BR112021000695A2 - métodos para tratar hemofilia a e para monitorar a eficácia da terapia gênica de fator viii de hemofilia a. - Google Patents

métodos para tratar hemofilia a e para monitorar a eficácia da terapia gênica de fator viii de hemofilia a. Download PDF

Info

Publication number
BR112021000695A2
BR112021000695A2 BR112021000695-8A BR112021000695A BR112021000695A2 BR 112021000695 A2 BR112021000695 A2 BR 112021000695A2 BR 112021000695 A BR112021000695 A BR 112021000695A BR 112021000695 A2 BR112021000695 A2 BR 112021000695A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
factor viii
patient
prednisolone
time point
prednisone
Prior art date
Application number
BR112021000695-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Hanspeter Rottensteiner
Werner Hoellriegl
Original Assignee
Baxalta Incorporated
Baxalta GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxalta Incorporated, Baxalta GmbH filed Critical Baxalta Incorporated
Publication of BR112021000695A2 publication Critical patent/BR112021000695A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

MÉTODOS PARA TRATAR HEMOFILIA A E PARA MONITORAR A EFICÁCIA DA TERAPIA GÊNICA DE FATOR VIII DE HEMOFILIA A REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS. A presente divulgação fornece, entre outros aspectos, polinucleotídeos com alteração de códon que codificam variantes de Fator VIII para expressão em células de mamífero. Em algumas modalidades, a divulgação também fornece vetores de terapia gênica de mamíferos e métodos para tratar hemofilia A. Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para dosar um paciente com hemofilia A com um polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo com alteração de códon, que codifica um polipeptídeo de Fator VIII.

Description

1 / 85
MÉTODOS PARA TRATAR HEMOFILIA A E PARA MONITORAR A EFICÁCIA DA TERAPIA GÊNICA DE FATOR VIII DE HEMOFILIA A REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório no de série U.S. 62/698.680, depositado em 16 de julho de 2018, e reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório no de série U.S. 62/867.171, depositado em 26 de junho de 2019, ambos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência em suas totalidades.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. A referida cópia de ASCII, criada em 15 de julho de 2019, é denominada 008073_5202_WO_Sequence_Listing.txt e tem 85000 bytes de tamanho.
FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO
[003] A coagulação sanguínea prossegue através de uma trajetória biológica complexa e dinâmica de reações bioquímicas interdependentes, denominada cascata de coagulação. O Fator de Coagulação VIII (FVIII) é um componente chave na cascata. O Fator VIII é recrutado a sítios de sangramento e forma um complexo Xase com Fator IX (FIXa) e Fator X (FX) ativados. O complexo Xase ativa FX, que, por sua vez, ativa pró-trombina em trombina, que, então, ativa outros componentes na cascata de coagulação para gerar um coágulo estável (analisado em Saenko et al., Trends Cardiovasc. Med., 9:185-192 (1999); Lenting et al., Blood, 92:3983-3996 (1998)).
[004] A hemofilia A é um distúrbio de sangramento ligado a X congênito caracterizado por uma deficiência em atividade de Fator VIII. A atividade de Fator VIII diminuída inibe um circuito de retroalimentação positivo na cascata de coagulação. Isto causa coagulação incompleta, que se
2 / 85 manifesta como episódios de sangramento com duração aumentada, hematomas extensivos, sangramento oral e nasal espontâneo, rigidez nas articulações e dor crônica e, possivelmente, sangramento interno e anemia em diversos casos (Zhang et al., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-124 (2009)).
[005] Convencionalmente, a hemofilia A é tratada por terapia de reposição de Fator VIII, que consiste em administrar proteína de Fator VIII (por exemplo, Fator VIII derivado de plasma ou recombinantemente produzido) a um indivíduo com hemofilia A. O Fator VIII é administrado profilaticamente para impedir ou reduzir a frequência de episódios de sangramento, em resposta a um episódio de sangramento agudo e/ou perioperativamente para controlar sangramento durante cirurgia. Entretanto, há diversas características indesejáveis da terapia de reposição de Fator VIII.
[006] Em primeiro lugar, a terapia de reposição de Fator VIII é usada para tratar ou controlar hemofilia A, mas não curar a deficiência de Fator VIII subjacente. Por causa disto, os indivíduos com hemofilia A precisam de terapia de reposição de Fator VIII pela duração de suas vidas. O tratamento contínuo é dispendioso e exige que o indivíduo mantenha adesão estrita, visto que perder apenas algumas doses profiláticas pode ter consequências sérias para os indivíduos com hemofilia A grave.
[007] Em segundo lugar, devido ao fato de que o Fator VIII tem uma meia-vida relativamente curta in vivo, a terapia de substituição de Fator VIII profilática convencional exige administração a cada segundo ou terceiro dia. Isto coloca um fardo sobre o indivíduo para manter a adesão por toda sua vida. Enquanto os fármacos de Fator VIII “de longa atuação” de terceira geração podem reduzir a frequência de administração, a terapia de reposição de Fator FVIII profilática com estes fármacos ainda exige administração mensal, semanal ou mais frequente perpetuamente. Por exemplo, o tratamento profilático com ELOCTATE™ [Fator Anti-hemofílico (Recombinante),
3 / 85 Proteína de Fusão Fc] exige administração a cada três a cinco dias (Informações de Prescrição do ELOCTATE™, Biogen Idec Inc., (2015)). Além disto, os efeitos a longo prazo de produtos biológicos quimicamente modificados (por exemplo, polipeptídeos peguilados) não são ainda completamente entendidos.
[008] Em terceiro lugar, entre 15% e 30% de todos os indivíduos que recebem terapia de substituição de Fator VIII formam anticorpos inibidores anti-Fator VIII, tornando a terapia ineficiente. A terapia de desvio de Fator VIII (por exemplo, administração de concentrados de complexo de protrombina derivados de plasma ou recombinantemente produzidos) pode ser usada para tratar hemofilia em indivíduos que formam anticorpos inibidores. Entretanto, a terapia de desvio de Fator VIII é menos eficaz do que a terapia de substituição de Fator VIII (Mannucci P.M., J Thromb Haemost., 1(7):1349-55 (2003)) e pode estar associada a um risco aumentado de complicação cardiovascular (Luu e Ewenstein, Haemophilia, 10 Suppl. 2:10- 16 (2004)).
[009] A terapia gênica somática é uma grande promessa para o tratamento de hemofilia A devido ao fato de que poderia remediar a subexpressão subjacente de atividade de Fator VIII funcional (por exemplo, devido a mutações com troca de sentido ou sem sentido), em vez de fornecer uma dose única de atividade de Fator VIII ao indivíduo. Por causa desta diferença no mecanismo de ação, em comparação à terapia de substituição de Fator VIII, a administração única de um vetor de terapia gênica de Fator VIII pode fornecer um indivíduo com Fator VIII por diversos anos, reduzindo o custo de tratamento e eliminando a necessidade de adesão do paciente ao tratamento continuada.
[0010] A terapia gênica de Fator de coagulação IX (FIX) foi usada efetivamente para tratar indivíduos com hemofilia B, uma afecção de coagulação de sangue relacionada caracterizada pela atividade de Fator IX
4 / 85 diminuída (Manno C.S., et al., Nat Med., 12(3):342-47 (2006)). Entretanto, a terapia gênica de Fator VIII apresenta diversos desafios exclusivos. Por exemplo, o polipeptídeo de Fator VIII do tipo selvagem de comprimento completo (2351 aminoácidos; número de acesso ao UniProt P00451) é cinco vezes maior do que o polipeptídeo de Fator IX do tipo selvagem de comprimento completo (461 aminoácidos; número de acesso ao UniProt P00740). Deste modo, a sequência de codificação do Fator VIII do tipo selvagem são 7053 pares de base, o que é grande demais para ser encapsulado em vetores de terapia gênica de AAV convencional. Ademais, a expressão recombinante relatada de variantes deletados de domínio B do Fator VIII (BDD-FVIII) foi pobre. Deste modo, diversos grupos tentaram alterar o uso de códon de construtos de BDD-FVIII, com sucesso limitado.
BREVE SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO
[0011] Consequentemente, há uma necessidade de variantes de Fator VIII cujas sequência de codificação são mais eficientemente encapsuladas em, e entregues por meio de, vetores de terapia gênica. Há também uma necessidade de ácidos nucleicos com alteração de códon sintéticos que expressam Fator VIII mais eficientemente. Tais variantes de Fator VIII e ácidos nucleicos com alteração de códon permitem o tratamento melhorado de deficiências de Fator VIII (por exemplo, hemofilia A). As deficiências acima e outros problemas associados ao tratamento de deficiências de Fator VIII (por exemplo, hemofilia A) são reduzidas ou eliminadas pelas variantes de Fator VIII com alteração de códon divulgadas.
[0012] De acordo com algumas modalidades, a presente divulgação fornece ácidos nucleicos que codificam variantes de Fator VIII que têm alta identidade de sequência com as sequências com alteração de códon divulgadas da cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA) e cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA) de Fator VIII. Em algumas modalidades, estes ácidos nucleicos incluem, ainda, uma sequência que codifica uma sequência
5 / 85 ligante que substitui o domínio B de Fator VIII nativo (por exemplo, uma sequência ligante que compreende um sítio de clivagem de furina), entre as sequências que codificam as cadeias pesada e leve de Fator VIII.
[0013] Num aspecto, a divulgação fornece um polinucleotídeo incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de Fator VIII. O polipeptídeo de Fator VIII inclui uma cadeia leve, uma cadeia pesada e um ligante de polipeptídeo unindo a terminação C da cadeia pesada à terminação N da cadeia leve. A cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma primeira sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade com CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3). A cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII é codificada por uma segunda sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade com CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4). O ligante de polipeptídeo compreende um sítio de clivagem de furina.
[0014] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o ligante de polipeptídeo é codificado por uma terceira sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5).
[0015] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII tem pelo menos 96% de identidade com a respectiva sequência de cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII tem pelo menos 96% de identidade com a respectiva sequência de cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)).
[0016] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII tem pelo menos 97% de identidade com a
6 / 85 respectiva sequência de cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII tem pelo menos 97% de identidade com a respectiva sequência de cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)).
[0017] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII tem pelo menos 98% de identidade com a respectiva sequência de cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII tem pelo menos 98% de identidade com a respectiva sequência de cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)).
[0018] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII tem pelo menos 99% de identidade com a respectiva sequência de cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII tem pelo menos 99% de identidade com a respectiva sequência de cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)).
[0019] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII tem pelo menos 99,5% de identidade com a respectiva sequência de cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII tem pelo menos 99,5% de identidade com a respectiva sequência de cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)).
7 / 85
[0020] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII tem pelo menos 99,9% de identidade com a respectiva sequência de cadeia pesada (por exemplo, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3)), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII tem pelo menos 99,9% de identidade com a respectiva sequência de cadeia leve (por exemplo, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4)).
[0021] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a primeira sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII é CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), e a segunda sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve do polipeptídeo de Fator FVIII é CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4).
[0022] Num aspecto, a divulgação fornece um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% de identidade com CS04-FL-NA, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII.
[0023] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com a respectiva sequência de polinucleotídeos de comprimento completo (por exemplo, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)).
[0024] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com a respectiva sequência de polinucleotídeos de comprimento completo (por exemplo, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)).
[0025] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com a respectiva sequência de polinucleotídeos de comprimento completo (por exemplo, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)).
8 / 85
[0026] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99% de identidade com a respectiva sequência de polinucleotídeos de comprimento completo (por exemplo, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)).
[0027] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com a respectiva sequência de polinucleotídeos de comprimento completo (por exemplo, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)).
[0028] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,9% de identidade com a respectiva sequência de polinucleotídeos de comprimento completo (por exemplo, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1)).
[0029] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos é CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1).
[0030] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0031] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 96% de identidade com CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0032] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade com CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0033] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 98% de identidade com CS04-
9 / 85 FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0034] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade com CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0035] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99,5% de identidade com CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0036] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99,9% de identidade com CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0037] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de Fator VIII que compreende a sequência de aminoácidos de CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[0038] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0039] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0040] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0041] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a
10 / 85 sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0042] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0043] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0044] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04- HC-NA e CS04-LC-NA.
[0045] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, a sequência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em CS04-FL-NA, CS04-HC-NA e CS04-LC-NA.
[0046] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo também inclui um elemento promotor ligado de maneira funcional ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII.
[0047] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo também inclui um elemento intensificador de maneira funcional ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII.
[0048] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o polinucleotídeo também inclui um elemento de poliadenilação ligado de maneira funcional ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII.
[0049] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o
11 / 85 polinucleotídeo também inclui um íntron ligado de maneira funcional à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de Fator VIII.
[0050] Numa modalidade dos polinucleotídeos descritos acima, o íntron é posicionado entre um elemento promotor e o sítio de iniciação de tradução (por exemplo, o primeiro ATG de codificação) da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de Fator VIII.
[0051] Em outro aspecto, a divulgação fornece um vetor de terapia gênica de mamífero incluindo um polinucleotídeo conforme descrito acima.
[0052] Numa modalidade do vetor de terapia gênica de mamífero descrito acima, o vetor de terapia gênica de mamífero é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
[0053] Numa modalidade do vetor de terapia gênica de mamífero descrito acima, o vetor de AAV é um vetor de AAV-8.
[0054] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para tratar hemofilia A que inclui administrar, a um paciente que precisa do mesmo, um vetor de terapia gênica de mamífero conforme descrito acima.
[0055] Em outro aspecto, a divulgação fornece um vetor de terapia gênica de mamífero conforme descrito acima para tratar hemofilia A.
[0056] Em outro aspecto, a divulgação fornece o uso de um vetor de terapia gênica de mamífero conforme descrito acima para a fabricação de um medicamento para tratar hemofilia A.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0057] A Figura 1 mostra ilustrações esquemáticas dos construtos de proteína de Fator VIII humanos do tipo selvagem e do tipo ReFacto.
[0058] As Figuras 2A e 2B mostram a sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS04 (SEQ ID NO: 1) que codificam uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CS04-FL-NA” para sequência de codificação de comprimento completo).
[0059] A Figura 3 mostra a sequência de aminoácidos variante de
12 / 85 Fator VIII (SEQ ID NO: 2) codificada pela sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS04 de acordo com algumas modalidades (“CS04-FL- AA” para a sequência de aminoácidos de comprimento completo).
[0060] A Figura 4 mostra a porção da sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS04 (SEQ ID NO: 3) que codifica a cadeia pesada de uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CS04-HC- NA”).
[0061] A Figura 5 mostra a porção da sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS04 (SEQ ID NO: 4) que codifica a cadeia leve de uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CS04-LC- NA”).
[0062] A Figura 6 mostra uma sequência de codificação exemplificativa (SEQ ID NO: 5) para um ligante com domínio B substituído de acordo com algumas modalidades. BDLO04 (SEQ ID NO: 5) é a respectiva porção da sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS04 que codifica um ligante com domínio B substituído.
[0063] As Figuras 7A, 7B e 7C mostram uma sequência de vetor de AAV (SEQ ID NO: 8) contendo uma sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS04 de acordo com algumas modalidades (“CS04-AV- NA”).
[0064] As Figuras 8A e 8B mostram a sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS08 (SEQ ID NO: 7) que codifica uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CS08-FL-NA”).
[0065] As Figuras 9A e 9B mostram a sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS10 (SEQ ID NO: 8) que codifica uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CS10-FL-NA”).
[0066] As Figuras 10A e 10B mostram a sequência de nucleotídeos com alteração de códon CS11 (SEQ ID NO: 9) que codifica uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CS11-FL-NA”).
13 / 85
[0067] As Figuras 11A e 11B mostram a sequência de codificação ReFacto do tipo selvagem CS40 (SEQ ID NO: 10), de acordo com algumas modalidades (“CS40-FL-NA”).
[0068] As Figuras 12A e 12B mostram a sequência de nucleotídeos com alteração de códon CH25 (SEQ ID NO: 11) que codifica uma variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades (“CH25-FL-NA”).
[0069] A Figura 13 mostra uma sequência de aminoácidos de Fator VIII humana do tipo selvagem (SEQ ID NO: 12), de acordo com algumas modalidades (“FVIII-FL-AA”).
[0070] A Figura 14 ilustra o esquema para clonar os construtos pCS40, pCS04, pCS08, pCS1O, pCS11 e pCh25, inserindo-se sequências de DNA de BDD-FVIII do tipo Refacto sintéticas na cadeia principal de vetor pCh-BBO1 por meio dos sítios de restrição AscI e NotI.
[0071] A Figura 15 mostra a integridade de preparações de genoma de vetor de AAV, conforme analisado por eletroforese em gel de agarose. Raia 1, marcador de DNA; raia 2, vCS40; raia 4, vCS04. Os vetores de AAV têm todos os genomas de tamanho igual, migrando a aproximadamente 5 kb (seta, lado direito). A escala no lado esquerdo indica o tamanho dos fragmentos de DNA em quilobases (kb).
[0072] A Figura 16 mostra a análise de proteína de preparações de vetor de AAV por PAGE e manchamento de prata. Raia 1, marcador de proteína (M); raia 2, vCS40; e raia 4, vCS04. Os construtos têm, todos, os mesmos capsídeos de AAV8 que consistem em VP1, VP2 e VP3 (setas, lado direito). A escala no lado esquerdo indica o tamanho do marcador de proteína em quilodaltons (kDa).
[0073] A Figura 17 mostra a atividade de FVIII após a administração sistêmica de um vetor de terapia gênica com base em (r)AAV8 contendo o construto com otimização de códon de Fator VIII CS04, conforme descrito no
3. cp, partículas de capsídeo de vetor; FVIII, fator VIII; LLOQ, limite inferior
14 / 85 de quantificação. Pontos de tempo de 14, 28, 42 e 56 dias são mostrados da esquerda para direita no gráfico.
