BR112021008767A2 - métodos e composições para o tratamento de doença infecciosa, autoimune e alérgica - Google Patents

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John W. COLSON
Lauren Anders HESSER
Cathryn R. Nagler
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Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA INFECCIOSA, AUTOIMUNE E ALÉRGICA. A presente invenção refere-se a métodos e composições para o tratamento de alergias alimentares, condições infecciosas, autoimunes e outras condições alérgicas. Consequentemente, a atual revelação se refere a um método para o tratamento de uma doença infecciosa, autoimune ou alérgica em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae ao indivíduo. Outros aspectos se referem a um método para o tratamento de uma alergia alimentar ou para a redução de uma resposta alérgica a um alérgeno ou para o tratamento de ou prevenção de uma resposta anafilática em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.

Description

“MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA INFECCIOSA, AUTOIMUNE E ALÉRGICA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001]O presente pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido de Patente Provisório Norte-Americano Nº 62/755.945 depositado em 5 de novembro de 2018, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
1. CAMPO DA INVENÇÃO
[002]A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular e medicina.
2. HISTÓRICO
[003]Um aumento geracional acentuado na prevalência da doença em sociedades ocidentalizadas tornou a alergia alimentar uma preocupação de saúde pública principal (1, 2). Uma hipótese para este aumento rápido na incidência propõe que fatores de estilo de vida recentes, incluindo uso frequente de antibióticos, mudanças na dieta, e taxas maiores de parto de cesárea e alimentação com fórmula, alteraram a composição da microbiota intestinal comensal, aumentando a suscetibilidade a doenças alérgicas.
Interações hospedeiro-microbiota são esenciais para estabelecer homeostase imune apropriada e perturbações de populações bacterianas selecionadas naturalmente, frequentemente referidas como disbiose, foram ligadas a muitas patologias diferentes; muitos estudos sugerem que a disbiose precoce pode ser particularmente prejudicial (3, 4).
[004]Há uma necessidade na técnica de composições que modiquem o microbioma para o tratamento eficaz de alergias e outras condições relacionadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005]A atual revelação satisfaz a necessidade na técnica de prover métodos e composições para o tratamento de alergias alimentares, condições infecciosas, autoimunes, e outras condições atópicas. Consequentemente, a atual revelação se refere a um método para o tratamento de uma doença infecciosa, autoimune ou alérgica em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae ao indivíduo. Outros aspectos se referem a um método para o tratamento de uma alergia alimentar ou para a redução de uma resposta alérgica a um alérgeno ou para o tratamento de ou prevenção de uma resposta anafilática em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo. Em alguns aspectos, o método se refere ao tratamento de uma alergia alimentar em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo. Em alguns aspectos, o método se refere ao tratamento de um indivíduo em risco de ter ou de desenvolver uma alergia alimentar ou resposta anafilática compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
Por exemplo, o indivíduo pode estar em risco devido a ter um histórico familiar de uma alergia alimentar ou uma predisposição genética a uma alergia alimentar ou em risco de resposta anafilática devido à exposição acidental a um alérgeno. Em alguns aspectos, o indivíduo é um que tem um perfil microbiano que é desfavorável ou uma indicação de que uma alergia alimentar pode estar presente ou pode se desenvolver no indivíduo. Em outros aspectos, os métodos se referem à redução de uma resposta alérgica a um alérgeno em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
Em outros aspectos, os métodos se referem ao tratamento ou prevenção de uma resposta anafilática em um indivíduo compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo. Ainda aspectos adicionais se referem a um método para o tratamento de uma doença atópica em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
Em alguns aspectos, o método é para o tratamento de atopia em um indivíduo pela administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
[006]Outros aspectos se referem a um método para o diagnóstico de um indivíduo com uma alergia alimentar, o método compreendendo a determinação da razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras; em que o indivíduo é diagnosticado com uma alergia alimentar quando a razão é menor do que 3. Outros aspectos se referem a um método para o diagnóstico de um indivíduo com uma condição alérgica, infeção ou condição autoimmune, o método compreendendo a determinação da razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras; em que o indivíduo é diagnosticado com uma condição alérgica, infecção ou condição autoimune quando a razão é menor do que 3. Em algumas modalidades, a razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras é menor do que, maior do que, ou cerca de 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 (ou qualquer faixa derivável delas).
[007]Outros aspectos da revelação se referem a uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico. Outros aspectos se referem a um comprimido, cápsula ou pó compreendendo a composição da revelação.
[008]Descritas abaixo são as modalidades específicas que podem ser usadas com qualquer dos aspectos descritos acima e aqui.
[009]Em algumas modalidades dos aspectos revelados acima, os métodos se referem ao tratamento de uma doença atópica. Em algumas modalidades, a doença atópica compreende eczema, dermatite atópica, asma ou rinite alérgica.
[010]Em algumas modalidades, o método é para a redução de uma resposta alérgica a um alérgeno em um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi determinado para inibir uma resposta alérgica ao alérgeno. As respostas alérgicas podem tomar múltiplas formas e ter múltiplos níveis de gravidade ou intensidade. Estas respostas alérgicas podem variar de pessoa para pessoa, mas elas também variam ao longo do tempo para qualquer indivíduo. Os sistemas para pontuar a gravidade ou intensidade da resposta são conhecidos e descritos na técnica. Por exemplo, um sistema de pontuação é descrito na Sampson et al, J. Allergy Clin. Immunol. Vol 130 (6) p. 1260 (2012), que é incorporada por referência para todos os propósitos. Deve ser entendido que a expressão redução de uma resposta alérgica significa a redução da gravidade ou intensidade de uma resposta alérgica como medido por um dos sistemas de pontuação conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a redução de uma resposta alérgica se refere a uma redução estatisticamente significativa da resposta alérgica. Em algumas modalidades, a gravidade ou intensidade média da resposta alérgica sobre uma população de múltiplas pessoas ou animais é reduzida. Em algumas modalidades, a resposta alérgica pode significar a resposta a qualquer doença atópica incluindo eczema, asma, e rinite alérgica além da alergia alimentar. Em algumas modalidades, a resposta alérgica é reduzida em pelo menos um grau, como pontuado de acordo com o sistema de pontuação descrito na Sampson et al.
Por exemplo, em certas modalidades, a resposta alérgica é reduzida de um grau 3 para um grau 2. Em algumas modalidades, a resposta alérgica é reduzida de um grau 2 até um grau 1. Em algumas modalidades, a resposta alérgica é reduzida de um grau 1 até uma grau 0. Em algumas modalidades, a resposta alérgica é reduzida de um grau 3 para um grau 1. Em algumas modalidades, a resposta alérgica é reduzida de um grau 3 até um grau 0. Em algumas modalidades, a resposta alérgica é reduzida de um grau 2 até um grau 0.
[011]O termo "prebiótico" se refere a um oligossacarídeo ou polissacarídeo com um grau de polímerização de dois ou mais que não é suscetível à digestão ou degradação anterior à entrada do tratogastrointestinal superior, tal como o intestino delgado, e é fermentável ou digerível por micróbios ou outros processos dentro do cólon no qual os oligossacarídeos fermentados ou digeridos ou seus subprodutos de digestão alteram o microbioma ou proveem benefício ao ser humano ou animal.
[012]Em algumas modalidades, os métodos são para o tratamento de uma resposta anafilática. Em algumas modalidades, a resposta anafilática é de uma alergia alimentar. Em algumas modalidades, a resposta anafilática é de uma alergia a fármaco. Em algumas modalidades, a resposta anafilática é de uma picada de inseto.
[013]Em algumas modalidades, o oligossacarídeo de cadeia curta tem um grau de polimeização de pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75. Em algumas modalidades, o prebiótico compreende galacto- oligossacarídeo (GOS). GOS pode ser encontrado frequentemente em abundância em leite materno que contém uma quantidade significativa de lactose e pode ser degradada por beta-galactosidases. Exemplos específicos de GOS incluem estaquiose, rafinose, verbascose, β(1–4)-galactosil-lactose (4´-galacto-oligossacarídeo) e β(1–6)-galactosil-lactose (6´-galacto- oligossacarídeo) e lactulose. Em algumas modalidades, o prebiótico compreende frutano (incluindo fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (scFOS), fruto-oligossacarídeos (FOS), e inulina), galactanos, glucanos, e outros oligossacarídeos. Exemplos de tais incluem FOS de cadeia curta (cadeias mais curtas de frutose abaixo, com grau de polimerização de 2-4); fruto- oligossacarídeos (com grau de polimerização de 4-20); inulina (com grau de polimerização > 20) ou fleína; oligossacarídeo de soja (SOS); galacto- oligossacarídeo (GOS); isomalto-oligossacarídeo (IMOS) (derivados de amidos em trigo, cevada, milho, aveia, tapioca, arroz, batata) incluindo isomaltose, isomaltotriose, e panose; oligossacarídeos de soja (SOS) (de soja) incluindo rafinose e tetrassacarídeo estaquiose; xilo-oligossacarídeos (XOS) incluindo xilano, xilobiose, xilotiose, e xilotetraose (derivados de amidos encontrados em brotos de bambu, frutas, vegetais, leite e mel); pecticoligossacarídeos (POS) incluindo pectina; quito-oligossacarídeos incluindo quitina; lactulose; beta- glucanos (de grãos de cereal, tais como aveia, cevada, trigo, centeio); e amido resistente tipo III, que inclui amido resistente que é formado quando alimentos contendo amido são resfriados (ex. pasta, batatas, e arroz). Outros exemplos incluem polióis tais como isomalte, maltitol, manitol, sorbitol, xilitol, lactitol, eritritol, e poliglicitol. As fontes de polióis incluem maçãs, damascos, abacates, amoras, cerejas, lichias, nectarinas, pêssegos, peras, ameixas, ameixas secas, melancia, couve-flor e cogumelos. Ainda outros exemplos incluem não frutanos tais com dextrinas, incluindo maltodextrinas, ciclodextrinas, e pirodextrinas (derivadas de batata e amido de milho), dextrina de trigo, amido de milho rico em amilose (e amido de milho), amilose, e amilopectina. Em algumas modalidades, o prebiótico compreende um ou mais deles em que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto-oligossacarídeo, lactulose, lactitol, eritritol, isomalte, poliglicitol, acetato e lactato. Em algumas modalidades, o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto-oligossacarídeo, lactulose, lactato, acetato, e lactitol.
[014]Também são incluídos derivados e formas processadas dos compostos descritos aqui. Os derivados ou formas processadas podem ser modificados para alterar as propriedades de fermentação do prebiótico, por exemplo, tornando o prebiótico mais prontamente digerível, mais específico para um certo tipo de bactéria ou para aumentar o rendimento de produtos fermentados, tais como ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) e/ou outros metabólitos. Também são incluídos alimentos e derivados de alimento conhecidos por conter quantidades destes compostos e/ou que são capazes de ter um efeito prebiótico. Estes alimentos podem ser processados para isolar seus amidos, ou podem ser administrados sem isolamento de seus amidos, por exemplo, pela trituração do alimento inteiro para o consumo. Exemplos de tais alimentos incluem: cebola, alcachofra, alho, trigo, banana, aspargos, chicória, alho-poró, tomate, brotos de bambu, frutas, vegetais, leite, mel, trigo, centeio, cevada, milho, aveia, tapioca, arroz e batata.
[015]O termo “derivado prebiótico” se refere a formas modificadas do prebiótico feitas antes para o consumo para aumentar as propriedades de fermentação, digestibilidade, ou aumentar a fermentação por produtos tais como ácidos graxos de cadeia curta e outros metabólitos.
[016]Em algumas modalidades, o prebiótico compreende um ou ambos os oligossacarídeos digeríveis e não digeríveis. Em algumas modalidades, o prebiótico compreende pelo menos 6 gramas de oligossacarídeos não digeríveis. Em algumas modalidades, o prebiótico compreende pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, ou 40 gramas (ou qualquer faixa derivável dos mesmos) de oligossacarídeos digeríveis e/ou não digeríveis. O termo "oligossacarídeos não digeríveis" como usado aqui se refere à parte de uma planta que é indigerível para o animal. Os oligossacarídeos não digeríveis podem ser solúveis em água (podem ser dissolvidos em água) ou insolúves em água (não podem dissolver em água). Exemplos específicos de oligossacarídeos não digeríveis adequados úteis nos métodos e composições da revelação incluem um ou mais dentre inulina (de chicória ou agave), fibra de linho, fibra de soja, fibra de aveia, fibra de milho, goma de guar, goma arábica, Casca de lariço, goma de feijão, goma acácia, fibra de abóbora, fibra de chia, e combinações dos mesmos.
[017]Em algumas modalidades, o oligossacarídeo compreende um oligossacarídeo modificado. Em algumas modalidades, o oligossacarídeo modificado compreende um oligossacarídeo de liberação de butirato fermentável de A. caccae. A liberação de butirato significa a geração do metabólito butirato como um subproduto de fermentação. Em algumas modalidades, o oligossacarídeo é um que aumenta a concentração, massa ou quantidade de lactato no trato gastrointestinal após a fermentação ou digestão.
Exemplos incluem trigo, centeio, milho/milho amarelo, aveia, arroz e batata.
Em algumas modalidades, o oligossacarídeo de liberação de butirato fermentável de A. caccae compreende um composto capaz de ser fermentado por A. caccae em butirato.
[018]Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de um composto que transporta butirato. Em algumas modalidades, o composto que transporta butirato compreende pHPMA-b- pBMA, que é ainda descrito na WO 2018/195067. Em algumas modalidades, o composto que transporta butirato compreende um que é revelado em WO 2018/195067, que é incorporado por referência. Em algumas modalidades, o composto que transporta butirato é administrado por alimentação intragástrica.
[019]Em algumas modalidades, 1x106 a 1x1015 células ou CFU de A. caccae são administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos, no máximo, ou cerca de 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, ou 1x1015 (ou qualquer faixa derivável contida ali) células ou CFU de A. caccae são administradas.
[020]Em algumas modalidades, a A. caccae, o prebiótico, e/ou composto que transporta butirato são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, a A. caccae é administrada pelo menos 1 hora antes do prebiótico e/ou composto que transporta butirato. Em algumas modalidades, a A. caccae e/ou composto que transporta butirato é administrada pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, ou 18 horas ou 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 dias, ou 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, ou 8 semanas (ou qualquer faixa derivável contida ali) antes ou depois do prebiótico e/ou composto que transporta butirato. Em algumas modalidades, pelo menos 10 gramas de prebiótico são administrados ao indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, ou 50 gramas (ou qualquer faixa derivável contida ali) de prebiótico são administradas ao indivíduo. Em algumas modalidades, a razão das unidades de formação de colônia de A. caccae para gramas de prebiótico e/ou composto que transporta butirato é 1000:1 – 10000:1. Em algumas modalidades, a razão é pelo menos, no máximo, ou cerca de 1:1, 2:1, 4:1, 5:1, 8:1, 10:1, 20:1, 40:1, 50:1, 80:1, 100:1, 150:1, 200:1, 250:1, 300:1, 400:1, 500:1, 1000:1, 1500:1, 2000:1, 2500:1, 3000:1, 3500:1, 4000:1, 4500:1, 5000:1, 7500:1, 10000:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:50, 1:80, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:400, 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000, 1:3500, 1:4000, 1:4500, 1:5000, 1:7500, ou 1:10000 (ou qualquer faixa derivável contida ali). Em algumas modalidades, o composto que transporta butirato é administrado após o prebiótico. Em algumas modalidades, o composto que transporta butirato e o prebiótico estão na mesma composição. Em algumas modalidades, o composto que transporta butirato é administrado imediatamente após ou menor do que 5, 10, 20, 30, ou 60 minutos (ou qualquer faixa derivável contida ali) após a administração do prebiótico.
[021]Em algumas modalidades, a alergia alimentar compreende a alergia ao leite de vaca. Em algumas modalidades, a alergia alimentar compreende uma alergia a amendoim ou ovo. Em algumas modalidades, o indivíduo foi diagnosticado com uma alergia alimentar, alergia ao leite de vaca, alergia a amendoim, alergia a ovo, alergia a soja, alergia a trigo/glúten, alergia a marisco, alergia a gergelim, alergia a nozes (pistache, caju, nozes, amêndoas, avelãs, nozes de macadâmia), condição alérgica, doença ou infecção autoimune. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado anteriormente para uma alergia alimentar, condição alérgica, doença ou infecção autoimune. Em algumas modalidades, o indivíduo foi determinado como sendo resistente ao tratamento anterior. Em algumas modalidades, o indivíduo não foi diagnosticado com uma alergia alimentar, condição alérgica, doença ou infecção autoimune e/ou não exibiu sintomas de uma alergia alimentar, condição alérgica, doença ou infecção autoimune.
[022]Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um recém-nascido, menor do que um ano de idade, menor do que cinco anos de idade, menor do que doze anos de idade ou menor do que dezoito anos de idade. Em algumas modalidades, o indivíduo é menor do que 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 anos ou 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 meses, ou, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 dias de idade (ou qualquer faixa derivável contida ali). Em modalidades específicas, o paciente é um paciente pediátrico - isto é, menor do que 18 anos de idade. Em outras modalidades, o paciente é um paciente adulto.
[023]Em algumas modalidades, a A. caccae compreende um produto bacteriano vivo. Em algumas modalidades, as bactérias são liofilizadas ou secas por congelamento. Em algumas modalidades, a A. caccae e/ou prebiótico são administrados oralmente. Em algumas modalidades, a A. caccae e/ou prebiótico são administrados em um comprimido ou cápsula. Em algumas modalidades, a A. caccae e/ou prebiótico são administrados por uma via de administração descrita aqui.
[024]O termo “alimento” ou “derivados de alimento” se refere a itens comestíveis cozidos ou não cozidos compreendendo prebióticos encontrados no item inteiro ou processado para ainda isolar o prebiótico.
[025]Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administração de uma fórmula ou alimento contendo lactato. Em algumas modalidades, o alimento é maçãs, damascos, abacates, amoras, cerejas, lichias, nectarinas, pêssegos, peras, ameixas, ameixas secas, melancia, couve- flor e cogumelos, cebola, alcachofra, alho, trigo, banana, aspargos, chicória,
alho-poró, tomate, brotos de bambu, frutas, vegetais, leite, mel, trigo, centeio, cevada, milho ou milho amarelo, aveia, tapioca, arroz e batata.
[026]Em algumas modalidades, o indivíduo é determinado como tendo uma razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras de menos do que 3. Em algumas modalidades, a razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras é menor do que, maior do que, ou cerca de 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 (ou qualquer faixa derivável contida ali).
[027]Em algumas modalidades, as OTUs protetoras compreendem uma ou mais OTUs selecionadas de 1111294, 360015, New Reference OTU147, 628226, 349024, 712677, 780650, 843459, 262095, New Reference OTU166, 579851, 551822, 298247, 345540, 582691, 259772, 325419, 797229, 557627, 828483, 299267, 4448331, 3376513, 813217, New.CleanUp.Reference OTU56927, 335701, 191999, 183865, 231787, 342397, 581782, 304641, 4389289, ou 541119 como descrito na Tabela Suplementar 3. Em algumas modalidades, as OTUs não protetoras compreendem uma ou mais OTUs selecionadas de 195258, 315846, 551902, 318190, 591635, 585227, 370225, 199354, 198866, 583398, 583656, 535375, 1111191, 580629, 365181, 359809, 585914, 365385, 583117, 180082, 589071, 514272, 484304, ou 589277 como descrito na Tabela Suplementar 3.
[028]Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um excipiente farmacêutico. Em algumas modalidades, a composição é formulada para a administração oral.
[029]Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o método de medição ou quantificação.
[030]O uso da palavra “um” ou “uma” quando usadas em conjunto com o termo “compreendendo” pode significar “um”, mas ele também é consistente com o significado de “um ou mais,” “pelo menos um” e “um ou mais do que um.”
[031]A expressão “e/ou” significa “e” ou “ou”. Para ilustrar, A, B, e/ou C inclui: A sozinho, B sozinho, C sozinho, uma combinação de A e B, uma combinação de A e C, uma combinação de B e C, ou uma combinação de A, B, e C. Em outras palavras, “e/ou” opera como um inclusive ou.
[032]As palavras “compreendendo” (e qualquer forma de compreendendo, tal como “compreendem” e “compreende”), “tendo” (e qualquer forma de tendo, tal como “têm” e “tem”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo, tal como “inclui” e “incluem”) ou “contendo” (e qualquer forma de contendo, tal como “contém” e “contêm”) são inclusive ou abertos e não excluem elementos adicionais, não recitados ou etapas do método.
[033]As composições e métodos para seu uso podem “compreender,” “consistir essencialmente em” ou “consistir em” quaisquer dos ingredientes ou etapas reveladas ao ongo de todo o relatório descritivo. As composições e métodos “consistindo essencialmente em” quaisquer dos ingredientes ou etapas reveladas limitam o escopo da reivindicação aos materiais ou etapas especificados que não afetam materialmente a básica e nova característica da invenção reivindicada.
[034]É contemplado que qualquer modalidade discutida neste relatório descritivo pode ser implementada com relação a qualquer método ou composição da invenção e vice-versa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para alcançar métodos da invenção.
[035]Outros objetos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição detalahada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, emboraindicando modalidades específicas da invenção, são dados por meio de ilustração somente, visto que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção tornar-se-ão aparentes àqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[036]Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais dentre estes desenhos em combinação com a descrição detalahada de modalidades específicas apresentadas aqui.
