BR112021001451A2 - anticorpos monoclonais anti-siglec-5 isolados, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos de produção de um anticorpo e de prevenção, composição farmacêutica e métodos para induzir ou promover a sobrevida, para diminuir a atividade, para diminuir os níveis celulares, para induzir a produção de espécies reativas, para induzir a formação de neutrophil extracellular trap (net), para induzir a ativação de neutrófilos, para atenuar um ou mais neutrófilos imunossuprimidos e para aumentar a atividade de fagocitose - Google Patents

anticorpos monoclonais anti-siglec-5 isolados, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos de produção de um anticorpo e de prevenção, composição farmacêutica e métodos para induzir ou promover a sobrevida, para diminuir a atividade, para diminuir os níveis celulares, para induzir a produção de espécies reativas, para induzir a formação de neutrophil extracellular trap (net), para induzir a ativação de neutrófilos, para atenuar um ou mais neutrófilos imunossuprimidos e para aumentar a atividade de fagocitose Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SIGLEC-5 ISOLADOS, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO E DE PREVENÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODOS PARA INDUZIR OU PROMOVER A SOBREVIDA, PARA DIMINUIR A ATIVIDADE, PARA DIMINUIR OS NÍVEIS CELULARES, PARA INDUZIR A PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS, PARA INDUZIR A FORMAÇÃO DE NEUTROPHIL EXTRACELLULAR TRAP (NET), PARA INDUZIR A ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS, PARA ATENUAR UM OU MAIS NEUTRÓFILOS IMUNOSSUPRIMIDOS E PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE FAGOCITOSE. A presente divulgação é direcionada, de modo geral, a composições que incluem anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, quiméricos, humanizados, fragmentos de anticorpos etc., que se ligam especificamente a uma proteína Siglec-5, por exemplo, Siglec-5 humano, e ao uso de tais composições na prevenção, redução do risco ou tratamento de um indivíduo em necessidade.

Description

“ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SIGLEC-5 ISOLADOS, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO E DE PREVENÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODOS PARA INDUZIR OU PROMOVER A SOBREVIDA, PARA DIMINUIR A ATIVIDADE, PARA DIMINUIR OS NÍVEIS CELULARES, PARA INDUZIR A PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS, PARA INDUZIR A FORMAÇÃO DE NEUTROPHIL EXTRACELLULAR TRAP (NET), PARA INDUZIR A ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS, PARA ATENUAR UM OU MAIS
NEUTRÓFILOS IMUNOSSUPRIMIDOS E PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE FAGOCITOSE” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.
Nº 62/711.405, depositado em 27 de julho de 2018, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
SUBMISSÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0002] O conteúdo da submissão abaixo em arquivo de texto ASCII é incorporado neste documento por referência na sua totalidade: formato legível por computador (CRF) da Listagem de Sequência (nome do arquivo: 735022002740SEQLIST.TXT, data de gravação: 25 de julho de 2019, tamanho: 106 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente divulgação refere-se a anticorpos anti-Siglec-5 e usos terapêuticos de tais anticorpos.
FUNDAMENTOS
[0004] A lectina-5 semelhante a Ig de ligação ao ácido siálico (Siglec-5) é uma proteína transmembrana do tipo 1, semelhante a imunoglobulina, expressa em células imunes e hematopoiéticas, incluindo células mieloides maduras, como monócitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, e células da micróglia, bem como células linfoides, (Crocker et al.
(2007) Nat Rev Immunol. 7:255–266; Macauley et al. (2014) Nat. Rev. Imm. 14: 653-666; Cornish et al (1998) Blood 92(6): 2123-2132; Yamanaka et al. (2009) Glycobiology. 19:841-846). Siglec-5 é um membro da família Siglec de lectinas que se ligam a resíduos de ácido siálico de glicoproteínas e glicolipídios. Um alvo de ligação potencial para proteínas Siglec são gangliosídeos; isto é, glicolipídeos que consistem em uma ceramida ligada a um glicano sialilado. A maioria dos gangliosídeos compartilha um núcleo comum de lacto-ceramida e um ou mais resíduos de ácido siálico. A diversidade nos ligantes de Siglec é gerada pela adição de outros açúcares neutros e ácido siálico em diferentes ligações, ramificadas ou terminais, e modificação do próprio ácido siálico.
[0005] Quatorze proteínas Siglec foram identificadas em humanos e nove em camundongos que são compostos de 2-17 domínios Ig extracelulares, incluindo um domínio do conjunto V do terminal amino que contém o sítio de ligação ao ácido siálico. A região de ligação ao ácido siálico está localizada no domínio do conjunto V semelhante a Ig, que contém dois resíduos aromáticos e um motivo arginina altamente conservado em todos os Siglecs (Crocker et al.
(2007) Nat Rev Immunol. 7:255–266; McMillan e Crocker (2008) Carbohydr Res.
343:2050–2056; Von Gunten e Bochner (2008) Ann NY Acad Sci. 1143:61–82; May et al. (1998) Mol. Cell 1:719–728; Crocker et al. (1999) Biochem J. 341:355– 361; e Crocker e Varki (2001) Trends Immunol. 2:337–342). Os sítios de ligação para ligantes sialilados foram mapeados por estruturas de cristal com e sem ligação de ligante (Attrill et al., (2006) J. Biol. Chem. 281 32774-32783; Alphey et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:5 3372-3377; Varki et al., Glycobiology, 16 pp.
1R–27R, May et al. (1998) Mol. Cell 1:5:719-728, Zhuravleva et al (2008) J. Mol. Biol. 375:437-447). Como as membranas celulares são ricas em ácidos siálicos, a ligação do ligante por Siglecs pode ocorrer em cis e trans, ambos afetando suas propriedades funcionais. Cada Siglec tem uma preferência distinta para ligar os diversos tipos de glicanos sialilados que são encontrados na superfície das células de mamíferos (Crocker et al. (2007) Nat Rev Immunol. 7: 255-266;).
A maioria dos Siglecs contém uma ou mais sequências de motivo inibitório baseado em tirosina imunorreceptor (ITIM) em suas caudas citoplasmáticas, o que permite que funcionem como receptores inibitórios e reguladores negativos das funções imunológicas por meio do recrutamento das tirosina fosfatases SHP1 e SHP2 (Crocker et al. (2007) Nat Rev Immunol. 7:255–266; McMillan e Crocker (2008) Carbohydr Res. 343:2050–2056; e Von Gunten and Bochner (2008) Ann NY Acad Sci. 1143:61–82). Certos Siglecs contêm sequências de motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptor (ITAM) em suas tails citoplasmáticas, o que os permite atuar como receptores ativadores e reguladores positivos da função imunológica através do recrutamento previsto de tirosina quinase do baço (Syk) (Macauley SM. et al., (2014) Nature Reviews Immunology 14, 653–666). A família de proteínas Siglec está associada a várias doenças humanas, incluindo autoimunidade, suscetibilidade a infecções, vários tipos de câncer, incluindo linfoma, leucemia e leucemia mieloide aguda, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, doenças neurodegenerativas, asma, alergia, sepse, obstrução pulmonar crônica doença, doença do enxerto contra o hospedeiro, eosinofilia e osteoporose (Macauley SM. et al., (2014) Nature Reviews Immunology 14, 653-666).
[0006] Siglec-5 contém um domínio tipo V semelhante a Ig do N- terminal extracelular (semelhante a imunoglobulina), domínios de conjuntos C2 semelhantes a Ig, bem como um motivo ITIM de consenso em seu domínio citoplasmático. A expressão de Siglec-5 em células COS demonstrou ligação de glóbulos vermelhos dependente de ácido siálico, que é mediada por ligações de ácido siálico terminais 2-3 ou 2-6 (Cornish et al. (1998) Blood 92 (6): 2123- 2132). A ligação do ligante dentro do domínio semelhante a lg do conjunto V do
N-terminal de Siglec-5 foi mapeada para as regiões do ligante GG' e alça CC' altamente variáveis. As interações de ligante foram investigadas com estruturas cristalinas dos domínios do conjunto Ig-V e primeiro Ig-C com e sem ligantes de ácido siálico ligados (Zhuravleva et al. (2008) J. Mol. Biol. 375; 437-447). Foi demonstrado que o Streptococcus do grupo B se liga a Siglec-5 em neutrófilos humanos de uma maneira independente de Sia, mediada pela proteína ancorada na parede celular  (Carlin et al (2009) J. Exp. Med. 206 (8) 1691-1699). A ligação da proteína GBS ao Siglec-5 resulta no recrutamento de fosfatases SHP e inibe funções como fagocitose, explosão oxidativa e produção de rede extracelular (Carlin et al (2009) J. Exp. Med. 206 (8) 1691-1699).
[0007] Siglec-5 sofre fosforilação de Tyr-520 e Tyr-544 por tirosina quinases, que recruta tirosina fosfatases SHP-1 e SHP-2, mediando a função como um receptor inibitório (Avril et al., (2005) J. Biol. Chem. 280: 19843-19851).
Após a fosforilação no Tyr-520 proximal no domínio ITIM, Siglec-5 liga SHP- 2/PTPN11 e SHP-1/PTPN6. Siglec-5 demonstrou inibir as atividades mediadas por FcRI em células de leucemia basofílica de rato, que foram previamente utilizadas para caracterizar uma classe de receptores inibitórios denominada KIRs (Receptores killer do tipo Ig) (Avril et al., (2005) J. Biol. Chem. 280: 19843- 19851). A atividade da fosfatase está associada à diminuição da mobilização de cálcio intracelular e à diminuição da fosforilação da tirosina em proteínas múltiplas (Ulyanova, T., et al., (1999) Eur J Immunol 29, 3440-3449; Paul, SP, et al., (2000) . Blood 96, 483-490), bem como com bloqueio de transdução de sinal e resposta imune, em parte, por desfosforilação de moléculas de sinalização em receptores ativadores adjacentes, incluindo aqueles que contêm motivos ITAM, receptores de reconhecimento de padrão, receptores semelhantes a Toll e danos receptores de padrão molecular associado (DAMP). Foi demonstrado que algumas funções inibidoras de Siglec-5 ocorrem na ausência de fosforilação da tirosina. Siglec-5 pode ativar SHP-1 ou SHP-2 de uma maneira independente de fosfotirosina, que pode ser suficiente para a sinalização inibitória (Avril et al., (2005) J. Biol. Chem. 280: 19843-19851).
[0008] Ligantes de Siglec ou ligação de receptor mediada por anticorpo induz endocitose de muitos membros da família Siglec, sugerindo que é uma característica biológica geral deste grupo de receptores (Tateno et al., (2007) Mol. Cell. Bio. 27(16): 5699–5710, Macauley SM. et al., (2014) Nature Reviews Immunology 14, 653–666). Um mecanismo semelhante de endocitose do receptor induzido por ligante e degradação subsequente foi relatado para receptores de tirosina-quinase (Monsonego-Oran et al., (2002) Febs letters 528, 83-89; e Fasen et al., (2008) Cell & Molecular Biology 9. 251-266), as well as steroid receptors (Callige et al., (2005) Mol. Cell. Biol. 25. 4349-4358; e Pollenz et al., (2006) Chemico-Biological Interactions. 164. 49-59).
[0009] Os anticorpos para Siglec-5 foram descritos em, por exemplo, WO2007120815, US20070244038, WO2002008257, Erickson-Miller et al. (2003) Exp. Hemat. 31: 382-388, e Cornish et al (1998) Blood 92(6): 2123-
2132.
[0010] Por conseguinte, há uma necessidade de anticorpos terapêuticos que se liguem especificamente a Siglec-5 e reduzam a expressão de Siglec-5 na superfície celular e/ou reduzam uma ou mais atividades de Siglec- 5 a fim de tratar uma ou mais doenças, distúrbios e condições associadas com atividade Siglec-5 indesejada.
[0011] Todas as referências citadas neste documento, incluindo patentes e pedidos de patente são incorporadas neste documento a título de referência em sua totalidade.
SUMÁRIO
[0012] A presente divulgação é geralmente direcionada a anticorpos anti-Siglec-5 e métodos de uso de tais anticorpos anti-Siglec-5. Os métodos fornecidos neste documento encontram uso na prevenção, redução do risco ou tratamento de um indivíduo com demência, demência frontotemporal,
doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de
Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica,
doença de Huntington, doença taupatia, Doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica,
artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behçet, Doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager,
paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical,
encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomartosos, sarcoidose,
doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma,
retinite pigmentosa, degeneração retinal n, infecção do trato respiratório, sepse,
infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget, câncer sólido e sanguíneo, câncer de bexiga, câncer cerebral,
câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão,
melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica
(CML), mieloma múltiplo, policitemia vera, trombocitose essencial, mielofibrose primária ou idiopática, mielesclerose primária ou idiopática, tumores derivados de mieloide, tumores que expressam Ligantes Sigl-5 e/ou Siglec-5, câncer de tireoide, infecções, herpes do CNS, infecções parasitárias, infecção por Tripanossoma, infecção Cruzi, infecção por Pseudomonas aeruginosa,
Leishmania infecção donovani, infecção por Streptococcus do grupo B, infecção por Campylobacter jejuni, infecção por Neisseria meningiditis, HIV tipo I e Haemophilus influenza. Os métodos fornecidos neste documento também encontram uso na indução ou promoção da sobrevivência, maturação, funcionalidade, migração ou proliferação de uma ou mais células imunes em um indivíduo que necessite destas. Os métodos fornecidos neste documento encontram uso adicional na diminuição da atividade, funcionalidade ou sobrevivência de células T reguladoras, células dendríticas imunossupressoras incorporadas em tumor, macrófagos imunossupressores incorporados em tumor, neutrófilos, células killer naturais (NK), células supressoras derivadas de mieloide, tumor macrófagos associados, neutrófilos, células NK, células de leucemia mieloide aguda (AML), células de leucemia linfocítica crônica (CLL)ou células de leucemia mieloide crônica (CML) em um indivíduo em necessidade.
Os métodos fornecidos neste documento também encontram uso na diminuição dos níveis celulares de Siglec-5.
[0013] Certos aspectos da presente divulgação são baseados, pelo menos em parte, na identificação de anticorpos anti-Siglec-5 que são capazes de diminuir os níveis de superfície celular de Siglec-5 em células, tais como células imunes primárias humanas e linhagens celulares que expressam Siglec- 5, que não inibem ou bloqueiam a ligação de ligantes de Siglec-5 a Siglec-5, que não apresentam reação cruzada com Siglec-14, que são capazes de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são capazes de induzindo a formação de rede extracelular de neutrófilos (NET), e/ou que aumentam a atividade de fagocitose em macrófagos.
[0014] Consequentemente, certos aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado, em que o anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis celulares de Siglec-5. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado, em que o anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis celulares de Siglec-5 e não inibe a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 isolado, em que o anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis celulares de Siglec-5 e não liga o Siglec-14.
[0015] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis de superfície celular de Siglec-5, diminui os níveis intracelulares de Siglec- 5, diminui os níveis totais de Siglec-5 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 induz a degradação de Siglec- 5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, derramamento de Siglec-5, regulação negativa da expressão de Siglec-5 ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo diminui os níveis celulares de Siglec-5 in vitro. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo diminui os níveis celulares de Siglec-5 in vivo. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 induz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 induz a formação de redes extracelulares de neutrófilos (NET) em neutrófilos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti- Siglec-5 induz a ativação de neutrófilos em neutrófilos. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos.
[0016] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 aumenta a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 aumenta os níveis de superfície celular de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 aumenta a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-5 aumenta os níveis de superfície celular de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide.
[0017] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um epítopo Siglec-5 linear. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um epítopo Siglec-5 descontínuo ou conformacional. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 compete com um ou mais anticorpos selecionados do grupo que consiste em S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8, e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos, pela ligação a Siglec-
5. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga ao mesmo epítopo ou epítopo de sobreposição como um ou mais anticorpos selecionados do grupo que consiste em S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5- 202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172- H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5- 174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-
03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5- G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos para ligação a Siglec-5.
[0018] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 268-278 de SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 268-278 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro do aminoácido sequência LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 226-244 de SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína de Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 226-244 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro do aminoácido sequência QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 228-238 de SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos correspondentes ao aminoácido resíduos 228-238 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti- Siglec-5 se liga à sequência de aminoácidos ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219).
[0019] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada, ou ambos, compreendem pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas dentre HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-
174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-
G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6,
S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-
174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-
03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores: (a) a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 103-115; (b) a HVR-
L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 127-135; (c) a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ
ID NOs: 153-163; (d) a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 20-28; (e) a HVR-
H2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 39-51; ou (f) a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:
70-79. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores: (a) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; (b) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; (c) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155; (d) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156; (e) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130,e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 157; (f) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158; (g) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159; (h) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 132 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160; (i) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161; (j) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162; (k) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163; (l) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (m) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; e (n) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161.
[0020] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 194- 211; e/ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ
ID NOs: 174-193. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8, e S5-G-03-H9; e/ou um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5- 176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5- 174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174- H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03- H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9.
[0021] Outros aspectos da presente divulgação se referem ao anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-Siglec-5 compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada, ou ambos, compreendem pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas dentre HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172- H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8, e S5-G-03-H9. Em algumas modalidades: (a) a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ
ID NOs: 103-115; (b) a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 127-135; (c) a HVR-
L3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 153-163; (d) a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ
ID NOs: 20-28; (e) a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 39-51; ou (f) a HVR-
H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 70-79. Em algumas modalidades: em que (a) a HVR-
H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (b) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; (c) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155; (d) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156; (e) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157; (f) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158; (g) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159; (h) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 132 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160; (i) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161; (j) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162; (k) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163; (l) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (m) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; e (n) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161.
[0022] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado em que o anticorpo anti-Siglec-5 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 194-211 e/ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 174-193. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado em que o anticorpo anti-Siglec-5 compreende um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8, e S5-G-03-H9; e/ou um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5- 176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-
174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174- H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03- H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado em que o anticorpo anti-Siglec-5 compete com um ou mais anticorpos selecionados do grupo que consiste em S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8, e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos, pela ligação a Siglec-
5. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado caracterizado pelo fato de que se liga essencialmente ao mesmo epítopo de Siglec-5 que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5- 182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172- H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5- 174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03- H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03- H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9.
[0023] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado que se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 268-278 de SEQ ID NO: 1 ou amino resíduos de ácido em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1, resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácido 226-244 da SEQ ID NO: 1 e resíduos de aminoácidos 228-238 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácidos 228-238 de SEQ ID NO: 1. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 isolado que se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro de sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a sequência de aminoácidos LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221), a sequência de aminoácidos QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220), e a sequência de aminoácidos ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219).
[0024] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo é da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo se liga a um receptor Fc inibitório. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o receptor Fc inibitório é o receptor Fc-gama inibitório IIB (FcγIIB). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores: (a) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1 humano ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir de grupo que consiste em: N297A, D265A, D270A, L234A, L235A, G237A, P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E, P331S, S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D, E430G, V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K, V305W, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU, ou compreende uma deleção de aminoácido na região Fc em uma posição correspondente a glicina 236; (b) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1 e compreende um domínio constante 1 de cadeia pesada de isotipo IgG2 (CH1) e região de dobradiça, opcionalmente em que o isotipo CH1 de IgG2 e a região de dobradiça compreendem a sequência de aminoácidos de ASTKGPSVFP
LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 218) e opcionalmente em que a região Fc do anticorpo compreende uma substituição de aminoácido S267E, uma substituição de aminoácido L328F, ou ambas, e/ou uma substituição de aminoácido N297A ou N297Q, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; (c) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2 e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir do grupo que consiste em: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, V309L, A330S, P331S, C214S, C232S, C233S, S267E, L328F, M252Y, S254T, T256E, H268E, N297A, N297Q, A330L, C127S, E430G, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração da EU; (d) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG4 humano ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir do grupo que consiste em: L235A, G237A, S228P, L236E, S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T, T256E, E233P, F234V, L234A/F234A, S228P, S241P, L248E, T394D, N297A, N297Q, L235E, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU; ou (e) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2/4 híbrido e, opcionalmente, em que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 118 a 260 de IgG2 humana e os aminoácidos 261 a 447 de IgG4 humana, em que o a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU ou Kabat. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores: (a) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1 humano ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir de grupo consistindo em: N297A, N297Q, D270A, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S,
E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S,
T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU; (b) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2 e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir do grupo que consiste em: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L,
N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E, C127S,
E430G, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; ou (c) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG4 e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região
Fc em uma posição de resíduo selecionada a partir do grupo que consiste em:
E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P,
L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores: (a) a região Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais em uma posição selecionada do grupo que consiste em A330L, L234F; L235E, P331S e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU; (b) a região Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais em uma posição selecionada do grupo que consiste em M252Y, S254T, T256E e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU; ou (c) a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido S228P de acordo com a numeração EU. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo tem um isotipo IgG4. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende uma substituição de aminoácido S228P na posição de resíduo 228, uma substituição de aminoácido F234A na posição de resíduo 234 e uma substituição de aminoácido L235A na posição de resíduo 235, em que a numeração da posição do resíduo está de acordo com a numeração EU.
[0025] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína Siglec-5 é uma proteína de mamífero ou uma proteína humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína Siglec-5 é uma proteína do tipo selvagem. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína Siglec-5 é uma variante de ocorrência natural. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a proteína Siglec-5 é expressa em uma ou mais células selecionadas do grupo que consiste em células dendríticas humanas, macrófagos humanos, neutrófilos humanos, células NK humanas, monócitos humanos, osteoclastos humanos, células B humanas, células T humanas, células T auxiliares humanas, células T citotóxicas humanas, granulócitos humanos e micróglia humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga especificamente a proteína Siglec-5 humana. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é um fragmento de anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo resíduos de aminoácidos em Siglec-5 humano. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é um fragmento de anticorpo que se liga a uma ou mais proteínas humanas selecionadas do grupo que consiste em Siglec-5 humana, uma variante de
Siglec-5 humana de ocorrência natural e uma variante da doença de Siglec-5 humana.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o fragmento de anticorpo é reticulado a um segundo fragmento de anticorpo que se liga a uma ou mais proteínas humanas selecionadas do grupo que consiste em Siglec-5 humana, uma variante de
Siglec-5 humana de ocorrência natural e uma variante da doença de Siglec-5 humana.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o fragmento é um fragmento Fab, Fab', Fab'-
SH, F(ab')2, Fv ou scFv.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo murino.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas a qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo é um anticorpo anti-
Siglec-5 humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo conjugado ou um anticorpo quimérico.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo biespecífico que reconhece um primeiro antígeno e um segundo antígeno.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o primeiro antígeno é Siglec-5 e o segundo antígeno é: (a) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica; (b) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica selecionada do grupo que consiste em receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas 1 e 2 relacionadas ao receptor de lipoproteínas de baixa densidade (LPR-1 e 2), receptor de toxina da difteria, CRM197, um anticorpo de domínio único de lhama, TMEM 30(A), um domínio de transdução de proteínas, TAT, Syn-B, penetratina, um peptídeo de poliarginina, um peptídeo de angiopep e ANG1005; (c) um agente causador de doença selecionado do grupo que consiste em peptídeos ou proteínas causadores de doenças ou ácidos nucleicos causadores de doenças, em que os ácidos nucleicos causadores da doença são antisense GGCCCC (G2C4) (SEQ
ID NO: 225) RNA de expansão de repetição, as proteínas causadoras da doença são selecionadas do grupo que consiste em beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas beta amiloide, precursor amiloide proteína ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberta 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína de príon, PrPSc,
huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2,
ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial,
polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteína AI, amiloide sérico A,
medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina,
queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM,
produtos de tradução não-ATG associados a repetição (RAN), peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA),
peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-
arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), peptídeos de repetição de ubiquitina e prolina-arginina (PR); (d) ligantes e/ou proteínas expressos em células imunes, em que os ligantes e/ou proteínas selecionadas do grupo que consiste em PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB,
CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA,
CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2,
CD5, CD39, CD73 e fosfatidilserina; e (e) uma proteína, lipídeo, polissacarídeo ou glicolipídeo expresso em uma ou mais células tumorais.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo conjugado.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é conjugado a um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-
Siglec-5 é conjugado a uma toxina selecionada do grupo que consiste em ricina,
cadeia A de ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, maitansinoide, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina,
colchicina, di-hidroxiantracina diona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de
Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina,
alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina,
crotina, caliqueamicina, inibidor Saponaria officinalis, glicocorticoide, auristatina,
auromicina, ítrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolastatina, cc1065 e uma cisplatina.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 é usado em combinação com um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína causadora de doença selecionada do grupo que consiste em beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos da mesma, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43,
proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína de príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina
1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpos de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteína AI,
amiloide A sérica, medsoína, prolactina, transtirretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG associados à repetição (RAN), peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR)
e qualquer combinação das mesmas; ou com um ou mais anticorpos que se ligam a uma proteína imunomoduladora selecionada do grupo que consiste em: PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73, TREM1, TREM2, CD33, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, fosfatidilserina, ácidos nucleicos causadores de doenças, RNA de expansão de repetição GGCCCC (G2C4) antisense (SEQ ID NO: 225) e qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o anticorpo anti-Siglec-5 tem constante de dissociação (KD) para Siglec-5 humano que varia de cerca de 0,42 nM a cerca de 79 nM, de cerca de 79 nM a cerca de 61 nM, de cerca de 15 nM a cerca de 5,3 nM, ou de cerca de 1,7 nM a cerca de 0,42 nM, em que o K D é determinado a uma temperatura de aproximadamente 25ºC.
[0026] Outros aspectos da presente divulgação referem-se a um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
Outros aspectos da presente divulgação referem-se a um vetor compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das modalidades anteriores. Outros aspectos da presente divulgação referem-se a uma célula hospedeira isolada compreendendo o vetor de qualquer uma das modalidades anteriores. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de produção de um anticorpo anti-Siglec-5, compreendendo a cultura da célula hospedeira de qualquer uma das modalidades anteriores de modo que o anticorpo anti-Siglec- 5 seja produzido. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a recuperação do anticorpo anti-Siglec-5 produzido pela célula hospedeira. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec-5 isolado produzido pelo método de qualquer uma das modalidades anteriores. Outros aspectos da presente divulgação referem-se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0027] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de prevenção, redução de risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo que consiste em demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença taupatia, doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica, artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy- Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar cortical basal, encefalomielite disseminada aguda, doenças granulosas, sarcoidose, doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionado à idade, glaucoma, retinite pigmentosa, degeneração retinal, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e câncer, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, policitemia vera, trombocitose essencial, mielofibrose primária ou idiopática, mielofibrose primária ou idiopática, tumores derivados de mieloide,
tumores que expressam Siglec-5, tumores que expressam um ou mais ligantes de Siglec-5, câncer de tireoide, infecções, herpes do SNC, infecções parasitárias, infecção por tripanossoma, infecção Cruzi, infecção por
Pseudomonas aeruginosa, infecção por Leishmania donovani, infecção por
Streptococcus do grupo B, infecção por Campylobacter jejuni, infecção por
Neisseria meningiditis, HIV tipo I e Haemophilus influenza, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 que diminui os níveis celulares de Siglec-5. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec-5 que diminui os níveis celulares de Siglec-5 para uso na prevenção, redução de risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo que consiste em demência, demência frontotemporal,
doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de
Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica,
doença de Huntington, doença taupatia, doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica,
artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager,
paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical,
encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomartosos, sarcoidose,
doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma,
retinite pigmentosa, degeneração da retina, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e câncer, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama,
câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma,
linfoma não-Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de ovário,
fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda
(AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML),
mieloma múltiplo, policitemia vera, trombocitose essencial, mielofibrose primária ou idiopática, mielesclerose primária ou idiopática, tumores derivados de mieloides, tumores que expressam Siglec-5, tumores que expressam uma ou mais ligantes de Siglec-5, câncer de tireoide, infecções, herpes do CNS,
infecções parasitárias, infecção por tripanossoma, infecção Cruzi, infecção por
Pseudomonas aeruginosa, infecção por Leishmania donovani, infecção por
Streptococcus do grupo B, infecção por Campylobacter jejuni, infecção por
Neisseria meningiditis, HIV tipo I e influenza Haemophilus.
Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de um anticorpo anti-Siglec-5 que diminui os níveis celulares de Siglec-5 na fabricação de um medicamento para prevenção, redução de risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo que consiste em demência, demência frontotemporal,
doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de
Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica,
doença de Huntington, doença de taupatia, doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica,
artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical,
encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomartosos, sarcoidose,
doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma,
retinite pigmentosa, degeneração da retina, infecção do trato respiratório, sepse,
infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e câncer, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama,
câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma,
linfoma não-Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de ovário,
fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda
(AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML),
mieloma múltiplo, policitemia vera, trombocitose essencial, mielofibrose primária ou idiopática, mielesclerose primária ou idiopática, tumores derivados de mieloides, tumores que expressam Siglec-5, tumores que expressam uma ou mais ligantes de Siglec-5, câncer de tireoide, infecções, herpes do CNS,
infecções parasitárias, infecção por tripanossoma, infecção Cruzi, infecção por infecção por Pseudomonas aeruginosa, infecção por Leishmania donovani,
infecção do grupo B Streptococcus, infecção por Campylobacter jejuni, infecção por Neisseria meningiditis, tipo I HIV, e influenza Haemophilus.
Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de prevenção, redução de risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo que consiste em demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer,
demência vascular, demência mista, doença taupatia, infecções, e câncer,
compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que diminui os níveis celulares de Siglec-5. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec-5 que diminui os níveis celulares de Siglec-5 para uso na prevenção, redução do risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo que consiste em demência, demência frontotemporal, Doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença taupatia, infecções e câncer. Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de um anticorpo anti-Siglec-5 que diminui os níveis celulares de Siglec-5 na fabricação de um medicamento para prevenção, redução do risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo consistindo em demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de taupatia, infecções e câncer. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0028] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para diminuir os níveis celulares de Siglec-5 em uma ou mais células em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti- Siglec-5 isolado. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec-5 isolado para uso na diminuição dos níveis celulares de Siglec-5 em uma ou mais células em um indivíduo em necessidade do mesmo.
Outros aspectos da presente divulgação referem-se ao uso de um anticorpo anti- Siglec-5 isolado na fabricação de um medicamento para diminuir os níveis celulares de Siglec-5 em uma ou mais células em um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0029] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec-5 isolado para uso na indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade. Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado na fabricação de um medicamento para induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0030] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para induzir a formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado. Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec-5 isolado para uso na indução da formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo com necessidade do mesmo. Outros aspectos da presente divulgação referem-se ao uso de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado na fabricação de um medicamento para induzir a formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0031] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de induzir a ativação de neutrófilos em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado.
Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec- 5 isolado para uso na indução da ativação de neutrófilos em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade do mesmo. Outros aspectos da presente divulgação se referem ao uso de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado na fabricação de um medicamento para induzir a ativação de neutrófilos em um ou mais neutrófilos em um indivíduo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0032] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de alívio de um ou mais neutrófilos imunossuprimidos em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado.
Outros aspectos da presente divulgação se referem a um anticorpo anti-Siglec- 5 isolado para uso no alívio de um ou mais neutrófilos imunossuprimidos em um indivíduo em necessidade do mesmo. Outros aspectos da presente divulgação referem-se ao uso de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado na fabricação de um medicamento para o alívio de um ou mais neutrófilos imunossuprimidos em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 de qualquer uma das modalidades anteriores.
[0033] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método para aumentar a atividade de fagocitose em macrófagos em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado.
[0034] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o método compreende ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de checkpoint inibitória e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de checkpoint inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de checkpoint inibidora é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e um anticorpo anti-
HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor inibidor de Killer (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-
TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-
A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-
3, um anticorpo antifosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-
CD30, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-
Siglec-6, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-10, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, e qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, uma ou mais terapias anticâncer padrão ou investigacionais são selecionadas do grupo que consiste em radioterapia,
quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercepte, adotiva terapia de transferência de células (ACT), terapia de transferência de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibitória é administrado em combinação com o anticorpo anti-
Siglec-5. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2 e qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o método compreende ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína estimuladora de checkpoint.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimuladora é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimuladora é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo agonista anti-CD40, um anticorpo agonista anti-OX40, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonista anti-TREM1,
um anticorpo agonista anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB,
um anticorpo agonista anti-CD27, um anticorpo agonista antiglicocorticoide GITR de proteína relacionado ao TNFR induzido, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista HVEM, um anticorpo agonista anti-CD30, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de pelo menos uma citocina estimuladora.
Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos uma citocina estimuladora é administrada em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, pelo menos uma citocina estimuladora é selecionada do grupo que consiste em IFN- 4, IFN- , IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-gama, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1- beta e qualquer combinação dos mesmos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0035] A FIG. 1A mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos entre Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) e Siglec-5 de macaco cynomolgus (SEQ ID NO: 2). Um asterisco ("*") indica as posições que possuem um único resíduo totalmente conservado; Dois pontos (":") indicam conservação entre grupos de propriedades fortemente semelhantes - pontuação > 0,5 na matriz Gonnet PAM 250; e um ponto final (".") indica conservação entre grupos de propriedades fracamente semelhantes - pontuação = < 0,5 na matriz Gonnet PAM 250. FIG. 1B mostra um alinhamento de aminoácidos entre Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) e Siglec-14 humano (SEQ ID NO: 3). Um asterisco ("*") indica as posições que possuem um único resíduo totalmente conservado; Dois pontos (":") indicam conservação entre grupos de propriedades fortemente semelhantes - pontuação > 0,5 na matriz Gonnet PAM 250; e um ponto final (".") indica conservação entre grupos de propriedades fracamente semelhantes - pontuação = < 0,5 na matriz Gonnet PAM 250.
[0036] A FIG. 2A mostra os resultados da análise de FACS de anticorpos anti-Siglec-5 que se ligam a células CHO que expressam Siglec-5 humano recombinante ou Siglec-14 humano recombinante. A FIG. 2B mostra os resultados da análise FACS de anticorpos específicos anti-Siglec-5 que se ligam a neutrófilos humanos primários, em comparação com controles de isotipo. Na FIG.2A e na FIG. 2B, o anticorpo 1A5 reconhece Siglec-5 humano e Siglec-14 humano.
[0037] A FIG. 3 mostra resultados que demonstram que os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação não bloqueiam a interação entre a proteína Siglec-5-Fc imobilizada e os ligantes de Siglec-5 em glóbulos vermelhos.
[0038] A FIG. 4A mostra a regulação negativa dependente de anticorpo anti-Siglec-5 do receptor Siglec-5 da superfície celular em células transfectantes CHO-S5. A FIG. 4B mostra a regulação negativa dependente do anticorpo Siglec-5 do receptor Siglec-5 da superfície celular em células B primárias humanas de doadores nulos para Siglec-14. A FIG. 4C mostra a regulação negativa de Siglec-5 em macrófagos humanos diferenciados M0, M1 e M2a na presença de anticorpos específicos anti-Siglec-5.
[0039] A FIG. 5 mostra a indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos primários humanos na presença de anticorpos anti-Siglec-5.
[0040] A FIG. 6 mostra a formação de redes extracelulares de neutrófilos (NET) por neutrófilos primários humanos incubados com anticorpos anti-Siglec-5.
[0041] A FIG. 7 mostra a fagocitose de células alvo por macrófagos humanos diferenciados in vitro na presença de anticorpos específicos anti- Siglec-5.
[0042] A FIG. 8 mostra a expressão de Siglec-5 em células imunes no sangue e em tumores isolados de camundongos transgênicos para Siglec-5 humano.
[0043] A FIG. 9 mostra os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que se ligam às células CHO que expressam Siglec-5 humano recombinante (CHO-S hSiglec-5), mas não se ligam às células CHO parentais que não expressam Siglec-5 (CHO-S Parental) ou células CHO expressando Siglec-14 humano recombinante (CHO-S hSiglec-14). As células CHO foram incubadas com concentrações crescentes de anticorpo anti-Siglec-5, conforme indicado no eixo x de cada gráfico. A ligação de anticorpos anti-Siglec-5 à superfície das células CHO foi então medida por FACS. O eixo y fornece a ligação de cada anticorpo anti-Siglec-5 indicado à superfície das células CHO em relação aos anticorpos de controle do isotipo hIgG1. S5-174-H2L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H3; S5-174-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H5; S5- 174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5-174-H4L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H7; S5-174-H4L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H8; S5-G03- H2L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H4; S5-G03-H2L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H5; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5-G03-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H8; e S5-G03-H3L3 refere-se ao anticorpo S5- G-03-H9.
[0044] A FIG. 10 mostra os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que regulam negativamente os níveis de superfície celular de Siglec-5 in vitro. As células CHO que expressam Siglec-5 (CHO-S5) foram incubadas com concentrações crescentes de anticorpo anti-Siglec-5, conforme indicado no eixo x de cada gráfico, durante 16-24 horas. A expressão de Siglec-5 na superfície das células foi então medida por análise FACS. A expressão percentual da superfície celular de Siglec-5 restante é fornecida no eixo y dos gráficos (% hSiglec-5 de Controle) e foi calculada de acordo com a fórmula: (MFI de 1A5-PE na presença do anticorpo de teste)/(MFI de 1A5-PE na ausência de anticorpo de teste)*100%, onde MFI é a Intensidade de Fluorescência Média, 1A5-PE se refere a anti-Siglec-5-PE, clone 1A5 (Biolegend), e o anticorpo de teste se refere ao anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação sendo testado. hIgG1 refere-se a anticorpos de controle de isotipo; S5- 174-H2L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H3; S5-174-H3L1 refere-se ao anticorpo S5- 174-H5; S5-174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5-174-H4L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H7; S5-174-H4L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H8; S5-G03-H2L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H4; S5-G03-H2L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03- H5; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5-G03-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H8; e S5-G03-H3L3 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H9.
[0045] A FIG. 11 mostra os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que aumentam a expressão de CD86 em células supressoras primárias derivadas de mieloide humano. Células supressoras derivadas de mieloide humano (MDSCs) obtidas de dois doadores de sangue humano (Dador 849 e Dador 851) foram tratadas com concentrações crescentes de anticorpos anti-Siglec-5, conforme indicado no eixo x dos gráficos (até 10 µg/mL), por 48 horas. A expressão de CD86 em MDSCs foi então quantificada por FACS usando anticorpo anti-CD86 (IT2.2). A intensidade de fluorescência mediana CD86 Média (MFI) de CD86 é fornecida no eixo y dos gráficos. mIgG1 e hIgG1 referem-se a anticorpos de controle de isotipo; S5-174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5-7A5.3 e S5-8A1.3 referem-se ao anticorpo 7A5 e 8A1, respectivamente.
[0046] A FIG. 12 mostra os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que aumentam a expressão de CCL4 em células supressoras primárias derivadas de mieloide humano. Células supressoras derivadas de mieloide humano (MDSCs) obtidas de dois doadores de sangue humano (Dador 849 e Dador 851) foram tratadas com concentrações crescentes de anticorpos anti-Siglec-5, conforme indicado no eixo x dos gráficos (até 10 µg/mL). O meio condicionado após 48 horas de tratamento com anticorpo foi avaliado para alterações na expressão de CCL4. O nível de expressão de CCL4 foi medido usando um kit Quantikine ELISA (R&D Systems) ou por Human Chemokine Legendplex (Biolegend) de acordo com o protocolo do fabricante e é fornecido no eixo y (pg/ml). mIgG1 e hIgG1 referem-se a anticorpos de controle de isotipo; S5-174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5-7A5.3 e S5-8A1.3 referem-se ao anticorpo 7A5 e 8A1, respectivamente.
[0047] A FIG. 13 mostra os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que aumentam a expressão de CD86 em células supressoras primárias derivadas de mieloide humano. Células supressoras derivadas de mieloide humano
(MDSCs) obtidas de dois doadores de sangue humano (Dador 910 e Dador 911) foram tratadas com os anticorpos anti-Siglec-5 (10 µg/mL) indicados no eixo x por 48 horas. Um controle sem tratamento com anticorpos também foi realizado com MDSCs do Doador 910 (“Sem Tratamento”). A expressão de CD86 em MDSCs foi então quantificada por FACS usando anticorpo anti-CD86 (IT2.2). A intensidade de fluorescência mediana CD86 Média (MFI) de CD86 é fornecida no eixo y dos gráficos.
mIgG1, mIgG2a e hIgG1 referem-se a anticorpos de controle de isotipo; S5-7A5.3 e S5-8A1.3 referem-se ao anticorpo 7A5 e 8A1, respectivamente; S5-1A5 é um anticorpo que se liga a Siglec-5 e Siglec-14 (BioLegend).
[0048] A FIG. 14 mostra os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que aumentam a expressão de CCL4 em células supressoras primárias derivadas de mieloide humano. Células supressoras derivadas de mieloide humano (MDSCs) obtidas de dois doadores de sangue humano (Dador 910 e Dador 911) foram tratadas com os anticorpos anti-Siglec-5 (10 µg/mL) indicados no eixo x por 48 horas. Um controle sem tratamento com anticorpos também foi realizado (“Sem Tratamento”). O meio condicionado após 48 horas de tratamento com anticorpo foi avaliado para alterações na expressão de CCL4. O nível de expressão de CCL4 foi medido usando um kit Quantikine ELISA (R&D Systems) ou por Human Chemokine Legendplex (Biolegend) de acordo com o protocolo do fabricante e é fornecido no eixo y (pg/ml). mIgG1, mIgG2a e hIgG1 referem-se a anticorpos de controle de isotipo; S5-7A5.3 e S5-8A1.3 referem-se ao anticorpo 7A5 e 8A1, respectivamente; S5-1A5 é um anticorpo que se liga a Siglec-5 e Siglec-14 (BioLegend).
DESCRIÇÃO DETALHADA Técnicas Gerais
[0049] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados neste documento são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J.
MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed.
(1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B.
Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
Definições
[0050] Conforme usado neste documento, o termo "prevenção" inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença, distúrbio ou condição específica em um indivíduo. Um indivíduo pode ser predisposto, suscetível a uma determinada doença, distúrbio ou condição, ou em risco de desenvolver tal doença, distúrbio ou condição, mas ainda não foi diagnosticado com a doença, distúrbio ou condição.
[0051] Conforme usado neste documento, um indivíduo "em risco" de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição específica pode ou não ter uma doença ou sintomas da doença detectáveis, e pode ou não ter exibido uma doença ou sintomas detectáveis antes dos métodos de tratamento descritos neste documento. “Em risco” denota que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição específica, como conhecido na técnica. Um indivíduo com um ou mais desses fatores de risco tem maior probabilidade de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição específica do que um indivíduo sem um ou mais desses fatores de risco.
[0052] Como utilizado neste documento, o termo "tratamento" refere-se à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão, melhorar ou diminuir o estado patológico e remissão ou prognóstico aprimorado de uma doença, distúrbio ou condição específica. Um indivíduo é “tratado” com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados a uma doença, distúrbio ou condição específica são mitigados ou eliminados.
[0053] Uma "quantidade eficaz" refere-se a pelo menos uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade eficaz pode ser fornecida em uma ou mais administrações. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade dos medicamentos de induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para uso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem resultados tais como a eliminação ou redução do risco, diminuição da gravidade, ou atraso do aparecimento da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, como redução de um ou mais sintomas resultantes da doença, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, redução da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, potencializando o efeito de outro medicamento, como via direcionamento, retardando a progressão da doença e/ou prolongando a sobrevida. Uma quantidade eficaz de droga, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, direta ou indiretamente. Como se entende no contexto clínico, uma quantidade eficaz de uma droga, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outra droga, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for atingido.
[0054] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz” é pelo menos a concentração mínima necessária para efetuar uma melhora mensurável de uma doença, distúrbio ou condição específica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz neste documento pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade, sexo e peso do paciente, e a capacidade do antagonista da proteína Siglec-5 para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do antagonista da proteína Siglec-5 são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[0055] Conforme usado neste documento, a administração "em conjunto" com outro composto ou composição inclui administração simultânea e/ou administração em diferentes momentos. A administração em conjunto também abrange a administração como uma coformulação ou administração como composições separadas, incluindo em diferentes frequências ou intervalos de dosagem, e usando a mesma via de administração ou diferentes vias de administração.
[0056] Um "indivíduo" para fins de tratamento, prevenção ou redução de risco refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda e zoológico, de esporte ou animais de estimação, como cães, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbil, camundongos, furões, ratos, gatos e similares. De preferência, o indivíduo é humano.
[0057] O termo "imunoglobulina" (Ig) é usado alternadamente com "anticorpo; neste documento. O termo "anticorpo" é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a desejada atividade biológica.
[0058] A unidade de anticorpo de 4 cadeias básica é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. O emparelhamento de uma VH e VL em conjunto forma um único sítio de ligação ao antígeno. Para estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, consulte, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª Edição, Daniel P. Sties, Abba I. Terr e Tristram G.
Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6.
[0059] A cadeia L de quaisquer espécies de vertebrados pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, chamado kappa (“κ”) e lambda (“λ”), com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes.
Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas alfa ("α"), delta ("δ"), epsilon ("ε"), gama ("γ") e mu ("μ"), respectivamente. As classes γ e α são ainda divididas em subclasses (isotipos) com base em diferenças relativamente menores na função e sequência de CH, por exemplo: os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e geralmente descritas em, por exemplo, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4ª ed. (W.B. Saunders Co., 2000).
[0060] “Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150,000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve tem também pontes de dissulfeto intracadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante de cadeia leve está alinhado ao primeiro domínio constante de cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado ao domínio variável de cadeia pesada. Acredita-se que os resíduos de aminoácidos específicos formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
[0061] Um anticorpo "isolado", como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, é aquele que foi identificado, separado e/ou recuperado de um componente de seu meio de produção (por exemplo, naturalmente ou recombinantemente). De preferência, o polipeptídeo isolado está livre de associação a todos os outros componentes contaminantes do seu meio de produção. Os componentes contaminantes do seu meio de produção, como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente interferem nas utilizações diagnósticas, terapêuticas ou de pesquisa para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo, tal como determinado através de, por exemplo, o método de Lowry, e, em algumas modalidades, até mais de 99% em peso; (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal através da utilização de, por exemplo, um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração prata.
Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células T recombinantes, visto que pelo menos um componente do meio natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, contudo, um polipeptídeo ou anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
[0062] A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo, como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, refere-se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser referidos como “VH” e “VL”, respectivamente. Esses domínios geralmente são as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação a antígenos.
[0063] O termo "variável" refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos, como os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação. O domínio V medeia a ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo particular ao seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em toda a extensão dos domínios variáveis. Em vez disso, está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos domínios variáveis de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões framework (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem cada um quatro regiões FRs, adotando amplamente uma configuração folha-beta, conectada por três HVRs, as quais formam alças que conectam a, e em alguns casos formam parte da, estrutura folha-beta. As HVRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e com as HVRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (veja Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5ª Edição, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos.
[0064] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-translacionais (por exemplo, isomerizações, amidações)
que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um ou mais sítios antigênicos. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal da presente divulgação pode ser um anticorpo biespecífico. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante nos um ou mais sítios antigênicos. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente divulgação podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, tecnologias de exibição de fago (ver, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J.
Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat’l Acad. Sci.
USA 101(34):12467-472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119- 132 (2004), o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US Nº 4.816.567), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que têm partes ou todos os loci de imunoglobulina humana ou genes que codificam sequências de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patente US Nºs. 5.545.807; 5.545.806;
5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13:65-93 (1995).
[0065] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" ou "anticorpo inteiro" são usados indistintamente para se referir a um anticorpo, como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo.
Especificamente, os anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesadas e leves, incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequência de aminoácidos destes.
Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.
[0066] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, de preferência de ligação ao antígeno e/ou à região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diabodies; anticorpos lineares (ver Patente US 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0067] A digestão de anticorpos por papaína, como os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab” e um fragmento “Fc” residual, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar rapidamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira juntamente com o domínio da região variável de cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente em relação à ligação ao antígeno, isto é, ele possui um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento com pepsina de um anticorpo origina um único grande fragmento F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfureto que possui atividade de ligação ao antígeno diferente e ainda é capaz de ligação cruzada ao antígeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por possuírem alguns resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação neste documento para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab', os quais têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.
[0068] O fragmento Fc compreende as porções de terminais carboxi de ambas as cadeias H mantidas juntas por ligações dissulfeto. As funções efetoras de anticorpos são determinadas pelas sequências na região Fc; a região é também reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos de células.
[0069] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento de antígeno e um sítio de ligação. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e cadeia pesada em associação estreita, não covalente. A partir da dobra destes dois domínios emanam seis alças hipervariáveis (3 alças cada das cadeias H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácido para ligação de antígeno e conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, até mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv que compreende somente três HVRs específicos para um antígeno) possui a habilidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora com uma afinidade inferior ao sítio de ligação inteiro.
[0070] "Fv de cadeia única" também abreviado como “sFv ou "scFv" são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL conectados em uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo sFv compreende adicionalmente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permitem ao sFv formar a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma análise de sFv, consulte Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
[0071] "Fragmentos funcionais" de anticorpos, como anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a ligação ao antígeno ou região variável do anticorpo intacto ou a região F de um anticorpo que retém ou modificou a capacidade de ligação ao FcR. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0072] O termo "diabodies" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo preparados através da construção de fragmentos sFv (consulte o parágrafo anterior) com ligantes peptídicos curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL de tal modo que se obtenha um pareamento intercadeia, mas não intracadeia, dos domínios V é obtido, resultando em um fragmento bivalente, isto é, um fragmento possuindo dois sítios de ligação a antígeno.
Diabodies biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv "crossover", em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Diabodies são descritos em maior detalhe, por exemplo, em EP 404.097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993).
[0073] Como utilizado neste documento, um "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo (imunoglobulina), como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, no qual uma porção de cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) ou homóloga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente US Nº 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 81:6851- 55 (1984)). Os anticorpos quiméricos de interesse neste documento incluem anticorpos PRIMATIZED® em que a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido pela, por exemplo, imunização de macacos Macaca com um antígeno de interesse. Tal como utilizado neste documento, "anticorpo humanizado" é utilizado como um subconjunto de "anticorpos quiméricos."
[0074] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos), como anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) na qual resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou um primata não humano, que possui a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas.
Em alguns casos, resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo, como a afinidade de ligação. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um e, tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de uma sequência de imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana, embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de resíduos FR individuais que melhoram a performance do anticorpo, como afinidade de ligação, isomeração, imunogenicidade, e semelhantes. O número dessas substituições de aminoácidos na FR é tipicamente não mais do que 6 na cadeia H, e na cadeia L, não mais do que 3. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Consulte também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); e Patente U.S. Nºs. 6.982.321 e 7.087.409.
[0075] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos correspondente à de um anticorpo, como um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação, produzido por um humano e/ou produzido usando qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos como divulgado neste documento. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos métodos descritos em Cole et al.,
Monoclonal Antibodies e Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Consulte também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico, que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desativados, por exemplo, xenocamundongo imunizado (consulte, por exemplo, Patentes U.S. Nºs. 6.075.181 e 6.150.584 em relação a tecnologia XENOMOUSETM). Consulte também, por exemplo, Li et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) em relação a anticorpos humanos gerados através de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.
[0076] O termo "região hipervariável," "HVR," ou "HV," quando utilizado neste documento, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo, tal como aquele de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, que são hipervariáveis em sequência e/ou forma alças estruturalmente definidas.
Geralmente os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3, em particular, desempenhe um papel único de conferir boa especificidade a anticorpos. Consulte, por exemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson e Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). Com efeito, os anticorpos de camelídeos de ocorrência natural e que consistem em uma cadeia pesada somente são funcionais e estáveis na ausência da cadeia leve. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993) e Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).
[0077] Várias delimitações de HVR estão em uso e estão englobadas neste documento. As HVRs que são regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de EU ou Kabat são baseadas na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Supra). Chothia refere-se, em vez disso, à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J.
Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs de AbM representam um meio-termo entre os CDRs de EU ou de Kabat e as alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software AbM de modelagem de anticorpo da Oxford Molecular. As HVRs de "contato" baseiam-se em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas HVRs estão descritos abaixo.
