BR112021011717A2

BR112021011717A2 - Substrato funcionalizado por ligante, método para a preparação do substrato funcionalizado por ligante, e, uso de um substrato funcionalizado por ligante

Info

Publication number: BR112021011717A2
Application number: BR112021011717-2A
Authority: BR
Inventors: Jan Kyhse-Andersen; Lars Winther; Jerald Rasmussen
Original assignee: Chreto Aps; 3M Innovative Properties Company
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2021-08-31
Also published as: CN113474082A; EP3897972A1; EP4134157A1; EP4134158A1; CA3123749A1; WO2020127311A1; CN113474082B; EP4134158B1; CN114452961A; CN114452961B; CN114456192A; AU2019409693A1; US20220048010A1; AU2019409693A8

Abstract

substrato funcionalizado por ligante, método para a preparação do substrato funcionalizado por ligante, e, uso de um substrato funcionalizado por ligante. substrato funcionalizado por ligante incluindo um substrato sólido, que foi modificado para prover grupos de ligantes de captura enxertados ligados covalentemente por meio de um ligador, métodos para preparar o dito substrato funcionalizado por ligante e o uso do mesmo, como para aumentar a taxa de ligação e a capacidade de ligação dinâmica (dbc).

Description

1 / 30 SUBSTRATO FUNCIONALIZADO POR LIGANTE, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DO SUBSTRATO FUNCIONALIZADO POR LIGANTE, E, USO DE UM SUBSTRATO FUNCIONALIZADO POR LIGANTE

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere à cinética receptor-ligante, taxas de ligação aumentadas e capacidade de ligação dinâmica aumentada do receptor de interesse a um substrato funcionalizado.

[002] Os substratos funcionalizados, métodos para preparação dos ditos substratos funcionalizados por ligante-ligador e a otimização do comprimento do ligador dos mesmos. Mais especificamente, os substratos funcionalizados por ligante e ligador incluem um substrato sólido, que foi modificado para prover grupos de ligante de ligação covalentemente ligados por meio de um comprimento de ligador, usado para aumentar a taxa de ligação e a capacidade de ligação dinâmica do composto receptor de interesse para o substrato.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O isolamento e a purificação de moléculas alvo, como biomacromoléculas, são importantes para fins terapêuticos e em pesquisas biomédicas. O processo geral de purificação industrial geralmente inclui uma série de operações unitárias, como extração, filtração, precipitação, assim como cromatografia de troca catiônica e aniônica e purificação por afinidade.

[004] A maior parte da captura atual ou cromatografia de purificação por afinidade é feita por meio de técnicas convencionais de coluna à base de resina. As resinas de cromatografia de contas porosas têm alta área de superfície em relação à massa contendo grupos de ligantes de afinidade interativos e, portanto, têm sido usadas em processos de purificação por afinidade de proteínas. Essas técnicas são demoradas e proveem problemas de estrangulamento severos na purificação a jusante, devido às taxas de ligação dependentes do transporte de massa por difusão. Isso também limita a

2 / 30 aplicabilidade das técnicas de cromatografia em triagem de alto desempenho e para processamento a jusante rápido.

[005] As tecnologias à base de filtros, membranas, nanofibras e nanopartículas, especialmente em formato descartável, estão se tornando cada vez mais importantes nos processos de fabricação de biofármacos e vacinas. As membranas têm sido usadas na separação passiva com base no tamanho molecular e na filtração ativa.

[006] Membranas funcionalizadas com propriedades de fluxo de processo aprimoradas (incluindo membranas contendo polímero funcional) normalmente sofrem de capacidades de ligação de biomateriais relativamente baixas devido à baixa razão entre área de superfície e massa, que em geral têm limitado seu uso em certos processos de purificação em grande escala.

[007] Porém, membranas e filtros apresentam alto potencial de produtividade (massa/volume/tempo do produto) devido às possíveis altas velocidades da corrente do processo e ao transporte eficiente de massa por convecção. Hoje, membranas e filtros são usados principalmente em processos de polimento para remover impurezas em níveis muito baixos em correntes de produto. Esses materiais, membranas, filtros e resinas de contas porosas, poderiam ser melhorados ainda mais. Além disso, os materiais à base de resina de contas podem ser mais economicamente aplicáveis, otimizando a cinética de ligação dinâmica entre o ligante e os receptores. Os processos de membrana, filtro ou contas resultantes serão ainda mais rápidos e mais eficientes e possibilitarão operações unitárias de purificação a jusante com pegada menor, maior capacidade e prover menos água residual e consumo de fluidos de tampão de processo.

[008] Substratos funcionalizados por ligante padrões, tais como membranas funcionalizadas por ligantes, são amplamente usados para a separação e purificação por afinidade de várias moléculas alvo. Por exemplo, membranas funcionalizadas por ligante podem ser usadas para purificar ou

3 / 30 separar uma molécula alvo com base em uma interação de afinidade ou com base na formação de uma ligação covalente.

[009] O documento US 5.451.453 descreve substratos com superfícies funcionais com azlactona, substratos de aduto e métodos para preparação de ambos.

[0010] O documento US 9.616.394 B2 descreve polímeros funcionalizados por ligante de guanidinil, métodos para fazer os mesmos e substratos contendo um revestimento enxertado dos polímeros funcionais por ligante.

[0011] O documento US 9.650.470 B2 descreve substratos funcionalizados por ligante, métodos de produção de substratos funcionalizados por ligante e métodos para usar substratos funcionalizados.

[0012] O documento US 9.958.364 B2 descreve substratos funcionalizados por ligante com capacidade de ligação aprimorada.

[0013] O documento US 9.758.547 B2 descreve substratos funcionalizados por ligante, métodos de produção de substratos funcionalizados por ligante e métodos para usar substratos funcionalizados.

[0014] O documento EP 2220107 B1 descreve um processo para purificação de uma biomolécula alvo, compreendendo as etapas de: (a) entrar em contato com (i) uma biomolécula alvo, (ii) um polipeptídeo de dupla afinidade (DAP), e (iii) um substrato sólido compreendendo um ligante de captura, e (b) recuperar a biomolécula alvo por elução, em que a biomolécula alvo e o polipeptídeo de dupla afinidade estão em contato em solução antes da mistura estar em contato com o substrato sólido.

[0015] O documento WO 2010/128033 A2 descreve um processo para purificação de uma molécula alvo, compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato uma molécula alvo, e uma população de polipeptídeos de ligação ao alvo (TBP), em solução por um tempo suficiente para permitir a formação do complexo; e (b) isolar o alvo do complexo de (a) por etapas de

4 / 30 purificação subsequentes, em que (i) os polipeptídeos de ligação alvo têm pelo menos duas funcionalidades de ligação; uma primeira funcionalidade de ligação para o alvo e uma segunda funcionalidade de ligação para um ligante de captura compreendido em um substrato sólido; e (ii) a primeira funcionalidade de ligação compreende pelo menos dois locais de ligação para o alvo, e o alvo compreende pelo menos dois locais de ligação para o TBP.

[0016] O polipeptídeo de afinidade dupla (DAP) descrito em EP 2220107 B1 tem a mesma funcionalidade que os polipeptídeos de ligação alvo (TBP) descritos em WO 2010/128033 A2, e os dois termos DAP e TBP são usados aqui intercambiavelmente para descrever o mesmo composto.

[0017] Embora exista uma série de substratos funcionalizados por ligante, há uma necessidade na técnica de substratos funcionalizados por ligante-ligador mais ideais que possam operar a uma alta taxa de ligação e com alta capacidade de ligação dinâmica para prover alto rendimento de produto – e, portanto, alta produtividade para reduzir o investimento em equipamentos de fabricação, custo operacional e pegada ambiental.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0018] É um objetivo das modalidades da invenção prover um substrato funcionalizado por ligante-ligador que permite uma taxa de ligação rápida ao receptor (composto de interesse) sem comprometer uma alta capacidade de ligação dinâmica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] Foi verificado pelos presentes inventores que, ao prover um substrato funcionalizado por ligante em que o ligante é ligado ao substrato por meio de um ligador de um comprimento específico e de preferência uma estrutura não dobrável, uma capacidade de ligação dinâmica consideravelmente aumentada, assim como uma taxa de ligação entre o ligante e um receptor de interesse podem ser obtidas.

