BR122016005348B1 - Sistema e método de triagem de espermatozoides - Google Patents
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Abstract
CHIP, SISTEMA E MÉTODOS DE TRIAGEM DE ELEVADO RENDIMENTO DE ESPERMATOZOIDES A presente invenção descreve um sistema, dispositivo e método para triagem de células de espermatozoides, em um chip de micro fluido. Em particular, várias características são incorporadas no chip de micro fluido e em sistemas de triagem para alinhar e orientar espermatozoides em canais de fluxo, bem como para determinar a orientação de espermatozoides e a medição do teor relativo de DNA.
Description
[001] Em geral, a invenção descreve um aparelho e um método para triagem de partículas e, mais particularmente, refere-se à triagem de alto rendimento de células de espermatozoides, em um chip de micro fluidos.
[002] Várias técnicas, incluindo citometria de fluxo, foram empregadas para produzir populações de espermatozoides enriquecidas no que diz respeito a determinadas características desejadas. Na indústria de produção de gado, a capacidade de influenciar os resultados reprodutivos tem vantagens óbvias. Por exemplo, a pré-seleção de gênero fornece um benefício econômico para a indústria de laticínios em que a pré-seleção de descendentes do sexo feminino assegura o nascimento de vacas leiteiras. De modo semelhante, a indústria da carne de bovino, bem como a indústria da carne de porco, e outros produtores de carne beneficiam da produção de machos. Além disso, espécies ameaçadas de extinção ou exóticas podem ser colocadas em programas de reprodução acelerada com um aumento da percentagem de descendentes do sexo feminino.
[003] Esforços anteriores para produzir populações comercialmente viáveis de espermatozoides triadas relativamente ao espermatozoides que possui o cromossomo X ou o espermatozoides que possui o cromossomo Y assentavam em grande parte na triagem de gotas em citômetros de fluxo de jato em ar. (Ver, por exemplo, Patente US No. 6,357,307, Patente US No. 5,985,216 e Patente US No. 5,135,759). No entanto, existem alguns inconvenientes com estes métodos e dispositivos. Mesmo com os avanços na citometria de fluxo de gotas, limitações práticas ainda existem que prejudicam o número de células de espermatozoides que podem ser triadas em uma determinada janela. Como tal, as doses de inseminação artificial (AI) triada por sexo são geralmente menores do que as doses convencionais de AI. Em bovinos, por exemplo, as doses convencionais de AI podem conter cerca de 10 milhões de espermatozoides, enquanto que as doses triadas por sexo muitas vezes contêm cerca de 2 milhões de espermatozoides. As doses convencionais de AI para equinos e suínos estão na magnitude de centenas de milhões e dos bilhões de espermatozoides, respectivamente. Os espermatozoides triados por sexo, embora potencialmente valiosos, não tem encontrado uso generalizado em qualquer uma das espécies, porque as dosagens mais baixas de AI geralmente resultam em taxas de gravidez e de natalidade mais baixas. Dado o grande número de espermatozoides necessários em equinos e suínos, doses aceitáveis não foram alcançados para AI.
[004] Os espermatozoides são células sensíveis ao tempo e delicadas que não possuem a capacidade de se regenerar. Assim, os tempos de triagem maiores são prejudiciais aos espermatozoides, pois eles continuamente se deterioram durante a coloração e triagem. Além disso, os espermatozoides triados em um citômetro de fluxo de jato de ar podem ser sujeitos a forças mecânicas, torção, tensões, estiramentos e lasers de alta potência que prejudicam mais os espermatozoides. Os espermatozoides se deslocam a velocidades entre cerca de 15 m/s e cerca de 20m/s na corrente de fluido de um citômetro de fluxo de jato de ar. Estas velocidades combinadas com as dimensões de transmissão estreitas podem dar origem a forças de cisalhamento que podem danificar as membranas espermáticas. Além disso, é necessária uma elevada fonte de laser, uma vez que os espermatozoides que se deslocam a altas velocidades permanecem incidentes ao perfil do feixe por um período de tempo mais curto que fornece menos de uma janela de excitação e de medição para diferenciar os espermatozoides. Finalmente, os espermatozoides que são ejetados de um bocal de jato de ar a 15m/s irão incidir num fluido num recipiente de recolha ou numa parede do recipiente a uma velocidade semelhante, apresentando uma nova oportunidade para ferir os espermatozoides.
[005] Certas concretizações da invenção reivindicada estão resumidas abaixo. Estas concretizações não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada, mas ao invés servem como breves descrições de possíveis formas da invenção. A invenção pode englobar uma variedade de formas que diferem desses sumários.
[006] Uma concretização refere-se a um sistema de triagem de espermatozoides que pode incluir uma fonte de amostra. Pelo menos um canal de fluxo pode ser formado em um substrato e em comunicação fluida com a fonte de amostra. Pelo menos um canal de fluxo pode incluir uma zona de inspeção, uma primeira saída e uma segunda saída. Pelo menos um mecanismo de desvio pode estar em comunicação fluida com o, pelo menos um, canal de fluxo para desviar seletivamente de espermatozoides para longe da primeira saída. Uma fonte de radiação eletromagnética pode ser configurada para iluminar espermatozoides em que o pelo menos um canal de fluxo na região da inspeção e um detector pode ser alinhado para medir as características dos espermatozoides. Um analisador em comunicação com o detector pode determinar as características dos espermatozoides e fornecer instruções para um controlador para ativar seletivamente o mecanismo de desvio. Um recipiente de recolhimento em comunicação com a segunda saída pode recolher os espermatozoides desviados com base nas características medidas dos espermatozoides.
[007] Outra concretização refere-se a um chip de micro fluidos para a triagem de espermatozoides. O chip de micro fluidos pode incluir uma pluralidade de canais de fluxo formados num substrato. Cada canal de fluxo pode incluir uma entrada em comunicação com duas saídas. Cada canal de fluxo pode ainda incluir uma região de foco de fluido tendo uma característica de foco de fluido associada para alinhar as células espermáticas dentro do canal de fluxo, uma região de orientação dos espermatozoides tendo uma característica de orientação dos espermatozoides associada para orientar células espermáticas dentro do canal de fluxo, e uma zona de inspeção, pelo menos parcialmente a jusante da região de foco do fluido e a região de orientação dos espermatozoides. Além disso, um mecanismo de desvio pode estar em comunicação com cada canal de fluxo.
[008] Outra concretização refere-se a um método de triagem de espermatozoides. O método pode começar por fluir os espermatozoides através de uma pluralidade de canais de fluxo em um chip de micro fluidos. Os espermatozoides podem então ser orientados dentro do chip de micro fluidos e feitos passar através de uma região de inspeção. Os espermatozoides podem ser interrogado na região de inspeção para determinar características dos espermatozoides. Os espermatozoides orientados podem ser diferenciados dos espermatozoides não orientados e/ou dos espermatozoides não viáveis e uma subpopulação de espermatozoides orientados pode ser selecionada com base nas características detectadas dos espermatozoides. A subpopulação de espermatozoides selecionada pode então ser recolhida no recipiente de recolha.
[009] A FIG. 1 ilustra um diagrama esquemático de um único canal de fluxo no sistema de multi fluidos de triagem de espermatozoides de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0010] As FIGS. 2A-C ilustram uma disposição de canais de fluxo de um chip de micro fluidos de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0011] As FIGS. 3A-D ilustram a operação de um mecanismo de desvio, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0012] As FIGS. 4A-C ilustram mecanismos de desviar alternativos, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0013] A FIG. 5 ilustra um mecanismo alternativo de desvio de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0014] A FIG. 6 ilustra um suporte de chip e um separador de feixe, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0015] A FIG. 7 ilustra, esquematicamente, um chip, suporte de chip e cartucho de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0016] A FIG. 8 ilustra uma célula de espermatozoide que tem um eixo longitudinal.
[0017] As FIGS. 9A-C ilustram um canal de fluxo, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0018] As FIGS. 10A-D ilustram vistas em corte de uma geometria do canal de fluxo, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0019] As FIGS. 11A-D ilustram vistas em corte de uma geometria do canal de fluxo, de acordo com certas concretizações aqui descritas
[0020] As FIGS. 12A-B ilustram uma parte de uma geometria do canal de fluxo de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0021] A FIG. 13 ilustra uma seção transversal vertical de uma geometria de canal de fluxo de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0022] As FIGS. 14A-B ilustram uma parte de uma geometria do canal de fluxo de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0023] A FIG. 15 ilustra uma seção transversal vertical de uma geometria de canal de fluxo de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0024] A FIG. 16 ilustra uma parte de uma geometria do canal de fluxo de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0025] A FIG. 17 ilustra uma parte de uma geometria do canal de fluxo de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0026] As FIGS. 18A-C ilustram uma geometria de orientação, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0027] As FIGS. 19A-C ilustram uma geometria de orientação, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0028] As FIGS. 20A-C ilustram características de canal de fluxo, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0029] As FIGS. 21A-B ilustram concretizações alternativas de características de orientação de espermatozoides de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0030] A FIG. 22 ilustra a óptica de captação de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0031] A FIG. 23 ilustra uma matriz de detectores, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0032] As FIGS. 24A-E ilustram vários esquemas de detecção, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0033] As FIGS. 25A-D ilustram a iluminação e as características de recolha de luz de canais de fluxo, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0034] As FIGS. 26A-D ilustram sistemas de detecção de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0035] A FIG. 27 ilustra um esquema de detecção que proporciona um único detector para múltiplos trajetos de luz, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0036] As FIGS. 28A-B ilustram um esquema de detecção que incorpora alternativas à detecção de fluorescência lateral, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0037] As FIGS. 29A-D ilustram um esquema de detecção para determinar a orientação de espermatozoides com um sinal para a frente, de acordo com certas concretizações aqui descritas.
[0038] Embora a presente invenção possa ser incorporada com várias modificações e formas alternativas, concretizações específicas são ilustradas nas figuras e descritas no presente documento por meio de exemplos ilustrativos. Deve ser entendido que as figuras e descrições detalhadas não se destinam a limitar o escopo da invenção à forma divulgada particular, mas que todas as modificações, alternativas, e equivalentes abrangidos pelo espírito e escopo das reivindicações se destinam a estar englobados.
[0039] Determinadas concretizações aqui descritas referem-se a um sistema de micro fluidos de elevado rendimento e a um dispositivo para a triagem de espermatozoides, que ultrapassa as deficiências nas velocidades de triagem dos dispositivos anteriores com a inclusão de uma pluralidade de canais de fluxo paralelos, mantendo os espermatozoides em condições mais suaves de triagem.
[0040] O termo "canal de fluxo", tal como aqui utilizado, refere-se a uma via formada em ou através de um meio que permite a circulação de fluidos, tais como líquidos ou gases. Os canais de fluxo de um sistema de mico fluidos pode ter dimensões das seções transversais na gama de entre cerca de 1 micrômetro e cerca de 500 micrômetros.
[0041] Um "sistema de micro fluidos" pode ser considerado um dispositivo que transporta partículas de interesse através de um ou mais canais de fluxo com a finalidade de monitorar, detecção, analisar e / ou triar as partículas de interesse.
[0042] O termo "viável" deve ser entendido para se referir a projeções geralmente aceites da saúde da célula. Como um exemplo, as técnicas de triagem de espermatozoides empregam um protocolo de coloração dupla no qual um corante diferencialmente permeia os espermatozoides com as membranas comprometidas. Tal protocolo de coloração distingue os espermatozoides de membrana comprometida dos espermatozoides que são geralmente mais saudáveis ao permear as células de espermatozoides de membranas comprometidas e extinguindo a fluorescência associada com um corante fluorescente seletivo de DNA. A permeação do corante de extinção é prontamente determinável no decurso da análise ou de triagem e pode servir como um substituto para os espermatozoides não viáveis. No entanto alguns espermatozoides que são extintos podem ser capazes de fertilização, alguns dos espermatozoides que não são extintos podem não ser capazes de fertilização, ou podem logo em seguida perder a capacidade de fertilizar. Em qualquer dos casos, os espermatozoides que são não extintos num tal protocolo fornecem um exemplo de espermatozoides que podem ser considerados "viáveis" em procedimentos convencionais.
[0043] Tal como aqui utilizados, os termos "segmento de feixe" e "pequeno feixe" devem ser entendidos de forma intercambiável para se referirem a uma porção de um feixe de radiação eletromagnética espacialmente separado da outra parte do feixe, onde cada parte pode compreender uma fracção de um perfil de feixe, ou pode compreender porções de feixe divididas por separadores de feixe convencionais, cada um tendo o mesmo perfil que o feixe inicial e uma fracção da intensidade.
[0044] Como aqui utilizados os termos "vertical", "lateral," "superior", "inferior", "acima", "abaixo", "para cima", "para baixo", e outras frases similares devem ser entendidas como termos descritivos que proporcionam uma relação geral entre as características representadas nas figuras e não limitativas das reivindicações, especialmente em relação aos canais de fluxo e chips de micro fluidos aqui descritos, que podem ser operados em qualquer orientação.
[0045] Passando agora às Figuras, a FIG. 1 ilustra um sistema de triagem de espermatozoides incluindo um aparelho de triagem de alto rendimento 10. O aparelho de triagem de alto rendimento 10 pode ser um dispositivo fluidicamente fechado 60, tal como um chip de micro fluidos 80, tendo pelo menos um canal de fluxo 18. Esquematicamente, o canal de fluxo 18 é ilustrado como um único canal de fluxo no entanto; o canal de fluxo 18, deve ser entendido como pelo menos um canal de fluxo no aparelho de triagem. Como um exemplo não limitativo, entre 4 e 512 canais de fluxo podem ser formados em um único aparelho de triagem de alto rendimento 10. Cada canal de fluxo 18 pode ser formado num substrato de chip e pode ter dimensões interiores de entre 25 micrômetros e 250 micrômetros. Os canais de fluxo 18 podem ser espaçados entre cerca de 100 e 3000 micrômetros entre si. O espaçamento dos canais de fluxo 18 pode depender da capacidade do sistema para detectar a fluorescência em cada canal ou no espaço exigido para implementar componentes mecânicos ou electromecânicos para desviar espermatozoides 12 no canal de fluxo 18.
[0046] Fluido de revestimento pode ser fornecido a partir de uma fonte de revestimento 16 e feito fluir para dentro do canal de fluxo 18 através de uma entrada de revestimento 50. Os espermatozoides 12 contidos numa amostra de fluido podem ser fornecidos por, e inicialmente localizado em, uma fonte de amostra 14. A amostra que contém partículas ou células de interesse, tais como células de espermatozoides, pode fluir a partir da fonte de amostra 14 e para dentro de pelo menos um canal de fluxo 18 através de uma entrada de amostra 48. A entrada de amostras 48 e a entrada de revestimento 50 podem ser configuradas de tal modo que um fluxo coaxial laminar ou quase laminar 72 se desenvolve no canal de fluxo 18. O fluxo coaxial 72 pode ser constituído por uma corrente interior 76, também referida como uma corrente de núcleo, de amostra e um fluxo exterior do fluido de revestimento 78. Taxas de fluxo adequadas podem ser aplicadas tanto na fonte de amostra 14 como na fonte de revestimento 16 para estabelecer velocidades de fluxo, relações adequadas entre amostra e revestimento, e taxas de eventos de partículas no canal de fluxo 18.
[0047] A velocidade das partículas no fluxo coaxial 72 pode estar entre cerca de 1,5 m/s e cerca de 5 m/s no canal de fluxo 18, em comparação com entre cerca de 15 m/s e cerca de 20 m/s, em um separador de gotas. Esta velocidade mais baixa reduz a pressão à qual as células de espermatozoides são expostas, e talvez mais importante reduz as forças de cisalhamento às quais as partículas são expostas no canal de fluxo 18. Além disso, o impacto associado com a recolha de gotículas é eliminado no sistema descrito.
[0048] Numa concretização, a amostra e o revestimento são estabelecidos a pressões que proporcionam uma relação da amostra com o revestimento de cerca de 1:20. Em certas concretizações, o fluido de revestimento pode ser quase eliminado ou mesmo totalmente eliminado, resultando em pouca ou nenhuma diluição. Em contraste, separadores de gotas tendem a diluir as células do espermatozoides cerca de 50:1 em fluido de revestimento e pode mesmo, diluir a amostra tanto quanto 100:1. Estes factores de diluição elevadas podem contribuir para a diluição de choque que pode ter um impacto negativo sobre a saúde do espermatozoides triados.
[0049] Voltando à FIG. 1, os espermatozoides 12 encontram-se ilustrados passando através de uma região de inspeção 26, no canal de fluxo 18, em que os espermatozoides 12 são iluminados com uma fonte de radiação eletromagnética 30 e em que a radiação eletromagnética emitidas ou refletidas 52 dos espermatozoides 12 são capturadas por um ou mais conjuntos de recolha óptica 54 que tem uma razão de aspecto apropriada e abertura numérica para projeção sobre um ou mais detectores 56, os quais podem alternadamente referidos como sensores, para a quantificação por um analisador 58. Uma decisão de triagem pode ser feita no analisador 58 que é então passado através de um controlador 36 para atuar a resposta adequada em um mecanismo de desvio 28. O mecanismo de desvio 28 pode ser um transdutor 42, tal como um transdutor de ultrassons, para a produção de ondas, que desviam as células no trajeto de fluxo 18. O transdutor 42 pode também ser um elemento piezoelétrico de formação de uma porção de um atuador. O mecanismo de desvio 28 pode dirigir espermatozoides para qualquer ou uma primeira saída 20, uma segunda saída 22, e uma terceira saída 24. No entanto, numa concretização, o mecanismo de desvio 28 pode dirigir espermatozoides para apenas uma primeira saída 20 ou uma segunda saída 22.
[0050] A radiação eletromagnética 46 emitida pela fonte de radiação eletromagnética 30 pode ser manipulada por moldagem óptica de feixe 40 e/ou um dispositivo de divisão de feixe 74 no espaço livre para produzir um ou mais feixe(s) manipulado(s) 44, que também pode ser referido como pequenos feixes ou como segmentos de feixe 44. Uma fonte de radiação eletromagnética apropriada pode incluir um laser de onda semi-contínua, tal como um Vanguard 355-350 ou um Vanguard 355-2500 modelo de laser disponível de Newport Spectra Physics (Irvine, CA). Um feixe manipulado sob a forma de um ou mais pequenos feixes pode ser propositadamente alterado para proporcionar a intensidade, potência e/ou geometria uniforme de um pequeno feixe para o pequeno feixe seguinte. Cada perfil de intensidade do pequeno feixe pode adicionalmente ser altamente uniforme em um ou mais eixos. Por exemplo, cada pequeno feixe pode ter um perfil de feixe com forma de "chapéu alto" ou de "chapéu plano", embora também possam ser utilizados outros perfis. Numa concretização, cada perfil pequeno feixe pode também ter uma distribuição de Gauss em um ou mais eixos. Cada pequeno feixe pode ter uma forma elíptica, circular, retangular ou outra forma adequada. Cada pequeno feixe também pode ter uma relação de aspecto, eixo de simetria ou outro perfil adequado. Alternativamente, os perfis de intensidade dos pequenos feixes podem ser variados de uma maneira não uniforme. Numa concretização, uma pluralidade de fibras ópticas pode ser empregue para entregar vários feixes a um ou mais canais de fluxo.
[0051] A fonte de radiação eletromagnética 30 pode ser uma fonte comum de radiação eletromagnética dividida entre cada um dos vários canais de fluxo 18. Como um exemplo, o dispositivo de divisão de feixe 74 pode ser um espelho segmentado, tal como o descrito na Patente US No. 7,492,522, o conteúdo total da qual é aqui incorporado por referência. O espelho segmentado pode dividir a radiação eletromagnética 46 em uma pluralidade de pequenos feixes, cada pequeno feixe sendo dirigido a uma zona de inspeção respectiva 26 de pelo menos um canal de fluxo 18. Em concretizações adicionais, um elemento de transmissão parcial pode ser incorporado em caminhos da luz no espaço livre ou como parte de um cabo de fibra. O elemento de transmissão parcial pode incluir aberturas de passagem e/ou regiões de bloqueio para obter um perfil do feixe final adequado para excitar células de espermatozoides na região de inspeção. Os elementos de transmissão parcial podem ser posicionados dentro de um trem óptico, ou alternativamente eles podem ser incorporados sobre ou dentro de um substrato de chip. Tal elemento pode incluir mais do que uma região de transmissão por canal de fluxo. Como um exemplo não limitativo, os pares de aberturas retangulares ao longo de um eixo de fluxo podem iluminar seqüencialmente células de espermatozoides, em um caminho de fluxo.
