BR112021026486B1 - METHOD OF PRODUCING AMINO ACID CONTAINING SULFUR OR A DERIVATIVE THEREOF, MICRO-ORGANISM, COMPOSITION FOR PRODUCING AN AMINO ACID, USE OF A PROTEIN AND A MICRO-ORGANISM - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE AMINOÁCIDO QUE CONTÉM ENXOFRE OU DERIVADO DO MESMO, MICRO-ORGANISMO, COMPOSIÇÃO PARA PRODUZIR UM AMINOÁCIDO, USO DE UMA PROTEÍNA E DE UM MICRO-ORGANISMO. O presente pedido refere-se a um método para produzir um aminoácido que contém enxofre ou um derivado de aminoácido que contém enxofre.METHOD OF PRODUCING AMINO ACID CONTAINING SULFUR OR DERIVATIVE THEREOF, MICRO-ORGANISM, COMPOSITION FOR PRODUCING AN AMINO ACID, USE OF A PROTEIN AND A MICRO-ORGANISM. The present application relates to a method for producing a sulfur-containing amino acid or a sulfur-containing amino acid derivative.

Description

CAMPO DA TÉCNICAFIELD OF TECHNIQUE

[001] A presente revelação refere-se a um método para produzir um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre.[001] The present disclosure relates to a method for producing a sulfur-containing amino acid or a sulfur-containing amino acid derivative.

ANTECEDENTES DA TÉCNICABACKGROUND OF THE TECHNIQUE

[002] Os L-aminoácidos têm sido produzidos industrialmente por meio de métodos de fermentação com o uso de micro-organismos pertencentes ao gênero Brevibacterium, ao gênero Corynebacterium, ao gênero Escherichia e semelhantes. Em tais métodos de produção, têm sido usadas cepas bacterianas isoladas da natureza, cepas mutantes artificiais das mesmas ou cepas modificadas para ter atividade melhorada de uma enzima envolvida na biossíntese de L-aminoácido por meio de tecnologia de recombinação de DNA.[002] L-amino acids have been produced industrially through fermentation methods using microorganisms belonging to the Brevibacterium genus, the Corynebacterium genus, the Escherichia genus and the like. In such production methods, bacterial strains isolated from nature, artificial mutant strains thereof or strains modified to have improved activity of an enzyme involved in L-amino acid biosynthesis through DNA recombination technology have been used.

[003] Enquanto isso, aminoácidos que contém enxofre têm sido usados como ingredientes para a síntese de rações animais, aditivos alimentícios, fluidos farmaceuticamente injetáveis e medicamentos, e pesquisas têm sido conduzidas para produzir biologicamente aminoácidos que contém enxofre e derivados do mesmo.[003] Meanwhile, sulfur-containing amino acids have been used as ingredients for the synthesis of animal feed, food additives, pharmaceutically injectable fluids and medicines, and research has been conducted to biologically produce sulfur-containing amino acids and derivatives thereof.

[004] Por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente n° U.S. US 2009-0298135 A1 revela que 0,8 g/l de L-metionina foi produzida por deleção do gene metJ no genoma de Escherichia coli e superexpressão da proteína YjeH, que é um exportador de L-metionina. Além disso, os polipeptídeos BrnF e BrnE foram relatados como exportadores de L-metionina de Corynebacterium glutamicum (C. Troschel et al., Journal of Bacteriology, páginas 3786-3794, junho de 2005).[004] For example, U.S. Patent Application Publication No. US 2009-0298135 A1 discloses that 0.8 g/l of L-methionine was produced by deletion of the metJ gene in the Escherichia coli genome and overexpression of the YjeH protein, which is an exporter of L-methionine. Furthermore, BrnF and BrnE polypeptides have been reported to export L-methionine from Corynebacterium glutamicum (C. Troschel et al., Journal of Bacteriology, pages 3786-3794, June 2005).

[005] Enquanto isso, na produção de aminoácidos que contém enxofre, a quantidade de NADPH consumida nos micro-organismos pode variar de acordo com o poder redutor de uma fonte de enxofre. Por exemplo, enquanto os sulfetos que não requerem NADPH têm os rendimentos teóricos mais altos, os sulfatos que requerem quatro NADPHs têm rendimentos teóricos baixos. No entanto, os sulfetos são desvantajosos porque são conhecidos por causar danos às células e têm baixa estabilidade. Portanto, um alto rendimento pode ser esperado no caso do uso de tiossulfato, que é uma fonte de enxofre que tem baixa demanda de NADPH e alta estabilidade intracelular, na produção de aminoácidos que contém enxofre. No entanto, não houve pesquisa substantiva na utilização eficiente de tiossulfato em micro-organismos de Corynebacterium glutamicum.[005] Meanwhile, in the production of sulfur-containing amino acids, the amount of NADPH consumed by microorganisms can vary according to the reducing power of a sulfur source. For example, while sulfides that require no NADPH have the highest theoretical yields, sulfates that require four NADPHs have low theoretical yields. However, sulfides are disadvantageous because they are known to cause cell damage and have low stability. Therefore, a high yield can be expected in the case of using thiosulfate, which is a sulfur source that has low NADPH demand and high intracellular stability, in the production of sulfur-containing amino acids. However, there has been no substantive research into the efficient utilization of thiosulfate in Corynebacterium glutamicum microorganisms.

REVELAÇÃOREVELATION PROBLEMA DA TÉCNICATECHNIQUE PROBLEM

[006] Os presentes inventores constataram recentemente que uma proteína codificada pelo gene ssuD está envolvida na utilização de tiossulfato e confirmaram que um micro-organismo modificado para ter atividade melhorada da proteína, tem melhorado a capacidade de produzir aminoácidos que contém enxofre com o uso de tiossulfato como fonte de enxofre, completando, assim, a presente revelação.[006] The present inventors have recently found that a protein encoded by the ssuD gene is involved in the utilization of thiosulfate and have confirmed that a microorganism modified to have improved protein activity has improved the ability to produce sulfur-containing amino acids with the use of thiosulfate as a source of sulfur, thus completing the present disclosure.

SOLUÇÃO DA TÉCNICATECHNIQUE SOLUTION

[007] A presente revelação fornece um método de produção de um aminoácido que contém enxofre e um derivado do aminoácido que contém enxofre, sendo que o método inclui cultivar um micro-organismo geneticamente modificado em um meio de cultura que contém tiossulfato, em que o micro-organismo inclui modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação a um micro-organismo não modificado.[007] The present disclosure provides a method of producing a sulfur-containing amino acid and a derivative of the sulfur-containing amino acid, the method including cultivating a genetically modified microorganism in a culture medium containing thiosulfate, wherein the microorganism includes genetic modification to increase the activity of a protein encoded by the ssuD gene compared to an unmodified microorganism.

[008] A presente revelação fornece um micro-organismo que produz um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre e que inclui modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação a um micro-organismo não modificado.[008] The present disclosure provides a microorganism that produces a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid and that includes genetic modification to increase the activity of a protein encoded by the ssuD gene compared to a non-suD microorganism. modified.

[009] A presente revelação fornece uma composição para produzir um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre, em que a composição inclui: um micro-organismo que inclui modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação a um micro-organismo não modificado ou uma cultura do mesmo; e tiossulfato.[009] The present disclosure provides a composition for producing a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid, wherein the composition includes: a microorganism that includes genetic modification to increase the activity of a protein encoded by the ssuD gene compared to an unmodified microorganism or a culture thereof; and thiosulfate.

[010] A presente revelação fornece o uso de uma proteína codificada pelo gene ssuD como uma tiossulfato redutase.[010] The present disclosure provides the use of a protein encoded by the ssuD gene as a thiosulfate reductase.

[011] A presente revelação fornece o uso de um micro-organismo pelo gene ssuD em comparação a um micro-organismo não modificado para produzir um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre.[011] The present disclosure provides the use of a microorganism by the ssuD gene in comparison to an unmodified microorganism to produce a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid.

EFEITOS VANTAJOSOSADVANTAGEOUS EFFECTS

[012] Os aminoácidos que contém enxofre ou derivado do mesmo, podem ser produzidos em massa usando o micro-organismo, a composição e o método de produção de um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre do mesmo usando o mesmo, de acordo com a presente revelação, e assim, pode ser usado eficientemente na produção de produtos úteis, incluindo os aminoácidos que contém enxofre ou derivado do mesmo.[012] Sulfur-containing amino acids or derivatives thereof can be mass produced using the microorganism, composition and method of producing a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid thereof using the same , in accordance with the present disclosure, and thus, can be used efficiently in the production of useful products, including amino acids containing sulfur or derivatives thereof.

MELHOR MODOBEST WAY

[013] A presente revelação será descrita em detalhes. Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada na presente revelação, pode ser aplicada a diferentes descrições e modalidades no presente documento. Ou seja, todas as combinações dos vários componentes revelados na presente revelação estão inclusas no escopo da presente revelação. Além disso, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pelas descrições fornecidas doravante no presente documento.[013] The present disclosure will be described in detail. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present disclosure can be applied to different descriptions and embodiments in the present document. That is, all combinations of the various components disclosed in the present disclosure are included within the scope of the present disclosure. Furthermore, the scope of the present disclosure should not be limited by the descriptions provided hereinafter.

[014] As pessoas versadas na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar, com o uso de não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para modalidades específicas da presente revelação. Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos no escopo da presente revelação.[014] Persons skilled in the art will recognize or be able to determine, with the use of no more than routine experimentation, many equivalents for specific embodiments of the present disclosure. Such equivalents are intended to be encompassed within the scope of the present disclosure.

[015] Um aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo geneticamente modificado que produz um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre.[015] One aspect of the present disclosure provides a genetically modified microorganism that produces a sulfur-containing amino acid or a sulfur-containing amino acid derivative.

[016] Outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de um aminoácido que contém enxofre e um derivado do aminoácido que contém enxofre, sendo que o método inclui cultivar um micro-organismo geneticamente modificado em um meio de cultura que contém tiossulfato.[016] Another aspect of the present disclosure provides a method of producing a sulfur-containing amino acid and a sulfur-containing amino acid derivative, the method including cultivating a genetically modified microorganism in a culture medium containing thiosulfate.

[017] O micro-organismo pode incluir modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD.[017] The microorganism may include genetic modification to increase the activity of a protein encoded by the ssuD gene.

[018] A presente revelação fornece um método de produção de um aminoácido que contém enxofre e um derivado do aminoácido que contém enxofre, sendo que o método inclui cultivar um micro-organismo geneticamente modificado em um meio de cultura que contém tiossulfato, em que o micro-organismo pode incluir modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação a um micro-organismo antes da modificação. Em uma modalidade da presente revelação, o método pode ser um método para aumentar a produção de aminoácidos que contém enxofre ou derivados dos aminoácidos que contém enxofre pelo micro-organismo.[018] The present disclosure provides a method of producing a sulfur-containing amino acid and a derivative of the sulfur-containing amino acid, the method including cultivating a genetically modified microorganism in a culture medium containing thiosulfate, wherein the microorganism may include genetic modification to increase the activity of a protein encoded by the ssuD gene compared to a microorganism before the modification. In one embodiment of the present disclosure, the method may be a method for increasing the production of sulfur-containing amino acids or derivatives of sulfur-containing amino acids by the microorganism.

[019] O método de fabricação pode incluir trazer o micro-organismo que tem atividade melhorada da proteína codificada pelo gene ssuD em comparação à atividade intrínseca ou uma cultura da mesma, em contato com tiossulfato.[019] The manufacturing method may include bringing the microorganism that has improved activity of the protein encoded by the ssuD gene compared to the intrinsic activity or a culture thereof, in contact with thiosulfate.

[020] Conforme utilizado no presente documento, a expressão "proteína codificada pelo gene ssuD" refere-se a uma proteína que o gene ssuD codifica ou uma proteína expressa pelo gene ssuD e pode ser denominada "proteína SsuD" (doravante no presente documento, denominada "proteína SsuD"). Convencionalmente, a proteína SsuD é conhecida por estar envolvida na degradação do sulfonato (R-SO3), especificamente como uma alcanossulfonato monooxigenase, conhecida como sulfonato monooxigenase. No entanto, não se sabe se a proteína SsuD está envolvida na utilização de tiossulfato em vez de sulfato orgânico.[020] As used herein, the expression "protein encoded by the ssuD gene" refers to a protein that the ssuD gene encodes or a protein expressed by the ssuD gene and may be referred to as "SsuD protein" (hereinafter in this document, called "SsuD protein"). Conventionally, the SsuD protein is known to be involved in the degradation of sulfonate (R-SO3), specifically as an alkanesulfonate monooxygenase, known as sulfonate monooxygenase. However, it is not known whether the SsuD protein is involved in the utilization of thiosulfate rather than organic sulfate.

[021] Na presente revelação, foi recentemente revelado que a proteína SsuD está envolvida na utilização de tiossulfato, especificamente que serve como uma redutase que reduz a tiossulfato, e foi confirmado que a produção de um aminoácido que contém enxofre pode ser aumentada melhorando-se a atividade da proteína SsuD.[021] In the present disclosure, it has recently been revealed that the SsuD protein is involved in the utilization of thiosulfate, specifically that it serves as a reductase that reduces thiosulfate, and it has been confirmed that the production of a sulfur-containing amino acid can be increased by improving the activity of the SsuD protein.

[022] A proteína SsuD da presente revelação pode ser uma proteína codificada pelo gene ssuD e pode ser denominada "proteína SsuD", "tiossulfato redutase" ou convencionalmente conhecido "alcanossulfonato monooxigenase”. Em uma modalidade, a proteína SsuD da presente revelação pode ser "sulfonato monooxigenase" ou "tiossulfato redutase" derivada a partir de um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium, especificamente uma proteína denominada oxidoredutase dependente de flavina classe LLM derivada a partir de um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium. Especificamente, a proteína SsuD pode ser derivada a partir de Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium callunae, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium deserti, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium pacaense, ou Corynebacterium suranareeae, mais especificamente Corynebacterium glutamicum, sem limitação aos mesmos. Uma sequência de aminoácidos da proteína SsuD pode estar disponível a partir de um banco de dados conhecido, como o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information (NCBI)).[022] The SsuD protein of the present disclosure may be a protein encoded by the ssuD gene and may be called "SsuD protein", "thiosulfate reductase" or conventionally known "alkanesulfonate monooxygenase". In one embodiment, the SsuD protein of the present disclosure may be "sulfonate monooxygenase" or "thiosulfate reductase" derived from a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, specifically a protein called flavin-dependent oxidoreductase class LLM derived from a microorganism belonging to the genus Corynebacterium. Specifically, the SsuD protein. can be derived from Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium callunae, Corynebacterium crenatum , Corynebacterium deserti, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium pacaense, or Corynebacterium suranareeae, more specifically Corynebacterium glutamicum, without limitation thereto. An amino acid sequence of the SsuD protein may be available from a known database such as the National Center for Biotechnology Information (NCBI).

[023] Em uma modalidade, a proteína SsuD pode incluir uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Além disso, será óbvio que qualquer proteína com a sequência de aminoácidos que inclui deleção, modificação ou adição de alguns aminoácidos, é abrangido pelo escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos retenha a homologia ou identidade e efeitos descritos acima equivalentes aos do polipeptídeo.[023] In one embodiment, the SsuD protein may include an amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 or an amino acid sequence with at least 80%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99% homology or identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43. Furthermore, it will be obvious that any protein with the amino acid sequence that includes deletion, modification or addition of some amino acids, is covered by the scope of the present disclosure, provided that the amino acid sequence retains the homology or identity and effects described above equivalent to those of the polypeptide.

[024] Adicionalmente, qualquer polipeptídeo, que tem atividade de sulfonato monooxigenase e atividade redutora de tiossulfato e codificado por um polinucleotídeo hibridizado com uma sonda construída com o uso de sequências de genes conhecidas, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos inteiramente ou parcialmente complementar ao polinucleotídeo sob condições rigorosas, também pode ser incluído sem limitação.[024] Additionally, any polypeptide, which has sulfonate monooxygenase activity and thiosulfate reducing activity and encoded by a polynucleotide hybridized with a probe constructed using known gene sequences, for example, a nucleotide sequence entirely or partially complementary to the polynucleotide under stringent conditions can also be included without limitation.

[025] Ou seja, na presente revelação, embora a expressão "proteína ou polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO predeterminada", "proteína ou polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO predeterminada", ou "proteína ou polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO "predeterminada" é usado, é óbvio que qualquer proteína que inclui deleção, modificação, substituição, substituição conservativa ou adição de um ou vários aminoácidos, pode ser usada na presente revelação, desde que a proteína tenha atividade idêntica ou equivalente à do polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. Por exemplo, a adição de uma sequência que não altera a função da proteína ao terminal N e/ou terminal C da sequência de aminoácidos, uma mutação de ocorrência natural, uma mutação silenciosa da mesma ou uma substituição conservativa da mesma, pode ser usada.[025] That is, in the present disclosure, although the expression "protein or polypeptide that includes an amino acid sequence of a predetermined SEQ ID NO", "protein or polypeptide consisting of an amino acid sequence of a predetermined SEQ ID NO", or "protein or polypeptide that has an amino acid sequence of a "predetermined" SEQ ID NO is used, it is obvious that any protein that includes deletion, modification, substitution, conservative substitution or addition of one or more amino acids, can be used in the present disclosure, provided that the protein has identical or equivalent activity to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO. For example, the addition of a sequence that does not alter the function of the protein to the N-terminus and/or C-terminus of the sequence. of amino acids, a naturally occurring mutation, a silent mutation thereof, or a conservative substitution thereof, may be used.

[026] Conforme usado no presente documento, o termo "substituição conservativa" se refere à substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente que tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. Essa substituição de aminoácido pode geralmente ocorrer com base na semelhança de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática de um resíduo.[026] As used herein, the term "conservative substitution" refers to the replacement of an amino acid with a different amino acid that has similar structural and/or chemical properties. This amino acid substitution can generally occur based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or amphipathic nature of a residue.

[027] Em uma modalidade da presente revelação, a proteína SsuD pode ser codificada por um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8, sem limitação ao mesmo.[027] In one embodiment of the present disclosure, the SsuD protein can be encoded by a polynucleotide that has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, without limitation thereto.

[028] Conforme utilizado no presente documento, o termo "polinucleotídeo" tem um significado inclusivo que inclui moléculas de DNA e RNA, e um nucleotídeo que é uma unidade estrutural básica no polinucleotídeo pode incluir não apenas um nucleotídeo natural, mas também, um análogo em que um açúcar ou uma base é modificado (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nova Iorque (1980); Uhlman e Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).[028] As used herein, the term "polynucleotide" has an inclusive meaning that includes DNA and RNA molecules, and a nucleotide that is a basic structural unit in the polynucleotide can include not only a natural nucleotide, but also an analogue in which a sugar or a base is modified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).

