Além disso, a metodologia para a produção de oleosinas modificadas da invenção e para uso nos métodos da invenção é fornecida na seção de Exemplos.

[00184] A cisteína introduzida pode ser um aminoácido adicional (isto é, uma inserção) ou pode substituir um aminoácido existente (isto é, uma substituição). De preferência, a cisteína introduzida substitui um aminoácido existente. Em uma modalidade preferida, o aminoácido substituído é um resíduo carregado. Preferivelmente, o resíduo carregado é previsto para estar nos domínios hidrofílicos e, portanto, suscetível de ser localizado na superfície do corpo oleoso.

[00185] As regiões/ braços hidrofílicas e hidrofóbicas da oleosina podem ser facilmente identificadas por aqueles especialistas na técnica usando metodologia padrão (por exemplo: Kyte e Doolitle (1982).

[00186] As oleosinas modificadas da invenção são de preferência variadas em peso molecular de 5 a 50 kDa, mais preferivelmente de 10 a 40 kDa, mais preferivelmente de 15 a 25 kDa.

[00187] As oleosinas modificadas da invenção estão, de preferência, na faixa de tamanho de 100 a 300 aminoácidos, mais preferivelmente de 110 a 260 aminoácidos, mais preferivelmente de 120 a 250 aminoácidos, mais preferivelmente de 130 a 240 aminoácidos, mais preferivelmente de 140 a 230 aminoácidos.

[00188] De preferência, as oleosinas modificadas compreendem uma região hidrofílica N-terminal, duas regiões centrais hidrofóbicas (unidas por um laço ou maçaneta de prolina) e uma região hidrofílica C-terminal.

[00189] De preferência, as oleosinas modificadas podem ser divididas quase igualmente o seu comprimento em quatro partes que correspondem à região hidrofílica N-terminal (ou braço), as duas regiões centrais hidrofóbicas (unidas por um laço ou maçaneta de prolina) e uma região hidrofílica C-terminal (ou braço).

[00190] De preferência, a topologia de oleosinas modificadas é atribuída às suas propriedades físicas, que incluem um núcleo hidrofóbico dobrado flanqueado pelos domínios hidrofílicos.

[00191] De preferência, as oleosinas modificadas podem ser formadas em corpos oleosos, quando combinadas com triacilglicerol (TAG) e fosfolipídio.

[00192] De preferência, a topologia confere uma natureza anfipática para a oleosina modificada resultante no domínio hidrofóbico sendo incorporada na monocamada fosfolipídica do corpo oleoso enquanto os domínios hidrofílicos flanqueados são expostos ao ambiente aquoso fora do corpo oleoso, como no citoplasma.

[00193] Em uma modalidade, a oleosina modificada da invenção ou usada no método da invenção compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade do domínio hidrofóbico de qualquer uma das sequências de proteínas oleosina referida na Tabela 1 acima.

[00194] Em uma modalidade, a oleosina modificada da invenção ou usada no método da invenção, compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade para qualquer uma das sequências de proteínas referidas na Tabela 1 acima.

[00195] Em outra modalidade, a oleosina modificada é essencialmente a mesma que qualquer uma das oleosinas referidas na Tabela 1 acima, além da cisteína ou cisteínas adicionais introduzidas artificialmente.

[00196] Em uma modalidade adicional, a oleosina modificada da invenção ou usada no método da invenção compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade com a sequência da oleosina da SEQ ID NO: 16.

[00197] Em outra modalidade, a oleosina modificada tem a mesma sequência de aminoácidos como a da SEQ ID NO: 16, além da cisteí- na ou cisteínas adicionais introduzidas artificialmente.

[00198] Em outra modalidade, a oleosina modificada tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 16 a 20. Proteínas de fusão com oleosinas modificadas

[00199] A invenção também proporciona proteínas de fusão, incluindo uma oleosina modificada da invenção fundida com uma proteína de interesse.

[00200] De preferência, a proteína de interesse está na extremidade N ou C-terminal da proteína de fusão.

[00201] Os métodos para expressar recombinantemente as proteínas de fusão são bem conhecidos dos especialistas na técnica (Papa- postolou e Howorka, 2009). A produção da proteína de fusão da invenção pode tipicamente envolver a fusão da sequência de codificação da proteína de interesse para a sequência de codificação da oleo- sina modificada.

[00202] Tais proteínas de fusão podem ser incluídas ou expressadas nos corpos oleosos da invenção e usadas para purificar e distribuir a proteína de interesse para uma variedade de aplicações, como discutido em Roberts et al., (2008).

[00203] No entanto, na invenção torna possível tirar vantagem da opção para variar a estabilidade/ integridade do corpo oleoso fornecido pela presença das oleosinas modificadas no corpo oleoso, permitindo assim a purificação mais rigorosa e procedimentos de distribuição. Proteínas de fusão com oleosinas não modificadas

[00204] A invenção também envolve o uso de proteína de fusão incluindo oleosina não modificada fundida a uma proteína de interesse. A produção da proteína de fusão da invenção pode envolver tipicamente a fusão da sequência de codificação da proteína de interesse para a sequência de codificação da oleosina não modificada.

[00205] De preferência, a proteína de interesse está na extremidade N ou C-terminal da proteína de fusão.

[00206] Tais proteínas de fusão podem ser incluídas ou expressadas nos corpos oleosos da invenção e usadas para purificar e distribuir a proteína de interesse para uma variedade de aplicações, como discutido em Roberts et al., (2008).

[00207] A presente invenção, no entanto, tira vantagem da opção para variar a estabilidade/ integridade do corpo oleoso fornecido pela presença das oleosinas modificadas no corpo oleoso, permitindo assim a purificação mais rigorosa e procedimentos de distribuição. Tecidos vegetativos

[00208] O tecido vegetal inclui brotos, folhas, raízes e caules. Um tecido vegetativo preferido é uma folha. Promotores específicos de tecido vegetativo

[00209] Um exemplo de um promotor específico vegetativo é encontrado em US 6229067; e US 7629454; e US 7153953; e US 6228643. Promotores específicos de pólen

[00210] Um exemplo de um promotor específico do pólen é encontrado em US 7141424; US 5545546; e US 5412085; e US 5086169; e US 7667097. Promotores específicos de semente

[00211] Um exemplo de um promotor específico de semente é encontrado em US 6342657; e US 7081565; e US 7405345; e US 7642346; e US 7371928. Promotores específicos de frutas

[00212] Um exemplo de um promotor específico de fruta é encontrado em US 5536653; e US 6127179; e US 5608150; e US 4943674. Polinucleotídeo e fragmentos

[00213] O termo "polinucleotídeo(s)", como aqui usado, significa um desoxirribonucleotídeo de fita simples ou dupla ou um polímero ribo- nucleotídeo de qualquer comprimento, mas de preferência de pelo menos 15 nucleotídeos, e incluem, como exemplos não limitantes, sequências de codificação e não codificação de um gene, complementos de sequência senso e anti-senso, exões, intrões, DNA genômico, cDNA, pré-mRNA, mRNA, rRNA, siRNA, miRNA, tRNA, ribozimas, os polipeptídeos recombinantes, sequências de RNA ou DNA de ocorrência natural isolado e purificado, sequências de RNA e DNA sintéticas, sondas de ácidos nucleicos, iniciadores e fragmentos.

[00214] Um "fragmento" de uma sequência de polinucleotídeo fornecido aqui é uma subsequência de nucleotídeos contíguos que é capaz de hibridação específica a um alvo de interesse, por exemplo, uma sequência que é de pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento. Os fragmentos da invenção compreendem 15 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 16 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 17 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 21 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 22 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 23 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 24 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 25 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 26 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 27 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 28 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 29 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 30 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 31 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 32 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 33 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 34 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 35 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 36 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 37 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 38 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 39 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 40 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 41 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 42 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 43 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 44 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 45 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 46 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 47 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 48 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 49 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 50 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 51 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 52 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 53 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 54 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 55 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 56 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 57 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 58 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 59 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 60 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 61 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 62 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 63 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 64 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 65 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 66 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 67 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 68 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 69 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 71 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 72 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 73 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 74 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 75 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 76 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 77 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 78 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 79 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 80 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 81 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 82 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 83 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 84 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 85 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 86 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 87 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 88 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 89 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 90 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 91 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 92 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 93 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 94 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 95 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 96 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 97 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 98 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 99 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 150 nu- cleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 250 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 350 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 450 nucleotídeos e mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos de nucleotídeos contíguos de um polinu- cleotídeo divulgado. Um fragmento de uma sequência polinucleotídica pode ser usado em antissenso, interferência de RNA (RNAi), silencia- mento de gene, tripla hélice ou tecnologia ribozima, ou como um iniciador, uma sonda, incluídos em um microarranjo, ou usados em métodos de seleção com base em polinucleotídeo da invenção.

[00215] O termo "iniciador" refere-se a um polinucleotídeo curto, normalmente tendo um grupo 3'OH livre, que é hibridado a um modelo e usado para a polimerização de um prime de um polinucleotídeo complementar ao alvo.

[00216] O termo "sonda" refere-se a um polinucleotídeo curto que é usado para detectar uma sequência polinucleotídica que é complementar à sonda, em um ensaio baseado em hibridação. A sonda pode ser constituída por um "fragmento" de um polinucleotídeo como definido aqui. Polipeptídeos e fragmentos

[00217] O termo "polipeptídeo", tal como usado aqui, engloba cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, mas preferivelmente pelo menos 5 aminoácidos, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptí- dicas covalentes. Os polipeptídeos da presente invenção ou usados nos métodos da invenção podem ser produtos naturais purificados, ou podem ser produzidos parcialmente ou totalmente usando técnicas recombinantes ou sintéticas. O termo pode referir-se a um polipeptí- deo, um agregado de um polipeptídeo como um dímero ou outro mul- tímero, um polipeptídeo de fusão, um fragmento de polipeptídeo, uma variante de polipeptídeo, ou seu derivado.

[00218] Um "fragmento" de um polipeptídeo é uma subsequência do polipeptídeo que executa uma função que é necessária para a atividade biológica e/ou fornece estrutura tridimensional do polipeptídeo. O termo pode referir-se a um polipeptídeo, um agregado de polipeptí- deo como um dímero ou outro multímero, um polipeptídeo de fusão, um fragmento de polipeptídeo, uma variante de polipeptídeo, ou seu derivado capaz de realizar as atividades enzimáticas acima.

[00219] O termo "isolado", como aplicado às sequências polinucleotí- dicas ou polipeptídicas reveladas aqui, é usado para se referir a sequências que são removidas do seu ambiente natural celular. Uma molécula isolada pode ser obtida por qualquer método ou combinação de métodos, incluindo técnicas bioquímicas, recombinantes e sintéticas.

[00220] O termo "recombinante" refere-se a uma sequência polinu- cleotídica que é removida de sequências que a cercam no seu contexto natural e/ou é recombinada com sequências que não estão presentes no seu contexto natural.

[00221] A sequência "recombinante" polipeptídica é produzida pela tradução de uma sequência de polinucleotídeo "recombinante".

[00222] O termo "derivado de" em relação aos polinucleotídeos ou polipeptídeos da invenção sendo derivados de gêneros ou espécies específicos, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo tem a mesma sequência que um polinucleotídeo ou polipeptídeo encontrado naturalmente nesses gêneros e espécies. O polinucleotídeo ou poli- peptídeo derivado de um gêneros ou espécie específica, podem, portanto, ser produzidos sinteticamente ou recombinantemente. Variantes

[00223] Conforme usado aqui, o termo "variante" refere-se às sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas diferentes das sequências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é eliminado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas de ocorrência natural, ou vari- antes de ocorrência não natural. As variantes podem ser da mesma ou de diferentes espécies e podem englobar homólogos, paralólogos e ortólogos. Em certas modalidades, as variantes dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção possuem atividades biológicas que são as mesmos ou semelhantes aos dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção. O termo "variante" com relação aos polinucleotídeos e poli- peptídeos engloba todas as formas de polinucleotídeos e polipeptídeos como definido aqui. Variantes polinucleotídicas

[00224] As sequências polinucleotídicas variantes preferivelmente apresentam pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 51%, mais preferivelmente pelo menos 52%, mais preferivelmente pelo menos 53%, mais preferivelmente pelo menos 54%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 56 %, mais preferivelmente pelo menos 57%, mais preferivelmente pelo menos 58%, mais preferivelmente pelo menos 59%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 61%, mais preferivelmente pelo menos 62%, mais preferivelmente pelo menos 63%, mais preferivelmente pelo menos 64%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 66%, mais preferivelmente pelo menos 67%, mais preferivelmente pelo menos 68%, mais preferivelmente pelo menos 69%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 71%, mais preferivelmente pelo menos 72%, mais preferivelmente pelo menos 73%, mais preferivelmente pelo menos 74%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 76%, mais preferivelmente pelo menos 77%, mais preferivelmente pelo menos 78%, mais preferivelmente pelo menos 79%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 81%, mais preferivelmente pelo menos 82%, mais preferivelmente pelo menos 83%, mais preferivelmente pelo menos 84%, mais preferi- velmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 86%, mais preferivelmente pelo menos 87%, mais preferivelmente pelo menos 88%, mais preferivelmente pelo menos 89%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, e mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com uma sequência da presente invenção. A identidade é encontrada em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 50 posições de nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 100 posições de nucleotídeos, e mais preferivelmente ao longo de todo o comprimento de um polinucleotídeo da invenção.

[00225] A identidade de sequência polinucleotídica pode ser determinada da seguinte maneira. A sequência polinucleotídica sujeita é comparada a uma sequência polinucleotídica candidata usando BLASTN (do conjunto de programas BLAST, versão 2.2.5 [Nov 2002]) em bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), que está publicamente disponível de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Os parâmetros padrão de bl2seq são usados, exceto que a filtragem de partes de baixa complexidade deve ser desligada.

[00226] A identidade das sequências polinucleotídicas pode ser examinada usando os seguintes parâmetros de linha de comando Unix: bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-FF-p blastn

[00227] O parâmetro -FF desliga a filtragem de seções de baixa complexidade. O parâmetro -p seleciona o algoritmo apropriado para o par de sequências. O programa bl2seq relata a identidade de se- quência como o número e a porcentagem de nucleotídeos idênticos em uma linha "Identidades=".

[00228] A identidade de sequência polinucleotídica também pode ser calculada ao longo de todo o comprimento da sobreposição entre uma sequência polinucleotídica candidata e sujeita usando programas de alinhamento de sequência global (por exemplo, Needleman, SB e Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Uma implementação completa do algoritmo de alinhamento global de Ne- edleman-Wunsch é encontrada no programa de agulha no pacote EMBOSS (Rice, P. Longden, I. e Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics, Junho 2000, vol 16, n° 6. pp.276-277), que pode ser obtido em http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/. O servidor European Bioinformatics Institute também oferece a facilidade de realizar alinhamentos globais de agulha EMBOSS entre as duas sequências online em http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/.

[00229] Alternativamente, o programa GAP pode ser usado qual calcula um alinhamento ideal global de duas sequências sem penalizar os terminais gaps. GAP é descrito no documento seguinte: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.

[00230] Um método preferido para o cálculo de identidade de sequência de % de polinucleotídeo baseia-se em alinhamento de sequências a serem comparadas usando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5).

[00231] As variantes de polinucleotídeo da presente invenção também englobam as que exibem uma semelhança com uma ou mais das sequências especificamente identificadas que é susceptível de preservar a equivalência funcional destas sequências e que não podem ser razoavelmente esperadas que tenham ocorrido por acaso. Tal similari- dade de sequência em relação aos polipeptídeos pode ser determinada usando o programa bl2seq publicamente disponível do conjunto de programas BLAST (versão 2.2.5 [Nov 2002]) de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) .