[0052] O analisador 58 e o controlador 36 podem ser dois componentes separados, ou podem representar duas funções desempenhadas por um único componente, tal como um dispositivo de processamento 32. Por exemplo, uma ou mais memórias ligadas através de um bus a um ou mais processadores pode executar instruções escritas por computador para executar cada uma das funções descritas no que diz respeito ao controlador 36 e ao analisador 58. Exemplos não limitantes de dispositivos de processamento adequados 32 incluem computadores pessoais e outros sistemas de computação. O analisador 58 pode estar em comunicação com uma interface de utilizador 62, que pode incluir um mostrador 64 e uma entrada 66. A interface de utilizador 62 pode exibir graficamente vários parâmetros de triagem e fornecer uma resposta visual para ajustar um ou mais dos parâmetros de triagem. Como um exemplo não limitativo, uma lógica de triagem pode compreender a lógica aplicada a cada decisão de triagem. A lógica de triagem pode ser ajustada por um usuário na interface do usuário 62 com base em dados de triagem gerados no visor 64 ou com base em uma representação visual dos dados de triagem proporcionados na interface de usuário 62. Os tipos de ajustes que podem ser feitos à lógica de triagem podem incluir o ajuste regiões de entrada, o ajuste da estratégia para lidar com eventos coincidentes, e/ou o ajuste dos envelopes de triagem associados a cada decisão de triagem potencial.
[0053] Como um exemplo ilustrativo, os espermatozoides podem ser identificados como um espermatozoide viável portador do cromossomo X, como um espermatozoide viável portador do cromossomo Y, ou na forma de partículas que não são desejáveis para recolhimento, como os resíduos e os espermatozoides não orientados. Numa concretização, o fluxo coaxial flui para a primeira saída 20 por defeito e a primeira saída 20 está em comunicação com um recipiente de recolhimento de resíduos. Nesta configuração, o recipiente em comunicação com a primeira saída 20 também pode ser um recipiente de recolha passiva, em que os espermatozoides são recolhidos no recipiente quando não for tomada qualquer medida. As partículas que são positivamente identificadas ou como espermatozoide viável portador de cromossomo X 68 ou como espermatozoide viável portador de cromossomo Y 70 podem ser ativamente desviadas por um mecanismo de desvio 28. O acionamento do mecanismo de desvio pode ser programado usando velocidades calculadas, bem como velocidades medidas individualmente e as velocidades agregadas para um número de espermatozoides. Os espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X 68 podem ser desviados para a segunda saída 22, ao passo que os espermatozoides viáveis portadores do cromossomo Y 70 podem ser desviados para a terceira saída 24.
[0054] Voltando à FIG. 2A uma porção de um sistema de triagem de espermatozoides 10 está ilustrado sob a forma de um chip de micro fluido 80 tendo vários trajetos de fluxo 18a, 18b, 18c, 18d, e 18n, que são, cada um, em geral, paralelos. Cada canal de fluxo 18 pode ser fluidicamente ligado à amostra e ao revestimento bem como para ao recipiente de recolha que forma o dispositivo fluidicamente fechado 60. Cada canal de fluxo 18 tem uma entrada de amostra 48 e uma entrada de revestimento 50 como descrito em relação à FIG. 1 para estabelecer o fluxo coaxial no seu interior. Uma zona de inspeção 26 é proporcionada através de cada um dos canais de fluxo 18. Um mecanismo de desvio específico é ilustrado sob a forma de uma válvula de bolha para desviar as partículas que fluem no canal de fluxo 18. As válvulas de bolha podem ser como as descritas na Patente US No. 7,569,788, o conteúdo total da qual é aqui incorporado por referência. As válvulas de bolha podem ser operadas em cada canal de fluxo 18 para permitir que as partículas fluam através da primeira saída 20 de cada canal 18, ou para desviar as partículas para a segunda saída 22 ou para a terceira saída 24 de cada canal 18. Deve ser apreciado, as válvulas de bolha são fornecidas nesta figura para fins ilustrativos e outros mecanismos de desvio 28, tais como mecanismos para desviar as células com ondas acústicas e mecanismos para facilitar a deflexão partículas com radiação eletromagnética podem também ser incorporados.
[0055] A FIG. 2B ilustra diferentes características, que podem ser permutáveis e não necessitam de ser utilizados em conjunto. Cada um dos canais de fluxo 18 é ilustrado apenas com a primeira 20 e com a segunda 22 saídas. Uma tal configuração pode ser utilizada para recolhimento de células com uma única característica desejada, recolhendo assim apenas espermatozoides viáveis portadores do cromossomo X ou espermatozoides viáveis portadores do cromossomo Y. Uma variedade de transdutores de ultrassons 82 é ilustrada a jusante da região de inspeção 26, e com o objetivo de desviar seletivamente as células de espermatozoides. O conjunto de transdutor ultra-sônico 82 pode ser incorporado dentro do chip de micro fluido 80 ou estes podem ser colocados no exterior do chip de micro fluido 80. Independentemente do posicionamento, o conjunto de transdutores ultra- sônicos 82 pode compreender uma série de transdutores ultra-sônicos 42 independentes que são ativados de forma independente pelo controlador 36 para desviar as células de espermatozoides sob demanda para as suas respectivas saídas nos canais de fluxo paralelos 18. Vários transdutores ultra- sônicos podem ser dispostos em matrizes ou outras formações ao longo da direção do fluxo para um dado canal de fluxo para permitir que múltiplas operações sejam aplicadas a uma dada partícula à medida que ela se desloca ao longo do canal de fluxo para uma região de seleção, ou ramo levando a várias saídas . Saídas de fluido podem interagir com um elemento de suporte adequado e fornecer características de tubagem adequadas para manter o isolamento de fluidos ou para agrupar vários fluidos de saída.
[0056] A FIG. 2C ilustra configurações alternativas dos canais e das saídas. Os canais de mistura podem ser fabricados com o chip de micro fluído 80 para recolhimento e mistura de saídas comuns. Numa concretização, saídas adjacentes são fundidas em fluxo do primeiro canal de fluxo 18a, do segundo canal de fluxo 18b, do terceiro canal de fluxo 18c, e do quarto canal de fluxo 18d. A lógica de triagem pode ser ajustada de acordo com diferentes configurações de chip para garantir que as segunda e terceira saídas, respectivamente, recolhem as mesmas partículas em cada corrente de fluido. Por exemplo, a primeira saída 20a' do primeiro canal de fluxo 18a funde-se com a primeira saída 20b' do segundo canal de fluxo 18b. A jusante de cada ponto de fusão, o único canal que recebe fluido de ambas as saídas pode ser agrupado em um primeiro canal de agrupamento 84. O primeiro canal de agrupamento 84 pode ser formado numa camada diferente do chip de micro fluído 80 para permitir o agrupamento de múltiplas saídas fundidas. O primeiro canal de agrupamento 84 pode estar em comunicação fluida com um primeiro recipiente de recolha comum. O primeiro canal de agrupamento 84 é adicionalmente ilustrado em uma configuração de recolha de fluido a partir da primeira saída 20c' do terceiro canal de fluxo 18c, da primeira saída 20d' do quarto canal de fluxo 18d.
[0057] Da mesma forma, um segundo canal de agrupamento 86 é ilustrado em comunicação com a segunda saída fundida 22a' do primeiro canal de fluxo 18a e a segunda saída 22b' do segundo canal de fluxo 18b, bem como com segunda saída fundida 22c' do terceiro canal de fluxo 18c e a segunda saída 22d' do quarto canal de fluxo 18d. O segundo canal de agrupamento 86 pode estar em comunicação fluida com um segundo recipiente de recolhimento comum. Um terceiro canal agrupamento 88 é ilustrado em comunicação com a terceira saída fundida 24a' do primeiro canal de fluxo 18a e a terceira saída 24b' do segundo canal de fluxo 18b, bem como com a terceira saída fundida 24c' do terceiro canal de fluxo 18c a terceira saída 24d' do quarto canal de fluxo 18d. O terceiro canal de agrupamento 88 pode estar em comunicação fluida com um terceiro recipiente de recolha comum.
[0058] Voltando agora para as FIGS. 3A-3D uma concretização do mecanismo de desvio 28 encontra-se representada em ação. Amostra contendo células de espermatozoides 12 pode ser fornecida através de uma entrada de amostras 48 e injetada num revestimento de fluxo de fluido proporcionado pela fonte de revestimento 16 através da entrada de revestimento 50. O canal de fluxo 18 transporta os espermatozoides 12 através da região de inspeção 26, em que as células são iluminadas pela fonte de radiação eletromagnética 30 e em que as características dos espermatozoides são determinadas pelo analisador 58 em comunicação com o detector 56.
[0059] Dois mecanismos de desvio oposto 28 são ilustrados sob a forma de uma primeira válvula de bolha 90a e de uma segunda válvula de bolha 90b a jusante da região de inspeção 26. As válvulas de bolha 90 são espaçadas opostas uma à outra, apesar de os peritos compreenderem que outras configurações podem também ser utilizadas. As primeira e segunda válvulas de bolha 90a e 90b estão em comunicação fluida com a conduta de fluxo 18, através de uma primeira passagem lateral 94a e de uma segunda passagem lateral 94b, respectivamente.
[0060] Líquido, geralmente fluido de revestimento, preenche estas passagens laterais 94a e 94b assegurando a comunicação flúida entre o canal de fluxo 18 e uma membrana 96 associada com cada uma. A membrana 96 pode ter a forma de um menisco ou outro material flexível, incluindo materiais elásticos. A membrana 96 define uma interface entre o fluido de revestimento e um outro volume de fluido 98, tal como um gás ou um gel em uma câmara de fluido 100 da válvula de bolha 90 associada. Um atuador pode ser fornecido para engatar quer a válvula de bolha 90, o que provoca uma perturbação momentaneamente no canal de fluxo 18 e deflecte o fluxo no seu interior quando ativado. Como ilustrado, um atuador é acoplado à primeira válvula de bolha 90a e à segunda válvula de bolha 90b. Uma válvula de bolha 90 pode servir como um amortecedor para absorver o pulso de pressão criado pelas outras válvulas de bolha 90 quando ativadas. Alternativamente, um atuador pode estar em comunicação com apenas uma válvula de bolha 90 para defletir as partículas ou células num único sentido. Alternativamente, um atuador pode estar em comunicação com uma única válvula de bolha para defletir as partículas em mais de uma direção. Como será descrito com mais pormenor mais tarde, uma válvula de bolha única pode ser configurada para seletivamente empurrar ou puxar a trajetória das partículas ao longo do seu percurso de fluido. Os atuadores podem ser pinos configurados para ativar qualquer um dos grupos de válvulas de bolha em vários canais de fluxo 18. Pinos podem ser configurados em uma série de arranjos para acomodar diferentes configurações, como as representadas nas FIGS. 2A-2C. Um exemplo ilustrativo de um atuador para acionar pinos individualmente para desviar as partículas em vários canais paralelos é descrita na Patente US 8,123,044, o conteúdo total da qual é aqui incorporada por referência.
[0061] A primeira passagem lateral 94a está ligada hidraulicamente a uma câmara de fluido 100a numa primeira válvula de bolha 90a, de modo a que à medida que é aumentada a pressão exercida nesta câmara, o fluxo no canal de fluxo 18, perto da passagem lateral 94a é deslocado para fora da passagem lateral 94a, substancialmente perpendicular ao fluxo normal no canal de fluxo. A segunda passagem lateral 94b, posicionada em frente da primeira passagem lateral 94a, é hidraulicamente ligada a uma segunda câmara de fluido 90b na segunda válvula bolha 90b e pode absorver a pressão associada com o deslocamento perpendicular causado pela primeira válvula bolha 90a. Esta primeira passagem lateral 94a coopera com a segunda passagem lateral 94b para dirigir o líquido antes mencionado, deslocamento causado pela pressurização da câmara de fluido 90a, de modo a que o deslocamento tenha um componente perpendicular ao fluxo normal das partículas, através do canal de fluxo 18. Numa concretização alternativa, uma única válvula de bolha pode ser utilizada sem uma segunda válvula de bolha cooperante.
[0062] A cooperação das duas passagens laterais 94 e das câmaras de fluxo 100 faz com que o fluxo flua através do canal de fluxo 18 para ser transientemente movido lateralmente para trás e para a frente mediante a pressurização e a despressurização da câmara de fluido 100, pelo atuador externo. Com base nas características detectadas dos espermatozoides, um atuador em qualquer uma das válvulas de bolha 90 pode ser acionado pelo controlador 36 e pode ser aplicado no desvio de espermatozoides tendo características predeterminadas para os separar das partículas que permanecem na amostra.
[0063] O canal de fluxo 18 está ilustrado com um primeiro ramo que leva a uma primeira saída 20, que é geralmente paralela com o canal de fluxo 18 existente. A primeira saída 20 pode ser uma saída por defeito para a qual as partículas fluem a menos que uma das válvulas de bolha 90 seja ativada. Uma segunda saída 22 pode ramificar para longe da primeira saída 20 a uma certa distância a jusante da região de inspeção 26. De modo semelhante, uma terceira saída 24 pode ser alcançada através de um ramo geralmente no lado oposto do canal de fluxo 18, como o primeiro ramo. O ângulo entre os ramos que se estendem para a segunda 22 e terceira 24 saídas pode ser separado entre 0 e 180 graus, ou mesmo entre 10 e 45 graus.
[0064] As células espermáticas 12 fornecidos a partir da fonte de amostra 14, podem conter vários tipos de células que podem ser diferenciadas pelo analisador 58. No caso de espermatozoides 12, pode haver espermatozoides viáveis portadores do cromossomo X 68, espermatozoides viáveis portadores de cromossomo Y 70, e partículas indesejáveis. As partículas indesejáveis podem incluir espermatozoides mortos, os espermatozoides não orientados que não puderam ser identificados, outras partículas, ou as células de espermatozoides que não se encontram suficientemente espaçadas no canal de fluxo para a separação.
[0065] Ao detectar uma característica predeterminada em uma célula espermática 12, ilustrada como um espermatozoide portador de um cromossomo X 68, o analisador 58 pode proporcionar um sinal ao controlador 36 para ativar o atuador externo adequado num momento adequado, que por sua vez engata a segunda válvula de bolha 90b para provocar variações de pressão na câmara de fluido 100b. Esta variação de pressão 96b desvia a membrana na segunda válvula de bolha 90b. A primeira passagem lateral 94a e a primeira válvula de bolha 90a absorvem as variações de pressão transientes resultantes no canal de fluxo 18, resultando numa força de desvio na câmara de fluxo 18, a qual está temporizada para desviar a célula espermática portadora de cromossomo X 68 para uma posição diferente no canal de fluxo 18 (visto na FIG. 3B). A câmara de fluido 90a da primeira válvula de bolha 90a pode ter uma parede resiliente, tal como um menisco, ou pode conter um fluido compressível, tal como um gás ou um gel. As propriedades resilientes permitem o fluxo de líquido a partir do canal de fluxo 18 para a primeira passagem lateral 94a, permitindo que o pulso de pressão seja absorvido proporcionando uma janela estreita em que as células são desviadas e evitando perturbações do fluxo nas partículas não selecionadas na corrente de partículas. Do mesmo modo, no caso de um espermatozoide portador de um cromossomo Y ser detetado, um atuador externo 70 pode ser utilizado para pressurizar a primeira válvula de bolha 90b e desviar a célula de espermatozoides para a terceira saída 24. Alternativamente, ou espermatozoides portadores de cromossomo Y ou espermatozoides portadores de cromossomo X, ou mesmo ambos, podem ser passivamente triados ao serem deixados passar para a primeira saída enquanto que os espermatozoides indesejáveis são desviados para longe da primeira saída.
[0066] A FIG. 3C ilustra um período imediatamente após o desvio da segunda válvula de bolha 90b quando a partícula de interesse, mostrada quando o mesmo espermatozoide viável portador de cromossomo X 68, deixou o volume entre a primeira passagem lateral 94a e a segunda passagem lateral 94b. Na seqüência de tal ativação a pressão dentro de ambas as câmaras de fluido 100 volta ao normal e cada membrana 96 volta para a posição de equilíbrio, enquanto o líquido de revestimento sai da primeira passagem lateral 94a e reentra na segunda passagem lateral 94b, tal como indicado pelas setas.
[0067] A FIG. 3D ilustra o sistema 10 após a conclusão da seqüência de comutação. As pressões no interior das câmaras de fluido 100 de cada válvula de bolha 90 são equalizadas, permitindo que o fluxo através do canal de fluxo 18 se normalize, de modo que os espermatozoides não desviados continuem em direção à primeira saída 20. Enquanto isso, a partícula de interesse, ainda ilustrada como uma célula espermácia viável portadora de cromossomo X, foi deslocada da sua trajetória original, e flui para o primeiro ramo e para a segunda saída 22, enquanto que as outras células podem continuar sem se desviarem em direção à primeira saída 20, separando assim as partículas com base na característica predeterminada.
[0068] Numa concretização alternativa, um ou ambos de entre a primeira válvula de bolha 90a e a segunda válvula de bolha 90b podem ser pré-carregados com pressão por um atuador. Em resposta às decisões de triagem geradas pelo analisador 58 e triar as ações do controlador 36, o atuador pode ser descarregado a partir da quer da válvula de bolha 90, a fim de recolher a respectiva membrana 96, puxar fluido de revestimento adicional para a respectiva passagem lateral 94, a fim de desviar a trajetória de uma das células de espermatozoides no sentido dessa passagem lateral 94.
[0069] No que se refere agora à FIG. 4A, uma concretização de um mecanismo de desvio 28, e em particular uma concretização da válvula de bolha 90, está representada na qual um atuador 92 é afixado a uma interface flexível 102 em um ponto de fixação 112. A interface flexível 102 pode ser fluidicamente vedada com a câmara de fluido 100, ou pode acionar um componente intermédio que por sua vez provoca as ações como as descritas abaixo. Numa primeira posição, a qual pode ser considerada como uma posição de repouso, o atuador 92 e a interface flexível 102 estão em repouso, de modo a que o fluido 98 na câmara de fluido 100 não desvia a membrana 96 para a passagem lateral 94. Numa segunda posição, a qual pode ser considerada como uma primeira posição de ativação, o atuador 92 pode ser acionado na interface flexível 102, fazendo com que a interface flexível 102 penetre no volume da câmara de fluido 100 de tal modo que a pressão seja aplicada sobre a membrana 96 e o fluido é expulso da passagem lateral 94. Este fluido de revestimento expulso fornece o pulso de pressão que pode desviar partículas, como espermatozoides, para longe da passagem lateral 94.
[0070] Quando o atuador 92 está ligado à interface flexível 102 em um ponto de fixação 112, uma terceira posição, a qual pode ser considerada uma segunda posição de ativação, é possível por meio de que o atuador 92 puxa a interface flexível 102 para fora da câmara de fluido 100 expandindo o volume (no caso de fluidos compressíveis) de tal modo que a membrana 96 é puxada e o fluido de revestimento adicional é arrastado para a passagem lateral 94. O pulso de pressão resultante pode puxar espermatozoides ou outras partículas para a passagem lateral 94 no canal de fluxo 18. Deve ser apreciado que os volumes dos compartimentos de fluido 100, o tipo de fluido 98, e as dimensões da passagem lateral 94 podem ser modificados para obter as deflexões desejadas do canal de fluxo 18. Além disso deve ser apreciado que a segunda posição e a terceira posição podem ser consideradas as posições extremas, e que uma multiplicidade de posições intermédias são também contempladas entre as duas posições extremas. Por exemplo, o canal de fluxo 18 pode compreender quatro, cinco, seis ou mais ramos, cada um dos quais pode ser capaz de receber partículas adequadamente deflectidas pela válvula de bolha 90.
[0071] A FIG. 4B fornece uma concretização alternativa, em que o atuador 92 é pré-carregado na interface flexível 102. Dito de outra forma, a câmara de fluido 100, o fluido 98, e a membrana 96 podem ser considerados como estando em uma posição de repouso, enquanto existe alguma deflexão da interface flexível 102 para o volume da câmara de fluido 100. O atuador 92 pode ainda ser conduzido para a interface flexível 102 para uma primeira posição de ativação, a qual atua sobre o fluido 98 para deslocar a membrana 96 e expelir o fluido de revestimento a partir da passagem lateral 94.
[0072] A movimentação do atuador 92 para fora, para a segunda posição de ativação, pode atuar para puxar a membrana 96 para o interior e puxar o fluido para a passagem lateral 94. Numa tal concretização, a movimentação do atuador 92 para uma posição, que pode parecer ser uma posição de repouso, pode realizar um pulso de pressão para desviar as partículas. Na concretização representada, este deslocamento pode resultar em um pulso de pressão que puxa as partículas para a passagem lateral 94. No entanto, pode ser proporcionado um ponto de fixação 112 entre o atuador 92 e a interface flexível 102, e a interface flexível 102 de tal modo que a interface flexível 102 pode ser pré-carregada na direção oposta.
