BR112021000282A2

BR112021000282A2 - Moléculas de anticorpo que se ligam a cd137 e ox40

Info

Publication number: BR112021000282A2
Application number: BR112021000282-0A
Authority: BR
Inventors: Mihriban Tuna; Miguel Gaspar; Michelle Morrow; Edmund Poon
Original assignee: F-Star Beta Limited
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2021-04-06
Also published as: CN112424229A; AU2019301206A1; KR20210031479A; JP7397055B2; IL280002A; US20220048996A1; TW202019963A; EP3820898A1; JP2021524267A; JP2024019415A; CA3106048A1; SG11202100172XA; MX2021000399A; WO2020011966A1

Abstract

moléculas de anticorpo que se ligam a cd137 e ox40. o presente pedido se refere a moléculas de anticorpo que se ligam e têm a capacidade para tornar tanto cd137 quanto ox40 em agonistas. as moléculas de anticorpo compreendem um sítio de ligação com base em cdr para cd137, e um sítio de ligação a antígeno ox40 que está localizado em um domínio constante da molécula de anticorpo. as moléculas de anticorpo da invenção têm aplicação, por exemplo, no tratamento de doenças, como câncer e doenças infecciosas.

Description

“MOLÉCULAS DE ANTICORPO QUE SE LIGAM A CD137 E OX40” Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere a moléculas de anticorpo que se ligam e têm a capacidade para tornar CD137 e OX40 agonistas. As moléculas de anticorpo compreendem um sítio de ligação com base em CDR para CD137, e um sítio de ligação a antígeno OX40 que está localizado em um domínio constante da molécula de anticorpo. As moléculas de anticorpo da invenção têm aplicação, por exemplo, no tratamento de doenças, como câncer e doenças infecciosas. Antecedentes da Invenção

[0002] O sistema imunológico de mamíferos é um sistema finamente equilibrado que algumas vezes é interrompido por doenças como cânceres. Os receptores de ponto de checagem desempenham um papel importante na resposta do sistema imunológico à doença exercendo efeitos coestimulatórios ou co-inibitórios, em que o equilíbrio desse determina o destino da resposta imunológica (Pardoll, 2012). Os co-inibidores inibem a proliferação de célula T e induzem a liberação de citocinas anti-inflamatórias. Esses atenuam a inflamação e evitam os danos ao órgão/tecido de reação imunológica excessiva. Os coestimulantes, por outro lado, promovem a expansão clonal de célula T, diferenciação e sobrevivência de efetor a fim de facilitar o desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora.

[0003] Uma abordagem imunoterapêutica contra câncer provada aciona o sistema imunológico para reconhecer e matar células tumorais alvejando-se esses receptores de ponto de checagem com anticorpos que bloqueiam a função de receptores co-inibitórios ou induzem a atividade de receptores coestimulatórios (Pardoll, 2012). Os anticorpos que bloqueiam a atividade de receptores co-inibitórios mostraram boa atividade clínica e são atualmente aprovados para o tratamento de câncer (Larkin et al., 2015). Demonstrou-se que os anticorpos que induzem a atividade de receptores coestimulatórios tem grande potencial em sistemas de modelo pré-clínico (Moran et al., 2013; Schaer et al., 2014) e diversos agentes estão atualmente em testes clínicos (Mayes et al., 2018; Melero et al., 2013). Esses anticorpos também são chamados de anticorpos agonistas visto que os mesmos imitam os ligantes desses receptores coestimulatórios.

[0004] Diversos receptores coestimulatórios de célula T são membros da superfamília de receptores TNF, uma família grande de proteínas envolvidas tanto em funções imunológicas quanto funções celulares não imunológicas expressas na superfície celular (Bremer, 2013). A análise estrutural dos complexos formados entre os receptores da família TNF e seus ligantes cognatos indica que na maioria dos casos há uma estequiometria de trímero para trímero e ligantes de família TNFR são tipicamente expressos na superfície celular como trímeros (Wajant, 2015). O modelo proposto para ativação de TNFR é que a interação com um ligante trimérico induz a trimerização de receptores monoméricos e inicia a transdução de sinal. Isso pressupõe que membros da família TNFR são expressos como monômeros e apenas a interação com ligante induz a formação de receptor trímeros. Esse modelo foi recentemente questionado (Vanamee & Faustman, 2018) e a associação desses monômeros em estruturas de ordem superior na ausência de interação com ligante ainda é uma questão de debate. A existência de dímeros receptores pré-montados ou mesmo trímeros inativos que exigem agrupamento adicional de múltiplos complexos de receptores explicariam a menor atividade de alguns ligantes TNF, apenas trímeros e solúveis como comparados a suas formas ligadas por membrana que podem formar super agrupamentos de ligantes e induzir super agrupamentos de receptores TNF, portanto, induzindo níveis superiores de ativação de receptor (Müller et al., 2008). Essa teoria também está em linha com a observação de que anticorpos específicos de TNFR tipicamente tem nenhuma ou baixa atividade agonística e exigem reticulação secundária de complexos de receptores TNF de anticorpo a fim de induzir agrupamento e ativação de receptor suficientes, portanto, imitando os super agrupamentos de ligantes TNF (Wajant, 2015).

[0005] A reticulação secundária de complexos de receptores TNF de anticorpo pode ser obtida in vitro por agentes de reticulação, como proteína A ou G ou anticorpos secundários que alvejam os domínios constantes de TNF anticorpos agonistas específicos de receptor (Vanamee & Faustman, 2018; Wajant, 2015). No entanto, in vivo, essa reticulação secundária exige a interação com receptores Fc gama presentes na superfície de células imunológicas como macrófagos, células NK ou células B. A interação de anticorpos com receptores Fc gama é complexa, visto que há 6 receptores Fc gama em seres humanos com padrões de expressão e afinidades diferentes para os 4 isotipos IgG humanos (Bruhns et al., 2009). Mostrou-se que os receptores Fc gama exigem atividade antitumoral ideal de anticorpos agonistas que alvejam alvos da superfamília de receptor TNF in vivo (Bulliard et al., 2013; Bulliard et al., 2014). No entanto, a dependência de anticorpos agonistas TNFR de receptor Fc gama mediado por reticulação para induzir a ativação forte dos receptores é propensa a limitar suas atividades gerais in vivo devido a diversos motivos: 1) células ligadas um anticorpo precisarão interagir com células que expressam receptor Fc gama em trans e a frequência dessa interação limitará a ativação das células que expressam TNFR; 2) a afinidade de receptores Fc gama para IgG humana é tipicamente para afinidade inferior em comparação com a afinidade de um anticorpo terapêutico típico para seu alvo (faixa micromolar versus faixa nanomolar respectivamente); e 3) receptores Fc gama media as funções efetoras de anticorpos como ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo) e ADCP (fagocitose celular dependente de anticorpo) e, portanto, têm o potencial de eliminar as próprias células que os anticorpos agonistas são destinados a ativar (Mayes et al., 2018).

[0006] Os anticorpos biespecíficos bivalentes que usam um dos antígenos cognatos para reticular um agonista de receptor TNF representam uma alternativa para a reticulação mediada por receptor Fc gama. O efeito de reticulação de anticorpo resultaria da ligação a um membro da família de receptor TNF e outro receptor expresso em superfície celular na mesma célula, em cis, ou outra célula, em trans. Esse mecanismo de reticulação de anticorpo, então, resultaria no super agrupamento do receptor TNF contanto que o segundo alvo seja expresso em altos níveis, imitando os super agrupamentos de ligantes TNF. A abordagem de anticorpo biespecífico para desenvolvimento de anticorpo agonista TNFR tem diversas vantagens teóricas para anticorpos agonistas monoespecíficos: 1) o agonismo de TNFR pode ser direcionado para células imunológicas particulares no microambiente tumoral e na periferia alvejando-se um segundo antígeno, como um receptor de ponto de checagem ou antígeno associado ao tumor, visto que a segunda especificidade do anticorpo biespecífico; 2) a afinidade dos domínios de ligação de reticulação do anticorpo biespecífico pode ser designada como maior que a afinidade do anticorpo para receptores Fc gama, portanto, tornado a reticulação mais eficaz; 3) as funções efetoras de anticorpo podem ser desativadas seletivamente com o uso de mutações, portanto, garantindo que não há depleção das células destinadas a serem ativadas; 4) agonismo de dois receptores TNF separados pode ser obtido em uma molécula única de agonista duplo, combinando-se a ativação de células imunológicas diferentes em um estímulo forte da resposta imunológica; 5) alvejando-se receptores co-expressos pode resultar na ativação de uma célula única em cis sem a exigência de interação de duas células jutas.

[0007] Diversos dentre os membros da família de receptor TNF tem padrões de expressão de sobreposição em células imunológicas. Especificamente, OX40, CD137, GITR e CD27 são expressos em células T ativadas e a co-expressão de OX40 e CD137 foi verificada experimentalmente (Ma et al., 2005).

[0008] OX40 é expresso predominantemente em células T ativadas, incluindo células T CD4+, células T CD8+, células auxiliadoras T do tipo 1 e do tipo 2 (Th1 e Th2) e células regulatórias T (Treg), e também é expresso em células exterminadoras naturais ativadas (NK). A interação de OX40 com seu ligante de OX40 (OX40L), expressa em células que apresentam antígeno (APCs), aumenta a expansão clonal de célula T, a diferenciação e a sobrevivência, e melhora a geração de células T de memória (Croft et al., 2009). O estímulo de OX40 pode ter um efeito direto sobre células T, promovendo sua proliferação e sobrevivência, ou um efeito indireto por meio da produção melhorada de citocinas inflamatórias, como IL2 e IFNγ. A sinalização de OX40 também pode modular a função de Tregs, embora nessas células essa anule suas atividades supressoras (Takeda et al., 2004). Em câncer, constatou-se que OX40 é expresso em células T de infiltração de tumor de pacientes com cânceres de cabeça e pescoço, melanoma e colorretal, em que altos níveis de linfócitos positivos OX40 se correlacionam com melhor sobrevivência (Petty et al., 2002; Vetto et al., 1997). Estudos pré-clínicos de anticorpos agonistas OX40 em camundongos demonstraram eficácia terapêutica em diversos modelos tumorais singênico, mas a eficácia de alvejar OX40 como uma monoterapia foi variável e parece estar correlacionada à imunogenicidade do tumor (Kjærgaard et al., 2000). Isso é consistente com a visão de que a expressão de OX40 em células T específicas de tumor exigiria a iniciação suficiente, provavelmente devido a tumores insuficientemente imunogênicos. Em determinados modelos singênicos a atividade antitumoral do OX86 anticorpo OX40 foi determinada para resultar de sua habilidade para depletar Tregs intratumorais que expressam altos níveis de OX40, de uma maneira dependente de receptor Fc gama (Bulliard et al., 2014).

[0009] Os anticorpos agonistas para OX40 estão atualmente em testes clínicos para câncer com a maior parte mostrando bons perfis de segurança, mas atividade clínica limitada

(Curti et al., 2013). O isotipo escolhido para esses anticorpos é variado, mas diversos fármacos de investigação são anticorpos IgG1 humano permitidos por receptor Fc gama, destinados, possivelmente, a depletar Tregs como o mecanismo de ação. A ausência de clear atividade clínica desses anticorpos suscitou testes de combinação de anticorpos agonistas OX40 com diversas outras terapias, incluindo inibição de PD1/PD-L1 ou CTLA4, terapia anti-VEGF e o inibidor de tirosina quinase axitinibe.

[0010] Esse mecanismo de depleção de Treg de ação foi demonstrado como muito eficaz em modelos pré-clínicos e diversos receptores podem ser alvejados para eliminar Tregs como GITR (Bulliard et al., 2014) e CTLA4 (Simpson et al., 2013). No entanto, anticorpos que alvejam os receptores equivalentes em seres humanos não mostraram ter os mesmos níveis de eficácia antitumoral na clínica (Glisson et al., 2016; Tran et al., 2017). Os motivos para isso não estão claros, mas níveis inferiores de células que expressam receptor Fc gama como macrófagos em tumores humanos como comparados a modelos tumorais singênico de camundongo (Milas et al., 1987) podem ser parte da explicação para uma ausência de capacidade de tradução clínica do mecanismo de ação desses anticorpos. Outros motivos podem ser os níveis de expressão diferentes desses marcadores em Tregs humanas como em comparação com Tregs de camundongo (Aspeslagh et al., 2016).

[0011] CD137 também é expresso em células T ativadas, incluindo CD4+, CD8+, Th1, Th2 e Tregs, mas seu perfil de expressão também inclui células B, células exterminadoras naturais (NK), células T exterminadoras naturais (NKT) e células dendríticas (DCs) (Bartkowiak & Curran, 2015). Como no caso de OX40, a interação de CD137 com seu ligante aciona a ativação de trajetórias de sinalização intracelular que resultam em sobrevivência de célula T, proliferação e indução de atividade citotóxica. O estímulo de CD137 preferencialmente estimula células T CD8+ quando comparado às células T CD4+ e resulta em suas proliferações, sobrevivências e funções efetoras citotóxicas por meio da produção de citocinas inflamatórias, e também contribui com a diferenciação e manutenção de células T CD8+ de memória. Demonstrou-se também que CD137 é especificamente expresso em subconjuntos reativos a tumor de linfócitos de infiltração de tumor (TILs) (Weigelin et al., 2016), que fornece parte da fundamentação por trás de seu engate agonístico in vivo e seu uso em seleção de TIL para transferência adotiva. Mostrou-se que a monoterapia de CD137 é eficaz em diversos modelos tumorais imunogênicos pré-clínicos como MC38, CT26 e linfomas de célula B. No entanto, para um tratamento ainda mais eficaz de tumores estabelecidos, o engate de CD137 em combinação com outros agentes como reguladores de quimioterapia, citocinas e outros reguladores de ponto de checagem mostrou efeitos benéficos melhorados em redução de crescimento tumoral (Bartkowiak & Curran, 2015). O alvejamento de CD137 em modelos pré-clínicos com anticorpos agonistas também está associado à inflamação de fígado e transaminite que resulta do acúmulo crescente de célula T CD8+ dependente da produção de IL27 por células mieloides (Bartkowiak et al., 2018).

[0012] Os anticorpos agonistas para CD137 estão atualmente em testes clínicos quanto a câncer, no entanto, o progresso clínico foi desacelerado por inflamação de fígado de alto grau dose-limitante, provavelmente de forma parecida com as observações feitas em camundongos (Sanchez-Paulete et al., 2016). Urelumabe (BMS-663513) foi o primeiro anticorpo agonista CD137 a entrar em testes clínicos e mostrou sinais de atividade clínica antes dos testes serem interrompidos devido à hepatotoxicidade fatal em doses acima de 1 mg/kg (Segal et al., 2017). Esse é um anticorpo IgG4 humano que tem a capacidade para ativar CD137 na ausência de reticulação (documento US 8.137.667 B2), embora a atividade seja aumentada mediante a reticulação, como esperado pela teoria de ativação de receptor total mediada por super agrupamento. Por outro lado, nenhuma toxicidade dose-limitante foi observada com utomilumabe (PF-05082566) quando testado até 10 mg/kg (Tolcher et al., 2017). Esse é um anticorpo IgG2 humano, e tem apenas a capacidade para ativar CD137 mediante a reticulação (documento US 8.337.850 B2). Testes clínicos adicionais estão sendo realizados com ambos os anticorpos, testando tanto monoterapias quanto a combinação com a radioterapia e quimioterapia, bem como terapias alvejadas e imuno-oncológicas existentes. Devido à hepatotoxicidade observada com urelumabe, esse anticorpo teve que ser dosado em níveis muito baixos e os sinais iniciais de atividade clínica ainda não foram observados nesses níveis.

[0013] Diversas moléculas biespecíficas que alvejam CD137 ou OX40 estão em estágio de desenvolvimento inicial em uma diversidade de empresas. O alvejamento de tumor de estímulo de CD137 que é testado por Macrogenics com o uso de moléculas DART agonista de CD137 de HER2 e EphA2 alvo, pela Roche com o uso de proteínas de fusão de ligante de CD137 de FAPalpha ou CD20 alvo, e pela Pieris Pharmaceuticals com o uso de moléculas de anticalina agonista de CD137 de HER2 alvo. Em que o alvejamento duplo de OX40 e CTLA4 é testado por Aligator Biosciences para depletar especificamente Tregs intratumorais que é esperado que expressem altos níveis de ambos os alvos.

[0014] Mostrou-se que a coestimulação de OX40 e CD137 in vivo estimula tanto células T CD4+ quanto CD8+ e induz a função de citotóxica tanto das células T CD4+ transeuntes de antígeno experimentado quanto de antígeno não experimentado. (Qui et al., 2011). Interessantemente, a coestimulação dupla teve a capacidade para induzir células T CD4+ transplantadas a reduzirem crescimento tumoral em camundongos imunodeficientes inoculados com um modelo tumoral singênico de melanoma (B16-F10), destacando a habilidade dessa terapia para induzir atividade tumoricida de células T CD4+ (Qui et al., 2011). Um teste clínico de escalonamento de dose de fase I que estuda o efeito de combinar um agonista OX40 (PF- 04518600) com um agonista CD137 (utomilumabe - PF-05082566) está atualmente (NCT02315066) em processo para avaliar a segurança dessa combinação, e um teste clínico de fase Ib/II que combina os mesmos agonistas de TNFR com bloqueio de PD- 1 por meio avelumabe também está atualmente em processo (NCT02554812). Esses estudos observarão a combinação de anticorpos agonistas monoespecíficos simples que irão exigir reticulação de receptor Fc gama para seus agonismos e podem, portanto, subestimar a atividade clínica de alvejar esses receptores em combinação.

[0015] A coestimulação dupla de OX40 e CD137 também foi recentemente testada em camundongos com o uso de uma abordagem de anticorpo biespecífico conjugando-se quimicamente dois anticorpos existentes contra OX40 e CD137 (Ryan et al., 2018). A molécula, denominada OrthomAb, teve a capacidade para induzir a proliferação de células T CD4+ e CD8+, bem como a produção de citocinas inflamatórias IL-2 e IFNγ in vitro.

In vivo, OrthomAb também teve a capacidade para reduzir o crescimento tumoral de um modelo tumoral singênico de melanoma (B16-F10). É previsto que a natureza biespecífica bivalente de OrthomAb permitirá a reticulação eficiente das moléculas quando engatado a ambos os alvos, que resulta no agrupamento de receptores OX40 e CD137 e, consequentemente, na ativação de célula T.

Esses resultados validam a abordagem de anticorpo biespecífico para alvejar OX40 e CD137 em uma única molécula.

O processo de fabricação da molécula OrthomAb gera múltiplas espécies de ordem superior, bem como os dímeros de anticorpo desejados que precisam ser adicionalmente purificados em diversos ciclos de etapas de exclusão de tamanho.

Esse processo de fabricação provavelmente não tornará essa abordagem viável para qualquer outro além de uma ferramenta de busca para validar combinações específicas de alvos.

Adicionalmente, a estrutura desse anticorpo biespecífico, em que duas macromoléculas grandes são mantidas juntas por um ligante químico pequeno, é propensa a ser instável in vivo e nenhum dado farmacocinético para abordar isso foi mostrado.

Infelizmente, o efeito antitumoral in vivo de OrthomAb foi apenas em comparação com a atividade de anticorpos agonistas OX40 ou CD137 e não a sua combinação, tornando pouco claro a possibilidade de a molécula ter um efeito devido a sua biespecificidade ou devido ao OrthomAb se comportar como uma combinação de anticorpos agonistas de agente único contra

OX40 e CD137.

[0016] A fundamentação para combinar o agonismo de membros da família de receptor TNF OX40 e CD137 em uma molécula bivalente, biespecífica e estável única é, portanto, estabelecida e tem o potencial para realizar super agrupamento independente de receptor Fc gama de OX40 e CD137, portanto, ativando tanto células T CD4+ quanto CD8+ para compor uma resposta imunológica antitumoral eficaz. Com base nos dados de combinação pré-clínica gerados com anticorpos monoclonais que alvejam as trajetórias de OX40 ou CD137, essa molécula também tem potencial como um parceiro de combinação para melhorar o efeito de padrão de terapias de cuidados de câncer para fornecer benefício ao paciente. Declarações da invenção

[0017] Os presentes inventores reconheceram que as moléculas de anticorpo que se ligam tanto ao CD137 quanto ao OX40 e que têm a capacidade para induzir o agrupamento e a sinalização de OX40 e/ou CD137 quando ligados a ambos os alvos, são altamente eficazes em ativar células imunológicas, por exemplo, em um microambiente tumoral. Além disso, os presentes inventores reconheceram que restringir a ativação de CD137 a locais em que CD137 e OX40 são co- expressos seria altamente eficaz em ativar células imunológicas sem elicitar toxicidades associadas a moléculas agonistas anti-CD137 conhecidas. Espera-se que isso seja útil, por exemplo, em imunoterapia para o tratamento de câncer e outras doenças.

[0018] Como descrito na seção de antecedentes acima, acredita-se que a ligação inicial de ligante de OX40 ou ligante de CD137 a OX40 ou CD137, respectivamente, inicia uma cadeia de eventos que resulta em trimerização de receptor, seguida por agrupamento de receptores, ativação e iniciação subsequente de atividade de célula T antitumoral potente. Para um agente terapêutico obter eficientemente a ativação de OX40 ou CD137, espera-se, portanto, que diversos monômeros receptores precisem ser ligados de forma a imitar a ligação pelo ligante trimérico.

[0019] Os presentes inventores isolaram as moléculas de anticorpo que compreendem um sítio de ligação a antígeno à base de região determinante de complementaridade (CDR) para CD137 e um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio constante da molécula de anticorpo. Os inventores mostraram que tais moléculas de anticorpo têm a capacidade para ligarem ambos os alvos simultaneamente quando ambos os alvos forem co-expressos. A co-expressão nesse sentido abrange situações em que CD137 e OX40 são expressos na mesma célula, por exemplo, uma célula imunológica, e situações em que CD137 e OX40 são expressos em células diferentes, por exemplo, duas células imunológicas diferentes localizadas adjacentes entre si no microambiente tumoral. Desse modo, acredita-se que as moléculas de anticorpo da invenção tenham a capacidade para se ligarem em cis a ambos os alvos expressos em uma célula única, bem como ter a capacidade para se ligarem em trans aos dois alvos expressos em células diferentes.

[0020] Os presentes inventores mostraram adicionalmente que uma molécula de anticorpo que compreende um sítio de ligação a antígeno com base em CDR para CD137 e um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio constante da molécula de anticorpo, teve a capacidade para se ligarem de movo bivalente a ambos os alvos. Especificamente, os presentes inventores mostraram que foi permitido que tal molécula de anticorpo se ligasse ao OX40 e CD137, e os complexos resultantes foram reticulados e submetidos a análise de espectrometria de massa, em que foi mostrado que 19 % dos complexos compreendem duas frações de OX40 e duas frações de CD137, demonstrando que a molécula de anticorpo foi ligada de modo bivalente a ambos os alvos.

[0021] Ademais, os inventores mostraram que quando essas moléculas de anticorpo são ligadas a ambos os alvos, as mesmas têm a capacidade para induzir o agrupamento e a sinalização de OX40 e CD137 in vitro. Atuando-se dessa forma, tais moléculas de anticorpo são chamadas “agonistas duplos”, isto é, as moléculas de anticorpo têm a capacidade para induzir a sinalização por meio dos receptores como resultado de reticulação por ligação dupla tanto ao OX40 quanto ao CD137.

[0022] Como demonstrado nesses exemplos, OX40 é preferencialmente expresso em células T CD4+ e CD137 é preferencialmente expresso em células T CD8+. Os presentes inventores demonstraram que as moléculas de anticorpo têm a capacidade para induzir o agonismo de OX40 em células T CD4+. Nesses casos, acredita-se que a molécula de anticorpo seja ligada ao CD137 por meio seu domínio de ligação a antígeno com base em CDR para reticular a molécula de anticorpo e o domínio de ligação a antígeno OX40 tem, ao mesmo tempo, a capacidade para se ligar a, agrupar e ativar OX40 expresso nas células T CD4+. De modo similar, os presentes inventores demonstraram que as moléculas de anticorpo têm a capacidade para induzir agonismo de CD137 em células T CD8+. Nesses casos, acredita-se que a molécula de anticorpo seja ligada ao OX40 por meio seu domínio de ligação a antígeno OX40 para reticular a molécula de anticorpo e o domínio de ligação a antígeno OX40 tenha, ao mesmo tempo, capacidade para se ligar a, agrupar e ativar o CD137 expresso nas células T CD8+.