[00232] A similaridade de sequências polinucleotídicas pode ser examinada através dos seguintes parâmetros de linha de comando Unix: bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-FF-p tblastx

[00233] O parâmetro -FF desliga a filtragem de seções de baixa complexidade. O parâmetro -p seleciona o algoritmo apropriado para o par de sequências. Este programa encontra regiões de similaridade entre as sequências e para cada região relata um "valor E", que é o número esperado de vezes que se poderia esperar para ver essa correspondência por acaso em um banco de dados de um tamanho de referência fixo contendo sequências aleatórias. O tamanho desta base de dados é definido por padrão no programa bl2seq. Para valores E pequenos, muito menos do que um, o valor E é aproximadamente a probabilidade de tal correspondência aleatória.

[00234] As sequências polinucleotídicas variantes preferivelmente apresentam um valor E de menos que 1 x 10-6 mais preferivelmente menos que 1 x 10-9, mais preferivelmente menos que 1 x 10-12, mais preferivelmente menos que 1 x 10-15, mais preferivelmente menos que 1 x 1018, mais preferivelmente menos que 1 x 10-21, mais preferivelmente menos que 1 x 10-30, mais preferivelmente menos que 1 x 10-40, mais preferivelmente menos que 1 x 10-50, mais preferivelmente menos que 1 x 10-60, mais preferivelmente menos que 1 x 10-70, mais preferivelmente menos que 1 x 10-80, mais preferivelmente menos que 1 x 10-90 e mais preferencialmente menos que 1 x 10-100, quando comparado com qualquer uma das sequências especificamente identificadas.

[00235] Alternativamente, os polinucleotídeos variantes da presente invenção ou usados nos métodos da invenção se hibridizam com as sequências polinucleotídicas especificadas, ou seus complementos sob condições rigorosas.

[00236] O termo "hibridizar sob condições rigorosas", e equivalentes gramaticais do mesmo, se refere à capacidade de uma molécula de polinucleotídeo para se hibridizar com uma molécula de polinucleo- tídeo alvo (tal como uma molécula de polinucleotídeo alvo imobilizada sobre um DNA ou RNA blot, como um Southern blot ou Northern blot) sob condições definidas de temperatura e concentração de sal. A capacidade de hibridizar sob condições rigorosas de hibridização pode ser determinada pela hibridização inicial em condições menos rigorosas, em seguida, aumentando o rigor para o rigor desejado.

[00237] No que refere-se às moléculas polinucleotídicas superiores a cerca de 100 bases de comprimento, as condições típicas de hibridi- zação rigorosas são não mais que 25 a 30° C (por exemplo, 10° C) abaixo da temperatura de fusão (Tm) do duplex nativo (ver Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing). A Tm para as moléculas polinu- cleotídicas maiores que cerca de 100 bases pode ser calculada pela fórmula Tm = 81, 5 + 0, 41% (G + C-log (Na+) (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton e McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). As condições rigorosas típicas para polinucleotídeo maior que 100 bases de comprimento seriam condições de hibridização, tais como pré-lavagem em uma solução de 6X SSC, 0,2% SDS; hibridizando a 65° C, 6X SSC, 0,2% SDS durante a noite, seguido por duas lavagens de 30 minutos cada em 1X SSC, 0,1% SDS a 65° C e duas lavagens de 30 minutos cada em 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 65° C.

[00238] No que refere-se às moléculas polinucleotídicas que têm um comprimento menor que 100 bases, as condições de hibridização rigoro sas exemplares são de 5 a 10° C abaixo da Tm. Em média, a Tm de uma molécula polinucleotídica de comprimento menor que 100 pb é reduzida em aproximadamente (500/comprimento de oligonucleotídeo)° C.

[00239] No que refere-se aos imitadores de DNA conhecidos como ácidos nucleicos peptídicos (PNAS) (Nielsen et al., Science. 1991, 06 de dezembro; 254 (5037) :1497-500), os valores de Tm são mais elevados do que aqueles para os híbridos DNA-DNA ou DNA-RNA e podem ser calculados usando a fórmula descrita no Giesen et al., Nucleic Acids Res. 01 de novembro, 1998, 26 (21):5004-6. Exemplos de condições de hibridização rigorosas para um híbrido DNA-PNA com um comprimento inferior a 100 bases são de 5 a 10° C abaixo da Tm.

[00240] Os polinucleotídeos variantes da presente invenção ou usados nos métodos da invenção também compreendem polinucleo- tídeos que diferem das sequências da invenção, mas que, como uma consequência da degenerescência do código genético, codificam um polipeptídeo com atividade semelhante a um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Uma alteração da sequência que não modifica a sequência de aminoácidos do polipeptí- deo é uma "variação silenciosa". Exceto para a ATG (metionina) e o TGG (triptofano), outros códons para o mesmo aminoácido podem ser alterados por meio de técnicas reconhecidas ma técnica, por exemplo, para otimizar a expressão do códon em um organismo hospedeiro específico.

[00241] As alterações da sequência polinucleotídica resultando em substituições conservadoras de um ou vários aminoácidos na sequência polipeptídica codificada sem alterar significativamente a sua atividade biológica também estão incluídas na invenção. Um especialista na técnica estará ciente dos métodos para fazer fenotipicamente substituições de aminoácidos silenciosas (ver, por exemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).

[00242] Os polinucleotídeos variantes, devido às variações silenciosas e substituições conservadoras na sequência polipeptídica codificada, podem ser determinados usando o programa bl2seq publicamente disponível a partir do conjunto de programas BLAST (versão 2.2.5 [Nov 2002]) do NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) por meio do algoritmo tblastx como descrito anteriormente. Variantes de polipeptídicas

[00243] O termo "variante" em relação aos polipeptídeos engloba polipeptídeos de ocorrência natural, produzidos recombinantemente e sinteticamente. As sequências polipeptídicas variantes apresentam preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 51%, mais preferivelmente pelo menos 52%, mais preferivelmente pelo menos 53%, mais preferivelmente pelo menos 54%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 56 %, mais preferivelmente pelo menos 57%, mais preferivelmente pelo menos 58%, mais preferivelmente pelo menos 59%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 61%, mais preferivelmente pelo menos 62%, mais preferivelmente pelo menos 63%, mais preferivelmente pelo menos 64%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 66%, mais preferivelmente pelo menos 67%, mais preferivelmente pelo menos 68%, mais preferivelmente pelo menos 69%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 71%, mais preferivelmente pelo menos 72%, mais preferivelmente pelo menos 73%, mais preferivelmente pelo menos 74%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 76%, mais preferivelmente pelo menos 77%, mais preferivelmente pelo menos 78%, mais preferivelmente pelo menos 79%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 81%, mais preferivelmente pelo menos 82%, mais preferivelmente pelo menos 83%, mais preferivelmente pelo menos 84%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 86%, mais preferivelmente pelo menos 87%, mais preferivelmente pelo menos 88%, mais preferivelmente pelo menos 89%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente menos pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, e mais preferencialmente menos pelo menos 99% de identidade com uma sequência da presente invenção. A identidade é encontrada em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições de amino- ácidos, preferivelmente pelo menos 50 posições de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 100 posições de aminoácidos, e mais preferivelmente ao longo de todo o comprimento de um polipeptídeo da invenção.

[00244] A identidade da sequência polipeptídica pode ser determinada da seguinte maneira. A sequência polinucleotídica sujeita é comparada a uma sequência polinucleotídica candidata usando BLASTN (do conjunto de programas BLAST, versão 2.2.5 [Nov 2002]) em bl2seq, que está publicamente disponível de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Os parâmetros padrão de bl2seq são usados, exceto que a filtragem de partes de baixa complexidade deve ser desligada.

[00245] A identidade da sequência polipeptídica também pode ser calculada ao longo de todo o comprimento da sobreposição entre uma sequência polinucleotídica candidata e sujeita usando programas de alinhamento de sequência global. EMBOSS-needle (disponível em http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) e GAP (Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235) nomo discutido acima também são programas de alinhamen- to de sequência global adequados para o cálculo de identidade de sequência polipeptídica.

[00246] Um método preferido para o cálculo de identidade de sequência de % de polinucleotídeo baseia-se em alinhamento de sequências a serem comparadas usando Clustal X (Jeanmougin et al., 1998, Trends Biochem. Sci. 23, 403-5).

[00247] As variantes de polipeptídeo da presente invenção ou usadas nos métodos da invenção também englobam as que exibem uma semelhança com uma ou mais das sequências especificamente identificadas que é susceptível de preservar a equivalência funcional destas sequências e que não podem ser razoavelmente esperadas que tenham ocorrido por acaso. Tal similaridade de sequência em relação aos polipeptídeos pode ser determinada usando o programa bl2seq publicamente disponível do conjunto de programas BLAST (versão 2.2.5 [Nov 2002]) de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). A similaridade de sequências polipeptídicas pode ser examinada através dos seguintes parâmetros de linha de comando Unix: bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-FF-p blastp

[00248] As sequências polipeptídicas variantes preferivelmente apresentam um valor E de menos que 1 x 10-6 mais preferivelmente menos que 1 x 10-9, mais preferivelmente menos que 1 x 10-12, mais preferivelmente menos que 1 x 10-15, mais preferivelmente menos que 1 x 10-18, mais preferivelmente menos que 1 x 10-21, mais preferivelmente menos que 1 x 10-30, mais preferivelmente menos que 1 x 10-40, mais preferivelmente menos que 1 x 10-50, mais preferivelmente menos que 1 x 10-60, mais preferivelmente menos que 1 x 10-70, mais preferivelmente menos que 1 x 10-80, mais preferivelmente menos que 1 x 10-90 e mais preferencialmente menos que 1 x 10-100, quando comparado com qualquer uma das sequências especificamen-te identificadas.

[00249] O parâmetro -FF desliga a filtragem de seções de baixa complexidade. O parâmetro -p seleciona o algoritmo apropriado para o par de sequências. Este programa encontra regiões de similaridade entre as sequências e para cada região relata um "valor E", que é o número esperado de vezes que se poderia esperar para ver essa correspondência por acaso em um banco de dados de um tamanho fixo de referência contendo sequências aleatórias. Para valores de E pequenos, muito menos que um, isto é, aproximadamente a probabilidade de tal correspondência aleatória.

[00250] As substituições conservativas de um ou vários aminoáci- dos de uma sequência polipeptídica descrita sem alterar significativamente sua atividade biológica também estão incluídas na invenção. Um especialista na técnica estará ciente dos métodos para fazer substituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosos (ver, por exemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306). Construções, vetores e seus componentes

[00251] O termo "construção genética" refere-se a uma molécula de polinucleotídeo, normalmente de DNA de fita dupla, que possa ter inserido em outra molécula de polinucleotídeo (a molécula de polinucleotídeo de inserção), tais como, mas não limitado a uma molécula de cDNA. Uma construção genética pode conter os elementos necessários que permitem a transcrição da molécula de polinucleotídeo de inserção, e, opcionalmente, traduzindo a transcrição em um polipeptídeo. A molécula de polinucleotídeo de inserção pode ser derivada da célula hospedeira, ou pode ser derivada de uma célula e organismo diferente e/ou pode ser um polinucleotídeo recombinante. Uma vez no interior da célula hospedeira, a construção genética pode se tornar integrada no DNA cromos- sômico hospedeiro. A construção genética pode ser ligada a um vetor.

[00252] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de polinucleotí- deo, geralmente DNA de fita dupla, que é usada para transportar a construção genética para uma célula hospedeira. O vetor pode ser capaz de replicação em pelo menos um sistema hospedeiro adicional, tais como E. coli.

[00253] O termo "construção de expressão" refere-se a uma construção genética que inclui os elementos necessários que permitem a transcrição da molécula de polinucleotídeo de inserção, e, opcionalmente, traduzindo a transcrição em um polipeptídeo. Uma construção de expressão compreende tipicamente em uma direção de 5' para 3':

[00254] a) um promotor funcional na célula hospedeira na qual a construção vai ser transformada,

[00255] b) o polinucleotídeo a ser expresso, e

[00256] c) um terminador funcional na célula hospedeira na qual a construção vai ser transformada.

[00257] O termo "região de codificação" ou "quadro de leitura aberto" (ORF) refere-se a fita senso de uma sequência de DNA genômica ou de uma sequência de cDNA que é capaz de produzir um produto de transcrição e/ou um polipeptídeo sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. A sequência de codificação pode, em alguns casos, identificada pela presença de um códon de iniciação da tradução 5' e um códon de interrupção da tradução 3'. Quando inserida em uma construção genética, uma "sequência de codificação" é capaz de ser expressada quando está operativamente ligada às sequências termi- nadoras e promotoras.

[00258] "Operativamente ligada" significa que o sequenciado a ser expressado é colocado sob o controle de elementos reguladores que incluem promotores, elementos reguladores específicos de tecidos, elementos regulatórios temporais, potenciadores, repressores e termi- nadores.

[00259] O termo "região não codificante" refere-se às sequências não traduzidas que estão a montante do sítio de início da tradução e a jusante do sítio de interrupção translacional. Estas sequências também são referidas, respectivamente, como UTR 5' e UTR 3'. Estas regiões incluem elementos necessários para a iniciação da transcrição e terminação, estabilidade do mRNA, e para a regulação da eficiência da tradução.

[00260] Terminadores são sequências que terminam a transcrição e são encontrados nas extremidades não traduzidas 3' dos genes a jusante da sequência traduzida. Os terminadores são determinantes importantes da estabilidade do mRNA e em alguns casos têm funções regulatórias espaciais.

[00261] O termo "promotor" refere-se a elementos cis-regulatórios não transcritos a montante da região de codificação que regulam a transcrição gênica. Os promotores compreendem elementos cis- iniciadores que especificam o sítio de início da transcrição e caixas conservadas como a caixa TATA, e os motivos que estão ligados por fatores de transcrição. Os íntrons dentro das sequências de codificação também podem regular a transcrição e influenciar o processamento pós-transcricional (incluindo junção, capping e poliadenilação).

[00262] Um promotor pode ser homólogo em relação ao polinucleo- tídeo a ser expresso. Isto significa que o promotor e o polinucleotídeo são encontrados operativamente ligados na natureza.

[00263] Alternativamente, o promotor pode ser heterólogo em relação ao polinucleotídeo a ser expresso. Isto significa que o promotor e o polinucleotídeo não são encontrados operativamente ligados na natureza.

[00264] Um "transgene" é um polinucleotídeo que é tirado de um organismo e introduzido em um organismo diferente por transformação. O transgene pode ser derivado da mesma espécie ou de uma espécie diferente, como as espécies do organismo no qual o transgene é introduzido.

[00265] Uma "repetição invertida" é uma sequência que é repetida, onde a segunda metade da repetição está na fita complementar, por exemplo, (5') GATCTA TAGATC (3') (3') CTAGAT ATCTAG (5')

[00266] A transcrição read-through produzirá uma transcrição que sofre emparelhamento de base complementar para formar uma estrutura de grampo de cabelo desde que exista um espaçador 3-5 pb entre as regiões repetidas. Células hospedeiras

[00267] As células hospedeiras podem ser derivadas de, por exemplo, organismos de bactérias, de fungos, de levedura, de inseto, de mamífero, de algas ou de plantas. As células hospedeiras também podem ser células sintéticas. As células hospedeiras preferidas são as células eucarióticas. Uma célula hospedeira particularmente preferida é uma célula de planta, especialmente uma célula de planta em um tecido vegetativo de uma planta.

