BR112021000598A2 - Método para produzir frutose-6-fosfato, micro-organismo recombinante, combinação de enzimas, composição e uso do micro-organismo - Google Patents

Método para produzir frutose-6-fosfato, micro-organismo recombinante, combinação de enzimas, composição e uso do micro-organismo Download PDF

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Abstract

“método para produzir frutose-6- fosfato, micro-organismo recombinante, combinação de enzimas, composição e uso do micro-organismo”. é descrito um método para a produção de frutose-6-fosfato (f6p) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (dhap) e gliceraldeído-3-fosfato (g3p) que compreende as etapas de: (a) converter enzimaticamente fosfato de di-hidroxiacetona (dhap) em di-hidroxiacetona (dha); e (b) converter enzimaticamente a assim produzida di-hidroxiacetona (dha) e gliceraldeído-3-fosfato (g3p) em frutose-6-fosfato (f6p); ou que compreende as etapas de: (a) converter enzimaticamente gliceraldeído-3-fosfato (g3p) em gliceraldeído; e (b) converter enzimaticamente o gliceraldeído assim produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (dhap) em frutose-1-fosfato (f1p); e (c) converter enzimaticamente a frutose-1-fosfato (f1p) assim produzida em frutose-6-fosfato (f6p).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA PRODUZIR FRUTOSE-6-FOSFATO, MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE, COMBINAÇÃO DE ENZIMAS, COMPOSIÇÃO E USO DO MICRO-ORGANISMO”
[001] A presente invenção refere-se a um método para a produção de frutose-6- fosfato (F6P) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P), que compreende as etapas de: (a) converter enzimaticamente fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di- hidroxiacetona (DHA); e (b) converter enzimaticamente a di-hidroxiacetona (DHA) assim produzida juntamente com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) ou que compreende as etapas de: (a’) converter enzimaticamente gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído; e (b’) converter enzimaticamente o gliceraldeído assim produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P); e (c’) converter enzimaticamente a frutose-1-fosfato (F1P) assim produzida em frutose-6-fosfato (F6P).
[002] Nas últimas décadas, os praticantes da engenharia metabólica têm se empenhado em fornecer soluções biológicas para a produção de produtos químicos, oferecendo assim alternativas aos processos químicos mais tradicionais. Em geral, as soluções biológicas permitem a utilização de matérias-primas renováveis (por exemplo, açúcares) e competem com os processos petroquímicos existentes. Uma solução biológica de múltiplas etapas para a produção de um produto químico tipicamente compreende um micro-organismo como o catalisador para a conversão da matéria-prima em uma molécula alvo. Um conjunto completo de reações enzimáticas para a produção de uma molécula alvo particular pode ser agrupado naquelas pertencentes às vias do carbono central e naquelas pertencentes à via específica do produto. As reações pertencentes às vias do carbono central e específicas do produto estão ligadas ao fato de que restrições redox (normalmente,
NAD(P)H) e energéticas (tipicamente, ATP) de todas e cada reação enzimática devem ser contabilizadas em um equilíbrio geral que contribui para a competitividade do processo. Historicamente, as vias de carbono central de heterótrofos que crescem em açúcares têm sido descritas como a via de Embden-Meyerhoff-Parnas (EMPP), a via da pentose fosfato (PPP), a via de Entner-Doudoroff (EDP) e a via de fosfoquetolase (PKP) (ver Gottschalk (1986), Bacterial Metabolism, 2ª edição, Springer-Verlag, Nova York). Cada via central ou combinações de vias centrais oferecem vantagens e desvantagens em relação a uma molécula alvo específica. A fim de fornecer bioprocessos competitivos, micro-organismos recombinantes com modificações que envolvem a EMPP, PPP e EDP foram descritos (M. Emmerling et al., Metab Eng. 1:117 (1999); L O. Ingram et al., Appl. Environ. Microbiol. 53: 2420 (1987); C. T. Trinh et al., Appl. Environ. Microbiol. 74:3634 (2008)). Mais recentemente, micro-organismos recombinantes com modificações que envolvem a PKP foram descritos (consultar Sonderegger et al. Appl. Environ. Microbiol. 70 (2004), 2892 a 2897, Patente US
7.253.001, Chinen et al. J. Biosci. Bioeng. 103 (2007), 262 a 269, Patente US
7.785.858; Fleige et al., Appl. Microbiol. Cell Physiol. 91 (2011), 769 a 776).
[003] A EMPP converte 1 mol de glicose em 2 mol de piruvato (PYR). Quando acetil-CoA é desejado, 1 mol de PYR pode ser convertido em 1 mol de acetil-CoA com a geração concomitante de 1 mol de CO2 e 1 mol de NADH. A soma das reações é dada na Equação 1. glicose + 2 ADP + 2 H3PO4 + 2 CoA + 4 NAD+ → 2 acetil-CoA + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O + 4 NADH + 4 H+ (Equação 1)
[004] A PPP fornece um meio para converter 1 mol de glicose em 1 mol de CO 2 e 2 mol de NADPH, com a geração concomitante de 0,67 mol de frutose-6-fosfato (F6P) e 0,33 mol de gliceraldeído-3-fosfato (GAP). O F6P e o GAP assim formados devem ser metabolizados por outras vias de reação, por exemplo, pela EMPP. A EDP converte 1 mol de glicose em 1 mol de GAP e 1 mol de PYR com a geração concomitante de 1 mol de NADPH. Como com a PPP, o GAP assim formado deve ser metabolizado por outras vias de reação. A PKP fornece um meio para converter 1 mol de glicose em 1 mol de GAP e 1,5 mol de acetil fosfato (AcP). Quando acetil-CoA é desejado, 1 equivalente de AcP mais 1 equivalente de coenzima A (CoA) pode ser convertido em 1 equivalente de acetil-CoA e 1 equivalente de fosfato inorgânico (Pi) pela ação da fosfotransacetilase.
[005] Para moléculas alvo específicas derivadas de porções químicas de AcCoA geradas através da PKP e quase neutralidade redox para as porções químicas de AcCoA, existe uma deficiência no saldo geral de energia. A PKP (e, da mesma forma, a PPP e EDP) não gera ATP para a conversão de glicose em glicose-6-fosfato. No caso de captação de glicose dependente de fosfoenolpiruvato (PEP), a PEP deve ser gerada por outros meios, por exemplo, através da EMPP. A reciclagem do GAP por meio da PKP agrava o problema, particularmente quando a via específica do produto fornece pouco ATP.
[006] Sonderegger (loc. Cit.) E a Patente US 7.253.001 revelam cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes que compreendem atividade de fosfocetolase nativa ou superexpressa juntamente com fosfotransacetilase superexpressa para aumentar o rendimento na conversão de misturas de glicose/xilose em etanol. Essas cepas apresentam captação de glicose independente de PEP tanto com o EMPP quanto com a PPP operativa.
[007] Chinen (loc. Cit.) e a Patente US 7.785.858 revelam uma bactéria recombinante selecionada do grupo que consiste na família Enterobacteriaceae, bactéria Coryneform e bactéria Bacillus que compreendem atividade aumentada de fosfocetolase para a conversão de glicose em moléculas alvo que são produzidas por meio do intermediário acetil-CoA, incluindo o grupo que consiste em ácido L- glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, L-cisteína, succinato e poli- hidroxibutirato. Essas cepas apresentam captação de glicose dependente de PEP com a EMPP operativa. Notavelmente, a atividade de fosfofrutocinase na bactéria da Patente US 7.785.858 é reduzida em comparação com a de uma cepa de tipo selvagem ou não modificada (consultar página 33).
[008] O documento WO 2013/007786 descreve um micro-organismo recombinante que tem atividade de fosfocetolase e no qual a EMPP é desativada ou diminuída pela abolição ou redução da fosfofrutocinase e no qual a ramificação oxidativa da PPP é desativada ou diminuída pela abolição ou redução da glicose-6- fosfato desidrogenase. Essas medidas levam a um aumento na quantidade de frutose- 6-fosfato (F6P), que é convertido pela fosfocetolase e alimentado na ramificação não oxidativa da PPP. Nesse caso, o gliceraldeído-3-fosfato (G3P) que resulta da ramificação não oxidativa da PPP é reciclado em frutose-1,6-bifosfato (FBP) por meio da condensação com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP). Essa reação é catalisada pela frutose-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13). A frutose-1,6-bifosfato (FBP) é então convertida em frutose-6-fosfato (F6P) pela ação da enzima frutose bifosfatase (EC
3.1.3.11).
[009] A frutose bifosfatase (EC 3.1.3.11) é altamente regulada (consultar, por exemplo, G.A. Tejwani, Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology 54:121 a 194 (1983)). A fim de evitar ciclos inúteis durante a glicólise, a atividade de bifosfatase frutose é regulada para baixo na presença de glicose. A inibição alostérica da Bifosfatase frutose de E. coli Tipo I (exigida para o crescimento em substrato neoglicogênico) é mediada pela Glicose-6-fosfato, o primeiro metabólito produzido mediante transporte de glicose para a célula (e também parte da importação de sacarose e das vias de metabolização em E. coli) e AMP (J. Hines et al., J. Biol. Chem. 282:24697 a 24706 (2007)). Essa enzima é basicamente inativa se glicose ou sacarose estiver presente no meio de cultura.
[010] Uma vez que nos processos de fermentação que empregam micro- organismos glicose ou sacarose são comumente usados como fonte de carbono e também são usados em concentrações bastante altas, tais condições de fermentação podem dificultar a eficiência da conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P). Portanto, há uma necessidade de desenvolver uma via que permita a conversão de fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P),
mesmo sob condições de altas concentrações de glicose ou sacarose no meio de cultura ou no recipiente de reação.
[011] A presente invenção atende a essa demanda ao fornecer um método para a produção de frutose-6-fosfato (F6P) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) que compreende as etapas de: (a) converter enzimaticamente fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di- hidroxiacetona (DHA); e (b) converter enzimaticamente a di-hidroxiacetona (DHA) assim produzida juntamente com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P); ou que compreende as etapas de: (a’) converter enzimaticamente gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído; e (b’) converter enzimaticamente o gliceraldeído assim produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P); e (c’) converter enzimaticamente a frutose-1-fosfato (F1P) assim produzida em frutose-6-fosfato (F6P).
[012] A conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) primeiro em di- hidroxiacetona (DHA) e sua condensação subsequente com GAP para produzir F6P fornece uma via alternativa para a condensação de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose- 1,6-bifosfato (FBP) e sua subsequente conversão em frutose-6-fosfato (F6P) com a vantagem de poder ser realizada fazendo-se uso de enzimas que não são reguladas (em particular inibidas) por glicose ou sacarose. Assim, essa conversão pode ocorrer mesmo em altas concentrações de glicose ou sacarose. O mesmo se aplica à conversão de DHAP e G3P conforme descrito nas etapas (a’) a (c').
[013] Os dois métodos alternativos para produzir frutose-6-fosfato (F6P) a partir de di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P), conforme descrito acima, também podem, naturalmente, ser aplicados em combinação (in vitro ou in vivo).
[014] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para produzir frutose-6-fosfato (F6P) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) que compreende as etapas de: (a) converter enzimaticamente fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di- hidroxiacetona (DHA); e (b) converter enzimaticamente a di-hidroxiacetona (DHA) assim produzida juntamente com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P).
[015] A conversão enzimática de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di- hidroxiacetona (DHA) de acordo com a etapa (a) do método de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser obtida empregando-se uma enzima classificada como EC 3.1.3.-. Essas enzimas também são chamadas de monoéster fosfórico hidrolases (ou fosfomonoesterases). As monoéster fosfórico hidrolases são enzimas que catalisam a hidrólise das ligações O-P por um ataque nucleofílico de fósforo por resíduos de cisteína ou íons metálicos coordenados.
[016] Em uma modalidade preferencial, a enzima classificada como EC 3.1.3.- é selecionada do grupo que consiste em: - açúcar fosfatase (EC 3.1.3.23); - 6-fosfogluconato fosfatase (EC 3.1.3.-); - Fosfato de piridoxal fosfatase (EC 3.1.3.74); - Frutose-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-); - Di-hidroxiacetona fosfatase (EC 3.1.3.-); - Hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-) - fosfatase ácida (EC 3.1.3.2); - fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1); - glicerol-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.21); e - 3-fosfoglicerato fosfatase (EC 3.1.3.38).
[017] Assim, em uma modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma açúcar fosfatase (EC 3.1.3.23). As açúcar fosfatases (EC 3.1.3.23) são enzimas que catalisam a seguinte reação: fosfato de açúcar + H2O → açúcar + fosfato
[018] Essa enzima ocorre em diversos organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, protozoários e bactérias. A enzima, por exemplo, foi descrita em Arabidopsis thaliana (número de acesso UniProt Q9ZVJ5), Plasmodium falciparum (número de acesso UniProt Q8IJ74), Streptococcus equinus, Streptococcus pyogenes, Saccharomyces cerevisia, Neisseria meningitidis, Lactococcus lactis, Klebsiella aerogenes, Escherichia coli (número de acesso UniProt P75792), Escherichia acidilactici, Enterococcus faecalis e Bacillus subtilis.
[019] Em princípio, qualquer açúcar fosfatase de EC 3.1.3.23 pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que tenha a capacidade de converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA). Em uma modalidade preferencial, é usada uma enzima de uma bactéria do gênero Escherichia, mais preferencialmente é usada uma enzima da espécie E. coli. Ainda mais preferencialmente, uma proteína YbiV ou uma proteína YidA de E. coli é usada (números de acesso UniProt P75792 (SEQ ID NO: 1; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39) e P0A8Y5 (SEQ ID NO: 2; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:41)).
[020] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 1 ou 2 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 1 ou 2 e tem a atividade de açúcar fosfatase (EC 3.1.3.23) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), conforme estabelecido no presente documento acima.
[021] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2.
[022] Com relação à determinação da identidade de sequência, conforme descrito no presente pedido, geralmente deve ser aplicado o seguinte: Quando as sequências que são comparadas não têm o mesmo comprimento, o grau de identidade se refere à porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência mais curta que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência mais longa ou à porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência mais longa que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência mais curta. Preferencialmente, o mesmo se refere à percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência mais curta que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência mais longa.
[023] O grau de identidade de sequência pode ser determinado realizando-se o alinhamento de pares preferencialmente com o uso de algoritmos e software bem conhecidos na técnica, como o algoritmo Needleman-Wunsch com o software EMBOSS NEEDLE.
[024] Ao aplicar essa metodologia para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, pelo menos 60% idêntica a uma sequência de referência, podem ser usadas configurações padrão do software EMBOSS NEEDLE, que são definidas como segue: - Matriz: BLOSUM62 - Abertura da lacuna: 10 - Extensão da lacuna: 0,5 - Sem penalidade de lacuna final.
[025] Preferencialmente, o grau de identidade é calculado ao longo do comprimento total da sequência alinhada.
[026] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de 6-fosfogluconato fosfatase (EC 3.1.3.-). 6-fosfogluconato fosfatases são enzimas que catalisam a desfoforilação de 6-fosfogluconato.
[027] Essa enzima foi, por exemplo, descrita para Escherichia coli. Assim, em uma modalidade preferencial, a enzima correspondente de E. coli é empregada no método de acordo com a presente invenção, mais preferencialmente a proteína YieH
(número de acesso UniProt P31467 (SEQ ID NO: 3; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40)).
[028] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 3 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 3 e tem a atividade de uma 6-fosfogluconato fosfatase com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que tal enzima é capaz de converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), como apresentado no presente documento acima.
[029] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[030] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma fosfato de piridoxal fosfatase (EC 3.1.3.74). As fosfato de piridoxal fosfatases são enzimas que catalisam a seguinte reação: Piridoxal 5'-fosfato + H2O → piridoxal + fosfato
[031] Essa enzima ocorre em diversos organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais e bactérias. A enzima, por exemplo, foi descrita em Homo sapien, Rattus norvegicus, Brachylagus idahoensis, Bos taurus, Canis lupus, Felis catus, Gallus, Meriones unguiculatus, Mus musculus, Paenibacillus thiaminolyticus, Sinorhizobium meliloti, Sus scorfa e Escherichia coli (número de acesso UniProt P27848). Em princípio, qualquer fosfato de piridoxal fosfatase de EC
3.1.3.74 pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que tenha a capacidade de converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di- hidroxiacetona (DHA). Em uma modalidade preferencial, é usada uma enzima de uma bactéria do gênero Escherichia, mais preferencialmente é usada uma enzima da espécie E. coli. Ainda mais preferencialmente, é usada uma proteína YigL de E. coli (número de acesso UniProt P27848 (SEQ ID NO: 4; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 42)).
[032] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 4 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 4 e tem a atividade de uma fosfato de piridoxal fosfatase (CE 3.1.3.74) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), conforme apresentado no presente documento acima.
[033] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
[034] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma frutose-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-). As frutose-1-fosfato fosfatases são enzimas que catalisam a desfosforilação de frutose-1-fosfato.
[035] Essa enzima foi, por exemplo, descrita para Escherichia coli. Assim, em uma modalidade preferencial, a enzima correspondente de E. coli é empregada no método de acordo com a presente invenção, mais preferencialmente a proteína YqaB (número de acesso UniProt P77475 (SEQ ID NO: 5; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 43)).
[036] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 5 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 5 e tem a atividade de uma frutose-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), conforme apresentado no presente documento acima.
[037] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[038] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma di-hidroxiacetona fosfatase (EC 3.1.3.-). As di-hidroxiacetonas fosfatases são enzimas que catalisam a desfosforilação do fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) para produzir DHA.
[039] Essa enzima foi, por exemplo, descrita para Corynebacterium glutamicum. Assim, em uma modalidade preferencial, a enzima correspondente de Corynebacterium glutamicum é empregada no método de acordo com a presente invenção, mais preferencialmente a proteína HdpA (número de acesso UniProt A4QFW4 (SEQ ID NO: 6; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 48)).
[040] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 6 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 6 e tem a atividade de uma di-hidroxiacetona fosfatase (EC 3.1.3.-) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), conforme apresentado no presente documento acima.
[041] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[042] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma hexitol fosfatase (EC
3.1.3.-). As hexitol fosfatases são enzimas que catalisam a desfosforilação de D- manitol 1-fosfato e D-sorbitol 6-fosfato.
[043] Essa enzima foi, por exemplo, descrita para Escherichia coli. Assim, em uma modalidade preferencial, a enzima correspondente de E. coli é empregada no método de acordo com a presente invenção, mais preferencialmente a proteína HxpA (número de acesso UniProt P77625 (SEQ ID NO: 7; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 44)).
[044] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 7 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 7 e tem a atividade de uma hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), conforme apresentado no presente documento acima.
[045] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[046] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma fosfatase ácida (EC
3.1.3.2). As fosfatases ácidas são enzimas que catalisam a seguinte reação: um monoéster de fosfato + H2O → um álcool + fosfato
[047] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer fosfatase ácida (EC 3.1.3.2) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA).
[048] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma fosfatase alcalina (EC
3.1.3.1). Como as fosfatases ácidas, as fosfatases alcalinas são enzimas que catalisam a seguinte reação: um monoéster de fosfato + H2O → um álcool + fosfato
[049] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter fosfato de di-
hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA).
[050] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma glicerol-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.21). As glicerol-1-fosfato fosfatases catalisam naturalmente a seguinte reação: glicerol 1-fosfato + H2O → glicerol + fosfato
[051] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer glicerol-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.21) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA).
[052] Em outra modalidade, a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) é obtida fazendo-se uso de uma 3-fosfoglicerato fosfatase (EC 3.1.3.38). As 3-fosfoglicerato fosfatases catalisam naturalmente a seguinte reação: D-glicerato 3-fosfato + H2O → D-glicerato + fosfato
[053] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, fungos e bactérias. Em princípio, 3-fosfoglicerato fosfatase (EC 3.1.3.38) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA).
[054] Conforme descrito acima, a di-hidroxiacetona (DHA) obtida na etapa (a) do método de acordo com a presente invenção pode, em seguida, ser adicionalmente convertida juntamente com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P), conforme descrito na etapa (b) do método. No caso de uma reação in vitro, o gliceraldeído-3-fosfato (G3P) pode simplesmente ser adicionado à reação. No caso de uma reação in vivo, o gliceraldeído-3-fosfato (G3P) é fornecido por outras vias metabólicas. Uma vez que o gliceraldeído-3-fosfato (G3P) é um intermediário na glicólise, bem como na Via de Entner-Douderoff, o mesmo ocorre basicamente em todos os organismos. Além disso, o mesmo é um isômero do fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) e pode ser produzido a partir do fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) pela ação de uma triose fosfato isomerase.
[055] A conversão de di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) de acordo com a etapa (b) do método de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, ser obtida empregando-se uma enzima denominada como aldeído liase (também algumas vezes denominada como carbono- carbono liases). Essas enzimas são classificadas em EC 4.1.2.-. Essas enzimas catalisam a clivagem de uma ligação C-C em uma molécula que tem um grupo carbonila e um grupo hidroxila para formar duas moléculas, cada uma um aldeído e uma cetona. No entanto, constatou-se que essas enzimas também são capazes de catalisar a condensação de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e di-hidroxiacetona (DHA) em frutose-6-fosfato (F6P).
[056] Em uma modalidade preferencial, uma aldeído liase empregada em um método de acordo com a presente invenção para converter di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) é uma frutose-6-fosfato aldolase, por exemplo, uma frutose-6-fosfato aldolase 1. Uma modalidade exemplificativa e preferencial é a frutose-6-fosfato aldolase 1 de E. coli que é codificada a partir do gene fsaA. A sequência de aminoácidos dessa proteína está disponível, por exemplo, sob o número de acesso UniProt P78055 (SEQ ID NO: 8; codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 34).
[057] Em outra modalidade preferencial, a aldeído liase empregada no método de acordo com a presente invenção para converter di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) é uma frutose-6-fosfato aldolase 2. Uma modalidade exemplificativa e preferencial é a frutose-6-fosfato aldolase 2 de E. coli que é codificada a partir do gene fsaB. A sequência de aminoácidos dessa proteína está disponível, por exemplo, sob o número de acesso UniProt P32669 (SEQ ID NO: 16; codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 36).
[058] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 8, 9 ou 16 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 8, 9 ou 16 e tem a atividade de uma frutose-6-fosfato aldolase com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) conforme apresentado no presente documento acima.
[059] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 9 ou 16. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 35) é uma forma mutada da sequência de SEQ ID NO: 8 com uma atividade enzimática superior.
[060] Em outra modalidade, a conversão de di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) de acordo com a etapa (b) do método de acordo com a invenção pode ser obtida empregando-se uma enzima denominada como uma transaldolase. Essas enzimas são classificadas em EC
2.2.1.2. Essas enzimas catalisam a seguinte reação: sedo-heptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato D-eritrose 4-fosfato + D-frutose 6-fosfato
[061] Essa enzima ocorre em diversos organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, algas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Acidithiobacillus ferrooxidans, Arthrobacter sp., Bifidobacterium bifidum, Blastobotrys adeninivorans, Bos taurus, Carcinus maenas, Chlorella sp., Chlorobium vibriforme f. thiosulfatophilum, Chromatium sp., Clostridium acetobutylicum, Cryptococcus neoformans, Cyberlindnera jadinii, Escherichia coli, Euglena sp., Francisella tularensis (Número de acesso UniProt Q5NFX0), Fusarium oxysporum, Gluconobacter oxydans (Número de acesso UniProt Q76EM7), Homo sapiens, Methanocaldococcus jannaschii, Moniiella megachiliensis, Mus musculus,
Musca domestica, Oryctolagus cuniculus, Rattus norvegicus, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Scheffersomyces stipitis, Solanum lycopersicum, Spinacia olearacea, Tetranychus telarius, Thermoplasma acidophilum, Thermotoga maritima, (Número de acesso UniProt Q9WYD1), Streptococcus pyogenes (Número de acesso UniProt Q99XT4 ; SEQ ID NO: 12 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 50)), Clostridium beijerinckii (número de acesso UniProt A0A0B5QQ90; SEQ ID NO: 13 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 53)), Caulobacter vibrioides (número de acesso UniProt Q9A2F1; SEQ ID NO: 14 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 54)), Streptococcus mutans (número de acesso UniProt Q8DVJ4; SEQ ID NO: 15 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 56)), E. coli (número de acesso UniProt P0A870; SEQ ID NO: 17 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 37)), Enterococcus faecalis (número de acesso UniProt A0A0M2AGL1; SEQ ID NO: 18 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 52)), Streptococcus suis (número de acesso UniProt A0A0E4C393; SEQ ID NO: 19 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 55)), Streptococcus pneumoniae (número de acesso UniProt A0A0D6J3Z8; SEQ ID NO: 20 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 58)), Streptococcus gordonii (número de acesso UniProt A8AZ46; SEQ ID NO: 10 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 51)), Streptococcus agalactiae (número de acesso UniProt Q8E738; SEQ ID NO: 31 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 57)) e Listeria monocytogenes (número de acesso UniProt A0A0H3GHX1; SEQ ID NO: 11 codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:49)).
[062] Em princípio, qualquer transaldolase de EC 2.2.1.2 pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que tenha a capacidade de converter di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6- fosfato (F6P). Em uma modalidade preferencial, é usada uma enzima de uma bactéria do gênero Streptococcus ou do gênero Listeria, mais preferivelmente é usada uma enzima da espécie Streptococcus gordonii ou da espécie Listeria monocytogenes.
[063] Em uma modalidade preferencial, é usada uma proteína de Streptococcus gordonii codificada pelo gene SGO_1787 de Streptococcus gordonii (número de acesso UniProt A8AZ46).
[064] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer um dos SEQ ID NOs: 10 a 15, SEQ ID NOs: 17 a 20, SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:31 ou mostra um sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga a qualquer um dos SEQ ID NOs: 10 a 20, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 31 e tem a atividade de uma transaldolase (EC 2.2.1.2) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6- fosfato (F6P) conforme apresentado no presente documento acima. A enzima de Streptococcus suis (número de acesso UniProt A0A0E4C393; SEQ ID NO: 19 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 55)) é particularmente preferencial.
[065] A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 (codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 38) é uma forma mutada da sequência de SEQ ID NO: 17 com uma atividade enzimática superior (talB F178Y).
[066] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou 11.
[067] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para produzir frutose-6-fosfato (F6P) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) que compreende as etapas de: (a’) converter enzimaticamente gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído; e (b’) converter enzimaticamente o gliceraldeído assim produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P); e (c’) converter enzimaticamente a frutose-1-fosfato (F1P) assim produzida em frutose-6-fosfato (F6P).
[068] A conversão enzimática de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído de acordo com a etapa (a’) do método de acordo com a presente invenção é uma reação de desfosforilação de acordo com o seguinte esquema: D-gliceraldeído-3-fosfato + H2O →D- gliceraldeído + H3PO4
[069] Essa clivagem hidrolítica do grupo fosfato é uma reação irreversível. A mesma pode, por exemplo, ser obtida empregando-se uma enzima classificada como EC 3.1.3.-. Essas enzimas também são chamadas de monoéster fosfórico hidrolases (ou fosfomonoesterases). As monoéster fosfórico hidrolases são enzimas que catalisam a hidrólise das ligações O-P por um ataque nucleofílico de fósforo por resíduos de cisteína ou íons metálicos coordenados.
[070] Em uma modalidade preferencial, a enzima classificada como EC 3.1.3.- é selecionada do grupo que consiste em: - gliceraldeído 3-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-); - fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1); - fosfatase ácida (EC 3.1.3.2); - açúcar fosfatase (EC 3.1.2.23); e - hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-).