[0023] Adicionalmente, os inventores mostraram que moléculas de anticorpo que compreendem os dois sítios de ligação a antígeno, como detalhado acima, e que foram modificadas para reduzir ou anular a ligação a receptores Fcγ tiveram a capacidade para induzir a sinalização por meio dos receptores quando os CD137 e OX40 foram co-expressos, mostrando que o agonismo ocorreu sem exigir a reticulação por receptores Fcγ. Visto que reticulação mediada por receptor Fcγ não é exigida para a atividade da molécula de anticorpo da invenção, espera-se que a sinalização por meio dos receptores OX40 ou CD137 seja localizada para sítios em que ambos os alvos estão presentes, como no microambiente tumoral. Desse modo, a molécula de anticorpo tem a capacidade para acionar o agonismo autonomamente, com base na expressão de ambos os alvos específicos e sem a necessidade de agentes de reticulação adicionais.

[0024] Ademais, visto que a ligação de receptor Fcγ é necessária para ADCC, espera-se que essa redução na ligação aos receptores Fcγ também resulte em ADCC reduzido, de modo que as células imunológicas alvo não sejam depletadas pelas moléculas de anticorpo da invenção. Os presentes inventores consideraram isso como importante visto que as moléculas de anticorpo foram designadas para ativar as células imunológicas que expressam CD137 e/ou OX40 a fim de promover uma resposta imunológica. A depleção dessas células imunológicas não é, portanto, desejada. Os inventores demonstraram que as moléculas de anticorpo que têm as propriedades definidas no presente documento tiveram a capacidade para ativar e induzir a proliferação de células imunológicas, em particular, células T que expressam CD137 e/ou OX40.

[0025] Os presentes inventores mostraram adicionalmente que as moléculas de anticorpo que compreende sítios de ligação a antígeno CD137 e OX40, como detalhado acima, tiveram a capacidade para suprimir o crescimento tumoral in vivo em camundongos. Adicionalmente, a supressão de crescimento tumoral mais eficaz foi observada com as moléculas biespecíficas de anticorpo como em comparação com uma combinação de duas moléculas de anticorpo monoespecífico em que uma das moléculas de anticorpo compreendeu um sítio de ligação a antígeno com base em CDR para CD137 e a outra molécula compreendeu um sítio de ligação a antígeno com base em CDR para OX40, demonstrando que o engate concorrente e o agonismo de OX40 e CD137 resultou em eficácia antitumoral aprimorada. Além disso, mostrou-se que as moléculas de anticorpo têm a capacidade para induzir a regressão tumoral completa e o estabelecimento de memória imunológica protetora contra novo desafio com células tumorais em um modelo tumoral de camundongo CT26. Acredita-se, portanto, que as moléculas de anticorpo da invenção mostrarão eficácia no tratamento de câncer em pacientes humanos. Visto que essas moléculas de anticorpo têm atividade de ADCC anulada, espera- se que as mesmas, portanto, suprimam o crescimento tumoral tornando as células imunológicas alvo em agonista sem depletar significativamente essas células T benéficas

(células de memória e efetoras).

[0026] Como observado nos estudos in vivo em camundongos, a ativação e a proliferação de células T induzidas pelas moléculas de anticorpo descritas no presente documento foram um efeito sistêmico em vez de um efeito localizado em tumor. Adicionalmente, um aumento em proliferação e ativação de células T CD4+ e CD8+ de memória central e memória efetora periféricas foi observada em um estudo de constatação de faixa de dose preliminar em macacos cinomolgo administrados com uma molécula de anticorpo da invenção. Desse modo, bem como o alvejamento de células T no microambiente tumoral, espera-se que as células T de memória periférica que expressam OX40 e CD137 sejam alvejadas pela molécula de anticorpo para acionar uma expansão de células T reativas a tumor que, então, fornecerão seu efeito antitumoral.

[0027] Portanto, além do sítio do próprio tumor real, o local anatômico afetado pelo tumor também pode ser considerado como incluindo locais em outra parte do corpo, por exemplo, linfonodos na periferia, nos quais as respostas imunológicas específicas de tumor são geradas.

[0028] Como explicado na seção de antecedentes acima, o desenvolvimento clínico de moléculas de agonista CD137 foi retido pelo menos em parte devido ao fato do tratamento ser associado à inflamação de fígado de alto grau dose-limitante (urelumabe) ou à baixa eficácia clínica (utomilumabe).

[0029] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que as células T presentes no fígado possam ter o potencial para serem ativadas por moléculas agonistas anti-CD137, que resulta em inflamação de fígado. Mostrou-se que as células T CD8+ promovem a inflamação de fígado e a apoptose após sepse/infecção viral (Wesche-Soldato et al., 2007). Mostrou- se que a terapia de anticorpo agonista anti-CD137 em camundongos resultou em infiltração de célula T dependente de CD137 no fígado (Dubrot J et al., 2010). Os resultados desses estudos, quando considerados juntos, indicam que os anticorpos agonistas anti-CD137 com alta atividade, como urelumabe, podem causar infiltração de células T CD8+ ativadas no fígado, portanto, resultando em inflamação de fígado. A atividade de utomilumabe pode ter sido muito baixa para esse efeito ser observado. Alternativamente, a toxicidade de fígado dose-limitante observada com o tratamento com urelumabe pode ser devido à ligação de epítopo particular por esse anticorpo.

[0030] Os presentes inventores conduziram um programa de seleção extensivo para isolar as moléculas de anticorpo que se ligam ao CD137 dimérico humano com alta afinidade, isto é, espera-se que os mesmos se liguem a CD137 com alta avidez. Em vista do protocolo de seleção usado, espera-se que as moléculas de anticorpo se liguem ao CD137 monomérico com uma afinidade inferior que a afinidade observada para CD137 dimérico.

[0031] “Afinidade”, como denominado no presente documento, pode se referir à força da interação de ligação entre uma molécula de anticorpo e seu antígeno cognato, como medido por KD. Como seria prontamente aparente ao elemento versado na técnica, em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para formar múltiplas interações de ligação com um antígeno (por exemplo, em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para se ligar o antígeno de modo bivalente e, opcionalmente, o antígeno é dimérico) a afinidade, como medida por KD, também pode ser influenciada por avidez, em que avidez se refere à força geral de um complexo de anticorpo-antígeno.

[0032] A expressão de CD137 por células imunológicas, como células T, é regulada de modo ascendente na ativação. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que devido à alta expressão de CD137 em células imunológicas ativadas, CD137 estará na forma de dímeros, trímeros e multímeros de ordem superior na superfície de tais células. Por outro lado, células imunológicas naïve, como células T naïve, expressam níveis baixos ou dispensáveis de CD137 em suas superfícies celulares e qualquer CD137 presente é, portanto, propenso a estar na forma monomérica. Acredita-se, portanto, que moléculas de anticorpo que se ligam ao CD137 com alta avidez, se ligarão preferencialmente a células imunológicas ativadas, como células T ativadas, em oposição a células imunológicas naïve.

[0033] Em vista do acima, acredita-se portanto que as moléculas de anticorpo da invenção não terão, amplamente, a capacidade para ativar CD137 na ausência de reticulação por meio de engate com OX40. Ademais, como descrito acima, os presentes inventores desenvolveram moléculas de anticorpo nas quais a reticulação mediada por receptor Fcγ foi reduzida ou anulada com a expectativa de que isso evitaria a ativação de CD137 em locais em que há pouca ou nenhuma co-expressão de OX40. A deficiência de ligação de receptor Fcγ foi mostrada como não afetando a atividade antitumoral da molécula de anticorpo. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que tais moléculas de anticorpo mostrarão toxicidade reduzida quando administradas a pacientes.

Acredita-se que isso seja devido ao fato de a ativação de CD137 ser amplamente restrita em locais em que OX40 e CD137 são co-expressos em níveis suficientes para acionar o agrupamento e a ativação de CD137. Os presentes inventores mostraram que em um estudo de constatação de faixa de dose preliminar em macacos cinomolgo, as doses de uma molécula de anticorpo da invenção foram bem toleradas até 30 mg/kg.

[0034] Os presentes inventores mostraram que as moléculas de anticorpo da invenção têm a capacidade para induzir baixos níveis de agrupamento e ativação de OX40 mesmo na ausência de reticulação. Diferente de anticorpos agonistas CD137, os anticorpos agonistas OX40 não mostraram toxicidades dose- limitantes (DLTs) na atividade clínica e agonista OX40 na ausência de reticulação, portanto, não é esperado que esse represente um problema para tratamento clínico. Pelo contrário, dependendo da condição a ser tratada, um nível baixo de atividade de agonista OX40 pelas moléculas de anticorpo na ausência de reticulação pode ser vantajoso. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que moléculas de anticorpo que compreende um sítio de ligação a antígeno OX40 com sua propriedade pode ser útil no contexto de tratamento de câncer induzindo ativação e expansão limitadas de células T reativas a tumor na ausência de reticulação, que resulta em um grupamento maior de células T reativas a tumor que pode, então, ser adicionalmente ativado por moléculas de Fcab reticuladas no microambiente tumoral.

[0035] Uma vantagem adicional das moléculas de anticorpo da invenção que foram modificadas para reduzir ou anular a ligação a receptores Fcγ pode ser que essas moléculas de anticorpo têm atividade antitumoral que não é dependente da depleção de células T regulatórias que expressam OX40 (Tregs). Tregs estão localizadas na periferia, que são potencialmente protetoras e podem reduzir o impacto de autoimunidade que pode ser causado por sobre-estimulação do sistema imunológico (Vignali DA et al., 2008). Desse modo, postulou-se que a depleção de Treg pode ter um efeito significativo na redução de crescimento tumoral em camundongos modelo (Bulliard et al., 2014; Simpson et al., 2013). No entanto, há evidência limitada de que a depleção de Treg em tumores humanos pode ser obtida por ADCC e, se a depleção de Treg ocorrer em seres humanos, isso não parece ser resultado de tal atividade antitumoral grave, como foi observado em camundongos modelo (Powell et al., 2007; Nizar S et al., 2009; Glisson BS et al., 2016; Tran B et al., 2017). Desse modo, se a molécula de anticorpo não significativamente depletar Tregs, mas ainda ter atividade antitumoral, isso pode indicar que a molécula de anticorpo tem atividade antitumoral que é independente de depleção de Treg mediada por receptor Fcγ.

[0036] Mostrou-se adicionalmente que as moléculas de anticorpo têm a capacidade para se ligarem com alta afinidade tanto ao CD137 humano e de cinomolgo quanto ao OX40 humano e de cinomolgo. Essa reatividade cruzada é vantajosa, visto que permite dosar e seguramente testar as moléculas de anticorpo a serem realizadas em macacos cinomolgo durante desenvolvimento pré-clínico.

[0037] Um recurso adicional das moléculas de anticorpo identificadas pelos inventores é que o sítio de ligação a antígeno para CD137 e o sítio de ligação a antígeno para OX40 são ambos contidos na própria estrutura de anticorpo.

Em particular, as moléculas de anticorpo não exigem que outras proteínas sejam fusionadas à molécula de anticorpo por meio de ligantes ou outros meios para resultar na molécula que podem se ligar de modo bivalente a ambos os seus alvos.

Isso tem uma diversidade de vantagens.

Especificamente, as moléculas de anticorpo identificadas pelos inventores podem ser produzidas com o uso de métodos similares àqueles empregados para a produção de anticorpos padrão, visto que os mesmos não compreendem quaisquer porções fusionadas.

Espera-se também que a estrutura resulte em estabilidade de anticorpo aprimorada, visto que os ligantes podem se degradar com o tempo, o que resulta em uma população heterogênea de moléculas de anticorpo.

Tais anticorpos na população que têm apenas uma proteína fusionada podem não ter a capacidade para atuar como um agonista dupla e sinalizar por meio dos receptores como resultado de reticulação por ligação tanto ao OX40 quanto CD137. A clivagem ou degradação do ligante pode ocorrer antes da administração ou após a administração do produto terapêutico ao indivíduo (por exemplo, através de clivagem enzimática ou do pH in vivo do indivíduo), portanto, que resulta em uma redução de sua eficácia enquanto circula no indivíduo.

Visto que não há ligantes nas moléculas de anticorpo identificadas pelos inventores, espera-se que as moléculas de anticorpo retenham o mesmo número de sítios de ligação tanto antes quanto após a administração.

Adicionalmente, a estrutura das moléculas de anticorpo identificadas pelos inventores também é preferencial a partir da perspectiva de imunogenicidade das moléculas, como a introdução de proteínas fusionadas ou ligantes ou ambos podem induzir a imunogenicidade quando as moléculas são administradas a um indivíduo, que resulta em eficácia reduzida da terapia.

[0038] Desse modo, a presente invenção fornece:

[1] Uma molécula de anticorpo que se liga a CD137 e OX40, que compreende (a) um sítio de ligação a antígeno à base de região determinante de complementaridade (CDR) para CD137; e (b) um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio CH3 da molécula de anticorpo; em que o sítio de ligação a antígeno à base de CDR compreende CDRs 1-6 apresentados em: (i) SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 1, 2, 16, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-3]; (iii) SEQ ID NOs 1, 2, 21, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-12]; (iv) SEQ ID NOs 25, 26, 27, 4, 5 e 28, respectivamente [FS30-35-14]; ou (v) SEQ ID NOs 33, 34, 35, 4, 5 e 36, respectivamente [FS30-5-37]; e em que o sítio de ligação a antígeno OX40 compreende uma primeira sequência, uma segunda sequência e uma terceira sequência localizadas nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3, respectivamente, em que as primeira, segunda e terceira sequências têm a sequência estabelecida em SEQ ID NOs 51, 52 e 53, respectivamente [FS20-22-49].

[2] Uma molécula de anticorpo que se liga a CD137 e OX40, que compreende (a) um sítio de ligação a antígeno à base de região determinante de complementaridade (CDR) para CD137; e (b) um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio CH3 da molécula de anticorpo; em que o sítio de ligação a antígeno à base de CDR compreende CDRs 1-6 apresentados em: (i) SEQ ID NOs 7, 8, 9, 10, 11 e 6, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 7, 8, 17, 10, 11 e 6, respectivamente [FS30-10-3]; (iii) SEQ ID NOs 7, 8, 22, 10, 11 e 6, respectivamente [FS30-10-12]; (iv) SEQ ID NOs 29, 30, 31, 10, 11 e 28, respectivamente [FS30-35-14]; ou (v) SEQ ID NOs 37, 38, 39, 10, 11 e 36, respectivamente [FS30-5-37]; e em que o sítio de ligação a antígeno OX40 compreende uma primeira sequência, uma segunda sequência e uma terceira sequência localizadas nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3, respectivamente, em que as primeira, segunda e terceira sequências têm a sequência estabelecida em SEQ ID NOs 51, 52 e 53, respectivamente [FS20-22-49].

[3] A molécula de anticorpo, de acordo com [1] ou [2], em que: (i) a primeira sequência está localizada nas posições 14 a 18 do domínio CH3 da molécula de anticorpo; (ii) a segunda sequência está localizada nas posições

45.1 a 77 do domínio CH3 da molécula de anticorpo; e/ou (iii) a terceira sequência está localizada nas posições 93 a 101 do domínio CH3 da molécula de anticorpo; e em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.

[4] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [3], em que a molécula de anticorpo compreende a sequência de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 54 [FS20- 22-49].

[5] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [4], em que a molécula de anticorpo compreende CDRs 1-6 estabelecidos em qualquer um de (i) a (iv) de [1] ou

[2].

[6] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [5], em que a molécula de anticorpo compreende CDRs 1-6 estabelecidos em qualquer um de (i) a (iii) de [1] ou

[2].

[7] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [6], em que a molécula de anticorpo compreende CDRs 1-6 estabelecidos em (i) de [1] ou [2].

[8] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [7], em que a molécula de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) e/ou domínio variável de cadeia leve (VL), preferencialmente um domínio VH e um domínio VL.

[9] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [8], em que a molécula de anticorpo compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina e/ou uma cadeia leve de imunoglobulina, preferencialmente uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina.

[10] A molécula de anticorpo, de acordo com [8] ou [9], em que a molécula de anticorpo compreende o domínio VH e/ou domínio VL, preferencialmente, o domínio VH e o domínio VL estabelecido em:

(i) SEQ ID NOs 12 e 14, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 18 e 14, respectivamente [FS30-10-3]; (iii) SEQ ID NOs 23 e 14, respectivamente [FS30- 10-12]; (iv) SEQ ID NOs 170 e 172, respectivamente [FS30-35- 14]; ou (v) SEQ ID NOs 40 e 42, respectivamente [FS30-5-37];

[11] A molécula de anticorpo, de acordo com [10], em que a molécula de anticorpo compreende os domínio VH e domínio VL estabelecidos em qualquer um de (i) a (iv) de [10].

[12] A molécula de anticorpo, de acordo com [10] ou [11], em que a molécula de anticorpo compreende os domínios VH e VL estabelecidos em qualquer um de (i) a (iii) de [10].

[13] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[10] a [12], em que a molécula de anticorpo compreende os domínio VH e domínio VL estabelecidos em (i) de [10].

[14] Uma molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [13], em que a molécula de anticorpo é uma molécula de IgG1 humano.

[15] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [14], em que a molécula de anticorpo compreende as cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo: (i) FS20-22-49AA/FS30-10-16 apresentadas em SEQ ID NOs 95 e 97, respectivamente; (ii) FS20-22-49AA/FS30-10-3 apresentadas em SEQ ID NOs 99 e 97, respectivamente; (iii) FS20-22-49AA/FS30-10-12 apresentadas em SEQ ID NOs 103 e 97, respectivamente; (iv) FS20-22-49AA/FS30-35-14 apresentadas em SEQ ID NOs 105 e 107, respectivamente; ou

(v) FS20-22-49AA/FS30-5-37 apresentadas em SEQ ID NOs 109 e 111, respectivamente.

[16] A molécula de anticorpo, de acordo com [15], em que a molécula de anticorpo compreende as cadeia leve e cadeia pesada apresentadas em qualquer um dentre (i) a (iv) de

[15].

[17] A molécula de anticorpo, de acordo com [15], em que a molécula de anticorpo compreende as cadeia leve e cadeia pesada apresentadas em qualquer um dentre (i) a (iii) de

[15].

[18] A molécula de anticorpo, de acordo com [15], em que a molécula de anticorpo compreende as cadeia leve e cadeia pesada apresentadas em (i) de [15].

[19] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [18], em que a molécula de anticorpo liga CD137 humano e OX40 humano.

[20] A molécula de anticorpo, de acordo com [19], em que o CD137 humano consiste em ou compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 127.

[21] A molécula de anticorpo, de acordo com [19] ou [20], em que o OX40 humano consiste em ou compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 130.

[22] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [21], em que a molécula de anticorpo se liga ao CD137 de cinomolgo e OX40 de cinomolgo.

[23] A molécula de anticorpo, de acordo com [22], em que o CD137 de cinomolgo consiste em ou compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 129.

[24] A molécula de anticorpo, de acordo com [23] ou [24], em que o OX40 de cinomolgo consiste em ou compreende a sequência apresentada em SEQ ID NO: 131.

[25] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[5] a [7], [11] a [13] e [16] a [18], em que a molécula de anticorpo se liga a CD137 humano e OX40 humano, e a afinidade (KD) pela qual a molécula de anticorpo se liga a CD137 humano está dentro de 2 vezes da afinidade (KD) pela qual a molécula de anticorpo se liga a OX40 humano.

[26] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[19] a [25], em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para se ligar a CD137 humano e OX40 humano simultaneamente.

[27] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [26], em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para ativar OX40 em uma célula imunológica na presença de CD137 expresso em superfície celular.

[28] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [27], em que a ligação da molécula de anticorpo ao OX40 em uma célula imunológica e ao CD137 causa o agrupamento de OX40 na célula imunológica.

[29] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [28], em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para ativar CD137 em uma célula imunológica na presença de OX40 expresso em superfície celular.

[30] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [29], em que a ligação da molécula de anticorpo ao CD137 em uma célula imunológica e ao OX40 causa o agrupamento de CD137 na célula imunológica, e em que OX40 é expresso na mesma célula imunológica ou em uma célula separada.

[31] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações [27] a [30], em que a célula imunológica é uma célula T.

[32] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [31], em que a molécula de anticorpo foi modificada para reduzir ou anular a ligação do domínio CH2 da molécula de anticorpo a um ou mais receptores Fcγ.

[33] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [32], em que a molécula de anticorpo não se liga a um ou mais receptores Fcγ.

[34] A molécula de anticorpo, de acordo com [32] ou [33], em que o receptor Fcγ é selecionado a partir do grupo que consiste em: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb e FcγRIII.

[35] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de

[1] a [34], em que a molécula de anticorpo tem a capacidade para induzir a proliferação de células T.

[36] Um conjugado que compreende a molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de [1] a [35] e uma molécula bioativa.

[37] Um conjugado que compreende a molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de [1] a [36] e uma identificação detectável.

[38] Uma molécula ou moléculas de ácido nucleico que codificam a molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de [1] a [35].

[39] A molécula ou moléculas de ácido nucleico que codificam a molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de [1] a

[4], [8] a [10], [14] a [15] e [19] a [35], em que a molécula (ou moléculas) de ácido nucleico compreende a sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada e/ou sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve de: (i) FS20-22-49AA/FS30-10-16 apresentadas em SEQ ID NOs 96 e 98, respectivamente;

(ii) FS20-22-49AA/FS30-10-3 apresentadas em SEQ ID NOs 100 e 102, respectivamente; (iii) FS20-22-49AA/FS30-10-12 apresentadas em SEQ ID NOs 104 e 102, respectivamente; (iv) FS20-22-49AA/FS30-35-14 apresentadas em SEQ ID NOs 106 e 108, respectivamente; ou (v) FS20-22-49AA/FS30-5-37 apresentadas em SEQ ID NOs 110 e 112, respectivamente.

[40] Um vetor ou vetores que compreendem a molécula ou moléculas de ácido nucleico, de acordo com qualquer um de

[38] a [39].

[41] Uma célula hospedeira recombinante que compreende a molécula (ou moléculas) de ácido nucleico, de acordo com qualquer um de [38] a [39], ou o vetor (ou vetores), de acordo com [40].

[42] Um método de produção da molécula de anticorpo, de acordo com qualquer um de [1] a [35], que compreende cultivar a célula hospedeira recombinante de [41] sob condições para produção da molécula de anticorpo.

[43] O método, de acordo com [42], que compreende adicionalmente isolar e/ou purificar a molécula de anticorpo.

[44] Uma composição farmacêutica que compreende a molécula de anticorpo ou conjugado, de acordo com qualquer um de [1] a [37], e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[45] A molécula de anticorpo ou o conjugado, de acordo com qualquer um de [1] a [37], para uso em um método para tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

[46] Um método de tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [37].

[47] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com [45], em que a molécula de anticorpo ou conjugado é para uso em tratamento de um câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo.

[48] O método de [46], em que a doença ou transtorno é um câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo.

[49] O uso da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com qualquer um de [1] a [37] na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer ou uma doença infecciosa.

[50] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com [47], método de [48], ou uso da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com [49], em que o câncer é um câncer sólido, opcionalmente em que o câncer sólido é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer de bexiga, câncer do cérebro, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, cervical câncer, fígado câncer, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, renal câncer e câncer de estômago.

[51] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com [47], método de [48], ou use da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com [49], em que a doença infecciosa é uma infecção viral persistente, opcionalmente em que a infecção viral persistente é selecionada a partir do grupo que consiste em vírus imunodeficiente humano (HIV), vírus Epstein-Barr, Citomegalovírus, vírus de Hepatite B, vírus de Hepatite C, vírus Varicela Zoster.

[52] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com [47], método de [48], ou use da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com [49], em que a doença infecciosa é uma infecção bacteriana persistente, opcionalmente, em que a infecção bacteriana persistente é uma infecção persistente de Staphylococcus aureus, Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Helicobacter pylori, Treponema pallidum, Enterococcus faecalis, ou Streptococcus pneumoniae.

[53] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com [47], método de [48], ou use da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com [49], em que a doença infecciosa é uma infecção fúngica persistente, opcionalmente, em que a infecção fúngica persiste é uma infecção persistente de Candida, por exemplo, Candida albicans, Cryptococcus (gattii e neoformans), Talaromyces (Penicillium) marneffe, Microsporum, por exemplo, Microsporum audouinii, e Trichophyton tonsurans.

[54] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com [47], método de [48], ou use da molécula de anticorpo ou conjugado de acordo com [49], em que a doença infecciosa é uma infecção parasitária persistente, opcionalmente, em que a infecção parasitária persistente é uma a infecção persistente de Plasmodium, como Plasmodium falciparum, ou Leishmania, como Leishmania donovani.