[00268] A "planta transgênica" refere-se a uma planta que contém material genético novo como resultado de manipulação genética ou transformação. O novo material genético pode ser derivado de uma planta da mesma espécie como a planta transgênica resultante ou a partir de uma espécie diferente. Métodos para isolar ou produzir polinucleotídeos

[00269] As moléculas polinucleotídicas da invenção podem ser isoladas usando uma variedade de técnicas conhecidas pelos especialistas da técnica. A título de exemplo, tais polipeptídeos podem ser isolados através do uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) descrita em Mullis et al., Eds. 1994, The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, incorporado aqui por referência. Os polipeptídeos da invenção podem ser amplificados usando iniciadores, tal como definido aqui, deri- vado das sequências polinucleotídicas da invenção.

[00270] Outros métodos para isolar polinucleotídeos da invenção incluem o uso de todos, ou porções de, polipeptídeos possuindo a sequência estabelecida aqui como sondas de hibridização. A técnica de hibridização de sondas polinucleotídicas marcadas para polinucleotí- deos imobilizados em suportes sólidos, tais como filtros de nitrocelulo- se ou membranas de nylon, pode ser usada para rastrear as bibliotecas genômicas ou de cDNA. Hibridização exemplar e condições de lavagem são: hibridização por 20 horas a 65° C em 5,0 X SSC, 0,5 % de dodecil sulfato de sódio, solução de 1 X Denhardt; lavagem (três lavagens de vinte minutos cada a 55° C) em 1,0 X SSC, 1% (p/v) de dodecil sulfato de sódio e, opcionalmente, uma lavagem (por vinte minutos) em 0,5 X SSC, 1% (p/v) de dodecil sulfato de sódio, a 60° C. Uma lavagem adicional opcional (por vinte minutos) pode ser conduzida sob condições de 0,1 X SSC, 1% (p/v) de dodecil sulfato de sódio, a 60° C.

[00271] Os fragmentos de polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas na técnica, tais como digestão de restrição de endonuclease, síntese de oligonucleotídeos e amplificação por PCR.

[00272] Uma sequência polinucleotídica parcial pode ser usada em métodos bem conhecidos na técnica para identificar a sequência poli- nucleotídica correspondente de comprimento completo. Tais métodos incluem métodos baseados em PCR, 5'RACE (Frohman MA, 1993, Methods Enzymol 218: 340-56) e método baseado em hibridização, métodos baseados em computador /banco de dados. Além disso, a título de exemplo, a PCR inversa permite a aquisição de sequências desconhecidas, flanqueando as sequências polinucleotídicas reveladas aqui, começando com os iniciadores com base em uma região conhecida (Triglia et al., 1998, Nucleic Acids Res 16, 8186, incorporado aqui por referência). O método usa várias enzimas de restrição para gerar um fragmento adequado na região conhecida de um gene. O fragmento é então circularizado por ligação intramolecular e usado como um modelo de PCR. Iniciadores divergentes são projetados a partir da região conhecida. A fim de reunir fisicamente os clones de comprimento completo, abordagens padrão de biologia molecular podem ser usadas (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987).

[00273] Pode ser benéfico ao produzir uma planta transgênica a partir de uma espécie específica, transformar tal planta com uma sequência ou sequências derivadas de tal espécie. O benefício pode ser de aliviar as preocupações do público em relação à transformação de espécies cruzadas na geração de organismos transgênicos. Além disso, quando a regulação negativa de um gene é o resultado desejado, pode ser necessário utilizar uma sequência idêntica (ou pelo menos altamente semelhante) para isso na planta, para a qual a expressão reduzida é desejada. Por estas razões, entre outros, é desejável ser capaz de identificar e isolar os ortólogos de um gene específico em várias espécies de plantas diferentes.

[00274] Variantes (incluindo ortólogos) podem ser identificados através dos métodos descritos. Métodos para a identificação de variantes Métodos físicos

[00275] Os polipeptídeos variantes podem ser identificados usando os métodos baseados em PCR (Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser). Tipicamente, a sequência de polinu- cleotídeo de um iniciador, útil para amplificar as variantes de moléculas polinucleotídicas da invenção por PCR, pode ser baseada em uma sequência que codifica uma região conservada da sequência de ami- noácidos correspondente.

[00276] Alternativamente, métodos de biblioteca de rastreamento bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser empregados (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987). Ao identificar variantes da sequência da sonda, a hibridação e/ou a severidade de lavagem será tipicamente reduzida relativamente para quando as combinações de sequência exatas forem procuradas.

[00277] As variantes de polipeptídeos também podem ser identificadas por métodos físicos, por exemplo, por bibliotecas de expressão de rastreamento usando anticorpos criados contra os polipeptídeos da invenção (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987) ou através da identificação de po- lipeptídeos a partir de fontes naturais com o auxílio de tais anticorpos. Métodos baseados em computador

[00278] As sequências das variantes da invenção, incluindo as variantes de polinucleotídeos e polipeptídeos, podem também ser identificadas por métodos com base em computador bem conhecidos dos especialistas na técnica, usando algoritmos de alinhamento de sequências de domínio público e ferramentas de pesquisa de similaridade de sequências para pesquisar bancos de dados de sequências (bancos de dados de domínio público incluem Genbank, EMBL, Swiss-Prot, PIR e outros). Ver, por exemplo, Nucleic Acids. Res. 29: 1-10 e 11-16, 2001, para exemplos de recursos online. Pesquisas de similaridade recuperam e alinham as sequências-alvo para a comparação com uma sequência a ser analisada (isto é, uma sequência de consulta). Algoritmos de comparação de sequências usam matrizes de pontuação para atribuir uma pontuação global a cada um dos alinhamentos.

[00279] Uma família exemplar de programas úteis para a identificação de variantes em bancos de dados de sequências é o conjunto de programas BLAST (versão 2.2.5 [Nov 2002]), incluindo BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN e tBLASTX, que estão disponíveis ao público em (ftp://ftp .ncbi.nih.gov explosão / /) do Centro Nacional para Informação em Biotecnologia (NCBI), National Library of Medicine, Edifício 38A, Sala 8N805, Bethesda, MD 20894 EUA. O servidor NCBI também proporciona a possibilidade de usar os programas para ras- trear uma série de bancos de dados de sequências publicamente disponíveis. BLASTN compara uma sequência de nucleotídeos de consulta contra um banco de dados de sequência de nucleotídeos. BLASTP compara uma sequência de aminoácidos de consulta contra um banco de dados de sequência de proteína. BLASTX compara uma sequência de nucleotídeos de consulta traduzida em todos os quadros de leitura contra um banco de dados de sequência de proteína. tBLASTN compara uma sequência de proteína de consulta contra uma base de dados de sequência de nucleotídeos dinamicamente traduzida em todos os quadros de leitura. tBLASTX compara as traduções de seis quadros de uma sequência de nucleotídeos de consulta contra as traduções de seis quadro de um banco de dados de sequência de nu- cleotídeos. Os programas BLAST podem ser utilizados com os parâmetros padrão ou os parâmetros podem ser alterados conforme necessário para refinar a busca.

[00280] O uso da família BLAST de algoritmos, incluindo BLASTN, BLASTP e BLASTX, é descrita na publicação de Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997.

[00281] As "ocorrências" para uma ou mais sequências do banco de dados por uma sequência consultada produzida por BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN, tBLASTX, ou um algoritmo semelhante, alinham e identificam porções semelhantes de sequências. As ocorrências são dispostas por ordem de grau de semelhança e de comprimento de sobreposição de sequência. As ocorrências a uma sequên- cia de banco de dados representam, geralmente, uma sobreposição ao longo de apenas uma fração do comprimento da sequência da sequência consultada.

[00282] Os algoritmos BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN e tBLASTX também produzem valores "esperados" para alinhamentos. O valor esperado (E) indica o número de ocorrência que se pode "esperar" para ver por acaso ao pesquisar um banco de dados do mesmo tamanho contendo sequências aleatórias contíguas. O valor esperado é usado como um limiar de significância para determinar se a ocorrência de um banco de dados indica verdadeira semelhança. Por exemplo, um valor E de 0,1 atribuído a uma ocorrência de polinucleotídeo é interpretado como significando que, em um banco de dados do tamanho do banco de dados rastreados, pode-se esperar ver 0,1 correspondências sobre a porção alinhada da sequência com uma pontuação semelhante simplesmente por acaso. Para sequências possuindo um valor E de 0,01 ou menos ao longo das porções alinhadas e cor-respondidas, a probabilidade de encontrar uma correspondência por acaso no banco de dados é de 1% ou menos usando o algoritmo BLASTN, BLASTP, BLASTX, tBLASTN ou tBLASTX.

[00283] Alinhamentos de sequências múltiplas de um grupo de sequências relacionadas podem ser realizados com CLUSTALW (Thompson, JD, Higgins, DG e Gibson, TJ (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc.u- strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top.html) ou T-COFEE (Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, Jaap Heringa, T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302: 205-217)) ou PILEUP, que usa alinhamentos progressivos emparelhados. (Feng e Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 25, 351).

[00284] As aplicações padrão de software de reconhecimento estão disponíveis para encontrar motivos ou sequências de assinatura. Por exemplo, MEME (Em múltiplo para elicitação de motivo) encontra motivos e as sequências de assinatura em um conjunto de sequências, e MAST (Alinhamento de motivo e ferramenta de busca) usa estes motivos para identificar motivos semelhantes ou iguais em sequências de consulta. Os resultados de MAST são fornecidos como uma série de alinhamentos com os dados estatísticos apropriados e uma visão geral dos motivos encontrados. MEME e MAST foram desenvolvidos na Universidade da Califórnia, São Diego.

[00285] PROSITE (Bairoch e Bucher, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 3583; Hofmann et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27, 215) é um método para identificar as funções das proteínas não caracterizadas traduzidas a partir de sequências genômicas ou de cDNA. O banco de dados de PROSITE (www.expasy.org/prosite) contém padrões e perfis biologicamente significativos e é concebido de modo que ele possa ser usado com ferramentas apropriadas computacionais para atribuir uma nova sequência a uma família conhecida de proteínas ou para determinar qual(is) domínio(s) conhecido(s) está(ão) presente(s) na sequência (Falquet et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30, 235). Própes- quisa é uma ferramenta que pode pesquisar bancos de dados SWISS-PROT e EMBL com um determinado padrão ou assinatura de sequência. Método para isolar polipeptídeos

[00286] Os polipeptídeos da invenção, ou usados nos métodos da invenção, incluindo variantes polipeptídicas, podem ser preparados usando métodos de síntese de peptídeos bem conhecidos na técnica, tais como síntese direta de peptídeos usando técnicas de fase sólida (por exemplo, Stewart et al., 1969, em Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, São Francisco, Califórnia, ou síntese automatizada, por exemplo, utilizando um sintetizador de peptídeo 431A Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). As formas modificadas dos poli- peptídeos podem também ser produzidas durante tal síntese.

[00287] Os polipeptídeos e variante de polipeptídeos da invenção, ou usados nos métodos da invenção, também podem ser purificados a partir de fontes naturais usando uma variedade de técnicas que são bem conhecidas na técnica (por exemplo, Deutscher, 1990, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 182, Guia para purificação de proteínas).

[00288] Alternativamente, os polipeptídeos e variante de polipeptí- deos da invenção, ou usados nos métodos da invenção, podem ser expressados de forma recombinante em células hospedeiras adequadas e separados das células, como discutido abaixo. Métodos para produção de construções e vetores

[00289] As construções genéticas da presente invenção compreendem uma ou mais sequências polinucleotídicas da invenção e/ou poli- nucleotídeos que codificam polipeptídeos da invenção, e podem ser úteis para a transformação, por exemplo, de organismos bacterianos, fúngicos, de insetos, mamíferos ou vegetais. As construções genéticas da presente invenção pretendem incluir construções de expressão conforme definido aqui.

[00290] Os métodos para a produção e utilização de construções e vetores genéticos são bem conhecidos na técnica e são descritos, em geral, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987). Métodos para produzir células hospedeiras compreendendo polinucle- otídeos, construções ou vetores

[00291] A invenção proporciona uma célula hospedeira que compreende uma construção ou vetor genético da invenção.

[00292] As células hospedeiras compreendendo construções gené- ticas, tais como construções de expressão, da presente invenção são úteis em métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987) para a produção recombinante de poli- peptídeos da invenção. Tais métodos podem envolver a cultura de células hospedeiras em um meio adequado, em condições adequadas para a expressão ou para a condução da expressão de um polipeptí- deo da invenção. O polipeptídeo recombinante expresso, que pode ser opcionalmente secretado para a cultura, pode então ser separado do meio, das células hospedeiras ou do meio de cultura por métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Deutscher, Ed., 1990, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guia para purificação de proteína). Métodos para produzir células vegetais e plantas compreendendo construções e vetores

[00293] A invenção proporciona ainda células vegetais que compreendem uma construção genética da invenção e células vegetais modificadas para alterar a expressão de um polinucleotídeo ou poli- peptídeo da invenção, ou usadas nos métodos da invenção. As plantas compreendendo tais células também formam um aspecto da invenção.

[00294] Os métodos para transformar células vegetais, plantas e porções das mesmas com polipeptídeos são descritos em Draper et al., 1988 Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual. Blackwell Sci. Pub. Oxford, p. 365; Potrykus e Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin; e Gelvin et al., 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht. Uma revisão de plantas transgênicas, incluindo técnicas de transformação, é fornecida em Galun e Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, Londres. Métodos para a manipulação genética de plantas

[00295] Um número de estratégias de transformação de plantas está disponível (por exemplo, Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol. Biol, 48, 297, Hellens RP, et al. (2000) Plant Mol. Biol 42: 819-32, Hel- lens R et al. Plant Meth 1:13). Por exemplo, as estratégias podem ser concebidas para aumentar a expressão de um polinucleotídeo/ poli- peptídeo em uma célula, órgão de planta e/ou em uma fase de desenvolvimento específica onde/quando ele é normalmente expressado ou para expressar ectopicamente um polinucleotídeo/ polipeptídeo em uma célula, tecido, órgão e/ou em uma fase de desenvolvimento específica onde/quando não é normalmente expressado. O polinucleotídeo/ polipeptídeo expressado pode ser derivado das espécies de plantas a serem transformadas ou pode ser derivado de uma espécie de plantas diferente.

[00296] As estratégias de transformação podem ser concebidas para reduzir a expressão de um polinucleotídeo/ polipeptídeo em uma célula, tecido, órgão de planta ou em uma fase de desenvolvimento específica onde/quando é normalmente expressado. Estas estratégias são conhecidas como estratégias de silenciamento do gene.

[00297] As construções genéticas para a expressão de genes em plantas transgênicas tipicamente incluem promotores para dirigir a expressão de um ou mais polinucleotídeo clonado, terminadores e sequências de marcadores selecionáveis para detectar a presença da construção genética na planta transformada.

[00298] Os promotores adequados para uso nas construções da presente invenção são funcionais em uma célula, um tecido ou um órgão de uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea e incluem promotores específicos de células, tecidos e órgãos, promotores específicos do ciclo celular, promotores temporais, promotores indutíveis, promotores constitutivos que são ativos na maioria dos tecidos vege- tais e promotores recombinantes. A escolha do promotor dependerá da expressão temporal e espacial do polinucleotídeo clonado, se for desejado. Os promotores podem ser aqueles normalmente associados com um transgene de interesse, ou promotores que são derivados de genes de outras plantas, vírus e bactérias e fungos patogênicos de plantas. Os especialistas na técnica serão, sem experimentação indevida, capaz de selecionar os promotores que são adequados para o uso na modificação e modulação de características de plantas usando construções genéticas que compreendem as sequências polinucleotí- dicas da invenção. Exemplos de promotores constitutivos de plantas incluem o promotor CaMV 35S, o promotor da nopalina sintase e o promotor da octopina sintase, e o promotor Ubi 1 de milho. Os promotores de plantas que são ativos em tecidos específicos, respondem aos sinais internos de desenvolvimento ou ao estresse abiótico ou bió- tico externo, são descritos na literatura científica. Promotores exemplares são descritos, por exemplo, em WO 02/00894, que é incorporado aqui por referência.