[0073] A FIG. 4C representa uma concretização alternativa de uma válvula de bolha na qual a interface flexível 102 pode compreender um elemento piezoelétrico bimorfo 110. O elemento piezoelétrico bimorfo 110 pode ser fornecido numa relação vedada com a câmara de fluido 100, ou pode assentar contra outro material flexível que é vedado contra a câmara de fluido 100 e através do qual o movimento do elemento piezoelétrico bimorfo 110 é alvo de uma translação. Na posição de repouso, o elemento piezoelétrico bimorfo 110 pode estar em repouso, de tal modo que as partículas passam a passagem lateral 94 sem serem desviadas. Em resposta a um sinal de controlo o elemento piezoelétrico bimorfo 110 pode se dobrar para uma primeira posição de ativação invadindo o volume da câmara de fluido 100 e fazendo com que a membrana 96 seja expelida para fora da passagem lateral 94. O pulso de pressão resultante pode desviar partículas para longe da passagem lateral 94 e da válvula de bolha 90. Da mesma forma, o piezoelétrico bimorfo 110 pode ser fornecido com um sinal fazendo com que o elemento se dobrar ou desvie para uma segunda posição de ativação. A segunda posição de ativação pode atuar sobre o fluido 98, a câmara de fluido 100, e a membrana 96 de modo que puxe o fluido para a passagem lateral 94. Desta forma, as partículas podem ser desviadas para a passagem lateral 94.
[0074] O elemento piezelétrico bimorfo 110 pode ser controlado com precisão através de sinais elétricos em grau de deflexão e temporização. Por exemplo, qualquer número de posições intermédias entre as primeira e a segunda posições de ativação pode ser conseguido para defletir as partículas com uma variedade de trajetórias. O elemento piezoelétrico bimorfo 110 pode somente exigir uma ligação elétrica, assim potencialmente simplificando problemas de espaçamento que poderiam de outra maneira existir.
[0075] Embora as válvulas de bolha apresentem um mecanismo de desvio viável, outros mecanismos de desvio 28 são contemplados para utilização com certos aspectos do chip de micro fluido aqui descrito. Uma disposição alternativa está ilustrada na FIG. 5, que mostra uma partícula a ser desviada pela ativação de transdutores 42, tal como elementos piezoelétricos ou transdutores de ultrassons. Cada transdutor 42 pode formar uma porção de uma matriz de transdutores 82. Cada transdutor 42 na série de transdutores 82 podem ser seqüencialmente ativado com base na velocidade calculada ou esperada da partícula para proporcionar pulsos que atuam sobre a partícula em vários pontos ao longo do canal de fluxo 18.
[0076] Uma fonte de radiação eletromagnética 30 pode fornecer radiação eletromagnética para inspecionar partículas. A fluorescência, dispersão, ou outras emissões responsivas podem ser detectadas por um ou mais detectores 56, e processadas pelo analisador 58. As decisões de triagem resultantes podem ser transportadas de um controlador 36 através de um elemento propulsor 108 para cada transdutor 42. O elemento de acionamento 108 pode proporcionar a ativação por temporização de transdutores 42 para interagir com uma célula de espermatozoides ou outras partículas várias vezes ao longo do canal de fluxo 18. Cada transdutor 42 pode ser um transdutor acústico, ou mesmo um transdutor de ultrassons, e a freqüência com que os transdutores são acionados pode ser optimizada para produzir um desvio de partículas, ou ainda mais especificamente para desviar ou fazer divergir os espermatozoides no canal de fluxo 18. Numa concretização, cada transdutor 42 pode proporcionar um único pulso dirigido para desviar a partícula, enquanto que noutra concretização, cada um dos transdutores pode produzir vários pulsos dirigidos para desviar a partícula. Em ainda outra concretização, um ou mais conjuntos de transdutores 82 pode ser operado para produzir uma onda estacionária no canal de fluxo 18. Como um mecanismo de desvio 28, a onda estacionária pode atrair ou repelir partículas dentro de certos nodos ou antinodos do campo acústico. Numa concretização, os transdutores 42 são operados na gama de 10-16MHz.
[0077] Numa concretização, um conjunto de transdutores 82 está presente em cada lado do canal de fluxo 18 para desviar as partículas em ambas as direções. Numa outra concretização, um único conjunto de transdutores 82 pode ser incorporado com o objetivo de desviar partículas ou células de espermatozoides em ambas as direções. O conjunto de transdutores 82 pode ser incorporado dentro de um substrato de chip, ou eles podem ser localizados numa superfície externa de um chip de micro fluidos 80. Adicionalmente, o conjunto de transdutores 82 pode ser removível do chip 80.
[0078] Numa concretização alternativa, um conjunto de elementos ópticos pode ser incorporado de uma maneira semelhante para desviar as partículas com uma pressão de radiação. Um único laser, ou outra fonte de radiação eletromagnética, pode ser fechado ou colocado de uma maneira que permite várias aplicações a uma única partícula que se desloca ao longo do canal de fluxo, ou que rapidamente segue partículas no canal de fluxo 18. Alternativamente, vários lasers podem ser utilizados para desviar uma partícula com várias aplicações de pressão de radiação.
[0079] Voltando agora à FIG. 6, um suporte de chip 104 é ilustrado para reter um chip de micro fluído 80 em uma posição precisa de modo a que um bloco atuador 106 e um feixe formado/separado possam se envolver com precisão com os mecanismos de desvio 28 e com as regiões de inspeção 26, respectivamente. Um dispositivo de separação do feixe 74 é ilustrado para a produção de múltiplos segmentos de feixe, cada um dos quais pode ser alinhado com um canal de fluxo 18 geralmente perpendicular ao canal de fluxo 18 ou com ele descrevendo um ângulo. O chip de suporte 104 pode incluir um mecanismo para fixar firmemente o chip de micro fluido 80 numa posição relativa, ou pode incluir mecanismos para ajustar a posição relativa do chip de micro fluido 80, tal como para alinhar o canal de fluxo no chip com os detectores e as fontes de iluminação.
[0080] Voltando agora à FIG. 7 uma concretização de um chip de micro fluido 80 é ilustrada em um suporte de chip 104, em conjugação com um sistema de fluidos sob a forma de um cartucho 168. Deve ser apreciado que algumas características ilustradas formadas em porções de suporte do chip 104 podem também ser integradas em uma camada adicional do próprio chip de micro fluido 80. O chip de micro fluido 80 é ilustrado com vários canais de fluxo 18 que têm uma entrada de revestimento 50 e uma entrada de amostra 48, para além de uma primeira saída 20, de uma segunda saída 22 e de uma terceira saída 24, em cada canal.
[0081] O cartucho 168 pode compreender uma série de reservatórios em comunicação fluida com o chip de micro fluido 80 e/ou com o suporte de chip 104. O cartucho 168 pode ser formado a partir de um polímero ou de outro material biocompatível adequado e cada reservatório é contemplado para reter diretamente fluidos, ou para reter foles ou outros contentores fechados cheio de fluidos. Um reservatório de amostra 114 pode ser um reservatório selado fluidicamente em comunicação fluida com um canal de amostra 134 no suporte 104 do chip. A ligação de fluído entre o reservatório de amostra e o canal de amostra 134 pode ser realizada em condições estéreis, para prevenir ou reduzir a exposição da amostra a agentes patogênicos e bactérias. Do mesmo modo, um reservatório de revestimento 116 pode ser fluidicamente ligado a um canal de revestimento 136 no suporte de chip 104. Cada um dos reservatórios pode ter um mecanismo de transporte associado. Como um exemplo, o fluido pode ser transportado através de gradientes de pressão criados em cada reservatório. Os gradientes de pressão podem ser criados com bombas, bombas peristálticas, e outros meios semelhantes.
[0082] Uma porção cortada da FIG. 7 ilustra a conexão do canal de revestimento 136 e do canal de amostra 134 às suas respectivas entradas e ao primeiro canal de fluxo 18a. Embora não ilustrados, os canais de fluxo restantes de 18b a 18n podem ter ligações de fluído semelhantes aos reservatórios através dos canais. Deste modo, cada canal de fluxo de 18a a 18n pode ser fornecido a partir de um reservatório comum 114 e a partir de um reservatório comum de revestimento 116 para facilitar o funcionamento em paralelo de vários canais em um chip de micro fluido 80.
[0083] O cartucho 168 pode conter reservatórios adicionais para fluidos processados. Como um exemplo, o cartucho 168 pode conter um reservatório de recolha passivo 120, um primeiro reservatório de recolha ativo 122 e um segundo reservatório de recolha ativo 124. O reservatório de recolha passivo 120 pode estar em comunicação fluida com a primeira saída 20 de cada canal 18 através de um canal passivo de recolha 140 onde o fluido de cada primeira saída 20 se aglomera e é alimentado através de uma linha de recolha passiva 150. Numa concretização, a recolha passiva pode ser o padrão de recolha e pode incluir resíduos e/ou partículas indesejáveis. Do mesmo modo, o primeiro reservatório de recolha ativo 122 pode ser fluidamente ligado à segunda saída 22 de cada canal de fluxo 18 através de um primeiro canal de recolha ativo 142 e de uma primeira linha ativa de recolha 152 e um segundo reservatório de recolha ativo 124 pode ser ligado à terceira saída 24 através de um segundo canal de recolha ativa 144 e uma segunda linha recolha ativa 154. Um segundo corte ilustra a relação entre a terceira saída 24 e o segundo canal de recolha ativa 144, que será semelhante para cada canal de fluxo 18. Fluidos e células de espermatozoides, seja ativamente ou passivamente triados, podem ser puxados através de cada respectiva saída, canal, linha e reservatório por um mecanismo de transporte, como um gradiente de pressão.
[0084] Como um exemplo ilustrativo, os canais no chip de microfluido 80 podem ter larguras entre cerca de 20 μm e cerca de 400 μm, enquanto que os canais no suporte de chip podem ter larguras entre cerca de 200 μm e cerca de 2 mm.As linhas que ligam cada canal aos seus respectivos reservatórios podem ter diâmetros interiores de entre cerca de 0,25 mm e cerca de 5 mm.
[0085] Uma concretização proporciona um sistema opcional de reciclagem de fluido de revestimento 160 para reciclagem do fluido de revestimento do reservatório de resíduos. A FIG. 7 ilustra uma linha de reciclagem 162 proporcionando uma comunicação flúida a partir do reservatório de recolha passivo 120 para o reservatório de revestimento 116. Uma bomba 164 pode ser fornecida na linha de reciclagem para dirigir o fluido através de um sistema de concentração 166, tal como um filtro, e daí para o reservatório de revestimento 116. Alternativamente, o reservatório de recolha passiva 120 e o reservatório de revestimento 116 podem ser fornecidos em pressões diferentes que tendem a impulsionar o fluido a partir do reservatório de recolha passiva 120 através da linha de reciclagem 162 e para o reservatório de revestimento 116. Alternativamente, outros mecanismos de transporte podem ser incorporados para transmitir o fluido a partir de um dos reservatórios de recolha para o reservatório de revestimento 116. Numa concretização, o filtro pode ser substituído por outros sistemas de concentração de células 166, ou por sistemas para a remoção de fluido ou sobrenadante. Numa concretização, uma série de filtros pode ser usada para condicionar o fluido de revestimento conforme apropriado para uma aplicação específica, tal como a triagem de espermatozoides. Outros exemplos não limitativos de sistemas de concentração de espermatozoides podem incluir sistemas de centrifugação, unidades de micro fluidos, membranas porosas, concentradores de espiral, ou hidrociclones, ou outros dispositivos de concentração de partículas ou sistemas remoção de fluidos. Em ainda outra concretização, o sistema de concentração de células 166 pode proporcionar espermatozoides ativamente recolhidos em um ou ambos dos primeiro 122 e segundo 124 reservatórios de recolha ativos numa concentração adequada para processamento posterior, enquanto fornece fluido de revestimento sobrenadante de volta para o reservatório de revestimento 116. Como um exemplo os espermatozoides podem ser concentrados até uma dosagem apropriada para a recepção de um extensor de congelamento, ou os espermatozoides podem ser concentrados até uma dosagem apropriada para a realização de AI, IVF ou outros procedimentos de reprodução assistida.
[0086] Ainda uma outra característica que pode estar presente em algumas concretizações é um elemento regulador de temperatura 170. O cartucho de 168 pode realizar o aquecimento e/ou o resfriamento de qualquer ou de todos os fluidos armazenados no seu interior. Por exemplo, o elemento regulador de temperatura 170 pode assumir a forma de pastilhas ou regiões de aquecimento e/ou de arrefecimento do cartucho 168. Cada câmara ou reservatório do cartucho 168 pode ser mantido a diferentes temperaturas ou ter a sua temperatura modificada durante a operação. Pode ser utilizado qualquer meio adequado para controlar a temperatura dentro de uma câmara ou região selecionada do cartucho de processamento de partículas unitárias. Em uma concretização de triagem de espermatozoides pode ser desejável manter os espermatozoides a uma temperatura relativamente constante, tal como uma temperatura baixa, tanto quanto possível. Pode ainda ser desejável arrefecer os espermatozoides com a finalidade de reduzir a atividade dos espermatozoides que se podem desalinhar e dos espermatozoides não orientados. Em tal concretização o cartucho pode ser construído a partir de um material termicamente condutor para a manutenção de cada reservatório facilmente a um temperaturas semelhante, especialmente a temperaturas refrigeradas.
[0087] Referindo brevemente à FIG. 8 um espermatozoide 200 é ilustrado em três pontos de vista. Embora exista alguma variação entre espécies, o espermatozoide 200 é representativo da forma básica de uma porção significativa de espermatozoides de mamíferos, incluindo os espermatozoides bovinos, os espermatozoides equinos, e os espermatozoides suínos. A forma básica da cabeça dos espermatozoides pode ser aqui referida como uma forma geral de pá. Como pode ser facilmente compreendido pelos peritos na arte os princípios aqui descritos serão igualmente aplicáveis a muitas outras espécies, como muitas das espécies enumeradas no Mammal Species of the World, pelo Wilson, D.E. e Reeder, D.M., (Smithsonian Institution Press, 1993), todo o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência.
[0088] As duas maiores partes da célula de espermática 200 são a cabeça do espermatozoide 204 e a cauda do espermatozoide 206. A cabeça do espermatozoide 204 alberga o DNA nuclear ao qual corantes seletivos de DNA se ligam, o que é vantajoso para o propósito de triar espermatozoides com base no sexo. A cabeça de espermatozoide 204 é geralmente em forma de pá, e tem um comprimento maior que a largura. Um eixo longitudinal 212 é ilustrado como um eixo ao longo do comprimento da cabeça de espermatozoide 204 através do seu centro, o qual pode ser geralmente paralelo com o comprimento da cauda de espermatozoide 206. Um eixo transversal 214 é ilustrado através do centro da cabeça de espermatozoide 204 e é perpendicular ao eixo longitudinal 212. Relativamente a uma orientação ideal, o espermatozoide que é rodado em torno do eixo longitudinal pode ser considerado "rodada" em forma sinônima com o termo aeronáutica rolagem, enquanto que o espermatozoide que é rodado sobre o eixo transversal 214 pode ser considerada "inclinado" numa forma sinônima com o termo aeronáutico picado. O comprimento da cabeça do espermatozoide está indicado ao longo do eixo longitudinal, como L. A largura da cabeça de espermatozoide 204 é indicada como W, enquanto que a espessura é indicada como T. A título de exemplo não limitativo, várias raças bovina têm espermatozoides com dimensões de aproximadamente L=10 micrômetros, W = 5 micrômetros, e T = 0,5 micrômetros.
[0089] A diferenciação de espermatozoides é difícil em muitas espécies, pois a absorção de corante seletivo de DNA difere apenas ligeiramente nos espermatozoides portadores de cromossomo X e nos espermatozoides portadores de cromossomo Y. A maioria das espécies de mamíferos demonstram uma diferença entre cerca de 2% a 5% em teor de DNA. Para localizar precisamente esta diferença cada célula espermática analisada é preferencialmente fornecida em um alinhamento uniforme e com uma orientação uniforme. À medida que os espermatozoides ficam desalinhados ou não orientados a sua fluorescência medida oscila muito mais do que alguns pontos percentuais. Idealmente, os espermatozoides seriam alinhados quando o eixo longitudinal passa através do ponto focal do detector e/ou da fonte de iluminação, enquanto que o eixo longitudinal e o eixo transversal se mantém ambos perpendiculares a um eixo óptico do detector e/ou um eixo do feixe de um feixe produzido por uma fonte de iluminação. Citômetros de fluxo de jato de ar anteriores modificados para a triagem de espermatozoides incluem um detector de fluorescência lateral com a finalidade de excluir os espermatozoides que são rodados, mas os detectores laterais não estão presentes em sistemas de micro fluidos, nem a geometria de chips de micro fluidos atuais permite a inclusão de detectores laterais. As características seguintes podem ser incorporadas individualmente ou em qualquer combinação ou permutação de modo a proporcionar espermatozoides orientados num chip de micro fluidos e/ou para determinar quando os espermatozoides são orientadas num chip de micro fluidos.
[0090] Voltando agora à FIG. 9A, uma vista em perspectiva de um canal de fluxo 318 está ilustrada. O canal de fluxo 318 ilustrado inclui tanto uma região de foco de fluido 330 como uma região de foco de fluido 330 e uma região de orientação de espermatozoides 332 formada numa porção de um chip de micro fluidos 300. Enquanto a região de foco de fluido 330 inclui uma característica de foco de fluido sob a forma de uma geometria de foco de fluido e uma região de orientação de espermatozoides 332 é ilustrada com a característica de orientação de uma geometria do canal de orientação, deverão ser apreciadas outras características de focagem e de orientação que podem ser incorporadas em lugar das, ou em adição às, geometrias retratadas.
[0091] O canal de fluxo 318 pode ser um de muitos canais de fluxo em um chip de micro fluidos, tal como entre 4 e 512 canais de fluxo. Uma entrada de fluxo de revestimento 350 é ilustrada a montante da entrada de amostra 348 no canal de fluxo 318 com o fim de estabelecer o fluxo coaxial, por vezes referido como o fluxo de revestimento.
[0092] A região de foco de fluido 330 pode incluir uma região de foco de fluido vertical 336 com uma geometria para focar e/ou alinhar um aspeto vertical do fluxo do núcleo e uma região de foco de fluido lateral 334, ou região de foco transversal, com uma geometria para a focagem e/ou alinhamento de um aspeto lateral da corrente do núcleo. Tal como ilustrado, a região de foco de fluido lateral 334 compreende o mesmo comprimento do canal de fluxo 318, como a região de foco de fluido 330, ambas as quais se sobrepõem à região de focagem vertical, fluido 336. Deve ser apreciado que região de foco do fluido lateral 334 pode ocupar menos do que a totalidade do região de foco de fluido, e que a região de foco de fluido vertical 336 não tem necessariamente de se sobrepor com a região de foco de fluido lateral 334. A região de foco de fluido lateral 334 pode ser considerada o comprimento do canal de fluxo 318 ao longo do qual uma largura de canal lateral, "w" diminui terminando num primeiro ponto de transição 338 para uma segunda largura, "w". Esta geometria tende a limitar o fluxo de núcleo de amostra, e pode geralmente ajudar no alinhamento das células espermáticas dentro do canal de fluxo 318 proporcionando uma faixa mais estreita da amostra em que estão geralmente confinadas.
[0093] Uma região 332 de orientação de espermatozoides pode seguir a região de foco de fluido 330 certa distância após o primeiro ponto de transição 338 no canal de fluxo 318, ou, alternativamente, a região de foco de fluido 330 e as regiões de orientação de espermatozoides 332 podem se sobrepor parcialmente ou totalmente. A região de orientação de espermatozoides 332 pode terminar num segundo ponto de transição 340, o qual pode ser seguido por uma região de inspeção 326. Numa concretização, o canal de reduzida largura, "w" pode ter uma dimensão consistente ao longo da região de orientação de espermatozoides 332, ou de uma porção da região de orientação de espermatozoides, e através da zona de inspeção 326.
[0094] Voltando à FIG. 9B, uma vista em corte vertical do canal de fluxo 318 está ilustrada, tendo uma região de foco de fluido lateral 334 e uma região de foco de fluido vertical 336, seguida por uma região de orientação de espermatozoides 332 e uma região de inspeção 326. Numa concretização, a região de foco de fluido vertical 336 inclui uma característica de foco de fluido vertical 342, que pode ser um canal de revestimento suplementar, uma série de rebordos, arestas, vigas, ondulações, ou redutores de velocidade, ou um transdutor capaz de produzir pulsos de pressão no canal de fluxo 318. Numa concretização de um canal a altura "h" é mantida relativamente constante até o primeiro ponto de transição 338. Em outras concretizações, a região de foco de fluido vertical 336 pode ter geometria que varia a altura do canal de "h", ou a região de orientação de espermatozoides 332 pode se sobrepor com o região de foco de fluido 330 a introduzindo uma geometria de canal que varia a altura do canal, antes do primeiro ponto de transição 338. Numa concretização, a altura do canal de "h" avança a partir do primeiro ponto de transição 338 a uma altura reduzida de canal "h '" no segundo ponto de transição 340. Em alternativa, a altura de canal de "h" pode ser reduzida através da zona de orientação de espermatozoides 332. A região de orientação de espermatozoides 332 pode começar após a região de foco de fluido 330, ou podem se sobrepor parcialmente, ou mesmo totalmente, com a região de foco de fluido 330.
