BR112021007995A2 - molécula de anticorpo antagonista, sequência de nucleotídeos isolada, plasmídeo, vírus, célula, uso de uma molécula de anticorpo, composição farmacêutica, método para tratar câncer ou uma infecção causada por um patógeno intracelular em um paciente - Google Patents

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Abstract

MOLÉCULA DE ANTICORPO ANTAGONISTA, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ISOLADA, PLASMÍDEO, VÍRUS, CÉLULA, USO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER OU UMA INFECÇÃO CAUSADA POR UM PATÓGENO INTRACELULAR EM UM PACIENTE. Trata-se de moléculas de anticorpos antagonistas inovadoras que se aglutinam especificamente ao TNFR2 em uma célula-alvo e, assim, bloqueiam a aglutinação de TNF- a TNFR2 e bloqueiam a sinalização de TNFR2, em que as moléculas de anticorpo também se aglutinam a receptores Fc por meio da região Fc. Também é descrito o uso de tais moléculas de anticorpos no tratamento de câncer ou infecções causadas por patógenos intracelulares.

Description

1 / 94 MOLÉCULA DE ANTICORPO ANTAGONISTA, SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ISOLADA, PLASMÍDEO, VÍRUS, CÉLULA, USO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,
MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER OU UMA INFECÇÃO CAUSADA POR UM PATÓGENO INTRACELULAR EM UM PACIENTE CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a inovadoras moléculas de anticorpos antagonistas que se aglutinam especificamente ao receptor do fator de necrose tumoral 2 (TNFR2) em células-alvo e, assim, bloqueiam a aglutinação do ligante TNF-α ao TNFR2 e que também bloqueiam a sinalização do TNFR2, cujas moléculas de anticorpo também se aglutinam a um receptor Fc por meio de sua região Fc. A invenção também se refere ao uso das mesmas em medicina, tal como no tratamento de câncer ou infecções causadas por um patógeno intracelular.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O receptor do fator de necrose tumoral (TNF) 2 (TNFR2, TNFR-2 ou TNFRII), também conhecido como membro da superfamília do fator de necrose tumoral 1B (TNFRSF1B) e CD120b, é um receptor de membrana que aglutina fator alfa de necrose tumoral (TNF-α ou TNFα). É encontrado, por exemplo, na superfície de células T, monócitos e macrófagos, e pode ativar a proliferação de células que expressam o receptor do TNFR2 por meio do fator nuclear kappa B (NF-κB). Notavelmente, o TNFR2 é altamente regulado positivamente no câncer e, em particular, em células imunes infiltrantes de tumor, por exemplo, células T reguladoras (Tregs), células T efetoras citotóxicas CD8+ e diferentes subpopulações de células mieloides.
[003] O TNFR2 foi discutido como um alvo promissor para a imunoterapia do câncer, e foi descrito como sendo altamente expresso na superfície de Tregs intratumorais e muitas células tumorais humanas
2 / 94 (Williams GS et al, Oncotarget. 2016; 7(42): 68.278 a 68.291; Vanamee ES et al, Trends in Molecular Medicine, 2017, vol. 23, edição 11, 1.037 a 1.046; Frontiers in Immunology, novembro de 2017 | Volume 8 | Artigo 1.482, Sci Signal. 2 de janeiro de 2018; 11 (511)).
[004] As células T reguladoras (que também podem ser referidas como células Treg, Tregs ou Tregs e que formalmente eram conhecidas como células T supressoras ou T reguladoras supressoras) constituem uma subpopulação de células T com capacidade de suprimir outras células imunes em configurações imunológicas normais e patológicas. Tregs são células CD4 positivas (células CD4+). Há outras células T CD4+ que não são Tregs; no entanto, as Tregs podem ser separadas das células CD4+ não Treg pelo fato de que as Tregs também são FOXP3 positivas (FOXP3+), enquanto as células CD4+ não Treg são FOXP3 negativas (FOXP3-). Tregs também podem ser separadas de células não Treg CD4+ em que Tregs também são CD25+CD127neg/baixo enquanto as células não Treg CD4+ são CD25-CD127+ ou CD25+CD127+.
[005] TNFR2 também foi discutido em conexão com doenças autoimunes (Faustman DL et al, Front Immunol. 2013; 4: 478, Clin Transl Immunology. 8 de janeiro de 2016; 5 (1):, J Neurosci. 4 de maio de 2016; 36 (18): 5.128 a 5.143) e doenças inflamatórias (Ait-Ali D et al, Endocrinology. Junho de 2008; 149 (6): 2.840 a 2.852, Sci Rep. 2016, 7 de setembro; 6:
32.834).
[006] Anticorpos anti-TNFR2 de diferentes tipos e com várias características também foram descritos anteriormente. Por exemplo, Williams et al (Oncotarget. 18 de outubro de 2016; 7 (42): 68.278 a 68.291) descreve anticorpos agonistas bloqueador e não bloqueador de ligante.
[007] O documento WO 2014/124134 divulga o uso de um agonista de TNFR2, como um anticorpo agonista anti-TNFR2 e/ou um ativador de NF- κB para a produção in vitro de uma composição enriquecida em Tregs
3 / 94 CD4+CD25alto. A composição é considerada útil no tratamento de distúrbios imunológicos ou doenças infecciosas em pacientes. O documento WO 2014/124134 divulga ainda anticorpos antagonistas de TNFR2 que podem se aglutinar a um ou dois epítopos de TNFR2. O primeiro desses epítopos incluía a sequência QTAQMCCSKCSPGQHAKVFC e o segundo epítopo incluía um aminoácido específico em uma posição específica no aminoácido de TNFRs humanos; o segundo epítopo pode incluir a sequência RLCAPLRKCRPGF. Diz-se que tais antagonistas de TNFR2 são úteis para produzir composições enriquecidas em linfócitos e depletadas de Tregs. Na patente U.S. nº 9 821 010 concedida, proveniente deste pedido PCT, o anticorpo antagonista foi especificado como se aglutinando seletivamente a um epítopo dentro da sequência KQEGCRLCAPLRKCRPGFGV, tal como o epítopo que compreende a sequência RLCAPLRKCRPGF. Os antagonistas de TNFR2 e as composições produzidas usando os antagonistas de TNFR2 são considerados úteis no tratamento de distúrbios proliferativos, como câncer ou doenças infecciosas.
[008] O documento WO 2016/187068 divulga anticorpos capazes de antagonizar membros da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral, como TNFR2. Diz-se que os anticorpos são úteis para modular Tregs, como na imunoterapia para o tratamento de distúrbios proliferativos e doenças infecciosas. Em particular, o mesmo divulga anticorpos antagonistas de TNFR2 que se aglutinam a epítopos específicos de TNFR2 humano e apresenta uma série de sequências CDR específicas de tais anticorpos. Os dados no documento WO 2016/187068 demonstram que a aglutinação específica das regiões Fab dos anticorpos antagonistas de TNFR2 a TNFR2 é provavelmente responsável pela modulação do crescimento de células Treg, em vez da aglutinação não específica das regiões Fc desses anticorpos.
[009] O documento WO 2017/040312 divulga anticorpos anti- TNFR2, e em particular anticorpos agonistas anti-TNFR2, que são capazes de
4 / 94 promover a sinalização de TNFR2 e ter um efeito na expansão ou proliferação de Tregs. O documento WO 2017/040312 divulga anticorpos que se aglutinam especificamente a um epítopo que compreende a sequência KCSPG, mas não a um epítopo que compreende a sequência KCRPG, excluindo, assim, os anticorpos do documento US 9 821 010 discutidos acima ou, alternativamente, não a outro membro da superfamília TNFR. Os anticorpos agonistas são considerados úteis no tratamento de doenças imunológicas. O documento WO 2017/040312 apresenta ainda a sequência completa de TNFR2 humano.
[0010] O documento WO 2017/083525 discute composições farmacológicas que compreendem anticorpos anti-TNFR2 e uso das mesmas no tratamento de distúrbios associados ao TNF-α e/ou TNFR2, como câncer. O documento WO 2017/083525 discute ainda anticorpos que compreendem um domínio Fc de IgG1 humano que é nulo para aglutinação a um receptor Fcγ e também supressão da expansão de Tregs.
[0011] O documento WO 2017/197331 divulga anticorpos antagonistas de TNFR2 que compreendem região determinante de complementaridade-cadeia pesada 3 com sequências específicas e discute a redução ou inibição da proliferação de Tregs e/ou promoção da proliferação de células T efetoras.
[0012] Receptores Fc são proteínas de membrana que se encontram na superfície celular de células efetoras imunes, incluindo monócitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, mastócitos, basófilos, eosinófilos e células assassinas naturais e linfócitos B. O nome é derivado de sua especificidade de aglutinação para a região Fc dos anticorpos. Os receptores Fc são encontrados na membrana celular - também conhecida como membrana plasmática ou membrana citoplasmática. Os receptores Fc podem ser subdivididos em FcγR ativadores e FcγR inibidor, que são conhecidos por regular coordenadamente a ativação celular através da aglutinação de Fcs de
5 / 94 imunoglobulina G agregada e transmissão de sinais ativadores ou inibição para a célula através de motivos ITAM ou ITIM intracelulares. A aglutinação de FcR de imunoglobulina agregada ou complexos imunes pode mediar a internalização de anticorpos na célula e pode resultar em fagocitose mediada por anticorpos, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos ou apresentação de antígeno ou apresentação cruzada. Os FcRs também são conhecidos por mediar ou aumentar a reticulação de receptores de superfície celular aglutinados a anticorpos. Essa reticulação é conhecida por ser necessária para parte, (Li et al 2011. 'Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies', Science, 333: 1.030 a 1.034; White et al 2011. 'Interaction with FcgammaRIIB is critical for the agonistic activity of anti-CD40 monoclonal antibody', J Immunol, 187: 1.754 a 1.763), mas não para o todo (Richman et al 2014. 'Anti-human CD40 monoclonal antibody therapy is potent without FcR crosslinking', Oncoimmunology, 3: e28610) da capacidade dos anticorpos de ativar a sinalização em células-alvo, e pode ou não ser necessária para atingir os efeitos terapêuticos.
[0013] Um subgrupo dos receptores Fc são receptores Fcγ (receptores Fc gama, FcgammaR, FcγR), que são específicos para anticorpos IgG. Existem dois tipos de receptores Fcγ: ativação de receptores Fcγ (também denominados receptores ativadores de Fcγ) e receptores inibidores de Fcγ. Os receptores ativadores e inibidores transmitem seus sinais por meio de motivos ativadores baseados em tirosina imunorreceptores (ITAM) ou motivos inibidores baseados em tirosina imunorreceptores (ITIM), respectivamente. Em seres humanos, FcγRIIb (CD32b) é um receptor Fcγ inibidor, enquanto FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a), FcγRIIc (CD32c) e FcγRIIIa (CD16a) são receptores Fcγ ativadores. FcγgRIIIb é um receptor ligado a GPI expresso em neutrófilos que não tem um motivo ITAM, mas também é considerado ativador por sua capacidade de reticular microdomínios lipídicos e engajar
6 / 94 com outros receptores. Em camundongos, os receptores ativadores são FcγRI, FcγRIII e FcγRIV.
[0014] É sabido que os anticorpos podem modular a atividade das células imunes através da interação com os receptores Fcγ. Especificamente, como os complexos imunes aos anticorpos modulam a ativação das células imunes é determinado pelo seu envolvimento relativo dos receptores Fcγ ativadores e inibidores. Diferentes isotipos de anticorpos se aglutinam com afinidade diferente aos receptores Fcγ ativadores e inibidores, resultando em diferentes razões A:I (razões ativação:inibição) (Nimmerjahn et al; Science. 2 de dezembro de 2005; 310 (5753): 1.510 a 1.512).
[0015] Ao se aglutinar a um receptor Fcγ inibidor, um anticorpo pode inibir, bloquear e/ou modular negativamente a função celular de efetores. Ao se aglutinar a um FcγR inibidor, os anticorpos podem estimular ainda mais a ativação celular por meio da agregação de receptores de sinalização direcionados a anticorpos em uma célula-alvo (Li et al. 2011 'Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies', Science, 333: 1.030 a 1.034; White et al 2011. 'Interaction with FcgammaRIIB is critical for the agonistic activity of anti- CD40 monoclonal antibody', J Immunol, 187: 1.754 a 1.763; White et al
2014. 'Fcgamma receptor dependency of agonistic CD40 antibody in lymphoma therapy can be overcome through antibody multimerization', J Immunol, 193: 1.828 a 1.835).
[0016] Ao se aglutinar a um receptor Fcγ ativador, um anticorpo pode ativar funções celulares efetoras e, assim, desencadear mecanismos como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), liberação de citocinas e/ou endocitose dependente de anticorpo, como NETosis (isto é, ativação e liberação de NETs, sequestradores extracelulares de neutrófilos) no caso de neutrófilos. A aglutinação de anticorpo a um receptor Fcγ ativador também pode levar a um
7 / 94 aumento de certos marcadores ativadores, como CD40, MHCII, CD38, CD80 e/ou CD86.
[0017] Dados recentes publicados por i.a. os inventores demonstram uma dependência crítica e diferencial do agonista de células T CD8 e anticorpos anti-4-1BB de depleção de Treg para aglutinação a FcγRs ativadores e inibidores respectivamente, para eficácia terapêutica (Buchan et al., 'Antibodies to Costimulatory Receptor 4-1BB Enhance Anti-tumor Immunity via T Regulatory Cell Depletion and Promotion of CD8 T Cell Effector Function', Immunity 2018 49(5):958 a 970). Além disso, e de maneira crítica, a administração simultânea de agonista de células T CD8 e anticorpos anti-4-1BB de depleção de Treg otimizados para aglutinação a FcγR de ativação e inibidor respectivamente, atividade terapêutica prejudicada. Esses dados demonstram a importância crítica de desenvolver anticorpos com engajamento apropriado e personalizado de FcγRs ativadores e inibidores para maximizar a atividade terapêutica de anticorpos com mecanismo de ação distinto. Ao mesmo tempo, eles demonstram que o engajamento subótimo de FcγRs ativadores e inibidores pode reduzir severamente a eficácia terapêutica.
[0018] Estes dados foram surpreendentes, pois contrastaram com as descobertas de anticorpos para outros membros TNFSR, notavelmente anticorpos anti-CD40 imunoestimulantes, que mostram uma necessidade obrigatória de engajamento dos FcγRs inibidores, mas não ativadores (Li et al. 2011 'Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti- tumor activities of agonistic CD40 antibodies', Science, 333: 1.030 a 1.034; White et al 2011. 'Interaction with FcgammaRIIB is critical for the agonistic activity of anti-CD40 monoclonal antibody', J Immunol, 187: 1.754 a 1.763). Tomados em conjunto, esses resultados demonstram que a dependência de FcγR pode variar entre anticorpos para diferentes alvos da mesma superfamília de receptores, e mesmo entre diferentes tipos de anticorpos para
8 / 94 o mesmo alvo, de uma maneira que não é facilmente previsível, mas pode ser crítica para entender e aproveitar ao desenvolver anticorpos para uso terapêutico.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0019] No trabalho que conduz à presente invenção, e também a uma invenção paralela, foram identificados dois grupos principais diferentes de anticorpos anti-TNFR2 com atividade terapêutica poderosa e diferentes características e mecanismos de ação.
[0020] Os inventores primeiro identificaram uma poderosa atividade terapêutica de anticorpos antagonistas anti-TNFR2 que bloqueiam a aglutinação de TNF-α ao receptor TNFR2. A atividade de tais anticorpos mostrou ser dependente das interações FcγR e, em particular, da aglutinação a FcγR ativador, para atividade terapêutica in vivo. Este grupo ou categoria de poderosos reagentes terapêuticos anti-TNFR2 foi caracterizado por 1) bloqueio e inibição pronunciados de sinalização de TNFR2 induzida por TNF-α (o ligante), e 2) uma atividade dependente de FcγR-engate, beneficiando mais fortemente de engatar FcγRs ativação ao invés de inibidores.
[0021] Os inventores identificaram então um grupo distinto de anticorpos anti-TNFR2 com atividade terapêutica igualmente poderosa in vivo, mas cujas características em muitos aspectos são opostas àquelas do tipo de anticorpos de TNFR2 bloqueadores e antagonistas que constituem o primeiro grupo e a presente invenção. Os anticorpos anti-TNFR2 deste segundo grupo não dependem do bloqueio de TNF-α ou inibição da sinalização de TNFR2 para atividade terapêutica, mas ao invés disso são caracterizados por forte ativação da sinalização de TNFR2. Contrastando ainda mais com os anticorpos bloqueadores do primeiro grupo, os anticorpos agonistas do segundo grupo não mostram dependência obrigatória do anticorpo:engajamento de FcγR, embora sua atividade seja melhorada com
9 / 94 variantes de anticorpo FcγR:engajamento. Em contrapartida adicional aos anticorpos bloqueadores e antagonistas do primeiro grupo, os anticorpos agonistas do segundo grupo mostram maior atividade em variantes de anticorpos com aglutinação melhorada a FcγR inibidor vs ativador.
[0022] A presente invenção se refere ao primeiro grupo de anticorpos anti-TNFR2, isto é, a moléculas de anticorpos antagonistas que, por se aglutinarem especificamente ao TNFR2, bloqueiam a aglutinação do TNF-α a TNFR2 e também bloqueiam a sinalização de TNFR2. Essas moléculas de anticorpo também têm uma região Fc que se aglutina a um receptor Fc, que é útil para conferir eliminação dependente de FcγR ou modulação funcional de células positivas para TNFR2, tais como, por exemplo, depleção de Treg ou modulação de macrófagos associados a tumor.
[0023] Os anticorpos agonistas pertencentes ao segundo grupo são usados nos Exemplos abaixo para comparação com as moléculas de anticorpo de TNFR2 bloqueadoras e antagonistas da presente invenção. Nos exemplos, também outros anticorpos com algumas características semelhantes àquelas do primeiro ou segundo grupo, ou ambos, são usados para comparação, como explicado mais detalhadamente abaixo.
[0024] Assim, a presente invenção se refere a moléculas de anticorpos antagonistas que se aglutinam especificamente a TNFR2 em uma célula-alvo e, assim, bloqueiam aglutinação de TNF-α a TNFR2 e bloqueiam a sinalização de TNFR2, e em que as moléculas de anticorpo também se aglutinam a um receptor Fcγ através de sua região Fc.
[0025] A presente invenção também se refere a exemplos específicos de tais moléculas de anticorpo inovadoras anti-TNFR2 bloqueadoras e antagonistas.
[0026] A presente invenção também se refere a sequências de nucleotídeos isoladas que codificam pelo menos uma das moléculas de anticorpo acima.
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[0027] A presente invenção também se refere a plasmídeos que compreendem pelo menos uma das sequências de nucleotídeos acima.
[0028] A presente invenção também se refere a vírus que compreendem pelo menos uma das sequências de nucleotídeos ou plasmídeos acima.
[0029] A presente invenção também se refere a células que compreendem uma das sequência de nucleotídeos acima, ou um dos plasmídeos acima, ou um dos vírus acima.
[0030] A presente invenção também se refere às moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima para uso em medicina.
[0031] A presente invenção também se refere às moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima para uso no tratamento de câncer ou de infecções causadas por um patógeno intracelular.
[0032] A presente invenção também se refere às moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima para uso no tratamento de câncer ou de infecções causadas por um patógeno intracelular.
[0033] A presente invenção também se refere a composições farmacêuticas que compreendem ou consistem em pelo menos uma das moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima e, opcionalmente, um diluente, carreador, veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Essa composição farmacêutica pode ser usada no tratamento de câncer ou infecções causadas por um patógeno intracelular.
[0034] A presente invenção também se refere a métodos para o tratamento de câncer ou infecções causadas por um patógeno intracelular em um paciente que compreende administrar ao paciente uma quantidade
11 / 94 terapeuticamente eficaz de pelo menos uma das moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células acima.
[0035] A presente invenção também se refere a moléculas de anticorpo, moléculas de anticorpo para uso, sequências de nucleotídeos isoladas, sequências de nucleotídeos isoladas para uso, plasmídeos, plasmídeos para uso, vírus, vírus para uso, células, células para uso, usos, composições farmacêuticas e métodos de tratamento conforme descrito no presente documento com referência à descrição, exemplos e/ou figuras anexas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0036] Assim, a presente invenção se refere a moléculas de anticorpos antagonistas que se aglutinam especificamente a TNFR2 em uma célula-alvo e, assim, bloqueiam aglutinação de TNF-α a TNFR2 e bloqueiam a sinalização de TNFR2, e em que as moléculas de anticorpo também se aglutinam a um receptor Fcγ através de sua região Fc.
[0037] As moléculas de anticorpo antagonistas divulgadas no presente documento bloqueiam tanto a aglutinação de TNF-α a TNFR2 quanto a sinalização de TNFR2. O fato de as moléculas de anticorpos antagonistas bloquearem a aglutinação do TNF-α a TNFR2 significa, no presente documento, que uma molécula de anticorpo que se aglutina ao receptor de TNFR2 evita, assim, que o ligante TNF-α se aglutine ao mesmo receptor. Isso é demonstrado com mais detalhes no Exemplo 3. O fato de as moléculas de anticorpo antagonistas divulgadas no presente documento bloquearem a sinalização de TNFR2 significa que elas bloqueiam a ativação de células mediada por TNFR2. Foi claramente demonstrado que o a sinalização mediada do TNF-α por TNFR2 inicia uma cascata de sinalização que termina na ativação do fator de transcrição nuclear NFκB (Thommesen et al. “Distinct differences between TNF receptor 1- and TNF receptor 2-mediated activation of NFkappaB”. J Biochem Mol Biol. maio de 2005 31;38(3):281 a 289; Yang
12 / 94 et al. “Role of TNF-TNF Receptor 2 Signal in Regulatory T Cells and Its Therapeutic Implications”. Front Immunol. 19 de abril de 2018; 9: 784). Isso, por sua vez, resulta na ativação da célula e na síntese de vários fatores pró- inflamatórios, um deles sendo IFN-γ em células NK (Liu et al. “NF-κB signaling in inflammation”. Signal Transduct Target Ther. 2017; 2. pii:
17.023; Tato et al. “Opposing roles of NF-kappaB family members in the regulation of NK cell proliferation and production of IFN-gamma”. Front Immunol. Abril de 2006; 18 (4): 505 a 513). No presente documento, os termos sinalização de TNFR2 e ativação de TNFR2 são usados indistintamente.
[0038] As moléculas de anticorpo aglutinam-se especificamente ao TNFR2. É bem conhecido que um anticorpo se aglutina especificamente a ou interage com uma molécula ou antígeno-alvo definido e que isso significa que o anticorpo se aglutina preferencial e seletivamente ao seu alvo e não a uma molécula que não seja um alvo. Por “molécula de anticorpo que se aglutina especificamente ao TNFR2” ou “molécula de anticorpo específico do TNFR2”, queremos dizer um anticorpo que se aglutina à proteína TNFR2 de uma maneira dependente da dose, mas não a uma proteína não relacionada. Além disso, o mesmo anticorpo se aglutina a células que expressam TNFR2 endogenamente, e essa aglutinação pode ser bloqueada por pré-incubação das mesmas células com um reagente de anticorpo policlonal de TNFR2 disponível comercialmente, mostrando que nenhuma aglutinação não específica pode ser detectada quando TNFR2 é mascarado por um reagente policlonal. Isso é mostrado no exemplo 2.
[0039] A molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 (ou a molécula de anticorpo anti-TNFR2) refere-se a uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a pelo menos um epítopo no domínio extracelular de TNFR2. Antígeno e epítopo de superfície celular são termos que seriam facilmente entendidos por uma pessoa versada em
13 / 94 imunologia ou biologia celular.