[00299] Os terminadores exemplares que são normalmente usados na transformação de planta de construção genética incluem, por exemplo, o terminador do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S, os terminadores Agrobacterium tumefaciens nopalina sintase ou octopina sintetase, o gene terminador Zea mays zeína, o terminador Oryza sativa ADP-glicose pirofosforilase e o terminador Solanum tuberosum PI-II.

[00300] Os marcadores selecionáveis comumente usados na transformação de plantas incluem o gene neomicina fofotransferase II (TNP II) que confere resistência à canamicina, o gene aadA, que confere resistência à espectinomicina e estreptomicina, a fosfinotricina acetil transferase (gene bar) para resistência à Ignite (AgrEvo) e Basta (Hoechst) e o gene higromicina-fosfotransferase (hpt) para resistência à higromicina.

[00301] O uso de construções genéticas que compreendem genes repórteres (sequências de codificação que expressam uma atividade que é externa ao hospedeiro, normalmente uma atividade enzimática e/ou um sinal visível (por exemplo, luciferase, GUS, GFP) que podem ser usados para análise de expressão do promotor em plantas e tecidos de plantas são também contemplados. A literatura de gene repórter é revista em Herrera-Estrella et al., 1993, Nature 303, 209, e Schrott, 1995, In: Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336.

[00302] A seguir, são publicações representativas revelando protocolos de transformação genética que podem ser usados para transformar geneticamente as seguintes espécies de plantas: arroz (Alam et al., 1999, Plant Cell Rep. 18, 572); maçã (Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412); milho (Patente US N°s de Série 5177010 e 5981840); trigo (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877); tomate (Patente US N°de Série 5159135); batata (Kumar et al., 1996 Planta J. 9, 821); mandioca (Li et al., 1996 Nat Biotechnology 14, 736); alface (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439); tabaco (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229); algodão (Patente US N°s de Série 5846797 e 5004863); gramíneas (Patentes US N°s 5187073 e 6020539); hortelã-pimenta (Niu et al., 1998, Plant Cell Rep. 17, 165);. plantas cítricas (Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183); cominho (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39); banana (Patente US N° de Série 5792935); soja (Patente US N°s 5416011; 5569 834; 5824877; 556304455 e 5968830); abacaxi (Patente US N° de Série 5952543); choupo (Patente US N°. 4795855); monocotiledôneas em geral (Patente US N°s 5591616 e 6037522); Brassica (Patente US N°s 5188958; 5463174 e 5750871); cereais (Patente US N° 6074877); pera (Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51); Prunus (Ramesh et al., 2006 Plant Cell Rep. 25(8):821-8; Song e Sink 2005 Plant Cell Rep. 2006; 25(2):117-23; Gonzalez Padilla et al., 2003 Plant Cell Rep.22(1):38- 45); morango (Oosumi et al., 2006. Planta 223(6):1219-30; Folta et al., 2006 Planta 14 de abril; PMID:16614818), rosa (Li et al., 2003), Rubus (Graham et al., 1995 Methods Mol Biol 1995; 44:129-33), tomate (Dan et al., 2006, Plant Cell Reports V25:432-441), maçã (Yao et al., 1995, Plant Cell Rep. 14, 407-412), canola (Brassica napus L.) (Cardoza e Stewart, 2006 Methods Mol Biol. 343:257-66), cártamo (Orlikowska et al., 1995, Plant Cell Tissue and Organ Culture 40:85-91), azevém (Alt- peter et al., 2004 Developments in Plant Breeding 11(7):255-250), arroz (Christou et al., 1991 Nature Biotech 9:957-962), milho (Wang et al 2009 in: Handbook of maize pp 609-639) e Actinidia eriantha (Wang et al., 2006, Plant Cell Rep. 25,5: 425-31). A transformação de outras espécies é também contemplada pela invenção. Os métodos e protoco-los adequados estão disponíveis na literatura científica. Plantas

[00303] O termo "planta" destina-se a incluir uma planta inteira, qualquer parte de uma planta, uma semente, uma fruta, propágulos e progênie de uma planta.

[00304] O termo 'propágulo' significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexuada ou assexuada, incluindo as sementes e as mudas.

[00305] As plantas da invenção podem ser cultivadas e autofecun- dadas ou cruzadas com uma estirpe de planta diferente e os híbridos resultantes, com as características fenotípicas desejadas, podem ser identificados. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que as características fenotípicas sujeitas são estavelmente mantidas e herdadas. As plantas resultantes de tais abordagens reprodutivas padrão também constituem um aspecto da presente invenção. Abreviaturas

[00306] Oleosina (ou Ole)_0-0 significa uma oleosina sem cisteínas modificadas.

[00307] Oleosina (ou Ole)_1-1 significa uma oleosina com uma cis- teína modificada em cada braço hidrofílico.

[00308] Oleosina (ou Ole)_1-3 significa uma oleosina com uma cis- teína modificada no braço hidrofílico N-terminal e três cisteínas modificadas no braço hidrofílico C-terminal.

[00309] Oleosina (ou Ole)_3-1 significa uma oleosina com três cis- teínas modificadas no braço hidrofílico N-terminal e um cisteína modificada no braço hidrofílico C-terminal.

[00310] Oleosina (ou Ole)_3-3 significa uma oleosina com três cis- teínas modificadas no braço hidrofílico N-terminal e três cisteínas modificadas no braço hidrofílico C-terminal.

[00311] Oleosina (ou Ole)_5-6 significa uma oleosina com cinco cis- teínas modificadas no braço hidrofílico N-terminal e seis cisteínas modificadas no braço hidrofílico C-terminal.

[00312] Oleosina (ou Ole)_6-7 significa uma oleosina com seis cis- teínas modificadas no braço hidrofílico N-terminal e sete cisteínas modificadas no braço hidrofílico C-terminal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00313] A figura 1 mostra a sequência da construção da Oleosi- na_0-0 e DGAT1 (S205A). CaMV35 é o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. attB1 é o sítio de recombinação GATEWAY®. UBQ10 é o íntron do gene A. thaliana UBQ10. O terminador OCS é o terminador octopina sintase.

[00314] A figura 2 mostra o arranjo da construção da Oleosina_1-1 e DGAT1 (S205A) transformado em Arabidopsis thaliana.

[00315] A figura 3 mostra a sequência da construção da Oleosi- na_1-3 e DGAT1 (S205A). CaMV35 é o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor. attB1 é o sítio de recombinação GATEWAY™. UBQ10 é o íntron do gene A. thaliana UBQ10. O terminador OCS é o terminador octopina sintase.

[00316] A figura 4 mostra a construção da Oleosina_3-1 e DGAT1 (S205A). CaMV35 é o promotor 35S do vírus do mosaico da couve- flor. attB1 é o sítio de recombinação GATEWAY™. UBQ10 é o íntron do gene A. thaliana UBQ10. O terminador OCS é o terminador octopina sintase.

[00317] A figura 5 mostra a construção da Oleosina_3-3 e DGAT1 (S205A). CaMV35 é o promotor 35S do vírus do mosaico da couve- flor. attB1 é o sítio de recombinação GATEWAY™. UBQ10 é o íntron do gene A. thaliana UBQ10. O terminador OCS é o terminador octopina sintase.

[00318] A figura 6 mostra um mapa da construção pRSh1 usada para transformar plantas. O mapa mostra a disposição das oleosinas com cisteínas artificialmente introduzidas (neste caso Oleo_3-3) sob o controle do promotor CaMV35s, bem como Arabidopsis thaliana DGAT1 (S205A) também sob o controle do promotor CaMV35S. Outras sequências de oleosina e sequências da enzima de síntese de TAG podem, naturalmente, ser substituídas por Oleo_3-3 e DGAT1 respectivamente.

[00319] A figura 7 mostra a comparação dot blot de anticorpos anti- oleosina de semente de sésamo se ligando a oleosina de semente de sésamo recombinante purificada com e sem resíduos de cisteína modificados.

[00320] A figura 8 mostra a análise imunoblot para detectar as pro teínas de cisteína oleosina expressadas E. coli em AOBs. Volume igual de AOB (7,5 μL incluindo 2x corante de carregamento SDS sem agente redutor) foi carregado por faixa. A concentração mM de GSSG é indicada acima de cada faixa.

[00321] A figura 9 mostra SDS e SDS-PAGE UREIA/ análise de imunoblot de Ole-0-0, Ole-1-1 e Ole-3-3 expressada em E. coli. As amostras foram preparadas a partir de corpos de inclusão (IB) e de corpos oleosos artificiais (AOBs) na presença e na ausência de agentes redutores (DTT e β-ME) ou agente oxidante (GSSG), onde quantidades iguais de proteína foram carregadas em faixas adjacentes.

[00322] A figura 10 mostra a análise de imunoblot da acumulação de oleosina (Oleo_0-0, Oleo_1-3, Oleo_3-1, e Oleo_3-3, SEQ ID NOs 11-20) nas sementes de Arabidopsis thaliana transgênica que expressam DGAT1 (S205A) e uma oleosina de sésamo sob o controle de promotores CaMV35S.

[00323] A figura 11 mostra a análise de imunoblot da acumulação de oleosina (Oleo_0-0, Oleo_1-3, Oleo_3-1, e Oleo_3-3, SEQ ID NOs 11-20) nos corpos oleosos de Arabidopsis thaliana transgênica que expressam DGAT1 (S205A) e uma oleosina de sésamo sob o controle de promotores CaMV35S. A aparência das bandas da oleosina oligo- mérica (dimérica e trimérica) na presença de agente oxidante (+) indica que as ligações de dissulfeto são capazes de formar no exterior dos corpos oleosos nativos.

[00324] A figura 12 mostra a análise de imunoblot da acumulação de oleosina (Oleo_0-0, Oleo_1-3, Oleo_3-1, e Oleo_3-3, SEQ ID NOs 11-20) nas folhas de Arabidopsis thaliana transgênica que expressam DGAT1 (S205A) e uma oleosina de sésamo sob o controle de promotores CaMV35S.

[00325] A figura 13 mostra imunoblot da acumulação de oleosina recombinante (seta preta) em folhas de Arabidopsis transgênica.

[00326] A figura 14 mostra os resultados FAMES GC/MS demonstrando acumulação de lipídios adicionais (setas pretas) em folhas de Arabidopsis hiperexpressando DGAT1 (S205A) e Ole_3,3.

[00327] A figura 15 mostra resultados GC/MS para o perfil de lipídios de folha total do tipo selvagem e linhagens independentes de Arabidopsis transgênica contendo DGAT1 (S205A) e Ole_3, 3. A seta cinza indica padrão interno. Setas pretas indicam lipídios neutros adicionais (ésteres de cera, ésteres de esterol e TAGs). Setas abertas mostram três linhagens (41S, 18A e 47C), que acumulam grandes quantidades de lipídios neutros em suas folhas em comparação ao tipo selvagem (e linha 50A)

[00328] A figura 16 mostra resultados GC/MS mostrando o perfil de TAG total do tipo selvagem e Arabidopsis transgênica (contendo DGAT1 (S205A) e Ole_3,3) 2, 3, 4 e 5 semanas após a germinação. Setas pretas indicam TAGs adicionais encontrados em folhas transgê- nicas, mas não do tipo selvagem.

[00329] A figura 17 mostra resultados FAMES GC/MS mostrando perfis totais de folhas lipídicas do tipo selvagem e Trifolium repens transgênica (contendo DGAT1 (S205A) e Ole_3,3).

[00330] A figura 18 mostra resultados FAMES GC/MS mostrando perfis de folha lipídicas C18:1 e C18:2 do tipo selvagem e Trifolium repens transgênico (contendo DGAT1 (S205A) e Ole_3,3). EXEMPLOS

[00331] A invenção será agora ilustrada com referência aos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLO 1: Criação de anticorpos de coelho antioleosina de semente de sésamo Geração de anticorpos de coelho antioleosina de sementes de sésamo

[00332] A oleosina de semente de sésamo de comprimento completo contendo um marcador His C-terminal (a sequência de nucleotídeo é mostrada na SEQ ID NO: 1) foi expressada em E. coli e corpos de inclusão foram preparados por técnicas padrão. Os corpos de inclusão foram solubilizados em tampão de ligação (100 mM tampão fosfato, pH 8,0, 500 mM NaCl, 8M ureia e 10 mM imidazol) e carregados em uma coluna contendo Ni agarose por cromatografia de afinidade por íons metálicos equilibrada (IMAC) (Invitrogen). As proteínas não ligadas foram removidas da coluna por lavagem com 6 volumes de tampão de lavagem (100 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 500 mM NaCl, 6M ureia e 50 mM imidazol). A proteína foi eluída em alíquotas de 1 vol. de tampão de eluição (100 mM tampão fosfato, pH 8,0, 500 mM NaCl, 6M ureia e 250mM imidazol). As frações eluídas foram analisadas por SDS- PAGE/corante Coomassie e a concentração de proteína medida usando o Ensaio de Bradford. 265μg da proteína oleosina recombinante purificada por IMAC foi misturado com uma quantidade igual de Adjuvante Completo de Freund para um volume final de 0,5 mL. Após a coleta de pré-sangue, a primeira injeção foi administrada em locais múltiplos na parte detrás do pescoço e área do ombro de um coelho. Doses de reforço contendo 77μg da oleosina purificada foram distribuídas na terceira e sétima semana após a primária, e um teste de sangramento de ~ 3 mL foi removido para análise preliminar na nona semana. O soro foi conservado pela adição de 0,25% v/v de fenol e 0,01% v/v de mertiola- to, e armazenado em alíquotas de 200μL a -20° C.

[00333] A sensibilidade dos anticorpos oleosina de semente de sésamo anticoelho foi avaliada por imuno-dotting que indicou que 0,25ng de oleosina de semente de sésamo poderia ser regularmente detectado com uma diluição de 1/2.000 do anticorpo (figura 7). Exemplo 2: Design e expressão da E.coli de oleosinas modificadas contendo um ou mais resíduos de cisteína introduzidos artificialmente Design de construção para a expressão em E. coli

[00334] Um número de construções de oleosina modificada para a expressão em E. coli foi concebido. Estas continham um ou três resíduos de cisteína nos braços hidrofílicos N-terminal e C-terminais. As construções foram baseadas na sequência de nucleotídeo e sequência de polipeptídeo traduzida a partir de uma oleosia de semente de sésamo, GenBank clone AF091840 que não contém resíduos de cisteína (SEQ ID NO: 16).

[00335] Todos os clones foram subclonados em pET29b usando sítios Ndel/Xhol modificados. Além disso, uma sequência de codificação ProTrp foi adicionada à região de codificação da extremidade 3' do braço hidrofílico C-terminal para imitar os resíduos de aminoácidos codificados pelo sítio Ncol anteriormente modificado por Peng et al. (2006). Stability enhancement of native and artificial oil bodies by gen- ipin crosslink. Patente de Taiwan I 250466.

[00336] As proteínas oleosina-cisteína modificadas para incluir resíduos de cisteína em ambas as regiões hidrofílicas N- e C- terminais descritas aqui são designadas Ole-1-1, Ole-1-3, Ole-3-1, e Ole-3-3 (SEQ ID NO 2, 3, 4, e 5, respectivamente), onde o primeiro e o segundo dígitos de algarismo correspondem ao número de ligações dissulfe- to no N- e C- terminal, respectivamente. A oleosina padrão sem os resíduos de cisteína foi usada como um controle e foi designada como Ole-0-0 (SEQ ID NO 1).

[00337] As cisteínas foram substituídas por resíduos carregados previstos para estar na superfície dos corpos oleosos e estão listadas abaixo.