[037]FIG. 1A-D. A transferência de microbiota de crianças saudáveis, mas não com CMA protege contra uma resposta alérgica ao alimento. (a) Mudança na temperatura corporal central em períodos indicados após o primeiro desafio com β lactoglobulina (BLG) em camundongos livres de germes e em camundongos colonizados com fezes de cada um dos 8 doadores (4 saudáveis, 4 com CMA, vide a Tabela Suplementar 1) que tinham sido sensibilizados com BLG mais toxina da cólera (CT) ; n=42 CMA, 31 saudáveis e 24 camundongos GF com 4-12 camundongos para cada um dos 8 doadores, coletados dos dois experimentos independentes. (b) IgE específica para BLG específico para BLG sérico, (c) IgG1 específica para BLG e (d) mMCPT-1 de camundongos em a. Para a, os círculos representam média, barras de erro representam s.e.m. Para b-d, os círculos representam camundongos individuais, as barras representam média+s.e.m. os modelos com efeito misto linear foram usados para comparar os grupos em a-d com o método de Benjamini-Hochberg FDR (BH-FDR) para a correção de testes múltiplos.
*P<0,05, **P<0,01 ***P<0,001.
[038]FIG. 2A-F. A na´´alise de amostras fecais de oito doadores infantis humanos revela assinaturas taxonômicas que se correlacionam com fenótipo alérgico. (a) Mapa de calor de OTUs diferencialmente abundantes entre doadores com CMA e saudáveis. As fileiras mostram 58 OTUs identificadas como diferentes na taxa de descobertas falsas (FDR) controlada a 0,10 e presente em pelo menos 4 amostras fecais humanas e pelo menos dois grupos de camundongos colonizados (vide a Tabela Suplementar 3). As colunas descrevem cada doador (D) ou grupo de camundongos colonizados (m). n=2-3 réplicas técnicas por doador, n=1-4 camundongos por grupo de camundongos colonizados com fezes tiradas em 2 e 3 semanas após a colonização (vide Métodos). Os gráficos de barras acima do mapa de calor representam a pontuação de abundância de OTUs potencialmente protetoras (laranja) ou não protetoras (azul) calculadas para cada doador ou grupo de camundongo. (b-d) A razão de OTUs protetoras sobre não protetoras (vide a FIG. 10B) derivadas de camundongos colonizados em a traçado contra os níveis de IgE específica para BLG, (b) IgG1 específica para BLG (c), e mMCPT-1 (d) de todos os camundongos na FIG. 1. Cada círculo representa resultados médios de todos os camundongos colonizados com cada uma das quatro fezes do doador saudável (laranja) ou com CMA (azul). (e) a análise de LEfSe da taxa que foram enriquecidos significativamente em camundongos colonizados saudáveis (laranja) ou camundongos colonizados por CMA (azul) de amostras em a (n=8 camundongos no grupo saudável e n = 9 camundongos no grupo com CMA, com amostras fecais coletadas em 2 e 3 semanas após a colonização). (f) Cladograma mostrando a composição da comunidade de amostras de camundongo colonizado de a, com a taxa detectada como diferencialmente abundante por análise de LEfSe colorida pelo grupo (saudável=laranja, CMA=azul). O método da discreta taxa de falsas descobertas (DS-FDR) foi usado para comparar grupos em a e o teste de Kruskal-Wallis foi realizado em e (vide Métodos).
[039]FIG. 3A-B. Assinaturas únicas do transcriptoma ileal distinguem camundongos saudáveis e colonizados por CMA. (a) Mapa de calor de 32 genes diferencialmente expressos (DEGs) em IECs ileais isolados de GF (n=3), camundongos colonizados saudáveis (n=18) ou colonizados por CMA (n=18) agrupados de pelo menos 2 experimentos independentes em sete dias após a colonização (vide a Tabela Suplementar 4). Cada coluna descreve um camundongo individual colonizado com as fezes do doador como indicado.
Quatro tipos de mudanças de expressão de gene são mostradas: (1) supra em saudáveis: genes que são suprarregulados em camundongos saudáveis em relação a ambos CMA e GF; (2) SUPRA em CMA: genes que são suprarregulados em camundongos com CMA em relação a ambos saudáveis e GF; (3) infra em saudáveis: genes que são infrarregulados em camundongos saudáveis em relação a ambos com CMA e GF; e (4) INFRA em CMA: genes que são infrarregulados em camundongos com CMA em relação a saudáveis e GF. (b) termos de Ontologia de Genes (GO) e caminhos de KEGG (negrito) enriquecidos significativamente em DEGs de a que são associados com camundongos colonizados saudáveis (laranja) ou colonizados por CMA (azul).
O teste hipergeométrico foi usado em b com o método de Benjamini-Hochberg FDR (BH-FDR) para a correção de testes múltiplos (vide Métodos).
[040]FIG. 4A-L. A correlação de OTUs ileais com DEGs no íleo de camundongos colonizados saudáveis identifica uma espécie Clostridial, A.
caccae, que protege contra uma resposta alérgica ao alimento. (a) Mapa de calor mostrando o coeficiente de correlação da classificação de Spearman entre abundância relativa de OTUs ileais (fileira) e expressão de DEGs (coluna) de amostras de IEC ileais de camundongo com CMA vs saudável (vide a FIG.
3a e Métodos). (b) a Correlação de Spearman entre abundância de OTU259772 (Lachnospiraceae) do conjunto de dados 16S ileal (vide a Tabela Suplementar 5) e expressão de RNA-Seq em IECs ileais de Ror2, Fbp1, Tgfbr3, Acot12 e Me1. O círculos representam camundongos individuais e faixas sombreadas indicam intervalo de 95% de confiança ajustado por regressão linear (c,d) Abundância de OTU259772 (Lachnospiraceae) por sequenciamento 16S (c) e abundância de Anaerostipes caccae por qPCR (d) em amostras ileais de camundongos saudáveis e colonizados por CMA. LD indica amostras que estavam abaixo do limite de detecção para o ensaio. (e)
Correlação de Spearman entre abundância de OTU259772 (Lachnospiraceae; sequenciamento 16S) e abundância de Anaerostipes caccae (qPCR) em amostras ileais de camundongos saudáveis e colonizados por CMA. Círculos representam camundongos individuais e faixas sombreadas indicam intervalo de 95% de confiança ajustado por regressão linear. As amostras ileais que estavam acima de LD em ambos 16S e experimentos de qPCR são mostradas (n=19). (f) A expressão de gene de Ror2, Fbp1, Tgfbr3, Acot12 e Me1 em IECs ileais isolados de camundongos GF e de camundongos saudáveis e colonizados por CMA ou camundongos monocolonizados com A. caccae por qPCR. Os dados são normalizados para Hprt como o gene de controle e mostrados como a modulação em expressão de GF, ajustado como 1. (g) A mudança na temperatura corporal central em períodos indicados após o primeiro desafio com BLG em BLG mais CMA sensibilizado por TC e camundongos monocolonizados por A. caccae. h-j, IgE específica para BLG sérico (h) IgG1 específica para BLG e (i) mMCPT-1(j) de camundongos em g.
k,l IL-13 (k) e IL-4 (l) em sobrenadantes de cultura de esplenócitos de CMA ou camundongos colonizados por A. caccae sacrificados 24 h após o desafio e estimulados por 72 h com BLG. Para c, d, f, e h-l círculos representam camundongos individuais, barras representam média+s.e.m. Para g, círculos representam média, barras representam s.e.m. Para a-b, n=18 colonizados saudáveis ou 18 camundongos colonizados por CMA por grupo. Para c e d, , n=19 colonizados saudáveis ou 21 camundongos colonizados por CMA por grupo. Para f, n= 14 GF, 20 camundongos colonizados por A. caccae, 18 colonizados saudáveis ou 23 colonizados por CMA por grupo. Para g-j n=16 colonizados por CMA e 16 camundongos colonizados por A. caccae coletados de três experimentos independentes com dois doadores diferentes com CMA (5 e 6) e barras representam média+s.e.m. Para k e l n=6 colonizados por CMA e 9 camundongos colonizados por A. caccae de um experimento, círculos representam camundongos individuais, barras representam média+s.e.e. O método de DS-FDR foi usado para comparar grupos em c, teste t de Student bilateral em d, análise de variância com um fator (ANOVA) com correção de testes múltiplos Bonferroni em f ou modelos com efeito misto linear em g, e testes t bilaterais em h-l após transformação de log. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
[041]FIG. 5. Sensibilização de camundongos colonizados saudáveis ou com CMA com BLG mais toxina da cólera não resulta em patologia intestinal.
As imagens representativas de amostras histológicas de BLG mais toxina de camundongos colonizados saudáveis ou com CMA sensibilizados com cólera 24 horas após o desafio para doadores 1 (saudável) e 5 (CMA, vide a Tabela Suplementar 1). Todas as seções coloridas com H&E ou PAS, como indicado.
Barras em escala = 100 μm.
[042]FIG. 6. A colonização a longo prazo de camundongos GF com fezes de crianças saudáveis ou com CMA não leva à patologia intestinal. As imagens representativas de amostras histológicas de camundongos colonizados saudáveis ou com CMA não sensibilizados coletados 5 a 6 meses após a colonização para doadores descritos na Tabela Suplementar 1. Todas as seções coloridas com H&E ou PAS, como indicado. Barras em escala = 100 μm.
[043]FIG. 7A-B. A análise de diversidade de amostras fecais de camundongos colonizados saudáveis ou com CMA. (a) Diversidade de índice de Shannon e (b) Uniformidade de índice de Pielou em fezes de camundongos colonizados saudáveis (laranja) e colonizados por CMA (azul) de FIG. 2A. n=1- 4 camundongos por grupo de camundongos colonizados com fezes tiradas em 2 e 3 semanas após a colonização (vide Métodos). Cada círculo representa uma amostra fecal, barras representam média±s.e.m. Os oito doadores fecais humanos alimentados com fórmula são descritos na Tabela Suplementar 1.
[044]FIG. 8A-D. A transferência de a microbiota de crianças exclusivamente amamentadas, saudáveis protege contra uma resposta anafilática à sensibilização com BLG mais toxina da cólera. (a) A mudança na temperatura corporal central em períodos indicados após o primeiro desafio com BLG de camundongos colonizados com fezes de doadores infantis saudáveis ou com CMA amamentados (n=13 camundongos por grupo, coletados de pelo menos 2 experimentos independentes). (b-d) IgE específica para BLG específico para BLG sérico, (b) IgG1 específica para BLG (c) e mMCPT-1 (d) de camundongos em a. Quatro dos camundongos colonizados por CMA sensibilizados com BLG + CT morreram de anafilaxia após o desafio.
Para a, os símbolos representam média, barras representam s.e.m. Para b-d, os símbolos representam camundongos individuais e barras representam média+s.e.m. Modelos com efeito misto linear foram usados para comparar grupos em a e teste t de Student bilateral em b após transformação de log. Os dois doadores fecais humanos amamentados são descritos na Tabela Suplementar 2. *P<0,05.
[045]FIG. 9A-D. A contínua exposição ao leite de vaca não induz a tolerância a BLG em camundongos livres de germes alimentados com água ou Enfamil e sensibilizados com BLG mais toxina da cólera. (a) A mudança na temperatura corporal central em períodos indicados após o primeiro desafio com BLG de camundongos alimentados com água (n=12) ou Enfamil (n=10) coletados de três experimentos independentes. b-d, IgE específica para BLG sérico, (b) IgG1 específica para BLG(c) e mMCPT-1 (d) de camundongos em a.
Para a, círculos representam média, barras de erro representam s.e.m. Para b- d, círculos representam camundongos individuais, barras representam média+s.e.m. Modelos com efeito misto linear foram usados para comparar grupos em a e teste t de Student bilaterals em b-d após transformação de log.
**P<0,01. n.s. = não significativo (P=0,36).
[046]FIG. 10A-B. a representação binária de OTUs protetoras e não protetoras em doadores com CMA e saudáveis e grupos de camundongos colonizados (a) O mapa binário da razão de presença/ausência de OTUs protetoras/não protetoras em doadores com CMA e saudáveis com o mesmo layout que a FIG 2a. As colunas descrevem cada doador (D) ou grupo de camundongos colonizados (m). n = 2-3 réplicas técnicas por doador e n = 1-4 camundongos por grupo de camundongos colonizados com fezes tiradas em 2 e 3 semanas após a colonização, vide Métodos). As fileiras mostram 58 OTUs FDR controladas em 0,10 (vide Métodos) em comparação de doador humano com CMA vs saudável, presente em pelo menos 4 amostras fecais humanas e pelo menos dois grupos de camundongos colonizados (vide a Tabela Suplementar 3). Os gráficos de barra acima do mapa de grade representam o número total de OTUs potencialmente protetoras (mais abundantes em doadores saudáveis; laranja) e potencialmente não protetoras (mais abundantes em doadores com CMA; azul) em cada grupo de doadores ou camundongos individuais. O mapa de grade representa a presença (verde) ou ausência (branco) de OTUs protetoras e não protetoras em cada amostra. (b) Uma razão de OTU protetora/não protetora foi computada por grupo de doadores ou camundongos individuais de a considerando a presença ou ausência de 58 OTUs. Os doadores e seus receptores de transferência murinos são mostrados em quadrados e círculos, respectivamente. A linha tracejada vertical representa uma razão de 2,6.
[047]FIG. 11. Validação de razão de OTU protetora/não protetora usando um cohorte independente maior de doadores infantis saudáveis e com CMA. Análise da razão de OTU protetora/não protetora (vide FIG. 2 e FIG. 10) em amostras fecais de crianças saudáveis (n=19) e com CMA (n=19) como anteriormente isolado e descrito de referência 5. A linha central horizontal indica a média, as caixas representam o 25º e 75º percentis, e os gráficos de caixa se estendem até o ponto de dados mais distante dentro de um máximo de 1,5 vez o intervalo interquartil (IQR). Todos os pontos individuais são mostrados, com cada círculo denotando um indivíduo. Fora as 58 OTUs mostradas na FIG. 2A, 55 OTUs foram atribuídas com IDs de referência conhecidas e 3 com IDs de Referência Nova. As IDs de Referência Nova de OTU não são comparáveis em todos os cohortes de análise diferentes, portanto, os inventores focaram nos OTUs com IDs de referência conhecidas.
Dentre os 55 OTUs conhecidos, 52 (29 OTUs protetoras e 23 OTUs não protetoras) foram detectadas neste cohorte e usadas para o cálculo da razão (vide Métodos). As outras 3 não foram detectadas. O teste de soma de postos de Wilcoxon bilateral foi usado. *P<0,05.
[048]FIG. 12A-C. A razão da abundância de OTU saudável vs com CMA é significativamente correlacionada entre amostras ileais e fecais de camundongo. (a) Os gráficos de bolha mostram um padrão similar em amostras fecal (n=8 camundongos em grupo saudável, n=9 camundongos em grupo com CMA, com amostras fecais coletadas em 2 e 3 semanas após a colonização, o mesmo que na FIG. 2A) e amostras ileais (n=22 camundongos em grupo saudável, n=25 camundongos em grupo com CMA) de camundongos saudáveis e colonizados por CMA. 58 OTUs significativamente diferencialmente abundantes entre doadores com CMA e saudáveis são mostradas na mesma ordem que na FIG. 2A. O tamanho do círculo indica a magnitude do enriquecimento de abundância relativa em relação a CMA ou saudável. A intensidade da cor indica a significância estatística calculada usando o teste de permutação de DS-FDR (vide Métodos). (b e c) A razão de abundância de OTU saudável versus com CMA é significativamente correlacionada entre amostras ileais e fecais de camundongo. Cada ponto representa uma OTU individual. Para b, para cada OTU, sua abundância média foi calculada no nível do grupo dentre 8 colonizados saudáveis e 9 camundongos colonizados por CMA para as amostras fecais, e dentre 22 camundongos colonizados saudáveis e 25 camundongos colonizados por CMA para as amostras ileais. As razões de abundância de OTU nas fezes são traçadas no eixo x com a razão de abundância de OTU no íleo no eixo y. Para c, n=35 camundongos (15 colonizados saudáveis e 20 colonizados por CMA)
agrupados de pelo menos dois experimentos independentes foram usados para o cálculo da razão de abundância de OTU tanto fecal quanto ileal, onde amostras fecais e ileais foram coletadas dos mesmos camundongos individuais. Para detalhes adicionais vide Métodos.
[049]FIG. 13A-C. Abundância de OTU259772 (Lachnospiraceae) e Anaerostipes caccae é correlacionada em amostras fecais de camundongos saudáveis e colonizados por CMA. Abundância de OTU259772 (Lachnospiraceae) do conjunto de dados 16S e (a) abundância de Anaerostipes caccae por qPCR (b) em amostras fecais de camundongos colonizados saudáveis (n=7) e colonizados por CMA (n=8) da FIG. 2. Para cada camundongo individual, 1-2 amostras fecais foram coletadas em 2 e 3 semanas após a colonização. LD indica amostras que estavam abaixo do limite de detecção para o ensaio. (c) Correlação de Spearman entre abundância de OTU259772 (Lachnospiraceae; sequenciamento 16S) e abundância de Anaerostipes caccae (qPCR) em amostras fecais de camundongos saudáveis e colonizados por CMA da FIG. 2. Amostras fecais que estavam acima de LD em ambos experimentos de 16S e qPCR são mostradas (n = 13). Cada círculo representa uma amostra fecal. Para a e b, as barras mostram média + s.e.m.
Para c, as faixas sombreadas indicam intervalo de 95% de confiança ajustado por regressão linear. O método de DS-FDR foi usado para comparar grupos em a e teste t de Student bilateral em b. ***P<0,001.
[050]FIG. 14. A abundância de Anaerostipes caccae em amostras ileais se correlaciona com a expressão gênica em IECs ileais. A correlação de Spearman entre abundância de Anaerostipes caccae por qPCR e expressão de RNA-Seq de Ror2, Fbp1, Tgfbr3, Acot12 e Me1 em IECs ileais (vide a FIG. 3A).
Os círculos mostram camundongos individuais e faixas sombreadas indicam intervalo de 95% de confiança ajustado por regressão linear. Camundongos n=36 (18 saudáveis e 18 colonizados por CMA) coletados de pelo menos dois experimentos independentes. As amostras com valores acima do limite de detecção são mostradas (abundância de A. caccae >0).
[051]A FIG. 15 mostra esquemas de isolamento e caracterização de A.
caccae.
[052]A FIG. 16. A. caccae_lah é altamente suscetível à ampicilina. Ela também é de alguma forma sucetível à tetraciclina.
[053]A FIG. 17. A. caccae_lah não é capaz de fermentar carboidratos complexos em monocultura, mas pode fermentar açúcares simples como aqueles na fórmula infantil, incluindo lactose. A. caccae_lah foi desenvolvida a partir de estoque congelado para 24 h em caldo de CMG, a seguir, 10 ul foram transferidos para dentro do caldo de levedura de peptona mínimo (PY) suplementado com 10 mg/ml de carboidratos. O crescimento e a produção de butirato foram medidos após 48 h. Todos os experimentos foram realizados em duplicata e os grupos foram analisados por ANOVA com um fator. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 versus PY sozinho.
[054]FIG. 18. A. caccae_lah é capaz de usar lactato e acetato juntos para produzir butirato. A. caccae_lah foi desenvolvido a partir de estoque de glicerol congelado para 24 h em caldo de CMG, a seguir 10 µl foram transferidos para dentro do caldo de PY mínimo suplementado com acetato a 33 mM e/ou lactato a 40 mM. O crescimento e a produção de butirato foram medidos após 48 h. Todos os experimentos foram realizados em duplicata e os grupos foram analisados por ANOVA com um fator. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001,****P<0,0001 versus PY sozinho.
[055]FIG. 19. A. caccae_lah produz butirato substancialmente maior de fibras em co-cultura com uma mistura bacteriana complexa de um doador infantil com alergia (CMA). A. caccae_lah ou amostra fecal humana com CMA foram desenvolvidas de estoque de glicerol congelado separadamente para 24 h em caldo de CMG, a seguir 10 µl total foram transferidos para dentro do caldo de PY mínimo suplementado com 10 mg/ml de amido de batata ou celobiose.
O crescimento e a produção de butirato foram medidos após 48 h. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
[056]FIG. 20A-B. A mistura bacteriana das fezes de camundongo do repositório de CMA produz mais butirato na base de referência do que as fezes humanas com CMA de estoque de glicerol congelado (A), mas a adição de A.
caccae_lah com lactato e acetato ainda resulta em uma diferença notável nos níveis de butirato (B). A. caccae_lah ou a mistura de CMA, derivada de fezes humanas ou de camundongo, foram desenvolvidas de estoque de glicerol congelado por 24 h separadamente em caldo de CMG, a seguir 10 µl total foram transferidos para dentro do caldo de PY mínimo suplementado com 10 mg/ml de carboidratos. Nas 24 h depois do grupo, CMA foi transferida no momento = 0, A. caccae_lah e carboidratos foram transferidos no momento = 24 h. O crescimento e a produção de butirato foram medidos após 48 h ou 72 h. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
[057]A FIG. 21 descreve o design experimental para determinar a colonização de A. caccae_lah em camundongos colonizados por CMA e a dependência de suplementos prebióticos.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS
[058]Para entender melhor o papel da microbiota na regulação da doença alérgica em seres humanos, os inventores colonizaram camundongos livres de germes (GF) com bactárias derivadas das fezes de crianças saudáveis ou alérgicas a leite de vaca (CMA). Os inventores mostram aqui que a colonização de camundongos livres de germes com bactérias de crianças saudáveis protegia contra a sensibilização ao alérgeno β-lactoglobulins do leite de vaca. Os camundongos colonizados com bactérias de crianças com CMA exibiram respostas anafiláticas ao desafio com BLG e aumentaram significativamente a IgE específica para BLG sérico. As diferenças na composição bacteriana separaram as populações saudáveis e com CMA em ambos os doadores humanos e os camundongos colonizados. A análise de
RNA-Seq das células epiteliais intestinais ileais revelou genes diferencialmente expressos (DEGs) que distinguiram camundongos saudáveis e colonizados por CMA em todos os doadores. A correlação de OTUs ileais com DEGs no íleo de camundongos colonizados saudáveis identificou uma espécie Clostridial, Anaerostipes caccae, que protegia contra uma resposta alérgica ao alimento.
