BR112021015009A2 - Métodos e composições para o tratamento da gastrite mastocística, esofagite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística - Google Patents

Métodos e composições para o tratamento da gastrite mastocística, esofagite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística Download PDF

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Abstract

métodos e composições para o tratamento da gastrite mastocística, esofagite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística. a presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística. em particular, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística através da administração de anticorpos que se ligam à siglec-8 humana ou composições que compreendem os ditos anticorpos. a presente invenção também fornece artigos de fabricação ou kits que compreendem anticorpos que se ligam à siglec-8 humana para o tratamento de gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO-
DOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DA GASTRITE MASTOCÍSTICA, ESOFAGITE MASTOCÍSTICA, ENTERITE MAS- TOCÍSTICA, DUODENITE MASTOCÍSTICA E/OU GASTROENTERI- TE MASTOCÍSTICA”". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica prioridade aos Pedidos Provi- sórios Norte-Americanos Nº de Série 62/806.604, depositado em 15 de fevereiro de 2019 e 62/925.704, depositado em 24 de outubro de 2019, as descrições de cada um dos quais são incorporadas ao pre- sente documento a título de referência na íntegra.
ENVIO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0002] O conteúdo do arquivo de texto ASCII enviado a seguir é incorporado ao presente documento a título de referência na íntegra: uma forma legível em computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 701712001040SEQLIST.TXT, data de registro: 13 de fevereiro de 2020, tamanho: 106 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se a métodos para tratar gastri- te mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística através da administração de anticorpos que se ligam à Siglec-8 huma- na e composições que compreendem os ditos anticorpos.
ANTECEDENTES
[0004] A Siglec-8, um membro da família relacionada à CD33 de lectinas similares a imunoglobulinas de ligação ao ácido siálico (Si- glecs), é uma proteína na superfície celular transmembrana com distri- buição tecidual restrita, expressa seletivamente na superfície de eosi- nófilos, mastócitos e, em níveis mais baixos, em basófilos. A Siglec-8 contém 3 domínios extracelulares similares a imunoglobulinas, uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática que contém 2 mo- tivos de sinalização com base em tirosina, incluindo um motivo inibidor com base em tirosina imunorreceptor com função inibidora. O envolvi- mento da Siglec-8 nos mastócitos pode resultar em inibição da libera- ção do mediador e, em eosinófilos, pode induzir à apoptose (Bochner, B. (2009) Clin. Exp. Allergy 39: 317-324).
[0005] Não há tratamentos aprovados pela FDA para gastrite e/ou gastroenterite com aumento de mastócitos. As terapias atuais e o ma- nejo da doença para estes pacientes incluem uma infinidade de diver- sas abordagens, incluindo inibidores da bomba de prótons, anti- histamínicos, dietas restritas/elementares, estabilizantes de mastóci- tos, corticosteroides sistêmicos ou orais e uso ocasional de produtos biológicos imunomoduladores. Como tal, continua a ser necessário um tratamento eficaz para estes e transtornos relacionados.
[0006] Todas as referências citadas no presente documento, inclu- indo pedidos de patentes, publicações de patentes e literatura científi- ca, são incorporadas a título de referência na íntegra, como se cada referência individual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada a título de referência.
BREVE SUMÁRIO
[0007] Para atender a esta e outras necessidades, a presente in- venção refere-se, inter alia, a métodos de tratamento ou prevenção de gastrite mastocística, esofagite mastocística, enterite mastocística, co- lite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocís- tica através da administração de anticorpos que se ligam à Siglec-8 humana e/ou composições que compreendem os ditos anticorpos. Es- tes métodos permitem o tratamento de indivíduos com um ou mais sin- tomas de esofagite, gastrite, enterite, duodenite e/ou gastroenterite que têm mastócitos teciduais elevados (por exemplo e não atendem aos critérios clínicos para esofagite, gastrite, colite, duodenite, enterite e/ou gastroenterite eosinofílica).
[0008] Consequentemente, determinados aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar ou prevenir um ou mais sin- tomas de gastrite, enterite, duodenite ou gastroenterite em um indiví- duo que compreendem: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compre- ende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar ou prevenir gastri- te mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística ou gas- troenterite mastocística em um indivíduo que compreendem: (a) detec- tar o número de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; (b) de- tectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade efi- caz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar um indivíduo com um ou mais sintomas de gastri- te, enterite, duodenite ou gastroenterite que compreendem: (a) detec-
tar o número de mastócitos de uma primeira amostra obtida de gástri- co, duodenal, jejunal, mucosa ileal ou cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos compa- rado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 hu- mana.
[0009] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de gastrite, enterite, duodenite ou gastroenterite em um indivíduo que compreendem admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma parte da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de eosinófilos. Outros aspectos da presente in- venção referem-se a métodos para tratar ou prevenir gastrite masto- cística, enterite mastocística, duodenite mastocística ou gastroenterite mastocística em um indivíduo que compreendem administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mu- cosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma parte da mucosa gás-
trica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de eosinófilos. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar um indivíduo com um ou mais sintomas de gastri- te, enterite, duodenite ou gastroenterite que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compre- ende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um núme- ro aumentado de eosinófilos em pelo menos um porção da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma refe- rência de eosinófilos. Em algumas modalidades, uma primeira amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo tem um número aumentado de mastócitos comparado com a referência de mastócitos. Em algumas modalidades, uma segunda amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo não tem número aumentado de eosinófilos compa- rado com a referência de eosinófilos.
[0010] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades descritas no presente documento, as primeira e segunda amostras são iguais. Em algumas modalidades, as primeira e segunda amostras são do mesmo tipo de tecido. Em algu- mas modalidades, uma ou ambas das primeira e segunda amostras são de uma biópsia gástrica ou duodenal. Em algumas modalidades, uma ou ambas das primeira e segunda amostras são de uma esofago- gatro-duodenoscopia (EGD) com biópsia. Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos três campos de alta potência (High- Power Fields, HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de ou mais mastócitos por HPF. Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos três campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 25 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos três campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 20 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalida- des, a primeira amostra tem pelo menos dois campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 30 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos dois campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 25 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos dois cam- pos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastóci- tos de 20 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) que tem uma contagem de mastócitos de 30 ou mais mastócitos.
Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) que tem uma contagem de mastócitos de 25 ou mais mastócitos.
Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) que tem uma contagem de mastócitos de 20 ou mais mastócitos.
Em algumas modalidades, os mastócitos são detectados por meio de coloração imuno-histoquímica (IHC) para triptase, CD117 (c-kit) ou receptor de IgE.
Em algumas mo- dalidades, a segunda amostra tem um ou mais HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de menos de 30 eosinófilos por HPF.
Em algumas modalidades, a segunda amostra é obtida da mucosa gástri- ca do indivíduo e a segunda amostra não tem pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF.
Em algumas modalidades, a segunda amostra é obtida da mucosa duodenal do indivíduo e a segunda amostra não tem pelo me- nos três HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF.
Em algumas modalidades, o número de mastócitos na primeira amostra é detectado 45 dias ou menos antes de administração da composição.
[0011] Em algumas modalidades, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas no presente documento, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com doença do refluxo gastroesofágico (Gastro- Esophageal Reflux Disease, GERD) (por exemplo, antes de tratamen- to com um anticorpo anti-Siglec-8). Em algumas modalidades, o indiví- duo é refratário a antiácidos, bloqueadores de H2 e/ou inibidores da bomba de prótons. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com síndrome do intestino irritável (Irritable Bowel Syn- drome, IBS) (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti- Siglec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosti- cado com dispepsia funcional (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com um ou mais dos seguintes: dor abdominal, cólicas abdominais, náuseas, vômitos, diarreia, distensão abdominal e saciedade precoce sem causa identificável (por exemplo, antes de tra- tamento com um anticorpo anti-Singlec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo é refratário e/ou não responde à intervenção farmacológica e/ou dietética. Em algumas modalidades, o indivíduo tinha anterior- mente (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti- Siglec-8) ou foi diagnosticado (por exemplo, tem um histórico anterior) com gastrite eosinofílica, mas é atualmente sintomático sem eosinófi- los elevados. Em algumas modalidades, o indivíduo teve (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi anterior- mente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um anti- corpo anti-Siglec-8) com gastrite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de gastrite eosinofílica sem eosinófilos elevados. Em algumas modalidades, o indivíduo foi anteriormente (por exemplo, an- tes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi diagnosticado
(por exemplo, tem um histórico anterior) com gastroenterite eosinofí- lica, mas atualmente é sintomático sem eosinófilos elevados.
Em al- gumas modalidades, o indivíduo teve (por exemplo, antes de tratamen- to com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi anteriormente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) com gastroenterite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de gastroenterite eosinofílica sem eosinófilos elevados.
Em algumas modalidades, o indivíduo teve (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi anteriormente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) com enterite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de enterite eosinofílica sem eosinófilos elevados.
Em algumas modalidades, o in- divíduo teve (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti- Siglec-8) ou foi anteriormente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) com duodenite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de duodenite eosinofílica sem eosinófilos elevados.
Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com dispepsia funcional (por exemplo, antes de trata- mento com um anticorpo anti-Siglec-8). Em algumas modalidades, um ou ambos de um número ou atividade de mastócitos em uma amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo são reduzidos após administração da composição compara- do com um nível de linha de base antes de administração da composi- ção.
Em algumas modalidades, antes de administração da composi- ção, o indivíduo não obteve sucesso ou não obteve um controle ade- quado através de um ou mais tratamentos padrão para gastrite ou gas- troenterite.
Em algumas modalidades, o um ou mais tratamentos pa- drão para gastrite ou gastroenterite são selecionados a partir do grupo que consiste em tratamento com inibidor da bomba de prótons (PPI), tratamento com corticosteroides e tratamento dietético.
Em algumas modalidades, um ou mais sintoma(s) de gastrite ou gastroenterite no indivíduo é/são reduzido(s) após administração da composição compa- rado com um nível de linha de base antes de administração da com- posição. Em algumas modalidades, um ou mais sintoma(s) de gastrite, duodenite, enterite ou gastroenterite no indivíduo é/são reduzido(s) em pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 65 % após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição. Em algumas modalidades, um ou mais das dores abdominais, náuseas, vômitos, perda de apetite, cólicas abdominais, plenitude antes de terminar uma refeição, distensão, diarreia e fezes líquidas ou aquosas no indivíduo são reduzidos após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
[0012] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de esofagite em um indivíduo que compreendem: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indiví- duo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida da mucosa esofágica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma refe- rência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número au- mentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar ou prevenir esofagite mastocística em um indivíduo que compreendem: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo; (b) detectar o número de eo- sinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a se- gunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos compa- rado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar um indivíduo com um ou mais sinto- mas de esofagite que compreendem: (a) detectar o número de mastó- citos de uma primeira amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amos- tra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um nú- mero aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 hu- mana.
[0013] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de esofagite em um indivíduo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa esofágica compa- rado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma porção da mucosa esofágica comparado com uma referência de eosinófilos. Ou- tros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar ou prevenir esofagite mastocística em um indivíduo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa esofágica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma porção da mucosa esofágica compa- rado com uma referência de eosinófilos. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar um indivíduo com um ou mais sintomas de esofagite que compreendem administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mu- cosa esofágica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma porção da mucosa esofágica comparado com uma refe- rência de eosinófilos. Em algumas modalidades, uma primeira amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo tem um número au- mentado de mastócitos comparado com a referência de mastócitos. Em algumas modalidades, uma segunda amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo não tem um número aumentado de eo- sinófilos comparado com a referência de eosinófilos.
[0014] Em algumas modalidades, as primeira e segunda amostras são iguais. Em algumas modalidades, uma ou ambas das primeira e segunda amostras são de uma amostra de biópsia esofágica. Em al- gumas modalidades, uma ou ambas das primeira e segunda amostras são de uma esofago-gatro-duodenoscopia (EGD) com biópsia. Em al- gumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) com uma contagem de mastócitos de 10 ou mais mastócitos por HPF. Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) com uma contagem de mastócitos de 15 ou mais mastócitos por HPF. Em algumas moda- lidades, os mastócitos são detectados por meio de coloração imuno- histoquímica (IHC) para triptase, CD117 (c-kit) ou receptor de IgE. Em algumas modalidades, a segunda amostra tem um ou mais HPFs com uma contagem de eosinófilos de menos de 10 eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, a segunda amostra não tem um HPF com uma contagem de eosinófilos de 10 ou mais eosinófilos por HPF. Em algu- mas modalidades, a segunda amostra tem um ou mais HPFs com uma contagem de eosinófilos de menos de 15 eosinófilos por HPF. Em al- gumas modalidades, a segunda amostra não tem um HPF com uma contagem de eosinófilos de 15 ou mais eosinófilos por HPF.
[0015] Em algumas modalidades, um ou mais de um número, ati- vidade ou localização de mastócitos em uma amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo são reduzidos após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de admi- nistração da composição. Em algumas modalidades, antes de adminis- tração da composição, o indivíduo não obteve sucesso ou não obteve um controle adequado através de um ou mais tratamentos padrão para esofagite. Em algumas modalidades, um ou mais sintoma(s) de esofa- gite no indivíduo é/são reduzido(s) após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição. Em algumas modalidades, um ou mais sintoma(s) de esofagite no indivíduo é/são reduzido(s) em pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 65 % após administra- ção da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição. Em algumas modalidades, um ou mais dentre azia, náusea, disfagia/dificuldade em engolir, vômito, dor abdominal, tosse, impactação alimentar, saciedade precoce, perda de apetite, dor no peito, intolerância ou recusa alimentar e refluxo gastro- esofágico no indivíduo são reduzidos após administração da composi- ção comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
[0016] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto-
dos para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de colite (por exem- plo, colite ulcerativa) em um indivíduo que compreendem: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade efi- caz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.
Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar ou prevenir a colite mastocística (por exemplo, co- lite ulcerativa) em um indivíduo que compreendem: (a) detectar o nú- mero de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da muco- sa cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade efi- caz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.
Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar um indivíduo com um ou mais sintomas de colite (por exemplo, colite ulcerativa) que compreendem: (a) detectar o nú- mero de mastócitos de uma primeira amostra obtida a partir da muco- sa cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quantidade efi- caz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.
[0017] Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de colite (por exem- plo, colite ulcerativa) em um indivíduo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compre- ende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma porção da mucosa cólica comparado com uma referência de eosinófilos. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para tratar ou prevenir colite mastocística (por exemplo, colite ulcerativa) em um indivíduo que compreendem administrar ao indiví- duo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mu- cosa cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo me- nos uma porção da mucosa cólica comparado com uma referência de eosinófilos. Outros aspectos da presente invenção referem-se a méto- dos para tratar um indivíduo com um ou mais sintomas de colite (por exemplo, colite ulcerativa) que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anti- corpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um nú- mero aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da muco- sa cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo me- nos uma porção da mucosa cólica comparado com uma referência de eosinófilos. Em algumas modalidades, uma primeira amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo tem um número aumentado de mastócitos comparado com a referência de mastócitos. Em algumas modalidades, uma segunda amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo não tem número aumentado de eosinófilos comparado com a referência de eosinófilos.
[0018] Em algumas modalidades, a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) com uma contagem de mas- tócitos de 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais ou 20-30 mastócitos por HPF. Em algumas modalidades, a segunda amostra tem um ou mais HPFs com uma contagem de eosinófilos de menos de 60 eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, a segunda amostra não tem um ou mais HPFs com uma contagem de eosinófilos de mais de 60 eosi- nófilos por HPF. Em algumas modalidades, as primeira e segunda amostras são iguais. Em algumas modalidades, os mastócitos são de- tectados por meio de coloração imuno-histoquímica (IHC) para trip- tase, CD117 ou receptor de IgE. Em algumas modalidades, o número de mastócitos na primeira amostra é detectado 45 dias ou menos an- tes de administração da composição. Em algumas modalidades, o in- divíduo teve ou foi anteriormente diagnosticado com colite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de colite eosinofílica sem eosi- nófilos elevados. Em algumas modalidades, um ou ambos de um nú- mero ou atividade de mastócitos em uma amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo são reduzidos após administração da com- posição comparado com um nível de linha de base antes de adminis- tração da composição. Em algumas modalidades, antes de adminis- tração da composição, o indivíduo não obteve sucesso ou não obteve um controle adequado através de um ou mais tratamentos padrão para colite. Em algumas modalidades, um ou mais sintoma(s) de colite no indivíduo é/são reduzido(s) após administração da composição compa-
rado com um nível de linha de base antes de administração da com- posição. Em algumas modalidades, um ou mais sintoma(s) de colite no indivíduo é/são reduzido(s) em pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 65 % após administração da compo- sição comparado com um nível de linha de base antes de administra- ção da composição.
[0019] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades descritas no presente documento, a composição é administrada através de infusão intravenosa. Em algu- mas modalidades, a composição é administrada através de infusão intravenosa uma vez por mês durante 3 ou mais meses, a cada 4 se- manas ou a cada 28 dias. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de infusão intravenosa uma vez por ciclo por 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ciclos, em que cada ciclo é de 1 mês, 4 semanas ou 28 dias. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de injeção subcutânea. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de infusão intravenosa em uma ou mais doses que compreendem entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo. Em algumas modalidades, o método compreende adminis- trar ao indivíduo uma primeira dose que compreende cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo e uma terceira dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma primeira dose que compreende cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo no Dia 1, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 26 e o Dia 32, uma tercei- ra dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 54 e o Dia 60, uma quarta dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 82 e o Dia 88, uma quinta dose que compre- ende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 110 e Dia 116 e uma sexta dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 138 e o Dia 144.
[0020] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades descritas no presente documento, o an- ticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de 50 % das cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição con- têm um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, substancialmen- te nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do an- ticorpo na composição contém um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em algumas modalida- des, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compre- ende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em algumas modalida- des, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 16 ou 21. Em algu- mas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de SEQ ID NOs: 11-14; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 23-24. Em algumas modalidades, o anticorpo com- preende uma região variável de cadeia pesada que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2-14; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16-24. Em algu- mas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos seleciona- da a partir de SEQ ID NOs: 2-10; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16-22. Em algumas modalidades, o anticorpo com- preende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoácidos seleci- onada a partir de SEQ ID NOs: 26-29; (2) uma HVR-H1 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC- FR2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a par- tir de SEQ ID NOs: 31-36; (4) uma HVR-H2 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 38-43; (6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FR4 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 45-46 e/ou (b) uma região variável de cadeia leve que compreende: (1) uma LC-FR1 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 48-49; (2) uma HVR-L1 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 51-53; (4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 55-58; (6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, o anticor- po compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que com- preende: (1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 26; (2) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (4) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FR4 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 45; e/ou (b) uma região variável de ca- deia leve que compreende: (1) uma LC-FR1 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; (4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em al- gumas modalidades, o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; (2) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (4) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FR4 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve que compreende: (1) uma LC-FR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 51; (4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma regi- ão variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve que com- preende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 97, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 e (li) uma HVR-L3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve que com- preende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 98, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 e (li) uma HVR-L3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; ou uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve que com- preende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 99, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e (li) uma HVR-L3 que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109; uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; ou uma região vari- ável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Em al- gumas modalidades, o anticorpo se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano.
Em algumas modalidades, o primata não humano é um babuíno. Em algumas modalidades, o anti- corpo se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
112. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algumas modali- dades, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 4F11. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo no Domí- nio 2 ou Domínio 3 da Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
113. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 103. Em algumas modalidades, o Domínio 3 compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 1H10. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana e compete com o anticorpo 4F11 pela ligação à Siglec-8. Em algumas modalidades, o anticorpo não compete com o anticorpo 2E2 pela ligação à Siglec-8. Em algumas modalida- des, o anticorpo não é o anticorpo 2E2. Em algumas modalidades, o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
112. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc de cadeia pesa- da que compreende uma região Fc de IgG humana. Em algumas mo- dalidades, a região Fc de IgG humana compreende uma região Fc de I9gG1 humana. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG1 humana não é fucosilada. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG huma- na compreende uma região Fc de IgG4 humana. Em algumas modali- dades, a região Fc de IgG4 humana compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numera-
dos de acordo com o índice EU conforme em Kabat. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo esgota os eosinófilos do sangue e/ou inibe a ativação dos mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo foi manipulado para melhorar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (Antibody-Dependent Cell- Mediated Cytotoxicity, ADCC). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que melhora a atividade de ADCC. Em algumas modalidades, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo não são fucosi- ladas. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoáci- dos selecionada a partir de SEQ ID NO: 76 ou 77. Em algumas moda- lidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0021] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades descritas no presente documento, a composição é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratar ou prevenir gastrite, gastroenterite ou esofagite. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais para tratar ou prevenir gastrite, gastroenterite ou esofagite são selecionados a partir do grupo que consiste em PPIs, corticosteroides sistêmicos, corticosteroides tópicos, anti-histamínicos, estabilizantes de mastócitos, bloqueadores H-2, anticorpos anti-lgE, inibidores de calcineurina, agentes imunomoduladores e agentes imu- nossupressores. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser hu- mano. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo e um veículo farmaceutica- mente aceitável.
[0022] Outros aspectos da presente invenção referem-se a artigos de fabricação ou kits que compreendem um medicamento que com-
preende uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e uma bula que compreende instruções para admi- nistração do medicamento a um indivíduo que precisa do mesmo de acordo com a qualquer uma das modalidades acima. Outros aspectos da presente invenção referem-se a artigos de fabricação ou kits que compreendem um medicamento que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e uma bula que compreende instruções para a administração do medicamento a um indivíduo que precisa do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades acima.
[0023] Deve ser entendido que uma, algumas ou todas as proprie- dades das várias modalidades descritas no presente documento po- dem ser combinadas para formar outras modalidades da presente in- venção. Estes e outros aspectos da presente invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica. Estas e outras modalida- des da presente invenção são ainda descritas pela descrição detalha- da a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0024] A Figura 1 fornece um diagrama esquemático que ilustra a patogênese das doenças gastrintestinais eosinofílicas (Eosinophilic Gastro-Intestinal Diseases, EGIDs).
[0025] As Figuras 2A e 2B mostram a distribuição (Figura 2A) e as características basais (Figura 2B) de pacientes sintomáticos com suspeita de EG/EEn que não atenderam aos critérios histopatológicos de entrada para eosinofilia mucosal para um estudo de Fase 2 de anti- corpo anti-Siglec-8 em pacientes com EG/EEn. Na Figura 2B, º = his- tórico médico na triagem de asma, rinite, alergia alimentar, dermatite atópica, alergia sazonal, alergia ambiental ou alergia ao pólen.
[0026] As Figuras 3A e 3B mostram que os mastócitos estão con- sistentemente elevados nas biópsias do estômago (Figura 3A) e duo- denal (Figura 3B) em pacientes sintomáticos. O sombreado horizontal indica níveis normais de mastócitos (consulte, por exemplo, Hahn et al. (2007) Am. J. Surg. Pathol. 31: 1669-1676; Tison et al. (2010) J. Aller- gy Clin. Immunol. 125: AB182; Walker et al. (2009) Aliment. Pharma- col. Ther. 29: 765-773; Martinez et al. (2013) Gut 62: 1160-1168; e Doyle et al. (2014) Am. J. Surg. Pathol. 38: 832-843).
[0027] A Figura 4 mostra a intensidade média dos sintomas (0-10) durante a triagem para cada um dos 8 sintomas para pacientes com 2 eosinófilos/HPF (n = 71; claro) ou pacientes com < 30 eosinófi- los/HPF, mas > 30 mastócitos/HPF (n = 16; escuro). Para a coorte com > 30 eosinófilos/HPF, um paciente não tinha dados de sintomas e não se inscreveu.
[0028] As Figuras 5A e 5B mostram dois estudos de caso de pa- cientes individuais.
[0029] As Figuras 6A e 6B mostram que o aumento da ativação de mastócitos é observado em tecidos onde apenas os mastócitos (e não eosinófilos) estão elevados. Na Figura 6A, tecido de biópsia gás- trica humana foi processado em células individuais, seguido por quan- tificação de mastócitos (CD117* Siglec-8*) e eosinófilos (CD117' Si- glec-8*) por meio de citometria de fluxo. Na Figura 6B, os mastócitos identificados na Figura 6A foram ainda analisados quanto ao marca- dor de ativação e desgranulação CD63 usando citometria de fluxo. À coloração com um anticorpo específico para CD63 ou anticorpo con- trole é mostrada.
[0030] A Figura 7 mostra a alteração média e mediana na pontua- ção total dos sintomas a partir da linha de base (média diária do perío- do de triagem) até a pontuação média diária nas duas semanas após a última dose do anticorpo anti-Siglec-8.
DESCRIÇÃO DETALHADA |. Definições
[0031] Deve ser entendido que a presente invenção não está limi-
tada a composições ou sistemas biológicos os quais podem, eviden- temente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa. Conforme usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as for- mas no singular "um", "uma" e "o/a" incluem as referências no plural, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência a "uma molécula" inclui opcionalmente uma com- binação de duas ou mais destas moléculas e assim por diante.
[0032] O termo "cerca de", conforme usado no presente documen- to, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo especialista neste campo técnico. Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro no presente documento inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas a este valor ou parâmetro per se.
[0033] Deve ser entendido que aspectos e modalidades da pre- sente invenção incluem "que compreende(m)", "que consiste(m)" e "que consiste(m) essencialmente em" aspectos e modalidades.
[0034] O termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos de comprimento total que têm uma região Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos com especi- ficidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anti- corpos biespecíficos, diacorpos e moléculas com uma única cadeia), bem como fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab') e Fv). O termo "imunoglobulina" (Ig) é usado alternadamente com "anticorpo" no presente documento.
[0035] A unidade básica de um anticorpo com 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas heterotetraméricas juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J e contém 10 sí-
tios de ligação a antígeno, enquanto que os anticorpos IgA compreen- dem 2-5 das unidades básicas de 4 cadeias que podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes em combinação com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de
150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H através de uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto que as duas cadeias H estão ligadas entre si através de uma ou mais ligações de dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem, no N-término, um domínio variável (VH) seguido por três domí- nios constantes (CH) para cada uma das cadeias a e y e quatro domí- nios CH para os isotipos u e e. Cada cadeia L tem, no N-término, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante em sua outra extremidade. A VL está alinhada com a VH e a CL está alinhada com o primeiro domínio constante de cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O emparelha- mento de uma VH e uma VL juntas forma um único sítio de ligação a antígeno. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos consulte, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8º Edição, Daniel P. Sties, Abba |. Terr e Tristram G. Parsolw (eds), Ap- pleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6.