[071] Assim, em uma modalidade, a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído é obtida fazendo-se uso de uma gliceraldeído 3-fosfato fosfatase (EC
3.1.3.-). Essas enzimas catalisam a desfosforilação de gliceraldeído-3-fosfato.
[072] Essa atividade foi, por exemplo, descrita para a proteína codificada pelo gene PH1655 de Pyrococcus horikoshii ou para a proteína codificada pelo gene MJ1437 de Methanocaldococcus jannaschii. Assim, em uma modalidade preferencial, é usada uma proteína correspondente de Pyrococcus horikoshii (número de acesso UniProt O59346 (SEQ ID NO: 21; codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 59)) ou de Methanocaldococcus jannaschii (número de acesso UniProt Q58832 (SEQ ID NO: 22; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 60)).
[073] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 21 ou como mostrada no SEQ ID NO: 22 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22 e tem a atividade de uma gliceraldeído 3- fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que tal enzima é capaz de converter gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído como apresentado no presente documento acima.
[074] Em outra modalidade, a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído é obtida fazendo-se uso de uma fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1). As fosfatases alcalinas são enzimas que catalisam a seguinte reação: um monoéster de fosfato + H2O → um álcool + fosfato
[075] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter gliceraldeído-3- fosfato (G3P) em gliceraldeído.
[076] Em outra modalidade, a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído é obtida fazendo-se uso de uma fosfatase ácida (EC 3.1.3.2). Como as fosfatases alcalinas, as fosfatases ácidas são enzimas que catalisam a seguinte reação: um monoéster de fosfato + H2O → um álcool + fosfato
[077] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer fosfatase ácida (EC 3.1.3.2) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter gliceraldeído-3- fosfato (G3P) em gliceraldeído.
[078] Em uma modalidade preferencial adicional, a conversão de gliceraldeído- 3-fosfato (G3P) em gliceraldeído é obtida fazendo-se uso de uma açúcar fosfatase
(EC 3.1.3.23). As açúcar fosfatases (EC 3.1.3.23) são enzimas que catalisam a seguinte reação: fosfato de açúcar + H2O → açúcar + fosfato
[079] Essa enzima ocorre em diversos organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, protozoários e bactérias. A enzima, por exemplo, foi descrita em Arabidopsis thaliana (número de acesso UniProt Q9ZVJ5), Plasmodium falciparum (número de acesso UniProt Q8IJ74), Streptococcus equinus, Streptococcus pyogenes, Saccharomyces cerevisia, Neisseria meningitidis, Lactococcus lactis, Klebsiella aerogenes, Escherichia coli (número de acesso UniProt P75792 (SEQ ID NO:1; codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:39)), Escherichia acidilactici, Enterococcus faecalis e Bacillus subtilis.
[080] Em princípio, qualquer açúcar fosfatase de EC 3.1.3.23 pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que tenha a capacidade para converter gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído. Em uma modalidade preferencial, é usada uma enzima de uma bactéria do gênero Escherichia, mais preferencialmente é usada uma enzima da espécie E. coli. Ainda mais preferencialmente, é usada uma proteína YbiV de E. coli (número de acesso UniProt P75792 (SEQ ID NO: 1; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39)).
[081] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 1 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 1 e tem a atividade de açúcar fosfatase (EC 3.1.3.23) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA), conforme estabelecido no presente documento acima.
[082] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[083] Em outra modalidade, a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído é obtida fazendo-se uso de uma hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-). As hexitol fosfatases são enzimas que catalisam a desfosforilação de D-manitol 1-fosfato e D- sorbitol 6-fosfato.
[084] Essa enzima foi, por exemplo, descrita para Escherichia coli. Assim, em uma modalidade preferencial, a enzima correspondente de E. coli é empregada no método de acordo com a presente invenção, mais preferencialmente a proteína HxpB (número de acesso UniProt P77247 (SEQ ID NO: 23; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 45)). Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 23 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 23 e tem a atividade de uma hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que tal enzima é capaz de converter gliceraldeído-3- fosfato (G3P) em gliceraldeído como apresentado no presente documento acima.
[085] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.
[086] Conforme descrito acima, o gliceraldeído obtido na etapa (a’) do método de acordo com a presente invenção pode então ser adicionalmente convertido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-6-fosfato (F1P), conforme descrito na etapa (b') do método. No caso de uma reação in vitro, o fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) pode simplesmente ser adicionado à reação. No caso de uma reação in vivo, o fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) é fornecido por outras vias metabólicas. Uma vez que o fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) é um intermediário na glicólise, bem como na via de Entner-Douderoff, o mesmo ocorre basicamente em todos os organismos. Além disso, o mesmo é um isômero de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e pode ser produzido a partir do gliceraldeído-3-fosfato (G3P) pela ação de uma triose fosfato isomerase.
[087] A conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído em frutose-1-fosfato (F1P) de acordo com a etapa (b’) do método de acordo com a invenção é uma condensação de aldol e prossegue de acordo com a seguinte reação: D-gliceraldeído + fosfato de di-hidroxiacetona D-frutose-1-fosfato
[088] Essa conversão pode, por exemplo, ser obtida fazendo-se uso de uma bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13).
[089] As bisfosfato frutose aldolases (EC 4.1.2.13) são enzimas que podem catalisar a seguinte reação: D-frutose-1,6-bisfosfato fosfato de glicerona + D-gliceraldeído-3- fosfato
[090] A enzima foi identificada em diversos organismos e as frutose-1,6- bisfosfato aldolases são divididas em duas classes, que dependem de diferentes mecanismos de reação. As frutose-1,6-bifosfato aldolases de Classe I são encontradas principalmente em animais e plantas superiores, enquanto as frutose- 1,6-bifosfato aldolases de Classe II são encontradas principalmente em algas, bactérias e leveduras. As enzimas pertencentes à Classe II exigem um íon metálico bivalente como cofator.
[091] As frutose-1,6-bisfosfato aldolases tento de Tipo I quanto de Tipo II foram isoladas a partir de diferentes fontes procarióticas e eucarióticas e, portanto, a frutose- 1,6-bifosfato aldolase é uma enzima glicolítica ubíqua que desempenha um papel crucial na glicólise, gliconeogênese e metabolismo de frutose (Brovetto M. et al. Chem. Rev. 111 (2011), 4346 a 4403).
[092] Assim, em uma modalidade preferencial, a frutose-1,6-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) se origina de um organismo procariótico, preferencialmente uma bactéria. A enzima, por exemplo, foi descrita como ocorrendo em Peptoniphilus asaccharolyticus, Escherichia coli, Thermus aquaticus, Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium sp., Corynebacterium sp., Heliobacter pylori, Lactobacillus sp., Mycobacterium sp., Penicillinum sp., Pseudomonas sp., Plasmodium falciparum, Saccharomyces sp. e Methylococcus cuniculus.
[093] Além disso, em uma modalidade preferencial, a frutose 1,6-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) se origina de um organismo eucariótico. A enzima, por exemplo, foi descrita como ocorrendo em Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Oryctolagus cuniculus, Gallus gallus, Zea mays, Bos taurus, Mus musculus e Medicago sativa.
[094] O estudo de Siebers et al. primeiro revelou que nenhum gene que codifica enzimas clássicas de Classe I e Classe II foi identificado em qualquer um dos genomas de arqueia sequenciados (Siebers B. et al., J Bol.Chem. 276 (2001), 28710 a 28718). A caracterização bioquímica e estrutural posterior de aldolases das duas arqueias hipertermofílicas, Thermoproteus tenax e Pyrococcus furiosus, mostrou que essas enzimas usam um mecanismo de base de Schiff e, portanto, pertencem às aldolases de classe I (Siebers et al., Loc. Cit.; Lorentzen E. et al., Biochem. Soc. Trans. 32 (2004), 259 a 263).
[095] As frutose-1,6-bifosfato aldolases de Classe I podem ser classificadas em três formas de isoenzima, distinguíveis com base na reatividade imunológica, bem como na renovação em relação aos substratos de frutose-1,6-bifosfato e frutose 1- fosfato (Blonski et al., Biochem. J. 323 (1997), 71 a 77). A isoenzima A, de músculo de coelho, foi a mais extensivamente estudada das frutose-1,6-bifosfato aldolases de classe I (Gefflaut et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 63 (1995), 301 a 340). Várias dezenas de isoenzimas diferentes foram sequenciadas e várias estruturas de isoenzimas de aldolase foram determinadas, incluindo aquelas do músculo de coelho (Sygusch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (1987), 7846 a 7850), músculo humano (Gamblin et al., FEBS Lett. 262 (1987), 282 a 286, Arakaki et al., Protein Sci. 13 (2004), 3077 a 3084) e Drosófila (Hester et al., FEBS Lett. 292 (1991), 237 a 242). Com exceção dos 20 resíduos de aminoácidos que compreendem a região C-terminal, a arquitetura molecular dessas isoenzimas foi altamente conservada. A dobra polipeptídica de cada uma das subunidades de enzima do homotetrâmero corresponde àquela de um barril β, com o local ativo localizado no centro do barril β (Sygusch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (1987), 7846 a 7850). Diferente de outras isoenzimas barril β, o local ativo é composto por um número substancial de resíduos de aminoácidos carregados, isto é, Asp-33, Lys-107, Lys-146, Glu-187 e Lys-229 (Blonski et al., Biochem. J. 323 (1997), 71 a 77).
[096] As FBP-aldolases de classe II exigem um cátion divalente, normalmente Zn2+ e são ativadas por cátions monovalentes (Horecker et al., In The Enzymes (Boyer, P.D., ed.), 1972, 3ª edição, vol. 7, 213 a 258, Academic Press, Nova York). As mesmas compartilham cerca de 15% de identidade de sequência com as enzimas de classe I (Naismith et al., J. Mol. Biol. 225 (1992), 1137 a 1141). Em uma modalidade preferencial, a frutose-1,6-bisfosfato aldolase empregada no método da invenção é fornecida na presença de um cátion divalente, preferencialmente Zn2+ e é ativada por cátions monovalentes.
[097] As enzimas FBP de classe II podem ser categorizadas adicionalmente em famílias de classe IIA e classe IIB. Tradicionalmente, as enzimas FBP de classe IIA e classe IIB foram categorizadas de acordo com a homologia de sequência e seu estado oligomérico. As enzimas FBP de classe IIA foram consideradas dímeros, enquanto os FBAs de classe IIB poderiam ser dímeros, tetrâmeros ou octâmeros. (Izard e Sygush, J. Biol. Chem 279 (2004), 11825 a 11833; Galkin et al., Biochemistry 48 (2009), 3186 a 3196; Nakahara et al., Plant Cell Physiol. 44 (2003), 326 a 333). O alinhamento de sequências de proteínas FBP mostrou que membros pertencentes a cada família exibem 40% de similaridade de sequência e identidade de sequência de aminoácidos entre as FBP aldolases de tipo A e B de classe II é da ordem de 25 a 30% (Plaumann et al., Curr. Genet. 31 (1997), 430 a 438). Os alinhamentos de sequência subsequentes das oito FBP aldolases de Classe II conhecidas mostraram que Arg- 331 é um dos resíduos altamente conservados. A modificação química e a mutagênese dirigida ao local confirmaram o papel crítico deste aminoácido no local ativo (Qamar et al., Protein Sci. 5 (1996), 154 a 161).
[098] A estrutura de cristal foi determinada para várias enzimas, isto é, de E. coli (Hall et al., J. Mol. Biol. 287 (1999), 383 a 394), Thermus aquaticus (Izard e Sygush; loc. cit.), Thermus caldophilus (Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 347
(2006), 616 a 625), Giardia lamblia (Galkin et al.; loc. cit.), Mycobacterium tuberculosis (Pegan et al., J. Mol.Biol. 386 (2009), 1038 a 1053). A estrutura secundária da FBP aldolase de Mycobacterium tuberculosis se assemelha àquela das outras aldolases bacterianas de classe II (Pegan et al., Loc. Cit.). A enzima tem um núcleo de folha β de oito fitas em que cada fita β (β1 a β8) é seguida em geral por uma hélice α (α1 a α8a), dando origem a uma dobra de barris(β/α) geral, também conhecido como dobra de barril TIM (a referência no banco de dados InterPro é IPR013785).
[099] Em princípio, qualquer frutose 1,6-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) pode ser empregada na conversão de D-eritrose em glicolaldeído de acordo com um método da invenção.
[0100] Em uma modalidade preferencial, a frutose-1,6-bisfosfato aldolase (EC
4.1.2.13) empregada em um método de acordo com a presente invenção é a frutose- 1,6-bisfosfato aldolase de Escherichia coli (cepa K12) (isto é, uma bisfosfato frutose aldolase de classe II) (Uniprot P0AB71) que mostra a sequência de aminoácidos como representada no SEQ ID NO: 24 (codificada pela sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 46 do gene fbaA) ou a frutose-1,6-bisfosfato aldolase de Escherichia coli (cepa K12) (isto é, uma bisfosfato frutose aldolase de classe I) (Uniprot P0A991) que mostra a sequência de aminoácidos como representada no SEQ ID NO: 25 (codificada pela sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 47 do gene fbaB) ou a frutose-1,6-bifosfato aldolase B de Homo sapiens (Uniprot P05062) que mostra a sequência de aminoácidos como representada no SEQ ID NO: 26 (codificada pela sequência de nucleotídeos do SEQ ID NO: 61 do gene ALDOB) ou a frutose-1,6-bifosfato aldolase A de Homo sapiens (Uniprot P04075) que mostra a sequência de aminoácidos como representada no SEQ ID NO: ou a frutose-1,6-bisfosfato aldolase C de Homo sapiens (Uniprot P09972) que mostra a sequência de aminoácidos como representada no SEQ ID NO: 28.
[0101] Assim, em uma modalidade preferencial, a frutose-1,6-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) empregada no método da invenção tem a sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer um dos SEQ ID NOs: 24 a 28 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga a qualquer um dos SEQ ID NOs: 24 a 28 e tem a atividade de uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que tal enzima é capaz de converter D-eritrose em glicolaldeído conforme apresentado no presente documento acima. Preferencialmente, o grau de identidade é determinado conforme descrito acima.
[0102] A atividade enzimática de uma frutose-1,6-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13) pode ser avaliada com métodos conhecidos do versado na técnica. Tais métodos são, por exemplo, descritos em Blonski K. et al., Biochem. J. 323 (1997), 71 a 77 e Szwergold et al., Arch. Biochem. Biophys. 317 (1995), 244 a 252.
[0103] Conforme descrito acima, a frutose-1-fosfato (F1P) obtida na etapa (b’) do método de acordo com a presente invenção pode, em seguida, ser adicionalmente convertida enzimaticamente em frutose-6-fosfato (F6P) (consultar etapa (c')). Essa conversão é uma isomerização e prossegue de acordo com a seguinte reação: D-frutose-1-fosfato D-frutose-6-fosfato
[0104] A conversão pode ser obtida empregando-se, por exemplo, uma fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2), uma fosfomanomutase (EC 5.4.2.8) ou uma beta- fosfoglucomutase (EC 5.4.2.6).
[0105] Assim, em uma modalidade, a conversão de frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6-fosfato (F6P) de acordo com a etapa (c’) do método de acordo com a invenção é obtida fazendo-se uso de uma fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2). As fosfoglucomutases são enzimas que catalisam naturalmente a seguinte reação: alfa-D-glicose 1-fosfato D-glicose 6-fosfato
[0106] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6-fosfato (F6P). Em uma modalidade preferencial, a enzima é uma enzima codificada pelo gene pgm de Aeromonas hydrophila, preferencialmente
Aeromonas hydrophila subespécie hydrophila, como a proteína que tem a sequência de aminoácidos como mostrada no número de acesso UniProt A0KIH4 (SEQ ID NO: 29; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 62 do gene pgm).
[0107] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 29 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 29 e tem a atividade de uma fosfoglucomutase (EC 5.4. 2.2) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6-fosfato (F6P) conforme apresentado no presente documento acima.
[0108] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
[0109] Em outra modalidade, a conversão de frutose-1-fosfato (F1P) em frutose- 6-fosfato (F6P) de acordo com a etapa (c’) do método de acordo com a invenção é obtida fazendo-se uso de uma fosfomanomutase (também denominada como fosfoglucomutase) (EC 5.4.2.8). Foi relatado que as fosfomanomutases (EC 5.4.2.8) catalisam naturalmente as seguintes reações: alfa-D-glicose 1-fosfato D-glicose 6-fosfato e alfa-D-manose 1-fosfato D-manose 6-fosfato
[0110] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, plantas, fungos e bactérias. Em princípio, qualquer fosfomanomutase (EC 5.4.2.8) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6-fosfato (F6P). Em uma modalidade preferencial, a enzima é uma enzima codificada pelo gene AHA_2903 de Aeromonas hydrophila, preferencialmente Aeromonas hydrophila subespécie hydrophila, como a proteína que tem a sequência de aminoácidos como mostrada no número de acesso UniProt A0KMA6 (SEQ ID NO: 30; codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 63 do gene AHA_2903).
[0111] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 30 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 30 e tem a atividade de uma fosfomanomutase (EC 5.4. 2.2) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6-fosfato (F6P) conforme apresentado no presente documento acima.
[0112] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.
[0113] Em outra modalidade, a conversão de frutose-1-fosfato (F1P) em frutose- 6-fosfato (F6P) de acordo com a etapa (c’) do método de acordo com a invenção é obtida fazendo-se uso de uma beta-fosfoglucomutase (também denominada como fosofomanomutase) (EC 5.4.2.6). Foi relatado que as beta-fosfoglucomutases (EC
5.4.2.6) catalisam naturalmente a seguinte reação: beta-D-glicose 1-fosfato beta-D-glicose 6-fosfato
[0114] Essa enzima ocorre em uma grande variedade de organismos, incluindo organismos procarióticos, como bactérias. Em princípio, qualquer beta- fosfoglucomutase (EC 5.4.2.6) pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção, desde que possa converter frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6- fosfato (F6P). Em uma modalidade preferencial, a enzima é uma enzima codificada pelo gene pgm de Escherichia coli (cepa K12), tal como a proteína que tem a sequência de aminoácidos como mostrada no número de acesso UniProt P36938 (SEQ ID NO: 32 codificada pelo gene denominado pgm) ou uma enzima codificada pelo gene ycjU de Escherichia coli (cepa K12), tal como a proteína com a sequência de aminoácidos como mostrada no número de acesso UniProt P77366 (SEQ ID NO: 33 codificada pelo gene denominado YcjU).
[0115] Em uma modalidade preferencial, essa enzima tem uma sequência de aminoácidos como mostrada no SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga ao SEQ ID NO: 32 ou
SEQ ID NO: 33 e tem a atividade de uma beta-fosfoglucomutase (EC 5.4. 2.6) com x sendo um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, em que essa enzima é capaz de converter frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6-fosfato (F6P) conforme apresentado no presente documento acima.
[0116] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando-se a respectiva sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33.
[0117] Um método de acordo com a presente invenção pode ser executado in vitro ou in vivo. Uma reação in vitro é entendida como uma reação em que nenhuma célula é empregada, isto é, uma reação acelular. Assim, in vitro significa preferencialmente em um sistema livre de célula. O termo “in vitro” em uma modalidade significa na presença de enzimas isoladas (ou sistemas de enzima que compreendem, opcionalmente, os cofatores possivelmente exigidos). Em uma modalidade, as enzimas empregadas no método são usadas na forma purificada.
[0118] Para executar o método in vitro, os substratos para a reação e as enzimas são incubados sob condições (tampão, temperatura, cossubstratos, cofatores, etc.) que permitem que as enzimas estejam ativas e a conversão enzimática ocorra. Permite-se que a reação prossiga por um tempo suficiente para produzir o respectivo produto. A produção dos respectivos produtos pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, como cromatografia gasosa possivelmente ligada à detecção por espectrometria de massa.
[0119] As enzimas podem estar em qualquer forma adequada que permita que a reação enzimática ocorra. As mesmas podem ser purificadas ou parcialmente purificadas ou na forma de extratos celulares em bruto ou extratos parcialmente purificados. Também é possível que as enzimas sejam imobilizadas em um carreador adequado.
[0120] Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção é executado em cultura, na presença de um organismo, preferencialmente um micro-organismo, que produz as enzimas descritas acima para as conversões do método de acordo com a presente invenção, como descrito acima no presente documento. Um método que emprega um micro-organismo para executar um método de acordo com a invenção é denominado um método “in vivo”. É possível usar um micro-organismo que produz naturalmente as enzimas descritas acima para as conversões do método de acordo com a presente invenção ou um micro-organismo que tenha sido geneticamente modificado para que expresse (o que inclui superexpressar) uma ou mais de tais enzimas. Assim, o micro-organismo pode ser um micro-organismo projetado que expressa enzimas descritas acima para as conversões do método de acordo com a presente invenção, isto é, que tem em seu genoma uma sequência de nucleotídeo que codifica tais enzimas e que foi modificado para superexpressar as mesmas. A expressão pode ocorrer de forma constitutiva ou de uma maneira induzida ou regulada.
[0121] Em outra modalidade, o micro-organismo pode ser um micro-organismo que tenha sido geneticamente modificado pela introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que contêm sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada de forma estável no genoma do micro-organismo ou pode estar presente de uma maneira extracromossômica, por exemplo, em um plasmídeo.
[0122] Esse micro-organismo geneticamente modificado pode ser, por exemplo, um micro-organismo que não expressa naturalmente as enzimas descritas acima para as conversões do método de acordo com a presente invenção e que foi geneticamente modificado para expressar tais enzimas ou um micro-organismo que expressa naturalmente tais enzimas e que foi geneticamente modificado, por exemplo, transformado com um ácido nucleico, por exemplo, um vetor, que codifica a respectiva enzima (ou enzimas), e/ou inserção de um promotor na frente da sequência de nucleotídeo endógena que codifica a enzima a fim de aumentar a respectiva atividade no dito micro-organismo.
[0123] No entanto, a invenção exclui preferencialmente os micro-organismos que ocorrem naturalmente, como encontrados na natureza, que expressam uma enzima, como descrito acima, em níveis em que existem na natureza. Em vez disso, o micro- organismo da presente invenção e empregado em um método da presente invenção é preferencialmente um micro-organismo de ocorrência não natural, que tenha sido geneticamente modificado para expressar (o que inclui superexpressão) uma enzima exógena da invenção que não existe normalmente em seu genoma ou foi projetado para superexpressar uma enzima exógena.
[0124] Assim, as enzimas e (micro)organismos empregados em conexão com a presente invenção são preferencialmente enzimas ou (micro)organismos de ocorrência não natural, isto é, são enzimas ou (micro)organismos que diferem de modo significativo das enzimas ou micro-organismo que ocorrem naturalmente e que não ocorrem na natureza. Em relação às enzimas, as mesmas são preferencialmente variantes de enzimas que ocorrem naturalmente que não ocorrem como tais na natureza. Tais variantes incluem, por exemplo, mutantes, em particular, preparados por métodos biológicos moleculares, que mostram propriedades melhoradas, como uma atividade de enzima mais alta, especificidade de substrato mais alta, resistência à temperatura mais alta e similares. Em relação aos (micro)organismos, os mesmos são preferencialmente organismos geneticamente modificados como descrito acima no presente documento que diferem de organismos que ocorrem naturalmente devido a uma modificação genética. Os organismos geneticamente modificados são organismos que não ocorrem naturalmente, isto é, que não podem ser encontrados na natureza, e que diferem substancialmente de organismos que ocorrem naturalmente devido à introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha.
[0125] Superexpressando-se uma enzima exógena ou endógena, como descrito no presente documento acima, a concentração da enzima é substancialmente superior ao que é encontrado na natureza, que pode, então, forçar de modo inesperado a reação da presente invenção que usa uma não natural para a respectiva enzima. Preferencialmente, a concentração da enzima superexpressada é de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% da proteína total da célula hospedeira.
[0126] Um substrato “não natural” é entendido como uma molécula que não é atuada pela respectiva enzima na natureza, mesmo que possa coexistir realmente no micro-organismo juntamente com a enzima endógena. Esse substrato “não natural” não é convertido pelo micro-organismo na natureza visto que outros substratos são preferenciais (por exemplo, o “substrato natural”). Assim, a presente invenção contempla utilizar um substrato não natural com as enzimas descritas acima em um ambiente não encontrado na natureza.
[0127] Assim, também é possível no contexto da presente invenção que o micro- organismo seja um micro-organismo que não tem naturalmente a respectiva atividade de enzima, mas que é geneticamente modificado de modo a compreender uma sequência de nucleotídeo que permite a expressão de uma enzima correspondente. De maneira similar, o micro-organismo também pode ser um micro-organismo que tem naturalmente a respectiva atividade enzimática, mas que é geneticamente modificado de modo a aumentar essa atividade, por exemplo, pela introdução de uma sequência de nucleotídeos exógena que codifica uma enzima correspondente ou pela introdução de um promotor para o gene endógeno que codifica a enzima para aumentar a produção endógena para níveis superexpressados (não naturais).
[0128] Se for usado um micro-organismo que expresse naturalmente uma enzima correspondente, é possível modificar esse micro-organismo de modo que a respectiva atividade seja superexpressada no micro-organismo. Isso pode, por exemplo, ser obtido efetuando-se mutações na região do promotor do gene correspondente ou pela introdução de um promotor de alta expressão de modo a levar a um promotor que assegura uma expressão superior do gene. Alternativamente, também é possível transformar o gene como tal, de modo a levar a uma enzima que mostra uma atividade superior.
[0129] Com o uso de micro-organismos que expressam as enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção, é possível realizar os métodos de acordo com a invenção diretamente no meio de cultura, sem a necessidade de separar ou purificar as enzimas.
[0130] Em uma modalidade, o organismo empregado em um método de acordo com a invenção é um micro-organismo que foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica pelo menos uma enzima descrita acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção. O termo "estranho" ou "exógeno" nesse contexto significa que a molécula de ácido nucleico não ocorre naturalmente no dito micro-organismo. Isso significa que a mesma não ocorre na mesma estrutura ou no mesmo local no micro-organismo. Em uma modalidade preferencial, a molécula de ácido nucleico estranha é uma molécula recombinante que compreende um promotor e uma sequência de codificação que codifica a respectiva enzima na qual o promotor que conduz a expressão da sequência de codificação é heteróloga em relação à sequência de codificação. "Heterólogo" nesse contexto significa que o promotor não é o promotor que conduz naturalmente a expressão da dita sequência de codificação, mas é um promotor que conduz naturalmente a expressão de uma sequência de codificação diferente, ou seja, é derivado de outro gene, ou é um promotor sintético ou um promotor quimérico. Preferencialmente, o promotor é um promotor heterólogo ao micro-organismo, isto é, um promotor que não ocorre naturalmente no respectivo micro-organismo. Ainda mais preferencialmente, o promotor é um promotor induzível. Os promotores para conduzir a expressão em diferentes tipos de organismos, em particular em micro-organismos, são bem conhecidos do versado na técnica.
