BR112021011043A2 - Construtos de rnai quimicamente modificados e seus usos - Google Patents

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Justin K. Murray
Bin Wu
Yuan Cheng
Bradley J. Herberich
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Abstract

construtos de rnai quimicamente modificados e seus usos. a presente invenção se relaciona com construtos de rnai quimicamente modificados para reduzir a expressão de um gene alvo. em particular, a invenção se relaciona com padrões específicos de nucleotídeos modificados a serem incorporados em construtos de rnai para melhorar a estabilidade e eficácia in vivo. são também descritas composições farmacêuticas compreendendo os construtos de rnai quimicamente modificados e métodos de inibir a expressão do gene alvo in vivo por administração dos construtos de rnai quimicamente modificados, por exemplo, para tratar ou melhorar várias condições de doença.

Description

CONSTRUTOS DE RNAi QUIMICAMENTE MODIFICADOS E SEUS USOS
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos E.U.A. N.º 62/777,677, depositado a 10 de dezembro de 2018, que é deste modo incorporado por referência em sua totalidade.
DESCRIÇÃO DO FICHEIRO DE TEXTO SUBMETIDO ELETRONICAMENTE
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências, que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada por referência em sua totalidade. A cópia do formato legível por computador da Listagem de Sequências, que foi criada a 9 de dezembro de 2019, é denominada A-2327- WO-PCT_SeqList_ST25 e tem 24,7 quilobytes em tamanho.
ÁREA DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção se relaciona com construtos de RNAi quimicamente modificados para reduzir a expressão de um gene alvo in vivo. Especificamente, a invenção se relaciona com padrões específicos de nucleotídeos modificados que conferem eficácia e estabilidade melhoradas de construtos de RNAi in vivo. Tais construtos de RNAi são úteis para inibir a expressão do gene alvo para propósitos terapêuticos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] Interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento de genes pós-transcricional encontrado em quase todos os filos e se acredita ser um mecanismo de defesa celular evolutivamente conservado (Fire et al., Nature, Vol. 391; 806–811, 1998; Fire et al., Trends Genet, Vol. 15: 358- 363, 1999; e Hamilton e Baulcombe, Science, Vol. 286, 950– 952, 1999). Fisiologicamente, o mecanismo de RNAi é iniciado pela geração mediada por enzimas Dicer de dúplexes de 18-25 pares de bases a partir de RNAs não codificantes mais longos. Estas moléculas curtas de RNA são carregadas no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde a fita senso ou fita passageira é descartada, e a fita antissenso ou fita guia hibrida com uma sequência de mRNA completamente ou parcialmente complementar (Nakanishi, Wiley Interdiscip. Rev. RNA, Vol. 7: 637-660, 2016). O silenciamento do mRNA é depois induzido através de degradação mediada por Ago2 ou repressão translacional (Bobbin e Rossi, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 56: 103–122, 2016).
[0005] Os avanços na tecnologia e metodologia de distribuição de RNAi levaram a um número crescente de resultados positivos com terapias baseadas em RNAi. Tais terapias representam uma classe promissora de terapêuticos, particularmente contra alvos que foram considerados “não passíveis de transformar em fármacos” por modalidades de molécula pequena ou biológicas. Embora muito progresso tenha sido feito para ultrapassar os passivos metabólicos inerentes do RNA natural através do desenvolvimento de modificações químicas e métodos de distribuição melhorados permanece uma necessidade na técnica de agentes de RNAi com eficácia e estabilidade in vivo intensificadas adequados para administração para propósitos terapêuticos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0006] A presente invenção é baseada, em parte, no desenho de padrões de modificação química para construtos de RNAi que melhoram a potência e/ou duração da atividade de silenciamento de genes dos construtos in vivo. Os padrões de modificação descritos aqui podem ser universalmente aplicados a uma variedade de construtos de RNAi tendo diferentes sequências e alvos. Os construtos de RNAi são úteis para inibir a expressão do gene alvo in vivo, por exemplo para propósitos terapêuticos.
[0007] Conformemente, a presente invenção proporciona construtos de RNAi que inibem a expressão de uma sequência do gene alvo, em que os construtos de RNAi compreendem uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar à sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, e em que os construtos de RNAi compreendem uma estrutura representada por uma das fórmulas descritas aqui. Em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção têm um padrão de modificação química selecionado de um dos padrões designados como P1 a P30 como descrito aqui.
[0008] Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A): 5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL- 5′ (A)
[0009] Na Fórmula (A), a fita superior listada na direção 5´ para 3´ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3´ para 5´ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2´-flúor; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-flúor, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por
2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um ácido nucleico bicíclico (BNA) e um desoxirribonucleotídeo; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; e NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo.
X pode ser um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo.
Um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso.
Y pode ser um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso.
X pode ser um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo. Um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares aos nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
[0010] Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-23 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 19-23 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que: os nucleotídeos nas posições 2, 7 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; e nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total. O construto de RNAi pode ter uma saliência de nucleotídeos em uma das ou ambas as extremidades 3´ da fita senso e da fita antissenso. Em certas modalidades, o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5´ da fita antissenso.
[0011] Em outras modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D):
5′-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL- 5′ (D)
[0012] Na Fórmula (D), a fita superior listada na direção 5´ para 3´ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3´ para 5´ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2´-flúor; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-flúor, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; e NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo. X pode ser um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo. Um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso. Y pode ser um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso. X pode ser um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo. Um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares aos nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
[0013] Em algumas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-23 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 19-23 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que: os nucleotídeos nas posições 2, 14 e 16 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 10 a 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; e nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total. O construto de RNAi pode ter uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5´ da fita antissenso. Alternativamente, o construto de RNAi pode ter uma saliência de nucleotídeos em ambas as extremidades 3´ da fita senso e da fita antissenso.
[0014] Os construtos de RNAi podem compreender pelo menos uma modificação no esqueleto, tal como uma ligação internucleotídica ou internucleosídica modificada. Em certas modalidades, os construtos de RNAi descritos aqui compreendem pelo menos uma ligação internucleotídica de fosforotioato. Em modalidades particulares, as ligações internucleotídicas de fosforotioato podem estar posicionadas nas extremidades 3' ou 5' das fitas senso e/ou antissenso.
[0015] Os construtos de RNAi podem compreender adicionalmente um ligante para facilitar a distribuição ou captação dos construtos de RNAi para tecidos ou células específicos, tais como células do fígado. Em algumas modalidades, o ligante visa a distribuição dos construtos de RNAi aos hepatócitos. Em estas e outras modalidades, o ligante pode compreender galactose, galactosamina ou N-acetil-galactosamina (GalNAc). Em certas modalidades, o ligante compreende uma fração de galactose multivalente ou GalNAc multivalente, tal como uma fração de galactose ou GalNAc trivalente ou tetravalente. O ligante pode ser covalentemente anexado à extremidade 5´ ou 3´ da fita senso do construto de RNAi, opcionalmente através de um ligador. Em algumas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ligante e ligador tendo uma estrutura de acordo com qualquer uma das Fórmulas I a IX descritas aqui. Em uma modalidade, os construtos de RNAi compreendem um ligante e ligador tendo uma estrutura de acordo com a Fórmula VI. Em uma outra modalidade, os construtos de RNAi compreendem um ligante e ligador tendo uma estrutura de acordo com a Fórmula VII. Ainda em uma outra modalidade, os construtos de RNAi compreendem um ligante e ligador tendo uma estrutura de acordo com a Fórmula IX.
[0016] A presente invenção proporciona também composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos construtos de RNAi descritos aqui e um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas são particularmente úteis para reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo nas células (p. ex., células do fígado) de um sujeito, particularmente quando a sobre-expressão do produto do gene alvo no sujeito está associada a um fenótipo patológico.
[0017] A presente invenção inclui métodos para reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou sujeito. Em uma modalidade, os métodos compreendem contatar a célula ou tecido com qualquer um dos construtos de RNAi descritos aqui. A célula ou tecido pode estar in vitro ou in vivo. Em uma outra modalidade, os métodos compreendem administrar qualquer um dos construtos de RNAi descritos aqui a um sujeito. Os construtos de RNAi podem ser administrados ao sujeito parenteralmente (p. ex., intravenosamente ou subcutaneamente).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0018] A Figura 1 mostra várias modalidades representativas de padrões de modificação química para construtos de RNAi. Em cada um dos esquemas, a fita superior representa a fita senso na direção 5´ para 3´ e a fita inferior representa a fita antissenso na direção 3´ para 5´. Os círculos pretos sólidos representam nucleotídeos modificados por 2´-O-metila (2′-OMe), os círculos listrados representam nucleotídeos modificados por 2′-flúor (2′-F) e os círculos brancos representam nucleotídeos abásicos invertidos (invAb) ou desoxirribonucleotídeos invertidos (invdN). As linhas cinza- claro conectando os círculos representam ligações de fosfodiéster, ao passo que as linhas pretas conectando os círculos representam ligações de fosforotioato. As caixas pretas denotam os locais de clivagem de Ago2 putativos dentro dos construtos de RNAi.
[0019] A Figura 2 é um gráfico de barras dos níveis de expressão da variante de PNPLA3 humana em fígados de camundongos injetados com um AAV codificando a variante de PNPLA3 humana e tratados com injeções subcutâneas a 5 mg/kg do construto de RNAi indicado tendo o padrão de modificação química P1 ou CM1. A expressão de PNPLA3 humana foi medida por qPCR e é relatada como níveis de expressão em relação aos animais tratados com veículo. Os níveis de expressão são mostrados no dia 8 após administração do construto de RNAi.
[0020] A Figura 3 é um gráfico de barras dos níveis de expressão da variante de PNPLA3 humana em fígados de camundongos injetados com um AAV codificando a variante de PNPLA3 humana e tratados com injeções subcutâneas a 5 mg/kg do construto de RNAi indicado tendo os padrões de modificação química P1, P2, P3 ou P4. A expressão de PNPLA3 humana foi medida por qPCR e é relatada como níveis de expressão em relação aos animais tratados com veículo. Os níveis de expressão são mostrados no dia 15 após administração do construto de RNAi.
[0021] As Figuras 4A e 4B são gráficos de linha ilustrando o fluxo total (fótons por segundo) em camundongos recebendo injeções subcutâneas de veículo ou os construtos de RNAi indicados tendo o padrão de modificação química P9 a uma dose de 1 mg/kg (Figura 4A) ou 3 mg/kg (Figura 4B) versus o número de semanas pós-injeção dos construtos de RNAi. O fluxo total representa o sinal de um repórter de luciferase, que contém sequências complementares às sequências dos construtos de RNAi, expressas pelos camundongos. Uma redução no fluxo total é indicativa de uma redução na expressão do repórter de luciferase.
[0022] A Figura 5 é um gráfico de barras dos níveis de expressão da variante de PNPLA3 humana em fígados de camundongos injetados com um AAV codificando a variante de PNPLA3 humana e tratados com injeções subcutâneas a 3 mg/kg dos construtos de RNAi indicados tendo os padrões de modificação química P9 (dúplexes n.os 7318 e 8709), CM2 (dúplex n.º 8103), CM3 (dúplex n.º 8104) ou CM4 (dúplex n.º 8105). A expressão de PNPLA3 humana foi medida por qPCR e é relatada como níveis de expressão em relação aos animais tratados com veículo. Os níveis de expressão são mostrados no dia 28 após administração do construto de RNAi.
[0023] A Figura 6 é um gráfico de barras dos níveis de expressão de ASGR1 de camundongo em fígados de camundongos tratados com injeções subcutâneas de 5 mg/kg dos construtos de RNAi de ASGR1 indicados. A expressão de ASGR1 de camundongo foi medida por qPCR e é relatada como níveis de expressão normalizados por níveis de expressão de Gapdh. Os níveis de expressão são mostrados no dia 4, dia 8 e dia 15 após administração dos construtos de RNAi ou tampão (solução salina tamponada com fosfato, PBS).
[0024] A Figura 7 é um gráfico de linhas mostrando a percentagem de mudança nos níveis séricos de Lp(a) em relação à linha de base em camundongos transgênicos duplos administrados com injeções subcutâneas a 0,5 mg/kg dos construtos de RNAi visados a LPA indicados. Ambos os construtos de RNAi tinham a mesma sequência e diferiam somente no padrão de modificações químicas; o dúplex n.º 3632 tinha o padrão de modificação CM1 e o dúplex n.º 3635 tinha o padrão de modificação P1. A percentagem de mudança nos níveis séricos de Lp(a) é mostrada no dia 14 (D14) e dia 28 (D28) após a injeção subcutânea única dos construtos de RNAi.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0025] A presente invenção é baseada, em parte, no desenho de padrões de modificação química para construtos de RNAi que produzem silenciamento potente e durável da expressão do gene alvo in vivo através de uma variedade de sequências e alvos. Foi mostrado que os construtos de RNAi quimicamente modificados descritos aqui têm potência e/ou duração melhoradas na atividade de silenciamento de genes in vivo em comparação com agentes de RNAi terapêuticos previamente descritos tendo padrões de modificação química alternativos. Os construtos de RNAi modificadas da invenção são úteis para inibir a expressão do gene alvo in vivo, p. ex., para tratar ou melhorar várias condições de doença. Conformemente, a presente invenção proporciona construtos de RNAi que inibem a expressão de uma sequência do gene alvo.
[0026] Como usado aqui, o termo “construto de RNAi” se refere a um agente compreendendo uma molécula de RNA que é capaz de subregular a expressão de um gene alvo através de um mecanismo de interferência de RNA quando introduzida em uma célula. A interferência de RNA é o processo pelo qual uma molécula de ácido nucleico induz a clivagem e degradação de uma molécula de RNA alvo (p. ex., molécula de RNA mensageiro ou mRNA) de uma maneira específica de sequências, p. ex., através de uma via do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma molécula de RNA de fita dupla compreendendo duas fitas antiparalelas de nucleotídeos contíguos que são suficientemente complementares entre si para hibridarem para formar uma região de dúplex. “Hibridar” ou “hibridação” se refere ao emparelhamento de polinucleotídeos complementares, tipicamente através de formação de ligações de hidrogênio (p. ex., formação de ligações de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen revertido) entre bases complementares nos dois polinucleotídeos. A fita compreendendo uma região tendo uma sequência que é substancialmente complementar a uma sequência alvo (p. ex., mRNA alvo) é referida como a “fita antissenso”. A “fita senso” se refere à fita que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antissenso. Em algumas modalidades, a fita senso pode compreender uma região que tem uma sequência que é substancialmente idêntica à sequência alvo.
[0027] Uma molécula de RNA de fita dupla pode incluir modificações químicas em ribonucleotídeos, incluindo modificações no açúcar ribose, base ou componentes do esqueleto dos ribonucleotídeos, tais como aquelas descritas aqui ou conhecidas na técnica. Quaisquer tais modificações, como usadas em uma molécula de RNA de fita dupla (p. ex., siRNA, shRNA ou similares), são englobadas pelo termo “RNA de fita dupla” para os propósitos desta divulgação.
[0028] Como usado aqui, uma primeira sequência é “complementar” a uma segunda sequência se um polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência puder hibridar com um polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência para formar uma região de dúplex sob certas condições, tais como condições fisiológicas. Outras tais condições podem incluir condições de hibridação moderadas ou estringentes, que são conhecidas dos peritos na técnica. Uma primeira sequência é considerada totalmente complementar (100% complementar) a uma segunda sequência se um polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência formar pares de bases com um polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência ao longo do comprimento inteiro da uma das ou ambas as sequências de nucleotídeos sem quaisquer emparelhamentos defeituosos. Uma sequência é “substancialmente complementar” a uma sequência alvo se a sequência for pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% complementar a uma sequência alvo. A percentagem de complementaridade pode ser calculada por divisão do número de bases em uma primeira sequência que são complementares a bases em posições correspondentes em uma segunda sequência ou sequência alvo pelo comprimento total da primeira sequência. Se pode também dizer que uma sequência é substancialmente complementar a uma outra sequência se existirem não mais do que 5, 4, 3 ou 2 emparelhamentos defeituosos ao longo de uma região de dúplex de 30 pares de bases quando as duas sequências são hibridadas. Em geral, se estiverem presentes quaisquer saliências de nucleotídeos, como definido aqui, a sequência de tais saliências não é considerada na determinação do grau de complementaridade entre duas sequências. A título exemplificativo, uma fita senso de 21 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 21 nucleotídeos de comprimento que hibridam para formar uma região de dúplex com 19 pares de bases com uma saliência de 2 nucleotídeos na extremidade 3' de cada fita seria considerada como sendo totalmente complementar como o termo é usado aqui.
[0029] Em algumas modalidades, uma região da fita antissenso compreende uma sequência que é totalmente complementar a uma região da sequência do gene alvo (p. ex., mRNA alvo). Em tais modalidades, a fita senso pode compreender uma sequência que é totalmente complementar à sequência da fita antissenso. Em outras de tais modalidades, a fita senso pode compreender uma sequência que é substancialmente complementar à sequência da fita antissenso, p. ex., tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 emparelhamentos defeituosos na região de dúplex formada pelas fitas senso e antissenso. Em certas modalidades é preferencial que quaisquer emparelhamentos defeituosos ocorram dentro das regiões terminais (p. ex., dentro de 6, 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos das extremidades 5' e/ou 3' das fitas). Em uma modalidade, quaisquer emparelhamentos defeituosos na região de dúplex formada a partir das fitas senso e antissenso ocorrem dentro de 6, 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos da extremidade 5' da fita antissenso.
[0030] Em certas modalidades, a fita senso e a fita antissenso do RNA de fita dupla podem ser duas moléculas separadas que hibridam para formar uma região de dúplex mas não estão de outro modo conectadas. Tais moléculas de RNA de fita dupla formadas a partir de duas fitas separadas são referidas como “pequenos RNAs interferentes” ou “RNAs interferentes curtos” (siRNAs). Assim, em algumas modalidades, os construtos de RNAi da invenção compreendem um siRNA.
[0031] Em outras modalidades, a fita senso e a fita antissenso que hibridam para formar uma região de dúplex podem ser parte de uma única molécula de RNA, i.e., as fitas senso e antissenso são parte de uma região autocomplementar de uma molécula de RNA única. Em tais casos, uma molécula de RNA única compreende uma região de dúplex (também referida como uma região de haste) e uma região de alça. A extremidade 3' da fita senso é conectada à extremidade 5' da fita antissenso por uma sequência contígua de nucleotídeos não emparelhados, que formarão a região de alça. A região de alça tem tipicamente um comprimento suficiente para permitir que a molécula de RNA se dobre de novo sobre si própria tal que a fita antissenso possa formar pares de bases com a fita senso para formar a região de dúplex ou haste. A região de alça pode compreender de cerca de 3 a cerca de 25, de cerca de 5 a cerca de 15 ou de cerca de 8 a cerca de 12 nucleotídeos não emparelhados. Tais moléculas de RNA com regiões pelo menos parcialmente autocomplementares são referidas como “pequenos RNAs em grampo” (shRNAs). Em certas modalidades,
os construtos de RNAi da invenção compreendem um shRNA. O comprimento de uma molécula de RNA pelo menos parcialmente autocomplementar, única, pode ser de cerca de 40 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, de cerca de 45 nucleotídeos a cerca de 85 nucleotídeos ou de cerca de 50 a cerca de 60 nucleotídeos e compreende uma região de dúplex e região de alça tendo cada uma os comprimentos recitados aqui.
[0032] Os construtos de RNAi da invenção compreendem uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região tendo uma sequência que é substancialmente ou totalmente complementar a uma sequência do gene alvo. Uma sequência do gene alvo se refere geralmente a uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência codificante parcial ou completa para um polipeptídeo. A sequência do gene alvo pode também incluir uma região não codificante, tal como a região não traduzida (UTR) 5´ ou 3´. Em certas modalidades, a sequência do gene alvo é uma sequência de RNA mensageiro (mRNA). Uma sequência de mRNA se refere a qualquer sequência de RNA mensageiro, incluindo variantes de splice, codificando uma proteína, variantes de proteína ou isoformas de qualquer espécie (p. ex., camundongo, rato, primata não humano, humano). Em uma modalidade, a sequência do gene alvo é uma sequência de mRNA codificando uma proteína humana. Uma sequência do gene alvo pode ser também uma sequência de RNA sem ser uma sequência de mRNA, tal como uma sequência de tRNA, sequência de microRNA ou sequência de RNA viral.
[0033] Uma região da fita antissenso do construto de RNAi pode ser substancialmente complementar ou totalmente complementar a pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos de uma sequência do gene alvo. Em algumas modalidades, a região alvo da sequência do gene para a qual a fita antissenso compreende uma região de complementaridade pode variar de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos consecutivos, de cerca de 16 a cerca de 28 nucleotídeos consecutivos, de cerca de 18 a cerca de 26 nucleotídeos consecutivos, de cerca de 17 a cerca de 24 nucleotídeos consecutivos, de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos consecutivos, de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos consecutivos, de cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos consecutivos ou de cerca de 19 a cerca de 21 nucleotídeos consecutivos.
