BR112021011061A2 - Construtos de rnai para inibir a expressão de pnpla3 - Google Patents

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Justin K. Murray
Michael OLLMANN
Oliver HOMANN
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Abstract

construtos de rnai para inibir a expressão de pnpla3. a presente invenção se relaciona com construtos de rnai para reduzir a expressão do gene pnpla3. métodos de uso de tais construtos de rnai para tratar ou prevenir doença do fígado, doença hepática gordurosa não alcoólica (nafld) também são descritos.

Description

CONSTRUTOS DE RNAI PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE PNPLA3
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção se relaciona com composições e métodos para modular a expressão no fígado do gene contendo o domínio de fosfolipase do tipo patatina 3 (PNPLA3). Em particular, a presente invenção se relaciona com agentes terapêuticos à base de ácidos nucleicos para reduzir a expressão de PNPLA3 via interferência de RNA e métodos de uso de tais agentes terapêuticos à base de ácidos nucleicos para tratar ou prevenir uma doença do fígado, tal como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Compreendendo um espectro de patologias hepáticas, a doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) é a doença do fígado crônica mais comum no mundo, cuja prevalência duplicou nos últimos 20 anos, e agora se estima que afete aproximadamente 20% da população mundial (Sattar et al. (2014) BMJ 349:g4596; Loomba e Sanyal (2013) Nature Reviews Gastroenterology & hepatology 10(11):686-690; Kim e Kim (2017) Clin Gastroenterol Hepatol 15(4):474-485; Petta et al. (2016) Dig Liver Dis 48(3):333-342). NAFLD começa com o acúmulo de triglicerídeos no fígado e é definida pela presença de gotículas de lipídeos citoplasmáticos em mais do que 5% dos hepatócitos em um indivíduo 1) sem um historial de consumo de álcool significativo e 2) no qual foi excluído o diagnóstico de outros tipos de doença do fígado (Zhu et al (2016) World J Gastroenterol 22(36):8226-33; Rinella (2015) JAMA 313(22):2263-73; Yki-Jarvinen (2016)
Diabetologia 59(6):1104-11). Em alguns indivíduos, o acúmulo de gordura ectópica no fígado, denominado esteatose, desencadeia inflamação e lesão hepatocelular conducentes a um estágio mais avançado da doença denominado esteato-hepatite não alcoólica (NASH) (Rinella, supra). À data de 2015, se prevê que 75-100 milhões de americanos tenham NAFLD; NASH sendo responsável por aproximadamente 10-30% dos diagnósticos de NAFLD (Rinella, supra; Younossi et al (2016) Hepatology 64(5):1577-1586).
[0003] A proteína contendo o domínio de fosfolipase do tipo patatina 3 (PNPLA3), anteriormente conhecida como adiponutrina (ADPN) e fosfolipase A2-épsilon independente de cálcio (iPLA(2)ε), é uma proteína transmembrana de tipo II (Wilson et al (2006) J Lipid Res 47(9):1940-9; Jenkins et al (2004) J Biol Chem 279(47):48968-75). Inicialmente identificada em células adiposas como uma proteína enriquecida de modo adiposo, associada a membranas induzida durante a adipogênese em camundongos, está agora bem caracterizado que é expressa em outros tecidos, incluindo o fígado (Wilson et al, supra; Baulande et al (2001) J Biol Chem 276(36):33336-44; Moldes et al. (2006) Eur J Endocrinol 155(3):461-8; Faraj et al. (2006) J Endocrinol 191(2):427-35; Liu et al (2004) J Clin Endocrinol Metab 89(6):2684-9; Lake et al (2005) J Lipid Res 46(11) :2477-87). Em sistemas bioquímicos sem células, a proteína PNPLA3 recombinante pode exibir atividade de triacilglicerol lipase ou transacilação (Jenkins et al., supra; Kumari et al (2012) Cell Metab 15(5):691-702; He et al (2010) J Biol Chem 285(9):6706-15). Em hepatócitos,
PNPLA3 é expressa no retículo endoplasmático e membranas lipídicas e exibe predominantemente atividade de triacilglicerol hidrolase (He et al., supra; Huang et al (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(17):7892-7; Ruhanen et al (2014) J Lipid Res 55(4):739-46; Pingitore et al. (2014) Biochim Biophys Acta 1841(4):574-80). Apesar de não ter um sinal secretor, dados indicam que a PNPLA3 é secretada e pode estar presente em plasma humano como multímeros dependentes de ligações dissulfeto (Winberg et al. (2014) Biochem Biophys Res Commun 446(4):1114-9). Em conformidade, novos agentes terapêuticos visando a função de PNPLA3 representam uma nova abordagem para reduzir níveis de PNPLA3 e tratar doenças hepatológicas, tais como doença de fígado gorduroso não alcoólico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] A presente invenção é baseada, em parte, no planejamento e geração de construtos de RNAi que visam o gene PNPLA3 e reduzem a expressão de PNPLA3 em células do fígado. A inibição da expressão de PNPLA3 específica para sequências é útil para tratar ou prevenir afecções associadas a expressão de PNPLA3, tais como doenças relacionadas com o fígado, tais como, por exemplo, fígado gorduroso simples (esteatose), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose (irreversível, formação avançada de feridas no fígado) ou obesidade relacionada com PNPLA3. Em conformidade, em uma modalidade, a presente invenção proporciona um construto de RNAi compreendendo uma fita sentido e uma fita antissentido, em que a fita antissentido compreende uma região tendo uma sequência que é complementar a uma sequência de mRNA de PNPLA3. Em certas modalidades, a fita antissentido compreende uma região tendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência antissentido listada na Tabela 1 ou Tabela 2. Em algumas modalidades, o RNAi da presente invenção inibe seletivamente os alelos minoritários PNPLA3-rs738409, PNPLA3-rs738408, e/ou PNPLA3-rs738409-rs738408 relativamente ao alelo de referência que não contém estas alterações.
[0005] Em algumas modalidades, a fita sentido dos construtos de RNAi descritos aqui compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissentido para formar uma região de hélice dupla de cerca de 15 até cerca de 30 pares de bases de comprimento. Nestas e em outras modalidades, as fitas sentido e antissentido têm, cada uma, cerca de 15 até cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, os construtos de RNAi compreendem pelo menos uma extremidade simétrica. Em outras modalidades, os construtos de RNAi compreendem pelo menos uma protuberância de nucleotídeos. Tais protuberâncias de nucleotídeos podem compreender pelo menos 1 até 6 nucleotídeos desemparelhados e podem estar localizadas na extremidade 3' da fita sentido, na extremidade 3' da fita antissentido ou na extremidade 3' de ambas as fitas sentido e antissentido. Em certas modalidades, os construtos de RNAi compreendem uma protuberância de dois nucleotídeos desemparelhados na extremidade 3' da fita sentido e na extremidade 3' da fita antissentido. Em outras modalidades, os construtos de RNAi compreendem uma protuberância de dois nucleotídeos desemparelhados na extremidade 3' da fita antissentido e em uma extremidade simétrica da extremidade 3' da fita sentido/extremidade 5' da fita antissentido.
[0006] Os construtos de RNAi da invenção podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados, incluindo nucleotídeos tendo modificações no anel ribose, nucleobase ou cadeia principal fosfodiéster. Em algumas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos 2'-modificados. Tais nucleotídeos 2'-modificados podem incluir nucleotídeos 2'-fluoro-modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados, nucleotídeos 2'-O-metoxietil- modificados, nucleotídeos 2'-O-alil-modificados, ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), ácidos glicolnucleicos (GNA), bases invertidas (por exemplo, adenosina invertida) ou suas combinações. Em uma modalidade particular, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos 2'- fluoro-modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados ou suas combinações. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos das fitas sentido e antissentido do construto de RNAi são nucleotídeos modificados.
[0007] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi compreendem pelo menos uma modificação na cadeia principal, tal como uma ligação internucleotídica ou internucleosídica modificada. Em certas modalidades, os construtos de RNAi descritos aqui compreendem pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em modalidades particulares, as ligações internucleotídicas fosforotioato podem estar posicionadas nas extremidades 3' ou 5' das fitas sentido e/ou antissentido.
[0008] Em algumas modalidades, a fita antissentido e/ou a fita sentido dos construtos de RNAi da invenção podem compreender ou consistir em uma sequência das sequências antissentido e sentido listadas na Tabela 1 ou
2. Em certas modalidades, o construto de RNAi pode ser um dos compostos de hélice dupla listados em qualquer uma das Tabelas 1 até 2.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0009] A Figura 1A-D mostra o rastreio de cinco moléculas de siRNA quanto a silenciamento de mRNA dependente da dose e durabilidade funcional in vivo.
[0010] A Figura 2A-G mostra o efeito de moléculas de siRNA para PNPLA3 in vivo em camundongos, peso do fígado, confirmação da expressão de PNPLA3 humano, teor de triglicerídeos hepáticos, níveis de TIMP1 no soro, e indicação histológica de esteatose ou inflamação.
[0011] A Figura 3A-G mostra o efeito de moléculas de siRNA para PNPLA3 in vivo, peso do fígado, confirmação da expressão de PNPLA3 humano, teor de triglicerídeos hepáticos, níveis de TIMP1 no soro, e indicação histológica de esteatose ou inflamação.
[0012] A Figura 4A-D mostra a capacidade de uma molécula de siRNA específica para PNPLA3rs738409-rs738408 para resgatar fenótipos associados a doença devido à sobre- expressão de PNPLA3rs738409-rs738408, teor de triglicerídeos hepáticos, níveis de TIMP1 no soro, e indicação histológica de esteatose ou inflamação.
[0013] A Figura 5A-L mostra a capacidade de uma molécula de siRNA específica para PNPLA3rs738409-rs738408 para prevenir o desenvolvimento de fibrose inicial.
[0014] As Figuras 6a e 6b mostram a sequência completa do plasmídeo de AAV contendo as sequências-alvo do alelo minoritário de PNPLA3. A porção contendo o promotor do CMV murino, repórter de luciferase do Pirilampo e sequências-alvo está sublinhada.
[0015] As Figuras 7a e 7b mostram a sequência completa do plasmídeo de AAV contendo as sequências-alvo do alelo de referência de PNPLA3. A porção contendo o promotor do CMV murino, repórter de luciferase do Pirilampo e sequências-alvo está sublinhada.
[0016] A Figura 8 mostra imagens exemplificativas de um camundongo injetado com AAV expressando sequências- alvo do alelo minoritário de PNPLA3 humano (linha de cima), versus um camundongo injetado com AAV expressando sequências-alvo do alelo de referência de PNPLA3 humano (linha de baixo). Após a aquisição de imagens de referência (primeira coluna), a mesma molécula de siRNA foi injetada em ambos os camundongos (D-2878 a 3 mpk). As colunas 2 até 5 são imagens capturadas nas semanas 1, 2, 3, e 4, respectivamente. As imagens foram convertidas para uma escala de cinzas usando software Living Image®. As regiões mais claras são áreas de baixo fluxo total [f/s], versus regiões mais escuras de alto fluxo [f/s]. A percentagem relativa do silenciamento de camundongos tratados com siRNA em cada momento semanal, normalizada para camundongos tratados com veículo, é exibida no inserto (linhas 2 e 4).
[0017] A Figura 9 mostra um exemplo de uma molécula de siRNA, D-2419, demonstrando silenciamento de mRNA dependente da dose e seletivo para alelos e eficácia funcional in vivo. (A) A molécula de siRNA, D-2419, foi injetada a 3,0 e 10,0 miligramas por quilograma de peso do corpo subcutaneamente no abdômen do camundongo. (B) Os dados representam a percentagem relativa média do silenciamento de mRNA, e erro padrão da média, do alelo PNPLA3rs738409-rs738408 humano versus PNPLA3TS relativamente ao grupo de controle tratado com veículo. (C) Fígados do grupo de tratamento durante duas semanas foram processados quanto ao teor de triglicerídeos para avaliar a eficácia funcional. (D) Para controlar a administração eficiente de siRNA, D-2787, mediada por GalNAc, um siRNA reativo de modo cruzado para HPRT e Hprt humano e de camundongo, respectivamente, foi administrado a 10 miligramas por quilograma e os fígados foram recolhidos passadas duas semanas. Os dados representam as cópias de mRNA de HPRT e mRNA de Hprt em camundongos tratados com D-2787 (N=4) versus tratados com veículo (N=5). (E) Os dados representam a percentagem relativa média do silenciamento de mRNA, e erro padrão da média, de mRNA de HPRT humano e Hprt de camundongo, respectivamente, relativamente ao grupo de controle tratado com veículo; todos normalizados para TBP humano. (F) Para confirmar a expressão de receptor de GalNAc nos hepatócitos de camundongos PXB®, níveis de mRNA de Asgr1 de camundongo e mRNA de ASGR1 humano foram avaliados na ausência e presença de D-2419.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0018] A presente invenção é dirigida a composições e métodos para regular a expressão do gene Contendo o Domínio de Fosfolipase do Tipo Patatina 3 (PNPLA3). Em algumas modalidades, o gene pode estar dentro de uma célula ou sujeito, tal como um mamífero (por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, composições da invenção compreendem construtos de RNAi que visam um mRNA de PNPLA3 e reduzem a expressão de PNPLA3 em uma célula ou mamífero. Tais construtos de RNAi são úteis para tratar ou prevenir várias formas de doenças relacionadas com o fígado, tais como, por exemplo, fígado gorduroso simples (esteatose), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose (irreversível, formação avançada de feridas no fígado) ou obesidade relacionada com PNPLA3.
[0019] Em 2008, um estudo de associação em todo o genoma (GWAS) explorando variações de sequências não sinônimas, ou polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP), associados a NAFLD identificou uma variante em PNPLA3, (rs738409[G], codificando I148M; que pode ser referida como PNPLA3-rs738409, PNPLA3-ma ou alelo minoritário de PNPLA3), como estando significativamente associada ao teor hepático de gordura. Desde este relato inicial, GWAS subsequentes confirmam PNPLA3 rs738409 como o principal determinante genético de NAFLD, significativamente associado a 1) níveis aumentados do biomarcador do soro para lesão no fígado, alanina transaminase (ALT), 2) incidência, progressão e gravidade de NAFLD, 3) indivíduos obesos e magros, e 4) o único SNP conhecido que se verificou estar significativamente associado a todos os estágios de NAFLD: esteatose, NASH, cirrose e carcinoma de células hepáticas. O consenso entre numerosos GWAS indica que a associação de PNPLA3 rs738409 a NAFLD é independente da idade, gênero, etnicidade, síndrome metabólica, índice de massa corporal, resistência à insulina, e lipídeos no soro. Além disso, análises estatísticas de múltiplas fontes estimam que aproximadamente 50% dos pacientes com NAFLD tenham a mutação PNPLA3 rs738409. Os pacientes podem ser homozigóticos ou heterozigóticos para a mutação PNPLA3 rs738409. Adicionalmente, foi descoberto que pacientes tendo a mutação PNPLA3 rs738409 muitas vezes também têm uma mutação rs738408 afastada em 3 pares de bases (Tian et al (2010) Nature Genetics 42:21-23). Assim, um paciente pode ter um alelo minoritário PNPLA3-rs738409, alelo minoritário PNPLA3-rs738408 ou mutação dupla de alelos minoritários PNPLA3-rs738409-rs738408 (PNPLA3-dma).
[0020] Pesquisadores desenvolveram modelos de camundongo para explorar a função de PNPLA3 in vivo. Até à data, nenhum fenótipo metabólico detectável foi identificado em resultado de deficiência de Pnpla3 ou sobre-expressão de Pnpla3. Em contraste, a expressão de Pnpla3I148M em camundongos transgênicos e camundongos com genes modificados, conduziu a níveis de triglicerídeos hepáticos aumentados relacionados com NAFLD. Assim, combinados, os dados de modelos de camundongo in vivo apontam para expressão da proteína Pnpla3I148M mutante, e ausência de sobre-expressão da proteína de tipo selvagem, como motor do fenótipo da doença. Estas descobertas, para além da elevada frequência do alelo minoritário em indivíduos afetados com NAFLD e associação predominante com a doença, sublinham PNPLA3 rs738409 como principal alvo terapêutico para NAFLD.
[0021] Interferência de RNA (RNAi) é o processo de introdução de RNA exógeno em uma célula conducente a degradação específica do mRNA codificando a proteína visada com um decréscimo resultante da expressão da proteína.
Avanços na tecnologia de RNAi e administração hepática e desfechos positivos crescentes com outras terapias à base de RNAi, sugerem RNAi como um meio convincente para tratar terapeuticamente NAFLD por abordagem direta de PNPLA3I148M.
Numerosos GWAS indicam um efeito dependente da dose de PNPLA3 rs738409 na incidência, progressão e gravidade NAFLD (GWAS); a razão de probabilidade tendendo a ser dupla, se não mais, para portadores homozigóticos versus portadores heterozigóticos, ainda pelo menos duas vezes mais para indivíduos heterozigóticos versus de tipo selvagem.
Assim, o silenciamento de PNPLA3 empregando especificidade da distinção alélica pode ser um meio potencial para reduzir triglicerídeos hepáticos em portadores de PNPLA3I148M, mas também apresenta um cenário no qual heterozigotas podem beneficiar sem silenciamento do alelo de tipo selvagem.
Nesse sentido, identificamos pequenos RNA interferentes (siRNA) SNP-específicos para PNPLA3I148M e demonstramos prova de conceito in vitro.
Usando ambas as linhagens de células de hepatoma, Hep3B (homozigótica para o alelo de referência, PNPLA3I148I) e HEPG2 (homozigótica para o alelo minoritário, PNPLA3I148M), identificamos sequências de siRNA capazes de inibir especificamente a expressão do gene PNPLA3I148M.
O efeito inibidor destas sequências foi confirmado por rastreio em células de ovário de hamster chinês (CHO) sobre-expressando PNPLA3I148I ou PNPLA3I148M.
Usando vírus adenoassociado (AAV) para sobre- expressar PNPLA3I148M humano in vivo, então demonstramos que o tratamento com SNP específicos para o alelo minoritário não só reduziu especificamente a expressão de
PNPLA3I148M humano em camundongos, mas também reverteu significativamente o acúmulo de triglicerídeos hepáticos induzido por sobre-expressão de PNPLA3I148M humano.
[0022] Como usado aqui, o termo "construto de RNAi" se relaciona com um agente compreendendo uma molécula de RNA que é capaz de sub-regular a expressão de um gene- alvo (por exemplo, PNPLA3) via um mecanismo de interferência de RNA quando introduzido em uma célula. A interferência de RNA é o processo pelo qual uma molécula de ácido nucleico induz a clivagem e degradação de uma molécula de RNA-alvo (por exemplo, molécula de RNA mensageiro ou mRNA) de um modo específico para sequências, por exemplo, através de uma via do complexo silenciador induzido por RNA (RISC). Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma molécula de RNA de fita dupla compreendendo duas fitas antiparalelas de nucleotídeos contíguos que são suficientemente complementares entre si para hibridarem, formando uma região de hélice dupla. "Hibridar" ou "hibridação" se relaciona com o emparelhamento de polinucleotídeos complementares, tipicamente via formação de ligações de hidrogênio (por exemplo, formação de ligações de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen revertido) entre bases complementares nos dois polinucleotídeos. A fita compreendendo uma região tendo uma sequência que é substancialmente complementar a uma sequência-alvo (por exemplo, mRNA-alvo) é referida como "fita antissentido." A "fita sentido" se relaciona com a fita que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antissentido. Em algumas modalidades, a fita sentido pode compreender uma região que tem uma sequência que é substancialmente idêntica à sequência-alvo.
[0023] Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi dirigido para PNPLA3. Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi que se liga ao sítio de PNPLA3 rs738409. Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi que se liga ao sítio de PNPLA3 rs738408. Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi que se liga aos sítios PNPLA3 rs738409 rs738408. Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi que se liga preferencialmente a PNPLA3 rs738409 relativamente à sequência de PNPLA3 nativa (PNPLA3-ref). Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi que se liga preferencialmente a PNPLA3 rs738408 relativamente à sequência PNPLA3-ref. Em algumas modalidades, a invenção é um RNAi que se liga preferencialmente a PNPLA3-dma relativamente a PNPLA3-ma. Em algumas modalidades, a invenção é uma molécula de RNAi que contém quaisquer das sequências presentes na Tabela 1 ou 2.
[0024] Uma molécula de RNA de fita dupla pode incluir modificações químicas em ribonucleotídeos, incluindo modificações no açúcar ribose, base ou componentes da cadeia principal dos ribonucleotídeos, como as descritas aqui ou conhecidas na técnica. Quaisquer de tais modificações, como usado em uma molécula de RNA de fita dupla (por exemplo, siRNA, shRNA ou similares), estão abrangidas pelo termo "RNA de fita dupla" para os propósitos desta revelação.
[0025] Como usado aqui, uma primeira sequência é "complementar" a uma segunda sequência se um polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência puder hibridar com um polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência para formar uma região de hélice dupla sob certas condições, como condições fisiológicas.
Outras de tais condições podem incluir condições de hibridação moderadas ou estringentes, que são conhecidas dos peritos na técnica.
Uma primeira sequência é considerada totalmente complementar (100% complementar) a uma segunda sequência se um polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência formar pares de bases com um polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência ao longo de todo o comprimento da uma ou ambas as sequências de nucleotídeos sem nenhuns emparelhamentos defeituosos.
Uma sequência é "substancialmente complementar" a uma sequência-alvo se a sequência for pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar a uma sequência-alvo.
A percentagem de complementaridade pode ser calculada dividindo o número de bases em uma primeira sequência que são complementares a bases em posições correspondentes em uma segunda sequência ou sequência-alvo pelo comprimento total da primeira sequência.
Também pode ser afirmado que uma sequência é substancialmente complementar a outra sequência se houver não mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 emparelhamentos defeituosos ao longo de uma região de hélice dupla de 30 pares de bases quando as duas sequências são hibridadas.
Em geral, se estiverem presentes quaisquer protuberâncias de nucleotídeos, como definido aqui, a sequência de tais protuberâncias não é considerada na determinação do grau de complementaridade entre duas sequências.
A título exemplificativo, uma fita sentido com
21 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissentido com 21 nucleotídeos de comprimento que hibridam para formar uma região de hélice dupla com 19 pares de bases com uma protuberância de 2 nucleotídeos na extremidade 3' de cada fita será considerada totalmente complementar tal como o termo é usado aqui.
[0026] Em algumas modalidades, uma região da fita antissentido compreende uma sequência que é totalmente complementar a uma região da sequência de RNA-alvo (por exemplo, mRNA de PNPLA3). Em tais modalidades, a fita sentido pode compreender uma sequência que é totalmente complementar à sequência da fita antissentido. Em outras de tais modalidades, a fita sentido pode compreender uma sequência que é substancialmente complementar à sequência da fita antissentido, por exemplo, tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 emparelhamentos defeituosos na região de hélice dupla formada pelas fitas sentido e antissentido. Em certas modalidades, é preferencial que quaisquer emparelhamentos defeituosos ocorram dentro das regiões terminais (por exemplo, a cerca de 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos das extremidades 5' e/ou 3' das fitas). Em uma modalidade, quaisquer emparelhamentos defeituosos na região de hélice dupla formada a partir das fitas sentido e antissentido ocorrem a cerca de 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos da extremidade 5' da fita antissentido.
[0027] Em certas modalidades, a fita sentido e fita antissentido do RNA de fita dupla podem ser duas moléculas separadas que hibridam para formar uma região de hélice dupla, mas não estão conectadas em nenhum outro modo. Tais moléculas de RNA de fita dupla formadas a partir de duas fitas separadas são referidas como "pequenos RNA interferentes" ou "RNA interferentes curtos" (siRNA). Assim, em algumas modalidades, os construtos de RNAi da invenção compreendem um siRNA.
[0028] Quando as duas fitas substancialmente complementares de um dsRNA são compreendidas por moléculas de RNA separadas, não é necessário, mas pode acontecer, que aquelas moléculas estejam covalentemente ligadas. Quando as duas fitas estão conectadas de modo covalente por um meio diferente de uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da outra fita respectiva que formam a estrutura de hélice dupla, a estrutura de conexão é referida como “ligador”. As fitas de RNA podem ter um número igual ou diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases na hélice dupla é o número de nucleotídeos na fita mais curta do dsRNA menos quaisquer protuberâncias que estejam presentes na hélice dupla. Para além da estrutura de hélice dupla, um RNAi pode compreender uma ou mais protuberâncias de nucleotídeos.
[0029] Em outras modalidades, a fita sentido e a fita antissentido que hibridam para formar uma região de hélice dupla podem fazer parte de uma única molécula de RNA, isto é, as fitas sentido e antissentido fazem parte de uma região autocomplementar de uma única molécula de RNA. Em tais casos, uma única molécula de RNA compreende uma região de hélice dupla (também referida como região de haste) e uma região de alça. A extremidade 3' da fita sentido é conectada à extremidade 5' da fita antissentido por uma sequência contígua de nucleotídeos desemparelhados, que irão formar a região de alça. A região de alça tem tipicamente um comprimento suficiente para permitir que a molécula de RNA se dobre de novo sobre si própria de modo que a fita antissentido possa formar pares de bases com a fita sentido para formar a região de hélice dupla ou haste. A região de alça pode compreender desde cerca de 3 até cerca de 25, desde cerca de 5 até cerca de 15 ou desde cerca de 8 até cerca de 12 nucleotídeos desemparelhados. Tais moléculas de RNA com regiões pelo menos parcialmente autocomplementares são referidas como "pequenos RNA em grampo" (shRNA). Em algumas modalidades, a região de alça pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 25 nucleotídeos desemparelhados. Em algumas modalidades, a região de alça pode ter 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou menos nucleotídeos desemparelhados. Em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção compreendem um shRNA. O comprimento de uma única molécula de RNA pelo menos parcialmente autocomplementar pode ir desde cerca de 35 nucleotídeos até cerca de 100 nucleotídeos, desde cerca de 45 nucleotídeos até cerca de 85 nucleotídeos, ou desde cerca de 50 até cerca de 60 nucleotídeos e compreende uma região de hélice dupla e região de alça, cada uma tendo os comprimentos aqui indicados.
[0030] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi da invenção compreendem uma fita sentido e uma fita antissentido, em que a fita antissentido compreende uma região tendo uma sequência que é substancial ou totalmente complementar a uma sequência de RNA mensageiro (mRNA) de PNPLA3. Como usado aqui, uma "sequência de mRNA de PNPLA3"
se relaciona com qualquer sequência de RNA mensageiro, incluindo variantes de encadeamento, codificando uma proteína PNPLA3, incluindo variantes ou isoformas de uma proteína PNPLA3 de qualquer espécie (por exemplo, camundongo, rato, primata não humano, humano). A proteína PNPLA3 também é conhecida como adiponutrina (ADPN) e fosfolipase A2-épsilon independente de cálcio (iPLA(2)ε)).
[0031] Uma sequência de mRNA de PNPLA3 também inclui a sequência do transcrito expressa como a sua sequência de DNA complementar (cDNA). Uma sequência de cDNA se relaciona com a sequência de um transcrito de mRNA expresso como bases de DNA (por exemplo, guanina, adenina, timina, e citosina) em vez de bases de RNA (por exemplo, guanina, adenina, uracila, e citosina). Assim, a fita antissentido dos construtos de RNAi da invenção pode compreender uma região tendo uma sequência que é substancial ou totalmente complementar a uma sequência de mRNA de PNPLA3 ou sequência de cDNA de PNPLA3-alvo. Uma sequência de mRNA ou cDNA de PNPLA3 pode incluir, mas sem limitação, qualquer sequência de mRNA ou cDNA de PNPLA3, como a que pode ser derivada da sequência de Referência do NCBI NM_025225.2.
[0032] Uma região da fita antissentido pode ser substancialmente complementar ou totalmente complementar a pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos da sequência de mRNA de PNPLA3. Em algumas modalidades, a região-alvo da sequência de mRNA de PNPLA3 para a qual a fita antissentido compreende uma região de complementaridade pode variar desde cerca de 15 até cerca de 30 nucleotídeos consecutivos, desde cerca de 16 até cerca de 28 nucleotídeos consecutivos, desde cerca de 18 até cerca de 26 nucleotídeos consecutivos, desde cerca de 17 até cerca de 24 nucleotídeos consecutivos, desde cerca de 19 até cerca de 25 nucleotídeos consecutivos, desde cerca de 19 até cerca de 23 nucleotídeos consecutivos, ou desde cerca de 19 até cerca de 21 nucleotídeos consecutivos. Em certas modalidades, a região da fita antissentido compreendendo uma sequência que é substancial ou totalmente complementar a uma sequência de mRNA de PNPLA3 pode compreender, em algumas modalidades, pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência antissentido listada na Tabela 1 ou Tabela 2. Em outras modalidades, a sequência antissentido compreende pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18 ou pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência antissentido listada na Tabela 1 ou Tabela 2. Em algumas modalidades, a sequência sentido e/ou antissentido compreende pelo menos 15 nucleotídeos de uma sequência listada na Tabela 1 ou 2 com não mais do que 1, 2 ou 3 emparelhamentos defeituosos de nucleotídeos.
[0033] A fita sentido do construto de RNAi compreende tipicamente uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissentido para que as duas fitas hibridem sob condições fisiológicas para formar uma região de hélice dupla. Uma "região de hélice dupla" se relaciona com as regiões em dois polinucleotídeos complementares ou substancialmente complementares que formam pares de bases entre si, por emparelhamento de bases de Watson-Crick ou outra interação por ligações de hidrogênio, para criar uma hélice dupla entre os dois polinucleotídeos. A região de hélice dupla do construto de RNAi deve ter um comprimento suficiente para permitir que o construto de RNAi entre na via de interferência de RNA, por exemplo, recrutando a enzima Dicer e/ou o complexo RISC. Por exemplo, em algumas modalidades, a região de hélice dupla tem cerca de 15 até cerca de 30 pares de bases de comprimento. Outros comprimentos para a região de hélice dupla dentro deste intervalo também são adequados, tais como cerca de 15 até cerca de 28 pares de bases, cerca de 15 até cerca de 26 pares de bases, cerca de 15 até cerca de 24 pares de bases, cerca de 15 até cerca de 22 pares de bases, cerca de 17 até cerca de 28 pares de bases, cerca de 17 até cerca de 26 pares de bases, cerca de 17 até cerca de 24 pares de bases, cerca de 17 até cerca de 23 pares de bases, cerca de 17 até cerca de 21 pares de bases, cerca de 19 até cerca de 25 pares de bases, cerca de 19 até cerca de 23 pares de bases ou cerca de 19 até cerca de 21 pares de bases. Em uma modalidade, a região de hélice dupla tem cerca de 17 até cerca de 24 pares de bases de comprimento. Em outra modalidade, a região de hélice dupla tem cerca de 19 até cerca de 21 pares de bases de comprimento.
[0034] Em algumas modalidades, um agente de RNAi da invenção contém uma região de hélice dupla com cerca de 24 até cerca de 30 nucleotídeos que interage com uma sequência de RNA-alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA- alvo de PNPLA3, para dirigir a clivagem do RNA-alvo. Sem pretender ficar restringido pela teoria, RNA longo de fita dupla introduzido em células pode ser degradado em siRNA por uma endonuclease do Tipo III denominada Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease-III, 15 processa o dsRNA em pequenos RNA interferentes com 19-23 pares de bases com protuberâncias em 3' de duas bases características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNA são então incorporados em um complexo silenciador induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam a hélice dupla do siRNA, permitindo que a fita antissentido complementar oriente o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Por ligação ao mRNA-alvo 20 apropriado, uma ou mais endonucleases presentes no RISC procedem à clivagem do alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188).
[0035] Para modalidades nas quais a fita sentido e fita antissentido são duas moléculas separadas (por exemplo, construto de RNAi compreende um siRNA), não é necessário que a fita sentido e fita antissentido tenham um comprimento igual ao comprimento da região de hélice dupla. Por exemplo, uma ou ambas as fitas podem ser maiores do que a região de hélice dupla e ter um ou mais nucleotídeos desemparelhados ou emparelhamentos defeituosos flanqueando a região de hélice dupla. Assim, em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende pelo menos uma protuberância de nucleotídeos. Como usado aqui, uma "protuberância de nucleotídeos" se relaciona com o nucleotídeo ou nucleotídeos não emparelhados que se estendem para além da região de hélice dupla nas extremidades terminais das fitas. Protuberâncias de nucleotídeos são tipicamente criadas quando a extremidade 3' de uma fita se estende para além da extremidade 5' da outra fita ou quando a extremidade 5' de uma fita se estende para além da extremidade 3' da outra fita. O comprimento de uma protuberância de nucleotídeos é geralmente entre 1 e 6 nucleotídeos, 1 e 5 nucleotídeos, 1 e 4 nucleotídeos, 1 e 3 nucleotídeos, 2 e 6 nucleotídeos, 2 e 5 nucleotídeos ou 2 e 4 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a protuberância de nucleotídeos compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos. Em uma modalidade particular, a protuberância de nucleotídeos compreende 1 até 4 nucleotídeos. Em certas modalidades, a protuberância de nucleotídeos compreende 2 nucleotídeos. Os nucleotídeos da protuberância podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou nucleotídeos modificados como descrito aqui. Em algumas modalidades, a protuberância compreende um dinucleotídeo 5'-uridina-uridina-3' (5'-UU- 3'). Em tais modalidades, o dinucleotídeo UU pode compreender ribonucleotídeos ou nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos 2'-modificados. Em outras modalidades, a protuberância compreende um dinucleotídeo 5'-desoxitimidina-desoxitimidina-3' (5'-dTdT-3').
[0036] A protuberância de nucleotídeos pode estar presente na extremidade 5' ou extremidade 3' de uma ou ambas as fitas. Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 5' e na extremidade 3' da fita antissentido. Em outra modalidade, o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 5' e na extremidade 3' da fita sentido. Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 5' da fita sentido e na extremidade 5' da fita antissentido. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 3' da fita sentido e na extremidade 3' da fita antissentido.
[0037] Os construtos de RNAi podem compreender uma única protuberância de nucleotídeos em uma extremidade da molécula de RNA de fita dupla e uma extremidade simétrica na outra. Uma "extremidade simétrica" significa que a fita sentido e fita antissentido têm um emparelhamento de bases total na extremidade da molécula e não há nenhuns nucleotídeos desemparelhados que se estendam para além da região de hélice dupla. Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 3' da fita sentido e uma extremidade simétrica na extremidade 5' da fita sentido e extremidade 3' da fita antissentido. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissentido e uma extremidade simétrica na extremidade 5' da fita antissentido e na extremidade 3' da fita sentido. Em certas modalidades, o construto de RNAi compreende uma extremidade simétrica em ambas as extremidades da molécula de RNA de fita dupla. Em tais modalidades, a fita sentido e fita antissentido têm o mesmo comprimento e a região de hélice dupla tem o mesmo comprimento das fitas sentido e antissentido (isto é, a molécula é de fita dupla ao longo de todo o seu comprimento).
[0038] A fita sentido e a fita antissentido podem, cada uma independentemente, ter cerca de 15 até cerca de
30 nucleotídeos de comprimento, cerca de 18 até cerca de 28 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 até cerca de 27 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 até cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 até cerca de 23 nucleotídeos de comprimento, cerca de 21 até cerca de 25 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 21 até cerca de 23 nucleotídeos de comprimento.
Em certas modalidades, a fita sentido e fita antissentido têm, cada uma, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24 ou cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.
Em algumas modalidades, a fita sentido e fita antissentido têm o mesmo comprimento mas formam uma região de hélice dupla que é mais curta do que as fitas, de modo que o construto de RNAi tem duas protuberâncias de nucleotídeos.
Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita sentido e uma fita antissentido que têm, cada uma, 21 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma região de hélice dupla que tem 19 pares de bases de comprimento, e (iii) protuberâncias de nucleotídeos de 2 nucleotídeos desemparelhados na extremidade 3' da fita sentido e na extremidade 3' da fita antissentido.
Em outra modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita sentido e uma fita antissentido que têm, cada uma, 23 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma região de hélice dupla que tem 21 pares de bases de comprimento, e (iii) protuberâncias de nucleotídeos de 2 nucleotídeos desemparelhados na extremidade 3' da fita sentido e na extremidade 3' da fita antissentido.
Em outras modalidades, a fita sentido e fita antissentido têm o mesmo comprimento e formam uma região de hélice dupla ao longo de todo o seu comprimento de modo que não há nenhumas protuberâncias de nucleotídeos em qualquer uma das extremidades da molécula de fita dupla. Em uma de tais modalidades, o construto de RNAi tem extremidades simétricas e compreende (i) uma fita sentido e uma fita antissentido, cada uma das quais tem 21 nucleotídeos de comprimento, e (ii) uma região de hélice dupla que tem 21 pares de bases de comprimento. Em outra de tais modalidades, o construto de RNAi tem extremidades simétricas e compreende (i) uma fita sentido e uma fita antissentido, cada uma das quais tem 23 nucleotídeos de comprimento, e (ii) uma região de hélice dupla que tem 23 pares de bases de comprimento.
[0039] Em outras modalidades, a fita sentido ou a fita antissentido é maior do que a outra fita e as duas fitas formam uma região de hélice dupla tendo um comprimento igual ao da fita mais curta, de modo que o construto de RNAi compreende pelo menos uma protuberância de nucleotídeos. Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita sentido que tem 19 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma fita antissentido que tem 21 nucleotídeos de comprimento, (iii) uma região de hélice dupla com 19 pares de bases de comprimento, e (iv) uma única protuberância de nucleotídeos de 2 nucleotídeos desemparelhados na extremidade 3' da fita antissentido. Em outra modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita sentido que tem 21 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma fita antissentido que tem 23 nucleotídeos de comprimento, (iii) uma região de hélice dupla com 21 pares de bases de comprimento, e (iv) uma única protuberância de nucleotídeos de 2 nucleotídeos desemparelhados na extremidade 3' da fita antissentido.
[0040] A fita antissentido dos construtos de RNAi da invenção pode compreender a sequência de qualquer uma das sequências antissentido listadas na Tabela 1 ou Tabela 2 ou a sequência de nucleotídeos 1-19 de quaisquer destas sequências antissentido. Cada uma das sequências antissentido listadas na Tabelas 1 e 6 compreende uma sequência de 19 nucleotídeos consecutivos (primeiros 19 nucleotídeos contando desde a extremidade 5') que é complementar a uma sequência de mRNA de PNPLA3 mais uma sequência de protuberância de dois nucleotídeos. Assim, em algumas modalidades, a fita antissentido compreende uma sequência de nucleotídeos 1-19 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-166 ou 167-332. Nucleotídeos modificados
[0041] Os construtos de RNAi da invenção podem compreender um ou mais nucleotídeos modificados. Um "nucleotídeo modificado" se relaciona com um nucleotídeo que tem uma ou mais modificações químicas no nucleosídeo, nucleobase, anel pentose, ou grupo fosfato. Como usado aqui, nucleotídeos modificados não abrangem ribonucleotídeos contendo adenosina monofosfato, guanosina monofosfato, uridina monofosfato, e citidina monofosfato, e desoxirribonucleotídeos contendo desoxiadenosina monofosfato, desoxiguanosina monofosfato, desoxitimidina monofosfato, e desoxicitidina monofosfato. No entanto, os construtos de RNAi podem compreender combinações de nucleotídeos modificados, ribonucleotídeos, e desoxirribonucleotídeos. A incorporação de nucleotídeos modificados em uma ou ambas as fitas de moléculas de RNA de fita dupla pode melhorar a estabilidade in vivo das moléculas de RNA, por exemplo, reduzindo a suscetibilidade das moléculas a nucleases e outros processos de degradação. A potência de construtos de RNAi para reduzir a expressão do gene-alvo também pode ser intensificada por incorporação de nucleotídeos modificados.
[0042] Em certas modalidades, os nucleotídeos modificados têm uma modificação do açúcar ribose. Estas modificações de açúcar podem incluir modificações na posição 2' e/ou 5' do anel pentose bem como modificações de açúcar bicíclico. Um nucleotídeo 2'-modificado se relaciona com um nucleotídeo tendo um anel pentose com um substituinte na posição 2' diferente de H ou OH. Tais modificações 2' incluem, mas sem limitação, 2'-O-alquila (por exemplo, O-C1-C10 ou O-C1-C10 alquila substituído), 2'- O-alila (O-CH2CH=CH2), 2'-C-alila, 2'-fluoro, 2'-O-metila (OCH3), 2'-O-metoxietila (O-(CH2)2OCH3), 2'-OCF3, 2'- O(CH2)2SCH3, 2'-O-aminoalquila, 2'-amino (por exemplo, NH2), 2'-O-etilamina e 2'-azido. Modificações na posição 5' do anel pentose incluem, mas sem limitação, 5'-metila (R ou S); 5'-vinila e 5'-metóxi.
[0043] Uma "modificação de açúcar bicíclico" se relaciona com uma modificação do anel pentose na qual uma ponte conecta dois átomos do anel para formar um segundo anel, resultando em uma estrutura de açúcar bicíclico. Em algumas modalidades, a modificação de açúcar bicíclico compreende uma ponte entre os carbonos 4' e 2' do anel pentose. Nucleotídeos compreendendo uma fração açúcar com uma modificação de açúcar bicíclico são referidos aqui como ácidos nucleicos bicíclicos ou BNA. Modificações de açúcar bicíclico exemplificativas incluem, mas sem limitação, α-L-Metilenóxi (4'-CH2-O-2') ácido nucleico bicíclico (BNA); β-D-Metilenóxi (4'-CH2-O-2') BNA (também referido como ácido nucleico trancado ou LNA); Etilenóxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA; Amino-óxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA; Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA; Metil(metilenóxi) (4'- CH(CH3)-O-2') BNA (também referido como etila constrangido ou cEt); metileno-tio (4'-CH2-S-2') BNA; metileno-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA; metilcarbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)- 2') BNA; propilenocarbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA; e Metoxi(etilenóxi) (4'-CH(CH2OMe)-O-2') BNA (também referido como MOE constrangido ou cMOE). Estes e outros nucleotídeos com açúcar modificado que podem ser incorporados nos construtos de RNAi da invenção são descritos na Patente dos EUA N.º 9,181,551, Publicação da Patente dos EUA N.º 2016/0122761, e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19: 937-954, 2012, todos os quais são deste modo incorporados a título de referência na sua totalidade.
[0044] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos 2'-fluoro- modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados, nucleotídeos 2'-O-metoxietil-modificados, nucleotídeos 2'-O-alil-modificados, ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) ou suas combinações. Em certas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos 2'-fluoro- modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados, nucleotídeos 2'-O-metoxietil-modificados, ou suas combinações. Em uma modalidade particular, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos 2'-fluoro- modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados ou suas combinações.
[0045] Ambas as fitas sentido e antissentido dos construtos de RNAi podem compreender um ou múltiplos nucleotídeos modificados. Por exemplo, em algumas modalidades, a fita sentido compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos modificados. Em certas modalidades, todos os nucleotídeos da fita sentido são nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, a fita antissentido compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos modificados. Em outras modalidades, todos os nucleotídeos da fita antissentido são nucleotídeos modificados. Em certas modalidades diferentes, todos os nucleotídeos da fita sentido e todos os nucleotídeos da fita antissentido são nucleotídeos modificados. Nestas e em outras modalidades, os nucleotídeos modificados podem ser nucleotídeos 2'- fluoro-modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados ou suas combinações.
[0046] Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos pirimidina precedendo um nucleotídeo adenosina na fita sentido, fita antissentido, ou ambas as fitas são nucleotídeos modificados. Por exemplo, quando a sequência 5'-CA-3' ou 5'-UA-3' aparecer em qualquer uma das fitas, os nucleotídeos citidina e uridina são nucleotídeos modificados, preferencialmente nucleotídeos 2'-O-metil-modificados. Em certas modalidades, todos os nucleotídeos pirimidina da fita sentido são nucleotídeos modificados (por exemplo, nucleotídeos 2'-O-metil- modificados), e o nucleotídeo 5' em todas as ocorrências da sequência 5'-CA-3' ou 5'-UA-3' na fita antissentido são nucleotídeos modificados (por exemplo, nucleotídeos 2'-O- metil-modificados). Em outras modalidades, todos os nucleotídeos da região de hélice dupla são nucleotídeos modificados. Em tais modalidades, os nucleotídeos modificados são preferencialmente nucleotídeos 2'-O- metil-modificados, nucleotídeos 2'-fluoro-modificados ou suas combinações.