[0074] A Figura 18 mostra perda de sangue reduzida, num ensaio de sangramento de ponta de cauda, após a administração sistêmica de um vetor de terapia gênica com base em (r)AAV8 contendo o construto com otimização de códon de Fator VIII CS04, conforme descrito no Exemplo 3. cp, partículas de capsídeo de vetor.
[0075] As Figuras 19A, 19B e 19C mostram a biodistribuição do vetor de terapia gênica com base em (r)AAV8 contendo o DNA de construto com otimização de códon de Fator VIII CS04 após a administração sistêmica. 1902 = fígado; 1904 = linfonodo; 1906 = músculo esquelético; 1908 = coração; 1910 = rim; 1912 = baço; 1914 = pulmão; 1916 = testículo; 1918 = cérebro.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO I. INTRODUÇÃO
[0076] A terapia gênica à base de AAV é uma grande promessa para o tratamento de hemofilia. Para hemofilia B, os primeiros dados clínicos são encorajadores pelo fato de que níveis de FIX de cerca de 10% podem ser mantidos em pelo menos alguns pacientes por mais de 1 ano. Para hemofilia A, entretanto, alcançar níveis de expressão terapêuticos de 5 a 10% com vetores de AAV permanece sendo desafiador por várias razões. Em primeiro lugar, a sequência de codificação de Fator VIII é muito grande para vetores à base de AAV convencionais. Em segundo lugar, construtos de Fator VIII com domínio B deletado ou truncado geneticamente modificados sofrem de uma expressão pobre in vivo, mesmo quando sofrem otimização de códon. Em terceiro lugar, estes construtos variantes de Fator VIII com domínio B deletado ou truncado têm meias-vidas curtas in vivo, exacerbando os efeitos da expressão pobre. Em quarto lugar, mesmo quando expresso, o FVIII não é eficientemente secretado das células, como são outros fatores de coagulação,
15 / 85 tais como Fator IX. Portanto, as estratégias para melhorar a expressão de FVIII são necessárias para tornar uma terapia gênica de FVIII uma opção terapêutica viável para pacientes com hemofilia A.
[0077] A presente divulgação se refere à descoberta de que sequências de codificação de variante de Fator VIII com alteração de códon solucionam estes e outros problemas associados à terapia gênica de Fator VIII. Por exemplo, os polinucleotídeos divulgados no presente documento fornecem expressão notoriamente melhorada em células de mamífero e exibem encapsulamento de vírion melhorado devido a interações de encapsulamento estabilizadas. Em algumas implementações, estas vantagens são alcançadas usando-se sequências de codificação para as cadeias pesada e leve do Fator VIII com alta identidade de sequência com o construto CS04 com alteração de códon (por exemplo, com alta identidade de sequência com a sequência de codificação de cadeia pesada CS04-HC e alta identidade de sequência com a sequência de codificação de cadeia leve CS04-LC).
[0078] Em algumas implementações, as moléculas de Fator VIII codificadas pelos polinucleotídeos descritos no presente documento foram encurtadas por truncamento, deleção ou substituição do domínio B do tipo selvagem. Deste modo, os polinucleotídeos são mais adequados para expressar o Fator VIII por meio de vetores de terapia gênica convencionais, que expressam de modo ineficiente polipeptídeos maiores, tais como o Fator VIII do tipo selvagem.
[0079] Vantajosamente, é mostrado no presente documento que a sequência de codificação de variante de Fator VIII com alteração de códon CS04 fornece expressão superior de um construto de Fator VIII com domínio B deletado in vivo. Por exemplo, é demonstrado no Exemplo 2 e na Tabela 4 que a administração intravenosa de vetores de terapia gênica à base de AAV que têm a sequência de codificação CS04 (SEQ ID NO: 1) fornece um aumento de 74 vezes na expressão de Fator VIII, em relação ao construto
16 / 85 CS40 correspondente codificado com a sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem (SEQ ID NO: 10), em camundongos com knockout de Fator VIII (Tabela 4).
[0080] Ademais, é também mostrado no presente documento que a sequência de codificação de variante de Fator VIII com alteração de códon CS04 fornece produção de vírus e encapsulamento de vírion superiores. Por exemplo, é demonstrado no Exemplo 1 que construtos de vetor de AAV contendo o construto CS04 forneceram rendimento viral 5 a 7 vezes maior, em relação ao construto CS40 correspondente codificado com a sequência de polinucleotídeos do tipo selvagem, quando isolado da mesma quantidade de pélete celular. II. DEFINIÇÕES
[0081] Conforme usado no presente documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos aos mesmos a menos que seja especificado o contrário.
[0082] Conforme usado no presente documento, os termos “Fator VIII” e “FVIII” são usados de forma intercambiável e se referem a qualquer proteína com atividade de Fator VIII (por exemplo, FVIII ativo, frequentemente denominado FVIIIa) ou precursor de proteína (por exemplo, pró-proteína ou pré-pró-proteína) de uma proteína com atividade de Fator VIII, particularmente, proteína de cofator de Fator IXa. Numa modalidade exemplificativa, um polipeptídeo de Fator VIII se refere a um polipeptídeo que tem sequências com alta identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais) com as cadeias pesada e leve de um polipeptídeo de Fator VIII do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o domínio B de um polipeptídeo de Fator VIII é deletado, truncado ou substituído por um polipeptídeo ligante para reduzir o tamanho do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII. Numa modalidade exemplificativa, os aminoácidos 20 a 1457 de CS04-FL-AA
17 / 85 constituem um polipeptídeo de Fator VIII.
[0083] Os exemplos não limitantes de polipeptídeos de Fator VIII do tipo selvagem incluem pré-pró-Fator VIII humano (por exemplo, números de acesso ao GenBank AAA52485, CAA25619, AAA58466, AAA52484, AAA52420, AAV85964, BAF82636, BAG36452, CAI41660, CAI41666, CAI41672, CAI43241, CA003404, EAW72645, AAH22513, AAH64380, AAH98389, AAI11968, AAI11970 ou AAB61261), pró-Fator VIII correspondente e variantes naturais dos mesmos; pré-pró-Fator VIII porcino (por exemplo, números de acesso ao UniProt F1RZ36 ou K7GSZ5), pró-Fator VIII e variantes naturais dos mesmos; pré-pro-Fator VIII de camundongo (por exemplo, números de acesso ao GenBank AAA37385, CAM15581, CAM26492 ou EDL29229), pró-Fator VIII correspondente e variantes naturais dos mesmos; pré-pró-Fator VIII de rato (por exemplo, número de acesso ao GenBank AAQ21580), pró-Fator VIII correspondente e variantes naturais dos mesmos; pré-pró-Fator VIII de rato; e outros homólogos de Fator VIII de mamífero (por exemplo, macaco, símio, hamster, porquinho da índia, etc.).
[0084] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo de Fator VIII inclui variantes naturais e construtos artificiais com atividade de cofator de Fator IX. Conforme usado na presente divulgação, Fator VIII abrange quaisquer variantes naturais, sequências alternativas, isoformas ou proteínas mutantes que retêm alguma atividade de cofator de Fator IX basal (por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou mais da atividade do tipo selvagem correspondente). Os exemplos das variações de aminoácido de Fator VIII (em relação a FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 12)) encontradas na população humana incluem, sem limitação, S19R, R22T, Y24C, Y25C, L26P/R, E30V, W33G, Y35C/H, G41C, R48C/K, K67E/N, L69P, E72K, D75E/V/Y, P83R, G89D/V, G92A/V, A97P, E98K, V99D, D101G/H/V, V104D, K108T, M110V, A111T/V, H113R/Y, L117F/R, G121S, E129V,
18 / 85
G130R, E132D, Y133C, D135G/Y, T137A/I, S138R, E141K, D145H, V147D, Y155H, V159A, N163K, G164D/V, P165S, C172W, S176P, S179P, V181E/M, K185T, D186G/N/Y, S189L, L191F, G193R, L195P, C198G, S202N/R, F214V, L217H, A219D/T, V220G, D222V, E223K, G224W, T252I, V253F, N254I, G255V, L261P, P262L, G263S, G266F, C267Y, W274C, H275L, G278R, G280D, E284K, V285G, E291G/K, T294I, F295L, V297A, N299I, R301C/H/L, A303E/P, I307S, S308L, F312S, T314A/I, A315V, G323E, L326P, L327P/V, C329F, 133IV, M339T, E340K, V345A/L, C348R/S/Y, Y365C, R391C/H/P, S392L/P, A394S, W401G, I405F/S, E409G, W412G/R, K427I, L431F/S, R437P/W, I438F, G439D/S/V, Y442C, K444R, Y450D/N, T454I, F455C, G466E, P470L/R/T, G474E/R/V, E475K, G477V, D478N, T479R, F484C, A488G, R490G, Y492C/H, Y492H, I494T, P496R, G498R, R503H, G513S/V, I522Y, K529E, W532G, P540T, T541S, D544N, R546W, R550C/G/H, S553P, S554C/G, V556D, R560T, D561G/H/Y, I567T, P569R, S577F, V578A, D579A/H, N583S, Q584H/K/R, I585R/T, M586V, D588G/Y, L594Q, S596P, N601D/K, R602G, S603I/R, W604C, Y605H/S, N609I, R612C, N631K/S, M633I, S635N, N637D/ES, Y639C, L644V, L650F, V653A/M, L659P, A663V, Q664P, F677L, M681I, V682F, Y683C/N, T686R, F698L, M699T/V, M701I, G705V, G710W, N713I, R717L/W, G720D/S, M721I/L, A723T, L725Q, V727F, E739K, Y742C, R795G, P947R, V1012L, E1057K, H1066Y, D1260E, K1289Q, Q1336K, N1460K, L1481P, A1610S, I1698T, Y1699C/F, E1701K, Q1705H, R1708C/H, T1714S, R1715G, A1720V, E1723K, D1727V, Y1728C, R1740G, K1751Q, F1762L, R1768H, G1769R, L1771P, L1775F/V, L1777P, G1779E/R, P1780L, I1782R, D1788H, M1791T, A1798P, S1799H, R1800C/G/H, P1801A, Y1802C, S1803Y, F1804S, L1808F, M1842I, P1844S, T1845P, E1848G, A1853T/V, S1858C, K1864E, D1865N/Y, H1867P/R, G1869D/V, G1872E, P1873R, L1875P, V1876L, C1877R/Y, L1882P, R1888I, E1894G, I1901F, E1904D/K, S1907C/R, W1908L,
19 / 85 Y1909C, A1939T/V, N1941D/S, G1942A, M1945V, L1951F, R1960L/Q, L1963P, S1965I, M1966I/V, G1967D, S1968R, N1971T, H1973L, G1979V, H1980P/Y, F1982I, R1985Q, L1994P, Y1998C, G2000A, T2004R, M2007I, G2013R, W2015C, R2016P/W, E2018G, G2022D, G2028R, S2030N, V2035A, Y2036C, N2038S, 2040Y, G2045E/V, 12051S, I2056N, A2058P, W2065R, P2067L, A2070V, S2082N, S2088F, D2093G/Y, H2101D, T2105N, Q2106E/P/R, G2107S, R2109C, 12117F/S, Q2119R, F2120C/L, Y2124C, R2135P, S2138Y, T2141N, M2143V, F2145C, N2148S, N2157D, P2162L, R2169C/H, P2172L/Q/R, T2173A/I, H2174D, R2178C/H/L, R2182C/H/P, M2183R/V, L2185S/W, S2192I, C2193G, P2196R, G2198V, E2200D, I2204T, I2209N, A2211P, A2220P, P2224L, R2228G/L/P/Q, L2229F, V2242M, W2248C/S, V2251A/E, M2257V, T2264A, Q2265R, F2279C/I, I2281T, D2286G, W2290L, G2304V, D2307A, P2319L/S, R2323C/G/H/L, R2326G/L/P/Q, Q2330P, W2332R, I2336F, R2339T, G2344C/D/S e C2345S/Y. As proteínas de Fator VIII também incluem polipeptídeos contendo modificações pós-traducionais.
[0085] Geralmente, os polinucleotídeos que codificam o Fator VIII codificam um polipeptídeo de cadeia única inativo (por exemplo, uma pré- pró-proteína) que passa por processamento pós-traducional para formar uma proteína de Fator VIII ativa (por exemplo, FVIIIa). Por exemplo, referindo-se à Figura 1, a pré-pró-proteína de Fator VIII humana do tipo selvagem é primeiramente clivada para liberar o peptídeo de sinalização codificado (não mostrado), formando uma primeira pró-proteína de cadeia única (mostrada como “FVIII do tipo selvagem humano”). A pró-proteína é, então, clivada entre os domínios B e A3 para formar um primeiro polipeptídeo que inclui a cadeia pesada de Fator VIII (por exemplo, os domínios A1 e A2) e o domínio B, e um segundo polipeptídeo que inclui a cadeia leve de Fator VIII (por exemplo, incluindo os domínios A3, C1 e C3). O primeiro polipeptídeo é adicionalmente clivado para remover o domínio B e também separar os
20 / 85 domínios A1 e A2, que permanecem associados à cadeia leve de Fator VIII na proteína de Fator ViIIa madura. Para revisão do processo de maturação de Fator VIII, consultar Graw et al., Nat Rev Genet., 6(6):488-501 (2005), cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[0086] Entretanto, em algumas modalidades, o polipeptídeo de Fator VIII é um polipeptídeo de Fator VIII de cadeia única. Os polipeptídeos de Fator VIII de cadeia única são geneticamente modificados para remover sítios de clivagem naturais e, opcionalmente, remover, truncar ou substituir o domínio B do Fator VIII. Deste modo, os mesmos não são maturados por clivagem (além da clivagem de um peptídeo de sinalização e/ou líder opcional) e são ativos como uma cadeia única. Os exemplos não limitantes de polipeptídeos de Fator VIII de cadeia única são descritos em Zollner et al. (Thromb Res, 134(1):125-31 (2014)) e Donath et al. (Biochem I., 312(1):49- 55 (1995)), cujas divulgações estão incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades para todos os propósitos.
[0087] Conforme usado no presente documento, o termo “cadeia pesada de Fator VIII” ou simplesmente “cadeia pesada” se refere ao agregado dos domínios A1 e A2 de um polipeptídeo de Fator VIII. Numa modalidade exemplificativa, os aminoácidos 20 a 759 de CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2) constituem uma cadeia pesada de Fator VIII.
[0088] Conforme usado no presente documento, o termo “cadeia leve de Fator VIII” ou simplesmente “cadeia leve” se refere ao agregado dos domínios A3, C1 e C2 de um polipeptídeo de Fator VIII. Numa modalidade exemplificativa, os aminoácidos 774 a 1457 de CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2) constituem uma cadeia leve de Fator VIII. Em algumas modalidades, uma cadeia leve de Fator VIII exclui o peptídeo a3 ácido, que é liberado durante a maturação in vivo.
[0089] Geralmente, as cadeias pesada e leve de Fator VIII são
21 / 85 expressas como uma cadeia de polipeptídeo único, por exemplo, juntamente com um domínio B opcional ou ligante com domínio B substituído. Entretanto, em algumas modalidades, uma cadeia pesada de Fator VIII e a cadeia leve de Fator VIII são expressas como cadeias de polipeptídeo separadas (por exemplo, coexpressas) e reconstituídas para formar uma proteína de Fator VIII (por exemplo, in vivo ou in vitro).
[0090] Conforme usado no presente documento, os termos “ligante com domínio B substituído” e “ligante de Fator VIII” são usados de forma intercambiável e se referem a versões truncadas de um domínio B de Fator VIII do tipo selvagem (por exemplo, aminoácidos 760 a 1667 de FVIII-FL- AA (SEQ ID NO: 12)) ou peptídeos geneticamente modificados para substituir o domínio B de um polipeptídeo de Fator VIII. Conforme usado no presente documento, um ligante de Fator VIII é posicionado entre a terminação C de uma cadeia pesada de Fator VIII e a terminação N de uma cadeia leve de Fator VIII num polipeptídeo variante de Fator VIII de acordo com algumas modalidades. Os exemplos não limitantes de ligantes com domínio B substituído são divulgados nas Patentes no U.S. 4.868.112,
5.112.950, 5.171.844, 5.543.502, 5.595.886, 5.610.278, 5.789.203, 5.972.885,
6.048.720, 6.060.447, 6.114.148, 6.228.620, 6.316.226, 6.346.513, 6.458.563,
6.924.365, 7.041.635 e 7.943.374; Publicações de Pedido de Patente no U.S. 2013/024960, 2015/0071883 e 2015/0158930; e Publicações PCT no WO 2014/064277 e WO 2014/127215, cujas divulgações estão incorporadas ao presente documento a título de referência, em suas totalidades, para todos os propósitos.
[0091] A não ser que especificado de outro modo no presente documento, a numeração de aminoácidos de Fator VIII se refere ao aminoácido correspondente na sequência de Fator VIII humano do tipo selvagem de comprimento completo (FVIII-FL-AA), apresentada como SEQ ID NO: 12 na Figura 13. De tal forma, ao fazer referência a uma substituição
22 / 85 de aminoácido numa proteína variante de Fator VIII divulgado no presente documento, o número de aminoácido mencionado se refere ao aminoácido análogo (por exemplo, estrutural ou funcionalmente equivalente) e/ou homólogo (por exemplo, evolucionariamente conservado na sequência de aminoácidos primária) na sequência de Fator VIII do tipo selvagem de comprimento completo. Por exemplo, uma substituição de aminoácido T2105N se refere a uma substituição de T para N na posição 2105 da sequência de Fator VIII humano do tipo selvagem de comprimento completo (FVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 12) e uma substituição de T para N na posição 1211 da proteína variante de Fator VIII codificada por CS04 (CS04-FL-AA; SEQ ID NO: 2).