[0040] Os métodos para avaliar a aglutinação de proteína são conhecidos pela pessoa versada em bioquímica e imunologia. Pode ser observado pelo especialista que esses métodos poderiam ser usados para avaliar a aglutinação de um anticorpo a um alvo e/ou a aglutinação da região Fc de um anticorpo a um receptor Fc; bem como a força relativa, ou a especificidade, ou a inibição, ou prevenção ou redução dessas interações. Exemplos de métodos que podem ser usados para avaliar a aglutinação de proteínas são, por exemplo, imunoensaios, BIAcore, western blots, radioimunoensaio (RIA) e ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) e citometria de Fluxo (FACS) (Ver Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York nas páginas 332 a 336 (1989) para uma discussão sobre a especificidade do anticorpo).
[0041] As células-alvo que expressam o TNFR2 ao qual o anticorpo bloqueador se aglutina de acordo com a presente invenção incluem células imunes e/ou células tumorais, como discutido acima e abaixo. O efeito da aglutinação das moléculas de anticorpo antagonistas de acordo com a invenção ao TNFR2 pode ser uma mudança na composição das células no tecido doente. Esta mudança na composição pode ocorrer por meio de uma mudança no número e/ou frequência de células que expressam TNFR2 no tecido doente. Por exemplo, o efeito no câncer inclui aumento do número de células T intratumorais, aumento da razão de células T CD8+/Treg (ou seja, o número de células T CD8+ para o número de Tregs) e/ou aumento do número de células mieloides associadas a antitumor em oposição às características pró-tumor. Isso é demonstrado no Exemplo 5. Em algumas modalidades, esses efeitos resultam em números reduzidos de Tregs de tecido, números aumentados de células T efetoras CD8+ e composição alterada de subconjuntos de células mieloides de tecido. A modulação de células que expressam TNFR2 em tecido após a invenção terapêutica in vivo com um
14 / 94 substituto (3-F10) para as moléculas de anticorpo antagonistas de acordo com a invenção é mostrada em detalhes no Exemplo 5. Para testar efeitos semelhantes de moléculas de anticorpos antagonistas humanos de acordo com a invenção, um experimento análogo pode ser realizado em camundongos que foram deletados em TNFR2 de camundongo e tornados transgênicos para TNFR2 humano. Alternativamente, e preferencialmente, embora requeira tempo e recursos significativos, os animais transgênicos para TNFR2 humano e FcγR humano podem ser gerados de maneira análoga em comparação com aquela descrita para CD40 e hFcγR anteriormente (Dahan et al. 2016. 'Therapeutic Activity of Agonistic, Human Anti-CD40 Monoclonal Antibodies Requires Selective FcgammaR Engagement', Cancer Cell, 29: 820 a 831). Esses camundongos TNFR2 FcγR humanizados podem então ser usados analogamente para testar efeitos semelhantes de moléculas de anticorpos antagonistas humanos de acordo com a invenção.
[0042] Tecido doente significa, neste contexto, tecido tumoral (ou seja, todas as células no microambiente tumoral, incluindo células tumorais, células imunes, células endoteliais e células estromais) ou tecido infetado por um patógeno intracelular.
[0043] Para decidir se uma molécula de anticorpo bloqueia ou não a aglutinação de ligante ao TNFR2, é possível usar um ensaio ELISA para determinar a quantidade de ligante de TNF-α aglutinado ao receptor de TNFR2 imobilizado na presença de anticorpos específicos de TNFR2. Um anticorpo bloqueador impedirá que o ligante, TNF-α, se aglutine ao receptor de TNFR2 imobilizado. Isso é demonstrado e explicado com mais detalhes no Exemplo 3 abaixo.
[0044] Uma molécula de anticorpo bloqueador de acordo com a invenção é um bloqueador completo, que adicionalmente é capaz de antagonizar a sinalização de TNFR2.
[0045] Um bloqueador completo é definido no presente documento
15 / 94 como uma molécula de anticorpo que reduz aglutinação de TNF-α ao TNFR2 em mais de 98%, ou seja, até 100%, em comparação à aglutinação de TNF-α na presença de apenas uma molécula de anticorpo de controle de isotipo. Um anticorpo de controle de isotipo é um anticorpo desenvolvido para uma proteína ou outra estrutura que não está presente em qualquer forma no ensaio em estudo. O controle de isotipo idealmente tem a mesma estrutura, mas pelo menos a mesma parte Fc que os anticorpos de comparação. Isto é bem conhecido da pessoa versada. Nos exemplos descritos no presente documento, o controle de isotipo tinha a mesma estrutura, a mesma parte Fc e era específico para isotiocianato de Fluoresceína (FITC). Em algumas modalidades, o bloqueador completo reduz aglutinação de TNF-α em mais de 99,5%.
[0046] Outros tipos de bloqueadores são bloqueadores parciais e bloqueadores fracos. Tal como utilizado no presente documento, um bloqueador parcial é uma molécula de anticorpo que reduz a aglutinação de TNF-α a TNFR2 em 60 a 98% (por exemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ou 98% e todos os números decimais entre estes) em comparação com a aglutinação de TNF-α na presença de apenas uma molécula de anticorpo de controle de isotipo, e um bloqueador fraco é uma molécula de anticorpo que reduz a aglutinação de TNF-α ao TNFR2 em menos de 60%, tal como 50 a 59,9% (ou 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 59,9% e todos os números decimais entre estes), em comparação com a aglutinação de TNF-α na presença de apenas uma molécula de anticorpo de controle de isotipo.
[0047] Pelo contrário, uma molécula de anticorpo não bloqueadora de TNFR2 é uma molécula de anticorpo que reduz a aglutinação de TNF-α ao TNFR2 em menos de 50% em comparação à aglutinação de TNF-α na presença de apenas uma molécula de anticorpo de controle de isotipo. Em
16 / 94 algumas modalidades, isso é determinado em dose alta, ELISA de um ponto como ou um ELISA de titulação de dose como mostrado no Exemplo 3 e Figuras 6 e 7.
[0048] Anticorpos bloqueadores parciais, bloqueadores fracos e não bloqueadores são usados nos exemplos para comparação com as moléculas de anticorpo bloqueador antagonista da presente invenção.
[0049] Várias propriedades e características podem fundamentar e (co)determinar a atividade biológica dos anticorpos. Além da capacidade de bloquear a aglutinação do ligante ao receptor, tais propriedades importantes incluem a capacidade do anticorpo de modular a sinalização do receptor, isto é, agonizar ou antagonizar a sinalização do receptor, e a dependência do anticorpo das interações FcγR para conferir atividade terapêutica.
[0050] Em primeiro lugar, caracterizamos a capacidade dos anticorpos bloqueadores completos, bloqueadores parciais e não bloqueadores para modular a sinalização de TNFR2. Dois extremos foram identificados.
[0051] No primeiro extremo, identificamos anticorpos que bloquearam completamente a aglutinação do ligante ao TNFR2, que bloqueou a sinalização de TNFR2 induzida por TNF-α, e que não induzem sinalização por si mesmas mediante a aglutinação a TNFR2 expresso em células endogenamente. Este grupo de anticorpos bloqueadores de ligante antagonistas forma a base da presente invenção.
[0052] No outro extremo, identificamos anticorpos que não bloqueiam a aglutinação de ligante ao TNFR2, mas ao se aglutinarem às células que expressam TNFR2 endogenamente agonizaram o receptor. Este segundo grupo de anticorpos constitui uma invenção separada e está incluído no presente documento para comparação.
[0053] Anticorpos e categorias definidas por bloqueio parcial agonista, bloqueio parcial não agonista e bloqueio completo não antagonista foram identificados adicionalmente demonstrando a biologia complexa e
17 / 94 grande heterogeneidade dos anticorpos anti-TNFR2, demonstrando claramente que os anticorpos da presente invenção formam um grupo único.
[0054] Para determinar se um anticorpo tem atividade agonista ou antagonista, é possível usar um ensaio de células Exterminadoras Naturais (NK) conforme descrito no Exemplo 4. Resumidamente, as células NK foram descritas como respondendo a estímulos de IL-2 e IL-12 com secreção de IFN-γ. TNF-α solúvel é produzido endogenamente e está presente em concentrações robustas, mas subótimas (~20 a 100 pg/ml), para a sinalização de TNFR2, o que significa que o IFN-γ pode ser aumentado e diminuído por meio da modulação da sinalização de TNFR2. Consequentemente, a adição exógena de TNF-α à concentração ideal de sinalização de TNFR2 aumenta as concentrações de IFN-γ neste ensaio, assim como a incubação com o anticorpo agonista anti-TNFR2 (Figura 8C). Ao contrário, a coincubação com anticorpo anti-TNF-α ou os anticorpos antagonistas bloqueadores de ligante descritos no presente documento diminui a liberação de IFN-γ neste ensaio. Assim, este ensaio pode ser usado para identificar a atividade agonista ou antagonista, ou a falta da mesma, de anticorpos anti-TNFR2. (TNFα Augments Cytokine-Induced NK Cell IFNγ Production through TNFR2. Almishri W.et al. J Innate Immun. 2016; 8: 617 a 629). Consequentemente, nesta configuração experimental, um anticorpo antagonista impede a sinalização de TNF-α induzida em células que expressam TNFR2, e por si só não estimula o receptor de TNFR2 ao se aglutinar ao mesmo. Especificamente, os anticorpos antagonistas neste ensaio não aumentam a liberação de IFN-γ mediante a aglutinação às células NK mencionadas acima, mas inibem a liberação de IFN-γ. Como mostrado na figura 8, os anticorpos bloqueadores completos descritos nesta invenção não induziram a sinalização de TNFR2, mas sim reduziram a sinalização de TNFR2 neste ensaio de TNF- α contendo células NK, resultando em menores quantidades de IFN-γ liberado. Conforme indicado na Figura 8, Exemplo 4, os anticorpos desta
18 / 94 invenção podem, portanto, ser classificados como anticorpos anti-TNFR2 antagonistas bloqueadores de ligante. Usando este ensaio, um anticorpo antagonista é definido como um anticorpo que resulta em >30% (por exemplo, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100%) de redução de liberação de IFN-γ dado que os níveis basais de TNF-α na cultura são de pelo menos 20 pg/ml. Uma vez que este ensaio usa células primárias de doadores de PBMC, pelo menos 4 doadores precisam ser incluídos e os valores médios devem ser calculados de todos os doadores. As células de cada doador a serem incluídas no cálculo das médias devem ter respondido ao controle positivo (TNF-α solúvel) tratamento com níveis elevados de IFN-γ >100% (>2 vezes) em relação ao tratamento com controle de isotipo.
[0055] A atividade antagonista também pode ser demonstrada usando a ativação mediada por IL-2 de células T de memória. A ativação é medida no presente documento pela regulação positiva do marcador ativador de células T CD25. Usando este ensaio, a adição de anticorpos agonistas não bloqueadores de TNFR2 regula positivamente a expressão de CD25, enquanto os anticorpos antagonistas bloqueadores de TNFR2 de acordo com a invenção resultam em menor expressão de CD25 em comparação com o controle de isotipo. Isto é verdade para os anticorpos humanos da invenção, bem como anticorpos substitutos murinos, e é mostrado no exemplo 4.
[0056] Além de se aglutinarem a TNFR2 e, assim, bloquearem a aglutinação e sinalização de TNF-α, as moléculas de anticorpo de acordo com a invenção também se aglutinam a receptores Fcγ. Uma dependência obrigatória das interações FcγR, de anticorpos anti-TNFR2 pertencentes ao grupo antagonista bloqueador de TNF-α de anticorpos da presente invenção para eficácia terapêutica, foi demonstrada em modelos experimentais de câncer de camundongo usando variantes de anticorpos que se engajam produtivamente, ou não se engajam produtivamente, à aglutinação FcγR. A dependência obrigatória de tais anticorpos antagonistas bloqueadores de
19 / 94 ligante da atividade terapêutica in vivo, e sua aglutinação/engajamento preferencial de FcγRs ativadores sobre inibidores para atividade terapêutica máxima in vivo, é mostrada no Exemplo 5. Os dados que demonstram a atividade in vivo independente de FcγR de anticorpos anti-TNFR2 não bloqueadores agonistas e seu engajamento preferencial diferencial de FcγRs inibitórios sobre FcγRs ativadores para a atividade terapêutica máxima estão incluídos neste exemplo apenas para fins comparativos e contrastantes. Coletivamente, nossos dados demonstram que vários tipos de anticorpos anti- TNFR2 podem ser gerados. Além disso, nossos dados demonstram que não é trivial, e não poderia ser previsto, quais variantes de anticorpos seriam terapeuticamente mais eficazes, se elas dependeriam de propriedades bloqueadoras, agonistas ou antagonistas (extrínsecas ou intrínsecas), e se elas dependeriam ou não do acoplamento de FcγR, ou se seriam mais eficazes em formatos de anticorpos associados com aglutinação preferencial/forte a receptores Fc gama ativadores ou inibidores.
[0057] A homologia relativamente alta entre os sistemas FcγR de camundongo e humano é responsável por muitos dos aspectos gerais dos mecanismos mediados por FcγR conservados entre as espécies. No entanto, as subclasses de IgG de camundongo e humana diferem em suas afinidades para seus FcγRs cognatos, tornando-se importante ao traduzir observações mediadas por FcγR no sistema de camundongo em terapêutica baseada em IgG humana para escolher um anticorpo, subclasse de anticorpo e/ou variante de subclasse projetada, que mostra a aglutinação apropriada a FcγRs ativadores humanos vs inibidores. A afinidade e/ou avidez de moléculas de anticorpo humano para receptores Fcγ humanos individuais pode ser determinada usando ressonância plasmônica de superfície (SPR). Em algumas modalidades, as moléculas de anticorpo de TNFR2 bloqueador aglutinam-se com maior afinidade aos receptores Fcγ ativadores do que aos receptores Fcγ inibidores. Com maior afinidade para receptores Fcγ ativadores do que
20 / 94 receptores Fcγ inibidores, incluímos o significado de variantes que se aglutinam com maior afinidade aos receptores Fcγ ativadores, por exemplo, FcγRIIA, FcγRIIIA e FcγRI, em comparação com o receptor Fcγ inibidor.
[0058] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo é uma IgG, que pode se aglutinar aos receptores Fcγ por meio da interação normal entre a região Fc da molécula de anticorpo e o receptor Fcγ.
[0059] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo TNFR2 bloqueador antagonista é uma IgG1 humana. É bem conhecido que a IgG1 humana se aglutina com alta afinidade ao FcγRI humano ativador e com afinidade inferior e semelhante aos receptores Fcγ ativadores humanos FcγRIIA, FcγRIIA, FcγRIIIA e a FcγRIIB inibidor humano. Isso foi demonstrado, por exemplo, usando ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[0060] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo de TNFR2 bloqueador antagonista é uma molécula de anticorpo IgG que mostra aglutinação melhorada a um ou vários receptores Fc ativadores e/ou sendo projetada para aglutinação aprimorada a um ou vários receptores Fcγ ativadores e/ou sendo projetada para aglutinação relativa melhorada a receptores Fc ativadores em comparação com receptores Fcγ inibidores. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFR2 é um anticorpo IgG1 humano projetado por Fc. Exemplos de tais variantes de anticorpos projetados incluem anticorpos afucosilados com aglutinação de anticorpo aprimorada seletiva a FcγRIIIA e anticorpos projetados por substituição de aminoácidos dirigida, mutacional ou por outros meios, resultando em aglutinação melhorada a um ou vários receptores Fcγ ativadores em comparação com FcγRIIB inibidor (Richards et al. 2008. 'Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells', Mol Cancer Ther, 7:
2.517 a 2.527; Lazar et al. 2006. 'Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function', Proc Natl Acad Sci U S A, 103: 4.005 a 4.010).
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[0061] Em algumas modalidades, o anticorpo IgG humano que é projetado para aglutinação melhorada aos receptores Fc gama ativadores pode ser um anticorpo IgG humano carregando as duas mutações S239D e I332E, ou as três mutações S239D, I332E e A330L, e/ou mutações G236A em sua porção Fc. Em algumas modalidades, o anticorpo IgG humano que é projetado para melhorar a aglutinação aos receptores Fc gama ativadores pode ser um anticorpo IgG humano fucosilado.
[0062] O receptor Fcγ ao qual se aglutina a região Fc das moléculas de anticorpo bloqueador antagonista da presente invenção pode ser um receptor Fcγ que expressa uma célula imune efetora como descrito acima.
[0063] A aglutinação da molécula de anticorpo específico de TNFR2 aos receptores de superfície do TNFR2 na célula-alvo e o coengajamento de FcγR na mesma célula ou células efetoras imunes em estreita proximidade pode resultar na depleção, ou modulação funcional, das células-alvo positivas para TNFR2 às quais a molécula de anticorpo se aglutina. Por depleção de uma célula, nos referimos no presente documento ao depleção, deleção ou eliminação da célula por meio da depuração física das células.
[0064] A depleção das células pode ser alcançada através de ADCC, isto é, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos ou citotoxicidade celular dependente de anticorpos, e/ou ADCP, isto é, fagocitose celular dependente de anticorpos. Isso significa que quando uma molécula de anticorpo, conforme descrito no presente documento, é administrada a um paciente, como um ser humano, ela se aglutina especificamente ao TNFR2 expresso na superfície das células, como Tregs, e essa aglutinação resulta na depleção das células. Em geral, as células de alta expressão são deletadas de forma mais eficaz em comparação com as células de baixa expressão. Como mostrado no exemplo 5, Figura 14, Tregs são as células de maior expressão no ambiente do tumor.
[0065] ADCC é um mecanismo imunológico através do qual células
22 / 94 efetoras portadoras de receptor Fc podem reconhecer e matar - isto é, depletar - células-alvo revestidas de anticorpos que expressam antígenos derivados de tumor, isto é, no presente caso, TNFR2, em sua superfície. O ADCP é um mecanismo semelhante, embora resulte na morte - isto é, depleção - das células-alvo por meio de fagocitose em vez de citotoxicidade.
[0066] Além disso, a aglutinação melhorada da região Fc das moléculas de anticorpo ao receptor Fcγ também pode melhorar a depleção da célula-alvo através da morte dependente do receptor Fc via ADCC ou ADCP. Isso é particularmente relevante para moléculas de anticorpo com aglutinação melhorada a receptores Fcγ ativadores.
[0067] O fato de as moléculas de anticorpo terem um efeito de depleção em células positivas para TNFR2 significa que mediante a administração a um paciente, como um humano, tal molécula de anticorpo se aglutina especificamente a TNFR2 expresso na superfície de células positivas para TNFR2, e esta aglutinação resulta na depleção de tais células-alvo.
[0068] As células que estão depletadas podem ser várias células diferentes, como explicado acima em conexão com a discussão sobre o que é a célula-alvo. Em geral, são as células que apresentam a maior expressão de TNFR2 que são depletadas. Outras células que também expressam TNFR2, mas não tão altamente, também podem ser depletadas, mas em menor grau em comparação com as células que têm a expressão de TNFR2 mais alta.
[0069] Como mencionado acima, o TNFR2 é altamente expresso em Tregs encontrados em tumores em vários pacientes com câncer e, em tais pacientes, a molécula de anticorpo da invenção se aglutinará preferencialmente a Tregs e, assim, resultará na depleção de Tregs. Tregs têm um efeito inibidor sobre a proliferação, ativação e capacidade citotóxica de outras células imunes, como células CD8 positivas (CD8+) e, portanto, a depleção de Tregs irá, pelo menos indiretamente, resultar em aumento da proliferação, ativação e possivelmente migração de células CD8+ e, portanto,
23 / 94 um aumento do número de células CD8+ intratumorais. As células T CD8+ são essenciais para uma depuração mediada pelo sistema imunológico de células tumorais (McKinney et al. Curr Opin Immunol. Dezembro de 2016; 43: 74 a 80; Klebanoff et al. Immunol Rev. Jun. 2006; 211: 214 a 224; Alexander-Miller. Immunol Res. 2005; 31 (1): 13 a 24). Portanto, um aumento na proliferação, ativação e capacidade citotóxica das células T CD8+ seria altamente benéfico para um paciente com câncer e pode levar à erradicação do câncer.
[0070] Um aumento na proliferação, ativação e capacidade citotóxica de células T CD8+ também seria altamente benéfico para o tratamento de uma infecção causada por um patógeno intracelular. Antígenos de patógenos intracelulares são tipicamente apresentados em moléculas MHC I que são instrumentais na ativação de células T CD8+. As células T CD8+ reconhecem as células infectadas e as lisam, destruindo, assim, o patógeno.
[0071] A aglutinação da molécula de anticorpo específico de TNFR2 e o bloqueio de sinalização de TNF-α também podem resultar na modulação funcional dos fenótipos celulares, por exemplo, modulação de uma célula mieloide pró-tumoral em uma célula mieloide com propriedades tumoricidas.
[0072] Em algumas modalidades, as células positivas para TNFR2, ou seja, as células-alvo, são células positivas para CD4 (CD4+), ou seja, células que expressam CD4.
[0073] Em algumas modalidades, as células positivas para TNFR2 são CD4+ e FOXP3+, ou seja, expressam CD4 e FOXP3. Essas células são Tregs. As células T CD8+ também expressam TNFR2, mas Tregs expressam níveis significativamente mais elevados de TNFR2 do que células T CD8 positivas, como mostrado na figura 14 no exemplo 5. Isso torna as Tregs mais suscetíveis à depleção em comparação com células CD8+ de menor expressão.
[0074] Em algumas situações, o TNFR2 é expresso preferencialmente em células imunes no microambiente tumoral (células infiltrantes de tumor,
24 / 94 TILS).
[0075] Em algumas modalidades, as Tregs serão as células em um microambiente tumoral que têm a maior expressão de TNFR2, resultando nas moléculas de anticorpo que se aglutinam especificamente a TNFR2 (ou as moléculas de anticorpo anti-TNFR2) tendo um efeito de depleção de Treg. Isso é discutido em mais detalhes abaixo, por exemplo, no Exemplo 5 e em conexão com as Figuras 13 e 15.
[0076] Em algumas modalidades, as células positivas para TNFR2 serão Tregs em um tumor sólido. Tais Tregs terão expressão muito alta de TNFR2 e, portanto, a administração de moléculas de anticorpo que se aglutinam especificamente a TNFR2 resultará preferencialmente na depleção de tais Tregs.
[0077] Para decidir se uma molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo que tem um efeito de depleção em células positivas para TNFR2, conforme referido no presente documento, é possível usar um teste in vivo em um modelo PBMC-NOG/SCID. Este teste in vivo é baseado no uso combinado de camundongos PBMC e camundongos NOG/SCID, que é chamado de modelo PBMC-NOG/SCID no presente documento. Ambos os camundongos NOG e camundongos SCID são conhecidos da pessoa versada (Ito M et al, (2002) camundongo NOD/SCID/γcnulo: mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood 100 (9): 3.175 a
3.182; Bosma GC et al; Nature. 10 de fevereiro de 1983; 301 (5900): 527 a 530; A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse) e além disso um modelo PBMC-NOG é conhecido (Cox et al. “Antibody-mediated targeting of the Orai1 calcium channel inhibits T cell function”. PLoS One. 23 de dezembro de 2013; 8 (12): e82944.; e Søndergaard et al. “Human T cells depend on functional calcineurin, tumor necrosis factor-α and CD80/CD86 for expansion and activation in mice.” Clin Exp Immunol. Maio de 2013; 172 (2): 300 a 310.) O teste in vivo no modelo PBMC-NOG/SCID compreende as
25 / 94 seguintes nove etapas consecutivas: 1) PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) humanas são isoladas, lavadas e ressuspensas em PBS estéril. Em algumas modalidades, as PBMCs são ressuspensas em PBS a 75x106 células/ml.