Alça Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
[0078] HVRs podem compreender "HVRs estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL, e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (uma modalidade preferida) (H2) e 93-102, 94-102 ou 95- 102 (H3) no VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com EU ou Kabat et al., supra, para cada uma dessas definições de HVR estendido.
[0079] Resíduos de "framework" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não são os resíduos de HVR como definidos neste documento.
[0080] Um "framework de aceptor humano" como utilizado neste documento é um framework que compreende a sequência de aminoácidos de um framework de VL ou VH derivado de um framework de imunoglobulina humana ou de um framework de consenso humano. Um framework aceptor humano "derivada de" um framework da imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácidos desta ou pode conter alterações pré-existentes na sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácidos preexistentes são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Onde alterações de aminoácidos preexistentes estão presentes em uma VH, essas alterações ocorrem preferencialmente em apenas três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácidos nessas posições podem por 71A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, o framework aceptor humano de VL é idêntico na sequência à sequência de framework da imunoglobulina humana de VL ou à sequência de framework de consenso humana.
[0081] Um "framework de consenso humano" é um framework que representa os resíduos de aminoácidos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de framework de VL ou VH da imunoglobulina humana.
Geralmente, a seleção das sequências VL ou VH da imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Exemplos incluem para o VL, o subgrupo pode ser o subgrupo kappa I, kappa II, kappa III ou kappa IV, como em Kabat et al., supra.
Além disso, para VH, o subgrupo pode ser o subgrupo I, subgrupo II ou subgrupo III, como em Kabat et al., supra.
[0082] Uma "modificação de aminoácidos" na posição especificada, por exemplo, de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, refere-se à substituição ou deleção do resíduo especificado, ou a inserção de pelo menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. A inserção "adjacente" a um resíduo especificado significa a inserção em um a dois dos resíduos dos mesmos. A inserção pode ser de terminal N ou terminal C relativamente ao resíduo especificado. A modificação de aminoácido preferida neste documento é uma substituição.
[0083] Um anticorpo "maturado por afinidade" como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, é um com uma ou mais alterações em uma ou mais HVRs deste, que resultam em melhoria na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com um anticorpo parental que não possua esta(s) alteração(ões). Em uma modalidade, um anticorpo maturado por afinidade tem afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por embaralhamento de domínio VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de HVR e/ou framework é descrita por, por exemplo: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J.
Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
[0084] Como usado neste documento, o termo "reconhece especificamente" ou "liga-se especificamente" refere-se a interações mensuráveis e reproduzíveis, como atração ou ligação entre um alvo e um anticorpo, como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, que é determinante da presença do alvo na presença de uma população heterogênea de moléculas, incluindo moléculas biológicas. Por exemplo, um anticorpo, como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, que se liga específica ou preferencialmente a um alvo ou epítopo é um anticorpo que se liga a esse alvo ou epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros alvos ou outros epítopos do alvo. Também é compreendido pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou uma fração) que se liga específica ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não se ligar específica ou preferencialmente a um segundo alvo. Assim, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Um anticorpo que se liga especificamente a um alvo pode ter uma constante de associação de pelo menos cerca de 10 3 M -1 ou 10 4 M -1, às vezes cerca 10 5 M -1 ou 10 6 M -1, em outros casos cerca 10 6 M -1 ou 10 7 M -1, cerca de 10 8 M -1 para 10 9 M -1, ou cerca de 10 10 M -1 para 10 11 M -1 ou superior. Uma variedade de formatos de imunoensaio pode ser usada para selecionar os anticorpos especificamente imunorreativos com uma proteína em particular. Por exemplo, imunoensaios de ELISA de fase sólida são rotineiramente usados para selecionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreativos a uma proteína. Consulte, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Publications, Nova Iorque, para uma descrição de formatos de imunoensaio e condições que podem ser usadas para determinar uma imunorreatividade específica.
[0085] Como utilizado neste documento, uma "interação" entre uma proteína Siglec-5 e uma segunda proteína abrange, sem limitação, interação proteína-proteína, interação física, interação química, ligação, ligação covalente e ligação iônica. Como utilizado neste documento, um anticorpo "inibe a interação" entre duas proteínas quando o anticorpo interrompe, reduz ou elimina completamente uma interação entre as duas proteínas. Um anticorpo da presente divulgação, ou fragmento do mesmo, "inibe a interação" entre duas proteínas quando o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga a uma das duas proteínas.
[0086] Um "anticorpo" agonista ou um anticorpo "ativador" é um anticorpo, como um anticorpo agonista anti-Siglec-5 da presente divulgação, que induz (por exemplo, aumenta) uma ou mais atividades ou funções do antígeno após o anticorpo se ligar ao antígeno.
[0087] Um anticorpo “bloqueador”, um anticorpo “antagonista” ou um anticorpo “inibidor” é um anticorpo, como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, que inibe ou reduz (por exemplo, diminui) a ligação a um ou mais ligantes após o anticorpo se ligar ao antígeno, e/ou que inibe ou reduz (por exemplo, diminui) uma ou mais atividades ou funções do antígeno após o anticorpo se ligar ao antígeno. Em algumas modalidades, os anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas, ou anticorpos inibidores inibem substancial ou completamente a ligação do antígeno a um ou mais ligantes e/ou uma ou mais atividades ou funções do antígeno.
[0088] “Funções efetoras” de anticorpos referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de variante de sequência de aminoácido ou região Fc de sequência nativa) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo.
[0089] O termo "região Fc" é usado neste documento para definir a região de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo as regiões Fc de sequência nativa e as regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana está habitualmente definida para alongar a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou desde Pro230, até ao terminal carboxila da mesma. A lisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração da EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou a purificação do anticorpo, ou por manipulação recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo.
Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, as populações de anticorpos com nenhum resíduo K447 removido e populações de anticorpo com uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. As regiões Fc de sequência nativa adequadas para uso nos anticorpos da presente divulgação incluem a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
[0090] Uma "sequência de região Fc nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc humana de sequência nativa de IgG1 (alotipos A e não A); região Fc humana de sequência nativa de IgG2; região Fc humana de sequência nativa de IgG3; e região Fc humana de sequência nativa de IgG4 bem como variantes de ocorrência natural da mesma.
[0091] Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência uma ou mais substituição(ões) de aminoácidos. Preferencialmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc variante neste documento, preferencialmente irá possuir pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região de sequência nativa de Fc e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de homologia com esta.
[0092] "Receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferencial é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII,
incluindo variantes alélicas e formas alternadas emendadas destes receptores, os receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor ativador ") e FcγRIIB (um" receptor inibidor "), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. Receptor de ativação de FcγRIIA contém um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina ("ITAM") no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcγRIIB contém um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptor (“ITIM”) em seu domínio citoplasmático. (consulte, por exemplo, M. Daëron, Annu. Rev.
Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu.
Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" neste documento. Os FcRs também podem aumentar a meia-vida sérica dos anticorpos.
[0093] A ligação a FcRn humano in vivo e meia-vida sérica dos polipeptídeos humanos de elevada afinidade de ligação a FcRn pode ser ensaiada, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagem de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano ou em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. WO 2004/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída a FcRs. Consulte também, por exemplo, Shields et al., J. Biol.
Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
[0094] Conforme usado neste documento, "percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" e "homologia" com relação a uma sequência de peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo referem-se à percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência específica de peptídeo ou polipeptídeo, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário,
para atingir a identidade percentual máxima da sequência e sem considerar quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência.
O alinhamento para fins de determinação do percentual de identidade da sequência de aminoácidos pode ser atingido de muitas formas no estado da técnica, por exemplo, usando software de computador livre, tal como os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN ou MEGALIGNTM (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos conhecidos na técnica necessários para atingir o alinhamento máximo em relação ao comprimento completo das sequências sendo comparadas.
[0095] Uma célula "isolada" é uma molécula ou uma célula que é identificada e separada de pelo menos uma célula contaminante com a qual está normalmente associada no ambiente em que foi produzida. Em algumas modalidades, a célula isolada está livre de associação a todos os componentes associados ao ambiente de produção. A célula isolada está em uma forma diferente da forma ou configuração em que é encontrada na natureza. As células isoladas se distinguem das células existentes naturalmente em tecidos, órgãos ou indivíduos. Em algumas modalidades, a célula isolada é uma célula hospedeira da presente divulgação.
[0096] Uma molécula de ácido nucleico “isolada” que codifica um anticorpo, como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada no meio em que foi produzida. De preferência, o ácido nucleico isolado está livre de associação a todos os componentes associados ao meio de produção. As moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos deste documento estão em uma forma diferente da forma ou configuração na qual são encontradas na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são, portanto, distinguidas do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos e anticorpos deste documento existentes naturalmente nas células.
[0097] O termo "vetor", conforme utilizado neste documento, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um DNA de cadeia dupla circular ao qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos, tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira, mediante a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente. Tais vetores são referidos neste documento como "vetores de expressão recombinantes", ou simplesmente "vetores de expressão." Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados indistintamente, uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada.
[0098] "Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", conforme usados intercambiavelmente neste documento, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos ou qualquer substrato que pode ser incorporado a um polímero por DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética.
Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos.
Se estiver presente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou após a montagem do polímero.
A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos.
Um polinucleotídeo pode compreender modificação(ões)
feita(s) após a síntese, tal como conjugação a um marcador.
Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotídicas, como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas
(por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.)
e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.),
aqueles contendo frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, camada-L-lisina,
etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.),
aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro,
metais oxidativos, etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, alfa anomérico ácidos nucleicos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila geralmente presente nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protetores padrão, ou ativado para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado com suportes sólidos ou semissólidos.
Os terminais OH 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos por aminas ou frações de grupos orgânicos de capping de 1 a 20 átomos de carbono.
Outras hidroxilas também podem ser derivatizadas de grupos protetores padrão.
Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que geralmente são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xilose ou lixose, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos básicos, como metil-ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH2 (“formacetal”), em que cada R ou R' é, independentemente, H ou alquil (1-20 C) substituído ou não substituído, contendo, opcionalmente, uma ligação (-O-) de éter, aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos referidos neste documento, incluindo RNA e DNA.
[0099] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula de cultura ou uma célula individual que pode ser ou ter sido um receptor para vetor(es) para a incorporação de inserções de polinucleotídeos. As células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento do DNA genômico) à célula de origem original devido a uma mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com polinucleotídeo(s) da presente divulgação.
[0100] "Carreadores", conforme usado neste documento, inclui carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que não sejam tóxicos para a célula ou para o mamífero exposto a eles nas dosagens e concentrações utilizadas. Frequentemente, o carreador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa tamponada de pH. Os exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácido orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como gelatina, imunoglobulinas ou albumina sérica; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparaginas, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; e/ou surfactantes aniônicos, tais como TWEEN™, polietileno glicol (PEG) e PLURONICS™.
[0101] Tal como utilizado neste documento, o termo "apoptose" refere-se ao processo direcionado por genes de destruição de células intracelulares. A apoptose é distinta da necrose; inclui ruptura do citoesqueleto, encolhimento e condensação citoplasmática, expressão de fosfatidilserina na superfície externa da membrana celular e bolhas, resultando na formação de vesículas ligadas à membrana celular ou corpos apoptóticos. O processo também é conhecido como "morte celular programada." Durante a apoptose, fenômenos característicos como superfícies celulares curvas, condensação da cromatina nuclear, fragmentação do DNA cromossômico e perda da função mitocondrial são observados. Várias tecnologias conhecidas podem ser usadas para detectar apoptose, como células de coloração com Anexina V, iodeto de propídio, ensaio de fragmentação de DNA e YO-PRO-1 (Invitrogen). Em algumas modalidades, a coloração com anexina V e iodeto de propídio pode ser usada, e as percentagens combinadas das populações de anexina V+/PI +, anexina V+/PI- e anexina V-/PI+ são consideradas células mortas.
[0102] Tal como utilizado neste documento, o termo "agente que diminui os níveis celulares de Siglec-5, inibe a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5, ou ambos" refere-se a uma molécula que reduz (incluindo significativamente), diminui, bloqueia, inibe ou interfere com a atividade biológica de um Siglec-5 (mamífero, como um Siglec-5 humano) in vitro, in situe/ou in vivo. O termo "agente" não implica em nenhum mecanismo específico de ação biológica e inclui expressamente e abrange todas as possíveis interações farmacológicas, fisiológicas e bioquímicas com um Siglec- 5 direta ou indireta, e se interagindo com um Siglec-5, um ou mais de seus ligantes, ou através de outro mecanismo, e suas consequências que podem ser alcançadas por uma variedade de composições diferentes e quimicamente divergentes. Agentes exemplares incluem, sem limitação, um anticorpo anti- Siglec-5 que se liga especificamente a um Siglec-5, uma proteína do receptor Siglec-5 solúvel, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc solúvel (por exemplo, imunoadesina Siglec-5), um receptor Siglec solúvel que se liga a um ligante de Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-Fc (por exemplo, imunoadesina de Siglec) que se liga a um ligante de Siglec-5, uma molécula antisense direcionada a um ácido nucleico que codifica um Siglec-5, um molécula de RNA de interferência curta ("siRNA") direcionada a um ácido nucleico que codifica um Siglec-5, um composto inibidor de Siglec-5, um RNA ou aptâmero de DNA que se liga a um Siglec-5 e um análogo estrutural Siglec-5. Em algumas modalidades, um inibidor de Siglec-5 (por exemplo, um anticorpo) se liga (interage fisicamente com) um agente que diminui os níveis celulares de Siglec- 5, inibe a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5, ou ambos, liga-se a um ligante de Siglec-5 e/ou inibe (reduz) a síntese ou produção de Siglec-5. Em outras modalidades, um agente do inibidor da presente divulgação liga um Siglec-5 e evita sua ligação a um ou mais de seus ligantes. Em ainda outras modalidades, um agente da presente divulgação reduz ou elimina a expressão (isto é, transcrição ou tradução) de um Siglec-5. Exemplos de tipos de agentes que diminuem os níveis celulares de Siglec-5, inibe a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5, ou ambos, são fornecidos neste documento.
[0103] Tal como utilizado neste documento, o termo "agente que se liga ou interage com Siglec-5" refere-se a uma molécula que interage direta ou indiretamente com uma proteína Siglec-5. O termo "agente" não implica em nenhum mecanismo específico de ação biológica e inclui expressamente e abrange todas as possíveis interações farmacológicas, fisiológicas e bioquímicas com um Siglec-5 direta ou indireta, e se interagindo com um Siglec-5 ou através de outro mecanismo, e suas consequências que podem ser alcançadas por uma variedade de composições diferentes e quimicamente divergentes. Agentes exemplares incluem, sem limitação, um anticorpo anti-Siglec-5 que se liga especificamente a um Siglec-5.
[0104] Tal como utilizado neste documento, o termo "interferência de RNA" ou "RNAi" refere-se geralmente a um processo em que uma molécula de RNA de fita dupla ou uma molécula de RNA em hairpin curto reduzindo ou inibindo a expressão de uma sequência de ácido nucleico com a qual a molécula de RNA em hairpin curto compartilha homologia substancial ou total. O termo "curto RNA de interferência" ou "siRNA" ou "agente de RNAi" refere-se a uma sequência de RNA que induz interferência de RNA. Ver Kreutzer et al., WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., WO 01/36646; Fire, WO 99/32619; Mello e Fire, WO 01/29058. Tal como utilizado neste documento, as moléculas de siRNA incluem moléculas de RNA que abrangem nucleotídeos quimicamente modificados e não nucleotídeos. O termo "agente ddRNAi" refere-se a um agente de RNAi direcionado por DNA que é transcrito a partir de um vetor exógeno. Os termos "RNA em hairpin curto" ou "shRNA" referem-se a uma estrutura de RNA tendo uma região duplex e uma região de alça. Em certas modalidades, os agentes ddRNAi são expressos inicialmente como shRNAs.
[0105] Tal como utilizado neste documento, o termo "aptâmero" refere-se a um oligonucleotídeo heterólogo capaz de se ligar forte e especificamente a um alvo molecular desejado, tal como, por exemplo, cofatores metabólicos comuns (por exemplo, Coenzima A, S-adenosil metionina e semelhantes), proteínas (por exemplo, proteína C5 do complemento, anticorpos e semelhantes), ou elementos estruturais conservados em moléculas de ácido nucleico (por exemplo, estruturas importantes para a ligação de fatores de transcrição e semelhantes). Os aptâmeros tipicamente compreendem sequências de nucleotídeos de DNA ou RNA variando de cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento, e de cerca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos de DNA ou RNA sintético podem ser feitos usando métodos e equipamentos de fosforamidita de fase sólida padrão, como usando um Sintetizador de DNA de alto rendimento 3900, disponível na Applied Biosystems (Foster City, CA). Os aptâmeros frequentemente incorporam derivados ou análogos dos nucleotídeos de ocorrência comum encontrados no DNA e RNA (por exemplo, A, G, C e T/U), incluindo a estrutura ou modificações de ligação (por exemplo, ácido nucleico de peptídeo (PNA) ou ligações de fosfotioato) para aumentar a resistência a nucleases, avidez de ligação, ou de outra forma alterar suas propriedades farmacocinéticas. Modificações exemplares são estabelecidas nas Patentes US Nºs. 6.455.308; 4.469.863; 5.536.821; 5.541.306; 5.637.683; 5.637.684;
5.700.922; 5.717.083; 5.719.262; 5.739.308; 5.773.601; 5.886.165; 5.929.226;
5.977.296; 6.140.482; e nas publicações WIPO WO 00/56746 e WO 01/14398.
Métodos para sintetizar oligonucleotídeos compreendendo tais análogos ou derivados são divulgados, por exemplo, nas publicações de patentes citadas acima, e nas Patentes US Nºs. 6.455.308; 5.614.622; 5.739.314; 5.955.599;
5.962.674; 6.117.992; e em WO 00/75372.
[0106] O termo "cerca de", como utilizado neste documento, refere- se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pela pessoa versada neste campo técnico. Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas a esse valor ou parâmetro per se.
[0107] Tal como usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o", "a" incluem o plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, a referência a um "anticorpo" é uma referência a de um a muitos anticorpos, tais como quantidades molares, e inclui equivalentes dos mesmos conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.
[0108] Entende-se que aspectos e modalidades da presente divulgação descritos neste documento incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente de" aspectos e modalidades.
Perspectiva Geral
[0109] A presente divulgação se refere a anticorpos anti-Siglec-5 que diminuem os níveis celulares de Siglec-5, induzem ou aumentam a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos, induzem ou aumentam a formação de redes extracelulares de neutrófilos (NET) em neutrófilos e/ou aumentam atividade de fagocitose em macrófagos; métodos de preparação e utilização de tais anticorpos anti-Siglec-5; composições farmacêuticas contendo tais anticorpos anti-Siglec-5; ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos anti- Siglec-5); e células hospedeiras contendo ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos anti-Siglec-5.
[0110] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ter uma ou mais atividades antagonistas que são devidas, pelo menos em parte, à capacidade dos anticorpos para reduzir a expressão celular (por exemplo, expressão da superfície celular) de Siglec-5 por indução de degradação, regulação negativa, clivagem, dessensibilização do receptor e/ou direcionamento lisossômico de Siglec-5.
[0111] Em algumas modalidades, a atividade Siglec-5 induzida por anticorpo pode ser determinada ou testada in vitro por qualquer uma das técnicas divulgadas neste documento, incluindo, sem limitação, o teste de ligação à placa de anticorpos anti-Siglec-5 de comprimento total para aumentar a densidade de anticorpos expostos a Siglec-5, reticulação de anticorpos anti-Siglec-5 com um anticorpo secundário, reticulação de anticorpos anti-Siglec-5 com células que expressam um ou mais receptores Fcg (por exemplo, FcgRIIB), usando anticorpos Siglec-5 em solução, e usando fragmentos Fab de anticorpos Siglec-
5.
[0112] Certos aspectos da presente divulgação são baseados, pelo menos em parte, na identificação de anticorpos anti-Siglec-5 que exibem a capacidade de diminuir os níveis de superfície celular de Siglec-5 nas células, resultando na redução, neutralização, prevenção ou limitação de uma ou mais atividades Siglec-5. Atividades Siglec-5 exemplares incluem, sem limitação, fosforilação de Tyr-520 e Tyr-544 por uma tirosina quinase da família Src, tal como Syk, LCK, FYM e/ou ZAP70; recrutamento e ligação às proteínas fosfatases específicas da tirosina SHP1 e SHP2; recrutamento e ligação a PLC- gama1, que atua como um fator de troca de nucleotídeo guanina para Dynamini- 1; recrutamento e ligação à proteína contendo o domínio SH2 (por exemplo, Crkl); recrutamento e ligação à tirosina quinase Syk do baço; recrutamento e ligação à proteína 2 ligada ao receptor do fator de crescimento SH3-SH2-SH3 (Grb2); recrutamento e ligação a várias proteínas contendo SH2; expressão modulada de uma ou mais citocinas pró-inflamatórias, como IFN-α4, IFN-beta, IL-1β, IL-1alfa, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, CRP, MCP-1 e MIP-1-beta; expressão modulada de uma ou mais citocinas pró-inflamatórias em uma ou mais células selecionadas de macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, osteoclastos, células T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos e células micrógliais; aumento da expressão de uma ou mais citocinas anti-
inflamatórias, como IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IL-16, TGF-beta, IL-1Ra, G-CSF e receptores solúveis para TNF,IFN-beta1a, IFN-beta1b, ou IL-6; expressão modulada de uma ou mais citocinas anti-inflamatórias em uma ou mais células selecionadas de macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos,
osteoclastos, células T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos e células micrógliais; modular a expressão de uma ou mais proteínas selecionadas a partir de C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3, ITGB2, HMOX1, LAT2,
CASP1, CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1, TyroBP, ALOX5AP, ITGAM,
SLC7A7, CD4, ITGAX, e PYCARD; inibição da fosforilação de quinase regulada por sinal extracelular (ERK); diminuição da fosforilação da tirosina em uma ou mais proteínas celulares, opcionalmente, em que uma ou mais proteínas celulares compreendem ZAP-70 e a fosforilação da tirosina ocorre em Tyr-319 de ZAP-70; expressão modulada do receptor 7 de quimiocina C-C (CCR7);
inibição da quimiotaxia das células micrógliais em relação às células que expressam CCL19 e que expressam CCL21; diminuição da proliferação de células T induzida por uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, monócitos, micróglia, micróglia M1, micróglia
M1 ativada, micróglia M2, macrófagos, neutrófilos, Células NK, macrófagos M1,
neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados,
células M1 NK ativadas, macrófagos M2, neutrófilos M2 e células M2 NK; inibição da produção de osteoclastos, diminuição da taxa de osteoclastogênese ou ambos; diminuição da sobrevivência de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células M1 NK, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células M1 NK ativadas, macrófagos M2,
neutrófilos M2, células M2 NK, monócitos, osteoclastos, células T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia, micróglia M1,
micróglia M1 ativada e micróglia M2; diminuição da proliferação de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células M1
NK, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células M1 NK ativadas,
macrófagos M2, neutrófilos M2, células M2 NK, monócitos, osteoclastos, células
T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia,
micróglia M1, micróglia M1 ativada e micróglia M2; inibir a migração de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B,
células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1,
células M1 NK, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células M1 NK ativadas, macrófagos M2, neutrófilos M2, células M2 NK, monócitos,
osteoclastos, células T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos,
neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia M1 ativada e micróglia M2; inibir uma ou mais funções de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos,
neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas,
macrófagos M1, neutrófilos M1, células M1 NK, macrófagos M1 ativadas,
neutrófilos M1 ativados, células M1 NK ativadas, macrófagos M2, neutrófilos M2,
células M2 NK, monócitos, osteoclastos, células T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia M1 ativada e micróglia M2; inibir a maturação de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células M1 NK, macrófagos M1 ativados, neutrófilos M1 ativados, células M1 NK ativadas, macrófagos M2,
neutrófilos M2, células M2 NK, monócitos, osteoclastos, células T, células T helpers, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia, micróglia M1,
micróglia M1 ativada e micróglia M2; inibição de um ou mais tipos de depuração selecionados de depuração de neurônios apoptóticos, depuração de resíduos de tecido nervoso, depuração de sinapses disfuncional, depuração de resíduos de tecido não nervoso, depuração de bactérias, eliminação de outros corpos estranhos, eliminação de proteínas causadoras de doenças, eliminação de peptídeos causadores de doenças e eliminação de células tumorais;
opcionalmente, em que a proteína causadora da doença é selecionada a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-
43, proteína FUS, C9orf72 (framework aberta do cromossomo 9 72), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase,
ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, Corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina,
apolipoproteína AI, amiloide A sérica, medina, prolactina, transtirretina, lisozima,
microglobulina beta 2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG (RAN)
associados à repetição, peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina
(GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), prolina-alanina (PA)
peptídeos de repetição, ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina
(PR) e a célula tumoral é de um câncer selecionado de câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer renal, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer de tireoide; inibição da fagocitose de um ou mais neurônios apoptóticos, restos de tecido nervoso,
sinapses disfuncionais, fragmentos de tecido não nervoso, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, peptídeos causadores de doenças, ácidos nucleicos causadores de doenças ou células tumorais;
opcionalmente, em que os ácidos nucleicos causadores da doença são
GGCCCC antisense (G2C4) (SEQ ID NO: 225) RNA de expansão de repetição,
as proteínas causadoras da doença são selecionadas de beta amiloide, beta amiloide oligomérico, placas beta amiloide, proteína precursora amiloide ou fragmentos destes, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72
(estrutura de leitura aberta do cromossomo 9 72), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1,
ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteína AI,
amiloide A sérica, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta
2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL,
proteína S-IBM, ATG não associado à repetição (RAN) produtos de tradução,
peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-
alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina
(PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR), e as células tumorais são de um câncer selecionado de câncer de bexiga, câncer de cérebro,
câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer de endométrio, câncer de rim, câncer de célula renal, câncer de pélvis renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma ou câncer de tireoide; ligação ao ligante de Siglec-5 em células tumorais; ligação ao ligante de Siglec-5 em células selecionadas de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, micróglia, macrófagos e células NK; inibição da morte de células tumorais por um ou mais dentre micróglia, macrófagos, neutrófilos,
células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
neutrófilos, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, células T,
células T helpers ou células T citotóxicas; inibir a atividade de proliferação de células antitumorais de um ou mais dentre micróglia, macrófagos, neutrófilos,
células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
neutrófilos, células T, células T helpers ou células T citotóxicas; inibição da atividade de metástase de células antitumorais de um ou mais dentre micróglia,
macrófagos, neutrófilos, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, células T, células T helpers ou células T citotóxicas; inibição de um ou mais receptores contendo motivos ITAM, opcionalmente em que um ou mais receptores contendo motivos ITAM são selecionados a partir de TREM1,
TREM2, SIRPB1, FcgR, DAP10 e DAP12; inibição da sinalização por um ou mais receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), opcionalmente em que um ou mais PRRs são selecionados a partir de receptores que identificam padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), receptores que identificam padrões moleculares associados a danos (DAMPs), e qualquer combinação destes; inibição de um ou mais receptores compreendendo o motivo D/Ex 0–
2YxxL/IX6–8YxxL/I (SEQ ID NO: 4); inibição da sinalização por um ou mais receptores tipo Toll; inibição da via de sinalização JAK-STAT; inibição do fator nuclear de cadeia leve de kappa-potenciador de células B ativadas (NFκB);
desfosforilação de um receptor contendo motivo ITAM; expressão modulada de um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata do complemento e/ou receptores que são expressos nas células imunes, opcionalmente em que um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata do complemento e/ou receptores que são expressos nas células imunes células compreendem CD86,
C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3, ITGB2, HMOX1, LAT2, CASP1,
CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1, TyroBP, ALOX5AP, ITGAM, SLC7A7,
CD4, ITGAX, e/ou PYCARD, e um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata do complemento e/ou receptores que são expressos em células imunes são expressos em um ou mais dentre micróglia, macrófagos, neutrófilos,
células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
neutrófilos, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, células T,
células T helpers ou células T citotóxicas; aumento da expressão de um ou mais genes dependentes de Siglec-5; normalização da interrupção da expressão do gene dependente de Siglec-5; diminuição da expressão de um ou mais genes dependentes de ITAM, opcionalmente em que um ou mais genes dependentes de ITAM são ativados por fatores de transcrição do fator nuclear de células T ativadas (NFAT); promoção ou resgate da funcionalidade de uma ou mais células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, neutrófilos imunossupressores, células NK imunossupressoras, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados ao tumor, células NK associadas ao tumor, células B reguladoras e células T reguladoras; aumento da infiltração de uma ou mais células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, neutrófilos imunossupressores, células NK imunossupressoras, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados ao tumor, neutrófilos associados ao tumor, células NK associadas a tumor, células B reguladoras e células T reguladoras em tumores; aumentar o número de células imunossupressoras mieloides/granulocíticas promotoras de tumor em um tumor, no sangue periférico ou em outro órgão linfoide; aumentando a atividade de promoção de tumor de células supressoras derivadas de mieloides; aumento da expressão de citocinas promotoras de tumor em um tumor ou no sangue periférico, opcionalmente em que as citocinas promotoras de tumor são VEGF, TGF-beta ou IL-10; aumento da infiltração tumoral de linfócitos T reguladores FoxP3+ promotores de tumor; aumento da atividade de promoção de tumor de células supressoras derivadas de mieloide (MDSC); aumento da atividade de promoção de tumor de células B reguladoras; aumento da atividade de promoção de tumor de neutrófilos imunossupressores; diminuição da ativação de linfócitos T específicos do tumor com potencial para eliminar o tumor; diminuição da infiltração de células NK específicas do tumor com potencial para eliminar o tumor; diminuindo o potencial de eliminar tumor de células NK; diminuindo a infiltração de linfócitos B específicos de tumor com potencial para aumentar a resposta imunológica; diminuição da infiltração de linfócitos T específicos do tumor com potencial para eliminar o tumor; aumento do volume do tumor; aumento da taxa de crescimento do tumor; aumento da metástase; aumento da taxa de recorrência do tumor; diminuir a eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam as respostas de células T antitumorais, opcionalmente em que uma ou mais imunoterapias são imunoterapias que têm como alvo uma ou mais proteínas alvo selecionadas de PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, TREM1, TREM2, CD39, CD73, receptor CSF-1, e qualquer combinação dos mesmos, ou de uma ou mais vacinas contra o câncer; inibição da mobilização de PLCγ/PKC/cálcio; e inibição da sinalização PI3K/Akt, Ras/MAPK.
[0113] Em algumas modalidades, o tratamento do câncer com anticorpos anti-Siglec-5: (i) diminui direta ou indiretamente a sobrevivência, proliferação, maturação, diferenciação e/ou funcionalidade das células imunossupressoras mieloides/granulocíticas promotoras de tumor que se acumulam no tumor, no sangue periférico e em órgãos linfoides de pacientes com câncer; (ii) diminuir o número de células imunossupressoras mieloides/granulocíticas promotoras de tumor no tumor, no sangue periférico e em outros órgãos linfoides de um paciente com câncer; (iii) bloquear a atividade de promoção de tumor de células supressoras derivadas de mieloide (MDSC); (iv) diminuir o número de células B reguladoras promotoras de tumor no tumor, no sangue periférico e em outros órgãos linfoides de um paciente com câncer; (v) diminuir a expressão de citocinas promotoras de tumor, como TGF-beta e IL-10, no tumor e no sangue periférico de um paciente com câncer; (vi) diminuir a infiltração de linfócitos T reguladores FoxP3 + promotora de tumor no tumor; (vii) aumentar a infiltração e ativação de linfócitos T com potencial para eliminar tumor; (viii) aumentar a infiltração de células NK específicas do tumor com potencial para eliminar o tumor; (ix) aumentar o potencial de morte tumoral das células NK; (x) aumentar a infiltração de linfócitos B específicos de tumor com potencial para aumentar a resposta imune; (xi) diminuir o volume do tumor; (xii) reduzir a taxa de crescimento do tumor; (xiii) reduzir e/ou inibir metástases; (xiv) reduzir a taxa de recorrência do tumor; (xv) aumentar a eficácia da imunoterapia que modula as respostas de células T antitumorais, como PD1/PDL1, CTLA4, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7- H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, KIR, GAL9, CD2, CD5, CD39, CD73, CD30, TIGIT, VISTA, TIM1, TIM3, TIM4 e vacinas contra o câncer, (xvi) induzir, ativar ou de outra forma aumentar a mobilização de PLCγ/PKC/cálcio; e (xvii) induzir, ativar ou de outro modo aumentar a sinalização PI3K/Akt, Ras/MAPK.
[0114] As células imunossupressoras às vezes também são chamadas de células supressoras derivadas do mieloide (MDSC). Em humanos, os MDSCs podem ser definidos por uma das seguintes combinações de marcadores: (1) CD14+ HLA-DRlow/−, (2) CD14+ IL4Rα+, (3) CD14+ HLA-DR− IL4Rα+, (4) CD34+ CD14+ CD11b+ Siglec-5+, (5) CD11b+ CD14+ Siglec-5+, (6) Siglec-5+ HLA- DR−, (7) Lin− HLA-DR−, (8) Lin− HLA-DR− Siglec-5+, (9) Lin− HLA-DR− Siglec- 5+ CD11b+, (10) Lin− Siglec-5+ CD11b+ CD15+, (11) Lin− HLA-DR− Siglec- 5+ CD11b+ CD14− CD15+, (12) CD11b+ CD14− Siglec-5+, (13) CD11b+ CD14− HLA- DR− Siglec-5+ CD15+, (14) Siglec-5+ HLA-DR− CD15+, (15) CD15+ IL4Rα+, (16)
CD11b+ CD15+ CD66b+, (17) CD15+ FSClow SSChigh, (18) CD15high Siglec-5+, (19) CD11b+ CD14− CD15+, (20) CD66b+ SSChigh, e (21) CD11b+ CD15+ (ver também Solito S et al. Annals of the NY Academy of Sciences, 2014). Em camundongos, os MDSCs podem ser definidos pela expressão dos marcadores de superfície CD45+, CD11b+, Gr1+, e/ou Il4Ra+. Linhagens monocíticas imunossupressoras exemplares adicionais são CD45+, CD11b+, Gr1low; e CD45+, CD11c+.
[0115] A presente divulgação se refere ainda a anticorpos ant-Siglec-5 que se ligam ou interagem com Siglec-5. Em certas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-5 diminuem os níveis de superfície celular de Siglec-5 e/ou não inibem a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5. Em certas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 ligam Sigelc-5 humano, não ligam Siglec-14 humano. Em certas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 ligam Siglec-5 humano, mas não ligam cyno Siglec-5.
Proteínas Siglec-5
[0116] Em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos, como anticorpos isolados (por exemplo, monoclonais), que interagem com ou de outra forma se ligam a regiões, tal como epítopos, dentro de uma proteína Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação se ligam a uma proteína Siglec-5 e modulam uma ou mais atividades Siglec-5 após a ligação à proteína Siglec-5, por exemplo, uma atividade associada à expressão de Siglec-5 em uma célula. As proteínas Siglec-5 da presente divulgação incluem, sem limitação, uma proteína Siglec-5 de mamífero, proteína Siglec-5 humana, proteína Siglec-5 de camundongo e proteína Siglec-5 de rato.
[0117] Siglec-5 é diversamente referido como uma molécula Siglec-5, lectina 5 semelhante a Ig de ligação ao ácido siálico, antígeno CD170, CD170, OBBP2, CD33L2 e OB-BP2.
[0118] Siglec-5 é um receptor semelhante a imunoglobulina expresso principalmente em células imunes, incluindo, sem limitação, macrófagos, neutrófilos,
células NK, células B, células dendríticas, osteoclastos, monócitos e micróglia. Em algumas modalidades, Siglec-5 forma um complexo de sinalização de receptor com CD64. Em algumas modalidades, a sinalização Siglec-5 resulta na inibição a jusante de PI3K ou outros sinais intracelulares. Em células mieloides, os sinais do receptor tipo Toll (TLR) são importantes para a inibição das atividades do Siglec-5, por exemplo, no contexto de uma resposta à infecção. Os TLRs também desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória patológica, por exemplo, os TLRs expressos em macrófagos, neutrófilos, células NK e células dendríticas.
[0119] Vários homólogos Siglec-5 são conhecidos, incluindo, sem limitação, Siglec-5 humano, Siglec-5 de macaco cynomolgus e Siglec-5 de camundongo. A sequência de aminoácidos de Siglec-5 humano é apresentada abaixo como SEQ ID NO: 1:
[0120] Em algumas modalidades, a Siglec-5 é uma pré-proteína que inclui uma sequência de sinais. Em algumas modalidades, a Siglec-5 é uma proteína madura. Em algumas modalidades, a proteína Siglec-5 madura não inclui uma sequência de sinais. Em algumas modalidades, a proteína Siglec-5 madura é expressa em uma célula. Em algumas modalidades, a proteína Siglec- 5 madura é expressa em uma célula, como a superfície de uma célula, incluindo, sem limitação, células dendríticas humanas, macrófagos humanos, monócitos humanos, osteoclastos humanos, neutrófilos humanos, células B humanas, células T humanas, célula T helper humana, células T citotóxicas humanas, granulócitos humanos e micróglia humana. Os agentes da presente divulgação, tais como anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, podem se ligar a qualquer uma das proteínas Siglec-5 da presente divulgação expressas em qualquer célula divulgada neste documento.
[0121] As proteínas Siglec-5 da presente divulgação, tal como Siglec-5 humana, contêm vários domínios, incluindo, sem limitação, uma sequência de sinal localizada nos resíduos de aminoácidos 1-16 de SEQ ID NO: 1, um tipo variável extracelular semelhante a imunoglobulina (IgV) domínio localizado nos resíduos de aminoácidos 19-136 de SEQ ID NO: 1, dois domínios de tipo C2 semelhantes a Ig localizados nos resíduos de aminoácidos 146-229 e 236-330 de SEQ ID NO: 1, um domínio transmembranar localizado nos resíduos de aminoácidos 442-462 da SEQ ID NO: 1, um motivo ITIM 1 localizado nos resíduos de aminoácidos 518-523 da SEQ ID NO: 1 e um motivo tipo SLAM localizado nos resíduos de aminoácidos 542-547 da SEQ ID NO: 1. Como um versado na técnica apreciará, os resíduos de início e término dos domínios da presente divulgação podem variar dependendo do programa de modelagem de computador usado ou do método usado para determinar o domínio.
[0122] Certos aspectos da presente divulgação fornecem anticorpos anti-Siglec-5 que se ligam a um Siglec-5 humano. Certos aspectos da presente divulgação fornecem anticorpos anti-Siglec-5 que se ligam a um Siglec- 5 humano, mas não se ligam ao Siglec-5 cyno.
[0123] Por conseguinte, como utilizado neste documento, uma proteína "Siglec-5" da presente divulgação inclui, sem limitação, uma proteína Siglec-5 de mamífero, proteína Siglec-5 humana e proteína Siglec-5 de primata.
Além disso, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem se ligar a um epítopo dentro de um ou mais de uma proteína Siglec-5 de mamífero, proteína Siglec-5 humana e Siglec-5 de primata. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem se ligar especificamente ao Siglec-5 humano.
[0124] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 podem ligar Siglec-5 de uma maneira dependente do pH. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem se ligar a Siglec-5 a um pH neutro e ser internalizados sem se dissociar da proteína Siglec-5.
Alternativamente, a um pH ácido, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem se dissociar de Siglec-5 uma vez internalizados e depois degradados pela via do endossoma/lisossomo. Em certas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente invenção liga-se à Siglec-5 a um pH que varia de 5,5 a 8,0, de 5,5 a 7,5, de 5,5 a 7,0, de 5,5 a 6,5, de 5,5 a 6,0, de 6,0 a 8,0, de 6,5 a 8,0, de 7,0 a 8,0, de 7,5 a 8,0, de 6,0 a 7,5, de 6,0 a 7,0, de 6,5 a 7,5.
Em certas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 se dissocia de Siglec-5 a um pH inferior a 6,0, inferior a 5,5, inferior a 5,0, inferior a 4,5, inferior a 4,0, inferior a 3,5, inferior a 3,0, inferior a 2,5 ou inferior a 2,0.
[0125] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5, ou que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 e/ou não inibem a interação entre Siglec-5 e um ou mais Siglec-5, ou que se ligam ou interagem com Siglec-5, tais como anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, ligam-se a uma proteína Siglec-5 de tipo selvagem da presente divulgação, suas variantes de ocorrência natural e/ou suas variantes de doença.
[0126] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 e/ou não inibem a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5, ligam uma variante de Siglec-5 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 e/ou não inibem a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5, não se ligam ao Siglec-14 humano. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 e/ou não inibem a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5, não ligam cyno ligam Siglec-5.
[0127] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5, se ligam a uma proteína Siglec-5 expressa na superfície de uma célula, incluindo, sem limitação, células dendríticas humanas, macrófagos humanos, células NK humanas, monócitos humanos, osteoclastos humanos, neutrófilos humanos, células T humanas, células B humanas, células T helper humanas, células T citotóxicas humanas, granulócitos humanos, células imunossupressoras derivadas de mieloide humano e micróglia humana. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 se ligam a uma proteína Siglec-5 expressa na superfície de uma célula e modulam (por exemplo, induzem ou inibem) pelo menos uma atividade de Siglec-5 da presente divulgação após ligação à proteína Siglec-5 expressa na superfície. Em algumas modalidades da presente divulgação, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga especificamente a uma proteína Siglec-5.
Ligantes de Siglec-5
[0128] Ligantes de Siglec-5 exemplares incluem, sem limitação, ácido siálico, glicolipídeos contendo ácido siálico, glicoproteínas contendo ácido siálico, glicolipídeos contendo alfa-2,8-disialil, glicoproteínas contendo ácido siálico ligadas a alfa-2,6 ramificadas, terminais glicolipídeos contendo ácido siálico ligado a alfa-2,6, glicoproteínas contendo ácido siálico ligado a alfa-2,3, disialogangliosídeos (por exemplo, gangliosídeos ou glicolipídeos contendo uma ceramida ligada a um glicano sialilado), mucinas secretadas, ligantes de Siglec- 5 expressos em células vermelhas do sangue, ligantes de Siglec-5 expressos em células bacterianas, ligantes de Siglec-5 expressos em células apoptóticas, ligantes de Siglec-5 expressos em células nervosas, ligantes de Siglec-5 expressos em células da glia, ligantes de Siglec-5 expressos em micróglia, ligantes de Siglec-5 expressos em astrócitos, ligantes de Siglec-5 expressos em células tumorais, ligantes de Siglec-5 expressos em vírus, ligantes de Siglec-5 expressos em células dendríticas, ligantes de Siglec-5 ligados a placas beta amiloides, ligantes de Siglec-5 ligados a emaranhados Tau, ligantes de Siglec-5 em proteínas causadoras de doenças, ligantes de Siglec-5 em peptídeos causadores de doenças, ligantes de Siglec-5 expressos em macrófagos, ligantes de Siglec-5 expressos em neutrófilos, ligantes de Siglec-5 expressos em células killer natural, ligantes de Siglec-5 expressos em monócitos, ligantes de Siglec-5 expressos em células T, ligantes de Siglec-5 expressos em células T helper, ligantes de Siglec-5 expressos em células T citotóxicas, ligantes de Siglec-5 expressos em células B, ligantes de Siglec-5 expressos em células dendríticas imunossupressoras embutidas em tumor, ligantes de Siglec-5 expressos em macrófagos imunossupressores embutidos em tumor, ligantes de Siglec-5 expressos em células supressoras derivadas de mieloide, ligantes de Siglec-5 expressos em células T reguladoras. Em algumas modalidades, os ligantes de Siglec-5 da presente divulgação são gangliosídeos (por exemplo, disialogangliosídeos). Os diasialogangliosídeos geralmente compartilham um núcleo comum de lacto-ceramida e um ou mais resíduos de ácido siálico.
[0129] Outros exemplos de ligantes de gangliosídeos adequados (por exemplo, disialogangliosídeos) estão listados na Tabela A. Geralmente, um gangliosídeo (por exemplo, disialogangliosídeos) é uma molécula composta de um glicoesfingolipídeo com um ou mais ácidos siálicos (por exemplo, ácido n- acetil-neuramínico, NANA) ligados à cadeia de açúcar.
Tabela A: Estruturas de ligantes de gangliosídeo de Siglec-5 exemplares GM2-1 = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-?)bDGalNAc(1-?)bDGalNAc(1-?)bDGlcp(1-1)Cer GM3 = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GM2,GM2a(?) = bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GM2b(?) = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GM1,GM1a = bDGalp(1-3)bDGalNAc[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer asialo-GM1,GA1 = bDGalp(1-3)bDGalpNAc(1-4)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer asialo-GM2, GA2 = bDGalpNAc (1-4) bDGalp (1-4) bDGlcp (1-1) Cer GM1b = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GD3 = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GD2 = bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GD1a = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer GD1alpha = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-6)]bDGalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer GD1b = bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer GT1a = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2- 3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GT1,GT1b = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer OAc-GT1b = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)aXNeu5Ac9Ac(2- 8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GT1c = bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-
3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GT3 = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGal(1-4)bDGlc(1-1)CerGQ1b = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2- 3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GGal = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-1)Cer onde: aNeu5Ac = ácido 5-acetil-alfa-neuramínico aNeu5Ac9Ac = ácido 5,9-diacetil-alfa-neuramínico bDGalp = beta-D-galactopiranose bDGalpNAc = N-acetil-beta-D-galactopiranose bDGlcp = beta-D-glucopiranose Cer = ceramida (esfingoide N-acilado geral) Anticorpos anti-Siglec-5
[0130] Certos aspectos da presente divulgação se referem a anticorpos anti-Siglec-5 que diminuem os níveis celulares de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui os níveis celulares de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode ter uma ou mais atividades que são devidas, pelo menos em parte, à capacidade do anticorpo anti-Siglec-5 de reduzir a expressão celular (por exemplo, superfície celular expressão) de Siglec-5 induzindo degradação, regulação negativa, clivagem, dessensibilização do receptor e/ou direcionamento lisossomal de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec- 5 da presente divulgação diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 in vivo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 em células (por exemplo, células CHO) que expressam Siglec-5 humano recombinante. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 em células imunes, incluindo, por exemplo, células imunes primárias (por exemplo, células B). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 em macrófagos (por exemplo, em macrófagos humanos). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 em macrófagos polarizados (por exemplo, macrófagos humanos polarizados). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui ou reduz os níveis de superfície celular de Siglec-5 em macrófagos M0, em macrófagos M1 e/ou em macrófagos M2a.
[0131] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação não inibe a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-5 diminui os níveis celulares de Siglec-5 e não inibe a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5. Outros aspectos da presente divulgação se referem a anticorpos anti-Siglec-5 que induzem a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos e/ou induzem a formação de redes extracelulares de neutrófilos (NET) em neutrófilos.
Outros aspectos da presente divulgação se referem a anticorpos anti-Siglec-5 que diminuem ou reduzem a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos e/ou diminuem ou reduzem a formação de redes extracelulares de neutrófilos (NET) em neutrófilos.
[0132] Conforme divulgado neste documento, o Siglec-5 pode ser constitutivamente reciclado em células e, como tal, pode reciclar na célula (por exemplo, endocitose) quaisquer agentes (por exemplo, anticorpos) que ligam Siglec-5 na superfície celular. No entanto, essa endocitose pode não levar a uma diminuição nos níveis celulares (por exemplo, níveis de superfície celular) do
Siglec-5. Embora tenha sido demonstrado que as células de leucemia mieloide aguda (AML) podem mediar a endocitose de anticorpos anti-Siglec-5 ligados a Siglec-5 expresso na superfície, nenhuma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 foi demonstrada. Consequentemente, certos aspectos da presente divulgação se referem a anticorpos anti-Siglec-5 que não apenas se ligam a Siglec-5 expresso na superfície celular, mas também diminuem os níveis celulares de Siglec-5. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação ligam-se a Siglec-5 expresso na superfície celular e são posteriormente endocitados na célula. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação ligam Siglec-5 expresso na superfície celular sem serem endocitados na célula.
[0133] Os níveis celulares de Siglec-5 podem referir-se, sem limitação, a níveis de superfície celular de Siglec-5, níveis intracelulares de Siglec-5 e níveis totais de Siglec-5. Em algumas modalidades, uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 compreende uma diminuição nos níveis de superfície celular de Siglec-5. Tal como utilizado neste documento, um anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis de superfície celular de Siglec-5 se induzir uma diminuição de 20% ou mais nos níveis de superfície celular de Siglec-5 conforme medido por quaisquer ensaios baseados em células in vitro ou adequados no modelo in vivo descrito neste documento ou conhecido na técnica, por exemplo, utilizando citometria de fluxo, tal como separação de células ativadas por fluorescência (FACS), para medir os níveis de superfície celular de Siglec-5. Em algumas modalidades, uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 compreende uma diminuição nos níveis intracelulares de Siglec-5. Tal como utilizado neste documento, um anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis intracelulares de Siglec-5 se induzir uma diminuição de 20% ou mais nos níveis intracelulares de Siglec-5 conforme medido por qualquer ensaio baseado em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito neste documento ou conhecido na técnica, por exemplo, imunocoloração, análise de Western blot, coimunoprecipitação e citometria celular. Em algumas modalidades, uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 compreende uma diminuição nos níveis totais de Siglec-5. Tal como utilizado neste documento, um anticorpo anti- Siglec-5 diminui os níveis totais de Siglec-5 se induzir uma diminuição de 20% ou mais nos níveis totais de Siglec-5 conforme medido por qualquer ensaio baseado em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito neste documento ou conhecido na técnica, por exemplo, imunocoloração, análise de Western blot, coimunoprecipitação e citometria celular. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 induzem a degradação de Siglec-5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, derramamento de Siglec-5 e/ou regulação negativa da expressão de Siglec-5. Em algumas modalidades, os níveis celulares de Siglec-5 são medidos em células primárias (por exemplo, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, micróglia, células T e macrófagos) ou em linhagens celulares utilizando um ensaio celular in vitro.
[0134] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação diminuem os níveis celulares de Siglec-5 em pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 31%, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 34%, pelo menos 35%, pelo menos 36%, pelo menos 37%, pelo menos 38%, pelo menos 39%, pelo menos 40%, pelo menos 41%, pelo menos 42%, pelo menos 43%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49%, pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos 55%, pelo menos 56%, pelo menos 57%, pelo menos 58%, pelo menos 59%, pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%,
pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, em pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais em comparação com os níveis celulares de Siglec-5 na ausência do anticorpo anti-Siglec-5.
[0135] Qualquer ensaio baseado nas células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito neste documento ou conhecido na técnica pode ser usado para medir a inibição da interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação ligam Siglec-5 e não inibem a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5.
[0136] Tal como utilizado neste documento, um anticorpo anti- Siglec-5 não inibe a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5 se diminuir a ligação do ligante a Siglec-5 em menos de 20% nas concentrações de anticorpos de saturação utilizando qualquer in vitro ou ensaio de cultura baseado em células descrito neste documento ou conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação inibem a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5 em menos de 20%, menos de 19%, menos de 18%, menos de 17%, menos de 16%, menos de 15%, menos de 14%, menos de 13%, menos de 12%, menos de 11%, menos de 10%, menos de 9%, menos de 8%, menos de 7%, menos de 6%, menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2% ou menos de 1% em concentrações de anticorpos de saturação utilizando qualquer ensaio in vitro ou ensaio de cultura baseado em células descrito neste documento ou conhecido na técnica.
[0137] Conforme utilizado neste documento, os níveis de Siglec-5 podem referir-se a níveis de expressão do gene que codifica Siglec-5; a níveis de expressão de um ou mais transcritos que codificam Siglec-5; aos níveis de expressão da proteína Siglec-5; e/ou à quantidade de proteína Siglec-5 presente nas células e/ou na superfície celular. Quaisquer métodos conhecidos na técnica para medir níveis de expressão gênica, transcrição, tradução e/ou abundância ou localização de proteínas podem ser utilizados para determinar os níveis de Siglec-5.