[0092] Conforme descrito no presente documento, o sistema de numeração de aminoácido de Fator VIII depende de se o peptídeo de sinalização de Fator VIII (por exemplo, aminoácidos 1 a 19 da sequência de Fator VIII humano do tipo selvagem de comprimento completo) está incluído. Quando o peptídeo de sinalização está incluído, a numeração é denominada “peptídeo de sinalização inclusive” ou “SPI”. Quando o peptídeo de sinalização não está incluído, a numeração é denominada “peptídeo de sinalização exclusivo” ou “SPE”. Por exemplo, F328S é numeração de SPI para o mesmo aminoácido que F309S, na numeração de SPE. A não ser que indicado de outro modo, toda numeração de aminoácido se refere ao aminoácido correspondente na sequência de Fator VIII humano do tipo selvagem de comprimento completo (FVIII-FL-AA), apresentada como SEQ ID NO: 12 na Figura 13.
[0093] Conforme descrito no presente documento, os polinucleotídeos com alteração de códon fornecem expressão aumentada de Fator VIII transgênico in vivo (por exemplo, quando administrados como parte de um vetor de terapia gênica), em comparação com o nível de expressão de Fator VIII fornecido por um construto de Fator VIII codificado nativamente (por
23 / 85 exemplo, um polinucleotídeo que codifica o mesmo construto de Fator VIII usando os códons humanos do tipo selvagem). Conforme usado no presente documento, o termo “expressão aumentada” se refere a um nível aumentado de atividade de Fator VIII transgênica no sangue de um animal que recebeu administração do polinucleotídeo com alteração de códon que codifica Fator VIII, em comparação com o nível de atividade de Fator VIII transgênica no sangue de um animal que recebeu administração de um construto de Fator VIII nativamente codificado. Os níveis de atividade podem ser medidos usando qualquer atividade de Fator VIII conhecida na técnica. Um ensaio exemplificativo para determinar a atividade de Fator VIII é o ensaio de FVIII Technochrome (Technoclone, Vienna, Áustria).
[0094] Em algumas modalidades, a expressão aumentada se refere a pelo menos 25% mais atividade de Fator VIII transgênico no sangue de um animal que recebeu administração do polinucleotídeo de Fator VIII com alteração de códon, em comparação com o nível de atividade de Fator VIII transgênico no sangue de um animal que recebeu administração de um polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente. Em algumas modalidades, a expressão aumentada se refere a 50% mais, pelo menos 75% mais, pelo menos 100% maior, pelo menos 3 vezes mais, pelo menos 4 vezes mais, pelo menos 5 vezes mais, pelo menos 6 vezes mais, pelo menos 7 vezes mais, pelo menos 8 vezes mais, pelo menos 9 vezes mais, pelo menos 10 vezes mais, pelo menos 15 vezes mais, pelo menos 20 vezes mais, pelo menos 25 vezes mais, pelo menos 30 vezes mais, pelo menos 40 vezes mais, pelo menos 50 vezes mais, pelo menos 60 vezes mais, pelo menos 70 vezes mais, pelo menos 80 vezes mais, pelo menos 90 vezes mais, pelo menos 100 vezes mais, pelo menos 125 vezes mais, pelo menos 150 vezes mais, pelo menos 175 vezes mais, pelo menos 200 vezes mais, pelo menos 225 vezes mais ou pelo menos 250 vezes mais atividade de Fator VIII transgênico no sangue de um animal que recebeu administração do polinucleotídeo de Fator VIII com
24 / 85 alteração de códon, em comparação com o nível de atividade de Fator VIII transgênico no sangue de um animal que recebeu administração de polinucleotídeo de Fator VIII codificado nativamente.
[0095] Conforme descrito no presente documento, os polinucleotídeos com alteração de códon fornecem produção de vetor aumentada, em comparação com o nível de produção de vetor fornecido por um construto de Fator VIII codificado nativamente (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o mesmo construto de Fator VIII usando os códons humanos do tipo selvagem). Conforme usado no presente documento, o termo “produção de vírus aumentada” se refere a um rendimento de vetor aumentado na cultura celular (por exemplo, titulação por litro de cultura) inoculada com o polinucleotídeo com alteração de códon que codifica o Fator VIII, em comparação ao rendimento de vetor na cultura celular inoculada com o construto de Fator VIII nativamente codificado. Os rendimentos de vetor podem ser medidos usando qualquer ensaio de titulação de vetor conhecido na técnica. Um ensaio exemplificativo para determinar o rendimento de vetor (por exemplo, de um vetor de AAV) é a qPCR que tem como alvo as repetições terminais invertidas de AAV2 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Parte B 23:18–28 (2012)).
[0096] Em algumas modalidades, produção de vírus aumentada se refere ao rendimento de vetor com alteração de códon pelo menos 25% maior, em comparação ao rendimento de um construto de Fator VIII nativamente codificado no mesmo tipo de cultura. Em algumas modalidades, a produção de vetor aumentada se refere ao rendimento de vetor com alteração de códon pelo menos 50% maior, pelo menos 75% maior, pelo menos 100% maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, pelo menos 15 vezes maior ou pelo menos 20 vezes maior, em comparação ao
25 / 85 rendimento de um construto de Fator VIII nativamente codificado no mesmo tipo de cultura.
[0097] Conforme usado no presente documento, o termo “hemofilia” se refere a um grupo de estados doentios amplamente caracterizados por coagulação ou formação de coágulo no sangue reduzida. A hemofilia pode se referir a hemofilia Tipo A, Tipo B ou Tipo C ou ao compósito de todos os três tipos de doenças. A hemofilia Tipo A (hemofilia A) é causada por uma redução ou perda de atividade de fator VIII (FVIII) e é a mais proeminente dos subtipos de hemofilia. A hemofilia Tipo B (hemofilia B) resulta da perda ou redução de função de coagulação de fator IX (FIX). A hemofilia Tipo C (hemofilia C) é uma consequência da perda ou redução em atividade de coagulação de fator XI (FXI). As hemofilias A e B são doenças ligadas a X, enquanto a hemofilia C é autossômica. Os tratamentos convencionais para hemofilia incluem administração tanto profilática quando sob demanda de fatores de coagulação, tal como FVIII, FIX, incluindo Bebulin®–VH, e FXI, assim como FEIBA-VH, desmopressina e infusões de plasma.
[0098] Conforme usado no presente documento, o termo “terapia gênica de FVIII” inclui qualquer abordagem terapêutica para fornecer um ácido nucleico que codifica Fator VIII a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à hemofilia. O termo abrange administrar qualquer composto, fármaco, procedimento ou regime que compreende um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII, incluindo qualquer forma modificada de Fator VIII (por exemplo, variante de Fator VIII), para manter ou melhorar a saúde de um indivíduo com hemofilia. O versado na técnica perceberá que o curso de terapia de FVIII ou a dose de um agente terapêutico de FVIII pode ser alterada, por exemplo, com base nos resultados obtidos de acordo com a presente divulgação.
[0099] Conforme usado no presente documento, o termo "terapia de
26 / 85 desvio" inclui qualquer abordagem terapêutica para fornecer agentes hemostáticos, compostos ou fatores de coagulação de não Fator VIII a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à hemofilia. Os compostos e fatores de coagulação de não Fator VIII incluem, porém sem limitação, Atividade de Desvio de Inibidor de Fator VIII (FEIBA), fator VII ativado recombinante (FVIIa), concentrados de complexo de protrombina e concentrados de complexo de protrombina ativada. Estes compostos e fatores de coagulação de não Fator VIII podem ser recombinantes ou derivados de plasma. O versado na técnica perceberá que o curso de terapia de desvio ou a dose de terapia de desvio pode ser alterada, por exemplo, com base nos resultados obtidos de acordo com a presente divulgação.
[00100] Conforme usado no presente documento, uma “terapia de combinação” incluindo a administração de um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII e um agente terapêutico de hemofilia A convencional inclui qualquer abordagem terapêutica para fornecer tanto um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII quanto uma molécula de Fator VIII e/ou agente hemostático de Fator VIII (por exemplo, agente terapêutico de desvio) a um paciente para aliviar, diminuir ou prevenir a recorrência de um ou mais sintomas (por exemplo, fatores clínicos) associados à hemofilia. O termo abrange administrar qualquer composto, fármaco, procedimento ou regime incluindo um ácido nucleico que codifica uma molécula de Fator VIII, incluindo qualquer forma modificada do fator VIII, que é útil para manter ou melhorar a saúde de um indivíduo com hemofilia e inclui qualquer um dos agentes terapêuticos descritos no presente documento.
[00101] Os termos “quantidade ou dose terapeuticamente eficaz” ou “quantidade ou dose terapeuticamente suficiente” ou “quantidade ou dose eficaz ou suficiente” se referem a uma dose que produz efeitos terapêuticos
27 / 85 para os quais é administrada. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco útil para tratar hemofilia pode ser a quantidade que é capaz de prevenir ou aliviar um ou mais sintomas associados à hemofilia. A dose exata dependerá do propósito do tratamento e será verificável por um versado na técnica com o uso de conjuntos de procedimentos conhecidos (consultar, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (volumes 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Edição, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
[00102] Conforme usado no presente documento, o termo “gene” se refere ao segmento de uma molécula de DNA que codifica uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, a região de codificação). Em algumas modalidades, um gene é posicionado por regiões imediatamente anteriores, seguintes e/ou intermediárias à região de codificação que estão envolvidas na produção de cadeia de polipeptídeo (por exemplo, elementos reguladores, tal como um promotor, intensificador, sequência de poliadenilação, região não traduzida 5’, região não traduzida 3’ ou íntron).
[00103] Conforme usado no presente documento, o termo “elementos reguladores” se referem a sequências de nucleotídeos, tais como promotores, intensificadores, terminadores, sequências de poliadenilação, íntrons, etc., que fornecem a expressão de uma sequência de codificação numa célula.
[00104] Conforme usado no presente documento, o termo “elemento promotor” se refere a uma sequência de nucleotídeos que auxilia no controle de expressão de uma sequência de codificação. De modo geral, os elementos promotores estão localizados 5’ do sítio de início de tradução de um gene. Entretanto, em certas modalidades, um elemento promotor pode estar localizado dentro de uma sequência de íntron ou 3’ da sequência de codificação. Em algumas modalidades, um promotor útil para um vetor de
28 / 85 terapia gênica é derivado do gene nativo da proteína alvo (por exemplo, um promotor de Fator VIII). Em algumas modalidades, um promotor útil para um vetor de terapia gênica é específico para expressão numa célula ou tecido particular do organismo alvo (por exemplo, um promotor específico para fígado). Em ainda outras modalidades, um dentre uma pluralidade de elementos promotores bem caracterizados é usado num vetor de terapia gênica descrito no presente documento. Os exemplos não limitantes de elementos promotores bem caracterizados incluem o promotor precoce de CMV, o promotor de β-actina e o promotor de proteína de ligação a metil CpG 2 (MeCP2). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo, que aciona a expressão substancialmente constante da proteína alvo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor induzível, que aciona a expressão da proteína alvo em resposta a um estímulo particular (por exemplo, exposição a um tratamento ou agente particular). Para uma análise de promotores de projeto para terapia gênica mediada por AAV, consultar Gray et al. (Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011)), cujo conteúdo está expressamente incorporado a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.
[00105] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" se refere a qualquer veículo usado para transferir um ácido nucleico (por exemplo, que codifica um construto de terapia de gene de Fator VIII) numa célula hospedeira. Em algumas modalidades, um vetor inclui um a replicon, que funciona para replicar o veículo, juntamente com o ácido nucleico alvo. Os exemplos não limitantes de vetores úteis para terapia gênica incluem plasmídeos, fagos, cosmídeos, cromossomos artificiais e vírus, que funcionam como unidades autônomas de replicação in vivo. Em algumas modalidades, um vetor é um veículo viral para introduzir um ácido nucleico alvo (por exemplo, um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica uma variante de Fator VIII). Muitos vírus eucarióticos modificados úteis para
29 / 85 terapia gênica são conhecidos na técnica. Por exemplo, os vírus adenoassociados (AAVs) são particularmente bem adequados para uso em terapia gênica humana devido ao fato de que os seres humanos são um hospedeiro natural para o vírus, os vírus nativos não são conhecidos por contribuir para quaisquer doenças, e os vírus impedem uma resposta imunológica branda.
[00106] Conforme usado no presente documento, o termo “ilha de CpG” se refere a uma região dentro de um polinucleotídeo que tem densidade estatisticamente elevada de dinucleotídeos CpG. Conforme usado no presente documento, uma região de um polinucleotídeo (por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII com alteração de códon) é uma ilha de CpG se, ao longo de uma janela de 200 pares de bases: (i) a região tiver o teor de GC maior que 50% e (ii) a razão de dinucleotídeos CpG observados por dinucleotídeos CpG esperados for pelo menos 0,6, conforme definido pela relação: ≥ 0,6.
[00107] Para informações adicionais sobre métodos para identificar ilhas de CpG, consultar Gardiner-Garden M. et al., J Mol Biol., 196(2):261-82 (1987), cujo conteúdo está expressamente incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade, para todos os propósitos.
[00108] Conforme usado no presente documento, o termo “ácido nucleico” se refere a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em sua forma de fita simples ou dupla fita e complementos dos mesmos. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de cadeia principal modificados, que são sintéticos, de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e que são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Os exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos,
30 / 85 fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de metila quiral, 2-O-metil ribonucleotídeos e ácidos nucleicos peptídicos (PNAs).
[00109] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e aminoácidos não natural, incluindo análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfosserina. Os aminoácidos de ocorrência natural podem incluir, por exemplo, D- e L-aminoácidos. Os aminoácidos usados no presente documento podem também incluir aminoácidos não naturais. Análogos de aminoácido referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, isto é, qualquer carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina ou metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptítidicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido se referem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural. Os aminoácidos podem ser referidos no presente documento por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, similarmente, podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos.
[00110] Quanto a sequências de aminoácidos, uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou
31 / 85 adições individuais a uma sequência de ácidos nucleicos ou peptídeos que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem dos aminoácidos na sequência codificada é uma “variante conservativamente modificada” em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservadora que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são adicionais e não excluem variantes polimórficos, homólogos entre espécies e alelos da divulgação.
[00111] Substituições de aminoácidos conservadoras que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Dependendo da funcionalidade do aminoácido particular, por exemplo, aminoácidos catalíticos, estruturais ou estericamente importantes, agrupamentos diferentes de aminoácido podem ser considerados substituições conservadoras uns dos outros. A Tabela 1 fornece agrupamentos de aminoácidos que são considerados substituições conservadoras com base na carga e polaridade do aminoácido, na hidrofobicidade do aminoácido, na exposição superficial/natureza estrutural do aminoácido e na propensão de estrutura secundária do aminoácido. TABELA 1. AGRUPAMENTOS DE SUBSTITUIÇÕES DE
AMINOÁCIDO CONSERVADORAS COM BASE NA FUNCIONALIDADE DO RESÍDUO NA PROTEÍNA. Característica Importante Agrupamentos Conservadores Carga/Polaridade 1. H, R e K
2. D e E
3. C, T, S, G, N, Q e Y
4. A, P, M, L, I, V, F e W Hidrofobicidade 1. D, E, N, Q, R e K
2. C, S, T, P, G, H e Y
3. A, M, I, L, V, F e W Exposição Estrutural/Superficial 1. D, E, N, Q, H, R e K
2. C, S, T, P, A, G, W e Y
3. M, I, L, V e F Propensão de Estrutura Secundária 1. A, E, Q, H, K, M, L e R
2. C, T, I, V, F, Y e W
3. S, G, P, D e N
32 / 85 Característica Importante Agrupamentos Conservadores Conservação Evolucionária 1. D e E
2. H, K e R
3. N e Q
4. S e T
5. L, I e V
6. F, Y e W
7. A e G
8. M e C
[00112] Os termos “idêntico” ou “identidade” percentual, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de peptídeos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (isto é, cerca de 60% de identidade, de preferência, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade mais alta sobre uma região especificada, quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada) conforme medido usando, por exemplo, um algoritmo de comparação de sequências BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros padrão descritos abaixo ou por alinhamento manual ou inspeção visual.
[00113] Conforme é conhecido na técnica, diversos programas diferentes podem ser usados para identificar se uma proteína (ou ácido nucleico conforme discutido abaixo) tem identidade ou similaridade de sequência com uma sequência conhecida. A identidade e/ou similaridade de sequência são determinadas usando técnicas-padrão conhecidas na arte, incluindo, porém sem limitação, o algoritmo de identidade de sequência local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade de sequência de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 85:2444 (1988), por implantações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), o programa de sequência Best Fit descrito por Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984), de preferência, usando
33 / 85 as configurações padrão ou por inspeção. De preferência, a identidade percentual é calculada por FastDB com base nos seguintes parâmetros: penalidade por pareamento errôneo de 1; penalidade por lacuna de 1; penalidade por tamanho de lacuna de 0,33; e penalidade por união de 30, “Current Methods in Sequence Comparison and Analysis”, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, páginas 127- 149 (1988), Alan R. Liss, Inc, todos os quais estão incorporados a título de referência.
[00114] Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria um alinhamento de múltiplas sequências a partir de um grupo de sequências relacionadas usando alinhamentos progressivos por pareamento. Também pode plotar uma árvore que mostra as relações de agrupamento usadas para criar o alinhamento. PILEEIP usa uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987); o método é similar àquele descrito por Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989), ambos incorporados a título de referência. Os parâmetros de PILEEIP úteis incluindo um peso de lacuna padrão de 3,00, um peso de comprimento da lacuna padrão de 0,10 e lacunas de extremidade ponderados.
