BR112021008180A2 - polipeptídeo de glp-1 tendo atividade agonista de receptor glp-1 e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

O presente pedido pertence ao campo da medicina. O presente pedido se refere a um polipeptídeo de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1 e ao uso do mesmo. O presente pedido se refere ainda a uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de GLP-1. Em particular, o presente pedido se refere a um polipeptídeo de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado em que o polipeptídeo de GLP-1 tem uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1.

Description

“POLIPEPTÍDEO DE GLP-1 TENDO ATIVIDADE AGONISTA DE RECEPTOR GLP-1 E USO DO MESMO” Campo da Técnica

[001]O presente pedido pertence ao campo da medicina. O presente pedido se refere a um polipeptídeo de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1 e ao uso do mesmo. O presente pedido se refere ainda a uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de GLP-1. Fundamentos

[002]Peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1) é um polipeptídeo contendo 37 aminoácidos. A sequência de aminoácido de GLP-1 (também referida nesta invenção como GLP-1(1-37)) é 1HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG. GLP-1 estimula a secreção de insulina agonizando-se o receptor GLP-1, de modo a causar uma diminuição nos níveis de glicose no sangue (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2013，23， 4011-4018；J. Med. Chem.，2015，58，1020−1037). Entretanto, a atividade de GLP-1(1-37) é muito fraca. Portanto, atenção foi focada em derivados de GLP-1(1- 37), tais como fragmentos de GLP-1 que são mais fortes do que GLP-1(1-37) em termos de bioatividade. Exemplos de fragmentos de GLP-1 incluem GLP-1(7-37) e GLP-1(7-36)NH2. A sequência de GLP-1(7-37) é 7HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID No. 1). A sequência de GLP- 1(7-36)NH2 é 7HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 (SEQ ID No. 2).

[003]Foi descoberto que GLP-1 tem um efeito de redução de glicose no sangue dependente da concentração de glicose. No caso de pacientes com níveis elevados de glicose no sangue, GLP-1 funciona para reduzir os níveis de glicose no sangue. GLP-1 não reduziria ainda mais os níveis de glicose no sangue em pacientes quando seus níveis de glicose no sangue são normais. Assim, GLP-1 reduz o risco de hipoglicemia que é comum quando da administração de um medicamento de redução de glicose no sangue, de modo a aumentar a segurança da medicação.

[004]GLP-1 ainda tem o efeito de perda de peso corporal. Estudos mostraram que pacientes com diabetes tipo 2 têm uma perda de peso média de 1,9 kg depois de 6 semanas de tratamento com GLP-1. Os pesquisadores acreditam que GLP-1 alcança perda de peso através de uma variedade de modos, incluindo a inibição de motilidade gástrica, retardando o esvaziamento gástrico e assim por diante. Além disso, GLP-1 pode agir ainda no sistema nervoso central, causando uma sensação de plenitude no corpo humano e causando uma perda de apetite.

[005]Portanto, GLP-1 mostrou um grande potencial como um agente terapêutico para tratar diabetes (especialmente diabetes tipo 2), obesidade e condições relacionadas.

[006]Novo Nordisk desenvolveu um análogo de GLP-1 fixando-se ácido glutâmico à lisina na 20a posição de GLP-1 e ainda ligando-se hexadecanoíla (palmitoíla) ao grupo amino do ácido glutâmico, que é comercializado sob o nome comercial Liraglutide. Exenatide (também conhecido como Exendin-4) é um análogo natural de GLP-1. Exenatide é um polipeptídeo contendo 39 aminoácidos isolado da saliva de Helioderma suspectum. A sequência de Exenatide é HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID No. 3).

[007]Além disso, a alanina de posição 8 de GLP-1 (Ala8/A8) é conhecida como um alvo de dipeptidil peptidase IV (DPP-IV). As variantes obtidas substituindo-se a alinda da posição 8 de GLP-1 ou um fragmento da mesma com glicina (Gly/G), serina (Ser/S) ou treonina (Thr/T) (por exemplo, Gly8-GLP-1, Ser8-GLP-1 ou Thr8-GLP-1; ver Metabolism ， 1999 ， 48 ， 252−258, ou Diabetologia ， 1998 ， 41 ， 271−278) aumentaram a resistência à degradação mediada por DPP-IV. Sumário da invenção

[008]O presente pedido fornece um polipeptídeo de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,

caracterizado em que o polipeptídeo de GLP-1 tem uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1. O polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo descrito nesta invenção é um agonista do receptor GLP-1 útil para tratar doenças em que é desejado ativar ou agonizar o receptor GLP-1.