[029] O polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo (gene ssuD) que codifica a proteína SsuD da presente revelação. O polinucleotídeo da presente revelação pode incluir várias modificações feitas em uma região de codificação fornecida para não alterar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo expresso a partir da região de codificação devido à degenerescência do códon ou em consideração aos códons preferenciais por um organismo vivo no qual a proteína é expressa. O polinucleotídeo da presente revelação pode ser, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de homologia ou identidade com a proteína SsuD da presente revelação. Especificamente, o polinucleotídeo que codifica uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia ou identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 pode ser polinucleotídeos com pelo menos 80%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia ou identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 8.[029] The polynucleotide can be a polynucleotide (ssuD gene) that encodes the SsuD protein of the present disclosure. The polynucleotide of the present disclosure may include various modifications made to a provided coding region so as not to alter the amino acid sequence of the polypeptide expressed from the coding region due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred by a living organism in which the protein is expressed. The polynucleotide of the present disclosure may be, for example, a polynucleotide encoding a polypeptide with at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% homology or identity with the SsuD protein of the present disclosure. Specifically, the polynucleotide encoding a protein that includes an amino acid sequence with at least 80% homology or identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 may be polynucleotides with at least 80%, 90%, 92%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.

[030] Adicionalmente, é óbvio que qualquer polinucleotídeo que pode ser traduzido em uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia ou identidade com SEQ ID NO: 43, devido à degenerescência do códon, pode ser incluído. Alternativamente, qualquer polinucleotídeo que codifica uma proteína que inclui uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e hibridizado com uma sonda construída com o uso de sequências de genes conhecidas, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos inteiramente ou parcialmente complementar à sequência polinucleotídica sob condições rigorosas, pode ser incluída sem limitação. O termo "condições rigorosas" significa condições que permitem a hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições são reveladas em detalhes em documentos conhecidos (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir a realização de hibridização entre genes com alta homologia ou identidade, por exemplo, uma homologia ou identidade de 70% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais, ou mais especificamente 99% ou mais, sem realizar a hibridização entre genes com uma homologia ou identidade inferior às homologias ou identidades acima, ou lavar uma vez, especificamente duas ou três vezes, sob convencional condições de lavagem para hibridização Southern a uma concentração de sal e temperatura de 60 °C, 1 x SSC e 0,1% SDS, especificamente 60 °C, 0,1 x SSC, 0,1% SDS e mais especificamente 68 °C, 0,1 x SSC e 0,1% SDS.[030] Additionally, it is obvious that any polynucleotide that can be translated into a protein that includes an amino acid sequence with at least 80% homology or identity with SEQ ID NO: 43, due to codon degeneracy, can be included. Alternatively, any polynucleotide encoding a protein that includes an amino acid sequence that has at least 80% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 and hybridized to a probe constructed using known gene sequences, e.g. , a nucleotide sequence that is entirely or partially complementary to the polynucleotide sequence under stringent conditions, may be included without limitation. The term "stringent conditions" means conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are disclosed in detail in known documents (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). For example, stringent conditions may include performing hybridization between genes with high homology or identity, e.g., a homology or identity of 70% or more, 80% or more, 85% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, even more specifically 97% or more, or more specifically 99% or more, without performing hybridization between genes with a homology or identity lower than the above homologies or identities, or washing once, specifically two or three times , under conventional wash conditions for Southern hybridization at a salt concentration and temperature of 60 °C, 1 x SSC and 0.1% SDS, specifically 60 °C, 0.1 x SSC, 0.1% SDS and more specifically 68 °C, 0.1 x SSC and 0.1% SDS.

[031] A hibridização requer que dois polinucleotídeos tenham sequências complementares, embora as bases sejam incompatíveis de acordo com o grau de rigor da hibridização. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos capazes de hibridizar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação pode incluir não somente uma sequência substancialmente similar de nucleotídeo como também um fragmento de polinucleotídeo isolado, porém complementar à sequência inteira.[031] Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although the bases are incompatible according to the degree of stringency of the hybridization. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Therefore, the present disclosure may include not only a substantially similar nucleotide sequence but also an isolated polynucleotide fragment, but complementary to the entire sequence.

[032] Especificamente, os polinucleotídeos com homologia ou identidade com o polinucleotídeo da presente revelação podem ser detectados com o uso de condições de hibridização que inclui um processo de hibridização realizado a um valor de Tm de 55 °C e as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser, porém sem limitação, 60 °C, 63 °C ou 65 °C, e pode ser adequadamente ajustado pelas pessoas versadas na técnica de acordo com os fins pretendidos.[032] Specifically, polynucleotides with homology or identity with the polynucleotide of the present disclosure can be detected using hybridization conditions that include a hybridization process carried out at a Tm value of 55 ° C and the conditions described above. Furthermore, the value of Tm may be, but is not limited to, 60°C, 63°C or 65°C, and may be suitably adjusted by those skilled in the art according to the intended purposes.

[033] Um grau apropriado de restringência para hibridização dos polinucleotídeos pode depender de comprimentos e um grau de complementaridade dos polinucleotídeos e seus parâmetros são bem conhecidos na técnica (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).[033] An appropriate degree of stringency for hybridization of polynucleotides may depend on lengths and a degree of complementarity of the polynucleotides and their parameters are well known in the art (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).

[034] Conforme utilizado no presente documento, o termo "homologia" ou "identidade" se refere a um grau de parentesco entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e pode ser expresso como uma porcentagem. Os termos homologia e identidade podem frequentemente ser usados indistintamente.[034] As used herein, the term "homology" or "identity" refers to a degree of relatedness between two amino acid sequences or nucleotide sequences and can be expressed as a percentage. The terms homology and identity can often be used interchangeably.

[035] A homologia de sequência ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservados pode ser determinada por algoritmo de alinhamento padrão e penalidades para lacuna padrão, estabelecidas por um programa podem ser usadas em conjunto com ele. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar umas com as outras pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de toda a sequência ou de todo o comprimento sob condições moderadas ou altamente rigorosas. É óbvio que polinucleotídeos que inclui um códon degenerado também podem ser considerados na hibridização.[035] The sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides can be determined by standard alignment algorithm and standard gap penalties established by a program can be used in conjunction with it. Substantially homologous or identical sequences can hybridize to each other at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire sequence or the entire length under moderate or highly stringent conditions. It is obvious that polynucleotides that include a degenerate codon can also be considered in hybridization.

[036] A homologia, semelhança ou identidade entre duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas podem ser determinadas com o uso de qualquer algoritmo de computador conhecido na técnica, por exemplo, programa "FASTA", que usa parâmetros padrão introduzidos por Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444. Alternativamente, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) conforme implementado no programa Needleman do pacote (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo pacote de programa GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, e CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada usando BLAST a partir do banco de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information) ou ClustalW.[036] The homology, similarity or identity between two polynucleotide or polypeptide sequences can be determined using any computer algorithm known in the art, for example, "FASTA" program, which uses standard parameters introduced by Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Academic. Sci USA 85:2444. Alternatively, homology, similarity or identity can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) as implemented in the package Needleman program (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet 16:276-277) (version 5.0.0 or later) (including GCG program package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 , and CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). For example, homology, similarity or identity can be determined using BLAST from the National Center for Biotechnology database. Information) or ClustalW.

[037] A homologia, semelhança ou identidade entre polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com o uso de um programa de computador GAP, conforme introduzido por Needleman et al., (1970), J Mol Biol. 48:443 conforme revelado por Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos em uma menor de duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação binária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745 conforme descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358 (1979) (ou EDNAFULL (Versão EMBOSS do NCBI NUC4.4) matriz de substituição); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade de abertura de lacuna de 10 e uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas nas extremidades.[037] Homology, similarity or identity between polynucleotides or polypeptides can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program, as introduced by Needleman et al., (1970), J Mol Biol. 48:443 as revealed by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Briefly, the GAP program defines similarity as the number of aligned symbols (i.e., nucleotides or amino acids) that are similar, divided by the total number of symbols in a smaller of two sequences. Default parameters for the GAP program may include: (1) a binary comparison matrix (which contains a value of 1 for identities and 0 for non-identities) and the weighted comparison matrix of Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745 as described by Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pages 353-358 (1979) (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix ); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10 and a gap extending penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.

[038] Além disso, a homologia de sequência, semelhança ou identidade entre dois determinados polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser identificados comparando-se sequências dos mesmos por hibridização Southern sob condições rigorosas definidas e as condições de hibridização rigorosas definidas são abrangidas pelo escopo da tecnologia e podem ser definidas por um método bem conhecido pelas pessoas versadas na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque).[038] Furthermore, sequence homology, similarity or identity between two given polynucleotides or polypeptides can be identified by comparing sequences thereof by Southern hybridization under defined stringent conditions and defined stringent hybridization conditions are within the scope of the technology and can be defined by a method well known to those skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

[039] Conforme utilizado no presente documento, o termo "melhoramento" da atividade do polipeptídeo ou proteína, refere-se a um aumento na atividade do polipeptídeo em comparação à atividade intrínseca. A melhoramento pode ser usado indistintamente com regulação positiva, superexpressão, aumento e semelhantes.[039] As used herein, the term "improvement" of the activity of the polypeptide or protein refers to an increase in the activity of the polypeptide compared to the intrinsic activity. Enhancement can be used interchangeably with upregulation, overexpression, augmentation and the like.

[040] A este respeito, o aumento pode incluir todos aqueles que exibem atividade que não foi originalmente possuída ou que exibe atividade melhorada em comparação à atividade intrínseca ou atividade antes da modificação. A "atividade intrínseca" refere-se à atividade de um determinado polipeptídeo ou proteína originalmente possuída por uma cepa parental ou micro-organismo não modificado antes da transformação, quando o micro-organismo é transformado por modificação genética causada por um fator natural ou artificial. Este termo pode ser usado alternadamente com "atividade antes da modificação". O "melhoramento" ou "aumento" da atividade de um polipeptídeo ou proteína em comparação à atividade intrínseca, significa que a atividade de um polipeptídeo ou proteína particular é aperfeiçoada em comparação àquela originalmente possuída por uma cepa parental ou micro-organismo não modificado antes da transformação.[040] In this regard, augmentation may include all those who exhibit activity that was not originally possessed or who exhibit improved activity compared to intrinsic activity or activity before modification. "Intrinsic activity" refers to the activity of a particular polypeptide or protein originally possessed by a parental strain or unmodified microorganism before transformation, when the microorganism is transformed by genetic modification caused by a natural or artificial factor. This term can be used interchangeably with "activity before modification". "Enhancement" or "enhancement" of the activity of a polypeptide or protein as compared to the intrinsic activity means that the activity of a particular polypeptide or protein is improved as compared to that originally possessed by a parental strain or unmodified microorganism prior to transformation.

[041] O termo "aumento em atividade" pode ser alcançado pela introdução de um polipeptídeo ou proteína estranha ou melhoramento da atividade de um polipeptídeo ou proteína endógena, especificamente alcançado pelo melhoramento da atividade de um polipeptídeo ou proteína endógena. O melhoramento da atividade do polipeptídeo ou proteína pode ser identificado com base em um aumento em um grau de atividade do polipeptídeo ou proteína, um nível de expressão do mesmo ou uma quantidade de um produto liberado a partir do mesmo.[041] The term "increase in activity" can be achieved by introducing a foreign polypeptide or protein or improving the activity of an endogenous polypeptide or protein, specifically achieved by improving the activity of an endogenous polypeptide or protein. Improvement of the activity of the polypeptide or protein can be identified based on an increase in a degree of activity of the polypeptide or protein, a level of expression thereof, or an amount of a product released therefrom.

[042] Conforme utilizado no presente documento, a expressão "melhoramento ou aumento da atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD ou proteína SsuD" também pode ser denominada "modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD", e isso significa que a atividade da proteína é melhorada em comparação à atividade intrínseca.[042] As used herein, the expression "improving or increasing the activity of a protein encoded by the ssuD gene or SsuD protein" may also be called "genetic modification to increase the activity of a protein encoded by the ssuD gene", and this means that the activity of the protein is improved compared to the intrinsic activity.

[043] O aumento na atividade da proteína SsuD pode incluir tanto um aumento na atividade pela introdução de uma proteína SsuD estranha quanto um aumento na atividade da proteína SsuD endógena.[043] The increase in the activity of the SsuD protein can include both an increase in activity by introducing a foreign SsuD protein and an increase in the activity of the endogenous SsuD protein.

[044] Conforme utilizado no presente documento, o termo "introdução de uma proteína" refere-se a fornecer a atividade de uma proteína particular a um micro- organismo que não possui originalmente a proteína ou melhorar a atividade da proteína em comparação à atividade intrínseca da proteína ou à atividade antes da modificação. Por exemplo, a introdução de uma proteína pode se referir à introdução de uma proteína particular, introdução de um polinucleotídeo que codifica uma proteína particular em um cromossomo do micro-organismo ou introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína particular em um microorganismo, expressando-se assim a atividade da proteína.[044] As used herein, the term "introducing a protein" refers to providing the activity of a particular protein to a microorganism that does not originally possess the protein or improving the activity of the protein in comparison to the intrinsic activity of the protein or activity before modification. For example, introduction of a protein may refer to the introduction of a particular protein, introduction of a polynucleotide encoding a particular protein into a chromosome of the microorganism, or introduction of a vector including a polynucleotide encoding a particular protein into a microorganism, thus expressing the activity of the protein.

[045] O melhoramento da atividade do polipeptídeo ou proteína pode ser alcançado aplicando-se vários métodos bem conhecidos na técnica sem limitação, desde que a atividade de um polipeptídeo ou proteína alvo seja melhorada em comparação a do micro-organismo antes da modificação. Especificamente, qualquer engenharia genética e/ou métodos de engenharia de proteínas bem conhecidos na técnica como métodos comuns da biologia molecular podem ser usados, sem limitação aos mesmos. (Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2.1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).[045] Improving the activity of the polypeptide or protein can be achieved by applying various methods well known in the art without limitation, provided that the activity of a target polypeptide or protein is improved compared to that of the microorganism before modification. Specifically, any genetic engineering and/or protein engineering methods well known in the art as common molecular biology methods may be used, without limitation thereto. (Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2.1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).

[046] Especificamente, na presente revelação, o melhoramento da atividade pode ser alcançado por: (1) aumentar um número de cópias de um gene ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou a proteína em uma célula; (2) substituir uma região regulatória de expressão gênica no cromossomo que codifica o polipeptídeo ou proteína com uma sequência com atividade mais forte; (3) modificar uma sequência de base que codifica um códon de iniciação ou uma região 5'-UTR do polipeptídeo ou proteína; (4) modificar uma sequência de nucleotídeos no cromossomo para aumentar a atividade do polipeptídeo ou proteína; (5) introduzir um polinucleotídeo estranho que tem a atividade do polipeptídeo ou proteína ou um polinucleotídeo variante com otimização de códon do polinucleotídeo; ou (6) modificar para melhorar a atividade por meio de qualquer combinação dos métodos descritos acima, sem limitação aos mesmos.[046] Specifically, in the present disclosure, improving activity can be achieved by: (1) increasing a number of copies of a gene or a polynucleotide encoding the polypeptide or protein in a cell; (2) replacing a gene expression regulatory region on the chromosome encoding the polypeptide or protein with a sequence with stronger activity; (3) modifying a base sequence encoding an initiation codon or a 5'-UTR region of the polypeptide or protein; (4) modifying a nucleotide sequence in the chromosome to increase the activity of the polypeptide or protein; (5) introducing a foreign polynucleotide that has the activity of the polypeptide or protein or a variant polynucleotide with codon optimization of the polynucleotide; or (6) modify to improve the activity through any combination of the methods described above, without limitation thereto.

[047] O método de melhorar a atividade de um polipeptídeo ou proteína pelo método de engenharia de proteína, pode ser realizado modificando-se ou modificando-se quimicamente uma região exposta selecionada por meio da análise de uma estrutura tridimensional do polipeptídeo ou proteína, sem limitação aos mesmos.[047] The method of improving the activity of a polypeptide or protein by the protein engineering method, can be carried out by modifying or chemically modifying an exposed region selected through analysis of a three-dimensional structure of the polypeptide or protein, without limitation to them.

[048] O aumento do número de cópias do gene ou polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou proteína descrito em (1) acima, pode ser realizado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, introduzindo-se um vetor, que se replica e funciona independentemente de uma célula hospedeira e está operacionalmente ligado ao gene ou polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou proteína, em uma célula hospedeira. Alternativamente, o aumento do número de cópias pode ser realizado introduzindo-se um vetor, que está operacionalmente ligado ao gene e é capaz de inserir o gene ou polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira, na célula hospedeira, porém, sem limitação ao mesmo.[048] Increasing the number of copies of the gene or polynucleotide encoding the polypeptide or protein described in (1) above, can be carried out by any method well known in the art, for example, by introducing a vector, which replicates and functions independently of a host cell and is operably linked to the gene or polynucleotide encoding the polypeptide or protein, in a host cell. Alternatively, increasing the number of copies can be accomplished by introducing a vector, which is operationally linked to the gene and is capable of inserting the gene or polynucleotide into the host cell's chromosome, but without limitation to the host cell.

[049] A substituição da região regulatória de expressão gênica (ou sequência regulatória de expressão) no cromossomo que codifica o polipeptídeo ou proteína por uma sequência com atividade mais forte descrita em (2) acima, pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, induzindo-se mutação na sequência por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou qualquer combinação das mesmas ou substituindo a sequência por uma sequência com atividade mais forte, para melhorar ainda mais a atividade da região regulatória de expressão. A região regulatória de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência de codificação do local de ligação ao ribossomo e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução, sem limitação ao mesmo. Por exemplo, o método pode ser realizado ligando-se um promotor heterólogo mais forte em vez de um promotor intrínseco, sem limitação ao mesmo.[049] Replacement of the gene expression regulatory region (or expression regulatory sequence) in the chromosome encoding the polypeptide or protein with a sequence with stronger activity described in (2) above, can be carried out by any method known in the art, for example, inducing mutation in the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or any combination thereof or by replacing the sequence with a sequence with stronger activity, to further improve the activity of the expression regulatory region. The expression regulatory region may include a promoter, an operator sequence, a ribosome binding site coding sequence, and a sequence for regulating transcription and translation termination, without limitation thereto. For example, the method can be carried out by binding a stronger heterologous promoter instead of an intrinsic promoter, without limitation thereto.

[050] Exemplos do promotor mais forte conhecido na técnica podem incluir promotores cj1 a cj7 (Patente n° U.S. 7662943 B2), promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR de fago Lambda, promotor PL, promotor tet, promotor lysCP1 (U.S. 2010-0317067 A1), promotor spl1, promotor spl7, promotor spl13 (U.S. 10584338 B2), promotor gapA, promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA ou aceB, promotor O2 (Patente n° U.S.10273491 B2), promotor tkt e promotor yccA, sem limitação aos mesmos.[050] Examples of the strongest promoter known in the art may include cj1 to cj7 promoters (U.S. Patent No. 7,662,943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, Lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, lysCP1 promoter (U.S. 2010-0317067 A1), spl1 promoter, spl7 promoter, spl13 promoter (U.S. 10584338 B2), gapA promoter, EF-Tu promoter, groEL promoter, aceA or aceB promoter, O2 promoter (Patent No. U.S. 10273491 B2) , tkt promoter and yccA promoter, without limitation thereto.