[00115] Um outro exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST, descrito em: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); e Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:5873-5787 (1993), ambos incorporados a título de referência. Um programa BLAST particularmente útil é o programa WU-BLAST-2 que foi obtido a partir de Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]. WU-BLAST-2 usa vários parâmetros de pesquisa, dos quais a maioria é definida nos valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são definidos com os seguintes valores: extensão de sobreposição=1, fração de sobreposição=0,125, limite de palavra (T)=11. Os parâmetros HSP S e HSP S2 são valores dinâmicos e são
34 / 85 estabelecidos pelo próprio programa dependendo da composição da sequência particular e composição do banco de dados particular contra o qual a sequência de interesse está sendo pesquisada; entretanto, os valores podem ser ajustados para aumentar a sensibilidade.
[00116] Um algoritmo útil adicional é BLAST com lacuna, conforme relatado por Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402, incorporado a título de referência. BLAST com lacunas usa escores de substituição de BLOSUM-62; parâmetro T limiar definido para 9; o método de dois acertos para disparar extensões sem lacunas, comprimentos de lacuna de k com um custo de 1O+k; Xu definido para 16 e Xg definido para 40 para estágio de pesquisa de banco de dados e para 67 para o estágio de saída dos algoritmos. Os alinhamentos com lacuna são acionados por um escore correspondente a ~22 bits.
[00117] Uma % de identidade de sequência de aminoácidos é determinada pelo número de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência “mais longa” na região alinhada. A sequência “mais longa” é aquela que tem os resíduos mais reais na região alinhada (lacunas introduzidas por WU-Blast-2 para maximizar o escore de alinhamento são ignoradas). De uma maneira similar, “identidade de sequência de ácidos nucleicos percentual (%)” em relação à sequência de codificação dos polipeptídeos identificados é definida como a porcentagem de resíduos de nucleotídeo numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeo na sequência de codificação da proteína de ciclo celular. Um método preferencial usa o módulo BLASTN de WU-BLAST-2 definido para os parâmetros padrão, com intervalo de sobreposição e fração de sobreposição definidos para 1 e 0,125, respectivamente.
[00118] O alinhamento pode incluir a introdução de lacunas nas sequências a serem alinhadas. Adicionalmente, para sequências que contêm mais ou menos aminoácidos do que a proteína codificada pela sequência da
35 / 85 Figura 2 (SEQ ID NO: 1), é entendido que, numa modalidade, a porcentagem de identidade de sequência será determinada com base no número de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos em relação ao número total de aminoácidos ou nucleotídeos. Assim, por exemplo, a identidade de sequência de sequências mais curtas do que aquela mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 1), conforme discutido abaixo, será determinada usando o número de nucleotídeos na sequência mais curta, numa modalidade. Em cálculos de identidade percentual, o peso relativo não é atribuído a várias manifestações de variação de sequência, tais como inserções, deleções, substituições, etc.
[00119] Numa modalidade, apenas identidades são pontuadas positivamente (+1) e todas as formas de variação de sequência incluindo lacunas recebem um valor de “0”, o que evidencia a necessidade de uma escala ponderada ou parâmetros conforme descrito abaixo para cálculos de similaridade de sequência. A identidade de sequência percentual pode ser calculada, por exemplo, dividindo-se o número de resíduo idêntico correspondentes pelo número total de resíduos da sequência “mais curta” na região alinhada e multiplicando-se por 100. A sequência “mais longa” é aquela que tem os resíduos mais atuais na região alinhada.
[00120] O termo “variantes alélicas” se refere a formas polimórficas de um gene num locus genético particular, assim como cDNAs derivados de transcritos de mRNA dos genes, e os polipeptídeos codificados pelos mesmos. O termo “códon de mamífero preferencial” se refere a um subconjunto de códons dentre o conjunto de códons que codificam um aminoácido que são mais frequentemente usados em proteínas expressas em células de mamífero, conforme escolhido dentre a seguinte lista: Gly (GGC, GGG); Glu (GAG); Asp (GAC); Val (GTG, GTC); Ala (GCC, GCT); Ser (AGC, TCC); Lys (AAG); Asn (AAC); Met (ATG); Ile (ATC); Thr (ACC); Tip (TGG); Cys (TGC); Tyr (TAT, TAC); Leu (CTG); Phe (TTC); Arg (CGC, AGG, AGA); Gln (CAG); His (CAC); e Pro (CCC).
36 / 85
[00121] Conforme usado no presente documento, o termo com alteração de códon se refere a uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína variante de Fator VIII), em que pelo menos um códon do polinucleotídeo nativo que codifica o polipeptídeo foi alterado para melhorar a propriedade da sequência de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, a propriedade melhorada promove transcrição aumentada de mRNA que codifica o polipeptídeo, estabilidade aumentada do mRNA (por exemplo, meia-vida de mRNA melhorada), tradução aumentada do polipeptídeo e/ou empacotamento aumentado do polinucleotídeo dentro do vetor. Os exemplos não limitantes de alterações que podem ser usadas para atingir as propriedades melhoradas incluem alterar o uso e/ou a distribuição de códons para aminoácidos particulares, ajustar o teor de GC global e/ou local, remover sequências ricas em AT, remover elementos de sequência repetidos, ajustar o teor de dinucleotídeo CpG global e/ou local, remover elementos reguladores crípticos (por exemplo, elementos de TATA box e CCAAT box), remover sítios de splicing de íntron/éxon, melhorar as sequências reguladoras (por exemplo, introdução de uma sequência consenso de Kozak) e remover elementos de sequência capazes de formar estrutura secundária (por exemplo, haste-alças) no mRNA transcrito.
[00122] Conforme discutido no presente documento, há várias nomenclaturas para referência a componentes da divulgação no presente documento. “CS-número” (por exemplo, “CS04”) se refere a polinucleotídeos com alteração de códon que codificam polipeptídeos de FVIII e/ou os polipeptídeos codificados, incluindo variantes. Por exemplo, CS04-FL se refere à sequência de polinucleotídeos ou sequência de aminoácidos CS04 com alteração de códon de Comprimento Completo (algumas vezes denominada presente documento “CS04-FL-AA” para a sequência de aminoácidos e “CS04-FL-NA” para a sequência de ácidos nucleicos) codificada pela sequência de polinucleotídeos CS04. Similarmente, “CS04-
37 / 85 LC” se refere à sequência de ácidos nucleicos com alteração de códon (“CS04-LC-NA”) que codifica a cadeia leve de um polipeptídeo de FVIII ou a sequência de aminoácidos (também denominada algumas vezes no presente documento “CS04-LC-AA”) da cadeia leve de FVIII codificada pela sequência de polinucleotídeos CS04. Igualmente, CS04-HC, CS04-HC-AA e CS04-HC-NA são iguais para a cadeia pesada de FVIII. Conforme será percebido por aqueles versados na técnica, para construtos tais como CS04, que têm apenas alteração de códon (por exemplo, não contêm substituições de aminoácido adicionais em comparação com Refacto), as sequências de aminoácidos serão idênticas, visto que as sequências de aminoácidos não são alteradas pela otimização de códon. Assim, os construtos de sequência da divulgação incluem, porém sem limitação, CS04-FL-NA, CS04-FL-AA, CS04-LC-NA, CS04-LC-AA, CS04-HC-AA e CS04-HC-NA. III. VARIANTES DE FATOR VIII COM ALTERAÇÃO DE CÓDON
[00123] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece polinucleotídeos com alteração de códon que codificam variantes de Fator VIII. Estes polinucleotídeos com alteração de códon fornecem expressão notavelmente melhorada de Fator VIII quando administrados num construto de terapia gênica à base de AAV. Os polinucleotídeos com alteração de códon também demonstram empacotamento de vírion com AAV aprimorado, em comparação com construtos convencionalmente com otimização de códon. Conforme demonstrado no Exemplo 2 e na Tabela 4, os requerentes alcançaram estas vantagens através da descoberta de um polinucleotídeo com alteração de códon (CS04-FL-NA) que codifica um polipeptídeo de Fator VIII com cadeias pesada e leve de Fator VIII do tipo selvagem humanas, e um ligante com domínio B substituído de 14 aminoácidos curto (o ligante “SQ”) contendo um sítio de clivagem de furina para facilitar a maturação de uma proteína de FVIIIa ativa in vivo.
[00124] Numa modalidade, um polinucleotídeo com alteração de
38 / 85 códon fornecido no presente documento tem sequências de nucleotídeos com alta identidade de sequência com pelo menos as sequências dentro de CS04 (SEQ ID NO: 1) que codificam a cadeia pesada de Fator VIII e as cadeias leves de Fator VIII. Conforme conhecido na técnica, o domínio B do Fator VIII é dispensável para atividade in vivo. Assim, em algumas modalidades, os polinucleotídeos com alteração de códon fornecidos no presente documento são completamente desprovidos de domínio B de Fator VIII. Em algumas modalidades, o domínio B de Fator VIII nativos é substituído por um ligante de aminoácido curto contendo um sítio de clivagem de furina, por exemplo, o ligante “SQ” que consiste nos aminoácidos 760 a 773 dos construtos CS04 (SEQ ID NOS: 2). O ligante “SQ” é também denominado BDLO04, (-AA para a sequência de aminoácidos e -NA para a sequência de nucleotídeos).
[00125] Numa modalidade, as cadeias pesada e leve de Fator VIII codificadas pelo polinucleotídeo com alteração de códon são cadeias pesada e leve de Fator VIII de ser humano, respectivamente. Em outras modalidades, as cadeias pesada e leve de Fator VIII codificadas pelo polinucleotídeo com alteração de códon são sequências de cadeia pesada e leve de outro mamífero (por exemplo, Fator VIII porcino). Em ainda outras modalidades, as cadeias pesada e leve de Fator VIII são cadeias pesada e leve quiméricas (por exemplo, uma combinação de uma sequência humana e uma segunda sequência de mamífero). Em ainda outras modalidades, as cadeias pesada e leve de Fator VIII são uma versão humanizada das cadeias pesada e leve de outro mamífero, por exemplo, sequências de cadeia pesada e leve de outro mamífero em que resíduos humanos são substituídos nas posições selecionadas para reduzir a imunogenicidade do peptídeo resultante quando administradas a um ser humano.
[00126] O teor de GC de genes humanos varia amplamente, de menos de 25% a mais de 90%. Entretanto, em geral, genes humanos com teores de GC mais altos são expressos em níveis mais baixos. Por exemplo, Kudla et al.
39 / 85 (PLoS Biol., 4(6):80 (2006)) demonstram que aumentar um teor de GC do gene aumenta a expressão do polipeptídeo codificado, principalmente aumentando a transcrição e efetuando um nível de estado de equilíbrio mais alto do transcrito de mRNA. De modo geral, o teor de GC desejado de um construto de gene com otimização de códon é maior ou igual a 60%. Entretanto, genomas de AAV nativos têm teores de GC de cerca de 56%.
[00127] Consequentemente, em algumas modalidades, os polinucleotídeos com alteração de códon fornecidos no presente documento têm um teor de CG que corresponde mais proximamente ao teor de GC de vírions de AAV nativos (por exemplo, cerca de 56% de GC), que é mais baixo que os teores de CG preferenciais de polinucleotídeos que sofrem otimização de códon convencional para a expressão em células de mamífero (por exemplo, a ou acima de 60% de GC). Conforme representado no Exemplo 1, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), que tem um teor de GC de cerca de 56%, melhorou o encapsulamento de vírion em comparação a sequência de codificação com alteração de códon similar com teor de GC mais alto.
[00128] Assim, em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é menor que 60%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é menor que 59%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é menor que 58%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é menor que 57%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é no máximo 56%.
[00129] Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de
40 / 85 Fator VIII é de 54% a 59%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 55% a 59%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 56% a 59%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 54% a 58%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 55% a 58%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 56% a 58%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 54% a 57%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 55% a 57%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 56% a 57%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 54% a 56%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é de 55% a 56%.
[00130] Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é 56±0,5%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é 56±0,4%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é 56±0,3%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de
41 / 85 Fator VIII é 56±0,2%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é 56±0,1%. Em algumas modalidades, o teor de GC geral de um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII é 56%. A. LIGANTES COM DOMÍNIO B SUBSTITUÍDO DE FATOR VIII
[00131] Em algumas modalidades, a ligação entre a cadeia pesada de FVIII e a cadeia leve (por exemplo, o domínio B no Fator VIII do tipo selvagem) é adicionalmente alterada. Devido a restrições de tamanho da capacidade de encapsulamento de AAV, variantes com domínio B deletado, truncadas e/ou substituídas por ligante devem melhorar a eficácia do construto de terapia gênica de FVIII. O ligante com domínio B substituído mais convencionalmente usado é este de SQ FVIII, que retém apenas 14 aminoácidos do domínio B como sequência ligante. Outra variante de VIII porcino (“OBI-1”, descrito na Patente no U.S. 6.458.563) é bem expressa em células CHO e tem um ligante ligeiramente mais longo de 24 aminoácidos. Em algumas modalidades, os construtos de Fator VIII codificados pelos polinucleotídeos com alteração de códon descritos no presente documento incluem uma sequência ligante de domínio B do tipo SQ. Em outras modalidades, os construtos de Fator VIII codificados pelos polinucleotídeos com alteração de códon descritos no presente documento incluem uma sequência ligante de domínio B do tipo OBI-1.
[00132] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Fator VIII codificados descritos no presente documento incluem um ligante de domínio B do tipo SQ (SFSQNPPVLKRHQR; BDL-SQ-AA; SEQ ID NO: 13), incluindo os aminoácidos 760 a 762/1657 a 1667 do domínio B de Fator VIII humano do tipo selvagem (FVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 12) (Sandberg et al. Thromb. Haemost. 85:93 (2001)). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ tem uma substituição de aminoácido em relação à
42 / 85 sequência do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ tem duas substituições de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente.
[00133] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Fator VIII codificados descritos no presente documento incluem um ligante de domínio B do tipo Greengene, incluindo os aminoácidos 760/1582 a 1667 do domínio B de Fator VIII humano do tipo selvagem (FVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 12) (Oh et al., Biotechnol. Prog., 17:1999 (2001)). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo Greengene tem uma substituição de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo Greengene tem duas substituições de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente.
[00134] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Fator VIII codificados descritos no presente documento incluem um ligante de domínio B do tipo SQ estendido, incluindo os aminoácidos 760 a 769/1657 a 1667 do domínio B de Fator VIII humano do tipo selvagem (FVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 12) (Thim et al., Haemophilia, 16:349 (2010)). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ estendido tem uma substituição de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo SQ estendido tem duas substituições de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente.
[00135] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Fator VIII codificados descritos no presente documento incluem um ligante de domínio B do tipo OBI-1 porcino, incluindo os aminoácidos SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEQ ID NO: 14) do domínio B de Fator VIII porcino do tipo selvagem (Toschi et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo
43 / 85 OBI-1 porcino tem uma substituição de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo OBI-1 porcino tem duas substituições de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente.
[00136] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Fator VIII codificados descritos no presente documento incluem um ligante de domínio B do tipo OBI-1 humano, incluindo os aminoácidos 760 a 772/1655 a 1667 do domínio B de Fator VIII humano do tipo selvagem (FVIII-FL-AA; SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo OBI-1 humano tem uma substituição de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo OBI-1 humano tem duas substituições de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente.
[00137] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de Fator VIII codificados descritos no presente documento incluem um ligante de domínio B do tipo 08, incluindo os aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO: 15) do domínio B de Fator VIII porcino do tipo selvagem (Toschi et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo OBI-1 porcino tem uma substituição de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente. Em algumas modalidades, o ligante de domínio B do tipo OBI-1 porcino tem duas substituições de aminoácido em relação à sequência do tipo selvagem correspondente. B. POLINUCLEOTÍDEOS COM ALTERAÇÃO DE CÓDON QUE
CODIFICAM UMA VARIANTE DE FATOR VIII COM UM LIGANTE
CLIVÁVEL POLINUCLEOTÍDEOS COM ALTERAÇÃO DE CÓDON CS04
[00138] Numa modalidade, os polinucleotídeos com alteração de códon fornecidos no presente documento incluem uma sequência de
44 / 85 nucleotídeos que codifica um polipeptídeo variante de Fator VIII com um ligante que é clivável in vivo. O polipeptídeo de Fator VIII inclui uma cadeia leve de Fator VIII, uma cadeia pesada de Fator VIII e um ligante de polipeptídeo unindo a terminação C da cadeia pesada à terminação N da cadeia leve. A cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma primeira sequência de nucleotídeos tendo alta identidade de sequência com CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), que é a porção de CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica uma cadeia pesada de Fator VIII. A cadeia leve do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma segunda sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), que é a porção de CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica uma cadeia leve de Fator VIII. O ligante de polipeptídeo inclui um sítio de clivagem de furina, que permite a maturação in vivo (por exemplo, após a expressão in vivo ou administração do polipeptídeo precursor).
[00139] Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 95% de identidade de sequência com CS04- HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 96% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 97% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 98% de identidade de sequência com CS04- HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99,5% de identidade
45 / 85 de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99,9% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são idênticas à CS04-HC-NA e à CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente.
[00140] Em algumas modalidades, o ligante de polipeptídeo do construto de Fator VIII é codificado por uma terceira sequência de nucleotídeos tendo alta identidade de sequência com BDLO04 (SEQ ID NO: 5), que codifica o ligante de 14 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 760 a 773 de CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos é idêntica a BDLO04 (SEQ ID NO: 5).
[00141] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo com alteração de códon tem uma sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ
46 / 85 ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS04- FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é idêntica a CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1).