[0047] Em modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos, os nucleotídeos da protuberância podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, ou nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, os nucleotídeos da protuberância são desoxirribonucleotídeos, por exemplo, desoxitimidina. Em outra modalidade, os nucleotídeos da protuberância são nucleotídeos modificados. Por exemplo, em algumas modalidades, os nucleotídeos da protuberância são nucleotídeos 2'-O-metil-modificados, nucleotídeos 2'- fluoro-modificados, nucleotídeos 2'-metoxietil- modificados ou suas combinações.
[0048] Os construtos de RNAi da invenção também podem compreender uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Como usado aqui, o termo "ligação internucleotídica modificada" se relaciona com uma ligação internucleotídica diferente da ligação 3'-5' fosfodiéster natural. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica contendo fósforo, tal como um fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, um alquilfosfonato (por exemplo, metilfosfonato, 3'- alquilenofosfonato), um fosfinato, um fosforamidato (por exemplo, 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidato), um fosforotioato (P=S), um fosforotioato quiral, um fosforoditioato, um tionofosforamidato, um tionoalquilfosfonato, um tionoalquilfosfotriéster e um boranofosfato.
Em uma modalidade, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação 2'-5' fosfodiéster.
Em outras modalidades, a ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica não contendo fósforo e, assim, pode ser referida como ligação internucleosídica modificada.
Tais ligações não contendo fósforo incluem, mas sem limitação, ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção açúcar de um nucleosídeo); ligações siloxano (-O-Si(H)2- O-); ligações sulfeto, sulfóxido e sulfona; ligações formacetila e tioformacetila; cadeias principais contendo alqueno; cadeias principais sulfamato; ligações metilenometilimino (-CH2-N(CH3)-O-CH2-) e metileno- hidrazino; ligações sulfonato e sulfonamida; ligações amida; e outras tendo partes de componentes N, O, S e CH2 mistas.
Em uma modalidade, a ligação internucleosídica modificada é uma ligação à base de peptídeo (por exemplo, aminoetilglicina) para criar um ácido peptídeonucleico ou PNA, como os descritos nas Patentes dos EUA N.os 5,539,082; 5,714,331; e 5,719,262. Outras ligações internucleotídicas e internucleosídicas modificadas adequadas que podem ser empregues nos construtos de RNAi da invenção são descritas na Patente dos EUA N.º
6,693,187, Patente dos EUA N.º 9,181,551, Publicação de Patente dos EUA N.º 2016/0122761, e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19: 937-954, 2012, todos os quais são deste modo incorporados a título de referência na sua totalidade.
[0049] Em certas modalidades, os construtos de RNAi compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato. As ligações internucleotídicas fosforotioato podem estar presentes na fita sentido, fita antissentido, ou ambas as fitas dos construtos de RNAi. Por exemplo, em algumas modalidades, a fita sentido compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato. Em outras modalidades, a fita antissentido compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato. Ainda em outras modalidades, ambas as fitas compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato. Os construtos de RNAi podem compreender uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato na extremidade 3', na extremidade 5', ou em ambas as extremidades 3' e 5' da fita sentido, da fita antissentido, ou de ambas as fitas. Por exemplo, em certas modalidades, o construto de RNAi compreende cerca de 1 até cerca de 6 ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais) ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas na extremidade 3' da fita sentido, da fita antissentido, ou de ambas as fitas. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende cerca de 1 até cerca de 6 ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais) ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas na extremidade 5' da fita sentido, da fita antissentido, ou de ambas as fitas.
Em uma modalidade, o construto de RNAi compreende uma única ligação internucleotídica fosforotioato na extremidade 3' da fita sentido e uma única ligação internucleotídica fosforotioato na extremidade 3' da fita antissentido.
Em outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas na extremidade 3' da fita antissentido (isto é, uma ligação internucleotídica fosforotioato na primeira e segunda ligações internucleotídicas na extremidade 3' da fita antissentido). Em outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas nas extremidades 3' e 5' da fita antissentido.
Ainda em outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas nas extremidades 3' e 5' da fita antissentido e duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas na extremidade 5' da fita sentido.
Ainda em outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas nas extremidades 3' e 5' da fita antissentido e duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas nas extremidades 3' e 5' da fita sentido (isto é, uma ligação internucleotídica fosforotioato na primeira e segunda ligações internucleotídicas em ambas as extremidades 5' e 3' da fita antissentido e uma ligação internucleotídica fosforotioato na primeira e segunda ligações internucleotídicas em ambas as extremidades 5' e 3' da fita sentido). Em quaisquer das modalidades nas quais uma ou ambas as fitas compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas fosforotioato, as ligações internucleotídicas remanescentes dentro das fitas podem ser as ligações 3'-5' fosfodiéster naturais. Por exemplo, em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica das fitas sentido e antissentido é selecionada de fosfodiéster e fosforotioato, em que pelo menos uma ligação internucleotídica é um fosforotioato.
[0050] Em modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos, dois ou mais dos nucleotídeos desemparelhados da protuberância podem ser conectados por uma ligação internucleotídica fosforotioato. Em certas modalidades, todos os nucleotídeos desemparelhados em uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissentido e/ou da fita sentido são conectados por ligações internucleotídicas fosforotioato. Em outras modalidades, todos os nucleotídeos desemparelhados em uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 5' da fita antissentido e/ou da fita sentido são conectados por ligações internucleotídicas fosforotioato. Ainda em outras modalidades, todos os nucleotídeos desemparelhados em qualquer protuberância de nucleotídeos são conectados por ligações internucleotídicas fosforotioato.
[0051] Em certas modalidades, os nucleotídeos modificados incorporados em uma ou ambas as fitas dos construtos de RNAi da invenção têm uma modificação da nucleobase (também referida aqui como "base"). Uma "nucleobase modificada" ou "base modificada" se relaciona com uma base diferente das bases purina de ocorrência natural adenina (A) e guanina (G) e bases pirimidina de ocorrência natural timina (T), citosina (C), e uracila (U). Nucleobases modificadas podem ter modificações sintéticas ou de ocorrência natural e incluem, mas sem limitação, bases universais, 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetilcitosina, xantina (X), hipoxantina (I), 2- aminoadenina, 6-metiladenina, 6-metilguanina e outros derivados alquila de adenina e guanina, derivados 2- propila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halo-uracila e citosina, 5-propinil-uracila e citosina, 6-azo-uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4- tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8- hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5- halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7- metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7- desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3-desazaguanina e 3- desaza-adenina.
[0052] Em algumas modalidades, a base modificada é uma base universal. Uma "base universal" se relaciona com um análogo de base que forma indiscriminadamente pares de bases com todas as bases naturais em RNA e DNA sem alterar a estrutura helicoidal dupla da região de hélice dupla resultante. Bases universais são conhecidas dos peritos na técnica e incluem, mas sem limitação, inosina, C- fenila, C-naftila e outros derivados aromáticos, azolcarboxamidas e derivados nitroazol, tais como 3- nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol e 6-nitroindol.
[0053] Outras bases modificadas adequadas que podem ser incorporadas nos construtos de RNAi da invenção incluem as descritas em Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., Vol. 10:297-310, 2000 e Peacock et al., J. Org. Chem., Vol. 76: 7295-7300, 2011, ambos os quais são deste modo incorporados a título de referência na sua totalidade. O perito está bem ciente de que guanina, citosina, adenina, timina, e uracila podem ser substituídas por outras nucleobases, tais como as nucleobases modificadas descritas acima, sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um polinucleotídeo compreendendo um nucleotídeo contendo tal substituição de nucleobases.
[0054] Em algumas modalidades dos construtos de RNAi da invenção, a extremidade 5' da fita sentido, fita antissentido, ou de ambas as fitas antissentido e sentido compreende uma fração fosfato. Como usado aqui, o termo "fração fosfato" se relaciona com um grupo fosfato terminal que inclui fosfatos não modificados (-O- P=O)(OH)OH) bem como fosfatos modificados. Fosfatos modificados incluem fosfatos nos quais um ou mais dos grupos O e OH é substituído por H, O, S, N(R) ou alquila em que R é H, um grupo protetor de amino ou alquila não substituído ou substituído. Frações fosfato exemplificativas incluem, mas sem limitação, 5'- monofosfato; 5'-difosfato; 5'-trifosfato; cobertura 5'- guanosina (7-metilada ou não metilada); cobertura 5'- adenosina ou qualquer outra estrutura de cobertura de nucleotídeos modificada ou não modificada; 5'- monotiofosfato (fosforotioato); 5'-monoditiofosfato
(fosforoditioato); 5'-alfa-tiotrifosfato; 5'-gama- tiotrifosfato, 5'-fosforamidatos; 5'-vinilfosfatos; 5'- alquilfosfonatos (por exemplo, alquila= metila, etila, isopropila, propila, etc.); e 5'-alquiléterfosfonatos (por exemplo, alquiléter =metoximetila, etoximetila, etc.).
[0055] Os nucleotídeos modificados que podem ser incorporados nos construtos de RNAi da invenção podem ter mais do que uma modificação química descrita aqui. Por exemplo, o nucleotídeo modificado pode ter uma modificação no açúcar ribose bem como uma modificação na nucleobase. A título exemplificativo, um nucleotídeo modificado pode compreender uma modificação em açúcar em 2' (por exemplo, 2'-fluoro ou 2'-metila) e compreender uma base modificada (por exemplo, 5-metilcitosina ou pseudouracila). Em outras modalidades, o nucleotídeo modificado pode compreender uma modificação em açúcar em combinação com uma modificação no 5'-fosfato que irá criar uma ligação internucleotídica ou internucleosídica modificada quando o nucleotídeo modificado tiver sido incorporado em um polinucleotídeo. Por exemplo, em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado pode compreender uma modificação em açúcar, tal como uma modificação 2'-fluoro, uma modificação 2'-O- metila, ou uma modificação de açúcar bicíclico, bem como um grupo 5'-fosforotioato. Em conformidade, em algumas modalidades, uma ou ambas as fitas dos construtos de RNAi da invenção compreendem uma combinação de nucleotídeos 2'- modificados ou BNA e ligações internucleotídicas fosforotioato. Em certas modalidades, ambas as fitas sentido e antissentido dos construtos de RNAi da invenção compreendem uma combinação de nucleotídeos 2'-fluoro- modificados, nucleotídeos 2'-O-metil-modificados, e ligações internucleotídicas fosforotioato. Construtos de RNAi exemplificativos compreendendo nucleotídeos e ligações internucleotídicas modificados são mostrados na Tabela 2. Função de construtos de RNAi
[0056] Preferencialmente, os construtos de RNAi da invenção reduzem ou inibem a expressão de PNPLA3 em células, particularmente células do fígado. Em conformidade, em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método para reduzir a expressão de PNPLA3 em uma célula por contato da célula com qualquer construto de RNAi descrito aqui. A célula pode estar in vitro ou in vivo. A expressão de PNPLA3 pode ser avaliada medindo a quantidade ou nível de mRNA de PNPLA3, proteína PNPLA3, ou outro biomarcador ligado à expressão de PNPLA3. A redução da expressão de PNPLA3 em células ou animais tratados com um construto de RNAi da invenção pode ser determinada relativamente à expressão de PNPLA3 em células ou animais não tratados com o construto de RNAi ou tratados com um construto de RNAi de controle. Por exemplo, em algumas modalidades, a redução da expressão de PNPLA3 é avaliada (a) medindo a quantidade ou nível de mRNA de PNPLA3 em células do fígado tratadas com um construto de RNAi da invenção, (b) medindo a quantidade ou nível de mRNA de PNPLA3 em células do fígado tratadas com um construto de RNAi de controle (por exemplo, agente de RNAi dirigido para uma molécula de RNA não expressa em células do fígado ou um construto de RNAi tendo uma sequência sem sentido ou misturada) ou nenhum construto, e (c) comparando os níveis de mRNA de PNPLA3 medidos a partir de células tratadas em (a) com os níveis de mRNA de PNPLA3 medidos a partir de células de controle em (b). Os níveis de mRNA de PNPLA3 nas células tratadas e células de controle podem ser normalizados para níveis de RNA para um gene de controle (por exemplo, RNA ribossomal 18S) antes da comparação. Os níveis de mRNA de PNPLA3 podem ser medidos por uma variedade de métodos, incluindo análise de transferência Northern, ensaios de proteção de nucleases, hibridação in situ por fluorescência (FISH), PCR com transcriptase reversa (RT), RT-PCR em tempo real, PCR quantitativo, e similares.
[0057] Em outras modalidades, a redução da expressão de PNPLA3 é avaliada (a) medindo a quantidade ou nível de proteína PNPLA3 em células do fígado tratadas com um construto de RNAi da invenção, (b) medindo a quantidade ou nível de proteína PNPLA3 em células do fígado tratadas com um construto de RNAi de controle (por exemplo, agente de RNAi dirigido para uma molécula de RNA não expressa em células do fígado ou um construto de RNAi tendo uma sequência sem sentido ou misturada) ou nenhum construto, e (c) comparando os níveis de proteína PNPLA3 medidos a partir de células tratadas em (a) com os níveis de proteína PNPLA3 medidos a partir de células de controle em (b). Métodos de medição dos níveis de proteína PNPLA3 são conhecidos dos peritos na técnica, e incluem Transferências Western, imunoensaios (por exemplo, ELISA), e citometria de fluxo. Um método à base de imunoensaio exemplificativo para avaliar a expressão da proteína PNPLA3 é descrito no Exemplo 2. O Exemplo 3 descreve um método exemplificativo para medir mRNA de PNPLA3 usando FISH para RNA. Qualquer método capaz de medir mRNA ou proteína de PNPLA3 pode ser usado para avaliar a eficácia dos construtos de RNAi da invenção.
[0058] Em algumas modalidades, os métodos para avaliar os níveis de expressão de PNPLA3 são realizados in vitro em células que expressam de modo nativo PNPLA3 (por exemplo, células do fígado) ou células que foram manipuladas para expressarem PNPLA3. Em certas modalidades, os métodos são realizados in vitro em células do fígado. Células do fígado adequadas incluem, mas sem limitação, hepatócitos primários (por exemplo, hepatócitos humanos, de primata não humano, ou roedor), células HepAD38, células HuH-6, células HuH-7, células HuH-5-2, células BNLCL2, células Hep3B ou células HepG2. Em uma modalidade, as células do fígado são células Hep3B. Em outra modalidade, as células do fígado são células HepG2.
[0059] Em outras modalidades, os métodos para avaliar níveis de expressão de PNPLA3 são realizados in vivo. Os construtos de RNAi e quaisquer construtos de RNAi de controle podem ser administrados a um animal (por exemplo, roedor ou primata não humano) e níveis de mRNA ou proteína de PNPLA3 são avaliados em tecido do fígado recolhido do animal após o tratamento. Alternativa ou adicionalmente, um biomarcador ou fenótipo funcional associado a expressão de PNPLA3 pode ser avaliado nos animais tratados.
[0060] Em certas modalidades, a expressão de PNPLA3 é reduzida em células do fígado em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% por um construto de RNAi da invenção.
Em algumas modalidades, a expressão de PNPLA3 é reduzida em células do fígado em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85% por um construto de RNAi da invenção.
Em outras modalidades, a expressão de PNPLA3 é reduzida em células do fígado em cerca de 90% ou mais, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais por um construto de RNAi da invenção.
A percentagem da redução da expressão de PNPLA3 pode ser medida por quaisquer dos métodos descritos aqui bem como outros conhecidos na técnica.
Por exemplo, em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 45% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células Hep3B (contêm PNPLA3 de tipo selvagem) in vitro.
Em modalidades relacionadas, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células Hep3B in vitro.
Em outras modalidades, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96% ou pelo menos 98% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células Hep3B in vitro.
Em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 45% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células HepG2 (contêm o alelo minoritário duplo PNPLA3-rs738409-rs738408) in vitro.
Em modalidades relacionadas, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células HepG2 in vitro. Em outras modalidades, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96% ou pelo menos 98% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células HepG2 in vitro. Em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 45% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células CHO transfectadas expressando PNPLA3 I148I ou I148M humano in vitro. Em modalidades relacionadas, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células CHO transfectadas expressando PNPLA3 I148I ou I148M humano in vitro. Em outras modalidades, os construtos de RNAi da invenção inibem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96% ou pelo menos 98% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células CHO transfectadas expressando PNPLA3 I148I ou I148M humano in vitro. A redução de PNPLA3 pode ser medida usando uma variedade de técnicas incluindo FISH de RNA ou PCR digital com gotículas, como descrito nos Exemplos 2 e 3.
[0061] Em algumas modalidades, um valor IC50 é calculado para avaliar a potência de um construto de RNAi da invenção para inibir a expressão de PNPLA3 em células do fígado. Um "valor IC50" é a dose/concentração requerida para alcançar 50% de inibição de uma função biológica ou bioquímica. O valor IC50 de qualquer substância ou antagonista particular pode ser determinado construindo uma curva de resposta à dose e examinando o efeito de diferentes concentrações da substância ou antagonista nos níveis de expressão ou atividade funcional em qualquer ensaio.
Os valores IC50 podem ser calculados para um determinado antagonista ou substância determinando a concentração necessária para inibir metade da resposta biológica máxima ou níveis de expressão nativos.
Assim, o valor IC50 para qualquer construto de RNAi pode ser calculado determinando a concentração do construto de RNAi necessária para inibir metade do nível de expressão nativa de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, nível de expressão de PNPLA3 em células do fígado de controle) em qualquer ensaio, tal como o imunoensaio ou ensaio FISH de RNA ou ensaios de PCR digital com gotículas descritos nos Exemplos.
Os construtos de RNAi da invenção podem inibir a expressão de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, células Hep3B) com um IC50 menor do que cerca de 20 nM.
Por exemplo, os construtos de RNAi inibem a expressão de PNPLA3 em células do fígado com um IC50 de cerca de 0,001 nM até cerca de 20 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 10 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 5 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 1 nM, cerca de 0,1 nM até cerca de 10 nM, cerca de 0,1 nM até cerca de 5 nM ou cerca de 0,1 nM até cerca de 1 nM.
Em certas modalidades, o construto de RNAi inibe a expressão de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, células Hep3B) com um IC50 de cerca de 1 nM até cerca de 10 nM.
Os construtos de RNAi da invenção podem inibir a expressão de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, células HepG2) com um IC50 menor do que cerca de
20 nM. Por exemplo, os construtos de RNAi inibem a expressão de PNPLA3 em células do fígado com um IC50 de cerca de 0,001 nM até cerca de 20 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 10 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 5 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 1 nM, cerca de 0,1 nM até cerca de 10 nM, cerca de 0,1 nM até cerca de 5 nM ou cerca de 0,1 nM até cerca de 1 nM. Em certas modalidades, o construto de RNAi inibe a expressão de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, células HepG2) com um IC50 de cerca de 1 nM até cerca de 10 nM. Os construtos de RNAi da invenção podem inibir a expressão de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, células CHO transfectadas expressando PNPLA3 I148I ou I148M humano) com um IC50 menor do que cerca de 20 nM. Por exemplo, os construtos de RNAi inibem a expressão de PNPLA3 em células do fígado com um IC50 de cerca de 0,001 nM até cerca de 20 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 10 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 5 nM, cerca de 0,001 nM até cerca de 1 nM, cerca de 0,1 nM até cerca de 10 nM, cerca de 0,1 nM até cerca de 5 nM ou cerca de 0,1 nM até cerca de 1 nM. Em certas modalidades, o construto de RNAi inibe a expressão de PNPLA3 em células do fígado (por exemplo, células CHO transfectadas expressando PNPLA3 I148I ou I148M humano) com um IC50 de cerca de 1 nM até cerca de 10 nM.
[0062] Os construtos de RNAi da invenção podem ser facilmente preparados usando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, usando síntese de ácidos nucleicos em fase sólida convencional. Os polinucleotídeos dos construtos de RNAi podem ser montados em um sintetizador de ácidos nucleicos adequado utilizando precursores padrão de nucleotídeos ou nucleosídeos (por exemplo, fosforamidites). Sintetizadores de ácidos nucleicos automatizados são vendidos comercialmente por várias empresas, incluindo sintetizadores de DNA/RNA da Applied Biosystems (Foster City, CA), sintetizadores MerMade da BioAutomation (Irving,TX), e sintetizadores OligoPilot da GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA).
[0063] O grupo protetor 2'-silila pode ser usado em conjunção com dimetoxitritila (DMT) lábil em ácidos na posição 5' de ribonucleosídeos para sintetizar oligonucleotídeos via química de fosforamidite. É conhecido que as condições da desproteção final não degradam significativamente produtos de RNA. Todas as sínteses podem ser conduzidas em qualquer sintetizador automatizado ou manual em larga, média ou pequena escala. As sínteses também podem ser realizadas em placas de múltiplos poços, colunas, ou lâminas de vidro.
[0064] O grupo 2'-O-silila pode ser removido através de exposição a íons fluoreto, que podem incluir qualquer fonte de íon fluoreto, por exemplo, aqueles sais contendo íon fluoreto emparelhado com contraíons inorgânicos, por exemplo, fluoreto de césio e fluoreto de potássio, ou aqueles sais contendo íon fluoreto emparelhado com um contraíon orgânico, por exemplo, um fluoreto de tetra-alquilamônio. Um catalisador éter coroa pode ser utilizado em combinação com o fluoreto inorgânico na reação de desproteção. Fontes preferenciais de íons fluoreto são fluoreto de tetrabutilamônio ou amino- hidrofluoretos (por exemplo, combinando HF aquoso com trietilamina em um solvente aprótico dipolar, por exemplo, dimetilformamida).
[0065] A escolha de grupos protetores para uso nos triésteres de fosfito e fosfotriésteres pode alterar a estabilidade dos triésteres para o fluoreto. Proteção metila do fosfotriéster ou triéster de fosfito pode estabilizar a ligação contra íons fluoreto e melhorar rendimentos do processo.
[0066] Uma vez que ribonucleosídeos têm um substituinte 2'-hidroxila reativo, pode ser desejável proteger a posição 2' reativa em RNA com um grupo protetor que é ortogonal a um grupo protetor 5'-O-dimetoxitritila, por exemplo, um estável a tratamento com ácido. Grupos protetores silila cumprem este critério e podem ser facilmente removidos em um passo final de desproteção de fluoreto que pode resultar em degradação mínima de RNA.
[0067] Catalisadores tetrazol podem ser usados na reação de acoplamento de fosforamidite padrão. Catalisadores preferenciais incluem, por exemplo, tetrazol, S-etil-tetrazol, benziltiotetrazol, p- nitrofeniltetrazol.
[0068] Como será apreciado pelo técnico perito, métodos adicionais de síntese dos construtos de RNAi descritos aqui serão evidentes para os habitualmente peritos na técnica. Adicionalmente, os vários passos de síntese podem ser realizados em uma sequência ou ordem alternativa para originar os compostos desejados. Outras transformações de química sintética, grupos protetores (por exemplo, para hidroxila, amino, etc., presentes nas bases) e metodologias de grupos protetores (proteção e desproteção) úteis na síntese dos construtos de RNAi descritos aqui são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os descritos em R. Larock, "Comprehensive Organic Transformations", VCH Publishers (1989); T. W. Greene e P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2ª Edição, John Wiley and Sons (1991); L. Fieser e M. Fieser, "Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis", John Wiley and Sons (1994); e L. Paquette, editor, "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis", John Wiley and Sons (1995), e suas edições subsequentes. Síntese customizada de agentes de RNAi também é disponibilizada por vários vendedores comerciais, incluindo Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO), AxoLabs GmbH (Kulmbach, Alemanha), e Ambion, Inc. (Foster City, CA).
[0069] Os construtos de RNAi da invenção podem compreender um ligante. Como usado aqui, um "ligante" se relaciona com qualquer composto ou molécula que é capaz de interagir com outro composto ou molécula, direta ou indiretamente. A interação de um ligante com outro composto ou molécula pode induzir uma resposta biológica (por exemplo, iniciar uma cascata de transdução do sinal, induzir endocitose mediada por receptores) ou pode ser apenas uma associação física. O ligante pode modificar uma ou mais propriedades da molécula de RNA de fita dupla à qual é ligado, tais como as propriedades farmacodinâmicas, farmacocinéticas, de ligação, absorção, distribuição celular, captação celular, carga e/ou eliminação da molécula de RNA.
[0070] O ligante pode compreender uma proteína do soro (por exemplo, albumina de soro humano, lipoproteína de baixa densidade, globulina), uma fração colesterol, uma vitamina (biotina, vitamina E, vitamina B12), uma fração folato, um esteroide, um ácido biliar (por exemplo, ácido cólico), um ácido graxo (por exemplo, ácido palmítico, ácido mirístico), um carbo-hidrato (por exemplo, uma dextrana, pululana, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina ou ácido hialurônico), um glicosídeo, um fosfolipídeo, ou anticorpo ou seu fragmento de ligação (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação que dirige o construto de RNAi para um tipo específico de células, como do fígado). Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercaladores (por exemplo, acridinas), reticuladores (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, di-hidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, ácido adamantanoacético, ácido 1-pirenobutírico, di- hidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido 03- (oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)colênico, dimetoxitritila, ou fenoxazina), peptídeos (por exemplo, peptídeo antenapédia, peptídeo Tat, peptídeos RGD), agentes alquilantes, polímeros, tais como polietilenoglicol (PEG) (por exemplo, PEG-40K), poliaminoácidos e poliaminas (por exemplo, espermina, espermidina).
[0071] Em certas modalidades, os ligantes têm propriedades endossomolíticas. Os ligantes endossomolíticos promovem a lise do endossomo e/ou transporte do construto de RNAi da invenção, ou seus componentes, do endossomo para o citoplasma da célula. O ligante endossomolítico pode ser um peptídeo ou peptidomimético policatiônico que exibe atividade e fusogenicidade de membrana dependentes do pH. Em uma modalidade, o ligante endossomolítico assume a sua conformação ativa a pH endossomal. A conformação "ativa" é aquela conformação na qual o ligante endossomolítico promove a lise do endossomo e/ou transporte do construto de RNAi da invenção, ou seus componentes, do endossomo para o citoplasma da célula. Ligantes endossomolíticos exemplificativos incluem o peptídeo GALA (Subbarao et al., Biochemistry, Vol. 26: 2964-2972, 1987), o peptídeo EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 118: 1581-1586, 1996), e seus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, Vol.1559: 56-68, 2.002). Em uma modalidade, o componente endossomolítico pode conter um grupo químico (por exemplo, um aminoácido) que irá sofrer uma alteração da carga ou protonação em resposta a uma alteração do pH. O componente endossomolítico pode ser linear ou ramificado.
[0072] Em algumas modalidades, o ligante compreende um lipídeo ou outra molécula hidrofóbica. Em uma modalidade, o ligante compreende uma fração colesterol ou outro esteroide. Foi relatado que oligonucleotídeos conjugados a colesterol são mais ativos do que os seus correspondentes não conjugados (Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development, Vol. 12: 103-228, 2002). Ligantes compreendendo frações colesterol e outros lipídeos para conjugação a moléculas de ácidos nucleicos também foram descritos nas Patentes dos EUA N.os 7,851,615; 7,745,608; e 7,833,992, todas as quais são deste modo incorporadas a título de referência na sua totalidade. Em outra modalidade, o ligante compreende uma fração folato. Polinucleotídeos conjugados a frações folato podem ser recolhidos por células através de uma via de endocitose mediada por receptores. Tais conjugados folato- polinucleotídeo são descritos na Patente dos EUA N.º 8,188,247, que é deste modo incorporada a título de referência na sua totalidade.
[0073] Uma vez que PNPLA3 é expresso em células do fígado (por exemplo, hepatócitos), em certas modalidades, é desejável aplicar especificamente o construto de RNAi naquelas células do fígado. Em algumas modalidades, construtos de RNAi podem ser especificamente dirigidos para o fígado empregando ligantes que se ligam ou interagem com proteínas expressas na superfície de células do fígado. Por exemplo, em certas modalidades, os ligantes podem compreender proteínas de ligação a antígenos (por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação (por exemplo, Fab, scFv)) que se ligam especificamente a um receptor expresso em hepatócitos.
[0074] Em certas modalidades, o ligante compreende um carbo-hidrato. Um "carbo-hidrato" se relaciona com um composto constituído por uma ou mais unidades monossacarídicas tendo pelo menos 6 átomos de carbono (que pode ser linear, ramificado ou cíclico) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono. Carbo-hidratos incluem, mas sem limitação, os açúcares (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, tetrassacarídeos, e oligossacarídeos contendo desde cerca de 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades monossacarídicas), e polissacarídeos, tais como amidos, glicogênio, celulose e gomas polissacarídicas. Em algumas modalidades, o carbo-hidrato incorporado no ligante é um monossacarídeo selecionado de uma pentose, hexose ou heptose e di- e tri-sacarídeos incluindo tais unidades monossacarídicas. Em outras modalidades, o carbo-hidrato incorporado no ligante é um aminoaçúcar, tal como galactosamina, glucosamina, N-acetilgalactosamina, e N- acetilglucosamina.
[0075] Em algumas modalidades, o ligante compreende uma hexose ou hexosamina. A hexose pode ser selecionada de glicose, galactose, manose, fucose, ou frutose. A hexosamina pode ser selecionada de frutosamina, galactosamina, glucosamina ou manosamina. Em certas modalidades, o ligante compreende glicose, galactose, galactosamina, ou glucosamina. Em uma modalidade, o ligante compreende glicose, glucosamina, ou N- acetilglucosamina. Em outra modalidade, o ligante compreende galactose, galactosamina, ou N-acetil- galactosamina. Em modalidades particulares, o ligante compreende N-acetil-galactosamina. Ligantes compreendendo glicose, galactose, e N-acetil-galactosamina (GalNAc) são particularmente eficazes no direcionamento de compostos para células do fígado. Ver, por exemplo, D'Souza e Devarajan, J. Control Release, Vol. 203: 126-139, 2.015. Exemplos de ligantes contendo GalNAc ou galactose que podem ser incorporados nos construtos de RNAi da invenção são descritos nas Patentes dos EUA N.os 7,491,805; 8,106,022; e 8,877,917; Publicação de Patente dos EUA N.º 20030130186; e Publicação WIPO N.º WO2013166155, todas as quais são deste modo incorporadas a título de referência na sua totalidade.
[0076] Em certas modalidades, o ligante compreende uma fração carbo-hidrato multivalente. Como usado aqui, uma "fração carbo-hidrato multivalente" se relaciona com uma fração compreendendo duas ou mais unidades carbo- hidrato capazes de se ligarem ou interagirem independentemente com outras moléculas. Por exemplo, uma fração carbo-hidrato multivalente compreende dois ou mais domínios de ligação compreendidos por carbo-hidratos que se podem ligar a duas ou mais moléculas diferentes ou dois ou mais sítios diferentes na mesma molécula. A valência da fração carbo-hidrato designa o número de domínios de ligação individuais dentro da fração carbo-hidrato. Por exemplo, os termos "monovalente", "bivalente", "trivalente", e "tetravalente", relativamente à fração carbo-hidrato, se relacionam com frações carbo-hidrato com um, dois, três, e quatro domínios de ligação, respectivamente. A fração carbo-hidrato multivalente pode compreender uma fração lactose multivalente, uma fração galactose multivalente, uma fração glicose multivalente, uma fração N-acetil-galactosamina multivalente, uma fração N-acetil-glucosamina multivalente, uma fração manose multivalente, ou uma fração fucose multivalente. Em algumas modalidades, o ligante compreende uma fração galactose multivalente. Em outras modalidades, o ligante compreende uma fração N-acetil-galactosamina multivalente. Nestas e outras modalidades, a fração carbo- hidrato multivalente é bivalente, trivalente, ou tetravalente. Em tais modalidades, a fração carbo-hidrato multivalente pode ser biantenária ou triantenária. Em uma modalidade particular, a fração N-acetil-galactosamina multivalente é trivalente ou tetravalente. Em outra modalidade particular, a fração galactose multivalente é trivalente ou tetravalente. Ligantes contendo GalNAc trivalentes e tetravalentes exemplificativos para incorporação nos construtos de RNAi da invenção são descritos em detalhe abaixo.
[0077] O ligante pode ser ligado ou conjugado à molécula de RNA do construto de RNAi direta ou indiretamente. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é covalentemente ligado diretamente à fita sentido ou antissentido do construto de RNAi. Em outras modalidades, o ligante é ligado covalentemente através de um ligador à fita sentido ou antissentido do construto de RNAi. O ligante pode ser ligado a nucleobases, frações açúcar, ou ligações internucleotídicas de polinucleotídeos (por exemplo, fita sentido ou fita antissentido) dos construtos de RNAi da invenção. A conjugação ou ligação a nucleobases purina ou seus derivados pode ocorrer em qualquer posição, incluindo átomos endocíclicos e exocíclicos. Em certas modalidades, as posições 2, 6, 7 ou 8 de uma nucleobase purina são ligadas a um ligante. A conjugação ou ligação a nucleobases pirimidina ou seus derivados também pode ocorrer em qualquer posição. Em algumas modalidades, as posições 2, 5 e 6 de uma nucleobase pirimidina podem ser ligadas a um ligante. A conjugação ou ligação a frações açúcar de nucleotídeos pode ocorrer em qualquer átomo de carbono. Átomos de carbono exemplificativos de uma fração açúcar que podem ser ligados a um ligante incluem os átomos de carbono 2', 3' e 5'. A posição 1' também pode ser ligada a um ligante, tal como em um resíduo a básico. Ligações internucleotídicas também podem suportar ligações de ligantes. Para ligações contendo fósforo (por exemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, e similares), o ligante pode ser ligado diretamente ao átomo de fósforo ou a um átomo de O, N, ou S ligado ao átomo de fósforo. Para ligações internucleosídicas contendo amina ou amida (por exemplo, PNA), o ligante pode ser ligado ao átomo de nitrogênio da amina ou amida ou a um átomo de carbono adjacente.
[0078] Em certas modalidades, o ligante pode ser ligado à extremidade 3' ou 5' da fita sentido ou antissentido. Em certas modalidades, o ligante é covalentemente ligado à extremidade 5' da fita sentido. Em outras modalidades, o ligante é covalentemente ligado à extremidade 3' da fita sentido. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é ligado ao nucleotídeo 3'-terminal da fita sentido. Em certas de tais modalidades, o ligante é ligado na posição 3' do nucleotídeo 3'-terminal da fita sentido. Em modalidades alternativas, o ligante é ligado perto da extremidade 3' da fita sentido, mas antes de um ou mais nucleotídeos terminais (isto é, antes de 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos terminais). Em algumas modalidades, o ligante é ligado na posição 2' do açúcar do nucleotídeo 3'-terminal da fita sentido.
[0079] Em certas modalidades, o ligante é ligado à fita sentido ou antissentido via um ligador.
Um "ligador" é um átomo ou grupo de átomos une covalentemente um ligante a um componente polinucleotídico do construto de RNAi.
O ligador pode ter desde cerca de 1 até cerca de 30 átomos de comprimento, desde cerca de 2 até cerca de 28 átomos de comprimento, desde cerca de 3 até cerca de 26 átomos de comprimento, desde cerca de 4 até cerca de 24 átomos de comprimento, desde cerca de 6 até cerca de 20 átomos de comprimento, desde cerca de 7 até cerca de 20 átomos de comprimento, desde cerca de 8 até cerca de 20 átomos de comprimento, desde cerca de 8 até cerca de 18 átomos de comprimento, desde cerca de 10 até cerca de 18 átomos de comprimento, e desde cerca de 12 até cerca de 18 átomos de comprimento.
Em algumas modalidades, o ligador pode compreender uma fração de ligação bifuncional, que geralmente compreende uma fração alquila com dois grupos funcionais.
Um dos grupos funcionais é selecionado para se ligar ao composto de interesse (por exemplo, fita sentido ou antissentido do construto de RNAi) e o outro é selecionado para se ligar essencialmente a qualquer grupo selecionado, tal como um ligante, como descrito aqui.
Em certas modalidades, o ligador compreende uma estrutura em cadeia ou um oligômero de unidades repetidas, como unidades etilenoglicol ou aminoácido.
Exemplos de grupos funcionais que são tipicamente empregues em uma fração de ligação bifuncional incluem, mas sem limitação, eletrófilos para reagirem com grupos nucleofílicos e nucleófilos para reagirem com grupos eletrofílicos.
Em algumas modalidades, frações de ligação bifuncionais incluem amino, hidroxila, ácido carboxílico, tiol, insaturações (por exemplo, ligações duplas ou triplas), e similares.
[0080] Ligadores que podem ser usados para ligar um ligante à fita sentido ou antissentido nos construtos de RNAi da invenção incluem, mas sem limitação, pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, 4-(N- maleimidometi1)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila, ácido 6-amino-hexanoico, C1-C10 alquila substituído, C2-C10 alquenila substituído ou não substituído ou C2-C10 alquinila substituído ou não substituído. Grupos substituintes preferenciais para tais ligadores incluem, mas sem limitação, hidroxila, amino, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro, tiol, tioalcóxi, halogênio, alquila, arila, alquenila e alquinila.
[0081] Em certas modalidades, os ligadores são cliváveis. Um ligador clivável é tal que é suficientemente estável fora da célula mas que, ao entrar em uma célula- alvo, é clivado, liberando as duas partes que o ligador mantém juntas. Em algumas modalidades, o ligador clivável é clivado pelo menos 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais ou pelo menos 100 vezes mais rapidamente na célula- alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode ser selecionada, por exemplo, para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um sujeito, ou sob uma segunda condição de referência (que pode ser selecionada, por exemplo, para imitar ou representar condições presentes no sangue ou soro).
[0082] Ligadores cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou a presença de moléculas de degradação. Em geral, agentes de clivagem são mais prevalentes ou se encontram em níveis ou atividades mais elevados dentro de células do que em soro ou sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade para substratos, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores, como mercaptanas, presentes em células, que podem degradar por redução um ligador clivável por redox; esterases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que originam um pH de cinco ou menor; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um ligador clivável por ácido ao atuarem como um ácido genérico, peptidases (que podem ser específicas para substratos), e fosfatases.
[0083] Um ligador clivável pode compreender uma fração que é suscetível ao pH. O pH do soro humano é 7,4, ao passo que o pH intracelular médio é ligeiramente menor, variando entre cerca de 7,1-7,3. Endossomos têm um pH mais ácido, situado no intervalo de 5,5-6,0, e lisossomos têm um pH ainda mais ácido, de cerca de 5,0. Alguns ligadores terão um grupo clivável que é clivado a um pH preferencial, desse modo liberando a molécula de RNA do ligante dentro da célula, ou no interior do compartimento desejado da célula.
[0084] Um ligador pode incluir um grupo clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo clivável incorporado em um ligador pode depender da célula a ser visada. Por exemplo, ligantes visando o fígado podem ser ligados a moléculas de RNA através de um ligador que inclui um grupo éster. As células do fígado são ricas em esterases, e consequentemente o ligador será clivado de modo mais eficiente em células do fígado do que em tipos de células que não são ricas em esterases. Outros tipos de células ricas em esterases incluem células do pulmão, córtex renal, e testículos. Ligadores que contêm ligações peptídicas podem ser usados quando o alvo são células ricas em peptidases, como células do fígado e sinoviócitos.
[0085] Em geral, a conveniência de um ligador clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente (ou condição) de degradação para clivar o ligador candidato. Também será desejável testar o ligador clivável candidato quanto à capacidade para resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim, é possível determinar a suscetibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, em que a primeira é selecionada de modo a ser indicadora de clivagem em uma célula-alvo e a segunda é selecionada de modo a ser indicadora de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo, sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sistemas desprovidos de células, em células, em cultura de células, em cultura de órgãos ou tecidos, ou em animais completos. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições desprovidas de células ou de cultura e confirmar, mediante avaliações adicionais, em animais completos. Em algumas modalidades, ligadores candidatos úteis são clivados pelo menos 2, 4, 10, 20, 50, 70 ou 100 vezes mais rapidamente na célula (ou sob condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições extracelulares).
[0086] Em outras modalidades, ligadores cliváveis por redox são utilizados. Ligadores cliváveis por redox são clivados por redução ou oxidação. Um exemplo de um grupo clivável de modo redutor é um grupo de ligação dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um ligador clivável candidato é um "ligador clivável de modo redutor" adequado, ou, por exemplo, é adequado para uso com um construto de RNAi particular e ligante particular, é possível usar um ou mais métodos descritos aqui. Por exemplo, um ligador candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outro agente redutor conhecido na técnica, que imita a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula- alvo. Os ligadores candidatos também podem ser avaliados em condições que são selecionadas de modo a imitar condições do sangue ou soro. Em uma modalidade específica, ligadores candidatos são clivados no máximo em 10% no sangue. Em outras modalidades, ligadores candidatos úteis são degradados pelo menos 2, 4, 10, 20, 50, 70 ou 100 vezes mais rapidamente na célula (ou sob condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições intracelulares) em comparação com sangue (ou sob condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições extracelulares).
[0087] Ainda em outras modalidades, ligadores cliváveis à base de fosfato são clivados por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que hidrolisa grupos fosfato em células são enzimas, tais como fosfatases em células. Exemplos de grupos cliváveis à base de fosfato são -O-P(O)(ORk)-O-, - O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O- P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S- P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S- P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)- S-. Modalidades específicas incluem -O-P(O)(OH)-O-, -O- P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)- S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -SP(S)(OH)-O-, -O- P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Outra modalidade específica é -O-P(O)(OH)-O-. Estes ligadores candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
[0088] Em outras modalidades, os ligadores podem compreender grupos cliváveis por ácido, que são grupos que são clivados sob condições ácidas. Em algumas modalidades, grupos cliváveis por ácido são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou menor (por exemplo, cerca de 6,0, 5,5, 5,0 ou menor), ou por agentes, tais como enzimas, que podem atuar como um ácido genérico. Em uma célula, organelos específicos de pH baixo, como endossomos e lisossomos, podem proporcionar um ambiente de clivagem para grupos cliváveis por ácido. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácido incluem mas não estão limitados a hidrazonas, ésteres, e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O, ou -OC(O). Uma modalidade específica é quando o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído, ou grupo alquila terciário, como dimetila, pentila ou t-butila. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
[0089] Em outras modalidades, os ligadores podem compreender grupos cliváveis à base de éster, que são clivados por enzimas, tais como esterases e amidases, em células. Exemplos de grupos cliváveis à base de éster incluem mas não estão limitados a ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Grupos cliváveis por éster têm a fórmula geral -C(O)O-, ou -OC(O) -. Estes ligadores candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
[0090] Em modalidades adicionais, os ligadores podem compreender grupos cliváveis à base de peptídeo, que são clivados por enzimas, tais como peptidases e proteases, em células. Grupos cliváveis à base de peptídeo são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para originar oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. Grupos cliváveis à base de peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquinileno. Uma ligação peptídica é um tipo especial de ligação amida formada entre aminoácidos para dar origem a peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem à base de peptídeo está geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação amida) formada entre aminoácidos, dando origem a peptídeos e proteínas, e não inclui a totalidade do grupo funcional amida. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo têm a fórmula geral – NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, em que RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
[0091] Outros tipos de ligadores adequados para ligar ligantes às fitas sentido ou antissentido nos construtos de RNAi da invenção são conhecidos na técnica e podem incluir os ligadores descritos nas Patentes dos EUA N.os 7,723,509; 8,017,762; 8,828,956; 8,877,917; e 9,181,551, todas as quais são deste modo incorporadas a título de referência na sua totalidade.
[0092] Em certas modalidades, o ligante covalentemente ligado à fita sentido ou antissentido dos construtos de RNAi da invenção compreende uma fração GalNAc, por exemplo, uma fração GalNAc multivalente. Em algumas modalidades, a fração GalNAc multivalente é uma fração GalNAc trivalente e é ligada à extremidade 3' da fita sentido. Em outras modalidades, a fração GalNAc multivalente é uma fração GalNAc trivalente e é ligada à extremidade 5' da fita sentido. Ainda em outras modalidades, a fração GalNAc multivalente é uma fração GalNAc tetravalente e é ligada à extremidade 3' da fita sentido. Ainda em outras modalidades, a fração GalNAc multivalente é uma fração GalNAc tetravalente e é ligada à extremidade 5' da fita sentido.
[0093] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi da invenção podem ser aplicados em uma célula ou tecido de interesse por administração de um vetor que codifica e controla a expressão intracelular do construto de RNAi.
Um "vetor" (também referido aqui como "vetor de expressão") é uma composição de matéria que pode ser usada para administrar um ácido nucleico de interesse no interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo “vetor” inclui um plasmídeo ou um vírus de replicação autônoma. Exemplos de vetores virais incluem, mas não estão limitados a, vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores retrovirais, e similares. Um vetor pode ser replicado em uma célula viva ou pode ser preparado sinteticamente.