[051] A modificação da sequência de base que codifica um códon de iniciação ou uma região 5'-UTR do polipeptídeo ou proteína descrita em (3) acima, pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, substituindo-se um códon de iniciação intrínseco com outro códon de iniciação com um nível de expressão mais alto do polipeptídeo ou proteína, sem limitação aos mesmos.[051] Modification of the base sequence encoding an initiation codon or a 5'-UTR region of the polypeptide or protein described in (3) above can be carried out by any method known in the art, for example, replacing a intrinsic initiation codon with another initiation codon with a higher expression level of the polypeptide or protein, without limitation thereto.

[052] A modificação da sequência de nucleotídeos no cromossomo para melhorar a atividade do polipeptídeo ou proteína descrita em (4) acima, pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, induzindo-se modificação em uma sequência regulatória de expressão por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa ou qualquer combinação das mesmas para melhorar ainda mais a atividade da sequência de nucleotídeos ou substituir a sequência por uma sequência de nucleotídeos modificada para ter uma atividade mais forte. A substituição pode ser a inserção do gene no cromossomo por recombinação homóloga, sem limitação ao mesmo. Um vetor usado no presente documento pode incluir ainda um marcador de seleção para detectar a inserção cromossômica.[052] Modification of the nucleotide sequence in the chromosome to improve the activity of the polypeptide or protein described in (4) above, can be carried out by any method known in the art, for example, inducing modification in an expression regulatory sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or any combination thereof to further improve the activity of the nucleotide sequence or replace the sequence with a nucleotide sequence modified to have stronger activity. Replacement can be the insertion of the gene into the chromosome by homologous recombination, without limitation. A vector used herein may further include a selection marker to detect chromosomal insertion.

[053] A introdução do polinucleotídeo estranho com a atividade do polipeptídeo ou proteína descrita em (5) acima, pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, introduzindo-se um polinucleotídeo estranho que codifica um polipeptídeo ou proteína com atividade idêntica/semelhante àquela do polipeptídeo ou proteína ou a introdução de um polinucleotídeo variante com códon otimizado do mesmo em uma célula hospedeira. A origem ou sequência do polinucleotídeo estranho não é particularmente limitada, desde que o polinucleotídeo estranho exiba atividade idêntica/semelhante à do polipeptídeo ou proteína. Além disso, um polinucleotídeo estranho com otimização de códon para transcrição e tradução otimizadas na célula hospedeira, pode ser introduzido na célula hospedeira. A introdução pode ser realizada por qualquer método de transformação conhecido apropriadamente selecionado pelas pessoas versadas na técnica. À medida que o polinucleotídeo introduzido é expresso na célula hospedeira, o polipeptídeo ou proteína é produzido, aumentando-se, assim, a atividade da mesma.[053] The introduction of the foreign polynucleotide with the activity of the polypeptide or protein described in (5) above, can be carried out by any method known in the art, for example, by introducing a foreign polynucleotide that encodes a polypeptide or protein with identical activity /similar to that of the polypeptide or protein or the introduction of a codon-optimized variant polynucleotide thereof into a host cell. The origin or sequence of the foreign polynucleotide is not particularly limited, as long as the foreign polynucleotide exhibits identical/similar activity to that of the polypeptide or protein. Furthermore, a foreign polynucleotide with codon optimization for optimized transcription and translation in the host cell can be introduced into the host cell. The introduction may be carried out by any known transformation method appropriately selected by those skilled in the art. As the introduced polynucleotide is expressed in the host cell, the polypeptide or protein is produced, thus increasing its activity.

[054] Finalmente, a combinação dos métodos descritos acima em (6) pode ser realizada aplicando-se um ou mais métodos descritos em (1) a (5).[054] Finally, the combination of the methods described above in (6) can be carried out by applying one or more methods described in (1) to (5).

[055] O melhoramento da atividade do polipeptídeo ou proteína conforme descrito acima, pode ser um aumento na atividade ou concentração do polipeptídeo ou proteína em comparação à atividade ou concentração do polipeptídeo ou proteína expressa em cepas de micro-organismos de tipo selvagem ou não modificados ou um aumento na quantidade de um produto obtido a partir do polipeptídeo ou proteína, sem limitação aos mesmos.[055] Improvement of the activity of the polypeptide or protein as described above may be an increase in the activity or concentration of the polypeptide or protein compared to the activity or concentration of the polypeptide or protein expressed in wild-type or unmodified strains of microorganisms or an increase in the amount of a product obtained from the polypeptide or protein, without limitation thereto.

[056] Conforme utilizado no presente documento, o termo "cepa antes da modificação" ou "micro-organismo antes da modificação" não exclui cepas que incluem mutações que ocorrem naturalmente em micro-organismos e pode se referir a uma cepa de tipo selvagem ou cepa de tipo natural, ou uma cepa antes de ser transformada por modificação genética devido a um fator natural ou artificial. A "cepa antes da modificação" ou "micro-organismo antes da modificação" pode ser usada indistintamente com "cepa não mutada", "cepa não modificada", "micro-organismo não mutado", "micro-organismo não modificado" ou "micro-organismo de referência".[056] As used herein, the term "strain before modification" or "microorganism before modification" does not exclude strains that include mutations that occur naturally in microorganisms and may refer to a wild-type strain or natural-type strain, or a strain before it is transformed by genetic modification due to a natural or artificial factor. The "strain before modification" or "microorganism before modification" may be used interchangeably with "unmutated strain", "unmodified strain", "unmutated microorganism", "unmodified microorganism" or " reference microorganism".

[057] Conforme utilizado no presente documento, o termo "vetor" refere-se a uma construção de DNA que contém uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo e operacionalmente ligada a uma sequência regulatória adequada de modo a ser capaz de expressar a proteína alvo em uma célula hospedeira adequada. A sequência regulatória pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para regular a transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo de mRNA adequado e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução. Quando uma célula hospedeira adequada é transformada com o vetor, o vetor pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode se integrar ao genoma do mesmo. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo pode ser inserido no cromossomo usando-se um vetor para inserção cromossômica nas células. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga, porém, sem limitação à mesma. O vetor pode ainda incluir um marcador de seleção para detectar a inserção cromossômica. O marcador de seleção é usado para selecionar células que são transformadas com o vetor, ou seja, para confirmar a inserção de moléculas de ácido nucleico desejadas, e exemplos do marcador de seleção podem incluir marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, tais como tolerância a fármacos, necessidade de nutrientes, resistência a agentes citotóxicos ou expressão de polipeptídeo de superfície. Apenas as células que expressam o marcador de seleção são capazes de sobreviver ou de apresentar diferentes fenótipos no ambiente tratado com um agente seletivo e, assim, as células transformadas podem ser selecionadas.[057] As used herein, the term "vector" refers to a DNA construct that contains a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a target protein and operably linked to a suitable regulatory sequence so as to be capable of express the target protein in a suitable host cell. The regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence for regulating the termination of transcription and translation. When a suitable host cell is transformed with the vector, the vector can replicate or function independently of the host genome or can integrate into the host genome. For example, a polynucleotide encoding a target protein can be inserted into the chromosome using a vector for chromosomal insertion into cells. The insertion of the polynucleotide into the chromosome can be carried out by any method known in the art, for example, homologous recombination, however, without limitation thereto. The vector may further include a selection marker to detect the chromosomal insertion. The selection marker is used to select cells that are transformed with the vector, i.e., to confirm the insertion of desired nucleic acid molecules, and examples of the selection marker may include markers that provide selectable phenotypes, such as drug tolerance, nutrient requirement, resistance to cytotoxic agents or surface polypeptide expression. Only cells that express the selection marker are capable of surviving or presenting different phenotypes in the environment treated with a selective agent and, thus, transformed cells can be selected.

[058] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores comumente usados na técnica podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A e Charon21A podem ser usados como o vetor de fago ou o vetor cosmídeo. Como o vetor de plasmídeo, o tipo pBR, o tipo pUC, o tipo pBluescriptII, o tipo pGEM, o tipo pTZ, o tipo pCL e o tipo pET podem ser usados. Especificamente, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 e pCC1BAC podem ser usados. No entanto, a modalidade não está limitada aos mesmos.[058] The vector used in the present disclosure is not particularly limited and any vector known in the art can be used. Examples of vectors commonly used in the art may include a natural or recombinant plasmid, cosmid, virus and bacteriophage. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A and Charon21A can be used as the phage vector or the cosmid vector. As the plasmid vector, pBR type, pUC type, pBluescriptII type, pGEM type, pTZ type, pCL type and pET type can be used. Specifically, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 and pCC1BAC can be used. However, the modality is not limited to them.

[059] Conforme utilizado no presente documento, o termo "transformação" refere-se a um processo de introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira ou micro-organismo de tal forma que o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo seja expresso na célula hospedeira. O polinucleotídeo transformado pode estar em uma forma inserida no cromossomo da célula hospedeira ou em uma forma localizada fora do cromossomo, desde que a proteína seja expressa na célula hospedeira. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e/ou RNA que codifica a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira em qualquer forma, desde que o polinucleotídeo seja introduzido na célula hospedeira e o polipeptídeo seja expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de uma cassete de expressão que é uma construção de gene que inclui todos os elementos essenciais necessários para a autorreplicação. O cassete de expressão permite-se incluir, em geral, um promotor ligado de modo operável ao polinucleotídeo, um sinal de terminação de transcrição, um sítio de ligação ao ribossomo e um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira em sua forma original e operacionalmente ligado a uma sequência necessária para a expressão na célula hospedeira, sem limitação à mesma.[059] As used herein, the term "transformation" refers to a process of introducing a vector that includes a polynucleotide encoding a target protein into a host cell or microorganism in such a way that the polypeptide encoded by the polynucleotide is expressed in the host cell. The transformed polynucleotide can be in a form inserted into the host cell's chromosome or in a form located outside the chromosome, as long as the protein is expressed in the host cell. Additionally, the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding the target protein. The polynucleotide can be introduced into the host cell in any form, as long as the polynucleotide is introduced into the host cell and the polypeptide is expressed therein. For example, the polynucleotide can be introduced into the host cell in the form of an expression cassette which is a gene construct that includes all essential elements necessary for self-replication. The expression cassette may generally include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site and a translation termination signal. The expression cassette may be in the form of a self-replicating expression vector. Furthermore, the polynucleotide can be introduced into the host cell in its original form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell, without limitation thereto.

[060] Ademais, conforme utilizado no presente documento, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma ligação operável entre uma sequência promotora, que permite a iniciação e mediação da transcrição de um polinucleotídeo que codifica a proteína alvo da presente revelação e a sequência de gene.[060] Furthermore, as used herein, the term "operably linked" refers to an operable link between a promoter sequence, which allows the initiation and mediation of transcription of a polynucleotide encoding the target protein of the present disclosure and the gene sequence.

[061] Métodos para a transformação com o vetor, de acordo com a presente revelação, incluem quaisquer métodos que permitem a introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira e podem ser realizados por técnicas padrão adequadas bem conhecidas na técnica selecionadas de acordo com a célula hospedeira. Por exemplo, podem ser usados eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, método de polietilenoglicol (PEG), método DEAE-dextrano, método de lipossoma catiônico e método de acetato de lítio-DMSO, mas a presente a revelação não se limita aos mesmos.[061] Methods for transformation with the vector, according to the present disclosure, include any methods that allow the introduction of a nucleic acid into a host cell and can be carried out by suitable standard techniques well known in the art selected in accordance with the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate precipitation (CaPO4), calcium chloride precipitation (CaCl2), microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and lithium acetate method can be used. -DMSO, but the present disclosure is not limited to them.

[062] O micro-organismo da presente revelação permite-se incluir tanto micro-organismos de tipo selvagem quanto micro-organismos que inclui modificação genética natural ou artificial, e qualquer micro-organismo introduzido com ou que inclui uma tiossulfato redutase, de acordo com a presente revelação, pode ser incluído no mesmo sem limitação.[062] The microorganism of the present disclosure can include both wild-type microorganisms and microorganisms that include natural or artificial genetic modification, and any microorganism introduced with or that includes a thiosulfate reductase, in accordance with the present disclosure, may be included therein without limitation.

[063] O micro-organismo da presente revelação pode incluir: pelo menos um dentre tiossulfato redutase da presente revelação; um polinucleotídeo que codifica o mesmo; e um vetor que inclui o polinucleotídeo.[063] The microorganism of the present disclosure may include: at least one of the thiosulfate reductase of the present disclosure; a polynucleotide encoding the same; and a vector that includes the polynucleotide.

[064] O micro-organismo pode ser um micro-organismo produtor de L- aminoácidos e/ou derivado do mesmo.[064] The microorganism can be a microorganism producing L-amino acids and/or derivatives thereof.

[065] Conforme utilizado no presente documento, o termo "micro-organismo produtor de L-aminoácidos e/ou derivado do mesmo" inclui tanto um micro-organismo com a capacidade natural de produzir L-aminoácidos/derivado do mesmo, quanto um micro-organismo preparado que fornece a capacidade de produzir L- aminoácidos/derivado do mesmo para uma cepa parental incapaz de produzir os L- aminoácidos ou derivado do mesmo. Especificamente, qualquer micro-organismo que inclui modificação genética para produzir um L-aminoácido alvo ou derivado do mesmo, por ter um mecanismo particular enfraquecido ou melhorado por meio da introdução de um gene exógeno ou melhoramento ou inativação da atividade de um gene endógeno.[065] As used herein, the term "microorganism producing L-amino acids and/or derivative thereof" includes both a microorganism with the natural ability to produce L-amino acids/derivative thereof, and a microorganism -prepared organism that provides the ability to produce L-amino acids/derivative thereof to a parental strain incapable of producing L-amino acids or derivative thereof. Specifically, any microorganism that includes genetic modification to produce a target L-amino acid or derivative thereof, by having a particular mechanism weakened or improved through the introduction of an exogenous gene or enhancing or inactivating the activity of an endogenous gene.

[066] Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual uma passagem de biossíntese de um L-aminoácido é melhorada ou uma passagem de degradação do mesmo é enfraquecida. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual uma passagem de biossíntese de L-metionina é melhorada.[066] For example, the microorganism may be a microorganism in which a biosynthesis passage of an L-amino acid is improved or a degradation passage thereof is weakened. For example, the microorganism may be a microorganism in which an L-methionine biosynthesis pathway is improved.

[067] Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual a atividade da proteína repressora da biossíntese de metionina e cisteína (McbR) ou proteína MetJ é enfraquecida ou eliminada ou um micro-organismo no qual a capacidade de produção de metionina é melhorada e/ou adicionada melhorando-se a atividade da metionina sintase (MetH) ou sulfito redutase (CysI). Alternativamente, o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida na passagem de biossíntese de L-aminoácido é melhorada ou uma enzima envolvida na passagem de degradação de L-aminoácido é enfraquecida/inativada.[067] For example, the microorganism may be a microorganism in which the activity of the methionine and cysteine biosynthesis repressor protein (McbR) or MetJ protein is weakened or eliminated or a microorganism in which the production capacity of methionine is improved and/or added improving the activity of methionine synthase (MetH) or sulfite reductase (CysI). Alternatively, the microorganism may be a microorganism in which the expression of a gene encoding an enzyme involved in the passage of L-amino acid biosynthesis is enhanced or an enzyme involved in the passage of L-amino acid degradation is weakened/inactivated. .