[009]O presente pedido fornece ainda o uso do polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1. O presente pedido fornece ainda um polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o uso no tratamento de uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1. O presente pedido fornece ainda um método para tratar uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[010]O presente pedido fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e opcionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. Descrição detalhada da invenção

[011]O presente pedido fornece um polipeptídeo de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado em que o polipeptídeo de GLP-1 tem uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1.

[012]Em uma modalidade, o polipeptídeo de GLP-1 do presente pedido compreende GLP-1 tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1; um fragmento de GLP-1 tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1; um GLP-1 estendido tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1; ou um análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1. O análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo compreende um análogo natural de GLP-1 ou um fragmento do mesmo, ou um análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos diferentes em sua sequência de aminoácido do(s) aminoácido(s) na posição correspondente em GLP-1.

[013]Em uma modalidade preferida, o GLP-1 é GLP-1(1-37). Em uma outra modalidade preferida o fragmento de GLP-1 compreende GLP-1(7-37) ou GLP-1(7- 36)NH2. Em uma modalidade preferida, o análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo compreende Exenatide, Gly8-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-GLP- 1(7-37), Ser8-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-GLP-1(7-37) ou Thr8-GLP-1(7-36)NH2.

[014]Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é Gly8-Pro13-GLP-1(7-37), Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-Pro13-GLP-1(7- 37), Ser8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-Pro13-GLP-1(7-37) ou Thr8-Pro13-GLP-1(7- 36)NH2.

[015]A sequência de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 é 7HGEGTFPSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH (SEQ ID No. 4). 2

[016]A sequência de Gly8-Pro13-GLP-1(7-37) é 7HGEGTFPSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID No. 5).

[017]Os aminoácidos no polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção podem ser substituídos ou não substituídos. Alternativamente, os aminoácidos no polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção podem ser aminoácidos naturais ou aminoácidos não naturais. Exemplos de aminoácidos não naturais incluem aminoácidos de α-metila (tal como α-metilalanina), D-aminoácidos, aminoácidos semelhantes à histidina (tais como 2-amino-histidina, β-hidróxi-histidina, homo- histidina, α-fluorometil-histidina ou α-metil-histidina), aminoácidos contendo um grupo metileno adicional na cadeia lateral (“homo” aminoácido), e aminoácidos em que um grupo funcional ácido carboxílico em uma cadeia lateral é substituído por um grupo ácido sulfônico (tal como cisteína). Entretanto, a menos que de outro modo estabelecido, o polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção preferivelmente compreende apenas aminoácidos naturais.

[018]O polipeptídeo de GLP-1 do presente pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser preparado usando um método conhecido na técnica, tal como tecnologia de síntese de peptídeo de fase sólida (ver CN101337989B, e CN1786031B). Sintetizadores de peptídeo estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Applied Biosystems. Reagentes para a síntese de fase sólida estão comercialmente disponíveis, por exemplo, de Midwest Biotech ou GL Biochem. O sintetizador de peptídeo de fase sólida pode ser usado para bloquear grupos interferentes, proteger os aminoácidos a serem reagidos, acoplar, desacoplar, e capear os aminoácidos não reagidos de acordo com as instruções do fabricante. O polipeptídeo de GLP-1 do presente pedido ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo também pode ser preparado por um método de engenharia genética.

[019]A numeração dos aminoácidos no polipeptídeo de GLP-1, GLP-1, fragmento de GLP-1, GLP-1 estendido, análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo descrito nesta invenção é determinada em uma maneira geralmente aceita na técnica (por exemplo, determinada de acordo com a numeração da sequência de aminoácido de GLP-1). Por exemplo, de acordo com a prática na técnica, o término amino de GLP- 1 (7-37) é designado como posição 7, e o término carbóxi é designado como posição

37. Os outros aminoácidos no polipeptídeo são numerados sequencialmente. O término C é uma forma carbóxi não substituída, a menos que de outro modo especificado. Definição

[020]Em algumas modalidades, GLP-1 se refere a GLP-1 (1-37) tendo 37 aminoácidos. Ainda em outras modalidades, GLP-1 se refere a GLP-1, um fragmento de GLP-1, um GLP-1 estendido, um análogo de GLP-1, ou um fragmento do mesmo. Os técnicos no assunto são capazes de determinar o significado do termo GLP-1 com base no contexto.