[0036] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, as quais têm cadeias pesa- das designadas a, ô, e, y e u, respectivamente. As classes y e a são ainda divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores na sequência e função de CH, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes subclasses: I9G1, IgG2, 1gG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os anticorpos IgG1 podem existir em múltiplas variantes polimór- ficas denominadas alotipos (revisados em Jefferis e Lefranc 2009. mAbs, Vol. 1 Edição 4; 1-7) qualquer uma das quais é adequada para uso na presente invenção. Variantes alotípicas comuns em populações humanas são aquelas designadas pelas letras a, f, n, z.
[0037] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado, sepa- rado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente produtor (por exemplo, naturalmente ou de forma recombinante). Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado é isento de associação com todos os outros componentes de seu ambiente produtor. Os componentes contaminantes de seu ambiente produtor, tal como o resultante de cé- lulas recombinantes transfectadas, são materiais que normalmente interferem na pesquisa, no diagnóstico ou no uso terapêutico do anti- corpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é purifica- do: (1) para mais de 95 % em peso de anticorpo conforme determina- do, por exemplo, por meio do método de Lowry e, em algumas modali- dades, para mais de 99 % em peso; (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N- terminal ou interna mediante uso de um sequenciador de copo girató- rio ou (3) até homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando azul de Coomassie ou coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro das célu- las recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do am- biente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no en- tanto, um polipeptídeo ou anticorpo isolado é preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.
[0038] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado no pre- sente documento, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma po- pulação de anticorpos substancialmente homogênea, ou seja, os anti- corpos individuais que compreendem a população são idênticos, exce- to quanto a possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modifica- ções pós-traducionais (por exemplo, isomerizações, amidações) que possam estar presentes em quantidades menores.
Em algumas moda- lidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem C-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve.
Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no C-término da cadeia pesada e/ou da cadeia leve.
Em algumas modalidades, a clivagem C-terminal remove uma lisina C-terminal da cadeia pesada.
Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem N-terminal na cadeia pesa- da e/ou cadeia leve.
Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoá- cidos são clivados no N-término da cadeia pesada e/ou da cadeia leve.
Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico.
Em algumas modalidades, os anticorpos monoclionais são altamente es- pecíficos, sendo direcionados contra vários sítios antigênicos (como um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multiespecífico). O modifi- cador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção po- dem ser feitos por meio de uma variedade de técnicas incluindo, por exemplo, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, tec- nologias de exibição em fagos e tecnologias para a produção de anti- corpos humanos ou similares aos humanos em animais que têm par- tes ou todos os loci de imunoglobulina humana ou genes que codifi-
cam sequências de imunoglobulina humana.
[0039] O termo "anticorpo nu" refere-se a um anticorpo que não é conjugado a uma porção citotóxica ou radiomarcador.
[0040] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo in- tacto" ou "anticorpo inteiro" são usados indistintamente para referir-se a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta em oposição a um fragmento de anticorpo. Especificamente, anticorpos inteiros inclu- em aqueles com cadeias pesadas e leves, incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa huma- na) ou variantes de sequência de aminoácidos dos mesmos. Em al- guns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efeto- ras.
[0041] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, a porção de ligação a antígeno e/ou a região va- riável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo in- cluem fragmentos Fab, Fab', F(ab'), e Fv; diacorpos; anticorpos linea- res (consulte Patente Norte-Americana Nº 5.641.870, Exemplo 2; Za- pata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anti- corpos com uma única cadeia e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0042] A digestão de anticorpos com papaína produziu dois frag- mentos de ligação a antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab" e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflete a ca- pacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira juntamente com o domínio da região variável de cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente em relação à ligação aan- tígeno, isto é, tem um único sítio de ligação a antígeno. O tratamento de um anticorpo com pepsina produz um único fragmento F(ab')
grande que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab |i- gados através de dissulfeto com atividade de ligação a antígeno dife- rente e ainda é capaz de se ligar de forma cruzada ao antígeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem alguns resí- duos adicionais no terminal carboxila do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes traz(em) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[0043] O fragmento Fc compreende as porções carbóxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas através de dissulfetos. As fun- ções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na re- gião Fc, a região que também é reconhecida pelos receptores Fc (FCcR) encontrados em determinados tipos de células.
[0044] "Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sí- tio de reconhecimento e ligação a antígeno completo. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associações não covalentes estreitas. A partir do dobramento destes dois domínios emanam seis alças hi- pervariáveis (3 alças cada da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação aantígeno e conferem especi- ficidade de ligação a antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reco- nhecer e se ligar ao antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.
[0045] "Fv com uma única cadeia", também abreviado como "sFv"
ou "scFv", são fragmentos de anticorpo que compreendem os domí- nios de anticorpo VH e VL conectados em uma única cadeia polipeptí- dica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo sFv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação aantígeno. Para uma revi- são sobre sFv, consulte Pluckthun em The Pharmacology of Monoclo- nal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, páginas 269-315 (1994).
[0046] "Fragmentos funcionais" dos anticorpos da presente inven- ção compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a região de ligação a antígeno ou região variável do anticor- po intacto ou a região Fv de um anticorpo que retém ou tem capacida- de de ligação modificada ao FcR. Exemplos de fragmentos de anticor- po incluem anticorpo linear, moléculas de anticorpo com uma única cadeia e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0047] Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo par- ticular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólo- go às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibem a atividade biológica desejada (Patente Norte-Americana Nº 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente documento incluem anticorpos PRIMATIZEDO, em que a região de ligação aantígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, pela imunização de macacos com um antígeno de interesse. Conforme usado no presente documento, "anticorpo humanizado" é usado como um subconjunto de "anticorpos quiméricos".
[0048] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) são anticorpos quiméricos que contêm uma se- quência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano com a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas mo- dificações podem ser feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo, tal como a afinidade de ligação. Em geral, um anticorpo hu- manizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancial- mente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma sequência de imunoglobulina não humana e todas ou substancialmen- te todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobu- lina humana, embora as regiões FR possam incluir uma ou mais subs- tituições de resíduos de FR individuais que melhoram o desempenho do anticorpo, tal como afinidade de ligação, isomerização, imunogeni- cidade, etc. Em algumas modalidades, o número destas substituições de aminoácidos na FR é de não mais do que 6 na cadeia H e, na ca- deia L, não mais do que 3. O anticorpo humanizado também compre- enderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região cons- tante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobu-
lina humana. Para mais detalhes consulte, por exemplo, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et a/., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Consulte também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); e Patentes Norte-Americanas Nº* 6.982.321 e 7.087.409. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são direcionados contra um único sítio antigênico. Em algumas modalidades, os anticor- pos humanizados são direcionados contra vários sítios antigênicos. Um método alternativo de humanização é descrito na Patente Norte- Americana Nº 7.981.843 e Publicação de Pedido de Patente Norte- Americana Nº 2006/0134098.
[0049] A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais das cadeias pesada ou leve do anticorpo. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia le- ve podem ser denominados como "VH" e "VL", respectivamente. Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação a antígeno.
[0050] Os termos "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando usados no presente documento, referem-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são de sequência hipervariável e/ou formam alças estruturalmente definidas. Em geral, os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Em anti- corpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade dentre as seis HVRs e acredita-se que a H3 em particular desempenhe um papel único em conferir especificidade fina a anticorpos. Consulte, por ex- emplo, Xu et al., Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson e Wu em Meth- ods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ,
2003)). Na verdade, os anticorpos de camelídeos de ocorrência natural que consistem em apenas uma cadeia pesada são funcionais e está- veis na ausência da cadeia leve. Consulte, por exemplo, Hamers- Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) e Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).
[0051] Uma série de delineamentos de HVR estão em uso e são abrangidos no presente documento. As HVRs que são regiões deter- minantes de complementaridade (CDRs) de Kabat se baseiam na va- riabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). As HVRs de Chothia referem-se, em vez disto, à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). As HVRs "Contact" são com base em uma análise das estruturas cristali- nas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas HVRs são indicados abaixo. Alça Kabat Chothia Contact L1 L24-L34 L26-L34 —L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 —L46-L55 L3 L89-L97 L91-L9O6 —L89-L96 H1 H31-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H53-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H93-H101
[0052] Salvo indicação em contrário, os resíduos do domínio vari- ável (resíduos de HVR e resíduos da região estrutural) são numerados de acordo com Kabat et a/., supra.
[0053] Resíduos de "região estrutural" ou "FR" são aqueles resí- duos de um domínio variável diferentes dos resíduos de HVR, confor- me definido no presente documento.
[0054] As expressões "numeração de resíduo de domínio variável conforme em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido con- forme em Kabat" e variações das mesmas referem-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domí- nios variáveis de cadeia leve a partir da compilação de anticorpos em Kabat et a/., supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos que correspondem a um encurtamento ou inserção em uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após resíduo 82 da FR. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo através de alinhamento em regi- ões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência nu- merada de Kabat "padrão".
[0055] Uma "região estrutural humana aceitadora", para fins do presente documento, é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma região estrutural de VL ou VH derivada de uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma região estrutural de consenso humana. Uma região estrutural humana aceitadora "deri- vada de" uma região estrutural de imunoglobulina humana ou uma re- gião estrutural de consenso humana pode compreender a mesma se- quência de aminoácidos ou pode conter alterações de sequência de aminoácidos preexistentes. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácidos preexistentes são 10 ou menos, 9 ou me- nos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos.
[0056] "Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoá- cidos", em relação a uma sequência polipeptídica de referência, é de-
finida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma se- quência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência após alinhamento das sequên- cias e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a percenta- gem máxima de identidade de sequência e não considerando quais- quer substituições conservativas como parte da identidade de sequên- cia.
O alinhamento para fins de determinação da identidade percentual da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando um software de computador publicamente disponível, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para o ali- nhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que estão sendo comparadas.
Por exemplo, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (a qual pode ser alternativamente expressa como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos para, com ou contra uma de- terminada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte for- ma: 100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como cor- respondências idênticas pelo alinhamento de sequência deste progra- ma de A e B e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B.
Será reconhecido que onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoá- cidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A.
[0057] Um anticorpo que "se liga a", "se liga especificamente a" ou é "específico para" um determinado polipeptídeo ou um epítopo em um determinado polipeptídeo é aquele que se liga a este determinado po- lipeptídeo ou epítopo em um determinado polipeptídeo sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo polipeptídi- co. Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) a um polipeptídeo diferente da Siglec-8 não relacionado é menos do que cerca de 10 % da ligação do anticorpo à Siglec-8, conforme medido por meio de métodos conhecidos na técni- ca (por exemplo, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)). Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a uma Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) tem uma cons- tante de dissociação (Ka) de < 1 uM, < 100 nM, € 10 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,7 nM, € 0,6 nM, < 0,5 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 108 M ou menos, por exemplo, a partir de 108 M a 103 M, por exemplo, a partir de 10º Ma 10º M).
[0058] O termo "anticorpo anti-Siglec-8" ou "um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana" refere-se a um anticorpo que se liga a um po- lipeptídeo ou epítopo de Siglec-8 humana sem se ligar substancial- mente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de um polipeptídeo diferente da Siglec-8 não relacionado.
[0059] O termo "Siglec-8", conforme usado no presente documen- to, refere-se a uma proteína Siglec-8 humana. O termo também inclui variantes de ocorrência natural de Siglec-8, incluindo variantes de spli- ce ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma Siglec-8 humana exemplificativa é mostrada em SEQ ID NO: 72. A sequência de aminoácidos de outra Siglec-8 humana exemplificativa é mostrada em SEQ ID NO: 73. Em algumas modalidades, uma proteína Siglec-8 humana compreende o domínio extracelular da Siglec-8 humana fun- dido a uma região Fc de imunoglobulina. A sequência de aminoácidos de um domínio extracelular da Siglec-8 humana exemplificativo fundi- do a uma região Fc de imunoglobulina é mostrada em SEQ ID NO: 74. A sequência de aminoácidos sublinhada em SEQ ID NO: 74 indica a região Fc da sequência de aminoácidos da proteína de fusão Siglec-8 Fc. Sequência de Aminoácidos da Siglec-8 Humana
GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAG DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGT LESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTL TPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFOG DATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCP SRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGT GTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIVNRSCRKKSARPAAGVG DTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGEL
HYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNP SSKEVRG (SEQ ID NO: 72) Sequência de Aminoácidos da Siglec-8 Humana
GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAG DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGT LESGHPRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTL TPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFOG DATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCP SRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGT GTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIVNRSCRKKSARPAAGVG DTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGEL HYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNP
SSKEVRG (SEQ ID NO: 73) Sequência de Aminoácidos da Proteína de Fusão Siglec-8 Fc
GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAG DRPYQDAPVATNNPDREVQAETAQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGT LESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTL TPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFOG DATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCP SRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQONEGT GTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74)
[0060] Anticorpos que "induzem à apoptose" ou são "apoptóticos" são aqueles que induzem à morte celular programada, conforme de- terminado por meio de ensaios de apoptose padrão, tal como ligação à anexina V, fragmentação de DNA, retração celular, dilatação do retícu- lo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas de membrana (denominados corpos apoptóticos). Por exemplo, a ati- vidade apoptótica dos anticorpos anti-Siglec-8 (por exemplo, um anti- corpo que se liga à Siglec-8 humana) da presente invenção pode ser mostrada pela coloração de células com anexina V.
[0061] As "funções efetoras" de anticorpos referem-se às ativida- des biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência na- tiva ou região Fc de sequência de aminoácidos variante) de um anti- corpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efeto- ras de anticorpos incluem: ligação a C1iq e citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação ne- gativa de receptores na superfície celular (por exemplo, receptores de células B); e ativação de células B.
[0062] "Citotoxicidade mediada por células dependentes de anti- corpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual a lg secretada ligada a receptores Fc (FcRs) presentes em determina- das células citotóxicas (por exemplo, células Natural Killer (NK), neu- trófilos e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula-alvo com antígeno e, subse- quentemente, matem a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos "ar- mam!" as células citotóxicas e são necessários para matar a célula-alvo através deste mecanismo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIll, enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FeyRII e FeyRIll. A expressão de Fc em células he- matopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Em algumas modalida- des, um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) descrito no presente documento aumenta a ADCC. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interes- se, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito nas Patentes Norte-Americanas Nº 5.500.362 ou 5.821.337, pode ser realizado. Cé- lulas efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e células Natural Killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse po- de ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele descrito em Clynes et al, PNAS USA 95: 652-656 (1998). Ou- tras variantes de Fc que alteram a atividade de ADCC e outras propri- edades do anticorpo incluem aquelas descritas por Ghetie et al., Nat Biotech. 15: 637-40, 1997; Duncan et al., Nature 332: 563-564, 1988; Lund et al., J. Immunol 147: 2657-2662, 1991; Lund et al., Mol Immu-
nol 29: 53-59, 1992; Alegre et al., Transplantation 57: 1537-1543, 1994; Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92: 11980-11984, 1995; Jefferis et al., Immunol Lett. 44: 111-117, 1995; Lund et al., FASEB J9: 115-119, 1995; Jefferis et al., Inmunol Lett 54: 101-104, 1996; Lund et al., J Immunol 157: 4963-4969, 1996; Armor et al., Eur J Immunol 29: 2613-2624, 1999; Idusogie et al., J Immunol 164: 4178-4184, 200; Reddy et al., J] Immunol 164: 1925-1933, 2000; Xu et al., Cell Immunol 200: 16-26, 2000; Idusogie et al., J Immunol 166: 2571-2575, 2001; Shields et al., J Biol Chem 276: 6591-6604, 2001; Jefferis et al., Immu- nol Lett 82: 57-65. 2002; Presta et al., Biochem Soc Trans 30: 487- 490, 2002; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 4005-4010, 2006; Patentes Norte-Americanas Nº 5.624.821; 5.885.573;
5.677.425; 6.165.745; 6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821;
5.648.260; 6.194.551; 6.737.056; 6.821.505; 6.277.375; 7.335.742; e
7.317.091.
[0063] O termo "região Fc" no presente documento é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobuli- na, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobu- lina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para se estender a partir de um resíduo de amino- ácido na posição Cys226 ou Pro230 até o terminal carboxila da mes- ma. Regiões Fc de sequência nativa adequadas para uso nos anticor- pos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana. Uma única substituição de aminoácido (S228P de acordo com a nume- ração de Kabat; designada IgG4Pro) pode ser introduzida para abolir a heterogeneidade observada no anticorpo IgG4 recombinante. Consulte Angal, S. et al. (1993) Mol Immunol 30, 105-108.
[0064] Anticorpo "não fucosilado" ou "deficiente em fucose" refere- se a uma variante de anticorpo de glicosilação que compreende uma região Fc em que uma estrutura de carboidrato ligada à região Fc tem fucose reduzida ou sem fucose. Em algumas modalidades, um anti- corpo com fucose reduzida ou sem fucose tem função de ADCC au- mentada. Os anticorpos não fucosilados ou deficientes em fucose têm fucose reduzida em relação à quantidade de fucose no mesmo anti- corpo produzida em uma linhagem de células. Em algumas modalida- des, uma composição de anticorpo não fucosilada ou deficiente em fucose considerada no presente documento é uma composição em que menos de cerca de 50 % dos glicanos N-ligados à região Fc dos anticorpos na composição compreendem fucose.
[0065] Os termos "fucosilação" ou "fucosilado" referem-se à pre- sença de resíduos de fucose nos oligossacarídeos ligados à estrutura peptídica de um anticorpo. Especificamente, um anticorpo fucosilado compreende fucose a(1,6) ligada no resíduo de N-acetilglucosamina (GICNAc) mais interno em um ou ambos os oligossacarídeos N-ligados à região Fc do anticorpo, por exemplo, na posição Asn 297 do domínio Fc de IgG1 humana (numeração EU dos resíduos da região Fc). Asn297 também pode estar localizada a cerca de +3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, em virtude de pequenas variações de sequência nas imunoglobu- linas.
[0066] O "grau de fucosilação" é a porcentagem de oligossacarí- deos fucosilados em relação a todos os oligossacarídeos identificados por meio de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, em uma composição de anticorpo tratada com N-glicosidase F avaliada pela espectrometria de massa por tempo de voo/dessorção-ionização a la- ser assistida por matriz (MALDI-TOF MS). Em uma composição de um "anticorpo totalmente fucosilado", essencialmente todos os oligossaca- rídeos compreendem resíduos de fucose, isto é, são fucosilados. Em algumas modalidades, uma composição de um anticorpo totalmente fucosilado tem um grau de fucosilação de pelo menos cerca de 90 %. Consequentemente, um anticorpo individual em tal composição com- preende, tipicamente, resíduos de fucose em cada um dos dois oligos- sacarídeos N-ligados na região Fc. Por outro lado, em uma composi- ção de um anticorpo "totalmente não fucosilado", essencialmente ne- nhum dos oligossacarídeos é fucosilado e um anticorpo individual em tal composição não contém resíduos de fucose em nenhum dos dois oligossacarídeos N-ligados na região Fc. Em algumas modalidades, uma composição de um anticorpo não fucosilado tem um grau de fu- cosilação de menos de cerca de 10 %. Em uma composição de um "anticorpo parcialmente fucosilado" apenas parte dos oligossacarídeos compreende fucose. Um anticorpo individual em tal composição pode compreender resíduos de fucose em nenhum, um ou ambos os oligos- sacarídeos N-ligados na região Fc, contanto que a composição não compreenda essencialmente todos os anticorpos individuais que não têm resíduos de fucose nos oligossacarídeos N-ligados na região Fc, nem essencialmente todos os anticorpos individuais que contêm resí- duos de fucose em ambos os oligossacarídeos N-ligados na região Fc. Em uma modalidade, uma composição de um anticorpo parcialmente fucosilado tem um grau de fucosilação de cerca de 10 % a cerca de 80 % (por exemplo, cerca de 50 % a cerca de 80 %, cerca de 60 % a cer- ca de 80 % ou cerca de 70 % a cerca de 80 % ).
[0067] "Afinidade de ligação", conforme usado no presente docu- mento, refere-se à força das interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Em algumas modali- dades, a afinidade de ligação de um anticorpo por uma Siglec-8 (a qual pode ser um dímero, tal como a proteína de fusão Siglec-8-Fc descrita no presente documento) pode, em geral, ser representada por uma constante de dissociação (Ka). A afinidade pode ser medida por meio de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento.
[0068] "Avidez de ligação", conforme usado no presente documen- to, refere-se à força de ligação de múltiplos sítios de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno).
[0069] Uma molécula de ácidos nucleicos "isolada" que codifica os anticorpos no presente documento é uma molécula de ácidos nuclei- cos que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácidos nucleicos contaminante com a qual ela está normalmente asso- ciada no ambiente no qual foi produzida. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é isento de associação com todos os compo- nentes associados ao ambiente produtor. As moléculas de ácidos nu- cleicos isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos no pre- sente documento estão em uma forma diferente da forma ou configu- ração na qual são encontradas na natureza. As moléculas de ácidos nucleicos isoladas, portanto, são distinguidas do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos e anticorpos no presente documento existen- tes naturalmente nas células.
[0070] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma prepa- ração que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz e que não contém componentes adicio- nais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação deve ser administrada. Estas formulações são estéreis.
[0071] "Veículos", conforme usado no presente documento, inclu- em veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitá- veis que não são tóxicos para a célula ou mamífero exposto aos mes- mos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa com pH tam- ponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxi- dantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecu- lar (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, aspara- gina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros car- boidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; con- tra-íons formadores de sal, tal como sódio; e/ou tensoativos não iôni- cos, tais como TWEEN'TY, polietileno glicol (PEG) e PLURONICSTY.
[0072] Conforme usado no presente documento, o termo "trata- mento" ou "tratar" refere-se à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo ou célula que está sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado patológico e remissão ou melhora do prognóstico. Um indivíduo é "tratado" com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas asso- ciados a uma doença (por exemplo, gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística e/ou gastroente- rite mastocística) são mitigados ou eliminados. Por exemplo, um indi- víduo é "tratado" com sucesso se o tratamento resultar em um aumen- to da qualidade de vida daqueles que sofrem de uma doença, diminui- ção da dose de outros medicamentos necessários para o tratamento da doença, redução da frequência de recorrência da doença, diminui- ção da gravidade da doença, retardo do desenvolvimento ou progres- são da doença e/ou extensão a sobrevida dos indivíduos.
[0073] Conforme usado no presente documento, "em conjunto com" ou "em combinação com" refere-se à administração de uma mo- dalidade de tratamento além de outra modalidade de tratamento. Co- mo tal, "em conjunto com" ou "em combinação com" refere-se à admi-
nistração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.
[0074] Conforme usado no presente documento, o termo "preve- nir" ou "prevenção" inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo. Um indiví- duo pode estar predisposto a uma doença, suscetível a uma doença ou em risco de desenvolver uma doença, mas ainda não foi diagnosti- cado com a doença. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) descritos no presente documento são usados para retardar o desen- volvimento de uma doença (por exemplo, gastrite mastocística, esofa- gite mastocística, colite mastocística, mastócitos enterite e/ou gastro- enterite mastocística).
[0075] Conforme usado no presente documento, um indivíduo "em risco" de desenvolver uma doença (por exemplo, gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística e/ou gastroenterite mastocística) pode ou não ter doença detectável ou sin- tomas de doença e pode ou não ter apresentado doença detectável ou sintomas de doença antes dos métodos de tratamento descritos no presente documento. "Em risco" denota que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, os quais são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento da doença (por exemplo, gastri- te mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística e/ou gastroenterite mastocística), conforme conhecido na técnica. Um indivíduo com um ou mais destes fatores de risco tem maior probabilidade de desenvolver a doença do que um indivíduo sem um ou mais destes fatores de risco.
[0076] Uma "quantidade eficaz" refere-se a pelo menos uma quan- tidade eficaz, nas dosagens e durante períodos de tempo necessários, para atingir o efeito desejado ou indicado, incluindo um resultado tera-
pêutico ou profilático. Uma quantidade eficaz pode ser fornecida em uma ou mais administrações. Uma "quantidade terapeuticamente efi- caz" é pelo menos a concentração mínima necessária para obter uma melhora mensurável de uma doença particular. Uma quantidade tera- peuticamente eficaz, no presente documento, pode variar de acordo com fatores como o estado patológico, idade, sexo e peso do paciente e a capacidade do anticorpo de induzir a uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode também ser aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quanti- dade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e durante períodos de tempo necessários, para atingir o re- sultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou no estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[0077] Administração "crônica" refere-se à administração do(s) medicamento(s) em um modo contínuo em oposição ao modo agudo, de forma a manter o efeito (atividade) terapêutico inicial por um perío- do de tempo prolongado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas sim de natu- reza cíclica.
[0078] O termo "bula" é usado para referir-se a instruções nor- malmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuti- cos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, ad- ministração, terapia combinada, contraindicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtos terapêuticos.
[0079] Conforme usado no presente documento, um "indivíduo" ou um "paciente" é um mamífero. Um "mamífero" inclui, para fins de tra- tamento, seres humanos, animais domésticos e de fazenda, de zooló-
gico, esportes ou de estimação, tais como cães, cavalos, coelhos, ga- do, porcos, hamsters, gerbos, camundongos, furões, ratos, gatos, etc. Em algumas modalidades, o indivíduo ou paciente é um ser humano.
11. Métodos
[0080] São fornecidos no presente documento métodos para tratar e/ou prevenir gastrite mastocística, esofagite mastocística, enterite mastocística, colite mastocística e/ou gastroenterite mastocística em um indivíduo que compreendem administrar ao indivíduo uma quanti- dade eficaz de um anticorpo descrito no presente documento que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) ou composições que compreendem os ditos anticorpos. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo está em uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo tem gastrite mastocística. Em algumas mo- dalidades, o indivíduo tem esofagite mastocística. Em algumas moda- lidades, o indivíduo tem enterite mastocística. Em algumas modalida- des, o indivíduo tem gastroenterite mastocística. Em algumas modali- dades, o indivíduo tem gastrite mastocística e gastroenterite mastocís- tica. Em algumas modalidades, o indivíduo tem gastrite mastocística e enterite mastocística. Em algumas modalidades, o indivíduo tem eso- fagite mastocística e gastrite mastocística. Em algumas modalidades, o indivíduo tem esofagite mastocística e gastroenterite mastocística. Em algumas modalidades, o indivíduo tem esofagite mastocística e enterite mastocística. Em algumas modalidades, o indivíduo tem eso- fagite mastocística, gastrite mastocística e gastroenterite mastocística. Em algumas modalidades, o indivíduo tem esofagite mastocística, gas- trite mastocística e enterite mastocística.