[068] Especificamente, exemplos de proteínas ou genes cuja expressão pode ser controlada para melhorar a passagem de biossíntese de L-aminoácidos ou enfraquecer/inativar a passagem de degradação da mesma, são os seguintes. Eles são fornecidos na ordem de uma proteína, um gene representativo que codifica a proteína e um número EC representativo do mesmo. A primeira letra da proteína é escrita em maiúscula e o gene é escrito em itálico. Por exemplo, tiossulfato sulfurtransferase, como Rdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, NCgl1369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCGl2678, e NCgl2890; sulfito redutase, cysI; sistema de transporte de tiossulfato/sulfato, cysPUWA (EC 3.6.3.25); 3‘-fosfoadenosina 5‘-fosfosulfato redutase, cysH (EC 1.8.4.8); sulfito redutase, cysJI (EC 1.8.1.2); cisteína sintase A, cysK (EC 2.5.1.47); cisteína sintase B, cysM (EC 2.5.1.47); serina acetiltransferase, cysE (EC 2.3.1.30); sistema de clivagem de glicina, gcvTHP-lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4); lipoyl sintase, lipA (EC 2.8.1.8); lipoil proteína ligase, lipB (EC 2.3.1.181); fosfoglicerato desidrogenase, serA (EC 1.1.1.95); 3-fosfoserina fosfatase, serB (EC 3.1.3.3); 3- fosfoserina/fosfohidroxitreonina aminotransferase, serC (EC 2.6.1.52); serina hidroximetiltransferase, glyA (EC 2.1.2.1); aspartoquinase I (EC 2.7.2.4); homosserina desidrogenase I, thrA (EC 1.1.1.3); aspartato quinase, lysC (EC 2.7.2.4); homosserina desidrogenase, hom (EC 1.1.1.3); homoserina O-acetiltransferase, metX (EC 2.3.1.31); homosserina O-succiniltransferase, metA (EC 2.3.1.46); cistationina gama- sintase, metB (EC 2.5.1.48); β-C-S-liase, aecD (EC 4.4.1.8, beta-liase); cistationina beta-liase, metC (EC 4.4.1.8); homocisteína S-metiltransferase independente de B12, metE (EC 2.1.1.14); metionina sintase, metH (EC 2.1.1.13); metilenotetrahidrofolato redutase, metF (EC 1.5.1.20); Exportador de L-metionina BrnFE; exportador de valina YgaZH (B2682, B2683), ygaZH (b2682, b2683); exportador YjeH, b4141; piridina nucleotídeo transidrogenase PntAB, pntAB (EC 1.6.1.2); O-succinilhomoserina sulfidrilase, MetZ (EC 2.5.1.48); e fosfoenolpiruvato carboxilase, Pyc (EC 4.1.1.31) podem ser usados. A passagem de biossíntese de L-aminoácidos pode ser melhorada ou a passagem de degradação dos mesmos pode ser enfraquecida melhorando-se a atividade de uma ou mais proteínas descritas acima ou algumas proteínas que constituem o sistema ou por superexpressão de polinucleotídeos que codificam os mesmos. Alternativamente, dentre glicose 6-fosfato isomerase, pgi (EC 5.3.1.9); homosserina quinase, thrB (EC 2.7.1.39); S-adenosilmetionina sintase, metK (EC 2.5.1.6); dihidrodipicolinato sintase, dapA (EC 4.2.1.52); fosfoenolpiruvato carboxilquinase, pck (EC 4.1.1.49); formiltetraidrofolato hidrolase, purU (EC 3.5.1.10); piruvato quinase I, pykF (EC 2.7.1.40); piruvato quinase II, pykA (EC 2.7.1.40); cistationina Y-liase, cg3086 (EC 4.4.1.1); cistationina β-sintase, cg2344 (EC 4.2.1.22); proteína regulatória Cg3031, cg3031; proteína repressora da biossíntese de metionina e cisteína McbR, mcbR; proteína repressora da transcrição Met, metJ; transportador de L-metionina MetQNI, metQ, metN, metI; N-aciltransferase, yncA; sRNA fnrS; e transportador de L-metionina, metP, pelo menos uma proteína selecionada pode ser inativada ou enfraquecida ou a expressão do gene que codifica a proteína pode ser suprimida ou removida.[068] Specifically, examples of proteins or genes whose expression can be controlled to improve the biosynthesis passage of L-amino acids or weaken/inactivate the degradation passage thereof, are as follows. They are given in the order of a protein, a representative gene encoding the protein, and a representative EC number thereof. The first letter of the protein is written in capital letters and the gene is written in italics. For example, thiosulfate sulfurtransferase, such as Rdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCgl0671, NCgl1369, NCgl2616, NCgl0053, NCgl0054, NCGl2678, and NCgl2890; sulfite reductase, cysI; thiosulfate/sulfate transport system, cysPUWA (EC 3.6.3.25); 3‘-phosphoadenosine 5‘-phosphosulfate reductase, cysH (EC 1.8.4.8); sulfite reductase, cysJI (EC 1.8.1.2); cysteine synthase A, cysK (EC 2.5.1.47); cysteine synthase B, cysM (EC 2.5.1.47); serine acetyltransferase, cysE (EC 2.3.1.30); glycine cleavage system, gcvTHP-lpd (EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4); lipoyl synthase, lipA (EC 2.8.1.8); lipoyl protein ligase, lipB (EC 2.3.1.181); phosphoglycerate dehydrogenase, serA (EC 1.1.1.95); 3-phosphoserine phosphatase, serB (EC 3.1.3.3); 3- phosphoserine/phosphohydroxythreonine aminotransferase, serC (EC 2.6.1.52); serine hydroxymethyltransferase, glyA (EC 2.1.2.1); aspartokinase I (EC 2.7.2.4); homoserine dehydrogenase I, thrA (EC 1.1.1.3); aspartate kinase, lysC (EC 2.7.2.4); homoserine dehydrogenase, hom (EC 1.1.1.3); homoserine O-acetyltransferase, metX (EC 2.3.1.31); homoserine O-succinyltransferase, metA (EC 2.3.1.46); cystathionine gamma synthase, metB (EC 2.5.1.48); β-C-S-lyase, aecD (EC 4.4.1.8, beta-lyase); cystathionine beta-lyase, metC (EC 4.4.1.8); B12-independent homocysteine S-methyltransferase, metE (EC 2.1.1.14); methionine synthase, metH (EC 2.1.1.13); methylenetetrahydrofolate reductase, metF (EC 1.5.1.20); Exporter of L-methionine BrnFE; valine exporter YgaZH (B2682, B2683), ygaZH (b2682, b2683); exporter YjeH, b4141; pyridine nucleotide transhydrogenase PntAB, pntAB (EC 1.6.1.2); O-succinylhomoserine sulfhydrylase, MetZ (EC 2.5.1.48); and phosphoenolpyruvate carboxylase, Pyc (EC 4.1.1.31) can be used. The passage of biosynthesis of L-amino acids can be improved or the passage of degradation thereof can be weakened by improving the activity of one or more proteins described above or some proteins that constitute the system or by overexpression of polynucleotides that encode them. Alternatively, from glucose 6-phosphate isomerase, pgi (EC 5.3.1.9); homoserine kinase, thrB (EC 2.7.1.39); S-adenosylmethionine synthase, metK (EC 2.5.1.6); dihydrodipicolinate synthase, dapA (EC 4.2.1.52); phosphoenolpyruvate carboxylkinase, pck (EC 4.1.1.49); formyltetrahydrofolate hydrolase, purU (EC 3.5.1.10); pyruvate kinase I, pykF (EC 2.7.1.40); pyruvate kinase II, pykA (EC 2.7.1.40); cystathionine Y-lyase, cg3086 (EC 4.4.1.1); cystathionine β-synthase, cg2344 (EC 4.2.1.22); regulatory protein Cg3031, cg3031; methionine and cysteine biosynthesis repressor protein McbR, mcbR; Met transcription repressor protein, metJ; L-methionine transporter MetQNI, metQ, metN, metI; N-acyltransferase, yncA; fnrS sRNA; and L-methionine transporter, metP, at least one selected protein can be inactivated or weakened or expression of the gene encoding the protein can be suppressed or removed.

[069] No entanto, estes são meramente exemplos e o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual a expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida em várias passagens de biossíntese de L-aminoácidos conhecidas é melhorada ou uma enzima envolvida em passagens de degradação é enfraquecida/inativada, sem limitação ao mesmo. O micro-organismo produtor de L- aminoácido pode ser preparado por meio de vários métodos conhecidos na técnica. O melhoramento da atividade da proteína e o aumento da expressão gênica, são conforme descritos acima.[069] However, these are merely examples and the microorganism may be a microorganism in which the expression of a gene encoding an enzyme involved in several known L-amino acid biosynthesis passages is improved or an enzyme involved in degradation passages is weakened/inactivated, without limitation thereto. The L-amino acid-producing microorganism can be prepared by various methods known in the art. Improving protein activity and increasing gene expression are as described above.

[070] Conforme utilizado no presente documento, o termo "inativação" ou "enfraquecimento" de um polipeptídeo ou proteína é um conceito que inclui a redução e a eliminação da atividade em comparação à atividade intrínseca. A inativação ou enfraquecimento podem ser usados indistintamente com regulação para baixo, diminuição e redução. A inativação ou enfraquecimento pode incluir um caso em que a atividade da proteína é reduzida ou eliminada em comparação a atividade intrínseca do micro-organismo por mutação de um gene que codifica a proteína, modificação de uma sequência regulatória de expressão ou deleção do gene na totalidade ou em parte, um caso em que a atividade global da proteína em uma célula é inferior à das cepas nativas ou cepas não modificadas devido à inibição da expressão ou tradução do gene que codifica o mesmo, um caso em que o gene não é expresso e um caso em que nenhuma atividade é obtida embora o gene seja expresso.[070] As used herein, the term "inactivation" or "weakening" of a polypeptide or protein is a concept that includes the reduction and elimination of activity compared to intrinsic activity. Inactivation or weakening can be used interchangeably with downregulation, diminution, and reduction. Inactivation or weakening may include a case in which the activity of the protein is reduced or eliminated in comparison to the intrinsic activity of the microorganism by mutation of a gene encoding the protein, modification of an expression regulatory sequence, or deletion of the gene in its entirety. or in part, a case in which the overall activity of the protein in a cell is lower than that of native strains or unmodified strains due to inhibition of expression or translation of the gene encoding it, a case in which the gene is not expressed, and a case in which no activity is obtained although the gene is expressed.

[071] Na presente revelação, a inativação/enfraquecimento de uma proteína pode ser alcançada por vários métodos bem conhecidos na técnica, sem limitação aos mesmos (Nakashima N. et al., Bacterial cell engineering by genome edition and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).[071] In the present disclosure, the inactivation/weakening of a protein can be achieved by several methods well known in the art, without limitation thereto (Nakashima N. et al., Bacterial cell engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).

EXEMPLOS DOS MÉTODOS INCLUEMEXAMPLES OF THE METHODS INCLUDE

[072] (1) deleção do gene que codifica a proteína no todo ou em parte,[072] (1) deletion of the gene that encodes the protein in whole or in part,

[073] (2) modificação de uma região regulatória de expressão (ou sequência regulatória de expressão) para reduzir a expressão do gene que codifica a proteína,[073] (2) modifying an expression regulatory region (or expression regulatory sequence) to reduce the expression of the gene encoding the protein,

[074] (3) modificação da sequência do gene que codifica a proteína para eliminar ou enfraquecer a atividade da proteína,[074] (3) modifying the sequence of the gene encoding the protein to eliminate or weaken the activity of the protein,

[075] (4) introdução de um oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, introdução de RNA antissenso) de ligação complementar a um transcrito de gene que codifica a proteína,[075] (4) introduction of an antisense oligonucleotide (e.g., introduction of antisense RNA) complementary binding to a gene transcript that encodes the protein,

[076] (5) adição de uma sequência complementar a uma sequência Shine- Dalgarno do gene que codifica a proteína a montante da sequência Shine-Dalgarno para formar uma estrutura secundária impedindo um ribossomo de se ligar à mesma,[076] (5) addition of a complementary sequence to a Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the protein upstream of the Shine-Dalgarno sequence to form a secondary structure preventing a ribosome from binding to it,

[077] (6) adição de um promotor para a transcrição reversa ao terminal 3’ da fase de leitura aberta (ORF) de uma sequência de nucleotídeos do gene que codifica a proteína (engenharia de transcrição reversa, RTE), ou qualquer combinação dos mesmos, sem limitação ao mesmo.[077] (6) adding a promoter for reverse transcription to the 3' end of the open reading frame (ORF) of a nucleotide sequence of the gene encoding the protein (reverse transcription engineering, RTE), or any combination thereof same, without limitation to the same.

[078] Especificamente, a deleção do gene que codifica a proteína no todo ou em parte pode ser realizada pela substituição de um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo intrínseca no cromossomo por um polinucleotídeo que tem alguns nucleotídeos deletados ou um gene marcador com o uso de um vetor para inserção cromossômica no micro-organismo. Como um exemplo de exclusão do polinucleotídeo no todo ou em parte, pode ser usado um método de exclusão do polinucleotídeo por recombinação homóloga, sem limitação ao mesmo.[078] Specifically, deletion of the gene encoding the protein in whole or in part can be accomplished by replacing a polynucleotide encoding an intrinsic target protein on the chromosome with a polynucleotide that has some nucleotides deleted or a marker gene with the use of a vector for chromosomal insertion into the microorganism. As an example of deleting the polynucleotide in whole or in part, a method of deleting the polynucleotide by homologous recombination can be used, without limitation thereto.

[079] Além disso, a deleção do gene no todo ou em parte pode ser realizada induzindo-se mutação como uso de luz, como luz ultravioleta ou uma substância química e selecionando-se cepas das quais o gene alvo é deletado dos mutantes. A deleção do gene pode incluir um método por tecnologia de recombinação de DNA. A tecnologia de recombinação de DNA pode ser realizada induzindo-se recombinação homóloga pela inserção de uma sequência de nucleotídeos ou vetor que tem homologia com o gene alvo no micro-organismo. Além disso, a sequência de nucleotídeos ou vetor inserido pode incluir um marcador de seleção dominante, sem limitação ao mesmo.[079] Furthermore, deletion of the gene in whole or in part can be accomplished by inducing mutation using light, such as ultraviolet light or a chemical substance, and selecting strains from which the target gene is deleted from the mutants. Gene deletion may include a method by DNA recombination technology. DNA recombination technology can be carried out by inducing homologous recombination by inserting a nucleotide sequence or vector that has homology with the target gene in the microorganism. Furthermore, the inserted nucleotide sequence or vector may include, without limitation, a dominant selection marker.

[080] Além disso, a modificação da sequência regulatória de expressão pode ser alcançada aplicando-se vários métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a modificação pode ser realizada induzindo-se mutação na região regulatória de expressão (sequência regulatória de expressão) por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou qualquer combinação das mesmas, para reduzir ainda mais a atividade da região regulatória de expressão (expressão regulatória sequência) ou substituindo-se a sequência com uma sequência com atividade mais fraca. A região regulatória de expressão pode incluir um promotor, uma sequência de operador, uma sequência de codificação do local de ligação ao ribossomo e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução, sem limitação ao mesmo.[080] Furthermore, modification of the expression regulatory sequence can be achieved by applying several methods well known in the art. For example, the modification can be accomplished by inducing mutation in the expression regulatory region (expression regulatory sequence) by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or any combination thereof, to further reduce the activity of the expression regulatory region. expression (regulatory expression sequence) or by replacing the sequence with a sequence with weaker activity. The expression regulatory region may include a promoter, an operator sequence, a ribosome binding site coding sequence, and a sequence for regulating transcription and translation termination, without limitation thereto.

[081] Além disso, a modificação da sequência do gene pode ser realizada induzindo-se a mutação na sequência do gene por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa, ou qualquer combinação dos mesmos, para enfraquecer ainda mais a atividade do polipeptídeo ou substituindo-se a sequência com uma sequência de gene modificada para ter atividade mais fraca ou uma sequência de gene modificada para não ter a atividade, sem limitação à mesma.[081] Furthermore, modification of the gene sequence can be carried out by inducing mutation in the gene sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or any combination thereof, to further weaken the activity of the polypeptide or replacing the sequence with a gene sequence modified to have weaker activity or a gene sequence modified to not have the activity, without limiting it.

[082] Por exemplo, a expressão do gene pode ser suprimida ou enfraquecida pela formação de um códon de terminação pela introdução de uma mutação na sequência de gene.[082] For example, gene expression can be suppressed or weakened by the formation of a termination codon by introducing a mutation into the gene sequence.

[083] No entanto, os métodos descritos acima são meramente exemplos e as pessoas versadas na técnica podem preparar um micro-organismo que produz L- aminoácidos e/ou derivados dos mesmos com o uso de qualquer método conhecido na técnica.[083] However, the methods described above are merely examples and those skilled in the art can prepare a microorganism that produces L-amino acids and/or derivatives thereof using any method known in the art.

[084] O L-aminoácido e/ou um derivado do mesmo pode ser um aminoácido que contém enxofre e/ou um derivado do aminoácido que contém enxofre.[084] The L-amino acid and/or a derivative thereof may be a sulfur-containing amino acid and/or a derivative of the sulfur-containing amino acid.

[085] Conforme utilizado no presente documento, o termo "aminoácido que contém enxofre" ou "derivado do aminoácido que contém enxofre" refere-se a um aminoácido que inclui enxofre ou um derivado do mesmo, especificamente um selecionado a partir de metionina, cisteína, cistina, lantionina, homocisteína, homocistina, homolantionina, e taurina, porém sem limitação a mesma, qualquer aminoácido que inclui enxofre e derivado do mesmo podem ser incluídos dentro do escopo da presente revelação, sem limitação.[085] As used herein, the term "sulfur-containing amino acid" or "sulfur-containing amino acid derivative" refers to an amino acid that includes sulfur or a derivative thereof, specifically one selected from methionine, cysteine , cystine, lanthionine, homocysteine, homocystine, homolanthionine, and taurine, but without limitation thereto, any amino acid that includes sulfur and derivative thereof may be included within the scope of the present disclosure, without limitation.

[086] O micro-organismo da presente revelação pode ser um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium sp., ao gênero Escherichia sp., ou ao gênero Lactobacillus sp., sem limitação aos mesmos. O micro-organismo pode incluir qualquer micro-organismo que tem capacidade melhorada para produzir L- aminoácidos e/ou derivados dos mesmos, melhorando-se atividade intrínseca da proteína SsuD ou introduzindo-se uma proteína SsuD estranha, sem limitação.[086] The microorganism of the present disclosure may be a microorganism belonging to the genus Corynebacterium sp., the genus Escherichia sp., or the genus Lactobacillus sp., without limitation thereto. The microorganism can include any microorganism that has improved ability to produce L-amino acids and/or derivatives thereof, by improving the intrinsic activity of the SsuD protein or by introducing a foreign SsuD protein, without limitation.

[087] O “micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium” pode incluir todos os micro-organismos pertencentes ao gênero Corynebacterium. Especificamente, o micro-organismo pode ser Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, ou Corynebacterium flavescens, e mais especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium stationis, Corynebacterium ammoniagenes, ou Corynebacterium deserti, ainda mais especificamente Corynebacterium glutamicum, porém, sem limitação aos mesmos.[087] The “microorganism belonging to the genus Corynebacterium” can include all microorganisms belonging to the genus Corynebacterium. Specifically, the microorganism may be Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, or Corynebacterium flavescens, and more specifically Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium stationis, Corynebacterium ammoniagenes, or Corynebacterium deserti, even more specifically Corynebacterium glutamicum, however, without limitation thereto.

[088] O “micro-organismo pertencente ao gênero Escherichia” pode incluir todos os micro-organismos pertencentes ao gênero Escherichia. Especificamente, o micro-organismo pode ser Escherichia coli, porém, sem limitação ao mesmo.[088] The “microorganism belonging to the genus Escherichia” can include all microorganisms belonging to the genus Escherichia. Specifically, the microorganism can be Escherichia coli, however, without limitation.

[089] O micro-organismo da presente revelação pode ser qualquer microorganismo que inclui a tiossulfato redutase da presente revelação e que usa tiossulfato como uma fonte de enxofre.[089] The microorganism of the present disclosure can be any microorganism that includes the thiosulfate reductase of the present disclosure and that uses thiosulfate as a source of sulfur.

[090] O método de produção da presente revelação pode incluir cultivar o micro-organismo da presente revelação em um meio de cultura que contém tiossulfato.[090] The method of producing the present disclosure may include cultivating the microorganism of the present disclosure in a culture medium that contains thiosulfate.

[091] Conforme usado no presente documento, o termo “cultivar” se refere desenvolver o micro-organismo em um ambiente ajustado apropriadamente. Um processo de cultura da presente revelação pode ser realizado de acordo com um meio apropriado e condições de cultura conhecidas na técnica. O processo de cultura pode ser facilmente ajustado para uso por um elemento versado na técnica de acordo com uma cepa a ser selecionada. A cultura do micro-organismo pode ser realizada em um processo em batelada, um processo contínuo, um processo em batelada alimentada, etc. conhecidos na técnica, sem limitação aos mesmos.[091] As used herein, the term “cultivate” refers to developing the microorganism in an appropriately adjusted environment. A culture process of the present disclosure can be carried out in accordance with an appropriate medium and culture conditions known in the art. The culture process can be easily adjusted for use by one skilled in the art according to a strain to be selected. Microorganism culture can be carried out in a batch process, a continuous process, a fed-batch process, etc. known in the art, without limitation thereto.

[092] Conforme utilizado no presente documento, o termo "meio de cultura" refere-se a um material em que os nutrientes necessários para a cultura do micro-organismo são misturados como ingredientes principais e fornecem nutrientes e fatores de crescimento, bem como água, que são essenciais para a sobrevivência e o crescimento. Especificamente, embora os meios de cultura e outras condições de cultivo para cultivar o micro-organismo da presente revelação não sejam particularmente limitados, desde que os meios de cultura sejam comumente usados na cultura de micro-organismos, o micro-organismo da presente revelação pode ser cultivado em um meio comum que contém fontes de carbono apropriados, fontes de nitrogênio, fontes de fósforo, compostos inorgânicos, aminoácidos e/ou vitaminas sob condições aeróbicas enquanto se ajusta a temperatura, pH e semelhantes.[092] As used herein, the term "culture medium" refers to a material in which the nutrients necessary for the culture of the microorganism are mixed as main ingredients and provide nutrients and growth factors, as well as water , which are essential for survival and growth. Specifically, although the culture media and other cultivation conditions for cultivating the microorganism of the present disclosure are not particularly limited, as long as the culture media are commonly used in culturing microorganisms, the microorganism of the present disclosure may be grown in a common medium that contains appropriate carbon sources, nitrogen sources, phosphorus sources, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins under aerobic conditions while adjusting temperature, pH and the like.