As descobertas demonstram que a composição da microbiota intestinal é crítica para a regulação das respostas alérgicas a antígenos dietéticos e sugere que as intervenções que modulam as comunidades bacterianas podem ser terapeuticamente relevantes para a alergia alimentar.
I. DEFINIÇÕES
[059]O termo “dose unitária” ou “dosagem” se refere a unidades fisicamente discretas adequadas para uso em um indivíduo, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica calculada para produzir as respostas desejadas discutidas aqui em associação com sua administração, isto é, a via e o regime de tratamento apropriado. A quantidade a ser administrada, ambos de acordo com o número de tratamentos e dose unitária, depende do efeito desejado. A quantidade de dosagem atual de uma composição das presentes modalidades administrada a um paciente ou indivíduo pode ser determinada por fatores físicos e fisiológicos, tais como peso corporal, a idade, saúde e sexo do indivíduo, o tipo de doença sendo tratada, a extensão da penetração da doença, intervenções terapêuticas anteriores ou simultâneas, idiopatia do paciente, a via de administração, e a potência, estabilidade e toxicidade da substância terapêutica particular. Por exemplo, uma dose também pode compreender de cerca de 1 µg/kg/peso corporal a cerca de 1000 mg/kg/peso corporal (esta tal faixa inclui doses intermediárias) ou mais por administração, e qualquer dose particular derivável das mesmas. Em exemplos não limitantes de uma faixa derivável dos números liustados aqui, uma faixa de cerca de 5 µg/kg/peso corporal a cerca de 100 mg/kg/peso corporal, cerca de 5 µg/kg/peso corporal a cerca de 500 mg/kg/peso corporal, etc., pode ser administrada. O praticante responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a concentração de ingrediente(s) ativo(s) em uma composição e as dose(s) apropriada(s) para o presente indivíduo.
[060]“Indivíduo” e “paciente” se referem a um ser humano ou não humano, tal como primatas, mamíferos e vertebrados. Em modalidades particulares, o indivíduo é um ser humano.
[061]Como usado aqui, os termos “tratar,” “tratamento,” “tratando” ou “melhora” quando usados em referência a uma doença, distúrbio ou condição médica, se referem a tratamentos terapêuticos para uma condição, em que o objetivo é reverter, aliviar, melhorar, inibir, retardar ou parar o progresso ou gravidade de um sintoma ou condição. O termo “tratando” inclui a redução ou alívio de pelo menos um efeito adverso ou sintoma de uma condição. O tratamento é geralmente “eficaz” se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos. Alternativamente, o tratamento é “eficaz” se o progresso de uma condição for reduzido ou interrompido. Ou seja, o “tratamento” inclui não apenas a melhoria dos sintomas ou marcadores, mas também uma cessação ou pelo menos retardo do progresso ou piora dos sintomas que seriam esperados na ausência do tratamento. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a, alívio de um ou mais sintoma(s), diminuição da extensão do déficit e um aumento da expectativa de vida quando comparado àquela esperada na ausência de tratamento.
[062]O termo “isolado” abrange uma bactéria ou outra entidade ou substância que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela foi associada quando inicialmente produzida (seja na natureza ou em um ambiente experimental), e/ou (2) produzida, preparada, purificada, e/ou fabricada pela mão do homem. As bactérias isoladas podem ser separadas de pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou mais dos outros componentes com os quais elas foram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, as bactérias isoladas são mais do que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% puras. Como usado aqui, uma substância é “pura” se ela for substancialmente livre de outros componentes.
[063]Os termos “purificar,” “purificando” e “purificado” se referem a uma bactéria ou outro material que foi separado de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela foi associada seja quando inicialmente produzida ou gerada (por exemplo, seja na natureza ou em um ambiente experimental), ou durante qualquer momento após sua produção inicial. Uma bactéria ou uma população de bactérias pode ser considerada purificada se ela for isolada em ou após a produção, tal como de um material ou ambiente contendo a bactéria ou a população de bactérias, e uma bactéria ou população de bactérias purificada pode conter outros materiais de até cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou acima de cerca de 90% e ainda pode ser considerada “isolada”. Em algumas modalidades, bactérias e populações de bactérias purificadas são mais do que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% puras. No caso das composições bacterianas providas aqui, os um ou mais tipos bacterianos presentes na composição podem ser independentemente purificados de uma ou mais outras bactérias produzidas e/ou presentes no material ou ambiente contendo o tipo bacteriano. As composições bacterianas e os componentes bacterianos dos mesmos são geralmente purificados de produtos residuais do habitat.
[064]Como usado aqui, o termo “compreendendo” ou “compreende” é usado em referência a composições, métodos, e respectivos componente(s) dos mesmos, que são essenciais para a invenção, ainda é aberto para a inclusão de elementos não especificados, sejam essenciais ou não.
[065]Como usado aqui, o termo “consistindo essencialmente em” se refere àqueles elementos exigidos para uma dada modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam materialmente a característica(s) básica e nova ou funcional daquela modalidade da invenção.
Com relação às composições farmacêuticas, o termo “consistindo essencialmente em” inclui os ingredientes ativos recitados, exclui quaisquer outros ingredientes ativos, mas não exclui quaisquer excipientes farmacêuticos ou outros componentes que não são terapeuticamente ativos.
[066]O termo “consistindo em” se refere a composições, métodos, e respectivos componentes dos mesmos como descrito aqui, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado naquela descrição da modalidade.
[067]Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem as referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, referências ao “método” incluem um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou que se tornarão aparentes àquelas pessoas versadas na técnica mediante a leitura desta revelação e assim por diante.
[068]Como usado aqui, “essencialmente livre,” em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que nenhum dos componentes especificados foi formulado propositalmente em uma composição e/ou está presente somente como um contaminante ou em quantidades traço.
A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não pretendida de uma composição está, portanto, bem abaixo de 0,01%. Mais preferida é uma composição na qual nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com métodos analíticos padrão.
[069]O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para significar “e/ou” a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas somente ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a revelação apoie uma definição que se refere somente a alternativas e “e/ou”. Como usado aqui, o termo “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[070]Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é usado para indica que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe dentre os indivíduos do estudo.
[071]A expressão “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade suficiente” significa uma dosagem de um fármaco ou agente suficiente para produzir um resultado desejado.
II. COMPOSIÇÕES MICROBIANAS
[072]As modalidades da presente revelação se referem a composições microbianas para o tratamento de doença infecciosa, autoimune ou alérgica.
[073]A presente revelação também provê uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais culturas microbianas como descrito acima. As espécies bacterianas, portanto, estão presentes na forma de apresentação como bactérias vivas, seja na forma seca ou liofilizada. Esta pode ser preferivelmente adaptada para a administração adequada; por exemplo, na forma de comprimido ou pó, potencialmente com um revestimento entérico, para o tratamento oral.
[074]Em aspectos particulares, a composição é formulada para administração oral. A administração oral pode ser alcançada usando uma formulação mastigável, uma formulação de dissolução, uma formulação encapsulada/revestida, um losango de múltiplas camadas (para separar os ingredientes ativos e/ou ingredientes ativos e excipientes), uma formulação de liberação lenta/cronometrada, ou outras formulações adequadas conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. Embora a palavra “comprimido” seja usada aqui, a formulação pode tomar uma variedade de formas físicas que podem ser comumente referidas por outros termos, tais como losango, pílula, cápsula ou os similares.
[075]Embora as composições da presente revelação sejam preferivelmente formuladas para a administração oral, outras vias de administração podem ser empregadas, no entanto, incluindo, mas não limitado a, subcutânea, intramuscular, intradérmica, transdérmica, intraocular, intraperitoneal, mucosal, vaginal, retal e intravenosa.
[076]A dose desejada da composição da presente revelação pode ser apresentada em múltiplas (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais) subdoses administradas em intervalos apropriados ao longo do dia, semana, mês ou ano.
[077]Em um aspecto, a composição revelada pode ser preparada como uma cápsula. A cápsula (isto é, o veículo) pode ser uma cápsula oca, geralmente cilíndrica formada de várias substâncias, tais como gelatina, celulose, carboidrato ou os similares.
[078]Em outro aspecto, a composição revelada pode ser preparada como um supositório. O supositório pode incluir, mas não é limitado às bactérias e um ou mais veículos, tais como polietileno glicol, acácia, monoglicerídeos acetilados, cera de carnaúba, acetato ftalato de celulose, amido de milho, dibutil ftalato, docusato sódico, gelatina, glicerina, óxidos de ferro, caulim, lactose, estearato de magnésio, metil parabeno, esmalte farmacêutico, povidona, propil parabeno, benzoato de sódio, monoleato de sorbitano, sacarose, talco, dióxido de titânio, cera branca e agentes colorantes.
[079]Em alguns aspectos, a composição microbiana revelada pode ser preparada como um comprimido. O comprimido pode incluir as bactérias e um ou mais agentes de formação de comprimido (isto é, veículos), tais como fosfato de cálcio dibásico, ácido esteárico, croscarmelose, sílica, celulose e revestimento de celulose. Os comprimidos podem ser formados usando um processo de compressão direta, embora aqueles versados na técnica venham a apreciar que várias técnicas podem ser usadas para formar os comprimidos.
[080]Em outros aspectos, a composição microbiana revelada pode ser formada como alimento ou bebida ou, alternativamente, como um aditivo para o alimento ou bebida, em que uma quantidade apropriada de bactérias é adicionada ao alimento ou bebida para render o alimento ou bebida, o veículo.
[081]Em algumas modalidades, a composição microbiana pode compreender ainda um alimento ou um suplemento nutricional eficaz para estimular o crescimento de A. caccae presente no trato gastrointestinal do indivíduo. Em algumas modalidades, o suplemento nutricional é produzido por outra bactéria asociada com um microbioma intestinal humano saudável.
III. ADMINISTRAÇÃO DE COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS
[082]A terapia provida aqui compreende a administração de uma combinação de agentes terapêuticos, tais como composições microbianas e prebióticos. A terapia pode ser administrada em qualquer maneira adequada conhecida na técnica. Por exemplo, a composição microbiana e o prebiótico podem ser administrados sequencialmente (em momentos diferentes) ou simultaneamente (no mesmo momento). Em algumas modalidades, a composição microbiana e o prebiótico estão em uma composição separada.
Em algumas modalidades, a composição microbiana e o prebiótico estão na mesma composição.
[083]As modalidades da revelação se referem a composições e métodos compreendendo bactérias e um ou mais prebióticos. As bactérias e/ou prebiótico(s) podem ser administrados em uma composição ou em mais do que uma composição, tal como 2 composições, 3 composições, ou 4 composições.
Várias combinações dos agentes podem ser empregadas, por exemplo, uma bactéria (ou composição compreendendo bactérias) é “A” e um prebiótico é “B”: A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[084]Em algumas modalidades, a composição microbiana é administrada antes do prebiótico. Em algumas modalidades, a composição microbiana é administrada pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 5, 6, 12, 24 horas ou 2, 3, 4, 6, 8, 10, dias ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 semanas (ou qualquer faixa derivável contida ali) antes do prebiótico. Em algumas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 doses (ou qualquer faixa derivável contida ali) da composição microbiana são administradas pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 5, 6, 12, 24 horas ou 2, 3, 4, 6, 8, 10, dias ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 semanas (ou qualquer faixa derivável contida ali) antes do prebiótico. Em algumas modalidades, a composição microbiana é administrada após o prebiótico. Em algumas modalidades, a composição microbiana é administrada pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 5, 6, 12, 24 horas ou 2, 3, 4, 6, 8, 10, dias ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 semanas (ou qualquer faixa derivável contida ali) após o prebiótico ou após pelo menos um dos prebióticos ou após pelo menos 2 dos prebióticos. Em algumas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 doses (ou qualquer faixa derivável contida ali) da composição microbiana são administradas pelo menos, no máximo, ou cerca de 1, 2, 3, 5, 6, 12, 24 horas ou 2, 3, 4, 6, 8, 10, dias ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 semanas (ou qualquer faixa derivável contida ali) após o prebiótico ou após pelo menos um dos prebióticos ou após pelo menos 2 dos prebióticos.
[085]Em algumas modalidades, a composição moduladora microbiana é formulada para a administração oral. O versado na técnica conhece uma avriedade de fórmulas que podem abranger micro-organismos vivos ou mortos e que podem estar presentes como suplementos alimentares (por exemplo, pílulas. comprimidos e os similares) ou como alimento funcional tal como bebidas ou iogurtes fermentados.
[086]Os agentes da revelação podem ser administrados pela mesma via de administração ou por vias de administração diferentes. Em algumas modalidades, o prebiótico é administrado por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal. Em algumas modalidades, a composição microbiana é administrada por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal. A dosagem apropriada pode ser determinada com base no tipo de doença a ser tratada, gravidade e curso da doença, a condição clínica do indivíduo, o histórico clínico do indivíduo e a resposta ao tratamento, e a critério do médico assistente.
[087]Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz ou suficiente de cada uma dentre a pelo menos uma população de bactérias isoladas ou purificadas ou da uma das pelo menos duas, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, ou 15 populações de bactérias isoladas ou purificadas das composições moduladoras microbianas das modalidades que são administradas a um ser humano será de pelo menos cerca de 1x103 unidades de formação de colônia (CFU) de bactérias ou pelo menos cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015 CFU (ou qualquer faixa derivável contida ali). Em algumas modalidades, uma dose única conterá bactérias (tais como uma bactéria ou espécie específica, gênero, ou família descrita aqui) presente em uma quantidade de menos, no máximo, ou cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015 ou mais CFU (ou qualquer faixa derivável contida ali). Em algumas modalidades, uma dose única conterá pelo menos, no máximo, ou cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015 ou maior do que 1x1015 CFU (ou qualquer faixa derivável contida ali) de bactérias totais.
[088]Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz ou suficiente de cada uma de pelo menos uma população de bactérias isoladas ou purificadas das composições microbianas das modalidades que são administradas a um ser humano será de pelo menos cerca de 1x103 células de bactérias ou pelo menos cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015 células (ou qualquer faixa derivável contida ali). Em algumas modalidades, uma dose única conterá bactérias (tais como uma bactéria ou espécie específica, gênero ou família descrita aqui) presente em uma quantidade de pelo menos, no máximo, ou cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015 ou mais células (ou qualquer faixa derivável contida ali).
Em algumas modalidades, uma dose única conterá pelo menos, no máximo, ou cerca de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015 ou maior do que 1x1015 células (ou qualquer faixa derivável contida ali) de bactérias totais.
[089]Os tratamentos podem incluir várias “doses unitárias”. A dose unitária é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica. A quantidade a ser administrada e a via e formulação particulares estão dentro da habilidade de determinação daqueles nas técnicas clínicas. Uma dose unitária não precisa ser administrada como uma injeção única, mas pode compreender infusão contínua durante um período de tempo ajustado. Em algumas modalidades, uma dose unitária compreende uma dose administrável única.
[090]A quantidade a ser administrada, tanto de acordo com o número de tratamentos quanto da dose unitária, depende do efeito desejado do tratamento. Uma dose eficaz é compreendida como se referindo a uma quantidade necessária para alcançar um efeito particular. Na prática em certas modalidades, é contemplado que doses na faixa de 10 mg/kg a 200 mg/kg podem afetar a capacidade protetora destes agentes. Assim, é contemplado que doses incluem doses de cerca de 0,1, 0,5, 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135,
140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, e 200, 300, 400, 500, 1000 µg/kg, mg/kg, µg/dia, ou mg/dia ou qualquer faixa derivável contida ali. Além disso, tais doses podem ser administradas em momentos múltiplos durante um dia e/ou em múltiplos dias, semanas, ou meses.
[091]Em certas modalidades, a dose eficaz da composição farmacêutica é uma que pode prover um nível sanguíneo de cerca de 1 M a 150 M. Em outra modalidade, a dose eficaz provê um nível sanguíneo de cerca de 4 M a 100 M.; ou cerca de 1 M a 100 M; ou cerca de 1 M a 50 M; ou cerca de 1 M a 40 M; ou cerca de 1 M a 30 M; ou cerca de 1 M a 20 M; ou cerca de 1 M a 10 M; ou cerca de 10 M a 150 M; ou cerca de 10 M a 100 M; ou cerca de 10 M a 50 M; ou cerca de 25 M a 150 M; ou cerca de 25 M a 100 M; ou cerca de 25 M a 50 M; ou cerca de 50 M a 150 M; ou cerca de 50 M a 100 M (ou qualquer faixa derivável contida ali).
Em outras modalidades, a dose pode prover o seguinte nível sanguíneo do agente que resulta de um agente terapêutico sendo administrado a um indivíduo: cerca de, pelo menos cerca de, ou no máximo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 μM ou mM ou qualquer faixa derivável contida ali. Em certas modalidades, o agente terapêutico que é administrado a um indivíduo é metabolizado no corpo em um agente terapêutico metabolizado, em cujo caso os níveis sanguíneos podem se referir à quantidade daquele agente. Alternativamente, na medida em que o agente terapêutico não é metabolizado por um indivíduo, os níveis sanguíneos discutidos aqui podem se referiri ao agente terapêutico não metabolizado.
[092]Quantidades precisas da composição terapêutica também dependem do julgamento do praticante e são peculiares a cada indivíduo. Os fatores que afetam a dose incluem estado físico e clínico do paciente, a via de administração, o objetivo de tratamento pretendido (alívio dos sintomas versus cura) e a potência, estabilidade e toxicidade da substância terapêutica particular ou outras terapias às quais o indivíduo pode estar sendo submetido.
[093]Será compreendido por aqueles versados na técnica e tornado ciente de que unidades de dosagem de µg/kg ou mg/kg de peso corporal podem ser convertidas e expressas em unidades de concentração comparáveis de µg/ml ou μM ou mM (níveis sanguíneos), tais como 4 M a 100 M.
Também será compreendido que a absorção é dependente da espécie e órgão/tecido. Os fatores de conversão aplicáveis e suposições fisiológicas a serem feitas no que se refere à medição da absorção e concentração são bem- conhecidos e permitiriam que aqueles versados na técnica convertessem uma medição da concentração em outra e fizesse comparações e conclusões razoáveis no que se refere às doses, eficácias e resultados descritos aqui.
[094]Prebióticos podem ser formulados usando técnicas de formulação farmacêutica conhecidas na técnica. Eles podem ser formulados usando técnicas especializadas conhecidas pela distribuição para regiões específicas do trato gastrointestinal. Dois exemplos conhecidos na técnica são descritos no pedido PCT publicado WO 2018/195067 A1 e também no pedido de patente norte-americano US15/257.673, cada um dos quais são incorporados por referência. Outras formulações para prebióticos ou combinações de prebióticos e A. caccae são conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, as composições da revelação incluem um composto que transporta butirato, tal como aqueles descritos na WO 2018/195067.
IV. MÉTODOS DE TRATAMENTO
[095]Os métodos da revelação se referem ao tratamento de doença infecciosa, autoimune ou alérgica. Em algumas modalidades, o método é para o tratamento de uma alergia alimentar. Em algumas modalidades, a alergia alimentar compreende uma alergia ao leite. Em algumas modalidades, a alergia ao leite compreende alergia ao leite de vaca.
Em algumas modalidades, a alergia ao leite compreende alergia ao leite de vaca, cabra ou ovelha.
Em algumas modalidades, o método é para o tratamento de alergias, asma,
diabetes (por exemplo, diabetes do tipo 1), rejeição a enxerto, artrite (artrite reumatoide, como artrite aguda, artrite reumatoide crônica, gota ou artrite gotosa, artrite gotosa aguda, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno do tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still,
artrite vertebral, e artrite reumatoide juvenil sistêmica, osteoartrite, artrite progressiva crônica, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa e espondilite anquilosante), doenças inflamatórias hiperproliferativas da pele, psoríase tais como psoríase em placas, psoríase gutata, psoríase pustulosa, e psoríase das unhas, atopia incluindo doenças atópicas tais como febre do feno e síndrome de Job, dermatite incluindo dermatite de contato,
dermatite de contato crônica, dermatite esfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme, dermatite numular, dermatite seborréica, dermatite não específica, dermatite de contato por irritação primária, dermatite atópica, síndrome de hiper-IgM ligada ao X, doenças inflamatórias intraoculares alérgicas, urticária tais como urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica,
miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia (incluindo escleroderma sistêmico), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) tal como MS espino-
óptica, MS progressiva primária (PPMS), e MS recorrente-remitente (RRMS),
esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, neuromielite óptica (NMO), doença inflamatória intestinal (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrointestinais mediadas autoimunes, colite tais como colite ulcerosa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrosante e colite transmural, e doença inflamatória intestinal autoimune), inflamação do intestino,
pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária,
síndrome do desconforto respiratório, incluindo síndrome do desconforto respiratório agudo ou adulto (ARDS), meningite, inflamação de toda ou parte da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, espondilite reumatoide, sinovite reumatoide, angioedema hereditário, lesão do nervo craniano como em meningite, herpes gestationis, penfigoide gestationis, prurido escroto, insuficiência ovariana prematura autoimune, perda auditiva súbita devido a uma condição autoimune, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite tal como encefalite de
Rasmussen e encefalite límbica e/ou do tronco cerebral, uveíte, tal como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior ou uveíte autoimune,
glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica tal como glomerulonefrite crônica ou aguda tal como GN primária, GN imunomediada, GN membranosa
(nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN membrano- ou membranosa proliferativa (MPGN),
incluindo Tipo I e Tipo II, e GN rapidamente progressiva, nefrite proliferativa,
insuficiência endócrina poliglandular autoimune, balanite incluindo balanite circunscrita plasmocelular, balanopostite, eritema anular centrífugo, eritema discrômico persistente, olho multiforme, granuloma anular, líquen nítido, líquen escleroso e atrófico, líquen simplex crônico, líquen espinhoso, líquen plano,
ictiose lamelar, hiperceratose epidermolítica, ceratose pré-maligna, pioderma gangrenoso, condições alérgicas e respostas, reação alérgica, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, eczema asteatótico, eczema disidrótico,
eczema palmoplantar e vesicular, asma tal como asma brônquica e asma autoimune, condições envolvendo a infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, reações imunes contra antígenos estranhos tais como grupos sanguíneos fetais A-B-O durante a gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos,
lúpus, incluindo nefrite por lúpus, cerebrite por lúpus, lúpus pediátrico, lúpus não renal, lúpus extra-renal, lúpus discoide e lúpus eritematoso discoide,
alopecia por lúpus, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) tal como SLE cutâneo ou
SLE cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE), e lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de início juvenil (Tipo I), incluindo diabetes mellitus insulino-dependente pediátrico (IDDM), e diabetes mellitus de início na idade adulta (diabetes tipo II) e diabetes autoimune.