[0078] 2) Camundongos NOG são injetados i.v. (por via intravenosa) com uma quantidade apropriada, tal como 200 µl, da suspensão de células da etapa 1). Se 200 µl forem injetados, isso corresponde a 15x106 células/camundongo.
[0079] 3) Um tempo adequado, como 2 semanas, após a injeção, os baços dos camundongos NOG são isolados e transformados em uma suspensão de célula única. Opcionalmente, uma pequena amostra da suspensão de célula única é retirada para determinar a expressão de TNFR2 em células T humanas por FACS, a fim de confirmar a expressão de TNFR2.
[0080] 4) A suspensão de células da etapa 3) é ressuspensa em PBS estéril. Em algumas modalidades, a suspensão de células é ressuspensa em PBS estéril a 50x106 células/ml. Se a determinação da expressão de TNFR2 opcional for incluída na etapa 3, o resto da suspensão de células é então ressuspensa na etapa 4.
[0081] 5) Camundongos SCID são injetados i.p. (intraperitonealmente) com uma quantidade apropriada, como 200 µl, da suspensão da etapa 4. Se 200 µl forem injetados, isso corresponde a 10x106 células/camundongo.
[0082] 6) Um tempo adequado, como 1 hora, após a injeção na etapa 5), os camundongos SCID são tratados com uma quantidade apropriada, como 10 mg/kg, da molécula de anticorpo a ser testada, um anticorpo de controle positivo (por exemplo anticorpos anti-CD25 conhecidos por depletar Tregs) ou um anticorpo monoclonal de controle de isotipo.
[0083] 7) O fluido intraperitoneal dos camundongos SCID tratados é coletado em um momento adequado, como 24 horas, após o tratamento na
26 / 94 etapa 6).
[0084] 8) Subconjuntos de células T humanas são identificados e quantificados por FACS usando os seguintes marcadores: CD45, CD4, CD8, CD25 e/ou CD127. Está bem estabelecido que as Tregs humanas podem ser distinguidas em uma população de PBMC humana como sendo CD4+CD25+CD127baixo/-.
[0085] 9) Os resultados da identificação e quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com a molécula de anticorpo testada são comparados com os resultados da identificação e quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com um anticorpo de controle positivo e com os resultados de identificação e quantificação dos subconjuntos de células T dos camundongos tratados com anticorpo monoclonal de controle de isotipo. Um menor número de Tregs no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com a molécula de anticorpo a ser testado em comparação com o número de Tregs no fluido intraperitoneal de camundongos tratados com controle de isotipo demonstra que a molécula de anticorpo tem um efeito de depleção em Tregs positivas para TNFR2.
[0086] Este ensaio é demonstrado em mais detalhes abaixo no Exemplo 5, em combinação com a Figura 15.
[0087] Como mencionado acima, outras células também podem expressar TNFR2, como células cancerosas. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo se aglutina preferencialmente ao TNFR2 expresso em células cancerosas e a aglutinação, então, resulta na depleção das células cancerosas diretamente.
[0088] Os anticorpos são bem conhecidos por pessoas versadas nas técnicas de imunologia e biologia molecular. Tipicamente, um anticorpo compreende duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L). No presente documento, às vezes nos referimos a essa molécula de anticorpo completa como um anticorpo em tamanho completo ou em comprimento completo. A
27 / 94 cadeia pesada do anticorpo compreende um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), e a cadeia leve da molécula do anticorpo compreende um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL). Os domínios variáveis (por vezes coletivamente referidos como a região Fv) se aglutinam ao alvo do anticorpo, ou antígeno. Cada domínio variável compreende três ciclos fechados, referidos como regiões determinantes complementares (CDRs), responsáveis pela aglutinação ao alvo. Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na aglutinação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de cadeias pesadas dos mesmos, anticorpos ou imunoglobulinas podem ser atribuídos a diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e em seres humanos várias das mesmas são divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2.
[0089] Outra parte de um anticorpo é a região Fc (também conhecida como domínio cristalizável do fragmento), que compreende dois dos domínios constantes de cada uma das cadeias pesadas do anticorpo. Como mencionado acima, a região Fc é responsável pelas interações entre o anticorpo e o receptor Fc.
[0090] O termo molécula de anticorpo, como utilizado no presente documento, abrange anticorpos de tamanho completo ou comprimento completo, bem como fragmentos funcionais de anticorpos de comprimento completo e derivados de tais moléculas de anticorpo.
[0091] Fragmentos funcionais de um anticorpo de tamanho completo têm as mesmas características de aglutinação ao antígeno que o anticorpo de tamanho completo correspondente e incluem os mesmos domínios variáveis (isto é, as sequências de VH e VL) e/ou as mesmas sequências de CDR que o anticorpo de tamanho completo correspondente. Um fragmento funcional nem sempre contém todas as seis CDRs de um anticorpo de tamanho completo
28 / 94 correspondente. Observa-se que moléculas que contêm três regiões CDR ou menos (em alguns casos, mesmo apenas uma única CDR ou uma parte da mesma) têm a capacidade de reter a atividade de aglutinação ao antígeno do anticorpo da qual as CDR (ou CDRs) são derivadas. Por exemplo, em Gao et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 32.389 a 32.393, é descrito que uma cadeia VL completa (incluindo todas as três CDRs) tem uma alta afinidade pelo seu substrato.
[0092] Moléculas contendo duas regiões CDR são descritas, por exemplo, por Vaughan & Sollazzo 2001, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4: 417 a 430. Na página 418 (coluna da direita - 3 Our Strategy for Design), é descrito um minicorpo incluindo apenas as regiões hipervariáveis CDR H1 e H2 intercaladas nas regiões da estrutura. O minicorpo é descrito como sendo capaz de se aglutinar a um alvo. Pessi et al., 1993, Nature, 362: 367 a 369 e Bianchi et al., 1994, J. Mol. Biol., 236: 649 a 659 são referenciados por Vaughan & Sollazzo e descrevem o minicorpo H1 e H2 e suas propriedades em mais detalhes. Em Qiu et al., 2007, Nature Biotechnology, 25: 921 a 929 é demonstrado que uma molécula que consiste em duas CDRs ligadas tem a capacidade de se aglutinar ao antígeno. Quiocho 1993, Nature, 362: 293 a 294 fornece um resumo da tecnologia “minicorpo”. Ladner 2007, Nature Biotechnology, 25: 875 a 877 comenta que as moléculas contendo duas CDRs têm a capacidade de reter a atividade de aglutinação ao antígeno.
[0093] Moléculas de anticorpo contendo uma única região CDR são descritas, por exemplo, em Laune et al., 1997, JBC, 272: 30.937 a 30.944, em que é demonstrado que uma gama de hexapeptídeos derivados de uma CDR exibe atividade de aglutinação ao antígeno e observa-se que peptídeos sintéticos de uma CDR completa e única exibem forte atividade de ligação. Em Monnet et al., 1999, JBC, 274: 3.789 a 3.796, é mostrado que uma variedade de peptídeos de 12 monômeros e regiões estruturais associadas tem
29 / 94 atividade de aglutinação ao antígeno e é comentado que um peptídeo do tipo CDR3 sozinho tem capacidade de se ligar a um antígeno. Em Heap et al., 2005, J. Gen. Virol., 86: 1.791 a 1.800, é relatado que um “micro-anticorpo” (uma molécula contendo uma única CDR) tem a capacidade de se ligar ao antígeno e é mostrado que um peptídeo cíclico de um anticorpo anti-HIV tem atividade e função de aglutinação ao antígeno. Em Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13: 1.882 a 1.891, mostra-se que uma única CDR pode conferir atividade de aglutinação ao antígeno e afinidade pelo seu antígeno lisozima.
[0094] Assim, moléculas de anticorpo tendo cinco, quatro, três ou menos CDRs têm a capacidade de reter as propriedades de aglutinação ao antígeno dos anticorpos completos a partir dos quais são derivados.
[0095] A molécula de anticorpo também pode ser um derivado de um anticorpo de comprimento completo ou um fragmento de tal anticorpo, desde que tal derivado ou fragmento retenha a capacidade de aglutinação de receptor Fcγ. Quando um derivado é usado, o mesmo deve ter as mesmas características de aglutinação a antígeno que o anticorpo de comprimento completo correspondente, no sentido de que se aglutina ao mesmo epítopo no alvo que o anticorpo de comprimento total.
[0096] Assim, pelo termo “molécula de anticorpo”, como usado no presente documento, inclui-se todos os tipos de moléculas de anticorpo e fragmentos funcionais e derivados das mesmas, incluindo: anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos de origem humana, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, cadeias pesadas de anticorpos, homodímeros de cadeias pesadas de anticorpos, heterodímeros de cadeias pesadas de anticorpos e heterodímeros de cadeias leves de anticorpos.
30 / 94
[0097] Além disso, o termo “molécula de anticorpo”, como utilizado no presente documento, inclui todas as classes de moléculas de anticorpo e fragmentos funcionais, incluindo: IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD e IgE, salvo indicação em contrário.
[0098] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo humano, uma molécula de anticorpo humanizado ou uma molécula de anticorpo de origem humana. Em algumas dessas modalidades, a molécula de anticorpo é um anticorpo IgG. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo é de um isotipo que engaja os receptores Fc ativadores de uma forma ideal. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo é um anticorpo IgG1.
[0099] O versado na técnica apreciará que a IgG2a de camundongo e a IgG1 humana engajem receptores Fcγ ativadores e compartilham a capacidade de ativar a deleção de células-alvo através de receptor Fcγ ativador portador de células imunes, por exemplo, ADCP e ADCC. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFR2 é um anticorpo IgG2a murino ou murino humanizado.
[00100] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 é uma molécula de anticorpo IgG2 humano.
[00101] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFR2 é um anticorpo murino que apresenta reação cruzada com TNFR2 humano.
[00102] Como descrito acima, diferentes tipos e formas de moléculas de anticorpo são abrangidos pela invenção e seriam conhecidos por aqueles versados na técnica em imunologia. Sabe-se que os anticorpos usados para fins terapêuticos são, frequentemente, modificados com componentes adicionais que modificam as propriedades da molécula de anticorpo.
[00103] Consequentemente, inclui-se que uma molécula de anticorpo descrita no presente documento ou uma molécula de anticorpo usada como
31 / 94 descrito no presente documento (por exemplo, uma molécula de anticorpo monoclonal, e/ou molécula de anticorpo policlonal, e/ou molécula de anticorpo biespecífico) compreende uma porção química detectável e/ou uma porção química citotóxica.
[00104] Por “porção química detectável”, inclui-se um ou mais do grupo que compreende: uma enzima; um átomo radioativo; uma porção química fluorescente; uma porção química quimioluminescente; uma porção química bioluminescente. A porção química detectável permite que a molécula de anticorpo seja visualizada in vitro, e/ou in vivo, e/ou ex vivo.
[00105] Por “porção química citotóxica”, inclui-se uma porção química radioativa e/ou enzima, por exemplo, em que a enzima é uma caspase e/ou toxina, por exemplo, em que a toxina é uma toxina bacteriana ou um veneno; em que a porção química citotóxica é capaz de induzir a lise celular.
[00106] Inclui-se, ainda, que a molécula de anticorpo pode estar sob uma forma isolada e/ou sob a forma purificada e/ou pode ser PEGuilada. A PEGuilação é um método pelo qual polímeros de polietileno glicol são adicionados a uma molécula como uma molécula de anticorpo ou derivado para modificar seu comportamento, por exemplo, para prolongar sua meia- vida aumentando seu tamanho hidrodinâmico, impedindo a depuração renal.
[00107] Conforme discutido acima, as CDRs de um anticorpo se aglutinam ao alvo do anticorpo. A atribuição de aminoácidos a cada CDR descrita neste documento está de acordo com as definições de acordo com Kabat EA et al. 1991, em “Sequences of Proteins of Immunological Interest” Quinta Edição, Publicação NIH no 91-3242, pp xv a xvii.
[00108] Como a pessoa versada na técnica saberia, também há outros métodos para atribuir aminoácidos a cada CDR. Por exemplo, o sistema internacional de informações ImMunoGeneTics (IMGT(R)) (http://www.imgt.org/ e Lefranc e Lefranc “The Immunoglobulin FactsBook” publicado por Academic Press, 2001).
32 / 94
[00109] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 é um anticorpo humano.
[00110] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 é um anticorpo de origem humana, isto é, um anticorpo originalmente humano que foi modificado como descrito neste documento.
[00111] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 é um anticorpo humanizado, isto é, um anticorpo originalmente não humano que foi modificado para aumentar sua similaridade com um anticorpo humano. Os anticorpos humanizados podem, por exemplo, ser de anticorpos murinos ou de lama.
[00112] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFR2 é um anticorpo monoclonal.
[00113] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFR2 é um anticorpo policlonal.
[00114] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente ao TNFR2 compreende uma das sequências VH- CDR1 listadas na Tabela 1 abaixo.
[00115] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente ao TNFR2 compreende uma das sequências VH- CDR2 listadas na Tabela 1 abaixo.
[00116] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 compreende uma das sequências VH- CDR3 listadas na Tabela 1 abaixo.
[00117] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 compreende uma das sequências de VL- CDR1 listadas na Tabela 1 abaixo.
[00118] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 compreende uma das sequências de VL-
33 / 94 CDR2 listadas na Tabela 1 abaixo.
[00119] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a TNFR2 compreende uma das sequências de VL- CDR3 listadas na Tabela 1 abaixo.
[00120] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 é uma molécula de anticorpo que compreende as 6 CDRs que têm SEQ. ID. NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6; ou uma molécula de anticorpo que compreende as 6 CDRs que têm SEQ. ID. NOs: 9, 10, 11, 12, 13 e 14; ou uma molécula de anticorpo que compreende as 6 CDRs que têm SEQ. ID. NOs: 17, 18, 19, 20, 21 e 22.
[00121] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 é uma molécula de anticorpo que compreende as 6 CDRs que têm SEQ. ID. NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e 6.
[00122] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem uma VH selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 7, 15 e 23.
[00123] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem uma VL selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 8, 16 e 24.
[00124] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 é uma molécula de anticorpo que compreende uma VH que tem SEQ. ID. NO: 7.
[00125] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 é uma molécula de anticorpo que compreende uma VH que tem SEQ. ID. NO: 8.
[00126] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 compreende uma VH que tem SEQ. ID. NO: 7 e uma VH tendo SEQ.
34 / 94 ID. NO: 8.
[00127] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 compreende um CH que tem SEQ. ID. NO: 217.
[00128] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 compreende um CL que tem SEQ. ID. NO: 218.
[00129] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti- TNFR2 compreende uma VH que tem SEQ. ID. NO: 7, uma VH que tem SEQ. ID. NO: 8, um CH que tem SEQ. ID. NO: 217 e um CL que tem SEQ. ID. NO: 218. TABELA 1: SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS DE MOLÉCULAS DE ANTICORPO BLOQUEADOR DE TNFR2 ANTAGONISTAS DE ACORDO COM A INVENÇÃO (NAS SEQUÊNCIAS VH E VL, AS SEQUÊNCIAS CDR ESTÃO MARCADAS EM NEGRITO) Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO: VH-CDR1 FDDYGMSWVRQAPG 1 VH-CDR2 SVIYSGGSTYYADSVKGR 2 VH-CDR3 CARDRSSSWYRDGMDV 3 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 4 VL-CDR2 GNSNRPS 5 VL-CDR3 CAAWDDSLSGWV 6 001-H10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMS
WVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTIS VH 7
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSSSWY RDGMDVWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVH
WYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 8
ASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTK
LTVLG VH-CDR1 FDDYGMSWVRQAPG 9 VH-CDR2 STIYSGDNAYYGASVRGR 10 VH-CDR3 ARVYSSSWRKRAFDI 11 VL-CDR1 CSGTSSNIESNTVN 12 VL-CDR2 SDNQRPS 13 VL-CDR3 CAAWDDSLSGWV 14 004-H02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMS
WVRQAPGKGLEWVSTIYSGDNAYYGASVRGRFTIS VH 15
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYSSSWR KRAFDIWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGTSSNIESNTVNWY
QQLPGTAPKLLIYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 16
AISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTV
LG VH-CDR1 FSDYYMSWIRQAPG 17 005-B08 VH-CDR2 AIISYDGGGKYFADPVKGR 18 VH-CDR3 ARYYGDGGFDP 19
35 / 94 Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO: VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 20 VL-CDR2 SNNQRPS 21 VL-CDR3 CAAWDDSLNGPV 22
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMS
WIRQAPGKGLEWVAIISYDGGGKYFADPVKGRFTI VH 23
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYGDGG FDPWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYVVH
WYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 24
ASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTK
LTVLG TABELA 2: SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS DE MOLÉCULAS DE ANTICORPO BLOQUEADOR DE TNFR2 QUE NÃO SÃO
ANTAGONISTAS E QUE SÃO USADAS NO PRESENTE DOCUMENTO PARA COMPARAÇÃO (NAS SEQUÊNCIAS VH E VL, AS SEQUÊNCIAS CDR ESTÃO MARCADAS EM NEGRITO) VH-CDR1 FSDYYMSWIRQAPG 25 VH-CDR2 ALIWYDGGNEYYADSVKGR 26 VH-CDR3 VRETGNYGMDV 27 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 28 VL-CDR2 RNNQRPS 29 VL-CDR3 CATWDDRVNGPV 30 005-B02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWI
RQAPGKGLEWVALIWYDGGNEYYADSVKGRFTISR VH 31
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRETGNYGMDV WGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHW
YQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 32
AISGLRSEDEADYYCATWDDRVNGPVFGGGTKLTVL
G VH-CDR1 FSSNYMSWVRQAPG 33 VH-CDR2 ALIWYDGSNKYYADSVKGR 34 VH-CDR3 AKDPLFDS 35 VL-CDR1 CTGRSSNIGAGYDVH 36 VL-CDR2 DNNKRPS 37 VL-CDR3 CAAWDDSLNGPV 38 001-E06 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNYMSWV
RQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYYADSVKGRFTISR VH 39
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPLFDSWGQ GTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGRSSNIGAGYDVHW
YQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 40
AISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL
G VH-CDR1 FNTYSMNWVRQAPG 41 VH-CDR2 SVLYSDDDTHYADSVKGR 42 VH-CDR3 ARDCGGDCHSGDDAFDI 43 001-G04 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 44 VL-CDR2 DNDKRPS 45 VL-CDR3 CAAWHDSLNGWV 46
36 / 94
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYSMNW
VRQAPGKGLEWVSVLYSDDDTHYADSVKGRFTISRD VH 47
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDCGGDCHSGD DAFDIWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQ VL QLPGTAPKLLIYDNDKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI 48
SGLRSEDEADYYCAAWHDSLNGWVLGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSAYGMHWVRQAPG 49 VH-CDR2 AVVSYDGREKHYADSVKGR 50 VH-CDR3 ARSDGGYDSDSGYY 51 VL-CDR1 CSGSTSNIGSNFVY 52 VL-CDR2 DNNKRPS 53 VL-CDR3 CSSYAYSDNIL 54 001-G10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYGMHW
VRQAPGKGLEWVAVVSYDGREKHYADSVKGRFTIS VH 55
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSDGGYDSDS GYYWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSTSNIGSNFVYWYQ VL QLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI 56
SGLRSEDEADYYCSSYAYSDNILFGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSNAWMSWVRQAPG 57 VH-CDR2 SGISSSGSSAYYADSVKGR 58 VH-CDR3 ARHYYYHIAGYYYDTFDI 59 VL-CDR1 CSGSSSNIGGNTVN 60 VL-CDR2 GNTNRPS 61 VL-CDR3 CAAWDDSLSGVV 62 001-C08 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSW
VRQAPGKGLEWVSGISSSGSSAYYADSVKGRFTISRD VH 63
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYYYHIAGYY YDTFDIWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGGNTVNWYQ VL QLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIS 64
GLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSSYAMSWVRQAPG 65 VH-CDR2 ATISYHGSDKDYADSVKGR 66 VH-CDR3 ARDANYHSSGYYYDVFDI 67 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 68 VL-CDR2 GNSNRPS 69 VL-CDR3 CAAWDDSLSTWV 70 001-H09 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWV
RQAPGKGLEWVATISYHGSDKDYADSVKGRFTISRD VH 71
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDANYHSSGYY YDVFDIWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQ VL QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIS 72
GLRSEDEADYYCAAWDDSLSTWVFGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSDYYMTWIRQAPG 73 VH-CDR2 SGISGSGGYIHYADSVKGR 74 VH-CDR3 AREGLLPDAFD 75 VL-CDR1 CSGSSSNIGNNYVS 76 VL-CDR2 RNNQRPS 77 VL-CDR3 CAAWDDSVSGWV 78 005-F10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWI
RQAPGKGLEWVSGISGSGGYIHYADSVKGRFTISRD VH 79
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGLLPDAFDIW GQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQ VL QLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI 80
SGLRSEDEADYYCAAWDDSVSGWVFGGGTKLTVLG 001-B11 VH-CDR1 FSSYSMNWVRQAPG 81
37 / 94 VH-CDR2 AVMSYDEYNTYYADSVKGR 82 VH-CDR3 AKGFYGDYPLWDY 83 VL-CDR1 CSGGNSNIGTNTVD 84 VL-CDR2 SNNQRPS 85 VL-CDR3 CAAWDDSVNGPV 86
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWV
RQAPGKGLEWVAVMSYDEYNTYYADSVKGRFTISR VH 87
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGFYGDYPLW DYWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGNSNIGTNTVDWY VL QQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLA 88
ISGLRSEDEADYYCAAWDDSVNGPVFGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSSYEMNWVRQAPG 89 VH-CDR2 STITGGGSIYDANSVQGR 90 VH-CDR3 ARDSTYHSSGYYYDVFDI 91 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 92 VL-CDR2 GNSNRPS 93 VL-CDR3 CAAWDDSLSGHWV 94 001-C07 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWV
RQAPGKGLEWVSTITGGGSIYDANSVQGRFTISRDNS VH 95
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSTYHSSGYYYD VFDIWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQ VL QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIS 96
GLRSEDEADYYCAAWDDSLSGHWVFGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSSYGMHWVRQAPG 97 VH-CDR2 SAVFGSGHGNTFYADAVKGR 98 VH-CDR3 AREQLWFGQDAFDI 99 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 100 VL-CDR2 GNSNRPS 101 VL-CDR3 CQSYDSSLSASV 102 001-D01 EVQLLESGGGLVQPGGPLRLSCAASGFTFSSYGMHW
VRQAPGKGLEWVSAVFGSGHGNTFYADAVKGRFTI VH 103
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREQLWFGQ DAFDIWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQ VL QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIS 104
GLRSEDEADYYCQSYDSSLSASVFGGGTKLTVLG VH-CDR1 FSDAWMTWVRQAPG 105 VH-CDR2 SDLSDSGGSTYYADSVKGR 106 VH-CDR3 GRLAAGGPVDY 107 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 108 VL-CDR2 SNNQRPS 109 VL-CDR3 CSVWDDSLNSWV 110 003-F10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMTW
VRQAPGKGLEWVSDLSDSGGSTYYADSVKGRFTISR VH 111
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGRLAAGGPVDY WGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHW
YQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 112
AISGLRSEDEADYYCSVWDDSLNSWVFGGGTKLTVL G
[00130] A fim de determinar ou demonstrar as características das moléculas de anticorpo da presente invenção, elas foram comparadas a moléculas de anticorpo que não bloqueiam a aglutinação de ligante TNF-α ao TNFR2. Esses anticorpos são mostrados na Tabela 3.