[0020] Então, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se

5 / 30 a um substrato funcionalizado por ligante, compreendendo: a. um substrato tendo grupos carboxílicos (-COOH), hidróxi (- OH), tio (-SH), amino (-NH2), ligações duplas C-C (-eno) ou ligações triplas C-C (-ino) na superfície do mesmo; b. covalentemente ligado aos ditos grupos carboxílicos (- COOH), hidróxi (-OH), tio (-SH), amino (-NH2), ligações duplas C-C (-eno) ou ligações triplas C-C (-ino) do dito substrato, um ligador, tal como um ligador semiflexível, tendo um comprimento de ligante de 10-25, tal como 17- 22 ligações, em que as ligações são C-C, C-N, C-N(H), C-C(O) e/ou C-O; e c. um grupo funcional de ligante ligado à superfície do substrato por meio do dito ligador.

[0021] Em algumas modalidades específicas da invenção, o ligador compreende uma combinação de uma ou mais ligações independentemente selecionadas a partir de ligações C-C, C-N e C-C(O), tal como quando usando diferentes aminoácidos, tais como metilalanina ou β-alanina na síntese do ligador. Consequentemente, em algumas modalidades, o ligador compreende um, dois ou três dos grupos definidos por:

[0022] Em outras modalidades, o ligador compreende a combinação de ligações encontradas em, por exemplo, polietileno glicol (PEG). C-O-C-C- O-C-C-O.

[0023] Em outras modalidades, o ligador compreende a combinação de ligações encontradas em poliamida, poliuretano ou policaramida:

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[0024] Em ainda outras modalidades, o ligador compreende a combinação das ligações C-C-C-C com cadeias laterais solúveis em água, tal como a série de ligações encontradas em, por exemplo, polidimetil amido acril amida.

[0025] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a preparação do substrato funcionalizado por ligante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende (a) ativar o substrato quimicamente ou introduzindo um radical, e (b) acoplar o ligante ao substrato diretamente por meio do ligador ou por copolimerização radicalar usando dois ou mais monômeros acrílicos, dos quais pelo menos um contém um ligante.

[0026] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um uso de um substrato funcionalizado por ligante de acordo com a invenção para capturar ou imobilizar um receptor de interesse.

LEGENDAS PARA AS FIGURAS

[0027] A figura 1 ilustra a estrutura e nomenclatura dos ligantes de afinidade de biotina ligadora “mais curtos”, “médios” e “longos” com amino terminal -NH2 (série A), Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C24- NH2 e -eno terminal (série B ) Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno, Biotina- C24-eno.

[0028] A figura 2 ilustra a determinação do comprimento diferente dos ligadores.

[0029] A figura 3 ilustra a composição do ligador de Biotina (etilenodiamina EDA, alfa-metil alanina e beta-alanina) a figura 4 ilustra a síntese da Biotina-C10-eno a figura 5 ilustra a síntese da Biotina-C10-NH2

7 / 30 a figura 6 ilustra a rota alternativa de síntese da Biotina-C10- NH2 a figura 7 ilustra a síntese da Biotina-C17-eno a figura 8 ilustra a síntese da Biotina-C17-NH2 a figura 9 ilustra a síntese da Biotina-C24-eno a figura 10 ilustra a síntese da Biotina-C24-NH2 a figura 11. Medição de capacidade de ligação dinâmica usando gráfico de Hanes – forma linearizada de isoterma de Langmuir – para substrato sólido funcionalizado por Biotina-C17. A equação da linha de tendência é y=13.08x+ 3,2307. A inclinação da linha de tendência é igual à capacidade máxima de ligação e é de 13,08 mg DAP/TBP em 0,25 mL de substrato sólido. Isso corresponde a uma DBC de 52,3 mg/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0030] No presente contexto, o comprimento do ligador é definido pelo número de ligações, em que as ligações são ligações C-C, C-N, C-N(H), C-C (O) e/ou C-O. A figura 2 ilustra adicionalmente como o número de ligações de ligador é determinado. É de notar que a biotina contém, por natureza, um ligador lipofílico. O ligador usado de acordo com a presente invenção contém amida e grupos parcialmente impedidos estericamente, o que evita que o ligador seja totalmente flexível.

[0031] Deve ser entendido que um ligador, no significado da presente invenção, refere-se a uma cadeia de pelo menos 6 átomos N, C, S ou O ligando o substrato e o grupo funcional de ligante da invenção. Normalmente, o ligador é uma sequência linear de pelo menos 6 átomos de N, O ou C, em que o comprimento do ligador é definido pela quantidade total de ligações na sequência linear de átomos (ver figura 2). As ligações podem incluir C-C, C- N, C-N(H), C-C(O) e/ou C-O.

[0032] Deve ser entendido que o comprimento prático do ligador

8 / 30 depende dos comprimentos reais das ligações químicas individuais, das funcionalidades circundantes, dos ângulos, da flexibilidade rotacional e da conformação no solvente. Por exemplo, as ligações C-C, C-O e C(O)-N(H) médias são cerca de 1,5, 1,4 e 1,3 Å, respectivamente. A ligação C-O pode girar parcialmente, enquanto a ligação amida não é tão livre para girar.

[0033] De acordo com a presente invenção, o comprimento do ligador é definido como o número de ligações químicas no ligador. Isto é, a partir do grupo funcional de ligante, como uma biotina, ao substrato. É de notar que a ligação terminal ao substrato também é contada. Consequentemente, ao contar o comprimento de um ligador, como mostrado neste documento, tendo um – eno terminal, a ligação do átomo de carbono terminal ao substrato também deve ser contada. Se o ligador, como mostrado aqui, tiver grupos amino terminais (-NH2), a ligação a esses grupos amino será contada como a última ligação. Deve-se estar ciente de que a biotina possui naturalmente um ligador C5 entre a estrutura do anel, os grupos ureido e tetra-hidrotiofeno e o grupo carboxila.

[0034] O domínio de ligação da biotina nas moléculas de avidina/estreptavidina está enterrado cerca de 9 Å abaixo da superfície da proteína e adiante. A presença de grupos volumosos na vizinhança da bolsa de ligação de biotina pode criar impedimentos estéricos e reduzir a eficiência de ligação.

[0035] Deve ser entendido que a funcionalidade e o comprimento do ligador de acordo com a presente invenção estão associados com a capacidade de ligação dinâmica e as taxas de ligação das moléculas DAP/TBP à superfície.

[0036] Tal como aqui utilizado, um “polipeptídeo de dupla afinidade” ou “DAP”, usado de forma intercambiável com “polipeptídeos de ligação alvo” ou “TBP”, refere-se a uma proteína recombinante compreendendo pelo menos um domínio de ligação capaz de se ligar à biomolécula alvo com a

9 / 30 especificidade de ligação desejada, conforme descrito aqui, assim como pelo menos um domínio de ligação capaz de se ligar ao substrato funcionalizado por ligante de acordo com a invenção. Moléculas de DAP adequadas são descritas em WO2009062942 e moléculas de TBP adequadas são descritas em WO 2010/128033 A2 incluem, em uma modalidade preferida, um monômero de estreptavidina fundido em uma proteína de fusão a quatro domínios de ligação de proteína A. Modalidades específicas da invenção

[0037] A presente invenção se refere, em um aspecto amplo, a um substrato funcionalizado por ligante compreendendo: a) um substrato tendo grupos carboxílico (-COOH), hidróxi (-OH), tio (-SH), amino (-NH2), ligações duplas C-C (-eno) ou ligações triplas C-C (-ino) na superfície do mesmo; b) covalentemente ligado aos ditos grupos carboxílico (-COOH), hidróxi (-OH), tio (-SH), amino (-NH2), ligações duplas C-C (-eno) ou ligações triplas C-C (-ino) do dito substrato, um ligador tendo um comprimento de ligador de 10-25, tal como 17-22 ligações, em que as ligações são C-C, C-N, C-N(H), C-C(O) e/ou C-O; e c) um grupo funcional de ligante ligado à superfície do substrato por meio do dito ligador.