Da mesma forma,
contempladas são as respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e tardia mediada por citocinas e linfócitos T, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatoide, granulomatose de Wegener,
agranulocitose, vasculites, incluindo vasculite, vasculite de grandes vasos
(incluindo polimialgia reumática e arterite de células T (Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa/periarterite nodosa), poliarterite microscópica, imunovasculite, vasculite do CNS, vasculite cutânea, vasculite de hipersensibilidade, vasculite necrotizante tal como vasculite necrosante sistêmica, e vasculite associada a ANCA, tal como vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS) e vasculite de pequenos vasos associada a ANCA, arterite temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoimune, anemia de Coombs positiva, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imunológica incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), doença de Addison, neutropenia autoimune, pancitopenia,
leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do SNC, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, como aquelas secundárias a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo de antígeno-anticorpo, doença anti-membrana basal glomerular, síndrome do anticorpo anti-fosfolipídio,
neurite alérgica, doença/síndrome de Behcet, síndrome de Castleman,
síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren,
síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide boloso e penfigoide da pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo,
penfigoide de membrana mucosa do pênfigo, e pênfigo eritematoso),
poliendocrinopatias autoimunes, doença ou síndrome de Reiter, lesão térmica,
pré-eclâmpsia, um complexo imunológico distúrbio tal como nefrite de imunocomplexo, nefrite mediada por anticorpos, polineuropatias, neuropatia crônica tal como polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM,
trombocitopenia autoimune ou imunomediada tal como púrpura trombocitopênica idiopática (PTI) incluindo PTI crônica ou aguda, esclerite como ceratoesclerite idiopática, episclerite, doença autoimune do testículo e ovário incluindo orquite e ooforite autoimune, hipotireoidismo primário,
hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite, tal como tireoidite autoimune, doença de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de
Hashimoto), ou tireoidite subaguda, doença autoimune da tireoide,
hipotireoidismo idiopático, doença de Grave, síndromes poliglandulares tais como síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas, como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome do homem ou pessoa rígida,
encefalomielite tais como encefalomielite alérgica ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), encefalomielite autoimune experimental, miastenia gravis, tal como miastenia gravis associada ao timoma,
degeneração cerebelar, neuromiotonia, opsoclonia ou síndrome de mioclonia opsoclonia (OMS), e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal,
síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupoide,
hepatite de células gianT, hepatite crônica ativa ou hepatite crônica ativa autoimune, pneumonite intersticial linfoide (LIP), bronquiolite obliterante (não transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barre, doença de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia idiopática por IgA, dermatose por IgA linear, dermatose neutrofílica febril aguda, dermatose pustulosa subcórnea, dermatose acantolítica transitória, cirrose tal como cirrose biliar primária e pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca ou celíaca, espru celíaco (enteropatia do glúten), espru refratário, espru idiopático,
crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; doença de Lou Gehrig),
doença da artéria coronária, doença autoimune do ouvido, como doença autoimune do ouvido interno (AIED), perda auditiva autoimune, policondrite,
como refratária, recidiva ou recidiva pulmonar proteinose alveolar, síndrome de
Cogan / ceratite intersticial não sifilítica, paralisia de Bell, doença / síndrome de
Sweet, rosácea autoimune, dor associada ao zoster, amiloidose, uma linfocitose não cancerosa, uma linfocitose primária, que inclui linfocitose monoclonal de células B monoclonais (por exemplo, gamopatia e gamopatia monoclonal de significado indeterminado, MGUS), neuropatia periférica,
síndrome paraneoplásica, canalopatias, como epilepsia, enxaqueca, arritmia,
distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, canalopatias do
SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose segmentar ou segmentar focal (GESF), oftalmopatia endócrina , coriorretinite, distúrbio hepatológico autoimune, fibromialgia, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinizantes, como doenças desmielinizantes autoimunes e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome alsophora totynecopia,
totinecopia, alsofagia, alsofagia, alsofagia, alsofagia, totinecopia, alsofagina
Fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactil), telangiectasia),
masculino e feminino infertilidade autoimune, por exemplo, devido a anticorpos antiespermatozoários, doença do tecido conjuntivo misto, doença de Chagas,
febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multifacetado pós -ca síndrome de rdiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de criador de pássaros, angiite granulomatosa alérgica, angiite linfocítica benigna,
síndrome de Alport, alveolite, como alveolite alérgica e alveolite fibrosante,
pulmão intersticial, reação transfusional, hanseníase, malária, doenças parasitárias como leishmaniose, cipossomíase, esquistossomose, ascaríase,
aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite,
fibrose endomiocárdica, fibrose intersticial difusa, fibrose intersticial fibrose fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, eritroblastose fetal, faciite eosinofílica, síndrome de Shulman,
síndrome de Felty, flarose, ciclite, como ciclite crônica, ciclite heterocrônica,
iridociclite aguda ou ciclite heterocrônica, iridociclite aguda ou ciclite crônica púrpura, infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), SCID,
síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), infecção por ecovírus, sepse,
endotoxemia, pancreatite, tiroxicose, infecção por parvovírus, infecção pelo vírus da rubéola, síndromes pós-vacinação, infecção congênita da rubéola,
infecção pelo vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, insuficiência gonadal autoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós-estreptocócica,
tromboangite ubiterans, tireotoxicose, tabes dorsalgia, corioidite, corioidite pneumonite de hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca,
ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia de alteração mínima, lesão familiar benigna e isquemia-reperfusão, reperfusão de órgão de transplante, autoimunidade retinal, inflamação articular, bronquite,
nefropatia de alteração mínima, lesão familiar benigna e isquemia-reperfusão,
reperfusão de órgão de transplante, autoimunidade retinal, inflamação das articulações, bronquite, obstrução respiratória crônica, silofiopatia pulmonar aforose / doença pulmonar estomatite, distúrbios arterioscleróticos,
asperniogênese, hemólise autoimune, doença de Boeck, crioglobulinemia,
contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enterite alérgica, eritema nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndrome da fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda auditiva sensoneural,
hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia,
mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário,
nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatosa, pancreatite, polirradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia espênica adquirida,
timoma não maligno, vitiligo, síndrome de choque tóxico, deficiência de adesão de leucócitos, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, antígeno-anticorpo mediada por complexo, doença antiglomerular da membrana basal, neurite alérgica, polendocrinopatias autoimunes , ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doenças reumáticas, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome nefrótica, insulite, insuficiência polendócrina,
síndrome poliglandular autoimune tipo I, hipoparatireoidismo idiopático de início na idade adulta (AOIH), cardiomiopatia, como cardiomiopatia dilatada,
epidermólise bolhosa aquisita (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrosante não purótica ou purulenta, esclerosante primária ou colangite aguda colangite aguda ou sinusite crônica, sinusite etmoide, frontal, maxilar ou esfenoidal, um distúrbio relacionado a eosinófilos, como eosinofilia, infiltração pulmonar eosinofilia, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler,
pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomas contendo eosinófilos,
anafilaxia, espondiloartrites soronegativas, doença autoimune poliendócrina,
colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crônica,
síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitória da infância, síndrome de
Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasia, distúrbios autoimunes associados com doença de colágeno, reumatismo, doença neurológica, linfadenite, redução da resposta da pressão arterial, disfunção vascular, lesão de tecido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, e doença que acompanha a vascularização, distúrbios de hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrites, lesão de reperfusão, distúrbio de reperfusão isquêmica, lesão de reperfusão do miocárdio ou outros tecidos,
traqueobronquite linfomatosa, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, falência de múltiplos órgãos, doenças bolhosas, necrose cortical renal, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios oculares e orbitais, síndromes associadas à transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocina, narcolepsia, inflamação grave aguda, inflamação crônica intratável, pielite, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulite, doença enxerto versus hospedeiro, hipersensibilidade de contato, hiper-reação asmática das vias aéreas, e endometriose.
V. KITS
[096]Certos aspectos da revelação também abrangem kits para a realização dos métodos da revelação, tais como kits compreendendo as composições descritas aqui. Os kits podem compreender um recipiente com um rótulo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente pode reter uma composição que inclui uma sonda que é útil para aplicações de prognóstico ou não prognóstico, tais como descrito acima. O rótulo no recipiente pode indicar que a composição é usada para uma aplicação específica de prognóstico ou não prognóstico, e também pode indicar direções para uso in vivo ou in vitro, tais como aquelas descritas acima. O kit pode compreender o recipiente descrito acima e um ou mais outros recipientes compreendendo materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso.
VI. EXEMPLOS
[097]Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção,
e assim podem ser consideradas para constituir modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente revelação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda podem obter um resultado parecido ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção.
EXEMPLO 1 – CRIANÇAS SAUDÁVEIS CONTÊM BACTÉRIAS
INTESTINAIS QUE PROTEGEM CONTRA A ALERGIA ALIMENTAR B. RESULTADOS
[098]O trabalho do laboratório dos inventores e outros demonstraram que as comunidades microbianas fecais das crianças com CMA são acentuadamente diferentes daquelas de suas contrapartes saudáveis (5, 6).
Combase nestes resultados, assim como evidencia que membros da microbiota podem ser protetores contra alergia (7), os inventores usaram um modelo de camundongo gnotobiótico para investigar se bactérias comensais desempenham um papel causal na proteção contra uma resposta alérgica ao alérgeno β-lactoglobulina (BLG) do leite de vaca. Os camundongos livres de germes (GF) foram colonizados com fezes humanas de quatro doadores infantis saudáveis e quatro alérgicos ao leite de vaca mediado por IgE (CMA) que foram combinados quanto à idade, gênero e modo de nascimento (8, 9) (Tabela Suplementar 1). Foi relatado anteriormente que a dieta é importante para a colonização estável de camundongos livres de germes com fezes humanas (ref. 10). Para apoiar o crescimento de bactérias humanas nos hospedeiros murinos, os camundongos receberam fezes de crianças saudáveis alimentadas com fórmula ou com CMA e foram alimentados com as mesmas fórmulas consumidas por seus doadores infantis humanos em adição a ração vegetal para camundongos. Os doadores infantis com CMA receberam uma fórmula de caseína extensivamente hidrolisada (EHCF) para gerenciar os sintomas alérgicos em progresso enquanto os doadores saudáveis receberam uma fórmula baseada em leite de vaca padrão (5). Os recipientes para transfeência inicial foram usados como repositórios vivos para experimentos subsequentes (vide Métodos).
[099]Grupos de camundongos GF e camundongos colonizados com a microbiota infantil saudável ou com CMA foram sensibilizados com BLG e a toxina da cólera (CT) adjuvante mucosal. Os camundongos GF, desprovidos de qualquer colonização bacteriana, foram altamente suscetíveis a respostas anafiláticas ao alimento como evidenciado por uma queda na temperatura corporal central (FIG. 1A) e produção de IgE e IgG1 específicas para BLG (FIG.
1B, C) (7, 11). Os inventores também mediram uma redução substancial na temperatura corporal central em camundongos colonizados com amostras fecais de cadaum dos quatro doadores com CMA em resposta ao desafio de BLG (FIG. 1A). Os camundongos colonizados por CMA sensibilizados produziram concentrações de soro significativamente maiores de IgE específica para BLG (FIG. 1B), IgG1 (FIG. 1C) e mMCPT-1 (FIG. 1D) quando comparado a camundongos colonizados saudáveis. Notavelmente, todos os camundongos que receberam as quatro microbiotas de criança saudável foram protegidos contra uma resposta anafilática ao desafio de BLG; sua temperatura corporal central após o desafio era significativamente diferente daquela medida em GF ou camundongos colonizados por CMA (FIG. 1A). a análise histológica não revelou qualquer evidência de patologia ou inflamação nas amostras de tecido ileal ou colônico tiradas após o desafio (FIG. 5) ou após a colonização a longo prazo (FIG. 6). A análise microbiana revelou que a diversidade e uniformidade da comunidade foram similares entre grupos de camundongos colonizados saudáveis e com CMA (FIG. 7). Para examinar se a fórmula contendo leite de vaca contribuiu para a proteção contra a anafilaxia independente da microbiota nos camundongos colonizados saudáveis, os inventores realizaram transferências fecais adicionais de doadores amamentados saudáveis e doadores com CMA (Tabela Suplementar 2). Os camundongos receptores receberam somente ração vegetal para camundongos. Os camundongos colonizados com fezes do doador amamentado saudável foram protegidos de uma resposta anafilática à sensibilização e desafio de BLG. No entanto, os camundongos colonizados com fezes de um doador amamentado com CMA exibiu uma queda significativamente maior na temperatura corporal central comparado a camundongos colonizados saudáveis (FIG. 8A) e níveis maiores de IgE específica para BLG (FIG. 8B). A senbilização também foi comparada a BLG em camundongos GF alimentado com água ou Enfamil. Ambos os grupos de camundongos responderam robustamente à sensibilização com BLG (FIG.
9). Não houve qualquer diferença significativa em sua queda na temperatura corporal central após o desafio ou em concentrações de soro de IgE ou IgG1 específicas para BLG; mMCPT-1 sérico foi, no entanto, suprimido em camundongos alimentados com a fórmula contendo leite de vaca.
[0100]A análise das amostras fecais dos oito doadores infantis humanos alimentados com fórmula (Tabela Suplementar 1) identificou 58 unidades taxonômicas operacionais (OTUs) que foram diferencialmente abundantes entre crianças saudáveis e com CMA (FIG. 2A; Tabela Suplementar 3). Uma vez que existe variação entre cada recipiente de transferência de doador e murino no nível único de OTU, os inventores examinaram se as diferenças da composição de microbioma derivadas do doador foram capazes de distinguir os grupos de camundongos colonizados.
Como uma medida agregada para prevenir os dados, os inventores calcularam o número de OTUs potencialmente "protetoras" (mais abundantes em doadores saudáveis, n=34) e potencialmente "não protetoras" (mais abundantes em doadores com CMA, n=24) para produzir uma razão de presença/ausência para cada doador (FIG. 10A; vide Métodos). Além disso, os inventores calcularam uma pontuação pesada em direção a cada OTU com base em sua abundância relativa na amostra (a seguir denominada pontuação de abundância) (FIG. 2A; vide Métodos). Quando a pontuação de abundância de OTU foi traçada contra a razão de presença/ausência, os doadores segregaram por razão em grupos saudáveis e com CMA (FIG. 10B, quadrados). Este limiar também separou os camundongos colonizados saudáveis e com CMA por seu fenótipo biológico (FIG. 10B, círculos), demonstrando que sua assinatura de microbiota agregada derivada do doador é validada nos recipientes de transferência de murinos. A razão significativamente maior de OTU protetora/não protetora em crianças saudáveis em relação áquelas com CMA foi independentemente corroborada em um conjunto de amostras não relacionado do mesmo cohorte de Neapolitan por reanálise de dados da amostra fecal 16S coletados em um estudo anteriormente publicado(5) (FIG. 11). A razão de OTU derivada do doador também separou camundongos saudáveis e colonizados por CMA quando traçados contra biomarcadores de doença alérgica incluindo IgE específica para BLG (FIG. 2B), IgG1 específica para BLG (FIG. 2C) e mMCPT-1 (FIG.
2D). De modo interessante, a análise do tamanho do efeito discriminante linear (LEfSe) (FIG. 2E, F) mostrou que Lachnospiraceae, uma família na classe Clostridia, foi enriquecida nos camundongos colonizados saudáveis (7).
[0101]A tolerância a antígenos dietéticos começa com sua absorção no intestino delgado (4, 12). A maioria das bactérias comensais reside no cólon; no intestino delgado, as bactérias são mais numerosas no íleo (13). A interação destas bactérias com IECs é central para a regulação da imunidade na interface de micróbios hospedeiros (13, 14). Os IECs ileais foram isolados de grupos de camundongos colonizados por cada um dos oito doadores infantis e quantificada a expressão gênica por RNASeq (FIG. 3A). Os camundongos colonizados saudáveis suprarregularam um conjunto único de genes ileais comparado a camundongos colonizados por CMA (FIG. 3A; Tabela Suplementar 4). Por exemplo, Fbp1, que codifica uma enzima gluconeogênica chave, expresso abundandemente em células epiteliais do intestino delgado (15), foi significativamente suprarregulado em todos os camundongos colonizados saudáveis (FIG. 3A). A expressão reduzida de Fbp1 foi associada com uma troca metabólica de fosforilação oxidativa por glicólise aeróbica (16, 17) que altera a oxigenação do epitélio e contribui para a disbiose (18). Tgfbr3 e Ror2 foram infrarregulados no íleo de camundongos colonizados por CMA em relação a camundongos colonizados saudáveis (FIG. 3A). Tgfbr3 codifica um receptor para o fator de crescimento TGF-β e é abundantemente expresso no intestino delgado de ratos em período de amamentação (19). TGFβRIII e TGF-β2 solúveis estão presentes em altas concentrações em leite materno; a ativação de sinalização de TGF-β por Wnt5a é mediada através de Ror2 e é importante para o reparo epitelial (20). Por contraste, Acot12 e Me1, genes envolvidos no metabolismo de piruvato, foram suprarregulados no íleo de camundongos colonizados por CMA em relação a camundongos colonizados saudáveis. Estes processos metabólicos e moleculares são refletidos nos caminhos da Ontologia de Genes significativamente alterados em camundongos colonizados com CMA e saudáveis descritos na FIG. 3B.
[0102]Para determinar se as assinaturas de OTU fecais identificadas na FIG. 2 também são reflexos de populações bacterianas ileais, os inventores examinaram a correlação entre OTUs ileais e a assinatura fecal em camundongos saudáveis e colonizados por CMA (FIG. 12A). Verificou-se que a maioria das taxas mudam na mesma direção (aumento ou diminuição em abundância) em saudável em relação a CMA entre amostras ileais e fecais de camundongo (FIG. 12B, C). A identificação de expressão gênica diferencial em IECs ileais de camundongos saudáveis e colonizados por CMA (FIG. 3A) sugeriu que as bactérias ileais regulam a imunidade do hospedeiro para contribuir para a sensibilização alérgica. A análise integrada das bactérias ileais e genes ileais diferencialmente expressos (DEGs) revelou 9 OTUs significativamente e consistentemente correlacionados com genes suprarregulados no íleo de camundongos colonizados saudáveis ou com CMA (FIG. 4A). De modo interessante, 3/5 das OTUs protetoras associadas com DEGs suprarregulados no íleo de camundongos colonizados saudáveis são membros da família Lachnospiraceae. Uma busca BLAST de sequências 16S reunidas contra as bases de dados NCBI (RNA ribossômico 16S, Bacteria e Archaea) revelou que todas as três OTUs protetoras Lachnospiraceae suprarreguladas nos camundongos colonizados saudáveis (259772, New18, 177986) têm Anaerostipes caccae como a espécie de combinação mais próxima. Em particular, OTU259772 foi anotado com A. caccae em um estudo anterior de fezes infantis humanas e dieta (21). A. caccae é formação de não esporos, utiliza lactato e acetato e produz butirato (22, 23). A correlação de Spearman entre Lachnospiraceae OTU259772 e vários DEGs ileais de interesse altamente correlacionados (Ror2, Fbp1, Tgfbr3, Acot12 e Me1) da FIG. 3A são descritos na FIG. 4B. A análise de amostras ileais e fecais usando PCR quantitativa (qPCR) com iniciadores específicos da espécie anteriormente validados (24) proveu confirmação independente do enriquecimento de A.
caccae em camundongos colonizados saudáveis (FIG. 4C-E e FIG. 13A-C). A abundância de A. caccae em amostras ileais também se correlacionou com DEGs de IECs ileais (FIG. 14). Vale destacar que dois dos DEGs altamente correlacionados (Acot12 e Me1) estão envolvidos no metabolismo de piruvato.
O butirato é uma fonte de energia importante para células epiteliais colônicas (25). O butirato aciona o consumo de oxigênio por colonócitos através da oxidação β, dessa forma, mantendo um nicho localmente hipóxico para anaeróbios obrigatórios produtores de butirato (26). Sob condições de disbiose, os colonócitos geram energia por meio da glicólise, um processo que inclui a produção de piruvato como um intermediário chave (27). É tentador especular que a correlação negativa entre a abundância de A. caccae produtor de butirato e os genes relacionados ao metabolismo do piruvato em IECs de camundongos colonizados por CMA é reflexo das mudanças metabólicas na função epitelial ileal sob condições de disbiose.