[00142] Em algumas modalidades, a variante de Fator VIII codificada pelo polinucleotídeo com alteração de códon tem uma sequência de aminoácidos com alta identidade de sequência com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 97% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 98% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos é idêntica a CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). C. VETORES DE EXPRESSÃO DE FATOR VIII
[00143] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos com alteração de códon descritos no presente documento são integrados em vetores de expressão. Os exemplos não limitantes de vetores de expressão incluem vetores virais (por exemplo, vetores adequados para terapia gênica), vetores de plasmídeo, vetores de bacteriófago, cosmídeos, fagomídeos, cromossomos artificiais e similares.
[00144] Os exemplos não limitantes de vetores virais incluem: retrovírus, por exemplo, vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV),
47 / 85 vírus do sarcoma murino de Harvey, vírus do tumor mamário murino e vírus do sarcoma de Rous; adenovírus, vírus adenoassociados; vírus do tipo SV40; poliomavírus; vírus de Epstein-Barr; papilomavírus; vírus da herpes; vírus vaccinia; e poliovírus.
[00145] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos com alteração de códon descritos no presente documento são integrados num vetor de terapia gênica. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é um retrovírus e, particularmente, um retrovírus com deficiência de replicação. Os protocolos para a produção de retrovírus com deficiência de replicação são conhecidos na técnica. Para análise, consultar Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) e Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
[00146] Numa modalidade, o vetor de terapia gênica é um vetor de terapia gênica à base de vírus adenoassociado (AAV). Sistemas de AAV foram descritos anteriormente e são geralmente bem conhecidos na técnica (Kelleher e Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141- 64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); e Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012), cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos). Os detalhes relacionados à geração e uso de vetores de rAAV são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. nos 5.139.941 e
4.797.368, cada uma das quais está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos. Numa modalidade particular, o vetor de AAV é um vetor de AAV-8.
[00147] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos com alteração de códon descritos no presente documento são integrados num vetor de expressão retroviral. Estes sistemas foram descritos anteriormente e são, de
48 / 85 modo geral, bem conhecidos na técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas e Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, páginas 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, páginas 149-188, 1986). Numa modalidade específica, o vetor retroviral é um vetor lentiviral (consultar, por exemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; Patentes U.S. nos 6.013.516 e 5.994.136).
[00148] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a expressão de um polipeptídeo de Fator VIII a partir de um polipeptídeo com alteração de códon em cultura celular, incluindo vetores de expressão eucarióticos e procarióticos. Em certas modalidades, um vetor plasmidial é contemplado para uso na expressão de um polipeptídeo de Fator VIII em cultura celular. Em geral, os vetores plasmidiais contendo réplicon e sequências de controle que são derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetor pode portar um sítio de replicação, assim como sequências de marcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. O plasmídeo incluirá o polinucleotídeo com alteração de códon que codifica o polipeptídeo de Fator VIII, ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle, por exemplo, um promotor.
[00149] Os exemplos não limitantes para expressão procariótica incluem plasmídeos, tal como pRSET, pET, pBAD, etc., em que os promotores usados em vetores de expressão procariótica incluem lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Os exemplos de vetores para expressão eucariótica incluem: (i) para expressão em levedura, vetores tais como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tais como AOX1, GAP, GAL1, AETG1, etc; (ii) para expressão em células de inseto, vetores tais como pMT, pAc5,
49 / 85 pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tais como PH, p1O, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc. e (iii) para expressão em células de mamífero, vetores tais como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc. e vetores derivados de sistemas virais, tal como vírus vaccinia, vírus adenoassociados, vírus da herpes, retrovírus, etc., usando promotores tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β-actina. D. DOSAGEM
[00150] A invenção fornece a administração dos construtos com otimização de códon da invenção a pacientes humanos que foram diagnosticados com hemofilia A (um “paciente com hemofilia A” ou “paciente”). Em geral, conforme representado no presente documento, a administração é feita usando partículas de AAV que contêm os construtos com otimização de códon da invenção. Ademais, conforme é mais completamente descrito abaixo, a administração dos construtos da invenção pode ser aumentada pela administração de prednisolona ou prednisona também. 2X1012 PARTÍCULAS DE VÍRUS ADENOASSOCIADO (AAV) POR
QUILOGRAMA DE PESO CORPORAL
[00151] Num aspecto, a divulgação fornece um método para tratar hemofilia A incluindo infundir por via intravenosa (por exemplo, por infusão intravenosa periférica), a um paciente com hemofilia A, uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04- FL-NA).
[00152] Numa modalidade, o polinucleotídeo com alteração de códon que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA), que é administrado ao paciente humano a uma dose de 2x1012 partículas de
50 / 85 vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, codifica um polipeptídeo variante de Fator VIII com um ligante que é clivável in vivo. O polipeptídeo de Fator VIII inclui uma cadeia leve de Fator VIII, uma cadeia pesada de Fator VIII e um ligante de polipeptídeo unindo a terminação C da cadeia pesada à terminação N da cadeia leve. A cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma primeira sequência de nucleotídeos tendo alta identidade de sequência com CS04-HC- NA (SEQ ID NO: 3), que é a porção de CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica uma cadeia pesada de Fator VIII. A cadeia leve do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma segunda sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), que é a porção de CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica uma cadeia leve de Fator VIII. O ligante de polipeptídeo inclui um sítio de clivagem de furina, que permite a maturação in vivo (por exemplo, após a expressão in vivo ou administração do polipeptídeo precursor).
[00153] Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 95% de identidade de sequência com CS04- HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 96% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 97% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 98% de identidade de sequência com CS04- HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira
51 / 85 e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99,5% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99,9% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são idênticas à CS04-HC-NA e à CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Nestas modalidades, as sequências de aminoácidos codificada por estas sequências de nucleotídeos são idênticas a CS04-HC-AA e CS04-LC-AA.
[00154] Em algumas modalidades, o ligante de polipeptídeo do construto de Fator VIII é codificado por uma terceira sequência de nucleotídeos tendo alta identidade de sequência com BDLO04 (SEQ ID NO: 5), que codifica o ligante de 14 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 760 a 773 de CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos é idêntica a BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Nestas modalidades, as sequências de aminoácidos codificada por estas sequências de nucleotídeos são idênticas aos aminoácidos 760 a 773 de CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo com alteração de códon), que é administrado ao paciente humano a uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, tem uma sequência de nucleotídeos com alta
52 / 85 identidade de sequência com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é idêntica a CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Nestas modalidades, a sequência de aminoácidos codificada por estas sequências de nucleotídeos é idêntica a CS04-FL-AA.
[00155] Em algumas modalidades, a variante de Fator VIII codificada pelo polinucleotídeo com alteração de códon tem uma sequência de aminoácidos com alta identidade de sequência com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 97% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 98% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos é idêntica a CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
53 / 85
[00156] Consequentemente, numa modalidade, a divulgação fornece um método para tratar hemofilia A que inclui infundir por via intravenosa, a um paciente com hemofilia A, uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que tem uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA).
[00157] Em algumas modalidades, as partículas de AAV são administradas numa dose única por infusão intravenosa (por exemplo, numa veia no braço do paciente). Em algumas modalidades, uma porção da dose única é administrada, o paciente é monitorado para sinais de uma reação adversa à administração por um breve período de tempo (por exemplo, 30 minutos), e, então, (por exemplo, se nenhum sinal de uma reação adversa aparecer) a porção restante da dose única é administrada ao paciente.
[00158] Em algumas modalidades, o paciente humano que recebeu por administração as partículas de AAV tem hemofilia grave A. Por exemplo, em algumas modalidades, o paciente tem um nível de atividade de Fator VIII em sua corrente sanguínea, ao não receber terapia de substituição de Fator VIII, que é menor do que 2% da quantidade de atividade de Fator VIII encontrada numa amostra de sangue de referência, por exemplo, uma amostra de sangue com atividade de Fator VIII normal (por exemplo, uma amostra de sangue de um sujeito determinado como não tendo hemofilia A), ou uma atividade de Fator VIII média encontrada nas amostras de sangue de uma pluralidade de sujeitos determinados como não tendo hemofilia A. Em algumas modalidades, o sujeito tem um nível de atividade de Fator VIII em sua corrente sanguínea, ao não receber terapia de substituição de Fator VIII, que é menor do que 2% da quantidade de atividade de Fator VIII encontrada numa amostra de sangue de referência.
[00159] Em algumas modalidades, o paciente humano que recebeu por administração as partículas de AAV não tem inibidores para FVIII (por
54 / 85 exemplo, anticorpos inibidores de Fator VIII), não tem defeitos hemostáticos diferentes da hemofilia A grave, não tem disfunção hepática crônica e/ou não tem insuficiência renal grave.
[00160] Consequentemente, em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento incluem uma etapa de qualificar um paciente para a administração de uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, tendo alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA). O método inclui determinar um nível de atividade de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente, quando o paciente não está recebendo uma terapia de substituição de Fator VIII, e qualificar o paciente para a administração das partículas de AAV quando o nível de atividade de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente é menor do que cerca de 2%, ou menor do que cerca de 1%, do nível de Fator VIII numa amostra de referência. Em algumas modalidades, o método inclui determinar se o paciente tem um ou mais dos inibidores para FVIII (por exemplo, anticorpos inibidores de Fator VIII), um defeito hemostático diferente de hemofilia A grave, disfunção hepática crônica e insuficiência renal grave e desqualificar o paciente se ele tiver qualquer uma das afecções enumeradas. 6X1012 PARTÍCULAS DE VÍRUS ADENOASSOCIADO (AAV) POR
QUILOGRAMA DE PESO CORPORAL
[00161] Num aspecto, a divulgação fornece um método para tratar hemofilia A incluindo infundir por via intravenosa (por exemplo, por infusão intravenosa periférica), a um paciente com hemofilia A, uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de
55 / 85 Fator VIII, que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04- FL-NA).
[00162] Numa modalidade, o polinucleotídeo com alteração de códon que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA), que é administrado ao paciente humano a uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, codifica um polipeptídeo variante de Fator VIII com um ligante que é clivável in vivo. O polipeptídeo de Fator VIII inclui uma cadeia leve de Fator VIII, uma cadeia pesada de Fator VIII e um ligante de polipeptídeo unindo a terminação C da cadeia pesada à terminação N da cadeia leve. A cadeia pesada do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma primeira sequência de nucleotídeos tendo alta identidade de sequência com CS04-HC- NA (SEQ ID NO: 3), que é a porção de CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica uma cadeia pesada de Fator VIII. A cadeia leve do polipeptídeo de Fator VIII é codificada por uma segunda sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), que é a porção de CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) que codifica uma cadeia leve de Fator VIII. O ligante de polipeptídeo inclui um sítio de clivagem de furina, que permite a maturação in vivo (por exemplo, após a expressão in vivo ou administração do polipeptídeo precursor).
[00163] Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 95% de identidade de sequência com CS04- HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 96% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 97% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências
56 / 85 de nucleotídeos têm pelo menos 98% de identidade de sequência com CS04- HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99,5% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos têm pelo menos 99,9% de identidade de sequência com CS04-HC-NA e CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de nucleotídeos são idênticas à CS04-HC-NA e à CS04-LC-NA (SEQ ID NOS: 3 e 4), respectivamente. Nestas modalidades, as sequências de aminoácidos codificada por estas sequências de nucleotídeos são idênticas a CS04-HC-AA e CS04-LC-AA.
[00164] Em algumas modalidades, o ligante de polipeptídeo do construto de Fator VIII é codificado por uma terceira sequência de nucleotídeos tendo alta identidade de sequência com BDLO04 (SEQ ID NO: 5), que codifica o ligante de 14 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 760 a 773 de CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a terceira sequência de nucleotídeos é idêntica a BDLO04 (SEQ ID NO: 5). Nestas modalidades, as sequências de aminoácidos codificada por estas
57 / 85 sequências de nucleotídeos são idênticas aos aminoácidos 760 a 773 de CS04- FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[00165] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo com alteração de códon), que é administrado ao paciente humano a uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, tem uma sequência de nucleotídeos com alta identidade de sequência com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 95% de identidade com CS04- FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 96% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 97% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 98% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é idêntica a CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). Nestas modalidades, a sequência de aminoácidos codificada por estas sequências de nucleotídeos é idêntica a CS04-FL-AA.
[00166] Em algumas modalidades, a variante de Fator VIII codificada pelo polinucleotídeo com alteração de códon tem uma sequência de aminoácidos com alta identidade de sequência com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 97% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 98% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência
58 / 85 de aminoácidos tem pelo menos 99% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,5% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,9% de identidade com CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos é idêntica a CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
[00167] Consequentemente, numa modalidade, a divulgação fornece um método para tratar hemofilia A que inclui infundir por via intravenosa, a um paciente com hemofilia A, uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que tem uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA).
[00168] Em algumas modalidades, as partículas de AAV são administradas numa dose única por infusão intravenosa (por exemplo, numa veia no braço do paciente). Em algumas modalidades, uma porção da dose única é administrada, o paciente é monitorado para sinais de uma reação adversa à administração por um breve período de tempo (por exemplo, 30 minutos), e, então, (por exemplo, se nenhum sinal de uma reação adversa aparecer) a porção restante da dose única é administrada ao paciente.
[00169] Em algumas modalidades, o paciente humano que recebeu por administração as partículas de AAV tem hemofilia grave A. Por exemplo, em algumas modalidades, o paciente tem um nível de atividade de Fator VIII em sua corrente sanguínea, ao não receber terapia de substituição de Fator VIII, que é menor do que 2% da quantidade de atividade de Fator VIII encontrada numa amostra de sangue de referência, por exemplo, uma amostra de sangue com atividade de Fator VIII normal (por exemplo, uma amostra de sangue de um sujeito determinado como não tendo hemofilia A), ou uma atividade de Fator VIII média encontrada nas amostras de sangue de uma pluralidade de sujeitos determinados como não tendo hemofilia A. Em algumas
59 / 85 modalidades, o sujeito tem um nível de atividade de Fator VIII em sua corrente sanguínea, ao não receber terapia de substituição de Fator VIII, que é menor do que 2% da quantidade de atividade de Fator VIII encontrada numa amostra de sangue de referência.
[00170] Em algumas modalidades, o paciente humano que recebeu por administração as partículas de AAV não tem inibidores para FVIII (por exemplo, anticorpos inibidores de Fator VIII), não tem defeitos hemostáticos diferentes da hemofilia A grave, não tem disfunção hepática crônica e/ou não tem insuficiência renal grave.
[00171] Consequentemente, em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento incluem uma etapa de qualificar um paciente para a administração de uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente humano, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo com alteração de códon que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, tendo alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA). O método inclui determinar um nível de atividade de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente, quando o paciente não está recebendo uma terapia de substituição de Fator VIII, e qualificar o paciente para a administração das partículas de AAV quando o nível de atividade de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente é menor do que cerca de 2%, ou menor do que cerca de 1%, do nível de Fator VIII numa amostra de referência. Em algumas modalidades, o método inclui determinar se o paciente tem um ou mais dos inibidores para FVIII (por exemplo, anticorpos inibidores de Fator VIII), um defeito hemostático diferente de hemofilia A grave, disfunção hepática crônica e insuficiência renal grave e desqualificar o paciente se ele tiver qualquer uma das afecções enumeradas.
COADMINISTRAÇÃO COM PREDNISOLONA OU PREDNISONA
[00172] Em algumas modalidades, os métodos descritos acima para
60 / 85 tratar hemofilia A administrando-se partículas de AAV em qualquer dose também incluem administrar, ao paciente humano, um curso de prednisolona ou prednisona, por exemplo, para reduzir o nível de uma resposta inflamatória, por exemplo, reduzindo-se a produção de citocinas e/ou quimiocinas do sujeito. Os métodos exemplificativos para coadministrar prednisolona ou prednisona com uma terapia gênica são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional no WO 2008/069942, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade, para todos os propósitos.
[00173] Em algumas modalidades, prednisolona ou prednisona é administrada ao paciente humano antes da administração das partículas de vírus adenoassociado (AAV), com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII, que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA). Por exemplo, em algumas modalidades, prednisolona ou prednisona é administrada cerca de uma semana ou cerca de um ou dois dias antes de as partículas de AAV serem administradas ao paciente. Em algumas modalidades, um curso de prednisolona ou prednisona é administrado começando cerca de uma semana ou cerca de um ou dois dias antes de as partículas de AAV serem administradas e é continuado após a administração das partículas de AAV.
[00174] Em algumas modalidades, prednisolona ou prednisona é coadministrada ao sujeito humano ao administrar as partículas de vírus adenoassociado (AAV), com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII, que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04- FL-NA). Por exemplo, em algumas modalidades, prednisolona ou prednisona é administrada no mesmo dia, por exemplo, diretamente antes ou após a administração das partículas de AAV. Em algumas modalidades, um curso de prednisolona ou prednisona é administrado no mesmo dia que as partículas de AAV são administradas e é continuado após a administração das partículas de
61 / 85 AAV.
[00175] Em algumas modalidades, prednisolona ou prednisona é administrada ao paciente após a administração das partículas de vírus adenoassociado (AAV), com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de Fator VIII, que tem alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04- FL-NA). Por exemplo, em algumas modalidades, prednisolona ou prednisona é primeiramente administrada cerca de um ou dois dias após as partículas de AAV serem administradas ao paciente.
[00176] Deve ser observado que a prednisolona ou prednisona é um fármaco de molécula pequena que é administrado por via oral (embora o mesmo possa também ser administrado por via intravenosa), e, assim, “coadministração” neste contexto não exige que uma única solução contenha ambos os fármacos.