[55] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso de acordo com qualquer um de [45], [47] e [50] a [54], em que o tratamento compreende administrar a molécula de anticorpo ou conjugado ao indivíduo em combinação com uma segunda terapia.

[56] O método de acordo com [46], [48] e [50] a [54], em que o método compreende adicionalmente administrar a quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda terapia ao indivíduo.

[57] A molécula de anticorpo ou conjugado para uso em um método de tratamento um câncer em um indivíduo de acordo com

[47] ou [50], em que o método compreende administrar a molécula de anticorpo ou conjugado ao indivíduo em combinação com um anticorpo que se liga a PD-1 ou PD-L1. Breve Descrição das Figuras

[0039] A Figura 1 mostra um alinhamento das sequências dos domínios CH3 de Fcabs FS20-22-38, FS20-22-41, FS20-22- 47, FS20-22-49, FS20-22-85, FS20-31-58, FS20-31-66, FS20-31- 94, FS20-31-102, FS20-31-108, e FS20-31-115, bem como o Fcab do tipo selvagem (WT). As posições das alças estruturais AB, CD e EF, bem como quaisquer substituições, deleções (denotadas por um til “~”) ou inserções de aminoácido presentes nos domínios CH3 dos Fcabs em comparação com a sequência de WT são indicadas. Os números dos resíduos de acordo com a sistemas de numeração IMGT, éxon IMGT (numeração consecutiva), EU e Kabat são mostrados.

[0040] A Figura 2 mostra a atividade de mAb CD137 e mAb2 OX40/CD137 em um ensaio de ativação de célula T CD137 humano na presença e na ausência de reticulação. As Figuras 2A e B mostram liberação de IL2 na presença de concentrações crescentes de anti-CD137mAb e na presença (Figura 2A) ou ausência (Figura 2B) de um anticorpo de reticulação. G1AA/20H4.9 mostrou atividade na presença e na ausência do anticorpo de reticulação, enquanto a atividade dos anticorpos G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16 foi observada apenas na presença do anticorpo de reticulação. As Figuras 2C e D mostram a liberação de IL-2 na presença de concentrações crescentes de mAb anti-CD137 FS30 em formato de mAb2 que compreende um Fcab OX40 anti-humano (FS20-22- 49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30- 10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16 e FS20-22-49AA/FS30-35-14) na presença (Figura 2C) ou ausência (Figura 2D) de um agente de reticulação. Os controles foram incluídos como a seguir: anticorpo anti-CD137 G2/MOR7480.1 (controle positivo); mAb anti-OX40 G1/11D4 e mAb2 FS20-22-49AA/4420 (controles negativos); mAb anti-FITC G1/4420 (controle negativo de isotipo). A Figura 2C mostra que há um aumento dependente de concentração na ativação de células DO11.10-hCD137, como evidenciado por um aumento em liberação de IL-2 de camundongo, na presença do mAb de controle positivo reticulado (G2/MOR7480.1) e os mAb2 anti-CD137 FS30 (FS20- 22-49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22- 49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16 e FS20-22- 49AA/FS30-35-14), mas não na presença do mAbs de controle negativo e mAb2 (G1/4420, FS20-22-49AA/4420 e G1/11D4). A Figura 2D mostra que na ausência de reticulação, o controle positivo G2/MOR7480.1, os mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20- 22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22- 49AA/FS30-10-16 e FS20-22-49AA/FS30-35-14 e os controles negativos G1/4420, FS20-22-49AA/4420 e G1/11D4 não mostraram ativação de célula T fraca, como evidenciado pelos baixos níveis basais de IL-2 medidos.

[0041] A Figura 3 mostra a atividade de mAb CD137, Fcab OX40 e mAb2 OX40/CD137 em ensaios de enterotoxina A estafilocócica (SEA). A liberação de IL-2 foi medida na presença do mAb/mAb2 indicado e na presença e na ausência de agentes de reticulação (FITC-dextrano para os controles de mAb anti-FITC e mAb2 simulados OX40/FITC, e anticorpo CH2 anti-humano para todas as outras moléculas testadas). A Figura 3A mostra a liberação de IL-2 na presença de mAbs G1/4420 (anti-FITC; controle de isotipo), G1AA/MOR7480.1 (anti-CD137), G1AA/FS30-10-16 (anti-CD137), G1AA/20H4.9 (anti-CD137), G1AA/11D4 (anti-OX40), FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) e FS20-22-49AA/4420 mais G1AA/FS30-10-16 em combinação, bem como mAb2 FS20-22- 49AA/FS30-10-16, em uma concentração de 3,7 nM.

Os resultados mostram que apenas o mAb2 OX40/CD137 aumentou a ativação de células T na ausência de agentes de reticulação artificiais em comparação com o controle de isotipo, enquanto os anticorpos que alvejam OX40 G1AA/11D4 e FS20- 22-49AA/4420 e o anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9 apenas mostraram ativação de célula T aumentada na presença de agentes de reticulação artificiais em comparação com o controle de isotipo, e os anticorpos anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16 não mostraram atividade estatisticamente significante mesmo na presença de agente de reticulação artificial.

A Figura 3B mostra a liberação de IL-2 na presença de mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30- 10-16 em concentrações crescentes na presença e na ausência de um agente de reticulação artificial (anticorpo CH2 anti- humano). Os resultados mostram que a ativação de células T induzida pelo mAb2 OX40/CD137 na ausência do anticorpo CH2 anti-humano foi comparável a quando o mesmo foi testado na presença desse agente de reticulação artificial.

As Figuras 3C e D mostra, a liberação de IL-2 na presença de concentrações crescentes de mAb e mAb2 na presença (Figura 3D) e ausência (Figura 3C) de um agente de reticulação artificial (FITC-dextrano para os controles de mAb anti-

FITC e mAb2 simulados OX40/FITC, e anticorpo CH2 anti-humano para todas as outras moléculas testadas). Os controles foram os como a seguir: G1/4420 (anti-FITC), G1/11D4 (anti-OX40), G2/MOR7480.1 (anti-CD137), G1/11D4 mais G2/MOR7480.1 em combinação, e FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC). Os resultados mostram que houve um aumento dependente de concentração na ativação de células T quando OX40 foi ligado pelos controles G1/11D4, tanto por si só quanto quando dosado em combinação com mAb anti-CD137 G2/MOR7480.1, e FS20-22-49A/4420 quando os mesmos foram reticulados. Os mAb2 OX40/CD137 tiveram atividade comparável na presença e na ausência de agente de reticulação artificial, e a atividade foi similar àquela do Fcab OX40 reticulado (FS20-22- 49AA/4420 Xlink). Pouca atividade foi observada com apenas o anticorpo anti-CD137 de controle (G2/MOR7480.1) tanto com quanto sem reticulação.

[0042] A Figura 4 mostra a atividade de mAb CD137, Fcab OX40 e mAb2 OX40/CD137 em ensaios de ativação de célula pan- T humana. A liberação de IL-2 foi medida na presença do mAb/mAb2 indicado e na presença e na ausência de agentes de reticulação (FITC-dextrano para os controles de mAb anti- FITC e mAb2 simulados OX40/FITC, e anticorpo CH2 anti-humano para todas as outras moléculas testadas). A Figura 4A mostra a liberação de IL-2 na presença de mAb e mAb2 em uma concentração de 3,7 nM. Os resultados mostram que apenas o mAb2 OX40/CD137 aumentaram a ativação de células T na ausência de agentes de reticulação artificiais. Os anticorpos que alvejam OX40 G1AA/11D4 e FS20-22-49AA/4420 e o anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9 mostrou apenas ativação de célula T aumentada na presença de agentes de reticulação.

Nenhuma atividade foi detectada para os anticorpos anti- CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16 mesmo na presença de agente de reticulação artificial, que confirma os resultados do ensaio SEA, como relatado na Figura 3A.

A Figura 4B mostra a liberação de IL-2 induzida por concentrações crescentes de mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16 na presença e na ausência de um agente de reticulação artificial (anticorpo CH2 anti-humano). O mAb2 OX40/CD137 teve atividade comparável na presença e na ausência do agente de reticulação artificial.

A Figura 4C mostra a liberação de IL-2 na presença de concentrações crescentes de mAb2 OX40/CD137 e os controles na ausência de agentes de reticulação artificiais, enquanto a Figura 4D mostra a liberação de IL-2 na presença de concentrações crescentes dos controles de agente único G1/4420, G1/11D4, G2/MOR7480.1 e FS20-22-49AA/4420 na presença de um agente de reticulação artificial (FITC-dextrano ou anticorpo CH2 anti-humano, como adequado). Os resultados mostram que o mAb2 OX40/CD137 teve atividade sub-nanomolar ou nanomolar de único dígito na ausência de agente de reticulação artificial.

Como esperado, o controle G1/4420 não teve atividade independentemente da presença de agente de reticulação.

Sem a presença de um agente de reticulação, os controles G1/11D4, FS20-22- 49AA/4420, G2/MOR7480.1, e a combinação de G1/11D4 e G2/MOR7480.1 teve pouca ou nenhuma atividade.

Quando reticulado por anticorpo CH2 anti-humano ou FITC-dextrano, os controles de agente anti-OX40 único e anti-CD137 exibiram um aumento dependente de concentração na ativação de células T, desse modo, demonstraram que o ensaio teve a capacidade para detectar a sinalização por meio de receptores OX40 ou

CD137 nas células T.

[0043] A Figura 5 mostra a atividade de mAb2 OX40/CD137 humano em ensaios de ativação de célula T CD4+ e CD8+. As Figuras 5A e B mostram a liberação de IL-2 em um ensaio de ativação de célula T CD4+ na presença de concentrações crescentes de mAb e mAb2, como indicado. mAb e mAb2 foram testados na presença (Figura 5B) ou ausência (Figura 5A) de agentes de reticulação artificiais (FITC-dextrano para os controles de mAb anti-FITC e mAb2 simulados OX40/FITC, e anticorpo CH2 anti-humano para todas as outras moléculas testadas). Os resultados mostram que o mAb2 OX40/CD137 teve a capacidade para ativar células T CD4+ na ausência de um agente de reticulação artificial. As células T CD4+ foram ativadas pelos controles anti-OX40 reticulados G1AA/11D4 e FS20-22-49AA/4420 (por si só e em combinação com G1AA/FS30- 10-16) mas não pelos controles anti-CD137 de agente único G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16. O controle anti-OX40 FS20- 22-49AA/4420 também mostrou um nível baixo de atividade na presença de células T CD4+ quando não reticulado, que foi amplamente aumentado mediante a reticulação do anticorpo. O Fcab anti-OX40 compartilhado tanto pelo mAb2 simulado FS20- 22-49AA/4420 quanto pelo mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foi, portanto, mostrado como tendo a capacidade para ativar células T CD4+ por meio de agonismo de OX40 quando os anticorpos foram reticulados pelo agente de reticulação artificial ou ligação de Fab a CD137. As Figuras 5C e D mostram a liberação de IL-2 em um ensaio de ativação de célula T CD8+ na presença de concentrações crescentes de mAb e mAb2, como indicado. mAb e mAb2 foram testados na presença (Figura 5D) ou ausência (Figura 5C) de agentes de reticulação artificiais (consultar a legenda das Figuras 5A e B para maiores detalhes). Os resultados mostram que o mAb2 OX40/CD137 teve a capacidade para ativar células T CD8+ na ausência de um agente de reticulação artificial.

A ativação de células T CD8+ foi observada tanto para os controles anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 quanto G1AA/FS30-10-16 (por si só e em combinação com FS20-22-49AA/4420), bem como pelos controles anti-OX40 FS20-22-49AA/4420 e, em menor extensão, G1AA/11D4, na presença de agente de reticulação artificial.

Os braços Fab anti-CD137 comuns tanto para mAb de controle G1AA/FS30-10-16 quanto para mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foram, portanto, mostrados como com a capacidade para a tornar CD137 expresso em agonista nas células T CD8+ quando os anticorpos foram reticulados pelo agente de reticulação artificial ou pela ligação de Fcab ao OX40, enquanto o Fcab anti-OX40 compartilhado tanto pelo mAb2 simulado FS20-22- 49AA/4420 quanto pelo mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 teve a capacidade para ativar células T CD8+ por meio de agonismo de OX40 quando os anticorpos foram reticulados pelo agente de reticulação artificial ou pela ligação de Fab a CD137. As Figuras 5E e F mostram a liberação de IL-2 em um ensaio de ativação de célula T CD4+ e um de CD8+, respectivamente, na presença de mAb/mAb2 em uma concentração de 3,7 nM e na presença ou na ausência de um agente de reticulação artificial (consultar a legendas das Figuras 5A e B para maiores detalhes). A Figura 5E mostra que o mAb2 OX40/CD137 teve a capacidade para ativar células T CD4+ na ausência de um agente de reticulação artificial.

As células T CD4+ foram ativadas pelos controles anti-OX40 reticulados G1AA/11D4 e FS20-22-49AA/4420 mas não pelos controles anti-CD137 de agente único G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16. O controle anti-OX40 FS20-22-49AA/4420 também mostrou um nível baixo de atividade quando não foi reticulado, que foi amplamente aumentado mediante a reticulação do anticorpo. O Fcab anti- OX40 compartilhado tanto pelo mAb2 simulado FS20-22- 49AA/4420 quanto pelo mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foi, portanto, mostrado como com a capacidade para ativar células T CD4+ por meio de agonismo de OX40 quando os anticorpos foram reticulados pelo agente de reticulação artificial ou pela ligação de Fab a CD137. A Figura 5F mostra que o mAb2 OX40/CD137 teve a capacidade para ativar células T CD8+ na ausência de um agente de reticulação artificial. A ativação de células T CD8+ foi observada para controles anti-CD137 G1AA/20H4.9 e G1AA/FS30-10-16 (por si só e em combinação com FS20-22-49AA/4420) na presença de agente de reticulação artificial, mas não pelo controle anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 ou para os controles anti-OX40 reticulados G1AA/11D4 e FS20- 22-49AA/4420. A ativação de células T CD8+ também foi observada para o controle anti-CD137 G1AA/20H4.9 na ausência de agente de reticulação artificial. Os braços Fab anti- CD137 comuns tanto para o mAb de controle G1AA/FS30-10-16 quanto para o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foram, portanto, mostrados como com a capacidade para tornar CD137 expresso em agonista em células T CD8+ quando os anticorpos foram reticulados pelo agente de reticulação artificial ou pela ligação de Fcab à OX40.

[0044] A Figura 6 mostra que as células T CD4+ expressam níveis inferiores de CD137 e níveis superiores de OX40 que as células T CD8+. O gráfico mostra intensidade de fluorescência de média geométrica (GMFI) de CD4+ ou células

T CD8+ tratadas com G1AA/MOR7480.1 ou G1AA/11D4. A ligação de G1AA/MOR7480.1 ao CD137 é uma medição de expressão de CD137 e a ligação de G1AA/11D4 a OX40 é uma medição de expressão de OX40.

[0045] A Figura 7 mostra a atividade de mAb e mAb2 CD137 anti-camundongo em um ensaio de ativação de célula T.

[0046] As Figuras 7A e B mostram a liberação de IL-2 na presença de concentrações crescentes de um mAb2 que se liga a receptores de OX40 de camundongo e CD137 de camundongo (FS20m-232-91AA/Lob12.3), e anticorpos de controle, na ausência (Figura 7A) e presença (Figura 7B) de um agente de reticulação artificial (anticorpo CH2 anti-humano ou FITC- dextrano, como adequado). Os controles foram anticorpos G1/4420 (anti-FITC), G1AA/OX86 (anti-mOX40), G1AA/Lob12.3 (anti-mCD137), G1AA/OX86 mais G1AA/Lob12.3 em combinação, e FS20m-232-91AA/4420 (mAb2 simulado mOX40/FITC). Os resultados mostram que na ausência de um agente de reticulação, os controles G1AA/OX86, FS20m-232-91AA/4420, G1AA/Lob12.3, e a combinação de G1AA/OX86 e G1AA/Lob12.3 não teve atividade. Quando reticulados pelo anticorpo CH2 anti- humano ou FITC-dextrano, os controles G1AA/OX86, FS20m-232- 91AA/4420 e G1AA/OX86 mais G1AA/Lob12.3 exibiram um aumento dependente de concentração na ativação de células T. Um aumento marginal na atividade foi observado para o controle G1AA/Lob12.3 quando reticulado. O mAb2 OX40/CD137 mostrou boa atividade independentemente da presença de um agente de reticulação artificial. As Figuras 7C e D mostram a atividade de anticorpos anti-CD137 de camundongo diferentes (G1AA/Lob12.3 e G1AA/3H3) na ausência (Figura 7C) ou presença (Figura 7D) de um anticorpo de reticulação (clone MK1A6) em células DO11.10-mCD137 estimuladas por CD3. A atividade de G1AA/3H3 foi observada na presença e na ausência do anticorpo de reticulação enquanto a atividade do anticorpo G1AA/Lob12.3 foi observada apenas na presença do anticorpo de reticulação. Portanto, o anticorpo G1AA/3H3 é denominado “independente de reticulação” e O anticorpo G1AA/Lob12.3 é denominado “dependente de reticulação”.

[0047] A Figura 8 mostra um ensaio de competição para testar a atividade de clone de mAb2 OX40/CD137 humano FS20- 22-49AA/FS30-10-16 na presença de um excesso de 100 vezes de um mAb2 simulado que alveja OX40 humano (FS20-22-49AA/4420), um anticorpo CD137 anti-humano (G1AA/FS30-10-16) ou suas combinações. Os dados das duplicatas são mostrados como desvio padrão (SD) mais ou menos médio. O teste estatístico foi realizado por um ANOVA de uma via e múltiplos testes de comparação da Dunnett. Os asteriscos acima das barras de erro representam a diferença significativa em comparação com amostras tratadas com controle de isotipo (G1/4420) (*** p<0,0002). Os resultados mostram que a atividade do mAb2 OX40/CD137 foi amplamente reduzida quando superado tanto pelo mAb2 simulado FS20-22-49AA/4420 para ligação ao OX40 e o mAb G1AA/FS30-10-16 para ligação ao CD137, as em comparação com quando o mAb2 OX40/CD137 teve a capacidade para ligar tanto os receptores na ausência do anti-OX40 quanto os anticorpos anti-CD137. A combinação do mAb2 simulado que alveja OX40 FS20-22-49AA/4420 e o mAb anti-CD137 G1AA/FS30- 10-16 diminuiu adicionalmente a atividade do mAb2 OX40/CD137. Esses resultados indicam que a fim de que o mAb2 OX40/CD137 induza a ativação de célula T por meio agrupamento e agonismo de OX40 e CD137, a ligação dupla do mAb2 para ambos os receptores é exigida.

[0048] A Figura 9 mostra um ensaio de competição para testar a atividade de mAb2 OX40/CD137 de camundongo FS20m- 232-91AA/Lob12.3 na presença de um excesso de 100 vezes do mAb2 simulado que alveja OX40 FS20m-232-91AA/4420, o mAb anti-CD137 G1/Lob12.3 ou o mAb controle negativo G1AA/4420 (anti-FITC). Os resultados mostram que a atividade do mAb2 foi amplamente reduzida quando superado pelo mAb G1/Lob12.3 para ligação ao CD137 e também foi reduzida a um nível baixo quando superado pelo mAb2 simulado FS20m-232-91AA/4420 para se ligar ao OX40, como em comparação com quando o mAb2 teve a capacidade para se ligar tanto aos receptores na ausência dos anticorpos anti-OX40 e anti-CD137. Como esperado, um nível similar de atividade foi observado para o mAb2 quando na presença de um excesso do mAb controle negativo como quando na ausência desse e os anticorpos anti-OX40 e anti- CD137. Esses resultados indicam que a fim de que o mAb2 induza a ativação de célula T por meio agrupamento e agonismo de OX40 e CD137, em que a ligação dupla do mAb2 a ambos os receptores é exigida.

[0049] A Figura 10 mostra a atividade antitumoral de mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral singênico CT26. Na Figura 10A, os volumes tumorais CT26 médios (mais ou menos o erro padrão da média) de camundongos tratados com Balb/c com G1/OX86 (controle positivo de anti-OX40 sem a mutação LALA), G1/Lob12.3 (anti-CD137 controle positivo sem a mutação LALA), G1/4420 (controle de IgG), a combinação de G1/OX86 e G1/Lob12.3, a combinação do mAb anti-OX40 G1AA/OX86 e o mAb anti-CD137 G1AA/Lob12.3 (ambos com a mutação LALA), FS20m-232-91/Lob12.3 (mAb2 OX40/CD137 sem a mutação LALA) e FS20m-232-91AA/Lob12.3 (mAb2 OX40/CD137 com a mutação LALA) são mostrados.

Os resultados mostram que o tratamento com o mAb2 OX40/CD137 tanto com quanto sem a mutação LALA (FS20m-232-91AA/Lob12.3 e FS20m-232- 91/Lob12.3, respectivamente) resultou em uma redução em crescimento tumoral em comparação com o tratamento com o anticorpo anti-OX40 G1/OX86, o anticorpo anti-CD137 G1/Lob12.3, a combinação desses dois anticorpos (G1/OX86 mais G1/Lob12.3), e a combinação dos anticorpos anti-OX40 e anti-CD137 que contêm LALA (G1AA/OX86 mais G1AA/Lob12.3). A Figura 10B mostra os volumes tumorais (ao longo do tempo) de camundongos que portam tumor CT26 individual tratados por meio injeção intraperitoneal com 3 mg/kg de controle de isotipo (clone G1AA/4420), mAb2 simulado mOX40/FITC (clone FS20m-232-91AA/4420), mAb anti-mCD137 (clone G1AA/Lob12.3), a combinação de mAb2 simulado mOX40/FITC e mAb anti-mCD137, ou mAb2 mOX40/CD137 (clone FS20m-232-91AA/Lob12.3). As linhas pontilhadas horizontais indicam em que 0 mm3 está no eixo geométrico y.

Qualitativamente, mAb2 mOX40/CD137 e a combinação de mAb2 simulado mOX40/FITC e mAb anti-mCD137 inibiu crescimento tumoral de CT26 em um subconjunto de animais.

A Figura 10C mostra os volumes tumorais médios (mais ou menos o erro padrão da média) dos camundongos que portam tumor CT26 individualmente representados na Figura 10B.

O grupo tratado com o mAb2 mOX40/CD137 teve um atraso de fase de crescimento tumoral precoce (dias 10-22) em comparação com o grupo de controle de isotipo.

O mAb anti- mCD137 e o mAb2 simulado mOX40/FITC não teve efeito em taxas de crescimento tumoral precoce como agentes únicos ou em combinação.

A Figura 10D mostra a plotagem de sobrevivência

Kaplan-Meier dos mesmos camundongos que portam tumor CT26 representados na Figura 10B e 10C. A análise de sobrevivência mostra que o tratamento com o mAb2 mOX40/CD137, mas não com o mAb anti-mCD137 e o mAb2 simulado mOX40/FITC como agentes únicos ou em combinação, resultou em aumentos estatisticamente significativos em sobrevivência em comparação com o controle de isotipo. (Comparação em pares foi realizada com o uso de teste de classificação de log (Mantel-Cox); **** p ≤ 0,0001, ns = não estatisticamente significativo.)

[0050] A Figura 11 mostra a atividade antitumoral de um mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral singênico B16-F10. Os camundongos foram tratados com FS20m- 232-91AA/Lob12.3 (mAb2 OX40/CD137) ou G1/4420 (controle de IgG). A média de erro padrão mais ou menos de volume tumoral médio é plotado. Os resultados mostram que o mAb2 OX40/CD137 teve a capacidade para reduzir significativamente o crescimento tumoral em um modelo singênico B16-F10 em comparação com camundongos tratados com o anticorpo de controle G1/4420.

[0051] A Figura 12 mostra a atividade de um mAb2 OX40/CD137 em combinação com um anticorpo anti-PD-1 ou anti- PD-L1 em um ensaio SEA. O mAb2 testado foi FS20-22-49AA/FS30- 10-16. Os controles foram G1/4420 (anti-FITC), G1AA/S1 (anti-PD-L1; Figura 12A), G1AA/5C4 (anti-PD-1; Figura 12B), testados na presença ou na ausência do mAb2 FS20-22- 49AA/FS30-10-16. Os resultados mostram uma diminuição dependente de concentração na ativação de células T quando o FS20-22-49AA/FS30-10-16 estava presente e que a adição de G1AA/S1 ou G1AA/5C4 ao mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 aumentou a liberação de IL-2 (resposta máxima) como em comparação com as células T tratadas com o mAb2 por si só. Nenhuma atividade foi observada quando as células T foram tratadas com os anticorpos de controle por si só. O teste estatístico entre grupos G1/4420 mais FS20-22-49AA/FS30-10-16 e G1AA/S1 mais FS20-22-49AA/FS30-10-16 (Figura 12A) ou G1/4420 mais FS20- 22-49AA/FS30-10-16 e G1AA/5C4 mais FS20-22-49AA/FS30-10-16 (Figura 12B) foi realizado com o uso de ANOVA de duas vias e teste de múltiplas comparações de Tukey com asteriscos indicando o valor p (* p < 0,032, ** p < 0,0021, *** p < 0,0002, **** p < 0,0001).

