BR122013030854B1 - Nucleic acid sequences, chimeric gene, vector, bacillus thuringiensis strain, as well as plant protection processes against insect damage. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQUÊN- CIAS DE ÁCIDO NUCLÉICO, GENE QUIMÉRICO, VETOR, CEPA DE BA- CtLLUS THURINGIENSIS, BEM COMO PROCESSOS DE PROTEÇÃO DE PLANTA CONTRA DANOS CAUSADOS POR INSETOS".Patent Descriptive Report for "NUCLEIC ACID SEQUENCES, CHEMERIC GENE, VECTOR, BACLLUS THURINGIENSIS CUP, AS WELL AS INSECT PROTECTION PROCEDURES".

Dividido do PIQ308659-3, depositado em 20.03.2003.Divided from PIQ308659-3, filed on March 20, 2003.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se ao campo do controle de pragas vegetais, particularmente ao controle de insetos, São fornecidas novas se- quências de ácido nucléico de cepas do Bacilfus thuringiensís {Bt), que codi- ficam proteínas inseticidas expressas durante os estágios de crescimento vegeta ti vo. Particularmente, são fornecidas as sequências de DNA que codi- ficam as proteínas denominadas de ISP-3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J, que são úteis para proteger plantas dos danos causados por insetos. São ainda fornecidos plantas e microorganismos que compreendem pelo menos uma das novas moléculas de ácido nucléico, assim como processos e meios para a utilização destas seqüências de ácido nucléico para a redução dos danos causados por insetos nas plantas. Técnica Anterior As pragas de insetos causam enormes perdas econômicas no mundo todo na produção de plantas de cultivo e os fazendeiros encaram todos os anos a ameaça de perdas de rendimento causadas pela infestação de insetos, A engenharia genética da resistência a insetos nas plantas de cultivo agrícolas tem sido uma abordagem atraente para reduzir os custos associados com as práticas de controle das plantas de cultivo e de controle químico. A primeira geração de plantas de cultivo resistentes a insetos foi introduzida no mercado a partir de 1996, com base na expressão em plantas de proteínas isoladas da bactéria do solo gram-positiva BaciHus íhuringiensis (Bt), As proteínas Cry de Bt inseticidas são produzidas durante o estágio de esporulação de cepas de Bt e as proteínas se acumulam em grandes cristais citoplasmáticos dentro da bactéria, Quando ingeridos por insetos, uma prote- ína Cry típica de Bt tóxica aos Lepídópteros é solubilizada e processada no intestino médio do inseto em uma forma ativa de aproximadamente 60 até 65 kDa. A proteína ativa exerce seu efeito tóxico através da ligação com as células epiteliais do intestino médio causando a formação de poros na mem- brana celular, que leva à lise osmótica das células (Gill e outros, 1992).Field of the Invention The present invention relates to the field of plant pest control, particularly insect control. New nucleic acid sequences from Bacilfus thuringiensis (Bt) strains are provided which encode insecticidal proteins expressed during vegetative growth stages. In particular, DNA sequences encoding proteins called ISP-3-1099E, ISP3-327D and ISP3-2245J, which are useful for protecting plants from insect damage, are provided. Plants and microorganisms comprising at least one of the new nucleic acid molecules are provided, as well as processes and means for using these nucleic acid sequences to reduce insect damage to plants. Background Art Insect pests cause huge economic losses worldwide in the production of crop plants, and farmers each year face the threat of yield losses caused by insect infestation. The genetic engineering of insect resistance in crop plants It has been an attractive approach to reduce the costs associated with crop control and chemical control practices. The first generation of insect resistant crop plants was introduced to the market since 1996, based on the expression in plants of proteins isolated from gram-positive soil bacteria BaciHus ihuringiensis (Bt). Cry proteins of Bt insecticides are produced during the sporulation stage of Bt strains and proteins accumulate in large cytoplasmic crystals within the bacterium. When ingested by insects, a Lepidopteran-toxic Bt Cry protein is solubilized and processed in the insect's midgut in an active form. from approximately 60 to 65 kDa. Active protein exerts its toxic effect by binding to midgut epithelial cells causing pore formation in the cell membrane, which leads to osmotic cell lysis (Gill et al., 1992).

Uma cepa de Bt pode produzir muitas toxinas diferentes. Desde o isolamento do primeiro gene que codifica uma proteína inseticida em cristal do Bt em 1981 (Schnepf e Whiteley, 1981) mais de 100 genes que codificam toxinas Cry do Bt foram clonados e as pragas de insetos foram eficientemen- te controladas através da expressão de proteínas derivadas do Bt em espé- cies de plantas de cultivo agrícola importantes. Entretanto, o uso de proteí- nas de Bt individuais é freqüentemente limitado, uma vez que a maior parte das proteínas de Bt são em grande parte ativa apenas contra um número relativamente pequeno das numerosas pragas de insetos existentes. Acredi- ta-se que a especificidade das proteínas Cry de Bt seja determinada por fa- tores tais como a ativação da toxina no intestino do inseto (Haider e outros, 1986) e sua capacidade de se ligar a receptores específicos (Hofmann e ou- tros 1988). É amplamente reconhecido que há um risco de que espécies de insetos susceptíveis possam desenvolver resistência contra as toxinas Cry do Bt. Conseqüentemente, têm sido feitos esforços ativos para identificar novas proteínas inseticidas. Uma estratégia, que foi utilizada, foi selecionar cepas de Bacillus para a produção de proteínas inseticidas durante os está- gios de crescimento vegetativo, ao invés de durante os estágios de esporu- lação. Utilizando esta abordagem, foi identificado um número de "proteínas inseticidas vegetativas" ou "VIPs".One Bt strain can produce many different toxins. Since the isolation of the first gene encoding a Bt crystal insecticide protein in 1981 (Schnepf and Whiteley, 1981) over 100 genes encoding Bt Cry toxins have been cloned and insect pests have been efficiently controlled by the expression of Bt-derived proteins in important agricultural plant species. However, the use of individual Bt proteins is often limited, since most Bt proteins are largely active only against a relatively small number of the numerous existing insect pests. The specificity of Bt Cry proteins is believed to be determined by factors such as the activation of the toxin in the insect gut (Haider et al., 1986) and its ability to bind to specific receptors (Hofmann et al.). 1988). It is widely recognized that there is a risk that susceptible insect species may develop resistance against Cry Bt toxins. Consequently, active efforts have been made to identify new insecticidal proteins. One strategy that was used was to select Bacillus strains for the production of insecticidal proteins during the vegetative growth stages rather than during the sporulation stages. Using this approach, a number of "vegetative insecticidal proteins" or "VIPs" have been identified.

Estruch e outros (1996), WO 94/21795, WO 96/10083, WO 98/44137, Patente U.S. Ne 5.877.012, Patente U.S. Ne 6.107.279, Patente U.S. Ne 6.137.033 e Patente U.S. Ne 6.291.156 descrevem o isolamento de vip3A(a), vip3A(b) e vip3A(c) dos fluidos do sobrenadante de cepas de Bt AB88, AB424 e AB51. De acordo com os autores estes genes codificam pro- teínas com atividade inseticida para uma faixa ampla de pragas de insetos Lepidópteros. O WO 98/18932 e o WO 99/57282 descrevem um número de seqüências de nucleotídeos isoladas de cepas de Bt. Estas seqüências são referidas como mis (mis-1 até mis-8), war e sup. De acordo com os autores as proteínas codificadas possuem atividade contra pragas Lepidópteras e Coleópteras.Estruch et al. (1996), WO 94/21795, WO 96/10083, WO 98/44137, US Patent No. 5,877,012, US Patent No. 6,107,279, US Patent No. 6,137,033 and US Patent 6,291,156 describe. isolating vip3A (a), vip3A (b) and vip3A (c) from Bt AB88, AB424 and AB51 strains supernatant fluids. According to the authors, these genes encode proteins with insecticidal activity for a wide range of Lepidopteran insect pests. WO 98/18932 and WO 99/57282 describe a number of nucleotide sequences isolated from Bt strains. These sequences are referred to as mis (mis-1 through mis-8), war and sup. According to the authors the encoded proteins have activity against Lepidoptera and Coleoptera pests.

O WO 00/09697 descreve toxinas do tipo MIS e do tipo WAR solúveis termolábeis, assim como toxinas menores (1 até 10 kDa), que po- dem ser obtidas partindo do sobrenadante de culturas de cepas de Bacillus laterosporus, que, de acordo com os autores, possuem atividade contra as larvas do Verme de Raiz do Milho do Oeste. O WO 98/00546 e a Patente U.S. Ne 6.274.721 descrevem o isolamento de cepas de Bt e de toxinas de Bt, que, de acordo com os auto- res, possuem atividade contra pragas Lepidópteras. O WO 99/33991 descreve o isolamento de cepas de Bt e de to- xinas de BT, que, de acordo com os autores, possuem atividade contra pra- gas de Lepidópteras.WO 00/09697 describes soluble thermolabile MIS-type and WAR-type toxins, as well as minor toxins (1 to 10 kDa), which can be obtained from the culture supernatant of Bacillus laterosporus strains, which according to The authors have activity against the larvae of the West Corn Rootworm. WO 98/00546 and U.S. Patent No. 6,274,721 describe the isolation of Bt strains and Bt toxins, which, according to the authors, have activity against Lepidopteran pests. WO 99/33991 describes the isolation of Bt strains and BT toxins, which, according to the authors, have activity against Lepidopteran plagues.

Recentemente, Selvapandiyan e outros, (2001) descreveram o isolamento de um gene que codifica uma proteína denominada de VIP-S. De acordo com os autores a proteína VIP-S exibia toxicidade contra um número de espécies de insetos Lepidópteras.Recently, Selvapandiyan et al. (2001) described the isolation of a gene encoding a protein called VIP-S. According to the authors the VIP-S protein exhibited toxicity against a number of Lepidopteran insect species.

Doss e outros (2002) descrevem a clonagem de VIP3V da cepa Bt kurstaki. O WO 02/078437 descreve as toxinas VIP3 de Bt, tais como a VIP3A, a VIP3B e a toxina híbrida VIP3A-B.Doss et al. (2002) describe the cloning of VIP3V from the Bt kurstaki strain. WO 02/078437 describes Bt VIP3 toxins such as VIP3A, VIP3B and hybrid VIP3A-B toxin.

Apesar do isolamento e da caracterização de um número relati- vamente alto de proteínas inseticidas diferentes até hoje, permanece uma necessidade de identificação, isolamento e caracterização de novas proteí- nas inseticidas. As razões para isso são múltiplas. Em primeiro lugar, devido à especificidade de proteínas inseticidas para grupos particulares de pragas alvo (espectros de insetos hospedeiros), há uma necessidade de clonar ge- nes que codificam proteínas com espectros de atividade diferentes, de forma que para as plantas de cultivo diferentes e para as regiões geográficas dife- rentes estejam disponíveis proteínas adequadas para o combate de pragas de insetos. A especificidade das proteínas Cry de Bt, por exemplo, é na mai- or parte dos casos limitada. Permanece desejável a identificação de toxinas com especificidade para alvos de insetos diferentes. Em segundo lugar, após o uso prolongado em uma região geográfica, sabe-se que os insetos possuem a capacidade de desenvolver resistência aos inseticidas químicos, aos sprays microbianos (por exemplo, baseados em misturas de esporos - cristais de Bt) e acredita-se que tenham a capacidade de desenvolver resis- tência a plantas que expressam proteínas inseticidas. O desenvolvimento de resistência dentro de populações de insetos podería potencial mente tornar as proteínas inseticidas existentes ineficientes, fornecendo uma necessidade de novos genes e proteínas. Em terceiro lugar, por razões de saúde e ambi- entais é desejável identificar proteínas com potência inseticida específica alta e atividade biológica aguda para as espécies de insetos alvo.Despite the isolation and characterization of a relatively high number of different insecticide proteins to this day, there remains a need for identification, isolation and characterization of new insecticide proteins. The reasons for this are multiple. Firstly, due to the specificity of insecticidal proteins for particular groups of target pests (host insect spectra), there is a need to clone genes that encode proteins with different activity spectra, so that for different crop plants and for different geographical regions adequate proteins are available to combat insect pests. The specificity of the Bt Cry proteins, for example, is in most cases limited. Identification of toxins with specificity for different insect targets remains desirable. Secondly, after prolonged use in a geographical region, insects are known to have the ability to develop resistance to chemical insecticides, microbial sprays (eg based on spore mixtures - Bt crystals) and are believed to be capable of developing resistance to plants expressing insecticidal proteins. The development of resistance within insect populations could potentially render existing insecticidal proteins inefficient, providing a need for new genes and proteins. Thirdly, for health and environmental reasons it is desirable to identify proteins with high specific insecticidal potency and acute biological activity for the target insect species.

Posteriormente aqui, incluindo as modalidades diferentes descri- tas nas reivindicações, são descritas as novas sequências de ácido nucléico e as sequências de aminoácidos isoladas de cepas de Badlius thuringiensis, que são úteis para proteger as plantas de danos causados por insetos, seja pela expressão das seqüências de ácido nucléico dentro das plantas sob o controle de promotores adequados ou pela aplicação externa das toxinas nas plantas. As toxinas da presente invenção são distintas das toxinas pesti- cidas descritas anteriormente.Hereinafter, including the different embodiments described in the claims, the novel nucleic acid sequences and amino acid sequences isolated from Badlius thuringiensis strains, which are useful for protecting plants from insect damage, are described, either by expressing them. nucleic acid sequences within plants under the control of appropriate promoters or by external application of toxins to plants. The toxins of the present invention are distinct from the pesticide toxins described above.

Sumário da invenção A invenção fornece proteínas inseticidas ISP3 e os ácidos nu- cléico s que codificam as mesmas. São fornecidas as proteínas inseticidas ISP3-1099E (SEQ ID N°; 2), ISP3-327D (SEG ID N°: 4) e ISP3-2245J (SEQSummary of the Invention The invention provides ISP3 insecticidal proteins and the nucleic acids encoding them. Insecticide proteins ISP3-1099E (SEQ ID NO: 2), ISP3-327D (SEG ID No: 4) and ISP3-2245J (SEQ

ID Ne: 6) e os ácidos nucléicos que codificam as mesmas, isp3-1099E (SEG ID N§: 1), isp3-327D (SEQ ID Na: 3} e isp3-2245J (SEG ID Ne: 5), respecti- vamente. As proteínas da invenção possuem atividade inseticida contra pra- gas de insetos Lepidópteros, particularmente contra os insetos selecionados do grupo que consiste em Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Heíico- verpa punctigera, Heüothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugíper- da, Agrotis ipsilon, Pecíinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cna- phalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemma- talis, Plathypena scabra, Pseudoplusia includens, Spodoptera exigua, Spodoptera ornithogalli, Epinotia aporema e Rachiplusia nu.ID Ne: 6) and the nucleic acids encoding them, isp3-1099E (SEG ID No: 1), isp3-327D (SEQ ID No: 3} and isp3-2245J (SEG ID Ne: 5), respectively. The proteins of the invention have insecticidal activity against Lepidopteran insect plagues, particularly against insects selected from the group consisting of Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Heicoverpa punctigera, Heüothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugípera, Agrotis. ipsilon, Pecinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cna-phalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemmalis, Plathypena scabra, Pseudoplusia includens, Spodoptera exigua, Spodoptera ornithogiata and Epinogiata nu.

Em uma outra modalidade da invenção são fornecidas as varia- ções inseticidas e os fragmentos das proteínas ISP3 e os ácidos nucléicos que as codificam. As variações fornecidas são, por exemplo, seqüências de ácido nucléico, que se hibridizam sob condições rigorosas à SEQ ID Ne: 1, à SEQ ID Ne: 3 ou à SEQ ID Ne: 5.In another embodiment of the invention the insecticidal variations and fragments of the ISP3 proteins and the nucleic acids encoding them are provided. The variations provided are, for example, nucleic acid sequences, which hybridize under stringent conditions to SEQ ID Ne: 1, SEQ ID Ne: 3 or SEQ ID Ne: 5.

Em uma modalidade da invenção, são fornecidas proteínas inse- ticidas que compreendem pelo menos 91% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 2, pelo menos 91% de identidade de seqüência com a SEQ IDIn one embodiment of the invention, unsuccessful proteins are provided which comprise at least 91% sequence identity with SEQ ID Ne: 2, at least 91% sequence identity with SEQ ID

Ne: 4 ou pelo menos 88% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 6.Ne: 4 or at least 88% sequence identity with SEQ ID Ne: 6.

Em uma modalidade adicional da invenção, são fornecidas as seqüências de ácido nucléico isoladas que compreendem pelo menos 93% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 1, pelo menos 94% de identi- dade de seqüência com a SEQ ID Ne: 3 ou pelo menos 97% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 5.In a further embodiment of the invention, isolated nucleic acid sequences comprising at least 93% sequence identity with SEQ ID Ne: 1, at least 94% sequence identity with SEQ ID Ne: 3 are provided. or at least 97% sequence identity to SEQ ID Ne: 5.

Ainda em uma modalidade adicional, são fornecidas as seqüên- cias de ácido nucléico que codificam as proteínas ISP3 da invenção, sendo que a seqüência de ácido nucléico é uma seqüência sintética que foi otimi- zada para a expressão em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas ou em células vegetais. É um outro objetivo da invenção fornecer genes quiméricos, que compreendem uma seqüência promotora ligada de forma operacional a uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J ou variações ativas como inseticidas ou fragmentos das mesmas. São também fornecidos os vetores que com- preendem seqüências de ácido nucléico que codificam as proteínas ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J ou variações ou fragmentos ativos como inseticidas das mesmas. A invenção fornece ainda células hospedeiras que compreen- dem genes quiméricos, particularmente microorganismos ou células vege- tais, tecidos vegetais, órgãos vegetais, sementes vegetais ou plantas inteiras transgênicas que compreendem as seqüências de nucleotídeos que codifi- cam as proteínas ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3- 2245J ou fragmentos ou variações ativas como inseticidas das mesmas. Em uma modalidade a planta transformada é uma planta de milho ou de algo- dão. Em uma outra modalidade, a planta transformada é uma planta de arroz ou soja. Em uma modalidade adicional a planta transformada é qualquer planta, particularmente qualquer planta selecionada do grupo do sorgo, do trigo, da cevada, do centeio, do girassol, da cana-de-açúcar, do tabaco de espécies de Brassica (tais como a colza de semente oleosa, a mostarda, a couve, o brocólis etc.), espécies vegetais (tomate, couve-flor, rabanete, es- pinafre, pimenta, cebola, feijão, ervilha, cenoura etc.), beterraba, espécies de árvores (maçã, pêra, ameixa, coníferas, árvores decíduas etc.), batata, alfa- fa, manga, papaia, banana.Still in an additional embodiment, the nucleic acid sequences encoding the ISP3 proteins of the invention are provided, and the nucleic acid sequence is a synthetic sequence that has been optimized for expression in monocotyledonous or dicotyledonous plants or in cells. vegetables. It is a further object of the invention to provide chimeric genes comprising a promoter sequence operably linked to a nucleic acid sequence encoding an ISP3 protein, particularly ISP3-1099E, ISP3-327D or ISP3-2245J or active variations such as insecticides or fragments. the same. Also provided are vectors comprising nucleic acid sequences encoding the ISP3 proteins, particularly ISP3-1099E, ISP3-327D or ISP3-2245J or variations or fragments active as insecticides thereof. The invention further provides host cells comprising chimeric genes, particularly microorganisms or plant cells, plant tissues, plant organs, plant seeds or transgenic whole plants comprising nucleotide sequences encoding ISP3 proteins, particularly ISP3- 1099E, ISP3-327D or ISP3- 2245J or fragments or insecticide-active variations thereof. In one embodiment the transformed plant is a corn or cotton plant. In another embodiment, the transformed plant is a rice or soybean plant. In an additional embodiment the transformed plant is any plant, particularly any plant selected from the group of sorghum, wheat, barley, rye, sunflower, sugar cane, tobacco of Brassica species (such as rapeseed). oil, mustard, kale, broccoli, etc.), plant species (tomatoes, cauliflower, radish, spinach, pepper, onions, beans, peas, carrots, etc.), beets, tree species ( apple, pear, plum, conifers, deciduous trees, etc.), potato, alfalfa, mango, papaya, banana.

Em uma outra modalidade, são fornecidos métodos de proteção de uma planta contra os danos causados por insetos, que compreendem colocar a dita planta em contato com uma proteína ISP3 inseticida. A planta pode ser colocada em contato com uma proteína ISP3 através da transfor- mação da planta com uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma pro- teína ISP3 ou através da aplicação de uma proteína ISP3 externamente à planta.In another embodiment, methods of protecting a plant against insect damage are provided, which comprises bringing said plant into contact with an insecticidal ISP3 protein. The plant can be contacted with an ISP3 protein by transforming the plant with a nucleotide sequence encoding an ISP3 protein or by applying an ISP3 protein externally to the plant.

Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma cepa de Bt que compreende um ácido nucléico isp3, particularmente isp3-1099E, isp3- 327D ou isp3-2245J.In one embodiment of the invention, a Bt strain comprising an isp3 nucleic acid, particularly isp3-1099E, isp3- 327D or isp3-2245J is provided.

Em uma modalidade adicional, é fornecida uma composição in- seticida que compreende uma quantidade eficiente como inseticida da prote- ína ISP3. Quando aplicada externamente à planta, a composição inseticida aumenta a resistência aos danos causados por insetos quando comparada à das plantas de controle, às quais não é aplicada tal composição.In a further embodiment, an insecticidal composition comprising an insecticidally effective amount of the ISP3 protein is provided. When applied externally to the plant, the insecticidal composition increases the resistance to insect damage compared to control plants to which no such composition is applied.

Em uma modalidade adicional, é fornecido um método de evolu- ção de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3, o método compreende as etapas de: (a) fornecimento de uma população de sequências de ácido nu- cléico que codificam as sequências de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 e/ou 4 e/ou 6 ou variações ou fragmentos das sequências de aminoácidos da SEQ ID N®: 2 e/ou 4 e/ou 6 ou variações ou fragmentos das seqüências de ami- noácidos da SEQ ID Ne: 2 e/ou 4 e/ou 6, em que as ditas variações ou frag- mentos possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91% com a SEQ ID N°; 2 ou 4 e pelo menos 88% com a SEQ ID Ne: 6 (b) embaralhamento da dita população de variações ou de frag- mentos para formar as moléculas de ácido nucléico recombínantes (c) seleção ou separação de moléculas de ácido nucléico re- co mbi na ntes, que codificam proteínas que possuem atividade inseticida (d) repetição das etapas {a) até (c) com as moléculas de ácido nucléico recombínantes selecionadas na etapa (c) até que uma molécula de ácido nucléico reco mbi na nte seja encontrada na etapa (c), em que a proteí- na codificada pela dita molécula de ácido nucléico possui a propriedade in- seticida desejada.In a further embodiment, a method of evolving a nucleic acid sequence encoding an ISP3 protein is provided, the method comprising the steps of: (a) providing a population of nucleic acid sequences encoding the sequences of amino acids of SEQ ID NO: 2 and / or 4 and / or 6 or variations or fragments of amino acid sequences of SEQ ID N: 2 and / or 4 and / or 6 or variations or fragments of amino acid sequences of SEQ ID Ne: 2 and / or 4 and / or 6, wherein said variations or fragments have a sequence identity of at least 91% with SEQ ID NO; 2 or 4 and at least 88% with SEQ ID Ne: 6 (b) shuffling said population of variations or fragments to form recombinant nucleic acid molecules (c) selecting or separating nucleic acid molecules cb ments that encode proteins having insecticidal activity (d) repeating steps (a) through (c) with the recombinant nucleic acid molecules selected in step (c) until a recombinant nucleic acid molecule is found in step (c), wherein the protein encoded by said nucleic acid molecule has the desired insecticidal property.

Descrição Detalhada das Modalidades O campo da invenção é fornecer métodos e meios para a redu- ção de danos causados por pragas às plantas, particularmente pragas de insetos, mais particularmente pragas de insetos lepidópteros, Foram identifi- cadas e isoladas novas sequências de ácido nucléico e proteínas, que são distintas das sequências de ácido nucléico e das proteínas descritas anteri- ormente e que podem ser utilizadas para o controle de pragas de insetos através da integração e da expressão de pelo menos uma destas novas se- qüências de nucleotídeos em plantas ou células vegetais ou através do tra- tamento externo de plantas ou partes vegetais com composições que com- preendem as toxinas codificadas por estas moléculas de ácido nucléico, É uma modalidade da invenção fornecer novas toxinas pestici- das isoladas das cepas de Baciilus thuringiensis. Particularmente, são forne- cidas as proteínas pesticidas denominadas de proteína ISP3-1099E, proteí- na ISP3-327D e ISP3-2245J.Detailed Description of the Modalities The field of the invention is to provide methods and means for reducing pest damage to plants, particularly insect pests, more particularly lepidopteran insect pests. New nucleic acid sequences have been identified and isolated. proteins, which are distinct from the nucleic acid sequences and proteins described above and which can be used for insect pest control by integrating and expressing at least one of these novel nucleotide sequences in plants or cells. It is a embodiment of the invention to provide novel pesticidal toxins isolated from the Baciilus thuringiensis strains. In particular, pesticide proteins called ISP3-1099E protein, ISP3-327D protein and ISP3-2245J are provided.

De acordo com esta invenção, uma "sequência de ácido nuclêi- co" refere-se a uma molécula de DNA ou de RNA na forma de filamentos simples ou duplos, preferencial mente um DNA ou um RNA, particularmente um DNA, que codifica qualquer uma das proteínas ISP3 desta invenção.According to this invention, a "nucleic acid sequence" refers to a DNA or RNA molecule in the form of single or double strands, preferably DNA or RNA, particularly DNA, which encodes any one. of the ISP3 proteins of this invention.

Uma "seqüência de ácido nucléico isolada", como utilizado aqui, refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que não está mais em seu ambiente natu- ral onde foi isolada, por exemplo, da seqüência de ácido nucléico em um outro hospedeiro bacteriano ou em um genoma nuclear vegetal.An "isolated nucleic acid sequence" as used herein refers to a nucleic acid sequence that is no longer in its natural environment where it was isolated, for example, from the nucleic acid sequence in another bacterial host or in a plant nuclear genome.

De acordo com esta invenção, os termos "proteína" ou "polipep- tídeo" são utilizados de forma intercambeável para se referirem a uma molé- cula que consiste em uma cadeia de aminoácidos, sem referência a qual- quer modo de ação específico, tamanho, estruturas tridimensionais ou ori- gem. Conseqüentemente, um fragmento ou uma parte de uma proteína ISP3 da invenção é ainda referido aqui como uma "proteína". Uma "proteína isola- da", como utilizado aqui, refere-se a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural. O ambiente natural da proteína refere-se ao ambiente em que a proteína poderia ser encontrada quando a seqüência de nucleotídeos que a codifica foi expressa e traduzida em seu ambiente natural, isto é, no ambiente do qual a seqüência de nucleotídeos foi isolada. Por exemplo, uma proteína isolada pode estar presente in vitro ou em um outro hospedeiro bac- teriano ou em uma célula vegetal ou pode ser secretada partindo de um ou- tro hospedeiro bacteriano ou de uma célula vegetal.According to this invention, the terms "protein" or "polypeptide" are used interchangeably to refer to a molecule consisting of an amino acid chain, without reference to any specific mode of action, size , three-dimensional structures or origin. Accordingly, a fragment or part of an ISP3 protein of the invention is further referred to herein as a "protein". An "isolated protein" as used herein refers to a protein that is no longer in its natural environment. The natural environment of the protein refers to the environment in which the protein could be found when the nucleotide sequence encoding it was expressed and translated into its natural environment, that is, the environment from which the nucleotide sequence was isolated. For example, an isolated protein may be present in vitro or in another bacterial host or in a plant cell or may be secreted from another bacterial host or plant cell.