[0095] A FIG. 9C ilustra uma configuração alternativa para a produção de fluxo coaxial ou de revestimento, pelo que a entrada de amostra 348 é fornecido em geral paralelamente com o canal de fluido 318. Nesta configuração, a entrada de amostra 348 pode ser fornecida numa configuração biselada para encorajar uma forma de fita para o fluxo de núcleo no início. Os vulgares peritos na arte irão apreciar qualquer configuração conhecida para estabelecer o fluxo de revestimento em um canal de micro fluído pode também ser incorporada com os aspectos de orientação aqui descritos. Como um exemplo não limitativo, qualquer um dos canais de entrada/saída do exemplo descritos na Patente US No. 7,311,476, o conteúdo total da qual é aqui incorporada por referência, pode ser incorporado com várias das características aqui descritas.
[0096] As FIGS. 10A-D ilustram um canal de fluxo 318 com uma geometria relativamente simples que incorpora tanto uma região de foco de fluido 330 como uma região de orientação de espermatozoides 332; no entanto, cada uma destas regiões também podem ser incorporadas em geometrias de canal de fluxo mais complexas. Cada uma das FIGS. 10A-D ilustra princípios gerais e não estão necessariamente representadas à escala ou refletem uma proporção de aspecto de 1:1. A FIG. 10A ilustra a seção AA como um canal de fluxo geralmente quadrado 318 preenchido com fluido de revestimento 352. Movendo-se para jusante para a seção BB, A FIG. 10B ilustra um fluxo amostra de núcleo 354 visto em relação coaxial com o fluido de revestimento 352. Uma visão mais próxima do fluxo de núcleo em BB ilustra um exemplo de uma célula espermácia não alinhada e não orientada 360. Setas em torno do fluxo de núcleo ilustram as forças aplicadas ao fluxo de núcleo através de mudanças na geometria do canal de fluxo 318. A transição de AA para BB resultou em um ligeiro alargamento do canal sem uma mudança em altura.
[0097] Movendo para jusante para CC a largura "w" do canal de fluxo 318 é reduzida focando a corrente de núcleo, que está ilustrada na célula espermácia 360 a mover-se para o centro da corrente de núcleo e tornando- se alinhada, enquanto se mantém uma posição não orientada na corrente. As forças que proporcionam o movimento lateral são ilustradas como setas a cheio enfatizando a influência hidrodinâmica desta porção da geometria do canal. Da seção CC para DD a altura "h" do canal de fluxo é reduzida tendendo a aplicar forças de orientação aos espermatozoides dentro da corrente de núcleo. Maiores forças são aplicadas a partir de posições verticais, em relação às posições posteriores, tendendo a orientar a superfície plana de uma célula espermácia.
[0098] As FIGS. 11A-11D ilustram uma geometria do canal de fluxo semelhante tendo seções em corte transversal circulares e elípticas. As FIGS. 10A-10D, excepto que o canal de fluxo 318 compreende seções transversais geralmente elípticas e circulares.
[0099] Enquanto uma formação de corrente de núcleo uniforme é benéfica para muitas técnicas de análise, é especialmente útil ao diferenciar diferenças relativamente pequenas de fluorescência de espermatozoides portadores de cromossomos X e espermatozoides portadores de cromossomo Y. Uma característica útil de um triador de espermatozoides seria a formação de uma corrente de núcleo que tem uma forma geralmente de fita, o que pode contribuir tanto para o alinhamento dos espermatozoides como para a orientação dos espermatozoides em um canal de fluxo.
[00100] Voltando agora à FIG. 12A, uma região de foco de fluido 430 é incorporada numa região do canal de fluxo 418 para gerar o fluxo de corrente de núcleo, ou fluxo de revestimento. A corrente de núcleo formando a geometria 400 é ilustrada como uma superfície interior de um canal de fluxo 418 em um chip de micro fluidos 80, tais como os chips de micro fluidos anteriormente descritos. A geometria de formação de corrente de núcleo 400 pode ser fabricada em plástico, policarbonato, vidro, metais ou outros materiais adequados, utilizando micro fabrico, moldagem por injeção, estampagem, maquinação, impressão em 3D ou por outras técnicas de fabrico adequadas. Como tal, a geometria de formação de corrente de núcleo pode ser formada numa única camada, ou por uma pluralidade de camadas empilhadas.
[00101] A geometria ilustrada de corrente de núcleo 400 oferece capacidades melhoradas de fluxo de revestimento e, assim, melhores capacidades de foco. Em particular, as entradas de revestimento 450 podem ser proporcionadas com formas de entrada de ar que são cônicas em cada volume de agregação de revestimento 422. Os volumes de agregação de revestimento podem fornecer uma única saída, ou várias saídas para mais componentes de canal de fluxo 418. Uma única saída está ilustrado, que se estende para dentro do região de foco de fluido 430. Alternativamente, uma única entrada pode ser ramificada para a geometria de formação de corrente de núcleo 400. Para além disso, as restrições de fluxo podem ser colocadas em um ou mais caminhos de fluidos provenientes do volume de agregação do revestimento 422.
[00102] A região de foco de fluido 430 ilustrada compreende um componente de foco de fluido lateral e um componente de foco de fluido vertical, em que ambos contribuem para a aceleração axial do fluido de revestimento e da amostra através do canal de fluxo 418. O componente de fluido de foco lateral ilustrado compreende uma câmara de foco de fluido lateral 420. A câmara de foco de fluido lateral 420 é fornecida com a amostra a partir da entrada da amostra 448, bem como o revestimento de um ou mais orifícios de entrada 450 de revestimento. Tal como ilustrado, as duas entradas de revestimento simétricas 450 enchem a câmara de foco de fluido lateral 420 a partir dos bordos, enquanto que a amostra entra na câmara de foco de fluido lateral 420 a partir do meio. Á medida que a amostra e o revestimento progridem ao longo da câmara de foco de fluido lateral 420 a largura da câmara é reduzida proporcionando uma crescente forçar para dentro a partir dos lados laterais da câmara, que tende a focar a amostra no meio da câmara de foco de fluido lateral 420 e que acelera tanto o revestimento como a amostra no canal de fluxo. O componente de foco de fluido vertical ilustrado compreende um primeiro canal de foco fluido vertical 424 em combinação com a posição da entrada de amostra 448 em relação à câmara de foco de fluido lateral 420. O primeiro canal de foco de fluido vertical 424 pode compreender um canal de circuito que se ramifica fora da câmara de foco de fluido lateral 420 e é colocada em comunicação fluida com a câmara de foco de fluido lateral 420 mais a jusante. Desta maneira, o primeiro canal de foco de fluido vertical 424 proporciona um meio para desviar uma parte do fluxo de revestimento que pode ser reintroduzida no canal de fluxo 418 num ponto mais tarde para focar a posição vertical da corrente de núcleo da amostra.
[00103] A FIG. 12B apresenta uma vista ilustrativa do componente de foco de fluido lateral. Um fluxo da amostra 406 é ilustrado a entrar na câmara de foco lateral 420 a partir da entrada de amostra 448. Enquanto o fluxo de revestimento 408 é ilustrado a entrar na câmara de foco de fluido lateral 420 a partir de cada entrada de revestimento 450 na extremidade da câmara de foco de fluido lateral 420. Como a largura da câmara de foco de fluido lateral diminui, o fluxo de revestimento 408 proporciona uma força de cisalhamento cada vez maior sobre a amostra 406, tanto acelerando o fluxo da amostra, o espaçamento entre as partículas na amostra, e focando lateralmente o fluxo da amostra para o centro da câmara de foco de fluido lateral 420.
[00104] O fluxo vertical da amostra 408 é influenciado por duas características de geometria de formação de corrente de núcleo 400, as quais podem ser melhor vistas na FIG. 13. A FIG. 13 representa uma seção transversal vertical ao longo de um eixo longitudinal da corrente de núcleo formando a geometria 400. Uma primeira influência vertical no sentido descendente sobre a corrente de amostra é criada a partir da entrada lateral da câmara de foco de fluido 420, porque a amostra é introduzida a partir de debaixo da região de foco de fluido lateral 420, de modo a que o seu fluxo ascendente encontre resistência do fluxo de revestimento 408 que está acima. Uma amostra representativa de fluxo 406 é ilustrada a atingir o final da entrada de amostra 448 e movendo-se para cima de encontro a um fluxo de revestimento 408. Uma vez que a corrente de núcleo da amostra 406 atinge o primeiro canal de foco de fluido vertical 424, o fluxo de revestimento 408 dirige a amostra para cima focando a amostra para longe da parte inferior do canal de fluxo 418.
[00105] Uma vez sujeita à região de foco 430, a amostra pode continuar através de uma região de orientação de espermatozoides 330 e de uma região de inspeção 326. Os espermatozoides podem ser orientados de acordo com características específicas na descrição seguinte e uma ação de triagem pode ser realizada de acordo com vários mecanismo descritos anteriormente.
[00106] Voltando à FIG. 14A, uma geometria de formação de corrente de núcleo alternativa 500 é ilustrada e incorpora um região de foco de fluido 530 que inclui uma ferradura dupla ou um circuito duplo na forma de um primeiro e de um segundo canais de foco de fluido verticais. Uma concretização refere-se a uma geometria de formação de corrente de núcleo 500 tendo um primeiro canal de foco de fluido vertical 524 e o segundo canal de foco de fluido vertical 526 configurado para contribuir para que o revestimento de foco de fluido vertical oposto flua para um canal de fluxo 518 para uma formação corrente de núcleo melhorada. A FIG. 14A ilustra uma entrada de amostra 548 posicionada ao mesmo nível vertical que a entrada de revestimento 550 conduzindo para uma câmara de foco de fluido lateral 520. O primeiro canal de foco de fluido vertical 524 se desloca verticalmente acima do canal de foco de fluido lateral 520 e o segundo canal de foco de fluido vertical 526 se desloca verticalmente abaixo do canal de foco de fluido lateral 520. Depois de ter sido submetido às características de focagem da câmara de foco lateral 520, o primeiro canal de foco vertical 524 e segundo canal de foco vertical 526, uma corrente de núcleo mais focada e/ou alinhada pode fluir através do restante do canal de fluxo 560.
[00107] No que se refere à FIG. 14B, o fluxo de revestimento é ilustrado através da entrada de revestimento e dividido em três partes. Um primeiro fluxo de revestimento 554 entra na câmara de foco de fluido lateral 520, e em resposta ao estreitamento da largura tende a focar a amostra no centro do canal de foco de fluido lateral 520. Uma segunda porção de fluxo revestimento 556 é desviada através do primeiro canal de foco de fluido vertical 524 e de uma terceira porção de fluxo de revestimento 558 é dirigida através do segundo canal de foco de fluido vertical 526. Um volume de agregação de revestimento 522 que proporciona uma área da seção transversal maior do que a extremidade da entrada de revestimento 550 proporciona um volume benéfico para a distribuição de taxas relativamente altas de fluxo de revestimento através de cada uma das porções de revestimento. Em especial o fluxo de revestimento aumentado através do primeiro canal de foco vertical 524 e o segundo canal de foco vertical 526 podem proporcionar uma melhor capacidade de focar a posição vertical de uma corrente de núcleo em um canal de fluxo 518.
[00108] Voltando agora à FIG. 15, um corte transversal vertical ao longo de um eixo longitudinal da geometria de formação de corrente de núcleo 500 ilustra uma amostra de corrente de fluxo 506 e um fluido de revestimento 508 introduzido no canal de fluxo 518 substancialmente à mesma posição vertical. O fluxo de revestimento 508 do primeiro canal de foco de fluido vertical 524 fornece uma influência de foco descendente sobre a corrente de núcleo da amostra, seguido por uma influência de foco ascendente a partir do fluido de revestimento fornecido a partir do segundo canal de foco de fluido vertical 526. A porção do canal de fluxo 518 na seqüência do revestimento vertical oposto flui a uma elevada posição vertical relativamente à câmara de foco de fluido lateral 520 e à entrada de amostra 548. A porção do canal de fluxo de 518 na seqüência da região de foco pode então ser manipulada em uma região concebida para conferir orientação às partículas na corrente de núcleo da amostra.
[00109] A FIG. 16 ilustra uma concretização alternativa da geometria de formação de corrente de núcleo 600, que apresenta sensivelmente a mesma seção transversal vertical representada na FIG. 15. Pode haver certas eficiências obtidas em vários aspectos de fluxo revestido, relativamente aos percursos de fluxo de fluido de revestimento ilustrado na FIG. 16. Em um aspecto o fluido de revestimento passa através de cada volume de agregação de revestimento 622 para a entrada focada 632 que imediatamente coloca o fluido de revestimento em uma trajetória para lateralmente focar a corrente de núcleo do fluido de amostra 606. Cada um dos primeiro canal de foco de fluido vertical 624 e segundo canal de foco de fluido vertical, 626 também se unem com uma entrada comum 630.
[00110] A FIG. 17 ilustra uma outra concretização da geometria de formação da corrente de núcleo 700, que tem componentes de fluxo de revestimento simplificados, tais como uma entrada estreita 732 e uma entrada comum 730 ligada diretamente ao volume de agregação de revestimento 722 de cada entrada de revestimento 750. Além disso, a FIG. 17 ilustra uma alternativa de colocação vertical de algumas porções de cada um dos primeiro canal de foco de fluido vertical 724 e do segundo canal de foco de fluido vertical 726. Orientação com um Canal de Fluxo Planar
[00111] Voltando à FIG. 18A, uma concretização de uma geometria de canal de orientação é ilustrada através da qual o canal de fluxo 818 faz a transição para uma altura reduzida, que pode ser geralmente referida como uma geometria de orientação planar 838. Essa geometria de orientação pode abranger tanto uma região de orientação 832 como uma região de inspeção 826. A geometria de orientação planar podem seguir qualquer uma das geometrias ou características de foco de fluido acima descritas tais como qualquer uma das geometrias de formação de corrente de núcleo descritas.
[00112] Antes da geometria do canal de orientação planar 832, o canal de fluxo 818 pode ter uma altura entre cerca de 25 micrômetros e 75 micrômetros e uma largura entre cerca de 100 micrômetros e cerca de 300 micrômetros. A altura "h" antes da geometria de orientação de canal 832 pode ser reduzida para uma segunda altura "h'" ao longo de um comprimento L. A altura reduzida "h'" pode ser de entre cerca de 10 micrômetros e 35 micrômetros para produzir uma corrente de núcleo que se aproxima de 1 até 0,5 micrômetros ao eixo estreito, ou que se aproxime da espessura de uma célula de espermatozoide. A FIG. 18A ilustra uma transição gradual em que o comprimento da transição "L" pode ser de entre cerca de 200 micrômetros e cerca de 5000 micrômetros. Antes da transição o canal de fluxo 818 pode ter uma relação largura altura entre cerca de 4:1 e 5:1, e após a transição a relação largura altura pode ser de cerca de 8:1 e 10:1.
[00113] Imediatamente após a qualquer geometria de foco, o canal de fluxo 818 pode ter uma forma geralmente retangular, ou as arestas adjacentes podem ser arredondadas, resultando em um perfil em forma de "D", visto em corte transversal da FIG. 18B. O perfil de início é indicado em linhas escondidas proporcionando uma comparação entre os dois perfis.
[00114] A FIG. 18C ilustra uma transição súbita mesmo antes da região de inspeção 826, a qual pode ter um comprimento de transição "L" entre cerca de 25 micrômetros e cerca de 200 micrômetros. Numa concretização, pode haver uma re-expansão 842 imediatamente após a região de inspeção 826. A combinação da transição curta e da re-expansão pode proporcionar um sistema que requer menos pressão para dirigir as células, ou que reduz a pressão de retorno do sistema.
[00115] Com referência às FIGS. 19A-19C, uma concretização de um canal de fluxo 918 é fornecida com uma geometria de orientação que imita um bocal de orientação de um fluxo de um citômetro de jato de ar. Em tal concretização, as características de foco de fluido e as características de orientação de espermatozoides podem se sobrepor e, de fato, serem incorporadas numa geometria comum. Um canal de fluxo 918 é proporcionado em comunicação fluida com uma primeira entrada de revestimento 950a e uma segunda entrada de revestimento 950b, cada uma das quais dá entrada numa câmara de orientação 930. A câmara de orientação 930 pode compreender uma área de superfície interna que imita o interior de um bocal. Uma entrada de amostra 948 é alimentada através de um tubo de injeção 910 através de uma saída de tubo de injeção 914 entrando para dentro da câmara de orientação 930. A câmara de orientação 930 pode ter uma seção transversal geralmente elíptica no seu ponto mais a montante, mas também pode ser circular ou retangular. Independentemente da altura da câmara de orientação ela pode ser de cerca de 1000 micrômetros. A superfície interior da câmara de orientação pode fazer a transição de mais de 5000 micrômetros para uma forma geralmente elíptica, ou mesmo um canal em forma de "D" tendo uma altura de 50 micrômetros e uma largura de 200 micrômetros. O tubo de injeção 910, pode se prolongar cerca de 3000 micrômetros, para a câmara de orientação e pode ter uma ou ambas as características internas e externas para fornecer uma corrente de fita de núcleo e partículas de orientação, como os espermatozoides, dentro da corrente de núcleo. Como um exemplo, o tubo de injeção pode ter uma ponta biselada. Como outro exemplo, o tubo de injeção pode ter um canal interno elíptico ou retangular, que termina na saída do tubo de injeção. O tubo de injeção 910 pode ter uma espessura externa de cerca de 300 micrômetros. Como um exemplo não limitativo, o canal interno pode ter uma altura de cerca de 100 micrômetros e uma largura de cerca de 200 micrômetros.
[00116] As várias características a jusante podem ser incorporadas em um canal de fluxo em combinação com qualquer uma das características de orientação ou de focagem previamente discutidas. Tais características podem proporcionar uma força de polarização que tende a orientar partículas ou alinhar as mesmas. Numa concretização, as características do canal a jusante podem ser as principais, ou mesmo as únicas, características de orientação dos espermatozoides em um canal de fluxo. Em tal concretização, as características do canal a jusante proporcionam orientação suficiente para análise e triagem. Numa outra concretização, as características do canal de jusante são utilizados em combinação com outras características de focagem e/ou características de orientação e podem servir para realinhar ou reorientar os espermatozoides que começaram a ficar desalinhados ou não orientados, respectivamente. As características do canal a jusante podem também ser fornecidas imediatamente antes de uma região de inspeção com o objetivo de obter a máxima eficácia na orientação de partículas, tal como as células de espermatozoides.
[00117] Voltando à FIG. 20A, uma característica de canal a jusante está ilustrada sob a forma de uma rampa 1002, a qual pode estar em uma porção de um canal de fluxo 1018. A rampa 1002 pode apresentar uma redução relativamente abrupta na altura do canal de fluxo, como descrito em relação às FIGS. 18A-C. A rampa 1002 pode ser concebida de modo a apresentar um fluxo de núcleo que tem uma espessura apenas ligeiramente maior do que a espessura de uma célula de espermatozoide. Uma rampa 1002 tendo uma inclinação de menos de 45 graus pode ser considerada como uma rampa suave, ao passo que uma rampa tendo uma inclinação de entre 45 graus e 90 graus pode ser considerada uma rampa abrupta.
[00118] A FIG. 20A mostra um exemplo de uma região de excitação 26, a qual se sobrepõe com a característica de canal a jusante. A rampa 1002 é ilustrada em pelo menos duas superfícies no interior do canal de fluxo, e pode terminar pouco depois da região de inspeção 26 a fim de reduzir a contrapressão e para permitir que o fluido flua mais facilmente através do sistema.
[00119] A FIG. 20B proporciona uma característica de canal a jusante, sob a forma de uma rampa 1002 seguida de uma expansão 1004, que pode ser chamada de redutores de velocidade. Estes redutores de velocidade podem ser colocados em série para se focarem numa corrente de núcleo imediatamente antes da região de inspeção, bem como para orientar o fluxo de espermatozoides na corrente de núcleo. Numa concretização, os redutores de velocidade ou a série de redutores de velocidade estão presentes na superfície única do canal de fluxo 18, enquanto noutra concretização os redutores de velocidade ou a série de redutores de velocidade pode estar presente em mais de uma superfície do canal de fluxo 18. Numa concretização relacionada, um único redutor da velocidade pode ter bordos arredondados e pode ser referido como uma ondulação. Do mesmo modo, uma série de redutores da velocidade pode ser referida como uma série de ondulações. Uma ondulação ou uma série de ondulações pode estar presente numa única superfície, ou pode estar presente em várias superfícies em um canal de fluxo 18. Os redutores da velocidade e/ou as ondulações de velocidade pode se prolongar entre cerca de 5 micrômetros e 15 micrômetros para o interior do canal de fluxo 18.