[0138] Além disso, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser usados para prevenir, reduzir o risco de, ou tratar demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de taupatia, infecções e/ou câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser utilizados para induzir ou promover a sobrevivência, maturação, funcionalidade, migração ou proliferação de uma ou mais células imunes em um indivíduo em necessidade; ou para diminuir a atividade, funcionalidade ou sobrevivência de células B reguladoras, células T reguladoras, células dendríticas imunossupressoras embutidas em tumor, macrófagos imunossupressores embutidos em tumor, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados aos tumores, macrófagos associados aos tumores, células de leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e/ou célula de leucemia mieloide crônica (CML) em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são anticorpos monoclonais.
[0139] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação diminui os níveis celulares de Siglec-5 (por exemplo, níveis de superfície celular, níveis intracelulares e/ou níveis totais). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação induz a regulação negativa de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação induz a clivagem de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação induz internalização de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-5 isolado da presente divulgação induz a liberação de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação induz a degradação de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-5 isolado da presente divulgação induz a dessensibilização de Siglec-5.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético para ativar transitoriamente Siglec-5.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir a degradação de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir a clivagem de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um mimético de ligante e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir a internalização de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec- 5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir a clivagem de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir a regulação negativa da expressão de Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação atua como um ligante mimético e ativa transitoriamente Siglec-5 antes de induzir a clivagem de Siglec-
5.
[0140] Em certas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 que diminui os níveis celulares de Siglec-5 e/ou não inibe a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5 é um anticorpo anti-Siglec-5 que se liga fisicamente ou interage com um Siglec-5. O anticorpo anti-Siglec-5 pode ter afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo (por exemplo, Siglec-5). Em certas modalidades, a Kd do anticorpo é de cerca de 10 pM a cerca de 100 nM. Por exemplo, Kd do anticorpo é qualquer um de cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 790 pM, cerca de 780 pM, cerca de 770 pM, cerca de 760 pM, cerca de 750 pM, cerca de 740 pM, cerca de 730 pM, cerca de 720 pM, cerca de 710 pM, cerca de 700 pM, cerca de 650 pM, cerca de 600 pM, cerca de 590 pM, cerca de 580 pM, cerca de 570 pM, cerca de 560 pM, cerca de 550 pM, cerca de 540 pM, cerca de 530 pM, cerca de 520 pM, cerca de 510 pM, cerca de 500 pM, cerca de 450 pM, cerca de 400 pM, cerca de 350 pM, cerca de 300 pM, cerca de 290 pM, cerca de 280 pM, cerca de 270 pM, cerca de 260 pM, cerca de 250 pM, cerca de 240 pM, cerca de 230 pM, cerca de 220 pM, cerca de 210 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM ou cerca de 20 pM, ou cerca de 15 pM a qualquer um de cerca de 1 pM, cerca de 2 pM, cerca de 3 pM, cerca de 4 pM, cerca de 5 pM, cerca de 6 pM, cerca de 7 pM, cerca de 8 pM, cerca de 9 pM, cerca de 10 pM, cerca de 11 pM, cerca de 12 pM, cerca de 13 pM ou cerca de 14 pM. Métodos para a preparação e seleção de anticorpos que interagem e/ou se ligam com especificidade a um Siglec-5 são descritos neste documento.
[0141] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação é um anticorpo murino. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multivalente ou um anticorpo quimérico. As descrições exemplificativas de tais anticorpos são encontradas ao longo da presente divulgação.
[0142] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a um Siglec-5 humano. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga especificamente ao Siglec-5 humano. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a Siglec-5, mas não se liga a Siglec-14. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação liga Siglec-5 humano, mas não liga Siglec-14 humano. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a Siglec-5, mas não se liga a Siglec-5 cyno. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação não bloqueia a ligação do ligante ao Siglec-5.
[0143] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec- 5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células in vivo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos, em neutrófilos primários, em neutrófilos humanos e/ou em neutrófilos humanos primários.
[0144] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) nas células in vivo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos, em neutrófilos primários, em neutrófilos humanos e/ou em neutrófilos humanos primários.
[0145] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) nas células. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em células in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) nas células in vivo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em neutrófilos, em neutrófilos primários, em neutrófilos humanos e/ou em neutrófilos humanos primários.
[0146] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) nas células. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em células in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) nas células in vivo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação diminui a produção ou formação de rede extracelular de neutrófilos (NET) em neutrófilos, em neutrófilos primários, em neutrófilos humanos e/ou em neutrófilos humanos primários.
[0147] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide.
[0148] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos humanos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos humanos primários. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos M0, em macrófagos M1 e/ou em macrófagos M2a. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos in vitro. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação induz ou aumenta a atividade de fagocitose em macrófagos in vivo.
[0149] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são anticorpos agonistas ou anticorpos antagonistas que se ligam a uma proteína Siglec-5 da presente divulgação expressa na superfície de uma célula e modulam (por exemplo, induzem ou inibem) uma ou mais atividades Siglec-5 da presente divulgação após ligação à proteína Siglec-5 expressa na superfície. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são anticorpos inertes. Ensaios
[0150] Os anticorpos anti-Siglec-5 que diminuem os níveis celulares de Siglec-5 podem ser identificados e/ou caracterizados usando métodos bem conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, ensaios de inibidor radiomarcado, ensaios ópticos, ensaios de ligação de proteína, ensaios de triagem bioquímica, imunoensaios, ensaios de medição de deslocamento de massa, ensaios de fluorescência e/ou ensaios de clivagem de peptídeo fluorogênico.
Ensaios de ligação e outros ensaios
[0151] Em certas modalidades, os anticorpos anti-Sigelc-5 que se ligam a Siglec-5 e diminuem os níveis celulares de Siglec-5 podem ser identificados por técnicas bem conhecidas na técnica para detectar a presença de uma interação do candidato a anticorpo anti-Siglec-5 e/ou afinidade de ligação a um Siglec-5.
[0152] Em certas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 que interagem com um Siglec-5 podem ser identificados usando um ensaio de inibidor radiomarcado. Por exemplo, uma quantidade conhecida de um candidato a agente radiomarcado pode ser incubada com uma quantidade conhecida de Siglec-5 imobilizado e um tampão. Subsequentemente, o Siglec-5 imobilizado pode ser lavado com um tampão e o Siglec-5 imobilizado pode ser medido quanto à presença remanescente do candidato a antibiótico anti-Siglec-5 radiomarcado usando técnicas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, um contador gama. Uma medição que indica a presença de uma substância radiomarcada pode indicar que o candidato a anticorpo radiomarcado é capaz de interagir e/ou ligar-se a Siglec-5.
[0153] Em certas modalidades, um anticorpo que interage com um Siglec-5 pode ser identificado usando uma técnica óptica. Uma técnica óptica exemplar para detectar um anticorpo Siglec-5 pode incluir, por exemplo, anexar Siglec-5 a uma superfície de enxerto ressonante colorimétrico, mudando assim o comprimento de onda da luz refletida devido a mudanças no caminho óptico que a luz deve tomar e, subsequentemente, medição adicional mudanças no comprimento de onda da luz refletida quando um agente candidato pode interagir com o Siglec-5. Por exemplo, nenhuma mudança no comprimento de onda medido da luz refletida quando um agente é incubado com Siglec-5 pode indicar que o candidato a agente é incapaz de interagir com Siglec-5. Mudanças no comprimento de onda medido da luz refletida quando um candidato a agente é incubado com Siglec-5 podem indicar que o candidato a anticorpo é capaz de se ligar e/ou interagir com Siglec-5.
[0154] Em certas modalidades, um anticorpo que interage com um Siglec-5 pode ser identificado usando um ensaio de ligação de proteína. Um exemplo de ensaio de ligação de proteína para detectar um anticorpo Siglec-5 pode incluir, por exemplo, co-imunoprecipitação de um Siglec-5 na presença do anticorpo candidato. Por exemplo, um Siglec-5 pode ser incubado com o anticorpo candidato em tampão e, subsequentemente, uma molécula imobilizada específica para capturar um Siglec-5, tal como, por exemplo, um anticorpo anti- Siglec-5, pode ser usado para capturar Siglec-5 na presença do anticorpo candidato e ligam-se ao Siglec-5, potencialmente com um anticorpo candidato de interação, durante procedimentos de lavagem conhecidos na técnica.
Subsequentemente, Siglec-5, potencialmente com um candidato a anticorpo em interação, pode ser liberado e a presença de um candidato a anticorpo pode ser detectada, com base nas características do candidato a anticorpo, por técnicas, tais como, por exemplo, espectrometria de massa e/ou Western blot.
[0155] Em certas modalidades, um anticorpo que interage com um Siglec-5 pode ser identificado usando um ensaio bioquímico e/ou imunoensaio bem conhecido na técnica. Uma técnica exemplar pode incluir, por exemplo, um ensaio para medir quantitativamente as alterações na concentração de Siglec-5 e/ou meia-vida da proteína usando técnicas, tais como, por exemplo, Western blot, imunocoloração e co-imunoprecipitação. Por exemplo, um candidato a anticorpo pode ser incubado com uma amostra contendo um Siglec-5, tal como uma célula que expressa Siglec-5, e subsequentemente a quantidade de proteína Siglec-5 e/ou níveis celulares podem ser medidos em pontos durante um estudo de curso de tempo. Alterações na quantidade de proteína, níveis celulares e/ou meia-vida da proteína em comparação com um tratamento de controle podem indicar que o anticorpo candidato Siglec-5 pode ser capaz de alterar a meia-vida e/ou atividade de Siglec-5.
[0156] Em certas modalidades, um ensaio de medição de deslocamento de massa pode ser usado para identificar um anticorpo que interage com um Siglec-5. Um ensaio de medição de deslocamento de massa exemplar pode incluir, por exemplo, detectar a presença de um anticorpo Siglec- 5 fortemente e/ou covalentemente ligado medindo uma alteração na massa de Siglec-5 quando o anticorpo candidato está interagindo com Siglec-5 usando instrumentos, tais como, mas não limitado a um espectrômetro de massa. Por exemplo, um ensaio de deslocamento de massa pode ser realizado em uma proteína inteira e/ou uma análise baseada em peptídeo, dependendo da natureza da interação do anticorpo candidato. A detecção de um deslocamento de massa correlacionado com a adição do referido anticorpo candidato a Siglec- 5 pode indicar que o anticorpo candidato pode ser capaz de interagir com ou inibir de outra forma um Siglec-5. Além disso, um ensaio de medição de deslocamento de massa exemplar pode incluir, por exemplo, detectar a adição de massa ao Siglec-5 correlacionando-se com a massa do candidato de anticorpo respectivo quando o candidato de anticorpo está interagindo com Siglec-5 usando técnicas, tais como, por exemplo, plasmon de superfície ressonância. Por exemplo, a mudança no índice de refração da luz pode ser medida e correlacionada com uma mudança na massa de Siglec-5 ligada a uma superfície do sensor.
[0157] Em certas modalidades, um ensaio de reticulação química pode ser usado para identificar um anticorpo Siglec-5 que interage com um Siglec-5. Por exemplo, um candidato a anticorpo pode ser incubado com um Siglec-5, in vivo ou in vitro, com uma molécula de reticulação capaz de ligar covalentemente um candidato a anticorpo interagindo com Siglec-5 à referida molécula Siglec-5. Subsequentemente, técnicas, tais como, mas não se limitando a, espectrometria de massa e/ou Western blot, podem ser usadas para identificar um candidato a anticorpo que pode ser capaz de interagir com ou inibir Siglec-5. Por exemplo, a detecção de Siglec-5 reticulado covalentemente com o anticorpo candidato pode indicar que o agente candidato pode ser capaz de interagir com ou inibir Siglec-5.
[0158] Em certas modalidades, os anticorpos que interagem com um Siglec-5 podem ser identificados usando um ensaio de fluorescência. Por exemplo, uma quantidade conhecida de um candidato a anticorpo fluorescente pode ser incubada com uma quantidade conhecida de Siglec-5 imobilizado e um tampão. Subsequentemente, o Siglec-5 imobilizado pode ser lavado com um tampão e o Siglec-5 imobilizado pode ser medido quanto à presença remanescente de um candidato a anticorpo Siglec-5 fluorescente usando técnicas conhecidas na técnica, tais como, mas não se limitando a fluorescência detecção. Uma medição que indica a presença de uma substância fluorescente pode indicar que o candidato a anticorpo fluorescente é capaz de interagir e/ou ligar-se ao Siglec-5.
[0159] Os ensaios descritos acima para identificar um anticorpo da presente divulgação que interage com, ou se liga a um Siglec-5 também podem ser usados para identificar anticorpos anti-Siglec-5 que não interagem com, ou se ligam a Siglec-14.
Ensaios de atividade
[0160] Os ensaios conhecidos na técnica e/ou descritos neste documento podem ser usados para identificar e testar atividades biológicas de anticorpos Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, são fornecidos ensaios para testar a capacidade dos anticorpos Siglec-5 para modular uma ou mais atividades Siglec-5.
Regiões de ligação de anticorpo anti-Siglec-5
[0161] Certos aspectos da presente divulgação fornecem anticorpos anti-Siglec-5 que se ligam a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 17-441, 19-360, 19-330, 19-229, 19-136, 146-229 ou 236-330 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondendo aos resíduos de aminoácidos 17-441, 19-360, 19-330, 19-229, 19-136, 146-229 ou 236-330 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 63-71 do Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 63- 71 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 63-71, 83-92 e 125-132 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo de Siglec-5 correspondente a resíduos de aminoácidos 63-71, 83-92 e 125-132 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 65-71 do Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro dos resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondendo aos resíduos de aminoácidos 65-71 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 65-71 e 81-87 do Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 65- 71 e 81-87 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-
5 liga-se a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 65-71,
77-84 e 119-127 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo Siglec-5 ou ortólogo correspondente aos resíduos de aminoácidos 65-71, 77-84 e 119-127 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 65-73 de humanos Siglec-5 (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 65-73 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 77-84 de Siglec-5 humano
(SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 77-84 de SEQ
ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 81-87 do Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro dos resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 81-
87 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 83-92 de Siglec-
5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 83-
92 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 liga-se a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 119-127 de
Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos
119-127 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 125-132 do Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro dos resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos
125-132 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 352-358 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em um homólogo ou ortólogo Siglec-5 correspondente aos resíduos de aminoácidos 352-358 de SEQ ID NO: 1.
[0162] Certos aspectos da presente divulgação fornecem anticorpos anti-Siglec-5 que se ligam a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 268-278, 226-244 ou 228-238 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec- 5, homólogo ou ortólogo correspondente aos resíduos de aminoácidos 268-278, 226-244 ou 228-238 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 liga-se a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 268-278 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5, homólogo ou ortólogo correspondente aos resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos dentro da sequência de aminoácidos LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 226-244 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) ou dentro de resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec- 5, homólogo ou ortólogo correspondente aos resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220 ).Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos 228-238 de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou dentro de resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5, homólogo ou ortólogo correspondente aos resíduos de aminoácidos 228-238 de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 se liga a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219).
[0163] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem se ligar a um epítopo conformacional. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem se ligar a um epítopo Siglec-5 descontínuo. Em algumas modalidades, o epítopo Siglec- 5 descontínuo pode ter dois ou mais peptídeos, três ou mais peptídeos, quatro ou mais peptídeos, cinco ou mais peptídeos, seis ou mais peptídeos, sete ou mais peptídeos, oito ou mais peptídeos, nove ou mais peptídeos, ou 10 ou mais peptídeos. Conforme divulgado neste documento, os epítopos Siglec-5 podem compreender um ou mais peptídeos compreendendo cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, ou 20 ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, ou 20 ou mais resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 de mamífero correspondendo à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0164] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação inibem competitivamente a ligação de pelo menos um anticorpo selecionado a partir de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 2, 3, 6 e 7. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação inibem competitivamente a ligação de pelo menos um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-
174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8 e S5-G-03-H9.
[0165] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação se ligam a um epítopo de Siglec-5 humano que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo Siglec-5 ligado por pelo menos um anticorpo selecionado a partir de qualquer um dos anticorpos listados em Tabelas 2, 3, 6 e 7. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação se ligam a um epítopo de Siglec-5 humano que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo Siglec-5 ligado por pelo menos um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5- 174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G- 03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9.
[0166] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação ligam-se essencialmente ao mesmo epítopo Siglec-5 ligado por pelo menos um anticorpo selecionado a partir de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 2, 3, 6 e 7. Em algumas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação ligam-se essencialmente ao mesmo epítopo Siglec-5 ligado por pelo menos um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9. Métodos exemplares detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0167] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação competem com um ou mais anticorpos selecionados de S5- 172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G- 07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5- 172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174- H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03- H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos para ligação a Siglec-5 quando o anticorpo anti-Siglec-5 reduz a ligação de um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172- H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5- 174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G- 03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação deste a Siglec-5 em uma quantidade que varia de cerca de 50% a 100%, em comparação com a ligação a Siglec-5 na ausência do anticorpo anti- Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compete com um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5- 174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5- G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5- 174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G- 03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos para ligação a Siglec-5 quando o anticorpo anti-Siglec- 5 reduz o ligação de um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-
174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-
H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-
H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação deste para Siglec-5 por pelo menos 50%, pelo menos 55%, por pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos
80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%, em comparação com a ligação a Siglec-5 na ausência do anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação que reduz a ligação de um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5-174, S5-
175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-
172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-
H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-
174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-
G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos com Siglec-5 em 100% indica que o anticorpo anti-Siglec-5 essencial bloqueia completamente a ligação de um ou mais anticorpos selecionados de
S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03,
S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5,
S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-
174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-
03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos com Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 e um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5-
174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-
G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6,
S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5- 174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-
03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos estão presentes em uma quantidade que corresponde a uma razão 10:1, razão 9:1, razão 8:1, razão 7:1, razão 6:1, razão 5:1, razão
4:1, razão 3:1, razão 2:1, razão 1:1, razão 0,75:1, razão 0,5:1, razão 0,25:1,
razão 0,1:1, razão 0,075:1, razão 0,050:1, razão 0,025:1, razão 0,01:1, razão
0,0075:1, razão 0,0050:1, razão 0,0025:1, razão 0,001:1, razão 0,00075:1, razão
0,00050:1, razão 0,00025:1, razão 0,0001:1, razão 1:10, razão 1:9, razão 1:8,
razão 1:7, razão 1:6, razão 1:5, razão 1:4, razão 1:3, razão 1:2, razão 1:0,75,
razão 1:0,5, razão 1:0,25, razão 1:0,1, razão 1:0,075, razão 1:0,050, razão
1:0,025, razão 1:0,01, razão 1:0,0075, razão 1:0,0050, razão 1:0,0025, razão
1:0,001, razão 1:0,00075, razão 1:0,00050, razão 1:0,00025 , ou razão 1:0.0001 do anticorpo anti-Siglec-5 para um ou mais anticorpos selecionados de S5-172,
S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07,
S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-
H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-
174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-
03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9e qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 está presente em excesso por uma quantidade que varia de cerca de 1,5 vezes a 100 vezes, ou maior do que 100 vezes em comparação com a quantidade de um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-
182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-
H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-
174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-
H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-
H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 está presente em uma quantidade que é cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes,
8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 35 vezes,
40 vezes, 45 vezes, 50 vezes, 55 vezes, 60 vezes, 65 vezes, Excesso de 70 vezes, 75 vezes, 80 vezes, 85 vezes, 90 vezes, 95 vezes ou 100 vezes em comparação com a quantidade de um ou mais anticorpos selecionados de S5- 172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G- 07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5- 172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174- H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03- H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos.
[0168] Qualquer ensaio de competição adequado ou ensaio de ligação Siglec-5 conhecido na técnica, tal como análise BIAcore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo, pode ser utilizado para determinar se um anticorpo anti- Siglec-5 compete com um ou mais anticorpos selecionados de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos para ligação a Siglec-5. Em um ensaio de competição exemplificativo, Siglec-5 imobilizada ou células que expressam Siglec-5 na superfície celular são incubadas em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga à Siglec-5 (por exemplo, primata humano ou não humano) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado pela sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação à Siglec-5. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante do hibridoma.
Como um controle, Siglec-5 imobilizado ou células que expressam Siglec-5 são incubadas em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação em condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo a Siglec-5, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associada a Siglec- 5 imobilizado ou células que expressam Siglec-5 é medida. Se a quantidade de marcador associada a Siglec-5 imobilizado ou células que expressam Siglec-5 for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo pela ligação a Siglec-5. Ver, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo anti-Siglec-5
[0169] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação compreendem (a) uma região variável da cadeia leve compreendendo pelo menos uma, duas ou três HVRs selecionados de HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de qualquer um dos anticorpos selecionados de S5-172, S5- 174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5- G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5- 174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G- 03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos; e/ou (b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, duas ou três HVRs selecionados de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de qualquer um dos anticorpos selecionados de S5-172, S5- 174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5- G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5- 174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G- 03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-
5 da presente divulgação compreendem pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionados de (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de um anticorpo selecionado deS5-172, S5-174, S5-175, S5-176,
S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-
172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-
H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-
G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-
G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5-
176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1,
S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-
174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-
H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-
H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-
175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-
172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-
H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-
174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-
G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; (iv) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174,
S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10,
S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-
174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-
H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; (v) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de um anticorpo selecionado de
S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5- 174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G- 03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; e (vi) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de um anticorpo selecionado deS5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5- 202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172- H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5- 174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G- 03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5- G-03-H9. Em algumas modalidades, a HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 compreendem sequências EU ou Kabat CDR, Chothia CDR ou Contact CDR de um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5- 176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5- 174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174- H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03- H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos.
[0170] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação compreendem um domínio variável da cadeia leve e um domínio variável da cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia leve compreende um ou mais dentre: (a) uma HVR-L1 compreendendo um aminoácido sequência selecionada de SEQ ID NOs: 103-115; (b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 127-135; e (c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 153-163; e/ou em que o domínio variável da cadeia pesada compreende um ou mais dentre: (a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 20-28; (b) uma HVR- H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 39-51; e (c) uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 70-79.
[0171] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação compreendem um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que (a) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, o HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (b) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; (c) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155; (d) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156; (e) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157; (f) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158; (g) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159; (h) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 132 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160; (i) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161; (j) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162; (k) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163; (l) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (m) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; e (n) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161.
[0172] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação compreendem uma região variável da cadeia leve de qualquer um dos anticorpos selecionados de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5- 172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174- H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5- G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5- G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; e/ou uma região variável da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos selecionados deS5-172, S5-174, S5-175, S5- 176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5- 174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174- H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03- H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação compreendem uma região variável da cadeia leve de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 2, 3, 6 e 7, ou selecionados a partir de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5- 174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-
H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03- H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; e/ou uma região variável da cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 2, 3, 6 e 7, ou selecionada a partir de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5- G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5- 172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174- H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03- H9.
[0173] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação compreendem uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 194-211; e/ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 174-193. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 195; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 175. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 196; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 176. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 198; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 178. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 199; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 179. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 174. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 201; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 180. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 202; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 181. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 203; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 182. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 204; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 183. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 184. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 184. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 185. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 185. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 186. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 186. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 187. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 187. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 188. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 188. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 189. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 189. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 190. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 190. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 191. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 191. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 191. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 192. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 192. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 192. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211; e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193.
[0174] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo anti- Siglec-5, em que o anticorpo compreende um VH como em qualquer uma das modalidades fornecidas acima e um VL como em qualquer uma das modalidades fornecidas acima. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compreende uma sequência VH selecionada de SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 e 193; e sequência VL selecionada de SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 e 211, incluindo pós-tradução modificações dessas sequências. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende a sequência VH e a sequência VL de um anticorpo selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03- H8 e S5-G-03-H9.
[0175] Em outro aspecto, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 ou 193. Em certas modalidades, uma sequência V H tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 ou 193 contém substituições (por exemplo, substituições conservadoras), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-Siglec- 5 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a Siglec-5. Em certas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 ou 193. Em certas modalidades, um total de 1 a 5 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 ou 193. Em certas modalidades, substituições, inserções, ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs).
Opcionalmente, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende a sequência VH da SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 ou 193, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma modalidade particular, o VH compreende um, dois ou três HVRs selecionados de: (a) HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrado na Tabela 2 e/ou Tabela 6; (b) HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrada na Tabela 2 e/ou Tabela 6; (c) HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrada na Tabela 2 e/ou Tabela 6.
[0176] Em outro aspecto, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compreende um domínio variável de cadeia leve (V L) tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 ou 211. Em certas modalidades, uma sequência VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 ou 211 contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-Siglec-5 compreendendo essa sequência retém a capacidade de se ligar a Siglec-5. Em algumas modalidades, um total de 1 a 10 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 ou 211. Em certas modalidades, um total de 1 a 5 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados na SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 ou 211. Em certas modalidades, as substituições, inserções, ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-Siglec-5 compreende a sequência VL de SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 ou 211, incluindo modificações pós-tradução dessa sequência. Em uma modalidade particular, o VL compreende um, dois ou três HVRs selecionados de (a) HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrado na Tabela 3 e/ou Tabela 7; (b) HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 7; e (c) HVR- L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de uma HVR-H1 mostrada na Tabela 3 e/ou Tabela 7.
[0177] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-172.
[0178] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-174.
[0179] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-175.
[0180] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-176.
[0181] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-182.
[0182] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-183.
[0183] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 159. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-190.
[0184] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 132; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-202.
[0185] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 161. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03.
[0186] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-07.
[0187] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-10.
[0188] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-172-H1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-172-H2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-172-H3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-172-H4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-172-H5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-172-H6.
[0189] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-174-H1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-174-H2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-174-H3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-174-H4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-174-H5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-174-H6. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-174-H7. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-174-H8.
[0190] Em algumas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos anti-Siglec-5 compreendendo (a) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03-H1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-G-03-H2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03-H3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03-H4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-G-03-H5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03-H6. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03-H7. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti- Siglec-5 S5-G-03-H8. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é o anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 S5-G-03-H9.
[0191] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compete pela ligação ao Siglec-5 humano com um anticorpo compreendendo uma sequência VH selecionada da SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 e 193; e uma sequência VL selecionada da SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 e 211. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compete pela ligação com um anticorpo selecionado a partir de S5-172, S5-174, S5-175, S5- 176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5- 174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174- H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03- H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8, e S5-G-03-H9.
[0192] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compete pela ligação ao Siglec-5 humano com um anticorpo anti-Siglec-5 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma HVR-H1, uma HVR-H2 e/ou uma HVR-H3 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma HVR-L1 e HVR-L2 e/ou uma HVR- L3, em que (a) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-
L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (b) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; (c) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155; (d) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156; (e) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157; (f) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158; (g) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159; (h) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 132, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160; (i) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161; (j) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162; (k) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163; (l) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (m) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; e (n) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161.
[0193] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação compete pela ligação ao Siglec-5 humano com um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 194 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 195 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175; um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 196 e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 176; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 197 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 177; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 198 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 178; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 199 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 200 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 201 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 180; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 202 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 181; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 203 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 182; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 204 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 183; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 184; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 184; um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 205 e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 185; um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205 e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 186; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 206 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 186; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 187; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 189; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 191; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 210 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 191; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 191; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 192; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 210 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 192; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 192; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 193; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 210 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 193; e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 193.
[0194] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a um epítopo de Siglec-5 humano que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-Siglec-5 compreendendo uma sequência VH selecionada a partir de SEQ ID NO: 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192 e 193; e uma sequência de VL selecionada a partir da SEQ ID NO: 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 e 211. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a um epítopo de Siglec-5 humano que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-Siglec-5 selecionado a partir de S5-172, S5-174, S5- 175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5- 172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174- H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5- 174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5- G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9.
[0195] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a um epítopo de Siglec-5 humano que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-Siglec-5 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma HVR-H1, uma HVR- H2 e/ou uma HVR-H2 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma HVR-L1, uma HVR-L2 e/ou uma HVR-L3, em que (a) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (b) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; (c) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 129 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155; (d) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156; (e) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157; (f) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158; (g) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159; (h) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 132 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160; (i) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161; (j) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 134 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162; (k) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163; (l) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153; (m) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154; e (n) a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51, a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77, a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133 e a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161.
[0196] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação se liga a um epítopo de Siglec-5 humano que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo ligado por um anticorpo anti-Siglec-5 compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 194 e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 174; um domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 195 e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 196 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 176; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 197 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 177; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 198 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 178; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 199 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 179; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 200 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 174; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 201 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 180; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 181; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 203 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 182; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ
ID NO: 204 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 183; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 184; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 206 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 184; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 205 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 185; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 205 e um domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 186; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 206 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 186; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 187; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 188; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 188; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 189; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 190; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 208 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 190; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 191; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 192; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 210 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 192; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 192; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 209 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 210 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193; e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 211 e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 193.
[0197] Qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação pode ser produzido por uma linhagem celular. Em algumas modalidades, a linhagem celular pode ser uma linhagem celular de mamífero.
Em certas modalidades, a linhagem celular pode ser uma linhagem celular de hibridoma. Em outras modalidades, a linhagem celular pode ser uma linhagem celular de levedura. Qualquer linhagem celular conhecida na técnica adequada para produção de anticorpos pode ser usada para produzir um anticorpo da presente divulgação. Linhagens celulares exemplificativas para produção de anticorpos são descritas ao longo da presente divulgação.
[0198] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo monoclonal anti-Siglec-5 selecionado a partir de S5-172, S5-174, S5- 175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9. Em certas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo antagonista. Em certas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo agonista ou um anticorpo inerte.
Afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-5
[0199] As constantes de dissociação (KD) de anticorpos anti-Siglec- 5 para Siglec-5 humano, Siglec-5 de mamífero ou ambos podem ter menos de 100 nM, menos de 75 nM, menos de 50 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 10 nM, menos de 9 nM, menos de 8 nM, menos de 7 nM, menos de menos de 6 nM, menos de 5 nM, menos de 4 nM, menos de 3 nM, menos de 2 nM, menos de 1 nM, menos de 0,95 nM, menos de 0,9 nM, menos de 0,85 nM, menos de 0,8 nM, menos de menos de 0,75 nM, menos de 0,70 nM, menos de 0,69 nM, menos de 0,68 nM, menos de 0,67 nM, menos de 0,66 nM, menos de 0,65 nM, menos de 0,64 nM, menos de 0,63 nM, menos de 0,62 nM, menos de 0,61 nM, menos de 0,6 nM, menos de 0,59 nM, menos de 0,58 nM, menos de 0,57 nM, menos de 0,56 nM, menos de 0,55 nM, menos de 0,54 nM, menos de 0,53 nM, menos de 0,52 nM, menos de 0,51 nM, menos de 0,50 nM, menos de 0,49 nM, menos de 0,48 nM, menos de 0,47 nM, menos de 0,46 nM, menos de 0,45 nM, menos de 0,44 nM, menos de 0,43 nM, menos de 0,42 nM, menos de 0,41 nM, menos de 0,4 nM, menos de 0,39 nM, menos de 0,38 nM, menos de 0,37 nM, menos de 0,36 nM, menos de 0,35 nM, menos de 0,34 nM, menos de 0,33 nM, menos de 0,32 nM, menos de 0,31 nM, menos de 0,3 nM, menos de 0,29 nM, menos de 0,28 nM, menos de 0,27 nM, menos de 0,26 nM, menos de 0,25 nM, menos de 0,24 nM, menos de 0,23 nM, menos de 0,22 nM, menos de 0,21 nM, menos de 0,2 nM, menos de 0,19 nM, menos de 0,18 nM, menos de 0,17 nM, menos de 0,16 nM, menos de 0,15 nM, menos de 0,14 nM, menos de 0,13 nM, menos de 0,12 nM, menos de 0,11 nM, menos de 0,1 nM, menos de 0,09 nM, menos de 0,08 nM, menos de 0,07 nM, menos de 0,06 nM, menos de 0,05 nM, menos de 0,04 nM, menos de 0,03 nM, menos de 0,02 nM ou menos de 0,01 nM (ou seja, 10 pM). Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma constante de dissociação (KD) para Siglec-5 humano, Siglec- 5 de mamífero ou ambos, que varia de menos de 80 nM a menos de 0,4 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma constante de dissociação (KD) para Siglec-5 humano que varia de cerca de 400 pm a cerca de 80 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma constante de dissociação (KD) para Siglec-5 humano de cerca de 0,42 nM, cerca de 0,85 nM, cerca de 1,1 nM, cerca de 1,5 nM, cerca de 1,7 nM, cerca de 5,3 nM, cerca de 7,1 nM, cerca de 15 nM, cerca de 31 nM, cerca de 61 nM ou cerca de 79 nM.
[0200] Em algumas modalidades de qualquer um dos anticorpos fornecidos neste documento, o anticorpo tem uma constante de dissociação (K D) de < 1 M, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, a partir de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, a partir de 10-9 M a 10-13 M). As constantes de dissociação podem ser determinadas por meio de qualquer técnica analítica, incluindo qualquer técnica bioquímica ou biofísica, como ELISA, ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (ver, por exemplo, Octet System da byBio), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), calorimetria de varredura diferencial (DSC), dicroísmo circular (CD), análise de fluxo interrompido e análises de fusão de proteína colorimétrica ou fluorescente. Em uma modalidade, a K D é medida por um ensaio de ligação a antígeno radiomarcado (RIA). Em algumas modalidades, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno, por exemplo, conforme descrito em Chen et al. J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999)). Em algumas modalidades, KD é medido usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE, por exemplo, um ensaio usando um BIACORE-2000 ou um BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25°C com antígeno imobilizado CM5 chips em ~10 unidades de resposta (RU). Em algumas modalidades, KD é medido usando um sistema ForteBio Octet® Red384 (ForteBio, Menlo Park, CA), por exemplo, como discutido nos exemplos neste documento. Em algumas modalidades, a KD é determinada a uma temperatura de aproximadamente 25ºC.
[0201] Os anticorpos anti-Siglec-5 adicionais, por exemplo, anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína Siglec-5 da presente divulgação, podem ser identificados, triados e/ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
Anticorpos anti-Siglec-5 capazes de se ligar a receptores Fc gama
[0202] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação mantêm a capacidade de ligar os receptores Fc gama. Em algumas modalidades, esses anticorpos quando possuem a especificidade correta do epítopo que é compatível com a ativação do receptor, podem ter características que permitam se agrupar e estimular transitoriamente, por exemplo, o receptor de Siglec-5. Em algumas modalidades, tais anticorpos podem posteriormente atuar como inibidores de longo prazo da expressão de Siglec-5 e/ou uma ou mais atividades de uma proteína Siglec-5 induzindo a degradação de Siglec-5, dessensibilização de Siglec-5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, derramamento de Siglec-5, regulação negativa da expressão de Siglec-5 e/ou degradação lisossomal de Siglec-5.
[0203] In vivo, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem agrupar receptores e ativar transitoriamente o Siglec-5 por qualquer um ou mais dos múltiplos mecanismos potenciais. Alguns isotipos de anticorpos humanos, como IgG2, possuem, devido à sua estrutura única, uma capacidade intrínseca de agrupar receptores ou manter os receptores em uma configuração agrupada, ativando assim receptores tais como Siglec-5 sem ligação a um receptor Fc (por exemplo, White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138–148).
[0204] Em algumas modalidades, outros anticorpos podem agrupar receptores (por exemplo, Siglec-5) ligando-se a receptores Fcg em células adjacentes. Em algumas modalidades, a ligação da região Fc IgG constante do anticorpo aos receptores Fcg pode levar à agregação dos anticorpos e os anticorpos, por sua vez, podem agregar os receptores aos quais se ligam por meio de sua região variável (Chu et al (2008) Mol Immunol, 45: 3926-3933; e Wilson et al., (2011) Cancer Cell 19, 101-113). Em algumas modalidades, a ligação com o receptor Fcg gama inibidor FcgR (FcgRIIB) que não provoca secreção de citocinas, explosão oxidativa, aumento da fagocitose e potencialização da citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpo é frequentemente uma maneira preferencial de agrupar anticorpos in vivo, visto que a ligação a FcgRIIB não está associada a efeitos de resposta imune adversos.
[0205] Existem outros mecanismos pelos quais os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação podem agrupar receptores. Por exemplo, em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo (por exemplo, fragmentos Fab) que são reticulados juntos podem ser usados para agrupar receptores (por exemplo, Siglec-5) de uma maneira semelhante a anticorpos com regiões Fc que se ligam a receptores Fcg, conforme descrito acima. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpos reticulados (por exemplo, fragmentos Fab) podem funcionar como anticorpos agonistas se induzirem o agrupamento de receptores na superfície celular e se ligarem a um epítopo apropriado no alvo (por exemplo, Siglec-5).
[0206] Portanto, em algumas modalidades, os anticorpos da presente divulgação que se ligam a uma proteína Siglec-5 podem incluir anticorpos agonistas que, devido à sua especificidade de epítopo, se ligam a Siglec-5 e ativam transitoriamente uma ou mais atividades de Siglec-5 antes de, por exemplo, diminuírem os níveis celulares de Siglec-5, inibem uma ou mais atividades de Siglec-5 (por exemplo, devido à diminuição dos níveis celulares de Siglec-5) e/ou inibem a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5 (por exemplo, devido à diminuição dos níveis celulares de Siglec-5). Em algumas modalidades, tais anticorpos podem se ligar ao sítio de ligação ao ligante em Siglec-5 e imitar transitoriamente a ação de um ligante natural. Alternativamente, tais anticorpos podem estimular o antígeno alvo para transduzir o sinal por ligação a um ou mais domínios que não são os sítios de ligação ao ligante. Em algumas modalidades, esses anticorpos não interferem na ligação ao ligante. Em algumas modalidades, independentemente de os anticorpos se ligarem ou não ao sítio de ligação ao ligante em Siglec-5, os anticorpos podem posteriormente atuar como inibidores de longo prazo da expressão de Siglec-5 e/ou uma ou mais atividades de uma proteína Siglec-5 induzindo a degradação de Siglec-5, dessensibilização de Siglec-5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, derramamento de Siglec-5, regulação negativa da expressão de Siglec-5 e/ou degradação lisossomal de Siglec-5.
[0207] As modificações e isotipos Fc de anticorpo exemplificativos são fornecidos na Tabela B abaixo. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação que é capaz de se ligar a um receptor Fc gama possui um isotipo Fc listado na Tabela B abaixo.
Tabela B: Isotipos Fc de anticorpo anti-Siglec-5 exemplificativos que são capazes de se ligar ao receptor Fc gama Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) IgG1 N297A IgG1 D265A e N297A IgG1 D270A IgG1 L234A e L235A L234A e G237A L234A e L235A e G237A L235A e G237A
Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU)
E233P e L234A e L235A
IgG1 D270A e/ou P238D e/ou L328E e/ou E233D e/ou
G237D e/ou H268D e/ou P271G e/ou A330R
IgG1 P238D e L328E e E233D e G237D e H268D e P271G e A330R
IgG1 P238D e L328E e G237D e H268D e P271G e A330R
IgG1 P238D e S267E e L328F e E233D e G237D e H268D e P271G e A330R
IgG1 P238D e S267E e L328F e G237D e H268D e P271G e A330R
IgG1 V263L
IgG1 V266L
IgG1 V273C ou V273E ou V273F ou V273L ou V273M ou
V273S ou V273Y
IgG1 V305K ou V305W
IgG2 V234A e G237A
IgG4 L235A e G237A e E318A
IgG4 S228P e L236E
Híbrido IgG2/4 IgG2 aa 118 a 260 e IgG4 aa 261 a 447
H268Q e V309L; e A330S e P331S
IgG1 C226S e C229S e E233P e L234V e L235A
IgG1 L234F e L235E e P331S
IgG2 C232S ou C233S
IgG2 A330S e P331S
IgG2 A330S e P331S e E430G
IgG1 S267E e L328F
Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) S267E sozinho IgG2 S267E e L328F IgG4 S267E e L328F IgG1 E430G IgG1 P331S e E430G IgG1 L234A e L235A e P331S e E430G IgG1 S267E e L328F e E430G IgG1 K322A e E430G IgG1 K322A e P331S e E430G IgG2 C127S IgG2 E430G IgG2 WT HC com Kappa (cadeia leve) LC HC C127S com Kappa LC Kappa LC C214S Kappa LC C214S e HC C233S Kappa LC C214S e HC C232S Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com as mutações P330S e P331S Fragmento F(ab')2 de WT IgG1 e qualquer uma das mutações listadas acima IgG1 Substituição da constante pesada 1 (CH1) e região de dobradiça de IgG1 por CH1 e região de dobradiça de IGg2
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS
Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) NTKVDKTVER KCCVECPPCP (SEQ ID NO: 218) Com um Kappa LC IgG1 Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com A330L e/ou L234F e/ou L235E e/ou P331S IgG1, IgG2 ou IgG4 Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com M252Y e/ou S254T e/ou T256E Camundongo IgG1 Para modelos de doenças de camundongos IgG4 WT
[0208] Além dos isotipos descritos na Tabela B, e sem desejar se limitar à teoria, pensa-se que os anticorpos com isotipos IgG1 ou IgG3 humanos e seus mutantes (por exemplo Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 2009, 20: 685-691) que se ligam aos Receptores Fcg I, IIA, IIC, IIIA, IIIB em humanos e/ou Receptores Fcg I, III e IV em camundongos, também podem atuar como transitórios anticorpos agonistas.
[0209] Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama é da classe IgG, da classe IgM ou da classe IgA. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0210] Em certas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG2. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG2 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc.
Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama se liga a um receptor Fc inibidor. Em certas modalidades, o receptor Fc inibidor é o receptor Fc gama inibidor IIB (FcγIIB). Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas de V234A (Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Cole et al. (1999) Transplantation, 68:563- 571), H268Q, V309L, A330S, P331S (US 2007/0148167; Armour et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2613-2624; Armour et al. (2000) The Haematology Journal 1(Suppl.1):27; Armour et al. (2000) The Haematology Journal 1(Suppl.1):27), C232S, e/ou C233S (White et al.(2015) Cancer Cell 27, 138–148), S267E, L328F (Chu et al., (2008) Mol Immunol, 45:3926-3933), M252Y, S254T, e/ou T256E, onde a posição de aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU .
[0211] Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG2 com um domínio constante de cadeia pesada que contém uma substituição de aminoácidos C127S, onde a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat (White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al., (2010) PROTEIN SCIENCE 19:753-762; e WO2008079246).
[0212] Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG2 com um domínio constante de cadeia leve Kappa que contém uma substituição de aminoácidos C214S, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat (White et al.,(2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al., (2010) PROTEIN SCIENCE 19:753-762; e WO2008079246).
[0213] Em certas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG1 de camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor gama Fc contém uma região constante de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG1 humano inclui uma região Fc. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama se liga a um receptor Fc inibidor. Em certas modalidades, o receptor Fc inibidor é o receptor Fc gama inibidor IIB (FcγIIB). Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas de N297A (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A (Shields et al. (2001) R. J. Biol.
Chem. 276, 6591–6604), D270A, L234A, L235A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984; Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-
1543. 31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al. (2000) Cell Immunol, 200:16-26), P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20167-20172), C127S, V263L, V266L, S267E, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, V305K, V305W, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D, e/ou E430G, onde a posição de aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU.
[0214] Em algumas modalidades, o anticorpo inclui um domínio constante de cadeia pesada do isotipo IgG2 1(CH1) e uma região de dobradiça (White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138–148). Em certas modalidades, o isotipo IgG2 CH1 e a região dobradiça contêm a sequência de aminoácidos de
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV
ECPPCP (SEQ ID NO: 218). Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo contém uma substituição de aminoácidos S267E, uma substituição de aminoácidos L328F, ou ambas, e/ou uma substituição de aminoácidos N297A ou N297Q, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU.
[0215] Em certas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama contém uma região constante de IgG4 humano. Em algumas modalidades, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc.
Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama se liga a um receptor Fc inibidor. Em certas modalidades, o receptor Fc inibidor é o receptor Fc gama inibidor IIB (FcγIIB). Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de L235A, G237A, S228P, L236E (Reddy et al., (2000) J Immunol,164:1925-1933), S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de S228P, F234A e L235A, onde a posição do aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas a partir de S228P na posição do resíduo Fc 228, F234A na posição do resíduo Fc 234 e L235A na posição do resíduo Fc 235, onde a posição do aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU.
[0216] Em certas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama possui um isotipo IgG2/4 híbrido. Em algumas modalidades, o anticorpo de ligação ao receptor Fc gama inclui uma sequência de aminoácidos contendo os aminoácidos 118 a 260 de acordo com a numeração EU ou Kabat de IgG2 humano e os aminoácidos 261-447 de acordo com a numeração EU ou Kabat de IgG4 humano (WO 1997/11971; WO 2007/106585).
[0217] Em certas modalidades, o anticorpo contém uma região constante de IgG4 de camundongo (Bartholomaeus, et al. (2014). J. Immunol.
192, 2091–2098).
[0218] Em algumas modalidades, a região Fc contém adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas a partir de A330L, L234F; L235E ou P331S de acordo com a numeração EU ou Kabat; e qualquer combinação destes.
Anticorpos antagonistas anti-Siglec-5
[0219] Uma terceira classe de anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação inclui anticorpos antagonistas. Em algumas modalidades, os anticorpos que se ligam a uma proteína Siglec-5 podem incluir anticorpos antagonistas que reduzem os níveis celulares de Siglec-5 e/ou inibem uma ou mais atividades de uma proteína Siglec-5. Tais anticorpos inibem uma ou mais atividades de uma proteína Siglec-5, prevenindo a interação (por exemplo, ligação) entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5 (por exemplo, indiretamente, como reduzindo os níveis celulares de Siglec-5) ou prevenindo a transdução de sinal do domínio extracelular de Siglec-5 para o citoplasma da célula na presença de um ou mais ligantes de Siglec-5. Os anticorpos antagonistas também podem inibir uma ou mais atividades de uma proteína Siglec-5, diminuindo os níveis de superfície celular de Siglec-5 induzindo a degradação de Siglec-5, dessensibilização de Siglec-5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, derramamento de Siglec-5, regulação negativa da expressão de Siglec-5 e/ou degradação lisossomal de Siglec-5. Em algumas modalidades, tais anticorpos anti-Siglec-5 antagonistas podem não ativar transitoriamente Siglec-5.
[0220] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 antagonistas da presente divulgação podem ter a especificidade do epítopo de um anticorpo anti-Siglec-5 agonista transitório da presente divulgação, mas possuem um domínio Fc que não tem capacidade de se ligar aos receptores de Fcg e, portanto, é incapaz de, por exemplo, ativar e aglomerar transitoriamente o Siglec-5.