[0081] Em algumas modalidades, os métodos compreendem de- tectar uma série de mastócitos e uma série de eosinófilos de uma ou mais amostras obtidas da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo (por exemplo, para gastrite mastocística ou gastro- enterite mastocística). Em algumas modalidades, os métodos compre- endem detectar uma série de mastócitos e uma série de eosinófilos de uma ou mais amostras obtidas da mucosa esofágica do indivíduo (por exemplo, para esofagite mastocística). A. Gastrite Mastocística, Esofagite Mastocística, Colite Mastocís- tica, Enterite Mastocística, Duodenite Mastocística e/ou Gastroen- terite Mastocística
[0082] Determinados aspectos da presente invenção referem-se a indivíduos com gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gas- troenterite mastocística. A presente invenção se baseia, pelo menos em parte, na descoberta de que uma subpopulação de pacientes do estudo clínico, apesar de ter sintomas de gastrite/gastroenterite eosi- nofílica, não tinha o aumento do número de eosinófilos na mucosa gástrica e/ou duodenal tipicamente usado para diagnosticar gastri- te/gastroenterite eosinofílica. Em vez disto, descobriu-se que estes pa- cientes tinham um número substancial de mastócitos (na maioria dos casos mais de 30 mastócitos/campo de alta potência (HPF)) na muco- sa gástrica e/ou duodenal. Os níveis normais foram medidos em apro- ximadamente menos de 20 mastócitos/HPF (Doyle et al., Am. J. Surg. Pathol. (2014) 38: 832-843; Jakate et al., Arch. Pathol. Lab. Med. (2006) 130: 362-367; Tison et al., Allergy Clin. Immunol. (2010) Abs- tract 714), implicando que os mastócitos elevados nestes pacientes podem ser responsáveis pela sintomatologia gastrintestinal.
[0083] Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosti- cado com doença do refluxo gastroesofágico (GERD) (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com doença do re-
fluxo gastroesofágico (DRGE) (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) e é refratário ao tratamento com um antiá- cido, bloqueador H2 e/ou inibidor da bomba de prótons.
Por exemplo, um ou mais sintomas de DRGE no indivíduo podem ser refratários ao tratamento com um antiácido, bloqueador de H2 e/ou inibidor da bom- ba de prótons ou o indivíduo pode ter DRGE que é refratária ao trata- mento com um antiácido, bloqueador de H2 e/ou inibidor da bomba de prótons.
Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnostica- do com síndrome do intestino irritável (IBS) (por exemplo, antes de tra- tamento com um anticorpo anti-Siglec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo tinha anteriormente ou foi diagnosticado (por exemplo, tem um histórico anterior) com gastrite eosinofílica, mas é sintomático sem eosinófilos elevados (por exemplo, antes de tratamento com um anti- corpo anti-Siglec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo teve (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi anteriormente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) com um ou mais dentre: dor abdominal, cólicas abdominais, náuseas, vômitos, diarreia, distensão abdominal e saciedade precoce sem causa identificável.
Em algumas modalidades, o indivíduo é (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo an- ti-Siglec-8) refratário e/ou não responde à intervenção farmacológica e/ou dietética.
Em algumas modalidades, o indivíduo teve (por exem- plo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi anteri- ormente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um an- ticorpo anti-Siglec-8) com gastrite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de gastrite eosinofílica (por exemplo, é sintomático) sem eosinófilos elevados.
Em algumas modalidades, o indivíduo tinha anteriormente ou foi diagnosticado (por exemplo, tem um histórico an- terior) com gastroenterite eosinofílica, mas é sintomático sem eosinófi- los elevados (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-
Siglec-8). Em algumas modalidades, o indivíduo teve (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8) ou foi anterior- mente diagnosticado (por exemplo, antes de tratamento com um anti- corpo anti-Siglec-8) com gastroenterite eosinofílica e o indivíduo tem um ou mais sintomas de gastroenterite eosinofílica (por exemplo, é sintomático) sem eosinófilos elevados. Por exemplo, antes de trata- mento com um anticorpo anti-Siglec-8, o indivíduo pode não apresen- tar eosinófilos elevados (por exemplo, de uma biópsia, conforme des- crito no presente documento), mas pode ter um histórico anterior ou diagnóstico de gastrite eosinofílica ou gastroenterite eosinofílica. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com dis- pepsia funcional (por exemplo, antes de tratamento com um anticorpo anti-Siglec-8). Sem querer estar limitado à teoria, acredita-se que mas- tócitos elevados podem ser responsáveis pela sintomatologia em es- tados patológicos como DRGE, IBS e dispepsia funcional, por exem- plo, ter sintomas similares à gastrite/gastroenterite eosinofílica, mesmo se o número de eosinófilos na mucosa gástrica e/ou duodenal (por exemplo, de uma biópsia conforme discutido no presente documento) não atende aos padrões clínicos para doença/envolvimento eosinofí- lico.
[0084] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um número au- mentado de mastócitos (por exemplo, comparado com uma referência de mastócitos) em pelo menos uma porção da mucosa gástrica, duo- denal, jejunal, ileal ou cólica, mas não tem um número aumentado de eosinófilos (por exemplo, comparado com uma referência de eosinófi- los) em pelo menos uma porção da mucosa gástrica, duodenal, jeju- nal, ileal ou cólica (por exemplo, para gastrite mastocística ou gastro- enterite mastocística). Em algumas modalidades, o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos (por exemplo, comparado com uma referência de mastócitos) em pelo menos uma porção da mucosa eso-
fágica, mas não tem um número aumentado de eosinófilos (por exem- plo, comparado com uma referência de eosinófilos) em pelo menos uma parte da mucosa esofágica (por exemplo, para esofagite masto- cística).
[0085] Em algumas modalidades, uma amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo tem um número aumentado de mastócitos, por exemplo, comparado com uma referência de mastócitos, mas uma amostra obtida da mucosa gástri- ca, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos, por exemplo, comparado com uma referên- cia de eosinófilos (por exemplo, para gastrite mastocística ou gastro- enterite mastocística). Em algumas modalidades, as amostras são a mesma amostra. Em algumas modalidades, as amostras são amostras diferentes. Em algumas modalidades, as amostras são do mesmo tipo de tecido. Em algumas modalidades, uma amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo tem um número aumentado de mastó- citos, por exemplo, comparado com uma referência de mastócitos, mas uma amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos, por exemplo, compa- rado com uma referência de eosinófilos (por exemplo, para esofagite mastocística). Em algumas modalidades, as amostras são a mesma amostra. Em algumas modalidades, as amostras são amostras dife- rentes.
[0086] Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa gástri- ca, duodenal, jejunal, ileal ou cólica tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco campos de alta potência (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastóci- tos de 30 ou mais mastócitos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofágica tem pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco campos de alta potência (HPFs), cada um com uma conta-
gem de mastócitos de 10 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofágica tem pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 20 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofágica tem pe- lo menos um, dois, três, quatro ou cinco campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 25 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas modalidades, a contagem máxima de mastócitos obtida de dois ou mais HPFs de uma amostra da muco- sa esofágica é de 10 ou mais mastócitos por HPF.
Em algumas moda- lidades, a contagem máxima de mastócitos obtida de dois ou mais HPFs de uma amostra da mucosa esofágica é de 15 ou mais mastóci- tos por HPF.
Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco campos de alta potência (HPFs), cada um com uma contagem de mastócitos de 10 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa esofágica). Em algumas modalidades, um indivíduo é selecio- nado para tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amostra de bi- ópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco - campos de alta energia (HPFs) que têm, cada um, uma conta- gem de mastócitos de 30 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, jejunal ou ileal). Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para tratamento (por exem- plo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo tem pe- lo menos um, dois, três, quatro ou cinco - campos de alta energia (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 10 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa esofágica). Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente inven- ção) se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indi- víduo tem pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco - campos de alta energia (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 20 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, jejunal ou ileal). Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amos- tra de biópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, dois, três, qua- tro ou cinco campos de alta energia (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 20-30 mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, jejunal ou ileal).
[0087] Em algumas modalidades, o número de mastócitos em uma amostra é detectado em menos do que cerca de 14, menos do que cerca de 28, menos do que cerca de 35, menos do que cerca de 45 ou menos do que cerca de 90 dias antes de administração de uma com- posição ou anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção.
[0088] Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa gástri- ca, duodenal, jejunal ou ileal tem um ou mais HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de menos de 30 eosinófilos por HPF. Em al- gumas modalidades, uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, je- junal ou ileal não tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, quatro ou cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófi- los de 30 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa gástrica não tem pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa duodenal, jejunal ou ileal não tem pelo menos três HPFs, cada um com uma con-
tagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para o tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, em pelo me- nos quatro ou pelo menos cinco campos de alta potência (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 30 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, jejunal ou ileal) e se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo não tem eosinófilos aumentados, por exemplo, se uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, jejunal ou ileal não tiver pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF (por exemplo, se uma amostra da mucosa gástrica, duodenal, jejunal ou ileal não tiver pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco HPFs que têm, cada um, uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF ou se uma amostra da mucosa gástrica, du- odenal, jejunal ou ileal não tiver pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF). Por exemplo, a amostra de eosinófilos pode ter 1, 2, 3, 4 ou 5 HPFs ou to- dos os HPFs testados podem não atender aos critérios clínicos para doença eosinofílica.
[0089] Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa cólica tem um ou mais HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de menos de 60 eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa cólica não tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa cólica não tem pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófi- los de 60 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa cólica não tem pelo menos três HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa cólica não tem pelo menos dois HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amos- tra da mucosa cólica não tem um HPF uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinófilos. Em algumas modalidades, um indivíduo é selecionado para o tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amos- tra de biópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, dois, três, qua- tro ou cinco - campos de alta energia (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 20, 30 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa cólica) e se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo não tem aumento de eosinófi- los, por exemplo, se uma amostra da mucosa cólica não tiver pelo me- nos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinófilos por HPF (por exemplo, se uma amostra da mucosa cólica não tiver pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinófilos por HPF). Por exemplo, a amostra de eosinófilos pode ter 1, 2, 3, 4 ou 5 HPFs ou todos os HPFs testados podem não atender aos critérios clí- nicos para doença eosinofílica.
[0090] Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofá- gica tem um ou mais HPFs, cada um com uma contagem de eosinófi- los de menos de 10 eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofágica não tem pelo menos um, pelo me- nos dois, pelo menos três, quatro ou cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 10 ou mais eosinófilos por HPF. Em algu- mas modalidades, um indivíduo é selecionado para o tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco campos de alta potência (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 10 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa esofágica) e se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo não tem eosinófilos aumentados, por exemplo, se uma amostra da mucosa esofágica não tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 10 ou mais eosinófilos por HPF. Por exemplo, a amostra de eosinófilos pode ter 1, 2, 3, 4 ou 5 HPFs ou todos os HPFs testados podem não atender aos critérios clínicos para doença eosinofílica.
[0091] Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofá- gica tem um ou mais HPFs, cada um com uma contagem de eosinófi- los de menos de 15 eosinófilos por HPF. Em algumas modalidades, uma amostra da mucosa esofágica não tem pelo menos um, pelo me- nos dois, pelo menos três, quatro ou cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 15 ou mais eosinófilos por HPF. Em algu- mas modalidades, um indivíduo é selecionado para o tratamento (por exemplo, usando qualquer um dos métodos da presente invenção) se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, em pelo me- nos quatro ou pelo menos cinco campos de alta potência (HPFs) que têm, cada um, uma contagem de mastócitos de 15 ou mais mastócitos por HPF (para uma amostra da mucosa esofágica) e se uma amostra (por exemplo, amostra de biópsia) obtida do indivíduo não tem eosinó- filos aumentados, por exemplo, se uma amostra da mucosa esofágica não tem pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo me- nos quatro ou pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de 15 ou mais eosinófilos por HPF. Por exemplo, a amostra de eosinófilos pode ter 1, 2, 3, 4 ou 5 HPFs ou todos os HPFs testados podem não atender aos critérios clínicos para doença eosino- fílica.
[0092] Em algumas modalidades, múltiplos HPFs (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 HPFs conforme descrito no presente documento) podem ser obtidos a partir de uma única biópsia (consulte Caldwell, J.M. et al. (2014) J. Allergy Clin. Immunol. 134: 1114-1124) ou, em alguns casos, de múltiplas biópsias. Os HPFs da presente invenção podem ser obti- dos a partir de 1, 2, 3, 4 ou 5 amostras (por exemplo, biópsias indivi- duais). Em outras palavras, a título de exemplo, 5 HPFs podem ser de um total de 2 amostras (por exemplo, 3 HPFs de uma amostra e 2 da outra, em vez de exigir 5 HPFs de cada uma das duas amostras).
[0093] Em algumas modalidades, uma amostra usada para conta- gem de mastócitos e/ou eosinófilos é obtida a partir de uma biópsia gástrica ou duodenal. Em algumas modalidades, uma amostra usada para contagem de mastócitos e/ou eosinófilos é obtida a partir de uma biópsia esofágica. Em algumas modalidades, uma amostra usada para contagem de mastócitos e/ou eosinófilos é obtida a partir de uma eso- fago-gatro-duodenoscopia (EGD) com biópsia. Em algumas modalida- des, várias amostras podem ser obtidas a partir de uma única biópsia. Por exemplo, uma biópsia esofágica pode conter 4-6 amostras que representam diferentes partes do esôfago (por exemplo, 2 amostras do esôfago proximal, 2 amostras do esôfago médio e 2 amostras do esô- fago distal).
[0094] Em algumas modalidades, o número de mastócitos é com- parado com uma referência de mastócitos. Em algumas modalidades, o número de eosinófilos é comparado com uma referência de eosinófi-
los. Em algumas modalidades, uma referência de mastócitos ou eosi- nófilos refere-se a uma amostra obtida de um indivíduo que não tem esofagite, gastrite, colite ou gastroenterite. Em algumas modalidades, uma referência de mastócitos ou eosinófilos refere-se a um valor limite numérico útil para diagnosticar esofagite, gastrite, colite ou gastroente- rite eosinofílica ou mastocística (por exemplo, uma série de mastócitos ou eosinófilos, opcionalmente por HPF, usado como um limite no diag- nóstico, conforme descrito acima). Em algumas modalidades, uma re- ferência de mastócitos ou eosinófilos refere-se a um valor médio de mastócitos ou eosinófilos obtidos de várias amostras. Conforme ob- servado no presente documento, um valor de referência e/ou valor de linha de base pode ser obtido a partir de um indivíduo, de dois indiví- duos diferentes ou de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos).
[0095] Em algumas modalidades, o número de mastócitos em uma amostra é detectado por meio de coloração com hematoxilina e eosina (H&E). Em algumas modalidades, o número de mastócitos em uma amostra é detectado por meio de coloração imuno-histoquímica (IHC) para um marcador de mastócitos incluindo, sem limitação, triptase, CD117 (c-kit) ou receptor de IgE. Em algumas modalidades, a ativação de mastócitos é detectada (por exemplo, mastócitos ativados são de- tectados) por meio de coloração de IHC para triptase e quantificação de desgranulação de mastócitos. Em algumas modalidades, a ativação de mastócitos é detectada (por exemplo, mastócitos ativados são de- tectados) por meio de coloração para marcadores de ativação de mas- tócitos (incluindo, sem limitação, CD63 e/ou CD107a), por exemplo, por meio de citometria de fluxo ou IHC.
[0096] Embora a detecção de mastócitos e eosinófilos seja descri- ta acima usando IHC e amostras de tecido, a carga e/ou ativação de mastócitos também podem ser avaliadas ao medir biomarcadores no soro, sangue ou urina. Em algumas modalidades, um indivíduo que testa níveis anormalmente elevados em um ou mais destes ensaios e, opcionalmente, não testa níveis elevados de eosinófilos, pode ser tra- tado usando os métodos da presente invenção. Em algumas modali- dades, o número e/ou a atividade dos mastócitos em um indivíduo são avaliados pela triptase ou beta triptase séricas. Em algumas modalida- des, o número e/ou a atividade dos mastócitos em um indivíduo são avaliados pelos níveis sanguíneos de triptase, histamina, leucotrieno e4, prostaglandina D2 e /ou heparina. Em algumas modalidades, o número e/ou a atividade dos mastócitos em um indivíduo são avalia- dos pelos níveis de N-metil-histamina, prostaglandina F2 alfa e/ou prostaglandina D2 na urina. B. Resposta ao Tratamento
[0097] Em algumas modalidades, administrar a um indivíduo con- forme descrito no presente documento (por exemplo, um indivíduo com gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mas- tocística) uma quantidade eficaz de uma composição da presente in- venção ou anticorpo descrito no presente documento que se liga à Si- glec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) reduz um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) sintomas no indivíduo, comparado com um nível de linha de base antes de administração do anticorpo.
[0098] A resposta ao tratamento em indivíduos com gastrite mas- tocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocís- tica, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística pode ser avaliada através de vários métodos. Por exemplo, o número, a ativida- de e/ou a localização dos mastócitos em uma amostra podem ser alte- rados após o tratamento. Em algumas modalidades, o número de mas- tócitos em uma amostra obtida do indivíduo após o tratamento é redu-
zido comparado com o número de mastócitos em uma amostra obtida antes de tratamento. Em algumas modalidades, a atividade dos mas- tócitos no indivíduo ou em uma amostra obtida do indivíduo após o tra- tamento é reduzida comparado com a atividade dos mastócitos no in- divíduo ou em uma amostra obtida antes de tratamento. Em algumas modalidades, um ou ambos de um número ou atividade de mastócitos em uma amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo são reduzidos após administração de uma composição da presente invenção comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição. Em algumas modali- dades, um ou mais de um número, atividade ou localização de mastó- citos em uma amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indiví- duo são reduzidos após administração de uma composição da presen- te invenção comparado com um nível de linha de base antes de admi- nistração da composição.
[0099] Em algumas modalidades, a resposta ao tratamento com uma composição ou anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção é avaliada pelo nível de expressão de um ou mais genes ou polipeptí- deos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de soro) obtida do indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, os níveis de triptase sérica; beta triptase; níveis sanguíneos de triptase, histamina, leucotri- eno e4, prostaglandina D2 e / ou heparina; e/ou os níveis urinários de N-metil-histamina, prostaglandina F2 alfa e/ou prostaglandina D2 do indivíduo são reduzidos, por exemplo, comparado com um nível de linha de base obtido do indivíduo antes de administração da composi- ção ou anticorpo ou comparado com um valor de referência adequado.
[00100] Em algumas modalidades, um ou mais sintomas no indiví- duo são reduzidos após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição. Os sintomas de gastrite e gastroenterite incluem, sem limitação, dor ab-
dominal, náusea, vômito, perda de apetite, cólicas abdominais, pleni- tude antes de terminar uma refeição, distensão, diarreia e fezes líqui- das ou aquosas. Os sintomas de esofagite incluem, sem limitação, azia, náusea, disfagia/dificuldade em engolir, vômitos, dor abdominal, tosse, impactação alimentar, saciedade precoce, perda de apetite, dor no peito, intolerância ou recusa alimentar e refluxo gastroesofágico. Em algumas modalidades, um ou mais sintomas são monitorados usando um questionário de resultado relatado pelo paciente (PRO), o qual pode ser preenchido, por exemplo, diariamente. Em algumas mo- dalidades, um ou mais sintomas são monitorados pela adição ou mé- dia de pontuações de um questionário diário de resultado relatado pelo paciente (PRO) obtido ao longo de um período de tempo, por exemplo, uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas/1 mês, etc. Em algumas modalidades, um ou mais sintomas no indivíduo são reduzidos em pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 65 % após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição, por exemplo, conforme medido pelas pontuações do questionário PRO. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais sintomas no indivíduo são reduzidos em pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 % ou pelo menos 65 % após administração da compo- sição comparado com um nível de linha de base antes de administra- ção da composição, por exemplo, conforme medido pelas pontuações médias ou medianas do questionário PRO ao longo de uma semana, duas semanas, três semanas ou quatro semanas/1 mês.
[00101] Em algumas modalidades, a administração de uma compo- sição ou anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção resulta em uma resposta sustentada ao tratamento. Em algumas modalidades, a ad- ministração de uma composição ou anticorpo da presente invenção resulta em uma resposta completa ao tratamento (por exemplo, após cessação do tratamento ou após uma única dose do anticorpo ou composição).
[00102] Os termos "linha de base" ou "valor de linha de base", usa- dos indistintamente no presente documento, podem referir-se a uma medição ou caracterização de um sintoma antes de administração da terapia (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) ou no início da admi- nistração da terapia. O valor da linha de base pode ser comparado com um valor de referência a fim de determinar a redução ou melhora de um sintoma de gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gas- troenterite mastocística considerada no presente documento. Um valor de referência e/ou valor de linha de base pode ser obtido a partir de um indivíduo, de dois indivíduos diferentes ou de um grupo de indiví- duos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indi- víduos).
[00103] Os termos "referência" ou "valor de referência", usados indistintamente no presente documento, podem referir-se a uma medi- ção ou caracterização de um valor ou sintoma em um indivíduo sem gastrite mastocística ou gastroenterite mastocística (ou em um grupo de tais indivíduos). Um "valor de referência" pode ser um valor absolu- to; um valor relativo; um valor que possui um limite máximo e/ou míni- mo; uma faixa de valores; um valor médio; um valor mediano; um valor médio; ou um valor comparado com um valor de linha de base. Da mesma forma, um "valor de linha de base" pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que possui um limite máximo e/ou mínimo; uma faixa de valores; um valor médio; um valor mediano; um valor médio; ou um valor comparado com um valor de referência. Um valor de referência pode ser obtido a partir de um indivíduo, de dois indiví- duos diferentes ou de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos). Em algumas modali-
dades, um valor de referência refere-se a um valor padrão ou de refe- rência no campo. Em algumas modalidades, um valor de referência refere-se a um valor calculado de novo a partir de um ou mais indiví- duos (por exemplo, sem gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística ou gastroenterite mastocística). C. Administração
[00104] Em algumas modalidades, antes de administração de uma composição ou anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção, o indiví- duo não obteve sucesso ou não obteve um controle adequado por um ou mais tratamentos padrão para esofagite, gastrite e/ou gastroenteri- te. Tratamentos padrão exemplificativos para esofagite, gastrite ou gastroenterite incluem, sem limitação, tratamento com inibidor da bomba de prótons (PPI), tratamento com corticosteroides e tratamento dietético.
[00105] Para prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um agente ativo dependerá do tipo de doença a ser tra- tada, conforme definido acima, da gravidade e do curso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou objetivos terapêuti- cos, terapia anterior, histórico clínico do indivíduo e resposta ao agente e a critério do médico que faz o atendimento. O agente é adequada- mente administrado ao indivíduo de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Em algumas modalidades, um intervalo entre as ad- ministrações de um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) descrito no presente documento é a partir de cerca de um mês ou mais. Em algumas modalidades, o inter- valo entre as administrações é de cerca de 1 mês, cerca de dois me- ses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco me- ses, cerca de seis meses ou mais. Conforme usado no presente do- cumento, um intervalo entre as administrações refere-se ao período de tempo entre uma administração do anticorpo e a próxima administra-
ção do anticorpo.
Conforme usado no presente documento, um inter- valo de cerca de um mês inclui quatro semanas.
Consequentemente, em algumas modalidades, o intervalo entre as administrações é de cerca de quatro semanas, cerca de cinco semanas, cerca de seis se- manas, cerca de sete semanas, cerca de oito semanas, cerca de nove semanas, cerca de dez semanas, cerca de onze semanas, cerca de doze semanas, cerca de dezesseis semanas, cerca de vinte semanas, cerca de vinte e quatro semanas ou mais.
Em algumas modalidades, o tratamento inclui múltiplas administrações do anticorpo, em que o in- tervalo entre as administrações pode variar.
Por exemplo, o intervalo entre a primeira administração e a segunda administração é de cerca de um mês e os intervalos entre as administrações subsequentes são de cerca de três meses.
Em algumas modalidades, o intervalo entre a primeira administração e a segunda administração é de cerca de um mês, o intervalo entre a segunda administração e a terceira adminis- tração é de cerca de dois meses e os intervalos entre as administra- ções subsequentes são de cerca de três meses.
Em algumas modali- dades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado em uma dose fixa.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec- 8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosa- gem de cerca de 0,1 mg a cerca de 1800 mg por dose.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma do- sagem de cerca de 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg e
1800 mg por dose.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 150 mg a cerca de 450 mg por dose.
Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticor- po que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg e 450 mg por dose.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anti- corpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg por do- se.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg por dose.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exem- plo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 1,0 mg/kg.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 descrito no presente documento é administrado a um indiví- duo a uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg ou 10,0 mg/kg.
Qualquer uma das frequências de dosagem descritas acima pode ser usada.
Qualquer frequência de dosagem descrita acima pode ser usa- da nos métodos ou usos das composições descritas no presente do- cumento.
A eficácia do tratamento com um anticorpo descrito no pre-
sente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) pode ser um avaliados usando qualquer uma das metodolo- gias ou ensaios descritos no presente documento em intervalos que variam entre todas as semanas e a cada três meses. Em algumas mo- dalidades, a eficácia do tratamento (por exemplo, redução ou melhora de um ou mais sintomas) é avaliada a cada um mês, a cada dois me- ses, a cada três meses, a cada quatro meses, a cada cinco meses, a cada seis meses ou mais após administração de um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, a eficácia do trata- mento (por exemplo, redução ou melhora de um ou mais sintomas) é avaliada a cada uma semana, a cada duas semanas, a cada três se- manas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas, a cada oito semanas, a cada nove semanas, a cada dez semanas, a cada onze semanas, a cada doze semanas, a cada dezesseis semanas, a cada vinte semanas, a cada vinte e quatro semanas ou mais.
[00106] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 des- crito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo (por exemplo, através de infusão intravenosa) em uma ou mais doses que compreendem en- tre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 4,0 mg/kg do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado a um indivíduo através de infusão intravenosa em uma ou mais doses que compreendem entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, por exemplo, a cerca de 0,3 mg/kg de anticorpo, cerca de 0,5 mg/kg de anticorpo, cer- ca de 1,0 mg/kg de anticorpo, cerca de 1,5 mg/kg de anticorpo, cerca de 2,0 mg/kg de anticorpo, cerca de 2,5 mg/kg de anticorpo ou cerca de 3,0 mg/kg de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, através de infusão intraveno- sa) em duas ou mais doses (por exemplo que compreende entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo) em um intervalo de cerca de 28 dias.
Em algumas modalidades, o anticorpo é administra- do ao indivíduo (por exemplo, através de infusão intravenosa) men- salmente em duas ou mais doses (por exemplo que compreende entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo). Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, através de infusão intravenosa) em duas ou mais doses (por exemplo que compreende entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo) em um intervalo de cerca de 4 semanas.
Em algumas mo- dalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, atra- vés de infusão intravenosa) de acordo com o seguinte cronograma: Dia 1, Dia 29, Dia 57, Dia 85, Dia 113 e Dia 141. Em algumas modali- dades, o anticorpo é administrado ao indivíduo através de infusão in- travenosa em uma primeira dose que compreende cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo e uma sexta do- se que compreende cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anti- corpo.
Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indiví- duo através de infusão intravenosa em uma primeira dose que com- preende cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo e uma sexta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.
Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo através de infusão intravenosa em uma primeira dose que compreende cerca de 0,3 mg/kg do anti- corpo, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do an- ticorpo, uma terceira dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do an- ticorpo, uma quarta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anti- corpo, uma quinta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anti- corpo e uma sexta dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anti- corpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indiví- duo através de infusão intravenosa de acordo com o seguinte crono- grama: cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo no Dia 1, cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo no Dia 29, cerca de 1,0 mg/kg de o anticorpo no Dia 57, cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo no Dia 85, cer- ca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo no Dia 113 e cer- ca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo no Dia 141.
[00107] Os anticorpos descritos no presente documento que se |li- gam à Siglec-8 humana podem ser usados individualmente ou em combinação com outros agentes nos métodos descritos no presente documento. Por exemplo, um anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana pode ser coadministrado com um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) agentes te- rapêuticos adicionais para o tratamento e/ou prevenção de gastrite, esofagite e/ou gastroenterite. Agentes terapêuticos adicionais para tra- tar e/ou prevenir gastrite, esofagite e/ou gastroenterite incluem, sem limitação, PPIs, corticosteroides sistêmicos, corticosteroides tópicos, anti-histamínicos, estabilizantes de mastócitos, bloqueadores H-2, an- ticorpos anti-lgE, inibidores de calcineurina, agentes imunomodulado- res e agentes imunossupressores (por exemplo, azatioprina, 6-MP, MMF e inibidores de MTOR).
[00108] Tais terapias combinadas observadas acima abrangem a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos es- tão incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas)
e administração separada, em cujo caso a administração do anticorpo da presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em al- gumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento e a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de um mês, cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses ou cerca de seis meses entre si. Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento e a administração de um ou mais agentes te- rapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de uma semana, cerca de duas semanas ou cerca de três semanas entre si. Em algumas mo- dalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento e a administração de um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de um dia, cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias ou cerca de seis dias de cada um.
[00109] Os anticorpos anti-Siglec8 e/ou um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais podem ser administrados por meio de qualquer via de administração adequada conhecida na técnica incluindo, sem limi- tação, através da administração oral, administração sublingual, admi- nistração bucal, administração tópica, administração retal, via inalação, administração transdérmica, injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção intravenosa (IV), injeção intra-arterial, injeção intramuscular, inje- ção intracardíaca, injeção intraóssea, injeção intraperitoneal, administra- ção transmucosal, administração vaginal, administração intravítrea, ad- ministração intra-articular, administração periarticular, administração lo- cal, administração epicutânea ou quaisquer combinações das mesmas. D. Anticorpos
[00110] Determinados aspectos da presente invenção fornecem an-
ticorpos isolados que se ligam a uma Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo agonista que se liga à Siglec-8 humana). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente docu- mento tem uma ou mais das seguintes características: (1) se liga a uma Siglec-8 humana; (2) se liga a um domínio extracelular de uma Siglec-8 humana; (3) se liga a uma Siglec-8 humana com uma afinida- de mais elevada do que o anticorpo 2E2 de camundongo e/ou anticor- po 2C4 de camundongo; (4) se liga a uma Siglec-8 humana com uma avidez maior do que o anticorpo 2E2 de camundongo e/ou o anticorpo 2C4 de camundongo; (5) tem uma Tm de cerca de 70 ºC -72 ºC ou su- perior em um ensaio de deslocamento térmico; (6) tem um grau redu- zido de fucosilação ou é não fucosilado; (7) se liga a uma Siglec-8 hu- mana expressa em eosinófilos e induz à apoptose de eosinófilos; (8) se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos; (9) se liga a uma Siglec-8 humana ex- pressa em mastócitos e inibe atividades dependentes de FceRI de mastócitos (por exemplo, liberação de histamina, liberação de PGD?2, fluxo de Ca?* e/ou liberação de B-hexosaminidase, etc.); (10) foi mani- pulado para melhorar a atividade de ADCC; (11) se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e mata mastócitos pela atividade de ADCC (in vitro e/ou in vivo); (12) se liga à Siglec-8 de um ser humano e um primata não humano; (13) se liga ao Domínio 1, Domínio 2 e/ou Domínio 3 da Siglec-8 humana ou se liga a um polipeptídeo de Siglec- 8 que compreende o Domínio 1, Domínio 2 e/ou Domínio 3 da Siglec-8 humana (por exemplo, proteínas de fusão descritas no presente do- cumento); e (14) esgota os eosinófilos ativados com uma ECso menor do que a ECs5o do anticorpo 2E2 ou 2C4 de camundongo.
Qualquer um dos anticorpos descritos na Patente Norte-Americana Nº 9.546.215 e/ou no documento WO2015089117 pode encontrar uso nos métodos, composições e kits fornecidos no presente documento.
[00111] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, a Si- glec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo descrito no presente documento se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito no presente documento se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e inibe a atividade mediada por mastócitos.
[00112] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se |i- gam a uma Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
72. Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. Em algumas modalida- des, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em algumas modali- dades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epíto- po no Domínio 2 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreen- de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algu- mas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, mas não a uma proteína de fusão que compreen- de a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 117, mas não a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Em algumas modali- dades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a uma pro- teína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, mas não a uma proteína de fusão que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116. Em algumas modalida- des, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo linear no domínio extracelular de Siglec-8 humana. Em algumas moda- lidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epí- topo conformacional no domínio extracelular de Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito no presente documento se liga a uma Siglec-8 humana expressa em eosinófilos e induz à apo- ptose de eosinófilos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito no presente documento se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e esgota os mastócitos. Em algumas modalidades, um an- ticorpo descrito no presente documento se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e inibe a atividade mediada por mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito no presente docu- mento se liga a uma Siglec-8 humana expressa em mastócitos e mata mastócitos pela atividade de ADCC. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito no presente documento esgota os mastócitos e inibe a ativação dos mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo no presente documento esgota os eosinófilos ativados e inibe a ativação dos mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo no presente documento (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 não fucosilado) esgota os eosinófilos do sangue e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo no presente documento (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 não fucosilado) esgota os eosinó- filos do sangue periférico e inibe a ativação de mastócitos.
[00113] É fornecido no presente documento um anticorpo anti-
Siglec-8 isolado que se liga à Siglec-8 humana e à Siglec-8 de primata não humano. A identificação de anticorpos com reatividade cruzada de primata seria útil para a testagem pré-clínica de anticorpos anti-Siglec- 8 em primatas não humanos. Em um aspecto, a invenção fornece anti- corpos que se ligam a uma Siglec-8 de primata não humano. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano. Em algumas moda- lidades, a Siglec-8 de primata não humano compreende uma sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, a Siglec-8 de primata não humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o primata não humano é um ba- buíno (por exemplo, Papio anubis). Em algumas modalidades, o anti- corpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana. Em uma outra modalidade, o Domínio 1 de Siglec-8 humana compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e uma Siglec-8 de primata não humano se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana. Em uma outra modalidade, o Domínio 3 de Siglec-8 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
114. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e uma Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo huma- nizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo de murino. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e uma Si- glec-8 de primata não humano é um anticorpo de IgG1 humana.
[00114] Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no pre- sente documento é um anticorpo monoclonal. Em um aspecto, um an-
ticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento é um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação a antígeno), por exemplo, um fragmento Fab, Fab"-SH, Fv, scFv ou (Fab'). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento compreende um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação a antíge- no), por exemplo, um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documen- to é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em um aspecto, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-8 descritos no presente docu- mento são purificados.
[00115] Emum aspecto, são fornecidos anticorpos anti-Siglec-8 que competem com o anticorpo 2E2 de murino e o anticorpo 2C4 de muri- no que se ligam à Siglec-8. Anticorpos anti-Siglec-8 que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo 2E2 de murino e o anticorpo 2C4 de murino também são fornecidos. Os anticorpos de murino anti-Siglec-8, 2E2 e 2C4, são descritos na Patente Norte-Americana Nº 8.207.305; Patente Norte-Americana Nº 8.197.811, Patente Norte-Americana Nº
7.871.612 e Patente Norte-Americana Nº 7.557.191.
[00116] Emum aspecto, são fornecidos anticorpos anti-Siglec-8 que competem com qualquer anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11, 2C4, 2E2) pela ligação à Siglec-8. Também são fornecidos anticorpos anti-Siglec- 8 que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11, 2C4, 2E2).
[00117] Em um aspecto da presente invenção, são fornecidos poli- nucleotídeos que codificam anticorpos anti-Siglec-8. Em determinadas modalidades, são fornecidos vetores que compreendem polinucleotí- deos que codificam anticorpos anti-Siglec-8. Em determinadas modali- dades, são fornecidas células hospedeiras que compreendem tais ve-
7T7IIN7T8 tores. Em outro aspecto da presente invenção, são fornecidas compo- sições que compreendem anticorpos anti-Siglec-8 ou polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-Siglec-8. Em determinadas modalidades, uma composição da presente invenção é uma formulação farmacêuti- ca para o tratamento de gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística. Em determinadas modalidades, uma com- posição da presente invenção é uma formulação farmacêutica para a prevenção de gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mas- tocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroen- terite mastocística.
[00118] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequên- cias HVR do anticorpo 2C4 de murino. Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências de HVR do anticorpo 2E2 de murino. Em algumas modalidades, a HVR é uma CDR de Kabat ou uma CDR de Chothia.
[00119] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequên- cias HVR do anticorpo murino 103. Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências de HVR do anticorpo 4F11 de murino. Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti- Siglec-8 que compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências de HVR do anticorpo 1H10 de murino. Em algumas modalidades, a HVR é uma CDR de Kabat ou uma CDR de Chothia.
[00120] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 2 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.
[00121] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a uma proteína de fusão que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, mas não a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a uma proteína de fusão que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, mas não a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito no presente documento se liga a uma proteína de fusão que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117, mas não a uma proteína de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.
[00122] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 100 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. Em algumas modalida- des, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 2 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
[00123] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 101 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em algumas modalida- des, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 3 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algumas modali- dades, o anticorpo descrito no presente documento se liga à Siglec-8 humana e à Siglec-8 de primata não humano.
[00124] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende
(1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 102 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em algumas modalida- des, o anticorpo descrito no presente documento se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em algumas modali- dades, o anticorpo descrito no presente documento se liga à Siglec-8 humana e Siglec-8 de primata não humano.
[00125] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00126] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos selecio- nada a partir de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00127] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[00128] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos selecio- nada a partir de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[00129] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 100 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103.
[00130] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 101 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104.
[00131] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (1) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 99, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 102 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
[00132] Um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento pode compreender qualquer sequência de domínio variável de região estrutural adequada, contanto que o anticorpo retenha a capacidade de se ligar à Siglec-8 humana. Conforme usado no presente documen- to, as regiões estruturais da cadeia pesada são designadas "HC-FR1- FR4" e as regiões estruturais da cadeia leve são designadas "LC-FR1- FR4". Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma sequência de região estrutural de domínio variável de cadeia pe- sada de SEQ ID NO: 26, 34, 38 e 45 (HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 e HC-FRA, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo an- ti-Siglec-8 compreende uma sequência de região estrutural de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 48, 51, 55 e 60 (LC-FR1, LC- FR2, LC-FR3 e LC-FRA, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma sequência de região estru- tural de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 48, 51, 58 e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 e LC-FRA, respectivamente).
[00133] Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreen- de um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma se- quência de região estrutural e regiões hipervariáveis, em que a se- quência de região estrutural compreende as sequências HC-FR1-HC- FR4 SEQ ID NOs: 26-29 (HC-FR1), SEQ ID NOs: 31-36 (HC-FR2), SEQ ID NOs: 38-43 (HC-FR3) e SEQ ID NOs: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 62; e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de região estrutural e regiões hipervariá- veis, em que a sequência de região estrutural compreende as sequên- cias HO-FRI-HC-FR4 SEQ ID NOs: 26-29 (HC-FR1 ), SEQ ID NOs: 31-36 (HC-FR2), SEQ ID NOs: 38-43 (HC-FR3) e SEQ ID NOs: 45 ou 46 (HC-FRA4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; a HVR-H2 compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 67-70. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um do- mínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de re- gião estrutural e regiões hipervariáveis, em que a sequência de região estrutural compreende as sequências LC-FR1I-LC-FR4 SEQ ID NOs: 48 ou 49 (LC-FR1 ), SEQ ID NOs: 51-53 (LC-FR2), SEQ ID NOs: 55- 58 (LC-FR3) e SEQ ID NO: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; a HVR- L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
66. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de região estrutural e regiões hipervariáveis, em que a sequência de regi- ão estrutural compreende as sequências LC-FR1I-LC-FR4 SEQ ID NOs: 48 ou 49 (LC-FR1 ), SEQ ID NOs: 51-53 (LC-FR2), SEQ ID NOs: 55-58 (LC-FR3) e SEQ ID NO: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR- L1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecio- nada a partir de SEQ ID NOs: 2-10 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de
SEQ ID NOs: 16-22. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2-10 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 23 ou 24. Em uma modalidade destes anti- corpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11-14 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16-22. Em uma modali- dade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compre- ende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11-14 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 23 ou
24. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de ca- deia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade destes anti- corpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e o domínio variável de ca- deia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
21.
[00134] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de ca- deia pesada compreendem o seguinte: a) HVR-H1 (IYGAH (SEQ ID NO: 61); b) HVR-H2 (VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO: 62); e c) HVR-H3 (DGSSPYYYSMEY (SEQ I|D NO: 63) DGSSPYYYGMEY (SEQ ID NO: 67); DGSSPYYYSMDY (SEQ ID NO: 68); DESSPYYYSMEV (SEQ ID NO: 69); ou DGSSPYYYGMDV (SEQ ID NO: 70).
[00135] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de ca-
deia pesada compreendem o seguinte: a) HVR-H1 (SYAMS (SEQ ID NO: 88); DYYMY (SEQ ID NO: 89); ou SSWMN (SEQ ID NO: 90); b) HVR-H2 (ISSGGSYTYYSDSVKG (SEQ ID NO: 91); RI- APEDGDTEYAPKFQG (SEQ ID NO: 92); ou QIYPGDDYTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 93); e c) HVR-H3 (HETAQAAWFAY (SEQ ID NO: 94); EGNYYGSSILDY (SEQ ID NO: 95); ou LGPYGPFAD (SEQ ID NO: 96).
[00136] Em algumas modalidades, as sequências de FR de cadeia pesada compreendem o seguinte: a) HC-FRI (EVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG- FSLT (SEQ ID NO: 26); EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT (SEQ ID NO: 27); QVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS (SEQ |D NO:28); ou QVALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT (SEQ ID NO:29)); b) HC-FR2 (WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 31); WVRQAPGKGLEWLG (SEQ ID NO: 32); WVRQOAPGKGLEWLS (SEQ ID NO: 33); WVRQOAPGKGLEWVG (SEQ ID NO: 34); WIRQPPG IDWIG: 35); ou WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID NO: 36); c) HC-FR3 (RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 38); RLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 39); RLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 40); RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 41); RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 42); ou RLSISKDNSKNQV SLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43); e d) HC-FR4 (WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 45); ou WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 46).
[00137] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de ca-
deia leve compreendem o seguinte: a) HVR-L1 (SATSSVSYMH (SEQ ID NO: 64); b) HVR-L2 (STSNLAS (SEQ ID NO: 65); e c) HVR-L3 (QORSSYPFT (SEQ ID NO: 66); ou QQRSSYPYT (SEQ ID NO: 71).
[00138] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de ca- deia leve compreendem o seguinte: a) HVR-L1 (SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 97); RASQDIT- NYLN (SEQ ID NO: 98); ou SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 99); b) HVR-L2 (DTSKLAY (SEQ ID NO: 100); FTSRLHS (SEQ ID NO: 101); ou DTSSLAS (SEQ ID NO: 102); e c) HVR-L3 (QQWSSNPPT (SEQ ID NO: 103); QOGNTL- PWT (SEQ ID NO: 104); ou QQWNSDPYT (SEQ ID NO: 105).
[00139] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 91 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 92 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; ou uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 93 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
[00140] Em algumas modalidades, as sequências de FR de cadeia leve compreendem o seguinte: a) LC-FR1 (EIVLTOSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 48); ou EIILTOSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 49); b) LC-FR2 (WFQOQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 51); WFQQKPGQAPRLWIY (SEQ ID NO: 52); ou WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 53); c) LC-FR3 (GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 55), GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 56), GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:57); or GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:58)); e d) LC-FR4 (FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 60).
[00141] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo anti- Siglec-8 humanizado) que se liga à Siglec-8 humana, em que o anti-
corpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma ca- deia leve região variável, em que o anticorpo compreende:
(a) um domínio variável de cadeia pesada que compreende:
(1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 26-29;
(2) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 61;
(3) uma HC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 31-36;
(4) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 62;
(5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 38-43;
(6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 63; e
(7) uma HC-FR4 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 45-46,
e/ou
(b) um domínio variável de cadeia leve que compreende:
(1) uma LC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 48-49;
(2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 64;
(3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 51-53;
(4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65;
(5) uma LC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 55-58;
(6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 60.
[00142] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2-10 e/ou que compre- ende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NOs: 16-22. Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2-14 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NOs: 16-24. Em um aspecto, é fornecido no presente do- cumento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio vari- ável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2-10 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NO: 23 ou 24. Em um aspecto, fornecido no presente documento é um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NOs: 11-14 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NOs: 16-22. Em um aspecto, é fornecido no pre- sente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um do- mínio variável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NOs: 11-14 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve sele- cionado a partir de SEQ ID NO: 23 ou 24. Em um aspecto, fornecido no presente documento é um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NO: 16 ou 21.
[00143] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NOs: 106-108 e/ou que com- preende um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NOs: 109-111. Em um aspecto, é fornecido no presente do- cumento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio vari- ável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 106 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 109. Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 107 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 110. Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 108 e/ou que compreende um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 111.
[00144] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variá- vel de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2-14. Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um anticorpo anti- Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 Y%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 106-108. Em algumas modalidades, uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência contém substituições, inserções ou eliminações em relação à sequên- cia de referência, mas um anticorpo que compreende esta sequência de aminoácidos retém a capacidade de se ligar à Siglec-8 humana.
Em algumas modalidades, as substituições, inserções ou eliminações (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 106-108.
[00145] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variá- vel de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16-24. Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um anticorpo anti- Siglec-8 que compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90 Y%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de iden- tidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 109-111. Em algumas modalidades, uma se- quência de aminoácidos que tem pelo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência contém substituições, inserções ou eliminações em relação à sequên- cia de referência, mas um anticorpo que compreende esta sequência de aminoácidos retém a capacidade de se ligar à Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, as substituições, inserções ou eliminações (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) ocorrem em regiões fora das HVRs (ou seja, nas FRs). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 21.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 109-111.
[00146] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende (a) uma, duas ou três HVRs de VH se- lecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 1 e/ou (b) uma, duas ou três HVRs de VL selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 1.
[00147] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende (a) uma, duas ou três HVRs de VH se- lecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 2 e/ou (b) uma, duas ou três HVRs de VL selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 2.
[00148] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende (a) uma, duas, três ou quatro FRs de VH selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 3 e/ou (b) um, dois, três ou quatro FRs de VL selecionadas dentre aquelas mostradas na Tabela 3.
[00149] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende um domínio variá- vel de cadeia pesada e/ou um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo mostrado na Tabela 4, por exemplo, anticorpo HAKA, anti- corpo HAKB, anticorpo HAKC etc. Tabela 1. Sequências de aminoácidos de HVRs de anticorpos Cadeia de anti- HVR1 HVR2 HVR3 corpo anticorpo 2E2 IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS | DGSSPYYYSMEY Cadeia pesada SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:63
SATSSVSYMH STSNLAS QQRSSYPFT Cadeia leve SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:66 Variantes de cadeia pesada humanizadas 2E2 RHA, 2E2 RHB, 2E2 RHC, 2E2 RHD, 2E2 RHE, 2E2 RHF, 2E2 RHG, 2E2 RHA2 e 2E2 RHB2 Cadeia pesada | IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS | DGSSPYYYSMEY
NNE SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:63 Variantes de cadeia leve humanizadas 2E2 RKA, 2E2 RKB, 2E2 RKC, 2E2 RKD, 2E2 RKE, 2E2 RKF e 2E2 RKG
SATSSVSYMH STSNLAS QQRSSYPFT Cadeia leve SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:66 Variantes de cadeia pesada humanizadas 2E2 RHE S-G, 2E2 RHE E-D, 2E2 RHE Y-V e 2E2 RHE triple
IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYGMEY 2E2 RHE S-G SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:67
IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYSMDY SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:68
IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYSMEV 2E2 RHE Y-V SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:69
IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYGMDV 2E2 RHE triple SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:70 Variantes de cadeia leve humanizadas 2E2 RKA F-Y e 2E2 RKF F-Y
SATSSVSYMH STSNLAS QQARSSYPYT 2E2 RKA F-Y SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:71
SATSSVSYMH STSNLAS QQARSSYPYT 2E2 RKF F-Y SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:71 Tabela 2. Sequências de aminoácidos de HVRs de anticorpos 1C3, 1H10 e 4F11 de murino
SYAMS IISSGGSYTYYSDSVKG HETAQAAWFAY 1C3 Cadeia pesada [eo eme Sos onto [ssontoss |
DYYMY RIAPEDGDTEYAPKFOG EGNYYGSSILDY Cadeia pesada jim fomenta Sonhos ssamNos scams |
SSWMN QIYPGDDYTNYNGKFKG LGPYGPFAD Cadeia pesada SEQ ID NO:90 SEQ ID NO:93 SEQ ID NO:96 SASSSVSYMH | DTSKLAY QQWSSNPPT 1C3 Cadeia leve [eo eme oDNoS sonoro | ssamteros | RASQDITNYLN | FTSRLHS QQAGNTLPWT Cadeia leve SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:101 SEQ ID NO:104 SASSSVSYMY | DTSSLAS QQWNSDPYT Cadeia leve SEQ ID NO:99 SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:105
Tabela 3. Sequências de aminoácidos de FRs de anticorpos
Batata pesada RREO RE RREO ER QVOLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT | WVROPPGKGLEWLG | RESISKDNSKSQVFLKINSLOTDDTALYYCAR | WGOGTSVTVSS mo [eo o jGEaDNOaD LGEGDNOS o | ecannona | EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLT | WVROAPGKGLEWVS | RFTISKONSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAR | WGQGTTVTVSS ma Goionaãa o jGeaDNOaN LGEGDNOSA o | icannoss | EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAVSGFSLT | WVROAPGKGLEWLG | RESISKONSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAR | WGQGTTVTVSS qem mana o een [GGEIDNOSS o (SEQloNOAS | (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:45) EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT | WVROAPGKGLEWLS | RFTISKONSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAR | WGOGTTVTVSS emo 5 Guomnoaa o jGEaoNOSS [EGDNOSD o | 'connods | meo Gmomnosa o jGealoNoSa LEGDNOSA o eeanNod) | S (SEQ ID NO:26) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:45) Ns eme faro o GEaNOSD [EDNA [GeoDNGt) | o (SEQ ID NO:26) (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:40) (SEQ ID NO:45) EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT | WVROAPGKGLEWVS | RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR | WGOGTTVTVSS qem Gmoonoaa o jGEoNOal o [EGDNOAD o | 'connods | QVOLOESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS | WIRQPPGKGLEWIG RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR | WGQOGTLVTVSS qm Gannoaa o jGEaDNoas [GEGDNOa o | econnods | QVOLOESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT | WVROPPGKGLEWLG | RLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR | WGOGTLVTVSS qem Gannoaa jGeaNoal [GEGDNOA o | econnods | (SEQ ID NO:26) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:45) EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT | WVROAPGKGLEWVG | RFTISKONSKNTVYLOMNSLRAEDTAVYYCAR | WGOGTTVTVSS qeemsso Guoonoaa o jGEaloNoSO [EGDNOS o | 'connods | (SEQ ID NO:26) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:45)
[Gadeia pesada JRR E E eg O ENO o san ear o SEGIONOAS | Bea fere RR A BR QIILTAOSPAIMSASPGEKVSITC WFQQKPGTSPKLWIY GVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC | FGSGTKLEIK
E E SA EA AA E
EIVLTOSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC FGPGTKLDIK a femeas o man [Gonna o igealnnosa | EIILTOSPATLSLSPGERATLSC WFQOQKPGQAPRLWIY GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC | FGPGTKLDIK [ee senna o mam [amas o gealnhosa | (SEQ ID NO:49) (SEQ ID NO:51) (SEQ ID NO:55) (SEQ ID NO:60)
EIVLTOSPATLSLSPGERATLSC WFQOQKPGQAPRLWIY GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC FGPGTKLDIK [ee sermos o mam [antas o igealhosa | eo eee o mam [Gamma jante | SB (SEQ ID NO:48) (SEQ ID NO:51) (SEQ ID NO:57) (SEQ ID NO:60) o EIVLTOSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC FGPGTKLDIK 3 eo eee o mam [Gantas jante |
EIVLTOSPATLSLSPGERATLSC WYQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC FGPGTKLDIK [ee sermos o mano [GanNoss o igealnnosa | (SEQ ID NO:48) (SEQ ID NO:51) (SEQ ID NO:55) (SEQ ID NO:60) (SEQ ID NO:48) (SEQ ID NO:51) (SEQ ID NO:58) (SEQ ID NO:60)
Tabela 4. Sequências de aminoácidos de regiões variáveis de anticorpos Nome do Anticor-
Nome do Anticor-
Nome do Anticor-
[00150] — Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, as quais têm cadeias pesadas designadas a, ô, e, y e nu, respecti- vamente. As classes y e a são ainda divididas em subclasses com ba- se em diferenças relativamente menores na sequência e função de CH, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes subclasses: Ig9G1, I9gG2, I9gG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os anticorpos I9gG1 podem existir em múltiplas variantes polimórficas denominadas alotipos (revisados em Jefferis e Lefranc 2009. mAbs, Vol. 1 Edição 4; 1-7) qualquer uma das quais é adequada para uso na presente invenção. Variantes alotí- picas comuns em populações humanas são aquelas designadas pelas letras a, f, n, z ou combinações das mesmas. Em qualquer uma das modalidades no presente documento, o anticorpo pode compreender uma região Fc de cadeia pesada que compreende uma região Fc de IgG humana. Em outras modalidades, a região Fc de IgG humana compreende uma IgG1 ou IgG4 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG4. Em algumas modalidades, a IgG4 humana com- preende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice EU conforme em Kabat. Em algumas modalidades, a IIG1 humana compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. Em algumas modalida- des, a IgG4 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.