[00120] A FIG. 20C ilustra uma característica de canal a jusante, sob a forma de uma zona de descompressão-compressão 1006, que também pode ser considerada um inverso de um redutor de velocidade. O fluxo é ilustrado a entrar na zona onde se inicialmente dispersa no alargamento do canal. Como o fluxo continua, é comprimido de novo no final abrupto da região alargada. Embora a concretização representada proporcione bordas, as superfícies podem ser lisas resultando em outra concretização das ondulações. Estas características podem se estender entre cerca de 5 micrômetros e 15 micrômetros no canal de fluxo.
[00121] A FIG. 20D ilustra uma série de características em forma de divisa 1008, que podem ser colocadas no canal de fluxo 18. A série de características em forma de divisa 1008 fornecem série de forças que podem tender a focar a corrente de núcleo. As características em forma de divisa 1008 podem compreender uma característica cortada em três lados de um canal de fluxo. Numa concretização as características em forma de divisa 1008 podem ser inclinadas ou apresentar um declive. As características em forma de divisa 1008 podem também possuir arestas arredondadas para submeter a corrente de núcleo a uma série de ondulações. Como os redutores de velocidade reversos, as divisas podem se estender entre cerca de 5 micrômetros e 15 micrômetros para o canal de fluxo 18. Alinhamento/Orientação dos Espermatozoides com Imans
[00122] Voltando à FIG. 21A, uma concretização de características de orientação de espermatozoides são descritas como um primeiro ímã 192A e um segundo ímã 192B que são utilizados para fornecer um campo magnético B para a orientação desejada de células de espermatozoides. O primeiro ímã 192A pode estar localizado numa posição vertical acima de um canal de fluxo e o segundo ímã 192B pode estar localizado em paralelo abaixo do canal de fluxo para produzir um campo magnético estático B que atua sobre os espermatozoides se movendo através do canal de fluxo. Os ímãs podem ser colocados em outras orientações desde que o campo magnético seja perpendicular às células de espermatozoides, que mostraram se alinhar com a sua dimensão planar perpendicular ao campo aplicado. Em certas concretizações, pode ser desejável para produzir um campo magnético suficientemente forte para orientar os espermatozoides em até 512 canais. Uma ou mais séries de ímãs podem ser utilizados em combinação para produzir este campo magnético estático. Numa concretização não limitativa, os imans 192 pode ser dispostos de modo a gerar um campo entre cerca de 0,05 Tesla a cerca de 1,0 Tesla. Alinhamento/orientação de Espermatozoides com Transdutores
[00123] Numa concretização alternativa, um transdutor ou uma série de transdutores podem ser colocados em um ou mais canais de fluxo no exterior de um chip de micro fluido. Um exemplo de um transdutor pode ser um transdutor piezoelétrico que tem uma superfície geralmente planar 194 em contato com uma superfície exterior do chip de micro fluido. Os referidos transdutores podem ser acionados para produzir uma onda estacionária no canal de fluxo. Os espermatozoides podem ser conduzidos para os nodos e antinodos da onda estacionária resultando tanto em um alinhamento e possível orientação dos espermatozoides no canal de fluxo.
[00124] Em algumas concretizações, uma onda estacionária pode ser produzida com um transdutor planar em adição a outras características de orientação ou de alinhamento. Por exemplo, a uma onda estacionária pode ser produzida no canal de fluxo para efeitos de alinhamento e espaçamento de espermatozoides, enquanto um campo magnético pode ser aplicado ao canal de fluxo para orientar os espermatozoides. Como um exemplo não limitativo, foi surpreendentemente descoberto um transdutor planar que opera entre 10-16MHz plaina o qual pode melhorar a orientação dos espermatozoides, enquanto fluem em um canal de fluxo.
[00125] Independentemente das características de orientação e de foco empregues em cada canal fluxo uma grande quantidade de precisão é necessária para iluminar os espermatozoides e detectar a radiação eletromagnética emitida ou refletida a partir dos espermatozoides iluminados. Os espermatozoides são células vivas, móveis, que podem propulsionadas ser de forma irregular pelo movimento da sua cauda. Como tal, mesmo com grande cuidado no alinhamento e orientação de espermatozoides em um canal de fluxo, existe sempre a possibilidade de um número de espermatozoides se tornar não orientado ou resistir às forças de orientação completamente. Esforços anteriores podem ter considerado a possibilidade de iluminar o espermatozoide de frente, ou a partir de todos os lados. No entanto, tais configurações não são aplicáveis para vários canais de fluxo em um único chip pois cada canal requer uma quantidade considerável de espaço tanto para os sistemas ópticos de recolha e como de iluminação, incluindo a superfície refletora e/ou lentes de refração.
[00126] Nos citômetros de fluxo de jato de ar anteriores, cada bocal ou corrente tende a ser monitorado separadamente em relação a características de desempenho e triagem. No entanto, num chip de micro fluido com de 4 até 512 canais de fluxo é desejável reunir certos dados para agregar certos dados para finalidades de apresentação e de seguimento de dados. Como a variação da fluorescência produzida nos espermatozoides corados é mínima, as variações na iluminação de cada um dos canais de fluxo devem ser reduzidas ou eliminadas. Um sistema como o descrito na Patente US 7,492,522, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência, pode ser empregue para proporcionar uma iluminação uniforme através de uma pluralidade de canais de fluxo 18.
[00127] Referindo brevemente de novo à FIG. 1, uma fonte de radiação eletromagnética 30 é ilustrada, a qual pode ser um laser de onda semi- contínua, tal como um Vanguard 355-350 ou um laser de modelo Vanguard 355-2500 disponível na Newport Spectra Physics (Irvine, CA). A radiação eletromagnética 46 emitida pela fonte de radiação eletromagnética 30 podem ser manipuladas por moldagem óptica do feixe 40 e/ou por um dispositivo de divisão de feixe 74 no espaço livre para produzir um ou mais feixe(s) manipulado(s) 44, por vezes referidos como segmentos de feixe ou pequenos feixes. Estes pequenos feixes podem assumir a forma de um ou mais feixes alterados para fornecer intensidade, potência e/ou geometria uniformes a uma pluralidade de canais de fluxo.
[00128] Uma configuração para atingir segmentos de feixe uniformes pode incluir óptica de modelação de feixes 40 no espaço livre para moldar a radiação eletromagnética da fonte de radiação eletromagnética 30 em um perfil altamente uniforme em um ou mais eixos, tais como um perfil de feixe com forma de "chapéu alto" ou "tipo plano". Como um exemplo, o perfil de feixe pode ter uma intensidade uniforme em um ou mais eixos ou pode ter uma distribuição de intensidade de Gauss em um ou mais eixos. Numa concretização um perfil de feixe com forma de chapéu alto pode ser dividido em vários segmentos de feixe de acordo com o número de canais de fluxo no chip de micro fluido. Um espelho segmentado, ou outro dispositivo para separar espacialmente segmentos do feixe, podem seguir as iniciais óptica modelar para projectar feixes múltiplos segmentos de viga sobre os canais de fluxo do chip de fluído. Os segmentos de feixe resultantes podem ser substancialmente paralelos e estar espaçados de acordo com o espaçamento dos canais de fluxo.
[00129] Numa concretização alternativa, a óptica de perfil de feixe pode proporcionar o feixe com um perfil de intensidade final de feixe, e a intensidade final de feixe pode ser subseqüentemente dividida por espelhos de divisão de feixes ou por outros dispositivos de divisão de feixe óptico adequados, em feixes múltiplos, ou segmentos de feixe, com dimensões uniformes . Como um exemplo, uma disposição espelhos de divisão de feixe, tais como uma micro disposição de espelhos de divisão de feixe pode ser empregue. Em um chip que se aproxima de 256 a 512 canais de fluxo, uma combinação de elementos de divisão de feixe pode ser usada. Por exemplo, um feixe pode ser dividido em vários segmentos de feixe, por exemplo de quatro a oito, por espelhos de divisão de feixe convencionais de tal modo que o perfil do feixe original é mantido em cada segmento de feixe a uma fracção da intensidade do feixe inicial. Cada segmento de feixe, uma vez que assim formado, pode ser dividido por um espelho segmentado para iluminar cada canal de fluxo no chip de micro fluído.
[00130] Além disso, numa concretização alternativa, elementos de bloqueio e mascaramento podem ser colocados no percurso de feixe de cada segmento de feixe. Os elementos de bloqueio ou de mascaramento podem ser únicos para cada percurso de fluxo, ou podem ter uma forma para ajudar a determinar informações específicas sobre a velocidade das partículas no trajeto de fluxo, o alinhamento das partículas no trajeto de fluxo, ou mesmo a orientação de partículas no trajeto de fluxo. Tais elementos podem estar localizados no espaço livre ou podem ser incorporados no substrato de um chip de micro fluido 80.
[00131] Referindo-nos agora à FIG. 22, um exemplo de óptica de captação 54, ou uma parte da óptica de captação, é ilustrado para utilização em vários sistemas aqui descritos. Um feixe representativo manipulado de radiação eletromagnética 44 pode ser incidente sobre a zona de inspeção 26 do chip de micro fluido 80 numa direção normal ao canal de fluxo. A radiação eletromagnética emitas 52 sob a forma de fluorescência para a frente são ilustradas emanando da partícula, a qual pode ser uma célula espermática 12.
[00132] A óptica de captação 54 pode ser colocada no percurso do feixe da radiação eletromagnética manipuladas, ou na posição a 0 graus em relação ao feixe de excitação 44. A óptica de captação 54 pode incluir uma lente de captação de alta abertura numérica 126 para recolhimento focada de luz refletida e/ou emitida na região de inspeção 26 de cada canal de fluxo 18. Uma lente de objectiva 140, ou múltiplas lentes de objectiva, podem focar a luz emitida recolhida e/ou reflectida sobre um plano da imagem 182, que incide sobre uma superfície de montagem de um conjunto de cabos de fibra óptica 188 com um cabo de fibra óptica 186 configurado para uma região de inspeção 26 de cada canal de fluxo 18. Numa concretização, a lente objectiva 140 pode compreender uma grande lente objectiva ou uma série de lentes capazes de emissões de fluorescência a partir de uma grande área do chip em uma pluralidade de detectores respectivos, ou fibras em comunicação com detectores. Como um exemplo não limitativo, a óptica de captação 54 pode compreender uma grande área, sistema óptico de baixo número f configurado para recolher a partir de uma área tendo um comprimento ou largura de entre cerca de 25 mm e 75 mm, e tendo um número f dentro de um intervalo de cerca de 0.9 a 1.2 e configurado para uma distância de trabalho de cerca de 10 mm e 30 mm. Alternativamente, uma ou mais micro lentes ou conjuntos de micro lentes também poderiam ser utilizados para recolher a fluorescência emitida a partir de vários canais de fluxo.
[00133] A FIG. 23 ilustra uma disposição óptica 190, tal como um conjunto de cabos de fibra óptica que podem ser usados para capturar a fluorescência frontal ou lateral a partir de uma série de canais de fluxo paralelos 18 em um chip de micro fluido 80. T al disposição óptica pode ser utilizada para recolhimento de fluorescência lateral para além da ópticas de recolha da FIG. 22. Em alternativa, a disposição óptica 190 pode ser posicionada na posição de frontal, ou a 0 graus, para recolhimento direta de fluorescência frontal a partir de cada canal de fluxo 18. Em uma concretização ilustrativa, cada primeiro detector no conjunto de primeiros detectores e de segundo detector em um conjunto de segundos detectores podem ser detectores de fluorescência laterais. Em operações de triagem de espermatozoides, estes detectores podem funcionar para determinar quando os espermatozoides ou não estão orientados, se estão não orientados devido à rotação, ou, devido à inclinação.
[00134] A FIG. 24A mostra um exemplo de um esquema de detecção que incorpora a óptica de captação 54 para a detecção de fluorescência anterior para além de um primeiro detector lateral 176 que recolhe a fluorescência lateral a um ângulo de cerca de 45 graus e um segundo detector lateral 178 recolhendo fluorescência lateral a 45 graus na direção oposta. O primeiro detector lateral 176 e o segundo detector lateral 178 podem ser caracterizados como tendo um ângulo de 90 graus entre o eixo óptico de cada um.
[00135] Além disso o esquema do sistema de detecção representado na FIG. 24A, FIGS. 24A-E, fornece várias orientações de espermatozoides dentro de um canal de fluxo 18, para além dos pulsos de forma de onda que podem ser gerados por cada um dos detectores anteriores 54, o primeiro detector lateral 176 e o segundo detector lateral 178 associado com a região de inspeção 26 de cada canal de fluxo. Estes pulsos de forma de onda podem ser determinados no analisador, e as características ou particularidades dos pulsos da forma de onda podem ser calculadas para uso em lógica de triagem aplicada pelo analisador 58. Geralmente, deve ser apreciado que um detector com um eixo óptico normal à superfície plana em forma de pá do espermatozoide irá fornecer o sinal máximo possível, enquanto que um detector com um eixo óptico que é paralelo à superfície planar deve estar efetivamente virado para o bordo estreito de uma cabeça de espermatozoides e pode gerar um sinal signifícativamente mais baixo.
[00136] A FIG. 24A mostra um exemplo de uma célula de espermatozoide 12 em um canal de fluxo sem rotação ou inclinação, permitindo que o sinal de fluorescência anterior capture uma altura de pulso máxima e a área de pulso para comparação direta com outros pulsos da forma de onda que representam outras células de espermatozoides. Os pulsos em forma de onda gerados pelo primeiro detector lateral 176 e pelo segundo detector lateral 178 podem ser vistos como substancialmente semelhantes entre si.
[00137] Voltando à FIG. 24B uma célula de espermatozoide inclinada 12 tem uma inclinação de cerca de 45 graus para baixo, apresentando o primeiro detector lateral 176 dentro de uma fluorescência normal e apresentando o segundo detector lateral 178 com o bordo do espermatozoide. Sob certas circunstâncias, o bordo do espermatozoide pode fluorescer de um modo muito brilhante, mas muito mais rapidamente que o que faria em outras orientações. O pulso em forma de onda produzido pelo primeiro detector lateral 176 terá uma altura de pico, uma área do pico, e uma largura de pico que podem ser comparadas com o pulso em forma de onda produzido pelo segundo detector lateral 178, assim como o pulso em forma de onda produzido a partir do detector frontal 54.
[00138] Da mesma forma, a FIG. 24C fornece um exemplo de uma cabeça de espermatozoide, que é inclinada para cima em 45 graus apresentando o primeiro detector lateral 176 com uma fluorescência e o segundo detector lateral 178 com uma fluorescência normal. Novamente uma diferença significativa podem existir na altura de pulso, na largura de pulso e na área de pulso dos pulsos de forma de onda resultantes dos detectores laterais. Assim, os parâmetros de forma de onda de pulsos medidos podem ser analisados para determinar quando as células de espermatozoide são inclinadas durante a detecção. As diferenças na altura, área, largura, da forma de onda de pulso podem ser comparadas para determinar as disparidades. Quando as disparidades excedem um limiar, pode ser determinado que uma célula de espermatozoide não foi bem alinhada para diferenciar com precisão suficiente a presença de espermatozoides portadores de cromossomo X ou os espermatozoides portadores do cromossomo Y. Parâmetros adicionais podem também ser determinadas para comparação, tal como uma inclinação de pulso, o tempo de subida e a área interior do pulso.
[00139] A FIG. 24D ilustra uma célula de espermatozoide, que está inclinada em 90 graus. Neste caso, os pulsos de forma de onda produzidos pelo primeiro detector lateral e pelo segundo detector lateral podem ser muito semelhantes. O pulso em forma de onda produzido pelo detector anterior deve variar drasticamente, por exemplo, a largura de pulso, o tempo de subida e a área pode ser distinguíveis dos espermatozoides numa orientação adequada.
[00140] A FIG. 24E ilustra uma célula de espermatozoide, que é rodada em torno do seu eixo longitudinal. A curvatura de uma cabeça de espermatozoide pode fornecer ao primeiro detector lateral e ao segundo detector lateral sinais semelhantes, mas um desfasamento ou atraso pode existir entre os tempos de cada um dos picos de forma de onda. Portanto, um tempo de subida, declive ou desfasamento de pico podem ser calculados entre os dois sinais para determinar quando as células.
[00141] Em muitas concretizações aqui descritas características e geometrias são empregues que tentam orientar os espermatozoides tanto para a inclinação como para a rotação. No entanto, alguma porcentagem de espermatozoides irá deixar de ficar orientados independentemente. Apesar das características de orientação descritas, alguns espermatozoides podem ser enviados para um estado oscilante dentro do canal de fluxo. Tais espermatozoides podem apresentar uma alta propensão para se tornarem não orientados em termos de inclinação e de rotação. Portanto, enquanto a própria rotação pode ser mais difícil de detectar em um chip de micro fluido, quaisquer dos meios descritos para a detecção de inclinação podem também ajudar na eliminação de espermatozoides de rodados a partir da saída para triagem por sexo.
[00142] Como pode ser facilmente entendido a partir do acima exposto, um verdadeiro valor de fluorescência lateral, ou alternativamente dispersão lateral, não foi anteriormente medido em vários canais de fluxo de um chip de micro fluido. No campo da triagem de espermatozoides, tal fluorescência lateral medida iria proporcionar informações valiosas em relação à orientação dos espermatozoides.
[00143] A FIG. 25A ilustra uma configuração de um chip de micro fluidos 1080 proporcionando a capacidade de medir tanto a fluorescência frontal 1052 como uma fluorescência lateral 1058 em um canal de fluxo 1018, ou em cada um dos vários canais de fluxo. Uma vista em corte transversal de uma porção de um chip de micro fluido 1080 é fornecida em que o fluxo no canal de fluxo 1018 pode ser entendido como sendo na direção para fora. As dimensões do canal de fluxo 1018 podem ser exageradas para maior clareza.
[00144] Um elemento refletor, sob a forma de uma superfície refletora 1010 pode ser associado com cada canal de fluxo 1018, com a finalidade de refletir uma fluorescência lateral 1058, ou a dispersão lateral, para uma posição em que possa ser detectada. Deve ser apreciado que um elemento de refração pode ser utilizado em lugar da, ou em combinação com a, superfície refletora 1010. Como um exemplo, o substrato de chip de micro fluido pode ser construído a partir de vários materiais tendo diferentes índices de refração para alcançar uma reflexão e/ou refração desejada da luz no trajeto particular, tal como fluorescência frontal ou a fluorescência lateral. Numa concretização, uma superfície refletora 1010a está associada com o canal de fluxo 1018a por colocação substancialmente em paralelo ao longo da zona de inspeção do canal de fluxo 1018a a um ângulo de cerca de 45 graus. Uma fluorescência lateral 1058a é ilustrada emitindo a partir de uma célula de espermatozoide 1012 sendo excitada com radiação eletromagnética 1044a. A fluorescência lateral se desloca até atingir a superfície refletora 1010a, altura em que a fluorescência lateral é redirecionada para ser substancialmente paralela com o sinal de fluorescência frontal 1052a. Como pode ser facilmente entendido, as superfícies refletoras 1010 podem ser proporcionadas em outros ângulos para recolhimento de fluorescência lateral de maneira que não seja em paralelo com a fluorescência frontal 1052.
[00145] O sistema descrito pode incluir a óptica de captação 54, como a anteriormente descrita, incluindo uma lente de captação grande, única, pelo que cada uma de entre a fluorescência frontal e a fluorescência lateral são projectadas sobre um plano de imagem coincidente com cabos de fibras está em comunicação com um detector de fluorescência. O detector de fluorescência lateral pode ser substancialmente idêntico ao detector de fluorescência frontal, a única diferença pode estar na execução de instruções armazenadas no analisador 58. Alternativamente, os esquemas de detecção como os representados nas FIGS. 26A-D também podem ser utilizados.
[00146] Um segundo canal de fluxo 1018b é ilustrado produzindo uma segunda fluorescência frontal 1052b e uma segunda fluorescência lateral 1058b, no entanto, uma tal concretização pode incluir entre 4 e 512 canais de fluxo. Numa concretização, cada conjunto de canais de fluxo 1018 e a sua superfície refletora associada 1010 podem ser separados dos outros conjuntos por um elemento de bloqueio 1026 que impede a diafonia entre os canais de fluxo 1018.
[00147] A FIG. 25B ilustra uma variação da superfície refletora 1110, que é formada por corte de uma porção do substrato que forma o chip de micro fluido 1180. A porção cortada 1112 pode ter uma superfície proximal 1114 e uma superfície distal 1116 em relação ao canal de fluxo 1118. A superfície proximal pode compreende a superfície refletora associada com o canal de fluxo 1118, e pode ser capaz de reflexão interna total até uma diferença no índice de refração. Tal como a figura anterior, um elemento de bloqueio pode, opcionalmente, ser adicionado entre cada conjunto de canais e a sua superfície refletora associada.
