BR112021004081A2 - nanopartículas virucidas, composição farmacêutica, composição virucida, método de desinfecção e/ou esterilização, dispositivo e uso das nanopartículas virucidas - Google Patents

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Valeria Cagno
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Francesco Stellacci
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Abstract

A presente invenção se refere a nanopartículas virucidas compreendendo uma porção de trissacarídeo e uso das mesmas contra o vírus da influenza.

Description

NANOPARTÍCULAS VIRUCIDAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO VIRUCIDA, MÉTODO DE DESINFECÇÃO E/OU ESTERILIZAÇÃO, DISPOSITIVO E USO DAS NANOPARTÍCULAS
VIRUCIDAS Campo da invenção
[001] A invenção se refere a nanopartículas virucidas compreendendo uma porção de trissacarídeo e uso das mesmas contra o vírus da influenza. Antecedentes da Invenção
[002] Os vírus da influenza estão entre os vírus mais infecciosos. Todos os anos, diferentes cepas de influenza infectam uma grande porção da população animal e humana, colocando em risco bebês, idosos e pessoas imunocomprometidas, todos com risco de hospitalização e morte devido a complicações relacionadas à influenza. Como resultado, a influenza sazonal apresenta impactos notáveis na socioeconômica. Na verdade, as doenças respiratórias podem custar uma porção significativa dos gastos totais com saúde nos países desenvolvidos e principalmente nos países em desenvolvimento. Como a influenza sofre mutações tão rapidamente, o desenvolvimento de uma vacina ainda é um grande desafio. O desenvolvimento de vacinas representaria desafios ainda maiores quando focado em pandemias ocasionais em vez de surtos anuais. Nesse caso, o tempo de desenvolvimento de uma nova vacina, que é em média de 6 meses, representaria um sério risco. Além disso, mesmo na presença de uma vacina, alcançar uma cobertura vacinal razoável está longe de ser uma conclusão precipitada. Portanto, o risco de uma nova pandemia, como a influenza espanhola, ainda está presente e é reconhecida como uma das principais ameaças à saúde global.
[003] Naturalmente, a segunda linha de defesa, depois das vacinas, são os antivirais. Vários medicamentos anti-influenza estão atualmente aprovados: inibidores da neuraminidase, como zanamivir e oseltamivir, inibidores do canal iônico, como amantadina, inibidores de fusão, como umifenovir (apenas na Rússia e China) e inibidor da polimerase, como baloxavir marboxil, que foi recentemente aprovado nos EUA e no Japão. No entanto, é reconhecido que a eficácia dos medicamentos atuais está longe do ideal. As preocupações com essas drogas variam de efeitos colaterais significativos ao aparecimento de vírus resistentes a drogas após um curto período de uso. Dada a importância desta questão, vários outros medicamentos estão em ensaios clínicos. A maioria dessas drogas são anticorpos monoclonais que inibem a fusão do vírus com a célula hospedeira. Embora sejam promissores, é provável que sejam consideravelmente caros devido aos seus processos de fabricação.
[004] Existem algumas linhas de pesquisa sobre o desenvolvimento de moléculas que possuem como alvo partes conservadas do vírus. Além disso, a busca por drogas virucidas (isto é, irreversíveis) com toxicidade limitada tem sido muito desafiadora. Recentemente, descobriu-se que peptídeos isolados da pele de rã possuem tal propriedade, mas seu EC50 é apenas micromolar e sua toxicidade é discutível.
[005] A interação entre a hemaglutinina viral (HA) e as glicoproteínas portadoras de ácido siálico (SA) nas células hospedeiras é a etapa primária da infecção por influenza. A afinidade de ligação entre o SA e o HA é baixa e compensada pela ligação multivalente. Inspirado por este fenômeno natural, houve várias tentativas de inibir o vírus da influenza usando materiais multivalentes revestidos com SA, como polímeros, dendrímeros e nanopartículas.
[006] Reuter et al. materiais de polímero decorados com ácido siálico sintetizado em várias arquiteturas, tal como polímeros lineares, polímeros ramificados em pente e dendrons; testou-os contra diferentes cepas do vírus da influenza A. Apenas arquiteturas ramificadas de alto peso molecular (> 100 kDa) foram encontradas inibindo uma cepa do vírus da influenza, X-31, em concentrações micro molares de ácido siálico. Papp et al. testou a atividade de inibição de nanopartículas de ouro funcionalizadas com ácido siálico (NPs) contra o vírus da influenza, uma cepa X-31, e relataram que NPs de diâmetro de núcleo de 14 nm possuem melhor atividade de inibição do que NPs de 2 nm. No entanto, neste estudo eles não mencionaram as concentrações de NP para inibir o vírus. O mesmo grupo também sintetizou glicoarquiteturas decoradas com ácido siálico de tamanhos diferentes e inibiu a cepa X-31 em concentrações milimolares.
[007] Era sabido que o vírus da influenza humana se liga de forma preferencial a um SA ligado a α2,6 nas glicoproteínas. Mais recentemente, materiais multivalentes contendo α2,6-sialillactose demonstraram inibir o vírus da influenza em baixas concentrações micromolares. Tang et al. polímeros em escova sintetizados contendo α2,6-sialillactose que inibiu a cepa da influenza A PR8 em concentrações micromolares da unidade de ácido siálico. Kwon et al. decorou os dendrímeros PAMAM com α2,6- sialillactose e inibiu várias cepas de influenza, como influenza A PR8, CAL 09 e NWS 33.
[008] As concentrações de material micromolar para inibir o vírus da influenza in vitro ainda são muito altas e as concentrações in vivo serão ainda maiores. Além disso, a maioria dos inibidores de entrada são virustáticos; o vírus torna-se infeccioso novamente após a diluição do complexo vírus-material in vitro.
[009] Na ausência de uma vacina eficaz de amplo espectro, há uma necessidade não atendida de medicamentos contra a influenza. Um medicamento anti-influenza ideal deve ser de amplo espectro, ter como alvo uma parte altamente conservada do vírus, ter um efeito irreversível, ou seja, ser viricida (a fim de evitar perda de eficácia devido à diluição nos fluidos corporais) em baixas concentrações, e obviamente não é tóxico. Descrição Resumida da Invenção
[010] Para resolver este problema, a presente invenção fornece nanopartículas que interagem fortemente com o HA, inibem irreversivelmente a infecciosidade do vírus da influenza em baixas concentrações e exibem toxicidade excessivamente baixa.
[011] Um aspecto da presente invenção fornece uma nanopartícula virucida compreendendo um núcleo e uma pluralidade de ligantes ligados de forma covalente ao núcleo, em que pelo menos uma porção dos referidos ligantes compreende uma porção de trissacarídeo e em que: - o núcleo é a ciclodextrina, - os ligantes são iguais ou diferentes e são ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos, e - cada porção de trissacarídeo é selecionada a partir de 3-
sialil-N-acetillactoseamina (3’SLN) e 6-sialil-N- acetillactoseamina (6’SLN).
[012] Outro aspecto da presente invenção fornece uma nanopartícula virucida representada pela Fórmula (I) Ciclodextrina Porção de trissacarídeo em que m é 2 a 8, e n é 2 a 28 ou 4 a 13.
[013] Outro aspecto da presente invenção fornece uma nanopartícula virucida representada pela Fórmula (II) em que: cada R, de maneira independente, é um ligante à base de alquila opcionalmente substituído, em que pelo menos dois dos referidos ligantes possuem uma porção de trissacarídeo selecionada a partir do grupo que compreende 3-sialil-N- acetillactoseamina (3’SLN) e 6-sialil-N-acetillactoseamina
(6’SLN), ou em que pelo menos um dos referidos ligantes possui 3’SLN e outro possui 6’SLN; cada R’, de maneira independente, é H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y- SO3-, um polímero ou uma porção com solubilização em água; x é 6, 7 ou 8; e y é um número inteiro de 4 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[014] Um outro aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais nanopartículas virucidas da presente invenção e pelo menos um excipiente, veículo e/ ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[015] Um outro aspecto da presente invenção fornece a nanopartícula virucida da presente invenção para uso no tratamento e/ ou prevenção de infecções pelo vírus da influenza e/ ou doenças associadas ao vírus da influenza.
[016] Um outro aspecto da presente invenção fornece uma composição virucida que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais nanopartículas virucidas da presente invenção e, opcionalmente, pelo menos um veículo de aerossol adequado.
[017] Um outro aspecto da presente invenção fornece um método de desinfecção e/ ou esterilização que compreende o uso das composições viricidas da presente invenção ou uma nanopartícula viricida da presente invenção.
[018] Um outro aspecto da presente invenção fornece um dispositivo compreendendo as composições virucidas da presente invenção, ou uma ou mais nanopartículas virucidas da presente invenção e meios para aplicar ou dispensar as composições virucidas ou as nanopartículas virucidas.
[019] Um outro aspecto da presente invenção fornece uma utilização das nanopartículas virucidas da presente invenção ou das composições virucidas da presente invenção para esterilização e/ ou para desinfecção. Breve descrição das figuras
[020] A Figura 1 mostra a estrutura química de NPs com composição de ligante diferente. Diâmetro NP médio: 2,9 ± 0,9 nm.
[021] A Figura 2 mostra imagens TEM da cepa Vic/ 11 do vírus H3N2: sem NPs (A), o vírus após 1 hora de incubação com NPs de LD 6’SLN (B) e com NPs de PEG(5) (C).
[022] A Figura 3 mostra a estrutura química de β-CD modificado por C15-6’SLN (A). Concentrações EC50 do CD modificado contra diferentes cepas de influenza (B). Atividade virucida contra a cepa PB/09 (C) experimento ex vivo no MucilAir (D). Ilustração de CD modificado interagindo com a cabeça globular HA (E).
[023] A Figura 4 mostra ciclodextrinas modificadas de exemplo. O número de 6’SLN ou 3’SLN por β-CD é o número médio calculado por 1H NMR. As estruturas químicas representativas das ciclodextrinas modificadas foram construídas com base nos resultados de NMR. EC50 representa as concentrações semi-inibitórias em células MDCK a 24 hpi contra A/ Países Baixos/ 2009 (H1N1) (Figura 7). N/ A: não avaliável. Para facilidade de referência nessas estruturas 3D, alguns dos açúcares, ligantes e trissacarídeos da ciclodextrina da retaguarda não são mostrados.
[024] A Figura 5 mostra que estudos 1H NMR foram conduzidos a fim de caracterizar as ciclodextrinas modificadas mostradas na Figura 4. O número médio de 6’SLN ou 3’SLN por β-ciclodextrina foi calculado comparando um pico distinto do trissacarídeo (♦) a um de β-ciclodextrina (•). Ambos os picos correspondem a um único hidrogênio.
[025] A Figura 6 mostra curvas de dose- resposta que demonstram a atividade antiviral de C6-6’(A), C14-6’ (B), C11-3’ (C) e C1-6’ (D) contra A/ Países Baixos/ 2009 H1N1. Os resultados são a média de 2 experimentos independentes realizados em duplicata.
[026] A Figura 7 mostra curvas de dose- resposta que demonstram a atividade antiviral de C11-6’ contra B/ Wisconsin/ 2010 (A), A/ Clínica/ 2018 H1N1 (B), A/ Cingapura/ 2004 H3N2 (C) e B/ Clínica/ 2018 (D). Os resultados são a média de 2 experimentos independentes realizados em duplicata.
[027] A Figura 8 mostra curvas de dose- resposta que demonstram a atividade antiviral de C11-3’ contra cepas aviárias A/ Turquia/ Turquia/ 2005 H5N1 (junto com controle de C11-6’) (A) e A/ Turquia/ Itália/ 977/ 1999 H7N1 (B). No caso do gráfico A, a infecção foi quantificada com os métodos FACS e ICC. Os resultados são a média de 2 experimentos independentes realizados em duplicata.