[093] Na presente revelação, as fontes de carbono podem incluir carboidratos, como glicose, sacarose, lactose, frutose, sacarose e maltose; álcoois de açúcar, tais como manitol e sorbitol; ácidos orgânicos, tais como ácido pirúvico, ácido láctico e ácido cítrico; e aminoácidos, tais como ácido glutâmico, metionina e lisina. Além disso, nutrientes orgânicos naturais, como hidrolisados de amido, melaço, melaço de cana, farelo de arroz, mandioca, bagaço de cana-de-açúcar e licor de maceração de milho podem ser usados, e especificamente carboidratos, como glicose e melaço pré- tratado estéril (isto é, melaço convertido em açúcares reduzidos) pode ser usado, e quantidades adequadas de quaisquer outras fontes de carbono também podem ser usadas sem limitação. Estas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em combinação de pelo menos duas delas, porém, sem limitação as mesmas.[093] In the present disclosure, carbon sources may include carbohydrates, such as glucose, sucrose, lactose, fructose, sucrose and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid and citric acid; and amino acids, such as glutamic acid, methionine and lysine. Additionally, natural organic nutrients such as starch hydrolysates, molasses, sugarcane molasses, rice bran, cassava, sugarcane bagasse and corn steep liquor can be used, and specifically carbohydrates such as glucose and molasses pre - sterile treated (i.e. molasses converted to reduced sugars) may be used, and suitable amounts of any other carbon sources may also be used without limitation. These carbon sources can be used alone or in combination with at least two of them, but without limitation the same.

[094] As fontes de nitrogênio podem incluir fontes de nitrogênio inorgânico, tais como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio; e fontes de nitrogênio orgânico, como aminoácidos, por exemplo, ácido glutâmico, metionina e glutamina, peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de maceração de milho, hidrolisado de caseína, peixe ou produtos de degradação e bolo de soja desengordurado ou produtos de degradação dos mesmos. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação de pelo menos duas, sem limitação às mesmas.[094] Nitrogen sources may include inorganic nitrogen sources, such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate; and organic nitrogen sources such as amino acids, e.g. glutamic acid, methionine and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or products of degradation and defatted soybean cake or degradation products thereof. These nitrogen sources can be used alone or in combination of at least two, without limitation.

[095] As fontes de fósforo podem incluir fosfato monopotássico, fosfato dipotássico ou sais que contém sódio correspondentes aos mesmos. Como compostos inorgânicos, podem ser usados cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês, carbonato de cálcio e semelhantes. Além disso, aminoácidos, vitaminas e/ou precursores apropriados podem ainda ser incluídos. Esses componentes e precursores podem ser adicionados ao meio de cultura em batelada ou processo contínuo, sem limitação aos mesmos.[095] Phosphorus sources may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate or sodium-containing salts corresponding thereto. As inorganic compounds, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like can be used. Furthermore, appropriate amino acids, vitamins and/or precursors may also be included. These components and precursors can be added to the culture medium in a batch or continuous process, without limitation thereto.

[096] Além disso, durante o processo de cultura do micro-organismo, compostos como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico, podem ser adicionados ao meio de cultura em um método adequado para ajustar o pH do meio de cultura. Além disso, um agente antiespumante, tal como éster de poliglicol de ácido graxo pode ser adicionado durante a cultura, a fim de inibir a formação de espumas. Adicionalmente, oxigênio ou gás que contém oxigênio podem ser injetados no meio de cultura para manter o meio de cultura em uma condição aeróbia, ou nitrogênio, hidrogênio ou gás dióxido de carbono podem ser injetados no meio de cultura para manter o meio de cultura em condições anaeróbicas e microaeróbicas sem injetar quaisquer outros gases para isso, porém, a modalidade não se limita às mesmas.[096] Furthermore, during the microorganism culture process, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture medium in a suitable method to adjust the pH of the microorganism. culture medium. Additionally, an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester can be added during cultivation in order to inhibit foam formation. Additionally, oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture medium to maintain the culture medium in an aerobic condition, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected into the culture medium to maintain the culture medium in an aerobic condition. anaerobic and microaerobic without injecting any other gases for this, however, the modality is not limited to them.

[097] A temperatura do meio de cultura pode ser mantida a 25 °C a 40 °C, mais especificamente a 30 °C a 37 °C, sem limitação ao mesmo. A cultura pode ser continuada até que uma quantidade desejada de um produto seja obtida, por exemplo, por 0,5 horas a 60 horas, sem limitação ao mesmo.[097] The temperature of the culture medium can be maintained at 25 °C to 40 °C, more specifically at 30 °C to 37 °C, without limitation. The culture may be continued until a desired amount of a product is obtained, for example, for 0.5 hours to 60 hours, without limitation thereof.

[098] O termo "fonte de enxofre" da presente revelação pode ser usado alternadamente com "fonte de fornecimento de enxofre" e se refere a uma substância que contém enxofre disponível na produção de um aminoácido que contém enxofre.[098] The term "sulfur source" of the present disclosure can be used interchangeably with "sulfur supply source" and refers to a sulfur-containing substance available in the production of a sulfur-containing amino acid.

[099] Na cultura do micro-organismo, a fonte de enxofre pode ser um fator importante na determinação de uma passagem metabólica no micro-organismo. No entanto, os fatores envolvidos no transporte de várias fontes de enxofre e os fatores envolvidos na degradação do mesmo, não foram revelados com precisão. Por exemplo, embora seja conhecido que Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem usa várias fontes de enxofre, sabe-se que a proteína SsuD não está envolvida no transporte de sulfato ou sulfito, mas envolvida apenas no transporte de sulfonato alifático (D. J. Koch, C. Ruckert, D. A. Rey, A. Mix, A. Puhler, J. Kalinowski. 2005. Role of the ssu and seu Genes of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Utilization of Sulfonates and Sulfonate Esters as Sulfur Sources. AEM. 71.10:6104-6114. 2005). Ou seja, uma proteína que transporta a fonte de enxofre para uma célula tem especificidade de substrato. Adicionalmente, após a fonte de enxofre ser transportada para a célula, uma enzima que degrada a fonte de enxofre pode variar e uma passagem metabólica que usa a mesma, também pode variar de acordo com uma estrutura e um grupo funcional da fonte de enxofre. Por exemplo, quando um sulfato é usado como fonte de enxofre, sabe-se que CysZ transporta o sulfato e CysDN, CysH e CysI estão envolvidos até que um sulfeto seja produzido (Bolten, Christoph J., Hartwig Schroder, Jeroen Dickschat e Christoph Wittmann. Towards Methionine Overproduction in Corynebacterium glutamicum Methanethiol and Dimethyldisulfide as Reduced Sulfur Sources. J. Microbiol. Biotechnol. (2010), 20(8), 1196-1203). No entanto, no caso em que a tiossulfato é usada como uma fonte de enxofre na produção de aminoácidos que contém enxofre, os fatores usados para transportar e degradar a tiossulfato ainda não foram claramente revelados.[099] In microorganism culture, the sulfur source can be an important factor in determining a metabolic passage in the microorganism. However, the factors involved in the transport of various sources of sulfur and the factors involved in its degradation have not been precisely revealed. For example, although wild-type Corynebacterium glutamicum is known to use multiple sources of sulfur, the SsuD protein is known not to be involved in sulfate or sulfite transport, but only involved in aliphatic sulfonate transport (D. J. Koch, C. Ruckert , D. A. Rey, A. Mix, A. Puhler, J. Kalinowski. 2005. Role of the ssu and its genes of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in Utilization of Sulfonates and Sulfonate Esters as Sulfur Sources. ). That is, a protein that transports the sulfur source into a cell has substrate specificity. Additionally, after the sulfur source is transported to the cell, an enzyme that degrades the sulfur source may vary and a metabolic pathway that uses it may also vary depending on the structure and functional group of the sulfur source. For example, when a sulfate is used as a source of sulfur, CysZ is known to transport the sulfate and CysDN, CysH, and CysI are involved until a sulfide is produced (Bolten, Christoph J., Hartwig Schroder, Jeroen Dickschat, and Christoph Wittmann . Towards Methionine Overproduction in Corynebacterium glutamicum Methanethiol and Dimethyldisulfide as Reduced Sulfur Sources. However, in the case where thiosulfate is used as a source of sulfur in the production of sulfur-containing amino acids, the factors used to transport and degrade thiosulfate have not yet been clearly revealed.

[0100] A fonte de enxofre pode ser tiossulfato. Especificamente, na presente revelação, a fonte de enxofre pode incluir tiossulfato, como tiossulfato de amônio ou tiossulfato de sódio ou uma mistura de tiossulfato e um composto que contém enxofre orgânico ou inorgânico, como sulfito, matéria-prima reduzida, como H2S, sulfeto, um derivado de sulfeto, metilmercaptano, tioglicolita, tiocianato e tioureia. Alternativamente, a fonte de enxofre pode não incluir qualquer material diferente de tiossulfato. No entanto, a modalidade não está limitada aos mesmos.[0100] The sulfur source can be thiosulfate. Specifically, in the present disclosure, the sulfur source may include thiosulfate, such as ammonium thiosulfate or sodium thiosulfate, or a mixture of thiosulfate and an organic or inorganic sulfur-containing compound, such as sulfite, reduced feedstock, such as H2S, sulfide, a derivative of sulfide, methylmercaptan, thioglycolite, thiocyanate and thiourea. Alternatively, the sulfur source may not include any material other than thiosulfate. However, the modality is not limited to them.

[0101] O método de produção dos aminoácidos que contém enxofre ou derivados dos aminoácidos que contém enxofre pode incluir a recuperação de aminoácidos que contém enxofre ou derivados dos aminoácidos que contém enxofre do microorganismo ou meio de cultura.[0101] The method of producing sulfur-containing amino acids or derivatives of sulfur-containing amino acids may include recovering sulfur-containing amino acids or derivatives of sulfur-containing amino acids from the microorganism or culture medium.

[0102] A etapa de recuperação pode ser realizada através da coleta de aminoácidos que contém enxofre desejados ou derivados dos aminoácidos que contém enxofre com o uso de um método apropriado conhecido na técnica de acordo com o método de cultura da presente revelação, como um método em batelada, contínuo ou batelada alimentada. Por exemplo, centrifugação, filtração, tratamento com um agente de precipitação de proteína (precipitação por sais), extração, desintegração ultrassônica, ultrafiltração, diálise, vários métodos cromatográficos, como cromatografia de peneira molecular (permeação em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de troca iônica e afinidade cromatografia, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), qualquer combinação dos mesmos pode ser usada, sem limitação aos mesmos.[0102] The recovery step can be carried out by collecting desired sulfur-containing amino acids or derivatives of sulfur-containing amino acids using an appropriate method known in the art in accordance with the culture method of the present disclosure, such as a method in batch, continuous or fed batch. For example, centrifugation, filtration, treatment with a protein precipitating agent (salt precipitation), extraction, ultrasonic disintegration, ultrafiltration, dialysis, various chromatographic methods such as molecular sieve chromatography (gel permeation), adsorption chromatography, chromatography ion exchange and affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), any combination thereof can be used, without limitation thereto.

[0103] A etapa de recuperação pode incluir ainda um processo de purificação. O processo de purificação pode ser realizado com o uso de um método apropriado conhecido na técnica.[0103] The recovery step may also include a purification process. The purification process can be carried out using an appropriate method known in the art.

[0104] Outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para a produção de um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre, em que a composição inclui: um micro-organismo que tem atividade melhorada de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação à atividade intrínseca ou uma cultura do mesmo; e tiossulfato.[0104] Another aspect of the present disclosure provides a composition for producing a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid, wherein the composition includes: a microorganism that has enhanced activity of a protein encoded by the ssuD gene in comparison to intrinsic activity or a culture thereof; and thiosulfate.

[0105] A proteína codificada pelo gene ssuD, micro-organismo, tiossulfato e aminoácido que contém enxofre são conforme descritos acima.[0105] The protein encoded by the ssuD gene, microorganism, thiosulfate and sulfur-containing amino acid are as described above.

[0106] A cultura pode ser preparada cultivando-se o micro-organismo da presente revelação em um meio de cultura.[0106] The culture can be prepared by cultivating the microorganism of the present disclosure in a culture medium.

[0107] A composição para a produção de um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre, de acordo com a presente revelação, pode incluir ainda qualquer componente capaz de auxiliar na produção de um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre e o componente pode ser apropriadamente selecionado a partir daqueles conhecidos na técnica.[0107] The composition for producing a sulfur-containing amino acid or a sulfur-containing amino acid derivative, according to the present disclosure, may further include any component capable of assisting in the production of a sulfur-containing amino acid or a sulfur-containing amino acid derivative. sulfur-containing amino acid and the component may be appropriately selected from those known in the art.

[0108] Outro aspecto da presente revelação fornece o uso de uma proteína codificada pelo gene ssuD como uma tiossulfato redutase.[0108] Another aspect of the present disclosure provides the use of a protein encoded by the ssuD gene as a thiosulfate reductase.

[0109] Outro aspecto da presente revelação fornece o uso de um micro-organismo que inclui modificação genética para aumentar atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação a um micro-organismo não modificado para a produção de aminoácidos que contém enxofre ou derivados dos aminoácidos que contém enxofre.[0109] Another aspect of the present disclosure provides the use of a microorganism that includes genetic modification to increase activity of a protein encoded by the ssuD gene compared to an unmodified microorganism for the production of sulfur-containing amino acids or derivatives of sulfur-containing amino acids.

[0110] A proteína codificada pelo gene ssuD, micro-organismo, culturas, tiossulfato e aminoácido que contém enxofre são conforme descritos acima.[0110] The protein encoded by the ssuD gene, microorganism, cultures, thiosulfate and sulfur-containing amino acid are as described above.

MODO PARA A INVENÇÃOMODE FOR INVENTION

[0111] Doravante no presente documento, a presente revelação será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes exemplos e exemplos experimentais. No entanto, os seguintes exemplos e exemplos experimentais são apresentados meramente para exemplificar a presente revelação e o escopo da presente revelação não é limitado aos mesmos.[0111] Hereinafter, the present disclosure will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples. However, the following examples and experimental examples are presented merely to exemplify the present disclosure and the scope of the present disclosure is not limited thereto.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PARA DELEÇÃO DE GENE MCBREXAMPLE 1: RECOMBINANT VECTOR PREPARATION FOR MCBR GENE DELETION

[0112] Primeiramente, a fim de preparar uma cepa produtora de metionina, como um aminoácido que contém enxofre representativo, a cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi usada para preparar um vetor para inativar o gene mcbR conhecido, que codifica uma proteína reguladora da transcrição de metionina e cisteína (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003).[0112] First, in order to prepare a strain producing methionine, as a representative sulfur-containing amino acid, the Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain was used to prepare a vector to inactivate the known mcbR gene, which encodes a protein regulating the transcription of methionine and cysteine (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003).

[0113] Especificamente, a fim de excluir o gene mcbR do cromossomo da cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, um vetor de plasmídeo recombinante, foi preparado de acordo com o seguinte método.[0113] Specifically, in order to exclude the mcbR gene from the chromosome of the Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain, a recombinant plasmid vector was prepared according to the following method.

[0114] Com base nas sequências de nucleotídeos depositadas no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), o gene mcbR e as sequências de flanco (SEQ ID NO: 1) de Corynebacterium glutamicum foram obtidos.[0114] Based on the nucleotide sequences deposited in GenBank of the US National Institutes of Health (NIH), the mcbR gene and the flanking sequences (SEQ ID NO: 1) of Corynebacterium glutamicum were obtained.

[0115] O PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo e iniciadores das SEQ ID NOS: 2, 3, 4 e 5 acima. O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 53 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, fragmentos de DNA de 700 pb foram obtidos, respectivamente.[0115] PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template and primers from SEQ ID NOS: 2, 3, 4 and 5 above. PCR was performed under the following conditions: denaturation at 95 °C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds and polymerization at 72°C for 30 seconds; and polymerization at 72 °C for 7 minutes. As a result, DNA fragments of 700 bp were obtained, respectively.

[0116] Um vetor pDZ (Patente n° U.S. US 9109242 B2) incapaz de se replicar em Corynebacterium glutamicum e os fragmentos do gene mcbR amplificados foram tratados com a enzima de restrição SmaI para inserção cromossômica, seguida por clonagem de montagem isotérmica. Escherichia coli DH5α foi transformada com o vetor e plaqueada em meio LB sólido contendo 25 mg/l de canamicina. As colônias transformadas com o vetor no qual um fragmento com deleção do gene alvo foi inserido por PCR foram selecionadas e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo e denominado pDZ-ΔmcbR.[0116] A pDZ vector (U.S. Patent No. US 9109242 B2) unable to replicate in Corynebacterium glutamicum and the amplified mcbR gene fragments were treated with the SmaI restriction enzyme for chromosomal insertion, followed by isothermal assembly cloning. Escherichia coli DH5α was transformed with the vector and plated on solid LB medium containing 25 mg/l kanamycin. Colonies transformed with the vector into which a fragment with deletion of the target gene was inserted by PCR were selected and then a plasmid was obtained by a plasmid extraction method and named pDZ-ΔmcbR.

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO E CULTURA DE CEPA DELETADA POR GENE MCBREXAMPLE 2: PREPARATION AND CULTURE OF STRAIN DELETED BY GENE MCBR

[0117] A cepa ATCC 13032 foi transformada com o vetor pDZ-ΔmcbR preparado no Exemplo 1 acima por eletroporação por recombinação cromossômica homóloga (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Posteriormente, a segunda recombinação foi realizada em meio sólido contendo sacarose. Após a conclusão da segunda recombinação, a cepa transformada de Corynebacterium glutamicum que tem deleção do gene mcbR foi identificada realizando-se PCR com o uso das SEQ ID NOs: 6 e 7, e a cepa recombinante foi denominada CM02-0618.[0117] Strain ATCC 13032 was transformed with the pDZ-ΔmcbR vector prepared in Example 1 above by electroporation by homologous chromosomal recombination (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Subsequently, the second recombination was carried out in solid medium containing sucrose. After completion of the second recombination, the transformed strain of Corynebacterium glutamicum that has a deletion of the mcbR gene was identified by performing PCR using SEQ ID NOs: 6 and 7, and the recombinant strain was named CM02-0618.

[0118] A cepa CM02-0618 foi depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o T ratado de Budapeste em 4 de janeiro de 2019, com o n° de Acesso KCCM12425P.[0118] Strain CM02-0618 was deposited at the Korean Microorganism Culture Center under the Budapest Treaty on January 4, 2019, with Accession No. KCCM12425P.