[00148] Voltando à FIG. 25C, cada canal de fluxo 1218 está associado a uma primeira superfície refletora 1220 e uma segunda superfície refletora 1222. Cada superfície refletora pode ser fornecida a cerca de 45 graus, proporcionando assim uma fluorescência lateral -90 1254 e uma fluorescência lateral +90 1256 em paralelo com a fluorescência frontal 1252. Tal como a Figura anterior, uma diferença no índice de refração dos materiais proporciona uma superfície refletora interna total produzindo assim uma fluorescência frontal e dois trajetos de luz de fluorescência lateral em resposta a partículas excitadas com radiação eletromagnética 1244. Uma tal concretização pode exigir um elemento de bloqueio para impedir a diafonia entre canais.
[00149] A FIG. 25D ilustra uma concretização onde a superfície refletora interna é fornecida em uma ou mais paredes laterais do próprio canal de fluxo 1318. O primeiro canal de fluxo 1318a é ilustrado com uma primeira parede lateral refletora 1320a e uma segunda parede lateral refletora 1322a. No entanto, deve ser apreciado, que o chip de micro fluido pode ser fabricado de modo a que apenas a primeira parede lateral tenha propriedades refletoras. Alternativamente, ambas as paredes laterais podem ter propriedades de reflexão, mas um sistema de detecção que pode ser empregue que detete apenas uma da fluorescência lateral +90 ou da fluorescência lateral -90. Em qualquer dos casos, um elemento de bloqueio 1326 pode ser incorporado entre os canais de fluxo, a fim de evitar a diafonia entre os canais. Numa concretização, as propriedades de refração dos vários substratos de chip podem ser alteradas em diferentes locais no chip para obter a reflexão e/ou a refração desejadas. Por exemplo, uma camada do meio do substrato, a qual coincide com as superfícies 1320 e 1322 pode compreender um material que tem um índice de refração diferente, em comparação com uma camada superior e inferior do substrato.
[00150] Vários sistemas de detecção podem ser utilizados para detectar a fluorescência frontal paralela e a fluorescência lateral produzida pelos chips das FIGS. 25A-D. Numa concretização, uma única lente grande de recolha é incorporada para a focagem de cada uma num plano de imagem incidente a um conjunto de fibras ópticas previamente descrito. Uma tal concretização pode exigir o dobro dos detectores.
[00151] Um sistema de detecção alternativo para recolhimento de uma fluorescência frontal 1452 e uma fluorescência lateral 1456 a partir de cada canal 1418 está representado na FIG. 26A. O chip de micro fluido 1480 produzido inclui uma superfície refletora 1410 associada a cada canal de fluxo 1418, que fornece um trajeto de luz frontal e um trajeto de luz lateral em resposta a uma excitação de radiação eletromagnética 1444. Um conjunto de lentes 1430, tal como um conjunto de micro lentes, pode ser alinhado com o chip de micro fluido 1480 para recolhimento de luz a partir de cada um dos trajetos de luz frontal e lateral. O conjunto de micro lentes 1430 pode incluir uma lente de captação frontal 1440a e uma lente de captação lateral 1442a para o primeiro canal de fluxo 1418a. Cada lente de captação frontal 1440 e cada lente de captação lateral 1442 pode ser configurada para focar a radiação eletromagnética recolhidas, quer seja fluorescência ou dispersão, para um detector frontal 1446a e um detector lateral 1448a, respectivamente. Alternativamente, o conjunto de lentes 1430 foca a eletromagnética recolhida numa disposição de cabos de fibra óptica em comunicação com detectores individuais.
[00152] A FIG. 26B ilustra uma concretização alternativa, incluindo um conjunto de fibra 1520, similar ao conjunto representado na FIG. 23, que incorpora o dobro do número de cabos de fibras para recolhimento de uma fluorescência frontal 1552 e de uma fluorescência lateral 1558 produzida por uma excitação da radiação eletromagnética 1544 e uma superfície refletora 1510 associada com cada canal de fluxo 1518. Da mesma forma, a FIG. 26C fornece um conjunto de detector 1650 em estreita proximidade com o chip de micro fluido 1680, em que cada canal de fluxo 1618 tem uma superfície refletora associada 1610, de modo que cada excitação da radiação eletromagnética 1644 pode produzir uma fluorescência frontal e lateral. Um detector frontal 1646 e um detector lateral 1684 são fornecidos no conjunto de detector 1650 para cada canal de fluxo 1618.
[00153] Numa concretização alternativa, os detectores, ou um conjunto de fibras, podem ser colocados numa relação de epi-iluminação com o feixe de excitação. A FIG. 26D ilustra um chip de micro fluido 1780, tendo um canal de fluxo 1718 e uma superfície refletora associada 1710 angulada para refletir a fluorescência lateral, ou a dispersão, na direção a partir da qual o feixe de excitação foi recebido em que pode ser recebido por um detector lateral 1748, ou um cabo de fibra em comunicação com um detector lateral 1748. Um espelho dicróico 1726 pode ser colocado em cada um dos canais para dirigir um feixe de excitação 1744 em direção ao canal de fluxo 1718, enquanto que a fluorescência emitida a partir da célula na direção posterior 1758 pode passar através do espelho dicróico 1726 para um detector posterior 1746, ou um cabo de fibra em comunicação com um detector posterior 1746. O exemplo descrito proporciona uma superfície refletora interna 1710, que pode dirigir uma fluorescência lateral 1756 para o detector lateral.
[00154] Podem ser facilmente vistas várias soluções potenciais para a questão da orientação dos espermatozoides em uma pluralidade de canais de fluxo paralelos em um chip que podem adicionar níveis de complexidade à geometria do canal, à óptica de captação, e/ou à configuração de detector necessária.
[00155] Voltando à FIG. 27, existe uma solução de potencial através do qual os detectores adicionais podem ser eliminados através da inclusão de máscaras, ou de um elemento de bloqueio de transmissão parcial. Em particular, uma primeira máscara de detecção 1820 e uma segunda máscara de detecção 1830 podem ser colocadas no trajeto da fluorescência frontal 1852 e da fluorescência lateral 1856, respectivamente. Cada máscara pode ser colocada no espaço livre, pode ser acoplada ao substrato do chip, ou pode ser acoplada a um outro elemento óptico no trajeto da fluorescência. O trajeto óptico através da primeira máscara detecção 1820 e através da segunda máscara detecção 1830 pode, em última análise chegar ao mesmo detector 1840, o que por sua vez produz uma forma de onda de pulso que representa a informação a partir tanto da fluorescência frontal como da fluorescência lateral. As máscaras podem ser configuradas, para transmissão mutuamente exclusiva, de modo que a forma de onda de pulso gerada pelo detector inclui segmentos diretamente atribuídos à fluorescência frontal e porções e segmentos diretamente atribuídos à fluorescência lateral. Alternativamente, a primeira máscara de detecção 1820 e a segunda máscara de detecção 1830 podem se sobrepor em certa medida, sem indevidamente causar erros nas medidas uma vez que um analisador pode ser utilizado para deconvoluir sinais.
[00156] Um analisador pode deconvoluir cada sinal a partir do pulso simples de forma de onda, proporcionando deste modo informações sobre a fluorescência frontal e a fluorescência lateral a partir de um único detector. Alternativamente, máscaras mais complexas podem ser incorporadas em cada trajeto de luz e o detector pode receber sinais a partir de mais do que um canal de fluxo, em que cada canal de fluxo compreende um padrão único de assinatura em cada máscara associada.
[00157] A FIG. 28A proporciona uma outra concretização de um esquema de detecção que pode ser incorporado com várias outras características aqui descritas. O esquema de detecção ilustrado elimina completamente a necessidade de detecção de fluorescência lateral e pode ser incorporado com cada um de entre 4 e 512 em canais de fluxo de um chip de micro fluido 1980. A célula de espermatozoide 1912 é ilustrada na região a inspeção de um canal de fluxo 1918, sendo interrogada por um feixe de radiação eletromagnética 1944. O feixe de excitação e uma fluorescência frontal levam a cabo no trajeto do feixe de excitação através do chip de micro fluido 1980 e encontram um espelho dicróico 1924 podem refletir um dos dois, uma vez que estão, cada um, num comprimento de onda diferente. Como um exemplo, a radiação eletromagnética 1944 podem ser produzidas por um laser operado a um comprimento de onda de UV e podem passar através do espelho dicróico 1924 e para um detector de absorção/extinção 1962. A porção transmitida da radiação eletromagnética 1960 pode ser utilizada para uma variedade de fins. O detector de absorção/extinção 1962 pode ser configurado para controlar eficazmente o canal de fluxo para detectar a presença de células, quando uma das células passa através do feixe de excitação 1944, a intensidade da porção transmitida 1960 que é recebida pelo detector de absorção/extinção 1962 é grandemente reduzida. Para além da mera presença de uma célula, a quantidade pela qual a fluorescência é extinta pode proporcionar uma medida quantificável para determinar se uma célula de espermatozoide que passa se encontra numa orientação desejada.
[00158] Ao mesmo tempo, uma fluorescência frontal reflectida 1952 é incidente sobre um detector de fluorescência frontal 1946, o qual pode ser utilizado para medir o teor de DNA das células de espermatozoide que passam 1912. A FIG. 28B ilustra um sinal representativo produzido por um detector de extinção/absorção. Uma linha de base 1940 pode ser vista e que indica que a potência máxima da porção transmitida 1960 do feixe de excitação é incidente sobre o detector de absorção/extinção 1962. Deve notar-se que o detector de absorção/extinção 1962, ou óptica no trajeto da luz que conduz ao detector, pode incluir um filtro de densidade neutra, ou algum outro dispositivo óptico para reduzir a potência do laser real visto pelo detector de absorção/extinção 1962. Em qualquer dos casos, uma linha de base é estabelecida que reflete o tempo em que nenhuns espermatozoides estão a passar através do feixe de excitação. Um pulso de forma de onda 1950 pode ser visto o qual representa uma célula de espermatozoide orientada passando pelo feixe seguida por um pulso de forma de onda menos pronunciado representativo de uma célula de espermatozoide não orientada 1960.
[00159] Características de forma de onda dos sinais produzidos pelo detector de extinção 1962 podem ser calculadas a fim de determinar que pulsos caracterizam as células de espermatozoides orientadas e que pulsos caracterizam as células de espermatozoides não orientadas . Pico de pulsos, área de pulsos, ou mesmo numa área interior de pulsos, que podem representar a alguma fracção de área de pulsos centrada em torno do pico de pulsos, podem, individualmente ou em combinação, proporcionar uma determinação da orientação dos espermatozoides.
[00160] A FIG. 28B ilustra também um sinal de fluorescência a partir do detector 1946, o sinal é ilustrado com uma primeira forma de onda de pulso 1970 correspondente à célula de espermatozoide orientada e uma segunda forma de onda de pulso 1980 correspondente à célula de espermatozoide não orientada. Quando uma célula de espermatozoide é determinada para ser orientada de acordo com o sinal de extinção, o sinal de fluorescência pode então ser analisada para a área de pico de pulso, a área de pulso, e/ou as características de forma de onda, a fim de quantificar a quantidade relativa de DNA nas células de espermatozoide para a determinação da presença de um cromossomo X ou de um cromossomo Y.
[00161] A FIG. 29A-D ilustra uma outra configuração potencial, que elimina tanto a necessidade de detecção de fluorescência lateral como a necessidade de um segundo detector. A FIG. 29A descreve geralmente uma vista em corte vertical de um chip de micro fluido 2080, que tem um canal de fluxo 2018 em que um feixe de excitação 2044 está esquematicamente ilustrado fazendo com que os espermatozoides produzam fluorescência frontal 2052 que passa através de uma máscara 2020 e para um detector 2054.
[00162] Uma vista de cima do chip de micro fluido ilustrado na FIG. 29B ilustra duas regiões distintas na máscara 2020. Uma célula de espermatozoides orientada 2012 é retratada em deslocação através do canal de fluxo 2018 a caminho da máscara 2020. Os sinais produzidos por cada região distinta da máscara passam através do mesmo detector 2054 e podem fornecer uma série de pulsos de forma de onda. O sinal gerado pelo detector, nesta janela 2054 pode ser visto na FIG. 29B para o caso do espermatozoide orientado 2014 e do espermatozoide não orientado 2016.
[00163] A primeira região de máscara 2022 pode ser a porção de medição do teor de DNA da máscara 2020 e pode compreender uma única abertura 2030 que é pelo menos tão larga como os espermatozoides a serem medidos, e pelo menos tão longa como a cabeça do espermatozoide. A altura de pico e a área de pico podem ser determinadas a partir da primeira forma de onda de pulso 2002A, a fim de diferenciar os espermatozoides portadores de cromossomo X dos espermatozoides portadores de cromossomo Y, enquanto que a primeira forma de onda de pulso 2002B do espermatozoide não orientado 2016, pode ser excluída da classificação de acordo com uma lógica de triagem.
[00164] A segunda região de máscara 2024 pode compreender várias aberturas. Numa concretização, vários pares espaçados de aberturas pode ser localizados seqüencialmente ao longo do trajeto de fluxo 2018. Cada par de aberturas pode ter uma posição transversal diferente, embora também possa haver alguma sobreposição. Numa concretização, a abertura espaçada pode ter uma largura de 1 a 10 micrômetros, embora também possam ser utilizadas larguras menores e maiores. O primeiro par de aberturas espaçadas 2026 é ilustrado como o mais afastado. Por conseguinte, os espermatozoides orientados 2014 tendem a apresentar uma fluorescência suficientemente boa através de ambas as aberturas para produzir uma segunda forma de onda de pulso 2004A, enquanto os espermatozoides não orientados 2016 podem produzir um pulso com metade da intensidade, mas provavelmente não irão produzir qualquer forma de onda de pulso.
[00165] Um segundo par de aberturas 2028 é ilustrado um pouco mais a jusante e com um menor espaçamento entre si. Os espermatozoides orientados 2014 irão fluorescer através de ambas as aberturas na máscara para produzir uma terceira forma de onda de pulso 2006A. Dependendo do grau de má orientação, um espermatozoide não orientado 2016 pode produzir alguma fluorescência nesta porção da máscara, mas o exemplo ilustrativo proporciona um bordo para o detector, e ainda sem qualquer forma de onda de pulso ser gerada. Uma abertura final 2032 na segunda região 2024 é ilustrada no centro do trajeto do fluxo de 2018. Mais uma vez, os espermatozoides orientados 2014 podem produzir uma quarta forma de onda de pulso 2008A. Mesmo os espermatozoides não orientados 2016 apresentam um bordo de frente para a máscara que pode produzir uma quarta forma de onda de pulso 2008B.
[00166] O detector é proporcionado em comunicação com um analisador que pode decifrar a presença ou a ausência dos segundo, terceiro e quarto pulsos da forma de onda, a fim de determinar se uma célula de espermatozoide foi orientada quando tiver passado através da região de inspeção. Num sistema digital, uma vez que a determinação da orientação tenha sido feita, a área de pulso e/ou o pico de pulso da primeira forma de onda de pulso pode ser avaliada e uma determinação sobre as características de sexo pode ser feita.
[00167] A FIG. 29D fornece uma disposição alternativa para a segunda região de máscara 2024', sob a forma de fendas que se deslocam progressivamente no padrão transversal ao longo do trajeto de fluxo. Deve notar-se qualquer número de outras configurações similares pode ser incorporado na segunda região de máscara 2024'. Em uma configuração não emparelhada, o número de pulsos de forma de onda, pode proporcionar uma indicação de se um espermatozoide está orientado e quanto não orientado ele pode estar. Pode ser entendido que qualquer número de padrões pode ser empregue, contanto que haja algumas diferenças na posição transversal das aberturas, ou fendas.
[00168] Como pode ser entendido pelo exposto acima, as características descritas para a focagem de uma corrente de núcleo, ou o alinhamento dos espermatozoides num canal de fluxo, podem ser combinadas com várias características para orientar os espermatozoides, bem como com diferentes características para detectar a orientação dos espermatozoides, e mesmo com outras características para focar uma corrente de núcleo. Do mesmo modo, uma ou mais das características de orientação descritas podem ser empregues em um único canal de fluxo para a finalidade de orientar os espermatozoides. Os peritos na arte reconhecerão que o invento acima descrito inclui vários aspectos inventivos, que podem ser fornecidos em qualquer combinação e inclui, pelo menos, o seguinte.
[00169] A1. Um sistema de triagem de espermatozoides que compreende: uma fonte de amostra; um substrato; pelo menos um canal de escoamento formada no substrato, o canal de fluxo tendo uma entrada em comunicação fluida com a fonte de amostra, o canal de fluxo, que compreende ainda uma zona de inspeção, uma primeira saída, e segunda saída; pelo menos, um mecanismo de desvio em comunicação com cada um dos, pelo menos, uma canais de escoamento para desviar seletivamente o espermatozoides em que o pelo menos um canal de fluxo para longe da primeira saída; uma fonte de radiação eletromagnética para iluminar espermatozoides na região da inspeção; um detector alinhado para medir as características de espermatozoides na região de inspeção do pelo menos um canal de fluxo; um analisador em comunicação com o detector para determinar as características do espermatozoides; um controlador em comunicação com o analisador para ativar seletivamente o mecanismo de desvio com base em características do espermatozoides medidos; e um recipiente de recolhimento em comunicação com a segunda saída.
[00170] A2. O sistema de acordo com a reivindicação A1, em que o pelo menos um canal de fluxo compreende canais de fluxo múltiplos formados num chip de micro fluido.
[00171] A3. O sistema de acordo com a reivindicação A2, em que os canais de fluxo múltiplos compreende entre 4 e 512 canais de fluxo.
[00172] A4. O sistema de acordo com a reivindicação A2 ou A3, em que ou os espermatozoides caracterizados como espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X ou os espermatozoides caracterizados como espermatozoides viáveis portadores de cromossomo Y são desviados para a segunda saída de cada canal de fluxo.
[00173] A5. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A4, em que o recipiente de recolhimento compreende um recipiente de recolhimento comum em comunicação fluida com a segunda saída de um ou mais canais de fluxo.
[00174] A6. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A5, em que cada canal de fluxo compreende ainda uma terceira saída.
[00175] A7. O sistema de acordo com a reivindicação A6, em que as células de espermatozoides caracterizadas como espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X são desviadas para uma de entre a segunda saída ou a terceira saída e espermatozoides caracterizados como sendo espermatozoides viáveis portadores do cromossomo Y são desviadas para outra de entre a segunda saída e a terceira saída.
[00176] A8. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A6, em que cada segunda saída dos canais de fluxo está ligada a um primeiro recipiente de recolhimento comum.
[00177] A9. O sistema de acordo com a reivindicação A6, em que cada terceira saída dos canais de fluxo está ligada a um segundo recipiente de recolhimento comum.
[00178] A10. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A9, que compreende ainda um recipiente de recolhimento passivo em comunicação com a primeira saída.
[00179] A11. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A9, compreendendo ainda uma fonte de revestimento, e em que o canal de fluxo compreende ainda uma entrada de revestimento em comunicação fluida com a fonte de revestimento.
[00180] A12. O sistema de acordo com a reivindicação A11, que compreende ainda um sistema de reciclagem de fluido de revestimento compreendendo: um mecanismo de transporte em comunicação fluida com o recipiente de recolhimento passiva; um trajeto de fluido que liga o recipiente de recolhimento passiva para a fonte de revestimento; e um dispositivo de concentração de partículas ou um sistema de remoção do fluido no trajeto do fluido do recipiente de recolhimento de ligação passiva para a fonte de revestimento.
[00181] A13. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A12, em que o pelo menos um canal de fluxo compreende vários canais de fluxo formados num chip de micro fluido e em que pelo menos uma porção do mecanismo de desvio está incorporada no chip de micro fluido.
[00182] A14. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A13, em que o pelo menos um canal de fluxo compreende vários canais de fluxo formados num chip de micro fluido e em que pelo menos uma porção do mecanismo de desvio está posicionada no exterior do chip de micro fluido.
[00183] A15. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A14, em que o mecanismo de desvio compreende uma passagem lateral, em comunicação fluida com o canal de fluxo e em comunicação fluida um volume de fluido através de uma interface flexível.
[00184] A16. O sistema de acordo com a reivindicação A15, em que o fluido compreende um selecionado de um grupo que consiste em: um gel, um líquido e um gás.
[00185] A17. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A16, que compreende ainda um atuador em contato de uma porção da interface flexível, em que o atuador está em comunicação com o controlador.
[00186] A18. O sistema de acordo com a reivindicação 17, em que o atuador é móvel entre uma posição de repouso e duas ou mais posições de ativação ao mesmo tempo mantém o contato com a interface flexível.