[0221] Em algumas modalidades, anticorpos anti-Siglec-5 antagonistas da presente divulgação possuem, sem limitação, uma ou mais das seguintes atividades: a capacidade de diminuir a ligação de uma proteína de sinalização de supressor de citocina (SOCS) (por exemplo, proteína SOCS3) a uma proteína Siglec-5, a capacidade de aumentar a degradação proteassomal de uma proteína Siglec-5, a capacidade de reduzir a expressão funcional de Siglec-5 na superfície de células dendríticas circulantes, macrófagos, monócitos, células T e/ou micróglia, a capacidade de diminuir ou inibir a fosforilação de Tyr-520 e Tyr-544 por uma tirosina quinase de família Src, tal como Syk, LCK, FYM e/ou ZAP70; a capacidade de inibir o recrutamento de e ligação às fosfatases de proteína específica de tirosina SHP1 e SHP2; a capacidade de inibir o recrutamento de e ligação à PLC-gama1, que atua como um fator de troca de nucleotídeo guanina para Dynamini-1; a capacidade de inibir o recrutamento de e ligação à proteína contendo domínio SH2(por exemplo, Crkl); a capacidade de inibir o recrutamento de e ligação à tirosina quinase Syk do baço; a capacidade de inibir o recrutamento de e ligação à proteína ligada ao receptor de fator de crescimento SH3-SH2-SH3 2 (Grb2); a capacidade de inibir o recrutamento de e ligação a múltiplas proteínas contendo SH2; a capacidade de modular a expressão de uma ou mais citocinas pró- inflamatórias, opcionalmente em que uma ou mais citocinas anti-inflamatórias são selecionadas a partir de membros da família IFN-α4, IFN-beta, IL-1β, IL-
1alpha, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11,
IL-12, IL-17, IL-18, IL-33, MCP-1, e MIP-1-beta; a capacidade de modular uma ou mais citocinas pró-inflamatórias em uma ou mais células selecionadas a partir de macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, células dendríticas,
células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, osteoclastos,
células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos e células micrógliais; a capacidade de modular a expressão de uma ou mais citocinas anti-inflamatórias, opcionalmente em que as uma ou mais citocinas anti-
inflamatórias são selecionadas a partir de IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IL-16, TGF-
beta, IL-1Ra, G-CSF, e receptores solúveis para TNF, IFN-beta1a, IFN-beta1b,
ou IL-6; a capacidade de modular a expressão de uma ou mais citocinas anti-
inflamatórias em uma ou mais células selecionadas a partir de macrófagos,
neutrófilos, células B, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos e células micrógliais; a capacidade de modular a expressão de uma ou mais proteínas selecionadas a partir de uma ou mais proteínas a partir de C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3,
ITGB2, HMOX1, LAT2, CASP1, CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1,
TyroBP, ALOX5AP, ITGAM, SLC7A7, CD4, ITGAX e PYCARD; a capacidade de contrariar a inibição de fosforilação de quinase regulada por sinal extracelular (ERK); a capacidade de prevenir fosforilação de tirosina diminuída em uma ou mais proteínas celulares, opcionalmente, em que as uma ou mais proteínas celulares compreendem ZAP-70 e a fosforilação de tirosina ocorre
Tyr-319 de ZAP-70; a capacidade de modular a expressão de receptor de quimiocina C-C 7 (CCR7); a capacidade de prevenir a inibição de quimiotaxia de célula micróglial para as células de expressão de CCL19 e CCL21; a capacidade de prevenir a diminuição de proliferação de células T induzida por uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas de medula óssea, células B, células B reguladoras,
células plasmáticas, monócitos, micróglia, micróglia M1, micróglia ativada por
M1, micróglia M2, macrófagos, neutrófilos, células NK, macrófagos M1,
neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1, macrófagos M2, neutrófilos M2 e células NK M2; a capacidade de prevenir a inibição de produção de osteoclastos, a capacidade de prevenir a taxa diminuída de osteoclastogênese,
ou ambos; a capacidade de prevenir a sobrevivência diminuída de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B,
células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1,
células NK M1, macrófagos ativados M1, neutrófilos ativados por M1, células
NK ativadas por M1, macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos,
osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos,
neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia ativada por M1 e micróglia M2; a capacidade de prevenir a proliferação diminuída de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK
M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1, macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos,
osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos,
neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia ativada por M1 e micróglia M2; a capacidade de aumentar a migração de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1,
macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos, osteoclastos,
células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos,
micróglia, micróglia M1, micróglia ativada por M1 e micróglia M2; a capacidade de prevenir a diminuição em uma ou mais funções de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK
M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1, macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos,
osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos,
neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia ativada por M1 e micróglia M2; a capacidade de aumentar a maturação de uma ou mais células selecionadas a partir de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1,
macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos, osteoclastos,
células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos,
micróglia, micróglia M1, micróglia ativada por M1 e micróglia M2; a capacidade de aumentar um ou mais tipos de depuração selecionada partir de depuração apoptótica neuronal, depuração de resíduo de tecido nervoso, depuração de sinapse disfuncional, depuração de resíduo de tecido não nervoso, depuração bacteriana, outra depuração de corpo estranho, depuração de proteína causadora de doença, depuração de peptídeo causador de doença e depuração de célula tumoral; opcionalmente em que a proteína causadora de doença é selecionada a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas beta amiloide, proteínas precursoras de amiloide ou fragmentos desta,
Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberta 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína priônica, PrPSc,
huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2,
ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteina AI, A amiloide sérica, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta 2,
gelsolina, queratoepitelina, cistatina, imunoglobulina de cadeia leve AL,
proteína S-IBM, produtos de tradução de repetição associada a não-ATG
(RAN), peptídeos de repetição de DiPeptídeos (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição prolina-alanina (PA),
ubiquitina e peptídeos de repetição prolina-arginina (PR) e a célula tumoral é de um câncer selecionado a partir de câncer da bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do cólon, câncer do reto, câncer endometrial, câncer renal,
câncer da pelve renal, leucemia, câncer pulmonar, melanoma, linfoma não
Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário,
fibrossarcoma e câncer de tireoide; inibir a fagocitose de um ou mais neurônios apoptóticos, resíduos de tecido nervoso, sinapses disfuncionais, resíduos de tecido não nervoso, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, peptídeos causadores de doenças, ácidos nucleicos causadores de doenças ou células tumorais; opcionalmente em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição GGCCCC (G2C4)
antisense (SEQ ID NO:225), as proteínas causadoras de doenças são selecionadas a partir de beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP,
alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína priônica, PrPSc, huntingtina, calcitocina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3,
ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial,
polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, Apolipoproteína AI, A amiloide sérica, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta 2,
gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve AL de imunoglobulina,
proteína S-IBM, produtos de tradução associados a repetição de não ATG
(RAN), peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina arginina (GR), peptídeos de repetição de alanina-prolina
(PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR), e as células tumorais são de um câncer selecionado a partir de câncer da bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do cólon, câncer do reto, câncer endometrial,
câncer renal, câncer da pelve renal, leucemia, câncer pulmonar, melanoma,
linfoma não Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário,
fibrossarcoma ou câncer de tireoide; ligar ao ligante de Siglec-5 em células tumorais; ligar ao ligante de Siglec-5 em células selecionadas a partir de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
monócitos, micróglia, macrófagos e células NK; inibir a morte de células tumorais por uma ou mais micróglias, macrófagos, neutrófilos, células NK,
células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos,
células T, células T helper ou células T citotóxicas; ativar a atividade de proliferação de células antitumorais de uma ou mais micróglias, macrófagos,
neutrófilos, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T helper ou células T citotóxicas;
a capacidade de aumentar a atividade de metástase de células antitumorais de uma ou mais micróglias, macrófagos, neutrófilos, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células
T, células T helper ou células T citotóxicas; a capacidade de aumentar a atividade de um ou mais receptores contendo motivo ITAM, opcionalmente em que o um ou mais receptores contendo motivo ITAM são selecionados a partir de TREM1, TREM2, SIRPB1, receptores Fc gama (FcgR), DAP10 e DAP12; a capacidade de aumentar a sinalização por um ou mais receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), opcionalmente em que o um ou mais PRRs são selecionados a partir de receptores que identificam padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), receptores que identificam padrões moleculares associados a danos (DAMPs), e qualquer combinação destes; a capacidade de aumentar a atividade de um ou mais receptores compreendendo o motivo D/Ex0–2YxxL/IX6–8YxxL/I (SEQ ID NO: 4); a capacidade de aumentar a sinalização por um ou mais receptores tipo Toll; a capacidade de aumentar o caminho de sinalização de JAK-STAT; a capacidade de aumentar a atividade do fator nuclear de potenciador de cadeia leve kappa de células B ativadas
(NFkB); a capacidade de aumentar a fosforilação de um receptor contendo motivo ITAM; a capacidade de aumentar a expressão de um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata de complemento e/ou receptores que são expressos em células imunológicas, opcionalmente em que os um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata de complemento e/ou receptores que são expressos em células imunológicas compreendem CD86,
C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3, ITGB2, HMOX1, LAT2, CASP1,
CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1, TyroBP, ALOX5AP, ITGAM, SLC7A7,
CD4, ITGAX e/ou PYCARD e o um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata de complemento e/ou receptores que são expressos em células imunológicas em uma ou mais dentre micróglia, macrófagos, neutrófilos,
células NK, células B, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células T, células T helper ou células T citotóxicas;
a capacidade de reduzir a expressão de um ou mais dentre genes dependentes de Siglec-5; a capacidade de aumentar a expressão de um ou mais genes dependentes de ITAM, opcionalmente em que o um ou mais genes dependentes de ITAM são ativados pelo fator nuclear de fatores de transcrição de células T ativadas (NFAT); a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a diferenciação de uma ou mais células dendríticas imunosupressoras,
macrófagos imunosupressores, neutrófilos imunosupressores, células NK imunosupressoras, células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados ao tumor, neutrófilos associados ao tumor, células NK associadas ao tumor, células B reguladoras e células T reguladoras; a capacidade de diminuir ou de outra forma inibir a funcionalidade de uma ou mais células dendríticas imunosupressoras, macrófagos imunosupressores, neutrófilos imunosupressores, células NK imunosupressoras, células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados ao tumor, neutrófilos associados ao tumor, células NK associadas ao tumor, células B reguladoras e células T reguladoras; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a infiltração de uma ou mais células dendríticas imunosupressoras, macrófagos imunosupressores, neutrófilos imunosupressores, células NK imunosupressoras, células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados ao tumor, neutrófilos associados ao tumor, células NK associadas ao tumor, células B reguladoras e células T reguladoras em tumores; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir o número de células mieloides promotoras de tumor/granulocíticas imunosupressoras em um tumor, em sangue periférico ou outro órgão linfoide; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a atividade promotora de tumor de células B reguladoras; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a expressão de citocinas promotoras de tumor, tal como TGF-beta ou IL-10, em um tumor ou em sangue periférico; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a infiltração de linfócitos T reguladores FoxP3+ promotores de tumor; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a atividade promotora de tumor de células supressoras derivadas de mieloide (MDSC); a capacidade de aumentar ou de outro modo de potencializar a atividade de macrófagos com potencial de eliminar tumor; a capacidade de aumentar ou de outro modo de potencializar a infiltração de tumor de macrófagos antitumorais com potencial de eliminar tumor; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a atividade de neutrófilos com potencial de eliminar tumor; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a infiltração de tumor de neutrófilos antitumorais com potencial de eliminar tumor; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor;
a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a infiltração de tumor de células NK específicas de tumor com potencial de eliminar tumor; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar o potencial de eliminar tumor de células NK; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a atividade de linfócitos B específicos de tumor com potencial para potencializar a resposta imunológica; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a infiltração de linfócitos B específicos de tumor com potencial de potencializar resposta imunológica; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a infiltração de linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor; a capacidade diminuir o volume tumoral; a capacidade de diminuir a taxa de crescimento tumoral; a capacidade de diminuir ou de outro modo inibir a metástase; a capacidade de diminuir a taxa de recorrência do tumor; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam respostas de células T antitumorais, opcionalmente em que a uma ou mais imunoterapias são imunoterapias que visam proteínas selecionadas a partir de receptor de
PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1,
CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT,
VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, TREM1, TREM2, CD39, CD73, CSF-1 e qualquer combinação destes ou de uma ou mais vacinas de câncer; a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a mobilização de PLCγ/PKC/cálcio; e a capacidade de aumentar ou de outro modo potencializar a sinalização de PI3K/Akt, Ras/MAPK.
[0222] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação possuem uma região Fc que exibe ligação reduzida com um ou mais receptores Fc gama. Exemplos de tais regiões Fc e modificações são fornecidas na Tabela C abaixo. Em algumas modalidades, o anticorpo possui um isotipo Fc listado na Tabela C.
Isotipos de anticorpo Fc com ligação reduzida a receptores Fc gama
[0223] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 com ligação reduzida aos receptores Fc gama têm um isotipo Fc listado na Tabela C abaixo.
Tabela C: Isotipos Fc de anticorpo anti-Siglec-5 exemplificativos com ligação reduzida ao receptor Fc gama Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) IgG1 N297A ou N297Q IgG1 D265A, D270A e N297A IgG1 L234A e L235A IgG1 L234A e G237A IgG1 L235A e G237A IgG1 E233P e L234A e L235A IgG2 V234A e G237A IgG4 F235A e G237A e E318A E233P e/ou F234V N297A ou N297Q IgG4 S228P e L236E S241P S241P e L248E
Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU)
S228P e F234A e L235A
IgG2 H268Q e V309L e A330S e P331S
IgG1 C220S e C226S e C229S e P238S
IgG1 C226S e C229S e E233P e L234V e L235A
IgG1 Excluídos os E233P e L234V e L235A e G236
P238A
D265A
N297A
A327Q ou A327G
P329A
IgG1 K322A e L234A e L235A
IgG1 L234F e L235E e P331S
IgG1 S267E e L328F
IgG1 V263L
IgG1 V273C ou V273E ou V273F ou V273L ou V273M ou V273S ou V273Y
IgG1 V305K
IgG1 ou IgG4 T394D
IgG2 C232S ou C233S
N297A ou N297Q
IgG2 V234A e G237A e P238S e H268A e V309L e
A330S e P331S
IgG1, IgG2 ou IgG4 modificações delta a, b, c, ab, ac, g
IgG1 Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com
A330L ou L234F e/ou L235E e/ou P331S e/ou A330S
IgG1, IgG2 ou IgG4 Qualquer uma das mutações listadas acima, juntamente com
Isotipo Fc Mutação (esquema de numeração EU) M252Y e/ou S254T e/ou T256E
[0224] Em certas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo contém uma região constante de IgG1 de camundongo. Em algumas modalidades, o anticorpo contém uma região constante de IgG1 humano. Em algumas modalidades, a região constante de IgG1 humano inclui uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo).
[0225] Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas de N297A, N297Q (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D270A, D265A, L234A, L235A (McEarchern et al., ( 2007) Blood, 109:1185-1192), C226S, C229S (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238S (Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34:2204-2210), E233P, L234V (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238A, A327Q, A327G, P329A (Shields RL. Et al., (2001) J Biol Chem. 276(9):6591- 604), K322A, L234F, L235E (Hezareh, et al., (2001) J Virol 75, 12161-12168; Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallographica 64, 700–704), P331S (Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallographica 64, 700–704), T394D (Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406–417), A330L, M252Y, S254T, e/ou T256E, onde a posição de aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU. Em certas modalidades, a região Fc inclui ainda uma exclusão de aminoácidos em uma posição correspondente à glicina 236, de acordo com a convenção de numeração EU.
[0226] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 possui um isotipo IgG1 com uma região constante de cadeia pesada que contém uma substituição de aminoácidos C220S de acordo com a convenção de numeração EU. Em algumas modalidades, a região Fc contém adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas dentre A330L, L234F; L235E ou P331S, de acordo com a numeração EU. Em certas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 contém uma região constante de IgG2 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG2 humana inclui uma região Fc.
Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas dentre P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, V309L, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU ou Kabat (Vafa O. et al., (2014) Methods 65:114–126).
[0227] Em certas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 contém uma região constante de IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região constante de IgG4 humana inclui uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais modificações. Por exemplo, em algumas modalidades, a região Fc contém uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo, em relação a uma região Fc do tipo selvagem do mesmo isotipo). Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de aminoácidos são selecionadas de E233P, F234V, L235A, G237A, E318A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984), S228P, L234A/F234A, L236E, S241P, L248E (Reddy et al., (2000) J Immunol,164:1925-1933; Angal et al., (1993) Mol Immunol.
30(1):105-8; US 8614299 B2; Vafa O. et al., (2014) Methods 65:114–126),
T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, e/ou N297Q, onde a posição do aminoácido está de acordo com a convenção de numeração EU.
[0228] Em algumas modalidades, a região Fc adicionalmente contém uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais selecionadas a partir de um M252Y, S254T e/ou T256E, em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU.
Mutações IgG adicionais
[0229] Em algumas modalidades, uma ou mais das variantes de IgG1 descritas neste documento podem ser combinadas com uma mutação A330L (Lazar et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010), ou uma ou mais dentre as mutações L234F, L235E e/ou P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167-20172), em que a posição de aminoácidos está de acordo com a convenção de numeração EU, para eliminar a ativação de complemento. Em algumas modalidades, as variantes de IgG descritas neste documento podem ser combinadas com uma ou mais mutações para aumentar a meia-vida do anticorpo anti-Siglec-5 no soro humano (por exemplo M252Y, S254T, mutações T256E de acordo com a convenção de numeração EU) (Dall'Acqua et al., (2006) J Biol Chem, 281:23514-23524; e Strohl e al., (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20: 685–691).
[0230] Em algumas modalidades, uma variante de IgG4 da presente divulgação pode ser combinada com uma mutação S228P de acordo com a convenção de numeração EU (Angal et al., (1993) Mol Immunol, 30:105- 108) e/ou com um ou mais mutações descritas em Peters et al., (2012) J Biol Chem. 13; 287(29):24525-33) para potencializar a estabilização do anticorpo.
Anticorpos Biespecíficos
[0231] Certos aspectos da presente divulgação referem-se a anticorpos biespecíficos que se ligam a um ou mais domínios de uma proteína Siglec-5 da presente divulgação e a um segundo antígeno. Os métodos de geração de anticorpos biespecíficos são bem conhecidos na técnica e descritos neste documento.
Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos da presente divulgação ligam-se a um ou mais resíduos de aminoácidos de uma proteína Siglec-5 da presente divulgação, como um ou mais resíduos de aminoácidos de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 correspondendo a resíduos de aminoácidos de SEQ
ID NO: 1. Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos da presente divulgação reconhecem um primeiro antígeno e um segundo antígeno.
Em algumas modalidades, o primeiro antígeno é uma proteína Siglec-5 ou uma variante de ocorrência natural desta.
Em algumas modalidades, o segundo antígeno também é uma proteína Siglec-5, ou uma variante de ocorrência natural desta.
Em algumas modalidades, o segundo antígeno é um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica (ver, por exemplo, Gabathuler
R., Neurobiol.
Dis. 37 (2010) 48-57). Esses segundos antígenos incluem, sem limitação, receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LPR-1 e 2), receptor da toxina diftérica, CRM197, um anticorpo de domínio único de lhama, TMEM 30 (A), um domínio de transdução de proteína, TAT, Syn-B, penetratina, um peptídeo de poliarginina, peptídeos de Angiopep como ANG1005 (ver, por exemplo,
Gabathuler, 2010), e outras proteínas da superfície celular que são enriquecidas em células endoteliais da barreira hematoencefálica (ver, por, Daneman et al.,
PLoS One. 2010 Out 29;5(10):e13741). Em algumas modalidades, o segundo antígeno é uma proteína causadora de doença, incluindo, sem limitação, beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas beta amiloide, proteína precursora amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN,
proteína priônica, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina,
ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteína AI, amiloide sérico A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve da imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos da tradução não-ATG associados à repetição (RAN), peptídeos por repetição de dipeptídeos (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição prolina-arginina (PR).
Em algumas modalidades, o segundo antígeno é um ou mais ligantes e/ou proteínas expressas em células imunológicas, incluindo, sem limitação, PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73 e fosfatidilserina. Em algumas modalidades, o segundo antígeno é uma proteína, lipídeo, polissacarídeo ou glicolipídeo expresso em uma ou mais células tumorais.
Fragmentos de Anticorpo
[0232] Certos aspectos da presente divulgação se referem a fragmentos de anticorpo que se ligam a uma ou mais dentre uma proteína Siglec- 5 da presente divulgação, uma variante de ocorrência natural de uma proteína Siglec-5 e uma variante de doença de uma proteína Siglec-5. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv ou scFv.
[0233] Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo é usado em combinação com um segundo anticorpo anti-Siglec-5 e/ou com um ou mais anticorpos que se ligam especificamente com uma proteína causadora de doença selecionados dentre: beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas beta amiloides, proteína precursora amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína priônica, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide da ilhota, insulina, apolipoproteína AI, amiloide sérico A, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, ceratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos da tradução não-ATG associados à repetição (RAN), peptídeos de repetição de dipeptídeos (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina- arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina, e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR), e qualquer combinação desta; ou com um ou mais anticorpos que se ligam com uma proteína imunomoduladora selecionada a partir do grupo que consiste em: PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73, fosfatidilserina e qualquer combinação destas.
[0234] Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo da presente divulgação podem ser fragmentos funcionais que se ligam com o mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo são versões miniaturizadas dos anticorpos anti-Siglec-5 ou fragmentos de anticorpo da presente divulgação que possuem o mesmo epítopo que o anticorpo de comprimento completo correspondente, mas um peso molecular menor. Esses fragmentos de anticorpo anti-Siglec-5 miniaturizados podem possuir melhor capacidade de penetração no cérebro e uma meia-vida mais curta, o que é vantajoso para utilidades de geração de imagens e diagnóstico (ver por exemplo, Lütje S et al., Bioconjug Chem. 2014 Fev 19;25(2):335-41; Tavaré R et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jan 21;111(3):1108-13; e Wiehr S et al., Prostate.
2014 Maio;74(7):743-55). Por conseguinte, em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação possuem melhor penetração no cérebro em comparação com seus anticorpos de comprimento completo correspondentes e/ou têm uma meia-vida mais curta em comparação com seus anticorpos de comprimento completo correspondentes.
Frameworks de anticorpo
[0235] Qualquer um dos anticorpos descritos neste documento inclui ainda um framework. Em algumas modalidades, o framework é um framework de imunoglobulina humana. Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5) compreende HVRs como em qualquer uma das modalidades acima e compreende adicionalmente um framework de aceptor humano, por exemplo, um framework de imunoglobulina humana ou um framework de consenso humano. Os frameworks de imunoglobulina humana podem ser parte do anticorpo humano, ou um anticorpo não humano pode ser humanizado pela substituição de um ou mais frameworks endógenos por região(ões) de framework humana(s). As regiões de framework humanas que podem ser usadas para a humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões de framework selecionadas usando o método de "melhor ajuste" (ver, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões de framework derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (ver, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et al.
J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões de framework (mutadas somaticamente) maduras de humano ou regiões de framework de linhagem germinal (ver, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); e regiões de framework derivadas de triagem de bibliotecas FR (ver, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611- 22618 (1996)).
[0236] Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 da presente divulgação e uma, duas, três ou quatro das regiões de framework de cadeia leve conforme mostrado na Tabela 5. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma HVR-H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3 da presente divulgação e uma, duas, três ou quatro das regiões de framework da cadeia pesada, conforme mostrado na Tabela 4. Em algumas modalidades, um anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma HVR-L1, uma HVR-L2 e uma HVR-L3 da presente divulgação e uma, duas, três ou quatro das regiões de framework da cadeia leve conforme mostrado na Tabela 5 e compreende ainda uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma HVR-H1, uma HVR-H2 e uma HVR-H3 da presente divulgação e uma, duas, três ou quatro das regiões de estrutura da cadeia pesada conforme mostrado na Tabela 4.
Preparação do anticorpo
[0237] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem abranger anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados e quiméricos, anticorpos humanos, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, e F(ab’)2), anticorpos poliespecíficos e biespecíficos, anticorpos multivalentes, anticorpos heteroconjugados, anticorpos conjugados, anticorpos derivados de bibliotecas, anticorpos com funções efetoras modificadas, proteínas de fusão contendo uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que inclui um sítio de reconhecimento de antígeno, como um epítopo com resíduos de aminoácidos de uma proteína Siglec-5 da presente divulgação, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos anti- Siglec-5 podem ser humanos, murinos, de rato ou de qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados).
(1) Anticorpos policlonais
[0238] Anticorpos policlonais, tais como anticorpos policlonais anti- Siglec-5, são geralmente criados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante (por exemplo, uma proteína Siglec-5 purificada ou recombinante da presente divulgação) a uma proteína que é imunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, or R1N=C=NR, em que R e R1 são independentemente grupos alquil inferiores. Os exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (lipídio monofosforil A, dicorinomicolato de trealose sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado por um versado na técnica sem experimentação indevida.
[0239] Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados desejados combinando, por exemplo, 100 μg (para coelhos) ou 5 μg (para camundongos) da proteína ou conjugado com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução intradérmica em vários sítios. Um mês depois, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em vários sítios. De sete a quatorze dias depois, os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao título de anticorpos. Os animais são reforçados até o título atingir um platô. Os conjugados também podem ser feitos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, agentes agregantes, tais como alúmen, são adequados para potencializar a resposta imunológica.
(2) Anticorpos monoclonais
[0240] Anticorpos monoclonais, tais como anticorpos monoclonais anti-Siglec-5, são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-traducionais (por exemplo, isomerizações, amidações) que podem estar presentes em quantidades menores. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.
[0241] Por exemplo, os anticorpos monoclonais anti-Siglec-5 podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feito pelos métodos do DNA recombinante (Patente U.S. Nº 4.816.567).
[0242] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado conforme descrito acima para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína usada para imunização (por exemplo, uma proteína Siglec-5 purificada ou recombinante da presente divulgação). Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic
Press, 1986)).
[0243] O agente de imunização incluirá tipicamente a proteína antigênica (por exemplo, uma proteína Siglec-5 purificada ou recombinante da presente divulgação) ou uma variante de fusão desta. Geralmente, linfócitos de sangue periféricos ("PBLs") são usados se células de origem humana forem desejadas, enquanto células de baço ou linfonodos são usadas se fontes de mamíferos não humanos forem desejadas. Os linfócitos são então fundidos com uma linhagem celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103.
[0244] As linhagens celulares imortalizadas são, normalmente, células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma originadas de roedores, bovinos ou humanos. Normalmente, são empregadas linhagens celulares de mieloma de ratos ou camundongos. As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que preferencialmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras não possuírem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.
[0245] As células de mieloma imortalizadas preferenciais são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável de alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio, tal como o meio HAT. Entre elas, são preferenciais as linhagens de mieloma murino, como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 (disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San
Diego, Califórnia, EUA), bem como células SP-2 e derivados destes (por exemplo, X63-Ag8-653) (disponível na American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA). Foram também descritas linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.
51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
[0246] O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno (por exemplo, uma proteína Siglec-5 da presente divulgação).
Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).
[0247] O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode ser testado quanto à presença de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno desejado (por exemplo, uma proteína Siglec-5 da presente divulgação). De preferência, a afinidade de ligação e a especificidade do anticorpo monoclonal podem ser determinadas por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio ligado a enzima (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. Por exemplo, a afinidade de ligação pode ser determinada pela análise Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0248] Após as células do hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada serem identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e cultivados por métodos padrão (Goding, supra). Os meios de cultura adequados para esse fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores em um mamífero.
[0249] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascites, ou soro por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, cromatografia de proteína A-Sefarose, cromatografia por hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise, cromatografia por afinidade e outros métodos, tais conforme descrito acima.
[0250] Os anticorpos monoclonais anti-Siglec-5 também podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, tais como os divulgados na Patente U.S. Nº 4.816.567, e conforme descrito acima. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que se ligam especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferencial de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados para células hospedeiras, como células de E. coli, células COS símias, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, a fim de sintetizar anticorpos monoclonais em tais células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluem et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Rev. 130:151-188 (1992).
[0251] Em certas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos gerados usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descreveu o isolamento de anticorpos murinos e humanos,
respectivamente, a partir de bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nanomolar ("nM")) por embaralhamento de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, essas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais para isolamento de anticorpos monoclonais de especificidade desejada (por exemplo, aqueles que se ligam a uma proteína Siglec-5 da presente divulgação).
[0252] O DNA que codifica anticorpos ou fragmentos destes também podem ser modificados, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para os domínios constantes de cadeia pesada e leve humana no lugar das sequências homólogas de murino (Patente U.S. Nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou por ligação covalente à sequência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipeptídeo não imunoglobulina.
Tipicamente, tais polipeptídeos não imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antígeno com especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno com especificidade para um antígeno diferente.
[0253] Os anticorpos monoclonais descritos neste documento (por exemplo, anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação ou fragmentos destes) podem ser monovalentes, cuja preparação é bem conhecida na técnica. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve de imunoglobulina e uma cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto da região Fc, de modo a impedir a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes podem ser substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são excluídos de modo a impedir a reticulação. Os métodos in vitro também são adequados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos destes, particularmente fragmentos Fab, pode ser realizada utilizando técnicas de rotina conhecidas na técnica.
[0254] Os anticorpos anti-Siglec-5 quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de bissulfeto ou pela formação de uma ligação de tioéter. Iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato são exemplos de reagentes apropriados para esta finalidade.
(3) Anticorpos humanizados
[0255] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação ou fragmentos de anticorpos destes podem ainda incluir anticorpos humanizados ou humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destes (tais como Fab, Fab’-SH, Fv, scFv, F(ab’)2 ou outras subsequências de ligação a antígeno de anticorpos), as quais contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos a partir de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade. Em alguns casos, resíduos de framework Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem conter resíduos que não se encontram nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou de framework importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um e, tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões FR são as de uma sequência de consenso imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, de maneira ideal, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) e Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
[0256] Os métodos para humanizar anticorpos não humanos anti- Siglec-5 são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados resíduos de "importação", que são tirados normalmente de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988), ou substituindo CDRs de roedor ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Dessa forma, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. Nº 4.816.567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são anticorpos tipicamente humanos nos quais alguns resíduos da CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos nos anticorpos de roedores.
[0257] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método de "melhor ajuste", a sequência de domínio variável de um anticorpo de roedor é testada contra toda a biblioteca das sequências de domínio variável humano conhecidas. A sequência humana mais próxima da do roedor é então aceita como a região framework humana (FR) para o anticorpo humanizado. Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987).
Outro método usa um framework particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo framework pode ser utilizado para vários anticorpos humanizados diferentes. Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993).
[0258] Além disso, também é importante ainda que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade em relação ao antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objetivo, de acordo com um método preferencial, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências precursoras e de vários produtos humanizados e manipulados conceituais utilizando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares aos versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar seu antígeno. Dessa maneira,
os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados das sequências receptoras e de importação, para que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada pelo antígeno ou antígenos alvo (por exemplo, proteínas Siglec-5 da presente divulgação), seja alcançada. Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antígeno.
[0259] São contempladas várias formas do anticorpo anti-Siglec-5 humanizado. Por exemplo, o anticorpo anti-Siglec-5 humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, a fim de gerar um imunoconjugado.
Alternativamente, o anticorpo anti-Siglec-5 humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgG1 intacto.
(4) Anticorpos humanos
[0260] Alternativamente, podem ser gerados anticorpos anti- Siglec-5 humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. A deleção homozigótica do gene da região de junção da cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e da linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após o desafio com antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); Patentes U.S. Nºs. 5.591.669 e WO 97/17852.
[0261] Alternativamente, a tecnologia de exibição de fago pode ser usada para produzir anticorpos humanos anti-Siglec-5 e fragmentos de anticorpos in vitro, a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. McCafferty et al., Nature 348:552- 553 (1990); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991). De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados na estrutura em um gene de proteína de revestimento principal ou secundário de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Uma vez que a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades.
Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser realizada em uma variedade de formatos, revisados em, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993).
Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição de fago.
Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolou uma matriz diversa de anticorpos antioxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para uma variedade de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol.
222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Ver também Patente U.S. Nºs. 5.565.332 e 5.573.905. Além disso, a tecnologia de exibição de levedura pode ser usada para produzir anticorpos humanos anti-Siglec-5 e fragmentos de anticorpos in vitro (por exemplo, WO 2009/036379; WO 2010/105256; WO 2012/009568; US 2009/0181855; US 2010/0056386; e Feldhaus e Siegel (2004) J. Immunological Methods 290:69-80). Em outras modalidades, a tecnologia de exibição de ribossomo pode ser usada para produzir anticorpos humanos anti-Siglec-5 e fragmentos de anticorpos in vitro
(por exemplo, Roberts e Szostak (1997) Proc Natl Acad Sci 94: 12297-12302; Schaffitzel et al. (1999) J. Immunolical Methods 231: 119-135; Lipovsek e Plückthun (2004) J. Immunological Methods 290: 51-67).
[0262] As técnicas de Cole et al. E Boerner et al., também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais anti-Siglec-5 humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 ( 1985) e Boerner et al., J. Immunol. 147 (1): 86-95 (1991). Da mesma forma, os anticorpos anti-Siglec-5 humanos podem ser produzidos pela introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógena foram parcial ou completamente inativados. Após o desafio, a produção de anticorpos humanos é observada, que se assemelha muito àquela observada em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo gênico, montagem e repertório de anticorpos.
Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nºs. 5.545.807;
5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65- 93 (1995).
[0263] Finalmente, os anticorpos humanos anti-Siglec-5 também podem ser gerados in vitro por células B ativadas (ver Patentes U.S. 5.567.610 e 5.229.275).
(5) Fragmentos de anticorpos
[0264] Em certas modalidades, há vantagens em usar fragmentos de anticorpo anti-Siglec-5, em vez de anticorpos anti-Siglec-5 inteiros. Tamanhos de fragmento menores permitem uma depuração rápida e uma melhor penetração no cérebro.
[0265] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos são derivados da digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., J.
Biochem. Biophys. Method. 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science 229:81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes, por exemplo, usando ácidos nucleicos que codificam anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação. Fragmentos de anticorpos Fab, Fv e scFv podem todos ser expressos e secretados a partir de E. coli, permitindo, assim, a produção direta de grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpos anti-Siglec-5 também podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpos discutidas acima.
Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos de F(ab’) 2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab’)2 podem ser isolados diretamente de uma cultura de células hospedeiras recombinantes. A produção de fragmentos de anticorpo Fab e F(ab’)2 com meia-vidas in vivo aumentadas é descrita na Patente U.S. Nº
5.869.046. Em outras modalidades, o anticorpo escolhido é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Ver WO 93/16185; Patente U.S. Nº 5.571.894; e Patente U.S. Nº 5.587.458. O fragmento de anticorpo anti-Siglec-5 também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. 5.641.870.
Tais fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
(6) Anticorpos biespecíficos e poliespecíficos
[0266] Anticorpos biespecíficos (BsAbs) são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, incluindo aqueles na mesma ou em outra proteína (por exemplo, uma ou mais proteínas Siglec-5 da presente divulgação). Alternativamente, uma parte de um
BsAb pode ser armada para se ligar ao antígeno Siglec-5 alvo e outra pode ser combinada com um braço que se liga a uma segunda proteína. Tais anticorpos podem ser derivados de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab’)2 ).
[0267] Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento completo é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes. Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983). Devido ao arranjo aleatório de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura em potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais somente uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é usualmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados no documento WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
[0268] De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos às sequências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão é preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2, e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo o sítio necessário para ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados para um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em modalidades quando razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. É, no entanto, possível inserir as sequências codificadoras para duas ou para todas as três cadeias polipeptídicas em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm significado em particular.
[0269] Em uma modalidade preferida dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (provendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em somente metade das moléculas biespecíficas fornece uma forma fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no documento WO 94/04690. Para mais detalhes da criação de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
[0270] De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011 ou Patente U.S. Nº 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser manipulada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura celular recombinante. A interface preferencial compreende, pelo menos, uma parte da região CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais de aminoácidos grandes por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados, como homodímeros.
[0271] As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab’)2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e evitar a formação de dissulfeto intermolecular.
Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
[0272] Os fragmentos Fab' podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) descreve a produção de moléculas totalmente humanizadas de anticorpo biespecífico F(ab’)2. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente de E. coli e sujeito a acoplamento químico direto in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.
[0273] Foram também descritas várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos bivalentes diretamente de cultura de células recombinantes. Por exemplo, heterodímeros bivalentes foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região da dobradiça para formar monômeros e depois reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. A tecnologia diacorpo descrita por Hollinger et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos/bivalentes. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante peptídico que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear-se com os domínios complementares VL e VH de outro fragmento, formando, desse modo, dois sítios de ligação ao antígeno. Relatou-se também outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo biespecíficos/bivalentes pela utilização de dímeros Fv(sFv) de cadeia simples. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
[0274] Os anticorpos com mais de duas valências também são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados.
Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
[0275] Anticorpos biespecíficos exemplificativos podem se ligar a dois epítopos diferentes em uma determinada molécula (por exemplo, uma proteína Siglec-5 da presente divulgação). Alternativamente, um braço direcionando um componente de sinalização Siglec-5 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeante em um leucócito, tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2, CD3, CD28 ou B7) ou receptores Fc para IgG (FcγR), tais como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) e FcγRIII (CD16), de modo a focar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa a proteína específica. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam uma proteína particular. Esses anticorpos possuem um braço de ligação ao antígeno e um braço que liga um agente citotóxico ou um quelante de radionuclídeo, como EOTUBE, DPTA, DOTA ou TETA. Outro anticorpo biespecífico de interesse se liga à proteína de interesse e ainda se liga ao fator tecidual (TF).
(7) Anticorpos multivalentes
[0276] Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rapidamente do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação ou fragmentos de anticorpo destes podem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes que os da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser produzidos facilmente por expressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação ao antígeno. O domínio de dimerização preferencial compreende uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação ao antígeno amino-terminal em relação à região Fc. O anticorpo multivalente preferido neste documento contém três a cerca de oito, mas de preferência quatro, sítios de ligação ao antígeno. O anticorpo multivalente contém pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas), em que a cadeia polipeptídica compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo e n é 0 ou 1. Similarmente, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender região da cadeia VH-CH1-ligante peptídico flexível-VH-CH1-
Fc; ou região da cadeia VH-CH1-VH-CH1-Fc. O anticorpo multivalente neste documento compreende preferencialmente ainda pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente neste documento pode, por exemplo, compreender aproximadamente de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve contemplados neste documento compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem adicionalmente um domínio CL. Os anticorpos multivalentes podem reconhecer o antígeno Siglec-5, bem como, sem limitação, antígenos adicionais de peptídeo A-beta, antígeno ou antígeno da proteína alfa- sinucleína ou antígeno da proteína Tau ou antígeno da proteína TDP-43 ou antígeno da proteína priônica ou antígeno da proteína huntingtina ou RAN, antígeno dos produtos de tradução, incluindo as repetições de dipeptídeo (peptídeos DPRs), compostas por glicina-alanina (GA), glicina-prolina (GP), glicina-arginina (GR), prolina-alanina (PA) ou prolina-arginina (PR), receptor de insulina, receptor de fator de crescimento semelhante à insulina, receptor de transferrina ou qualquer outro antígeno que facilita a transferência de anticorpos através da barreira hematoencefálica.
(8) Anticorpos heteroconjugados
[0277] Anticorpos heteroconjugados também estão dentro do escopo da presente divulgação. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos unidos covalentemente (por exemplo, anticorpos anti-Siglec- 5 da presente divulgação ou fragmentos de anticorpos destes). Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, e o outro, à biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imunológico para células indesejadas, Patente US Nº 4.676.980, e foram usadas para tratar a infecção pelo HIV. Publicações Internacionais Nºs. WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 0308936. Contempla-se que os anticorpos podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de bissulfeto ou pela formação de uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles divulgados, por exemplo, na Patente U.S. Nº 4.676.980. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são divulgados na Patente U.S. Nº 4.676.980, juntamente com várias técnicas de reticulação.
(9) Manipulação da função efetora
[0278] Também pode ser desejável modificar um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação para modificar a função efetora e/ou aumentar a meia-vida sérica do anticorpo. Por exemplo, o sítio de ligação ao receptor Fc na região constante pode ser modificado ou mutado para remover ou reduzir a afinidade de ligação a certos receptores Fc, como FcRI, FcRII, e/ou FcRIII.
Em algumas modalidades, a função efetora é prejudicada pela remoção da N- glicosilação da região Fc (por exemplo, no domínio CH2 da IgG) do anticorpo.
Em algumas modalidades, a função efetora é prejudicada pela modificação de regiões, tais como 233-236, 297, e/ou 327-331 de IgG humana, conforme descrito em PCT WO 99/58572 e Armour et al., Molecular Immunology 40: 585- 593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000).
[0279] Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, é possível incorporar um epítopo de ligação ao receptor de recuperação no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Patente U.S.
5.739.277, por exemplo. Conforme utilizado neste documento, o termo "epítopo de ligação ao receptor de recuperação" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável por aumentar a meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG.
(10) Outras modificações na sequência de aminoácidos
[0280] Modificações na sequência de aminoácidos de anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, ou fragmentos de anticorpos destes, também são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo são preparadas através da introdução de alterações nucleotídicas apropriadas no ácido nucleico que codifica os anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possua as características desejadas (ou seja, a capacidade de se ligar ou interagir fisicamente com uma proteína Siglec-5 da presente divulgação). As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos pós- traducionais do anticorpo, tais como alteração do número ou posição dos sítios de glicosilação.
[0281] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-Siglec-5 que são locais preferenciais para mutagênese é chamado de "mutagênese de varredura de alanina" conforme descrito por Cunningham e Wells in Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados como arg, asp, his, lys e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferencialmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno alvo.
Esses locais de aminoácidos demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas por meio da introdução de variantes adicionais ou outras em, ou para, os sítios de substituição. Desta forma, embora o sítio para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um determinado sítio, a varredura de alanina ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpos são selecionadas para a atividade desejada.
[0282] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino ("N") e/ou carboxi- ("C") terminais que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos que contém cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequenciais de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.
Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil do terminal N ou o anticorpo fundido com um polipeptídeo citotóxico.
Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
[0283] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas as alterações de FR também são contempladas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela D abaixo, com o título de "substituições preferenciais". Se estas substituições resultam numa alteração na atividade biológica, então alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela D, ou conforme adicionalmente descrito acima em referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos triados.
Tabela D: Substituições de Aminoácidos Resíduo Original Substituições Exemplificativas Substituições Preferenciais Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp, lys; arg gln Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) Ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
[0284] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são alcançadas por meio de substituições seletivas que se diferem de modo significativo em seus efeitos de manutenção de (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação helical ou de lâmina, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) do total da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural estão divididos em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cis, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e (6) aromático: trp, tyr, phe.
[0285] As substituições não conservativas implicam a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0286] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo pode também ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reticulação aberrante. Por outro lado, pode ser adicionada ligação(ões) de cisteína ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
[0287] Um tipo de variante de substituição particularmente preferencial envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo precursor (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec- 5 humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento posterior terão propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo de origem a partir do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes de substituição envolve a maturação por afinidade usando exibição de fagos. Resumidamente, vários sítios de região hipervariáveis (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpos assim geradas são exibidas de uma forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões para o produto do gene III de M13 embalado dentro de cada partícula. As variantes exibidas no fago são então triadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme divulgado neste documento. De modo a identificar os sítios candidatos da região hipervariável para modificação, a mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno (por exemplo, uma proteína Siglec-5 da presente divulgação). Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas neste documento. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a triagem conforme descrito neste documento e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento posterior.
[0288] Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração designa-se a exclusão de uma ou mais frações do carboidrato encontrado no anticorpo e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.
[0289] A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a um N ou ligada a um O. Ligada a N se refere à ligação da fração carboidrato a uma cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da fração carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação de ligação a O se refere à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
[0290] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é realizada convenientemente ao se alterar a sequência de aminoácidos de tal forma que contenha uma ou mais das sequências de tripeptídeo descritas acima (para sítios de glicosilação de ligação a N). A alteração também pode ser pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligada a O).
[0291] As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-IgE são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida ao sítio), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante dos anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação) ou fragmentos de anticorpos.
(11) Conjugados de anticorpos
[0292] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, ou fragmentos de anticorpo destes, podem ser conjugados com um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico. Pode ser utilizado qualquer método adequado conhecido na técnica para conjugar moléculas, tal como um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico para anticorpos.
[0293] Por exemplo, a conjugação de droga envolve o acoplamento de uma carga ou droga citotóxica (anticâncer) ativa e biológica a um anticorpo que se direciona especificamente a um determinado marcador tumoral (por exemplo, uma proteína que, idealmente, é encontrada apenas nas ou sobre as células tumorais). Os anticorpos rastreiam essas proteínas no corpo e se ligam à superfície das células cancerígenas. A reação bioquímica entre o anticorpo e a proteína alvo (antígeno) dispara um sinal na célula tumoral, que absorve ou internaliza o anticorpo juntamente com a citotoxina. Depois que o ADC é internalizado, a droga citotóxica é liberada e elimina o câncer. Devido a esse direcionamento, o ideal é que a droga tenha efeitos colaterais menores e proporcione uma janela terapêutica mais ampla do que outros agentes quimioterapêuticos. As técnicas para conjugar anticorpos são divulgadas e conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Jane de Lartigue, OncLive 5 de julho de 2012; ADC Review on antibody-drug conjugates; e Ducry et al., (2010).
Bioconjugate Chemistry 21 (1): 5–13).
[0294] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode ser conjugado com uma toxina selecionada dentre ricina, cadeia A da ricina, doxorrubicina, daunorrubicina, um maitansinoide, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, di-hidroxi-antracina diona, actinomicina, toxina da difteria, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inibidor de Saponaria officinalis, glicocorticoide, auristatina, auromicina, ítrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolastatina, cc1065 e uma cisplatina.
(12) Outras modificações de anticorpos
[0295] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, ou fragmentos de anticorpos destes, podem ser modificados ainda mais para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Preferencialmente, as frações adequadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não-limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados ao polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas destes. O propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero for ligado, eles poderão ser moléculas iguais ou diferentes.
Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando às propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser melhorado, se o derivado do anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc. Tais técnicas e outras formulações adequadas são divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).
Ensaios de ligação e outros ensaios
[0296] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser testados para atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos como ELISA, ressonância plasmônica de superfície (SPR), Western blot, etc.
[0297] Em algumas modalidades, os ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 2, 3, 6 e 7, ou selecionado de S5-172, S5- 174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5- G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5- 174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G- 03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9. Em certas modalidades, tal anticorpo competidor se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado por qualquer um dos anticorpos listados nas Tabelas 2, 3, 6 e 7, ou selecionado de S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9. Os métodos exemplificativos detalhados para o mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0298] Em um ensaio de competição exemplificativo, Siglec-5 imobilizada ou células que expressam Siglec-5 na superfície celular são incubadas em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga à Siglec-5 (por exemplo, primata humano ou não humano) e um segundo anticorpo não marcado que está sendo testado pela sua capacidade de competir com o primeiro anticorpo pela ligação à Siglec-5. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante do hibridoma. Como um controle, Siglec-5 imobilizado ou células que expressam Siglec-5 são incubadas em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação em condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo a Siglec-5, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associada a Siglec-5 imobilizado ou células que expressam Siglec-5 é medida. Se a quantidade de marcador associada a Siglec- 5 imobilizado ou células que expressam Siglec-5 for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo pela ligação a Siglec-5. Ver, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual capt.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Ácidos Nucleicos, vetores e células hospedeiras
[0299] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser produzidos por meio da utilização de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. Nº 4.816.567. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos isolados com uma sequência nucleotídica que codifica qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são fornecidos. Tais ácidos nucleicos podem codificar uma sequência de aminoácidos contendo a VL e/ou uma sequência de aminoácidos contendo a VH do anticorpo anti-Siglec-5 (por exemplo, as cadeias leve e/ou pesada do anticorpo). Em algumas modalidades, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) contendo esses ácidos nucleicos são fornecidos. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira contendo esse ácido nucleico também é fornecida. Em algumas modalidades, a célula hospedeira contém (por exemplo, foi transduzida com): (1) um vetor contendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos contendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos contendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor contendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos contendo o VL do anticorpo e um segundo vetor contendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos contendo o VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster chinês (CHO) ou células linfoides (por exemplo, células Y0, NS0, Sp20).
[0300] Métodos de produção de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação são fornecidos. Em algumas modalidades, o método inclui cultivar uma célula hospedeira da presente divulgação contendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-Siglec-5, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é subsequentemente recuperado da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).
[0301] Para produção recombinante de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-Siglec-5 é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado por meio da utilização de procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[0302] Os vetores adequados contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação ou fragmentos destes, polipeptídeos (incluindo anticorpos) descritos neste documento incluem, sem limitação, vetores de clonagem e vetores de expressão. Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados dentre um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira que se pretende usar, os vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição particular e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Os exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript
(por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores de transferência, tais como PSA3 e pAT28.
Estes e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais tais como BioRad, Stratagene e Invitrogen.
[0303] Os vetores de expressão geralmente são construções polinucleotídicas replicáveis que contêm um ácido nucleico da presente divulgação. O vetor de expressão pode ser replicável nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados aos plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, adenovírus associados, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT Nº WO 87/04462. Os componentes do vetor podem geralmente incluir, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricional adequado (tais como promotores, potencializadores e terminador). Para a expressão (ou seja, tradução), um ou mais elementos controladores de translação também são geralmente necessários, tais como sítios de ligação ao ribossomo, sítios de iniciação da tradução, e códons de parada.
[0304] Os vetores que contêm os ácidos nucleicos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer de um número de meios adequados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso tal como o vírus vaccinia). A opção de introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira. Em algumas modalidades, o vetor contém um ácido nucleico contendo uma ou mais sequências de aminoácidos que codificam um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0305] As células hospedeiras adequadas para a clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem as células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias (por exemplo, as Patentes U.S. Nºs.
5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523; e Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.
248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli.). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da massa celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser posteriormente purificado.
[0306] Além de procariotas, microrganismos eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, também são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram "humanizadas", resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano (por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)).
[0307] As células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo glicosilado também podem ser derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas inúmeras cepas de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros (por exemplo, as Patentes U.S. Nºs. 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e
6.417.429, descrevendo a tecnologia PLANTIBODIES™ para a produção de anticorpos em plantas transgênicas.).
[0308] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamífero que estão adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); Células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44- 68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0.
Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed, Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
Atividades de Siglec-5 Ativação PI3K
[0309] Em algumas modalidades, os agentes Siglec-5 da presente divulgação, como os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, podem induzir a ativação de PI3K após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0310] PI3Ks são uma família de quinases de transdutor de sinal intracelular relacionadas, capazes de fosforilar o grupo hidroxila na posição 3 do anel inositol de fosfatidilinositol (PtdIns). A família PI3K é dividida em três classes diferentes (Classe I, Classe II e Classe III) com base na estrutura primária, regulação e especificidade do substrato lipídico in vitro.
[0311] A PI3K ativada produz vários fosfoinositídeos 3-fosforilados, incluindo, sem limitação, PtdIns3P, PtdIns(3,4)P2, PtdIns(3,5)P2 e PtdIns(3,4,5)P3. Esses fosfoinositídeos 3-fosforilados funcionam em um mecanismo pelo qual proteínas de sinalização são recrutadas para várias membranas celulares. Estas proteínas de sinalização contêm domínios de ligação de fosfoinositídeo, incluindo, sem limitação, domínios PX, domínios de homologia de plecstrina (domínios PH) e domínios FYVE. Qualquer método conhecido na técnica para determinar a ativação de PI3K pode ser usado.
[0312] Em algumas modalidades, os agentes Siglec-5 da presente divulgação, como os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis diminuídos de atividade de PI3K, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença taupatia, infecções e câncer.
Expressão modulada de citocinas
[0313] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) mediadores pró-inflamatórios no cérebro após a ligação a uma proteína Siglec- 5 expressa na superfície de uma célula. Em certas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação modulam a expressão de citocinas (por exemplo, mediadores pró-inflamatórios) e/ou reduzem a expressão de mediadores anti-inflamatórios após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0314] A inflamação é parte de uma resposta biológica complexa dos tecidos vasculares a estímulos prejudiciais, como patógenos, células danificadas e irritantes. Os sinais clássicos de inflamação aguda são dor, calor, vermelhidão e inchaço. A inflamação é uma resposta imunológica que protege um organismo, limitando o sítio da lesão ou eliminando uma infecção, recrutando e ativando células do sistema imunológico. A resposta inflamatória é rigidamente regulada e restrita em sua duração e gravidade para evitar causar danos ao organismo. A inflamação pode ser classificada como aguda ou crônica. A inflamação aguda é impulsionada pela resposta imunológica inata, que inicialmente reconhece estímulos prejudiciais e recruta leucócitos do sangue para os tecidos lesados. Uma cascata de eventos bioquímicos, incluindo liberação de citocinas e quimiocinas, propaga a resposta inflamatória, envolvendo o sistema vascular local, o sistema imunológico e várias células dentro do tecido lesado. A inflamação crônica é prolongada e persistente, o que leva a uma mudança progressiva no tipo de células imunológicas que participam da resposta inflamatória. A inflamação crônica é caracterizada por destruição progressiva e fibrose do tecido como resultado do processo inflamatório.
[0315] Conforme usado neste documento, mediadores anti- inflamatórios são proteínas envolvidas direta ou indiretamente (por exemplo, por meio de uma via de sinalização anti-inflamatória) em um mecanismo que reduz, inibe ou inativa uma resposta inflamatória. Qualquer método conhecido na técnica para identificar e caracterizar mediadores anti-inflamatórios pode ser usado. Exemplos de mediadores anti-inflamatórios incluem, sem limitação, citocinas, tais como IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IL-16, IFN-alfa, TGF-beta, IL-1Ra, G-CSF e receptores solúveis para TNF-alfa ou IL-6. Exemplos de mediadores pró-inflamatórios incluem, sem limitação, citocinas, tais como IFN-α4, IFN-β, IL- 1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, CRP, IL-33, MCP-1 e
MIP-1-beta.
[0316] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) a expressão de citocinas, como IL-1b, IL-8 e TNF-a. Em certas modalidades, a expressão modulada das citocinas ocorre em macrófagos, neutrófilos, células assassinas naturais (NK), células dendríticas, monócitos, osteoclastos, células de Langerhans da pele, células de Kupffer, células T e/ou células micrógliais. A expressão modulada pode incluir, sem limitação, um aumento na expressão do gene, um aumento na expressão transcricional ou um aumento na expressão da proteína. Qualquer método conhecido na técnica para determinar gene, transcrição (por exemplo, mRNA) e/ou expressão de proteínas pode ser usado.
Por exemplo, a análise de Northern blot pode ser usada para determinar os níveis de expressão do gene de citocina, RT-PCR pode ser usado para determinar o nível de transcrição de citocina e a análise de Western blot pode ser usada para determinar os níveis de proteína de citocina.
[0317] Tal conforme usado neste documento, uma citocina pode ter expressão modulada se a sua expressão em uma ou mais células de um sujeito tratado com anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação for modulada em comparação com a expressão da mesma citocina expressa em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti- Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode modular a expressão de citocina em uma ou mais células de um sujeito por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, em pelo menos
135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais, por exemplo, em comparação com a expressão de citocina em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em outras modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 pode modular a expressão de citocina em uma ou mais células de um sujeito por pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes ou pelo menos 10 vezes mais, por exemplo, em comparação com a expressão de citocina em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0318] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são úteis para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis anormais de um ou mais mediadores pró- inflamatórios, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Expressão modulada de mediadores pró-inflamatórios
[0319] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular (por exemplo, aumentar ou diminuir) a expressão de mediadores pró-inflamatórios após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0320] Conforme usado neste documento, mediadores pró- inflamatórios são proteínas envolvidas direta ou indiretamente (por exemplo, por meio de vias de sinalização pró-inflamatórias) em um mecanismo que induz, ativa, promove ou de outra forma aumenta uma resposta inflamatória. Qualquer método conhecido na técnica para identificar e caracterizar mediadores pró- inflamatórios pode ser usado.
[0321] Exemplos de mediadores pró-inflamatórios incluem, sem limitação, citocinas, tais como interferons tipo I e II, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, membros da família IL-20, IL-33, LIF, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18 e CRP.
[0322] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular a expressão funcional e/ou a secreção de mediadores pró-inflamatórios, como interferons tipo I e II, IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM- CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, CRP, IL-33, MCP-1 e MIP- 1-beta. Em certas modalidades, a expressão modulada dos mediadores pró- inflamatórios ocorre em macrófagos, neutrófilos, células NK, células dendríticas, monócitos, osteoclastos, células de Langerhans da pele, células de Kupffer, células T e/ou células micrógliais. A expressão modulada pode incluir, sem limitação, expressão gênica modulada, expressão transcricional modulada ou expressão proteica modulada. Qualquer método conhecido na técnica para determinar gene, transcrição (por exemplo, mRNA) e/ou expressão de proteínas pode ser usado. Por exemplo, a análise de Northern blot pode ser usada para determinar os níveis de expressão do gene do mediador pro-inflamatório, a RT- PCR pode ser usada para determinar o nível de transcrição do mediador pro- inflamatório e a análise de Western blot pode ser usada para determinar os níveis de proteína do mediador pro-inflamatório.