[00338] Cisteína única N-terminal (Ole-1-x) Glu3Cys

[00339] Cisteína triplo N-terminal (Ole-3-x) Glu3Cys Arg12Cys Gln23Cys

[00340] Cisteína única C-terminal (Ole-x-1) Gln137Cys

[00341] Cisteína tripla C-terminal (Ole-x-3) Gln112Cys Lys123Cys Gln137Cys

[00342] As construções foram concebidas que poderiam ser relativamente simples sub clonadas a partir do GENEART fornecendo espinha dorsal (pCR4Blunt-TOPO) em pET29b (Novogen) através de digestão Ncol/Xhol e de ligação. Isto colocou a sequência de codificação da oleosina a jusante da fusão pET29 N-terminal S^marcador e a mon- tante do marcador His C-terminal (figuras 1-5 e SEQ ID NOS 1-10). As oleosinas e as sequências de oleosinas modificadas usadas são resumidas no Sumário da tabela de Sequências. Expressão em E. coli e purificação de oleosinas modificadas contendo pelo menos uma cisteína introduzida artificialmente

[00343] A expressão das oleosinas de semente de sésamo recom- binantes (com e sem cisteínas modificadas) no sistema de expressão da E. coli foi avaliada por SDS-PAGE/corante Coomassie azul brilhante e SDS-PAGE/ análise imunoblot usando anticorpos criados contra a oleosina da semente de sésamo (descrito no Exemplo 1).

[00344] A expressão da oleosina modificada recombinante foi induzida em uma cultura de 10 mL fresca inoculada de E. coli (BL21 Roset- ta-Gami), contendo uma sequência de codificação da oleosina (com ou sem resíduos de cisteína modificadas) no vetor de expressão pET29. A cultura foi cultivada a 37° C, 220rpm, até a fase log média (OD6000,5 0,7); a expressão foi induzida pela adição de IPTG a 1 mM de concentração final. A cultura induzida foi incubada a 37° C, 220rpm, por mais 2-3h. Dadas as propriedades da oleosina modificada, os requerentes não tentaram expressá-la em uma forma solúvel, mas escolheram extraí-la de corpos de inclusão. As alíquotas (1 mL) da cultura foram transferidas para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células pele- tizadas por centrifugação (2655 x g durante 5 min a 4° C).

[00345] As células peletizadas foram ressuspensas em Reagente BugBuster® (Merck) a 5 mL/g de pelota de células úmidas, com a adição de DNase a 40 μg/mL e misturadas suavemente em um rotor durante 30 min seguido por centrifugação a 8000g durante 10 min a 4° C. A pelota celular resultante foi retirarada com BugBuster® e DNase como descrito acima. A proteína solúvel restante e os detritos de células em suspensão foram separados dos corpos de inclusão insolúveis por centrifugação a 8000g durante 10 min a 4° C.

[00346] As oleosinas recombinantes foram ainda purificadas a partir dos corpos de inclusão, usando um procedimento adaptado de D'Andrea et al. (2007). Resumidamente: a preparação de corpos de inclusão foi lavada por re-suspensão em 200 mM de tampão de carbonato de sódio, pH 11 (5 mL por grama de pélete de células inicial) e resse- dimentada por centrifugação a 8000 x g durante 10 min a 4° C. O péle- te de corpo de inclusão lavada foi novamente ressuspenso em 5 mL de 200 mM de tampão carbonato de sódio por grama de pelota e adicionada a 9 volumes de clorofórmio recentemente preparado: mistura de metanol (5:4 v/v) dando uma proporção final de 5:4 :1 (clorofórmio: metanol: tampão). A suspensão foi misturada suavemente durante 5 min, que formou uma mistura de fase única leitosa, que foi centrifugada a 10.000 x g durante 10 min a 4° C, e o sobrenadante contendo a oleosina modificada foi cuidadosamente separado da pelota e transferido para um novo tubo. As alíquotas do sobrenadante foram secadas sob uma corrente de nitrogênio e a proteína ressolubilizada em 8M ureia e quantificada por Qubit® (Invitrogen). EXEMPLO 3: Uso de anticorpos antioleosina de sementes de sésamo para ligar a oleosina de semente de sésamo com cisteínas introduzidas artificialmente

[00347] Um dot-blot foi usado para comparar a capacidade dos anticorpos anti- oleosina de semente de sésamo (Abs) descritos no Exemplo 1 para se ligar a oleosina sem cisteínas versus as oleosinas contendo cisteínas (descrito no Exemplo 2). Série de diluições de 12 a 0,25ng de Ole-0-0, Ole-1-3 e Ole-3-1 purificadas foram manchadas em uma membrana de transferência Hybond-P PVDF pré-equilibrada. Esta foi incubada com os anticorpos anti- oleosina de semente de sésamo, 1:2000 como o Ab primário. O blot foi então incubado com o Ab secundário adequado e desenvolvido por quimioluminescência (figura 7). Os resultados indicam que em um imunoblot, os anticorpos anti- oleosina de semente de sésamo são até uma ordem de magnitude mais sensível à oleosina sem resíduos de cisteína que as oleosinas com resíduos de cisteína. Como uma consequência de sensibilidades diferentes, foi necessário carregar quantidades diferentes de proteína recombinante para os géis para análise por imunoblot. Apesar da carga da faixa não uniforme ainda é possível comparar diferentes oleosi- nas entre as faixas em termos da sua distribuição relativa entre as formas monoméricas e oligoméricas. EXEMPLO 4: Criação de corpos oleosos artificiais com E. coli expressando oleosinas modificadas contendo pelo menos um cisteína introduzida artificialmente e alterando o grau de reticulação Preparação de corpos oleosos artificiais

[00348] Os corpos oleosos artificiais (AOBs) foram então preparados ao secar as alíquotas do sobrenadante descrito no Exemplo 3, calculado para conter 150μg ou 1mg de oleosina recombinante.

[00349] O processo para gerar os AOBs envolveu a combinação de PL, TAG, e da oleosina recombinante/ oleosina modificada. Na ausência de fortes agentes caotrópicos, a força disruptiva necessária para dissociar oleosinas recombinantes individuais a partir da fração purificada envolveu vários ciclos alternados de sonicação e arrefecimento. Isto foi conseguido pela solubilização das amostras de 150μg e 1mg de oleosina/ oleosina modificada em 20 μL de clorofórmio contendo 150μg PL (Sigma, Cat # P3644) e misturadas com 60μL de óleo de semente de sésamo purificado (Tzen e Huang 1992) e 940μL de AOB tampão (50 mM tampão fosfato de sódio, pH 8,0, 100mM NaCl). A mistura completa foi então sonicada três vezes por 30s (Sonics & Materials Vibra-cell VC600, 600 W, 20 kHz; 1/8"sonda de microponta cônica, ajuste de potência # 3).

[00350] Os requerentes também descobriram que o processo de purificação pode ser dimensionado com sucesso e quando uma pelota de células de 50g foi usada como material de partida foi necessário substituir a corrente de nitrogênio com um evaporador rotativo a vácuo para remover o clorofórmio e a maioria do metanol. Neste ponto, a maioria da oleosina/ oleosina modificado precipitou para fora do solvente azeotrópico e foi separada por centrifugação a 12.000 g durante 10 min.

[00351] Os corpos de inclusão foram suspensos em 1 mL AOB Tampão II (50 mM fosfato de sódio, pH 8,0, 100 mM NaCl, 20 mM β- mercaptoetanol, 10 mM DTT e 5% [v/v] de óleo de sésamo) e, então, sonicados 4x. Os AOBs foram concentrados por centrifugação a 12.000 rpm durante 10 min, isto resultou na formação de uma suspensão de AOBs sobreposta à fração aquosa. A fração subjacente aquosa foi removida por pipeta, e os restantes dos AOBs foram lavados (para remover proteínas solúveis e agentes de redução) por agitação suave em 1 mL AOB Tampão III (50 mM fosfato de sódio, pH 8,0, 100 mM NaCl). Após a lavagem, os AOBs foram reconcentrados por centrifugação, e a fração aquosa subjacente removida, em seguida, ressus- pensa por vórtice em AOB Tampão IV (50 mM tampão fosfato de sódio, pH 8,0, 100 mM NaCI, 1 mM GSSG) e os AOBs armazenados a 4° C para análises posteriores.

[00352] Ole-0-0 recombinante e todas as variações de oleosina- cisteína foram expressadas com sucesso e encontradas nos corpos de inclusão de E. coli (figura 9). Ole-0-0 estava predominantemente presente como um monômero (nos corpos de inclusão, bem como nos AOBs); este migrou fracionadamente mais rápido do que o marcador de peso molecular de 20 kDa (SDS e SDS- UREIA PAGE redutores e não redução). Também estavam presentes duas bandas imunorreati- vas migratórias mais lentas de aproximadamente 35 e 36 kDa, que provavelmente correspondem a duas formas de oleosina dimérica. Como a Ole-0-0 não está prevista para conter quaisquer resíduos de cisteína, a intensidade global e a razão dos dois dímeros aparentes foram influenciadas pela presença de agentes redutores (β-ME @ 5% do tampão de carregamento de amostra e 10 mM DTT).

[00353] Nos corpos de inclusão, a forma predominante de Ole-1-1 é monomérica. Apenas uma forma dimérica pareceu estar presente e isto não foi influenciado por agentes redutores ou ureia. Ole-1-1 de AOBs (gerada na presença de agente redutor e, em seguida, na presença de agente oxidante) mostrou um grande aumento na proporção de dímero para monômero, bem como a formação de oligômeros tri- méricos, tetraméricos e, provavelmente, pentaméricos (o foco eletrofo- rético destes oligômeros foi consideravelmente melhorado no gel SDS- UREIA). A remoção do GSSG e a reintrodução de agentes redutores para os AOBs resultaram na presença de monômero e dímero apenas em proporções semelhantes observadas nos corpos de inclusão. Os AOBs gerados com Ole-1-1 (na ausência de agentes redutores e GSSG) mostraram a presença de porções quase iguais de monômero e dímero e uma pequena quantidade de trímero, indicando que as condições sob as quais os AOBs são formados têm alguma redução potencial. A adição subsequente de GSSG resultou em um aumento nas porções oligoméricas, bem como o aparecimento de uma forma tetramérica.

[00354] Enquanto o monômero foi a forma predominante de Ole-3-3 nos corpos de inclusão, uma percentagem relativamente elevada também estava presente em formas oligoméricas múltiplas. A proporção de oligômeros diminuiu para uma pequena extensão, com a adição de agente redutor e um pouco mais pela adição dos agentes redutores e caotrópicos. As formas oligoméricas de Ole-3-3 que eram maiores do que um trímero foram mal resolvidas quando a proteína recombinante foi extraída dos AOBs. A criação de grandes formas oligoméricas foi promovida pela adição de GSSG e na ausência de agentes redutores e caotrópicos, uma porção destas formas oligoméricas falharam para entrar no gel de carga. Combinado, estes resultados indicam que nos AOBs, a Ole-3-3 foi altamente reticulada e a posição das reticulações foi mais variável comparada com a Ole-3-3 recuperada dos corpos de inclusão. Isto sugere que, apesar de reticulação considerável pré- existente (dentro dos corpos de inclusão), no AOB a Ole-3-3 tem acesso a um elevado número de parceiros potenciais para a reticula- ção. Da mesma forma, para Ole-1-3 e Ole-3-1, o número de espécies de reticulação aumentou quando havia mais de uma cisteína em uma ou ambas as regiões hidrofílicas (figuras 8 e 9).

[00355] Pode-se esperar que em SDS-PAGE não redutora, os oli- gômeros contendo o mesmo número de oleosinas, mas com as ligações de dissulfeto em diferentes posições, migraria diferentemente um do outro. Na verdade, isto pode ser visto na figura 8, onde os dados indicam que a posição dos braços da oleosina, em relação um ao outro, estão em posições diferentes ao longo do corpo oleoso. Por exemplo, a Ole-1-1 só pode formar uma ligação dissulfeto por braço e esta tem que se formar na mesma posição, onde, com a presença de três cisteínas, permite que mais de uma ligação dissulfeto se forme, mas também permite que as ligações dissulfeto se formem com dife-rentes graus de braço hidrofílico se sobrepondo, bem como com oleo- sinas múltiplas ligadas ao mesmo braço (figuras 8 e 9).

[00356] A adição de SDS e agentes redutores (DTT e β-ME) diminuiu o número de complexos oligoméricos (figura 9). A adição de SDS e ureia resulta em um padrão semelhante ao SDS sozinho, exceto que as formas diméricas múltiplas anteriormente resolvidas migraram como uma e as formas triméricas e tetraméricas parecem estar em maior abundância presumivelmente porque elas também estão migrando como bandas individuais, o que aumenta a intensidade correspondentemente (figura 9). Em contraste, a presença de SDS, agente redutor e ureia resultou em menos formas oligoméricas de Ole-1-1 e Ole-1-3, mas não Ole-3-1 ou Ole-3-3 (figura 9). No caso de Ole-3-1 e Ole-3-3 parece que a ureia não desnatura completamente as oleosinas dissul- feto e pode, de fato, prevenir a redução completa das ligações dissul- feto. Pode ser que estas ligações são formadas durante a geração de corpos de inclusão (seria necessário ver as preps. reduzidas e não reduzidas do corpo de inclusão). Além disso, a presença da oleosina di- mérica formada na ausência de resíduos de cisteína modificados (figuras 8 e 9) indica que alguma oligomerização é devido a outros tipos de atração, por exemplo, ligação hidrófoba forte que não é totalmente interrompida por SDS, mas pode ser quase completamente interrompida pela combinação de SDS e ureia (figura 8 e 9).

[00357] O efeito do aumento do número de sítios de reticulação potenciais em uma oleosina peptídeo na integridade e estabilidade da emulsão do AOB pode ser avaliado como se segue. Determinação quantitativa da integridade do AOB

[00358] A avaliação da estabilidade e da integridade do AOB usando absorvância (OD600), a contagem direta dos AOBs usando um hemoci- tômetro, ou a avaliação visual da coalescência por microscopia provou ser altamente variável e, entre outras coisas, foi influenciada pelo: grau de agitação de pré-amostragem; quantidade da amostra removida; tempo deixado sob o microscópio. Para evitar isso, os requerentes desenvolveram um método simples para quantificar a quantidade de TAG liberado dos AOBs no meio circundante durante uma variedade de tratamentos, como forma de comparar a integridade. As quantidades essencialmente iguais (com base na estimativa FAMES-GC/MS de TAG e determinação Bradford de proteína) de preparações de AOB são feitas até um volume total de 200μL usando tampão AOB (contendo proteinase K [PNK] quando apropriado em uma relação de 1:1 de PNK: proteínas totais em amostras de OB ou AOB em tubos de vidro de inserção GC de 250μL e cober- tos com uma tampa de plástico. Após o tratamento (temperatura elevada ou exposição a PNK) 15μL de óleo de peixe (Vitamax®, Austrália) é adicionado à amostra e misturado por vórtice seguido por centrifugação a 5.200 g por 1 min. A adição de óleo de peixe, seguida por vórtice permite que qualquer TAG que tenha vazado dos AOBs se misture com o óleo de peixe adicionado e flutue por breve centrifugação. 4μL da fase de óleo é amostrado e submetido a esterificação de metil ácido graxo (FAME) e, em seguida, analisado por GC-MS (números de modelo Shimadzu, equipado com uma coluna capilar GC 50mQC2/BPX70-0.25 (SGE) como descrito por Browse et al. (1986). Na ausência de óleo de peixe adicionado, a quantidade de TAG que tinha vazado dos AOBs era muito pequena para formar uma camada visível de amostragem, mesmo depois de centrifugação, em tal caso, o volume máximo teria sido de 6μL. Os perfis de lipídios muito diferentes do óleo de peixe e de óleo de sésamo permitiu distinguir facilmente o TAG que vazou do TAG acrescentado.