38 / 94 TABELA 3: SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS DE MOLÉCULAS DE ANTICORPO DE TNFR2 NÃO BLOQUEADOR MENCIONADAS NO
PRESENTE DOCUMENTO COMO ANTICORPOS DE REFERÊNCIA (NAS SEQUÊNCIAS VH E VL, AS SEQUÊNCIAS CDR ESTÃO MARCADAS EM TEXTO EM NEGRITO) Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO: VH-CDR1 FSDYYMSWVRQAPG 113 VH-CDR2 ANINTDGSEKYYLDSVKGR 114 VH-CDR3 AREEYGAFDI 115 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 116 VL-CDR2 DNNKRPS 117 VL-CDR3 CQSFDRGLSGSIV 118 001-F02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMS
WVRQAPGKGLEWVANINTDGSEKYYLDSVKGRFT VH 119
ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEYGAF DIWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWY
QQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 120
AISGLRSEDEADYYCQSFDRGLSGSIVFGGGTKLTV
LG VH-CDR1 FSSYAMHWVRQAPG 121 VH-CDR2 SAISGGATTTYYADSVKGR 122 VH-CDR3 AKGGTGDPYYFDY 123 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 124 VL-CDR2 RNNQRPS 125 VL-CDR3 CAARDDGLSGPV 126 001-F06 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMH
WVRQAPGKGLEWVSAISGGATTTYYADSVKGRFT VH 127
ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGTGDP YYFDYWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVH
WYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 128
ASLAISGLRSEDEADYYCAARDDGLSGPVFGGGTKL
TVLG 001-A09 VH-CDR1 FSSNYMSWVRQAPG 129 VH-CDR2 SVISGSGGSTYYADSVKGR 130 VH-CDR3 ARDRGWFDP 131 VL-CDR1 CSGSRSNIDNSYVS 132 VL-CDR2 RNNQRPS 133 VL-CDR3 CATWDDSLSGPV 134
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNYMSW
VRQAPGKGLEWVSVISGSGGSTYYADSVKGRFTIS VH 135
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGWFDP WGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSRSNIDNSYVSWY
QQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 136
AISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGPVFGGGTKLTV
LG 001-B05 VH-CDR1 FSNAWMSWVRQAPG 137 VH-CDR2 SSISSASGYIYYGDSVKGR 138 VH-CDR3 ARGTLYGDFDEF 139 VL-CDR1 CSGSSSNIGNNAVN 140 VL-CDR2 GNTNRPS 141
39 / 94 Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO: VL-CDR3 CQSYDSSLSGYVV 142
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMS
WVRQAPGKGLEWVSSISSASGYIYYGDSVKGRFTIS VH 143
RDNSKNTLYLQMNNLRAEDTAVYYCARGTLYGDF DEFWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWY
QQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASL VL 144
AISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGYVVFGGGTKLTV
LG 001-B09 VH-CDR1 FSRHAMNWVRQAPG 145 VH-CDR2 SSISTGSSYIDYADSVKGR 146 VH-CDR3 AREKGHYYYGMDV 147 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 148 VL-CDR2 GNSYRPS 149 VL-CDR3 CQSYDTSLSAYVV 150
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRHAMN
WVRQAPGKGLEWVSSISTGSSYIDYADSVKGRFTIS VH 151
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREKGHYYY GMDVWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVH
WYQQLPGTAPKLLIYGNSYRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 152
ASLAISGLRSEDEADYYCQSYDTSLSAYVVFGGGTK
LTVLG 001-C03 VH-CDR1 FSNAWMSWVRQAPG 153 VH-CDR2 SAISVSGINTYYADSVKGR 154 VH-CDR3 ARDTGSLGVDY 155 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 156 VL-CDR2 RNNQRPS 157 VL-CDR3 CQSYDSSLSISV 158
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMS
WVRQAPGKGLEWVSAISVSGINTYYADSVKGRFTI VH 159
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTGSLGV DYWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWY VL QQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASL 160
AISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSISVFGGGTKLTVLG 001-C05 VH-CDR1 FSSNEMSWIRQAPG 161 VH-CDR2 SVIYSGGSTYYADSVKGR 162 VH-CDR3 ARREGWLVPFDY 163 VL-CDR1 CSGSSSNIGSNTVN 164 VL-CDR2 GNIIRPS 165 VL-CDR3 CQSFDTTLSGSIV 166
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNEMSW
IRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRD VH 167
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARREGWLVPFD YWGQGTLVTVSS
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWY VL QQLPGTAPKLLIYGNIIRPSGVPDRFSGSKSGTSASLA 168
ISGLRSEDEADYYCQSFDTTLSGSIVFGGGTKLTVLG 001-G05 VH-CDR1 FSSYAMSWVRQAPG 169 VH-CDR2 SVISGSGGSTYYADAVKGR 170 VH-CDR3 TTDSGSGSYL 171 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 172 VL-CDR2 SNNQRPS 173 VL-CDR3 CAAWDDSLNGPV 174
40 / 94 Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW
VRQAPGKGLEWVSVISGSGGSTYYADAVKGRFTIS VH 175
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTTDSGSGSYL WGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVH
WYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 176
ASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKL
TVLG VH-CDR1 FSDYYMTWIRQAPG 177 VH-CDR2 SSISGGSTYYADSRKGR 178 VH-CDR3 AREPGYSYGFFDY 179 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 180 VL-CDR2 SNNQRPS 181 VL-CDR3 CQSYDRSLSGSIV 182 001-A10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMT
WIRQAPGKGLEWVSSISGGSTYYADSRKGRFTISR VH 183
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREPGYSYGFF DYWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVH
WYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 184
ASLAISGLRSEDEADYYCQSYDRSLSGSIVFGGGTKL
TVLG VH-CDR1 SSSYWMSWVRQAPG 185 VH-CDR2 SAISGSGGSTYYADSVKGR 186 VH-CDR3 AREYSGYEFDF 187 VL-CDR1 CTGSSSNIGARSDVH 188 VL-CDR2 GNRNRPS 189 VL-CDR3 CQSFDRGLSGSIV 190 001-C06 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTSSSYWMS
WVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTI VH 191
SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYSGYEF DFWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGARSDVHW
YQQLPGTAPKLLIYGNRNRPSGVPDRFSGSKSGTSAS VL 192
LAISGLRSEDEADYYCQSFDRGLSGSIVFGGGTKLT
VLG VH-CDR1 FSSNYMSWVRQAPG 193 VH-CDR2 SSISSSSSYIYYADSVKGR 194 VH-CDR3 ARDRGRTGTDY 195 VL-CDR1 CSGTTSNIGSYAVN 196 VL-CDR2 GNINRPS 197 VL-CDR3 CQSYDSSLSASL 198 001-H03 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNYMSW
VRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRD VH 199
NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGRTGTDY WGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGTTSNIGSYAVNW
YQQLPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSAS VL 200
LAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSASLFGGGTKLTVL
G VH-CDR1 FSRYWMHWVRQVPG 201 VH-CDR2 SGISDSGVVTYYADSVKGR 202 VH-CDR3 ARAQSVAFDI 203 004-E08 VL-CDR1 CSGSSSNIGAGHDVH 204 VL-CDR2 YDDLLPS 205 VL-CDR3 CAAWDDSLSGWV 206
41 / 94 Clone de SEQ. ID. Região Sequência anticorpo NO:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMH
WVRQVPGKGLEWVSGISDSGVVTYYADSVKGRFT VH 207
ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAQSVAF DIWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGAGHDVH
WYQQLPGTAPKLLIYYDDLLPSGVPDRFSGSKSGTS VL 208
ASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTK
LTVLG VH-CDR1 FSSYAMSWVRQAPG 209 VH-CDR2 STIIGSGANTWYADSVKGR 210 VH-CDR3 ARHEGYYYYGMDV 211 VL-CDR1 CTGSSSNIGAGYDVH 212 VL-CDR2 GNSNRPS 213 VL-CDR3 CAAWDDSLNGRV 214 005-A05 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW
VRQAPGKGLEWVSTIIGSGANTWYADSVKGRFTIS VH 215
RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHEGYYYY GMDVWGQGTLVTVSS QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYVVH
WYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTS VL 216
ASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGRVFGGGTK LTVLG
[00131] As sequências nas Tabelas 1, 2 e 3 acima são todas de origem humana e derivadas da biblioteca n-CoDeR®, conforme explicado em detalhes no Exemplo 1.
[00132] Em algumas modalidades, as moléculas de anticorpo que se aglutinam especificamente a TNFR2 aqui descritas também podem compreender uma ou ambas as regiões constantes (CH e/ou CL) listadas na Tabela 4 abaixo. TABELA 4: SEQ. ID. Região Sequência NO:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP CH EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY 217
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAG CL VETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPT 218
ECS AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVH TFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTI
KPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQ CH ISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKV 219
NNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMP EDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSY SCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
42 / 94 SEQ. ID. Região Sequência NO:
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVH TFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTI
KPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQ CH ISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYASTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKV 220
NNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMP EDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSY SCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
QPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQG CL METTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSR 221
ADCS
[00133] O primeiro CH (SEQ. ID. NO: 217) e o primeiro CL (SEQ. ID. NO: 218) as sequências na Tabela 4 acima são de origem humana. O segundo CH (SEQ. ID. NO: 219) e o terceiro CH (SEQ. ID. NO: 220) na Tabela 4 são ambos de IgG2a murina, com essa diferença que a terceira sequência CH (SEQ. ID. NO: 220) contém uma mutação N297A. A segunda sequência CL (SEQ. ID. NO: 221) é da região constante da cadeia leve lambda murina. Estas sequências murinas são utilizadas nos exemplos para os anticorpos substitutos.
[00134] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo aglutina a TNFR2 (hTNFR2) humano.
[00135] Em algumas modalidades, é vantajoso que a molécula de anticorpo se aglutine a hTNFR2 e a TNFR2 de macaco cinomolgo (cmTNFR2 ou cynoTNFR2). A reatividade cruzada com TNFR2 expressa em células de macaco cinomolgo, também denominado macaco caranguejeiro ou Macaca fascicularis, pode ser vantajosa, uma vez que permite a testagem animal da molécula de anticorpo sem ter que usar um anticorpo substituto, que se concentra particularmente em tolerabilidade.
[00136] Em algumas modalidades, é necessário usar um anticorpo substituto para testar a atividade funcional de uma molécula de anticorpo em modelos in vivo relevantes em camundongos. Para garantir a comparabilidade entre o efeito da molécula de anticorpo em seres humanos e os resultados in vivo para o anticorpo substituto em camundongos, é essencial selecionar um anticorpo substituto funcionalmente equivalente com as mesmas
43 / 94 características in vitro da molécula de anticorpo humano.
[00137] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo não se aglutina especificamente a um epítopo de TNFR2 que compreende ou consiste em na sequência KCSPG.
[00138] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo da presente invenção ou usada de acordo com a invenção é uma molécula de anticorpo que é capaz de competir com os anticorpos específicos fornecidos no presente documento, por exemplo, capaz de competir com moléculas de anticorpo que compreende uma VH selecionado do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 7, 15 e 23; e/ou uma VL selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 8, 16 e 24, para aglutinação a TNFR2.
[00139] Por “com capacidade de competir com", entende-se que o anticorpo competidor tem a capacidade de inibir ou interferir de outra forma, pelo menos em parte, a aglutinação de uma molécula de anticorpo, conforme definido no presente documento, ao TNFR2 alvo específico.
[00140] Por exemplo, tal molécula de anticorpo competidor pode ser capaz de inibir a aglutinação de uma molécula de anticorpo bloqueador antagonista descrita no presente documento em pelo menos cerca de 10%; por exemplo, pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, cerca de 100% e/ou inibindo a capacidade do anticorpo aqui descrito de prevenir ou reduzir a aglutinação de TNFR2 ao ligante alvo específico TNF-α em pelo menos cerca de 10%; por exemplo, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100%.
[00141] A aglutinação competitiva pode ser determinada por métodos
44 / 94 bem conhecidos por pessoas versadas na técnicas, tal como o ensaio imunossorvente conectado à enzima (ELISA).
[00142] Os ensaios ELISA podem ser usados para avaliar anticorpos modificadores ou bloqueadores de epítopos. Métodos adicionais adequados para identificar anticorpos concorrentes são divulgados em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, que é incorporado ao presente documento a título de referência (por exemplo, consultar as páginas 567 a 569, 574 a 576, 583 e 590 a 612, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2).
[00143] Em algumas modalidades, é de interesse usar não a própria molécula de anticorpo, mas uma sequência de nucleotídeos que codifica essa molécula de anticorpo. A presente invenção abrange, assim, sequências de nucleotídeos que codificam as moléculas de anticorpo de TNFR-2 antagonista bloqueador.
[00144] As sequências de nucleotídeos e moléculas de anticorpos antagonistas e bloqueadores descritos acima podem ser usadas em medicina, e então tal sequência de nucleotídeos e/ou molécula de anticorpo pode ser incluída em uma composição farmacêutica, como discutido mais abaixo.
[00145] As sequências de nucleotídeos, composições farmacêuticas e/ou moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas no tratamento de câncer, conforme discutido mais adiante.
[00146] As sequências de nucleotídeos, composições farmacêuticas e/ou moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas no tratamento de uma infecção causada por um patógeno intracelular, conforme discutido mais adiante.
[00147] As sequências de nucleotídeos e/ou moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas na fabricação de uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer.
[00148] As sequências de nucleotídeos e/ou moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas na fabricação de
45 / 94 uma composição farmacêutica para uso no tratamento de uma infecção causada por um patógeno intracelular.
[00149] As composições farmacêuticas e/ou moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas em um método para tratamento de câncer em um paciente, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica ou molécula de anticorpo é administrada ao paciente.
[00150] As composições farmacêuticas e/ou moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas em um método para tratamento de uma infecção causada por um patógeno intracelular em um paciente, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica ou molécula de anticorpo é administrada ao paciente.
[00151] Em algumas modalidades relacionadas ao tratamento do câncer, o câncer é um câncer sólido ou leucêmico. Um tumor sólido é uma massa anormal de tecido que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos (não câncer) ou malignos (câncer). Os tumores sólidos malignos são denominados no presente documento câncer sólido. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados de acordo com o tipo de células que os formam. Exemplos de cânceres ou tumores sólidos são sarcomas, carcinomas e linfomas.
[00152] Exemplos mais específicos de cânceres sólidos são câncer de pulmão, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de tireoide, câncer de cérebro, câncer de sistema nervoso central, melanoma, neuroblastoma, tumor de Wilms, rabdomiossarcoma, retinoblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, linfoma e câncer ósseo.
[00153] Exemplos mais específicos de cânceres leucêmicos são leucemia linfocítica aguda, doença mieloproliferativa crônica, leucemia não
46 / 94 linfocítica aguda, leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfocítica aguda de células T, linfomas não Hodgkin e doenças linfoproliferativas crônicas.
[00154] Em algumas modalidades relacionadas ao tratamento de uma infecção causada por um patógeno intracelular, como vírus ou bactérias. Exemplos específicos de patógenos intracelulares são Legionella pneumophila, R. rickettsia, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocyotogenes, Salmonella spp, Escherichia coli invasiva, Neisseria spp, Brucella spp, Shigella spp, vírus da Gripe, vírus do Herpes, vírus da Hepatite, Coxsackievírus, vírus Epstein-Barr ou Rinovírus.
[00155] Em algumas modalidades relacionadas a tratamento de câncer, as moléculas de anticorpo antagonista bloqueador descritas acima podem ser usadas em combinação com uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação. Alternativamente, as sequências de nucleotídeos acima discutidas que codificam uma molécula de anticorpo de TNFR2 bloqueador e não bloqueadora podem ser usadas em combinação com a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um anticorpo agonista coestimulador. Anticorpos para inibidores de ponto de verificação são anticorpos direcionados a CTLA4, PD1, PD-L1, VISTA, TIGIT, CD200, CD200R, BTLA, LAG3, TIM3, B7-H3, B7-H4, B7-H7. Exemplos de anticorpos agonistas coestimuladores são anticorpos direcionados a OX40, 41BB, OX40L, 41BBL, GITR, ICOS, DR3, DR4, DR5, CD40, CD27, RANK, HVEM, LIGHT e B7-H6. Alternativamente, as moléculas de anticorpo de TNFR2 antagonista e bloqueador discutidas acima podem ser usadas em combinação com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um agonista coestimulador. Alternativamente, as sequências de nucleotídeos discutidas acima que codificam uma molécula de anticorpo de
47 / 94 TNFR2 bloqueador podem ser usadas em combinação com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um agonista coestimulador. Em algumas dessas modalidades, a molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação é um anticorpo anti-PD-1. Acredita-se que os anticorpos PD-1 (ou PD1) bloqueiam o sinal inibidor mediado por PD-L1, principalmente em células T CD8+; e, assim, permitem uma resposta antitumoral mediada por células T aumentada. Um anticorpo TNFR2 antagonista de depleção de Tregs funcionaria por meio de um mecanismo separado para aumentar a resposta antitumoral. Consequentemente, esses tratamentos podem sinergizar uns com os outros. O mesmo é verdadeiro para outros inibidores de ponto de verificação e anticorpos agonistas coestimuladores.
[00156] Além disso, as moléculas de anticorpo de TNFR2 bloqueador antagonista discutidas acima podem ser usadas em combinação com outros tratamentos anticâncer, tais como quimioterapia (por exemplo, mas não se limitando a doxorrubicina, paraplatina, ciclofosfamida, paclitaxel, gemcitabina, 5-fluorouracila, docetaxel, vincristina, Mitoxantrona, mutamicina, epirrubicina e metotrexato), inibidores de tirosina quinase ou serina/treonina quinase de molécula pequena (por exemplo, mas não se limitando a ibrutinibe, imatinibe, suntinibe, regorafenibe, sorafenibe, dasatinibe, erlotinibe, vandetanibe, midostaurina, vemurafenibe, dafrafenibe, palbociclibe, ribociclibe, Trametinibe ou alectinibe), inibidores direcionados a receptores de fator de crescimento (por exemplo, mas não limitados a fármacos direcionados a EGFR/HER1/ErbB1, EGFR2/HER2/ErbB2, EGFR3/HER3/ErbB3, VEGFR, PDGFR HGFR, RET, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina IGFR, FGFR), agentes antiangiogênicos (por exemplo, mas não limitados a Bevacizumab, Everolimus, Lenalidomida, Talidomida, Ziv-aflibercept) ou irradiação. Normalmente, todos os fármacos
48 / 94 anticâncer mencionados acima causam morte de células cancerígenas, o que levará à exposição de neoantígenos e inflamação. No momento em que os neoantígenos são expostos e há um influxo de células inflamatórias no tumor, podem ocorrer efeitos sinérgicos do fármaco anticâncer, e a adição de um anticorpo de TNFR2 bloqueador ligante antagonista, que pode depletar Tregs e, assim, melhorar o sistema imunológico ainda mais.
[00157] É conhecido pela pessoa versada em medicina que os medicamentos podem ser modificados com diferentes aditivos, por exemplo, para alterar a taxa em que o medicamento é absorvido pelo organismo; e pode ser modificado de diferentes formas, por exemplo, para permitir uma via de administração específica para o corpo.
[00158] Consequentemente, inclui-se que as moléculas de anticorpo antagonista bloqueador, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células descritos no presente documento podem ser combinados com um excipiente, carreador, diluente, veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável em uma composição farmacêutica. Nesse contexto, o termo composição farmacêutica pode ser usado indistintamente com os termos preparação farmacêutica, formulação farmacêutica, composição terapêutica, preparação terapêutica, formulação terapêutica e entidade terapêutica.
[00159] As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem compreender, ou em algumas modalidades consistem em, moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus ou células.
[00160] As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem, em algumas modalidades, consistir em, ou compreender, plasmídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as moléculas de anticorpo descritas acima ou que compreendem as sequências de nucleotídeos descritas acima.
[00161] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas
49 / 94 podem compreender sequências de nucleotídeos que codificam partes de, ou uma, molécula de anticorpo completa descrita no presente documento integrada em uma célula ou genoma viral ou em um virioma. A composição farmacêutica pode, então, compreender uma célula ou um vírus como um veículo de entrega para um anticorpo da invenção (ou um veículo de entrega para uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo da invenção). Por exemplo, em uma modalidade, o vírus pode estar sob a forma de um vírus oncolítico terapêutico que compreende sequências de nucleotídeos que codificam pelo menos uma dentre as moléculas de anticorpo descritas no presente documento. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo IgG humano comprimento completo.
[00162] Em algumas modalidades, a invenção se refere a um vírus que compreende uma sequência de nucleotídeos da invenção ou um plasmídeo da invenção. Preferencialmente, o vírus é um vírus oncolítico, tal como um vírus oncolítico terapêutico. Os vírus são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica de medicina e virologia.
[00163] Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende sequências de nucleotídeos que codificam a sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 1 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 1 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 1 acima. Em algumas modalidades, esse vírus oncolítico compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade com uma sequência estabelecida na tabela 1 acima.
[00164] Como um exemplo, uma sequência de nucleotídeos que
50 / 94 codifica o anticorpo 001-H10 poderia ser como apresentada na Tabela 5. TABELA 5: EXEMPLO DE SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM O ANTICORPO 001-H10 - AS PARTES DAS SEQUÊNCIAS
QUE ESTÃO SUBLINHADAS NA TABELA CODIFICAM AS SEQUÊNCIAS VH E VL, RESPECTIVAMENTE, DE 001-H10 SEQ. ID. Codificação Sequência NO:
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATG ATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGG AGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGTACATATTACGCAG ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGA ACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTG CCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGAAGCAGCAGCTGGTACCGCG ATGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCT CAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC CAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAA GGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAG
CAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACA 001-H10 VH AAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG 222
GACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACA ACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGG ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAATGA CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGG CAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGG GCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACGGCC CCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTC CCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGG CCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTG
CAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGA 001-H10 VL ACCAAGCTGACGGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTC
ACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCC ACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACA GTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGA GACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCA GCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAA GCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAG ACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGA
[00165] Alguns vírus oncolíticos têm capacidade para hospedar
51 / 94 inserções de DNA grandes o suficiente para acomodar a integração de sequências de anticorpos humanos de comprimento completo. Os vírus Vaccinia atenuados e os vírus Herpes Simples são exemplos de vírus oncolíticos terapêuticos cujo genoma é suficientemente grande para permitir a integração de sequências de anticorpos IgG de comprimento total (Chan et al.
2014. 'Oncolytic Poxviruses', Annu Rev Virol, 1: 119 a 141; Bommareddy. et al 2018. 'Integrating oncolytic viruses in combination cancer immunotherapy', Nat Rev Immunol, 18: 498 a 513). Os anticorpos IgG de comprimento total foram integrados com sucesso ao vírus Vaccinia oncolítico, resultando na expressão e liberação extracelular (produção) de anticorpos IgG de comprimento total mediante a infecção de células hospedeiras suscetíveis a vírus, por exemplo, células cancerosas (Kleinpeter et al. 2016. 'Vectorization in an oncolytic vaccinia virus of an antibody, a Fab and a scFv against programmed cell death -1 (PD-1) allows their intratumoral delivery and an improved tumor-growth inhibition', Oncoimmunology, 5: e1220467). Os adenovírus também podem ser geneticamente modificados para codificar anticorpos IgG de comprimento completo que sejam funcionalmente produzidos e secretados mediante a infecção celular (Marino et al. 2017. 'Development of a versatile oncolytic virus platform for local intra-tumoural expression of therapeutic transgenes', PLoS One, 12: e0177810).
[00166] A invenção também abrange composições farmacêuticas que compreendem um vírus, tal como um vírus oncolítico, conforme discutido acima, e um diluente, veículo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[00167] A invenção também compreende outras modalidades terapêuticas, ou “formatos” de fármacos, tais como conjugados de fármacos de anticorpos, proteínas de fusão, etc., e a composição farmacêutica que compreende tais modalidades terapêuticas.