[0323] Em certas modalidades, mediadores pró-inflamatórios incluem citocinas inflamatórias. Por conseguinte, em certas modalidades, anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular a secreção de uma ou mais citocinas inflamatórias. Exemplos de citocinas inflamatórias cuja secreção pode ser modulada por anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação incluem, sem limitação, tais como interferons tipo I e II, IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM- CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, CRP, IL-33, MCP-1 e MIP- 1-beta.
[0324] Em certas modalidades, os mediadores pró-inflamatórios incluem receptores inflamatórios, proteínas da cascata do complemento e/ou receptores que são expressos em células imunológicos. Por conseguinte, em certas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular a expressão de um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata do complemento e/ou receptores que são expressos em células imunológicos. Exemplos de receptores inflamatórios, proteínas da cascata do complemento e/ou receptores que são expressos em células imunológicas cuja expressão pode ser modulada por anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação incluem, sem limitação, CD86, CD80, CD83, C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3, ITGB2, HMOX1, LAT2, CASP1, CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1, TyroBP, ALOX5AP, ITGAM, SLC7A7, CD4, ITGAX e PYCARD.
[0325] Tal conforme usado neste documento, um mediador pró- inflamatório pode ter expressão modulada se a sua expressão em uma ou mais células de um sujeito tratado com um agente Siglec-5, tal como um anticorpo agonista anti-Siglec-5 da presente divulgação for modulada (por exemplo, aumentada ou diminuída) em comparação com a expressão do mesmo mediador pró-inflamatório expresso em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo agonista anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode modular a expressão do mediador pró-inflamatório em uma ou mais células de um sujeito por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, em pelo menos 135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais, por exemplo, em comparação com expressão de mediador pró-inflamatório em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em outras modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 pode modular a expressão do mediador pró-inflamatório em uma ou mais células de um sujeito por pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes ou pelo menos 10 vezes mais, por exemplo, em comparação com a expressão do mediador pró-inflamatório em uma ou mais células de um correspondente sujeito que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0326] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190%, pelo menos 200%, pelo menos 210%, pelo menos 220%, pelo menos 230%, pelo menos 240%, pelo menos 250%, pelo menos 260%, pelo menos 270%, pelo menos 280%, pelo menos 290%, pelo menos 300% ou pelo menos 310%, por exemplo, em comparação com a expressão de CD86 em células mieloides não tratado com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0327] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide em pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,2 vezes, pelo menos 3,4 vezes, pelo menos 3,6 vezes, pelo menos 3,8 vezes, pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 4,2 vezes, por exemplo, em comparação com a expressão de CD86 em células mieloides não tratadas com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0328] Em algumas modalidades, a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada cerca de 48 horas após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0329] Em algumas modalidades, a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada usando quaisquer métodos conhecidos na técnica para medir os níveis de expressão de proteínas.
Exemplos de métodos para medir os níveis de expressão de proteínas incluem, sem limitação, citometria de fluxo ou classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), Western blots e métodos de microscopia (por exemplo, microscopia de fluorescência). Em certas modalidades, a expressão de CD86 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada por FACS.
[0330] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190%, pelo menos 200%, pelo menos 210%, pelo menos 220%, pelo menos 230%, pelo menos 240%, pelo menos 250%, pelo menos 260%, pelo menos 270%, pelo menos 280%, pelo menos 290%, pelo menos 300%, pelo menos 310% ou mais, por exemplo, em comparação com a expressão de CCL4 em células mieloides não tratado com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0331] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação aumenta a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide em pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,2 vezes, pelo menos 3,4 vezes, pelo menos 3,6 vezes, pelo menos 3,8 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,2 vezes ou mais, por exemplo, em comparação com a expressão de CCL4 em células mieloides não tratadas com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0332] Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada cerca de 48 horas após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0333] Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada medindo a expressão de CCL4 no meio de crescimento celular em cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada medindo a expressão de CCL4 no meio de crescimento celular cerca de 48 horas após o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0334] Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada usando quaisquer métodos conhecidos na técnica para medir os níveis de expressão de proteínas.
Exemplos de métodos para medir os níveis de expressão de proteínas incluem,
sem limitação, citometria de fluxo ou classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), ELISA, Western blots, kits comerciais como o kit Quantikine ELISA (R&D Systems) ou Human Chemokine Legendplex (Biolegend)e métodos de microscopia (por exemplo, microscopia de fluorescência). Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada usando um kit Quantikine ELISA (R&D Systems) ou por Human Chemokine Legendplex (Biolegend). Em certas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada usando ELISA, tal como usando o kit Quantikine ELISA (R&D Systems). Em algumas modalidades, a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas de mieloide é determinada por citometria de fluxo, tal como usando Human Chemokine Legendplex (Biolegend).
[0335] Em algumas modalidades, alguns anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser úteis para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis anormais de um ou mais mediadores pró-inflamatórios, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Fosforilação ERK
[0336] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir a fosforilação de quinase regulada por sinal extracelular (ERK) após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0337] Quinases reguladas por sinal extracelular (ERKs) são quinases de sinalização intracelular de proteína quinase amplamente expressas que estão envolvidas, por exemplo, na regulação da meiose, mitose e funções pós-mitóticas em células diferenciadas. Vários estímulos, como fatores de crescimento, citocinas, infecção por vírus, ligantes para receptores acoplados à proteína G heterotrimérica, agentes de transformação e carcinógenos, ativam as vias ERK. A fosforilação de ERKs leva à ativação de sua atividade quinase.
[0338] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis diminuídos de fosforilação de ERK, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Fosforilação de Syk
[0339] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir a fosforilação de tirosina quinase do baço (Syk) após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0340] A tirosina quinase do baço (Syk) é uma molécula de sinalização intracelular que funciona a jusante de Siglec-5 fosforilando vários substratos, facilitando assim a formação de um complexo de sinalização que leva à ativação celular e processos inflamatórios.
[0341] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis diminuídos de fosforilação de Syk, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Fosforilação Siglec-5
[0342] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir transitoriamente a fosforilação Siglec-5 de Tyr-520 e Tyr-544 por uma tirosina quinase da família Src, como Src, Syk, Fyn, Fgr, Lck, Hck, Blk, Lyn e Frk após ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0343] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis diminuídos de fosforilação de Siglec-5, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Fosforilação de receptores contendo motivo ITAM
[0344] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir fosforilação de receptores contendo o motivo ITAM, como TREM1, TREM2, SIRPB1, FcgR, DAP10 e DAP12, após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0345] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis diminuídos de fosforilação de receptores contendo motivo ITAM, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Expressão modulada do receptor 7 de quimiocina C-C
[0346] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem modular a expressão do receptor de quimiocina C- C 7 (CCR7) após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula. A expressão modulada (por exemplo, aumentada ou diminuída) pode incluir, sem limitação, modulação na expressão gênica, modulação na expressão transcricional ou modulação na expressão da proteína. Qualquer método conhecido na técnica para determinar gene, transcrição (por exemplo, mRNA) e/ou expressão de proteínas pode ser usado. Por exemplo, a análise de Northern blot pode ser usada para determinar os níveis de expressão do gene do mediador anti-inflamatório, a RT-PCR pode ser usada para determinar o nível de transcrição do mediador anti-inflamatório e a análise de Western blot pode ser usada para determinar os níveis de proteína do mediador anti-inflamatório.
[0347] O receptor 7 de quimiocina C-C (CCR7) é um membro da família de receptores acoplados à proteína G. O CCR7 é expresso em vários tecidos linfoides e pode ativar células B e células T. Em algumas modalidades, o CCR7 pode modular a migração de células T de memória para órgãos linfoides secundários, como nódulos linfáticos. Em outras modalidades, o CCR7 pode estimular a maturação das células dendríticas. CCR7 é uma proteína receptora que pode ligar os ligantes de quimiocina (motivo C-C) CCL19/ELC e CCL21.
[0348] Tal conforme usado neste documento, CCR7 pode ter expressão modulada se a sua expressão em uma ou mais células de um sujeito tratado com um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação for modulada (por exemplo, aumentada ou diminuída) em comparação com a expressão de CCR7 expresso em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode modular a expressão de CCR7 em uma ou mais células de um sujeito por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, em pelo menos 135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais, por exemplo, em comparação com expressão de CCR7 em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em outras modalidades, o anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação modula a expressão de CCR7 em uma ou mais células de um sujeito por pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes ou pelo menos 10 vezes mais, por exemplo, em comparação com a expressão de CCR7 em uma ou mais células de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0349] Em algumas modalidades, o aumento da expressão de CCR7 ocorre em macrófagos, neutrófilos, células NK, células dendríticas e/ou células micrógliais. O aumento da expressão de CCR7 pode induzir a quimiotaxia das células micrógliais em direção às células que expressam as quimiocinas CCL19 e CCL21. Por conseguinte, em certas modalidades, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação podem induzir a quimiotaxia das células micrógliais em relação às células que expressam CCL19 e CCL21.
[0350] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são úteis para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis anormais de CCR7, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
O aprimoramento ou normalização da capacidade das células dendríticas derivadas da medula óssea de induzir a proliferação de células T específicas ao antígeno
[0351] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem potencializar e/ou normalizar a capacidade das células dendríticas derivadas da medula óssea de induzir a proliferação de células T específicas do antígeno após a ligação com uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0352] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação podem potencializar e/ou normalizar a capacidade das células dendríticas derivadas da medula óssea de induzir a proliferação de células T específicas do antígeno em uma ou mais células dendríticas derivadas da medula óssea de um sujeito por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, pelo menos 135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200%, por exemplo, em comparação com a capacidade das células dendríticas derivadas da medula óssea de induzir a proliferação de células T específicas do antígeno em uma ou mais células dendríticas derivadas da medula óssea de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo. Em outras modalidades, um anticorpo antagonista anti- Siglec-5 pode potencializar e/ou normalizar a capacidade das células dendríticas derivadas da medula óssea de induzir a proliferação de células T específicas do antígeno em uma ou mais células dendríticas derivadas da medula óssea de um sujeito por pelo menos pelo menos pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, em pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes ou pelo menos 10 vezes, por exemplo, em comparação com a capacidade das células dendríticas derivadas da medula óssea de induzir a proliferação de células T específicas ao antígeno em uma ou mais células dendríticas derivadas da medula óssea de um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0353] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas à capacidade diminuída ou desregulada de células dendríticas derivadas da medula óssea para induzir T específico do antígeno proliferação celular, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Produção de osteoclastos
[0354] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir a produção de osteoclastos e/ou aumentar a taxa de osteoclastogênese após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0355] Conforme usado neste documento, um osteoclasto é um tipo de célula óssea que pode remover tecido ósseo removendo sua matriz mineralizada e quebrando o osso orgânico (por exemplo, reabsorção óssea). Os osteoclastos podem ser formados pela fusão de células da linhagem mieloide. Em algumas modalidades, os osteoclastos podem ser caracterizados por alta expressão de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e catepsina K.
[0356] Tal conforme usado neste documento, a taxa de osteoclastogênese pode ser aumentada se a taxa de osteoclastogênese em um sujeito tratado com um anticorpo antagonista anti-Siglec-5 for maior do que a taxa de osteoclastogênese em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode aumentar a taxa de osteoclastogênese em um sujeito por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos
70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, em pelo menos 135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais,
por exemplo, em comparação com a taxa de osteoclastogênese em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em outras modalidades, um anticorpo antagonista anti-Siglec-5 da presente divulgação pode aumentar a taxa de osteoclastogênese em um sujeito por pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,3 vezes,
pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos
3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes,
pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos
7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes ou pelo menos 10 vezes mais, por exemplo, em comparação com a taxa de osteoclastogênese em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0357] Tal conforme usado neste documento, a taxa de osteoclastogênese pode ser diminuída se a taxa de osteoclastogênese em um sujeito tratado com um anticorpo antagonista anti-Siglec-5 da presente divulgação for menor do que a taxa de osteoclastogênese em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo agonista anti-Siglec-5 da presente divulgação pode diminuir a taxa de osteoclastogênese em um sujeito por pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, em pelo menos 135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200%, por exemplo, em comparação com a taxa de osteoclastogênese em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em outras modalidades, um anticorpo agonista anti-Siglec-5 da presente divulgação pode diminuir a taxa de osteoclastogênese em um sujeito por pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes ou pelo menos 10 vezes mais, por exemplo, em comparação com a taxa de osteoclastogênese em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0358] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas à formação e manutenção anormal do osso, incluindo osteoporose, que está associada à diminuição patológica na densidade óssea e doenças osteoporóticas que estão associadas ao aumento patológico da densidade óssea.
Proliferação e sobrevivência de células que expressam Siglec-5
[0359] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem aumentar a proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, monócitos, neutrófilos, osteoclastos, células Langerhans da pele, células Kupffer, células T e células micrógliais após ligação com a proteína Siglec-5 expressa em uma célula.
[0360] Conforme usado neste documento, os macrófagos da presente divulgação incluem, sem limitação, macrófagos M1, macrófagos M1 ativados e macrófagos M2 (por exemplo, macrófagos M2a). Tal conforme usado neste documento, os neutrófilos da presente divulgação incluem, sem limitação, neutrófilos M1, neutrófilos M1 ativados e neutrófilos M2. Tal conforme usado neste documento, as células assassinas naturais (NK) da presente divulgação incluem, sem limitação, células M1 NK, células M1 NK ativadas e células M2 NK.
Tal conforme usado neste documento, as células micrógliais da presente divulgação incluem, sem limitação, células micrógliais M1, células micrógliais M1 ativadas e células micrógliais M2.
[0361] As células micrógliais são um tipo de célula glial que são os macrófagos residentes do cérebro e da medula espinhal e, portanto, atuam como a primeira e principal forma de defesa imunológica ativa no sistema nervoso central (SNC). As células micrógliais constituem 20% da população total de células gliais no cérebro. As células micrógliais estão constantemente vasculhando o SNC em busca de placas, neurônios danificados e agentes infecciosos. O cérebro e a medula espinhal são considerados órgãos com "privilégios imunológicos", pois são separados do resto do corpo por uma série de células endoteliais conhecidas como barreira hematoencefálica, que impede a maioria das infecções de atingir o tecido nervoso vulnerável. No caso em que agentes infecciosos são introduzidos diretamente no cérebro ou atravessam a barreira hematoencefálica, as células micrógliais devem reagir rapidamente para diminuir a inflamação e destruir os agentes infecciosos antes que danifiquem o tecido neural sensível. Devido à indisponibilidade de anticorpos do resto do corpo (poucos anticorpos são pequenos o suficiente para atravessar a barreira hematoencefálica), a micróglia deve ser capaz de reconhecer corpos estranhos, engoli-los e atuar como células apresentadoras de antígenos, ativando as células T. Como esse processo deve ser realizado rapidamente para evitar danos potencialmente fatais, as células micrógliais são extremamente sensíveis a pequenas alterações patológicas no SNC. Elas alcançam essa sensibilidade em parte por possuir canais únicos de potássio que respondem a pequenas mudanças no potássio extracelular.
[0362] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem aumentar a expressão de CD80, CD83 e/ou CD86 em células dendríticas, monócitos, macrófagos, neutrófilos, células NK e/ou micróglia.
[0363] Conforme usado neste documento, a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, células dendríticas, monócitos, células T e/ou micróglia pode incluir expressão aumentada se a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, monócitos,
osteoclastos, células de Langerhans da pele, células Kupffer e/ou micróglia em um sujeito tratado com um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação é maior que a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, monócitos,
osteoclastos, células de Langerhans da pele, células Kupffer, células T,
neutrófilos e/ou micróglia em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode aumentar a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células B, células
NK, monócitos, osteoclastos, células Langerhans da pele, células Kupffer,
células T e/ou micróglia em um sujeito em pelo menos 10%, pelo menos 15%,
pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos
60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%,
pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 115%, pelo menos 120%, pelo menos 125%, pelo menos 130%, pelo menos 135%, pelo menos 140%, pelo menos 145%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200%, por exemplo, em comparação com a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos,
neutrófilos, células B, células NK, monócitos, osteoclastos, células de
Langerhans da pele, células Kupffer, células T e/ou micróglia em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5. Em outras modalidades, um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode aumentar a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, monócitos, osteoclastos, células
Langerhans da pele, células Kupffer, células T e/ou micróglia em um sujeito pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2,0 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,15 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,25 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,35 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,45 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,55 vezes, pelo menos 3,0 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4,0 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5,0 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6,0 vezes, pelo menos 6,5 vezes, pelo menos 7,0 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8,0 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9,0 vezes, pelo menos 9,5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, por exemplo, em comparação com a taxa de proliferação, sobrevivência e/ou função de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, monócitos, osteoclastos, células de Langerhans da pele, células Kupffer, células T e/ou micróglia em um sujeito correspondente que não é tratado com o anticorpo anti-Siglec-5.
[0364] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, diminuir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a uma redução na proliferação, sobrevivência, aumento da apoptose e/ou função das células dendríticas, neutrófilos, macrófagos, neutrófilos, células B, células NK, monócitos, osteoclastos, células de Langerhans da pele, células Kupffer, células T e/ou micróglia incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doenças tipo taupatias, infecções e câncer.
Depuração e fagocitose
[0365] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir depuração e/ou fagocitose após a ligação a uma proteína Siglec-5 expressa em uma célula de um ou mais neurônios apoptóticos, resíduos de tecido nervoso do sistema nervoso, resíduos de tecido não nervoso do sistema nervoso, sinapses disfuncionais, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, peptídeos causadores de doenças, ácido nucleico causador de doenças ou células tumorais. Em certas modalidades, as proteínas causadoras de doença incluem, sem limitação, beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas beta amiloide, proteína precursora amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína priônica, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteína AI, amiloide sérico A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve da imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos da tradução não-ATG associados à repetição (RAN), peptídeos por repetição de dipeptídeos (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição prolina-arginina (PR).
Em certas modalidades, os ácidos nucleicos causadores de doenças incluem, sem limitação, antisense GGCCCC (G2C4) (SEQ ID NO: 225) RNA de expansão de repetição.
[0366] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir um ou mais tipos de depuração, incluindo, sem limitação, depuração de neurônios apoptóticos, depuração de fragmentos de tecido nervoso, depuração de sinapse disfuncional, depuração de restos de tecido não nervoso, bactérias ou eliminação de outro corpo estranho, depuração de proteína causadora de doença, depuração de peptídeo causador de doença, depuração de ácido nucleico causador de doença e depuração de células tumorais.
[0367] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem induzir a fagocitose de um ou mais neurônios apoptóticos, resíduos de tecido nervoso, sinapses disfuncionais, resíduos de tecido não nervoso, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, peptídeos causadores de doença, ácido nucleico causador de doenças e/ou células tumorais.
[0368] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem aumentar a fagocitose por neutrófilos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, monócitos e/ou micróglia sob condições de níveis reduzidos de fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF).
[0369] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, diminuir o risco de, ou tratar condições e/ou doenças associadas a neurônios apoptóticos, resíduos de tecido nervoso do sistema nervoso, resíduos de tecido não nervoso de o sistema nervoso, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença tipo taupatia, doença de Nasu-Hakola, acidente vascular cerebral, trauma agudo, trauma crônico, lúpus, colite aguda e crônica, artrite reumatoide, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, obesidade, malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, Doença de Behçet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degeneração ganglionar basal cortical, encefalomielite disseminada aguda, distúrbios granulomartosos, sarcoidose, doenças do envelhecimento, convulsões, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma,
retinite pigmentosa, degeneração retinal, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e câncer, incluindo câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer renal, câncer de células renais, câncer de pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML), mieloma múltiplo, policitemia vera, trombocitose essencial, mielofibrose primária ou idiopática, mieloesclerose primária ou idiopática, tumores derivados de mieloides, tumores que expressam Siglec-5, câncer de tireoide, infecções, herpes do SNC, infecções parasitárias, infecção por tripanossoma, infecção por Cruzi, infecção por Pseudomonas aeruginosa, infecção por Leishmania donovani, infecção por Streptococcus do grupo B, infecção por Campylobacter jejuni, infecção por Neisseria meningiditis, HIV tipo I e Haemophilus influenza. Em algumas modalidades, os agentes Siglec-5 da presente divulgação, como os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, são benéficos para prevenir, reduzir o risco ou tratar condições e/ou doenças associadas a neurônios apoptóticos, resíduos de tecido nervoso do sistema nervoso, resíduos de tecido não nervoso do sistema nervoso, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções, e câncer.
Expressão gênica dependente de Siglec-5
[0370] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação podem diminuir a atividade e/ou expressão de genes dependentes de Siglec-5 e, por isso, aumentar a expressão gênica associada à cascata de sinalização que ativa o sistema imunológico, como a expressão gênica associada a receptores contendo ITAM, receptores de reconhecimento de padrão, de receptores tipo Toll, de receptores de padrão molecular associado a dano (DAMP), tais como um ou mais fatores de transcrição da família de fatores de transcrição do fator nuclear de células T ativadas (NFAT).
[0371] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para prevenir, reduzir o risco de ou tratar condições e/ou doenças associadas a níveis altos de genes dependentes de Siglec-5, incluindo, sem limitação, demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer.
Ativação de células T dependente de Siglec-5
[0372] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação podem aumentar a atividade das células T citotóxicas, células T helper ou ambas. Em algumas modalidades, os agentes Siglec-5 da presente divulgação, como antagonistas de anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, são benéficos para a prevenção, redução do risco ou tratamento de condições e/ou doenças associadas à diminuição da atividade das células T citotóxicas, células T helper ou ambas, incluindo, sem limitação, tumores, incluindo tumores sólidos, como câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer de rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer de tireoide.
Inibição de neutrófilos dependente de Siglec-5
[0373] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação podem diminuir a atividade dos neutrófilos. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para a prevenção, redução do risco ou tratamento de condições e/ou doenças associadas à diminuição da atividade de células assassinas naturais, neutrófilos ou ambos, incluindo, sem limitação, tumores, incluindo tumores sólidos, como câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer de rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer de tireoide.
Morte celular aprimorada dependente de Siglec-5 por células assassinas naturais (NK)
[0374] Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação podem aumentar a atividade de morte de células NK. Em algumas modalidades, os anticorpos antagonistas anti-Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para a prevenção, redução do risco ou tratamento de condições e/ou doenças associadas à diminuição da atividade de células assassinas naturais, neutrófilos ou ambos, incluindo, sem limitação, tumores, incluindo tumores sólidos, como câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer de rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer de tireoide.
Inibição de células imunológicas associadas a tumores dependente de Siglec-5
[0375] Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação podem diminuir a atividade, diminuir a proliferação, diminuir a sobrevivência, diminuir a funcionalidade, diminuir a infiltração em tumores ou órgãos linfoides (por exemplo, baço e nódulos linfáticos), e/ou promovem a apoptose de células T reguladoras ou células dendríticas imunossupressoras inibidoras fixadas com tumor ou macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor, células B reguladoras associadas a tumor ou células supressoras derivadas de mieloide. Em algumas modalidades, os anticorpos agonistas anti- Siglec-5 da presente divulgação são benéficos para a prevenção, diminuição do risco ou tratamento das condições e/ou doenças associadas à atividade de um ou mais tipos de células supressoras imunológicas, incluindo, sem limitação, tumores, incluindo tumores sólidos que não expressam Siglec-5, tais como câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer de rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, câncer de tireoide e tumores de sangue que expressam Siglec-5, tais como células de leucemia.
Composições Farmacêuticas
[0376] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser incorporados em uma variedade de formulações para administração terapêutica combinando os agentes com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis apropriados e podem ser formulados em preparações nas formas sólida, semissólida, líquida ou gasosa. Exemplos de tais formulações incluem, sem limitação, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas e aerossóis. As composições farmacêuticas podem incluir, dependendo da formulação desejada, carreadores de diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. O diluente é selecionado para não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes incluem, sem limitação, água destilada, água tamponada, solução salina fisiológica, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank.
Uma composição ou formulação farmacêutica da presente divulgação pode ainda incluir outros carreadores, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos, excipientes e similares. As composições também podem incluir substâncias adicionais para aproximar condições fisiológicas, tais como agentes de ajuste e tampão de pH, agentes de ajuste de toxicidade, agentes umectantes e detergentes.
[0377] Uma composição farmacêutica da presente divulgação também pode incluir qualquer uma de uma variedade de agentes estabilizadores, como um antioxidante, por exemplo. Quando a composição farmacêutica inclui um polipeptídeo, o polipeptídeo pode ser complexado com vários compostos conhecidos que potencializam a estabilidade in vivo do polipeptídeo ou, de outra forma, potencializam suas propriedades farmacológicas (por exemplo, aumentam a meia-vida do polipeptídeo, reduzem sua toxicidade e potencializam a solubilidade ou absorção). Exemplos de tais modificações ou agentes complexantes incluem, sem limitação, sulfato, gluconato, citrato e fosfato. Os polipeptídeos de uma composição também podem ser complexados com moléculas que potencializam seus atributos in vivo.
Tais moléculas incluem, sem limitação, carboidratos, poliaminas, aminoácidos, outros peptídeos, íons (por exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, manganês) e lipídios.
[0378] Outros exemplos de formulações que são adequadas para vários tipos de administração podem ser encontrados na Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadélfia, PA, 17ª ed.
(1985). Para uma breve revisão dos métodos para distribuição de drogas, ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
[0379] Para administração oral, o ingrediente ativo pode ser administrado em formas de dosagem sólidas, como cápsulas, comprimidos e pós, ou em formas de dosagem líquidas, como elixires, xaropes e suspensões.
O(s) componente(s) ativo(s) pode(m) ser encapsulado(s) em cápsulas de gelatina juntamente com ingredientes inativos e carreadores em pó, como glicose, lactose, sacarose, manitol, amido, celulose ou derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato de magnésio. Exemplos de ingredientes inativos adicionais que podem ser adicionados para fornecer cor, sabor, estabilidade, capacidade de tamponamento, dispersão ou outras características desejáveis conhecidas são óxido de ferro vermelho, sílica gel, lauril sulfato de sódio, dióxido de titânio e tinta branca comestível. Diluentes semelhantes podem ser usados para fazer comprimidos prensados. Tanto os comprimidos quanto as cápsulas podem ser fabricados como produtos de liberação sustentada para fornecer liberação contínua de medicamento por um período de horas. Os comprimidos podem ser revestidos com açúcar ou revestidos com película para mascarar qualquer sabor desagradável e proteger o comprimido da atmosfera, ou com revestimento entérico para desintegração seletiva no trato gastrointestinal. As formas de dosagem líquidas para administração oral podem conter corantes e aromas para aumentar a aceitação do paciente.
[0380] As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções de injeção estéril isotônicas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que entregam a formulação isotônica com o sangue do destinatário pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizadores e conservantes.
[0381] Os componentes utilizados para formular as composições farmacêuticas são preferencialmente de elevada pureza e estão substancialmente isentos de contaminantes potencialmente prejudiciais (por exemplo, pelo menos de grau National Food (NF), geralmente e pelo menos de grau analítico, e mais tipicamente pelo menos de grau farmacêutico). Além disso, as composições destinadas ao uso in vivo são geralmente estéreis. Na medida em que um determinado composto deve ser sintetizado antes do uso, o produto resultante é tipicamente substancialmente livre de quaisquer agentes potencialmente tóxicos, particularmente quaisquer endotoxinas, que podem estar presentes durante o processo de síntese ou purificação. As composições para administração parentérica também são estéreis, substancialmente isotônicas e feitas sob condições de GMP.
[0382] As formulações podem ser otimizadas para retenção e estabilização no cérebro ou sistema nervoso central. Quando o agente é administrado no compartimento craniano, é desejável que o agente seja retido no compartimento e não difundir ou atravessar a barreira hematoencefálica. As técnicas de estabilização incluem reticulação, multimerização ou ligação a grupos como polietilenoglicol, poliacrilamida, carreadores neutros de proteínas, etc. de modo a obter um aumento no peso molecular.
[0383] Outras estratégias para aumentar a retenção incluem o aprisionamento de um agente da presente divulgação, como um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação, em um implante biodegradável ou bioerodível.
A taxa de liberação do agente terapeuticamente ativo é controlada pela taxa de transporte através da matriz polimérica e pela biodegradação do implante. O transporte da droga através da barreira polimérica também será afetado pela solubilidade do composto, hidrofilicidade do polímero, extensão da reticulação do polímero, expansão do polímero mediante absorção de água, de modo a tornar a barreira polimérica mais permeável à droga, geometria do implante e similares. Os implantes são de dimensões proporcionais ao tamanho e formato da região selecionada como sítio de implantação. Os implantes podem ser partículas, folhas, adesivos, placas, fibras, microcápsulas e similares e podem ter qualquer tamanho ou forma compatível com o sítio de inserção selecionado.
[0384] Os implantes podem ser monolíticos, ou seja, ter o agente ativo distribuído homogeneamente através da matriz polimérica ou encapsulada, onde um reservatório do agente ativo é encapsulado pela matriz polimérica. A seleção da composição polimérica a ser empregada variará com o sítio da administração, o período de tratamento desejado, a tolerância do paciente, a natureza da doença a ser tratada e similares. As características dos polímeros incluirão biodegradabilidade no sítio da implantação, compatibilidade com o agente de interesse, facilidade de encapsulamento, meia-vida no ambiente fisiológico.
[0385] As composições poliméricas biodegradáveis que podem ser empregadas podem ser ésteres ou éteres orgânicos que, quando degradados, resultam em produtos de degradação fisiologicamente aceitáveis, incluindo os monômeros. Anidridos, amidas, ortoésteres ou outros semelhantes, sozinhos ou em combinação com outros monômeros, podem ser usados. Os polímeros serão polímeros de condensação. Os polímeros podem ser reticulados ou não reticulados. De particular interesse são os polímeros de ácidos carboxílicos hidroxialifáticos quer homo- ou copolímeros e polissacarídeos. Entre os poliésteres de interesse estão incluídos polímeros de ácido d-lático, ácido L- lático, ácido lático racêmico, ácido glicólico, policaprolactona e combinações destes. Ao empregar o L-lactato ou D-lactato, um polímero lentamente biodegradável é alcançado, enquanto a degradação é substancialmente aprimorada com o racemato. Os copolímeros de ácido glicólico e láctico são de particular interesse, onde a velocidade de biodegradação é controlada pela proporção de ácido glicólico para ácido láctico. O copolímero mais rapidamente degradado possui quantidades aproximadamente iguais de ácido glicólico e láctico, onde qualquer homopolímero é mais resistente à degradação. A razão de ácido glicólico para ácido lático também afetará a fragilidade do implante,
onde um implante mais flexível é desejável para geometrias maiores. Entre os polissacarídeos de interesse estão o alginato de cálcio e celuloses funcionalizadas, particularmente ésteres de carboximetilcelulose caracterizados por serem insolúveis em água, um peso molecular de cerca de 5 kD a 500 kD, etc. Hidrogéis biodegradáveis também podem ser empregados nos implantes da presente divulgação. Os hidrogéis são tipicamente um material de copolímero, caracterizado pela capacidade de absorver um líquido. Hidrogéis biodegradáveis exemplificativos que podem ser empregados são descritos em Heller em: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. III, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, pp 137-149.
Dosagens farmacêuticas
[0386] As composições farmacêuticas da presente divulgação contendo um agente anti-Siglec-5 da presente divulgação tal como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, podem ser administradas a um indivíduo em necessidade de tratamento com o agente Siglec-5, preferencialmente um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, intracraniana, intraespinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação.
[0387] As dosagens e a concentração de droga desejadas das composições farmacêuticas da presente divulgação podem variar dependendo da utilização particular prevista. A determinação da dosagem ou via de administração apropriada está dentro das habilidades daquele ordinariamente versado na técnica. Experimentos em animais fornecem orientações confiáveis para a determinação de doses efetivas para terapia humana. O escalonamento de doses eficazes entre espécies pode ser realizado seguindo os princípios descritos em Mordenti, J. e Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in
Toxicokinetics,” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46.
[0388] Para administração in vivo de qualquer um dos agentes Siglec-5 da presente divulgação, tal como qualquer um dos anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng/kg até cerca de 100 mg/kg de peso corporal de um indivíduo ou mais por dia, preferencialmente cerca de 1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratada, o tratamento é mantido até que seja alcançada a supressão desejada dos sintomas.
[0389] Um regime de dosagem exemplificativo pode incluir a administração de uma dose inicial de um agente Siglec-5, tal como um anticorpo anti-Siglec-5 de cerca de 2 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg a cada duas semanas. Outros regimes de dosagem podem ser úteis, dependendo do padrão de decaimento farmacocinético que o médico deseje atingir. Por exemplo, a dosagem de um indivíduo de uma a vinte e uma vezes por semana é contemplada neste documento. Em certas modalidades, a dosagem que varia de cerca de 3 μg/kg a cerca de 2 mg/kg (como cerca de 3 μg/kg, cerca de 10 μg/kg, cerca de 30 μg/kg, cerca de 100 μg/kg, cerca de 300 μg/kg, cerca de 1 mg/kg e cerca de 2/mg/kg) pode ser usada. Em certas modalidades, a frequência de dosagem é três vezes por dia, duas vezes por dia, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas ou uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses ou mais. O progresso da terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem, incluindo o agente Siglec-5, como o anticorpo anti-Siglec-5 administrado, pode variar ao longo do tempo, independentemente da dose usada.
[0390] As dosagens para um agente Siglec-5 específico, como um anticorpo anti-Siglec-5 específico, podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que receberam uma ou mais administrações do agente Siglec-5, como o anticorpo anti-Siglec-5. Os indivíduos recebem doses incrementais de um agente Siglec-5, como um anticorpo anti-Siglec-5. Para avaliar a eficácia de um agente Siglec-5, tal como um anticorpo anti-Siglec-5, um sintoma clínico de qualquer uma das doenças, distúrbios ou condições da presente divulgação (por exemplo, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, convulsões, distrofia retiniana, lesão cerebral traumática, uma lesão medular, depressão de longo prazo, doenças vasculares ateroscleróticas e sintomas indesejáveis do envelhecimento normal) podem ser monitorados.
[0391] A administração de um agente Siglec-5, anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do destinatário, se o objetivo da administração é terapêutico ou profilático e outros fatores conhecidos por profissionais habilidosos. A administração de um agente Siglec-5, tal como um anticorpo anti-Siglec-5 pode ser essencialmente contínua durante um período de tempo pré-selecionado ou pode estar em uma série de doses espaçadas.
[0392] Orientação sobre dosagens específicas e métodos de distribuição é fornecida na literatura; ver, por exemplo, as patentes U.S. Nºs
4.657.760; 5.206.344; ou 5.225.212. Está dentro do escopo da presente divulgação que diferentes formulações serão eficazes para diferentes tratamentos e diferentes distúrbios, e que a administração destinada a tratar um órgão ou tecido específico pode exigir a distribuição de uma maneira diferente daquela para outro órgão ou tecido. Além disso, as dosagens podem ser administradas por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Para administrações repetidas ao longo de muitos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas de doença. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
Usos terapêuticos
[0393] Aspectos adicionais da presente divulgação fornecem métodos de modular (por exemplo, ativar ou inibir) uma ou mais atividades de Siglec-5, incluindo, sem limitação, modular (por exemplo, ativar ou inibir) uma proteína Siglec-5 da presente divulgação, reagir a uma ou mais fosforilações de Tyr-520 e Tyr-544 por uma família Src tirosina quinase, tal como Syk, LCK, FYM e/ou ZAP70; recrutar a ligação e ligar às fosfatases de proteína específicas de tirosina SHP1 e SHP2; recrutar a ligação e ligar à PLC-gama1, que atua como fator de troca de nucleotídeo de guanina para Dynamini-1; recrutar a ligação e ligar à proteína contendo domínio SH2 (por exemplo, Crkl); recrutar a ligação e ligar à tirosina quinase do baço Syk; recrutar a ligação e ligar à proteína 2 ligada a receptor de fator de crescimento SH3-SH2-SH3 (Grb2); recrutar a ligação e ligar às múltiplas proteínas contendo SH2; modular (por exemplo, ativar e inibir) a expressão de uma ou mais citocinas pró-inflamatórias, opcionalmente em que uma ou mais citocinas anti-inflamatórias são selecionadas de IFN-α4, IFN-beta, IL-1β, IL-1alpha, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-33, MCP-1 e MIP-1-beta; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de uma ou mais citocinas pró-inflamatórias em uma ou mais células selecionadas de macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, osteoclastos, células T, células T helper,
células T citotóxicas, granulócitos e células micrógliais; modular (por exemplo,
ativação ou inibição) a expressão de uma ou mais citocinas anti-inflamatórias,
opcionalmente em que as uma ou mais citocinas anti-inflamatórias são selecionadas de IL-4, IL-10, IL-13, IL-35, IL-16, TGF-beta, IL-1Ra, G-CSF e receptores solúveis para TNF, IFN-beta1a, IFN-beta1b, or IL-6; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de uma ou mais citocinas anti-inflamatórias em uma ou mais células selecionadas de macrófagos, neutrófilos, células NK,
células B, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
monócitos, osteoclastos, células T, células T, células T citotóxicas, granulócitos e células micrógliais; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de uma ou mais proteínas selecionadas de C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3,
ITGB2, HMOX1, LAT2, CASP1, CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1,
TyroBP, ALOX5AP, ITGAM, SLC7A7, CD4, ITGAX, e PYCARD; ativar a fosforilação de quinase regulada por sinal extracelular (ERK); modular (por exemplo, ativar ou inibir) a fosforilação de tirosina em uma ou mais proteínas celulares, opcionalmente, em que a uma ou mais proteínas celulares compreendem ZAP-70 e a fosforilação de tirosina ocorre na Tyr-319 de ZAP-70;
modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de receptor de quimiocina C-
C 7 (CCR7); ativar a quimiotaxia de célula micróglial para células que expressam
CCL19 e CCL21; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a proliferação de célula
T induzida por uma ou mais células selecionadas de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, micróglia, micróglia M1,
micróglia ativada por M1, micróglia M2, macrófagos, neutrófilos, células NK,
células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1,
neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1, macrófagos M2, neutrófilos M2 e células NK M2; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a produção de osteoclasto, modular
(por exemplo, ativar ou inibir) a taxa de osteoclastogênese ou ambos; modular
(por exemplo, ativar ou inibir) a sobrevivência de uma ou mais células selecionadas de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras,
células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1,
macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos, osteoclastos, células
T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia,
micróglia M1 e micróglia M2; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a proliferação de uma ou mais células selecionadas de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK, células B,
células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1,
células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células
NK ativadas M1, macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos,
osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos,
neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia M1 ativada e micróglia M2; modular
(por exemplo, ativar ou inibir) a migração de uma ou mais células selecionadas de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea,
macrófagos, neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1,
macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK M2, monócitos, osteoclastos, células
T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia,
micróglia M, micróglia M1 ativada e micróglia M2; modular (por exemplo, ativar ou inibir) uma ou mais funções de uma ou mais células selecionadas de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos,
neutrófilos, células NK, células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1, neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1,
neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1, macrófagos M2,
neutrófilos M2, células NK M2, monócitos, osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas, granulócitos, neutrófilos, micróglia, micróglia M1,
micróglia M1 ativada e micróglia M2; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a maturação de uma ou mais células selecionadas de células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, macrófagos, neutrófilos, células NK,
células B, células B reguladoras, células plasmáticas, macrófagos M1,
neutrófilos M1, células NK M1, macrófagos ativados por M1, neutrófilos ativados por M1, células NK ativadas por M1, macrófagos M2, neutrófilos M2, células NK
M2, monócitos, osteoclastos, células T, células T helper, células T citotóxicas,
granulócitos, neutrófilos, micróglia, micróglia M1, micróglia M1 ativada e micróglia M2; ativar um ou mais tipos de depuração selecionada de depuração apoptótica de neurônios, depuração de resíduos de tecido nervoso, depuração de sinapse disfuncional, resíduos de tecido não nervoso, depuração bacteriana,
depuração de outros corpos estranhos, depuração de proteína causadora de doenças, depuração de peptídeo causador de doenças e depuração de célula tumoral; opcionalmente em que a proteína causadora de doenças é selecionada de amiloide beta, amiloide beta oligomérica, placas beta amiloide, proteína precursora amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43,
proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína priônica, PrPSc, huntingtina, calcitonina, dismutase superóxido,
ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de
Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina,
apolipoproteina AI, amiloide seroso A, medina, prolactina, transtirretina, lisozima,
microglobulina beta 2, gelsolina, ceratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG associados a repetição (RAN), peptídeos de repetição de dipeptídeos (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP),
peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR)
e a célula tumoral é de um câncer selecionado câncer de bexiga, câncer cerebral,
câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer do rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer do ovário, fibrossarcoma e câncer da tireoide; ativar a fagocitose de um ou mais neurônios apoptóticos, resíduos de tecido nervoso, resíduos de tecido não nervoso de sinapses disfuncionais, bactérias, outros corpos estranhos, proteínas causadoras de doenças, peptídeos causadores de doenças, ácidos nucleicos causadores de doenças ou células tumorais;
opcionalmente em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição antisense GGCCCC (G2C4) (SEQ ID NO: 225), as proteínas causadoras de doenças são selecionadas de amiloide beta, amiloide beta oligomérica, placas beta amiloide, proteína precursora amiloide ou fragmentos desta, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72
(quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína priônica, PrPSc, huntingtina, calcitonina, dismutase superóxido, ataxina, ataxina
1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpo de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide de ilhotas, insulina, apolipoproteina AI,
amiloide seroso A, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina, ceratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL,
proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG associados a repetição (RAN),
peptídeos de repetição de dipeptídeos (DPR), peptídeos de repetição de glicina-
alanina (GA), peptídeos de repetição glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA),
ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR), e as células tumorais são de um câncer selecionado de câncer de bexiga, câncer cerebral,
câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer do rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer do ovário, fibrossarcoma e câncer da tireoide; inibir a ligação ao ligante de Siglec-5 em células tumorais; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a ligação ao ligante de Siglec-5 em células selecionadas de neutrófilos, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos,
macrófagos e células NK; ativar a morte da célula tumoral por uma ou mais micróglias, macrófagos, neutrófilos, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células B, células T, células
T helper ou células T citotóxicas; ativar a atividade de proliferação de células antitumorais de uma ou mais micróglias, macrófagos, neutrófilos, células NK,
células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos,
células B, células T, células T helper ou células T citotóxicas; ativar a atividade de metástase de células antitumorais de uma ou mais micróglias, macrófagos,
neutrófilos, células NK, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos, células B, células T, células T helper ou células T citotóxicas; modular (por exemplo, ativar ou inibir) receptores contendo motivo
ITAM, opcionalmente em que o um ou mais receptores contendo motivo ITAM são selecionados de TREM1, TREM2, SIRPB1, FcgR, DAP10 e DAP12; modular
(por exemplo, ativar ou inibir) a sinalização por um ou mais receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), opcionalmente em que o um ou mais PRRs são selecionados de receptores que identificam padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), receptores que identificam padrões moleculares associados a danos (DAMPs) e quaisquer combinações destes; modular (por exemplo, ativar ou inibir) um ou mais receptores compreendendo o motivo D/Ex0–
2YxxL/IX6–8YxxL/I (SEQ ID NO: 4); modular (por exemplo, ativar ou inibir) a sinalização de um ou mais receptores tipo Toll; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a sinalização da via JAK-STAT; modular (por exemplo, ativar ou inibir) de fator nuclear kappa-cadeia-leve-potencializador de células B ativadas (NFκB);
fosforilação de um receptor contendo motivo ITAM; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata de complemento e/ou receptores, opcionalmente em que o um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata de complemento e/ou receptores compreendem CD86, C1qa, C1qB, C1qC, C1s, C1R, C4, C2, C3, ITGB2,
HMOX1, LAT2, CASP1, CSTA, VSIG4, MS4A4A, C3AR1, GPX1, TyroBP,
ALOX5AP, ITGAM, SLC7A7, CD4, ITGAX e/ou PYCARD e o um ou mais receptores inflamatórios, proteínas da cascata de complemento e/ou receptores são expressos em uma ou mais micróglias, macrófagos, neutrófilos, células NK,
células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, neutrófilos,
células B, células T, células T helper ou células T citotóxicas; modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de um ou mais genes dependentes de
Siglec-5; normalizar expressão gênica dependente de Siglec-5 interrompida;
modular (por exemplo, ativar ou inibir) a expressão de um ou mais genes dependentes de ITAM, opcionalmente em que o um ou mais genes dependentes de ITAM são ativados por fatores nucleares de fatores de transcrição de células
T ativadas (NFAT); resgatar a funcionalidade de uma ou mais células dendríticas,
macrófagos imunosupressores, neutrófilos imunosupressores, células NK imunosupressoras, células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor, células B reguladoras e células T reguladoras; reduzir a infiltração de uma ou mais células dendríticas imunosupressoras, macrófagos imunosupressores,
neutrófilos imunosupressores, células NK imunosupressoras, células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor, células B reguladoras e células T reguladoras em tumores; aumentar o número de células imunosupressoras promotoras de mieloide/granulocíticas em um tumor, em sangue periférico ou outros órgão linfoide; aumentar a expressão de citocinas promotoras de tumor em um tumor ou em sangue periférico, opcionalmente em que as citocinas promotoras de tumor são TGF-beta ou IL-10; aumentar a infiltração de tumor linfócitos T FoxP3+ promotores de tumor; potencializar a atividade promotora de tumor de células supressoras derivadas de mieloide (MDSC); diminuir a ativação de linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor; diminuir a infiltração de células NK específicas de tumor com potencial de eliminar tumor; diminuir o potencial de células NK de eliminar o tumor; potencializar a atividade promotora de tumor de células B reguladoras; aumentar a infiltração tumoral de células B reguladoras; diminuir a infiltração tumoral de linfócitos B específicos de tumor com potencial para potencializar a resposta imunológica; diminuir a infiltração tumoral de linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor; aumentar o volume tumoral; aumentar a taxa de crescimento de tumor; aumentar a metástase; aumentar a taxa de recorrência de tumor; diminuir a eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam as respostas antitumor de células T, opcionalmente em que a uma ou mais imunoterapias são imunoterapias que direcionam uma ou mais proteínas alvo selecionadas de PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, TREM1, TREM2, CD39, CD73, receptor CSF-1 e quaisquer combinações destes, ou de uma ou mais vacinas de câncer; inibição de mobilização de PLCγ/PKC/cálcio; e/ou inibição de sinalização de PI3K/Akt, Ras/MAPK em um indivíduo em necessidade desta, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente Siglec-5 da presente divulgação, tal como um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação, para modular (por exemplo, ativar ou inibir) uma ou mais atividades de Siglec-5 no indivíduo.
[0394] Conforme divulgado neste documento, os anticorpos anti-
Siglec-5 da presente divulgação que se ligam a Siglec-5 e diminuem os níveis celulares de Siglec-5, podem ser usados para prevenir, reduzir o risco ou tratar demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e/ou câncer. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 são selecionados a partir de anticorpos, receptores Siglec-5 solúveis, proteínas de fusão Siglec-5-Fc, imunoadesinas Siglec-5, receptores Siglec solúveis que se ligam a um ou mais ligantes de Siglec-5, proteínas de fusão Siglec-Fc, imunoadesinas Siglec, moléculas antisense, siRNAs, inibidores de moléculas pequenas, proteínas e peptídeos.
Em algumas modalidades, os anticorpos Siglec-5 são anticorpos agonistas. Em algumas modalidades, os anticorpos Siglec-5 são anticorpos inertes. Em algumas modalidades, os anticorpos Siglec-5 são anticorpos antagonistas.
[0395] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de prevenção, redução de risco ou tratamento de demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e/ou câncer, por administração a um indivíduo em necessidade deste de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente da presente divulgação que diminui os níveis celulares de Siglec-5. Em algumas modalidades, o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um receptor de Siglec-5 solúvel, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc, uma imunoadesina Siglec-5, um receptor de Siglec solúvel que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-Fc, uma imunoadesina Siglec, uma molécula antisense, um siRNA, um inibidor de molécula pequena, uma proteína e um peptídeo. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação.
[0396] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de prevenção, redução do risco ou tratamento do câncer, administrando a um indivíduo em necessidade deste, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente da presente divulgação que diminui os níveis celulares de Siglec-
5. Em algumas modalidades, o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um receptor de Siglec-5 solúvel, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc, uma imunoadesina Siglec-5, um receptor de Siglec solúvel que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-Fc, uma imunoadesina Siglec, uma molécula antisense, um siRNA, um inibidor de molécula pequena, uma proteína e um peptídeo. Em certas modalidades, o agente é um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, o agente inibe uma ou mais atividades Siglec-5 selecionadas de: (a) promover a proliferação, maturação, migração, diferenciação e/ou funcionalidade de um ou mais de células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, neutrófilos imunossupressores, células NK imunossupressores, células B, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos supressores associados a tumor, células NK supressoras associadas a tumor e células T reguladoras; (b) potencializar a infiltração de uma ou mais células dendríticas imunossupressoras, macrófagos imunossupressores, neutrófilos imunossupressores, células NK imunossupressoras, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos supressores associados a tumor, células NK supressoras associadas a tumor, células B reguladoras e células T reguladoras em tumores; (c) aumentar o número de células imunossupressoras mieloides/granulocíticas promotoras de tumor em um tumor, no sangue periférico ou em outro órgão linfoide; (d) potencializar a atividade de promoção de tumor de células supressoras derivadas de mieloide (MDSC); (e) aumentar a expressão de citocinas promotoras de tumor em um tumor ou no sangue periférico, opcionalmente em que as citocinas promotoras de tumor são TGF-beta ou IL-10; (f) aumentar a infiltração tumoral de linfócitos T reguladores FoxP3 + promotores de tumor; (g) diminuir a ativação de linfócitos T específicos do tumor com potencial de eliminar tumor; (h) diminuir a infiltração de linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor; (i) diminuir a infiltração de células NK específicas de tumor com potencial de eliminar tumor; (j) diminuir o potencial de eliminar tumor das células NK; (k) diminuir a infiltração de linfócitos B específicos de tumor com potencial para potencializar a resposta imunológica; (l) diminuir a ativação de linfócitos B específicos de tumor com potencial para aumentar a resposta imunológica; (m) aumentar o volume do tumor; (n) aumentar a taxa de crescimento do tumor; (o) aumentar a metástase; (p) aumentar a taxa de recorrência do tumor; (q) diminuir a eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam as respostas de células T antitumorais, opcionalmente em que uma ou mais imunoterapias são imunoterapias que têm como alvo uma ou mais proteínas alvo selecionadas de PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-
1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT,
BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5,
CD2, CD5, TREM1, TREM2, CD39, CD73, receptor CSF-1 e qualquer combinação destes, ou vacinas contra o câncer; (r) inibir a mobilização de
PLCγ/PKC/cálcio; e (s) inibir a sinalização PI3K/Akt, Ras/MAPK.
