BR112021014966A2

BR112021014966A2 - Métodos para purificar moléculas de mrna e para produzir uma composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112021014966A2
Application number: BR112021014966-0A
Authority: BR
Inventors: Johannes GEIGER; Martin Treml
Original assignee: Ethris Gmbh
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2021-10-05
Also published as: JP2022521161A; US20220162586A1; AU2020220357A1; EP4379052A2; LT3924487T; CA3129663A1; DK3924487T3; EP3924487A1; MX2021009169A; EP3924487B1; KR20210125536A; CN113396219A; WO2020165158A1; ZA202106391B; PT3924487T

Abstract

métodos para purificar moléculas de mrna e para produzir uma composição farmacêutica. a presente descrição provê um método para purificar moléculas de mrna compreendendo (ia) purificar moléculas de mrna precipitadas a partir de uma suspensão compreendendo moléculas de mrna precipitadas, (ib) lavar e dissolver as moléculas de mrna purificadas, (iia) purificar as moléculas de mrna usando uma solução que compreende um agente quelante, seguido por (iib) lavar as moléculas de mrna purificadas, em que as etapas (ia) a (iib) são realizadas usando filtração de fluxo tangencial.

Description

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MÉTODOS PARA PURIFICAR MOLÉCULAS DE MRNA E PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[001] A presente invenção se refere a um método para purificar moléculas de mRNA compreendendo (Ia) purificar moléculas de mRNA precipitadas a partir de uma suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas, (Ib) lavar e dissolver as moléculas de mRNA purificadas, (IIa) purificar as moléculas de mRNA usando uma solução que compreende um agente quelante, seguido por (IIb) lavar as moléculas de mRNA purificadas, em que as etapas (Ia) a (IIb) são realizadas usando filtração de fluxo tangencial.

[002] A informação genética é armazenada como ácido desoxirribonucleico (DNA) na célula e pode ser transcrita em ácido ribonucleico (RNA) quando necessário. As moléculas de DNA e RNA são constituídas por nucleotídeos que consistem em uma base nitrogenada, um açúcar de cinco carbonos e pelo menos um grupo fosfato. Existem diferentes tipos de moléculas de RNA, incluindo moléculas de mRNA que carregam a informação genética para a síntese de proteínas. Em eucariotos, essas moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA como moléculas de mRNA pré-maduras e são subsequentemente modificadas pela adição de, por exemplo, um cap 5’ e uma cauda de poliadenosina 3’ (poli(A)). As moléculas de mRNA maduras são então transferidas do núcleo da célula para o citoplasma, onde são traduzidas em proteínas. Assim, a sequência de DNA, bem como a quantidade, estabilidade e eficiência de tradução da molécula de mRNA madura determinam principalmente a síntese de proteínas em uma célula.

[003] Para otimizar a síntese de uma proteína desejada em uma célula, por exemplo, em contextos terapêuticos, as abordagens com base em mRNA representam uma ferramenta promissora. O uso de moléculas de mRNA tem a vantagem de que as moléculas precisam ser introduzidas apenas

2 / 84 no citoplasma de uma célula para tradução de proteínas (Tavernier et al., 2011, J Control Release, 150(3):238-247; Yamamoto et al., 2009, Eur J Pharm Biopharm, 71(3):484-489). Em comparação com o uso da respectiva sequência de DNA compreendida em um transportador apropriado, como um plasmídeo, o uso de moléculas de mRNA é, além disso, menos difícil, mais eficiente e evita o risco considerável de DNA cromossômico ser alterado se o plasmídeo ou partes dele forem incorporados no genoma. As moléculas de mRNA são geradas principalmente por transcrição in vitro, por exemplo, em aplicações terapêuticas. Essas abordagens são com base em modelos de DNA, que são gerados pela linearização do próprio DNA plasmidal ou pela reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir de um DNA plasmidal. Ambas as abordagens estão bem estabelecidas e podem ser facilmente ampliadas. No entanto, em ambos os casos, as moléculas de mRNA devem ser purificadas antes de poderem ser usadas em aplicações a jusante.

[004] A purificação de moléculas de mRNA sintetizadas é crucial, pois os contaminantes afetam negativamente a maioria das aplicações a jusante, especialmente em contextos terapêuticos. Diferentes subprodutos podem contaminar as moléculas de mRNA desejadas, como componentes usados e/ou gerados em processos a montante, como a síntese de mRNA. No caso de ambas as abordagens in vivo e in vitro, fragmentos curtos da molécula de mRNA podem ocorrer, por exemplo, por hidrólise e transcrição abortiva. A hidrólise da molécula de mRNA pode ocorrer na presença de um catalisador ou de uma enzima, mas também espontaneamente, e resulta na degradação da respectiva molécula de mRNA e, assim, na formação de fragmentos da molécula de mRNA de comprimento variável. No caso de transcrição abortiva (cf. por exemplo, Revyakin et al., 2006, Science, 314(5802):1139-1143), a RNA polimerase se liga ao respectivo elemento promotor em uma molécula de DNA para transcrição, desenrola a fita dupla de DNA que circunda o local de início da transcrição e começa com a síntese de uma molécula de mRNA.

3 / 84 No entanto, em alguns casos, a RNA polimerase não escapa da região promotora do DNA, mas permanece estacionária enquanto transcreve uma parte da molécula de DNA. À medida que o DNA desenrolado se acumula dentro da enzima, a RNA polimerase ejeta a parte do DNA na qual a informação genética para transcrição está armazenada e libera a molécula de RNA sintetizada de um a 15 nucleotídeos de comprimento (cf. por exemplo, Goldman et al., 2009, Science, 324(5929):927-928). Para evitar, por exemplo, uma resposta imune indesejada após a administração de uma composição farmacêutica compreendendo tais fragmentos de moléculas de mRNA curtos, é altamente desejável obter moléculas de mRNA não fragmentadas purificadas para outras aplicações a jusante, especialmente em contextos terapêuticos.

[005] Existem diferentes abordagens para purificação de moléculas de mRNA, incluindo precipitação e filtração, bem como suas combinações. Para a remoção de sais, nucleotídeos e proteínas indesejados, as abordagens baseadas na precipitação de RNA representam, por exemplo, um método fácil e de baixo custo para obter moléculas de RNA purificadas como um pelete que pode ser ressuspenso em um tampão de escolha. Diferentes soluções podem ser usadas para precipitação compreendendo, por exemplo, tiocianato de guanidina (GSCN), acetato de amônio (NH4OAc), etanol, cloreto de lítio e acetato de sódio (revisado, por exemplo, por Walker e Lorsch, 2013, Methods Enzymol, 530: 337-343). Por outro lado, os métodos de filtração são baseados em conceitos mecânicos para purificar uma molécula alvo, como moléculas de mRNA. No caso de filtração, uma alimentação, isto é, uma solução ou suspensão compreendendo as moléculas alvo, tais como moléculas de mRNA, é passada através de ou por uma membrana de filtro, sendo esta última referida como filtração de fluxo tangencial (TFF).

[006] WO 2014/152966 A1 e WO 2015/164773 A1 descrevem, por exemplo, métodos para a purificação de moléculas de mRNA usando TFF

4 / 84 com vários volumes de solução e/ou suspensão. As moléculas de mRNA são purificadas por precipitação das moléculas de mRNA usando, por exemplo, ureia, GSCN e/ou cloreto de potássio e os precipitados são lavados várias vezes. No entanto, em ambos os casos, não é mostrado que os métodos são capazes de purificar as moléculas de mRNA alvo em vista de fragmentos de mRNA curtos, tais como moléculas de mRNA abortivas e/ou produtos de hidrólise.

[007] WO 2016/193206 A1 descreve um método para a produção e purificação de RNA, em que a purificação de RNA compreende pelo menos uma etapa de TFF e de preferência nenhuma etapa compreendendo uma extração de fenol/clorofórmio e/ou precipitação de DNA e/ou RNA. Além disso, as moléculas de RNA preferencialmente purificadas aplicando uma etapa de purificação adicional utilizando, por exemplo, cromatografia de troca catiônica e/ou aniônica e/ou cromatografia de fase reversa. Como acima, o documento não descreve a purificação de moléculas de RNA alvo em vista de moléculas de mRNA abortivas e/ou produtos de hidrólise de moléculas de mRNA.

[008] WO 2018/157133 A1 descreve métodos para purificação em grande escala de moléculas de mRNA. A invenção refere-se especialmente ao uso de uma célula agitada ou dispositivo de filtração Nutsche agitado para preparar composições de moléculas de mRNA limpas e homogêneas. Como mostrado nos Exemplos, as moléculas de mRNA são precipitadas usando GSCN e o precipitado é lavado usando uma solução compreendendo GSCN e etanol. Curiosamente, as composições de moléculas de mRNA obtidas pelo método reivindicado são comparadas com composições compreendendo moléculas de mRNA purificadas usando TFF e é mostrado que apenas a purificação baseada em TFF resultou em uma solução que compreendia enzimas residuais além das moléculas de mRNA alvo.

[009] Portanto, ainda há a necessidade de ter em mãos soluções

5 / 84 alternativas para ser capaz de purificar com eficiência moléculas de mRNA em grande escala, especialmente em vista de moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise de moléculas de mRNA, garantindo baixos níveis de sais que podem ser problemáticos para aplicações a jusante, como GSCN e usando um sistema que pode ser facilmente automatizado.

[0010] O presente pedido aborda a necessidade de obter moléculas de mRNA purificadas com alto rendimento, provendo as modalidades conforme recitadas nas reivindicações.

[0011] Em particular, a presente invenção refere-se a um método para purificar moléculas de mRNA, dito método compreendendo (Ia) purificar moléculas de mRNA precipitadas a partir de uma suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas usando uma primeira solução, (Ib) lavar e dissolver as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (Ia) usando uma segunda solução, (IIa) purificar as moléculas de mRNA a partir das moléculas de mRNA dissolvidas obtidas na etapa (Ib) usando uma terceira solução compreendendo um agente quelante, seguido por (IIb) lavar as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (Ia) usando uma quarta solução, em que as etapas (Ia) a (IIb) são realizadas usando filtração de fluxo tangencial.

[0012] Surpreendentemente, verificou-se que o método de acordo com a presente invenção resulta em um alto grau de purificação de moléculas de mRNA e, portanto, em uma solução compreendendo moléculas de mRNA purificadas, mas nenhum ou quase nenhum produto de hidrólise de molécula de mRNA e moléculas de mRNA abortivas. Em particular, verificou-se que, aplicando os referidos produtos de hidrólise da molécula de mRNA do método, moléculas de mRNA abortivas, proteínas e sais que podem ser problemáticos para aplicações a jusante são removidos de forma eficiente. Assim, ao aplicar o método de acordo com a presente invenção, pode ser obtida uma solução compreendendo moléculas de mRNA purificadas que é

6 / 84 adequada para aplicações a jusante, como aplicações farmacêuticas.

[0013] No contexto da presente invenção, o termo “um método para purificação” refere-se a um método para obter moléculas alvo de uma mistura, por exemplo, uma solução ou suspensão, compreendendo as referidas moléculas alvo a serem purificadas e componentes diferentes das moléculas alvo, em que a concentração das moléculas alvo é realçada ou aumentada na solução obtida após a realização do referido método em comparação com a concentração das moléculas alvo na mistura antes de realizar o referido método. A purificação de moléculas alvo também pode ser referida como o enriquecimento das referidas moléculas alvo, removendo ou pelo menos removendo substancialmente componentes diferentes das moléculas alvo.

[0014] No contexto da presente invenção, as moléculas alvo são moléculas de mRNA. Aqui, o termo “mRNA” e “molécula de mRNA”, que são usados de modo intercambiável, referem-se a uma molécula de RNA de fita simples construída, por exemplo, de nucleotídeos A, C, G e/ou U, ou seja, nucleotídeos compreendendo adenina, guanina, citosina e uracila como a respectiva base nitrogenada. Além disso, uma molécula de mRNA contém uma ou mais sequências de codificação que podem ser usadas como um modelo durante a síntese de uma sequência de aminoácidos durante a tradução. Assim, a molécula de mRNA a ser purificada compreende preferencialmente uma sequência de codificação, isto é, uma sequência que pode ser traduzida em uma sequência de aminoácidos, tal como uma proteína e que compreende um códon de início e um códon de parada. A sequência de codificação pode ser uma sequência de ocorrência natural, uma sequência otimizada de códons parcial ou totalmente derivada da sequência natural a ser usada ou uma sequência artificial. Otimização de códons refere-se a uma técnica que é aplicada para maximizar a expressão de proteínas, aumentando a eficiência de tradução da respectiva molécula de mRNA, pois em alguns casos existem códons que são preferencialmente usados por algumas espécies

7 / 84 para um determinado aminoácido. Além disso, a referida molécula de mRNA pode compreender uma região 5’ e/ou 3’ não traduzida (UTRs), um ou mais locais de entrada de ribossomo interno (IRES), uma ou mais sequências adicionais para promover a tradução e/ou um ou mais modificações para ajustar e/ou estender a duração da ação. Outras características das moléculas de mRNA são descritas em mais detalhes abaixo.

[0015] Portanto, o termo “mRNA” deve ser entendido como significando qualquer molécula de RNA que seja adequada para a expressão de uma sequência de aminoácidos ou que seja traduzível em uma sequência de aminoácidos, como uma proteína. Assim, uma “molécula de mRNA” deve ser entendida como uma molécula de mRNA que exibe uma propriedade e/ou atividade pela qual é caracterizada e, portanto, pode ser traduzida em uma sequência de aminoácidos, tal como uma proteína com a referida sequência de aminoácidos mostrando a atividade e/ou propriedade que o caracteriza.

[0016] Aqui, o termo “sequência de aminoácidos” abrange qualquer tipo de sequência de aminoácidos, ou seja, cadeias de dois ou mais aminoácidos que estão cada uma ligada por meio de ligações peptídicas e se referem a qualquer sequência de aminoácidos de interesse. De preferência, a sequência de aminoácidos codificada tem pelo menos 5 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente pelo menos 10 aminoácidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 50, 100, 200 ou 500 aminoácidos. Assim, o termo “sequência de aminoácidos” abrange peptídeos curtos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas de fusão, proteínas, bem como seus fragmentos, tais como partes de proteínas conhecidas, de preferência partes funcionais. Estes podem ser, por exemplo, partes biologicamente ativas de uma proteína ou partes antigênicas, como epítopos, que podem ser eficazes na criação de anticorpos. No que diz respeito à função da sequência de aminoácidos, não há limitação e as possíveis sequências de aminoácidos são descritas mais detalhadamente abaixo.

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[0017] Em contraste, os componentes a serem removidos durante a purificação das referidas moléculas de mRNA e, portanto, componentes diferentes das moléculas alvo incluem, por exemplo, moléculas de mRNA que são parcial ou completamente degradadas por hidrólise. A degradação por hidrólise é um processo aleatório e os produtos de degradação resultantes, aqui referidos como “produtos de hidrólise” ou também “produtos de hidrólise da molécula de mRNA”, são mais curtos em pelo menos 1 nucleotídeo do que a molécula de mRNA que foi hidrolisada. Assim, dependendo do comprimento da molécula de mRNA que foi hidrolisada, os produtos de hidrólise resultantes podem ter, por exemplo, um comprimento inferior a 10.000 nucleotídeos, de preferência inferior a 5.000 nucleotídeos, mais preferencialmente inferior a 500 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente inferior a 250 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente menos do que 170 nucleotídeos, e mais preferencialmente menos do que 120 nucleotídeos. Outro exemplo de componentes a serem removidos são moléculas de mRNA abortivas que podem ter um comprimento de, por exemplo, menos de 50 nucleotídeos, preferencialmente menos de 25 nucleotídeos, e mais preferencialmente menos de 15 nucleotídeos.

[0018] Além disso, os componentes a serem removidos durante a purificação das moléculas de mRNA incluem, por exemplo, componentes usados durante a síntese in vitro das moléculas alvo, como a transcrição in vitro de moléculas de mRNA e/ou componentes compreendidos em células usadas para amplificação de modelos para a síntese do moléculas alvo e/ou para a transcrição de moléculas de mRNA. No caso de transcrição in vitro de moléculas de mRNA, tais componentes compreendem, por exemplo, proteínas, tais como enzimas utilizadas para a transcrição in vitro; sais; íons como íons de magnésio; nucleosídeo-trifosfatos; mono-, di- e/ou trifosfatos incluindo 5’ caps e/ou análogos de 5’ caps; transcrições abortivas; produtos de hidrólise; um tampão tal como ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico

9 / 84 (MOPS); e/ou um agente quelante tal como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[0019] O método de acordo com a presente invenção é realizado por filtração de fluxo tangencial (TFF). O TFF é caracterizado em que a suspensão ou solução compreendendo as moléculas de mRNA a serem purificadas flui tangencialmente através da superfície de uma membrana de filtro com as moléculas de mRNA sendo preferencialmente retidas no retentado. Portanto, ao realizar TFF para purificar as moléculas de mRNA, a presença de uma torta de filtro que pode obstruir a membrana do filtro com o tempo é evitada e, assim, o tempo que a membrana do filtro pode ser usada é aumentado.

[0020] Assim, o sistema para purificar moléculas alvo de acordo com a presente invenção é um sistema TFF. Um sistema TFF tipicamente compreende um dispositivo de filtro, como uma cápsula, cassete e suporte, ou módulo de fibra oca, uma bomba, tubulação, uma válvula ou braçadeira e um reservatório de fluido e, opcionalmente, um manômetro (cf. Figura 1). um sistema TFF pode ser usado continuamente, mesmo com altas concentrações de moléculas de mRNA, sem obstrução dos poros da membrana do filtro. O uso de um sistema TFF é vantajoso, pois permite a purificação de alto rendimento das moléculas de mRNA a serem purificadas.

[0021] Digno de nota, o termo “solução” comumente se refere a uma mistura homogênea de duas ou mais substâncias e é, em particular, aplicado ao estado líquido da matéria, embora soluções de gases e sólidos também sejam possíveis. Aqui, o termo “solução”, especialmente no caso da “primeira solução”, “segunda solução”, “terceira solução” e “quarta solução” de acordo com a presente invenção, engloba um líquido tal como água, uma mistura de líquidos, de preferência homogênea, bem como por exemplo, uma mistura de um líquido e um sal, de preferência dissolvido.

[0022] De acordo com a presente invenção, é provido um método de

10 / 84 purificação de moléculas de mRNA, em que o referido método compreende como etapa (Ia) a purificação de moléculas de mRNA precipitadas de uma suspensão que compreende as referidas moléculas de mRNA precipitadas. A referida purificação é conseguida usando uma primeira solução. A suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas pode ser obtida, por exemplo, por lise celular ou transcrição in vitro. Assim, as moléculas de mRNA precipitadas devem ser purificadas a partir de componentes de células ou de misturas de transcrição in vitro, como sequências de aminoácidos, incluindo proteínas e enzimas, trifosfatos de nucleosídeos, componentes de tampão e, opcionalmente, 5’ caps e análogos de 5’ cap. 5’ caps e análogos de 5’ cap podem estar contidos na suspensão usada para realizar a etapa (Ia), por exemplo, no caso de as moléculas de mRNA terem sido transcritas in vitro e terem sido co-transcricionalmente capeadas em 5’. Portanto, a etapa (Ia) é vantajosa para remover componentes ou componentes celulares de misturas de transcrição in vitro de moléculas de mRNA precipitadas.

[0023] Em algumas modalidades da presente invenção, a primeira solução contém acetato de amônio (NH4OAc). Assim, as moléculas de mRNA precipitadas são purificadas da suspensão usando uma primeira solução compreendendo NH4OAc. Além disso, a primeira solução preferencialmente tem um pH na faixa de 1 a 12, mais preferencialmente na faixa de 1 a 10, ainda mais preferencialmente na faixa de 3 a 9, e mais preferencialmente na faixa de 6 a 8. Assim, as moléculas de mRNA precipitadas são purificadas a partir da suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas usando uma primeira solução que compreende NH4OAc e tem um pH na faixa de 1 a 12, de preferência na faixa de 1 a 10, mais preferencialmente na faixa de 3 a 9, e ainda mais preferencialmente na faixa de 6 a 8.

[0024] O método de purificação de moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção compreende ainda como etapa (Ib) a lavagem e a dissolução das moléculas de mRNA precipitadas purificadas obtidas a partir

11 / 84 da etapa (Ia) descrita acima usando uma segunda solução. A referida segunda solução pode ser qualquer solução em que as moléculas de mRNA podem ser ressuspensas e em que as moléculas de mRNA permanecem estáveis, isto é, não hidrolisam, por exemplo água. A realização da etapa (Ib) é vantajosa para remover especialmente componentes da primeira solução e para obter moléculas de mRNA dissolvidas.

[0025] Em algumas modalidades da presente invenção, a segunda solução é água.

[0026] O método de purificação de moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção compreende ainda como etapa (IIa) a purificação das moléculas de mRNA das moléculas de mRNA dissolvidas obtidas na etapa (Ib) usando uma terceira solução compreendendo um agente quelante. Isto é particularmente vantajoso para remover moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise da solução que compreende as moléculas de mRNA dissolvidas.

[0027] O termo “agente quelante” refere-se a moléculas que quelam cátions e, em particular, a moléculas com grupos doadores que podem se ligar a um átomo central em um complexo de coordenação dependendo de vários fatores, como pH e/ou temperatura, a concentração do agente quelante, e/ou o tipo de cátion a ser quelado. Os agentes quelantes podem ser caracterizados, por exemplo, pelo número de dentados, isto é, o número de grupos doadores, por molécula e/ou o número de posições de coordenação no cátion a ser quelado. Por exemplo, o agente quelante EDTA tem seis dentados e quelata um cátion divalente em um complexo de cátion divalente de agente quelante 1:1.

[0028] De preferência, no contexto da presente invenção, o termo “agente quelante” refere-se a agentes quelantes que são capazes de complexar cátions divalentes e/ou trivalentes, tais como, por exemplo, íons divalentes de magnésio e cálcio e/ou íons de ferro trivalentes. Geralmente, os agentes

12 / 84 quelantes com menos de quatro posições de coordenação no cátion têm menor atividade quelante em comparação com agentes quelantes com quatro ou mais posições de coordenação no cátion, especialmente em vista de complexar de forma eficiente cátions divalentes e/ou trivalentes.