[00177] Em algumas modalidades, o curso de prednisolona ou prednisona é administrado ao paciente ao longo de um período de pelo menos duas semanas, por exemplo, diariamente ou a cada dois dias. Em algumas modalidades, o curso de prednisolona ou prednisona é administrado ao longo de um período de pelo menos três semanas. Em algumas modalidades, a dose de prednisolona ou prednisona diminui durante o curso. Por exemplo, numa modalidade, o curso começa com a administração de cerca de 60 mg de prednisolona ou prednisona por dia e é reduzido na medida em que o curso progride.
[00178] Numa modalidade, o curso inclui a administração de cerca de 60 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente humano, durante a primeira semana do curso, a administração de cerca de 40 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, durante a segunda semana do curso, e a administração de cerca de 30 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, durante a terceira semana imediatamente após a infusão das partículas de AAV.
62 / 85
[00179] Em algumas modalidades, o curso inclui reduzir adicionalmente a administração de prednisolona ou prednisona após a terceira semana, por exemplo, a administração de uma dose decrescente de prednisolona ou prednisona. Numa modalidade, a dose decrescente de prednisolona ou prednisona inclui administrar sucessivamente doses (por exemplo, uma ou mais doses em cada concentração) de cerca de 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia, cerca de 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia, cerca de 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia e cerca de 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia.
[00180] Numa modalidade, a dose decrescente de prednisolona ou prednisona inclui a administração de cerca de 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após a conclusão do curso inicial de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 3 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após os 5 dias em que o paciente recebeu por administração 20 mg de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 3 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após os 3 dias em que o paciente recebeu por administração 15 mg de prednisolona ou prednisona e a administração de cerca de 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 3 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após os 3 dias em que o paciente recebeu por administração 10 mg de prednisolona ou prednisona.
[00181] Numa modalidade, a dose decrescente de prednisolona ou prednisona inclui a administração de cerca de 30 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 7 dias consecutivos imediatamente após a conclusão do curso inicial de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 7 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o paciente recebeu por
63 / 85 administração 30 mg de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o sujeito humano recebeu por administração 20 mg de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o paciente recebeu por administração 15 mg de prednisolona ou prednisona e a administração de cerca de 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o paciente recebeu por administração 10 mg de prednisolona ou prednisona.
[00182] Em algumas modalidades, o comprimento de uma dose decrescente de prednisolona ou prednisona administrada ao paciente é determinada com base em se o paciente ainda está exibindo sinais de inflamação do fígado no final do curso inicial de prednisolona ou prednisona (por exemplo, conforme indicado por uma redução nos níveis de Fator VIII, por exemplo, titulação de Fator VIII ou atividade de Fator VIII ou aumento nas enzimas hepáticas).
[00183] Por exemplo, numa modalidade, um primeiro nível de Fator VIII (por exemplo, titulação ou atividade) na corrente sanguínea do paciente (por exemplo, numa amostra de sangue coletada de um paciente) é determinado após a administração de partículas de vírus adenoassociado (AAV) incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII ao paciente e enquanto o paciente está recebendo um curso inicial do tratamento com o esteroide glicocorticoide. Um segundo nível de Fator VIII (por exemplo, titulação ou atividade) na corrente sanguínea do paciente é determinado após a conclusão do curso inicial de tratamento com o esteroide glicocorticoide. O segundo nível de Fator VIII é, então, comparado ao primeiro nível de Fator VIII. O paciente recebe por administração uma primeira dose decrescente do esteroide glicocorticoide ao longo de um
64 / 85 período de tempo de não mais do que três semanas quando o segundo nível de Fator VIII não está diminuindo (por exemplo, quando o segundo nível de Fator VIII não é menor do que o primeiro nível de Fator VIII ou não é menor do que uma quantidade limite abaixo do primeiro nível de Fator VIII). O paciente recebe por administração uma segunda dose decrescente do esteroide glicocorticoide ao longo de um período de tempo que excede três semanas quando o segundo nível de Fator VIII está diminuindo (por exemplo, quando o segundo nível de Fator VIII é menor do que o primeiro nível de Fator VIII ou é menor do que uma quantidade limite abaixo do primeiro nível de Fator VIII).
[00184] Similarmente, em algumas modalidades, um primeiro nível de enzimas hepáticas (por exemplo, uma atividade ou titulação de enzima hepática) na corrente sanguínea do paciente é determinado antes (por exemplo, ou logo depois) da administração de partículas de vírus adenoassociado (AAV) incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII ao paciente. Um segundo nível de enzimas hepáticas (por exemplo, uma titulação ou atividade de enzima hepática) na corrente sanguínea do paciente é determinado após a conclusão do curso inicial de tratamento com o esteroide glicocorticoide. O segundo nível de enzimas hepáticas é, então, comparado ao primeiro nível de enzimas hepáticas. O paciente recebe por administração uma primeira dose decrescente do esteroide glicocorticoide ao longo de um período de tempo de não mais do que três semanas quando o segundo nível de enzimas hepáticas não está diminuindo (por exemplo, quando o segundo nível de enzimas hepáticas não é maior do que o primeiro nível de enzimas hepáticas, ou não é superior a uma quantidade limite acima do primeiro nível de enzimas hepáticas). O paciente recebe por administração uma segunda dose decrescente do esteroide glicocorticoide ao longo de um período de tempo que excede três semanas quando o segundo nível de enzimas hepáticas está aumentando (por exemplo,
65 / 85 quando o segundo nível de enzimas hepáticas é maior do que o primeiro nível de enzimas hepáticas ou maior do que uma quantidade limite acima do primeiro nível de enzimas hepáticas).
[00185] Em algumas modalidades, a primeira dose decrescente de prednisolona ou prednisona inclui a administração de cerca de 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após a conclusão do curso inicial de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 3 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após os 5 dias em que o paciente recebeu por administração 20 mg de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 3 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após os 3 dias em que o sujeito humano recebeu por administração 15 mg de prednisolona ou prednisona e a administração de cerca de 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 3 dias consecutivos (por exemplo, imediatamente) após os 3 dias em que o paciente recebeu por administração 10 mg de prednisolona ou prednisona.
[00186] Em algumas modalidades, a segunda dose decrescente de prednisolona ou prednisona inclui a administração de cerca de 30 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 7 dias consecutivos imediatamente após a conclusão do curso inicial de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 7 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o paciente recebeu por administração 30 mg de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o paciente recebeu por administração 20 mg de prednisolona ou prednisona, a administração de cerca de 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em
66 / 85 que o paciente recebeu por administração 15 mg de prednisolona ou prednisona e a administração de cerca de 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao paciente, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o paciente recebeu por administração 10 mg de prednisolona ou prednisona.
[00187] Em algumas modalidades, o curso de prednisolona ou prednisona é administrado após a detecção de uma indicação de uma reação imune no paciente, após a administração das partículas de AAV. Em algumas modalidades, o curso de prednisolona ou prednisona é administrado após a detecção de uma indicação de inflamação do fígado no paciente. Por exemplo, em algumas modalidades, o paciente é monitorado para inflamação do fígado após a administração das partículas de AAV, e o paciente recebe por administração um curso de prednisolona ou prednisona mediante a detecção da inflamação do fígado.
[00188] Em algumas modalidades, uma diminuição rápida ou grande na expressão de Fator VIII ou atividade de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente indica inflamação do fígado no sujeito. Em algumas modalidades, é possível que um pico precoce da atividade de Fator VIII possa ser observado seguido por uma diminuição pequena e/ou gradual, após a qual a proteína de Fator VIII pode ser produzida a um nível de algum modo menor, o que não exige a administração de um curso de prednisolona ou prednisona. Por exemplo, em algumas modalidades, a quantidade de Fator VIII (por exemplo, um nível de titulação de Fator VIII ou atividade de Fator VIII) na corrente sanguínea do paciente é monitorada após a administração das partículas de AAV, e o sujeito recebe por administração um curso de prednisolona ou prednisona se uma diminuição rápida ou grande na quantidade de Fator VIII (por exemplo, mais do que uma diminuição limite no nível de titulação de Fator VIII ou atividade de Fator VIII, em comparação a um nível na corrente sanguínea do paciente após a administração das
67 / 85 partículas de AAV) for detectada.
[00189] Em algumas modalidades, um aumento no nível de enzimas hepáticas no paciente indica inflamação do fígado no sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades, o nível de enzimas hepáticas no paciente é monitorado após a administração das partículas de AAV, e o paciente recebe por administração um curso de prednisolona ou prednisona se um aumento no nível de enzimas hepáticas (por exemplo, mais do que um aumento limite na quantidade de enzimas hepáticas, por exemplo, em comparação a um nível de linha de base de enzimas hepáticas no paciente antes da administração das partículas de AAV ou logo após a administração das partículas de AAV) for detectado. MONITORAMENTO PÓS-ADMINISTRAÇÃO
[00190] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para monitorar um paciente para reações adversas e/ou eficácia de tratamento, após a administração de partículas de vírus adenoassociado (AAV) com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, por exemplo, polinucleotídeos que têm alta identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA). Em algumas modalidades, o paciente é monitorado para um ou mais dentre (a) uma indicação de inflamação do fígado (por exemplo, por meio de diminuições rápidas ou grandes nos níveis de Fator VIII (por exemplo, titulação ou atividade) e/ou aumentos nas enzimas hepáticas (por exemplo, titulação ou atividade)), (b) um aumento nos anticorpos inibidores de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente, (c) um aumento nas proteínas de capsídeo na corrente sanguínea do paciente, (d) um aumento nos anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do paciente e (e) um aumento nos polinucleotídeos, ou fragmentos dos mesmos, que codificam o polipeptídeo de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente. Em algumas modalidades, o sujeito é adicionalmente tratado mediante a detecção de uma ou mais dentre reação adversa e/ou ineficácia do tratamento.
68 / 85
[00191] Por exemplo, numa modalidade, um método é fornecido para monitorar a eficácia da terapia gênica de Fator VIII para hemofilia A usando partículas de vírus adenoassociado (AAV) que incluem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Fator VIII. O método inclui determinar se os anticorpos inibidores de Fator VIII estão presentes na corrente sanguínea do paciente (por exemplo, numa amostra de sangue coletada do paciente) após a administração das partículas de AAV ao paciente. Em algumas modalidades, quando os anticorpos inibidores de Fator VIII são detectados na corrente sanguínea do paciente (por exemplo, quando um aumento no nível de anticorpos inibidores de Fator VIII é detectado, em comparação a um nível no paciente antes da administração das partículas de AAV), o método inclui administrar um agente alternativo para tratamento de hemofilia A ao paciente.
[00192] Em algumas modalidades, o agente alternativo para o tratamento de hemofilia A é uma forma alternativa de Fator VIII (por exemplo, uma que não inclui, ou mascara, um ou mais epítopos alvejados pelos anticorpos inibidores de Fator VIII detectados). Em algumas modalidades, a forma alternativa do Fator VIII é uma proteína de Fator VIII quimicamente modificada (por exemplo, uma proteína de Fator VIII humana ou porcina quimicamente modificada). Em algumas modalidades, a forma alternativa do Fator VIII é uma proteína de Fator VIII derivada de uma proteína de Fator VIII não humana, por exemplo, uma proteína de Fator VIII porcina. Em algumas modalidades, o agente alternativo para o tratamento de hemofilia A é uma terapia de desvio de Fator VIII, por exemplo, um agente terapêutico que inclui o Fator II, Fator IX e Fator X. Por exemplo, em algumas modalidades, a terapia de desvio de Fator VIII é um complexo de Atividade de Desvio de Inibidor de Fator VIII (FEIBA), fator VII ativado recombinante (FVIIa), um concentrado de complexo de protrombina ou um concentrado de complexo de protrombina ativada.
[00193] Numa modalidade, é fornecido um método para monitorar o
69 / 85 nível de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, ou um fragmento do mesmo, na corrente sanguínea do paciente após a administração das partículas de AAV.
Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo.
O método também inclui medir o nível de polinucleotídeo que codifica a proteína de Fator VIII, ou fragmentos do mesmo, na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que tem uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo.
O método também inclui medir o nível de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1, ou fragmentos dos mesmos, na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que tem uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo.
O método também inclui medir o nível de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1, ou fragmentos dos mesmos, na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
Em algumas modalidades do método, o ponto de tempo posterior é de pelo menos 14 dias depois ou pelo menos 21 dias depois.
Em algumas modalidades, o ponto de tempo posterior é de 7 dias, 14 dias ou 21 dias após a administração das partículas de AAV.
70 / 85
[00194] Numa modalidade, um método é fornecido para monitorar o nível de proteína de capsídeo na corrente sanguínea do paciente após a administração das partículas de AAV. Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do referido paciente, em que as partículas de AAV incluem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo. O método também inclui medir o nível da proteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais. Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL- NA) num primeiro ponto de tempo. O método também inclui medir o nível da proteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais. Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do referido paciente, em que as partículas de AAV incluem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo. O método também inclui medir o nível da proteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais. Em algumas modalidades do método, o ponto de tempo posterior é de pelo menos 14 dias depois ou pelo menos 21 dias depois. Em algumas modalidades, o ponto de tempo posterior é de 7 dias, 14 dias ou 21 dias após a administração das partículas de AAV.
71 / 85
[00195] Numa modalidade, um método é fornecido para monitorar o nível de anticorpos inibidores de Fator VIII na corrente sanguínea do paciente após a administração das partículas de AAV. Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo. O método também inclui medir o nível de anticorpos anti-Fator VIII na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais. Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo. O método também inclui medir o nível de anticorpos anti-Fator VIII na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais. Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV), em que as partículas de AAV incluem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo. O método também inclui medir o nível de anticorpos anti-Fator VIII na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais. Em algumas modalidades do método, o ponto de tempo posterior é de pelo menos 14 dias depois ou pelo menos 21 dias depois. Em algumas modalidades, o ponto de tempo posterior é de 7 dias, 14 dias ou 21 dias após a administração das partículas de AAV.
[00196] Numa modalidade, um método é fornecido para monitorar o
72 / 85 nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do sujeito após a administração das partículas de AAV.
Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do referido paciente, em que as partículas de AAV incluem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo.
O método também inclui medir o nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que inclui uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo.
O método também inclui medir o nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
Numa modalidade, o método inclui administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do paciente, em que as partículas de AAV incluem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo.
O método também inclui medir o nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
Em algumas modalidades do método, o ponto de tempo posterior é de pelo menos 14 dias depois ou pelo menos 21 dias depois.
Em algumas modalidades, o ponto de tempo posterior é de 7 dias, 14 dias ou 21 dias após a administração das partículas de AAV.
73 / 85 IV. EXEMPLOS EXEMPLO 1 – CONSTRUÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE
EXPRESSÃO DE VARIANTE DE FATOR VIII COM ALTERAÇÃO DE CÓDON
[00197] Dois obstáculos tiveram que ser superados a fim de se criar uma sequência de codificação de Fator VIII que seja eficaz para terapia gênica para hemofilia A. Em primeiro lugar, por causa das limitações de tamanho genômico de vetores de entrega de terapia gênica convencionais (por exemplo, vírions de AAV), o polipeptídeo de Fator VIII codificado teve que ser consideravelmente encurtado. Em segundo lugar, a sequência de codificação teve que ser alterada para: (i) estabilizar interações de encapsulamento dentro do vetor de entrega, (ii) estabilizar o intermediário de mRNA e (iii) melhorar a robustez da transcrição/tradução do mRNA.
[00198] Para alcançar o primeiro objetivo, os Requerentes começaram com um construto de variante de Fator VIII com domínio B deletado, denominado no presente documento “FVIII-BDD-SQ.” Neste construto, o domínio B é substituído por uma sequência de quatorze aminoácidos denominada sequência “SQ”. FVIII-BDD-SQ recombinante é vendido sob o nome comercial REFACTO® e mostrou ser eficaz para o controle da hemofilia A. Entretanto, a sequência de codificação nativa para FVIII-BDD- SQ, que inclui sequências de ácidos nucleicos do tipo selvagem humanas para as cadeias pesada e leve de Fator VIII, é inefetivamente expressa em vetores de terapia gênica.
[00199] Para solucionar a expressão pobre do FVIII-BDD-SQ nativo, o algoritmo de otimização de códon descrito em Fath et al. (PLoS ONE, 6:e17596 (2011)), modificado conforme descrito em Ward et al. (Blood, 117:798 (2011)) e em McIntosh et al. (Blood, 121, 3335-3344 (2013)) foi aplicado à sequência de FVIII-BDD-SQ para criar a primeira sequência de codificação intermediária CS04a. Entretanto, os Requerentes reconheceram
74 / 85 que a sequência CS04a criada usando o algoritmo modificado poderia ser melhorada modificando-se adicionalmente a sequência. Consequentemente, os Requerentes reintroduziram dinucleotídeos CpG, reintroduziram o códon CGC para arginina, alteraram as distribuições de códon de leucina e serina, reintroduziram pares de códons altamente conservados e removeram elementos crípticos de TATA box, CCAAT box e sítio de splicing, evitando ilhas de CpG e super-representação local de extensões ricas em AT e ricas em GC.
[00200] Em primeiro lugar, o algoritmo modificado substitui sistematicamente códons contendo dinucleotídeos CpG (por exemplo, códons de arginina) com códons de não dinucleotídeo CpG e elimina/evita dinucleotídeos CpG criados por códons vizinhos. Esta evitação estrita de dinucleotídeos CpG é usualmente feita para prevenir a imunidade induzida por TLR após a injeção intramuscular de vacinas de DNA. Entretanto, fazer isto limita as possibilidades de otimização de códon. Por exemplo, o algoritmo modificado exclui o uso do conjunto completo de códons de arginina CGX. Isto é particularmente disruptivo na codificação de genes para a expressão em células humanas, devido ao fato de que CGC é o códon de arginina mais frequentemente usado em genes humanos altamente expressos. Adicionalmente, evitar a criação de CpGs por códons vizinhos limita adicionalmente as possibilidades de otimização (por exemplo, limita o número de pares de códons que podem ser usados em conjunto).