[00151] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um anticorpo anti-Siglec-8 que compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos seleci- onada a partir de SEQ ID NOs: 76 ou 77. Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; e/ou uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 induz à apoptose de eosinófilos ativados. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec- 8 induz apoptose de eosinófilos em repouso. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota os eosinófilos ativados e inibe a ativação dos mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-8 esgota ou reduz os mastócitos e inibe a ativação dos mastóci- tos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota ou re- duz o número de mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 mata os mastócitos pela atividade de ADCC. Em algumas modalidades, o anticorpo esgota ou reduz os mastócitos que expres- sam Siglec-8 em um tecido. Em algumas modalidades, o anticorpo es- gota ou reduz os mastócitos que expressam Siglec-8 em um fluido bio- lógico.
1. Afinidade de Anticorpo
[00152] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento se liga à Siglec-8 humana com aproximadamente a mesma ou maior afinidade e/ou maior avidez comparado com o anti- corpo 2E2 de camundongo e/ou anticorpo 2C4 de camundongo. Em determinadas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 no presente documento fornecido tem uma constante de dissociação (Ka) de < 1 UM, < 150 nM, < 100 nM, < 50 NM, € 10 NM, € 1 NM, < 0,1 nM, < 0,01 NM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10:86 M ou menos, por exemplo, a par- tir de 108 M a 107º M, por exemplo, a partir de 10º M a 10º M). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento se liga à Siglec-8 humana em cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, afinidade cerca de 7 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 9 vezes ou cerca de 10 vezes maior do que o anticorpo 2E2 de camun- dongo e/ou o anticorpo 2C4 de camundongo. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16 ou
21.
[00153] Em uma modalidade, a afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode ser determinada por meio de um ensaio de resso- nância plasmônica em superfície. Por exemplo, o valor de Ka ou Ka po- de ser medido usando um BlAcore'Y-2000 ou um BlAcore'Y-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 ºC com chips de antígeno CM5 imobilizado em — 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensores de dextrana carboximetilada (CM5, BIAcore& Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi- imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instru- ções do fornecedor. Os anticorpos de captura (por exemplo, Fc anti- humano) são diluídos com acetato de sódio a 10 mM, pH de 4,8, antes de injeção em uma vazão de 30 ul/minuto e posteriormente imobiliza- dos com um anticorpo anti-Siglec-8. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Siglec-8 dimérico são injetadas em PBS com Tween 20 a 0,05 % (PBST) a 25 ºC em uma vazão de aproxima- damente 25 ul/min. As taxas de associação (Kon) e as taxas de dissoci- ação (Ko) são calculadas usando um modelo de ligação de Langmuir simples de um-para-um (BlAcore& Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissoci- ação. A constante de dissociação em equilíbrio (Ka) é calculada como a proporção kos/Kon. Consulte, por exemplo, Chen, Y. et al., (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881.
[00154] Em outra modalidade, a interferometria de biocamada pode ser usada para determinar a afinidade de anticorpos anti-Siglec-8 con- tra a Siglec-8. Em um ensaio exemplificativo, a proteína Singlec-8-Fc marcada é imobilizada em sensores de captura anti-humanos e incu- bada com concentrações crescentes de fragmentos Fab de camun- dongo, quiméricos ou humanizados anti-Siglec-8 para obter medições de afinidade usando um instrumento tal como, por exemplo, o Octet Red 384 System 384 (ForteBio).
[00155] A afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode, por exemplo, também ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980) usando métodos padrão bem conhecidos na técnica relevante. Consulte também Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660 (1947).
2. Avidez de Anticorpos
[00156] Em algumas modalidades, a avidez de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode ser determinada por meio de um ensaio de resso- nância plasmônica em superfície. Por exemplo, o valor de Ka ou Ka pode ser medido usando um BlAcore T100. Anticorpos de captura (por exemplo, Fc anti-humano de cabra e Fc de cabra anti-ccamundongo) são imobilizados em um chip CM5. As células de fluxo podem ser imo- bilizadas com anticorpos anti-humanos ou anti-camundongo. O ensaio é conduzido em uma determinada temperatura e vazão, por exemplo, a 25 ºC em uma vazão de 30 ul/min. Siglec-8 dimérica é diluída em tampão de ensaio em várias concentrações, por exemplo, em uma concentração que varia a partir de 15 nM a 1,88 uM. Os anticorpos são capturados e injeções de alto desempenho são conduzidas, seguido por dissociações. As células de fluxo são regeneradas com um tam- pão, por exemplo, glicina a 50 mM, pH de 1,5. Os resultados são com-
parados com uma célula de referência vazia e múltiplas injeções de tampão de ensaio e analisados com parâmetros de ajuste global de 1:11.
3. Ensaios de Competição
[00157] Os ensaios de competição podem ser usados para deter- minar se dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo que reconhece epítopos idênticos ou estericamente sobrepostos ou um anticorpo inibe competitivamente a ligação de outro anticorpo ao antígeno. Estes en- saios são conhecidos na técnica. Normalmente, o antígeno ou células que expressam antígeno são imobilizadas em uma placa com múlti- plos cavidades e a capacidade de anticorpos não marcados de blo- quear a ligação de anticorpos marcados é medida. Marcadores co- muns para tais ensaios de competição são marcadores radioativos ou marcadores enzimáticos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 descrito no presente documento compete com um anticorpo 2E2 descrito no presente documento pela ligação ao epítopo presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento compete com um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 pela ligação ao epítopo presente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento compete com um anticorpo 2C4 des- crito no presente documento pela ligação ao epítopo presente na su- perfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algu- mas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente do- cumento compete com um anticorpo que compreende um domínio va- riável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (conforme encontrado na Patente Norte-Americana Nº 8.207.305) e uma cadeia leve região variável que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (conforme encontrado na Patente Norte-Americana Nº 8.207.305) pela ligação ao epítopo pre- sente na superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito).
4. Estabilidade Térmica
[00158] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento tem uma temperatura de fusão (Tm) de pelo me- nos cerca de 70 ºC, pelo menos cerca de 71 ºC ou pelo menos cerca de 72 “C em um ensaio de deslocamento térmico. Em um ensaio de deslocamento térmico exemplificativo, as amostras que compreendem um anticorpo anti-Siglec-8 humanizado são incubadas com um corante fluorescente (Sypro Orange) por 71 ciclos com aumento de 1 ºC por ciclo em um termociclador qPCR para determinar a Tm. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 tem uma Tm similar ou superior comparado ao anticorpo 2E2 de camundongo e/ou anticorpo 2C4 de camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos selecio- nada a partir de SEQ ID NOs: 16 ou 21. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 tem a mesmo ou uma Tm mais alta comparado com um anticorpo 2C4 quimérico. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-Siglec-8 tem a mesma ou uma Tm mais alta comparado com um anticorpo que tem uma cadeia pesada que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 e uma cadeia leve que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO : 85.
5. Ensaios de Atividade Biológica
[00159] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 des- crito no presente documento esgota os eosinófilos e inibe os mastóci-
tos. Ensaios para avaliar a apoptose de células são bem conhecidos na técnica, por exemplo, coloração com anexina V e o ensaio TUN- NEL.
[00160] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 des- crito no presente documento induz à atividade de ADCC. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente docu- mento mata eosinófilos que expressam Siglec-8 através de atividade de ADCC. Em algumas modalidades, uma composição compreende anticorpos anti-Siglec-8 não fucosilados (isto é, afucosilados). Em al- gumas modalidades, uma composição que compreende anticorpos anti-Siglec-8 não fucosilados descritos no presente documento aumen- ta a atividade de ADCC contra eosinófilos que expressam a Siglec-8 comparado com uma composição que compreende anticorpos anti- Siglec-8 parcialmente fucosilados. Ensaios para avaliar a atividade de ADCC são bem conhecidos na técnica e descritos no presente docu- mento. Em um ensaio exemplificativo, para medir a atividade de ADCC, células efetoras e células-alvo são usadas. Exemplos de célu- las efetoras incluem células natural killer (NK), linfócitos granulares grandes (LGL), células assassinas ativadas por linfocina (LAK) e PBMCs que compreendem NKs e LGL ou leucócitos com receptores Fc nas superfícies celulares, tais como neutrófilos, eosinófilos e ma- crófagos. As células efetoras podem ser isoladas de qualquer fonte, incluindo indivíduos com uma doença de interesse (por exemplo, gas- trite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística). A célula-alvo é qualquer célula que expressa na superfície celular an- tígenos aos quais os anticorpos a serem avaliados podem reconhecer. Um exemplo de tal célula-alvo é um eosinófilo que expressa Siglec-8 na superfície celular. Outro exemplo de tal célula-alvo é uma linhagem de células (por exemplo, linhagem de células Ramos) que expressa
Siglec-8 na superfície celular (por exemplo, Ramos 2C10)). As células- alvo podem ser marcadas com um reagente que permite a detecção de citólise. Exemplos de reagentes para marcação incluem uma subs- tância radioativa, tal como cromato de sódio (Na2º*CrO4). Consulte, por exemplo, Immunology, 14, 181 (1968); J. Immunol. Methods., 172, 227 (1994); e J. Immunol. Methods., 184,29 (1995).
[00161] Em um ensaio exemplificativo para avaliar a atividade de ADCC e apoptótica de anticorpos anti-Siglec-8 em mastócitos, mastó- citos humanos são isolados de tecidos humanos ou fluidos biológicos de acordo com protocolos publicados (Guhl et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011, 75: 382-384; Kulka et al., em Current Protocols in Immunology, 2001, (John Wiley & Sons, Inc.)) ou diferenciadas de cé- lulas-tronco hematopoiéticas humanas, por exemplo, conforme des- crito por Yokoi et al., J Allergy Clin Immunol., 2008, 121: 499-505. Os mastócitos purificados são ressuspensos em meio RPMI completo em uma placa de fundo em U com 96 cavidades estéril e incubados na presença ou ausência de anticorpos anti-Siglec-8 durante 30 minutos em concentrações que variam entre 0,0001 ng/ml e 10 pg/ml. As amostras são incubadas durante mais 4 a 48 horas com e sem células natural killer purificadas (NK) ou PBL fresco para induzir à ADCC. À morte celular por apoptose ou ADCC é analisada por meio de citome- tria de fluxo usando anticorpos conjugados fluorescentes para detectar mastócitos (CD117 e FcyR1) e Anexina-V e 7AAD para discriminar cé- lulas vivas e mortas ou moribundas. A coloração com Anexina-V e 7AAD é realizada de acordo com as instruções do fabricante.
[00162] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento inibe atividades mediadas por mastócitos. A trip- tase de mastócitos tem sido usada como biomarcador para o número total e ativação de mastócitos. Por exemplo, triptase total e ativa, bem como histamina, N-metil histamina e 11-beta-prostaglandina F2, po-
dem ser medidas no sangue ou na urina para avaliar a redução nos mastócitos. Consulte, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana Nº 20110293631 para um ensaio exemplificativo de atividade de mastócitos. E. Preparação de Anticorpo
[00163] O anticorpo descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) é preparado usando téc- nicas disponíveis na técnica para gerar anticorpos, métodos exemplifi- cativos os quais são descritos em mais detalhes nas seções a seguir.
1. Fragmentos de Anticorpo
[00164] A presente invenção abrange fragmentos de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos podem ser gerados por meios tradicionais, tal como digestão enzimática ou técnicas recombinantes. Em determi- nadas circunstâncias, há vantagens em usar fragmentos de anticor- pos, em vez de anticorpos inteiros. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et a/. (2003) Nat. Med. 9: 129-134.
[00165] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (consulte, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Me- thods 24: 107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamen- te por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos e secretados a partir de E. coli, deste modo, permitindo a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamen- te, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abor- dagem, os fragmentos F(ab'), podem ser isolados diretamente da cul- tura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab'), com meia-vida aumentada in vivo que compreendem um receptor de resgate os resíduos de epítopo de ligação são descritos na Patente Norte-Americana Nº 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para aqueles versados na técnica. Em determinadas modalidades, um anticorpo é um fragmento Fv com uma única cadeia (scFv). Consulte documento WO 93/16185; Patentes Norte-Americanas Nºº 5.571.894; e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são des- providos de regiões constantes; assim, eles podem ser adequados pa- ra ligação não específica reduzida durante o uso in vivo. As proteínas de fusão scFv podem ser construídas para produzir a fusão de uma proteína efetora no terminal amino ou carboxila de um scFv. Consulte Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticor- po também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente Norte-Americana Nº 5.641.870, por exemplo. Es- tes anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
2. Anticorpos Humanizados
[00166] A presente invenção abrange anticorpos humanizados. Vá- rios métodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos no mesmo provenientes de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados como resíduos de "importa- ção" pelo fato de que são, tipicamente, retirados de um domínio variá- vel de "importação". A humanização pode ser essencialmente realiza- da seguindo o método de Winter (Jones et a/. (1986) Nature 321: 522- 525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al.
(1988) Science 239: 1534-1536) substituindo as sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo hu- mano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticor- pos quiméricos (Patente Norte-Americana Nº 4.816.567) em que subs- tancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não hu- mana. Na prática, os anticorpos humanizados são, tipicamente, anti- corpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos da FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
[00167] A escolha de domínios variáveis humanos, leves e pesados a serem usados na produção de anticorpos humanizados pode ser im- portante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método de- nominado "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um an- ticorpo de roedor (por exemplo, camundongo) é rastreada contra toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecidas. À sequência humana que está mais próxima daquela do roedor é, então, aceita como a região estrutural humana para o anticorpo humanizado (Sims et a/. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901. Outro método usa uma região estrutural particular deri- vada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma região estrutural pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferen- tes (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151: 2623.
[00168] É ainda geralmente desejável que os anticorpos sejam hu- manizados com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras pro- priedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências precursoras e vários pro-
dutos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Estão disponíveis programas de compu- tador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imuno- globulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desta forma, os resí- duos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e sequências de importação, de modo que a característica de anticor- po desejada, tal como afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s)- alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão direta e substancialmente envolvidos na influência da ligação a antíge- no.
3. Anticorpos Humanos
[00169] Os anticorpos anti-Siglec-8 humana da presente invenção podem ser construídos ao combinar sequência(s) de domínio variável de clones de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição em fagos derivadas de seres humanos com sequências de domínio cons- tante humano conhecidas. Alternativamente, os anticorpos monoclio- nais anti-Siglec-8 humana da presente invenção podem ser produzidos por meio do método de hibridoma. Linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produ- ção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exem- plo, por Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Mono- clonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51- 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., J. Immu- nol., 147: 86 (1991).
[00170] É possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após a imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a elimina- ção homozigótica do gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e da linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes para a linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após o desafio com antígeno. Consulte, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993).
[00171] O embaralhamento gênico também pode ser usado para derivar anticorpos humanos de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores), onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo não humano inicial. De acordo com este méto- do, o qual também é denominado de "impressão de epítopo", a região variável de cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não humano obtido por meio de técnicas de exibição em fagos, conforme descrito no presente documento, é substituída por um repertório de genes de domínio V humano, criando um população de scFv de cadeia não humana/cadeia humana ou quimeras de Fab. A seleção com antí- geno resulta no isolamento de um scFv ou Fab quimérico de cadeia não humana/cadeia humana, em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação a antígeno destruído após a remoção da cadeia não huma- na correspondente no clone de exibição em fagos primário, ou seja, o epítopo governa a escolha do parceiro da cadeia humana. Quando o processo é repetido para substituir a cadeia não humana remanescen- te, um anticorpo humano é obtido (consulte documento PCT WO
93/06213 publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humaniza- ção tradicional de anticorpos não humanos através de enxertia de CDRs, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, os quais não possuem resíduos de FR ou CDR de origem não humana.
4. Anticorpos Biespecíficos
[00172] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclionais que possuem especificidades de ligação por pelo menos dois antíge- nos diferentes. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecí- ficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em determinadas mo- dalidades, uma das especificidades de ligação é pela Siglec-8 e a ou- tra é por qualquer outro antígeno. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes da Siglec-8. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam a Siglec-8. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticor- pos biespecíficos F(ab')2).
[00173] “Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Consulte Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983), documento WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993 e Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991). Para obter mais detalhes sobre a geração de anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos de ligação cruzada ou "heteroconju- gados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando qualquer método de ligação cruzada conveniente. Agentes de ligação cruzada adequados são bem conhe- cidos na técnica e são descritos na Patente Norte-Americana Nº
4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de ligação cruzada.
5. Anticorpos de Domínio Único
[00174] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente inven- ção é um anticorpo de domínio único. Um anticorpo de domínio único é uma cadeia polipeptídica única que compreende a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em deter- minadas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº 6.248.516 B1). Em uma modalidade, um anticorpo de domínio único consiste na totalidade ou uma parte do domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo.
6. Variantes de Anticorpos
[00175] Em algumas modalidades, e/são considerada(s) a(s) modi- ficação(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente documento. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afi- nidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo podem ser prepa- radas ao introduzir alterações apropriadas na sequência de nucleotí- deos que codifica o anticorpo ou através de síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, eliminações e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticor- po. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, contanto que a construção fi- nal possua as características desejadas. As alterações de aminoáci- dos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do anticorpo em questão no momento em que esta sequência é feita.
[00176] Um método útil para a identificação de determinados resí- duos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagê- nese é denominado de "mutagênese por varredura de alanina", con- forme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-
1085. No presente documento, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negati- vamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Aquelas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são, então, refinadas pela introdução de outras variantes ou outras va- riantes em ou nos locais de substituição. Assim, embora o local para a introdução de uma variação da sequência de aminoácidos seja prede- terminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predetermi- nada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um determinado local, a varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região-alvo e as imunoglobulinas expressas são rastreadas quanto à atividade desejada.
[00177] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila que variam, quanto ao comprimento, a partir de um resíduo a polipeptídeos que contêm cem ou mais resí- duos, bem como inserções intra-sequência de um único ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras varian- tes de inserção da molécula de anticorpo incluem fusão ao N- ou C- término do anticorpo de uma enzima ou polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
[00178] Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem C-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no C- término da cadeia pesada e/ou da cadeia leve. Em algumas modalida- des, a clivagem C-terminal remove uma lisina C-terminal da cadeia pesada. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no N- término da cadeia pesada e/ou da cadeia leve. Em algumas modalida- des, as formas truncadas de anticorpos monoclonais podem ser pro- duzidas por meio de técnicas recombinantes.
[00179] Em determinadas modalidades, um anticorpo da presente invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão até a qual o anticorpo é glicosilado. A glicosilação de polipeptídeos é, tipicamente, N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação de uma porção car- boidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconheci- mento para ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceil- galactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais co- mumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
[00180] A adição ou eliminação de sítios de glicosilação ao anticor- po é convenientemente realizada ao alterar a sequência de aminoáci- dos, de modo que uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligada) sejam criadas ou removi- das. A alteração também pode ser feita pela adição, eliminação ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequên- cia do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligada).
[00181] “Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o carboi- drato ligado à mesma pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que carece de fucose ligada a uma região Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Patente Norte- Americana Nº 2003/0157108 (Presta, L.). Consulte também documento
US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltda.). Anticorpos com uma N-acetilglucosamina (GICNAc) bisseccionada no carboidrato ligado a uma região Fc do anticorpo são citados no documento WO 2003/011878, Je- an-Mairet et al. e Patente Norte-Americana Nº 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarí- deo ligado a uma região Fc do anticorpo são relatados no documento WO 1997/30087, Patel et al. Consulte também documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.) a res- peito de anticorpos com carboidratos alterados ligados à sua região Fc. Consulte também documento US 2005/0123546 (Umana et al.) so- bre moléculas de ligação a antígeno com glicosilação modificada.
[00182] Em determinadas modalidades, uma variante de glicosila- ção compreende uma região Fc, em que uma estrutura de carboidrato ligada à região Fc carece de fucose. Estas variantes melhoraram a função de ADCC. Opcionalmente, a região Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram ainda mais a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração EU dos resíduos). Exemplos de publicações re- lacionadas a anticorpos "desfucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/ 0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336: 1239- 1249 (2004); Yamane-Ohnuki et a/l., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens de células que produzem anticorpos desfucosi- lados incluem células Lec13 CHO deficientes em fucosilação de prote- ínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Pedi- do de Patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., Especialmente no Exemplo 11) e |li-
nhagens de células com silenciamento (knockout), tal como o gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO com silenciamento (knockout) (Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)) e células que superexpressam B1,4-N-acetilglicosminiltransferase Il (GnT-Ill) e Golgi u-manosidase Il (Manil).
[00183] São considerados no presente documento anticorpos que têm fucose reduzida em relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma célula CHO de tipo selvagem. Por exem- plo, o anticorpo tem uma quantidade menor de fucose do que teria se fosse produzido por células CHO nativas (por exemplo, uma célula CHO que produz um padrão de glicosilação nativo, tal como uma célu- la CHO que contém um gene FUT8 nativo). Em determinadas modali- dades, um anticorpo anti-Siglec-8 fornecido no presente documento é aquele em que menos de cerca de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5% ou 1 % dos glicanos N-ligados no mesmo compreendem fucose. Em determinadas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 fornecido no presente documento é aquele em que nenhum dos glicanos N-ligados no mesmo compreende fucose, isto é, em que o anticorpo é comple- tamente sem fucose ou não tem fucose ou é não fucosilado ou é fuco- silado. A quantidade de fucose pode ser determinada ao calcular a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas à Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com elevado teor de mano- se) medido através de espectrometria de massa MALDI-TOF, confor- me descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração EU dos resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de + 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, em virtude de pequenas variações de sequência em anticorpos.
Em algumas modalidades, pelo menos uma ou duas das cadeias pe- sadas do anticorpo não são fucosiladas.
[00184] Em uma modalidade, o anticorpo é alterado para melhorar sua meia-vida sérica. Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação ao receptor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Patente Norte-Americana Nº 5.739.277, por exemplo. Con- forme usado no presente documento, o termo "epítopo de ligação ao re- ceptor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma mo- lécula de IgG (por exemplo, I9gG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsá- vel por aumentar a meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG (docu- mento US 2003/0190311, Patente Norte-Americana Nº 6.821.505; Pa- tente Norte-Americana Nº 6.165.745; Patente Norte-Americana Nº
5.624.821; Patente Norte-Americana Nº 5.648.260; Patente Norte- Americana Nº 6.165.745; Patente Norte-Americana Nº 5.834.597).
[00185] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoá- cido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os locais de interesse para mutagênese por substituição incluem as regi- ões hipervariáveis, mas alterações de FR também são consideradas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 5 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultaaem em uma mudança desejável na atividade biológica, então, mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoáci- dos, podem ser introduzidas e os produtos selecionados. Tabela 5
EO note Te Var meaAS PE qt
[00186] “Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas ao selecionar substituições que diferem signi- ficativamente quanto ao seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutu- ra do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofo- bicidade da molécula no local-alvo ou c) o volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda edição, páginas 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (11) não polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (1), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares sem carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), GIn (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H)
[00187] —Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades em comum da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[00188] As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe. Estes resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais de substituição conservativa ou nos locais restantes (não conservados).
[00189] “Um tipo de variante com substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo pre- cursor (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento posterior terá/terão propriedades biológicas modificadas (por exemplo, aumentadas) em relação ao anticorpo precursor a partir do qual é/são gerada(s). Uma maneira conveniente de gerar tais variantes de substi- tuição envolve a maturação por afinidade usando exibição em fagos. Resumidamente, vários locais da região hipervariável (por exemplo, 6- 7 locais) sofrem mutação para gerar todas as substituições de amino- ácidos possíveis em cada local. Os anticorpos assim gerados são exi- bidos em partículas de fago filamentoso como fusões com pelo menos parte de uma proteína de revestimento de fago (por exemplo, o produ- to do gene Ill de M13) empacotado dentro de cada partícula. As vari- antes exibidas em fagos são, então, rastreadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). A fim de identificar locais da região hipervariável candidatos para modificação, mutagênese de varredura (por exemplo, varredura de alanina) pode ser realizada para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significati- vamente para a ligação a antígeno. Alternativa ou adicionalmente, po- de ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antíge- no-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Estes resíduos de contato e resíduos vizinhos são candida- tos para substituição de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo aqueles elaborados no presente documento. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido à tria- gem usando métodos conhecidas na técnica, incluindo aqueles descri- tos no presente documento, e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para pos- terior desenvolvimento.
[00190] As moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos in- cluem, porém sem limitações, isolamento de uma fonte natural (no ca- so de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação através de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma variante anterior preparada ou uma versão não variante do anti- corpo.
[00191] Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos em uma região Fc de anticorpos da presente invenção, deste modo, gerando uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma subs- tituição) em uma ou mais posições de aminoácidos, incluindo aquela de uma cisteína de dobradiça. Em algumas modalidades, a variante da região Fc compreende uma região Fc de IgG4 humana. Em uma outra modalidade, a região Fc de I9gG4 humana compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são nume- rados de acordo com o índice EU conforme em Kabat.
[00192] De acordo com a presente descrição e os ensinamentos da técnica, considera-se que, em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma ou mais alterações compa- rado com o anticorpo homólogo de tipo selvagem, por exemplo, na re- gião Fc. Estes anticorpos, no entanto, reteriam substancialmente as mesmas características necessárias para a utilidade terapêutica com- parado com sua contraparte de tipo selvagem. Por exemplo, acredita- se que determinadas alterações podem ser feitas na região Fc as quais resultariam na ligação a C1iq alterada (ou seja, aumentada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito no documento WOS99/51642. Consulte também Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente Norte- Americana Nº 5.648.260; Patente Norte-Americana Nº 5.624.821; e documento WO94/29351 para referência a outros exemplos de varian- tes da região Fc. Os documentos VWO00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com liga- ção aumentada ou diminuída a FcRs. O conteúdo destas publicações de patentes é especificamente incorporado ao presente documento a título de referência. Consulte também Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação aumentada ao receptor Fc neonatal (FCcRn), o qual é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)), são descri- tos no documento US2005/0014934A1 (Hinton et a/.). Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições que me-
lhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Variantes polipeptídicas com sequências de aminoácidos da região Fc alteradas e capacidade de ligação a C1g aumentada ou diminuída são descritas na Patente Nor- te-Americana Nº 6.194.551B1, documento WO99/51642. Os conteú- dos destas publicações de patentes são especificamente incorporados ao presente documento a título de referência. Consulte também Iduso- gie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
7. Vetores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes
[00193] Para a produção recombinante de um anticorpo da presen- te invenção, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou pa- ra expressão. O DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar es- pecificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor de- pende, em parte, da célula hospedeira a ser usada. Em geral, as célu- las hospedeiras são de origem procariota ou eucariota (geralmente de mamífero). Será reconhecido que regiões constantes de qualquer iso- tipo podem ser usadas para esta finalidade, incluindo regiões constan- tes de IgG, IgM, IgA, I1gD e IgE, e que tais regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer ser humano ou espécie animal. Geração de Anticorpos Usando Células Hospedeiras Procariotas: a) Construção de Vetores
[00194] As sequências polinucleotídicas que codificam componen- tes polipeptídicos do anticorpo da presente invenção podem ser obti- das usando técnicas recombinantes padrão. As sequências polinucleo- tídicas desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de célu- las produtoras de anticorpos, tais como células de hibridoma. Alterna- tivamente, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando um sin-
tetizador de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólo- gos em hospedeiros procariotas. Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica podem ser usados para fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célu- la hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo ou ambos) e sua compati- bilidade com a célula hospedeira particular na qual ele reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, porém sem limitações: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promo- tor, um sítio de ligação ao ribossomo (RBS), uma sequência sinaliza- dora, a inserção de ácido nucleico heteróloga e uma sequência de término de transcrição.