[0029] Os agentes quelantes de acordo com a presente invenção são agentes quelantes com pelo menos quatro posições de coordenação no cátion a ser quelado, mais preferencialmente agentes quelantes com mais de quatro posições de coordenação no cátion a ser quelado, ainda mais preferencialmente pelo menos quatro dentados por molécula, aqui também referidos como “agentes quelantes potentes”, mais preferencialmente agentes quelantes com mais de quatro posições de coordenação no cátion a ser quelado que são usados em composições e/ou formulações farmacêuticas, e ainda mais preferencialmente EDTA. Agentes quelantes com mais de quatro posições de coordenação no cátion a ser quelado que são usados em composições farmacêuticas são, por exemplo, usados em antídotos compreendendo solução de Na2EDTA (por exemplo, 2g/10 ml; cf. por exemplo GPUPharma GmbH) e/ou dinatrium EDTA de cálcio (por exemplo 50 mg/ml, Amp. 10 ml; cf. por exemplo. Laboratoires SERB), ou por exemplo usados como excipientes (cf. por exemplo Phenhydan, Desitin Arzneimittel GmbH; ou Soluvit N, Baxter; ou Fluimucil, Zambon GmbH).

[0030] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente quelante é EDTA.

[0031] Exemplos de agentes quelantes preferidos estão listados na Tabela 1 com EDTA sendo o agente quelante mais preferido. Tabela 1 Nome Abreviações Dentados por molécula Ácido nitrilotriacético NTA 4 Ácido etilenodiaminotetracético EDTA 6 Ácido ciclo-hexanodiaminotetracético CDTA 6 Ácido dietilenotriaminopenta-acético DTPA 8 Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N’,N’-tetraacético EGTA 6 Ácido N-(2-hidroxietil)etilenodiamina-N,N,N’-triacético HEDTA 5 Trietilenotetramina-hexa-acetato TTHA 10 Ácido etilenodiamina-N, N’-disuccínico EDDS 6

13 / 84 Nome Abreviações Dentados por molécula Ácido trans-1,2-diaminociclo-hexanotetra-acético DCTA 6 Ácido 1,3-propilendiamintetra-acético PDTA 6

[0032] Agentes quelantes potentes, como o EDTA, podem remover com eficiência especialmente cátions divalentes, como os cátions magnésio. Os cátions de magnésio são, por exemplo, necessários para as enzimas envolvidas na transcrição de moléculas de mRNA e, portanto, estão presentes em níveis elevados em misturas de transcrição celular e in vitro. Foi verificado pelos presentes inventores que uma remoção eficiente de produtos de hidrólise e moléculas de mRNA abortivas pode ser alcançada usando um agente quelante potente, tal como EDTA na etapa (IIa), permitindo assim um alto grau de purificação de moléculas de mRNA. Sem estar vinculado à teoria, é hipotetizado que os referidos cátions mencionados acima podem suportar a formação de estruturas secundárias e terciárias de moléculas de mRNA e que a remoção, especialmente de cátions divalentes, como cátions de magnésio, pode ser de particular relevância para a purificação de mRNA moléculas como moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise podem tender a se ligar às moléculas de mRNA a serem purificadas na presença dos referidos cátions. Assim, acredita-se que ao remover os cátions divalentes usando um agente quelante potente como o EDTA na etapa (IIa), o ponto de fusão é reduzido e a estrutura secundária e/ou terciária das moléculas de mRNA é afetada. Portanto, moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise podem ser removidos como permeado. Portanto, a etapa (IIa) é particularmente vantajosa para remover moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise.

[0033] De acordo com a presente invenção, a terceira solução compreende um agente quelante, preferencialmente um agente quelante potente como definido acima, mais preferencialmente EDTA. Como afirmado acima, a capacidade de complexação dos agentes quelantes pode ser influenciada pelo pH, uma vez que a constante de construção complexa de um determinado agente quelante é influenciada pelo pH. Por exemplo, o EDTA é

14 / 84 especialmente potente em valores de pH mais elevados, como um pH entre 8 e 10, tendo em vista os íons de magnésio quelantes. No entanto, é desejável ajustar o pH tendo em vista um equilíbrio ótimo entre a capacidade de complexação de um determinado agente quelante e a estabilidade das moléculas de mRNA a serem purificadas. Neste contexto, observou-se que um agente quelante potente como o EDTA pode remover com eficiência, especialmente cátions divalentes a um pH entre 1 e 10, de preferência entre 6 e 8. Assim, sem estar vinculado à teoria, é hipotetizado que por isso o ponto de fusão especialmente de moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise que estão ligados a moléculas de mRNA podem ser reduzidos por agentes quelantes potentes como EDTA e, portanto, moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise podem ser removidos enquanto têm um pH que é ao mesmo tempo ajustado para um valor que preserva a estabilidade das moléculas de mRNA a serem purificadas.

[0034] Assim, em uma modalidade preferida, o valor de pH na terceira solução contendo um agente quelante é ajustado para um valor de pH em que o respectivo agente quelante tem uma capacidade quelante ótima.

[0035] Portanto, o uso, por exemplo, de um agente quelante potente, como EDTA a um pH entre 1 e 10, de preferência a um pH entre 6 e 8, é vantajoso para uma remoção eficiente de cátions divalentes e, portanto, por sua vez, para uma remoção eficiente de abortivos Moléculas de mRNA e produtos de hidrólise. No caso de ser usado um dos agentes quelantes alternativos mencionados acima, pode ser necessário ajustar o pH a um valor de pH em que a referida alternativa seja eficaz na remoção de íons, preferencialmente, cátions de magnésio divalentes. As gamas de pH correspondentes são indicadas na Tabela acima para os agentes quelantes preferidos.

[0036] Em algumas modalidades, a terceira solução tem um pH na faixa de 1 e 10, de preferência na faixa entre 3 e 9, e mais preferencialmente

15 / 84 na faixa entre 6 e 8.

[0037] O pH da terceira solução pode ser obtido usando um tampão. Tampões preferidos (com suas respectivas faixas de pH dadas entre parênteses) compreendem 2- [bis(2-hidroxietil)amino]-2- (hidroximetil) propano-1,3-diol (Bis-Tris; faixa de pH 5,8-7,2), ácido N-(2-acetamido) iminodiacético (ADA; faixa de pH 6,0-7,2), ácido N- (2-acetamido) -2- aminoetanossulfônico (ACES; faixa de pH 6,1-7,5), ácido 1,4- piperazinodietanossulfônico (PIPES; faixa de pH 6,1-7,5), ácido 2-hidroxi-3- morfolin-4-ilpropano-1-sulfônico (MOPSO; faixa de pH 6,2-7,6), 1,3- bis(tris(hidroximetil)metilamino)propano (Bis-Tris propano; faixa de pH 6,3- 9,5), ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES; faixa de pH 6,4-7,8), ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico (MOPS; faixa de pH 6,5-7,9), Ácido 2-[[1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino] etanossulfônico (TES; faixa de pH 6,8-8,2), ácido 2-[4-(2-hidroxietil) piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES; faixa de pH 6,8-8,2), ácido 3-(N, N- bis[2-hidroxietil]amino) -2-hidroxipropanossulfônico (DIPSO; faixa de pH 7,0-8,2), ácido 4-(N-morfolino)butanossulfônico (MOBS; faixa de pH 6,9- 8,3) e ácido 3-[[1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]-2- hidroxipropano-1-sulfônico (TAPSO; faixa de pH 7,0-8,2). Um tampão particularmente preferido é MOPS com um pH preferido entre 6 e 8, mais preferencialmente entre 6,5 e 7,5.

[0038] Em algumas modalidades, a terceira solução tem um pH na faixa de 1 e 10, de preferência na faixa entre 3 e 9, e mais preferencialmente na faixa entre 6 e 8, e compreende um tampão, preferivelmente MOPS.

[0039] Em algumas modalidades da presente invenção, a terceira solução compreende tampão MOPS e é preferencialmente obtida ajustando o pH do tampão MOPS antes da adição de um agente quelante, preferencialmente EDTA.

[0040] Assim, em algumas modalidades da presente invenção, a

16 / 84 terceira solução que compreende preferencialmente EDTA como agente quelante para remover especialmente cátions divalentes, tais como cátions de magnésio, compreende ainda tampão MOPS e tem um pH entre 6 e 8. Em algumas modalidades da presente invenção, a terceira solução pode ser obtida preparando um tampão MOPS, ajustando o pH do referido tampão MOPS a um pH entre 1 e 10, de preferência entre 6 e 8, e depois adicionando EDTA como agente quelante preferido.

[0041] Em algumas modalidades da presente invenção, a terceira solução compreende MOPS 40 mM e EDTA 10 mM e tem um pH entre 6 e 8, de preferência entre 6,5 e 7,5.

[0042] O método de purificação de moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção compreende ainda como etapa (IIb) a lavagem das moléculas de mRNA purificadas obtidas a partir da etapa (IIa) usando uma quarta solução. A quarta solução pode ser qualquer solução em que as moléculas de mRNA permaneçam estáveis, isto é, não hidrolisem. O etapa (IIb) é vantajoso para remover os componentes da terceira solução com a referida quarta solução compreendendo, por exemplo, cloreto de sódio ou citrato ou sendo água.

[0043] Como afirmado acima, a segunda e a quarta solução podem ser qualquer solução em que as moléculas de mRNA nas quais as moléculas de mRNA permanecem estáveis, isto é, não hidrolisam. Tal fluido pode ser, por exemplo, água, de preferência água sem nuclease ou água sem RNase, como água para injeção (água WFI). No caso da quarta solução, tal fluido pode ainda ser, por exemplo, glicose tamponada com HEPES, cloreto de sódio e/ou citrato.

[0044] Assim, em algumas modalidades da presente invenção, a quarta solução é água.

[0045] Em algumas modalidades da presente invenção, a segunda e a quarta soluções são água.

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[0046] Em algumas modalidades da presente invenção, a quarta solução compreende cloreto de sódio e/ou citrato.

[0047] Em algumas modalidades da presente invenção, a segunda solução é água e/ou a quarta solução é água ou compreende cloreto e/ou citrato de sódio. Isto é vantajoso para a obtenção de uma solução compreendendo as moléculas de mRNA purificadas após a etapa (IIb) sem a introdução de componentes que teriam que ser removidos em etapas adicionais antes do processamento posterior ou aplicação posterior.

[0048] Em modalidades preferidas da presente invenção, a segunda solução é água e a quarta solução compreende cloreto de sódio e/ou citrato, de preferência a um pH entre 4 e 5. Isto é altamente vantajoso especialmente para contextos terapeuticamente como cloreto de sódio e/ou citrato é preferencialmente incluído em uma composição farmacêutica compreendendo as moléculas de mRNA purificadas. Assim, isto é vantajoso em vista de uma formulação subsequente das moléculas de mRNA obtidas em composições farmacêuticas, uma vez que cloreto de sódio e/ou citrato são componentes freqüentemente usados de composições farmacêuticas. Assim, o uso de uma quarta solução que compreende cloreto de sódio ou citrato, que é um componente preferido de composições farmacêuticas, permite uma integração eficiente em termos de tempo e custo das etapas necessárias para purificar as referidas moléculas de mRNA e formulá-las em uma composição farmacêutica.

[0049] No caso de a quarta solução compreender cloreto e/ou citrato de sódio, o pH da quarta solução é preferencialmente entre 3 e 6, mais preferencialmente entre 3,5 e 5,5, e ainda mais preferencialmente entre 4 e 5.

[0050] Em modalidades preferidas do método de acordo com a presente invenção, o etanol não está incluído em nenhuma das primeira, segunda, terceira e/ou quarta solução usada no referido método.

[0051] Como afirmado acima, foi surpreendentemente verificado que,

18 / 84 aplicando o método de acordo com a presente invenção, um alto grau de purificação de moléculas de mRNA pode ser obtido. De preferência, a solução obtida pela realização do referido método compreende moléculas de mRNA purificadas, mas nenhum ou apenas níveis muito baixos de produtos de hidrólise e moléculas de mRNA abortivas. Mais preferencialmente, a porcentagem de moléculas de mRNA é de pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de todas as moléculas de RNA (moléculas de mRNA, produto de hidrólise e moléculas de mRNA abortivas) na solução obtida após a etapa (IIb). Isso pode ser medido por métodos bem conhecidos dos versados na técnica, como, por exemplo, eletroforese em gel, análise de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou por investigação de eletroferogramas obtidos por eletroforese em gel capilar ou eletroforese capilar, como análise por Analisador de Fragmentos. A última abordagem é descrita exemplarmente em mais detalhes nos Exemplos abaixo.

[0052] Em algumas modalidades da presente invenção, pelo menos a etapa (IIa), de preferência as etapas (Ia) a (IIb), são realizadas a uma temperatura entre 0 °C e 25 °C, de preferência entre 2 °C e 8 °C. Assim, o método de acordo com a presente invenção é preferencialmente realizado entre 0 °C e 25 °C, pelo menos no caso da etapa (IIa), isto é, a purificação das moléculas de mRNA das moléculas de mRNA dissolvidas obtidas a partir da etapa (Ib) usando um terceira solução compreendendo um agente quelante potente, preferencialmente EDTA. Assim, as moléculas de mRNA abortivas e os produtos da hidrólise são removidos realizando o etapa (IIa) a uma temperatura entre 0 °C e 25 °C, de preferência a uma temperatura entre 2 °C e 8 °C. Especialmente as temperaturas mais baixas, como temperaturas entre 2 °C e 8 °C, são vantajosas, pois a quantidade de degradação das moléculas de mRNA por hidrólise é reduzida em comparação com a quantidade de degradação que é observada ao realizar especialmente a etapa (IIa) a uma

19 / 84 temperatura mais alta, tal como uma temperatura acima de 25 °C. Assim, para obter grandes quantidades de moléculas de mRNA purificadas, é vantajoso realizar pelo menos a etapa (IIa), de preferência pelo menos as etapas (Ia) a (IIb) do método de acordo com a presente invenção a uma temperatura entre 0 °C e 25 °C, de preferência entre 2 °C e 8 °C.

[0053] Em algumas modalidades da presente invenção, as moléculas de mRNA precipitadas compreendidas na suspensão são obtidas por transcrição in vitro, de preferência usando um molde de DNA. Assim, as moléculas de mRNA a serem purificadas de acordo com a presente invenção podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica. De preferência, as moléculas de mRNA são transcritas in vitro usando um molde de DNA.

[0054] A transcrição in vitro requer um modelo de DNA linear ou linearizado purificado contendo um promotor, trifosfatos de ribonucleotídeo, um sistema tampão e uma polimerase de RNA apropriada, como uma polimerase de RNA de T7. Por exemplo, um tal modelo de DNA linear purificado pode ser sintetizado quimicamente in vitro, opcionalmente seguido por amplificação do modelo usando, por exemplo, um método baseado em PCR. Alternativamente, um molde de DNA para transcrição pode ser obtido a partir de um plasmídeo de DNA que é geralmente obtido por lise celular, purificado e linearizado, por exemplo, usando uma enzima de restrição específica do local. Em ambos os casos, a sequência modelo de DNA linear obtida pode ser usada para a transcrição in vitro de moléculas de mRNA na presença de nucleotídeos A, C, G e U usando protocolos de laboratório padrão.

[0055] Em algumas modalidades da presente invenção, as moléculas de mRNA a serem purificadas são produzidas por transcrição in vitro na presença de nucleotídeos não modificados e/ou modificados. Assim, as moléculas de mRNA a serem purificadas podem ser sintetizadas por

20 / 84 transcrição in vitro com base em um molde de DNA linear ou linearizado usando nucleotídeos não modificados e/ou modificados.

O termo “nucleotídeo não modificado” aqui utilizado refere-se aos nucleotídeos A, C, G, T e U conforme descrito acima.

Particularmente, no caso da transcrição in vitro de uma molécula de mRNA, o referido termo refere-se a nucleotídeos A, C, G e U.

O termo “nucleotídeo modificado” aqui utilizado refere-se a qualquer isômero de ocorrência natural ou quimicamente sintetizado de nucleotídeos A, C, G, T e U, bem como a quaisquer análogos de ocorrência natural ou sintetizados quimicamente, nucleotídeo alternativo ou modificado ou seu isômero tendo por exemplos de modificações químicas ou resíduos substituídos.

Os nucleotídeos modificados podem ter uma modificação de base e/ou uma modificação de açúcar.

Os nucleotídeos modificados também podem ter modificações do grupo fosfato, por exemplo, em relação à capa de cinco primer de uma molécula de mRNA.

Os nucleotídeos modificados também incluem nucleotídeos que são sintetizados pós-transcricionalmente por modificação covalente dos nucleotídeos.

Além disso, qualquer mistura adequada de nucleotídeos não modificados e modificados é possível.

Um número não limitativo de exemplos de nucleotídeos modificados pode ser encontrado na literatura (por exemplo, Cantara et al., Nucleic Acids Res, 2011, 39(Issue suppl_1):D195-D201; Helm and Alfonzo, Chem Biol, 2014, 21(2):174-185; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51(29):7110- 31) e alguns nucleotídeos modificados preferidos são mencionados exemplarmente a seguir com base em seus respectivos resíduos de nucleosídeo: 1-metiladenosina, 2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina, 2-metiladenosina, 2’-O-ribosilfosfato adenosina, N6- metil-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6-acetiladenosina, N6- glicinilcarbamoiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-metiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, N6-(cis-hidroxi-

21 / 84 isopentenil)adenosina, N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 1,2’-O- dimetiladenosina, N6,2’-O-dimetiladenosina, 2’-O-metiladenosina, N6,N6,2’- O-trimetiladenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, 2- metiltio-N6-metiladenosina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, 2-metiltio- N6-treonil carbamoiladenosina, N6-2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)adenosina, 7- metiladenosina, 2-metiltio-adenosina, 2-metoxi-adenosina, 2’-amino-2’- deoxiadenosina, 2’-azido-2’-deoxiadenosina, 2’-fluoro-2’-deoxiadenosina, 2- aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-deaza-adenosina, 7-deaza-8-aza- adenosina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza- 2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina; 2-tiocitidina, 3- metilcitidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5- metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 5-hidroxicitidina, lisidina, N4-acetil-2’- O-metilcitidina, 5-formil-2’-O-metilcitidina, 5,2’-O-dimetilcitidina, 2-O- metilcitidina, N4,2’-O-dimetilcitidina, N4,N4,2’-O-trimetilcitidina, isocitidina, pseudocitidina, pseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2’-metil-2’- deoxicitidina, 2’-amino-2’-deoxicitidina, 2’-fluoro-2’-deoxicitidina, 5- iodocitidina, 5-bromocitidina, 2’-azido-2’-deoxicitidina, 2’-amino-2’- deoxicitidina, 2’-fluor-2’-deoxicitidina, 5-aza-citidina, 3-metil-citidina, 1- metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tio-5- metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-l-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-l- metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-l-deaza-pseudoisocitidina, 2-metoxi- citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-l- metil-pseudoisocitidina, zebularina,5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5- aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina; 1-metilguanosina, N2,7- dimetilguanosina, N2-metilguanosina, 2’-O-ribosilfosfato guanosina, 7- metilguanosina, hidroxiwibutosina, 7-aminometil-7-deazaguanosina, 7-ciano- 7-deazaguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, N2,7,2’-O-trimetilguanosina, N2,2’-O-dimetilguanosina, 1,2’-O-dimetilguanosina, 2’-O-metilguanosina,

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N2,N2,2’-O-trimetilguanosina, N2,N2J-trimetilguanosina, Isoguanosina, 4- demetilwiosina, epoxiqueuosina, hidroxiwibutosina submodificada, hidroxiwibutosina submodificada metilada, isowiosina, peroxiwibutosina, galactosil-queuosina, mannosil-queuosina, queuosina, archaeosina, wibutosina, metilwiosina, wiosina, 7-aminocarboxipropildemetilwiosina, 7- aminocarboxipropilwiosina, 7-aminocarboxipropilwiosinametiléster, 7-deaza- guanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza- guanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil- guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metilguanosina, 8-oxo- guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio- guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, N1-metilguanosina, 2’-amino-3’- deoxiguanosina, 2’-azido-2’-deoxiguanosina, 2’-fluoro-2’-deoxiguanosina, 2- tiouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina, 3-metiluridina, 4-tiouridina, 5- metil-2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-carboximetiluridina, 5- carboximetilaminometiluridina, 5-hidroxiuridina, 5-metiluridina, 5- taurinometiluridina, 5-carbamoilmetiluridina, 5-(carboxi-hidroximetil)uridina metil éster, di-hidrouridina, 5-metildi-hidrouridina, 5-metilaminometil-2- tiouridina, 5-(carboxi-hidroximetil)uridina, 5-(carboxi-hidroximetil)-2’-O- metiluridina metil éster, 5-(isopentenilaminometil)uridina, 5- (isopentenilaminometil)-2-tiouridina, 3,2’-O-dimetiluridina, 5- carboximetilaminometil-2’-O-metiluridina, 5-carbamoil-hidroximetiluridina, 5-carbamoilmetil-2’-O-metiluridina, 5-carbamoilmetil-2-tiouridina, 5- metoxicarbonilmetil-2’-O-metiluridina, 5-(isopentenilaminometil)-2’-O- metiluridina, 5,2’-O-dimetiluridina, 2’-O-metiluridina, 2’-O-metil-2- tiorudina, 2-tio-2’-O-metiluridina, uridina 5- ácido oxiacético, 5- metoxicarbonilmetiluridina, uridina 5- ácido oxiacético metil éster, 5- metoxiuridina, 5-aminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina, 5-metilaminometil-2-selenouridina, 5-metoxicarbonilmetil-2- tiouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, pseudouridina, 1-metil-3-(3-amino-3-

23 / 84 carboxipropil)pseudouridina, 1-metilpseudouridina, 3-metilpseudouridina, 2’- O-metilpseudouridina, 5-formiluridina, 5-aminometil-2-geraniluridina, 5- taurinometiluridina, 5-iodouridina, 5-bromouridina, 2’-metil-2’-deoxiuridina, 2’-amino-2’-deoxiuridina, 2’-azido-2’-deoxiuridina, 2’-fluoro-2’- deoxiuridina, inosina, 1-metilinosina, 1,2’-O-dimetilinosina, 2’-O- metilinosina, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio- pseudouridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5- propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5- taurinometil-2-tio-uridina, 1-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1- metil-pseudouridina, 4-tio-l-metil-pseudouridina, 2-tio-l-metil-pseudouridina, 1-metil-l-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-l-deaza-pseudouridina, di- hidropseudouridina, 2-tio-di-hidrouridina, 2-tio-di-hidropseudouridina, 2- metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2- tio-pseudouridina, 1,2’-O-dimetiladenosina, 1,2’-O-dimetilguanosina, 1,2’-O- dimetilinosina, 2,8-dimetiladenosina, 2- metiltiometilenetio-N6-isopentenil- adenosina, 2-geraniltiouridina, 2-lisidina, 2-metiltio N6- treonilcarbamoiladenosina cíclica, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil) adenosina, 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6- treonilcarbamoiladenosina, 2-selenouridina, 2-tio-2’-O-metiluridina, 2’-O- metiladenosina, 2’-O-metilcitidina, 2’-O-metilguanosina, 2’-O-metilinosina, 2’-O-metilpseudouridina, 2’-O-metiluridina, 2’-O-metiluridina 5-ácido oxiacético metil éster, 2’-O-ribosiladenosinafosfato, 2’-O- ribosilguanosinafosfato, 3,2’-O-dimetiluridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)- 5,6-di-hidrouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina, 5,2’-O- dimetilcitidina, 5,2’-O-dimetiluridina, 5-(carboxi-hidroximetil)-2’-O- metiluridina metil éster, 55-(isopentenilaminometil)-2’-O-metiluridina, 5- aminometil-2-geraniltiouridina, 5-aminometil-2-selenouridina, 5- aminometiluridina, 5-carbamoilmetil-2’-O-metiluridina, 5-carboxi- hidroximetiluridina, 5-carboximetil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-

24 / 84 geraniltiouridina, 5-carboximetilaminometil-2-selenouridina, 5- carboximetilaminometil-2’-O-metiluridina, 5-cianometiluridina, 5-formil-2’- O-metilcitidina, 5-metoxicarbonilmetil-2’-O-metiluridina, 5-metilaminometil- 2-geraniltiouridina, 7-aminocarboxipropil-demetilwiosina, 7-metilguanosina, 8-metiladenosina, N2,2’-O-dimetilguanosina, N2,7,2’-O-trimetilguanosina, N2,7-dimetilguanosina, N2,N2,2’-O-trimetilguanosina, N2,N2,7- trimetilguanosina, N2,N2,7-trimetilguanosina, N4,2’-O-dimetilcitidina, N4,N4,2’-O-trimetilcitidina, N4,N4-dimetilcitidina, N4-acetil-2’-O- metilcitidina, N6,2’-O-dimetiladenosina, N6,N6,2’-O-trimetiladenosina, N6- formiladenosina, N6-hidroximetiladenosina, agmatidina, 2-metiltio N6- treonilcarbamoiladenosina cíclica, glutamil-queuosina, guanosina adicionada a qualquer nucleotídeo, extremidade 5’ de guanilato, hidroxi-N6- treonilcarbamoiladenosina; mais preferivelmente pseudo-uridina, N1-metil- pseudo-uridina, 2’-fluoro-2’-deoxicitidina, 5-iodocitidina, 5-metilcitidina, 2- tiouridina, 5-iodouridina e/ou 5-metil-uridina.