[0103]Foi examinado a seguir se A. caccae pode imitar as mudanças na expressão gênica e proteção contra anafilaxia associada com a microbiota saudável por monocolonização de camundongos GF (vide Métodos). Alguns dos genes significativamente suprarregulados em camundongos colonizados saudáveis (Fbp1, Tgfbr3) também foram significativamente suprarregulados em camundongos monocolonizados A. caccae (FIG. 4F) quando comparados a GF ou camundongos colonizados por CMA. A expressão de Acot12 foi significativamente suprarregulada em camundongos colonizados por CMA, mas não em camundongos colonizados saudáveis ou monocolonizados A. caccae (FIG. 4F). Camundongos monocolonizados sensibilizados com BLG mais CT A.
caccae foram protegidos contra uma resposta anafilática ao desafio de BLG.
Como na FIG. 1, os camundongos colonizados com CMA exibiram uma queda acentuada na temperatura corporal central indicativa de anafilaxia (FIG. 4G).
Ambas as mudanças na temperatura corporal central e concentrações séricas de mMCPT-1 foram significativamente reduzidas em camundongos monocolonizados A caccae comparado a camundongos colonizados com CMA (FIG. 4 G, J). O anticorpo antígeno específico, dependente de Th2 (IgE e IgG1 específicas para BLG sérico) (FIG. 4H, I) e respostas de citocina IL-13 e IL-4 (FIG. 4K, L) foram todos reduzidos em camundongos monocolonizados A caccae.
[0104]Os inventores mostraram que as bactérias anaeróbicas associadas à mucosa na classe Clostridia têm atraído considerável interesse devido a seus papéis relatados na manutenção da homesostase intestinal através da indução de células T reguladoras (28, 29), produção de metabólitos imunomoduladores (30, 31), e regulação da resistência à colonização (32). Os inventores mostraram que tais bactérias imunomoduladoras estão presentes no íleo, no local da absorção do alimento e demonstraram seu papel na proteção contra uma resposta anafilática ao alimento. A análise mecanística das mudanças associadas a Clostridia na expressão gênica ileal descrita aqui provavelmente revela caminhos adicionais críticos para a manutenção da tolerância a antígenos dietéticos. O modelo descrito no relatório não trata de quando o estado alérgico aciona a disbiose (33) ou a disbiose precede a alergia. De fato, muitos fatores provavelmente contribuem para o desenvolvimento de alergias alimentares. Estes dados demonstram que as bactérias comensais desempenham um importante papel na prevenção de respostas alérgicas ao alimento e provê prova de conceito para o desenvolvimento de estratégias moduladoras do microbioma para prevenir ou tratar esta doença.
C. MÉTODOS
[0105]Criação de camundongos gnotobióticos. Todos os camundongos foram alimentados e alojados na Instalação Animal de Pesquisa Gnotobiótica (GRAF). Os camundongos foram mantidos nas unidades de alojamento de isolador de filme flexível estilo Trexler (Class Biologically Clean) com gaiolas de camundongo de policarbonato Ancare (catálogo #N10HT) e Lascas de Pinheiro Teklad (7088; esterilizadas por autoclave) em um ciclo claro/escuro de 12 horas em uma temperatura ambiente de 20-24oC. Os camundongos foram providos com água estéril autoclavada, grau USP, em pH 5,2 ad libitum. A roupa de cama era trocada semanalmente; as gaiolas dos camundongos alimentados com fórmula exigiam mudanças na roupa de cama quase diariamente devido ao vazamento da fórmula das garrafas. Todos os camundongos foram alimentados com Purina Lab Diet® 5K67, armazenados em um ambiente com controle de temperatura de acordo com The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition, 2013). A dieta foi esterilizada por autoclave a 121oC x 30 minutos. A esterilidade dos isolantes foi avaliada semanalmente por ambos cultivo e análise de rRNA 16S das amostras fecais por qPCR. O cultivo foi em BHI, Nutrient and Sabbaroud Broth a 37oC aeróbico e anaeróbico e 42oC aeróbico para 96 horas. Todos os camundongos são inicialmente selecionados mediante a rederivação ou receita para todos os parasitas internos e externos, perfil de sorologia total e/ou PCR, bacteriologia, e análise macroscópica e histológica dos órgãos principais através de IDEXX
Radil ou Charles River Lab usando um Axenic Profile Screen. Camundongos livres de germes (GF) C3H/HeN foram transferidos para dentro da instalação de T. Golovkina (University of Chicago).
[0106]Preparação de amostras fecais humanas. Amostras fecais saudáveis (não alérgicas) foram obtidas de participantes em um programa de vacinação. Estes indivíduos não estavam em risco de distúrbios atópicos e seu histórico clínico foi negativo para qualquer condição alérgica. As crianças com CMA foram diagnosticadas em um centro terciário de alergia pediátrica (Programa de Alergia Pediátrica do Departamento de Ciência Médica Translacional da Universidade de Nápoles ‘Federico II’); para informações completas de pacientes vide as Tabelas Suplementares 1 e 2. Todos os aspectos deste estudo foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovados para o Comitê de Ética da Universidade de Nápoles ‘Federico II’. Consentimento informado por escrito foi obtido dos pais/guardiões de todas as crianças envolvidas nesta pesquisa. Amostras fecais frescas foram coletadas na clínica em tubos estéreis, pesadas, misturadas com 2 mL de caldo de LB + 30% de glicerol por 100-500 mg, divididas em alíquotas em criofrascos estéreis e imediatamente armazenadas a -80oC. As amostras foram enviadas para a Universidade de Chicago em gelo seco onde elas foram armazenadas a -80˚C até a homogeneização. Para colonizar camundongos, amostras fecais congeladas foram introduzidas em uma câmara anaeróbica e descongeladas. As fezes descongeladas foram misturadas com 3 mm de contas de vidro de borossilicato em um tubo estéril de 50 mL com 2,5 mL de PBS pré-reduzido + 0,05% de cisteína e submetidas a vórtice gentilmente para dissociar. O homogenado resultante foi filtrado através de um filtro de 100 µm.
Este processo de homogeneização e filtração foi repetido três mais vezes e o filtrado final foi misturado com um volume igual de 30% de glicerol + 0,05% de cisteína. Esta solução foi dividida em alíquotas em tubos Balch com rolhas de borracha para transporte e introdução dentro do isolador gnotobiótico. A solução fecal restante foi congelada em alíquotas a -80˚C.
[0107]Colonização de camundongos livres de germes. Todos os camundongos foram desmamados em 3 semanas de idade sobre uma ração vegetal para camundongos (Purina Lab Diet® 5K67) e colonizados no desmame. Os camundongos GF receberam água estéril autoclavada. Ambos os camundongos macho e fêmea foram usados para todos os experimentos.
Cada experimento foi controlado pelo companheiro de ninhada. Todos os camundongos foram identificados por marcas auriculares exclusivas de 5 dígitos. Todo trabalho foi realizado de acordo com os Comitês Institucionais de Biossegurança e Cuidado e Uso de Animais. Cada transferência de doador infantil humano foi mantida em seu próprio isolante de filme flexível para evitar a contaminação cruzada. Em todos os experimentos, camundongos de repositório foram criados de doadores fecais humanos por alimentação intragástrica de camundongos GF com 500 µL de homogenado fecal infantil recém-preparado. Estes repositórios foram a seguir usados para colonizar subsequentes camundongos experimentais por meio da transferência de camundongo para camundongo por alimentação intragástrica de fezes de camundongo. As amostras fecais de ambos os camundongos de repositório e experimentais foram examinadas regularmente por análise de rRNA 16S o que demonstrou que a transferência de camundongo para camundongo de camundongos de repositório para experimentais por alimentação foi altamente reproduzível e estável ao longo do tempo. Para a colonização de camundongos experimentais, uma partícula fecal recém-eliminada de um repositório de camundongo foi homogeneizada em 1 mL de PBS estéril e 250 µL deste homogenado foram usados para alimentar um camundongo receptor. Para camundongos alimentados com fórmula infantil, a água potável foi substituída pela fórmula quatro horas antes da colonização. Camundongos colonizados com fezes da criança saudável receberam Enfamil, camundongos infantis
(Mead Johnson Nutrition, Evansville, EM) e colonizados por CMA receberam fórmula de caseína extensivamente hidrolisada (EHCF), Nutramigen I (Mead Johnson Nutrition) ad libitum. Ambas as formas secas e líquidas das fórmulas foram utilizadas. A fórmula seca foi misturada com água estéril autoclavada, grau USP, de acordo com as instruções do fabricante. Todas as fórmulas foram atualizadas diariamente.
[0108]Para camundongos monocolonizados Anaerostipes caccae, A.
caccae (DSM-14662, DSMZ) foi cultivada em uma câmara anaeróbica (Coy, Modelo B) em Caldo de Schaedler reduzido (Remel) durante a noite a 37˚C até uma densidade óptica (OD600) de 1,08. 250 µL (aproximadamente 2,5x108 CFU) foram alimentados aos camundongos GF. Estes camundongos foram monitorados para a colonização por qPCR com iniciadores específicos da espécie (Tabela Suplementar 6) e foram mantidos como repositórios vivos.
Para a colonização de camundongos experimentais, a fórmula infantil Enfamil (líquida) foi adicionada à água potável quatro horas antes da colonização. Uma partícula fecal recém-eliminada de um repositório de camundongo foi a seguir homogeneizada em 1 mL de PBS estéril e 250 µL deste homogenado foram usados para alimentar um camundongo receptor. A monocolonização com A.
caccae foi confirmada por sequenciamento direcionado a rRNA 16S de amostras fecais coletadas em sacrifício para todos os camundongos experimentais.
[0109]Sequenciamento direcionado a rRNA 16S. O DNA bacteriano foi extraído usando o kit de isolamento de DNA Power Soil (MoBio). O sequenciamento de amplicon de gene rRNA 16S foi realizado em uma Illumina MiSeq na Instalação de Preparação e Sequenciamento de Amostras Ambientais do Laboratório Nacional de Argonne. Os procedimentos descritos na referência 34 foram usados para gerar leituras finais emparelhadas de 151 pb das amostras fecais com códigos de barra de 12 pb. A região V4 do gene rRNA 16S foi amplificada por PCR com iniciadores específicos da região
(515F-806R) que incluem sequências do adaptador do sequenciador usadas na célula da fluxo Illumina.
A coorte de assinatura da microbiota consistindo em amostras fecais do doador infantil e amostras gnotobióticas ileais e fecais de camundongo (n=99) foi analisada por Insights Quantitativos sobre Ecologia
Microbiana (QIIME) (versão 1.9) (35). Leituras brutas foram reduzidas para remover bases de baixa qualidade; sequências de sobreposição de extremidade emparelhada 3’ foram fundidas usando SeqPrep (encontrado na rede mundial de computadores em github.com/jstjohn/SeqPrep). O protocolo de coleta de OTU de referência aberta foi usado em 97% de identidade de sequência contra a base de dados Greengenes (liberação 08/2013) (36). As sequências foram alinhadas com PyNAST (37). Atribuições taxonômicas foram feitas com o atribuidor de taxonomia de consenso uclust (38); as sequências quiméricas previstas foram removidas usando ChimeraSlayer (v20110519)
(encontrado na rede mundial de computadores em microbiomeutil.sourceforge.net). Os dados eram rarefeitos a uma profundidade uniforme de 3.160 leituras para a coorte de camundongo doador e colonizado
(n=99, consistindo em amostras fecais do doador, amostras fecais do camundongo em 2 e 3 semanas após a colonização e amostras ileais de camundongo), e 10.050 leituras para a coorte de camundongo mostrada na
FIG. 12C (n=70, consistindo em amostras fecais e ileais emparelhadas dos 35 camundongos em 1 semana após a colonização). As métricas de diversidade alfa (índice de Shannon) e beta foram comparadas entre grupos com CMA e saudáveis usando teste Mann-Whitney-Wilcoxon bilateral (não paramétrico) e
PERMANOVA com distância UniFrac pesada em pacote vegan R (v2.4.5) (39),
respectivamente.
A uniformidade de índice de Pielou foi computada por onde é índice de Shannon e como o número máximo de OTUs.
A
Taxa de Descobertas Falsas Discreta (DS-FDR) (40) foi usada para identificar a taxa bacteriana diferencialmente abundante entre as comunidades fecais dos grupos com CMA e saudáveis com parâmetros “transform_type=normdata, method=meandiff, alpha=0,10, numperm=1000, fdr_method=dsfdr” (02262018 acessado) (https://github.com/biocore/dsFDR). Comparado ao método Benjamini-Hochberg-FDR (BH-FDR), o método de DS-FDR aumentou a energia com tamanho de amostra limitado e é robusto para estrutura de dados esparsa (baixa proporção de valores não zero na tabela de abundância de micróbios), portanto, é exclusivamente adequado para a análise de dados das comunidades de micróbios (40). O algoritmo de DS-FDR não computa os valores P ajustados; em vez disso, ele estima a taxa de descobertas falsas de um teste de permutação (1000 permutações padrão), que controla a FDR no nível desejado (0,10). Como tal, ele computa os valores P brutos, estatísticas de teste e hipóteses rejeitadas no resultado (Tabela Suplementar 3 e Tabela Suplementar 5). Em cada comparação, OTUs presentes em menos do que 4 amostras foram removidas antes da aplicação do teste de DS-FDR. O tamanho do efeito da análise discriminante linear (LEfSe) foi usado para identificar os gêneros significativamente enriquecidos em grupos com CMA ou saudáveis comparado ao outros, usando o valor de normalização por amostra de
1.000,000 e valores padrão para outros parâmetros (41). Na análise de LEfSe, a pontuação da análise discriminante linear (LDA) foi computada quanto à taxa diferencialmente abundante entre os dois grupos. Um táxon em P<0,05 (teste Kruskal-Wallis) e log10(LDA) ≥ 2,0 (ou ≤ −2,0) foi considerado significativo.
Para a FIG. 2A, após o teste de abundância diferencial na comparação de doador com CMA vs saudável usando DS-FDR, os inventores ainda filtraram as OTUs significativas ao exigir a presença em pelo menos dois grupos de camundongo, deixando um total de 58 OTUs para análise adicional. Uma razão de OTU foi calculada pela divisão do número total de OTUs potencialmente protetoras (mais abundantes em saudável) pelo número total de OTUs potencialmente não protetoras (mais abundantes em CMA) por amostra. Além disso, uma pontuação de abundância de OTU foi computada considerando a abundância de 58 OTUs identificadas em CMA em relação a amostras fecais de doador saudável, mostradas na FIG. 2A. Primeiramente, a transformação de dados foi aplicada sobre a abundância relativa para aproximar o sinal da distribuição gaussiana. A abundância relativa de cada OTU foi multiplicada por uma constante (1×106) para trazer todos os valores para mais do que 1, log10 transformado e ampliado pela divisão do valor por suas raiz quadrada média nas amostras. A abundância de OTUs potencialmente não protetoras foi multiplicada por (-1). Em seguida, a soma da abundância transformada das 58 OTUs foi calculada para gerar a pontuação do agregado. Para validar as diferenças de razão de OTU na coorte independente, os inventores reanalisaram os dados de sequenciamento 16S de amostras fecais coletadas das crianças saudáveis e com CMA (n=38) em ref. 5 usando o mesmo protocolo de análise descrito acima, com dados rarefeitos a uma profundidade uniforme de 6.424 leituras. Dentre as 58 OTUs mostradas na FIG 2A, 55 OTUs foram atribuídas com IDs de referência conhecidas e 3 com IDs de Referência Nova (Tabela Suplementar 3). As IDs de Referência Nova de OTU não são comparáveis entre cohortes de análise diferentes, consequentemente, os inventores focaram nas OTUs com IDs de referência conhecidas. Fora as 55 OTUs conhecidas, 52 foram combinadas na coorte independente reanalisada e usadas para o cálculo da razão de OTU protetora/não protetora descrita na FIG. 10.
[0110]Sensibilização e desafio de alérgeno alimentar. Os protocolos foram adaptados de referência 7. Todos os camundongos foram desmamados para uma ração vegetal para camundongos (Purina Lab Diet® 5K67) em 3 semanas de idade. Os camundongos GF receberam água estéril autoclavada.
Para camundongos colonizados com fezes de doadores infantis, ou monocolonizados com A. caccae, a água potável foi substituída por fórmula quatro horas antes da colonização. Camundongos colonizados com fezes saudáveis ou A.caccae receberam Enfamil; camundongos colonizados com
CMA receberam Nutramigen (ambos de Mead Johnson). No dia 0, uma semana após desmame (GF) ou colonização (saudável/A.caccae/CMA), todos os camundongos jejuaram por 4 horas e a seguir receberam uma alimentação de bicarbonato de sódio a 200 mM. 30 minutos depois, os camundongos receberam 20 mg de BLG (Sigma) mais 10 µg de CT (List Biologicals). Este protocolo foi repetido semanalmente por 5 semanas. Para camundongos alimentados com fórmula, a fórmula foi substituída por água estéril pela semana após a última sensibilização. Antes do desafio no dia 42, os camundongos jejuaram por 4 horas e receberam bicarbonato de sódio por alimentação. Duas doses de 100 mg de BLG cada foram a seguir administrados por meio de alimentação intragástrica 30 minutos separadamente. A temperatura corporal central foi medida de uma maneira cega antes do desafio de alérgeno e a cada 5 minutos após o primeiro desafio até pelo menos 30 minutos após o segundo desafio usando uma sonda retal (PhysiTemp). O soro foi coletado 1 hora após o segundo desafio para medir os níveis de mMCPT-1. O soro foi coletado 24 horas após o desafio para medições de anticorpo.
[0111]ELISAs. mMCPT-1 foi quantificada em soro coletado 1 hora após o segundo desafio de acordo com o protocolo do fabricante (eBioscience).
ELISAs específicas para BLG foram realizadas usando protocolos modificados a partir da referência 7. Em resumo, as placas foram revestidas durante a noite a 4˚C com 100 µg/mL de BLG em tampão de carbonato-bicarbonato a 100 mM (pH 9,6). As placas foram bloqueadas por 2 horas à temperatura ambiente com 3% de BSA. As amostras foram adicionadas em 1% de BSA e incubadas durante a noite a 4˚C. Os ensaios foram padronizados com anticorpos específicos para BLG (IgE ou IgG1) purificados em uma coluna de afinidade com CNBr-Sepharose de camundongos imunizados com BLG+alum (42). Os anticorpos específicos para BLG foram detectados com IgE-UNLB anticamundongo de cabra (Southern Biotech) e IgG-AP anticabra de coelho
(ThermoFisher) a seguir desenvolvidas com p-NPP (KPL Labs) ou IgG1-HRP (Southern Biotech) e desenvolvidas com TMB (Sigma).
[0112]Para a análise de citocina, baços foram colhidos 24 h após o desafio de A. caccae ou camundongos colonizados com CMA sensibilizados com BLG+CT por 5 semanas. Esplenócitos foram estimulados em uma concentração de 2x106 células/ml a 37ºC, 10% de CO2 com 10 mg/ml de BLG (Sigma) em cDMEM (com 4% de FCS (HyClone), HEPES a 10 mM (Gibco), 100 U/ml de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) e 2-mercaptoetanol a 55 µM (Gibco). As concentrações de citocina em sobrenadantes de cultura por 72 h foram determinadas por ELISA para IL-13 e IL-4 (ambos de Invitrogen).
[0113]Isolamento celular epitelial. Como em experimentos de sensibilização, os camundongos foram desmamados a 3 semanas de idade e colocados em fórmula infantil antes da colonização. Sete dias após a colonização, os camundongos sofreram eutanásia e o íleo foi removido. Para o isolamento de IEC, os tecidos foram limpos e invertidos como descrito na ref.
(43). IECs foram coletadas por inflação do tecido invertido em Solução de Recuperação de Células (Corning) a cada 5 minutos por 30 minutos. As amostras de IEC foram lisadas em TRIZol (ThermoFisher) e RNA foi extraído com minikit de RNA PureLink (Ambion) mais tratamento de DNAse na coluna (PureLink DNAse Set, Ambion).
[0114]RNASeq. As bibliotecas de RNA foram preparadas usando Kit de preparação da biblioteca total TruSeq Stranded com Ribo-Zero humano/camundongo/rato (Illumina). As amostras foram sequenciadas no Núcleo de Genômica Funcional da Universidade de Chicago, usando química de leituras únicas de 50 pb em um instrumento HiSeq2500, com réplicas de sequenciamento em duas pistas. A qualidade de contas brutas foi avaliada por FastQC (v0.11.5) (44). A pontuação de QC30 em todas as 39 amostras de RNAseq foi 96,81%±0,06% (média±s.e.m), que representa a porcentagem de bases com pontuação de qualidade ≥ Q30. O alinhamento com o transcriptoma de referência de camundongo foi realizado com anotação do gene Gencode
(vM16, GRCm38) por Kallisto (v0.43.1) com o modo específico do filamento
(45). Este modo implementa um algoritmo de pseudoalinhamento com base em kmer para quantificar precisamente transcritos de dados de RNASeq ao detectar robustamente erros nas leituras.
A taxa de mapeamento médio foi de
62,77%±1,10% (média±S.E.M) com base nos pseudoalinhamentos de Kallisto para o transcriptoma de referência.
Em média, 35 milhões de leituras de sequenciamento brutas foram geradas por amostra e 22 milhões foram mapeados para transcriptoma usando Kallisto.
A abundância no nível de transcrito foi quantificada especificando o protocolo específico do filamento,
resumida em nível de gene usando tximport (v1.4.0) (46), normalizada pelo método de média reduzida de valores M (TMM), e log2-transformada.
Os genes expressos em pelo menos 3 amostras (contagens por milhão de leituras
(CPM)>3) foram mantidos para análise adicional.
Os genes diferencialmente expressos entre grupos foram identificados usando algoritmo limma voom com pesos de precisão (v3.34.5) (47). A função de Correlação em duplicata foi usada para estimar a correlação dentre amostras de camundongo com Doador
(1 a 8) como o fator de bloqueio.