[021]“Polipeptídeo de GLP-1” inclui GLP-1 tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 (isto é, uma mutação T13P); um fragmento de GLP-1 tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1; um GLP-1 estendido tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1; ou um análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1. “GLP-1” é GLP-1(1-37).

[022]“Fragmento de GLP-1” é um fragmento de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1 (por exemplo, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2). O fragmento de GLP-1 inclui um polipeptídeo obtido por truncamento de um ou mais aminoácidos no término N ou término C de GLP-1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2). Por exemplo, GLP-1(9-36) representa um fragmento obtido por truncamento de 2 aminoácidos no término N e 1 aminoácido no término C de GLP-1(7-37). Além disso, os aminoácidos no fragmento são numerados com o mesmo número como o número de aminoácido correspondente em GLP-1(7-37). Por exemplo, o ácido glutâmico N-terminal em GLP-1(9-36) está na 9a posição; a 12a posição é fenilalanina, e a 22a posição é glicina, que é o mesmo como GLP-1(7-37). Preferivelmente, os aminoácidos no fragmento de GLP-1 são numerados com o mesmo número como o número de aminoácido correspondente em GLP-1.

[023]“GLP-1 estendido” se refere a um polipeptídeo tendo atividade agonista de receptor GLP-1 obtido adicionando-se um ou mais aminoácidos ao término N e/ou término C de GLP-1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, GLP-1(1-37), GLP- 1(7-37), GLP-1(7-36)NH2). Por exemplo, GLP-1(5-37) pode ser obtido adicionando-se dois aminoácidos no término N de GLP-1(7-37); e GLP-1(7-38) pode ser obtido adicionando-se um aminoácido no término C de GLP-1(7-37). Preferivelmente, os aminoácidos no GLP-1 estendido são numerados com o mesmo número como o número de aminoácido correspondente em GLP-1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2).

[024]“Análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo” se refere a um polipeptídeo tendo homologia a GLP-1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2) e também tendo atividade agonista de receptor GLP-1. O análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo compreende um análogo natural de GLP-1 ou um fragmento do mesmo, ou um análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos diferentes em sua sequência de aminoácido do(s) aminoácido(s) na posição correspondente em GLP-1. Em uma modalidade preferida, o análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo compreende Exenatide, Gly8-GLP-1(1-37), Gly8-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-GLP-1(7-37), Ser8-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-GLP-1(1-37) ou Thr8-GLP-1(7-36)NH2. Preferivelmente, os aminoácidos no análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo são numerados com o mesmo número como o número de aminoácido correspondente em GLP-1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36)NH2).

[025]Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é Gly8-Pro13-GLP-1(7-37), Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-Pro13-GLP-1(7- 37), Ser8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Thr8- Pro13-GLP-1(7-37) ou Thr8- Pro13-GLP-1(7- 36)NH2.

[026]Em uma modalidade, o término N do polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é não substituído. Em uma outra modalidade, o término N do polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é alquilado ou acilado (preferivelmente alquilado ou acilado usando-se um grupo C1-C20 alquila ou acila). Em uma modalidade, o término C do polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é não substituído. Em uma outra modalidade, o término C do polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é amidado com um grupo -NH2, -NHR ou -NRR’ ou esterificado com um grupo (C1-C20) alquila.

[027]Visto que os polipeptídeos de GLP-1 descritos nesta invenção podem conter um ácido, um grupo funcional básico ou ambos em sua sequência de aminoácido, os polipeptídeos de GLP-1 descritos nesta invenção são capazes de reagir com uma variedade de bases inorgânicas, ácidos inorgânicos, e ácidos orgânicos para formar sais. Os ácidos comumente usados para formar sais ácidos são ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc., e ácidos orgânicos tais como ácido p-toluenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido oxálico, ácido p-bromobenzenossulfônico, ácido carbônico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, e semelhantes. Exemplos de tais sais incluem sulfato, pirossulfato, sulfato de hidrogênio, sulfito, bissulfito, fosfatos, fosfato de mono-hidrogênio, fosfato de di- hidrogênio, metafosfato, pirofosfato, cloreto, bromo, iodeto, acetato, propionato, caprato, octoato, acrilato, formiato, isobutirato, hexanoato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, buteno-1,4- diato, hexeno-1,6-diato, benzoato, clorobenzoato, metil benzoato, dinitrobenzoato,

hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, tartarato, metanossulfonato, propanossulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato, e semelhantes.