Em algumas modalidades, o agente inibe uma ou mais atividades de Siglec-5 selecionadas de: (a) promover a proliferação, maturação, migração, diferenciação e/ou funcionalidade de uma ou mais células dendríticas imunosupressoras,
macrófagos imunosupressores, neutrófilos imunosupressores, células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênico, macrófagos associados a tumor, células mieloides CD14+ não tumorigênicas, células B reguladoras e células T reguladoras; (b) potencializar a infiltração de uma ou mais células dendríticas imunosupressoras, macrófagos imunosupressoras, neutrófilos imunosupressores, células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas, macrófagos associados a tumor, células B reguladoras e células
T reguladoras em tumores; (c) aumentar o número de células imunosupressoras mieloide/granulocíticas promotoras de tumor e/ou células mieloides CD14+ não tumorigênicas em um tumor, em sangue periférico ou outro órgão linfoide; (d)
potencializar a atividade promotora de tumor de células mieloides supressoras derivadas de tumor não tumorigênicas e/ou células mieloides CD14+ não tumorigênicas; (e) aumentar a expressão de citocinas promotoras de tumor em um tumor ou em sangue periférico, opcionalmente em que as citocinas promotoras de tumor são TGF-beta ou IL-10; (f) aumentar a infiltração de tumor de linfócitos T reguladores FoxP3+ promotores de tumor; (g) diminuir a ativação de linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor; (h) diminuir a infiltração de linfócitos T específicos de tumor com potencial de eliminar tumor;
(i) diminuir a infiltração de células NK específicos de tumor com potencial de eliminar tumor; (j) diminuir o potencial de eliminar tumor de células NK; (k)
diminuir a infiltração de linfócitos B específicos de tumor com potencial de potencializar a resposta imunológica; (l) diminuir a ativação de linfócitos B específicos de tumor com potencial de potencializar a resposta imunológica; (m)
aumentar o volume do tumor; (n) aumentar a taxa de crescimento do tumor; (o)
aumentar a metástase; (p) aumentar a taxa de recorrência do tumor; (q)
aumentar a expressão de um ou mais ligantes PD-1; (r) diminuir a eficácia de uma ou mais imunoterapias que modulam as respostas de células T antitumorais, opcionalmente em que a uma ou mais imunoterapias que direcionam a uma ou mais proteínas selecionadas de C PD1/PDL1, CD40, OX40,
ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3,
B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3,
TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73, TREM1, TREM2, receptor
CSF-1 e qualquer combinação destes, ou de uma ou mais vacinas de câncer; (s)
inibição de mobilização de PLCγ/PKC/cálcio; (t) inibição de sinalização de PI3K/Akt, Ras/MAPK; e (u) diminuir a eficácia de um ou mais agentes quimioterápicos, opcionalmente em que o um ou mais agentes quimioterápicos são gemcitabina, capecitabina, antraciclinas, doxorubicina (Adriamycin®),
epirubicina (Ellence®), taxanos, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®), 5-
fluorouracil (5-FU), ciclofosfamida (Cytoxan®), carboplatina (Paraplatin®), e qualquer combinação destes.
Em algumas modalidades, o agente exibe uma ou mais atividades selecionadas de: (a) aumentar o número de células T CD3 + que se infiltram no tumor; (b) inibir a ligação de Siglec-5 a um ou mais ligantes de
Siglec-5; (c) diminuir os níveis celulares de Siglec-5 em células imunológicas periféricas (d) reduzir o número de células mieloides CD14 + não tumorigênicas,
opcionalmente em que as células mieloides CD14 + não tumorigênicas são células infiltrantes de tumor ou, opcionalmente, em que as células mieloides
CD14 + não tumorigênicas as células estão presentes no sangue; (e) reduzir o número de células mieloides CD14 + não tumorigênicas, opcionalmente em que as células mieloides CD14 + não tumorigênicas são células infiltrantes de tumor ou, opcionalmente, em que as células mieloides CD14 + não tumorigênicas estão presentes no tumor; (f) reduzir os níveis de PD-L1 em uma ou mais células,
opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (g) reduzir os níveis de PD-L2 em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (h) reduzir os níveis de CD11b em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas
(MDSC); (i) reduzir os níveis de B7-H3 em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (j) reduzir os níveis de CD200R em uma ou mais células,
opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (k) reduzir os níveis de CD163 em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (l) reduzir os níveis de CD206 em uma ou mais células, opcionalmente em que uma ou mais células são células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (m) diminuir a taxa de crescimento do tumor de tumores sólidos; (n) reduzir o volume do tumor; (o) aumentar a eficácia de um ou mais inibidores de PD-1; (p) aumentar a eficácia de uma ou mais terapias de inibidor de checkpoint e/ou terapias de modulação imunológica, opcionalmente em que uma ou mais terapias de inibidor de checkpoint e/ou terapias de modulação imunológica têm como alvo um ou mais de CTL4, a via de adenosina, PD-L1, PD-L2, OX40, TIM3, LAG3 ou qualquer combinação destes; (q) inibir a diferenciação, sobrevivência e/ou uma ou mais funções de células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC); (r) induzir a morte celular de uma ou mais células supressoras derivadas de mieloide (MDSC); e (s) aumentar a proliferação de células T na presença de células supressoras derivadas de mieloide não tumorigênicas (MDSC). Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a doença, distúrbio ou lesão é câncer. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, a doença, distúrbio ou lesão é câncer e o câncer expressa Siglec-5 ou um ou mais ligantes de Siglec-5. Em algumas modalidades que podem ser combinadas com qualquer uma das modalidades anteriores, o agente é benéfico para prevenir, diminuir o risco ou tratar câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer do endométrio, câncer renal, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mieloide crônica (CML) e/ou mieloma múltiplo.
[0397] Conforme divulgado neste documento, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação também podem ser utilizados para a induzir e/ou promover a maturação, funcionalidade, migração ou proliferação de sobrevivência de uma ou mais células imunológicas (por exemplo, células imunológicas inatas ou células imunológicas adaptativas). Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de induzir ou promover a sobrevivência, maturação, funcionalidade, migração ou proliferação de uma ou mais células imunológicas em um indivíduo em necessidade destas, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente da presente divulgação que diminui os níveis celulares de Siglec-5. Em algumas modalidades, o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um receptor de Siglec-5 solúvel, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc, uma imunoadesina Siglec-5, um receptor de Siglec solúvel que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-Fc, uma imunoadesina Siglec, uma molécula antisense, um siRNA, um inibidor de molécula pequena, uma proteína e um peptídeo. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti- Siglec-5 isolado da presente divulgação. Em algumas modalidades, as uma ou mais células imunológicas são selecionadas dentre células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células NK, micróglia, células T, células T helper, células T citotóxicas e qualquer combinação destas.
[0398] Outros aspectos da presente divulgação se referem a um método de avaliação da capacidade de resposta de um sujeito em necessidade deste a um agente que se liga ou interage com Siglec-5, o método compreendendo: a. medir os níveis de expressão de CD45+ e CD14+ em células mieloides não tumorigênicas em uma amostra de sangue obtida do sujeito antes da administração ao sujeito de um anticorpo anti-Siglec-5; b. administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente; e C. medir os níveis de expressão de CD45+ e CD14+ em células mieloides não tumorigênicas em uma amostra de sangue obtida do sujeito após a administração do anticorpo anti- Siglec-5, em que uma redução nos níveis de CD45+ CD14+ em células mieloides não tumorigênicas após a administração do anticorpo anti-Siglec-5 indica que o sujeito responde ao agente. Em algumas modalidades, o método de avaliação da capacidade de resposta compreende ainda administrar uma ou mais quantidades terapeuticamente eficazes adicionais do agente. Em algumas modalidades, isso pode ser combinado com qualquer uma das modalidades anteriores, o agente é selecionado de um anticorpo, um receptor de Siglec-5 solúvel, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc, uma imunoadesina Siglec-5, um receptor de Siglec solúvel, uma proteína de fusão Siglec-Fc, uma imunoadesina Siglec, uma molécula antisense, um siRNA, um inibidor de molécula pequena, uma proteína e um peptídeo. Quaisquer métodos adequados para obter uma amostra, como uma amostra de sangue, podem ser utilizados. Em algumas modalidades, o método de avaliação da capacidade de resposta compreende ainda administrar uma ou mais quantidades terapeuticamente eficazes adicionais do agente. Em algumas modalidades, o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um receptor de Siglec-5 solúvel, uma proteína de fusão Siglec- 5-Fc, uma imunoadesina Siglec-5, um receptor de Siglec solúvel, uma proteína de fusão Siglec-Fc, uma imunoadesina Siglec, uma molécula antisense, um siRNA, um inibidor de molécula pequena, uma proteína e um peptídeo. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti-Siglec-5 isolado ou conjugado de anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-5 é o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, o sujeito é humano.
[0399] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 reduz os níveis celulares (por exemplo, superfície celular, intracelular ou total) de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 induz a degradação de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 induz a clivagem de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec- 5 induz a internalização de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-
Siglec-5 induz a derramamento de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 induz a regulação negativa da expressão de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é ativado transitoriamente e, em seguida, induz a degradação de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é ativado transitoriamente e, em seguida, induz a clivagem de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 ativa transitoriamente e, em seguida, induz a internalização de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 ativa transitoriamente e, em seguida, induz o derramamento de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-5 ativa transitoriamente e, em seguida, induz a regulação negativa da expressão de Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 ativa transitoriamente e, em seguida, induz a diminuição da expressão de Siglec-5.
Em certas modalidades, o indivíduo possui um alelo variante Siglec-5.
[0400] Conforme divulgado neste documento, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação podem ainda ser usados para diminuir a atividade, funcionalidade ou sobrevivência de células T reguladoras, células B reguladoras, células dendríticas imunossupressoras incorporadas ao tumor, macrófagos imunossupressores incorporados ao tumor, neutrófilos imunossupressores incorporados ao tumor, células NK imunossupressoras incorporadas ao tumor, células supressoras derivadas de mieloides, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor, células de leucemia mieloide aguda (AML), células de leucemia linfocítica crônica (CLL) e/ou células de leucemia mieloide crônica (CML). Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para diminuir a atividade, funcionalidade ou sobrevivência de células T reguladoras, células B regulatórias, células dendríticas imunossupressoras incorporadas ao tumor, macrófagos imunossupressores incorporados ao tumor, neutrófilos imunossupressores incorporados ao tumor, células NK imunosupressores incorporadas ao tumor,
células supressoras derivadas de mieloide, macrófagos associados a tumor, neutrófilos associados a tumor, células NK associadas a tumor, células de leucemia mieloide aguda (AML), células de leucemia linfocítica crônica (CLL) ou células de leucemia mieloide crônica (CML) em um indivíduo em necessidade deste, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado dentre um anticorpo antagonista, um anticorpo inerte e um anticorpo agonista.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-5 é um anticorpo anti-Siglec-5 isolado ou conjugado de anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo anti-Siglec-5 compreende um anticorpo anti-Siglec-5 conjugado com um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico.
[0401] Conforme divulgado neste documento, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação podem ser usados para diminuir os níveis celulares de Siglec-5 em uma ou mais células in vitro ou in vivo, incluindo, sem limitação, glóbulos vermelhos, células bacterianas, células apoptóticas, células nervosas, células da glia, micróglia, astrócitos, células tumorais, vírus, células dendríticas, ligantes de Siglec-5 ligados a placas beta amiloides, ligantes de Siglec-5 ligados a emaranhados Tau, ligantes de Siglec-5 em proteínas causadoras de doenças, ligantes de Siglec-5 em peptídeos causadores de doenças, macrófagos, neutrófilos, células assassinas naturais, monócitos, células T, células T helper, células T citotóxicas, células B, células dendríticas imunossupressoras incorporadas ao tumor, macrófagos imunossupressores incorporados ao tumor, células supressoras derivadas de mieloide e/ou células T reguladoras. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para diminuir os níveis celulares de Siglec-5 em uma ou mais células em um indivíduo em necessidade deste, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que se liga ou interage com
Siglec-5. Em algumas modalidades, o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um anticorpo antagonista, um anticorpo inerte, um anticorpo agonista, um ligante de Siglec-5, um fragmento agonista de ligante de Siglec-5, uma imunoadesina Siglec-5, um mimético de ligante de Siglec-5, um receptor de solúvel Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc, um receptor de Siglec solúvel que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-Fc que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5 e um pequeno composto da molécula. Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti-Siglec-5 isolado ou conjugado de anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo anti-Siglec-5 compreende um anticorpo anti-Siglec-5 conjugado com um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico. Em algumas modalidades, uma ou mais células são selecionadas de glóbulos vermelhos, células bacterianas, células apoptóticas, células nervosas, células da glia, micróglia, astrócitos, células tumorais, vírus, células dendríticas, ligantes de Siglec-5 ligados a placas beta amiloides, ligantes de Siglec-5 ligados a emaranhados Tau, ligantes de Siglec-5 em proteínas causadoras de doenças, ligantes de Siglec-5 em peptídeos causadores de doenças, macrófagos, neutrófilos, células assassinas naturais, monócitos, células T, células T helper, células T citotóxicas, células B, células dendríticas imunossupressoras incorporadas ao tumor, macrófagos imunossupressores incorporados ao tumor, células supressoras derivadas de mieloide, células T reguladoras e qualquer combinação destas.
[0402] Os níveis celulares de Siglec-5 podem referir-se, sem limitação, a níveis de superfície celular de Siglec-5, níveis intracelulares de Siglec-5 e níveis totais de Siglec-5. Em algumas modalidades, uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 compreende uma diminuição nos níveis de superfície celular de Siglec-5. Tal conforme usado neste documento, um anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis de superfície celular de Siglec-5 se induzir uma diminuição de 21% ou mais nos níveis de superfície celular de Siglec-5 conforme medido por quaisquer ensaios baseados em células in vitro ou em modelo in vivo adequado descrito neste documento ou conhecido na técnica. Em algumas modalidades, uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 compreende uma diminuição nos níveis intracelulares de Siglec-5. Tal conforme usado neste documento, um anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis intracelulares de Siglec-5 se induzir uma diminuição de 21% ou mais nos níveis intracelulares de Siglec-5 conforme medido por qualquer ensaio baseado em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito neste documento ou conhecido na técnica. Em algumas modalidades, uma diminuição nos níveis celulares de Siglec-5 compreende uma diminuição nos níveis totais de Siglec-5.
Tal conforme usado neste documento, um anticorpo anti-Siglec-5 diminui os níveis totais de Siglec-5 se induzir uma diminuição de 20% ou mais nos níveis totais de Siglec-5 conforme medido por qualquer ensaio baseado em células in vitro ou modelo in vivo adequado descrito neste documento ou conhecido na técnica. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 induzem a degradação de Siglec-5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, derramamento de Siglec-5 e/ou regulação negativa da expressão de Siglec-5.
Em algumas modalidades, os níveis celulares de Siglec-5 são medidos em células primárias (por exemplo, células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, micróglia, células T e macrófagos) ou em linhagens celulares utilizando um ensaio celular in vitro.
[0403] Conforme divulgado neste documento, os anticorpos anti- Siglec-5 da presente divulgação podem ser usados para induzir a ativação de neutrófilos e/ou alívio de neutrófilos imunossuprimidos, por exemplo, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e/ou formação de armadilha extracelular (NET) em um ou mais neutrófilos in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de indução da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade deste, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que se liga ou interage com Siglec-5. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de indução da formação de armadilha extracelular (NET) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade deste, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que se liga ou interage com Siglec-5. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de induzir a ativação de neutrófilos em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade deste, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que se liga ou interage com Siglec-5. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de aliviar um ou mais neutrófilos imunossuprimidos em um indivíduo em necessidade deste,
administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que se liga ou interage com Siglec-5. Em algumas modalidades, o agente é selecionado a partir de um anticorpo, um anticorpo antagonista, um anticorpo inerte, um anticorpo agonista, um ligante de Siglec-5, um fragmento agonista de ligante de Siglec-5, uma imunoadesina Siglec-5, um mimético de ligante de
Siglec-5, um receptor de solúvel Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-5-Fc, um receptor de Siglec solúvel que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5, uma proteína de fusão Siglec-Fc que se liga a um ou mais ligantes de Siglec-5 e um pequeno composto da molécula.
Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo anti-Siglec-5 isolado ou conjugado de anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo anti-
Siglec-5 compreende um anticorpo anti-Siglec-5 conjugado com um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico.
Em algumas modalidades, a uma ou mais células são selecionadas de glóbulos vermelhos, células bacterianas, células apoptóticas, células nervosas, células da glia, micróglia,
astrócitos, células tumorais, vírus, células dendríticas, ligantes de Siglec-5 ligados a placas beta amiloides, ligantes de Siglec-5 ligados a emaranhados Tau, ligantes de Siglec-5 em proteínas causadoras de doenças, ligantes de Siglec-5 em peptídeos causadores de doenças, macrófagos, neutrófilos, células assassinas naturais, monócitos, células T, células T helper, células T citotóxicas, células B, células dendríticas imunossupressoras incorporadas ao tumor, macrófagos imunossupressores incorporados ao tumor, células supressoras derivadas de mieloide, células T reguladoras e qualquer combinação destas.
[0404] Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma variante heterozigótica de Siglec-5.
[0405] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem envolver ainda a coadministração de anticorpos anti-Siglec-5 ou anticorpos anti-Siglec-5 biespecíficos, com anticorpos que se ligam a receptores de reconhecimento de padrões, anticorpos que se ligam a receptores do tipo Toll, anticorpos que se ligam a receptores de padrão molecular associado a dano (DAMP) e/ou anticorpos que se ligam a citocinas ou anticorpos a interleucinas).
[0406] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem incluir ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou de investigação. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint é selecionado de um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e um anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor inibidor de Killer (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo antifosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-Siglec-6, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-10, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti- TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, um anticorpo anti- TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5 e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a uma ou mais terapias anticâncer padrão ou em investigação são selecionadas de radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercepte, terapia de transferência de células adotivas (ACT), terapia de transferência de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia vacinal e terapia com citocinas.
[0407] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem incluir ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibitória. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de citocina inibidora é administrado em combinação com o agente Siglec-5, tal como um anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado dentre um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2 e qualquer combinação destes.
[0408] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem incluir ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante é administrado em combinação com o agente Siglec-5, tal como um anticorpo anti- Siglec-5. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante é selecionado de um anticorpo anti-CD40 agonista, um anticorpo anti-OX40 agonista, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonístico anti-TREM1, um anticorpo agonístico anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, uma proteína GITR relacionada a TNFR induzida por antiglicocorticoide, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista HVEM, um anticorpo agonista anti-CD30, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação destes.
[0409] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação podem incluir ainda a administração ao indivíduo de pelo menos uma citocina estimulante. Em algumas modalidades, a pelo menos uma citocina estimulante é administrada em combinação com o agente Siglec-5, como um anticorpo anti-Siglec-5. Em algumas modalidades, a pelo menos uma citocina estimulante é selecionada dentre IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação destes.
Demência
[0410] A demência é uma síndrome inespecífica (ou seja, um conjunto de sinais e sintomas) que se apresenta como uma séria perda da capacidade cognitiva global em uma pessoa anteriormente não prejudicada, além do que se pode esperar do envelhecimento normal. A demência pode ser estática como resultado de uma lesão cerebral global única. Alternativamente, a demência pode ser progressiva, resultando em declínio a longo prazo devido a danos ou doenças no corpo. Embora a demência seja muito mais comum na população geriátrica, também pode ocorrer antes dos 65 anos. As áreas cognitivas afetadas pela demência incluem, sem limitação, memória, atenção, linguagem e solução de problemas. Geralmente, os sintomas devem estar presentes por pelo menos seis meses antes de um indivíduo ser diagnosticado com demência.
[0411] Formas exemplificativas de demência incluem, sem limitação, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência semântica e demência com corpos de Lewy.
[0412] Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a demência. Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti-Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades Siglec-5 em um indivíduo com demência.
Demência frontotemporal
[0413] A demência frontotemporal (FTD) é uma condição resultante da deterioração progressiva do lobo frontal do cérebro. Com o tempo, a degeneração pode avançar para o lobo temporal. Perdendo apenas para a doença de Alzheimer (AD) na prevalência, a FTD responde por 20% dos casos de demência pré-senil. As características clínicas da FTD incluem déficits de memória, anormalidades comportamentais, mudanças de personalidade e problemas de linguagem (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C., Trends Genet.
24:186-194 (2008); Neary, D., et al., Neurology 51:1546-1554 (1998); Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K. & Hodges, J. R., Neurology 58:1615-1621 (2002)).
[0414] Uma porção substancial dos casos da FTD é herdada de maneira autossômica dominante, mas mesmo em uma família, os sintomas podem abranger um espectro, desde FTD com distúrbios comportamentais, até Afasia Progressiva Primária, até Degeneração Ganglionar Corticobasal. A FTD, como a maioria das doenças neurodegenerativas, pode ser caracterizada pela presença patológica de agregados proteicos específicos no cérebro doente.
Historicamente, as primeiras descrições da FTD reconheceram a presença de acúmulos intraneuronais da proteína Tau hiperfosforilada em emaranhados neurofibrilares ou corpos de Pick. Uma função causal para a proteína Tau associada ao microtúbulo foi respaldada pela identificação de mutações no gene que codifica a proteína Tau em várias famílias (Hutton, M., et al., Nature 393:702- 705 (1998). No entanto, a maioria dos cérebros com FTD não mostra acúmulo de Tau hiperfosforilada, mas exibe imunorreatividade à ubiquitina (Ub) e à proteína TAR de ligação ao DNA (TDP43) (Neumann, M., et al., Arch. Neurol.
64:1388-1394 (2007)). Foi demonstrado que a maioria dos casos de FTD com inclusões de Ub (FTD-U) carrega mutações no gene da Progranulina.
[0415] Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a FTD.
Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti-Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com FTD.
Doença de Alzheimer
[0416] A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência. Não há cura para a doença, que piora à medida que progride e, eventualmente, leva à morte. Na maioria das vezes, a AD é diagnosticada em pessoas com mais de 65 anos. No entanto, a doença de Alzheimer de início precoce, menos prevalente, pode ocorrer muito mais cedo.
[0417] Os sintomas comuns da doença de Alzheimer incluem sintomas comportamentais, como dificuldade em lembrar eventos recentes; sintomas cognitivos, confusão, irritabilidade e agressão, alterações de humor, problemas de linguagem e perda de memória a longo prazo. À medida que a doença progride, as funções corporais são perdidas, levando à morte. A doença de Alzheimer se desenvolve por um período desconhecido e variável antes de se tornar totalmente aparente, e pode progredir sem diagnóstico por anos.
[0418] Em algumas modalidades, administrar de um anticorpo anti-
Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com doença de Alzheimer.
Doença de Parkinson
[0419] A doença de Parkinson, que pode ser chamada de parkinsonismo idiopático ou primário, síndrome rígida hipocinética (HRS) ou paralisia agitante, é um distúrbio cerebral neurodegenerativo que afeta o controle do sistema motor. A morte progressiva das células produtoras de dopamina no cérebro leva aos principais sintomas do Parkinson. Na maioria das vezes, a doença de Parkinson é diagnosticada em pessoas com mais de 50 anos de idade. A doença de Parkinson é idiopática (sem causa conhecida) na maioria das pessoas. No entanto, fatores genéticos também desempenham um papel na doença.
[0420] Os sintomas da doença de Parkinson incluem, sem limitação, tremores nas mãos, braços, pernas, mandíbula e face, rigidez muscular nos membros e tronco, lentidão de movimento (bradicinesia), instabilidade postural, dificuldade para caminhar, problemas neuropsiquiátricos, alterações na fala ou comportamento, depressão, ansiedade, dor, psicose, demência, alucinações e problemas de sono.
[0421] Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Parkinson. Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com doença de Parkinson.
Esclerose lateral amiotrófica (ALS)
[0422] Conforme usado neste documento, esclerose lateral amiotrófica (ALS) ou doença do neurônio motor ou doença de Lou Gehrig são usadas de forma intercambiável e referem-se a uma doença debilitante com etiologia variada caracterizada por fraqueza rapidamente progressiva, atrofia e fasciculações musculares, espasticidade muscular, dificuldade na fala (disartria), dificuldade em engolir (disfagia) e dificuldade em respirar (dispneia).
[0423] Foi demonstrado que a Progranulina desempenha um papel na ALS (Schymick, JC et al., (2007) J Neurol Neurosurg Psychiatry.;78:754-6) e protege contra os danos causados por proteínas que causam ALS tal como TDP- 43 (Laird, AS et al., (2010). PLoS ONE 5: e13368). Foi também demonstrado que o pro-NGF induz a morte mediada por p75 de oligodendrócitos e neurônios corticospinais após lesão da medula espinhal (Beatty et al., Neuron (2002),36, pp. 375-386; Giehl et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (2004), 101, pp 6226-30).
[0424] Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a ALS.
Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti-Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com esclerose lateral amiotrófica.
Doença de Huntington
[0425] A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa hereditária causada por uma mutação autossômica dominante no gene Huntingtina (HTT). A expansão de uma repetição de tripleto de citocina-adenina-guanina (CAG) no gene Huntingtina resulta na produção de uma forma mutante da proteína Huntingtina (Htt) codificada pelo gene. Essa proteína Huntingtina mutante (mHtt) é tóxica e contribui para a morte neuronal.
Os sintomas da doença de Huntington costumam aparecer entre 35 e 44 anos, embora possam aparecer em qualquer idade.
[0426] Os sintomas da doença de Huntington incluem, sem limitação, problemas de controle motor, movimentos aleatórios e espasmódicos (coreia), movimentos oculares anormais, equilíbrio comprometido, convulsões,
dificuldade em mastigar, dificuldade em engolir, problemas cognitivos, fala alterada, déficits de memória, dificuldades de pensamento, insônia, fadiga, demência, alterações na personalidade, depressão, ansiedade e comportamento compulsivo.
[0427] Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença de Huntington (HD). Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti-Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com doença de Huntington.
Doença tipo Taupatia
[0428] As taupatias, ou tauopatias, são uma classe de doença neurodegenerativa causada pela agregação da proteína tau associada ao microtúbulo no cérebro. A doença de Alzheimer (AD) é a doença tipo taupatia mais conhecida e envolve um acúmulo de proteína tau dentro dos neurônios na forma de emaranhados neurofibrilares insolúveis (NFTs). Outras taupatias e distúrbios incluem paralisia supranuclear progressiva, demência pugilística (encefalopatia traumática crônica), demência frontotemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Lytico-Bodig (demência de Parkinson-complexo de Guam), demência com predomínio de emaranhados, Ganglioglioma e gangliocitoma, Meningioangiomatose, panencefalite esclerosante subaguda, encefalopatia por chumbo, esclerose tuberosa, doença de Hallervorden-Spatz, lipofuscinose, doença de Pick, degenaração corticobasal, doença por grãos argirofílicos (AGD), doença de Huntington e degeneração lobar frontotemporal.
[0429] Em algumas modalidades, administrar um anticorpo anti- Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a doença tipo taupatia. Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec- 5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com uma doença tipo taupatia.
Esclerose Múltipla
[0430] A esclerose múltipla (MS) também pode ser referida como esclerose disseminada ou encefalomielite disseminada. A MS é uma doença inflamatória na qual as bainhas de mielina ao redor dos axônios do cérebro e da medula espinhal são danificadas, levando à desmielinização e cicatrização, bem como a um amplo espectro de sinais e sintomas. A MS afeta a capacidade das células nervosas do cérebro e da medula espinhal de se comunicarem efetivamente. As células nervosas se comunicam enviando sinais elétricos chamados potenciais de ação por fibras longas chamadas axônios, que estão contidos em uma substância isolante chamada mielina. Na MS, o próprio sistema imunológico do corpo ataca e danifica a mielina. Quando a mielina é perdida, os axônios não podem mais conduzir sinais de maneira efetiva. O início da MS geralmente ocorre em jovens adultos e é mais comum em mulheres.
[0431] Os sintomas da MS incluem, sem limitação, alterações na sensação, tais como perda de sensibilidade ou formigamento; ardência ou dormência, tais como hipoestesia e parestesia; fraqueza muscular; clônus; espasmos musculares; dificuldade de se mover; dificuldades com coordenação e equilíbrio, tais como ataxia; problemas na fala, tal como disartria, ou na deglutição, tais como disfagia; problemas visuais, tais como nistagmo, neurite óptica incluindo fosfenos e diplopia; fadiga; dor aguda ou crônica; e dificuldades na bexiga e intestino; comprometimento cognitivo em vários graus; sintomas emocionais de depressão ou humor instável; fenômeno de Uhthoff, que é uma exacerbação dos sintomas existentes devido a uma exposição a temperaturas ambientes mais altas do que as normais; e sinal de Lhermitte, que é uma sensação elétrica que desce pelas costas ao dobrar o pescoço.
[0432] Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação pode prevenir, reduzir o risco e/ou tratar a esclerose múltipla. Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-
Siglec-5 pode modular uma ou mais atividades de Siglec-5 em um indivíduo com esclerose múltipla.
Câncer
[0433] Ainda outros aspectos da presente divulgação fornecem métodos para prevenir, reduzir o risco ou tratar um indivíduo com câncer, administrando ao indivíduo em necessidade desta uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado da presente divulgação. Qualquer um dos anticorpos isolados da presente divulgação pode ser usado nesses métodos. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo agonista da presente divulgação. Em outras modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo antagonista da presente divulgação. Em outras modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo inerte da presente divulgação. Em outras modalidades, o anticorpo isolado é um conjugado de anticorpo da presente divulgação.
[0434] Conforme descrito neste documento, sabe-se que o microambiente do tumor é conhecido por conter um infiltrado imunológico heterogêneo, que inclui linfócitos T, linfócitos B, macrófagos, neutrófilos, células NK e células da linhagem mieloide/granulocítica. A presença e atividade de células T reguladoras, células B reguladoras, células mieloides imunossupressoras incorporadas a tumor e/ou macrófagos M2, neutrófilos M2 e/ou células M2-NK em tumores estão associadas a um prognóstico ruim. Por outro lado, a presença e atividade de células T citotóxicas é benéfica para a terapia do câncer. Espera-se que as terapias que potencializam direta ou indiretamente a atividade das células T citotóxicas e reduzem o número e a atividade das várias células imunossupressoras proporcionem benefício terapêutico significativo. Um estudo pré-clínico seminal mostrou sinergias entre drogas que direcionam células imunossupressoras (por exemplo, anticorpos bloqueadores CSF1/CSF1R) e anticorpos bloqueadores de checkpoint imunológico que ativam células T citotóxicas, indicando que a manipulação de ambos os tipos de células mostra eficácia em modelos de tumores nos quais as terapias individuais são pouco eficazes (Zhu Y; Cancer Res. 15 de setembro de 2014; 74(18):5057-69). Portanto, em algumas modalidades, o bloqueio de Siglec-5, que é expresso em células mieloides, neutrófilos, células B, um subconjunto de células T e células imunológicas associadas a tumores, pode estimular uma resposta imunológica antitumoral benéfica, resultando em uma resposta imunológica antitumoral terapêutica.
[0435] Em algumas modalidades, os métodos para prevenir, reduzir o risco ou tratar um indivíduo com câncer incluem ainda a administração ao indivíduo de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint. Exemplos de anticorpos que se ligam especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint incluem, sem limitação, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e um anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um receptor inibidor anti-Killer (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM- 1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo antifosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-Siglec-6, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-10, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5 e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint é administrado em combinação com um agente Siglec-5 da presente divulgação, tal como um anticorpo anti-Siglec-5 antagonista da presente divulgação.
[0436] Em algumas modalidades, um câncer a ser prevenido ou tratado pelos métodos da presente divulgação inclui, sem limitação, câncer de células escamosas (por exemplo, câncer epitelial de células escamosas), câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago, incluindo câncer gastrintestinal e câncer estromal gastrointestinal,
câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, câncer do carcinoma do trato urinário, hepatoma,
câncer de mama, câncer do cólon, câncer do reto, câncer colorretal, câncer do endométrio ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim ou renal,
câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, carcinoma hepático,
carcinoma anal, carcinoma de pênis, melanoma, melanoma de espalhamento superficial, melanoma lentigo maligno, melanoma lentiginoso acral, melanomas nodulares, mieloma múltiplo e linfoma de células B; leucemia linfocítica crônica
(CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como a proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema (tal como o associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, cérebro, bem como câncer da cabeça e pescoço, e metástases associadas.
Em algumas modalidades, o câncer é câncer colorretal.
Em algumas modalidades, o câncer é selecionado dentre câncer de pulmão de células não-pequenas, glioblastoma,
neuroblastoma, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer de ovário,
melanoma, carcinoma da mama, câncer gástrico e carcinoma hepatocelular.
Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama triplo negativo.
Em algumas modalidades, o câncer pode ser um câncer em estágio inicial ou em estágio avançado.
Em algumas modalidades, o câncer pode ser um tumor primário.
Em algumas modalidades, o câncer pode ser um tumor metastático em um segundo sítio derivado de qualquer um dos tipos de câncer acima.
[0437] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem ser usados para prevenir, reduzir o risco ou tratar o câncer, incluindo, sem limitação, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de cólon e do reto, câncer do endométrio, câncer de rim, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não- Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma e câncer de tireoide.
[0438] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para prevenir, reduzir o risco ou tratar um indivíduo com câncer, administrando ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação.
[0439] Em algumas modalidades, o método inclui ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula imune inibidora de checkpoint e/ou outra terapia anticâncer padrão ou em investigação. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint é administrado em combinação com um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint é selecionado de um anticorpo anti-PD- L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e um anticorpo anti-HVEM, um anticorpo antiatenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo antirreceptor inibidor de Killer (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo antifosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-Siglec-6, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-10, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, um anticorpo anti-TIGIT, um anticorpo anti-VISTA, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5 e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a terapia anticâncer padrão ou em investigação é uma ou mais terapias selecionadas entre radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, imatinibe (Gleevec®), trastuzumabe (Herceptin®), transferência de células adotivas (ACT), transferência de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia vacinal e terapia de citocinas.
[0440] Em algumas modalidades, o método inclui ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é administrado em combinação com um anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado dentre um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2 e qualquer combinação destes.
[0441] Em algumas modalidades, o método inclui ainda administrar ao indivíduo pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante imunológico. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, o pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante é selecionado de um anticorpo anti-CD40 agonista, um anticorpo anti-OX40 agonista, um anticorpo agonista anti-ICOS, um anticorpo agonista anti-CD28, um anticorpo agonístico anti-TREM1, um anticorpo agonístico anti-TREM2, um anticorpo agonista anti-CD137/4-1BB, um anticorpo agonista anti-CD27, uma proteína GITR relacionada a TNFR induzida por antiglicocorticoide, um anticorpo agonista anti-BTLA, um anticorpo agonista HVEM, um anticorpo agonista anti-CD30, um anticorpo agonista anti-CD2, um anticorpo agonista anti-CD5 e qualquer combinação destes.
[0442] Em algumas modalidades, o método inclui ainda administrar ao indivíduo pelo menos uma citocina estimulante. Em algumas modalidades, pelo menos uma citocina estimulante é administrada em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5 da presente divulgação. Em algumas modalidades, a pelo menos uma citocina estimulante é selecionada dentre IFN-α4, IFN-β, IL-1β, TNF- α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-γ, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação destes.
Kits/Artigos de Fabricação
[0443] A presente divulgação também fornece kits e/ou artigos de fabricação contendo um agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento) ou um fragmento funcional deste. Kits e/ou artigos de fabricação da presente divulgação podem incluir um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo purificado da presente divulgação. Em algumas modalidades, os kits e/ou artigos de fabricação incluem ainda instruções para uso de acordo com os métodos desta divulgação. Em algumas modalidades, essas instruções compreendem uma descrição da administração do agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento) para prevenir, reduzir o risco ou tratar um indivíduo com uma doença, distúrbio, ou lesão selecionada de demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer, de acordo com quaisquer métodos desta divulgação.
[0444] Em algumas modalidades, as instruções compreendem uma descrição de como detectar a proteína Siglec-5, por exemplo, em um indivíduo, em uma amostra de tecido ou em uma célula. O kit e/ou artigo de fabricação pode compreender ainda uma descrição da seleção de um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação se esse indivíduo tem a doença e o estágio da doença.
[0445] Em algumas modalidades, os kits e/ou artigos de fabricação podem incluir ainda outro anticorpo da presente divulgação (por exemplo, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula inibidora de checkpoint, pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora e/ou pelo menos um anticorpo agonístico que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimulante) e/ou pelo menos uma citocina estimulante. Em algumas modalidades, os kits e/ou artigos de fabricação podem incluir ainda instruções para o uso do anticorpo e/ou citocina estimulante em combinação com um agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento), instruções para usar um agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec- 5 descrito neste documento) em combinação com um anticorpo e/ou citocina estimulante, ou instruções para usar um agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento) e um anticorpo e/ou citocina estimulante, de acordo com quaisquer métodos desta divulgação.
[0446] Geralmente, as instruções incluem informações sobre dosagem, cronograma de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade. As instruções fornecidas nos kits e/ou artigos de fabricação da presente divulgação são normalmente instruções escritas num rótulo ou folheto informativo (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas em um disco de armazenamento magnético ou ótico) também são aceitáveis.
[0447] O rótulo ou folheto informativo indica que a composição é usada para o tratamento, por exemplo, uma doença da presente divulgação. As instruções podem ser fornecidas para a prática de qualquer dos métodos descritos neste documento.
[0448] Os kits e/ou artigos de fabricação desta divulgação estão em embalagens adequadas. Embalagem adequada inclui, mas não está limitada às ampolas, garrafas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, sacos de Mylar ou de plástico selados), e semelhantes. Também estão contempladas as embalagens para o uso em combinação com um dispositivo específico, como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba. Os kits e/ou artigos de fabricação podem também ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou uma ampola possuindo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente pode também ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou uma ampola possuindo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento). O recipiente pode ainda compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.
[0449] Kits e/ou artigos de fabricação podem opcionalmente fornecer componentes adicionais, como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula(s) sobre ou associada(s) com o recipiente.
Usos Diagnósticos
[0450] Os agentes Siglec-5 da presente divulgação, tais como os anticorpos isolados da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento) também têm utilidade diagnóstica. Portanto, esta divulgação fornece métodos para uso de anticorpos desta divulgação, ou fragmentos funcionais destes, para fins de diagnóstico, tais como a detecção de proteína Siglec- 5 em um indivíduo ou em amostras de tecido derivadas de um indivíduo.
[0451] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente humano que sofre ou corre risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou lesão da presente divulgação. Em algumas modalidades, os métodos de diagnóstico envolvem detectar uma proteína Siglec-5 em uma amostra biológica, tal como um espécime de biópsia, um tecido ou uma célula. Um agente Siglec-5 da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti- Siglec-5 descrito neste documento) é colocado em contato com a amostra biológica e o anticorpo ligado ao antígeno é detectado. Por exemplo, um espécime de biópsia pode ser corado com um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento, a fim de detectar e/ou quantificar células associadas à doença. O método de detecção pode envolver a quantificação do anticorpo ligado ao antígeno. A detecção de anticorpos em amostras biológicas pode ocorrer com qualquer método conhecido na técnica, incluindo microscopia de imunofluorescência, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, ELISA, análise FACS, imunoprecipitação ou tomografia por emissão de micro- positrons. Em certas modalidades, o anticorpo é radiomarcado, por exemplo, com 18F e, subsequentemente, detectado utilizando análise de tomografia por emissão de micro-positrons. A ligação de anticorpos também pode ser quantificada em um paciente por técnicas não invasivas, como tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por raios-X, tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT) e tomografia axial computadorizada (CAT).
[0452] Em outras modalidades, um anticorpo isolado da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento) pode ser usado para detectar e/ou quantificar, por exemplo, micróglia em um espécime de cérebro retirado de um modelo de doença pré-clínico (por exemplo, um modelo de doença não humana). Assim, um anticorpo isolado da presente divulgação (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-5 descrito neste documento) pode ser útil na avaliação da resposta terapêutica após o tratamento em um modelo para uma doença ou lesão do sistema nervoso, tal como demência frontotemporal, mal de Alzheimer, demência vascular, convulsões, distrofia retiniana, doenças vasculares ateroscleróticas, doença de Nasu-Hakola, ou esclerose múltipla, em comparação com um controle.
[0453] A presente divulgação será compreendida mais amplamente por meio de referência aos Exemplos a seguir. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da presente divulgação. Todas as citações ao longo da divulgação são expressamente incorporadas a este documento por referência.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de anticorpos específicos para Siglec-5
[0454] A presente divulgação fornece anticorpos que se ligam a Siglec-
5. Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece anticorpos que se ligam a Siglec-5, mas não se ligam a Siglec-14, uma proteína altamente homóloga a Siglec-
5.
[0455] A sequência de aminoácidos de Siglec-5 humano é apresentada abaixo como (SEQ ID NO: 1) Siglec-5 humano contém uma sequência de sinal localizada nos resíduos de aminoácidos 1-16 SEQ ID NO: 1, um domínio extracelular localizado nos resíduos de aminoácidos 17-441, um domínio extracelular de tipo variável tipo imunoglobulina (IgV) localizado no aminoácido resíduos 19-136 de SEQ ID NO: 1, dois domínios de tipo C2 tipo Ig localizados nos resíduos de aminoácidos 146-229 e 236-330 de SEQ ID NO: 1, um domínio transmembranar localizado nos resíduos de aminoácidos 442-462 de SEQ ID NO: 1, um motivo ITIM 1 localizado nos resíduos de aminoácidos 518-523 da SEQ ID NO: 1, e um motivo tipo SLAM localizado nos resíduos de aminoácidos 542-547 da SEQ ID NO: 1. Um alinhamento do A sequência de aminoácidos de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) com homólogo Siglec-5 de cynomolgus (SEQ ID NO: 2) é mostrada na FIG. 1A. Um alinhamento da sequência de aminoácidos de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) e Siglec-14 humano (SEQ ID NO: 4) é mostrado na FIG.1B.
[0456] Sequência de aminoácidos Siglec-5 (SEQ ID NO: 1):
[0457] Conforme mostrado na FIG. 1B, o Siglec-5 humano e o Siglec-14 humano são altamente homólogos em seus domínios extracelulares, compartilhando 80% de identidade sobre a totalidade de seus domínios extracelulares, mas> 99% de identidade nos primeiros 237 aminoácidos de seus domínios extracelulares.
[0458] Os anticorpos específicos para Siglec-5 foram gerados usando uma abordagem de genômica molecular, conforme descrito em Adler, et al. mAbs. 2017 “Rare, high-affinity mouse anti-PD-1 antibodies that function in checkpoint blockade, discovered using microfluidics and molecular genomics”. Dez camundongos (cinco camundongos SJ/L e cinco camundongos Balb/c) foram imunizados com a proteína Siglec-5 marcada com His, abrangendo o domínio extracelular de Siglec-5 humano, usando um protocolo de imunização repetitiva em múltiplos sítios de três semanas (RIMMS). Nove dos dez animais desenvolveram um forte título contra o imunogênio. Os nódulos linfáticos e os baços foram colhidos destes camundongos e as células B foram isoladas a partir deles por seleção negativa.
[0459] O linfonodo e as células B esplênicas de cada animal foram reunidos e 10 6 células B de cada animal foram ressuspensas em PBS com Optiprep a 10% (Sigma) para gerar gotículas de emulsão de célula única, após o que as cadeias pesada e leve foram amplificadas por RT-PCR em um chip microfluídico de vidro, conforme descrito em Adler, et al.
Resumidamente, um chip microfluídico de vidro de gota de emulsão de co- fluxo projetado personalizado foi usado para gerar emulsões de gotículas de ~45 µm de diâmetro contendo suspensões de células únicas e grânulos de oligo-dT em tampão de lise celular para capturar poli(A) + mRNA. Os grânulos ligados ao mRNA foram então ressuspensos em uma mistura de RT-PCR de extensão de sobreposição, contendo tampão RT-PCR de uma etapa 2x, transcriptase reversa Superscript III, Platinum Taq (ThermoFisher) e uma mistura de primers direcionados contra a região C de IgK, a região IgG C e todas as regiões V. A região de sobreposição era uma sequência de DNA que codifica uma sequência scFv rica em Gly-Ser. A mistura de grânulos foi injetada em um chip microfluídico de emulsão de gotículas de vidro Telos com uma mistura de surfactante à base de óleo mineral para gerar gotículas de 27 µm. Este processo amplificou e uniu as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve de células individuais para formar scFvs ligados.
[0460] Após a reação de RT-PCR, o produto de RT-PCR foi purificado em um gel de agarose e uma reação de PCR aninhada foi realizada para adicionar adaptadores para sequenciamento profundo ou exibição de levedura. O produto de PCR interno foi purificado em gel antes do sequenciamento ou clonagem em levedura. O vetor de clonagem de levedura (pYD) continha um promotor GAL1/10, uma corrente de parede celular Aga2 e um marcador c-Myc C-terminal. Saccharomyces cerevisiae foram eletroporados com o produto de PCR purificado em gel e vetor pYD linearizado para recombinação homóloga.
[0461] A plataforma de anticorpos à base de levedura foi usada para selecionar anticorpos que se ligam a Siglec-5, mas que não ligam Siglec-14. Para identificar as células que expressam scFv que se ligam a Siglec-5, as células de levedura foram coradas com proteína Siglec-5-Fc marcada com His biotinilada (70 nM), depois coradas com estreptavidina PE.
Para identificar células scFv que se ligam a Siglec-14, células de levedura foram coradas com Siglec-14-Fc (70 nM, R&D) e, em seguida, com IgG anti- humano conjugado com APC. A levedura foi corada com anti-c-Myc, seguido por anticorpo secundário conjugado com AF-488, para confirmar a expressão de scFv na superfície celular. As células de levedura que expressam scFv's que se ligam a Siglec-5, mas que não a Siglec-14, foram selecionadas por classificação na população AF488 +/PE+/APC-.
[0462] As minipreps de plasmídeo foram preparadas a partir de levedura recuperada do tipo FACS. A PCR da extremidade de cauda foi usada para adicionar adaptadores Illumina às bibliotecas de plasmídeo para sequenciamento profundo de anticorpos. Bibliotecas de sequenciamento foram quantificadas usando um kit quantitativo de PCR Illumina Lib rary Quantification (KAPA). As bibliotecas foram sequenciadas em um MiSeq (Illumina) usando um MiSeq Reagent Kit v2 de 500 ciclos, de acordo com as instruções do fabricante. Aproximadamente 100.000-150.000 leituras de sequência foram obtidas de cada biblioteca. Comparar as frequências de pré-classificação e pós-classificação de um scFv dentro da biblioteca produz o enriquecimento em vezes desse anticorpo específico após a classificação.
Onze anticorpos com enriquecimento de pelo menos 4 vezes foram expressos em células de mamíferos como anticorpos completos e caracterizados in vitro (Tabela 1).
Tabela 1: Enriquecimento em vezes de anticorpos anti-Siglec-5 gerados por genômica molecular Anticorpo Frequência de Frequência pós- Enriquecimento pré-classificação classificação (%) em vezes (%) S5-172 0,07 1,7 24,3 S5-174 0,06 1,6 26,2 S5-175 0,03 1,5 49,7 S5-176 0,04 1,3 31,5 S5-182 0,05 1,1 21,8 S5-183 0,02 1,0 51,0 S5-190 0,09 2,7 29,8 S5-202 0,06 2,4 40,2 S5-G-03 0,03 0,56 18,7 S5-G-07 0,07 0,76 10,9 S5-G-10 0,08 0,32 4,0 Exemplo 2: Humanização de anticorpos anti-Siglec-5
[0463] O objetivo dos seguintes estudos foi gerar variantes humanizadas de anticorposSiglec-5 anti-humanos de camundongo: S5-172, S5- 174 e S5-G-03.
[0464] Os anticorpos anti-Siglec-5 murinos foram humanizados enxertando os CDRs de cada anticorpo precursor de camundongo em frameworks de linhagem germinativa humana mais próximas na sequência do anticorpo de camundongo. Anticorpos com uma ou mais mutações reversas de framework também foram gerados. No total, foram criados 6 anticorpos anti- Siglec-5 humanizados de S5-172 (S5-172-H1 a S5-172-H6); 8 anticorpos anti- Siglec-5 humanizados de S5-174 (S5-174-H1 a S5-174-H8) foram criados; e 9 anticorpos anti-Siglec-5 humanizados de S5-G-03 (S5-G-03-H1 a S5-G-03-H9) foram criados.
[0465] As sequências de HVR da região variável de cadeia pesada dos anticorpos são mostradas na Tabela 2. abaixo. As sequências de HVR da região variável de cadeia leve dos anticorpos são mostradas na Tabela 3 abaixo.
As sequências das regiões de framework de cadeia pesada dos anticorpos são mostradas na Tabela 4 abaixo. As sequências das regiões de framework de cadeia leve dos anticorpos são mostradas na Tabela 5 abaixo. As sequências da região variável de cadeia pesada dos anticorpos são mostradas na Tabela 6 abaixo (as sequências de HVR estão sublinhadas). As sequências da região variável de cadeia leve dos anticorpos são mostradas na Tabela 7 abaixo (as sequências de HVR estão sublinhadas).