[0034] A fita senso do construto de RNAi compreende tipicamente uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso tal que as duas fitas hibridem sob condições fisiológicas para formar uma região de dúplex. Uma “região de dúplex” se refere às regiões em dois polinucleotídeos complementares ou substancialmente complementares que formam pares de bases entre si, por emparelhamento de bases de Watson-Crick ou outra interação por ligações de hidrogênio, para criar um dúplex entre os dois polinucleotídeos. A região de dúplex do construto de RNAi deve ter um comprimento suficiente para permitir que o construto de RNAi entre na via de interferência de RNA, p. ex., por recrutamento da enzima Dicer e/ou do complexo RISC. Por exemplo, em algumas modalidades, a região de dúplex tem cerca de 15 a cerca de 30 pares de bases de comprimento. Outros comprimentos para a região de dúplex dentro desta gama são também adequados, tais como cerca de 15 a cerca de 28 pares de bases, cerca de 15 a cerca de 26 pares de bases, cerca de 15 a cerca de 24 pares de bases, cerca de 15 a cerca de 22 pares de bases, cerca de 17 a cerca de 28 pares de bases, cerca de 17 a cerca de 26 pares de bases, cerca de 17 a cerca de 24 pares de bases, cerca de 17 a cerca de 23 pares de bases, cerca de 17 a cerca de 21 pares de bases, cerca de 19 a cerca de 25 pares de bases, cerca de 19 a cerca de 23 pares de bases ou cerca de 19 a cerca de 21 pares de bases. Em uma modalidade, a região de dúplex tem cerca de 17 a cerca de 24 pares de bases de comprimento. Em uma outra modalidade, a região de dúplex tem cerca de 19 a cerca de 21 pares de bases de comprimento. Em certas modalidades, a região de dúplex tem cerca de 19 pares de bases de comprimento. Em outras modalidades, a região de dúplex tem cerca de 21 pares de bases de comprimento.
[0035] Para modalidades nas quais a fita senso e a fita antissenso são duas moléculas separadas (p. ex., construto de RNAi compreende um siRNA), não é necessário que a fita senso e a fita antissenso tenham um comprimento igual ao comprimento da região de dúplex. Por exemplo, uma das ou ambas as fitas podem ser maiores do que a região de dúplex e ter um ou mais nucleotídeos não emparelhados ou emparelhamentos defeituosos flanqueando a região de dúplex. Assim, em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende pelo menos uma saliência de nucleotídeos. Como usado aqui, uma “saliência de nucleotídeos” se refere ao nucleotídeo ou nucleotídeos não emparelhados que se estendem para além da região de dúplex nas extremidades terminais das fitas. As saliências de nucleotídeos são tipicamente criadas quando a extremidade 3' de uma fita se estende para além da extremidade 5' da outra fita ou quando a extremidade 5' de uma fita se estende para além da extremidade 3' da outra fita. O comprimento de uma saliência de nucleotídeos é geralmente entre 1 e 6 nucleotídeos, 1 e 5 nucleotídeos, 1 e 4 nucleotídeos, 1 e 3 nucleotídeos, 2 e 6 nucleotídeos, 2 e 5 nucleotídeos ou 2 e 4 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a saliência de nucleotídeos compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos. Em uma modalidade particular, a saliência de nucleotídeos compreende 1 a 4 nucleotídeos. Em certas modalidades, a saliência de nucleotídeos compreende 2 nucleotídeos. Em certas outras modalidades, a saliência de nucleotídeos compreende um único nucleotídeo.
[0036] Os nucleotídeos na saliência podem ser ribonucleotídeos ou nucleotídeos modificados como descrito aqui. Em algumas modalidades, os nucleotídeos na saliência são nucleotídeos 2´-modificados (p. ex., nucleotídeos modificados por 2ʹ-flúor, nucleotídeos modificados por 2ʹ- O-metila), desoxirribonucleotídeos, nucleotídeos invertidos (p. ex., nucleotídeos abásicos invertidos, desoxirribonucleotídeos invertidos) ou suas combinações. Por exemplo, em uma modalidade, os nucleotídeos na saliência são desoxirribonucleotídeos, p. ex., desoxitimidina. Em uma outra modalidade, os nucleotídeos na saliência são nucleotídeos modificados por 2'-O-metila, nucleotídeos modificados por 2'-flúor, nucleotídeos modificados por 2'- metoxietila ou suas combinações. Em outras modalidades, a saliência compreende um dinucleotídeo de 5´-uridina-uridina- 3' (5'-UU-3'). Em tais modalidades, o dinucleotídeo UU pode compreender ribonucleotídeos ou nucleotídeos modificados, p. ex., nucleotídeos 2'-modificados. Em outras modalidades, a saliência compreende um dinucleotídeo de 5´-desoxitimidina- desoxitimidina-3' (5'-UU-3'). Quando uma saliência de nucleotídeos está presente na fita antissenso, os nucleotídeos na saliência podem ser complementares à sequência do gene alvo, formar um emparelhamento defeituoso com a sequência do gene alvo ou compreender alguma outra sequência (p. ex., sequência de polipirimidina ou polipurina, tal como UU, TT, AA, GG, etc.).
[0037] A saliência de nucleotídeos pode estar na extremidade 5' ou extremidade 3' de uma das ou ambas as fitas. Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos na extremidade 5' e na extremidade 3' da fita antissenso. Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos na extremidade 5' e na extremidade 3' da fita senso. Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos na extremidade 5' da fita senso e na extremidade 5' da fita antissenso. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e na extremidade 3' da fita antissenso.
[0038] Os construtos de RNAi podem compreender uma saliência de nucleotídeos em uma extremidade da molécula de RNA de fita dupla e uma extremidade cega na outra. Uma “extremidade cega” significa que a fita senso e a fita antissenso têm emparelhamento de bases total na extremidade da molécula e não existem nenhuns nucleotídeos não emparelhados que se estendam para além da região de dúplex. Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita senso e extremidade 3' da fita antissenso. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso e na extremidade 3' da fita senso. Em certas modalidades, o construto de RNAi compreende uma extremidade cega em ambas as extremidades da molécula de RNA de fita dupla. Em tais modalidades, a fita senso e a fita antissenso têm o mesmo comprimento e a região de dúplex tem o mesmo comprimento das fitas senso e antissenso (i.e., a molécula tem fita dupla ao longo do seu comprimento inteiro).
[0039] A fita senso e a fita antissenso nos construtos de RNAi da invenção podem, cada uma independentemente, ter cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, cerca de 18 a cerca de 28 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento, cerca de 19 a cerca de 21 nucleotídeos de comprimento, cerca de 21 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, a fita senso e a fita antissenso têm, cada uma independentemente, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24 ou cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a fita senso e a fita antissenso têm o mesmo comprimento mas formam uma região de dúplex que é mais curta do que as fitas tal que o construto de RNAi tenha duas saliências de nucleotídeos. Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita senso e uma fita antissenso que têm cada uma 21 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma região de hélice dupla que tem 19 pares de bases de comprimento e (iii) saliências de nucleotídeos de 2 nucleotídeos não emparelhados tanto na extremidade 3' da fita senso como na extremidade 3' da fita antissenso. Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita senso e uma fita antissenso que têm cada uma 23 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma região de dúplex que tem 21 pares de bases de comprimento e (iii) saliências de nucleotídeos de 2 nucleotídeos não emparelhados tanto na extremidade 3' da fita senso como na extremidade 3' da fita antissenso. Em outras modalidades, a fita senso e a fita antissenso têm o mesmo comprimento e formam uma região de dúplex ao longo do seu comprimento inteiro tal que não existam nenhumas saliências de nucleotídeos em qualquer uma das extremidades da molécula de fita dupla. Em uma tal modalidade, o construto de RNAi tem extremidades cegas e compreende (i) uma fita senso e uma fita antissenso, cada uma das quais tem 21 nucleotídeos de comprimento, e (ii) uma região de dúplex que tem 21 pares de bases de comprimento. Em outra tal modalidade, o construto de RNAi tem extremidades cegas e compreende (i) uma fita senso e uma fita antissenso, cada uma das quais tem 23 nucleotídeos de comprimento, e (ii) uma região de dúplex que tem 23 pares de bases de comprimento.
[0040] Em outras modalidades, a fita senso ou a fita antissenso é maior do que a outra fita e as duas fitas formam uma região de dúplex tendo um comprimento igual àquele da fita mais curta tal que o construto de RNAi compreenda pelo menos uma saliência de nucleotídeos. Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita senso que tem 19 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma fita antissenso que tem 21 nucleotídeos de comprimento, (iii) uma região de dúplex de 19 pares de bases de comprimento e (iv) uma saliência de nucleotídeos de 2 nucleotídeos não emparelhados na extremidade 3' da fita antissenso. Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende (i) uma fita senso que tem 21 nucleotídeos de comprimento, (ii) uma fita antissenso que tem 23 nucleotídeos de comprimento, (iii) uma região de dúplex de 21 pares de bases de comprimento e (iv) uma saliência de nucleotídeos de 2 nucleotídeos não emparelhados na extremidade 3' da fita antissenso.
[0041] Os construtos de RNAi da invenção compreendem preferencialmente nucleotídeos modificados. Um “nucleotídeo modificado” se refere a um nucleotídeo que tem uma ou mais modificações químicas no nucleosídeo, nucleobase, anel de pentose ou grupo fosfato. Como usado aqui, os nucleotídeos modificados não englobam ribonucleotídeos contendo monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina e monofosfato de citidina. No entanto, os construtos de RNAi podem compreender combinações de nucleotídeos modificados e ribonucleotídeos. A incorporação de nucleotídeos modificados em uma das ou ambas as fitas de moléculas de RNA de fita dupla pode melhorar a estabilidade in vivo das moléculas de RNA, p. ex., por redução da suscetibilidade das moléculas a nucleases e outros processos de degradação. A potência dos construtos de RNAi para reduzir a expressão do gene alvo pode ser também intensificada por incorporação de nucleotídeos modificados, particularmente quando incorporados em padrões específicos como descrito em mais detalhe aqui.
[0042] Em certas modalidades, os nucleotídeos modificados têm uma modificação do açúcar ribose. Estas modificações de açúcar podem incluir modificações na posição 2' e/ou 5' do anel de pentose bem como modificações de açúcar bicíclico. Um nucleotídeo 2'-modificado se refere a um nucleotídeo tendo um anel de pentose com um substituinte na posição 2' sem ser OH. Tais modificações 2´ incluem, mas não estão limitadas a, 2ʹ-H (p. ex., desoxirribonucleotídeos), 2ʹ-O-alquila (p. ex., alquila substituída O-C1-C10 ou O-C1-C10), 2ʹ-O-alila (O- CH2CH=CH2), 2ʹ-C-alila, 2'-desoxi-2'-flúor (também referida como 2'-F ou 2ʹ-flúor), 2ʹ-O-metila (OCH3), 2ʹ-O-metoxietila (O-(CH2)2OCH3), 2ʹ-OCF3, 2ʹ-O(CH2)2SCH3, 2ʹ-O-aminoalquila, 2ʹ-amino (p. ex., NH2), 2ʹ-O-etilamina e 2ʹ-azido. As modificações na posição 5' do anel de pentose incluem, mas não estão limitadas a, 5'-metila (R ou S); 5'-vinila e 5'- metóxi.
[0043] Uma "modificação de açúcar bicíclico” se refere a uma modificação do anel de pentose onde uma ponte conecta dois átomos do anel para formar um segundo anel resultando em uma estrutura de açúcar bicíclico. Em algumas modalidades, a modificação de açúcar bicíclico compreende uma ponte entre os carbonos 4' e 2' do anel de pentose. Os nucleotídeos compreendendo uma fração de açúcar com uma modificação de açúcar bicíclico são referidos aqui como ácidos nucleicos bicíclicos ou BNAs. Modificações de açúcar bicíclico exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, Ácido nucleico bicíclico (BNA) de α-L-metileno-óxi (4ʹ-CH2—O-2ʹ); BNA de β-D-metileno-óxi (4ʹ-CH2—O-2ʹ) (também referido como um ácido nucleico bloqueado ou LNA); BNA de etileno-óxi (4ʹ- (CH2)2—O-2ʹ); BNA de amino-óxi (4ʹ-CH2—O—N(R)-2ʹ); BNA de oxiamino (4ʹ-CH2—N(R)—O-2ʹ); BNA de metil(metileno-óxi) (4ʹ- CH(CH3)—O-2ʹ) (também referido como etila restrita ou cEt); BNA de metileno-tio (4ʹ-CH2—S-2ʹ); BNA de metileno-amino (4ʹ- CH2-N(R)-2ʹ); BNA carbocíclico de metila (4ʹ-CH2—CH(CH3)-2ʹ); BNA carbocíclico de propileno (4ʹ-(CH2)3-2ʹ); e BNA de metoxi(etileno-óxi) (4ʹ-CH(CH2OMe)-O-2ʹ) (também referido como MOE restrito ou cMOE). Estes e outros nucleotídeos com açúcar modificado que podem ser incorporados nos construtos de RNAi da invenção são descritos na Patente dos EUA N.º 9,181,551, Publicação de Patente dos EUA N.º 2016/0122761 e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19: 937-954, 2012, todos os quais são deste modo incorporados por referência em suas totalidades.
[0044] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos modificados por 2'- flúor, nucleotídeos modificados por 2'-O-metila, nucleotídeos modificados por 2'-O-metoxietila, nucleotídeos modificados por 2´-O-alquila, nucleotídeos modificados por 2'-O-alila, ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), desoxirribonucleotídeos ou suas combinações. Em certas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos modificados por 2'-flúor, nucleotídeos modificados por 2'-O-metila, nucleotídeos modificados por 2'-O-metoxietila ou suas combinações. Em certas modalidades, os construtos de RNAi compreendem um ou mais nucleotídeos modificados por 2'-flúor, nucleotídeos modificados por 2'- O-metila ou suas combinações.
[0045] Ambas as fitas senso e antissenso dos construtos de RNAi podem compreender um ou múltiplos nucleotídeos modificados. Por exemplo, em algumas modalidades, a fita senso compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos modificados. Em certas modalidades, todos os nucleotídeos na fita senso são nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, a fita antissenso compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos modificados. Em outras modalidades, todos os nucleotídeos na fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em certas outras modalidades, todos os nucleotídeos na fita senso e todos os nucleotídeos na fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em estas e outras modalidades, os nucleotídeos modificados podem ser nucleotídeos modificados por 2'-flúor, nucleotídeos modificados por 2'-O-metila ou suas combinações.
[0046] Em certas modalidades, os nucleotídeos modificados incorporados em uma das ou ambas as fitas dos construtos de RNAi da invenção têm uma modificação da nucleobase (também referida aqui como “base”). Uma “nucleobase modificada” ou “base modificada” se refere a uma base sem ser as bases de purina de ocorrência natural adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina de ocorrência natural timina (T), citosina (C) e uracila (U). As nucleobases modificadas podem ter modificações sintéticas ou de ocorrência natural e incluem, mas não estão limitadas a, bases universais, 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina (X), hipoxantina (I), 2-aminoadenina, 6-metiladenina, 6- metilguanina e outros derivados de alquila de adenina e guanina, derivados de 2-propila e outros de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2- tiocitosina, 5-halo-uracila e citosina, 5-propinil-uracila e citosina, 6-azo-uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-
tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8- substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5- trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5- substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3- desazaguanina e 3-desaza-adenina.
[0047] Em algumas modalidades, a base modificada é uma base universal. Uma “base universal” se refere a um análogo de base que forma indiscriminadamente pares de bases com todas as bases naturais em RNA e DNA sem alterar a estrutura helicoidal dupla da região de dúplex resultante. As bases universais são conhecidas dos peritos na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, inosina, C-fenila, C-naftila e outros derivados aromáticos, carboxamidas de azol e derivados de nitroazol, tais como 3-nitropirrol, 4- nitroindol, 5-nitroindol e 6-nitroindol.
[0048] Outras bases modificadas adequadas que podem ser incorporadas nos construtos de RNAi da invenção incluem aquelas descritas em Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., Vol. 10: 297–310, 2000 e Peacock et al., J. Org. Chem., Vol. 76: 7295-7300, 2011, ambos os quais são deste modo incorporados por referência em suas totalidades. O perito está bem ciente de que guanina, citosina, adenina, timina e uracila podem ser substituídas por outras nucleobases, tais como as nucleobases modificadas descritas acima, sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um polinucleotídeo compreendendo um nucleotídeo transportando tal nucleobase de substituição.
[0049] Em algumas modalidades, as fitas senso e antissenso dos construtos de RNAi podem compreender um ou mais nucleotídeos abásicos. Um “nucleotídeo abásico” ou “nucleosídeo abásico” é um nucleotídeo ou nucleosídeo que carece de uma nucleobase na posição 1ʹ do açúcar ribose. Em certas modalidades, os nucleotídeos abásicos são incorporados nas extremidades terminais das fitas senso e/ou antissenso dos construtos de RNAi. Em uma modalidade, a fita senso compreende um nucleotídeo abásico como o nucleotídeo terminal em sua extremidade 3´, sua extremidade 5' ou ambas as suas extremidades 3’ e 5´. Em uma outra modalidade, a fita antissenso compreende um nucleotídeo abásico como o nucleotídeo terminal em sua extremidade 3´, sua extremidade 5' ou ambas as suas extremidades 3’ e 5´. Em tais modalidades nas quais o nucleotídeo abásico é um nucleotídeo terminal pode ser um nucleotídeo invertido - isto é, ligado ao nucleotídeo adjacente através de uma ligação internucleotídica 3ʹ-3ʹ (quando na extremidade 3ʹ de uma fita) ou através de uma ligação internucleotídica 5´-5‘ (quando na extremidade 5' de uma fita) em vez da ligação internucleotídica 3'-5´ natural. Os nucleotídeos abásicos podem também compreender uma modificação de açúcar, tal como qualquer uma das modificações de açúcar descritas acima. Em certas modalidades, os nucleotídeos abásicos compreendem uma modificação 2ʹ, tal como uma modificação de 2ʹ-flúor, modificação de 2ʹ-O-metila ou uma modificação de 2ʹ-H (desóxi). Em uma modalidade, o nucleotídeo abásico compreende uma modificação de 2'-O-metila. Em uma outra modalidade, o nucleotídeo abásico compreende uma modificação de 2'-H (i.e., um nucleotídeo abásico de desóxi).
[0050] Os inventores descobriram que a incorporação de nucleotídeos modificados em construtos de RNAi de acordo com certos padrões resulta em construtos de RNAi com atividade de silenciamento de genes melhorada in vivo. Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi da invenção compreende uma fita senso e uma fita antissenso que compreendem sequências que são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de pelo menos 15 pares de bases, em que: • os nucleotídeos nas posições 2, 7 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor; • os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor; e • nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2'-flúor no total.
[0051] Em outras modalidades, o construto de RNAi da invenção compreende uma fita senso e uma fita antissenso que compreendem sequências que são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de pelo menos 19 pares de bases, em que: • os nucleotídeos nas posições 2, 7 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2′-flúor, os nucleotídeos nas posições 4, 6, 10 e 12 (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos opcionalmente modificados por 2'-flúor e todos os outros nucleotídeos na fita antissenso são nucleotídeos modificados sem ser nucleotídeos modificados por 2'-flúor; e
• os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2′-flúor, os nucleotídeos na fita senso em posições emparelhadas com as posições 3 e 5 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos opcionalmente modificados por 2'-flúor e todos os outros nucleotídeos na fita senso são nucleotídeos modificados sem ser nucleotídeos modificados por 2'-flúor.
[0052] Em tais modalidades, os nucleotídeos modificados sem ser nucleotídeos modificados por 2′-flúor podem ser selecionados de nucleotídeos modificados por 2ʹ-O-metila, nucleotídeos modificados por 2ʹ-O-metoxietila, nucleotídeos modificados por 2ʹ-O-alquila, nucleotídeos modificados por 2ʹ-O-alila, BNAs e desoxirribonucleotídeos. Em estas e outras modalidades, o nucleotídeo terminal na extremidade 3', na extremidade 5' ou tanto na extremidade 3´ como na extremidade 5' da fita senso pode ser um nucleotídeo abásico ou um desoxirribonucleotídeo. Em tais modalidades, o nucleotídeo abásico ou desoxirribonucleotídeo pode ser invertido - i.e., ligado ao nucleotídeo adjacente através de uma ligação internucleotídica 3ʹ-3ʹ (quando na extremidade 3ʹ de uma fita) ou através de uma ligação internucleotídica 5´-5‘ (quando na extremidade 5' de uma fita) em vez da ligação internucleotídica 3'-5´ natural.
[0053] Em qualquer uma das modalidades descritas acima, os nucleotídeos nas posições 2, 7, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor. Em outras modalidades, os nucleotídeos nas posições 2, 4, 7, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor. Ainda em outras modalidades, os nucleotídeos nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor. Ainda em outras modalidades, os nucleotídeos nas posições 2, 4, 6, 7, 10, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor. Em modalidades alternativas, os nucleotídeos nas posições 2, 7, 10, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor. Em certas outras modalidades, os nucleotídeos nas posições 2, 4, 7, 10, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'- flúor.
[0054] Em qualquer uma das modalidades descritas acima, os nucleotídeos na fita senso em posições emparelhadas com as posições 3, 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'- flúor. Em algumas modalidades, os nucleotídeos na fita senso em posições emparelhadas com as posições 5, 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor. Em outras modalidades, os nucleotídeos na fita senso em posições emparelhadas com as posições 3, 5, 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5') são nucleotídeos modificados por 2'-flúor.
[0055] Em certas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar a uma sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A):
5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL- 5′
(A) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- flúor, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um ácido nucleico bicíclico (BNA) e um desoxirribonucleotídeo; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo;
NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; x é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso; y é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso; e z é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares a nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
[0056] Em algumas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A) existe uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso - i.e., y é 1, 2, 3 ou 4. Em uma tal modalidade, y é 2. Em modalidades nas quais existe uma saliência de 2 nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso (i.e., y é 2), x é 0 e z é 2 ou x é 1 e z é 2. Em outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), o construto de RNAi compreende uma extremidade cega na extremidade 3´ da fita senso e na extremidade 5´ da fita antissenso (i.e., y é 0). Em tais modalidades onde não existe saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso (i.e., y é 0): (i) x é 2 e z é 4, (ii) x é 3 e z é 4, (iii) x é 0 e z é 2, (iv) x é 1 e z é 2 ou (v) x é 2 e z é 2. Em qualquer uma das modalidades nas quais x é maior que 0, o nucleotídeo NA que é o nucleotídeo terminal na extremidade 5´ da fita senso pode ser um nucleotídeo invertido, tal como um nucleotídeo abásico invertido ou um desoxirribonucleotídeo invertido.