[028] A Figura 9 mostra a comparação da atividade antiviral de C11-6’ e P8-6’ in vitro. Os painéis (a) e (b) mostram nos gráficos à esquerda a atividade inibitória de cada composto contra A/ PB/ 09, sobreposta aos resultados dos ensaios de viabilidade celular. Todos os compostos apresentam um comportamento muito semelhante. Nos gráficos à direita nestes painéis são mostrados os resultados do teste viricida (isto é, diluição). Observe que nos eixos da Figura, ffu significa unidades formadoras de foco e NT para não tratado. Em (c), C11-6’ foi testado contra as seguintes cepas virais: A/ Cingapura/ 2004 (H3N2), B/ Wisconsin/ 2010 e A/ Clínica/ 2018 (H1N1). Os resultados são a média e SEM de 2 experimentos independentes realizados em duplicata.
[029] A Figura 10 mostra a atividade virucida de C14-6’ (A), C6-6’ (B) e C11-3’ (C) contra A/ Países Baixos/ 2009 (H1N1). Os experimentos foram realizados com uma concentração de composto de 100 μg/ mL. Os resultados são a média e SEM de 2 experimentos independentes.
[030] A Figura 11 mostra a comparação da atividade inibitória ex vivo de C11-6’ e P8-6’. C11-6’ forneceu uma proteção total contra a cepa H1N1 09 da pandemia clínica em condição de co-tratamento, enquanto P8-6’ forneceu apenas uma proteção mínima no início da infecção (a). Na Figura 11 (b), a imunofluorescência de 7 dias após a infecção (condição de co-tratamento) confirma a proteção fornecida por C11-6’. Vermelho: anticorpo monoclonal da Influenza A, azul: DAPI, verde: β-IV-tubulina (marcador de células ciliadas). A espessura de cada tecido foi demonstrada na parte inferior da imagem correspondente (b). C11-6’ também mostrou alta eficácia na condição pós-tratamento (c). Os resultados de (a) e (c) são a média e SEM de 2 a 4 experiências independentes realizadas em duplicado. As imagens de (b) são representativas de 10 imagens tiradas para cada condição.
[031] A Figura 12 mostra a liberação de LDH de tecidos infectados. Os tecidos foram infectados e tratados com C11-6’ (50 μg) ou P8-6’ no momento da infecção. Lavagens apicais realizadas em 96 e 24 hpi foram submetidas à medição de LDH. Os resultados são a média e SEM de 2 experimentos independentes para H1N1 e H1N1 de C11-6’ e de um único experimento realizado em duplicata para P8-6’.
[032] A Figura 13 mostra uma longa experiência de co-tratamento. Os tecidos foram infectados e tratados com C11-6’ (50 μg) no momento da infecção. As lavagens apicais diárias foram coletadas nos primeiros 5 dias, e posteriormente aos 9, 17 e 23 dias, com uma lavagem no dia anterior para avaliar a produção diária de vírus. Os resultados são a média de um único experimento realizado em duplicata.
[033] A Figura 14 mostra a toxicidade ex vivo. Os tecidos foram tratados com diferentes doses de C11-6’ ou um volume igual de meio ou triton 5% com adição diária. 96 horas após o tratamento, os tecidos foram submetidos a: A) ensaio de MTT, B) ensaio de LDH em que a viabilidade dos tecidos foi avaliada, C) avaliação da resistência epitelial trans e D) ensaio de ELISA para avaliar a liberação de citocinas pró-inflamatórias. LDH e ELISA foram realizados em meio basal coletado. Os experimentos são a média e SEM de 2 experimentos independentes.
[034] A Figura 15 mostra a atividade antiviral in vivo de C11-6’. (a - c) Os camundongos foram tratados por via nasal com PBS ou C11-6’ simultaneamente e 48 horas após a infecção com A/ PB/ 09. As cargas virais foram quantificadas 48 e 96 horas após a infecção (a) e a morbidade (perda de temperatura (b) e peso (c)) dos camundongos infectados foi monitorada diariamente, (d - f) Os camundongos foram tratados intranasalmente com PBS ou C11-6’ 6 horas após a infecção e diariamente durante 3 dias (14 μg/ camundongo). Morbidade (d - e) e sobrevivência (f) de camundongos infectados foram monitorados diariamente. Os resultados são expressos como médias ± SEM. As setas indicam os tempos de tratamento.
[035] A Figura 16 mostra 1H NMR specta empilhados de β-clicodextrina, 6’SLN-β-etilamina e C11-6’. A Figura 17 mostra o espectro DOSY do C11-6’ demonstrando que o composto resultante é isento de trissacarídeos não ligados.
[036] A Figura 18 mostra a estratégia de aprisionamento realizada para FACS. Descrição detalhada da invenção
[037] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. As publicações e pedidos discutidos neste documento são fornecidos apenas para sua invenção antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não possui o direito de anteceder tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
[038] Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto ao qual a matéria neste documento pertence. Tal como aqui utilizadas, as seguintes definições são fornecidas a fim de facilitar a compreensão da presente invenção.
[039] O termo “compreende” é de forma geral usado no sentido de incluir, ou seja, permitir a presença de uma ou mais características ou componentes. Além disso, conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, a linguagem “compreendendo” pode incluir formas de realização análogas descritas em termos de “consistindo em” e/ ou “consistindo essencialmente em”.
[040] Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo “e/ ou” usado em uma frase como “A e/ ou B” neste documento se destina a incluir “A e B”, “A ou B”, “A”, e “B”.
[041] Conforme usado no relatório descritivo e reivindicações, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[042] Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo “pelo menos um” usado em uma frase como “pelo menos um átomo C” pode significar “um átomo C” ou “dois átomos C” ou mais átomos C.
[043] Tal como usado neste documento, o termo “virustático” refere-se a uma caracterização da eficácia antiviral determinada por teste in vitro que demonstra a inibição reversível da infecciosidade de um vírus após a interação com uma composição antiviral. A interação inibe a infecciosidade, por exemplo, pela ligação ao vírus ou de outra forma interferindo com os ligantes de superfície do vírus. No entanto, uma vez que a interação termina (por exemplo, por diluição) e na ausência de quaisquer materiais adicionados ou condições que promovam a reconstituição viral,
é possível que o vírus retome a infectividade.
[044] Tal como usado neste documento, o termo “virucida” refere-se a uma caracterização da eficácia antiviral determinada por testes in vitro que demonstram a inibição irreversível da infecciosidade de um vírus após interação com um composto ou composição antiviral. A interação inibe a infecciosidade, por exemplo, pela ligação ao vírus ou de outra forma interferindo com os ligantes de superfície do vírus. No entanto, mesmo após o término da interação (por exemplo, por diluição) e na ausência de quaisquer materiais adicionados ou condições que promovam a reconstituição viral, é essencialmente impossível para o vírus retomar a infectividade.
[045] Tal como usado neste documento, o termo “biocompatível” refere-se à compatibilidade com células, tecidos, órgãos ou sistemas vivos e não possui risco significativo de lesão, toxicidade ou rejeição pelo sistema imunológico.
[046] Conforme usado neste documento, “nano”, tal como usado em “nanopartícula”, refere-se ao tamanho nanométrico, tal como uma partícula com um tamanho nanométrico, e não se destina a transmitir qualquer limitação de forma específica. Em particular, “nanopartícula” abrange nanoesferas, nanotubos, nanoboxes, nanoclusters, nanobastões e semelhantes. Em certas formas de realização, as nanopartículas e/ ou núcleos de nanopartículas aqui contemplados possuem uma geometria de forma geral poliédrica ou esférica.
[047] Tal como usado neste documento, “influenza” refere-se a vírus de RNA (humano ou animal),
transmissíveis pelo ar, que buscam ácido siálico, tais como vírus da influenza A, vírus da influenza B, vírus da influenza C e vírus da influenza D. O vírus da influenza A engloba os seguintes serotipos: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 e H6N1.
[048] Conforme usado neste documento, o termo “alquila” refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear contendo de 1 a 50 átomos de carbono, de forma preferencial 4 a 30 átomos de carbono. Exemplos representativos de alquila incluem, mas não estão limitados a metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila,
[049] Tal como usado neste documento, o termo “carboxialquila” refere-se a um grupo carboxi anexado à porção molecular parental através de um grupo alquila como aqui definido.
[050] Embora os ácidos siálicos ligados a α2,6 sejam conhecidos por interagirem com o vírus da influenza humana, a sequência exata de glicano que fornece ligação de alta afinidade permaneceu obscura na literatura. Os presentes inventores demonstraram que a maioria dos vírus da influenza humana se ligam com alta afinidade a glicanos que terminam com duas ou mais, de preferência três ou quatro porções trissacarídicas, de forma específica 6-sialil-N- acetillactoseamina (6’SLN) ou 3-sialil-N-acetillactoseamina (3’SLN).
[051] Um aspecto da presente invenção fornece uma nanopartícula virucida compreendendo um núcleo e uma pluralidade de ligantes ligados de forma covalente ao núcleo, em que pelo menos uma porção dos referidos ligantes compreende uma porção de trissacarídeo e em que
- o núcleo é nanopartícula de metal ou material orgânico, em que, de preferência, a nanopartícula de metal é selecionada a partir do grupo que compreende nanopartículas de ouro, nanopartículas de óxido de ferro, nanopartículas de prata, nanopartículas de platina, nanopartículas de cobalto, nanopartículas de zinco, nanopartículas de sílica, nanopartículas de seleneto de cádmio, nanopartículas de liga de ouro, nanopartículas de óxido de alumínio, nanopartículas de óxido de cobre, nanopartículas de óxido de magnésio, nanopartículas de óxido de níquel, nanopartículas de dióxido de titânio, nanopartículas de óxido de zinco e, de forma mais preferencial, a nanopartícula de metal é uma nanopartícula de ouro, e em que o material orgânico é selecionado a partir do grupo que compreende ciclodextrinas, polímeros, dendrímeros e dendrons, de preferência o material orgânico é uma ciclodextrina, - os ligantes são iguais ou diferentes e são ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos ou ligantes à base de polietilenoglicol (PEG). De preferência, os ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos são ligantes à base de alquila C4-C30 opcionalmente substituídos, de forma mais preferencial os ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos são carboxialquila C4-C30 opcionalmente substituídos; de forma preferencial ligantes à base de PEG são selecionados a partir do grupo que compreende PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8; de forma mais preferencial, os ligantes são derivados do grupo que compreende polietilenoglicol 5 (PEG5), ácido 16-mercaptohexadecônico (C15) e ácido 11-mercaptoundecanóico, - a porção de trissacarídeo é 3-sialil-N-acetillactoseamina
(3’SLN) e/ ou 6-sialil-N-acetillactoseamina (6’SLN).
[052] No contexto da presente invenção, a porção de trissacarídeo é exposta em um ligante ligado de forma covalente à superfície externa de uma nanopartícula (NP) de forma que quaisquer outros ligantes não impeçam a interação entre a porção de trissacarídeo e o vírus da influenza.
[053] O diâmetro médio do núcleo varia de cerca de 1,0 nm a cerca de 200 nm, de forma preferencial de 1 nm a 5 nm, de forma mais preferencial de 1,5 nm a 3 nm. O tamanho total das nanopartículas possui um diâmetro médio de partícula de 3 nm a 250 nm, ou de 3 nm a 200 nm, de forma preferencial de 3 nm a 10 nm, de forma mais preferencial de 4,5 nm a 6 nm.
[054] Em algumas formas de realização, o núcleo em nanopartículas virucidas da invenção é um material orgânico, de preferência um polímero, em que um polímero é selecionado a partir do grupo que compreende ácido poliacrílico (PAA), álcool polivinílico (PVA), polietilenoglicol (PEG), ácido polilático (PLA), poliglicólido (PGA), polidioxanona (PDO) e poli (ácido láctico-co-glicólico).
[055] Em algumas formas de realização, o núcleo em nanopartículas virucidas da invenção é um material orgânico, de preferência um dendrímero selecionado a partir do grupo que compreende poli (amidoamina) (PAMAM) e bis-MPA.