[0052] A Figura 13 mostra a atividade antitumoral de um mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo e um antagonista PD-1 em um modelo tumoral de camundongo CT26, tesado unicamente e em combinação. Os volumes tumorais em camundongos que portam tumor CT26 tratados com (Figura 13A) uma combinação de anticorpos de controle de isotipo (G1AA/4420 e mIgG1/4420), (Figura 13B) um anticorpo PD-1 anti-camundongo, (Figura 13C) um mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo (mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3), ou (Figura 13D) uma combinação de um anticorpo PD-1 anti-camundongo e o mAb2 anti-OX40/CD137 de camundongo, mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 são mostrados. A proporção de camundongos com tumores regredidos (definidos como um volume tumoral menor que ou igual a 62,5 mm3) no término do estudo, 60 dias após a inoculação celular, são mostrados para cada grupo de tratamento. Os resultados mostram que a combinação de um anticorpo antagonista anti- PD-1 e FS20m-232-91AA/Lob12.3 resultou em proporção mais alta de animais, 7 dentre 15 (47 %), com resposta de regressão tumoral completa (Figura 13D). Os camundongos submetidos a tratamento com agente único com anticorpo anti- PD-1 (Figura 13B) ou FS20m-232-91AA/Lob12.3 (Figura 13C) mostraram 0 % e 7 % de regressão tumoral no fim do estudo, respectivamente. A Figura 13E mostra uma plotagem de sobrevivência Kaplan-Meier de camundongos que portam tumor CT26 tratados como descrito pelas Figuras 13A-D. A análise de sobrevivência mostrou que a combinação de FS20m-232- 91AA/Lob12.3 e o anticorpo anti PD-1, resultou em um benefício de sobrevivência estatisticamente significativo em comparação com os anticorpos de controle de isotipo (teste de classificação de log (Mantel Cox), p < 0,0001). Nenhuma diferença de sobrevivência significativa foi observada para tratamentos de agente único em comparação com os anticorpos de controle de isotipo.

[0053] A Figura 14 mostra dependente de dose, atividade antitumoral de um mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral singênico CT26. A Figura 14A mostra volumes tumorais de camundongos que portam tumor CT26 tratados por meio injeção intraperitoneal (i.p.) com 10 mg/kg de anticorpo de controle de isotipo (G1AA/4420), ou 0,1, 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3. A proporção de camundongos com tumores regredidos (definidos como um volume tumoral menor que ou igual a 62,5 mm3) no fim do estudo, 67 dias após a inoculação celular, é mostrada para cada grupo de tratamento (consultar o lado direito superior de cada gráfico). Os resultados mostram que 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 resultaram em regressão tumoral em 4 % (1/25), 4 % (1/25), 8 % (2/25) e 4 % (1/25) de animais no fim do estudo, respectivamente. Nenhum dos animais no controle de isotipo e grupos de 0,1 mg/kg de FS20m-232-

91AA/Lob12.3 mostrou regressão tumoral. A Figura 14B mostra uma plotagem de sobrevivência Kaplan-Meier de camundongos que portam tumor CT26 tratados como descrito pela Figura 14A. A análise de sobrevivência mostrou queFS20m-232- 91AA/Lob12.3 em todos os níveis de dose testados resultaram em benefício de sobrevivência estatisticamente significativo em comparação com o controle de isotipo. A comparação de grupos de 1 e 3 mg/kg, e grupos de 3 e 10 mg/kg, não mostrou diferença estatística em sobrevivência. A comparação em pares foi realizada entre cada grupo e controle de isotipo de 10 mg/kg, salvo caso indicado, com o uso de teste de classificação de log (Mantel- Cox); * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,0005, **** p ≤ 0,0001, ns = não estatisticamente significativo.

[0054] A Figura 15 mostra uma comparação da eficácia antitumoral de anticorpos mAb2 OX40/CD137 que contém clones de Fab anti-CD137 diferentes em um modelo tumoral singênico CT26. A Figura 15A mostra os volumes tumorais CT26 médios em camundongos BALB/c tratados com G1/4420 (controle de IgG), FS20m-232-91AA/Lob12.3 (mAb2 OX40/CD137 com clone agonista CD137 dependente de reticulação Lob12.3) e FS20m- 232-91AA/3H3 (mAb2 OX40/CD137 com clone agonista CD137 independente de reticulação 3H3). Os volumes tumorais médios mais ou menos do padrão de erro da média são mostrados. Os resultados mostram que o tratamento com dos anticorpos mAb2 OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3 ou FS20m-232-91AA/3H3) resultou em a redução em crescimento tumoral em comparação com o tratamento com o anticorpo de controle de isotipo (G1/4420) e que nenhuma diferença no nível de redução foi observada em camundongos tratados com FS20m-232-

91AA/Lob12.3 ou FS20m-232-91AA/3H3. A Figura 15B mostra uma plotagem de sobrevivência Kaplan-Meier de camundongos que portam tumor CT26 tratados como descrito pela Figura 15A. A análise de sobrevivência mostrou que o tratamento com o mAb2 OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3 ou FS20m-232-91AA/3H3) resultou em um benefício de sobrevivência estatisticamente significativo em comparação com o tratamento com o anticorpo de controle de isotipo (teste de classificação de log (Mantel Cox); p < 0,05) mas que nenhuma diferença foi observada entre camundongos tratados com qualquer um dos mAb2 OX40/CD137. Descrição Detalhada

[0055] Aspectos e modalidades da presente invenção serão agora discutidos com referência às figuras anexas. Aspectos e modalidades adicionais serão evidentes àqueles elementos versados na técnica. Todos os documentos mencionados neste texto estão incorporados ao presente documento a título de referência.

[0056] A presente invenção se refere a moléculas de anticorpo que se ligam a CD137 e OX40. Especificamente, as moléculas de anticorpo da presente invenção compreendem um sítio de ligação um antígeno baseado em CDR para CD137 e um sítio de ligação um antígeno OX40 localizado em um domínio constante da molécula de anticorpo. Os termos "CD137" e "OX40" podem se referir a CD137 humano e OX40 humano, CD137 murino e OX40 murino, e/ou CD137 de macaco cinomolgo e OX40 de macaco cinomolgo, a menos que o contexto indique de outro modo. De preferência os termos "CD137" e "OX40" se referem a CD137 humano e OX40 humano, a menos que o contexto exija de outro modo.

[0057] O termo "molécula de anticorpo" descreve uma imunoglobulina natural ou produzida parcial ou totalmente de modo sintético. A molécula de anticorpo pode ser humana ou humanizada, preferencialmente, humana. A molécula de anticorpo é, de preferência, uma molécula de anticorpo monoclonal. Exemplos de anticorpos são os isotipos de imunoglobulina, como imunoglobulina G, e suas subclasses isotípicas, como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como fragmentos das mesmas. A molécula de anticorpo pode ser isolada, no sentido de ser livre de contaminantes, como anticorpos com a capacidade para se ligarem a outros polipeptídeos e/ou componentes séricos.

[0058] O termo “molécula de anticorpo”, como usado no presente documento, desse modo, inclui fragmentos de anticorpo, contanto que os ditos fragmentos compreendam um sítio de ligação a antígeno à base de CDR para CD137 e um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio constante. A menos que o contexto exija de outro modo, o termo "molécula de anticorpo", conforme usado no presente documento, é, assim, equivalente a "molécula de anticorpo ou fragmento da mesma".

[0059] É possível considerar anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Essas técnicas podem envolver introduzir as CDRs, ou regiões variáveis e/ou as sequências de domínio constante que fornecem o sítio de ligação um antígeno OX40, em uma imunoglobulina diferente. A introdução das CDRs de uma imunoglobulina em outra imunoglobulina é descrita, por exemplo, no documento EP-A-

184187, GB 2188638A ou EP-A-239400. Técnicas semelhantes podem ser empregadas para as sequências de domínio constante relevantes. Alternativamente, um hibridoma ou outra célula que produz uma molécula de anticorpo pode ser submetida a mutação genética ou outras mudanças, que podem ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

[0060] Visto que os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo "molécula de anticorpo" deve ser interpretado como abrangendo fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo que compreenda um domínio de ligação de imunoglobulina, natural ou total ou parcialmente sintético. As moléculas quiméricas que compreendem um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundidas a outro polipeptídeo estão, portanto, incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas nos documentos EP-A-0120694 e EP-A-0125023.

[0061] Um exemplo de um anticorpo fragmento que compreende tanto sequências de CDR quanto domínio CH3 é um minicorpo, que compreende um scFv ligado a um domínio CH3 (Hu et al., 1996).

[0062] A molécula de anticorpo da presente invenção se liga a CD137 e OX40. A ligação nesse contexto pode se referir a uma ligação específica. O termo "específico" pode se referir à situação em que a molécula de anticorpo não mostrará qualquer ligação significativa a moléculas diferentes de sua parceira (ou suas parceiras) de ligação específica, no presente documento, CD137 e OX40. O termo "específico" também é aplicável quando a molécula de anticorpo é específica para epítopos particulares, como epítopos em CD137 e OX40, que são portados por vários antígenos, nesse caso, a molécula de anticorpo será capaz de se ligar aos vários antígenos que portam o epítopo. Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo da presente invenção não se liga, ou não mostra qualquer ligação significativa, a TNFRSF1A, TNFRSF1B, GITR, NGFR, CD40 e/ou DR6.

[0063] Anticorpos e métodos para suas construções e usos são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Holliger e Hudson (2005). É possível considerar anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver introduzir CDRs ou regiões variáveis de uma molécula de anticorpo em uma molécula de anticorpo diferente (documentos EP-A-184187, GB 2188638A e EP-A-239400).

[0064] Um sítio de ligação a antígeno à base de CDR é um sítio de ligação a antígeno em uma região variável de anticorpo. Um sítio de ligação a antígeno à base de CDR, pode ser formado por três CDRs, como as três CDRs de domínio variável de cadeia leve (VL) ou três CDRs de domínio variável de cadeia pesada (VH). Preferencialmente, o sítio de ligação a antígeno à base de CDR é formado por seis CDRs, três CDRs de VL e três CDRs de VH. As contribuições das CDRs diferentes com a ligação do antígeno podem variar em sítios de ligação do antígeno diferentes.

[0065] As três CDRs de domínio VH do sítio de ligação a antígeno podem estar localizadas em um domínio VH de imunoglobulina e as três CDRs de domínio VL podem estar localizadas em um domínio VL de imunoglobulina. Por exemplo, o sítio de ligação a antígeno à base de CDR pode estar localizado em uma região variável de anticorpo.

[0066] A molécula de anticorpo pode ter um ou, preferencialmente, mais que um, por exemplo dois, sítios de ligação do antígeno à base de CDR para o primeiro antígeno. A molécula de anticorpo, desse modo, pode compreender um domínio VH e um domínio VL, mas, preferencialmente, compreende dois domínios VH e dois domínios VL, isto é, dois pares de domínio VH/VL, como é o caso em moléculas de IgG de ocorrência natural, por exemplo.

[0067] O sítio de ligação a antígeno com base em CDR pode compreender os três CDRs de VH ou três CDRs de VL, preferencialmente, os três CDRs de VH e os três CDRs de VL, de anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, ou FS30-35- 14, ou FS30-5-37, preferencialmente, anticorpo FS30-10-16.

[0068] As sequências de domínio VH e VL desses anticorpos são apresentadas como o seguinte: (i) as sequências de domínio VH e VL para SEQ ID NOs FS30-10-16 são mostradas em SEQ ID NOs 12 e 14, respectivamente; (ii) as sequências de domínio VH e VL para SEQ ID NOs FS30-10-3 são mostradas em SEQ ID NOs 18 e 14, respectivamente; (iii) as sequências de domínio VH e VL para SEQ ID NOs FS30-10-12 são mostradas em SEQ ID NOs 23 e 14, respectivamente; (iv) as sequências de domínio VH e VL para SEQ ID NOs FS30-35-14 são mostradas em SEQ ID NOs 170 e 172, respectivamente; e

(v) as sequências de domínio VH e VL para SEQ ID NOs FS30-5-37 são mostradas em SEQ ID NOs 40 e 42, respectivamente.

[0069] A pessoa versada na técnica não teria dificuldade em determinar as sequências das CDRs a partir das sequências de domínio VH e VL dos anticorpos apresentados acima. As sequências de CDR podem, por exemplo, ser determinadas de acordo com Kabat (Kabat et al., 1991) ou o sistema de informações internacional ImMunoGeneTics (IMGT) (Lefranc et al., 2015).

[0070] As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de domínio VH da molécula de anticorpo, de acordo com a numeração IMGT, podem ser as sequências localizadas nas posições 27-38, 56- 65 e 105-117, do domínio VH da molécula de anticorpo, respectivamente.

[0071] As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de domínio VH da molécula de anticorpo, de acordo com a numeração Kabat, podem ser as sequências localizadas nas posições 31-35, 50- 65 e 95-102 do domínio VH, respectivamente.

[0072] As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de domínio VL da molécula de anticorpo, de acordo com a numeração IMGT, podem ser as sequências localizadas nas posições 27-38, 56- 65 e 105-117, do domínio VL, respectivamente.

[0073] As sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de domínio VL da molécula de anticorpo, de acordo com a numeração Kabat, podem ser as sequências localizadas nas posições 24-34, 50- 56 e 89-97 do domínio VL, respectivamente.

[0074] Por exemplo, a molécula de anticorpo pode compreender a sequência da CDR1 de domínio VH, CDR2 e CDR3 de:

(i) SEQ ID NOs 1, 2 e 3, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 1, 2 e 16, respectivamente [FS30-10- 3]; (iii) SEQ ID NOs 1, 2 e 21, respectivamente [FS30- 10-12]; (iv) SEQ ID NOs 25, 26 e 27, respectivamente [FS30-35- 14]; ou (v) SEQ ID NOs 33, 34 e 35, respectivamente [FS30-5- 37], em que as sequências de CDR são definidas de acordo com o esquema de numeraçãoImMunoGeneTics (IMGT).

[0075] A molécula de anticorpo pode compreender a sequência da CDR1, CDR2 e CDR3 de domínio VH de: (i) SEQ ID NOs 7, 8 e 9, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 7, 8 e 17, respectivamente [FS30-10- 3]; (iii) SEQ ID NOs 7, 8 e 22, respectivamente [FS30- 10-12]; (iv) SEQ ID NOs 29, 30 e 31, respectivamente [FS30-35- 14]; ou (v) SEQ ID NOs 37, 38 e 39, respectivamente [FS30-5- 37], em que as sequências de CDR são definidas de acordo com o esquema de numeração Kabat.

[0076] Por exemplo, a molécula de anticorpo pode compreender a sequência da CDR1 de domínio VL, CDR2 e CDR3 de: (i) SEQ ID NOs 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-3]; (iii) SEQ ID NOs 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-

10-12]; (iv) SEQ ID NOs 4, 5 e 28, respectivamente [FS30-35- 14]; ou (v) SEQ ID NOs 4, 5 e 36, respectivamente [FS30-5-37], em que as sequências de CDR são definidas de acordo com o esquema de numeraçãoImMunoGeneTics (IMGT).

[0077] Por exemplo, a molécula de anticorpo pode compreender a sequência da CDR1 de domínio VL, CDR2 e CDR3 de: (i) SEQ ID NOs 10, 11 e 6, respectivamente [FS30-10- 16]; (ii) SEQ ID NOs 10, 11 e 6, respectivamente [FS30-10- 3]; (iii) SEQ ID NOs 10, 11 e 6, respectivamente [FS30- 10-12]; (iv) SEQ ID NOs 10, 11 e 28, respectivamente [FS30-35- 14]; ou (v) SEQ ID NOs 10, 11 e 36, respectivamente [FS30-5- 37], em que as sequências de CDR são definidas de acordo com o esquema de numeração Kabat.

[0078] As sequências de VH e VL de anticorpos FS30-10-16, FS30-10-3, e FS30-10-12 são idênticas com a exceção do resíduo na posição 109 do VH, de acordo com o esquema de numeração IMGT (resíduo 97 do VH de acordo com o esquema de numeração Kabat). Desse modo, a molécula de anticorpo pode compreender as sequências de domínio CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e/ou sequências de domínio CDR1, CDR2 e CDR3 de VL, sequência de domínio VH e/ou sequência de domínio VL, de anticorpo FS30-10-16, em que a molécula de anticorpo compreende opcionalmente uma substituição de aminoácido na posição 109 da cadeia pesada, de acordo com o esquema de numeração IMGT (resíduo 97 da cadeia pesada, de acordo com o esquema de numeração Kabat), em que o resíduo na dita posição é, preferencialmente, selecionado a partir do grupo que consiste em asparagina (N), treonina (T) e leucina (L).

[0079] O sítio de ligação a antígeno com base em CDR pode compreender os domínios VH ou VL, preferencialmente, os domínios VH e VL, de anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30- 10-12, FS30-35-14, ou FS30-5-37, preferencialmente, anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, ou FS30-35-14, mais preferencialmente, anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, ou FS30-10-12, com máxima preferência, anticorpo FS30-10-16.

[0080] O domínio VH de anticorpos FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, FS30-35-14, e FS30-5-37 pode ter a sequência estabelecida em SEQ ID NOs 12, 18, 23, 170, e 40, respectivamente. O domínio VL de anticorpos FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, FS30-35-14, e FS30-5-37 pode ter a sequência estabelecida em SEQ ID NOs 14, 14, 14, 172, e 42, respectivamente.

[0081] A molécula de anticorpo da invenção compreende um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio constante da molécula de anticorpo. O domínio constante pode ser um domínio CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4, preferencialmente um domínio constante é um domínio CH1, CH2 ou CH3, mais preferencialmente, um domínio CH2 ou CH3, com máxima preferência, um domínio CH3.

[0082] Aminoácido posições de resíduo do domínio constante são numerados no presente documento de acordo com o esquema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT), salvo caso indicação contrária. O esquema de numeração IMGT é descrito em Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)).

[0083] O sítio de ligação a antígeno OX40 pode compreender uma primeira, segunda e terceira sequências, localizada em uma primeira, segunda e terceira alças estruturais do domínio constante, respectivamente. A modificação genética de alças estruturais de domínio constante de anticorpo para criar sítios de ligação a antígeno para antígenos-alvo é conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Wozniak-Knopp et al., 2010, e publicações de patente nº WO2006/072620 e WO2009/132876. Preferencialmente, as primeira, segunda e terceira alças estruturais são as alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3 da molécula de anticorpo, respectivamente. No domínio CH3, as alças estruturais AB, CD e EF estão localizadas nos resíduos 11-18, 43-78 e 92-101 do domínio CH3, respectivamente. A modificação das sequências de alças estruturais de anticorpo domínios constantes para criar novos sítios de ligação a antígeno é descrita, por exemplo, nos documentos WO2006/072620 e WO2009/132876.

[0084] Em uma modalidade preferida, o sítio de ligação a antígeno OX40 da molécula de anticorpo compreende a primeira, segunda e terceira sequências de: (i) FS20-22-49 estabelecido em SEQ ID NOs 51, 52 e 53, respectivamente; (ii) FS20-22-38 estabelecido em SEQ ID NOs 51, 59 e 60, respectivamente; (iii) FS20-22-41 estabelecido em SEQ ID NOs 51, 52 e 60, respectivamente; (iv) FS20-22-47 estabelecido em SEQ ID NOs 51, 52 e 65, respectivamente; ou

(v) FS20-22-85 estabelecido em SEQ ID NOs 51, 52 e 68, respectivamente.

[0085] O sítio de ligação a antígeno OX40 pode compreender as sequências de alças estruturais AB, CD e EF de FS20-22- 49, FS20-22-38, FS20-22-41, FS20-22-47, ou FS20-22-85, em que as alças estruturais AB, CD e EF são as sequências localizadas nos resíduos 11-18, 43-78 e 92-101 do domínio CH3, respectivamente e o domínio CH3 de FS20-22-49, FS20-22- 38, FS20-22-41, FS20-22-47, ou FS20-22-85 é estabelecido em SEQ ID NO: 54, 61, 63, 66 e 69, respectivamente.

[0086] Em uma modalidade mais preferida, o sítio de ligação a antígeno OX40 da molécula de anticorpo compreende as primeira, segunda e terceira sequências de FS20-22-49 estabelecidas em SEQ ID NOs 51, 52 e 53, respectivamente. Por exemplo, o sítio de ligação a antígeno OX40 pode compreender as sequências de alças estruturais AB, CD e EF de FS20-22-49 estabelecido em SEQ ID NOs 56, 57 e 58, respectivamente.

[0087] Em que o sítio de ligação a antígeno OX40 da molécula de anticorpo compreende as primeira, segunda e terceira sequências de FS20-22-38, FS20-22-41, FS20-22-47, FS20-22-49, ou FS20-22-85, em que as primeira, segunda e terceira sequências estão, preferencialmente, localizadas nas posições 14 a 18, 45.1 a 77, e 93 a 101 do domínio CH3 da molécula de anticorpo, respectivamente.

[0088] Em que o sítio de ligação a antígeno OX40 compreende as sequências de alças estruturais AB, CD e EF de FS20-22-38, FS20-22-41, FS20-22-47, FS20-22-49, ou FS20-22- 85, em que as sequências de alças estruturais AB, CD e EF estão, preferencialmente, localizadas nas posições 11 a 18,

43 a 78 e 92 a 101 do domínio CH3 da molécula de anticorpo, respectivamente.

[0089] A molécula de anticorpo pode compreender adicionalmente uma leucina (L) na posição 91 do domínio CH3 da molécula de anticorpo. Em particular, uma molécula de anticorpo que compreende um sítio de ligação a antígeno OX40 que compreende as primeira, segunda e terceira sequências de FS20-22-85 pode compreender uma leucina na posição 91 do domínio CH3 da molécula de anticorpo.

[0090] Em uma modalidade alternativa, o sítio de ligação a antígeno OX40 da molécula de anticorpo compreende as primeira, segunda e terceira sequências de: (i) FS20-31-58 estabelecido em SEQ ID NOs 71, 72 e 73, respectivamente; (ii) FS20-31-66 estabelecido em SEQ ID NOs 71, 72 e 76, respectivamente; (iii) FS20-31-94 estabelecido em SEQ ID NOs 79, 80 e 81, respectivamente; (iv) FS20-31-102 estabelecido em SEQ ID NOs 84, 85 e 76, respectivamente; (v) FS20-31-108 estabelecido em SEQ ID NOs 84, 88 e 89, respectivamente; ou (vi) FS20-31-115 estabelecido em SEQ ID NOs 84, 92 e 89, respectivamente.

[0091] O sítio de ligação a antígeno OX40 pode compreender as sequências de alças estruturais AB, CD e EF de FS20-31- 58, FS20-31-66, FS20-31-94, FS20-31-102, FS20-31-108, ou FS20-31-115, em que as alças estruturais AB, CD e EF são as sequências localizadas nos resíduos 11-18, 43-78 e 92-101 do domínio CH3, respectivamente e o domínio CH3 de FS20-31-58,

FS20-31-66, FS20-31-94, FS20-31-102, FS20-31-108 ou FS20-31- 115 é estabelecido em SEQ ID NO: 54, 61, 63, 66 e 69, respectivamente.

[0092] Em que o sítio de ligação a antígeno OX40 da molécula de anticorpo compreende as primeira, segunda e terceira sequências de FS20-31-58, FS20-31-66, FS20-31-94, FS20-31-102, FS20-31-108, ou FS20-31-115, em que as primeira, segunda e terceira sequências estão, preferencialmente, localizadas nas posições 14 a 18, 45.1 a 77, e 92 a 101 do domínio CH3 da molécula de anticorpo, respectivamente.

[0093] Em que o sítio de ligação a antígeno OX40 compreende as sequências de alças estruturais AB, CD e EF de FS20-31-58, FS20-31-66, FS20-31-94, FS20-31-102, FS20-31- 108, ou FS20-31-115, em que as sequências de alças estruturais AB, CD e EF estão, preferencialmente, localizadas nas posições 11 a 18, 43 a 78, e 92 a 101 do domínio CH3 da molécula de anticorpo, respectivamente.