De acordo com esta invenção, as seqüências de ácido nucléico, particularmente as seqüências de DNA, que codificam novas proteínas ISP3 foram isoladas e caracterizadas. Os novos genes foram denominados isp3- 1099E, isp3-327D e isp3-2245J e suas proteínas codificadas ISP3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J, respectivamente.According to this invention, nucleic acid sequences, particularly DNA sequences, encoding new ISP3 proteins have been isolated and characterized. The new genes were named isp3-1099E, isp3-327D and isp3-2245J and their encoded proteins ISP3-1099E, ISP3-327D and ISP3-2245J, respectively.

De acordo com esta invenção "proteína ISP3-1099E" refere-se a qualquer proteína que compreenda o fragmento menor da seqüência de aminoácidos da SEQ ID Ne: 2, que mantenha a atividade inseticida (referido posteriormente aqui como o "menor fragmento tóxico"). Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas que compreendem o menor fragmento tóxico. São também incluídas nesta invenção as variações da seqüência de aminoácido na SEQ ID Ns: 2, tais como as seqüências de aminoácidos essencialmente similares à SEQ ID Ns: 2, que possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91%, particularmente de pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos, que é de- terminada utilizando alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O pro- grama GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para as comparações de seqüências de aminoácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'pe- nalidade de criação de espaços' (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalida- de de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento') de 2. Preferencial- mente, as proteínas que possuem alguns, preferencial mente 5-10, particu- larmente menos de 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou deletados sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar a atividade in- seticida da proteína ou pelo menos sem alterar a atividade inseticida da pro- teína de uma forma negativa, estão incluídas nesta definição.According to this invention "ISP3-1099E protein" refers to any protein comprising the minor fragment of the amino acid sequence of SEQ ID Ne: 2, which maintains insecticidal activity (hereinafter referred to as the "minor toxic fragment") . This includes hybrid or chimeric proteins that comprise the smallest toxic fragment. Also included in this invention are amino acid sequence variations in SEQ ID Ns: 2, such as amino acid sequences essentially similar to SEQ ID Ns: 2, which have a sequence identity of at least 91%, particularly at least 92. %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at the amino acid sequence level, which is determined using pairwise alignments using the GCG Wisconsin Package GAP program (Madison, Wisconsin, USA, version 10.2). The GAP program is used with the following parameters for amino acid sequence comparisons: the 'blosum62' classification matrix, a 'space creation penalty' (or 'space weight') of 8 and a 'space extension penalty' (or 'weight of length') of 2. Preferably, proteins having some, preferably 5-10, particularly less than 5, amino acids added, substituted or deleted without Significantly altering, preferably without altering protein insecticidal activity or at least without altering protein insecticidal activity in a negative manner, are included in this definition.

De acordo com esta invenção, a "proteína ISP3-327D" refere-se a qualquer proteína que compreenda o menor fragmento da seqüência de aminoácidos da SEQ ID Ne: 4 que mantenha a atividade inseticida (referido posteriormente aqui como o "menor fragmento tóxico"). Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas que compreendem o menor fragmento tóxico. São também incluídas nesta invenção as variações da seqüência de aminoácido na SEQ ID Ne: 4, tais como as seqüências de aminoácidos essencialmente similares, que possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91%, particularmente de pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos, que é determinada utilizando alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O programa GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para as comparações de seqüências de amino- ácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'penalidade de criação de espaços' (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalidade de extensão de es- paço' (ou 'peso do comprimento') de 2. Preferencialmente, as proteínas que possuem alguns, preferencial mente 5-10, particularmente menos de 5, ami- noácidos adicionados, substituídos ou deletados sem alterar significativa- mente, preferencial mente sem alterar a atividade inseticida da proteína ou pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma ne- gativa, estão incluídas nesta definição.According to this invention, "ISP3-327D protein" refers to any protein comprising the smallest fragment of the amino acid sequence of SEQ ID Ne: 4 that maintains insecticidal activity (hereinafter referred to as the "smallest toxic fragment"). ). This includes hybrid or chimeric proteins that comprise the smallest toxic fragment. Also included in this invention are amino acid sequence variations in SEQ ID Ne: 4, such as essentially similar amino acid sequences, which have a sequence identity of at least 91%, particularly at least 92%, 93%, 94. %, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at the amino acid sequence level, which is determined using pairwise alignments using the GCG Wisconsin Package GAP program (Madison, Wisconsin, USA, version 10.2). The GAP program is used with the following parameters for amino acid sequence comparisons: the 'blosum62' classification matrix, a 'space creation penalty' (or 'space weight') of 8 and a 'penalty Preferably, proteins having some, preferably 5-10, particularly less than 5, amino acids added, substituted or deleted without significantly altering preferably without altering the insecticidal activity of the protein or at least without altering the insecticidal activity of the protein in a negative manner are included in this definition.

De acordo com esta invenção, a "proteína ISP3-2245J" refere-se a qualquer proteína que compreenda o menor fragmento da seqüência de aminoácidos da SEQ ID Ne: 6, que mantenha a atividade inseticida (referido posteriormente aqui como o "menor fragmento tóxico"). Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas que compreendem o menor fragmento tóxico. São também incluídas nesta invenção as variações da seqüência de aminoácido na SEQ ID Ns: 6, tais como as seqüências de aminoácidos essencialmente similares à SEQ ID Ns: 2, que possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 88%, particularmente de pelo menos 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos, que é determinada utilizando alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O programa GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para as compara- ções de seqüências de aminoácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'penalidade de criação de espaços' (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalidade de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento') de 2. Prefe- rencialmente, as proteínas que possuem alguns, preferencial mente 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou dele- tados sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar a ativi- dade inseticida da proteína ou pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma negativa, estão incluídas nesta definição.In accordance with this invention, the "ISP3-2245J protein" refers to any protein comprising the smallest amino acid sequence fragment of SEQ ID Ne: 6, which maintains insecticidal activity (hereinafter referred to as the "minor toxic fragment"). "). This includes hybrid or chimeric proteins that comprise the smallest toxic fragment. Also included in this invention are amino acid sequence variations in SEQ ID Ns: 6, such as amino acid sequences essentially similar to SEQ ID Ns: 2, which have a sequence identity of at least 88%, particularly at least 89. %, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at the amino acid sequence level, which is determined using pairwise alignments using the Wisconsin GAP package program. GCG (Madison, Wisconsin, USA, version 10.2). The GAP program is used with the following parameters for amino acid sequence comparisons: the 'blosum62' classification matrix, a 'space creation penalty' (or 'space weight') of 8 and a 'penalty 2. Preferably, proteins having some, preferably 5-10, particularly less than 5, amino acids added, substituted or deleted without significantly altering, preferably without altering the insecticidal activity of the protein or at least without altering the insecticidal activity of the protein in a negative way are included in this definition.

Como utilizado aqui, "que compreende" deve ser interpretado como especificando a presença das características citadas, os números in- teiros, as etapas ou os componentes aos quais são referidos, mas não im- pede a presença ou a adição de uma ou mais características, números intei- ros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, o termo "DNA/proteína que compreende a seqüência ou a região X", como utilizado aqui, refere-se a um DNA ou uma proteína que inclui ou contém pelo menos a seqüência ou a região X, de forma que outras seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos possam ser incluídos na extremidade 5' (N-terminal) e/ou 3' (C-terminal), por exemplo, (a seqüência de nucleotídeos de) uma proteína marcadora que pode ser selecionada como é divulgado na EP 0 193 259, (a seqüência de nucleotídeos de) um peptídeo de trânsito e/ou uma seqüência líder a 5' ou a 3'. O "menor fragmento tóxico" de uma proteína ISP3 da invenção, como utilizado aqui, é o menor fragmento ou parte de uma proteína ISP3 que retenha a atividade inseticida que pode ser obtida através da digestão enzimática da proteína ISP3 de comprimento completo ou o menor fragmen- to ou parte de uma proteína ISP3 que retenha a atividade inseticida que po- de ser obtida fazendo deleções de nucleotídeos no DNA que codifica uma proteína ISP3. É entendido, que o DNA que codifica fragmentos de ISP3 tó- xicos mais curtos também pode ser sintetizado quimicamente e o fragmento tóxico menor que pode ser obtido da transcrição e da tradução do DNA sin- tético é incluído na definição de menor fragmento tóxico.As used herein, "comprising" shall be construed as specifying the presence of the aforementioned characteristics, the whole numbers, the steps or the components to which they are referred, but does not preclude the presence or addition of one or more characteristics. , whole numbers, steps or components or groups thereof. Thus, the term "DNA / protein comprising the sequence or region X" as used herein refers to a DNA or protein that includes or contains at least the sequence or region X, such that other sequences of nucleotides or amino acids may be included at the 5 '(N-terminal) and / or 3' (C-terminal) end, for example (the nucleotide sequence of) a selectable marker protein as disclosed in EP 0 193 259, (the nucleotide sequence of) a transit peptide and / or a 5 'or 3' leader sequence. The "smallest toxic fragment" of an ISP3 protein of the invention as used herein is the smallest fragment or part of an ISP3 protein that retains insecticidal activity that can be obtained by enzymatic digestion of the full length ISP3 protein or the smallest fragmen. - or part of an ISP3 protein that retains the insecticidal activity that can be obtained by deleting nucleotides in the DNA encoding an ISP3 protein. It is understood that DNA encoding shorter toxic ISP3 fragments can also be chemically synthesized and the smaller toxic fragment that can be obtained from the transcription and translation of synthetic DNA is included in the definition of the smallest toxic fragment.

Em uma modalidade da invenção, o menor fragmento tóxico de uma proteína ISP3 possui um peso molecular de aproximadamente 65 kDa que é determinado através da análise de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio). Em uma outra modalidade, o me- nor fragmento tóxico de uma proteína ISP3 possui um peso molecular de aproximadamente 23 kDa. Em uma outra modalidade, o menor fragmento tóxico de uma proteína ISP3 possui um peso molecular de aproximadamente 33 kDa. Em uma modalidade adicional, o menor fragmento tóxico compre- ende os aminoácidos centrais da proteína ISP3, em particular do aminoácido 200 até o aminoácido 455 da SEQ ID Ne: 2, da SEQ ID Ne: 4 ou da SEQ IDIn one embodiment of the invention, the smallest toxic fragment of an ISP3 protein has a molecular weight of approximately 65 kDa which is determined by SDS-PAGE (sodium polyacrylamide gel electrophoresis) analysis. In another embodiment, the smallest toxic fragment of an ISP3 protein has a molecular weight of approximately 23 kDa. In another embodiment, the smallest toxic fragment of an ISP3 protein has a molecular weight of approximately 33 kDa. In a further embodiment, the smallest toxic fragment comprises the central amino acids of the ISP3 protein, in particular amino acid 200 to amino acid 455 of SEQ ID Ne: 2, SEQ ID Ne: 4 or SEQ ID

Ne: 6. A digestão enzimática das proteínas ISP3 pode ser realizada utilizando enzimas purificadas ou utilizando fluidos do suco gástrico de lar- vas de insetos e incubando os extratos do suco gástrico com soluções que compreendem uma das proteínas ISP3, como é descrito em Yu e outros (1997). Os produtos proteolíticos podem ser separados e visualizados em SDS-PAGE. Os ensaios biológicos podem ser realizados com fragmentos protéicos fracionados por cromatografia processados com a finalidade de determinar a relação entre cada fragmento proteolítíco e a sua atividade in- seticida. O suco gástrico preferido utilizado para determinar o menor frag- mento tóxico de proteínas ISP3 é o suco gástrico de insetos Lepidópteros, preferencial mente do Verme da Espiga de Milho (Heticoverpa zea)> da La- garta do Algodão (Heiicoverpa armtgera), do Verme do Broto Nativo (Heiico- verpa punctigera), do Verme do Broto do Tabaco (Helioíhis virescens), da Broca do Milho Europeu (Qstrinia nubüaiis}, da Lagarta de Cereais do Outo- no (Spodoptera frugiperda), da Lagarta Negra que destrói plantas novas (Agrotis ipsilon), da Lagarta Cor-de-Rosa do Algodoeiro (Pecíinophora gos- syp/e//a), da Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incetluias), do Dobra- dor de Folhas (Cnaphalocrocis medinaiis), da Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens), da Broca em Manchas do Caule do Milho (Chilo partei- ius), da Lagarta Aveludada (Anticarsia gemmatalis), do Mede-Palmos da So- ja (Pseudopiusia inciudens), da Broca da Vagem (Epinotia aporema), Rachi- plusia nu.Ne: 6. The enzymatic digestion of ISP3 proteins may be performed using purified enzymes or using gastric juice fluids from larvae and incubating the gastric juice extracts with solutions comprising one of the ISP3 proteins as described in Yu and others (1997). Proteolytic products can be separated and visualized in SDS-PAGE. Biological assays may be performed with chromatographically fractionated protein fragments processed to determine the relationship between each proteolytic fragment and its insecticidal activity. The preferred gastric juice used to determine the smallest toxic fragment of ISP3 proteins is the gastric juice of Lepidopteran insects, preferably from the Corn Cob Worm (Heticoverpa zea)> Cotton Worm (Heiicoverpa armtgera), from the Worm. of the Native Sprout (Heiicoverpa punctigera), the Tobacco Sprout Worm (Helioíhis virescens), the European Corn borer (Qstrinia nubüaiis}, the Autumn Cereal Caterpillar (Spodoptera frugiperda), the Black Caterpillar that destroys plants (Agrotis ipsilon), Pink Cottonworm (Pecínophora gosysp / e // a), Yellow Stem Drill (Scirphophaga incetluias), Leaf Bender (Cnaphalocrocis medinaiis), Stem Pink (Sesamia inferens), Corn Stem Drill (Chilo parti- ius), Velvety Caterpillar (Anticarsia gemmatalis), Sow Mede-Palmos (Pseudopiusia inciudens), da Pod (Epinotia aporema), Rachitia nu.

As extremidades das sequências de amínoácidos N- e C- terminais do menor fragmento tóxico são conveniente mente determinadas através da determinação da sequência de aminoácidos dos fragmentos ante- riores através de técnicas rotineira mente disponíveis na técnica.The ends of the N- and C-terminal amino acid sequences of the smallest toxic fragment are conveniently determined by determining the amino acid sequence of the preceding fragments by techniques routinely available in the art.

Como utilizado aqui, os termos "i$p3-1099E", Mi$p3-327D” e "i$p3-2245J‘ referem-se a qualquer seqüência de DNA que codifica a "prote- ína ISP3-1099E" ou a "proteína ISP3-327D" ou a "proteína ISP3-2245J", respectiva mente, como é definido anterior mente. Isto inclui as sequências de DNA que ocorrem naturalmente, artificiais ou sintéticas que codificam as pro- teínas da SEQ ID Ne: 2 ou da SEQ ID N-: 4 ou da SEQ ID NG: 6 ou seus fra- gmentos ou variações inseticidas como definido anteriormente. São também incluídas aqui as seqüências de DNA, que codificam proteínas inseticidas, que são similares o suficiente às seqüências de DNA fornecidas na listagem de sequência de forma que possam se {isto é, ter a capacidade de) hibridizar com estas seqüências de DNA sob condições de híbridizaçâo rigorosas. "Condições de hibridização rigorosas", como utilizado aqui, refe- re-se particularmente às condições a seguir: imobilização do DNA relevante em um filtro e pré-hibridização dos filtros durante 1 até 2 horas em 50% de formamida, SSPE 5 x, reagente de Denhardt 2 x e SDS 0,1% a 42°C ou 1 ou 2 horas em SSC 6 x, reagente de Denhardt 2 x e SDS 0,1 % a 68°C. A sonda marcada (Digoxigenina ou radioativa) desnaturada é então adicionada dire- tamente ao fluido de pré-hibridização e a incubação é realizada durante 16 até 24 horas na temperatura apropriada mencionada anteriormente. Após a incubação, os filtros são então lavados durante 30 minutos à temperatura ambiente em SSC 2 x, SDS 0,1%, seguidos por 2 lavagens de 30 minutos cada a 68°C em SSC 0,5 x e SDS 1%. Uma auto-radiografia é estabelecida através da exposição dos filtros durante 24 até 48 horas a um filme de raio-XAs used herein, the terms "i $ p3-1099E", Mi $ p3-327D "and" i $ p3-2245J 'refer to any DNA sequence encoding the "ISP3-1099E protein" or " ISP3-327D "or" ISP3-2245J protein ", respectively, as defined above. This includes the naturally occurring, artificial or synthetic DNA sequences encoding the proteins of SEQ ID Ne: 2 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NG: 6 or fragments or insecticidal variations thereof as defined above Also included herein are DNA sequences encoding insecticidal proteins which are similar enough to the DNA sequences provided in sequence listing so that they can (ie have the ability to) hybridize to these DNA sequences under stringent hybridization conditions. "Stringent hybridization conditions" as used herein refers particularly to the following conditions : immobilization of relevant DNA in a filter and prehybridization of filters for 1 to 2 hours in 50% formamide, 5 x SSPE, 2 x Denhardt reagent and 0.1% SDS at 42 ° C or 1 or 2 hours in 6 x SSC, 2 x Denhardt reagent 0.1% SDS at 68 ° C. The denatured labeled (Digoxigenin or radioactive) probe is then added directly to the prehybridization fluid and incubated for 16 to 24 hours at the appropriate temperature mentioned above. After incubation, the filters are then washed for 30 minutes at room temperature in 2 x SSC, 0.1% SDS, followed by 2 30 minute washes each at 68 ° C in 0.5 x SSC and 1% SDS. An autoradiograph is established by exposing the filters for 24 to 48 hours to an x-ray film.

(Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70°C com uma tela intensificadora. [SSC 20 x = NaCI 3 M e citrato de sódio 0,3 M; reagente de Denhart 100 x = 2% (p/v) de albumina de soro bovino, 2% (p/v) Ficoll™ e 2% (p/v) de polivinilpir- rolidona; SDS = dodecil sulfato de sódio; SSPE 20 x = NaCI 3,6 M, fosfato de sódio 0,2 M e EDTA 0,02M pH 7,7]. Evidentemente, condições e parâmetros equivalentes podem ser utilizados neste processo enquanto mantêm ainda as condições de hibridização rigorosas. É evidente que há muitas abordagens conhecidas na técnica para o isolamento de variações das seqüências de DNA da invenção. As variações podem, por exemplo, ser isoladas partindo de cepas de Bt através da hibridização descrita supra e/ou através da tecnologia da PCR que é co- nhecida na técnica. Os iniciadores específicos ou degenerados podem ser produzidos para regiões das seqüências de DNA do isp3 e utilizados para amplificar variações de cepas conhecidas ou novas de Bt.(Kodak XAR-2 or equivalent) at -70 ° C with an intensifying screen. [SSC 20 x = 3 M NaCl and 0.3 M sodium citrate; Denhart's reagent 100 x = 2% (w / v) bovine serum albumin, 2% (w / v) Ficoll ™ and 2% (w / v) polyvinylpyrrolidone; SDS = sodium dodecyl sulfate; 20 x SSPE = 3.6 M NaCl, 0.2 M sodium phosphate and 0.02 M EDTA pH 7.7]. Of course, equivalent conditions and parameters can be used in this process while still maintaining stringent hybridization conditions. Clearly, there are many known approaches in the art for isolating variations of the DNA sequences of the invention. Variations may, for example, be isolated from Bt strains by the hybridization described above and / or by PCR technology which is known in the art. Specific or degenerate primers can be produced for regions of the isp3 DNA sequences and used to amplify variations of known or new Bt strains.

As variações preferidas do DNA de isp3-1099E desta invenção são seqüências de DNA que codificam as variações de proteínas ISP-1099E inseticidas descritas anteriormente ou uma seqüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelo menos 93%, particularmente pelo menos 94%, mais preferencial mente 95%, 96% ou 97%, mais preferencial mente pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 1. As variações preferidas do DNA de isp3-327D desta invenção são as seqüências de DNA que codificam as variações de proteínas ISP3- 327D descritas anteriormente ou uma seqüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelo menos 94%, preferencialmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 3. As variações preferidas do DNA de isp3-2245J desta invenção são seqüências de DNA que codificam as variações da proteína ISP3-2245J descritas anteriormente ou uma se- qüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelo menos 97%, preferencialmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 5. As identidades de seqüência referidas às anteriores são calculadas utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA) Versão 10.2. O programa de GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para os ácidos nucléicos: a matriz de classificação 'nwsgapdna', uma 'penalidade de criação de espaço' (ou 'peso do espaço') de 50 e uma 'penalidade de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento') de 3. As condições de hibridização rigorosa são como defini- do anteriormente. "Atividade inseticida" de uma proteína, como utilizado aqui, signi- fica a capacidade de uma proteína de matar insetos quando tal proteína é alimentada aos insetos, preferencialmente através da expressão em um hospedeiro recombinante tal como uma planta. É entendido que uma proteí- na possui atividade inseticida se esta possuir a capacidade de matar o inseto durante pelo menos um de seus estágios de desenvolvimento, preferencial- mente o estágio larvar. "Quantidades de controle de insetos" de uma proteína, como utilizado aqui, refere-se a uma quantidade de proteína que é suficiente para limitar os danos em uma planta, causados por insetos (por exemplo, larvas de insetos) que se alimentam de tal planta, em níveis comercialmente acei- táveis, por exemplo, matando os insetos ou inibindo o desenvolvimento, a fertilidade ou o crescimento do inseto de uma maneira que forneçam menos danos a uma planta e o rendimento da planta não é significativamente afeta- do de forma adversa.Preferred variations of the isp3-1099E DNA of this invention are DNA sequences encoding the previously described insecticidal ISP-1099E protein variations or a DNA sequence encoding an insecticidal protein of at least 93%, particularly at least 94%. More preferably 95%, 96% or 97%, more preferably at least 98% or at least 99% sequence identity to SEQ ID Ne: 1. Preferred variations of the isp3-327D DNA of this invention are as follows. DNA sequences encoding the previously described ISP3- 327D protein variations or a DNA sequence encoding an insecticidal protein of at least 94%, preferably at least 95%, particularly at least 96%, 97%, 98% or at least 99% sequence identity to SEQ ID Ne: 3. Preferred DNA variations of isp3-2245J of this invention are DNA sequences encoding the variations of the ISP3-2245J protein described above. or a DNA sequence encoding an insecticidal protein of at least 97%, preferably at least 98% or at least 99% sequence identity with SEQ ID Ne: 5. The sequence identities referred to above are calculated using the GCG Wisconsin Package GAP program (Madison, Wisconsin, USA) Version 10.2. The GAP program is used with the following parameters for nucleic acids: the 'nwsgapdna' classification matrix, a 'space creation penalty' (or 'space weight') of 50 and a 'space extension penalty' '(or' weight of length ') of 3. Stringent hybridization conditions are as defined above. "Insecticidal activity" of a protein as used herein means the ability of a protein to kill insects when such a protein is fed to insects, preferably through expression in a recombinant host such as a plant. It is understood that a protein has insecticidal activity if it has the ability to kill the insect during at least one of its developmental stages, preferably the larval stage. "Insect Control Amounts" of a protein as used herein refers to an amount of protein that is sufficient to limit the damage to a plant caused by insects (eg insect larvae) that feed on such a protein. commercially acceptable levels, for example by killing insects or inhibiting insect development, fertility or growth in a manner that provides less damage to a plant and the yield of the plant is not significantly affected. adverse.

De acordo com esta invenção, os insetos susceptíveis às novas proteínas ISP3 da invenção são colocados em contato com esta proteína em quantidades que controlam os insetos, preferencialmente, em quantidades inseticidas. Os insetos alvos preferidos para as proteínas desta invenção são pragas de insetos que danificam economicamente as plantas de milho, algo- dão, arroz ou soja, particularmente nos países da Américas do Norte e do Sul, da Ásia e da Austrália. O termo planta, como utilizado aqui, abrange plantas inteiras assim como partes de plantas, tais como folhas, caules, se- mentes, flores ou raízes. Os insetos alvo particularmente preferidos para as proteínas ISP3 desta invenção são pragas de insetos lepidópteros, tais como Heliothis spp., Helicoverpa spp., Spodoptera spp., Ostrinia spp., Pectinopho- ra spp., Agrotis spp., Scirphophaga spp., Cnaphalocrocis spp., Sesamia spp., Chilo spp., Anticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp. e Rachi- plusia spp., preferencialmente Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helico- verpa armigera, Helicoverpa punctera, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugi- perda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens, Epinotia aporema e Rachiplusia nu. As proteínas ISP3 da invenção possuem particularmente atividade inseticida contra pelo menos uma espécie de insetos lepidópteros, mais preferencial- mente contra várias espécies de insetos Lepidópteros.In accordance with this invention, insects susceptible to the novel ISP3 proteins of the invention are contacted with this protein in insect controlling amounts, preferably insecticidal amounts. Preferred target insects for the proteins of this invention are insect pests that economically damage maize, cotton, rice or soybean plants, particularly in the countries of North and South America, Asia and Australia. The term plant as used herein encompasses whole plants as well as plant parts such as leaves, stems, seeds, flowers or roots. Particularly preferred target insects for the ISP3 proteins of this invention are lepidopteran insect pests such as Heliothis spp., Helicoverpa spp., Spodoptera spp., Ostrinia spp., Agrectis spp., Scirphophaga spp. spp., Sesamia spp., Chilo spp., Anticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp. and Rachi-plusia spp., preferably Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Helicoverpa punctera, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugi- , Pseudoplusia includens, Epinotia aporema and Rachiplusia nu. The ISP3 proteins of the invention have particularly insecticidal activity against at least one species of lepidopteran insects, more preferably against various species of lepidopteran insects.

Os termos "proteína ISP3", "proteína ISP3 desta invenção", "pro- teína ISP" ou "proteína ISP desta invenção", como utilizados aqui, referem- se a qualquer uma das novas proteínas isoladas de acordo com esta inven- ção e identificadas e definidas aqui como as proteínas ISP3-1099E, ISP3- 327D e ISP3-2245J.The terms "ISP3 protein", "ISP3 protein of this invention", "ISP protein" or "ISP protein of this invention" as used herein refer to any of the novel proteins isolated according to this invention and identified and defined herein as the ISP3-1099E, ISP3- 327D and ISP3-2245J proteins.