[0056] Além disso, o termo “nucleotídeo modificado” compreende nucleotídeos contendo isótopos, como deutério. O termo “isótopo” se refere a um elemento com o mesmo número de prótons, mas diferente número de nêutrons, resultando em diferentes números de massa. Assim, isótopos de hidrogênio, por exemplo, não estão limitados a deutério, mas incluem também trítio. Além disso, a molécula de mRNA também pode conter isótopos de outros elementos, incluindo, por exemplo, carbono, oxigênio, nitrogênio e fósforo. Também é possível que os nucleotídeos modificados sejam deuterados ou contenham outro isótopo de hidrogênio ou de oxigênio, carbono, nitrogênio ou fósforo.

[0057] Assim, no caso de as moléculas de mRNA a serem purificadas serem produzidas por transcrição in vitro na presença de quatro tipos de nucleotídeos, ou seja, A, C, G e U nucleotídeos, o número total de tipos de nucleotídeos modificados pode ser 0, 1, 2, 3 ou 4. Assim, em algumas

25 / 84 modalidades, pelo menos um nucleotídeo de um tipo de nucleotídeo, por exemplo, pelo menos um nucleotídeo U, pode ser um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de no total dois tipos de nucleotídeos, por exemplo, pelo menos um nucleotídeo U e pelo menos um nucleotídeo C, pode ser um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de no total três tipos de nucleotídeos, por exemplo, pelo menos um nucleotídeo G, pelo menos um nucleotídeo U e pelo menos um nucleotídeo C, pode ser um nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo de todos os quatro tipos de nucleotídeo pode ser um nucleotídeo modificado. Em todas essas modalidades, um ou mais nucleotídeos por tipo de nucleotídeo podem ser modificados, a porcentagem dos referidos nucleotídeos modificados por tipo de nucleotídeo sendo 0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 100%.

[0058] Em algumas modalidades, a porcentagem total de nucleotídeos modificados compreendidos nas moléculas de mRNA a serem purificadas é 0%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 100%.

[0059] As moléculas de mRNA a serem purificadas podem, por exemplo, ser caracterizadas em que 0,5 a 50%, de preferência 5 a 50% dos nucleotídeos U e 5 a 50% dos nucleotídeos C são modificados. Os referidos nucleotídeos U modificados são preferencialmente 5-ioduridina e os referidos nucleotídeos C modificados são preferencialmente 5-iodcitidina.

[0060] Em algumas modalidades, as moléculas de mRNA a serem purificadas podem ser caracterizadas em que 15 a 25% dos nucleotídeos U e 5 a 15% dos nucleotídeos C são modificados, em que os referidos nucleotídeos U modificados são preferencialmente 5-metiluridina e os referidos nucleotídeos C modificados são de preferência 5-iodcitidina.

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[0061] Em algumas modalidades, as moléculas de mRNA a serem purificadas podem ser caracterizadas em que 30 a 50% dos nucleotídeos U e 10 a 20% dos nucleotídeos C são modificados, em que os referidos nucleotídeos U modificados são preferencialmente 5-ioduridina e os referidos nucleotídeos C modificados são de preferência 5-iodcitidina.

[0062] Em algumas modalidades, as moléculas de mRNA a serem purificadas podem ser caracterizadas em que 30 a 50% dos nucleotídeos U e 5 a 15% dos nucleotídeos C são modificados, em que os referidos nucleotídeos U modificados são preferencialmente 5-ioduridina e os referidos nucleotídeos C modificados são de preferência 5-iodcitidina.

[0063] Em algumas modalidades, as moléculas de mRNA a serem purificadas podem ser caracterizadas em que 0,5 a 5% dos nucleotídeos U e 25 a 35% dos nucleotídeos C são modificados, em que os referidos nucleotídeos U modificados são preferencialmente 2-tiouridina e os referidos nucleotídeos C modificados são de preferência 5-metilcitidina.

[0064] As moléculas de mRNA a serem purificadas podem, por exemplo, também ser caracterizadas por 50 a 100%, de preferência 100%, dos nucleotídeos U serem modificados. Os referidos nucleotídeos U modificados são de preferência N1-metil-pseudo-uridina.

[0065] Em algumas modalidades da presente invenção, o método compreende antes da etapa (Ia) uma etapa de obtenção de uma suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas usando acetato de amônio. A precipitação de moléculas de mRNA é vantajosa para a remoção de sais, nucleotídeos e proteínas, especialmente porque a precipitação de mRNA é fácil e econômica. Diferentes soluções são conhecidas do especialista na técnica para precipitação compreendendo, por exemplo, GSCN, NH4OAc, etanol, cloreto de lítio, acetato de sódio e cloreto de sódio. No entanto, especialmente para aplicações terapêuticas, é altamente vantajoso evitar sais como GSCN e LDS. Portanto, em algumas modalidades da presente invenção,

27 / 84 as moléculas de mRNA são precipitadas usando NH4OAc. Assim, a suspensão usada na etapa (Ia) é preferencialmente obtida usando NH4OAc para precipitar as moléculas de mRNA.

[0066] Conforme mencionado acima, em algumas modalidades da presente invenção, a primeira solução contém acetato de amônio. De preferência, a quantidade total de NH4OAc na suspensão e na primeira solução está entre 0,1 mol/l e 5 mol/l, de preferência entre 1 mol/l e 4 mol/l, mais preferencialmente entre 2 mol/l e 3 mol/l e, portanto, menos do que 5 mol/l, de preferência menos do que 4 mol/l, mais preferivelmente menos do que 3 mol/l. A baixa quantidade de acetato de amônio é altamente vantajosa em vista de um processamento a jusante eficiente em termos de tempo e custo. A primeira solução pode ainda ter um pH na faixa de 1 a 12, de preferência entre 6,5 e 7,5.

[0067] Em algumas modalidades da presente invenção, a primeira solução contém acetato de amônio, em que a quantidade total de NH4OAc na suspensão e a primeira solução está entre 1 mol/l e 4 mol/l, de preferência entre 2 mol/l e 3 mol/eu.

[0068] Em algumas modalidades da presente invenção, a primeira solução tem um pH na faixa de 1 a 12, de preferência entre 6,5 e 7,5, e contém acetato de amônio, em que a quantidade total de NH4OAc na suspensão e a primeira solução está entre 1 mol/l e 4 mol/l, de preferência entre 2 mol/l e 3 mol/l.

[0069] Em algumas modalidades da presente invenção, o método para purificar moléculas de mRNA compreende ainda adicionar uma quinta solução às moléculas de mRNA dissolvidas obtidas na etapa (Ib) antes de purificar as moléculas de mRNA usando uma terceira solução compreendendo um agente quelante de acordo com a etapa (IIa). A quinta solução compreende preferencialmente o mesmo agente quelante que a terceira solução. Assim, a quinta solução compreende preferencialmente

28 / 84 EDTA como agente quelante para remover especialmente catiões divalentes, tais como catiões magnésio, e opcionalmente tampão MOPS. No entanto, a concentração do agente quelante compreendida na quinta solução é preferencialmente superior à concentração do agente quelante compreendida na terceira solução. Ao adicionar a quinta solução às moléculas de mRNA dissolvidas obtidas na etapa (Ib) antes de realizar a etapa (IIa), a composição da solução na qual as moléculas de mRNA obtidas na etapa (Ib) são suspensas pode ser ajustada à composição da terceira solução utilizada na etapa (IIa). Isto tem a vantagem de que os potenciais efeitos de diluição podem ser reduzidos e, assim, o rendimento e/ou reprodutibilidade da purificação da molécula de mRNA de acordo com o método aqui descrito pode ser aumentado.

[0070] Em algumas modalidades da presente invenção, o método para purificar moléculas de mRNA compreende ainda desfosforilar e/ou poliadenilar e/ou pós-capeamento das moléculas de mRNA. Assim, as moléculas de mRNA podem não apenas ser purificadas usando o método da presente invenção, mas adicionalmente ser modificadas para garantir a sua capacidade de serem traduzidas em sequências de aminoácidos funcionais, como proteínas. Tais modificações compreendem a desfosforilação das moléculas de mRNA para remover, por exemplo, 5’ mono-, di- e/ou trifosfatos que são adicionados durante a síntese in vitro ou transcrição das moléculas de mRNA e/ou durante o capeamento 5’ co-transcricional; a poliadenilação das moléculas de mRNA como a cauda poli(A) é o principal determinante do tempo de vida de uma molécula de mRNA na maioria dos casos; e pós-capeamento de moléculas de mRNA no caso de capeamento 5’ co-transcricional não ser realizado. Como especialmente as caudas 5’ caps e 3’ poli(A) são consideradas os principais determinantes da eficiência do mRNA, a incorporação de tais características em um método de purificação da molécula de mRNA é vantajosa tendo em vista a maximização do tempo e

29 / 84 da eficiência de custo do processamento da molécula de mRNA e maximizar a duração da ação das moléculas de mRNA purificadas.

[0071] A presença de um 5’ cap é vantajosa para aumentar a estabilidade das moléculas de mRNA e, portanto, para prolongar a duração da ação das moléculas de mRNA.

[0072] Assim, no caso de as moléculas de mRNA precipitadas a serem purificadas não compreenderem um 5’ cap ou um análogo de 5’ cap, as moléculas de mRNA são preferencialmente pós-transcricionalmente 5’ capeadas, por exemplo, por adição enzimática de um C1-m7G cap ou um m7GpppG cap.

[0073] No entanto, mais preferencialmente as moléculas de mRNA são co-transcricionalmente 5’ capeadas, por exemplo, usando um análogo de ARCA cap ou aplicando a tecnologia Trilink (tecnologia CleanCap; cf. US 2018/273576 A1). Neste caso, usar o método TFF de acordo com a presente invenção é vantajoso para remover o análogo de tampa limpo.

[0074] Além disso, no caso das moléculas de mRNA precipitadas a serem purificadas não compreenderem uma cauda 3’ poli(A), as moléculas de mRNA são preferencialmente poliadeniladas enzimaticamente com uma cauda poli(A) que consiste em pelo menos 100 nucleotídeos A, de preferência de pelo menos 120 Nucleotídeos A, mais preferencialmente de pelo menos 240 nucleotídeos A. Opcionalmente, a cauda poli(A) a ser adicionada compreende nucleotídeos não A, de preferência nucleotídeos G dentro da sequência da cauda poli(A) e/ou em uma extremidade da cauda poli(A), em que a referida extremidade não deve ser adicionada para a extremidade 3’ das moléculas de mRNA a serem purificadas. Verificou-se que adicionar uma cauda poli(A) às moléculas de mRNA é vantajoso para prolongar a duração da ação da referida molécula de mRNA e, portanto, para obter os níveis desejados de tradução.

[0075] Portanto, em algumas modalidades da presente invenção, o

30 / 84 método para purificar moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção compreende ainda desfosforilar as moléculas de mRNA.

[0076] Em outras modalidades da presente invenção, o método compreende ainda poliadenilar as moléculas de mRNA.

[0077] Em ainda outras modalidades da presente invenção, o método compreende ainda pós-capeamento das moléculas de mRNA.

[0078] Em algumas modalidades, o método para purificar moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção compreende pelo menos desfosforilar e poliadenilar as moléculas de mRNA.

[0079] Em algumas modalidades, o método para purificar moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção compreende pelo menos desfosforilar e pós-capeamento das moléculas de mRNA, em que a desfosforilação das moléculas de mRNA é realizada após pós-capeamento das moléculas de mRNA.

[0080] Em algumas modalidades da presente invenção, o método para purificar moléculas de mRNA compreende desfosforilar as moléculas de mRNA obtidas a partir da etapa (Ib), seguido pela realização das etapas (Ia) a (IIb), seguido por poliadenilar as moléculas de mRNA obtidas, seguido por realizar novamente etapas (Ia) a (IIb), em que a última etapa (Ia) é preferencialmente realizada a uma temperatura entre 20 °C e 30 °C, de preferência entre 23 °C e 27 °C, mais preferencialmente a 25 °C, opcionalmente seguida filtrando o retentado obtido compreendendo as moléculas de mRNA. Assim, para maximizar a eficiência de custo e tempo de processamento de moléculas de mRNA, o método para purificar moléculas de mRNA compreende ainda as etapas de desfosforilação e poliadenilação das moléculas de mRNA. Em particular, verificou-se ser vantajoso incorporar as duas últimas etapas juntamente com etapas adicionais para purificar as moléculas de mRNA para remover também componentes introduzidos durante a desfosforilação e poliadenilação.

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[0081] Portanto, especialmente no caso das moléculas de mRNA a serem purificadas compreenderem um 5’ caps ou análogo de 5’ cap adicionado de forma co-transcricional, o método para purificar as moléculas de mRNA pode compreender as seguintes etapas. Primeiro, as moléculas de mRNA precipitadas são purificadas de uma suspensão que compreende as referidas moléculas de mRNA precipitadas usando uma primeira solução na etapa (Ia), a referida primeira solução compreendendo preferencialmente acetato de amônio. As moléculas de mRNA precipitadas purificadas são então na etapa (Ib) lavadas e dissolvidas usando uma segunda solução, preferencialmente água, para remover, por exemplo, proteínas, sais e trifosfatos de nucleosídeo. As moléculas de mRNA dissolvidas são então desfosforiladas por métodos conhecidos pelos versados na técnica para a remoção de mono-, di- e trifosfatos 5 ‘de moléculas de RNA que podem não ter sido tampadas. As moléculas de mRNA desfosforiladas são purificadas usando a primeira solução, preferencialmente compreendendo acetato de amônio, em uma etapa posterior (Ia) e subsequentemente lavadas usando a segunda solução, que é preferencialmente água, em uma etapa posterior (Ib). As moléculas de mRNA assim obtidas são ainda purificadas na etapa (IIa) usando uma terceira solução compreendendo um agente quelante, de preferência EDTA, e de preferência MOPS a um pH entre 0 e 8, mais preferencialmente a um pH entre 6,5 e 7,5, para remover o mRNA abortivo moléculas e produtos de hidrólise. A terceira solução é então removida realizando uma etapa de lavagem na etapa (IIb) usando uma quarta solução. Se um etapa de poliadenilação não for necessário, por exemplo, porque um molde de DNA que compreende uma sequência que codifica uma cauda poli(A) foi usado para a transcrição in vitro, as moléculas de mRNA purificadas obtidas são lavadas na etapa (IIb) usando uma quarta solução, de preferência compreendendo citrato e/ou cloreto de sódio, e a referida etapa (IIb) é opcionalmente seguida por uma etapa de filtração adicional usando,

32 / 84 por exemplo, uma membrana de filtro com um tamanho de poro inferior a 0,3 µm. No caso de um etapa de poliadenilação ser vantajosa, por exemplo, porque um molde de DNA que não compreende uma sequência que codifica uma cauda poli(A) foi usado para transcrição in vitro, as moléculas de mRNA purificadas obtidas são lavadas na etapa (IIb) usando uma quarta solução, de preferência água, e podem então ser alongadas adicionando enzimaticamente uma cauda poli(A) 3’ usando protocolos de laboratório de rotina para garantir o prolongamento da ação das moléculas de mRNA, por exemplo, adicionando poli(A) polimerase. As moléculas de mRNA são então submetidas às etapas (Ia) a (IIb) conforme descrito antes, exceto que a etapa (Ia) é preferencialmente realizada a uma temperatura entre 20 °C e 30 °C, de preferência entre 23 °C e 27 °C, mais preferencialmente a 25 °C, por exemplo para remover a poli(A) polimerase adicionada, e exceto que a quarta solução usada na etapa (IIb) compreende preferencialmente citrato e/ou cloreto de sódio, para obter moléculas de mRNA purificadas compreendendo caudas de 5’ caps ou análogos de 5’ cap e 3’ poli(A). Opcionalmente, as moléculas de mRNA purificadas obtidas podem ser submetidas a uma etapa de filtração adicional usando, por exemplo, uma membrana de filtro com um tamanho de poro inferior a 0,3 µm.

[0082] No caso de as moléculas de mRNA a serem purificadas não compreenderem um 5’ cap ou análogo de 5’ cap adicionado co- transcricionalmente, o método para purificar moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção pode compreender uma etapa adicional, de preferência enzimaticamente, adição pós-transcricional um 5’ cap ou um análogo de 5’ caps em comparação com o procedimento descrito acima. Assim, o método para purificar as moléculas de mRNA pode compreender as seguintes etapas. Primeiro, as moléculas de mRNA precipitadas são purificadas de uma suspensão que compreende as referidas moléculas de mRNA precipitadas usando uma primeira solução na etapa (Ia), a referida

33 / 84 primeira solução compreendendo preferencialmente acetato de amônio.

As moléculas de mRNA precipitadas purificadas são então na etapa (Ib) lavadas e dissolvidas usando uma segunda solução, preferencialmente água, para remover, por exemplo, proteínas, sais e trifosfatos de nucleosídeo.

O método então compreende adicionalmente a desfosforilação das moléculas de mRNA obtidas na etapa (Ib), em seguida realizar as etapas (Ia) e (Ib), realizar a poliadenilação das moléculas de mRNA obtidas, em seguida realizar as etapas (Ia) a (IIb). Se um etapa de poliadenilação não for necessária, por exemplo, porque um molde de DNA que compreende uma sequência que codifica uma cauda poli(A) foi usado para a transcrição in vitro, as moléculas de mRNA purificadas obtidas são lavadas na etapa (IIb) usando uma quarta solução, de preferência compreendendo citrato e/ou cloreto de sódio, e a referida etapa (IIb) é opcionalmente seguida por uma etapa de filtração adicional usando, por exemplo, uma membrana de filtro com um tamanho de poro inferior a 0,3 µm.

No caso de um etapa de poliadenilação ser vantajosa, por exemplo, porque um molde de DNA que não compreende uma sequência que codifica uma cauda poli(A) foi usado para transcrição in vitro, as moléculas de mRNA purificadas obtidas são lavadas na etapa (IIb) usando uma quarta solução, de preferência água, e podem então ser alongadas adicionando enzimaticamente uma cauda poli(A) 3’ usando protocolos de laboratório de rotina para garantir o prolongamento da ação das moléculas de mRNA, por exemplo, adicionando poli(A) polimerase.

As moléculas de mRNA são então submetidas às etapas (Ia) a (IIb), em que a etapa (Ia) é preferencialmente realizada a uma temperatura entre 20 °C e 30 °C, preferencialmente entre 23 °C e 27 °C, mais preferencialmente a 25 °C, por exemplo para remover a poli(A) polimerase adicionada, e em que a etapa (IIb) é realizada usando uma quarta solução compreendendo preferencialmente citrato e/ou cloreto de sódio, opcionalmente seguida por filtrar o retentado obtido compreendendo as moléculas de mRNA.

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[0083] Portanto, as etapas (Ia) a (IIb) são preferencialmente realizadas antes de realizar qualquer alongamento de moléculas de mRNA, como poliadenilação 3’ e, opcionalmente, capeamento 5’. Em particular, as etapas (Ia) a (IIb) são preferencialmente realizadas antes da poliadenilação 3’ das moléculas de mRNA, e as etapas (Ia) a (Ib) são preferencialmente realizadas antes do capeamento 5’. Isso se aplica a todas as quatro modalidades descritas acima, ou seja, para a purificação de moléculas de mRNA que são co- transcricionalmente e pós-transcricionalmente 5 ‘tampadas, respectivamente.