A função lmFit foi usada para ajustar todas amostras de camundongo (n=39, 18 colonizados por CMA, 18 colonizados saudáveis, e 3 GF) em um modelo linear incorporando a estrutura de correlação computada do acima.
Os contrastes foram ajustados como CMA versus saudável, CMA versus GF e saudável versus GF para identificar DEGs em cada comparação.
Os genes que são significativamente diferencialmente expressos entre CMA e saudável e também diferentes de camundongos GF foram identificados usando um procedimento em duas etapas: (1) Genes foram detectados como diferentes na comparação de CMA vs saudável com modulação ≥1,5 ou ≤-1,5 no valor p corrigido pela taxa de descobertas falsas
(FDR) menor do que 0,10; (2) Genes da etapa (1) foram ainda filtrados por modulação ≥1,5 ou ≤-1,5 na comparação de CMA vs GF ou saudável vs GF em
FDR 0,05. Um limiar de FDR mais rigoroso (0,05) foi aplicado na etapa (2) para priorizar positivos potencialmente verdadeiros quando comparado ao controle negativo (GF). A correção de testes múltiplos foi realizada usando o método de
FDR Benjamini-Hochberg (BH-FDR) (48). Um total de 32 DEGs passou estes limiares, que representam quatro tipos de mudanças de expressão de gene em camundongos colonizados: (1) Supra em saudáveis: genes que são suprarregulados em camundongos saudáveis em relação a ambos CMA e GF;
(2) supra em CMA: genes que são suprarregulados em camundongos com
CMA em relação a ambos saudáveis e GF; (3) Infra em saudáveis: genes que são infrarregulados em camundongos saudáveis em relação a ambos com
CMA e GF; e (4) infra em CMA: genes que são infrarregulados em camundongos com CMA em relação a saudáveis e GF.
Os quatro grupos de
DEGs são mostrados nas FIGS. 3A e 4A.
Ontologia de Genes e caminhos de
KEGG significativamente enriquecidos nos 32 DEGs de interesse foram identificados usando clusterprofiler (v3.6.0) (49) no valor p corrigido da taxa de descobertas falsas (FDR) menor do que 0,10 (método de BH-FDR, teste hipergeométrico). Os DEGs foram divididos em dois grupos para esta análise;
(1) Saudável incluiu todos os genes que foram Supra em saudáveis e Infra em
CMA e (2) CMA incluiu todos os genes que foram Supra em CMA e Infra em saudáveis.
A correlação entre DEGs e OTUs ileais significativamente e diferencialmente abundantes entre amostras com CMA e saudáveis foi computada usando o método de correlação da classificação de Spearman,
seguido poela aplicação de filtros para (1) manter as OTUs que mostram correlação significativa com pelo menos 1 DEG do grupo designado em
P<0,05. Para OTUs potencialmente protetoras (mais abundantes em saudáveis), elas são correlacionadas com genes de grupo “Supra em saudáveis” ou “Infra em saudáveis”; para OTUs potencialmente não protetoras
(mais abundantes em CMA), elas são correlacionadas com genes de grupo
“supra em CMA” ou “infra em CMA”; (2) manter as OTUs que mostram tendência relativamente consistente de correlação positiva (ρ de Spearman>0,20) através de pelo menos 60% dos DEGs do grupo designado.
Para OTUs potencialmente protetoras, elas são correlacionadas com genes de grupo “Supra em saudáveis” e “Infra em CMA” unidos; para OTUs potencialmente não protetoras, elas são correlacionadas com genes de grupo “Supra em CMA” e “Infra em saudáveis” unidos; (3) manter OTUs presentes em pelo menos 3 camundongos com CMA e 3 saudáveis. 9 OTUs ileais passaram estes filtros de correlação e são mostradas na FIG. 4A. A correlação entre a abundância relativa de OTUs e a expressão gênica foi calculada usando o método de correlação de Spearman com amostras que são acima do limite de detecção para o ensaio.
[0115]qPCR. A expressão gênica foi medida por qPCR como descrito na referência 7. Em resumo, cDNA foi preparado de RNA usando o kit iScript cDNA Synthesis (BioRad). A expressão gênica foi medida com PowerUp SYBR green master mix (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores são listados na Tabela Suplementar 7 (20, 50-54). A expressão de genes de interesse foi normalizada para Hprt. A expressão relativa foi medida usando ΔΔCt centralizado em torno da média geométrica; camundongos GF foram usados como uma referência.
[0116]A presença de A. caccae em amostras fecais e ileais foi confirmada usando qPCR como descrito na ref. (25). O DNA bacteriano foi extraído usando o Power Soil DNA Isolation Kit (MoBio) e qPCR foi realizada usando PowerUp SYBR green master mix (Applied Biosystems) usando 4 µl de cada iniciador a 10 µM de diluição de trabalho e 2 µl de DNA bacteriano. Os iniciadores são listados na Tabela Suplementar 6. As condições de ciclagem para a reação consistiam em um ciclo de ativação de 50°C para 2 min seguido por um ciclo de 95°C por 10 min e 40 ciclos a 94°C por 20 s, 55°C por 20 s e 72°C por 50 s. A sonda fluorescente foi detectada na última etapa deste ciclo.
Uma curva de fusão foi realizada no final da PCR para confirmar a especificidade do produto de PCR. A abundância relativa é expressa como 2-Ct normalizada para cópias de 16S rRNA total por g de material fecal e multiplicada por uma constante (1x1025) para colocar todos os valores acima de
1.
[0117]Análise Histopatológica. Para a análise histológica, peças de 3 mm de tecido do meio do cólon e meio do íleo foram fixadas em 10% de formalina para coloração H&E ou fixador Carnoy para coloração de ácido periódico de Schiff (PAS). O seccionamento e coloração foram realizados pelo Centro de Recursos de Tecido Humano da Universidade de Chicago. Todas as seções foram revisadas por um patologista GI de uma maneira cega.
[0118]Análise Estatística. Prisma 7.0 (GraphPad) foi usado para realizar ANOVA de um fator (FIG. 4F) com correção de Bonferroni para comparações múltiplas e teste t de Student bilateral (FIG. 4D e FIG. 13B), como indicado nas legendas da Figura. O método de DS-FDR foi usado para identificar OTUs significativas (FIG. 2A, FIG. 4C e FIG. 13A) comparando o grupo com CMA com o grupo saudável. O método de BH-FDR foi usado para a correção de testes múltiplos em análise RNA-Seq (FIG. 3A) e análise de enriquecimento de GO (FIG. 3B). A Diversidade de Shannon e Uniformidade de Pielou foram comparadas usando um teste Mann-Whitney-Wilcoxon não paramétrico bilateral (FIG. 7A, B). A análise da razão de OTU protetora/não protetora na coorte independente, maior de crianças foi realizada usando teste Mann-Whitney-Wilcoxon bilateral (FIG. 11). As respostas biológicas de diferentes camundongos colonizados doadores à sensibilização com BLG (FIG.
1A-D, FIG. 4G, FIG. 8A, FIG. 9A) foram exploradas com modelos com efeito misto linear (55) com base na probabilidade máxima restrita (REML) em R (lmerTest v3.0.1) (56). As mudanças de temperatura do grupo (GF, saudável e CMA na FIG. 1A; A. caccae e CMA na FIG. 4G; BFD saudável e BFD com CMA na FIG. 8A; H2O e Enfamil na FIG. 9A) ao longo do tempo (tanto linear e quadrático) foram modeladas como Temperatura = Grupo + Tempo*Grupo +
Tempo*Tempo*Grupo com interceptações aleatórias e inclinações estimadas para camundongos individuais. Os contrastes das tendências de temperatura do grupo foram realizados usando testes t com o ajuste de Benjamini-Hochberg FDR (BH-FDR) para comparações múltiplas. Para controlar para casos onde os grupos continham doadores múltiplos (FIG. 1A), o modelo anterior foi atualizado para incluir camundongos aninhados dentro de cada doador como um efeito aleatório e repetiu os contrastes. Visto que os resultados dos dois modelos foram concordantes, os resultados do primeiro modelo são relatados quanto à consistência dos métodos. Para a FIG. 1B-D, as concentrações de anticorpo foram log transformados e modelados como log(Concentração) = Grupo com doadores como um efeito aleatório. Os contrastes para diferenças de grupo foram realizados usando os métodos mencionados anteriormente.
Para FIG. 4H-I, FIG. 8B-D, FIG 9B-D, as concentrações de anticorpo e citocina foram log transformados e comparados usando testes t. Os comandos de análise de dados (incluindo os arquivos de dados e arquivos R Markdown para a reproducibilidade) são disponíveis dos autores mediante a solicitação.
D. TABELAS TABELA SUPLEMENTAR 1. DADOS DO PACIENTE PARA
DOADORES INFANTIS ALIMENTADOS COM FÓRMULAS USADOS NESTE ESTUDO. Saudáveis CMA Nº de ID do 1 2 3 4 5 6 7 8 doador Sexo Mascul Mascul Mascul Mascul Mascul Mascul Mascul Mascul ino ino ino ino ino ino ino ino Modalidade Cesari Cesari Cesari Cesari Cesari Cesari Cesari cesari de Parto ana ana ana ana ana ana ana ana Idade a a a a a a a a Gestacional termo termo termo termo termo termo termo termo Amamentaçã 14 < 14 < 14 < 14 <14 <14 14 < 14 o dias dias dias dias dias dias dias dias
Idade na 6 6 6 6 6 6 6 6 coleta de meses meses meses meses meses meses meses meses fezes
Idade no -- -- -- -- 2 2 6 5 início dos meses meses meses meses sintomas de 12 20 CMA dias dias
Sintomas no -- -- -- -- Urticári Urticári Eczem Eczem diagnostic de ae ae a, a, CMA vômito vômito Urticári vômito a, vômito
Mecanismo -- -- -- -- Sim Sim Sim Sim mediado por IgE
Valor do teste de sensibilidade cutânea no diagnóstico (mm)
- -- -- -- -- 5 12 10 4 Alfalactoalbu mina
- -- -- -- -- 3 3 1 10 Betalactoglob ulinaa
- Caseína -- -- -- -- 3 5 4 8
- Leite -- -- -- -- 7 6 5 7 integral
IgE sérica -- -- -- -- 340 127 267 358 total no diagnóstico (kU/L)
TABELA SUPLEMENTAR 2. DADOS DO PACIENTE PARA DOADORES INFANTIS AMAMENTADOS NA FIGURA SUPLEMENTAR 4.
Criança Criança com alergia Descrição saudável ao leite de vaca Nº da ID do doador 9 10 Sexo Feminino Feminino Modalidade de Parto Espontâneo Espontâneo Idade gestacional A termo A termo Amamentação Sim Sim (mãe consumindo (mãe consumindo proteína do proteína do leite de leite de vaca) vaca) Idade na coleta de fezes 6 meses 6 meses Idade no início dos sintomas da CMA -- 5 meses Eczema, irritabilidade, Sintomas no vômito, insuficiência de diagnóstico de CMA -- crescimento, diarreia Mecanismo mediado por IgE -- Sim Valor do teste de sensibilidade cutânea no diagnóstico (mm) -Alfalactoalbumina -- 15 -Betalactoglobulina -- 1
-Caseína -- 7 -Leite integral -- 15 IgE sérica total no diagnóstico (kU/L) -- 334 TABELA SUPLEMENTAR 3. 58 OTUS DIFERENCIALMENTE
ABUNDANTES ENTRE AMOSTRAS FECAIS DE DOADOR COM CMA E SAUDÁVEL, MOSTRADAS NA FIGURA 2A Mudan Estatístic Rejeiçã Valores P OTU ça na a do Taxonomia o da brutos de direção Teste de DS-FDR DS-FDR DS-FDR k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,184530 0,015984 f__Enterobacteriace 1111294 eis DE 795 016 ae; g__; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; Supra f__Lachnospiraceae em - ; saudáv VERDA 0,068956 0,001998 g__[Ruminococcus]; 360015 eis DE 969 002 s__gnavus k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; New.Referência saudáv VERDA 0,039674 0,000999 f__Clostridiaceae; OTU147 eis DE 728 001 g__; s__ - Supra VERDA 0,034540 0,000999 k__Bacteria; 628226 em DE 622 001 p__Firmicutes; saudáv c__Clostridia;
eis o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; o__Lactobacillales; Supra f__Streptococcacea em - e; saudáv VERDA 0,015940 0,013986 g__Streptococcus; 349024 eis DE 88 014 s__
Supra k__Bacteria; em - p__Firmicutes; saudáv VERDA 0,012704 0,027972 c__Clostridia; 712677 eis DE 055 028 o__Clostridiales k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; saudáv VERDA 0,010383 0,012987 f__Clostridiaceae; 780650 eis DE 613 013 g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; saudáv VERDA 0,009899 0,002997 f__Clostridiaceae; 843459 eis DE 159 003 g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Erysipelotrichi; Supra o__Erysipelotrichale em - s; saudáv VERDA 0,007552 0,019980 f__Erysipelotrichace 262095 eis DE 857 02 ae; g__; s__
k__Bacteria; Supra p__Firmicutes; em - c__Clostridia; New.Referência saudáv VERDA 0,005328 0,006993 o__Clostridiales; OTU166 eis DE 787 007 f__Lachnospiraceae k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichale s; Supra f__Erysipelotrichace em - ae; saudáv VERDA 0,005308 0,022977 g__[Eubacterium]; 579851 eis DE 631 023 s__dolichum k__Bacteria; Supra p__Firmicutes; em - c__Clostridia; saudáv VERDA 0,005216 0,026973 o__Clostridiales; 551822 eis DE 137 027 f__Clostridiaceae k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra o__Clostridiales; em - f__Lachnospiraceae saudáv VERDA 0,004133 0,000999 ; g__Epulopiscium; 298247 eis DE 646 001 s__
k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,003450 0,000999 f__Enterobacteriace 345540 eis DE 891 001 ae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; saudáv VERDA 0,002271 0,004995 f__Clostridiaceae; 582691 eis DE 895 005 g__; s__
Supra k__Bacteria; em - p__Firmicutes; saudáv VERDA 0,002219 0,016983 c__Clostridia; 259772 eis DE 727 017 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae
; g__Coprococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; saudáv VERDA 0,001426 0,000999 f__Clostridiaceae; 325419 eis DE 612 001 g__; s__
k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,001367 0,000999 f__Enterobacteriace 797229 eis DE 202 001 ae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; saudáv VERDA 0,000748 0,000999 f__Clostridiaceae; 557627 eis DE 282 001 g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra c__Clostridia; em - o__Clostridiales; saudáv VERDA 0,000737 0,020979 f__Clostridiaceae; 828483 eis DE 522 021 g__Clostridium k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,000617 0,026973 f__Enterobacteriace 299267 eis DE 653 027 ae; g__; s__
- k__Bacteria; Supra VERDA 0,000531 0,030969 p__Proteobacteria; 4448331 em DE 974 031 c__Gammaproteoba saudáv cteria;
eis o__Enterobacteriale s; f__Enterobacteriace ae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; Supra f__Lachnospiraceae em - ; saudáv VERDA 0,000490 0,024975 g__[Ruminococcus]; 3376513 eis DE 385 025 s__gnavus k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,000418 0,004995 f__Enterobacteriace 813217 eis DE 414 005 ae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; Supra f__Lachnospiraceae em - ; New.CleanUp.Refe saudáv VERDA 0,000411 0,001998 g__[Ruminococcus]; rência OTU56927 eis DE 459 002 s__gnavus k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; Supra f__Lachnospiraceae em - ; saudáv VERDA 0,000408 0,032967 g__[Ruminococcus]; 335701 eis DE 096 033 s__gnavus
Supra em - k__Bacteria; saudáv VERDA 0,000393 0,008991 p__Firmicutes; 191999 eis DE 548 009 c__Clostridia; o__Clostridiales;
f__Lachnospiraceae k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; Supra f__Lachnospiraceae em - ; saudáv VERDA 0,000364 0,014985 g__[Ruminococcus]; 183865 eis DE 63 015 s__gnavus k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,000362 0,003996 f__Enterobacteriace 231787 eis DE 215 004 ae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; Supra f__Lachnospiraceae em - ; saudáv VERDA 0,000334 0,006993 g__[Ruminococcus]; 342397 eis DE 965 007 s__gnavus k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,000327 0,012987 f__Enterobacteriace 581782 eis DE 138 013 ae; g__; s__
k__Bacteria; p__Proteobacteria; Supra c__Gammaproteoba em - cteria; saudáv VERDA 0,000299 0,014985 o__Enterobacteriale 304641 eis DE 547 015 s; f__Enterobacteriace ae; g__; s__ k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,000274 0,032967 f__Enterobacteriace 4389289 eis DE 745 033 ae; g__; s__ k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Gammaproteoba cteria; Supra o__Enterobacteriale em - s; saudáv VERDA 0,000220 0,032967 f__Enterobacteriace 541119 eis DE 503 033 ae; g__; s__ k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; o__Bacteroidales; SUPRA f__Bacteroidaceae; em VERDA 0,000463 0,000999 g__Bacteroides; 195258 CMA DE 044 001 s__ovatus k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,000912 0,012987 f__[Barnesiellaceae] 315846 CMA DE 6 013 ; g__; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA o__Clostridiales; em VERDA 0,001063 0,002997 f__Ruminococcacea 551902 CMA DE 128 003 e; g__; s__
SUPRA em VERDA 0,001133 0,002997 k__Bacteria; 318190 CMA DE 533 003 p__Firmicutes; c__Clostridia;
o__Clostridiales; f__Ruminococcacea e; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; f__Ruminococcacea SUPRA e; em VERDA 0,001212 0,004995 g__Ruminococcus; 591635 CMA DE 852 005 s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; SUPRA f__Ruminococcacea em VERDA 0,001492 0,022977 e; g__Oscillospira; 585227 CMA DE 734 023 s__
k__Bacteria; p__Actinobacteria; c__Actinobacteria; o__Bifidobacteriales ; f__Bifidobacteriacea SUPRA e; em VERDA 0,001699 0,008991 g__Bifidobacterium; 370225 CMA DE 313 009 s__adolescentis k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,003134 0,012987 f__[Barnesiellaceae] 199354 CMA DE 517 013 ; g__; s__
k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,003516 0,002997 f__Porphyromonada 198866 CMA DE 506 003 ceae; g__Parabacteroides;
s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae SUPRA ; em VERDA 0,003665 0,000999 g__[Ruminococcus]; 583398 CMA DE 419 001 s__
k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,003887 0,000999 f__Bacteroidaceae; 583656 CMA DE 232 001 g__Bacteroides; s__
k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,004373 0,000999 f__Bacteroidaceae; 535375 CMA DE 572 001 g__Bacteroides; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae SUPRA ; em VERDA 0,004749 0,021978 g__[Ruminococcus]; 1111191 CMA DE 497 022 s__gnavus k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,005200 0,017982 f__Bacteroidaceae; 580629 CMA DE 626 018 g__Bacteroides; s__
SUPRA k__Bacteria; em VERDA 0,006143 0,000999 p__Actinobacteria; 365181 CMA DE 29 001 c__Coriobacteriia; o__Coriobacteriales;
f__Coriobacteriacea e; g__Collinsella; s__aerofaciens k__Bacteria; p__Proteobacteria; c__Betaproteobacte ria; SUPRA o__Burkholderiales; em VERDA 0,007206 0,006993 f__Alcaligenaceae; 359809 CMA DE 031 007 g__Sutterella; s__
k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; o__Bacteroidales; f__Porphyromonada SUPRA ceae; em VERDA 0,007841 0,001998 g__Parabacteroides; 585914 CMA DE 977 002 s__distasonis k__Bacteria; p__Actinobacteria; c__Actinobacteria; o__Bifidobacteriales ; f__Bifidobacteriacea SUPRA e; em VERDA 0,009299 0,014985 g__Bifidobacterium; 365385 CMA DE 774 015 s__
k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,009878 0,000999 f__Bacteroidaceae; 583117 CMA DE 272 001 g__Bacteroides; s__
k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,011856 0,002997 f__Porphyromonada 180082 CMA DE 764 003 ceae; g__Parabacteroides;
s__ k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; o__Bacteroidales; SUPRA f__Bacteroidaceae; em VERDA 0,016312 0,002997 g__Bacteroides; 589071 CMA DE 063 003 s__uniformis k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA o__Clostridiales; em VERDA 0,029745 0,011988 f__Lachnospiraceae 514272 CMA DE 704 012 ; g__; s__ k__Bacteria; p__Actinobacteria; c__Actinobacteria; o__Bifidobacteriales ; f__Bifidobacteriacea SUPRA e; em VERDA 0,030173 0,004995 g__Bifidobacterium; 484304 CMA DE 538 005 s__ k__Bacteria; p__Bacteroidetes; c__Bacteroidia; SUPRA o__Bacteroidales; em VERDA 0,052225 0,001998 f__Bacteroidaceae; 589277 CMA DE 784 002 g__Bacteroides; s__ TABELA SUPLEMENTAR 4. 32 GENES EXPRESSOS
DIFERENCIALMENTE EM AMOSTRAS DE RNASEQ ILEAIS DE
CAMUNDONGO COLONIZADO COM CMA E SAUDÁVEL E DIFERENTES DO CONTROLE NEGATIVO (CAMUNDONGOS GF), MOSTRADOS NA FIGURA 3A.