[0094] Como uma alternativa à numeração IMGT, as posições de resíduo de aminoácido no domínio constante, que incluem a posição de sequências de aminoácido, substituições, deleções e inserções, como descrito no presente documento, podem ser numeradas de acordo com numeração éxon IMGT (também denominada numeração consecutiva), numeração EU, ou numeração Kabat. A concordância entre numeração IMGT, numeração éxon IMGT, numeração EU, e numeração Kabat do posições de resíduo do domínio CH3 são mostradas na Figura

1.

[0095] Desse modo, por exemplo, em que o presente pedido se refere às primeira, segunda e terceira sequências que estão localizadas nas posições 14 a 18, 45.1 a 77, e 93 a 101 do domínio CH3 da molécula de anticorpo, respectivamente, em que o posições de resíduo são numeradas de acordo com o esquema de numeração IMGT, em que as primeira, segunda e terceira sequências estão localizadas nas posições 18 a 22, 46 a 50, e 74 a 82 do domínio CH3, em que as resíduo posições são numeradas de acordo com o esquema de numeração éxon IMGT, como mostrado na Figura 1.

[0096] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo compreende um domínio CH3 que compreende, tem ou consiste na sequência de domínio CH3 de FS20-22-38, FS20-22-41, FS20-22- 47, FS20-22-49, FS20-22-85, FS20-31-58, FS20-31-66, FS20-31- 94, FS20-31-102, FS20-31-108, ou FS20-31-115, em que a sequência de domínio CH3 de FS20-22-38, FS20-22-41, FS20-22- 47, FS20-22-49, FS20-22-85, FS20-31-58, FS20-31-66, FS20-31- 94, FS20-31-102, FS20-31-108, e FS20-31-115 é estabelecido em SEQ ID NOs 54, 61, 63, 66, 69, 74, 77, 82, 86, 90 e 93, respectivamente.

[0097] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo compreende um domínio CH3 que compreende, tem ou consiste na sequência de domínio CH3 de FS20-22-49 apresentada em SEQ ID NO 54.

[0098] O domínio CH3 da molécula de anticorpo pode opcionalmente compreender um resíduo de lisina adicional (K) na C-terminal imediato da sequência de domínio CH3.

[0099] Além disso, a molécula de anticorpo da invenção pode compreender um domínio CH2 de uma molécula de imunoglobulina G, como um domínio CH2 de uma molécula de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. De preferência a molécula de anticorpo da invenção compreende um domínio CH2 de uma molécula de IgG1. O domínio CH2 pode ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 48.

[0100] O domínio CH2 da molécula de anticorpo pode compreender uma ou mais mutações que reduzem ou anulam a ligação do domínio CH2 a um ou mais receptores Fcγ, como FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, e/ou a complemento. Os inventores postularam que reduzir ou anular a ligação aos receptores Fcγ diminuirá ou eliminará ADCC mediado pela molécula de anticorpo. De modo similar, espera-se que reduzir ou anular a ligação ao complemento reduza ou elimine CDC mediado pela molécula de anticorpo. As mutações para diminuir ou anular a ligação do domínio CH2 a um ou mais receptores Fcγ e/ou complemento são conhecidas na técnica (Wang et al., 2018). Essas mutações incluem a "mutação LALA" descrita em Bruhns et al., 2009 e Hezareh et al., 2001, que envolve a substituição dos resíduos de leucina nas posições IMGT 1,3 e 1,2 do domínio CH2 com alanina (L1.3A e L1.2A). Alternativamente, a geração de anticorpos de a-glicosil através de mutação do sítio de glicosilação ligado por N conservado mutando-se a aparagina (N) na posição IMGT 84,4 do domínio CH2 para alanina, glicina ou glutamina (N84.4A, N84.4G ou N84.4Q) também é conhecida por diminuir a função efetor de IgG1 (Wang et al., 2018). Como uma alternativa adicional, a ativação de complemento (ligação de C1q) e ADCC são conhecidos por serem reduzidos através de mutação da prolina na posição IMGT 114 do domínio CH2 para alanina ou glicina (P114A ou P114G) (Idusogie et al., 2000; Klein et al., 2016). Essas mutações também podem ser combinadas a fim de gerar moléculas de anticorpo com atividade de ADCC ou CDC adicionalmente reduzida ou nenhuma atividade.

[0101] Desse modo, a molécula de anticorpo pode compreender um domínio CH2, em que o domínio CH2 compreende: (i) resíduos de alanina nas posições 1,3 e 1,2; e/ou (ii) uma alanina ou glicina na posição 114; e/ou (iii) uma alanina, glutamina ou glicina na posição 84,4; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.

[0102] Em uma modalidade preferencial, a molécula de anticorpo compreende um domínio CH2, em que o domínio CH2 compreende: (i) um resíduo de alanina na posição 1.3; e (ii) um resíduo de alanina na posição 1.2; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.

[0103] Por exemplo, o domínio CH2 pode ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 49.

[0104] Em uma modalidade alternativa preferencial, a molécula de anticorpo compreende um domínio CH2, em que o domínio CH2 compreende: (i) um resíduo de alanina na posição 1.3; (ii) um resíduo de alanina na posição 1.2; e (iii) uma alanina na posição 114; em que a numeração de resíduo de aminoácido está de acordo com o esquema de numeração IMGT.

[0105] Por exemplo, o domínio CH2 pode ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 50.

[0106] Em uma modalidade preferencial, a molécula de anticorpo que se liga ao CD137 e OX40 compreende (a) um sítio de ligação a antígeno à base de CDR para CD137; e

(b) um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio CH3 da molécula de anticorpo; em que o sítio de ligação a antígeno com base em CDR compreende os três CDRs de VH e três CDRs de VL (CDRs 1-6) de anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, FS30-35-14, ou FS30-5-37, preferencialmente, FS30-10-16, FS30-10-3, ou FS30-10-12, mais preferencialmente, FS30-10-16 ou FS30-10- 3, com máxima preferência, FS30-10-16; e em que o sítio de ligação a antígeno OX40 compreende uma primeira sequência, uma segunda sequência e uma terceira sequência localizadas nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3, respectivamente, em que as primeira, segunda e terceira sequências têm a sequência de FS20-22-49 estabelecida em SEQ ID NOs 51, 52 e 53, respectivamente.

[0107] Em uma modalidade adicional preferencial, a molécula de anticorpo que se liga ao CD137 e OX40 compreende (a) um sítio de ligação a antígeno à base de CDR para CD137; e (b) um domínio CH3 que compreende, tem ou consiste na sequência estabelecida em SEQ ID NO: 54 [FS20-22-49]; em que o sítio de ligação a antígeno com base em CDR compreende os três CDRs de VH e três CDRs de VL (CDRs 1-6) de anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, FS30-35-14, ou FS30-5-37, preferencialmente, FS30-10-16, FS30-10-3, ou FS30-10-12, mais preferencialmente, FS30-10-16 ou FS30-10- 3, com máxima preferência, FS30-10-16.

[0108] Em uma modalidade ainda adicional preferencial, a molécula de anticorpo que se liga ao CD137 e OX40 compreende (a) um domínio VH e um domínio VL que compreende o sítio de ligação a antígeno à base de CDR para CD137; e

(b) um domínio CH3 que compreende, tem ou consiste na sequência estabelecida em SEQ ID NO: 54 [FS20-22-49]; em que os domínios VH e VL compreende, tem ou consiste nos VH e VL de anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, FS30-35-14, ou FS30-5-37, preferencialmente, FS30-10-16, FS30-10-3, ou FS30-10-12, mais preferencialmente, FS30-10- 16 ou FS30-10-3, com máxima preferência, FS30-10-16.

[0109] Em uma modalidade adicional preferida, a molécula de anticorpo que se liga ao CD137 e OX40 compreende uma cadeia pesada que compreende, tem ou consiste na cadeia pesada e na cadeia leve de anticorpo: (i) FS20-22-49AA/FS30-10-16 apresentadas em SEQ ID NOs 95 e 97, respectivamente; (ii) FS20-22-49AA/FS30-10-3 apresentadas em SEQ ID NOs 99 e 97, respectivamente; (iii) FS20-22-49AA/FS30-10-12 apresentadas em SEQ ID NOs 103 e 97, respectivamente; (iv) FS20-22-49AA/FS30-35-14 apresentadas em SEQ ID NOs 105 e 107, respectivamente; ou (v) FS20-22-49AA/FS30-5-37 apresentadas em SEQ ID NOs 109 e 111, respectivamente; em que a molécula de anticorpo preferencialmente, compreende a cadeia leve e cadeia pesada estabelecidas em (i) a (iv), mais preferencialmente, compreende a cadeia leve e cadeia pesada set out in (i) a (iii), com máxima preferência, compreende a cadeia leve e cadeia pesada estabelecidas em (i).

[0110] As moléculas de anticorpo da presente invenção também podem compreender variantes de uma primeira, segunda ou terceira sequência, sequência de alça estrutural de AB,

CD ou EF, sequências de domínio CH3, domínio CH2, domínio CH2 e CH3, CDR, domínio VH, domínio VL, cadeia leve e/ou cadeia pesada reveladas no presente documento. Variantes adequadas podem ser obtidas por meio de métodos de alteração de sequência, ou mutação e triagem. Em uma modalidade preferida, uma molécula de anticorpo que compreende uma ou mais sequências variantes mantém uma ou mais das características funcionais da molécula de anticorpo parental, como especificidade de ligação e/ou afinidade de ligação com CD137 e OX40. Por exemplo, uma molécula de anticorpo que compreende uma ou mais sequências variantes de preferência se liga a CD137 e/ou OX40 com a mesma afinidade, ou com uma afinidade maior, do que a molécula de anticorpo (parental). A molécula de anticorpo parental é uma molécula de anticorpo que não compreende a inserção (ou inserções), deleção (ou deleções) e/ou substituição (ou substituições) de aminoácido que foram incorporadas na molécula de anticorpo variante.

[0111] Por exemplo, uma molécula de anticorpo da invenção pode compreender uma primeira, segunda ou terceira sequência, sequência de alça estrutural de AB, CD ou EF, sequência de domínio CH3, domínio CH2, domínio CH2 e CH3, CDR, domínio VH, domínio VL, cadeia leve e/ou cadeia pesada que tem pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência com uma sequência de alça estrutural, domínio CH3, domínio CH2, domínio CH2 e CH3, CDR, FW, domínio VH, domínio VL, cadeia leve ou cadeia pesada revelada no presente documento.

[0112] Em uma modalidade preferencial, a molécula de anticorpo da invenção compreende uma sequência de domínio CH3 que tem pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência com a sequência de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 54 [FS20-22-49].

[0113] Em uma modalidade adicional preferencial, a molécula de anticorpo tem ou compreende uma sequência de domínio CH2, que tem pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,1 %, pelo menos 99,2 %, pelo menos 99,3 %, pelo menos 99,4 %, pelo menos 99,5 %, pelo menos 99,6 %, pelo menos 99,7 %, pelo menos 99,8 %, ou pelo menos 99,9 % de identidade de sequência com a sequência de domínio CH2 apresentada em SEQ ID NO: 48 ou 49.

[0114] A identidade de sequência é comumente definida com referência ao algoritmo GAP (pacote GCG Wisconsin, Accelerys Inc, San Diego, EUA). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de intervalos. De modo geral, parâmetros padrão são usados, com uma penalidade de criação de intervalo igual a 12 e uma penalidade de extensão de intervalo igual a 4. O uso de GAP pode ser preferencial, mas outros algorítimos podem ser usados, por exemplo, BLAST (que usa o método de Altschul et al., 1990), FASTA (que usa o método de Pearson e Lipman, 1988), ou o algoritmo de Smith-Waterman (Smith e Waterman, 1981), ou o programa TBLASTN, de Altschul et al., 1990 supra, que emprega, de modo geral, os parâmetros padrão. Em particular, o algoritmo psi-Blast (Altschul et al., 1997) pode ser usado.

[0115] Uma molécula de anticorpo da invenção também pode compreender uma primeira, uma segunda ou uma terceira sequência, sequência de alça estrutural de AB, CD ou EF, domínio CH3, domínio CH2, domínio CH2 e CH3, CDR, domínio VH, domínio VL, cadeia leve e/ou cadeia pesada que tem uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), preferencialmente, 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com uma primeira, uma segunda ou uma terceira sequência, sequência de alça estrutural de AB, CD ou EF, sequência de domínio CH3, domínio CH2, domínio CH2 e CH3, CDR, FW, domínio VH, domínio VL, cadeia leve ou cadeia pesada revelada no presente documento. Em particular, alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões de estrutura da molécula de anticorpo fora das sequências de domínio VH e VL e/ou em uma ou mais regiões de estrutura do domínio CH3. Por exemplo, as alterações podem ser no domínio CH3 fora das sequências descritas no presente documento como uma primeira, uma segunda e uma terceira sequências, ou como sequências de alça estrutural de AB, CD ou EF.

[0116] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo da invenção pode compreender uma sequência de domínio CH3 com uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), de preferência, 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com a sequência de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 54, 61, 63, 66, 69, 74, 77, 82, 86, 90, ou 93.

[0117] Em uma modalidade adicional preferencial, a molécula de anticorpo compreende uma sequência de domínio CH2, com uma ou mais alterações de sequência de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), preferencialmente 20 alterações ou menos, 15 alterações ou menos, 10 alterações ou menos, 5 alterações ou menos, 4 alterações ou menos, 3 alterações ou menos, 2 alterações ou menos, ou 1 alteração em comparação com a sequência de domínio CH2 apresentada em SEQ ID NO: 48 ou 49.

[0118] Em modalidades preferenciais em que um ou mais aminoácidos são substituídos com outro aminoácido, as substituições podem ser substituições conservativas, por exemplo, de acordo com a seguinte Tabela. Em algumas modalidades, aminoácidos na mesma categoria na coluna intermediária são substituídos por outro, isto é, um aminoácido não polar é substituído com outro aminoácido não polar, por exemplo. Em algumas modalidades, os aminoácidos na mesma linha na coluna da direita são substituídos por outros. ALIFÁTICO Não polar G A P

I L V

Polar - não carregado C S T M

N Q Polar - carregado D E

K R AROMÁTICO H F W Y

[0119] Em algumas modalidades, substituição (ou substituições) pode ser funcionalmente conservativa. Isto é, em algumas modalidades a substituição pode não afetar (ou pode não afetar substancialmente) uma ou mais propriedades funcionais (por exemplo, afinidade de ligação) da molécula de anticorpo que compreende a substituição como em comparação com a molécula de anticorpo não substituída equivalente.

[0120] A molécula de anticorpo preferencialmente se liga ao CD137 humano e OX40 humano. Preferencialmente, a molécula de anticorpo tem a capacidade para se ligar simultaneamente ao CD137 humano e a OX40 humano, em que CD137 humano e OX40 humano são co-expressos. A co-expressão nesse sentido abrange situações em que CD137 e OX40 são expressos na mesma célula, por exemplo uma célula imunológica como a célula T, e situações em que CD137 e OX40 são expressos em células diferentes, por exemplo, duas células imunológicas diferentes localizadas adjacentes entre si no microambiente tumoral. Desse modo, acredita-se que as moléculas de anticorpo da invenção têm a capacidade para se ligarem a ambos os alvos em uma célula única em cis bem como têm a capacidade para se ligarem aos dois alvos expressos em células diferentes em trans.

[0121] A molécula de anticorpo preferencialmente se liga ao CD137 humano dimérico com uma afinidade (KD) de 8 nM,

7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, ou 0,3 nM ou com uma afinidade superior. Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga ao CD137 humano, com uma afinidade (KD) de 0,3 nM, ou com uma afinidade superior. A molécula de anticorpo pode se ligar a CD137 dimérico com uma afinidade maior que CD137 monomérico. O CD137 humano pode, por exemplo, ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 127.

[0122] A molécula de anticorpo preferencialmente se liga ao OX40 humano dimérico com uma afinidade (KD) de 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, ou 0,3 nM ou com uma afinidade superior. Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga ao OX40 humano, com uma afinidade (KD) de 0,3 nM, ou com uma afinidade superior. A molécula de anticorpo pode se ligar a OX40 dimérico com uma afinidade maior que OX40 monomérico. O OX40 humano pode, por exemplo, ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 130.

[0123] A molécula de anticorpo preferencialmente se liga ao CD137 de cinomolgo e OX40 de cinomolgo. A ligação a CD137 de cinomolgo e OX40 bem como CD137 humano e OX40 é benéfico visto que permite testar a molécula de anticorpo nos macacos cinomolgo quanto à eficácia e toxicidade antes da administração aos seres humanos. Preferencialmente, a molécula de anticorpo tem a capacidade para se ligar simultaneamente ao CD137 de cinomolgo e OX40 de cinomolgo, em que CD137 de cinomolgo e OX40 de cinomolgo são co- expressos.

[0124] A molécula de anticorpo se liga preferencialmente ao CD137 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) de 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, ou 0,3 nM ou com uma afinidade superior.

Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga a CD137 dimérico de cinomolgo, com uma afinidade (KD) de 0,3 nM, ou com uma afinidade superior. O CD137 de cinomolgo pode, por exemplo, ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 129.

[0125] A molécula de anticorpo se liga, preferencialmente, a OX40 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) de 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM ou 1 nM, ou com uma afinidade superior. Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga ao OX40 de cinomolgo, com uma afinidade (KD) de 1 nM, ou com uma afinidade superior. O OX40 de cinomolgo pode, por exemplo, ter a sequência apresentada em SEQ ID NO: 131.

[0126] A molécula de anticorpo se liga preferencialmente ao OX40 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) que está dentro de 10 vezes, 9 vezes, 8 vezes, 7 vezes, 6 vezes, ou 5 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga a OX40 humano dimérico. Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga a OX40 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) que está dentro de 5 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga a OX40 humano dimérico.

[0127] A molécula de anticorpo se liga preferencialmente ao CD137 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) que está dentro de 30 vezes, 20 vezes, 10 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, ou 2 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga a CD137 dimérico humano. Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga a CD137 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) que está dentro de 2 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga a CD137 humano dimérico.

[0128] Como descrito nos presentes Exemplos, acredita-se que a similaridade na ligação a antígenos humanos e de cinomolgo pode ser vantajosa visto que seria esperado que o comportamento do mAb2 em estudos com macaco cinomolgo pode ser extrapolado para seres humanos. Acredita-se que seja benéfico realizar estudos de eficácia e toxicidade realizados com a molécula de anticorpo em macacos cinomolgo, que podem ser preditivos da eficácia e toxicidade da molécula de anticorpo em seres humanos.

[0129] A molécula de anticorpo se liga preferencialmente a ao CD137 dimérico humano com uma afinidade (KD) que está dentro de 10 vezes, 9 vezes, 8 vezes, 7 vezes, 6 vezes, ou 5 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga ao OX40 humano dimérico. Preferencialmente, a molécula de anticorpo se liga a CD137 dimérico humano com uma afinidade (KD) que está dentro de 2 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga ao OX40 humano dimérico.

[0130] A molécula de anticorpo se liga preferencialmente ao CD137 de cinomolgo dimérico com uma afinidade (KD) que está dentro de 10 vezes, 9 vezes, 8 vezes, 7 vezes, 6 vezes, ou 5 vezes da afinidade (KD) que a molécula de anticorpo se liga a OX40 de cinomolgo dimérico.

[0131] Como descrito nos presentes Exemplos, acredita-se que uma molécula de anticorpo que tem afinidade similar para ligação a ambos os alvos, isto é, CD137 e OX40 pode ser vantajoso devido ao fato de a molécula de anticorpo poder ser mais propensa a se ligar a células que expressam ambos os alvos.

[0132] A afinidade de ligação de uma molécula de anticorpo a um antígeno cognato, como OX40 humano, CD137 humano, OX40 de cinomolgo, ou CD137 de cinomolgo pode ser determinada por ressonância de plasmon de superfície (SPR), como Biacore, por exemplo. A afinidade de ligação de uma molécula de anticorpo a OX40 ou CD137 expresso em superfície celular pode ser determinada por citometria de fluxo.

[0133] Mostrou-se que as moléculas de anticorpo têm faixa de atividades em ligação de ligante. Por exemplo, a molécula de anticorpo pode ter a capacidade para bloquear, pode não ter a capacidade para bloquear, ou pode ter a capacidade para bloquear parcialmente a ligação de CD137L ao CD137.

[0134] Preferencialmente, a molécula de anticorpo pode ter a capacidade para bloquear, pode não ter a capacidade para bloquear, ou pode ter a capacidade para bloquear parcialmente a ligação de CD137L ao CD137. Mais preferencialmente, a molécula de anticorpo tem a capacidade para bloquear parcialmente a ligação de CD137L ao CD137.

[0135] Preferencialmente, a molécula de anticorpo tem a capacidade para induzir a sinalização de OX40 e/ou CD137 como resultado de reticulação por ligação dupla tanto ao OX40 quanto ao CD137 quando os dois alvos são co-expressos. Atuando-se dessa forma, tais moléculas de anticorpo são chamadas “agonistas duplos”, isto é, as moléculas de anticorpo têm a capacidade para induzir a sinalização por meio dos receptores como resultado de reticulação por ligação dupla tanto ao OX40 quanto ao CD137. Desse modo, preferencialmente, a molécula de anticorpo tem a capacidade para elicitar o agonismo duplo quando tanto OX40 quanto CD137 são co-expressos. Como descrito no presente documento, espera-se que tais agonistas duplos sejam vantajosos. Por exemplo, acredita-se que tal agonista duplo possa ter a capacidade para elicitar um estímulo forte da resposta imunológica, visto que combinaria a ativação de células imunológicas diferentes, por exemplo, combinaria a atividade células T de CD8+ e CD4+ por ligação a ambos os alvos em células diferentes em trans. Como um exemplo adicional, acredita-se que tal agonista duplo pode ter a capacidade para resultar na ativação de uma célula única que co-expressa ambos os alvos sem a exigência de duas células que interagem juntas, por ligação a ambos os alvos em cis.

[0136] Mais preferencialmente, o agonista duplo deve ter a capacidade para acionar agonismo autonomamente por engate simultâneo com seus alvos específicos (OX40 e CD137) e sem a necessidade de reticulação adicional, por exemplo, agentes de reticulação ou receptores Fcy. Como descrito no presente documento, espera-se que tal atividade autônoma seja vantajosa visto que será restrita a locais em que ambos os alvos são co-expressos e, portanto, espera-se que reduzam a toxicidade potencialmente associada à ativação de CD137 em locais em que há pouca ou nenhuma co-expressão de OX40.

[0137] A habilidade de uma molécula de anticorpo para ativar células T pode ser medida com o uso de um ensaio de ativação de célula T. As células T liberam IL-2 na ativação. Um ensaio de ativação de célula T pode, portanto, medir a liberação de IL-2 para determinar o nível de ativação de célula T induzido pela molécula de anticorpo.

[0138] Por exemplo, a habilidade da molécula de anticorpo para ativar células T é determinada medindo-se a concentração da molécula de anticorpo exigida para obter a liberação média máxima de IL-2 pelas células T em um ensaio de ativação de células T. Isso é denominado EC50 abaixo.

[0139] Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo tem um EC50 em um ensaio de ativação de célula T que está dentro de 50 vezes, 40 vezes, 30 vezes, 20 vezes, 10 vezes, ou 5 vezes do EC50 de FS20-22-49AA/FS30-10-16 no mesmo ensaio, em que FS20-22-49AA/FS30-10-16 consiste na cadeia pesada de SEQ ID NO: 95 e na cadeia leve de SEQ ID NO: 97.

[0140] Por exemplo, a molécula de anticorpo pode ter um EC50 em um ensaio de ativação de célula T de 30 nM ou menor, 25 nM ou menor, 20 nM ou menor, 14 nM ou menor, 10 nM ou menor, 5 nM ou menor, 4 nM ou menor, 3 nM ou menor, 2 nM ou menor, 1,5 nM, 1 nM ou 0,5 nM ou menor, preferencialmente, 1,5 nM ou menor, mais preferencialmente, 1 nM ou menor quando reticulada.

[0141] Além disso, ou alternativamente, a habilidade de uma molécula de anticorpo para ativar células T pode ser determinada medindo-se a concentração máxima de IL-2 liberada pelas células T em um ensaio de ativação de célula T na presença da molécula de anticorpo.