[0131] Em uma modalidade adicional, a molécula de ácido nucleico é estranha ao micro-organismo, pois a enzima codificada não é endógena ao micro-organismo, isto é, naturalmente não é expressa pelo micro-organismo quando não é geneticamente modificada. Em outras palavras, a enzima codificada é heteróloga em relação ao micro-organismo. A molécula de ácido nucleico estranha pode estar presente no micro-organismo na forma extracromossômica, por exemplo, como um plasmídeo, ou integrada de forma estável no cromossomo. Uma integração estável é preferencial. Assim, a modificação genética pode consistir, por exemplo, na integração do gene (ou genes) correspondente que codifica a enzima (ou enzimas) para o cromossomo, ou na expressão da enzima (ou enzimas) de um plasmídeo que contém um promotor a montante da sequência de codificação de enzima, em que o promotor e sequência de codificação se originam preferencialmente de organismos diferentes, ou qualquer outro método conhecido pelo versado na técnica.
[0132] O termo “micro-organismo” no contexto da presente invenção se refere a bactérias, bem como a fungos, tais como leveduras, e também a algas e arqueia. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo é uma bactéria. Em princípio, qualquer bactéria pode ser usada. As bactérias preferenciais a serem empregadas no processo, de acordo com a invenção, são bactérias do gênero Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas, Zymomonas ou Escherichia. Em uma modalidade particularmente preferencial, a bactéria pertence ao gênero Escherichia e ainda mais preferencial à espécie Escherichia coli. Em outra modalidade preferencial, a bactéria pertence à espécie Pseudomonas putida ou à espécie Zymomonas mobilis ou à espécie Corynebacterium glutamicum ou à espécie Bacillus subtilis.
[0133] Também é possível empregar uma bactéria extremofílica, como Thermus thermophilus, ou bactérias anaeróbias da família Clostridiae.
[0134] Em outra modalidade preferencial, o micro-organismo é um fungo, mais preferencialmente um fungo do gênero Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus, Trichoderma, Kluyveromyces ou Pichia e ainda mais preferencialmente da espécie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Pichia torula ou Pichia utilis.
[0135] Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção faz uso de um micro-organismo fotossintético que expressa pelo menos uma enzima para a conversão de acordo com a invenção, como descrito acima. Preferencialmente, o micro-organismo é uma bactéria fotossintética ou uma microalga. Em uma modalidade adicional, o micro-organismo é uma alga, mais preferencialmente uma alga pertencente às diatomáceas.
[0136] Também é concebível o uso no método, de acordo com a invenção, de uma combinação de micro-organismos, em que micro-organismos diferentes expressam enzimas diferentes, como descrito acima. A modificação genética de micro- organismos para expressar uma enzima de interesse também será descrita adicionalmente em detalhes abaixo.
[0137] Em outra modalidade, o método da invenção compreende a etapa de fornecer o organismo, preferencialmente o micro-organismo que porta a respectiva atividade ou atividades de enzima na forma de uma cultura (de célula), preferencialmente na forma de uma cultura de célula líquida, uma etapa subsequente de cultivar o organismo, preferencialmente o micro-organismo em um fermentador (também frequentemente denominado biorreator) sob condições adequadas que permitem a expressão da respectiva enzima e que compreendem adicionalmente a etapa de efetuar uma conversão enzimática de um método da invenção, como descrito acima no presente documento. Os dispositivos fermentadores ou de biorreatores adequados e condições de fermentação são conhecidos pelo versado na técnica. Um biorreator ou um fermentador se refere a qualquer dispositivo ou sistema fabricado ou projetado conhecido na técnica que suporte um ambiente biologicamente ativo. Assim, um biorreator ou um fermentador pode ser um recipiente no qual um produto químico/bioquímico semelhante ao método da presente invenção é executado, o que envolve organismos, preferencialmente micro-organismos e/ou substâncias bioquimicamente ativas, isto é, a enzima (ou enzimas) descrita acima derivada de tais organismos ou organismos que portam a enzima (ou enzimas) descrita acima. Em um biorreator ou fermentador, esse processo pode ser aeróbico ou anaeróbico. Esses biorreatores são comumente cilíndricos e podem variar em tamanho de litros a metros cúbicos, e geralmente são feitos de aço inoxidável. Em relação a isso, sem estar vinculado à teoria, o fermentador ou biorreator pode ser projetado de maneira que seja adequado para cultivar os organismos, preferencialmente micro-organismos, em, por exemplo, uma cultura de batelada, cultura de batelada alimentada, cultura de perfusão ou cultura de quimiostato, todas as quais são geralmente conhecidas na técnica.
[0138] O meio de cultura pode ser qualquer meio de cultura adequado para cultivar o respectivo organismo ou micro-organismo.
[0139] Conforme descrito acima, o método de acordo com a presente invenção pode ser particularmente útil e vantajoso quando implantado em um micro-organismo, conforme descrito no documento WO 2013/007786. Esse documento descreve um micro-organismo recombinante que tem atividade de fosfocetolase e no qual a EMPP é desativada ou diminuída pela abolição ou redução da fosfofrutocinase e no qual a ramificação oxidativa da PPP é desativada ou diminuída pela abolição ou redução da glicose-6-fosfato desidrogenase. Essas medidas levam a um aumento na quantidade de frutose-6-fosfato (F6P), que é convertido pela fosfocetolase e alimentado na ramificação não oxidativa da PPP. Nesse caso, o gliceraldeído-3-fosfato (G3P) que resulta da ramificação não oxidativa da PPP é reciclado em frutose-1,6-bifosfato (FBP) por meio da condensação com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP). Essa reação é catalisada pela bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13). A frutose-1,6-bifosfato (FBP) é então convertida em frutose-6-fosfato (F6P) pela ação da enzima frutose bifosfatase (EC 3.1.3.11). O método de acordo com a presente invenção contorna a regulação de bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13) e bifosfatase frutose (EC 3.1.3.11) e sua inibição em níveis superiores de glicose ou sacarose no meio de fermentação. Assim, o método de acordo com a presente invenção permite a conversão de fosfato de di- hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) nesse micro-organismo, mesmo sob condições de altas concentrações de glicose ou sacarose no meio de cultura ou no recipiente de reação. Assim, em uma modalidade preferencial, o método descrito acima para produzir frutose-6-fosfato de acordo com a invenção é implantado em um micro-organismo como descrito em W O 2013/007786.
[0140] Por conseguinte, em uma modalidade preferencial, o método de acordo com a presente invenção é implantado em um micro-organismo que não é apenas caracterizado por expressar de forma recombinante as enzimas descritas acima em conexão com o método, mas que é, além disso, caracterizado por:
a) ter atividade de fosfocetolase; b) (i) ter uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase ou por reduzir a atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro-organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de fosfofrutocinase; e c) (i) ter uma ramificação oxidativa diminuída ou inativada da via da pentose fosfato (PPP) pela inativação do gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase.
[0141] Esse micro-organismo é caracterizado por ter atividade de fosfocetolase, de modo a aumentar o fluxo de acetil-CoA produzido. Normalmente, um micro- organismo converte a glicose através da via de Embden-Meyerhof-Parnas em piruvato, que pode então ser convertido em acetil-CoA pela enzima piruvato desidrogenase. No entanto, essa conversão é acompanhada pela liberação de CO 2 e, assim, um átomo de carbono é perdido, o qual pode ter sido usado na produção de metabólitos úteis. A fim de aumentar a quantidade de acetil-CoA em um micro- organismo, é, portanto, desejável que o acetil-CoA seja formado através de uma via diferente para evitar a perda de átomos de carbono. Com o uso de um micro- organismo com atividade de fosfocetolase, fosfato e frutose-6-fosfato são convertidos em eritrose-4-fosfato e acetilfosfato e a fosfotransacetilase converte adicionalmente acetilfosfato em acetil-CoA sem perda de um átomo de carbono. Assim, no final, o rendimento de acetil-CoA pode ser aumentado com o uso de um micro-organismo que tem atividade de fosfocetolase. Esse micro-organismo é capaz de converter glicose em acetil-CoA sem perda de um átomo de carbono. Micro-organismos recombinantes nos quais uma fosfocetolase é expressa de forma natural ou heteróloga são revelados nos documentos US 7.785.858 e US 7.253.001.
[0142] O termo "atividade de fosfocetolase", como usado no presente documento, significa uma atividade enzimática que é capaz de converter D-xilulose-5-fosfato em D-gliceraldeído-3-fosfato de acordo com a seguinte reação: D-xilulose-5-fosfato + fosfato → D-gliceraldeído-3-fosfato + acetil-fosfato + água ou que é capaz de catalisar a reação mostrada acima e que também é capaz de converter D-frutose-6-fosfato em D-eritrose-4-fosfato de acordo com a seguinte reação: D-Frutose 6-fosfato + fosfato → acetil fosfato + D-eritrose 4-fosfato + água
[0143] As fosfocetolases anteriores são normalmente classificadas em EC 4.1.2.9 e as últimas em EC 4.1.2.22. Ambos os tipos de fosfocetolases podem ser utilizados no escopo da presente invenção. A Figura 1 mostra esquemas para as reações globais com o uso das duas opções da fosfocetolase conforme descrito no presente documento.
[0144] Essa atividade enzimática pode ser medida por ensaios conhecidos na técnica. Um exemplo desse ensaio é dado na seção de Exemplos abaixo.
[0145] No contexto da presente invenção, um micro-organismo que tem atividade de fosfocetolase pode, por exemplo, ser um micro-organismo que tem naturalmente atividade de fosfocetolase ou um micro-organismo que não tem naturalmente atividade de fosfocetolase e foi geneticamente modificado para expressar uma fosfocetolase ou um micro-organismo que tem naturalmente atividade de fosfocetolase e que foi geneticamente modificado, por exemplo, transformado com um ácido nucléico, por exemplo, um vetor, que codifica uma fosfocetolase a fim de aumentar a atividade de fosfocetolase no dito micro-organismo.
[0146] Micro-organismos que inerentemente, isto é, naturalmente, têm atividade de fosfocetolase são conhecidos na técnica e qualquer um deles pode ser usado no contexto da presente invenção.
[0147] Também é possível, no contexto da presente invenção, que o micro- organismo seja um micro-organismo que não tem naturalmente atividade de fosfocetolase, mas que é geneticamente modificado de modo a compreender uma sequência de nucleotídeos que permite a expressão de uma fosfocetolase. De maneira semelhante, o micro-organismo também pode ser um micro-organismo que tem naturalmente atividade de fosfocetolase, mas que é geneticamente modificado de modo a aumentar a atividade de fosfocetolase, por exemplo, pela introdução de uma sequência de nucleotídeos exógena que codifica uma fosfocetolase.
[0148] A modificação genética de micro-organismos para expressar uma enzima de interesse será descrita em detalhes abaixo.
[0149] A fosfocetolase expressa no micro-organismo pode ser qualquer fosfocetolase, em particular uma fosfocetolase de organismos procarióticos ou eucarióticos. As fosfocetolases procarióticas são descritas, por exemplo, a partir de Lactococcus lactis.
[0150] A fosfocetolase expressa no micro-organismo pode ser uma fosfocetolase de ocorrência natural ou pode ser uma fosfocetolase que é derivada de uma fosfocetolase de ocorrência natural, por exemplo, pela introdução de mutações ou outras alterações que, por exemplo, alteram ou melhoram a atividade enzimática, a estabilidade, etc.
[0151] O micro-organismo é de preferência adicionalmente caracterizado por ter uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica uma fosfofrutocinase ou por reduzir a atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro-organismo não modificado ou por não possuir atividade de fosfofrutocinase. Assim, o micro-organismo é um micro- organismo que naturalmente tem uma EMPP incluindo a atividade de fosfofrutocinase, mas que foi modificado, em particular geneticamente modificado, de modo que a atividade de fosfofrutocinase seja completamente abolida ou de modo que seja reduzida em comparação com o micro-organismo não modificado correspondente, ou o micro-organismo é um micro-organismo que naturalmente não tem uma atividade de fosfofrutocinase.
[0152] Como já mencionado acima, quando a glicose é processada por meio da
EMPP em acetil-CoA, um átomo de carbono é perdido pela liberação de CO2 na última etapa. Introduzindo-se a fosfocetolase, essa perda pode ser evitada. Uma vez que a frutose-6-fosfato é um substrato para a fosfocetolase, é desejável que o acúmulo de frutose-6-fosfato seja mantido em um nível alto no micro-organismo a fim de aumentar o rendimento em acetil-CoA. Uma vez que a frutose-6-fosfato também é um substrato para uma enzima da via de Embden-Meyerhof-Parnas, ou seja, a fosfofrutocinase, o micro-organismo recombinante tem uma atividade de fosfofrutocinase reduzida em comparação com um micro-organismo não modificado ou o gene (ou genes) que codifica uma fosfofrutocinase foi inativado. Isso garante que o fluxo de frutose-6- fosfato seja direcionado para a fosfocetolase e para produzir acetil-CoA sem perda de CO2, porque a frutose-6-fosfato ou a maior parte da frutose-6-fosfato não pode mais ser processada através da via de Embden-Meyerhof-Parnas. Micro-organismos recombinantes nos quais uma fosfocetolase é expressa de forma natural ou heteróloga e que têm atividade de fosfofrutocinase reduzida são revelados no documento US 7.785.858.
[0153] A "atividade de fosfofrutocinase" significa uma atividade enzimática que converte ATP e frutose-6-fosfato em ADP e frutose-1,6-bifosfato (EC 2.7.1.11). Essa atividade enzimática pode ser medida por ensaios conhecidos na técnica como, por exemplo, descrito por Kotlarz et al. (Methods Enzymol. (1982) 90, 60 a 70).
[0154] O termo "um micro-organismo que é caracterizado por ter uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica uma fosfofrutocinase ou por redução da atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro-organismo não modificado", preferencialmente se refere a um micro-organismo no qual a inativação do gene (ou genes) que codifica uma fosfofrutocinase ou a redução da atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro-organismo não modificado é obtida por uma modificação genética do micro-organismo que leva à dita inativação ou redução.
[0155] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo recombinante que tem uma via de Embden Meyerhof-Parnas (EMPP) inativada pela inativação do gene (ou genes) que codifica uma fosfofrutoquinase. A inativação do gene (ou genes) que codifica uma fosfofrutocinase no contexto da presente invenção significa que o gene (ou genes) que codifica para a fosfofrutocinase que está presente no micro-organismo é inativado de modo que o mesmo não é mais expresso e/ou não leva à síntese de fosfofrutocinase funcional. A inativação pode ser obtida de várias maneiras diferentes conhecidas na técnica. A inativação pode, por exemplo, ser obtida pela ruptura do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase ou pela exclusão limpa do dito gene (ou genes) através da introdução de um marcador de seleção. Alternativamente, o promotor do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase pode ser mutado de uma maneira que o gene (ou genes) não seja mais transcrito em mRNA. Outras maneiras de inativar o gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase conhecida na técnica são: expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma sequência de nucleotídeos complementar à transcrição do gene (ou genes) da fosfofrutocinase, de modo que o mRNA não possa mais ser traduzido em proteína, expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de RNAi; expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma atividade de clivagem específica de um transcrito do dito gene (ou genes) ou expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de cossupressão. Esses polinucleotídeos podem ser incorporados em um vetor, que pode ser introduzido no micro-organismo por transformação para obter a inativação do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase.
[0156] O termo "inativação" no contexto da presente invenção significa preferencialmente inativação completa, ou seja, que o micro-organismo não apresenta atividade de fosfofrutocinase. Isso significa, em particular, que o micro-organismo não apresenta atividade de fosfofrutocinase independente das condições de crescimento usadas.
[0157] Preferencialmente, "inativação" significa que o gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase que está presente no micro-organismo é geneticamente modificado de modo a impedir a expressão da enzima. Isso pode ser obtido, por exemplo, pela exclusão do gene, ou partes do mesmo, em que a exclusão de partes do mesmo impede a expressão da enzima, ou pela ruptura do gene na região de codificação ou na região promotora em que a ruptura tem o efeito de que nenhuma proteína é expressa ou uma proteína disfuncional é expressa.
[0158] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo recombinante que tem uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída pela redução da atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro-organismo não modificado. Preferencialmente, essa redução é obtida por uma modificação genética do micro-organismo. Isso pode ser obtido, por exemplo, por mutagênese aleatória ou mutagênese direcionada ao local do promotor e/ou da enzima e seleção subsequente de promotores e/ou enzimas com as propriedades desejadas ou por sequências de nucleotídeos complementares ou efeito RNAi como descrito acima.
[0159] No contexto da presente invenção, uma "atividade reduzida" significa que a expressão e/ou a atividade de uma enzima, em particular da fosfofrutocinase, no micro-organismo geneticamente modificado é de pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30% ou 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70% ou 80% e particularmente preferencial pelo menos 90% ou 100% inferior ao micro-organismo não modificado correspondente. Os métodos para medir o nível de expressão de uma dada proteína em uma célula são bem conhecidos do versado na técnica. Os ensaios para medir a atividade enzimática reduzida de uma fosfofrutocinase são conhecidos na técnica.
[0160] Em outra modalidade, o micro-organismo é um micro-organismo que não tem uma atividade de fosfofrutocinase. Isso significa preferencialmente que tal micro- organismo naturalmente não possui uma atividade de fosfofrutocinase. Isso significa que esse micro-organismo não contém naturalmente em seu genoma uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima com atividade de fosfofrutocinase.
Exemplos de tais micro-organismos são Zymomonas mobilis (J.S. Suo et al., Nat. Biotechnol. 23:63 (2005)) e Ralstonia eutropha (C. Fleige et al., Appl. Microb. Cell Physiol. 91:769 (2011)).
[0161] O micro-organismo pode ser adicionalmente caracterizado por ter uma ramificação oxidativa diminuída ou inativada da via da pentose fosfato (PPP) pela inativação do gene (ou genes) que codifica uma glicose-6-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado ou por não possuir atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Assim, o micro-organismo é preferencialmente um micro-organismo que naturalmente tem uma PPP que inclui atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase, mas que foi modificado, em particular geneticamente modificado, de modo que a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase seja completamente abolida ou de modo que seja reduzida em comparação com o micro-organismo não modificado correspondente, ou o micro-organismo é um micro-organismo que naturalmente não possui uma atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase.
[0162] Diminuir ou inativar a ramificação oxidativa da via da pentose fosfato aumenta adicionalmente o rendimento em acetil-CoA, uma vez que a glicose-6-fosfato não será mais retirada pelo ciclo da pentose fosfato. A totalidade ou quase totalidade da glicose-6-fosfato no micro-organismo será convertida em frutose-6-fosfato, que será em seguida convertida em acetil-CoA.
[0163] A "atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase" significa uma atividade enzimática que converte glicose-6-fosfato e NADP+ em 6-fosfoglucono-δ-lactona e NADPH (EC 1.1.1.49). Essa atividade enzimática pode ser medida por ensaios conhecidos na técnica como, por exemplo, descrito por Noltmann et al. (J. Biol. Chem. (1961) 236, 1225 a 1230).
[0164] O termo "um micro-organismo que é caracterizado por ter uma ramificação oxidativa diminuída ou inativada da via da pentose fosfato (PPP) por inativação do gene (ou genes) que codifica uma glicose-6-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-
organismo não modificado" se refere preferencialmente a um micro-organismo no qual a inativação do gene (ou genes) que codifica uma glicose-6-fosfato desidrogenase ou a redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado é obtida por uma modificação genética do micro- organismo que leva à dita inativação ou redução.
[0165] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo recombinante que tem uma ramificação oxidativa inativada da via da pentose fosfato (PPP) por inativação do gene (ou genes) que codifica uma glicose-6- fosfato desidrogenase. A inativação do gene (ou genes) que codifica uma glicose-6- fosfato desidrogenase no contexto da presente invenção significa que o gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase que está presente no micro- organismo está inativado de modo que não sejam mais expressos e/ou não levem à síntese de glicose-6-fosfato desidrogenase funcional. A inativação pode ser obtida de várias maneiras diferentes conhecidas na técnica. A inativação pode, por exemplo, ser obtida pela interferência no gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase ou pela exclusão limpa do dito gene (ou genes) através da introdução de um marcador de seleção. Alternativamente, o promotor do gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase pode ser mutado de uma forma que o gene (ou genes) não seja mais transcrito em mRNA. Outras maneiras de inativar o gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase conhecida na técnica são: expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma sequência de nucleotídeos complementar à transcrição do gene (ou genes) da glicose-6-fosfato desidrogenase, de modo que o mRNA não possa mais ser traduzido em proteína, expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de RNAi; expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma atividade de clivagem específica de um transcrito do dito gene (ou genes) ou expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de cossupressão. Esses polinucleotídeos podem ser incorporados em um vetor, que pode ser introduzido no micro-organismo por transformação para obter a inativação do gene (ou genes) que codifica a glicose-6- fosfato desidrogenase.
[0166] O termo "inativação" no contexto da presente invenção significa preferencialmente inativação completa, ou seja, que o micro-organismo não apresenta atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Isso significa, em particular, que o micro-organismo não apresenta atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase independente das condições de crescimento usadas.
[0167] Preferencialmente, "inativação" significa que o gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase que está presente no micro-organismo é geneticamente modificado de modo a impedir a expressão da enzima. Isso pode ser obtido, por exemplo, pela exclusão do gene, ou partes do mesmo, em que a exclusão de partes do mesmo impede a expressão da enzima, ou pela ruptura do gene na região de codificação ou na região promotora em que a ruptura tem o efeito de que nenhuma proteína é expressa ou uma proteína disfuncional é expressa.
[0168] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo recombinante que tem uma ramificação oxidativa diminuída da via da pentose fosfato (PPP), reduzindo-se a atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado. Preferencialmente, essa redução é obtida por uma modificação genética do micro- organismo. Isso pode ser obtido, por exemplo, por mutagênese aleatória ou mutagênese direcionada ao local do promotor e/ou da enzima e seleção subsequente de promotores e/ou enzimas com as propriedades desejadas ou por sequências de nucleotídeos complementares ou efeito RNAi como descrito acima.
[0169] No contexto da presente invenção, uma "atividade reduzida" significa que a expressão e/ou a atividade de uma enzima, em particular da glicose-6-fosfato desidrogenase, no micro-organismo geneticamente modificado é de pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30% ou 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70% ou 80% e particularmente preferencial pelo menos 90% ou 100% inferior ao micro-organismo não modificado correspondente. Os métodos para medir o nível de expressão de uma dada proteína em uma célula são bem conhecidos do versado na técnica. Os ensaios para medir a atividade enzimática reduzida de uma glicose-6-fosfato desidrogenase são conhecidos na técnica.
[0170] Em outra modalidade, o micro-organismo é um micro-organismo que não tem uma atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Isso significa preferencialmente que tal micro-organismo naturalmente não possui uma atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Isso significa que esse micro-organismo não contém naturalmente em seu genoma uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Exemplos de tais micro- organismos são Acinetobacter baylyi (Barbe et al., Nucl. Acids Res. 32 (2004), 5766 a 5779), arqueia do filo hipertermofílico, como Sulfolobus solfataricus (Nunn et al., J. Biol. Chem. 285 (2010), 33701 a 33709), Thermoproteus tenax, Thermoplasma acidophilum e Picrophilus torridus (Reher and Schönheit, FEBS Lett. 580 (2006), 1198 a 1204).
[0171] O micro-organismo pode, em princípio, também ser caracterizado por ter atividade de frutose-1,6-bisfosfato fosfatase. No entanto, conforme descrito acima, uma vez que essa enzima pode ser inibida por altos níveis de glicose, é preferencial que sua ação seja substituída pelo método de acordo com a presente invenção para produzir frutose-6-fosfato (F6P) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P). O frutose-6-fosfato pode, em seguida, ser novamente convertido através da via de fosfocetolase em acetil-CoA. De fato, o produto fosfato de acetila de fosfocetolase se interconverte em acetil-CoA através de ação da enzima fosfato acetiltransferase EC 2.3.1.8. Assim, o micro-organismo recombinante é capaz de produzir acetil-CoA a partir da glicose em uma abordagem estequiometria de 3:1. A soma das reações é dada na Equação 2. glicose + ATP + 3 CoA → 3 acetil-CoA + ADP + H3PO4 + 2 H2O (Equação 2)
[0172] Em outra modalidade, o micro-organismo é adicionalmente caracterizado pelo fato de que a EMPP é adicionalmente diminuída ou inativada pela inativação do gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro- organismo não modificado. Diminuir adicionalmente a EMPP em uma etapa adicionalmente a jusante pela diminuição ou inativação da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase garante que nenhum ou quase nenhum gliceraldeído 3-fosfato que possa ser produzido no micro-organismo será processado através da glicólise em acetil-CoA, de modo que um átomo de carbono seria perdido pela liberação de CO 2 na última etapa catalisada pela piruvato desidrogenase. Portanto, o bloqueio da EMPP pela diminuição ou inativação da atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase garante adicionalmente que o fluxo geral seja direcionado para a fosfocetolase.
[0173] A "atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase" significa uma atividade enzimática que converte gliceraldeído 3-fosfato, fosfato e NAD+ em fosfato de 3-fosfo-D-gliceroíla e NADH + H+ (EC 1.2.1.12). Essa atividade pode ser medida por ensaios conhecidos na técnica como, por exemplo, descrito por D'Alessio et al. (J. Biol. Chem. (1971) 246, 4326 a 4333).
[0174] O termo "um micro-organismo que é caracterizado por ter uma via Embden- Meyerhof-Parnas (EMPP) adicionalmente diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado" se refere preferencialmente a um micro- organismo no qual a inativação do gene (ou genes) que codifica uma gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase ou a redução da atividade do gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado é obtida por uma modificação genética do micro-organismo que leva à dita inativação ou redução.
[0175] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo recombinante no qual a EMPP é adicionalmente diminuída ou inativada pela inativação do gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado. A inativação do gene (ou genes) que codifica uma glicose3-fosfato desidrogenase no contexto da presente invenção significa que o gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase que está presente no micro-organismo está inativado de modo que não sejam mais expressos e/ou não levem à síntese de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase funcional. A inativação pode ser obtida de várias maneiras diferentes conhecidas na técnica. A inativação pode, por exemplo, ser obtida pela ruptura do gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou pela exclusão limpa do dito gene (ou genes) através da introdução de um marcador de seleção. Alternativamente, o promotor do gene que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase pode ser mutado de uma forma que o gene (ou genes) não seja mais transcrito em mRNA. Outras maneiras de inativar o gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase conhecida na técnica são: expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma sequência de nucleotídeos complementar à transcrição do gene (ou genes) da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, de modo que o mRNA não possa mais ser traduzido em proteína, expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de RNAi; expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma atividade de clivagem específica de um transcrito do dito gene (ou genes) ou expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de cossupressão. Esses polinucleotídeos podem ser incorporados em um vetor, que pode ser introduzido no micro-organismo por transformação para obter a inativação do gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase.
[0176] O termo "inativação" no contexto da presente invenção significa preferencialmente inativação completa, ou seja, que o micro-organismo não apresenta atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Isso significa, em particular, que o micro-organismo não apresenta atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase independente das condições de crescimento usadas.
[0177] Preferencialmente, "inativação" significa que o gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase que está presente no micro- organismo é geneticamente modificado de modo a impedir a expressão da enzima. Isso pode ser obtido, por exemplo, pela exclusão do gene, ou partes do mesmo, em que a exclusão de partes do mesmo impede a expressão da enzima, ou pela ruptura do gene na região de codificação ou na região promotora em que a ruptura tem o efeito de que nenhuma proteína é expressa ou uma proteína disfuncional é expressa.
[0178] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo recombinante que tem uma EMPP diminuída pela redução da atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro- organismo não modificado. Preferencialmente, essa redução é obtida por uma modificação genética do micro-organismo. Isso pode ser obtido, por exemplo, por mutagênese aleatória ou mutagênese direcionada ao local do promotor e/ou da enzima e seleção subsequente de promotores e/ou enzimas com as propriedades desejadas ou por sequências de nucleotídeos complementares ou efeito RNAi como descrito acima.