[0057] Em certas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), o NM nas posições 4 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'- flúor. Em outras modalidades, o NM nas posições 4, 6 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Ainda em outras modalidades, o NM nas posições 4, 6, 10 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um,
um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Em modalidades alternativas nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), o NM nas posições 10 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Em modalidades relacionadas, o NM nas posições 4, 10 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Em outras modalidades alternativas nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), o NM nas posições 4, 6 e 10 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM na posição 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Em algumas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2'-O- metila. Em outras modalidades, cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Ainda em outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), cada NM, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
[0058] Em qualquer uma das modalidades descritas acima nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A), cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, pode ser um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Em estas modalidades e qualquer uma das modalidades descritas acima, NT na Fórmula (A) pode ser um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
[0059] Em certas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar a uma sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (B): 5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NF NL NF NL NF NL- 5′ (B) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; x é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso; y é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso; e z é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares a nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
[0060] Em algumas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (B) existe uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso - i.e., y é 1, 2, 3 ou 4. Em uma tal modalidade, y é 2. Em modalidades nas quais existe uma saliência de 2 nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso (i.e., y é 2), x é 0 e z é 2 ou x é 1 e z é 2. Em outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (B), o construto de RNAi compreende uma extremidade cega na extremidade 3´ da fita senso e na extremidade 5´ da fita antissenso (i.e., y é 0). Em tais modalidades onde não existe saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso (i.e., y é 0): (i) x é 2 e z é 4, (ii) x é 3 e z é 4, (iii) x é 0 e z é 2, (iv) x é 1 e z é 2 ou (v) x é 2 e z é 2. Em qualquer uma das modalidades nas quais x é maior que 0, o nucleotídeo NA que é o nucleotídeo terminal na extremidade 5´ da fita senso pode ser um nucleotídeo invertido, tal como um nucleotídeo abásico invertido ou um desoxirribonucleotídeo invertido.
[0061] Em qualquer uma das modalidades descritas acima nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (B), cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, pode ser um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Em tais modalidades e qualquer uma das modalidades descritas acima, NT na Fórmula (B) pode ser um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
[0062] Em algumas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar a uma sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (C):
5′-(Ab)x NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT- 3′ 3′-NL NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NL NL NM NL NF NL- 5′
(C) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- flúor, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; e x é 0 ou 1 e Ab é um nucleotídeo abásico invertido.
[0063] Em certas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (C), o NM na fita antissenso é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Em estas e outras modalidades, cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Em modalidades alternativas, cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor. Em algumas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (C), cada NM, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
[0064] Em qualquer uma das modalidades descritas acima nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (C), cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, pode ser um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Em estas modalidades e qualquer uma das modalidades descritas acima, NT na Fórmula (C) pode ser um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Por exemplo, em uma modalidade, NT é um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido e x é 0. Em uma outra modalidade, NT é um nucleotídeo modificado por 2'- O-metila e x é 1. Ainda em uma outra modalidade, NT é um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido e x é 1.
[0065] Em certas modalidades, o construto de RNAi da invenção compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar a uma sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D):
5′-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL- 5′
(D) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- flúor, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um ácido nucleico bicíclico (BNA) e um desoxirribonucleotídeo; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; x é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso; y é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso; e z é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares a nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
[0066] Em algumas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D) existe uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso - i.e., y é 1, 2, 3 ou 4. Em uma tal modalidade, y é 2. Em modalidades nas quais existe uma saliência de 2 nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso (i.e., y é 2), x é 0 e z é 2 ou x é 1 e z é 2. Em outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D), o construto de RNAi compreende uma extremidade cega na extremidade 3´ da fita senso e na extremidade 5´ da fita antissenso (i.e., y é 0). Em tais modalidades onde não existe saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita senso (i.e., y é 0): (i) x é 2 e z é 4, (ii) x é 3 e z é 4, (iii) x é 0 e z é 2, (iv) x é 1 e z é 2 ou (v) x é 2 e z é 2. Em qualquer uma das modalidades nas quais x é maior que 0, o nucleotídeo NA que é o nucleotídeo terminal na extremidade 5´ da fita senso pode ser um nucleotídeo invertido, tal como um nucleotídeo abásico invertido ou um desoxirribonucleotídeo invertido.
[0067] Em certas modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D), o NM nas posições 4, 6, 8, 9 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor, e o NM nas posições 7 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Em outras modalidades, o NM nas posições 4 e 6 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor, e o NM nas posições 7 a 9 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
Ainda em outras modalidades, o NM nas posições 4, 6, 8, 9 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM nas posições 7 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'- flúor.
Em modalidades alternativas nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D), o NM nas posições 4, 6, 8, 9 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM nas posições 7 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
Em certas outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D), o NM nas posições 7, 8, 9 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'- O-metila, e o NM nas posições 4, 6 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
Em estas e outras modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D), o NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
Em modalidades alternativas, o NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
[0068] Em qualquer uma das modalidades descritas acima nas quais o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D), cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, pode ser um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila. Em estas modalidades e qualquer uma das modalidades descritas acima, NT na Fórmula (D) pode ser um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila.
[0069] Os construtos de RNAi da invenção podem também compreender uma ou mais ligações internucleotídicas modificadas. Como usado aqui, o termo “ligação internucleotídica modificada” se refere a uma ligação internucleotídica sem ser a ligação de fosfodiéster 3’ para 5´ natural. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica contendo fósforo, tal como um fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, um alquilfosfonato (p. ex., metilfosfonato, 3'-alquilenofosfonato), um fosfinato, um fosforamidato (p. ex., 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidato), um fosforotioato (P=S), um fosforotioato quiral, um fosforoditioato, um tionofosforamidato, um tionoalquilfosfonato, um tionoalquilfosfotriéster e um boranofosfato. Em uma modalidade, uma ligação internucleotídica modificada é uma ligação de fosfodiéster 2’ para 5´. Em outras modalidades, a ligação internucleotídica modificada é uma ligação internucleotídica não contendo fósforo e assim pode ser referida como uma ligação internucleosídica modificada. Tais ligações não contendo fósforo incluem, mas não estão limitadas a, ligações de morfolino (formadas em parte a partir da porção de açúcar de um nucleosídeo); ligações de siloxano (—O—Si(H)2—O—); ligações de sulfeto, sulfóxido e sulfona; ligações de formacetila e tioformacetila; esqueletos contendo alqueno; esqueletos de sulfamato; ligações de metilenometilimino (—CH2—N(CH3)—O—CH2—) e metileno-hidrazino; ligações de sulfonato e sulfonamida; ligações de amida; e outras tendo partes de componentes N, O, S e CH2 mistas. Em uma modalidade, a ligação internucleosídica modificada é uma ligação à base de peptídeos (p. ex., aminoetilglicina) para criar um ácido nucleico de peptídeo ou PNA, tal como aquelas descritas nas Patentes dos E.U.A. N.os 5,539,082; 5,714,331; e 5,719,262. Outras ligações internucleotídeos e internucleosídeos modificadas adequadas que podem ser empregues nos construtos de RNAi da invenção são descritas na Patente dos E.U.A. N.º 6,693,187, Patente dos E.U.A. N.º 9,181,551, Publicação de Patente dos E.U.A. N.º 2016/0122761 e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19: 937-954, 2012, todos os quais são deste modo incorporados por referência em suas totalidades.
[0070] Em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato. As ligações internucleotídicas de fosforotioato podem estar presentes na fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas dos construtos de RNAi. Por exemplo, em algumas modalidades, a fita senso compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato. Em outras modalidades, a fita antissenso compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato. Ainda em outras modalidades, ambas as fitas compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato. Os construtos de RNAi podem compreender uma ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato na extremidade 3', na extremidade 5' ou em ambas as extremidades 3' e 5' da fita senso, da fita antissenso ou de ambas as fitas. Por exemplo, em certas modalidades, o construto de RNAi compreende cerca de 1 a cerca de 6 ou mais (p. ex., cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais) ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas na extremidade 3' da fita senso, da fita antissenso ou de ambas as fitas. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende cerca de 1 a cerca de 6 ou mais (p. ex., cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais) ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas na extremidade 5' da fita senso, da fita antissenso ou de ambas as fitas.
[0071] Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma única ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3’ da fita senso. Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3’ da fita senso. Em uma modalidade, o construto de RNAi compreende uma única ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3' da fita senso e uma única ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3' da fita antissenso. Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3' da fita antissenso (i.e., uma ligação internucleotídica de fosforotioato na primeira e segunda ligações internucleotídicas na extremidade 3' da fita antissenso). Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidade 3’ e 5´ da fita antissenso.
Ainda em outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 3' e 5' da fita antissenso e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas na extremidade 5' da fita senso.
Ainda em outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 3' e 5' da fita antissenso e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3' da fita senso.
Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 3' e 5' da fita antissenso e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 3' e 5' da fita senso (i.e., uma ligação internucleotídica de fosforotioato na primeira e segunda ligações internucleotídicas em ambas as extremidades 5' e 3' da fita antissenso e uma ligação internucleotídica de fosforotioato na primeira e segunda ligações internucleotídicas em ambas as extremidades 5' e 3' da fita senso). Ainda em outra modalidade, o construto de
RNAi compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 3' e 5' da fita antissenso e uma única ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3' da fita senso. Em quaisquer das modalidades nas quais uma das ou ambas as fitas compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato, as ligações internucleotídicas restantes dentro das fitas podem ser as ligações de fosfodiéster 3’ para 5´ naturais. Por exemplo, em algumas modalidades, cada ligação internucleotídica das fitas senso e antissenso é selecionada de fosfodiéster e fosforotioato, em que pelo menos uma ligação internucleotídica é um fosforotioato.
[0072] Em modalidades nas quais o construto de RNAi compreende uma saliência de nucleotídeos, dois ou mais dos nucleotídeos não emparelhados da saliência podem ser conectados por uma ligação internucleotídica de fosforotioato. Em certas modalidades, todos os nucleotídeos não emparelhados em uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e/ou da fita senso são conectados por ligações internucleotídicas de fosforotioato. Em outras modalidades, todos os nucleotídeos não emparelhados em uma saliência de nucleotídeos na extremidade 5' da fita antissenso e/ou da fita senso são conectados por ligações internucleotídicas de fosforotioato. Ainda em outras modalidades, todos os nucleotídeos não emparelhados em qualquer saliência de nucleotídeos são conectados por ligações internucleotídicas de fosforotioato.
[0073] Os construtos de RNAi da invenção podem ter qualquer um dos padrões de modificação química P1 até P30 ilustrados na Figura 1. Por exemplo, em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-23 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 19-23 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que: os nucleotídeos nas posições 2, 7 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total; e o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos nas extremidades 3´ da fita senso e da fita antissenso.
[0074] Em uma modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo:
(i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e na extremidade 3' da fita antissenso.
[0075] Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 1; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 8 e 10 a 13; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 7, 9 e 14 a 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 e entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 (contando a partir da extremidade 5');
e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1 a 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso.
[0076] Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições
19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 10, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8, 9, 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e na extremidade 3' da fita antissenso.
[0077] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições
19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 10, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8, 9, 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e na extremidade 3' da fita antissenso.
[0078] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e
(iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e na extremidade 3' da fita antissenso.
[0079] Em certas modalidades, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-21 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 21-23 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que: os nucleotídeos nas posições 2, 7 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 8 a 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total; e o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3´ da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso/extremidade 3’ da fita senso.
[0080] Em uma modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e
(iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0081] Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 1; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 10 e 12 a 15; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 9, 11 e 16 a 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 e entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1-2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0082] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14 e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos;
(ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0083] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido nas posições 1 e 22; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 10 e 12 a 15; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 9, 11 e 16 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 21 e 22; e
(b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1-2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0084] Em uma modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 19 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12 e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 19 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 17 e 18 e entre nucleotídeos nas posições 18 e 19 (contando a partir da extremidade 5'); e
(b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0085] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 19 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 18, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 19 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições
17 e 18 e entre nucleotídeos nas posições 18 e 19 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0086] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0087] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição
1; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 10 e 12 a 15; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 9, 11 e 16 a 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 e entre nucleotídeos nas posições 21 e 22; e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1-2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0088] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo:
(i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 6, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0089] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9, 11 a 14, 17 e 19; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10, 15, 16, 18 e 20; e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 6, 8 a 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5');
em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0090] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 19 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 18, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 19 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 18 e 19 e opcionalmente entre nucleotídeos nas posições 17 e 18 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3,
entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0091] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 7, 10, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 8, 9, 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e
(iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0092] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 10, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8, 9, 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0093] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9, 11 a 14, 17 e 19; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10, 15, 16, 18 e 20; e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo:
(i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 10, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8, 9, 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0094] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 7, 10, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 6, 8, 9 11, 13 e 15 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0095] Em algumas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-23 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 19-23 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que: os nucleotídeos nas posições 2, 14 e 16 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 10 a 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; e nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total. Em tais modalidades, o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso/extremidade 3' da fita senso. Em modalidades alternativas, o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos em ambas as extremidades 3´ da fita senso e da fita antissenso.
[0096] Em uma modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 8, 9, 14 e 16, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 7, 10 a 13, 15 e 17 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0097] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos;
(ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 14 e 16, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 13, 15 e 17 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0098] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 e 9 a 12; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6, 8 e 13 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e
(b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 23 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 14 e 16, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 7 a 13, 15 e 17 a 23 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 e entre nucleotídeos nas posições 22 e 23 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0099] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 19 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 5 e 7 a 10; nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 4, 6 e 11 a 18, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 19 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 18 e 19 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 4, 6, 8, 9, 14 e 16, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3, 5, 7, 10 a 13, 15 e 17 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0100] Em uma outra modalidade particular, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 20 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 1; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 8 a 11; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 7 e 12 a 20 (contando a partir da extremidade 5'); e
(iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 18 e 19 e entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 14 e 16, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 13, 15 e 17 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1-2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso e uma extremidade cega na extremidade 5' da fita antissenso.
[0101] Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 1; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 8 a 11; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 7 e 12 a 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 e entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 14 e 16, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 13, 15 e 17 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1 a 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso.
[0102] Em certas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-23 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 19-23 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que:
os nucleotídeos nas posições 2, 7, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 10 a 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total; e o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos nas extremidades 3´ da fita senso e da fita antissenso.
[0103] Por exemplo, em uma modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 7 a 10; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 6 e 11 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e
(iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso.
[0104] Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 1; nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 8 a 11; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 2 a 7 e 12 a 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 e entre nucleotídeos nas posições 21 e 22 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1,
3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem uma saliência de nucleotídeos compreendendo 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso e uma saliência de nucleotídeos compreendendo 1 a 2 nucleotídeos na extremidade 3' da fita antissenso.
[0105] Em certas modalidades da invenção, o construto de RNAi compreende uma fita senso de 19-21 nucleotídeos de comprimento e uma fita antissenso de 19-21 nucleotídeos de comprimento, em que as sequências da fita antissenso e da fita senso são suficientemente complementares entre si para formar uma região de dúplex de 19-21 pares de bases, em que: os nucleotídeos nas posições 2, 7, 12 e 14 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; os nucleotídeos na fita senso nas posições emparelhadas com as posições 10, 11 e 13 na fita antissenso (contando a partir da extremidade 5´) são nucleotídeos modificados por 2´-flúor; e nem a fita senso nem a fita antissenso têm cada uma mais do que 7 nucleotídeos modificados por 2´-flúor no total. Em uma tal modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos;
(ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 e 11 a 14; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8, 10 e 15 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem duas extremidades cegas.
[0106] Em uma outra tal modalidade, o construto de RNAi compreende: (a) uma fita senso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos;
(ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 9 a 12; e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1 a 8 e 13 a 20, e um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido na posição 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) uma ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (b) uma fita antissenso tendo: (i) um comprimento de 21 nucleotídeos; (ii) nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 2, 7, 12 e 14, e nucleotídeos modificados por 2'-O-metila nas posições 1, 3 a 6, 8 a 11, 13 e 15 a 21 (contando a partir da extremidade 5'); e (iii) ligações internucleotídicas de fosforotioato entre nucleotídeos nas posições 1 e 2, entre nucleotídeos nas posições 2 e 3, entre nucleotídeos nas posições 19 e 20 e entre nucleotídeos nas posições 20 e 21 (contando a partir da extremidade 5'); em que o construto de RNAi tem duas extremidades cegas.
[0107] Em algumas modalidades da invenção, a extremidade 5' da fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas antissenso e senso dos construtos de RNAi compreende uma fração de fosfato. Como usado aqui, o termo “fração de fosfato” se refere a um grupo fosfato terminal que inclui fosfatos não modificados (—O—P=O)(OH)OH) bem como fosfatos modificados. Os fosfatos modificados incluem fosfatos nos quais um ou mais dos grupos O e OH são substituído por H, O, S, N(R) ou alquila onde R é H, um grupo protetor de amino ou alquila não substituída ou substituída. Frações de fosfato exemplificativas incluem, mas estão limitadas a, 5'- monofosfato; 5'-difosfato; 5'-trifosfato; cobertura de 5'- guanosina (7-metilada ou não metilada); cobertura de 5'- adenosina ou qualquer outra estrutura de cobertura de nucleotídeos modificada ou não modificada; 5'-monotiofosfato (fosforotioato); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato); 5'- alfa-tiotrifosfato; 5'-gama-tiotrifosfato, 5'- fosforamidatos; 5'-vinilfosfatos; 5'-alquilfosfonatos (p. ex., alquila = metila, etila, isopropila, propila, etc.); e 5'-alquiléterfosfonatos (p. ex., alquiléter = metoximetila, etoximetila, etc.).
[0108] Os nucleotídeos modificados que podem ser incorporados nos construtos de RNAi da invenção podem ter mais do que uma modificação química descrita aqui. Por exemplo, o nucleotídeo modificado pode ter uma modificação no açúcar ribose bem como uma modificação na nucleobase. A título de exemplo, um nucleotídeo modificado pode compreender uma modificação em açúcar em 2' (p. ex., 2'-flúor ou 2'-metila) e compreender uma base modificada (p. ex., 5-metilcitosina ou pseudouracila). Em outras modalidades, o nucleotídeo modificado pode compreender uma modificação em açúcar em combinação com uma modificação no 5'-fosfato que criaria uma ligação internucleotídica ou internucleosídica modificada quando o nucleotídeo modificado tiver sido incorporado em um polinucleotídeo. Por exemplo, em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado pode compreender uma modificação em açúcar, tal como uma modificação de 2'-flúor, uma modificação de 2'-O-metila ou uma modificação de açúcar bicíclico, bem como um grupo 5'-fosforotioato. Conformemente, em algumas modalidades, uma das ou ambas as fitas dos construtos de RNAi da invenção compreendem uma combinação de nucleotídeos modificados em 2´ ou BNAs e ligações internucleotídicas de fosforotioato. Em certas modalidades, ambas as fitas senso e antissenso dos construtos de RNAi da invenção compreendem uma combinação de nucleotídeos modificados por 2'-flúor, nucleotídeos modificados por 2'-O-metila e ligações internucleotídicas de fosforotioato.
[0109] Em certas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 da fita antissenso contando a partir da extremidade 5’ nos construtos de RNAi pode compreender A, dA, dU, U ou dT. Em algumas modalidades, pelo menos um dos três primeiros pares de bases dentro da região de dúplex a partir da extremidade 5´ da fita antissenso é um par de bases AU. Em uma modalidade particular, o primeiro par de bases dentro da região de dúplex a partir da extremidade 5´ da fita antissenso é um par de bases AU.
[0110] Os construtos de RNAi da invenção podem ser prontamente preparados usando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, usando síntese de ácidos nucleicos em fase sólida convencional. Os polinucleotídeos dos construtos de RNAi podem ser montados em um sintetizador de ácidos nucleicos adequado utilizando precursores padrão de nucleotídeos ou nucleosídeos (p. ex., fosforamiditas). Sintetizadores de ácidos nucleicos automatizados são vendidos comercialmente por vários vendedores, incluindo sintetizadores de DNA/RNA da Applied Biosystems (Foster City, CA), sintetizadores MerMade da BioAutomation (Irving, TX) e sintetizadores OligoPilot da GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA). Um método exemplificativo para sintetizar os construtos de RNAi da invenção é descrito no Exemplo 1.
[0111] Um grupo protetor 2'-silila pode ser usado em conjunção com dimetoxitritila (DMT) lábil em ácidos na posição 5' de ribonucleosídeos para sintetizar oligonucleotídeos através de química de fosforamidita. É conhecido que as condições da desproteção final não degradam significativamente produtos de RNA. Todas as sínteses podem ser conduzidas em qualquer sintetizador automatizado ou manual em larga, média ou pequena escala. As sínteses podem ser também levadas a cabo em placas de múltiplos poços, colunas ou lâminas de vidro.
[0112] O grupo 2'-O-silila pode ser removido através de exposição a íons de fluoreto, que podem incluir qualquer fonte de íons de fluoreto, p. ex., aqueles sais contendo íon de fluoreto emparelhado com contraíons inorgânicos, p. ex., fluoreto de césio e fluoreto de potássio, ou aqueles sais contendo íon de fluoreto emparelhado com um contraíon orgânico, p. ex., um fluoreto de tetra-alquilamônio. Um catalisador éter coroa pode ser utilizado em combinação com o fluoreto inorgânico na reação de desproteção. Fontes preferenciais de íons de fluoreto são fluoreto de tetrabutilamônio ou amino-hidrofluoretos (p. ex., combinando HF aquoso com trietilamina em um solvente aprótico dipolar, p. ex., dimetilformamida).