[0084] Além disso, em todas as quatro modalidades descritas acima, as etapas de desfosforilação das moléculas de mRNA seguidas pelas etapas de execução (Ia) e (Ib) podem ser opcionais. Portanto, algumas modalidades correspondem às quatro modalidades, conforme descrito acima, exceto as etapas de desfosforilação das moléculas de mRNA seguidas pelas etapas de execução (Ia) e (Ib).

[0085] A TFF pode ser realizada usando como dispositivo de filtro uma cápsula, cassete e porta-cassete ou módulo de fibra oca. Especialmente, os módulos de fibra oca permitem percursos de fluxo totalmente pré- montados, pré-esterilizados e descartáveis que permitem o processamento estéril e fornecem um método de baixo custo para o empacotamento de membranas de filtro.

[0086] As membranas de filtro utilizadas para a purificação da molécula de mRNA podem ser de qualquer tipo de material adequado para a purificação da molécula de mRNA e, portanto, não interagir com as moléculas de mRNA a serem purificadas. Exemplos de materiais de membranas de filtro incluem polietersulfona não modificada (PES), polietersulfona modificada (mPES), membrana de fibra oca mPES, fluoreto de polivinilideno (PVDF), acetato de celulose, nitrocelulose, éster de celulose mista (ME), polietileno de MW ultra-alto (UPE), polifluorotetraetileno (PTFE), nylon, polissulfona (PS), poliacrilonitrila, polipropileno, cloreto de

35 / 84 polivinila, difluoreto de polivinilideno (PVDF) e suas combinações.

[0087] As membranas de filtro são caracterizadas por seu valor de corte de peso molecular (MWCO), que se refere ao menor peso molecular das partículas em daltons, dos quais 90% são retidos pela membrana. De preferência, uma membrana de filtro tem um tamanho de poro que é apropriado para reter moléculas de mRNA enquanto permite que componentes de tamanho menor do que o MWCO e, portanto, o tamanho de poro, passem através da membrana de filtro como permeado. Dado que têm de ser removidos diferentes componentes de diferentes tamanhos, é vantajoso ajustar o tamanho dos poros da membrana do filtro ao tamanho dos componentes a serem removidos no respectivo etapa do método de acordo com a presente invenção.

[0088] Em algumas modalidades da presente invenção, no caso da etapa (Ia), uma membrana de filtro com um peso molecular de corte entre 300 kDa e 0,65 µm é usada para TFF, de preferência de 500 kDa, e/ou em que no caso das etapas ( Ib) e (IIb) uma membrana de filtro com um peso molecular de corte entre 1 kDa e 0,65 µm é usada, de preferência entre 1 kDa e 300 kDa, mais preferencialmente entre 1 kDa e 50 kDa, ainda mais preferencialmente de 50 kDa, 70 kDa e/ou 100 kDa e/ou em que no caso da etapa (IIa) uma membrana de filtro com um peso molecular de corte de pelo menos 50 kDa, de preferência de pelo menos 70 kDa, é usada, mais preferencialmente de 70 kDa ou 100 kDa. A membrana do filtro usada no TFF é crucial, pois o tamanho dos poros da membrana do filtro determina o tamanho das partículas, como moléculas de mRNA e componentes que podem passar pela membrana do filtro e, portanto, são incluídos no permeado.

[0089] Assim, o MWCO da membrana do filtro é de preferência pelo menos 300 kDa ou 0,065 µm no caso do etapa (Ia). De preferência, o MWCO é selecionado a partir do grupo que consiste em 300 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 0,05 µm, 0,1 µm, 0,2 µm, 0,45 µm, 0,5 µm, 0,65 µm, com um MWCO de 500

36 / 84 kDa sendo particularmente preferido. Isto é vantajoso para reter moléculas de mRNA precipitadas enquanto remove, por exemplo, enzimas e proteínas compreendidas em células que foram lisadas para obter moléculas de mRNA a serem purificadas ou no caso de moléculas de mRNA transcritas in vitro, enzimas, nucleosidtrifosfatos modificados e não modificados, 5’ caps, 5’ análogos de tampa e componentes de tampão compreendidos em misturas de reação de transcrição in vitro. Assim, o valor de MWCO apropriado pode ser escolhido considerando, por exemplo, o tamanho das enzimas que foram usadas nas etapas de pré-processamento, como a transcrição in vitro das moléculas de mRNA a serem purificadas e que devem ser removidas por TFF na etapa (I a). A polimerase de T7RNA é uma enzima bem conhecida na técnica que não será removida de forma eficiente no caso de usar uma membrana de filtro com um MWCO inferior a 100 kDa. Ao aplicar na etapa (Ia) um MWCO na faixa de 1 kDa a 750 kDa, o TFF pode ser referido como ultrafiltração, ao etapa que no caso de aplicação de um MWCO na faixa de 0,05 µm a 0,65 µm, o TFF pode ser referido como microfiltração.

[0090] No caso das etapas (Ib) e (IIb), o MWCO é de preferência pelo menos 1 kDa, de preferência entre 1 kDa e 50 kDa, mais preferencialmente pelo menos 50 kDa, e ainda mais preferencialmente pelo menos 70 kDa. De preferência, o MWCO é selecionado a partir do grupo que consiste em 1 kDa, 3 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 70 kDa, 100 kDa, 300 kDa, 0,05 µm, 0,1 µm, 0,2 µm, 0,45 µm, 0,5 µm e 0,65 µm, com um MWCO de 50 kDa, 70 kDa ou 100 kDa sendo particularmente preferido. Isto é vantajoso para purificar as moléculas de mRNA enquanto remove eficientemente sais e outros componentes compreendidos na respectiva solução, como acetato de amônio, agentes quelantes como EDTA, tampão como MOPS, moléculas de mRNA abortivas e/ou produtos de hidrólise. No caso de moléculas de mRNA comparativamente grandes, um MWCO de mais de 300 kDa também pode ser considerado.

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[0091] No caso da etapa (IIa), o MWCO é de preferência pelo menos 50 kDa, mais preferencialmente pelo menos 70 kDa, ainda mais preferencialmente 70 kDa ou 100 kDa. Quando se utiliza, por exemplo, um tampão MOPS-EDTA como descrito acima, um MWCO de 100 kDa é particularmente preferido. No caso de outros agentes quelantes potentes ou outras combinações de agente quelante potente - tampão serem aplicados, mesmo MWCO com 100 kDa e mais pode ser considerado para purificação de moléculas de mRNA comparativamente grandes.

[0092] Os processos que usam TFF podem, além disso, ser caracterizados em vista de diferentes variáveis, sendo as duas mais importantes a pressão transmembrana e a taxa de fluxo.

[0093] A “pressão transmembrana” (TMP) se refere à força motriz que impulsiona os componentes através da membrana do filtro. Em algumas modalidades, a pressão transmembrana é no caso das etapas (Ia) e (Ib), por exemplo, em uma escala de laboratório de 500 mg de mRNA no caso típico, entre 100 mbar e 500 mbar, de preferência entre 200 mbar e 400 mbar, e no caso das etapas (IIa) e (IIb) entre 2 mbar e 20 mbar, de preferência entre 5 mbar e 15 mbar.

[0094] O termo “fluxo” se refere ao volume de solução fluindo através de um sistema TFF e especialmente na área da membrana do filtro com uma “taxa de fluxo” referindo-se ao volume de solução fluindo através do referido sistema durante um determinado tempo. Assim, a taxa de fluxo ou velocidade de fluxo cruzado refere-se à taxa de fluxo de uma solução através da membrana do filtro. Em algumas modalidades, a taxa de fluxo no caso das etapas (Ia) e (Ib) é, por exemplo, em uma escala de laboratório de 500 mg de mRNA no caso típico, entre 1,5 L/min e 2,5 L/min, de preferência entre 1,6 L/min e 1,9 L/min, e no caso das etapas (IIa) e (IIb) entre 0,2 L/min e 0,6 L/min, de preferência entre 0,35 L/min e 0,45 L/min.

[0095] Em modalidades particularmente preferidas da presente

38 / 84 invenção, o método para purificar moléculas de mRNA é realizado usando TFF contínua. A TFF contínua se refere a um sistema TFF no qual o retentado é usado como alimentação para outra rodada de TFF. Aqui, o termo “alimentação” refere-se a uma solução ou suspensão compreendendo as moléculas de mRNA a serem purificadas. Assim, a alimentação inicial compreendendo as moléculas de mRNA e é submetida a uma primeira rodada de filtração usando TFF, e o retentado obtido compreendendo as moléculas de mRNA é usado novamente como alimentação para outra rodada de TFF circulando pelo menos as moléculas de mRNA. Isto é vantajoso para aumentar o nível de purificação devido a etapas repetidas de purificação de uma forma automatizada, enquanto reduz o risco de perder moléculas de mRNA devido a uma transferência entre sistemas.

[0096] Assim, em algumas modalidades da presente invenção, as moléculas de mRNA são compreendidas em um retentado após a filtração de fluxo tangencial, de preferência pelo menos em um retentado obtido pelas etapas (Ia) a (IIa). No caso da etapa (IIb), as moléculas de mRNA podem ser compreendidas em um retentado ou um permeado.

[0097] Em algumas modalidades, as moléculas de mRNA são compreendidas no retentado obtido pelas etapas (Ia) a etapa (IIb).

[0098] Em algumas modalidades da presente invenção, o retentado obtido na etapa (Ia) é usado como solução de alimentação para a filtração de fluxo tangencial na etapa (Ib), o retentado obtido na etapa (Ib) é como solução de alimentação na etapa (IIa) e o retentado obtido na etapa (IIa) é como solução de alimentação na etapa (IIb). Assim, a presente invenção é preferencialmente realizada usando TFF contínua para realizar pelo menos as etapas (Ia) a (IIb). Mais especificamente, as moléculas de mRNA estão preferencialmente circulando em um sistema TFF contínua para purificação de acordo com a presente invenção. Assim, em uma modalidade da presente invenção, pelo menos as etapas (Ia) a (IIa), de preferência as etapas (Ia) a

39 / 84 (IIb), são realizadas usando TFF contínua.

[0099] Uma outra vantagem de um sistema TFF é que ele pode ser facilmente usado para diafiltração e especialmente para diafiltração contínua. Por diafiltração, partes de uma solução ou suspensão podem ser trocadas por outra. Por exemplo, na diafiltração descontínua, uma solução é primeiro diluída e depois concentrada de volta ao volume inicial. No entanto, isso pode afetar negativamente a funcionalidade das moléculas de mRNA a serem purificadas.

[00100] Portanto, em modalidades preferidas da presente invenção, as moléculas de mRNA a serem purificadas estão circulando pelo menos para as etapas (Ia) a (IIb) em um sistema TFF contínua para purificação de acordo com o método descrito acima usando diafiltração de volume constante. Volume constante ou diafiltração contínua refere-se a um processo de filtração, em que um volume constante é retido no sistema de filtração. Assim, a mesma quantidade de solução ou suspensão é adicionada como o volume da solução ou suspensão que passa a membrana do filtro como permeado. Assim, o volume do retido é o mesmo que o volume que é inicialmente alimentado no sistema TFF, ou seja, o volume de alimentação, e o volume de lavagem, ou seja, o volume de diafiltração, é o mesmo volume que o volume do permeado. A combinação de TFF contínua e diafiltração contínua é vantajosa para remover contaminantes como permeado enquanto mantém as moléculas de mRNA a serem purificadas na parte circulante do sistema TFF em volume constante para preservar sua função.

[00101] Portanto, em algumas modalidades da presente invenção, pelo menos as etapas (Ia) a (IIa), de preferência as etapas (Ia) a (IIb), são realizadas usando diafiltração, de preferência diafiltração contínua.

[00102] Em algumas modalidades da presente invenção, o volume de diafiltração de qualquer uma da primeira, segunda, terceira e/ou quarta solução é pelo menos 1 vez o volume da suspensão da etapa (Ia), por

40 / 84 exemplo, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, de preferência pelo menos 10 vezes. Determinar o referido volume de diafiltração é de interesse especial em vista de uma troca ótima entre tempo e eficiência de custo e o nível de purificação a ser alcançado. Foi verificado que o volume de diafiltração de qualquer uma da primeira, segunda, terceira e/ou quarta solução é pelo menos 1 vez o volume da suspensão da etapa (Ia), preferivelmente pelo menos 10 vezes. Isso é vantajoso para garantir uma remoção substancial de componentes enquanto permite o processamento de alto rendimento e, portanto, a purificação da molécula de mRNA em grande escala.

[00103] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração é 1 vez o volume da suspensão da etapa (Ia) e, portanto, do volume da suspensão compreendendo as moléculas de mRNA precipitadas inicialmente alimentadas ao sistema TFF na etapa (Ia).

[00104] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração é duas vezes o volume da suspensão.

[00105] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração é 3 vezes o volume da suspensão.

[00106] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração é 4 vezes o volume da suspensão.

[00107] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração é 5 vezes o volume da suspensão.

[00108] Em ainda algumas modalidades, o volume de diafiltração é pelo menos 5 vezes o volume de suspensão da etapa (Ia).

[00109] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração é pelo menos 10 vezes o volume da suspensão da etapa (Ia) e, portanto, do volume da suspensão que compreende as moléculas de mRNA precipitadas inicialmente alimentadas ao sistema TFF na etapa (Ia). Verificou-se que o uso de um volume de diafiltração de pelo menos 10 vezes o volume inicialmente alimentado no sistema TFF é vantajoso para remover substancialmente os

41 / 84 componentes destinados à respectiva etapa, conforme descrito acima.

[00110] Portanto, é preferido que o volume de diafiltração de qualquer uma da primeira, segunda, terceira e/ou quarta solução seja pelo menos 10 vezes o volume da suspensão da etapa (Ia). É ainda mais preferido que pelo menos o volume de diafiltração da terceira e quarta solução seja pelo menos 10 vezes o volume da suspensão da etapa (Ia).

[00111] Em algumas modalidades, o volume de diafiltração da primeira, segunda, terceira e quarta solução é pelo menos 10 vezes o volume da suspensão da etapa (Ia).

[00112] Um sistema fechado totalmente automatizado para a obtenção de moléculas de mRNA purificadas de acordo com o método da presente invenção é mostrado exemplarmente na Figura 2. O sistema compreende o sistema TFF contínua mostrado na Figura 1.que está em conexão de fluido com um sistema de produção de mRNA, de preferência através de uma primeira válvula. Digno de nota, o termo “válvula” aqui utilizado abrange válvulas, (por exemplo, torneiras de duas e/ou três vias), braçadeiras e conectores MPC; preferencialmente válvulas e/ou conectores MPC. Além disso, é preferível que um conector MPC seja usado em combinação com uma braçadeira. Assim, dois elementos, por exemplo duas tubulações, podem ser conectadas de uma maneira que permite o uso único e/ou garante compatibilidade com vários sistemas, estabilidade contra alta pressão e/ou mudanças de pressão, por exemplo, em uma das tubulações e/ou baixo custo.

[00113] O sistema de produção de mRNA pode compreender um vaso de reação e pelo menos um outro vaso. O vaso de reação e o pelo menos um outro vaso estão, de preferência, em conexão fluídica um com o outro e com o sistema TFF por meio de uma tubulação de conexão. A primeira válvula é posicionada entre a tubulação de conexão do sistema de produção de mRNA e uma tubulação do sistema TFF, de preferência a tubulação na qual a alimentação circula do reservatório para o dispositivo de filtro.

42 / 84 Alternativamente, o sistema de produção de mRNA pode estar em conexão fluídica com a tubulação na qual o retentado circula do dispositivo de filtro para o reservatório, ou com o reservatório. Digno de nota, o termo “tubulação” usado neste documento pode se referir a uma tubulação, um tubo, um tubo ou uma combinação dos mesmos. Além disso, a tubulação de conexão do sistema de produção de mRNA pode compreender uma bomba auxiliar. Uma bomba auxiliar é vantajosa para ajustar automaticamente as velocidades dos fluidos transferidos através da tubulação de conexão.

[00114] As moléculas de mRNA a serem purificadas de acordo com o método da presente invenção podem ser obtidas, por exemplo, por cultivo de células para amplificação de molécula de mRNA celular ou, de preferência, por transcrição in vitro (IVT). No caso de as moléculas de mRNA serem obtidas de células, células como células de E. coli podem ser cultivadas em um fermentador sob condições de cultivo específicas de células adequadas para a produção de moléculas de mRNA. Os parâmetros das referidas condições de cultivo são, de preferência, regulados automaticamente, por exemplo, fornecendo as respectivas quantidades de meio de cultivo, gás e/ou tampão. Assim, o sistema de produção de mRNA pode compreender um vaso de reação e pelo menos um vaso adicional, em que o vaso de reação é um fermentador e o pelo menos um vaso adicional compreende, por exemplo, um respectivo meio de cultivo, gás e/ou solução tampão. Alternativamente, se as moléculas de mRNA a serem purificadas forem obtidas por IVT, um molde IVT, por exemplo, um respectivo molde de DNA para IVT da molécula de mRNA alvo a ser purificada e reagentes IVT, tais como uma enzima para IVT, por exemplo, uma polimerase de RNA T7 e uma mistura de NTPs são necessários. Portanto, o sistema de produção de mRNA pode compreender um vaso de reação e pelo menos um outro vaso, em que pelo menos um outro vaso compreende pelo menos um dos referidos reagentes IVT.

[00115] Assim, o vaso de reação está de preferência em conexão

43 / 84 fluídica com pelo menos um outro vaso, de preferência pelo menos um primeiro vaso adicional e um segundo vaso adicional.

[00116] O primeiro vaso adicional pode compreender pelo menos um dos referidos reagentes IVT e está de preferência em conexão fluídica com o vaso de reação através do tubo de conexão e uma segunda e uma terceira válvulas. A segunda válvula é preferencialmente posicionada entre o vaso de reação e o tubo de conexão, e a terceira válvula entre o tubo de conexão e o primeiro vaso adicional. Ao fechar a primeira válvula e abrir a segunda e a terceira válvulas, as moléculas de mRNA podem ser produzidas, por exemplo, por IVT, de preferência dentro do vaso de reação. Ao fechar a terceira válvula e abrir a primeira e a segunda válvulas, as moléculas de mRNA produzidas podem ser transferidas do sistema de produção de mRNA para o sistema TFF.

[00117] O segundo vaso adicional pode compreender uma solução para precipitar moléculas de mRNA, em que a referida solução compreende preferencialmente acetato de amônio (NH4OAc), por exemplo, 5 M NH4OAc. De preferência, o segundo vaso adicional está em conexão fluídica com a tubulação de conexão por meio de uma quarta válvula. Ao abrir a segunda e a quarta válvulas e fechar a primeira e a terceira válvulas, as moléculas alvo podem ser precipitadas, de preferência no vaso de reação ou, no caso de o vaso de reação ser um fermentador, no segundo vaso adicional. Após a abertura da primeira válvula, as moléculas de mRNA precipitadas em suspensão podem ser transferidas do sistema de produção de mRNA para o sistema TFF para purificação da molécula de mRNA de acordo com o método da invenção.

[00118] Portanto, o sistema mostrado na Figura 2 compreende um sistema TFF, de preferência um sistema de diafiltração contínua, com um reservatório. De preferência, o reservatório está em conexão fluídica com pelo menos três vasos adicionais, isto é, pelo menos um terceiro vaso adicional, um quarto vaso adicional e um quinto vaso adicional, através de pelo menos

44 / 84 uma quinta, sexta e sétima válvulas, respectivamente. O terceiro vaso adicional pode compreender a primeira solução, o quarto vaso adicional a segunda solução e o quinto vaso adicional a terceira solução de acordo com a presente invenção. Se a segunda e a quarta solução diferirem uma da outra, o reservatório está, de preferência, em conexão fluídica com um sexto vaso adicional compreendendo a quarta solução, por exemplo, através de uma oitava válvula. Portanto, é preferido que o terceiro vaso adicional compreenda a primeira solução, em que a primeira solução compreende NH4OAc, por exemplo, NH4OAc 2,5 M, para purificar moléculas de mRNA precipitadas, sendo o quarto vaso ainda água, por exemplo, água para injeção (WFI) como a segunda solução, o quinto vaso adicional a terceira solução, em que a terceira solução compreende EDTA como agente quelante e, opcionalmente, MOPS. No caso da quarta solução não ser água, o sexto vaso adicional compreende preferencialmente cloreto de sódio e/ou citrato. Além disso, uma bomba auxiliar pode estar presente para ajustar automaticamente as velocidades dos fluidos transferidos de qualquer um dos referidos pelo menos três outros vasos para o reservatório.

[00119] Portanto, o reservatório compreende preferencialmente moléculas de mRNA precipitadas em suspensão que foram transferidas do sistema de produção de mRNA através da primeira válvula, abrindo a primeira válvula por um período de tempo predeterminado. Ao abrir a quinta válvula por um período de tempo predeterminado, a primeira solução pode ser adicionada às moléculas de mRNA precipitadas em suspensão e a mistura pode então ser transferida por pelo menos uma rodada de TFF contínua para o dispositivo de filtro, em que a membrana de filtro tem preferencialmente um peso molecular limite entre 300 kDa e 0,65 µm. Assim, a suspensão compreendendo as moléculas de mRNA precipitadas pode ser purificada, por exemplo, a partir de componentes de misturas IVT, tais como proteínas, sais e/ou NTPs de acordo com a etapa (Ia) do método aqui descrito. A suspensão

45 / 84 compreendendo as moléculas de mRNA precipitadas purificadas é preferencialmente transferida de volta para o reservatório como retentado. Para realizar a etapa (Ib) e, portanto, para lavar e dissolver as moléculas de mRNA precipitadas purificadas obtidas na etapa (Ia), a sexta válvula é aberta por um período de tempo predeterminado. Assim, a segunda solução pode ser adicionada à suspensão compreendendo as moléculas de mRNA precipitadas no reservatório. Ao realizar pelo menos uma rodada de TFF contínua usando o dispositivo de filtro, de preferência com uma membrana de filtro tendo um corte molecular entre 1 kDa e 0,65 µm, por exemplo, o NH4OAc contido na primeira solução pode ser removido. Ao abrir a sétima válvula por um período de tempo predeterminado, a terceira solução pode então ser adicionada às moléculas de mRNA lavadas e dissolvidas no reservatório. Ao realizar pelo menos uma rodada de TFF contínua usando o dispositivo de filtro, em que a membrana de filtro tem preferencialmente um peso molecular de corte de 50 kDa, mais preferencialmente de 100 kDa, moléculas de mRNA abortivas e produtos de hidrólise de molécula de mRNA podem ser removidos de forma eficiente de acordo com etapa (IIa) do método aqui descrito. Para lavar as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (IIa), por exemplo, removendo componentes da terceira solução, a etapa (IIb) pode então ser realizada. Portanto, a sexta ou a oitava válvula é aberta por um período de tempo predeterminado para adicionar água ou a quarta solução compreendendo cloreto de sódio e/ou citrato às moléculas de mRNA purificadas por pelo menos uma rodada de TFF contínua usando o dispositivo de filtro que compreende um membrana de filtro, de preferência com um peso molecular de corte de 50 kDa.