[0038] Em algumas modalidades, o ligador tem um comprimento de 10-25 ligações, tal como um comprimento de 10-24 ligações, tal como um comprimento de 10-23 ligações, tal como um comprimento de 10-22 ligações, tal como um comprimento de 10-21 ligações, tal como um comprimento de 10-20 ligações, tal como um comprimento de 10-19 ligações, tal como um comprimento de 10-18 ligações, tal como um comprimento de 10-17 ligações, tal como um comprimento de 10-16 ligações, tal como um comprimento de 10-15 ligações, tal como um comprimento de 10-14 ligações, tal como um comprimento de 10-13 ligações, tal como um comprimento de 10-12 ligações, tal como um comprimento de 10-11 ligações, tal como um comprimento de 11-25 ligações, tal como um comprimento de 12-25 ligações, tal como um

10 / 30 comprimento de 13-25 ligações, tal como um comprimento de 14-25 ligações, tal como um comprimento de 15-25 ligações, tal como um comprimento de 16-25 ligações, tal como um comprimento de 17-25 ligações, tal como um comprimento de 18-25 ligações, tal como um comprimento de 19-25 ligações, tal como um comprimento de 20-25 ligações, tal como um comprimento de 21-25 ligações, tal como um comprimento de 22-25 ligações, tal como um comprimento de 23-25 ligações, tal como um comprimento de 24-25 ligações.

[0039] Em algumas modalidades, o ligador tem um comprimento de 17-21 ligações, tal como um comprimento de 17-20 ligações, tal como um comprimento de 17-19 ligações, tal como um comprimento de 17-18 ligações, tal como um comprimento de 18-22 ligações, tal como um comprimento de 19-22 ligações, tal como um comprimento de 20-22 ligações, tal como um comprimento de 21-22 ligações, tal como um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 ligações.

[0040] Em uma modalidade do substrato funcionalizado por ligante de acordo com a invenção, o substrato é um substrato sólido, tal como na forma de chapas, membranas, contas, selas ou granulados. Com superfícies lisas e grandes superfícies internas devido à porosidade.

[0041] Em uma modalidade do substrato funcionalizado por ligante de acordo com a invenção, o substrato é um substrato sólido que pode ser enxertado por polimerização de vinil iniciada por radical.

[0042] Em uma modalidade do substrato funcionalizado por ligante de acordo com a invenção, o substrato é selecionado do grupo que consiste em agarose, diatomito, gel de sílica, celulose, éteres de celulose, carboximetilcelulose, celulose degenerada, membranas à base de agarose ou papel, nitrocelulose, ésteres mistos de nitrocelulose, sílicas e vidros de poros controlados, poliamidas, éter polissulfona, álcoois polivinílicos, policarbonato, poliuretano, polietersulfona, polissulfona, tereftalato de polietileno, fluoreto de polivinilideno, poliestireno ou polipropileno,

11 / 30 polietileno e polímeros de cobloco, misturas e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o substrato está na forma de partículas, películas, telas tecidas ou não tecidas, espojas, fibras, chapas, contas, filtro ou uma membrana. O substrato usado de acordo com a invenção é geralmente poroso para área de superfície aumentada e propriedades ideais de fluxo de líquido e pode ser tanto orgânico quanto inorgânico, incluindo polimérico.

[0043] Em uma modalidade do substrato funcionalizado por ligante de acordo com a invenção, o ligador é selecionado do grupo que consiste em 2-Vinil-4,4-dimetil-5-oxazolona (VDMA), derivados de vinil azlactona, derivados acrílicos, derivados de hexandi-isocianato (HDI), derivados de di- isocianato ou misturas dos mesmos.

[0044] Os métodos de síntese de peptídeos de alongamento em etapas por acoplamento em etapas de aminoácidos protegidos ou outros blocos de construção multifuncionais são bem descritos a partir de, por exemplo, síntese de peptídeos em fase sólida de Merrifield clássica ou em solução. Os vários grupos de proteção quimio-seletiva e ortogonal incluem Boc, Fmoc, Benzyl ou t-But, entre outros. A formação da amida é feita usando, por exemplo, carbodi-imidas, éster ativo eficiente, HATU/HOAt ou reações semelhantes. Um resumo dos reagentes e métodos SPPS pode ser visto, por exemplo, em Merrifield, R. B. Em Peptides: “Synthesis, Structures and Applications”; (Gutte, B., Ed.); Academic Press: San Diego, CA, 1995; pp 93-168 ou em Fernando Albericio (ed.): “Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide”, CRC Press 2000. e em mais geral para conjugação e reticulação em Shan S. Wong, “Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking”, CRC Press, 1991.

[0045] Além disso, o uso de 2-Vinil-4,4-dimetil azlactona (VDMA) e derivados para alongar e enxertar ligadores é bem conhecido. Por exemplo, descrito em Jamie M. Messman et al Macromolecules 2009, 42, 3933–3941, US2016231208, e outras referências citadas no presente documento.

[0046] Em uma modalidade do substrato funcionalizado por ligante

12 / 30 de acordo com a invenção, o grupo funcional de ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em biotina ou análogos de biotina. Análogos de biotina são conhecidos por um versado na técnica e referem-se a derivados de biotina capazes de se ligar a avidina, neutravidina ou estreptavidina, como qualquer composto constituído de um anel ureido fundido com um anel tetra- hidrotiofeno, como iminobiotina ou destiobiotina.

[0047] Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que o comprimento e a natureza do ligador têm uma influência distinta tanto na capacidade de ligação dinâmica (DBC) como na taxa de ligação da utilização resultante da mesma para ligação a uma molécula receptora como, por exemplo, polipeptídeo de dupla afinidade (DAP) ou proteína de ligação alvo (TBP) e removê-lo de forma eficiente da solução, que é um requisito para a purificação de uma biomolécula alvo. O ligador deve ser, de preferência, semiflexível em água a pH 4, para permitir uma configuração alongada e, assim, maior eficiência de ligação. O ligador entre o substrato e o grupo funcional de ligante, como a biotina, deve ser estendido na água, mas não deve ser completamente flexível ou livre para girar ou dobrar em todas as direções.

[0048] Além disso, os inventores verificaram que o comprimento ideal para atingir um grupo funcional de ligante sendo uma bolsa de ligação de biotina requer orientação para a eficiência de ligação dinâmica ideal. As várias otimizações de ligador descritas na técnica anterior são tipicamente com base em equilíbrio de estado estacionário, condições de ligação estática ou de experimentos com moléculas pequenas ou de cromatografia de troca catiônica e aniônica.

[0049] Em uma modalidade do uso de acordo com a invenção, o uso é para purificação de uma biomolécula alvo, compreendendo as etapas de: (a) entrar em contato com (i) uma biomolécula alvo, (ii) um polipeptídeo de dupla afinidade (DAP), e (iii) um substrato funcionalizado

13 / 30 por ligante de acordo com a invenção, e (b) recuperar a biomolécula alvo por elução, em que a biomolécula alvo e o polipeptídeo de dupla afinidade estão em contato em solução antes da mistura estar em contato com o substrato funcionalizado por ligante.

[0050] Em uma modalidade do uso de acordo com a invenção, o uso é para purificação de uma biomolécula alvo, compreendendo as etapas de: a) colocar em contato uma molécula alvo, e uma população de polipeptídeos de ligação ao alvo (TBP) ou polipeptídeo de dupla afinidade (DAP), em solução por um tempo suficiente para permitir a formação do complexo; e (b) isolar o alvo do complexo de (a) por etapas de purificação subsequentes, em que (i) os polipeptídeos de ligação alvo têm pelo menos duas funcionalidades de ligação; uma primeira funcionalidade de ligação para o alvo e uma segunda funcionalidade de ligação para um ligante de captura compreendido em um substrato sólido; e (ii) a primeira funcionalidade de ligação compreende pelo menos dois locais de ligação para o alvo, e o alvo compreende pelo menos dois locais de ligação para o TBP/ DAP.