[0113] A escolha de grupos protetores para uso nos triésteres de fosfita e fosfotriésteres pode alterar a estabilidade dos triésteres na direção do fluoreto. A proteção de metila do fosfotriéster ou triéster de fosfita pode estabilizar a ligação contra íons de fluoreto e melhorar rendimentos do processo.
[0114] Uma vez que os ribonucleosídeos têm um substituinte de 2'-hidroxila reativo pode ser desejável proteger a posição 2' reativa em RNA com um grupo protetor que é ortogonal a um grupo protetor 5'-O-dimetoxitritila, p. ex., um estável a tratamento com ácido. Os grupos protetores silila cumprem este critério e podem ser prontamente removidos em um passo final de desproteção de fluoreto que pode resultar em degradação mínima de RNA.
[0115] Catalisadores de tetrazol podem ser usados na reação de acoplamento de fosforamidita padrão. Catalisadores preferenciais incluem, p. ex., tetrazol, S-etil-tetrazol, benziltiotetrazol, p-nitrofeniltetrazol.
[0116] Como pode ser apreciado pelo especialista perito, métodos adicionais de síntese dos construtos de RNAi descritos aqui serão evidentes para os peritos na técnica. Adicionalmente, os vários passos de síntese podem ser realizados em uma sequência ou ordem alternativa para dar os compostos desejados. Outras transformações de química sintética, grupos protetores (p. ex., para hidroxila, amino, etc., presentes nas bases) e metodologias de grupos protetores (proteção e desproteção) úteis na síntese dos construtos de RNAi descritos aqui são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles tais como descritos em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH
Publishers (1989); T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2ª Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) e suas edições subsequentes. A síntese customizada de agentes de RNAi está também disponível a partir vários vendedores comerciais, incluindo Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO), AxoLabs GmbH (Kulmbach, Alemanha) e Ambion, Inc. (Foster City, CA).
[0117] Os construtos de RNAi da invenção podem compreender um ligante. Como usado aqui, um “ligante” se refere a qualquer composto ou molécula que é capaz de interagir com um outro composto ou molécula, diretamente ou indiretamente. A interação de um ligante com um outro composto ou molécula pode induzir uma resposta biológica (p. ex., iniciar uma cascata de transdução de sinal, induzir endocitose mediada por receptores) ou pode ser apenas uma associação física. O ligante pode modificar uma ou mais propriedades da molécula de RNA de fita dupla à qual é anexado, tais como as propriedades farmacodinâmicas, farmacocinéticas, de ligação, absorção, distribuição celular, captação celular, carga e/ou eliminação da molécula de RNA.
[0118] O ligante pode compreender uma proteína sérica (p. ex., albumina sérica humana, lipoproteína de baixa densidade, globulina), uma fração de colesterol, uma vitamina (biotina, vitamina E, vitamina B12), uma fração de folato, um esteroide, um ácido biliar (p. ex., ácido cólico), um ácido graxo (p. ex., ácido palmítico, ácido mirístico), um carboidrato (p. ex., uma dextrana, pululana, quitina,
quitosana, inulina, ciclodextrina ou ácido hialurônico), um glicosídeo, um fosfolipídeo, ou anticorpo ou seu fragmento de ligação (p. ex., anticorpo ou fragmento de ligação que visa o construto de RNAi para um tipo específico de células, tal como fígado). Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercalantes (p. ex., acridinas), reticulantes (p. ex., psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (p. ex., fenazina, di-hidrofenazina), endonucleases artificiais (p. ex., EDTA), moléculas lipofílicas, p. ex., ácido adamantanoacético, ácido 1- pirenobutírico, di-hidrotestosterona, 1,3-Bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geranilóxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3- (oleoil)colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina), peptídeos (p. ex., peptídeo de Antennapedia, peptídeo Tat, peptídeos RGD), agentes alquilantes, polímeros, tais como polietilenoglicol (PEG) (p. ex., PEG-40K), poliaminoácidos e poliaminas (p. ex., espermina, espermidina).
[0119] Em certas modalidades, os ligantes têm propriedades endossomolíticas. Os ligantes endossomolíticos promovem a lise do endossomo e/ou transporte do construto de RNAi da invenção, ou seus componentes, do endossomo para o citoplasma da célula. O ligante endossomolítico pode ser um peptídeo ou peptidomimético policatiônico, que mostra atividade e fusogenicidade de membrana dependentes do pH. Em uma modalidade, o ligante endossomolítico assume sua conformação ativa a pH endossomal. A conformação “ativa” é aquela conformação na qual o ligante endossomolítico promove a lise do endossomo e/ou transporte do construto de RNAi da invenção, ou seus componentes, do endossomo para o citoplasma da célula. Ligantes endossomolíticos exemplificativos incluem o peptídeo GALA (Subbarao et al., Biochemistry, Vol. 26: 2964-2972, 1987), o peptídeo EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 118: 1581-1586, 1996) e seus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1559: 56-68, 2002). Em uma modalidade, o componente endossomolítico pode conter um grupo químico (p. ex., um aminoácido) que sofrerá uma mudança na carga ou protonação em resposta a uma mudança no pH. O componente endossomolítico pode ser linear ou ramificado.
[0120] Em algumas modalidades, o ligante compreende um lipídeo ou outra molécula hidrofóbica. Em uma modalidade, o ligante compreende uma fração de colesterol ou outro esteroide. Foi relatado que os oligonucleotídeos conjugados a colesterol são mais ativos do que suas contrapartidas não conjugadas (Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development, Vol. 12: 103-228, 2002). Os ligantes compreendendo frações de colesterol e outros lipídeos para conjugação a moléculas de ácidos nucleicos foram também descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os 7,851,615; 7,745,608; e 7,833,992, todas as quais são deste modo incorporadas por referência em suas totalidades. Em uma outra modalidade, o ligante compreende uma fração de folato. Os polinucleotídeos conjugados a frações de folato podem ser captados por células através de uma via de endocitose mediada por receptores. Tais conjugados folato-polinucleotídeo são descritos na Patente dos E.U.A. N.º 8,188,247, que é deste modo incorporada por referência em sua totalidade.
[0121] O ligante pode visar o construto de RNAi para um tecido ou tipo de célula específico para inibir seletivamente a expressão do gene alvo em messe tecido ou tipo de célula específico. Em uma modalidade, o ligante visa a distribuição do construto de RNAi especificamente às células do fígado (p. ex., hepatócitos) usando várias abordagens como descrito em mais detalhe em baixo. Em certas modalidades, os construtos de RNAi são visados às células do fígado com um ligante que se liga ao receptor de asialoglicoproteína expresso na superfície (ASGR) ou seu componente (p. ex., ASGR1, ASGR2).
[0122] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi podem ser especificamente visados para o fígado por emprego de ligantes que se ligam a ou interagem com proteínas expressas na superfície de células do fígado. Por exemplo, em certas modalidades, os ligantes podem compreender proteínas de ligação ao antígeno (p. ex., anticorpos ou seus fragmentos de ligação (p. ex., Fab, scFv)) que se ligam especificamente a um receptor expresso em hepatócitos, tal como o receptor da asialoglicoproteína e o receptor de LDL. Em uma modalidade particular, o ligante compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação que se liga especificamente a ASGR1 e/ou ASGR2. Em uma outra modalidade, o ligante compreende um fragmento Fab de um anticorpo que se liga especificamente a ASGR1 e/ou ASGR2. Um “fragmento Fab” é compreendido por uma cadeia leve de imunoglobulina (i.e., região variável de cadeia leve (VL) e região constante (CL)) e a região CH1 e região variável (VH) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma outra modalidade, o ligante compreende um fragmento de anticorpo variável de cadeia única (fragmento scFv) de um anticorpo que se liga especificamente a ASGR1 e/ou ASGR2. Um “fragmento scFv” compreende as regiões VH e VL de um anticorpo, em que estas regiões estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos, e opcionalmente compreendendo um ligador de peptídeo entre as regiões VH e VL que permite que o Fv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Anticorpos e seus fragmentos de ligação exemplificativos que se ligam especificamente a ASGR1 que podem ser usados como ligantes para visar os construtos de RNAi da invenção para o fígado são descritos na Publicação WIPO N.º WO 2017/058944, que é deste modo incorporada por referência em sua totalidade. Outros anticorpos ou seus fragmentos de ligação que se ligam especificamente a ASGR1, receptor de LDL ou outras proteínas expressas na superfície do fígado adequadas para uso como ligantes nos construtos de RNAi da invenção estão comercialmente disponíveis.
[0123] Em certas modalidades, o ligante compreende um carboidrato. Um “carboidrato” se refere a um composto constituído por uma ou mais unidades de monossacarídeo tendo pelo menos 6 átomos de carbono (que pode ser linear, ramificado ou cíclico) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono. Os carboidratos incluem os, mas não estão limitados aos, açúcares (p. ex., monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, tetrassacarídeos e oligossacarídeos contendo de cerca de 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades de monossacarídeos) e polissacarídeos, tais como amidos, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeos. Em algumas modalidades, o carboidrato incorporado no ligante é um monossacarídeo selecionado de uma pentose, hexose ou heptose e di e trissacarídeos incluindo tais unidades de monossacarídeos. Em outras modalidades, o carboidrato incorporado no ligante é um aminoaçúcar, tal como galactosamina, glucosamina, N- acetilgalactosamina, e N-acetilglucosamina.
[0124] Em algumas modalidades, o ligante compreende uma hexose ou hexosamina. A hexose pode ser selecionada de glucose, galactose, manose, fucose ou frutose. A hexosamina pode ser selecionada de frutosamina, galactosamina, glucosamina ou manosamina. Em certas modalidades, o ligante compreende glucose, galactose, galactosamina ou glucosamina. Em uma modalidade, o ligante compreende glucose, glucosamina ou N-acetilglucosamina. Em outra modalidade, o ligante compreende galactose, galactosamina ou N-acetil- galactosamina. Em modalidades particulares, o ligante compreende N-acetil-galactosamina. Os ligantes compreendendo glucose, galactose e N-acetil-galactosamina (GalNAc) são particularmente eficazes no direcionamento de compostos para células do fígado porque tais ligantes se ligam ao ASGR expresso na superfície dos hepatócitos. Ver, p. ex., D'Souza e Devarajan, J. Control Release, Vol. 203: 126-139, 2015. Exemplos de ligantes contendo GalNAc ou galactose que podem ser incorporados nos construtos de RNAi da invenção são descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os 7,491,805; 8,106,022; e 8,877,917; Publicação de Patente dos E.U.A. N.º 20030130186; e Publicação WIPO N.º WO2013166155, todas as quais são deste modo incorporadas por referência em suas totalidades.
[0125] Em certas modalidades, o ligante compreende uma fração de carboidrato multivalente. Como usado aqui, uma “fração de carboidrato multivalente” se refere a uma fração compreendendo duas ou mais unidades de carboidratos capazes de se ligarem ou interagirem independentemente com outras moléculas.
Por exemplo, uma fração de carboidrato multivalente compreende dois ou mais domínios de ligação compreendidos por carboidratos que se podem ligar a duas ou mais moléculas diferentes ou dois ou mais locais diferentes na mesma molécula.
A valência da fração de carboidrato denota o número de domínios de ligação individuais dentro da fração de carboidrato.
Por exemplo, os termos “monovalente”, “bivalente”, “trivalente” e “tetravalente” com referência à fração de carboidrato se referem a frações de carboidrato com um, dois, três, e quatro domínios de ligação, respectivamente.
A fração de carboidrato multivalente pode compreender uma fração de lactose multivalente, uma fração de galactose multivalente, uma fração de glucose multivalente, uma fração de N-acetil-galactosamina multivalente, uma fração de N-acetil-glucosamina multivalente, uma fração de manose multivalente ou uma fração de fucose multivalente.
Em algumas modalidades, o ligante compreende uma fração de galactose multivalente.
Em outras modalidades, o ligante compreende uma fração de N-acetil- galactosamina multivalente.
Em estas e outras modalidades, a fração de carboidrato multivalente é bivalente, trivalente ou tetravalente.
Em tais modalidades, a fração de carboidrato multivalente pode ser biantenária ou triantenária.
Em uma modalidade particular, a fração de N-acetil-galactosamina multivalente é trivalente ou tetravalente.
Em outra modalidade particular, a fração de galactose multivalente é trivalente ou tetravalente.
Ligantes contendo GalNAc trivalentes e tetravalentes exemplificativos para incorporação nos construtos de RNAi da invenção são descritos em detalhe em baixo.
[0126] O ligante pode ser anexado ou conjugado à molécula de RNA do construto de RNAi diretamente ou indiretamente. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é covalentemente anexado diretamente à fita senso ou antissenso do construto de RNAi. Em outras modalidades, o ligante é covalentemente anexado através de um ligador à fita senso ou antissenso do construto de RNAi. O ligante pode ser anexado a nucleobases, frações de açúcar ou ligações internucleotídicas de polinucleotídeos (p. ex., fita senso ou fita antissenso) dos construtos de RNAi da invenção. A conjugação ou anexação a nucleobases de purina ou seus derivados pode ocorrer em qualquer posição, incluindo átomos endocíclicos e exocíclicos. Em certas modalidades, as posições 2, 6, 7 ou 8 de uma nucleobase de purina são anexadas a um ligante. A conjugação ou anexação a nucleobases de pirimidina ou seus derivados pode também ocorrer em qualquer posição. Em algumas modalidades, as posições 2, 5 e 6 de uma nucleobase de pirimidina podem ser anexadas a um ligante. A conjugação ou anexação a frações de açúcar de nucleotídeos pode ocorrer em qualquer átomo de carbono. Átomos de carbono exemplificativos de uma fração de açúcar que podem ser anexados a um ligante incluem os átomos de carbono 2', 3' e 5'. A posição 1' pode ser também anexada a um ligante, tal como em um nucleotídeo básico. As ligações internucleotídeos pode também suportar anexações de ligantes. Para ligações contendo fósforo (p. ex., fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato e similares), o ligante pode ser anexado diretamente ao átomo de fósforo ou a um átomo de
O, N, ou S ligado ao átomo de fósforo. Para ligações internucleosídeos contendo amina ou amida (p. ex., PNA), o ligante pode ser anexado ao átomo de nitrogênio da amina ou amida ou a um átomo de carbono adjacente.
[0127] Em certas modalidades, o ligante pode ser anexado à extremidade 3' ou 5' de qualquer uma das fitas senso ou antissenso. Em certas modalidades, o ligante é covalentemente anexado à extremidade 5' da fita senso. Em tais modalidades, o ligante é anexado ao nucleotídeo 5'- terminal da fita senso. Em estas e outras modalidades, o ligante é anexado na posição 5' do nucleotídeo 5'-terminal da fita senso. Em modalidades nas quais um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido é o nucleotídeo 5'-terminal da fita senso e ligado ao nucleotídeo adjacente através de uma ligação internucleotídica 5'-5', o ligante pode ser anexado na posição 3’ do nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido. Em outras modalidades, o ligante é covalentemente anexado à extremidade 3' da fita senso. Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante é anexado ao nucleotídeo 3'-terminal da fita senso. Em certas tais modalidades, o ligante é anexado na posição 3' do nucleotídeo 3'-terminal da fita senso. Em modalidades nas quais um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido é o nucleotídeo 3´-terminal da fita senso e ligado ao nucleotídeo adjacente através de uma ligação internucleotídica 3'-3', o ligante pode ser anexado na posição 5’ do nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido. Em modalidades alternativas, o ligante é anexado perto da extremidade 3' da fita senso, mas antes de um ou mais nucleotídeos terminais (i.e., antes de 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos terminais). Em algumas modalidades, o ligante é anexado na posição 2' do açúcar do nucleotídeo 3'-terminal da fita senso. Em outras modalidades, o ligante é anexado na posição 2' do açúcar do nucleotídeo 5'-terminal da fita senso.
[0128] Em certas modalidades, o ligante é anexado à fita senso ou antissenso através de um ligador. Um “ligador” é um átomo ou grupo de átomos une covalentemente um ligante a um componente de polinucleotídeo do construto de RNAi. O ligador pode ter de cerca de 1 até cerca de 30 átomos de comprimento, de cerca de 2 a cerca de 28 átomos de comprimento, de cerca de 3 a cerca de 26 átomos de comprimento, de cerca de 4 a cerca de 24 átomos de comprimento, de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de comprimento, de cerca de 7 a cerca de 20 átomos de comprimento, de cerca de 8 a cerca de 20 átomos de comprimento, de cerca de 8 a cerca de 18 átomos de comprimento, de cerca de 10 a cerca de 18 átomos de comprimento e de cerca de 12 a cerca de 18 átomos de comprimento. Em algumas modalidades, o ligador pode compreender uma fração de ligação bifuncional, que compreende geralmente uma fração de alquila com dois grupos funcionais. Um dos grupos funcionais é selecionado para se ligar ao composto de interesse (p. ex., fita senso ou antissenso do construto de RNAi) e o outro é selecionado para se ligar essencialmente a qualquer grupo selecionado, tal como um ligante como descrito aqui. Em certas modalidades, o ligador compreende uma estrutura em cadeia ou um oligômero de unidades repetidas, tais como unidades de etilenoglicol ou aminoácidos. Exemplos de grupos funcionais que são tipicamente empregues em uma fração de ligação bifuncional incluem, mas não estão limitados a, eletrófilos para reagirem com grupos nucleofílicos e nucleófilos para reagirem com grupos eletrofílicos. Em algumas modalidades, as frações de ligação bifuncionais incluem amino, hidroxila, ácido carboxílico, tiol, insaturações (p. ex., ligações duplas ou triplas) e similares.
[0129] Os ligadores que podem ser usados para anexar um ligante à fita senso ou antissenso nos construtos de RNAi da invenção incluem, mas não estão limitados a, pirrolidina, ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, 4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila, ácido 6-amino-hexanoico, alquila C1-C10 substituída, alquenila C2-C10 substituída ou não substituída ou alquinila C2-C10 substituída ou não substituída. Grupos substituintes preferenciais para tais ligadores incluem, mas não estão limitados a, hidroxila, amino, alcóxi, carbóxi, benzila, fenila, nitro, tiol, tioalcóxi, halogênio, alquila, arila, alquenila e alquinila.
[0130] Em certas modalidades, os ligadores são cliváveis. Um ligador clivável é tal que é suficientemente estável fora da célula, mas que após entrada em uma célula alvo é clivado para liberar as duas partes que o ligador mantém juntas. Em algumas modalidades, o ligador clivável é clivado pelo menos 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais ou pelo menos 100 vezes mais rapidamente na célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode, p. ex., ser selecionada para mimetizar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um sujeito ou sob uma segunda condição de referência (que pode, p. ex., ser selecionada para mimetizar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).
[0131] Os ligadores cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, p. ex., pH, potencial redox ou a presença de moléculas de degradação. Geralmente, os agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados a níveis ou atividades mais elevados dentro de células do que em soro ou sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade para substratos, incluindo, p. ex., enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores tais como mercaptanas, presentes em células, que podem degradar por redução um ligador clivável por redução; esterases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente ácido, p. ex., aqueles que resultam em um pH de cinco ou mais baixo; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um ligador clivável por ácido ao atuarem como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas para substratos) e fosfatases.
[0132] Um ligador clivável pode compreender uma fração que é suscetível ao pH. O pH do soro humano é 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente mais baixo, variando de cerca de 7,1-7,3. Os endossomos têm um pH mais ácido, na gama de 5,5-6,0, e os lisossomos têm um pH ainda mais ácido em torno de 5,0. Alguns ligadores terão um grupo clivável que é clivado a um pH preferencial, liberando deste modo a molécula de RNA a partir do ligante dentro da célula ou no compartimento desejado da célula.
[0133] Um ligador pode incluir um grupo clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo clivável incorporado em um ligador pode depender da célula a ser visada. Por exemplo, os ligadores visando o fígado podem ser ligados a moléculas de RNA através de um ligador que inclui um grupo éster. As células do fígado são ricas em esterases, e portanto o ligador será clivado mais eficientemente em células do fígado do que em tipos de células que não são ricos em esterases. Outros tipos de células ricos em esterases incluem células do pulmão, córtex renal e testículos. Os ligadores que contêm ligações de peptídeo podem ser usados quando se visam células ricas em peptidases, tais como células do fígado e sinoviócitos.
[0134] Em geral, a adequabilidade de um ligador clivável candidato pode ser avaliada por teste da capacidade de um agente (ou condição) de degradação de clivar o ligador candidato. Será também desejável testar o ligador clivável candidato quanto à capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim se pode determinar a suscetibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, onde a primeira é selecionada para ser indicativa de clivagem em uma célula alvo e a segunda é selecionada para ser indicativa de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, p. ex., sangue ou soro. As avaliações podem ser levadas a cabo em sistemas isentos de células, em células, em cultura de células, em cultura de órgãos ou tecidos ou em animais inteiros. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições isentas de células ou de cultura e confirmar por avaliações adicionais em animais inteiros. Em algumas modalidades, ligadores candidatos úteis são clivados pelo menos 2, 4, 10, 20, 50, 70 ou 100 vezes mais rapidamente na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições extracelulares).