[0119] A fim de analisar a capacidade de produção de L-metionina da cepa CM02-0618 preparada, a cepa e a cepa parental, cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, foram cultivadas da seguinte maneira.[0119] In order to analyze the L-methionine production capacity of the prepared strain CM02-0618, the strain and the parental strain, strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, were cultivated in the following manner.

[0120] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e Corynebacterium glutamicum CM02-0618 foram inoculados em um balão defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semente e cultivados sob agitação a 30 °C por 20 horas a 200 rpm. Em seguida, 1 ml de um caldo de cultura do mesmo foi inoculado em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado enquanto se agitava a 30 °C por 48 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes. No meio de produção, (NH4)2S2O3, que é um tipo de tiossulfato, foi usado como fonte de enxofre.[0120] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and Corynebacterium glutamicum CM02-0618 were inoculated in a 250 ml corner baffle flask containing 25 ml of a seed medium and grown under shaking at 30 ° C for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of a culture broth thereof was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 24 ml of a production medium and cultivated while shaking at 30 ° C for 48 hours at 200 rpm. The compositions of the seed medium and production medium are as follows. In the production medium, (NH4)2S2O3, which is a type of thiosulfate, was used as a sulfur source.

<MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)><SEED MEDIUM (PH 7.0)>

[0121] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada).[0121] 20 g of glucose, 10 g of peptone, 5 g of yeast extract, 1.5 g of urea, 4 g of KH2PO4, 8 g of K2HPO4, 0.5 g of MgSO4-7H2O, 100 μg of biotin , 1000 μg of thiamine HCl, 2000 μg of calcium pantothenate and 2000 μg of nicotinamide (based on 1 l of distilled water).

<MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)><PRODUCTION MEDIUM (pH 8.0)>

[0122] 50 g de glicose, 12 g de (NH4)2S2O3, 5 g de extrato de levedura, 1 g de KH2PO4, 1,2 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 100 μg de HCL de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 e 1 μg de cianocobalamina (vitamina B12) (com base em 1 l de água destilada).[0122] 50 g of glucose, 12 g of (NH4)2S2O3, 5 g of yeast extract, 1 g of KH2PO4, 1.2 g of MgSO47H2O, 100 μg of biotin, 100 μg of thiamine HCL, 2000 μg of calcium pantothenate, 3000 μg of nicotinamide, 30 g of CaCO3 and 1 μg of cyanocobalamin (vitamin B12) (based on 1 l of distilled water).

[0123] As cepas foram cultivadas de acordo com o método de cultura descrito acima e as concentrações de L-metionina contida no caldo de cultura, foram analisadas e mostradas na Tabela 1 abaixo.[0123] The strains were cultivated according to the culture method described above and the concentrations of L-methionine contained in the culture broth were analyzed and shown in Table 1 below.

TABELA 1TABLE 1

[0124] Confirmação da capacidade de produção de L-metionina de cepas de tipo selvagem e com deleção por gene mcbR [0124] Confirmation of the L-methionine production capacity of wild-type strains and those with mcbR gene deletion

[0125] Como resultado, foi confirmado que a capacidade de produção de L- metionina da cepa com deleção por gene mcbR foi melhorada em 0,04 g/l em comparação à da cepa de controle. Além disso, foi confirmado que a metionina foi produzida mesmo quando a tiossulfato foi usada como uma única fonte de enxofre. Com base no mesmo, foi assumido que uma proteína envolvida na utilização de tiossulfato pode estar presente em um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium.[0125] As a result, it was confirmed that the L-methionine production capacity of the mcbR gene deletion strain was improved by 0.04 g/l compared to that of the control strain. Furthermore, it was confirmed that methionine was produced even when thiosulfate was used as a sole sulfur source. Based on this, it was assumed that a protein involved in the utilization of thiosulfate may be present in a microorganism belonging to the genus Corynebacterium.

EXEMPLO 3: SELEÇÃO DE GENE ENVOLVIDO NA UTILIZAÇÃO DE TIOSSULFATO POR ANÁLISE DE TRANSCRIÇÃOEXAMPLE 3: SELECTION OF GENE INVOLVED IN THE USE OF THIOSULPHATE BY TRANSCRIPTION ANALYSIS

[0126] Nenhuma proteína específica de tiossulfato de cepas do gênero Corynebacterium é conhecida. No entanto, conforme confirmado no Exemplo 2, a cepa CM02-0618 produziu metionina quando tiossulfato foi usada como uma única fonte de enxofre e, assim, um experimento foi realizado para selecionar uma proteína envolvida na utilização de tiossulfato.[0126] No specific thiosulfate protein from strains of the genus Corynebacterium is known. However, as confirmed in Example 2, strain CM02-0618 produced methionine when thiosulfate was used as a sole sulfur source, and thus an experiment was performed to select a protein involved in thiosulfate utilization.

[0127] Especificamente, após a cultura da cepa CM02-0618 preparada no Exemplo 2 alterando-se apenas a fonte de enxofre (sulfato de amônio e tiossulfato de amônio), foi realizada a análise do Transcriptoma (análise do nível de RNA). Foi usado o mesmo método de cultura do Exemplo 2.[0127] Specifically, after culturing the CM02-0618 strain prepared in Example 2 by changing only the sulfur source (ammonium sulfate and ammonium thiosulfate), Transcriptome analysis was performed (RNA level analysis). The same culture method as in Example 2 was used.

TABELA 2TABLE 2

[0128] Resultados do experimento com os principais transcritos do gene da cepa CM02-0618 nas condições usando sulfato de amônio e tiossulfato de amônio [0128] Results of the experiment with the main transcripts of the gene from strain CM02-0618 under conditions using ammonium sulfate and ammonium thiosulfate

[0129] Com base nos resultados do experimento, foi confirmado que um nível de RNA de um gene que codifica SsuD (Ncgl1173) que é convencionalmente conhecido como monooxigenase de sulfonato foi significativamente aumentado.[0129] Based on the results of the experiment, it was confirmed that an RNA level of a gene encoding SsuD (Ncgl1173) which is conventionally known as sulfonate monooxygenase was significantly increased.

[0130] Assim, foi confirmado que a proteína SsuD não reage com o sulfato, mas reage especificamente com tiossulfato e, portanto, pode-se presumir que a proteína está envolvida na utilização de tiossulfato.[0130] Thus, it was confirmed that the SsuD protein does not react with sulfate, but reacts specifically with thiosulfate and, therefore, it can be assumed that the protein is involved in the utilization of thiosulfate.

EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DOS EFEITOS DA CEPA DELETADA POR GENE SSUDEXAMPLE 4: CONFIRMATION OF THE EFFECTS OF THE STRAIN DELETED BY THE SSUD GENE

[0131] A fim de identificar os efeitos de inativação da proteína SsuD selecionada como uma proteína que reage especificamente com tiossulfato no Exemplo 3, um vetor foi preparado para deletar o gene ssuD.[0131] In order to identify the inactivating effects of the SsuD protein selected as a protein that specifically reacts with thiosulfate in Example 3, a vector was prepared to delete the ssuD gene.

EXEMPLO 4-1: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA DELEÇÃO DO GENE SSUDEXAMPLE 4-1: VECTOR PREPARATION FOR DELETION OF THE SSUD GENE

[0132] A fim de deletar o gene ssuD do cromossomo da cepa Corynebacterium ATCC 13032, um vetor de plasmídeo recombinante foi preparado de acordo com o seguinte método.[0132] In order to delete the ssuD gene from the chromosome of the Corynebacterium ATCC 13032 strain, a recombinant plasmid vector was prepared according to the following method.

[0133] Com base nas sequências de nucleotídeos depositadas no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), o gene ssuD e as sequências de flanco (SEQ ID NO: 8) de Corynebacterium glutamicum foram obtidos.[0133] Based on the nucleotide sequences deposited in GenBank of the US National Institutes of Health (NIH), the ssuD gene and flanking sequences (SEQ ID NO: 8) of Corynebacterium glutamicum were obtained.

[0134] Com o objetivo de deletar o gene ssuD, o PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo e iniciadores das SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12 acima. O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 53 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, fragmentos de DNA de 700 pb foram obtidos, respectivamente.[0134] In order to delete the ssuD gene, PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template and primers from SEQ ID NOs: 9, 10, 11 and 12 above. PCR was performed under the following conditions: denaturation at 95 °C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds and polymerization at 72°C for 30 seconds; and polymerization at 72 °C for 7 minutes. As a result, DNA fragments of 700 bp were obtained, respectively.

[0135] Um vetor pDZ incapaz de se replicar em Corynebacterium glutamicum e os fragmentos do gene ssuD amplificados foram tratados com a enzima de restrição SmaI para inserção cromossômica, seguido por clonagem de montagem isotérmica. Escherichia coli DH5α foi transformada com o vetor e plaqueada em meio LB sólido contendo 25 mg/l de canamicina. As colônias transformadas com o vetor no qual um fragmento com deleção do gene alvo foi inserido por PCR foram selecionadas e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo e denominado pDZ-ΔSsuD.[0135] A pDZ vector unable to replicate in Corynebacterium glutamicum and the amplified ssuD gene fragments were treated with the SmaI restriction enzyme for chromosomal insertion, followed by isothermal assembly cloning. Escherichia coli DH5α was transformed with the vector and plated on solid LB medium containing 25 mg/l kanamycin. Colonies transformed with the vector into which a fragment with deletion of the target gene was inserted by PCR were selected and then a plasmid was obtained by a plasmid extraction method and named pDZ-ΔSsuD.

EXEMPLO 4-2: PREPARAÇÃO E CULTURA DE CEPAS DELETADAS POR GENE SSUDEXAMPLE 4-2: PREPARATION AND CULTURE OF STRAINS DELETED BY THE SSUD GENE

[0136] A cepa 13032/ΔmcbR foi transformada com o vetor pDZ-ΔSsuD preparado no Exemplo 4-1 acima por eletroporação por recombinação cromossômica homóloga (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Posteriormente, a segunda recombinação foi realizada em meio sólido contendo sacarose. Após a conclusão da segunda recombinação, a cepa transformada de Corynebacterium glutamicum que tem deleção do gene ssuD foi identificada realizando-se PCR com o uso das SEQ ID NOs: 13 e 14, e a cepa recombinante foi denominada Corynebacterium glutamicum CM02-0618/ΔSsuD.[0136] Strain 13032/ΔmcbR was transformed with the pDZ-ΔSsuD vector prepared in Example 4-1 above by electroporation by homologous chromosomal recombination (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Subsequently, the second recombination was carried out in solid medium containing sucrose. After completion of the second recombination, the transformed strain of Corynebacterium glutamicum that has a deletion of the ssuD gene was identified by performing PCR using SEQ ID NOs: 13 and 14, and the recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum CM02-0618/ΔSsuD .

EXEMPLO 4-3: ANÁLISE DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE METIONINA DE CEPAS DELETADAS POR GENE SSUDEXAMPLE 4-3: ANALYSIS OF THE METHIONINE PRODUCTION CAPACITY OF STRAINS DELETED BY THE SSUD GENE

[0137] A fim de analisar a capacidade de produção de L-metionina da cepa CM02- 0618/ΔSsuD preparada, a cepa e a cepa parental, cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, foram cultivadas da seguinte maneira.[0137] In order to analyze the L-methionine production capacity of the prepared CM02-0618/ΔSsuD strain, the strain and the parental strain, strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, were cultivated in the following manner.

[0138] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum CM02-0618 preparado no Exemplo 2 e CM02-0618/ΔSsuD foram inoculados em um balão defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semente e cultivados sob agitação a 30 °C por 20 horas em 200 rpm. Em seguida, 1 ml de um caldo de cultura do mesmo foi inoculado em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado enquanto se agitava a 30 °C por 48 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes.[0138] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum CM02-0618 prepared in Example 2 and CM02-0618/ΔSsuD were inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 25 ml of a seed medium and cultivated under shaking at 30 ° C for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of a culture broth thereof was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 24 ml of a production medium and cultivated while shaking at 30 ° C for 48 hours at 200 rpm. The compositions of the seed medium and production medium are as follows.

<MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)><SEED MEDIUM (PH 7.0)>

[0139] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada).[0139] 20 g glucose, 10 g peptone, 5 g yeast extract, 1.5 g urea, 4 g KH2PO4, 8 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4-7H2O, 100 μg biotin , 1000 μg of thiamine HCl, 2000 μg of calcium pantothenate and 2000 μg of nicotinamide (based on 1 l of distilled water).

<MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)><PRODUCTION MEDIUM (pH 8.0)>

[0140] 50 g de glicose, 12 g de (NH4)2S2O3, 5 g de extrato de levedura, 1 g de KH2PO4, 1,2 g de MgSO4^7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCL de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida e 30 g de CaCO3 (com base em 1 l de água destilada).[0140] 50 g of glucose, 12 g of (NH4)2S2O3, 5 g of yeast extract, 1 g of KH2PO4, 1.2 g of MgSO4^7H2O, 100 μg of biotin, 1000 μg of thiamine HCL, 2000 μg of calcium pantothenate, 3000 μg of nicotinamide and 30 g of CaCO3 (based on 1 l of distilled water).

[0141] As cepas foram cultivadas de acordo com o método de cultura descrito acima e as concentrações de L-metionina contida no caldo de cultura, foram analisadas e mostradas na Tabela 3 abaixo.[0141] The strains were cultivated according to the culture method described above and the concentrations of L-methionine contained in the culture broth were analyzed and shown in Table 3 below.

TABELA 3TABLE 3

[0142] Confirmação da capacidade de produção de L-metionina da cepa deletada do gene ssuD [0142] Confirmation of the L-methionine production capacity of the ssuD gene deleted strain

[0143] Como resultado, foi confirmado que a capacidade de produção de L- metionina da cepa com deleção do gene ssuD foi reduzida em cerca de 50% em comparação com a cepa de controle. Com base no mesmo, foi confirmado que a proteína SsuD é uma proteína envolvida na utilização de tiossulfato.[0143] As a result, it was confirmed that the L-methionine production capacity of the strain with deletion of the ssuD gene was reduced by about 50% compared to the control strain. Based on the same, it was confirmed that the SsuD protein is a protein involved in thiosulfate utilization.

EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO E CULTURA DE CEPA AUMENTADA POR EXPRESSÃO DO GENE SSUDEXAMPLE 5: PREPARATION AND CULTURE OF STRAIN ENHANCED BY EXPRESSION OF THE SSUD GENE

[0144] Um vetor foi preparado para melhorar a atividade da proteína SsuD selecionada como uma proteína que reage especificamente com tiossulfato no Exemplo 3.[0144] A vector was prepared to improve the activity of the SsuD protein selected as a protein that specifically reacts with thiosulfate in Example 3.

EXEMPLO 5-1: PREPARAÇÃO DE VETOR PARA AUMENTAR A EXPRESSÃO DO GENE SSUDEXAMPLE 5-1: VECTOR PREPARATION TO INCREASE SSUD GENE EXPRESSION

[0145] A fim de inserir adicionalmente o gene ssuD no cromossomo de Corynebacterium ATCC 13032, um vetor de plasmídeo foi preparado de acordo com o seguinte método.[0145] In order to further insert the ssuD gene into the chromosome of Corynebacterium ATCC 13032, a plasmid vector was prepared according to the following method.

[0146] Primeiramente, um vetor para deletar Ncgl1464 (Transposase) foi preparado para inserir o gene ssuD.[0146] First, a vector to delete Ncgl1464 (Transposase) was prepared to insert the ssuD gene.

[0147] Com base nas sequências de nucleotídeos depositadas no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), gene Ncgl1464 e sequências de flanco (SEQ ID NO: 15) de Corynebacterium glutamicum foram obtidos. Para deletar o gene Ncgl1464, o PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo e iniciadores de SEQ ID NOs: 16, 17, 18 e 19 acima. O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 53 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, fragmentos de DNA foram obtidos, respectivamente.[0147] Based on the nucleotide sequences deposited in GenBank of the US National Institutes of Health (NIH), Ncgl1464 gene and flanking sequences (SEQ ID NO: 15) of Corynebacterium glutamicum were obtained. To delete the Ncgl1464 gene, PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template and primers from SEQ ID NOs: 16, 17, 18 and 19 above. PCR was performed under the following conditions: denaturation at 95 °C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds and polymerization at 72°C for 30 seconds; and polymerization at 72 °C for 7 minutes. As a result, DNA fragments were obtained, respectively.

[0148] Um vetor pDZ incapaz de se replicar em Corynebacterium glutamicum e os fragmentos do gene Ncgl1464 amplificados foram tratados com a enzima de restrição SmaI para inserção cromossômica, seguido por clonagem de montagem isotérmica. Escherichia coli DH5α foi transformada com o vetor e plaqueada em meio LB sólido contendo 25 mg/l de canamicina. As colônias transformadas com o vetor no qual um fragmento com deleção do gene alvo foi inserido por PCR foram selecionadas e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo e denominado pDZ-ΔNcgl1464.[0148] A pDZ vector unable to replicate in Corynebacterium glutamicum and the amplified Ncgl1464 gene fragments were treated with the SmaI restriction enzyme for chromosomal insertion, followed by isothermal assembly cloning. Escherichia coli DH5α was transformed with the vector and plated on solid LB medium containing 25 mg/l kanamycin. Colonies transformed with the vector into which a deletion fragment of the target gene was inserted by PCR were selected and then a plasmid was obtained by a plasmid extraction method and named pDZ-ΔNcgl1464.

[0149] Posteriormente, com o objetivo de obter fragmentos do gene ssuD, o PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo e SEQ ID NOs: 20 e 21. Adicionalmente, um promotor PgapA foi usado para melhorar a expressão do gene ssuD. Para obtê-los, o PCR foi realizado utilizando o DNA cromossômico do Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo utilizando iniciadores das SEQ ID NOs: 22 e 23. O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 53 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, fragmentos do gene ssuD e fragmentos do promotor gapA foram obtidos.[0149] Subsequently, with the aim of obtaining fragments of the ssuD gene, PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a model and SEQ ID NOs: 20 and 21. Additionally, a PgapA promoter was used to improve expression of the ssuD gene. To obtain them, the PCR was carried out using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template using primers from SEQ ID NOs: 22 and 23. The PCR was carried out under the following conditions: denaturation at 95 °C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds and polymerization at 72°C for 30 seconds; and polymerization at 72 °C for 7 minutes. As a result, fragments of the ssuD gene and fragments of the gapA promoter were obtained.

[0150] Um vetor pDZ-ΔNcgl1464 incapaz de se replicar em Corynebacterium glutamicum foi tratado com a enzima de restrição ScaI, seguido pela reação IST junto com os dois fragmentos de DNA amplificados. Escherichia coli DH5α foi transformada com o vetor e plaqueada em meio LB sólido contendo 25 mg/l de canamicina. As colônias transformadas com o vetor no qual o gene alvo foi inserido por PCR foram selecionadas e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo e denominado pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD.[0150] A pDZ-ΔNcgl1464 vector unable to replicate in Corynebacterium glutamicum was treated with the ScaI restriction enzyme, followed by the IST reaction together with the two amplified DNA fragments. Escherichia coli DH5α was transformed with the vector and plated on solid LB medium containing 25 mg/l kanamycin. Colonies transformed with the vector into which the target gene was inserted by PCR were selected, and then a plasmid was obtained by a plasmid extraction method and named pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD.