Uma proteína ISP3, como utilizado aqui, pode ser uma proteína no tamanho de comprimento completo ou pode estar em uma forma trunca- da contanto que a atividade inseticida seja mantida ou pode ser uma combi- nação de proteínas ou domínios de proteínas diferentes em uma proteína híbrida ou de fusão. Uma "toxina de ISP3" refere-se a um fragmento ou a uma parte inseticida de uma proteína ISP3, particularmente ao menor frag- mento tóxico da mesma. Um "gene isp", "gene isp3", "DNA de isp" ou "DNA de isp3", como utilizado aqui, é uma seqüência de DNA que codifica uma proteína ISP3 de acordo com esta invenção, se referindo particularmente a qualquer uma das seqüências de DNA do isp3-1099E, do isp3-327D ou do isp3-2245J definidas aqui. A seqüência de ácido nucléico, particularmente a seqüência de DNA, que codifica as proteínas ISP3 desta invenção pode ser produzida de forma sintética e pode ser inserida em vetores de expressão para produzir altas quantidades de proteínas ISP3. As proteínas ISP3 podem ser utilizadas para preparar anticorpos monoclonais ou policlonais específicos de uma maneira convencional (Hõfte e outros, 1988; Harlow e Lane, 1988).An ISP3 protein as used herein may be a full-length protein or may be in a truncated form as long as the insecticidal activity is maintained or may be a combination of different proteins or protein domains in one protein. hybrid or fusion. An "ISP3 toxin" refers to a fragment or an insecticidal part of an ISP3 protein, particularly the smallest toxic fragment thereof. An "isp gene", "isp3 gene", "isp DNA" or "isp3 DNA" as used herein is a DNA sequence encoding an ISP3 protein according to this invention, particularly referring to any of isp3-1099E, isp3-327D or isp3-2245J DNA sequences defined herein. The nucleic acid sequence, particularly the DNA sequence, encoding the ISP3 proteins of this invention can be synthetically produced and can be inserted into expression vectors to produce high amounts of ISP3 proteins. ISP3 proteins may be used to prepare specific monoclonal or polyclonal antibodies in a conventional manner (Hoff et al., 1988; Harlow and Lane, 1988).

Em uma modalidade da invenção, são fornecidos anticorpos que se ligam especificamente à proteína ISP3. Em particular, são fornecidos an- ticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam à ISP3-1099E, à ISP3- 327D ou à ISP3-2245J ou a fragmentos ou variações das mesmas. Estão incluídos os fragmentos de anticorpos monoclonais ou policlonais, que man- têm a capacidade de se ligarem à proteína ISP3 ou a um fragmento contra o qual foram produzidos. Um anticorpo para uma proteína ISP3 pode ser pre- parado através da utilização da proteína ISP3 como um antígeno em um animal (tal como um coelho ou um camundongo), utilizando métodos conhe- cidos na técnica, tais como os descritos em Harlow e Lane "Using Antibodi- es: A Laboratory Manual" (Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998), em Liddell e Cryer "A Praticai Guide to Monoclonal Antibodies" (Wiley and Sons, 1991). Os anticorpos podem ser utilizados para isolar, identificar, caracterizar ou purificar a proteína ISP3 à qual se ligam. Por exemplo, o an- ticorpo pode ser utilizado para detectar a proteína ISP3 em uma amostra, permitido que o anticorpo e a proteína formem um complexo imunológico e detectando a presença do complexo imunológico, por exemplo, através de ELISA ou de imunoblots.In one embodiment of the invention, antibodies that specifically bind to the ISP3 protein are provided. In particular, monoclonal or polyclonal antibodies that bind to ISP3-1099E, ISP3- 327D or ISP3-2245J or fragments or variations thereof are provided. Included are monoclonal or polyclonal antibody fragments that retain the ability to bind to the ISP3 protein or a fragment against which they were produced. An antibody to an ISP3 protein can be prepared by using the ISP3 protein as an antigen in an animal (such as a rabbit or mouse) using methods known in the art such as those described in Harlow and Lane. " Using Antibodies: A Laboratory Manual "(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998), in Liddell and Cryer" A Practical Guide to Monoclonal Antibodies "(Wiley and Sons, 1991). Antibodies may be used to isolate, identify, characterize or purify the ISP3 protein to which they bind. For example, the antibody may be used to detect the ISP3 protein in a sample, allowing the antibody and protein to form an immune complex and detecting the presence of the immune complex, for example by ELISA or immunoblots.

Em adição, são fornecidos kits imunológicos, úteis para a detec- ção de proteínas ISP3, fragmentos ou epitopos de proteínas em uma amos- tra. As amostras podem ser células, sobrenadantes de células, suspensões de células e similares. Tal kit compreende um anticorpo que se liga à proteí- na ISP3 (ou a um fragmento da mesma) e um ou mais reagentes para de- tecção imunológica.In addition, immunological kits useful for detecting ISP3 proteins, protein fragments or epitopes in a sample are provided. Samples may be cells, cell supernatants, cell suspensions and the like. Such a kit comprises an antibody that binds to the ISP3 protein (or a fragment thereof) and one or more reagents for immunological detection.

Os anticorpos também podem ser utilizados para isolar proteínas inseticidas com atividade similar, por exemplo, através de ELISA (ensaio imunológico ligado à enzima) ou "Western blotting". As linhagens de anticor- pos monoclonais com especificidade de ligação desejada podem ser tam- bém utilizadas para clonar o DNA para o anticorpo monoclonal particular.Antibodies can also be used to isolate insecticidal proteins with similar activity, for example by ELISA (enzyme linked immunoassay) or Western blotting. Monoclonal antibody strains with desired binding specificity may also be used to clone DNA for the particular monoclonal antibody.

Em uma modalidade adicional da invenção, são fornecidos inici- adores da PCR e/ou sondas e kits para a detecção das seqüências de DNA do isp3-1099E, do isp3-327D ou do isp3-2245J. Os pares de iniciadores para a PCR para amplificar o DNA de isp3 partindo de amostras podem ser sinte- tizados com base na SEQ ID Ne: 1, na SEQ ID Ne: 3 ou na SEQ ID Ne: 5, como é conhecido na técnica (ver Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Pri- mer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press e McPher- son e outros (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primeira Edi- ção, Springer Verlag, Alemanha). Similarmente, os fragmentos de DNA da SEQ ID Ns: 1, da SEQ ID Ns: 3 ou da SEQ ID Ne: 5 podem ser utilizados co- mo sondas de hibridização. Um kit de detecção de isp3 pode compreender iniciadores específicos para isp3 ou sondas específicas para isp3 e um pro- tocolo associado para utilizar os iniciadores ou as sondas para detectar o DNA de isp3 em uma amostra. Tal kit de detecção pode, por exemplo, ser utilizado para determinar, se uma planta foi transformada com um gene isp3 (ou parte do mesmo) da invenção.In a further embodiment of the invention, PCR primers and / or probes and kits for detecting isp3-1099E, isp3-327D or isp3-2245J DNA sequences are provided. Primer pairs for PCR to amplify isp3 DNA from samples can be synthesized based on SEQ ID Ne: 1, SEQ ID Ne: 3 or SEQ ID Ne: 5, as is known in the art ( see Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Prime: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press and McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany). Similarly, DNA fragments of SEQ ID Ns: 1, SEQ ID Ns: 3, or SEQ ID Ne: 5 may be used as hybridization probes. An isp3 detection kit may comprise isp3 specific primers or isp3 specific probes and an associated protocol for using the primers or probes to detect isp3 DNA in a sample. Such a detection kit may, for example, be used to determine if a plant has been transformed with an isp3 gene (or part thereof) of the invention.

Devido à degeneração do código genético, alguns códons de aminoácidos podem ser substituídos por outros sem alterar a seqüência de aminoácidos da proteína. Além disso, alguns aminoácidos podem ser substi- tuídos por outros aminoácidos equivalentes sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar, a atividade inseticida da proteína, pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma negativa. Por exemplo, as substituições conservativas de aminoácidos dentro das catego- rias básicas (por exemplo, Arg, His, Lys), ácida (por exemplo, Asp, Glu), não polar (por exemplo, Ala, Vai, Trp, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp) ou polar (por exemplo, Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gin) estão dentro do âmbito da inven- ção contanto que a atividade inseticida da proteína ISP3 não seja significati- vamente, preferencialmente não, alterada, pelo menos não alterada de uma maneira negativa. Em adição, as substituições de aminoácidos não conser- vativas estão dentro do âmbito da invenção contanto que a atividade inseti- cida da proteína ISP3 não seja alterada significativamente, preferencialmen- te não ou pelo menos não alterada de uma maneira negativa. As variações ou os equivalentes das seqüências de DNA da invenção incluem seqüências de DNA que se hibridizam com as seqüências de DNA de isp3 da SEQ IDDue to the degeneration of the genetic code, some amino acid codons can be replaced with others without changing the amino acid sequence of the protein. In addition, some amino acids may be substituted for other equivalent amino acids without significantly altering, preferably without altering, the insecticidal activity of the protein, at least without altering the insecticidal activity of the protein in a negative manner. For example, conservative amino acid substitutions within the basic categories (e.g. Arg, His, Lys), acidic (e.g. Asp, Glu), nonpolar (e.g. Ala, Val, Trp, Leu, Ile). , Pro, Met, Phe, Trp) or polar (e.g., Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gin) are within the scope of the invention as long as the insecticidal activity of the ISP3 protein is not significantly preferably unchanged, at least unchanged in a negative manner. In addition, non-conservative amino acid substitutions are within the scope of the invention as long as the insecticidal activity of the ISP3 protein is not significantly altered, preferably not or at least not negatively altered. Variations or equivalents of the DNA sequences of the invention include DNA sequences that hybridize to the isp3 DNA sequences of SEQ ID.

Ne: 1 ou da SEQ ID Ne: 3 ou da SEQ ID Ns: 5 sob condições de hibridização rigorosas e que codificam uma proteína com as mesmas características in- seticidas que às da proteína desta invenção ou seqüências de DNA que possuem um uso de códons diferente comparado com o dos genes isp3 na- tivos desta invenção, mas que codificam uma proteína com a mesma ativi- dade inseticida e com substancialmente a mesma, preferencialmente a mesma, seqüência de aminoácidos. As seqüências de DNA de isp3 podem ter os códons otimizados através da adaptação do uso de códons aos mais preferidos nos genes vegetais, particularmente aos genes nativos do gênero ou da espécie vegetal de interesse (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura e ou- tros, 1977) utilizando tabelas de uso de códons disponíveis (por exemplo, mais adaptadas para a expressão no algodão, na soja, no milho ou no ar- roz). As tabelas de uso de códons para várias espécies de plantas são publi- cadas, por exemplo, por Ikemura (1993) e Nakamura e outros (2000).Ne: 1 or SEQ ID Ne: 3 or SEQ ID Ns: 5 under stringent hybridization conditions and encoding a protein having the same insecticidal characteristics as those of the protein of this invention or DNA sequences having codon usage compared to that of the native isp3 genes of this invention but which encode a protein having the same insecticidal activity and substantially the same, preferably the same, amino acid sequence. Isp3 DNA sequences can be codon optimized by adapting codon usage to the most preferred in plant genes, particularly native genes of the genus or plant species of interest (Bennetzen & Hall 1982; Itakura et al. 1977) using available codon usage tables (for example, best suited for expression in cotton, soybean, maize or rice). Codon usage tables for various plant species are published, for example, by Ikemura (1993) and Nakamura et al. (2000).

Ainda, filamentos longos de nucleotídeos AT ou GC podem ser removidos e sítios de restrição adequados podem ser introduzidos.In addition, long strands of AT or GC nucleotides may be removed and suitable restriction sites may be introduced.

Ainda, o terminal N de uma proteína ISP3 pode ser modificado para possuir um contexto ótimo de início da tradução, adicionando ou dele- tando da mesma um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal da proteína. Na maior parte dos casos, é preferido que as proteínas da inven- ção sejam expressas em células vegetais iniciando com um dipeptídeo Met- Asp ou Met-Ala para o início ótimo da tradução, requerendo a inserção no DNA de isp3 de um códon que codifica um aminoácido Asp ou Ala a jusante do códon de início como um novo segundo códon. Alternativamente, o quar- to nucleotídeo da SEQ ID Ne: 1, da SEQ ID Ne: 3 ou da SEQ ID Ns: 5 pode ser substituído por um 'G', de forma que o segundo aminoácido (seguido da Met) seja Asp. Similarmente, o segundo códon (AAC ou AAT, que codifica Asn) pode ser substituído por um códon para Asp (GAT ou GAC) ou Ala (GCT, GCC, GCA ou GCG) ou por qualquer outro códon que comece com um 'G'.In addition, the N-terminus of an ISP3 protein can be modified to have an optimal translation initiation context by adding or deleting one or more amino acids at the N-terminus of the protein. In most cases, it is preferred that the proteins of the invention be expressed in plant cells starting with a Met-Asp or Met-Ala dipeptide for optimal translation initiation, requiring insertion into the isp3 DNA of a codon encoding an amino acid Asp or Ala downstream of the start codon as a new second codon. Alternatively, the fourth nucleotide of SEQ ID Ne: 1, SEQ ID Ne: 3 or SEQ ID Ns: 5 may be replaced by a 'G' so that the second amino acid (followed by Met) is Asp. Similarly, the second codon (AAC or AAT, which encodes Asn) may be replaced by an Asp (GAT or GAC) or Ala (GCT, GCC, GCA, or GCG) codon or any other codon beginning with a 'G' .

As seqüências de DNA podem ser também modificadas para remover sítios de processamento ilegítimos. Como os genes bacterianos podem conter motivos, que são reconhecidos em outros hospedeiros, espe- cialmente em hospedeiros eucarióticos tais como plantas, como sítios de processamento a 5' ou a 3', a transcrição nestes outros hospedeiros pode ser prematuramente terminada, resultando em um mRNA truncado. Os sítios de processamento ilegítimos podem ser identificados através da análise com base em computador das seqüências de DNA e/ou através da análise da PCR que é conhecida na técnica.DNA sequences can also be modified to remove illegitimate processing sites. Because bacterial genes may contain motifs, which are recognized in other hosts, especially eukaryotic hosts such as plants, as 5 'or 3' processing sites, transcription in these other hosts may be prematurely terminated, resulting in a Truncated mRNA. Illegitimate processing sites can be identified by computer-based analysis of DNA sequences and / or by PCR analysis that is known in the art.

Evidentemente, pode ser construída qualquer seqüência de DNA que difira em sua utilização de códons, mas que codifica a mesma proteína ou uma proteína similar com substancialmente a mesma atividade inseticida, dependendo da finalidade particular. Foi descrito nos sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos que a alteração da utilização de códons em rela- ção àquela da célula hospedeira é desejada em hospedeiros estranhos (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura e outros, 1977). As tabelas de utilização de códons estão disponíveis na literatura (Wada e outros, 1990; Murray e ou- tros, 1989) e nos bancos de dados de seqüências de DNA principais (por exemplo, EMBL em Heidelberg, Alemanha) e são como descrito por Naka- mura e outros (2000). Conseqüentemente, as seqüências de DNA sintéticas podem ser construídas de forma que as mesmas ou substancialmente as mesmas proteínas seja produzidas. É evidente que várias seqüências de DNA podem ser produzidas uma vez que a seqüência de aminoácidos das proteínas ISP3 desta invenção é conhecida. Tais outras seqüências de DNA incluem as seqüências de DNA sintéticas ou semi-sintéticas que foram alte- radas com a finalidade de inativar certos sítios no gene, por exemplo, inati- vando seletivamente certos elementos reguladores ou de processamento crípticos presentes na seqüência nativa como descrito nas publicações PCT WO 91/16432 e WO 93/09218 ou adaptando o uso geral de códons com o de um organismo mais relacionado, preferencialmente o de um organismo hospedeiro em que é desejada a expressão. Várias técnicas para a modifi- cação do uso de códons para os preferidos pelas células hospedeiras po- dem ser encontradas em patentes e na literatura científica. O método exato de modificação do uso de códons não é crítico para esta invenção contanto que a maior parte ou todos as seqüências reguladoras ou os elementos de processamento crípticos tenham sido substituídos por outras seqüências.Of course, any DNA sequence that differs in its codon usage but which encodes the same protein or a similar protein with substantially the same insecticidal activity can be constructed, depending on the particular purpose. It has been described in prokaryotic and eukaryotic expression systems that changing codon usage relative to that of the host cell is desired in foreign hosts (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977). Codon utilization tables are available in the literature (Wada et al., 1990; Murray et al., 1989) and main DNA sequence databases (eg, EMBL in Heidelberg, Germany) and are as described by Nakamaura et al. (2000). Consequently, synthetic DNA sequences can be constructed such that the same or substantially the same proteins are produced. It is evident that various DNA sequences may be produced since the amino acid sequence of the ISP3 proteins of this invention is known. Such other DNA sequences include synthetic or semi-synthetic DNA sequences that have been altered for the purpose of inactivating certain sites in the gene, for example by selectively inactivating certain cryptic regulatory or processing elements present in the native sequence as described. in PCT publications WO 91/16432 and WO 93/09218 or adapting general codon usage to that of a more related organism, preferably that of a host organism in which expression is desired. Several techniques for modifying the use of codons for host cell favorites may be found in patents and in the scientific literature. The exact method of modifying codon usage is not critical to this invention as long as most or all of the regulatory sequences or cryptic processing elements have been replaced by other sequences.

Pequenas modificações em uma seqüência de DNA tais como as descritas anteriormente podem ser feitas rotineiramente, isto é, através de mutagênese mediada pela PCR (Ho e outros, 1989, White e outros, 1989). As modificações mais profundas em uma seqüência de DNA podem ser rotineiramente executadas através da síntese de novo do DNA de uma região codificadora desejada utilizando técnicas disponíveis.Minor modifications to a DNA sequence such as those described above can be routinely made, that is, through PCR-mediated mutagenesis (Ho et al., 1989, White et al., 1989). Deeper modifications to a DNA sequence can be routinely performed by de novo synthesis of DNA from a desired coding region using available techniques.

Com o termo "substancialmente a mesma", quando refere-se à seqüência de aminoácidos de uma proteína ISP3, entende-se que inclua uma seqüência de aminoácidos que difere não mais que 5%, preferencial- mente não mais que 2%, da seqüência de aminoácidos da proteína compa- rada; e quando refere-se à toxicidade de uma proteína ISP3, entende-se que inclua, uma proteína cujo valor médio de LC50 (que é a concentração da pro- teína que causa 50% de mortalidade da população de teste), calculado par- tindo de três ensaios biológicos independentes, realizados utilizando as mesmas condições de ensaio biológico, difere em não mais que um fator de 2 do valor médio de LC50 obtido para a proteína comparada (também calcu- lado partindo de três ensaios biológicos independentes, realizados utilizando as mesmas condições de ensaio biológico como para a proteína que é com- parada). Os valores de LC50 são calculados com a análise de Probit, utili- zando o programa POLO PC (da LeOra Software, 1987, Berkely, Califórnia).By the term "substantially the same", when referring to the amino acid sequence of an ISP3 protein, it is meant to include an amino acid sequence that differs no more than 5%, preferably no more than 2%, from the amino acid sequence. amino acids of the compared protein; and when referring to the toxicity of an ISP3 protein, it is understood to include a protein whose mean LC50 value (which is the protein concentration that causes 50% mortality in the test population), calculated from of three independent biological assays performed using the same biological assay conditions differs by no more than a factor of 2 from the average LC50 value obtained for the compared protein (also calculated from three independent biological assays performed using the same biological assay conditions as for the protein that is compared). LC50 values are calculated with Probit analysis using the POLO PC program (from LeOra Software, 1987, Berkely, California).

Entende-se que 95% (ou 90%) dos limites de confidência (um parâmetro associado calculado com a análise de Probit) são calculados para os valores de LC50 de cada uma das duas proteínas que serão comparadas a fim de determinar se existe uma diferença estatisticamente significativa nos valores de LC50· Em geral, é observado que a toxicidade de duas proteínas é subs- tancialmente a mesma, se os limites de confidência se sobrepuserem e substancialmente diferente se os limites de confidência não se sobrepuse- rem. O termo "domínio" de uma toxina ISP3 (ou proteína ISP3) como utilizado aqui significa qualquer (quaisquer) parte(s) ou domínio(s) da toxina (ou proteína ISP3) com uma estrutura ou função específica que pode(m) ser transferido(s) para uma outra proteína para fornecer uma nova proteína hí- brida com pelo menos uma característica funcional (por exemplo, as caracte- rísticas de ligação e/ou de toxicidade) da toxina ISP3 (ou proteína ISP3) da invenção (Ge e outros, 1991). Tais partes podem formar uma característica essencial da proteína híbrida com as características de ligação e/ou de toxi- cidade das proteínas ISP3 desta invenção. Tal proteína híbrida pode ter uma faixa de hospedeiros maior, uma maior toxicidade e/ou pode ser utilizada em uma estratégia para prevenir o desenvolvimento de resistência de insetos (EP 408 403; Visser e outros, 1993). As seqüências de DNA que codificam os domínios são abrangidas por esta definição. Uma proteína híbrida ou uma proteína de fusão é utilizada aqui para significar uma proteína compreendida de domínios protéicos diferentes, formando uma proteína quimérica funcio- nal com as características dos domínios individuais. Um outro domínio que uma proteína híbrida ou quimérica pode, por exemplo, compreender é um domínio de estabilização. Foi descrito, por exemplo, que os domínios de es- tabilização estão presentes no terminal C de proteína(s) VIP3(a) e acredita- se que forneçam estabilidade à proteína tóxica no ambiente intestinal de in- setos susceptíveis.It is understood that 95% (or 90%) of confidence limits (an associated parameter calculated with Probit analysis) are calculated for the LC50 values of each of the two proteins that will be compared to determine if there is a difference. statistically significant in LC50 values · It is generally observed that the toxicity of two proteins is substantially the same if the confidence limits overlap and substantially different if the confidence limits do not overlap. The term "domain" of an ISP3 toxin (or ISP3 protein) as used herein means any toxin (or ISP3 protein) part (s) or domain (s) with a specific structure or function that may be transferred (s) to another protein to provide a novel hybrid protein with at least one functional characteristic (e.g., binding and / or toxicity characteristics) of the ISP3 toxin (or ISP3 protein) of the invention (Ge et al., 1991). Such moieties may form an essential feature of the hybrid protein with the binding and / or toxicity characteristics of the ISP3 proteins of this invention. Such a hybrid protein may have a larger host range, greater toxicity and / or may be used in a strategy to prevent the development of insect resistance (EP 408 403; Visser et al., 1993). The DNA sequences encoding the domains are covered by this definition. A hybrid protein or fusion protein is used herein to mean a protein comprised of different protein domains, forming a functional chimeric protein having the characteristics of the individual domains. Another domain that a hybrid or chimeric protein may, for example, comprise is a stabilization domain. For example, it has been described that the stabilizing domains are present at the C-terminus of VIP3 protein (s) and are believed to provide stability to the toxic protein in the intestinal environment of susceptible insects.

Em adição à criação de proteínas híbridas, a função dos domí- nios específicos também pode ser analisada através da introdução de dele- ções de todos ou parte do(s) domínio(s) ou da introdução de mutações no domínio e das análises do efeito resultante sobre a toxicidade para os inse- tos, a estabilidade da proteína, a sensibilidade à proteólise da enzima, as alterações de temperaturas, a ligação a DNA/proteínas/células específicas etc. É uma modalidade da invenção fornecer um método de "evolu- ção" de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3, particularmente ISP3-1099E ou ISP3-327D ou ISP3-2245J, em uma nova seqüência de ácido nucléico, que codifica uma proteína que possui atividade inseticida. A seqüência de ácido nucléico evoluída possui preferencial mente maior atividade inseticida comparada com a da seqüência não-evoluída. O termo "evolução" como utilizado aqui refere-se a um método de maior evolu- ção da seqüência através da recombinante das seqüências, como descrito na Patente U.S. Ne 5.811.238, WO 97/20078 e Patente U.S. Ne 6.180.406, incorporados aqui como referência. O "embaralhamento" de ácido nucléico é utilizado aqui para indicar a recombinação in vitro ou in vivo entre seqüên- cias de ácido nucléico de uma população ou grupo de ácidos nucléicos e pode ser realizada como é conhecido na técnica e como descrito na Patente U.S. Ne 5.811.238, no WO 97/20078, na Patente U.S. Ne 6.180.406, na Pa- tente U.S. Ne 6.117.679, todos incorporados aqui como referência. O método de evolução de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3 compreende as etapas a seguir: (a) fornecimento de uma população de seqüências de ácido nu- cléico que codificam as seqüências de aminoácidos da SEQ ID Ne: 2 e/ou 4 e/ou 6 ou variações ou fragmentos das seqüências de aminoácidos da SEQ ID Ne: 2 e/ou 4 e/ou 6, em que as ditas variações ou fragmentos possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91% com a SEQ ID Ne: 2 ou 4 e pelo menos 88% com a SEQ ID Ne: 6. (b) embaralhamento da dita população de variações ou fragmen- tos para formar moléculas recombinantes de ácido nucléico (c) seleção ou varredora de moléculas recombinantes de ácido nucléico, que codificam proteínas que possuem atividade inseticida; repetição das etapas (a) até (c) com as moléculas recombinantes de ácido nucléico selecionadas na etapa (c) até que seja encontrada uma molécula recombinante de ácido nucléico na etapa (c), em que a proteína codificada pela dita molécula de ácido nucléico possui a propriedade inseticida deseja- da.In addition to the creation of hybrid proteins, the function of specific domains can also be analyzed by introducing deletions of all or part of the domain (s) or by introducing mutations in the domain and effect analyzes. resulting in insect toxicity, protein stability, sensitivity to enzyme proteolysis, temperature changes, binding to specific DNA / proteins / cells etc. It is an embodiment of the invention to provide a method of "evolving" a nucleic acid sequence encoding an ISP3 protein, particularly ISP3-1099E or ISP3-327D or ISP3-2245J, into a novel nucleic acid sequence encoding an protein that has insecticidal activity. The evolved nucleic acid sequence preferably has greater insecticidal activity compared to that of the unevolved sequence. The term "evolution" as used herein refers to a method of further sequence evolution by recombinant sequences, as described in US Patent No. 5,811,238, WO 97/20078 and US Patent 6,180,406, incorporated herein. here as a reference. Nucleic acid "scrambling" is used herein to indicate in vitro or in vivo recombination between nucleic acid sequences of a population or group of nucleic acids and may be performed as is known in the art and as described in US Pat. No. 5,811,238, WO 97/20078, US Patent No. 6,180,406, US Patent No. 6,117,679, all incorporated herein by reference. The method of evolution of a nucleic acid sequence encoding an ISP3 protein comprises the following steps: (a) providing a population of nucleic acid sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID Ne: 2 and / or 4 and / or 6 or amino acid sequence variations or fragments of SEQ ID Ne: 2 and / or 4 and / or 6, wherein said variations or fragments have a sequence identity of at least 91% with SEQ ID Ne : 2 or 4 and at least 88% with SEQ ID Ne: 6. (b) shuffling said population of variations or fragments to form recombinant nucleic acid molecules (c) selecting or scanning recombinant nucleic acid molecules, that encode proteins that have insecticidal activity; repeating steps (a) through (c) with the recombinant nucleic acid molecules selected in step (c) until a recombinant nucleic acid molecule is found in step (c), wherein the protein encoded by said nucleic acid molecule has the desired insecticidal property.