[00359] Usando os padrões internos C15:0 e C17: 0 os requerentes podem calcular as quantidades absolutas de C18:2 (o maior lipídio no óleo de semente de sésamo) recuperado após o tratamento. Determinação da integridade e da estabilidade da emulsão do AOB a uma temperatura elevada

[00360] As emulsões de óleo em água são menos estáveis a temperaturas elevadas, daí, é de interesse investigar se as oleosinas modificadas com números variáveis de cisteínas introduzidas influenciam a integridade do AOB em temperatura elevada. Para alcançar isto, os requerentes determinam a integridade (utilizando o método descrito acima) dos OBs e AOBs (contendo diferentes oleosinas) em um tampão de fosfato (50 mM tampão Na-fosfato, pH 8, 100 mM NaCl) a 95° C. Os AOBs são aquecidos durante 2 h. A integridade é determinada como descrito acima.

[00361] O efeito de proporções mais elevadas da oleosina reticula- da: TAG sobre a estabilidade dos AOBs no fluido do rúmen pode ser avaliado como se segue. Determinação da integridade do AOB no fluido do rúmen

[00362] Um dos objetivos do dissulfeto foi proporcionar algum grau de proteção contra a biohidrogenação pela microflora do rúmen. A avaliação da estabilidade do AOB com o fluido do rúmen pode ser avaliada como se segue. Os AOBs são adicionados a um volume igual (25μL) de fluido de rúmen. As amostras são incubadas a 39° C durante 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min, no final da incubação um volume igual de tampão de carregamento (Invitrogen) é adicionado, misturado e aquecido a 70° C durante 10min. 15μL de cada mistura de tampão de amostra/ carregamento é comparada por SDS-PAGE/imunoblot. A integridade é determinada como descrito acima. Análise da integridade AOB em Proteinase K

[00363] Para investigar a influência da oleosina modificada em um integridade de ambiente degradativa altamente reproduzível e controlável é determinada (usando o método descrito acima) dos AOBs (contendo diferentes oleosinas modificadas) após incubação em um tampão de fosfato (50 mM tampão Na-fosfato, pH 8, 100mM NaCl) contendo 1:1 (g/g de proteína) Proteinase K (Invitrogen), a 37° C por 4h. Enquanto a atividade máxima de Proteinase K é conseguida abaixo de 65° C, a temperatura mais baixa é usada a fim de reduzir a influência da temperatura sobre a instabilidade do AOB. A integridade é determinada como descrito acima. EXEMPLO 5: Design e expressão em planta da oleosina modificada contendo uma ou mais cisteínas introduzidas artificialmente Construção concebida para expressão em planta

[00364] Os requerentes sintetizaram sequências de codificação individuais para a oleosina de semente de sésamo (com base no clone do GenBank AF091840) com diferentes números de cisteínas nos bra- ços N- e C-terminais. A sequência de codificação foi flanqueada por um sítio 5' Notl e um sítio 3' Ndel. Um cassete aceitador separado foi sintetizado contendo um sítio attL1, um sítio Notl e sítio Ndel seguido por uma sequência de terminação nos, um promotor CaMV35S voltado para a frente, a Arabidopsis thaliana DGAT1 (S205A) (SEQ ID NOs 11-20 e as figuras 1-5) além de seu próprio íntron UBQ10, um sítio attL2. As oleosinas de semente de sésamo com números diferentes de cisteínas foram individualmente transferidas para o cassete aceitador através dos sítios Notl e Ndel. Cada um destes cassetes completados foram então transferidos para um vetor binário de planta pRSh1, figura 6 (Winichayakul et al., 2008) através da reação de recombinação LR. Isto colocou a oleosina a jusante de um promotor CaMV35S (já contido dentro de pRSh1) e colocou um terminador nos (já contido dentro de pRSh1) a jusante da Arabidopsis DGAT1 (S205A) (figuras 1-5). As se-quências de nucleotídeo que codificam as oleosinas de semente de sésamo (com cisteínas) e DGAT1 foram otimizadas para a expressão em Arabidopsis thaliana, isto incluiu otimização da frequência de co- dão, conteúdo de GC, remoção de sítios de splicing crípticos, remoção de sequências de instabilidade de mRNA, remoção de sítios potenciais de reconhecimento de poliadenilação, e adição de codão de parada tetranucleotídeo (Brown et al., 1990; Beelman e Parker, 1995; Rose, 2004; Rose e Beliakoff, 2000; Norris et al., 1993).

[00365] Deve ser observado que a sequência da oleosina usada é apenas para exemplo. Qualquer sequência de oleosina ou esteroleosi- na ou caleosina poderia ser modificada para conter as regiões de reti- culação. As sequências codificantes dos ORFs completos (após splicing) foram verificadas contra repetição da sequência traduzida original da oleosina e como sendo idênticas ao longo das regiões codifi- cantes da oleosina. Transformação de Arabidopsis thaliana com oleosinas de sementes de sésamo contendo cisteínas

[00366] A transformação de Arabidopsis thaliana var Columbia (com construções descritas acima), as análises de sementes T2 para oleo- sinas modificadas, a análise imunoblot de corpos oleosos de Arabi- dopsis thaliana contendo oleosina de semente de sésamo com diferentes números de cisteínas foram realizadas como descrito anteriormente (Scott et al., 2007).

[00367] Tanto o método de imersão floral (floral-dip) (Clough, 1998) como o de floral-drop (Martinez-Trujillo, 2004) foram usados na transformação de Arabidopsis em Agrobacterium tumefaciens GV3101 contendo as construções binárias. As sementes T1 foram coletadas das plantas tratadas, germinadas e selecionadas por pulverização em 14 d e 21 d pós-germinação com Basta®. As plantas T1 resistentes a Basta® (71, 62 e 23 transformantes contendo as construções da única oleosina de semente de sésamo e da oleosina modificada respectivamente) foram transplantadas, deixadas para autofertilizar, o conjunto de sementes e as sementes T2 foram coletadas. As quantidades iguais do extrato de sementes de plantas de Arabidopsis resistentes a Basta® foram analisadas por SDS-PAGE/imunoblot com os anticorpos anti- oleosina de semente de sésamo; a oleosina de semente de sé-samo recombinante e a oleosina modificada de tamanho apropriado foram observadas na maioria das amostras (figura 10). A análise Southern blot foi realizada em linhagens T2 selecionadas para determinar o número de sítios de inserção. EXEMPLO 6: Extração e purificação de corpos oleosos com oleosinas modificadas contendo pelo menos uma cisteína introduzida artificialmente a partir das sementes de Arabidopsis thaliana Preparações do corpo oleoso bruto de sementes de Arabidopsis thali- ana

[00368] As preparações de OB bruto foram preparadas a partir de sementes de plantas produzidas como descrito no Exemplo 5, por moagem de 200mg das sementes com um almofariz e pilão contendo uma ponta de espátula de areia e 750μL de tampão de extração (10 mM tampão fosfato, pH 7,5 contendo 600 mM sacarose) ou por homogeneização de 25 mg de sementes a 300 μl de tampão de extração usando um homogeneizador Wiggenhauser D-130. Um tampão de extração adicional de 750μL foi adicionado e a pasta no almofariz e transferida para um tubo de microcentrífuga de 2mL enquanto que a ponta homogeneizadora foi enxaguada em 1 mL de tampão de extração e este volume foi adicionado à semente homogeneizada. As amostras foram então centrifugadas a 20.000 x g durante 5 min; isso deixou uma pelota e um sobrenadante aquoso que foi sobreposto por uma camada oleosa imiscível contendo corpos oleosos intactos e rompidos, bem como TAG livre. A camada superior oleosa foi suavemente empurrada para o lado do tubo, e a camada aquosa e o material peletizado descartados. A camada oleosa foi então re-suspensa a partir do lado do tubo por vórtice em tampão de extração e colocada em um tubo de 2ml de microcentrífuga fresco. O volume final foi completado para 0,5 mL com tampão de extração. Preparações purificadas do corpo oleoso de sementes de Arabidopsis thaliana e resíduos de cisteína reticulados entre as oleosinas modificadas

[00369] 25 mg de semente de Arabidopsis (de plantas transforma das como descrito no Exemplo 5) foram moídos em 300 μL de tampão de extração (10 mM tampão fosfato, pH 7,5 contendo 600 mM sacarose), usando um homogeneizador Wiggenhauser D-130. A semente foi moída até ser esmagada e a amostra apareceu "cremosa" e espumosa quando o amido foi liberado das sementes. A ponta homogeneizadora foi enxaguada em 1 ml de tampão e este volume foi adicionado à semente moída. As amostras foram preparadas até este ponto em lotes de 4, em seguida, centrifugadas 14.000 rpm durante 5 min. Uma ponta de carregamento fina de gel foi usada para empurrar suavemente a camada oleosa para o lado do tubo, e a camada aquosa removida para um tubo fresco. A camada oleosa foi ressuspensa a partir do lado do tubo, usando tampão de extração e colocada em um tubo fresco de 2 ml. O volume final foi completado até 0,5 ml (conforme lido no lado do tubo) com tampão de extração, as amostras foram divididas em dois e o agente oxidante (3mM GSSG) foi adicionado a um tubo e incubado em temperatura ambiente durante 10 min. As preparações do corpo oleoso foram então adicionadas a um volume igual de tampão de carregamento de gel 2 x e fervidas por 5 min antes de serem carre-gadas em um gel.

[00370] As amostras foram executadas em NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Midi Gels (Invitrogen) pré-fundido em um sistema Criterion gel (Bio-Rad), ou NuPAGE® Novex 12% Bis-Tris gradiente gel de 1,0 mm, 15 poços, cat # NP0343BOX, com tampão de corrida NuPAGE® MES SDS (apenas para Bis-Tris Gel) (20X), cat# NP0002-02, ou em géis Tris-HCl fundidos à mão. Os géis foram manchados com SafeStain (Invitrogen) para mostrar a proteína total carregada ou blotted para uma membrana de nitrocelulose usando o sistema de iBlot (Invitro- gen). Em cada caso, o controle negativo era uma amostra extraída de sementes Columbia de tipo selvagem e o controle positivo era o mesmo método de extração (embora a moagem tenha sido realizada por almofariz e pilão) realizado em sementes de sésamo do tipo selvagem. 10 μl de cada amostra e o controle negativo foram carregados no gel, e 5 μl foi usado para o controle positivo.

[00371] Após blotting, a membrana foi bloqueada em uma solução de 12,5% de pó de leite desnatado em TBST (50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,2% Tween) durante pelo menos 1,5 horas. A membrana foi então lavada em TBST 3 x 5 minutos antes da incubação com o anticorpo primário (anti-sésamo) a 1/1000 em TBST por 1 hora em temperatura ambiente. Após mais 3 lavagens com TBST, a incubação com anticorpo secundário (anti-coelho) a 1/5000 foi realizada por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana foi submetida a 3 lavagens adicionais, em seguida o sinal foi desenvolvido usando o protocolo padrão de quimioluminescência.

[00372] A figura 11 mostra a acumulação de unidades de oleosina de sementes de sésamo nos corpos oleosos sob o controle do promotor CaMV35S. Pode ser visto que a oleosina recombinante e polioleo- sina se acumularam nas sementes de Arabidopsis thaliana e foram corretamente direcionadas para os corpos oleosos (figura 11). Além disso, pode ser visto que, na presença de agente oxidante durante 10 minutos, as oleosinas recombinantes contendo cisteínas formaram re- ticulações como evidenciado pelo aparecimento de oligômeros e desaparecimento correspondente das formas monoméricas nestas amostras, e não nos corpos oleosos transgênicos do tipo selvagem ou não oxidados.

[00373] O efeito de aumentar o número de sítios potenciais de reti- culação em um peptídeo oleosina in planta na integridade e estabilidade da emulsão do OB pode ser avaliado como se segue. Determinação quantitativa de integridade do OB

[00374] Avaliação da estabilidade e da integridade do OB usando absorvância (OD600), contagem direta de AOBs usando um hemocitô- metro, ou avaliação visual da coalescência por microscopia provou ser altamente variável e, entre outras coisas foi influenciada pelo: grau de agitação de pré-amostragem; quantidade da amostra removida; tempo deixado sob o microscópio. Para evitar isto, os requerentes desenvolveram um método simples para quantificar a quantidade de TAG liberado do OBs para o meio circundante durante uma variedade de tratamentos, como meio de comparação de integridade. As quantidades essencialmente iguais (com base na estimativa FAMES-GC/MS de TAG e determinação Bradford de proteína) de preparações de OB são feitas até um volume total de 200μL usando tampão AOB (contendo Proteinase K [PNK] quando apropriado em uma relação de 1:1 de PNK: proteínas totais em amostras de OB em tubos de inserção de vidro GC de 250μL e coberto com uma tampa de plástico. Seguindo o tratamento (temperatura elevada ou exposição a PNK), 15μL de óleo de peixe (Vitamax®, Austrália) é adicionado à amostra e misturado por vórtice seguido por centrifugação a 5.200 g durante 1 min. A adição de óleo de peixe, seguida por vórtice permite que qualquer TAG que tenha vazado dos OBs se misture com o óleo de peixe adicionado e flutue por breve centrifugação. 4μL da fase de óleo é amostrado e submetido a esterificação de metil ácido graxo (FAME) e, em seguida, analisado por GC-MS (números de modelo Shimadzu, equipado com uma coluna capilar GC 50mQC2/BPX70-0.25 (SGE) como descrito por Browse et al. (1986). Na ausência de óleo de peixe adicionado, a quantidade de TAG que tinha vazado dos OBs era muito pequena para formar uma camada visível de amostragem, mesmo depois de centrifugação, em tal caso, o volume máximo teria sido de 6μL. Os perfis de lipídios muito diferentes do óleo de peixe e de óleo de sésamo permitiu distinguir facilmente o TAG que vazou do TAG acrescentado.

[00375] Usando os padrões internos C15:0 e C17: 0 os requerentes podem calcular as quantidades absolutas de C18:2 (o maior lipídio no óleo de semente de sésamo) recuperado após o tratamento. Determinação da integridade e da estabilidade da emulsão do OB a uma temperatura elevada

[00376] As emulsões de óleo em água são menos estáveis a temperaturas elevadas, daí, é de interesse investigar se as oleosinas modificadas com números variáveis de cisteínas introduzidas influenciam a integridade do OB e do AOB em temperatura elevada. Para alcançar isto, os reque- rentes determinam a integridade (utilizando o método descrito acima) dos OBs (contendo diferentes oleosinas) em um tampão de fosfato (50 mM tampão Na-fosfato, pH 8, 100 mM NaCl) a 95° C. Os AOBs são aquecidos durante 2 h. A integridade é determinada como descrito acima.