[028]O sal de adição de base pode ser formado a partir de uma base inorgânica tal como amônio, um hidróxido de metal alcalino ou metal alcalino terroso, um carbonato, um bicarbonato ou semelhantes. As substâncias básicas seguintes são comumente usadas para formar sais básicos, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato de potássio e semelhantes. Preferivelmente, o sal do polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção é um sal farmaceuticamente aceitável.

[029]Doenças em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1 como descrito nesta invenção incluem uma ou mais doenças selecionadas a partir do grupo consistindo em diabetes (por exemplo, diabetes tipo 1 ou diabetes tipo 2), obesidade, acidente vascular cerebral, alterações catabólicas depois da cirurgia, ou síndrome do intestino irritável.

[030]O presente pedido fornece ainda o uso do polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1. O presente pedido fornece ainda um polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o uso no tratamento de uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1. O presente pedido fornece ainda um método para tratar uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[031]O presente pedido fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e opcionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica descrita nesta invenção pode ser um comprimido, uma cápsula, um grânulo, um xarope, uma suspensão, uma solução, uma dispersão, uma preparação de liberação lenta para administração oral ou não oral, uma preparação para injeção intravenosa, uma preparação para injeção subcutânea, uma preparação para inalação, uma preparação transdérmica, um supositório retal ou vaginal.

[032]O carreador farmaceuticamente aceitável descrito nesta invenção se refere a um carreador farmaceuticamente aceitável bem conhecido aos técnicos no assunto, e o carreador farmaceuticamente aceitável do presente pedido inclui, mas não é limitado a, um enchedor, um agente umectante, um aglutinante, um agente desintegrante, um lubrificante, um aglutinante, um deslizante, um agente flavorizante, um surfactante, um preservante, e semelhantes. Enchedores incluem, mas não são limitados a, lactose, celulose microcristalina, amido, açúcar em pó, dextrina, manitol, sulfato de cálcio, e semelhantes. Agentes umectantes e aglutinantes incluem, mas não são limitados a, carboximetilcelulose sódica, hidroxipropilcelulose, hidroxipropil metil celulose, gelatina, sacarose, polivinilpirrolidona, e semelhantes. Agentes desintegrantes incluem, mas não são limitados a, carboximetil amido sódico, polivinilpirrolidona reticulada, croscarmelose sódica, hidroxipropilcelulose substituída inferior, e semelhantes. Lubrificantes incluem, mas não são limitados a, estearato de magnésio, aerosil, talco, óleo vegetal hidrogenado, polietilenoglicol, lauril sulfato de magnésio, e semelhantes. Aglutinantes incluem, mas não são limitados a, goma arábica, ácido algínico, carboximetilcelulose cálcica, carboximetilcelulose sódica, glicose, dextrina, dextrose, etilcelulose, gelatina, glicose líquida, goma guar, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, aluminossilicato de magnésio, maltodextrina, metil celulose, polimetacrilato, polivinilpirrolidona, amido pré-gelatinizado, alginato de sódio, sorbitol, amido, xarope e tragacanto. Deslizantes incluem, mas não são limitados a, sílica coloidal, celulose em pó, trissilicato de magnésio, sílica, e talco. Agentes flavorizantes incluem, mas não são limitados a, aspartame, esteviosídeo, frutose, glicose, xarope, mel, xilitol, manitol, lactose, sorbitol, maltitol, glicirrizina. Surfactantes incluem, mas não são limitados a, Tween-80, poloxâmero. Preservantes incluem, mas não são limitados a, parabeno, benzoato de sódio, sorbato de potássio, e semelhantes.

[033]Métodos para preparar várias composições farmacêuticas contendo várias quantidades de ingredientes ativos são conhecidos, ou estarão evidentes aos técnicos no assunto à luz desta invenção, como descrito em REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19a ed. (1995). Os métodos para preparar as composições farmacêuticas incluem incorporação de excipientes, carreadores, diluentes farmacêuticos adequados e semelhantes. As composições farmacêuticas descritas nesta invenção são fabricadas em uma maneira conhecida, incluindo métodos convencionais de mistura, dissolução ou liofilização.

[034]Nas composições farmacêuticas descritas nesta invenção, a quantidade de ingrediente ativo pode variar de cerca de 0,01 % a cerca de 99 % em peso de uma forma de dosagem unitária dada. Em tais formulações de composição farmacêutica terapeuticamente úteis, o ingrediente ativo está em uma quantidade tal que um nível de dosagem eficaz possa ser obtido.