[0051] Em algumas modalidades, o método compreende uma etapa de lavagem de impurezas, como proteínas da célula hospedeira (HCP), DNA, vírus, imobilizando seletivamente ou removendo o polipeptídeo de dupla afinidade da solução de produto alvo.

[0052] Em uma modalidade da mesma, a biomolécula alvo é um anticorpo.

[0053] Deve ser entendido que o termo anticorpo, tal como aqui usado, pode referir-se a qualquer molécula de imunoglobulina, tal como uma molécula de imunoglobulina com afinidade de ligação à Proteína A, tal como qualquer molécula de imunoglobulina compreendendo uma região Fc, ou uma região Fab, tal como de IgG da família de genes VH3 humanos.

EXEMPLOS

[0054] Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção.

14 / 30 Resumindo, vários ligadores de acordo com a invenção foram preparados e as capacidades de ligação dinâmica e as taxas de ligação foram medidas.

[0055] Em mais detalhes, a biotina foi funcionalizada com uma amina. Por síntese em etapas usando VDMA, os ligadores foram construídos com um grupo terminal de acrílico ou amina. O mesmo método foi usado para sintetizar versões mais longas do ligador. Em uma rota de síntese alternativa, os ligadores de vários comprimentos foram sintetizados usando acoplamentos de amida passo a passo, semelhantes aos métodos SPPS.

[0056] Os vários ligadores foram acoplados ou enxertados aos substratos e testados quanto à capacidade de ligação dinâmica e taxas de ligação. A capacidade dinâmica medida e as taxas dependeram dos comprimentos de ligador. Métodos analíticos

[0057] Cromatografia de coluna por vaporização a seco for realizada em um Teledyne ISCO, Combi Flash Rf+ Lumen usando colunas de alumina básica RediSepRf ou de sílica SiliCycle SiliaSep.

[0058] HPLC-MS analítico foi realizado usando um Cromatógrafo Líquido/Detector Seletivo de Massa Agilent 1100 série (MSD) (Quadropolo Único) equipado com uma interface de eletropulverização e um detector de arranjo de diodos UV. As análises foram realizadas com métodos usando uma coluna ACE 3 C8 (3,0 x 50 mm) com um gradiente de acetonitrila em TFA aquoso a 0,1% ao longo de 3 min e um fluxo de 1 mL/min ou um Xbridge C18 (3,0 x 50 mm) coluna com um gradiente de acetonitrila em bicarbonato de amônio 10 mM ao longo de 3 min e um fluxo de 1 mL/min.

[0059] Os espectros de NMR intermediários foram registrados em um Nanalysis NMReady 60e a 25°C. Os espectros de NMR finais foram registrados em um instrumento Bruker 400 MHz a 25 ºC ºC usando D6- DMSO como solvente e TMS como referência. Nomes comerciais ou nomes triviais foram usados para materiais comerciais e reagentes.

15 / 30 EXEMPLO 1 Síntese de Biotina-C10-eno

[0060] A: Síntese de biotina aminada: N-(2-aminoetil)-5-(2-oxo- 1,3,3a,4,6,6a-hexa-hidrotieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida.

[0061] A biotina foi refluxada (5 gramas, Aldrich) em metanol (100 ml) e TsOH (5 mg, Aldrich) durante a noite, então o volume da reação foi reduzido por destilação suave em vácuo em evaporador rotativo para produzir um óleo transparente do éster metílico de biotina. Em seguida, foram adicionados 5 ml de 1,2 diaminoetano (Aldrich) em etanol (25 ml) e a mistura foi agitada durante a noite e depois reduzida por destilação suave em vácuo em evaporador rotativo para produzir um óleo semicristalino amarelo claro. A biotina aminada era pura de acordo com H-NMR, LC-MS e cromatografia em camada fina (TLC) e foi usada sem purificação adicional para a adição de VDMA (2-Vinil-4,4-dimetil azlactona, CAS No. 29513-26 -6) em água na próxima etapa.

[0062] Ver a Figura 3 ilustra a posição do ligador de Biotina (etilenodiamina EDA, alfa-metil alanina e beta-alanina)

[0063] B: A uma solução de N-(2-aminoetil)-5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a- hexa-hidrotieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (1,0 g, 3,5 mmol) em água (20 mL), foi adicionado VDMA, 534 mg, 3,8 mmol). A reação foi agitada durante 5 min e depois seca por congelamento. O produto bruto (1,56 g) foi purificado por coluna de cromatografia de sílica (80 g de sílica, injeção de líquido em metanol, DCM/MeOH, 5% 2 CV, 5 a 20% em 4 CV, 20 a 60% em 2 CV, 60% para 8 CV). As frações reunidas foram concentradas. O resíduo foi dissolvido em água e liofilizado para render Biotina-C10-eno como um sólido branco (1,2 g, 2,8 mmol, rendimento: 80 %). Espectrometria de massa [M+H] + 426 Da.

[0064] Ver figura 4 ilustrando a síntese da Biotina-C10-eno.

[0065] A Biotina-C10-eno foi usado para o experimento de coenxerto

16 / 30 iniciado por radical em suportes sólidos como membranas por copolimerização com uma acrilamida e pode ser usado para o acoplamento do Biotina-C-10-eno a substratos aminados pela adição de Michael à ligação de vinil terminal. EXEMPLO 2 Síntese de Biotina-C10-NH2

[0066] A Biotina-C10-eno (1,0 g, 2,3 mmol) foi adicionada uma solução de amônia 12 N em água (12 M, 23 mL, 282 mmol). A mistura de reação foi agitada a 80°C durante 3 h em um recipiente resistente à pressão fechado. A solução foi liofilizada para obter 1,0 g de Biotina-C10-NH2. O composto foi totalmente distinguido por H-NMR, C-NMR e LCMS

[0067] Ver figura 5 ilustrando a síntese da Biotina-C10-NH2. EXEMPLO 3 Síntese de Biotina-C17-eno

[0068] 415 mg, (3,0 mmol) VMDA foi adicionado a uma solução de Biotina-C10-NH2, sintetizado como no exemplo 2, (1,3 g, 2,9 mmol) em água (20 mL). A reação foi agitada durante 5 min e depois seca por congelamento. A solução bruta (1,61 g) foi purificada por coluna de cromatografia de sílica (80 g de coluna de sílica, injeção de líquido em metanol, DCM/MeOH, 5% 2 CV, 5 a 20% em 3 CV, 20 a 60% em 3 CV, 60% 8 CV). As frações contendo o produto e o VDMA hidrolisado foram reunidas e concentradas por destilação suave em vácuo em evaporador rotativo. O material foi adicionalmente purificado por coluna de cromatografia de alumina básica (8 g de coluna básica de alumina, injeção de líquido em metanol, DCM/MeOH 0 a 5% em 8 CV). As frações reunidas foram concentradas por destilação suave em vácuo em evaporador rotativo. O resíduo foi dissolvido em água e liofilizado para render Biotina-C17-eno como um sólido branco (425 mg, 0,73 mmol, rendimento: 32 %). Espectrometria de massa [M+H] + 582 Da.

[0069] Ver figura 7 ilustrando a síntese da Biotina-C17-eno.

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[0070] Biotina-C17-eno foi usado para o experimento de coenxerto iniciado por radical em membranas por copolimerização com uma acrilamida e pode ser usado para o acoplamento do Biotina-C-17-eno a substratos aminados pela adição de Michael à ligação dupla de vinil terminal de Biotina- C17-eno.