[00195] Em geral, vetores de plasmídeo que contêm replicon e se- quências de controle que são derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em relação a estes hospedeiros. O vetor normalmente carrega um sítio de replicação, bem como sequên- cias de marcação que são capazes de permitir seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transforma- da usando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. pBR322 contém genes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, portanto, fornece meios fáceis para identificar célu- las transformadas. O pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos também podem conter, ou ser modifica- dos para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de de- rivados de pBR322 usados para a expressão de anticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al., Patente Norte-Americana Nº 5.648.237.
[00196] Além disso, vetores de fago que contêm replicon e sequên- cias de controle que são compatíveis com o micro-organismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em relação a estes hospedeiros. Por exemplo, um bacteriófago, tal como AGEM.TM.-11, pode ser usado na preparação de um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis, tal como E. coli LE392.
[00197] O vetor de expressão da presente invenção pode compre- ender dois ou mais pares promotor-cistron que codificam cada um dos componentes polipeptídicos. Um promotor é uma sequência regulado- ra não traduzida localizada a montante (5') de um cistron que modula sua expressão. Os promotores procariotas normalmente se enqua- dram em duas classes, indutíveis e constitutivos. O promotor indutível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cistron sob o seu controle em resposta a variações na condição de cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma variação na temperatura.
[00198] Um grande número de promotores reconhecidos para uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. O promotor selecionado pode ser operacionalmente ligado ao DNA do cistron que codifica a cadeia leve ou pesada ao remover o promotor do DNA fonte através da digestão com enzimas de restrição e inserir a sequência do promotor isolada no vetor da presente invenção. Tanto a sequência do promotor nativo como muitos promotores heterólogos podem ser usados para controlar a amplificação e/ou expressão dos genes-alvo. Em algumas modalidades, promotores heterólogos são usados, uma vez que geralmente permitem uma maior transcrição e rendimentos mais elevados do gene-alvo expresso comparado com o promotor polipeptídeo-alvo nativo.
[00199] — Promotores adequados para uso com hospedeiros procario- tas incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores de B-galacta- mase e lactose, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac ou trc. No entanto, outros promoto- res que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bac- terianos ou fágicos conhecidos) também são adequados. Suas se- quências de nucleotídeos foram publicadas, deste modo, permitindo que aqueles versados na técnica as ligue operativamente a cistrons que codificam as cadeias leve e pesada-alvo (Siebenlist et a/. (1980) Cell 20: 269) usando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer sítios de restrição necessários.
[00200] Em um aspecto da presente invenção, cada cistron dentro do vetor recombinante compreende um componente de sequência si- nalizadora de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência sinaliza- dora pode ser um componente do vetor ou pode ser uma parte do DNA do polipeptídeo-alvo que é inserido no vetor. A sequência sinali- zadora selecionada para fins da presente invenção deve ser aquela que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras proca- riotas que não reconhecem e processam as sequências sinalizadoras nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência sinalizadora é substituída por uma sequência sinalizadora procariota selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicili- nase, lpp ou líderes termicamente estáveis de enterotoxina Il (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma modalidade da presente invenção, as sequências sinalizadoras usadas em ambos os cistrons do sistema de expressão são sequências sinalizadoras STII ou varian- tes das mesmas.
[00201] Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não requer a presença de sequências sinaliza- doras de secreção dentro de cada cistron. A este respeito, as cadeias leve e pesada de imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Deter- minadas cepas hospedeiras (por exemplo, as cepas trxB de E. coli) fornecem condições citoplásmicas que são favoráveis para a formação de ligações de dissulfeto, deste modo, permitindo o dobramento e montagem adequados de subunidades de proteínas expressas. Proba and Pluckthun, Gene, 159: 203 (1995).
[00202] Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos usando um sistema de expressão no qual a proposta quan- titativa dos componentes polipeptídicos expressos pode ser modulada a fim de maximizar o rendimento de anticorpos secretados e adequa- damente montados da presente invenção. Tal modulação é consegui- da, pelo menos em parte, ao modular simultaneamente as intensida- des de tradução para os componentes polipeptídicos.
[00203] Uma técnica para modular a intensidade de tradução é descrita em Simmons et a/., Patente Norte-Americana Nº 5.840.523. Ele usa variantes da região de início de tradução (TIR) dentro de um cistron. Para uma determinada TIR, uma série de variantes de se- quência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos pode ser criada com uma variedade de intensidades de tradução, deste modo, constituindo um meio conveniente para ajustar este fator para o nível de expressão desejado da cadeia específica. As variantes de TIR podem ser gera- das por meio de técnicas convencionais de mutagênese que resultam em alterações de códons que podem alterar a sequência de aminoáci- dos. Em determinadas modalidades, as mudanças na sequência de nucleotídeos são silenciosas. As alterações naTIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento das sequências de Shine-Dalgarno, juntamente com alterações na sequência sinalizado- ra. Um método para gerar sequências sinalizadoras mutantes é a ge- ração de um "banco de códons" no início de uma sequência codifican- te que não altera a sequência de aminoácidos da sequência sinaliza- dora (ou seja, as alterações são silenciosas). Isto pode ser realizado ao alterar a posição do terceiro nucleotídeo de cada códon; além dis- so, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina e arginina, têm vá- rias primeiras e segundas posições que podem adicionar complexida- de ao fazer o banco. Este método de mutagênese é descrito em deta- lhes em Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4: 151-158.
[00204] Em uma modalidade, um conjunto de vetores é gerado com uma faixa de intensidades de TIR para cada cistron nos mesmos. Este conjunto limitado permite uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeia, bem como o rendimento dos produtos de anticorpos de- sejados sob várias combinações de intensidade de TIR. As intensida- des de TIR podem ser determinadas ao quantificar o nível de expres- são de um gene repórter, conforme descrito em detalhes em Simmons et al., Patente Norte-Americana Nº 5.840.523. Com base na compara- ção da intensidade de tradução, as TIRs individuais desejadas são se- lecionadas para serem combinadas nas construções de vetor de ex- pressão da presente invenção.
[00205] Células hospedeiras procariotas adequadas para expressar anticorpos da presente invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, espécies de Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia mar- cescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Para-
coccus. Em uma modalidade, células Gram-negativas são usadas. Em uma modalidade, células de E. coli são usadas como hospedeiros para a presente invenção. Exemplos de cepas de E. coli incluem a cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washing- ton, DC: American Society for Microbiology, 1987), páginas 1190-1219; Depósito ATCC Nº 27.325) e seus derivados, incluindo a cepa 33D3 que tem o genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Ig lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente Norte-Americana Nº 5.63***). Outras cepas e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. coli A 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308 (ATCC 31.608) também são adequadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limita- tivos. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma das bactérias supracitadas com genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Em geral, é necessário selecionar a bactéria apropriada levan- do em consideração a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies de E. coli, Serratia ou Salmonella po- dem ser adequadamente usadas como hospedeiros quando plasmí- deos bem conhecidos, tais como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410, são usados para fornecer o replicon. Normalmente, a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíti- cas e inibidores de protease adicionais podem desejavelmente ser in- corporados na cultura de células. b) Produção de Anticorpos
[00206] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meio nutriente conven- cional modificado conforme apropriado para induzir promotores, sele- cionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as se- quências desejadas.
[00207] Transformação significa introduzir DNA no hospedeiro pro-
cariota de modo que o DNA seja replicável, seja como um elemento extracromossômico ou por um integrante cromossômico. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio que emprega cloreto de cálcio é geralmente usado para células bacteria- nas que contêm barreiras de parede celular substanciais. Outro méto- do de transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Ainda outra técnica usada é a eletroporação.
[00208] As células procariotas usadas para produzir os polipeptí- deos da presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e adequados para a cultura das células hospedeiras selecio- nadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo de Luria (LB) mais os suplementos de nutrientes necessários. Em algumas modali- dades, o meio também contém um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procariotas que contêm o vetor de expres- são. Por exemplo, ampicilina é adicionada ao meio para o crescimento de células que expressam o gene resistente à ampicilina.
[00209] “Quaisquer suplementos necessários além de fontes de car- bono, nitrogênio e fosfato inorgânico também podem ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidas isoladamente ou como uma mistura com outro suplemento ou meio, tal como uma fonte complexa de nitrogênio. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
[00210] As células hospedeiras procariotas são cultivadas em tem- peraturas adequadas. Em determinadas modalidades, para o cresci- mento de E. coli, as temperaturas de crescimento variam a partir de cerca de 20 ºC a cerca de 39 ºC; a partir de cerca de 25 “ºC a cerca de 37 ºC; ou cerca de 30 ºC. O pH do meio pode ser qualquer pH que va-
ria a partir de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Em determinadas modalidades, para E. coli, o pH é a partir de cerca de 6,8 a cerca de 7,4 ou cerca de 7,0.
[00211] Se um promotor indutível é usado no vetor de expressão da presente invenção, a expressão da proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção, promotores PhoA são usados para controlar a transcrição dos polipeptídeos. Consequentemente, as células hospedeiras trans- formadas são cultivadas em um meio limitante de fosfato para indução. Em determinadas modalidades, o meio limitante de fosfato é o meio C.R.A.P. (consulte, por exemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com a construção de vetor empregada, conforme é conhecido na técnica.
[00212] Em uma modalidade, os polipeptídeos expressos da pre- sente invenção são secretados e recuperados do periplasma das célu- las hospedeiras. A recuperação de proteínas envolve, tipicamente, a destruição do micro-organismo, geralmente através de meios tais co- mo choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que as células são rompidas, os resíduos celulares ou células inteiras podem ser removi- dos através de centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser pos- teriormente purificadas, por exemplo, por meio de cromatografia em resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser trans- portadas para o meio de cultura e isoladas do mesmo. As células po- dem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser ainda isolados e identificados usando métodos comumente conhecidos, tais como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio de Western blot.
[00213] Em um aspecto da presente invenção, a produção de anti-
corpos é conduzida em grande quantidade através de um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação descontínua em grande escala estão disponíveis para a produção de proteínas recom- binantes. Fermentações em grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade e, em determinadas modalidades, cerca de 1.000 a
100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores usam impulsores agitadores para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose. A fermentação em pequena escala refere-se geralmente à fermenta- ção em um fermentador que não tem mais do que aproximadamente 100 litros de capacidade volumétrica e pode variar a partir de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
[00214] Em um processo de fermentação, a indução da expressão da proteína é, tipicamente, iniciada após as células terem crescido sob condições adequadas até uma densidade desejada, por exemplo, uma ODss5o de cerca de 180-220, estágio no qual as células estão na fase estacionária inicial. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordo com a construção de vetor empregada, conforme é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas durante períodos mais curtos antes da indução. As células são, em geral, indu- zidas durante cerca de 12-50 horas, embora um tempo de indução mais longo ou mais curto possa ser usado.
[00215] Para melhorar o rendimento da produção e a qualidade dos polipeptídeos da presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para melhorar a montagem e o dobramento adequados dos polipeptídeos de anticorpo secretados, vetores adicionais que superexpressam proteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FKpA (uma peptidilprolil cis,trans-isomerase com atividade de chaperona) pode ser usado para cotransformar as células procariotas hospedeiras. Foi demonstrado que as proteínas chaperonas facilitam o dobramento adequado e a solubilidade de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et a/l., Patente Norte-Americana Nº 6.083.715; Georgiou et al., Patente Norte-Americana Nº 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) Ju. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Micro- biol. 39: 199-210.
[00216] Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas ex- pressas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), determinadas cepas hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, as cepas de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar muta- ção(ões) genética(s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease Ill, OmpT, DegP, Tsp, Protease |, Pro- tease Mi, Protease V, Protease VI e combinações das mesmas. Algu- mas cepas deficientes em protease de E. coli estão disponíveis e são descritas, por exemplo, em Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Patente Norte-Americana Nº 5.264.365; Georgiou et a/l., Patente Norte- Americana Nº 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63- 72 (1996).
[00217] Em uma modalidade, cepas de E. coli deficientes em enzi- mas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que superexpres- sam uma ou mais proteínas chaperonas são usadas como células hospedeiras no sistema de expressão da presente invenção. c) Purificação de Anticorpo
[00218] Em uma modalidade, a proteína de anticorpo produzida no presente documento é adicionalmente purificada para obter prepara- ções que são substancialmente homogêneas para outros ensaios e usos. Métodos padrão de purificação de proteínas conhecidos na téc- nica podem ser empregados. Os procedimentos a seguir são exem-
plos de procedimentos de purificação adequados: fracionamento por imunoafinidade ou colunas de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, tal como DEAE, cromatofocalização, SDS-PAGE, pre- cipitação com sulfato de amônio e filtração em gel usando, por exem- plo, Sephadex G-75.
[00219] Em um aspecto, proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade dos produtos de anticorpo da presente invenção. A proteína A é uma proteína da parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se liga com alta afinidade à região Fc dos anticorpos. Lindmark et a/. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13. A fase sólida na qual a proteína A é imobilizada pode ser uma coluna que compreende uma superfície de vidro ou sílica ou uma co- luna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol, para possivelmente prevenir a aderência inespecífica de con- taminantes.
[00220] “Como a primeira etapa de purificação, uma preparação de- rivada da cultura de células, conforme descrito acima, pode ser aplica- da em uma fase sólida imobilizada com Proteína A para permitir a liga- ção específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida seria, então, lavada para remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse é recupera- do da fase sólida através de eluição. Geração de Anticorpos Usando Células Hospedeiras Eucariotas:
[00221] “Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariota ge- ralmente inclui um ou mais dos seguintes componentes não limitativos: uma sequência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de término de transcrição.
a) Componente Sequência Sinalizadora
[00222] Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariota também pode conter uma sequência sinalizadora ou outro polipeptídeo que tem um sítio de clivagem específico no N-término da proteína ma- dura ou polipeptídeo de interesse. A sequência sinalizadora heteróloga selecionada pode ser aquela que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Na expressão de células de mamíferos, estão disponíveis sequências si- nalizadoras de mamífero, bem como líderes secretores virais, por exemplo, o sinal gD do Herpes simplex. O DNA para tal região precur- sora é ligado ao quadro de leitura do DNA que codifica o anticorpo. b) Origem de Replicação
[00223] Em geral, um componente origem de replicação não é ne- cessário para vetores de expressão de mamíferos. Por exemplo, a ori- gem de SV40 normalmente pode ser usada apenas, uma vez que con- tém o promotor inicial. c) Seleção do Componente Gene
[00224] Os vetores de expressão e clonagem podem conter um ge- ne de seleção, também denominado marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a an- tibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampiícilina, neomicina, meto- trexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevante ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos.
[00225] Um exemplo de um esquema de seleção usa um medica- mento para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a medica- mentos e, portanto, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam os medicamentos neomicina, ácido micofe-
nólico e higromicina.
[00226] Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico do anticorpo, tais como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-l e -ll, genes de me- talotioneína, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase de prima- ta, etc.
[00227] Por exemplo, em algumas modalidades, as células trans- formadas com o gene de seleção de DHFR são primeiro identificadas pela cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira apropriada quando DHFR de tipo selvagem é empregado é a linhagem de células de ová- rio de hamster Chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).
[00228] —Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hos- pedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transforma- das ou cotransformadas com sequências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador selecio- nável, tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH), pode ser selecionadas através de crescimento celular em meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibió- tico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Consulte Patente Norte-Americana Nº 4.965.199. As células hospedei- ras podem incluir NSO0, CHOK1, CHOK1SV ou derivados, incluindo li- nhagens de células deficientes em glutamina sintetase (GS). Métodos para uso de GS como um marcador selecionável para células de ma- miíferos são descritos na Patente Norte-Americana Nº 5.122.464 e Pa- tente Norte-Americana Nº 5.891.693.
d) Componente Promotor
[00229] Os vetores de expressão e clonagem geralmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um anticorpo). Sequências promotoras são conhecidas para eucariotas. Por exemplo, virtualmente todos os genes eucariotas têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcri- ção de muitos genes é uma região CNCAAT, onde N pode ser qual- quer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariotas está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência codificante. Em determi- nadas modalidades, qualquer uma ou todas estas sequências podem ser inseridas adequadamente em vetores de expressão eucariotas.
[00230] A transcrição de vetores em células hospedeiras de mamí- feros é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus, tais como vírus polioma, vírus da varíola, adenoví- rus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sar- coma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e ví- rus Simian 40 (SV40), promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, promotores de choque térmico, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
[00231] Os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 são conve- nientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente ob- tido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para ex- pressar DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus do papiloma bovino como um vetor é descrito na Patente Norte-Americana Nº
4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente Nor- te-Americana Nº 4.601.978. Consulte também Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982), o qual descreve a expressão de cDNA de interfe- ron B humano em células de camundongo sob o controle de um pro- motor de timidina quinase do vírus do Herpes simplex. Alternativamen- te, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor. e) Componente Elemento Intensificador
[00232] A transcrição de DNA que codifica um anticorpo da presen- te invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada pela inserção de uma sequência intensificadora no vetor. Muitas se- quências intensificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Normalmente, no entanto, deverá ser usado um intensificador de um vírus de células eucariotas. Exemplos incluem o intensificador de SVA40 no lado posterior da origem de replicação (pb 100-270), o inten- sificador do promotor precoce de citomegalovírus humano, o intensifi- cador do promotor precoce de citomegalovírus de camundongo, o in- tensificador de polioma no lado posterior da origem de replicação e intensificadores adenovirais. Consulte também Yaniv, Nature 297: 17- 18 (1982) que descreve elementos intensificadores para ativação de promotores eucariotas. O intensificador pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou 3' à sequência codificante do polipeptídeo do anti- corpo, mas geralmente está localizado em um local 5' do promotor. f) Componente de Término de Transcrição
[00233] Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucariotas também podem conter sequências necessárias para térmi- no da transcrição e para estabilizar o MRNA. Estas sequências estão normalmente disponíveis nas regiões não traduzidas 5' e, ocasional-
mente, 3', de DNAs ou cDNAs eucariotas ou virais. Estas regiões con- têm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliade- nilados na porção não traduzida do MRNA que codifica um anticorpo. Um componente de término de transcrição útil é a região de poliadeni- lação do hormônio de crescimento bovino. Consulte documento WO94/11026 e o vetor de expressão no presente documento descrito. g) Seleção e Transformação de Células Hospedeiras
[00234] As células hospedeiras adequadas para clonar ou expres- sar o DNA nos vetores do presente documento incluem células eucari- otas superiores descritas no presente documento, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et a/., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster Chinês/- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TMA4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL- 1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; células CHOK1, células CHOK1ISV ou derivados e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[00235] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima para a produção de anti- corpos e cultivadas em meio nutriente convencional modificado con- forme apropriado para induzir a promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.
h) Cultivo de Células Hospedeiras
[00236] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis, tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são ade- quados para a cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Bar- nes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes Norte-Americanas Nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; docu- mentos WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente RU 30.985 podem ser usados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qual- quer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como clore- to de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES ), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o medicamento GENTAMYCIN'Y), oligoelementos (definidos como com- postos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos também podem ser incluídos em con- centrações apropriadas que serão conhecidas por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e as- sim por diante, são aquelas previamente usadas com a célula hospe- deira selecionada para expressão e serão evidentes para aqueles ver-
sados na técnica. i) Purificação do Anticorpo
[00237] Ao usar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser pro- duzido intracelularmente ou diretamente secretado no meio. Se o anti- corpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os detritos em partículas, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisa- dos, podem ser removidos, por exemplo, por meio de centrifugação ou ultrafiltração. Quando o anticorpo é secretado para o meio, os sobre- nadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiro concen- trados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Milli- pore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser inclu- ído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de con- taminantes adventícios.
[00238] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxila- patita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, a cro- matografia de afinidade sendo uma técnica conveniente. A adequa bili- dade da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja pre- sente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticor- pos que são com base nas cadeias pesadas y1, y2 ou y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Methods 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para y3 huma- no (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A matriz à qual o ligan- te de afinidade está ligado pode ser agarose, mas outras matrizes es- tão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro com tamanho de poros controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem vazões mais rápidas e tempos de processamento mais cur-
tos do que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX'TY (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purifica- ção de proteínas, tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSEY, cromatografia em resina de troca catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de áci- do poliaspártico), cromatografia por SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amônio também estão disponíveis, dependendo do anticor- po a ser recuperado.
[00239] Após qualquer/quaisquer etapa(s) de purificação prelimi- nar(es), a mistura que compreende o anticorpo de interesse e conta- minantes pode ser submetida à purificação adicional, por exemplo, através de cromatografia de interação hidrofóbica sob baixo pH usan- do um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, realizada em baixas concentrações de sal (por exemplo, a partir de cerca de 0- 0,25 M de sal).
[00240] Em geral, várias metodologias para a preparação de anti- corpos para uso em pesquisa, teste e uso clínico estão bem estabele- cidas na técnica, consistentes com as metodologias descritas acima e/ou conforme considerado apropriado por aqueles versados na técni- ca para um anticorpo particular de interesse. Produção de Anticorpos Não Fucosilados
[00241] São fornecidos no presente documento métodos para a preparação de anticorpos com um grau reduzido de fucosilação. Por exemplo, os métodos considerados no presente documento incluem, porém sem limitações, o uso de linhagens de células deficientes em fucosilação de proteínas (por exemplo, células Lec13 CHO, células CHO com silenciamento do gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, células que superexpressam B1,4-N-acetilglicosminiltransferase Ill e superex-
pressão adicional de u-manosidase || de Golgi, etc.) e adição de (um) análogo(s) de fucose a um meio de cultura de células usado para a produção dos anticorpos. Consulte Ripka et al., Arc. Biochem. Bi- ophys. 249: 533-545 (1986); Pedido de Patente Norte-Americana Nº 2003/0157108 A1, Presta, L; documento WO 2004/056312 A1; Yama- ne-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); e Patente Norte- Americana Nº 8.574.907. Técnicas adicionais para reduzir o teor de fucose de anticorpos incluem a tecnologia Glymaxx descrita na Publi- cação de Pedido de Patente Norte-Americana Nº 2012/0214975. Téc- nicas adicionais para reduzir o teor de fucose de anticorpos também incluem a adição de um ou mais inibidores de glicosidase a um meio de cultura de células usado para a produção dos anticorpos. Inibidores de glicosidase incluem a-glucosidase |, a-glucosidase || e a-manosi- dase |. Em algumas modalidades, o inibidor de glicosidase é um inibi- dor de a-manosidase | (por exemplo, kifunensina).
[00242] “Conforme usado no presente documento, "fucosilação de núcleo" refere-se à adição de fucose ("fucosilação") à N-acetilglu- cosamina ("GIcNAc'") no término redutor de redução de um glicano N- ligado. Também são fornecidos anticorpos produzidos por tais méto- dos e composições dos mesmos.
[00243] Em algumas modalidades, a fucosilação de cadeias de açúcar complexas ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc (ou do- mínio) é reduzida. Conforme usado no presente documento, uma "ca- deia de açúcar complexa ligada a N-glicosídeo" é tipicamente ligada à asparagina 297 (de acordo com a numeração de Kabat), embora uma cadeia de açúcar complexa ligada a N-glicosídeo também possa ser ligada a outros resíduos de asparagina. Uma "cadeia de açúcar com- plexa ligada a N-glicosídeo" exclui um tipo de cadeia de açúcar com um elevado teor de manose, em que apenas manose é incorporada no término não redutor da estrutura do núcleo, mas inclui 1) um tipo com-
plexo, em que o lado terminal de redução da estrutura central tem um ou mais ramos de galactose-N-acetilglucosamina (também denomina- do como "gal-GIcNAc") e o lado terminal não redutor de Gal-GIcNAc tem opcionalmente um ácido siálico, N-acetilglucosamina bissecionada ou similar; ou 2) um tipo híbrido, em que o lado terminal não redutor da estrutura central tem tanto o ramo da cadeia de açúcar ligada a N- glicosídeo com elevado teor de manose como a cadeia de açúcar complexa ligada a N-glicosídeo.
[00244] Em algumas modalidades, a "cadeia de açúcar complexa ligada a N-glicosídeo" inclui um tipo complexo em que o lado terminal não redutor da estrutura do núcleo tem zero, um ou mais ramos de ga- lactose-N-acetilglucosamina (também denominado como "gal-GIcNAc") e o lado terminal não redutor de Gal-GIcNAc tem opcionalmente ainda uma estrutura tal como um ácido siálico, N-acetilglucosamina bisseci- onada ou similar.
[00245] De acordo com os presentes métodos, normalmente ape- nas uma pequena quantidade de fucose é incorporada na(s) cadeia(s) de açúcar complexa(s) ligada(s) a N-glicosídeo. Por exemplo, em vá- rias modalidades, menos do que cerca de 60 %, menos do que cerca de 50 %, menos do que cerca de 40 %, menos do que cerca de 30 %, menos do que cerca de 20 %, menos do que cerca de 15 %, menos do que cerca de 10 %, menos do que cerca de 5 % ou menos do que cer- ca de 1 % do anticorpo tem fucosilação de núcleo por fucose em uma composição. Em algumas modalidades, substancialmente nenhuma parte (isto é, menos de cerca de 0,5 %) do anticorpo tem fucosilação de núcleo por fucose em uma composição. Em algumas modalidades, mais do que cerca de 40 %, mais do que cerca de 50 %, mais do que cerca de 60 %, mais do que cerca de 70 %, mais do que cerca de 80 %, mais do que cerca de 90 %, mais do que cerca de 91 %, mais do que cerca de 92 %, mais do que cerca de 93 %, mais do que cerca de
94 %, mais do que cerca de 95 %, mais do que cerca de 96 %, mais do que cerca de 97 %, mais do que cerca de 98 % ou mais do que cerca de 99 % do anticorpo não são fucosilados em uma composição.
[00246] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um anticorpo em que substancialmente nenhuma (ou seja, me- nos de cerca de 0,5 %) das cadeias de carboidrato ligadas a N- glicosídeo contém um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um anticorpo em que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo são não fucosiladas.