[00120] Opcionalmente, uma etapa adicional é realizada entre a etapa (Ib) e (IIa). Portanto, o sistema TFF pode compreender ainda um sétimo vaso adicional que está em conexão fluídica, por exemplo, com o reservatório, de preferência através de uma nona válvula. O referido sétimo vaso adicional

46 / 84 pode compreender a quinta solução, em que a quinta solução compreende de preferência pelo menos o agente quelante da terceira solução, de preferência EDTA, em uma concentração mais elevada como a referida terceira solução. Ao abrir a nona válvula por um determinado período de tempo após a realização da etapa (Ib), a quinta solução pode ser adicionada às moléculas de mRNA dissolvidas na segunda solução. Isto tem a vantagem de que o rendimento e a reprodutibilidade do método da invenção podem ser aumentados reduzindo o tempo que é necessário para ajustar a concentração de pelo menos o agente quelante no sistema TFF para a respectiva concentração conforme especificado neste documento para a terceira solução. Além disso, uma bomba auxiliar pode estar presente para ajustar automaticamente as velocidades dos fluidos transferidos do sétimo vaso adicional para o reservatório (não mostrado).

[00121] Opcionalmente, o sistema de produção de molécula de mRNA pode compreender ainda um vaso provisório, de preferência em conexão fluídica com a tubulação de conexão do sistema de produção de molécula de mRNA, de preferência por meio de uma válvula provisória. O vaso provisório pode ser um saco, de preferência estéril. Ao abrir a primeira válvula e a válvula provisória por um período de tempo predeterminado, pelo menos uma fração da suspensão ou solução compreendendo as moléculas de mRNA pode ser transferida do sistema TFF para o sistema de produção de molécula de mRNA e/ou da produção de molécula de mRNA sistema para o sistema TFF. Isto pode ser vantajoso para armazenar pelo menos uma fração da referida suspensão ou solução, de preferência por um período de tempo predeterminado. Assim, pelo menos a referida fração da referida suspensão ou solução pode ser objetada a uma rodada adicional de purificação, por exemplo, etapas (Ia) e (Ib), etapas (IIa) e (IIb) e/ou uma combinação dos mesmos. Além disso, durante o armazenamento de pelo menos uma fração da suspensão ou solução no vaso provisório, o sistema TFF e/ou o sistema de

47 / 84 produção de molécula de mRNA podem ser limpos, lavados com água e/ou tampão e/ou esterilizados. Opcional ou alternativamente, o vaso provisório pode ser usado para obter pelo menos uma fração da solução ou suspensão compreendida no vaso provisório, de preferência a solução ou suspensão compreendendo as moléculas de mRNA purificadas. Opcionalmente, o sistema pode compreender ainda um filtro para uma etapa de filtração adicional (não representada). O referido filtro pode compreender uma membrana de filtro com um tamanho de poro inferior a 0,3 µm, por exemplo, de 0,22 µm, para uma etapa de filtração final e, portanto, pode ser útil para uma filtração final de suspensão compreendendo as moléculas de mRNA purificadas conforme obtidas a partir do vaso intermediário.

[00122] Pode ser vantajoso modificar as moléculas de mRNA a serem purificadas, por exemplo, por desfosforilação, adicionando uma capa 5 ‘e/ou uma cauda poli(A) 3’. Em particular, as etapas (Ia) a (IIb) são preferencialmente realizadas pelo menos uma vez antes da poliadenilação 3’ das moléculas de mRNA, e as etapas (Ia) a (Ib) são preferencialmente realizadas pelo menos uma vez antes do capeamento 5’. Opcionalmente, as moléculas de mRNA obtidas podem ser desfosforiladas após pelo menos uma primeira etapa (Ia) e pelo menos uma primeira etapa (Ib) seguida por pelo menos uma segunda etapa (Ia) e pelo menos uma segunda etapa (Ib). Portanto, o sistema pode compreender ainda um ou mais dos seguintes (não representados): um segundo’ vaso adicional, de preferência compreendendo reagentes necessários para tampar e de preferência em conexão fluídica com a tubulação de conexão do sistema de produção de mRNA por meio de uma quarta’ válvula, um segundo’’ vaso adicional, de preferência compreendendo reagentes necessários para desfosforilação e de preferência em conexão fluídica com a tubulação de conexão do sistema de produção de mRNA através de uma quarta’’ válvula, e um segundo’’’ vaso adicional, de preferência compreendendo reagentes necessários para adicionar

48 / 84 enzimaticamente uma cauda poli(A), por exemplo pelo menos uma poli(A) polimerase, e de preferência em conexão fluídica com a tubulação de conexão do sistema de produção de mRNA via uma quarta’’’ válvula. Ao abrir a primeira válvula e a válvula provisória por um período de tempo predeterminado, pelo menos uma fração da suspensão respectiva que compreende as moléculas de mRNA a ser purificada pode ser transferida do sistema TFF para o vaso provisório do sistema de produção de mRNA. Ao fechar a primeira válvula e abrir a quarta’, quarta’’ e/ou quarta’’’ válvula, o capeamento, desfosforilação e/ou poliadenilação das moléculas de mRNA podem ser realizados, de preferência no vaso provisório. Alternativamente ou adicionalmente, no caso do vaso de reação não ser um fermentador, o vaso de reação pode ser usado em vez do vaso provisório e, assim, a segunda válvula em vez da válvula provisória é aberta. Ao fechar a quarta’, quarta’’ e/ou quarta’’’ válvula e abrir a primeira válvula, a suspensão que compreende as moléculas de mRNA modificadas pode ser transferida do sistema de produção de molécula de mRNA para o sistema TFF.

[00123] De notar que o dispositivo de filtro pode compreender mais do que uma membrana de filtro que pode ser trocada automaticamente. De preferência, o dispositivo de filtro compreende mais do que uma unidade de dispositivo de filtro, por exemplo, cada uma compreendendo uma coluna de filtro e as moléculas de mRNA são transferidas para TFF contínua para pelo menos uma das unidades tendo uma membrana de filtro com um peso molecular de corte conforme especificado acima para a respectiva etapa do método.

[00124] Além disso, conforme representado na Figura 2, o sistema pode compreender uma saída, por exemplo, um vaso de saída em conexão fluídica com o reservatório, por exemplo, através de uma décima válvula. De preferência, o referido vaso de saída refere-se a ou está em conexão fluídica com um saco estéril, de preferência de uso único, para armazenar pelo menos

49 / 84 uma fração da solução ou suspensão compreendendo as moléculas de mRNA purificadas. Abrindo a décima válvula, moléculas de mRNA purificadas podem ser obtidas. Alternativamente, na (última execução) etapa (IIb), as moléculas de mRNA purificadas podem estar compreendidas no permeado em vez do retentado. Opcionalmente, o sistema pode compreender ainda um filtro para uma etapa de filtração adicional (não representada). O referido filtro pode compreender uma membrana de filtro com um tamanho de poro inferior a 0,3 µm, por exemplo, de 0,22 µm, para uma etapa de filtração final e, portanto, pode ser útil para uma filtração final de suspensão compreendendo as moléculas de mRNA purificadas, por exemplo, o permeado ou como obtido do vaso de saída. Além disso, uma bomba auxiliar pode estar presente para ajustar automaticamente as velocidades dos fluidos transferidos do reservatório para a saída (não mostrado).

[00125] O sistema pode ainda compreender um, de preferência regulado automaticamente, elemento de resfriamento e/ou aquecimento (não mostrado). O referido elemento de resfriamento e/ou aquecimento pode ser posicionado pelo menos parcialmente em torno de uma ou mais das tubulações, vasos (por exemplo, vaso de reação, vaso provisório, outro vaso e/ou reservatório) e/ou o dispositivo de filtro. De preferência, um elemento de resfriamento é posicionado pelo menos parcialmente em torno do reservatório e/ou do dispositivo de filtro. Assim, o método de acordo com a presente invenção pode ser realizado a uma temperatura entre 0 °C e 25 °C, de preferência para a maioria das etapas entre 2 °C e 8 °C, controlando o respectivo elemento de resfriamento e/ou aquecimento. Assim, podem ser obtidas grandes quantidades de moléculas de mRNA purificadas.

[00126] De preferência, o sistema pode compreender ainda um elemento, de preferência regulado automaticamente, para a regulação do pH (não mostrado). O referido elemento pode compreender um dispositivo para medir o pH de uma solução e/ou suspensão, como um medidor de pH e,

50 / 84 opcionalmente, um vaso de regulação de pH, em que o último está de preferência em conexão fluídica com pelo menos um dos vasos (por exemplo, vaso de reação, embarcação provisória, embarcação adicional e/ou reservatório). Assim, o pH da solução ou suspensão no respectivo vaso pode ser medido e/ou controlado. Adicionalmente ou alternativamente, o pH do permeado pode ser medido, de preferência continuamente. Assim, o processo de purificação do mRNA pode ser monitorado e ter a qualidade verificada.

[00127] Além disso, a concentração e/ou pureza do ácido nucleico pode ser medida, de preferência usando o permeado. Isso pode ser feito, por exemplo, fotometricamente, medindo a absorvância de moléculas incluindo moléculas de mRNA na faixa de UV em cerca de 260 e 280 nm. Por exemplo, um quociente de um valor obtido em cerca de 260 nm a um valor obtido em cerca de 280 nm pode ser indicativo para a pureza do respectivo ácido nucleico em uma solução ou suspensão. Por exemplo, uma razão de cerca de 1,8 a cerca de 2,0 pode ser indicativa para moléculas de DNA ou RNA de alta pureza, enquanto, por exemplo, uma razão de menos de 1,8 pode ser indicativa de impurezas, por exemplo, por proteínas. Assim, podem ser obtidas informações sobre a composição, por exemplo, do permeado, incluindo concentrações de moléculas de mRNA. Opcional ou alternativamente, a concentração da molécula de mRNA pode ser determinada com base em uma medição de condutividade, de preferência contínua. Assim, o sistema pode ainda compreender um elemento, de preferência regulado automaticamente, para quantificação de ácido nucleico (não mostrado), tal como um espectrômetro e/ou um espectrofotômetro, por exemplo, uma nanogota e/ou meios para realizar uma medição de condutividade.

[00128] Qualquer um dos vasos (por exemplo, vaso de reação, vaso provisório, outro vaso e/ou reservatório) ou todos os vasos podem ser posicionados em uma respectiva balança. Assim, o peso do respectivo vaso pode ser medido, o peso da solução ou suspensão compreendendo as

51 / 84 moléculas de mRNA a serem purificadas ou purificadas no respectivo vaso pode ser determinado e a quantidade apropriada de uma respectiva solução ou componente adicionado, por exemplo, da primeira, segunda, terceira, quarta e/ou quinta solução e/ou reagentes IVT. Assim, o processo de produção e/ou purificação do mRNA pode ser otimizado e automatizado.

[00129] Para assegurar uma regulação automática da produção de mRNA e/ou processo de purificação, o sistema compreende preferencialmente meios de controle adaptados para controlar os meios mencionados acima, por exemplo, válvulas, bombas (auxiliares), um elemento de aquecimento e/ou resfriamento, um elemento para regulação de pH, um elemento para quantificação de ácido nucleico, meios para realizar uma medição de condutividade e/ou um equilíbrio. Aqui, o termo “sistema” deve ser entendido como um dispositivo e pode ser usado de forma intercambiável com o mesmo.

[00130] No que diz respeito ao tubo de ligação do sistema de produção da molécula de mRNA, o referido tubo de ligação pode ser um tubo de ligação conforme representado na Figura 2, por exemplo, conectar fluidamente o vaso de reação e outros vasos em série. Alternativamente, a tubulação de conexão pode se referir a duas ou mais tubulações conectando os respectivos vasos. Assim, a tubulação de conexão pode, por exemplo, referir- se a pelo menos uma primeira tubulação conectando fluidamente o vaso de reação e o primeiro vaso adicional e uma segunda tubulação conectando fluidamente o vaso de reação e o segundo vaso adicional. De preferência, uma ou mais das ditas duas ou mais tubulações compreendem uma válvula entre os respectivos vasos e, opcionalmente, uma bomba auxiliar.

[00131] Qualquer um dos componentes do sistema descrito acima pode ser um componente de uso único. De preferência, um ou mais dos vasos (por exemplo, provisório, de reação e/ou outro vaso) e/ou uma ou mais das válvulas (provisórias) podem ser um respectivo vaso de uso único e válvula,

52 / 84 respectivamente. De preferência, o vaso intermediário e/ou o vaso de reação é um respectivo vaso de uso único. Opcionalmente, todo o sistema pode ser um sistema para uso único, por exemplo, para a produção e purificação de uma molécula de mRNA específica. Isso tem a vantagem de que a respectiva molécula de mRNA pode ser produzida e purificada sob condições estéreis, evitando as etapas de lavagem, limpeza e/ou esterilização que consomem tempo e custos que, de outra forma, seriam necessárias para reduzir o risco de contaminação. Assim, de preferência, um ou mais componentes do sistema descrito acima são respectivos componentes de uso único.

[00132] Um sistema como mostrado exemplarmente na Figura 2 tem várias vantagens. Em tal sistema fechado, o risco de contaminações, por exemplo, por RNase é minimizado, enquanto ao mesmo tempo o rendimento pode ser aumentado, pois o entupimento das membranas do filtro pode ser evitado usando TFF contínua. Além disso, esse sistema é fácil de manusear, por exemplo, por meio de uma transferência de fluido regulada por bomba e até mesmo totalmente automatizada, por exemplo, regulando automaticamente as bombas e/ou válvulas (auxiliares). Além disso, é facilmente escalável e bem ajustável de acordo com requisitos específicos do cliente. Assim, a purificação de alto rendimento de moléculas de mRNA pode ser realizada de uma maneira altamente eficiente e automatizada de acordo com o método descrito usando um sistema como mostrado na Figura 2.

[00133] A presente invenção se refere ainda a um método para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo (a) purificar moléculas de mRNA de acordo com o método de purificação de moléculas de mRNA descrito acima, e (b) formular as moléculas de mRNA assim obtidas em uma composição farmacêutica. Isto é de interesse especial para a aplicação de moléculas de mRNA purificadas em contextos farmacêuticos, como a administração de moléculas de mRNA para permitir a síntese de uma proteína, um déficit ou defeito da qual está associado a uma doença e/ou a

53 / 84 presença da qual é necessária ou benéfica em uma célula.

[00134] De preferência, a função da sequência de aminoácidos, que pode ser traduzida da molécula de mRNA purificada de acordo com a presente invenção, na célula ou na vizinhança da célula é necessária ou benéfica, por exemplo, uma sequência de aminoácidos cuja falta ou forma defeituosa é um gatilho para uma doença ou doença, cuja provisão pode moderar ou prevenir uma doença ou doença, ou uma sequência de aminoácidos que pode promover um processo que é benéfico para o corpo, em uma célula ou sua vizinhança. A sequência de aminoácidos codificada pode ser a sequência de aminoácidos completa ou uma variante funcional desta. Além disso, a sequência de aminoácidos codificada pode atuar como um fator, indutor, regulador, estimulador ou enzima, ou um fragmento funcional do mesmo, em que esta sequência de aminoácidos é aquela cuja função é necessária para remediar um distúrbio, em particular um distúrbio metabólico ou a fim de iniciar processos in vivo, como a formação de novos vasos sanguíneos, tecidos, etc. Aqui, a variante funcional é entendida como um fragmento que na célula pode realizar a função da sequência de aminoácidos cuja função na célula é necessário ou a falta ou forma defeituosa da qual é patogénica.

[00135] De preferência, tal sequência de aminoácidos é vantajosa no que diz respeito a aplicações em finalidades suplementares ou médicas para gerar ou regenerar funções fisiológicas causadas pela biossíntese de sequência de aminoácidos subótima e, portanto, também para influenciar favoravelmente direta ou indiretamente o curso das doenças. Distúrbios com base genética conhecida são, por exemplo, fibrose cística, hemofilia, hipertensão, nível elevado de colesterol, câncer, distúrbios neurodegenerativos, doença mental e outros. Um catálogo online com atualmente 22.993 entradas de Genes Humanos e Desordens Genéticas junto com seus respectivos genes e uma descrição de seus fenótipos estão

54 / 84 disponíveis na página da web ONIM (Online Mendelian Inheritance in Man) (http://onim.org); sequências de cada um estão disponíveis a partir da base de dados UniProt (http://www.uniprot.org). Como exemplos não limitativos, a Tabela 2 a seguir lista algumas doenças congênitas e o (s) gene (s) correspondente (s). Devido ao alto grau de interação das vias de sinalização celular, a mutação de um determinado gene causa uma multiplicação de sintomas patogênicos, dos quais apenas um característico está listado na Tabela 2.

[00136] A proteína também pode ter o potencial de induzir uma reação imunogênica agindo, por exemplo, como um antígeno. Essas proteínas se prestam a aplicações em fins médicos ou suplementares, incluindo vacinação. Tabela 2 Doença Patologia Gene, hereditariedade Doenças sanguíneas Anemia de Fanconi Anemia e neutropenia, evidência de que um FANCA, autossômico recessivo mecanismo de reparo de DNA é afetado Hemofilia-A Sangramento anormal Fator VIII de coagulação, cromossomo X recessivo Hemofilia-B Sangramento anormal Fator IX de coagulação, cromossomo X recessivo Esferocitose hereditária eritrócitos de formato esférico (esferócitos) Anquirina (ANK1) (vários tipos) Hemoglobinúria paroxística Anemia e presença de sangue na urina PIG-A, cromossomo X noturna Porfiria cutânea tardia Superprodução de heme, sobrecarga de ferro Uroporfirinogênio descarboxilase (UROD), autossômico recessivo Deficiência imunológica Devido à síntese de DNA prejudicada, Adenosina desaminase, autossômica combinada grave (SCID) deficiência imunológica grave na imunidade recessiva, IL-2R-γ, JAK3, (IL-7R-α, humoral e celular RAG1/2, Artemis, CD3δ, CD3ε Anemia falciforme Hemoglobina anormal (HbS) β-Hemoglobina (HB), autossômico recessivo Talassemia (formas α e β) Ausência de α- ou β hemoglobina, resultando [00137] Exclusão de em anemia HBA1 e/ou HBA2, Doença de von Willebrand Sangramento anormal, hemorragia Formas autossômicas dominantes e (três tipos conhecidos, o Tipo semelhante à hemofilia A e B recessivas III é o mais grave) Câncer Melanoma maligno A mutação P16 leva à proliferação Inibidor de quinase dependente de descontrolada de fibroblastos ciclo 2 (CDKN2) Neurofibromatose (2 tipos) Tumores benignos nos nervos auditivos levam NF1, NF2, autossômico dominante à surdez Surdez (Orelha) Surdez Perda de audição Surdez-1A (DFNB1), autossômica recessiva Síndrome de Pendred Perda de audição Pendrin (PDS), autossômico recessivo Coração Ataxia Telangiectasia O reparo do dano ao DNA foi perturbado, ATM,

55 / 84 Aterosclerose Aumento do colesterol no sangue apoE, Síndrome de LQT (QT Defeito do canal de potássio LQT1 e outros genes longo) Síndrome de Von-Hippel O crescimento anormal dos vasos sanguíneos VHL, autossômico dominante Lindau pode levar ao câncer Síndrome de William’s A deleção de elastina resulta em defeitos Deleção de genes de elastina e LIM Beuren vasculares, estenose aórtica supravalvar quinase Doenças metabólicas e doenças de armazenamento de glicogênio Adrenoleucodistrofia Transporte e metabolismo de ácidos graxos ABCD1, cromossômico X perturbados Alcaptonúria Defeito no metabolismo do nitrogênio, a urina Oxidase homogentísica, autossômica escurece quando exposta ao oxigênio recessiva Diabetes tipo I Produção de insulina perturbada IDDM1, IDDM2, GCK,... Galactosemia distúrbio do metabolismo da galactose Gene da uridiltransferase da galactose- 1-fosfato (GALT), autossômico recessivo Doença de Gaucher Perturbação do metabolismo da gordura Glucocerebrosidase Má absorção de glicose Transporte de glicose e galactose perturbados FANCA, autossômico galactosidase para fora do lúmen intestinal, resultando em recessivoSGLT1, autossômico diarreia recessivo Doença de armazenamento Acúmulo de glicose no fígado e rim Glicose-6-Fosfatase, autossômica de glicogênio Tipo I, doença recessiva de Von-Gierke Doença de armazenamento Acúmulo de glicogênio no fígado, coração, α-1-glucosidase, autossômica de glicogênio tipo II, doença músculo esquelético, cardiomegalia recessiva de Pompe Doença de armazenamento Acúmulo de glicogênio no fígado, coração, Enzima de desramificação, de glicogênio Tipo III, músculo esquelético, hepatoomegalia autossômica recessiva doença de Cori Doença de armazenamento Não é possível destilizar o glicogênio nas Fosforilase muscular, autossômica de glicogênio tipo V, doença células musculares recessiva de McArdle Glicose-6-Fosfato A incapacidade de manter a glutationa leva à G6PD, cromossômico X recessivo Desidrogenase anemia hemolítica Hemocromatose hereditária Excesso de ferro no corpo (especialmente Hemocromatose (HFE) (4 tipos) fígado) devido à absorção excessiva de ferro no intestino Homocistinúria Defeito no metabolismo do nitrogênio Defeito da cistationa sintetase, autossômico recessivo Síndrome de Lesh Nyhan Acúmulo de ácido úrico levando à gota, HPRT1, cromossômico X cálculos de ureia e perda muscular Doença de urina no xarope Defeito no metabolismo de aminoácidos leva Alfa-desidrogenase de cadeia de bordo ao acúmulo de α-cetoacidas e morte nos ramificada (BCKDH) primeiros meses se não for tratado Síndrome de Menkes Capacidade reduzida de absorver cobre, leva à ATP7A, cromossômico X recessivo morte na infância se não for tratada Obesidade Peso corporal elevado Níveis elevados de leptina poligênica podem desempenhar uma função Fenilcetonúria A incapacidade de quebrar a fenilalanina em Fenilalanina hidroxilase (PAH), tirosina leva ao retardo mental autossômica recessiva Doença de Tangier níveis reduzidos de lipoproteínas de alta Gene do cassete-1 de ligação de ATP densidade no plasma (ABCA1) Síndrome de Zellweger (leva Altos níveis de ferro e cobre no sangue PXR1 (receptor na superfície dos à morte de bebês) peroxissomos) Doença de Wilson Acúmulo de cobre no cérebro e fígado ATP7B (ATPase tipo P), autossômica recessiva Sistema musculoesquelético Acondroplasia Baixa estatura com cabeça grande devido à Receptor 3 do fator de crescimento de proliferação lenta de condrócitos fibroblastos (FGF3R), Síndrome de Charcot-Marie- Degeneração dos músculos dos membros Diferentes formas causadas por Tooth e sua forma mais diferentes mutações genéticas, grave de Síndrome de autossômicas recessivas e Dejerine-Sottas cromossômicas X