[00168] As moléculas de anticorpo, as sequências de nucleotídeos, os plasmídeos, os vírus, as células e/ou as composições farmacêuticas descritos
52 / 94 no presente documento podem ser adequados para a administração parenteral, incluindo soluções de injeção estéreis aquosas e/ou não aquosas que podem conter antioxidantes, e/ou tampões, e/ou bacteriostáticos, e/ou solutos que rendem a formulação isotônica com o sangue do destinatário pretendido; e/ou suspensões estéreis aquosas e/ou não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e/ou agentes espessantes. As moléculas de anticorpo, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenados em uma condição desidratada por congelamento (ou seja, liofilizada) que exige apenas a adição do carreador líquido estéril, por exemplo, água para preparações injetáveis, imediatamente antes do uso.
[00169] Soluções e suspensões para injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, e/ou grânulos e/ou comprimidos estéreis do tipo anteriormente descrito.
[00170] Para administração parenteral a pacientes humanos, o nível de dosagem diária da molécula de anticorpo anti-TNFR2 será, geralmente, de 1 mg/kg de peso corporal do paciente a 20 mg/kg ou, em alguns casos, até 100 mg/kg administrado em doses únicas ou divididas. Doses mais baixas podem ser usadas em circunstâncias especiais, por exemplo, em combinação com a administração prolongada. Em qualquer caso, o médico determinará a dosagem real que será mais adequada para qualquer paciente individual e variará com a idade, peso e resposta do paciente em particular. As dosagens acima são exemplificativas do caso médio. Pode haver, evidentemente, casos individuais em que sejam necessárias faixas de dosagem mais altas ou mais baixas, e tais faixas são abrangidas pelo escopo desta invenção.
[00171] Normalmente, uma composição farmacêutica (ou medicamento) descrita no presente documento que compreende uma molécula de anticorpo conterá a molécula de anticorpo anti-TNFR2 a uma concentração
53 / 94 entre aproximadamente 2 mg/ml e 150 mg/ml ou entre aproximadamente 2 mg/ml e 200 mg/ml.
[00172] Geralmente, em seres humanos, a administração oral ou parenteral das moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento é a via preferencial, sendo a mais conveniente. Para uso veterinário, as moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou as composições farmacêuticas descritos no presente documento são administradas como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal e o cirurgião veterinário determinará o regime de dosagem e a via de administração que será mais apropriada para um animal particular. Assim, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica que compreende uma quantidade de uma molécula de anticorpo, plasmídeo de sequência de nucleotídeos, vírus e/ou célula da invenção eficazes para tratar várias condições (conforme descrito acima e mais abaixo). De preferência, as moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento são adaptados para a entrega por uma via selecionada a partir do grupo que compreende: intravenosa (IV ou i.v.); intramuscular (IM ou i.m.); subcutânea (SC ou s.c.) ou intratumoral.
[00173] A presente invenção também inclui moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus, células e/ou composições farmacêuticas descritas no presente documento que compreendem sais de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitáveis das moléculas ou partes de aglutinação de alvo da presente invenção. Os ácidos que são usados para preparar os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de base supramencionados úteis nesta invenção são aqueles que formam sais de adição de ácido não tóxicos, isto é, sais que contêm ânions farmacologicamente aceitáveis, tais como sais de cloridrato, bromidrato,
54 / 94 iodidrato, nitrato, sulfato, bissulfato, fosfato, ácido fosfático, acetato, lactato, citrato, ácido de citrato, tartarato, bitartarato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato, benzoato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e sais de pamoato [isto é, 1,1'- metileno-bis-(2-hidróxi-3 naftoato)], entre outros.
Os sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados para produzir formas de sal farmaceuticamente aceitáveis dos agentes de acordo com a presente invenção.
As bases químicas que podem ser usadas como reagentes para preparar sais de base farmaceuticamente aceitáveis dos presentes agentes que são de natureza ácida são aquelas que formam sais de base não tóxicos com tais compostos.
Tais sais básicos não tóxicos incluem, porém sem limitação, aqueles derivados de cátions farmacologicamente aceitáveis, tais como cátions de metais alcalinos (por exemplo, potássio e sódio) e cátions de metais alcalinoterrosos (por exemplo, cálcio e magnésio), sais de adição de amina solúveis em água ou amônio, tal como N-metilglucamina-(meglumina), e o alcanolamônio inferior e outros sais básicos de aminas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis, entre outros.
As moléculas de anticorpos, sequências de nucleotídeos, plasmídeos, vírus e/ou células descritas no presente documento podem ser liofilizado para armazenamento e reconstituídos em um carreador adequado antes do uso.
Qualquer método de liofilização adequado (por exemplo, secagem por aspersão, secagem de massa) e/ou técnicas de reconstituição podem ser empregados.
Será observado por pessoas versadas na técnicas que a liofilização e a reconstituição podem levar a graus variáveis de perda de atividade de anticorpos (por exemplo, com imunoglobulinas convencionais, os anticorpos IgM tendem a ter maior perda de atividade que os anticorpos IgG) e que os níveis de uso podem ter que ser ajustados para cima para compensar.
Em uma modalidade, a porção química de aglutinação ao polipeptídeo liofilizado (desidratada por congelamento) perde não mais do que 20%, ou não mais do que 25%, ou não mais do que
55 / 94 30%, ou não mais do que 35%, ou não mais do que 40%, ou não mais do que 45%, ou não mais do que 50% da sua atividade (antes da liofilização) quando reidratados.
[00174] As moléculas de anticorpo anti-TNFR2, sequências de nucleotídeos e composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser usadas no tratamento de câncer em um sujeito ou paciente. No presente documento, os termos sujeito e paciente são usados indistintamente.
[00175] “Paciente” (ou sujeito), como o termo é usado no presente documento, refere-se a um animal, incluindo ser humano, que foi diagnosticado como tendo uma doença específica.
[00176] Em algumas modalidades, o paciente (ou sujeito) é um animal, incluindo ser humano, que foi diagnosticado como tendo câncer e/ou que exibe sintomas de câncer.
[00177] Em algumas modalidades, o paciente (ou sujeito) é um animal, incluindo humano, que foi diagnosticado como tendo uma infecção causada por um patógeno intracelular e/ou que exibe sintomas de uma infecção causada por um patógeno intracelular.
[00178] Em algumas modalidades, o paciente (ou sujeito) é um paciente com alta expressão de TNFR2 em tecido doente. Neste contexto, alta expressão significa um nível mais alto de expressão de TNFR2 em comparação com o tecido saudável correspondente. Normalmente, o tecido saudável usado para tal comparação é um tecido de referência (ou referência padrão) coletado de tecido saudável de um ou vários indivíduos saudáveis. O nível de expressão pode ser medido por técnicas padrão como imunohistoquímica (IHC), classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou medições de expressão de mRNA.
[00179] Inclui-se que o paciente pode ser mamífero ou não mamífero. Preferencialmente, o paciente mamífero é um ser humano, um cavalo, uma vaca, uma ovelha, um porco, um camelo, um cachorro ou um gato. Mais
56 / 94 preferencialmente, o paciente mamífero é um ser humano.
[00180] Por exibir sintomas de câncer, inclui-se que o paciente exiba um sintoma de câncer, e/ou um marcador de diagnóstico de câncer, e/ou o sintoma de câncer, e/ou um marcador de diagnóstico de câncer que podem ser medidos, e/ou avaliados, e/ou quantificados.
[00181] Seria prontamente evidente para a pessoa versada em medicina quais seriam os sintomas e os marcadores de diagnóstico de câncer e como medir, e/ou avaliar, e/ou quantificar se há uma redução ou aumento na gravidade dos sintomas de câncer ou uma redução ou aumento dos marcadores de diagnóstico de câncer; além de como esses sintomas e/ou marcadores de diagnóstico de câncer podem ser usados para formar um prognóstico para o câncer.
[00182] Os tratamentos contra o câncer são, frequentemente, administrados como um curso de tratamento, ou seja, o agente terapêutico é administrado por um período de tempo. A duração do curso do tratamento dependerá de vários fatores, que podem incluir o tipo de agente terapêutico que está sendo administrado, o tipo de câncer que está sendo tratado, a gravidade do câncer que está sendo tratado e a idade e saúde do paciente, entre outras razões.
[00183] Por “durante o tratamento”, inclui-se que o paciente esteja atualmente recebendo um curso de tratamento, e/ou recebendo um agente terapêutico, e/ou recebendo um curso de um agente terapêutico.
[00184] Em algumas modalidades, o câncer a ser tratado, de acordo com a presente invenção, é um tumor sólido.
[00185] Cada um dos cânceres descritos acima é bem conhecido, e os sintomas e marcadores de diagnóstico de câncer são bem descritos, assim como o são os agentes terapêuticos usados para tratar esses cânceres. Por conseguinte, os sintomas, marcadores de diagnóstico de câncer e agentes terapêuticos usados para tratar os tipos de câncer acima mencionados seriam
57 / 94 conhecidos pelos versados em medicina.
[00186] As definições clínicas do diagnóstico, prognóstico e progressão de um grande número de cânceres dependem de determinadas classificações conhecidas como estadiamento. Esses sistemas de estadiamento atuam para agrupar vários marcadores de diagnóstico de câncer e sintomas de câncer para fornecer um resumo do diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão do câncer. É conhecido pela pessoa versada em oncologia como avaliar o diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão do câncer usando um sistema de estadiamento e quais marcadores de diagnóstico e sintomas de câncer devem ser usados para fazer isso.
[00187] Por “estadiamento do câncer”, inclui-se o estadiamento Rai, que inclui o estágio 0, estágio I, estágio II, estágio III e estágio IV, e/ou o estadiamento Binet, que inclui o estágio A, estágio B e estágio C, e/ou o estadiamento de Ann Arbor, que inclui os estágios I, II, III e IV.
[00188] Sabe-se que o câncer pode causar anormalidades na morfologia das células. Essas anormalidades geralmente ocorrem de maneira reproduzível em certos tipos de câncer, o que significa que o exame dessas alterações na morfologia (também conhecido como exame histológico) pode ser usado no diagnóstico ou prognóstico do câncer. Técnicas para visualizar amostras para examinar a morfologia das células e preparar amostras para visualização são bem-conhecidas na técnica; por exemplo, microscopia de luz ou microscopia confocal.
[00189] Por “exame histológico”, inclui-se a presença de pequenos linfócitos maduros e/ou a presença de pequenos linfócitos maduros com uma borda estreita do citoplasma, a presença de pequenos linfócitos maduros com um núcleo denso sem núcleos discerníveis, e/ou a presença de pequenos linfócitos maduros com uma borda estreita do citoplasma, e com um núcleo denso sem nucléolos discerníveis, e/ou a presença de células atípicas, e/ou células clivadas, e/ou prolinfócitos.
58 / 94
[00190] Sabe-se que o câncer é resultado de mutações no DNA da célula, que podem levar a célula a evitar a morte celular ou a proliferar incontrolavelmente. Portanto, o exame dessas mutações (também conhecido como exame citogenético) pode ser uma ferramenta útil para avaliar o diagnóstico e/ou prognóstico de um câncer. Um exemplo disso é a exclusão da localização cromossômica 13q14.1, que é característica da leucemia linfocítica crônica. As técnicas para examinar mutações nas células são bem- conhecidas na técnica; por exemplo, hibridização fluorescente in situ (FISH).
[00191] Por “exame citogenético”, inclui-se o exame do DNA em uma célula e, em particular, os cromossomos. O exame citogenético pode ser usado para identificar alterações no DNA que podem estar associadas à presença de câncer refratário e/ou câncer recidivado. Tais podem incluir: deleções no braço longo do cromossomo 13, e/ou a deleção do local cromossômico 13q14.1, e/ou trissomia do cromossomo 12, e/ou deleções no braço longo do cromossomo 12, e/ou deleções no braço longo do cromossomo 11, e/ou a exclusão de 11q, e/ou deleções no braço longo do cromossomo 6, e/ou a exclusão de 6q, e/ou deleções no braço curto do cromossomo 17, e/ou a exclusão da translocação 17p, e/ou a translocação t(11:14), e/ou a translocação (q13:q32), e/ou rearranjos de receptores de genes de antígenos e/ou rearranjos de BCL2, e/ou rearranjos de BCL6, e/ou translocações t(14:18), e/ou translocações t(11:14), e/ou translocações (q13:q32), e/ou translocações (3:v), e/ou translocações (8:14), e/ou translocações (8:v), e/ou translocações t(11:14) e (q13:q32).
[00192] Sabe-se que os pacientes com câncer apresentam certos sintomas físicos, que geralmente são resultado da carga do câncer no corpo. Esses sintomas geralmente reaparecem no mesmo câncer e, portanto, podem ser característicos do diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão da doença. Uma pessoa versada em medicina entende quais sintomas físicos estão associados a quais tipos de câncer e como a avaliação desses sistemas
59 / 94 físicos pode se correlacionar com o diagnóstico, e/ou prognóstico, e/ou progressão da doença. Por “sintomas físicos”, inclui-se hepatomegalia e/ou esplenomegalia.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00193] Nos exemplos abaixo, é feita referência às seguintes Figuras:
[00194] a Figura 1 demonstra que os anticorpos da invenção se aglutinam a TNFR2. Figuras 1 A a 1 D: anticorpos humanos mostraram por ELISA que se aglutinam à proteína TNFR2 humana de uma maneira dependente da dose, gerando diferentes valores de EC50. Figura 1 E: Os anticorpos murinos 3-F10 e 5-A05 aglutinam-se a mTNFR2 com uma afinidade semelhante.
[00195] A Figura 2 mostra a aglutinação de anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 a células T CD4+ ativadas in vitro. Células T CD4+ derivadas de sangue humano (Figuras 2 A a 2 D) e células T CD4+ esplênicas de camundongo (Figura 2 E) foram ativadas com IL-2 e CD3/CD28 Dynabeads®. A afinidade de anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 para células ativadas foram analisados por FACS em concentrações que variam de 0,002 a 267 nM (humano) e 0,00003 a 133 nM (camundongo). As curvas mostram média de intensidade de fluorescência (MFI) após a subtração do fundo de controle de isotipo (Figura 2 A (bloqueadores completos e parciais), Figura 2 B (bloqueadores parciais), Figuras 2 C e 2 D (não bloqueadores), Figura 2 E (bloqueador completo (3-F10) e não bloqueador (5- A05) de camundongo).
[00196] Embora os anticorpos de TNFR2 humanos se aglutinem com diferentes afinidades às CD4s ativadas in vitro (variando os valores de EC50 de 0,59 a 53 nM), os anticorpos de TNFR2 de camundongo se aglutinam com afinidade semelhante (valores de EC50 que variam de 0,072 a 0,11 nM).
[00197] A Figura 3 mostra que os anticorpos de TNFR2 n-CoDeR® se aglutinam especificamente ao TNFR2. Células T CD4+ derivadas de sangue
60 / 94 humano (Figura 3 A) e células T CD4+ esplênicas de camundongo (Figura 3 B) foram ativadas 3 dias com IL-2 recombinante e microesferas ativadores de CD3/CD28. As células ativadas in vitro foram bloqueadas com um anticorpo de TNFR2 policlonal (linha cinza) ou deixadas em PBS (linha preta) por 30 min antes de serem coradas com concentração subótima dos diferentes anticorpos de TNFR2 n-CoDeR® ou controle de isotipo (linha tracejada) por 15 min. As células foram então lavadas e incubadas com um anticorpo secundário conjugado com APC por 30 min antes de serem analisadas por citometria de fluxo.
[00198] Todos os anticorpos podem ser bloqueados pelo anticorpo policlonal de TNFR2, portanto, mostra que os anticorpos de TNFR2 n- CoDeR® (humano e de camundongo) são específicos para TNFR2.
[00199] A Figura 4 mostra a reatividade cruzada de anticorpos n- CoDeR® específicos de TNFR2 humano para Cinomolgos. As células T CD4+ foram isoladas de sangue de cinomolgo e estimuladas com PMA e ionomicina. Após 2 dias, as células foram marcadas com anticorpos n- CoDeR® específicos para TNFR2 de 0,1, 1 ou 10 µg/ml ou controle de isotipo seguido de incubação com um anticorpo a-humano secundário conjugado com APC. As células foram analisadas por citometria de fluxo. A figura mostra as porcentagens de células T TNFR2+ para os anticorpos individuais sobre o controle de isotipo. Os resultados são o valor médio e DP de 2 a 3 experimentos individuais.
[00200] A maioria dos anticorpos de TNFR2 mostra aglutinação de reação cruzada a células Cinomolgos.
[00201] A Figura 5 mostra que todos os anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 descritos no presente documento se aglutinam a outros epítopos na proteína de TNFR2 além do clone MR2-1 de TNFR2. As células T CD4+ derivadas de sangue humano foram estimuladas com rhIL-2 e microesferas ativadores de CD3/CD28 2 a 3 dias. As células ativadas foram
61 / 94 bloqueadas por 40 µg/ml de anticorpo MR2-1 (Figura 5 A, barras pretas) ou deixadas com PBS (Figura 5 A, barras cinza) 30 min, em seguida, anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2/TNFR2 policlonal (pTNFR2) foram adicionados e as células foram incubadas 15 min. A percentagem de anticorpos de TNFR2 n-CoDeR® ligados foram analisados por FACS após incubação com anticorpos secundários conjugados com APC. Na Figura 5 B, as células T CD4+ ativadas foram bloqueadas com 40µg/ml de anticorpos n- CoDeR® específicos para TNFR2/pTNFR2 (barras pretas) ou deixadas com PBS (barra cinza) e depois incubadas 15 min com anticorpo MR2-1 conjugado com PE. As células foram então analisadas por FACS.
[00202] O anticorpo MR2-1 não interferiu na aglutinação dos anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 e os anticorpos n-CoDeR® não afetaram a aglutinação de MR2-1 às células ativadas, mostrando que todos os anticorpos n-CoDeR® se aglutinam a outros domínios da proteína TNFR2 do que o anticorpo MR2-1.
[00203] A Figura 6 mostra a atividade de bloqueio do ligante de anticorpos anti-TNFR2 humanos. Os ELISAs de bloqueio foram realizados com mAbs n-CoDeR® específicos para hTNFR2 para avaliar as características de bloqueio do ligante. Figura 6 A: Todos os anticorpos foram incubados a 10 µg/ml. Subsequentemente, todos os anticorpos que reduzem o sinal alcançado com o controle de isotipo em mais de 50% (indicado pela linha pontilhada) foram dosados para explorar ainda mais o potencial de bloqueio do ligante. A Figura 6 B mostra mAbs bloqueadores completos, as Figuras 6 C e 6 D mostram mAbs bloqueadores parciais e a Figura 6 E mostra mAbs bloqueadores fracos. Todos os outros mAbs são considerados mAbs não bloqueadores.
[00204] A Figura 7 mostra a atividade de bloqueio do ligante de anticorpos anti-TNFR2 de camundongo. Os ELISAs de bloqueio foram realizados com mAbs n-CoDeR® específicos para mTNFR2 para avaliar as
62 / 94 características de bloqueio do ligante. Figura 7 A: Todos os anticorpos foram incubados a 10 µg/ml. Subsequentemente, todos os anticorpos que reduzem o sinal alcançado com o controle de isotipo em mais de 50% (indicado pela linha pontilhada) foram dosados para explorar ainda mais o potencial de bloqueio do ligante. A Figura 7 B mostra mAbs bloqueadores completos, a Figura 7 C e 7 D mostram mAbs bloqueadores parciais e a Figura 7 E mostra mAbs bloqueadores fracos. Todos os outros mAbs são considerados mAbs não bloqueadores. Com base nisso, os anticorpos 3-F10 e 5-A05 foram escolhidos para representar anticorpos bloqueadores completos e anticorpos não bloqueadores, respectivamente.
[00205] Figura 8 Categorização de anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 de acordo com’’ sua capacidade de agonizar/antagonizar a sinalização de TNFR2 e capacidade de bloquear aglutinação de TNF-α ao TNFR2. A capacidade dos anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 de aumentar ou reduzir a produção de IFN-γ foi monitorada usando células NK estimuladas por IL-2 e IL-12 e foi representada graficamente como uma função da capacidade dos anticorpos de bloquear aglutinação de ligante TNF- α a TNFR2 como descrito acima. Figura 8 A: Células NK derivadas de sangue humano foram estimuladas com 20 ng/ml de rhIL-2 e 20 ng/ml de rhIL-12 com a adição de 10 µg/ml de anticorpos n-CoDeR® específicos de TNFR2, controle de isotipo ou 100 ng/ml rhTNF-α por 24h. A quantidade de IFN-γ nos sobrenadantes da cultura foi medida usando MSD. A quantidade de IFN-γ é normalizada para o controle de isotipo (valores de IFN-γ de controle de isotipo = 1 na figura) e mostrada na Figura 8 A. Os anticorpos humanos que tinham um valor de EC50 mais alto do que 25 nM para células T CD4+ ativadas in vitro não foram incluídos na análise. Figura 8 B: as células NK humanas também produzem TNF-α nestas culturas (dados mostrados significam níveis de TNF-α de dois doadores. Os sobrenadantes das culturas celulares foram recolhidos e as quantidades de IFN-γ produzidas foram
63 / 94 analisadas usando MSD. Os resultados são normalizados contra um controle de isotipo. Os resultados de IFN-γ são o valor médio de 3 doadores em 2 experimentos independentes. Os resultados revelam dois grupos extremos caracterizados por 1) anticorpos com propriedades antagonistas e bloqueadoras completas, e 2) anticorpos com propriedades agonistas não bloqueadoras, respectivamente. Os anticorpos não bloqueadores agonistas são agonistas e aumentam a produção de IFN-γ a partir de células NK estimuladas por citocinas, enquanto os anticorpos bloqueadores são antagonistas e inibem a liberação de IFN-γ. A Figura 8 C mostra que a liberação de IFN-γ é dependente de TNF-α tendo em vista que a neutralização de TNF-α solúvel diminui o IFN-γ, enquanto adicionar TNF-α exógeno aumenta IFN-γ. A Figura 8 D mostra que a adição de um anticorpo anti-TNF-α bloqueador resulta em uma neutralização dependente da dose de TNF-α solúvel. A uma dose de 1 µg/ml, nenhum TNF-α solúvel pode ser detectado no sobrenadante.
[00206] A Figura 9 mostra que os anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 antagonistas não bloqueadores, mas não os bloqueadores, aumentam a proporção de células CD25+ na população de células T CD4+ de memória. As células T CD4+ derivadas de sangue humano (Figura 9 A) e células T CD4+ esplênicas de camundongo (Figura 9 B) foram ativadas com anticorpos n-CoDeR® específicos de IL-2 e TNFR2 recombinante, controle de isotipo ou TNF-α recombinante. Após 3 dias de cultura, as células foram coradas para CD25 e CD45RO (humano)/CD44 e CD62L (camundongo) e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados mostram a porcentagem de células que expressam CD25 na população de memória (células CD45RO+ (humanas)/CD44+CD62L- (camundongo)) sobre a porcentagem de células CD25+ recuperadas em culturas com controle de isotipo. Os resultados são o valor médio e SEM de 7 dadores (Figura 9 A, humano) e 3 camundongos (em 2 experimentos independentes) (Figura 9 B). Em ambas as culturas humanas e de camundongos, os anticorpos não bloqueadores de TNFR2 induziram a
64 / 94 porcentagem de células de memória CD25+, enquanto os anticorpos bloqueadores não tiveram tal efeito na população de memória. Tanto para culturas humanas (Figura 9 A) quanto murinas (Figura 9 B), a adição de TNF- α exógeno aumenta a população de célula T de memória CD25+ * = p <0,05 conforme calculado por ANOVA de uma via.