[035]O comprimido, cápsula e semelhantes descritos nesta invenção podem compreender: um aglutinante tal como tragacanto, goma arábica, amido de milho ou gelatina; um excipiente tal como fosfato de dicálcio; um agente desintegrante tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico, etc.; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um adoçante tal como sacarose, frutose, lactose ou aspartame; ou um agente flavorizante tal como sabor hortelã, gaultéria ou cereja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais dos tipos acima, um carreador líquido tal como óleo vegetal ou polietilenoglicol. Vários outros materiais podem estar presentes, como um revestimento, ou de outro modo alteram a forma física da forma de dosagem unitária sólida. Por exemplo, comprimidos ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar, etc. O xarope pode conter um ingrediente ativo, sacarose ou frutose como um adoçante, metilparabeno ou propilparabeno como um preservante, um corante e um agente flavorizante tal como sabor cereja ou laranja. Certamente, qualquer material usado para preparar qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e não tóxico nas quantidades utilizadas. Além disso, o ingrediente ativo pode ser incorporado em uma formulação de liberação lenta e um dispositivo de liberação lenta.

[036]O ingrediente ativo também pode ser administrado intravenosamente ou intraperitonealmente por infusão ou injeção. Uma solução aquosa do ingrediente ativo ou um sal do mesmo pode ser preparada, opcionalmente com um surfactante não tóxico. Dispersões em glicerol, polietilenoglicol líquido, triacetina e misturas dos mesmos, e óleos também podem ser preparados. Sob condições habituais de armazenamento e uso, estas formulações contêm um preservante para impedir o crescimento dos microrganismos.

[037]Formas de dosagem da composição farmacêutica adequadas para injeção ou infusão podem compreender solução ou dispersão aquosa estéril ou pó estéril compreendendo um ingrediente ativo adequado para a preparação pronta-para- o-uso de uma solução ou dispersão estéril, injetável ou infundível (opcionalmente encapsulada em um lipossomo). Em todos os casos, as formas de dosagem finais devem ser estéreis, líquidas, e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. O carreador líquido pode ser um meio de dispersão de solvente ou líquido incluindo, por exemplo, água, etanol, polióis (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietilenoglicol líquido, e semelhantes), óleos vegetais, glicerídeos não tóxicos, e misturas adequadas dos mesmos. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, por formação de lipossomo, mantendo-se o tamanho de partícula desejado no caso de dispersão, ou pelo uso de um surfactante. A prevenção de microrganismos pode ser obtida usando-se vários agentes antibacterianos e antifúngicos tais como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferido incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção prolongada da composição injetável pode ser provocada pelo uso de uma composição que compreende um agente de retardo de absorção (por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina).

[038]Soluções injetáveis estéreis são preparadas combinando-se o ingrediente ativo em uma quantidade desejada em um solvente adequado com os vários outros ingredientes listados acima, seguido por esterilização por filtro. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são técnicas de secagem a vácuo e liofilização que resultam em pós do ingrediente ativo mais quaisquer ingredientes adicionalmente desejados presentes na solução de filtração estéril.

[039]Os carreadores sólidos úteis incluem sólidos fragmentados (por exemplo, talco, argila, celulose microcristalina, sílica, alumina, etc.). Carreadores líquidos úteis incluem água, etanol ou etileno glicol ou uma mistura de água-etanol/etileno glicol, e as composições farmacêuticas do presente pedido podem ser dissolvidas ou dispersas nos carreadores líquidos em uma quantidade eficaz, opcionalmente com o auxílio de um surfactante não tóxico. Adjuvantes (tais como fragrâncias) e agentes antimicrobianos adicionais podem ser adicionados para otimizar as propriedades para um uso dado.

[040]Espessantes (tais como polímeros sintéticos, ácidos graxos, sais e ésteres de ácido graxo, álcoois graxos, celuloses modificadas ou materiais inorgânicos modificados) também podem ser usados com carreadores líquidos para formar pastas revestíveis, géis, unguentos, sabões, etc. que são usados diretamente sobre a pele do usuário.

[041]A quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente ativo dependerá não apenas do sal particular selecionado, mas também da via de administração, da propriedade da doença a ser tratada, e da idade e condições do paciente, e basicamente dependerá da decisão do médico ou clínico atendentes.