[0094] Geralmente, um vetor para expressar um construto de RNAi da invenção compreenderá um ou mais promotores operavelmente ligados a sequências codificando o construto de RNAi. A frase "operavelmente ligado" ou "sob o controle da transcrição", como usada aqui, significa que o promotor está na localização e orientação corretas em relação a uma sequência polinucleotídica para controlar a iniciação da transcrição por RNA polimerase e expressão da sequência polinucleotídica. Um "promotor" se relaciona com uma sequência reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou maquinaria sintética introduzida, requerida para iniciar a transcrição específica de uma sequência genética. Promotores adequados incluem, mas sem limitação, RNA pol I, pol II, HI ou U6 RNA pol III, e promotores virais (por exemplo, promotor genético inicial imediato do citomegalovírus humano (CMV), promotor inicial do SV40, e a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous). Em algumas modalidades, um promotor HI ou U6RNA pol III é preferencial. O promotor pode ser um promotor específico para tecidos ou induzível. Têm interesse particular promotores específicos para o fígado, tais como sequências promotoras do gene de alfa-antitripsina humana, gene de albumina, gene de hemopexina e gene de lipase hepática. Promotores induzíveis incluem promotores regulados por ecdisona, estrógeno, progesterona, tetraciclina, e isopropil-PD1-tiogalactopiranosídeo (IPTG).
[0095] Em algumas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende um siRNA, as duas fitas separadas (fita sentido e antissentido) podem ser expressas a partir de um único vetor ou de dois vetores separados. Por exemplo, em uma modalidade, a sequência codificando a fita sentido é operavelmente ligada a um promotor em um primeiro vetor e a sequência codificando a fita antissentido é operavelmente ligada a um promotor em um segundo vetor. Em tal modalidade, o primeiro e segundo vetores são cointroduzidos, por exemplo, por infecção ou transfecção, em uma célula-alvo, de modo que as fitas sentido e antissentido, depois de transcritas, irão hibridar intracelularmente para formar a molécula de siRNA. Em outra modalidade, as fitas sentido e antissentido são transcritas a partir de dois promotores separados localizados em um único vetor. Em algumas de tais modalidades, a sequência codificando a fita sentido é operavelmente ligada a um primeiro promotor e a sequência codificando a fita antissentido é operavelmente ligada a um segundo promotor, em que o primeiro e segundo promotores estão localizados em um único vetor. Em uma modalidade, o vetor compreende um primeiro promotor operavelmente ligado a uma sequência codificando a molécula de siRNA, e um segundo promotor operavelmente ligado à mesma sequência na direção oposta, de modo que a transcrição da sequência a partir do primeiro promotor resulta na síntese da fita sentido da molécula de siRNA e a transcrição da sequência a partir do segundo promotor resulta na síntese da fita antissentido da molécula de siRNA.
[0096] Em outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende um shRNA, uma sequência codificando a única molécula de RNA pelo menos parcialmente autocomplementar é operavelmente ligada a um promotor para produzir um único transcrito. Em algumas modalidades, a sequência codificando o shRNA compreende uma repetição invertida unida por uma sequência polinucleotídica ligadora para produzir a estrutura de haste e alça do shRNA após a transcrição.
[0097] Em algumas modalidades, o vetor codificando um construto de RNAi da invenção é um vetor viral. Vários sistemas de vetores virais que são adequados para expressar os construtos de RNAi descritos aqui incluem, mas sem limitação, vetores adenovirais, vetores retrovirais (por exemplo, vetores lentivirais, vírus da leucemia murina de Maloney), vetores virais adenoassociados; vetores virais de herpes simplex; vetores do SV 40; vetores virais de polioma; vetores virais de papiloma; vetores picornavirais; e vetores poxvirais (por exemplo, vírus vaccinia). Em certas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral (por exemplo, vetor lentiviral).
[0098] Vários vetores adequados para uso na invenção, métodos para inserir sequências de ácidos nucleicos codificando moléculas de siRNA ou shRNA em vetores, e métodos para administrar os vetores nas células de interesse pertencem ao âmbito dos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Dornburg, Gene Therap., Vol. 2: 301- 310, 1995; Eglitis, Biotechniques, Vol. 6: 608-614, 1988; Miller, HumGene Therap., Vol. 1: 5-14, 1990; Anderson, Nature, Vol. 392: 25-30, 1998; Rubinson D A et al., Nat. Genet., Vol. 33: 401-406, 2003; Brummelkamp et al., Science, Vol. 296: 550-553, 2002; Brummelkamp et al., Cancer Cell, Vol. 2: 243-247, 2002; Lee et al., Nat Biotechnol, Vol. 20:500-505, 2002; Miyagishi et al., Nat Biotechnol, Vol. 20: 497-500, 2002; Paddison et al., GenesDev, Vol. 16: 948-958, 2002; Paul et al., Nat Biotechnol, Vol. 20: 505-508, 2002; Sui et al., ProcNatl Acad Sci USA, Vol. 99: 5515-5520, 2002; e Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 99:6047-6052, 2002, todos os quais são deste modo incorporados a título de referência na sua totalidade.
[0099] A presente invenção também inclui composições e formulações farmacêuticas compreendendo os construtos de RNAi descritos aqui e transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições e formulações são úteis para reduzir a expressão de PNPLA3 em um sujeito necessitado. Quando forem contempladas aplicações clínicas, composições e formulações farmacêuticas serão preparadas em uma forma apropriada para a aplicação pretendida. Geralmente, tal implicará preparar composições que estão essencialmente desprovidas de pirogênios, bem como outras impurezas que podem ser nocivas para humanos ou animais.
[0100] As frases "farmaceuticamente aceitáveis" ou "farmacologicamente aceitáveis" se relacionam com entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras indesejáveis quando administradas a um animal ou um humano. Como usado aqui, "transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção e similares aceitáveis para uso na formulação de agentes farmacêuticos, tais como agentes farmacêuticos adequados para administração a humanos. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Excetuando no caso de qualquer meio ou agente convencional ser incompatível com os construtos de RNAi da presente invenção, é contemplado o seu uso em composições terapêuticas. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições, desde que não inativem os vetores ou construtos de RNAi das composições.
[0101] Composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de alguns critérios, incluindo, mas sem limitação, a via de administração, tipo e extensão da doença ou distúrbio a ser tratado, ou dose a ser administrada. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas com base na via de administração pretendida. Por exemplo, em certas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas para administração parenteral. Formas de administração parenteral incluem injeção ou infusão intravenosa, intra- arterial, subcutânea, intratecal, intraperitoneal ou intramuscular. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa. Em tal modalidade, a composição farmacêutica pode incluir um veículo de administração à base de lipídeo. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada para administração subcutânea. Em tal modalidade, a composição farmacêutica pode incluir um ligante de direcionamento (por exemplo, ligantes contendo GalNAc descritos aqui).
[0102] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de um construto de RNAi descrito aqui. Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para produzir um resultado clínico benéfico ou desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para reduzir a expressão de PNPLA3 em hepatócitos de um sujeito. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz pode ser uma quantidade suficiente para reduzir apenas parcialmente a expressão de PNPLA3, por exemplo, para um nível comparável à expressão do alelo de PNPLA3 de tipo selvagem em heterozigotas humanos. Foi relatado que transportadores heterozigóticos humanos de alelos variantes de PNPLA3 com perda de função têm menores níveis no soro de colesterol não HDL e um risco menor de doença de artérias coronárias e enfarte do miocárdio em comparação com não transportadores (Nioi et al., New England Journal of
Medicine, Vol. 374(22):2131-2141, 2016). Assim, sem ficar restringido pela teoria, se crê que uma redução parcial da expressão de PNPLA3 pode ser suficiente para alcançar a redução benéfica de colesterol não HDL no soro e redução do risco de doença de artérias coronárias e enfarte do miocárdio.
[0103] Uma quantidade eficaz de um construto de RNAi da invenção pode ir desde cerca de 0,01 mg/kg de peso do corpo até cerca de 100 mg/kg de peso do corpo, cerca de 0,05 mg/kg de peso do corpo até cerca de 75 mg/kg de peso do corpo, cerca de 0,1 mg/kg de peso do corpo até cerca de 50 mg/kg de peso do corpo, cerca de 1 mg/kg até cerca de 30 mg/kg de peso do corpo, cerca de 2,5 mg/kg de peso do corpo até cerca de 20 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 5 mg/kg de peso do corpo até cerca de 15 mg/kg de peso do corpo. Em certas modalidades, uma única dose eficaz de um construto de RNAi da invenção pode ser cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg. A composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de construto de RNAi pode ser administrada semanal, bissemanal, mensal, trimestral, ou bianualmente. A determinação precisa do que será considerado uma quantidade eficaz e frequência da administração pode se basear em vários fatores, incluindo a estatura, idade, e estado geral de saúde do paciente, tipo de distúrbio a ser tratado (por exemplo, enfarte do miocárdio, falha cardíaca, doença de artérias coronárias,
hipercolesterolemia), construto de RNAi particular empregue, e via de administração. Estimativas de dosagens eficazes e meias vidas in vivo para qualquer construto de RNAi da invenção particular podem ser determinadas usando métodos convencionais e/ou realização de testes em modelos animais apropriados.
[0104] A administração das composições farmacêuticas da presente invenção pode ser efetuada através de qualquer via comum desde que o tecido-alvo esteja disponível através dessa via. Tais vias incluem, mas sem limitação, as vias parenteral (por exemplo, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa), oral, nasal, bucal, intradérmica, transdérmica e sublingual, ou por injeção direta em tecido do fígado ou administração através da veia portal hepática. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada parenteralmente. Por exemplo, em certas modalidades, a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é administrada subcutaneamente.
[0105] Sistemas de dispersões coloidais, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esférulas, e sistemas à base de lipídeo, incluindo emulsões óleo-em-água, micélios, micélios mistos, e lipossomos, podem ser usados como veículos de administração para os construtos de RNAi da invenção ou vetores codificando tais construtos. Emulsões graxas comercialmente disponíveis que são adequadas para administrar os ácido nucleicos da invenção incluem Intralipid®, Liposyn®, Liposyn®II, Liposyn®III,
Nutrilipid e outras emulsões lipídicas similares. Um sistema coloidal preferencial para uso como veículo de administração in vivo é um lipossomo (isto é, uma vesícula de membrana artificial). Os construtos de RNAi da invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomos ou podem formar complexos com aqueles, em particular com lipossomos catiônicos. Alternativamente, construtos de RNAi da invenção podem ser complexados com lipídeos, em particular com lipídeos catiônicos. Lipídeos e lipossomos adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina), negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG)), e catiônicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropila (DOTAP) e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOTMA)). A preparação e uso de tais sistemas de dispersões coloidais são bem conhecidos na técnica. Formulações exemplificativas também são reveladas na Pat. dos EUA N.º 5,981,505; Pat. dos EUA N.º 6,217,900; Pat. dos EUA N.º 6,383,512; Pat. dos EUA N.º 5,783,565; Pat. dos EUA N.º 7,202,227; Pat. dos EUA N.º 6,379,965; Pat. dos EUA N.º. 6,127,170; Pat. dos EUA N.º 5,837,533; Pat. dos EUA N.º 6,747,014; e W003/093449.
[0106] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi da invenção são totalmente encapsulados em uma formulação lipídica, por exemplo, para formar uma SPLP, pSPLP, SNALP, ou outra partícula ácido nucleico-lipídeo. Como usado aqui, o termo "SNALP" se relaciona com uma partícula ácido nucleico-lipídeo estável, incluindo SPLP. Como usado aqui, o termo "SPLP" se relaciona com uma partícula ácido nucleico-lipídeo compreendendo DNA plasmídico encapsulado dentro de uma vesícula lipídica. SNALP e SPLP contêm tipicamente um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um lipídeo que previne a agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídeo). SNALPs e SPLPs são excecionalmente úteis para aplicações sistêmicas, uma vez que exibem tempos de vida em circulação prolongados após injeção intravenosa e se acumulam em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados do sítio da administração). SPLP incluem "pSPLP," que incluem um complexo de agente de condensação-ácido nucleico encapsulado como apresentado na Publicação PCT N.º WO00/03683. As partículas ácido nucleico-lipídeo têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm até cerca de 150 nm, cerca de 60 nm até cerca de 130 nm, cerca de 70 nm até cerca de 110 nm ou cerca de 70 nm até cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Adicionalmente, os ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas ácido nucleico-lipídeo, são resistentes em solução aquosa a degradação com uma nuclease. Partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são revelados, por exemplo, nas Patentes dos EUA N.os 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; e Publicação PCT N.º WO96/40964.
[0107] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas esterilizadas e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Geralmente, estas preparações são esterilizadas e fluidas no sentido de que existe capacidade de injeção fácil. As preparações devem ser estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e devem ser conservadas contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. Solventes ou meios de dispersão apropriados podem conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e similares), suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, usando um revestimento, tal como lecitina, mantendo o tamanho desejado das partículas no caso de dispersão, e usando tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0108] Soluções injetáveis esterilizadas podem ser preparadas incorporando os compostos ativos, em uma quantidade apropriada, em um solvente juntamente com quaisquer outros ingredientes (por exemplo, como enumerado acima) consoante o desejado, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes desejados, por exemplo, como enumerado acima. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos preferenciais de preparação incluem técnicas de secagem a vácuo e dessecação que geram um pó do(s) ingrediente(s) ativo(s) mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.
[0109] As composições da presente invenção podem ser geralmente formuladas em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais de adição de ácido (formados com grupos amino livres) derivados de ácidos inorgânicos (por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico), ou a partir de ácidos orgânicos (por exemplo, acético, oxálico, tartárico, mandélico, e similares). Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas (por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico) ou de bases orgânicas (por exemplo, isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares).
[0110] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução geralmente é adequadamente tamponada e o diluente líquido é primeiramente tornado isotônico, por exemplo, com solução salina ou de glicose suficiente. Tais soluções aquosas podem ser usadas, por exemplo, para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Preferencialmente são empregues meios aquosos esterilizados como é conhecido dos peritos na técnica, particularmente à luz da presente revelação. A título ilustrativo, uma única dose pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no sítio proposto de infusão (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Para administração humana, as preparações devem cumprir padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza como requerido por padrões da FDA. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende ou consiste em uma solução salina esterilizada e um construto de RNAi descrito aqui. Em outras modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende ou consiste em um construto de RNAi descrito aqui e água esterilizada (por exemplo, água para injeção, API). Ainda em outras modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende ou consiste em um construto de RNAi descrito aqui e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0111] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção são embaladas com ou armazenadas dentro de um dispositivo para administração. Dispositivos para formulações injetáveis incluem, mas sem limitação, portos de injeção, seringas pré-cheias, autoinjetores, bombas de injeção, injetores no corpo ("on-body injectors"), e canetas de injeção. Dispositivos para formulações aerossolizadas ou em pó incluem, mas sem limitação, inaladores, insufladores, aspiradores, e similares. Assim, a presente invenção inclui dispositivos de administração compreendendo uma composição farmacêutica da invenção para tratar ou prevenir um ou mais dos distúrbios descritos aqui. Métodos para inibir a expressão de PNPLA3
[0112] A presente invenção também proporciona métodos para inibir a expressão de um gene PNPLA3 em uma célula. Os métodos incluem contatar uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de fita dupla, em uma quantidade eficaz para inibir a expressão de PNPLA3 na célula, desse modo inibindo a expressão de PNPLA3 na célula. O contato de uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de fita dupla, pode ser efetuado in vitro ou in vivo. Contatar uma célula in vivo com o agente de RNAi inclui contatar uma célula ou grupo de células dentro de um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, com o agente de RNAi. Também são possíveis combinações de métodos in vitro e in vivo para o contato de uma célula.
[0113] A presente invenção proporciona métodos para reduzir ou inibir a expressão de PNPLA3 em um sujeito necessitado, bem como métodos para tratar ou prevenir de afecções, doenças, ou distúrbios associados a expressão ou atividade de PNPLA3. Uma "afecção, doença, ou distúrbio associado a expressão de PNPLA3" se relaciona com afecções, doenças, ou distúrbios nos quais os níveis de expressão de PNPLA3 estão alterados ou nos quais níveis de expressão elevados de PNPLA3 estão associados a um risco aumentado de desenvolver a afecção, doença ou distúrbio.
[0114] O contato de uma célula pode ser direto ou indireto, como discutido acima. Além disso, o contato de uma célula pode ser efetuado via um ligante de direcionamento, incluindo qualquer ligante descrito aqui ou conhecido na técnica. Em modalidades preferenciais, o ligante de direcionamento é uma fração carbo-hidrato, por exemplo, um ligante GalNAc3, ou qualquer outro ligante que dirija o agente de RNAi para um sítio de interesse.
[0115] Em uma modalidade, contatar uma célula com um RNAi inclui "introduzir" ou "administrar o RNAi dentro da célula" facilitando ou efetivando a captação ou absorção para o interior da célula. A absorção ou captação de um RNAi pode ocorrer através de processos celulares difusivos ou ativos não auxiliados, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. A introdução de um RNAi em uma célula pode ser efetuada in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, para introdução in vivo, RNAi pode ser injetado em um sítio de tecido ou administrado sistemicamente. Introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica tais como eletroporação e lipofecção. Outras abordagens são descritas aqui abaixo e/ou são conhecidas na técnica.
[0116] O termo “inibir”, como usado aqui, é usado alternadamente com “reduzir”, “silenciar”, “sub-regular”, “suprimir” e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição.
[0117] É pretendido que a frase "inibir a expressão de um PNPLA3" se relacione com inibição da expressão de qualquer gene PNPLA3 (tal como, por exemplo, um gene PNPLA3 de camundongo, um PNPLA3 de rato, um gene PNPLA3 de macaco, ou um gene PNPLA3 humano) bem como variantes ou mutantes de um gene PNPLA3. Assim, o gene PNPLA3 pode ser um gene PNPLA3 de tipo selvagem, um gene PNPLA3 mutante
(tal como um gene PNPLA3 mutante originando deposição de amiloide), ou um gene PNPLA3 transgênico no contexto de uma célula, grupo de células, ou organismo geneticamente manipulado.
[0118] "Inibir a expressão de um gene PNPLA3" inclui qualquer nível de inibição de um gene PNPLA3, por exemplo, supressão pelo menos parcial da expressão de um gene PNPLA3. A expressão do gene PNPLA3 pode ser avaliada com base no nível ou na alteração do nível de qualquer variável associada à expressão de um gene PNPLA3, por exemplo, nível de mRNA de PNPLA3, nível de proteína PNPLA3 ou o número ou extensão de depósitos de amiloide. Este nível pode ser avaliado em uma célula individual ou em um grupo de células, incluindo, por exemplo, uma amostra derivada de um sujeito.
[0119] A inibição pode ser avaliada por um decréscimo de um nível absoluto ou relativo de uma ou mais variáveis que estão associadas a expressão de PNPLA3 em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que seja utilizado na técnica, por exemplo, um nível de referência pré-dose, ou um nível determinado a partir de um sujeito, célula, ou amostra similar que não é tratado ou é tratado com um controle (tal como, por exemplo, controle só de tampão ou controle de agente inativo). Em algumas modalidades dos métodos da invenção, a expressão de um gene PNPLA3 é inibida em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%,
pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%.
[0120] A inibição da expressão de um gene PNPLA3 pode se manifestar por uma redução da quantidade de mRNA expressa por uma primeira célula ou grupo de células (tais células podem estar presentes, por exemplo, em uma amostra derivada um sujeito) no qual um gene PNPLA3 é transcrito e que foi ou tem sido tratado (por exemplo, por contato da célula ou células com um agente de RNAi da invenção, ou por administração de um agente de RNAi da invenção a um sujeito no qual as células estão ou estiveram presentes) de modo que a expressão de um gene PNPLA3 é inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células mas que não foi ou não tem sido tratado desse modo (célula(s) de controle). Em modalidades preferenciais, a inibição é avaliada expressando o nível de mRNA em células tratadas como percentagem do nível de mRNA em células de controle, usando a seguinte fórmula: (mRNA em células de controle) - (mRNA em células tratadas) ————————————————————————— · 100% (mRNA em células de controle)
[0121] Alternativamente, a inibição da expressão de um gene PNPLA3 pode ser avaliada em termos de uma redução de um parâmetro que está funcionalmente ligado a expressão de um gene PNPLA3, por exemplo, expressão de proteína PNPLA3 ou atividades de proteínas da via Hedgehog. O silenciamento de um gene PNPLA3 pode ser determinado em qualquer célula expressando PNPLA3, de modo constitutivo ou por engenharia genômica, e por qualquer ensaio conhecido na técnica.
[0122] A inibição da expressão de uma proteína PNPLA3 pode se manifestar por uma redução do nível da proteína PNPLA3 que é expresso por uma célula ou grupo de células (por exemplo, o nível de proteína expressa em uma amostra derivada de um sujeito). Como explicado acima, para a avaliação da supressão de mRNA, a inibição de níveis de expressão de proteína em uma célula ou grupo de células tratado pode ser similarmente expressa como percentagem do nível de proteína em uma célula ou grupo de células de controle.
[0123] Uma célula ou grupo de células de controle que pode ser usado para avaliar a inibição da expressão de um gene PNPLA3 inclui uma célula ou grupo de células que ainda não foi contatado com um agente de RNAi da invenção. Por exemplo, a célula ou grupo de células de controle pode ser derivado de um sujeito individual (por exemplo, um sujeito humano ou animal) antes do tratamento do sujeito com um agente de RNAi.
[0124] O nível de mRNA de PNPLA3 que é expresso por uma célula ou grupo de células, ou o nível de mRNA em circulação de PNPLA3, pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para avaliar a expressão de mRNA. Em uma modalidade, o nível de expressão de PNPLA3 em uma amostra é determinado detectando um polinucleotídeo transcrito, ou sua porção, por exemplo, mRNA do gene PNPLA3. RNA pode ser extraído de células usando técnicas de extração RNA incluindo, por exemplo, usar extração ácida com fenol/isotiocianato de guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparação de RNA RNeasy (Qiagen) ou PAXgene (PreAnalytix, Suíça). Formatos típicos de ensaio utilizando hibridação de ácidos ribonucleicos incluem ensaios de transcrição em núcleos isolados ("nuclear run- on"), RT-PCR, ensaios de proteção contra RNases (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), transferência Northern, hibridação in situ, e análise de microsséries. mRNA de PNPLA3 em circulação pode ser detectado usando métodos descritos em PCT/US2012/043584, cuja totalidade do conteúdo é deste modo incorporada aqui a título de referência.
[0125] Em uma modalidade, o nível de expressão de PNPLA3 é determinado usando uma sonda de ácido nucleico. O termo "sonda", como usado aqui, se relaciona com qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a um PNPLA3 específico. Sondas podem ser sintetizadas pelo perito na técnica, ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. As sondas podem ser especificamente planejadas para serem etiquetadas. Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, mas sem limitação, RNA, DNA, proteínas, anticorpos e moléculas orgânicas.
[0126] mRNA isolado pode ser usado em ensaios de hibridação ou amplificação que incluem, mas sem limitação, análises Southern ou Northern, análises de reação em cadeia de polimerase PCR) e séries de sondas. Um método para a determinação de níveis de mRNA envolve contatar o mRNA isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridar com mRNA de PNPLA3. Em uma modalidade, o mRNA é imobilizado sobre uma superfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo, processando o mRNA isolado em um gel de agarose e transferindo o mRNA do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. Em uma modalidade alternativa, a(s) sonda(s) são imobilizadas sobre uma superfície sólida e o mRNA é contatado com a(s) sonda(s), por exemplo, em uma série de chips genéticos da Affymetrix. O perito pode facilmente adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na determinação do nível de mRNA de PNPLA3.
[0127] Um método alternativo para determinar o nível de expressão de PNPLA3 em uma amostra envolve o processo de amplificação de ácidos nucleicos e/ou transcriptase reversa (para preparar cDNA), por exemplo, de mRNA na amostra, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental apresentada em Mullis, 1987, Pat. dos EUA N.º 4,683,202), reação em cadeia de ligase (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193), replicação de sequências autossustentada (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificação da transcrição (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197), replicação por círculo rolante (Lizardi et al., Pat. dos EUA N.º 5,854,033) ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucleicos, seguido de detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácidos nucleicos se tais moléculas estiverem presentes em números muito baixos. Em aspectos particulares da invenção, o nível de expressão de PNPLA3 é determinado por RT-PCR fluorogênica quantitativa (isto é, o Sistema TaqMan™). Os níveis de expressão de mRNA de PNPLA3 podem ser monitorados usando uma coloração em membrana (como usado em análise de hibridação, como Northern, Southern, em pontos e similares) ou micropoços, tubos de amostra, géis, esférulas ou fibras (ou qualquer suporte sólido compreendendo ácidos nucleicos ligados). Ver Pat. dos EUA N.os 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 e 5,445,934, que são incorporadas aqui a título de referência. A determinação do nível de expressão de PNPLA3 também pode compreender usar sondas de ácidos nucleicos em solução.
[0128] Em modalidades preferenciais, o nível de expressão de mRNA é avaliado usando ensaios de DNA ramificado (bDNA) ou PCR em tempo real (qPCR). O uso destes métodos é descrito e exemplificado nos Exemplos apresentados aqui.
[0129] O nível de expressão de proteína PNPLA3 pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para a medição de níveis de proteínas. Tais métodos incluem, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hiperdifusão, reações com precipitina em fluido ou em gel, espectroscopia de absorção, ensaios colorimétricos, ensaios espectrofotométricos, citometria de fluxo, imunodifusão (simples ou dupla), Imunoeletroforese, transferência Western, radioimunoensaio (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA), ensaios imunofluorescentes, ensaios de eletroquimioluminescência, e similares.
[0130] Em algumas modalidades, a eficácia dos métodos da invenção pode ser monitorada detectando ou monitorando uma redução em um sintoma de uma doença associada a PNPLA3, tal como redução do inchaço de edema das extremidades, face, laringe, trato respiratório superior, abdômen, tronco e genitais, pródromo; inchaço da laringe; erupção não prurítica; náusea; vômito; ou dor abdominal. Estes sintomas podem ser avaliados in vitro ou in vivo usando qualquer método conhecido na técnica.
[0131] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o agente de RNAi é administrado a um sujeito de modo que o agente de RNAi é aplicado em um sítio específico dentro do sujeito. A inibição da expressão de PNPLA3 pode ser avaliada usando medições do nível ou alteração do nível de mRNA de PNPLA3 ou proteína PNPLA3 em uma amostra derivada de fluido ou tecido do sítio específico dentro do sujeito. Em modalidades preferenciais, o sítio é selecionado do grupo consistindo em fígado, plexo coroide, retina, e pâncreas. O sítio também pode ser uma subseção ou subgrupo de células de qualquer um dos sítios acima mencionados. O sítio também pode incluir células que expressam um tipo particular de receptor. Métodos de tratamento ou prevenção de Doenças Associadas a PNPLA3
[0132] A presente invenção proporciona métodos terapêuticos e profiláticos que incluem administrar a um sujeito com uma doença, distúrbio e/ou afecção associada a PNPLA3, ou propenso a desenvolver uma doença, distúrbio e/ou afecção associada a PNPLA3, composições compreendendo um agente de RNAi, ou composições farmacêuticas compreendendo um agente de RNAi, ou vetores compreendendo um RNAi da invenção. Exemplos não limitadores de doenças associadas a PNPLA3 incluem, por exemplo, fígado gorduroso (esteatose), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose do fígado, acúmulo de gordura no fígado, inflamação do fígado, necrose hepatocelular, fibrose do fígado, obesidade ou doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Em uma modalidade, a doença associada a PNPLA3 é NAFLD. Em outra modalidade, a doença associada a PNPLA3 é NASH. Em outra modalidade, a doença associada a PNPLA3 é fígado gorduroso (esteatose). Em outra modalidade, a doença associada a PNPLA3 é resistência à insulina. Em outra modalidade, a doença associada a PNPLA3 não é resistência à insulina.
[0133] Em certas modalidades, a presente invenção proporciona um método para reduzir a expressão de PNPLA3 em um paciente em sua necessidade, compreendendo administrar ao paciente quaisquer dos construtos de RNAi descritos aqui. O termo "paciente", como usado aqui, se relaciona com um mamífero, incluindo humanos, e pode ser usado alternadamente com o termo "sujeito". Preferencialmente, o nível de expressão de PNPLA3 em hepatócitos no paciente é reduzido após a administração do construto de RNAi em comparação com o nível de expressão de PNPLA3 em um paciente não recebendo o construto de RNAi.
[0134] Os métodos da invenção são úteis para tratar um sujeito tendo uma doença associada a PNPLA3, por exemplo, um sujeito que irá beneficiar de redução da expressão do gene PNPLA3 e/ou produção da proteína PNPLA3. Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de redução do nível de expressão do gene Contendo o Domínio de Fosfolipase do Tipo Patatina 3 (PNPLA3) em um sujeito tendo doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de redução do nível de proteína PNPLA3 em um sujeito com NAFLD. A presente invenção também proporciona métodos de redução do nível de atividade da via Hedgehog em um sujeito com NAFLD.
[0135] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de um sujeito tendo uma NAFLD. Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de um sujeito tendo uma doença associada a PNPLA3, por exemplo, fígado gorduroso (esteatose), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose do fígado, acúmulo de gordura no fígado, inflamação do fígado, necrose hepatocelular, fibrose do fígado, obesidade, ou doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Os métodos de tratamento (e usos) da invenção incluem administrar ao sujeito, por exemplo, um humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi da invenção visando um gene PNPLA3 ou de uma composição farmacêutica compreendendo um agente de RNAi da invenção visando um gene PNPLA3 ou de um vetor da invenção compreendendo um agente de RNAi visando um gene PNPLA3.
[0136] Em um aspecto, a invenção proporciona métodos de prevenção de pelo menos um sintoma em um sujeito tendo NAFLD, por exemplo, a presença de vias de sinalização Hedgehog elevadas, fadiga, fraqueza, perda de peso, perda de apetite, náusea, dor abdominal, vasos sanguíneos do tipo aranha, amarelecimento da pele e olhos (icterícia), prurido, acúmulo de fluidos e inchaço das pernas (edema), inchaço do abdômen (ascites), e confusão mental. Os métodos incluem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi, por exemplo, dsRNA, composições farmacêuticas, ou vetores da invenção, desse modo prevenindo pelo menos um sintoma no sujeito tendo um distúrbio que irá beneficiar de redução da expressão do gene PNPLA3.
[0137] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona usos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi da invenção para tratar um sujeito, por exemplo, um sujeito que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão do gene PNPLA3. Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona usos de um agente de RNAi, por exemplo, um dsRNA, da invenção visando um gene PNPLA3 ou composição farmacêutica compreendendo um agente de RNAi visando um gene PNPLA3 na fabricação de um medicamento para tratar um sujeito, por exemplo, um sujeito que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão do gene PNPLA3 e/ou produção de proteína PNPLA3, tal como um sujeito tendo um distúrbio que irá beneficiar de redução da expressão de um gene PNPLA3, por exemplo, uma doença associada a PNPLA3.
[0138] Em outro aspecto, a invenção proporciona usos de um RNAi, por exemplo, um dsRNA, da invenção para prevenir pelo menos um sintoma em um sujeito sofrendo de um distúrbio que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão de um gene PNPLA3 e/ou produção de proteína PNPLA3.
[0139] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona usos de um agente de RNAi da invenção na fabricação de um medicamento para prevenir pelo menos um sintoma em um sujeito sofrendo de um distúrbio que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão de um gene PNPLA3 e/ou produção de proteína PNPLA3, tal como uma doença associada a PNPLA3.
[0140] Em uma modalidade, um agente de RNAi visando PNPLA3 é administrado a um sujeito tendo uma doença associada a PNPLA3, por exemplo, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), de modo que a expressão de um gene PNPLA3, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue ou outro tecido ou fluido do sujeito é reduzida em pelo menos cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%,
75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais quando o agente de dsRNA é administrado ao sujeito.
[0141] Os métodos e utilizações da invenção incluem administrar uma composição descrita aqui de modo que a expressão do gene-alvo PNPLA3 seja decrescida, tal como por cerca de 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 ou cerca de 80 horas. Em uma modalidade, a expressão do gene-alvo PNPLA3 é decrescida durante um período prolongado, por exemplo, pelo menos cerca de dois, três, quatro, cinco, seis, sete dias ou mais, por exemplo, cerca de uma semana, duas semanas, três semanas ou cerca de quatro semanas ou mais.
[0142] A administração do dsRNA de acordo com os métodos e usos da invenção pode originar uma redução da gravidade, sinais, sintomas, e/ou marcadores de tais doenças ou distúrbios em um paciente com uma doença associada a PNPLA3, por exemplo, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Por “redução”, neste contexto, se pretende significar um decréscimo estatisticamente significativo de tal nível. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100%. A eficácia do tratamento ou prevenção de doença pode ser avaliada, por exemplo, medindo a progressão da doença, remissão da doença, gravidade de sintomas, redução de dor, qualidade de vida, dose de uma medicação requerida para manter um efeito do tratamento, nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma doença determinada sendo tratada ou sendo o alvo de prevenção. Pertence à capacidade do perito na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de NAFLD pode ser avaliada, por exemplo, por monitoração periódica de sintomas de NAFLD, níveis de gordura no fígado, ou expressão de genes a jusante. A comparação das últimas leituras com as leitura iniciais proporciona a um médico uma indicação da eficácia do tratamento. Pertence à capacidade do perito na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um RNAi visando PNPLA3 ou sua composição farmacêutica, "eficaz contra" uma doença associada a PNPLA3 indica que a administração de um modo clinicamente apropriado origina um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significativa de pacientes, como melhoria de sintomas, uma cura, uma redução da doença, extensão de vida, melhoria da qualidade de vida, ou outro efeito geralmente reconhecido como positivo por médicos familiares com o tratamento de NAFLD e/ou uma doença associada a PNPLA3 e das causas relacionadas.
[0143] Um efeito de tratamento ou preventivo é evidente quando ocorre uma melhoria estatisticamente significativa de um ou mais parâmetros do estado de doença, ou por uma ausência do agravamento ou do desenvolvimento de sintomas que de outro modo seriam antecipados. Como exemplo, uma alteração favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável de doença, e preferivelmente pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais, pode ser indicador de tratamento eficaz. A eficácia de um determinado fármaco de RNAi ou formulação desse fármaco também pode ser avaliada usando um modelo animal experimental para a doença determinada, como conhecido na técnica. Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando é observada uma redução estatisticamente significativa de um marcador ou sintoma.
[0144] Aos sujeitos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de RNAi, tal como cerca de 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,9 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,5 mg/kg de dsRNA, 2,6 mg/kg de dsRNA, 2,7 mg/kg de dsRNA, 2,8 mg/kg de dsRNA, 2,9 mg/kg de dsRNA, 3,0 mg/kg de dsRNA, 3,1 mg/kg de dsRNA, 3,2 mg/kg de dsRNA, 3,3 mg/kg de dsRNA, 3,4 mg/kg de dsRNA, 3,5 mg/kg de dsRNA, 3,6 mg/kg de dsRNA, 3,7 mg/kg de dsRNA, 3,8 mg/kg de dsRNA, 3,9 mg/kg de dsRNA, 4,0 mg/kg de dsRNA, 4,1 mg/kg de dsRNA, 4,2 mg/kg de dsRNA, 4,3 mg/kg de dsRNA, 4,4 mg/kg de dsRNA, 4,5 mg/kg de dsRNA, 4,6 mg/kg de dsRNA, 4,7 mg/kg de dsRNA, 4,8 mg/kg de dsRNA, 4,9 mg/kg de dsRNA, 5,0 mg/kg de dsRNA, 5,1 mg/kg de dsRNA, 5,2 mg/kg de dsRNA,
5,3 mg/kg de dsRNA, 5,4 mg/kg de dsRNA, 5,5 mg/kg de dsRNA, 5,6 mg/kg de dsRNA, 5,7 mg/kg de dsRNA, 5,8 mg/kg de dsRNA, 5,9 mg/kg de dsRNA, 6,0 mg/kg de dsRNA, 6,1 mg/kg de dsRNA, 6,2 mg/kg de dsRNA, 6,3 mg/kg de dsRNA, 6,4 mg/kg de dsRNA, 6,5 mg/kg de dsRNA, 6,6 mg/kg de dsRNA, 6,7 mg/kg de dsRNA, 6,8 mg/kg de dsRNA, 6,9 mg/kg de dsRNA, 7,0 mg/kg de dsRNA, 7,1 mg/kg de dsRNA, 7,2 mg/kg de dsRNA, 7,3 mg/kg de dsRNA, 7,4 mg/kg de dsRNA, 7,5 mg/kg de dsRNA, 7,6 mg/kg de dsRNA, 7,7 mg/kg de dsRNA, 7,8 mg/kg de dsRNA, 7,9 mg/kg de dsRNA, 8,0 mg/kg de dsRNA, 8,1 mg/kg de dsRNA, 8,2 mg/kg de dsRNA, 8,3 mg/kg de dsRNA, 8,4 mg/kg de dsRNA, 8,5 mg/kg de dsRNA, 8,6 mg/kg de dsRNA, 8,7 mg/kg de dsRNA, 8,8 mg/kg de dsRNA, 8,9 mg/kg de dsRNA, 9,0 mg/kg de dsRNA, 9,1 mg/kg de dsRNA, 9,2 mg/kg de dsRNA, 9,3 mg/kg de dsRNA, 9,4 mg/kg de dsRNA, 9,5 mg/kg de dsRNA, 9,6 mg/kg de dsRNA, 9,7 mg/kg de dsRNA, 9,8 mg/kg de dsRNA, 9,9 mg/kg de dsRNA, 9,0 mg/kg de dsRNA, 10 mg/kg de dsRNA, 15 mg/kg de dsRNA, 20 mg/kg de dsRNA, 25 mg/kg de dsRNA, 30 mg/kg de dsRNA, 35 mg/kg de dsRNA, 40 mg/kg de dsRNA, 45 mg/kg de dsRNA, ou cerca de 50 mg/kg de dsRNA. Em uma modalidade, a sujeitos podem ser administrados 0,5 mg/kg do dsRNA. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[0145] A administração do RNAi pode reduzir a presença de níveis de proteína PNPLA3, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31 %, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,
43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais.
[0146] Antes da administração de uma dose completa do RNAi, aos pacientes pode ser administrada uma dose menor, como uma infusão a 5%, e podem ser monitorados quanto a efeitos adversos, como uma reação alérgica. Em outro exemplo, o paciente pode ser monitorado quanto a efeitos imunoestimuladores indesejados, como níveis acrescidos de citocinas (por exemplo, TNF-alfa ou INF- alfa).
[0147] Devido aos efeitos inibidores da expressão de PNPLA3, uma composição de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica preparada a partir dessa pode aumentar a qualidade de vida.
[0148] Um RNAi da invenção pode ser administrado em forma "nua", em que o agente de RNAi modificado ou não modificado é diretamente suspenso em solvente de tampão aquoso ou adequado, como um "RNAi livre". Um RNAi livre é administrado na ausência de uma composição farmacêutica. O RNAi livre pode estar em uma solução tampão adequada. A solução tampão pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato, ou fosfato, ou qualquer combinação respectiva. Em uma modalidade, a solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pH e a osmolalidade da solução tampão contendo o RNAi podem ser ajustados de modo que seja adequada para administração a um sujeito.
[0149] Em alternativa, um RNAi da invenção pode ser administrado na forma de uma composição farmacêutica, como uma formulação lipossomal de dsRNA.
[0150] Sujeitos que irão beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão do gene PNPLA3 são aqueles tendo doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e/ou uma doença ou distúrbio associado a PNPLA3 como descrito aqui.
[0151] O tratamento de um sujeito que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição de expressão do gene PNPLA3 inclui tratamento terapêutico e profilático.
[0152] A invenção proporciona adicionalmente métodos e usos de um agente de RNAi ou de uma sua composição farmacêutica para tratar um sujeito que irá beneficiar de redução e/ou inibição de expressão do gene PNPLA3, por exemplo, um sujeito tendo uma doença associada a PNPLA3, em combinação com outros agentes farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com agentes farmacêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são correntemente empregues para tratar estes distúrbios.
[0153] Por exemplo, em certas modalidades, um RNAi visando um gene PNPLA3 é administrado em combinação, por exemplo, com um agente útil no tratamento de uma doença associada a PNPLA3 como descrito aqui em outro local. Por exemplo, agentes terapêuticos e métodos terapêuticos adicionais adequados para tratar um sujeito que irá beneficiar de redução da expressão de PNPLA3, por exemplo, um sujeito tendo uma doença associada a PNPLA3, incluem um agente de RNAi visando uma porção diferente do gene
PNPLA3, um agente terapêutico, e/ou procedimentos para tratar uma doença associada a PNPLA3 ou uma combinação de quaisquer dos anteriores.
[0154] Em certas modalidades, um primeiro agente de RNAi visando um gene PNPLA3 é administrado em combinação com um segundo agente de RNAi visando uma porção diferente do gene PNPLA3. Por exemplo, o primeiro agente de RNAi compreende uma primeira fita sentido e uma primeira fita antissentido formando uma região de fita dupla, em que substancialmente todos os nucleotídeos da referida primeira fita sentido e substancialmente todos os nucleotídeos da primeira fita antissentido são nucleotídeos modificados, em que a referida primeira fita sentido é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3', e em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente; e o segundo agente de RNAi compreende uma segunda fita sentido e uma segunda fita antissentido formando uma região de fita dupla, em que substancialmente todos os nucleotídeos da segunda fita sentido e substancialmente todos os nucleotídeos da segunda fita antissentido são nucleotídeos modificados, em que a segunda fita sentido é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3', e em que o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[0155] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos da primeira e segunda fitas sentido e/ou todos os nucleotídeos da primeira e segunda fitas antissentido compreendem uma modificação.
[0156] Em uma modalidade, o pelo menos um dos nucleotídeos modificados é selecionado do grupo consistindo em um nucleotídeo desoxi-timina (dT) 3'- terminal, um nucleotídeo 2'-O-metil-modificado, um nucleotídeo 2'-fluoro-modificado, um nucleotídeo 2'- desoxi-modificado, um nucleotídeo trancado, um nucleotídeo não trancado, um nucleotídeo restringido em termos da conformação, um etil-nucleotídeo constrangido, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo 2'-amino- modificado, um nucleotídeo 2'-O-alil-modificado, nucleotídeo 2'-C-alquil-modificado, nucleotídeo 2'- hidroxil-modificado, um nucleotídeo 2'-metoxietil- modificado, um nucleotídeo 2'-O-alquil-modificado, um morfolino-nucleotídeo, um fosforamidato, um nucleotídeo compreendendo uma base não natural, um nucleotídeo tetra- hidropirano-modificado, um nucleotídeo 1,5-anidro- hexitol-modificado, um nucleotídeo ciclo-hexenil- modificado, um nucleotídeo compreendendo um grupo fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um grupo metilfosfonato, um nucleotídeo compreendendo um 5'- fosfato e um nucleotídeo compreendendo um mímico de 5'- fosfato.
[0157] Em certas modalidades, um primeiro agente de RNAi visando um gene PNPLA3 é administrado em combinação com um segundo agente de RNAi visando um gene que é diferente do gene PNPLA3. Por exemplo, o agente de RNAi visando o gene PNPLA3 pode ser administrado em combinação com um agente de RNAi visando o gene SCAP. O primeiro agente de RNAi visando um gene PNPLA3 e o segundo agente de RNAi visando um gene diferente do gene PNPLA3, por exemplo, o gene SCAP, podem ser administrados como partes da mesma composição farmacêutica. Alternativamente, o primeiro agente de RNAi visando um gene PNPLA3 e o segundo agente de RNAi visando um gene diferente do gene PNPLA3, por exemplo, o gene SCAP, podem ser administrados como partes de composições farmacêuticas diferentes.
[0158] O agente de RNAi e um agente terapêutico e/ou tratamento adicionais podem ser administrados ao mesmo tempo e/ou na mesma combinação, por exemplo, parenteralmente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em instantes separados e/ou mediante outro método conhecido na técnica ou descrito aqui.