[00201] Como não se espera que a imunidade induzida por TLR seja um problema associado à terapia gênica à base de AAV direcionada ao fígado, códons incluindo CpGs, e códons vizinhos que criam CpGs, foram reintroduzidos na sequência de codificação intermediária CS04a, preferencialmente na sequência que codifica a cadeia leve de Fator VIII (por exemplo, na extremidade 3’ da sequência de codificação FVIII-BDD-SQ). Isto permitiu o uso mais frequente de códons humanos preferenciais,
75 / 85 particularmente aqueles para arginina. Foi tomado cuidado, entretanto, para evitar a criação de ilhas de CpG, que são regiões de sequência de codificação que têm uma alta frequência de sítios de CpG. Isto é contrário aos ensinamentos de Krinner et al. (Nucleic Acids Res., 42(6):3551-64 (2014)), que sugerem que domínios de CpG a jusante de sítios de início de transcrição promovem altos níveis de expressão de genes.
[00202] Em segundo lugar, o algoritmo modificado aplica certos códons exclusivamente, tais como CTG para leucina, GTG para valina e CAG para glutamina. Entretanto, isto ofende os princípios do uso equilibrado de códons, por exemplo, conforme proposto em Haas et al. (Current Biology, 6(3):315-24 (1996)). Considerando-se o superuso de códons preferenciais pelo algoritmo modificado, códons de leucina alternativos foram reintroduzidos quando permitido pelas outras regras aplicadas à alteração de códons (por exemplo, frequência de CpG e teor de GC).
[00203] Em terceiro lugar, o algoritmo modificado substitui pares de códons sem considerar quão conservados os mesmos estão em natureza, quando certos critérios (por exemplo, a presença de dinucleotídeos CG) são satisfeitos. Considerando-se as propriedades benéficas que podem ter sido conservadas pela evolução, os pares de códon mais conservados que foram substituídos pelo algoritmo e os pares de códon preferenciais mais conservados, por exemplo, conforme descrito em Tats et al. (BMC Genomics 9:463 (2008)), foram analisados e ajustados quando permitido pelas outras regras aplicadas à alteração de códon (por exemplo, frequência de CpG e teor de GC).
[00204] Em quarto lugar, os códons de serina usados na sequência de codificação intermediária foram também geneticamente modificados novamente. Especificamente, códons de serina AGC, TCC e TCT foram introduzidos na sequência de codificação modificada com frequência mais alta, para melhor correspondência geral ao uso de códon humano (Haas et al.,
76 / 85 supra).
[00205] Em quinto lugar, elementos de TATA box, CCAAT box e sítios de splicing de íntron/éxon foram triados e removidos da sequência de codificação modificada. Ao modificar a sequência de codificação, foi tomado cuidado para evitar a super-representação local de extensões ricas em AT ou ricas em GC.
[00206] Finalmente, adicionalmente da otimização do uso de códon dentro da sequência de codificação, as exigências estruturais do vírion de AAV subjacente foram consideradas ao refinar adicionalmente a sequência de codificação intermediária CS04a. Os vetores de AAV (por exemplo, a porção de ácido nucleico de um vírion de AAV) são encapsulados como moléculas de DNA de fita simples em seus capsídeos (para revisão, consultar Daya e Berns, Clin. Microbiol Rev., 21(4):583-93 (2008)). O teor de GC do vetor é, portanto, provável de influenciar o encapsulamento do genoma e, assim, os rendimentos de vetor durante a produção. Como muitos algoritmos, o algoritmo modificado usado aqui cria uma sequência de genes otimizada com um teor de GC de pelo menos 60% (consultar, Fath et al., PLoS One, 6(3):e17596 (2011) (errata em: PLoS One, (6)3 (2011)). Entretanto, a proteína de capsídeo de AAV8 é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem um teor de GC menor de cerca de 56%. Assim, para imitar melhor a sequência de codificação de proteína de capsídeo de AAV8 nativa, o teor de GC da sequência de codificação intermediária CS04a foi reduzido para 56%.
[00207] A sequência de codificação CS04 resultante, mostrada na Figura 2, tem um teor de GC geral de 56%. O teor de dinucleotídeo de CpG da sequência é moderado. Entretanto, os dinucleotídeos CpG estão predominantemente na porção a jusante da sequência de codificação, por exemplo, a porção que codifica a cadeia leve de Fator VIII. A sequência CS04 tem 79,77% de identidade de sequência de nucleotídeos com as sequências de codificação correspondentes no Fator VIII do tipo selvagem (acesso ao
77 / 85 Genbank M14113).
[00208] Para propósitos de comparação, diversos outros construtos ReFacto com otimização de códon foram preparados. O construto ReFacto CS08 foi submetido à otimização de códon conforme descrito em Radcliff P.M. et al., Gene Therapy, 15:289-97 (2008), cujo conteúdo está expressamente incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade, para todos os propósitos. O construto ReFacto com otimização de códon CS10 foi obtido junto à Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemanha). O construto ReFacto com otimização de códon CS11 foi obtido junto à Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, ETSA). O construto ReFacto com otimização de códon CH25 foi obtida a partir de serviços da ThermoFischer Scientific’s GeneArt (Regensburg, Alemanha). O construto ReFacto CS40 consiste na sequência de codificação de Fator VIII do tipo selvagem. As identidades de sequência compartilhadas entre cada uma das sequências de codificação ReFacto são mostradas na Tabela 2, abaixo. TABELA 2 – MATRIZ DE IDENTIDADE PERCENTUAL PARA CONSTRUTOS DE FATOR VIII COM ALTERAÇÃO DE CÓDON. CS04 CS08 CS10 CS11 CS40 CH25 CS04 100% CS08 82,2% 100% CS10 79,4% 78,4% 100% CS11 78,3% 78,1% 77,5% 100% CS40 79,8% 76,7% 77,6% 75,4% 100% CH25 85,1% 85,0% 79,9% 79,4% 75,8% 100%
[00209] Plasmídeos de cada construto foram construídos clonando-se diferentes fragmentos de DNA sintéticos no mesmo plasmídeo de cadeia principal de vetor (pCh-BBO1). A síntese de DNA dos fragmentos de BDD- FVIII do tipo Refacto com sítios de restrição de enzima AscI e NotI de flanqueamento foi feita por ThermoFischer Scientific (Regensburg, Alemanha). A cadeia principal de vetor contém duas repetições terminais invertidas (ITRs) derivadas de AAV2 de flanqueamento que abrangem uma sequência promotora/intensificadora derivada do gene de transtirretina murino específico para fígado, sítios de restrição de enzima AscI e NotI para inserção
78 / 85 do respectivo BDD-FVIII do tipo Refacto e um sítio de poliA sintético. Após a ligação dos insertos e cadeia principal de vetor preparados por meio dos sítios AscI e NotI, os plasmídeos resultantes foram amplificados em escala de miligramas. As sequências de BDD-FVIII do tipo Refacto dos construtos foram verificadas por sequenciamento direto (Microsynth, Balgach, Suíça). A clonagem resultou em sete diferentes construtos de plasmídeo nomeados pCS40, pCS04, pCS08, pCS1O, pCS11 e pCh25 (Figura 14). Os construtos têm a mesma cadeia principal de vetor e codificam a mesma proteína de FVIII com domínio B deletado (BDD-FVIII do tipo Refacto), mas se diferem em sua sequência de codificação de FVIII.
[00210] Vetores à base de AAV8 foram preparados pelo método de transfecção de três plasmídeos, conforme descrito em Grieger JC, et al. (Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, Mol Ther., 6 de outubro. (2015) doi: 10.1038/mt.2015.187. [Publicação eletrônica antes da impressão]), cujo conteúdo está expressamente incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade, para todos os propósitos. Células de suspensões HEK293 foram usadas para transfecções de plasmídeo usando o plasmídeo de vetor de FVIII correspondente, o plasmídeo auxiliar pXX6-80 (que porta genes auxiliares adenovirais), e o plasmídeo de encapsulamento pGSK2/8 (que contribui com os genes rep2 e cap8). Para isolar os construtos de AAV8, os péletes de célula de culturas de um litro foram processados usando gradientes de iodixanol, conforme descrito em Grieger et al. (2015, Supra). O procedimento resultou em preparações de vetor chamadas de vCS04, vCS08, vCS1O, vCS11 e vCH25. Os vetores foram quantificados por qPCR usando o procedimento de qPCR universal que tem como alvo as repetições terminais invertidas de AAV2 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Parte B 23:18–28 (2012)). Um plasmídeo de vetor de controle que porta repetições terminais invertidas de AAV2 serviu
79 / 85 para preparar a curva padrão. O construto vCS04 resultante é apresentado como SEQ ID NO: 8 nas Figuras 7A a 7C.
[00211] A integridade dos genomas de vetor foi analisada por eletroforese em gel de agarose de AAV. A eletroforese foi realizada conforme descrito em Fagone et al., Human Gene Therapy Methods 23:1-7 (2012). Em suma, preparações de vetor de AAV foram incubadas a 75°C por 10 minutos na presença de SDS 0,5% e, então, resfriadas até a temperatura ambiente. Aproximadamente 1,5E10 genomas de vetor (vg) foram carregados por raia num gel de agarose 1xTAE 1% e submetidos à eletroforese por 60 min a 7 V/cm de extensão de gel. O gel foi, então, manchado em solução GelRed 2x (Biotium número de catálogo 41003) e imageado por ChemiDocTMMP (Biorad). Os resultados mostrados na Figura 15 demonstram que os vetores virais vCS04 e vCS40 têm genoma do mesmo tamanho, indicado por uma banda distinta na faixa de 5 kb (Figura 15, raias 2 a 4). Apesar de um tamanho de vetor de aproximadamente 5,2 kb, o genoma é uma banda homogênea confirmando o encapsulamento correto do genoma de algum modo superdimensionado (em relação a um genoma do tipo selvagem de AAV de 4,7 kb). Todas as preparações de vetor vCS mostram o mesmo tamanho genômico (dados não mostrados).
[00212] A fim de confirmar o padrão esperado de proteínas de capsídeo, SDS PAGE seguido por manchamento prata foi realizado com os vetores vCS04 e vCS40 (Figura 16). Conforme mostrado na Figura, o procedimento de purificação a jusante resultou em material altamente purificado que exibe o padrão de proteína esperado de VP1, VP2 e VP3 (Figura 16, raias 2 a 4). O mesmo padrão foi visto com todas as outras preparações virais (não mostradas). O procedimento de SDS-PAGE das preparações de AAV foi feito de acordo com os procedimentos padrão. Cada raia continha 1E10 vg do respectivo construto viral e foi separada num gel de Bis-Tris 4 a 12% (NuPAGE® Novex, Life Technologies) de acordo com as
80 / 85 instruções do fabricante. Manchamento prata foi realizado com um kit SilverQuestTM (Novex, Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante.
[00213] Surpreendentemente, o vetor de AAV vCS04 teve encapsulamento de vírion mais alto, medido por rendimentos mais altos na produção de vírus AAV, em comparação ao construto de codificação do tipo selvagem the vCS40 e aos outros construtos com otimização de códon. Conforme mostrado na Tabela 3, o vetor de vCS04 replicou substancialmente melhor do que vCS40, fornecendo um aumento de rendimento de 5 a 7 vezes na titulação de AAV. TABELA 3 – RENDIMENTOS POR LITRO DE CULTURA CELULAR OBTIDOS COM OS CONSTRUTOS DE VETOR DE AAV vCS04 E vVCD40, CONFORME PURIFICADO A PARTIR DE CÉLULAS DE PÉLETES. Construto Concentração de vetor Rendimentos Aumento em vezes [vg/ml] [vg/litro] versus tipo selvagem x10E12 x10E12 vCS40 2,0 11,0 - vCS04 – Amostra 1 17,6 79,2 7,2 vCS04 – Amostra 2 15,9 58,8 5,4 EXEMPLO 2 – EXPRESSÃO IN VIVO DE SEQUÊNCIAS DE
EXPRESSÃO DE VARIANTE DE FATOR VIII COM ALTERAÇÃO DE CÓDON
[00214] Para testar a potência biológica das sequências variantes de Fator VIII com alteração de códon, os construtos de FVIII do tipo ReFacto descritos no Exemplo 1 foram administrados a camundongos que não têm o Fator VIII. Em suma, os ensaios foram realizados em camundongos com knockout (ko) C57B1/6 de FVIII (com 6 a 8 animais por grupo) por injeção na veia da cauda de 4E12 genomas de vetor (vg) por quilograma de peso corporal de camundongo. Sangue foi extraído 14 dias após a injeção por punção retro-orbital, e plasma foi preparado e congelado usando procedimentos padrão. Os níveis de expressão no dia 14 foram escolhidos
81 / 85 devido ao fato de que há mínima influência de anticorpos inibidores neste momento, que são vistos em alguns animais deste modelo de camundongo em momentos posteriores. A atividade de FVIII no plasma de camundongo foi determinada usando o ensaio de FVIII Technochrome realizado, com apenas pequenas modificações, conforme sugerido pela fabricação (Technoclone, Vienna, Áustria). Para o ensaio, as amostras de plasma foram apropriadamente diluídas e misturadas com reagentes de ensaio, contendo trombina, fator IX ativado (FIXa), fosfolipídeos, fator X e cálcio. Após a ativação de FVIII por trombina, um complexo com FIXa, fosfolipídeos e cálcio é formado. Este complexo ativa FX para FX ativado (FXa) que, por sua vez, cliva para-nitroanilida (pNA) a partir do substrato cromogênico. A cinética da formação de pNA é medida a 405 nm. A taxa é diretamente proporcional à concentração de FVIII na amostra. As concentrações de FVIII são lidas a partir de uma curva de referência, e os resultados são dados em IU de FVIII/mililitro.
[00215] Os resultados, apresentados na Tabela 4 abaixo, demonstram que as sequências com alteração de códon projetadas usando algoritmos comerciais (CS10, CS11 e CH25) forneceram apenas um aumento modesto em BDD-Fator VIII (3 a 4 vezes) em comparação ao construto de BDD-Fator VIII do tipo selvagem (CS40). Similarmente, o construto de BDD-Fator VIII com alteração de códon preparado conforme descrito em Radcliffe et al. (CS08) forneceu apenas um aumento de 3 a 4 vezes na expressão de BDD- FVIII. Este resultado é consistente com os resultados relatados em Radcliff et al. Surpreendentemente, o construto CS04 forneceu expressão de BDD-FVIII muito mais alta nos ensaios de biopotência in vivo (por exemplo, um aumento de 74 vezes). TABELA 4 – EXPRESSÃO DE FVIII NO PLASMA DE
CAMUNDONGOS COM KNOCKOUT DE FVIII INDUZIDA PELOS DIFERENTES CONSTRUTOS DE VETOR DE AAV.
82 / 85 Construto Algoritmo de FVIII Médio Desvio padrão Número de Aumento em Códon Expressão no Dia 14 camundongos vezes [IU/ml] versus tipo selvagem vCS40 Tipo selvagem 0,03 0,03 12 - humano vCS04 do Requerente 2,21 1,20 55 73,7 vCS08 Radcliffe et al. 0,11 0,01 6 3,6 vCS10 Eurofins 0,09 0,01 7 3,0 vCS11 IDT 0,08 0,02 8 2,7 vCH25 GeneArt 0,13 0,12 18 4,3 EXEMPLO 3 – EFICÁCIA NÃO CLÍNICA E AVALIAÇÃO DE
TOXICOLOGIA DE UM VETOR DE TERAPIA GÊNICA DE FVIII HUMANO EM CAMUNDONGOS
[00216] A hemofilia A é um distúrbio de sangramento herdado causado pelo fator VIII (FVIII) ausente ou defeituoso e tratado com concentrados de fator recombinante ou derivados de plasma. Estes concentrados precisam ser infundidos numa base regular para manter níveis adequados de FVIII para controlar e impedir eventos de sangramento. Dados os desafios da terapia de substituição de proteína, a terapia gênica pode oferecer uma abordagem terapêutica alternativa para pacientes com hemofilia A. Introduzindo-se uma cópia de gene F8 funcional nas células hepáticas alvo para induzir a expressão de FVIII endógeno, infusões frequentes de fator de coagulação pode não ser mais necessárias.
[00217] A terapia gênica à base de vírus adenoassociado (AAV) tem o potencial para fornecer benefício clínico em pacientes com hemofilia A. Um vetor de terapia gênica à base de (r)AAV8 recombinante contendo o construto com otimização de códon de Fator VIII CS04 é projetado para entregar um transgene de FVIII com domínio B deletado com otimização de códon (BDDFVIII) sob o controle de um promotor de transtirretina específico para fígado. Este construto foi usado para examinar a relação dependente de dose para atividade de FVIII em camundongos com knockout (ko) F8 e para avaliar a toxicidade após uma única administração intravenosa.
[00218] Em suma, para testar a eficácia do tratamento, 12 camundongos machos com knockout de FVIII por grupo receberam por
83 / 85 administração uma única dose intravenosa de 3,0×1011, 1,2×1012 ou 3,0×1012 das partículas de capsídeo de vetor (cp)/kg ou 10 ml/kg de tampão. As amostras de sangue retro-orbitais foram coletadas a cada duas semanas ao longo de 8 semanas e analisadas para FVIII usando um ensaio cromogênico. As amostras de plasma obtidas a partir da amostragem de sangue em vida final foram também usadas para a análise de anticorpos neutralizantes e de ligação de FVIII. No final do período de observação, o controle hemostático foi avaliado usando um ensaio de sangramento de ponta da cauda.