EXEMPLO 5-2: PREPARAÇÃO E CULTURA DE CEPA MELHORADA POR EXPRESSÃO DO GENE SSUDEXAMPLE 5-2: PREPARATION AND CULTURE OF IMPROVED STRAIN BY EXPRESSION OF THE SSUD GENE

[0151] A cepa CM02-0618 foi transformada com os vetores pDZ-ΔNcgl1464 e pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD preparados no Exemplo 5-1 acima por eletroporação por recombinação cromossômica homóloga (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Posteriormente, a segunda recombinação foi realizada em meio sólido contendo sacarose. Após a conclusão da segunda recombinação, a cepa de Corynebacterium glutamicum transformada que tem deleção do gene Ncgl1464 e a cepa de Corynebacterium glutamicum que tem tanto deleção do gene Ncgl1464 quanto inserção do gene ssuD, foram identificadas realizando-se PCR usando iniciadores das SEQ ID NOs: 24 e 25. A cepa com deleção do gene Ncgl1464 foi denominada CM02-0618/ΔNcgl1464, e a cepa que tem tanto deleção do gene Ncgl1464 quanto inserção do gene ssuD, foi denominada CM02-0736.[0151] Strain CM02-0618 was transformed with the vectors pDZ-ΔNcgl1464 and pDZ-ΔNcgl1464-PgapASsuD prepared in Example 5-1 above by electroporation for homologous chromosomal recombination (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541- 545, 1999). Subsequently, the second recombination was carried out in solid medium containing sucrose. After completion of the second recombination, the transformed Corynebacterium glutamicum strain that has a deletion of the Ncgl1464 gene and the Corynebacterium glutamicum strain that has both a deletion of the Ncgl1464 gene and an insertion of the ssuD gene were identified by performing PCR using primers from SEQ ID NOs : 24 and 25. The strain with deletion of the Ncgl1464 gene was named CM02-0618/ΔNcgl1464, and the strain that has both a deletion of the Ncgl1464 gene and an insertion of the ssuD gene was named CM02-0736.

[0152] A cepa CM02-0736 foi depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em quinta-feira, 2 de maio de 2019, com o n° de Acesso KCCM12512P.[0152] Strain CM02-0736 was deposited at the Korean Microorganism Culture Center under the Budapest Treaty on Thursday, May 2, 2019, with Accession No. KCCM12512P.

EXEMPLO 5-3: ANÁLISE DE CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE METIONINA DE CEPA MELHORADA POR EXPRESSÃO DO GENE SSUDEXAMPLE 5-3: ANALYSIS OF METHIONINE PRODUCTION CAPACITY OF A STRAIN IMPROVED BY EXPRESSION OF THE SSUD GENE

[0153] A fim de analisar a capacidade de produção de L-metionina das cepas preparadas CM02-0618/ΔNcgl1464 e CM02-0736, as cepas e a cepa parental, cepa CM02-0618, foram cultivadas da seguinte maneira.[0153] In order to analyze the L-methionine production capacity of the prepared strains CM02-0618/ΔNcgl1464 and CM02-0736, the strains and the parental strain, strain CM02-0618, were cultivated in the following way.

[0154] Cada um das cepas CM02-0618, CM02-0618/ΔNcgl1464 e CM02-0736 foi inoculada em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semente e cultivada durante a agitação a 30 °C por 20 horas a 200 rpm. Em seguida, 1 ml de um caldo de cultura do mesmo foi inoculado em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado enquanto se agitava a 30 °C por 48 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes.[0154] Each of strains CM02-0618, CM02-0618/ΔNcgl1464 and CM02-0736 was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 25 ml of a seed medium and grown while shaking at 30 ° C for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of a culture broth thereof was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 24 ml of a production medium and cultivated while shaking at 30 ° C for 48 hours at 200 rpm. The compositions of the seed medium and production medium are as follows.

<MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)><SEED MEDIUM (PH 7.0)>

[0155] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada).[0155] 20 g glucose, 10 g peptone, 5 g yeast extract, 1.5 g urea, 4 g KH2PO4, 8 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4-7H2O, 100 μg biotin , 1000 μg of thiamine HCl, 2000 μg of calcium pantothenate and 2000 μg of nicotinamide (based on 1 l of distilled water).

<MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)><PRODUCTION MEDIUM (pH 8.0)>

[0156] 50 g de glicose, 12 g de (NH4)2S2O3, 5 g de extrato de levedura, 1 g de KH2PO4, 1,2 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCL de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 e 1 μg de cianocobalamina (vitamina B12) (com base em 1 l de água destilada).[0156] 50 g of glucose, 12 g of (NH4)2S2O3, 5 g of yeast extract, 1 g of KH2PO4, 1.2 g of MgSO47H2O, 100 μg of biotin, 1000 μg of thiamine HCL, 2000 μg of calcium pantothenate, 3000 μg of nicotinamide, 30 g of CaCO3 and 1 μg of cyanocobalamin (vitamin B12) (based on 1 l of distilled water).

[0157] As cepas foram cultivadas de acordo com o método de cultura descrito acima e as concentrações de L-metionina contida no caldo de cultura, foram analisadas e mostradas na Tabela 4 abaixo.[0157] The strains were cultivated according to the culture method described above and the concentrations of L-methionine contained in the culture broth were analyzed and shown in Table 4 below.

TABELA 4TABLE 4

[0158] Confirmação da capacidade de produção de L-metionina da cepa melhorada por gene ssuD [0158] Confirmation of the L-methionine production capacity of the strain improved by the ssuD gene

[0159] Como resultado, foi confirmado que a capacidade de produção de L- metionina da cepa melhorada por gene ssuD, foi aumentada em cerca de 50% pelo aumento da expressão do gene ssuD em comparação à da cepa de controle. Além disso, foi confirmado que a proteína SsuD está envolvida na utilização de tiossulfato, conforme confirmado no Exemplo 4.[0159] As a result, it was confirmed that the L-methionine production capacity of the ssuD gene-enhanced strain was increased by about 50% by increasing the expression of the ssuD gene compared to that of the control strain. Furthermore, it was confirmed that the SsuD protein is involved in thiosulfate utilization, as confirmed in Example 4.

EXEMPLO 6: CULTURA COMPARATIVA ENTRE TIOSSULFATO E OUTRO SULFONATOEXAMPLE 6: COMPARATIVE CULTURE BETWEEN THIOSULPHATE AND OTHER SULFONATE

[0160] A proteína SsuD é conhecida como uma proteína envolvida na dessulfonação de sulfonato. Sulfonato, que tem uma estrutura de R-SO3, em que R é um grupo orgânico e é diferente de tiossulfato, que tem uma estrutura de S-SO3.[0160] The SsuD protein is known as a protein involved in sulfonate desulfonation. Sulfonate, which has an R-SO3 structure, where R is an organic group and is different from thiosulfate, which has an S-SO3 structure.

[0161] Assim, os efeitos de tiossulfato na produção de metionina foram identificados por meio de um experimento comparativo com o uso de sulfonato.[0161] Thus, the effects of thiosulfate on methionine production were identified through a comparative experiment with the use of sulfonate.

[0162] As cepas de Corynebacterium glutamicum CM02-0618 e CM02-0736 foram inoculadas em um frasco de canto defletor de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semente e cultivadas sob agitação a 30 °C por 20 horas a 200 rpm. Em seguida, 1 ml de um caldo de cultura do mesmo foi inoculado em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado enquanto se agitava a 30 °C por 48 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes.[0162] Corynebacterium glutamicum strains CM02-0618 and CM02-0736 were inoculated into a 250 ml baffled corner flask containing 25 ml of a seed medium and cultivated under shaking at 30 ° C for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of a culture broth thereof was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 24 ml of a production medium and cultivated while shaking at 30 ° C for 48 hours at 200 rpm. The compositions of the seed medium and production medium are as follows.

<MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)><SEED MEDIUM (PH 7.0)>

[0163] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada).[0163] 20 g of glucose, 10 g of peptone, 5 g of yeast extract, 1.5 g of urea, 4 g of KH2PO4, 8 g of K2HPO4, 0.5 g of MgSO4-7H2O, 100 μg of biotin , 1000 μg of thiamine HCl, 2000 μg of calcium pantothenate and 2000 μg of nicotinamide (based on 1 l of distilled water).

<MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)><PRODUCTION MEDIUM (pH 8.0)>

[0164] 50 g de glicose, 12 g de (NH4)2S2O3, metanossulfonato ou etanossulfonato (dependendo da fonte de enxofre), 5 g de extrato de levedura, 1 g de KH2PO4, 1,2 g de MgSO47H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCL de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 e 1 μg de cianocobalamina (vitamina B12) (com base em 1 l de água destilada).[0164] 50 g of glucose, 12 g of (NH4)2S2O3, methanesulfonate or ethanesulfonate (depending on the sulfur source), 5 g of yeast extract, 1 g of KH2PO4, 1.2 g of MgSO47H2O, 100 μg of biotin , 1000 μg of thiamine HCL, 2000 μg of calcium pantothenate, 3000 μg of nicotinamide, 30 g of CaCO3 and 1 μg of cyanocobalamin (vitamin B12) (based on 1 l of distilled water).

[0165] As cepas foram cultivadas de acordo com o método de cultura descrito acima e as concentrações de L-metionina contida no caldo de cultura, foram analisadas e mostradas na Tabela 5 abaixo.[0165] The strains were cultivated according to the culture method described above and the concentrations of L-methionine contained in the culture broth were analyzed and shown in Table 5 below.

TABELA 5TABLE 5

[0166] Comparação da capacidade de produção de metionina entre tiossulfato e vários sulfonatos como fontes de enxofre [0166] Comparison of methionine production capacity between thiosulfate and various sulfonates as sulfur sources

[0167] Como resultado, no caso em que o tiossulfato foi usado como fonte de enxofre em cada cepa, a produção de metionina aumentou em até 600% em comparação ao caso do uso de sulfonato como fonte de enxofre.[0167] As a result, in the case where thiosulfate was used as a sulfur source in each strain, methionine production increased by up to 600% compared to the case of using sulfonate as a sulfur source.

[0168] Com base no mesmo, foi confirmado que a produção de metionina foi maior quando tiossulfato foi usada como fonte de enxofre, e também foi confirmado que o melhoramento da atividade da proteína SsuD está envolvido em tal aumento na produção de metionina.[0168] Based on the same, it was confirmed that methionine production was higher when thiosulfate was used as a sulfur source, and it was also confirmed that improving the activity of the SsuD protein is involved in such an increase in methionine production.

EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE METIONINA QUE TEM A EXPRESSÃO MELHORADA DE GENES METH E CYSI SEM DELETAR O GENE MCBREXAMPLE 7: PREPARATION OF METHIONINE PRODUCING STRAIN THAT HAS IMPROVED EXPRESSION OF METH AND CYSI GENES WITHOUT DELETING THE MCBR GENE EXEMPLO 7-1: PREPARAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PARA MELHORAR TANTO O GENE METH QUANTO O CYSIEXAMPLE 7-1: PREPARATION OF RECOMBINANT VECTOR TO IMPROVE BOTH METH GENE AND CYSI

[0169] A fim de identificar a possibilidade de vários aminoácidos, que contém enxofre, poder ser produzidos melhorando-se a atividade da proteína SsuD da presente revelação e usando-se tiossulfato como uma fonte de enxofre, o experimento descrito acima foi aplicado a outra cepa produtora de metionina. Primeiramente, a fim de preparar uma cepa produtora de metionina sem deletar mcbR, um vetor para potencializar tanto o gene metH (Ncgl1450), que codifica uma metionina sintase, quanto o gene cysI (Ncgl2718), que codifica uma sulfito redutase na cepa ATCC 13032, foi preparado.[0169] In order to identify the possibility that various sulfur-containing amino acids can be produced by improving the activity of the SsuD protein of the present disclosure and using thiosulfate as a source of sulfur, the experiment described above was applied to another methionine-producing strain. First, in order to prepare a methionine-producing strain without deleting mcbR, a vector to enhance both the metH gene (Ncgl1450), which encodes a methionine synthase, and the cysI gene (Ncgl2718), which encodes a sulfite reductase in strain ATCC 13032 , was prepared.

[0170] Especificamente, um vetor de plasmídeo recombinante foi preparado para inserir adicionalmente os genes metH e cysI no cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, de acordo com o seguinte método. Com base nas sequências de nucleotídeos depositadas no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), o gene metH e as sequências de flanco (SEQ ID NO: 26) e o gene cysI e as sequências flanqueadoras (SEQ ID NO: 27) de Corynebacterium glutamicum foram obtidos.[0170] Specifically, a recombinant plasmid vector was prepared to additionally insert the metH and cysI genes into the chromosome of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, according to the following method. Based on nucleotide sequences deposited in the US National Institutes of Health (NIH) GenBank, the metH gene and flanking sequences (SEQ ID NO: 26) and the cysI gene and flanking sequences (SEQ ID NO: 27) of Corynebacterium glutamicum were obtained.

[0171] Primeiramente, um vetor para deletar Ncgl1201 (Transposase) foi preparado para inserir esses genes. Com base nas sequências de nucleotídeos depositadas no GenBank dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), gene Ncgl1021 e sequências de flanco (SEQ ID NO: 28) de Corynebacterium glutamicum foram obtidos. Para deletar o gene Ncgl1021, o PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo e iniciadores de SEQ ID NOs: 29, 30, 31 e 32 acima. O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 53 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, fragmentos de DNA foram obtidos. Um vetor pDZ incapaz de se replicar em Corynebacterium glutamicum e os fragmentos do gene Ncgl1021 amplificados foram tratados com a enzima de restrição Xbal para inserção cromossômica, seguido por clonagem de montagem isotérmica. Escherichia coli DH5α foi transformada com o vetor e plaqueada em meio LB sólido contendo 25 mg/l de canamicina. As colônias transformadas com o vetor no qual um fragmento com deleção do gene alvo foi inserido por PCR foram selecionadas e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo e denominado pDZ-ΔNcgl1021.[0171] First, a vector to delete Ncgl1201 (Transposase) was prepared to insert these genes. Based on the nucleotide sequences deposited in GenBank of the US National Institutes of Health (NIH), Ncgl1021 gene and flanking sequences (SEQ ID NO: 28) of Corynebacterium glutamicum were obtained. To delete the Ncgl1021 gene, PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template and primers from SEQ ID NOs: 29, 30, 31 and 32 above. PCR was performed under the following conditions: denaturation at 95 °C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds and polymerization at 72°C for 30 seconds; and polymerization at 72 °C for 7 minutes. As a result, DNA fragments were obtained. A pDZ vector unable to replicate in Corynebacterium glutamicum and the amplified Ncgl1021 gene fragments were treated with the XbaI restriction enzyme for chromosomal insertion, followed by isothermal assembly cloning. Escherichia coli DH5α was transformed with the vector and plated on solid LB medium containing 25 mg/l kanamycin. Colonies transformed with the vector into which a deletion fragment of the target gene was inserted by PCR were selected and then a plasmid was obtained by a plasmid extraction method and named pDZ-ΔNcgl1021.

[0172] Posteriormente, com o objetivo de obter os genes metH e cysI, o PCR foi realizado utilizando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como modelo e iniciadores das SEQ ID NOs: 33, 34, 35 e 36 acima. Adicionalmente, um promotor Pcj7 foi usado para melhorar a expressão do gene metH e um promotor Pspl1 foi usado para melhorar a expressão do gene cysl. Para obtê- los, o PCR foi realizado utilizando o DNA cromossômico do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 como modelo e usando iniciadores das SEQ ID NOs: 37 e 38 para o promotor Pcj7 e PCR foi realizado usando DNA do vetor spl1-GFP conhecido (US 10584338 B2) como um modelo e usando iniciadores das SEQ ID NOs: 39 e 40 para o promotor Psp L1. O PCR foi realizado nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C durante 5 minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, anelamento a 53 °C durante 30 segundos e polimerização a 72 °C durante 30 segundos; e polimerização a 72 °C durante 7 minutos. Como resultado, fragmentos de DNA dos genes metH e cysI, promotor Pcj7 (US 7662943 B2) e promotor Pspl1 (US 10584338 B2) foram obtidos.[0172] Subsequently, with the aim of obtaining the metH and cysI genes, the PCR was carried out using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 as a template and primers from SEQ ID NOs: 33, 34, 35 and 36 above. Additionally, a Pcj7 promoter was used to improve metH gene expression and a Pspl1 promoter was used to improve cysl gene expression. To obtain them, PCR was performed using the chromosomal DNA of Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 as a template and using primers from SEQ ID NOs: 37 and 38 for the Pcj7 promoter and PCR was performed using DNA from the known spl1-GFP vector (US 10584338 B2) as a template and using primers from SEQ ID NOs: 39 and 40 for the Psp L1 promoter. PCR was performed under the following conditions: denaturation at 95 °C for 5 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 53°C for 30 seconds and polymerization at 72°C for 30 seconds; and polymerization at 72 °C for 7 minutes. As a result, DNA fragments of the metH and cysI genes, Pcj7 promoter (US 7662943 B2) and Pspl1 promoter (US 10584338 B2) were obtained.

[0173] Um vetor pDZ-ΔNcgl1021 incapaz de se replicar em Corynebacterium glutamicum foi tratado com a enzima de restrição ScaI e os quatro fragmentos de DNA amplificados foram tratados com a enzima de restrição Scal, seguida pela reação IST. Escherichia coli DH5α foi transformada com o vetor e plaqueada em meio LB sólido contendo 25 mg/l de canamicina. As colônias transformadas com o vetor no qual o gene alvo foi inserido por PCR foram selecionadas e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo e denominado pDZ-ΔNcgl1021- Pcj7metH-Pspl1cysI.[0173] A pDZ-ΔNcgl1021 vector unable to replicate in Corynebacterium glutamicum was treated with the ScaI restriction enzyme and the four amplified DNA fragments were treated with the Scal restriction enzyme, followed by the IST reaction. Escherichia coli DH5α was transformed with the vector and plated on solid LB medium containing 25 mg/l kanamycin. Colonies transformed with the vector into which the target gene was inserted by PCR were selected, and then a plasmid was obtained by a plasmid extraction method and named pDZ-ΔNcgl1021- Pcj7metH-Pspl1cysI.