[0159] A presente invenção também proporciona métodos de uso de um agente de RNAi da invenção e/ou de uma composição contendo um agente de RNAi da invenção para reduzir e/ou inibir a expressão de PNPLA3 em uma célula. Em outros aspectos, a presente invenção proporciona um RNAi da invenção e/ou uma composição compreendendo um RNAi da invenção para uso na redução e/ou inibição da expressão do gene PNPLA3 em uma célula. Em ainda outros aspectos, é proporcionado o uso de um RNAi da invenção e/ou de uma composição compreendendo um RNAi da invenção para a fabricação de um medicamento para reduzir e/ou inibir a expressão do gene PNPLA3 em uma célula. Ainda em outros aspectos, a presente invenção proporciona um RNAi da invenção e/ou uma composição compreendendo um RNAi da invenção para uso na redução e/ou inibição da produção de proteína PNPLA3 em uma célula. Em ainda outros aspectos, é proporcionado o uso de um RNAi da invenção e/ou de uma composição compreendendo um RNAi da invenção para a fabricação de um medicamento para reduzir e/ou inibir a produção de proteína PNPLA3 em uma célula. Os métodos e usos incluem contatar a célula com um RNAi, por exemplo, um dsRNA, da invenção e manter a célula durante um período de tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um gene PNPLA3, desse modo inibindo a expressão do gene PNPLA3 ou inibindo a produção de proteína PNPLA3 na célula.
[0160] A redução da expressão do gene pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma redução da expressão de PNPLA3 pode ser determinada determinando o nível de expressão de mRNA de PNPLA3 usando métodos que são rotineiros para o habitualmente perito na técnica, por exemplo, transferência Northern, qRT-PCR, determinando o nível de proteína PNPLA3 usando métodos que são rotineiros para o habitualmente perito na técnica, tais como transferência Western, técnicas imunológicas, métodos de citometria de fluxo, ELISA, e/ou determinando uma atividade biológica de PNPLA3.
[0161] Nos métodos e usos da invenção, a célula pode ser contatada in vitro ou in vivo, isto é, a célula pode estar dentro de um sujeito.
[0162] Uma célula adequada para tratamento usando os métodos da invenção pode ser qualquer célula que expresse um gene PNPLA3, por exemplo, uma célula de um sujeito tendo NAFLD ou uma célula compreendendo um vetor de expressão compreendendo um gene PNPLA3 ou porção de um gene PNPLA3. Uma célula adequada para utilização nos métodos e usos da invenção pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de primata (como uma célula humana ou uma célula de primata não humano, por exemplo, uma célula de macaco ou uma célula de chimpanzé), uma célula não de primata (como uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de camelo, uma célula de lama, uma célula de cavalo, uma célula de cabra, uma célula de coelho, uma célula de borrego, uma célula de hamster, de porquinho- da-índia, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de leão, uma célula de tigre, uma célula de urso, ou uma célula de búfalo), uma célula de pássaro (por exemplo, uma célula de pato ou uma célula de ganso), ou uma célula de baleia. Em uma modalidade, a célula é uma célula humana.
[0163] A expressão do gene PNPLA3 pode ser inibida na célula em pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100%.
[0164] A produção de proteína PNPLA3 pode ser inibida na célula em pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,
43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100%.
[0165] Os métodos e usos da invenção in vivo podem incluir administrar a um sujeito uma composição contendo um RNAi, em que o RNAi inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene PNPLA3 do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado é um humano, a composição pode ser administrada por quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindo mas não se limitando às vias subcutânea, intravenosa, oral, intraperitoneal, ou parenteral, incluindo administração intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparênquima e intratecal), intramuscular, transdérmica, pelas vias aéreas (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção subcutânea ou intravenosa. Em uma modalidade, as composições são administradas por injeção subcutânea.
[0166] Em algumas modalidades, a administração é efetuada via uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o RNAi de um modo consistente ao longo de um período de tempo prolongado. Assim, uma injeção de depósito pode reduzir a frequência da dosagem necessária para se obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de PNPLA3, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção de depósito também pode proporcionar concentrações no soro mais consistentes. Injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferenciais, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.
[0167] Em algumas modalidades, a administração é efetuada via uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba cirurgicamente implantada. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica implantada subcutaneamente. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosa, subcutânea, arterial, ou epidural. Em modalidades preferenciais, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba cirurgicamente implantada que administra o RNAi no sujeito.
[0168] O modo de administração pode ser escolhido com base em ser desejado um tratamento local ou sistêmico e com base na área a ser tratada. A via e sítio de administração podem ser escolhidos para aumentar o direcionamento para o alvo.
[0169] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona métodos para inibir a expressão de um gene PNPLA3 em um mamífero, por exemplo, um humano. A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo um RNAi, por exemplo, um dsRNA, que visa um gene PNPLA3 em uma célula de um mamífero para uso na inibição da expressão do gene PNPLA3 no mamífero. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona o uso de um RNAi, por exemplo, um dsRNA, que visa um gene PNPLA3 em uma célula de um mamífero na fabricação de um medicamento para inibir a expressão do gene PNPLA3 no mamífero.
[0170] Os métodos e usos incluem administrar ao mamífero, por exemplo, um humano, uma composição compreendendo um RNAi, por exemplo, um dsRNA, que visa um gene PNPLA3 em uma célula do mamífero e manter o mamífero durante um período de tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA do gene PNPLA3, desse modo inibindo a expressão do gene PNPLA3 no mamífero.
[0171] A redução da expressão do gene pode ser avaliada em amostra de sangue periférico do sujeito a quem foi administrado RNAi por quaisquer métodos conhecidos na técnica, por exemplo, qRT-PCR, descritos aqui. A redução da produção da proteína pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica e por métodos, por exemplo, ELISA ou transferência Western, descritos aqui. Em uma modalidade, uma amostra de tecido serve como material de tecido para monitorar a redução da expressão do gene e/ou proteína PNPLA3. Em outra modalidade, a amostra de sangue serve como material de tecido para monitorar a redução da expressão do gene e/ou proteína PNPLA3.
[0172] Em uma modalidade, a verificação da clivagem mediada por RISC do alvo in vivo após a administração de agente de RNAi é efetuada realizando 5'-RACE ou modificações do protocolo conhecidas na técnica (Lasham A et al., (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-el9) (Zimmermann et al. (2006) Nature 441: 111-4).
[0173] É entendido que todas as sequências de ácidos ribonucleicos reveladas aqui podem ser convertidas em sequências de ácidos desoxirribonucleicos com uma base timina substituindo uma base uracila na sequência. De igual modo, todas as sequências de ácidos desoxirribonucleicos reveladas aqui podem ser convertidas em sequências de ácidos ribonucleicos com uma base uracila substituindo uma base timina na sequência. Sequências de ácidos desoxirribonucleicos, sequências de ácidos ribonucleicos, e sequências contendo misturas de desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos de todas as sequências reveladas aqui estão incluídas na invenção.
[0174] Adicionalmente, quaisquer sequências de ácidos nucleicos reveladas aqui podem ser modificadas com qualquer combinação de modificações químicas. O perito na técnica apreciará prontamente que tal designação "RNA" ou "DNA" para descrever polinucleotídeos modificados é, em certos casos, arbitrária. Por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo um nucleotídeo tendo um substituinte 2'-OH no açúcar ribose e uma base timina pode ser descrito como uma molécula de DNA tendo um açúcar modificado (2'-OH para o 2'-H natural de DNA) ou como uma molécula de RNA tendo uma base modificada (timina (uracila metilada) para uracila natural de RNA).
[0175] Em conformidade, é pretendido que sequências de ácidos nucleicos proporcionadas aqui, incluindo, mas sem limitação, aquelas presentes na listagem de sequências, abranjam ácidos nucleicos contendo qualquer combinação de RNA e/ou DNA natural ou modificado, incluindo, mas sem limitação, tais ácidos nucleicos tendo nucleobases modificadas. A título de exemplo adicional e sem limitação, um polinucleotídeo tendo a sequência
"ATCGATCG" abrange quaisquer polinucleotídeos tendo tal sequência, quer esteja modificada ou não modificada, incluindo, mas sem limitação, tais compostos compreendendo bases de RNA, como os tendo a sequência "AUCGAUCG" e os tendo algumas bases de DNA e algumas bases de RNA tais como "AUCGATCG" e polinucleotídeos tendo outras bases modificadas, tais como "ATmeCGAUCG", em que meC indica uma base citosina compreendendo um grupo metila na posição 5.
[0176] Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e os resultados alcançados, são proporcionados meramente para fins ilustrativos e não devem ser considerados limitadores do escopo das reivindicações adjuntas.
INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA
[0177] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados a título de referência tal como se cada publicação, patente, ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência. No entanto, a citação de uma referência aqui não deve ser considerada um reconhecimento de que tal referência é técnica anterior da presente invenção. Na medida em que qualquer das definições ou termos fornecidos nas referências incorporadas por referência difiram dos termos e discussão aqui proporcionados, prevalecerão os presentes termos e definições.
EQUIVALENTES
[0178] O relatório descritivo descrito anteriormente é considerado suficiente para permitir ao perito na técnica praticar a invenção. A descrição precedente e os exemplos detalham determinadas modalidades preferenciais da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que independentemente de quão detalhado o que precede possa aparecer no texto, a invenção pode ser praticada de muitas maneiras e a invenção deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e todos os seus equivalentes.
[0179] Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e os resultados alcançados, são proporcionados meramente para fins ilustrativos e não devem ser considerados limitadores da presente invenção.
[0180] Todas as experiências com animais descritas aqui foram aprovadas pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Amgen e os animais foram cuidados de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8aEdição (National Research Council (U.S.) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute for Laboratory Animal Research (U.S.), e National Academies Press (U.S.) (2011) "Guide for the care and use of laboratory animals". 8ª Edição, National Academies Press, Washington, D.C. Os camundongos foram alojados individualmente em uma sala com ar-condicionado a 22±2 ºC com um ciclo de doze horas de luz; doze horas de escuridão (0600-1800 horas). Os animais tiveram acesso ad libitum a uma dieta de ração regular (Envigo, 2920X, ou uma dieta como de outro modo afirmado) e a água (purificada por osmose reversa) via um sistema de irrigação automática, a menos que indicado em contrário. No final, sangue foi recolhido por punção cardíaca sob anestesia profunda, e então, seguindo as diretrizes da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC), os animais foram eutanasiados por um método físico secundário. EXEMPLO 1: Seleção, Planejamento e Síntese de moléculas de siRNA para PNPLA3 Modificadas
[0181] A identificação e seleção de sequências ótimas para moléculas de siRNA terapêuticas visando o gene contendo o domínio de fosfolipase do tipo patatina 3 (PNPLA3) foram efetuadas usando análise bioinformática de um transcrito de PNPLA3 humano (NM_025225.2). A Tabela 1 mostra sequências identificadas como tendo propriedades terapêuticas. Ao longo das várias sequências, {INVAB} é um A básico invertido, {INVDA} é uma desoxitimidina invertida, GNA é um ácido glicolnucleico, dT é desoxitimidina e dC é desoxicitosina. Tabela 1. Sequências de siRNA dirigidas para PNPLA3 HÉLICE SEQUÊNCIA SEQ ID SEQUÊNCIA SEQ ID NO: DUPLA SENTIDO NO: ANTISSENTIDO (ANTISSENTI N.º (5'-3') (SENTIDO) (5'-3') DO) D-1000 GGGCAAUAA 1 AGCAGGUACUUUA 2
AGUACCUGC UUGCCCUU
UUU D-1001 CGGCCAAUG 3 AGCUGGUGGACAU 4
UCCACCAGC UGGCCGUU
UUU D-1002 GGUCCAGCC 5 AAGAAGUUCAGGC 6
UGAACUUCU UGGACCUU UUU
D-1003 GCUUCAUCC 7 CUGUAGAAGGGGA 8
CCUUCUACA UGAAGCUU
GUU D-1004 GCGGCUUCC 9 UAGAAGCCCAGGA 10
UGGGCUUCU AGCCGCUU
AUU D-1005 GCCUCUGAG 11 ACCAACUCAGCUC 12
CUGAGUUGG AGAGGCUU
UUU D-1006 GUGACAACG 13 AUGAAGGGUACGU 14
UACCCUUCA UGUCACUU
UUU D-1007 CCCGCCUCC 15 UUUGGGACCUGGA 16
AGGUCCCAA GGCGGGUU
AUU D-1008 CUUCAUCCC 17 ACUGUAGAAGGGG 18
CUUCUACAG AUGAAGUU
UUU D-1009 GGUAUGUUC 19 CAUGAAGCAGGAA 20
CUGCUUCAU CAUACCUU
GUU D-1010 GUAUGUUCC 21 GCAUGAAGCAGGA 22
UGCUUCAUG ACAUACUU
CUU D-1011 UAUGUUCCU 23 GGCAUGAAGCAGG 24
GCUUCAUGC AACAUAUU
CUU D-1012 AUGUUCCUG 25 GGGCAUGAAGCAG 26
CUUCAUGCC GAACAUUU CUU
D-1013 UGUUCCUGC 27 AGGGCAUGAAGCA 28
UUCAUGCCC GGAACAUU
UUU D-1014 GUUCCUGCU 29 AAGGGCAUGAAGC 30
UCAUGCCCU AGGAACUU
UUU D-1015 UUCCUGCUU 31 GAAGGGCAUGAAG 32
CAUGCCCUU CAGGAAUU
CUU D-1016 UCCUGCUUC 33 AGAAGGGCAUGAA 34
AUGCCCUUC GCAGGAUU
UUU D-1017 CCUGCUUCA 35 UAGAAGGGCAUGA 36
UGCCCUUCU AGCAGGUU
AUU D-1018 CUGCUUCAU 37 GUAGAAGGGCAUG 38
GCCCUUCUA AAGCAGUU
CUU D-1019 UGCUUCAUG 39 UGUAGAAGGGCAU 40
CCCUUCUAC GAAGCAUU
AUU D-1020 GCUUCAUGC 41 CUGUAGAAGGGCA 42
CCUUCUACA UGAAGCUU
GUU D-1021 CUUCAUGCC 43 ACUGUAGAAGGGC 44
CUUCUACAG AUGAAGUU
UUU D-1022 UUCAUGCCC 45 CACUGUAGAAGGG 46
UUCUACAGU CAUGAAUU GUU
D-1023 UCAUGCCCU 47 CCACUGUAGAAGG 48
UCUACAGUG GCAUGAUU
GUU D-1024 CAUGCCCUU 49 GCCACUGUAGAAG 50
CUACAGUGG GGCAUGUU
CUU D-1025 AUGCCCUUC 51 GGCCACUGUAGAA 52
UACAGUGGC GGGCAUUU
CUU D-1026 UGCCCUUCU 53 AGGCCACUGUAGA 54
ACAGUGGCC AGGGCAUU
UUU D-1027 GCCCUUCUA 55 AAGGCCACUGUAG 56
CAGUGGCCU AAGGGCUU
UUU D-1028 GGUAUGUUC 57 GAUGAAGCAGGAA 58
CUGCUUCAU CAUACCUU
CUU D-1029 GUAUGUUCC 59 GGAUGAAGCAGGA 60
UGCUUCAUC ACAUACUU
CUU D-1030 UAUGUUCCU 61 GGGAUGAAGCAGG 62
GCUUCAUCC AACAUAUU
CUU D-1031 AUGUUCCUG 63 GGGGAUGAAGCAG 64
CUUCAUCCC GAACAUUU
CUU D-1032 UGUUCCUGC 65 AGGGGAUGAAGCA 66
UUCAUCCCC GGAACAUU UUU
D-1033 GUUCCUGCU 67 AAGGGGAUGAAGC 68
UCAUCCCCU AGGAACUU
UUU D-1034 UUCCUGCUU 69 GAAGGGGAUGAAG 70
CAUCCCCUU CAGGAAUU
CUU D-1035 UCCUGCUUC 71 AGAAGGGGAUGAA 72
AUCCCCUUC GCAGGAUU
UUU D-1036 CCUGCUUCA 73 UAGAAGGGGAUGA 74
UCCCCUUCU AGCAGGUU
AUU D-1037 CUGCUUCAU 75 GUAGAAGGGGAUG 76
CCCCUUCUA AAGCAGUU
CUU D-1038 UGCUUCAUC 77 UGUAGAAGGGGAU 78
CCCUUCUAC GAAGCAUU
AUU D-1039 UUCAUCCCC 79 CACUGUAGAAGGG 80
UUCUACAGU GAUGAAUU
GUU D-1040 UCAUCCCCU 81 CCACUGUAGAAGG 82
UCUACAGUG GGAUGAUU
GUU D-1041 CAUCCCCUU 83 GCCACUGUAGAAG 84
CUACAGUGG GGGAUGUU
CUU D-1042 UCCCCUUCU 85 AGGCCACUGUAGA 86
ACAGUGGCC AGGGGAUU UUU
D-1043 GAUCAGGAC 87 AUCGGCUCGGGUC 88
CCGAGCCGA CUGAUCUU
UUU D-1044 UGGGCUUCU 89 ACGACGUGGUAGA 90
ACCACGUCG AGCCCAUU
UUU D-1045 GAGCGAGCA 91 AUGCGGGGCGUGC 92
CGCCCCGCA UCGCUCUU
UUU D-1046 UGCACUGCG 93 AGGACGCCGACGC 94
UCGGCGUCC AGUGCAUU
UUU D-1047 UGGAGCAGA 95 ACCUGCAGAGUCU 96
CUCUGCAGG GCUCCAUU
UUU D-1048 UGCAGGUCC 97 AGAUCUGAGAGGA 98
UCUCAGAUC CCUGCAUU
UUU D-1049 CCCGGCCAA 99 AUGGUGGACAUUG 100
UGUCCACCA GCCGGGUU
UUU D-1050 UUCUACAGU 101 AGAUAAGGCCACU 102
GGCCUUAUC GUAGAAUU
UUU D-1051 UCUACAGUG 103 AGGAUAAGGCCAC 104
GCCUUAUCC UGUAGAUU
UUU D-1052 CUUCCUUCA 105 AGCACGCCUCUGA 106
GAGGCGUGC AGGAAGUU UUU
D-1053 UUCCUUCAG 107 UCGCACGCCUCUG 108
AGGCGUGCG AAGGAAUU
AUU D-1054 GCGUGCGAU 109 ACAUCCACAUAUC 110
AUGUGGAUG GCACGCUU
UUU D-1055 CGUGCGAUA 111 UCCAUCCACAUAU 112
UGUGGAUGG CGCACGUU
AUU D-1056 UGGAUGGAG 113 UCACUCACUCCUC 114
GAGUGAGUG CAUCCAUU
AUU D-1057 ACGUACCCU 115 ACAUCAAUGAAGG 116
UCAUUGAUG GUACGUUU
UUU D-1058 UGGACAUCA 117 AUGAGCUUGGUGA 118
CCAAGCUCA UGUCCAUU
UUU D-1059 CACCUGCGU 119 AGAUGCUGAGACG 120
CUCAGCAUC CAGGUGUU
UUU D-1060 ACCUGCGUC 121 AGGAUGCUGAGAC 122
UCAGCAUCC GCAGGUUU
UUU D-1061 CCAGAGACU 123 ACAUGUCACCAGU 124
GGUGACAUG CUCUGGUU
UUU D-1062 AUGGCUUCC 125 AGGCAUAUCUGGA 126
AGAUAUGCC AGCCAUUU UUU
D-1063 CCGCCUCCA 127 AUUUGGGACCUGG 128
GGUCCCAAA AGGCGGUU
UUU D-1064 UACCUGCUG 129 ACCUCAGCACCAG 130
GUGCUGAGG CAGGUAUU
UUU D-1065 ACCUGCUGG 131 ACCCUCAGCACCA 132
UGCUGAGGG GCAGGUUU
UUU D-1066 CUCUCCACC 133 AACUGGGAAAGGU 134
UUUCCCAGU GGAGAGUU
UUU D-1067 UUUUUCACC 135 AUUUUAGUUAGGU 136
UAACUAAAA GAAAAAUU
UUU D-1068 CGGCCAAUG 137 AGCUGGUGGACAU 138
UCCACCAGC UGGCCGUU
UUU D-1069 GGUCCAGCC 139 AAGAAGUUCAGGC 140
UGAACUUCU UGGACCUU
UUU D-1070 GCGGCUUCC 141 UAGAAGCCCAGGA 142
UGGGCUUCU AGCCGCUU
AUU D-1071 GUGACAACG 143 AUGAAGGGUACGU 144
UACCCUUCA UGUCACUU
UUU D-1072 GGUAUGUUC 145 CAUGAAGCAGGAA 146
CUGCUUCAU CAUACCUU GUU
D-1073 GUAUGUUCC 147 GCAUGAAGCAGGA 148
UGCUUCAUG ACAUACUU
CUU D-1074 UGUUCCUGC 149 AGGGCAUGAAGCA 150
UUCAUGCCC GGAACAUU
UUU D-1075 GUUCCUGCU 151 AAGGGCAUGAAGC 152
UCAUGCCCU AGGAACUU
UUU D-1076 CCUGCUUCA 153 UAGAAGGGCAUGA 154
UGCCCUUCU AGCAGGUU
AUU D-1077 GCUUCAUGC 155 CUGUAGAAGGGCA 156
CCUUCUACA UGAAGCUU
GUU D-1078 CUUCAUGCC 157 ACUGUAGAAGGGC 158
CUUCUACAG AUGAAGUU
UUU D-1079 UUCAUGCCC 159 CACUGUAGAAGGG 160
UUCUACAGU CAUGAAUU
GUU D-1080 AUGGCUUCC 161 AGGCAUAUCUGGA 162
AGAUAUGCC AGCCAUUU
UUU D-1081 AUGCCCUUC 163 GGCCACUGUAGAA 164
UACAGUGGC GGGCAUUU
CUU D-1082 GCUUCAUGC 165 AUGUAGAAGGGCA 166
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU
D-1083 GGAAAGACU UUUUUGGAACAGU
GUUCCAAAA CUUUCCUU AUU 333 334 D-1084 GGUAUGUUC CAUGAAGCAGGAA
CUGCUUCAU CAUACCUU GUU 335 336 D-1085 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU CUU 337 338 D-1086 UGUUCCUGC AGGGCAUGAAGCA
UUCAUGCCC GGAACAUU UUU 339 340 D-1087 GCUUCAUGC CUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU GUU 341 342 D-1088 CUUCAUGCC ACUGUAGAAGGGC
CUUCUACAG AUGAAGUU UUU 343 344 D-1089 GCGGCUUCC UAGAAGCCCAGGA
UGGGCUUCU AGCCGCUU AUU 345 346 D-1090 GUUCCUGCU AAGGGCAUGAAGC
UCAUGCCCU AGGAACUU UUU 347 348 D-1091 AUGGCUUCC AGGCAUAUCUGGA
AGAUAUGCC AGCCAUUU UUU 349 350 D-1092 CCUGCUUCA UAGAAGGGCAUGA
UGCCCUUCU AGCAGGUU AUU 351 352
D-1093 UUCAUGCCC AACUGUAGAAGGG
UUCUACAGU CAUGAAUU UUU 353 354 D-1094 UUCAUGCCC CACUGUAGAAGGG
UUCUACAGU CAUGAAUU GUU 355 356 D-1095 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 357 358 D-1096 GGUCCAGCC AAGAAGUUCAGGC
UGAACUUCU UGGACCUU UUU 359 360 D-1097 GCGGCUUCC UAGAAGCCCAGGA
UGGGCUUCU AGCCGCUU AUU 361 362 D-1098 GCGGCUUCC UAGAAGCCCAGGA
UGGGCUUCU AGCCGCUU AUU 363 364 D-1099 GUUCCUGCU AAGGGCAUGAAGC
UCAUGCCCU AGGAACUU UUU 365 366 D-1100 GUUCCUGCU AAGGGCAUGAAGC
UCAUGCCCU AGGAACUU UUU 367 368 D-1101 CCUGCUUCA UAGAAGGGCAUGA
UGCCCUUCU AGCAGGUU AUU 369 370 D-1102 CCUGCUUCA UAGAAGGGCAUGA
UGCCCUUCU AGCAGGUU AUU 371 372
D-1103 AUGCCCUUC GGCCACUGUAGAA
UACAGUGGC GGGCAUUU CUU 373 374 D-1104 AUGGCUUCC AGGCAUAUCUGGA
AGAUAUGCC AGCCAUUU UUU 375 376 D-1105 GUGACAACG AUGAAGGGUACGU
UACCCUUCA UGUCACUU UUU 377 378 D-1106 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU CUU 379 380 D-1107 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU CUU 381 382 D-1108 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU CUU 383 384 D-1109 GUAUGUUCC AGGCAUGAAGCAG
UGCUUCAUG GAACAUACUU CCU 385 386 D-1110 UGGUAUGUU GCAUGAAGCAGGA
CCUGCUUCA ACAUACCAUU UGU 387 388 D-1111 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU U 389 390 D-1112 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU C{INVAB} 391 392
D-1113 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 393 394 D-1114 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 395 396 D-1115 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 397 398 D-1116 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 399 400 D-1117 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 401 402 D-1118 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 403 404 D-1119 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 405 406 D-1120 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 407 408 D-1121 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 409 410 D-1122 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 411 412
D-1123 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 413 414 D-1124 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 415 416 D-1125 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 417 418 D-1126 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 419 420 D-1127 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 421 422 D-1128 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 423 424 D-1129 GCUUCAUG[ AUGUAGAAGGGCA DC]CCUUCU UGAAGCUU ACAUUU 425 426 D-1130 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA C[DC]UUCU UGAAGCUU ACAUUU 427 428 D-1131 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA [DC]CUUCU UGAAGCUU ACAUUU 429 430 D-1132 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 431 432
D-1133 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 433 434 D-1134 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 435 436 D-1135 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 437 438 D-1136 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 439 440 D-1137 GCUUCAUGC AACUGUAGAAGGG
CCUUCUACA CAUGAAGCUU GUU 441 442 D-1138 CUGCUUCAU AUGUAGAAGGGCA
GCCCUUCUA UGAAGCAGUU CAU 443 444 D-1139 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU U 445 446 D-1140 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU U{INVAB} 447 448 D-1141 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU{INVAB } 449 450
D-1142 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 451 452 D-1143 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 453 454 D-1144 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 455 456 D-1145 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 457 458 D-1146 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 459 460 D-1147 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 461 462 D-1148 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 463 464 D-1149 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 465 466 D-1150 GCUUCAUGC AUGUAGAAGGGCA
CCUUCUACA UGAAGCUU UUU 467 468 D-1151 GUAUGUUCC GCAUGAAGCAGGA UGCUUCAUG 469 ACAUACUU 470
CUU{INVAB } D-1152 GGUAUGUUC AAUGAAGCAGGAA
CUGCUUCAU CAUACCUU UUU 471 472 D-1153 GUAUGUUCC ACAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU UUU 473 474 D-1154 CGGCCAAUG AGCUGGUGGACAU
UCCACCAGC UGGCCGUU UUU 475 476 D-1155 UGGAGCAGA ACCUGCAGAGUCU
CUCUGCAGG GCUCCAUU UUU 477 478 D-1156 ACGUACCCU ACAUCAAUGAAGG
UCAUUGAUG GUACGUUU UUU 479 480 D-1157 CCAGAGACU ACAUGUCACCAGU
GGUGACAUG CUCUGGUU UUU 481 482 D-1158 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 483 484 D-1159 [INVAB]GC AAAUGUAGAAAGG
UUCAUGCCU CAUGAAGCUU
UUCUACAUU U 485 486 D-1160 [INVAB]GC AAAUGUAGAAAGG UUCAUGCCU 487 CAUGAAGCUU 488
UUCUACAUU
U D-1161 UGCUUCAUG UGUAGAAAGGCAU
CCUUUCUAC GAAGCAUU AUU 489 490 D-1162 UAUGUUCCU AGCAUGAAGCAGG
GCUUCAUGC AACAUAUU UUU 491 492 D-1163 UUCCUGCUU AAAAGGCAUGAAG
CAUGCCUUU CAGGAAUU UUU 493 494 D-1164 UCAUGCCUU ACACUGUAGAAAG
UCUACAGUG GCAUGAUU UUU 495 496 D-1165 CAUGCCUUU ACCACUGUAGAAA
CUACAGUGG GGCAUGUU UUU 497 498 D-1166 AUGCCUUUC AGCCACUGUAGAA
UACAGUGGC AGGCAUUU UUU 499 500 D-1167 GGUAUGUUC UAUGAAGCAGGAA
CUGCUUCAU CAUACCUU AUU 501 502 D-1168 GUAUGUUCC UCAUGAAGCAGGA
UGCUUCAUG ACAUACUU AUU 503 504 D-1169 UAUGUUCCU UGCAUGAAGCAGG
GCUUCAUGC AACAUAUU AUU 505 506
D-1170 UUCCUGCUU UAAAGGCAUGAAG
CAUGCCUUU CAGGAAUU AUU 507 508 D-1171 CUGCUUCAU UUAGAAAGGCAUG
GCCUUUCUA AAGCAGUU AUU 509 510 D-1172 GCUUCAUGC UUGUAGAAAGGCA
CUUUCUACA UGAAGCUU AUU 511 512 D-1173 UUCAUGCCU UACUGUAGAAAGG
UUCUACAGU CAUGAAUU AUU 513 514 D-1174 UCAUGCCUU UCACUGUAGAAAG
UCUACAGUG GCAUGAUU AUU 515 516 D-1175 CAUGCCUUU UCCACUGUAGAAA
CUACAGUGG GGCAUGUU AUU 517 518 D-1176 AUGCCUUUC UGCCACUGUAGAA
UACAGUGGC AGGCAUUU AUU 519 520 D-1177 ACGUACCCU UCAUCAAUGAAGG
UCAUUGAUG GUACGUUU AUU 521 522 D-1178 CCAGAGACU UCAUGUCACCAGU
GGUGACAUG CUCUGGUU AUU 523 524 D-1179 AUGGCUUCC UGGCAUAUCUGGA
AGAUAUGCC AGCCAUUU AUU 525 526
D-1180 GUUCCUGCU AAAGGCAUGAAGC
UCAUGCCUU AGGAACUU UUU 527 528 D-1181 CCUGCUUCA UAGAAAGGCAUGA
UGCCUUUCU AGCAGGUU AUU 529 530 D-1182 GCUUCAUGC AUGUAGAAAGGCA
CUUUCUACA UGAAGCUU UUU 531 532 D-1183 CUUCAUGCC ACUGUAGAAAGGC
UUUCUACAG AUGAAGUU UUU 533 534 D-1184 UUCAUGCCU AACUGUAGAAAGG
UUCUACAGU CAUGAAUU UUU 535 536 D-1185 GCUUCAUCC AUGUAGAAAGGGA
CUUUCUACA UGAAGCUU UUU 537 538 D-1186 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 539 540 D-1187 [INVAB]GC AAAUGUAGAAGGG
UUCAUGCCC CAUGAAGCUU
UUCUACAUU U 541 542 D-1188 [INVAB]GC AAAUGUAGAAGGG
UUCAUGCCC CAUGAAGCUU
UUCUACAUU U 543 544
D-1189 [INVAB]GC UAGAAGCCCAGGA
GGCUUCCUG AGCCGCUU
GGCUUCUAU U 545 546 D-1190 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 547 548 D-1191 CUGCGGCUU UAGAAGCCCAGGA
CCUGGGCUU AGCCGCAGUU CU{INVAB} 549 550 D-1192 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 551 552 D-1193 [INVAB]GC UAGAAGCCCAGGA
GGCUUCCUG AGCCGCUU
GGCUUCUAU U 553 554 D-1194 CUGCGGCUU UAGAAGCCCAGGA
CCUGGGCUU AGCCGCAGUU CU{INVAB} 555 556 D-1195 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 557 558 D-1196 [INVAB]GC UAGAAGCCCAGGA
GGCUUCCUG AGCCGCUU
GGCUUCUAU U 559 560
D-1197 CUGCGGCUU UAGAAGCCCAGGA
CCUGGGCUU AGCCGCAGUU CU{INVAB} 561 562 D-1198 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 563 564 D-1199 [INVAB]GC UAGAAGCCCAGGA
GGCUUCCUG AGCCGCUU
GGCUUCUAU U 565 566 D-1200 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 567 568 D-1201 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 569 570 D-1202 [INVAB]CU UAGAAGCCCAGGA
GCGGCUUCC AGCCGCAGUU
UGGGCUUCU A 571 572 D-1203 [INVAB]AU AGGCAUAUCUGGA
GGCUUCCAG AGCCAUUU
AUAUGCCUU U 573 574 D-1204 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA AUGGCUUCC 575 AGCCAUGUUU 576
AGAUAUGCC
U D-1205 ACAUGGCUU AGGCAUAUCUGGA
CCAGAUAUG AGCCAUGUUU CC{INVAB} 577 578 D-1206 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 579 580 D-1207 [INVAB]AU AGGCAUAUCUGGA
GGCUUCCAG AGCCAUUU
AUAUGCCUU U 581 582 D-1208 ACAUGGCUU AGGCAUAUCUGGA
CCAGAUAUG AGCCAUGUUU CC{INVAB} 583 584 D-1209 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 585 586 D-1210 [INVAB]AU AGGCAUAUCUGGA
GGCUUCCAG AGCCAUUU
AUAUGCCUU U 587 588 D-1211 ACAUGGCUU AGGCAUAUCUGGA
CCAGAUAUG AGCCAUGUUU CC{INVAB} 589 590 D-1212 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA AUGGCUUCC 591 AGCCAUGUUU 592
AGAUAUGCC
U D-1213 [INVAB]AU AGGCAUAUCUGGA
GGCUUCCAG AGCCAUUU
AUAUGCCUU U 593 594 D-1214 ACAUGGCUU AGGCAUAUCUGGA
CCAGAUAUG AGCCAUGUUU CC{INVAB} 595 596 D-1215 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 597 598 D-1216 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 599 600 D-1217 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 601 602 D-1218 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 603 604 D-1219 [INVAB]AC ACAUCAAUGAAGG
GUACCCUUC GUACGUUU
AUUGAUGUU U 605 606
D-1220 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 607 608 D-1221 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 609 610 D-1222 [INVAB]AC ACAUCAAUGAAGG
GUACCCUUC GUACGUUU
AUUGAUGUU U 611 612 D-1223 CAACGUACC ACAUCAAUGAAGG
CUUCAUUGA GUACGUUGUU UG{INVAB} 613 614 D-1224 [INVAB]AC ACAUCAAUGAAGG
GUACCCUUC GUACGUUU
AUUGAUGUU U 615 616 D-1225 CAACGUACC ACAUCAAUGAAGG
CUUCAUUGA GUACGUUGUU UG{INVAB} 617 618 D-1226 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 619 620 D-1227 [INVAB]AC ACAUCAAUGAAGG
GUACCCUUC GUACGUUU
AUUGAUGUU U 621 622
D-1228 CAACGUACC ACAUCAAUGAAGG
CUUCAUUGA GUACGUUGUU UG{INVAB} 623 624 D-1229 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 625 626 D-1230 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 627 628 D-1231 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 629 630 D-1232 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 631 632 D-1233 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 633 634 D-1234 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 635 636 D-1235 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 637 638
D-1236 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 639 640 D-1237 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 641 642 D-1238 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 643 644 D-1239 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 645 646 D-1240 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 647 648 D-1241 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 649 650 D-1242 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU [DC]UUUCU ACAU 651 652 D-1243 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 653 654 D-1244 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA GCUUCAUGC 655 UGAAGCAGUU 656
CUUUCUACA
U D-1245 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 657 658 D-1246 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 659 660 D-1247 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 661 662 D-1248 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 663 664 D-1249 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 665 666 D-1250 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 667 668 D-1251 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 669 670 D-1252 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 671 672
D-1253 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 673 674 D-1254 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 675 676 D-1255 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 677 678 D-1256 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 679 680 D-1257 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 681 682 D-1258 CUGCUUCAU AUGUAGAAGGGCA
GCCCUUCUA UGAAGCAGUU CAU 683 684 D-1259 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 685 686 D-1260 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA UUCAUGCCC 687 UGAAGCUU 688
UUCUACAUU
U D-1261 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 689 690 D-1262 CUGCUUCAU AUGUAGAAGGGCA
GCCCUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 691 692 D-1263 [INVAB]CU AUGUAGAAGGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CCUUCUACA U 693 694 D-1264 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 695 696 D-1265 AUGUUCCUG AGGCAUGAAGCAG
CUUCAUGCC GAACAUUU UUU 697 698 D-1266 UGUUCCUGC AAGGCAUGAAGCA
UUCAUGCCU GGAACAUU UUU 699 700 D-1267 UGCCUUUCU AGGCCACUGUAGA
ACAGUGGCC AAGGCAUU UUU 701 702 D-1268 CGUACUUCG CAUACAAGGACGA
UCCUUGUAU AGUACGUU GUU 703 704
D-1269 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA UUCAUGC[D UGAAGCUU C]CUUCUAC AUUU 705 706 D-1270 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 707 708 D-1271 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 709 710 D-1272 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 711 712 D-1273 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 713 714 D-1274 [INVAB]GC AUGUAGAAGGGCA
UUCAUGCCC UGAAGCUU
UUCUACAUU U 715 716 D-1275 [INVAB]CC UAGAAAGGCAUGA
UGCUUCAUG AGCAGGUU
CCUUUCUAU U 717 718 D-1276 [INVAB]CC UAGAAAGGCAUGA UGCUUCAUG 719 AGCAGGUU 720
CCUUUCUAU
U D-1277 UUCCUGCUU UAGAAAGGCAUGA
CAUGCCUUU AGCAGGAAUU CU{INVAB} 721 722 D-1278 [INVAB]CC UAGAAAGGCAUGA
UGCUUCAUG AGCAGGUU
CCUUUCUAU U 723 724 D-1279 UUCCUGCUU UAGAAAGGCAUGA
CAUGCCUUU AGCAGGAAUU CU{INVAB} 725 726 D-1280 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCUU U 727 728 D-1281 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCUU U 729 730 D-1282 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCUU U 731 732 D-1283 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 733 734 D-1284 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA GCCUUUCUA 735 AGGCAUUU 736
CAGUGGCUU
U D-1285 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 737 738 D-1286 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 739 740 D-1287 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 741 742 D-1289 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 743 744 D-1290 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 745 746 D-1291 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 747 748 D-1292 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 749 750 D-1293 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC CUUCAUGCC 751 AUGAAGCAUU 752
UUUCUACAG
U D-1294 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 753 754 D-1295 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 755 756 D-1296 [INVAB]GU AAAGGCAUGAAGC
UCCUGCUUC AGGAACUU
AUGCCUUUU U 757 758 D-1297 [INVAB]CC UAGAAAGGCAUGA
UGCUUCAUG AGCAGGUU
CCUUUCUAU U 759 760 D-1298 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 761 762 D-1299 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 763 764 D-1300 UUCCUGCUU UAGAAAGGCAUGA
CAUGCCUUU AGCAGGAAUU CU{INVAB} 765 766
D-1301 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 767 768 D-1302 UUCCUGCUU UAGAAAGGCAUGA
CAUGCCUUU AGCAGGAAUU CU{INVAB} 769 770 D-1303 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 771 772 D-1304 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 773 774 D-1305 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 775 776 D-1306 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 777 778 D-1307 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA
CCUGCUUCA AGCAGGAAUU
UGCCUUUCU A 779 780 D-1308 [INVAB]UU UAGAAAGGCAUGA CCUGCUUCA 781 AGCAGGAAUU 782
UGCCUUUCU
A D-1309 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 783 784 D-1310 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 785 786 D-1311 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 787 788 D-1312 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 789 790 D-1313 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 791 792 D-1314 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 793 794 D-1315 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 795 796 D-1316 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA AUGCCUUUC 797 AGGCAUGAUU 798
UACAGUGGC
U D-1317 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 799 800 D-1318 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 801 802 D-1319 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 803 804 D-1320 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 805 806 D-1321 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 807 808 D-1322 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 809 810 D-1323 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 811 812 D-1324 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC CUUCAUGCC 813 AUGAAGCAUU 814
UUUCUACAG
U D-1325 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 815 816 D-1326 [INVAB]CA ACCACUGUAGAAA
UGCCUUUCU GGCAUGUU
ACAGUGGUU U 817 818 D-1327 [INVAB]CU UUAGAAAGGCAUG
GCUUCAUGC AAGCAGUU
CUUUCUAAU U 819 820 D-1328 [INVAB]GC UUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAAU U 821 822 D-1329 [INVAB]UU UACUGUAGAAAGG
CAUGCCUUU CAUGAAUU
CUACAGUAU U 823 824 D-1330 [INVAB]GU AAAGGCAUGAAGC
UCCUGCUUC AGGAACUU
AUGCCUUUU U 825 826 D-1331 AUGUUCCUG AAAGGCAUGAAGC
CUUCAUGCC AGGAACAUUU UU{INVAB} 827 828
D-1332 [INVAB]AU AAAGGCAUGAAGC
GUUCCUGCU AGGAACAUUU
UCAUGCCUU U 829 830 D-1333 [INVAB]GU AAAGGCAUGAAGC
UCCUGCUUC AGGAACUU
AUGCCUUUU U 831 832 D-1334 AUGUUCCUG AAAGGCAUGAAGC
CUUCAUGCC AGGAACAUUU UU{INVAB} 833 834 D-1335 [INVAB]AU AAAGGCAUGAAGC
GUUCCUGCU AGGAACAUUU
UCAUGCCUU U 835 836 D-1336 [INVAB]GU AAAGGCAUGAAGC
UCCUGCUUC AGGAACUU
AUGCCUUUU U 837 838 D-1337 AUGUUCCUG AAAGGCAUGAAGC
CUUCAUGCC AGGAACAUUU UU{INVAB} 839 840 D-1338 [INVAB]AU AAAGGCAUGAAGC
GUUCCUGCU AGGAACAUUU
UCAUGCCUU U 841 842 D-1339 [INVAB]AU AAAGGCAUGAAGC
GUUCCUGCU AGGAACAUUU
UCAUGCCUU U 843 844
D-1340 [INVAB]AU AAAGGCAUGAAGC
GUUCCUGCU AGGAACAUUU
UCAUGCCUU U 845 846 D-1341 [INVAB]GC UACUGUAGAAAGG
UUCAUGCCU CAUGAAGCUU
UUCUACAGU A 847 848 D-1342 [INVAB]GC UACUGUAGAAAGG
UUCAUGCCU CAUGAAGCUU
UUCUACAGU A 849 850 D-1343 [INVAB]UU UACUGUAGAAAGG
CAUGCCUUU CAUGAAUU
CUACAGUAU U 851 852 D-1344 [INVAB]GC UACUGUAGAAAGG
UUCAUGCCU CAUGAAGCUU
UUCUACAGU A 853 854 D-1345 GCUUCAUGC UACUGUAGAAAGG
CUUUCUACA CAUGAAGCUU GU{INVAB} 855 856 D-1346 [INVAB]GC UAGAAGCCCAGGA
GGCUUCCUG AGCCGCUU
GGCUUCUAU U 857 858 D-1347 [INVAB]AU AGGCAUAUCUGGA GGCUUCCAG 859 AGCCAUUU 860
AUAUGCCUU
U D-1348 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 861 862 D-1349 [INVAB]AC AGGCAUAUCUGGA
AUGGCUUCC AGCCAUGUUU
AGAUAUGCC U 863 864 D-1350 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 865 866 D-1351 [INVAB]CA ACAUCAAUGAAGG
ACGUACCCU GUACGUUGUU
UCAUUGAUG U 867 868 D-1352 [INVAB]AC ACAUCAAUGAAGG
GUACCCUUC GUACGUUU
AUUGAUGUU U 869 870 D-1353 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 871 872 D-1354 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 873 874
D-1355 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 875 876 D-1356 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 877 878 D-1357 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 879 880 D-1358 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 881 882 D-1359 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA {INVAB} 883 884 D-1360 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 885 886 D-1361 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 887 888 D-1362 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 889 890
D-1363 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 891 892 D-1364 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 893 894 D-1365 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 895 896 D-1366 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGG
UCAUCCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 897 898 D-1367 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGGA
UUCAUCCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 899 900 D-1368 UGCUUCAUC ACUGUAGAAAGGG
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 901 902 D-1369 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGGA
CCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 903 904 D-1370 [INVAB]AC UCAGGUGAAAGAG
AUUGCUCUU CAAUGUUU
UCACCUGAU U 905 906
D-1371 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 907 908 D-1372 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 909 910 D-1373 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 911 912 D-1374 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 913 914 D-1375 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 915 916 D-1376 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 917 918 D-1377 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 919 920 D-1378 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 921 922 D-1379 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 923 924 D-1380 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 925 926
D-1381 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 927 928 D-1381 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC UCAUGCC[D AUGAAGUU T]UUCUACA GUUU 929 930 D-1382 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 931 932 D-1383 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 933 934 D-1384 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 935 936 D-1385 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 937 938 D-1386 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC UCAUGC[DC AUGAAGUU ]UUUCUACA GUUU 939 940 D-1387 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC UCAUGCCU[ 941 AUGAAGUU 942
DT]UCUACA
GUUU D-1388 [INVAB]GC AUGUAGAAUCCCA
UUCAUGGGA UGAAGCUU
UUCUACAUU U 943 944 D-1389 [INVAB]CU ACUGUAGAUUCGC
UCAUGCGAA AUGAAGUU
UCUACAGUU U 945 946 D-1390 CUGCUUCAU UUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 947 948 D-1391 [INVAB]CU UUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA A 949 950 D-1392 CUGCUUCAU UUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVDA} 951 952 D-1393 CUGCUUCAU AUGUAGAAUCCCA
GGGAUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 953 954 D-1394 [INVAB]CU AUGUAGAAUCCCA