[0179] No contexto da presente invenção, uma "atividade reduzida" significa que a expressão e/ou a atividade de uma enzima, em particular da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, no micro-organismo geneticamente modificado é de pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30% ou 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70% ou 80% e particularmente preferencial pelo menos 90% ou 100% inferior ao micro-organismo não modificado correspondente. Os métodos para medir o nível de expressão de uma dada proteína em uma célula são bem conhecidos do versado na técnica. Os ensaios para medir a atividade enzimática reduzida de uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase são conhecidos na técnica.
[0180] Em outra modalidade, em que o micro-organismo recombinante é uma bactéria, o gene (ou genes) que codifica o transportador de PTS dependente de PEP foi inativado. No contexto da presente invenção, inativação significa que o gene (ou genes) que codifica para o transportador de PTS dependente de PEP que está presente no micro-organismo é inativado de modo que não seja mais expresso e/ou não leve à síntese do transportador de PTS dependente de PEP funcional. A inativação do gene (ou genes) que codifica o transportador de PTS dependente de PEP deve ser tal que as bactérias não sejam mais capazes de transportar glicose através do transportador de PTS dependente de PEP.
[0181] O transportador de PTS dependente de PEP (por exemplo, de E. coli, B. subtilis) é conhecido na técnica. Um exemplo para a inativação do transportador de PTS dependente de PEP é mostrado na seção Exemplo abaixo.
[0182] A inativação pode ser obtida de várias maneiras diferentes conhecidas na técnica. A inativação pode, por exemplo, ser obtida pela ruptura do gene (ou genes) que codifica o transportador de PTS dependente de PEP ou por exclusão limpa do dito gene (ou genes) por meio da introdução de um marcador de seleção. Alternativamente, o promotor do gene (ou genes) que codifica o transportador de PTS dependente de PEP pode ser mutado de forma que o gene (ou genes) não seja mais transcrito em mRNA. Outras maneiras de inativar o gene (ou genes) que codifica o transportador de PTS dependente de PEP conhecido na técnica são: expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma sequência de nucleotídeos complementar à transcrição do gene (ou genes) do transportador de PTS dependente de PEP, de modo que o mRNA não possa mais ser traduzido em proteína, expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de RNAi; expressar um polinucleotídeo que codifica o RNA com uma atividade de clivagem específica de um transcrito do dito gene (ou genes) ou expressar um polinucleotídeo que codifica RNA que suprime a expressão do dito gene (ou genes) através do efeito de cossupressão. Esses polinucleotídeos podem ser incorporados em um vetor, que pode ser introduzido no micro-organismo por transformação para obter a inativação do gene (ou genes) que codifica o transportador de PTS dependente de PEP.
[0183] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo, com capacidade para consumir glicose.
[0184] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo, com capacidade para consumir frutose.
[0185] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo, com capacidade para consumir xilose.
[0186] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo, com capacidade para consumir manose.
[0187] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo, com capacidade para consumir mais do que um açúcar. Preferencialmente, o dito mais de um açúcar compreende sacarose, glicose, manose e/ou xilose. Em uma modalidade mais preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo, com capacidade para consumir dois ou mais açúcares selecionados do grupo que consiste em sacarose, glicose, manose e xilose. Organismos e/ou micro-organismos capazes de consumir glicose, frutose, xilose e/ou manose ocorrem naturalmente e são conhecidos na técnica.
[0188] Em outra modalidade, o dito organismo e/ou micro-organismo é geneticamente modificado para ser capaz de consumir glicose, frutose, xilose e/ou manose e/ou geneticamente modificado para aumentar a capacidade do organismo e/ou micro-organismo de consumir glicose, frutose, xilose e/ou manose. As modificações genéticas correspondentes são conhecidas na técnica.
[0189] Em uma modalidade, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo com capacidade para consumir açúcar através de um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS).
[0190] Em outra modalidade, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo com capacidade para consumir açúcar através de um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS).
[0191] Os organismos e/ou micro-organismos capazes de consumir açúcar através de um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS) e/ou através de um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS) são conhecidos na técnica.
[0192] Em outra modalidade, o dito organismo e/ou micro-organismo é geneticamente modificado para ser capaz de consumir açúcar através de um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS) ou através de um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS). Em outra modalidade preferencial, o dito organismo e/ou micro-organismo é geneticamente modificado para aumentar a capacidade do organismo e/ou micro-organismo de consumir açúcar através de um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS) ou através de um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS). As modificações genéticas correspondentes são conhecidas na técnica.
[0193] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo que possui um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS) diminuído ou inativado.
[0194] Sem estar vinculado à teoria, esse organismo, preferencialmente um micro- organismo, pode, de preferência, ser geneticamente modificado pela exclusão ou inativação de um gene (ou genes) do dito Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS).
[0195] As modificações genéticas correspondentes são conhecidas na técnica.
[0196] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo que tem um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase melhorado (não PTS) para absorção de açúcar.
[0197] Sem estar vinculado à teoria, esse organismo, preferencialmente um micro- organismo, pode preferencialmente ser geneticamente modificado pela superexpressão de um gene (ou genes) do dito Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS) para absorção de açúcar.
[0198] As modificações genéticas correspondentes são conhecidas na técnica.
[0199] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo que tem um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS) diminuído ou inativado e um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS) melhorado para absorção de açúcar.
[0200] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo com capacidade para consumir sacarose através de um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS).
[0201] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção utiliza um organismo, preferencialmente um micro-organismo que consome sacarose, em que o dito organismo, preferencialmente o dito micro-organismo, foi geneticamente modificado pela introdução de pelo menos um gene de um Sistema de Transporte não de Fosfotransferase (não PTS). Sem estar vinculado à teoria, esse organismo e/ou micro-organismo foi geneticamente modificado pela introdução de um gene selecionado do grupo que consiste em cscA, cscB e cscK de Escherichia coli W (M. Bruschi et al., Biotechnology Advances 30 (2012) 1001 a 1010).
[0202] Em outra modalidade preferencial, o método da presente invenção faz uso de um organismo, preferencialmente um micro-organismo que foi geneticamente modificado para ter um Sistema de Transporte de Fosfotransferase (PTS) diminuído ou inativado e uma superexpressão de pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste de galP, glk e glf.
[0203] Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção faz uso de um organismo, preferencialmente um micro-organismo, que é geneticamente modificado a fim de evitar o vazamento de acetil-CoA aumentando, desse modo, a concentração intracelular de acetil-CoA. As modificações genéticas que levam a um aumento na concentração intracelular de acetil-CoA são conhecidas na técnica. Sem estar vinculado à teoria, tal organismo, preferencialmente um micro-organismo, pode ser, de preferência, geneticamente modificado removendo-se ou desativando-se um ou mais dos seguintes genes: ∆ackA (acetato quinase), ∆ldh (lactato desidrogenase), ∆adhE (álcool desidrogenase), ∆frdB e/ou ∆frdC (fumarato redutase e fumarato desidrogenase), ∆ poxB (piruvato oxidase), ∆ pgk (fosfoglicerato quinase), ∆iclR (repressor transcricional de ligação de DNA IclR).
[0204] Exclusões adicionais que podem ser vantajosas no contexto da presente invenção são as exclusões nos genes que codificam 6-fosfogluconato desidratase (por exemplo, o gene edd em E. coli) e/ou nos genes que codificam 2-ceto-3-desoxi-6- fosfogluconato aldolase (por exemplo, o gene eda em E. coli).
[0205] Alternativamente, ou além de qualquer uma das remoções acima, o organismo ou micro-organismo pode ser geneticamente modificado superexpressando-se o gene panK/coaA que codifica pantotenato quinase, aumentando, desse modo, o acúmulo intracelular de CoA/acetil-CoA.
[0206] Essas modificações que evitam o vazamento de acetil-CoA são conhecidas na técnica e organismos modificados correspondentes têm sido usados em métodos para a bioconversão de álcool isoamílico exógeno em acetato de isoamila por uma cepa de E. coli que expressa ATF2 (Metab. Eng. 6 (2004), 294 a 309).
[0207] Outros genes que podem ser superexpressos no organismo ou micro- organismo incluem os seguintes: ○ pckA (fosfoenolpiruvato carboxiquinase) ○ tktA (transcetolase 1) ○ tktB (transcetolase 2) ○ talA (transaldolase A) ○ talB (transaldolase B) ○ rpiA (ribose-5-fosfato isomerase A) ○ rpiB (ribose-5-fosfato isomerase B) ○ rpE (ribulose-fosfato 3-epimerase) ○ pgi (glicose-6-fosfato isomerase) ○ galP (galactose:simportador H+)
○ glk (glucoquinase) ○ glf (proteína de difusão facilitada por glicose) ○ pta (fosfato acetiltransferase)
[0208] O micro-organismo recombinante pode adicionalmente ser caracterizado por ser capaz de converter acetil-CoA em acetona. Métodos para fornecer um tal micro-organismo recombinante são, por exemplo, revelados no documento EP 2 295
593. O termo "que é capaz de converter acetil-CoA em acetona" no contexto da presente invenção significa que o organismo/micro-organismo tem a capacidade de produzir acetona dentro da célula devido à presença de enzimas que fornecem atividades enzimáticas que permitem produzir acetona a partir da acetil-CoA.
[0209] A acetona é produzida por certos micro-organismos, como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa e Pseudomonas putida. A síntese de acetona é mais bem caracterizada em Clostridium acetobutylicum. A mesma começa com uma reação (etapa de reação 1) em que duas moléculas de acetil-CoA são condensadas em acetoacetil-CoA. Essa reação é catalisada pela acetil-CoA acetiltransferase (EC 2.3.1.9). A acetoacetil-CoA é então convertida em acetoacetato por uma reação com ácido acético ou ácido butírico que resulta na produção de acetil-CoA ou butiril-CoA (etapa de reação 2). Essa reação é catalisada, por exemplo, por acetoacetilCoA transferase (EC 2.8.3.8). A acetoacetilCoA transferase é conhecida de vários organismos, por exemplo, de E. coli, no qual a mesma é codificada pelo gene atoAD, ou de Clostridium acetobutylicum, no qual a mesma é codificada pelo gene ctfAB. No entanto, também outras enzimas podem catalisar essa reação, por exemplo, 3-oxoácido CoA transferase (EC 2.8.3.5) ou succinato CoA ligase (EC 6.2.1.5).
[0210] Por fim, o acetoacetato é convertido em acetona por uma etapa de descarboxilação (etapa de reação 3) catalisada por acetoacetato descarboxilase (EC
4.1.1.4).
[0211] As etapas de reação 1 e 2 descritas acima e as enzimas que as catalisam não são características para a síntese de acetona e podem ser encontradas em vários organismos. Em contraste, a etapa de reação 3 que é catalisada pela acetoacetato descarboxilase (EC 4.1.1.4) é encontrada apenas nos organismos que são capazes de produzir acetona.
[0212] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo, que naturalmente tem a capacidade de produzir acetona. Assim, preferencialmente o micro-organismo pertence ao gênero Clostridium, Bacillus ou Pseudomonas, mais preferencialmente às espécies Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellulolyticum, Bacillus polymyxa ou Pseudomonas putida.
[0213] Em outra modalidade preferencial, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo, derivado de um organismo/micro-organismo que naturalmente não produz acetona, mas que foi geneticamente modificado de modo a produzir acetona, ou seja, pela introdução do gene (ou genes) necessário para permitir a produção de acetona no micro-organismo. Em princípio, qualquer micro-organismo pode ser geneticamente modificado dessa forma. As enzimas responsáveis pela síntese da acetona foram descritas acima. Os genes que codificam as enzimas correspondentes são conhecidos na técnica e podem ser usados para modificar geneticamente um dado micro-organismo de modo a produzir acetona. Conforme descrito acima, as etapas de reação 1 e 2 da síntese de acetona ocorrem naturalmente na maioria dos organismos. No entanto, a etapa de reação 3 é característica e crucial para a síntese de acetona. Assim, em uma modalidade preferencial, um micro-organismo geneticamente modificado derivado de um micro-organismo que naturalmente não produz acetona é modificado de modo a conter uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que catalisa a conversão de acetoacetato em acetona por descarboxilação, por exemplo, uma acetoacetato descarboxilase (EC 4.1.1.4). As sequências de nucleotídeos de vários organismos que codificam essa enzima são conhecidas na técnica, por exemplo, o gene adc de Clostridium acetobutylicum (números de acesso Uniprot P23670 e P23673), Clostridium beijerinckii (Clostridium MP; Q9RPK1), Clostridium pasteurianum (número de acesso Uniprot P81336),
Bradyrhizobium sp. (cepa BTAi1 / ATCC BAA-1182; número de acesso Uniprot A5EBU7), Burkholderia mallei (ATCC 10399 A9LBS0), Burkholderia mallei (número de acesso Uniprot A3MAE3), Burkholderia mallei FMH A5XJB2, Burkholderia cenocepacia (número de acesso Uniprot A0B471), Burkholderia ambifaria (número de acesso Uniprot Q0b5P1), Burkholderia phytofirmans (número de acesso Uniprot B2T319), Burkholderia spec. (número de acesso Uniprot Q38ZU0), Clostridium botulinum (número de acesso Uniprot B2TLN8), Ralstonia pickettii (número de acesso Uniprot B2UIG7), Streptomyces nogalater (número de acesso Uniprot Q9EYI7), Streptomyces avermitilis (número de acesso Uniprot Q82NF4), Legionella pneumophila (número de acesso Uniprot Q5ZXQ9), Lactobacillus salivarius (número de acesso Uniprot Q1WVG5), Rhodococcus spec. (número de acesso Uniprot Q0S7W4), Lactobacillus plantarum (número de acesso Uniprot Q890G0), Rhizobium leguminosarum (número de acesso Uniprot Q1M911), Lactobacillus casei (número de acesso Uniprot Q03B66), Francisella tularensis (número de acesso Uniprot Q0BLC9), Saccharopolyspora erythreae (número de acesso Uniprot A4FKR9), Korarchaeum cryptofilum (número de acesso Uniprot B1L3N6), Bacillus amyloliquefaciens (número de acesso Uniprot A7Z8K8), Cochliobolus heterostrophus (número de acesso Uniprot Q8NJQ3), Sulfolobus islandicus (número de acesso Uniprot C3ML22) e Francisella tularensis subsp. holarctica (cepa OSU18).
[0214] Mais preferencialmente, o micro-organismo é geneticamente modificado de modo a ser transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa 2 da reação acima mencionada da síntese de acetona, ou seja, a conversão de acetoacetil CoA em acetoacetato.
[0215] Ainda mais preferencialmente, o micro-organismo é geneticamente modificado de modo a ser transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa 1 da reação mencionada acima da síntese de acetona, ou seja, a condensação de duas moléculas de acetil CoA em acetoacetatil CoA.
[0216] Em uma modalidade particularmente preferencial, o micro-organismo é geneticamente modificado de modo a ser transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 1 mencionada acima da síntese de acetona e com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 2 mencionada acima da síntese de acetona ou com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 1 da síntese de acetona mencionada acima e com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 3 mencionada acima da síntese de acetona ou com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 2 mencionada acima da síntese de acetona e com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 3 mencionada acima da síntese de acetona ou com um molécula de ácido que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 1 mencionada acima da síntese de acetona e com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 2 mencionada acima da síntese de acetona e com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima capaz de catalisar a etapa de reação 3 mencionada acima do síntese de acetona.
[0217] Métodos para preparar os micro-organismos geneticamente modificados acima mencionados são bem conhecidos na técnica. Assim, geralmente, o micro- organismo é transformado com um construto de DNA que permite a expressão da respectiva enzima no micro-organismo. Esse construto normalmente compreende a sequência de codificação em questão ligada a sequências regulatórias que permitem a transcrição e tradução na respectiva célula hospedeira, por exemplo, um promotor e/ou intensificador e/ou terminador de transcrição e/ou locais de ligação de ribossomo, etc. A técnica anterior já descreve micro-organismos que foram geneticamente modificados de modo a serem capazes de produzir acetona. Em particular, genes de, por exemplo, Clostridium acetobutylicum foram introduzidos em E. coli, permitindo assim a síntese de acetona em E. coli, uma bactéria que naturalmente não produz acetona (Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079 a 1085; Hanai et al.,
Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814 a 7818). Em particular Hanai et al. (loc. cit.) mostra que é suficiente introduzir uma sequência de ácido nucleico que codifica uma acetoacetato descarboxilase (tal como aquela de Clostridium acetobutylicum), a fim de obter produção de acetona em E. coli, indicando que as enzimas endógenas em E. coli catalisam as etapas de reação 1 e 2 mencionadas acima (isto é, os produtos de expressão dos genes atoB e atoAD de E. coli) são suficientes para fornecer substrato para produzir acetona.
[0218] Em outro aspecto, o micro-organismo recombinante é adicionalmente caracterizado por ser capaz de converter acetil-CoA em acetona e converter acetona em isobuteno. Métodos para fornecer esse micro-organismo recombinante são, por exemplo, revelados nos documentos EP-A 2 295 593 (EP 09 17 0312), WO 2011/032934, WO 2015/101493, WO 2014/086780, WO 2010/001078, WO 2012/052427, WO 2017/071124, WO 2015/004211, WO 2014/064198 e WO 2014/086781.
[0219] Em outro aspecto, o micro-organismo recombinante é adicionalmente caracterizado por ser capaz de converter acetil-CoA em isobuteno com o uso de uma rota metabólica que não inclui um intermediário de acetona. Métodos para fornecer esse micro-organismo recombinante são, por exemplo, revelados nos documentos WO2016042012, WO2017/085167, WO2018/206262, WO2013/186215, WO2016/034691, WO2017/191239, US2019/0100742, WO 2016/042011, WO 2017/162738, WO2015082447, WO 2010/001078, WO 2012/052427, WO 2017/071124, WO 2015/004211, WO 2014/064198 e WO 2014/086781.
[0220] Em outro aspecto, o micro-organismo recombinante é caracterizado por ser capaz de converter acetil-CoA em acetona e converter acetona em propeno. Métodos para fornecer esse micro-organismo recombinante são, por exemplo, revelados em Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814 a 7818.
[0221] Em outro aspecto, o micro-organismo recombinante é caracterizado por ser capaz de converter acetil-CoA em acetona e converter acetona em isopropanol.
[0222] A conversão de acetona em isopropanol precisa de um álcool desidrogenase secundária que converta acetona em isopropanol em uma reação dependente de NADPH (Chen, J.-S., FEMS Microbiol. Rev. 17:263 a 273 (1995)).
[0223] Consequentemente, em outro aspecto, o micro-organismo recombinante é caracterizado por ser capaz de converter acetona em isopropanol pela (super)expressão de uma álcool desidrogenase secundária.
[0224] Para aumentar a disponibilidade de NADPH, a expressão de enzimas transidrogenase (como PntAB e UdhA (SthA)) pode ser modificada (Jan et al., Biotechnol Prog. 29(5):1124 a 30 (2013)).
[0225] Consequentemente, em outro aspecto, o micro-organismo recombinante é caracterizado por a disponibilidade de NADPH ser aumentada, por exemplo, pela (super)expressão de uma ou mais enzimas trans-hidrogenase, preferencialmente PntAB e UdhA (SthA).
[0226] Em uma forma de modalidade preferencial, pretende-se efetuar exclusões genéticas adicionais de modo a aumentar a produção de acetona e, consequentemente, de isopropanol. Pode, por exemplo, ser vantajoso nesse contexto excluir um ou mais, preferencialmente todos os seguintes genes: fsaA (que codifica para frutose-6-fosfato aldolase 1) e fsaB (que codifica para frutose-6-fosfato aldolase 2).
[0227] Preferencialmente, a fim de aumentar adicionalmente a produção de isopropanol, outros genes que podem ser modificados para serem superexpressos são os genes pntAB (subunidades alfa e beta da transidrogenase do nucleotídeo piridina, Uniprot P07001 e P0AB67, Sequências de Referência NCBI: NP_416120.1 e NP_416119.1), preferencialmente de E. coli.
[0228] Em uma modalidade mais preferencial, o organismo ou micro-organismo é caracterizado por superexpressar um ou mais dos seguintes genes para a conversão de acetil-CoA em acetona e/ou isopropanol: ○ para a etapa 1 acima: thlA (acetil-CoA transferase; referência NCBI WP_010966157.1; Número de Acesso UniProt P45359); preferencialmente o gene thlA de Clostridium acetobulyticum
○ para a etapa 2 acima: atoD, atoA (acetato CoA-transferase; referência NCBI NP_416725.1 e NP_416726.1; Número de Acesso UniProt P76458 e P76459, respectivamente); preferencialmente os genes atoD, atoA de Escherichia coli ○ para a etapa 3 acima: adc (Acetoacetato descarboxilase; referência NCBI NP_149328.1; Número de Acesso UniProt P23670); preferencialmente o gene adc de Clostridium acetobutylicum ○ para uma etapa 4: adh (isopropanol desidrogenase dependente de NADP; referência NCBI AF_157307.2; Número de Acesso UniProt P25984); preferencialmente o gene adh de Clostridium beijerinckii
[0229] Um versado na técnica reconheceria que outras modificações genéticas nos micro-organismos da presente invenção poderiam levar a melhorias na eficácia pela qual os micro-organismos da presente invenção convertem a matéria-prima em produto. Por exemplo, micro-organismos naturais comumente produzem produtos como formato, acetato, lactato, succinato, etanol, glicerol, 2,3-butanodiol, metilglioxal e hidrogênio; todos os quais seriam prejudiciais à produção de, por exemplo, acetona, isobuteno ou propeno a partir de açúcares. A eliminação ou redução substancial de tais subprodutos indesejados pode ser obtida pela eliminação ou redução das atividades de enzimas essenciais que levam à sua produção. Essas atividades incluem, porém, sem limitação, o grupo que consiste em: - acetil-CoA + formato = CoA + piruvato (por exemplo, catalisado pela formato C-acetiltransferase, também conhecida como piruvato formato-liase (EC
2.3.1.54); para E. coli-pflB, NCBI-GeneID: 945514); - ATP + acetato = ADP + acetil fosfato (por exemplo, catalisado por acetato quinase (EC 2.7.2.1); para E. coli-ackA, NCBI-GeneID: 946775); - (R) -lactato + NAD+ = piruvato + NADH + H+ (por exemplo, catalisado por L-lactato desidrogenase (EC 1.1.1.28); para E. coli-ldhA, NCBI-GeneID: 946315); - succinato + aceitador = fumarato + aceitador reduzido (por exemplo, catalisado por succinato desidrogenase (EC 1.3.99.1); para E. coli que compreende frdA e frdB, NCBI-GeneID: 948667 e 948666, respectivamente);
- um 2-oxo carboxilato (por exemplo, piruvato) = um aldeído (por exemplo, acetaldeído + CO2 (por exemplo, catalisado por piruvato descarboxilase (EC 4.1.1.1)); - acetaldeído + CoA + NAD+ = acetil-CoA + NADH + H+ (por exemplo, catalisado por acetaldeído desidrogenase (acetilação) (EC 1.2.1.10); para E. coli- adhE, NCBI-GeneID: 945837); - sn-glicerol 3-fosfato + NAD(P)+ = fosfato de glicerona + NAD(P)H + H+ (por exemplo, catalisado por glicerol-3-fosfato desidrogenase [NAD(P)+] (EC 1.1.1.94); para E. coli-gpsA, NCBI-GeneID: 948125); - 2 piruvato = 2-acetolactato + CO2 (por exemplo, catalisado por acetolactato sintetase (EC 2.2.1.6); para E. coli-ilvH e ilvI, NCBI-GeneID: 947267 e 948793, respectivamente); - fosfato de glicerona = metilglioxal + fosfato (por exemplo, catalisado por metilglioxal sintase (EC 4.2.3.3); para E. coli-mgsA, NCBI-GeneID: 945574); e - formato + H+ = CO2 + H2 (por exemplo, catalisado por formato hidrogenilase (EC 1.2.1.2 juntamente com EC 1.12.1.2); para E. coli-fdhF (EC 1.2.1.2), NCBI-GeneID: 948584).
[0230] Assim, em uma modalidade preferencial, o micro-organismo pode adicionalmente ser caracterizado por uma ou mais das atividades enzimáticas listadas acima serem eliminadas ou reduzidas.
[0231] Um versado na técnica reconheceria adicionalmente que modificações genéticas para elementos reguladores nos micro-organismos da presente invenção poderiam levar a melhorias na eficácia pela qual os micro-organismos da presente invenção convertem matéria-prima em produto. Dentro de E. coli, tais modificações genéticas incluem, porém, sem limitação, o grupo que consiste em: - excluir o gene fnr (NCBI-GeneID: 945908), um regulador global do crescimento anaeróbio; e - excluir o gene rpoS (NCBI-GeneID: 947210), uma RNA polimerase, fator sigma S (sigma 38); e - excluir o gene iclR (repressor transcricional de ligação de DNA IclR).
[0232] Assim, em outra modalidade preferencial, o micro-organismo mostra pelo menos uma dessas exclusões.
[0233] Assim, como descrito acima, o método da presente invenção pode ser implantado em micro-organismos recombinantes como descrito acima que podem ser usados para a conversão de glicose em acetil-CoA. Acetil CoA (também conhecido como acetil Coenzima A) em estrutura química é o tioéster entre a coenzima A (um tiol) e o ácido acético e é uma molécula precursora importante para a produção de metabólitos úteis. O acetil-CoA pode então ser adicionalmente convertido pelo micro- organismo recombinante em metabólitos úteis, tais como ácido L-glutâmico, L- glutamina, L-prolina, L-arginina, L-leucina, succinato e poli-hidroxibutirato.
[0234] O micro-organismo recombinante também pode ser usado para converter acetil-CoA em acetona.
[0235] O micro-organismo recombinante também pode ser usado para converter acetil-CoA em isobuteno.
[0236] O micro-organismo recombinante também pode ser usado para converter acetil-CoA em propeno.
[0237] O micro-organismo recombinante também pode ser usado para converter acetil-CoA em isopropanol.
[0238] Em outra modalidade, o método da invenção compreende a etapa de fornecer o organismo, preferencialmente o micro-organismo que porta a respectiva atividade ou atividades de enzima na forma de uma cultura (de célula), preferencialmente na forma de uma cultura de célula líquida, uma etapa subsequente de cultivar o organismo, preferencialmente o micro-organismo em um fermentador (também frequentemente denominado biorreator) sob condições adequadas que permitem a expressão da respectiva enzima e que compreendem adicionalmente a etapa de efetuar uma conversão enzimática de um método da invenção, como descrito acima no presente documento. Os dispositivos fermentadores ou de biorreatores adequados e condições de fermentação são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Um biorreator ou um fermentador se refere a qualquer dispositivo ou sistema fabricado ou projetado conhecido na técnica que suporte um ambiente biologicamente ativo. Assim, um biorreator ou um fermentador pode ser um recipiente no qual um produto químico/bioquímico semelhante ao método da presente invenção é executado, o que envolve organismos, preferencialmente micro-organismos e/ou substâncias bioquimicamente ativas, isto é, a enzima (ou enzimas) descrita acima derivada de tais organismos ou organismos que portam a enzima (ou enzimas) descrita acima. Em um biorreator ou fermentador, esse processo pode ser aeróbico ou anaeróbico. Esses biorreatores são comumente cilíndricos e podem variar em tamanho de litros a metros cúbicos, e geralmente são feitos de aço inoxidável. Em relação a isso, sem estar vinculado à teoria, o fermentador ou biorreator pode ser projetado de maneira que seja adequado para cultivar os organismos, preferencialmente micro-organismos, em, por exemplo, uma cultura de batelada, cultura de batelada alimentada, cultura de perfusão ou cultura de quimiostato, todas as quais são geralmente conhecidas na técnica.