Um ácido nucléico não-evoluído é um ácido nucléico fornecido como o material de partida na etapa (a), enquanto que um ácido nucléico evoluído correspondente que é utilizado aqui refere-se a um ácido nucléico recombinante obtido na etapa (d) quando realizado o método utilizando o ácido nucléico não-evoluído na etapa (a). Os ácidos nucléicos preferidos utilizados na etapa (a) são seqüências de ácido nucléico que codificam as seqüências de aminoácidos da ISP3-1099E (SEQ ID Ne: 2) e/ou da ISP3- 327D (SEQ ID Ne: 4) e/ou da ISP3-2245J (SEQ ID Ns: 6) ou variações ou fragmentos dos mesmos. A população de moléculas de ácidos nucléicos e/ou variações e/ou fragmentos de moléculas de ácidos nucléicos na etapa (a) podem compreender o DNA que codifica uma única proteína ISP3 e/ou variações e/ou fragmentos do ácido nucléico que codifica uma única proteína ISP3 da invenção ou uma mistura de ácidos nucléicos que codificam proteí- nas ISP3 diferentes da invenção e/ou fragmentos e/ou variações dos mes- mos. As seqüências de ácido nucléico que codificam variações da seqüência de aminoácidos SEQ ID Ne: 2 são seqüências de ácido nucléico que codifi- cam seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 91%, preferenci- almente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência no nível de aminoáci- dos com a SEQ ID Ne: 2. As seqüências de ácido nucléico que codificam variações da seqüência de aminoácidos SEQ ID Ne: 4 são seqüências de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 91%, preferencial mente pelo menos 92 ou 93%, mais preferencial- mente pelo menos 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüên- cia no nível de aminoácidos com a SEQ ID Ne: 4. As seqüências de ácido nucléico que codificam variações da seqüência de aminoácidos SEQ ID Ne: 6 são seqüências de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoáci- dos que possuem pelo menos 88%, preferencialmente pelo menos 89 ou 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência no nível de aminoácidos com a SEQ IDAn unevolved nucleic acid is a nucleic acid provided as the starting material in step (a), while a corresponding evolved nucleic acid that is used herein refers to a recombinant nucleic acid obtained in step (d) when performing the method using unevolved nucleic acid in step (a). Preferred nucleic acids used in step (a) are nucleic acid sequences encoding the amino acid sequences of ISP3-1099E (SEQ ID Ne: 2) and / or ISP3- 327D (SEQ ID Ne: 4) and / or ISP3-2245J (SEQ ID Ns: 6) or variations or fragments thereof. The population of nucleic acid molecules and / or variations and / or fragments of nucleic acid molecules in step (a) may comprise DNA encoding a single ISP3 protein and / or variations and / or nucleic acid fragments encoding a single ISP3 protein of the invention or a mixture of nucleic acids encoding different ISP3 proteins of the invention and / or fragments and / or variations thereof. Nucleic acid sequences encoding amino acid sequence variations SEQ ID Ne: 2 are nucleic acid sequences encoding amino acid sequences having at least 91%, preferably at least 92%, more preferably at least 93%. , 94%, 95%, 98%, 99% or 100% amino acid sequence identity with SEQ ID Ne: 2. Nucleic acid sequences encoding amino acid sequence variations SEQ ID Ne: 4 are nucleic acid sequences encoding amino acid sequences that have at least 91%, preferably at least 92 or 93%, more preferably at least 94%, 95%, 98%, 99% or 100% sequence identity - amino acid level with SEQ ID Ne: 4. The nucleic acid sequences encoding variations of the amino acid sequence SEQ ID Ne: 6 are nucleic acid sequences encoding amino acid sequences that have at least 88%, preferably at least 89 or 90%, more preferably at least 91%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% or 100% amino acid level sequence identity with SEQ ID

Ne: 6.Ne: 6.

Uma seqüência de ácido nucléico evoluída obtida na etapa (d) codifica preferencial mente uma proteína com maior atividade inseticida, isto é, a proteína possui, por exemplo, maior toxicidade que a proteína codificada pelas seqüências não-evoluídas utilizadas na etapa (a) como material de partida ou possui atividade contra um espectro diferente de insetos alvo que as seqüências não-evoluídas ou se liga a um sítio de ligação alvo diferente em um inseto alvo. A seleção ou a varredura da toxicidade maior desejada e/ou espectro de toxicidade diferente (etapa (c)) pode ser feita realizando ensaios biológicos com insetos, comparando a atividade inseticida das prote- ínas codificadas pelas seqüências de ácido nucléico evoluídas e não- evoluídas. Outros ensaios funcionais alternativos ou adicionais podem ser realizados, dependendo da propriedade inseticida desejada. Por exemplo, se a maior ligação for uma propriedade desejada, pode ser realizado um ensaio de ligação antes de realizar um ensaio biológico com o inseto.An evolved nucleic acid sequence obtained in step (d) preferably encodes a protein with higher insecticidal activity, ie the protein has, for example, greater toxicity than the protein encoded by the unevolved sequences used in step (a) as starting material either has activity against a different spectrum of target insects than unevolved sequences or binds to a different target binding site on a target insect. Selection or scanning of the desired major toxicity and / or different toxicity spectrum (step (c)) can be done by performing insect biological assays comparing the insecticidal activity of proteins encoded by evolved and unevolved nucleic acid sequences. . Other alternative or additional functional assays may be performed depending on the desired insecticidal property. For example, if higher binding is a desired property, a binding assay may be performed prior to performing a biological assay with the insect.

As seqüências de DNA do isp3 da invenção, preparadas partin- do do DNA total, podem ser ligadas em vetores de expressão adequados e transformadas em uma cepa bacteriana, tal como E. coli ou uma cepa de Bt e os clones podem ser então selecionados através de métodos convencio- nais de sondas imunológicas em colônias (French e outros, 1986) para a expressão da toxina com anticorpos monoclonais ou policlonais produzidos contra as proteínas ISP3.The isp3 DNA sequences of the invention prepared from total DNA can be ligated into suitable expression vectors and transformed into a bacterial strain such as E. coli or a Bt strain and the clones can then be selected by conventional methods of colonic immunological probes (French et al., 1986) for the expression of the toxin with monoclonal or polyclonal antibodies raised against ISP3 proteins.

Os clones de Bt ou de E. coli podem ser então selecionados em relação à produção de proteínas ISP3 (o sobrenadante de cultura isento de células ou o lisado de células podem ser corridos em géis de SDS-PAGE utilizando métodos padronizados e procedimentos de western-blotting pa- dronizados podem ser realizados) ou as bactérias podem ser testadas em relação à sua atividade inseticida comparada com a das bactérias de contro- le. Os clones podem ser também analisados em relação à presença de mRNA que codifica uma proteína ISP3 utilizando procedimentos de PCR padronizados, tal como a RT-PCR.Bt or E. coli clones can then be selected for ISP3 protein production (cell-free culture supernatant or cell lysate can be run on SDS-PAGE gels using standard methods and western blot procedures). standard blotting can be performed) or the bacteria can be tested for their insecticidal activity compared to that of the control bacteria. Clones can also be analyzed for the presence of mRNA encoding an ISP3 protein using standard PCR procedures such as RT-PCR.

Os genes que codificam as proteínas ISP3 desta invenção po- dem ser seqüenciados de uma maneira convencional (Maxam e Gilbert, 1980; Sanger, 1977) para a obtenção da seqüência de DNA. As compara- ções de seqüência indicaram que os genes são diferentes dos genes descri- tos anteriormente que codificam toxinas com atividade contra Lepidópteras.The genes encoding the ISP3 proteins of this invention may be sequenced in a conventional manner (Maxam and Gilbert, 1980; Sanger, 1977) to obtain the DNA sequence. Sequence comparisons indicated that the genes are different from the previously described genes that encode toxins with activity against Lepidoptera.

Uma parte eficiente como inseticida das seqüências de DNA, que codificam uma parte eficiente como inseticida das proteínas ISP3 re- cém-identificadas, pode ser produzida de uma maneira convencional após a análise de seqüência do gene. A seqüência de aminoácidos das proteínas ISP3 pode ser determinada partindo da seqüência de DNA das seqüências de DNA isoladas. Por "uma parte eficiente como inseticida (ou porção ou fragmento)" das seqüências de DNA que codificam a proteína ISP3, também referida aqui como "gene truncado" ou "DNA truncado", entende-se uma se- qüência de DNA que codifica um polipeptídeo que possui menos aminoáci- dos que a forma da proteína ISP3 de comprimento completo, mas que é in- seticida.An insecticide-efficient portion of DNA sequences, which encode an insecticide-efficient portion of newly identified ISP3 proteins, can be produced in a conventional manner following gene sequence analysis. The amino acid sequence of ISP3 proteins can be determined from the DNA sequence of the isolated DNA sequences. By "an insecticidally-efficient part (or portion or fragment)" of the DNA sequences encoding the ISP3 protein, also referred to herein as the "truncated gene" or "truncated DNA", is meant a DNA sequence encoding a polypeptide that has fewer amino acids than the full-length form of the ISP3 protein but is insecticidal.

Para expressar toda ou uma parte eficiente como inseticida da seqüência de DNA que codifica uma proteína ISP3 desta invenção em E. coli, em outras cepas de Bt e em plantas, podem ser introduzidos sítios de restrição adequados, flanqueando a seqüência de DNA. Isto pode ser feito através da mutação direcionada ao sítio, utilizando procedimentos bem co- nhecidos (Stanssens e outros, 1989; White e outros, 1989). Para obter uma melhor expressão em plantas, o uso de códons do gene isp3 ou de uma par- te do gene isp3 eficiente como inseticida desta invenção pode ser modifica- do para formar um gene ou parte de um gene equivalente, modificado ou artificial de acordo com as publicações PCT WO 91/16432 e WO 93/09218 e publicações EP 0 385 962, EP 0 359 472 e Patente U.S. Ne 5.689.052 ou os genes ou partes de genes isp3 podem ser inseridas no genoma de plastí- deos, mitocôndrias ou cloroplastos e expressas ali utilizando um promotor adequado (por exemplo, Mc Bride e outros, 1995; Patente U.S. Ne 5.693.507).To express all or an insecticide-efficient part of the DNA sequence encoding an ISP3 protein of this invention in E. coli, other Bt strains, and plants, suitable restriction sites may be introduced flanking the DNA sequence. This can be done by site-directed mutation using well-known procedures (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). For better expression in plants, the use of isp3 gene codons or an insecticide-efficient part of the isp3 gene may be modified to form a gene or part of an equivalent, modified or artificial gene accordingly. with PCT publications WO 91/16432 and WO 93/09218 and EP 0 385 962, EP 0 359 472 and US Patent No. 5,689,052 or isp3 genes or parts of genes can be inserted into the plastid, mitochondrial genome or chloroplasts and expressed therein using a suitable promoter (e.g., Mc Bride et al., 1995; US Patent No. 5,693,507).

Para obter uma maior expressão em plantas monocotiledôneas tal como o milho ou o arroz, um íntron, preferencialmente um íntron de mo- nocotiledônea, também pode ser adicionado ao gene quimérico. Por exem- plo, foi mostrado que a inserção do íntron do gene Adh1 do milho na região reguladora a 5' aumenta a expressão no milho (Callis e outros, 1987). Simi- larmente, o íntron HSP70, que é descrito na Patente U.S. Ne 5.859.347, po- de ser utilizado para aumentar a expressão. A seqüência de DNA do gene isp3 ou de sua parte inseticida pode ser adicionalmente alterada de uma maneira neutra em relação à tradução, para modificar seqüências de DNA inibidoras possíveis presentes na parte do gene através da inserção de ín- tron direcionada ao sítio e/ou através da introdução de alterações no uso dos códons, por exemplo, adaptando o uso dos códons aos mais preferidos pe- las plantas, preferencialmente o gênero de planta relevante específico (Mur- ray e outros, 1989), sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar, a seqüência de aminoácido codificada.For greater expression in monocotyledonous plants such as maize or rice, an intron, preferably a monocotyledon intron, may also be added to the chimeric gene. For example, it has been shown that insertion of the maize Adh1 gene intron into the 5 'regulatory region increases expression in maize (Callis et al., 1987). Similarly, intron HSP70, which is described in U.S. Patent No. 5,859,347, may be used to increase expression. The DNA sequence of the isp3 gene or its insecticidal part may be further altered in a translation-neutral manner to modify possible inhibitory DNA sequences present in the gene part by insertion of the site-directed intron and / or by introducing changes in codon usage, for example by adapting codon usage to the most preferred by plants, preferably the specific relevant plant genus (Murray et al., 1989), without significantly changing, preferably without changing , the encoded amino acid sequence.

De acordo com uma modalidade desta invenção, é preferido que as proteínas sejam direcionadas para organelas intracelulares tais como plastídeos, preferencialmente cloroplastos, mitocôndrias ou sejam secreta- das da célula, otimizando potencialmente a estabilidade e/ou a expressão das proteínas. Para esta finalidade, em uma modalidade desta invenção, os genes quiméricos da invenção compreendem uma região codificadora que codifica um peptídeo sinal ou alvo, ligada à região codificadora da proteína ISP3 da invenção. Os peptídeos particularmente preferidos que devem ser incluídos nas proteínas desta invenção, são os peptídeos de trânsito para o cloroplasto ou outras regiões peptídicas de trânsito especialmente duplica- das de direcionamento para os plastídeos dos genes selecionados cujo pro- duto gênico é direcionado para os plastídeos, o peptídeo de trânsito otimiza- do de Capellades e outros (Patente U.S. Ne 5.635.618), o peptídeo de trânsi- to descrito em Wong e outros (1992) e os peptídeos de direcionamento no pedido de patente PCT publicado WO 00/26371. São também preferidos os peptídeos que sinalizam a secreção de uma proteína ligada a tal peptídeo fora da célula, tais como o sinal de secreção do inibidor II da proteinase da batata (Keil e outros, 1986), o sinal de secreção do gene 3 da alfa amilase do arroz (Sutliff e outros, 1991) e o sinal de secreção da proteína PR1 do tabaco (Cornelissen e outros, 1986).According to one embodiment of this invention, it is preferred that the proteins be directed to intracellular organelles such as plastids, preferably chloroplasts, mitochondria, or cell secretions, potentially optimizing protein stability and / or expression. For this purpose, in one embodiment of this invention, the chimeric genes of the invention comprise a coding region encoding a signal or target peptide linked to the coding region of the ISP3 protein of the invention. Particularly preferred peptides which should be included in the proteins of this invention are the chloroplast transit peptides or other specially duplicated transit peptide regions targeting the plastids of the selected genes whose gene product is directed to the plastids, the Capellades et al. optimized transit peptide (US Patent No. 5,635,618); the transit peptide described in Wong et al. (1992); and the targeting peptides in published PCT patent application WO 00/26371. Also preferred are peptides that signal secretion of a protein bound to such a peptide outside the cell, such as the secretion signal from potato proteinase inhibitor II (Keil et al., 1986), the secretion signal from alpha gene 3. rice amylase (Sutliff et al., 1991) and the secretion signal of tobacco protein PR1 (Cornelissen et al., 1986).

Os peptídeos de sinal particularmente úteis de acordo com a invenção incluem o peptídeo de trânsito para os cloroplastos (por exemplo, Van Den Broeck e outros, 1985) ou o peptídeo otimizado de trânsito para os cloroplastos da Patente U.S. Ns 5.510.471 e da Patente U.S. Ns 5.635.618 que possibilita o transporta da proteína para os cloroplastos, um peptídeo de sinal de secreção ou um peptídeo que direciona a proteína a outros plastí- deos, para as mitocôndrias, para o RE ou para uma outra organela. As se- qüências de sinal para o direcionamento para organelas intracelulares ou para a secreção para fora da célula vegetal ou para a parede celular são encontradas em proteínas naturalmente direcionadas ou secretadas, prefe- rencialmente as descritas por Klõsgen e outros (1989), Klõsgen e Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih e outros (1999), Morris e outros (1999), Hesse e outros (1989), Tavladoraki e outros (1998), Terashima e outros (1999), Park e outros (1997), Shcherban e outros (1995), dos quais todos são incorporados aqui como referência, particularmente as seqüências peptídicas de sinal de proteínas direcionadas ou secretadas do milho, do algodão, da soja ou do arroz.Particularly useful signal peptides according to the invention include the chloroplast transit peptide (e.g., Van Den Broeck et al., 1985) or the chloroplast-optimized transit peptide of US Patent No. 5,510,471 and US Patent No. 4,510,471. No. 5,635,618 which makes it possible to transport protein to chloroplasts, a secretion signal peptide or a peptide that directs protein to other plastids, mitochondria, RE, or another organelle. Signal sequences for targeting intracellular organelles or secretion out of the plant cell or cell wall are found in naturally directed or secreted proteins, preferably those described by Klösgen et al (1989), Klösgen et al. Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999), Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki et al. (1998), Terashima et al. (1999), Park et al. (1997), Shcherban et al. (1995), all of which are incorporated herein by reference, particularly protein signal peptide sequences directed or secreted from maize, cotton, soybean or rice.

Para permitir a secreção das proteínas ISP3 para fora da célula hospedeira transformada, um peptídeo de sinal de secreção apropriado pode ser fundido com a extremidade amino terminal (extremidade N-terminal) da proteína ISP3. Ainda, qualquer peptídeo putativo de sinal de secreção de Bacillus nativo pode ser deletado ou pode ser substituído por um peptídeo de sinal apropriado, tal como um peptídeo de sinal de secreção eucariótico que é descrito anteriormente. Particularmente, os aminoácidos 1 até 54 das proteínas ISP3 da invenção compreendem um peptídeo de sinal putativo de Bacillus. Os aminoácidos 1 até 10, preferencialmente 1 até 50, mais prefe- rencialmente 1 até 54 podem ser removidos das proteínas ISP3 ou podem ser substituídos por um peptídeo de sinal apropriado, particularmente um peptídeo de sinal eucariótico que é descrito anteriormente. Os peptídeos sinais putativos podem ser detectados utilizando uma análise com base em computador, utilizando programas tal como o programa de busca de Peptí- deos de Sinal (SignalP V1.1 ou 2.0), utilizando uma matriz para bactérias gram-positivas procarióticas e um escore limiar menor que 0,5, especialmen- te um escore limiar de 0,25 ou menor (Von Heijne, Gunnar, 1986 e Nielsen e outros, 1996).To allow secretion of the ISP3 proteins out of the transformed host cell, an appropriate secretion signal peptide may be fused to the amino terminal end (N-terminal end) of the ISP3 protein. In addition, any native putative Bacillus secretion signal peptide may be deleted or may be replaced by an appropriate signal peptide, such as a eukaryotic secretion signal peptide that is described above. Particularly, amino acids 1 to 54 of the ISP3 proteins of the invention comprise a putative Bacillus signal peptide. Amino acids 1 to 10, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 54 may be removed from the ISP3 proteins or may be substituted by an appropriate signal peptide, particularly a eukaryotic signal peptide that is described above. Putative signal peptides can be detected using computer-based analysis using programs such as the SignalP V1.1 or 2.0 SignalPeptide search program using a matrix for prokaryotic gram-positive bacteria and a score. threshold lower than 0.5, especially a threshold score of 0.25 or lower (Von Heijne, Gunnar, 1986 and Nielsen et al., 1996).

Além disso, as propriedades de ligação das proteínas ISP3 da invenção podem ser avaliadas, utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Van Rie e outros, 1990), para determinar se as proteínas ISP3 da invenção se ligam aos sítios no intestino do inseto, tal como no intestino médio, que não são reconhecidas (ou competem com) por outras proteínas de Bt. As proteínas inseticidas de Bt com sítios de ligação diferentes para os quais não há competição pela ligação em insetos susceptíveis relevantes são muito valiosas para substituir proteínas de Bt às quais os insetos podem ter desenvolvido resistência ou para utilizar em combinação com proteínas inseticidas de Bt que possuem um modo diferente de ação para prevenir ou retardar o desenvolvimento de resistência do inseto contra as proteínas de Bt, particularmente quando expressas em uma planta. Devido às caracterís- ticas das toxinas de Bt recém-isoladas, estas são extremamente úteis para a transformação de plantas, por exemplo, monocotiledôneas tais como o milho e o arroz e dicotiledôneas tais como o algodão e a soja, para proteger estas plantas de danos causados por insetos. É esperado que as propriedades de ligação das proteínas ISP3 da presente invenção sejam diferentes compara- das com às de toxinas Cry. Tais propriedades de ligação diferentes podem ser medidas através de ensaios de ligação de rotina que são descritos ante- riormente ou na Patente U.S. Ne 6.291.156 e na Patente U.S. Ne 6.137.033.In addition, the binding properties of the ISP3 proteins of the invention may be evaluated using methods known in the art (e.g., Van Rie et al., 1990) to determine whether the ISP3 proteins of the invention bind to insect gut sites, as in the midgut, which are not recognized (or compete with) for other Bt proteins. Bt insecticidal proteins with different binding sites for which there is no competition for binding on relevant susceptible insects are very valuable in replacing Bt proteins to which insects may have developed resistance or for use in combination with Bt insecticidal proteins that possess a different mode of action to prevent or retard the development of insect resistance against Bt proteins, particularly when expressed in a plant. Due to the characteristics of newly isolated Bt toxins, they are extremely useful for the transformation of plants, for example monocotyledons such as maize and rice and dicotyledons such as cotton and soybean, to protect these plants from damage. caused by insects. The binding properties of the ISP3 proteins of the present invention are expected to be different compared to those of Cry toxins. Such different binding properties may be measured by routine binding assays which are described above or in U.S. Patent No. 6,291,156 and U.S. Patent No. 6,137,033.

Especialmente para as finalidades de controle da resistência de insetos para uma praga de inseto específica, é preferido combinar uma pro- teína ISP3 desta invenção com uma outra proteína de controle de insetos, particularmente uma proteína Cry de Bt ou uma proteína VIP ou VIP-similar, preferencialmente uma proteína que não reconhece pelo menos um sítio de ligação reconhecido por tal proteína ISP3. As proteínas preferidas de contro- le de insetos para combinar com as proteínas ISP3 desta invenção, particu- larmente para a expressão simultânea em plantas, preferencial mente plantas de milho, de algodão, de arroz ou de soja, incluem as proteínas Cry, tais como a proteína Cry1F ou híbridos derivados de uma proteína Cry1F (por exemplo, as proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas na Patente U.S. Ns 6.326.169; na Patente U.S. Ne 6.281.016; na Patente U.S. Ns 6.218.188 ou fragmentos tóxicos das mesmas), as proteínas do tipo Cry1A ou fragmentos tóxicos das mesmas, preferencialmente a proteína CrylAc ou híbridos deri- vados da proteína CrylAc (por exemplo, a proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descrita na Patente U.S. Ne 5.880.275) ou a proteína CrylAb ou Bt2 ou fra- gmentos inseticidas das mesmas que são descritos na EP451878, as proteí- nas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag que são descritas no WO 02/057664, as pro- teínas Cry que são descritas no WO 01/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesma que é descrito em Estruch e outros (1996) e na Patente U.S. Ne 6.291.156, proteínas inseticidas de cepas das espécies de Xenorhabdus (que são descritas no WO 98/50427), de Serratia (particular- mente de S. entomophila) ou de Photorhabdus, tais como as proteínas Tc de Photorhabdus que são descritas no WO 98/08932 (por exemplo, Waterfield e outros, 2001; Ffrench-Constant e Bowen, 2000). Em uma modalidade, tal co- expressão é facilmente obtida através da transformação de uma planta que já expressa uma proteína de controle de insetos com uma ISP3 desta inven- ção ou através do cruzamento de plantas transformadas com a proteína de controle de insetos e plantas transformadas com uma ou mais proteínas ISP desta invenção. Para as plantas de milho, arroz, algodão ou soja, preferen- cialmente a proteína ISP3-327D ou a proteína ISP3-1099E ou a proteína ISP3-2245J é utilizada como a primeira proteína de controle de insetos e como a segunda proteína de controle de insetos são utilizadas as proteínas CrylAb, CrylAc, CrylAe ou VIP3Aa ou derivados das mesmas. Os métodos para a obtenção da expressão de proteínas inseticidas diferentes de Bt (ou similarmente, para outras proteínas de controle de insetos) na mesma planta em um esforço de minimizar ou prevenir o desenvolvimento da resistência de plantas transgênicas resistentes a insetos são descritos na EP 0 408 403. É entendido que as proteínas diferentes podem ser expressas na mesma planta ou cada uma pode ser expressa em uma única planta e então combi- nada na mesma planta através do cruzamento de plantas individuais uma com a outra. Por exemplo, na produção de sementes híbridas, cada planta parental pode expressar uma única proteína. Após o cruzamento das plantas parentais para a produção de híbridos, ambas as proteínas são combinadas na planta híbrida. É bem sabido que as proteínas Cry de Bt são expressas na for- ma de pró-toxinas, que são convertidas no núcleo tóxico através de proteóli- se no intestino dos insetos. Quando as proteínas ISP3 da invenção são combinadas com as proteínas Cry de Bt, é entendido que os genes Cry de Bt que codificam a pró-toxina completa ou o núcleo tóxico ou qualquer forma intermediária podem ser utilizados.Especially for insect resistance control purposes for a specific insect pest, it is preferred to combine an ISP3 protein of this invention with another insect control protein, particularly a Bt Cry protein or a VIP or similar VIP protein. preferably a protein that does not recognize at least one binding site recognized by such an ISP3 protein. Preferred insect control proteins to combine with the ISP3 proteins of this invention, particularly for simultaneous expression in plants, preferably corn, cotton, rice or soybean plants, include Cry proteins such as Cry1F protein or hybrids derived from a Cry1F protein (e.g. Cry1A-Cry1F hybrid proteins described in US Patent No. 6,326,169; US Patent No. 6,281,016; US Patent No. 6,218,188 or toxic fragments thereof) , Cry1A-like proteins or toxic fragments thereof, preferably CrylAc protein or hybrids derived from CrylAc protein (for example, the hybrid Cry1Ab-Cry1Ac protein described in US Patent No. 5,880,275) or CrylAb or Bt2 protein or insecticidal fragments thereof as described in EP451878, Cry2Ae, Cry2Af or Cry2Ag proteins which are described in WO 02/057664, Cry proteins which are described in WO 01/47952, protein V IP3Aa or a toxic fragment thereof as described in Estruch et al. (1996) and in US Patent No. 6,291,156, insecticidal proteins of strains of Xenorhabdus species (which are described in WO 98/50427), from Serratia (particularly S. entomophila) or Photorhabdus, such as Photorhabdus Tc proteins which are described in WO 98/08932 (e.g., Waterfield et al., 2001; (French-Constant and Bowen, 2000). In one embodiment, such co-expression is readily accomplished by transforming a plant that already expresses an insect control protein with an ISP3 of this invention or by crossing transformed plants with the insect control protein and transformed plants. with one or more ISP proteins of this invention. For maize, rice, cotton or soybean plants, preferably ISP3-327D protein or ISP3-1099E protein or ISP3-2245J protein is used as the first insect control protein and as the second insect control protein. Insects are used or derived from CrylAb, CrylAc, CrylAe or VIP3Aa proteins. Methods for obtaining expression of insecticidal proteins other than Bt (or similarly, for other insect control proteins) in the same plant in an effort to minimize or prevent the development of resistance of insect resistant transgenic plants are described in EP 0. 408 403. It is understood that different proteins may be expressed in the same plant or each may be expressed in a single plant and then combined in the same plant by crossing individual plants with one another. For example, in hybrid seed production, each parent plant may express a single protein. After crossing parent plants for hybrid production, both proteins are combined in the hybrid plant. It is well known that Bt Cry proteins are expressed as pro-toxins, which are converted to the toxic nucleus through proteolysis in the insect gut. When the ISP3 proteins of the invention are combined with the Bt Cry proteins, it is understood that the Bt Cry genes encoding the complete pro-toxin or toxic nucleus or any intermediate form may be used.