GCUUCAUGG UGAAGCAGUU
GAUUCUACA U 955 956 D-1395 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC UCAUGCCUU 957 AUGAAGUU 958
UCUACAGUU
U D-1396 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 959 960 D-1397 [INVAB]GC AUGUAGAAAGGCA
UUCAUGCCU UGAAGCUU
UUCUACAUU U 961 962 D-1398 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG {INVAB} 963 964 D-1399 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 965 966 D-1400 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 967 968 D-1401 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 969 970 D-1402 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 971 972 D-1403 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC UCAUGCCUU 973 AUGAAGUU 974
UCUACAGUU
U D-1404 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 975 976 D-1405 AUGCCUUUC AGCCACUGUAGAA
UACAGUGGC AGGCAUGAUU UU{INVAB} 977 978 D-1406 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 979 980 D-1407 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCUU U 981 982 D-1408 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCUU U 983 984 D-1409 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC U 985 986 D-1410 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 987 988 D-1411 [INVAB]AU AGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCUU U 989 990
D-1412 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 991 992 D-1413 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 993 994 D-1414 [INVAB]UC AGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC {INVAB} 995 996 D-1415 [INVAB]AU UGCCACUGUAGAA
GCCUUUCUA AGGCAUUU
CAGUGGCAU U 997 998 D-1416 UCAUGCCUU UGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 999 1000 D-1417 [INVAB]UC UGCCACUGUAGAA
AUGCCUUUC AGGCAUGAUU
UACAGUGGC A 1001 1002 D-1418 UCAUGCCUU UGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVDA} 1003 1004 D-1419 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1005 1006 D-1420 CUGCUUCAU UUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1007 1008
D-1421 CUGCUUCAU UUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVDA} 1009 1010 D-1422 UCAUGCCUU UGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 1011 1012 D-1423 UCAUGCCUU UGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVDA} 1013 1014 D-1424 [INVAB]CU ACUGUAGAAAGGC
UCAUGCCUU AUGAAGUU
UCUACAGUU U 1015 1016 D-1425 CUGCUUCAU AUGUA[AB]AAAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1017 1018 D-1426 CUGCUUCAU AUGUA[AB]AAAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1019 1020 D-1427 UGCUUCAUG ACUGU[AB]GAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVAB} 1021 1022 D-1428 UGCUUCAUG ACUGU[AB]GAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVAB} 1023 1024 D-1429 UCAUGCCUU AGCCA[AB]UGUA
UCUACAGUG GAAAGGCAUGAUU GC{INVAB} 1025 1026
D-1430 UCAUGCCUU AGCCA[AB]UGUA
UCUACAGUG GAAAGGCAUGAUU GC{INVAB} 1027 1028 D-1431 CUGCUUCAU AU[GNA- GCCUUUCUA G]UAGAAAGGCAU CA{INVAB} 1029 GAAGCAGUU 1030 D-1432 CUGCUUCAU AUG[GNA- GCCUUUCUA U]AGAAAGGCAUG CA{INVAB} 1031 AAGCAGUU 1032 D-1433 CUGCUUCAU AUGU[GNA- GCCUUUCUA A]GAAAGGCAUGA CA{INVAB} 1033 AGCAGUU 1034 D-1434 CUGCUUCAU AUGUA[GNA- GCCUUUCUA G]AAAGGCAUGAA CA{INVAB} 1035 GCAGUU 1036 D-1435 CUGCUUCAU AUGUAG[GNA- GCCUUUCUA A]AAGGCAUGAAG CA{INVAB} 1037 CAGUU 1038 D-1436 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1039 AGUU 1040 D-1437 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1041 1042 D-1438 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 1043 1044 D-1439 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA GCUUCAUGC 1045 UGAAGCAGUU 1046
CUUUCUACA {INVAB} D-1440 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1047 1048 D-1441 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1049 1050 D-1442 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 1051 1052 D-1443 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1053 1054 D-1444 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1055 1056 D-1445 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA U 1057 1058 D-1446 [INVAB]CU AUGUAGAAAGGCA
GCUUCAUGC UGAAGCAGUU
CUUUCUACA {INVAB} 1059 1060 D-1447 CUGCUUCAU A[AB]GUAGAAAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1061 1062
D-1448 CUGCUUCAU AU[AB]UAGAAAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1063 1064 D-1449 CUGCUUCAU AUG[AB]AGAAAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1065 1066 D-1450 CUGCUUCAU AUGU[AB]GAAAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1067 1068 D-1451 CUGCUUCAU AUGUAG[AB]AAG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1069 1070 D-1452 CUGCUUCAU AUGUAGA[AB]AG
GCCUUUCUA GCAUGAAGCAGUU CA{INVAB} 1071 1072 D-1453 CAACGUACC ACAUCAAUGAAGG
CUUCAUUGA GUACGUUGUU UG{INVAB} 1073 1074 D-1454 CAACGUACC ACAUCAAUGAAGG
CUUCAUUGA GUACGUUGUU UG{INVAB} 1075 1076 D-1455 ACAUGGCUU AGGCAUAUCUGGA
CCAGAUAUG AGCCAUGUUU CC{INVAB} 1077 1078 D-1456 ACAUGGCUU AGGCAUAUCUGGA
CCAGAUAUG AGCCAUGUUU CC{INVAB} 1079 1080 D-1457 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1081 1082
D-1458 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1083 1084 D-1459 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1085 1086 D-1460 CUGCGGCUU UAGAAGCCCAGGA
CCUGGGCUU AGCCGCAGUU CU{INVAB} 1087 1088 D-1461 CUGCGGCUU UAGAAGCCCAGGA
CCUGGGCUU AGCCGCAGUU CU{INVAB} 1089 1090 D-1462 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 1091 1092 D-1463 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG U 1093 1094 D-1464 [INVAB]UG ACUGUAGAAAGGC
CUUCAUGCC AUGAAGCAUU
UUUCUACAG {INVAB} 1095 1096 D-1465 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 1097 1098 D-1466 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 1099 1100
D-1467 UGCUUCAUG ACUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 1101 1102 D-1468 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 1103 1104 D-1469 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 1105 1106 D-1470 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CAU 1107 1108 D-1471 UGCUUCAUG UCUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVAB} 1109 1110 D-1472 UGCUUCAUG UCUGUAGAAAGGC
CCUUUCUAC AUGAAGCAUU AG{INVDA} 1111 1112 D-1473 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVDT} 1113 1114 D-1474 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1115 AGUU 1116 D-1475 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1117 AGUU 1118 D-1476 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1119 AGUU 1120
D-1477 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1121 AGUU 1122 D-1478 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1123 AGUU 1124 D-1479 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1125 AGUU 1126 D-1480 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1127 AGUU 1128 D-1481 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1129 AGUU 1130 D-1482 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1131 AGUU 1132 D-1483 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1133 AGUU 1134 D-1484 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1135 AGUU 1136 D-1485 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1137 AGUU 1138 D-1486 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1139 AGUU 1140
D-1487 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1141 AGUU 1142 D-1488 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1143 AGUU 1144 D-1489 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1145 AGUU 1146 D-1490 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1147 AGUU 1148 D-1491 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]A[DG]GCAUGA CA{INVAB} 1149 AGCAGUU 1150 D-1492 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A][DA]GGCAUGA CA{INVAB} 1151 AGCAGUU 1152 D-1493 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AG[DG]CAUGA CA{INVAB} 1153 AGCAGUU 1154 D-1494 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1155 AGUU 1156 D-1495 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1157 AGUU 1158 D-1496 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1159 AGUU 1160
D-1497 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1161 AGUU 1162 D-1498 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1163 AGUU 1164 D-1499 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1165 AGUU 1166 D-1500 CUGCUUCAU AUGUAGAAAGGCA
GCCUUUCUA UGAAGCAGUU CA{INVAB} 1167 1168 D-1501 UGCUUCAUG U[GNA- CCUUUCUAC C]UGUAGAAAGGC AG{INVDA} 1169 AUGAAGCAUU 1170 D-1502 UGCUUCAUG UC[GNA- CCUUUCUAC U]GUAGAAAGGCA AG{INVDA} 1171 UGAAGCAUU 1172 D-1503 UGCUUCAUG UCUG[GNA- CCUUUCUAC U]AGAAAGGCAUG AG{INVDA} 1173 AAGCAUU 1174 D-1504 UGCUUCAUG UCUGU[GNA- CCUUUCUAC A]GAAAGGCAUGA AG{INVDA} 1175 AGCAUU 1176 D-1505 UGCUUCAUG UCUGUAG[GNA- CCUUUCUAC A]AAGGCAUGAAG AG{INVDA} 1177 CAUU 1178 D-1506 UGCUUCAUG U[AB]UGUAGAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1179 1180
D-1507 UGCUUCAUG UC[AB]GUAGAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1181 1182 D-1508 UGCUUCAUG UCU[AB]UAGAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1183 1184 D-1509 UGCUUCAUG UCUG[AB]AGAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1185 1186 D-1510 UGCUUCAUG UCUGU[AB]GAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1187 1188 D-1511 UGCUUCAUG UCUGUA[AB]AAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1189 1190 D-1512 UGCUUCAUG UCUGUAG[AB]AA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU AG{INVDA} 1191 1192 D-1513 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVDT} 1193 1194 D-1514 UCAUGCCUU UGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVAB} 1195 1196 D-1515 UCAUGCCUU UGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVDA} 1197 1198 D-1516 UCCUGCUUC AUAGAAAGGCAUG
AUGCCUUUC AAGCAGGAUU UA{INVDT} 1199 1200
D-1517 UCCUGCUUC UUAGAAAGGCAUG
AUGCCUUUC AAGCAGGAUU UA{INVAB} 1201 1202 D-1518 UCCUGCUUC UUAGAAAGGCAUG
AUGCCUUUC AAGCAGGAUU UA{INVDA} 1203 1204 D-1519 UAUGUUCCU AAGGCAUGAAGCA
GCUUCAUGC GGAACAUAUU CU{INVDT} 1205 1206 D-1520 UAUGUUCCU UAGGCAUGAAGCA
GCUUCAUGC GGAACAUAUU CU{INVAB} 1207 1208 D-1521 UAUGUUCCU UAGGCAUGAAGCA
GCUUCAUGC GGAACAUAUU CU{INVDA} 1209 1210 D-1522 UCCUGCUUC AUAGAAAGGCAUG
AUGCCUUUC AAGCAGGAUU UA{INVAB} 1211 1212 D-1523 UAUGUUCCU AAGGCAUGAAGCA
GCUUCAUGC GGAACAUAUU CU{INVAB} 1213 1214 D-1524 UCAUGCCUU AGCCACUGUAGAA
UCUACAGUG AGGCAUGAUU GC{INVDT} 1215 1216 D-1525 UCCUGCUUC AUAGAAAGGCAUG
AUGCCUUUC AAGCAGGAUU UA{INVDT} 1217 1218 D-1526 UCCUGCUUC UUAGAAAGGCAUG
AUGCCUUUC AAGCAGGAUU UA{INVDA} 1219 1220
D-1527 UAUGUUCCU UAGGCAUGAAGCA
GCUUCAUGC GGAACAUAUU CU{INVDA} 1221 1222 D-1528 UGCUUCAUG UCUGUA[GNA- CCUUUCUAC G]AAAGGCAUGAA AG{INVDA} 1223 GCAUU 1224 D-1529 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1225 AGUU 1226 D-1530 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1227 AGUU 1228 D-1531 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1229 AGUU 1230 D-1532 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1231 AGUU 1232 D-1533 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1233 AGUU 1234 D-1534 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1235 AGUU 1236 D-1535 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1237 AGUU 1238 D-1536 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1239 AGUU 1240
D-1537 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1241 AGUU 1242 D-1538 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCU[LNA- A]AGGCAUGAAGC T]UCUACA{ AGUU INVAB} 1243 1244 D-1539 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCC[LNA- A]AGGCAUGAAGC T]UUCUACA AGUU {INVAB} 1245 1246 D-1540 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUU[LNA A]AGGCAUGAAGC - AGUU T]CUACA{I NVAB} 1247 1248 D-1541 CUGCUUCAU AUGU[GNA- GCCUUUC[L A]GAAAGGCAUGA NA- AGCAGUU T]ACA{INV AB} 1249 1250 D-1542 CUGCUUCAU AUG[GNA- GCCUUUCU[ U]AGAAAGGCAUG LNA- AAGCAGUU A]CA{INVA B} 1251 1252 D-1543 CUGCUUCAU A[GNA- GCCUUUCUA U]GUAGAAAGGCA C[LNA- UGAAGCAGUU A]{INVAB} 1253 1254
D-1544 CUGCUUCAU AUGUAG[AB]AAG GCCUU[LNA GCAUGAAGCAGUU - T]CUACA{I NVAB} 1255 1256 D-1545 CUGCUUCAU AUGU[AB]GAAAG GCCUUUC[L GCAUGAAGCAGUU NA- T]ACA{INV AB} 1257 1258 D-1546 CUGCUUCAU AUG[AB]AGAAAG GCCUUUCU[ GCAUGAAGCAGUU LNA- A]CA{INVA B} 1259 1260 D-1547 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1261 AGUU 1262 D-1548 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCUUUCUA A]AGGCAUGAAGC CA{INVAB} 1263 AGUU 1264 D-1549 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCU[LNA- A]AGGCAUGAAGC T]UCUACA{ AGUU INVAB} 1265 1266 D-1550 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCU[LNA- A]AGGCAUGAAGC T]UCUACA{ AGUU INVAB} 1267 1268
D-1551 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCU[LNA- A]AGGCAUGAAGC T]UCUACA{ AGUU INVAB} 1269 1270 D-1552 CUGCUUCAU AUGUAGA[GNA- GCCU[LNA- A]AGGCAUGAAGC T]UCUACA{ AGUU INVAB} 1271 1272 D-1553 UGCUUCAUG UCUG[AB]AGAAA CCUUUCU[L GGCAUGAAGCAUU NA- A]CAG{INV DA} 1273 1274 D-1554 UGCUUCAUG UCUGU[AB]GAAA CCUUUC[LN GGCAUGAAGCAUU A- T]ACAG{IN VDA} 1275 1276 D-1555 UGCUUCAUG UCUGUAG[AB]AA CCUU[LNA- GGCAUGAAGCAUU T]CUACAG{ INVDA} 1277 1278 D-1556 UGCUUCAUG UC[GNA- CCUUUCUAC U]GUAGAAAGGCA [LNA- UGAAGCAUU A]G{INVDA } 1279 1280 D-1557 UGCUUCAUG UCUG[GNA- CCUUUCU[L U]AGAAAGGCAUG NA- 1281 AAGCAUU 1282
A]CAG{INV DA} D-1558 UGCUUCAUG UCUGU[GNA- CCUUUC[LN A]GAAAGGCAUGA A- AGCAUU T]ACAG{IN VDA} 1283 1284 D-1559 UGCUUCAUG U[AB]UGUAGAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU A[LNA- G]{INVDA} 1285 1286 D-1560 UGCUUCAUG UC[AB]GUAGAAA
CCUUUCUAC GGCAUGAAGCAUU [LNA- A]G{INVDA } 1287 1288 D-1561 UCAUGCCUU AGCCA[AB]UGUA UCUACA[LN GAAAGGCAUGAUU A- G]UGGC{IN VAB} 1289 1290 D-1562 UCAUGCCUU AGCCA[AB]UGUA UCUACAG[L GAAAGGCAUGAUU NA- T]GGC{INV AB} 1291 1292 D-1563 UCAUGCCUU AGCCA[AB]UGUA
UCUACAGUG GAAAGGCAUGAUU GC{INVAB} 1293 1294
D-1564 GGUAUGUUC 2257 AAUGAAGCAGGAA 2258
CUGCUUCAU CAUACCUU
UUU D-1565 GGUAUGUUC 2259 UAUGAAGCAGGAA 2260
CUGCUUCAU CAUACCUU
AUU D-1566 GUAUGUUCC 2261 ACAUGAAGCAGGA 2262
UGCUUCAUG ACAUACUU
UUU D-1567 UAUGUUCCU 2263 UGCAUGAAGCAGG 2264
GCUUCAUGC AACAUAUU
AUU D-1568 AUGUUCCUG 2265 AGGCAUGAAGCAG 2266
CUUCAUGCC GAACAUUU
UUU D-1569 UGUUCCUGC 2267 AAGGCAUGAAGCA 2268
UUCAUGCCU GGAACAUU
UUU D-1570 GUUCCUGCU 2269 AAAGGCAUGAAGC 2270
UCAUGCCUU AGGAACUU
UUU D-1571 UUCCUGCUU 2271 AAAAGGCAUGAAG 2272
CAUGCCUUU CAGGAAUU
UUU D-1572 UUCCUGCUU 2273 UAAAGGCAUGAAG 2274
CAUGCCUUU CAGGAAUU
AUU D-1573 UCCUGCUUC 2275 AGAAAGGCAUGAA 2276
AUGCCUUUC GCAGGAUU UUU
D-1574 CCUGCUUCA 2277 UAGAAAGGCAUGA 2278
UGCCUUUCU AGCAGGUU
AUU D-1575 CUGCUUCAU 2279 AUAGAAAGGCAUG 2280
GCCUUUCUA AAGCAGUU
UUU D-1576 CUGCUUCAU 2281 UUAGAAAGGCAUG 2282
GCCUUUCUA AAGCAGUU
AUU D-1577 UGCUUCAUG 2283 UGUAGAAAGGCAU 2284
CCUUUCUAC GAAGCAUU
AUU D-1578 GCUUCAUGC 2285 AUGUAGAAAGGCA 2286
CUUUCUACA UGAAGCUU
UUU D-1579 GCUUCAUGC 2287 UUGUAGAAAGGCA 2288
CUUUCUACA UGAAGCUU
AUU D-1580 CUUCAUGCC 2289 ACUGUAGAAAGGC 2290
UUUCUACAG AUGAAGUU
UUU D-1581 UUCAUGCCU 2291 AACUGUAGAAAGG 2292
UUCUACAGU CAUGAAUU
UUU D-1582 UUCAUGCCU 2293 UACUGUAGAAAGG 2294
UUCUACAGU CAUGAAUU
AUU D-1583 UCAUGCCUU 2295 ACACUGUAGAAAG 2296
UCUACAGUG GCAUGAUU UUU
D-1584 UCAUGCCUU 2297 UCACUGUAGAAAG 2298
UCUACAGUG GCAUGAUU
AUU D-1585 CAUGCCUUU 2299 ACCACUGUAGAAA 2300
CUACAGUGG GGCAUGUU
UUU D-1586 CAUGCCUUU 2301 UCCACUGUAGAAA 2302
CUACAGUGG GGCAUGUU
AUU D-1587 AUGCCUUUC 2303 AGCCACUGUAGAA 2304
UACAGUGGC AGGCAUUU
UUU D-1588 AUGCCUUUC 2305 UGCCACUGUAGAA 2306
UACAGUGGC AGGCAUUU
AUU D-1589 UGCCUUUCU 2307 AGGCCACUGUAGA 2308
ACAGUGGCC AAGGCAUU
UUU D-1590 GCCUUUCUA 2309 AAGGCCACUGUAG 2310
CAGUGGCCU AAAGGCUU
UUU D-1591 GGUAUGUUC 2311 GAUGAAGCAGGAA 2312
CUGCUUCAU CAUACCUU
CUU D-1592 GUAUGUUCC 2313 GGAUGAAGCAGGA 2314
UGCUUCAUC ACAUACUU
CUU D-1593 UAUGUUCCU 2315 GGGAUGAAGCAGG 2316
GCUUCAUCC AACAUAUU CUU
D-1594 AUGUUCCUG 2317 GGGGAUGAAGCAG 2318
CUUCAUCCC GAACAUUU
CUU D-1595 UGUUCCUGC 2319 AGGGGAUGAAGCA 2320
UUCAUCCCC GGAACAUU
UUU D-1596 GUUCCUGCU 2321 AAGGGGAUGAAGC 2322
UCAUCCCCU AGGAACUU
UUU D-1597 UUCCUGCUU 2323 GAAGGGGAUGAAG 2324
CAUCCCCUU CAGGAAUU
CUU D-1598 UCCUGCUUC 2325 AGAAGGGGAUGAA 2326
AUCCCCUUC GCAGGAUU
UUU D-1599 CCUGCUUCA 2327 UAGAAGGGGAUGA 2328
UCCCCUUCU AGCAGGUU
AUU D-1600 CUGCUUCAU 2329 GUAGAAGGGGAUG 2330
CCCCUUCUA AAGCAGUU
CUU D-1601 UGCUUCAUC 2331 UGUAGAAGGGGAU 2332
CCCUUCUAC GAAGCAUU
AUU D-1602 GCUUCAUCC 2333 CUGUAGAAGGGGA 2334
CCUUCUACA UGAAGCUU
GUU D-1603 CUUCAUCCC 2335 ACUGUAGAAGGGG 2336
CUUCUACAG AUGAAGUU UUU
D-1604 UUCAUCCCC 2337 CACUGUAGAAGGG 2338
UUCUACAGU GAUGAAUU
GUU D-1605 UCAUCCCCU 2339 CCACUGUAGAAGG 2340
UCUACAGUG GGAUGAUU
GUU D-1606 CAUCCCCUU 2341 GCCACUGUAGAAG 2342
CUACAGUGG GGGAUGUU
CUU D-1607 AUCCCCUUC 2343 GGCCACUGUAGAA 2344
UACAGUGGC GGGGAUUU
CUU D-1608 UCCCCUUCU 2345 AGGCCACUGUAGA 2346
ACAGUGGCC AGGGGAUU
UUU D-1609 CCCCUUCUA 2347 AAGGCCACUGUAG 2348
CAGUGGCCU AAGGGGUU
UUU D-1610 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2441 GUU 2442 D-1611 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2443 GUU 2444 D-1612 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2445 GUU 2446 D-1613 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2447 GUU 2448
D-1614 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2449 GUU 2450 D-1615 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2451 GUU 2452 D-1616 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2453 GUU 2454 D-1617 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2455 GUU 2456 D-1618 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2457 GUU 2458 D-1619 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2459 GUU 2460 D-1620 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2461 GUU 2462 D-1621 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2463 GUU 2464 D-1622 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2465 GUU 2466 D-1623 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2467 GUU 2468
D-1624 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2469 GUU 2470 D-1625 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2471 GUU 2472 D-1626 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2473 GUU 2474 D-1627 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2475 GUU 2476 D-1628 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2477 GUU 2478 D-1629 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2479 GUU 2480 D-1630 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2481 GUU 2482 D-1631 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2483 GUU 2484 D-1632 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2485 GUU 2486 D-1633 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2487 GUU 2488
D-1634 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2489 GUU 2490 D-1635 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2491 GUU 2492 D-1636 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2493 GUU 2494 D-1637 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2495 AUU 2496 D-1638 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2497 AUU 2498 D-1639 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2499 AUU 2500 D-1640 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2501 AUU 2502 D-1641 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2503 AUU 2504 D-1642 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UAUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2505 AUU 2506 D-1643 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCAGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2507 AUU 2508
D-1644 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUAUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2509 AUU 2510 D-1645 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGAAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2511 AUU 2512 D-1646 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2513 AUU 2514 D-1647 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAAAAAGGCAUGAAGC AGA 2515 AUU 2516 D-1648 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2517 AUU 2518 D-1649 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCT 2519 AUU 2520 D-1650 UCAUGCCUU
UCUACAGUG UGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2521 AUU 2522 D-1651 UCAUGCCUU
UCUACAGUG UGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2523 AUU 2524 D-1652 UCCUGCUUC
AUGCCUUUC AUAGAAAGGCAUGAAGCAGG UAT 2525 AUU 2526 D-1653 UCCUGCUUC
AUGCCUUUC UUAGAAAGGCAUGAAGCAGG UAA 2527 AUU 2528
D-1654 UCCUGCUUC
AUGCCUUUC UUAGAAAGGCAUGAAGCAGG UAA 2529 AUU 2530 D-1655 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUT 2531 AUU 2532 D-1656 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC UAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2533 AUU 2534 D-1657 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC UAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2535 AUU 2536 D-1658 UCCUGCUUC
AUGCCUUUC AUAGAAAGGCAUGAAGCAGG UAA 2537 AUU 2538 D-1659 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2539 AUU 2540 D-1660 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2541 AUU 2542 D-1661 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCT 2543 AUU 2544 D-1662 UCCUGCUUC
AUGCCUUUC AUAGAAAGGCAUGAAGCAGG UAT 2545 AUU 2546 D-1663 UCCUGCUUC
AUGCCUUUC UUAGAAAGGCAUGAAGCAGG UAA 2547 AUU 2548
D-1664 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC UAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2549 AUU 2550 D-1665 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2551 AUU 2552 D-1666 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2553 GUU 2554 D-1667 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2555 GUU 2556 D-1668 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2557 GUU 2558 D-1669 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2559 GUU 2560 D-1670 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2561 GUU 2562 D-1671 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2563 GUU 2564 D-1672 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2565 GUU 2566 D-1673 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2567 GUU 2568
D-1674 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2569 GUU 2570 D-1675 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2571 GUU 2572 D-1676 CUGCUUCAU
GCCTUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2573 GUU 2574 D-1677 CUGCUUCAU
GCCUUTCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2575 GUU 2576 D-1678 CUGCUUCAU
GCCUUUCTA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2577 GUU 2578 D-1679 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2579 GUU 2580 D-1680 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2581 GUU 2582 D-1681 CUGCUUCAU
GCCUUTCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2583 GUU 2584 D-1682 CUGCUUCAU
GCCUUUCTA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2585 GUU 2586 D-1683 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGAAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2587 GUU 2588
D-1684 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2589 GUU 2590 D-1685 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2591 GUU 2592 D-1686 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2593 GUU 2594 D-1687 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2595 GUU 2596 D-1688 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2597 GUU 2598 D-1689 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2599 GUU 2600 D-1690 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGAAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2601 AUU 2602 D-1691 UGCUUCAUG
CCUUUCTAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2603 AUU 2604 D-1692 UGCUUCAUG
CCUUTCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2605 AUU 2606 D-1693 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2607 AUU 2608
D-1694 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2609 AUU 2610 D-1695 UGCUUCAUG
CCUUUCTAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2611 AUU 2612 D-1696 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UAUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2613 AUU 2614 D-1697 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCAGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2615 AUU 2616 D-1698 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2617 AUU 2618 D-1699 UCAUGCCUU
UCUACAGTG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2619 AUU 2620 D-1700 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2621 AUU 2622 D-1701 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2623 GUU 2624 D-1702 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUAUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2625 GUU 2626 D-1703 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUAUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2627 AUU 2628
D-1704 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2629 AUU 2630 D-1705 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2631 AUU 2632 D-1706 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2633 AUU 2634 D-1707 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2635 AUU 2636 D-1708 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2637 AUU 2638 D-1709 CUGCUUCAU A[MEO- GCCUUUCUA I]GUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2639 GUU 2640 D-1710 CUGCUUCAU AUG[MEO- GCCUUUCUA I]AGAAAGGCAUGAAGCAGU CAA 2641 U 2642 D-1711 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGU[MEO- CAA 2643 I]GAAAGGCAUGAAGCAGUU 2644 D-1712 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUA[MEO- CAA 2645 I]AAAGGCAUGAAGCAGUU 2646 D-1713 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUAGA[MEO- CAA 2647 I]AGGCAUGAAGCAGUU 2648
D-1714 CUGCUUCAU A[MEO- GCCUUUCUA I]GUAGAAAGGCAUGAAGCA CCA 2649 GUU 2650 D-1715 CUGCUUCAU AUG[MEO- GCCUUUCUC I]AGAAAGGCAUGAAGCAGU CAA 2651 U 2652 D-1716 CUGCUUCAU GCCUUCCUA AUGUAG[MEO- CAA 2653 I]AAGGCAUGAAGCAGUU 2654 D-1717 CUGCUUCAU GCCUCUCUA AUGUAGA[MEO- CAA 2655 I]AGGCAUGAAGCAGUU 2656 D-1718 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AAGUAGAAAGGCAUGAAGCA CUA 2657 GUU 2658 D-1719 CUGCUUCAU
GCCUUUCUU AUGAAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2659 GUU 2660 D-1720 CUGCUUCAU
GCCUUUCAA AUGUUGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2661 GUU 2662 D-1721 CUGCUUCAU
GCCUAUCUA AUGUAGAUAGGCAUGAAGCA CAA 2663 GUU 2664 D-1722 UGCUUCAUG A[MEO- CCUUUCUAC I]UGUAGAAAGGCAUGAAGC ACA 2665 AUU 2666 D-1723 UGCUUCAUG AC[MEO- CCUUUCUAC I]GUAGAAAGGCAUGAAGCA AGA 2667 UU 2668
D-1724 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUG[MEO- AGA 2669 I]AGAAAGGCAUGAAGCAUU 2670 D-1725 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGU[MEO- AGA 2671 I]GAAAGGCAUGAAGCAUU 2672 D-1726 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGUA[MEO- AGA 2673 I]AAAGGCAUGAAGCAUU 2674 D-1727 UGCUUCAUG AC[MEO- CCUUUCUAC I]GUAGAAAGGCAUGAAGCA CGA 2675 UU 2676 D-1728 UGCUUCAUG CCUUUCUCC ACUG[MEO- AGA 2677 I]AGAAAGGCAUGAAGCAUU 2678 D-1729 UGCUUCAUG CCUUUCCAC ACUGU[MEO- AGA 2679 I]GAAAGGCAUGAAGCAUU 2680 D-1730 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUUUAGAAAGGCAUGAAGCA AAA 2681 GUU 2682 D-1731 CUGCUUCAU
GCCUUUAUA AUGUAUAAAGGCAUGAAGCA CAA 2683 GUU 2684 D-1732 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2685 GUU 2686 D-1733 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2687 GUU 2688
D-1734 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2689 AUU 2690 D-1735 UGCUUCAUG
CCUUTCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2691 AUU 2692 D-1736 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2693 AUU 2694 D-1737 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAAAAAGGCAUGAAGCA CAA 2695 GUU 2696 D-1738 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2697 AUU 2698 D-1739 CUGCUUCAU AU[MEO- GCCUUUCUA I]UAGAAAGGCAUGAAGCAG CAA 2699 UU 2700 D-1740 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUCUAGAAAGGCAUGAAGCA GAA 2701 GUU 2702 D-1741 CUGCUUCAU
GCCUUACUA AUGUAGUAAGGCAUGAAGCA CAA 2703 GUU 2704 D-1742 UGCUUCAUG ACU[MEO- CCUUUCUAC I]UAGAAAGGCAUGAAGCAU AGA 2705 U 2706 D-1743 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGUAG[MEO- AGA 2707 I]AAGGCAUGAAGCAUU 2708
D-1744 UGCUUCAUG CCUUCCUAC ACUGUAG[MEO- AGA 2709 I]AAGGCAUGAAGCAUU 2710 D-1745 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUAUAGAAAGGCAUGAAGCA UAA 2711 GUU 2712 D-1746 CUGCUUCAU
GCCUUUUUA AUGUAAAAAGGCAUGAAGCA CAA 2713 GUU 2714 D-1747 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2715 GUU 2716 D-1748 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2717 GUU 2718 D-1749 CUGCUUCAU
GCCUUTCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2719 GUU 2720 D-1750 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2721 GUU 2722 D-1751 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AAGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2723 GUU 2724 D-1752 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2725 GUU 2726 D-1753 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAAAAAGGCAUGAAGC AGA 2727 AUU 2728
D-1754 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUAG[MEO- CAA 2729 I]AAGGCAUGAAGCAGUU 2730 D-1755 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2731 GUU 2732 D-1756 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2733 GUU 2734 D-1757 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2735 GUU 2736 D-1758 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2737 GUU 2738 D-1759 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2739 GUU 2740 D-1760 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2741 GUU 2742 D-1761 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2743 GUU 2744 D-1762 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2745 GUU 2746 D-1763 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2747 GUU 2748
D-1764 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2749 GUU 2750 D-1765 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2751 AUU 2752 D-1766 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2753 AUU 2754 D-1767 CUGCUUCAU
GGGAUUCUA AUGUAGAAUCCCAUGAAGCA CAA 2755 GUU 2756 D-1768 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2757 GUU 2758 D-1769 GUAUGUUCC
UGCUUCAUG AGGCAUGAAGCAGGAACAUA CCA 2759 CUU 2760 D-1770 UGUCCUGCU
UCAUGCCUU AGAAAGGCAUGAAGCAGGAC UCA 2761 AUU 2762 D-1771 GCUUCAUGC
CUUUCUACA AACUGUAGAAAGGCAUGAAG GUA 2763 CUU 2764 D-1772 CUUCAUGCC
UUUCUACAG ACACUGUAGAAAGGCAUGAA UGA 2765 GUU 2766 D-1773 UUCAUGCCU
UUCUACAGU ACCACUGUAGAAAGGCAUGA GGA 2767 AUU 2768
D-1774 CUGCUUCAU
GCCUUUCAA AUGUUGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2769 GUU 2770 D-1775 CUGCUUCAU AUG[MEO- GCCUUUCUC I]AGAAAGGCAUGAAGCAGU CAA 2771 U 2772 D-1776 UGCUUCAUG CCUUUCUCC ACUG[MEO- AGA 2773 I]AGAAAGGCAUGAAGCAUU 2774 D-1777 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGU[MEO- CAA 2775 I]GAAAGGCAUGAAGCAGUU 2776 D-1778 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGU[MEO- AGA 2777 I]GAAAGGCAUGAAGCAUU 2778 D-1779 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUA[MEO- CAA 2779 I]AAAGGCAUGAAGCAGUU 2780 D-1780 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGUA[MEO- AGA 2781 I]AAAGGCAUGAAGCAUU 2782 D-1781 CUGCUUCAU GCCUUCCUA AUGUAG[MEO- CAA 2783 I]AAGGCAUGAAGCAGUU 2784 D-1782 CUGCUUCAU GCCUCUCUA AUGUAGA[MEO- CAA 2785 I]AGGCAUGAAGCAGUU 2786 D-1783 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGAAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2787 AUU 2788
D-1784 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2789 AUU 2790 D-1785 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2791 AUU 2792 D-1786 CUGCUUCAU
GCCUUUCTA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2793 GUU 2794 D-1787 CUGCUUCAU
GCCUUUCTA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2795 GUU 2796 D-1788 UGCUUCAUG
CCUUUCTAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2797 AUU 2798 D-1789 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2799 AUU 2800 D-1790 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2801 AUU 2802 D-1791 CUGCUUCAU AU[MEO- GCCUUUCUA I]UAGAAAGGCAUGAAGCAG CAA 2803 UU 2804 D-1792 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUAG[MEO- CAA 2805 I]AAGGCAUGAAGCAGUU 2806 D-1793 CUGCUUCAU
GCCUUACUA AUGUAGUAAGGCAUGAAGCA CAA 2807 GUU 2808
D-1794 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGUAG[MEO- AGA 2809 I]AAGGCAUGAAGCAUU 2810 D-1795 UGCUUCAUG CCUUCCUAC ACUGUAG[MEO- AGA 2811 I]AAGGCAUGAAGCAUU 2812 D-1796 UGCUUCAUG ACU[MEO- CCUUUCUAC I]UAGAAAGGCAUGAAGCAU AGA 2813 U 2814 D-1797 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGU[MEO- CAA 2815 I]GAAAGGCAUGAAGCAGUU 2816 D-1798 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGU[MEO- CAA 2817 I]GAAAGGCAUGAAGCAGUU 2818 D-1799 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGU[MEO- CAA 2819 I]GAAAGGCAUGAAGCAGUU 2820 D-1800 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUAG[MEO- CAA 2821 I]AAGGCAUGAAGCAGUU 2822 D-1801 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2823 AUU 2824 D-1802 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCAAUGUAGAAAGGCAUG GCA 2825 AUU 2826 D-1803 CUGCUUCAU
GGGAUUGUA AUGUACAAUCCCAUGAAGCA CAA 2827 GUU 2828
D-1804 CUGCUUCAU GCCUUUCTA AUGU[MEO- CAA 2829 I]GAAAGGCAUGAAGCAGUU 2830 D-1805 UGCUUCAUG CCUUUCUAC ACUGUA[MEO- AGA 2831 I]AAAGGCAUGAAGCAUU 2832 D-1806 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2833 GUU 2834 D-1807 CUGCUUCAU
GCCUTUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2835 GUU 2836 D-1808 CUGCUUCAU GCCUUTCUA AUGUAG[MEO- CAA 2837 I]AAGGCAUGAAGCAGUU 2838 D-1809 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2839 AUU 2840 D-1810 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2841 AUU 2842 D-1811 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC ACUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2843 AUU 2844 D-1812 UGUUCCUGC
UUCAUGCCU AAGGCAUGAAGCAGGAACAU UUA 2845 U 2846 D-1813 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2847 GUU 2848
D-1814 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2849 AUU 2850 D-1815 UGUUCCUGC
UUCAUGCCU AAGGCAUGAAGCAGGAACAU A 2851 U 2852 D-1816 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUUA 2853 AUU 2854 D-1817 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2855 ACC 2856 D-1818 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUUA 2857 ACC 2858 D-1819 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2859 AUU 2860 D-1820 UAUGUUCCU
GCUUCAUGC AACGCAUGAAGCAGGAACAU GUA 2861 AUU 2862 D-1821 UAUGUUCCU
GCUUCAUGG AAGCCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2863 AUU 2864 D-1822 UAUGUUCCU
GCUUCAAGC AAGGCUUGAAGCAGGAACAU CUA 2865 AUU 2866 D-1823 UAUGUUCCU
GCUUCUUGC AAGGCAAGAAGCAGGAACAU CUA 2867 AUU 2868
D-1824 UAUGUUCCU
GCUUGAUGC AAGGCAUCAAGCAGGAACAU CUA 2869 AUU 2870 D-1825 UAUGUUCCU
GCUACAUGC AAGGCAUGUAGCAGGAACAU CUA 2871 AUU 2872 D-1826 UAUGUUCCU
GCAUCAUGC AAGGCAUGAUGCAGGAACAU CUA 2873 AUU 2874 D-1827 UAUGUUCCU
GGUUCAUGC AAGGCAUGAACCAGGAACAU CUA 2875 AUU 2876 D-1828 UAUGUUCCU
CCUUCAUGC AAGGCAUGAAGGAGGAACAU CUA 2877 AUU 2878 D-1829 UAUGUUCCA
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCUGGAACAU CUA 2879 AUU 2880 D-1830 UAUGUUCGU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCACGAACAU CUA 2881 AUU 2882 D-1831 UAUGUUGCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGCAACAU CUA 2883 AUU 2884 D-1832 UAUGUACCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGUACAU CUA 2885 AUU 2886 D-1833 UAUGAUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAUCAU CUA 2887 AUU 2888
D-1834 UAUCUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAAGAU CUA 2889 AUU 2890 D-1835 UAAGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACUU CUA 2891 AUU 2892 D-1836 UUUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAA CUA 2893 AUU 2894 D-1837 AAUGUUCCU
GCUUCAUGC AAGGCAUGAAGCAGGAACAU CUA 2895 UUU 2896 D-1838 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2897 AUU 2898 D-1839 UCAUGCCUU
UCUACAGUG ACCCACUGUAGAAAGGCAUG GGA 2899 AUU 2900 D-1840 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGGCACUGUAGAAAGGCAUG CCA 2901 AUU 2902 D-1841 UCAUGCCUU
UCUACAGUC AGCGACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2903 AUU 2904 D-1842 UCAUGCCUU
UCUACAGAG AGCCUCUGUAGAAAGGCAUG GCA 2905 AUU 2906 D-1843 UCAUGCCUU
UCUACACUG AGCCAGUGUAGAAAGGCAUG GCA 2907 AUU 2908
D-1844 UCAUGCCUU
UCUACUGUG AGCCACAGUAGAAAGGCAUG GCA 2909 AUU 2910 D-1845 UCAUGCCUU
UCUAGAGUG AGCCACUCUAGAAAGGCAUG GCA 2911 AUU 2912 D-1846 UCAUGCCUU
UCUUCAGUG AGCCACUGAAGAAAGGCAUG GCA 2913 AUU 2914 D-1847 UCAUGCCUU
UCAACAGUG AGCCACUGUUGAAAGGCAUG GCA 2915 AUU 2916 D-1848 UCAUGCCUU
UGUACAGUG AGCCACUGUACAAAGGCAUG GCA 2917 AUU 2918 D-1849 UCAUGCCUA
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAUAGGCAUG GCA 2919 AUU 2920 D-1850 UCAUGCGUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAACGCAUG GCA 2921 AUU 2922 D-1851 UCAUGGCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGCCAUG GCA 2923 AUU 2924 D-1852 UCAAGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCUUG GCA 2925 AUU 2926 D-1853 UCUUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAAG GCA 2927 AUU 2928
D-1854 UGAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUC GCA 2929 AUU 2930 D-1855 ACAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2931 UUU 2932 D-1856 UCAUGCCUU
ACUACAGUG AGCCACUGUAGUAAGGCAUG GCA 2933 AUU 2934 D-1857 AUGCCUUUC
UACAGUGGC AGCCACUGUAGAAAGGCAUU UUA 2935 U 2936 D-1858 AUGCCUUUC
UACAGUGGC AGCCACUGUAGAAAGGCAUU A 2937 U 2938 D-1859 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2939 AUU 2940 D-1860 AAUGCCUUU
CUACAGUGG AGCCACUGUAGAAAGGCAUU CU 2941 U 2942 D-1861 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCUA 2943 AUU 2944 D-1862 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2945 AAG 2946 D-1863 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCUA 2947 AAG 2948
D-1864 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCUA 2949 AUU 2950 D-1865 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2951 AAG 2952 D-1866 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCUA 2953 AAG 2954 D-1867 CUGCUUCAU GCCUUUCUA AUGUA[MEO- CAA 2955 I]AAAGGCAUGAAGCAGUU 2956 D-1868 GCGGCUUCG
ACGGCUUCU UAGAAGCCGUCGAAGCCGCU AUU 2957 U 2958 D-1869 GCGGCUUCG
ACGGGUUCU UAGAACCCGUCGAAGCCGCU AUU 2959 U 2960 D-1870 GCGGCUUCG
ACGCCUUCU UAGAAGGCGUCGAAGCCGCU AUU 2961 U 2962 D-1871 GCGGCUUCG
ACCGCUUCU UAGAAGCGGUCGAAGCCGCU AUU 2963 U 2964 D-1872 GCGGCUUCC
UGGGCUUCU AUAGAAGCCCAGGAAGCCGC AUU 2965 UU 2966 D-1873 AGCUUCAUG
GGAUUGUAC AUGUACAAUCCCAUGAAGCU AUUU 2967 U 2968
D-1874 UCAUGCCUU
UGAUCACUG AGCCAGUGAUCAAAGGCAUG GCA 2969 AUU 2970 D-1875 GCGGCUUCC
UGGGCUUCU UAGAAGCCCAGGAAGCCGCU AUU 2971 U 2972 D-1876 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC ACUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2973 AUU 2974 D-1877 UCAUGCCUU
UCUACAGUG AGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2975 AUU 2976 D-1878 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2977 GUU 2978 D-1879 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2979 GUU 2980 D-1880 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2981 GUU 2982 D-1881 UCAUGCCUU
UCUACAGUG UGCCACUGUAGAAAGGCAUG GCA 2983 AUU 2984 D-1882 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAA 2985 GUU 2986 D-1883 UGCUUCAUG
CCUUUCUAC UCUGUAGAAAGGCAUGAAGC AGA 2987 AUU 2988
D-1884 CUGCUUCAU
GCCUUUCUA AUGUAGAAAGGCAUGAAGCA CAT 2989 GUU 2990
[0182] Para melhorar a potência e estabilidade in vivo de sequências de siRNA para PNPLA3, modificações químicas foram incorporadas em moléculas de siRNA para PNPLA3. Especificamente, modificações 2'-O-metila e 2'- fluoro do açúcar ribose foram incorporadas em posições específicas dentro dos siRNA para PNPLA3. Ligações internucleotídicas fosforotioato também foram incorporadas nas extremidades terminais das sequências antissentido e/ ou sentido. A Tabela 2 abaixo ilustra as modificações nas sequências sentido e antissentido para cada um dos siRNA para PNPLA3 modificados. As sequências de nucleotídeos na Tabela 2 e em outras partes do pedido estão listadas de acordo com as seguintes notações: A, U, G, e C =ribonucleotídeo correspondente; dT = desoxitimidina; dA = desoxiadenosina; dC = desoxicitidina; dG = desoxiguanosina; invDT = desoxitimidina invertida; invDA = desoxiadenosina invertida; invDC = desoxicitidina invertida; invDG = desoxiguanosina invertida; a, u, g, e c = 2'-O-metilribonucleotídeo correspondente; Af, Uf, Gf, e Cf = 2'-desoxi-2'-fluoro("2'-fluoro")-ribonucleotídeo correspondente; Ab = Abásico; MeO-I = 2'-metoxi-inosina; GNA = ácido glicolnucleico; sGNA = ácido glicolnucleico com 3'-fosforotioato; LNA = ácido nucleico trancado. A inserção de um "s" na sequência indica que os dois nucleotídeos adjacentes estão conectados por um grupo fosforotiodiéster (por exemplo, uma ligação internucleotídica fosforotioato). A menos que indicado em contrário, todos os outros nucleotídeos são conectados por grupos 3'-5' fosfodiéster.