56 / 84 Síndrome de Cockayne (2 Envelhecimento prematuro e baixa estatura, proteína de complementação cruzada tipos) perda do reparo de DNA “em tempo real” de reparo de excisão do grupo 8 (ERCC8) Displasia condroectodérmica Malformação dos ossos e polidactilia EVC, autossômico recessivo Displasia diastrófica (DTD) Mãos malformadas, defeito no transportador Gene DTDST de sulfato Distrofia muscular de Aumento do tecido muscular com DMD, cromossômico X recessivo duchenne subsequente perda de função Fibrodisplasia Ossificante Formação óssea heterotópica NOG, BMP, autossômico dominante Progressiva Ataxia de Friedreich Aumento do coração e perda progressiva da Frataxina, autossômica recessiva coordenação muscular Hipofosfatasia Produção de uma versão anormal de fosfatase ALPL, autossômico recessivo alcalina afetando o processo de mineralização Síndrome de Marfan Distúrbio do tecido conjuntivo devido à Fibrilina 1 (FBN), autossômica deficiência de fibrilina dominante Distrofia miotônica (início Defeito da proteína quinase nas células do Dystrophia myotonica protein kinase durante a idade adulta jovem) músculo esquelético (DMPK, distrofia miotônica), autossômica dominante Osteogênese imperfeita Defeito na formação de colágeno tipo I leva a COL1A1, COL1A2 (vários tipos) múltiplas fraturas após o nascimento Síndrome de Prader-Willi Diminuição do tônus muscular e retardo SNRPN (pequena ribonucleoproteína mental N) deletada devido a uma deleção no cromossomo 15 Neurônios e cérebro Doença de Alzheimer Aumento da produção de amiloide, Poligênico, PS1, PS2,... incapacidade progressiva de lembrar fatos Esclerose lateral amiotrófica Degeneração progressiva das células do Superóxido dismutase 1 (SOD1), (ALS) (várias formas) neurônio motor (defeito na eliminação dos vários genes envolvidos radicais superóxidos) Síndrome de Angelman Retardo mental com riso inadequado Impressão genômica no cromossomo 15 Piruvato desidrogenase Defeitos neurológicos se não tratados Piruvato desidrogenase, autossômica recessiva Doença Refsum O acúmulo de ácido fitânico leva à neuropatia Fitanoil-CoA hidroxilase (PHYH), periférica autossômica recessiva Síndrome de Rett Retardo mental com desenvolvimento Proteína-2 de ligação a metil-CpG interrompido entre 6 e 18 meses de idade (MECP2), cromossômico X dominante Doença de Tay-Sachs (várias A degradação perturbada do gangliosídeo HEXA (β-hexosaminidase A), formas de gravidade) GM2 leva a danos neurológicos autossômica recessiva Doença de LaFora Forma agressiva de epilepsia EPM2A, autossômico recessivo Tremor essencial (formas Tremor incontrolável ETM1, ETM2, autossômico variáveis) dominante Síndrome do X Frágil Ausência de proteína de ligação a RNA O gene FMR1 não é expresso devido a FMR1, retardo mental uma amplificação CGG na região 5’UTR Doença de Huntington Demência progressiva com início na idade HTT (Huntington), autossômico adulta dominante Intestino Síndrome de Bartter (3 tipos) Doença renal Gene B do canal de cloreto renal (CLCNKB), autossômico recessivo Doença renal policística (2 doença renal PDK1, PDK2, autossômica tipos) dominante, também há uma forma autossômica recessiva conhecida (ARPKD) Pulmão Alfa-1-antitripsina Alvéolos defeituosos devido à liberação SERPINA1, codominante autossômico descontrolada de elastase Asma Desordem inflamatória crônica das vias Poligênico aéreas

57 / 84 Fibrose cística Muco excessivamente viscoso devido ao CFTR (regulador transmembrana de transporte de íon Cl- defeituoso condutância de fibrose cística), autossômico recessivo Disfunção do metabolismo Os recém-nascidos têm peso corporal normal, Transportador de cassete de ligação de do surfactante (vários tipos) mas todos não conseguem inflar ATP (ABCA3) Discinesia cliliar primária Muco excessivamente viscoso devido à DNAI1, CCNO, CCDC40 entre outros função ciliar defeituosa/ausente Doenças de armazenamento lisosssomal Doença de Fabry Além de outras, lesões cutâneas devido ao α-Galactosidase A, cromossômico X acúmulo de trihexosídeo de ceramida recessivo Doença de Gaucher Acúmulo de glicocerebrosídeos [00138] Glucocerebrosid Tipo I: forma adulta (tempo (gangliosídeos, esfingolipídeos) ase, autossômica recessiva, de vida normal sob tratamento) Tipo II: forma infantil (morte antes dos 1 anos) Tipo III: forma juvenil (início na primeira infância, menos grave do que o Tipo II) Síndrome de Hunter Acúmulo de mucopolissacarídeos L-iduronossulfato sulfatase, cromossômico X recessivo Síndrome de Hurler (morte Acúmulo de mucopolissacarídeos α-L-iduronidase, autossômica aos 10 anos) recessiva Doença de Niemann-Pick Defeito na liberação de colesterol dos Esfingomielinase, autossômica (três formas distintas A, B, lisossomos, acúmulo de esfingomielina recessiva C) Doença de Tay-Sachs (morte Acúmulo de gangliosídeo GM2 em células Hexosaminidase A, autossômica aos 4 anos) neuronais recessiva Pele Albinismo Defeito no metabolismo do nitrogênio Deficiência de tirosinase, autossômica recessiva Albinismo oculocutâneo, tipo Biossíntese reduzida de pigmento de melanina OCA2, autossômico recessivo

II Síndrome de Ehlers-Danlos Hérnia diafragmática. comum, descolamento Vários defeitos na síntese de colágeno (vários tipos) de retina Epidermólise bolhosa Defeitos na manutenção da estabilidade Epidermólise bolhosa tipo macular (vários tipos, incluindo EB estrutural dos queratinócitos ou adesão do (EBM), Epidermólise bolhosa 3 simplex, EB juncional, EB queratinócito à derme subjacente progressiva (EBR3), Epidermólise distrófica e síndrome de bolhosa 4 pseudojuntual (EBR4), Kindler) Desmoplakin (DSP), Plakophilin-1 (PKP1), kreatina (KRT5, KRTGA14), plectina (PLEC) subunidade de integrina (ITGB4), subunidades de laminina (LAMA3, LAMP3, LAMB3, LAMC2), colágeno (COL17A1, COL7A1 (autossômico dominante), FERMT1, autossômico recessivo Doença de Hartnup Defeito na captação de triptofano no trato SLC6A19, autossômico recessivo gastrointestinal, pele sensível à luz Telangiectasia hemorrágica Telangiectasia da pele e membranas mucosas Endoglin (ENG), autossômica hereditária, síndrome de dominante Osler-Weber-Rendu Hipercolesterolemia familiar elevação do colesterol sérico ligado à Receptor de lipoproteína de baixa lipoproteína de baixa densidade, acúmulo na densidade (LDLR), apolipoproteína B pele e arteriosclerose (APOB), autossômica dominante Xeroderma pigmentosa defeito de pele e melanoma devido à Defeito de reparo de DNA, exposição aos raios ultravioleta autossômico recessivo Calvície masculina Conversão perturbada de testosterona em di- 5-α-redutase hidrotestosterona na pele Doenças hepáticas genéticas

58 / 84 Distúrbios do metabolismo Interrupções no processo de várias etapas que FAH, TAT, HPD, autossômico de aminoácidos decompõe o aminoácido tirosina e recessivo fenilalanina Beta-talassemia Escassez de glóbulos vermelhos maduros HBB, autossômico recessivo intermediária Síndrome de Crigler-Najjar Deficiência de glucuronidação em que a UGT1A1, autossômico recessivo bilirrubina é dissolvida em água Distúrbios de oxidação de Deficiência no processamento de ácidos HADHA, ACADVL autossômico ácidos graxos graxos de cadeia longa e ácidos graxos de recessivo cadeia muito longa, resultando em letargia e hipoglicemia Distúrbios do metabolismo Gliconeogênese prejudicada causando FBP1, ALDOB, autossômico da frutose hipoglicemia recessivo Galactosemia Deficiência no processamento de galactose GALT, GALK1, GALE, autossômico recessivo Doenças de armazenamento A violação perturbada de glicose 6-fosfato e G6PC, SLC37A4, AGL, GBE1, de glicogênio glicogênio leva ao acúmulo de glicogênio, autossômico recessivo bem como a moléculas de glicogênio anormais, causando danos às células Transtorno de biossíntese de Diminuição da descarboxilase do UROD autossômico dominante, heme uroporfirinogênio, resultando no acúmulo de ALAS2 ligado ao X dominante, compostos chamados porfirinas, causando ALAD autossômico recessivo níveis tóxicos no fígado Doenças do metabolismo Falta de proteína funcional, que impede a NPC1, NPC2 autossômico recessivo, (transporte) de lipídios movimentação do colesterol e de outros LDLR, autossômico dominante lipídios, levando ao seu acúmulo nas células Distúrbios do metabolismo Distúrbios no armazenamento e transporte de ATP7B, HAMP, HFE, HFE2, de metais ferro e cobre, resultando em acúmulo em autossômico recessivo tecidos e órgãos Distúrbios de ácidos Quebra interrompida de vários blocos de BCKDHA, BCKDHB e DBT, PCCA orgânicos construção de proteínas (aminoácidos), certos e PCCB, MUT, MMAA, MMAB, (acidúrias/acidemias) lipídios e colesterol MMADHC, MCEE, IVD, MCCC1 ou MCCC2, autossômico recessivo Hiperoxalúria primária tipo 1 Repartição interrompida de glioxilato, AGXT, GRHPR, autossômico levando a danos renais recessivo Colestase intra-hepática Acúmulo de ácidos biliares nas células do ATP8B1, autossômico recessivo familiar progressiva fígado, causando danos ao fígado Desordem de atividade de A falta de atividade enzimática perturba o ADAMTS13, autossômico recessivo trombócitos equilíbrio normal entre sangramento e coagulação Desordens do ciclo da uréia Desordem do ciclo da ureia que causa uma OTC (transtorno ligado ao X), CPS1, forma de hiperamonemia ASS1 e SLC25A13, ASL, autossômico recessivo

[00139] No que diz respeito à etapa de purificação de moléculas de mRNA, o mesmo se aplica conforme descrito acima em conexão com o método para purificar moléculas de mRNA de acordo com a presente invenção, em que dito método compreende as etapas de (Ia) purificar moléculas de mRNA precipitadas a partir de uma suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas usando uma primeira solução, (Ib) lavar e dissolver as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (Ia) usando uma segunda solução, (IIa) purificar as moléculas de mRNA a partir das moléculas de mRNA dissolvidas obtidas na etapa (Ib) usando uma terceira

59 / 84 solução compreendendo um agente quelante, tal como EDTA, seguido por (IIb) lavar as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (Ia) usando uma quarta solução, em que as etapas (Ia) a (IIb) são realizadas usando filtração de fluxo tangencial.

[00140] No que diz respeito à etapa de formulação das moléculas de mRNA purificadas assim obtidas em uma composição farmacêutica, a referida etapa pode compreender a adição de cloreto de sódio ou citrato no caso das moléculas de mRNA purificadas com água sendo usadas como a quarta solução usada na etapa (IIb) e na última etapa (IIb) no caso de mais de uma etapa (IIb), respectivamente. Isto é vantajoso no caso das moléculas de mRNA purificadas não serem obtidas em uma solução que já compreende cloreto de sódio ou citrato ou no caso de as moléculas de mRNA purificadas serem obtidas em uma solução que já contém cloreto de sódio ou citrato, mas em outra concentração que a desejada para administração. No último caso, o método pode compreender ainda uma etapa de determinação da concentração respectiva e ajustá-la, se necessário. De preferência, as moléculas de mRNA purificadas são compreendidas em uma solução que compreende ainda cloreto ou citrato de sódio em uma concentração vantajosa para administração usando uma quarta solução compreendendo o referido cloreto ou citrato de sódio na respectiva concentração com um pH entre 3 e 6, de preferência entre 4 e 5, na (última) etapa (IIb) do método para purificar moléculas de mRNA descrito acima.

[00141] A formulação das moléculas de mRNA purificadas obtidas em uma composição farmacêutica pode compreender a etapa de adição de um transportador farmaceuticamente aceitável. As moléculas de mRNA purificadas são preferencialmente incluídas em uma quantidade eficaz, isto é, uma quantidade suficiente para induzir uma resposta terapêutica detectável no sujeito ao qual a composição farmacêutica será administrada. As moléculas de mRNA purificadas e/ou a composição farmacêutica podem estar em soluções

60 / 84 aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões e emulsões, bem como cremes e supositórios, mas também podem ter a forma de pós, comprimidos ou aerossóis.

[00142] O termo “transportador farmaceuticamente aceitável” aqui utilizado refere-se a compostos químicos, materiais, ingredientes e/ou composições, que são, dentro do escopo do julgamento médico sensato, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação risco/benefício razoável. Assim, um transportador farmaceuticamente aceitável é uma substância inativa formulada juntamente com a substância farmaceuticamente ativa para facilitar seu manuseio em vista de dosagem, adsorção, solubilidade ou considerações farmacocinéticas.

[00143] Exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, tampão, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes e soluções estéreis. Em particular, os transportadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meio tamponado. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais como azeite e ésteres orgânicos como oleato de etila. Outros exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose, citrato, fosfato e outros ácidos orgânicos; contra-íons formadores de sal, por exemplo, sódio e potássio; polipeptídeos de baixo peso molecular (> 10 resíduos de aminoácidos); proteínas, por exemplo albumina sérica ou gelatina; polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina ou glicina; carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas;

61 / 84 monossacarídeos; dissacarídeos; outros açúcares, por exemplo sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; agentes quelantes, por ex. EDTA; surfactantes não iônicos, por exemplo, monolaurato de polioxietileno sorbitano, disponível no mercado com o nome comercial Tween, propilenoglicol, Pluronics ou polietilenoglicol; antioxidantes incluindo metionina, ácido ascórbico e tocoferol; e/ou conservantes, por exemplo cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, por exemplo metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol). Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados e suas formulações são descritos em mais detalhes em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co. Além disso, conservantes, estabilizantes e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes, nanossistemas ou lipossomas e semelhantes.

[00144] A presente invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica compreendendo moléculas de mRNA purificadas de acordo com qualquer um dos respectivos métodos aqui descritos e fabricadas de acordo com o método descrito acima. A composição farmacêutica é vantajosa para ajustar e/ou aumentar a tradução de uma sequência de aminoácidos, como uma proteína em células de um sujeito ao qual a composição farmacêutica é administrada, em que a presença da referida sequência de aminoácidos, como uma proteína, é benéfica e/ou necessário para o sujeito, por exemplo, no contexto de uma doença.

[00145] No que diz respeito à composição farmacêutica, às moléculas de mRNA, sua purificação e a formulação da composição farmacêutica, o mesmo se aplica conforme indicado acima, incluindo as características e vantagens mencionadas no contexto das respectivas modalidades descritas acima.

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[00146] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por meio de uma grande variedade de classes de formas e vias de administração conhecidas pelos versados na técnica, tais como injeção de agulha, o uso de inaladores, nebulizadores, cremes, espumas, géis, loções e pomadas. A dose e a duração da ação dependem da função que as referidas moléculas de mRNA purificadas devem cumprir e devem ser deliberadamente ajustadas em cada caso. A duração da ação será tão longa quanto possível, por exemplo, se as referidas moléculas de mRNA purificadas forem usadas para uma terapia crônica de uma doença devido a um gene deficiente, enquanto com outras indicações pode ser ajustada para uma janela de tempo específica. Além disso, é possível a administração sistêmica das referidas moléculas de mRNA purificadas formuladas em uma composição farmacêutica adequada.

[00147] Figura 1: Visão geral de um sistema de filtração de fluxo tangencial contínuo (TFF) com moléculas de mRNA circulantes de acordo com o método descrito. As moléculas de mRNA estão em suspensão na etapa (Ia), dissolvidas na etapa (Ib) e em solução no caso das etapas (IIa) e (IIb), respectivamente.

[00148] Figura 2: Visão geral de um sistema exemplar para purificar moléculas de mRNA de acordo com o método descrito (com posições exemplificativamente representadas de válvulas, bombas (auxiliares) e/ou (mais) vasos).

[00149] Figura 3: SDS-PAGE seguido por coloração coomassie coloidal do retentado TFF compreendendo moléculas de mRNA codificando tdTomato não modificadas após purificação da respectiva mistura de transcrição in vitro (IVT) de acordo com as etapas (Ia) e (Ib) em RT. Pista 1: mistura de enzimas em amonioacetato (NH4OAc) como controle; pista 2: mistura de enzimas após iniciar o sistema TFF; pista 3: mistura de enzimas após TFF em água sem nuclease; pista 4: Mistura IVT; pista 5: Mistura IVT após a preparação do sistema TFF; pista 6: Mistura IVT após TFF em água

63 / 84 sem nuclease ; pista 7: mistura de enzimas em água sem nuclease como controle. A mistura de enzimas consistia em inibidor de RNase, T7 RNA polimerase, pirofosfatase inorgânica e DNase I.

[00150] Figura 4: SDS-PAGE seguido por coloração coomassie coloidal do retentado TFF compreendendo moléculas de mRNA codificando tdTomato não modificadas após purificação da respectiva mistura de transcrição in vitro (IVT) de acordo com as etapas (Ia) e (b) em RT. Pista 1: mistura de enzimas em água sem nuclease como controle; pista 2: Mistura IVT antes de TFF; pista 3: Mistura IVT após a preparação do sistema TFF; pista 4: IVT mistura após TFF em água sem nuclease água; pista 5: Mistura IVT após TFF em água em água sem nuclease (após diafiltração com amonioacetato 2,5 M e água sem nuclease, a respectiva mistura foi concentrada 2,5 vezes para detectar com eficiência a remoção de proteínas). A mistura de enzimas consistia em inibidor de RNase, T7 RNA polimerase, pirofosfatase inorgânica e DNase I.

[00151] Figura 5: SDS-PAGE seguido por coloração coomassie coloidal do retentado TFF compreendendo moléculas de mRNA codificando tdTomato não modificadas após purificação da respectiva mistura de transcrição in vitro (IVT) de acordo com as etapas (Ia) e (b) a 4 °C. Pista 1: mistura de enzimas em água sem nuclease como controle; pista 2: Mistura IVT antes de TFF; pista 3: Mistura IVT após um volume de lavagem (igual ao volume inicial de alimentação); pista 4: IVT mistura após TFF em água sem nuclease água; pista 5: Mistura IVT após TFF em água em água sem nuclease (após diafiltração com amonioacetato 2,5 M e água sem nuclease, a respectiva mistura foi concentrada 2,5 vezes para detectar com eficiência a remoção de proteínas). A mistura de enzimas consistia em inibidor de RNase, T7 RNA polimerase, pirofosfatase inorgânica e DNase I.

[00152] Figura 6: A) Western Blot da proteína hCFTR traduzida em células HEK293 após transfecção com mRNA hCFTR purificado por TFF e

64 / 84 mRNA hCFTR purificado por precipitação com amonioacetato seguida por lavagem com etanol 70%, formulado usando Lipofectamine Messenger Max. Como governante, as bandas da proteína Hsp90 são mostradas. As células não transfectadas foram utilizadas como controlo negativo. B) O hCFTR expresso foi quantificado por análise densitométrica usando Image Lab Software e normalizado para a proteína HSP90. Células não transfectadas (UT) foram utilizadas como controle negativo.

[00153] Figura 7: Quantidades residuais de diferentes incrementadas em moléculas de mRNA que não são hCFTR em comparação com a quantidade das moléculas de mRNA alvo de hCFTR após vários volumes de lavagem em porcentagem. A filtração de fluxo tangencial foi realizada a RT.

[00154] Figura 8: Quantidades residuais de diferentes incrementadas em moléculas de mRNA que não são hCFTR em comparação com a quantidade das moléculas de mRNA alvo de hCFTR após vários volumes de lavagem em porcentagem. A filtração de fluxo tangencial foi realizada a 4 °C.

[00155] Figura 9: Eletroforese em gel capilar usando Analisador de Fragmentos foi realizada a partir de mRNA tdTomate incrementado com diferentes oligonucleotídeos de DNA (15 nt, 25 nt e 120 nt) contendo um oligonucleotídeo de DNA antisense de 25 nt antes (A) e após (B) purificação de TFF a 4 °C. O marcador inferior é um padrão interno fornecido no kit de reagentes do Analisador de Fragmentos para normalizar os tempos de retenção do pico em cada execução capilar (oligonucleotídeo de RNA de 15 nt de comprimento).