[00247] Conforme descrito acima, uma variedade de sistemas de vetores de expressão de hospedeiros mamíferos podem ser usados para expressar um anticorpo. Em algumas modalidades, o meio de cultura não é suplementado com fucose. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um análogo de fucose é adicionada ao meio de cultura. Neste contexto, uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade do análogo que é suficiente para diminuir a incorporação de fucose em uma cadeia de açúcar complexa ligada a N-glicosídeo de um anticorpo em pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de %, em pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 % ou pelo menos cerca de 50 %. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos por meio dos presentes métodos compreendem pelo me- nos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de %, pelo menos cerca de 40 % ou pelo menos cerca de 50 % de proteína fucosilada não nuclear (por exemplo, sem fucosilação no nú- cleo), comparado com os anticorpos produzidos a partir das células hospedeiras cultivadas na ausência de um análogo de fucose.
[00248] O teor (por exemplo, a proporção) de cadeias de açúcar nas quais a fucose não está ligada à N-acetilglucosamina na extremi- dade redutora da cadeia de açúcar versus cadeias de açúcar nas quais a fucose está ligada à N-acetilglucosamina na extremidade redu-
tora da cadeia de açúcar pode ser determinado, por exemplo, confor- me descrito nos Exemplos. Outros métodos incluem hidrazinólise ou digestão enzimática (consulte, por exemplo, Biochemical Experimenta- tion Methods 23: Method for Stud Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), editado por Reiko Takahashi (1989)), mar- cação com fluorescência ou marcação com radioisótopo da cadeia de açúcar liberada, em seguida, separação da cadeia de açúcar marcada por cromatografia. Além disso, as composições das cadeias de açúcar liberadas podem ser determinadas ao analisar as cadeias através do método HPAEC-PAD (consulte, por exemplo, J. Lig Chromatogr. 6: 1557 (1983)). (consulte a Publicação do Pedido de Patente Norte- Americana Nº 2004/0110282.).
Ill. Composições
[00249] Em alguns aspectos, também são fornecidas no presente documento composições (por exemplo, composições farmacêuticas) que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-8 descritos no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Si- glec-8). Em alguns aspectos, é fornecida no presente documento uma composição que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento, em que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de cerca de 50 % das cadeias de carboidratos ligadas a N- glicosídeos contêm um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos liga- das a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de cerca de 45 %, cerca de 40 %, cerca de 35 %, cerca de 30 %, cerca de 25 %, cer- ca de 20 % ou cerca de 15 % das cadeias de carboidratos ligadas a N- glicosídeo contêm um resíduo de fucose. Em alguns aspectos, é for- necida no presente documento uma composição que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento, em que o an-
ticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que substancialmente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo contêm um resíduo de fucose.
[00250] As formulações terapêuticas são preparadas para armaze- namento ao misturar o ingrediente ativo que tem o grau de pureza de- sejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington: The Science and Practice of Phar- macy, 20º Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro Ed., Fila- délfia, Pa. 2000). Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações usadas e incluem tampões, antioxidantes, incluindo ácido ascórbico, metionina, vitamina E, metabissulfito de sódio; conservantes, isotonici- ficantes, estabilizantes, complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); agentes quelantes, tais como EDTA e/ou tensoativos não iônicos.
[00251] “Tampões podem ser usados para controlar o pH em uma faixa que otimiza a eficácia terapêutica, especialmente se a estabilida- de for dependente do pH. Os tampões podem estar presentes em con- centrações que variam a partir de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM. Agentes de tamponamento adequados para uso com a presente in- venção incluem ácidos orgânicos e inorgânicos e sais dos mesmos. Por exemplo, citrato, fosfato, succinato, tartarato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Além disso, os tampões podem ser constituí- dos por sais de histidina e trimetilamina, tal como Tris.
[00252] Conservantes podem ser adicionados para prevenir o cres- cimento microbiano e estão, tipicamente, presentes em uma faixa de cerca a partir de 0,2 % -1,0 % (p/v). Conservantes adequados para uso com a presente invenção incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; halogenetos de benzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de benzetônio; timerosal, fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol, 3-pentanol e m- cresol.
[00253] Agentes de tonicidade, algumas vezes conhecidos como "estabilizantes", podem estar presentes para ajustar ou manter a toni- cidade do líquido em uma composição. Quando usados com biomolé- culas grandes e carregadas, tais como proteínas e anticorpos, eles são frequentemente denominados "estabilizantes" porque podem inte- ragir com os grupos carregados das cadeias laterais de aminoácidos, deste modo, diminuindo o potencial para interações inter e intramole- culares. Os agentes de tonicidade podem estar presentes em qualquer quantidade entre cerca de 0,1 % a cerca de 25 % em peso ou entre cerca de | a cerca de 5 % em peso, levando em consideração as quantidades relativas dos outros ingredientes. Em algumas modalida- des, os agentes de tonicidade incluem álcoois de açúcar poli-hídricos, tri-hídricos ou álcoois de açúcar superiores, tais como glicerina, eritri- tol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.
[00254] —Excipientes adicionais incluem agentes que podem servir como um ou mais dos seguintes: (1) agentes de volume, (2) intensifi- cadores de solubilidade, (3) estabilizantes e (4) e agentes que evitam a desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Estes excipientes incluem: álcoois de açúcar poli-hídricos (enumerados acima); aminoá- cidos, tais como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, argi- nina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc.; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, tais como sacarose, lactose, lactitol, trealose, estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (por exemplo, inositol), polietileno glicol; agentes redutores que contêm enxofre, tais como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio,
tioglicerol, a-monotioglicerol e tio sulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular, tais como albumina de soro humano, albumina de so- ro bovino, gelatina ou outras imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; monossacarídeos (por exemplo, xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos (por exemplo, lactose, malto- se, sacarose); trissacarídeos, tal como rafinose; e polissacarídeos, tais como dextrina ou dextrana.
[00255] “Tensoativos não iônicos ou detergentes (também conheci- dos como "agentes umectantes") podem estar presentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem como para proteger a proteína terapêutica contra a agregação induzida por agitação, o que também permite que a formulação seja exposta a tensão superficial de cisa- lhamento sem causar desnaturação da proteína ou anticorpo terapêu- tico ativo. Os tensoativos não iônicos estão presentes em uma faixa a partir de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml ou cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml. Em algumas modalidades, os tensoativos não iônicos estão presentes em uma faixa a partir de cerca de 0,001 % a cerca de 0,1 % p/v ou cerca de 0,01 % a cerca de 0,1 % p/v ou cerca de 0,01 % a cerca de 0,025 % p/v.
[00256] Tensoativos não iônicos adequados incluem polissorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), polióis PLURO- NICG, TRITONGO, monoéteres de polioxietileno sorbitano (TWEENQG-20, TWEENG-80, etc.), lauromacrogo! 400, polioxil 40 estearato, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de gli- cerol, éster de ácido graxo de sacarose, metilcelulose e carboximetil- celulose. Detergentes aniônicos que podem ser usados incluem lauril sulfato de sódio, dioctil sulfosuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiônicos incluem cloreto de benzalcônio ou clore- to de benzetônio.
[00257] Para que as formulações sejam usadas para administração in vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por meio de filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições terapêuticas no presente documento geralmente são co- locadas em um recipiente com uma abertura de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00258] A via de administração está de acordo com métodos co- nhecidos e aceitos, tal como através de um bolus único ou múltiplo ou infusão durante um longo período de tempo de uma maneira adequa- da, por exemplo, injeção ou infusão por via subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, vias intra-arterial, intralesional ou intra- articular, administração tópica, inalação ou por meio de liberação sus- tentada ou liberação prolongada. Em algumas modalidades, uma composição ou anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção é admi- nistrado através de infusão intravenosa uma vez por mês durante 3 ou mais meses. Em algumas modalidades, uma composição ou anticorpo anti-Siglec-8 da presente invenção é administrado através de infusão intravenosa uma vez por ciclo (por exemplo, no Dia 1) por 1,2,3,4,5 ou 6 ciclos, em que cada ciclo tem 1 mês, 4 semanas ou 28 dias.
[00259] A formulação no presente documento também pode conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação par- ticular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades comple- mentares que não afetam adversamente umas às outras. Tais com- postos ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.
4. Artigos de Fabricação ou Kits
[00260] Em outro aspecto, é fornecido um artigo de fabricação ou kit que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 huma- na). O artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda instruções para o uso do anticorpo nos métodos da presente invenção. Assim, em determinadas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende instruções para o uso de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga à Si- glec-8 humana em métodos para tratar e/ou prevenir gastrite mastocís- tica, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística em um indiví- duo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga à Siglec-8 humana. Em de- terminadas modalidades, o artigo de fabricação compreende um medi- camento que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e uma bula que compreende instruções para a administração do medi- camento em um indivíduo que precisa do mesmo para tratar e/ou pre- venir gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mas- tocística. Em algumas modalidades, a bula indica ainda que o trata- mento é eficaz na redução de um ou mais sintomas no indivíduo com gastrite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, ente- rite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocís- tica comparado com um nível de linha de base antes de administração do medicamento. Em algumas modalidades, o indivíduo é diagnostica- do com gastrite mastocística, colite mastocística, duodenite mastocís- tica, enterite mastocística ou gastroenterite mastocística antes de ad- ministração do medicamento que compreende o anticorpo. Em deter- minadas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
[00261] O artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (tais como seringas de câmara única ou dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, tal como vidro ou plástico. O recipiente contém a formulação.
[00262] O artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda um rótulo ou uma bula, que está no recipiente ou associada ao mesmo, pode indicar instruções para reconstituição e/ou uso da formulação. O rótulo ou bula pode ainda indicar que a formulação é útil ou destinada à administração subcutânea, intravenosa ou outros modos de adminis- tração para tratar e/ou prevenir gastrite mastocística, esofagite masto- cística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocísti- ca e/ou gastroenterite mastocística em um indivíduo. O recipiente que contém a formulação pode ser um frasco de uso único ou um frasco de uso múltiplo, o que permite administrações repetidas da formulação reconstituída. O artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda um segundo recipiente que compreende um diluente adequado. O ar- tigo de fabricação ou kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial, terapêutico e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.
[00263] Em uma modalidade específica, a presente invenção forne- ce kits para uma unidade de administração de dose única. Estes kits compreendem um recipiente de uma formulação aquosa de anticorpo terapêutico, incluindo seringas pré-enchidas de uma ou várias câma- ras. Seringas pré-enchidas exemplificativas estão disponíveis a partir da Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha.
[00264] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um artigo de fabricação ou kit que compreende as formulações descri- tas no presente documento para administração em um dispositivo au- toinjetor. Um autoinjetor pode ser descrito como um dispositivo de in- jeção o qual, após a ativação, fornecerá seu conteúdo sem ação adici- onal necessária do paciente ou do administrador. Eles são particular- mente adequados para automedicação de formulações terapêuticas quando a taxa de entrega deve ser constante e o tempo de distribuição é maior do que alguns instantes.
[00265] Em outro aspecto, é fornecido um artigo de fabricação ou kit que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no presente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 huma- na). O artigo de fabricação ou kit pode compreender ainda instruções para o uso do anticorpo nos métodos da presente invenção. Assim, em determinadas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende instruções para o uso de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga à Si- glec-8 humana em métodos para tratar ou prevenir gastrite mastocísti- ca, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística em um indiví- duo que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga à Siglec-8 humana. Em de- terminadas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende um medicamento que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e uma bula informativa que compreende instruções para a administração do medicamento em um indivíduo que precisa do mes- mo para tratar e/ou prevenir gastrite mastocística, esofagite mastocís- tica, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística.
[00266] A presente invenção também fornece um artigo de fabrica- ção ou kit que compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito no pre- sente documento (por exemplo, um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana) em combinação com um ou mais medicamentos adicionais (por exemplo, um segundo medicamento) para tratar ou prevenir gas- trite mastocística, esofagite mastocística, colite mastocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroenterite mastocística em um indivíduo. O artigo de fabricação ou kit pode compreender ain- da instruções para o uso do anticorpo em combinação com um ou mais medicamentos adicionais nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o artigo de fabricação ou kit no presente documento opcio- nalmente compreende ainda um recipiente que compreende um se- gundo medicamento, em que o anticorpo anti-Siglec-8 é um primeiro medicamento e cujo artigo ou kit compreende ainda instruções no rótu- lo ou bula para o tratamento de indivíduo com o segundo medicamento em uma quantidade eficaz. Assim, em determinadas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende instruções para o uso de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga à Siglec-8 humana em combinação com um ou mais medicamentos adicionais em métodos para tratar ou prevenir gastrite mastocística, mastócitos esofagite celular, colite mas- tocística, enterite mastocística, duodenite mastocística e/ou gastroen- terite mastocística em um indivíduo. Em determinadas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende um medicamento que compre- ende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana (por exemplo, um primeiro medicamento), um ou mais medicamentos adicionais e uma bula informativa que compreende instruções para a administração do primeiro medicamento em combinação com o um ou mais medicamen- tos adicionais (por exemplo, um segundo medicamento). Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem in- cluir, porém sem limitações, PPlIs, corticosteroides sistêmicos, corticos- teroides tópicos, anti-histamínicos, estabilizantes de mastócitos, blo- queadores H-2, anticorpos anti-lgE, inibidores de calcineurina, agentes imunomoduladores e agentes imunossupressores (por exemplo, azati- oprina, 6-MP, MMF e inibidores de MTOR).
[00267] Deve ser entendido que os aspectos e modalidades descri- tos no presente documento são apenas para fins ilustrativos e que vá- rias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas para aqueles versados na técnica e devem ser incluídos no espírito e âmbito do presente pedido e âmbito das reivindicações em anexo.
EXEMPLOS
[00268] A presente invenção será mais completamente entendida por meio de referência aos exemplos a seguir. Os exemplos não de- vem, no entanto, ser interpretados como limitando o escopo da pre- sente invenção. Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descritos no presente documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão suge- ridas para aqueles versados na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e âmbito do presente pedido e escopo das reivindicações em anexo. Exemplo 1: Estrutura de um estudo de Fase 1b, aberto, com esca- lonamento de dose, prova de conceito para avaliar a segurança, tolerabilidade e benefício clínico do tratamento com anticorpo an- ti-Siglec-8 em pacientes com gastrite e/ou gastroenterite masto- cística
[00269] Um estudo em andamento que avalia a eficácia e seguran- ça do anticorpo anti-Siglec-8 para o tratamento de pacientes com gas- trite e/ou gastroenterite eosinofílica encontrou uma subpopulação de pacientes que, apesar de atender aos critérios de sintomas de dor ab- dominal, náusea e/ou diarreia, não apresentava o número pré-requisito de eosinófilos na mucosa gástrica e/ou duodenal. Em vez disso, des- cobriu-se que estes pacientes tinham um número substancial de mas- tócitos (na maioria dos casos maior do que 30 mastócitos/campo de alta potência (HPF)) na mucosa gástrica e/ou duodenal. Os níveis normais foram medidos em aproximadamente menos de 20 mastóci- tos/HPF (Doyle et al., Am. J. Surg. Pathol. (2014) 38: 832-843; Jakate et al., Arch. Pathol. Lab. Med. (2006) 130: 3 62-367; Tison et al., Aller- gy Clin. Immunol. (2010) Abstract 714), sugerindo que os mastócitos elevados nestes pacientes podem ser responsáveis pela sintomatolo- gia gastrintestinal. Uma vez que os pacientes preencheram os mes-
mos critérios de sintomas que os pacientes para o estudo do anticorpo anti-Siglec-8 e não obtiveram sucesso ou não obtiveram um controle adequado com os tratamentos da classe de sistema de órgãos (SOC), eles têm uma necessidade substancial de melhores tratamentos.
[00270] “Uma redução no número ou ativação de mastócitos tecidu- ais pode ser útil no tratamento de pacientes com sintomas gastrintesti- nais moderados a graves e aumento do número de mastócitos no es- tômago e/ou duodeno, uma condição denominada como gastrite e/ou gastroenterite mastocística neste estudo.
[00271] Uma vez que gastrite e gastroenterite mastocística são en- tidades de doença relativamente mal descritas, não há tratamentos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA). As terapias atu- ais e o manejo da doença para estes pacientes incluem uma infinidade de várias abordagens, incluindo inibidores da bomba de prótons (IBP), dietas restritas/elementares, corticosteroides sistêmicos ou orais e uso ocasional de produtos biológicos imunomoduladores não recomenda- dos.
[00272] O estudo descrito neste exemplo é concebido para testar a segurança e eficácia do tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 em pa- cientes com gastrite e/ou gastroenterite mastocística. Seleção de Dose
[00273] Neste estudo, os pacientes com gastrite e/ou gastroenterite mastocística são tratados com até seis doses de anticorpo anti-Siglec- 8 HEKA (IgG1 não fucosilado) (também conhecido como "medicamen- to sob estudo") administrado a cada 4 semanas. As doses são 0,3 mg/kg para a primeira infusão, 1 mg/kg para a segunda infusão e 3 mg/kg para 4 infusões subsequentes. Seleção de Pacientes
[00274] A população para este estudo é de pacientes adultos do sexo masculino e feminino com gastrite e/ou gastroenterite mastocísti-
ca com idade entre 18 e 80 anos.
[00275] Os critérios de inclusão de pacientes incluem:
[00276] 1) Pacientes do sexo masculino ou feminino com idade en- tre 18 e 80 anos no momento da assinatura do Termo de Consenti- mento Livre e Esclarecido (CIF).
[00277] 2) Sem sucesso no processo de triagem para o estudo an- terior do anticorpo anti-Siglec-8 pelo fato de não atender ao critério de elegibilidade de eosinofilia da mucosa gástrica (definida como maior do que ou igual a 30 eosinófilos/HPF em 5 HPFs) ou mucosa duodenal (definida como maior do que ou igual a 30 eosinófilos/HPF em 3 HPFs) da esofago-gastro-duodenoscopia (EGD) realizada durante o período de triagem do estudo de anticorpo anti-Siglec-8.
[00278] 3) Pontuação média semanal maior do que ou igual a 3 (em uma escala de O a 10) registrada para dor abdominal, diarreia ou náu- sea em um questionário de desfecho relatado pelo paciente (PRO) du- rante pelo menos 2 semanas de 3 semanas de Coleção PRO. Um mí- nimo de 4 questionários foram preenchidos a cada semana de qualifi- cação.
[00279] 4) Teve maior do que ou igual a 30 mastócitos/HPF em pelo menos 3 HPFs na mucosa duodenal e/ou gástrica do EGD realizado durante o período anterior de triagem do estudo de anticorpo anti- Siglec-8.
[00280] 5) Os indivíduos não obtiveram sucesso ou controle ade- quado com os tratamentos padrão para sintomas de EG ou EGE (que podem incluir IBPs, corticosteroides tópicos ou sistêmicos e/ou dieta, dentre outros).
[00281] 6) Se outros tratamentos para EG, EGE ou EoE na inscri- ção, os pacientes tinham dose estável por pelo menos 5 meias-vidas antes da triagem e estavam dispostos a continuar com aquela dose durante o estudo.
[00282] 7) &Seo paciente estava sob restrições alimentares pré- existentes, eles estão dispostos a manter estas restrições alimentares ao longo do estudo, tanto quanto possível.
[00283] 8) Capaz e disposto a cumprir todos os procedimentos do estudo.
[00284] Os critérios de exclusão de pacientes incluem:
[00285] 1) Hipersensibilidade conhecida a qualquer constituinte do medicamento sob estudo.
[00286] 2) Presença de valores laboratoriais anormais considerados pelo investigador como clinicamente significativos.
[00287] 3) Qualquer doença, condição (médica ou cirúrgica) ou anormalidade cardíaca que, na opinião do Investigador, colocaria o indivíduo em risco aumentado.
[00288] 4) Histórico conhecido de abuso ou dependência de álcool, drogas ou outras substâncias.
[00289] 5) Participação em um estudo de intervenção simultâneo com a última intervenção ocorrendo nos 30 dias anteriores à adminis- tração do medicamento sob estudo (ou 90 dias ou 5 meias-vidas, o que for mais longo, para produtos biológicos).
[00290] 6) Mulheres que estão grávidas, amamentando ou plane- jando engravidar durante a participação no estudo.
Design de Estudo
[00291] Este estudo é um estudo de fase 1b, multicêntrico, aberto para avaliar a segurança, tolerabilidade e benefício clínico do anticorpo anti-Siglec-8, administrado em infusões mensais para até 6 doses em pacientes com gastrite e/ou gastroenterite mastocística. Este estudo inclui pacientes que foram selecionados e atenderam a todos os crité- rios de seleção de pacientes para o estudo anterior de anticorpos anti- Siglec-8, exceto quanto ao critério de ter maior do que ou igual a 30 eosinófilos/HPF em 5 HPFs na mucosa gástrica ou maior do que ou igual a 30 eosinófilos/HPF em 3 HPFs na mucosa duodenal. Para se- rem elegíveis para este estudo, os pacientes apresentam maior do que ou igual a 30 mastócitos/HPF em pelo menos 3 HPFs na mucosa gás- trica e/ou duodenal. Os pacientes são consentidos para este estudo após não obterem sucesso na triagem para o estudo anterior de anti- corpos anti-Siglec-8.
[00292] O estudo é concebido da seguinte forma:
[00293] 1) Um período de triagem de 45 dias com avaliações inici- ais para elegibilidade. As avaliações de linha de base do estudo ante- rior de anticorpos anti-Siglec-8 podem ser usadas como linha de base a avaliações para este estudo se coletadas dentro de 45 dias do início da inscrição. Os resultados da biópsia de triagem do Esofago-Gastro- Duodenoscopia (EGD) do estudo anterior de anticorpos anti-Siglec-8 podem ser usados se os sintomas persistirem (conforme indicado no critério de inclusão número 3).
[00294] 2)Se os pacientes não obtiveram sucesso na triagem para o estudo anterior do anticorpo anti-Siglec-8 pelo fato de não ter mais do que 30 eosinófilos/HPF na mucosa gástrica ou duodenal, mas ti- nham maior do que ou igual a 30 mastócitos/HPF em pelo menos 3 HPFs na mucosa duodenal e/ou gástrica, eles recebem 6 doses de anticorpo anti-Siglec-8 através de infusão intravenosa nos Dias 1, 29 (+ 3 dias), 57 (t+ 3 dias), 85 (+ 3 dias), 113 (+ 3 dias) e 141 (+ 3 dias) neste estudo.
[00295] 3) Uma repetição de EGD com biópsia é realizada no Dia 155 (+ 3 dias) ou aproximadamente 2 semanas após a última dose do medicamento sob estudo se o paciente parou precocemente.
[00296] 4) Os medicamentos pré-estudo e as restrições dietéticas pré-existentes permanecem inalterados ao longo do estudo. Os paci- entes são submetidos a uma avaliação de base padronizada de hábi- tos alimentares, hábitos/restrições alimentares e comportamentos para evitar alimentos e são solicitados a manter hábitos e restrições simila- res ao longo do estudo.
Objetivo Primário
[00297] O objetivo principal deste estudo é avaliar a segurança e tolerabilidade do anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com gastrite e/ou gastroenterite mastocística.
Objetivo Secundários
[00298] Os objetivos secundários deste estudo são avaliar os efei- tos do anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com gastrite e/ou gastro- enterite mastocística quanto aos seguintes parâmetros:
[00299] 1) Mudança no número de mastócitos/HPF em biópsias gástrica e duodenal.
[00300] 2) Mudança na pontuação dos sintomas gastrintestinais, conforme estimado por um questionário diário de resultados relatados pelo paciente (PRO).
[00301] 3) Alteração na contagem absoluta de eosinófilos no san- gue periférico.
Medidas de Resultados Farmacodinâmicos
[00302] O sangue (soro) é coletado para avaliação das concentra- ções de anticorpos anti-Siglec-8 usando um ensaio de imunoabsorção enzimática validado (ELISA).
Medidas de Resultados de Eficácia
[00303] O número de mastócitos na mucosa gástrica e duodenal é avaliado. Além disso, o número de eosinófilos e mastócitos na mucosa esofágica é avaliado em pacientes com esofagite eosinofílica concomi- tante.
[00304] Outras medidas de resultados de eficácia neste estudo in- cluem:
[00305] 1) Alteração percentual desde a linha de base no número de mastócitos/HPF na mucosa gástrica e/ou duodenal em pacientes com gastrite e/ou gastroenterite mastocística.
[00306] 2) Alteração da linha de base nas médias semanais de sin- tomatologia gastrintestinal medida pelo questionário PRO (pontuação diária total e por item, incluindo para os seguintes sintomas: intensida- de da dor abdominal, intensidade da náusea, intensidade do vômito, frequência da diarreia, intensidade da cólica abdominal, intensidade da distensão, intensidade da saciedade precoce e intensidade da perda de apetite).
[00307] 3) Proporção de pacientes com resposta histológica, defini- da como menos de 30 mastócitos/HPF na mucosa gástrica e/ou duo- denal em pacientes com gastrite e/ou gastroenterite mastocística.
[00308] 4) Alteração da linha de base no número de contagens ab- solutas de eosinófilos no sangue periférico.
[00309] 5) Alteração da linha de base no número de eosinófilos e mastócitos/HPF em biópsias esofágicas em pacientes com esofagite eosinofílica concomitante.
[00310] 6) Avaliação morfológica das biópsias gástricas e duode- nais antes e após o tratamento.
[00311] 7) Alteração percentual em relação à linha de base no peso corporal.
[00312] 8) Alteração da linha de base no questionário de saúde fun- cional e bem-estar relatado pelo paciente SF-36.
Medicamento, Dose e Administração do Estudo
[00313] Todos os pacientes recebem 6 infusões intravenosas de anticorpo anti-Siglec-8 durante o estudo, administrado como uma úni- ca infusão intravenosa periférica usando uma bomba de infusão con- forme indicado no Manual de Farmácia do estudo. A dose exata é cal- culada antes de cada infusão e com base no peso do paciente no momento. O anticorpo anti-Siglec-8 na dose de 0,3 mg/kg é preparado de acordo com o peso corporal do paciente e administrado no Dia 1. O anticorpo anti-Siglec-8 na dose de 1 mg/kg é preparado de acordo com o peso corporal do paciente e administrado no Dia 29 (+ 3 dias). As infusões subsequentes de uma dose de 3 mg/kg são preparadas de acordo com o peso corporal do paciente e administradas no Dia 57 (t+ 3 dias), Dia 85 (+ 3 dias), Dia 113 (+ 3 dias) e Dia 141 (+ 3 dias).