Cada um dos compostos de siRNA na Tabela 2 compreende uma região de hélice dupla com 19 pares de bases com uma protuberância de 2 nucleotídeos na extremidade 3' de ambas as fitas ou um "bluntmer" em uma ou ambas as extremidades.
O GalNAc3K2AhxC6 é:
Tabela 2. Sequências de siRNA dirigidas para PNPLA3 com modificações Hélice Sequência SEQ ID Sequência SEQ ID dupla sentido (5'-3') NO: antissentido NO: N.º (sentido) (5'-3') (antiss entido) D-2000 GfsgsGfcAfaUfaA 167 asGfscAfgGfuA 168 fAfGfuAfcCfuGfc fcuuUfaUfuGfc UfsusUf CfcsUfsu D-2001 CfsgsGfcCfaAfuG 169 asGfscUfgGfuG 170 fUfCfcAfcCfaGfc fgacAfuUfgGfc UfsusUf CfgsUfsu D-2002 GfsgsUfcCfaGfcC 171 asAfsgAfaGfuU 172 fUfGfaAfcUfuCfu fcagGfcUfgGfa UfsusUf CfcsUfsu
D-2003 GfscsUfuCfaUfcC 173 csUfsgUfaGfaA 174 fCfCfuUfcUfaCfa fgggGfaUfgAfa GfsusUf GfcsUfsu D-2004 GfscsGfgCfuUfcC 175 usAfsgAfaGfcC 176 fUfGfgGfcUfuCfu fcagGfaAfgCfc AfsusUf GfcsUfsu D-2005 GfscsCfuCfuGfaG 177 asCfscAfaCfuC 178 fCfUfgAfgUfuGfg fagcUfcAfgAfg UfsusUf GfcsUfsu D-2006 GfsusGfaCfaAfcG 179 asUfsgAfaGfgG 180 fUfAfcCfcUfuCfa fuacGfuUfgUfc UfsusUf AfcsUfsu D-2007 CfscsCfgCfcUfcC 181 usUfsuGfgGfaC 182 fAfGfgUfcCfcAfa fcugGfaGfgCfg AfsusUf GfgsUfsu D-2008 CfsusUfcAfuCfcC 183 asCfsuGfuAfgA 184 fCfUfuCfuAfcAfg faggGfgAfuGfa UfsusUf AfgsUfsu D-2009 GfsgsUfaUfgUfuC 185 csAfsuGfaAfgC 186 fCfUfgCfuUfcAfu faggAfaCfaUfa GfsusUf CfcsUfsu D-2010 GfsusAfuGfuUfcC 187 gsCfsaUfgAfaG 188 fUfGfcUfuCfaUfg fcagGfaAfcAfu CfsusUf AfcsUfsu D-2011 UfsasUfgUfuCfcU 189 gsGfscAfuGfaA 190 fGfCfuUfcAfuGfc fgcaGfgAfaCfa CfsusUf UfasUfsu D-2012 AfsusGfuUfcCfuG 191 gsGfsgCfaUfgA 192 fCfUfuCfaUfgCfc fagcAfgGfaAfc CfsusUf AfusUfsu
D-2013 UfsgsUfuCfcUfgC 193 asGfsgGfcAfuG 194 fUfUfcAfuGfcCfc faagCfaGfgAfa UfsusUf CfasUfsu D-2014 GfsusUfcCfuGfcU 195 asAfsgGfgCfaU 196 fUfCfaUfgCfcCfu fgaaGfcAfgGfa UfsusUf AfcsUfsu D-2015 UfsusCfcUfgCfuU 197 gsAfsaGfgGfcA 198 fCfAfuGfcCfcUfu fugaAfgCfaGfg CfsusUf AfasUfsu D-2016 UfscsCfuGfcUfuC 199 asGfsaAfgGfgC 200 fAfUfgCfcCfuUfc faugAfaGfcAfg UfsusUf GfasUfsu D-2017 CfscsUfgCfuUfcA 201 usAfsgAfaGfgG 202 fUfGfcCfcUfuCfu fcauGfaAfgCfa AfsusUf GfgsUfsu D-2018 CfsusGfcUfuCfaU 203 gsUfsaGfaAfgG 204 fGfCfcCfuUfcUfa fgcaUfgAfaGfc CfsusUf AfgsUfsu D-2019 UfsgsCfuUfcAfuG 205 usGfsuAfgAfaG 206 fCfCfcUfuCfuAfc fggcAfuGfaAfg AfsusUf CfasUfsu D-2020 GfscsUfuCfaUfgC 207 csUfsgUfaGfaA 208 fCfCfuUfcUfaCfa fgggCfaUfgAfa GfsusUf GfcsUfsu D-2021 CfsusUfcAfuGfcC 209 asCfsuGfuAfgA 210 fCfUfuCfuAfcAfg faggGfcAfuGfa UfsusUf AfgsUfsu D-2022 UfsusCfaUfgCfcC 211 csAfscUfgUfaG 212 fUfUfcUfaCfaGfu faagGfgCfaUfg GfsusUf AfasUfsu
D-2023 UfscsAfuGfcCfcU 213 csCfsaCfuGfuA 214 fUfCfuAfcAfgUfg fgaaGfgGfcAfu GfsusUf GfasUfsu D-2024 CfsasUfgCfcCfuU 215 gsCfscAfcUfgU 216 fCfUfaCfaGfuGfg fagaAfgGfgCfa CfsusUf UfgsUfsu D-2025 AfsusGfcCfcUfuC 217 gsGfscCfaCfuG 218 fUfAfcAfgUfgGfc fuagAfaGfgGfc CfsusUf AfusUfsu D-2026 UfsgsCfcCfuUfcU 219 asGfsgCfcAfcU 220 fAfCfaGfuGfgCfc fguaGfaAfgGfg UfsusUf CfasUfsu D-2027 GfscsCfcUfuCfuA 221 asAfsgGfcCfaC 222 fCfAfgUfgGfcCfu fuguAfgAfaGfg UfsusUf GfcsUfsu D-2028 GfsgsUfaUfgUfuC 223 gsAfsuGfaAfgC 224 fCfUfgCfuUfcAfu faggAfaCfaUfa CfsusUf CfcsUfsu D-2029 GfsusAfuGfuUfcC 225 gsGfsaUfgAfaG 226 fUfGfcUfuCfaUfc fcagGfaAfcAfu CfsusUf AfcsUfsu D-2030 UfsasUfgUfuCfcU 227 gsGfsgAfuGfaA 228 fGfCfuUfcAfuCfc fgcaGfgAfaCfa CfsusUf UfasUfsu D-2031 AfsusGfuUfcCfuG 229 gsGfsgGfaUfgA 230 fCfUfuCfaUfcCfc fagcAfgGfaAfc CfsusUf AfusUfsu D-2032 UfsgsUfuCfcUfgC 231 asGfsgGfgAfuG 232 fUfUfcAfuCfcCfc faagCfaGfgAfa UfsusUf CfasUfsu
D-2033 GfsusUfcCfuGfcU 233 asAfsgGfgGfaU 234 fUfCfaUfcCfcCfu fgaaGfcAfgGfa UfsusUf AfcsUfsu D-2034 UfsusCfcUfgCfuU 235 gsAfsaGfgGfgA 236 fCfAfuCfcCfcUfu fugaAfgCfaGfg CfsusUf AfasUfsu D-2035 UfscsCfuGfcUfuC 237 asGfsaAfgGfgG 238 fAfUfcCfcCfuUfc faugAfaGfcAfg UfsusUf GfasUfsu D-2036 CfscsUfgCfuUfcA 239 usAfsgAfaGfgG 240 fUfCfcCfcUfuCfu fgauGfaAfgCfa AfsusUf GfgsUfsu D-2037 CfsusGfcUfuCfaU 241 gsUfsaGfaAfgG 242 fCfCfcCfuUfcUfa fggaUfgAfaGfc CfsusUf AfgsUfsu D-2038 UfsgsCfuUfcAfuC 243 usGfsuAfgAfaG 244 fCfCfcUfuCfuAfc fgggAfuGfaAfg AfsusUf CfasUfsu D-2039 UfsusCfaUfcCfcC 245 csAfscUfgUfaG 246 fUfUfcUfaCfaGfu faagGfgGfaUfg GfsusUf AfasUfsu D-2040 UfscsAfuCfcCfcU 247 csCfsaCfuGfuA 248 fUfCfuAfcAfgUfg fgaaGfgGfgAfu GfsusUf GfasUfsu D-2041 CfsasUfcCfcCfuU 249 gsCfscAfcUfgU 250 fCfUfaCfaGfuGfg fagaAfgGfgGfa CfsusUf UfgsUfsu D-2042 UfscsCfcCfuUfcU 251 asGfsgCfcAfcU 252 fAfCfaGfuGfgCfc fguaGfaAfgGfg UfsusUf GfasUfsu
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[0183] Um painel de siRNA totalmente quimicamente modificados, incluindo siRNA abrangendo o SNP rs738409 e/ou rs738408 em PNPLA3, foi preparado e testado quanto à potência e seletividade do silenciamento de mRNA in vitro. Cada hélice dupla de siRNA consistiu em duas fitas, a fita sentido ou 'viajante' e a fita antissentido ou 'guia'. As fitas têm 21 ou 23 nucleotídeos de comprimento com 19 pares de bases complementares. Em alguns casos, há protuberâncias 3' com dois pares de bases. O siRNA foi preparado com substituição do 2'-OH natural na ribose de cada nucleotídeo por um grupo 2'-OMe ou 2'-F. Opcionalmente, ligações internucleotídicas fosfosdiéster em uma ou ambas as fitas foram substituídas por fosforotioatos para reduzir a degradação por exonucleases.
[0184] A eficácia de cada uma das moléculas de siRNA na redução da expressão de PNPLA3 foi avaliada usando um formato de ensaio de transfecção de siRNA in vitro em 384 poços seguido de um ensaio de hibridação in situ fluorescente visando moléculas de ácidos ribonucleicos (FISH de RNA) para determinar valores IC50 e de atividade máxima. Este ensaio foi realizado na linhagem de células de carcinoma hepatocelular humano células Hep3B (ATCC HB- 8064) e células de ovário de hamster chinês (CHO) expressando PNPLA3 I148I humano. HepB3 de carcinoma hepatocelular humano foi mantido em meio EMEM (ATCC 30- 2003) suplementado com soro fetal de bovino 10% e antibiótico/antimicótico 1% a 37 °C e 5% de CO2. Células CHO expressando PNPLA3 I148I humano foram mantidas em meio contendo CD-CHO 50% (Life Technologies), Meio Ex-Cell CHO 5 50% (Sigma), L-Glutamina 8 mM, 1 x HT, antibiótico/antimicótico 1% e 10 μg/mL de Puromicina a 37 °C e 5% de CO2.
[0185] Para ensaios com células Hep3B, complexos de transfecção das moléculas de siRNA e o reagente de transfecção Lipofectamina RNAiMAX (Life Technologies) em meio EMEM (ATCC 30-2003) foram preparados em placas de 384 poços (PerkinElmer), a 10 μg por poço, de acordo com as recomendações do fabricante. Para ensaios com células CHO humanas, complexos de transfecção das moléculas de siRNA e o reagente de transfecção Lipofectamina RNAiMAX em meio F12K (Mediatech) foram preparados em placas de 384 poços, a 10 μg por poço, de acordo com as recomendações do fabricante. Células foram diluídas para 67 000 células/mL em meio sem antibióticos/antimicóticos e 30 μL foram adicionados a cada poço, uma densidade final de 2000 células/poço em 40 μL de meio. Após uma incubação durante 20 minutos à temperatura ambiente, as placas foram transferidas para um incubador a 37 °C e 5% de CO2. Ensaios de transfecção de células Hep3B foram incubados durante 72 horas e ensaios transfecção de PNPLA3 I148I humano em CHO foram incubados durante 48 horas.
[0186] Na colheita, as células foram fixadas em uma solução fixadora de formaldeído 8% (Thermo Scientific) durante 15 minutos à temperatura ambiente. As placas foram então sujeitas a desidratação com lavagens sequenciais com etanol a 50%, 70% e 100%. As placas foram então seladas e armazenadas a -20 °C.
[0187] O ensaio FISH de RNA foi realizado usando o kit de Ensaio de Rastreio Affymetrix QuantiGene® View RNA HC (QVP0011), o Kit de Amplificação do Sinal Affymetrix View HC 3-plex (QVP0213), e sondas específicas para genes Affymetrix: PNPLA3 Humano 0,33 mL View RNA Tipo 6 (etiqueta 650) VA6-20279-01 e PPIB Humano 0,44 mL View RNA Tipo 1 (etiqueta 488) VA1-10148-01.
[0188] As placas foram primeiramente re-hidratadas com lavagens sequenciais com etanol a 100%, 70% e 50%. As células foram então lavadas com PBS, e então permeabilizadas e digeridas com protease de acordo com as instruções do kit. O alvo Working Probe Sets foi preparado de acordo com o protocolo dos fabricantes, adicionado aos poços, e incubado durante 3 horas a 40 °C. O protocolo do fabricante foi seguido para as hibridações sequenciais com os Working Probe Sets, as Working PreAmps, as Working Amps, e as Working LPs. Por fim, contracolorações de núcleos foram aplicadas (Hoechst 33342 e Cell Mask Blue; Molecular Probes). As placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente, lavadas com PBS,
recobertas com 80 μL de PBS, e então as placas foram seladas para imagiologia.
[0189] Todas as placas foram submetidas a imagiologia em um Sistema de Rastreio Opera Phenix High Content (PerkinElmer), usando o Canal de UV para Hoechst 33342 e Cell Mask Blue, o Canal 488 para sondas de Tipo 1, e o Canal 647 para sondas do Tipo 6.
[0190] Dados de FISH de RNA foram analisados usando software Columbus e imagens foram geradas usando Genedata Screener. Os resultados do ensaio para PNPLA3 I148I transfectado em CHO são mostrados na Tabela 3. Os resultados do ensaio para PNPLA3 I148M transfectado em CHO são mostrados na Tabela 4. O silenciamento de PNPLA3 proporciona uma percentagem de silenciamento em comparação com controle. Valores negativos indicam um decréscimo de níveis de PNPLA3. Tabela 3. Ensaio FISH de RNA em PNPLA3 I148I transfectado em CHO Hélice dupla N.º IC50 (μM) Silenciamento de PNPLA3 (%) D-2001 .0589 -33,9 D-2002 .0158 -67,2 D-2003 .0427 -43,4 D-2004 .00835 -63,5 D-2006 .0177 -77,8 D-2008 .125 -10,7 D-2009 .00769 -45,5 D-2010 .00558 -80 D-2011 .035 -3 D-2012 > 0,5 -3,7
D-2013 .036 -6,4 D-2014 .0122 -58,2 D-2015 > 0,5 8 D-2016 > 0,5 8 D-2017 .0153 -73,2 D-2018 .00386 -31,5 D-2019 .125 D-2020 > 0,5 D-2021 > 0,5 8 D-2022 > 0,167 -6,8 D-2023 .0257 -36,9 D-2024 > 0,5 4 D-2025 > 0,5 -2,5 D-2026 .022 -35,1 D-2027 .00172 -16,5 D-2028 > 0,5 10 D-2029 .0106 -56,2 D-2032 .00205 -52,9 D-2033 .0107 -61,7 D-2034 > 0,5 6 D-2035 > 0,5 -3,8 D-2036 .00665 -55,9 D-2037 > 0,5 4 D-2038 > 0,5 10 D-2039 .0116 -23,9 D-2040 > 0,5 -25,4 D-2041 > 0,5 9 D-2042 .00959 -25,5 D-2043 > 0,5 9
D-2044 .00552 -29 D-2045 > 0,5 9 D-2046 > 0,5 9 D-2047 > 0,5 -5,9 D-2048 .00618 -56,3 D-2049 > 0,5 12 D-2050 > 0,5 10 D-2051 > 0,5 -17,2 D-2052 > 0,5 -8,3 D-2053 > 0,5 11 D-2054 > 0,5 -14,9 D-2055 > 0,5 -10,6 D-2056 > 0,5 10 D-2057 .00485 -59,2 D-2058 .014 -53 D-2059 > 0,5 -4,9 D-2060 > 0,5 18 D-2061 .00795 -44,8 D-2062 .000668 -74,6 D-2063 > 0,5 -21,8 D-2064 > 0,5 9 D-2065 > 0,5 -10,5 D-2066 .0412 -42,2 D-2067 > 0,5 10
Tabela 4. Ensaio FISH de RNA em PNPLA3 I148M transfectado em CHO Hélice dupla N.º IC50 (μM) Silenciamento de PNPLA3 (%)
D-2000 .0316 -29,2 D-2001 .0131 -81,8 D-2002 .00216 -90,5 D-2003 .022 -50,4 D-2004 .00429 -88 D-2005 > 0,5 15 D-2006 .00301 -89,2 D-2007 > 0,5 6 D-2009 .00274 -86,9 D-2010 .00203 -93,3 D-2011 .000694 -11,9 D-2012 > 0,5 -18 D-2013 .011 -66,4 D-2014 .0057 -84,3 D-2015 > 0,5 -13,5 D-2016 > 0,5 -12,4 D-2017 .00448 -89,4 D-2018 .0104 -36,2 D-2019 .0302 -7,7 D-2020 .01 -78,9 D-2021 .00435 -83,5 D-2022 .00628 -88,6 D-2023 .0143 -44,3 D-2024 > 0,5 11 D-2025 .00355 -58,2 D-2026 .000867 -39,4 D-2027 > 0,5 32 D-2028 .00205 -89,9 D-2029 .0019 -94
D-2030 > 0,5 -9,4 D-2031 > 0,5 4
[0191] FISH de RNA também foi realizado em uma linhagem de células hepáticas contendo o mutante duplo PNPLA3-rs738408-rs738409, bem como uma linhagem de células de tipo selvagem de controle, Hep3B. Células Hep3B e HepG2 (adquiridas à ATCC) foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM da Corning para Hep3B e EMEM da ATCC para HepG2) suplementado com soro fetal de bovino 10% (FBS, Sigma) e penicilina-estreptomicina 1% (P-S, Corning). A transfecção de siRNA foi realizada do modo seguinte: 1 μL de siRNA de teste e 4 μL de MEM ou EMEM simples, dependendo da linhagem de células, foram adicionados a placas de ensaio CellCarrier-384 Ultra revestidas com PDL (PerkinElmer) por BioMek FX (Beckman Coulter). 5 μL de Lipofectamina RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific), pré- diluídos em MEM ou EMEM simples (especificamente 0,035 μL de RNAiMAX em 5 μL de MEM para Hep3B e 0,06 μL de RNAiMAX em 5 μL de EMEM para HepG2), foram então distribuídos nas placas de ensaio pelo Distribuidor de Reagentes Multidrop Combi (Thermo Fisher Scientific). Após 20 min de incubação da mistura siRNA/RNAiMAX à temperatura ambiente (TA), 30 μL de células Hep3B ou HepG2 (2000 células por poço) em MEM ou EMEM suplementado com FBS 10% e P-S 1% foram adicionados ao complexo de transfecção usando o Distribuidor de Reagentes Multidrop Combi. As placas de ensaio foram incubadas durante 20 min à TA antes de serem colocadas em um incubador. As células foram então incubadas durante 72 h a 37 °C e 5% de CO2. O Ensaio de Células ViewRNA ISH foi realizado seguindo o protocolo do fabricante (Thermo Fisher Scientific) usando uma plataforma de ensaio FISH automatizada montada internamente para o manejo de líquidos.
Em resumo, células foram fixadas em formaldeído 4% (Thermo Fisher Scientific) durante 15 min à TA, permeabilizadas com detergente durante 3 min à TA e então tratadas com solução de protease durante 10 min à TA.
A incubação de pares de sondas específicas para o alvo (Thermo Fisher Scientific) foi efetuada durante 3 h, ao passo que Sondas para Pré- amplificadores, Amplificadores e Etiquetas (Thermo Fisher Scientific) foram processadas durante 1 h cada.
Todos os passos de hibridação foram conduzidos a 40 °C no incubador automatizado Cytomat 2 C-LIN (Thermo Fisher Scientific). Após as reações de hibridação, células foram coradas durante 30 min com Hoechst e CellMask Blue (Thermo Fisher Scientific) e então submetidas a imagiologia em Opera Phenix (PerkinElmer). As imagens foram analisadas usando o Sistema de Armazenamento e Análise de Dados de Imagens Columbus (PerkinElmer) para obter contagens médias de manchas por célula.
As contagens de manchas foram normalizadas usando os poços de controle elevado (contendo solução salina tamponada com fosfato, Corning) e baixo (sem pares de sondas para o alvo). Os valores normalizados contra as concentrações totais de siRNA foram representados graficamente e os dados foram ajustados a um modelo sigmoide de quatro parâmetros em Genedata Screener (Genedata) para obter IC50 e atividade máxima.
Os resultados do ensaio para células HepG2 são mostrados na Tabela 5 e os resultados do ensaio para células Hep3B são mostrados na Tabela 6. O silenciamento de PNPLA3 proporciona uma percentagem de silenciamento em comparação com controle. Valores negativos indicam um decréscimo de níveis de PNPLA3. Nos casos em que uma hélice dupla foi processada mais do que uma vez, é mostrado o IC50 médio, com um desvio padrão.
Tabela 5. Ensaio FISH de RNA em células hepáticas HepG2 Hélice dupla IC50 (μM) Silenciamento N.º de PNPLA3 (%) D-2001 .0132 -70,5 D-2003 .0458 -46,9 D-2004 .0049 -74,2 D-2006 .00283 -69,6 D-2009 .00448 -62,2 D-2010 .00206 -52 D-2013 .00319 -71,7 D-2014 .00164 -67,4 D-2017 .00222 -60,9 D-2018 .00717 -52,7 D-2020 .00664 -68,3 D-2021 .00559 -61,5 D-2022 .004 -30,5 D-2023 > 0,5 -18 D-2025 .0041 -61,9 D-2026 .00937 -34,6 D-2043 > 0,1 -5,394 D-2045 > 0,1 -37,195 D-2046 > 0,1 0,94 D-2047 > 0,1 -11,446
D-2048 0,000355 -56,824 D-2049 Não definido -30,881 D-2050 > 0,1 -11,814 D-2051 0,000903 -73,749 D-2052 0,000235 -38,467 D-2053 0,000142 -19,405 D-2054 > 0,1 -29,069 D-2055 > 0,1 -31,986 D-2056 Não definido -38,596 D-2057 0,000197 -87,199 D-2058 0,00126 -40,177 D-2059 > 0,1 -11,162 D-2060 > 0,1 -8,147 D-2069 0,0329 -62,804 D-2072 0,00377 -47,552 D-2078 > 0,1 -25,077 D-2073 0,00602 -54,092 D-2084 0,000549 -45,854 D-2084 0,0018 -60,106 D-2085 0,000122 -38,539 D-2085 0,0076 -68,83 D-2086 0,00182 -25,524 D-2087 0,00103 -53,242 D-2088 0,00111 -26,614 D-2089 0,000776 -55,436 0,000457 +/- -62,57 +/- 1,46 D-2089 0,000174 D-2090 Não definido -56,094 D-2092 0,000979 -52,168
D-2099 0,000727 -43,233 D-2100 0,000152 -40,651 D-2104 0,000712 -72,734 D-2105 0,000129 -75,994 D-2128 0,00154 -60,927 D-2138 0,0142 -63,864 D-2149 0,000518 -74,288 D-2152 0,00524 -64,758 D-2153 0,00149 -72,861 D-2155 > 0,1 -32,937 D-2156 0,0183 -75,145 D-2157 > 0,0333 -37,881 D-2158 0,00368 -79,231 D-2159 0,00167 -85,848 D-2160 0,00442 -37,827 D-2172 0,0000615 -74,462 D-2182 0,000211 -79,605 D-2183 0,000159 -80,865 D-2187 0,00109 -67,777 D-2188 0,000728 -71,503 D-2189 0,000224 -58,772 D-2190 0,000803 -72,508 D-2192 0,00125 -33,021 D-2193 0,000152 -74,239 D-2194 0,00385 -50,848 D-2196 0,000362 -70,158 D-2197 0,000180 -54,44 D-2198 0,000269 -45,556 D-2199 0,000198 -81,082
D-2201 0,000356 -82,2 D-2202 0,000123 -62,466 D-2203 0,00476 -68,112 D-2204 0,000300 -63,383 D-2205 0,000442 -70,712 D-2206 0,000969 -74,194 D-2208 0,000202 -64,046 D-2209 0,000752 -63,083 D-2210 0,0000991 -60,426 D-2211 0,0000948 -71,098 D-2213 0,00119 -65,57 D-2214 0,000293 -72,959 D-2215 0,000307 -64,561 D-2217 0,00198 -87,273 D-2218 0,000186 -64,522 D-2219 0,000577 -74,879 D-2220 0,000189 -74,278 D-2221 0,000173 -54,639 D-2223 0,00131 -69,834 D-2224 0,000527 -84,911 D-2225 0,000561 -68,969 D-2226 0,00109 -75,536 D-2227 0,000227 -85,915 D-2228 0,00202 -50,227 D-2229 Não definido -59,847 D-2230 0,000156 -53,194 D-2231 0,000351 -65,054 D-2232 0,0000619 -63,991 D-2233 0,0000982 -74,304
D-2234 0,000290 -81,992 D-2235 0,000127 -83,593 D-2236 0,000243 -80,826 D-2237 0,0000711 -62,814 D-2238 0,0000690 -76,476 D-2239 0,000123 -74,747 D-2240 0,000120 -79,301 D-2241 0,000201 -88,769 D-2242 0,000179 -84,503 D-2243 0,000264 -88,712 D-2244 0,0000605 -82,556 D-2245 0,000125 -83,93 D-2246 0,000122 -84,41 D-2247 0,000100 -81,777 D-2248 0,000141 -79,18 D-2249 0,0000710 -85,093 D-2250 0,000494 -81,724 D-2251 0,000196 -87,601 D-2252 0,0000796 -62,87 D-2253 0,000501 -78,699 D-2254 0,0000979 -67,617 D-2255 0,000359 -81,18 D-2256 0,000610 -98,206 D-2257 0,000151 -76,718 D-2258 0,000325 -87,548 D-2259 0,000124 -82,545 D-2260 0,000109 -85,47 D-2261 0,000231 -75,386 D-2262 0,000162 -72,407
D-2263 0,000271 -74,968 D-2264 0,000132 -76,418 D-2265 > 0,1 -17,144 D-2266 Não definido -58,475 D-2267 > 0,1 -3,991 D-2280 0,0000390 -85,368 D-2286 0,00304 -89,536 D-2287 0,00142 -85,435 D-2287 0,000261 -66,501 D-2288 0,000839 -81,988 D-2289 0,0012 -83,437 D-2289 0,00168 -69,471 D-2290 0,00157 -73,089 D-2291 0,0112 -64,108 D-2292 0,00411 -66,681 D-2292 0,00138 -56,253 D-2293 0,00112 -61,118 D-2294 0,000408 -70,684 D-2295 0,000195 -65,493 D-2297 0,00165 -61,821 D-2297 0,000684 -69,444 D-2318 0,000986 -69,28 D-2319 0,00136 -67,654 D-2320 0,00129 -83,723 D-2323 0,00194 -74,525 D-2324 0,00209 -63,745 D-2325 0,000301 -81,302 D-2327 0,000306 -77,959 D-2327 0,000610 -56,293
D-2328 0,000131 -72,631 D-2345 0,000131 -72,677 D-2346 0,0000274 -71,459 D-2347 0,000640 -78,414 D-2348 0,000101 -64,627 D-2349 0,000487 -52,131 D-2350 0,000102 -68,668 D-2351 Não definido -70,229 D-2352 0,000332 -81,083 0,0027713 +/- -68,138 +/- 9,28 D-2352 0,00426 D-2353 0,000410 -83,001 D-2353 0,00215 -64,343 D-2354 0,003405 +/- 0,00185 -72,56 +/- 7,42 D-2354 0,000362 -72,776 D-2355 0,00215 -69,321 D-2358 0,0011 -61,081 D-2359 0,000654 -76,258 D-2360 Não definido -59,027 D-2361 0,00414 -57,88 D-2362 0,000772 -87,512 D-2364 0,00104 -53,895 D-2370 0,0024 -83,423 D-2371 0,00418 -72,262 D-2372 0,00492 -67,648 D-2373 0,000906 -64,099 D-2374 0,00282 -64,049 D-2375 0,00125 -59,813 D-2376 0,00171 -63,025
D-2377 0,00168 -61,597 D-2378 0,00505 -72,446 D-2379 0,00511 -80,576 D-2380 0,0497 -82,835 D-2381 0,000944 -71,788 D-2382 0,000830 -65,087 D-2383 0,00118 -71,393 D-2386 0,0000367 -44,073 D-2387 0,00224 -74,24 D-2390 0,00188 -69,313 D-2391 0,000493 -72,314 D-2393 0,008875 +/- 0,0112 -48,855 +/- 15,6 D-2401 0,000125 -69,217 D-2409 0,00479 -68,703 D-2402 > 0,5 21,01 +/- 6,08 D-2410 0,00533 -64,812 D-2411 0,00283 -64,889 D-2412 0,00211 -67,781 0,006575 +/- -64,021 +/- 15,8 D-2413 0,0000212 D-2417 0,00558 -50,293 D-2418 0,00566 -59,533 D-2419 > 0,5 -15,364 +/- 7,56 0,000498 +/- -65,15 +/- 17,5 D-2423 0,000414 D-2426 > 0,1 -15,207 D-2430 0,0000511 -63,602 0,000262 +/- -67,206 +/- 9,13 D-2444 0,000192
0,001795 +/- -51,619 +/- D-2454 0,000106 0,163 D-2456 0,000274 -61,291 D-2472 0,000314 -70,624 D-2473 > 0,1 -19,624 +/- 7,27 D-2474 0,000339 -37,846 D-2475 0,002249 +/- 0,00231 -41,661 +/- 8,64 D-2476 0,000594 -26,48 D-2477 0,000547 -61,592 D-2478 0,000168 -65,904 D-2479 0,0005565 -65,14 D-2480 0,000907 -53,271 D-2481 0,0004005 -59,5 D-2482 0,000493 -61,712 0,0004015 +/- -66,803 +/- .197 D-2483 0,000218 D-2484 0,0003375 -67,4 D-2485 0,0002865 -44,529 D-2486 0,0012575 -62,847 D-2487 0,000454 -54,396 D-2488 0,0002415 -66,315 D-2489 > 0,5 -2,973 +/- 1,98 D-2490 0,0011555 -62,566 D-2491 0,0006005 -60,304 D-2492 0,0007775 -47,748 D-2493 0,001465 -48,8 D-2494 0,0008985 -50,707 D-2495 0,001317 -55,5 D-2496 0,0001374 -68,949
0,00013615 +/- -72,763 +/- 4,02 D-2497 0,0000691 0,000332 +/- -82,507 +/- 6,15 D-2498 0,000259 D-2499 0,0004155 -75,4 0,0000742 +/- -74,968 +/- 5,41 D-2500 0,0000407 D-2501 > 0,5 -1,648 +/- 2,2 0,0002705 +/- -68,406 +/- 5,36 D-2502 0,000252 0,000313 +/- -67,858 +/- 8,2 D-2503 0,000198 0,0006445 +/- -59,733 +/- 7,96 D-2504 0,000385 D-2505 0,0004985 -53,3 D-2506 > 0,1 -16,588 +/- 14,9 D-2507 0,002136 -64,978 D-2508 > 0,1 -20,61 +/- 11,1 D-2509 0,001242 -65,112 D-2510 0,0015895 -56,416 D-2511 0,00166 -19,901 D-2512 0,000593 -0,374 0,0001497 +/- -69,663 +/- 11,6 D-2513 0,000123 0,000204 +/- -69,924 +/- 13,7 D-2514 0,0000594 0,000331 +/- -71,29 +/- 8,74 D-2515 0,000129
0,000348 +/- -65,905 +/- 14,8 D-2516 0,000249 0,000452 +/- -68,212 +/- 11,2 D-2517 0,000322 D-2518 0,0006965 -73,226 D-2519 > 0,5 -1,486 +/- 4,67 D-2520 0,000098 -75,127 0,000717 +/- -61,216 +/- 12,8 D-2521 0,000378 0,000661 +/- -56,771 +/- 16,9 D-2522 0,000748 D-2523 0,0003685 -73,312 0,0002745 +/- -65,341 +/- 12,7 D-2524 0,0000686 D-2525 0,003855 +/- 0,0033 -44,288 +/- 19,0 0,0006115 +/- -57,77 +/- 13,2 D-2526 0,000204 D-2527 0,000333 -77,405 0,0002665 +/- -62,407 +/- 8,65 D-2528 0,000105 0,0076967 +/- -44,194 +/- 6,73 D-2529 0,00555 0,0132 -42,657 +/- D-2530 0,222 D-2531 0,00312 -32,789 +/- 12,0 D-2532 0,005795 +/- 0,00268 -44,051 +/- 2,82 D-2533 0,005515 +/- 0,00356 -43,145 D-2534 0,0129 -28,734 +/- 16,4
0,003195 +/- -29,79 D-2535 0,000233 D-2536 0,005865 +/- 0,00456 -25,918 D-2537 0,0133 -25,755 +/- 3,32 D-2538 > 0,1 -40,955 +/- 5,3 D-2539 0,004785 +/- 0,00183 -34,334 +/- 11,0 D-2540 0,0044 +/- 0,00075 -39,221 D-2541 0,002735 +/- 0,00141 -62,39 +/- 3,03 D-2542 0,01323 +/- 0,0108 -30,917 +/- 1,57 D-2543 > 0,1 -8,54 +/- 8,37 D-2544 0,017 -23,757 +/- 2,2 D-2545 0,01642 +/- 0,0164 -52,394 +/- 7,21 D-2546 > 0,1 -25,351 +/- 7,84 D-2547 0,00412 -25,042 +/- 5,28 D-2548 0,00411 +/- 0,00184 -40,406 +/- 1,26 D-2549 0,02285 +/- 0,00318 -53,713 +/- 14,1 D-2550 0,015935 +/- 0,0115 -41,907 D-2551 0,00795 -26,39 D-2552 0,01165 +/- 0,00841 -41,306 D-2553 0,00361 -70,457 D-2554 0,00656 -42,866 D-2555 > 0,1 -11,425 D-2556 0,00336 -63,996 D-2557 > 0,1 -2,734 D-2558 0,00251 -66,775 D-2559 > 0,1 -7,034 D-2560 0,0234 -44,657 D-2561 0,00154 -74,225 D-2562 0,00454 -66,578
D-2563 0,00182 -77,025 D-2564 0,009 -64,021 D-2565 0,00609 -70,965 D-2566 0,00255 -52,65 D-2567 0,00584 -56,603 D-2568 0,0157 -63,002 D-2569 0,00327 -64,898 D-2570 0,00144 -55,424 D-2571 > 0,1 -18,661 D-2572 0,00557 -25,668 D-2573 0,0115 -55,329 D-2574 0,00289 -69,84 D-2575 0,00378 -69,491 D-2576 0,00527 -64,841 D-2577 0,00511 -46,449 D-2578 0,0026 -67,821 D-2579 0,00402 -67,057 D-2580 0,00119 -64,422 D-2581 0,00915 -73,008 D-2582 0,000823 -77,053 D-2583 0,00851 -66,555 D-2584 0,00513 -54,442 D-2585 0,0154 -67,707 D-2586 0,00701 -69,624 D-2587 0,00732 -66,627 D-2588 0,00226 -70,854 D-2589 0,00837 -31,221 D-2590 0,0249 -41,857 D-2591 0,009 -64,021
D-2592 0,00609 -70,965 D-2593 0,00255 -52,65 D-2594 0,00584 -56,603 D-2595 0,0157 -63,002 D-2596 0,00327 -64,898 D-2597 0,00144 -55,424 D-2598 > 0,1 -18,661 D-2599 0,00557 -25,668 D-2600 0,0115 -55,329 D-2601 0,00289 -69,84 D-2602 0,00378 -69,491 D-2603 0,00527 -64,841 D-2604 0,00511 -46,449 D-2605 0,0026 -67,821 D-2606 0,00402 -67,057 D-2607 0,00119 -64,422 D-2608 0,00915 -73,008 D-2609 0,000823 -77,053 D-2610 0,00141 -37,663 +/- 39,4 D-2611 > 0,1 -2,829 +/- 0,006 D-2612 > 0,1 -15,894 D-2613 0,00809 -58,833 D-2614 0,00204 -73,042 D-2615 0,00306 -70,087 D-2616 7,95E-04 -71,014 D-2617 0,00218 -75,769 D-2618 0,0429 -31,19 +/- 2,61 D-2619 0,02495 +/- 0,0192 -59,645 +/- 13,4 D-2620 0,0055 +/- 0,00329 -73,308 +/- 5,33
D-2621 0,004705 +/- 0,00176 -63,053 +/- 7,66 D-2622 0,004525 +/- 0,00231 -66,895 +/- 7,78 D-2623 0,00435 -31,366 +/- 14,5 D-2624 0,0056 +/- 0,0016 -65,16 +/- 10,9 D-2625 0,00764 +/- 0,00115 -73,065 +/- 9,97 D-2626 0,021645 +/- 0,0267 -71,117 +/- 3,63 D-2627 0,00651 +/- 0,00489 -63,009 +/- 8,83 D-2628 0,01334 +/- 0,00588 -48,771 +/- 2,35 D-2629 0,005504 +/- 0,00434 -74,111 +/- 4,61 D-2630 0,007965 +/- 0,00684 -70,17+/- 5,32 D-2631 > 0,1 -8,645 D-2632 > 0,1 -37,841 D-2633 0,0111 -53,354 D-2634 0,0187 -63,686 D-2635 0,00797 -58,605 D-2636 > 0,1 -34,727 D-2637 0,00541 -61,225 D-2638 0,00397 -62,221 D-2639 0,0295 +/- 0,0187 -51,328 +/- 12,8 D-2640 0,0212 -37,799 +/- 16,1 D-2641 0,00164 -21,913 +/- 14,1 D-2642 > 0,1 -11,733 +/- 23,5 D-2643 > 0,1 -23,009 D-2644 0,00165 -46,514 D-2645 0,00242 -75,956 D-2646 > 0,1 -15,539 +/- 1,03 D-2647 0,00243 -73,363 0,00117 +/- -74,63 +/- 1,55 D-2648 0,0000849
D-2649 0,007455 +/- 0,00756 -46,662 +/- 2,86 D-2650 0,003845 +/- 0,00122 -67,914 +/- 1,87 D-2651 0,000449 -70,274 D-2652 0,0014 -66,6 D-2653 0,00299 -59,695 D-2654 0,00431 -26,338 +/- 4,54 0,00254 +/- 0,0012 -52,632 +/- D-2655 0,938 D-2656 0,003275 +/- 0,00112 -37,351 +/- 0,79 D-2657 0,007435 +/- 0,00357 -37,313 +/- 3,03 D-2658 > 0,1 -22,486 +/- 10,6 D-2659 > 0,1 -10,905 +/- 3,7 D-2660 > 0,1 -4,489 +/- 8,45 D-2661 0,00875 +/- 0,00728 -56,877 +/- 9,41 D-2662 > 0,1 -8,133 D-2663 0,00268 +/- 0,000778 -73,024 +/- 1,16 D-2664 0,008 -30,908 +/- 1,19 0,004675 +/- -39,914 +/- 3,72 D-2665 0,000516 0,004085 +/- -46,423 +/- 3,66 D-2666 0,000106 D-2667 0,017107 +/- 0,0145 -72,967 +/- 2,96 D-2668 0,00589 +/- 0,000919 -73,779 +/- 2,9 0,0035033 +/- -67,153 +/- D-2669 0,00167 0,761 0,0129 -59,149 +/- D-2670 0,371 D-2671 0,0157 +/- 0,00156 -57,5 +/- 3,88 D-2672 > 0,1 -3,262 +/- 6,36
D-2673 0,00461 +/- 0,00173 -50,295 +/- 14,1 D-2674 0,00279 -54,886 +/- 32,2 D-2675 > 0,1 -13,5 +/- 21,4 D-2676 0,015075 +/- 0,0156 -50,255 +/- 8,86 D-2677 > 0,1 -22,123 D-2678 > 0,1 -43,995 D-2679 0,00268 -83,804 D-2680 > 0,1 -47,702 D-2681 > 0,1 -38,246 D-2682 0,00305 +/- 0,000255 -70,849 +/- 11,3 D-2683 0,00363 -59,037 +/- 15,6 D-2684 0,00763 -74,35 D-2685 0,00585 +/- 0,00379 -72,725 +/- 18,8 D-2686 > 0,1 -6,429 0,0031933 +/- -70,122 +/- 5,47 D-2687 0,000225 0,0023063 +/- -65,267 +/- 8,73 D-2688 0,00152 0,0025767 +/- -66,016 +/- 11,4 D-2689 0,000721 0,0032367 +/- -63,04+/- 13,4 D-2690 0,00272 D-2691 > 0,1 -63,208 D-2692 0,00376 -62,833 D-2693 0,002915 +/- 0,00131 -71,229 +/- 10,9 0,003245 +/- -69,264 D-2694 0,000573 D-2695 0,01652 +/- 0,0179 -51,139 +/- 17,8 D-2696 0,0024 12,88
D-2697 0,013 -63,845 0,003285 +/- -79,24 D-2698 0,000304 0,002205 +/- 0,00117 -67,306 +/- D-2699 0,216 0,0022297 +/- -67,949 +/- 7,66 D-2700 0,00129 0,0026037 +/- -54,669 +/- 7,49 D-2701 0,00196 D-2702 0,00448 -64,496 D-2703 0,00254 -65,869 D-2704 0,00257 -71,285 0,002505 +/- -64,722 +/- 4,62 D-2705 0,000346 D-2706 0,003865 +/- 0,00264 -63,247 +/- 10,0 0,003425 +/- -65,82+/- 2,07 D-2707 0,000318 0,0055112 +/- -66,395 +/- 10,4 D-2708 0,00582 D-2709 0,00243 -76,778 D-2710 0,000912 -78,289 D-2711 > 0,1 4,37 +/- 9,89 0,0046104 +/- -65,876 +/- 9,59 D-2712 0,00608 0,0010115 +/- -67,741 +/- 2,46 D-2713 0,00102 0,0063585 +/- -66,904 +/- D-2714 0,00869 0,044 0,0061022 +/- -74,054 D-2715 0,00862
D-2716 0,00338 +/- 0,00308 -70,054 +/- 9,47 D-2717 0,0033 +/- 0,00155 -72,932 +/- 7,6 D-2718 0,0155 -58,784 D-2719 0,00527 -57,281 D-2720 0,0215 -41,76 D-2721 0,01829 +/- 0,0132 -64,649 +/- 3,84 D-2722 0,0164 -53,261 D-2723 0,00733 -47,56 D-2724 0,00564 -37,19 D-2725 0,00776 -42,77 D-2726 0,00675 -42,811 D-2727 0,00667 -57,414 D-2728 0,0438 -37,169 D-2729 0,00454 -25,538 D-2730 0,0241 -47,501 D-2731 0,0088 -44,866 D-2732 0,0326 -44,68 D-2733 0,0217 -25,146 D-2734 > 0,1 -14,582 D-2735 0,0202 -28,294 D-2736 0,014 -38,251 D-2737 > 0,1 -17,833 D-2738 0,00514 -62,424 D-2739 0,0317 -41,409 D-2740 0,0111 -59,253 D-2741 0,0111 -59,687 D-2742 0,0229 -82,351 D-2743 0,00933 -59,271 D-2744 0,0215 -54,24
D-2745 0,00619 -57,406 D-2746 0,00654 -69,738 D-2747 0,0307 -63,431 D-2748 0,0152 -59,477 D-2749 0,0329 -45,543 D-2750 0,0149 -47,589 D-2751 0,0261 -54,747 D-2752 0,0106 -65,912 D-2753 0,0113 -66,051 D-2754 0,0201 -65,582 D-2755 > 0,1 -25,144 D-2756 0,0179 -65,965 D-2757 0,0251 -40,795 D-2758 0,0312 -40,55 D-2759 0,00936 -63,545 D-2760 0,00859 -74,99 D-2761 0,0115 -71,716 D-2762 0,00777 -68,169 D-2763 0,0106 -72,426 D-2764 0,0327 -58,009 0,003215 +/- -77,976 D-2766 0,000516 D-2767 0,00376 +/- 0,000552 -74,346 0,00396 +/- -76,319 D-2768 0,0000566 D-2769 0,005655 +/- 0,00165 -72,844 +/- 3,26 D-2770 0,0041 +/- 0,000778 -79,301 +/- 1,36 D-2771 0,00891 +/- 0,00137 -70,223
0,004855 +/- -72,651 D-2772 0,00000707 0,004115 +/- -77,716 +/- 5,2 D-2773 0,000544 D-2774 0,00467 +/- 0,000354 -76,397 +/- 3,67
Tabela 6. Ensaio FISH de RNA em células hepáticas Hep3B Hélice dupla IC50 (μM) Silenciamento N.º de PNPLA3 (%) D-2001 .00842 -37 D-2003 .0158 -32,1 D-2004 .00266 -32,4 D-2006 .00948 -54,1 D-2009 .00228 -29,5 D-2010 .00219 -37,2 D-2013 .00524 -31,5 D-2014 .00148 -37,6 D-2017 .00333 -37,6 D-2018 .00315 -21,3 D-2020 > 0,5 6 D-2021 > 0,5 -1,6 D-2022 .00272 -30,9 D-2023 > 0,5 24 D-2025 .0101 -30,3 D-2026 .00551 -23 D-2413 -45,832 D-2419 > 0,5 -4,545 D-2426 > 0,1 -15,207
D-2454 0,00187 -51,735 D-2473 > 0,1 -21,333 D-2522 0,00504 -43,036 D-2523 0,0122 -52,084 D-2564 0,01 -63,199 D-2565 0,00938 -58,392 D-2566 0,00343 -61,484 D-2567 0,0175 -53,489 D-2568 > 0,1 -18,367 D-2569 0,0195 -62,568 D-2570 0,0127 -77,141 D-2571 > 0,1 -15,922 D-2572 > 0,1 -12,434 D-2573 > 0,1 -14,649 D-2574 0,0215 -52,515 D-2575 0,0203 -53,175 D-2576 0,018 -48,137 D-2577 > 0,1 -16,105 D-2578 > 0,1 -21,309 D-2579 > 0,1 -17,510 D-2580 > 0,1 -24,616 D-2581 > 0,1 -13,987 D-2582 0,0574 -30,543 D-2583 > 0,1 -23,990 D-2584 > 0,1 -6,715 D-2585 > 0,1 -17,518 D-2586 > 0,1 -24,518 D-2587 0,0391 -58,478 D-2588 0,0218 -56,609
D-2589 > 0,1 -17,418 D-2590 > 0,1 -21,161 D-2591 0,0167 -59,366 D-2592 0,0104 -61,548 D-2593 Não definido -61,879 D-2594 0,0211 -43,856 D-2595 0,0272 -63,020 D-2596 > 0,1 -10,278 D-2597 0,0546 -31,743 D-2598 Não definido -47,517 D-2599 0,00489 -70,825 D-2600 > 0,1 -8,522 D-2601 0,0364 -31,836 D-2602 0,00577 -65,062 D-2603 0,01 -58,287 D-2604 0,00353 -40,649 D-2605 0,0113 -50,691 D-2606 > 0,1 -5,097 D-2607 0,0261 -49,898 D-2608 > 0,1 -23,747 D-2609 > 0,1 -23,804 D-2620 > 0,5 -21,969 D-2637 >0,1 -12,63 D-2638 >0,1 -16,25 D-2639 >0,1 -22,905 D-2640 >0,1 -14,572 D-2666 > 0,5 -14,898 D-2667 > 0,5 -14,537 D-2668 > 0,5 -18,779
D-2669 > 0,5 -8,624 D-2670 > 0,5 -16,641 D-2671 > 0,5 -8,665 D-2672 > 0,5 4,92 D-2673 > 0,5 -8,024 D-2675 > 0,5 -17,999 D-2676 > 0,5 -22,989 D-2677 > 0,5 -11,245 D-2678 > 0,5 -10,209 D-2679 -46,578 D-2680 > 0,5 -12,289 D-2681 > 0,5 -9,564 D-2682 0,184 -57,848 D-2683 > 0,5 -19,024 D-2684 > 0,5 -5,026 D-2685 0,0395 -34,673 D-2686 > 0,5 -12,298 D-2687 > 0,5 -7,153 D-2688 > 0,5 -12,895 D-2689 > 0,5 -20,429 D-2690 > 0,5 -8,608 D-2691 > 0,5 -7,608 D-2692 > 0,5 -7,763 D-2693 > 0,5 -12,294 D-2694 > 0,5 -10,718 D-2695 -25,618 D-2696 > 0,5 -7,666 D-2697 > 0,5 -11,529 D-2698 > 0,5 -11,875
D-2699 > 0,5 -4,132 D-2700 -34,399 D-2701 > 0,5 -4,434 D-2702 > 0,5 -9,919 D-2703 > 0,5 -9,667 D-2704 > 0,5 -1,989 D-2705 > 0,5 -8,5 D-2706 >0,167 D-2707 >0,167 D-2708 0,103 -32,624 D-2709 > 0,5 -2,042 D-2710 > 0,5 -5,079 D-2712 > 0,5 -1,399 D-2717 > 0,5 -1,399 D-2718 0,00521 -38,552 D-2719 0,013 D-2720 > 0,5 -2,52 D-2721 > 0,5 -3,882 D-2722 > 0,5 -6,527 D-2723 > 0,5 -16,917 D-2724 0,0227 -46,386 D-2725 0,0187 D-2726 0,0105 D-2727 0,0124 -38,592 D-2728 0,00741 -30,796 D-2729 0,0152 -36,3 D-2730 > 0,5 -17,996 D-2731 0,00433 -45,007 D-2732 > 0,5 -4,662
D-2733 > 0,5 -8,838 D-2734 > 0,5 -11,614 D-2735 > 0,5 -15,778 D-2736 > 0,5 -17,337 D-2737 > 0,5 -11,139 D-2717 > 0,5 -6,604 D-2738 0,00878 -30,636 D-2739 > 0,5 -12,614 D-2740 0,013 -57,307 D-2741 0,00938 -48,272 D-2742 0,0271 D-2743 0,00623 -41,449 D-2744 0,015 -37,951 D-2745 0,00611 -53,267 D-2746 0,0108 -63,434 D-2747 > 0,5 -13,578 D-2748 0,0382 -38,04 D-2749 > 0,5 -8,412 D-2750 > 0,5 -2,25 D-2751 > 0,5 -12,014 D-2752 > 0,5 10,68 D-2753 > 0,5 -3,443 D-2754 0,0704 -40,897 D-2755 > 0,5 -9,405 D-2756 > 0,5 -18,327 D-2757 > 0,5 -10,531 D-2758 > 0,5 -13,929 D-2759 0,0174 -39,948 D-2760 0,048 -66,415
D-2761 > 0,5 -14,128 D-2762 0,0132 -61,074 D-2763 0,0333 -67,071 D-2764 > 0,5 -10,771 D-2413 -45,832 D-2419 > 0,5 -4,545 EXEMPLO 3: Ensaio de siRNA por PCR de digital com gotículas para PNPLA3-rs738409 e PNPLA3-rs738409-rs738408
[0192] Seguindo o protocolo dos fabricantes, hepatócitos primários humanos descongelados (Xenotech/Sekisui doador lote#HC3-38) em meio OptiThaw (Xenotech cat#K8000), as células foram centrifugadas e, após aspiração do meio, ressuspensas em meio de hepatócitos OptiPlate (Xenotech cat#K8200) e plaqueadas em placas revestidas com colágeno de 96 poços (Greiner cat#655950). Após um período de incubação de 2-4 horas, o meio foi removido e substituído por meio de hepatócitos OptiCulture (Xenotech cat#K8300). 2-4 horas após a adição do meio OptiCulture, siRNA conjugados a GalNAc foram administrados em células via captação livre (sem reagente de transfecção). As células foram incubadas durante 24-72 horas a 37 °C e 5% de CO2. As células foram então submetidas a lise com tampão Qiagen RLT (79216) +2- mercaptoetanol 1% (Sigma, M-3148), e lisados foram armazenados a -20 °C. RNA foi purificado usando um instrumento Qiagen QIACube HT (9001793) e um Kit Qiagen RNeasy 96 QIACube HT (74171) de acordo com as instruções do fabricante. Amostras foram analisadas usando um sistema
QIAxpert (9002340). cDNA foi sintetizado a partir de amostras de RNA usando o kit de Transcrição Reversa de cDNA Applied Biosystems High Capacity (4368813), as reações foram montadas de acordo com as instruções do fabricante, a concentração de RNA de entrada variou por amostra. Foi realizada transcrição reversa num sistema de aplicação de ciclos térmicos BioRad Tetrad (modelo# PTC- 0240G) sob as condições seguintes: 25 °C durante 10 minutos, 37 °C durante 120 minutos, 85 °C durante 5 minutos seguido de paragem infinita (opcional) 4 °C.