[056] Em algumas formas de realização, o núcleo em nanopartículas virucidas da invenção é um material orgânico, de preferência um dendron selecionado a partir do grupo que compreende poli (amidoamina) (PAMAM) e bis-MPA.
[057] Em formas de realização preferidas, o núcleo em nanopartículas virucidas da invenção é um material orgânico que é ciclodextrina.
[058] As ciclodextrinas (CDs) são derivados cíclicos de glicose de ocorrência natural que consistem em unidades de glucopiranosídeo ligadas a alfa (14). Sua estrutura cíclica cria um formato de cone truncado com as hidroxilas primárias das unidades de glicose na face estreita e as hidroxilas secundárias na face mais larga. Cada rosto pode ser funcionalizado de forma rápida e independente. Os CDs naturais mais comumente usados possuem 6, 7 e 8 unidades de glucopiranosídeo, conhecidas como alfa, beta e gama ciclodextrina, respectivamente. A ciclodextrina preferida é beta. Devido à estrutura cíclica dos CDs, eles possuem uma cavidade capaz de formar complexos de inclusão supramolecular com moléculas hóspedes. Como os CDs ocorrem naturalmente, são prontamente funcionalizados, possuem uma cavidade para inclusão de hóspedes e são biocompatíveis, eles encontraram uso em muitas aplicações comerciais, incluindo entrega de drogas, purificadores de ar, etc. A diferença na reatividade de cada face dos CDs foi usada para a síntese de uma ampla gama de ciclodextrinas modificadas. A face principal dos CDs é mais facilmente modificada, sendo possível o controle sobre o grau e a localização da substituição. Derivados de CD que carregam um bom grupo de saída, como CDs halogenados, são intermediários importantes na funcionalização de CD. Ao substituir todas as unidades de hidroxilas primárias de CDs por unidades de iodo, obtém-se um intermediário que permite a completa funcionalização da face primária, enquanto deixa intactas as hidroxilas secundárias e o formato de cone truncado rígido. Em uma forma de realização, heptakis-6-iodo-6-deoxi-beta-ciclodextrina foi sintetizado seguido por reação com mercaptoundecaosulfonato (MUS) para produzir um CD funcionalizado na face primária com grupos undecanaosulfonato. É então possível modificar independentemente a face secundária da ciclodextrina para introduzir mais grupos de solubilização, moléculas de corante, polímeros, etc. Além disso, o tamanho de β-CD (d ~ 1,5 nm) cai dentro do tamanho de nano preferido para núcleos de invenção e combina bem com a cabeça globular HA (~ 5 nm). A beta-ciclodextrina possui uma estrutura química rígida que se acredita contribuir para a atividade virucida e pode ter no máximo 7 ligantes contendo trissacarídeos, dependendo da face estreita, de preferência 3 a 4 ligantes contendo trissacarídeos, sendo três o número de pontos de ligação de ácido siálico na cabeça globular HA do vírus da influenza.
[059] As nanopartículas virucidas da presente invenção também podem ser moléculas simples purificadas ou compostos que também se destinam a ser englobados no escopo da presente invenção.
[060] Uma forma de realização da presente invenção fornece uma nanopartícula virucida compreendendo um núcleo e uma pluralidade de ligantes ligados de forma covalente ao núcleo, em que pelo menos uma porção dos referidos ligantes compreende uma porção de trissacarídeo e em que - o núcleo é ciclodextrina, de forma preferencial selecionado a partir do grupo que compreende alfa-ciclodextrina, beta- ciclodextrina, gama-ciclodextrina ou combinações dos mesmos,
- os ligantes são iguais ou diferentes e são ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos, de preferência ligantes à base de alquila C4-C30 opcionalmente substituídos, de forma mais preferencial ligantes à base de alquila C6-C15 opcionalmente substituídos, - cada porção de trissacarídeo é selecionada a partir de 3- sialil-N-acetillactoseamina (3’SLN) e 6-sialil-N- acetillactoseamina (6’SLN).
[061] Em algumas formas de realização das nanopartículas virucidas da invenção, alguns ou todos os ligantes compreendem 3’SLN, alguns ou todos os referidos ligantes compreendem 6’SLN e alguns, mas não todos os referidos ligantes não compreendem nenhuma porção de trissacarídeo.
[062] Uma nanopartícula virucida da presente invenção, em que o núcleo é ciclodextrina, pode ser representada pela Fórmula (I) em que m é 2 a 8, de preferência m é 2 a 7 ou 2 a 6, de forma mais preferencial m é 3 ou 4, n é 2 a 28 ou 4 a 13 ou 4 a 30 ou 6 a 15, de preferência 2 a 28 ou 4 a 13, em algumas formas de realização n é 2 ou 4 ou 6 a 13 ou 28 ou 30, e de preferência a ciclodextrina é selecionada a partir do grupo que compreende alfa-ciclodextrina, beta-ciclodextrina, gama-ciclodextrina ou combinações dos mesmos.
[063] Outro aspecto da presente invenção fornece uma nanopartícula virucida representada pela Fórmula (II) em que cada R, de maneira independente, é um ligante à base de alquila opcionalmente substituído, em que pelo menos dois dos referidos ligantes possuem uma porção de trissacarídeo selecionada a partir do grupo que compreende 3-sialil-N- acetillactoseamina (3’SLN) e 6-sialil-N-acetillactoseamina (6’SLN), ou em que pelo menos um dos referidos ligantes possui 3’SLN e outro possui 6’SLN; de forma preferencial ligante à base de alquila opcionalmente substituído é ligante à base de alquila C4-C30 opcionalmente substituído, de forma mais preferencial ligante à base de alquila C6-C15 opcionalmente substituído ou ligante à base de alquila C6- C15 opcionalmente substituído compreendendo 6’SLN; cada R’, de maneira independente, é H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y- SO3-, um polímero ou uma porção com solubilização em água; de forma preferencial R’ é H; de preferência R’, de maneira independente, é H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y-SO3-, ou um polímero; de preferência R’, de maneira independente, é -(CH2)y-COOH,
-(CH2)y-SO3- ou um polímero; de preferência R’, de maneira independente, é H, -(CH2)y-COOH, ou -(CH2)y-SO3-; de preferência R’, de maneira independente, é -(CH2)y-COOH, ou -(CH2)y-SO3-; x é 6, 7 ou 8; e y é um número inteiro de pelo menos 4 a cerca de 20, de forma preferencial y é pelo menos 4, de forma preferencial y é 4 a 20, de forma preferencial y é 7 a 11, de forma mais preferencial y é 10. Em outras formas de realização, y é pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11. Em outras formas de realização, y é no máximo 100, no máximo 70, no máximo 50, no máximo 25, no máximo 20, no máximo 15, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[064] O polímero nas nanopartículas virucidas da invenção pode ser selecionado a partir de polímeros sintéticos e naturais. Em uma forma de realização da invenção, os polímeros sintéticos são selecionados a partir do grupo que compreende, mas não está limitado a polietilenoglicol (PEG), poli (álcool vinílico) (PVA), poli (acrilamida) (PAAM), poli (n-butil acrilato), poli (α-ésteres), (PEG-b- PPO-b-PEG), poli (N-isopropilacrilamida) (pNIPAAM), ácido polillaticoglicólico (PLGA) e/ ou combinações dos mesmos.
[065] Em outra forma de realização da invenção, os polímeros naturais são selecionados a partir do grupo que compreende dextrano, dextrinas, glicose, celulose e/ ou combinações dos mesmos.
[066] Em algumas formas de realização de nanopartículas virucidas da invenção, a porção de trissacarídeo é de preferência 6’SLN, que é específico para cepas de influenza humana. Em outras formas de realização de nanopartículas virucidas da invenção, a porção de trissacarídeo é de preferência 3’SLN, que é específico para cepas de influenza aviária.
[067] Os ligantes (ou compostos de ligante) de nanopartículas virucidas da invenção são tipicamente suficientemente longos (pelo menos 2, ou pelo menos 4 ou pelo menos 6 átomos de carbono) e hidrofóbicos.
[068] Tipicamente, no contexto da presente invenção, os ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos são selecionados a partir do grupo que compreende ligantes à base de hexano, pentano, octano, undecano, hexadecano.
[069] Ligantes à base de alquila substituídos, ligantes à base de alquila C4-C30 substituídos e carboxialquilas C4-C30 substituídos de nanopartículas virucidas da presente invenção são substituídos por 1, 2, 3, 4 ou 5 substituintes independentemente selecionados a partir do grupo que compreende alquenila, alqueniltio, alqueniloxi, alcoxi, alcoxialcoxi, alcoxialcoxialcoxi, alcoxialcoxialquila, alcoxialquila, alcoxicarbonila, alcoxicarbonilalcoxi, alcoxicarbonilalquila, alcoxisulfonila, alquila, alquilamidoalquila, alquilcarbonila, alquilcarbonilalcoxi, alquilcarbonilalquila, alquilcarbonilalquiltio, alquilcarboniloxi, alquilcarboniltio, alquilasulfinila, alquilasulfinilalquila, alquila sulfonila, alquilasulfonilalquila, alquiltio, alquiltio alquila, alquiltio alcoxi, alquinila, alquiniloxi, alquiniltio, arila, arilcarbonila, ariloxi, arilsulfonila, carboxi,
carboxialcoxi, carboxialquila, ciano, cianoalcoxi, cianoalquila, cianoalquiltio, 1,3-dioxolanila, dioxanila, ditianila, etilenodioxi, formila, formilalcoxi, formilalquila, halo alquenila, halo alqueniloxi, haloalcoxi, haloalquila, haloalquinila, halo alquiniloxi, halogênio, heterociclo, heterociclocarbonila, heterocicloxi, heterociclo sulfonila, hidroxi, hidroxialcoxi, hidroxialquila, mercapto, mercapto alcoxi, mercapto alquila, metilenodioxi, e nitro. De preferência, os ligantes à base de alquila substituídos, os ligantes à base de alquila C4- C30 substituídos e as carboxialquilas C4-C30 substituídos são substituídos por um grupo mercapto (substituindo o oxigênio correspondente da ciclodextrina não modificada). O ligante à base de alquila substituído preferido é o ligante à base de alquilamidoalquila C4-C30 ou C2-C28 ou C4-C13 substituído.
[070] A proporção da porcentagem entre os ligantes e os ligantes compreendendo uma porção de trissacarídeos é de 75%: 25% a 95%: 5%; de forma preferencial 88%: 12%.
[071] No contexto da presente invenção, “pluralidade de ligantes” refere-se a um núcleo de nanopartícula virucida que é revestido, parcialmente ou completamente, por uma pluralidade de ligantes da invenção, em que pelo menos uma porção dos referidos ligantes compreende uma porção de trissacarídeos da invenção. O revestimento pode ser homogêneo, não estruturado ou estruturado. Em algumas formas de realização, a nanopartícula virucida compreende densidade muito alta (HD) de ligantes que compreendem a porção de trissacarídeo da invenção, por exemplo, 25% do total de ligantes. Em algumas formas de realização, a nanopartícula virucida compreende cerca de 2 a cerca de 5 ligantes da invenção por nm2, em que pelo menos uma porção dos referidos ligantes compreende uma porção de trissacarídeo. Em outras formas de realização, a nanopartícula virucida compreende quatro ligantes da invenção por nm2, em que pelo menos uma porção de tais ligantes compreende uma porção de trissacarídeo.