Preferencialmente, para as finalidades de seleção, mas também para aumentar as opções de controle de ervas daninhas, as plantas trans- gênicas da invenção são também transformadas com um DNA que codifica uma proteína que confere resistência a um herbicida de amplo espectro, por exemplo, os herbicidas com base no glufosinato ou no glifosato. A parte do gene isp3 eficiente como inseticida ou seu equivalen- te, preferencialmente o gene quimérico isp3, que codifica uma parte eficiente como inseticida da proteína ISP3, pode ser inserida de forma estável de uma maneira convencional no genoma nuclear de uma única célula vegetal e a célula transformada dessa forma pode ser utilizada de uma maneira conven- cional para produzir uma planta transformada que é resistente a insetos. Sob este aspecto, um vetor de T-DNA, contendo a parte do gene isp3 eficiente como inseticida, em Agrobacterium tumefaciens pode ser utilizado para transformar a célula vegetal e depois disso, uma planta transformada pode ser regenerada partindo da célula vegetal transformada utilizando os proce- dimentos descritos, por exemplo, na EP 0 116 718, na EP 0 270 822, na pu- blicação PCT WO 84/02913 e no pedido de Patente Européia publicado EPOPreferably, for selection purposes, but also to increase weed control options, the transgenic plants of the invention are also transformed with a DNA encoding a protein that confers resistance to a broad spectrum herbicide, e.g. herbicides based on glufosinate or glyphosate. The insecticide-efficient part of the isp3 gene or its equivalent, preferably the isp3 chimeric gene encoding an insecticide-efficient portion of the ISP3 protein, can be stably inserted in a conventional manner into the nuclear genome of a single plant cell and The cell transformed in this way can be used in a conventional manner to produce a transformed plant that is resistant to insects. In this respect, a T-DNA vector containing the insecticide-efficient part of the isp3 gene in Agrobacterium tumefaciens can be used to transform the plant cell and thereafter a transformed plant can be regenerated from the transformed plant cell using the proce - described in, for example, EP 0 116 718, EP 0 270 822, PCT publication WO 84/02913 and EPO published European Patent Application

242 246 e em Gould e outros (1991). A construção de um vetor de T-DNA para a transformação de plantas mediada por Agrobacterium é bem conhe- cida na técnica. O vetor de T-DNA pode ser um vetor binário como é descrito na EP 0 120 561 e na EP 0 120 515 ou um vetor co-integrado que pode se integrar no plasmídeo Ti de Agrobacterium através de recombinação homó- loga, como é descrito na EP 0 116 718. Os vetores de T-DNA preferidos contêm cada um promotor ligado de forma operacional à parte do gene isp3 eficiente como inseticida entre as seqüências da borda do T-DNA ou pelo menos localizado à esquerda da seqüência da borda direita. As seqüências das bordas são descritas em Gielen e outros (1984). Evidentemente, outros tipos de vetores podem ser utilizados para transformar a célula vegetal, utili- zando procedimentos tais como a transferência direta do gene (como é des- crito, por exemplo, na EP 0 223 247), a transformação mediada por pólen (como é descrito, por exemplo, na EP 0 270 356 e no WO 85/01856), a transformação de protoplastos como descrito, por exemplo, na Patente U.S.242,246 and Gould et al. (1991). The construction of a T-DNA vector for Agrobacterium-mediated plant transformation is well known in the art. The T-DNA vector may be a binary vector as described in EP 0 120 561 and EP 0 120 515 or a cointegrated vector which may integrate into the Agrobacterium Ti plasmid through homologous recombination as described. EP 0 116 718. Preferred T-DNA vectors each contain a promoter operably linked to the part of the isp3 efficient insecticide gene between T-DNA edge sequences or at least located to the left of the right edge sequence. Edge sequences are described in Gielen et al. (1984). Of course, other types of vectors can be used to transform the plant cell using procedures such as direct gene transfer (as described, for example, in EP 0 223 247), pollen-mediated transformation (such as EP 0 270 356 and WO 85/01856), the transformation of protoplasts as described, for example, in US Patent

Ne 4.684.611, a transformação mediada por vírus de RNA (como é descrito, por exemplo, na EP 0 067 553 e na Patente U.S. Ne 4.407.956), a transfor- mação mediada por lipossomos (como é descrito, por exemplo, na Patente U.S. Ne 4.536.475) e outros métodos tais como os métodos descritos recen- temente para a transformação de certas linhagens de milho (por exemplo, na Patente U.S. Ne 6.140.553; Fromm e outros, 1990; Gordon-Kamm e outros, 1990) e de arroz (Shimamoto e outros, 1989; Datta e outros, 1990) e o mé- todo para a transformação de monocotiledôneas em geral (publicação PCT WO 92/09696). Para a transformação do algodão, é especialmente preferido o método descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. Para a transformação do arroz, faz-se referência aos métodos descritos no WO 92/09696, no WO 94/00977 e no WO 95/06722.No. 4,684,611, RNA virus-mediated transformation (as described, for example, in EP 0 067 553 and US Patent No. 4,407,956), liposome-mediated transformation (as described, for example, in U.S. Patent No. 4,536,475) and other methods such as the methods recently described for the transformation of certain maize strains (for example, U.S. Patent No. 6,140,553; Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al. , 1990) and rice (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990) and the method for processing monocotyledons in general (PCT publication WO 92/09696). For cotton processing, the method described in PCT patent publication WO 00/71733 is especially preferred. For the processing of rice, reference is made to the methods described in WO 92/09696, WO 94/00977 and WO 95/06722.

O termo "milho" como utilizado aqui refere-se à Zea mays. O algodão como utilizado aqui refere-se a Gossypium spp., particularmente G. hirsutum e G. barbadense. O termo "arroz" refere-se a Oryza spp., particu- larmente O. sativa. "Soja" refere-se a Glycine spp., particularmente G. Max.The term "corn" as used herein refers to Zea mays. Cotton as used herein refers to Gossypium spp., Particularly G. hirsutum and G. barbadense. The term "rice" refers to Oryza spp., Particularly O. sativa. "Soy" refers to Glycine spp., Particularly G. Max.

Além da transformação do genoma nuclear, é também incluída na invenção a transformação do genoma de plastídeos, preferencialmente do genoma de cloroplastos. Kota e outros (1999) descreveram um método para superexpressar uma proteína Cry2Aa em cloroplastos do tabaco. A planta transformada resultante pode ser utilizada em um es- quema de cruzamento vegetal convencional para produzir plantas mais transformadas com as mesmas características ou para introduzir a parte do gene isp3 eficiente como inseticida em outras variedades da mesma ou de plantas de espécies relacionadas. As sementes, que são obtidas das plantas transformadas, contêm a parte do gene isp3 eficiente como inseticida na forma de uma inserção genômica estável. As células da planta transformada podem ser cultivadas de uma maneira convencional para produzir a parte eficiente como inseticida da toxina ou da proteína ISP3, que pode ser recu- perada para uso em composições inseticidas convencionais contra Lepidóp- teras (Patente U.S. Ne 5.254.799). A parte do gene isp3 eficiente como inseticida é inserida no ge- noma de uma célula vegetal de forma que o gene inserido fique a jusante (isto é, a 3') de, sob o controle de, um promotor que pode direcionar a ex- pressão da parte do gene na célula vegetal. Isto é preferencial mente realiza- do através da inserção do gene quimérico isp3 no genoma da célula vegetal, particularmente no genoma nuclear ou dos plastídeos (por exemplo, cloro- plastos).In addition to nuclear genome transformation, transformation of the plastid genome, preferably the chloroplast genome, is also included in the invention. Kota et al. (1999) described a method for overexpressing a Cry2Aa protein in tobacco chloroplasts. The resulting transformed plant can be used in a conventional plant breeding scheme to produce more transformed plants with the same characteristics or to introduce the isp3-efficient part of the gene as an insecticide into other varieties of the same or related species plants. The seeds, which are obtained from the transformed plants, contain the part of the isp3 gene efficient as an insecticide in the form of a stable genomic insert. Transformed plant cells can be cultured in a conventional manner to produce the insecticide-efficient part of the toxin or ISP3 protein, which can be recovered for use in conventional Lepidopteran insecticide compositions (US Patent No. 5,254,799). . The insecticide-efficient part of the isp3 gene is inserted into the genome of a plant cell such that the inserted gene is downstream (i.e., 3 ') from, under the control of, a promoter that can direct the expression. pressure of part of gene in plant cell. This is preferably accomplished by inserting the isp3 chimeric gene into the plant cell genome, particularly in the nuclear or plastid genome (e.g., chloroplasts).

Os promotores preferidos incluem: os promotores 35 S constitu- tivos fortes (os "promotores 35S"), do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) de isolados CM 1841 (Gardner e outros, 1981), CabbB-S (Franck e outros, 1980) e CabbB-JI (Hull e Howell, 1987); o promotor 35S descrito por Odell e outros (1985), os promotores da família da ubiquitina (por exemplo, o promo- tor da ubiquitina do milho de Christensen e outros, 1992, EP 0 342 926, ver também Cornejo e outros, 1993), o promotor gos2 (de Pater e outros, 1992), o promotor emu (Last e outros, 1990), os promotores da actina de Arabi- dopsis tal como o promotor descrito por An e outros (1996), os promotores da actina do arroz tal como o promotor descrito por Zhang e outros (1991) e o promotor descrito na Patente U.S. Ne 5.641.876; os promotores do vírus mosaico de veio da Mandioca (WO 97/48819, Verdaguer e outros (1998)), a série pPLEX de promotores do Vírus de Atrofia do Trevo Subterrâneo (WO 96/06932, particularmente o promotor S7), um promotor da álcool desidro- genase, por exemplo, pAdhIS (números de acesso no GenBank X04049, X00581) e o promotor TRT e o promotor TR2' (o "promotor TR1" e o "promo- tor TR2", respectivamente) que controlam a expressão dos genes 1' e 2', respectivamente, do T-DNA (Velten e outros, 1984). Alternativamente, pode ser utilizado um promotor que não é constitutivo, mas ao invés disso é espe- cífico para um ou mais tecidos ou órgãos da planta (por exemplo, folhas e/ou raízes) através do qual a parte do gene isp3 inserida é expressa somente nas células de tecido(s) ou órgão(s) específicos. Por exemplo, a parte do gene isp3 eficiente como inseticida poderia ser seletivamente expressa nas folhas de uma planta (por exemplo, milho, algodão, arroz, soja) colocando a parte do gene eficiente como inseticida sob o controle de um promotor com indução leve tal como promotor do gene da subunidade pequena da ribulo- se-1,5-bifosfato carboxilase da própria planta ou de uma outra planta, tal como a ervilha, como é descrito na Patente U.S. Ns 5.254.799. O promotor pode, por exemplo, ser escolhido de forma que o gene isp3 da invenção seja expresso somente nos tecidos ou células em que a praga de inseto alvo se alimenta de forma que a alimentação pelo inseto alvo susceptível resultará em danos reduzidos causados pelos insetos à planta hospedeira, compara- das com plantas que não expressam o gene isp3. Uma praga de inseto Le- pidóptera que danifica principal mente as raízes pode ser assim controlada de forma eficiente através da expressão de um gene isp3 sob um promotor específico à raiz. Um promotor preferencialmente ativo nas raízes é descrito no WO 00/29566. Um promotor preferido para a expressão preferencial na raiz é o promotor ZRP (e modificações do mesmo) que é descrito na Patente U.S. Ne 5.633.363. Uma outra alternativa é utilizar um promotor cuja expres- são pode ser induzida, por exemplo, um promotor que pode ser induzido por feridas tal como o promotor MPI descrito por Cordera e outros (1994), que é induzido pelo ferimento (tal como o causado pela alimentação dos insetos) ou um promotor que pode ser induzido por um reagente químico, tal como a dexametasona que é descrita por Aoyama e Chua (1997) ou um promotor que pode ser induzido pela temperatura, tal como o promotor de choque térmico descrito na Patente U.S. Ne 5.447.858 ou um promotor que pode ser induzido por outros estímulos externos. A parte do gene isp3 eficiente como inseticida é inserida no ge- noma da planta de forma que a parte do gene inserida fique a montante (isto é, a 5') de sinais reguladores da transcrição adequados da extremidade 3' (isto é, sinais de formação do produto da transcrição e de poliadenilação).Preferred promoters include: strong constituent 35 S promoters (the "35S promoters"), Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) from CM 1841 isolates (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al. , 1980) and CabbB-JI (Hull and Howell, 1987); the 35S promoter described by Odell et al. (1985), the ubiquitin family promoters (e.g. Christensen et al. ubiquitin promoter, 1992, EP 0 342 926, see also Cornejo et al., 1993) , the gos2 promoter (from Pater et al., 1992), the emu promoter (Last et al., 1990), the Arabidopsis actin promoters such as the promoter described by An et al. (1996), the actin promoters of the rice such as the promoter described by Zhang et al. (1991) and the promoter described in US Patent No. 5,641,876; the cassava shaft mosaic virus promoters (WO 97/48819, Verdaguer et al. (1998)), the pPLEX series of Underground Clover Atrophy Virus promoters (WO 96/06932, particularly the S7 promoter), a promoter of the dehydrogenase, for example, pAdhIS (GenBank accession numbers X04049, X00581) and the TRT promoter and the TR2 'promoter (the "TR1 promoter" and the "TR2 promoter", respectively) that control the expression of 1 'and 2' genes, respectively, of the T-DNA (Velten et al., 1984). Alternatively, a promoter that is not constitutive may be used, but is instead specific for one or more plant tissues or organs (e.g., leaves and / or roots) through which the inserted isp3 gene part is expressed. only in specific tissue (s) or organ (s) cells. For example, the insecticide-efficient isp3 gene part could be selectively expressed in the leaves of a plant (eg, corn, cotton, rice, soybean) by placing the insecticide-efficient gene part under the control of a mildly induced promoter such as as a promoter of the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit gene from the plant itself or from another plant such as the pea, as described in US Patent No. 5,254,799. The promoter may, for example, be chosen such that the isp3 gene of the invention is expressed only in the tissues or cells in which the target insect pest feeds so that feeding by the susceptible target insect will result in reduced insect damage to the target. host plant, compared to plants that do not express the isp3 gene. A Lepidopteran insect pest that primarily damages the roots can thus be effectively controlled by expressing an isp3 gene under a root-specific promoter. A preferentially active promoter in the roots is described in WO 00/29566. A preferred promoter for preferred root expression is the ZRP promoter (and modifications thereof) which is described in U.S. Patent No. 5,633,363. Another alternative is to use a promoter whose expression may be induced, for example, a wound-induced promoter such as the MPI promoter described by Cordera et al. (1994), which is induced by injury (such as that caused insect feed) or a promoter that may be induced by a chemical reagent such as dexamethasone which is described by Aoyama and Chua (1997) or a temperature-induced promoter such as the heat shock promoter described in U.S. Patent No. 5,447,858 or a promoter that may be induced by other external stimuli. The insecticide-efficient isp3 gene part is inserted into the plant germ such that the inserted gene part is upstream (i.e. 5 ') of suitable 3' end transcriptional regulatory signals (i.e. of transcription product formation and polyadenylation).

Isto é preferencial mente realizado através da inserção do gene quimérico isp3 no genoma da célula vegetal. Os sinais preferidos de poliadenilação e de formação de produtos da transcrição incluem aqueles do gene 35S do CaMV, do gene da nopalina sintase (Depicker e outros, 1982), do gene da octopina sintase (Gielen e outros, 1984) e do gene 7 do T-DNA (Velten e Schell, 1985), que atuam como seqüências de DNA não-traduzidas a 3' em células vegetais transformadas. A introdução do vetor de T-DNA em Agrobacterium pode ser rea- lizada utilizando métodos conhecidos, tal como a eletroporação ou o cruza- mento triparental. A parte do gene isp3 eficiente como inseticida pode ser opcio- nalmente inserida no genoma da planta na forma de um gene híbrido (Paten- te U.S. Ne 5.254.799; Vaeck e outros, 1987) sob o controle do mesmo pro- motor como um gene marcador que pode ser selecionado ou classificado, tal como o gene neo (EP 0 242 236) que codifica a resistência à canamicina, de forma que a planta expressa uma proteína de fusão que pode ser facilmente detectada. A transformação de células vegetais também pode ser utilizada para produzir as proteínas da invenção em grandes quantidades em culturas de células vegetais, por exemplo, para produzir uma proteína ISP3 que pos- sa ser então aplicada nas plantas de cultivo após a formulação apropriada.This is preferably accomplished by inserting the isp3 chimeric gene into the plant cell genome. Preferred signs of polyadenylation and transcriptional product formation include those of the CaMV 35S gene, the nopaline synthase gene (Depicker et al., 1982), the octopine synthase gene (Gielen et al., 1984) and the T-DNA (Velten and Schell, 1985), which act as 3 'untranslated DNA sequences in transformed plant cells. The introduction of the T-DNA vector into Agrobacterium can be accomplished using known methods such as electroporation or triparental crossing. The insecticide-efficient part of the isp3 gene may optionally be inserted into the plant genome in the form of a hybrid gene (US Patent No. 5,254,799; Vaeck et al., 1987) under the control of the same promoter as a gene. marker gene that can be selected or sorted, such as the neo gene (EP 0 242 236) that encodes kanamycin resistance, so that the plant expresses a fusion protein that can be easily detected. Plant cell transformation can also be used to produce the proteins of the invention in large quantities in plant cell cultures, for example to produce an ISP3 protein which can then be applied to the crop plants after appropriate formulation.

Quando se faz referência aqui a uma célula vegetal transgênica, esta refere- se a uma célula vegetal (ou ainda a um protoplasto de planta) em uma cultu- ra isolada ou tecidual, ou a uma célula de planta (ou protoplasto) contida em uma planta ou em um órgão ou tecido diferenciado e ambas as possibilida- des são especificamente incluídas aqui. Conseqüentemente, uma referência a uma célula vegetal na descrição ou nas reivindicações não significa que refere-se apenas a células isoladas em cultura, mas refere-se a qualquer célula vegetal, qualquer que seja o local que possa estar ou qualquer que seja o tipo de tecido ou órgão vegetal em que possa estar presente.When referring herein to a transgenic plant cell, it refers to a plant cell (or a plant protoplast) in an isolated or tissue culture, or a plant cell (or protoplast) contained in a plant or in a differentiated organ or tissue and both possibilities are specifically included here. Accordingly, a reference to a plant cell in the description or claims does not mean that it refers only to isolated cells in culture, but refers to any plant cell, wherever it may be, or whatever type of plant it may be. plant tissue or organ in which it may be present.

Todo ou parte do gene isp3, que codifica uma proteína antilepi- dóptera, pode ser também utilizada para transformar outros microorganis- mos, tais como bactérias, tal como um B. thuringiensis que possui atividade inseticida contra Lepidóptera ou Coleóptera.All or part of the isp3 gene, which encodes an antilepideroid protein, may also be used to transform other microorganisms, such as bacteria, such as a B. thuringiensis that has insecticidal activity against Lepidoptera or Coleoptera.

Dessa maneira, pode ser produzida uma cepa de Bt transforma- da que é útil para combater um espectro amplo de pragas de insetos Lepi- dópteros e/ou Coleópteros ou para combater pragas de insetos Lepidópteros adicionais. A transformação de bactérias, tais como as bactérias do gênero Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus ou Escherichia, com todo ou uma parte do gene isp desta invenção, incorporada em um veículo de clonagem adequado, pode ser realizada de uma maneira convencional, preferencial- mente utilizando técnicas convencionais de eletroporação que são descritas em Mahillon e outros (1989) e na publicação de Patente PCT WO 90/06999.In this way, a transformed Bt strain can be produced which is useful for combating a broad spectrum of Lepidopteran and / or Coleopteran insect pests or for combating additional Lepidopteran insect pests. Transformation of bacteria, such as bacteria of the genus Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus or Escherichia, with all or part of the isp gene of this invention, incorporated into a suitable cloning vehicle, may be carried out in a conventional manner, preferably using conventional electroporation techniques which are described in Mahillon et al. (1989) and in PCT Patent Publication WO 90/06999.

As cepas de espécies de Bacillus transformadas contendo o ge- ne isp3 desta invenção podem ser fermentadas através de métodos conven- cionais (Dulmage, 1981; Bernhard e Utz, 1993) para fornecer altos rendi- mentos de células. Sob condições de crescimento apropriadas que são bem entendidas, estas cepas secretam proteínas ISP3 em altos rendimentos.Transformed Bacillus species strains containing the isp3 gene of this invention can be fermented by conventional methods (Dulmage, 1981; Bernhard and Utz, 1993) to provide high cell yields. Under appropriate growing conditions that are well understood, these strains secrete ISP3 proteins in high yields.

Os microorganismos adequados alternativos em que os genes isp3 podem ser expressos são fungos, algas ou vírus, particularmente espé- cies que são espécies colonizadoras de plantas (por exemplo, (en- do)simbiônticas) ou agentes patogênicos de insetos.Alternative suitable microorganisms in which isp3 genes may be expressed are fungi, algae or viruses, particularly species that are colonizing plant species (e.g., (synd)) or insect pathogens.

Uma composição inseticida, particularmente antilepidóptera, desta invenção pode ser formulada de uma maneira convencional utilizando os microorganismos transformados com o gene isp3 ou preferencialmente suas proteínas ISP3 respectivas ou a toxina ISP3 ou uma parte da toxina eficiente como inseticida como um ingrediente ativo, junto com veículos, di- luentes, emulsificantes e/ou dispersantes adequados (por exemplo, que são descritos por Bernhard e Utz, 1993). A composição inseticida pode ser for- mulada na forma de um pó que pode ser umedecido, em péletes, de grânu- los ou de pó fino ou na forma de uma formulação líquida com solventes aquosos ou não aquosos como uma espuma, um gel, uma suspensão, um concentrado etc. Os exemplos de composições que compreendem esporos inseticidas de Bt são descritos no WO 96/10083.A particularly antilepidopteran insecticidal composition of this invention may be formulated in conventional manner using the microorganisms transformed with the isp3 gene or preferably their respective ISP3 proteins or the ISP3 toxin or a part of the insecticide-efficient toxin as an active ingredient, together with vehicles. suitable diluents, emulsifiers and / or dispersants (e.g., which are described by Bernhard and Utz, 1993). The insecticidal composition may be formulated as a powder which may be moistened in pellets, granules or fine powder or as a liquid formulation with aqueous or non-aqueous solvents such as a foam, a gel, a suspension, a concentrate etc. Examples of compositions comprising Bt insecticidal spores are described in WO 96/10083.

Um método para controlar insetos, particularmente Lepidóptera, de acordo com esta invenção, pode compreender a aplicação (por exemplo, a borrifação), em um local (área) que deve ser protegido, de uma quantidade inseticida das proteínas ISP3 ou de composições que compreendem as pro- teínas ISP3 ou que compreendem células hospedeiras transformadas com os genes isp3 desta invenção. O local que deve ser protegido pode incluir, por exemplo, o habitat das pragas de insetos ou a vegetação em crescimen- to (por exemplo, aplicação na folhagem) ou uma área em que a vegetação dever crescer (por exemplo, aplicação no solo ou na água). Uma composi- ção preferida compreende uma quantidade inseticida de pelo menos uma das proteínas ISP3 da invenção, preferencialmente produzida por um hos- pedeiro bacteriano e a aplicação preferida da composição é a aplicação nas folhas, a aplicação no solo ou o revestimento de sementes. O termo "colocar em contato" é utilizado aqui para significar "co- locar em contato físico com". O contato de uma planta com uma proteína inseticida significa que a proteína inseticida é colocada em contato com célu- las da planta, internamente (por exemplo, através da expressão na planta) ou externamente (por exemplo, através da aplicação de composições que compreendem a proteína inseticida externamente à planta). É entendido que o termo não indica o período de tempo de contato, mas compreende qual- quer período de tempo de contato (por exemplo, contato breve, contato lon- go). Quando se faz referência a um método de proteção de uma planta con- tra danos causados por insetos que compreende colocar a dita planta em contato (ou células ou tecidos da mesma) com uma proteína inseticida da invenção, o contato é preferencialmente longo o suficiente e extenso o sufi- ciente (com uma quantidade alta o suficiente de proteína em contato com um número grande o suficiente de células) para prevenir ou reduzir os danos causados por insetos.A method for controlling insects, particularly Lepidoptera, according to this invention may comprise applying (for example spraying) to a protected area (area) an insecticidal amount of the ISP3 proteins or compositions comprising ISP3 proteins or comprising host cells transformed with the isp3 genes of this invention. The location to be protected may include, for example, insect pest habitat or growing vegetation (eg foliage application) or an area where vegetation should grow (eg soil application or in the water). A preferred composition comprises an insecticidal amount of at least one of the ISP3 proteins of the invention, preferably produced by a bacterial host, and the preferred application of the composition is leaf application, soil application or seed coating. The term "getting in touch" is used here to mean "putting in physical contact with". Contact of a plant with an insecticidal protein means that the insecticidal protein is brought into contact with plant cells, either internally (e.g., through expression in the plant) or externally (eg, by applying compositions comprising insecticidal protein outside the plant). It is understood that the term does not indicate the contact time period, but comprises any contact time period (eg, brief contact, long contact). When referring to a method of protecting a plant against insect damage comprising contacting said plant (or cells or tissues thereof) with an insecticidal protein of the invention, the contact is preferably long enough and enough (with a high enough protein in contact with a sufficiently large number of cells) to prevent or reduce insect damage.

Esta invenção refere-se ainda a um método de controle de pra- gas de insetos Lepidópteros do algodão, particularmente lagarta que ataca o algodoeiro, vermes do broto, vermes da espiga, preferencial mente uma pra- ga de inseto Lepidóptero selecionado do grupo Helicoverpa zea (Verme da Espiga de Milho), Helicoverpa armigera (Lagarta que ataca o Algodoeiro), Helicoverpa punctígera (Lagarta que ataca o algodoeiro Nativa), Heliothis virescens (Verme do broto do Tabaco), Spodoptera frugiperda (Lagarta de Cereais do Outono) e Pectinophora gossipiella (Lagarta cor-de-rosa que ata- ca o algodoeiro), cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J, todas como definido aqui, (isto é, colocando em contato uma planta de algodão com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo, plantando uma planta de algodão transformada com um gene isp3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteí- na ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta in- venção, particularmente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos de algodão Lepidópte- ros para minimizar os danos nas plantas de algodão.This invention further relates to a method of insect control of cotton lepidopterans, particularly caterpillar attacking cotton, bud worms, earworms, preferably a lepidopteran insect pest selected from the Helicoverpa zea group. (Corn Cob Worm), Helicoverpa armigera (Caterpillar attacking Cotton), Helicoverpa punctígera (Caterpillar attacking Native Cotton), Heliothis virescens (Tobacco Sprout Worm), Spodoptera frugiperda (Autumn Cereal Caterpillar) and Pectinophora gossipiella (Pink caterpillar attacking cotton), the method of which comprises applying to a protected area or plant an ISP3 protein which is defined herein, preferably an ISP3-1099E protein and / or a ISP3-327D protein and / or an ISP3-2245J protein, all as defined herein (that is, by contacting a cotton plant with an ISP3 protein of this invention, for example, by planting a cotton plant (transformed with an isp3 gene of this invention or by spraying a composition containing an ISP3 protein of this invention). The invention further relates to the use of the ISP3 proteins of this invention, particularly the ISP3-1099E protein and / or the ISP3-327D protein and / or the ISP3-2245J protein against Lepidopteran cotton insect pests to minimize damage to cotton plants.