[00207] A Figura 10 A mostra que os anticorpos antagonistas bloqueadores de ligante têm efeito antitumoral mais pronunciado como mIgG2a, um isotipo que preferencialmente engaja receptores Fc ativadores. Camundongos Balb/c foram injetados por via subcutânea com 1x106 células CT26. Após 8 dias, com um tamanho médio de tumor de 3x3 mm, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo ip como indicado nas figuras. Os tumores foram medidos duas vezes por semana até atingirem um diâmetro de 15 mm, quando após os camundongos foram eliminados. A figura superior mostra o crescimento do tumor em camundongos tratados com controle de isotipo, então as duas figuras abaixo, no painel esquerdo, mostram o anticorpo bloqueador de ligante antagonista (figura do meio) e o anticorpo bloqueador não ligante agonista (figura inferior) em FcγR defeituoso Formato Ig. O painel intermediário mostra os mesmos anticorpos no formato de IgG2a murino, engajando principalmente FcγRs ativadores e o painel direito os anticorpos no formato de IgG1 murino engajando principalmente o FcγRIIb inibidor. Para a Figura 10 B, os camundongos sobreviventes foram seguidos durante 70 dias. Conforme visto nas figuras, o anticorpo antagonista bloqueador é mais eficaz como tratamento de tumor em um formato de IgG2a engajando FcγRs principalmente ativadores e não tem efeito em um formato com aglutinação de FcγR defeituosa. Por outro lado, o anticorpo agonista não bloqueador é mais eficaz como tratamento de tumor em um formato de IgG1 engajando preferencialmente o FcγR inibidor. Além disso, o anticorpo agonista tem efeitos antitumorais independentes de FcγR intrínsecos, conforme visto
65 / 94 usando o formato de anticorpo N297A. *** = p <0,001 em comparação com o controle de isotipo conforme calculado pelo teste Log-rank Mantel Cox.
[00208] A Figura 11 mostra que os anticorpos antagonistas bloqueadores de ligante são eficazes como tratamento antitumor em combinação com anti-PD-L1. Camundongos C57/BL6 foram injetados por via subcutânea com 1x106 células MC38. Com um tamanho médio do tumor de 3x3 mm, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo i.p. como indicado nas figuras. A figura mostra as curvas de crescimento do tumor de camundongos individuais. Figura 11 A: controle de isotipo, Figura 11 B: anticorpo direcionado a PD-1, Figura 11 C: anticorpo 3-F10 (anticorpo substituto, ligante bloqueador, antagonista), Figura 11 D: combinação de 3-F10 e PD1. Os tumores foram medidos duas vezes por semana até atingirem um diâmetro de 15 mm, quando após os camundongos foram eliminados. A Figura 11 E mostra as curvas de sobrevivência dos quatro grupos de tratamento diferentes, ** = p <0,01, *** = p <0,001 em comparação com o controle de isotipo calculado pelo teste Log-rank Mantel Cox.
[00209] A Figura 12 mostra que os anticorpos antagonistas bloqueadores são eficazes como tratamento antitumor em combinação com anti-PD-L1. Camundongos C57/BL6 foram injetados por via subcutânea com 1x106 células MC38. Com um tamanho médio do tumor de 5x5 mm, os camundongos foram tratados duas vezes com anticorpo de controle de isotipo ou 3F10 (dias 1 e 4), ou quatro dias consecutivos com anti-PD-L1 seguidos por uma quinta injeção dois dias depois (no total, cinco injeções nos dias 1, 2, 3, 4 e 7), ou uma combinação de ambos. Todos os anticorpos foram administrados a 10 mg/kg i.p. A Figura mostra o crescimento médio do tumor +/- SEM, n = 10/grupo. * = p <0,05, *** = p <0,001 conforme calculado usando o teste ANOVA de uma via.
[00210] Figura 13: Camundongos C57/BL6 foram injetados por via
66 / 94 subcutânea com 1x106 células B16.F10. Após 3 dias, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo i.p., conforme indicado nas figuras. Os tumores foram medidos duas vezes por semana até atingirem um diâmetro de 15 mm, quando após os camundongos foram eliminados. Figura 13 A: controle de isotipo, Figura 13 B: anticorpo 3-F10 (anticorpo substituto, ligante bloqueador, antagonista). A Figura 13 C mostra as curvas de sobrevivência dos dois grupos de tratamento diferentes. * = p <0,05 em comparação com o controle de isotipo conforme calculado pelo teste Log-rank Mantel Cox.
[00211] A Figura 14 mostra que o anticorpo substituto antagonista bloqueador de ligante 3F10 altera a composição das células imunes em tumores. Os camundongos foram inoculados com células tumorais CT26 conforme descrito e injetados com anticorpos conforme indicado uma vez que os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 7x7 mm. após 3 injeções, no dia 8 após o início do tratamento, os camundongos foram sacrificados e os tumores colhidos. As suspensões de células únicas de tumor foram analisadas quanto ao conteúdo de células imunes por FACS. Figura 14 A: O anticorpo substituto antagonista bloqueador de ligante 3F10 causa depleção de Treg e Figura 14 B: influxo ou expansão de células T CD8+. Isso causa uma mudança na razão de células T Treg/CD8+ conforme ilustrado na Figura 14 C. A Figura 14 D mostra que não apenas o número de células T, mas também o número de células mieloides, aqui macrófagos associados a tumor (TAMs, definidos como sendo CD11b+F4/80+MHCII+, mas negativos para ambos Ly6G e Ly6C), são significativamente reduzidos. O anticorpo substituto agonista não bloqueador de ligante 5A05 também modula os números de TAM, mas ainda é significativamente diferente do anticorpo bloqueador de ligante 3F10.
[00212] A Figura 15 mostra que as células T em tumores humanos expressam níveis de TNFR2 semelhantes às células T recuperadas de
67 / 94 camundongos NOG reconstituídos com PBMC. Brevemente, camundongos NOG foram injetados i.v. com 15 a 20x106 células PBMC. Após 10 a 12 dias, os baços foram removidos dos camundongos, a suspensão de uma única célula foi preparada e a expressão de TNFR2 foi avaliada por FACS. Anteriormente, a expressão de TNFR2 foi avaliada em células T recuperadas de amostras de sangue e tumor de 3 ou 9 pacientes com câncer, respectivamente. Conforme mostrado na figura, a expressão de TNFR2 em Tregs e células T CD8 são muito comparáveis entre as células T humanas cultivadas e ativadas in vivo nos camundongos NOG e as células T de tumores humanos.
[00213] A Figura 16 mostra que o anticorpo antagonista bloqueador de ligante 1-H10 depleta Tregs in vivo de uma maneira dependente de FcγR. Camundongos NOG foram injetados i.v. com 15 a 20x106 células PBMC. Após 10 a 12 dias, os baços foram removidos dos camundongos, a suspensão de célula única foi preparada e, em seguida, injetada i.p. em camundongos SCID. (10 a 15x106/camundongos). Após 1 h, os camundongos foram tratados com 10 mg/kg de anticorpo i.p. e 24 horas após a injeção do anticorpo, o fluido i.p. foi coletado dos camundongos e as células no fluido foram analisadas usando FACS. A Figura 16 A mostra a porcentagem média de Tregs corados (definido como CD45+CD3+CD4+CD25+CD127baixo/neg) da população CD45+ humana e mostra que Tregs são significativamente depletadas pelo anticorpo bloqueador 1-H10. A Figura 16 B mostra a porcentagem média de T CD8+ do CD45+ humano e mostra que 1-H10 aumenta significativamente a população de células T CD8+. A Figura 16 C mostra que a razão entre células T CD8+ e as Tregs é significativamente aumentada por 1-H10. Os dados na Figura 16 AC são apresentados como a média de quatro experimentos diferentes, onde cada ponto representa um camundongo. Yervoy e um anticorpo anti-CD25 disponível comercialmente foram usados como controles positivos. Todos os dados são normalizados
68 / 94 para o controle de isotipo de modo que nas Figura 16 A e B o controle de isotipo seja ajustado para 100% e, na Figura 16 C, para 1. A Figura 16 D mostra um experimento separado em que o anticorpo 1-H10 IgG1N297Q defeituoso de aglutinação a FcγR foi usado (designado 1-H10NQ na figura) para avaliar a dependência da aglutinação de FcγR para a depleção de Treg. Como mostrado na figura, a depleção é mais eficaz no formato de IgG1 de tipo selvagem (1-H10) em comparação com o defeituoso de Fc (1-H10NQ).
[00214] A Figura 17 mostra que os anticorpos não bloqueadores de TNFR2 de ligante antagonista não induzem a liberação de citocinas in vitro. A liberação de IFN-γ induzida por vários anticorpos específicos para TNFR2 foi medida em três sistemas in vitro diferentes. Como controles positivos, e anticorpo anti-CD3 = OKT3, um anticorpo anti-CD52 = Alemtuzumabe e um anticorpo anti-CD28 foram usados. O controle de isotipo foi usado como um controle negativo. Cada ponto representa PBMC de um doador humano. A Figura 17 A mostra os resultados de culturas de células de alta densidade em que PBMCs foram cultivadas a 1x107 células/ml. Após 48 h, 10 µg/ml de anticorpo foi adicionado e incubado por 24 h. Como pode ser visto na figura, Alemtuzumabe e OKT3 induziram liberação significativa de IFN-γ, mas nenhum dos anticorpos específicos para TNFR2. A Figura 17 B mostra culturas in vitro de fase sólida realizadas revestindo poços de uma placa de 96 poços com anticorpos antes de adicionar PBMCs. Novamente, Alemtuzumabe e OKT3 induziram liberação significativa de IFN-γ junto com alguns dos anticorpos específicos para TNFR2. No entanto, o anticorpo bloqueador completo 1-H10 não induziu a liberação de citocina acima do anticorpo de controle de isotipo. A Figura 17 C mostra a estimulação de sangue total com anticorpo e, aqui, Alemtuzumabe induziu liberação significativa de IFN-γ, mas nenhum dos anticorpos específicos para TNFR2.
[00215] A Figura 18 mostra que os anticorpos TNFR2 não bloqueadores de ligante antagonista não induzem a liberação de citocinas in
69 / 94 vivo. Camundongos NOG foram injetados i.v. com 25-x106 células PBMC. Após 14 dias, quando o sangue dos camundongos mostrou consistir em aproximadamente 40% de células T humanas, os camundongos foram tratados com 10 µg de anticorpo. A temperatura corporal foi medida 1h após a injeção (Figura 18 A). O experimento foi encerrado 5 h após a injeção e o sangue foi analisado para teor de IFN-γ (Figura 18 B) ou TNF-α (Figura 18 C). **** = p <0,0001 e ** = p <0,01 calculados com ANOVA de uma via.
[00216] A Figura 19 mostra a aglutinação a variantes de TNFR2 sem domínios individuais. A aglutinação do anticorpo a variantes do TNFR2 expressas em células HEK foi testada em uma abordagem de citometria de fluxo. A falta de domínio 1 e 2 não afeta significativamente a aglutinação (Figura 19 A e B), enquanto 3 e parcialmente 4 anulam completamente a interação entre o anticorpo e TNFR2 (Figura 19 C e D). Da mesma forma, a falta de domínio 1 + 3 impede a aglutinação de todos os anticorpos (exceto 1F06) completamente (Figura 19 E), enquanto a falta de domínio 2 + 4 anula a aglutinação completamente para os anticorpos agonistas (1F02, 1F06, 4E08) e reduz significativamente aglutinação também para os antagonistas (1H10, 4H02, 5B08) (Figura 19 F). Cinza escuro indica controle positivo e branco indica anticorpo de controle negativo.
[00217] A Figura 20 mostra uma comparação da sequência de aminoácidos do domínio 3 humano (H-D3) e de camundongo (M-D3) do TNFR2. Aminoácidos semelhantes são marcados em branco, enquanto as diferenças são marcadas em cinza. As cinco sequências abaixo representam as 5 construções diferentes contra as quais os anticorpos são testados. As trocas de sequência de humano para camundongo estão sublinhadas, enquanto a sequência não marcada é completamente humana. Os domínios 1, 2 e 4 são humanos e não contêm quaisquer substituições ou mutações.
[00218] A Figura 21 mostra a aglutinação ao TNFR2 humano e de camundongo de tipo selvagem (painéis à esquerda). Construtos de hTNFR2
70 / 94 mutado (m1, m2, m3 e m4) foram usados para estreitar o local de aglutinação para diferentes anticorpos anti-hTNFR2. A análise de citometria de fluxo revelou que as mutações nos aas 119 a 132 não afetam a aglutinação do anticorpo, enquanto mutações nos aas 151 a 160 anulam completamente a aglutinação de todos os anticorpos. Mutações em 134 a 144 interrompem a aglutinação para anticorpos bloqueadores e antagonistas apenas, mas não afetam significativamente os anticorpos agonistas. Barras cinza escuro indicam controle positivo e anticorpo branco de controle negativo. A linha tracejada é o nível do anticorpo de controle negativo.
EXEMPLOS
[00219] Exemplos específicos, sem limitação, que incorporam determinados aspectos da invenção serão descritos agora.
[00220] Em muitos dos exemplos, em particular nos exemplos in vivo, o anticorpo 3-F10 foi usado. Este é um anticorpo de camundongo, que é um anticorpo substituto para os anticorpos humanos divulgados no presente documento. O mesmo f oi selecionado com base em sua capacidade de se aglutinar a TNFR2 murino, seu bloqueio aglutinação de ligante TNF- murino a TNFR2, e com base em sua atividade antagonista em um ensaio de ativação de células T murinas, conforme descrito no exemplo 4. Em alguns exemplos, o anticorpo 3-F10 foi testado e comparado em diferentes formatos de anticorpos associados à aglutinação forte e preferencial a receptores Fc gama ativadores em relação aos inibidores (mIgG2a), aglutinação forte e preferencial a FcγR inibidor de camundongo (mIgG1) ou aglutinação defeituosa a FcγR de camundongo(mIgG2a N297A).
[00221] Em alguns exemplos, o anticorpo 5-A05, foi usado. Esse é um anticorpo substituto de camundongo para os anticorpos agonistas não bloqueadores anti-TNFR2 humanos incluídos aqui para referência e por razões comparativas. 5-A05 foi selecionado como substituto com base na sua capacidade de se aglutinar a TNFR2 murino, falta de efeitos bloqueadores de
71 / 94 aglutinação de ligante de TNF-α murino a TNFR2, e em sua atividade agonista em um ensaio de ativação de células T murinas, conforme descrito no exemplo 4. Em alguns exemplos, o anticorpo 5-A05 foi testado e comparado em diferentes formatos de anticorpos associados à aglutinação forte e preferencial para ativação sobre receptores Fc gama inibitórios (mIgG2a), aglutinação forte e preferencial a FcγR inibidor sobre FcγR ativador de camundongo (mIgG1) ou aglutinação defeituosa a Fcγ de camundongo (N297A).
[00222] Em alguns dos exemplos e figuras, uma nomenclatura ligeiramente diferente dos clones de anticorpo é usada, por exemplo, o clone 001-H10 é às vezes encurtado para 1-H10 ou 1H10, 005-B08 às vezes é encurtado para 5-B08 ou 5B08 etc. EXEMPLO 1 - GERAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE TNFR2
[00223] (Veja também a figura 1 e a descrição acima dessa figura.) ISOLAMENTO DE FRAGMENTOS DE ANTICORPO scFv
[00224] A biblioteca de scFv n-CoDeR® (BioInvent; Söderlind E, et al Nat Biotechnol. 2000; 18(8):852 a 856) foi usada para isolar os fragmentos de anticorpo scFv que reconhecem TNFR2 humana ou de camundongo.
[00225] A biblioteca de fagos foi usada em três drageamentos consecutivos em oposição à proteína humana ou de camundongo recombinante (Sino Biological). Após a incubação de fago, as células foram lavadas para remover os fagos não ligados. Os fagos de aglutinação foram eluídos com tripsina e amplificados em E. coli. O estoque de fago resultante foi convertido para o formato scFv. E.coli foram transformadas com plasmídeos portadores de scFv e clones individuais de scFv foram expressos. IDENTIFICAÇÃO DE scFv DE AGLUTINAÇÃO A TNFR2 ÚNICO
[00226] O scFv convertido do terceiro drageamento foi testado usando- se uma análise FMAT homogênea (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) para aglutinação a células 293 FT transfectadas para expressar TNFR2
72 / 94 humano ou de camundongo ou uma proteína não relacionada.
[00227] Em suma, as células transfectadas foram adicionadas a placas de fundo transparente, juntamente com o sobrenadante que contém scFv das placas de expressão (diluído 1:7), anticorpo anti-His Tag de camundongo (0,4 µg/ml; R&D systems) e um anticorpo anticamundongo de cabra conjugado com APC (0,2 µg/ml; nº cat. 115-136-146, Jackson Immunoresearch). As placas FMAT foram incubadas à temperatura ambiente durante 9 h antes da leitura. Os clones bacterianos que se aglutinam às células transfectadas com TNFR2, mas não às células transfectadas com uma proteína não relacionada, foram classificados como ativos e colhidos em cereja em placa de 96 poços. AGLUTINAÇÃO DE IgG A TNFR2 EM ELISA
[00228] Placas de 96 poços (placa Lumitrac 600 LIA, Greiner) foram revestidas durante a noite a 4 °C com proteína TNFR2-Fc recombinante humana ou de camundongo (Sino Biological) a 1 pmol/poço. Após a lavagem, doses tituladas de mAbs anti-TNFR2 de 20 µg/ml a 0,1 ng/ml (133 nM a 1 pM) foram deixadas aglutinar durante 1 hora. As placas foram, então, lavadas novamente e os anticorpos aglutinados foram detectados com um anticorpo secundário anti-F(ab)-HRP humano (Jackson ImmunoResearch) diluído em 50 ng/ml. Super Signal ELISA Pico (Thermo Scientific) foi usado como substrato e as placas foram analisadas com o uso de leitor de Microplacas Tecan Ultra.
[00229] Os dados, que são mostrados na Tabela 6 e nas Figuras 1 A a 1 D, mostram que todos os anticorpos anti-TNFR2 humanos se aglutinam à proteína de TNFR2 humana. Os valores de EC50 variam de 0,082 nM para 1- C08 a 4,4 nM para 1-A09.
[00230] Além disso, os clones substitutos do anticorpo de camundongo 3-F10 e 5-A05 também se aglutinam à proteína de mTNFR2. Esses dois clones se aglutinam com uma afinidade muito semelhante (Tabela 6 e Figura 1E).
73 / 94 TABELA 6. VALORES DE EC50 DE AGLUTINAÇÃO DE ANTICORPOS À PROTEÍNA TNFR2 (PROTEÍNA HUMANA, EXCETO PELO CLONE 3F10 E 5A05) Clone EC50 (nM) 1-C08 0,082 1-E06 0,20 1-G10 0,29 1-H10 0,29 4-H02 0,20 5-B02 0,15 5-B08 0,17 1-G04 1,7 1-H09 0,30 1-D01 0,37 5-F10 0,22 1-B11 0,25 1-C07 0,26 1-B05 0,23 1-F02 0,31 1-F06 0,15 4-E08 0,38 1-G05 0,54 1-A09 4,4 1-B09 0,18 1-C03 0,75 1-C05 0,38 3-F10 (camundongo) 0,97 5-A05 (camundongo) 1,4 EXEMPLO 2 - ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS
[00231] (Veja também as figuras 2 a 5 e a descrição acima dessas figuras.) ISOLAMENTO DE CÉLULAS T CD4+
[00232] PBMCs de leucócitos humanos e macacos Cinomolgos (M. fascicularis) sangue total foram isolados usando gradientes Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). As células T CD4+ foram isoladas de PBMCs por classificação magnética de células usando o kit de isolamento de células T CD4+ (humano) ou MicroBeads CD4, primata não humano (Cinomolgos) ambos de Miltenyi. As células T CD4+ de camundongo foram isoladas do baço usando o kit de isolamento de células T CD4+ (camundongo) de Miltenyi. TITULAÇÃO DE ANTICORPOS N-CODER® ESPECÍFICOS DE TNFR2
[00233] A capacidade e afinidade dos anticorpos de TNFR2 n-
74 / 94 CoDeR® para se aglutinar a TNFR2 expresso em células foram obtidas usando células T CD4+ ativadas in vitro. As células T CD4+ humanas foram estimuladas com 50 ng/ml de rhIL-2 (R&D systems) e Dynabeads® T- Activator CD3/CD28 para Expansão e Ativação de Células T (Gibco) 2 a 3 dias a 37 °C. As células ativadas in vitro foram marcadas com uma quantidade crescente de anticorpos n-CoDeR® específicos de TNFR2 ou controle de isotipo, variando de 0,002 a 267 nM. As células foram então incubadas com um ab secundário de IgG a-humano conjugado com APC (Jackson) seguido por análise por citometria de fluxo (FACSVerse, BD). As curvas de titulação resultantes são mostradas na Figura 2 A a 2 D. As células T CD4+ de camundongo foram estimuladas com 135 U/ml rmIL-2 (R&D systems) e Dynabeads® T-Activator CD3/CD28 para Expansão e Ativação de células T (Gibco) 2 a 3 dias a 37 °C. As células ativadas in vitro foram marcadas com uma quantidade crescente de anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 ou controle de isotipo, variando de 0,00003 a 133 nM. As células foram então incubadas com um ab secundário de IgG de camundongo a-conjugado com APC (Jackson) seguido por análise por citometria de fluxo (FACSVerse, BD). As curvas de titulação são mostradas na Figura 2E. Os valores de EC50 para as curvas de titulação foram calculados no Microsoft Excel e são mostrados na Tabela 7. Para os anticorpos humanos, os valores de EC50 diferiram de 0,6 nM (4-H02) a 52,7 nM (1-C03). Os anticorpos de camundongo se aglutinaram a células ativadas in vitro com afinidade semelhante (0,072 nM (3-F10) e 0,11 nM (5-A05)). ESPECIFICIDADE DE ANTICORPOS DE TNFR2 c-CoDeR®
[00234] A especificidade dos anticorpos de TNFR2 para TNFR2 foi obtida em experimentos de bloqueio de FACS com um anticorpo comercial policlonal TNFR2 (R&D systems). As células T CD4+ (camundongo e humano) estimuladas 2 a 3 dias com rhIL-2 a 50 ng/ml (R&D systems) (humanos)/135 U/ml de IL-2 rm (R&D systems) (camundongo) e
75 / 94 Dynabeads® T-Activator CD3/CD28 para Expansão e Ativação de Células T (Gibco) foram bloqueados com 40 µg/ml de anticorpo de TNFR2 policlonal (R&D systems) por 30 min, seguido imediatamente por 15 min de incubação com anticorpos de TNFR2 n-CoDeR® ou controle de isotipo. A concentração de anticorpos n-CoDeR® usada foi baseada nas curvas de titulação para os anticorpos de TNFR2 n-CoDeR® individuais e uma concentração subótima para cada anticorpo foi escolhida. As células foram então lavadas e incubadas 30 min com um anticorpo secundário conjugado com APC (Jackson). As células foram analisadas por citometria de fluxo usando FACSVerse (BD Biosciences). Toda a aglutinação de anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 (humanos e de camundongo) pode ser bloqueada por um anticorpo policlonal de TNFR2 como mostrado na Figura 3. Estes resultados verificam que os anticorpos de TNFR2 n-CoDeR® se aglutinam especificamente ao TNFR2 em células T CD4+ ativadas in vitro. MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS n-CoDeR® ESPECÍFICOS PARA TNFR2 CONTRA O CLONE DE ANTICORPO DE TNFR2 MR2-1
[00235] O clone MR2-1 do anticorpo de TNFR2 (Invitrogen) se aglutina a um domínio específico da proteína de TNFR2. A possibilidade de os anticorpos n-CoDeR® específicos de TNFR2 terem aglutinado ao mesmo domínio que MR2-1 foi testada por experimentos de bloqueio FACS.