[0239] O meio de cultura pode ser qualquer meio de cultura adequado para cultivar o respectivo organismo ou micro-organismo.
[0240] Quando realizado utilizando-se um micro-organismo, o método de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser concebido como um método de cultura de fermentação contínua ou como uma cultura em batelada ou qualquer método de cultura adequado conhecido pela pessoa versada na técnica.
[0241] A presente invenção também se refere a um método para a produção de acetona e/ou isobuteno e/ou propeno a partir de glicose ou qualquer uma das outras fontes de carbono mencionadas acima em que o micro-organismo recombinante descrito acima é cultivado em condições que permitem a produção de acetona e/ou isobuteno e/ou propeno e em que a acetona e/ou isobuteno e/ou propeno são isolados. Os micro-organismos são cultivados em condições de cultura adequadas, que permitem a ocorrência da reação enzimática (ou reações enzimáticas). As condições de cultura específicas dependem do micro-organismo específico usado, mas são bem conhecidas do versado na técnica. As condições de cultura são geralmente escolhidas de forma as mesmas permitam a expressão dos genes que codificam as enzimas para as respectivas reações. Vários métodos são conhecidos pelos versados na técnica a fim de melhorar e ajustar a expressão de certos genes em certos estágios da cultura, como indução da expressão gênica por indutores químicos ou por uma mudança de temperatura.
[0242] Em outra modalidade preferencial, o método de acordo com a invenção compreende adicionalmente a etapa de coletar produtos gasosos, em particular isobuteno ou propeno, desgaseificação da reação, ou seja, recuperação dos produtos que desgaseificam, por exemplo, da cultura. Assim, em uma modalidade preferencial, o método é realizado na presença de um sistema para coletar isobuteno ou propeno na forma gasosa durante a reação.
[0243] Na verdade, alcenos curtos como o isobuteno e o propeno assumem o estado gasoso à temperatura ambiente e à pressão atmosférica. O método de acordo com a invenção, portanto, não exige a extração do produto do meio de cultura líquido, uma etapa que é sempre muito cara quando realizada em escala industrial. A evacuação e armazenamento dos hidrocarbonetos gasosos e sua possível separação física e conversão química subsequentes podem ser realizados de acordo com qualquer método conhecido por um versado na técnica.
[0244] As enzimas usadas no método de acordo com a invenção podem ser enzimas que ocorrem naturalmente ou enzimas que são derivadas de enzimas que ocorrem naturalmente, por exemplo, pela introdução de mutações ou outras alterações que, por exemplo, alteram ou melhoram a atividade enzimática, a estabilidade, etc.
[0245] Os métodos para modificar e/ou melhorar as atividades enzimáticas desejadas de proteínas são bem conhecidos pelo versado na técnica e incluem, por exemplo, mutagênese aleatória ou mutagênese dirigida a local e seleção subsequente de enzimas que têm propriedades ou abordagens desejadas da chamada “evolução direcionada”.
[0246] Por exemplo, para a modificação genética em células procarióticas, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima correspondente pode ser introduzida em plasmídeos que permitem a mutagênese ou modificação de sequência por recombinação de sequências de DNA. Os métodos padrão (consultar Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) permitem que trocas de base sejam realizadas ou sequências naturais ou sintéticas sejam adicionadas. Os fragmentos de DNA podem ser ligados com o uso de adaptadores e ligantes complementares aos fragmentos. Além disso, medidas de engenharia que fornecem locais de restrição adequados ou removem DNA excedente ou locais de restrição podem ser usadas. Nesses casos, em que inserções, remoções ou substituições são possíveis, mutagênese in vitro, “reparo de iniciador”, restrição ou ligação podem ser usados. Em geral, uma análise de sequência, análise de restrição e outros métodos de bioquímica e biologia molecular são realizados como métodos de análise. As variantes de enzima resultantes são, então, testadas para a atividade desejada, por exemplo, atividade enzimática, com um ensaio como descrito acima e, em particular, para sua atividade de enzima aumentada.
[0247] Como descrito acima, o micro-organismo empregado em um método da invenção ou contido na composição da invenção pode ser um micro-organismo que tenha sido geneticamente modificado pela introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima correspondente. Assim, em uma modalidade preferencial, o micro-organismo é um micro-organismo recombinante que tenha sido geneticamente modificado para ter uma atividade aumentada de pelo menos uma enzima descrita acima para as conversões do método de acordo com a presente invenção. Isso pode ser obtido, por exemplo, pela transformação do micro-organismo com um ácido nucleico que codifica uma enzima correspondente. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico introduzida no micro-organismo é uma molécula de ácido nucleico que é heteróloga em relação ao micro-organismo, isto é, não ocorre naturalmente no dito micro-organismo.
[0248] No contexto da presente invenção, uma “atividade aumentada”
preferencialmente significa que a expressão e/ou a atividade de uma enzima no micro- organismo geneticamente modificado é pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30% ou 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70% ou 80% e de modo particularmente preferencial pelo menos 90% ou 100% mais alta do que o micro-organismo não modificado correspondente. Em modalidades ainda mais preferenciais, o aumento em expressão e/ou atividade pode ser pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 500%. Em modalidades particularmente preferenciais, a expressão é pelo menos 10 vezes, mais preferencialmente pelo menos 100 vezes e ainda mais preferencialmente pelo menos 1.000 vezes mais alta do que o micro-organismo não modificado correspondente.
[0249] O termo expressão/atividade “aumentada” também cobre a situação em que o micro-organismo não modificado correspondente não expressa uma enzima correspondente de modo que a expressão/atividade correspondente no micro- organismo não modificado seja zero. Preferencialmente, a concentração da enzima superexpressada é de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% da proteína total da célula hospedeira.
[0250] Os métodos para medir o nível de expressão de uma dada proteína em uma célula são bem conhecidos do versado na técnica. Em uma modalidade, a medição do nível de expressão é feita medindo-se a quantidade da proteína correspondente. Os métodos correspondentes são bem conhecidos do versado na técnica e incluem Western Blot, ELISA, etc. Em outra modalidade, a medição do nível de expressão é feita medindo-se a quantidade do RNA correspondente. Métodos correspondentes são bem conhecidos do versado na técnica e incluem, por exemplo, Northern Blot.
[0251] No contexto da presente invenção, o termo “recombinante” significa que o micro-organismo é geneticamente modificado de modo a conter uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima, como definido acima em comparação a um micro-organismo de tipo selvagem ou não modificado. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima como definido acima pode ser usada isolada ou como parte de um vetor.
[0252] As moléculas de ácido nucleico podem compreender adicionalmente sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo compreendido na molécula de ácido nucleico. O termo “ligado de modo operativo” ou "ligado de modo operacional", como usado ao longo da presente descrição, se refere a uma ligação entre uma ou mais sequências de controle de expressão e a região de codificação no polinucleotídeo a ser expressa de tal maneira que a expressão seja alcançada sob condições compatíveis com a sequência de controle de expressão.
[0253] A expressão compreende a transcrição da sequência de DNA heteróloga, preferencialmente em um mRNA traduzível. Os elementos reguladores que garantem a expressão em fungos, assim como em bactérias, são bem conhecidos por as pessoas versadas na técnica. Os mesmos abrangem promotores, melhoradores, sinais de terminação, sinais de direcionamento e semelhantes. Exemplos são dados mais abaixo em conexão com explicações sobre vetores.
[0254] Os promotores para uso em conexão com a molécula de ácido nucleico podem ser homólogos ou heterólogos em relação à sua origem e/ou em relação ao gene a ser expresso. Promotores adequados são, por exemplo, promotores que se prestam à expressão constitutiva. No entanto, os promotores que são ativados apenas em um ponto no tempo determinado por influências externas também podem ser usados. Promotores artificiais e/ou induzíveis quimicamente podem ser usados nesse contexto.
[0255] Os vetores podem compreender adicionalmente sequências de controle de expressão operacionalmente ligadas aos ditos polinucleotídeos contidos nos vetores. Essas sequências de controle de expressão podem ser adequadas para assegurar a transcrição e a síntese de um RNA traduzível em bactérias ou fungos.
[0256] Além disso, é possível inserir diferentes mutações nos polinucleotídeos por métodos usuais em biologia molecular (consultar, por exemplo, Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY,
EUA), que levam à síntese de polipeptídeos que possivelmente têm propriedades biológicas modificadas. A introdução de mutações pontuais é concebível em posições nas quais uma modificação da sequência de aminoácidos, por exemplo, influencia a atividade biológica ou a regulagem do polipeptídeo.
[0257] Além disso, mutantes que possuem um substrato modificado ou especificidade de produto podem ser preparados. Preferencialmente, tais mutantes mostram uma atividade aumentada. Alternativamente, podem ser preparados mutantes cuja atividade catalítica é abolida sem perder atividade de ligação de substrato.
[0258] Além disso, a introdução de mutações nos polinucleotídeos que codificam uma enzima como definido acima permitem que a taxa de expressão de gene e/ou a atividade das enzimas codificadas pelos ditos polinucleotídeos sejam reduzidas ou aumentadas.
[0259] Para modificar geneticamente as bactérias ou fungos, os polinucleotídeos que codificam uma enzima, como definido acima, ou partes dessas moléculas podem ser introduzidos em plasmídeos que permitem mutagênese ou modificação de sequência por recombinação de sequências de DNA. Os métodos padrão (consultar Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) permitem que trocas de base sejam realizadas ou sequências naturais ou sintéticas sejam adicionadas. Fragmentos de DNA podem ser conectados entre si aplicando-se adaptadores e ligantes aos fragmentos. Além disso, medidas de engenharia que fornecem locais de restrição adequados ou removem DNA excedente ou locais de restrição podem ser usadas. Nesses casos, em que inserções, remoções ou substituições são possíveis, mutagênese in vitro, “reparo de iniciador”, restrição ou ligação podem ser usados. Em geral, uma análise de sequência, análise de restrição e outros métodos de bioquímica e biologia molecular são realizados como métodos de análise.
[0260] Assim, de acordo com a presente invenção, um micro-organismo recombinante pode ser produzido modificando-se geneticamente fungos ou bactérias que compreendem introduzir os polinucleotídeos descritos acima, moléculas de ácido nucleico ou vetores em um fungo ou bactéria.
[0261] O polinucleotídeo que codifica a enzima respectiva é expresso de modo a levar à produção de um polipeptídeo que tem qualquer uma das atividades descritas acima. Uma visão geral de sistemas de expressão diferentes é, por exemplo, contida em Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, em Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516 a 544) e em Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1 a 9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500 a 4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456 a 463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427 a 440). Uma visão geral dos sistemas de expressão de levedura é, por exemplo, fornecida por Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261 a 279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13 a 19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79 a 93, Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486 a 496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742 a 745) e Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067 a 1072).
[0262] Vetores de expressão foram amplamente descritos na literatura. Como regra, os mesmos contêm não apenas um gene marcador de seleção e uma origem de replicação que garante a replicação no hospedeiro selecionado, mas também um promotor bacteriano ou viral e, na maioria dos casos, um sinal de terminação para transcrição. Entre o promotor e o sinal de terminação está, em geral, pelo menos um local de restrição ou um poliligante que possibilita a inserção de uma sequência de DNA de codificação. A sequência de DNA que controla naturalmente a transcrição do gene correspondente pode ser usada como a sequência promotora, se a mesma estiver ativa no organismo hospedeiro selecionado. No entanto, essa sequência também pode ser trocada por outras sequências promotoras. É possível usar promotores que asseguram a expressão constitutiva do gene e promotores induzíveis que permitem um controle deliberado da expressão do gene. As sequências de promotores bacterianos e virais que possuem essas propriedades são descritas em detalhe na literatura. Sequências reguladoras para a expressão em micro-organismos (por exemplo, E. coli, S. cerevisiae) são descritas suficientemente na literatura. Promotores que permitem uma expressão particularmente elevada de uma sequência a jusante são, por exemplo, o promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60 a 89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., em Rodriguez e Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nova York, (1982), 462 a 481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21 a 25), lp1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97 a 100). Promotores induzíveis são usados preferencialmente para a síntese de polipeptídeos. Esses promotores levam frequentemente a rendimentos de polipeptídeo superiores aos promotores constitutivos. A fim de obter uma quantidade ótima de polipeptídeo, um processo de dois estágios é usado frequentemente. Primeiro, as células hospedeiras são cultivadas sob condições ótimas até uma densidade de célula relativamente alta. Na segunda etapa, a transcrição é induzida dependendo do tipo de promotor usado. A esse respeito, um promotor tac que pode ser induzido por lactose ou IPTG (=isopropil-ß-D-tiogalactopiranosídeo) é particularmente adequado (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80 (1983), 21 a 25). Sinais de terminação para transcrição também são descritos na literatura.
[0263] A transformação da célula hospedeira com um polinucleotídeo ou vetor, como descrito acima, pode ser executada por métodos padrão, como, por exemplo, descrito em Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. A célula hospedeira é cultivada em meios de nutriente que satisfazem as necessidades da célula hospedeira particular usada, em particular, em relação ao valor de pH, temperatura, concentração salina, aeração, antibióticos, vitaminas, elementos vestigiais, etc.
[0264] A presente invenção, além disso, se refere a um micro-organismo recombinante que foi transformado com (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e
(b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima selecionada do grupo que consiste em (i) uma aldeído liase (EC 4.1.2.-); e/ou (ii) uma transaldolase (EC 2.2.1.2).
[0265] Em uma modalidade preferencial, a monoéster fosfórico hidrolase (EC
3.1.3.-) codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente é heteróloga em relação ao micro-organismo, o que significa que o mesmo não ocorre naturalmente nesse micro-organismo. Mais preferencialmente, a enzima codificada se origina de outro micro-organismo, em particular de um micro-organismo de um gênero diferente ou de uma espécie diferente. Em outra modalidade, a enzima é artificial, pois não ocorre na natureza. Isto inclui variantes melhoradas da enzima que foram preparadas por abordagens de mutagênese ou engenharia genética.
[0266] Em outra modalidade preferencial, a aldeído liase (EC 4.1.2.-) ou a transaldolase (EC 2.2.1.2) codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente é heteróloga em relação ao micro-organismo, o que significa que a mesma não ocorre naturalmente nesse micro-organismo. Mais preferencialmente, a enzima codificada se origina de outro micro-organismo, em particular de um micro-organismo de um gênero diferente ou de uma espécie diferente. Em outra modalidade, a enzima é artificial, pois não ocorre na natureza. Isto inclui variantes melhoradas da enzima que foram preparadas por abordagens de mutagênese ou engenharia genética.
[0267] Em uma modalidade particularmente preferencial, as enzimas mencionadas tanto em (a) quanto (b), acima, são heterólogas em relação ao micro- organismo.
[0268] A presente invenção também se refere ao uso desse micro-organismo de acordo com a presente invenção para primeiro converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) pela enzima mencionada em (a) e, em seguida, converter adicionalmente a di-hidroxiacetona (DHA) produzida juntamente com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) por uma enzima mencionada em (b).
[0269] A presente invenção, além disso, se refere a um micro-organismo recombinante que foi transformado com (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13); em que o dito micro-organismo também possui atividade de fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2) ou fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
[0270] Em uma modalidade preferencial, a monoéster fosfórico hidrolase (EC
3.1.3.-) codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente é heteróloga em relação ao micro-organismo, o que significa que o mesmo não ocorre naturalmente nesse micro-organismo. Mais preferencialmente, a enzima codificada se origina de outro micro-organismo, em particular de um micro-organismo de um gênero diferente ou de uma espécie diferente. Em outra modalidade, a enzima é artificial, pois não ocorre na natureza. Isto inclui variantes melhoradas da enzima que foram preparadas por abordagens de mutagênese ou engenharia genética.
[0271] Em outra modalidade preferencial, a bisfosfato frutose aldolase (EC
4.1.2.13) codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente é heteróloga em relação ao micro-organismo, o que significa que não ocorre naturalmente nesse micro- organismo. Mais preferencialmente, a enzima codificada se origina de outro micro- organismo, em particular de um micro-organismo de um gênero diferente ou de uma espécie diferente. Em outra modalidade, a enzima é artificial, pois não ocorre na natureza. Isto inclui variantes melhoradas da enzima que foram preparadas por abordagens de mutagênese ou engenharia genética.
[0272] Em uma modalidade particularmente preferencial, as enzimas mencionadas tanto em (a) quanto (b), acima, são heterólogas em relação ao micro- organismo.
[0273] Em outra modalidade preferencial, esse micro-organismo foi, além disso, transformado com
(c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima selecionada do grupo que consiste em: (i) Fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2); ou (ii) Fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
[0274] Em uma modalidade preferencial, a fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2) ou a fosfomanomutase (EC 5.4.2.8) codificada pela sequência de nucleotídeos correspondente é heteróloga em relação ao micro-organismo, o que significa que a mesma não ocorre naturalmente nesse micro-organismo. Mais preferencialmente, a enzima codificada se origina de outro micro-organismo, em particular de um micro- organismo de um gênero diferente ou de uma espécie diferente. Em outra modalidade, a enzima é artificial, pois não ocorre na natureza. Isto inclui variantes melhoradas da enzima que foram preparadas por abordagens de mutagênese ou engenharia genética.
[0275] Em uma modalidade particularmente preferencial, todas as três enzimas mencionadas em (a), (b) e (c), acima, são heterólogas em relação ao micro- organismo.
[0276] A presente invenção também se refere ao uso desse micro-organismo de acordo com a presente invenção para primeiro converter gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído pela enzima mencionada em (a) e, em seguida, converter adicionalmente o gliceraldeído produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P) por uma enzima mencionada em (b) e, em seguida, converter adicionalmente a frutose-1-fosfato (F1P) produzida em frutose-6-fosfato (F6P) por uma enzima mencionada em (c).
[0277] Um micro-organismo recombinante de acordo com a presente invenção pode, além disso, exibir uma ou mais das características descritas acima para o micro- organismo no qual o método de acordo com a presente invenção pode ser implantado.
[0278] Por conseguinte, em uma modalidade preferencial, o micro-organismo é um micro-organismo recombinante que foi transformado com (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima selecionada do grupo que consiste em (i) uma aldeído liase (EC 4.1.2.-); e/ou (ii) uma transaldolase (EC 2.2.1.2); e/ou que foi transformado com (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13); em que o dito micro-organismo também possui atividade de fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2) ou fosfomanomutase (EC 5.4.2.8) e que é, além disso, caracterizado por: a) ter atividade de fosfocetolase; b) (i) ter uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase ou por reduzir a atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro-organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de fosfofrutocinase; e c) (i) ter uma ramificação oxidativa diminuída ou inativada da via da pentose fosfato (PPP) pela inativação do gene (ou genes) que codifica a glicose-6-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase.
[0279] Com relação às enzimas que podem ser expressas pelo micro-organismo e às modalidades preferenciais, se aplica o mesmo que foi apresentado no presente documento acima em relação a um método de acordo com a invenção e ao micro-
organismo da invenção.
[0280] Além disso, a presente invenção se refere a uma combinação de enzimas que compreende (a) uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma enzima selecionada do grupo que consiste em (i) uma aldeído liase (EC 4.1.2.-); e/ou (ii) uma transaldolase (EC 2.2.1.2).
[0281] Além disso, a presente invenção se refere a uma combinação de enzimas que compreende (a) uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13); e (c) uma enzima selecionada dentre (i) uma fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2); ou (ii) uma fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
[0282] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende um micro-organismo de acordo com a presente invenção ou a combinação de enzimas de acordo com a presente invenção.
[0283] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de uma combinação de enzimas ou de um micro-organismo ou de uma composição de acordo com a presente invenção para primeiro converter fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di- hidroxiacetona (DHA) pela enzima mencionada em (a) e, em seguida, converter adicionalmente a di-hidroxiacetona (DHA) produzida juntamente com gliceraldeído-3- fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) por uma enzima mencionada em (b) como descrito acima, ou para primeiro converter gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído pela enzima mencionada em (a) e, em seguida, converter adicionalmente o gliceraldeído produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P) por uma enzima mencionada em (b) e, em seguida, converter adicionalmente a frutose-1-fosfato (F1P) produzida em frutose-6-fosfato (F6P) por uma enzima mencionada em (c) como descrito acima.
[0284] Em relação às enzimas e ao micro-organismo enumerados nos usos anteriores, se aplica o mesmo que foi apresentado no presente documento acima em relação a um método de acordo com a invenção, em particular no que diz respeito às modalidades preferenciais.
[0285] A Figura 1 mostra o impacto da concentração de AMP na atividade de frutose bifosfatase.
[0286] A Figura 2 mostra o impacto da concentração de AMP em Fsa A129S.
[0287] A Figura 3 mostra a produtividade específica de acetona e isopropanol para cepas que superexpressam as enzimas responsáveis pela conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e di-hidroxi-acetona fosfato (DHAP) em frutose-6-fosfato (F6P) (GBI 17553, linha sólida) e para as cepas que não superexpressam as enzimas responsáveis pela conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) em frutose-6-fosfato (GBI 15847, linha pontilhada).
[0288] Neste relatório descritivo, vários documentos que incluem pedidos de patente são citados. A revelação desses documentos, embora não considerada relevante para a patenteabilidade desta invenção, é incorporada à mesma a título de referência em sua totalidade. Mais especificamente, todos os documentos referidos são incorporados a título de referência como se cada documento individual tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
[0289] A invenção será agora descrita a título de referência aos exemplos a seguir que são apenas ilustrativos e não devem ser interpretados como uma limitação do escopo da presente invenção.
EXEMPLOS MÉTODOS E MATERIAIS GERAIS
[0290] Os procedimentos para ligações e transformações são bem conhecidos na técnica. Técnicas adequadas para utilização nos exemplos que se seguem podem ser encontradas em Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Sambrook J., supra.
[0291] Materiais e métodos adequados para a manutenção e crescimento de culturas bacterianas são bem conhecidos na técnica. Técnicas adequadas para utilização nos exemplos seguintes podem ser encontradas em Manual of Methods for General Bacteriology (Philipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Philips, eds).
[0292] Todos os reagentes e materiais usados para o crescimento e manutenção de células bacterianas foram obtidos da Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO), a menos que especificado de outra forma. SUPEREXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS. a) Enzimas de E. coli
[0293] Têm sido usados plasmídeos da coleção ASKA (Kitagawa, M et al. DNA Res. 12:291 a 299 (2005)) para a superexpressão de enzimas de E.coli.
[0294] Células da cepa BL21 (DE3) (Novagen) foram cultivadas em meio LB e foram tornadas eletrocompetentes. As células BL21 eletrocompetentes foram transformadas com os plasmídeos correspondentes para a expressão das enzimas desejadas (consultar Tabela 1) e, em seguida, semeadas em placas LB contendo cloranfenicol (25μg/ml). As placas foram incubadas durante a noite a 30 °C.
[0295] As células transformadas foram cultivadas com agitação (160 rpm) com o uso de meio de autoindução ZYM-5052 (Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41:207 a 234 (2005)) durante 20h a 30 °C. As células foram coletadas por centrifugação a 4 °C,
4.000 rpm por 20 min e os péletes foram armazenados a -80 °C.