[0135] Em outras modalidades, ligadores cliváveis por redox são utilizados. Os ligadores cliváveis por redox são clivados após redução ou oxidação. Um exemplo de um grupo redutoramente clivável é um grupo de ligação dissulfeto (- S–S-). Para determinar se um ligador clivável candidato é um “ligador redutoramente clivável” adequado ou, por exemplo, é adequado para uso com um construto de RNAi particular e ligante particular é possível usar um ou mais métodos descritos aqui. Por exemplo, um ligador candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outro agente redutor conhecido na técnica, que mimetiza a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, p. ex., uma célula alvo. Os ligadores candidatos podem ser também avaliados sob condições que são selecionadas para mimetizarem condições do sangue ou soro. Em uma modalidade específica, os ligadores candidatos são clivados no máximo em 10% no sangue. Em outras modalidades, os ligadores candidatos úteis são degradados pelo menos 2, 4, 10, 20, 50, 70 ou 100 vezes mais rapidamente na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições intracelulares) em comparação com sangue (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições extracelulares).
[0136] Ainda em outras modalidades, os ligadores cliváveis à base de fosfato, que são clivados por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato, são empregues para anexar covalentemente um ligante à fita senso ou antissenso do construto de RNAi. Um exemplo de um agente que hidrolisa grupos fosfato em células são enzimas, tais como fosfatases em células. Exemplos de grupos cliváveis à base de fosfato são –O–P(O)(ORk)-O–, –O–P(S)(ORk)-O–, –O–P(S)(SRk)-O–, –S– P(O) (ORk)-O–, –O–P(O)(ORk)-S–, –S–P(O)(ORk)-S–, –O– P(S)(ORk)-S–, –S–P(S)(ORk)-O–, –O–P(O)(Rk)-O–, –O–P(S)(Rk)- O–, –S–P(O)(Rk)-O–, –S–P(S)(Rk)-O–, –S–P(O)(Rk)-S– e –O– P(S)(Rk)-S–, onde Rk pode ser hidrogênio ou alquila. Modalidades específicas incluem –O–P(O)(OH)–O–, –O–P(S)(OH)– O–, –O–P(S)(SH)–O–, –S–P(O)(OH)–O–, –O–P(O)(OH)–S–, –S– P(O)(OH)–S–, –O–P(S)(OH)–S–, –S–P(S)(OH)–O–, –O–P(O)(H)–O–, –O–P(S)(H)–O–, –S–P(O)(H)–O–, –S–P(S)(H)–O–, –S–P(O)(H)–S– e –O–P(S)(H)–S–. Uma outra modalidade específica é –O– P(O)(OH)–O–. Estes ligadores candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[0137] Em outras modalidades, os ligadores podem compreender grupos cliváveis por ácido, que são grupos que são clivados sob condições ácidas. Em algumas modalidades, os grupos cliváveis por ácido são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou mais baixo (p. ex., cerca de 6,0, 5,5, 5,0 ou mais baixo) ou por agentes, tais como enzimas, que podem atuar como um ácido geral. Em uma célula, organelas específicas de pH baixo, tais como endossomos e lisossomos, podem proporcionar um ambiente de clivagem para grupos cliváveis por ácido. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácido incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Os grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral –C=NN–, C(O)O ou –OC(O). Uma modalidade específica é quando o carbono anexado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído ou grupo alquila terciário tal como dimetila, pentila ou t-butila. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[0138] Em outras modalidades, os ligadores podem compreender grupos cliváveis à base de éster, que são clivados por enzimas, tais como esterases e amidases, em células. Exemplos de grupos cliváveis à base de éster incluem, mas não estão limitados a, ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Os grupos cliváveis por éster têm a fórmula geral –C(O)O– ou –OC(O)–. Estes ligadores candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[0139] Em modalidades adicionais, os ligadores podem compreender grupos cliváveis à base de peptídeo, que são clivados por enzimas, tais como peptidases e proteases, em células. Os grupos cliváveis à base de peptídeo são ligações de peptídeo formadas entre aminoácidos para originar oligopeptídeos (p. ex., dipeptídeos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. Os grupos cliváveis à base de peptídeo incluem o grupo amida (–C(O)NH–). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquinileno. Uma ligação de peptídeos é um tipo especial de ligação de amida formada entre aminoácidos para originar peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem à base de peptídeo está geralmente limitado à ligação de peptídeo (i.e., a ligação de amida) formada entre aminoácidos originando peptídeos e proteínas. Os grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo têm a fórmula geral –NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)–, onde RA e RB são as cadeias laterais dos dois aminoácidos adjacentes. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[0140] Outros tipos de ligadores adequados para anexar ligantes às fitas senso ou antissenso nos construtos de RNAi da invenção são conhecidos na técnica e podem incluir os ligadores descritos nas Patentes dos E.U.A. N.os 7,723,509; 8,017,762; 8,828,956; 8,877,917; e 9,181,551, todas as quais são deste modo incorporadas por referência em suas totalidades.
[0141] Em certas modalidades, o ligante covalentemente anexado à fita senso ou antissenso dos construtos de RNAi da invenção compreende uma fração de GalNAc, p. ex., uma fração de GalNAc multivalente. Em algumas modalidades, a fração de GalNAc multivalente é uma fração de GalNAc trivalente e é anexada à extremidade 3' da fita senso. Em outras modalidades, a fração de GalNAc multivalente é uma fração de GalNAc trivalente e é anexada à extremidade 5' da fita senso. Ainda em outras modalidades, a fração de GalNAc multivalente é uma fração de GalNAc tetravalente e é anexada à extremidade 3' da fita senso. Ainda em outras modalidades, a fração de GalNAc multivalente é uma fração de GalNAc tetravalente e é anexada à extremidade 5' da fita senso.
[0142] Em certas modalidades, os construtos de RNAi da invenção compreendem um ligante tendo a seguinte estrutura:
Em modalidades preferenciais, o ligante tendo esta estrutura é covalentemente anexado à extremidade 5’ da fita senso através de um ligador, tal como os ligadores descritos aqui. Em uma modalidade, o ligador é um ligador de amino-hexila.
[0143] Frações e ligadores de GalNAc trivalentes e tetravalentes exemplificativos que podem ser anexados às moléculas de RNA de fita dupla nos construtos de RNAi da invenção são proporcionados nas fórmulas estruturais I-IX em baixo. “Ac” nas fórmulas listadas aqui representa um grupo acetila.
[0144] Em uma modalidade, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula I, em que cada n é independentemente 1 a 3, k é 1 a 3, m é 1 ou 2, j é 1 ou 2, e o ligante é anexado à extremidade 3´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA I
[0145] Em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula II, em que cada n é independentemente 1 a 3, k é 1 a 3, m é 1 ou 2, j é 1 ou 2, e o ligante é anexado à extremidade 3´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA II
[0146] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula III, em que o ligante é anexado à extremidade 3´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA III
[0147] Ainda em uma outra modalidade, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula IV, em que o ligante é anexado à extremidade 3´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida): 3′
FÓRMULA IV
[0148] Em certas modalidades, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula
V, em que cada n é independentemente 1 a 3, k é 1 a 3, e o ligante é anexado à extremidade 5´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA V
[0149] Em outras modalidades, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula VI, em que cada n é independentemente 1 a 3, k é 1 a 3, e o ligante é anexado à extremidade 5´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA VI
[0150] Em uma modalidade particular, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula VII, em que X = O ou S e em que o ligante é anexado à extremidade 5´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada):
FÓRMULA VII
[0151] Em algumas modalidades, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula VIII, em que cada n é independentemente 1 a 3, e o ligante é anexado à extremidade 5´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA VIII
[0152] Em certas modalidades, o construto de RNAi compreende um ligante e ligador tendo a seguinte estrutura da Fórmula IX, em que o ligante é anexado à extremidade 5´ da fita senso da molécula de RNA de fita dupla (representada pela linha ondulada sólida):
FÓRMULA IX
[0153] Uma ligação de fosforotioato pode ser substituída pela ligação de fosfodiéster mostrada em qualquer uma das Fórmulas I-IX para anexar covalentemente o ligante e o ligador à fita de ácido nucleico.
[0154] A presente invenção inclui também composições e formulações farmacêuticas compreendendo os construtos de RNAi descritos aqui e transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições e formulações são úteis para reduzir a expressão de um gene alvo em um sujeito com sua necessidade. Onde são contempladas aplicações clínicas, as composições e formulações farmacêuticas serão preparadas em uma forma apropriada para a aplicação pretendida. Geralmente, isto implicará preparar composições que estão essencialmente isentas de pirogênios, bem como outras impurezas que poderiam ser prejudiciais para humanos ou animais.
[0155] As frases “farmaceuticamente aceitáveis” ou “farmacologicamente aceitáveis” se referem a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras indesejáveis quando administradas a um animal ou um humano. Como usado aqui, “transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável” inclui solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção e similares aceitáveis para uso na formulação de farmacêuticos, tais como farmacêuticos adequados para administração a humanos. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Excetuando no caso de qualquer meio ou agente convencional ser incompatível com os construtos de RNAi da presente invenção é contemplado seu uso em composições terapêuticas. Ingredientes ativos suplementares podem ser também incorporados nas composições, contanto que não inativem os vetores ou construtos de RNAi das composições.
[0156] As composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas dependem de um número de critérios, incluindo, mas não se limitando a, via de administração, tipo e extensão da doença ou disfunção a ser tratada ou dose a ser administrada. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas com base na via de distribuição pretendida. Por exemplo, em certas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas para distribuição parenteral. As formas parenterais de distribuição incluem injeção ou infusão intravenosa, intra- arterial, subcutânea, intratecal, intraperitoneal ou intramuscular. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é formulada para distribuição intravenosa. Em uma tal modalidade, a composição farmacêutica pode incluir um veículo de distribuição à base de lipídeo. Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada para distribuição subcutânea. Em uma tal modalidade, a composição farmacêutica pode incluir um ligante de direcionamento (p. ex., ligantes contendo GalNAc ou contendo anticorpo descritos aqui).
[0157] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de um construto de RNAi descrito aqui. Uma “quantidade eficaz” é uma quantidade suficiente para produzir um resultado clínico benéfico ou desejado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para reduzir a expressão do gene alvo em um tecido ou tipo de célula particular (p. ex., fígado ou hepatócitos) de um sujeito.
[0158] A administração das composições farmacêuticas da presente invenção pode ser através de qualquer via comum desde que o tecido alvo esteja disponível através dessa via. Tais vias incluem, mas não estão limitadas a, vias parenteral (p. ex., subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa), oral, nasal, bucal, intradérmica, transdérmica e sublingual ou por injeção direta em tecido do fígado ou distribuição através da veia portal hepática. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada parenteralmente. Por exemplo, em certas modalidades, a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é administrada subcutaneamente.
[0159] Sistemas de dispersões coloidais, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esférulas, e sistemas à base de lipídeos, incluindo emulsões óleo-em- água, micélios, micélios mistos e lipossomos, podem ser usados como veículos de distribuição para os construtos de RNAi da invenção. Emulsões de gordura comercialmente disponíveis que são adequadas para distribuir os ácidos nucleicos da invenção incluem Intralipid® (Baxter International Inc.), Liposyn® (Abbott Pharmaceuticals), Liposyn®II (Hospira), Liposyn®III (Hospira), Nutrilipid (B. Braun Medical Inc.) e outras emulsões de lipídeos similares. Um sistema coloidal preferencial para uso como um veículo de distribuição in vivo é um lipossomo (i.e., uma vesícula de membrana artificial). Os construtos de RNAi da invenção podem ser encapsuladas dentro de lipossomos ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomos catiônicos. Alternativamente, os construtos de RNAi da invenção podem ser complexados com lipídeos, em particular com lipídeos catiônicos. Lipídeos e lipossomos adequados incluem neutros (p. ex., dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), diestearoilfosfatidilcolina), negativos (p. ex., dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG)) e catiônicos (p. ex., dioleoiltetrametilaminopropila (DOTAP) e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOTMA)). A preparação e uso de tais sistemas de dispersões coloidais são bem conhecidos na técnica. Formulações exemplificativas são também divulgadas na Pat. dos E.U.A. N.º 5,981,505; Pat. dos E.U.A. N.º 6,217,900; Pat. dos E.U.A. N.º 6,383,512; Pat. dos E.U.A. N.º 5,783,565; Pat. dos E.U.A. N.º 7,202,227; Pat. dos E.U.A. N.º 6,379,965; Pat. dos E.U.A. N.º 6,127,170; Pat. dos E.U.A. N.º 5,837,533; Pat. dos E.U.A. N.º 6,747,014; e WO03/093449.
[0160] Em algumas modalidades, os construtos de RNAi da invenção são totalmente encapsulados em uma formulação de lipídeos, p. ex., para formar uma SNALP ou outra partícula ácido nucleico-lipídeo. Como usado aqui, o termo “SNALP” se refere a uma partícula ácido nucleico-lipídeo estável. As SNALP contêm tipicamente um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um lipídeo que previne a agregação da partícula (p. ex., um conjugado PEG-lipídeo). As SNALP são excecionalmente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem tempos de vida de circulação prolongados após injeção intravenosa e se acumulam em locais distais (p. ex., locais fisicamente separados do local de administração). As partículas ácido nucleico-lipídeo têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, cerca de 70 nm a cerca de 110 nm ou cerca de 70 nm a cerca de 90 nm e são substancialmente não tóxicas. Adicionalmente, os ácidos nucleicos quando presentes nas partículas ácido nucleico-lipídeo são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. As partículas ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são divulgados, p. ex., nas Patentes dos E.U.A.
Nos, 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; e Publicação PCT N.º WO 96/40964.
[0161] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Geralmente, estas preparações são estéreis e fluidas no sentido em que existe injetabilidade fácil. As preparações devem ser estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e devem ser conservadas contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. Solventes ou meios de dispersão apropriados podem conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e similares), suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho requerido das partículas no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser promovida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes retardadores da absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0162] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação dos compostos ativos em uma quantidade apropriada em um solvente em conjunto com quaisquer outros ingredientes (por exemplo como enumerado acima) como desejado, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes desejados, p. ex., como enumerado acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos preferenciais de preparação incluem técnicas de secagem a vácuo e dessecação que originam um pó do(s) ingrediente(s) ativo(s) mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.
[0163] As composições da presente invenção podem ser geralmente formuladas em uma forma neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais de adição de ácidos (formados com grupos amino livres) derivados de ácidos inorgânicos (p. ex., ácidos clorídrico ou fosfórico) ou de ácidos orgânicos (p. ex., acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares). Os sais formados com os grupos carboxila livres podem ser também derivados de bases inorgânicas (p. ex., hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico) ou de bases orgânicas (p. ex., isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares).
[0164] Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução é geralmente adequadamente tamponada e o diluente líquido é em primeiro lugar tornado isotônico, por exemplo com solução salina ou de glucose suficiente. Tais soluções aquosas podem ser usadas, por exemplo, para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Preferencialmente são empregues meios aquosos estéreis como é conhecido dos peritos na técnica, particularmente à luz da presente divulgação. A título ilustrativo, uma única dose pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local de infusão proposto (ver, por exemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences” 15ª Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Para administração humana, as preparações devem cumprir padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza como requerido por padrões da FDA. Em certas modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende ou consiste em uma solução salina estéril e um construto de RNAi descrito aqui. Em outras modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende ou consiste em um construto de RNAi descrito aqui e água estéril (p. ex., água para injeção, WFI). Ainda em outras modalidades, uma composição farmacêutica da invenção compreende ou consiste em um construto de RNAi descrito aqui e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0165] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção são embaladas com ou armazenadas dentro de um dispositivo para administração. Os dispositivos para formulações injetáveis incluem, mas não estão limitados a, portas de injeção, seringas pré-cheias, autoinjetores, bombas de injeção, injetores no corpo e canetas de injeção. Os dispositivos para formulações aerossolizadas ou em pó incluem, mas não estão limitadas a, inaladores, insufladores, aspiradores e similares. Assim, a presente invenção inclui dispositivos de administração compreendendo uma composição farmacêutica da invenção para tratar ou prevenir uma ou mais doenças ou disfunções.
[0166] A presente invenção proporciona um método para reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo em uma célula por contato da célula com qualquer um dos construtos de RNAi descritos aqui. A célula pode estar in vitro ou in vivo. A expressão do gene alvo pode ser avaliada por medição da quantidade ou nível de mRNA alvo, proteína alvo ou um outro biomarcador ligado à expressão do gene alvo. A redução da expressão do gene alvo em células ou animais tratados com um construto de RNAi da invenção pode ser determinada em relação à expressão do gene alvo em células ou animais não tratados com o construto de RNAi ou tratados com um construto de RNAi de controle. Por exemplo, em algumas modalidades, a redução ou inibição da expressão do gene alvo é avaliada por (a) medição da quantidade ou nível de mRNA alvo em células tratadas com um construto de RNAi da invenção, (b) medição da quantidade ou nível de mRNA alvo em células tratadas com um construto de RNAi de controle (p. ex., agente de RNAi dirigido a uma molécula de RNA não expressa nas células ou um construto de RNAi tendo uma sequência sem sentido ou embaralhada) ou nenhum construto e (c) comparação dos níveis de mRNA alvo medidos a partir de células tratadas em (a) com os níveis de mRNA alvo medidos a partir de células de controle em (b). Os níveis de mRNA alvo nas células tratadas e células de controle podem ser normalizados para níveis de RNA para um gene de controle (p. ex., RNA ribossomal 18S ou gene de manutenção) antes da comparação. Os níveis de mRNA alvo podem ser medidos por uma variedade de métodos, incluindo análise de transferência de Northern, ensaios de proteção de nucleases, hibridação in situ por fluorescência (FISH), PCR com transcriptase reversa (RT), RT-PCR em tempo real, PCR quantitativa, PCR digital com gotículas e similares.
[0167] Em outras modalidades, a redução ou inibição da expressão do gene alvo é avaliada por (a) medição da quantidade ou nível de proteína alvo em células tratadas com um construto de RNAi da invenção, (b) medição da quantidade ou nível de proteína alvo em células tratadas com um construto de RNAi de controle (p. ex., agente de RNAi dirigido a uma molécula de RNA não expressa nas células ou um construto de RNAi tendo uma sequência sem sentido ou embaralhada) ou nenhum construto e (c) comparação dos níveis de proteína alvo medidos a partir de células tratadas em (a) com os níveis de proteína alvo medidos a partir de células de controle em (b). Métodos de medição dos níveis de proteína alvo são conhecidos dos peritos na técnica e incluem Transferências de Western, imunoensaios (p. ex., ELISA) e citometria de fluxo.
[0168] A presente invenção proporciona também um método para reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo em um sujeito com sua necessidade compreendendo administração ao sujeito de qualquer um dos construtos de RNAi descritos aqui. Os construtos de RNAi da invenção podem ser usados para tratar ou melhorar condições, doenças ou disfunções associadas à expressão ou atividade aberrante do gene alvo, por exemplo, onde a sobre-expressão de um produto gênico causa um fenótipo patológico. Genes alvo exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, LPA, PNPLA3, ASGR1, F7, F12, FXI, APOCIII, APOB, APOL1, TTR, PCSK9, SCAP, KRAS, CD274, PDCD1, C5, ALAS1,
HAO1, LDHA, ANGPTL3, SERPINA1, AGT, HAMP, LECT2, EGFR, VEGF, KIF11, AT3, CTNNB1, HMGB1, HIF1A e STAT3. Os genes alvo podem também incluir genes virais, tais como os genes virais da hepatite B e hepatite C, genes virais da imunodeficiência humana, genes virais do herpes, etc. Em algumas modalidades, o gene alvo é um gene que codifica um microRNA (miRNA) humano.
[0169] Em certas modalidades, a expressão do gene alvo é reduzida nas células ou em um sujeito em pelo menos 50% por um construto de RNAi da invenção. Em algumas modalidades, a expressão do gene alvo é reduzida nas células ou em um sujeito em pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85% por um construto de RNAi da invenção. Em outras modalidades, a expressão de um gene alvo é reduzida em células do fígado em cerca de 90% ou mais, p. ex., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais por um construto de RNAi da invenção. A percentagem de redução da expressão do gene alvo pode ser medida por quaisquer dos métodos descritos aqui bem como outros conhecidos na técnica.
[0170] Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e os resultados alcançados, são proporcionados somente para propósitos ilustrativos e não são para serem considerados como limitando o escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS Exemplo 1. Atividade In Vivo de Construtos de RNAi de PNPLA3 com Diferentes Padrões de Modificação Química
[0171] Para avaliar o efeito de diferentes padrões de modificação química na eficácia in vivo de construtos de RNAi, construtos de RNAi visando o gene 3 contendo domínio de fosfolipase tipo patatina (PNPLA3) foram sintetizados com vários padrões de nucleotídeos modificados por 2′-flúor e nucleotídeos modificados por 2′-O-metila e avaliados em um modelo de camundongo humanizado expressando PNPLA3 como descrito em detalhe em baixo.
[0172] Os construtos de RNAi foram sintetizadas usando química de fosforamidita em fase sólida. A síntese foi realizada em um instrumento MerMade12 (Bioautomation).