[00377] O efeito de proporções mais elevadas da oleosina reticulada: TAG aumenta a estabilidade dos OBs no fluido do rúmen pode ser avaliado como se segue. Determinação da integridade do OB no fluido do rúmen

[00378] Um dos objetivos do dissulfeto foi proporcionar algum grau de proteção contra a biohidrogenação pela microflora do rúmen. A avaliação da estabilidade do OB com o fluido do rúmen pode ser avaliada como se segue. Os OBs são adicionados a um volume igual (25μL) de fluido de rúmen. As amostras são incubadas a 39° C durante 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min, no final da incubação um volume igual de tampão de carregamento (Invitrogen) é adicionado, misturado e aquecido a 70° C durante 10min. 15μL de cada mistura de tampão de amostra/ carregamento é comparada por SDS-PAGE/imunoblot. A integridade é determinada como descrito acima. Análise da integridade OB em Proteinase K

[00379] Para investigar a influência da oleosina modificada em uma integridade de ambiente degradativa altamente reproduzível e controlável é determinada (usando o método descrito acima) dos AOBs (contendo diferentes oleosinas modificadas) após incubação em um tampão de fosfato (50 mM tampão Na-fosfato, pH 8, 100mM NaCl) contendo 1:1 (g/g de proteína) Proteinase K (Invitrogen), a 37° C por 4h. Enquanto a atividade máxima de Proteinase K é conseguida abaixo de 65° C, a temperatura mais baixa é usada a fim de reduzir a influência da temperatura sobre a instabilidade do OB. A integridade é determinada como descrito acima. EXEMPLO 7: Produção de corpos oleosos nas folhas de Arabidopsis thaliana

[00380] A fim de produzir corpos oleosos no tecido vegetativo, é necessário produzir triaciclglicerol no tal tecido (por exemplo, folhas). Produção de triacilglicerol nas porções vegetativas da planta

[00381] Na maioria das plantas (incluindo Lolium perenne), a maioria dos lipídios da folha está ligada a um esqueleto de glicerol e existe como diacilgliceróis. Estes são incorporados em bicamadas lipídicas, onde funcionam como membranas de múltiplas organelas sub- celulares ou como a membrana da célula em si. A maioria das bica- madas lipídicas na folha é a membrana tilacoide do cloroplasto. Uma pequena quantidade de lipídio da folha existe como ceras epicuticula- res e uma percentagem ainda menor estão presentes sob a forma de triacilglicerol (TAG).

[00382] A maioria das plantas sintetiza e armazena TAG nos embriões em desenvolvimento e nas células de pólen onde é subsequentemente usado para fornecer energia que possa ser catabolizada durante a germinação e o crescimento do tubo polínico. As dicotiledôneas podem acumular até aproximadamente 60% do seu peso de sementes como TAG. Normalmente, este nível é consideravelmente mais baixo nas sementes monocotiledôneas onde a principal forma de armazenamento de energia é carboidratos (por exemplo, amido). A única etapa comprometida na biossíntese de TAG é a última, isto é, a adição de um terceiro ácido graxo para um diacilglicerol existente, gerando assim o TAG. Nas plantas, esta etapa é realizada por uma das três enzimas, incluindo: acil CoA: diacilglicerol aciltransferase (DGAT1); um acil CoA não relacionado: diacilglicerol acil transferase (DGAT2), e fosfolípidos: diacilglicerol aciltransferase (Zou et al., 1999; Bouvier-Navé et al., 2000; Dahlqvist et al., 2000; Lardizabal et al., 2001). A hiperexpressão da região transcrita de qualquer um destes genes nas porções vegeta- tivas de plantas leva à formação de gotículas de TAG no citoplasma de células de folha, tal como demonstrado pela hiperexpressão de: Arabi- dopsis DGAT1 em tabaco por Bouvier-Navé et al., (2000); árvore de tungue DGAT2 em levedura e tabaco por Shockey et al., (2006); Ara- bidopsis PDAt em Arabidopsis por Stahl et al., (2004). A hiperexpres- são de Arabidopsis DGAT1 em alguns casos foi demonstrada por aumentar o nível total de lipídios, mas não necessariamente pelo acúmulo de TAG, por exemplo, em raízes peludas de Lotus japonicus (Bryan et al., 2004) e em folhas de Lolium perenne (Cookson et al., 2009).

[00383] Para demonstrar a acumulação de TAG nas folhas destas plantas é possível comparar a quantidade total de extrato lipídico de folhas destas plantas com a das plantas não transformadas ou plantas transformadas com o vetor binário vazio. Assegurando que as plantas são cultivadas sob as mesmas condições ambientais e que as folhas amostradas são fisiologicamente equivalentes. Com os padrões internos apropriados a quantificação do extrato total de lipídios pode ser conseguida usando a análise FAMES GC-MS (tal como descrito por Winichayakul et al., 2008 Delivery of grasses with high levels of unsaturated, protected fatty acids. Proceedings of the New Zealand Grassland Association, 70:211-216). Alternativamente, os lipídios totais podem ser extraídos usando o método Folsch (Folsch et al., 1957 J. Folsch, M. Lees e GA Slone-Stanley, A simple method for the determi-nation of total lipid extraction and purification, Journal of Biological Chemistry 226 (1957), pp. 497-507) e quantificados usando padrões internos adequados com um GC-MS equipado com uma coluna RTX65TG Restek (Restek Corp, Bellefonte, PA).

[00384] As folhas foram amostradas a partir de plantas hiperex- pressando a A. thaliana DGAT1 (S205A) e a construção da oleosina de semente de sésamo (Oleo_0-0, ou Oleo_1-1, ou Oleo_1-3, ou Oleo_3-1, ou Oleo_3-3, SEQ ID NOs 11-20, figuras 1-5) e analisadas por SDS-PAGE/imunoblot usando o antissoro policlonal anti-oleosina de semente de sésamo. Pode ser visto que a oleosina recombinante foi acumulou-se nas folhas de Arabidopsis thaliana (figura 12).

[00385] A expressão e acumulação simultânea de proteína oleosi- na/ oleosina modificada na mesma célula (por exemplo, célula de folha) resultarão na produção de corpos oleosos de triglicéridos encapsulados por uma monocamada fosfolipídica incorporada com oleosina; isto tem sido demonstrado com oleosina não modificada em levedura (Ting et al., 1997) e sementes (Abell et al., 2004). Preparações do corpo oleoso das folhas de Arabidopsis thaliana transgênica

[00386] Os corpos oleosos podem ser extraídos das folhas de Ara- bidopsis thaliana transgênica expressando DGAT1 (S205A) e a construção de oleosina de semente de sésamo (Oleo_0-0, ou Oleo_1-1, ou Oleo_1-3, ou Oleo_3-1, ou Oleo_3-3, SEQ ID NOs 11-20, figuras 1-5).

[00387] O efeito de aumentar o número de sítios de reticulação potenciais em um peptídeo oleosina nos OBs de tais plantas pode ser avaliado medindo a integridade e estabilidade de emulsão do OB, tal como descrito no Exemplo 6. Design e construção de oleosinas contendo mais de três resíduos de cisteína em cada braço hidrofílico

[00388] As linhagens ole-3,3 tinham níveis substanciais elevados de lipídios sob a forma de TAGs quando co-expressadas com DGAT1 (S205A), enquanto as linhagens contendo ole-0,0 não tinham níveis lipídicos elevados acima da DGAT1 hiperexpressando controle. A ole- 1,1, ole-1,3 e ole-3,1 mostraram que havia uma correlação entre o nível de acumulação de lipídios na folha e o aumento do número de cis- teínas modificadas de cada braço (Tabela 3). Tabela 3. Composição de ácidos graxos (como % do peso seco) de folhas de Arabidopsis expressando o controle de vetores, DGAT1 (S205A) sozinho, ou DGAT1 (S205A) e diferentes formas de oleosina (contendo nenhuma cisteína adicional ou até 3 cisteínas adicionais em cada braço hidrofílico).

[00389] A correlação entre o aumento de lipídios total (mostrado como sendo TAG) e o número de cisteínas modificadas para os domínios hidrofílicos indicaram que o número de cisteínas pode ser uma forma de influenciar o nível de TAG desejado. Consequentemente, novas construções com mais de 3 cisteínas por braço hidrofílico foram concebidas. Embora não seja possível colocar um número infinito de cisteínas/ braço hidrofílico; as limitações incluem:

[00390] • Comprimento dos braços - se os resíduos adicionais fo rem adicionados para fazer espaço para as cisteínas, então, eventu-almente, o grau de interação do domínio hidrofóbico seria reduzido, uma vez que a sua capacidade para entrar em contato seria limitada pela sua liberdade para se mover no OB.

[00391] • Manter a proporção de +, - e de resíduos anfipáticos - se o equilíbrio e a distribuição destes resíduos são alterados dramatica-mente, é provável que os braços hidrofílicos não interagissem efetiva-mente com a superfície do OB e, como tal, não forneceria qualquer a proteção contra as lipases ou coalescência.

[00392] • Disponibilidade de enxofre - o aumento do número de cis- teínas por molécula de oleosina pode colocar a planta sob estresse nutricional se o enxofre for limitante.

[00393] A cisteína-oleosina original foi modificada para transportar 3 cisteínas não pareadas relativamente espaçadas em cada braço, ao substituir aminoácidos e predominantemente aqueles que poderiam ser previstos para ser neutros ou carregados, mas não hidrofóbicos.

[00394] A oleosina presumivelmente precisa ter certo nível de carga negativa e no C-terminal isto parece ser conseguido por K(Lys), conti-nuando assim a estratégia de resíduos de troca carregada ou neutros com cisteínas adicionais pode resultar em fraca estabilidade em termos de prevenir a coalescência. Além disso, na região hidrofílica N- terminal, parece haver muito poucos resíduos deixados entre as ciste- ínas modificadas para permitir a substituição adicional de resíduos, mantendo simultaneamente o espaçamento e oscilação entre os ami- noácidos carregados positiva e negativamente. Consequentemente, para os resíduos adicionais N- e C-terminais adicionados (cisteínas), em vez de resíduos existentes substitutos com cisteínas. Alternativamente, uma oleosina com braços hidrofílicos mais longos poderia ter sido usada.

[00395] Duas construções adicionais (Ole-5,6 e Ole-6,7) foram também concebidas. Estes não são propositadamente desequilibrados em termos de resíduos de cisteína por braço, mas organizado para tentar produzir tipicamente 4-5 resíduos entre cada cisteína. Na verdade, para aumentar as cisteínas para 6 no braço N-terminal foi necessário gerar resíduos adicionais (em oposição à substituição de resíduos existentes); isso foi alcançado ao replicar os primeiros 6 resíduos da Ole- 3,3.

[00396] Ao invés de ter sequências totalmente novas de nucleotí- deos criadas, o TGT triplo para codificar a cisteína foi adicionado (quando apropriado) para gerar Ole_5,6. Para resíduos de glutamina adicionais o códon GGA triplo foi usado. Para os 6 resíduos N- terminais adicionais na Ole_6-7 o N- terminal da Ole_3,3 foi replicado e fundido na estrutura.

[00397] A estratégia de subclonagem foi concebida para ser idêntica às oleosinas cisteínas iniciais, ou seja, subclonadas em oleoaceptor por Notl/Ndel. Estas são então recombinadas por reação LR em pRSH1 (Winichayakul et al., 2008). Essencialmente colocando a Ara- bidopsis DGAT1 (S205A) e a oleosina sob seus próprios promotores CaMV35S e terminadores OCS. Ambos os clones de DGA1 e de oleo- sina contêm um íntron UBQ10.

[00398] O NetGene2 foi usado para prever o padrão de junção de Ole_5,6 e Ole_6,7. Ambos foram previstos para ter um único doador e sítio aceitador na fita direta (ambos foram previstos para ter uma pro-babilidade muito elevada de reconhecimento) e nenhum sítio na fita complementar.

[00399] Os dados indicam que as oleosinas contendo cisteínas 1,3 ou 3,1 acumulam níveis detectáveis de TAG, mas isto é, certamente, menos do que a oleosina cisteína 3,3 (a 1,1 acumulada quantidades vestigiais enquanto a 0,0 não). Isto sugere ainda mais fortemente que as oleosinas 5,6 e 6,7 são susceptíveis de acumular até mais TAG do que a construção 3,3. Os primeiros dados das construções 5,6 e 6,7 estarão disponíveis em breve. Transformação de oleosinas contendo cisteínas modificadas e DGAT1 em Arabidopsis thaliana do tipo selvagem

[00400] Cinco construções de genes dissulfeto-oleosina/DGAT1 (S205A) e um controle (construção contendo DGAT1 (S205A), mas não oleosina) foram transferidas para o vetor binário da planta pRSh1 (Winichayakul et al., 2008) e transformados em Arabidopsis thaliana do tipo selvagem usando transformação mediada por Agrobacterium.

[00401] Uma modificação do método de imersão floral tradicional foi seguido, uma vez que tem sido relatado que imersões florais tendem a danificar síliquas em desenvolvimento, devido à presença de detergente nos inóculos (Martinez-Trujillo et al., 2004). Portanto, uma inoculação gota a gota de cada flor foi realizada usando uma micropipeta. A inoculação foi repetida após uma semana para introduzir o inóculo nas flores recentemente desenvolvidas. As sementes foram coletadas quando as sílicas secaram, então foram limpadas e plantadas para o rastreamento de transformantes.

[00402] O rastreamento de transformantes foi realizado pela seleção BASTA e os transformantes homozigotos foram selecionados através da análise da proporção de segregação para resistência a BASTA. Transformação de oleosinas contendo cisteínas modificadas e DGAT1 em Trifolium repens do tipo selvagem

[00403] A transformação em Trifolium repens (trevo branco) foi realizada de acordo com o procedimento do Voisey et al., (1994).

[00404] As sementes foram pesadas para fornecer aproximadamente 400-500 cotilédones (isto é, 200 - 250 sementes) para dissecção (0,06gm = 100 sementes). Em um tubo de centrífuga, as sementes foram lavadas com etanol a 70% durante 1 minuto. A superfície esterilizada em alvejante (5% de cloro disponível) por agitação em um misturador circular durante 15 minutos, seguido de quatro lavagens em água estéril. As sementes foram embebidas durante a noite a 4° C.

[00405] As mesmas construções usadas para transformar Arabi- dopsis (acima) foram mantidas na estirpe GV3101 de Agrobacterium e inoculados em 25 mL de caldo de MGL (Tabela 4) contendo especti- nomicina a uma concentração de 100 mg/L. As culturas foram cultivadas durante a noite (16 horas) em um agitador rotativo (200 rpm) a 28° C. As culturas bacterianas foram colhidas por centrifugação (3000xg, 10 minutos). O sobrenadante foi removido e as células ressuspensas em 5 mL de uma solução 10 mM de MgSO4.

[00406] Os cotilédones foram dissecados de sementes usando um microscópio de dissecação. Primeiro, o revestimento de semente e endosperma foram removidos. Os cotilédones foram separados do ra-dical com o bisturi pela colocação da lâmina entre os cotilédones e cortando através do talo restante. Os explantes cotiledonares foram colhidos em um disco de filtro estéril em meio CR7.

[00407] Para a transformação, uma alíquota de 3μl de suspensão de Agrobacterium foi dispensada a cada cotilédone dissecado. As placas foram seladas e cultivadas a 25° C sob um fotoperíodo de 16 horas. Após um período de 72 horas de cocultura, os cotilédones trans- formados foram transferidos para placas contendo meio CR7 suple-mentado com glufosinato de amônio (2,5 mg/ L) e timentin (300mg/L) e retornados para a sala de cultura.

[00408] Após a regeneração dos brotos, os explantes foram transferidos para meio CR5 suplementado com glufosinato de amônio (2,5 mg/L) e timentin (300mg/L). Os brotos em regeneração são subculti- vados três semanas para meios CR5 frescos contendo a seleção.

[00409] Como ocorre a formação de raízes, as plântulas foram transferidas para banheiras contendo meio CR0 contendo seleção de glufosinato de amônio. Grandes grupos de regenerantes foram divididos em plântulas individuais nesta fase. Plantas inteiras enraizadas crescendo sob a seleção foram, então, plantadas em turfeiras estéreis. Uma vez estabelecidas em plantas de turfeiras foram, então, transferir para a estufa. Tabela 4. Composições de meio usadas para a transformação de Tri-folium repens

[00410] Os resultados FAMES GC/MS mostrando o Trifolium re- pens trangênico (contendo DGAT1 (S205A) e Ole_3,3 ou Ole_5,6 ou Ole 6,7) tinham elevado perfis totais lipídicos da folha em comparação com o tipo selvagem (figura 17). Houve uma correlação geral entre o nível mais elevado do lipídio da folha e o número maior de cisteínas modificadas para a oleosina.