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas fsaA atgGAACTGTATCTGGATACTTCAGACGTTGTTGCGGTGAAGGCGCTGTCA SEQ ID NO: 8 CGTATTTTTCCGCTGGCGGGTGTGACCACTAACCCAAGCATTATCGCCGC Número de acesso GGGTAAAAAACCGCTGGATGTTGTGCTTCCGCAACTTCATGAAGCGATGG Uniprot P78055
GCGGTCAGGGGCGTCTGTTTGCCCAGGTAATGGCTACCACTGCCGAAGG GATGGTTAATGACGCGCTTAAGCTGCGTTCTATTATTGCGGATATCGTGGT
GAAAGTTCCGGTGACCGCCGAGGGGCTGGCAGCTATTAAGATGTTAAAAG 79/100
CGGAAGGGATTCCGACGCTGGGAACCGCGGTATATGGCGCAGCACAAGG GCTGCTGTCGGCGCTGGCAGGTGCGGAATATGTTGCGCCTTACGTTAATC GTATTGATGCTCAGGGCGGTAGCGGCATTCAGACTGTGACCGACTTACAC CAGTTATTGAAAATGCATGCGCCGCAGGCGAAAGTGCTGGCAGCGAGTTT CAAAACCCCGCGTCAGGCGCTGGACTGCTTACTGGCAGGATGTGAATCAA TTACTCTGCCACTGGATGTGGCACAACAGATGATTAGCTATCCGGCGGTT
GATGCCGCTGTGGCGAAGTTTGAGCAGGACTGGCAGGGAGCGTTTGGCA GAACGTCGATTtaa SEQ ID NO:34 A129S mutado por fsaA ATGAGAGGATCTCACCATCACCATCACCATACGGATCCGGCCCTGAGGGC SEQ ID NO: 9
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
CGAACTGTATCTGGATACTTCAGACGTTGTTGCGGTGAAGGCGCTGTCAC GTATTTTTCCGCTGGCGGGTGTGACCACTAACCCAAGCATTATCGCCGCG GGTAAAAAACCGCTGGATGTTGTGCTTCCGCAACTTCATGAAGCGATGGG CGGTCAGGGGCGTCTGTTTGCCCAGGTAATGGCTACCACTGCCGAAGGG ATGGTTAATGACGCGCTTAAGCTGCGTTCTATTATTGCGGATATCGTGGTG
AAAGTTCCGGTGACCGCCGAGGGGCTGGCAGCTATTAAGATGTTAAAAGC 80/100
GGAAGGGATTCCGACGCTGGGAACCGCGGTATATGGCGCAGCACAAGGG CTGCTGTCGGCGCTGGCAGGTGCGGAATATGTTagcCCTTACGTTAATCGT
ATTGATGCTCAGGGCGGTAGCGGCATTCAGACTGTGACCGACTTACACCA GTTATTGAAAATGCATGCGCCGCAGGCGAAAGTGCTGGCAGCGAGTTTCA AAACCCCGCG TCAGGCGCTGGACTGCTTACTGGCAGGATGTGAATCAATTACTCTGCCAC TGGATGTGGCACAACAGATGATTAGCTATCCGGCGGTTGATGCCGCTGTG
GCGAAGTTTGAGCAGGACTGGCAGGGAGCGTTTGGCAGAACGTCGATTG GCCTATGCGGACGCTAA SEQ ID NO:35
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas fsaB atgGAACTGTATCTGGACACCGCTAACGTCGCAGAAGTCGAACGTCTGGCA SEQ ID NO: 16 CGCATATTCCCCATTGCCGGGGTGACAACTAACCCGAGCATTATCGCTGC Número de acesso CAGCAAGGAGTCCATATGGGAAGTGCTGCCGCGTCTGCAAAAAGCGATT Uniprot P32669
GGTGATGAGGGCATTCTGTTTGCTCAGACCATGAGCCGCGACGCGCAGG GGATGGTGGAAGAAGCGAAGCGCCTGCGCGACGCTATTCCGGGTATTGT
GGTGAAAATCCCGGTGACTTCCGAAGGTCTGGCAGCAATTAAAATACTGA 81/100
AAAAAGAGGGTATTACTACACTTGGCACTGCTGTATATAGCGCCGCACAA GGGTTATTAGCCGCACTGGCAGGGGCAAAATACGTTGCTCCGTATGTTAA CCGCGTAGATGCCCAGGGCGGAGACGGCATTCGTACGGTTCAGGAGCTG CAAACGCTGTTAGAAATGCACGCGCCAGAAAGCATGGTGCTGGCAGCCA GCTTTAAAACGCCGCGTCAGGCGCTGGACTGTTTACTGGCAGGATGTGAA TCCATCACCCTGCCCTTAGATGTAGCGCAACAAATGCTCAACACCCCTGC
GGTAGAGTCAGCTATAGAGAAGTTCGAACACGACTGGAATGCCGCATTTG GCACTACTCATCTCtaa SEQ ID NO:36 talB atgACGGACAAATTGACCTCCCTTCGTCAGTACACCACCGTAGTGGCCGAC SEQ ID NO: 17
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas ACTGGGGACATCGCGGCAATGAAGCTGTATCAACCGCAGGATGCCACAA Número de acesso CCAACCCTTCTCTCATTCTTAACGCAGCGCAGATTCCGGAATACCGTAAGT Uniprot P0A870
TGATTGATGATGCTGTCGCCTGGGCGAAACAGCAGAGCAACGATCGCGC GCAGCAGATCGTGGACGCGACCGACAAACTGGCAGTAAATATTGGTCTG GAAATCCTGAAACTGGTTCCGGGCCGTATCTCAACTGAAGTTGATGCGCG
TCTTTCCTATGACACCGAAGCGTCAATTGCGAAAGCAAAACGCCTGATCAA 82/100
ACTCTACAACGATGCTGGTATTAGCAACGATCGTATTCTGATCAAACTGGC TTCTACCTGGCAGGGTATCCGTGCTGCAGAACAGCTGGAAAAAGAAGGCA TCAACTGTAACCTGACCCTGCTGTTCTCCTTCGCTCAGGCTCGTGCTTGTG CGGAAGCGGGCGTGTTCCTGATCTCGCCGTTTGTTGGCCGTATTCTTGAC TGGTACAAAGCGAATACCGATAAGAAAGAGTACGCTCCGGCAGAAGATCC GGGCGTGGTTTCTGTATCTGAAATCTACCAGTACTACAAAGAGCACGGTT ATGAAACCGTGGTTATGGGCGCAAGCTTCCGTAACATCGGCGAAATTCTG GAACTGGCAGGCTGCGACCGTCTGACCATCGCACCGGCACTGCTGAAAG AGCTGGCGGAGAGCGAAGGGGCTATCGAACGTAAACTGTCTTACACCGG
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
CGAAGTGAAAGCGCGTCCGGCGCGTATCACTGAGTCCGAGTTCCTGTGG CAGCACAACCAGGATCCAATGGCAGTAGATAAACTGGCGGAAGGTATCCG
TAAGTTTGCTATTGACCAGGAAAAACTGGAAAAAATGATCGGCGATCTGCT Gtaa SEQ ID NO:37 F178Y mutado por talB atgACGGACAAATTGACCTCCCTTCGTCAGTACACCACCGTAGTGGCCGAC SEQ ID NO: 64
ACTGGGGACATCGCGGCAATGAAGCTGTATCAACCGCAGGATGCCACAA 83/100
CCAACCCTTCTCTCATTCTTAACGCAGCGCAGATTCCGGAATACCGTAAGT TGATTGATGATGCTGTCGCCTGGGCGAAACAGCAGAGCAACGATCGCGC GCAGCAGATCGTGGACGCGACCGACAAACTGGCAGTAAATATTGGTCTG GAAATCCTGAAACTGGTTCCGGGCCGTATCTCAACTGAAGTTGATGCGCG TCTTTCCTATGACACCGAAGCGTCAATTGCGAAAGCAAAACGCCTGATCAA ACTCTACAACGATGCTGGTATTAGCAACGATCGTATTCTGATCAAACTGGC TTCTACCTGGCAGGGTATCCGTGCTGCAGAACAGCTGGAAAAAGAAGGCA
TCAACTGTAACCTGACCCTGCTGTTCTCCTTCGCTCAGGCTCGTGCTTGTG CGGAAGCGGGCGTGTTCCTGATCTCGCCGTaTGTTGGCCGTATTCTTGAC
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
TGGTACAA AGCGAATACCGATAAGAAAGAGTACGCTCCGGCAGAAGATCCGGGCGTG GTTTCTGTATCTGAAATCTACCAGTACTACAAAGAGCACGGTTATGAAACC GTGGTTATGGGCGCAAGCTTCCGTAACATCGGCGAAATTCTGGAACTGGC AGGCTGCGACCGTCTGACCATCGCACCGGCACTGCTGAAAGAGCTGGCG
GAGAGCGAAGGGGCTATCGAACGTAAACTGTCTTACACCGGCGAAGTGA 84/100
AAGCGCGTCCGGCGCGTATCACTGAGTCCGAGTTCCTGTGGCAGCACAA
CCAGGATCCAATGGCAGTAGATAAACTGGCGGAAGGTATCCGTAAGTTTG CTATTGACCAGGAAAAACTGGAAAAAATGATCGGCGATCTGCTGtaa SEQ ID NO:38 ybiV atgAGCGTAAAAGTTATCGTCACAGACATGGACGGTACTTTTCTTAACGACG SEQ ID NO: 1 CCAAAACGTACAACCAACCACGTTTTATGGCGCAATATCAGGAACTGAAAA Número de acesso AGCGCGGCATTAAGTTCGTTGTTGCCAGCGGTAATCAGTATTACCAGCTT Uniprot P75792
ATTTCATTCTTTCCTGAGCTAAAGGATGAGATCTCTTTTGTCGCGGAAAAC GGCGCACTGGTTTACGAACATGGCAAGCAGTTGTTCCACGGCGAACTGAC
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
CCGACATGAATCGCGGATTGTTATTGGCGAGTTGCTAAAAGATAAGCAAC TCAATTTTGTCGCCTGCGGTCTGCAAAGTGCATATGTCAGCGAAAATGCC CCCGAAGCATTTGTCGCACTGATGGCAAAACACTACCATCGCCTGAAACC TGTAAAAGATTATCAGGAGATTGACGACGTACTGTTCAAGTTTTCGCTCAA CCTGCCGGATGAACAAATCCCGTTAGTGATCGACAAACTGCACGTAGCGC
TCGATGGCATTATGAAACCCGTTACCAGTGGTTTTGGCTTTATCGACCTGA 85/100
TTATTCCCGGTCTACATAAAGCAAACGGTATTTCGCGGTTACTGAAACGCT GGGATCTGTCACCGCAAAATGTGGTAGCGATTGGCGACAGCGGTAACGA TGCGGAGATGCTGAAAATGGCGCGTTATTCCTTTGCGATGGGCAATGCTG CGGAAAACATTAAACAAATCGCCCGTTACGCTACCGATGATAATAATCATG
AAGGCGCGCTGAATGTGATTCAGGCGGTGCTGGATAACACATCCCCTTTT AACAGCtga SEQ ID NO:39 yieH atgTCCCGGATAGAAGCGGTATTTTTCGACTGCGACGGTACGCTGGTCGAC SEQ ID NO: 3 AGTGAAGTCATTTGCTCTCGCGCATATGTAACGATGTTTCAGGAATTTGGT Número de acesso ATTACGCTCGATCCTGAAGAGGTATTCAAACGTTTCAAAGGTGTAAAACTG Uniprot P31467
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
TACGAAATTATCGATATTGTTTCCCTTGAACATGGTGTTACGTTAGCGAAA ACAGAAGCTGAACACGTTTACCGTGCAGAAGTCGCTCGGCTGTTCGATTC AGAACTGGAAGCCATCGAAGGGGCTGGAGCGCTCCTGTCAGCGATCACT GCGCCAATGTGTGTGGTATCTAACGGCCCAAATAACAAAATGCAGCATTC TATGGGCAAGCTGAATATGTTGCACTACTTCCCGGATAAACTGTTCAGCG
GCTACGATATTCAGCGCTGGAAGCCAGACCCGGCGTTAATGTTCCATGCG 86/100
GCAAAAGCGATGAATGTAAATGTAGAAAACTGCATTCTGGTTGATGACTCA GTTGCCGGTGCACAATCTGGTATCGACGCAGGTATGGAAGTGTTCTACTT CTGCGCCGACCCGCACAATAAGCCGATCGTTCACCCGAAAGTCACCACCT
TTACCCATCTTTCGCAGTTACCTGAACTGTGGAAAGCGCGTGGTTGGGAT ATTACGGCAtag SEQ ID NO:40 yidA atgGCTATTAAACTCATTGCTATCGATATGGATGGCACCCTTCTGCTGCCCG SEQ ID NO: 2 ATCACACCATTTCACCCGCCGTTAAAAATGCGATTGCCGCAGCTCGCGCC Número de acesso CGTGGCGTGAATGTCGTGCTAACGACGGGTCGCCCGTATGCAGGTGTGC Uniprot P0A8Y5
ACAACTACCTGAAAGAGCTGCATATGGAACAGCCGGGCGACTACTGCATT
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
ACTTATAACGGCGCGCTGGTACAGAAGGCCGCTGATGGTAGCACCGTGG CGCAAACTGCTCTCAGCTATGACGACTATCGTTTCCTGGAAAAACTCTCTC GCGAAGTCGGTTCTCATTTCCACGCCCTGGACCGCACCACGCTGTACACC GCCAACCGTGATATCAGCTACTACACGGTGCATGAATCCTTCGTTGCCAC CATTCCGCTGGTGTTCTGCGAAGCGGAGAAAATGGACCCCAATACCCAGT
TCCTGAAAGTGATGATGATTGATGAACCCGCCATCCTCGACCAGGCTATC 87/100
GCGCGTATTCCGCAGGAAGTGAAAGAGAAATATACCGTGCTGAAAAGTGC GCCGTACTTCCTCGAAATCCTCGATAAACGCGTTAACAAAGGTACGGGGG TGAAATCACTGGCCGACGTGTTAGGTATTAAACCGGAAGAAATCATGGCG ATTGGCGATCAGGAAAACGATATCGCAATGATTGAATATGCAGGCGTCGG TGTGGCGATGGATAACGCTATTCCTTCAGTGAAAGAAGTGGCGAACTTTG
TCACCAAATCTAACCTTGAAGATGGCGTGGCGTTTGCTATTGAGAAGTATG TGCTGAATtaa SEQ ID NO:41 yigL atgTACCAGGTTGTTGCGTCTGATTTAGATGGCACGTTACTTTCTCCCGACC SEQ ID NO: 4 ATACGTTATCCCCTTACGCCAAAGAAACTCTGAAGCTGCTCACCGCGCGC Número de acesso
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas GGCATCAACTTTGTGTTTGCGACCGGTCGTCACCACGTTGATGTGGGGCA Uniprot P27848
AATTCGCGATAATCTGGAGATTAAGTCTTACATGATTACCTCCAATGGTGC GCGCGTTCACGATCTGGATGGTAATCTGATTTTTGCTCATAACCTGGATCG CGACATTGCCAGCGATCTGTTTGGCGTAGTCAACGACAATCCGGACATCA TTACTAACGTTTATCGCGACGACGAATGGTTTATGAATCGCCATCGCCCG
GAAGAGATGCGCTTTTTTAAAGAAGCGGTGTTCCAATATGCGCTGTATGA 88/100
GCCTGGATTACTGGAGCCGGAAGGCGTCAGCAAAGTGTTCTTCACCTGC GATTCCCATGAACAACTGCTGCCGCTGGAGCAGGCGATTAACGCTCGTTG GGGCGATCGCGTCAACGTCAGTTTCTCTACCTTAACCTGTCTGGAAGTGA TGGCGGGCGGCGTTTCAAAAGGCCATGCGCTGGAAGCGGTGGCGAAGAA ACTGGGCTACAGCCTGAAGGATTGTATTGCGTTTGGTGACGGGATGAACG ACGCCGAAATGCTGTCGATGGCGGGGAAAGGCTGCATTATGGGCAGTGC
GCACCAGCGTCTGAAAGACCTTCATCCCGAGCTGGAAGTGATTGGTACTA ATGCCGACGACGCGGTGCCGCATTATCTGCGTAAACTCTATTTATCGtaa SEQ ID NO:42
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas yqaB atgTACGAGCGTTATGCAGGTTTAATTTTTGATATGGATGGCACAATCCTGG SEQ ID NO: 5 ATACGGAGCCTACGCACCGTAAAGCGTGGCGCGAAGTATTAGGGCACTA Número de acesso CGGTCTTCAGTACGATATTCAGGCGATGATTGCGCTTAATGGATCGCCCA Uniprot P77475
CCTGGCGTATTGCTCAGGCAATTATTGAGCTGAATCAGGCCGATCTCGAC CCGCATGCGTTAGCGCGTGAAAAAACAGAAGCAGTAAGAAGTATGCTGCT
GGATAGCGTCGAACCGCTTCCTCTTGTTGATGTGGTGAAAAGTTGGCATG 89/100
GTCGTCGCCCAATGGCTGTAGGAACGGGGAGTGAAAGCGCCATCGCTGA GGCATTGCTGGCGCACCTGGGATTACGCCATTATTTTGACGCCGTCGTCG CTGCCGATCACGTCAAACACCATAAACCCGCGCCAGACACATTTTTGTTGT GCGCGCAGCGTATGGGCGTGCAACCGACGCAGTGTGTGGTCTTTGAAGA
TGCCGATTTCGGTATTCAGGCGGCCCGTGCAGCAGGCATGGACGCCGTG GATGTTCGCTTGCTGtga SEQ ID NO:43 hxpA gtgCGGTGCAAAGGTTTTCTGTTTGATCTTGATGGAACGCTGGTGGATTCC SEQ ID NO: 7 CTGCCTGCGGTAGAACGGGCGTGGAGCAACTGGGCCAGACGTCATGGGT Número de acesso TAGCGCCGGAAGAGGTGCTGGCTTTCATTCACGGTAAACAGGCGATCACC Uniprot P77625
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
TCTCTGCGCCATTTTATGGCGGGCAAATCCGAGGCTGATATTGCCGCCGA GTTTACGCGTCTGGAGCACATCGAGGCCACGGAAACCGAAGGTATTACC GCGCTTCCGGGGGCAATCGCCTTACTCAGTCATTTGAATAAAGCAGGTAT TCCGTGGGCCATTGTGACTTCTGGCTCCATGCCGGTAGCGCGAGCGCGC CATAAAATAGCTGGGCTTCCCGCACCAGAGGTGTTTGTAACCGCTGAGCG
AGTGAAGCGCGGAAAACCAGAACCTGATGCGTATCTGTTAGGCGCGCAG 90/100
CTGCTGGGGCTTGCGCCGCAGGAGTGTGTGGTGGTGGAAGATGCTCCCG CTGGCGTGCTTTCTGGCCTGGCGGCGGGTTGTCATGTCATTGCGGTTAAC GCTCCGGCAGATACCCCGCGCCTGAATGAGGTCGATTTGGTCCTCCACA
GTCTGGAGCAAATTACTGTGACCAAACAGCCAAATGGCGATGTTATTATTC AGtga SEQ ID NO:44 hxpB atgTCAACCCCGCGTCAGATTCTTGCTGCAATTTTTGATATGGATGGATTAC SEQ ID NO: 23 TTATCGACTCAGAACCTTTATGGGATCGAGCCGAACTGGATGTGATGGCA Número de acesso AGCCTGGGGGTGGATATCTCCCGTCGTAACGAGCTGCCGGACACCTTAG Uniprot P77247
GTTTACGCATCGATATGGTGGTCGATCTTTGGTACGCCCGGCAACCGTGG
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
AATGGGCCAAGCCGTCAGGAAGTAGTAGAACGGGTTATTGCCCGTGCCAT TTCACTGGTTGAAGAGACACGTCCATTATTACCAGGCGTGCGCGAAGCCG TTGCGTTATGCAAAGAACAAGGTTTATTGGTGGGACTGGCCTCCGCGTCA CCACTACATATGCTGGAAAAAGTGTTGACCATGTTTGACTTACGCGACAGT TTCGATGCCCTCGCCTCGGCCGAAAAACTGCCTTACAGCAAGCCGCATCC
GCAAGTATATCTCGACTGCGCAGCAAAACTGGGCGTTGACCCTCTGACCT 91/100
GCGTAGCGCTGGAAGATTCGGTAAATGGCATGATCGCCTCTAAAGCAGCC CGCATGCGTTCCATCGTCGTTCCTGCGCCAGAAGCGCAAAATGATCCACG
TTTTGTATTAGCAGACGTCAAACTTTCATCGCTGACAGAACTCACCGCAAA AGACCTTCTCGGTtaa SEQ ID NO:45 fbaA atgTCTAAGATTTTTGATTTCGTAAAACCTGGCGTAATCACTGGTGATGACG SEQ ID NO: 24 TACAGAAAGTTTTCCAGGTAGCAAAAGAAAACAACTTCGCACTGCCAGCA Número de acesso GTAAACTGCGTCGGTACTGACTCCATCAACGCCGTACTGGAAACCGCTGC Uniprot P0AB71
TAAAGTTAAAGCGCCGGTTATCGTTCAGTTCTCCAACGGTGGTGCTTCCTT TATCGCTGGTAAAGGCGTGAAATCTGACGTTCCGCAGGGTGCTGCTATCC
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
TGGGCGCGATCTCTGGTGCGCATCACGTTCACCAGATGGCTGAACATTAT GGTGTTCCGGTTATCCTGCACACTGACCACTGCGCGAAGAAACTGCTGCC GTGGATCGACGGTCTGTTGGACGCGGGTGAAAAACACTTCGCAGCTACC GGTAAGCCGCTGTTCTCTTCTCACATGATCGACCTGTCTGAAGAATCTCTG CAAGAGAACATCGAAATCTGCTCTAAATACCTGGAGCGCATGTCCAAAATC
GGCATGACTCTGGAAATCGAACTGGGTTGCACCGGTGGTGAAGAAGACG 92/100
GCGTGGACAACAGCCACATGGACGCTTCTGCACTGTACACCCAGCCGGA AGACGTTGATTACGCATACACCGAACTGAGCAAAATCAGCCCGCGTTTCA CCATCGCAGCGTCCTTCGGTAACGTACACGGTGTTTACAAGCCGGGTAAC GTGGTTCTGACTCCGACCATCCTGCGTGATTCTCAGGAATATGTTTCCAAG AAACACAACCTGCCGCACAACAGCCTGAACTTCGTATTCCACGGTGGTTC CGGTTCTACTGCTCAGGAAATCAAAGACTCCGTAAGCTACGGCGTAGTAA AAATGAACATCGATACCGATACCCAATGGGCAACCTGGGAAGGCGTTCTG AACTACTACAAAGCGAACGAAGCTTATCTGCAGGGTCAGCTGGGTAACCC GAAAGGCGAAGATCAGCCGAACAAGAAATACTACGATCCGCGCGTATGG
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
CTGCGTGCCGGTCAGACTTCGATGATCGCTCGTCTGGAGAAAGCATTCCA GGAACTGAACGCGATCGACGTTCTGtaa SEQ ID NO:46 fbaB atgACAGATATTGCGCAGTTGCTTGGCAAAGACGCCGACAACCTTTTACAG SEQ ID NO: 25 CACCGTTGTATGACAATTCCTTCTGACCAGCTTTATCTCCCCGGACATGAC Número de acesso TACGTAGACCGCGTAATGATTGACAATAATCGCCCGCCAGCGGTGTTACG Uniprot P0A991
TAATATGCAGACGTTGTACAACACCGGGCGTCTGGCTGGCACAGGATATC 93/100
TTTCTATTCTGCCGGTTGACCAGGGCGTTGAGCACTCTGCCGGAGCTTCA TTTGCTGCTAACCCGCTCTACTTTGACCCGAAAAACATTGTTGAACTGGCG ATCGAAGCGGGCTGTAACTGTGTGGCGTCAACTTACGGCGTGCTGGCGT CGGTATCGCGGCGTTATGCGCATCGCATTCCATTCCTCGTCAAACTTAATC ACAACGAGACGCTAAGTTACCCGAATACCTACGATCAAACGCTGTATGCC AGCGTGGAGCAGGCGTTCAACATGGGCGCGGTTGCGGTTGGTGCGACTA TCTATTTTGGCTCGGAAGAGTCACGTCGCCAGATTGAAGAAATTTCTGCG GCTTTTGAACGTGCGCACGAGCTGGGTATGGTGACAGTGCTGTGGGCCT ATTTGCGTAACTCCGCCTTTAAGAAAGATGGCGTTGATTACCATGTTTCCG
Genes de E.coli para Sequência de nucleotídeos Proteína codificada superexpressão de Enzimas
CCGACCTGACCGGTCAGGCAAACCATCTGGCGGCAACCATCGGTGCAGA TATCGTCAAACAAAAAATGGCGGAAAATAACGGCGGCTATAAAGCAATTAA TTACGGTTACACCGACGATCGTGTTTACAGCAAATTGACCAGCGAAAACC CGATTGATCTGGTGCGTTATCAGTTAGCTAACTGCTATATGGGTCGGGCT GGGTTGATAAACTCCGGCGGTGCTGCGGGCGGTGAAACTGACCTCAGCG
ATGCAGTGCGTACTGCGGTTATCAACAAACGCGCAGGCGGAATGGGGCT 94/100
GATTCTTGGACGTAAAGCGTTCAAGAAATCGATGGCTGACGGCGTGAAAC TGATTAACGCCGTGCAGGACGTTTATCTCGATAGCAAAATTACTATCGCCtg a SEQ ID NO:47 TABELA 1: ENZIMAS DE E. COLI SUPEREXPRESSAS COM O USO DE PLASMÍDEOS DA COLEÇÃO ASKA E A SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO CORRESPONDENTE.
[0296] A expressão das enzimas recombinantes foi verificada em um gel de proteína, após a purificação da proteína recombinante com o uso de um separador His (kit Protino Ni-IDA 1000, Macherey Nagel). A purificação foi processada de acordo com as recomendações do fabricante.
[0297] b) Enzimas de outros organismos além de E.coli
[0298] Os genes alvo (consultar a Tabela 2) de vários organismos foram otimizados em códons por GeneArt® (Invitrogen) para expressão ótima em Escherichia coli. Além disso, um separador His foi adicionado na extremidade 5’do gene e um códon de parada adicional foi adicionado na extremidade 3'. A construção do gene é flanqueada por locais de restrição NdeI e EcoRI e fornecida dentro do plasmídeo pET25b + (Merckmillipore).
[0299] Células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Novagen) foram transformadas com esses vetores de acordo com o procedimento de choque térmico padrão. As células transformadas foram cultivadas com agitação (160 rpm) com o uso de meio de autoindução ZYM-5052 (Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41:207 a 234(2005)) durante 20h a 30 °C. As células foram coletadas por centrifugação a 4 °C, 4.000 rpm por 20 min e os péletes foram armazenados a -80 °C.