EXEMPLO 7-2: DESENVOLVIMENTO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L- METIONINA E IDENTIFICAÇÃO DE PRODUÇÃO DE L-METIONINA COM O USO DA MESMAEXAMPLE 7-2: DEVELOPMENT OF L-METHIONINE PRODUCTION STRAIN AND IDENTIFICATION OF L-METHIONINE PRODUCTION WITH THE USE OF THE SAME

[0174] A cepa ATCC 13032 foi transformada com os vetores pDZ-ΔNcgl1021 e pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI preparados no Exemplo 7-1 acima por eletroporação por recombinação cromossômica homóloga (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Posteriormente, a segunda recombinação foi realizada em meio sólido contendo sacarose. Após a conclusão da segunda recombinação, a inserção do gene Pcj7-metH-Pspl1cysI na cepa transformada de Corynebacterium glutamicum foi identificada usando as SEQ ID NOs: 41 e 42. As cepas recombinantes foram denominadas Corynebacterium glutamicum 13032/ΔNcgl1021 (cepa transformada com pDZ-ΔNcgl1021) e CM02-0753 (transformada com pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysIn).[0174] Strain ATCC 13032 was transformed with the vectors pDZ-ΔNcgl1021 and pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI prepared in Example 7-1 above by electroporation for homologous chromosomal recombination (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541 -545, 1999). Subsequently, the second recombination was carried out in solid medium containing sucrose. After completion of the second recombination, the insertion of the Pcj7-metH-Pspl1cysI gene in the transformed strain of Corynebacterium glutamicum was identified using SEQ ID NOs: 41 and 42. The recombinant strains were named Corynebacterium glutamicum 13032/ΔNcgl1021 (strain transformed with pDZ- ΔNcgl1021) and CM02-0753 (transformed with pDZ-ΔNcgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysIn).

[0175] Para analisar a capacidade de produção de L-metionina das cepas 13032/ΔNcgl1021 e CM02-0753 preparadas, as cepas e a cepa parental, cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, foram cultivadas da seguinte maneira.[0175] To analyze the L-methionine production capacity of the prepared strains 13032/ΔNcgl1021 and CM02-0753, the strains and the parental strain, strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, were cultivated as follows.

[0176] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e cepas da presente revelação, isto é, Corynebacterium glutamicum 13032/ΔNcgl1021 e CM02-0753 foram inoculados em um balão defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semente e cultivados enquanto agitados a 30 °C por 20 horas a 200 rpm. Em seguida, 1 ml de um caldo de cultura do mesmo foi inoculado em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado enquanto se agitava a 30 °C por 48 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes.[0176] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and strains of the present disclosure, i.e., Corynebacterium glutamicum 13032/ΔNcgl1021 and CM02-0753 were inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 25 ml of a seed medium and grown while shaking at 30 °C for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of a culture broth thereof was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 24 ml of a production medium and cultivated while shaking at 30 ° C for 48 hours at 200 rpm. The compositions of the seed medium and production medium are as follows.

<MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)><SEED MEDIUM (PH 7.0)>

[0177] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada).[0177] 20 g glucose, 10 g peptone, 5 g yeast extract, 1.5 g urea, 4 g KH2PO4, 8 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4-7H2O, 100 μg biotin , 1000 μg of thiamine HCl, 2000 μg of calcium pantothenate and 2000 μg of nicotinamide (based on 1 l of distilled water).

<MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)><PRODUCTION MEDIUM (pH 8.0)>

[0178] 50 g de glicose, 12 g de (NH4)2S2O3, 5 g de extrato de levedura, 1 g de KH2PO4, 1,2 g de MgSO4^7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCL de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 e 1 μg de cianocobalamina (vitamina B12) (com base em 1 l de água destilada).[0178] 50 g of glucose, 12 g of (NH4)2S2O3, 5 g of yeast extract, 1 g of KH2PO4, 1.2 g of MgSO4^7H2O, 100 μg of biotin, 1000 μg of thiamine HCL, 2000 μg of calcium pantothenate, 3000 μg of nicotinamide, 30 g of CaCO3 and 1 μg of cyanocobalamin (vitamin B12) (based on 1 l of distilled water).

[0179] As cepas foram cultivadas de acordo com o método de cultura descrito acima e as concentrações de L-metionina contida no caldo de cultura, foram analisadas e mostradas na Tabela 6 abaixo.[0179] The strains were cultivated according to the culture method described above and the concentrations of L-methionine contained in the culture broth were analyzed and shown in Table 6 below.

TABELA 6TABLE 6

[0180] Confirmação da capacidade de produção de L-metionina da cepa que contém o gene mcbR [0180] Confirmation of the L-methionine production capacity of the strain containing the mcbR gene

[0181] Como resultado, foi confirmado que a capacidade de produção de L- metionina da cepa em que o gene mcbR estava presente e os genes metH e cysI foram superexpressos foi melhorada em comparação à da cepa de controle. Com base no mesmo, foi confirmado que a cepa na qual os genes metH e cysI foram superexpressos sem deletar o gene mcbR teve a capacidade de produção de metionina, e a cepa foi usada no seguinte experimento.[0181] As a result, it was confirmed that the L-methionine production capacity of the strain in which the mcbR gene was present and the metH and cysI genes were overexpressed was improved compared to that of the control strain. Based on the same, it was confirmed that the strain in which the metH and cysI genes were overexpressed without deleting the mcbR gene had the ability to produce methionine, and the strain was used in the following experiment.

EXEMPLO 8: DESENVOLVIMENTO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L- METIONINA QUE TEM ATIVIDADE DE SSUD MELHORADA E QUE INCLUI MCBR E IDENTIFICAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE L-METIONINAEXAMPLE 8: DEVELOPMENT OF L-METHIONINE PRODUCTION STRAIN THAT HAS IMPROVED SSUD ACTIVITY AND INCLUDES MCBR AND IDENTIFICATION OF L-METHIONINE PRODUCTION CAPACITY

[0182] Uma cepa que tem atividade melhorada da proteína SsuD foi preparada com o uso da cepa produtora de metionina preparada no Exemplo 7, e, em seguida, a capacidade de produção de L-metionina da mesma foi identificada.[0182] A strain that has improved activity of the SsuD protein was prepared using the methionine-producing strain prepared in Example 7, and then its L-methionine production capacity was identified.

EXEMPLO 8-1: PREPARAÇÃO DA CEPA QUE TEM ATIVIDADE DE SSUD MELHORADAEXAMPLE 8-1: PREPARATION OF THE STRAIN THAT HAS IMPROVED SSUD ACTIVITY

[0183] Especificamente, a cepa CM02-0753 do Exemplo 7 foi transformada com o vetor pDZ-ΔNcgl464-PgapASsuD preparado no Exemplo 5 por eletroporação por recombinação cromossômica homóloga (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Posteriormente, a segunda recombinação foi realizada em meio sólido contendo sacarose.[0183] Specifically, strain CM02-0753 from Example 7 was transformed with the pDZ-ΔNcgl464-PgapASsuD vector prepared in Example 5 by electroporation by homologous chromosomal recombination (Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). Subsequently, the second recombination was carried out in solid medium containing sucrose.

[0184] Após a conclusão da segunda recombinação, a inserção do gene PgapA- SsuD no sítio Ncgl1464 do Corynebacterium glutamicum transformado, foi identificada usando as SEQ ID NOs: 23 e 24. A cepa recombinante preparada foi denominada Corynebacterium glutamicum CM02-0756.[0184] After completion of the second recombination, the insertion of the PgapA-SsuD gene in the Ncgl1464 site of the transformed Corynebacterium glutamicum was identified using SEQ ID NOs: 23 and 24. The prepared recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum CM02-0756.

[0185] A CM02-0756 foi depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em quinta-feira, 2 de maio de 2019, com o n° de Acesso KCCM12513P.[0185] CM02-0756 was deposited with the Korean Microorganism Culture Center under the Budapest Treaty on Thursday, May 2, 2019, with Accession No. KCCM12513P.

EXEMPLO 8-2: IDENTIFICAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE METIONINA DA CEPA PREPARADAEXAMPLE 8-2: IDENTIFICATION OF METHIONINE PRODUCTION CAPACITY OF THE PREPARED STRAIN

[0186] A fim de analisar a capacidade de produção de L-metionina da cepa CM02-0753 preparada do Exemplo 7 e da cepa CM02-0756 preparada no Exemplo 8-1, as cepas foram cultivadas da seguinte maneira.[0186] In order to analyze the L-methionine production capacity of strain CM02-0753 prepared from Example 7 and strain CM02-0756 prepared in Example 8-1, the strains were cultivated in the following way.

[0187] As cepas de Corynebacterium glutamicum CM02-0753 e CM02-0756 foram inoculadas em um frasco de canto defletor de 250 ml contendo 25 ml de um meio de semente e cultivadas sob agitação a 30 °C por 20 horas a 200 rpm. Em seguida, 1 ml de um caldo de cultura do mesmo foi inoculado em um frasco defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivado enquanto se agitava a 30 °C por 48 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção são as seguintes.[0187] Corynebacterium glutamicum strains CM02-0753 and CM02-0756 were inoculated into a 250 ml baffled corner flask containing 25 ml of a seed medium and cultivated under shaking at 30 ° C for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of a culture broth thereof was inoculated into a 250 ml corner baffle flask containing 24 ml of a production medium and cultivated while shaking at 30 ° C for 48 hours at 200 rpm. The compositions of the seed medium and production medium are as follows.

<MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)><SEED MEDIUM (PH 7.0)>

[0188] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCl de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio e 2000 μg de nicotinamida (com base em 1 l de água destilada).[0188] 20 g of glucose, 10 g of peptone, 5 g of yeast extract, 1.5 g of urea, 4 g of KH2PO4, 8 g of K2HPO4, 0.5 g of MgSO4-7H2O, 100 μg of biotin , 1000 μg of thiamine HCl, 2000 μg of calcium pantothenate and 2000 μg of nicotinamide (based on 1 l of distilled water).

<MEIO DE PRODUÇÃO (pH 8,0)><PRODUCTION MEDIUM (pH 8.0)>

[0189] 50 g de glicose, 12 g de (NH4)2S2O3, 5 g de extrato de levedura, 1 g de KH2PO4, 1,2 g de MgSO4^7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de HCL de tiamina, 2000 μg de pantotenato de cálcio, 3000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 e 1 μg de cianocobalamina (vitamina B12) (com base em 1 l de água destilada).[0189] 50 g of glucose, 12 g of (NH4)2S2O3, 5 g of yeast extract, 1 g of KH2PO4, 1.2 g of MgSO4^7H2O, 100 μg of biotin, 1000 μg of thiamine HCL, 2000 μg of calcium pantothenate, 3000 μg of nicotinamide, 30 g of CaCO3 and 1 μg of cyanocobalamin (vitamin B12) (based on 1 l of distilled water).

[0190] As cepas foram cultivadas de acordo com o método de cultura descrito acima e as concentrações de L-metionina contida no caldo de cultura, foram analisadas e mostradas na Tabela 7 abaixo.[0190] The strains were cultivated according to the culture method described above and the concentrations of L-methionine contained in the culture broth were analyzed and shown in Table 7 below.

TABELA 7TABLE 7

[0191] Confirmação da capacidade de produção de L-metionina da cepa que contém o gene mcbR quando o gene ssuD é superexpresso [0191] Confirmation of the L-methionine production capacity of the strain containing the mcbR gene when the ssuD gene is overexpressed

[0192] Como resultado, foi confirmado que o rendimento de L-metionina foi aumentado na cepa produtora de metionina que inclui mcbR melhorando-se atividade da proteína SsuD e usando-se tiossulfato como fonte de enxofre.[0192] As a result, it was confirmed that the yield of L-methionine was increased in the methionine-producing strain that includes mcbR by improving the activity of the SsuD protein and using thiosulfate as a sulfur source.

[0193] Estes resultados indicam que os aminoácidos que contém enxofre ou derivados dos aminoácidos que contêm enxofre, podem ser produzidos com o uso de tiossulfato como uma fonte de enxofre, melhorando-se a atividade da proteína SsuD que é recentemente confirmada na presente revelação como uma proteína envolvida na utilização de tiossulfato.[0193] These results indicate that sulfur-containing amino acids or derivatives of sulfur-containing amino acids can be produced using thiosulfate as a source of sulfur, improving the activity of the SsuD protein, which is recently confirmed in the present disclosure as a protein involved in the utilization of thiosulfate.

[0194] Anteriormente, é fornecida a descrição da presente revelação para fins ilustrativos, e deve-se entender que as pessoas versadas na técnica podem realizar mudanças e modificações sem que haja mudança no conceito da técnica e nas características essenciais da presente revelação. Assim, é claro que as modalidades descritas anteriormente são ilustrativas em todos os aspectos e não limitam a presente revelação. Portanto, o escopo da revelação é definido, não apenas pela descrição detalhada, mas pelas reivindicações e seus equivalentes, e toda as variações dentro do escopo das reivindicações e seus equivalentes são para serem construídas como sendo incluídas na revelação.[0194] Previously, the description of the present disclosure is provided for illustrative purposes, and it should be understood that persons skilled in the art can make changes and modifications without changing the concept of the technique and the essential characteristics of the present disclosure. Thus, it is clear that the above-described embodiments are illustrative in all respects and do not limit the present disclosure. Therefore, the scope of the disclosure is defined, not only by the detailed description, but by the claims and their equivalents, and all variations within the scope of the claims and their equivalents are to be construed as being included in the disclosure.

Claims (7)

1. Método de produção de um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre, sendo que o método é caracterizado por compreender cultivar um micro-organismo, no qual a atividade de uma proteína codificada pelo gene ssuD é melhorada comparada à atividade intrínseca, em um meio de cultura que inclui tiossulfato, em que o micro-organismo utiliza tiossulfato como uma fonte de enxofre, em que o micro-organismo é um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Escherichia sp, em que a proteína codificada pelo gene ssuD tem atividade de tiossulfato reductase, em que a proteína codificada pelo gene ssuD inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, em que o gene ssuD inclui uma sequência de nucleotídeos da posição 1001 a 2140 da SEQ ID NO:8, em que a atividade da proteína é melhorada por: (1) aumentar um número de cópias do gene ssuD; (2) substituir uma região regulatória de expressão gênica no cromossomo que codifica o polipeptídeo ou proteína com uma sequência com atividade mais forte; (3) modificar uma sequência de base que codifica um códon de iniciação ou uma região 5'-UTR do polipeptídeo ou proteína; (4) modificar uma sequência de nucleotídeos no cromossomo para aumentar a atividade do polipeptídeo ou proteína; (5) introduzir um gene ssuD estranho ou um polinucleotídeo variante com otimização de códon do gene ssuD; ou (6) uma combinação dos mesmos.1. Method of producing a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid, the method being characterized by cultivating a microorganism, in which the activity of a protein encoded by the ssuD gene is improved compared to the activity intrinsic, in a culture medium that includes thiosulfate, in which the microorganism uses thiosulfate as a source of sulfur, in which the microorganism is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or the genus Escherichia sp, in which the protein encoded by the ssuD gene has thiosulfate reductase activity, wherein the protein encoded by the ssuD gene includes an amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, wherein the ssuD gene includes a nucleotide sequence of position 1001 to 2140 of SEQ ID NO: 8, in which protein activity is improved by: (1) increasing copy number of the ssuD gene; (2) replacing a gene expression regulatory region on the chromosome encoding the polypeptide or protein with a sequence with stronger activity; (3) modifying a base sequence encoding an initiation codon or a 5'-UTR region of the polypeptide or protein; (4) modifying a nucleotide sequence in the chromosome to increase the activity of the polypeptide or protein; (5) introduce a foreign ssuD gene or a codon-optimized variant polynucleotide of the ssuD gene; or (6) a combination thereof. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo ser Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium deserti, Corynebacterium crenatum ou Escherichia coli.2. Method according to claim 1, characterized in that the microorganism is Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium deserti, Corynebacterium crenatum or Escherichia coli. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender recuperar o aminoácido que contém enxofre ou o derivado do aminoácido que contém enxofre do micro-organismo ou do meio de cultura.3. Method according to claim 1, characterized in that it comprises recovering the sulfur-containing amino acid or the sulfur-containing amino acid derivative from the microorganism or the culture medium. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a melhoria da atividade da proteína codificada pelo gene ssuD ser alcançada aumentando-se um número de cópias de um polinucleotídeo que codifica a proteína, melhorando-se a atividade promotora, modificando-se um códon de iniciação ou uma combinação dos mesmos.4. Method, according to claim 1, characterized in that improving the activity of the protein encoded by the ssuD gene is achieved by increasing a number of copies of a polynucleotide encoding the protein, improving the promoter activity, modifying an initiation codon or a combination thereof. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o aminoácido que contém enxofre ou o derivado do aminoácido que contém enxofre compreender pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em metionina, cisteína, cistina, lantionina, homocisteína, homocistina, homolantionina e taurina.5. Method according to claim 1, characterized in that the sulfur-containing amino acid or the sulfur-containing amino acid derivative comprises at least one selected from the group consisting of methionine, cysteine, cystine, lanthionine, homocysteine, homocystine, homolanthionine and taurine. 6. Micro-organismo caracterizado por produzir um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre com uso de tiossulfato como uma fonte de enxofre e que inclui uma atividade melhorada de uma proteína codificada pelo gene ssuD em comparação à atividade intrínseca, em que a proteína codificada pelo gene ssuD tem atividade de tiossulfato reductase, em que o micro-organismo é um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Escherichia sp, em que a proteína codificada pelo gene ssuD inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, em que o gene ssuD inclui uma sequência de nucleotídeos da posição 1001 a 2140 da SEQ ID NO:8, em que a atividade da proteína é melhorada por: (1) aumentar um número de cópias do gene ssuD; (2) substituir uma região regulatória de expressão gênica no cromossomo que codifica o polipeptídeo ou proteína com uma sequência com atividade mais forte; (3) modificar uma sequência de base que codifica um códon de iniciação ou uma região 5'-UTR do polipeptídeo ou proteína; (4) modificar uma sequência de nucleotídeos no cromossomo para aumentar a atividade do polipeptídeo ou proteína; (5) introduzir um gene ssuD estranho ou um polinucleotídeo variante com otimização de códon do gene ssuD; ou (6) uma combinação dos mesmos.6. Microorganism characterized by producing a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid using thiosulfate as a source of sulfur and which includes an enhanced activity of a protein encoded by the ssuD gene compared to the intrinsic activity, in that the protein encoded by the ssuD gene has thiosulfate reductase activity, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or the genus Escherichia sp, wherein the protein encoded by the ssuD gene includes an amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, wherein the ssuD gene includes a nucleotide sequence from position 1001 to 2140 of SEQ ID NO: 8, wherein the activity of the protein is improved by: (1) increasing a number of copies of the ssuD gene; (2) replacing a gene expression regulatory region on the chromosome encoding the polypeptide or protein with a sequence with stronger activity; (3) modifying a base sequence encoding an initiation codon or a 5'-UTR region of the polypeptide or protein; (4) modifying a nucleotide sequence in the chromosome to increase the activity of the polypeptide or protein; (5) introduce a foreign ssuD gene or a codon-optimized variant polynucleotide of the ssuD gene; or (6) a combination thereof. 7. Composição para produzir um aminoácido que contém enxofre ou um derivado do aminoácido que contém enxofre, em que a composição é caracterizada por compreender: o microorganismo, conforme definido na reivindicação 6, ou uma cultura do mesmo, e tiossulfato.7. Composition for producing a sulfur-containing amino acid or a derivative of the sulfur-containing amino acid, wherein the composition is characterized by comprising: the microorganism, as defined in claim 6, or a culture thereof, and thiosulfate.