[00411] Os resultados FAMES GC/MS mostrando o Trifolium repens trangênico (contendo DGAT1 (S205A) e Ole_3,3 ou Ole_5,6 ou Ole 6,7) tinha perfis lipídicos da folha C18:1 e C18:2 elevados em comparação com o tipo selvagem como também visto em Arabidopsis (figura 18). O nível mais elevado da folha C18:1 e C18:2 foi encontrado nas plantas transformadas com a oleosina contendo o maior número de cisteínas modificadas. Determinação do conjunto do corpo oleoso em folhas (e sementes)

[00412] Outro rastreamento foi realizado utilizando análise imuno- blot (com um anticorpo antioleosina de semente de sésamo, Scott et al., 2007) para determinar as linhagens hiperexpressando a proteína oleosina. Usando este método, os corpos oleosos (OBS) foram extraídos de sementes T2 de transformantes putativos usando gradiente de densidade de sacarose ou proteína total foi extraída de folhas em um tampão de desnaturação/ redução e as proteínas foram separadas em SDS-PAGE, transferidas para membrana de nitrocelulose, e desafiadas com um anticorpo criado contra a oleosina de sésamo (Scott et al., 2007).

[00413] O corpo oleoso bruto (OB) foi extraído de 25 mg de sementes em 500 μL de tampão de OB (10 mM fosfato de sódio, pH 7,5 contendo 600 mM sacarose). Após centrifugação a 13.000 x g, a camada aquosa foi cuidadosamente sugada e a camada de gordura foi ressus- pensa em 200 μL de tampão de OB sem perturbar a pelota no fundo. 20 μL de cada extrato OB foram adicionados com corante de carregamento 4x e agente redutor 10x, aquecidos até 70° C durante 5 min e carregados em gel de poliacrilamida 4-12% para análise de imuno- transferência. O blot foi incubado em anticorpo de oleosina a-sésamo (1° Ab) em 1:750 de diluição durante uma hora, e mais uma hora em anticorpo secundário (1:10.000).

[00414] A oleosina é naturalmente expressada em sementes e não nas folhas. No entanto, uma vez que tenham coexpressado DGAT1 com oleosina sob o controle de promotores CaMV35S poderia preverse que isso iria permitir níveis detectáveis de oleosina a acumular-se nas folhas. As folhas de linhagens transformadas com elevada expressão de oleosina recombinante nas sementes (identificado por análise de imunoblot) foram analisadas por imunoblot usando anticorpos criados contra a oleosina de sésamo.

[00415] A Tabela 5 abaixo resume o número de transformantes putativos gerados e o número de plantas expressando a oleosina recom- binante na semente e na folha. Tabela 5

[00416] Deve ser observado que o nível de oleosina recombinante que acumulou nas folhas foi consideravelmente menor do que nas sementes. No entanto, a proporção de linhagens individuais que acumularam níveis detectáveis em ambas as folhas era muito maior do que quando a oleosina foi expressa por si só (Roberts Lab, dados não publicados), indicando que a coexpressão de ambos DGAT1 e oleosina na folha tem levou a acumulação de níveis mais elevados de oleosina. Análise de folhas de plantas transgênicas coexpressando DGAT1 (S205A) e oleosinas dissulfeto

[00417] As sementes de linhagens homozigóticas hiperexpressando a proteína oleosina nas sementes foram germinadas para permitir o crescimento de 2, 3, 4 ou 5 semanas. Material de folha suficiente foi colhido para FAMES GC-MS, bem como por GC-MS, usando uma coluna RTX 65-TG Restek que permite a separação e identificação de ácidos graxos livres, diacilglicerídeos, ésteres de cera, ésteres de esterol e triacilglicerídeos sem derivatização. Preparação de material para análise FAMES-GC/MS

[00418] 10 mg de pó de folha liofilizado foram colocados em um tu bo de tampa de rosca 13 x 100 mm, 10 μL de padrão interno não meti- lado (C15:0 FA, 4 mg/mL dissolvido em heptano) foi adicionado. A esta mistura, 1 mL de reagente HCl metanólico (1 mL de 3 M solução diluída a 1 M usando metanol seco que tinha sido tratado com 5% de 2,2- dimetoxipropano como um limpador de água. O tubo foi então lavado com gás N2, em seguida, imediatamente selado com tampa revestida de Teflon, e aquecido a 80° C durante 1 h. Após os tubos terem sido resfriados até a temperatura ambiente, 10 μL de padrão pré-metilado (4 mg/mL de C17:0 dissolvido em heptano) foram adicionados. A esta mistura, 0,6 mL de heptano e 1,0 mL de 0,9% (p/v) de NaCl foram adi-cionados e muito bem misturados em vórtice. Após centrifugação a 500 rpm durante 1 min em temperatura ambiente, 100 μL da camada superior (contendo heptanos) foram coletados e transferidos para uma inserção de vidro de fundo plano montado em um frasco marrom para análise GC/MS. Análise FAMES GC/MS

[00419] O FAMES GC/MS foi analisado usando a coluna capilar SGE BPX70 (50m x 0,22 mm x 0,25 μm). A condição de GC-MS foi como se segue: a temperatura foi programada de 80° C para 150° C a 15° C/min e, em seguida, para 250° C a 8°C/min e mantida isotérmica durante 10 min. As amostras foram injetadas em um modo de divisão; fluxo total de 28,4 mL/min; fluxo de coluna de 0,82 mL/min; e um fluxo de limpeza de 3,0 mL/min. A pressão foi mantida a 150 kPa; a tempe-ratura da fonte iônica foi de 200° C e uma temperatura de interface foi mantida a 260° C. Os compostos alvo foram adquiridos por espectro- metria de massa em um modo de varredura começando a 50 m/z e terminando a 350 m/z. Extração de TAG e de lipídios polares

[00420] O TAG foi extraído usando um método modificado de Ruiz- López et al., (2003). Resumidamente, para cada análise de TAG, entre 34-80 mg de pó de folha liofilizado foram colocados em tubo de tampa de rosca tarada de 13 mm e pesados, 2,4 mL de 0,17 M de NaCl em MeOH foram adicionados e misturados por agitação em vórtice. Após a adição de 4,8 mL de heptano e 10 μL de padrão interno (C14:0, 10 μg.μL-1), a suspensão foi misturada suavemente e incubada sem agitação em banho de água a 80° C durante 2 h. Após o resfriamento para a temperatura ambiente, a fase superior (contendo lipídios) foi transferida para o tubo de tampa de rosca fresco e evaporada até secar sob uma corrente de gás N. Finalmente, o pó seco foi ressuspenso em 100 μL de heptanos, misturado completamente, então, transferido para uma inserção de vidro de fundo plano montado em um frasco marrom para análise TAG. Análise TAG GC-MS

[00421] A análise TAG foi realizada em um Hewlett Packard (HP) GC e Shimadzu Scientific Instruments Inc. MS (QP2010). Todas as análises foram realizadas com uma coluna capilar RESTEK MXT- 65TG (65% difenil - 35% dimetil polissiloxano, 30,0 m x 0,10 μm de espessura x 0,25 de diâmetro) em modo de ionização de Impacto Eletrônico (EI). Hélio foi usado como gás veículo. Todas as amostras foram injetadas no modo sem divisão, em alíquotas de 1,0 μL, e um fluxo de coluna de 1,2 mL.min-1. O cromatógrafo de gás foi programado de 200 para 370° C a 15° C.min-1 e mantido isotérmico a 370° C por 15 min. A temperatura de porta do injetor de amostra foi mantida a 350° C, temperatura de forno por coluna a 200° C, com uma pressão de 131,1 kPa e um fluxo de puruficação de 3,0 mL.min-1. As condições de espectrometria de massa foram as seguintes: temperatura da fonte de íons foi mantida a 260° C durante a execução GC-MS, os espectros de massa foram obtidos em tensão de ionização de 70 eV a uma corrente de emissão de 60 μA e uma temperatura de interface de 350° C . Modo de aquisição foi por digitalização a uma velocidade de 5000, 0,25 segundos por varredura. Os picos de cromatografia com a massa para proporção de carregamento de 45 m/z para 1090 m/z foram coletados a partir de 9 min e terminando a 25 min. EXEMPLO 8: Outras oleosinas, caleosinas e esteroleosinas modificadas para conter resíduos de cisteína adicionais nos braços hidrofílicos N- e C-terminais

[00422] Os requerentes têm usados a mesma estratégia para oleo- sina de semente de sésamo, número de acesso AAD42942, (isto é, substituindo resíduos carregados previstos para estar na superfície dos OBs com cisteínas) para modificar as cisteínas para os braços hi- drofílicos N- e C-terminais de oleosinas, caleosinas e esteroleosinas. Em alguns casos, tem sido possível substituir apenas aminoácidos ne-gativamente carregados (ácido glutâmico e ácido aspártico) que são relativamente e uniformemente espaçados. No caso da oleosina de sésamo AAD42942 foi necessário, por vezes, comprometer a substi-tuição de carga. Deve ser observado nos exemplos abaixo que duas caleosinas (AAB71227 e AAF13743) contêm duas cisteínas endógenas em seu braço C-terminal. Estas são deixadas inalteradas na modificação.

[00423] Para determinar a posição da substituição de aminoácidos, cada proteína foi alinhada com a oleosina de sésamo (AAD42942) na a forma original, bem como as formas contendo 1 ou 3 cisteínas por braço hidrofílico (isto é, ole_0,0; ole_1,1; ole_3,1; ole_1,3; ole_3,3). Os ácidos glutâmicos potenciais e ácidos aspárticos em N-terminal ou C- terminal de cada um dos braços hidrofílicos (determinado por traços de hidrofobicidade) foram então destacados com caixas cinzas, assim como os resíduos de lisina, arginina e glutamina relevante (os quais foram todas alterados com sucesso na oleosina de sésamo (AAD42942). A mutação destes resíduos em cisteína foi então considerada juntamente com o seu espaçamento entre si. As substituições finais são, então, mostradas com a sequência de peptídeo original e a sequência modificada apenas. Neste caso, apenas 3 cisteínas foram modificadas em cada braço, no entanto, o número poderia ter sido maior ou menor. Uma abordagem alternativa teria sido trabalhar com cada proteína em isolamento e simplesmente começar pela identificação das regiões hidrofílicas por traços de hidrofobicidade, então começar o processo de substituição com o aminoácido carregado mais apropriado.

[00424] A Tabela 6 abaixo mostra a oleosina e a caleosina adicional que os requerentes modificaram para introduzir cisteínas nas porções hidrofílicas. Tabela 6

[00425] A T Fabela 7 abaixo faz referência a SEQ ID NO nas oleosi- nas modificadas.

[00426] A sequência modificada pode ser expressada como descrito nos exemplos acima para produzir corpos oleosos, emulsões, células hospedeiras transgênicas, plantas, etc., e para testar as propriedades de cada.

[00427] Não é a intenção limitar o escopo da invenção com os exemplos referidos apenas acima. Como seria apreciado por um especialista na técnica, muitas variações são possíveis sem o afastamento do escopo da invenção. REFERÊNCIAS Abell et al., (2004). Plant J., 37: 461-70. Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, Andrianov et al., (2010). Plant Biotechnol J. 8(3):277-87. Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Bairoch and Bucher (1994), Nucleic Acids Res. 22, 3583 Bao et al., (2000) Plant J. 22(1):39-50. Birch (1997) Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297 Bolton and McCarthy (1962) PNAS 84:1390 Bowie et al., (1990). Science 247, 1306 Bouvier-Nave et al., (2000) Eur. J. Biochem. 267, 85-96. Bryan et al., (2007) Modification of fatty acid biosynthesis. United States Patent 20070118927. Capuano et al., (2007 ). Biotechnol Adv. 25:203-206. Notredame et al., (2000). J. Mol. Biol. 302: 205-217 Chen et al., (1999). 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Claims

1. Oleosina modificada, caracterizada pelo fato de que é modificada com uma sequência selecionada dentre qualquer uma das SEQ ID NO: 16, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 e 53, que inclui pelo menos uma cisteína introduzida artificialmente, em que a oleosina mo-dificada contém não mais do que 7 cisteínas introduzidas artificialmente em cada uma da região conservada hidrofílica N-terminal e a região conservada hidrofílica C-terminal, e em que as cisteínas são distribuídas substancialmente uniformemente ao longo das regiões hidrofílicas N-terminal e C-terminal da oleosina.

2. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com-preende a oleosina modificada, como definida na reivindicação 1, em que a célula hospedeira é um microrganismo é selecionado dentre uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula fúngica e uma célula de algas.

3. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 2, ca-racterizada pelo fato de que também é geneticamente modificada para expressar uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG), em que a enzima de síntese TAG é selecionada dentre: diacilglicerol aciltransfe- rase1 (DGAT1); diacilglicerol acil transferase2 (DGAT2); fosfatidilcoli- na-esterol O-aciltransferase (PDAT) e forma solúvel citosólica de DGAT (DGAT solúvel ou DGAT3).

4. Corpo oleoso, caracterizado pelo fato de que compreende uma oleosina modificada, como definida na reivindicação 1.

5. Emulsão, caracterizada pelo fato de que compreende um corpo oleoso, como definido na reivindicação 4.

6. Ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende um corpo oleoso, como definido na reivindicação 4.

7. Método para produzir um corpo oleoso, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de combinar: (a) pelo menos duas das oleosinas modificadas, como defi-nidas na reivindicação 1, (b) triacilglicerol, e (c) fosfolipídio, para produzir o corpo oleoso.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os componentes (a), (b) e (c) são combinados como especificado em pelo menos um dentre: (i) dentro de uma célula hospedeira; (ii) dentro de uma célula hospedeira em que oleosinas mo-dificadas são expressas; (iii) dentro da célula hospedeira do item (i) ou (ii) que tam-bém é modificada geneticamente para expressar uma enzima de síntese de triacilglicerol (TAG); (iv) dentro da célula hospedeira de qualquer um dos itens (i) a (iii) que faça parte de um organismo; (v) dentro da célula hospedeira de qualquer um dos itens (i) a (iii) que faça parte de uma planta; (vi) dentro da célula hospedeira de qualquer um dos itens (i) a (iii) que faça parte de uma planta que acumula de 50% a 400% mais lipídios que uma planta de controle adequada; (vii) in vitro; em que o método opcionalmente inclui a etapa adicional de purificação dos corpos oleosos da célula ou organismo.

9. Método para produção de uma planta que acumula mais óleo que uma planta controle adequada, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar uma planta transformada para expressar a oleosina modificada como definida na reivindicação 1.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta é também transformada com um polinucleo- tídeo que codifica uma enzima de síntese de TAG para expressar a enzima de síntese de TAG e, assim, sintetizar TAG.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, carac-terizado pelo fato de que a planta acumula de 50% a 400% mais lipídios do que uma planta controle adequada.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a planta é processada em pelo menos uma dentre: (i) uma ração animal; e (ii) uma matéria-prima para biocombustível.

13. Método para produzir um corpo oleoso em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir em uma célula hospedeira pelo menos uma oleosina modificada, como definida na reivindicação 1, e uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima de síntese de TAG; e (b) cultivar a célula hospedeira a fim de expressar a oleosi- na modificada e a enzima de síntese de TAG, em que o método opcionalmente compreende pelo menos uma das etapas adicionais: (i) processar a célula hospedeira em uma fração de óleo; e (ii) processar o óleo em pelo menos um dentre: (A) um combustível; (B) um produto oleoquímico; (C) um óleo nutricional; (D) um óleo cosmético; (E) um ácido graxo poliinsaturato (PUFA); e (F) uma combinação de qualquer um dentre (A) a (E).