Esta invenção refere-se ainda a um método para controle de pragas de insetos do milho, particularmente vermes da espiga, lagarta de cereais do outono, brocas do milho, preferencialmente uma praga de inseto do milho selecionada do grupo de Helicoverpa zea (Verme da Espiga de Mi- lho), Agrotis ipsilon (Lagarta Negra que Destrói Plantas novas), Ostrinia nubi- lalis (Broca do Milho Europeu) e Spodoptera frugiperda (Lagarta de Cereais do Outono), cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferen- cialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J todas como definido aqui, (isto é, colocando uma planta de milho em contato com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo, plantando uma planta de milho transformada com um gene isp3 desta inven- ção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta in- venção, particularmente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos de milho Lepidópteros para minimizar os danos causados às plantas de milho.This invention further relates to a method for controlling corn insect pests, particularly earworms, autumn cereal caterpillar, corn borers, preferably a maize insect pest selected from the Helicoverpa zea group (Spike Worm). Agrotis ipsilon (Black Caterpillar Destroying Young Plants), Ostrinia nubilalis (European Corn borer) and Spodoptera frugiperda (Autumn Cereal Caterpillar), the method of which comprises application to an area or plant be protected from an ISP3 protein that is defined herein, preferably an ISP3-1099E protein and / or an ISP3-327D protein and / or an ISP3-2245J protein all as defined herein, (i.e. placing a corn plant contacting an ISP3 protein of this invention, for example by planting a maize plant transformed with an isp3 gene of this invention or spraying a composition containing an ISP3 protein of this invention). The invention further relates to the use of the ISP3 proteins of this invention, particularly the ISP3-1099E protein and / or the ISP3-327D protein and / or the ISP3-2245J protein against Lepidopteran maize insect pests to minimize damage. caused to corn plants.

Esta invenção refere-se ainda a um método para o controle de pragas de insetos de arroz Lepidópteros, particularmente brocas do caule do arroz, larvas do arroz, lagartas que destroem plantas novas do arroz, lagarta de cereais do arroz, grumixá do arroz, dobradores de folha do arroz, prefe- rencialmente uma praga de inseto de arroz selecionado do grupo de Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incertulas), Dobrador de Folhas (Cnapha- locrocis medinalis), Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens) e Broca do Caule em Manchas do Milho (Chilo partellus), cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J, todas como é defi- nido aqui, (isto é, colocando em contato uma planta de arroz com uma prote- ína ISP3 desta invenção, por exemplo, plantando uma planta de arroz trans- formada com um gene isp3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta invenção, particularmente a proteína ISP3- 1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos Lepidópteros do arroz para minimizar os danos causados às plan- tas de arroz.This invention further relates to a method for pest control of Lepidopteran rice insects, particularly rice stem borers, rice larvae, caterpillars that destroy young rice plants, rice cereal caterpillar, rice grumixá, benders. rice leaf, preferably a rice insect pest selected from the Yellow Stem borer (Scirphophaga incertulas), Leaf Bender (Cnapha- locrocis medinalis), Pink Stem Borer (Sesamia inferens) and Corn Spot Stem borer (Chilo partellus), the method of which comprises applying to a protected area or plant an ISP3 protein which is defined herein, preferably an ISP3-1099E protein and / or an ISP3-327D protein and / or an ISP3-2245J protein, all as defined herein, (that is, by contacting a rice plant with an ISP3 protein of this invention, for example by planting a rice plant transformed with a isp3 gene of this invention or by spraying a composition containing an ISP3 protein of this invention). The invention further relates to the use of the ISP3 proteins of this invention, particularly the ISP3-1099E protein and / or the ISP3-327D protein and / or the ISP3-2245J protein against rice Lepidopteran insect pests to minimize damage to rice plants.

Esta invenção refere-se ainda a um método para o controle de pragas de insetos da soja Lepidópteros, preferencialmente uma praga de inseto da soja selecionada do grupo de Lagarta Aveludada do Feijão (Anti- carsia gemmatalis), Mede Palmos da Soja (Pseudoplusia includens), Lagarta de Cereais da Beterraba (Spodoptera exígua), Lagarta de Cereais de Listras Amarelas (Spodoptera ornithogalli), Vermes da Espiga de Milho (Helicoverpa zea), Broca da Vagem (Epinotia aporema) e Rachiplusia nu, cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J, todas como é definido aqui, (isto é, colocando em contato uma planta de so- ja com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo plantando uma plan- ta de soja transformada com um gene isp3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A inven- ção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta invenção, particular- mente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos Lepidópteros da soja para minimizar os danos causados às plantas de soja.This invention further relates to a method for the control of Lepidopteran soybean insect pests, preferably a soybean insect pest selected from the Bean Velvety Caterpillar group (Antcarsia gemmatalis), Soybean Mede Palmos (Pseudoplusia includens). , Beet Cereal Caterpillar (Spodoptera exígua), Yellow Striped Cereal Caterpillar (Spodoptera ornithogalli), Corn Cob Worms (Helicoverpa zea), Pod Burs (Epinotia aporema) and Naked Rachiplusia, whose method comprises application in a area or plant to be protected, of an ISP3 protein that is defined herein, preferably an ISP3-1099E protein and / or an ISP3-327D protein and / or an ISP3-2245J protein, all as defined herein, (i.e. by contacting a soybean plant with an ISP3 protein of this invention, for example by planting a soybean plant transformed with an isp3 gene of this invention or by spraying a composition containing an ISP3 protein of this invention). The invention further relates to the use of the ISP3 proteins of this invention, particularly the ISP3-1099E protein and / or the ISP3-327D protein and / or the ISP3-2245J protein against soybean Lepidopteran insect pests to minimize the damage caused to soybean plants.

Para a obtenção da proteína ou da toxina da ISP3, as células dos hospedeiros recombinantes que expressam a proteína ISP3 podem ser cultivadas de uma maneira convencional em um meio de cultura adequado. A toxina secretada pode ser separada e purificada do meio de cultura. Alter- nativamente, se as proteínas não forem secretadas, as células podem ser lisadas utilizando meios convencionais tal como a degradação de enzimas ou detergentes ou similares. A toxina pode ser então separada e purificada através de técnicas padronizadas tal como a cromatografia, a extração, a eletroforese ou similares.To obtain the ISP3 protein or toxin, recombinant host cells expressing the ISP3 protein may be cultured in a conventional manner in a suitable culture medium. The secreted toxin may be separated and purified from the culture medium. Alternatively, if proteins are not secreted, cells may be lysed using conventional means such as degradation of enzymes or detergents or the like. The toxin can then be separated and purified by standard techniques such as chromatography, extraction, electrophoresis or the like.

O termo "gene" significa qualquer fragmento de DNA ou de RNA que compreende uma região (a "região transcrita") que é transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) em uma célula, ligado de forma operacional a regiões reguladoras adequadas, por exemplo, um promotor que pode ser expresso em plantas. Um gene pode compreender assim vá- rios fragmentos ligados de forma operacional tal como um promotor, uma seqüência líder a 5', uma região codificadora e uma seqüência não traduzida a 3', que compreende um sítio de poliadenilação. Um gene endógeno a um organismo particular (tal como uma espécie de planta ou uma cepa bacteria- na) é um gene, que é encontrado naturalmente em tal organismo na nature- za. Um gene quimérico, quando refere-se a um DNA de isp3 desta invenção, refere-se a uma seqüência de DNA do isp3 que possui seqüências regulado- ras a 5' e/ou a 3' diferentes das seqüências reguladoras a 5' e/ou a 3' bacte- rianas que ocorrem naturalmente, que controlam a expressão do gene isp3 em sua célula hospedeira nativa. O termo "expressão de um gene" refere-se ao processo em que uma região do DNA ou do RNA que é ligada de forma operacional a regiões reguladoras apropriadas, particularmente a um promotor, é transcrita em um RNA que é biologicamente ativo, isto é, que é capaz de interagir com uma outra molécula de aminoácido ou que é capaz de ser traduzido em um poli- peptídeo ou uma proteína ativa biologicamente. É dito que um gene codifica um RNA quando o produto final da expressão do gene é um RNA biologica- mente ativo, tal como, por exemplo, um RNA com sentido inverso, uma ribo- zima ou um intermediário replicativo. É dito que um gene codifica uma prote- ína quando o produto final da expressão do gene é uma proteína ou um poli- peptídeo biologicamente ativo.The term "gene" means any DNA or RNA fragment comprising a region (the "transcribed region") that is transcribed into an RNA molecule (for example, an mRNA) in a cell, operably linked to regulatory regions. suitable, for example, a plant-promoter. A gene may thus comprise several operably linked fragments such as a promoter, a 5 'leader sequence, a coding region, and a 3' untranslated sequence comprising a polyadenylation site. A gene endogenous to a particular organism (such as a plant species or a bacterial strain) is a gene, which is naturally found in such an organism in nature. A chimeric gene, when referring to an isp3 DNA of this invention, refers to an isp3 DNA sequence that has 5 'and / or 3' regulatory sequences different from the 5 'and / or the naturally occurring 3 'bacteria that control the expression of the isp3 gene in its native host cell. The term "gene expression" refers to the process in which a region of DNA or RNA that is operatively linked to appropriate regulatory regions, particularly a promoter, is transcribed into an RNA that is biologically active, that is. which is capable of interacting with another amino acid molecule or capable of being translated into a biologically active polypeptide or protein. A gene is said to encode an RNA when the end product of gene expression is a biologically active RNA, such as, for example, an antisense RNA, a ribozyme, or a replicative intermediate. A gene is said to encode a protein when the end product of gene expression is a biologically active protein or polypeptide.

Para a finalidade desta invenção a "identidade de seqüência" de duas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos relacionadas, expressa na forma de uma porcentagem, refere-se ao número de posições nas duas seqüências alinhadas de forma ótima que possuem resíduos idênticos (x100) divididos pelo número de posições comparadas. Um espaço, isto é, uma posição em um alinhamento em que um resíduo está presente em uma seqüência, mas não na outra é considerado como uma posição com resí- duos não-idênticos. Para calcular a identidade de seqüência entre duas se- qüências para a finalidade desta invenção, é utilizado o programa GAP, que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) e que é fornecido pelo Wisconsin Package, Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, EUA. Os parâmetros de GAP utilizados são uma penalidade de criação de espaço = 50 (nucleotídeos)/8 (aminoácidos), uma penalidade de extensão de espaço = 3 (nucleotídeos)/2 (aminoácidos) e uma matriz de classificação "nwsgapdna" (nucleotídeos) ou "blosum62" (aminoácidos). O GAP utiliza o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas seqüências ao longo de seu comprimento total, maximizando o número de combinações e minimizando o número de espa- ços. Os parâmetros pré-estabelecidos são uma penalidade de criação de espaço = 50 (nucleotídeos)/8 (proteínas) e a penalidade de extensão de es- paço = 3 (nucleotídeos)/2 (proteínas). Para os nucleotídeos a matriz de clas- sificação pré-estabelecida é "blosum62" (Henikoff & Henikoff, 1992).For the purpose of this invention the "sequence identity" of two related nucleotide or amino acid sequences, expressed as a percentage, refers to the number of positions in the two optimally aligned sequences that have identical (x100) divided residues by the number of positions compared. A space, that is, a position in an alignment where a residue is present in one sequence but not in the other is considered as a position with non-identical residues. To calculate the sequence identity between two sequences for the purpose of this invention, we use the GAP program, which uses the algorithm of Needleman and Wunsch (1970) and is provided by the Wisconsin Package, Version 10.2, Genetics Computer Group (GCG). ), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, USA. The GAP parameters used are a space creation penalty = 50 (nucleotides) / 8 (amino acids), a space extension penalty = 3 (nucleotides) / 2 (amino acids) and an "nwsgapdna" (nucleotides) rating matrix or "blosum62" (amino acids). GAP uses the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch to align two sequences along their total length, maximizing the number of combinations and minimizing the number of spaces. The default parameters are a space creation penalty = 50 (nucleotides) / 8 (proteins) and the space extension penalty = 3 (nucleotides) / 2 (proteins). For nucleotides the predefined classification matrix is "blosum62" (Henikoff & Henikoff, 1992).

Estas e/ou outras modalidades desta invenção são refletidas nas expressões das reivindicações, que fazem parte da descrição da invenção.These and / or other embodiments of this invention are reflected in the expressions of the claims, which are part of the description of the invention.

Os Exemplos a seguir ilustram a invenção e não são fornecidos para limitar a invenção ou à busca de proteção. A listagem de seqüência referida nos Exemplos, nas Reivindicações a não Descrição é a seguinte: SEQ ID Ne: 1: seqüência de DNA do isp3-1099EThe following Examples illustrate the invention and are not provided to limit the invention or the pursuit of protection. The sequence listing referred to in the Examples, in Claims and Non-Description is as follows: SEQ ID Ne: 1: isp3-1099E DNA sequence

SEQ ID Ne: 2: seqüência de aminoácidos da ISP3-1099ESEQ ID Ne: 2: ISP3-1099E amino acid sequence

SEQ ID Ne: 3: seqüência de DNA do isp3-327DSEQ ID Ne: 3: isp3-327D DNA Sequence

SEQ ID Ne: 4: seqüência de aminoácidos da ISP3-327DSEQ ID Ne: 4: ISP3-327D amino acid sequence

SEQ ID Ne: 5: seqüência de DNA do isp3-2245JSEQ ID Ne: 5: isp3-2245J DNA Sequence

SEQ ID Ne: 6: seqüência de aminoácidos da ISP3-2245J A não ser que seja citado de outra forma nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padronizados que são descritos em Sambrook e Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Labora- tory Press, NY, nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Pro- tocols in Molecular Biology, Current Protocols, EUA e nos Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (Reino Unido). Os materiais e os métodos padronizados para o trabalho mo- lecular de plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Cray, publicado juntamente pela BIOS Scientific Publications Ltd. (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Os mate- riais e os métodos para as reações em cadeia da polimerase podem ser en- contrados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press e em McPherson e outros (2000) PCR - Basics. From Background to Bench, Primeira Edição, Springer Verlag, Alemanha, Exemplos Exemplo 1: Caracterização de cepas bacterianas Uma cepa bacleriana, chamada aqui de BTS01099E, foi isolada partindo da poeira de grãos da Bélgica. Uma cepa bacteriana adicional, chamada aqui de BTS00327D, foi isolada de estrume de cavalo da Espanha, Uma outra cepa bacteriana,. chamada aqui de BTS02245J, foi isolada da poeira de grãos das Filipinas, Cada cepa foi crescida durante a noite em placas de LB com ágar (meio LB com 1,5% de ágar adicionado; meio LB: 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCI, 5 g/L de extrato de levedura, pH 7,3) a 28°C, Para culturas em pequena escala, 20 mL de meio TB (Terrific Broth: 12 g/L de triptona, 24 g/L de extrato de levedura, 3,8 g/L de KH2PO4, 12,5 g/L de K2HP04, 5 mL/L de glicerol, pH 7,1) foram inoculados e cultivados durante 65 horas a 28°C em uma plataforma giratória possuindo aproximadamente 70 rotações por minu- to, Após 65 horas, uma mistura de inibidor de protease foi adicionada à cul- tura, Este coquetel possui os ingredientes a seguir (os volumes fornecidos são os necessários para serem adicionados em uma cultura de 20 mL): 200 ai de PMSF (100 mM), 200 xL de uma mistura de benzamidina.HCI (100 mM) e ácido epsilon-amino-n-capróico (500 mM), 400 xL de EGTA (0,5 M), 40 xL de antipaína (0,5 mg/mL)/leupeptina (0,5 mg/mL) e 20 xL de beta- me rcapto etanol (14 M). O meio de cultura ao qual a mistura de inibidor de proteases foi adicionada, foi então centrifugado durante 20 minutos a 3000 rpm. Em al- guns casos, o sobrenadante foi concentrado aproximadamente 4 vezes utili- zando Centríprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (N- de Cat. da Millipore 4305), Para o armazenamento a longo prazo, uma alça de células es- ponjadas foi adicionada a 0,5 mL de 25% de glicerol e após submeter ao vórtex, armazenada a -70°C, As células esporuladas foram obtidas através do cultivo da cepa em placas de LB com ágar até a esporulação (que é visí- vel sob microscópio luminoso).SEQ ID Ne: 6: ISP3-2245J amino acid sequence Unless otherwise noted in the Examples, all recombinant DNA techniques are performed according to standard protocols that are described in Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Ausubel et al. Volumes 1 and 2 (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA and Brown Volumes I and II (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (United Kingdom). Standard materials and methods for plant molecular work are described in Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R. D. D. Cray, published jointly by BIOS Scientific Publications Ltd. (United Kingdom) and Blackwell Scientific Publications, United Kingdom. Materials and methods for polymerase chain reactions can be found in Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Manual Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press and McPherson et al. (2000) PCR - Basics. From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germany, Examples Example 1: Characterization of Bacterial Strains A Baclerian strain, here called BTS01099E, has been isolated from the grain dust of Belgium. An additional bacterial strain, here called BTS00327D, has been isolated from horse manure from Spain, Another bacterial strain. called here BTS02245J, was isolated from Philippine grain dust. Each strain was grown overnight on LB plates with agar (LB medium with 1.5% added agar; LB medium: 10 g / L tryptone, 10 g / l NaCl, 5 g / l yeast extract, pH 7.3) at 28 ° C For small-scale cultures 20 ml TB medium (Terrific Broth: 12 g / l tryptone, 24 g / L yeast extract, 3.8 g / L KH2PO4, 12.5 g / L K2HP04, 5 mL / L glycerol, pH 7.1) were inoculated and cultured for 65 hours at 28 ° C on a platform. at approximately 70 revolutions per minute. After 65 hours, a protease inhibitor mixture was added to the culture. This cocktail has the following ingredients (the volumes provided are needed to be added in a 20 mL culture). ): 200 µl PMSF (100 mM), 200 µl of a mixture of benzamidine.HCl (100 mM) and epsilon-amino-n-caproic acid (500 mM), 400 µl EGTA (0.5 M), 40 µl. xL antipain (0.5 mg / mL) / leupeptin (0.5 mg / ml) and 20 µl beta-methoxy ethanol (14 M). The culture medium to which the protease inhibitor mixture was added was then centrifuged for 20 minutes at 3000 rpm. In some cases, the supernatant was concentrated approximately 4-fold using Centriprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (Millipore Cat. No. 4305). For long-term storage, a sponged cell loop was added. to 0.5 mL of 25% glycerol and after vortexing, stored at -70 ° C. The sporulated cells were obtained by culturing the strain on LB agar plates until sporulation (which is visible under a microscope). bright).

Após o cultivo em placas de LB com ágar de colônias de células isoladas, a análise microscópica das culturas das cepas BTS01099E, BTS00327D e BTS02245J mostrou a presença de células vegetativas isola- das móveis em forma de bastão e esporângios contendo um esporo oval. Os cristais para espora is foram detectados em culturas de BTS00327D, BTS01099E e BTS02245J.After culturing in LB plates with isolated cell colony agar, microscopic analysis of the BTS01099E, BTS00327D and BTS02245J strains showed the presence of isolated stick-shaped mobile vegetative cells and sporangia containing an oval spore. Spore crystals were detected in cultures of BTS00327D, BTS01099E and BTS02245J.

Com base na forma similar a um bastão, no crescimento aeróbi- co e na presença de cristais paraesporais, acredita-se que estas 3 cepas sejam cepas da espécie Bacillus thuringiensis.Based on their rod-like shape, aerobic growth, and the presence of paraspinal crystals, these 3 strains are believed to be strains of the Bacillus thuringiensis species.

Cada cepa pode ser cultivada em meios padronizados convenci- onais, preferencial mente o meio T3 {triptona 3 g/L, triptose 2 g/L, extrato de levedura 1,5 g/L, 5 mg de MnCl2, 0,05 M de Na2HP04.2H20, 0,05 M de NaH- aPOj.HaO, pH 6,8 e 1,5% de ágar), preferencial mente a 28°C. Para armaze- namento a longo prazo, é preferido misturar um volume equivalente de uma suspensão de cristal de esporo com um volume equivalente de glícerol a 50% e armazenar a -70°C ou liofilizar uma suspensão de cristais de esporos, Para a esporulação, o cultivo em melo T3 é preferido durante 72 horas a 28°C.Each strain can be grown in conventional standardized media, preferably T3 medium (3 g / L tryptone, 2 g / L tryptose, 1.5 g / L yeast extract, 5 mg MnCl 2, 0.05 M Na2HP04.2H2 O, 0.05 M NaH-aPO3.HaO, pH 6.8 and 1.5% agar), preferably at 28 ° C. For long term storage, it is preferred to mix an equivalent volume of a spore crystal suspension with an equivalent volume of 50% glycerol and store at -70 ° C or lyophilize a spore crystal suspension. melo T3 cultivation is preferred for 72 hours at 28 ° C.

Exemplo 2: Ensaios biológicos de cepas de Bacillus com insetos (utilizando sobrenadante de cultura contendo a proteína inseticida) Os ensaios biológicos foram realizados em larvas neonatais de Heiicoverpa zea, Helioíhis virescerts, Ostrinia nubílalis, Spodoptera frugiper- da e Agrotis ipsilon. O sobrenadante isento de células de culturas bactéria nas de cepas de Bacillus diferentes foi utilizado nos ensaios biológicos com insetos ("ensaio de contaminação da superfície") contra vários insetos lepidopteros. A cepa BTS01099E, BTS00327D ou BTS02245J foi cultivada a 28°C em meio TB, O sobrenadante de cultura isento de células foi coletado 65 horas após o início da cultura, foram feitas diluições e aplicadas na super- fície de uma dieta artificial solidificada (ágar 20 g, água 1000 ml, farinha de milho 96 g, levedura 30 g, gérmen de trigo 64 g, sal de Wesson 7,5 g, casei- na 15 g, ácido sórbico 2 g, Aureomicina 0,3 g, Nipagina 1 g, óleo de gérmen de trigo 4 ml_r saca rose 15 g, colesterol 1 g, ácido ascórbico 3,5 g, mistura de vitaminas modificadas de Vanderzand 12 g) (com base em Vanderzand 1962), dispensada em cavidades de placas de 48 cavidades Gostar e foi permitido que solidificasse. 25 «L da solução do sobrenadante foram aplica- dos na superfície de cada cavidade (1 cm2). Uma larva de inseto neonatal (L1; primeiro instar) foi colocada em cada cavidade e 18-20 larvas foram uti- lizadas por amostra. As placas foram mantidas a 25 + 1°C e as taxas de mortalidade (porcentagem de larvas mortas versus vivas) foram registradas após 7 dias. Como um controle negativo, uma dieta padronizada e o TB fo- ram utilizados.Example 2: Biological Assay of Insect Bacillus Strains (Using Culture Supernatant Containing Insecticide Protein) Biological assays were performed on neonatal larvae of Heiicoverpa zea, Helioíhis virescerts, Ostrinia nubílalis, Spodoptera frugiperda and Agrotis ipsilon. The bacterial cell-free supernatant from different Bacillus strains was used in biological insect tests ("surface contamination assay") against various lepidopteran insects. The BTS01099E, BTS00327D or BTS02245J strain was cultured at 28 ° C in TB medium. Cell-free culture supernatant was collected 65 hours after culture initiation, dilutions were made and applied to the surface of a solidified artificial diet (agar 20 g, water 1000 ml, maize meal 96 g, yeast 30 g, wheat germ 64 g, Wesson salt 7.5 g, casein 15 g, sorbic acid 2 g, Aureomycin 0,3 g, Nipagine 1 g, wheat germ oil 4 ml_r saca rose 15 g, cholesterol 1 g, ascorbic acid 3.5 g, Vanderzand modified vitamin mixture 12 g) (based on Vanderzand 1962), dispensed into 48-well plate wells Like and was allowed to solidify. 25 µl of the supernatant solution was applied to the surface of each well (1 cm2). A neonatal insect larva (L1; first instar) was placed in each cavity and 18-20 larvae were used per sample. Plates were kept at 25 + 1 ° C and mortality rates (percentage of dead versus live larvae) were recorded after 7 days. As a negative control, a standardized diet and TB were used.

Os resultados (mostrados na Tabela 1 abaixo) mostraram que os sobrenadantes isentos de células das cepas BTS01099E, BTS00327D e BTS02245J exibiam toxicidade para larvas de Helioíhis virescens, Helicover- pa zea e Ostrínia nubilalis. Em adição, o sobrenadante da cepa BTS02245J também mostrou toxicidade para larvas de Spodoptera fruglperda e o sobre- nadante BTS00327D mostrou toxicidade para as larvas de Agrotis ipsilon, Hv: Helioíhis virescens, Hz: Heiicoverpa zea, On: Ostrínia nubila- lis, Sf: Spodopíera frugiperda: Aí: Agrotis ipsilon: nt: não testado Controles negativos (dieta padronizada): BTS02245J - Hv 9%, Hz 0%, On 0%, Sf 0% BTS00327D - Hv 10%, Hz 6%, On 4%, Aí 0% BTS01099E - Hv 10%, Hz 0%, On 0% Observações adicionais: gi: inibição do crescimento das larvas (larvas ainda vivas no es- tágio instar L1/L2 após 7 dias) ir: crescimento irregular da larva (uma proporção de larvas vivas no estágio instar L1/L2, uma proporção de larvas vivas no estágio instar L3/L4 após 7 dias) O sobrenadante isento de células da cepa BTS02245J causou 11% e 33% de mortalidade das larvas de H. virescens, 94% e 50% de morta- lidade das larvas de H. zea, 50% de mortalidade das larvas de O. nubilaiis e 78% de mortalidade das larvas de S. frugiperda, mostrando que o sobrena- dante desta cepa possui atividade inseticida, particularmente contra H. zea e S. frugiperda. A toxicidade é provavelmente causada por uma proteína se- cretada por esta cepa no meio de cultura. O sobrenadante isento de células da cepa BTS00327D causou 70% de mortalidade das larvas de H. virescens, 35% até 78% de mortalida- de das larvas de H. zea, 100% de mortalidade das larvas de O. nubilaiis e 100% de mortalidade das larvas de Agrotis ipsilon Assim, o sobrenadante desta cepa mostrou grande toxicidade a pelo menos quatro espécies diferen- tes de insetos Lepidópteras. A toxicidade ê provavelmente causada por uma proteína ativa como inseticida secretada por esta cepa no meio de cultura, O sobrenadante isento de células da cepa BTS01099E causou 25% de mortalidade das larvas de H. virescens, 10% de mortalidade das larvas de H. zea e 46% de mortalidade das larvas de O. nubilaiis, indicando que o sobrenadante desta cepa possui atividade tóxica contra espécies dife- rentes de insetos Lepidópteros. A toxicidade é provavelmente causada por uma proteína ativa como inseticida secretada por esta cepa no meio de cul- tura.The results (shown in Table 1 below) showed that cell-free supernatants from the BTS01099E, BTS00327D, and BTS02245J strains exhibited toxicity to Helioíhis virescens, Helicoverpazea, and Ostrinia nubilalis larvae. In addition, the BTS02245J strain supernatant also showed toxicity to Spodoptera fruglperda larvae and the BTS00327D supernatant showed toxicity to Agrotis ipsilon larvae, Hv: Helioíhis virescens, Hz: Heiicoverpa zea, On: Ostrinia nubila: lubis: Frugiperda spodopíera: Ai: Agrotis ipsilon: nt: not tested Negative controls (standard diet): BTS02245J - Hv 9%, Hz 0%, On 0%, Sf 0% BTS00327D - Hv 10%, Hz 6%, On 4%, There 0% BTS01099E - Hv 10%, Hz 0%, On 0% Additional Remarks: gi: inhibition of larval growth (larvae still alive at the instar stage L1 / L2 after 7 days) ir: irregular larval growth (one proportion of live larvae in the L1 / L2 instar stage, a proportion of live larvae in the L3 / L4 instar stage after 7 days) BTS02245J cell-free supernatant caused 11% and 33% mortality of H. virescens larvae, 94 % and 50% mortality of H. zea larvae, 50% mortality of O. nubilaiis larvae and 78% mortality. larvae of S. frugiperda, showing that the supernatant of this strain has insecticidal activity, particularly against H. zea and S. frugiperda. Toxicity is probably caused by a protein secreted by this strain in the culture medium. The cell-free supernatant of the BTS00327D strain caused 70% mortality of H. virescens larvae, 35% to 78% mortality of H. zea larvae, 100% mortality of O. nubilai larvae and 100% mortality. Mortality of Agrotis ipsilon larvae Thus, the supernatant of this strain showed great toxicity to at least four different species of Lepidopteran insects. Toxicity is probably caused by an insecticide-active protein secreted by this strain in the culture medium. The cell-free supernatant of strain BTS01099E caused 25% mortality of H. virescens larvae, 10% mortality of H. zea larvae. and 46% mortality of O. nubilaiis larvae, indicating that the supernatant of this strain has toxic activity against different species of Lepidopteran insects. Toxicity is probably caused by a protein active as an insecticide secreted by this strain in the culture medium.