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas hdpA ATGCATCATCATCACCATCACATGACCGTGAATATTAGCTATCTGACCGAT SEQ ID NO: 6 (de Corynebarium ATGGATGGCGTGCTGATTAAAGAAGGTGAAATGATTCCGGGTGCCGATCG Número de acesso glutamicum (cepa R) TTTTCTGCAAAGCCTGACAGATAATAACGTGGAATTTATGGTGCTGACCAA Uniprot A4QFW4
CAACAGCATTTTTACACCGCGTGATCTGAGCGCACGTCTGAAAACCAGCG GTCTGGATATTCCGCCTGAACGTATTTGGACCAGCGCAACCGCCACCGCA
CATTTTCTGAAAAGTCAGGTGAAAGAAGGCACCGCATACGTTGTTGGTGA 96/100
AAGCGGTCTGACCACCGCACTGCATACCGCAGGTTGGATTCTGACAGATG CAAATCCGGAATTTGTTGTTCTGGGTGAAACCCGTACCTATAGCTTTGAAG CAATTACCACCGCCATTAATCTGATTTTAGGTGGTGCACGTTTCATTTGTA CCAATCCGGATGTTACCGGTCCGAGTCCGAGCGGTATTCTGCCTGCAACC GGTAGCGTTGCAGCACTGATTACCGCAGCAACCGGTGCAGAACCGTATTA CATTGGTAAACCGAATCCTGTGATGATGCGTAGCGCACTGAATACCATTG GTGCACATAGCGAACATACCGTTATGATTGGTGATCGTATGGATACCGAT GTTAAAAGTGGTCTGGAAGCAGGTCTGAGTACCGTTCTGGTTCGTAGCGG TATTTCAGATGATGCAGAAATTCGTCGTTATCCGTTTCGTCCGACACATGT
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
GATTAATAGCATTGCCGATCTGGCAGATTGTTGGGATGATCCGTTTGGTG
ATGGTGCATTTCATGTTCCGGATGAACAGCAGTTTACCGATTAA SEQ ID NO:48 LMRG_00181 ATGCATCTGGATAGCGCAAATCTGGATGACGTGAAAAAAATCCAGGCAAG SEQ ID NO: 11 (de Listeria monocytogenes CAGCATCTTTAAAGGCATTACCACCAATCCGAGCATTCTGGTTAAAGAAAA Número de acesso sorotipo 1/2a (cepa ATGTAATCGTCAGACCGCCATTAACCGTATTCTGGAACTGACCGATAAACA Uniprot 97/100 10403S)) GGTTTTTGTTCAGACCGTTGGCTTTACCTATGAAGAAATTCTGGCAGATGC A0A0H3GHX1
ACGTATGCTGCTGACCATGTTTGGTAAAGACAAAATCGCAATCAAAATTCC GGCACATGAAGCAGGCACCAATGTTATTGATACCCTGAAAAAAGAGGACA AAACCATTCAGATTCTGGGCACCGCAATTTATAGCGCAGATCAGGCAATTA CCGCAGCACTGGCAGGCGCAGATTTTGTTGCACCGTATGTTAATCGTATG AGCGCAGCAAATATCGACCCGTTTAAAGAAATTACCCAGATGCGCCACTT CTTCGATAAAAAAGCACTGAAAACCCAGATTATGGCAGCCAGCTTTAAACA TAGCGGTCAGGTTATGCAGGCCTATGAAAGCGGTGCAGATACCGTTACCA TTCC
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
GTATGAAATCTATAGCCAGATGACCAATAAAGTTCTGGCAGTTGAAGCCAT TCGCGTGTTTAATGAAGATGCAGTTCTGTACGAGAAATGA SEQ ID NO:49 mipB ATGGAATATATGCTGGATACCCTGGATCTGGAAGCAATCAAAAAATGGCAT SEQ ID NO: 12 (de Streptococcus pyogenes CACATTCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGAGCATTGCAAAAAA Número de acesso sorotipo M1) AGAAGGCGAGATCGATTTTTTTGAACGCATTCGTGAAGTGCGTGCCATTAT Uniprot Q99XT4
TGGTGATAAAGCAAGCATTCATGTTCAGGTTATTGCCCAGGATTATGAAGG 98/100
CATTCTGAAAGATGCAGCAGAAATTCGTCGTCAGTGTGGTGATAGCGTTTA TGTTAAAGTTCCGGTTACCACCGAAGGTCTGGCAGCAATTAAAACCCTGA AAGCAGAAGGTTATCATATTACCGCAACCGCAATTTATACCACCTTTCAGG GCCTGCTGGCAATTGAAGCCGGTGCAGATTATCTGGCTCCGTATTATAAC CGTATGGAAAATCTGAACATTGATCCGGAAGCAGTTATTGAACAGCTGGC CGAAGCAATTAATCGTGAAAATGCCAATAGCAAAATTCTGGCAGCCAGCTT TAAAAACGTTGCCCAGGTGAATAAAAGTTTTGCACTGGGTGCACAGGCAA TTACCGCAGGTCCGGATGTTTTTGAAGCAGGTTTTGCCATGCCGAGCATT CAGAAAGCAGTTGATGATTTTGGTAAAGACTGGGAAGCAATTCATCACCG
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas CAAAAGCATCTGA SEQ ID NO:50 SGO_1787 ATGGAATTTATGCTGGATACCCTGAACCTGGAAGAAATCAAAAAATGGTCA SEQ ID NO: 10 (de Streptococcus gordonii) GAAGTTCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGACCATTGCAAAAAA Número de acesso AGAAGGCAAAATCGACTTTTTCGAACGCATTAGCGCAGTGCGTGAAATTAT Uniprot A8AZ46
TGGTGAAGGTCCGAGCATTCATGTTCAGGTTGTTGCAAAAGATTATGAGG
GCATTCTGAAAGATGCAGCCACCATTCGTAAAAAATGTGGTGATGCCGTG 99/100
TATATCAAAATTCCGGTTACACCGGATGGTCTGGCAGCAATTAAAACCCTG AAAGCAGAAGGCTATAAAATCACCGCAACCGCAATTTATACCACCTTTCAG GGCCTGCTGGCAATTGAAGCAGAAGCAGATTATCTGGCACCGTATTATAA CCGTATGGAAAATCTGAACATCGATTCCGATGCAGTTATTAGTCAGCTGGC ACAGGCCATTGAACGTGATCATAGCGATAGCAAAATTCTGGCAGCCAGCT TTAAAAACGTTGCACAGGTTAATCGTGCATTTGCAGATGGTGCACAGGCA GTTACCGCAGGTCCGGATGTTTTTGCAGCAGCATTTGCAATGCCGAGTAT
TGCAAAAGCAGTTGATGATTTTGCAACCGATTGGAGCGATATTCACAGCCA AGAATATGTGTGA SEQ ID NO:51
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas UMC_00018 ATGGAATTTATGCTGGACACCATTAACCTGGAAGCCATTCGTAAATATCAG SEQ ID NO: 18 (de Enterococcus faecalis AAAATTCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGAGCATTGTTAAACA Número de acesso EnGen0302) GGCAGGCAAAATTGATTTTTTTGCCCAGATGAAAGAAATCAAAAAGACCAT Uniprot TGGTCAGGCAAGCCTGCATGTTCAGGTTGTTGGTCAGACCACCGAAGAAA A0A0M2AGL1
TGCTGGAAGATGCACAGACCATTGTGCAGCAGCTGGGTCAAGAAACCTTT
ATCAAAATTCCGGTTAATGAAGCAGGTCTGGCAGCAATTAAACAGCTGAAA 100/100
CAGGCAAATTATCGTATTACCGCAACCGCCATTTATACCGAATTTCAGGGT TATCTGGCAATTGCAGCCGGTGCAGATTACCTGGCACCGTATTATAACCG TATGGAAAATCTGACCATCGACAGCCAGAAAGTTATTGAACATCTGGCAG CCGAAATTAAACGTACCAATGCCAAAAGCAAAATTCTGGCAGCGAGCTTTA AAAACGTTGCGCAGATTAATCAGGCATGTCAGATGGGTGCACAGGCAGTT ACCATTGCACCGGAACTGGTTACCCAAGGTCTGGCCATGCCTGCAATTCA
GAAAGCAGTTACCGATTTTCAAGAAGATTGGGTTGCAGTTTTTGGTGTGGA AACCGTTAATGAACTGGCCTGA SEQ ID NO:52 tal ATGCGCTTTTTTCTGGATACCGCCAACGTGGATCATATTAAAGAAGCAAAT SEQ ID NO: 13
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas (de Clostridium beijerinckii GAAATGGGCGTGATTTGTGGTGTTACCACCAATCCGAGCCTGGTTGCAAA Número de acesso (Clostridium MP)) AGAAGGTCGCGATTTTAACGAAGTGATCAAAGAAATTACCGAGATTGTGG Uniprot ATGGTCCGATTAGCGGTGAAGTTGTTGCCGAAGATGCACAGGGTATGATT A0A0B5QQ90
AAAGAGGGACGCGAAATTGCAGCCATCCATAAAAACATGATTGTGAAAATT CCGATGACCGCAGAAGGTCTGAAAGCAACCAAAGTTCTGAGCAGCGAAG
GTATTAAAACCAATGTGACCCTGATTTTTAGCGCAACCCAGAGCCTGCTG 101/100
GCAGCAAATGCCGGTGCAACCTATGTTAGCCCGTTTCTGGGTCGTGTTGA TGATATTAGCATGATTGGTATGGATCTGGTTCGTGATATTGCCGAAATTTTT GCCGTTCATGGTATCGAAACCGAAATCATTGCAGCAAGCGTTCGTAATCC GATTCATGTTATTGAAGCAGCAAAAGCGGGTGCCGATATTGCAACCATTC CGTATGCACTGGTTATGCAGATGCTGAATCATCCGCTGACCGATCAAGGT
CTGGAAAAATTCAAAGCAGATTGGGCAGCAGCATTCGGCAAATGA SEQ ID NO:53 tal ATGCAGATTTTTCTGGATAGCACCGACACCAAAGTTATTGCCGATCTGGCA SEQ ID NO: 14 (de Caulobacter vibrioides AGCACCGGTCTGATTGATGGTGTTACCACCAATCCGACACTGATTGCAAA Número de acesso
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas (cepa ATCC 19089)) AAGCGGTCGTCCGATGCTGGAAGTGATTGCAGAAATTTGTGATATTGTTC Uniprot Q9A2F1
CGGGTCCGATTAGCGCAGAAGTTGCAGCAACCACCGCAGATGCAATGATT GCCGAAGGTCAGAAACTGGCAAAAATTGCACCGAATGTTGTTGTGAAAAT TCCGCTGACACGTGATGGCCTGATTGCATGTGCAGCATTTGCAGATGAAG AAATCAAAACCAATGTGACCCTGTGTTTTAGCCCGACACAGGCACTGCTG
GCAGCAAAAGCCGGTGCAACCTATATTAGCCCGTTTATTGGTCGTCTGGA 102/100
TGATTATGGCTTTGATGGTATGGATCTGATTCGTGATATTCGTGCCATCTA TGATAACTATGGCTATGAAACCGAAATTCTGGCAGCCAGCGTTCGTAATG CAGCACATGTTAAAGAAGCAGCAATTGTTGGCGCAGATGTTGTTACCATTC CTCCGGCAGTTTTTAGCGATCTGTATAAACATCCGCTGACCGATAAAGGTC
TGGAACAGTTCCTGAAAGATTGGGCATCAACCGGTCAGAGCATTCTGTAA SEQ ID NO:54 fsa_like ATGGAATTTATGCTGGACACCCTGAACATTGAAGAAATTCGTAAATGGGCA SEQ ID NO: 19 (de Streptococcus suis) GAAGTGCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGACCATTGCACGTA Número de acesso AAGAAGGTGACATAGATTTTTTTGAACGCCTGCATCTGATTCGCGATATTA Uniprot
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas TTGGTCCGAATGCAAGCCTGCATGTTCAGGTTGTTGCAAAAGATTATGAAG A0A0E4C393
GTATTCTGGCCGACGCGAAAAAAATCCGTGAACTGGCACCGGAAAACATC TATATCAAAGTTCCGGTTACACCGGCAGGTCTGGCAGCAATGAAAACCCT GAAAGCACAGGGTTATCAGATTACCGCAACCGCAATTTATACCGTTTTTCA GGGTCTGCTGGCAATTGAAGCCGGTGCAGATTATCTGGCTCCGTATTATA
ACCGTATGGCCAACCTGAATATTGATAGCAATGCAGTTATTGCACAGCTGA 103/100
GCGAAGCAATTGATCGTGAATGTAGCGAAAGCAAAATTCTGGCAGCCAGC TTTAAAAACGTTGATCAGGTTAATCAGGCCTTTGCAAATGGTGCACAGGCA ATTACCGCAGGCGCAGATATTTTTGAAGCAGCATTTAGTATGCCGAGCATT
GAAAAAGCCGTTAACGATTTTGCAGATGATTGGAGCGCAATTCATGGTCG TTATACCATCTGA SEQ ID NO:55 SMU_494 ATGGAATTTATGCTGGATACCCTGAACCTGGCCGATATTGAAAAATGGGC SEQ ID NO: 15 (de Streptococcus mutans AGCAATTCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGAGCATTGCAAAAA Número de acesso sorotipo c (cepa ATCC AAGAAGGCAAAATCGACTTCTTTGAACAGGTTAAACGTGTGCGTGCAATTA Uniprot Q8DVJ4 700610) TTGGTGAAGAACCGAGCATTCATGCACAGGTTGTTGCAGCAGATGTTGAA
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
GGTATTATCAAAGATGCCCACAAACTGCAAGATGAATTAGGTGGTAATCTG TATGTTAAAGTTCCGGTTAGCCCGACCGGTCTGACCGCAATGAAACAGCT GAAAGAAGAAGGTTTTCAGATTACCGCAACCGCCATTTATACCGTTTTTCA GGGTCTGCTGGCAATTGAAGCCGGTGCAGATTATCTGGCTCCGTATTATA ACCGTATGGAAAACCTGAACATTGATCCGATTGAAGTTATTGGTCAGCTGG
CACAGGCCATTGAATGTCAGCAGGCAAGCGCAAAAATTCTGGCAGCCAGC 104/100
TTTAAAAACGTTACCCAGGTTGCAAAAGCACTGGCAGCCGGTGCCAAAGC AGTTACCGCAGGCGCAGATATTTTTGCAGCAGGTTTTGCAAATCCGAGTAT
TCAGAAAGCCGTTGATGATTTTGCAGCCGATTGGGAAAGCACCCAGGGTC GTCCGTATATCTAA SEQ ID NO:56 fsa_like ATGGAATTTCTGCTGGATACCCTGAATCTGGAAGCAATCAAAAAATGGCAT SEQ ID NO: 31 (de Streptococcus CACATTCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGACCATTGCAAAAAA Número de acesso agalactiae sorotipo III (cepa AGAAGGCGACATCCATTTTTTTCAGCGCATTCGTGATGTGCGCGAAATTAT Uniprot Q8E738 NEM316)) TGGTCGTGAAGCAAGCCTGCATGTTCAGGTTGTTGCAAAAGATTATCAGG
GCATTCTGGATGATGCAGCCAAAATTCGTCAAGAAACCGATGATGACATCT
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
ACATTAAAGTTCCGGTTACACCGGATGGTCTGGCAGCAATTAAAACCCTG AAAGCAGAAGGTTATAACATTACCGCAACCGCCATTTATACCAGTATGCAG GGTCTGCTGGCAATTAGTGCCGGTGCAGATTATCTGGCTCCGTATTTTAAC CGTATGGAAAACCTGGATATTGATGCGACCCAGGTTATTAAAGAACTGGC ACAGGCAATTGAACGTACCGGTAGCAGCAGCAAAATTCTGGCAGCCAGCT
TTAAAAACGCAAGCCAGGTTACCAAAGCACTGAGCCAGGGTGCACAGAGT 105/100
ATTACCGCAGGTCCGGATATTTTTGAAAGCGTTTTTGCCATGCCGAGCATT
GCCAAAGCAGTTAATGATTTTGCAGATGATTGGAAAGCCAGCCAGCATAG CGAACATATCTAA SEQ ID NO:57 fsaA ATGGAATTTATGCTGGATACCCTGAACCTGGATGAAATCAAAAAATGGTCA SEQ ID NO: 20 (de Streptococcus GAAATTCTGCCGCTGGCAGGCGTTACCAGCAATCCGACCATTGCAAAACG Número de acesso pneumoniae) TGAAGGTAGCATCAACTTTTTCGAACGCATTAAAGATGTGCGCGAACTGAT Uniprot TGGTAGCACCCCGAGCATTCATGTTCAGGTTATTAGCCAGGATTTTGAGG A0A0D6J3Z8
GCATTCTGAAAGATGCACATAAAATTCGTCGTCAAGCCGGTGATGACATCT TTATCAAAGTTCCGGTTACACCGGCAGGTCTGCGTGCAATTAAAGCACTG
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
AAAAAAGAAGGCTATCATATTACCGCAACCGCCATTTATACCGTTATTCAG GGTCTGCTGGCAATTGAAGCCGGTGCAGATTATCTGGCTCCGTATTATAA CCGTATGGAAAATCTGAACATCGACAGCAATAGCGTTATTCGTCAGCTGG CACTGGCCATTGATCGTCAGAATAGCCCGAGCAAAATTCTGGCAGCCAGC TTTAAAAACGTTGCCCAGGTTAATAATGCACTGGCAGCGGGTGCACATGC
AGTTACCGCAGGCGCAGATGTTTTTGAAAGCGCATTTGCAATGCCGAGTA 106/100
TTCAGAAAGCAGTGGATGATTTTTCCGATGATTGGTTTGTTACCCAGAATA GTCGCAGCATCTGA SEQ ID NO:58 PH1655 ATGCATCATCATCATCATCACATGGTGAAAGTGATCTTTTTCGATCTGGAT SEQ ID NO: 21 (de Pyrococcus horikoshii GATACCCTGGTTGATACCAGCAAACTGGCAGAAATTGCACGTAAAAATGC Número de acesso (cepa ATCC 700860)) CATCGAAAATATGATTCGTCATGGTCTGCCGGTTGATTTTGAAACCGCATA Uniprot O59346
TAGTGAACTGATCGAGCTGATTAAAGAATACGGTAGCAACTTTCCGTATCA CTTCGATTATCTGCTGCGTCGTCTGGATCTGCCGTATAATCCGAAATGGAT TAGTGCCGGTGTTATCGCATATCACAATACCAAATTTGCCTATCTGCGTGA AGTTCCGGGTGCGCGTAAAGTTCTGATTCGTCTGAAAGAACTGGGTTATG
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
AACTGGGCATTATTACCGATGGTAATCCGGTTAAACAGTGGGAAAAAATTC TGCGTCTGGAACTGGATGATTTTTTTGAACATGTGATCATCAGCGATTTCG AGGGTGTTAAAAAACCGCATCCGAAAATCTTCAAAAAAGCCCTGAAAGCCT TTAACGTGAAACCGGAAGAGGCACTGATGGTTGGTGATCGTCTGTATAGC GATATTTATGGTGCAAAACGTGTGGGTATGAAAACCGTTTGGTTTCGCTAT
GGTAAACATAGTGAACGCGAACTGGAATATCGTAAATATGCCGATTATGAG 107/100
ATCGACAATCTGGAAAGCCTGCTGGAAGTTCTGGCACGTGAAAGCAGCAG CAACAAAAAAGTTCATCCGCCTCGTCAGCAGATTTGA SEQ ID NO:59 MJ1437 ATGCATCATCATCACCATCACATGATTAAAGGCATCCTGTTTGATCTGGAT SEQ ID NO: 22 (de Methanocaldococcus GATACCCTGTATAACAGCAGCGAATTTGTTGAAATTGCACGTCGTGAAGCA Número de acesso jannaschii (cepa ATCC GTGAAAAGCATGATTGATGCAGGTCTGAACATCGATTTTGAAGAAGCCAT Uniprot Q58832 43067)) GAACATCCTGAACAAGATCATCAAAGATAAGGGCAGCAACTATGGCAAAC
ATTTCGATGATCTGGTTAAAGCCGTTCTGGGTAAATATGATCCGAAAATTA TCACCACCGGCATTATCACCTATCACAATGTGAAAGTTGCACTGCTGCGTC CGTATCCGCATACCATTAAAACCCTGATGGAACTGAAAGCAATGGGTCTG
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
AAACTGGGTGTTATTACCGATGGTCTGACCATTAAACAGTGGGAAAAACTG ATTCGTCTGGGCATTCATCCGTTTTTTGATGATGTGATTACCAGCGAAGAA TTTGGTCTGGGCAAACCGCATCTGGAATTTTTCAAATATGGCCTGAAACGT ATGGGCCTGAAAGCCGAAGAAACCGTTTATGTTGGTGATCGTGTGGACAA AGATATTAAGCCTGCAAAAGAACTGGGCATGATTACCGTTCGTATTCTGAA
AGGCAAATACAAAGACATGGAAGATGATGAGTATAGCGACTACACCATTAA 108/100
TAGCCTGCAAGAGCTGGTTGACATTGTGAAAAACCTGAAAAAGGATTAA SEQ ID NO:60 ALDOB ATGCATCATCATCACCATCACATGGCACATCGTTTTCCGGCACTGACCCAA SEQ ID NO: 26 (de Homo sapiens GAACAGAAAAAAGAACTGAGCGAAATTGCCCAGAGCATTGTTGCAAATGG Número de acesso (Humano)) TAAAGGTATTCTGGCAGCAGATGAAAGCGTTGGTACAATGGGTAATCGTC Uniprot P05062
TGCAACGTATTAAAGTGGAAAACACCGAAGAAAATCGTCGTCAGTTTCGTG AAATTCTGTTTAGCGTTGATAGCAGCATTAATCAGAGTATTGGTGGCGTGA TTCTGTTCCATGAAACCCTGTATCAGAAAGATAGCCAGGGTAAACTGTTTC GCAACATCCTGAAAGAAAAAGGTATTGTGGTGGGCATCAAACTGGATCAA
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
GGTGGTGCACCGCTGGCAGGCACCAATAAAGAAACCACCATTCAAGGTCT GGATGGTCTGAGCGAACGTTGTGCACAGTACAAAAAAGATGGTGTGGATT TTGGTAAATGGCGTGCAGTTCTGCGTATTGCAGATCAGTGTCCGAGCAGC CTGGCAATTCAAGAAAATGCAAATGCACTGGCACGTTATGCAAGCATTTGT CAGCAGAATGGTCTGGTTCCGATTGTTGAACCGGAAGTTATTCCGGATGG
TGACCATGATCTGGAACATTGTCAGTATGTTACCGAAAAAGTGCTGGCAG 109/100
CCGTTTATAAAGCACTGAATGATCATCATGTTTACCTGGAAGGCACCCTGC TGAAACCGAATATGGTTACCGCAGGTCATGCATGTACCAAAAAATACACAC CGGAACAGGTTGCAATGGCAACCGTTACCGCACTGCATCGTACCGTTCCG GCAGCAGTTCCGGGTATTTGTTTTCTGAGCGGTGGTATGAGCGAAGAAGA TGCAACCCTGAATCTGAATGCAATTAATCTGTGTCCGCTGCCGAAACCGT GGAAACTGAGCTTTAGCTATGGTCGTGCACTGCAAGCAAGCGCACTGGCA GCATGGGGTGGTAAAGCAGCAAATAAAGAAGCAACCCAAGAGGCCTTTAT GAAACGTGCAATGGCCAATTGTCAGGCAGCAAAAGGCCAGTATGTTCATA CCGGTAGCAGCGGTGCCGCAAGCACCCAGAGCCTGTTTACCGCATGTTA
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas TACCTATTGA SEQ ID NO:61 pgm ATGGCACAGCATAGCCATGCAGGTCAGCCTGCACGTCTGAGCGATCTGA SEQ ID NO: 29 (de Aeromonas hydrophila CCAATATTCCGCGTCTGGTTAGCGCATATTATCTGAATAAACCGGATATGA Número de acesso subsp. hydrophila (cepa GCCGTCCGGAACAGCGTGTTGCATTTGGCACCAGCGGTCATCGTGGTAG Uniprot A0KIH4 ATCC 7966)) CGCACTGCATAATGCATTTACCGAAAGCCATATTCTGGCAGTTACCCAGG
CACTGGTTGAATATCGTCAGCAGGCAGGTATTACCGGTCCGCTGTTTGTT 110/100
GGTATGGATACCCATGCACTGAGCGAAAGCGCATTTGCAAGCGCAGTTGA AGTTCTGGCAGCAAATGGTGTTGAAACCCGTATTCAGGCAGGTCTGGGTT TTACCCCGACACCGGTTATTAGCCATGCCATTCTGCGTCATAATGCAGGTA AACCGGCAGCACGTGCAGATGGTGTTGTTATTACCCCGAGCCATAATCCG CCTGAAGATGGTGGCTTTAAATACAATCCGCCTCATGGTGGTCCTGCCGA AGGTGAAATTACAAAATGGGTTGAAGATCGTGCCAATGCAATTCTGGAAG CCGGTCTGGCAGGCGTTAAACGTATGGCATTTGCAGAAGCACTGAAAAGC CCGTTTGTTGCACTGCATGATTATGTTACCCCGTATGTTGATGATCTGAAA AACGTTCTGGATATGGATGCCATTAAACAGGCAGGCATTAAAATCGGTGTT
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
GATCCGTTAGGTGGTAGCGGTGTTGCCTATTGGGATGTTATTGCAAAAAC CTATGGCCTGAATATCGAGGTGGTGAACTATAAAGTTGATCCGACCTTTAG CTTTATGACCCTGGATAAAGATGGCAAAATTCGTATGGATTGTAGCAGTCC GTTTGCAATGGCAAGCCTGATTGCACTGAAAGACAAATTTGATATTGCGCT GGGTAACGATCCGGATTATGATCGTCATGGTATTGTTACCAAAAGCGGTC
TGATGAATCCGAATCATTATCTGGCCGTTGCAATTCAGTACCTGTTTACCC 111/100
ATCGTACCGGTTGGAGCAAAGAAAGCGCTGTTGGCAAAACCCTGGTTAGC AGCAGCATGATTGATCGTGTTGCCGGTGAAATTGGTCGTACCCTGAAAGA AGTTCCGGTTGGTTTTAAATGGTTTGTGGATGGTCTGTATAGCGGTGAATT TGGTTTTGGTGGTGAAGAAAGTGCCGGTGCCAGCTTTCTGCGTAAAGATG GTACAGTTTGGACCACCGATAAAGACGGTTTTATTCTGGCCCTGCTGGCA GCAGAAATTCTGGCCGTGACCGGTAAAGATCCGCAGACACATTATGATGC ACTGGAAGCAAAATTTGGTCGTAGCAGCTATCGTCGTATTGATGCACCGG CAAATAGCGCACAGAAAGCAGTTCTGAGCAAATTAGATCCGGCACTGGTG GAAGCAAGCACCTTAGCCGGTGAACCGATTATTGCCAAACTGACCAAAGC
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
ACCGGGTAATGATGCAGCAATTGGTGGTCTGAAAGTTGTTACCGAAAATG GTTGGTTTGCAGCACGTCCGAGCGGCACCGAAAGCATCTATAAAATCTAT ATGGAATCCTTCAAAGGCGAAGCACATCTGGATCTGATTCAGCAAGAAGC
ACAGCAGATTGTTAGCGCAGCACTGGCAAAAGCCGGTGTTTAATAA SEQ ID NO:62 AHA_2903 ATGAATCTGACCTGTTTCAAAGCCTATGACATTCGTGGTAAACTGGGTGAT SEQ ID NO: 30 112/100 (de Aeromonas hydrophila GAACTGAATATCGAAATTGCCTATCGTATTGGTCGTGCAACCGCACAGTAT Número de acesso subsp. hydrophila (cepa CTGAAAGCAACCCGTATTGCAGTTGGTGGTGATGTTCGTCTGACCAGCGA Uniprot A0KMA6 ATCC 7966)) AGGTCTGAAACAGGCACTGGCAAATGGTATTCTGGATGCAGGTTGTGATG
TTATTGATCTGGGTGTTACCGGCACCGAAGAAACCTATTTCGCAGCATTTA CCCTGGATATTGATGGTGCAATTGAAGTTACCGCAAGCCATAATCCGATG GATTACAATGGTATGAAACTGGTTGGTCGTGATGCATGTCCGATTAGCGG TGATAGCGGTCTGAATGATATTCGTGCACTGGCAGAAAAAGGTGATTTTAG CGTTAGCTTTCGTCGTGGCACCCTGAGCAAAAAAAGCATCCTGGATGCCT ATGTTGATCATCTGCTGACCTATATCAAACCGCATCAGCTGCGTCCGCTGA
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
AATTAGTTGTTAATGCAGGTAATGGTGCAGCCGGTCATGTTATCGATGTGA TTGAACAGCGTTTTAACATTCTGAACATCCCGGTGGAATTTATCAAAATCC ATCATGAAGAAAACGGCAACTTTCCGAATGGCATTCCGAATCCGCTGCTG CCGGAAAATCGTGATGTTACCAGTGAAGCAGTTAAACTGCATCATGCAGA TATGGGTATTGCATGGGATGGTGATTTTGATCGCTGTTTTCTGTTTGATGA
GAACGGCATTTTTATCGAGGGCTATTATATCGTTGGTCTGCTGGCAGAAG 113/100
CATTTCTGGTTGAAAATCCGCATGAACGCATTATTCATGATCCGCGTCTGA CCTGGAATACCATCGATATTGTTGAAAAAAGCGGTGGTATTCCGGTTCAGT CAAAAACCGGTCATGCCTTTATCAAAGAACGTATGCGTAGCGAAAATGCC ATTTATGGTGGTGAAATGAGCGCACATCATTATTTTCGCGATTTTGGTTATT GCGATAGCGGTATGATTCCGTGGCTGCTGGTTATTAATCTGCTGAGCCTG AAAAATAGCACCCTGTCAAGCCTGGTTGCAGAACGTGTTAAAGCATATCC GTGTAGCGGTGAAATTAACTATCGTGTTGATAACGCCCTGGAAATCATCAA AAAACTGGAAGAGGTTTATGTTCCGCTGGCCGTTAAAGTTGAATATGTTGA TGGTCTGAGCATCGAGATGAATGATTGGCGTTTTAATGTGCGCATTAGCAA
Genes para superexpressão Sequência de Nucleotídeos Proteína codificada de Enzimas
TACAGAACCTCTGCTGCGTCTGAATGTTGAAAGCAAAAACAACATTAGCAA
ACTGACCAGTGGTCTGAATAGCCTGCATAAGATGATTAACAACATCTAA SEQ ID NO:63 TABELA 2: ENZIMAS DE VÁRIOS ORGANISMOS E SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO CORRESPONDENTE (CÓDON OTIMIZADO PARA EXPRESSÃO EM E. COLI).
114/100
[0300] A expressão das enzimas recombinantes foi verificada em um gel de proteína, após a purificação da proteína recombinante com o uso de uma armadilha de His (kit Protino Ni-IDA 1000, Macherey Nagel). A purificação foi processada de acordo com as recomendações do fabricante. EXEMPLO 1: TESTES DE INIBIÇÃO DE ATIVIDADE DE FRUTOSE-6- FOSFATO-ALDOLASE E FRUTOSE BIFOSFATASE
[0301] Uma série de testes foi realizada a fim de determinar se o AMP tem um efeito inibidor na atividade enzimática da frutose-6-fosfato aldolase e/ou frutose bifosfatase. O protocolo usado para testar as atividades enzimáticas foi adaptado de C. Guérard-Hélaine, V. De Berardinis, M. Besnard-Gonnet, E. Darii, M. Debacker, et al. Genome Mining for Innovative Biocatalysts: New Dihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox. ChemCatChem, Wiley, 7:1871 a 1879 (2015).