[072] Em algumas formas de realização da invenção, a pluralidade de ligantes da invenção compreende uma mistura de pelo menos dois ligantes estruturalmente diferentes, como polietilenoglicol 5 (PEG (5)) e ácido 16- mercaptohexadecônico (C15). O termo “mistura de pelo menos dois ligantes estruturalmente diferentes”, como usado neste documento, refere-se a uma combinação de dois ou mais ligantes da invenção como definido acima, em que os referidos ligantes diferem um do outro em sua composição química em pelo menos uma posição. A mistura pode ser de forma vantajosa organizada de forma que os ligantes sem nenhuma porção de trissacarídeo forneçam espaçamento ideal para os ligantes que possuem uma porção de trissacarídeo e não impeçam as interações entre as porções trissacarídeo e o HA viral da influenza. Assim, existirá uma proporção de porcentagem entre os ligantes não portadores versus aqueles portadores de uma porção de trissacarídeo, variando de cerca de 75:25 a cerca de 95: 5, de preferência cerca de 88:12.
[073] De acordo com uma forma de realização da invenção, nanopartículas de ouro (NPs) de ligante misto de PEG (5) e ácido 16-mercaptohexadecônico (C15) foram sintetizadas. O PEG (5) aumenta a solubilidade dos NPs em água, enquanto o C15 é o ligante para enxertar o trissacarídeo. A escolha do ligante foi com base em duas razões: 1) C15 é suficientemente longo para atingir três pontos de ligação do ácido siálico, que estão separados por ~ 4 nm, no HA, 2) O ligante rígido à base de carbono aumenta a atividade virucida.
[074] Os ligantes estão de forma geral presentes na superfície do núcleo em uma quantidade que otimiza a ligação das porções trissacarídeo à hemaglutinina da influenza. O núcleo possui normalmente quatro ligantes por nm2. Em algumas formas de realização, o núcleo possui cerca de 2 a cerca de 5 ligantes por nm2.
[075] Vantagens importantes das nanopartículas virucidas da invenção é que a análise de toxicidade detalhada não mostrou qualquer alteração da estrutura do tecido nem liberação de citocinas pró-inflamatórias. Testes in vivo mostraram que o tratamento com as nanopartículas virucidas da invenção melhorou significativamente o estado de saúde dos camundongos infectados e reduziu a carga viral nos pulmões, independentemente da adição do fármaco antes ou após a infecção.
[076] Outro aspecto da invenção descreve uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais nanopartículas virucidas da invenção e pelo menos um excipiente, veículo e/ ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[077] Quanto aos excipientes, veículos e diluentes apropriados, pode ser feita referência à literatura padrão que os descreve, por exemplo, ao capítulo
25.2 do Vol. 5 de “Comprehensive Medicinal Chemistry”, Pergamon Press. 1990, e de “Lexikon der Hilfsstoffe fur
Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete”, por H.P. Fiedler, Editio Cantor, 2002. O termo “veículo, excipiente e/ ou diluente farmaceuticamente aceitável” significa um veículo, excipiente ou diluente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é de forma geral segura e possui toxicidades aceitáveis. Os veículos, excipientes ou diluentes aceitáveis incluem aqueles que são aceitáveis para uso veterinário, bem como uso farmacêutico humano. Um “veículo, excipiente e/ ou diluente farmaceuticamente aceitável”, conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, inclui um e mais de um tal veículo, excipiente e/ ou diluente.
[078] Opcionalmente, a composição farmacêutica da presente invenção compreende ainda um ou mais agentes ativos adicionais, de preferência agentes antivirais.
[079] As nanopartículas virucidas da invenção que são utilizadas nos métodos da presente invenção podem ser incorporadas em uma variedade de formulações e medicamentos para administração terapêutica. Mais particularmente, uma nanopartícula virucida, tal como aqui fornecida, pode ser formulada em composições farmacêuticas por combinação com veículos, excipientes e/ ou diluentes adequados farmaceuticamente aceitáveis e pode ser formulada em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, drágeas, géis, pastas, pomadas, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis. Como tal, a administração das nanopartículas virucidas pode ser alcançada de várias maneiras, incluindo administração oral, bucal, inalação (pulmonar, nasal), retal, parenteral,
intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intracraniana e/ ou intratraqueal. Além disso, as nanopartículas virucidas podem ser administradas de uma maneira local em vez de sistêmica, em um depósito ou formulação de liberação sustentada. As nanopartículas virucidas podem ser formuladas com excipientes, diluentes ou veículos comuns e comprimidas em comprimidos, ou formuladas como elixires ou soluções para administração oral conveniente, ou administradas pelas vias intramuscular ou intravenosa. As nanopartículas virucidas podem ser administradas por via transdérmica e podem ser formuladas como formas de dosagem de liberação sustentada e semelhantes. As nanopartículas virucidas podem ser administradas sozinhas, em combinação umas com as outras, ou podem ser usadas em combinação com outros compostos conhecidos. As formulações adequadas para utilização na presente invenção são encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company (1985) Philadelphia, PA, 17th ed.), Que é aqui incorporado por referência. Além disso, para uma breve revisão dos métodos para distribuição de drogas, ver, Langer, Science (1990)249: 1527-1533, que é aqui incorporado por referência.
[080] Podem ser preparadas preparações de liberação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo as nanopartículas virucidas da invenção, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietila- metacrilato) ou poli (álcool vinílico)), polilactídeos
(Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e [gama] etila-L-glutamato, etileno-acetato de vinil não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico, como o LUPRON DEPOT(TM) (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[081] As nanopartículas virucidas da presente invenção também podem ser aprisionadas em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas de albumina) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980).
[082] As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser fabricadas de uma maneira que é conhecida pelos técnicos no assunto, isto é, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. Os seguintes métodos e excipientes são meramente exemplificativos e não são de forma alguma limitantes. Para injeção, uma nanopartícula virucida (e opcionalmente outro agente ativo) pode ser formulada em preparações por meio da dissolução, suspensão ou emulsificação das mesmas em um solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleos vegetais ou outros semelhantes, glicerídeos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propilenoglicol; e se desejado, com aditivos convencionais tais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizantes e conservantes. De preferência, as nanopartículas virucidas da presente invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Esses penetrantes são de forma geral conhecidos no estado da técnica.
[083] De preferência, as formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas das nanopartículas virucidas na forma solúvel em água. Além disso, as suspensões das nanopartículas viricidas podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, como oleato de etila ou triglicerídeos, ou lipossomas. As suspensões aquosas para injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade das nanopartículas viricidas para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.
[084] A quantidade de uma nanopartícula virucida da invenção que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo da doença viral tratada, da espécie de mamífero e do modo particular da administração. Será também entendido que o nível de dose específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregado; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo a ser tratado; o tempo e a via de administração; a taxa de excreção; outras drogas administradas anteriormente; e a gravidade da doença viral particular em terapia, como é bem compreendido pelos técnicos no assunto.
[085] Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento e/ ou prevenção de infecções do vírus da influenza e/ ou doenças associadas aos vírus da influenza, compreendendo a administração a um sujeito em necessidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais nanopartículas virucidas da invenção.
[086] Outro aspecto da invenção fornece as nanopartículas virucidas da invenção para uso no tratamento e/ ou prevenção de infecções pelo vírus da influenza e/ ou doenças associadas aos vírus da influenza.
[087] Conforme usado neste documento, os termos “sujeito” ou “paciente” são bem conhecidos no estado da técnica e são usados indistintamente aqui para se referir a um mamífero, incluindo cão, gato, rato, camundongo, macaco, vaca, cavalo, cabra, ovelha, porco, camelo e, de forma mais preferencial, um humano. Outros animais, como uma galinha, também são abrangidos por esses termos. Em formas de realização preferidas, os termos “sujeito” ou “paciente” referem-se a um ser humano e animais, como cachorro, gato, rato, camundongo, macaco, vaca, cavalo, cabra, ovelha, porco, camelo, galinha. Em algumas formas de realização, o sujeito é um sujeito com necessidade de tratamento ou um sujeito sendo infectado por um vírus da influenza. Em outra forma de realização, um sujeito pode ser um animal infectado pela influenza aviária, como uma galinha. No entanto, em outras formas de realização, o sujeito pode ser um sujeito saudável ou um sujeito que já foi submetido a tratamento. O termo não denota uma idade ou sexo específico. Assim, pretende-se que sejam abrangidos sujeitos adultos, crianças e recém-nascidos, sejam homens ou mulheres.
[088] “Tratamento” refere-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já estão infectados por um vírus da influenza, bem como aqueles nos quais a infecção viral da influenza deve ser prevenida. Portanto, o mamífero, de preferência humano, a ser tratado neste documento pode ter sido diagnosticado como sendo infectado por um vírus da influenza, ou pode estar predisposto ou suscetível a ser infectado por um vírus da influenza. O tratamento inclui a melhora de pelo menos um sintoma, cura e/ ou prevenção do desenvolvimento de uma doença ou condição devido à infecção viral por influenza. Prevenção significa atenuar ou reduzir a capacidade de um vírus da influenza de causar infecção ou doença, por exemplo, afetando um evento viral pós-entrada.
[089] “Mamífero” para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda ou animais de estimação, como cães, cavalos, gatos, vacas, macacos, etc. De preferência, o mamífero é humano.
[090] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de uma nanopartícula virucida da invenção eficaz para alterar um vírus da influenza e torná-lo inerte em um sujeito receptor e/ ou se sua presença resultar em uma alteração detectável na fisiologia de um sujeito receptor, por exemplo, melhora pelo menos um sintoma associado a uma infecção viral, evita ou reduz a taxa de transmissão de pelo menos um agente viral.
[091] Outro aspecto da invenção fornece uma composição virucida compreendendo uma quantidade eficaz de uma ou mais nanopartículas viricidas da invenção e, opcionalmente, pelo menos um veículo adequado ou veículo de aerossol. “Uma quantidade eficaz” refere-se à quantidade suficiente para inibir irreversivelmente os vírus da influenza; isto é, suficiente para obter o efeito viricida. Em uma forma de realização, o veículo adequado é selecionado a partir do grupo que compreende estabilizantes, fragrâncias, corantes, emulsificantes, espessantes, agentes umectantes ou misturas dos mesmos. Em outra forma de realização, a composição viricida pode estar na forma de um líquido, um gel, uma espuma, um spray ou uma emulsão. Em uma outra forma de realização, a composição viricida pode ser um ambientador, uma solução esterilizante ou uma solução desinfetante.
[092] Outro aspecto da invenção fornece um dispositivo (ou um produto) que compreende a composição virucida da invenção ou uma ou mais nanopartículas virucidas da invenção e meios para aplicar e/ ou dispensar as nanopartículas virucidas da invenção. Em outra forma de realização, os meios compreendem um distribuidor, um aplicador em spray ou um suporte sólido embebido com as nanopartículas viricidas da invenção. Em outra forma de realização, o suporte é um tecido ou não tecido, um têxtil, uma toalha de papel, algodão, uma folha de polímero absorvente ou uma esponja.
[093] Outro aspecto da invenção fornece um método de desinfecção e/ ou esterilização usando as nanopartículas viricidas da invenção ou a composição viricida da invenção ou a composição farmacêutica da invenção.
[094] Em uma forma de realização preferida, o método de desinfecção e/ ou esterilização compreende as etapas de (i) fornecer pelo menos uma nanopartícula virucida da invenção ou uma composição virucida da invenção, ou composição farmacêutica da invenção, (ii) contatar uma superfície contaminada com vírus da influenza ou uma superfície suspeita de estar contaminada pelo vírus da influenza com a pelo menos uma nanopartícula virucida da invenção ou uma composição virucida da invenção ou composição farmacêutica da invenção por um tempo suficiente para obter efeito virucida. Em algumas formas de realização, a superfície contaminada com vírus da influenza é pele humana ou animal. Em outras formas de realização, a superfície contaminada pelo vírus da influenza é uma superfície não viva, como equipamentos médicos, roupas, máscaras, móveis, quartos, etc.