[0142] Em uma modalidade preferencial, a concentração máxima de IL-2 liberada pelas células T em um ensaio de ativação de célula T na presença da molécula de anticorpo está dentro de 20 %, ou 10 % da concentração máxima de IL-2 liberada pelas células T na presença de FS20-22-49AA/FS30- 10-16 no mesmo ensaio, em que FS20-22-49AA/FS30-10-16 consiste na cadeia pesada de SEQ ID NO: 95 e na cadeia leve de SEQ ID NO: 97.

[0143] O ensaio de ativação de célula T preferencialmente, compreende células T que co-expressam OX40 e CD137. Em uma modalidade preferida, o ensaio de ativação de célula T não compreende quaisquer agentes com a capacidade para reticular as moléculas de anticorpo diferentes de CD137 e OX40.

[0144] O ensaio de ativação de célula T pode ser um ensaio de célula T como descrito no presente documento, como um ensaio de célula pan-T, um ensaio de célula T CD4+, ou um ensaio de célula T CD8+ como descrito nos presentes Exemplos.

[0145] Por exemplo, um ensaio de ativação de célula T pode ser um ensaio de liberação de IL-2 com base em células T isoladas das Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMCs) humanas. Um ensaio de ativação de célula T CD4+ ou um ensaio de ativação de célula T CD8+ pode ser um ensaio de liberação de IL-2 com base em células T CD4+ ou células T CD8+ isoladas de PBMCs humanas, respectivamente. Como explicado nos presentes Exemplos, uma molécula de anticorpo que tem a capacidade para ativar células T tanto em um ensaio de célula T CD4+ quanto um CD8+, tem a capacidade para ativar tanto OX40 quanto CD137 (também denominado “agonista duplo”). Por exemplo, o ensaio de ativação de célula T pode compreender isolar PBMCs humanas dos cones de depleção de leucócito. Métodos para isolar PBMCs são conhecidos na técnica e descritos nos presentes exemplos. As células T podem, então, ser isoladas das PBMCs. Os métodos para isolar células T (todas as células T, células T CD4+, ou células T CD8+) de PBMCs são novamente conhecidos na técnica e descritos nos presentes Exemplos.

[0146] O ensaio de ativação pode envolver preparar o número exigido de células T, por exemplo, em meios experimentais, como um meio de célula T. O número exigido de células T pode ser preparado em uma concentração de 1,0 x 106 células/ml. As células T podem, então, ser estimuladas com o uso de um reagente de ativação de célula T adequado que fornece os sinais exigidos para ativação de célula T. Por exemplo, o reagente de ativação de célula T pode ser um reagente que compreende CD3 e CD28, como microesferas que compreendem CD3 e CD28. As células T isoladas podem ser incubadas durante a noite com o reagente de ativação de célula T para ativar as células T. Após isso, as células T ativadas podem ser lavadas para separar as células T do reagente de ativação de célula T e serem ressuspensas em meio de célula T em uma concentração adequada, como 2,0 x 106 células/ml. As células T ativadas podem, então, ser adicionadas às placas revestidas com anticorpo CD3 anti- humano.

[0147] Uma diluição adequada de cada molécula de anticorpo de teste pode ser preparada e adicionada aos poços. As células T podem, então, ser incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 24 horas com o anticorpo de teste. Os tensoativos podem ser coletados e ensaiados para determinar a concentração de IL-2 no tensoativo. Métodos para determinar a concentração de IL-2 em uma solução são conhecidos na técnica e descritos nos presentes exemplos. A concentração de IL-2 humano pode ser plotada versus a concentração de log da molécula de anticorpo. As curvas resultantes podem ser ajustadas com o uso do log (agonista) versus equação de resposta.

[0148] A molécula de anticorpo pode ser conjugada a uma molécula bioativa ou uma identificação detectável. Nesse caso, a molécula de anticorpo pode ser referida como um conjugado. Tais conjugados são usados no tratamento de doenças, como descrito no presente documento.

[0149] Por exemplo, a molécula bioativa pode ser um modulador de sistema imunológico, como uma citocina, preferencialmente, uma citocina humana. Por exemplo, a citocina pode ser uma citocina que estimula a ativação e/ou proliferação de célula T. Exemplos de citocinas para conjugação à molécula de anticorpo incluem IL-2, IL-10, IL- 12, IL-15, IL-21, GM-CSF e IFN-gama.

[0150] Alternativamente, a molécula bioativa pode ser uma armação de ligante, como uma armação de ligante de uma citocina, por exemplo, de TGF-beta ou IL-6.

[0151] Alternativamente, a molécula bioativa pode ser um radioisótopo terapêutico.

[0152] A radioimunoterapia é usada em tratamento de câncer, por exemplo. Radioisótopos terapêuticos adequados para radioimunoterapia são conhecidos na técnica e incluem ítrio-90, iodo-131, bismuto-213, astatina-211, lutétio-177, rênio-188, cobre-67, actínio-225, e iodo-125 e térbio-161.

[0153] As identificações detectáveis adequadas que podem ser conjugadas a moléculas de anticorpo são conhecidas na técnica e incluem radioisótopos como iodo-125, iodo-131, ítrio-90, índio-111 e tecnécio-99; fluorocromos, como fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, vermelho Texas e derivados de corante ciano, por exemplo, Cy7 e Alexa750; corantes cromogênicos, como diaminobenzidina; microesferas de látex; identificações de enzima como rábano peroxidase; corantes de fósforo ou laser com absorção espectralmente isolada ou características de emissão; E frações químicas, como biotina, que podem ser detectadas por meio de ligação a uma fração detectável de cognato específico, por exemplo, avidina identificada.

[0154] A molécula de anticorpo pode ser conjugada à molécula bioativa ou identificação detectável por meio de qualquer ligação covalente ou não covalente adequada, como uma ligação de dissulfeto ou peptídeo. Em que a molécula bioativa é uma citocina, a citocina pode ser ligada à molécula de anticorpo por meio de um ligante de peptídeo. Os ligantes de peptídeo adequados são conhecidos na técnica e podem ser de 5 a 25, 5 a 20, 5 a 15, 10 a 25, 10 a 20, ou 10 a 15 aminoácidos em comprimento.

[0155] Em algumas modalidades, a molécula bioativa pode ser conjugada à molécula de anticorpo por um ligante clivável. O ligante pode permitir a liberação da molécula bioativa da molécula de anticorpo em um sítio de terapia. Os ligantes podem incluir ligações de amida (por exemplo, ligantes peptídicos), ligações de dissulfeto ou hidrazonas. Os ligantes de peptídeo, por exemplo, podem ser clivados por proteases específicas de sítio, as ligações de dissulfeto podem ser clivadas pelo ambiente de redução do citosol e hidrazonas podem ser clivadas por hidrólise mediada por ácido.

[0156] A invenção também fornece uma molécula ou moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma molécula de anticorpo da invenção. A pessoa versada não teria dificuldade em preparar essas moléculas de ácido nucleico com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[0157] A molécula ou as moléculas de ácido nucleico pode, por exemplo, compreendem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 55 ou 113, 62, 64, 67, 70, 75, 78, 83, 87, 91, ou 94, que codifica os domínios CH3 de FS20-22-49, FS20-22-38, FS20- 22-41, FS20-22-47, FS20-22-85, FS20-31-58, FS20-31-66, FS20- 31-94, FS20-31-102, FS20-31-108 e FS20-31-115,

respectivamente. Por exemplo, a molécula ou moléculas de ácido nucleico podem compreender a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 55 ou 113, em que ambas codificam o domínio CH3 de FS20-22-49. Em algumas modalidades, a molécula ou moléculas de ácido nucleico compreendem a sequência estabelecida em SEQ ID NO: 113, que codifica o domínio CH3 de FS20-22-49. Preferencialmente, a molécula ou as moléculas de ácido nucleico compreendem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 55, que codifica o domínio CH3 de FS20-22-49.

[0158] A molécula ou moléculas de ácido nucleico pode codificar o domínio VH e/ou domínio VL, preferencialmente, os domínio VH e domínio VL de anticorpo FS30-10-16, FS30-10- 3, FS30-10-12, FS30-35-14, ou FS30-5-37, preferencialmente, anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, FS30-10-12, ou FS30-35-14, mais preferencialmente, anticorpo FS30-10-16, FS30-10-3, ou FS30-10-12, com máxima preferência, anticorpo FS30-10-16. As sequências de domínio VH e VL desses anticorpos são descritas no presente documento.

[0159] Por exemplo, a molécula (ou moléculas) de ácido nucleico pode compreender: (i) a sequência de ácidos nucleicos de domínio VH de anticorpo FS30-10-16 apresentada em SEQ ID NO: 13, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de domínio VL de anticorpo FS30-10-16 apresentada em SEQ ID NO: 15; ou (ii) a sequência de ácidos nucleicos de domínio VH de anticorpo FS30-10-3 apresentada em SEQ ID NO: 19, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de domínio VL de anticorpo FS30-10-3 apresentada em SEQ ID NO: 20; (iii) a sequência de ácidos nucleicos de domínio VH de anticorpo FS30-10-12 apresentada em SEQ ID NO: 24, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de domínio VL de anticorpo FS30-10-12 apresentada em SEQ ID NO: 20; (iv) a sequência de ácidos nucleicos de domínio VH de anticorpo FS30-35-14 apresentada em SEQ ID NO: 171, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de domínio VL de anticorpo FS30-35-14 apresentada em SEQ ID NO: 32; ou (v) a sequência de ácidos nucleicos de domínio VH de anticorpo FS30-5-37 apresentada em SEQ ID NO: 41, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de domínio VL de anticorpo FS30-5-37 apresentada em SEQ ID NO: 43.

[0160] A molécula ou moléculas de ácido nucleico pode codificar a cadeia pesada e/ou cadeia leve, preferencialmente, as cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-16, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-35-14, ou FS20- 22-49AA/FS30-5-37, preferencialmente, anticorpo FS20-22- 49AA/FS30-10-16, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30- 10-12, ou FS20-22-49AA/FS30-35-14, mais preferencialmente, anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-16, FS20-22-49AA/FS30-10-3 ou FS20-22-49AA/FS30-10-12, com máxima preferência, FS20-22- 49AA/FS30-10-16. As sequências de domínio VH e VL desses anticorpos são descritas no presente documento.

[0161] Por exemplo, a molécula (ou moléculas) de ácido nucleico pode compreender: (i) a sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-16 apresentada em SEQ ID NO: 96, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-16 apresentada em SEQ ID NO: 98; ou (ii) a sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-3 apresentada em SEQ ID NO: 100, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-3 apresentada em SEQ ID NO: 102; (iii) a sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-12 apresentada em SEQ ID NO: 104, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-10-12 apresentada em SEQ ID NO: 102; (iv) a sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-35-14 apresentada em SEQ ID NO: 106, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-35-14 apresentada em SEQ ID NO: 108; ou (v) a sequência de ácidos nucleicos de cadeia pesada de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-5-37 apresentada em SEQ ID NO: 110, e/ou a sequência de ácidos nucleicos de cadeia leve de anticorpo FS20-22-49AA/FS30-5-37 apresentada em SEQ ID NO: 112.

[0162] Em que um ácido nucleico codifica o domínio VH e VL, ou cadeia pesada e leve, de uma molécula de anticorpo da invenção, em que os dois domínios ou as duas cadeias podem ser codificadas em duas moléculas de ácido nucleico separadas.

[0163] Uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser usada para expressar uma molécula de anticorpo da invenção. O ácido nucleico geralmente será fornecido na forma de um vetor recombinante para expressão. Outro aspecto da invenção, desse modo, fornece um vetor que compreende um ácido nucleico como descrito acima. Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, em que contêm sequências regulatórias adequadas, que incluem sequências promotoras, fragmentos terminadores, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências, como apropriado. Preferencialmente, o vetor contém sequências regulatórias adequadas para acionar a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago ou fagemídeo, como adequado.

[0164] Uma molécula de ácido nucleico ou vetor, como descrito no presente documento, pode ser introduzida em uma célula hospedeira. As técnicas para a introdução de ácido nucleico ou vetores em células hospedeiras são bem apresentadas na técnica e qualquer técnica adequada pode ser empregada. Uma faixa de células hospedeiras adequada para a produção de moléculas de anticorpo recombinantes são conhecidas na técnica, e incluem células hospedeiras bacterianas, de levedura, de inseto ou de mamífero. Uma célula hospedeira preferencial é uma célula de mamífero, como uma célula CHO, NS0 ou HEK, por exemplo, uma célula HEK293.

[0165] Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de uma molécula de anticorpo da invenção que compreende expressar um ácido nucleico que codifica a molécula de anticorpo em uma célula hospedeira e opcionalmente isolar e/ou purificar a molécula de anticorpo assim produzida. Métodos para cultivar células hospedeiras são bem conhecidos na técnica. O método pode compreender adicionalmente isolar e/ou purificar a molécula de anticorpo. As técnicas para a purificação de moléculas de anticorpo recombinantes são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, HPLC, FPLC ou cromatografia por afinidade, por exemplo, com o uso de Proteína A ou Proteína L. Em algumas modalidades, a purificação pode ser realizada com o uso de uma etiqueta de afinidade na molécula de anticorpo. O método também pode compreender formular a molécula de anticorpo em uma composição farmacêutica, opcionalmente com um excipiente farmaceuticamente aceitável ou outra substância conforme descrito abaixo.

[0166] Como explicado acima, CD137 e OX40 são ambos expressos em células do sistema imunológico, incluindo células T. Por exemplo, OX40 é expresso em células do sistema imunológico, que incluem células T ativadas, em particular células T CD4+, células T CD8+, células auxiliadoras T do tipo 1 (Th1), células auxiliadoras T do tipo 2 (Th2) e células regulatórias T (Treg), e células T de infiltração de tumor, bem como células de morte natural ativadas (NK). CD137 é expresso em células do sistema imunológico, que inclui células T, em particular, células T CD8+, células B, células NK e linfócitos de infiltração de tumor (TILs). CD137 é expresso em um nível menor em células T CD4+ que células T CD8+ (consultar o Exemplo 14 e a Figura 6), mas que também mostrou-se estar envolvido em induzir a proliferação e a ativação de alguns subconjuntos de células T CD4+ (Wen et al., 2002).

[0167] Mostrou-se que a ativação de OX40 desempenhou um papel na melhoria de ativação de célula T, expansão clonal de célula T, diferenciação e sobrevivência de célula T e a geração de células T de memória. Mostrou-se que a ativação de CD137 desempenha um papel de intensificar a proliferação,

a sobrevivência e a função efetora de citotoxicidade de células T CD8+, bem como diferenciação e manutenção de célula T CD8+ de células T CD8+ de memória. Também foi demonstrado que a ativação de CD137 intensifica ADCC mediado por célula NK, bem como a proliferação de célula B, sobrevivência e produção de citocina.

[0168] Em vista da resposta imunológica que melhora a atividade de OX40 e CD137, investigou-se as moléculas agonistas OX40 e CD137 no contexto de tratamento de câncer, e espera-se que todos tenham aplicação no tratamento de doenças infecciosas.

[0169] As moléculas de anticorpo como descrito no presente documento podem, desse modo, ser úteis para aplicações terapêuticas, em particular, no tratamento de câncer e doenças infecciosas.

[0170] Uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser usada em um método de tratamento do corpo humano ou animal. Os aspectos relacionados da invenção fornecem; (i) uma molécula de anticorpo descrita no presente documento para uso como um medicamento, (ii) uma molécula de anticorpo descrita no presente documento para uso em um método de tratamento de uma doença ou um transtorno, (iii) o uso de uma molécula de anticorpo descrita no presente documento na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de uma doença ou um transtorno; e, (iv) um método de tratamento de uma doença ou um transtorno em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento.

[0171] O indivíduo pode ser um paciente, preferencialmente, um paciente humano.

[0172] O tratamento pode ser qualquer tratamento ou terapia no qual algum efeito terapêutico desejado é obtido, por exemplo, a inibição ou atraso do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, um impedimento na taxa de progresso, melhoria da condição, cura ou remissão (seja parcial ou total) da condição, prevenção, melhoria, atraso, anulação ou detenção de um ou mais sintomas e/ou sinais da condição ou prolongamento de sobrevivência de um indivíduo ou paciente além do esperado na ausência de tratamento.

[0173] O tratamento como uma medida profiláctica (isto é, profilaxia) também é incluído. Por exemplo, um indivíduo suscetível a ou em risco da ocorrência ou recorrência de uma doença, como câncer pode ser tratado como descrito no presente documento. Tal tratamento pode impedir ou atrasar a ocorrência ou recorrência da doença no indivíduo.

[0174] Um método de tratamento como descrito pode ser compreender administrar pelo menos um tratamento adicional ao indivíduo em adição à molécula de anticorpo. A molécula de anticorpo descrita no presente documento pode, desse modo, ser administrada a um indivíduo em separado ou em combinação com um ou mais outros tratamentos. Em que a molécula de anticorpo é administrada ao indivíduo em combinação com outro tratamento, o tratamento adicional pode ser administrado ao indivíduo simultaneamente com, sequencialmente a ou separadamente da administração da molécula de anticorpo. Em que o tratamento adicional é administrado simultaneamente com a molécula de anticorpo, a molécula de anticorpo e o tratamento adicional podem ser administrados ao indivíduo como uma preparação combinada. Por exemplo, a terapia adicional pode ser uma terapia ou agente terapêutico conhecido para a doença a ser tratada.

[0175] Embora uma molécula de anticorpo possa ser administrada por si só, as moléculas de anticorpo serão frequentemente administradas na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além da molécula de anticorpo. Outro aspecto da invenção, por tanto, fornece uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de anticorpo, como descrito no presente documento. Um método que compreende formular uma molécula de anticorpo em uma composição farmacêutica também é fornecido.

[0176] As composições farmacêuticas podem compreender, além da molécula de anticorpo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, carreador, tampão, estabilizante ou outros materiais bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. O termo “farmaceuticamente aceitável” como usado no presente documento pertence a compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de julgamento médico, adequados para o uso em contato com os tecidos de um indivíduo (por exemplo, ser humano) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, compatível com uma razão de benefício/risco razoável. Cada carreador, excipiente, etc. também deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação. A natureza precisa do carreador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser por infusão, injeção ou qualquer outra via adequada, como discutido abaixo.

[0177] Para administração parenteral, por exemplo, subcutânea ou intravenosa, por exemplo, por injeção, a composição farmacêutica que compreende a molécula de anticorpo pode estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é isenta de pirogênio e tem pH adequado, isotonicidade e estabilidade. Aqueles de conhecimento relevante na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas com o uso, por exemplo, de veículos isotônicos como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer com Lactato. Os conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser empregados como exigido, incluindo tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, como ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de amônio de octadecildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenílico, butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo- hexanol; 3’-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal como sódio; complexos metálicos (por exemplo,

complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos, como TWEENTM, PLURONICSTM ou polietileno glicol (PEG).

[0178] Em algumas modalidades, moléculas de anticorpo podem ser fornecidas em uma forma liofilizada para reconstituição antes da administração. Por exemplo, moléculas de anticorpo liofilizadas podem ser reconstituídas em água estéril e misturadas com solução salina antes da administração a um indivíduo.

[0179] A administração pode ser em uma "quantidade terapeuticamente eficaz", que é suficiente para mostrar benefício a um indivíduo. A quantidade real administrada, e taxa e período de tempo de administração, dependerão da natureza e severidade do que está sendo tratado, o indivíduo particular que está sendo tratado, a condição clínica do indivíduo, a causa do distúrbio, o sítio de entrega da composição, o tipo de molécula de anticorpo, o método de administração, a programação de administração e outros fatores conhecidos por profissionais da área médica. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões em dosagem etc., está dentro da responsabilidade dos profissionais em geral e outros profissionais da área médica, e muitos dependem da severidade dos sintomas e/ou progressão de uma doença que está sendo tratada. Doses adequadas de moléculas de anticorpo são bem conhecidas na técnica (Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991). Dosagens específicas indicadas no presente documento, ou no Physician's Desk Reference (2003) conforme apropriado para uma molécula de anticorpo que está sendo administrada, podem ser usadas. A quantidade terapeuticamente eficaz ou dose adequada de uma molécula de anticorpo pode ser determinada por comparação com a atividade in vitro e atividade in vivo em um modelo animal. Métodos para extrapolação de dosagens eficazes em camundongos e outros animais de teste para seres humanos são conhecidos. A dose precisa dependerá de vários fatores, incluindo o tamanho e localização da área a ser tratada, e a natureza precisa da molécula de anticorpo.

[0180] Uma dose de anticorpo típica está na faixa 100 µg a 1 g para aplicações sistêmicas, e 1 µg a 1 mg para aplicações tópicas. Uma dose de carga superior inicial, seguida por uma ou mais doses inferiores, pode ser administrada. Essa é uma dose para um tratamento simples de um indivíduo adulto, que pode ser proporcionalmente ajustado para crianças e jovens, e também ajustado para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular.

[0181] Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanais ou mensais, a critério do médico. O cronograma de tratamento para um indivíduo pode ser dependente das propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da composição de anticorpo, em que a via de administração e a natureza da condição é tratada.

[0182] O tratamento pode ser periódico, e o período entre administrações pode ser de cerca de duas semanas ou mais, por exemplo, cerca de três semanas ou mais, cerca de quatro semanas ou mais, cerca de uma vez por mês ou mais, cerca de cinco semanas ou mais, ou cerca de seis semanas ou mais. Por exemplo, o tratamento pode ser a cada duas a quatro semanas ou a cada quatro a oito semanas. As formulações e vias adequadas de administração são descritas acima.

[0183] Em uma modalidade preferencial, uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser para uso em um método de tratamento de câncer.

[0184] O câncer pode ser caracterizado pela proliferação anormal de células cancerígenas malignas. Em que um tipo particular de câncer, como câncer de mama, é denominado, se refere a uma proliferação anormal de células malignas do tecido relevante, como tecido de mama. Um câncer secundário que está localizado na mama, mas é o resultado de proliferação anormal de células malignas de outro tecido, como tecido de ovário, não é um câncer de mama, como denominado no presente documento, mas é um câncer de ovário.

[0185] O câncer pode ser um câncer primário ou secundário. Desse modo, uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser para uso em um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer é um tumor primário e/ou uma metástase tumoral.

[0186] Um tumor de um câncer a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode compreender TILs que expressam OX40 e/ou CD137, por exemplo, em suas superfícies celulares. Em uma modalidade, o tumor pode ter sido determinado para compreender TILs que expressam um ou ambos OX40 e CD137. Métodos para determinar a expressão de um antígeno em uma superfície celular são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, citometria de fluxo.

[0187] Por exemplo, o câncer a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em leucemias, como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL)

e leucemia linfoblástica crônica (CLL); linfomas, como linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin e mieloma múltiplo; e cânceres sólidos, como sarcomas (por exemplo, sarcomas de tecido mole), câncer de pele (por exemplo, carcinoma de célula de Merkel), melanoma, câncer de bexiga (por exemplo, carcinoma urotelial de bexiga), câncer do cérebro (por exemplo, glioblastoma multiforme), câncer de mama, câncer uterino/endometrial, câncer de ovário (por exemplo, cistadenoma seroso ovariano), câncer de próstata, câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC), como carcinoma pulmonar de célula escamosa, e câncer de pulmão de célula pequena (SCLC)), câncer colorretal (por exemplo, adenocarcinoma colorretal), cervical câncer (por exemplo, cervical câncer de célula escamosa e endocervical adenocarcinoma), fígado câncer (por exemplo, carcinoma hepatocelular), câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço), câncer oesofageal (por exemplo, carcinoma oesofageal), câncer pancreático, renal câncer (por exemplo, câncer de célula renal), câncer adrenal, câncer de estômago (por exemplo, adenocarcinoma de estômago), câncer testicular (por exemplo, tumores de célula germinal testicular), câncer da vesícula e trato biliar (por exemplo, colangiocarcinoma), câncer de tireoide, câncer de timo, câncer ósseo e câncer cerebral.

[0188] Em uma modalidade preferencial, o câncer a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é um câncer sólido.

[0189] Mais preferencialmente, o câncer a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é um câncer sólido selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, câncer de bexiga, câncer do cérebro, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer colorretal, cervical câncer, fígado câncer, câncer de cabeça e pescoço, câncer pancreático, renal câncer e câncer de estômago.

[0190] Em uma modalidade adicional preferencial, o câncer a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser um câncer que é responsivo a tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem, como um anticorpo que se liga ao PD-1, PD-L1 ou CTLA4. Acredita-se que tais tumores tenham níveis superiores de TIL e/ou carga mutacional de tumor superior que tumores que não são responsivos a terapia de inibidor de ponto de checagem. Tais tumores também são denominados tumores mornos ou quentes.