[00236] As células T CD4+ humanas foram estimuladas 2 a 3 dias com 50 ng/ml de rhIL-2 (R&D systems) e Dynabeads® T-Activator CD3/CD28 para expansão e ativação de células T (Gibco). As células ativadas foram bloqueadas com 40 µg/ml MR2-1 (barras pretas na Figura 5 A), ou PBS (barras cinza na Figura 5). Após 30 min de incubação, as células foram imediatamente coradas para TNF-R2 policlonal (pTNFR2) ou anticorpo n- CoDeR ® específico para TNF-R2 durante 15 min. Após incubação com um reagente IgG anti-humano secundário conjugado com APC (Jackson), as
76 / 94 células foram analisadas por citometria de fluxo (FACSVerse, BD). Na Figura 5 B, as células T CD4+ ativadas foram bloqueadas com 40 µg/ml de anticorpos n-CoDeR® específicos para TNFR2 ou pTNFR2 (barras pretas) ou deixadas com PBS (barra cinza) e depois incubadas 15 min com PE conjugado com anticorpo MR2-1. Novamente, as células foram então analisadas por FACS. Uma vez que a porcentagem de células MR2-1+ foi a mesma para n-CoDeR® bloqueado e para células não bloqueadas (Figura 5 B) e a aglutinação de anticorpos n-CoDeR® foi a mesma com ou sem bloqueio MR2-1 (Figura 5 A), esses dados mostram que os anticorpos n- CoDeR® se aglutinam a outros epítopos da proteína TNFR2 que não o anticorpo MR2-1. AGLUTINAÇÃO DE ANTICORPOS DE TNFR2 n-CoDeR® A
CYNOMOLGUS
[00237] Para validar a reatividade cruzada de anticorpos de TNFR2 para Cinomolgos, células T CD4+ de Cinomolgos foram estimuladas 2 dias com 50 ng/ml de PMA (Sigma) e 100 ng/ml de ionomicina (Sigma) para causar regulação crescente de TNFR2. As células foram incubadas com anticorpos n-CoDeR® específicos de TNFR2 em 3 concentrações diferentes (0,1, 1 e 10 µg/ml) e depois incubadas com um reagente IgG secundário a- humano conjugado com APC (Jackson). As células foram analisadas por citometria de fluxo (FACSVerse, BD) e o resultado mostra que a maioria dos anticorpos n-CoDeR® específicos de TNFR2 humano poderiam se aglutinar a TNFR2 de Cinomolgos, os resultados para os anticorpos individuais são apresentados na Figura 4.
[00238] Em resumo, os dados do exemplo 2 mostram que os anticorpos humanos se aglutinam especificamente a TNFR2 expresso endogenamente em células imunes humanas. Além disso, os dados mostram que esta aglutinação pode ser bloqueada pela adição de um anticorpo policlonal disponível comercialmente contra TNFR2, o que indica uma especificidade muito alta
77 / 94 para TNFR2. O mesmo é verdadeiro para os clones substitutos 3F10 e 5A05 em relação às células murinas que expressam TNFR2 murino. Além disso, a aglutinação dos clones humanos não é afetada por anticorpos MR2-1 que mostram uma especificidade de epítopo diferente em comparação com MR2-
1. TABELA 7. VALORES DE EC50 CALCULADOS NA TITULAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE TNFR2 PARA CÉLULAS T CD4+ ATIVADAS IN VITRO. Clone EC50 (nM) 1-C08 2,6 1-E06 4,1 1-G10 3,3 1-H10 1,1 4-H02 0,59 5-B02 0,80 5-B08 1,2 1-G04 18 1-H09 16 1-D01 3,9 5-F10 32 1-B11 27 1-C07 36 1-B05 1,5 1-F02 0,79 1-F06 2,5 4-E08 2,3 1-G05 0,66 1-A09 48 1-B09 29 1-C03 53 1-C05 12 3-F10 (camundongo) 0,072 5-A05 (camundongo) 0,11 EXEMPLO 3 - TESTE DE CARACTERÍSTICAS DE BLOQUEIO DE
LIGANTE
[00239] (Veja também as figuras 6 a 7 e a descrição acima dessas figuras.)
MÉTODO ELISA
[00240] Placas de 96 poços foram revestidas com hTNFR2 (Sinobioologicals No. Cat. 10414-H08H) ou mTNFR2 (Sinobioologicals No. Cat. 50128 M08H) a 2,5 pmol/poço em tampão de revestimento ELISA (carbonato de sódio a 0,1 M pH 9,5) e incubadas durante a noite a 4 °C. Após
78 / 94 lavagem em tampão de lavagem ELISA (PBS com 0,05% de Tween20), as placas foram incubadas sob agitação lenta por 1 h em temperatura ambiente com mAbs n-CoDeR® a 10 µg/ml (ELISA de uma dose) ou 33 nM e subsequente 1:2 diluições (titulação ELISA) em tampão de bloco contendo 0,45% de gelatina de peixe. Posteriormente, hTNF-α-bio recombinante (R&D Cat. No. BT210) ou mTNF-α (Gibco Cat. No. PMC3014) foram adicionados a uma concentração final de 5 nM e 2 nM respectivamente e deixados incubar por mais 15 min. Depois disso, as placas foram lavadas. Para os ELISAs humanos, Streptavidin-HRP (Jackson No. Cat. 016-030-084) diluída 1:2.000 em tampão bloqueador foi adicionada e novamente incubada por 1 h em temperatura ambiente seguida por lavagens primeiro em tampão ELISA e depois em tampão Tris (pH 9,8). O substrato (Super Signal ELISA Pico da Thermo Scientific Cat. No. 37069) foram posteriormente diluídas de acordo com as instruções do fabricante, adicionadas aos poços e incubadas no escuro durante 10 min antes da leitura em um Tecan Ultra. Para o camundongo ELISAs, coelho anti-mTNF-α (Sinobiológico. Cat. No. 50349-RP02) diluído para 1 µg/ml em foi adicionado e deixado a incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, anti-Rabbit-HRP diluído 1:10.000 em tampão bloqueador foi adicionado e novamente incubado durante 1 h à temperatura ambiente. A adição e leitura de substrato foram realizadas como acima.
[00241] Os dados são apresentados nas Tabelas 8 e 9 abaixo e nas Figuras 6 e 7. TABELA 8. VALORES DE EC50 DE ANTICORPOS HUMANOS BLOQUEADORES DE LIGANTE: OS ANTICORPOS FORAM TITULADOS E OS VALORES DE EC50 FORAM CALCULADOS. Clone EC50 (nM) Bloqueio 001-H10 0,9 Completo 004-H02 0,4 Completo 005-B08 0,3 Completo 005-B02 0,2 Completo 001-E06 0,3 Parcial 001-G10 1,6 Parcial 001-C08 1,1 Parcial 001-H09 1,4 Parcial
79 / 94 Clone EC50 (nM) Bloqueio 005-F10 0,03 Parcial 001-G04 3,2 Parcial 001-B11 1,0 Fraco 001-C07 0,8 Fraco 001-D01 1,4 Fraco TABELA 9. VALORES DE EC50 DE ANTICORPOS MURINOS BLOQUEADORES DE LIGANTE: OS ANTICORPOS FORAM TITULADOS E OS VALORES DE EC50 FORAM CALCULADOS. Clone EC50 (nM) Bloqueio 3-F10 1,9 Completo 4-C01 2,7 Completo 4-A06 2,0 Parcial 4-A07 >500 Parcial 4-F06 6,2 Parcial 5-C09 8,6 Parcial 2-D09 4,4 Parcial 4-B12 >500 Parcial 3-G06 13 Parcial 2-H01 25 Fraco 4-C02 >500 Fraco 4-G09 2,6 Fraco 4-C03 8,3 Fraco
DEFINIÇÕES DE BLOQUEIO
[00242] • Bloqueadores completos são definidos como redutores de aglutinação de TNF-α com mais de 98%
[00243] • Bloqueadores parciais são definidos como redutores de aglutinação de TNF-α com 60 a 98%
[00244] • Bloqueadores fracos são definidos como redutores de aglutinação de TNF-α com menos de 60%
[00245] • Os anticorpos não bloqueadores são definidos como não atingindo mais de 50% de bloqueio em ELISA de alta dose de um ponto, conforme mostrado nas figuras 6A e 7A
[00246] Os dados mostrados neste exemplo mostram que vários anticorpos foram gerados variando de anticorpos que inibem completamente o ligante TNF-α de aglutinação a anticorpos que não inibem o bloqueio do ligante de todo. Isso é verdadeiro tanto para anticorpos humanos quanto para substitutos murinos. EXEMPLO 4 - FUNCIONALIDADE IN VITRO DE ANTICORPOS
80 / 94
[00247] (Veja também as figuras 8 a 9 e a descrição acima dessas figuras.) CAPACIDADE DE ANTICORPOS TNFR2 PARA REGULAR A PRODUÇÃO DE IFN-γ DE CÉLULAS NK ESTIMULADA POR
CITOCINA
[00248] As características agonistas/antagonistas de anticorpos específicos para TNFR2 foram avaliadas usando um ensaio de células NK descrito por Almishri et al. (TNFα Augments Cytokine-Induced NK Cell IFNγ Production through TNFR2. Almishri W.et al. J Innate Immun. 2016; 8: 617 a 629).
[00249] Em resumo, as células NK humanas foram isoladas de PBMCs humanos por MACS usando “kit de isolamento NK” (Miltenyi). 100 µl de células NK (1x106 células/ml) foram cultivadas com 20 ng/ml de rhIL-2 (R&D systems) e 20 ng/ml de rhIL-12 (R&D systems) juntamente com 10 µg/ml de anticorpos específicos de TNFR2, 10 µg/ml de controle de isotipo ou 100 ng/ml de TNF-α (R&D systems) em placas de fundo em U (Corning® 96 Well TC-Treated Microplates, Sigma-Aldrich). Os sobrenadantes foram coletados após 24h e a quantidade de IFN-γ produzida foi avaliada por MSD.
[00250] Como controle, o anticorpo anti-TNF-α neutralizando TNF-α (No. Cat. AF-210-NA, R&D systems) foi incluído. Como visto na Figura 8 D, uma dose de 1 µg/ml neutralizou completamente o TNF-α solúvel e essa dose também reduziu a liberação de IFN-γ.
[00251] Os anticorpos de TNFR2 humanos não bloqueadores aumentaram distintamente a produção de IFN-γ das células NK estimuladas por IL-2 e IL-12 (2 a 3 vezes mais IFN-γ do que o controle de isotipo) enquanto os anticorpos antagonistas (aqui mostrados por bloqueadores completos) mostraram efeitos antagonistas sobre Produção de IFN-γ em células NK (Figura 8A).
[00252] Este teste foi considerado não representativo para ser realizado
81 / 94 com os anticorpos substitutos de camundongo devido à falta de TNF-α produzido endogenamente nas culturas murinas, bem como expressão de FcγR inibidor em células NK murinas e apenas ativação de FcγR na contraparte humana. Em vez disso, o ensaio de ativação de células T de memória (indução de CD25) conforme descrito abaixo foi usado para abordar as propriedades agonistas ou antagonistas dos anticorpos substitutos murinos. INDUÇÃO DE CÉLULAS T CD4+ DE MEMÓRIA QUE EXPRESSAM CD25 POR ANTICORPOS TNFR2
[00253] Para compreender melhor as características agonistas/antagonistas dos anticorpos de TNFR2, foi avaliada a sua capacidade de aumentar a proporção de células T CD4+ de memória que expressam CD25.
[00254] Resumidamente, células T CD4+ humanas foram isoladas de PBMCs por MACS usando o “kit de isolamento de células T CD4+” de Miltenyi. As células T CD4+ foram cultivadas com 10 ng/ml de rhIL-2 (R&D systems) e 10 µg/ml de anticorpo específico para TNFR2 ou quantidade indicada de rhTNF-α (R&D systems). Após 3 dias, a expressão de CD25 em células de memória (células CD45RO+) foi analisada por FACS (Figura 9A).
[00255] Da mesma forma, as células T CD4+ de camundongo foram isoladas do baço por MACS usando o “kit de isolamento de células T CD4+” (Miltenyi) e cultivadas com 10 ng/ml rmIL-2 (R&D systems) e 10 µg/ml de anticorpo específico TNFR2 ou indicado quantidade de rmTNF-α (R&D systems). A expressão de CD25 em células de memória (células CD44+ CD62L-) foi analisada por FACS após 3 dias (Figura 9B).
[00256] A porcentagem de células que expressam CD25 foi aumentada em culturas de células de memória estimuladas com TNFR2 não bloqueador, tanto em humanos quanto em camundongos. No entanto, a estimulação com anticorpos bloqueadores diminuiu, não aumentou, a expressão de CD25 nessas culturas.
82 / 94
[00257] Em resumo, os dados no exemplo 4 mostram que os anticorpos bloqueadores de ligante são antagonistas conforme medido por vários métodos in vitro: inibição de liberação de IFN-γ mediada por células NK e ativação de células de memória CD4+ conforme medido pela expressão de CD25. Os anticorpos bloqueadores de ligante antagonistas são mostrados de acordo com a invenção enquanto os anticorpos não bloqueadores de ligante agonistas são incluídos para comparação. EXEMPLO 5 - O mAb TNFR2 ANTICAMUNDONGO ANTAGONISTA
BLOQUEADOR DE LIGANTE SUBSTITUTO TEM EFEITO ANTITUMORAL IN VIVO
[00258] (Veja também as figuras 10 a 16 e a descrição acima dessas figuras.)
EFEITO TERAPÊUTICO EM DIFERENTES MODELOS DE TUMOR
[00259] Para avaliar o efeito antitumoral in vivo de mAbs anti-TNFR2 antagonistas bloqueadores de ligante, um substituto de camundongo, denominado 3F10, foi investigado in vivo em diferentes modelos de tumor, usando diferentes formatos de isotipos, e sozinho ou em combinação com anti-PD-1 conforme descrito abaixo.
[00260] Os camundongos foram criados e mantidos em instalações locais, de acordo com as diretrizes do home office. Camundongos Balb/C e C57/BL6 fêmeas de seis a oito semanas de idade foram disponibilizadas pela Taconic (Bomholt, Dinamarca) e mantidas em biotérios locais. As células CT26, MC38 e B16.F10 (ATCC) foram cultivadas em RPMI tamponado com glutamax, suplementado com FCS a 10%. Quando as células estavam semiconfluentes, as mesmas foram separadas com tripsina e ressuspensas em PBS estéril a 10x106 células/ml. Os camundongos foram injetados s.c. com 100 µl de suspensão de células que correspondem a 1x106 células/camundongo. 3 a 8 dias após a injeção, dependendo do modelo, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de
83 / 94 anticorpo i.p. (controle de isotipo, controle de isotipo, 3-F10 ou 5-A05) e conforme indicado nas figuras. Os tumores foram medidos duas vezes/semana até atingirem um diâmetro de 15 mm, em que, depois, os camundongos foram eliminados.
[00261] O mAb TNFR2 anticamundongo agonista bloqueador de ligante 3-F10 mostra efeito antitumoral terapêutico em três modelos de tumor diferentes (Figuras 10 a 13), com efeito curativo em CT26 mais sensível ao tratamento (Figura 10) e efeito inibidor de crescimento tumor em MC38 e B16 mais resistentes ao tratamento (Figuras 11 a 13). O EFEITO ANTITUMORAL DE MAB TNFR2 ANTICAMUNDONGO
ANTAGONISTA BLOQUEADOR DE LIGANTE É DEPENDENTE DE FC:FCγR
[00262] Para avaliar a importância da interação Fc-FcγR no efeito antitumoral in vivo do mAb substituto de camundongo anti-TNFR2 antagonista bloqueador de ligante, diferentes formatos de Fc deste anticorpo foram investigados in vivo no modelo de tumor CT26, conforme descrito abaixo.
[00263] Os camundongos foram criados e mantidos conforme descrito acima. As células CT26 (ATCC) foram cultivadas e injetadas como descrito acima. Quando os tumores atingiram 3x3 mm, camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo i.p. (controle de isotipo, 3- F10 IgG1, 3-F10 IgG2a ou 3-F10-N297A (defeituoso em Fc). Os tumores foram medidos duas vezes por semana até atingirem um diâmetro de 15 mm, quando após os camundongos foram eliminados.
[00264] O 3-F10-N297A defeituoso em Fc mostra atividade terapêutica mínima ou nenhuma em comparação com o controle de isotipo, indicando que o engajamento de Fc é crucial para a eficácia terapêutica deste mAb TNFR2 antagonista anticamundongo bloqueador de ligante (Figuras 10 A e 10 B). Ambos os formatos IgG1 e IgG2a mostram eficácia terapêutica significativa.
84 / 94 No entanto, o formato de IgG2a que se aglutina preferencialmente aos receptores Fcγ ativadores mostra um efeito terapêutico superior indicativo de depleção/fagocitose de Tregs sendo um importante mecanismo de ação deste mAb TNFR2 anticamundongo antagonista bloqueador de ligante (Figura 10 A a 10 B). Isso está em contraste com um anticorpo substituto agonista não bloqueador 5A05 que mostra alguma atividade no formato defeituoso em Fc e mostra melhor atividade no formato de IgG1 murino, conhecido por se aglutinar preferencialmente ao FcγR inibidor. O anticorpo antagonista bloqueador de ligante (3F10) está de acordo com a invenção e o anticorpo agonista não bloqueador de ligante (5A05) é incluído para referência. EFEITO DE COMBINAÇÃO COM mAb ANTI-PD-1
[00265] Para avaliar o efeito antitumoral combinacional in vivo de mAbs anti-TNFR2 antagonistas bloqueadores de ligante, um substituto de camundongo (3-F10) com anti-PD-1, a combinação de tratamento foi investigada in vivo no modelo de tumor MC38, conforme descrito abaixo.
[00266] Os camundongos foram criados e mantidos conforme descrito acima. As células MC38 (ATCC) foram cultivadas e injetadas como descrito acima. Oito dias após a injeção, camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo i.p. (controle de isotipo, PD-1 anticamundongo, 3-F10 ou uma combinação de PD-1 anticamundongo e 3- F10) e conforme indicado nas Figuras 11 A a 11 E. Os tumores foram medidos duas vezes por semana até atingirem um diâmetro de 15 mm, quando após os camundongos foram eliminados.
[00267] Tanto o PD-1 anticamundongo quanto o mAb TNFR2 anticamundongo antagonista bloqueador de ligante 3-F10 mostram efeito terapêutico inibidor do crescimento tumoral em efeito no modelo MC38 (Figura 11 A a 11 E). Quando o anti-PD1 e o mAb TNFR2 anticamundongo antagonista 3-F10 são combinados, os tumores são curados no MC38 resistente ao tratamento (Figura 11 D a 11 E).
85 / 94 EFEITO DE COMBINAÇÃO COM mAb ANTI-PD-L1
[00268] Para avaliar o efeito antitumoral combinacional in vivo de mAbs anti-TNFR2 antagonistas bloqueadores de ligante, combinamos ainda o substituto de camundongo (3F10) com anti-PD-L1 para tratamento no modelo de tumor MC38, conforme descrito abaixo.
[00269] Os camundongos foram criados e mantidos conforme descrito acima. As células MC38 (obtidas a partir de Dr. M. Cragg, Universidade de Southampton) foram cultivadas e injetadas como descrito acima. Seis dias após a injeção, os camundongos foram tratados duas vezes com anticorpo de controle de isotipo ou 3F10 (dias 1 e 4), ou quatro dias consecutivos com anti- PD-L1 (clone 10F.9G2, Bioxcell) seguido por uma quinta injeção dois dias depois (em total de cinco injeções nos dias 1, 2, 3, 4 e 7), ou uma combinação de ambos. Todos os anticorpos foram administrados a 10 mg/kg i.p. Os tumores foram medidos com calibradores duas vezes por semana até atingirem um volume de 2.000 mm3, em que, depois, os camundongos foram eliminados.
[00270] O PD-L1 anticamundongo e o mAb TNFR2 anticamundongo antagonista bloqueador de ligante 3-F10 mostram efeito terapêutico de inibição do crescimento tumoral em efeito no modelo MC38 (Figura 12). Quando o anti-PD-L1 e o mAb TNFR2 anticamundongo antagonista 3-F10 são combinados, o efeito antitumoral é ainda mais intensificado (Figura 12).
MODULAÇÃO DE CÉLULAS IMUNES IN VIVO
[00271] Para investigar os efeitos nas células imunes no tumor in vivo, camundongos BalbC foram inoculados com células CT26 conforme descrito acima. Depois que os tumores atingiram aproximadamente 7x7 mm, os camundongos foram tratados com 10 mg/kg de anticorpos administrados i.p. como indicado nas figuras. Os camundongos foram tratados nos dias 1, 4 e 7 e terminados no dia 8. Os tumores foram dissecados, mecanicamente divididos em pequenos pedaços e assimilados com o uso de uma mistura de 100 µg/ml
86 / 94 de Collagenase e Dnase a 100 µg/ml a 37 °C por 2x5 min com Vortex entre os mesmos. Após a filtração através de um filtro de 70 µm, a suspensão de células foi lavada (400 g por 10 min) com PBS que contém FBS a 10%. Posteriormente, as células foram ressuspensas em tampão MACS e coradas com um painel de anticorpos com coloração de CD45, CD3, CD8, CD4 e CD25 ou um painel de anticorpos com coloração MHCII, F4/80, Ly6C, CD11b e Ly6G. Antes da coloração, as células foram bloqueadas para aglutinação inespecífica com o uso de 100 µg/ml de IVIG (imunoglobulinas intravenosas purificadas). As células foram analisadas em um Verso FACS. Tregs de Camundongo foram quantificados como sendo CD45+CD3+CD4+CD25+ e TAMs como sendo CD11b+Ly6G-Ly6C- F4/80+MHCII+. Os resultados são mostrados na Figura 14.
[00272] Como visto na figura 14, o tratamento com o anticorpo bloqueador de ligante/antagonista TNFR2 resulta em uma depleção de T reg no tumor. Uma tendência mais fraca de aumento no influxo de células CD8+T também é observada. Em conjunto, isso resulta em uma razão entre células T CD8+ e T reg muito melhor (Figura 14 C). Além disso, o anticorpo antagonista modula o compartimento mieloide, reduzindo o número de macrófagos associados ao tumor (Figura 14 D). MODELO PBMC-NOG/SCID
[00273] Para confirmar as descobertas in vivo sobre a atividade de depleção mAb substituto de TNFR2 anticamundongo antagonista bloqueador de ligante, analisamos a capacidade de depleção do mAb bloqueador de ligante anti-TNFR2 humano antagonista 1-H10 no modelo PBMC- NOG/SCID in vivo conforme descrito abaixo.