[095] Outro aspecto da invenção fornece o uso de uma nanopartícula virucida da invenção ou uma composição virucida da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção para esterilização e/ ou desinfecção. Em algumas formas de realização, a esterilização e a desinfecção são para superfícies contaminadas com vírus da influenza ou superfícies suspeitas de estarem contaminadas por vírus da influenza. Em algumas formas de realização preferidas, as superfícies são de pele humana ou animal. Em outras formas de realização preferidas, as superfícies são superfícies não vivas, tais como equipamentos médicos, roupas, máscaras, móveis, quartos, etc. Em uma forma de realização, a composição virucida da invenção ou a composição farmacêutica da invenção é usada como um virucida desinfetante para uso frequente. Em outra forma de realização, a composição virucida da invenção ou a composição farmacêutica da invenção é aplicada por pulverização. Em uma outra forma de realização, a composição virucida da invenção da composição farmacêutica da invenção é aplicada sobre uma máscara protetora.
[096] Os técnicos no assunto apreciarão que a invenção aqui descrita é suscetível a variações e modificações diferentes das de forma específica descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações sem se afastar do espírito ou de suas características essenciais. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individual ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características. A presente invenção deve, portanto, ser considerada como em todos os aspectos ilustrados e não restritivos, o escopo da invenção sendo indicado pelas reivindicações anexas, e todas as alterações que vêm dentro do significado e faixa de equivalência se destinam a ser abrangidas.
[097] A descrição anterior será mais completamente entendida com referência aos seguintes exemplos. Tais exemplos são, no entanto, exemplos de métodos de prática da presente invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Exemplos Dados experimentais Ensaio de Densidade
[098] NPs em três densidades diferentes de 6- sialil-N-acetillactoseamina (6’SLN) foram sintetizados a fim de demonstrar a densidade ideal de 6’SLN (Figura 1). Experimentos de controle de NPs de ouro revestidos com PEG (5) e 3-sialil-N-acetillactoseamina (3’SLN) também foram realizados.
[099] Estudos comparativos de dose-resposta foram conduzidos em duas cepas de influenza A H1N1 (PB/09) e H3N2 (Cing/04) e uma cepa B, Yamagata. NPs de LD-6’SLN possui a menor concentração de metade inibitória (EC50) contra todos os vírus testados. Os NPs, em geral, inibiram o subtipo A da influenza melhor do que o subtipo B. Tabela 1: Concentrações metade inibitórias (EC50) e citotóxicas (CC50) in vitro de diferentes NPs contra a cepa H1N1 de PB/09. As molaridades foram calculadas com base em NPs e trissacarídeos/ NP separadamente. Cepa de EC50 EC50 de EC50 de CC50 influenza (μg/mL) NPs (nM) 6’SLN (μg/ml) (nM) NPs de LD H1N1 0,13 0,64 11,5 > 500 6’SLN PB/09 (18 6’SLN/NP) NPs de HD H1N1 0,45 2,2 83 > 500 6’SLN PB/09
Cepa de EC50 EC50 de EC50 de CC50 influenza (μg/mL) NPs (nM) 6’SLN (μg/ml) (nM) (38 6’SLN/NP) NPs de LD(-) H1N1 1,1 5,4 43 > 500 6’SLN PB/09 (8 6’SLN/NP) NPs de LD H1N1 5,3 27,2 489 > 500 3’SLN PB/09 (18 3’SLN/NP) NPs de PEG5 H1N1 N/ D N/ D N/ D > 500 PB/09 Tabela 2: EC50 e CC50 de diferentes NPs contra a cepa H3N2 Cing/04. Cepa de EC50 EC50 de EC50 de CC50 influenza (μg/mL) NPs (nM) 6’SLN (μg/ mL) (nM) NPs de LD H3N2 0,58 2,8 50,4 > 500 6’SLN CING/04 (18 6’SLN/NP) NPs de HD H3N2 1,12 5,9 224,4 > 500 6’SLN CING/04 (38 6’SLN/NP) NPs de LD(-) H3N2 1,9 9,4 75,2 > 500 6’SLN CING/04 (8 6’SLN/NP) NPs de LD H3N2 4,5 22 396 > 500 3’SLN CING/04 (18 3’SLN/NP) PEG5 NPs H3N2 N/ D N/ D N/ D > 500
Cepa de EC50 EC50 de EC50 de CC50 influenza (μg/mL) NPs (nM) 6’SLN (μg/ mL) (nM) CING/04 Tabela 3: EC50 e CC50 de diferentes NPs contra Influenza B/ Yamagata. Cepa de EC50 EC50 de EC50 de CC50 influenza (μg/ mL) NPs 6’SLN (μg/ mL) (nM) (nM) NPs de LD B/Y 13,7 67 1206 > 500 6’SLN amagata (18 6’SLN/NP) NPs de HD B/Y 17,25 85 3230 > 500 6’SLN amagata (38 6’SLN/NP) NPs de LD(-) B/Y 53,3 260 2080 > 500 6’SLN (8 amagata 6’SLN/NP) NPs de LD B/Y > 100 > 100 > 1000 > 500 3’SLN amagata (18 3’SLN/NP) PEG5 NPs B/Y N/ D N/ D N/ D > 500 amagata
[0100] Ensaios viricidas foram então conduzidos para determinar se o mecanismo de inibição é irreversível. Em um ensaio viricida, os NPs foram incubados com o vírus na concentração de IC99 correspondente por um determinado período de tempo. Diluições em série foram então conduzidas do inóculo e a infectividade residual do vírus foi medida. A atividade virucida de NPs de LD 6’SLN contra as cepas PB/09 e Cing/04 foi testada aumentando a concentração do vírus dez vezes em relação aos experimentos de dose-resposta. O título da cepa PB/09 foi reduzido em 2 logs, enquanto Cing/04 foi reduzido em 1,5 logs. A redução de 1-2 logs no título do vírus indica que o vírus é irreversivelmente inibido. Estudos TEM para demonstrar a interação vírus-NP
[0101] A interação vírus-NP foi demonstrada também com microscopia eletrônica (TEM). O vírus H3N2 Vic/ 11 foi incubado com NPs de LD 6’SLN por 1 hora. Após a preparação das grades TEM, a coloração com metila tungstênio foi conduzida. A maioria dos vírus foi totalmente coberta com NPs de LD 6’SLN (Figura 2B). Os experimentos de controle foram conduzidos com NPs de PEG(5) em que os NPs estavam ao redor, mas não anexados ao envelope viral (Figura 2C). Potencial dos NPs para inibir o vírus da influenza aviária
[0102] As pandemias de influenza de forma geral aparecem quando cepas de influenza animal se misturam com cepas de influenza humana. Portanto, o próximo objetivo é inibir irreversivelmente as cepas de influenza aviária com NPs da invenção. A pesquisa preliminar foi conduzida com uma cepa de vírus adaptada a ovo, CAL/09. PB/09 e CAL/09 são duas cepas humanas de H1N1 muito semelhantes. NPs de LD- 6’SLN possuem uma forte atividade na cepa PB/09. No entanto, a cepa CAL/09, que é replicada usando ovos de galinha, liga NPs de LD 3’SLN com maior afinidade (Tabela 4). Este resultado indica que NPs de LD 3’SLN inibem cepas de influenza aviária. Tabela 4: A cepa de vírus adaptada a ovo prefere a ligação -2,3, enquanto a cepa adaptada a camundongo prefere a ligação -2,6.
PB/09 de camundongo CAL/09 de ovo adaptado EC50 (μg/ mL) adaptado EC50 (μg/ mL) LD-6’SLN 0,13 34,9 LD-3’SLN 5,13 1,18 De núcleo de ouro a núcleo de ciclodextrina
[0103] O vírus da influenza humana foi irreversivelmente inibido com NPs de ouro enxertados com C15-6’SLN. No entanto, é importante transformar o núcleo de ouro em um material orgânico para aplicações farmacêuticas. Entre os diferentes materiais orgânicos, como polímeros, dendrímeros e dendrons, a ciclodextrina (CD) é o núcleo preferido para enxertar ligantes com 6’SLN a fim de direcionar HA.
[0104] O tamanho do CD (d ~ 1,5 nm) é comparável ao NP de ouro (metal) da invenção (~ 3 nm) e combina bem com a cabeça globular HA (~ 5 nm). Semelhante aos NPs de ouro (metal), a ciclodextrina possui uma estrutura química rígida, que contribui para a atividade viricida junto com o ligante. Além disso, a beta-ciclodextrina pode ter no máximo 7 trissacarídeos (e de forma mais preferencial 3 ou 4 trissacarídeos), sendo três o número exato de pontos de ligação do ácido siálico na cabeça globular HA (Figura 3A). Portanto, β-CD foi modificado com C15-6’SLN de uma forma muito semelhante às nanopartículas de ouro.
[0105] Em comparação com materiais orgânicos anteriores contendo ácido siálico, valores de EC50 significativamente mais baixos foram obtidos em diferentes vírus da influenza humana (Figura 3B). A atividade virucida da ciclodextrina modificada foi comprovada com experimentos in vivo e ex vivo nos quais o título viral foi reduzido em vários logs (Figuras 3 C e D). Os resultados bem-sucedidos em ex vivo indicam que a ciclodextrina modificada irá inibir irreversivelmente o vírus in vivo.
[0106] É aqui mostrado que a escolha do trissacarídeo, bem como do ligante, é muito importante para inibir irreversivelmente os vírus da influenza humana com nanomateriais. O ligante C15-6’SLN em dois núcleos diferentes, nanopartículas de ouro e ciclodextrina, inibiu várias cepas do vírus da influenza humana em concentrações de nanomateriais muito baixas. As concentrações de EC50 na faixa baixa de nM (1-100 nM) foram alcançadas, em relação às unidades de trissacarídeo, enquanto os valores de EC50 da literatura foram 50 a 500 vezes maiores para materiais semelhantes. Atividade antiviral in vitro de ciclodextrinas modificadas
[0107] A β-ciclodextrina (β-CD) foi modificada com diferentes ligantes, com e sem trissacarídeos, a fim de investigar a relação entre a estrutura química e a atividade antiviral. Ciclodextrinas modificadas de exemplo são mostradas na Figura 4. Elas carregam um número comparável de trissacarídeos (ver Figura 5 e Tabela 5), determinado com 1H Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR)). Os ensaios de dose-resposta contra a cepa da influenza A/ Países Baixos/ 2009 (H1N1) (A/ PB/ 09), foram realizados para comparar a atividade inibitória desses NPs (Figura 6). A infecção foi quantificada por meio de ensaios imunocitoquímicos, 24 horas pós-infecção (hpi). β-CDs contendo um ligante hidrofóbico suficientemente longo e o grupo final 6’SLN (C6-6’SLN, C11-6’SLN e C14-6’SLN)
mostraram forte atividade inibitória contra a infecção de células pelo vírus da influenza A/ PB/ 09, com valores de EC50 na faixa nanomolar. Por outro lado, o β-CD com um ligante mais curto, C1-6’SLN, inibiu fracamente a infecção. A introdução de um ligante suficientemente longo aumentou claramente a flexibilidade do grupo final; portanto, as concentrações inibitórias diminuíram. O EC50 foi comparável (embora ligeiramente superior) quando o ligante hidrofóbico foi substituído por um ligante PEG8 hidrofílico (PEG8-6’SLN). Tabela 5: Número médio de 6’SLN ou 3’SLN por β-ciclodextrina determinado por 1H NMR e pesos moleculares correspondentes. Número de Número de Peso molecular espaçadores/ CD 6’SLN/ CD (kDa) P8-6’ 4 3,5 5,7 C14-6’ 3,1 3 4,1 C11-6’ 3,6 3,1 4,1 C6-6’ 2,8 2,7 3,4 C11-3’ 3 2,7 3,9 C1-6’ - 3 3,5
[0108] C11-6’SLN, a nanopartícula que mostrou a melhor atividade inibitória contra A/ PB/ 09, exibiu forte atividade antiviral contra cepas de influenza humana de ambos os tipos A e B (Tabela 6 e Figura 7). É importante ressaltar que ele inibiu as cepas clínicas A (H1N1) e B muito recentes (da temporada de influenza 2017/2018), isoladas de pacientes no Hospital Universitário de Genebra e passadas apenas uma vez nas células. C11-6’SLN não mostrou qualquer atividade antiviral contra HSV-2, um vírus de ligação a HSPG, indicando a especificidade do composto para vírus dependentes de ácido siálico.