[00156] Figura 10: Representativamente, o fluxo de permeado foi medido em diferentes pontos de ajuste de pressão transmembrana.

[00157] Figura 11: A eletroforese em gel capilar usando o Analisador de Fragmentos foi realizada a partir de hCFTR mRNA enriquecido com 25 nt e 120 nt de oligonucleotídeos de DNA de comprimento e 256 nt de moléculas de mRNA de GLP-1 de comprimento antes da purificação de acordo com a

65 / 84 Abordagem 1 (A), após a etapa (Ib) (B), após etapa (IIa) (C), e após a etapa (IIb) (D) em temperatura ambiente. O marcador inferior é um padrão interno fornecido no kit de reagentes do Analisador de Fragmentos para normalizar os tempos de retenção do pico em cada execução capilar (oligonucleotídeo de RNA de 15 nt de comprimento).

[00158] Figura 12: A eletroforese em gel capilar usando o Analisador de Fragmentos foi realizada a partir de hCFTR mRNA incrementado com 25 nt e 120 nt de oligonucleotídeos de DNA de comprimento e 256 nt de moléculas de mRNA de GLP-1 de comprimento antes (A) e após (B) purificação de acordo com a Abordagem 2 em RT. O marcador inferior é um padrão interno provido no kit de reagentes do Analisador de Fragmentos para normalizar os tempos de retenção do pico em cada execução capilar (oligonucleotídeo de RNA de 15 nt de comprimento).

[00159] Outros aspectos e vantagens da invenção serão descritos nos exemplos a seguir, que são dados para fins de ilustração e não como forma de limitação. Cada publicação, patente, pedido de patente ou outro documento citado neste pedido é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. Exemplos

[00160] Métodos e materiais são descritos neste documento para uso na presente descrição; outros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica também podem ser usados. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

[00161] As abreviaturas utilizadas neste documento e suas respectivas descrições estão listadas na Tabela 3. Tabela 3 Abreviação Descrição °C Graus Celsius CFTR Regulador de condutância transmembrana em fibrose cística EDTA Ácido etilenodiaminotetracético HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência IVT Transcrição in vitro kDa Kilodalton

66 / 84 Abreviação Descrição l // ml Litro // Mililitro M // mM Molar // Milimolar mbar Milibar min Minuto mg Miligrama MOPS Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico mPES Polietersulfona Modificada mRNA Ácido ribonucleico mensageiro (RNA) MWCO Peso molecular de corte NaOH Hidróxido de sódio nt Nucleotídeo(s) NH4OAc Acetato de amônio, CH3COONH4 RT Temperatura ambiente, por exemplo entre 20 °C a 25 °C, por exemplo 22 °C SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio TFF Filtragem de fluxo tangencial TMP Pressão transmembrana x Vezes µl Microlitro % Percentagem Materiais e Métodos Materiais, dispositivos, software e sistema de testagem usados

[00162] Os materiais são listados na Tabela 4. Tabela 4 Material Fornecedor Cat# Solução de amoniumacetato 5 M pH 7 Sigma Aldrich 09691-1L Filtro TFF 50 kDA mPES Spectrumlabs C02-E050-05-N Filtro TFF 100 kDA mPES Spectrumlabs C02-E100-05-N Filtro TFF 300 kDA mPES Spectrumlabs C02-E300-05-N Filtro TFF 500 kDA mPES Spectrumlabs C02-E500-05-N HiPerSolv Chromanorm Water para HPLC VWR 83650,320 Água para injeção B. Braun 3703444 Solução de sal dissódico de EDTA pH 7 Sigma Aldrich E7889 MOPS BioUltra para biologia molecular Sigma Aldrich 6947 Solução de hidróxido de sódio a 32% Carl Roth T197.1 Kit de análise de RNA de sensibilidade padrão Advanced Analytical DNF-471 (15 nt) Lipofectamine® MessengerMax™ Thermo Fisher Scientific LMRNA015 Luminata Classico Millipore WBLUC0500 MEM, Suplemento GlutaMAX™ Thermo Fisher Scientific 41090028 Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374 PVDF Pre-cut Blotting Membranes, 0,2 μm Thermo Fisher Scientific LC2002 Roti-Load Carl Roth K930.1 SuperSignalTM West Femto Thermo Fisher Scientific 34095 TRIS-Acetato 3-8%, 1 mm, 15-alvéolos Thermo Fisher Scientific EA03755BOX Tampão de corrida TRIS-Acetato Thermo Fisher Scientific LA0041 TRYPSIN 0.05% EDTA Thermo Fisher Scientific 25300054 Bloqueador/Diluente WesternBreeze® Thermo Fisher Scientific WB7050 Solução de lavagem WesternBreeze® (16X Thermo Fisher Scientific WB7003 mAb anti-humano CFTR de camundongo R&D Systems MAB25031 mAb anti-HSP90 de camundongo Origene TA500494 cOmpleeteTM, Inibidor de protease sem EDTA Sigma Aldrich 11873580001 Ditiotreitol (DTT) GE Healthcare 17-1318-02 Solução DNase I (2500 U/mL) Thermo Fisher Scientific 90083 DPBS 1x sem Ca e Mg Thermo Fisher Scientific 14190-169

67 / 84 Material Fornecedor Cat# Soro fetal bovino, inativado pelo calor Thermo Fisher Scientific 10500064 IgG-HRP de burro anti-camundongo Abcam ab6820 Coomassie coloidal Roth A152.1 Ácido o-fosfórico, 85% Rotipuran, p.a.,ACS, ISO Carl Roth 63661. Inibidor de Rnsae RiboLick Thermo Fisher Scientific DNAse I (sem Rnase) Thermo Fisher Scientific Pirofosfatase inorgânica Thermo Fisher Scientific T7 RNA Polimerase Thermo Fisher Scientific Bolt 4 - 12 % Bis-Tris Plus 10 alvéolos Invitrogen NW04120BOX Tampão de carregamento de amostra Bolt LDS Life technologies B0007 (4x) Precision Plus Protein Dual Color Standards BioRad 161-0374 Tampão de corrida SDS Bolt MES (20x) Life technologies B0002 Solução de cloreto de magnésio Sigma Aldrich M1028 Espermidina Sigma Aldrich 85578 Solução de ditiotreitol (DTT) Sigma Aldrich 43816 GTP Jena Bioscience NU-1012 ATP Jena Bioscience NU-1010 CTP Jena Bioscience NU-1011 UTP Jena Bioscience NU-1013 análogo de cap ARCA Jena Bioscience NU-855

[00163] Os dispositivos são listados na Tabela 5. Tabela 5 Dispositivo Fornecedor Sistema de TFF KR2i Spectrum Laboratories, Inc. Analisador de fragmentos Advanced Analytical Chemidoc XRS BioRad Laboratories Novex Bolt Mini Gel Tank Life technologies

[00164] Os softwares são listados na Tabela 6. Tabela 6 Software Fornecedor ProSize 3.0 Advanced Analytical Excel Plug In Spectrum Laboratories, Inc. MS Excel Microsoft Image Lab BioRad Laboratories Open Lab Chem Station Agilent

[00165] O sistema de testagem é listado na Tabela 7. Tabela 7 Sistema de testagem Espécie Cepa HEK 293 humana N.A.

Purificação de uma mistura IVT via TFF - etapas (Ia) e (Ib)

[00166] A seguir, uma mistura de transcrição in vitro (IVT) foi usada compreendendo moléculas de mRNA alvo de tdTomato não modificadas, transcritas in vitro e não modificadas com 1644 nucleotídeos (nt) de comprimento. Além disso, foi usada uma mistura de enzimas compreendendo T7 RNA polimerase, pirofosfatase inorgânica, inibidor de RNAse e DNase I.

68 / 84 Precipitação de RNA

[00167] A mistura IVT e a mistura de enzimas foram precipitadas, cada uma, com uma quantidade igual de NH4OAc 5 M gelado com um pH de 7 a uma concentração final de NH4OAc 2,5 M e incubadas em gelo durante pelo menos 30 minutos. Antes da TFF, a respectiva mistura foi diluída 1: 1 com 2,5 M NH4OAc pH 7 para uma concentração final de cerca de 0,5 mg/ml mRNA na mistura. O IVT ou mistura de enzimas foi conectado ao sistema TFF, que foi inicialmente ativado por 10 minutos circulando a mistura de IVT a 50 ml/min com a pinça de permeado fechada. Etapa (Ia): Remoção de proteínas, nucleotídeos e sais

[00168] A diafiltração da respectiva mistura foi realizada a 50 ml/min a um TMP constante de cerca de 200-300 mbar usando uma coluna de filtro mPES de MWCO de 500 kDa. A respectiva mistura foi diafiltrada com 10 volumes de lavagem de 2,5 M NH4OAc pH 7. Esta etapa removeu enzimas, nucleotídeos de maneira eficiente, bem como componentes do tampão da transcrição in vitro. A etapa (Ia) pode ser usada para remover quaisquer outras proteínas e/ou enzimas de quaisquer outras etapas de produção intermediárias (por exemplo, desfosforilação, pós-capeamento, poliadenilação,...). Para algumas enzimas (por exemplo, poli(A) polimerase, que se liga com alta afinidade às moléculas de mRNA de interesse), um detergente (por exemplo, SDS, LDS,...) pode ser adicionado ao tampão de amoniumacetato de pH 7. No caso de poli(A) polimerase ser usada para poliadenilação, a etapa subsequente (Ia) é preferencialmente realizada a uma temperatura entre 20 °C e 30 °C, preferencialmente entre 23 °C e 27 °C, mais preferencialmente a 25 °C. Tal temperatura é vantajosa para a remoção eficiente da poli(A) polimerase. Etapa (Ib): Remoção de NH4OAc da etapa (Ia)

[00169] Para remover NH4OAc e resolver as moléculas de mRNA, uma coluna de filtro mPES MWCO de 100 kDA foi usada para diafiltração com 10 volumes de lavagem usando água livre de nuclease a uma taxa de

69 / 84 fluxo de 50 ml/min e um TMP de cerca de 200-300 mbar. Alternativamente, uma coluna de filtro mPES de MWCO de 50 kDa pode ser usada dependendo do tamanho da molécula de mRNA.

[00170] Para investigar a eficiência de purificação das etapas (Ia) e (Ib), o retentado TFF compreendendo as moléculas de mRNA pode ser amostrado antes e depois da TFF (isto é, etapa (Ib)) e analisado, por exemplo, usando medição de UV, analisador de fragmento, dodecil de sódio eletroforese em gel de sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) seguido por, por exemplo, coloração coomassie coloidal.

[00171] Conforme mostrado nas Figuras 3 a 5, as enzimas podem ser eficientemente removidas das moléculas de mRNA aplicando as etapas (Ia) e (Ib) conforme descrito acima. Assim, as moléculas de mRNA foram retidas pela coluna TFF, enquanto as enzimas e/ou proteínas foram removidas de forma eficiente. A análise do pico de esfregaço revelou que o pré-pico do esfregaço era de 4,7% antes da purificação de TFF e tinha um desvio de +1,3% para a purificação de TFF a 4 °C e + 1,8% após a purificação de TFF realizada em TA. Portanto, nenhuma degradação do mRNA pode ser observada. Purificação de mRNA precipitado e dissolvido via TFF - Desenvolvimento das etapas (IIa) e (IIb)

[00172] A seguir, o mRNA precipitado e dissolvido foi usado para purificação adicional. Testando diferentes membranas de filtração e o efeito do EDTA na transmissão do mRNA

[00173] Membranas de filtro diferentes com tamanhos de poros variados foram testadas em relação à transmissão de moléculas de mRNA usando água sem nuclease sozinha ou água sem nuclease com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 10 mM adicional. Quatro colunas de mPES foram testadas com um peso molecular de corte (MWCO) de 500 kDa, 300

70 / 84 kDa, 100 kDa e 50 kDa, respectivamente. A pressão transmembrana (TMP) foi ajustada usando a pinça de retentado no sistema TFF e mantida a 40 mbar para as colunas com MWCO de 500 kDa e 50 kDa, respectivamente, e a 100 mbar para colunas com MWCO de 100 kDa e 300 kDa, respectivamente. A bomba principal foi ajustada para uma taxa de fluxo de 15 ml/min e o TFF foi realizado em temperatura ambiente. A concentração inicial da molécula de mRNA na alimentação era de 0,1 mg/ml e as concentrações da molécula de mRNA no retentado e no permeado foram medidas usando medições de UV. Cada coluna foi testada com volumes de lavagem 10x do volume da amostra original.

[00174] Sem EDTA, as moléculas de mRNA foram retidas pela coluna testada com um MWCO de 500 kDa. Foi assumido que tamanhos de poros menores (ou seja, 300 kDa, 100 kDa e 50 kDa) também não permitirão a passagem das moléculas de mRNA e, portanto, não foram testados sem a presença de EDTA.

[00175] Com o EDTA, as moléculas de mRNA se moveram surpreendentemente através dos poros da membrana do filtro MWCO de 500 kDa e também foram parcialmente perdidas usando a membrana do filtro MWCO de 300 kDa. No entanto, as moléculas de mRNA poderiam ser retidas com sucesso usando as membranas de filtro MWCO de 100 e 50 kDa na presença de EDTA 10 mM. Portanto, a coluna MWCO de 100 kDa foi escolhida para a filtração de moléculas de mRNA nas experiências mostradas abaixo.

[00176] Deve-se notar que a precipitação esporádica das moléculas de mRNA foi observada em alguns casos após filtração com EDTA 10 mM. No entanto, esta precipitação pode ser evitada de forma eficiente usando um tampão compreendendo MOPS 40 mM e EDTA 10 mM. Preparação de um MOPS 40 mM e tampão de diafiltração 10 mM EDTA

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[00177] Foi preparado um tampão de ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico (MOPS) 1 M, em que o MOPS foi dissolvido em água sem nuclease. O pH do tampão MOPS 1 M foi então ajustado a um pH de 7 usando NaOH a 32%. O tampão MOPS 1 M obtido com um pH de 7 foi misturado com EDTA 0,5 M e água sem nuclease para finalmente obter um tampão de diafiltração compreendendo MOPS 40 mM e EDTA 10 mM. Determinação dos volumes de tampão de lavagem para remover oligonucleotídeos de ácido nucleico

[00178] A eficiência do processo TFF, ou seja, o número mínimo de ciclos de lavagem necessários para a remoção completa de impurezas, como oligonucleotídeos de ácido nucleico representando transcritos abortivos e/ou produtos de hidrólise, depende fortemente da rejeição da molécula pelo filtro de membrana e seu tamanho de poro. Portanto, o respectivo efeito dos volumes do tampão de lavagem foi investigado para determinar o número de ciclos de lavagem necessários para remover oligonucleotídeos de ácido nucleico incrementados de mRNA precipitado e dissolvido compreendendo moléculas de mRNA de interesse.

[00179] Para este experimento, a taxa de fluxo de TFF foi ajustada para 15 ml/min e o TMP foi mantido constante em cerca de 40 mbar usando uma coluna de filtro mPES de MWCO de 100 kDa. Em um volume total de alimentação de 5 ml, 500 μL de moléculas de mRNA foram enriquecidos com oligonucleotídeo de DNA de 10 nt de comprimento representando 2,5% da molécula de mRNA alvo (m/m), oligonucleotídeo de DNA de 50 nt de comprimento representando 2,5% da molécula de mRNA alvo ( m/m), e oligonucleotídeos de DNA de 120 nt de comprimento representando 5% da molécula de mRNA alvo (m/m). Amostras para análise de HPLC de fase reversa foram coletadas após 5x, 10x, 15x e 20x volumes de lavagem do volume de alimentação original com o tampão de diafiltração compreendendo 40 mM MOPS e 10 mM EDTA. Antes da retirada da amostra, o grampo do

72 / 84 permeado foi fechado e a válvula do retentado aberta para circulação do retentado a 50 ml/min por 5 minutos. Para cada ciclo de lavagem, 100 μL de amostra foram coletados usando uma seringa estéril e as amostras foram mantidas em gelo até a análise. O TFF foi realizado à temperatura ambiente. As amostras foram investigadas usando análise de HPLC de fase reversa com a área detectada a 260 nm sendo representativa para as quantidades relativas de oligonucleotídeo de DNA na amostra. As áreas correspondentes antes de TFF (controle) foram definidas para 100% de oligonucleotídeo.

[00180] Em todos os casos, nenhum oligonucleotídeo de ácido nucleico pôde ser detectado após a aplicação de volumes de lavagem 5x, 10x, 15x e 20x ao volume de alimentação, respectivamente. Portanto, os resultados mostraram que já após 5x os volumes de lavagem com tampão de lavagem, não foi possível detectar mais oligonucleotídeos de ácido nucleico no retentado. Um mínimo de 10x o volume de lavagem com tampão de lavagem foi determinado ser suficiente para a remoção dos oligonucleotídeos de ácido nucleico das moléculas de mRNA. Determinação dos volumes de lavagem com água livre de nuclease para remoção de EDTA

[00181] Uma vez que a remoção dos oligonucleotídeos de DNA por TFF é realizada usando tampão de lavagem, isto é, tampão de diafiltração compreendendo MOPS 40 mM e EDTA 10 mM, uma etapa de filtração subsequente é vantajosa para trocar o tampão de lavagem por água livre de nuclease. Portanto, um experimento foi realizado para determinar a quantidade de ciclos de lavagem necessária para a remoção do tampão de lavagem das moléculas de mRNA. Do experimento anterior, a solução de alimentação compreendendo as moléculas de mRNA e tendo um volume total de cerca de 5 ml que foi previamente filtrado com 20x volumes de lavagem de tampão de diafiltração foi diafiltrada com água livre de nuclease a uma taxa de fluxo de 15 ml/min e uma constante TMP de 40 mbar usando uma coluna

73 / 84 de filtro mPES MWCO de 100 kDA. As amostras para a análise de HPLC de fase reversa foram tomadas após 5x, 10x, 15x e 20x volumes de lavagem do volume de alimentação original com água sem nuclease. A fim de quantificar a quantidade de EDTA residual após cada ciclo de lavagem com água livre de nuclease, o tampão de diafiltração compreendendo MOPS 40 mM e EDTA 10 mM foi titulado e uma curva padrão de calibração registrada (cf. Tabela 6; curva padrão de calibração MOPS-EDTA: log (y) = 0,6467 log (x) +1,9128; r = 0,99462; r² = 0,99877; modelo de curva: log/log). Uma vez que o tampão MOPS sozinho não mostra nenhum sinal de absorção a 260 nm, as concentrações indicadas na Tabela 8 e na Tabela 9 correspondem à concentração de EDTA. A experiência foi realizada a 22 °C RT. Na Tabela 9, os dados são mostrados após a remoção do EDTA após cada ciclo de lavagem.

[00182] Como mostrado na Tabela 9, as quantidades decrescentes de EDTA de acordo com a área de pico detectada por HPLC de fase reversa a 260 nm após aumentar os volumes de lavagem revelaram que um mínimo de 10x os volumes de lavagem com água livre de nuclease eram necessários para a remoção parcial de EDTA residual. Tabela 8 EDTA cSOLL [mM] Área de pico 260 nm EDTA calculado [mM] Precisão Precisão absoluta 1,00 74,864 0,92 92% 8% 0,80 68,269 0,79 99% 1% 0,50 56,447 0,57 115 % 15 % 0,10 19,282 0,10 96 % 4% 0,05 13,057 0,05 100 % 0% Tabela 9 ID ÁREA EDTA Residual [mM] MOPS-EDTA 20x tampão de lavagem 0x água sem nuclease 205,65 ULOQ acima 20x tampão de lavagem 5x água sem nuclease 60,7 0,65 20x tampão de lavagem 10x água sem nuclease 24,3 0,14 20x tampão de lavagem 15x água sem nuclease 7,8 LOQ abaixo 20x tampão de lavagem 20x água sem nuclease 13,8 0,05 Testagem dos parâmetros determinados

[00183] Nos experimentos anteriores que foram realizados em RT, o número mínimo de ciclos de lavagem usando tampão de diafiltração

74 / 84 necessário para a remoção de oligonucleotídeos de DNA na etapa (IIa), bem como o número mínimo de ciclos de lavagem usando água sem nuclease necessária para a remoção de EDTA residual na etapa (IIb) foram determinados. Para testar os parâmetros determinados, 500 μg de mRNA foram enriquecidos com oligonucleotídeos de ácido nucleico de 10 nt de comprimento representando 2,5% do volume da molécula de mRNA alvo, oligonucleotídeo de DNA de 50 nt de comprimento representando 2,5% do volume da molécula de mRNA alvo e oligonucleotídeo de DNA de 120 nt de comprimento representando 5% do volume da molécula de mRNA alvo em um volume de alimentação total de 5 ml (referido como “Antes da TFF” na Tabela 8 e na Tabela 9).

[00184] Para os experimentos descritos abaixo, a seguinte configuração foi usada, salvo indicação em contrário: A solução de alimentação compreendendo 0,1 mg/ml de moléculas de mRNA foi diafiltrada usando uma coluna de filtro 100 kDa MWCO mPES a uma taxa de fluxo de 15 ml/min e um TMP de cerca de 40 mbar. Os volumes de lavagem aplicados foram em ambos os casos 10x, ou seja, 10x o volume de lavagem com tampão de diafiltração compreendendo 40 mM MOPS e 10 mM EDTA seguido por 10x o volume de lavagem com água livre de nuclease (referido como “Após TFF” na Tabela 8 e Tabela 9). Uma vez que as moléculas de mRNA são propensas à degradação por hidrólise, especialmente a temperaturas elevadas, as experiências foram realizadas a 4 °C, isto é, usando água gelada, para manter a hidrólise da molécula de mRNA no mínimo.