Tabela 2: Sequências de HVR de cadeia pesada de anticorpos anti- Siglec-5 Ab HVR H1 HVR H2 HVR H3 S5-172 DYNMY YIDSYNGGTRYNQKFKG EGFGYDDREWFAY (SEQ ID (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 70) NO: 20) S5-174 NYWMH EIDPSDGYVTYNQNFKG VYYGNSIYYAMDY (SEQ ID (SEQ ID NO: 40) (SEQ ID NO: 71) NO: 21) S5-175 SYYMH AIYPGNSDTSYNQKFKG LVRPRPYGMDY (SEQ ID (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 72) NO: 22)
Ab HVR H1 HVR H2 HVR H3
S5-176 DYNIY YFDPYNGGTNYNQRFKD EGYGYDDREWFAY
(SEQ ID (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 73)
NO: 23)
S5-182 SYWLH MIHPNSGSTDYNERFKS TFYYFDY (SEQ ID NO:
(SEQ ID (SEQ ID NO: 43) 74)
NO: 24)
S5-183 SYGVS VIWGDGSTNYHSDLIS PRAFYYGSRGYWYFDV
(SEQ ID (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 75)
NO: 25)
S5-190 DYNMY YIDSYNGGTRYNQKFKG EGFGYDDREWFAY
(SEQ ID (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 70)
NO: 20)
S5-202 SYGVS VIWGDGSTNYHSALIS PGAFYYGSRYYWYFDV
(SEQ ID (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 76)
NO: 25)
S5-G-03 TYGMS TINSNGDNTYYPDSVKG AWPSITTVFAPYTLDY
(SEQ ID (SEQ ID NO: 46) (SEQ ID NO: 77)
NO: 26)
S5-G-07 SYTMY YINPSSGYTEYNQKFKD SDSKGDY (SEQ ID NO:
(SEQ ID (SEQ ID NO: 47) 78)
NO: 27)
S5-G-10 EYTIH WFYPGSGSIKYNEKFKD HERAAQAAWSAY (SEQ
(SEQ ID (SEQ ID NO: 48) ID NO: 79)
NO: 28)
S5-172- DYNMY YIDSYNGGTRYAQKFQG EGFGYDDREWFAY H1; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 70)
Ab HVR H1 HVR H2 HVR H3
172-H2 NO: 20)
S5-172- DYNMY YIDSYNGGTRYAQKFQG EGFGYDDREWFAY
H3; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 70)
172-H4 NO: 20)
S5-172- DYNMY YIDSYNGGTRYAQKFQG EGFGYDDREWFAY
H5; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 70)
172-H6 NO: 20)
S5-174- NYWMH EIDPSDGYVTYAQKFQG VYYGNSIYYAMDY
H1; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 71)
174-H2 NO: 21)
S5-174- NYWMH EIDPSDGYVTYAQKFQG VYYGNSIYYAMDY
H3; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 71)
174-H4 NO: 21)
S5-174- NYWMH EIDPSDGYVTYAQKFQG VYYGNSIYYAMDY
H5; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 71)
174-H6 NO: 21)
S5-174- NYWMH EIDPSDGYVTYAQKFQG VYYGNSIYYAMDY
H7; S5- (SEQ ID (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 71)
174-H8 NO: 21)
S5-G-03- TYGMS TINSNGDNTYYADSVKG AWPSITTVFAPYTLDY
H1; S5-G- (SEQ ID (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 77)
03-H2; NO: 26)
S5-G-03-
H3
S5-G-03- TYGMS TINSNGDNTYYADSVKG AWPSITTVFAPYTLDY H4; S5-G- (SEQ ID (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 77)
Ab HVR H1 HVR H2 HVR H3
03-H5; NO: 26)
S5-G-03-
H6
S5-G-03- TYGMS TINSNGDNTYYADSVKG AWPSITTVFAPYTLDY
H7; S5-G- (SEQ ID (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 77)
03-H8; NO: 26)
S5-G-03-
H9
Tabela 3: Sequências de HVR de cadeia leve de anticorpos anti-
Siglec-5
Ab HVR L1 HVR L2 HVR L3
S5-172 KSSQSLLYSTN WASTRES QQFYTYPFT (SEQ
QMTFLA (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 153)
ID NO: 103) 127)
S5-174 KATQDVGTAV WTSTRHT (SEQ QQYRSYPFT (SEQ
A (SEQ ID NO: ID NO: 128) ID NO: 154)
104)
S5-175 RASQDISNYLN YTSRLHS (SEQ QQGNTLPWT (SEQ
(SEQ ID NO: ID NO: 129) ID NO: 155)
105)
S5-176 KSSQSLLYSTN WASTRES HQFYSYPFT (SEQ
QMTYLA (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 156)
ID NO: 106) 127)
S5-182 KASQDINSYLS RANRLVD (SEQ LQYDELYT (SEQ ID (SEQ ID NO: ID NO: 130) NO: 157) 107)
Ab HVR L1 HVR L2 HVR L3
S5-183 RASENIYSYLA NTKTLVE (SEQ QHHYGPPPT (SEQ
(SEQ ID NO: ID NO: 131) ID NO: 158)
108)
S5-190 KSSQSLLYSTN WASTRES QQFYSYPFT (SEQ
QMNFLA (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: 159)
ID NO: 109) 127)
S5-202 KASQDVSTAV SASYRYT (SEQ QQHYSPPPT (SEQ
A (SEQ ID NO: ID NO: 132) ID NO: 160)
110)
S5-G-03 RASSSVSSSFL STSNLAS (SEQ QQYSGYPLT (SEQ
H (SEQ ID NO: ID NO: 133) ID NO: 161)
111)
S5-G-07 RASQDIGNSLN ATSSLDS (SEQ LQYASSPLT (SEQ
(SEQ ID NO: ID NO: 134) ID NO: 162)
112)
S5-G-10 RASGNIHNYLA NAKTLTD (SEQ QHFWSTPYT (SEQ
(SEQ ID NO: ID NO: 135) ID NO: 163)
113)
S5-172-H1; KSSQSVLYSS WASTRES QQFYTYPFT (SEQ
S5-172-H3; NNKNYLA (SEQ ID NO: ID NO: 153)
S5-172-H5 (SEQ ID NO: 127)
114)
S5-172-H2; KSSQSVLYSS WASTRES QQFYTYPFT (SEQ
S5-172-H4; NNKNYLA (SEQ ID NO: ID NO: 153)
S5-172-H6 (SEQ ID NO: 127) 114)
Ab HVR L1 HVR L2 HVR L3
S5-174-H1; RASQDVGTAV WTSTRHT (SEQ QQYRSYPFT (SEQ
S5-174-H3; A (SEQ ID NO: ID NO: 128) ID NO: 154)
S5-174-H5; 115)
S5-174-H7
S5-174-H2; RASQDVGTAV WTSTRHT (SEQ QQYRSYPFT (SEQ
S5-174-H4; A (SEQ ID NO: ID NO: 128) ID NO: 154)
S5-174-H6; 115)
S5-174-H8
S5-G-03-H1; RASSSVSSSFL STSNLAS (SEQ QQYSGYPLT (SEQ
S5-G-03-H4; H (SEQ ID NO: ID NO: 133) ID NO: 161)
S5-G-03-H7 111)
S5-G-03-H2; RASSSVSSSFL STSNLAS (SEQ QQYSGYPLT (SEQ
S5-G-03-H5; H (SEQ ID NO: ID NO: 133) ID NO: 161)
S5-G-03-H8 111)
S5-G-03-H3; RASSSVSSSFL STSNLAS (SEQ QQYSGYPLT (SEQ
S5-G-03-H6; H (SEQ ID NO: ID NO: 133) ID NO: 161)
S5-G-03-H9 111)
Tabela 4: Sequências framework de cadeia pesada de anticorpos anti-Siglec-5
Ab VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
S5-172 QAYLQQSGP WVKQSHGK KATLTVDKSS WGQGTLVTV
ELVKPGASV SLEWIG STAFMHLNS SA (SEQ ID
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LTSEDSAVY NO: 80)
SLT (SEQ ID 29) YCAR (SEQ
NO: 5) ID NO: 52)
S5-174 QAYLQQSGA WVKQRPGQ KATLTVDRS WGQGTSVTV
Ab VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
ELVKPGTSV GLEWVG SSTAYMQLS SS (SEQ ID
KLSCKASGY (SEQ ID NO: SLTSEDSAV NO: 81)
TFT (SEQ ID 30) YYCAG (SEQ
NO: 6) ID NO: 53)
S5-175 QAYLQQSGA WVKQRPGQ KAKLTAVTSA WGQGTSVTV
VLARPGASV GLEWIG STAYMEVSS SS (SEQ ID
RMSCKASGY (SEQ ID NO: LTNEDSAVY NO: 81)
SFT (SEQ ID 31) YCTP (SEQ
NO: 7) ID NO: 54)
S5-176 QAYLQQSGP WVKQSHGK KATLTVDKSS WGQGTLVTV
ELVKPGASV SLEWIG STAFMQLNS SA (SEQ ID
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LTSEDSAVY NO: 80)
SFT (SEQ ID 29) YCAR (SEQ
NO: 8) ID NO: 55)
S5-182 QAYLQQSGA WVKQRPGQ KATLIVDKSS WGQGTALTV
ELVKPGASV GLEWIG STAYMQLSS SS (SEQ ID
KLSCKASGY (SEQ ID NO: LTSEDSAVY NO: 82)
TFT (SEQ ID 31) YCAK (SEQ
NO: 9) ID NO: 56)
S5-183 QAYLQQSGP WVRQPPGK RLSISKDNSK WGTGTTVAV
GLVAPSQSL GLEWLG SQVFLKLNSL SS (SEQ ID
SITCTVSGFS (SEQ ID NO: QIADTATYYC NO: 83)
VT (SEQ ID 32) AR (SEQ ID
NO: 10) NO: 57)
S5-190 QAYLQQSGP WVKQSHGK KATLTVDKSS WGQGTLVTV ELVKPGASV SLEWIG STAFMHLNS SA (SEQ ID
Ab VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LTSEDSAVY NO: 80)
SLT (SEQ ID 29) YCAR (SEQ
NO: 5) ID NO: 52)
S5-202 QAYLQQSGP WVRQPPGK RLSISKDNSK WGTGTTVTV
GLVAPSQSL GLEWLG SQVFLKLNSL SS (SEQ ID
SITCTVSGLS (SEQ ID NO: QTDDTATYY NO: 84)
LT (SEQ ID 32) CAK (SEQ ID
NO: 11) NO: 58)
S5-G-03 QAYLQQSGG WVRQTPDKR RFTISRDNAN WGQGTSVTV
GLVQPGQSL LELVA (SEQ NTLYLQMSS SS (SEQ ID
KLSCAASGF ID NO: 33) LKSEDTAMY NO: 81)
TFS (SEQ ID FCAR (SEQ
NO: 12) ID NO: 59)
S5-G-07 QAYLQQSGA WVKQRPGQ KATLTADKSS WGQGTTLTV
ELARPGASV GLEWIG STAYMQLISL SS (SEQ ID
KMSCKASGY (SEQ ID NO: TSEDSAVYY NO: 85)
TFS (SEQ ID 31) CAR (SEQ ID
NO: 13) NO: 60)
S5-G-10 QAYLQQSGA WVKQRSGQ KATLTADKSS WGQGTLVTV
ELVKPGASV GLEWIG STVYMELSR SA (SEQ ID
KLSCKASGYI (SEQ ID NO: LTSEDSAVYF NO: 80)
FT (SEQ ID 34) CAT (SEQ ID
NO: 14) NO: 61)
S5-172-H1; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RVTITADKST WGQGTLVTV S5-172-H2 EVKKPGSSV GLEWMG STAYMELSS SS (SEQ ID
Ab VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LRSEDTAVY NO: 86)
SLT (SEQ ID 35) YCAR (SEQ
NO: 15) ID NO: 62)
S5-172-H3; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RVTITVDKST WGQGTLVTV
S5-172-H4 EVKKPGSSV GLEWMG STAYMELSS SS (SEQ ID
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LRSEDTAVY NO: 86)
SLT (SEQ ID 35) YCAR (SEQ
NO: 15) ID NO: 63)
S5-172-H5; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RATLTVDKST WGQGTLVTV
S5-172-H6 EVKKPGSSV GLEWMG STAYMELSS SS (SEQ ID
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LRSEDTAVY NO: 86)
SLT (SEQ ID 35) YCAR (SEQ
NO: 15) ID NO: 64)
S5-174-H1; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RVTITADKST WGQGTLVTV
S5-174-H2 EVKKPGSSV GLEWMG STAYMELSS SS (SEQ ID
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LRSEDTAVY NO: 86)
TFT (SEQ ID 35) YCAR (SEQ
NO: 16) ID NO: 62)
S5-174-H3; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RVTITVDKST WGQGTLVTV
S5-174-H4 EVKKPGSSV GLEWMG STAYMELSS SS (SEQ ID
KVSCKASGY (SEQ ID NO: LRSEDTAVY NO: 86)
TFT (SEQ ID 35) YCAG (SEQ
NO: 16) ID NO: 65)
S5-174-H5; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RATLTVDKST WGQGTLVTV
S5-174-H6 EVKKPGSSV GLEWVG STAYMELSS SS (SEQ ID KLSCKASGY (SEQ ID NO: LRSEDTAVY NO: 86)
Ab VH FR1 VH FR2 VH FR3 VH FR4
TFT (SEQ ID 36) YCAG (SEQ
NO: 17) ID NO: 66)
S5-174-H7; QVQLVQSGA WVRQAPGQ RATLTVDRS WGQGTLVTV
S5-174-H8 EVKKPGSSV GLEWVG TSTAYMELS SS (SEQ ID
KLSCKASGY (SEQ ID NO: SLRSEDTAV NO: 86)
TFT (SEQ ID 36) YYCAG (SEQ
NO: 17) ID NO: 67)
S5-G-03- EVQLLESGG WVRQAPGK RFTISRDNSK WGQGTLVTV
H1; S5-G- GLVQPGGSL GLEWVS NTLYLQMNS SS (SEQ ID
03-H2; S5- RLSCAASGF (SEQ ID NO: LRAEDTAVY NO: 86)
G-03-H3 TFS (SEQ ID 37) YCAK (SEQ
NO: 18) ID NO: 68)
S5-G-03- EVQLLESGG WVRQAPGK RFTISRDNSK WGQGTLVTV
H4; S5-G- GLVQPGGSL GLELVA NTLYLQMNS SS (SEQ ID
03-H5; S5- RLSCAASGF (SEQ ID NO: LRAEDTAVY NO: 86)
G-03-H6 TFS (SEQ ID 38) YCAR (SEQ
NO: 18) ID NO: 69)
S5-G-03- EVQLLQSGG WVRQAPGK RFTISRDNSK WGQGTLVTV
H7; S5-G- GLVQPGGSL GLELVA NTLYLQMNS SS (SEQ ID
03-H8; S5- RLSCAASGF (SEQ ID NO: LRAEDTAVY NO: 86)
G-03-H9 TFS (SEQ ID 38) YCAR (SEQ NO: 19) ID NO: 69)
Tabela 5: Sequências framework de cadeia leve de anticorpos anti-
Siglec-5
Ab VL FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4
S5-172 DIVLTQTPLS WYQQKPGQ GVPDRFTGS FGSGTKLEIR
LAVSVGEKV SPKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
TMNC (SEQ (SEQ ID NO: SSVKAEDLAI 164)
ID NO: 87) 116) YYC (SEQ ID
NO: 136)
S5-174 DIQMTQTRN WYQVKPGQ GVPDRFTGS FGSGTKLEIK
FMSTSVGDR SPKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
VNITC (SEQ (SEQ ID NO: KNVQSEDLA 165)
ID NO: 88) 117) DYFC (SEQ
ID NO: 137)
S5-175 DVVLTQSTS WYQQKPDG GVPSRFSGS FGGGTKLEIK
SLSASLGDR TVKLLIY GSGTDYSLTI (SEQ ID NO:
VTISC (SEQ (SEQ ID NO: SNLEQEDIAT 166)
ID NO: 89) 118) YFC (SEQ ID
NO: 138)
S5-176 DIVMTQSPS WYQQKPGQ GVPDRFTGS FGSGTRWEI
SLAASVGEK SPKLLIF GSGTDFTLTI K (SEQ ID
VTMSC (SEQ (SEQ ID NO: SSVKAEDLA NO: 167)
ID NO: 90) 119) VYYC (SEQ
ID NO: 139)
S5-182 DVVMTQSPS WFQQKPGK GVPSRFSGS FGGGTKLEIK
SMYASLGER SPKTLIY GSGQDYSLTI (SEQ ID NO:
VTITC (SEQ (SEQ ID NO: SSLEYEDMGI 166) ID NO: 91) 120) YYC (SEQ ID
Ab VL FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4
NO: 140)
S5-183 DIVMTQSPA WYQQKQGK GVPSRFSGS FGTGTKLELK
SLSASVGET SPQLLVY GSDTQFSLKI (SEQ ID NO:
VTITC (SEQ (SEQ ID NO: NSLQPEDFG 168)
ID NO: 92) 121) TYYC (SEQ
ID NO: 141)
S5-190 DIQMTQTPS WYQQKPGQ GVPDRFAGS FGSGTELEIK
SLAVSVGEK SPKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
VTLSC (SEQ (SEQ ID NO: SSVKAEDLA 169)
ID NO: 93) 116) VYYC (SEQ
ID NO: 142)
S5-202 DIQMTQAHK WYQQKPGQ GVPDRFTGS FGGGTRREI
VMSTSVGDR SPKLLIY GSGTDFTFTI K (SEQ ID
VSITC (SEQ (SEQ ID NO: SSVQAEDLA NO: 170)
ID NO: 94) 116) VYYC (SEQ
ID NO: 143)
S5-G-03 DIVLTQSPAI WYQQKSGA GVPTRFSGS FGGGTKLEIK
MSASPGEKV SPKLWIY GSGTSYSLSI (SEQ ID NO:
TMTC (SEQ (SEQ ID NO: SSVEAEDTA 166)
ID NO: 95) 122) TYFC (SEQ
ID NO: 144)
S5-G-07 DVVMTQSPS WLQQEPDG GVPKRFSGS FGAGTKLEL
SLSASLGER TIKRLIS RSGSDYSLTI K (SEQ ID
VSLTC (SEQ (SEQ ID NO: SSLESEDFV NO: 171) ID NO: 96) 123) DYYC (SEQ
Ab VL FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4
ID NO: 145)
S5-G-10 DVQMNQSPA WYQQKQGK GVPSRFSGS FGGGTKLEM
SLSASVGET SPQLLVY GSGTQYSLKI K (SEQ ID
VTITC (SEQ (SEQ ID NO: NTLQPEDFG NO: 172)
ID NO: 97) 121) SYYC (SEQ
ID NO: 146)
S5-172-H1; DIVMTQSPD WYQQKPGQ GVPDRFSGS FGQGTKLEIK
S5-172-H3; SLAVSLGER PPKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
S5-172-H5 ATINC (SEQ (SEQ ID NO: SSLQAEDVA 173)
ID NO: 98) 124) VYYC (SEQ
ID NO: 147)
S5-172-H2; DIVLTQSPDS WYQQKPGQ GVPDRFSGS FGQGTKLEIK
S5-172-H4; LAVSLGERV PPKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
S5-172-H6 TMNC (SEQ (SEQ ID NO: SSVQAEDVA 173)
ID NO: 99) 124) VYYC (SEQ
ID NO: 148)
S5-174-H1; DIQMTQSPS WYQQKPGK GVPSRFSGS FGQGTKLEIK
S5-174-H3; SLSASVGDR APKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
S5-174-H5; VTITC (SEQ (SEQ ID NO: SSLQPEDFA 173)
S5-174-H7 ID NO: 100) 125) TYYC (SEQ
ID NO: 149)
S5-174-H2; DIQMTQSPS WYQQKPGK GVPSRFSGS FGQGTKLEIK
S5-174-H4; SLSTSVGDR APKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO:
S5-174-H6; VTITC (SEQ (SEQ ID NO: SSVQPEDLA 173)
S5-174-H8 ID NO: 101) 125) TYYC (SEQ ID NO: 150)
Ab VL FR1 VL FR2 VL FR3 VL FR4 S5-G-03-H1; DIQMTQSPS WYQQKPGK GVPSRFSGS FGQGTKLEIK S5-G-03-H4; SLSASVGDR APKLLIY GSGTDFTLTI (SEQ ID NO: S5-G-03-H7 VTITC (SEQ (SEQ ID NO: SSLQPEDFA 173) ID NO: 100) 125) TYYC (SEQ ID NO: 149) S5-G-03-H2; DIQMTQSPS WYQQKPGK GVPSRFSGS FGQGTKLEIK S5-G-03-H5; SLSASVGDR APKLWIY GSGTDYTLTI (SEQ ID NO: S5-G-03-H8 VTITC (SEQ (SEQ ID NO: SSLQPEDFA 173) ID NO: 100) 126) TYYC (SEQ ID NO: 151) S5-G-03-H3; DIQLTQSPSS WYQQKPGK GVPSRFSGS FGQGTKLEIK S5-G-03-H6; LSASVGDRV APKLWIY GSGTDYTLTI (SEQ ID NO: S5-G-03-H9 TMTC (SEQ (SEQ ID NO: SSVQPEDFA 173) ID NO: 102) 126) TYYC (SEQ ID NO: 152) Tabela 6: Sequências da região variável da cadeia pesada de anticorpos anti-Siglec-5
SEQ ID Ab HCVR NO: S5-172 QAYLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSLTDYNMY
WVKQSHGKSLEWIGYIDSYNGGTRYNQKFKGKATL 174
TVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCAREGFGYDD
REWFAYWGQGTLVTVSA S5-174 QAYLQQSGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTNYWMH WVKQRPGQGLEWVGEIDPSDGYVTYNQNFKGKAT 175
LTVDRSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAGVYYGNSI
SEQ ID Ab HCVR NO:
YYAMDYWGQGTSVTVSS S5-175 QAYLQQSGAVLARPGASVRMSCKASGYSFTSYYM
HWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYNQKFKGKAK 176
LTAVTSASTAYMEVSSLTNEDSAVYYCTPLVRPRPY
GMDYWGQGTSVTVSS S5-176 QAYLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNIY
WVKQSHGKSLEWIGYFDPYNGGTNYNQRFKDKATL 177
TVDKSSSTAFMQLNSLTSEDSAVYYCAREGYGYDD
REWFAYWGQGTLVTVSA S5-182 QAYLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWLH
WVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTDYNERFKSKATLI 178
VDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAKTFYYFDYW
GQGTALTVSS S5-183 QAYLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSVTSYGVS
WVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSDLISRLSISK 179
DNSKSQVFLKLNSLQIADTATYYCARPRAFYYGSRG
YWYFDVWGTGTTVAVSS S5-190 QAYLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSLTDYNMY
WVKQSHGKSLEWIGYIDSYNGGTRYNQKFKGKATL 174
TVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVYYCAREGFGYDD
REWFAYWGQGTLVTVSA S5-202 QAYLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGLSLTSYGVSW
VRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSALISRLSISKD 180
NSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKPGAFYYGSRYY WYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID Ab HCVR NO: S5-G-03 QAYLQQSGGGLVQPGQSLKLSCAASGFTFSTYGMS
WVRQTPDKRLELVATINSNGDNTYYPDSVKGRFTIS 181
RDNANNTLYLQMSSLKSEDTAMYFCARAWPSITTVF
APYTLDYWGQGTSVTVSS S5-G-07 QAYLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFSSYTMY
WVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTEYNQKFKDKATL 182
TADKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYYCARSDSKGDY
WGQGTTLTVSS S5-G-10 QAYLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYIFTEYTIHW
VKQRSGQGLEWIGWFYPGSGSIKYNEKFKDKATLT 183
ADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCATHERAAQAA
WSAYWGQGTLVTVSA S5-172- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSLTDYNMY H1; S5- WVRQAPGQGLEWMGYIDSYNGGTRYAQKFQGRVT 184 172-H2 ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGFGYDD
REWFAYWGQGTLVTVSS S5-172- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSLTDYNMY H3; S5- WVRQAPGQGLEWMGYIDSYNGGTRYAQKFQGRVT 185 172-H4 ITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGFGYDD
REWFAYWGQGTLVTVSS S5-172- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSLTDYNMY H5; S5- WVRQAPGQGLEWMGYIDSYNGGTRYAQKFQGRAT 186 172-H6 LTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGFGYDD
REWFAYWGQGTLVTVSS S5-174- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWM 187
SEQ ID Ab HCVR NO: H1; S5- HWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDGYVTYAQKFQGRV 174-H2 TITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSI
YYAMDYWGQGTLVTVSS S5-174- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYWM H3; S5- HWVRQAPGQGLEWMGEIDPSDGYVTYAQKFQGRV 188 174-H4 TITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGVYYGNSI
YYAMDYWGQGTLVTVSS S5-174- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKLSCKASGYTFTNYWM H5; S5- HWVRQAPGQGLEWVGEIDPSDGYVTYAQKFQGRA 189 174-H6 TLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGVYYGNS
IYYAMDYWGQGTLVTVSS S5-174- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKLSCKASGYTFTNYWM H7; S5- HWVRQAPGQGLEWVGEIDPSDGYVTYAQKFQGRA 190 174-H8 TLTVDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGVYYGNS
IYYAMDYWGQGTLVTVSS S5-G- 03-H1; EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMS S5-G- WVRQAPGKGLEWVSTINSNGDNTYYADSVKGRFTI 191 03-H2; SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAWPSITTV S5-G- FAPYTLDYWGQGTLVTVSS 03-H3 S5-G- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMS 03-H4; WVRQAPGKGLELVATINSNGDNTYYADSVKGRFTIS 192 S5-G- RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAWPSITTVF 03-H5; APYTLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID Ab HCVR NO: S5-G- 03-H6 S5-G- 03-H7; EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYGMS S5-G- WVRQAPGKGLELVATINSNGDNTYYADSVKGRFTIS 193 03-H8; RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAWPSITTVF S5-G- APYTLDYWGQGTLVTVSS 03-H9 Tabela 7: Sequências de região variável de cadeia leve de anticorpos anti-Siglec-5
SEQ ID Ab LCVR NO: S5-172 DIVLTQTPLSLAVSVGEKVTMNCKSSQSLLYSTNQMT
FLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGS 194
GTDFTLTISSVKAEDLAIYYCQQFYTYPFTFGSGTKLE
IR S5-174 DIQMTQTRNFMSTSVGDRVNITCKATQDVGTAVAWY QVKPGQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFT 195
LTIKNVQSEDLADYFCQQYRSYPFTFGSGTKLEIK S5-175 DVVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQ QKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLT 196
ISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK S5-176 DIVMTQSPSSLAASVGEKVTMSCKSSQSLLYSTNQM TYLAWYQQKPGQSPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSG 197
SGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCHQFYSYPFTFGSGTR
SEQ ID Ab LCVR NO:
WEIK S5-182 DVVMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWF QQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYS 198
LTISSLEYEDMGIYYCLQYDELYTFGGGTKLEIK S5-183 DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQ QKQGKSPQLLVYNTKTLVEGVPSRFSGSGSDTQFSL 199
KINSLQPEDFGTYYCQHHYGPPPTFGTGTKLELK S5-190 DIQMTQTPSSLAVSVGEKVTLSCKSSQSLLYSTNQM
NFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFAGS 200
GSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQFYSYPFTFGSGT
ELEIK S5-202 DIQMTQAHKVMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWY QQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFT 201
FTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPPTFGGGTRREIK S5-G-03 DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSFLHWY QQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPTRFSGSGSGTSYS 202
LSISSVEAEDTATYFCQQYSGYPLTFGGGTKLEIK S5-G-07 DVVMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGNSLNWL QQEPDGTIKRLISATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSL 203
TISSLESEDFVDYYCLQYASSPLTFGAGTKLELK S5-G-10 DVQMNQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWY QQKQGKSPQLLVYNAKTLTDGVPSRFSGSGSGTQY 204
SLKINTLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEMK S5-172- DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKN 205 H1; S5- YLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSG
SEQ ID Ab LCVR NO: 172-H3; SGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFYTYPFTFGQGTK S5-172- LEIK H5 S5-172-
DIVLTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSVLYSSNNK H2; S5-
NYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGS 172-H4; 206
GSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQFYTYPFTFGQG S5-172-
TKLEIK H6 S5-174- H1; S5-
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVGTAVAWY 174-H3; QQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFT 207 S5-174-
LTISSLQPEDFATYYCQQYRSYPFTFGQGTKLEIK H5; S5- 174-H7 S5-174- H2; S5-
DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQDVGTAVAWY 174-H4; QQKPGKAPKLLIYWTSTRHTGVPSRFSGSGSGTDFT 208 S5-174-
LTISSVQPEDLATYYCQQYRSYPFTFGQGTKLEIK H6; S5- 174-H8 S5-G-03- H1; S5- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSSSFLHWY G-03-H4; QQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTL 209 S5-G-03- TISSLQPEDFATYYCQQYSGYPLTFGQGTKLEIK H7
SEQ ID Ab LCVR NO: S5-G-03- H2; S5- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSSSFLHWY G-03-H5; QQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYT 210 S5-G-03- LTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPLTFGQGTKLEIK H8 S5-G-03- H3; S5-
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSFLHW G-03-H6; YQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDY 211 S5-G-03-
TLTISSVQPEDFATYYCQQYSGYPLTFGQGTKLEIK H9 Exemplo 3: Caracterização da ligação do anticorpo anti-Siglec-5
[0466] O objetivo dos seguintes estudos foi medir as afinidades de ligação dos anticorpos anti-Siglec-5 gerados conforme descrito acima e avaliar a sua ligação em células que expressam Siglec-5.
[0467] As afinidades de ligação aparentes dos anticorpos anti- Siglec-5 foram medidas por ressonância plasmônica de superfície de matriz (SPR), de acordo com técnicas padrão (Abdiche, et al. (2016) MAbs 8:264-277).
Resumidamente, os anticorpos anti-Siglec-5 foram imobilizados em um chip HC 30M em quatro densidades diferentes, na concentração de anticorpos de 10 µg/mL, 2,5 µg/mL, 0,63 µg/mL e 0,16 µg/mL. Concentrações variáveis (0-500 nM) de Siglec-5 humano marcado com histidina ou Siglec-5 de cynomolgus (NovoProtein) foram então ligadas à superfície anti-Siglec-5 capturada (tempo de injeção de 5 min, tempo de dissociação de 15 min) em tampão de corrida HBS-EP+/1 mg/mL. Tampão de corrida BSA. A análise cinética foi realizada usando o software Carterra para extrair constantes de taxa de associação e dissociação (ka e kd, respectivamente) para cada anticorpo. As constantes de afinidade aparente (KD) foram calculadas a partir da razão kd/ka. Os resultados de afinidade para a ligação de anticorpos anti-Siglec-5 ao Siglec-5 humano são mostrados na Tabela 8 abaixo. Nenhum dos anticorpos anti-Siglec-5 se ligou à proteína cynomolgus Siglec-5.
Tabela 8: Parâmetros de afinidade de anticorpos Siglec-5 para Siglec-5 humano Anticorpo ka (M-1 s-1) kd (s-1) KD S5-172 3,5E+05 5,3E-04 1,5 nM S5-174 2,5E+05 4,3E-04 1,7 nM S5-175 2,9E + 04 4.5E-04 15 nM S5-176 4,7E + 05 5,1E-04 1,1 nM S5-182 1,6E + 05 8,5E-04 5,3 nM S5-183 2,1E + 04 1,3E-03 61 nM S5-190 5,4E+05 4.6E-04 0,85 nM S5-202 3,6E+04 1,1E-03 31 nM S5-G-03 1,4E+04 1,0E-04 7,1 nM S5-G-07 2,4E+04 1,0E-05 0,42 nM S5-G-10 8,6E+03 6,8E-04 79 nM
[0468] Os anticorpos anti-Siglec-5 foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligarem a células CHO que foram transfectadas de forma estável com Siglec-5 humano (CHO-S5) ou Siglec-14 humano (CHO-S14). Os anticorpos anti-Siglec-5 também foram avaliados quanto à capacidade de se ligarem a neutrófilos humanos primários. As células foram incubadas com várias diluições dos anticorpos anti-Siglec-5 durante 30 minutos em gelo no escuro, seguido por uma incubação de 30 minutos com um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado por fluorescência. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS (PBS+2% FBS, 2 mM EDTA) e a citometria de fluxo foi realizada em um BD FACS Canto. Os dados foram analisados usando software FlowJo (Ashland, OR). Os resultados são mostrados in Figura 2A e Figura 2B.
Nas figuras, " hIgG1" e "mIgG1" referem-se a anticorpos de controle de isotipo, e "S5/14 1A5" refere-se a um anticorpo disponível comercialmente que se liga a Siglec-5 e Siglec-14 (BioLegend, clone 1A5).
[0469] Todos os anticorpos anti-Siglec-5 ligaram-se às células CHO-S5 e aos neutrófilos; no entanto, apenas o anticorpo comercial 1A5 mostrou ligação substancial a CHO-S14. Anticorpos anti-Siglec-5 S5-172, S5- 174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07 e S5- G-10 não mostrou ligação substancial a CHO-S14. Estes resultados mostraram que os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação se ligam a Siglec-5, mas não se ligam a Siglec-14. Juntos, esses resultados indicaram que os anticorpos anti-Sigelc-5 da presente divulgação são específicos para Siglec-5 e não reconhecem Siglec-14.
Exemplo 4: Binning de epítopo de anticorpos anti-Siglec-5
[0470] O objetivo dos estudos a seguir foi criar um compartimento de epítopo para anticorpos específicos anti-Siglec-5 e anticorpos que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14.
[0471] Os compartimentos de epítopo dos anticorpos anti-Siglec-5 foram determinados por matriz SPR, de acordo com técnicas padrão (Abdiche, et al. (2014) PLoS One 9:e92451). Resumidamente, os anticorpos anti-Siglec-5 foram imobilizados em um chip HC 30M em uma densidade previamente determinada para resultar em ligação robusta ao antígeno. Siglec-5 humano marcado com His (50 nM) foi pré-misturado com anticorpos competidores (200 nM), após os quais foram injetados na matriz durante 5 minutos em tampão de corrida BSA HBS-EP+/1 mg/mL. A ligação do antígeno: anticorpo competidor ao anticorpo imobilizado é indicativo de que o anticorpo imobilizado e o anticorpo competidor se enquadram em dois compartimentos de epítopos diferentes. A falta de ligação do antígeno: anticorpo competidor é indicativa de que o anticorpo imobilizado e o anticorpo competidor caem no mesmo compartimento do epítopo.
[0472] Os resultados do binning de epítopos dos anticorpos anti- Siglec-5 são mostrados abaixo na Tabela 9. Na Tabela 9, “7A5” e “8A1” referem- se a anticorpos que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14. O anticorpo 7A5 tem uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 214 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 215. O anticorpo 8A1 tem uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 216 e uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 217. “1A5”, “194128”, “REA393”, “C2” e “E1” referem-se a anticorpos disponíveis comercialmente que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14 (BioLegend, clone 1A5; R&D Systems, clone 194128; Miltenyi, clone REA393; Santa Cruz, clones C-2 e E-1). Os anticorpos específicos anti-Siglec-5 descritos neste documento se enquadram nos Compartimentos de Epítopo 3, 4 e 5. Os anticorpos que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14 se enquadram em diferentes Caixas de Epítopo 1 e 2.
Tabela 9: Resultados de binning de epítopo de anticorpos anti- Siglec-5 Clone Bin S5-172 5 S5-174 5 S5-175 3 S5-176 5 S5-182 4 S5-183 3
S5-190 5 S5-202 3 S5-G03 3 S5-G07 4 S5-G10 4 7A5 1 8A1 1 1A5 1 194128 1 REA393 1 C2 2 E1 2
[0473] Os anticorpos anti-Siglec-5 foram avaliados quanto à sua capacidade de competir com a ligação do ligante aos receptores Siglec-5. O domínio de ligação ao ligante de Siglec-5 está contido em seus primeiros 2 domínios semelhantes a Ig, uma região onde as sequências de aminoácidos de Siglec-5 e Siglec-14 são quase idênticas (Angata, et al., FASEB Journal, 2006).
Para medir a competição do anticorpo anti-Siglec-5 com a ligação do ligante a Siglec-5, um ensaio de adesão sólida de glóbulos vermelhos (RBC) foi realizado de acordo com protocolos padrão (Kelm et al., Current Biology, 1994). Os glóbulos vermelhos (RBCs) são altamente decorados com glicoproteínas contendo ácidos siálicos; portanto, a capacidade de um anticorpo anti-Siglec-5 de bloquear a ligação de RBC ao Siglec-5 imobilizado pode ser usada para determinar a interferência do ligante. Resumidamente, 5 µg/ml de Siglec-5-Fc foi revestido durante a noite em temperatura ambiente em placas Immunolon de 96 poços, lavado com PBS, então bloqueado por uma hora com tampão de ligação (PBS contendo 0,25% de BSA 1 mM CaCl2). Os anticorpos anti-Siglec-5 (0,5 µg/ml ou 1,0 µg/ml) foram ligados durante uma hora em temperatura ambiente com agitação suave. Após a remoção do anticorpo não ligado, os glóbulos vermelhos foram adicionados a cada poço a uma concentração de 3,0x10 6 células por ml e incubados em temperatura ambiente durante uma hora. Os RBCs não ligados foram então cuidadosamente lavados 3X com PBS, e adicionou-se água a cada poço para lise hipotônica dos RBCs ligados. A placa foi transferida para -80ºC durante 10 minutos, seguida de 37ºC durante 15 minutos. Os RBCs ligados foram detectados pela atividade da peroxidase, seguida por ácido sulfúrico 2N para interromper a reação. O sinal foi detectado a 450 nm. Os dados foram calculados como uma percentagem da ligação do RBC ao Siglec-5-Fc ligado à placa na ausência de anticorpo.
[0474] Os resultados do ensaio de competição de ligante são mostrados na Figura 3. Na Figura 3, “apenas RBC” refere-se a glóbulos vermelhos que não foram incubados com um anticorpo; “MIgG1” e “hIgG1” referem-se a anticorpos de controle de isotipo; S5/14 1A5 refere-se a um anticorpo comercialmente disponível que se liga a Siglec-5 e Siglec-14 (BioLegend, clone 1A5). O anticorpo 2G5 refere-se a um anticorpo que se liga a Siglec-5 e Siglec-14. O anticorpo 2G5 tem uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 212 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 213.
[0475] Os anticorpos específicos anti-Siglec-5 da presente divulgação (S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07 e S5-G-10) não bloquearam a ligação do ligante a Siglec-5 em nenhuma das concentrações de anticorpo testadas. Em contraste, ambos os anticorpos que se ligam ao Siglec-5 e ao Siglec-14 bloquearam a ligação do ligante nas duas concentrações testadas. Estes resultados indicaram que os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação não bloqueiam a ligação do ligante ao Siglec-5.
Exemplo 5: diminuição induzida por anticorpo anti-Siglec-5 nos níveis de superfície celular de Siglec-5 in vitro
[0476] O objetivo dos estudos a seguir foi testar se os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação reduzem os níveis de superfície celular de Siglec-5 em células in vitro.
[0477] Os anticorpos anti-Siglec-5 da divulgação predefinida foram testados quanto à sua capacidade de reduzir os níveis de Siglec-5 na superfície de células CHO estavelmente transfectadas com Siglec-5 (CHO-S5). As células CHO-S5 foram incubadas com anticorpos anti-Siglec-5 (0,25 µg/mL) durante 16- 24 horas a 37ºC com 5% de CO2, após o qual a expressão de Siglec-5 na superfície celular foi detectada por análise FACS. As células foram incubadas com um anticorpo de detecção, anti-Siglec-5-PE, clone 1A5 (Biolegend) durante 30 minutos em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS (PBS+2% FBS, 2 mM de EDTA) e a citometria de fluxo foi realizada em um BD FACS Canto. Os dados foram analisados usando software FlowJo. A expressão percentual da superfície celular de Siglec-5 restante foi calculada usando a seguinte fórmula: (MFI de 1A5-PE na presença do anticorpo de teste)/(MFI de 1A5-PE na ausência de anticorpo de teste)*100%. Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 4A. Conforme mostrado na Figura 4A, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação reduziram os níveis de Siglec- 5 na superfície de células CHO estavelmente transfectadas com Siglec-5 recombinante.
[0478] Os anticorpos anti-Siglec-5 foram avaliados quanto à sua capacidade de reduzir o Siglec-5 na superfície de células imunes humanas primárias. As células B foram isoladas de dadores humanos saudáveis que foram identificados como homozigóticos para o polimorfismo nulo de Siglec-14, conforme descrito em Yamanaka, et al. (2009) Glycobiology 19:841-6. As células foram incubadas com anticorpos anti-Siglec-5 (0,016 µg/mL) durante 16-24 horas, após o qual a quantidade de Siglec-5 remanescente na superfície celular foi quantificada por citometria de fluxo, conforme descrito acima. Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 4B. Conforme mostrado na Figura 4B, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação reduziram os níveis de Siglec- 5 na superfície de células B humanas in vitro.
[0479] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação foram avaliados adicionalmente quanto à sua capacidade de reduzir os níveis de Siglec-5 na superfície de macrófagos humanos primários, que foram polarizados como tipo M0, tipo M1 ou tipo M2a. Resumidamente, os monócitos foram isolados a partir de sangue fresco obtido de doadores humanos saudáveis e diferenciados em macrófagos com 0,1 µg/ mL de rHuM-CSF durante 7 dias. No dia 7, os macrófagos foram cultivados em 0,1 µg/mL de rHuM-CSF ou polarizados para M1 (na presença de 10 ng/mL LPS+20 ng/mL IFNgama) ou M2a (na presença de 50 ng/mL IL-4) durante dois dias. Macrófagos polarizados foram tratados com anticorpos anti-Siglec-5 (10 µg/mL) durante 18 horas, após o qual a quantidade de Siglec-5 remanescente na superfície celular foi quantificada por citometria de fluxo, conforme descrito acima. Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 4C. Como mostrado na Figura 4C, os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação reduziram os níveis de Siglec-5 na superfície de macrófagos humanos in vitro. Além disso, os resultados mostraram que os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação reduziram os níveis de Siglec-5 na superfície de macrófagos M0, macrófagos M1 e macrófagos M2a.
[0480] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação mostraram capacidades diferentes para reduzir o nível de Siglec-5 na superfície das células. Os anticorpos anti-Siglec-5 S5-172, S5-174, S5-176, S5-190 e S5- G-03 reduziram o nível de Siglec-5 em ambos os transfectantes CHO-S5 e em células B imunes primárias; o anticorpo anti-Siglec-5 S5-G-03 mostrou a maior redução de Siglec-5 em células B em comparação com a observada com os outros anticorpos anti-Siglec-5 testados. Outros anticorpos anti-Siglec-5, como S5-175 e S5-202, reduziram os níveis de superfície celular de Siglec-5 em um grau menor. Vários anticorpos anti-Siglec-5, como S5-182 e S5-183, mostraram apenas uma redução modesta dos níveis de superfície celular Siglec-5. Os anticorpos anti-Siglec-5 S5-172, S5-174 e S5-G-03 mostraram habilidades semelhantes para reduzir os níveis de superfície celular Siglec-5 em todos os três subconjuntos de macrófagos: M0, M1 e M2a. Tomados em conjunto, esses resultados mostraram que os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação reduzem ou diminuem os níveis celulares de Siglec-5, mas não bloqueiam a ligação do ligante ao Siglec-5, ao contrário dos anticorpos que reconhecem Siglec-5 e Siglec-14, que reduzem ou diminuem os níveis celulares de Siglec-5 e bloqueiam a ligação do ligante ao Siglec-5.
Exemplo 6: Caracterização da produção de ROS na presença de anticorpos anti-Siglec-5 in vitro
[0481] O objetivo dos estudos a seguir foi avaliar o efeito dos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por neutrófilos primários humanos.
[0482] Para avaliar a produção de ROS, os neutrófilos foram isolados de amostras de sangue humano coletadas entre 2 a 4 horas antes do isolamento com o kit direto de neutrófilos humanos EasySep™ (STEMCELL Technologies). Os neutrófilos foram semeados a 100.000 células/poço em uma placa de 96 poços (Thermo Scientific) com RPMI 1640 (Mediatech) suplementado com 0,5% de Soro Bovino Fetal Hyclone (GE Healthcare Life Sciences). O anticorpo anti-Siglec-5 foi adicionado a 1 μg/mL e incubado a 37oC com CO2 a 5% durante 10 min. CM-H2DCFDA (Life Technologies) foi reconstituído a 1 mM com DMSO e diluído para 10 µM em PBS. A solução de detecção foi adicionada aos neutrófilos no meio a uma concentração final de 2 µM de CM-H2DCFDA. Após incubação a 37oC durante1 hora, a intensidade de fluorescência no comprimento de onda de excitação: 495 nm e comprimento de onda de emissão: 530 nm foi medida usando o leitor de microplacas Synergy H1 (BioTek) ou o leitor de microplacas SpectraMax i3x (Molecular Devices). Os valores de intensidade de fluorescência foram calculados em média para todas as amostras duplicadas. O valor da intensidade de fluorescência da amostra sem anticorpo adicionado foi subtraído de todas as amostras.
[0483] Os resultados do ensaio de produção de ROS são mostrados na Figura 5. Na Figura 5, "hIgG1" refere-se a um anticorpo de controle de isotipo.
[0484] Os resultados na Figura 5 mostram que certos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, como S5-172, S5-174 e S5-176, aumentaram o nível de ROS produzido por neutrófilos. Outros anticorpos anti- Siglec-5, como S5-175, S5-182, S5-183, S5-190 e S5-202, mostraram uma diminuição no nível de ROS produzidos por neutrófilos em comparação com o observado com o anticorpo de controle de isotipo.
Exemplo 7: Caracterização da formação de NET na presença de anticorpos anti-Siglec-5 in vitro
[0485] O objetivo dos estudos a seguir foi avaliar a formação de armadilha extracelular de neutrófilos (NET) por neutrófilos primários humanos na presença de anticorpos anti-Siglec-5.
[0486] Para avaliar a formação de NET, os neutrófilos foram isolados do sangue humano coletado entre 2-4 horas antes do isolamento com o kit direto de neutrófilos humanos EasySep™ (STEMCELL Technologies). Os neutrófilos foram semeados a 100.000 células/poço em uma placa de 96 poços (Thermo Scientific) com RPMI 1640 (Mediatech) suplementado com 0,5% de Soro Bovino Fetal Hyclone (GE Healthcare Life Sciences). O anticorpo Siglec-5 foi adicionado a 1 μg/mL e incubado a 37 oC com 5% de CO2 durante a noite. A coloração de ácido nucleico verde SYTOX (Life Technologies) foi diluída a 25 μM em PBS. A solução de detecção foi adicionada aos neutrófilos na mídia em uma concentração final de 5 μM SYTOX® Green Nucleic Acid Stain. Após incubação a 37oC durante 5 min, a intensidade de fluorescência no comprimento de onda de excitação: 495 nm e comprimento de onda de emissão: 530 nm foi medida usando o leitor de microplacas Synergy H1 (BioTek) ou o leitor de microplacas SpectraMax i3x (Molecular Devices). Os valores de intensidade de fluorescência foram calculados em média para todas as amostras duplicadas. O valor da intensidade de fluorescência da amostra sem anticorpo adicionado foi subtraído de todas as amostras.
[0487] Os resultados do ensaio de formação NET são mostrados na Figura 6 Na Figura 6, "hIgG1" refere-se a um anticorpo de controle de isotipo.
[0488] Os resultados na Figura 6 mostram que certos anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, incluindo S5-172, S5-174, S5-175, S5-182 e S5-183, aumentaram a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos em relação ao observado com o anticorpo de controle de isotipo. Outros anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação, como S5-176, S5-190 e S5-202, resultaram em uma diminuição na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos.
Exemplo 8: estimulação de fagocitose por anticorpos anti-Siglec-5 in vitro
[0489] O objetivo dos estudos a seguir foi avaliar a capacidade dos anticorpos anti-Siglec-5 de estimular ou induzir a fagocitose in vitro em macrófagos humanos primários.
[0490] Macrófagos humanos primários, derivados conforme descrito acima, foram incubados com anticorpos anti-Siglec-5 durante a noite, seguido pela adição de células Raji marcadas com CFSE opsonizadas com anti-
CD20 em uma razão de 3:1 macrófagos:células Raji. 24 horas depois, as células CD14+FITC+, que representam macrófagos que têm células Raji fagocitadas foram quantificadas por citometria de fluxo.
[0491] Os resultados do ensaio de fagocitose são mostrados na Figura 7. Macrófagos M0, macrófagos M1 e macrófagos M2a tratados com anticorpo anti-Siglec-5 S5-G-03 mostraram fagocitose significativamente maior do que quando tratados com o anticorpo de controle de isotipo. O anticorpo anti- Siglec-5 S5-174 mostrou fagocitose aumentada em macrófagos M0 e macrófagos M1. O anticorpo anti-Siglec-5 S5-172 resultou em um aumento modesto da fagocitose em macrófagos M0 e macrófagos M2a. Estes resultados indicaram que os anticorpos específicos anti-Siglec-5 da presente divulgação podem aumentar a fagocitose de células alvo por macrófagos.
Exemplo 9: caracterização da expressão de Siglec-5 em camundongos transgênicos para Siglec-5 humano
[0492] O objetivo dos estudos a seguir foi avaliar a expressão de Siglec-5 em células imunes em camundongos transgênicos para Siglec-5 humano e comparar a expressão de Siglec-5 em células imunes circulantes e células imunes infiltrantes de tumor.
[0493] Nos estudos a seguir, foram usados camundongos transgênicos para o lócus genômico humano que codifica Siglec-5.
Camundongos transgênicos Siglec-5 e camundongos de controle tipo selvagem foram inoculados no flanco traseiro direito com a linha de tumor MC38 singênica.
Quando os tumores atingiram aproximadamente 200-250 mm3, o sangue e os tumores foram colhidos e analisados quanto à expressão de Siglec-5.
Resumidamente, os tumores foram dissociados usando o kit de dissociação Miltenyi Tumor, após o qual as células foram passadas por um filtro de células de 70 µm e lavadas com PBS + FBS a 2%. Células sanguíneas e células tumorais dissociadas foram coradas com camundongo CD11b, camundongo
GR1, camundongo CD11c, camundongo NK1.1, camundongo CD3, camundongo CD8, camundongo CD19 e o anticorpo específico Siglec-5 (S5- 190) durante 30 minutos em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS (PBS+2% FBS, 2 mM de EDTA) e a citometria de fluxo foi realizada em um BD Fortessa. Os dados foram analisados utilizando software FlowJo.
[0494] Os resultados destes estudos são mostrados na Figura 8.
A intensidade média de fluorescência (MFI) do anticorpo anti-Siglec-5 em células de camundongos transgênicos (TG) é comparada ao fundo, o qual foi definido pelo MFI em células de camundongos do tipo selvagem (WT).
[0495] Nas células sanguíneas circulantes, a população de células (neutrófilos e granulócitos) CD11bhiGr1hi expressou níveis substanciais de Siglec-5. Pouca expressão de Siglec-5 foi observada em células CD11bhiGr1mid circulantes (monócitos), células dendríticas CD11c+ ou células NK1.1+ NK. Em contraste, as células imunes que se infiltram no tumor mostraram substancialmente mais expressão de Siglec-5. As células dendríticas CD11bhiGr1hi(MDSC), CD11bhiGr1mid (monócitos, macrófagos) CD11bmidGr1hi e CD11c+ infiltrantes de tumor também mostraram expressão significativa de Siglec-5 sobre o fundo; em contraste, as células NK infiltrantes de tumor não expressaram níveis significativos de Siglec-5. Estes resultados indicaram que o Siglec-5 é regulado positivamente no microambiente tumoral e provavelmente contribui para a patologia do câncer.
Exemplo 10: Mapeamento de epítopo de anticorpos Siglec-5
[0496] Os anticorpos anti-Siglec-5 são testados quanto à sua capacidade de se ligar a peptídeos de 15-mer ou 25-mer abrangendo toda a sequência de aminoácidos Siglec-5 humana. Os anticorpos anti-Siglec-5 também são comparados a um anticorpo Siglec-5 de referência determinando sua região de ligação Siglec-5.
[0497] O binning de epítopos dos anticorpos anti-Siglec-5 é realizado, por exemplo, em um instrumento BiaCore T200. A análise de dados é realizada usando o software de avaliação BiaCore T200, versão 2.0. HBS-EP+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 a 0,05% v/v, pH 7,4) é usado como tampão de corrida e para a preparação de reagentes. Siglec- 5 humano, quimera Fc (10 nM; R&D Systems) é capturado (tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de estabilização de 0 s) em um chip sensor CM5 (GE Healthcare) imobilizado com IgG anti-humano de Fc. A amostra de anticorpo anti-Siglec-5 de camundongo (100 nM) é então fluída sobre a superfície Siglec-5 capturada (tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de dissociação de 0 s), seguido por um anticorpo anti-Siglec-5 de camundongo de referência (100 nM, tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de dissociação de 30 s). A superfície do chip é regenerada entre os ciclos usando 10 mM de glicina-HCl, pH 1,7 (tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de estabilização de 60 s). O sinal SPR resultante é obtido como a diferença na resposta das medições realizadas em uma célula de fluxo em branco. Um controle de ligante zero (antígeno 0 nM + IgG 100 nM) não mostra nenhuma ligação não específica significativa do anticorpo à superfície do chip sensor.
[0498] Peptídeos lineares de 15-mer são sintetizados com base na sequência de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), com uma sobreposição de 14 resíduos. Além disso, os peptídeos lineares de 25-mer são sintetizados com base na sequência de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) com um único deslocamento de resíduo. A ligação de anticorpos anti-Siglec-5 a cada um dos peptídeos sintetizados é testada usando um método baseado em ELISA. Neste ensaio, as matrizes de peptídeos são incubadas com solução de anticorpo primário (durante a noite a 4°C). Após a lavagem, as matrizes de peptídeos são incubadas com uma diluição de 1/1000 de um conjugado de peroxidase de anticorpo (SBA, cat. Nr. 2010-05) durante uma hora a 25°C. Após lavagem, são adicionados o substrato de peroxidase 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) e 2 µl/ml de H2O2 a 3%. Após uma hora, o desenvolvimento da cor é medido. O desenvolvimento da cor é quantificado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e um sistema de processamento de imagem.
[0499] Alternativamente, para reconstruir epítopos da molécula alvo, são sintetizadas bibliotecas de peptídeos em alça e combinatórios. Um suporte de polipropileno funcionalizado com amino é obtido por enxerto com uma formulação de polímero hidrofílico proprietária, seguido por reação com t-butiloxicarbonil-hexametilenodiamina (BocHMDA) usando di- ciclohexilcarbodiimida (DCC) com N-hidroxibenzotriazol (HOBt) e subsequente clivagem de grupos ácido trifluoroacético (TFA). A síntese de peptídeo Fmoc padrão é usada para sintetizar peptídeos no suporte sólido funcionalizado com amino por estações de manipulação de líquidos JANUS modificadas personalizadas (Perkin Elmer).
[0500] A síntese de mímicas estruturais é feita usando a tecnologia patenteada Chemically Linked Peptides on Scaffolds (CLIPS) da Pepscan. A tecnologia CLIPS permite estruturar peptídeos em alças simples e alças duplas. Os modelos CLIPS são acoplados a resíduos de cisteína. As cadeias laterais de múltiplas cisteínas nos peptídeos são acopladas a um ou dois modelos CLIPS. Por exemplo, uma solução de 0,5 mM do mP2 CLIPS (2,6-bis(bromometil)piridina) é dissolvida em bicarbonato de amônio (20 mM, pH 7,8)/acetonitrila (1:3 (v/v)). Esta solução é adicionada às matrizes de peptídeos. O modelo CLIPS se ligará às cadeias laterais de duas cisteínas, conforme presentes nos peptídeos ligados à fase sólida das matrizes de peptídeos (placa de 455 poços com poços de 3 µl). As matrizes de peptídeos são agitadas suavemente na solução durante 30 a 60 minutos enquanto estão completamente cobertas pela solução. Finalmente, as matrizes de peptídeos são lavadas extensivamente com excesso de H2O e sonicadas em tampão de ruptura contendo SDS a 1%/β-mercaptoetanol a 0,1% em PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 minutos, seguido por sonicação em H 2O por mais 45 minutos.