Materiais
[0173] Acetonitrila (Grau de Síntese de DNA, AXO152-2505, EMD)
[0174] Reagente de Cobertura A (tetra- hidrofurano/lutidina/anidrido acético 80:10:10 (v/v/v), BIO221/4000, EMD)
[0175] Reagente de Cobertura B (1-metilimidazol a 16%/tetra- hidrofurano, BIO345/4000, EMD)
[0176] Solução Ativadora (5-(etiltio)-1H-tetrazol (ETT) a 0,25 M em acetonitrila, BIO152/0960, EMD)
[0177] Reagente de Destritilação (ácido dicloroacético a 3% em diclorometano, BIO830/4000, EMD)
[0178] Reagente de Oxidação (iodo a 0,02 M em tetra- hidrofurano/piridina/água 70:20:10 (v/v/v), BIO420/4000, EMD)
[0179] Solução de dietilamina (DEA a 20% em acetonitrila, NC0017-0505, EMD)
[0180] Reagente de Tiolação (5-N- [(dimetilamino)metileno]amino-3H-1,2,4-ditiazol-3-thiona a 0,05 M (BIOSULII/160K) em piridina/acetonitrila 40:60 (v/v))
[0181] Fosforamidita de ligador de 5′-amino-hexila, fosforamidita fosforilante, fosforamidita de 2′- desoxitimidina e fosforamiditas de 2′-metóxi e 2´-flúor de adenosina, guanosina, citosina e uridina (Thermo Fisher Scientific), 0,10 M em acetonitrila ao longo de ~10 mL de peneiras moleculares (3 Å, JT Baker)
[0182] Suporte CPG (Hi-Load Universal Support, 500A (BH5- 3500-G1), 79,6 μmol/g, 0,126 g (10 μmol))
[0183] Hidróxido de amônio (concentrado, J. T. Baker) Síntese
[0184] Soluções de reagentes, soluções de fosforamidita e solventes foram anexados ao instrumento MerMade12. Suporte sólido foi adicionado a cada coluna (tubo SPE de 4 mL com frita superior e inferior), e as colunas foram afixadas ao instrumento. As colunas foram lavadas duas vezes com acetonitrila. As linhas de fosforamidita e solução de reagente foram purgadas. A síntese foi iniciada usando o software Poseidon. A síntese foi realizada pela repetição do ciclo de desproteção/acoplamento/oxidação/cobertura síntese. Especificamente, ao suporte sólido foi adicionado reagente de destritilação para remover o grupo protetor 5'- dimetoxitritila (DMT). O suporte sólido foi lavado com acetonitrila. Ao suporte foram adicionados fosforamidita e solução ativadora seguida por incubação para acoplar o nucleotídeo de entrada ao grupo 5'-hidroxila livre. O suporte foi lavado com acetonitrila. Ao suporte foi adicionado reagente de oxidação ou tiolação para converter o triéster de fosfita no triéster de fosfato ou fosforotioato. Ao suporte foram adicionados os reagentes de cobertura A e B para terminar quaisquer cadeias de oligonucleotídeos não reagidas. O suporte foi lavado com acetonitrila. Após o ciclo de reação final, a resina foi lavada com solução de dietilamina para remover os grupos protetores 2-cianoetila. O suporte foi lavado com acetonitrila e seco sob vácuo.
Conjugação de GalNAc
[0185] Fitas senso para conjugação a uma fração de N-acetil- galactosamina (GalNAc) trivalente (estrutura mostrada na Fórmula VII em baixo) foram preparadas com um ligador de 5'- amino-hexila. Após síntese automática, a coluna foi removida do instrumento e transferida para um coletor de vácuo em uma câmara. O grupo protetor 5'-monometoxitritila (MMT) foi removido do suporte sólido por tratamentos sucessivos com alíquotas de 2 mL de ácido trifluoroacético (TFA) a 1% em diclorometano (DCM) com filtração a vácuo. Quando a cor laranja/amarela não era mais observável no eluente, a resina foi lavada com diclorometano. A resina foi lavada com 5 mL de di-isopropiletilamina a 2% em N,N-dimetilformamida (DMF). Em um frasco separado, uma solução de GalNAc3-Lys2-Ahx (67 mg, 40 µmol) em DMF (0,5 mL), a estrutura e síntese da qual são descritas em baixo, foi preparada com tetrafluoroborato de 1,1,3,3-tetrametilurônio (TATU, 12,83 mg, 40 µmol) e di- isopropiletilamina (DIEA) (10,5 µL, 360 µmol). A solução de acoplamento ativada foi adicionada à resina, e a coluna foi coberta e incubada à temperatura ambiente durante a noite. A resina foi lavada com DMF, DCM e seca sob vácuo.
Clivagem
[0186] As colunas de síntese foram removidas do sintetizador ou coletor de vácuo. O suporte sólido de cada coluna foi transferido para um frasco de 10 mL. Ao suporte sólido foram adicionados 4 mL de hidróxido de amônio concentrado. A cobertura foi estreitamente afixada ao frasco, e a mistura foi aquecida a 55 °C durante 4 h. A garrafa foi levada para a geladeira e resfriada durante 20 minutos antes de abrir na câmara. A mistura foi filtrada através de um tubo SPE de 8 mL para remover o suporte sólido. O frasco e o suporte sólido foram enxaguados com 1 mL de etanol/água 50:50. Análise e Purificação
[0187] Uma porção do filtrado combinado foi analisada e purificada por cromatografia de troca aniônica. As frações agrupadas foram dessalinizadas por cromatografia por exclusão de tamanhos e analisadas por cromatografia líquida de elevado desempenho-espectrometria de massa (HPLC-MS) de fase reversa de par iônico. As frações agrupadas foram liofilizadas para obter um pó amorfo branco. Cromatografia analítica de troca aniônica (AEX):
[0188] Coluna: Thermo DNAPac PA200RS (4,6 x 50 mm, 4 μm)
[0189] Instrumento: Agilent 1100 HPLC
[0190] Tampão A: fosfato de sódio a 20 mM, acetonitrila a 10%, pH 8,5
[0191] Tampão B: fosfato de sódio a 20 mM, acetonitrila a 10%, pH 8,5, brometo de sódio a 1 M
[0192] Caudal: 1 mL/min a 40 °C
[0193] Gradiente: B a 20-65% em 6,2 min
Cromatografia preparativa de troca aniônica (AEX):
[0194] Coluna: Tosoh TSK Gel SuperQ-5PW, 21 x 150 mm, 13 μm
[0195] Instrumento: Agilent 1200 HPLC
[0196] Tampão A: fosfato de sódio a 20 mM, acetonitrila a 10%, pH 8,5
[0197] Tampão B: fosfato de sódio a 20 mM, acetonitrila a 10%, pH 8,5, brometo de sódio a 1 M
[0198] Caudal: 8 mL/min
[0199] Volume de injeção: 5 mg
[0200] Gradiente: B a 35-55% ao longo de 20 min Cromatografia preparativa por exclusão de tamanhos (SEC):
[0201] Coluna: GE Hi-Prep 26/10
[0202] Instrumento: GE AKTA Pure
[0203] Tampão: etanol a 20% em água
[0204] Caudal: 10 mL/min
[0205] Volume de injeção: 15 mL usando bomba de carga de amostras HPLC de Fase Reversa de Par Iônico (IR-RP):
[0206] Coluna: Water Xbridge BEH OST C18, 2,5 μm, 2,1 x 50 mm
[0207] Instrumento: Agilent 1100 HPLC
[0208] Tampão A: DIEA a 15,7 mM, hexafluoroisopropanol (HFIP) a 50 mM em água
[0209] Tampão B: DIEA a 15,7 mM, HFIP a 50 mM em água/acetonitrila 50:50
[0210] Caudal: 0,5 mL/min
[0211] Gradiente: B a 10-30% ao longo de 6 min Emparelhamento
[0212] Uma pequena quantidade da fita senso e da fita antissenso foi pesada em frascos individuais. Aos frascos foi adicionado tampão de reconstituição de siRNA (Qiagen) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração aproximada de 2 mM com base no peso seco. A concentração real da amostra foi medida no NanoDrop One (ssDNA, coeficiente de extinção = 33 μg/OD260). As duas fitas foram depois misturadas em uma razão equimolar, e a amostra foi aquecida durante 5 minutos em uma incubadora a 90 °C e deixada a resfriar lentamente até à temperatura ambiente. A amostra foi analisada por AEX. O dúplex foi registrado e submetido a testes in vivo como descrito em mais detalhe em baixo. Preparação de GalNAc3-Lys2-Ahx Fórmula VII em que X = O ou S. A linha ondulada representa o ponto de anexação ao nucleotídeo 5´ terminal da fita senso do construto de RNAi.
[0213] A um tubo falcon de 50 mL foi adicionado Fmoc-Ahx-OH (1,13 g, 3,19 mmol) em DCM (30 mL) seguido por DIEA (2,23 mL, 12,78 mmol). A solução foi adicionada a resina de Cloreto tritila 2-Cl (3,03 g, 4,79 mmol) em um tubo de centrífuga de 50 mL e carregada em um agitador durante 2 h. O solvente foi drenado e a resina foi lavada com DCM/MeOH/DIEA 17:2:1 (30 mL x2), DCM (30 mL x4) e seca. A carga foi determinada como sendo 0,76 mmol/g com detecção espectrofotométrica de UV a 290 nm.
[0214] 3 g da resina de Tritila 2-Cl carregada foram suspensos em 4-metilpiperidina a 20% em DMF (20 mL) e, após 30 min, o solvente foi drenado. O processo foi repetido mais uma vez, e a resina foi lavada com DMF (30 mL x3) e DCM (30 mL x3).
[0215] A uma solução de Fmoc-Lys(ivDde)-OH (3,45 g, 6 mmol) em DMF (20 mL) foi adicionado TATU (1,94 g, 6 mmol) seguido por DIEA (1,83 mL, 10,5 mmol). A solução foi depois adicionada à resina desprotegida acima, e a suspensão foi colocada em um agitador durante a noite. O solvente foi drenado e a resina foi lavada com DMF (30 mL x3) e DCM (30 mL x3).
[0216] A resina foi tratada com 4-metilpiperidina a 20% em DMF (15 mL) e após 10 min o solvente foi drenado. O processo foi repetido mais uma vez e a resina foi lavada com DMF (15 mL x4) e DCM (15 mL x4).
[0217] A uma solução de Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (3,54 g, 6 mmol) em DMF (20 mL) foi adicionado TATU (1,94 g, 6 mmol) seguido por DIEA (1,83 mL, 10,5 mmol). A solução foi depois adicionada à resina desprotegida acima e a suspensão foi colocada em um agitador durante a noite. O solvente foi drenado e a resina foi lavada com DMF (30 mL x3) e DCM (30 mL x3).
[0218] A resina foi tratada com hidrazina a 5% em DMF (20 mL) e, após 5 min, o solvente foi drenado. O processo foi repetido mais quatro vezes e a resina foi lavada com DMF (30 mL x4) e DCM (30 mL x 4).
[0219] A uma solução de ácido 5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3- acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetra-hidro-2H- piran-2-il)óxi)pentanoico (4,47 g, 10 mmol) em DMF (40 mL) foi adicionado TATU (3,22 g, 10 mmol), e a solução foi agitada durante 5 min. DIEA (2,96 mL, 17 mmol) foi adicionada à solução, e a mistura foi depois adicionada à resina acima. A suspensão foi mantida à temperatura ambiente durante a noite e o solvente foi drenado. A resina foi lavada com DMF (3 x 30 mL) e DCM (3 x 30 mL).
[0220] A resina foi tratada com TFA a 1% em DCM (30 mL com Tri-isopropilsilano a 3%) e, após 5 min, o solvente foi drenado. O processo foi repetido mais três vezes, e o filtrado combinado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi triturado com éter de dietila (50 mL) e a suspensão foi filtrada e seca para dar o produto em bruto. O produto em bruto foi purificado com cromatografia de fase reversa e eluído com MeCN a 0-20% em água. As frações foram combinadas e liofilizadas para dar o produto como um sólido branco.
[0221] A Tabela 1 em baixo ilustra as posições das modificações nas sequências senso e antissenso para cada um dos construtos de RNAi PNPLA3 modificados. As sequências de nucleotídeos são listadas de acordo com as seguintes notações: dT, dA, dG, dC = desoxirribonucleotídeo correspondente; a, u, g e c = ribonucleotídeo de 2'-O-metila correspondente; Af, Uf, Gf e Cf = ribonucleotídeo de 2ʹ- desoxi-2ʹ-flúor (“2ʹ-flúor”) correspondente; Phos = o nucleotídeo terminal tem um grupo monofosfato em sua extremidade 5'; invAb = nucleotídeo abásico invertido (i.e., nucleotídeo abásico ligado ao nucleotídeo adjacente através de um substituinte em sua posição 3´ (uma ligação 3'-3') quando na extremidade 3' de uma fita ou ligado ao nucleotídeo adjacente através de um substituinte em sua posição 5´ (uma ligação internucleotídica 5´-5´) quando na extremidade 5' de uma fita); e invdX = desoxirribonucleotídeo invertido (i.e., desoxirribonucleotídeo ligado ao nucleotídeo adjacente através de um substituinte em sua posição 3’ (uma ligação 3'-3') quando na extremidade 3' de uma fita ou ligado ao nucleotídeo adjacente através de um substituinte em sua posição 5' (uma ligação internucleotídica 5´-5´) quando na extremidade 5' de uma fita). A inserção de um “s” na sequência indica que os dois nucleotídeos adjacentes são conectados por um grupo fosforotiodiéster (p. ex., uma ligação internucleotídica de fosforotioato). A não ser que indicado de outro modo, todos os outros nucleotídeos são conectados por grupos fosfodiéster 3'-5'. Todos os construtos de RNAi foram conjugados à fração de GalNAc mostrada na Fórmula VII através da extremidade 5´ da fita senso.
A Tabela 1 lista também a designação de padrão e a designação de família de sequências para cada construto de RNAi.
As designações de padrão são esquematicamente representadas na Figura 1. Se um construto de RNAi tiver a mesma designação de família de sequências que um outro construto de RNAi, então os dois construtos têm a mesma sequência nuclear, mas diferem no padrão de modificação química.
Tabela 1. Construtos de RNAi de PNPLA3 Modificados Exemplificativos Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
211 CM1 T2 CfgGfcCfaAfuGfUfCf 1 {Phos}asGfscUfgGfuGf 4 8 cAfcCfaGfcUfsusUf gacAfuUfgGfcCfgsUfsu 0 454 P1 T2 cggccaAfuGfUfCfCfa 2 {Phos}asGfscUfgGfUfg 4 4 ccagcususu gacAfuUfggccgsusu 1 211 CM1 T3 GfgUfcCfaGfcCfUfGf 3 {Phos}asAfsgAfaGfuUf 4 9 aAfcUfuCfuUfsusUf cagGfcUfgGfaCfcsUfsu 2 355 P1 T3 gguccaGfcCfUfGfAfa 4 {Phos}asAfsgAfaGfUfu 4 2 cuucuususu cagGfcUfggaccsusu 3 212 CM1 T5 GfcUfuCfaUfgCfCfCf 5 {Phos}csUfsgUfaGfaAf 4 5 uUfcUfaCfaGfsusUf gggCfaUfgAfaGfcsUfsu 4 239 P1 T5 gcuucaUfgCfCfCfUfu 6 {Phos}csUfsgUfaGfAfa 4 3 cuacagsusu gggCfaUfgaagcsusu 5 212 CM1 T6 GfcGfgCfuUfcCfUfGf 7 {Phos}usAfsgAfaGfcCf 4 0 gGfcUfuCfuAfsusUf cagGfaAfgCfcGfcsUfsu 6 346 P1 T6 gcggcuUfcCfUfGfGfg 8 {Phos}usAfsgAfaGfCfc 4 4 cuucuasusu cagGfaAfgccgcsusu 7 212 CM1 T8 GfuGfaCfaAfcGfUfAf 9 {Phos}asUfsgAfaGfgGf 4 1 cCfcUfuCfaUfsusUf uacGfuUfgUfcAfcsUfsu 8
Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
391 P1 T8 gugacaAfcGfUfAfCfc 1 {Phos}asUfsgAfaGfGfg 4 8 cuucaususu 0 uacGfuUfgucacsusu 9 212 CM1 T11 GfgUfaUfgUfuCfCfUf 1 {Phos}csAfsuGfaAfgCf 5 4 gCfuUfcAfuGfsusUf 1 aggAfaCfaUfaCfcsUfsu 0 239 P1 T11 ggsuaugUfuCfCfUfGf 1 {Phos}csAfsuGfaAfGfc 5 0 cuucaugsusu 2 aggAfaCfauaccsusu 1 237 CM1 T12 GfuAfuGfuUfcCfUfGf 1 {Phos}gsCfsaUfgAfaGf 5 0 cUfuCfaUfgCfsusUf 3 cagGfaAfcAfuAfcsUfsu 2 239 P1 T12 guauguUfcCfUfGfCfu 1 {Phos}gsCfsaUfgAfAfg 5 1 ucaugcsusu 4 cagGfaAfcauacsusu 3 237 CM1 T15 UfgUfuCfcUfgCfUfUf 1 {Phos}asGfsgGfcAfuGf 5 1 cAfuGfcCfcUfsusUf 5 aagCfaGfgAfaCfasUfsu 4 239 P1 T15 uguuccUfgCfUfUfCfa 1 {Phos}asGfsgGfcAfUfg 5 2 ugcccususu 6 aagCfaGfgaacasusu 5 212 CM1 T16 GfuUfcCfuGfcUfUfCf 1 {Phos}asAfsgGfgCfaUf 5 2 aUfgCfcCfuUfsusUf 7 gaaGfcAfgGfaAfcsUfsu 6 346 P1 T16 guuccuGfcUfUfCfAfu 1 {Phos}asAfsgGfgCfAfu 5 5 gcccuususu 8 gaaGfcAfggaacsusu 7 236 CM1 T19 CfcUfgCfuUfcAfUfGf 1 {Phos}usAfsgAfaGfgGf 5 8 cCfcUfuCfuAfsusUf 9 cauGfaAfgCfaGfgsUfsu 8
Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
346 P1 T19 ccugcuUfcAfUfGfCfc 2 {Phos}usAfsgAfaGfGfg 5 7 cuucuasusu 0 cauGfaAfgcaggsusu 9 236 CM1 T23 CfuUfcAfuGfcCfCfUf 2 {Phos}asCfsuGfuAfgAf 6 9 uCfuAfcAfgUfsusUf 1 aggGfcAfuGfaAfgsUfsu 0 239 P1 T23 cuucauGfcCfCfUfUfc 2 {Phos}asCfsuGfuAfGfa 6 4 uacagususu 2 aggGfcAfugaagsusu 1 212 CM1 T24 UfuCfaUfgCfcCfUfUf 2 {Phos}csAfscUfgUfaGf 6 3 cUfaCfaGfuGfsusUf 3 aagGfgCfaUfgAfasUfsu 2 353 P1 T24 uucaugCfcCfUfUfCfu 2 {Phos}csAfscUfgUfAfg 6 9 acagugsusu 4 aagGfgCfaugaasusu 3 355 CM1 T27 AfuGfcCfcUfuCfUfAf 2 {Phos}gsGfscCfaCfuGf 6 8 cAfgUfgGfcCfsusUf 5 uagAfaGfgGfcAfusUfsu 4 391 P1 T27 augcccUfuCfUfAfCfa 2 {Phos}gsGfscCfaCfUfg 6 6 guggccsusu 6 uagAfaGfggcaususu 5 354 P1 T5 gcuucaUfgCfCfCfUfu 2 {Phos}asUfsgUfaGfAfa 6 0 cuacaususu 7 gggCfaUfgaagcsusu 6 524 P2 T5 [invAb]gcuucaUfgCf 2 {Phos}asUfsgUfaGfAfa 6 1 CfCfUfucuacaususu 8 gggCfaUfgaagcsusu 6 561 P3 T5 cugcuucaUfgCfCfCfU 2 {Phos}asUfsgUfaGfAfa 6 4 fucuacas[invAb] 9 gggCfaUfgaagcagsusu 7
Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
561 P4 T5 [invAb]cugcuucaUfg 3 {Phos}asUfsgUfaGfAfa 6 5 CfCfCfUfucuacsasu 0 gggCfaUfgaagcagsusu 7 619 P3 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 {Phos}asUfsgUfaGfAfa 6 1 fucuacas[invAb] 1 aggCfaUfgaagcagsusu 8 626 P9 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 {Phos}asUfsguagAfaag 6 7 fucuacas[invAb] 1 gCfaUfgaagcagsusu 9 732 P9 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 0 fucuacas[invdA] 2 usUfsguagAfaaggCfaUf 0 gaagcagsusu 731 P9 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 8 fucuacas[invAb] 1 asUfsguagAfaaggCfaUf 1 gaagcagsusu 706 P9 T23 ugcuucauGfcCfUfUfU 3 7 2 fcuacags[invAb] 3 asCfsuguaGfaaagGfcAf 2 ugaagcasusu 851 P9 T23 ugcuucauGfcCfUfUfU 3 7 3 fcuacags[invdA] 4 usCfsuguaGfaaagGfcAf 3 ugaagcasusu
Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
870 P9 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 9 fucuacas[invdT] 5 asUfsguagAfaaggCfaUf 1 gaagcagsusu 810 CM2 T5,1 cugcuuCfaUfGfCfcuu 3 7 3 ucuacsasu 6 asUfsguaGfaaAfggcaUf 4 gAfagcagsusu 810 CM3 T5,1 cugcuuCfaUfGfCfcuu 3 7 4 ucuacsasu 6 asUfsguaGfaaaggcaUfg 5 Afagcagsusu 810 CM4 T5,1 cugcuuCfaUfGfCfcuu 3 7 5 ucuacsasu 6 asUfsguaGfaAfAfggcaU 6 fgAfagcagsusu 746 P11 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 3 fucuacas[invAb] 1 asUfsgUfagAfaaggCfaU 7 fgaagcagsusu 746 P10 T5,1 [invAb]cugcuucaUfg 3 7 4 CfCfUfUfucuacsasu 7 asUfsguagAfaaggCfaUf 1 gaagcagsusu
Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
746 P16 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 6 fucuacas[invAb] 1 asUfsguagAfaaGfgCfaU 8 fgaagcagsusu 746 P17 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 9 fucUfaCfas[invAb] 8 asUfsguagAfaaGfgCfaU 8 fgaagcagsusu 747 P15 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 0 fucuacas[invAb] 1 asUfsgUfaGfAfaaGfgCf 9 aUfgaagcagsusu 688 P3 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 8 3 fucuacas[invAb] 1 asUfsgUfaGfAfaaggCfa 0 Ufgaagcagsusu 731 P9 T5,1 cugcuucaUfgCfCfUfU 3 7 9 fucuacas[invAb] 1 usUfsguagAfaaggCfaUf 0 gaagcagsusu 706 P3 T23 ugcuucauGfcCfUfUfU 3 7 4 fcuacags[invAb] 3 asCfsuGfuAfGfaaagGfc 1 Afugaagcasusu
Dúp Desig Desig Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação nação (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : : 757 P11 T23 ugcuucauGfcCfUfUfU 3 7 6 fcuacags[invAb] 3 asCfsuGfuaGfaaagGfcA 2 fugaagcasusu 757 P18 T23 ugcuucauGfcCfUfUfU 3 7 9 fcuacags[invAb] 3 asCfsuGfuaGfaaAfgGfc 3 Afugaagcasusu 758 P12 T23 ugcuucauGfcCfUfUfU 3 7 0 fcuAfcAfgs[invAb] 9 asCfsuGfuaGfaaagGfcA 2 fugaagcasusu
[0222] Em um conjunto inicial de experiências, treze construtos de RNAi de PNPLA3 diferentes com sequências diferentes foram sintetizados para ter o padrão de modificação química P1 ou o padrão de modificação química de controle CM1. Foi relatado que moléculas de siRNA tendo o padrão de modificação química de controle CM1 têm efeitos de silenciamento de genes potentes e prolongados in vivo. Ver Nair et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 136: 16958-16961, 2014. A eficácia dos construtos de RNAi quimicamente modificados na inibição da expressão do gene PNPLA3 foi avaliada em um modelo de camundongo humanizado expressando PNPLA3 humana de tipo selvagem ou formas variantes de PNPLA3 humana. Para criar o modelo de camundongo, adenovírus associado (AAV; serótipo AAV8 ou AAV7; isento de endotoxinas) diluído em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) até 1×1012 partículas virais por animal foi injetado intravenosamente na veia da cauda de camundongos machos C57BL/6NCrl (Charles River Laboratories Inc.) para dirigir a expressão de genes humanos PNPLA3, PNPLA3rs738409 ou PNPLA3rs738409-rs738408. Os camundongos tinham geralmente 10-12 semanas de idade e um n de 4 a 6 animais foi incluído por grupo de tratamento.