[0109] 6’SLN é conhecido por ser específico para cepas de influenza humana, enquanto 3’SLN é preferido para cepas de influenza aviária como um ponto de fixação primário.
Para provar a generalidade desta abordagem, especialmente contra cepas de influenza que são conhecidas por terem a capacidade de cruzar a barreira das espécies, C11-3’SLN foi sintetizado e testado (Figura 4) contra cepas de influenza aviária.
C11-3’SLN inibiu com sucesso duas cepas aviárias, H5N1 e H7N1, nas concentrações de 4,1 e 8,8 μg/ ml, respectivamente (ver Tabela 6). De fato, esses resultados confirmam a estratégia adotada contra cepas humanas.
É importante ressaltar que uma dessas cepas aviárias, H5N1, possui um potencial significativo para causar a próxima pandemia de influenza.
Foi testado adicionalmente se C11- 3’SLN pode inibir uma cepa humana, A/ PB/ 09 e se C11-6’SLN também seria ativo contra uma cepa aviária, H5N1. C11-3’SLN exibiu uma boa atividade inibitória contra A/ PB/ 09 (Figura 4 e Tabela 6), enquanto C11-6’SLN não mostrou qualquer atividade contra H5N1 (Tabela 6 e Figura 8). Estes resultados estão de acordo com a literatura anterior, comparando as afinidades de ligação de cepas aviárias e humanas aos diferentes tipos de ácidos siálicos.
As cepas de influenza aviária (particularmente as cepas H5N1) ligam-se de forma preferencial ao ácido siálico ligado a alfa -2,3, que possui uma conformação trans fina e direta.
Por outro lado, o local de ligação do ácido siálico mais amplo de cepas humanas pode acomodar tanto a conformação cis volumosa do ácido siálico ligado a alfa -2,6 quanto o ácido siálico ligado a -2,3 mais estreito.
Tabela 6: Atividade inibitória de C11-6’SLN e C11-3’SLN contra diferentes cepas de influenza. Composto CC50 EC50 (μg/mL) EC50 Ϯ (μg/mL) (nM) A/ Países Baixos/ C11-6’ > 100 0,18 (0,14 - 42 2009 (H1N1) 0,24) C11-3’ > 100 6,5 (4,1- > 1000 10,1) A/ Clínica/ 2018 C11-6’ > 100 0,5 (0,4 - 125 (H1N1) 0,67) Singapura/ 2004 C11-6’ > 100 0,23 (0,16 - 56,5 (H3N2) 0,34) B/ Wisconsin/ 2010* C11-6’ > 100 2,2 (1,49 - 500 3,42) B/ Clínica/ 2018 C11-6’ > 100 20 (10,5 - > 1000 28,7) A/ Turquia/ C11-3’ > 100 4,1 (2,55- 931 Turquia/ 2005 6,7) (H5N1) C11-6’ > 100 N/D N/D A/ Turquia/ Itália/ C11-3’ > 100 8,8 (3,2-26) > 1000 1999 (H7N1) HSV-2 (controle) C11-6’ > 100 N/D N/D * B subtipo Yamagata
[0110] Ϯ As concentrações molares foram determinadas com base no número de núcleos de ciclodextrina. CC50: Metade da concentração citotóxica máxima.
[0111] Em seguida, os ensaios virucidas foram conduzidos para determinar o mecanismo de inibição, isto é, virucida (irreversível) ou virustático (reversível). A síntese de nanopartículas semelhantes que compartilham o núcleo β-ciclodextrina e a porção 6’SLN mas diferentes ligantes, destaca uma característica estrutural que confere ação virucida (Figuras 9 e 10). Foi hipotetizado que um dos principais componentes da inibição viral irreversível é que a porção de ligação (aqui 6’SLN) é carregada por um ligante hidrofóbico.
Para testar esta hipótese, C11-6’SLN e P8-6’SLN foram comparados.
Resumidamente, as quantidades dos compostos que fornecem proteção completa (10 μg de C11-6’ e 50 μg de P8-6’) foram incubadas com A/ PB/ 09 por 1h.
Diluições em série dos inóculos foram conduzidas seguidas de avaliação da infecciosidade.
No caso de C11-6’, o gráfico em (a) mostra que a proteção completa foi mantida após a diluição e os gráficos em (c) mostram que essa propriedade foi encontrada contra uma série de cepas diferentes.
Isso é chamado de atividade inibitória irreversível (isto é, resistente à diluição) um mecanismo viricida.
No caso de P8- 6’, o gráfico em (b) mostra que, embora na concentração inicial a proteção completa estivesse presente, após a diluição, a diferença com a infecciosidade da amostra de controle (vírus sozinho) foi perdida, ou seja, o efeito inibitório foi considerado reversível (virustático). Essas duas nanopartículas diferem apenas na hidrofobicidade do ligante e mostram atividade inibitória comparável.
Nos ensaios virucidas, C11-6’SLN reduziu o título do vírus em 1000 vezes (Figura 9b), enquanto a infecção foi totalmente recuperada no caso de P8-6’SLN (Figura 9a). Portanto, C11- 6’SLN possui um efeito inibitório irreversível sobre o vírus, enquanto o efeito de P8-6’SLN é reversível.
Vale ressaltar que ambas as nanopartículas não são tóxicas para as células (Figura 9a e 9b). A atividade virucida de C11-6’SLN contra outras cepas de influenza foi investigada, confirmando sua atividade irreversível, independentemente da cepa (Figura 9c). Atividade ex vivo de ciclodextrinas modificadas
[0112] Experimentos ex vivo foram realizados em MucilAir®, um modelo 3D de epitélio reconstituído de vias aéreas humanas. Essas culturas de interface ar-líquido imitam perfeitamente tanto a arquitetura pseudoestratificada (células basais, ciliadas e caliciformes) e o mecanismo de defesa de barreira (ou seja, a depuração mucociliar e a imunidade celular epitelial) do epitélio respiratório superior humano, o principal local de replicação do vírus da Influenza em humanos. Os experimentos ex vivo foram conduzidos com a cepa 09 pandêmica H1N1 clínica que não foi passada nas células para excluir qualquer tendência de adaptação. C11-6’SLN ou P8-6’SLN (50 μg/ tecido) e o vírus (104 cópias de RNA/ tecido) foram primeiro adicionados simultaneamente na superfície apical dos tecidos, sem incubação prévia. Após quatro horas, os inóculos foram removidos, os tecidos foram lavados e a evolução da infecção monitorada diariamente com qPCR das lavagens apicais do tecido, sem qualquer reaplicação das nanopartículas. C11- 6’SLN preveniu completamente a replicação do vírus ao longo de todo o curso do experimento, enquanto P8-6’SLN reduziu ligeiramente a replicação viral nos primeiros dois dias após a infecção (dpi), mas não depois disso (Figura 11a).
[0113] Além disso, nos tecidos tratados com C11-6’SLN, a inibição da replicação viral também foi refletida pela ausência de células infectadas e a morfologia não perturbada dos tecidos tratados, notavelmente diferente dos tecidos não tratados ou tratados com P8-6’SLN (Figura 11b). As imagens de imunofluorescência e a falta de liberação de lactato desidrogenase (LDH) nas lavagens apicais demonstraram que a camada de células ciliadas, bem como o batimento ciliar fisiológico e a integridade do tecido foram preservados (Figura 11b e 12). Em forte contraste, o tecido não tratado ou os controles tratados com P8-6’SLN apresentaram espessura reduzida devido à alteração da camada de células ciliadas e presença de células infectadas (Figura 11b). Para excluir que o nível viral residual detectado por qPCR nos tecidos tratados era infeccioso, os tecidos foram mantidos em cultura por 23 dias, mas nenhum aumento no título viral foi observado ao longo do tempo, enquanto os tecidos não tratados estavam persistentemente espalhando vírus (Figura 13). É importante ressaltar que os experimentos ex vivo foram realizados também em condições pós-tratamento mais rigorosas em que C11-6’SLN (30 μg/ tecido) foi administrado a cada 24 horas por 4 dias, começando em 1 dpi para imitar uma administração terapêutica. Além disso, nessas condições, a nanopartícula apresentou notável atividade inibitória, comprovando seu potencial como agente terapêutico (Figura 11c). No mesmo modelo ex vivo, a biocompatibilidade de altas doses de C11-6’SLN, administradas diariamente, foi avaliada. C11-6’SLN não mostrou qualquer atividade citotóxica ou pró-inflamatória nas condições descritas acima (Figura 14). Atividade in vivo de ciclodextrinas modificadas
[0114] Experimentos in vivo foram conduzidos com camundongos BALB/c em condições de co- e pós-tratamento. Nos experimentos de co-tratamento, camundongos foram administrados com C11-6’SLN (25 μg/ camundongo) e A/ PB/ 09 (100 partículas infecciosas/ camundongo) simultaneamente por meio da via intranasal. A temperatura corporal e o peso dos camundongos foram medidos diariamente para estimar o impacto da administração de C11-6’SLN na condição fisiológica dos animais infectados. Em 2 dpi, metade dos camundongos foram sacrificados aleatoriamente e o resto dos camundongos retratados com C11-6’SLN. O segundo grupo de ratos foi sacrificado em 4 dpi. Os títulos virais foram quantificados a partir de lavagens bronco-alveolares (BAL) (Figura 15a). Uma diminuição significativa dos títulos virais foi observada nos dias 2 e 4 após a infecção em camundongos tratados (Figura 15a). A atividade antiviral do C11-6’SLN também diminuiu significativamente a morbidade com uma preservação significativa do peso e da temperatura corporal em comparação com camundongos não tratados (Figuras 15b e 15c). Coletivamente, esses resultados demonstram a capacidade das nanopartículas C11-6’SLN de prevenir a infecção in vivo e a propagação do vírus nos pulmões.
[0115] O potencial terapêutico in vivo de C11- 6’SLN também foi avaliado por meio da condição pós-tratamento. Os camundongos foram infectados com A/ PB/ 09 (100 partículas infecciosas/ camundongo) e tratados com C11-6’SLN, 6 hpi (14 μg/ camundongo) diariamente durante os próximos três dias com a mesma dose de nanopartícula (Figuras 15d a f). Peso e temperatura corporal dos camundongos foram medidos a cada dia. Embora C11-6’SLN tenha sido menos potente na condição pós-tratamento, ainda atrasou o progresso da infecção. Os camundongos tratados apresentaram uma redução dos sinais de morbidade (Figuras 15d e 15e) e melhores pontuações clínicas.
Essas melhorias nos estados fisiológicos do animal infectado se correlacionaram com a sobrevivência prolongada (Figura 15f). Métodos Síntese de ciclodextrinas modificadas
[0116] Produtos químicos: Neu5Acα(2,6)-Galβ(1- 4)-GlcNAc-β-etilamina e Neu5Acα(2,3)-Galβ(1-4)-GlcNAc-β- etilamina foram adquiridos da TCI Chemicals. Heptakis-(6- deoxi-6-mercapto)-beta-ciclo-dextrina e sal de sódio de carboximetila-beta-ciclodextrina foram adquiridos em Cyclodextrin-Shop. O ácido 11-dodecenóico foi adquirido da abcr GmbH. O ácido 14-pentadecenóico foi adquirido à Larodan AB. A maleimida-PEG8-CH2CH2COOH foi adquirida da PurePEG. Todos os outros produtos químicos e solventes foram adquiridos da Sigma-Aldrich.