[0071] O ligador também foi usado em um exemplo separado para uma extensão adicional com outra unidade VDMA, criando um derivado de ligador ainda mais longo. EXEMPLO 4

[0072] Este exemplo ilustra a rota de síntese para os ligadores de Biotina de diferentes comprimentos (C-10, C-17 e C-24). Dois tipos de ligantes de afinidade (série A: NH2 amino terminal e série B: vinil-eno terminal) com comprimento de ligador diferente (C10, C17 e C24) foram sintetizados usando reações de acoplamento de peptídeo por HATU/DIPEA e Fmoc ortogonal N-terminal e desproteção de Boc por piperidina e HCl 2 M. As etapas finais são o acoplamento N-terminal de Biotina como éster N- hidróxi succinimida (NHS) ativo para as moléculas de ligador de peptídeo e a desproteção N-Boc final para a síntese das moléculas de ligador de Biotina de amino N-terminal Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C-24-NH2 (série A).

[0073] As moléculas de ligante de biotina Biotina-C10-eno, Biotina- C17-eno, Biotina-C24-eno com grupos terminais -eno (série B) foram sintetizadas por acoplamento de 2-Vinil-4,4-dimetil azlactona VDMA no grupo amino terminal de Biotina-EDA-NH2, Biotina-C10-NH2 e Biotina- C17-NH2 em água a fim de obter uma molécula ligadora alongada C7.

[0074] O primeiro tipo, chamado Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 Biotina-C24-NH2, possui um grupo amino terminal (série A). O segundo tipo, chamado Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno Biotina-C24-eno, tem um grupo terminal de vinil-eno (série B).

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[0075] Para cada tipo abaixo, três compostos foram necessários com, respectivamente, n = 1, 2 e 3.

Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno, Biotina-C24-eno.

Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C24-NH2.

[0076] A abordagem usou reações de acoplamento de peptídeos. A cadeia do ligador é composta por três componentes diferentes: Etilenodiamina EDA e os dois aminoácidos: α-metil alanina e β-alanina.

A cadeia de ligador composta por etilenodiamina EDA, α-metil alanina α- MeAla e β-alanina β-Ala.

[0077] Como um exemplo, para a síntese da série B, mostra a Figura 7 adicionando 2-Vinil-4,4-dimetil azlactona VDMA a Biotina-C10-NH2 dará o ligante de afinidade C7 alongado Biotina-C17-eno Síntese da série A com NH2 terminal (Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C24-NH2) Síntese dos diferentes blocos de construção usados na síntese dos ligadores da série A e da série B. Fmoc-EDA-HCl

[0078] A uma solução de Fmoc-Cl (16,1 g, 62,4 mmol) em diclorometano (300 mL) resfriado com banho de gelo, foi adicionada gota a

19 / 30 gota uma solução de terc-butil N-(2-aminoetil) carbamato (Boc-EDA) (10,0 g , 62,4 mmol) em 20 mL de DCM. A reação foi agitada a temperatura ambiente. Após 30 min, formou-se um precipitado branco. 10 mL de MeOH foram adicionados e a solução tornou-se homogênea. A mistura foi lavada com água (2 x 100 mL). A fase orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada. O sólido foi lavado com éter dietílico e seco sob vácuo para produzir Fmoc-EDA-Boc (16,9 g, 44,2 mmol, rendimento: 70,8 %). A uma solução de Fmoc-EDA-Boc (4,00 g, 10,5 mmol) em 1,4-dioxano (50,0 mL), foi adicionada uma solução 4M de HCl em 1,4-dioxano (4,00 M, 55 mL, 220 mmol). A mistura da reação foi agitada durante 1 hora. O sólido foi filtrado e lavado com éter dietílico para produzir Fmoc-EDA-HCl (3,5 g, 11,0 mmol, rendimento: quantitativo) como um sólido branco. Biotina-NHS

[0079] A uma solução de N,N′-disuccinimidil carbonato (12,7 g, 49,5 mmol) e biotina (11,0 g, 45,0 mmol) em N, N-dimetilformamida (50,0 mL), foi adicionado trietilamina TEA (31,4 mL, 0,225 mol). A mistura da reação foi agitada durante 16 horas. O sólido foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco sob vácuo para produzir Biotina-NHS (11,2 g, 0,0328 mol, rendimento: 72,9%) como um sólido branco e usado sem purificação adicional. Fmoc-EDA-MeAla-NH2-HCl e Fmoc-EDA-NH2-HCl

[0080] A Fmoc-EDA-MeAla-NHBoc ou Fmoc-EDA-NHBoc em 1,4- dioxano, foi adicionada uma solução 4 M de HCl em 1,4-dioxano (20 eq). A mistura de reação foi agitada por 1 hora e então concentrada. O material bruto foi usado sem purificação adicional. Procedimento para acoplamento Boc-α-metilalanina

[0081] A uma solução de Boc-α-metilalanina (1,2 eq) e HATU (1,1

20 / 30 eq) em acetonitrila (concentração cerca de 0,15 M), foi adicionado DIPEA (5 eq). A mistura foi agitada durante 10 min. A essa mistura, foram adicionados os compostos de amina N-terminais (1 eq) e a solução resultante foi agitada durante 30 min. Quando o produto precipitou, o sólido foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco sob vácuo. Caso contrário, a solução foi diluída com acetato de etilo, lavada duas vezes com uma solução 0,5 M de HCl em água, lavada duas vezes com água e lavada uma vez com salmoura. A fase orgânica foi então seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada. Procedimento para acoplamento Boc-β-alanina

[0082] A uma solução de Boc-β-alanina (1,2 eq) e HATU (1,1 eq) em acetonitrila (concentração cerca de 0,15 M), foi adicionado DIPEA (5 eq). A mistura foi agitada durante 10 min. A essa mistura, foi adicionado o composto de amina N-terminal (1 eq) e a solução resultante foi agitada durante 30 min. Quando o produto precipitou, o sólido foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco sob vácuo. Caso contrário, a solução foi diluída com acetato de etilo, lavada duas vezes com uma solução 0,5 M de HCl em água, lavada duas vezes com água e lavada uma vez com salmoura. A fase orgânica foi então seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada. Em ambos os casos, o material bruto foi usado sem purificação adicional. NH2-EDA-NHBoc

[0083] A Fmoc-etilenodiamina-NHBoc, foi adicionada uma solução a 20% de piperidina em acetonitrilo. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos e então concentrada. A solução foi concentrada e o produto bruto foi seco 24 horas sob vácuo. O sólido foi triturado três vezes com éter dietílico. O sólido foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco sob vácuo. O material bruto foi usado sem purificação adicional. Biotina-EDA-NHBoc

[0084] A uma solução de NH2-etilenodiamina-NHBoc em acetonitrila e água (concentração cerca de 0,1 M), foi adicionada Biotina-NHS (2 eq). A

21 / 30 mistura de reação foi agitada 30 minutos e verificada por LCMS. Se necessário, 0,5 eq adicional de Biotina-NHS foi adicionado e a mistura foi agitada durante 1 hora. A mistura foi concentrada em evaporador rotativo e purificada por cromatografia em sílica (injeção líquida em metanol; DCM 2 CV, DCM/MeOH 0 a 60% em 14 CV). Biotina-EDA-NH2-HCl

[0085] A Biotina-Etilenodiamina-NHBoc foi adicionada uma solução 2M de HCl em água. A mistura de reação foi agitada durante a noite e então concentrada. O material bruto foi redissolvido em metanol e concentrado. O sólido foi seco sob vácuo. Síntese da série A com NH2 terminal (Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C24-NH2) Biotina-C10-NH2

[0086] Biotina-C10-NH2 (Figura 5) foi sintetizada por uma série de reações de acoplamento de peptídeo a partir de acoplamento HATU de Boc- MeAla e N-Fmoc protegido etileno diamina Fmoc-EDA em acetonitrila para formar FmocNH-EDA-MeAla-NHBoc. O grupo de proteção N-Boc terminal foi removido por HCl 2 M para formar o grupo amino N-terminal Fmoc- EDA-MeAla-NH2. O Fmoc-EDA-MeAla-NH2 foi acoplado ao BocNH-β- alanina para formar o Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-NHBoc. O grupo Fmoc terminal foi removido por piperidina a 20% em acetonitrilo para formar o grupo amino terminal. Em seguida, Biotina-NHS foi acoplado ao NH2-EDA- MeAla-β-Ala-NHBoc em acetonitrila-água à temperatura ambiente e, finalmente, o grupo NHBoc foi removido com HCl 2 M à temperatura ambiente, a fim de sintetizar a Biotina-C10-NH2 com grupo amino terminal. A rota de síntese é descrita na Figura 7. O composto Biotina-C10-NH2 foi totalmente distinguido por H-NMR, C-NMR e LC-MS. O peso da fórmula é 479,04, a massa medida é 478,21. Biotina-C17-NH2