CMA versus Saudável CMA versus GF Saudável versus GF Expressão Valor P Direção da Valor P Direção da Valor P Gene EnsemblGenelD Média de Grupo DEG Modulação Modulação Modulação ajustado pela mudança ajustado pela mudança ajustado pela RNAseq
FDR FDR FDR Slc22a13 ENSMUSG00000074028 2,778111515 SUPRA em 0,029753823 -2,401525743 NE 0,063113496 3,40496861 SUPRA em 0,005425032 8,17711977 saudáveis saudáveis Fbpl ENSMUSG00000069805 5,555254563 SUPRA em 8,17E-05 -2,063132823 ND 0,000581517 2,373595096 SUPRA em 2,38E-07 4,897041951 saudáveis saudáveis Apcddl ENSMUSG00000071847 1,494018834 SUPRA em 0,049270498 -1,609221514 NE 0,435864462 1,265635652 SUPRA em 0,025785895 2,03668812 saudáveis saudáveis Npl ENSMUSG00000042684 5,041978196 SUPRA em 0,085368856 -1,559896139 NE 0,293803914 1,388291017 SUPRA em 0,024969934 2,165589797 saudáveis saudáveis Abcc2 ENSMUSG00000025194 9,209485113 SUPRA em CMA 0,010848769 1,505881058 SUPRA em 2,04E-05 2,175407835 ND 0,042313216 1,444608007
CMA Bhmt ENSMUSG00000074768 1,082085196 SUPRA em CMA 0,071649815 1,509332678 SUPRA em 0,010731326 1,975422585 NE 0,410644089 1,308805284
CMA Mfsd2b ENSMUSG00000037336 1,777883345 SUPRA em CMA 0,061865715 1,537225758 SUPRA em 0,000867035 2,82533517 NE 0,075749268 1,837944202
CMA Cyp3a59 ENSM USG00000061292 2,136791204 SUPRA em CMA 0,027389658 1,549562876 SUPRA em 3,05E-05 3,39446921 ND 0,009662128 2,190597918
CMA Lrrnl ENSM USG00000034648 1,595303389 SUPRA em CMA 0,013681852 1,581394892 SUPRA em 0,007383553 1,714726833 NE o,777501394 1,084312869
CMA Slc9b2 ENSMUSG00000037994 1,102430337 SUPRA em CMA 0,085368856 1,605005893 SUPRA em 0,031991401 2,02570437 NE 0,591859824 1,262116469
CMA Mroh7 ENSM USG00000047502 3,89754756 SUPRA em CMA 0,021327414 1,617161783 SUPRA em 2,72E-03 2,033697925 NE 0,42241223 1,257572339
CMA Grin2a ENSMUSG00000059003 2,458692024 SUPRA em CMA 0,085653544 1,617995585 SUPRA em 0,044336212 1,964067568 NE 0,676602939 1,213889325
CMA Cntnl ENSMUSG00000055022 1,148935328 SUPRA em CMA 0,014593455 1,651618302 SUPRA em 0,005875115 1,875544221 NE 0,68375077 1,135579703
CMA Letm2 ENSM USG00000037363 1,650075654 SUPRA em CMA 0,018797255 1,66583385 SUPRA em 0,001104306 2,371462071 NE 0,242181977 1,423588595
CMA Ptafr ENSM USG00000056529 1,301260118 SUPRA em CMA 0,073471735 1,694815563 SUPRA em 0,021173615 2,232120867 NE 0,540574153 1,317028776
CMA Mel ENSM USG00000032418 4,3922554 SUPRA em CMA 0,016384547 1,703263564 SUPRA em 0,03823817 1,603254667 NE 0,863312513 -1,062378672
CMA Smcol ENSMUSG00000046345 1,23463105 SUPRA em CMA 0,090599686 1,755629553 SUPRA em 0,026988488 2,508688181 NE 0,501298796 1,428939367
CMA Cyp2b10 ENSM USG00000030483 7,581089071 SUPRA em CMA 0,029753823 1,757005744 SUPRA em 0,009227326 2,023601722 NE 0,699603833 1,151733129
CMA Cyp2j13 ENSM USG000000285 71 4,136663388 SUPRA em CMA 0,053930421 1,800872438 SUPRA em 0,001587354 3,68957984 NE 0,120415488 2,048773562
CMA Acot12 ENSMUSG00000021620 5,494716849 SUPRA em CMA 5,48E-05 2,01501538 SUPRA em 5,70E-05 2,402984772 NE 0,462442117 1,192539171
CMA Cyp2c29 ENSM USG00000003053 2,680142327 SUPRA em CMA 8,17E-05 4,735853239 SUPRA em 6,17E-03 3,403244621 NE 0,593296835 -1,391570036
CMA Akrlc19 ENSM USG00000071551 6,653987069 INFRA em 0,007181957 1,539241268 NE 0,08837154 -1,323738676 INFRA em 0,000475667 -2,037553198 saudáveis saudáveis Gstml ENSM USG00000058135 3,552920591 INFRA em 0,010848769 1,592387077 NE 0,988990596 -1,002868547 INFRA em 0,020964575 -1,596954914 saudáveis saudáveis
Ceslf ENSM USG00000031725 6,194279856 INFRA em 0,027389658 1,893583214 NE 0,186446914 -1,487066804 INFRA em 0,00373614 -2,815884739 saudáveis saudáveis Ceslg ENSM USG00000057074 2,742386148 INFRA em 0,090559257 1,907760384 ND 0,030963104 -1,97871865 INFRA em 0,001377 -3,774921051 saudáveis saudáveis Tgfbr3 ENSMUSG00000029287 1,883866476 INFRA em CMA 0,000408545 -2,74659932 INFRA em 0,007704498 -2,236046082 NE 0,553319278 1,228328585
CMA Actal ENSM USG00000031972 1,201617812 INFRA em CMA 0,027389658 -2,50720332 INFRA em 0,006712918 -2,803646543 NE 0,822471304 -1,118236611
CMA Histlh2bj ENSMUSG00000069300 1,79373615 INFRA em CMA 0,072249982 -1,935238841 INFRA em 0,000113721 -3,822281003 ND 0,039087358 -1,97509523
CMA Gp2 ENSMUSG00000030954 0,806917328 INFRA em CMA 0,070122494 -1,870775326 INFRA em 0,001158966 -2,871474818 NE 0,208403405 -1,534911637
CMA Ddit4 ENSMUSG00000020108 3,745786556 INFRA em CMA 0,070340591 -1,576061582 INFRA em 0,037955029 -1,679764946 NE 0,861431628 -1,065799056
CMA Histlh2bn ENSMUSG00000095217 3,070162335 INFRA em CMA 0,08015986 -1,565406563 INFRA em 0,000151693 -2,672909018 ND 0,037500512 -1,707485507
CMA Ror2 ENSMUSG00000021464 2,322930094 INFRA em CMA 0,03422688 -1,545471585 INFRA em 7,86E-05 -2,277636991 NE 0,05497608 -1,473748863
CMA NE: Não avaliável; quando DEG não satisfaz os critérios de filtragem em qualquer comparação "CMA vs GF" ou "Saudável vs GF", a Mudança de Direção não é avaliável.
ND: Não determinado; quando DEG satisfaz os critérios de filtragem em ambas as comparações "CMA vs GF" e "Saudável vs GF", aquele com valor P maior é reiniciado para não determinado para solucionar os conflitos.
TABELA SUPLEMENTAR 5. 108 OTUS DIFERENCIALMENTE ABUNDANTES ENTRE AMOSTRAS ILEAIS DE CAMUNDONGO COM CMA E SAUDÁVEIS. Mudança na Rejeição Estatística do Valores P brutos OTU da DS- Taxonomia Direção Teste de DS-FDR de DS-FDR
FDR k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 349024 -0,22217917 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 259772 -0,044282455 0,000999001 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E g__Coprococcus; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 828483 -0,017799339 0,021978022 o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; saudáveis E g__Clostridium k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra em VERDAD 262095 -0,015344578 0,001998002 c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichales; saudáveis E f__Erysipelotrichaceae; g__; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 332718 -0,012123767 0,001998002 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra em VERDAD 360238 -0,007986609 0,011988012 c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichales; saudáveis E f__Erysipelotrichaceae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 238205 -0,004499814 0,000999001 o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; saudáveis E g__Clostridium; s__butyricum k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 359750 -0,004188868 0,021978022 o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; saudáveis E g__Clostridium; s__perfringens k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; New.Referên Supra em VERDAD -0,004114455 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; cia OTU16 saudáveis E g__Streptococcus; s__luteciae k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 309696 -0,003306804 0,003996004 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Proteobacteria; Supra em VERDAD c__Gammaproteobacteria; 345540 -0,003062398 0,000999001 saudáveis E o__Enterobacteriales; f__Enterobacteriaceae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 586271 -0,002603169 0,01998002 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E g__[Ruminococcus]; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra em VERDAD 356760 -0,002063474 0,000999001 c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichales; saudáveis E f__Erysipelotrichaceae; g__; s__
303809 -0,001887759 0,000999001 k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD o__Clostridiales; f__Clostridiaceae;
saudáveis E g__Clostridium; s__butyricum k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 327851 -0,00174762 0,001998002 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; New.Referên Supra em VERDAD -0,001578146 0,000999001 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; ciaOTU18 saudáveis E g__Coprococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 291195 -0,001382348 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 577710 -0,000950458 0,010989011 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E g__Blautia; s__producta k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 292820 -0,000949102 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
Supra em VERDAD k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; 573157 -0,000929379 0,011988012 saudáveis E o__Lactobacillales k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 529116 -0,000921743 0,001998002 o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; saudáveis E g__Clostridium
Supra em VERDAD k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; 579608 -0,000882353 0,001998002 saudáveis E o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae;
g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 289925 -0,000678999 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 177986 -0,000602909 0,028971029 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E g__Coprococcus; s__
New.CleanU k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra em VERDAD p.Referência -0,000594549 0,003996004 c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichales; saudáveis E OTU64312 f__Erysipelotrichaceae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 967427 -0,000546212 0,001998002 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 237444 -0,000487754 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 328283 -0,000459212 0,003996004 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; Supra em VERDAD 145801 -0,00045917 0,000999001 c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichales; saudáveis E f__Erysipelotrichaceae; g__; s__
New.Referên Supra em VERDAD -0,000449108 0,026973027 k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli;
ciaOTU109 saudáveis E o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 592866 -0,000408332 0,017982018 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E g__[Ruminococcus]; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 4313711 -0,00035444 0,000999001 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; New.Referên Supra em VERDAD -0,000337736 0,004995005 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; ciaOTU26 saudáveis E g__Coprococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 351020 -0,000324044 0,014985015 o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; saudáveis E g__Clostridium; s__neonatale k__Bacteria; p__Proteobacteria; Supra em VERDAD c__Gammaproteobacteria; 833731 -0,000280741 0,000999001 saudáveis E o__Enterobacteriales; f__Enterobacteriaceae; g__; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD 392887 -0,000260077 0,025974026 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; g__; saudáveis E s__
Supra em VERDAD k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; 199301 -0,000256085 0,01998002 saudáveis E o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; g__;
s__
New.CleanU Supra em VERDAD k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; p.Referência -0,000237095 0,002997003 saudáveis E o__Clostridiales; f__Clostridiaceae; g__; s__ OTU98242 k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD 255359 -0,00020765 0,007992008 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E g__Streptococcus; s__
New.CleanU k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD p.Referência -0,000197185 0,010989011 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E OTU22852 g__Coprococcus; s__
k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; New.Referên Supra em VERDAD -0,00018357 0,021978022 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; ciaOTU72 saudáveis E g__Coprococcus; s__
k__Bacteria; p__Actinobacteria; Supra em VERDAD c__Actinobacteria; o__Bifidobacteriales; 132041 -0,000168657 0,017982018 saudáveis E f__Bifidobacteriaceae; g__Bifidobacterium; s__
New.CleanU k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD p.Referência -0,000163884 0,022977023 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E OTU102634 g__Streptococcus; s__
New.CleanU k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; Supra em VERDAD p.Referência -7,42886E-05 0,014985015 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; saudáveis E OTU48619 g__Coprococcus; s__
New.CleanU k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Bacilli; Supra em VERDAD p.Referência -7,35692E-05 0,022977023 o__Lactobacillales; f__Streptococcaceae; saudáveis E OTU92891 g__Streptococcus; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 77514 0,000105274 0,028971029 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae;
CMA E g__Blautia; s__ k__Bacteria; p__Bacteroidetes; SUPRA em VERDAD 560336 0,000118911 0,028971029 c__Bacteroidia; o__Bacteroidales;
CMA E f__Bacteroidaceae; g__Bacteroides; s__ SUPRA em VERDAD k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; 566434 0,000132797 0,016983017 CMA E o__Clostridiales; f__; g__; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 4352657 0,000145962 0,022977023 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae;
CMA E g__Blautia; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 367790 0,000158719 0,028971029 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae;
CMA E g__Blautia; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 3768338 0,000171334 0,028971029 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae;
CMA E g__Blautia; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 311587 0,000184786 0,007992008 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae; g__;
CMA E s__
k__Bacteria; p__Verrucomicrobia; c__Verrucomicrobiae; SUPRA em VERDAD 273232 0,000198366 0,022977023 o__Verrucomicrobiales;
CMA E f__Verrucomicrobiaceae; g__Akkermansia; s__muciniphila k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 804526 0,000198943 0,021978022 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae;
CMA E g__Coprococcus; s__ k__Bacteria; p__Firmicutes; c__Clostridia; SUPRA em VERDAD 331850 0,000211798 0,022977023 o__Clostridiales; f__Lachnospiraceae;
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CMA E g__[Ruminococcus]; s__gnavus k__Bacteria; p__Firmicutes; SUPRA em VERDAD c__Erysipelotrichi; o__Erysipelotrichales; 579851 0,082564668 0,000999001 CMA E f__Erysipelotrichaceae; g__[Eubacterium]; s__dolichum TABELA SUPLEMENTAR 6. SEQUÊNCIA INICIADORA USADA PARA ANÁLISE DE QPCR DE ANAEROSTIPES
CACCAE F GTTTTCGGATGGATTTCCTATAT (SEQ ID NO:1) Anaerostipes caccae Ref 24. R CTTTTCACACTGAATCATGCGATT (SEQ ID NO:2)
TABELA SUPLEMENTAR 7. SEQUÊNCIAS INICIADORAS USADAS PARA A ANÁLISE DE QPCR NA FIGURA 4F F TGAAGAGCTACTGTAATGATCAGTCAAC (SEQ ID NO:3) Hprt Ref. 50. R AGCAAGCTTGCAACCTTAACCA (SEQ ID NO:4) F CCATCATAATCGAACCTGAG (SEQ ID NO:5) Fbp1 Ref. 51. R CTTCTCAGAAGGCTCATCAG (SEQ ID NO:6) F CCGGTGTGAACTGTCACCGATC (SEQ ID NO:7) Modificada a Tgfbr3 partir da Ref. R CCTGATGAAAACTGGACCACAG (SEQ ID NO:8) 52.
F ATCGACACCTTGGGACAACC (SEQ ID NO:9) Ror2 Ref. 20. R AGTGCAGGATTGCCGTCTG (SEQ ID NO:10) F CCGTGGCACTAAGGTCAGTT (SEQ ID NO:11) Acot12 Ref. 53. R ACGTTACGGTGCACGAATTG (SEQ ID NO:12) F AGTATCCATGAACAAAGGGCAC (SEQ ID NO:13) Me1 Ref. 54. R ATCCCATTACAGCCAAGGTC (SEQ ID NO:14)
EXEMPLO 2: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO, FERMENTAÇÃO EM VITRO, DESIGN EXPERIMENTAL EM VIVO INICIAL A. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE A. CACCAE
[0119]A. caccae é isolada das fezes da criança saudável congelada em 30% do estoque de glicerol. Primeiramente, estoque de glicerol fecal não diluído do doador saudável #2 é transferido para placas em ágar de infusão de cérebo e coração (BHI) suplementado com Vitamina K, hemina, e antibióticos.
Os antibióticos usados são 16 μg/ml de ciprofloxacina ou uma mistura de 16 μg/ml de ciprofloxacina, 6 μg/ml de gentamicina, 5 μg/ml de aztreonam, e 10 μg/ml de colistina (58, 60). Este doador foi escolhido porque ele tinha a mais alta abundância relativa de A. caccae dos quatro doadores saudáveis de dados de sequenciamento anteriores. As placas são incubadas em câmaras anaeróbicas a 37°C por seis dias. As placas são a seguir raspadas e suspensas em 50% de solução de glicerol. Esta suspensão é a seguir dividida em alíquotas e uma alíquota é usada para qPCR e a outra é congelada a -80°C para ser usada para culturas futuras. A abundância de A. caccae é quantificada usando qPCR com iniciadores específicos da espécie contra o gene 16S rRNA (24). A alíquota congelada da suspensão da placa(s) mostrada como tendo a mais alta abundância de A. caccae é diluída e transferida para placas em Agar BHI e incubada em câmaras anaeróbicas a 37°C por seis dias. Colônias únicas são a seguir selecionadas da diluição a 10-5 e inoculadas em caldo de carne picada e de glicose pré-reduzido (CMG) e incubadas em uma câmara anaeróbica durante a noite. Uma alíquota desta cultura de caldo é a seguir tomada para a amplificação de 16S rRNA de PCR específica e PCR universal de A. caccae para o sequenciamento de Sanger. Outra alíquota é tirada e diluída 1:1 com 50% de solução de glicerol e congelada a -80°C em criofrascos. As colônias que são positivas para A. caccae por ambos PCR e sequenciamento de Sanger são a seguir semeadas sobre ágar BHI do criofrasco congelado para aumentar a pureza. Uma colônia única desta placa é a seguir inoculada em caldo de carne picada + glicose e desenvolvida durante a noite a 37°C na câmara anaeróbica. As alíquotas desta cultura de estoques são diluídas 1:1 em 50% de glicerol e armazenadas em criofrascos a -80°C para estudos futuros. Este isolamento é mostrado na FIG. 15.
[0120]Outra confirmação de isolamento de A. caccae é analisada por análise do genoma inteiro CosmosID®. O método descrito na FIG. 15 produziu 7 isolados de A. caccae, todos derivados do doador saudável #2. As três colônias que pareceram ser as mais diferentes umas das outras por sequenciamento de Sanger (denotadas 66a_Rep_1_1_IonXpress_011_trimmed, D24_colony_4_2_IonXpress_015, D24_colony_5_IonXpress_016) tiveram o genoma inteiro sequenciado. Todas as três colônias analisadas são altamente similares a A. caccae 3 2 56FAA e A.
caccae DSM 14662, mas uma cepa única destas referências conhecidas. Elas estão dentro da homologia de corte a ser classificada como homologia de A.
caccae (>98,5%), mas a distância de SNP (>100 SNPs) identifica os presentes isolados como uma cepa única das cepas de referência 3_2_56FAA e DSM
14662. No entanto, todos os presentes isolados são edênticos uns aos outros (0 SNPs), assim esta cepa é aqui referida como A. caccae_lah. A análise do genoma inteiro por CosmosID® também confirmou a ausência de quaisquer genes de virulência nos isolados e o único gene de resistência a antibiótico registrado foi para a classe da tetraciclina. Isto é ainda descrito na seguinte tabela.
[0121]A suscetibilidade a antibiótico de A. caccae_lah foi caracterizada pela inibição do crescimento em torno dos discos de antibiótico. Uma lasca de gelo do estoque congelado de A. caccae_lah é desenvolvida em caldo de CMG durante a noite e 100 μl de caldo são espalhados sobre ágar BHI. Os discos de antibiótico (10 μg de estreptomicina, 30 μg de canamicina, 30 μg de tetraciclina e 10 μg de ampicilina) são a seguir colocados no topo do ágar para medir a zona de inibição que demonstra a suscetibilidade ao antibiótico. As placas são incubadas a 37°C em condições anaeróbicas por seis dias. A. caccae_lah é altamente suscetível à ampicilina como mostrado pelo grande raio de inibição (FIG. 16). Também é de alguma forma suscetível à tetraciclina mesmo que ela possua um gene de resistência à tetraciclina (FIG. 16).
B. FERMENTAÇÃO EM VITRO
[0122]A. caccae_lah não é capaz de fermentar carboidratos complexos em monocultura, mas ela pode fermentar açúcares simples como aqueles na fórmula infantil, incluindo lactose. Uma lasca de gelo do estoque de A.
caccae_lah foi desenvolvida por 24 h em caldo de CMG a 37°C em condições anaeróbicas. Este método de pré-cultura é usado para todos os experimentos de fermentação em vitro futuros. A seguir, 10 μl de pré-cultura foram transferidos para 7 mL de caldo de levedura de peptona mínimo (PY) sozinho ou suplementado com 10 mg/ml de glicose, sacarose, lactose, celobiose, ou amido de batata. Todas estas variações de PY foram anaeróbicoamente pré- reduzidas preparadas por Anaerobe Systems. O crescimento e produção de butirato foram medidos após 48 h. A. caccae_lah cresceu abundantemente quando o caldo de PY foi suplementado com sacarose, glicose, e lactose comparado à celobiose ou amido de batata quando medido por OD600. O butirato em solução é quantificado por HPLC-UV-Vis como descrito na referência 61 e 62. De modo similar ao crescimento, A. caccae_lah produziu o máximo de butirato quando desenvolvido em sacarose, glicose, ou lactose. Estes açúcares simples são similares àqueles encontrados na fórmula infantil. Para testar a abundância de A. caccae_lah e sua produção de butirato na fórmula infantil, A. caccae_lah foi desenvolvido em caldo de PY suplementado com Nutramigen® (10 mg/ml de carboidratos), uma fórmula infantil hipoalergênica, fortificada com ferro projetada para crianças com CMA, ou Enfamil® (10 mg/ml de carboidratos), fórmula infantil padrão contendo leite de vaca. Estas são as mesmas fórmulas consumidas pelos doadores infantis saudáveis (Enfamil) e com CMA (Nutramigen) e também são consumidas por todos os camundongos colonizados com estes respectivos microbiomas. A abundância de A. caccae_lah foi similar quando desenvolvida com Enfamil ou Nutramigen como caldo de PY, provando que A. caccae_lah não depende do consumo de leite de vaca para o crescimento. No entanto, a produção de butirato foi mais alta em Nutramigen comparado ao caldo de PY sozinho. A maioria do açúcar em Nutramigen é xarope de milho que contém frutose e sacarose, o que espelha a alta produção de butirato por A. caccae_lah quando suplementado com sacarose sozinha. Todos os grupos foram analisados por ANOVA com um fator. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 versus PY.