Os peptídeos portadores de T3 CLIPS (2,4,6-tris(bromometil)piridina) são produzidos de maneira semelhante à descrita acima, mas com três cisteínas.
[0501] Peptídeos em alça: peptídeos restritos de comprimento de 17 aminoácidos. As posições 2 a 16 são 15-mers derivadas da sequência alvo. Os resíduos Cys nativos são protegidos pelo grupo acetamidometil (ACM). As posições 1 e 17 são Cys que estão ligadas por frações mP2 CLIPS. Peptídeos combinatórios (miméticos descontínuos): peptídeos restritos de comprimento 33. As posições 2-16 e 18-32 são peptídeos de 15- mer derivados da sequência alvo com resíduos Cys nativos protegidos por ACM. As posições 1, 17 e 33 são Cys que estão ligadas por frações T3 CLIPS.
[0502] A ligação do anticorpo a cada um dos peptídeos sintetizados é testada em um ELISA baseado em PEPSCAN. As matrizes de peptídeos são incubadas com solução de anticorpo de teste composta da concentração otimizada experimentalmente do anticorpo de teste e solução de bloqueio (por exemplo 4% de soro de cavalo, 5% de ovalbumina (p/v) em PBS/1% de Tween80). As matrizes de peptídeos são incubadas com a solução de anticorpo de teste durante a noite a 4°C. Após extensa lavagem com tampão de lavagem (1 × PBS, 0,05% de Tween80), as matrizes de peptídeos são incubadas com uma diluição de 1/1000 de um conjugado de peroxidase de anticorpo apropriado por uma hora a 25°C. Após lavagem com o tampão de lavagem, o substrato de peroxidase 2,2'-azino-di-3-
etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) e 2 µl/ml de H2O2 a 3%. Após uma hora, o desenvolvimento da cor é medido. O desenvolvimento da cor é quantificado com um dispositivo de carga acoplada (CCD)- câmera e um sistema de processamento de imagem.
[0503] Alternativamente, um método de espectrometria de massa é usado para identificar epítopos conformacionais. A fim de determinar os resíduos-chave de epítopos conformacionais na proteína Siglec-5, aos quais os anticorpos anti-Siglec-5 se ligam, com alta resolução, os complexos anticorpo/antígeno são incubados com reticuladores deuterados e submetidos a clivagem proteolítica multienzimática. Após o enriquecimento dos peptídeos reticulados, as amostras são analisadas por espectrometria de massa de alta resolução (nLC-Orbitrap MS) e os dados gerados são analisados usando o software XQuest. Especificamente, os complexos Siglec-5 ECD/anticorpo são gerados pela mistura de soluções equimolares de antígeno Siglec-5 e anticorpo (4 µM em 5 µl cada). Um µl da mistura obtida é misturado com 1 µl de uma matriz composta por uma matriz de ácido sinapínico recristalizado (10 mg/ml) em acetonitrila/água (1:1, v/v), TFA de 0,1% (Kit K200 MALDI) Após a mistura, 1 µl de cada amostra é colocado em uma placa MALDI (SCOUT 384). Após a cristalização em temperatura ambiente, a placa é introduzida em um espectrômetro de massa MALDI e analisada imediatamente. A análise é repetida em triplicado. Os picos que representam o anticorpo monomérico, o antígeno e os complexos de anticorpo e antígeno/anticorpo são detectados nos pesos moleculares previstos.
[0504] É então determinado se o epítopo na ligação conformacional compete com os peptídeos C1q não estruturados gerados por proteólise.
Especificamente, para determinar se os complexos de domínio extracelular anti- Siglec-5 (ECD)/anticorpo podem competir com os peptídeos lineares, o antígeno Siglec-5 ECD é digerido com pepsina imobilizada. 25 µl do antígeno com uma concentração de 10 µM são misturados com 5 µM de pepsina imobilizada e incubados em temperatura ambiente durante 30 minutos. Após o tempo de incubação, as amostras são centrifugadas e o sobrenadante é pipetado. A conclusão da proteólise é controlada por espectrometria de massa High-Mass MALDI no modo linear. A proteólise da pepsina é otimizada de forma a obter uma grande quantidade de peptídeo na faixa de 1000-3500 Da. Em seguida, 5 µl dos peptídeos de antígeno gerados por proteólise são misturados com 5 µl de anticorpos (8 µM) e incubados a 37ºC durante 6 horas. Após a incubação dos anticorpos com os peptídeos do antígeno Siglec-5, 5 µl da mistura são misturados com 5 µl do antígeno Siglec-5 intacto (4 µM) para que a mistura final contenha 2 µM/2 µM/2,5 µM de Siglec-5/anticorpo/peptídeos do antígeno Siglec-
5. A análise MALDI ToF MS é realizada usando o módulo de interação HM3 da CovalX com um laser de nitrogênio padrão e com foco em diferentes faixas de massa de 0 a 2000 kDa.
[0505] Para a análise, os seguintes parâmetros são aplicados para o espectrômetro de massa: modo Linear e Positivo; Fonte de íons 1:20 kV; Fonte de íons 2:17 kV; Extração de íons de pulso: 400 ns; para HM3: Tensão de ganho: 3,14 kV; Tensão de ganho: 3,14 kV; Tensão de aceleração: 20 kV. Para calibrar o instrumento, uma calibração externa com clusters de Insulina, BSA e IgG é aplicada. Para cada amostra, 3 pontos são analisados (300 disparos de laser por pontos). O espectro apresentado corresponde à soma de 300 disparos de laser.
Os dados de MS são analisados usando o software de análise Complex Tracker versão 2.0 (CovalX Inc). Para identificar os epítopos conformacionais para a ligação de Siglec-5 a anticorpos anti-Siglec-5 (usando reticulação química) espectrometria de massa MALDI de alta massa e espectrometria de massa nLCOrbitrap, a interface de interação entre o antígeno e os anticorpos segue o seguinte procedimento. 5 µl do antígeno da amostra (concentração 4 µM) são misturados com 5 µl do anticorpo da amostra (concentração 4 µM) para obter uma mistura de anticorpo/antígeno com concentração final 2 µM/ 2 µM. A mistura é incubada a 37ºC durante 180 minutos. Em uma primeira etapa, 1 mg de reticulador DiSuccinimidil Suberato H12 (DSS-H12) é misturado com 1 mg de reticulador DiSuccinimidil Suberato D12 (DSS-D12). Os 2 mg preparados foram misturados com 1 ml de DMF a fim de obter uma solução de DSS H12/D12 a 2 mg/ml. 10 µl da mistura de anticorpo/antígeno preparada anteriormente foram misturados com 1 µl da solução de reticulador d0/d12 preparada (2 mg/ml). A solução é incubada 180 minutos em temperatura ambiente para se obter a reação de reticulação.
[0506] Para facilitar a proteólise, pode ser necessário reduzir as ligações dissulfeto presentes na proteína. As amostras reticuladas são misturadas com 20 µL de bicarbonato de amônio (25 mM, pH 8,3). Depois de misturar, 2,5 µl de DTT (500 mM) são adicionados à solução. A mistura é então incubada 1 hora a 55ºC. Após a incubação, 2,5 µl de iodioacetamida (1 M) são adicionados antes de 1 hora de incubação em temperatura ambiente em uma sala escura. Após a incubação, a solução é diluída 1/5 pela adição de 120 µl do tampão usado para a proteólise. 145 µl da amostra reticulada reduzida/alquilada são misturados com 2 µl de tripsina (Sigma, T6567). A mistura proteolítica é incubada durante a noite a 37ºC. Para proteólise de a-quimotripsina, o tampão de proteólise é Tris-HCL de 100 mM, CaCl2 de 10 mM, pH 7,8. Os 145 µl do complexo reticulado reduzido/alquilado são misturados com 2 µl de α- quimiotripsina a 200 µM e incubados durante a noite a 30ºC. Para esta análise, um nLC em combinação com a espectrometria de massa Orbitrap é usado. Os peptídeos de reticulação são analisados usando Xquest versão 2.0 e software stavrox. Os peptídeos e aminoácidos reticulados são então identificados.
Exemplo 11: Anticorpos anti-Siglec-5 humanizados se ligam a células CHO que expressam Siglec-5 recombinante
[0507] Os seguintes estudos examinaram a cinética de ligação de anticorpos anti-Siglec-5 humanizados da presente divulgação em células CHO que expressam Siglec-5 recombinante ou Siglec-14 recombinante.
[0508] Vários anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligarem a células CHO que foram transfectadas de forma estável com Siglec-5 humano (CHO-S5) ou Siglec-14 humano (CHO-S14). As células foram incubadas com várias diluições dos anticorpos anti-Siglec-5 durante 30 minutos em gelo no escuro, seguido por uma incubação de 30 minutos com um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado por fluorescência. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS (PBS+2% de FBS, 2 mM de EDTA) e a citometria de fluxo foi realizada em um BD FACS Canto. Os dados foram analisados usando software FlowJo (Ashland, OR). Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 9. Na Figura 9, hIgG1 refere-se aos anticorpos de controle de isotipo; S5-174-H2L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H3; S5-174-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-174- H5; S5-174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5-174-H4L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H7; S5-174-H4L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H8; S5-G03- H2L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H4; S5-G03-H2L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H5; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5-G03-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H8; e S5-G03-H3L3 refere-se ao anticorpo S5- G-03-H9.
[0509] Conforme mostrado na Figura 9, todos os anticorpos anti- Siglec-5 humanizados testados ligam-se a células CHO-S5; nenhum dos anticorpos anti-Siglec-5 humanizados testados ligou-se a CHO-S14 ou a células CHO de controle. Os anticorpos anti-Siglec-5 humanizados ligam-se a células CHO-S5 em uma extensão semelhante àquela observada usando anticorpos anti-Siglec-5 parentais (não humanizados). Estes resultados mostraram que os anticorpos anti-Siglec-5 humanizados da presente divulgação ligam-se ao Siglec-5 humano, mas não se ligam ao Siglec-14 humano. Juntos, esses resultados indicaram que os anticorpos anti-Siglec-5 humanizados da presente divulgação mantêm a especificidade de ligação ao Siglec-5.
Exemplo 12: Anticorpos anti-Siglec-5 humanizados regulam negativamente os níveis de superfície celular Siglec-5
[0510] Os estudos a seguir examinaram se os anticorpos anti- Siglec-5 humanizados da presente divulgação reduzem os níveis de superfície celular de Siglec-5 em células in vitro.
[0511] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação foram testados quanto à sua capacidade de reduzir os níveis de Siglec-5 na superfície de células CHO estavelmente transfectadas com Siglec-5 (CHO- S5). As células CHO-S5 foram incubadas com anticorpos anti-Siglec-5 durante 16-24 horas a 37ºC com CO 2 a 5%, após o qual a expressão de Siglec-5 na superfície celular foi detectada por análise FACS. As células foram incubadas com um anticorpo de detecção de um compartimento distinto, anti-Siglec-5-PE, clone 1A5 (Biolegend) durante 30 minutos em gelo no escuro. As células foram lavadas duas vezes em tampão FACS (PBS+2% FBS, 2 mM de EDTA) e a citometria de fluxo foi realizada em um BD FACS Canto. Os dados foram analisados usando software FlowJo. A expressão percentual da superfície celular de Siglec-5 restante foi calculada usando a seguinte fórmula: (MFI de 1A5-PE na presença do anticorpo de teste)/(MFI de 1A5-PE na ausência de anticorpo de teste)*100%.
[0512] Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 10 Na Figura10, hIgG1 refere-se aos anticorpos de controle de isotipo; S5- 174-H2L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H3; S5-174-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H5; S5-174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5- 174-H4L1 refere-se ao anticorpo S5-174-H7; S5-174-H4L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H8; S5-G03-H2L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H4; S5- G03-H2L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H5; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5-G03-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H8; e S5-G03-H3L3 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H9. Conforme mostrado na Figura 10, os anticorpos anti-Siglec-5 humanizados da presente divulgação reduziram os níveis de Siglec-5 na superfície das células CHO Siglec-5 em uma extensão comparável em relação aos anticorpos anti-Siglec-5 parentais originais.
Exemplo 13: Os anticorpos anti-Siglec-5 induzem a expressão de CD86 e CCL4.
[0513] Os anticorpos anti-Siglec-5 da presente divulgação foram avaliados adicionalmente quanto à sua capacidade de aumentar os níveis de CD86 na superfície de células supressoras primárias derivadas de mieloide humano (MDSCs). Resumidamente, os monócitos foram isolados a partir do sangue fresco obtido de dois doadores humanos saudáveis e diferenciados em macrófagos com 0,1 µg/mL de rHuGM-CSF e rHuIL-6 por 7 dias. No dia 7, as MDSCs foram tratadas com anticorpos anti-Siglec-5 (várias concentrações, até 10 µg/mL) durante 48 horas, após a qual expressão de CD86, um marcador pró-inflamatório em MDSCs foi quantificada usando anti-CD86 (IT2.2) anticorpo.
[0514] Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 11 (CD86) e Figura 12 (CCL4). Na Figura 11 e Figura 12, S5-174-H3L2 refere-se ao anticorpo S5-174-H6; S5-G03-H3L1 refere-se ao anticorpo S5-G-03-H7; S5- 7A5.3 e S5-8A1.3 refere-se ao anticorpo 7A5 e 8A1, respectivamente, que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14.
[0515] Conforme mostrado na Figura 11, o anticorpo anti-Siglec-5 S5-G-03-H7 induziu a expressão de CD86 em MDSCs. Além disso, o meio condicionado após 48 horas de tratamento com anticorpo foi avaliado quanto a alterações na expressão de CCL4, um quimioatraente para células NK, monócitos e outras células imunes. A expressão de CCL4 foi medida usando um kit Quantikine ELISA (R&D Systems) ou por Human Chemokine Legendplex (Biolegend), de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 12. Conforme mostrado na Figura 12, o anticorpo anti-Siglec-5 S5-G-03-H7 também induziu a expressão de CCL4 nestas células.
[0516] Em uma série separada de experimentos, os anticorpos anti-Siglec-5 adicionais foram testados quanto à sua atividade em MDSCs usando um protocolo semelhante ao descrito acima. Os resultados desses estudos são mostrados na Figura 13 e Figura 14. Na Figura 13 e Figura 14, S5-7A5.3 e S5-8A1.3 referem-se ao anticorpo 7A5 e 8A1, respectivamente, que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14; S5-1A5 é um anticorpo que se liga a Siglec-5 e Siglec-14 (BioLegend).
[0517] Conforme mostrado na Figura 13 e Figura 14,o anticorpo anti-Siglec-5 S5-G10 induziu a expressão de CD86 e CCL4, respectivamente, enquanto outros anticorpos anti-Siglec 5 ou outros anticorpos anti-Siglec 5/14 não tiveram efeito. O efeito de S5-G10 na expressão de CD86 e CCL4 pode ser devido a propriedades únicas associadas ao compartimento de epítopo de S5- G10.
Exemplo 14: epítopos de anticorpo anti-Siglec-5
[0518] Os anticorpos Siglec-5 da presente divulgação foram testados quanto à sua capacidade de se ligar a peptídeos de 15 ou 25-mer abrangendo todo o domínio extracelular Siglec-5 humano. Os anticorpos Siglec- 5 também foram comparados a um anticorpo Siglec-5 de referência determinando sua região de ligação Siglec-5.
[0519] O binning de epítopos dos anticorpos foi realizado em um instrumento BiaCore T200. A análise dos dados foi realizada com o software de avaliação BiaCore T200, versão 2.0. HBS-EP+ (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, surfactante P20 0,05% v/v, pH 7,4) foi usado como tampão de corrida e para a preparação de reagentes. Siglec-5 humano, quimera Fc (10 nM; R&D Systems) foi capturado (tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de estabilização de 0 s) em um chip sensor CM5 (GE Healthcare) imobilizado com anti-Fc IgG humano. A amostra de anticorpo anti-Siglec 5 de camundongo (100 nM) foi então fluída sobre a superfície Siglec 5 capturada (tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de dissociação de 0 s), seguido por um anticorpo anti-Siglec 5 de camundongo de referência (100 nM, tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de dissociação de 30 s). A superfície do chip foi regenerada entre os ciclos usando 10 mM de glicina-HCl, pH 1,7 (tempo de contato de 60 s, taxa de fluxo de 30 μL/min, tempo de estabilização de 60 s). O sinal SPR resultante foi obtido como a diferença na resposta das medições realizadas em uma célula de fluxo em branco. Um controle de ligante zero (antígeno de 0 nM + IgG de 100 nM) não mostrou nenhuma ligação não específica significativa do anticorpo à superfície do chip sensor.
[0520] Peptídeos lineares de 15-mer foram sintetizados com base na sequência de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1), com uma sobreposição de 14 resíduos. Além disso, os peptídeos lineares de 25-mer foram sintetizados com base na sequência de Siglec-5 humano (SEQ ID NO: 1) com um único deslocamento de resíduo. A ligação dos anticorpos Siglec-5 a cada um dos peptídeos sintetizados foi testada em um método baseado em ELISA. Neste ensaio, as matrizes de peptídeos foram incubadas com solução de anticorpo primário (durante a noite a 4°C). Após a lavagem, as matrizes de peptídeos foram incubadas com uma diluição de 1/1000 de um conjugado de peroxidase de anticorpo (SBA, cat. Nr.2010-05) durante uma hora a 25°C. Após a lavagem, o substrato de peroxidase 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) e 2 µl/ml of 3% H2O2 foram adicionados. Após uma hora, o desenvolvimento da cor foi medido. O desenvolvimento da cor é quantificado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e um sistema de processamento de imagem.
[0521] Alternativamente, para reconstruir epítopos da molécula alvo, foram sintetizadas bibliotecas de peptídeos em alça e combinatórios . Um suporte de polipropileno funcionalizado com amino foi obtido por enxerto com uma formulação de polímero hidrofílico proprietária, seguido por reação com t- butiloxicarbonil-hexametilenodiamina (BocHMDA) usando di- ciclohexilcarbodiimida (DCC) com N-hidroxibenzotriazol (HOBt) e subsequente clivagem de grupos ácido bocluoroacético (TFA). A síntese de Fmoc-peptídeo padrão foi usada para sintetizar peptídeos no suporte sólido funcionalizado com amino por estações de manipulação de líquidos JANUS modificadas personalizadas (Perkin Elmer).
[0522] A síntese de mímicas estruturais foi feita usando a tecnologia patenteada Chemically Linked Peptides on Scaffolds (CLIPS) da Pepscan. A tecnologia CLIPS permite estruturar peptídeos em alças simples e alças duplas. Os modelos CLIPS são acoplados a resíduos de cisteína. As cadeias laterais de múltiplas cisteínas nos peptídeos são acopladas a um ou dois modelos CLIPS. Por exemplo, uma solução de 0,5 mM do mP2 CLIPS (2,6- bis(bromometil)piridina) é dissolvida em bicarbonato de amônio (20 mM, pH 7,8)/acetonitrila (1:3 (v/v)). Esta solução é adicionada às matrizes de peptídeos.
O modelo CLIPS se ligará às cadeias laterais de duas cisteínas, conforme presentes nos peptídeos ligados à fase sólida das matrizes de peptídeos (placa de 455 poços com poços de 3 µl). As matrizes de peptídeos são agitadas suavemente na solução durante 30 a 60 minutos enquanto estão completamente cobertas pela solução. Finalmente, as matrizes de peptídeos são lavadas extensivamente com excesso de H2O e sonicadas em tampão de ruptura contendo 1% de SDS/0,1% de β-mercaptoetanol em PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 minutos, seguido por sonicação em H2O por mais 45 minutos. Os peptídeos portadores de T3 CLIPS (2,4,6-tris(bromometil)piridina) foram feitos de maneira semelhante, mas agora com três cisteínas.
[0523] Peptídeos em alça: peptídeos restritos de comprimento 17.
As posições 2 a 16 são 15-mers derivadas da sequência alvo. Os resíduos Cys nativos são protegidos pelo grupo acetamidometil (ACM). As posições 1 e 17 são Cys que estão ligadas por frações mP2 CLIPS. Peptídeos combinatórios (miméticos descontínuos): peptídeos restritos de comprimento 33. As posições 2-16 e 18-32 são peptídeos de 15-mer derivados da sequência alvo com resíduos Cys nativos protegidos por ACM. As posições 1, 17 e 33 são Cys que estão ligadas por frações T3 CLIPS.
[0524] A ligação do anticorpo a cada um dos peptídeos sintetizados é testada em um ELISA baseado em PEPSCAN. As matrizes de peptídeos são incubadas com solução de anticorpo de teste composta da concentração otimizada experimentalmente do anticorpo de teste e solução de bloqueio (por exemplo 4% de soro de cavalo, 5% de ovalbumina (p/v) em PBS/1% de Tween80). As matrizes de peptídeos são incubadas com a solução de anticorpo de teste durante a noite a 4°C. Após extensa lavagem com tampão de lavagem (1 × PBS, 0,05% de Tween80), as matrizes de peptídeos são incubadas com uma diluição de 1/1000 de um conjugado de peroxidase de anticorpo apropriado por uma hora a 25°C. Após lavagem com o tampão de lavagem, o substrato de peroxidase 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) e 2 µl/ml de H2O2 a 3% são adicionados Após uma hora, o desenvolvimento da cor é medido. O desenvolvimento da cor é quantificado com um dispositivo de carga acoplada (CCD)- câmera e um sistema de processamento de imagem.
[0525] Conforme indicado na Tabela 10 abaixo, os anticorpos S5- G-10, S5-G-07, S5-PN202, S5/14 C2, S5/14-8A1.3, S5/14-REA383 mostraram ligação robusta com peptídeos lineares dentro dos domínios extracelulares (incluindo o domínio IgV e proximal ao segundo domínio do tipo C2 semelhante a Ig) de Siglec-5. Conforme indicado na Tabela 10, o peptídeo reconhecido pelo anticorpo S5/14-REA383 corresponde aos resíduos de aminoácidos 73-88 da SEQ ID NO: 1 e possui a sequência de aminoácidos de: PETQGRF (SEQ ID NO: 224). O peptídeo reconhecido pelo anticorpo S5/14-8A1.3 corresponde aos resíduos de aminoácidos 28-42 da SEQ ID NO: 1 e possui a sequência de aminoácidos PCSFSYPWRSWYSS (SEQ ID NO: 223). O peptídeo reconhecido pelo anticorpo S5/14-C2 corresponde aos resíduos de aminoácidos 136-142 da SEQ ID NO: 1 e possui a sequência de aminoácidos DIHFLEP (SEQ ID NO: 222).
[0526] O peptídeo reconhecido pelo anticorpo anti-Siglec-5 S5-PN 202 corresponde aos resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1 e possui a sequência de aminoácidos LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221). O peptídeo reconhecido pelo anticorpo anti-Siglec-5 S5-G-07 corresponde aos resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1 e possui a sequência de aminoácidos QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220). O peptídeo reconhecido pelo anticorpo anti-Siglec-5 S5-G-10 corresponde aos resíduos de aminoácidos 228-238 da SEQ ID NO: 1 e possui as sequências de aminoácidos ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219). Tomados em conjunto, estes resultados mostraram que os anticorpos anti-Siglec-5 específicos para Siglec-5 da presente divulgação se ligam a regiões em Siglec-5 que são distintas das regiões dentro de Siglec-5 de anticorpos que se ligam a Siglec-5 e Siglec-14.
Tabela 10 Número de Anticorpo BIN aminoácidos Sequência S5-G-10 4 228-238 ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219) S5-G-07 4 226-244 QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220) S5-PN 202 3 268-278 LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221) S5/14-C2 2 136-142 DIHFLEP (SEQ ID NO:222)
S5/14-8A1.3 1 28-42 PCSFSYPWRSWYSS (SEQ ID NO: 223) S5/14-REA393 1 73-88 PETQGRF (SEQ ID NO: 224)
[0527] CERTAS SEQUÊNCIAS: mAb 2G5: Região Variável de Cadeia Leve:
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPD
HLFTGLIGTTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNH LVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 212); mAb 2G5: Região Variável da Cadeia Pesada:
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQSHGK
SLEWIGYIDPYNGNTTYNQRFKGKATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDAAVYYC ATFYGFDGFAYWGQGSLVAVSA (SEQ ID NO: 213); mAb 7A5: Região Variável de Cadeia Leve:
DIVMIQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQ
SPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSFP LTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 214); mAb 7A5: Região Variável da Cadeia Pesada:
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASGYSFTDYNMYWVKQSHGK
SLEWIGYIDPYNGGTTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAFMHLNSLTSEDSAVFYC AFYYGYYGVPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 215); mAb 8A1: Região Variável de Cadeia Leve:
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTYVAWYQQKPGQ
SPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLNISNVQSEDLAEYFCQQFNSYP YTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 216); e mAb 8A1: Região Variável da Cadeia Pesada:
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASDYAFTSYNIYWVKQSHGK
SLEWIGYIDPYNGGTSYNQTFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYC AMKVGYEAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 217).

Claims (93)

REIVINDICAÇÕES
1. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 diminuir os níveis celulares de Siglec- 5, e em que o anticorpo não se liga a Siglec-14.
2. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 diminuir os níveis celulares de Siglec- 5, e em que o anticorpo anti-Siglec-5 não inibe a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5.
3. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 não inibir a interação entre Siglec-5 e um ou mais ligantes de Siglec-5.
4. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 diminuir os níveis de superfície celular de Siglec-5, diminuir os níveis intracelulares de Siglec-5, diminuir os níveis totais de Siglec-5, ou qualquer combinação dos mesmos.
5. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 induzir a degradação de Siglec-5, clivagem de Siglec-5, internalização de Siglec-5, liberação de Siglec-5, regulação negativa de Siglec-5 expressão, ou qualquer combinação dos mesmos.
6. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo anticorpo diminuir os níveis celulares de Siglec-5 in vivo.
7. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neutrófilos.
8. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 induzir a formação de redes extracelulares (NET, "neutrophil extracellular traps") em neutrófilos.
9. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 aumentar a atividade de fagocitose em macrófagos.
10. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 aumentar a expressão de CD86 em células supressoras derivadas da linhagem mieloide.
11. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 aumentar a expressão de CCL4 em células supressoras derivadas da linhagem mieloide.
12. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 inibir uma ou mais atividades de Siglec-5.
13. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado pelos níveis celulares de Siglec-5 serem medidos em células primárias selecionadas do grupo que consiste em células dendríticas, células dendríticas derivadas da medula óssea, monócitos, micróglia, macrófagos, neutrófilos, células B e células NK, ou em linhagens de células, e em que os níveis celulares de Siglec-5 são medidos utilizando um ensaio de células in vitro.
14. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 competir com um ou mais anticorpos selecionados do grupo que consiste em S5-172, S5-174, S5-175, S5- 176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-
H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos, pela ligação a Siglec-5.
15. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1, resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec 5 que corresponde aos resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1 e resíduos de aminoácidos 228-238 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácidos 228- 238 da SEQ ID NO: 1.
16. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a sequência de aminoácidos LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221), a sequência de aminoácidos QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220) e a sequência de aminoácidos ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219).
17. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada, ou ambos, compreendem pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas de HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174,
S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5 -G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174 -H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03 -H8 e S5-G-03-H9.
18. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por: (a) a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 103-115; (b) a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127-135; (c) a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 153-163; (d) a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20-28; (e) a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51; ou (f) a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79.
19. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 17 ou a reivindicação 18, caracterizado por: (a) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (b) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
128, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71;
(c) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
129, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72;
(d) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156, a
HVR -H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 342 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73;
(e) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
130, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74;
(f) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
131, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75;
(g) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70;
(h) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
132, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76;
(i) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
133, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77;
(j) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
134, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78;
(k) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
135, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79; (l) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (m) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71; ou (n) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77.
20. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve compreende: (a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 103-115, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas
SEQ ID NOs: 103-115;
(b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127-135, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas
SEQ ID NOs: 127-135; e
(c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 153-163, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas
SEQ ID NOs: 153-163; e em que o domínio variável de cadeia pesada compreende:
(a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20-28, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID
NOs: 20-28;
(b) uma HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID
NOs: 39-51; e
(c) uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID
NOs: 70-79.
21. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 194-211; e/ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 174-193.
22. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5 -175, S5-176, S5-182, S5-183, S5- 190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172 -H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5- 174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03- H2, S5-G-03-H3, S5 -G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G- 03-H8 e S5-G-03-H9, e/ou um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5 -G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172 -H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03- H5, S5-G-03-H6, S5 -G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G -03-H9.
23. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada, ou ambos, compreendem pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas dentre HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-
176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5 -G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174 -H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G -03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03 -H8 e S5-G-03-H9.
24. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por: (a) a HVR-L1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 103-115; (b) a HVR-L2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127-135; (c) a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 153-163; (d) a HVR-H1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20-28; (e) a HVR-H2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51; ou (f) a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79.
25. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 23 ou reivindicação 24 caracterizado por: (a) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (b) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 104, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
128, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71;
(c) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 105, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
129, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 155, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72;
(d) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 106, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 156, a
HVR -H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 73;
(e) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 107, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
130, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 157, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74;
(f) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 108, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
131, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 158, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75;
(g) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 109, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 159, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70;
(h) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 110, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
132, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 160, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 76;
(i) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
133, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77;
(j) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 112, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
134, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 162, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27, a HVR-
H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 78;
(k) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
135, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 163, a
HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 79; (l) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 153, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 70; (m) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 154, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 71; ou (n) a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 111, a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 133, a HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 161, a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 e a HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 77.
26. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo domínio variável de cadeia leve compreender: (a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 103-115, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 103-115;
(b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127-135, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127-135; e (c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 153-163, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 153-163; e em que o domínio variável de cadeia pesada compreende: (a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20-28, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20-28; (b) uma HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51; e (c) uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79.
27. ANTICORPO MONOCLONAL anti-Siglec-5 isolado caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 194-211 e/ou um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 174-193.
28. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172 -H2, S5-172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5- 174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5 -G- 03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9; e/ou um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172- H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172 -H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G- 03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5 -G-03-H7, S5- G-03-H8 e S5-G -03-H9.
29. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 competir com um ou mais anticorpos selecionados do grupo que consiste em S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5- 182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172- H2, S5- 172-H3, S5-172-H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5-174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174- H5, S5-174-H6, S5-174-H7, S5-174-H8, S5-G- 03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03- H4, S5-G-03-H5, S5-G-03-H6, S5- G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9, e qualquer combinação dos mesmos, pela ligação a Siglec-5.
30. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO caracterizado por se ligar essencialmente ao mesmo epítopo de Siglec-5 que um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em: S5-172, S5-174, S5-175, S5-176, S5-182, S5-183, S5-190, S5-202, S5-G-03, S5-G-07, S5-G-10, S5-172-H1, S5-172-H2, S5-172-H3, S5-172 -H4, S5-172-H5, S5-172-H6, S5- 174-H1, S5-174-H2, S5-174-H3, S5-174-H4, S5-174-H5, S5-174-H6, S5-174- H7, S5-174-H8, S5-G-03-H1, S5-G-03-H2, S5-G-03-H3, S5-G-03-H4, S5-G-03 - H5, S5-G-03-H6, S5-G-03-H7, S5-G-03-H8 e S5-G-03-H9.
31. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro dos resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácidos 268-278 da SEQ ID NO: 1, resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec 5 que corresponde aos resíduos de aminoácidos 226-244 da SEQ ID NO: 1 e resíduos de aminoácidos 228-238 da SEQ ID NO: 1 ou resíduos de aminoácidos em uma proteína Siglec-5 que correspondem aos resíduos de aminoácidos 228- 238 da SEQ ID NO: 1.
32. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 se ligar a um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: a sequência de aminoácidos LSWFQGSPALN (SEQ ID NO: 221), a sequência de aminoácidos QTITIFRNGIALEILQNTS (SEQ ID NO: 220) e a sequência de aminoácidos ITIFRNGIALE (SEQ ID NO: 219).
33. ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-SIGLEC-5 ISOLADO caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada, em que o domínio variável de cadeia leve compreende:
(a) uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 103-115, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas
SEQ ID NOs: 103-115;
(b) uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127-135, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas
SEQ ID NOs: 127-135; e
(c) uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 153-163, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas
SEQ ID NOs: 153-163; e em que o domínio variável de cadeia pesada compreende:
(a) uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 20-28, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID
NOs: 20-28;
(b) uma HVR-H2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 39-51; e
(c) uma HVR-H3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 90% de homologia com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 70-79.
34. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-33, caracterizado pelo anticorpo ser da classe IgG, classe IgM ou classe IgA.
35. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ter um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
36. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo anticorpo se ligar a um receptor Fc inibidor.
37. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo receptor Fc inibidor ser o receptor Fc-gama IIB (FcγIIB) inibidor.
38. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por: (a) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1 humano ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: N297A, D265A, D270A, L234A, L235A, G237A, P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G, A330R, C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E, P331S, S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T, T256E, N297Q, P238S, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, T394D, E430G, V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K, V305W e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos é de acordo com a numeração EU, ou compreende uma deleção de aminoácido na região Fc em uma posição correspondente à glicina 236;
(b) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1 e compreende um domínio constante de cadeia pesada 1 (CH1) e região de dobradiça do isotipo IgG2, opcionalmente, em que a CH1 e região de dobradiça do isotipo IgG2 compreende a sequência de aminoácidos de ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE
STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 218), e opcionalmente em que a região Fc do anticorpo compreende uma substituição de aminoácido S267E, uma substituição de aminoácido L328F, ou ambas, e/ou uma substituição de aminoácido N297A ou N297Q, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; (c) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2 e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, V309L, A330S, P331S, C214S, C232S, C233S, S267E, L328F, M252Y, S254T, T256E, H268E, N297A, N297Q, A330L, C127S, E430G, e qualquer combinação dos mesmos, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; (d) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG4 humano ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: L235A, G237A, S228P, L236E, S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T, T256E, E233P, F234V, L234A/F234A, S228P, S241P, L248E, T394D, N297A, N297Q, L235E e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; ou (e) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2/4 híbrido e, opcionalmente, em que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 118 a 260 da IgG2 humana e os aminoácidos 261 a 447 da IgG4 humana, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU.
39. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por: (a) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG1 humano ou de camundongo e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: N297A, N297Q, D270A, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; (b) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG2 e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E, C127S, E430G e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; ou (c) o anticorpo anti-Siglec-5 tem um isotipo IgG4 e compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc em uma posição de resíduo selecionada do grupo que consiste em: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU.
40. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por: (a) a região Fc compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais em uma posição selecionada do grupo que consiste em A330L, L234F; L235E, P331S e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração
EU; (b) a região Fc compreende adicionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais em uma posição selecionada do grupo que consiste em M252Y, S254T, T256E e qualquer combinação das mesmas, em que a numeração dos resíduos está de acordo com a numeração EU; ou (c) a região Fc compreende adicionalmente uma substituição de aminoácido S228P de acordo com a numeração EU.
41. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizado pelo anticorpo ter um isotipo IgG4.
42. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 compreender uma substituição de aminoácido S228P na posição de resíduo 228, uma substituição de aminoácido F234A na posição de resíduo 234 e uma substituição de aminoácido L235A na posição de resíduo 235, em que a numeração da posição do resíduo está de acordo com a numeração EU.
43. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-42, caracterizado pela proteína Siglec-5 ser uma proteína de mamífero ou uma proteína humana.
44. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-43 caracterizado pela proteína Siglec-5 ser uma proteína de tipo selvagem.
45. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-43, caracterizado pela proteína Siglec-5 ser uma variante de ocorrência natural.
46. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-45, caracterizado pela proteína Siglec-5 ser expressa em uma ou mais células selecionadas do grupo que consiste em células dendríticas humanas, macrófagos humanos, neutrófilos humanos, células NK humanas,
monócitos humanos, osteoclastos humanos, células T humanas, células T helper humanas, células T citotóxicas humanas, granulócitos humanos e micróglia humana.
47. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-46, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 se ligar especificamente a uma proteína Siglec-5 humana.
48. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser um fragmento de anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo resíduos de aminoácidos na proteína Siglec-5 humana.
49. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-48, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser um fragmento de anticorpo que se liga a uma ou mais proteínas humanas selecionadas do grupo que consiste em Siglec-5 humano, uma variante de ocorrência natural de Siglec-5 humano e uma variante de doença de Siglec-5 humano.
50. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 48 ou reivindicação 49, caracterizado pelo fragmento de anticorpo ser reticulado a um segundo fragmento de anticorpo que se liga a uma ou mais proteínas humanas selecionadas do grupo que consiste em Siglec-5 humano, uma variante de ocorrência natural de Siglec-5 humano e uma variante de doença de Siglec-5 humano.
51. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-50, caracterizado pelo fragmento ser um fragmento Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv ou scFv.
52. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-51, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser um anticorpo murino.
53. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-51, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser um anticorpo humanizado, um anticorpo biespecífico, um anticorpo multivalente, um anticorpo conjugado ou um anticorpo quimérico.
54. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-51, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser um anticorpo biespecífico que reconhece um primeiro antígeno e um segundo antígeno.
55. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo primeiro antígeno ser Siglec-5 e o segundo antígeno ser: (a) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica; (b) um antígeno que facilita o transporte através da barreira hematoencefálica selecionado do grupo que consiste em receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), proteínas relacionadas ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 e 2 (LPR-1 e 2), receptor da toxina diftérica, CRM197, um anticorpo de domínio único de lhama, TMEM 30(A), um domínio de transdução de proteína, TAT, Syn-B, penetratina, um peptídeo de poliarginina, um peptídeo de angiopep e ANG1005; (c) um agente causador de doenças selecionado do grupo que consiste em peptídeos ou proteínas causadores de doenças ou ácidos nucleicos causadores de doenças, em que os ácidos nucleicos causadores de doenças são RNA de expansão de repetição GGCCCC (G2C4) antisense (SEQ ID NO: 225), as proteínas causadoras de doenças são selecionadas do grupo que consiste em beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos da mesma, Tau, IAPP, alfa- sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína c9RAN, proteína príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpos de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteína AI, amiloide A sérica, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG associados à repetição (RAN), peptídeos de repetição de DiPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR); (d) ligantes e/ou proteínas expressos em células imunes, em que os ligantes e/ou proteínas são selecionados do grupo que consiste em PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA, KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73 e fosfatidilserina; e (e) uma proteína, lipídio, polissacarídeo ou glicolipídeo expresso em uma ou mais células tumorais.
56. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-53, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser um anticorpo conjugado.
57. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser conjugado a um marcador detectável, uma toxina ou um agente terapêutico.
58. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser conjugado a uma toxina selecionada do grupo que consiste em ricina, cadeia A de ricina, doxorrubicina,
daunorrubicina, um maitansinoide, taxol, brometo de etídio, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracina diona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retictocina, enomicina, curicina, crotina, caliqueamicina, inibidor de Saponaria officinalis, glicocorticoide, auristatina, auromicina, ítrio, bismuto, combrestatina, duocarmicinas, dolastatina, cc1065 e uma cisplatina.
59. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-58, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ser usado em combinação com um ou mais anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína causadora de doença selecionada do grupo que consiste em beta amiloide, beta amiloide oligomérica, placas de beta amiloide, proteína precursora de amiloide ou fragmentos da mesma, Tau, IAPP, alfa-sinucleína, TDP-43, proteína FUS, C9orf72 (quadro de leitura aberto 72 do cromossomo 9), proteína de príon, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutase, ataxina, ataxina 1, ataxina 2, ataxina 3, ataxina 7, ataxina 8, ataxina 10, corpos de Lewy, fator natriurético atrial, polipeptídeo amiloide das ilhotas, insulina, apolipoproteína AI, amiloide A sérica, medsoina, prolactina, transtirretina, lisozima, beta 2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadeia leve de imunoglobulina AL, proteína S-IBM, produtos de tradução não ATG associados à repetição (RAN), peptídeos de repetição de diPeptídeo (DPR), peptídeos de repetição de glicina-alanina (GA), peptídeos de repetição de glicina-prolina (GP), peptídeos de repetição de glicina-arginina (GR), peptídeos de repetição de prolina-alanina (PA), ubiquitina e peptídeos de repetição de prolina-arginina (PR) e qualquer combinação das mesmas; ou com um ou mais anticorpos que se ligam a uma proteína imunomoduladora selecionada do grupo que consiste em: PD1/PDL1, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, LIGHT, BTLA, CD30, TIGIT, VISTA,
KIR, GAL9, TIM1, TIM3, TIM4, A2AR, LAG3, DR-5, CD2, CD5, CD39, CD73, TREM1, TREM2, CD33, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, fosfatidilserina, ácidos nucleicos causadores de doenças, RNA de expansão de repetição GGCCCC (G2C4) antisense (SEQ ID NO: 225) e qualquer combinação das mesmas.
60. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ter constante de dissociação (KD) para Siglec-5 humano e Siglec-5 de mamífero que varia de cerca de 0,42 nM a cerca de 79 nM, em que a KD é determinada a uma temperatura de aproximadamente 25ºC.
61. ANTICORPO anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo anticorpo anti-Siglec-5 ter constante de dissociação (KD) para Siglec-5 humano que varia de cerca de 79 nM a cerca de 61 nM, de cerca de 15 nM a cerca de 5,3 nM, ou de cerca de 1,7 nM a cerca de 0,42 nM, em que a KD é determinada a uma temperatura de aproximadamente 25ºC.
62. ÁCIDO NUCLEICO isolado caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
63. VETOR caracterizado por compreender o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 62.
64. CÉLULA HOSPEDEIRA isolada caracterizada por compreender o vetor de acordo com a reivindicação 63.
65. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO anti- Siglec-5, caracterizado por compreender a cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 64, de modo que o anticorpo anti-Siglec-5 seja produzido.
66. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado por compreender adicionalmente recuperar o anticorpo anti-Siglec-5 produzido pela célula hospedeira.
67. ANTICORPO anti-Siglec-5 isolado caracterizado por ser produzido pelo método de acordo com a reivindicação 65 ou a reivindicação 66.
68. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender o anticorpo anti-Siglec-5, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
69. MÉTODO DE PREVENÇÃO, redução do risco ou tratamento de uma doença, distúrbio ou lesão selecionada do grupo que consiste em demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença tipo taupatia, infecções e câncer, caracterizado por compreender a administração, a um indivíduo em necessidade, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti- Siglec-5 de qualquer uma das reivindicações 1-61.
70. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo câncer expressar Siglec-5 ou um ou mais ligantes de Siglec-5.
71. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 69 ou a reivindicação 70, caracterizado pelo câncer ser selecionado do grupo que consiste em câncer de bexiga, câncer de cérebro, câncer de mama, câncer de cólon, câncer do reto, câncer do endométrio, câncer renal, câncer de células renais, câncer da pelve renal, leucemia, câncer de pulmão, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de ovário, fibrossarcoma, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (LMC) e mieloma múltiplo.
72. MÉTODO PARA INDUZIR OU PROMOVER A SOBREVIDA, maturação, funcionalidade, migração ou proliferação de uma ou mais células imunes em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
73. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado por uma ou mais células imunes serem selecionadas do grupo que consiste em células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células NK, micróglia, células T, células T helper, células T citotóxicas e qualquer combinação das mesmas.
74. MÉTODO PARA DIMINUIR A ATIVIDADE, funcionalidade ou sobrevida de células T reguladoras, células dendríticas imunossupressoras incorporadas ao tumor, macrófagos imunossupressores incorporados ao tumor, células supressoras derivadas da linhagem mieloide, macrófagos associados ao tumor, células de leucemia mieloide aguda (LMA), células de leucemia linfocítica crônica (LLC), ou células de leucemia mieloide crônica (LMC) em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
75. MÉTODO PARA DIMINUIR OS NÍVEIS CELULARES de Siglec-5 em uma ou mais células em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-Siglec-5 isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
76. MÉTODO PARA INDUZIR A PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS de oxigênio (ROS) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
77. MÉTODO PARA INDUZIR A FORMAÇÃO DE NEUTROPHIL EXTRACELLULAR TRAP (NET) em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender, a administração, ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti- Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
78. MÉTODO PARA INDUZIR A ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS em um ou mais neutrófilos em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
79. MÉTODO PARA ATENUAR UM OU MAIS NEUTRÓFILOS IMUNOSSUPRIMIDOS em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
80. MÉTODO PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE FAGOCITOSE em macrófagos em um indivíduo em necessidade, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-Siglec-5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-61.
81. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69-80, caracterizado por compreender ainda a administração, ao indivíduo, de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de checkpoint inibidora e/ou uma ou mais terapias anticâncer padrão ou experimentais.
82. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado por pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de checkpoint inibidora é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-
5.
83. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 81 ou reivindicação 82, caracterizado por pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de checkpoint inibidora é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-L2, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo anti-B7-H4 e um anticorpo anti-HVEM, um anticorpo anti-atenuador de linfócitos B e T (BTLA), um anticorpo anti-receptor inibidor de Killer (KIR), um anticorpo anti-GAL9, um anticorpo anti-TIM-1, um anticorpo anti-TIM3, um anticorpo anti-TIM-4, um anticorpo anti-A2AR, um anticorpo anti-CD39, um anticorpo anti-CD73, um anticorpo anti-LAG-3, um anticorpo anti-fosfatidilserina, um anticorpo anti-CD27, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-TNFa, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-Siglec-6, um anticorpo anti-Siglec-7, um anticorpo anti-Siglec-9, um anticorpo anti-Siglec-10, um anticorpo anti-Siglec-11, um anticorpo anti-TREM1 antagonista, um anticorpo anti-TREM2 antagonista, e qualquer combinação dos mesmos.
84. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado por uma ou mais terapias anticâncer padrão ou experimentais serem selecionadas do grupo que consiste em radioterapia, quimioterapia citotóxica, terapia direcionada, terapia com imatinibe, terapia com trastuzumabe, terapia com etanercepte, terapia de transferência adotiva de células (ACT), terapia de transferência de células T com receptor de antígeno quimérico (CAR-T), terapia com vacina e terapia com citocinas.
85. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69-84, caracterizado por compreender ainda a administração, ao indivíduo, de pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora.
86. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5.
87. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 85 ou reivindicação 86, caracterizado por o pelo menos um anticorpo que se liga especificamente a uma citocina inibidora é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-CCL2, um anticorpo anti-CSF-1, um anticorpo anti-IL-2 e qualquer combinação dos mesmos.
88. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69-87, caracterizado por compreender ainda a administração, ao indivíduo, de pelo menos um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimuladora.
89. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado por pelo menos um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimuladora é administrado em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5.
90. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 88 ou reivindicação 89, caracterizado por pelo menos um anticorpo agonista que se liga especificamente a uma proteína de checkpoint estimuladora é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD40 agonista, um anticorpo anti- OX40 agonista, um anticorpo anti-ICOS agonista, um anticorpo anti-CD28 agonista, um anticorpo anti-TREM1 agonista, um anticorpo anti-TREM2 agonista, um anticorpo anti-CD137/4-1BB agonista, um anticorpo anti-CD27 agonista, um anticorpo anti-proteína relacionada a TNFR induzida por glicocorticoide (GITR) agonista, um anticorpo anti-BTLA agonista, um anticorpo HVEM agonista, um anticorpo anti-CD30 agonista, um anticorpo anti-CD2 agonista, um anticorpo anti-CD5 agonista e qualquer combinação dos mesmos.
91. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 69-90, caracterizado por compreender ainda a administração, ao indivíduo, de pelo menos uma citocina estimuladora.
92. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado por pelo menos uma citocina estimuladora ser administrada em combinação com o anticorpo anti-Siglec-5.
93. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 91 ou a reivindicação 92, caracterizado por pelo menos uma citocina estimuladora ser selecionada do grupo que consiste em IFN-4, IFN-, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, CRP, membros da família IL-20, LIF, IFN-gama, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, CXCL10, IL-33, MCP-1, MIP-1-beta e qualquer combinação dos mesmos.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190248A1 (ar) 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
EP3625258A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Alector LLC Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
CN113122575B (zh) * 2021-05-07 2023-02-28 华中科技大学同济医学院附属梨园医院 siglec-5、基因表达拮抗剂或蛋白活性拮抗剂的应用
CA3233089A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Advantigen Biosciences, Llc Siglec receptor check point inhibitors and method of using them to inhibit neoplastic cell growth

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2102511A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 Paul J. Higgins Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69316369D1 (en) 1992-07-27 1998-02-19 Hybridon Inc Oligonukleotid alkylphosphonothiate
AU668423B2 (en) 1992-08-17 1996-05-02 Genentech Inc. Bispecific immunoadhesins
EP0680489A1 (en) 1993-01-21 1995-11-08 HYBRIDON, Inc. Foldback triplex-forming oligonucleotides
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5962674A (en) 1995-06-01 1999-10-05 Hybridon, Inc. Synthesis of oligonucleotides containing alkylphosphonate internucleoside linkages
US5614622A (en) 1995-06-01 1997-03-25 Hybridon, Inc. 5-pentenoyl moiety as a nucleoside-amino protecting group, 4-pentenoyl-protected nucleotide synthons, and related oligonucleotide syntheses
US5955599A (en) 1995-06-01 1999-09-21 Hybridon, Inc. Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
US6140482A (en) 1995-06-01 2000-10-31 Hybridon, Inc. Primary phosphoramidate internucleoside linkages and oligonucleotides containing the same
US5637683A (en) 1995-07-13 1997-06-10 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid analog with amide linkage and method of making that analog
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
JP2002514895A (ja) 1995-09-28 2002-05-21 アレクション、ファーマスーティカルズ、インコーポレーテッド ブタ細胞相互作用タンパク質
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
US6117992A (en) 1996-08-26 2000-09-12 Hybridon, Inc. Reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages
US5886165A (en) 1996-09-24 1999-03-23 Hybridon, Inc. Mixed backbone antisense oligonucleotides containing 2'-5'-ribonucleotide- and 3'-5'-deoxyribonucleotides segments
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US5739314A (en) 1997-04-25 1998-04-14 Hybridon, Inc. Method for synthesizing 2'-O-substituted pyrimidine nucleosides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
DK1163250T3 (da) 1999-03-24 2006-11-13 Exiqon As Forbedret syntese af [2.2.1]bicyclonukleosider
KR20010001577A (ko) 1999-06-07 2001-01-05 윤종용 고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법
AU6629200A (en) 1999-08-25 2001-03-19 Philip P Garner Alpha-helical peptide nucleic acid alpha-pna
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2002008257A2 (en) 2000-07-21 2002-01-31 Bristol-Myers Squibb Company Siglec (sialic acid-binding ig-related lectin) polypeptides and uses thereof
US6455308B1 (en) 2001-08-01 2002-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of serum amyloid A4 expression
JP2006504971A (ja) 2002-11-01 2006-02-09 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・コロラド，ア・ボディー・コーポレイト マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析によるタンパク質アイソフォームの定量的解析
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
EP1995321A2 (en) * 2005-08-15 2008-11-26 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP2001490A1 (en) 2006-03-15 2008-12-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients by an inhibitor of complement
US20070244038A1 (en) 2006-04-12 2007-10-18 The Regents Of The University Of California Methods for treating lymphocyte-associated disorders by modulation of siglec activity
UY30776A1 (es) 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
CN103396489A (zh) * 2007-02-23 2013-11-20 默沙东公司 工程改造的抗IL-23p19抗体
AU2008298603B2 (en) 2007-09-14 2015-04-30 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
WO2010002862A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
DK2593594T3 (en) 2010-07-16 2017-12-11 Adimab Llc ANTIBODY LIBRARIES
SG10201913611QA (en) * 2014-08-08 2020-03-30 Alector Llc Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
AU2016276981B2 (en) * 2015-06-12 2022-10-06 Alector Llc Anti-CD33 antibodies and methods of use thereof
CA2996059A1 (en) * 2015-08-28 2017-03-09 Alector Llc Anti-siglec-7 antibodies and methods of use thereof
EP3625258A1 (en) * 2017-05-16 2020-03-25 Alector LLC Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof

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