[00187] A19. O sistema de acordo com a reivindicação A18, que compreende ainda uma terceira saída, e em que as partículas fluem passivamente para a segunda saída e em que o movimento do atuador entre a posição de repouso e a primeira posição ativa desvia partículas para a primeira saída, e em que o movimento do atuador entre a posição de repouso e a segunda posição ativa desvia partículas para uma terceira saída.
[00188] A20. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A18, em que o atuador está ligado ao interface flexível.
[00189] A21. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A18 a A20, em que o atuador está pré-carregado na interface flexível.
[00190] A22. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A21, que compreende ainda um elemento piezoelétrico bimorfo.
[00191] A23. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A15 a A22, em que o elemento piezoelétrico bimorfo compreende a interface flexível.
[00192] A24. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A15 a A22, em que o elemento piezoelétrico bimorfo contacta a interface flexível.
[00193] A25. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A15 a A24, em que o elemento piezoelétrico bimorfo está configurado para deflexão em duas direções, para desviar os espermatozoides nas duas direções do canal de fluxo.
[00194] A26. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A25, em que o mecanismo de desvio compreende um transdutor ligado ao canal de fluxo.
[00195] A27. O sistema de acordo com a reivindicação A26, em que o transdutor compreende um transdutor de ultrassons para desviar partículas no canal de fluxo.
[00196] A28. O sistema de acordo com a reivindicação A27, em que o transdutor de ultrassons compreende um conjunto de transdutores de ultrassons e que compreende ainda um elemento de acionamento que temporiza a ativação de cada transdutor no conjunto para conseguir a deflexão desejada.
[00197] A29. O sistema de acordo com a reivindicação A28, compreendendo um segundo conjunto de transdutores de ultrassons, em que cada conjunto de transdutores de ultrassons está localizado em lados opostos do canal de fluxo.
[00198] A30. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A28 ou A29, em que o conjunto de transdutores de ultrassons está configurado para produzir múltiplas ondas estacionárias.
[00199] A31. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A28 a A30, em que o conjunto de transdutores de ultrassons é configurado para manter a trajetória de uma célula de espermatozoide no trajeto do fluxo em direção à primeira saída, desviar a trajetória de uma célula de espermatozoide em um trajeto de fluxo para a segunda saída, ou o desviar trajetória de uma célula de espermatozoide em um trajeto de fluxo no sentido de uma terceira saída.
[00200] A32. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A261 a A31, em que o transdutor está pelo menos parcialmente incorporado no substrato adjacente ao canal de fluxo.
[00201] A33. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A26 a A32, em que o transdutor está colocado em contato com uma superfície exterior do substrato.
[00202] A34. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A33, que compreende ainda uma ou mais fontes de radiação eletromagnética para desviar os espermatozoides no canal de fluxo.
[00203] A35. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A34, que compreende ainda a óptica de conformação do feixe para a manipulação da radiação eletromagnética produzidas a partir da fonte de radiação eletromagnética para inspecionar os espermatozoides em cada região de inspeção do pelo menos um canal de fluxo.
[00204] A36. O sistema de acordo com a reivindicação A35, em que o pelo menos um canal de fluxo compreende uma pluralidade de canais de fluxo, e em que o sistema óptico de conformação de feixe compreender um dispositivo de divisão de feixe para dirigir feixes substancialmente equivalentes para a região de inspeção de cada um da pluralidade de canais de fluxo.
[00205] A37. O sistema de acordo com a reivindicação A36, em que o dispositivo de divisão de feixe compreende uma superfície refletora ou material de refração para refletir porções do perfil de feixe como segmentos de feixe ou para dividir uma intensidade de feixe entre os feixes que têm o mesmo perfil.
[00206] A38. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A35 a A37, em que a óptica de conformação do feixe compreende ainda uma óptica de conformação do feixe para um perfil de feixe com forma de chapéu alto.
[00207] A39. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A38, em que cada canal de fluxo tem uma superfície refletora associada ou um elemento de refração associado que redireciona uma fluorescência lateral produzida pelos espermatozoides no canal de fluxo.
[00208] A40. O sistema de acordo com a reivindicação A39, em que a superfície refletora associada ou o elemento de refração associado redireciona uma fluorescência lateral numa direção substancialmente paralela a uma primeira fluorescência.
[00209] A41. O sistema de acordo com a reivindicação A39 ou A40, em que a primeira fluorescência compreende uma fluorescência frontal.
[00210] A42. O sistema de acordo com a reivindicação A39 ou A40, em que a primeira fluorescência compreende uma fluorescência posterior.
[00211] A43. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A39 a A42, em que a superfície refletora é constituída por uma superfície do substrato.
[00212] A44. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A39 a A42, em que a superfície refletora é constituída por uma superfície do canal de fluxo.
[00213] A45. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A39 a A44, em que cada canal de fluxo é separado por um elemento de bloqueio da luz.
[00214] A46. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A39 a A42 ou A45, em que a superfície refletora compreende ainda um elemento refletor incorporado no substrato.
[00215] A47. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A39 a A43, ou a reivindicação A45, em que a superfície refletora compreende uma superfície exterior do substrato formada pela porção cortada adjacente à região de inspeção, em que a diferença de índice de refração na porção cortada proporciona uma propriedade de reflexão.
[00216] A48. O sistema de acordo com a reivindicação A47, em que a porção recortada proporciona uma superfície refletora em cerca de 45 graus em relação à superfície do substrato e/ou do plano desejado ou orientação dos espermatozoides.
[00217] A49. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A47 ou 48, que compreende ainda uma segunda superfície refletora que compreende uma segunda superfície exterior do substrato formada por uma segunda porção cortada adjacente à região de inspeção para a produção de uma segunda fluorescência lateral.
[00218] A50. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A49, em que o detector compreende um detector de fluorescência frontal.
[00219] A51. O sistema de acordo com a reivindicação 50, compreendendo ainda um primeiro detector de fluorescência lateral.
[00220] A52. O sistema de acordo com a reivindicação 51, que compreende ainda um segundo detector de fluorescência lateral.
[00221] A53. O sistema de acordo com a reivindicação A52, em que o primeiro e o segundo detectores de fluorescência lateral estão localizados com uma separação de cerca de 90 graus entre si.
[00222] A54. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A51 a A53, compreendendo ainda um conjunto de primeiros detectores de fluorescência lateral de medição de um primeiro valor de fluorescência lateral em cada um de uma pluralidade de canais de fluxo e um segundo conjunto de detectores de fluorescência lateral.
[00223] A55. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A54, que compreende ainda a óptica de captação para recolhimento de fluorescência a partir de um ou mais canais de fluxo.
[00224] A56. O sistema de acordo com a reivindicação A55, em que a óptica de captação compreende uma única lente de captação para recolhimento de fluorescência de múltiplos canais.
[00225] A57. O sistema de acordo com a reivindicação A55, compreendendo ainda um conjunto de lente de captação de fluorescência a partir de cada canal de fluxo.
[00226] A58. O sistema de acordo com a reivindicação A55, compreendendo ainda um conjunto de fibras para recolhimento de fluorescência a partir de cada canal de fluxo.
[00227] A59. O sistema de acordo com a reivindicação 55, que compreende ainda a óptica de captação de epi-iluminação frontal.
[00228] A60. O sistema de acordo com a reivindicação A59, compreendendo ainda um espelho dicróico posicionado de modo a refletir a radiação eletromagnética da fonte de radiação eletromagnética para a região de inspeção e por meio de que as emissões de fluorescência na direção posterior se deslocam para um detector.
[00229] A61. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A60, em que o canal de fluxo compreende características de foco de fluido.
[00230] A62. O sistema de acordo com a reivindicação A61, em que as características de foco de fluido do canal de fluxo compreendem ainda: uma geometria de formação de corrente de núcleo.
[00231] A63. O sistema de acordo com a reivindicação A62, em que a geometria de formação de corrente de núcleo compreende ainda: uma região de foco do fluido lateral; um primeiro componente de foco de fluido vertical; e um segundo componente de foco de fluido vertical.
[00232] A64. O sistema de acordo com a reivindicação A63, em que o primeiro componente de foco de fluido vertical, compreende um primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo componente de foco de fluido vertical compreende um segundo canal de foco de fluido vertical.
[00233] A65. O sistema de acordo com a reivindicação A64, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical estão em comunicação com o canal de fluxo em posições verticais opostas.
[00234] A66. O sistema de acordo com a reivindicação A64 ou A65, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical proporciona uma primeira influência vertical e em que o segundo canal de foco de fluido vertical proporciona uma segunda influência vertical na direção oposta à da primeira influência vertical.
[00235] A67. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A61 a A66, em que as características de foco de fluido do canal de fluxo compreendem ainda: transdutores para produzir ondas de pressão em cada canal de fluxo.
[00236] A68. O sistema de acordo com a reivindicação A67, em que o, pelo menos um, conjunto de transdutores está posicionado simetricamente em relação aos outros com uma superfície perpendicular à orientação desejada dos espermatozoides.
[00237] A69. O sistema de acordo com a reivindicação A68, que compreende ainda uma série de transdutores para cada canal de fluxo.
[00238] A70. O sistema de acordo com a reivindicação A69, em que a série de transdutores está configurada para produzir uma onda de pressão estacionária ao longo do canal de fluxo.
[00239] A71. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A70, em que o, pelo menos um, canal de fluxo compreende características de orientação.
[00240] A72. O sistema de acordo com a reivindicação A71, em que as características de orientação compreendem uma geometria do canal interior dimensionado para orientar células de espermatozoides.
[00241] A73. O sistema de acordo com a reivindicação A72, em que a geometria do canal compreende ainda uma geometria de canal planar.
[00242] A74. O sistema de acordo com qualquer as reivindicações A72 ou A73, em que a geometria de canal compreende ainda uma geometria de bocal.
[00243] A75. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A72 a A74, em que a geometria do canal compreende ainda uma ou mais das seguintes características de canal: uma divisa, uma rampa suave, uma rampa abrupta, uma zona de compressão-descompressão, um degrau, ou uma ou mais ondulações.
[00244] A76. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A71 a A75, em que as características de orientação compreendem ainda: um ímã para a produção de um campo magnético na região da orientação de cada canal de fluxo.
[00245] A77. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A76, em que o canal de fluxo compreende ainda uma entrada de revestimento em comunicação fluida com a fonte de revestimento, e uma entrada de amostra em comunicação fluida com a fonte de amostra, a entrada de amostra posicionada no interior de um fluxo de revestimento criado pela entrada de revestimento para facilitar um fluxo de co-axial do revestimento e da amostra.
[00246] A78. O sistema de acordo com a reivindicação A77, em que a entrada de amostra compreende uma entrada que é chanfrada, achatada, ou tem uma seção transversal retangular.
[00247] A79. O sistema de acordo com a reivindicação A77 ou A78, em que o canal de fluxo compreende uma primeira largura e uma primeira altura na entrada de amostra.
[00248] A80. O sistema de acordo com a reivindicação A79, em que o canal de fluxo compreende uma segunda largura e uma segunda altura num primeiro ponto de transição.
[00249] A81. O sistema de acordo com a reivindicação A80, em que a largura do canal de fluxo é reduzida entre a entrada da amostra e o primeiro ponto de transição.
[00250] A82. O sistema de acordo com a reivindicação A80 ou A81, em que o canal de fluxo compreende uma terceira largura e uma terceira altura num segundo ponto de transição.
[00251] A83. O sistema de acordo com a reivindicação A81, em que a largura permanece constante entre o primeiro ponto de transição e o segundo ponto de transição e a altura é reduzida entre o primeiro ponto de transição e o segundo ponto de transição.
[00252] A84. O sistema de acordo com a reivindicação A82 ou A83, em que a terceira altura e a terceira largura são mantidas através da zona de inspeção.
[00253] A85. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A84, em que o canal de fluxo passa de uma de secção transversal quadrada para uma secção transversal retangular.
[00254] A86. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A1 a A82, em que o canal de fluxo passa de uma secção transversal circular para uma secção transversal elíptica.
[00255] A87. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A86, que compreende ainda pelo menos uma máscara.
[00256] A88. O sistema de acordo com a reivindicação A87, em que a pelo menos uma máscara compreende uma máscara de iluminação posicionada no trajeto da radiação eletromagnética dirigidas para a região de inspeção.
[00257] A89. O sistema de acordo com a reivindicação A88, em que a máscara de iluminação compreende uma primeira região e uma segunda região ao longo do trajeto de fluxo.
[00258] A90. O sistema de acordo com a reivindicação A89, em que a primeira região proporciona uma abertura configurada para produzir um pulso de forma de onda suficiente para diferenciar espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X de espermatozoides viáveis portadores de cromossomo Y, quando orientados.
[00259] A91. O sistema de acordo com a reivindicação A89 ou A90, em que a segunda região compreende uma série de aberturas configuradas para produzir uma série de pulsos da forma de onda que diferenciam as células de espermatozoides orientadas das células de espermatozoides não orientadas.
[00260] A92. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de A89 a A91, em que a segunda região compreende uma série de aberturas com diferentes perfis transversais ao longo do trajeto de fluxo.
[00261] A93. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A89 a A92, em que a segunda região compreende um primeiro par de aberturas espaçadas, seguido por um segundo par de aberturas espaçadas, em que o espaçamento é diferente entre o primeiro par de aberturas e o segundo par de aberturas.
[00262] A94. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A89 a A92, em que a segunda região compreende uma série seqüencial de aberturas ao longo do trajeto de fluxo, tendo cada abertura uma posição transversal diferente ao longo do trajeto de fluxo.
[00263] A95. O sistema de acordo com a reivindicação A88 em que a, pelo menos uma, máscara compreende pelo menos uma máscara de detecção num trajeto de luz da radiação eletromagnética recolhidas.
[00264] A96. O sistema de acordo com a reivindicação A95, em que uma primeira máscara de detecção é colocada no trajeto da fluorescência frontal emitida e uma segunda máscara de detecção é colocada no trajeto da fluorescência lateral emitida.
[00265] A97. O sistema de acordo com a reivindicação A96, em que a primeira máscara de detecção e a segunda máscara de detecção têm diferentes perfis de fendas, e em que cada máscara está em comunicação com o mesmo detector.
[00266] A98. O sistema de acordo com a reivindicação A97, em que o analisador está em comunicação com o detector e está configurado para deconvoluir um primeiro pulso de forma de onda que representam a fluorescência frontal e um segundo pulso da forma de onda que representa a fluorescência lateral com base no perfil de fendas em cada uma das primeiras máscaras de detecção e segunda máscara de detecção.
[00267] A99. O sistema de acordo com a reivindicação A87, em que a máscara é posicionada no espaço livre.
[00268] A100. O sistema de acordo com a reivindicação A87, em que a máscara é localizada sobre o substrato.
[00269] A101. O sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações A1 a A100, em que o detector compreende um primeiro detector e o sistema compreende ainda um segundo detector.
[00270] A102. O sistema de acordo com a reivindicação A101, em que o primeiro detector compreende um detector de absorção e o segundo detector compreende um detector de fluorescência.
[00271] A103. O sistema de acordo com a reivindicação A102, que compreende ainda um filtro de densidade neutra no trajeto óptico do detector de absorção.
[00272] B1. Um chip de micro fluído para a triagem de espermatozoides compreendendo: um substrato uma pluralidade de canais de fluxo formados no substrato, compreendendo cada canal de fluxo; uma entrada; uma região de foco de fluido tendo uma característica de foco de fluido associada para alinhar as células de espermatozoide dentro do canal de fluxo; uma região de orientação de espermatozoides tendo uma característica de orientação de espermatozoides associada para orientar células de espermatozoides dentro do canal de fluxo; uma região de inspeção, pelo menos parcialmente a jusante da região de foco de fluido e da região de orientação de espermatozoides; pelo menos uma primeira saída e uma segunda saída; e um mecanismo de desvio em comunicação com cada canal de fluxo.
[00273] B2. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B1, em que as características de foco de fluido do canal de fluxo compreendem ainda: uma geometria de formação de corrente de núcleo.
[00274] B3. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B1 ou B2, em que a geometria de formação de corrente de núcleo compreende ainda: uma região de foco de fluido lateral; um primeiro componente de foco de fluido vertical; e um segundo componente de foco de fluido vertical.
[00275] B4. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B3, em que o primeiro componente de foco de fluido vertical, compreende um primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo componente de foco de fluido vertical compreende um segundo canal de foco de fluido vertical.
[00276] B5. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B4, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical estão em comunicação com o canal de fluxo em posições verticais opostas.
[00277] B6. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação A4 ou B5, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical proporciona uma primeira influência vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical proporciona uma segunda influência vertical na direção oposta à da primeira influência vertical.
[00278] B7. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B6, em que a característica de foco da região de foco de fluido compreende ainda: transdutores de ultrassons para produzir ondas de pressão na região de foco de cada canal de fluxo.
[00279] B8. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B7, em que a característica de foco de fluido da região de foco de fluido compreende ainda um conjunto de transdutor de ultrassons para produzir uma onda de pressão estacionária ao longo do canal de fluxo.
[00280] B9. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B8, em que a característica de orientação de espermatozoides da região que orienta o canal de fluxo compreende ainda: uma geometria de canal.
[00281] B10. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B9, em que a geometria do canal compreende ainda uma geometria de canal planar.
[00282] B11. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B9 ou B10, em que a geometria de canal compreende ainda uma geometria de bocal.
[00283] B12. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B9 a B11, em que a geometria de canal compreende ainda uma ou mais das seguintes características de canal: uma divisa, uma rampa suave, uma zona de compressão-descompressão, uma rampa abrupta, ou um degrau.
[00284] B13. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B12, em que as características de orientação dos espermatozoides da região de orientação dos espermatozoides compreende ainda: um ímã para a produção de um campo magnético na região da orientação de cada canal de fluxo.
[00285] B14. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B13, em que as características de orientação dos espermatozoides da região de orientação dos espermatozoides compreende ainda um conjunto de transdutor de ultrassons para produzir uma onda de pressão estacionária ao longo do canal de fluxo.
[00286] B15. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B14, em que o mecanismo de desvio compreende uma válvula de bolha.
[00287] B16. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B14, em que o mecanismo de desvio compreende um conjunto de transdutores de ultrassons.
[00288] B17. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B16, em que cada canal de fluxo tem uma superfície refletora ou elemento de refração associados que redirecionam uma fluorescência lateral produzida pelos espermatozoides no canal de fluxo.
[00289] B18. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B17, em que a superfície refletora associada redireciona uma fluorescência lateral numa direção substancialmente paralela a uma primeira fluorescência.
[00290] B19. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B18, em que a primeira fluorescência compreende uma fluorescência frontal.
[00291] B20. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B18, em que a primeira fluorescência compreende uma fluorescência posterior.
[00292] B21. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B17 a B19, em que a superfície refletora é formada como uma superfície sobre o substrato.
[00293] B22. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B17 a B19, em que a superfície refletora é formada como uma superfície do canal de fluxo.
[00294] B23. O chip de micro fluido de acordo com qualquer uma das reivindicações B1 a B22, em que o canal de fluxo compreende ainda uma entrada de revestimento em comunicação fluida com a fonte de revestimento, e em que a entrada de amostra está posicionada dentro de um fluxo de revestimento criado pela entrada de revestimento para facilitar um fluxo de co-axial do revestimento e da amostra.
[00295] B24. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B23, em que a entrada de amostra compreende uma entrada chanfrada.
[00296] B25. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B23 ou B24, em que o canal de fluxo compreende uma primeira largura e uma primeira altura na entrada da amostra.
[00297] B26. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação 825, em que o canal de fluxo compreende uma segunda largura e uma segunda altura num primeiro ponto de transição.
[00298] B27. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação 826, em que a largura do canal de fluxo é reduzida entre a entrada da amostra e o primeiro ponto de transição.
[00299] B28. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação 827, em que o canal de fluxo compreende uma terceira largura e uma terceira altura num segundo ponto de transição.
[00300] B29. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação 828, em que a largura permanece constante entre o primeiro ponto de transição e o segundo ponto de transição e a altura é reduzida entre o primeiro ponto de transição e o segundo ponto de transição.
[00301] B30. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação B28 ou B29, em que a terceira altura e a terceira largura são mantidas através da zona de inspeção.
[00302] B31. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação 82, em que o canal de fluxo passa de uma de seção transversal quadrada para uma seção transversal retangular.
[00303] B32. O chip de micro fluido de acordo com a reivindicação 82, em que o canal de fluxo passa de uma seção transversal circular para uma seção transversal elíptica.