[042]As formulações acima podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, que é uma unidade fisicamente separada contendo uma dose unitária adequada para administração a humanos e outros corpos mamíferos. A forma de dosagem unitária pode ser uma cápsula ou um comprimido. A quantidade de ingrediente ativo na dose unitária pode variar ou ser ajustada entre cerca de 0,01 a cerca de 1000 mg ou mais, dependendo do tratamento particular envolvido.

[043]O termo “tratado”, “tratando” ou “tratamento” como usado nesta invenção geralmente se refere à aquisição do efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático de acordo com a prevenção da doença ou seus sintomas no todo ou em parte; e/ou pode ser terapêutico de acordo com a estabilização parcial ou completa ou cura da doença e/ou o efeito colateral devido à doença. Como usado nesta invenção, “tratado”, “tratando” ou “tratamento” abrange qualquer tratamento para a doença de um paciente, incluindo: (a) prevenção da doença ou condição no paciente que pode estar predisposto à doença ou condição mas que ainda não foi diagnosticado; (b) inibição dos sintomas da doença, isto é, prevenção de seu desenvolvimento; ou (c) remissão dos sintomas da doença, isto é, causando regressão da doença ou sintomas no todo ou em parte.

[044]O polipeptídeo de GLP-1 descrito nesta invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, também pode ser administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para o tratamento de diabetes. Tais agentes terapêuticos adicionais incluem, mas não são limitados a, sulfonilureias (por exemplo, glibenclamida, gliclazida, glipizida, gliquidona, glimepirida,

etc.), biguanidas (por exemplo, metformina)), inibidores de α-glicosidase (acarbose, voglibose, etc.), tiazolidinodionas (por exemplo, rosiglitazona). Exemplos

[045]Em seguida, o presente pedido demonstrará os efeitos benéficos do presente pedido por via de exemplos. Os técnicos no assunto reconhecerão que estes exemplos são ilustrativos e não restritivos. Estes exemplos não limitarão o escopo do presente pedido de modo algum. Os métodos experimentais descritos nos exemplos seguintes, a menos que de outro modo especificado, são métodos convencionais; os reagentes e materiais, a menos que de outro modo especificado, estão comercialmente disponíveis. Exemplo 1: Preparação de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2

[046]A estrutura primária de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 é: His-Gly-Glu-Gly- Thr-Phe-Pro-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala- Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2. Neste exemplo, resina de amida MBHA Rink (adquirida da GL Biochem) foi usada para sintetizar Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 na sequência de Arg a His.

1.1) Acoplamento do primeiro aminoácido Fmoc-Arg(Pbf)-OH com resina de amida MBHA Rink:

[047]100 g de resina de amida MBHA Rink foram adicionados a um frasco de reação de 2 L, seguido pela adição de 1 L de solução de hexahidropiridina/DMF a 25 % ao frasco de reação. Depois de 30 minutos, a solução de hexahidropiridina/DMF foi removida por um dispositivo de sucção por pressão negativa. Depois, 32,7 g de Fmoc- Arg(Pbf)-OH, 6,8 g de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 7,84 ml de N,N-di- isopropilcarbodiimida (DIC) e 500 ml de DMF foram adicionados ao frasco de reação. A reação foi continuada por 120 minutos. A resina foi coletada por filtração. A resina coletada foi lavada sucessivamente com álcool isopropílico, DMF, álcool isopropílico, DMF, álcool isopropílico, e éter dietílico. A resina lavada foi seca ao peso constante.

1.2) Acoplamento do segundo aminoácido:

1.2.1) Desproteção: A resina seca com o primeiro aminoácido foi adicionado a um frasco de reação de 2 L. Ao frasco de reação foi adicionado 1 L de DMF para intumescer suficientemente a resina. A DMF é movida em um frasco para armazenar o líquido residual por intermédio de um dispositivo de sucção por pressão negativa. 1 L de solução de hexahidropiridina/DMF a 25 % foi adicionado ao frasco de reação, e depois o frasco de reação foi colocado em um agitador (velocidade do agitador: 120 rpm) por 30 minutos. O líquido foi movido em um frasco para armazenar líquido residual por intermédio de um dispositivo de sucção por pressão negativa. A resina foi lavada sucessivamente com DMF, álcool isopropílico, DMF, isopropanol, DMF, e o líquido de lavagem foi transferido para um frasco para armazenar líquido residual por intermédio de um dispositivo de sucção por pressão negativa depois de cada lavagem.