[00185] Esta configuração resultou na remoção eficiente de oligonucleotídeos de DNA de todos os três comprimentos testados (Tabela 10), bem como de tampão de diafiltração residual (Tabela 11), conforme determinado usando HPLC de fase reversa. Além disso, a análise de esfregaço de pico foi realizada após a eletroforese em gel capilar usando o Analisador de Fragmentos antes e após a purificação (Tabela 12). As análises de

75 / 84 esfregaço de pico indicaram que a integridade do mRNA não variou devido à purificação de TFF e, portanto, não foi afetada pelo método. Tabela 10 Área de pico de oligonucleotídeos de DNA Comprimento 10 nt Comprimento 50 nt Comprimento 120 nt Antes da TFF 100 % 100 % 100 % Depois da TFF 0,0 % 0,0 % 0,0 % Tabela 11 Área de pico MOPS-EDTA MOPS-EDTA Residual [mM] Antes de TFF 193,0 Acima do limite superior da quantificação Depois de TFF 27,4 0,17 Tabela 12 Esfregaço pré-pico [%] Referência (sem MOPS-EDTA) 20,0 Antes da TFF com MOPS-EDTA, pH 7; Duplicato 1 18,2 Antes da TFF com MOPS-EDTA, pH 7; Duplicato 2 15,4 10x tampão de lavagem 10x água sem nuclease; Duplicato 1 17,4 10x tampão de lavagem 10x água sem nuclease; Duplicato 2 16,5 Determinação da eficiência de tradução de moléculas de mRNA purificadas

[00186] Além disso, foi de grande interesse determinar a eficiência de tradução das moléculas de mRNA purificadas obtidas. Portanto, 1,4x106 células HEK293 foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas com 3,75 µg de moléculas de mRNA purificadas como descrito acima e de acordo com um procedimento padrão, respectivamente. A transfecção foi realizada usando MessengerMax (1:15). Após 24 h, as células foram lisadas e investigadas usando SDS-page e Western Blot, respectivamente, usando 50 µg de lisado de células cada.

[00187] Como pode ser visto na Figura 6, uma quantidade comparável de moléculas de mRNA foi detectada usando Western Blot (A) e quantificada (B). Determinação de um limite para a remoção de mRNA com diferentes comprimento

[00188] Um total de 300 µg de mRNA alvo hCFTR mRNA foi adicionado com diferentes moléculas de mRNA variando em comprimento usando um volume total de 5 ml. Em particular, 6 tipos diferentes de

76 / 84 moléculas de mRNA foram usados para análise dos picos com cada tipo representando 16,7% do volume da molécula de mRNA alvo. Três tipos de moléculas de mRNA exibiram uma cauda e uma cauda poli(A) e tinham um comprimento total de 3.632 nt, 1.864 nt e 1.111 nt, respectivamente. Dois tipos não possuíam um cap nem uma cauda poli(A) e exibiam um comprimento total de 494 nt e 256 nt, respectivamente. O último tipo refere- se a um oligonucleotídeo de comprimento de DNA de 120 nt que serviu como um controle positivo.

[00189] A molécula de mRNA em pico compreendendo a solução foi filtrada como descrito acima em RT (Figura 7) e 4 °C (Figura 8), respectivamente. As amostras foram retiradas antes da TFF (diretamente após a preparação da amostra), após 5x, 10x, 15x e 20x os volumes de lavagem do volume da amostra original usando o tampão de diafiltração descrito acima e após a lavagem adicional usando 10x volumes de lavagem de água de água sem nuclease. Para cada ciclo de lavagem, 100 µl de amostra foram coletados usando uma seringa estéril e mantida em gelo até a análise. A transmissão das moléculas através dos poros do filtro foi avaliada por eletroforese em gel capilar usando um analisador de fragmentos.

[00190] Como mostrado na Figura 7 e Figura 8, um corte para moléculas de mRNA com pelo menos um comprimento de 951 nt pode ser observado usando uma coluna de mPES de 100 kDa. Para moléculas de mRNA com um comprimento inferior a 951 nt, as colunas com um MWCO inferior podem ser vantajosas, como, por exemplo, colunas de mPES de 50 kDa ou 70 kDa. Aumentando a concentração da molécula de mRNA de 0,1 mg/ml para 1 mg/ml

[00191] No seguinte conjunto final de experimentos (Figura 9), o procedimento de filtragem descrito a seguir foi aplicado a uma solução compreendendo mRNA de tdTomato não modificado de 1644 nt de

77 / 84 comprimento como molécula de mRNA alvo. Em particular, um total de 5 ml de solução de alimentação foi analisado compreendendo moléculas de mRNA de 1 mg/ml, correspondendo a um total de 5 mg de moléculas de mRNA, bem como um oligonucleotídeo de DNA de 15 nt e um oligonucleotídeo antisense de 25 nt de comprimento - que se liga de forma complementar para a molécula de mRNA de interesse - representando 2,5% da molécula de mRNA alvo (m/m) e oligonucleotídeos de 120 nt de comprimento representando 5% da molécula de mRNA alvo (m/m). Esta solução de alimentação em pico foi diafiltrada a 4 °C usando uma coluna de filtro 100 kDa MWCO mPES a uma taxa de fluxo de 15 ml/min e um TMP de cerca de 40 mbar. Os volumes de lavagem aplicados foram i) 10x o volume de lavagem com água sem nuclease, seguido por ii) 10x o volume de lavagem com tampão de diafiltração compreendendo 40 mM de MOPS e 10 mM de EDTA, seguido por iii) 10x o volume de lavagem com água sem nuclease.

[00192] Os valores de esfregaço foram investigados como um indicador da integridade do mRNA. Em particular, os seguintes valores de esfregaço foram obtidos: um pré-pico de esfregaço de 6,4% antes da TFF, bem como um pré-pico de esfregaço de 5,9% após a TFF. As áreas de esfregaço pré-pico refletem a proporção de produtos hidrolisados relacionados ao mRNA. Assim, nenhum produto de hidrólise pode ser medido pela análise do Analisador de fragmentos e pode ser mostrado que a purificação de TFF não afeta a integridade do mRNA. Esboço exemplar para a determinação de parâmetros TFF ideais aplicando medidas de rotina

[00193] A seguir está uma breve descrição de como o especialista pode otimizar o método TFF descrito acima, aplicando medidas de rotina. Etapa (Ia)

[00194] A taxa de fluxo de TFF pode ser ajustada de modo a atingir uma taxa de cisalhamento suficiente para recircular as moléculas de mRNA

78 / 84 precipitadas através do sistema TFF e varrer as moléculas de mRNA precipitadas da superfície do filtro. Abrindo a braçadeira de permeado, um fluxo de permeado suficiente pode ser alcançado. A remoção da enzima pode ser determinada, por exemplo, por análise de SDS-Page e os volumes de lavagem necessários podem ser ajustados por medidas de rotina (preferencialmente 1-20 volumes de lavagem; mais preferencialmente 5-15; mais preferencialmente 9-11). Um volume de lavagem é definido como um volume igual de meio de diafiltração, por exemplo, tampão de acetato de amônio com pH 7, do volume inicial de alimentação. Etapa (Ib)

[00195] Os mesmos parâmetros descritos na etapa (Ia) podem ser aplicados. Por este meio, o tampão pode, por exemplo, ser trocado por água livre de nuclease a fim de resolver as moléculas de mRNA e remover o tampão (por exemplo, acetato de amônio). A remoção do tampão pode ser determinada por exemplo, condutividade, medição de UV e volumes de lavagem necessários podem ser ajustados por medidas de rotina (preferencialmente 1-20 volumes de lavagem; mais preferencialmente 5-15; mais preferencialmente 9-11). Um volume de lavagem é definido como um volume igual de meio de diafiltração, por exemplo, água livre de nuclease, do volume de alimentação inicial. Etapa (IIa)

[00196] A taxa de fluxo de TFF pode ser ajustada de modo a atingir uma taxa de cisalhamento suficiente para recircular as moléculas de mRNA através do sistema TFF e varrer as moléculas de mRNA da superfície do filtro. Abrindo a braçadeira de permeado, um fluxo de permeado suficiente pode ser alcançado. A perda de mRNA de interesse pode ser monitorizada, por exemplo, por medição de UV (por exemplo, medição online/offline) na linha de permeado. Se a perda de mRNA de interesse for observada, a taxa de fluxo e/ou TMP pode ser ajustada por medidas de rotina até que nenhuma

79 / 84 perda adicional de mRNA de interesse seja observada. Os volumes de lavagem necessários podem ser ajustados por medidas de rotina dependentes da quantidade de impurezas (por exemplo, transcrições abortivas e/ou produtos de hidrólise); (preferencialmente 1-20 volumes de lavagem; mais preferencialmente 5-15; mais preferencialmente 9-11). Um volume de lavagem é definido como um volume igual de meio de diafiltração, por exemplo, MOPS-EDTA a um pH de 7, do volume inicial de alimentação. Etapa (IIb)

[00197] Os mesmos parâmetros descritos na etapa (IIa) podem ser aplicados. Por este meio, o tampão pode, por exemplo, ser trocado por água livre de nuclease para remover o tampão, por exemplo, MOPS-EDTA. A remoção do tampão pode ser determinada por exemplo, condutividade, medição de UV e volumes de lavagem necessários podem ser ajustados por medidas de rotina (preferencialmente 1-20 volumes de lavagem; mais preferencialmente 5-15; mais preferencialmente 9-11). Um volume de lavagem é definido como um volume igual de meio de diafiltração, por exemplo, água livre de nuclease, do volume de alimentação inicial.

[00198] Os experimentos de excursão de TMP podem ser úteis para determinar as condições ideais para a purificação da molécula de mRNA. A título de exemplo, um total de 5 ml de solução de alimentação compreendendo uma concentração de molécula de mRNA alvo de 1,0 mg/ml no tampão de diafiltração usado na etapa (IIa), conforme descrito acima, foi diafiltrado usando uma coluna de filtro mPES MWCO de 100 kDa e uma taxa de fluxo de 15 ml/min. O fluxo de permeado foi medido em ml/min em 6 valores de TMP diferentes variando de cerca de 50 mbar a cerca de 150 mbar. Como pode ser visto na Figura 10 para tdTomato mRNA, o TMP ideal foi determinado como sendo cerca de 50 mbar a uma taxa de fluxo de 15 ml/min, mas isso pode depender do cenário experimental. Exemplo Comparativo

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[00199] A seguir, é descrito um exemplo que foi realizado a fim de comparar os resultados obtidos pelo método descrito neste documento (abordagem 1) e pelo método descrito em WO 2015/164773 A1 (abordagem 2). Abordagem 1

[00200] Transcrito in vitro, o mRNA de hCFTR não modificado (cf. US 9713626 B2; sedimento de 5 mg) foi colocada em pico com oligonucleotídeos de DNA de 25 nucleotídeos (nt) e comprimento de 120 nt, bem como com moléculas de peptídeo 1 semelhante a glucagon de 256 nt de comprimento (GLP-1 moléculas de mRNA (SEQ ID NO: 1). Os oligonucleotídeos de DNA de 25 nt foram colocados em pico junto ao mRNA a uma proporção de 2,5% referente à quantidade total de mRNA em µg. Os oligonucleotídeos de DNA de 120 nt foram colocados em pico junto ao mRNA em uma proporção de 5,0% referente à quantidade total de mRNA em µg. E as moléculas de mRNA de GLP-1 de 256 nt de comprimento foram colocadas em pico junto ao mRNA a uma proporção de 16% referente à quantidade total de mRNA em µg.

[00201] As moléculas de mRNA em pico foram precipitadas usando NH4OAc 2,5 M (pH 7).

[00202] Para a remoção de proteínas, sais e transcrições abortivas, a etapa (Ia) foi realizada com 10x volumes de lavagem 2,5 M NH4OAc usando 500 kDa MWCO mPES com 50 mL/min de taxa de fluxo e ~ 200-300 mbar TMP (concentração de mRNA: 0,5 mg/mL).

[00203] Para a remoção de NH4OAc e para resolver as moléculas de mRNA, a etapa (Ib) foi realizada com 10x volumes de lavagem de água livre de nuclease usando um MWCO de 50 kDa mPES com taxa de fluxo de 50 mL/min e TMP de ~ 200-300 mbar (concentração de mRNA: 0,5 mg/mL).

[00204] Para a remoção de cátions divalentes, transcritos abortivos e/ou produtos de hidrólise, a etapa (IIa) foi realizada com volumes de

81 / 84 lavagem 10x de MOPS 40 mM e EDTA 10 mM usando um MWCO de 100 kDa mPES com taxa de fluxo de 15 mL/min e TMP de ~ 20 mbar (concentração de mRNA: 1,0 mg/mL).

[00205] Para a remoção do tampão de diafiltração MOPS-EDTA, a etapa (IIb) foi realizada usando 10x volumes de lavagem de água sem nuclease usando 100 kDa MWCO mPES com 15 mL/min de taxa de fluxo e ~ 20 mbar TMP (concentração de mRNA: 1,0 mg/mL).

[00206] As moléculas de mRNA obtidas foram investigadas usando um Analisador de Fragmentos/HPLC de fase reversa para a remoção de oligonucleotídeos em pico e um Nanodrop para a determinação da recuperação da molécula de mRNA. Abordagem 2 (conforme descrito em WO 2015/164773 A1)

[00207] Transcrito in vitro, o mRNA de hCFTR não modificado (cf. US 9713626 B2; 10,26 mg de sedimento) foi colocado em pico com oligonucleotídeos de DNA de 25 nucleotídeos (nt) e comprimento de 120 nt, bem como com moléculas de mRNA de GLP-1 de 256 nt de comprimento (SEQ ID NO: 1). Os oligonucleotídeos de DNA de 25 nt de comprimento foram colocados em pico junto ao mRNA a uma proporção de 2,5% referente à quantidade total de mRNA em µg. Os oligonucleotídeos de DNA de 120 nt foram colocados em pico junto ao mRNA em uma proporção de 5,0% referente à quantidade total de mRNA em µg. E as moléculas de mRNA de GLP-1 de 256 nt de comprimento foram colocadas em pico junto ao mRNA a uma proporção de 16% referente à quantidade total de mRNA em µg.

[00208] As moléculas de mRNA em pico foram precipitadas usando i) tiocianato de guanidínio; laurilsarcosil de sódio e citrato de sódio para concentrações finais de tiocianato de guanidínio 2,09 M; 0,26% de lauril sarcosil de sódio e 13,0 mM de citrato de sódio e ii) etanol absoluto até a concentração final de ~ 38% de EtOH e incubado por 5 minutos à temperatura ambiente.

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[00209] O carregamento foi realizado usando ~ 22 mL de mRNA precipitado com uma taxa de fluxo de ~ 6 mL/min usando 500 kDa MWCO mPES (concentração de mRNA:0,52 mg/mL).

[00210] A lavagem foi realizada repetindo o fluxo de duas etapas> 5 vezes com taxa de fluxo de ~ 6 mL/min usando um mPES de MWCO de 500 kDa (concentração de mRNA: 0,52 mg/mL): etapa a) lavagem usando 5 mL de tiocianato de guanidínio 2,09 M; 0,26% de laurilsarcosil de sódio; Citrato de sódio 13,0 mM; ~ 38% de EtOH e etapa b) lavagem usando 5 mL de etanol a 80%.

[00211] A eluição (etapa C) foi realizada tratando o mRNA sólido obtido com 5 mL de água livre de nuclease e recirculando por 5-10 minutos (permeado fechado) para garantir a dissolução. Este procedimento foi repetido até que nenhuma outra molécula de mRNA fosse recuperada usando uma taxa de fluxo de ~ 6 mL/min e um mPES de MWCO de 500 kDa (concentração de mRNA: 0,52 mg/mL).

[00212] A diálise (etapa D) foi realizada usando ~ 5 volumes de lavagem com citrato de sódio 1 mM (pH 6,4), taxa de fluxo de ~ 6 mL/min e um MWCO de 100 kDa mPES (concentração de mRNA: 0,52 mg/mL).

[00213] As moléculas de mRNA obtidas foram investigadas usando um Analisador de Fragmentos/HPLC de fase reversa para a remoção de oligonucleotídeos em pico e um Nanodrop para a determinação da recuperação da molécula de mRNA.

[00214] De notar, a seguinte alteração foi feita no caso da Abordagem 2 descrita acima em comparação com o método descrito em WO 2015/164773 A1: Após redução linear para manter a taxa de cisalhamento na coluna do filtro constante, a taxa de fluxo inicialmente planejada foi de 6 mL/min. No entanto, esta taxa de fluxo resultou em um TMP muito baixo, ou seja, a taxa de fluxo de permeado eficaz foi de 0 mL/min e a diafiltração não foi possível. Portanto, a taxa de fluxo foi aumentada gradativamente até que um TMP

83 / 84 suficiente foi observado levando a um fluxo de permeado considerável. Assim, a taxa de fluxo final usada para as etapas a) a d) variou de 20-24 mL/min (taxa de fluxo do permeado entre 1,1 e 1,25 mL/min).

[00215] Os resultados mostrados na Tabela 13 foram obtidos pela análise do Fragment Analyzer que foi realizada para amostras de mRNA de hCFTR purificadas e não purificadas. Os respectivos eletroferogramas são mostrados na Figura 11 para a Abordagem 1 e na Figura 12 para a Abordagem 2, respectivamente. Tabela 13 Etapa do processo Quantidade residual de 25 Quantidade residual de Quantidade residual nt DNA oligo [%] 120 nt DNA oligo [%] de 256 nt mRNA [%] Antes da purificação 100,0% 100,0 % 100,0 % Ia/Ib 0,0% 1,1 % 81,6 % IIa 0,0% 0,0 % 2,3 % IIb 0,0% 0,0 % 2,4 % Etapa C 0,0% 25,6 % 86,6 % Etapa D 0,0% 5,7 % 91,4 %

[00216] No caso da Abordagem 1, a remoção de oligonucleotídeos de DNA em pico (25 nt e 120 nt) foi conseguida principalmente pela etapa (Ia)/(Ib). A etapa (IIa) foi necessária para remover o mRNA de 256 nt que representa produtos hidrolíticos mais longos. A etapa (IIb) não removeu ainda mais o mRNA de 256 nt, mostrando que para a remoção de produtos hidrolíticos e sequências abortivas a etapa (IIa) usando um agente quelante potente como o EDTA é essencial.

[00217] No caso da Abordagem 2, a remoção de oligonucleotídeos de DNA incrementados (25 nt e 120 nt) foi apenas parcialmente alcançada pela etapa A a C. A etapa D não removeu completamente os oligonucleotídeos de DNA de 120 nt. O mRNA de 256 nt representando produtos hidrolíticos mais longos permaneceu quase completamente na amostra após a purificação de TFF. Assim, a realização de uma diálise usando citrato de sódio 1 mM (etapa D) não teve efeito forte na eliminação adicional dos oligonucleotídeos de DNA de 120 nt de comprimento que representam moléculas de mRNA abortivas e especialmente do mRNA de 256 nt de comprimento que

84 / 84 representa produtos hidrolíticos mais longos.

[00218] A seguir, a sequência de mRNA de 256 nt de comprimento usada aqui é descrita em mais detalhes. SEQ ID No: 1 Sequência GLP-1 otimizada por códon

GGGAGACUGCCAAGAUGAAGAUCAUCCUGUGGCUGUGCGUGUUCGG CCUGUUCCUGGCCACCCUGUUCCCCAUCAGCUGGCAGAUGCCUG UGGAAAGCGGCCUGAGCAGCGAGGAUAGCGCCAGCAGCGAGAGC UUCGCCAAGCGGAUCAAGAGACACGGCGAGGGCACCUUCACCAG CGACGUGUCCAGCUACCUGGAAGGCCAGGCCGCCAAAGAGUUUA

UCGCCUGGCUCGUGAAGGGCAGAGGCUGAGAAUU Parte do promotor T7, C: Ethris mínimo 5’UTR, seguido por um nucleotídeo U adicional, TISU 5’UTR, códon de início, sequência de mRNA de GLP-1 otimizada por códons, códon de parada, Parte do Sítio de Restrição EcoRI mRNA não poliadenilado foi usado para experimentos de picos

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para purificar moléculas de mRNA, dito método caracterizado pelo fato de que compreende: (Ia) purificar moléculas de mRNA precipitadas a partir de uma suspensão compreendendo moléculas de mRNA precipitadas usando uma primeira solução, (Ib) lavar e dissolver as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (Ia) usando uma segunda solução, (IIa) purificar as moléculas de mRNA a partir das moléculas de mRNA dissolvidas obtidas na etapa (Ib) usando uma terceira solução compreendendo um agente quelante, seguido por (IIb) lavar as moléculas de mRNA purificadas obtidas na etapa (Ia) usando uma quarta solução, em que as etapas (Ia) a (IIb) são realizadas usando filtração de fluxo tangencial.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente quelante é EDTA.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a terceira solução tem um pH entre 1 e 10.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a terceira solução compreende um tampão MOPS.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as etapas (Ia) a (IIb) são realizadas a uma temperatura entre 0 °C e 25 °C.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, antes da etapa (Ia), dita suspensão é obtida pelo uso de acetado de amônio para precipitar as moléculas de mRNA, e em que a primeira solução contém acetato de amônio.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a segunda solução é água e/ou em que a quarta solução é água ou compreende cloreto e/ou citrato de sódio.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as moléculas de mRNA são contidas em um retentado após uma filtração de fluxo tangencial.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o retentado obtido na etapa (Ia) é usado como solução de alimentação para a filtração de fluxo tangencial na etapa (Ib), o retentado obtido na etapa (Ib) é como solução de alimentação na etapa (IIa) e o retentado obtido na etapa (IIa) é como solução de alimentação na etapa (IIb).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as moléculas de mRNA contidas na suspensão são obtidas por transcrição in vitro.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente realizar a desfosforilação e/ou poliadenilação e/ou pós- capeamento das moléculas de mRNA.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende a desfosforilação das moléculas de mRNA obtidas na etapa (Ib), em seguida realizar as etapas (Ia) a (IIb), em seguida realizar a poliadenilação das moléculas de mRNA obtidas, em seguida realizar as etapas (Ia) a (IIb).

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que no caso da etapa (Ia) uma membrana de filtro com um peso molecular de corte entre 300 kDa e 0,65 µm é usada para filtração de fluxo tangencial, e/ou em que no caso das etapas (Ib) e (IIb) uma membrana de filtro com um peso molecular de corte de entre 1 kDa e 0,65 µm é usada, e/ou em que no caso da etapa (IIa) uma membrana de filtro com um peso molecular de corte de pelo menos 70 kDa é usada.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o volume de diafiltração de qualquer uma da primeira, segunda, terceira e/ou quarta solução é pelo menos 1 vez o volume da suspensão da etapa (Ia).

15. Método para produzir uma composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende purificar moléculas de mRNA de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e formular as moléculas de mRNA obtidas desse modo em uma composição farmacêutica.