[00219] No final do estudo, todas as amostras eram negativas para anticorpos de ligação anti-BDD-FVIII com a exceção de 4 animais (tratados com 3,0×1012 cp/kg de vetor) que testaram positivo para anticorpos de ligação e neutralizantes. Estes animais foram excluídos da análise estatística dos níveis de atividade de FVIII e perda de sangue no ensaio de sangramento de ponta da cauda. A administração de 1,2×1012 ou 3,0×1012 cp/kg de vetor resultou num aumento dependente de dose na atividade de FVIII de plasma média para 0,6 e 1,9 IU/ml, respectivamente, calculado ao longo do período de investigação, mas a atividade de FVIII estava abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ) em camundongos tratados com tampão ou 3,0×1011 cp/kg de vetor (Figura 17).
[00220] A eficácia foi avaliada num ensaio de sangramento de ponta da cauda no Dia 63. Perda de sangue ao longo de 60 minutos em mg/g de peso corporal é apresentada na Figura 18. Os animais tratados com tampão ou 3,0×1011 cp/kg do vetor de terapia gênica mostraram perda de sangue similar (6,1 mg/g e 7,5 mg/g, respectivamente), consistente com a ausência de atividade de FVIII detectável. Doses mais altas do vetor de terapia gênica reduziram significativamente a perda de sangue de uma maneira dependente de dose (1,2×1012: 0,6 mg/g, 3,0×1012: 0,4 mg/g; teste de Jonckheere- Terpstra: valor P unilateral <0,001).
[00221] Para testar a toxicologia do construto, camundongos machos
84 / 85 C57BL/6J (n=20/grupo) foram injetados por via intravenosa com uma única dose de bolus de 1×1013, 3×1013 ou 5×1013 cp/kg de vetor ou tampão de formulação (Tabela 5). A avaliação da toxicidade foi baseada em sinais clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, oftalmologia e patologia clínica e anatômica. Necrópsias completas foram realizadas em 5 animais de cada coorte, e constatações macroscópicas, pesos de órgão e os resultados de exames microscópicos foram registrados. Tecidos foram coletados para avaliação de biodistribuição por reação em cadeia de polimerase quantitativa de mais 5 animais de cada coorte. Sangue foi coletado antes da dosagem e na necrópsia. A atividade de FVIII, antígeno de BDD-FVIII, anticorpos anti– BDD-FVIII de ligação, anticorpos anti–BDD-FVIII neutralizantes e anticorpos anti-AAV8 de ligação foram analisados. TABELA 5 – PROJETO DO ESTUDO DE TOXICIDADE. Tamanho de grupo Item de teste Dose cp/mg Dia de Terminação 3 Semana de Semana de Terminação 3 Terminação 18 Tampão (controles) 0 20 20 20 vCS04 1×1013 20 20 20 vCS04 3×1013 20 20 20 vCS04 5×1013 20 20 20
[00222] Foi constatado que uma única administração de bolus intravenoso do vetor de terapia gênica a até 5×1013 cp/kg foi bem tolerada. Nenhuma morte ocorreu durante o estudo e nenhum sinal clínico ou observação pós-dosagem foi considerada como estando relacionada à administração do vetor. Nenhuma constatação oftálmica negativa foi observada. Nenhum efeito no peso corporal ou consumo de alimentos foi observado. Nenhuma alteração nos parâmetros de química clínica, hematologia ou urinálise foi observada. E nenhuma constatação macroscópica ou microscópica toxicologicamente relevante foi relacionada à administração do vetor de terapia gênica.
[00223] As avaliações de atividade de FVIII e antígeno de BDD-FVIII eram propensas à ampla variabilidade, mais provavelmente como um resultado da geração de anticorpos neutralizantes para BDD-FVIII humano.
85 / 85 Entretanto, animais individuais em todos os grupos de vetores tiveram atividades acima dos níveis de linha de base geral no Dia 3 e nas Semanas 3 e 18 (dados não mostrados). Nas amostras de tecido coletadas, o DNA de vetor foi detectado predominantemente no fígado. A biodistribuição ao fígado e outros tecidos foi relacionada à dose e foi geralmente mais alta no ponto de tempo mais precoce e diminuída ao longo do tempo. A presença de DNA de vetor no cérebro e testículos diminuiu significativo ao longo do tempo e, em muitos animais, estava abaixo do LLOQ do ensaio na Semana 18 (Figura 19).
[00224] Considerados em conjunto, estes resultados mostram que a terapia gênica de BDD-FVII com otimização de códon é eficaz quando administrada a camundongos com knockout de FVIII em doses ≥ 1,2×1012 cp/kg. O nível de nenhum efeito adverso observado foi considerado como sendo 5,0×1013 cp/kg, a dose mais alta testada no estudo de toxicidade.
[00225] Em algumas modalidades, as dosagens administradas a camundongos podem ser convertidas em dosagens humanas de acordo com a orientação fornecida em “Guidance for Industry - Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers”, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Administração de Alimentos e Medicamentos, Centro para Avaliação e Pesquisa de Fármacos (CDER), julho de 2005, Pharmacology and Toxicology, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência, em sua totalidade, para todos os propósitos.
[00226] Entende-se que os exemplos e modalidades descritos no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações em luz dos mesmos serão sugeridas aos versados na técnica e devem ser incluídas no espírito e âmbito deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente documento estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims (41)

1 / 12 REIVINDICAÇÕES
1. Método para tratar hemofilia A caracterizado pelo fato de que compreende infundir, a um sujeito humano diagnosticado com hemofilia A, uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do sujeito humano, em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA).
2. Método para tratar hemofilia A caracterizado pelo fato de que compreende infundir, a um sujeito humano diagnosticado com hemofilia A, uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do sujeito humano, em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA).
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar, ao sujeito humano diagnosticado com hemofilia A, um curso de prednisolona ou prednisona.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito curso de prednisolona ou prednisona é administrado após a infusão das partículas de AAV.
5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que administrar o curso de prednisolona ou prednisona compreende: administrar 60 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, durante a primeira semana imediatamente após a infusão das partículas de AAV; administrar 40 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, durante a segunda semana imediatamente após a infusão das partículas de AAV; e administrar 30 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao
2 / 12 sujeito humano, durante a terceira semana imediatamente após a infusão das partículas de AAV.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente administrar uma dose decrescente de prednisolona ou prednisona após a terceira semana imediatamente após a infusão das partículas de AAV.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que administrar a dose decrescente de prednisolona ou prednisona compreende: administrar 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após a conclusão do curso inicial de prednisolona ou prednisona; administrar 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 3 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 20 mg de prednisolona ou prednisona; administrar 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 3 dias consecutivos imediatamente após os 3 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 15 mg de prednisolona ou prednisona; e administrar 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 3 dias consecutivos imediatamente após os 3 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 10 mg de prednisolona ou prednisona.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que administrar a dose decrescente de prednisolona ou prednisona compreende: administrar 30 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 7 dias consecutivos imediatamente após a conclusão do
3 / 12 curso inicial de prednisolona ou prednisona; administrar 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 7 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 30 mg de prednisolona ou prednisona; administrar 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 20 mg de prednisolona ou prednisona; administrar 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 15 mg de prednisolona ou prednisona; e administrar 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 10 mg de prednisolona ou prednisona.
9. Método caracterizado pelo fato de que compreende: determinar um primeiro nível de atividade de Fator VIII numa amostra de sangue coletada a partir de um sujeito humano diagnosticado com Hemofilia A após a administração de partículas de vírus adenoassociado (AAV) que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII ao sujeito humano, e enquanto o sujeito humano está recebendo um curso inicial de tratamento com o esteroide glicocorticoide; determinar um segundo nível de atividade de Fator VIII numa amostra de sangue coletada a partir do sujeito humano após a conclusão do curso inicial do tratamento com o esteroide glicocorticoide; comparar o segundo nível de atividade de Fator VIII ao primeiro nível de atividade de Fator VIII; e
4 / 12 administrar uma dose decrescente do esteroide glicocorticoide, em que: quando o segundo nível de atividade de Fator VIII não é menor do que o primeiro nível de atividade de Fator VIII, uma primeira dose decrescente do esteroide glicocorticoide é administrada ao longo de um período de tempo de no máximo três semanas; e quando o segundo nível de atividade de Fator VIII é menor do que o primeiro nível de atividade de Fator VIII, uma segunda dose decrescente do esteroide glicocorticoide é administrada ao longo de um período de tempo que excede três semanas.
10. Método caracterizado pelo fato de que compreende: determinar um primeiro nível de atividade de enzima hepática numa amostra de sangue coletada a partir de um sujeito humano diagnosticado com Hemofilia A antes da administração de partículas de vírus adenoassociado (AAV) que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII ao sujeito humano; determinar um segundo nível de atividade de enzima hepática numa amostra de sangue coletada a partir do sujeito humano após a administração de partículas de AAV que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII ao ser humano, e após a conclusão de um curso inicial do tratamento com o esteroide glicocorticoide; comparar o segundo nível de atividade de enzima hepática ao primeiro nível de atividade de enzima hepática; e administrar uma dose decrescente do esteroide glicocorticoide, em que: quando o segundo nível de atividade de enzima hepática não é maior do que o primeiro nível de atividade de enzima hepática, uma primeira dose decrescente do esteroide glicocorticoide é administrada ao longo de um período de tempo de no máximo três semanas; e
5 / 12 quando o segundo nível de atividade de enzima hepática é maior do que o primeiro nível de atividade de Fator VIII, uma segunda dose decrescente do esteroide glicocorticoide é administrada ao longo de um período de tempo que excede três semanas.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que administrar a primeira dose decrescente do esteroide glicocorticoide compreende: administrar 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após a conclusão do curso inicial do tratamento com o esteroide glicocorticoide; administrar 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 3 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 20 mg de prednisolona ou prednisona; administrar 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 3 dias consecutivos imediatamente após os 3 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 15 mg de prednisolona ou prednisona; e administrar 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 3 dias consecutivos imediatamente após os 3 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 10 mg de prednisolona ou prednisona.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que administrar a segunda dose decrescente do esteroide glicocorticoide compreende: administrar 30 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 7 dias consecutivos imediatamente após a conclusão do curso inicial do tratamento com o esteroide glicocorticoide; administrar 20 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao
6 / 12 sujeito humano, por 7 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 30 mg de prednisolona ou prednisona; administrar 15 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 7 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 20 mg de prednisolona ou prednisona; administrar 10 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 15 mg de prednisolona ou prednisona; e administrar 5 mg de prednisolona ou prednisona por dia ao sujeito humano, por 5 dias consecutivos imediatamente após os 5 dias em que o sujeito humano recebeu administração de 10 mg de prednisolona ou prednisona.
13. Método para monitorar a eficácia da terapia gênica de Fator VIII de hemofilia A usando partículas de vírus adenoassociado (AAV) que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Fator VIII, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: determinar se anticorpos inibidores de Fator VIII estão presentes numa amostra de sangue coletada a partir do sujeito humano após a administração das partículas de AAV ao sujeito humano; e mediante a detecção da presença de um inibidor de Fator VIII no sangue do sujeito humano, administrar um agente alternativo para o tratamento de hemofilia A ao sujeito humano.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente alternativo compreende uma proteína de Fator VIII humana quimicamente modificada.
15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado
7 / 12 pelo fato de que o agente alternativo compreende uma proteína de Fator VIII porcina.
16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o agente alternativo é um agente terapêutico de desvio de Fator VIII que compreende o Fator II, o Fator IX e o Fator X.
17. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do referido paciente, em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
18. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do dito paciente, em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
19. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV), em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de polinucleotídeo que codifica a proteína de
8 / 12 Fator VIII ou um fragmento do mesmo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 14 dias.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 21 dias.
23. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do dito paciente, em que as partículas de AAV compreendem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível da referida proteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
24. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do dito paciente, em que as partículas de AAV compreendem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e
9 / 12 b) medir o nível da referida proteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
25. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV), em que as partículas de AAV compreendem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível da referida proteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 14 dias.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 21 dias.
29. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do referido paciente, em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de anticorpos anti-Fator VIII na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
10 / 12
30. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do dito paciente, em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de anticorpos anti-Fator VIII na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
31. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV), em que as partículas de AAV compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de anticorpos anti-Fator VIII na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 14 dias.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 21 dias.
35. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 2x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso
11 / 12 corporal do dito paciente, em que as partículas de AAV compreendem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
36. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de 6x1012 partículas de vírus adenoassociado (AAV) por quilograma de peso corporal do dito paciente, em que as partículas de AAV compreendem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 (CS04-FL-NA) num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
37. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a) administrar a um paciente com hemofilia A uma dose de partículas de vírus adenoassociado (AAV), em que as partículas de AAV compreendem uma proteína de capsídeo e um polinucleotídeo que codifica uma proteína de Fator VIII num primeiro ponto de tempo; e b) medir o nível de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente num ponto de tempo posterior, em que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias ou mais.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: c) antes da administração da dose das partículas de vírus adenoassociado (AAV) ao referido paciente, medir um nível de linha de base
12 / 12 dos anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente; e d) opcionalmente, comparar o nível medido de anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente no ponto de tempo posterior com o nível de linha de base dos anticorpos antiproteína de capsídeo na corrente sanguínea do referido paciente.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 7 dias.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 14 dias.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que o referido ponto de tempo posterior é de 21 dias.
BR112021000695-8A 2018-07-16 2019-07-15 métodos para tratar hemofilia a e para monitorar a eficácia da terapia gênica de fator viii de hemofilia a. BR112021000695A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862698680P 2018-07-16 2018-07-16
US62/698,680 2018-07-16
US201962867171P 2019-06-26 2019-06-26
US62/867,171 2019-06-26
PCT/US2019/041802 WO2020018419A1 (en) 2018-07-16 2019-07-15 Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021000695A2 true BR112021000695A2 (pt) 2021-04-20

Family

ID=67660451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021000695-8A BR112021000695A2 (pt) 2018-07-16 2019-07-15 métodos para tratar hemofilia a e para monitorar a eficácia da terapia gênica de fator viii de hemofilia a.

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220333135A1 (pt)
EP (1) EP3823985A1 (pt)
JP (1) JP2021530524A (pt)
KR (1) KR20210034013A (pt)
CN (1) CN112449640A (pt)
AU (1) AU2019306194A1 (pt)
BR (1) BR112021000695A2 (pt)
CA (1) CA3106590A1 (pt)
CO (1) CO2021000468A2 (pt)
MX (1) MX2021000582A (pt)
TW (1) TW202006141A (pt)
WO (1) WO2020018419A1 (pt)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023506171A (ja) * 2019-12-12 2023-02-15 武田薬品工業株式会社 発現が上昇した組換えｆｖｉｉｉバリアントをコードするウイルスベクターを使用する、血友病ａの遺伝子療法
EP4355768A1 (en) * 2021-06-14 2024-04-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
JPH0788399B2 (ja) 1985-04-12 1995-09-27 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド 新規プロコアギュラント蛋白質
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6924365B1 (en) 1998-09-29 2005-08-02 Transkaryotic Therapies, Inc. Optimized messenger RNA
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
WO2008069942A2 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Biogen Idec Ma Inc. Novel methods of enhancing delivery of a gene therapy vector using steroids
GB0911870D0 (en) 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
WO2013119880A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Global Bio Therapeutics Usa, Inc. Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof
GB201210357D0 (en) 2012-06-12 2012-07-25 Ucl Business Plc Factor VIII sequences
WO2014064277A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Vrije Universiteit Brussel Vector for liver-directed gene therapy of hemophilia and methods and use thereof
PT3889173T (pt) 2013-02-15 2023-10-10 Bioverativ Therapeutics Inc Gene do fator viii otimizado
HUE050484T2 (hu) 2013-09-12 2020-12-28 Biomarin Pharm Inc VIII. faktort kódoló gént tartalmazó AAV vektorok
TWI756185B (zh) * 2015-09-24 2022-03-01 美商拜奧馬林製藥公司 腺相關病毒因子viii載體、相關病毒粒子及包含其之治療調配物
CN116949052A (zh) * 2015-11-13 2023-10-27 武田药品工业株式会社 用于血友病a的基因治疗的具有增加的表达的编码重组fviii变体的病毒载体

Also Published As

Publication number Publication date
EP3823985A1 (en) 2021-05-26
MX2021000582A (es) 2021-04-12
AU2019306194A1 (en) 2021-02-04
JP2021530524A (ja) 2021-11-11
KR20210034013A (ko) 2021-03-29
CN112449640A (zh) 2021-03-05
WO2020018419A1 (en) 2020-01-23
CA3106590A1 (en) 2020-01-23
US20220333135A1 (en) 2022-10-20
CO2021000468A2 (es) 2021-04-08
TW202006141A (zh) 2020-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7307836B2 (ja) 組換えｆｖｉｉｉ変異型をコードする血友病ａ遺伝子治療用高発現ウイルスベクター
US11707536B2 (en) Viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression for gene therapy of hemophilia A
WO2018217731A1 (en) Viral vectors encoding recombinant fix with increased expression for gene therapy of hemophilia b
JP6695426B2 (ja) 組換えｆｖｉｉｉ変異型をコードする血友病ａ遺伝子治療用高発現ウイルスベクター
BR112021000695A2 (pt) métodos para tratar hemofilia a e para monitorar a eficácia da terapia gênica de fator viii de hemofilia a.
US20230023826A1 (en) Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
WO2022264040A1 (en) Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
EA046432B1 (ru) Вирусные векторы, кодирующие рекомбинантные варианты fviii с повышенной экспрессией для генной терапии гемофилии a

Legal Events

Date Code Title Description
B11A Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing
B11Y Definitive dismissal - extension of time limit for request of examination expired [chapter 11.1.1 patent gazette]