[0223] Todos os construtos de RNAi foram testados em camundongos injetados com AAV-PNPLA3, PNPLA3rs738409 e/ou PNPLA3rs738409-rs738408. Pelo menos dois grupos de controle tratados com veículo: AAV-vetor vazio e AAV-PNPLA3, PNPLA3rs738409 ou PNPLA3rs738409-rs738408 tratado com veículo foram também incluídos. Duas semanas pós-injeção de AAV, os camundongos foram tratados com uma única dose de construto de RNAi (0,5 mM), através de injeção subcutânea, a 0,5, 1,0, 3,0 ou 5,0 miligramas por quilograma de animal, diluídos em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific, 14190-136). Aos 8, 15, 22, 28 ou 42 dias pós- injeção de RNAi, os fígados foram coletados dos animais, instantaneamente congelados em nitrogênio líquido, processados quanto a RNA purificado usando um instrumento Qiagen QIACube HT (9001793) e um Estojo Qiagen RNeasy 96 QIACube HT (74171) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram analisadas usando um sistema QIAxpert (9002340). O RNA foi tratado com Promega RQ1 RNase-Free DNase (Promega, M6101) e preparado para qPCR em Tempo Real usando o Estojo Applied Biosystem TaqManTM RNA-to-CTTM 1-Step (4392653). A qPCR em Tempo Real foi realizada em uma máquina QuantStudio Real-Time PCR. Os resultados são baseados na expressão gênica de PNPLA3 humano como normalizada para Gapdh de camundongo (ensaios TaqManTM da Invitrogen, hs00228747_m1 e 4352932E, respectivamente) e apresentados como o silenciamento relativo da expressão de mRNA de PNPLA3 humano em comparação com animais de controle tratados com veículo.
[0224] Os resultados deste conjunto inicial de experiências comparando construtos de RNAi com um padrão de modificação química P1 (dúplexes n.os 4544, 3552, 2393, 3464, 3918, 2390, 2391, 2392, 3465, 3467, 2394, 3539 e 3916) com aqueles com o padrão de modificação de controle CM1 (dúplexes n.os 2118, 2119, 2125, 2120, 2121, 2124, 2370, 2371, 2122, 2368, 2369, 2123 e 3558) são mostrados na Figura 2. Quando os construtos de RNAi foram subcutaneamente administrados a 5 mg/kg a camundongos expressando o gene variante PNPLA3rs738409 humano, os construtos tendo o padrão P1 reduziram geralmente a expressão de PNPLA3 em um grau maior quando medido 8 dias após injeção do que os construtos tendo o padrão CM1 independentemente da sequência.
[0225] As variações do padrão de modificação P1 para modificar o comprimento das fitas, a natureza das extremidades do construto de RNAi (i.e., saliência versus extremidade cega) e/ou para incluir nucleotídeos abásicos invertidos na extremidade 5’ ou 3´ da fita senso foram feitas e aplicadas a construtos de RNAi tendo a mesma sequência nuclear. Os construtos de RNAi com os novos padrões foram avaliadas no modelo de camundongo humanizado quanto a melhorias na eficácia in vivo. Especificamente, os construtos de RNAi com os padrões de modificação química P1, P2, P3 ou P4 (dúplexes n.os 3540, 5241, 5614 e 5615) foram administrados subcutaneamente a camundongos expressando o gene variante PNPLA3rs738409 humano a uma dose de 5 mg/kg. Os níveis de expressão de PNPLA3 humana no fígado foram avaliados aos 15 dias após administração dos construtos de RNAi. Os resultados são mostrados na Figura 3. Os construtos de RNAi com os padrões P2, P3 ou P4 produziram uma redução média maior da expressão de PNPLA3 do que os construtos de RNAi com o padrão P1.
[0226] Variações adicionais do padrão P3 foram feitas para aumentar a potência e a duração do silenciamento de mRNA in vivo. Os nucleotídeos modificados por 2'-flúor nas posições 4 e 6 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5’ no padrão P3 (dúplex n.º 6191) foram mudados para nucleotídeos modificados por 2'-O-metila para produzir o padrão P9. (dúplex n.º 6267). Um construto de RNAi tendo o padrão P9 com um desoxirribonucleotídeo de adenosina invertido no lugar do nucleotídeo abásico invertido na extremidade 3' da fita senso (dúplex n.º 7320) foi também sintetizado. Todos os três construtos foram avaliados no modelo de camundongo humanizado descrito acima. Em animais tratados com 5 mg/kg de dúplex n.º 6267, a expressão hepática de PNPLA3 humana foi reduzida em 97% aos 22 dias após administração, ao passo que os animais tratados com 5 mg/kg de dúplex n.º 6191 exibiram uma redução de 92% nos níveis de expressão hepática de PNPLA3 humana no mesmo momento. O dúplex n.º 7320 foi mais potente e produziu uma duração mais longa de silenciamento do gene do que os dúplexes n.os 6191 e 6267 pois os animais tratados com 3 mg/kg de dúplex n.º
7320 exibiram uma redução de 95% nos níveis de expressão hepática de PNPLA3 humana aos 28 dias após administração.
[0227] O padrão P9 foi aplicado a construtos de RNAi de PNPLA3 com duas sequências nucleares diferentes (dúplexes n.os 7318, 7320, 7062, 8513 e 8709) e avaliado quanto à eficácia in vivo em um ensaio de visualização de bioluminescência in vivo às doses de 1 mg/kg e 3 mg/kg. Para o ensaio de visualização de bioluminescência, um vetor de adenovírus associado (AAV) foi desenhado para conter o promotor de citomegalovírus murino, a sequência total para a Luciferase do Vaga-Lume e, depois, imediatamente a jusante do códon de paragem da Luciferase do Vaga-Lume, uma tira sintetizada de sequências de mRNA específicas dos construtos de RNAi a serem testadas. As sequências de mRNA foram flanqueadas por dez nucleotídeos adicionais em cada extremidade. O vetor, “PP3A (DM)”, foi empacotado em serótipo AAV, AAVDJ8 (isento de endotoxina). Antes da injeção, PP3A (DM) foi diluído em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) até 5×1011 partículas virais por animal e injetado intravenosamente na veia da cauda de camundongos machos BALB/c (Charles River Laboratories Inc.). Os camundongos tinham geralmente 10-12 semanas de idade e um n = 5 animais foi incluído por grupo.
[0228] Duas semanas após injeção de AAV, os camundongos foram injetados com Substrato Bioluminescente RediJect D- Luciferina (PerkinElmer, 770504) de acordo com as instruções do fabricante. Após um pulso de dez minutos, os camundongos foram visualizados em um IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer). Os camundongos foram depois randomizados em grupos de acordo com as pontuações de fluxo total da linha de base de uma região de interesse definida englobando o fígado. Uma vez randomizados, os camundongos foram tratados com uma dose única de construto de RNAi (0,5 mM), através de injeção subcutânea, a 1,0 ou 3,0 miligramas por quilograma de peso corporal, diluída em solução salina tamponada com fosfato (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) ou tratada somente com solução salina tamponada com fosfato (indicado como “veículo”). Os camundongos foram visualizados semanalmente seguindo o mesmo protocolo, aplicando as mesmas restrições de passagem para pontuações de fluxo total. Os dados são representados como fluxo total (fótons por segundo, eixo y) versus a semana pós-injeção de construto de RNAi (eixo x). Uma redução no fluxo total indica expressão reduzida do repórter de luciferase.
[0229] Os resultados desta experiência são mostrados nas Figuras 4A e 4B. O sinal do repórter de luciferase de animais tratados com os diferentes construtos de RNAi tendo o padrão P9 foi significativamente reduzido em comparação com o sinal de animais tratados com veículo durante pelo menos 3 semanas após uma dose única de 1 mg/kg (Figura 4A) e pelo menos 5 semanas para uma dose única de 3 mg/kg (Figura 4B) dos construtos de RNAi. Para muitos dos construtos de RNAi, uma dose única de 3 mg/kg foi suficiente para inibir a expressão do repórter de luciferase durante até 6 semanas.
[0230] Estes construtos de RNAi (dúplexes n.os 7318, 7320, 7062, 8513 e 8709) foram também avaliados no modelo de camundongo humanizado descrito acima. Especificamente, os construtos de RNAi foram administrados subcutaneamente a camundongos expressando o gene variante PNPLA3rs738409-rs738408 humanizado a 0,5, 1 ou 3 mg/kg. Os níveis de expressão de
PNPLA3 humana no fígado foram avaliados por qPCR aos 28 ou 42 dias após administração dos construtos de RNAi.
Os resultados são apresentados como o silenciamento relativo da expressão de mRNA de PNPLA3 humano em comparação com animais de controle tratados com veículo e são mostrados na Tabela 2 em baixo.
Tabela 2. Eficácia In Vivo de Construtos de RNAi de PNPLA3 Dia 28 Dia 42 Dúple Dose Silenciament Erro Silenciament Erro x N.º (mg/kg o Relativo Padrã o Relativo Padrã ) Médio o Médio o (n = 4) (n = 4)
8709 0,5 -57,95 2,07 — — 8513 0,5 -46,58 7,95 — — 7318 0,5 -68,83 6,18 — — 7320 0,5 -50,01 3,38 — — 7062 0,5 -50,65 5,23 — —
8709 1 -71,96 4,58 -54,55 5,67 8513 1 -74,47 2,17 -60,54 2,32 7318 1 -76,88 3,04 -71,07 2,41 7320 1 -66,30 3,27 -62,21 4,36 7062 1 -69,37 2,32 -57,74 4,30
8709 3 -91,70 2,00 -81,13 3,19 8513 3 -90,54 1,17 -74,77 3,28 7318 3 -93,25 1,13 -70,80 8,38 7320 3 -91,08 0,60 -80,12 4,64 7062 3 -90,52 1,42 -83,75 1,56
[0231] Os construtos de RNAi tendo o padrão de modificação P9 são mais potentes e produzem uma duração mais longa de silenciamento do gene do que os padrões previamente testados. A administração dos construtos de RNAi a uma dose única de 0,5 mg/kg resultou em cerca de 50% de redução na expressão hepática de PNPLA3 humana às quatro semanas após administração da dose única, ao passo que a administração dos construtos a uma dose de 1 mg/kg resultou em cerca de 70% de redução na expressão hepática de PNPLA3 humana às quatro semanas após administração da dose única. A dose de 1 mg/kg foi suficiente para manter redução maior do que 55% da expressão de PNPLA3 até seis semanas após uma dose única. A administração de uma dose única de 3 mg/kg dos construtos de RNAi resultou em uma redução de 90% ou maior da expressão hepática de PNPLA3 humana às quatro semanas após administração da dose única. A expressão hepática de PNPLA3 humana foi ainda reduzida até cerca de 75% ou maior às seis semanas após administração da dose de 3 mg/kg. A potência e a duração do silenciamento do gene melhoradas foram observadas com construtos de RNAi tendo duas sequências distintas ilustrando que o padrão de modificação química P9 é eficaz na estabilização de construtos de RNAi pelo menos parcialmente independente da sequência de nucleobases.
[0232] Depois, a eficácia in vivo de construtos de RNAi de PNPLA3 tendo o padrão de modificação química P9 foi comparada com construtos de RNAi de PNPLA3 tendo um de três padrões de modificação de controle diferentes. Foi relatado previamente que os padrões de modificação CM2, CM3 e CM4 aumentem a estabilidade metabólica de moléculas de siRNA levando a potência e duração do silenciamento do gene melhoradas. Ver
Foster et al., Molecular Therapy, Vol. 26: 708-717, 2018. Todos os construtos de RNAi tinham as mesmas sequências de nucleotídeos nucleares nas fitas senso e antissenso e diferiam somente no padrão de modificação química. Dois construtos diferentes tendo o padrão de modificação P9 foram sintetizados - um tendo um abásico invertido na extremidade 3´ da fita senso (dúplex n.º 7318) e um tendo uma desoxitimidina invertida na extremidade 3´ da fita senso (dúplex n.º 8709). Construtos de RNAi tendo um dos padrões de modificação CM2, CM3 ou CM4 foram também sintetizados (dúplexes n.os 8103, 8104 e 8105, respectivamente). Cada um dos construtos de RNAi foi depois administrado subcutaneamente a camundongos expressando o gene variante PNPLA3rs738409-rs738408 humanizado a uma dose de 3 mg/kg. Os níveis de expressão de PNPLA3 humana no fígado foram avaliados por qPCR aos 28 dias após administração dos construtos de RNAi. Os resultados são mostrados na Figura 5. O construto de RNAi tendo o padrão de modificação P9 com o abásico invertido na extremidade 3´ da fita senso (dúplex n.º 7318) produziu a maior redução na expressão hepática de PNPLA3 entre todos os construtos testados. O construto de RNAi tendo o padrão de modificação P9 com a desoxitimidina invertida na extremidade 3´ da fita senso (dúplex n.º 8709) produziu uma redução maior na expressão hepática de PNPLA3 do que o construto tendo padrão CM4 (dúplex n.º 8105) e reduções comparáveis na expressão hepática de PNPLA3 com os construtos tendo os padrões CM2 e CM3 (dúplexes n.os 8103 e 8104, respectivamente).
[0233] Em um conjunto separado de experiências, variações alternativas do padrão de modificação P3 foram desenhadas e avaliadas quanto à eficácia in vivo no modelo de camundongo de PNPLA3 humanizado.
As variações do padrão P3 foram aplicadas a construtos de RNAi com duas sequências diferentes.
As sequências das fitas senso e antissenso para cada um dos construtos de RNAi são mostradas na Tabela 1 e os padrões de modificação são mostrados esquematicamente na Figura 1. Os construtos de RNAi foram administrados subcutaneamente a camundongos expressando o gene variante PNPLA3rs738409-rs738408 humanizado a uma dose de 3 mg/kg.
Os níveis de expressão de PNPLA3 humana no fígado foram avaliados por qPCR aos 28 dias após administração dos construtos de RNAi.
Os resultados são mostrados na Tabela 3 em baixo.
Todos os construtos de RNAi produziram uma redução de cerca de 90% ou maior na expressão hepática de PNPLA3 humana às quatro semanas após uma única injeção subcutânea de 3 mg/kg.