22 / 30

[0087] A síntese de Biotina-C17-NH2 (Figura 8) seguiu as mesmas reações de acoplamento de peptídeo por HATU/DIPEA, desproteção de Boc com HCl 2 M, desproteção de Fmoc com piperidina e biotinilação com Biotina-NHS conforme descrito para Biotina-C10-NH2

[0088] O grupo de proteção Boc de Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-NHBoc (ligador C-10) foi removido por tratamento com HCl 2 M para formar Fmoc- EDA-MeAla-β-Ala-NH2. O grupo amino terminal foi então acoplado a Boc- MeAla por HATU/DIPEA em acetonitrila. O grupo protetor Boc terminal foi removido por HCl 2 M e depois acoplado a β-Ala-NHBoc por acoplamento HATU/DIPEA. Em seguida, o grupo Fmoc foi removido com 20% de piperidina em acetonitrila, a biotina foi acoplada ao grupo NH2 terminal como éster ativo NHS e finalmente o grupo Boc terminal removido com HCl 2 M para formar a molécula ligadora de afinidade Biotina-C17-NH2. Finalmente, após a desproteção de Biotina-C17-NHBoc, obteve-se 1,5 g de produto com um rendimento geral de 31% (10 etapas). O composto foi totalmente distinguido por H-NMR, C-NMR e LC-MS. O peso da fórmula é 635,22, a massa medida é 634,31. Biotina-C24-NH2

[0089] A síntese de Biotina-C24-NH2 (Figura 10) seguiu as mesmas reações de acoplamento de peptídeo por HATU/DIPEA, desproteção de Boc com HCl 2 M, desproteção de Fmoc com piperidina e biotinilação com Biotina-NHS conforme descrito para Biotina-C10-NH2 e Biotina-C17-NH2.

[0090] O grupo de proteção Boc de Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala- MeAla- β-Ala-NHBoc (ligador C-17) foi primeiramente removido por tratamento com HCl 2 M para formar Fmoc-EDA-MeAla-β-Ala-MeAla- β- Ala-NH2. O grupo amino terminal foi então novamente acoplado a Boc- MeAla por HATU/DIPEA em acetonitrila. O grupo protetor Boc terminal foi novamente removido por HCl 2 M e depois acoplado a β-Ala-NHBoc por acoplamento HATU/DIPEA. Em seguida, o grupo Fmoc foi removido com

23 / 30 20% de piperidina em acetonitrila, a biotina foi acoplada ao grupo NH2 terminal como éster ativo NHS e finalmente o grupo Boc terminal removido com HCl 2 M para formar a molécula ligadora de afinidade Biotina-C24- NH2. Com a experiência da síntese de Biotina-C10-NH2 e Biotina-C17-NH2, essa síntese de Biotina-C24-NH2 resultou em 2 g de material foram obtidos com um rendimento global de 30% (14 etapas). O composto foi totalmente distinguido por H-NMR, C-NMR e LC-MS. O peso da fórmula é 791,40, a massa medida é 790,39. Síntese da série B com vinil -eno terminal (Biotina-C10-eno, Biotina-C17- eno e Biotina-C24-eno)

[0091] A uma solução de Biotina-EDA-NH2, Biotina-C10-NH2 ou Biotina-C17-NH2 em água, foi adicionada uma solução 1 M de bicarbonato de sódio em água até pH 8. A essa solução foi adicionado VDMA. A mistura foi concentrada e submetida a cromatografia de sílica (injeção líquida em metanol, DCM 2 CV, DCM/MeOH 0 a 20% em 5 CV, 20 a 40% em 3 CV, 40 a 60% em 1 CV e 60% para 3 CV). As frações reunidas foram concentradas. Os produtos foram dissolvidos em metanol, concentrados e secos sob vácuo para produzir Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno e Biotina-C24-eno, respectivamente. Biotina-C10-eno

[0092] Biotina-C10-eno (Figura 4) com grupo vinil terminal foi sintetizada por adição de 2-Vinil-4,4-dimetil azlactona VDMA ao grupo amino terminal de Biotina-EDA-NH2 em água. A biotina-C10-eno foi finalmente purificada por cromatografia de sílica e totalmente distinguida por H-NMR, C-NMR e LC-MS. O peso da fórmula é 425,55, a massa medida é 425,21. Biotina-C17-eno

[0093] Biotina-C17-eno (Figura 7) com grupo vinil terminal foi consequentemente sintetizada por adição de 2-Vinil-4,4-dimetil azlactona

24 / 30 VDMA ao grupo amino terminal de Biotina-C10-NH2 em água. A biotina- C17-eno foi finalmente purificada por cromatografia de sílica e totalmente distinguida por H-NMR, C-NMR e LC-MS. O peso da fórmula é 581,73, a massa medida é 581,31 Biotina-C24-eno

[0094] Biotina-C24-eno (Figura 9) com grupo vinil terminal pode ser sintetizada seguindo a mesma estratégia: A adição de 2-Vinil-4,4-dimetil azlactona VDMA ao grupo amino terminal de Biotina-C17-NH2 em água resultou na formação do ligante de afinidade C7 alongado Biotina-C24-eno quase quantitativamente. A biotina-C24-eno foi finalmente purificada por cromatografia de sílica e totalmente distinguida por H-NMR, C-NMR e LC- MS. O peso da fórmula é 737,91, a massa medida é 737,39 EXEMPLO 5 Aminação do substrato de contas

[0095] WorkBeads 40/10 000 ACT (Bio-Works AB) contendo grupos de bromo-hidrina reativos foram tratados com 1,2-diamino etano (5% em água) à temperatura ambiente durante a noite. As contas foram lavadas com água e um tampão de trietilamina (50 mM). As contas funcionalizadas com amina primária resultantes foram utilizadas para o acoplamento do meio e dos ligadores de comprimento longo com biotina. EXEMPLO 6 Acoplamento de Biotina-C10-eno ou Biotina-C17-eno ao substrato aminado:

[0096] O substrato aminado (exemplo 5) foi misturado com a Biotina- C10-eno ou a Biotina-C17-eno sintetizada como descrito nos exemplos 1 e 3 respectivamente (50 nmol/ml de suporte aminado) em 50 mM de trietilamina (2ml/ml de suporte aminado ) por 6 horas. A reação foi interrompida lavando- se abundantemente com água para evitar qualquer vazamento.

[0097] Os dois tipos de contas resultantes com Biotina-C10 ou

25 / 30 Biotina-C17, podem ser usados para purificação de, por exemplo, um anticorpo pela captura de moléculas de Polipeptídeo de Dupla Afinidade (DAP) ou Polipeptídeo de Ligação Alvo (TBP) de acordo com métodos de purificação de anticorpos descritos anteriormente, tais como os processos de purificação descritos em EP 2220107 B1 ou em WO 2010/128033 A2. EXEMPLO 7 Acoplamento de Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C24- NHNH2 em resina de agarose com ativação de bromo-hidrina

[0098] BioWorks Work Beads 40/10.000 ACT (4 ml, 150 µmol/ml bromo-hidrina ativada, 50% de pasta fluida em 20% de etanol/água) foram transferidas para um filtro de vidro, drenados para 20% de etanol/água e lavadas várias vezes com água e secadas por sucção durante 5 min.