[0302] a) Impacto da concentração de AMP na atividade de frutose bifosfatase
[0303] 120 µl de cada ensaio cinético continha tampão Tris HCl (50 mM; pH 7,5), 115/100 NaCl 20 mM, MgCl2 10 mM, NADP+ 1 mM, AMP (várias concentrações testadas), Frutose 1,6-bifosfato 1 mM (F1,6bisP), 0,2 mg/ml de Enzima FBP e as enzimas auxiliares (glicose-6-fosfato isomerase (PGI) e glicose-6-fosfato desidrogenase dependente NADP+ (zwf) (0,5 mg/ml cada)). A mistura foi incubada a 30 °C por até 20 minutos e a reação foi monitorada por espectrofotometria a 340 nm (medindo a formação de NADPH), assumindo que 1 molécula de NADPH reduzida foi produzida por molécula de Frutose-6-Fosfato. Os resultados são mostrados na Figura 1. Foi observado um forte impacto inibitório do AMP na atividade de frutose bifosfatase.
[0304] b) Impacto da concentração de AMP na atividade de frutose-6-fosfato aldolase de FsaA A129S
[0305] 120 µl de cada ensaio cinético continha tampão Tris HCl (50 mM; pH 8,5), NADP+ 1 mM, AMP (várias concentrações testadas), DHA 200 mM, D 3 mM, L-G3P, 0,4 mg/ml de FsaA A129S e as enzimas auxiliares (glicose-6-fosfato isomerase (PGI) e glicose-6-fosfato desidrogenase dependente de NADP+ (zwf) (0,5 mg/ml cada)).
[0306] A mistura foi incubada a 30 °C por até 20 minutos e a reação foi monitorada por espectrofotometria a 340 nm (medindo para formação de NADPH), assumindo que 1 molécula de NADPH reduzida foi produzida por molécula de Frutose-6-Fosfato. Os resultados são mostrados na Figura 2. Nenhum efeito inibidor de AMP pode ser observado com FSAA A129S.
[0307] EXEMPLO 2: CONVERSÃO IN VITRO DE GLICERALDEÍDO-3- FOSFATO (G3P) E FOSFATO DE DI-HIDROXIACETONA (DHAP) EM FRUTOSE-6- FOSFATO (F6P) ATRAVÉS DE UM INTERMEDIÁRIO DI-HIDROXIACETONA (DHA).
[0308] Uma série de testes foi realizada para determinar as melhores combinações de enzimas para converter G3P e DHAP em F6P. Essas combinações de enzimas devem realizar as 2 etapas: DHAP→ DHA DHA + G3P → F6P
[0309] a) Enzima que catalisa a conversão de DHA e G3P em F6P 116/100
[0310] O protocolo usado para testar as atividades enzimáticas foi adaptado de C. Guérard-Hélaine, V. De Berardinis, M. Besnard-Gonnet, E. Darii, M. Debacker, et al.; Genome Mining for Innovative Biocatalysts: New Dihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox. ChemCatChem, Wiley, 7:1871 a 1879 (2015).
[0311] 120 µl de cada ensaio cinético continha tampão Tris HCl (50 mM pH 8,5), D 3 mM, L-G3P, DHA 200 mM, NADP+ 1 mM, 0,4 mg/ml de enzima e as enzimas auxiliares (glicose-6-fosfato isomerase (PGI) e glicose-6-fosfato desidrogenase dependente de NADP+ (zwf) (0,5 mg/ml cada)). A mistura foi incubada a 30 °C e a reação monitorada por espectrofotometria a 340 nm (medindo a formação de NADPH), assumindo que 1 molécula de NADPH reduzida foi produzida por molécula de F6P. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Codificação do gene SEQ ID NO Número Uniprot Atividade para a enzima LMRG_00181 49 A0A0H3GHX1 ++++
Codificação do gene SEQ ID NO Número Uniprot Atividade para a enzima mipB 50 Q99XT4 ++++ SGO_1787 51 A8AZ46 ++++ fsaA A129S 35 - +++ fsa-like 57 Q8E738 +++ UMC_00018 52 A0A0M2AGL1 ++ SMU_494 56 Q8DVJ4 ++ fsa-like 55 A0A0E4C393 ++ fsa 58 A0A0D6J3Z8 ++ fsaB 36 P32669 ++ 117/100 talB F178Y 38 - ++ tal 53 A0A0B5QQ90 + tal 54 Q9A2F1 + Controle (sem substrato) - Controle (sem enzima) - TABELA 3: PRODUÇÃO DE F6P A PARTIR DE DHA E G3P, COM
ENZIMAS DIFERENTES
[0312] a) Enzima que catalisa a conversão de DHAP em DHA
[0313] O protocolo usado para testar as atividades enzimáticas foi adaptado de C. Guérard-Hélaine, V. De Berardinis, M. Besnard-Gonnet, E. Darii, M. Debacker, et al.; Genome Mining for Innovative Biocatalysts: New Dihydroxyacetone Aldolases for the Chemist’s Toolbox. ChemCatChem, Wiley, 7:1871 a 1879 (2015)).
[0314] 120 µl de cada ensaio cinético continha tampão Tris HCl (50 mM pH 8,5),
MgCl2 10 mM, DHAP 100 mM, NADP+ 0,8 mM, 0,6 mg/ml de enzima, 0,8 mg/ml de frutose-6-fosfato aldolase 1 de E. coli MG1655 (FSAA mutado A129S) e as enzimas auxiliares (glicose-6-fosfato isomerase (PGI) e glicose-6-fosfato desidrogenase dependente de NADP+ (zwf) (0,5 mg/ml cada)). A mistura foi incubada a 30 °C e a reação monitorada por espectrofotometria a 340 nm (medindo a formação de NADPH), assumindo que 1 molécula de NADPH reduzida foi produzida por molécula de F6P. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Codificação do SEQ ID NO Número Uniprot Atividade gene para a enzima ybiV 39 P75792 +++ yieH 40 P31467 +++ yidA 41 P0A8Y5 ++ 118/100 yigL 42 P27848 ++ yqaB 43 P77475 + hdpA 48 A4QFW4 + hxpA 44 P77625 + Controle (sem substrato) - Controle (sem enzima) - TABELA 4: PRODUÇÃO DE DHA A PARTIR DE DHAP COM ENZIMAS
DIFERENTES
[0315] EXEMPLO 3: CONVERSÃO IN VITRO DE GLICERALDEÍDO-3- FOSFATO (G3P) E DI-HIDROXIACETONA-FOSFATO (DHAP) EM FRUTOSE-6- FOSFATO (F6P) ATRAVÉS DE UM INTERMEDIÁRIO GLICERALDEÍDO.
[0316] Uma série de testes foi realizada para determinar as melhores combinações de enzimas para converter G3P e DHAP em F6P. A melhor combinação de enzimas deve realizar as 3 etapas: G3P→ Gliceraldeído Gliceraldeído + DHAP → F1P F1P → F6P
[0317] a) Enzimas que catalisam a conversão de G3P em gliceraldeído
[0318] 200 µl de cada ensaio cinético continha tampão Tris HCl (50 mM pH 7,5), NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, G3P (1-10-50 mM) e 2 mg/ml da enzima testada (consultar tabela 7). A mistura foi incubada durante a noite a 30 °C e a reação foi arrefecida bruscamente com 1 volume de acetonitrila. Os produtos finais foram analisados por LCMS. Análises LC-MS foram realizadas em um Ultimate 3000 (Dionex, Thermo Fisher Scientific) acoplado a um espectrômetro de massa Q-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) equipado com uma fonte eletrospray (ESI) e operando no modo de íon negativo. As separações cromatográficas foram realizadas com o uso de 119/100 uma coluna de amida HILIC (1,9 μm, 2,1 × 150 mm) mantida a 25 °C (Waters) operada sob eluição gradiente, como segue. As fases móveis foram: (A) formiato de amônio 10 mM pH 9,45 (ajustado com hidróxido de amônio), enquanto a fase móvel (B) foi 100% acetonitrila e a vazão foi 500 μl/min. A eluição começou com uma etapa isocrática de 1,5 min a 95% de B, seguida por um gradiente linear de 95 a 55% da fase B em 7 min. O sistema cromatográfico foi então enxaguado por 2 min a 55% de B e o funcionamento foi encerrado com uma etapa de equilíbrio de 8,5 min.
Codificação do gene SEQ ID NO Número Uniprot Atividade para a enzima PH1655 59 O59346 - MJ1437 60 Q58832 - hxpB 45 P77247 + Controle (sem substrato) -
Codificação do gene SEQ ID NO Número Uniprot Atividade para a enzima Controle (sem enzima) - TABELA 5: ENZIMAS QUE CATALISAM A CONVERSÃO DE G3P EM GLICERALDEÍDO.
[0319] a) Enzimas que catalisam a conversão de gliceraldeído e DHAP em F1P, e a conversão adicional de F1P em F6P
[0320] 200 µl de cada ensaio cinético continha tampão Tris HCl (50 mM pH 7,5), NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, NADP+ 1 mM, DHAP 10 mM, Gliceraldeído 10 mM, 1 mg/ml de AldoB, 1 mg/ml de PGM e PMM e as enzimas auxiliares (glicose-6-fosfato isomerase (PGI) e glicose-6-fosfato desidrogenase dependente de NADP+ (zwf) (1 mg/ml cada)). A mistura foi incubada a 30 °C e a reação monitorada por 120/100 espectrofotometria a 340 nm (medindo a formação de NADPH), assumindo que 1 molécula de NADPH reduzida foi produzida por molécula de F6P. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
Ensaio Genes SEQ ID NO Número Uniprot Atividade 1 ALDOB 61 P05062 + pgm 62 A0KIH4 2 ALDOB 61 P05062 + AHA_2903 63 A0KMA6 3 ALDOB 61 P05062 ++ pgm 62 A0KIH4 AHA_2903 63 A0KMA6 4 Controle (sem substrato) -
Ensaio Genes SEQ ID NO Número Uniprot Atividade 5 Controle (sem enzima) - TABELA 6: ENZIMAS QUE CATALISAM A CONVERSÃO DE GLICERALDEÍDO E DHAP EM F1P E A CONVERSÃO ADICIONAL DE F1P EM F6P. A ENZIMA CODIFICADA POR ALDOB FOI INCUBADA JUNTAMENTE COM AS ENZIMAS CODIFICADAS POR PGM (ENSAIO 1), COM AS ENZIMAS CODIFICADAS POR AHA_2903 (ENSAIO 2) OU COM AMBOS (ENSAIO 3). EXEMPLO 4: CONSTRUÇÃO DE UM NOVO CHASSI DE E. COLI PARA
A PRODUÇÃO DE ACETONA E ISOPROPANOL
[0321] Como a maioria dos organismos, a E. coli converte glicose em acetil-CoA. Um chassi de E. coli modificado no qual o rendimento de produção de acetil-CoA é otimizado foi descrito anteriormente (WO 2013/007786). Um chassi bacteriano, cepa 121/100 A, foi construído com o seguinte genótipo: MG1655 ∆ptsHI ∆zwf_edd_eda ∆pfkA ∆pfkB
[0322] A superexpressão com base em plasmídeo de um gene PKT da fosfocetolase YP 003354041.1 de Lactococcus lactis na cepa A resultou na cepa B, uma cepa com um metabolismo de carbono central religado, em que uma nova via catabólica de carbono à base de fosfocetolase substituiu a via de Embden-Meyerhoff- Parnas (EMPP) inativada, a via de pentose fosfato (PPP) e a via de Entner Doudoroff (EDP). Mediante a introdução de uma via de acetona na cepa B, rendimentos de acetona superiores foram observados, em comparação com a cepa MG1655 de tipo selvagem que expressa a mesma via de acetona.
[0323] A fim de construir uma cepa que tem uma via de PKT e capaz de crescimento robusto em sacarose como fonte de carbono, a cepa A foi adicionalmente manipulada como descrito abaixo.
[0324] Um gene PKT foi introduzido no cromossomo da cepa A, no locus kdgk (kdgK:: P1_RBST7_pkt). A cepa resultante tinha o seguinte genótipo:
MG1655 ∆ptsHI ∆zwf_edd_eda ∆pfkA ∆pfkB kdgK:: P1_RBST7_pkt
[0325] Essa cepa foi passada por vários meses em meio mínimo suplementado com glicose como fonte de carbono, enquanto selecionava continuamente clones ou populações com a maior taxa de crescimento, até que um tempo de duplicação de menos de 5 horas fosse obtido.
[0326] Várias exclusões de genes foram realizadas a fim de aumentar a produção de acetona e isopropanol: DhemA DfsaA DfsaB.
[0327] Para aumentar adicionalmente a produção de isopropanol, os genes pntAB (piridina nucleotídeo transidrogenase subunidades alfa e beta, Uniprot P07001 e P0AB67, Sequências de referência NCBI: NP_416120.1 e NP_416119.1) de E. coli foram superexpressos pela inserção de um promotor constitutivo forte no locus pntAB.
[0328] A cepa resultante é denominada como cepa C doravante no presente documento. EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO DE CEPAS DE E. COLI PARA A 122/100 PRODUÇÃO DE ACETONA E ISOPROPANOL A PARTIR DE ACETIL-COA
[0329] Esse exemplo de trabalho mostra a produção de acetona e isopropanol por cepas de E. coli recombinantes, expressando os genes que constituem a via da acetona e do isopropanol.
[0330] As enzimas usadas nesse estudo para converter acetil-CoA em acetona e isopropanol estão listadas na Tabela 7.
Número de Etapa Enzima Gene Referência NCBI Acesso Uniprot Acetil-CoA transferase de
I Clostridium thlA WP_010966157.1 P45359 acetobulyticum Acetato CoA-transferase atoD NP_416725.1
II de Escherichia coli atoA NP_416726.1 P76458
Número de Etapa Enzima Gene Referência NCBI Acesso Uniprot P76459 Acetoacetato descarboxilase de III adc NP_149328.1 P23670 Clostridium acetobutylicum Isopropanol desidrogenase IV dependente de NADP de adh AF_157307.2 P25984 Clostridium beijerinckii 123/100 TABELA 7: ENZIMAS QUE CATALISAM A CONVERSÃO DE ACETIL-
COA EM ACETONA E ISOPROPANOL EXPRESSÃO DA VIA BIOSSINTÉTICA DE ACETONA/ISOPROPANOL EM E. COLI.
[0331] A cepa C, conforme descrita no Exemplo 4, foi usada como micro- organismo hospedeiro.
[0332] Todos os genes listados foram códons otimizados para expressão em E. coli e sintetizados pelo GeneArt® (Thermofisher), exceto os genes atoD e atoA. Os últimos foram amplificados diretamente do DNA genômico de E.coli MG1655.
[0333] Um vetor de expressão contendo a origem de replicação pSC e um marcador de resistência à espectinomicina foi usado para a expressão dos genes thlA, atoD, atoA, adc e adh. O vetor construído foi denominado pGB5344. EXPRESSÃO EM E. COLI DAS ENZIMAS RESPONSÁVEIS PELA
CONVERSÃO DE GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO (G3P) E FOSFATO DE DI- HIDROXIACETONA (DHAP) EM FRUTOSE-6-FOSFATO (F6P).
[0334] A versão modificada de pUC18 (New England Biolabs), contendo um Local de Clonagem Múltipla modificado (pUC18 MCS) (WO 2013/007786) e um gene de resistência à ampicilina (plasmídeo pGB 271), foi usada para a superexpressão dos genes listados na Tabela 8.
Enzima Gene Referência Número de Plasmídeo NCBI Acesso construído Uniprot Transaldolase de fsaA_SS WP_011922247 A0A0E4C39 Streptococcus suis .1 3 pGB 12689 6-fosfogluconato yieH WP_000086486 P31467 fosfatase de .1 124/100 Escherichia coli TABELA 8: ENZIMAS QUE CATALISAM A CONVERSÃO DE DHAP E G3P EM F6P.
[0335] As diferentes combinações dos plasmídeos foram transformadas por eletroporação na cepa C. As cepas produzidas dessa forma estão resumidas na Tabela 9.
Cepa Vetores Cepa GBI 15847: pGB 5344 Cepa C, que expressa toda a via metabólica da + pGB 271 acetona/isopropanol, sem superexpressão de enzimas responsáveis pela conversão de Gliceraldeído-3- Fosfato (G3P) e Di-hidroxi-Acetona Fosfato (DHAP) em Frutose-6-Fosfato (F6P)
Cepa Vetores Cepa GBI 17553: pGB 5344 + pGB 12689 Cepa C, que expressa toda a via metabólica da acetona/isopropanol + superexpressão de enzimas responsáveis pela conversão de Gliceraldeído-3- Fosfato (G3P) e Fosfato de Di-hidroxi-Acetona (DHAP) em Frutose-6-Fosfato (F6P) TABELA 9: CEPAS GERADAS PARA CONVERSÃO IN VIVO DE GLICOSE EM ACETONA + ISOPROPANOL. EXEMPLO 6: CRESCIMENTO DE CEPAS DE E. COLI E PRODUÇÃO DE ACETONA/ISOPROPANOL A PARTIR DE ACETIL-COA CONDIÇÕES PRÉ-CULTURA 125/100
[0336] As células transformadas foram, em seguida, semeadas em placas LB, abastecidas com ampicilina (100 µg/ml) e espectinomicina (100 µg/ml). As placas foram incubadas por 2 dias a 30 °C. Colônias isoladas foram usadas para inocular meio LB, suplementado com ampicilina e espectinomicina. Essas pré-culturas foram cultivadas a 30 °C para obter uma densidade óptica de 0,6.
CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO
[0337] A fermentação foi realizada em um biorreator de 1 litro com controle de pH e temperatura (Multifors 2, Infors HT). As células de pré-culturas foram usadas para inocular 500 ml do meio de fermentação (Tabela 10), complementado com ampicilina (100 µg/ml), espectinomicina (100 µg/ml), tiamina (0,6 mM), glicose (1 g/l) e glicerol (5 g/l), para obter uma densidade óptica inicial (OD600) de 0,05. Durante a fase de crescimento a temperatura (T = 32 °C), pH = 6,5 e pO2 = 5% foram mantidos constantes. A alimentação de glicose foi aumentada de 0,1 g/g de DCW/h para 0,35 g/g de DCW/h. Os pulsos de adição de 5 g/l de extrato de levedura foram feitos quando a OD600 atingiu 2, 8 e 20.
Produtos Concentração final no biorreator Extrato de Levedura 5 g/l Triptona 10 g/l Sulfato de sódio, Na2SO4 0,71 g/l Sulfato de amônio, (NH4)2SO4 1,34 g/l Fosfato de potássio monobásico, KH2PO4 3,4 g/l Fosfato de sódio dibásico, Na2HPO4 4,45 g/l Sulfato de magnésio, MgSO4 4 mM Solução de elementos residuais 5000X 1X Antiespumante Struktol® J 673 A (Struktol) 80 µl/l 126/100 TABELA 10. COMPOSIÇÃO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO (DERIVADO DO MEIO ZYM-5052 (STUDIER FW, PROT. EXP. PUR. 41, (2005), 207 A 234)). FASE DE PRODUÇÃO DE ACETONA/ISOPROPANOL
[0338] Durante essa fase a temperatura, T = 34 °C, pH 6,5 e pO 2 = 5% foram mantidos constantes. A alimentação de glicose foi iniciada com 0,50 g de sacarose/g DCW/h e então ajustada de acordo com o consumo da cepa. A concentração de glicerol foi mantida superior a 2 g/l.
[0339] A produção de acetona/isopropanol pelas cepas foi analisada continuamente com o uso de um Cromatógrafo Gasoso 7890A (Agilent Technology), equipado com Detector de Ionização de Chama (FID) para medir acetona e isopropanol. Os compostos orgânicos voláteis foram separados cromatograficamente em Hi-Plex H USP L17, 100 x 7,7 mm (Agilent) com o uso do cromatógrafo Agilent 1260 InfinityII, acetona/isopropanol foram quantificados com o uso de padrões (Sigma).
[0340] A Figura 3 mostra a comparação entre a produtividade específica observada de acetona e isopropanol para uma cepa de produção que expressa as enzimas responsáveis pela conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-6-fosfato (F6P) ou, como um controle, para uma cepa que não expressa as enzimas responsáveis pela conversão de gliceraldeído-3- fosfato (G3P) e di-hidroxi-acetona fosfato (DHAP) em frutose-6-fosfato (F6P).
[0341] Quando as enzimas responsáveis pela conversão de gliceraldeído-3- fosfato (G3P) e di-hidroxi-acetona fosfato (DHAP) em frutose-6-fosfato (F6P) são superexpressas (cepa GBI 17553), a produtividade específica de acetona e isopropanol (moles produzidos por unidade de peso celular por unidade de tempo) é superior em comparação com a cepa GBI 15847.
127/100

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para a produção de frutose-6-fosfato (F6P) a partir de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) e gliceraldeído-3-fosfato (G3P) caracterizado por (A) compreender as etapas de: (a) converter enzimaticamente fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA); e (b) converter enzimaticamente a di-hidroxiacetona (DHA) assim produzida juntamente com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P); ou (B) compreender as etapas de: (a’) converter enzimaticamente gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído; e (b’) converter enzimaticamente o gliceraldeído assim produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P); e (c’) converter enzimaticamente a frutose-1-fosfato (F1P) assim produzida em frutose-6-fosfato (F6P).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1 (A), caracterizado por a conversão de fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) de acordo com a etapa (a) ser obtida por uma monoéster fosfórico hidrolase (EC
3.1.3.-).
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-) ser selecionado do grupo que consiste em: (i) açúcar fosfatase (EC 3.1.3.23); (ii) 6-fosfogluconato fosfatase (EC 3.1.3.-); (iii) Fosfato de piridoxal fosfatase (EC 3.1.3.74); (iv) Frutose-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-); (v) Di-hidroxiacetona fosfatase (EC 3.1.3.-); (vi) Hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-); (vii) Fosfatase ácida (EC 3.1.3.2); (viii) Fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1); (ix) Glicerol-1-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.21); e (x) 3-fosfoglicerato fosfatase (EC 3.1.3.38).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a conversão de di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído-3- fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) de acordo com a etapa (b) ser obtida por (i) uma aldeído liase (EC 4.1.2.-); ou (ii) uma transaldolase (EC 2.2.1.2).
5. Método, de acordo com a reivindicação 1 (B), caracterizado por a conversão de gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído de acordo com a etapa (a’) ser obtida por uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-).
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-) ser selecionado do grupo que consiste em: (i) Gliceraldeído 3-fosfato fosfatase (EC 3.1.3.-); (ii) Fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1); (iii) Fosfatase ácida (EC 3.1.3.2); (iv) Açúcar fosfatase (EC 3.1.3.23); e (v) Hexitol fosfatase (EC 3.1.3.-).
7. Método, de acordo com a reivindicação 1 (B) ou 5 ou 6, caracterizado por a conversão de gliceraldeído e fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1-fosfato (F1P) de acordo com a etapa (b’) ser obtida por uma bifosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13).
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 (B) ou 5 a 7, caracterizado por a conversão de frutose-1-fosfato (F1P) em frutose-6- fosfato (F6P) de acordo com a etapa (c’) ser obtida por (i) Fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2); ou (ii) Fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser realizado in vitro.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 (A) a 4, caracterizado por ser realizado in vivo em um micro-organismo recombinante que tenha sido transformado com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que pode catalisar a conversão listada na etapa (a), de acordo com a reivindicação 1, e com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que pode catalisar a conversão listada na etapa (b), de acordo com a reivindicação 1.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 (B) ou reivindicações 5 a 8, caracterizado por ser realizado in vivo em um micro- organismo recombinante que tenha sido transformado com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que pode catalisar a conversão listada na etapa (a), de acordo com a reivindicação 1 (B), e com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que pode catalisar a conversão listada na etapa (b), de acordo com a reivindicação 1 (B).
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o micro-organismo, além disso, ter sido transformado com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima que pode catalisar a conversão listada na etapa (c’), de acordo com a reivindicação 1 (C).
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que o micro-organismo ser, além disso, caracterizado por: a) ter atividade de fosfocetolase; b) (i) ter uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase ou por reduzir a atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro- organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de fosfofrutocinase; e c) (i) ter uma ramificação oxidativa diminuída ou inativada da via da pentose fosfato (PPP) pela inativação do gene (ou genes) que codifica a glicose- 6-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o micro-organismo ser, além disso, caracterizado pelo fato de a EMPP ser adicionalmente diminuída ou inativada pela inativação do gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado.
15. Micro-organismo recombinante caracterizado por ter sido transformado com
(a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima selecionada do grupo que consiste em (i) uma aldeído liase (EC 4.1.2.-); e/ou (ii) uma transaldolase (EC 2.2.1.2).
16. Micro-organismo recombinante caracterizado por ter sido transformado com: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13); em que o dito micro-organismo também possui atividade de fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2) ou fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
17. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por, além disso, ter sido transformado com (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima selecionada do grupo que consiste em: (i) Fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2); e (ii) Fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
18. Micro-organismo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, sendo que o mesmo é, além disso, caracterizado por a) ter atividade de fosfocetolase; b) (i) ter uma via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMPP) diminuída ou inativada por inativação do gene (ou genes) que codifica a fosfofrutocinase ou por reduzir a atividade de fosfofrutocinase em comparação com um micro- organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de fosfofrutocinase; e c) (i) ter uma ramificação oxidativa diminuída ou inativada da via da pentose fosfato (PPP) pela inativação do gene (ou genes) que codifica a glicose- 6-fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado; ou (ii) não possuir atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase.
19. Micro-organismo recombinante, de acordo com a reivindicação 18, que é, além disso, caracterizado por o EMPP ser adicionalmente diminuído ou inativado pela inativação do gene (ou genes) que codifica a gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase ou pela redução da atividade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase em comparação com um micro-organismo não modificado.
20. Combinação de enzimas caracterizada por compreender: (a) uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); e (b) uma enzima selecionada do grupo que consiste em (i) uma aldeído liase (EC 4.1.2.-); e/ou (ii) uma transaldolase (EC 2.2.1.2).
21. Combinação de enzimas caracterizada por compreender: (a) uma monoéster fosfórico hidrolase (EC 3.1.3.-); (b) uma bisfosfato frutose aldolase (EC 4.1.2.13); e (c) uma enzima selecionada dentre (i) uma fosfoglucomutase (EC 5.4.2.2); ou (ii) uma fosfomanomutase (EC 5.4.2.8).
22. Composição caracterizada por compreender o micro-organismo, de acordo com a reivindicação 15, ou a combinação de enzimas, de acordo com a reivindicação 20.
23. Composição caracterizada por compreender o micro-organismo, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, ou a combinação de enzimas, de acordo com a reivindicação 21.
24. Uso do micro-organismo, de acordo com a reivindicação 15, ou da combinação de enzimas, de acordo com a reivindicação 20, ou da composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por ser para primeiro converter di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) em di-hidroxiacetona (DHA) pela enzima mencionada em (a) e, em seguida, adicionalmente converter a di-hidroxiacetona (DHA) produzida junto com gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em frutose-6-fosfato (F6P) por uma enzima mencionada em (b).
25. Uso do micro-organismo, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, ou de uma combinação de enzimas, de acordo com a reivindicação 21, ou da composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por ser para primeiro converter gliceraldeído-3-fosfato (G3P) em gliceraldeído pela enzima mencionada em (a) e, em seguida, converter adicionalmente o gliceraldeído produzido juntamente com fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP) em frutose-1- fosfato (F1P) por uma enzima mencionada em (b) e, em seguida, adicionalmente converter a frutose-1-fosfato (F1P) produzida em frutose-6-fosfato (F6P) por uma enzima mencionada em (c).
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