[0117] Métodos: Derivados da ciclodextrina para o vírus da influenza foram sintetizados em três etapas. A primeira etapa foi a conjugação dos ligantes na ciclodextrina. A segunda etapa foi a ativação de N-hidroxissuccinimida (NHS) do grupo final -COOH dos ligantes. A terceira etapa foi o enxerto de SLN nos ligantes. Etapa 1: Modificação da β-ciclodextrina com os ligantes
[0118] 0,04 mmol de Heptakis-(6-deoxi-6- mercapto)-beta-ciclodextrina foi agitado com 0,28 mmol de moléculas bi-funcionais (ligantes) com grupos terminais de ácido carboxílico e alil (como ácido 6-heptenóico, ácido 11- dodecenóico ou ácido 14-pentadecenóico) em 5 mL de DMSO, na presença de uma lâmpada UV (250 W), durante a noite. Os derivados heptakis-(ácido 6-deoxi-6-alcanóico)-beta- ciclodextrina resultantes foram precipitados da mistura de
DCM-éter dietílico por centrifugação e secos sob vácuo.
[0119] Para modificar a β-ciclodextrina com o espaçador de PEGs, 0,04 mmol heptakis-(6-deoxi-6- mercapto)- beta-ciclodextrina foi agitado com 0,28 mmol de maleimida- PEG8-CH2CH2COOH em 5 mL de tampão de fosfato, pH: 6,8, durante a noite. A β-ciclodextrina modificada foi purificada com diálise e seca com liofilização. Etapa 2: reações de ativação do NHS
[0120] 0,04 mmol dos derivados de ciclodextrina obtidos na etapa 1, respectivamente, foram agitados com 1,12 mmol de N-hidroxissuccinimida (NHS), 0,56 mmol de etila-3- (3-dimetilaminopropila) carbodiimida (EDC-hcl) e 0,02 mmol de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) em 5 mL de DMSO, durante a noite. Os derivados de ciclodextrina ativados por NHS resultantes foram primeiro precipitados em água gelada e, em seguida, lavados com acetonitrila e éter dietílico. Os produtos foram secos sob vácuo.
[0121] Para obter C1-6’, a etapa 1 foi ignorada e a reação de ativação de NHS foi conduzida diretamente. O sal de sódio de carboximetila-beta-ciclodextrina diretamente (0,04 mmol) foi ativado com 1,12 mmol de NHS 0,56 mmol de EDC-hcl e 0,02 mmol de DMAP foi adicionado. A reação de ativação foi conduzida durante a noite. O derivado de ciclodextrina resultante foi primeiro precipitado em uma mistura de DCM-éter dietílico e posteriormente lavado três vezes. O produto foi seco sob vácuo. O enxerto 6’SLN foi conduzido da mesma maneira que a etapa 3. Etapa 3: Enxerto de trissacarídeo
[0122] 5,6 μmol de Neu5Acα(2,6)-Galβ(1-4)- GlcNAc-β-etilamina (Neu5Acα(2,3)-Galβ(1-4)- GlcNAc-β-
etilamina no caso de C11-3’) foi misturado com 1,6 μmol dos derivados de ciclodextrina obtidos na etapa 2,15 μmol de trietilamina (TEA) foi adicionado e a reação foi conduzida durante a noite em 1 mL de DMSO. Os produtos da reação foram diluídos com tampão de fosfato 0,01 M (pH: 7,5) e concentrados usando filtros de amicon (MWCO: 3k). Os derivados heptakis-(6-deoxi-6-SLN-etilcarboxamido- alquiltio)-beta-ciclodextrina resultantes foram posteriormente lavados com água destilada e secos com liofilização. O enxerto do trissacarídeo nas ciclodextrinas modificadas com ligante foi confirmado com estudos 1H e DOSY NMR (Figuras 16 e 17). Síntese de ciclodextrina modificada por C15-6’SLN
[0123] Modificação C15 de β-CD: 55 mg de β-CD modificado com tiol e 70 mg de ácido 14-pentadecenóico em 5 mL de DMSO foram agitados durante a noite sob luz ultravioleta.
[0124] Ativação de NHS de C15-β-CD: O material resultante foi ativado usando 100 mg de NHS, 75 mg de EDC e 2,5 mg de DMAP em DMF, durante a noite. C15-β-CD ativado por NHS foi precipitado de água gelada e posteriormente lavado três vezes. A última precipitação foi feita em acetonitrila.
[0125] Enxerto de 6’SLN em C15-β-CD: 5 mg de C15-β-CD e 5 mg de amina funcionalizada 6’SLN e 3 mg de TEA foram agitados durante a noite em DMSO. O material resultante é limpo com filtros de amicon. Síntese de nanopartículas de PEG
[0126] Síntese de NPs de PEG(5): 88,6 mg de ácido tetracloroáurico (3) tri-hidratado (HAuCL4 * 3H2O) em 15 mL de EtOH foi misturado com 56 mg de HS-PEG (5) em 5 mL de EtOH por 10 minutos. À mistura foram adicionados 94,6 mg de boro-hidrato de sódio (NaBH4) em 37,5 mL de EtOH, gota a gota. Para a formação completa de NP, foi realizada uma reação durante a noite. NPs resultantes foram limpos com filtros de amicon usando mistura de solvente EtOH-H2O.
[0127] NPs ligantes misturado com PEG (5)-C15: Uma reação de troca de ligante foi realizada com 1,5 mg de ácido 16-mercaptohexacanóico (HS-C15-COOH) e 20 mg de NPs de PEG(5), em DMF, durante a noite. Os NPs foram precipitados em mistura de DMF-éter dietílico e posteriormente lavados três vezes.
[0128] Ativação de NHS de NPs: 15 mg de NPs foram ativados usando 10 mg de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), 2 mg de cloridrato de etilcarbodiimida (EDC) e 0,1 mg de 4-(dimetilamino)-piridina (DMAP) em DMF, durante a noite. Os NPs resultantes foram precipitados da mistura de DMF-éter dietílico e posteriormente lavados três vezes.
[0129] Enxerto de 6’SLN em NPs: 5 mg de NPs ativados por NHS em 1 mL de DMSO foram misturados com 1,7 mg de 6’SLN funcionalizado com amina em 3 mL de tampão de fosfato 0,1 M (pH: 7,5). Após 5 horas de reação, os NPs enxertados com 6’SLN foram limpos com filtros de amicon. Ensaios Biológicos
[0130] Materiais: O meio DMEM-Glutamax foi adquirido da Thermo Fischer Scientific. Tween 20® para tampão de lavagem e comprimidos de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) foram adquiridos da Sigma Aldrich. O anticorpo primário (anticorpo monoclonal para Influenza A) foi adquirido na Eight Diagnostics. O anticorpo secundário (IgG anti- camundongo, anticorpo ligado a HRP) foi adquirido na Cell
Signaling Technology®. O ensaio de proliferação celular CellTiter 96® AQueous One Solution que contém um composto de tetrazólio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, sal interno; MTS] e um reagente de acoplamento de elétrons (etossulfato de fenazina; PES) foram adquiridos na Promega.
[0131] Cultura de células: A linha celular MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Cells), foi adquirida da ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD). As células foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco com suplemento de glicose (DMEM + GlutaMAX™) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/ estreptomicina. As linhas de células MDCK foram cultivadas em atmosfera úmida com CO2 (5%) a 37 ºC.
[0132] Cepas virais: Um isolado clínico de HSV- 2 foi originalmente fornecido pelo Prof. M. Pistello, (Universidade de Pisa, Itália) e foi propagado e titulado por ensaio de placa em células Vero. H1N1 Neth09 e B Yamagata foram um gentil presente do Prof M. Schmolke (Universidade de Genebra). A cepa aviária NIBRG-23 (preparada por genética reversa usando proteínas de superfície A/ Turquia/ Turquia/ 1/ 2005 H5N1 e estrutura A/PR/8/34 (H1N1)) foi obtida do National Institute for Biological Standards and Controls, Potters Bar, Reino Unido e foi cultivado em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade, seguido de purificação e caracterização do vírus. Amostras clínicas foram fornecidas pelo Hospital Universitário de Genebra de pacientes anônimos. Todas as cepas de influenza foram propagadas e tituladas por ICC em células MDCK na presença de tripsina tratada com TPCK (0,2 mg/ ml).
Ensaios de viabilidade celular
[0133] A viabilidade celular foi medida pelo ensaio MTS [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio]. Culturas de células confluentes semeadas em placas de 96 poços foram incubadas com diferentes concentrações de nanopartículas ou ligante em triplicata nas mesmas condições experimentais descritas para os ensaios antivirais. A viabilidade celular foi determinada pelo CellTiter 96 Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância foi medida usando um leitor de microplaca (modelo 680, BIORAD) a 490 nm. O efeito na viabilidade celular em diferentes concentrações de nanopartículas ou ciclodextrinas foi expresso em porcentagem, comparando-se a absorbância das células tratadas com a das células incubadas apenas com meio de cultura. As concentrações citotóxicas de 50% (CC50) e os intervalos de confiança de 95% (CIs) foram determinados usando o software Prism (Graph-Pad Software, San Diego, CA). Ensaios de inibição
[0134] As células MDCK foram pré-plaqueadas com 24 horas de antecedência em placas de 96 poços. Concentrações crescentes de materiais foram incubadas com o vírus da influenza (MOI: 0,02 ou 0,01 para H5N1 e 0,1 para outros vírus) a 37 ºC por uma hora e, em seguida, as misturas foram adicionadas às células. Após a adsorção do vírus (1 h a 37 ºC), o inóculo do vírus foi removido, as células foram lavadas e meio fresco foi adicionado. Após 24 h de incubação a 37 ºC, a infecção foi analisada com ensaio imunocitoquímico (ICC). As células foram fixadas e permeabilizadas com metanol.
Em seguida, o anticorpo primário (diluição 1: 100) foi adicionado e incubado por 1 hora a 37 ºC. As células foram lavadas com tampão de lavagem (DPBS + Tween 0,05%) três vezes; em seguida, o anticorpo secundário (diluição 1: 750) foi adicionado. Após 1 hora, as células foram lavadas e a solução DAB foi adicionada. As células infectadas foram contadas e as porcentagens de infecção foram calculadas comparando o número de células infectadas em condições tratadas e não tratadas.
[0135] No caso do H5N1, ensaios de inibição com base em citometria de fluxo foram conduzidos adicionalmente. As células MDCK foram pré-plaqueadas com 24 horas de antecedência em placas de 24 poços (75.000 células/ poço). Concentrações crescentes de materiais foram incubadas com o vírus da influenza (MOI: 0,04) a 37 ºC por uma hora e, em seguida, as misturas foram adicionadas às células. Após a adsorção do vírus (1 h a 37 ºC), o inóculo do vírus foi removido, as células foram lavadas e meio fresco foi adicionado. Após 5 horas de incubação a 37 ºC, a infecção foi analisada por citometria de fluxo. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e fixadas usando tampão de fixação IC (Thermo Fisher Scientific, Países Baixos) por 15 minutos em temperatura ambiente seguido por permeabilização usando tampão de permeabilização IX IC (Thermo Fisher Scientific, Países Baixos) por 15 minutos a 4 ºC. As células foram coradas com anticorpo monoclonal de camundongo da nucleoproteína do vírus anti-Influenza A [D67J] (FITC) (Abeam ab210526, Países Baixos) durante 30 minutos a 4 ºC. A diluição do anticorpo foi 1:80 em tampão de permeabilização e 50 μl por tubo foram adicionados. A análise FACS foi realizada usando o software FACS Calibur 3. A concentração que produz redução de 50% no número de células infectadas (concentração efetiva (EC50)) foi determinada usando o software Prism. A estratégia de disparo para FACS foi realizada conforme mostrado na Figura 18. O primeiro disparo foi feito com base em FSC/ SSC e, em seguida, o bloqueio negativo para FITC foi feito. Este aprisionamento foi aplicado às amostras restantes.