1.2.2) Reação de acoplamento: 53,5 g de Fmoc-Gly-OH, 28,0 ml de DIC e 24,3 g de HOBt foram colocados em um frasco Erlenmeyer, e depois dissolvidos adicionando-se 500 ml de DMF para obter uma solução. O frasco Erlenmeyer foi colocado em um agitador para ativação por 10 minutos (velocidade do agitador: 120 rpm) para obter uma solução ativada. A solução ativada foi adicionada ao frasco de reação contendo a resina obtida na etapa 1.2.1). O frasco de reação depois foi colocado em um agitador (velocidade do agitador: 120 rpm) por 120 minutos. O líquido foi movido em um frasco para armazenar líquido residual por intermédio de um dispositivo de sucção por pressão negativa. A resina foi lavada sucessivamente com DMF, álcool isopropílico, DMF, e álcool isopropílico, e o líquido de lavagem foi transferido para um frasco para armazenar líquido residual por intermédio de um dispositivo de sucção por pressão negativa depois de cada lavagem. A resina lavada foi seca ao peso constante.

1.3) Acoplamento do 3o ao 30o aminoácidos:

[048]A Etapa 1.2) foi repetida usando 84,3 g de Fmoc-Lys(Boc)-OH, 61,1 g de

Fmoc-Val-OH, 63,6 g de Fmoc-Leu-OH, 94,8 g de Fmoc-Trp(BOC)-OH, 56,0 g de Fmoc-Ala-OH, 63,6 g de Fmoc-Ile-OH, 69,7 g Fmoc-Phe-OH, 76,6 g Fmoc-Glu(OtBu)- OH, 84,3 g de Fmoc-Lys(Boc)-OH, 56,0 g de Fmoc-Ala-OH, 56,0 g de Fmoc-Ala-OH, 109,9 g de Fmoc-Gln(Trt)-OH, 53,5 g de Fmoc-Gly-OH, 76,6 g de Fmoc-Glu(OtBu)- OH, 63,6 g de Fmoc-Leu-OH, 82,7 g de Fmoc-Tyr(tBu)-OH 69,0 g de Fmoc-Ser(tBu)- OH, 69,0 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 61,1 g de Fmoc-Val-OH, 74,07 g de Fmoc- Asp(OtBu)-OH, 69,0 g de Fmoc-Ser(tBu)-OH, 60,7 g de Fmoc-Pro-OH, 69,7 g de Fmoc-Phe-OH, 71,5 g de Fmoc-Thr(tBu)-OH, 53,5 g de Fmoc-Gly-OH, 109,9 g de Fmoc-Glu(OtBu)-OH, 53,5 g de Fmoc-Gly-OH, e 111,5 g de Fmoc-His(Trt)-OH como reagentes de reação em sequência para obter His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)- Phe-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly- Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly- Arg(pbf)-resina seca.

1.4) A His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)- Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(pbf)-resina seca foi adicionada a um frasco de fundo redondo de 2 L. 1 L de TFA/H2O/EDT (V/V/V = 95:2,5:2,5) foi adicionado ao frasco. O frasco foi colocado em um agitador por 2 horas (120 rpm). O líquido de reação foi filtrado para obter um filtrado. O filtrado foi adicionado às porções a 3 L de éter dietílico anidro para fornecer um precipitado branco. O precipitado foi coletado por filtração e pesado, e 220 g de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 bruto foram obtidos. O produto bruto foi purificado por HPLC para fornecer Gly8-Pro13-GLP-1(7- 36)NH2 purificado: MS m/z = 3,280,6 (unicamente carregado)；1640,8 (duplamente carregado); 1094,2 (triplamente carregado). Exemplo 2: Estudo de eficácia de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Exenatide e Liraglutide por via de administração subcutânea 1) O modelo animal experimental de diabetes Tipo 2

[049]Ratos Wistar machos de aproximadamente 200 gramas foram jejuados durante a noite com acesso livre à água. Os ratos foram administrados com uma dose única de estreptozotocina (STZ) por injeção intraperitoneal (ip) em uma quantidade de 45 mg/Kg. Depois, os ratos foram normalmente alimentados e testados quanto à glicose no sangue de jejum. A glicose no sangue de jejum em ratos que é consistentemente e estavelmente mais alta do que 20 mM sugere uma modelagem bem-sucedida. 2) Método experimental

[050]Quarenta e oito ratos foram aleatoriamente divididos em 6 grupos, cada um com 8 ratos. No começo do experimento (0 hora), a concentração de glicose no sangue dos ratos (ratos STZ) foi 26,1 ± 1,7 mM (n = 48). Em 0 hora, os ratos STZ foram injetados subcutaneamente com doses diferentes de fármacos para o teste. Em 3, 6, e 9 horas, amostras de sangue foram tiradas da veia da cauda dos ratos. As amostras de sangue foram testadas para fornecer as concentrações de glicose no sangue dos ratos.