[0191] Exemplos de tais tumores incluem carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço (HNSCC), melanoma, câncer de pulmão (como câncer de pulmão escamoso, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de célula não pequena [NSCLC], ou carcinoma pulmonar de célula pequena [SCLC]), câncer de próstata, câncer de cervical, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de tireoide, câncer renal, câncer colorretal (MSI ou MSS; por exemplo, adenocarcinoma colorretal), câncer oesofageal, linfoma de não Hodgkin (NHL), câncer gástrico, endometrial câncer, câncer pancreático, câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, mesotelioma e câncer urotelial. Em uma modalidade preferida, o câncer é câncer gástrico. O câncer pode ser, adicionalmente, um câncer que não foi tratado anteriormente com um agente quimioterápico ou radioterápico, isto é, o indivíduo a ser tratado pode ser um paciente com câncer que não recebeu tratamento com um agente quimioterápico ou radioterápico para o câncer em questão. Em uma modalidade preferida, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento é para uso em um método de tratamento um câncer que e responsivo a um ou mais inibidores de ponto de checagem imunológico em um indivíduo, em que o método compreende tratar o paciente com a molécula de anticorpo em combinação com um agente que inibe a interação entre PD-1 e PD-L1.

[0192] Alternativamente, o câncer a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser um câncer, como câncer do pâncreas ou câncer de próstata que não é responsivo ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem, como um anticorpo que se liga ao PD-1, PD-L1 ou CTLA4. Tais tumores também são denominados como tumores frios.

[0193] Os presentes inventores mostraram que tumores que não respondem ao tratamento com um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 por si só, foram responsivos ao tratamento com o anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento. Desse modo, a molécula de anticorpo da invenção pode ser para uso em um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer não é responsivo, ou é refratário, ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem por si só, e em que o método compreende administrar a molécula de anticorpo ao indivíduo em combinação com um agente que inibe a interação entre PD-1 e PD-L1. Um método de tratamento um câncer em um indivíduo, em que o câncer não é responsivo, ou é refratário, ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem por si só, e em que o método compreende administrar a molécula de anticorpo ao indivíduo em combinação com um agente que inibe a interação entre PD- 1 e PD-L1 também é contemplado.

[0194] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que o tratamento de um câncer, que não é responsivo ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem por si só, com quimioterapia, radioterapia, um agente imunoterápico, como um agente imunoestimulante, ou uma vacina antitumoral resultará em morte celular de câncer que, por sua vez, resulta em um aumento em TILs no tumor e a expressão superior de receptores imunossupressores, que por sua vez tornam o câncer responsivo ao tratamento com inibidores de ponto de checagem, isto é, tornam um tumor frio em um tumor morno. Desse modo, a molécula de anticorpo da invenção pode ser para uso em um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o câncer não é responsivo, ou é refratário, ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem por si só, e em que o método compreende administrar a molécula de anticorpo ao indivíduo em combinação com um agente quimioterápico, radioterapêutico ou imunoestimulante ou uma vacina anticâncer e opcionalmente um agente que inibe a interação entre PD-1 e PD-L1. Um método de tratamento um câncer em um indivíduo, em que o câncer não é responsivo, ou é refratário, ao tratamento com um ou mais inibidores de ponto de checagem por si só, e em que o método compreende administrar a molécula de anticorpo ao indivíduo em combinação com um agente quimioterápico, radioterapêutico ou imunoestimulante, ou uma vacina anticâncer e opcionalmente um agente que inibe a interação entre PD-1 e PD-L1 também é contemplado. Em uma modalidade preferida, o agente que inibe a interação entre PD-1 e PD-L1 é um anticorpo que liga PD-1 ou PD-L1.

[0195] No contexto de câncer, tratamento pode incluir inibir crescimento de câncer, incluir remissão completa de câncer e/ou inibir a metástase de câncer, bem como inibir a recorrência de câncer. O crescimento de câncer se refere, de modo geral, a qualquer um dentre um número de índices que indicam a alteração no câncer para uma forma mais desenvolvida. Desse modo, índices para medir uma inibição de crescimento de câncer incluem uma diminuição em sobrevivência de célula cancerígena, uma diminuição em volume de tumor ou morfologia (por exemplo, como determinado com o uso de tomografia computadorizada (CT), sonografia ou outro método de imageamento), um crescimento tumoral atrasado, uma destruição de vasculatura de tumor, desempenho aprimorado em teste de pele com hipersensitividade atrasada, um aumento na atividade de células anti-cancerígenas imunológicas ou outras respostas imunológicas anticâncer, e uma diminuição em níveis de antígenos específicos de tumor. As respostas imunológicas de ativação e intensificação para tumores cancerígenos em um indivíduo pode aprimorar a capacidade do indivíduo para resistir ao crescimento de câncer, em particular, o crescimento de um câncer já presente no indivíduo e/ou para diminuir a propensão para crescimento de câncer no indivíduo.

[0196] No contexto de tratamento de câncer, uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser administrado a um indivíduo em combinação com outra terapia anticâncer ou agente terapêutico, como uma terapia anticâncer ou agente terapêutico que mostrou ser adequado, ou potencialmente adequados, para o tratamento do câncer em questão. Por exemplo, a molécula de anticorpo pode ser administrada ao indivíduo em combinação com a agente quimioterápico, radioterapia, um radionuclídeo, um agente imunoterápico, uma vacina antitumor, um vírus oncolítico, uma terapia de transferência celular adotiva (ACT), como terapia de célula NK adotiva ou terapia com células T de receptor de antígeno quimérico (CAR), TILs autólogos ou células T gama/delta, ou um agente para terapia hormonal. Uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento também pode ser administrada a um indivíduo em combinação com um adjuvante ou neoadjuvante, como uma terapia hormonal de neoadjuvante, um agente anti-angiogênico, como um anticorpo anti-VEGF ou anti-VEGFR2, ou um agente citotóxico.

[0197] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a molécula de anticorpo descrita no presente documento pode atuar como um adjuvante em terapia anticâncer. Especificamente, acredita-se que a administração da molécula de anticorpo a um indivíduo em combinação com quimioterapia ou radioterapia, por exemplo, acionará uma resposta imunológica maior contra o câncer que é obtido com quimioterapia ou radioterapia por si só.

[0198] Um ou mais agentes quimioterápicos para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: taxanos, antibióticos citotóxicos, inibidores de tirosina quinase, inibidores de PARP, inibidores de enzima de B-Raf, inibidores de MEK,

inibidores de c-MET, inibidores de VEGFR, inibidores de PDGFR, agentes alquilantes, análogos de platina, análogos de nucleosídeo, antifolatos, derivados de talidomídeo, agentes quimioterápicos antineoplásicos e outros.

Taxanos incluem docetaxel, paclitaxel e nab-paclitaxel; antibióticos citotóxicos incluem actinomicina, bleomicina, e antraciclinas como doxorubicina, mitoxantrona e valrubicina; inibidores de tirosina quinase incluem erlotinibe, gefitinibe, axitinibe, PLX3397, imatinibe, cobemitinibe e trametinibe; inibidores de PARP incluem piraparibe; inibidores da enzima B-Raf incluem vemurafenibe e dabrafenibe; agentes alquilantes incluem dacarbazina, ciclofosfamida e temozolomida; análogos de platina incluem carboplatina, cisplatina e oxaliplatina; análogos de nucleosídeo incluem azacitidina, capecitabina, fludarabina, fluorouracil e gemcitabina e; antifolatos incluem metotrexato e pemetrexede.

Outros agentes quimioterápicos adequados para uso na presente invenção incluem defactinibe, entinostate, eribulina, irinotecano e vinblastina.

Um agente quimioterápico para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser uma fluropirimidina.

Por exemplo, em que o câncer a ser tratado é HER2 negativo, como câncer gástrico de HER2 negativo, em que a molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser administrado em combinação com platina, um análogo de platina e uma fluoropirimidina.

Em que o câncer a ser tratado é HER2 positivo, como câncer gástrico de HER2 positivo, em que a molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser administrada em combinação com platina ou um análogo de platina, uma fluoropirimidina e trastuzumabe.

[0199] Os agentes terapêuticos preferenciais para administração com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento são doxorubicina, mitoxantrona, ciclofosfamida, cisplatina e oxaliplatina.

[0200] A radioterapia para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser radioterapia ou braquiterapia de feixe externo.

[0201] Radionuclídeos para administração com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: ítrio-90, iodo-131, bismuto-213, astatina-211, lutétio 177, rênio-188, cobre-67, actínio-225, iodo-125 e térbio-161.

[0202] Um agente imunoterápico para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser uma molécula de anticorpo terapêutica, nucleotídeo, citocina ou terapia à base de citocina. Por exemplo, a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar a uma molécula regulatória imunológica, por exemplo, uma molécula de ponto de checagem inibitório ou uma molécula coestimulatória imunológica, um receptor do sistema imunológico inato, ou um antígeno de tumor, por exemplo, um antígeno de tumor de superfície de célula ou um antígeno de tumor solúvel. Exemplos de moléculas regulatórias imunológicas às quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, VISTA, ligante de morte programada 1 (PD-L1), proteína de morte celular programada 1 (PD-1), CD47, CD73, CSF-1R, KIR, CD40, HVEM, IL-10 e CSF-1. Exemplos de receptores do sistema imunológico inato aos quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem receptores TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9, semelhante a RIG-I (por exemplo, RIG-I e MDA-5), e STING. Exemplos de antígenos de tumor aos quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem HER2, EGFR, CD20 e TGF-beta.

[0203] Os presentes inventores mostraram que administração de uma molécula de anticorpo da invenção em combinação com um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 resultou em ativação de célula T e regressão tumoral melhoradas em um modelo tumoral de camundongo em comparação com tratamento com a molécula de anticorpo da invenção ou um anticorpo anti- PD-1 ou anti-PD-L1 por si só. Sem desejar se ligar por teoria, esses resultados sugerem que a administração da molécula de anticorpo da invenção em combinação com um agente que te a capacidade para inibir a interação entre PD-1 e PD- L1 resulta em efeitos tumorais melhorados, bem como de modo que uma administração combinada possa ser adequada para o tratamento de tumores que são refratários ou resistentes ou tem recorrência após monoterapia de anticorpo PD-1 ou PD-L1.

[0204] Desse modo, a molécula de anticorpo da invenção pode ser para uso em um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o método compreende administrar a molécula de anticorpo em combinação com um agente que tem a capacidade para inibir a interação entre PD-1 e PD-L1. Também é fornecido um agente com a capacidade para inibir a interação entre PD1 e PD-L1, como uma molécula de anticorpo que se liga a PD-1 ou PD-L1, para uso em um método de tratamento de câncer em um indivíduo, em que o método compreende administrar o agente que tem a capacidade para inibir interação entre PD-1 e PD-L1 em combinação com um anticorpo da invenção. Um método de tratamento de câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo a quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de anticorpo da invenção e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que tem a capacidade para inibir a interação entre PD-1 e PD-L1.

[0205] Em uma modalidade preferida, o agente que tem a capacidade para inibir a interação de PD-1 e PD-L1 é uma molécula de anticorpo que se liga a PD-1 ou PD-L1. Os anticorpos que se ligam ao PD-1 são conhecidos na técnica e incluem nivolumabe (5C4) e pembrolizumabe. Os anticorpos conhecidos que se ligam ao PD-L1 incluem YW243.55.S1, durvalumabe, atezolizumabe e avelumabe. A molécula de anticorpo da invenção pode ser para administração com um dentre esses anticorpos anti-PD-1 ou PD-L1 conhecidos, ou com outro anticorpo anti-PD-1 ou PD-L1. A preparação dos anticorpos alternativos que se ligam ao PD-1 ou PD-L1 estão dentro das capacidades do elemento versado na técnica com o uso de métodos de rotina.

[0206] O ácido nucleico para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser um siRNA.

[0207] As citocinas ou terapia à base de citocina podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em: IL-2, pró-fármaco de IL2, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-9, IL-15, IL-18, IL-21 conjugados, e interferon tipo I.

[0208] Vacinas antitumorais para o tratamento de câncer foram ambas implantadas na clínica e discutidas em detalhes na literatura científica (como Rosenberg, 2000). Isso envolve principalmente estratégias para estimular o sistema imunológico a responder a vários marcadores celulares expressos por células cancerosas autólogas ou alogênicas com o uso daquelas células como um método de vacinação, com ou sem fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). O GM-CSF provoca uma forte resposta na apresentação de antígenos e trabalha particularmente bem quando empregado com as ditas estratégias.

[0209] Uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento também pode ser administrado a um indivíduo com câncer, em particular, um indivíduo com câncer gástrico, em combinação com ramucirumabe e/ou paclitaxel; irinotecano e docetaxel ou paclitaxel; ou pembrolizumabe. O tratamento com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento em combinação com pembrolizumabe é preferido no tratamento de câncer gástrico de MSI-H e/ou dMMR.

[0210] Em vista da resposta imunológica que melhora a atividade de moléculas de agonista duplo OX40 e CD137, espera-se que OX40 e CD137 tenham aplicação no tratamento de doenças infecciosas. Desse modo, em outra modalidade preferida, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser para uso em um método de tratamento uma doença infecciosa, como uma doença grave ou infecciosa persistente.

[0211] Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que moléculas agonistas OX40 e CD137 podem ter a capacidade para melhorar a resposta imunológica contra uma doença infecciosa grave causada por um patógeno induzindo-se a rápida infiltração e ativação de células imunológicas inatas, como neutrófilos e monócitos, dessa forma, facilitando a liberação do patógeno responsável pela doença infecciosa grave. Portanto, em uma modalidade adicional, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser para uso em um método de tratamento uma doença infecciosa grave, como uma doença bacteriana grave. Em uma modalidade preferida, a doença infecciosa grave é uma doença bacteriana grave causada por uma infecção por uma bactéria gram positiva, como uma bactéria do gênero Listeria, Streptococcus pneumoniae ou Staphylococcus aureus.

[0212] Doenças infecciosas são normalmente liberadas pelo sistema imunológico, mas algumas infecções persistem por longos períodos de tempo, como meses ou anos, e são combatidas de forma ineficaz pelo sistema imunológico. Tais infecções também são denominadas como infecções persistentes ou crônicas.

[0213] Preferencialmente, a molécula de anticorpo como descrito no presente documento é usada para tratar uma doença infecciosa persistente, como uma infecção vira, bacteriana, fúngica ou parasitária persistente, preferencialmente, uma infecção viral ou bacteriana persistente.

[0214] Em uma modalidade preferida, a infecção viral persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente de: vírus imunodeficiente humano (HIV), vírus Epstein-Barr, Citomegalovírus, vírus de Hepatite B, vírus de Hepatite C, vírus Varicela Zoster.

[0215] Em uma modalidade preferida, a infecção bacteriana persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente de: Staphylococcus aureus, Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Helicobacter pylori, Treponema pallidum, Enterococcus faecalis, ou Streptococcus pneumoniae.

[0216] Descreveu-se o agonismo de CD137 como benéfico no contexto de tratamento de infecções por bactéria gram positiva. Desse modo, em uma modalidade preferida, a infecção bacteriana persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente por uma bactéria gram positiva. Em uma modalidade mais preferida, a infecção bacteriana persistente é uma infecção persistente por uma bactéria gram positiva selecionada a partir do grupo que consiste em: Staphylococcus aureus, Mycobacterium leprae, Enterococcus faecalis e Streptococcus pneumoniae.

[0217] Em uma modalidade preferida, a infecção fúngica persistente a ser tratado com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento é uma infecção persistente de: Candida, por exemplo, Candida albicans, Cryptococcus (gattii e neoformans), Talaromyces (Penicillium) marneffe, Microsporum, por exemplo, Microsporum audouinii, e Trichophyton tonsurans.

[0218] Em uma modalidade preferida, a infecção parasitária persistente a ser tratada com o uso de uma molécula de anticorpo como descrito no presente é uma infecção persistente de: Plasmodium, como Plasmodium falciparum, ou Leishmania, como Leishmania donovani.

[0219] No contexto de tratamento de uma doença infecciosa persistente, a molécula de anticorpo pode ser administrada a um indivíduo em combinação com uma segunda terapia ou agente terapêutico que foi mostrado como adequado, ou espera- se que seja adequado, para o tratamento do patógeno em questão. Por exemplo, a molécula de anticorpo pode ser administrada ao indivíduo em combinação com um agente imunoterápico. Um agente imunoterápico para administração em combinação com uma molécula de anticorpo como descrito no presente documento pode ser uma molécula de anticorpo terapêutica. Por exemplo, a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar a um receptor do sistema imunológico inato. Exemplos de receptores do sistema imunológico inato aos quais a molécula de anticorpo terapêutica pode se ligar incluem receptores TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9, semelhante a RIG-I (por exemplo, RIG-I e MDA-5), e STING.

[0220] Em que a molécula de anticorpo é usada para impedir uma doença infecciosa, a molécula de anticorpo pode ser administrada em combinação com uma vacina para o patógeno em questão. Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a molécula de anticorpo descrita no presente documento pode atuar como um adjuvante em vacinação. Especificamente, acredita-se que administração da molécula de anticorpo a um indivíduo em combinação com vacina, acionará uma resposta imunológica maior contra o patógeno do que é obtida com a vacina por si só.

[0221] No contexto do tratamento de uma doença infecciosa persistente, o tratamento pode incluir eliminar a infecção, reduzir a carga patogênica do indivíduo, e impedir a recorrência da infecção. Por exemplo, o tratamento pode compreender impedir, melhorar, atrasar, anular ou interromper um ou mais sintomas e/ou sinais da infecção persistente. Alternativamente, o tratamento pode incluir impedir uma doença infecciosa.

[0222] Os recursos revelados na descrição anterior, ou nas seguintes reivindicações, ou nos desenhos anexos, expressos em suas formas específicas ou em termos de um meio para realizar a função revelada, ou um método ou processo para obter os resultados revelados, como adequado, pode, separadamente, ou em qualquer combinação de tais recursos, ser usados para realizar a invenção de diversas formas da mesma.

[0223] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades exemplificativas descritas acima, diversas modificações e variações equivalentes serão evidentes àqueles elementos versados na técnica dada essa revelação. Consequentemente, as modalidades exemplificativas da invenção apresentadas acima são consideradas como ilustrativas e não são limitantes. Várias alterações às modalidades descritas podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

[0224] Para evitar qualquer dúvida, quaisquer explicações teóricas fornecidas no presente documento são fornecidas para fins de aprimorar o entendimento de um leitor. Os inventores não desejam se ligar a qualquer uma dessas explicações teóricas.

[0225] Quaisquer dentre os cabeçalhos de seção usados no presente documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito.

[0226] Ao longo deste relatório descritivo, que inclui as reivindicações que seguem, salvo caso o contexto exija o contrário, a palavra “compreende” e “inclui”, e variações como “compreendem”, “que compreende”, e “que inclui” será entendida como implicando a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas declarados, porém não implicando a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.

[0227] Deve ser observado que, como usado no relatório específico e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem referentes no plural, exceto se o contexto claramente ditar de outro modo. As faixas podem ser expressas no presente documento como a partir de “cerca de” um valor particular, e/ou a “cerca de” outro valor particular. Quando tal faixa for expressa, será incluído outra modalidade a partir do um valor particular e/ou ao outro valor particular. De modo similar, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente “cerca de,” ficará entendido que o valor em particular forma uma outra modalidade. O termo “cerca de” em relação a um valor numérico é opcional e significa, por exemplo, +/- 10 %. Exemplos

[0228] Os presentes inventores tiveram o objetivo de gerar mAb2 que tivessem a capacidade para tornar tanto OX40 quanto CD137 em agonista na ausência de agentes de reticulação artificiais ou reticulação mediada por receptor Fcγ e que tivessem a capacidade para produzir uma resposta imunológica melhorada contra doenças como câncer. Nesse contexto, um mAb2 é uma molécula de anticorpo que compreende um sítio de ligação a antígeno com base em CDR que se liga a CD137 e um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado no domínio CH3 da molécula de anticorpo.

[0229] A fim de alcançar esse objetivo, os presentes inventores primeiro usaram métodos de maturação de seleção e afinidade para identificar Fcabs que tiveram a capacidade para se ligar a OX40 e induzir a ativação de célula T em seres humanos e camundongo, respectivamente (consultar Exemplos 2 e 3). Os inventores subsequentemente introduziram o sítio de ligação a antígeno OX40 desses Fcabs em um formato de mAb2 e mostraram que diversos desses mAb2 "simulados" OX40 anti-humano tiveram a capacidade para se ligarem a OX40 humano e de cinomolgo com a alta afinidade e ativar as células T quando reticulados (consultar Exemplo 4). Dentre esses, o clone FS20-22-49 mostrou o maior aumento em atividade agonística mediante a reticulação e também teve o menor EC50 para sua atividade agonística na presença de reticulação e foi, portanto, levado para o sítio de ligação a antígeno OX40 para desenvolvimento do mAb2 de indivíduo.

[0230] A fim de desenvolver o sítio de ligação a antígeno com base em CDR que se liga e tem a capacidade para tornar CD137 em agonista, os presentes inventores usaram métodos de seleção para identificar anticorpos monoclonais (mAbs) que podem se ligar a CD137 humano e tiveram apenas a capacidade para ativar células T quando reticulados (consultar o Exemplo 5). Os CDRs desses mAbs identificados foram subsequentemente clonados em mAb2 que compreendeu o sítio de ligação a antígeno OX40 FS20-22-49. Os CDRs desses mAb2 foram otimizados em sequência a fim de produzir os seguintes mAb2: FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22- 49AA/FS30-10-16, FS20-22-49AA/FS30-35-14 e FS20-22- 49AA/FS30-5-37 (consultar Exemplo 6). Demonstrou-se que todos esses mAb2 tem um alto nível de especificidade ao CD137 humano e têm a capacidade para ativar CD137 quando reticulados em um ensaio de ativação de célula T (consultar Exemplo 7). Nenhum dos mAb2 mostrou qualquer habilidade significativa para ativar CD137 na ausência de reticulação.

[0231] Tendo estabelecido que o sítio de ligação a antígeno OX40 FS20-22-49AA nos mAb2 selecionados teve a capacidade para se ligar e ativar OX40 quando reticulado e que, separadamente, os sítios de ligação a antígeno com base em CDR CD137 FS30-10-3, FS30-10-12, FS30-10-16, FS30-35-14 e FS30-5-37 tiveram a capacidade para se ligarem e ativarem CD137 quando reticulados, os presentes inventores demonstraram que os mAb2 que contêm esses domínios de ligação a antígeno tiveram a capacidade para ativar tanto OX40 quanto CD137 (também denominado “agonismo duplo”). Tal agonista duplo teria a capacidade para i) se ligar a OX40 para reticular o mAb2 e se ligar, agrupar e ativar (transformar em agonista) CD137, e ii) se ligar a CD137 para reticular o mAb2 e se ligar, agrupar e ativar (transformar em agonista) OX40. De modo importante, o agonista duplo deve ter a capacidade para acionar o agonismo autonomamente, com base na expressão dos alvos específicos (OX40 e CD137) e sem a necessidade de agentes de reticulação adicionais.

[0232] Os presentes inventores demonstraram que as moléculas de mAb2 testadas tiveram a capacidade para se ligarem a CD137 humano, OX40 humano, CD137 de cinomolgo e OX40 de cinomolgo (consultar o Exemplo 8) e que as moléculas de mAb2 testadas tiveram a capacidade para se ligarem a CD137 humano e OX40 humano simultaneamente (consultar o Exemplo 9). Os presentes inventores mostraram que a mutação “LALA” no domínio CH2 do mAb2 reduziu suas ligações a receptores Fcγ e que o clone de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 não teve a capacidade para induzir a ativação de ADCC em um bioensaio de ADCC (consultar o Exemplo 10).

[0233] Os presentes inventores também mostraram que as moléculas de mAb2 OX40/CD137 testadas se ligaram a OX40 e CD137 humano e de cinomolgo expressos em célula, sem ligação não específica observada (consultar o Exemplo 11).

[0234] Os presentes inventores demonstraram, então, que as moléculas de mAb2 testadas que contêm essa mutação LALA tiveram a capacidade para induzir a ativação de célula T na ausência de agentes de reticulação artificiais em um ensaio de ativação de célula T com o uso de enterotoxina A estafilocócica (SEA; consultar Exemplo 12). Os presentes inventores também demonstraram que as moléculas de mAb2 testadas podem induzir a ativação de célula T na ausência de agentes de reticulação artificiais em um ensaio de ativação de célula pan-T e que essa atividade é dependente do mAb2 que engata tanto OX40 quanto CD137 ao mesmo tempo (consultar o Exemplo 13 e 16). Os inventores confirmaram adicionalmente que o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 teve a capacidade para ativar esses receptores em células T CD4+ e CD8+, respectivamente, na ausência de reticulação (consultar o Exemplo 14).