[0193] PCR digital com gotículas (ddPCR) foi realizado usando o sistema de PCR digital com gotículas QX200 AutoDG da BioRad de acordo com as instruções do fabricante. As reações foram montadas em uma placa de PCR de 96 poços transparente Eppendorf (951020303) usando BioRad ddPCR Supermix para Sondas (1863010), e ensaios de qPCR etiquetados de modo fluorescente para PNPLA3 (IDT Hs.PT.58.21464637, razão entre iniciador e sonda 3,6:1) e TBP (IDT Hs.PT.53a.20105486, razão entre iniciador e sonda 3,6:1) e água sem RNase (Ambion, AM9937). A concentração final de iniciador/sonda é 900 nM/250 nM, respectivamente, a concentração de cDNA de entrada variou entre poços. Gotículas foram formadas usando um gerador de gotículas BioRad Auto DG (1864101) montado com consumíveis recomendados pelo fabricante (cartuchos BioRad DG32 1864108, pontas BioRad 1864121, placa de PCR de 96 poços azul Eppendorf 951020362, óleo para geração de gotículas BioRad para sondas 1864110 e uma montagem de placa de gotículas BioRad). As gotículas foram amplificadas num aparelho de aplicação de ciclos térmicos BioRad C1000
Touch (1851197) usando as condições seguintes: ativação da enzima a 95 °C durante 10 minutos, desnaturação a 94 °C durante 30 segundos seguido de emparelhamento/extensão a 60 °C durante um minuto, 40 ciclos usando uma velocidade de rampa de 2 °C/segundo, desativação da enzima a 98 °C durante 10 minutos seguido de uma paragem infinita (opcional) a 4 °C.
As amostras foram então lidas em um Leitor de Gotículas BioRad QX200, medindo o sinal FAM/HEX que está correlacionado com a concentração de PNPLA3 ou TBP.
Os dados foram analisados usando o pacote de software QuantaSoft da BioRad.
As amostras são agrupadas por canal (etiqueta fluorescente) para determinar a concentração por amostra.
Cada amostra é então expressa como a razão da concentração do gene de interesse (PNPLA3)/concentração do gene doméstico (TBP) para controlar diferenças na carga de amostras.
Os dados são então importados para Genedata Screener, onde cada siRNA de teste é normalizado para a mediana dos poços de controle neutros (somente tampão). Valores IC50 são relatados na Tabela 7. Tabela 7. Ensaio de ddPCR em hepatócitos primários Hélice IC50 (μM) % de silenciamento de PNPLA3 dupla N.º D-2068 .0339 -49,628 D-2069 .00408 -52,997 D-2070 .00433 -42,193 D-2072 .00884 -53,16 D-2073 > 2,0 -7,435 D-2078 .0044 -43,123 D-2084 0,00499 -38,791
D-2085 0,00539 -64,312 D-2086 > 2,0 -14,938 D-2087 > 2,0 -25,465 D-2088 0,207 -34,944 D-2089 0,0107 -38,791 D-2090 0,0218 -38,977 D-2091 0,0508 -41,209 D-2092 0,00192 -44 D-2093 0,00634 -30,233 D-2094 > 2,0 4,93 D-2095 0,00181 -59,814 D-2096 0,0181 -52,807 D-2099 0,00549 -39,296 D-2100 0,0142 -55,281 D-2158 0,0681 -48,649 D-2159 0,0325 -36,036 D-2160 > 0,667 -13,514 D-2161 > 2,0 -24,229 D-2162 0,0726 -28,634 D-2163 > 0,667 -16,3 D-2164 > 2,0 -15,418 D-2165 0,00644 -26,872 D-2166 0,00192 -30,045 D-2167 > 0,667 -6,726 D-2168 > 2,0 -15,418 D-2169 > 2,0 -13,004 D-2170 > 2,0 -9,417 D-2171 0,00505 -44,395 D-2172 0,003 -55,336
D-2173 0,00598 -46,188 D-2174 > 2,0 -9,009 D-2175 0,017 -27,928 D-2176 0,00452 -35,426 D-2177 > 2,0 4,5 D-2178 > 2,0 1,8 D-2179 > 2,0 -6,306 D-2180 0,00546 -40,969 D-2181 0,00152 -43,119 D-2182 0,00317 -54,128 D-2183 0,00232 -53,211 D-2184 0,0109 -50,459 D-2185 > 2,0 -7,339 D-2186 0,0021 -48,624 D-2187 > 2,0 -11,009 D-2188 > 2,0 1,32 D-2191 0,0984 -66,923 D-2192 0,124 -64,231 D-2193 0,138 -60,606 D-2194 0,0478 -54,182 D-2195 0,0801 -47,515 D-2199 0,0517 -62,973 D-2201 0,0165 -72,404 D-2202 0,00946 -49,459 D-2203 0,0241 -58,545 D-2204 0,0382 -45,576 D-2205 0,0222 -50,946 D-2206 0,0459 -46,081 D-2209 0,0867 -46,622
D-2212 0,358 -60 D-2216 0,0826 -58,942 D-2218 0,0242 -63,462 D-2220 0,0113 -69,333 D-2221 0,138 -55,541 D-2224 0,0198 -66,486 D-2225 0,245 -68,077 D-2228 0,155 -44,606 D-2229 0,0651 -38,909 D-2231 0,0512 -56,892 D-2232 0,0678 -67,981 D-2233 0,00802 -57,182 D-2234 0,00473 -55,947 D-2235 0,00816 -62,115 D-2236 0,00245 -51,542 D-2237 0,00495 -60 D-2238 0,00561 -63,017 D-2239 0,00453 -55,537 D-2240 0,00584 -56,116 D-2241 0,00755 -54,76 D-2242 0,0137 -56,332 D-2243 0,00329 -57,118 D-2244 0,0127 -56,909 D-2245 0,00697 -58,364 D-2246 0,00713 -56,828 D-2247 0,00875 -57,797 D-2248 0,0098 -58,59 D-2249 0,00603 -57,759 D-2250 0,0105 -62,155
D-2251 0,00521 -59,914 D-2252 0,00988 -58,678 D-2253 0,00481 -57,118 D-2254 0,00721 -56,332 D-2255 0,00788 -52,838 D-2256 0,00831 -55,455 D-2257 0,00503 -54,545 D-2258 0,00626 -54,545 D-2259 0,00401 -55,947 D-2260 0,00379 -52,423 D-2261 0,00151 -54,31 D-2262 0,00292 -53,448 D-2263 0,00607 -59,483 D-2264 0,00703 -59,504 D-2265 > 4,0 -20,524 D-2266 0,0129 -32,727 D-2267 0,107 -27,273 D-2275 0,00359 -45,701 D-2276 0,00416 -43,891 D-2277 0,00218 -49,14 D-2278 0,00743 -42,986 D-2279 0,0116 -53,846 D-2280 0,00347 -36,652 D-2281 0,0134 -37,557 D-2282 0,00864 -34,842 D-2283 0,00738 -49,558 D-2284 0,0202 -38,053 D-2285 0,00543 -45,487 D-2286 0,00934 -47,611
D-2287 0,00652 -55,575 D-2288 0,0259 -61,593 D-2289 0,00549 -53,805 D-2290 0,00476 -51,062 D-2291 0,0105 -42,584 D-2292 0,0059 -45,455 D-2293 0,0117 -45,646 D-2294 0,0109 -52,823 D-2295 0,01246 +/- 0,015 -59,847 +/- 15,2 D-2296 0,0279 -41,346 D-2297 0,00529 -55,926 D-2298 0,00838 -35,577 D-2299 0,00832 -40,865 D-2300 0,00371 -40,096 D-2301 0,00563 -38,365 D-2302 0,00639 -40,385 D-2303 0,00669 -41,25 D-2304 0,00212 -38,462 D-2305 0,00573 -37,736 D-2306 0,0645 -33,962 D-2307 0,00232 -33,019 D-2308 0,00181 -31,132 D-2309 0,0447 -45,283 D-2310 0,00655 -42,453 D-2311 0,00613 -41,509 D-2312 0,00941 -50 D-2313 0,0218 -41,784 D-2314 0,0142 -42,723 D-2315 0,0182 -31,455
D-2316 > 4,0 -23,005 D-2317 0,0228 -37,089 D-2318 0,00809 -45,352 D-2319 0,0165 -44,601 D-2320 0,0184 -38,373 D-2321 0,00766 -41,627 D-2322 0,00815 -46,507 D-2323 0,0168 -48,325 D-2324 0,00663 -62,254 D-2325 0,00716 -39,367 D-2326 0,044 -52,036 D-2327 0,00282 -65,701 D-2328 0,00411 -53,991 D-2329 0,012 -48,357 D-2330 0,019 -42,593 D-2331 0,00448 -47,418 D-2332 0,00944 -37,327 D-2333 0,00514 -37,327 D-2334 0,154 -38,249 D-2335 0,0089 -40,092 D-2336 0,0169 -48,148 D-2337 0,00274 -46,296 D-2338 0,0225 -42,723 D-2339 0,00222 +/- 0,00136 -43,218 +/- 4,81 D-2340 0,0136 -56,561 D-2341 0,0222 -50,226 D-2342 0,0273 -55,385 D-2343 0,0164 -41,784 D-2344 0,0314 -60,282
D-2345 0,0103 -65,1 D-2346 0,0427 -63,9 D-2347 0,00446 -49,4 D-2348 0,113 -53,4 D-2349 0,0176 -56,3 D-2350 0,00467 -49,4 Exemplo 4: Rastreio da eficácia de moléculas de siRNA para PNPLA3 selecionadas em um modelo de camundongo humanizado
[0194] Adenovírus associado (AAV; serótipo AAV8 ou AAV7; sem endotoxinas, preparado internamente pela Amgen) diluído em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190-136) para 4.e11 até 1.e12 partículas virais por animal, foi injetado intravenosamente na veia da cauda de camundongos C57BL/6NCrl machos (Charles River Laboratories Inc.) para conduzir a expressão de PNPLA3TS (PNPLA3-TS), PNPLA3rs738409 (PNPLA3-I148M), ou PNPLA3rs738409-rs738408 (PNPLA3-I148M DM) humano no fígado. Os camundongos tinham geralmente 10-12 semanas de idade e n=4-6 animais foram incluídos por grupo. Cada ronda de rastreio incluiu pelo menos dois grupos de controle tratados com veículo: AAV-vetor vazio e AAV-PNPLA3TS ou PNPLA3rs738409 e PNPLA3rs738409-rs738408 tratados com veículo. Todos os siRNA foram testados contra AAV- PNPLA3TS, PNPLA3rs738409, e/ou PNPLA3rs738409-rs738408. Duas semanas após a injeção de AAV, os camundongos foram tratados com uma única dose de siRNA D-2324 (0,5 mM), via injeção subcutânea, a 0,5, 1,0, 3,0 ou 5,0 miligramas por quilograma de animal, diluídos em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190-136). Aos 8,
15, 22, 28 ou 42 dias após a injeção de siRNA, fígados foram recolhidos dos animais, instantaneamente congelados em nitrogênio líquido, processados para RNA purificado usando um instrumento QIACube HT (Qiagen, 9001793) e kits RNeasy 96 QIACube HT (Qiagen, 74171) de acordo com as instruções do fabricante. Amostras foram analisadas usando um sistema QIAxpert (Qiagen, 9002340). RNA foi tratado com DNase Sem RNase RQ1 (Promega, M6101) e preparado para qPCR em Tempo Real usando o kit TaqManTM RNA-to-CTTM 1-Step (Applied Biosystems, 4392653). qPCR em Tempo Real foi realizado em uma máquina de PCR em Tempo Real QuantStudio. Os resultados são baseados na expressão genética de PNPLA3 humano normalizada para Gapdh de camundongo (ensaios TaqManTM da Invitrogen, hs00228747_m1 e 4352932E, respectivamente), e apresentados como o silenciamento relativo da expressão de mRNA de PNPLA3 humano em comparação com animais de controle tratados com veículo. A expressão de PNPLA3 endógeno de camundongo foi determinada para comparação (Invitrogen, Mm00504420_m1).
[0195] Para a análise do teor de triglicerídeos hepáticos, aproximadamente 0,05-0,1 miligramas de fígado congelado de um animal foram homogeneizados em um mililitro de isopropanol. Após uma hora de incubação em gelo, amostras foram submetidas a rotação a 10 000 rpm em um microcentrifugador, e sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços profundos limpa. O teor de triglicerídeos foi determinado usando o Reagente para Triglicerídeos Infinity colorimétrico (Thermo Fisher Scientific, TR22421) e Padrão de Triglicerídeos (Pointe Scientific, T7531-STD) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados são apresentados como miligramas de triglicerídeos por miligramas de tecido.
[0196] Figura 1A-D. Um exemplo de cinco moléculas de siRNA rastreadas quanto a silenciamento de mRNA dependente da dose e durabilidade funcional in vivo. Camundongos expressando PNPLA3rs738409-rs738408 humano foram tratados com siRNA duas semanas após injeções de AAV intravenosas. N=6 camundongos por grupo; dados representados como a média e o erro padrão da média. (A) siRNA foram injetados a 0,5, 1,0, 3,0 ou 5,0 miligramas por quilograma de peso do corpo subcutaneamente no abdômen do camundongo. Quatro semanas após o tratamento com siRNA, os camundongos foram sacrificados, e os fígados foram recolhidos e processados para análise da expressão genética. Os dados representam o silenciamento relativo médio de PNPLA3rs738409-rs738408 humano em cada conjunto de grupos relativamente ao grupo de controle tratado com veículo. (B) Fígados do mesmo grupo de tratamento durante quatro semanas também foram processados quanto ao teor de triglicerídeos para avaliar a eficácia funcional. Os dados representam os miligramas médios de triglicerídeos por grama de tecido processado. (C) siRNA foram injetados a 1,0 e 3,0 miligramas por quilograma de peso do corpo subcutaneamente no abdômen de um coorte paralelo de animais. Os camundongos foram recolhidos seis semanas após o tratamento com siRNA para comparar a durabilidade das moléculas de siRNA in vivo. Os fígados foram recolhidos e processados para análise da expressão genética. Os dados representam o silenciamento relativo médio de PNPLA3rs738409-rs738408 humano em cada conjunto de grupos relativamente ao grupo de controle tratado com veículo. (D) Fígados do mesmo grupo de tratamento durante seis semanas também foram processados quanto ao teor de triglicerídeos para avaliar a eficácia funcional ao longo do tempo. Os dados representam os miligramas médios de triglicerídeos por grama de tecido processado.
[0197] Dados do silenciamento relativo são mostrados nas Tabelas 8-12, mostrando o silenciamento relativo no dia 8, 15, 22, 28 e 42, respectivamente, e as várias doses. O silenciamento de PNPLA3 é uma percentagem, com valores negativos indicando um decréscimo de níveis de PNPLA3. Tabela 8. Dia 8 ensaio de silenciamento de PNPLA3 Número da Vetor Partículas Dose Silenciamento hélice AAV de AAV/ administrada de PNPLA3 (%) dupla animal (mg/kg) PNPLA3- D-2092 I148M 1,00E+12 3 -91,51 PNPLA3- D-2092 I148M 1,00E+12 5 -92,64 PNPLA3- D-2095 I148M 1,00E+12 3 -79,21 PNPLA3- D-2095 I148M 1,00E+12 5 -86,38 PNPLA3- D-2068 I148M 4,00E+11 5 -34,15 PNPLA3- D-2069 I148M 4,00E+11 5 -82,74 PNPLA3- D-2070 I148M 4,00E+11 5 -79,64
PNPLA3- D-2071 I148M 4,00E+11 5 -48,80 PNPLA3- D-2071 WT 4,00E+11 5 -59,43 PNPLA3- D-2075 I148M 4,00E+11 5 -79,10 PNPLA3- D-2075 WT 4,00E+11 5 -60,60 PNPLA3- D-2079 I148M 4,00E+11 5 -50,08 PNPLA3- D-2072 I148M 4,00E+11 5 -44,40 PNPLA3- D-2072 WT 4,00E+11 5 -43,75 PNPLA3- D-2077 I148M 4,00E+11 5 -28,46 PNPLA3- D-2076 I148M 4,00E+11 5 -83,25 PNPLA3- D-2078 I148M 4,00E+11 5 -49,10 PNPLA3- D-2078 WT 4,00E+11 5 -3,45 PNPLA3- D-2073 I148M 4,00E+11 5 -39,42 PNPLA3- D-2074 I148M 4,00E+11 5 -46,68 PNPLA3- D-2074 WT 4,00E+11 5 -5,11 PNPLA3- D-2084 I148M 4,00E+11 5 -87,49
PNPLA3- D-2084 I148M 8,00E+11 5 -88,75 PNPLA3- D-2084 I148M 8,00E+11 1 -16,49 PNPLA3- D-2084 WT 8,00E+11 1 -15,42 PNPLA3- D-2085 I148M 4,00E+11 5 -77,14 PNPLA3- D-2085 I148M 8,00E+11 5 -84,42 PNPLA3- D-2085 I148M 8,00E+11 1 -25,19 PNPLA3- D-2085 WT 8,00E+11 1 -21,14 PNPLA3- D-2086 I148M 4,00E+11 5 -64,54 PNPLA3- D-2086 I148M 4,00E+11 5 -52,95 PNPLA3- D-2087 I148M 4,00E+11 5 -20,15 PNPLA3- D-2088 I148M 4,00E+11 5 -47,18 PNPLA3- D-2088 I148M 8,00E+11 5 -66,96 PNPLA3- D-2089 I148M 8,00E+11 5 -85,47 PNPLA3- D-2089 WT 8,00E+11 1 -21,01 PNPLA3- D-2089 I148M 8,00E+11 1 -34,21
PNPLA3- D-2089 I148M 1,00E+12 5 -90,55 PNPLA3- D-2090 I148M 8,00E+11 5 -89,58 PNPLA3- D-2090 I148M 8,00E+11 1 -50,13 PNPLA3- D-2090 WT 8,00E+11 1 8,76 PNPLA3- D-2091 WT 8,00E+11 5 -35,70 PNPLA3- D-2092 I148M 8,00E+11 5 -92,34 PNPLA3- D-2092 I148M 8,00E+11 1 -51,35 PNPLA3- D-2092 WT 8,00E+11 1 -42,88 PNPLA3- D-2093 I148M 8,00E+11 5 -83,87 PNPLA3- D-2094 I148M 8,00E+11 5 -70,12 PNPLA3- D-2095 I148M 8,00E+11 1 -29,95 PNPLA3- D-2095 WT 8,00E+11 1 67,40 PNPLA3- D-2095 I148M 8,00E+11 5 -85,42 PNPLA3- D-2096 WT 8,00E+11 5 -90,44 PNPLA3- D-2081 I148M 8,00E+11 5 6,25
PNPLA3- D-2081 I148M 8,00E+11 5 -11,81 PNPLA3- D-2097 I148M 8,00E+11 5 -87,61 PNPLA3- D-2098 I148M 8,00E+11 5 -79,84 PNPLA3- D-2099 I148M 8,00E+11 5 -84,36 PNPLA3- D-2100 I148M 8,00E+11 5 -79,67 PNPLA3- D-2101 I148M 8,00E+11 5 -89,64 PNPLA3- D-2102 I148M 8,00E+11 5 -61,49 PNPLA3- D-2103 I148M 8,00E+11 5 -19,65 PNPLA3- D-2104 I148M 8,00E+11 5 -79,70 PNPLA3- D-2104 I148M 1,00E+12 5 -82,87 PNPLA3- D-2105 I148M 8,00E+11 5 -84,49 PNPLA3- D-2105 I148M 1,00E+12 5 -87,71 PNPLA3- D-2152 I148M 1,00E+12 5 -39,35 PNPLA3- D-2153 I148M 1,00E+12 5 -79,04 PNPLA3- D-2154 I148M 1,00E+12 5 -66,72
PNPLA3- D-2155 I148M 1,00E+12 5 -44,68 PNPLA3- D-2156 I148M 1,00E+12 5 -84,72 PNPLA3- D-2157 I148M 1,00E+12 5 -17,25 PNPLA3- I148M D-2280 DM 1,00E+12 5 -99,70 PNPLA3 D-2280 WT 1,00E+12 5 -51,13 PNPLA3- D-2295 WT 1,00E+12 5 -35,90 PNPLA3- I148M D-2295 DM 1,00E+12 5 -94,68 PNPLA3- D-2296 WT 1,00E+12 5 -23,24 PNPLA3- I148M D-2296 DM 1,00E+12 5 -92,78 PNPLA3- D-2297 WT 1,00E+12 5 43,71 PNPLA3- I148M D-2297 DM 1,00E+12 5 -94,59 PNPLA3- D-2324 WT 1,00E+12 5 6,53
PNPLA3- I148M D-2324 DM 1,00E+12 5 -97,39 PNPLA3- D-2326 WT 1,00E+12 5 -8,25 PNPLA3- I148M D-2326 DM 1,00E+12 5 -77,82 PNPLA3- D-2328 WT 1,00E+12 5 -2,12 PNPLA3- I148M D-2328 DM 1,00E+12 5 -92,49
Tabela 9. Dia 15 ensaio de silenciamento de PNPLA3 Número da Vetor Partículas Dose Silenciamento hélice AAV de AAV/ administrada de PNPLA3 (%) dupla animal (mg/kg) PNPLA3- D-2092 I148M 1,00E+12 3 -87,58 PNPLA3- D-2092 I148M 1,00E+12 5 -93,96 PNPLA3- D-2095 I148M 1,00E+12 3 -81,73 PNPLA3- D-2095 I148M 1,00E+12 5 -72,99 PNPLA3- D-2131 I148M 1,00E+12 5 -66,02 PNPLA3- D-2186 I148M 1,00E+12 5 -87,67
PNPLA3- D-2089 I148M 1,00E+12 5 -95,01 PNPLA3- D-2104 I148M 1,00E+12 5 -76,01 PNPLA3- D-2105 I148M 1,00E+12 5 -72,67 PNPLA3- D-2123 I148M 1,00E+12 5 -56,93 PNPLA3- D-2128 I148M 1,00E+12 5 -37,26 PNPLA3- D-2138 I148M 1,00E+12 5 -62,16 PNPLA3- D-2149 I148M 1,00E+12 5 -72,34 PNPLA3- D-2156 I148M 1,00E+12 5 -75,81 PNPLA3- D-2259 I148M 1,00E+12 5 -79,15 PNPLA3- D-2260 I148M 1,00E+12 5 -69,97 PNPLA3- D-2261 I148M 1,00E+12 5 -50,40 PNPLA3- D-2262 I148M 1,00E+12 5 -84,36 PNPLA3- D-2263 I148M 1,00E+12 5 -77,08 PNPLA3- D-2264 I148M 1,00E+12 5 -40,86 PNPLA3- D-2269 I148M 1,00E+12 5 -37,55
PNPLA3- D-2270 I148M 1,00E+12 5 -77,42 PNPLA3- D-2271 I148M 1,00E+12 5 -26,87 PNPLA3- D-2272 I148M 1,00E+12 5 -56,05 PNPLA3- I148M D-2280 DM 1,00E+12 3 -86,30 PNPLA3- I148M D-2287 DM 1,00E+12 3 -94,73 PNPLA3- I148M D-2289 DM 1,00E+12 3 -93,48 PNPLA3- I148M D-2292 DM 1,00E+12 3 -82,48 PNPLA3- I148M D-2297 DM 1,00E+12 3 -72,61 PNPLA3- I148M D-2322 DM 1,00E+12 3 -32,92 PNPLA3- I148M D-2324 DM 1,00E+12 3 -87,56 PNPLA3- I148M D-2327 DM 1,00E+12 3 -86,70
PNPLA3- D-2345 WT 1,00E+12 5 -83,48 PNPLA3- D-2346 WT 1,00E+12 5 -75,93 PNPLA3- D-2347 WT 1,00E+12 5 -22,83 PNPLA3- D-2348 WT 1,00E+12 5 -20,09 PNPLA3- D-2349 WT 1,00E+12 5 -67,70 PNPLA3- D-2350 WT 1,00E+12 5 -57,51 PNPLA3- D-2351 WT 1,00E+12 5 -56,11 PNPLA3- I148M D-2352 DM 1,00E+12 3 -92,21 PNPLA3- I148M D-2353 DM 1,00E+12 3 -89,55 PNPLA3- I148M D-2354 DM 1,00E+12 3 -90,21 PNPLA3- I148M D-2358 DM 1,00E+12 3 -95,10 PNPLA3- I148M D-2359 DM 1,00E+12 3 -91,17
PNPLA3- I148M D-2360 DM 1,00E+12 3 -63,98 PNPLA3- I148M D-2361 DM 1,00E+12 3 -92,47 PNPLA3- I148M D-2362 DM 1,00E+12 3 -95,10 PNPLA3- I148M D-2364 DM 1,00E+12 3 -95,31 PNPLA3- I148M D-2370 DM 1,00E+12 3 -95,99 PNPLA3 D-2370 WT 1,00E+12 3 11,88 PNPLA3- D-2371 I148M DM 1,00E+12 3 -91,14 PNPLA3- D-2372 I148M DM 1,00E+12 3 -93,71 PNPLA3- D-2373 I148M DM 1,00E+12 3 -73,80 PNPLA3- D-2374 I148M DM 1,00E+12 3 -75,98
PNPLA3- D-2375 I148M DM 1,00E+12 3 -96,68 PNPLA3- D-2376 I148M DM 1,00E+12 3 -96,78 PNPLA3- D-2377 I148M DM 1,00E+12 3 -96,88 PNPLA3- D-2378 I148M DM 1,00E+12 3 -97,60 PNPLA3- D-2379 I148M DM 1,00E+12 3 -94,73 PNPLA3- D-2380 I148M DM 1,00E+12 3 -94,73 PNPLA3- D-2381 I148M DM 1,00E+12 3 -76,24 PNPLA3- D-2382 I148M DM 1,00E+12 3 -80,33 PNPLA3- D-2383 I148M DM 1,00E+12 3 -71,98 PNPLA3- D-2384 I148M DM 1,00E+12 3 -87,24
PNPLA3- D-2385 I148M DM 1,00E+12 3 -78,77 PNPLA3- D-2386 I148M DM 1,00E+12 3 -70,58 PNPLA3- D-2387 I148M DM 1,00E+12 3 -67,09 PNPLA3- D-2390 I148M DM 1,00E+12 3 -92,97 PNPLA3- D-2391 I148M DM 1,00E+12 3 -94,10 PNPLA3- D-2392 I148M DM 1,00E+12 3 -92,14 PNPLA3- D-2395 I148M DM 1,00E+12 3 -85,63 PNPLA3- D-2396 I148M DM 1,00E+12 3 -94,63 PNPLA3- D-2397 I148M DM 1,00E+12 3 -92,90 PNPLA3- D-2398 I148M DM 1,00E+12 3 -95,48
PNPLA3- D-2399 I148M DM 1,00E+12 3 -93,40 PNPLA3- D-2400 I148M DM 1,00E+12 3 -97,55 PNPLA3- D-2401 I148M DM 1,00E+12 3 -96,98 PNPLA3- D-2402 I148M DM 1,00E+12 3 -97,25 PNPLA3 D-2403 WT 1,00E+12 3 36,90 PNPLA3- D-2404 I148M DM 1,00E+12 3 -95,08 PNPLA3- D-2405 I148M DM 1,00E+12 3 -96,93 PNPLA3 D-2406 WT 1,00E+12 3 28,80 PNPLA3- D-2395 I148M DM 1,00E+12 3 -17,25 PNPLA3- D-2396 I148M DM 1,00E+12 3 -93,70
PNPLA3- I148M D-2413 DM 1,00E+12 3 -94,80 PNPLA3- I148M D-2415 DM 1,00E+12 3 -90,95 PNPLA3- D-2418 I148M DM 1,00E+12 3 -88,45 PNPLA3 D-2419 WT 1,00E+12 3 43,72 PNPLA3 D-2453 WT 1,00E+12 3 -81,33 PNPLA3 D-2454 WT 1,00E+12 3 -83,38 PNPLA3 D-2455 WT 1,00E+12 3 -68,85 PNPLA3 D-2456 WT 1,00E+12 3 -89,03 PNPLA3 D-2460 WT 1,00E+12 3 -68,65 PNPLA3 D-2461 WT 1,00E+12 3 -47,85
Tabela 10. Dia 22 ensaio de silenciamento de PNPLA3 Número da Vetor Partícula Dose Silenciament hélice AAV s de AAV/ administrad o de PNPLA3 dupla animal a (mg/kg) (%)
PNPLA3 D-2092 -I148M 1,00E+12 3 -74,61 PNPLA3 D-2092 -I148M 1,00E+12 5 -85,78 PNPLA3 D-2095 -I148M 1,00E+12 3 -27,78 PNPLA3 D-2095 -I148M 1,00E+12 5 -33,60 PNPLA3 -I148M D-2324 DM 1,00E+12 3 -56,68 PNPLA3 -I148M D-2324 DM 1,00E+12 5 -88,02 PNPLA3 D-2089 -I148M 1,00E+12 5 -80,86 PNPLA3 D-2104 -I148M 1,00E+12 5 -65,61 PNPLA3 D-2105 -I148M 1,00E+12 5 -39,67 PNPLA3 -I148M D-2280 DM 1,00E+12 5 -84,12 PNPLA3 -I148M D-2297 DM 1,00E+12 3 -58,01 PNPLA3 -I148M D-2297 DM 1,00E+12 5 -76,43
PNPLA3 -I148M D-2352 DM 1,00E+12 5 -92,74 PNPLA3 D-2353 -I148M DM 1,00E+12 5 -84,54 PNPLA3 D-2354 -I148M DM 1,00E+12 5 -89,06 PNPLA3 D-2355 -I148M DM 1,00E+12 5 -95,53 PNPLA3 D-2356 -I148M DM 1,00E+12 5 -94,99 PNPLA3 D-2357 -I148M DM 1,00E+12 5 -97,37
Tabela 11. Dia 28 ensaio de silenciamento de PNPLA3 Número Vetor AAV Partículas Dose Silenciamento da de AAV/ administrada de PNPLA3 (%) hélice animal (mg/kg) dupla PNPLA3- D-2092 I148M 1,00E+12 3 -72,57 PNPLA3- D-2092 I148M 1,00E+12 5 -82,74 PNPLA3- D-2095 I148M 1,00E+12 3 -32,93
PNPLA3- D-2095 I148M 1,00E+12 5 -55,31 PNPLA3- D-2089 I148M 1,00E+12 5 -63,49 PNPLA3- D-2104 I148M 1,00E+12 5 -44,39 PNPLA3- D-2105 I148M 1,00E+12 5 -39,80 PNPLA3- D-2370 I148M DM 1,00E+12 3 -89,28 PNPLA3- D-2400 I148M DM 1,00E+12 3 -88,23 PNPLA3- D-2401 I148M DM 1,00E+12 3 -91,95 PNPLA3- D-2402 I148M DM 1,00E+12 0,5 -50,65 D-2402 PNPLA3- I148M DM 1,00E+12 1 -69,37 D-2402 PNPLA3- I148M DM 1,00E+12 3 -96,43 D-2402 PNPLA3- I148M DM 1,00E+12 3 -85,44 D-2402 PNPLA3- I148M DM 1,00E+12 3 -90,52 PNPLA3- D-2404 I148M DM 1,00E+12 3 -95,67 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 0,5 -68,83 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 1 -76,88
PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 3 -97,53 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 3 -93,95 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 3 -89,66 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 3 -93,25 PNPLA3- D-2420 I148M DM 1,00E+12 3 -95,93 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 0,5 -50,01 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 1 -66,30 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 3 -94,99 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 3 -80,05 D-2421 PNPLA3 WT 1,00E+12 3 -36,65 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 3 -91,08 PNPLA3- D-2425 I148M DM 1,00E+12 3 -16,07 PNPLA3- D-2426 I148M DM 1,00E+12 3 -37,54 PNPLA3- D-2427 I148M DM 1,00E+12 3 -25,19 PNPLA3- D-2428 I148M DM 1,00E+12 3 -16,71
PNPLA3- D-2437 I148M DM 1,00E+12 3 -93,78 PNPLA3- D-2438 I148M DM 1,00E+12 3 -90,63 PNPLA3- D-2439 I148M DM 1,00E+12 3 -88,10 PNPLA3- D-2440 I148M DM 1,00E+12 3 -95,25 PNPLA3- D-2441 I148M DM 1,00E+12 3 -90,13 PNPLA3- D-2442 I148M DM 1,00E+12 3 -57,24 PNPLA3- D-2443 I148M DM 1,00E+12 3 -95,43 PNPLA3- D-2444 I148M DM 1,00E+12 3 -90,58 PNPLA3- D-2445 I148M DM 1,00E+12 3 -84,55 PNPLA3- D-2446 I148M DM 1,00E+12 3 -81,50 PNPLA3- D-2427 I148M DM 1,00E+12 3 -90,09 PNPLA3- D-2462 I148M DM 1,00E+12 3 -89,20 PNPLA3- 1,00E+12 3 -41,25 D-2463 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 3 -60,53 D-2464 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 3 -91,35 D-2465 I148M DM
PNPLA3- 1,00E+12 3 -93,68 D-2466 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 3 -85,15 D-2467 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 0,5 -46,58 D-2472 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 1 -74,47 D-2472 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 3 -88,79 D-2472 I148M DM D-2472 PNPLA3 WT 1,00E+12 3 -23,16 PNPLA3- 1,00E+12 3 -90,54 D-2472 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 0,5 -57,95 D-2473 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 1 -71,96 D-2473 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 3 -91,70 D-2473 I148M DM PNPLA3- 1,00E+12 3 -85,94 D-2473 I148M DM D-2473 PNPLA3 WT 1,00E+12 3 -18,70 D-2675 PNPLA3- 1,00E+12 3 -25,9 I148M DM D-2677 PNPLA3- 1,00E+12 3 -3,807 I148M DM D-2678 PNPLA3- 1,00E+12 3 -31,76 I148M DM D-2679 PNPLA3- 1,00E+12 3 -88,48 I148M DM
D-2680 PNPLA3- 1,00E+12 3 -56,44 I148M DM D-2681 PNPLA3- 1,00E+12 3 -35,71 I148M DM D-2682 PNPLA3- 1,00E+12 3 -71,43 I148M DM D-2683 PNPLA3- 1,00E+12 3 -68,62 I148M DM D-2685 PNPLA3- 1,00E+12 3 -29,93 I148M DM D-2687 PNPLA3- 1,00E+12 3 -75,05 I148M DM D-2689 PNPLA3- 1,00E+12 3 -81,12 I148M DM D-2690 PNPLA3- 1,00E+12 3 -79,08 I148M DM D-2694 PNPLA3- 1,00E+12 3 -4,531 I148M DM D-2695 PNPLA3- 1,00E+12 3 29,23 I148M DM D-2668 PNPLA3- 1,00E+12 3 -65,16 I148M DM D-2669 PNPLA3- 1,00E+12 3 -78,36 I148M DM D-2670 PNPLA3- 1,00E+12 3 -56,05 I148M DM D-2671 PNPLA3- 1,00E+12 3 -56,87 I148M DM
Tabela 12. Dia 42 ensaio de silenciamento de PNPLA3
Número da Vetor Partículas Dose Silenciamento hélice AAV de AAV/ administrada de PNPLA3 (%) dupla animal (mg/kg) PNPLA3- D-2402 I148M DM 1,00E+12 1 -57,74 PNPLA3- D-2402 I148M DM 1,00E+12 3 -83,75 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 1 -71,07 PNPLA3- D-2419 I148M DM 1,00E+12 3 -70,8 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 1 -62,21 PNPLA3- D-2421 I148M DM 1,00E+12 3 -80,12 PNPLA3- D-2472 I148M DM 1,00E+12 1 -60,54 PNPLA3- D-2472 I148M DM 1,00E+12 3 -74,77 PNPLA3- D-2473 I148M DM 1,00E+12 1 -54,55
PNPLA3- D-2473 I148M DM 1,00E+12 3 -81,13 Exemplo 5: Prevenção e resgate de NAFLD por moléculas de siRNA em um modelo de camundongo PNPLA3rs738409-rs738408 humanizado
[0198] O modelo de camundongo 'Síndrome da Obesidade Induzida pelo Estilo de Vida Americano' (‘American Lifestyle-Induced Obesity Syndrome'), ou ALIOS, para NAFLD/NASH é desenvolvido nutrindo camundongos com uma dieta rica em gorduras trans (45% da quantidade total de gordura) e açúcar (Tetri 2008). Para estes estudos, camundongos C57BL/6NCrl machos com oito até dez semanas de idade (Charles River Laboratories Inc.) foram injetados com AAV-vetor vazio ou AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, como descrito previamente. No momento da injeção de AAV, os camundongos foram mantidos com uma dieta de ração normal ou colocados na dieta ALIOS (Envigo, TD.06303) completa com água potável composta por 55% de frutose e 45% de glicose (Sigma, F0127 e G7021, respectivamente) até à colheita. Em experiências anteriores, foi estabelecido que a sobre-expressão de PNPLA3rs738409-rs738408, neste contexto, acelera e agrava fenótipos de NAFLD (dados não mostrados).