[00304] C1. Um método de triagem de espermatozoides que compreende as etapas de: fluir os espermatozoides através de uma pluralidade de canais de fluxo de um chip de micro fluido; orientar os espermatozoides dentro da pluralidade de canais de fluxo; fluir os espermatozoides orientados através de uma região de inspeção nos canais de fluxo; interrogar os espermatozoides na pelo menos uma região de inspeção para determinar as características dos espermatozoides; diferenciar os espermatozoides orientados dos espermatozoides não orientados nos canais de fluxo; selecionar uma subpopulação de espermatozoides orientados com base nas características detectadas dos espermatozoides; e recolher a subpopulação selecionada de espermatozoides num recipiente de recolhimento.
[00305] C2. O método de acordo com a reivindicação C1, que compreende ainda as etapas de: proporcionar uma fonte de radiação eletromagnética; manipular a radiação eletromagnética produzida a partir da fonte de radiação eletromagnética para inspecionar múltiplas regiões de inspeção.
[00306] C3. O método de acordo com a reivindicação C2, em que a etapa de manipulação da radiação eletromagnética compreende ainda as etapas de: dividir a radiação eletromagnética produzidas pela fonte de radiação eletromagnética.
[00307] C4. O método de acordo com a reivindicação C2 ou C3, em que a etapa de manipulação da radiação eletromagnética compreende ainda a etapa de: manipulação da forma do perfil do feixe de radiação eletromagnética.
[00308] C5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações C1 a C4, em que a etapa de selecionar uma subpopulação de espermatozoides com base nas características de espermatozoides detectadas compreende ainda a etapa de desviar o fluxo de um espermatozoide selecionado dentro do canal de fluxo com base nas características detectadas dos espermatozoides.
[00309] C6. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações C1 a C5, que compreende ainda a etapa de diferenciação entre os espermatozoides orientados e os espermatozoides não orientados e excluindo os espermatozoides não orientados da seleção.
[00310] C7. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações C1 a C6, que compreende ainda as etapas de: gerar um primeiro sinal com um detector de fluorescência frontal em resposta às radiação eletromagnética emitidas de espermatozoides na região de inspeção, em que o primeiro sinal compreende pulsos de forma de onda tendo características de pulso detectáveis.
[00311] C8. O método de acordo com a reivindicação C7, que compreende ainda a etapa de gerar um segundo sinal com um detector de fluorescência lateral.
[00312] C9. O método de acordo com a reivindicação C8, em que a etapa de gerar um segundo sinal com um detector de fluorescência lateral compreende ainda a associação de um elemento de reflexão com cada canal de fluxo para refletir a fluorescência lateral para o exterior e detectar a fluorescência lateral em paralelo com uma fluorescência frontal.
[00313] C10. O método de acordo com a reivindicação C9, que compreende ainda a etapa de detecção da fluorescência para a frente através de uma primeira máscara e da fluorescência lateral através de uma segunda máscara.
[00314] C11. O método de acordo com a reivindicação C10, compreendendo ainda a etapa de deconvolver um primeiro pulso em forma de onda e um segundo pulso em forma de onda a partir do sinal produzido pelo detector.
[00315] C12. O método de acordo com a reivindicação C11, em que o pulso em forma de onda deconvolvido fornece a orientação dos espermatozoides.
[00316] C13. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações C1 a C7, compreendendo adicionalmente as etapas de gerar uma pluralidade de pulsos de forma de onda com um único detector, em resposta a um único espermatozoide, em que a pluralidade de pulsos em forma de onda fornece informações de orientação sobre a célula de espermatozoide.
[00317] C14. O método de acordo com a reivindicação C13, compreendendo ainda a etapa de medição da extinção de laser para determinar a orientação dos espermatozoides.
[00318] C15. O método de acordo com a reivindicação C14, que compreende ainda as etapas de: gerar um segundo sinal com um primeiro detector de fluorescência lateral, em que o segundo sinal compreende pulsos de forma de onda tendo características de pulso detectáveis; e gerar um terceiro sinal com um segundo detector de fluorescência lateral, em que o segundo sinal compreende pulsos de forma de onda tendo características de pulso detectáveis.
[00319] C16. O método de acordo com a reivindicação C15, em que as características de pulso dos segundo e terceiro sinais diferenciaram a orientação das células de espermatozoide.
[00320] C17. O método de acordo com a reivindicação C15 da reivindicação 16, em que as características de pulso são selecionadas a partir do grupo que consiste em: altura de pico, largura de pulso, desfasamento de pico de pulso, declive de pulso, área de pulso, e as suas combinações.
[00321] C18. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações C15 a C17, compreendendo ainda as etapas de comparar as características de pulso do segundo sinal com as características de pulso do terceiro sinal, para determinar a orientação dos espermatozoides.
[00322] Como pode ser facilmente entendido a partir do acima mencionado, os conceitos básicos da presente invenção podem realizados de uma variedade de modos. A invenção envolve numerosas e variadas formas de realização de esperma separado quanto ao sexo incluindo o, mas não limitada ao, melhor modo da invenção.
[00323] Como tal, as formas de realização ou elementos particulares da invenção divulgados pela descrição ou mostrados nas figuras ou nas tabelas acompanhando este pedido não se destinam a ser limitantes, mas ao invés exemplares das numerosas e variadas formas de realização genericamente englobadas pela invenção ou equivalentes englobados no que diz respeito a qualquer seu elemento particular. Adicionalmente, a descrição específica de uma única concretização ou elemento da invenção pode não descrever explicitamente todas as formas de realização ou elementos possíveis; muitas alternativas são implicitamente divulgadas pela descrição e figuras.
[00324] Deve ser entendido que cada elemento de um dispositivo ou cada etapa de um método pode ser descrito por um termo de dispositivo ou termo de método. Tais termos podem ser substituídos onde se deseja tornar explícito a cobertura implicitamente ampla à qual esta invenção está destinada. Como apenas um exemplo deve ser entendido que todos as etapas de um método podem ser divulgados como uma ação, um meio para tomar essa ação, ou como um elemento que causa essa ação. Similarmente, cada elemento de um dispositivo pode ser divulgado como o elemento físico ou a ação que esse elemento físico facilita. Como apenas um exemplo, a divulgação de "triador" deve ser entendida como englobando a divulgação do ato de "triar" - seja explicitamente discutido ou não -- e, reciprocamente, existisse efetivamente divulgação do ato de "triar", uma tal divulgação deve ser entendida como englobando a divulgação de um "triador" e mesmo um "meio para separação". Tais termos alternativos para cada elemento ou etapa são para ser entendidos como sendo explicitamente incluídos na descrição.
[00325] Adicionalmente, quanto a cada termo usado deve ser entendido que, a não ser que a sua utilização em este pedido seja inconsistente com tal interpretação, as definições de dicionário comuns devem ser entendidas como estando incluídas na descrição para cada termo como contido no Random House Webster’s Unabridged Dictionary, segunda edição, cada definição incorporada desse modo por referência.
[00326] Além do mais, para os propósitos da presente invenção, o termo "um" ou "uma" entidade se refere a um ou mais dessa entidade. Como tal, os termos "um" ou "uma", "um(a) ou mais" e "pelo menos um(a)" podem ser usados indistintamente aqui.
[00327] Todos os valores numéricos aqui são assumidos como sendo modificados pelo termo "cerca de", seja ou não explicitamente indicado. Para os propósitos da presente invenção, as gamas podem ser expressas como a partir de "cerca de" um valor particular até "cerca de" outro valor particular. Quando uma tal gama é expressa, outra forma de realização inclui a partir de um valor particular até ao outro valor particular. A recitação de gamas numéricas pelos pontos terminais inclui todos os valores numéricos subsomados dentro dessa gama. Uma gama numérica de um a cinco inclui por exemplo os valores numéricos 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, e assim por diante. Será adicionalmente entendido que os pontos terminais de cada uma das gamas são significativos em relação ao outro ponto terminal, e independentemente do outro ponto terminal. Quando um valor é expresso como uma aproximação por uso do antecedente "cerca de", deve ser entendido que o valor particular forma outra forma de realização.
[00328] A seção de antecedentes deste pedido de patente proporciona uma declaração da área de esforço à qual a invenção pertence. Esta seção pode também incorporar ou conter parafraseamento de certas patentes dos Estados Unidos, pedidos de patente, publicações, ou assunto da invenção reivindicada úteis no relato de informações, problemas, ou preocupações sobre o estado da tecnologia ao qual a invenção está dirigida. Não se pretende que qualquer patente dos Estados Unidos, pedido de patente, publicação, declaração ou outra informação citado ou incorporado aqui seja interpretado, compreendido ou considerado como sendo admitido como técnica prévia no que diz respeito à invenção.
[00329] As reivindicações apresentadas em esta especificação são deste modo incorporadas por referência como parte desta descrição da invenção, e o requerente expressamente reserva o direito de usar todo o ou uma porção de tal conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrição adicional para suportar qualquer uma das ou todas as reivindicações ou qualquer seu elemento ou componente, e o requerente reserva expressamente adicionalmente o direito de mover qualquer porção do ou todo o conteúdo incorporado de tais reivindicações ou qualquer seu elemento ou componente da descrição para as reivindicações ou vice versa como necessário para definir a matéria para a qual é solicitada proteção por este pedido ou por qualquer pedido subseqüente ou continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte, ou para obter qualquer benefício de, redução em taxas nos termos de, ou para respeitar as leis de patentes, regras, ou regulamentos de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado por referência deverá sobreviver durante a pendência inteira deste pedido incluindo qualquer subseqüente continuação, divisão, ou seu pedido de continuação em parte ou qualquer sua reedição ou extensão.
Claims (61)
1. Sistema de triagem de espermatozoides caracterizado por compreender: uma fonte de amostra; um substrato; pelo menos um canal de fluxo formado no substrato, o canal de fluxo tendo uma entrada em comunicação fluida com a fonte de amostra, o canal de fluxo compreendendo adicionalmente uma região de foco de fluido lateral, um primeiro canal de foco de fluido vertical, um segundo canal de foco de fluido vertical, uma região de inspeção, e pelo menos uma primeira saída, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical estão em comunicação fluida com o canal de fluxo a partir de lados verticais opostos e pelo menos um do primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical se sobrepondo com a região de foco de fluido lateral, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical compreendem uma forma de ferradura dupla; uma fonte de radiação eletromagnética para iluminar os espermatozoides na região de inspeção; um detector alinhado para medir as características dos espermatozoides na região de inspeção do pelo menos um canal de fluxo; um analisador em comunicação com o detector para determinar as características dos espermatozoides; e um recipiente de recolhimento em comunicação com a pelo menos uma saída.
2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente uma fonte de revestimento, e em que o canal de fluxo compreende adicionalmente uma entrada de revestimento em comunicação fluida com a fonte de revestimento.
3. Sistema de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente um sistema de reciclagem de fluido de revestimento compreendendo: um mecanismo de transporte em comunicação fluida com o recipiente de recolhimento passivo; um trajeto do fluido que liga o recipiente de recolhimento passivo à fonte de revestimento; e um dispositivo de concentração de partículas ou um sistema de remoção do fluido no trajeto de fluido que liga o recipiente de recolhimento passivo à fonte de revestimento.
4. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um canal de fluxo compreender vários canais de fluxo formados em um chip de microfluido e em que pelo menos uma porção do mecanismo de desvio está incorporada no chip de microfluido.
5. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um canal de fluxo compreender vários canais de fluxo formados em um chip de microfluido e em que pelo menos uma porção do mecanismo de desvio está posicionada no exterior do chip de microfluido.
6. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente um mecanismo de desvio que compreende uma passagem lateral em comunicação fluida com o canal de fluxo e em comunicação fluida com um volume de fluido através de uma interface flexível.
7. Sistema de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o fluido compreender um selecionado dentre o grupo que consiste em: um gel, um líquido e um gás.
8. Sistema de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender adicionalmente um atuador em contato com uma porção da interface flexível, em que o atuador está em comunicação com o controlador.
9. Sistema de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o atuador ser móvel entre uma posição de repouso e duas ou mais posições de ativação enquanto mantendo o contato com a interface flexível.
10. Sistema de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender adicionalmente uma segunda saída e uma terceira saída, em que as partículas fluem passivamente para a segunda saída e em que o movimento do atuador entre a posição de repouso e a primeira posição ativa desvia as partículas para a primeira saída, e em que o movimento do atuador entre a posição de repouso e a segunda posição ativa desvia partículas para uma terceira saída.
11. Sistema de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o atuador estar ligado à interface flexível.
12. Sistema de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o atuador estar pré-carregado na interface flexível.
13. Sistema de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender adicionalmente um elemento piezoelétrico bimorfo.
14. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o elemento piezoelétrico bimorfo compreender a interface flexível.
15. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o elemento piezoelétrico bimorfo contatar a interface flexível.
16. Sistema de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o elemento piezoelétrico bimorfo estar configurado para deflexão em duas direções, para desviar os espermatozoides nas duas direções do canal de fluxo.
17. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a óptica de conformação do feixe para a manipulação da radiação eletromagnética produzida a partir da fonte de radiação eletromagnética para inspecionar os espermatozoides em cada região de inspeção de pelo menos um canal de fluxo.
18. Sistema de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por pelo menos um canal de fluxo compreender uma pluralidade de canais de fluxo, e em que a óptica de conformação de feixe compreende um dispositivo de divisão de feixe para dirigir feixes substancialmente equivalentes para a região de inspeção de cada um da pluralidade de canais de fluxo.
19. Sistema de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o dispositivo de divisão de feixe compreender uma superfície refletora ou material de refração para refletir porções do perfil de feixe como segmentos de feixe ou para dividir uma intensidade de feixe entre os feixes que têm o mesmo perfil.
20. Sistema de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a óptica de conformação do feixe compreender adicionalmente uma óptica de conformação do feixe para estabelecer um perfil de feixe com forma de chapéu alto.
21. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por cada canal de fluxo ter uma superfície refletora associada ou um elemento de refração associado que redireciona uma fluorescência lateral produzida pelos espermatozoides no canal de fluxo.
22. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a superfície refletora associada ou o elemento de refração associado redirecionar uma fluorescência lateral em uma direção substancialmente paralela a uma primeira fluorescência.
23. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a primeira fluorescência compreender uma fluorescência frontal.
24. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a primeira fluorescência compreender uma fluorescência posterior.
25. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a superfície refletora ser formada por uma superfície no substrato.
26. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a superfície refletora ser constituída por uma superfície do canal de fluxo.
27. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por cada canal de fluxo ser separado por um elemento de bloqueio da luz.
28. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a superfície refletora compreender adicionalmente um elemento refletor incorporado no substrato.
29. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a superfície refletora compreender uma superfície exterior do substrato formada pela porção cortada adjacente à região de inspeção, em que a diferença de índice de refração na porção cortada proporciona uma propriedade de reflexão.
30. Sistema de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a porção cortada proporcionar uma superfície refletora de cerca de 45 graus em relação à superfície do substrato e/ou do plano desejado ou orientação dos espermatozoides.
31. Sistema de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender adicionalmente uma segunda superfície refletora que compreende uma segunda superfície exterior do substrato formada por uma segunda porção cortada adjacente à região de inspeção para a produção de uma segunda fluorescência lateral.
32. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente pelo menos uma máscara.
33. Sistema de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a pelo menos uma máscara compreender uma máscara de iluminação posicionada no trajeto da radiação eletromagnética direcionada para a região de inspeção.
34. Sistema de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a máscara de iluminação compreender uma primeira região e uma segunda região ao longo do trajeto de fluxo.
35. Sistema de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a primeira região proporcionar uma abertura configurada para produzir um pulso de forma de onda suficiente para diferenciar espermatozoides viáveis portadores de cromossomo X de espermatozoides viáveis portadores de cromossomo Y, quando orientados.
36. Sistema de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a segunda região compreender uma série de aberturas configuradas para produzir uma série de pulsos da forma de onda que diferenciam as células de espermatozoides orientadas das células de espermatozoides não orientadas.
37. Sistema de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a segunda região compreender uma série de aberturas com diferentes perfis transversais ao longo do trajeto de fluxo.
38. Sistema de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por a segunda região compreender um primeiro par de aberturas espaçadas, seguido por um segundo par de aberturas espaçadas, em que o espaçamento é diferente entre o primeiro par de aberturas e o segundo par de aberturas.
39. Sistema de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a segunda região compreender uma série sequencial de aberturas ao longo do trajeto de fluxo, tendo cada abertura uma posição transversal diferente ao longo do trajeto de fluxo.
40. Sistema de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por pelo menos uma máscara compreender pelo menos uma máscara de detecção.
41. Sistema de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a primeira máscara de detecção ser colocada no trajeto da fluorescência frontal emitida e uma segunda máscara de detecção ser colocada no trajeto da fluorescência lateral emitida.
42. Sistema de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por a primeira máscara de detecção e a segunda máscara de detecção terem diferentes perfis de fendas, e em que cada máscara está em comunicação com o mesmo detector.
43. Sistema de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por o analisador estar em comunicação com o detector e estar configurado para deconvoluir um primeiro pulso de forma de onda que representa a fluorescência frontal e um segundo pulso da forma de onda que representa a fluorescência lateral com base no perfil de fendas em cada uma das primeiras máscaras de detecção e segunda máscara de detecção.
44. Sistema de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a máscara ser posicionada no espaço livre.
45. Sistema de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a máscara ser localizada sobre o substrato.
46. Método de triagem de espermatozoides caracterizado por compreender as etapas de: fluir os espermatozoides através de uma pluralidade de canais de fluxo em um chip de microfluido; orientar os espermatozoides dentro da pluralidade de canais de fluxo ao submeter os espermatozoides a uma região de foco de fluido lateral, um primeiro canal de foco de fluido vertical, e um segundo canal de foco de fluido vertical, em que o primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical estão em comunicação fluida com o canal de fluxo a partir de lados verticais opostos e pelo menos um do primeiro canal de foco de fluido vertical e o segundo canal de foco de fluido vertical se sobrepondo com a região de foco de fluido lateral, em que a etapa de orientar espermatozoides compreende adicionalmente desviar o fluido de revestimento através de uma ferradura dupla formada por um primeiro canal de foco de fluido vertical e um segundo canal de foco de fluido para fluir os espermatozoides orientados através de uma região de inspeção nos canais de fluxo; interrogar os espermatozoides na pelo menos uma região de inspeção para determinar as características dos espermatozoides; diferenciar os espermatozoides orientados dos espermatozoides não orientados nos canais de fluxo; selecionar uma subpopulação de espermatozoides orientados com base nas características detectadas de espermatozoides; e recolher a subpopulação selecionada de espermatozoides em um recipiente de recolhimento.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de: proporcionar uma fonte de radiação eletromagnética; manipular a radiação eletromagnética produzida a partir da fonte de radiação eletromagnética para inspecionar múltiplas regiões de inspeção.
48. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a etapa de seleção de uma subpopulação de espermatozoides com base nas características detectadas dos espermatozoides compreender adicionalmente a etapa de desviar o fluxo de espermatozoides selecionado dentro do canal de fluxo com base nas características detectadas dos espermatozoides.
49. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de diferenciar os espermatozoides orientados dos espermatozoides não orientados e excluir os espermatozoides não orientados da seleção.
50. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de: gerar um primeiro sinal com um detector de fluorescência frontal em resposta à radiação eletromagnética emitida de espermatozoides na região de inspeção, em que o primeiro sinal compreende pulsos de forma de onda tendo características de pulso detectáveis.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de gerar um segundo sinal com um detector de fluorescência lateral.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por a etapa de gerar um segundo sinal com um detector de fluorescência lateral compreender adicionalmente a associação de um elemento de reflexão com cada canal de fluxo para refletir a fluorescência lateral para fora e detectar a fluorescência lateral em paralelo com uma fluorescência frontal.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de detecção da fluorescência frontal através de uma primeira máscara e da fluorescência lateral através de uma segunda máscara.
54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de deconvolver um primeiro pulso em forma de onda e um segundo pulso em forma de onda a partir do sinal produzido pelo detector.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por o pulso em forma de onda deconvolvido fornecer a orientação dos espermatozoides.
56. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de gerar uma pluralidade de pulsos de forma de onda com um único detector, em resposta a um único espermatozoide, em que a pluralidade de pulsos em forma de onda fornece informações de orientação sobre a célula de espermatozoide.
57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de medição da extinção de laser para determinar a orientação dos espermatozoides.
58. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de: gerar um segundo sinal com um primeiro detector de fluorescência lateral, em que o segundo sinal compreende pulsos de forma de onda tendo características de pulso detectáveis; e gerar um terceiro sinal com um segundo detector de fluorescência lateral, em que o segundo sinal compreende pulsos de forma de onda tendo características de pulso detectáveis.
59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por as características de pulso dos segundo e terceiro sinais diferenciarem a orientação das células de espermatozoide.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as características de pulso serem selecionadas a partir do grupo que consiste em: altura de pico, largura de pulso, desfasamento de pico de pulso, declive de pulso, área de pulso, e as suas combinações.
61. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de comparar as características de pulso do segundo sinal com as características de pulso do terceiro sinal, para determinar a orientação dos espermatozoides.
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