[0136] A infectividade do H7N1 foi avaliada por meio da atividade da luciferase. As células MDCK foram semeadas em 5x104 em placas de 96 poços. Após 24h, o meio foi substituído por meio sem soro. Concentrações crescentes de C11-3’ foram incubadas com 100 pfu de H7N1 A/ Turquia/ Itália/ 977/1999 que codifica a NanoLuciferase. A mistura foi incubada por 1h a 37 ºC antes da adição às células para outra incubação de 1h a 37 ºC (100 μl por poço). As células foram lavadas e o meio substituído por meio sem soro com 1 μg/ mL de TPCK-Tripsina. Vinte e quatro horas após a infecção, as células foram lavadas e depois lisadas com 40 μl por poço de tampão de ensaio Nano Glo® Luciferase (Promega) diluído 1/2 em PBS. A atividade da luciferase foi medida nos lisados celulares usando um leitor de placas Tecan Infinite M200PRO: 15 μl de substrato de ensaio Nano Glo® Luciferase (Promega) diluído 1/5000 em PBS foram adicionados a 15 μl de lisado para cada poço. Ensaios virucidas
[0137] Os vírus (unidade formadora de foco (ffu): 105/ mL) e os materiais de teste (concentração de EC99, Tabela 7) foram incubados durante 1 hora a 37 ºC. Diluições em série dos complexos vírus-material juntamente com os controles não tratados foram conduzidas e transferidas para as células. Após 1 hora, a mistura foi removida e meio fresco foi adicionado. No dia seguinte, os títulos virais foram avaliados com o ensaio ICC. Para o ensaio ICC, foi seguido o mesmo procedimento descrito acima. Tabela 7: As concentrações de material nas quais os ensaios virucidas in vitro foram realizados. Material Concentração (μg/ mL) A/ Países Baixos/ 2009 C6-6’ 100 H1N1 C11-6’ 100 C14-6’ 100 P8-6’ 500 C11-3’ 500 NPs de C15-6’SLN 100 NPs de PEG4- 500 6’SLN A/ Singapura/ 2004 H3N2 C11-6’ 100 B/ Wisconsin/ 2010 C11-6’ 200 Análise de dados
[0138] Todos os resultados são apresentados como os valores médios de três experiências independentes realizadas em duplicado. Os valores de EC50 para curvas de inibição foram calculados por análise de regressão usando o programa GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA) para ajustar uma curva de resposta de dose sigmoidal de inclinação variável. Ex vivo
[0139] Co-tratamento nº 1: cepa de H1N1 PB/09 (pfu: 104-105) e CD-C15-6’SLN (400 μg/ mL) foram adicionados simultaneamente ao MucilAir (reconstrução do epitélio das vias aéreas humanas). Após 4 horas, o sobrenadante foi removido e meio fresco foi adicionado. O título viral do sobrenadante foi seguido a cada 24 horas com qPCR.
[0140] Co-tratamento nº 2: epitélios das vias aéreas humanas reconstruídos in vitro, tecidos MucilAir, (Epithelix Sari, Genebra, Suíça) foram cultivados na interface ar-líquido a partir de uma mistura de células epiteliais de pólipo nasal originárias de doadores saudáveis. A cepa clínica Influenza H1N1 pdm 2009 (1e4 cópias/ tecido) e C11-6’ (50 μg/ tecido) foram transferidos para tecidos sem pré-incubação, juntamente com o controle não tratado. Após 4 horas de tempo de incubação, os tecidos foram lavados duas vezes. Diariamente, o meio basal foi trocado. Para realizar medições diárias de qPCR, 200 μL de meio foram adicionados aos tecidos e coletados 20 minutos depois. O RNA extraído com o kit de extração viral EZNA (Omega Biotek) foi quantificado usando qPCR com o kit QuantiTect (# 204443; Qiagen, Hilden, Alemanha) em um termociclador StepOne ABI.
[0141] Pós-tratamento: os tecidos de MucilAir foram infectados com H1N1 pdm 2009 (1e4 cópias/ tecido). Após 4 h, o inóculo foi removido e os tecidos foram lavados. Após 20 h, uma lavagem apical foi feita por 20’ e, subsequentemente, C11-6’ (30 μg/ tecido), ou um volume igual de meio nos tecidos não tratados, foram adicionados de maneira apical. Todos os dias após a lavagem apical 20’, nova adição de C11-6’ foi realizada. O RNA foi então extraído e qPCR feito conforme descrito acima. Um procedimento semelhante na ausência de vírus foi conduzido para estudos de toxicidade.
Imunofluorescência
[0142] As células infectadas com influenza foram detectadas diretamente com o anticorpo da Influenza A (Light Diagnostic) e o anticorpo primário de beta tubulina (Abcam) foi usado como marcador de células ciliadas. O Ab de cabra anti-coelho Alexa 488 e o Ab de cabra anti-camundongo Alexa 594 (Life Technologies) foram usados como o Ab secundário e os núcleos foram corados com DAPI. As imagens foram adquiridas com microscópio confocal Zeiss LSM 700 Meta e processadas pela Imaris. Ensaio de lactato desidrogenase (LDH)
[0143] A liberação de LDH no meio basal foi medida com o Kit de Detecção de Citotoxicidade (Roche 04744926001). Ensaio de MTT
[0144] A solução de MTT foi diluída em meio MucilAir (1 mg/ ml) e 300 μl foram adicionados de forma basal em uma placa de 24 poços. Após 4 horas de incubação a 37 ºC, os tecidos foram transferidos para novas placas e lisados com 1 ml de DMSO. O sobrenadante foi lido a 570 nm. As porcentagens de viabilidade foram calculadas comparando tecidos tratados e não tratados.
ELISA
[0145] Interleucina-6 (IL-6), quimiocina 10 do motivo CXC (CXCL10 ou IP-10), quimiocina 5 do motivo CC (CCL5 ou RANTES), interleucina-8 (IL-8 ou CXCL-8) e interferon lambda (IL-29/ IL-28B) foram medidos no meio basal por ELISA (R&D DY206-05, DY266-05, DY278-05, DY208-05 e DY1598B-05) após o tratamento diário com diferentes concentrações de CD. In vivo
[0146] Pré-tratamento: Quatro grupos de cinco camundongos BALB/c foram tratados no dia 0 com 50 μl de PBS ou C11-6’ (25 μg em 50 μl) e imediatamente inoculados com A/ PB/ 09 (102 ffu). Diariamente, a temperatura corporal e o peso dos camundongos foram medidos. Dois dias após a infecção, 2 grupos de camundongos foram sacrificados (um grupo com pbs e o outro tratado com C11-6’). Homogenato de pulmão e mucosa nasal e lavado broncoalveolar foram coletados para quantificar o título viral por meio de medidas de qPCR. O grupo tratado com C11-6’ foi retratado com a mesma quantidade da nanopartícula. Dois dias depois, todos os camundongos restantes foram sacrificados, o homogenato de pulmão e a mucosa nasal foram coletados. Após a ruptura do tecido, o RNA foi extraído com Trizol e quantificado por qPCR enquanto o BAL foi submetido ao ensaio de placa. Dois experimentos independentes foram realizados.
[0147] Pós-tratamento: 2 grupos de dez ratos BALB/c foram infectados com A/ PB/ 09 (102 ffu) e tratados 6 horas após a infecção e subsequentemente diariamente durante 7 dias. A temperatura corporal e o peso dos ratos foram medidos diariamente. O endpoint humano foi usado durante o estudo de sobrevivência: os camundongos foram sacrificados por meio de deslocamento cervical quando os pesos corporais foram reduzidos para 75% dos pesos iniciais. Além disso, os animais que atingiram o estado moribundo (sem resposta e sem consciência dos estímulos) também foram sacrificados. Ensaios de dose-resposta
[0148] Uma concentração fixa de vírus (ffu: 103) foi incubada com doses variáveis de nanopartículas, por 1 hora a 37 ºC. A mistura então transferida para as células.
Após 1 hora, a mistura foi removida e as células foram lavadas.
No dia seguinte, a infecção foi analisada com ensaio imunocitoquímico (ICC).

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, caracterizada por compreender um núcleo e uma pluralidade de ligantes ligados de forma covalente ao núcleo, em que pelo menos uma porção dos referidos ligantes compreende uma porção de trissacarídeo e em que: - o núcleo é a ciclodextrina, - os ligantes são iguais ou diferentes e são ligantes à base de alquila opcionalmente substituídos, e - cada porção de trissacarídeo é selecionada a partir de 3- sialil-N-acetillactoseamina (3’SLN) e 6-sialil-N- acetillactoseamina (6’SLN).
2. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a ciclodextrina é selecionada a partir do grupo que compreende alfa-ciclodextrina, beta-ciclodextrina, gama-ciclodextrina ou combinações dos mesmos.
3. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo fato de que os ligantes são ligantes à base de alquila C4-C30 opcionalmente substituídos.
4. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os ligantes são compostos de ligante à base de alquila C6-C15 opcionalmente substituídos.
5. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que alguns ou todos os referidos ligantes compreendem 3’SLN, alguns ou todos os referidos ligantes compreendem 6’SLN e alguns, mas não todos os referidos ligantes não compreendem nenhuma porção de trissacarídeo.
6. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, caracterizada pelo fato de ser representada pela Fórmula (I): Ciclodextrina Porção de trissacarídeo em que m é 2 a 8, e n é 2 a 28 ou 4 a 13.
7. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a ciclodextrina é selecionada a partir do grupo que compreende alfa-ciclodextrina, beta-ciclodextrina e gama- ciclodextrina.
8. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 7, caracterizada pelo fato de que m é 3 ou 4.
9. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, caracterizada pelo fato de ser representada pela Fórmula (II) em que:
cada R, de maneira independente, é um ligante à base de alquila opcionalmente substituído, em que pelo menos dois dos referidos ligantes possuem uma porção de trissacarídeo selecionada a partir do grupo que compreende 3-sialil-N- acetillactoseamina (3’SLN) e 6-sialil-N-acetillactoseamina (6’SLN), ou em que pelo menos um dos referidos ligantes possui 3’SLN e outro possui 6’SLN; cada R’, de maneira independente, é H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y- SO3-, um polímero ou uma porção com solubilização em água; x é 6, 7 ou 8; e y é um número inteiro de 4 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
10. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que R’ é H.
11. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 10, caracterizada pelo fato de que os referidos ligantes à base de alquila são ligantes à base de alquila C4-C30 opcionalmente substituídos.
12. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA. de acordo com uma qualquer das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que os ligantes à base de alquila são ligantes à base de alquila C6-C15 opcionalmente substituídos compreendendo 6’SLN.
13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais nanopartículas virucidas, conforme definida em uma qualquer das reivindicações 1 a 12, e pelo menos um excipiente, veículo e/ ou diluente farmaceuticamente aceitável.
14. NANOPARTÍCULA VIRUCIDA, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento e/ ou prevenção de infecções por vírus da influenza e/ ou doenças associadas aos vírus da influenza.
15. COMPOSIÇÃO VIRUCIDA, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais nanopartículas virucidas, conforme definidas em uma qualquer das reivindicações 1 a 12 e, opcionalmente, pelo menos um veículo de aerossol adequado.
16. MÉTODO DE DESINFECÇÃO E/OU ESTERILIZAÇÃO, caracterizado pelo fato de que compreende o uso da composição virucida, conforme definida em uma qualquer das reivindicações 13 ou 15, ou uma nanopartícula virucida, conforme definida em uma qualquer das reivindicações 1 a 12.
17. DISPOSITIVO, caracterizado pelo fato de que compreende a composição virucida, conforme definida em uma qualquer das reivindicações 13 ou 15, ou uma ou mais nanopartículas virucidas, conforme definida em uma qualquer das reivindicações 1 a 12, e meios para aplicar ou dispensar a composição virucida ou as nanopartículas virucidas.
18. USO DAS NANOPARTÍCULAS VIRUCIDAS, conforme definidas em uma qualquer das reivindicações 1 a 12, ou das composições virucidas, conforme definidas em uma das reivindicações 13 ou 15, caracterizado pelo fato de ser para esterilização e/ ou desinfecção.
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