[00314] A segurança e a tolerabilidade são avaliadas ao longo do estudo por meio do monitoramento e avaliação de eventos adversos (AEs), cuja gravidade é avaliada pelos NCI Common Terminology Cri- teria for Adverse Events (CTCAE). São atribuídos a todos os AÉEs um grau de gravidade e eles são avaliados para determinar se são clini- camente significativos e relacionados ao medicamento em estudo. Exemplo 2: Pacientes sintomáticos com suspeita de gastrite e/ou enterite eosinofílica têm contagens elevadas de mastócitos na mucosa sem eosinofilia
[00315] O acúmulo patológico e a superativação de eosinófilos es- tão implicados em várias doenças inflamatórias crônicas no trato Gl (Figura 1), incluindo esofagite (EoE), gastrite (EG), enterite (EEn) e colite eosinofílicas (coletivamente denominadas doenças gastrintesti- nais eosinofílicas, EGIDs). Pacientes com EGIDs apresentam diminui- ção da qualidade de vida em virtude de sintomas debilitantes, tais co- mo disfagia/dificuldade para engolir, dor abdominal, náuseas, vômitos e diarreia.
[00316] Embora a patogênese de EGIDs tenha sido historicamente considerada como sendo impulsionada por eosinófilos, foi mostrado que os mastócitos também estão elevados em EoE (Caldwell et al. (2014) J. Allergy Clin. Immunol. 134: 1114-1124; Youngblood et al. (2019) JCI Insight 4 (19)). No entanto, o papel dos mastócitos nas EGIDs, particularmente outras que não EoE, ainda não foi estabeleci- do. EG e EEn afetam 45.000-50.000 pacientes nos EUA, embora este número possa ser uma subestimativa significativa. As opções de tra-
tamento atuais, tais como restrição alimentar e corticosteroides, têm eficácia limitada e/ou são inadequadas para uso crônico. Como tal, continua a haver uma necessidade significativa não atendida de novas terapias direcionadas.
[00317] Conforme observado no Exemplo 1, durante a inscrição pa- ra um estudo em andamento que avalia a eficácia e segurança do an- ticorpo anti-Siglec-8 para o tratamento de pacientes com gastrite eosi- nofílica e/ou gastroenterite, foi identificada uma subpopulação de paci- entes que não tem o número pré-requerido de eosinófilos na mucosa gástrica e/ou duodenal, mas em vez disso tinham um número substan- cial de mastócitos (na maioria dos casos maior do que 30 mastóci- tos/campo de alta potência (HPF)) na mucosa gástrica e/ou duodenal). Este exemplo caracteriza estes pacientes sintomáticos com suspeita de EG/EEn que não preencheram os critérios histopatológicos de en- trada para eosinofilia mucosal para o estudo de Fase 2 do anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com EG/EEn. Protocolo de Triagem
[00318] Pacientes com diagnóstico prévio ou suspeita de EG/EEn entraram na triagem. Indivíduos com uma pontuação média semanal de > 3 intensidade (escala 0-10) para dor abdominal, diarreia e/ou náusea por 2 2 semanas em um questionário de desfecho relatado pe- lo paciente (PRO) qualificado para endoscopia alta (EGD) com biópsia.
[00319] Múltiplas biópsias foram retiradas de cada indivíduo sinto- mático de acordo com um protocolo padronizado: 8-10 biópsias gástri- cas, 4-6 biópsias duodenais e 4-6 biópsias esofágicas (apenas se o indivíduo tivesse um histórico de EoE ou se características de EoE fossem observadas durante EGD). Os critérios de entrada foram: > 30 eosinófilos (eos)/campo de alta potência (hpf; área de 0,237 mm2) em hpfs (estômago) e/ou > 30 eos/hpf em 3 hpfs (duodeno); e nenhuma outra causa conhecida para sintomas gastrintestinais ou eosinofilia te-
cidual.
[00320] O questionário PRO diário capturou 8 sintomas: dor abdo- minal, náusea, diarreia, vômito, saciedade precoce, perda de apetite, cólica abdominal e distensão abdominal. Resultados
[00321] A distribuição do paciente é mostrada na Figura 2A. 113 pacientes entraram na triagem e 88 foram considerados sintomáticos. Destes 88, descobriu-se que 71 (81 %) tinham 2 30 eos e > 30 mastó- citos quando rastreados conforme descrito acima, 16 (18 %) tinham > mastócitos apenas e apenas 1 (1 %) tinha > 30 eos apenas. Assim, 87 de 88 pacientes sintomáticos tinham contagens elevadas de mas- tócitos. A Figura 2B compara as características basais de pacientes com > 30 eos (72 no total) com pacientes com > 30 mastócitos, mas < 30 eos (16 no total).
[00322] Os números de eosinófilos e mastócitos nas biópsias do estômago (Figura 3A) ou duodenal (Figura 3B) são mostrados nas Fi- guras 3A e 3B. Em biópsias estomacais (Figura 3A), os pacientes com > 30 eos/hpf em 5 hpfs tiveram uma contagem média de pico de célu- las (por 5 hpf) de 89 eosinófilos e 64 mastócitos, enquanto que pacien- tes com 2 30 mastócitos/hpf em 5 hpfs mas < 30 eos/hpf em 5 hpfs tiveram uma contagem média de pico de células (por 5 hpf) de 7 eosi- nófilos e 52 mastócitos. Em biópsias duodenais (Figura 3B), os pacien- tes com 2 30 eos/hpf em 3 hpfs tiveram uma contagem média de pico de células (por 3 hpf) de 65 eosinófilos e 56 mastócitos, enquanto que pacientes com > 30 mastócitos/hpf em 3 hpf mas < 30 eos/hpf em 3 hpfs tiveram uma contagem média de pico de células (por 3 hpf) de 15 eosinófilos e 51 mastócitos. A Figura 4 mostra a pontuação média de intensidade dos sintomas para ambas as populações de pacientes com relação à saciedade precoce, distensão, dor abdominal, perda de apetite, cólicas abdominais, náusea, diarreia e vômito (de cima para baixo). Perfis de sintomas similares foram observados entre os dois grupos (ou seja, pacientes cujas biópsias mostraram > 30 eos/hpf vs. pacientes cujas biópsias mostraram < 30 eos/hpf mas > 30 mastóci- tos/hpf).
[00323] Dois estudos de caso individuais são mostrados nas Figu- ras 5A e 5B. O paciente no estudo de caso A (Figura 5A) tinha sido diagnosticado com EG confirmado por biópsia em 2015. Este paciente não estava em uso de esteroides tópicos ou sistêmicos antes da bióp- sia de triagem. O paciente no estudo de caso B (Figura 5B) não tinha diagnóstico prévio de EGID. Estes sintomas são consistentes com EG e/ou EEn, apesar do baixo nível de eosinófilos na triagem.
[00324] Além disso, a análise de tecido de biópsia gástrica humana indicou que o aumento da ativação de mastócitos foi observado em tecidos onde apenas mastócitos (e não eosinófilos) foram encontrados elevados. Tecido de biópsia gástrica humana foi processado em célu- las individuais e mastócitos (células CD117* Siglec-8*) e eosinófilos (células CD117' Siglec-8*) foram isolados por meio de citometria de fluxo (Figura 6A). Destes, os mastócitos foram ainda analisados quanto à ativação de mastócitos e marcador de desgranulação CD63 usando citometria de fluxo (Figura 6B). Para determinar se os mastóci- tos foram ativados, as células foram coradas com anti-CD63 ou anti- corpo de controle negativo. Estes resultados demonstram a ativação dos mastócitos nestes tecidos.
[00325] Os dados de resultados do questionário PRO descrito aci- ma também foram analisados. A Figura 7 mostra a alteração média e mediana na pontuação total dos sintomas desde a linha de base (mé- dia diária do período de triagem) até a pontuação média diária nas du- as semanas após a última dose de anticorpo anti-Siglec-8. Os resulta- dos demonstram uma redução média de 64 % e uma redução de 69 % na pontuação total dos sintomas após a última dose de anticorpo anti-
Siglec-8, comparado com a linha de base. Conclusão
[00326] 88 pacientes com suspeita de EG e/ou EEn e sintomas ati- vos foram submetidos à endoscopia e biópsia. 72/88 preencheram os critérios histológicos de eosinófilos para o estudo. 87/88 (99 %) dos pacientes selecionados tinham contagens elevadas de mastócitos em biópsias de tecido gástrico e/ou duodenal. Os perfis dos sintomas fo- ram similares entre os pacientes com e sem eosinofilia tecidual.
[00327] Estes dados sugerem que os mastócitos desempenham um papel patogênico importante em pacientes com suspeita de EG/EEn e levantam a possibilidade de uma condição não eosinofílica estimulada por mastócitos. Em virtude da capacidade do anticorpo anti-Siglec-8 de inibir os mastócitos, os pacientes com mastócitos elevados sem eosinofilia tecidual foram convidados a participar de um ensaio clínico aberto com o anticorpo anti-Siglec-8.
SEQUÊNCIAS
[00328] Todas as sequências polipeptídicas são apresentadas a partir do N-término para o C-término, salvo indicação em contrário.
[00329] Todas as sequências de ácidos nucleicos são apresentadas a partir de 5' para 3', a menos que indicado de outra forma. Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 de camundongo
QVQAQLKESGPGLVAPSOQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEW
LGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQOTDDTALYYC ARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 1) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHA
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WVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2)
Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHB
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WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHC
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WVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHD
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WLSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVY YCARDGSSPYYYSMEYWGOQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 5) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHE
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WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 6) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHF
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WVSVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVY YCARDGSSPYYYSMEYWGOQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHG
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WVSVIWAGGSTNYNSALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 8)
Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHA2
QVOALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIRQPPGKGLEW
IGVIWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC ARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 9) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHB2
QVOALQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLE
WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHE S-G mutante
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE
WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYGMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHE E-D
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE
WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 12) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHE Y-V
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE
WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 13) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 2E2 RHE mutante triplo
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE
WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14)
Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2 de camundongo
QILTASPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY
STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 15) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
RKA EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY
STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 16) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
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STSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 17) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
RKC EIILTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY
STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 18) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
RKD EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWI
YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQORSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 19) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
RKE EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY
STSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 20)
Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
RKF EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY
STSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 21) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2
RKG EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLI
YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQORSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 22) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2 RKA F-Y mutante
EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY
STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 23) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 2E2 RKF F-Y mutante
EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY
STSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 24) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada HEKA e cadeia pesada
HEKF EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQOSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSG (SEQSLSP: 75) Sequência de aminoácidos da cadeia leve HEKA
EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 76) Sequência de aminoácidos da cadeia leve HEKF
EIVLTASPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK
VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 77) Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de 1gG1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PG (SEQ ID NO: 78) Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de 1gG4
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT VLHQODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 79) Sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve de Ig capa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL
QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOG LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 80) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de IgG1 2C4 e 2E2 de murino
QVQAQLKRASGPGLVAPSOQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLE WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT NSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSS SVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPE VSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEV HTAQTQAQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQODWLNGKEFKCRVNSAAFPA PIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITV
EWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFT CSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG (SEQ ID NO: 81) Sequência de aminoácidos da cadeia leve capa de 2C4 de murino
EIILTASPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV
KWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSY TCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 82) Sequência de aminoácidos da cadeia leve capa de 2E2 de murino
QILTASPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV
KWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSY TCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 83) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada quimérica de IgG1 2C4 e 2E2
QVQAQLKRASGPGLVAPSOQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLE WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 84) Sequência de aminoácidos da cadeia leve capa de 2C4 quimérico
EIILTASPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA
KVQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 85) Sequência de aminoácidos da cadeia leve capa de 2E2 quimérico
QILTASPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA
KVQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 86) Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de IgG4 HEKA (IgG4 contém uma mutação S228P)
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG
FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 87) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 1C3 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia)
EVQVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVRQTPDKRLE
WVAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YYCARHETAQAAWFAYWGOQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 106) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 1H10 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia)
EVOLQQOSGAELVRPGASVKLSCTASGENIKDYYMYWVKQRPEQGLE
WIGRIAPEDGDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVY YCTTEGNYYGSSILDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 107) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de 4F11 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia)
QVALQAQQASGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSWMNWVKQRPGKGL
EWIGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYFCARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 108) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 103 de camundongo
QIVLTASPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRW
IYDTSKLAYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSN PPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 109) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 1H10 de camundongo
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKPDGTVKLLI
YFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLP WTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 110) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de 4F11 de camundongo
QIVLTASPAIVSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQRPGSSPRLLI
YDTSSLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYCQQWNSDP YTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos do domínio 1 de Siglec-8 humana
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETOQGRFQLLGDIWSND
CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRP (SEQ ID NO:112) Sequência de aminoácidos do domínio 2 de Siglec-8 humana
DILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTAR SSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVS (SEQ |D NO: 113) Sequência de aminoácidos do domínio 3 de Siglec-8 humana
YPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPP
ARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGS QHISLSLSLQONEGTGTSRPVSQVTLAAVGG (SEQ ID NO: 114) Sequência de aminoácidos da proteína de fusão de domínio 1 de Siglec-8 humana
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETOQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRPIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 115) Sequência de aminoácidos da proteína de fusão dos domínios 1 e 2 de Siglec-8 humana
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETOQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGP TTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSIEGRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 116) Sequência de aminoácidos da proteína de fusão dos domínios 1,2 e 3 de Siglec-8 humana
MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETOQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGP TTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPW NLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGOQSLRLVCAVNSNPPARLS WTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHIS LSLSLQONEGTGTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 117)

Claims (106)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de gastrite, enterite, duodenite ou gastroenterite em um indivíduo, carac- terizado pelo fato de que compreende: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amos- tra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quan- tidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.
2. Método para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de gastrite, enterite, duodenite ou gastroenterite em um indivíduo, carac- terizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa gás- trica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosinófilos em pelo menos uma porção do mucosa gástrica, duo- denal, jejunal, ileal ou cólica comparado com uma referência de eosi- nófilos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que uma primeira amostra obtida a partir da mucosa gás- trica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo tem um número aumentado de mastócitos comparado com a referência de mastócitos e em que uma segunda amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo não tem um número au- mentado de eosinófilos comparado com a referência de eosinófilos.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteri- zado pelo fato de que as primeira e segunda amostras são iguais.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 e 4, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas das primeira e segunda amostras é/são de uma biópsia gástrica ou duodenal.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 e 4, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas das primeira e segunda amostras é/são de uma esofago-gatro-duodenoscopia (EGD) com biópsia.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3e4 a, caracterizado pelo fato de que a primeira amostra tem pe- lo menos um campo de alta potência (HPF) que tem uma contagem de mastócitos de 20 ou mais mastócitos por HPF.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os mastócitos são detectados por meio de coloração imuno-histoquímica (IHC) para triptase, CD117 ou receptor de IgE.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,3 e4 a, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra tem um ou mais HPFs, cada um com uma contagem de eosinófilos de menos de 30 eosinófilos por HPF.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1, 3 e 4 a 8, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra é obtida da mucosa gástrica do indivíduo e em que a segunda amostra não tem pelo menos cinco HPFs, cada um com uma contagem de eo- sinófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1, 3 e 4 a 8, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra é obtida da mucosa duodenal do indivíduo e em que a segunda amostra não tem pelo menos três HPFs, cada um com uma contagem de eosi- nófilos de 30 ou mais eosinófilos por HPF.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1, 3 e 4 a 11, caracterizado pelo fato de que o número de mastó- citos na primeira amostra é detectado 45 dias ou menos antes de ad- ministração da composição.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou foi di- agnosticado com doença do refluxo gastroesofágico (DRGE).
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo é refratário ao tratamento com um anti- ácido, bloqueador de H2 e/ou inibidor da bomba de prótons.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou foi di- agnosticado com síndrome do intestino irritável (IBS).
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou foi di- agnosticado com dispepsia funcional.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo teve ou foi an- teriormente diagnosticado com gastrite eosinofílica e em que o indiví- duo tem um ou mais sintomas de gastrite eosinofílica sem eosinófilos elevados.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo teve ou foi an- teriormente diagnosticado com gastroenterite eosinofílica e em que o indivíduo tem um ou mais sintomas de gastroenterite eosinofílica sem eosinófilos elevados.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que um ou ambos de um nú- mero ou atividade de mastócitos em uma amostra obtida a partir da mucosa gástrica, duodenal, jejunal, ileal ou cólica do indivíduo são re- duzidos após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que, antes de administração da composição, o indivíduo não obteve sucesso ou um controle adequado por um ou mais tratamentos padrão de atendimento para gastrite ou gastroenterite.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais tratamentos padrão para gastrite ou gastroenterite são selecionados a partir do grupo que consiste em tra- tamento com inibidor da bomba de prótons (PPI), tratamento com cor- ticosteroides e tratamento dietético.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que um ou mais sintoma(s) de gastrite, duodenite, enterite ou gastroenterite no indivíduo é/são redu- zido(s) após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais sintoma(s) de gastrite, duodenite, en- terite ou gastroenterite no indivíduo é/são reduzido(s) em pelo menos 60 % após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre dor ab- dominal, náusea, vômito, perda de apetite, cólicas abdominais, pleni- tude antes de terminar uma refeição, distensão, diarreia e fezes líqui-
das ou aquosas no indivíduo são reduzidos após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de admi- nistração da composição.
25. Método para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de esofagite em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreen- de: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amos- tra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quan- tidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.
26. Método para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de esofagite em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreen- dem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composi- ção que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa esofágica comparado com uma refe- rência de mastócitos e em que o indivíduo não tem um número au- mentado de eosinófilos em pelo menos uma porção da mucosa esofá- gica comparado com uma referência de eosinófilos.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que uma primeira amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo tem um número aumentado de mastócitos comparado com a referência de mastócitos e em que uma segunda amostra obtida a partir da mucosa esofágica do indivíduo não aumen-
taram o número de eosinófilos comparado com os eosinófilos de refe- rência.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25 ou 27, carac- terizado pelo fato de que as primeira e segunda amostras são iguais.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25, 27 e 28, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas das primeira e segunda amostras é/são de uma amostra de biópsia esofá- gica.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25, 27 e 28, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas das primeira e segunda amostras é/são de uma esofago-gatro- duodenoscopia (EGD) com biópsia.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25, 27 e 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a primeira amos- tra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) com uma conta- gem de mastócitos de 10 ou mais mastócitos por HPF.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que os mastócitos são detectados por meio de colora- ção imuno-histoquímica (IHC) para triptase, CD117 ou receptor de IgE.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25, 27 e 28 a 32, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra tem um ou mais HPFs com uma contagem de eosinófilos de menos de 15 eosinófilos por HPF.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25, 27 e 28 a 32, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra não tem um HPF com uma contagem de eosinófilos de 15 ou mais eosinófilos por HPF.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem ou foi di- agnosticado com doença do refluxo gastroesofágico (DRGE).
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo é refratário ao tratamento com um anti- ácido, bloqueador de H2 e/ou inibidor da bomba de prótons.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 36, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre um número, atividade ou localização de mastócitos em uma amostra obti- da a partir da mucosa esofágica do indivíduo é reduzido após adminis- tração da composição comparado com um nível de linha de base an- tes de administração da composição.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 37, caracterizado pelo fato de que, antes de administração da composição, o indivíduo não obteve sucesso ou um controle ade- quado por um ou mais tratamentos padrão para esofagite.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 38, caracterizado pelo fato de que um ou mais sintoma(s) de esofagite no indivíduo é/são reduzido(s) após administração da com- posição comparado com um nível de linha de base antes de adminis- tração da composição.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais sintoma(s) de esofagite no indivíduo é/são reduzido(s) em pelo menos 60 % após administração da compo- sição comparado com um nível de linha de base antes de administra- ção da composição.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 25 a 38, caracterizado pelo fato de que um ou mais dentre azia, náusea, disfagia/dificuldade em engolir, vômito, dor abdominal, tosse, impactação de comida, saciedade precoce, perda de apetite, dor no peito, intolerância alimentar ou a recusa e o refluxo gastroesofágico no indivíduo são reduzidos após administração da composição compara- do com um nível de linha de base antes de administração da composi-
ção.
42. Método para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de colite em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) detectar o número de mastócitos de uma primeira amos- tra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo; (b) detectar o número de eosinófilos de uma segunda amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo; e (c) se a primeira amostra tiver um número aumentado de mastócitos comparado com uma referência de mastócitos e a segunda amostra não tiver um número aumentado de eosinófilos comparado com uma referência de eosinófilos, administrar ao indivíduo uma quan- tidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana.
43. Método para tratar ou prevenir um ou mais sintomas de colite em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana, em que o indivíduo tem um número aumentado de mastócitos em pelo menos uma porção da mucosa cólica comparado com uma referência de mas- tócitos e em que o indivíduo não tem um número aumentado de eosi- nófilos em pelo menos uma porção da mucosa cólica comparado com uma referência de eosinófilos.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que uma primeira amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo tem um número aumentado de mastócitos compa- rado com a referência de mastócitos e em que uma segunda amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo não aumentaram o núme- ro de eosinófilos comparado com os eosinófilos de referência.
45. Método, de acordo com a reivindicação 42 ou 44, carac- terizado pelo fato de que as primeira e segunda amostras são iguais.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 45, caracterizado pelo fato de que a colite é a colite ulcero- sa.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 46, caracterizado pelo fato de que a primeira amostra tem pelo menos um campo de alta potência (HPF) com uma contagem de mastócitos de 30 ou mais mastócitos por HPF.
48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que os mastócitos são detectados por meio de colora- ção imuno-histoquímica (IHC) para triptase, CD117 ou receptor de IgE.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 48, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra tem um ou mais HPFs com uma contagem de eosinófilos de menos de 60 eosinófilos por HPF.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 48, caracterizado pelo fato de que a segunda amostra não tem um HPF com uma contagem de eosinófilos de 60 ou mais eosinó- filos por HPF.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 50, caracterizado pelo fato de que o número de mastócitos na primeira amostra é detectado 45 dias ou menos antes de adminis- tração da composição.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 51, caracterizado pelo fato de que o indivíduo teve ou foi anteriormente diagnosticado com colite eosinofílica e em que o indiví- duo tem um ou mais sintomas de colite eosinofílica sem eosinófilos elevados.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 52, caracterizado pelo fato de que um ou ambos de um nú- mero ou atividade de mastócitos em uma amostra obtida a partir da mucosa cólica do indivíduo são reduzidos após administração da com- posição comparado com um nível de linha de base antes administra- ção da composição.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 53, caracterizado pelo fato de que, antes de administração da composição, o indivíduo não obteve sucesso ou um controle ade- quado por um ou mais tratamentos padrão para colite.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 54, caracterizado pelo fato de que um ou mais sintoma(s) de colite no indivíduo é/são reduzido(s) após administração da composi- ção comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais sintoma(s) de colite no indivíduo é/são reduzido(s) em pelo menos 60 % após administração da composição comparado com um nível de linha de base antes de administração da composição.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a composição é adminis- trada através de infusão intravenosa.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracteriza- do pelo fato de que a composição é administrada através de infusão intravenosa uma vez por mês durante 3 ou mais meses.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a composição é adminis- trada através de injeção subcutânea.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a composição é adminis- trada através de infusão intravenosa em uma ou mais doses que com- preendem entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma primeira dose que compreende cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo e um terceiro dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracteriza- do pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma primeira dose que compreende cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo no Dia 1, uma segunda dose que compreende cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 26 e o Dia 32, uma terceira dose que compreen- de cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 54 e o Dia 60, uma quarta dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 82 e o Dia 88, uma quinta dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 110 e o Dia 116 e um sexta dose que compreende cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo entre o Dia 138 e o Dia
144.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 62, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo liga- das à região Fc, em que menos de 50 % das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do o anticorpo na composição contém um resí- duo de fucose.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracteriza- do pelo fato de que substancialmente nenhuma das cadeias de car- boidratos ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição contém um resíduo de fucose.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de ca- deia leve compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 16 ou 21.
68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11-14; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 23-24.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2-14; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16-24.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 2-10; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 16-22.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 26-29; (2) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 31-36; (4) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 38-43; (6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FRA4 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 45-46 e/ou (b) uma região variável de cadeia leve que compreende: (1) uma LC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 48-49; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 51-53; (4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 55-58; (6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 60.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 26; (2) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 34; (4) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 38; (6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FRA4 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve que compreende: (1) uma LC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 48; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 51; (4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 55; (6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 60.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende: (1) uma HC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 26; (2) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 34; (4) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá-
cidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 38; (6) uma HVR-H3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FRA4 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NOs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve que compreende: (1) uma LC-FR1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 48; (2) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 51; (4) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 58; (6) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 60.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 91 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 92 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; ou uma região variável de cadeia pesada que compreende (i) uma HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) uma HVR-H2 que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 93 e (iii) uma HVR-H3 que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende (i) uma HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) uma HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 e (iii) uma HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; e/ou uma região vari- ável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109;
uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e/ou uma região vari- ável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110; ou uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; e/ou uma região vari- ável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano.
77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteriza- do pelo fato de que o primata não humano é um babuíno.
78. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112.
79. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 3 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.
80. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anti- corpo 4F11.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 2 ou Domínio 3 da Siglec-8 humana.
82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 113.
83. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anti- corpo 1C3.
84. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 114.
85. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o anti- corpo 1H10.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo no Domínio 1 da Siglec-8 humana e compete com o anticorpo 4F11 pela ligação à Siglec-8.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo não compete com o anticorpo 2E2 pela ligação à Siglec-8.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo não é o anticorpo 2E2.
89. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteriza- do pelo fato de que Domínio 1 compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 112.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 89, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticor- po humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 90, caracterizado pelo fato de que o anticorpo esgota os eo- sinófilos do sangue e inibe a ativação de mastócitos.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 91, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc de cadeia pesada que compreende uma região Fc de
IgG humana.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc de IgG humana compreende uma regi- ão Fc de IgG1 humana.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc de IgG1 humana não é fucosilada.
95. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc de IgG humana compreende uma regi- ão Fc de IgG4 humana.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracteriza- do pelo fato de que a região Fc de IgG4 humana compreende a substi- tuição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice EU conforme em Kabat.
97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 89, caracterizado pelo fato de que o anticorpo foi manipula- do para melhorar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).
98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma substi- tuição de aminoácido na região Fc que melhora a atividade de ADCC.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 65 a 91, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo não são fucosiladas.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 76 ou 77.
101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 100, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticor-
po monoclonal.
102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 101, caracterizado pelo fato de que a composição é adminis- trada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratar ou prevenir gastrite, gastroenterite ou esofagite.
103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracteri- zado pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos adicionais pa- ra tratar ou prevenir gastrite, gastroenterite ou esofagite são selecio- nados a partir do grupo que consiste em PPls, corticosteroides sistê- micos, corticosteroides tópicos, anti-histamínicos, estabilizantes de mastócitos Bloqueadores H-2, anticorpos anti-lgE, inibidores de calci- neurina, agentes imunomoduladores e agentes imunossupressores.
104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 103, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser hu- mano.
105. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
106. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de que compreende um medicamento que compreende uma composição que compreende um anticorpo que se liga à Siglec-8 humana e uma bula que compreende instruções para a administração do medicamento em um indivíduo que precisa do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 105.
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