[051]Os resultados experimentais são mostrados na tabela abaixo. Tabela 1 Concentração Concentração Concentração Concentração de glicose no de glicose no de glicose no de glicose no sangue em 0 sangue em 3 sangue em 6 sangue em 9 hora (mM ， horas (mM ， horas (mM ， horas (mM ， média ± sem) média ± sem) média ± sem) média ± sem) Gly8-Pro13-GLP-1(7- 27,4 ± 0,8 23,4 ± 1,1 19,5 ± 0,5 16,3 ± 0,7 36)NH2 (1 μg/kg) Liraglutide 24,6 ± 2,6 24,5 ± 2,4 23,0 ± 2,3 22,4 ± 2,5 (1 μg/kg)

Exenatide 25,4 ± 1,2 20,6 ± 0,9 16,9 ± 0,6 12,6 ± 0,9 (1 μg/kg) Gly8-Pro13-GLP-1(7- 24,0 ± 1,1 18,5 ± 0,9 14,5 ± 0,8 10,5 ± 0,6 36)NH2 (10 μg/kg) Liraglutide 23,3 ± 0,8 22,5 ± 0,8 20,8 ± 0,8 19,7 ± 0,6 (10 μg/kg)

[052]Os dados acima mostraram que o efeito de redução de glicose no sangue de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 foi significativamente melhor do que aquele de Liraglutide (P < 0,01).

[053]O efeito de redução de glicose no sangue de Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 foi similar àquele de Exenatide, sem uma diferença significativa entre os dois. Entretanto, espera-se que Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2 possa causar menos respostas imunes anormais do que Exenatide.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de GLP-1 tendo atividade agonista de receptor GLP-1, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de GLP-1 tem uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1.

2. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de GLP-1 compreende: GLP-1 tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1; um fragmento de GLP-1 tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1; um GLP-1 estendido tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1; ou um análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo tendo uma mutação de treonina para prolina na posição correspondente à 13a posição da sequência de aminoácido de GLP-1 e tendo atividade agonista de receptor GLP-1.

3. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o GLP-1 é GLP- 1(1-37).

4. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de GLP-1 compreende GLP-1(7-37) ou GLP-1(7-36)NH2.

5. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o análogo de GLP- 1 ou um fragmento do mesmo compreende um análogo natural de GLP-1 ou um fragmento do mesmo, ou um análogo de GLP-1 ou um fragmento do mesmo tendo 1,

2, 3, 4 ou 5 aminoácidos diferentes em sua sequência de aminoácido do(s) aminoácido(s) na posição correspondente em GLP-1.

6. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o análogo de GLP- 1 ou um fragmento do mesmo compreende Exenatide, Gly8-GLP-1(1-37), Gly8-GLP- 1(7-36)NH2, Ser8-GLP-1(7-37), Ser8-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-GLP-1(1-37) ou Thr8-GLP- 1(7-36)NH2.

7. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de GLP-1 é Gly8-Pro13-GLP-1(7-37), Gly8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Ser8-Pro13-GLP-1(7-37), Ser8-Pro13-GLP-1(7-36)NH2, Thr8-Pro13-GLP-1(7-37) ou Thr8- Pro13-GLP-1(7-36)NH2.

8. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e opcionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição farmacêutica é um comprimido, uma cápsula, um grânulo, um xarope, uma suspensão, uma solução, uma dispersão, uma preparação de liberação lenta para administração oral ou não oral, uma preparação para injeção intravenosa, uma preparação para injeção subcutânea, uma preparação para inalação, uma preparação transdérmica, um supositório retal ou vaginal.

10. Uso do polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1.

11. Polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o uso no tratamento de uma doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1.

12. Método para tratar um doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de GLP-1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

13. Uso, polipeptídeo de GLP-1 ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou método, de acordo com as reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADOS pelo fato de que a doença em necessidade de ativar ou agonizar o receptor GLP-1 compreende: diabetes, obesidade, acidente vascular cerebral, alterações catabólicas depois de cirurgia, ou síndrome do intestino irritável.