Tabela 3. Eficácia In Vivo de Construtos de RNAi de PNPLA3 com Padrões de Modificação Química Alternativos Dúplex Designação Designação Silenciamento Padrão N.º de Padrão de Família Relativo Erro de Médio ao dia Sequências 28 (n = 4)
6883 P3 T5,1 -89,28 2,29 7319 P9 T5,1 -95,93 0,91 7464 P10 T5,1 -90,63 1,52 7463 P11 T5,1 -93,78 0,90 7470 P15 T5,1 -90,58 2,70 7466 P16 T5,1 -95,25 0,26 7469 P17 T5,1 -95,43 0,78
7064 P3 T23 -95,67 1,42 7576 P11 T23 -89,20 1,90 7580 P12 T23 -93,68 1,29 7579 P18 T23 -91,35 1,84 Exemplo 2. Atividade In Vivo de Construtos de RNAi de ASGR1 com Diferentes Padrões de Modificação Química
[0234] Como mostrado no Exemplo 1, o padrão de modificação química P1 aplicado a 13 diferentes construtos de RNAi com diferentes sequências visando o mRNA de PNPLA3 humano melhorou a potência de silenciamento do gene dos construtos. Para explorar se o padrão de modificação química P1 intensificaria a potência dos construtos de RNAi visando um outro gene do fígado, um construto de RNAi visando o mRNA do receptor de asialoglicoproteína 1 (ASGR1) foi sintetizado com o padrão de modificação química P1 de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. Um construto de RNAi tendo a mesma sequência foi sintetizado com o padrão de modificação química de controle CM1. As sequências dos construtos de RNAi são proporcionadas em baixo na Tabela 4 usando as mesmas notações descritas acima para a Tabela 1. Uma fração de GalNAc com a estrutura mostrada na Fórmula VII foi conjugada à extremidade 5´ da cadeia senso do construto de RNAi designado como dúplex n.º 1520 e uma fração de GalNAc com a estrutura mostrada na Fórmula IX foi conjugada à extremidade 5´ da cadeia senso do construto de RNAi designado como dúplex n.º 1421. A conjugação das frações de GalNAc às cadeias senso dos construtos de RNAi foi conduzida como descrito no Exemplo 1, exceto que, para a fração de GalNAc com a estrutura mostrada na Fórmula IX, a fração de GalNAc foi preparada como se segue. A uma solução de ácido 2-(2-(2-(2-
(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6- (acetoximetil)tetra-hidro-2H-piran-2- il)oxi)etoxi)etoxi)etoxi)acético (5,37 g, 10 mmol) em DMF (40 mL) foi adicionado TATU (3,22 g, 10 mmol), e a solução foi agitada durante 5 min. DIEA (2,96 mL, 17 mmol) foi adicionada à solução, e a mistura foi depois adicionada à resina descrita no Exemplo 1 acima. A suspensão foi mantida à temperatura ambiente durante a noite e o solvente foi drenado. A resina foi lavada com DMF (3 x 30 mL) e DCM (3 x 30 mL). Tabela 4. Construtos de RNAi de ASGR1 Modificados Exemplificativos Dúp Desig Fra Sequência Senso S Sequência Antissenso S lex nação ção (5'-3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Gal I I o NAc D D
N N
O O : : 142 CM1 Fór GfuGfgGfaAfgAfAfAf 8 {Phos}asCfsuUfcAfuCfu 8 1 mul gAfuGfaAfgUfsusUf 1 uuCfuUfcCfcAfcsUfsu 3 a IX 152 P1 Fór gugggaAfgAfAfAfGfa 8 {Phos}asCfsuUfcAfUfcu 8 0 mul ugaagususu 2 uuCfuUfcccacsusu 4 a
VII
[0235] A eficácia in vivo dos construtos de RNAi na inibição da expressão hepática de ASGR1 de camundongo foi avaliada por administração dos construtos de RNAi a camundongos C57BL/6J. Animais C57BL/6 de tipo selvagem com 10-12 semanas de idade (Charles River) foram alimentados com ração padrão (2020× dieta global para roedores extrudada sem proteína de soja Teklad; Harlan). Os camundongos receberam uma injeção subcutânea de tampão ou do construto de RNAi indicado a 5 mg/kg de peso corporal em 0,25 mL de tampão no dia 0 (n = 9 por grupo). Três animais no dia 4, três animais no dia 8 e três animais no dia 15 foram coletados para análise adicional. O RNA total do fígado de animais coletados foi processado para análise de qPCR. A eficácia do construto de RNAi foi avaliada por comparação da quantidade de mRNA de Asgr1 no tecido hepático dos animais tratados com o construto de RNAi com a quantidade de mRNA de Asgr1 no tecido hepático de animais injetados com tampão. Os resultados mostram que os animais recebendo o construto de RNAi tendo o padrão de modificação P1 (dúplex n.º 1520) exibiram uma maior redução na expressão hepática de ASGR1 do que os animais recebendo o construto de RNAi tendo o padrão de modificação de controle CM1 em todos os momentos medidos (Figura 6). Similar aos resultados descritos no Exemplo 1 com construtos de RNAi visando o mRNA de PNPLA3 humana, o padrão de modificação química P1 melhora a potência dos construtos de RNAi. Exemplo 3. Atividade In Vivo de Construtos de RNAi de LPA com Diferentes Padrões de Modificação Química
[0236] Para avaliar adicionalmente a capacidade dos padrões de modificação química descritos aqui de melhorar a potência in vivo dos construtos de RNAi, os construtos de RNAi visando um terceiro gene do fígado, o gene LPA, foram sintetizados e conjugados a uma fração de GalNAc com a estrutura mostrada na Fórmula VII de acordo com os métodos descritos no Exemplo
1. As sequências dos construtos de RNAi são proporcionadas em baixo na Tabela 5 usando as mesmas notações descritas acima para a Tabela 1. A Tabela 5 lista também a designação de padrão e a designação de família de sequências para cada construto de RNAi. As designações de padrão são esquematicamente representadas na Figura 1. Se um construto de RNAi tiver a mesma designação de família de sequências que um outro construto de RNAi, então os dois construtos têm a mesma sequência nuclear, mas diferem no padrão de modificação química. Tabela 5. Construtos de RNAi de LPA Modificados Exemplificativos Dúp Desig Desig Sequência Senso (5'- S Sequência Antissenso S lex nação nação 3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : : 363 CM1 T101 GfcCfcCfuUfaUfUfGfuU 8 {Phos}usCfsgUfaUfaAf 1 2 faUfaCfgAfsusUf 5 caaUfaAfgGfgGfcsUfsu 0 7
Dúp Desig Desig Sequência Senso (5'- S Sequência Antissenso S lex nação nação 3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
363 P1 T101 gccccuUfaUfUfGfUfuau 8 {Phos}usCfsgUfaUfAfa 1 5 acgasusu 6 caaUfaAfggggcsusu 0 8 497 P1 T102 acacaaUfgCfUfCfAfgac 8 {Phos}csUfsgCfgUfCfu 1 3 gcagsusu 7 gagCfaUfugugususu 0 9 624 P4 T102 [invAb]ugacacaaUfgCf 8 {Phos}csUfsgCfgUfCfu 1 8 UfCfAfgacgcsasg 8 gagCfaUfugugucasusu 1 0 793 P19 T102 ugacacAfaUfGfCfUfcag 8 usUfsgCfgUfcUfGfagca 1 4 acgcas[invAb] 9 UfuGfugucasusu 1 1 109 P27 T102 acacaaUfgCfUfCfAfgac 9 usUfsgcguCfugagCfaUf 1 27 gcaaus[invAb] 0 ugugususu 1 2 113 P28 T102 acacaaUfgCfUfCfAfgac 9 usUfsgcguCfugagCfaUf 1 51 gcas[invAb] 1 ugugususu 1 2
Dúp Desig Desig Sequência Senso (5'- S Sequência Antissenso S lex nação nação 3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
460 P1 T103 ccuagaGfgCfUfCfCfuuc 9 {Phos}usUfscAfgAfAfg 1 1 ugaasusu 2 gagCfcUfcuaggsusu 1 3 624 P6 T103 agccuagaGfgCfUfCfCfu 9 {Phos}usUfscAfgAfAfg 1 7 ucugsasa 3 gagCfcUfcuaggcususu 1 4 833 P10 T104 [invAb]uucgcccuUfgGf 9 usGfsguguAfacacCfaAf 1 6 UfGfUfuacacscsa 4 gggcgaasusu 1 5 113 P25 T104 [invAb]cgcccuUfGfGfU 9 usGfsguguAfacacCfaAf 1 13 fguuacaccasusu 5 gggcgsusu 1 6 113 P22 T104 [invAb]cgcccuUfGfGfU 9 usGfsguguAfacaccaAfg 1 18 fguuacacscsa 6 Gfgcgsusu 1 7 113 P19 T105 cagaauCfaAfGfUfGfucc 9 usUfsgCfaAfgGfAfcacu 1 72 uugcas[invAb] 7 UfgAfuucugsusu 1 8
Dúp Desig Desig Sequência Senso (5'- S Sequência Antissenso S lex nação nação 3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : :
171 P25 T105 [invAb]gaaucaAfGfUfG 9 usUfsgcaaGfgacaCfuUf 1 83 fuccuugcaasusu 8 gauucsusu 1 9 184 P30 T105 cagaaucaAfGfUfGfuccu 9 usUfsgcaaGfgacaCfuUf 1 44 ugcas[invAb] 9 gauucsusg 2 0 115 P27 T106 aaucaaGfuGfUfCfCfuug 1 asUfsugcaAfggacAfcUf 1 80 caauus[invAb] 0 ugauususu 2 0 1 184 P29 T106 agaaucaaGfuGfUfCfCfu 1 asUfsugcaAfggacAfcUf 1 36 ugcaas[invAb] 0 ugauuscsu 2 1 2 839 P19 T107 agucuuGfgUfCfCfUfcua 1 asUfsgUfcAfuAfGfagga 1 5 ugacas[invAb] 0 CfcAfagacususu 2 2 3 840 P9 T107 agucuuggUfcCfUfCfUfa 1 asUfsgucaUfagagGfaCf 1 1 ugacas[invAb] 0 caagacususu 2 3 4
Dúp Desig Desig Sequência Senso (5'- S Sequência Antissenso S lex nação nação 3') E (5'-3') E N.º de de Q Q Padrã Famíl I I o ia de D D Sequê N N ncias O O : : 113 P24 T107 agucuuGfgUfCfCfUfcua 1 asUfsgUfcAfuagaggaCf 1 44 ugacas[invAb] 0 cAfagacususu 2 2 5 499 P1 T108 uucugaAfgAfAfGfCfacc 1 {Phos}asGfsuUfgGfUfg 1 5 aacususu 0 cuuCfuUfcagaasusu 2 4 6 618 P2 T108 [invAb]uucugaAfgAfAf 1 {Phos}asGfsuUfgGfUfg 1 2 GfCfaccaacususu 0 cuuCfuUfcagaasusu 2 5 6 615 P7 T108 [invAb]ccuucugaAfgAf 1 {Phos}asGfsuUfgGfUfg 1 0 AfGfCfaccaacs[invAb] 0 cuuCfuUfcagaaggsusu 2 6 7
[0237] Em uma experiência inicial, construtos de RNAi tendo a mesma sequência de nucleotídeos foram sintetizados para terem o padrão de modificação química de controle CM1 (dúplex n.º 3632) ou o padrão de modificação química P1 (dúplex n.º 3635). A eficácia in vivo dos dois construtos foi avaliada em um modelo de camundongo transgênico duplo, que expressa uma partícula de Lp(a) humana totalmente funcional com níveis sérios de linha de base de Lp(a) de cerca de 50-60 mg/dL em média. Lp(a) é uma lipoproteína de baixa densidade consistindo em uma partícula de LDL e a glicoproteína apolipoproteína (a) (apo(a)), que está ligada à apolipoproteína B da partícula de LDL por uma ligação de dissulfeto. Apo(a) é codificada pelo gene LPA e as mudanças nos níveis séricos de Lp(a) refletem mudanças na expressão do gene LPA. Os camundongos transgênicos duplos foram gerados por cruzamento de camundongos transgênicos expressando apo(a) humana de um cromossomo artificial de levedura (YAC) contendo o gene LPA humano total (Frazer et al., Nature Genetics, Vol. 9: 424-431, 1995) com camundongos transgênicos expressando apoB-100 humana (Linton et al., J. Clin. Invest., Vol. 92: 3029-3037, 1993). Os construtos de RNAi de LPA foram administradas como uma única injeção subcutânea a uma dose de 0,5 mg/kg. Amostras de soro foram tiradas antes da injeção e depois pós-injeção no dia 14 e dia 28. As concentrações de Lp(a) foram medidas no soro usando um ensaio ELISA de Lp(a) (# de Cat. 10-1106-01, Mercodia AB, Uppsala, Suécia). Uma percentagem de mudança no nível de Lp(a) para cada animal em um momento particular foi calculada com base no nível da linha de base de Lp(a) desse animal. Os resultados são mostrados na Figura 7. Às duas semanas após injeção, embora não estatisticamente significativo, a administração do dúplex n.º 3635, que tinha o padrão de modificação P1, resultou em uma diminuição média maior nos níveis séricos de Lp(a) (-49%) em comparação com o dúplex n.º 3632 (-35%), que tinha o padrão de modificação de controle CM1.
[0238] Em uma segunda série de experiências, construtos de RNAi de LPA visando áreas distintas do mRNA de LPA daquelas no primeiro conjunto de experiências foram sintetizados com o padrão de modificação química P1 ou uma variação desse padrão.
Os construtos de RNAi com os novos padrões foram avaliados no modelo de camundongo transgênico duplo quanto a melhorias tanto na magnitude como na duração da supressão da expressão do gene LPA in vivo.
Especificamente, os construtos de RNAi de LPA de três famílias de sequências diferentes tendo o padrão de modificação P1 ou uma das variantes do padrão (p. ex., padrões de modificação química P2, P4, P6 ou P7) foram administrados subcutaneamente aos camundongos transgênicos duplos descritos acima a uma dose de 2 mg/kg.
Os níveis séricos de Lp(a) foram medidos nos animais antes da injeção para obter os níveis da linha de base e às semanas 1, 2 e 4 após administração dos construtos de RNAi de LPA.
Os resultados deste conjunto de experiências são mostrados na Tabela 6 em baixo.
Entre as três famílias de sequências, os construtos de RNAi tendo o padrão de modificação P2, P4, P6 ou P7 resultaram em uma maior redução e duração da supressão dos níveis séricos de Lp(a) em comparação com os construtos de RNAi tendo o padrão de modificação P1. Os construtos de RNAi tendo os padrões de modificação química P6 ou P7 resultaram em redução maior do que 80% dos níveis séricos de Lp(a) até 4 semanas após uma única injeção subcutânea de 2 mg/kg.
Tabela 6. Eficácia In Vivo de Construtos de RNAi de LPA
Percentagem de Mudança na Lp(a) Sérica a partir da Linha de Base (média ± SEM) Dúplex Designação Designação Semana Semana Semana N.º de Padrão de Família 1 2 4 de Sequências P1 T102 -66 ± -73 ± 16 ± 4973 6% 7% 21% P4 T102 -73 ± -78 ± -37 ± 6248 12% 10% 15% P1 T103 -92 ± -95 ± -76 ± 4601 2% 1% 3% P6 T103 -93 ± -95 ± -86 ± 6247 2% 1% 1% P1 T108 -70 ± -70 ± 14 ± 4995 12% 12% 33% P2 T108 -87 ± -82 ± -45 ± 6182 1% 5% 7% P7 T108 -92 ± -93 ± -83 ± 6150 2% 2% 1%
[0239] Depois, variações alternativas dos padrões de modificação química foram desenhadas e avaliadas quanto à eficácia in vivo no modelo de camundongo transgênico duplo. As variações do padrão de modificação química foram aplicadas a construtos de RNAi com sequências de cinco famílias de sequências diferentes. As sequências das fitas senso e antissenso para cada um dos construtos de RNAi são proporcionadas na Tabela 5 e os padrões de modificação são mostrados esquematicamente na Figura 1. Os construtos de RNAi foram administrados subcutaneamente a camundongos transgênicos duplos expressando partículas de Lp(a) humana a uma dose de 1 mg/kg.
Os níveis séricos de Lp(a) foram medidos nos animais antes da injeção para obter os níveis da linha de base e às semanas 2, 3 e 4 após administração dos construtos de RNAi de LPA.
Os resultados são mostrados na Tabela 7 em baixo.
Várias das variações do padrão, tais como P9, P19, P22, P24, P27, P28 e P29, resultaram em níveis séricos de Lp(a) reduzidos em mais do que 50% às quatro semanas após uma única injeção subcutânea de 1 mg/kg.
Os construtos de RNAi tendo o padrão de modificação química P27 foram particularmente eficazes na supressão dos níveis séricos de Lp(a) pois estes construtos produziram uma redução sustentada de cerca de 75% dos níveis de Lp(a) às quatro semanas após uma única injeção.
Tabela 7. Eficácia In Vivo de Construtos de RNAi de LPA com Padrões de Modificação Química Alternativos Percentagem de Mudança Média na Lp(a) Sérica a partir da Linha de Base
Dúplex Designação Designação Semana Semana Semana N.º de Padrão de Família 2 3 4 de Sequências
7934 P19 T102 -77% -76% -28% 10927 P27 T102 -92% -85% -77% 11351 P28 T102 -85% -89% -68% 8336 P10 T104 -39% -59% -16%
Percentagem de Mudança Média na Lp(a) Sérica a partir da Linha de Base Dúplex Designação Designação Semana Semana Semana N.º de Padrão de Família 2 3 4 de Sequências 11318 P22 T104 -64% -81% -64% 11313 P25 T104 -51% -54% +3 11372 P19 T105 -72% -75% -13% 17183 P25 T105 -56% -37% -16% 18444 P30 T105 -75% -70% -44% 11580 P27 T106 -86% -78% -74% 18436 P29 T106 -87% -80% -63% 8401 P9 T107 -90% -82% -58% 8395 P19 T107 -79% -84% -59% 11344 P24 T107 -87% -75% -67%
[0240] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente discutidos e citados aqui são deste modo incorporados por referência em suas totalidades. É entendido que a invenção divulgada não está limitada à metodologia, protocolos e materiais descritos particulares pois estes podem variar. É também entendido que a terminologia usada aqui é somente para os propósitos de descrição de modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo das reivindicações anexas.
[0241] Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas aqui.
É pretendido que tais equivalentes sejam abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims (71)

REIVINDICAÇÕES
1. Construto de RNAi que inibe a expressão de uma sequência do gene alvo, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar à sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (A): 5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NM NL NM NL NL NF NM NL NM NL NF NL- 5′ (A) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- flúor, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um ácido nucleico bicíclico (BNA) e um desoxirribonucleotídeo; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ-
O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; x é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso; y é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso; e z é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares a nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
2. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fita senso e a fita antissenso têm, cada uma independentemente, 19 a 30 nucleotídeos de comprimento.
3. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fita senso e a fita antissenso têm, cada uma independentemente, 19 a 25 nucleotídeos de comprimento.
4. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 0, y é 2 e z é 2.
5. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 1 e NA é um nucleotídeo abásico invertido, y é 2 e z é 2.
6. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 2, y é 0 e z é 4.
7. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 2, y é 0 e z é 2.
8. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 3 e o NA na extremidade 5´ é um nucleotídeo abásico invertido, y é 0 e z é 4.
9. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 0, y é 0 e z é 2.
10. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que x é 1 e NA é um nucleotídeo abásico invertido, y é 0 e z é 2.
11. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, caracterizado pelo fato de que NT é um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila
12. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metila.
13. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 4 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
14. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o NM na posição 6 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
15. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o NM na posição 10 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
16. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 10 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
17. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o NM na posição 4 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
18. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 4, 6 e 10 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM na posição 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
19. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, caracterizado pelo fato de que cada NM, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metila.
20. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila.
21. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-flúor.
22. Construto de RNAi que inibe a expressão de uma sequência do gene alvo, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar à sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (B): 5′-(NA)x NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NF NL NF NL NF NL- 5′
(B) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; x é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso; y é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso; e z é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares a nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
23. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que x é 0, y é 2 e z é 2.
24. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que x é 0, y é 0 e z é 2.
25. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que x é 1 e NA é um nucleotídeo abásico invertido, y é 2 e z é 2.
26. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que x é 2, y é 0 e z é 4.
27. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que x é 3 e o NA na extremidade 5´ é um nucleotídeo abásico invertido, y é 0 e z é 4.
28. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26 e 27, caracterizado pelo fato de que NT é um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila
29. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24, 25, 26, 27 e 28, caracterizado pelo fato de que cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila.
30. Construto de RNAi que inibe a expressão de uma sequência do gene alvo, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar à sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (C): 5′-(Ab)x NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NF NF NF NL NL NM NL NM NL NT- 3′ 3′-NL NL NL NL NL NL NL NL NL NF NL NF NL NL NL NL NF NL NL NM NL NF NL- 5′ (C) em que:
a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- flúor, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; e x é 0 ou 1 e Ab é um nucleotídeo abásico invertido.
31. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que cada NM, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metila.
32. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que NT é um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido e x é
0.
33. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que NT é um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila e x é 1.
34. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de o NM na fita antissenso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-flúor.
35. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila.
36. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de cada NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-flúor.
37. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35 e 36, caracterizado pelo fato de que NT é um nucleotídeo abásico invertido ou desoxirribonucleotídeo invertido e x é 0.
38. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 e 37, caracterizado pelo fato de que cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila.
39. Construto de RNAi que inibe a expressão de uma sequência do gene alvo, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma sequência que é complementar à sequência do gene alvo e a fita senso compreende uma sequência que é suficientemente complementar à sequência da fita antissenso para formar uma região de dúplex, em que o construto de RNAi compreende uma estrutura representada pela Fórmula (D):
5′-(NA)x NL NL NL NL NM NL NF NF NF NF NL NL NL NL NL NL NL NL NT(n)y-3′ 3′-(NB)z NL NL NL NM NL NF NL NM NL NL NM NM NM NM NL NM NL NF NL- 5′
(D) em que: a fita superior listada na direção 5′ para 3′ é a fita senso e a fita inferior listada na direção 3′ para 5′ é a fita antissenso; cada NF representa um nucleotídeo modificado por 2′- flúor; cada NM representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- flúor, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um ácido nucleico bicíclico (BNA) e um desoxirribonucleotídeo; cada NL representa independentemente um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo modificado por 2ʹ- O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; NT representa um nucleotídeo modificado selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo; x é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando x é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NA sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O- metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NA podem ser complementares a nucleotídeos na fita antissenso; y é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando y é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais n nucleotídeos sejam nucleotídeos salientes modificados ou não modificados que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita antissenso; e z é um número inteiro de 0 a 4, contanto que, quando z é 1, 2, 3 ou 4, um ou mais dos nucleotídeos NB sejam um nucleotídeo modificado independentemente selecionado de um nucleotídeo modificado por 2´-O-metila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-metoxietila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alquila, um nucleotídeo modificado por 2´-O-alila, um BNA e um desoxirribonucleotídeo, e um ou mais dos nucleotídeos NB podem ser complementares a nucleotídeos NA quando presentes na fita senso ou podem ser nucleotídeos salientes que não formam pares de bases com nucleotídeos na fita senso.
40. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a fita senso e a fita antissenso têm, cada uma independentemente, 19 a 30 nucleotídeos de comprimento.
41. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a fita senso e a fita antissenso têm, cada uma independentemente, 19 a 25 nucleotídeos de comprimento.
42. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que x é 2, y é 0 e z é 4.
43. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que x é 1 e NA é um nucleotídeo abásico invertido, y é 2 e z é 2.
44. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que x é 1 e NA é um nucleotídeo abásico invertido, y é 0 e z é 2.
45. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que x é 0, y é 0 e z é 2.
46. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que x é 2, y é 0 e z é 2.
47. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 e 46, caracterizado pelo fato de que NT é um nucleotídeo abásico invertido, um desoxirribonucleotídeo invertido ou um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila.
48. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 e 47, caracterizado pelo fato de que cada NL, em ambas as fitas senso e antissenso, é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O- metila.
49. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 4, 6, 8, 9 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor, e o NM nas posições 7 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'- O-metila.
50. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 4, 6, 8, 9 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM nas posições 7 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
51. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 4, 6, 8, 9 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM nas posições 7 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
52. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48, caracterizado pelo fato de que o NM nas posições 7, 8, 9 e 12 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, e o NM nas posições 4, 6 e 16 na fita antissenso contando a partir da extremidade 5´ é, cada um, um nucleotídeo modificado por 2'-flúor.
53. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 e 52, caracterizado pelo fato de que o NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-flúor.
54. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 e 52, caracterizado pelo fato de que o NM na fita senso é um nucleotídeo modificado por 2ʹ-O-metila.
55. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 e 54, caracterizado pelo fato de que a fita senso, a fita antissenso ou ambas as fitas senso e antissenso compreendem uma ou mais ligações internucleotídicas de fosforotioato.
56. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a fita antissenso compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 3´ e 5´.
57. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 e 56, caracterizado pelo fato de que a fita senso compreende uma única ligação internucleotídica de fosforotioato entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3´.
58. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 e 56, caracterizado pelo fato de que a fita senso compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato consecutivas entre os nucleotídeos terminais na extremidade 3´.
59. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 e 58, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi compreende adicionalmente um ligante.
60. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende uma fração de colesterol, uma vitamina, um esteroide, um ácido biliar, uma fração de folato, um ácido graxo, um carboidrato, um glicosídeo ou anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.
61. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o ligante visa a distribuição do construto de RNAi aos hepatócitos.
62. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende galactose, galactosamina ou N-acetil-galactosamina.
63. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende uma fração de galactose multivalente ou fração de N-acetil- galactosamina multivalente.
64. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a fração de galactose multivalente ou fração de N-acetil-galactosamina multivalente é trivalente ou tetravalente.
65. Construto de RNAi, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59, 60, 61, 62, 63 e 64, caracterizado pelo fato de que o ligante é covalentemente anexado à fita senso opcionalmente através de um ligador.
66. Construto de RNAi, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o ligante é covalentemente anexado à extremidade 5' da fita senso.
67. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de RNAi, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 e 66, e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
68. Método para inibir a expressão de um gene alvo em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da célula com o construto de RNAi, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 e 66.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que as células estão in vivo.
70. Método para inibir a expressão de um gene alvo em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do sujeito do construto de RNAi, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 e 66.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o construto de RNAi é administrado ao sujeito através de uma via de administração parenteral.
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