[0099] Biotina-C10 (8,8 mg, 20 µmol), Biotina-C17 (12,0 mg, 20 µmol) e Biotina-C24 (15,1 mg, 20 µmol), foram cada uma dissolvida em 4 ml de tampão Na2CO3/NaHCO3 0,1 M, pH = 9,3. A solução de Biotina-C10- NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina-C24-NH2 (4 ml) é então adicionada à resina Work Beads (4 ml) em um frasco de plástico de 10 ml, respectivamente.

[00100] A solução é então colocada em um misturador rotativo e agitada por 16 h em temperatura ambiente.

[00101] As resinas são então transferidas para um filtro de vidro, drenadas para as soluções de Biotina-C10-NH2, Biotina-C17-NH2 e Biotina- C24-NH2. As WorkBeads biotiniladas drenadas são então lavadas com água (10x) e incubadas com 5 ml de solução de etanol amina 1 M para inativar os grupos ativadores de bromo-hidrina restantes na agarose. As resinas são então agitadas no misturador rotativo por 8 h.

[00102] Finalmente, as resinas são transferidas para um filtro de vidro, drenadas para reagente de capeamento de etanol amina 1M, lavadas com água (10 x), com HCL 0,1 M (5 x), e com água (10x), etanol 20% (5x), secadas por

26 / 30 sucção.

[00103] As preparações de resina biotinilada foram armazenadas em etanol a 20% como pasta fluida a 50%.

[00104] Estas resinas de agarose biotiniladas com ligador Biotina-C10- NH-, Biotina-C17-NH- e Biotina-C24-NH são testadas quanto à capacidade de ligação dinâmica e estudos de taxa de ligação com DAP. EXEMPLO 8 Medindo a Capacidade de ligação Dinâmica (DBC)

[00105] Para determinar a DBC de DAP ou TBP para ligador de biotina acoplado à superfície de suporte sólido, a isoterma de adsorção de Langmuir é aplicada. Isso se baseia nas premissas listadas abaixo: • a superfície é homogênea.

[00106] • a adsorção não pode ocorrer além da cobertura da monocamada.

[00107] • todos os locais de adsorção são equivalentes e as ligações são independentes umas das outras.

[00108] • não há interações entre as moléculas adsorvidas e as moléculas na solução e não há interações entre o solvente e a superfície.

[00109] A isoterma de adsorção de Langmuir é baseada no equilíbrio entre o DAP e a biotina ligada ao suporte sólido. Portanto, é obrigatório que o DAP exceda a capacidade máxima de ligação para que cada análise seja capaz de atingir o equilíbrio

[00110] Usando a isoterma de Langmuir, a ligação do DAP à superfície da biotina pode ser descrita como:

[00111] Que pode ser reorganizado em: C* = DBC C*/q* - 1/k

[00112] Onde q* é a massa de DAP ligado expressa como mg de DAP

27 / 30 ligado por ml de contas de resina de biotina ou membrana, c* é a concentração de equilíbrio de DAP em solução, DBC é a capacidade de ligação máxima e k é a constante de equilíbrio de adsorção. (ref: Beier et al, Adsorption of Amylase Enzyme on Ultrafiltration Membranes, Langmuir (2007), vol 23, pp 9341-51)

[00113] A DBC pode ser determinada plotando C * em relação a C*/q*. A inclinação é igual à DBC. Substratos sólidos funcionalizados preparados como descrito nos Exemplos acima foram analisados quanto à capacidade de ligação dinâmica por incubação de uma quantidade conhecida de substrato sólido com quatro quantidades diferentes de DAP em solução.

[00114] O substrato sólido (0,25 mL) foi colocado em uma coluna Omnifit (6,6 mm/100 mm) (Diba Industries Inc., Danbury, CT, EUA) e equilibrado com Citrato 0,3 M pH 3,5, tween 20 0,1%. Um Äkta Pure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) foi usado para carregar 10 mL de solução de DAP nas concentrações de 1,8, 1,4, 1,1 e 0,9 mg/mL, respectivamente, para a coluna Omnifit contendo o substrato sólido funcionalizado. A velocidade do fluxo da bomba foi fixada em 1,0 mL por minuto, o que corresponde a um tempo de residência na coluna de 15 segundos. Depois de lavar o DAP não ligado e coletar a fração de fluxo, ele foi analisado quanto ao teor de DAP usando um espectrômetro Nanodrop (ThermoFisher, Waltham, MA, EUA). Coeficiente de extinção para DAP: εDAP = 1,12 cm2/mg e MW=42.758 kDa

[00115] A concentração de equilíbrio no líquido a granel (C*, mg/mL) foi calculada pela determinação do teor de DAP total na solução após a incubação com o substrato sólido. A concentração de equilíbrio (q *, mg/mL) no substrato sólido foi calculada subtraindo o teor de DAP em

[00116] solução de fluxo a partir do teor inicial de DAP na solução. Os dados coletados dos experimentos foram usados plotando C* (y) como uma função linear de C*/q* (x) como mostrado na Figura 11. A inclinação da linha de tendência linear dá a capacidade máxima de ligação para a quantidade de

28 / 30 substrato sólido usado no experimento de ligação. Nesta análise, foi testado 0,25 mL de substrato sólido, sendo que a capacidade de ligação dinâmica (DBC) em mg/mL é obtida multiplicando a inclinação por quatro.

[00117] Na Tabela 1 estão os resultados de DBC resumidos da análise dos substratos sólidos funcionalizados com Biotina-C10, Biotina-C17 e Biotina-C24. A partir da tabela, é claro que o substrato sólido funcionalizado com Biotina-C17 leva à DBC mais alta. Densidade de Número de átomos Composto DBC (mg/ml) acoplamento espaçadores Biotina-C10 5 µmol/ml C10 35,9 Biotina-C17 5 µmol/ml C17 52,3 Biotina-C24 5 µmol/ml C24 33,1 Nenhum 0 µmol/ml Nulo 9,7

[00118] Tabela 1. Resumo da capacidade de ligação dinâmica determinada (“DBC”, mg/mL) do substrato sólido funcionalizado com Biotina-C10, Biotina-C17 e Biotina-C24 a uma velocidade de fluxo de 1,0 mL/minuto, correspondendo a um tempo de residência de 15 segundos. Um substrato sólido não funcionalizado foi incluído como um controle. EXEMPLO 9 Taxa de ligação (tempo de residência)

[00119] Substratos sólidos funcionalizados preparados conforme descrito nos Exemplos acima foram analisados adicionalmente para entender se o tempo de residência afetará a DBC. Para cada velocidade da bomba, a DBC foi determinada como acima, no exemplo 8. A velocidade do fluxo da bomba foi variada para atingir diferentes tempos de residência do DAP em contato com o substrato sólido, ou seja, 0,5, 1,0 e 2,0 mL por minuto, o que corresponde a tempos de residência de 30, 15 e 7,5 segundos, respectivamente. A capacidade de ligação dinâmica foi determinada conforme descrito no EXEMPLO 9 acima para os substratos sólidos funcionalizados com Biotina-C10, Biotina-C17 e Biotina-C24 e os resultados estão resumidos na Tabela 2.

[00120] O substrato sólido funcionalizado com Biotina-C17 provê

29 / 30 DBC máxima em comparação com os outros Ligadores de Biotina. Também é observado que a DBC para Biotina-C17 é quase constante (menos de 4% de redução), o que significa que a taxa de ligação é muito mais rápida para Biotina-C17 em comparação com o outro ligador testado. Biotina-C10 e Biotina-C24 têm redução de DBC de 20% e 10%, respectivamente, no intervalo medido de tempos de residência. Densidade de Número de átomos Tempo de DBC Composto acoplamento espaçadores Residência (s) (mg/ml) Biotina-C10 5 µmol/ml C10 30 45,2 Biotina-C10 5 µmol/ml C10 15 43,3 Biotina-C10 5 µmol/ml C10 7,5 36,8 Biotina-C17 5 µmol/ml C17 30 50,0 Biotina-C17 5 µmol/ml C17 15 49,1 Biotina-C17 5 µmol/ml C17 7,5 47,9 Biotina-C24 5 µmol/ml C24 30 38,6 Biotina-C24 5 µmol/ml C24 15 34,6 Biotina-C24 5 µmol/ml C24 7,5 34,6

[00121] Tabela 2. Resumo da capacidade de ligação dinâmica medida (“DBC”, mg/mL) do substrato sólido funcionalizado Biotina-C10, Biotina- C17 e Biotina-C24 a velocidades de fluxo de 0,5, 1,0 e 2,0 mL/minuto, correspondendo a um tempo de residência de 30, 15 e 7,5 segundos, respectivamente. O substrato sólido funcionalizado com Biotina-C17 leva a uma DBC mais alta em todos os tempos de residência medidos e é afetado apenas em uma extensão menor pela diminuição no tempo de residência. EXEMPLO 10 Enxertar Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno ou Biotina-C24-eno em membranas

[00122] Coenxerto iniciado por radical de ligadores de três comprimentos diferentes: Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno ou Biotina-C24- eno, respectivamente, com N, N-dimetilacrilamida para chapas de membrana de éter de polissulfona (3M).