Exemplo 3: Clonagem dos genes iso3 Clonagem da sequência de nucleotídeos que codifica ISF3-1Q99E partindo da cepa BTSQ1Q99E O DNA total da cepa BTS01099E foi preparado e pardalmente digerido com Sal/3A. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em um gradiente de sacarose.Example 3: Cloning of iso3 genes Cloning of nucleotide sequence encoding ISF3-1Q99E from strain BTSQ1Q99E The total DNA of strain BTS01099E was prepared and spontaneously digested with Sal / 3A. Digested DNA was size fractionated on a sucrose gradient.

Os fragmentos variando de 7 kb até 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19l (um derivado do pUC19; Yannisch-Perron e outros, 1985), após a digestão com Ba/r?H1 e o tratamento do vetor de clonagem com TsAP (fosfatase alcalina termossensível). A mistura de ligação foi então submetida à eletroporação em células de E. coli XLI-Blue. Os transforman- tes foram plaqueados em placas de LB-triacilina contendo X-gal e IPTG e as colônias brancas foram selecionadas para serem utilizadas em experimentos de hibridização em filtro. Os clones de E. coli recombinantes contendo o ve- tor foram então selecionados com uma sonda marcada com DIG que foi pre- parada como a seguir. Primeiro, foi realizada uma PCR utilizando as células moldes da cepa BTS01099E. O produto resultante da amplificação foi purifi- cado em gel e clonado em pGEM-T. O plasmídeo resultante foi utilizado co- mo molde em uma reação da PCR utilizando dNTPs marcados com DIG e os mesmos iniciadores que os na primeira reação da PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de amplificação foi utilizada em reações de hibridi- zação .Fragments ranging from 7 kb to 10 kb were ligated to the pUC191 cloning vector (a pUC19 derivative; Yannisch-Perron et al., 1985) after Ba / r? H1 digestion and treatment of the cloning vector with TsAP ( thermosensitive alkaline phosphatase). The ligation mixture was then electroporation into E. coli XLI-Blue cells. Transformants were plated on LB-triacylin plates containing X-gal and IPTG and white colonies were selected for use in filter hybridization experiments. Recombinant E. coli clones containing the vector were then selected with a DIG-labeled probe which was prepared as follows. First, a PCR was performed using the BTS01099E strain template cells. The resulting amplification product was gel purified and cloned into pGEM-T. The resulting plasmid was used as a template in a PCR reaction using DIG-labeled dNTPs and the same primers as in the first PCR reaction. An appropriate amount of this amplification product was used in hybridization reactions.

Após a identificação de uma colônia positiva contendo um plas- mídeo que porta o gene isp3 de comprimento completo, a seqüência deste gene foi determinada utilizando o método de marcação do terminador com corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prisrri-377. Ambos os filamentos codificadores e não-codifícadores foram seqüenciados. A seqüência do quadro aberto de leitura encontrado no fragmen- to de DNA clonado de uma colônia positiva é mostrada na SEG ID Ne: 1 (i$p3-1099E). Foi descoberto que esta seqüência de DNA codifica a nova proteína mostrada na SEQ ID N°: 2 (ISP3-1099E).After identifying a positive colony containing a plasmid carrying the full-length isp3 gene, the sequence of this gene was determined using the dye terminator tagging method and a Perkin Elmer ABI Prisrri-377 DNA sequencer. Both coding and non-coding filaments were sequenced. The sequence of the open reading frame found in the cloned DNA fragment of a positive colony is shown in SEG ID Ne: 1 (i $ p3-1099E). This DNA sequence has been found to encode the new protein shown in SEQ ID NO: 2 (ISP3-1099E).

Para mostrar que esta seqüência de DNA é a causa da atividade inseticida observada, a seqüência foi expressa em uma cepa bactéria na e o sobrenadante ou o lisado de células da cepa recombinante foi testado em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos com insetos.To show that this DNA sequence is the cause of the observed insecticidal activity, the sequence was expressed in a bacterial strain and the recombinant strain cell supernatant or lysate was tested for insecticidal activity in insect biological assays.

Clonagem da seqüência de nucleotídeos que codifica ISP3-327D partindo da cepa BTS0Q327D O DNA total da cepa BTS00327D foi preparado e parcial mente digerido com Sau3A. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em um gradiente de sacarose.Cloning of ISP3-327D encoding nucleotide sequence from strain BTS0Q327D Total DNA from strain BTS00327D was prepared and partially digested with Sau3A. Digested DNA was size fractionated on a sucrose gradient.

Os fragmentos variando de 7 kb até 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19l (um derivado do pUC19; Yannisch-Perron e outros, 1985), após a digestão com BamH1 e o tratamento do vetor de clonagem com TsAP (fosfatase alcalina termossensfvel). A mistura de ligação foi então submetida à eletroporação em células de £ coli XLI-Blue. Os transforman- tes foram plaqueados em placas de LB-triacílina contendo X-gal e IPTG e as colônias brancas foram selecionadas para serem utilizadas em experimentos de hibrídização em filtro. Os clones de E. coli recombinantes contendo o ve- tor foram então selecionados com uma sonda marcada com DIG que foi pre- parada como a seguir. Primeiro, foi realizada uma PCR utilizando as células moldes da cepa BTS0G327D. O produto resultante da amplificação foi purifi- cado em gel e clonado em pGEM-T. O plasmídeo resultante foi utilizado co- mo molde em uma reação da PCR utilizando dNTPs marcados com DIG e os mesmos iniciadores que os na primeira reação da PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de amplificação foi utilizada em reações de hibridí- zação.Fragments ranging from 7 kb to 10 kb were ligated to the pUC191 cloning vector (a pUC19 derivative; Yannisch-Perron et al., 1985) following BamH1 digestion and treatment of the TsAP (heat-sensitive alkaline phosphatase) cloning vector . The ligation mixture was then electroporated into XLI-Blue coli cells. Transformants were plated on LB-triacillin plates containing X-gal and IPTG and white colonies were selected for use in filter hybridization experiments. Recombinant E. coli clones containing the vector were then selected with a DIG-labeled probe which was prepared as follows. First, a PCR was performed using the BTS0G327D strain template cells. The resulting amplification product was gel purified and cloned into pGEM-T. The resulting plasmid was used as a template in a PCR reaction using DIG-labeled dNTPs and the same primers as in the first PCR reaction. An appropriate amount of this amplification product was used in hybridization reactions.

Após a identificação de uma colônia positiva contendo um plas- mídeo que porta o gene isp3 de comprimento completo, a sequência deste gene foi determinada utilizando o método de marcação do terminador com corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Ambos os filamentos codificadores e não-codificadores foram seqüenciados. A sequência do quadro aberto de leitura encontrado no fragmen- to de DNA clonado de uma colônia positiva é mostrada na SEQ ID N°: 3 (,isp3-327D). Foi descoberto que esta sequência de DNA codifica a nova pro- teína mostrada na SEQ ID N°; 4 (ISP3-327D).Upon identification of a positive colony containing a plasmid carrying the full-length isp3 gene, the sequence of this gene was determined using the dye terminator tagging method and a Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA sequencer. Both coding and non-coding filaments were sequenced. The sequence of the open reading frame found in the cloned DNA fragment of a positive colony is shown in SEQ ID NO: 3 (, isp3-327D). This DNA sequence has been found to encode the new protein shown in SEQ ID NO; 4 (ISP3-327D).

Para mostrar que esta seqüência de DNA é a causa da atividade inseticida observada, a sequência foi expressa em uma cepa bacteriana e o sobrenadante ou o lisado de células da cepa recombinante foi testado em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos com insetos.To show that this DNA sequence is the cause of the observed insecticidal activity, the sequence was expressed in a bacterial strain and the recombinant strain cell supernatant or lysate was tested for insecticidal activity in insect biological assays.

Clonagem da seqüência de nucleotídeos que codifica ISP3-2245J partindo da cepa BTS02245J O DNA total da cepa BTS02245J foi preparado e parcial mente digerido com Sau3A. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em um gradiente de sacarose.Cloning of ISP3-2245J encoding nucleotide sequence from strain BTS02245J Total DNA of strain BTS02245J was prepared and partially digested with Sau3A. Digested DNA was size fractionated on a sucrose gradient.

Os fragmentos variando de 7 kb até 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19l (um derivado do pUC19; Yannisch-Perron e outros, 1985), após a digestão com SamH1 e o tratamento do vetor de clonagem com TsAP (fosfatase alcalina termossensível). A mistura de ligação foi então submetida à eletroporação em células de E. coli XL1-Blue. Os transforman- tes foram plaqueados em placas de LB-triacilina contendo X-gal e IPTG e as colônias brancas foram selecionadas para serem utilizadas em experimentos de hibridização em filtro. Os clones de E. coli recombinantes contendo o ve- tor foram então selecionados com uma sonda marcada com DIG que foi pre- parada como a seguir. Primeiro, foi realizada uma PCR utilizando as células moldes da cepa BTS02245J. O produto resultante da amplificação foi purifi- cado em gel e clonado em pGEM-T. O plasmídeo resultante foi utilizado co- mo molde em uma reação da PCR utilizando dNTPs marcados com DIG e os mesmos iniciadores que os na primeira reação da PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de amplificação foi utilizada em reações de hibridi- zação.Fragments ranging from 7 kb to 10 kb were ligated to the cloning vector pUC191 (a pUC19 derivative; Yannisch-Perron et al., 1985) after digestion with SamH1 and treatment of the cloning vector with TsAP (thermosensitive alkaline phosphatase) . The ligation mixture was then electroporated into XL1-Blue E. coli cells. Transformants were plated on LB-triacylin plates containing X-gal and IPTG and white colonies were selected for use in filter hybridization experiments. Recombinant E. coli clones containing the vector were then selected with a DIG-labeled probe which was prepared as follows. First, a PCR was performed using the BTS02245J strain template cells. The resulting amplification product was gel purified and cloned into pGEM-T. The resulting plasmid was used as a template in a PCR reaction using DIG-labeled dNTPs and the same primers as in the first PCR reaction. An appropriate amount of this amplification product was used in hybridization reactions.

Após a identificação de uma colônia positiva contendo um plas- mídeo que porta o gene isp3 de comprimento completo, a seqüência deste gene foi determinada utilizando o método de marcação do terminador com corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Ambos os filamentos codificadores e não-codificadores foram seqüenciados. A seqüência do quadro aberto de leitura encontrado no fragmen- to de DNA clonado de uma colônia positiva é mostrada na SEQ ID Ne: 5 {isp3-2245J). Foi descoberto que esta seqüência de DNA codifica a nova proteína mostrada na SEQ ID Ne: 6 (ISP3-2245J).After identifying a positive colony containing a plasmid carrying the full-length isp3 gene, the sequence of this gene was determined using the dye terminator tagging method and a Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA sequencer. Both coding and non-coding filaments were sequenced. The open frame reading sequence found in the cloned DNA fragment of a positive colony is shown in SEQ ID Ne: 5 (isp3-2245J). This DNA sequence has been found to encode the new protein shown in SEQ ID Ne: 6 (ISP3-2245J).

Para mostrar que esta seqüência de DNA é a causa da atividade inseticida observada, a seqüência foi expressa em uma cepa bacteriana e o sobrenadante ou o lisado de células da cepa recombinante foi testado em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos com insetos.To show that this DNA sequence is the cause of the observed insecticidal activity, the sequence was expressed in a bacterial strain and the recombinant strain cell supernatant or lysate was tested for insecticidal activity in biological insect assays.

Exemplo 4: Expressão recombinante de proteínas ISP3 em E. coli A SEQ ID NP: 1 (isp3-1099E), a SEQ ID N°: 3 (isp3-327D) e a SEQ ID N°: 5 {isp3-2245J) foram subclonadas em um vetor de expressão, sob o controle do promotor crylAb e expressas na cepa de E, coii WK6. Du- rante a subclonagem, um sítio de restrição Wcol foi introduzido no códon de início ATG, alterando assim o segundo aminoãcido da SEQ ID Ne: 2, da SEQ ID Ng: 4 e da SEQ ID NP: 6 de Aspa ra gin a (Asn) para Aspartato (Asp). A análise de SDS-PAGE de iisados de células de E. coii trans- formadas mostrou que as proteínas do peso molecular esperado (+ 88 kDa) foram produzidas para cada um dos três genes, Como controles negativos foi utilizado o lisado de células de E. coii WK6 não-transformadas. O lisado de células de culturas de E. coii recombinantes, que expressam isp3-327D e isp3-1099E, foi utilizado em ensaios biológicos com insetos (ensaios de contaminação de superfície) como é descrito no Exem- plo 5. Os resultados são resumidos na Tabela 2 abaixo. Os símbolos de po- sitivo indicam mortalidade de insetos significativa em relação ao controle negativo, Hz: Helicoverpa zea, Hv: Heliothis virescens, Sf: Spodoptera frugiperda, Dw: Diabrotica virgifera virgifera, Ag: Anticarsia gemmatalis Ensaios biológicos: Hz: Contaminação de superfície na alimentação de Heliothis em placas Costar de 48 cavidades múltiplas» 25 «L/cavidade (1 cm2), 18x1L1 por concentração Hv: Contaminação de superfície na alimentação de Heliothis em placas Costar de 24 cavidades múltiplas, 50 ocL/cavidade (1 cm2), 20x1 L1 por concentração Sf: Contaminação de superfície na alimentação de littoraiis em placas Costar de 48 cavidades múltiplas, 25 odJcavidade (1 cm2), 18x1L1 por concentração Ag: Contaminação de superfície na alimentação de littoralis em placas Costar de 24 cavidades múltiplas, 50 ocL/cavidade (2 cm2), 12x1L1 por concentração Incubação à T: 25 + 1°C; Escore após 7 dias Para a proteína ISP3-327D e a proteína ISP3-1099E, foi encon- trada uma mortalidade significativa nos ensaios de contaminação de superfí- cie com Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Spodoptera frugiperda e Anti- carsia gemmatalis. Em adição, o lisado de células não diluído de E. coli ex- pressando ISP3-327D ou ISP3-1099E mostrou mortalidade significativa con- tra Ostrinia nubilalis (50% (gi) de mortalidade para ISP3-327D, 26% (gi) de mortalidade para ISP3-1099E comparados com 0% de mortalidade pelo con- trole WK6).Example 4: Recombinant Expression of ISP3 Proteins in E. coli SEQ ID NP: 1 (isp3-1099E), SEQ ID No.: 3 (isp3-327D) and SEQ ID No.: 5 (isp3-2245J) were subcloned into an expression vector under the control of the crylAb promoter and expressed in the E, coii WK6 strain. During subcloning, a restriction site Wcol was introduced into the ATG start codon, thereby altering the second amino acid of SEQ ID Ne: 2, SEQ ID Ng: 4 and SEQ ID NP: 6 of Aspa ra gin a ( Asn) to Aspartate (Asp). SDS-PAGE analysis of transformed E. coli cell lysates showed that proteins of the expected molecular weight (+ 88 kDa) were produced for each of the three genes. As negative controls the E cell lysate was used. coii WK6 unprocessed. Recombinant E. coli cell lysate expressing isp3-327D and isp3-1099E was used in insect biological assays (surface contamination assays) as described in Example 5. The results are summarized in Table 2 below. Positive symbols indicate significant insect mortality relative to negative control, Hz: Helicoverpa zea, Hv: Heliothis virescens, Sf: Spodoptera frugiperda, Dw: Diabrotica virgifera virgifera, Ag: Anticarsia gemmatalis. Biological tests: Hz: Surface contamination. Heliothis feeding on 48-well multi-well Costar plates 25 'L / well (1 cm2), 18x1L1 per concentration Hv: Surface contamination on Heliothis feeding on 24-well multi-cost Costar Heliothis plates, 50 µL / well (1 cm2) , 20x1 L1 per concentration Sf: Surface contamination in the feeding of Littoralis plates in 48 multi-well Costar plates, 25 odJcavity (1 cm2), 18x1L1 per concentration Ag: Surface contamination in the feeding of Littoralis plates in the 24-well multiple Costar plates, 50 ocL / well (2 cm2), 12x1L1 per concentration Incubation at T: 25 + 1 ° C; 7-day score For ISP3-327D protein and ISP3-1099E protein, significant mortality was found in the Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Spodoptera frugiperda and Anti- carsia gemmatalis surface contamination assays. In addition, undiluted E. coli cell lysate expressing ISP3-327D or ISP3-1099E showed significant mortality against Ostrinia nubilalis (50% (gi) mortality for ISP3-327D, 26% (gi) of mortality for ISP3-1099E compared to 0% mortality by WK6 control).

Exemplo 5: Expressão recombinante de proteínas ISP3 em Bt A SEQ ID Ne: 1 (isp3-1099E) e a SEQ ID Ne: 5 foram subclona- das em um vetor bidirecional e expressas em uma cepa de Bt que não pro- duz cristal (IPS 78/11 ou Berliner 1715cry'). Nos ensaios biológicos, o sobre- nadante da cepa Bt não-transformada é utilizado como o controle negativo. O sobrenadante de cultura isento de células da cepa Bt recom- binante é testado em relação à toxicidade contra larvas de insetos Lepidóp- teros, particularmente contra H. virescens, H. zea, H. armigera, O. nubilalis, S. frugiperda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella e A. gemmatalis, utili- zando um ensaio de contaminação de superfície como descrito anteriormen- te (Exemplo 2) e abaixo (para determinar os valores de LC50)· O sobrenadante da cepa de Bt recombinante é obtido como a seguir. A cepa de Bt é cultivada durante a noite em placas de LB com ágar contendo eritromicina (20 ocg/mL) a 28°C. Para culturas em pequena escala, 20 ml_ de meio TB contendo eritromicina (20 ocg/mL) são inoculados e cultivados durante 65 horas a 28°C em uma plataforma giratória que pos- sui aproximadamente 70 rotações por minuto. Após 65 horas, uma mistura de inibidores de proteases é adicionada à cultura. Este coquetel possui os ingredientes a seguir (os volumes fornecidos são os necessários para serem adicionados em uma cultura de 20 ml_): 200 ocL de PMSF (100 mM), 200 ocL de uma mistura de benzamidina.HCI (100 mM)/ácido epsilon-amino-n- capróico (500 mM), 400 ocL de EGTA (0,5 M), 40 ocL de antipaína (0,5 mg/ml_)/leupeptina (0,5 mg/mL) e 20 ocL de beta-mercaptoetanol (14 M). O meio de cultura ao qual a mistura de inibidores de proteases foi adicionada, é então centrifugado durante 20 minutos a 3000 rpm. Em al- guns casos, o sobrenadante é concentrado aproximadamente 4 vezes utili- zando centriprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (Ne de Cat. da Millipore 4305).Example 5: Recombinant Expression of ISP3 Proteins in Bt SEQ ID Ne: 1 (isp3-1099E) and SEQ ID Ne: 5 were subcloned into a bidirectional vector and expressed in a non-crystal producing Bt strain ( IPS 78/11 or Berliner 1715cry '). In biological assays, the untransformed Bt strain surplus is used as the negative control. The recombinant Bt strain cell-free supernatant is tested for toxicity against Lepidopteran insect larvae, particularly against H. virescens, H. zea, H. armigera, O. nubilalis, S. frugiperda, Agrotis. ipsilon, Pectinophora gossypiella and A. gemmatalis using a surface contamination assay as described above (Example 2) and below (to determine LC50 values) · Recombinant Bt strain supernatant is obtained as follows . The Bt strain is grown overnight on LB plates with agar containing erythromycin (20 µg / ml) at 28 ° C. For small scale cultures, 20 ml of erythromycin-containing TB medium (20 µg / ml) is inoculated and cultured for 65 hours at 28 ° C on a turntable that has approximately 70 rotations per minute. After 65 hours, a mixture of protease inhibitors is added to the culture. This cocktail has the following ingredients (the volumes provided are those required to be added in a 20 ml culture): 200 µl PMSF (100 mM), 200 µl benzamidine.HCI (100 mM) / epsilon acid mixture -amino-n-caproic acid (500 mM), 400 µl EGTA (0.5 M), 40 µL antipain (0.5 mg / ml) / leupeptin (0.5 mg / ml) and 20 µL beta- mercaptoethanol (14 M). The culture medium to which the protease inhibitor mixture was added is then centrifuged for 20 minutes at 3000 rpm. In some cases, the supernatant is concentrated approximately 4-fold using centriprep YM-10 Centrifuge Filter Devices (Millipore Cat. No. 4305).

Para Helicoverpa zea e Heliothis virescens é utilizada a dieta artificial a seguir no ensaio de contaminação de superfície: água 1 litro, ágar 20 g, farinha de soja 81 g, gérmen de trigo 36 g, mistura de sais de Wesson 10 g, sacarose 14,7 g, Nipagina 1 g, ácido sórbico 1,1 g, mistura de vitami- nas Vanderzant 9,5 g, óleo de milho 5 ml_, Nistatina 0,06 g, Aureomicina 0,17g.The following artificial diet is used for Helicoverpa zea and Heliothis virescens in the surface contamination test: water 1 liter, 20 g agar, 81 g soy flour, 36 g wheat germ, 10 g Wesson salt mixture, sucrose 14 , 7g, Nipagine 1g, Sorbic acid 1.1g, Vanderzant Vitamin Mix 9.5g, Corn Oil 5ml, Nystatin 0.06g, Aureomycin 0.17g.

Nos ensaios de contaminação de superfície para outros insetos lepidópteros, é utilizada a dieta artificial a seguir: água 1 litro, ágar 20 g, fari- nha de milho 112 g, gérmen de trigo 28 g, levedura 30 g, ácido sórbico 1,2 g, Nipagina 1 g, Aureomicina 0,06 g, Nistatina 0,03 g, ácido ascórbico 4,8 g. A dieta artificial é dispensada nas cavidades de placas de 24 cavidades múltiplas Costar e foi permitido que solidificasse. 50 ocL de sobre- nadante diluído foram aplicados sobre a superfície de cada cavidade (2 cm2). Uma ou duas larvas neonatais (L1; primeiro instar) são colocadas em cada cavidade (dependendo da espécie, por exemplo, para O. nubilalis 2 larvas/cavidade) e aproximadamente 20 até 24 larvas são utilizadas por di- luição do sobrenadante. Seis até oito diluições do sobrenadante (o fator de diluição é aproximadamente 3), variando de aproximadamente 4050 até 0,1 ng/cm2 são testadas. As placas são mantidas a 25 + 1 °C e as taxas de mor- talidade (porcentagem de larvas mortas versus vivas) são registradas após 7 dias. Como um controle negativo a dieta padronizada e o TB são utilizados.For surface contamination tests for other lepidopteran insects, the following artificial diet is used: 1 liter water, 20 g agar, 112 g cornmeal, 28 g wheat germ, 30 g yeast, sorbic acid 1,2 g, Nipagine 1 g, Aureomycin 0.06 g, Nystatin 0.03 g, Ascorbic acid 4.8 g. The artificial diet is dispensed into the Costar 24-well multiple plate wells and allowed to solidify. 50 μL of diluted supernatant were applied to the surface of each well (2 cm2). One or two neonatal larvae (L1; first instar) are placed in each well (depending on species, eg for O. nubilalis 2 larvae / well) and approximately 20 to 24 larvae are used by supernatant dilution. Six to eight supernatant dilutions (dilution factor is approximately 3) ranging from approximately 4050 to 0.1 ng / cm2 are tested. Plaques are kept at 25 + 1 ° C and mortality rates (percentage of dead versus live larvae) are recorded after 7 days. As a negative control standard diet and TB are used.

Os valores de LC50 e/ou os valores de LC90 são calculados com a análise de probit utilizando o programa POLO PC {de LeOra Software, 1987, Berkely, Califórnia). O valor de LC50 é a concentração total de proteínas no sobrena- dante quando 50% das larvas de insetos são mortas Os ensaios biológicos mostram que as proteínas codificadas por cada uma das seqüências isp3-1099E e isp3-2245J clonadas causam uma atividade inseticida significativa contra os insetos Lepidópteros selecionados, A SEQ ID N°: 3 (isp3-327D) foi subclonada em um vetor bifunci- onal e expressa na cepa Bt que não produz cristais IPS78/11. Nos ensaios biológicos, o sobrenadante da cepa Bt não-transformada foi utilizado como o controle negativo. A análise de SDS-PAGE mostrou que o sobrenadante de cultura continha uma proteína com um peso molecular próximo ao peso molecular calculado da proteína ISP3-327D (+ 88 kDa).LC50 values and / or LC90 values are calculated by probit analysis using the POLO PC program (from LeOra Software, 1987, Berkely, California). The LC50 value is the total protein concentration in the supernatant when 50% of insect larvae are killed. Biological assays show that the proteins encoded by each of the cloned isp3-1099E and isp3-2245J sequences cause significant insecticidal activity against the selected Lepidopteran insects, SEQ ID NO: 3 (isp3-327D) was subcloned into a bifunctional vector and expressed in the Bt strain that does not produce IPS78 / 11 crystals. In biological assays, the untransformed Bt strain supernatant was used as the negative control. SDS-PAGE analysis showed that the culture supernatant contained a protein with a molecular weight close to the calculated molecular weight of the ISP3-327D protein (+ 88 kDa).