[0199] Duas semanas após a injeção de AAV e iniciação da dieta, os camundongos foram tratados com uma única dose de siRNA D-2324 (0,5 mM), via injeção subcutânea, a 5,0 miligramas por quilograma de animal, diluídos em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190-136) ou um controle de veículo. A dosagem foi repetida bissemanalmente até à colheita. No momento da colheita, pesos do corpos foram recolhidos, seguido de soro via punção cardíaca sob anestesia com isoflurano, seguido de pesos do fígado. O lobo mediano foi fixado via formalina tamponada neutra 10%, seguido de processamento e embutimento em parafina. O remanescente do fígado foi instantaneamente congelado para análise do conteúdo e expressão genética, como descrito previamente.
[0200] Tecido de fígado instantaneamente congelado foi processado para análise da expressão de RNA e genética, como descrito previamente. Os resultados são mostrados como o valor Ct bruto e expressão relativa de mRNA do gene indicado normalizada para Gapdh de camundongo. (Ensaios TaqManTM da Invitrogen: PNPLA3 humano, hs00228747_m1; Pnpla3 de camundongo, Mm00504420_m1; Gapdh de camundongo, 4352932E).
[0201] Tecidos fixados com formalina foram processados para coloração com Hematoxilina e Eosina (Dako, CS70030-2, CS70130-2, respectivamente) de acordo com as instruções do fabricante. A pontuação de esteatose e inflamação foi efetuada por um patologista certificado.
[0202] A análise do soro incluiu TIMP1, um biomarcador associado a NASH e fibrose relacionada com NASH (Youssani 2011). O ELISA de TIMP1 (R&D Systems, MTM100) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.
[0203] Figura 2A-G. Para avaliar a capacidade de uma molécula de siRNA D-2324 específica para PNPLA3rs738409- rs738408 para prevenir o desenvolvimento de fenótipos associados a NAFLD e sobre-expressão de PNPLA3rs738409-
rs738408, camundongos receberam AAV8-vetor vazio (EV), ou AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, ou veículo, e foram mantidos com uma dieta de ração regular ou transitaram para a dieta ALIOS.
Duas semanas após injeções de AAV, os camundongos foram tratados com siRNA ou veículo, em semanas alternadas durante seis semanas; um total de três rondas de injeção.
Os camundongos foram recolhidos às oito semanas.
Os resultados são apresentados como a média e erro padrão dos grupos, N=8 por grupo.
Os asteriscos representam significância estatística para o coorte AAV8-PNPLA3rs738409- rs738408, gerada por ANOVA de Uma via empregando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. (A) A razão entre o peso do fígado (gramas) e o peso do corpo (gramas) no momento da colheita.
Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, **=0,0018, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (B) Confirmação da expressão de mRNA de PNPLA3 humano e silenciamento no fígado por qPCR. (esquerda) Valor Ct bruto e (direita) expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo; comparando os grupos nutridos com ALIOS PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA. (C) A análise da expressão de mRNA de Pnpla3 de camundongo em fígado por qPCR indica que Pnpla3 endógeno não é significativamente alterado por sobre-expressão mediada por AAV ou silenciamento de siRNA. (esquerda) Valor Ct bruto e (direita) expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo; comparando o grupo sem AAV nutrido com ração com os grupos nutridos com ALIOS PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA. (D) Teor de triglicerídeos hepáticos apresentado como miligramas de triglicerídeos por grama de tecido de fígado. Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, *=0,0393, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **=0,0063. (E) TIMP1 no soro apresentado como picogramas por mililitro de soro. Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (F) Indicação histológica de esteatose com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, sem significância, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **=0,0012. (G) Indicação histológica de inflamação com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001.
[0204] Figura 3A-G. Para avaliar a capacidade de uma molécula de siRNA específica para PNPLA3rs738409-rs738408 para prevenir a progressão adicional de doença mediada por PNPLA3rs738409-rs738408 após o surgimento da doença, camundongos receberam AAV8-vetor vazio (EV), ou AAV8- PNPLA3rs738409-rs738408, ou veículo, e foram mantidos com uma dieta de ração regular ou transitaram para a dieta ALIOS. Oito semanas após injeções de AAV e alterações da dieta, os camundongos foram tratados com siRNA ou veículo, em semanas alternadas durante mais oito semanas; um total de quatro rondas de injeção. Os camundongos foram recolhidos às dezesseis semanas.
Apesar de nenhuma alteração ter sido observada na esteatose, quando o tratamento com siRNA começou após a indução de doença, vários pontos finais diferentes associados a doença foram significativamente reduzidos.
Os resultados são apresentados como médias e erro padrão, N=8 por grupo.
Os asteriscos representam significância estatística para o coorte AAV8-PNPLA3rs738409- rs738408, gerada por ANOVA de Uma via empregando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. (A) A razão entre o peso do fígado (gramas) e o peso do corpo (gramas) no momento da colheita.
Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ***=0,0006. (B) Confirmação da expressão de mRNA de PNPLA3 humano e silenciamento no fígado por qPCR. (esquerda) Valor Ct bruto e (direita) expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo; comparando os grupos nutridos com ALIOS PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA. (C) A análise da expressão de mRNA de Pnpla3 de camundongo em fígado por qPCR indica que Pnpla3 endógeno não é significativamente alterado por sobre-expressão mediada por AAV ou silenciamento de siRNA. (esquerda) Valor Ct bruto e (direita) expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo; comparando o grupo sem AAV nutrido com ração com os grupos nutridos com ALIOS PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA. (D) Teor de triglicerídeos hepáticos apresentado como miligramas de triglicerídeos por grama de tecido de fígado.
Valores P ajustados: AAV- EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408
+ siRNA, *=0,0403. (E) TIMP1 no soro apresentado como picogramas por mililitro de soro. Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, **=0,0027, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **=0,002. (F) Indicação histológica de esteatose com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409- rs738408 + siRNA, não significativo. (G) Indicação histológica de inflamação com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **=0,0068.
[0205] Figura 4A-D. Para avaliar a capacidade de uma molécula de siRNA específica para PNPLA3rs738409-rs738408 para resgatar fenótipos associados a doença devido à sobre- expressão de PNPLA3rs738409-rs738408, fígado e soro de camundongos nutridos com ALIOS AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408 tratados com veículo durante oito semanas foram comparados com fígados e soro de camundongos nutridos com ALIOS AAV8- PNPLA3rs738409-rs738408 tratados com veículo ou tratados com siRNA durante dezesseis semanas. Apesar de nenhuma alteração ter sido observada na esteatose neste momento com o tratamento com siRNA, triglicerídeos hepáticos, TIMP1 no soro, e inflamação foram todos estatisticamente menores às dezesseis semanas em comparação com controles de veículo às oito semanas. Os resultados são apresentados como médias e erro padrão, N=8 por grupo. Os asteriscos representam significância estatística para o coorte AAV8- PNPLA3rs738409-rs738408 tratado com veículo durante oito semanas, gerada por ANOVA de Uma via empregando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. (A) Teor de triglicerídeos hepáticos apresentado como miligramas de triglicerídeos por grama de tecido de fígado. Valores P ajustados: 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo, não significativo; 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **=0,0011. (B) Timp1 no soro apresentado como picogramas por mililitro de soro. Valores P ajustados: 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo, não significativo; 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, *=0,0134. (C) Indicação histológica de esteatose com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo, não significativo; 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, não significativo. (D) Indicação histológica de inflamação com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo, não significativo; 16SMN AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, *=0,0112. Exemplo 6: Prevenção de fibrose do fígado por moléculas de siRNA em um modelo de camundongo PNPLA3rs738409-rs738408 humanizado
[0206] A dieta "AMLN", desenvolvida pela Amylin Pharmaceuticals (Clapper 2013), é uma versão modificada da dieta ALIOS. A ração inclui um aumento de dez vezes de colesterol (2%) e sacarose adicional. Camundongos com a dieta "AMLN" desenvolveram fibrose ligeira até moderada após 20-30 semanas (artigos de Clapper, Mells e Kristiansen). Para este estudo, camundongos C57BL/6NCrl machos com oito até dez semanas de idade (Charles River Laboratories Inc.) foram injetados com AAV-vetor vazio ou AAV- PNPLA3rs738409-rs738408, como descrito acima, para acelerar o surgimento da doença. No momento da injeção de AAV, os camundongos continuaram com uma dieta de ração normal ou transitaram para a dieta Envigo, TD.170748, completa com água potável composta por 55% de frutose e 45% de glicose (Sigma, F0127 e G7021, respectivamente) até à colheita.
[0207] Duas semanas após a injeção de AAV e iniciação da dieta, camundongos foram tratados com uma única dose de siRNA D-2324 (0,5 mM), via injeção subcutânea, a 5,0 miligramas por quilograma de animal, diluídos em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190-136) ou um controle de veículo. A dosagem foi repetida bissemanalmente até à colheita. No momento da colheita, pesos do corpos foram recolhidos, seguido de soro via punção cardíaca sob anestesia com isoflurano, seguido de pesos do fígado. O lobo mediano foi fixado via formalina tamponada neutra 10%, seguido de processamento e embutimento em parafina. O remanescente do fígado foi instantaneamente congelado para análise da expressão genética.
[0208] Tecido de fígado instantaneamente congelado foi processado para análise da expressão de RNA e genética, como descrito previamente. Os resultados são mostrados como o valor Ct bruto e expressão relativa de mRNA do gene indicado normalizada para Gapdh de camundongo. (Ensaios TaqManTM da Invitrogen: PNPLA3 humano, hs00228747_m1; Pnpla3 de camundongo, Mm00504420_m1; Col1a1 de camundongo, Mm00801666_g1; Col3a1 de camundongo, Mm01254471_g1; Col4a1, Mm01210125_m1; Gapdh de camundongo, 4352932E). Col1a1, Col3a1 e Col4a1 são marcadores da matriz extracelular associados a ativação de células hepáticas estreladas e fibrose do fígado (Baiocchini 2016).
[0209] Tecidos fixados com formalina foram processados para coloração com Hematoxilina, Eosina, e Tricrômico de Masson (Dako, CS70030-2, CS70130-2, AR17311- 2, respectivamente) de acordo com as instruções do fabricante. A coloração com anti-Actina do Músculo Liso foi efetuada sem recuperação de antígeno e usando um dispositivo automático de coloração DAKO. As lâminas foram processadas usando Peroxidazed 1 e Sniper (Biocare, PX968 e BS966, respectivamente) e coradas com anticorpo monoclonal anti-alfa-Actina do, Músculo Liso (Sigma, F3777), seguido de anti-FITC de Coelho (Invitrogen, 711900), polímero Envision-HRP de Coelho (Dako, K4003), DAB+ (Dako, K3468), e Hematoxilina. A pontuação da quantidade de esteatose, inflamação, hiperplasia de células ovais/ duto biliar, e células positivas para aSMA foi efetuada por um patologista certificado.
[0210] Soro foi analisado quanto a TIMP1 de camundongo (R&D Systems, MTM100) e Citoqueratina 18-M30 de Camundongo (Cusabio, CSB-E14265m) de acordo com as instruções do fabricante. Para além de TIMP1, Citocina 18-
M30 foi identificada como biomarcador potencial para NAFLD/NASH, incluindo fibrose inicial (Neuman 2014 e Yang 2015). Figura 5A-L.
Para avaliar a capacidade de uma molécula de siRNA específica para PNPLA3rs738409-rs738408 para prevenir o desenvolvimento de fibrose inicial, camundongos receberam AAV8-vetor vazio (EV), ou AAV8-PNPLA3rs738409- rs738408, ou veículo, e foram mantidos com uma dieta de ração regular ou transitaram para a dieta AMLN.
Duas semanas após injeções de AAV, os camundongos foram tratados com siRNA, D-2324, ou veículo, em semanas alternadas durante mais dez semanas; um total de seis rondas de injeção.
Os camundongos foram recolhidos às dez semanas.
Os resultados são apresentados como médias e erro padrão, Nutridos com ração sem AAV + veículo e nutridos com AMLN AAV8- PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo, N=8 por grupo; nutridos com AMLN AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e AAV8-PNPLA3rs738409- rs738408 + siRNA, N=12 por grupo.
Os asteriscos representam significância estatística para o coorte AAV8-PNPLA3rs738409- rs738408 tratado com veículo, gerada por ANOVA de Uma via empregando o teste de comparações múltiplas de Dunnett. (A) A razão entre o peso do fígado (gramas) e o peso do corpo (gramas) no momento da colheita.
Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (B) Confirmação da expressão de mRNA de PNPLA3 humano e silenciamento no fígado por qPCR. (esquerda) Valor Ct bruto e (direita) expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo; comparando os grupos PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA. (C) A análise da expressão de mRNA de Pnpla3 de camundongo em fígado por qPCR indica que Pnpla3 endógeno não é significativamente alterado por sobre-expressão mediada por AAV ou silenciamento de siRNA. (esquerda) Valor Ct bruto e (direita) expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh camundongo; comparando o grupo nutrido com ração sem AAV com os grupos nutridos com AMLN PNPLA3rs738409-rs738408 + veículo e PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA. (D) Timp1 no soro apresentado como picogramas por mililitro de soro.
Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (E) CK18m30 no soro apresentado como picogramas por mililitro de soro.
Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (F) Indicação histológica de inflamação com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, *=0,0108, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (G) Indicação histológica de hiperplasia de células ovais/duto biliar com base na coloração com H&E, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **=0,0081. (H) Coloração imuno-histoquímica para anti-Actina de Músculo Liso, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4).
Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, *=0,0101, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ***=0,0002. (I) Coloração com tricrômico de Masson para fibrose, pontuada como: Dentro de limites normais (0), mínima (1), ligeira (2), moderada (3), e grave (4). Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, não significativo, AAV- PNPLA3rs738409- rs738408 + siRNA, não significativo. (J) Expressão de mRNA de Col1a1 de camundongo em fígado por qPCR. Expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo. Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (K) Expressão de mRNA de Col3a1 de camundongo em fígado por qPCR. Expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo. Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, ****<0,0001. (L) Expressão de mRNA de Col4a1 de camundongo em fígado por qPCR. Expressão relativa de mRNA em número de vezes normalizada para Gapdh de camundongo. Valores P ajustados: grupo sem AAV + veículo, ****<0,0001, AAV-EV + veículo, ***<0,0005, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408 + siRNA, **<0,0041. Exemplo 7: Rastreamento de moléculas de siRNA de PNPLA3 usando um modelo de camundongo de imagiologia por bioluminescência
[0211] Camundongos BALB/c machos (Charles River Laboratories Inc.), em geral com 10-12 semanas de idade, foram injetados com vírus Adenoassociado (AAV; serótipo AAVDJ8; sem endotoxinas, preparado internamente pela
Amgen) diluído em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190-136). AAV foi administrado desde 5e11 até 7,5e11 partículas virais por animal e injetado intravenosamente na veia da cauda. Os construtos de AAV foram planejados com um promotor do CMV (Citomegalovírus) murino e um repórter de Luciferase do Pirilampo onde, na extremidade 3', uma fiada de nucleotídeos contendo extensões de qualquer uma das sequências-alvo de siRNA PNPLA3TS humana (alelo de referência) ou PNPLA3rs738409-rs738408 humana (alelo minoritário), e outras sequências-alvo de interesse de PNPLA3 humano não abrangendo SNP, como detalhado nas Figuras 6 e 7.
[0212] Duas semanas após a injeção de AAV, os camundongos foram injetados com D-Luciferina RediJect (PerkinElmer, 770504) de acordo com as instruções do fabricante. O sinal bioluminescente nos camundongos foi capturado usando um Sistema de Imagiologia In Vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer) e analisado usando Software Living Image (PerkinElmer). Os camundongos foram então randomizados em grupos de n=5 com base no sinal do fluxo total [fótons/segundo] na região do fígado. Após a randomização em grupos de tratamento, os camundongos receberam uma única dose de siRNA (0,5 mM) diluída em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190-136). O siRNA foi administrado via injeção subcutânea, aos miligramas por quilograma indicados de dose do animal. Para cada ronda de rastreamento, e cada tipo de AAV, foi incluído um grupo de controle tratado com veículo.
[0213] Às 1, 2, 3 e 4 semanas após a injeção do siRNA, os camundongos foram novamente submetidos a imagiologia e medições do fluxo total [f/s] foram recolhidas usando a mesma região de interesse definida estabelecida para as leituras de referência.
Para cada animal, a percentagem relativa do silenciamento foi determinada calculando a percentagem de alteração do fluxo total na semana 1, 2, 3 ou 4 relativamente ao fluxo total do animal na referência, normalizada para a alteração média do fluxo total relativamente à referência do grupo de controle de veículo para o mesmo momento.
Por exemplo, Animal tratado com siRNA tem um silenciamento relativo calculado do modo seguinte: (fluxo total do animal na semana 2)/(fluxo total do animal na referência), normalizado para a média (fluxo total de animais com veículo na semana 2/ fluxo total de animais com veículo na referência). A Figura 8 apresenta imagens representativas de animais injetados com AAV expressando as sequências-alvo do alelo minoritário de PNPLA3 humano ou sequências-alvo do alelo de referência, e a alteração do fluxo total ao longo do tempo, antes e após o tratamento com siRNA.
Tabela 13. Ensaio de silenciamento de PNPLA3 Númer Silenciamen Silenciamen Silenciamen Silenciamen Silenciamen o da Partícula Dose to de to de to de to de to de hélic Vetor AAV s de AAV/ administra PNPLA3, Dia PNPLA3, Dia PNPLA3, Dia PNPLA3, Dia PNPLA3, Dia e animal da (mg/kg) 8 (%) 15 (%) 22 (%) 29 (%) 43 (%) dupla D- PNPLA3- 2324 I148M DM 5E+11 5 -98,03 -94,77 -94,15 -65,40 D- PNPLA3- 2370 I148M DM 5E+11 5 -96,48 -96,52 -95,40 -69,31 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 5E+11 5 -97,66 -97,09 -96,84 -90,52 D- PNPLA3- 2324 I148M DM 5E+11 3 -96,39 -91,43 -87,71 -61,75 D- PNPLA3- 2370 I148M DM 5E+11 3 -97,42 -95,98 -95,51 -85,66
D- PNPLA3- 2419 I148M DM 5E+11 3 -97,37 -95,32 -95,52 -81,81 D- PNPLA3- 2421 I148M DM 5E+11 3 -96,13 -93,99 -95,26 -85,49 D- PNPLA3- 2404 I148M DM 5E+11 3 -97,77 -96,82 -96,83 D- PNPLA3- 2402 I148M DM 5E+11 3 -97,69 -96,69 -96,81 -55,46 D- PNPLA3- 2472 I148M DM 5E+11 3 -95,89 -93,61 -92,05 -68,74 D- PNPLA3- 2443 I148M DM 5E+11 3 -97,33 -96,51 -95,82 -84,56 D- PNPLA3- 2466 I148M DM 5E+11 3 -97,96 -97,13 -96,75 -79,62 D- PNPLA3- 2473 I148M DM 5E+11 3 -97,18 -95,95 -95,79 -68,96 D- PNPLA3- 2324 I148M DM 5E+11 1 -90,86 -82,53 -80,56 -74,32
D- PNPLA3- 2370 I148M DM 5E+11 1 -93,49 -90,34 -89,17 -56,45 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 5E+11 1 -89,12 -84,16 -87,52 -47,52 D- PNPLA3- 2421 I148M DM 5E+11 1 -83,03 -70,41 -74,45 -26,47 D- PNPLA3- 2404 I148M DM 5E+11 1 -94,34 -91,18 -90,01 -59,48 D- PNPLA3- 2402 I148M DM 5E+11 1 -87,41 -79,59 -84,95 -32,94 D- PNPLA3- 2472 I148M DM 5E+11 1 -87,28 -79,86 -76,77 -33,42 D- PNPLA3- 2443 I148M DM 5E+11 1 -48,96 -46,63 -69,39 -34,70 D- PNPLA3- 2466 I148M DM 5E+11 1 -90,36 -83,03 -85,21 -44,20 D- PNPLA3- 2473 I148M DM 5E+11 1 -80,89 -76,26 -84,45 -56,63
D- 2454 PNPLA3 TS 5E+11 3 -97,89 -85,94 -92,41 -44,16 D- 2453 PNPLA3 TS 5E+11 3 -98,67 -90,86 -94,56 -72,71 D- 2456 PNPLA3 TS 5E+11 3 -97,75 -84,03 -87,90 -40,07 D- 2455 PNPLA3 TS 5E+11 3 -89,75 -61,34 -80,50 -38,33 D- 2454 PNPLA3 TS 5E+11 1 -94,43 -73,24 -89,57 -60,76 D- 2453 PNPLA3 TS 5E+11 1 -94,15 -72,63 -80,99 5,10 D- 2456 PNPLA3 TS 5E+11 1 -79,90 -50,52 -69,95 -20,01 D- 2455 PNPLA3 TS 5E+11 1 -71,82 -1,32 -55,65 17,39 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 7,5E+11 3 -98,00 -97,61 -96,67 -91,38
D- PNPLA3- 2666 I148M DM 7,5E+11 3 -94,32 -94,07 -90,69 -80,56 D- PNPLA3- 2667 I148M DM 7,5E+11 3 -95,49 -94,77 -93,58 -85,70 D- PNPLA3- 2676 I148M DM 7,5E+11 3 -94,63 -91,64 -89,02 -72,10 D- PNPLA3- 2699 I148M DM 7,5E+11 3 -90,85 -85,48 -57,10 D- PNPLA3- 2700 I148M DM 7,5E+11 3 -97,65 -96,86 -93,76 -87,13 D- PNPLA3- 2701 I148M DM 7,5E+11 3 -97,37 -96,59 -95,00 -88,29 D- PNPLA3- 2705 I148M DM 7,5E+11 3 -95,74 -91,67 -86,98 -75,38 D- PNPLA3- 2706 I148M DM 7,5E+11 3 -95,51 -91,01 -85,19 -68,36 D- PNPLA3- 2707 I148M DM 7,5E+11 3 -94,33 -89,29 -85,91 -66,08
D- PNPLA3- 2708 I148M DM 7,5E+11 3 -97,72 -96,34 -95,70 -89,66 D- PNPLA3- 2684 I148M DM 7,5E+11 3 -94,66 -89,59 -85,28 -55,31 D- PNPLA3- 2686 I148M DM 7,5E+11 3 -96,29 -94,61 -89,34 -51,49 D- PNPLA3- 2688 I148M DM 7,5E+11 3 -95,97 -94,43 -93,01 -82,63 D- PNPLA3- 2691 I148M DM 7,5E+11 3 -94,47 -86,71 -81,93 -64,98 D- PNPLA3- 2692 I148M DM 7,5E+11 3 -96,52 -94,01 -89,97 -80,83 D- PNPLA3- 2696 I148M DM 7,5E+11 3 -96,94 -94,79 -92,89 -83,76 D- PNPLA3- 2697 I148M DM 7,5E+11 3 -91,39 -83,82 -75,89 -51,50 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 7,5E+11 3 -95,52 -93,54 -91,46 -74,42
D- PNPLA3- 2523 I148M DM 7,5E+11 3 -94,27 -91,79 -66,89 -50,87 D- PNPLA3- 2413 I148M DM 7,5E+11 3 -94,04 -95,17 -76,04 -53,22 D- PNPLA3- 2523 I148M DM 7,5E+11 1 -65,61 -86,75 78,32 163,55 D- PNPLA3- 2413 I148M DM 7,5E+11 1 -83,37 -85,51 -26,85 -9,13 D- PNPLA3- 2667 I148M DM 7,5E+11 1 -58,87 -59,41 -4,15 35,34 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 7,5E+11 1 -91,58 -90,56 -73,21 -54,90 D- PNPLA3- 2688 I148M DM 7,5E+11 1 -73,57 -84,01 -37,46 -1,49 D- PNPLA3- 2708 I148M DM 7,5E+11 1 -84,06 -86,91 -65,11 -62,60 D- PNPLA3- 2669 I148M DM 7,5E+11 1 -0,36 15,49 220,82 268,45
D- PNPLA3- 2711 I148M DM 7,5E+11 3 -0,01 49,59 238,44 212,77 D- PNPLA3- 2713 I148M DM 7,5E+11 3 -91,72 -90,51 -63,93 -30,60 D- PNPLA3- 2716 I148M DM 7,5E+11 3 -86,43 -87,62 -53,78 -44,36 D- PNPLA3- 2674 I148M DM 7,5E+11 3 -80,59 -81,95 -36,01 0,59 D- PNPLA3- 2698 I148M DM 7,5E+11 3 -85,22 -71,73 483,18 807,64 D- PNPLA3- 2693 I148M DM 7,5E+11 3 -75,98 -59,22 39,49 110,57 D- 2456 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -85,45 -78,57 -73,40 -58,06 D- 2523 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -27,40 -30,01 -40,22 -49,59 D- 2413 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -36,68 -27,93 -10,77 12,54
D- 2419 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 115,08 100,96 101,39 64,16 D- 2679 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -34,16 -6,82 17,45 17,46 D- 2688 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 135,68 67,66 73,67 48,09 D- 2708 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 69,43 40,96 50,89 52,15 D- 2669 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 189,68 50,72 148,32 147,67 D- 2711 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 109,67 114,26 75,39 93,47 D- 2713 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 115,32 48,86 18,67 1,36 D- 2716 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 205,93 114,38 114,09 83,88 D- 2674 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 81,00 67,18 109,44 65,24
D- 2698 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 105,88 76,39 62,37 37,65 D- 2693 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 148,52 125,48 116,64 61,43 D- 2690 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 260,84 226,65 132,56 143,47 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 7,5E+11 1 -93,56 -89,52 -84,43 -63,34 D- PNPLA3- 2717 I148M DM 7,5E+11 1 -80,51 -67,95 -58,97 -22,43 D- PNPLA3- 2718 I148M DM 7,5E+11 1 -71,69 -55,51 -36,08 38,24 D- PNPLA3- 2721 I148M DM 7,5E+11 1 -63,71 -62,50 -48,52 -12,97 D- PNPLA3- 2719 I148M DM 7,5E+11 1 -78,95 -70,97 -65,38 -13,45 D- PNPLA3- 2713 I148M DM 7,5E+11 1 -70,43 -64,51 -43,23 -0,48
D- PNPLA3- 2712 I148M DM 7,5E+11 1 -79,63 -68,64 -51,82 -8,94 D- PNPLA3- 2720 I148M DM 7,5E+11 1 -65,95 -86,70 -40,92 2,24 D- PNPLA3- 2722 I148M DM 7,5E+11 1 -80,32 -75,04 -63,28 -34,56 D- PNPLA3- 2723 I148M DM 7,5E+11 1 -72,69 -55,59 -39,98 35,01 D- PNPLA3- 2724 I148M DM 7,5E+11 1 -87,97 -78,29 -73,04 -42,89 D- PNPLA3- 2725 I148M DM 7,5E+11 1 -79,65 -70,69 -32,50 -35,65 D- PNPLA3- 2726 I148M DM 7,5E+11 1 -40,03 -38,86 -14,74 55,71 D- PNPLA3- 2716 I148M DM 7,5E+11 1 34,75 92,81 181,00 440,62 D- 2454 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -98,16 -95,32 -90,10 -88,50
D- 2523 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -44,09 -18,41 133,97 45,50 D- 2413 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -64,12 -40,89 38,07 -3,05 D- 2717 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -47,67 -19,71 109,49 42,75 D- 2718 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -77,04 -60,05 -3,84 -40,18 D- 2721 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -47,41 -49,33 10,37 -41,12 D- 2719 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -29,15 -27,68 72,52 -20,99 D- 2720 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -67,46 -46,37 66,09 -20,66 D- 2726 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -83,36 -81,38 -37,21 -61,84 D- 2723 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -76,09 -57,32 -7,17 -45,85
D- PNPLA3- 2419 I148M DM 7,5E+11 3 -96,66 -97,62 -93,93 -88,77 D- PNPLA3- 2765 I148M DM 7,5E+11 3 -96,64 -97,81 -95,29 -87,53 D- PNPLA3- 2766 I148M DM 7,5E+11 3 -97,30 -98,15 -95,74 -90,07 D- PNPLA3- 2724 I148M DM 7,5E+11 3 -97,41 -97,40 -94,77 -74,92 D- PNPLA3- 2768 I148M DM 7,5E+11 3 -93,09 -95,62 -90,36 -74,62 D- PNPLA3- 2769 I148M DM 7,5E+11 3 -96,94 -97,93 -95,17 -89,60 D- PNPLA3- 2770 I148M DM 7,5E+11 3 -89,23 -94,14 -90,41 -79,60 D- PNPLA3- 2771 I148M DM 7,5E+11 3 -97,22 -97,80 -95,95 -90,02 D- PNPLA3- 2772 I148M DM 7,5E+11 3 -97,47 -97,84 -95,09 -92,03
D- PNPLA3- 2773 I148M DM 7,5E+11 3 -97,51 -97,95 -96,18 -93,12 D- PNPLA3- 2774 I148M DM 7,5E+11 3 -96,78 -97,86 -95,36 -91,98 D- PNPLA3- 2413 I148M DM 7,5E+11 3 -97,94 -98,01 -96,24 -91,62 D- PNPLA3- 2419 I148M DM 7,5E+11 3 -95,82 -97,64 -93,55 -89,59 D- PNPLA3- 2717 I148M DM 7,5E+11 3 -96,64 -97,39 -95,19 -90,49 D- 2453 PNPLA3 TS 7,5E+11 1,5 -94,74 -92,67 -88,92 -82,19 D- 2724 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 20,64 74,00 49,42 77,34 D- 2522 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -27,08 53,78 58,28 17,26 D- 2765 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -65,40 -34,32 -35,49 -46,32
D- 2766 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -11,64 30,74 34,37 27,78 D- 2767 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 14,66 60,91 75,79 39,35 D- 2768 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 50,61 196,44 345,66 149,29 D- 2769 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 30,51 68,93 90,25 35,98 D- 2770 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 25,01 69,81 95,00 99,26 D- 2771 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 60,93 158,57 281,70 147,49 D- 2772 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -3,32 58,08 89,41 85,72 D- 2773 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -36,28 -20,77 21,91 -22,36 D- 2774 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 2,83 51,07 71,49 65,75
D- 2413 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 -5,20 44,59 50,74 28,08 D- 2419 PNPLA3 TS 7,5E+11 3 101,03 115,15 32,98 -16,47 D- 2717 PNPLA3 TS 7,5E+11 1,5 21,80 107,39 173,59 87,94
Exemplo 8: Confirmação da eficácia de uma molécula de siRNA seletiva para PNPLA3rs738409-rs738408 em um modelo de camundongo de fígado humanizado quimérico
[0214] Para avaliar a eficácia de um siRNA seletivo para o alelo minoritário de PNPLA3 em hepatócitos humanos in vivo, camundongos PXB com fígado humanizado quimérico da PhoenixBio Co., Ltd (Japão) foram usados (Miyamoto et al. (2017) Xenobiotica 47(12):1052-1063; Tateno et al. (2015) PLoS One 10(11):e0142145. doi:10.1371/journal.pone.0142145). No momento do início do estudo, os camundongos machos tinham aproximadamente quatro meses de idade; pelo menos três meses pós- transplante. A PhoenixBio determinou que os camundongos tinham um índice de substituição de hepatócitos humanos de 90-95% e, com base em genotipagem anterior, eram heterozigóticos para PNPLA3rs738409 (Lote BD195). À chegada, os camundongos foram colocados a dieta ProLab RMH 3000, como recomendado pela PhoenixBio. Após um período de aclimatação de uma semana, a dieta foi mudada para uma dieta indutora de NASH rica em frutose com alto teor de gordura (Research Diets, D19021301). Após uma semana com a dieta indutora de NASH, os camundongos foram randomizados com base em medições do peso do corpo. Os camundongos foram tratados com uma única dose de siRNA (0,5 mM), via injeção subcutânea, a 3,0 ou 10,0 miligramas por quilograma de animal, diluídos em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific,14190- 136) ou receberam apenas veículo. Às duas ou quatro semanas após a injeção de siRNA, fígados foram recolhidos dos animais, instantaneamente congelados em nitrogênio líquido, processados para RNA purificado usando um Sistema de Isolamento e Purificação de DNA/RNA Automatizado QIAcube (Qiagen) e Kit RNeasy Mini QIAcube (Qiagen, 74116) de acordo com as instruções do fabricante.
Amostras foram analisadas usando um Espectrofotômetro NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific, ND-8000-GL). RNA foi tratado com DNase sem RNase RQ1 (Promega, M6101) e preparado para PCR Digital de Gotículas (ddPCR) de acordo com as instruções do fabricante.
O Kit de Síntese da 1ª Fita de cDNA AccuScript High Fidelity (Thermo Fisher, 200820) foi usado para a reação de transcrição reversa e as reações de PCR foram montadas usando ddPCR Supermix para Sondas (BioRad, 1863010). ddPCR foi realizada usando um sistema de PCR digital de gotículas AutoDG (BioRad, QX200). Os seguintes ensaios TaqMan™ foram adquiridos à Invitrogen: PNPLA3 humano (Hs00228747_m1), ASGR1 humano (Hs1005019_m1), Asgr1 de camundongo (Mm01245581_m1), e um ensaio de distinção dos alelos minoritário PNPLA3 rs738409 humano/de referência (C______7241_10). Os seguintes ensaios foram adquiridos à Integrated DNA Technologies Inc.: TBP humano (Hs.
PT 53a.20105486; razão entre iniciador e sonda 3,6:1), HPRT1 humano (Hs.PT.39a.22214821; razão entre iniciador e sonda 3,6:1), e Hprt de camundongo (Mm.PT.39a.22214828; razão entre iniciador e sonda 3,6:1). Os resultados para PNPLA3, HPRT e ASGR1 humanos, e Hprt e Asgr1 de camundongo, são apresentados como cópias por reação de 20 microlitros, normalizados para TBP humano.
Os dados para PNPLA3 humano, HPRT humano e Hprt de camundongo também são apresentados como a percentagem relativa do silenciamento da expressão de mRNA em comparação com o de animais de controle tratados com veículo.
[0215] Para a análise do teor de triglicerídeos hepáticos, aproximadamente 0,05-0,1 miligramas de fígado congelado dos camundongos foram homogeneizados em um mililitro de isopropanol. Após uma hora de incubação em gelo, amostras foram submetidas a rotação a 10 000 rpm em um microcentrifugador, e sobrenadantes foram transferidos para uma placa de 96 poços profundos limpa. O teor de triglicerídeos foi determinado usando o Reagente para Triglicerídeos Infinity colorimétrico (Thermo Fisher Scientific, TR22421) e Padrão de Triglicerídeos (Pointe Scientific, T7531-STD) de acordo com as instruções do fabricante, e um leitor de microplacas SpectraMax Plus com o software SoftMax Pro6 (Molecular Devices). Os resultados são apresentados como miligramas de triglicerídeos por grama de tecido do fígado.
[0216] A Figura 9 mostra um exemplo de uma molécula de siRNA, D-2419, demonstrando silenciamento de mRNA dependente da dose e seletivo para alelos e eficácia funcional in vivo. Após uma semana de dieta indutora de NASH, camundongos heterozigóticos para PNPLA3rs738409-rs738408 humano foram tratados com siRNA ou veículo. (A) A molécula de siRNA, D-2419, foi injetada a 3,0 e 10,0 miligramas por quilograma de peso do corpo subcutaneamente no abdômen do camundongo. Duas e quatro semanas após o tratamento com siRNA, os camundongos foram sacrificados, e os fígados foram recolhidos e processados para análise. Usando ddPCR e um reagente de dois corantes TaqMan® específico para alelos para distinguir os alelos minoritário versus de referência de PNPLA3, os dados demonstram silenciamento dependente da dose e seletivo para alelos de PNPLA3rs738409- rs738408 e nenhuma alteração mensurável de PNPLA3TS.
N=5 camundongos por grupo; os dados são apresentados como o valor médio e o erro padrão da média.
ANOVA de duas vias, ** 0,001, *** <0,001, **** <0,0001, NS = não significativo. (B) Os dados representam a percentagem relativa média do silenciamento de mRNA, e erro padrão da média, do alelo PNPLA3rs738409-rs738408 humano versus PNPLA3TS relativamente ao grupo de controle tratado com veículo.
Os valores são relativos ao valor médio de controle de veículo às duas semanas, todos normalizados para TBP humano. (C) Fígados do grupo de tratamento durante duas semanas foram processados quanto ao teor de triglicerídeos para avaliar a eficácia funcional.
Os dados representam os miligramas de triglicerídeos por grama de fígado.
N=5 camundongos por grupo; os dados são apresentados como o valor médio e o erro padrão da média.
ANOVA de uma via, ** 0,01, NS = não significativo. (D) Para controlar a administração eficiente de siRNA, D-2787, mediada por GalNAc, um siRNA reativo de modo cruzado para HPRT e Hprt humano e de camundongo, respectivamente, foi administrado a 10 miligramas por quilograma e os fígados foram recolhidos passadas duas semanas.
Os dados representam as cópias de mRNA de HPRT e mRNA de Hprt em camundongos tratados com D-2787 (N=4) versus tratados com veículo (N=5). Os dados são apresentados como o valor médio e o erro padrão da média.
ANOVA de uma via, * 0,01. (E) Os dados representam a percentagem relativa média do silenciamento de mRNA, e erro padrão da média, de mRNA de HPRT humano e Hprt de camundongo, respectivamente, relativamente ao grupo de controle tratado com veículo; todos normalizados para TBP humano. (F) Para confirmar a expressão de receptor de GalNAc nos hepatócitos de camundongos PXB®, níveis de mRNA de Asgr1 de camundongo e mRNA de ASGR1 humano foram avaliados na ausência e presença de D-2419, às duas semanas e quatro semanas após a injeção de siRNA.
N=5 camundongos por grupo; os dados são apresentados como o valor médio e o erro padrão da média.

Claims (43)

REIVINDICAÇÕES
1. Construto de RNAi compreendendo uma fita sentido e uma fita antissentido, caracterizado pelo fato de que a fita antissentido compreende uma região tendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos de uma sequência antissentido listada na Tabela 1 ou 2, e em que o construto de RNAi inibe a expressão do gene Contendo o Domínio de Fosfolipase do Tipo Patatina 3 (PNPLA3).
2. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fita antissentido compreende uma região que é complementar a uma sequência de mRNA de PNPLA3.
3. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a fita sentido compreende uma região tendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos de uma sequência antissentido listada na Tabela 1 ou 2.
4. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o construto inibe preferencialmente um alelo minoritário PNPLA3-rs738409.
5. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o construto tem uma inibição pelo menos 10% maior de um alelo minoritário PNPLA3-rs738409 em comparação com o alelo maioritário.
6. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o construto inibe preferencialmente um alelo minoritário PNPLA3-rs738408.
7. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o construto tem uma inibição pelo menos 10% maior de um alelo minoritário duplo PNPLA3- rs738409-rs738408 em comparação com o alelo maioritário.
8. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a fita sentido compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissentido para formar uma região de hélice dupla de cerca de 15 até cerca de 30 pares de bases de comprimento.
9. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região de hélice dupla tem cerca de 17 até cerca de 24 pares de bases de comprimento.
10. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região de hélice dupla tem cerca de 19 até cerca de 21 pares de bases de comprimento.
11. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região de hélice dupla tem 19 pares de bases de comprimento.
12. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região de hélice dupla tem 20 pares de bases de comprimento.
13. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a região de hélice dupla tem 21 pares de bases de comprimento.
14. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a fita sentido e a fita antissentido têm, cada uma, cerca de 15 até cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
15. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fita sentido e a fita antissentido têm, cada uma, cerca de 19 até cerca de 27 nucleotídeos de comprimento.
16. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fita sentido e a fita antissentido têm, cada uma, cerca de 21 até cerca de 25 nucleotídeos de comprimento.
17. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fita sentido e a fita antissentido têm, cada uma, cerca de 21 até cerca de 23 nucleotídeos de comprimento.
18. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende pelo menos uma extremidade simétrica.
19. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende pelo menos uma protuberância de nucleotídeos de 1 até 4 nucleotídeos desemparelhados.
20. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a protuberância de nucleotídeos tem 2 nucleotídeos desemparelhados.
21. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende uma protuberância de nucleotídeos na extremidade 3' da fita sentido, na extremidade 3' da fita antissentido ou na extremidade 3' de ambas as fita sentido e fita antissentido.
22. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a protuberância de nucleotídeos compreende um dinucleotídeo 5'-UU-3' ou um dinucleotídeo 5'-dTdT-3'.
23. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
24. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo modificado é um nucleotídeo 2'-modificado.
25. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo modificado é um nucleotídeo 2'-fluoro-modificado, um nucleotídeo 2'-O- metil-modificado, um nucleotídeo 2'-O-metoxietil- modificado, um nucleotídeo 2'-O-alil-modificado, um ácido nucleico bicíclico (BNA), um ácido glicolnucleico, uma base invertida ou suas combinações.
26. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o nucleotídeo modificado é um nucleotídeo 2'-O-metil-modificado, um nucleotídeo 2'-O- metoxietil-modificado, um nucleotídeo 2'-fluoro-modificado ou suas combinações.
27. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos nas fitas sentido e antissentido são nucleotídeos modificados.
28. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos modificados são nucleotídeos 2'-O-metil-modificados, nucleotídeos 2'- fluoro-modificados ou suas combinações.
29. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende pelo menos uma ligação internucleotídica fosforotioato.
30. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas na extremidade 3' da fita antissentido.
31. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas em ambas as extremidades 3' e 5' da fita antissentido e duas ligações internucleotídicas fosforotioato consecutivas na extremidade 5' da fita sentido.
32. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a fita antissentido compreende uma sequência selecionada das sequências antissentido listadas na Tabela 1 ou Tabela 2.
33. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a fita sentido compreende uma sequência selecionada das sequências sentido listadas na Tabela 1 ou Tabela 2.
34. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi é qualquer um dos compostos em hélice dupla listados em qualquer uma das Tabelas 1 até 2.
35. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi reduz o nível de expressão de PNPLA3 em células do fígado após incubação com o construto de RNAi em comparação com o nível de expressão de PNPLA3 em células do fígado que foram incubadas com um construto de RNAi de controle.
36. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que as células do fígado são células Hep3B ou HepG2.
37. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi inibe pelo menos 10% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células Hep3B in vitro.
38. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi inibe pelo menos 10% da expressão de PNPLA3 a 5 nM em células HepG2 in vitro.
39. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi inibe a expressão de PNPLA3 em células Hep3B com um IC50 menor do que cerca de 1 nM.
40. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi inibe a expressão de PNPLA3 em células HepG2 com um IC50 menor do que cerca de 1 nM.
41. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de RNAi, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
42. Método para reduzir a expressão de PNPLA3 em um paciente com sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente o construto de RNAi, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão de PNPLA3 em hepatócitos é reduzido no paciente após a administração do construto de RNAi em comparação com o nível de expressão de PNPLA3 em um paciente não recebendo o construto de RNAi.
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