[00274] Os camundongos foram criados e mantidos em instalações locais, de acordo com as diretrizes do home office. Camundongos NOG fêmeas com oito semanas de vida foram disponibilizados pela Taconic (Bomholt, Dinamarca) e mantidos em biotérios locais. Para o modelo PBMC-
87 / 94 NOG (xenoenxerto humano primário), PBMCs humanas foram isoladas com o uso de Ficoll Paque PLUS e, após a lavagem, as células foram ressuspensas em PBS estéril a 75x106 células/ml. Os camundongos NOG foram injetados i.v. com 200 µl de suspensão de células que correspondem a 15x106 células/camundongo. 2 semanas após a injeção, os baços foram isolados e processados em uma suspensão de célula única. Depois disso, uma pequena amostra foi retirada para determinar a expressão de TNFR2 em células T humanas por FACS (Figura 15). Esse FACS mostrou que a expressão de TNFR2 em células Tregs e células T CD8+ são muito comparáveis entre as células T humanas cultivadas e ativadas in vivo em camundongos NOG, e células T de tumores humanos. A maioria das células foi ressuspensa em PBS estéril a 50x106 células/ml. Os camundongos SCID foram injetados i.p. com 200 µl da suspensão correspondente a 10x106 células/camundongo. 1 h depois, os camundongos foram tratados com 10 mg/kg de Yervoy, anti-CD25, 1-H10, 1-H10-N297Q (versão Fc defeituosa de 1-H10) ou mAb de controle de isotipo. O líquido intraperitoneal dos camundongos foi coletado após 24 h. Subconjuntos de células T humanas foram identificados e quantificados por FACS com o uso dos seguintes marcadores: CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127 (todos da BD Biosciences).
[00275] A atividade de depleção de 1-H10 Treg foi superior a Yervoy e 1-H10N297Q (Figura 16), confirmando que o mAb anti-TNFR2 antagonista bloqueador de ligante 1-H10 depleta Tregs e que a interação Fc está envolvida nesta depleção (Figura 16 D).
[00276] Em resumo, o exemplo 5 mostra que:
1. Anticorpos bloqueadores de ligante antagonistas podem ter fortes efeitos antitumorais em vários modelos de tumor
2. Este efeito pode ser aumentado pela combinação com anticorpos anti-PD1
3. O efeito depende do engajamento de FcγRs ativadores
88 / 94
4. O tratamento com o anticorpo substituto bloqueador de ligante antagonista altera significativamente a composição de células T em tumores, com uma razão de células T CD8+/Treg aumentada, e redução em macrófagos associados a tumor.
5. Em tumores humanos, as células com maior expressão de TNFR2 são Tregs
6. Em um modelo de xenoenxerto humano onde a expressão de TNFR2 tumoral é imitada em células T, Tregs humanas são delatadas e os níveis de células T CD8+ são aumentados
7. Esta deleção de Treg é mais pronunciada se o anticorpo puder engajar FcγRs ativadores. EXEMPLO 6 - ANTICORPOS BLOQUEADORES DE LIGANTE
ANTAGONISTAS NÃO INDUZEM GRANDES QUANTIDADES DE CITOCINAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS
[00277] (Veja também as figuras 17 a 18 e a descrição acima dessas figuras.)
[00278] A liberação de grandes quantidades de citocinas pró- inflamatórias é um possível efeito colateral dos anticorpos imunomoduladores usados para o tratamento de pacientes. Portanto, medimos aqui a liberação de citocinas induzida por anticorpos bloqueadores de ligantes antagonistas usando dois métodos diferentes. O primeiro é baseado na estimulação de anticorpos em culturas in vitro, e o segundo é baseado no xenoenxerto de células imunes humanas para camundongos imunodeficientes. Para in vitro, a configuração da cultura demonstrou impactar amplamente a liberação de citocinas (Vessillier et al., J Immunol Methods. Setembro de 2015; 424: 43 a 52). Para compensar as diferenças nas metodologias, três configurações diferentes de cultura in vitro foram usadas de acordo com publicações recentes.
[00279] Para os Ensaios de Liberação de Citocina (CRA) de Cultura de
89 / 94 Células de Alta Densidade (HDC), as PBMCs foram cultivadas a 1x107 células/ml em meio de teste CTL sem soro (Cell Technology Limited) suplementado com glutamina a 2 mM, piruvato a 1 mM, 100 IU/ml de penicilina e estreptomicina. 2 ml de cultura de células foram colocados em uma placa de 12 poços. Após 48 h, 10 µg/ml de anticorpo foram adicionados a 1x105 PBMCs pré-incubados em uma placa de fundo plano de 96 poços e incubados por 24 h.
[00280] A CRA de PBMC de fase sólida (SP) foi realizada revestindo poços de uma placa de 96 poços com 1 µg/ml de anticorpo por 1 h. Após a lavagem da placa com PBS, 1x105 PBMCs em 200 µl de meio completo foram adicionados por poço e incubados por 48 h.
[00281] A liberação de citocinas também foi medida após estimulação de 200 µl de sangue total com 5 µg/ml de anticorpo por 48 h.
[00282] No final do período de incubação, as placas foram centrifugadas e o sobrenadante da cultura foi retirado e armazenado a -20 °C. Concentrações de IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-8 e TNF-α foram medidos usando placas MSD personalizadas, de acordo com as instruções do fabricante (Meso Scale Discovery, EUA).
[00283] Em resumo, o anticorpo antagonista bloqueador não induziu nenhuma liberação significativa de citocina em nenhum dos cenários in vitro. Os anticorpos de controle positivo, Alemtuzumabe e OKT3 induziram citocinas, o mais pronunciado de todos foi IFN-γ, mas como visto na figura 17, o anticorpo 1H10 não induziu IFN-γ além de um anticorpo de controle de isotipo. Nenhuma outra citocina foi elevada até 1H10 (dados não mostrados). MODELO DE TOLERABILIDADE PBMC-NOG
[00284] Para investigar a tolerabilidade do mAb anti-TNFR2 humano antagonista bloqueador de ligante 1-H10, analisamos a liberação de citocinas in vivo no modelo PBMC-NOG como descrito abaixo.
[00285] Os camundongos foram criados e mantidos em instalações
90 / 94 locais, de acordo com as diretrizes do home office.
Camundongos NOG fêmeas com oito semanas de vida foram disponibilizados pela Taconic (Bomholt, Dinamarca) e mantidos em biotérios locais.
Para o modelo PBMC- NOG (xenoenxerto humano primário), PBMCs humanas foram isoladas com o uso de Ficoll Paque PLUS e, após a lavagem, as células foram ressuspensas em PBS estéril a 125x106 células/ml.
Os camundongos NOG foram injetados i.v. com 200 µl de suspensão de células que correspondem a 25x106 células/camundongo. 2 semanas após a injeção, amostras de sangue foram coletadas para analisar o nível de “humanização”, ou seja, a quantidade de células humanas no sangue dos camundongos NOG.
O sangue era composto de aprox. 40% de células T humanas e os camundongos foram considerados humanizados.
Os camundongos foram então tratados com 10 µg de Yervoy, anti-CD3 (OKT-3), 1-H10 ou mAb de controle de isotipo.
A temperatura corporal foi medida antes da injeção do anticorpo e 1 h após a injeção, Figura 18 A.
Como visto na Figura 18 A, o anticorpo de controle positivo OKT3 induziu uma redução dramática da temperatura corporal, conforme publicado anteriormente, e de acordo com a toxicidade observada na clínica com este anticorpo.
Em contraste, 1-H10 não mostrou qualquer efeito na temperatura corporal.
Cinco horas após a injeção de anticorpos, os experimentos foram encerrados e o sangue foi coletado para análise da liberação de citocinas (MSD). As citocinas medidas foram IFN-γ humano, TNF-α, IL-6 e IL1β.
Dentre esses, IFN-γ e TNF-α foram quantificados em níveis altos o suficiente para serem confiáveis.
Conforme visto nas Figuras 18 B e 18 C, o anticorpo de controle positivo OKT3 induziu liberação significativa de IFN-γ e TNF-α (de acordo com a toxicidade observada na clínica com este anticorpo), enquanto os camundongos tratados com 1H10 não tiveram liberação significativa de IFN-γ.
No entanto, houve uma tendência de aumento de liberação de TNF-α, embora não seja significativa e não tão dramática quanto para OKT3.
91 / 94
[00286] Em resumo, o exemplo 6 mostra que os anticorpos não bloqueadores de ligante de TNFR2, aqui exemplificados com o anticorpo denominado 1-H10, não induzem níveis substanciais de liberação de citocinas conforme medido por vários métodos publicados anteriormente. Uma vez que a liberação de citocinas é um fator limitante para desenvolvimento clínico de vários anticorpos imunomoduladores, isso indica um perfil de segurança aceitável a esse respeito. EXEMPLO 7 - EPÍTOPOS DE ANTICORPOS DIRECIONADOS AO TNFR2 GERADOS
NOCAUTES DE CONSTRUÇÃO DE DOMÍNIO
[00287] Em um primeiro conjunto de experimentos, construtos de DNA que codificam diferentes variantes de TNFR2, faltando um ou mais dos 4 domínios extracelulares, descritos na tabela 10, foram usados. Em um segundo conjunto de experimentos, foram utilizados construtos de DNA que codificam variantes de TNFR2, onde diferentes partes do domínio 3 foram trocadas com a parte murina correspondente, conforme descrito na tabela 11. O último é possível uma vez que nenhum dos anticorpos reage de forma cruzada ao TNFR murina. Em ambos os casos, as construções foram adquiridas da GeneArt (ThermoFisher). As construções foram clonadas em um vetor de expressão, contendo o promotor CMV e a origem OriP de replicação do plasmídeo, e expressas transitoriamente em células HEK293- EBNA adaptadas a suspensão. TABELA 10. CONSTRUTOS DE TNFR2 USADAS PARA
TRANSFECÇÃO EM QUE UM OU VÁRIOS DOMÍNIOS FORAM DELETADOS. Construto Descrição hTNFR2 tipo selvagem, TNFR2 humano de comprimento total (uniprot nº P20333) hTNFR2-Δ1 hTNFR2 com domínio TNFR-Cys 1 (aa 39-76) excluído hTNFR2-Δ2 hTNFR2 com domínio TNFR-Cys 2 (aa 77-118) excluído hTNFR2-Δ3 hTNFR2 com domínio TNFR-Cys 3 (aa 119-162) excluído hTNFR2-Δ4 hTNFR2 com domínio TNFR-Cys 4 (aa 163-201) excluído hTNFR2-Δ1+3 hTNFR2 com domínio TNFR-Cys 1 e 3 (aa 39-76 e 119-162) excluídos hTNFR2-Δ2+4 hTNFR2 com domínio TNFR-Cys 2 e 4 (aa 77-118 e 163-201) excluídos
92 / 94 TABELA 11. CONSTRUTOS DE TNFR2 USADOS PARA TRANSFECÇÃO, VÁRIAS PARTES DO DOMÍNIO 3 FORAM TROCADAS PELA SEQUÊNCIA MURINA CORRESPONDENTE. Construto Descrição hTNFR2 tipo selvagem, TNFR2 humano de comprimento total (uniprot nº P20333) mTNFR2 tipo selvagem, TNFR2 murino de comprimento total (uniprot nº P25119) hTNFR2-m1 hTNFR2 com aa 119-132 substituído por aa 120-133 de mTNFR2 hTNFR2-m2 hTNFR2 com aa 134-144 substituído por aa 135-146 de mTNFR2 hTNFR2-m3 hTNFR2 com aa 151-160 substituído por aa 153-162 de mTNFR2 hTNFR2-m4 hTNFR2 com aa 130-144 substituído por aa 131-146 de mTNFR2
ANÁLISE DE AGLUTINAÇÃO BASEADA EM CITOMETRIA DE FLUXO
[00288] As células HEK-293-E foram transfectadas com os respectivos plasmídeos de cDNA de variantes do TNFR2 usando Lipofectamin 2000. 48h após a transfecção, as células foram colhidas e coradas com os anticorpos indicados durante 30 minutos. Após 2 etapas de lavagem com PBS, os anticorpos ligados à superfície foram corados com um anti-IgG secundário acoplado a APC. Antes da análise de citometria de fluxo no citômetro de fluxo BD-Verse, as células foram lavadas e coradas para vivo/morto.
[00289] Os experimentos de aglutinação baseados em citometria de fluxo de células HEK 293 transfectadas mostraram claramente que o domínio 1 e o domínio 2 não afetam a aglutinação (domínio 1) ou afetam apenas marginalmente a aglutinação (domínio 2) de qualquer um dos anticorpos a essas células. Como controle positivo, foi utilizado um anticorpo policlonal anti-TNFR2 humano. O anticorpo de controle positivo mostrou alta aglutinação a todos os construtos testados, enquanto o anticorpo negativo não mostrou aglutinação (Figura 19). Todos os anticorpos testados mostraram uma perda completa de aglutinação ao TNFR2 sem o domínio 3. Da mesma forma, a maioria dos anticorpos não poderia se aglutinar ao TNFR2 se o domínio 4 estivesse ausente. Todos os anticorpos antagonistas (1H10, 4H02 e 5B08) mostraram aglutinação drasticamente reduzida a TNFR2 Δ4 de mais de 50% em comparação com a aglutinação a TNFR2 Δ1 e TNFR2 Δ2. Da mesma forma, a remoção de dois domínios do TNFR2 mostrou claramente
93 / 94 que a falta do domínio 3 ou 4 anulou severamente a aglutinação de todos os anticorpos testados ao TNFR2, com a possível exceção do anticorpo agonista 1F06, enquanto a falta do domínio 4 aboliu a aglutinação dos anticorpos agonistas e reduziu a aglutinação dos anticorpos antagonistas de forma significativa. (Figuras 19 E e 19 F). AGLUTINAÇÃO A TNFR2 QUIMÉRICO CAMUNDONGO-HUMANO
[00290] Para estreitar ainda mais o local de aglutinação e definir os epítopos, partes do domínio 3 do TNFR2 humano foram substituídas pela sequência de camundongo correspondente. Uma vez que todos os anticorpos mostram muito pouca reatividade cruzada com o TNFR2 de camundongo, uma perda de aglutinação a certos construtos permitiria refinar o epítopo de aglutinação. A Figura 20 exibe as diferentes construções de TNFR2 quiméricas de camundongo-humano. Quatro substituições diferentes foram feitas, trocando 14 (m1), 12 (m2), 10 (m3) ou 16 (m4) aminoácidos da sequência humana pela sequência de camundongo correspondente. Os outros três domínios (1, 2, 4) contêm sequências exclusivamente humanas.
[00291] Esses construtos (domínios de TNFR2 1-4 com mutações em 3) foram então transfectadas em células HEK293 e os anticorpos foram testados quanto à aglutinação utilizando uma abordagem de citometria de fluxo. Como controles positivos, foram usados anticorpos policlonais contra TNFR2 de camundongo, bem como contra TNFR2 humano. Como esperado, devido à similaridade de sequência, ambos os anticorpos de controle policlonal mostraram reatividade cruzada significativa e reconheceram TNFR2 humano e de camundongo. Obviamente, os melhores sinais foram alcançados ao combinar os anticorpos com o alvo pretendido.
[00292] Nossos anticorpos monoclonais mostraram forte aglutinação ao TNFR2 humano, mas nenhuma ou apenas muito pouca aglutinação ao TNFR2 de camundongo (Figura 21 painéis à esquerda). Uma aglutinação semelhante com muito pouca redução foi observada para todos os clones ao
94 / 94 construto hTNFR2 m1 com mutações nos aas 119-132, indicando que nenhum dos anticorpos se liga a um epítopo dentro dessa região. No entanto, as mutações em aa 134-144 (construto hTNFR2 m2) anularam a aglutinação completamente para metade dos anticorpos testados, correspondendo aos anticorpos bloqueadores antagonistas 1-H10, 4-H02 e 5-B08, indicando que os anticorpos se aglutinam pelo menos parcialmente dentro desta região. O 1- G10 é um bloqueador parcial também fortemente afetado por esta substituição. Digno de nota, os anticorpos agonistas (1-F02, 1-F06 e 4-E08) retiveram a aglutinação usando o construto 2, sugerindo fortemente um epítopo diferente em comparação com os anticorpos antagonistas. Curiosamente, todos os anticorpos perderam a aglutinação ao construto de hTNFR2 m3 com mutações nos aas 151-160. Isso indica que todos os anticorpos, tanto agonistas quanto antagonistas, têm pelo menos um epítopo parcial dentro dessa sequência. O teste de um construto de hTNFR2 m4 ligeiramente maior com mutações em aa 130-144 mostrou aglutinação semelhante ao do construto hTNFR2 m2.
CONCLUSÕES DE EPÍTOPOS DE AGLUTINAÇÃO
[00293] Agrupando os anticorpos em seu papel funcional, os anticorpos agonistas (1-F02, 1-F06 e 4-E08), parecem se aglutinar a uma parte terminal C muito distal do domínio 3 abrangendo aa 151-160 e provavelmente se estendendo a uma parte maior do domínio 4, enquanto o epítopo para os antagonistas (1-H10, 5-B08 e 4-H02) é deslocado mais em direção ao centro do domínio 3, abrangendo aa 134-160 e provavelmente cobre uma parte menor do domínio 4. No entanto, apesar disso, seus epítopos parecem se sobrepor até certo ponto.
[00294] Nenhum dos anticorpos se aglutina à parte terminal N do domínio 3, aa 119-134. Os locais de aglutinação ao domínio 4 são bastante prováveis para todos os anticorpos, mas não foram identificados completamente.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Molécula de anticorpo antagonista caracterizada pelo fato de que se aglutina especificamente ao TNFR2 em uma célula-alvo e, assim, bloqueia a aglutinação de TNF-α a TNFR2 e bloqueia a sinalização de TNFR2, e em que a molécula de anticorpo também se liga a um receptor Fcγ através de sua região Fc.
    2. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo se aglutina com maior afinidade aos receptores Fcγ ativadores do que aos receptores Fcγ inibidores.
    3. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a aglutinação da molécula de anticorpo ao TNFR2 resulta em mudança nos números e/ou frequência de células que expressam TNFR2 em tecido doente.
    4. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a aglutinação da molécula de anticorpo a TNFR2 resulta na infiltração de células T e/ou células mieloides em tecido doente e/ou uma mudança na composição de células T e/ou células mieloides em tecido doente.
    5. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em: um anticorpo de tamanho completo, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única e um fragmento de aglutinação a antígeno do mesmo que retém a capacidade de aglutinar um receptor Fc por meio da sua região Fc.
    6. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que se aglutina a TNFR2 humano (hTNFR2) e/ou a TNFR2 de macaco cinomolgo (cmTNFR2).
    7. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em uma molécula de anticorpo IgG humano, uma molécula de anticorpo IgG humanizado e uma molécula de anticorpo IgG de origem humana.
    8. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 7, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo IgG1 humano.
    9. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que foi projetada para melhorar a aglutinação aos receptores Fc gama ativadores.
    10. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.
    11. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que não se aglutina especificamente a um epítopo que compreende ou que consiste na sequência KCSPG.
    12. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em moléculas de anticorpo que compreendem 1 a 6 dentre as CDRs VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3, em que VH-CDR1, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 1, 9 e 17; em que VH-CDR2, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 2, 10 e 18; em que VH-CDR3, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 3, 11 e 19; em que VL-CDR1, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 4, 12 e 20;
    em que VL-CDR2, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 5, 13 e 21; e em que VL-CDR3, se presente, é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. ID. NOs: 6, 14 e 22.
    13. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que compreende uma cadeia pesada variável (VH) que compreende as seguintes CDRs (i) SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 2 e SEQ. ID. NO: 3; ou (ii) SEQ. ID. NO: 9, SEQ. ID. NO: 10 e SEQ. ID. NO: 11; ou (iii) SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 18 e SEQ. ID. NO: 19; e/ou em que a molécula de anticorpo compreende uma cadeia leve variável (VL) que compreende as seguintes CDRs: (i) SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5 e SEQ. ID. NO: 6; ou (ii) SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13 e SEQ. ID. NO: 14; ou (iii) SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 21 e SEQ. ID. NO:
    22.
    14. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido de cadeia pesada variável (VH) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID. NOs 7, 15 e 23; e/ou em que a molécula de anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve variável (VL) selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ. ID. NOs: 8, 16 e 24.
    15. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a molécula de anticorpo é caracterizada pelo fato de que é uma molécula de anticorpo que tem capacidade para competir pela aglutinação a TNFR2 com uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14.
    16. Sequência de nucleotídeos isolada caracterizada pelo fato de que codifica uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
    17. Plasmídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16.
    18. Vírus caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, ou um plasmídeo de acordo com a reivindicação 17.
    19. Vírus de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação.
    20. Célula caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, ou um plasmídeo de acordo com a reivindicação 16, ou um vírus de acordo com a reivindicação 18 ou 19.
    21. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 17, um vírus de acordo com a reivindicação 18 ou 19, e/ou um célula de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é para uso em medicina.
    22. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 17, um vírus de acordo com a reivindicação 18 ou 19, e/ou uma célula de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer ou de uma infecção causada por um patógeno intracelular.
    23. Molécula de anticorpo, sequência de nucleotídeos,
    plasmídeo, vírus e/ou célula para uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o paciente a ser tratado é um paciente com alta expressão de TNFR2 em tecido doente.
    24. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, plasmídeo de acordo com a reivindicação 17, vírus de acordo com a reivindicação 19 e/ou célula de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer em combinação com: uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; e/ou uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação, um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um vírus que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação.
    25. Uso de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 17, um vírus de acordo com a reivindicação 18, e/ou uma célula de acordo com reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para uso no tratamento de câncer ou de uma infecção causada por um patógeno intracelular.
    26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é para uso no tratamento de câncer ou de uma infecção em um paciente com alta expressão de TNFR2 em tecido doente.
    27. Uso de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é para uso no tratamento de câncer e deve ser administrada em combinação com: uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; e/ou uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação, um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um vírus que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação.
    28. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 17, um vírus de acordo com a reivindicação 18 ou 19, e/ou uma célula de acordo com a reivindicação 20, e opcionalmente um diluente, carreador, veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
    29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer ou de uma infecção causada por um patógeno intracelular.
    30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer em combinação com uma composição farmacêutica que compreende: uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; e/ou uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação, um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um vírus que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação
    31. Método para tratar câncer ou uma infecção causada por um patógeno intracelular em um paciente caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, uma sequência de nucleotídeos de acordo com a reivindicação 16, um plasmídeo de acordo com a reivindicação 20, um vírus de acordo com a reivindicação 21 ou 22, uma célula de acordo com a reivindicação 23, ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29.
    32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o paciente é um paciente com alta expressão de TNFR2 em tecido doente.
    33. Método para tratar câncer de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que também uma quantidade terapeuticamente eficaz de: uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação; e/ou uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação, um plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação ou um vírus que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo que se aglutina especificamente a um inibidor de ponto de verificação é administrada ao paciente.
    34. Molécula de anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 24, sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a reivindicação 24, plasmídeo para uso de acordo com a reivindicação 24, vírus de acordo com a reivindicação 19, vírus para uso de acordo com a reivindicação 24, célula para uso de acordo com a reivindicação 24, uso de acordo com para a reivindicação 27, composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30, ou método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação é PD-1.
    35. Molécula de anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 24, sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a reivindicação 24, plasmídeo para uso de acordo com a reivindicação 24, vírus de acordo com a reivindicação 19, vírus para uso de acordo com a reivindicação 24, célula para uso de acordo com a reivindicação 24, uso de acordo com para a reivindicação 27, composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30, ou método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de verificação é PD-L1.
    36. Molécula de anticorpo para uso de acordo com a reivindicação 22, 23, 24, 34 ou 35, sequência de nucleotídeos para uso de acordo com a reivindicação 22, 23, 24, 34 ou 35, plasmídeo para uso de acordo com a reivindicação 25, 26, 34 ou 35, vírus para uso de acordo com a reivindicação 25, 26, 34 ou 35, célula para uso de acordo com a reivindicação 22, 23, 24, 34 ou 35, uso de acordo com para a reivindicação 25, 26, 27, 34 ou 35, composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29, 30, 34 ou 35, ou método de acordo com a reivindicação 31, 32, 33, 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer sólido.
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