Utilizando 0 ensaio de contaminação de superfície como é des- crito no Exemplo 2, 0 sobrenadante de cultura isento de células da cepa de Bt IPS78/11 que expressa a SEQ ID NQ: 3 (Isp3-327D) mostrou atividade inseticida significativa contra Ostrinia nubifafis (On), Pectlnophora gossypietla (Pg) e Helicoverpa zea (Hz), como é mostrado na Tabela 3. gi; inibição do crescimento de larvas/Dvv: Diabroíica virgifera virgifera Ensaios Biológicos: Os ensaios de contaminação de superfície, como descritos ante- riormente, utilizando o sobrenadante concentrado após 26 horas de cultura em TB e seguidos da adição do coquetel de inibidores de proteases. A dieta artificial de Heliothis (como acima) foi utilizada para H. zea e a dieta artificiai para littoralis para 0. nubillalis e P. gossypíella. Para H. zea e 0. nubialis foram utilizadas placas Costar de 48 cavidades, 25 «L/cavidade (1 cm2), 18 cavidades com uma larva L1 por cavidade. Para P. gossypíella foram utiliza- das placas Costar de 24 cavidades, 50 «L/cavidade (2 cm2) e 12 cavidades com duas larvas L1 por cavidade. A dieta artificial para Dvv (como acima) foi utilizada para Dvv em placas de 24 cavidades, 50 *L/cavidade (2 cm2), 6 cavidades com 4 L1/cavidade. O ensaio biológico mostrou que a proteína codificada pela se- quência clonada Isp3-327D possuía atividade inseticida significativa contra os insetos Lepidópteros selecionados.Using the surface contamination assay as described in Example 2, the Bt strain cell-free culture supernatant of IPS78 / 11 expressing SEQ ID NO: 3 (Isp3-327D) showed significant insecticidal activity against Ostrinia nubifafis (On), Pectlnophora gossypietla (Pg) and Helicoverpa zea (Hz), as shown in Table 3. gi; larval growth inhibition / Dvv: Diabroíica virgifera virgifera Biological Assays: Surface contamination assays, as described above, using concentrated supernatant after 26 hours of TB culture followed by the addition of the protease inhibitor cocktail. The artificial Heliothis diet (as above) was used for H. zea and the artificial diet for littoralis for 0. nubillalis and P. gossypíella. For H. zea and 0. nubialis 48-well Costar plates, 25 µl / well (1 cm2), 18 wells with one L1 larva per well were used. For P. gossypíella, 24-well Costar plates, 50 µl / well (2 cm2) and 12 wells with two L1 larvae per well were used. The artificial Dvv diet (as above) was used for Dvv in 24-well, 50 * L / well (2 cm2), 6-well 4 L1 / well plates. The biological assay showed that the protein encoded by the cloned sequence Isp3-327D had significant insecticidal activity against the selected Lepidopteran insects.

Exemplo 6: caracterização adicional da ISP3-327D O sobrenadante da cepa de Bt que não produz cristal 1PS78/11 expressando a SEQ ID Na: 3 (isp3-327D) foi utilizado para testar a capacida- de de digestão pela tripsina da proteína ISP3-327D e a toxicidade dos frag- mentos resultantes. O tratamento com a tripsina do sobrenadante da cultura de IPS78/11 transformada resultou em duas bandas maiores de aproxima- damente 65 kDa e aproximadamente 23 kDa, que são determinadas através da análise de SDS-PAGE.Example 6: Further Characterization of ISP3-327D The 1PS78 / 11 non-crystal producing Bt strain supernatant expressing SEQ ID NO: 3 (isp3-327D) was used to test the trypsin digestion capacity of the ISP3- 327D and the toxicity of the resulting fragments. Trypsin treatment of the transformed IPS78 / 11 culture supernatant resulted in two larger bands of approximately 65 kDa and approximately 23 kDa, which are determined by SDS-PAGE analysis.

Tanto o sobrenadante tratado com tripsina (4 horas de tratamen- to; a reação foi interrompida com PMSF de uma concentração final de 0,1 mM) quanto o sobrenadante que não foi tratado com tripsina foram utilizados nos ensaios de contaminação de superfície contra Helicoverpa zea. O en- saio de contaminação de superfície foí realizado no alimento de heliothis em placas de 48 cavidades múltiplas (25 xL/cavidade; 1 cm2}. Foram testadas seis diluições do sobrenadante. Por diluição foram utilizadas 18 cavidades e uma larva L1 por cavidade. A mortalidade foi avaliada após a incubação a 25° + 1°C após 7 dias.Both trypsin-treated supernatant (4 hours of treatment; the reaction was stopped with PMSF at a final concentration of 0.1 mM) and non-trypsin-treated supernatant were used in Helicoverpa zea surface contamination assays. . Surface contamination testing was performed on the heliothis feed in 48 multi-well plates (25 xL / well; 1 cm2). Six supernatant dilutions were tested, and 18 wells and one L1 larva per well were diluted. Mortality was assessed after incubation at 25 ° + 1 ° C after 7 days.

Os valores de LCso para a proteína ISP3-327D não tratada e tra- tada com tripsina mostrou intervalos de confiança com 90% de sobreposi- ção, mostrando que a proteína tratada com tripsina mantém a atividade tóxi- ca contra H. zea.LCso values for untreated and trypsin-treated ISP3-327D protein showed 90% confidence intervals overlap, showing that the trypsin-treated protein maintains toxic activity against H. zea.

Exemplo 7: Ensaios biológicos com insetos do arroz de proteínas ISP3 re- combinantes As seqüências para isp3-1099E (SEQ ID Ne: 1), isp3-327D (SEQ ID Ne: 3) e isp3-2245J (SEQ ID Ne: 5) foram expressas em E. coli como é descrito anteriormente.Example 7: Rice Insect Biological Assays of Recombinant ISP3 Proteins The sequences for isp3-1099E (SEQ ID Ne: 1), isp3-327D (SEQ ID Ne: 3) and isp3-2245J (SEQ ID Ne: 5) were expressed in E. coli as described above.

Os lisados de células de E. coli recombinante foram testados em ensaios biológicos com insetos em relação à atividade contra quatro pragas de arroz Lepidópteras. Foram testadas cinco até seis doses por proteína. (a) Ensaio biológico com a Broca Amarela do Caule (Scir- phophaga incertulas): Adultos da Broca Amarela do Caule foram coletados de campos de arroz. Os ovos colocados pelos adultos foram coletados e mantidos em placas de Petri para eclosão a 30°C. As larvas recém-eclodidas foram utili- zadas nos ensaios biológicos.Recombinant E. coli cell lysates were tested in insect biological assays for activity against four Lepidopteran rice pests. Five to six doses per protein were tested. (a) Biological assay with Yellow Stem Drill (Sciropophaga incertulas): Adults of Yellow Stem Drill were collected from rice fields. The eggs laid by the adults were collected and kept in petri dishes for hatching at 30 ° C. Newly hatched larvae were used in biological assays.

Bainhas da haste do arroz de 6 cm foram utilizadas. Segmentos de seis centímetros de comprimento das bainhas foliares foram cortados de hastes de arroz recém-cortadas da variedade susceptível TN1. A parte mais interna do segmento, junto com uma cobertura de bainha, foram imersas separadamente em doses de proteínas diferentes durante 30 segundos. A bainha da haste tratada foi imobilizada verticalmente sobre 2 cm de gel de ágar em tubos para amostras (7 cm de comprimento; 2,5 cm de diâmetro). 10-15 larvas neonatais da Broca Amarela do Caule foram adicionadas a ca- da haste tratada e os tubos foram selados e incubados durante cinco dias.6 cm rice stalk sheaths were used. Six-centimeter length segments of leaf sheaths were cut from freshly cut susceptible variety TN1 rice stems. The innermost part of the segment, along with a sheath cover, were immersed separately in different protein doses for 30 seconds. The treated stem sheath was immobilized vertically over 2 cm of agar gel in sample tubes (7 cm long; 2.5 cm diameter). 10-15 neonatal larvae of the yellow stem borer were added to each treated stem and the tubes were sealed and incubated for five days.

Após 5 dias, os números de larvas sobreviventes e de mortas foram conta- dos. (b) Ensaio biológico com o Dobrador de Folhas (Cnaphalocrocis medinalis): Os insetos foram coletados de campos de arroz no norte da ín- dia. As larvas de insetos foram cultivadas sobre as plantas de arroz na estu- fa. Os adultos emergentes foram confinados na câmara de oviposição e as plantas que sofreram oviposição foram mantidas em bandejas de água du- rante a eclosão das larvas. Foram utilizadas larvas de um dia de idade nos ensaios biológicos.After 5 days, the numbers of surviving and dead larvae were counted. (b) Leaf Folding Biological Assay (Cnaphalocrocis medinalis): Insects were collected from rice fields in northern India. Insect larvae were cultivated on rice plants in the study. Emerging adults were confined to the oviposition chamber and plants that underwent oviposition were kept in water trays during larval hatching. One day old larvae were used in the biological assays.

Os ensaios biológicos foram conduzidos em câmaras cilíndricas, utilizando folhas recém-cortadas de plantas de arroz no estágio de formação de grelo. Uma lâmina foliar de 8 cm de comprimento foi cortada da estria central do grelo de arroz. A lâmina foliar foi colocada na câmara e foram aplicadas dosagens de proteínas diferentes. Após 30 minutos, cinco até dez larvas foram adicionadas por folha. Pelo menos três folhas foram utilizadas por dose de proteína. Cinco dias após a incubação, o número de larvas mor- tas e sobreviventes foi contado. (c) Ensaio biológico com a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesa- mia inferens): Os insetos foram coletados em campos de arroz no norte da ín- dia e cultivados sobre plantas de arroz.Biological assays were conducted in cylindrical chambers using freshly cut leaves of rice plants at the stage of sprouting. An 8 cm long leaf blade was cut from the central groove of the rice greens. The leaf blade was placed in the chamber and different protein dosages were applied. After 30 minutes, five to ten larvae were added per leaf. At least three leaves were used per protein dose. Five days after incubation, the number of dead and surviving larvae was counted. (c) Biological Assay with Pink Stem Drill (Sessemia inferens): Insects were collected from rice fields in northern India and grown on rice plants.

Os ensaios biológicos foram realizados em frascos de vidro (7,5 cm x 2,5 cm de diâmetro) utilizando uma dieta artificial constituída de pó se- co de feijão, levedura de cervejaria, ácido sórbico, ácido ascórbico, metil pa- rabeno, ágar e água. A dieta foi colocada nos frascos até 2 cm de profundi- dade. Pelo menos três frascos foram preparados por dose de proteína. 40 ocL da dose de teste foram espalhados uniformemente sobre a superfície da dieta em cada frasco e deixados secar durante uma hora. Dez até quinze larvas do primeiro instar da Broca Cor-de-Rosa do Caule foram adicionadas por frasco. Após sete dias o número de larvas mortas e sobreviventes foi contado. (d) Ensaios biológicos com a Broca em Manchas do Caule do Milho (Chilo partellus): Os insetos foram mantidos em uma dieta artificial constituída de pó de feijão vermelho, levedura de cervejaria, ácido sórbico, pó de folha de sorgo, ácido ascórbico, ácido metil para-hidróxi benzóico, vitaminas, óleo de gérmen de trigo, mistura de sais de Wesson, ágar, formaldeído e água. As larvas neonatais destas culturas foram utilizadas nos ensaios biológicos. Os ensaios biológicos foram realizados como descrito para a Broca Cor-de- Rosa do Caule (Sesamia inferens). (e) Resultados dos ensaios biológicos com insetos no arroz Os resultados dos ensaios biológicos, resumidos na tabela 4 abaixo, mostraram que a ISP3-327D e a ISP3-1099E eram altamente tóxicas para quatro pragas Lepidópteras do arroz, a saber, a Broca Amarela do Cau- le (Scirphophaga incertulas), o Dobrador de Folhas (Cnaphalocrocis medina- lis), a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens) e a Broca em Man- chas do Caule de Milho {Chilo partellus). Ainda, a proteína ISP3-2245J mos- trou toxicidade significativa para três pragas lepidópteras do arroz, a saber, a Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incertulas), o Dobrador de Folhas (Cnaphaíocrocis medinalís) e a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia infe- rens), enquanto que não foi detectada qualquer toxidade da proteína ISP3- 2245J contra a Broca em Manchas do Caule de Milho (Chilo partetlus). YSB: Broca Amarela do Caule, LF: Dobrador de Folhas, PSB: Broca Cor-de-Rosa do Caule, SSB; Broca em Manchas do Caule; os símbo- los de positivo {+) indicam mortalidade significativa em relação ao controle negativo.Biological assays were performed in glass flasks (7.5 cm x 2.5 cm in diameter) using an artificial diet consisting of dried bean powder, brewer's yeast, sorbic acid, ascorbic acid, methyl pa- raben, agar and water. The diet was placed in the bottles up to 2 cm deep. At least three vials were prepared per protein dose. 40 µl of the test dose was evenly spread over the diet surface in each vial and allowed to dry for one hour. Ten to fifteen first instar larvae of the Pink Stem Drill were added per flask. After seven days the number of dead and surviving larvae was counted. (d) Biological tests with Corn Stem Drill (Chilo partellus): Insects were kept on an artificial diet consisting of red bean powder, brewer's yeast, sorbic acid, sorghum leaf powder, ascorbic acid, methyl parahydroxy benzoic acid, vitamins, wheat germ oil, Wesson salt mixture, agar, formaldehyde and water. The neonatal larvae of these cultures were used in biological assays. Biological assays were performed as described for the Pink Stem Drill (Sesamia inferens). (e) Results of Biological Insect Assays in Rice The results of the biological assays, summarized in Table 4 below, showed that ISP3-327D and ISP3-1099E were highly toxic to four Lepidopteran rice pests, namely the yellow borer. (Scirphophaga incertulas), Leaf Bender (Cnaphalocrocis medinais), Pink Stem Drill (Sesamia inferens) and Corn Stem Drill (Chilo partellus). In addition, ISP3-2245J protein showed significant toxicity to three rice lepidopteran pests, namely the Yellow Stem Drill (Scirphophaga incertulas), the Leaf Bender (Cnaphaíocrocis medinalís) and the Pink Stem Drill. (Sesamia inferens), while no toxicity of the ISP3-2245J protein against the Chilo partetlus Spotted Drill was detected. YSB: Yellow Stem Drill, LF: Leaf Bender, PSB: Pink Stem Drill, SSB; Stem Spot Drill; Positive (+) symbols indicate significant mortality relative to the negative control.

Exemplo 8: Produção de proteínas ISP3 em plantas transformadas São construídos vetores de expressão que compreendem um promotor que pode ser expresso em plantas, ligado de forma operacional a uma seqüência de DNA que codifica ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J (ou um fragmento tóxico ou variação do mesmo) e um sinal de poliadenila- ção a 3'. Uma seqüência líder, tal como a proveniente do gene da proteína de ligação com a clorofila a/b de Petúnia (Harpster e outros, 1988), é inseri- da a 5' do DNA do isp3, Preferencial mente, o uso de códons do isp3-1099E, do isp3-327D e do isp3-2245J é adaptado ao da planta hospedeira (por exemplo, milho, algodão ou arroz), por exemplo, como é descrito no WO 94/24264.Example 8: Production of ISP3 Proteins in Transformed Plants Expression vectors are constructed which comprise a plant-expressable promoter operably linked to a DNA sequence encoding ISP3-1099E, ISP3-327D or ISP3-2245J (or a toxic fragment or variation thereof) and a 3 'polyadenylation signal. A leader sequence, such as that derived from the Petunia chlorophyll a / b binding protein gene (Harpster et al., 1988), is inserted 5 'from the isp3 DNA. isp3-1099E, isp3-327D and isp3-2245J is adapted to that of the host plant (e.g. corn, cotton or rice), for example as described in WO 94/24264.

Os promotores utilizados para controlar os genes isp3 são sele- cionados dos promotores constitutivos CaMV 35S <Hull e Howell, 1987), o promotor da ubiquitina do milho, o promotor da actina do arroz e o promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca. Como a terminação do produto da transcrição a 3' e o sinal de poliadenilação, são utilizados o 3'35S, o 3'nos (Depicker e outros, 1982), 3'ocs ou o gene 7 a 3‘. Para a transformação me- diada por Agrobacterium, o cassete de expressão é inserido em um vetor de T-DNA, entre as sequências das bordas à direita e à esquerda.The promoters used to control the isp3 genes are selected from the constituent promoters CaMV 35S (Hull and Howell, 1987), the maize ubiquitin promoter, the rice actin promoter, and the cassava vein mosaic virus promoter. As the 3 'transcription product termination and polyadenylation signal, 3'35S, 3'nos (Depicker et al., 1982), 3'ocs or the 7 to 3' gene are used. For Agrobacterium-mediated transformation, the expression cassette is inserted into a T-DNA vector between the right and left edge sequences.

Transformação de plantas de milho iZea mavs), de algodão (Gossvpium hir- sutum ou Gossvpium barbadense) e de arroz fOrvza sativa).Processing of iZea mavs maize, cotton (Gossvpium hirutum or Gossvpium barbadense) and rice fOrvza sativa).

As células de milho são transformadas de forma estável através da transformação mediada por Agrobacterium como é descrito na Patente U.S. N® 6.140.553, incorporada aqui como referência. As células de algodão são transformadas de forma estável através da transformação mediada por Agrobacterium como é descrito no WO 00/71733, incorporado aqui como referência. As células de arroz são transformadas de forma estável como é descrito no WO 92/09696, As células e as plantículas transformadas são regeneradas co- mo é descrito nas referências anteriores. Para as construções que compre- endem adicionalmente um gene marcador setecionável, tal como um gene de resistência a um herbicida, por exemplo, o 2mEPSPS (EP 0 508 909 e EP 0 507 698 incorporadas aqui como referência) que confere resistência ao glifosato ou o gene bar ou PAT que confere resistência ao glufosinato de amônio (EP 0 242 236 e EP 0 242 246 incorporadas como referência), as células são cultivadas em meios para seleção contendo o agente seletivo, de forma que a maior parte dos regenerantes selecionados são transformados.Corn cells are stably transformed by Agrobacterium-mediated transformation as described in U.S. Patent No. 6,140,553, incorporated herein by reference. Cotton cells are stably transformed by Agrobacterium-mediated transformation as described in WO 00/71733, incorporated herein by reference. Rice cells are stably transformed as described in WO 92/09696. Transformed cells and planticles are regenerated as described in the previous references. For constructs additionally comprising a selectable marker gene, such as a herbicide resistance gene, for example, 2mEPSPS (EP 0 508 909 and EP 0 507 698 incorporated herein by reference) which confers glyphosate resistance or the bar or PAT gene that confers resistance to ammonium glufosinate (EP 0 242 236 and EP 0 242 246 incorporated by reference), cells are cultured in selection media containing the selective agent, so that most of the selected regenerants are transformed. .

Dos regenerantes, os transformantes que expressam o gene isp3 são selecionados por ELISA, por Southern blot, por Northern blot e/ou pela análise da PCR, Os eventos de transformação, particularmente os eventos de cópia única, são então selecionados para a atividade inseticida para pragas de insetos Lepídópteros (utilizando ensaios biológicos). As plan- tas contendo o gene quimérico isp3-1099E, isp3-327D ou isp3-2245J mos- tram maior resistência a insetos lepidópteros comparadas com plantas de controle não-transformadas. Particularmente plantas com altos níveis de to- lerância a insetos expressam um alto nível de proteína ISP3 e de mRNA do isp3.Of the regenerants, isp3 gene expressing transformants are selected by ELISA, Southern blot, Northern blot and / or PCR analysis. Transformation events, particularly single copy events, are then selected for insecticidal activity for Lepidopteran insect pests (using biological assays). Plants containing the isp3-1099E, isp3-327D, or isp3-2245J chimeric gene show greater resistance to lepidopteran insects compared with non-transformed control plants. Particularly plants with high levels of insect tolerance express a high level of ISP3 protein and isp3 mRNA.

Os transformantes são adicionalmente selecionados em relação às características agronômicas (fenótipo normal, rendimento, arquitetura da planta etc.). Após os aumentos da semente, são realizados testes de campo de plantas de milho, de algodão ou de arroz transformadas em regiões dife- rentes onde as pragas de insetos susceptíveis estão presentes, demons- trando que as plantas que expressam as proteínas ISP3 possuem uma tole- rância a insetos maior sob condições do campo em ambientes diferentes.Transformants are additionally selected for agronomic characteristics (normal phenotype, yield, plant architecture, etc.). After seed increases, field trials of maize, cotton or rice plants transformed in different regions are carried out where susceptible insect pests are present, demonstrating that plants expressing ISP3 proteins have a tole. - higher insect resistance under field conditions in different environments.

Particularmente, após a infestação (artificial ou natural) do campo por pragas de insetos, as perdas de rendimento das plantas transformadas são reduzi- das comparadas com plantas de controle não-transformadas.Particularly, after insect (artificial or natural) field infestation by insect pests, yield losses of transformed plants are reduced compared to non-transformed control plants.

Para gerar plantas com ampla atividade inseticida, os eventos de expressão de ISP3 são cruzados uns com os outros e com outras plantas transgênicas, que expressam proteínas inseticidas com um espectro inseti- cida diferente preferencial mente complementar. A progênie dos cruzamentos é analisada em relação à atividade inseticida utilizando ensaios biológicos para uma faixa de pragas de insetos diferentes. As plantas com atividade inseticida contra a faixa de insetos de- sejada são geradas desta forma.To generate plants with broad insecticidal activity, ISP3 expression events are crossed with each other and with other transgenic plants, which express insecticidal proteins with a different, preferably complementary, insecticide spectrum. The progeny of crosses is analyzed for insecticidal activity using biological assays for a range of different insect pests. Plants with insecticidal activity against the desired range of insects are generated in this way.

Esta invenção não está limitada às plantas de milho, algodão, soja ou arroz anteriores, aos métodos de transformação, às construções de vetores (promotor, extremidades a 3' etc.) ou às proteínas ISP3 particulares ou às seqüências de DNA utilizadas. A invenção inclui variações ou equiva- lentes das proteínas ISP3 que mantêm a atividade inseticida.This invention is not limited to previous corn, cotton, soybean or rice plants, transformation methods, vector constructs (promoter, 3 'ends etc.) or particular ISP3 proteins or DNA sequences used. The invention includes variations or equivalents of ISP3 proteins that maintain insecticidal activity.

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Claims (17)

1. Sequência de ácido nucleico codificando uma proteína inseti- cida, caracterizada pelo fato de que compreende uma a sequência de nucle- otídeos degenerada de SEQ ID NO: 1, da posição de nucleotídeos de 598 à posição de nucleotídeos 1365, em que a referida sequência degenerada co- difica a mesma sequência de aminoácidos que SEQ ID NO: 1 da posição de nucleotídeo 598 à posição de nucleotídeo 1365.Nucleic acid sequence encoding an insecticide protein, characterized in that it comprises a degenerate nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, from nucleotide position 598 to nucleotide position 1365, wherein said degenerate sequence codifies the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 from nucleotide position 598 to nucleotide position 1365. 2. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotí- deos degenerada de SEQ ID NO: 1 codificando a mesma sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1.Nucleic acid sequence according to claim 1, characterized in that it comprises a degenerate nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the same amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 3. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína é inseticida contra pelo menos uma espécie de insetos selecionada do grupo que consiste em Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiper- da, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus e Anticarsia gemmatalis.Nucleic acid sequence according to claim 1 or 2, characterized in that said protein is an insecticide against at least one insect species selected from the group consisting of Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiper. da, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus and Anticarsia gemmatalis. 4. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora heteróloga ligada de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3.Chimeric gene, characterized in that it comprises a heterologous promoter sequence operably linked to a nucleic acid sequence as defined in any one of claims 1 to 3. 5. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora heteróloga ligada de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 da posição de nucleotídeos de 598 à posição de nucleotídeos 1365, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.Chimeric gene, characterized in that it comprises a heterologous promoter sequence operably linked to a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 from nucleotide position 598 to nucleotide position 1365, or a degenerate nucleotide sequence of same encoding the same amino acid sequence. 6. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codifican- do a mesma sequência de aminoácidos.Chimeric gene according to claim 5, characterized in that it comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a degenerate nucleotide sequence of the same encoding the same amino acid sequence. 7. Gene quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nu- cleico codifica uma proteína inseticida contra pelo menos uma espécie de insetos selecionada do grupo que consiste em Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus e Anticarsia gemmatalis.Chimeric gene according to any one of claims 4 to 6, characterized in that said nucleic acid sequence encodes an insecticidal protein against at least one insect species selected from the group consisting of Helicoverpa zea. , Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus and Anticarsia gemmatalis. 8. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nu- cleico compreende os nucleotídeos 1 a 2364 de SEQ ID NO: 1.Chimeric gene according to any one of claims 5 to 7, characterized in that said nucleic acid sequence comprises nucleotides 1 to 2364 of SEQ ID NO: 1. 9. Gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é uma sequência sintética, que foi que foi otimizada para expressão em plan- tas monocotiledôneas ou dicotiledôneas.Chimeric gene according to any one of claims 5 to 7, characterized in that the nucleic acid sequence is a synthetic sequence which has been optimized for expression in monocotyledonous or dicotyledonous plants. 10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o gene quimérico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 9.Vector, characterized in that it comprises the chimeric gene as defined in any one of claims 1 or 9. 11. Processo de proteção de uma planta contra danos causados por insetos, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a referida planta em contato com uma proteína inseticida, em que a referida proteína compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, do aminoácido 200 ao aminoácido 455.A process of protecting a plant against insect damage, wherein it comprises contacting said plant with an insecticidal protein, wherein said protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of the amino acid 200 to amino acid 455. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida proteína tem a sequência de amino ácidos de SEQ ID NO: 2.Process according to claim 11, characterized in that said protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracte- rizado pelo fato de que a referida proteína inseticida é codificada por um ge- ne quimérico integrado ao genoma da referida planta.Process according to claim 11 or 12, characterized in that said insecticidal protein is encoded by a chimeric genus integrated into the genome of said plant. 14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido gene quimérico é integrado por cruzamento de uma planta transgênica compreendendo o referido gene quimérico com outra planta e seleção de sua progênie das mesmas compreendendo o referido gene quimérico.Process according to claim 13, characterized in that said chimeric gene is integrated by crossing a transgenic plant comprising said chimeric gene with another plant and selecting its progeny comprising said chimeric gene. 15. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracte- rizado pelo fato de que a referida proteína é aplicada externamente à referi- da planta.Process according to Claim 11 or 12, characterized in that said protein is applied externally to said plant. 16. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracte- rizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de milho, algodão, so- ja ou arroz.Process according to Claim 11 or 12, characterized in that said plant is a maize, cotton, soy or rice plant. 17. Cepa de Bacillus thuringiensis, caracterizada pelo fato de que compreende o gene quimérico, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 5 a 9.Bacillus thuringiensis strain, characterized in that it comprises the chimeric gene as defined in any one of claims 5 to 9.