[00123] A membrana foi cortada em pedaços redondos (10 cm de diâmetro) e lavada com água, seguida de dioxano. A membrana foi embebida em 10% de N, N-dimetil acrilamida (Fluka) em dioxano seco e isento de oxigênio e 0,1% de Biotina-C10-eno, Biotina-C17-eno e Biotina-C24-eno,

30 / 30 respectivamente, e com benzoequinona (Fluka, 25 ppm) como iniciador radical. As membranas foram irradiadas com lâmpada UV por 10 minutos sob atmosfera neutra (nitrogênio seco). As membranas foram lavadas com dioxano.

[00124] O homopolímero lavado foi coletado e usado para aproximar o comprimento do polímero enxertado por SEC. A distribuição de homopolímero foi ampla em aproximadamente 500 a 25000 Da de peso molecular, em comparação com um padrão MW.

[00125] As três membranas diferentes resultantes com poliacrilamida desenhada e Biotina-C10, Biotina-C17 e Biotina-C24 foram lavadas extensivamente com água quente (60°C) para remover qualquer homopolímero e evitar vazamento posterior.

[00126] As membranas resultantes estavam fisicamente intactas, embora ligeiramente amareladas, e tinham copolímero de enxerto consistindo em uma estrutura de poliacrilamida e os diferentes comprimentos de ramificações semirrígidas. As ramificações (Pente) são diferentes da cadeia principal.

[00127] As diferentes membranas com enxertos de poliacrilamida com ligadores de diferentes comprimentos de pontos de ramificação (Pente) foram testadas em uma configuração semelhante ao exemplo 8. As membranas foram cortadas em pequenos pedaços (aproximadamente 2x2 mm) e embaladas na coluna Omnifit.

[00128] O experimento foi repetido várias vezes, devido a problemas com o dobramento das membranas na coluna. A capacidade de ligação foi melhor para C17 (membrana de 10-25 mg/mg) cerca de + 15-25% melhor do que as preparações C10 e C24, que tinham quase a mesma capacidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Substrato funcionalizado por ligante, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um substrato tendo grupos carboxílicos (-COOH), hidróxi (- OH), tio (-SH), amino (-NH2), ligações duplas C-C (-eno) ou ligações triplas C-C (-ino) na superfície do mesmo; b. covalentemente ligado aos ditos grupos carboxílicos (- COOH), hidróxi (-OH), tio (-SH), amino (-NH2), ligações duplas C-C (-eno) ou ligações triplas C-C (-ino) do dito substrato, um ligador tendo um comprimento de ligante de 10-25, tal como 17-22 ligações, em que as ligações são C-C, C-N, C-N(H), C-C(O) e/ou C-O; e c. um grupo funcional de ligante ligado à superfície do substrato por meio do dito ligador.

2. Substrato funcionalizado por ligante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato sólido.

3. Substrato funcionalizado por ligante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato sólido que pode ser enxertado por polimerização de vinil iniciada por radical.

4. Substrato funcionalizado por ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o substrato é selecionado do grupo que consiste em agarose, tal como na forma de uma resina ou grânulos, diatomito, gel de sílica, celulose, éteres de celulose, carboximetilcelulose, celulose degenerada, membranas à base de agarose ou papel, nitrocelulose, ésteres mistos de nitrocelulose, sílicas e vidros de poros controlados, poliamidas, éter polissulfona, álcoois polivinílicos, policarbonato, poliuretano, polietersulfona, polissulfona, tereftalato de polietileno, fluoreto de polivinilideno, poliestireno ou polipropileno, polietileno e polímeros de cobloco, misturas e combinações dos mesmos.

5. Substrato funcionalizado por ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ligador é selecionado do grupo que consiste em 2-Vinil-4,4-dimetil-5- oxazolona (VDMA), derivados de vinil azlactona, derivados acrílicos, derivados de hexandi-isocianato (HDI), derivados de di-isocianato ou misturas dos mesmos.

6. Substrato funcionalizado por ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional de ligante é selecionado do grupo que consiste em biotina ou análogos de biotina.

7. Substrato funcionalizado por ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ligador tem um comprimento de 10-25 ligações, tal como um comprimento de 10-24 ligações, tal como um comprimento de 10-23 ligações, tal como um comprimento de 10-22 ligações, tal como um comprimento de 10-21 ligações, tal como um comprimento de 10-20 ligações, tal como um comprimento de 10-19 ligações, tal como um comprimento de 10-18 ligações, tal como um comprimento de 10-17 ligações, tal como um comprimento de 10-16 ligações, tal como um comprimento de 10-15 ligações, tal como um comprimento de 10-14 ligações, tal como um comprimento de 10-13 ligações, tal como um comprimento de 10-12 ligações, tal como um comprimento de 10-11 ligações, tal como um comprimento de 11-25 ligações, tal como um comprimento de 12-25 ligações, tal como um comprimento de 13-25 ligações, tal como um comprimento de 14-25 ligações, tal como um comprimento de 15-25 ligações, tal como um comprimento de 16-25 ligações, tal como um comprimento de 17-25 ligações, tal como um comprimento de 18-25 ligações, tal como um comprimento de 19-25 ligações, tal como um comprimento de 20-25 ligações, tal como um comprimento de 21-25 ligações, tal como um comprimento de

22-25 ligações, tal como um comprimento de 23-25 ligações, tal como um comprimento de 24-25 ligações.

8. Método para a preparação do substrato funcionalizado por ligante como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende (a) ativar o substrato quimicamente ou introduzindo um radical, e (b) acoplar o ligante ao substrato diretamente por meio do ligador ou por copolimerização radicalar usando dois ou mais monômeros acrílicos, dos quais pelo menos um contém um ligante.

9. Uso de um substrato funcionalizado por ligante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para capturar ou imobilizar um composto de interesse.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato ser para purificação de uma biomolécula alvo, compreendendo as etapas de: (a) entrar em contato com (i) uma biomolécula alvo, (ii) um polipeptídeo de dupla afinidade, e (iii) um substrato funcionalizado por ligante como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, e (b) recuperar a biomolécula alvo por elução, em que a biomolécula alvo e o polipeptídeo de dupla afinidade estão em contato em solução antes da mistura estar em contato com o substrato funcionalizado por ligante e, opcionalmente, c) lavar as impurezas e/ou remover o polipeptídeo de dupla afinidade.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato ser para purificação de uma biomolécula alvo, compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato uma molécula alvo, e uma população de polipeptídeos de ligação ao alvo (TBP), em solução por um tempo suficiente para permitir a formação do complexo; e (b) isolar o alvo do complexo de (a) por etapas de purificação subsequentes, em que (i) os polipeptídeos de ligação alvo têm pelo menos duas funcionalidades de ligação; uma primeira funcionalidade de ligação para o alvo e uma segunda funcionalidade de ligação para um ligante de captura compreendido em um substrato sólido; e (ii) a primeira funcionalidade de ligação compreende pelo menos dois locais de ligação para o alvo, e o alvo compreende pelo menos dois locais de ligação para o TBP.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a biomolécula alvo é um anticorpo.