Estes resultados são mostrados na FIG. 17.
[0123]A. caccae_lah é capaz de usar lactato e acetato juntos para produzir butirato. A. caccae e outra Clostridia são geralmente consideradas como espécies que fermentam a fibra, no entanto, como visto nos dados anteriores A. caccae_lah sozinha não é capaz de consumir fibras complexas para o crescimento ou produção de butirato. Outros grupos mostraram que degradadores primários, a saber, espécies de Bacteroides, quebram as fibras complexas e produzem metabólitos lactato e acetato cuja espécie Clostridia pode a seguir consumir para produzir butirato (59). Para examinar se esta alimentação cruzada complexa poderia ser imitada em vitro, caldo de PY é suplementado apenas com estes metabólitos para estimular a produção de butirato por A. caccae_lah. A pré-cultura dee A. caccae_lah foi desenvolvida de estoque de glicerol congelado como descrito acima, a seguir 10 μl foram transferidos para caldo de PY mínimo suplementado com acetato 33 mM e/ou lactato 40 mM (57). O crescimento e produção de butirato foram medidos após 48 h. Como mostrado na FIG. 18, A. caccae_lah teve crescimento significativo quando suplementado com qualquer ou ambos os metabólitos. De modo interessante, a cepa apenas produziu níveis significativamente altos de butirato quando suplementado com ambos lactato e acetato comparado à suplementação única. Estes dados apoiam os mecanismos de alimentação cruzada e ciclos metabólicos descritos por outras publicações para bactérias nesta família. Todos os grupos foram analisados por ANOVA com um fator.
*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001,****P<0,0001 versus PY sozinha.
[0124]Como mostrado na FIG. 19, A. caccae_lah produz substancialmente mais butirato dos carboidratos complexos em co-cultura com uma mistura bacteriana complexa de um doador infantil alérgico (CMA). Pré- culturas de amostra fecal com CMA de A. caccae_lah ou humana (estoque de glicerol congelado de doador humano 6) foram desenvolvidas como descrito acima. A seguir, 10 μl total (10 μl de A. caccae_lah, 10 μl de CMA, ou 5 μl de A.
caccae_lah + 5 μl de CMA) foram transferidos para o caldo de PY mínimo sozinho ou suplementado com 10 mg/ml de amido de batata ou celobiose (Anaerobe Systems). O crescimento e produção de butirato foram medidos após 48 h. A. caccae_lah em monocultura cresceu de modo similar ao longo de todos os tr~es meios e esteve abaixo do limite de detecção na cultura de CMA.
Quando A. caccae_lah é co-cultivado com a mistura bacteriana de CMA, sua abundância foi similar ou levemente maior do que aquela no crescimento da cultura única como medido por qPCR. Isto demonstra que A. caccae_lah é capaz de competir por substrato e estabelecer um nicho em co-cultura complexa. Como mostrado anteriormente, A. caccae_lah em monocultura não foi capaz de produzir butirato significativo quando desenvolvido em quaisquer meios suplementados com carboidrato. A produção de butirato também foi mínima pela cultura de CMA sozinha em PY e PY + Amido. No entanto, a co- cultura produziu níveis significativamente maiores de butirato comparado a A.
caccae_lah sozinha ou CMA sozinha quando suplementado com qualquer carboidrato, particularmente amido. Há alguma evidência de que amido de batata pode ser um bom suplemento prebiótico para apoiar o crescimento e produção de butirato de A. caccae_lah em vivo. Quando suplementado com celobiose, CMA e co-cultura produziram mais butirato do que A. caccae_lah sozinha sugerindo que a mistura bacteriana com CMA contém algumas espécies capazes de produzir butirato da quebra da fibra, e que a adição de A.
caccae_lah não contribui com qualquer butirato adicional para o sistema. Assim a celobiose não seria um suplemento prebiótico adequado.
[0125]Os inventores determinaram se a mistura bacteriana das fezes de camundongos de repositório colonizados com CMA se comportaria de modo similar à mistura himana com CMA, visto que as fezes destes camundongos de repositório serão usadas para colonizar todos os camundongos com CMA futuros. As partículas fecais de camundongos de repositório colonizados anteriormente de doador com CMA 6 foram coletadas, homogeneizadas em PBS estéril, a seguir diluídas 1:1 em 50% de solução de glicerol e congeladas a -80°C em criofrascos. As pré-culturas de A. caccae_lah, microbiota com CMA humana (hCMA) e microbiota com CMA de camundongo (msCMA) foram preparadas como descrito acima. As pré-culturas foram a seguir inoculadas dentro do caldo de PY com ou sem suplementos sozinhos (10ul), juntos (5 ul de A. caccae + 5 ul de CMA), ou A. caccae_lah e suplementos foram adicionados 24 h depois. Os suplementos (Nutramigen, lactato/acetato) foram adicionados na mesma concentração que anteriormente descrito e aproximadamente 10 mg/ml de farelo de trigo foram usados. O crescimento e produção de butirato foram medidos a t = 48 h ou 72 h, para permitir crescimento total em 48 h de A. caccae no grupo no qual ele foi adicionado no período posterior. Nem mistura de CMA teve A. caccae mensurável, como esperado. A mistura bacteriana das fezes de camundongo do repositório de CMA produz mais butirato na base de referência do que fezes humanas com CMA recém-descongeladas, mas a adição de A. caccae_lah com lactato e acetato ainda resulta em m aumento notável na concentração de butirato (FIG.
20). Existem muitos fatores que podem contribuir para a diferença entre as duas fontes de CMA incluindo perda de espécies durante a transferência para o camundongo, um aumento na abundância de produtores de butirato no camundongo de repositório ao longo do tempo, ou a diferença no tempo gasto em cultura congelada.
[0126]A. caccae_lah é capaz de se desenvolver quando inoculada em menor abundância em vitro. Nesta série de experimentos, os inventores determinaram se A. caccae_lah ainda seria capaz de se desnvolver em co- cultura quando inoculada com menor abundância do que a mistura de CMA, visto que A. caccae estará em abundância relativa muito menor quando introduzida em um camundongo colonizado com CMA. Este experimento foi realizado para refletir a realidade de introduzir A. caccae_lah em um camundongo colonizado com CMA mais precisamente do que uma inoculação a 1:1 simultânea. A. caccae_lah ou as pré-culturas com CMA foram realizadas como descrito aqui, a seguir 10 μl foram transferidos para dentro do caldo de PY mínimo suplementado com 10 mg/ml de carboidratos (10 mg/ml de carboidratos Nutramigen, Nutramigen mais 10 mg/ml de scFOS (fruto-
oligossacarídeo de cadeia curta, um prebiótico clínico), ou Nutramigen mais LA (lactato 40 mM + acetato 33 mM)). A. caccae_lah e pré-culturas com CMA foram transferidas para caldo de PY suplementado ou caldo de CMG em várias razões: 10 ul de A. caccae_lah:0 ul de CMA; 5 ul de A. caccae_lah: 5 ul de CMA; 3 ul de A. caccae_lah:7 ul de CMA; 1 ul de A. caccae_lah:9 ul de CMA.
como mostrado por qPCR específica da espécie, o volume de A. caccae_lah não efetou notavelmente sua expansão ou produção de butirato. A adição da scFOS diminuiu a concentração de butirato total comparado aos meios com Nutramigen sozinho. A adição de lactato e acetato resulta na mais alta concentração de butirato. A quantidade de butirato nestes meios é maior em co-cultura do que em A. caccae_lah sozinho, e na monocultura de A.
caccae_lah não existe qualquer lactato ou acetato detectável nos meios em 48 h. Isto sugere que as espécies com CMA em cultura estão contribuindo com lactato e acetato adicionais para o sistema, o que pode permitir a produção contínua de butirato por A. caccae_lah após os metabólitos suplementados serem esgotados.
[0127]Antes de começar os experimentos de colonização in vivo, a presença de A. caccae nos camundongos de repositório saudáveis e ausência em camundongos de repositório com CMA foi confirmada e medida por qPCR.
Os camundongos de repertório colonizados com fezes de doador infantil saudável 2 mostram abundância de A. caccae mensurável por qPCR, enquanto camundongos de repertório colonizados com fezes de doador com CMA 6 não mostram. Os inventores prevem que a provisão de A. caccae_lah para os camundongos colonizados com CMA com os suplementos prebióticos permitirá que as espécies se desenvolvam e estabeleçam um nicho no hospedeiro. De modo ideal, os inventores seriam capazes de administrar A. caccae_lah tal que a abundância de A. caccae_lah em camundongos colonizados com CMA alcance um nível similar àquele detectado em camundongos colonizados saudáveis.
C. PLANO EXPERIMENTAL PARA ESTUDOS EM VIVO INICIAIS (FIG. 21)
[0128]Neste experimento, os inventores buscam validar a colonização de A. caccae_lah em camundongos colonizados por CMA e sua dependência de suplementos prebióticos. Camundongos livres de germes (GF) livres de germes C3H/HeN são desmamados e alimentados com Nutramigen. Ao mesmo tempo, os camundongos recebem uma pasta fecal do camundongo de repositório com CMA (doador humano 6) por alimentação intragástrica (I.G.) para estabelecer o microambiente com CMA no modelo de camundongo. Os micróbios de CMA recebem 7 dias para colonizar. Os camundongos recebem um fornecimento contínuo de Nutramigen por todo o experimento. A alimentação ad libitum dos camundongos com Nutramigen, juntamente com suplementos adicionais de lactato/acetato ou carboidrato pode prover suficiente substrato contínuo para ajudar A. caccae a colonizar. Começando no dia 7 após o desmame, os camundongos recebem alimentação I.G. de ambos A.
caccae_lah e prebiótico ou controle. Cohortes de camundongos recebem 100 ul de PBS (controle) ou um suplemento prebiótico (10 mg/ml de lactato mais 10 mg/ml de acetato ou 10 mg/ml de amido de batata) logo após a coleta fecal.
Trinta minutos depois, os camundongos recebem 250 ul de produto bioterapêutico vivo (LBP, isto é, aproximadamente 1x106 de CFU A.caccae_lah), ou o mesmo volume de caldo de CMG estéril em glicerol como o controle negativo. Após a primeira semana, a alimentação do LBP é interrompida, mas o prebiótico (ou controle) continua a ser administrado por outra semana. Isto é para determinar se a administração do prebiótico é suficiente para manter a população de LBP (A. caccae_lah) no camundongosem introduzir mais bactérias. As fezes são coletadas diariamente durante este período de duas semanas para analisar a abundância de A.
caccae_lah por qPCR e concentração de butirato fecal por HPLC UV-Vis. Os camundongos são sacrificados no dia 42 ou no primeiro período que a abundância de A. caccae não é detectada nas fezes. Após o sacrifício, butirato cecal é medido e a expressão dos genes Ror2, Fbp1, Tgfbr3, Acot1, e Me1 é analisada em células epiteliais intestinais ileais (iIECs) por qPCR. O butirato cecal é normalmente uma medida mais sensível do que o butirato fecal, e pode ser uma melhor medida de produção de butirato por A. caccae_lah em vivo porque a maioria do butirato produzido no cólon é imediatamente consumida por colonócitos. Estes genes específicos são escolhidos para análise em iIECs porque eles são imunologicamente relevantes e foram mostrados como sendo diferencialmente expressos entre camundongos colonizados saudáveis, com CMA e A. caccae (Vide FIG. 4f.).
[0129]Como um experimento adicional, os inventores podem almejar intensificar a colonização por A. caccae_lah pela distribuição adicional de um composto que transporta butirato para os camundongos pela alimentação I.G.. Exemplos de composto que transporta butiratos são descritos no pedido PCT publicado WO 2018/195067 A1, Hubbell et al. Uma solução de 80 mg/mL do polímero de distribuição de butirato pHPMA-b-pBMA é preparada e diluída até 53,3 mg/mL como descrito na Hubbell et al. No experimento descrito diretamente acima [parágrafo 129], os cohortes de camundongos que recebem o suplemento prebiótico também recebem 125 uL desta solução diluída de polímero de distribuição de butirato por alimentação I.G. imediatamente após receber o suplemento prebiótico. O restante do experimento é realizado como descrito acima.
* * *
[0130]Todos os métodos revelados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente revelação.
Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será aparente àqueles versados na técnica que as variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem se afastar do conceito,
espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui embora os mesmos resultados ou similares sejam alcançados. Todos tais substituitos e modificações similares aparentes àqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, como definido pelas reivindicações em anexo.
REFERÊNCIAS
[0131]As referências a seguir, desde que elas provejam procedimentos exemplares ou outros detalhes suplementares àqueles apresentados aqui, são especificamente incorporadas aqui por referência.
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Claims (90)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para o tratamento de uma alergia alimentar ou para a redução de uma resposta alérgica a um alérgeno ou para o tratamento de ou prevenção de uma resposta anafilática em um indivíduo, CARACTERIZADO por compreender a administração de uma composição compreendendo bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
2. Método para o tratamento de um paciente em risco de uma alergia alimentar ou de uma resposta anafilática, CARACTERIZADO por compreender a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
3. Método para o tratamento de uma doença atópica em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método CARACTERIZADO por compreender a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença atópica compreende eczema, dermatite atópica, asma ou rinite alérgica.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto-oligossacarídeo, lactulose, lactitol, eritritol, isomalte, poliglicitol, acetato e lactato.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto- oligossacarídeo, lactulose, lactato, acetato, e lactitol.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre um oligossacarídeo digerível e um oligossacarídeo não digerível.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende pelo menos 6 gramas de oligossacarídeos não digeríveis.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligossacarídeo compreende um oligossacarídeo modificado.
10.Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligossacarídeo modificado compreende um oligossacarídeo de liberação de butirato fermentável A. caccae.
11.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de que 1x106 a 1x1015 CFU de A. caccae é administrado ao indivíduo.
12.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um composto que transporta butirato.
13.Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto que transporta butirato compreende pHPMA-b-pBMA.
14.Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto que transporta butirato é administrado oralmente.
15.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae, o prebiótico, e/ou o composto que transporta butirato são administrados simultaneamente.
16.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada antes do prebiótico e/ou composto que transporta butirato.
17.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada após o prebiótico e/ou o composto que transporta butirato.
18.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada pelo menos 1 hora antes do prebiótico e/ou o composto que transporta butirato.
19.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto que transporta butirato é administrado após o prebiótico.
20.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 10 gramas de prebiótico são administrados ao indivíduo.
21.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão das unidades de formação de colônia de A. caccae para gramas de prebiótico é 1000:1 – 10000:1.
22.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, CARACTERIZADO pelo fato de que a alergia alimentar compreende uma alergia a leite de vaca, ovo, alergia a amendoim, alergia à soja, alergia a trigo/glúten, alergia a frutos do mar, alergia a gergelim, ou alergia a frutos secos de árvores.
23.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com uma alergia alimentar ou com uma doença atópica.
24.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo foi tratado anteriormente para uma alergia alimentar ou doença atópica.
25.Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo foi determinado como sendo resistente ao tratamento anterior.
26.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
27.Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é menor do que um ano de idade, menor do que cinco anos de idade, menor do que doze anos de idade ou menor do que dezoito anos de idade.
28.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae compreende um produto bacteriano vivo.
29.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, CARACTERIZADO pelo fato de que as bactérias são liofilizadas ou secas por congelamento.
30.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae e/ou prebiótico são administrados oralmente.
31.Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae e/ou prebiótico são administrados em um comprimido ou cápsula.
32.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-31, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a administração de uma fórmula ou alimento contendo lactato.
33.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é determinado como tendo uma razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras de menos do que 3.
34.Método para o diagnóstico de um indivíduo com uma alergia alimentar, o método CARACTERIZADO por compreender a determinação da razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras; em que o indivíduo é diagnosticado com uma alergia alimentar quando a razão é menor do que 3.
35.Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda o tratamento do indivíduo diagnosticado com uma alergia alimentar com uma composição, compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico ao indivíduo.
36.Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto- oligossacarídeo, lactulose, lactitol, eritritol, isomalte, poliglicitol, lactato e acetato.
37.Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto- oligossacarídeo, lactulose, lactato, acetato, e lactitol.
38.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre um oligossacarídeo digerível e um oligossacarídeo não digerível.
39.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-38, CARACTERIZADO pelo fato de que o prebiótico compreende pelo menos 6 gramas de oligossacarídeos não digeríveis.
40.Método, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligossacarídeo compreende um oligossacarídeo modificado.
41.Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligossacarídeo modificado compreende uma A. caccae oligossacarídeo de liberação de butirato fermentável.
42.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-41, CARACTERIZADO pelo fato de que 1x106 a 1x1015 CFU de A. caccae é administrado ao indivíduo.
43.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a administração de um composto que transporta butirato.
44.Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto que transporta butirato compreende pHPMA-b-pBMA.
45.Método, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto que transporta butirato é administrado oralmente.
46.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-45, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae, o prebiótico, e/ou o composto que transporta butirato são administrados simultaneamente.
47.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada antes do prebiótico e/ou do composto que transporta butirato.
48.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada após o prebiótico e/ou o composto que transporta butirato.
49.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-48, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada pelo menos 1 hora antes do prebiótico e/ou do composto que transporta butirato.
50.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43-49, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto que transporta butirato é administrado após o prebiótico.
51.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-50, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos 10 gramas de prebiótico são administrados ao indivíduo.
52.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-51, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão das unidades de formação de colônia de A. caccae para gramas de prebiótico é 1000:1 – 10000:1.
53.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-52, CARACTERIZADO pelo fato de que a alergia alimentar compreende uma alergia ao leite de vaca.
54.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-53, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo não foi diagnosticado com uma alergia alimentar e/ou não exibiu sintomas de uma alergia alimentar.
55.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-54, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
56.Método, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é menor do que um ano de idade, menor do que cinco anos de idade, menor do que doze anos de idade ou menor do que dezoito anos de idade.
57.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-56, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae compreende um produto bacteriano vivo.
58.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-57, CARACTERIZADO pelo fato de que as bactérias são liofilizadas ou secas por congelamento.
59.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-58, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae e/ou prebiótico são administrados oralmente.
60.Método, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae e/ou prebiótico são administrados em um comprimido ou cápsula.
61.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-60, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a administração de uma fórmula ou alimento contendo lactato.
62.Composição, CARACTERIZADA por compreender a bactéria Anaerostipes caccae e um prebiótico.
63.Composição, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADA pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto- oligossacarídeo, lactulose, lactitol, eritritol, isomalte, poliglicitol.
64.Composição, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que o prebiótico compreende um ou mais dentre galacto- oligossacarídeo, lactulose, e lactitol.
65.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 64, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda um composto que transporta butirato.
66.Composição, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADA pelo fato de que o composto que transporta butirato compreende pHPMA-b- pBMA.
67.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 64, CARACTERIZADA pelo fato de que o prebiótico compreende um ou ambos os oligossacarídeos digeríveis e não digeríveis.
68.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 67, CARACTERIZADA pelo fato de que o prebiótico compreende pelo menos 6 gramas de oligossacarídeos não digeríveis.
69.Composição, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligossacarídeo compreende um oligossacarídeo modificado.
70.Composição, de acordo com a reivindicação 69, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligossacarídeo modificado compreende um oligossacarídeo de liberação de butirato fermentável A. caccae.
71.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 70, CARACTERIZADA pelo fato de que a A. caccae está em uma quantidade de 1x106 a 1x1015 de dosagem de CFU.
72.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 71, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão das unidades de formação de colônia de A. caccae para gramas de prebiótico é 1000:1 – 10000:1.
73.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 72, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda um excipiente farmacêutico.
74.Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62- 73, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é formulada para administração oral.
75.Comprimido, cápsula ou pó, CARACTERIZADO por compreender a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62-74.
76.Método para o tratamento de uma doença infecciosa, autoimune ou alérgica em um indivíduo, CARACTERIZADO por compreender a administração de uma composição compreendendo a bactéria Anaerostipes caccae ao indivíduo.
77.Método, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença compreende uma doença atópica.
78.Método, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença atópica compreende eczema, dermatite atópica, asma ou rinite alérgica.
79.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-78, CARACTERIZADO pelo fato de que 1x106 a 1x1015 CFU de A. caccae são administrados ao indivíduo.
80.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-79, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo foi diagnosticado com uma doença infecciosa, autoimune ou alérgica.
81.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo foi tratado anteriormente para a doença infecciosa, autoimune ou alérgica.
82.Método, de acordo com a reivindicação 81, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo foi determinado como sendo resistente ao tratamento anterior.
83.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-82, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
84.Método, de acordo com a reivindicação 83, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é menor do que um ano de idade, menor do que cinco anos de idade, menor do que doze anos de idade ou menor do que dezoito anos de idade.
85.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-84, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae compreende um produto bacteriano vivo.
86.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-85, CARACTERIZADO pelo fato de que as bactérias são liofilizadas ou secas por congelamento.
87.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-86, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada oralmente.
88.Método, de acordo com a reivindicação 87, CARACTERIZADO pelo fato de que a A. caccae é administrada em um comprimido ou cápsula.
89.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-88, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a administração de uma fórmula ou alimento contendo lactato.
90.Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-89, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo é determinado como tendo uma razão de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) protetoras/não protetoras de menos do que 3.
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