[0235] Visto que os mAb2 OX40/CD137 anti-humano não se ligam a proteínas de camundongo, a fim de testar o potencial de um mAb2 OX40/CD137 para ilicitar uma resposta antitumoral mediada por célula T, em que um mAb2 paralelo foi produzido para alvejar OX40 de camundongo e CD137 de camundongo, tanto com quanto sem a mutação LALA (identificado como FS20m-232- 91AA/Lob12.3 e FS20m-232-91/Lob12.3, respectivamente). Os inventores mostraram que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 pode induzir a ativação de célula T sem quaisquer agentes de reticulação adicionais e que essa atividade é dependente do mAb2 que engata tanto OX40 quanto CD137 ao mesmo tempo (consultar os Exemplos 15 e 16).

[0236] Os presentes inventores demonstraram que os mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 e FS20m-232-91/Lob12.3 têm eficácia antitumoral in vivo em um modelo tumoral singênico CT26 (consultar o Exemplo 17). Os inventores demonstraram adicionalmente que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 tem um efeito em células T circulantes, aumentando a frequência de células T ativadas e proliferantes (consultar os Exemplos 18 e 19). Os inventores demonstraram que o mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3 tem eficácia antitumoral in vivo em um modelo tumoral singênico B16-F10 (consultar Exemplo 20).

[0237] Os inventores realizaram uma avaliação de caracterização analítica e estabilidade preliminar do mAb2 (consultar o Exemplo 21). Todos os cinco mAb2 testados mostraram caracterização analítica e estabilidade favorável.

[0238] Os presentes inventores demonstraram que a combinação do mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 com um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-1 em um ensaio de ativação de célula T com o uso de SEA pode resultar em um aumento na atividade máxima de células T in vitro acima que é observada com o mAb2 OX40/CD137 por si só. Os presentes inventores mostraram adicionalmente que o tratamento com a combinação do mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 e um anticorpo anti-PD-1 in vivo em um modelo tumoral de camundongo CT26 teve a capacidade para resultar em um aumento em atividade antitumoral, para fornecer um benefício de sobrevivência, e para melhorar modulação farmacodinâmica de células T e células NK proliferantes em comparação com o tratamento com qualquer agente único (consultar o Exemplo 22).

[0239] Os presentes inventores demonstraram que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 tem atividade antitumoral dependente de dose in vivo em um modelo tumoral singênico CT26 até um determinado nível de dose e que essa atividade foi mantida em níveis superiores de dose. Os inventores também mostraram que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 pode induzir o estabelecimento de memória imunológica protetora em camundongos de “resposta completa” e a proteção contra nova inoculação com células CT26 (consultar o Exemplo 23). Os inventores demonstraram que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 tem um efeito em células T circulantes, aumentando significativamente a frequência de células T CD4+ proliferantes (Ki67+) quanto CD8+ em níveis variantes de dose (consultar o Exemplo 24). Os inventores mostraram adicionalmente que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 tem a capacidade para aumentar a frequência de CD8 células T ativadas (CD69+) e proliferantes (Ki67+), e que a depleção de célula T CD4 tem um efeito prejudicial nessa resposta farmacodinâmica periférica mediada pelo mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3 (consultar o Exemplo 25). Os inventores mostraram que o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 teve atividade funcional similar em um ensaio de PBMC de macaco cinomolgo primário em comparação com um ensaio humano equivalente, em que o mAb2 foi bem tolerado em macacos cinomolgo em doses até 30 mg/kg, e que esse teve a capacidade para induzir um aumento relacionado a fármaco em proliferação e ativação de células T CD4+ e CD8+ de memória central e memória efetora e células NK em macacos cinomolgo (consultar o Exemplo 26).

[0240] Os inventores também mostraram que quando estudado em camundongos BALB/c, o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 induziu um aumento moderado e transiente em níveis de célula T infiltração e proliferação no fígado em comparação com um agonista CD137 independente de reticulação, que induziu infiltração, proliferação e ativação de célula T de fígado elevadas e mantidas (consultar Exemplo 27). Por fim, em um modelo tumoral de camundongo singênico CT26, os inventores mostraram que entre camundongos tratados com o mAb2 FS20m- 232-91AA/Lob12.3 ou um mAb2 OX40/CD137 que compreende o mesmo Fcab OX40 em par com um clone de Fab anti-CD137 independente de reticulação, não houve diferenças em crescimento tumoral ou sobrevivência, independentemente da habilidade do clone de Fab independente de reticulação para induzir níveis e proliferação de célula T aumentados como em comparação com o clone de anti-CD137 Lob12.3 dependente de reticulação do mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 (consultar Exemplo 28).

[0241] Esses experimentos são descritos em maiores detalhes nos seguintes Exemplos. Exemplo 1 – Seleção e caracterização de antígeno

[0242] Os métodos de seleção e triagem usados para identificar mAb2 que têm a capacidade para se ligar e tornar tanto OX40 quanto CD137 em agonista exigem o uso de vários antígenos OX40 e CD137. A produção desses antígenos é descrita em maiores detalhes abaixo.

1.1 Antígenos OX40

[0243] Os antígenos OX40 usados para a seleção de Fcabs específicos para OX40 humano e de camundongo e para testar a reatividade cruzada de Fcabs selecionados com OX40 de cinomolgo foram preparados internamente ou obtidos a partir de fontes comerciais, como descrito abaixo.

1.1.1 Preparação de antígenos OX40 humano, de cinomolgo e de camundongo recombinantes e solúveis

[0244] Para preparar antígenos OX40 diméricos, solúveis e recombinantes, o domínio extracelular de OX40 foi fusionado a camundongo Fc, que aprimorou a solubilidade e estabilidade do antígeno. Especificamente, o domínio extracelular do OX40 relevante (humano, de cinomolgo ou de camundongo) foi clonado no vetor pFUSE-mIgG2aFc2 (Invivogen nº de catálogo pfuse- mg2afc2) com o uso de enzimas de restrição EcoRI-HF e BglII para produzir antígenos com um domínio Fc IgG2a de camundongo na terminação C. Os antígenos OX40 recombinantes foram, então, produzidos por expressão transiente nas células HEK293-6E (Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá) e purificados com o uso de colunas de proteína A mAb Select SuRe (GE Healthcare, 11003494), seguido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para garantir que o antígeno resultante foi uma espécie única e não conteve agregados.

[0245] Para preparar versões biotiniladas dos antígenos OX40 recombinantes, os antígenos foram biotinilados com o uso de kit de Sulfo-NHS-SS-Biotina EZ-Link™ (Thermo Fisher Scientific, nº de catálogo 21331) seguindo o protocolo do fabricante. O antígeno OX40 biotinilado foi usado para os experimentos de seleção descritos abaixo, mas não para medições de afinidade de ligação. A purificação dos antígenos OX40 biotinilados foi realizada em duas etapas, com o uso de uma coluna de dessalinização PD-10 (GE Healthcare, 17-0851- 01) seguida por uma coluna de giro Amicon 30k Millipore, UFC903024) de acordo com instruções do fabricante.

Propriedades biofísicas dos antígenos recombinantes foram caracterizadas por análise de SE-HPLC para garantir que nenhum agregado estivesse presente e por PAGE para verificar o tamanho das moléculas. A determinação de tamanho por PAGE indicou que os antígenos solúveis foram diméricos, visto que seus pesos moleculares estimados foram o dobro do peso molecular previsto de um monômero. Os antígenos recombinantes também foram analisados por análise de alteração de gel que mostrou que a extensão de biotinilação foi acima 90 %. ELISA e ressonância de plasmon de superfície (SPR) foram usados para confirmar que os antígenos OX40 humano (hOX40-mFc), de camundongo (mOX40-mFc) e de cinomolgo (cOX40-mFc) recombinantes e biotinilados podem ser ligados por anticorpos específicos OX40 (anticorpo 11D4 [Patente europeia nº 2242771] para OX40 humano e de cinomolgo; anticorpo OX40 anti-humano de ovelha policlonal para OX40 de cinomolgo [R&D Systems nº de catálogo AF3388]; anticorpo ACT35 para OX40 humano [Biolegend nº de catálogo 35002] e anticorpo OX86 para OX40 de camundongo [Biolegend nº de catálogo 119408]). Esses antígenos são listados na Tabela 2 abaixo.

1.1.2 Preparação de linhagens celulares que expressam OX40 humano, de cinomolgo e de camundongo

[0246] OX40 humano, de cinomolgo e de camundongo (consultar a Tabela 1 para sequências) foram clonados em vetor pLVX-EF1a-IRES-puro (Clontech, nº de catálogo 631253) com o uso de enzimas de restrição SpeI-HF e NotI-HF. Os vetores foram, então, transformados na linhagem celular Lenti-X 293T (Clontech, nº de catálogo 632180) juntamente com uma mistura de empacotamento Lenti-X HTX (nº de catálogo de Clontech 631249) para gerar lentivirus. Os lentivirus foram, então, usados para transduzir células DO11.10 (Saúde Judaica Nacional [National Jewish Health]). As células que superexpressam OX40 foram selecionadas por incubação das células com 5 µg/ml de puromicina (nº de catálogo de Life Technologies A11113803) por aproximadamente 2 semanas, após a clonagem de linhagem celular por diluição em série. A expressão de OX40 pelas linhagens celulares foi testada por citometria de fluxo com o uso de anticorpos específicos OX40 identificados de modo fluorescente (OX86; ACT35; e OX40 anti- humano de ovelha policlonal, como descrito no Exemplo 1.1.1 e na Tabela 2). Linhagens celulares que expressam OX40 humano (DO11.10-hOX40), de camundongo (DO11.10-mOX40) ou de cinomolgo (DO11.10-cOX40), em que todas as células mostraram pelo menos valores de fluorescência 10 vezes maiores que células não transduzidas na análise de citometria de fluxo, foram selecionadas. Essas linhagens celulares são listadas na Tabela 2 abaixo.

[0247] Tabela 1: Sequências de OX40 Gene de Espécie Fonte ID de clone Número de SEQ interesse (nº de acesso Genbank ID catálogo) NO OX40 Humano Thermo MHS6278- BC105070 132 Fisher 202858046 Scientific OX40 Cinomolgo Síntese de N/A XP_005545179 134 gene OX40 Camundongo Síntese de N/A NM_011659.2 133 gene

1.1.3 Antígenos OX40 comercialmente disponíveis

[0248] Diversos antígenos OX40 comercialmente disponíveis foram testados.

[0249] O domínio extracelular OX40 humano etiquetado por His recombinante foi obtido a partir da SinoBiologicals (nº de catálogo 10481-H08H-50). No entanto, a análise de SE-HPLC desse antígeno mostrou que menos que 50 % do antígeno estavam em uma forma não agregada monomérica. Esse antígeno não foi, portanto, usado em análise subsequente.

[0250] OX40 humano/Fc humano recombinante (hOX40-hFc) e OX40 de camundongo/Fc humano recombinante (mOX40-hFc), que compreenderam o domínio Fc IgG1 humano na terminação C, foram obtidos a partir de R&D Systems (hOX40-hFc: nº de Catálogo 3388-OX-050; mOX40-hFc: nº de Catálogo 1256-OX-050) e biotinilados internamente. As propriedades biofísicas desses antígenos solúveis foram caracterizadas por análise de SE- HPLC para garantir que nenhum agregado estivesse presente e por PAGE para verificar o tamanho das moléculas. A determinação de tamanho por PAGE indicou que os antígenos solúveis foram diméricos, visto que seus pesos moleculares estimados foram o dobro daquele esperado para o antígeno monomérico. Os antígenos solúveis também foram analisados por análise de alteração de gel que mostrou que a extensão de biotinilação foi acima 90 %. ELISA e SPR foram usados para confirmar que os antígenos OX40 humano (hOX40-hFc) e camundongo (mOX40-hFc) recombinantes e biotinilados podem ser ligados por anticorpos específicos OX40 (11D4; ACT35; e OX86 como descrito no Exemplo 1.1.1 e na Tabela 2 abaixo.

[0251] Tabela 2: Antígenos OX40

Nome de Fonte Versão Espécie Antígeno Formato de SEQ ID antígeno (comercial/ biotinilada solúvel/expresso antígeno NO/Fonte internamente preparada? em célula de preparado) antígeno hOX40- internamente Sim ser humano solúvel dimérico 135 mFc mOX40- internamente Sim camundongo solúvel dimérico 136 mFc cOX40- internamente Sim cinomolgo solúvel dimérico 137 mFc DO11.10- internamente Não ser humano expresso em conformação 132 hOX40 célula natural DO11.10- internamente Não camundongo expresso em conformação 133 mOX40- célula natural DO11.10- internamente Não cinomolgo expresso em conformação 134 cOX40 célula natural hOX40- comercial Sim ser humano solúvel dimérico nº de hFc catálogo 3388-OX- 050 (R&D Systems) mOX40- comercial Sim camundongo solúvel dimérico nº de hFc catálogo 1256-OX- 050 (R&D Systems)

1.2 Antígenos CD137

[0252] Os antígenos CD137 usados para a seleção de mAbs específico para CD137 humano e para testar a reatividade cruzada de Fcabs selecionados com OX40 de cinomolgo foram preparados internamente ou obtidos a partir de fontes comerciais, como descrito abaixo.

1.2.1 Preparação de antígenos CD137 humano e de cinomolgo recombinantes e solúveis

[0253] Visto que foi constatado que diversos antígenos recombinantes comercialmente disponíveis são inadequados para o uso, por exemplo, devido ao fato de níveis inaceitáveis de agregados estarem presentes quando testados, os seguintes antígenos diméricos e monoméricos recombinantes (Tabela 3) foram produzidos internamente para uso em seleção, triagem e caracterização adicional dos mAbs anti-CD137.

[0254] Tabela 3: Antígenos CD137 humano e de cinomolgo recombinantes Tipo Designação Espécie Solúvel Versão Formato SEQ ID ou biotinilada de NOs expresso preparada? Antígeno em célula Recombinante hCD137- Humano Solúvel Sim Dímero 138 & mFc-Avi 141 Recombinante hCD137- Humano Solúvel Sim Monômero 158 Avi-His Recombinante cCD137- Macaco Solúvel Sim Dímero 140 & mFc-Avi cinomolgo 141

[0255] O antígeno monomérico foi produzido clonando-se DNA que codifica o domínio extracelular de CD137 humano em conjunto com uma sequência de Avi e seis resíduos de histidina C-terminal em vetores pFUSE modificados (Invivogen nº de catálogo pfuse-mg2afc2) com o uso de enzimas de restrição EcoRI-HF e BamHI-HF. Os vetores foram transfectados em células HEK293-6E, e CD137 expresso foi purificado com o uso de uma coluna de níquel excel HisTrap™ (GE Healthcare, 17-3712-06) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para garantir que o antígeno foi uma espécie única e não conteve agregados.

[0256] Para produzir os antígenos diméricos, os construtos de DNA que codificam o domínio extracelular do CD137 humano ou de cinomolgo (cino) fusionado com o domínio Fc mIgG2a em conjunto com uma sequência de Avi foram clonados em vetores pFUSE modificados e transfectados em células HEK293-6E. CD137 recombinante foi purificado com o uso de coluna de proteína A MabSelect SuRe™ (GE Healthcare, 11003494) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) para garantir que o antígeno fosse uma espécie única e não tivesse agregados.

[0257] As versões biotiniladas dos antígenos CD137 diméricos e monoméricos foram preparadas com o uso de um kit de reação de proteína ligase de biotina-biotina de BirA (Avidity LLC, BirA500) para produzir antígeno monomérico CD137 identificado como uma molécula de biotina simples e antígenos diméricos CD137 etiquetados com duas moléculas de biotina, uma para cada um dos dois monômeros. Especificamente, 3 mg do antígeno CD137 foram misturados com 7,8 µl de mistura de enzima BirA a uma razão molar de enzima para substrato de 1:50. Os aditivos foram, então, adicionados de acordo com as recomendações do fabricante (142 µl de Biomix A, 142 µl de Biomix B, 142 µl de Biotina) e a mistura de reação foi incubada por duas horas à temperatura ambiente. Para manter a integridade dos antígenos biotinilados, a mistura de reação teve tampão imediatamente trocado por DPBS com o uso de filtros de 30 µm Amicon.

[0258] Os antígenos CD137 foram adicionalmente purificados por SEC para garantir a remoção da enzima BirA e produzir uma preparação de proteína monodispersada de alta qualidade final sem agregados de alto peso molecular.

Especificamente, antígenos do mesmo lote de produção foram misturados e analisados quanto a estabilidade e pureza por cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC), eletroforese em gel de poliacrilamida de SDS (SDS-PAGE), e cromatografia por exclusão de tamanho com dispersão de luz em múltiplos ângulos (SEC-MALS). A biotinilação completa das proteínas foi confirmada por um gel de SDS-PAGE de troca de estreptavidina. Confirmou-se que os antígenos CD137 humano recombinantes se ligam a um anticorpo de controle positivo CD137 anti-humano, 20H4.9 (Patente nº US7288638), in vitro por ressonância de plasmon de superfície (SPR) e a células DO11.10 que expressam ligante de CD137 humano por citometria de fluxo. Confirmou-se que o antígeno CD137 de cino recombinante se liga a células DO11.10 que expressam ligante de CD137 de cino por citometria de fluxo. Para garantir a maior pureza possível para os antígenos CD137 usados nos protocolos de seleção, a caracterização de proteína completa dos antígenos foi realizada para garantir que a porcentagem de proteína agregados presente não excedeu 2 %.

1.2.2 Preparação de linhagens celulares que expressam CD137 humano, de cinomolgo e de camundongo

[0259] As células DO11.10 (Saúde Judaica Nacional [National Jewish Health]) que expressam CD137 humano ou de cino de tamanho total, designadas “DO11.10-hCD137” e “DO11.10-cCD137” respectivamente (consultar a Tabela 4), foram produzidas a fim de apresentar o antígeno em sua conformação mais natural durante a seleção e caracterização adicional dos mAbs anti-CD137 selecionados.

[0260] As células DO11.10 que expressam CD137 de camundongo de comprimento total, designadas “DO11.10- mCD137”, também foram geradas a fim de determinar a ligação de um mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo para se ligar a CD137 de camundongo expresso em célula (consultar Exemplo 11.2).

[0261] A transdução lentiviral foi usada para gerar células DO11.10 que sobrepreexpressam receptores CD137 humano, de cino ou camundongo com o uso do Sistema de Embalagem Lenti-X HTX (Clontech, 631249). O vetor de expressão Lenti-X (pLVX) (Clontech, 631253) que contém cDNA que codifica o CD137 humano (SEQ ID NO: 126), CD137 de cino (SEQ ID NO:128) ou CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 164), foi co-transfectado com uma Mistura de Embalagem HTX Lenti-X na Linhagem Celular de Lenti-X 293T (Clontech, 632180) para gerar vírus. A linhagem de células DO11.10 foi, então, transduzida com esses vetores lentivirais.

[0262] A expressão de CD137 humano, de cino ou de camundongo nessas células foi confirmada por ligação de anticorpos de controle positivo de anti-CD137 (20H4.9, MOR7480.1 (Publicação de Patente nº US 2012/0237498 A1) e Lob12.3 (Universidade de Southampton), respectivamente) às células com o uso de citometria de fluxo.

[0263] Tabela 4: Antígenos CD137 humano e de cinomolgo expressos em superfície celular Tipo Designação Espécie Apresentação SEQ ID Expresso em DO11.10- Célula Humano superfície 126 hCD137 celular

Tipo Designação Espécie Apresentação SEQ ID Expresso em DO11.10- Macaco Célula superfície 128 cCD137 cinomolgo celular Expresso em DO11.10- Célula Camundongo superfície 164 mCD137 celular Exemplo 2 – Seleção e caracterização de Fcabs OX40 anti- humano

2.1 Seleção de naïve de Fcabs de OX40 anti-humano

[0264] A fim de selecionar Fcabs específicos para OX40 humano a partir de bibliotecas de fago naïve tanto OX40 humano dimérico, solúvel, biotinilado e recombinante (hOX40- mFc; consultar a Tabela 2) e OX40 humano expresso em célula (DO11.10-hOX40) foram usados como antígenos. As células que expressam OX40 humano foram usadas além do OX40 humano dimérico, solúvel, biotinilado e recombinante em alguns dos protocolos de seleção para garantir que os Fcabs selecionados tiveram a capacidade para se ligar a OX40 em sua conformação natural nas superfícies celulares.

[0265] Seis bibliotecas de fago naïve que exibem o domínio CH3 (numeração IMGT 1.4-130) que compreende alças AB (resíduos 14 a 18 de acordo com o esquema de numeração IMGT) e alças EF (resíduos 92 a 101 de acordo com o esquema de numeração IMGT) parcialmente aleatorizados no domínio CH3 foram construídas. Uma dentre as seis bibliotecas compreendeu adicionalmente clones com uma inserção de dois ou quatro aminoácidos (codificados por dois ou quatro códons de NNK) na posição 101 na alça EF do domínio CH3 (resíduos inseridos são numerados 101.1 a 101.4 de acordo com o esquema de numeração IMGT).

[0266] Todas as seis bibliotecas foram submetidas a três ciclos de seleção com o uso de OX40 humano dimérico, solúvel, biotinilado e recombinante (hOX40-mFc; consultar a Tabela 2). Todas as seis bibliotecas também foram submetidas a uma campanha de seleção adicional com o uso de hOX40-mFc em um primeiro ciclo de seleção seguido por OX40 humano expresso em célula (DO11.10-hOX40 em dois ciclos de seleção adicionais; consultar a Tabela 2).

[0267] 2133 clones identificados após o terceiro ciclo de seleção das seis bibliotecas foram triados por ELISA quanto à ligação a OX40 humano. Isso resultou em 32 ligantes positivos únicos serem identificados, os quais foram subclonados e expressos como Fcabs solúveis (que consiste em uma dobradiça truncada [SEQ ID NO: 101], domínio CH2 e CH3) em células HEK Expi293 (Fcabs clonados em vetor pTT5 [Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá] transfectadas com o uso de kit de Transfecção ExpiFectamine 293 [Life Technologies, A14524] em células Expi293F [Life technologies, A14527]).

[0268] Os 32 Fcabs únicos foram testados quanto às suas habilidades para se ligarem a OX40 humano expresso em célula (DO11.10-hOX40). 15 dos 32 Fcabs triados mostraram ligação de célula a DO11.10-hOX40 e o EC50 para essas interações estava na faixa de 0,1 a 62 nM. Os 15 Fcabs que mostraram ligação a DO11.10-hOX40 foram testados com o uso de um ensaio de repórter NF-κB humano interno que testa quanto a ativação da trajetória de sinalização de NF-κB. Seis dos 15 Fcabs mostraram um aumento em atividade quando reticulados com um anticorpo Fc anti-humano no ensaio de repórter NF-κB humano, sugerindo que esses Fcabs teriam a capacidade para ativar sinalização de OX40. Fcabs designados FS20-22 e FS20-31 mostraram altos níveis de atividade nesse ensaio, e suas atividades aumentaram quando o Fcab foireticulado com um mAb CH2 anti-humano (clone MK1A6 (Jefferis et al., 1985 e Jefferis et al., 1992), produzido internamente). Esses foram selecionados quanto a maturação por afinidade.

2.2 Maturação de afinidade de Fcabs OX40 anti-humano

[0269] As bibliotecas de maturação por afinidade para FS20-22 e FS20-31 foram criadas aleatorizando-se cinco resíduos na alça AB (resíduos 14 a 18) ou cinco resíduos na alça CD (resíduos 45.1 a 77) do domínio CH3 com o uso de iniciadores aleatorizados a partir de ELLA Biotech com o uso de uma distribuição equimolar de aminoácidos que exclui cisteínas, ou aleatorizando-se porções da alça EF (resíduos 92 a 94 e 97 a 101 do domínio CH3 (toda numeração de resíduo está de acordo com o esquema de numeração IMGT).

[0270] 1410 Fcabs das saídas da maturação por afinidade foram triados por ELISA quanto à ligação a OX40 humano e 204 ligantes positivos únicos foram identificados, subclonados e expressos como Fcabs solúveis nas células HEK Expi293, como descrito noExemplo 2.1 acima.

[0271] As separações dos Fcabs solúveis quando ligados a hOX40-mFc foram medidos com o uso de um Biacore 3000 (GE Healthcare) na ausência e presença de reticulação de anti- CH2 com o uso de clone MK1A6 de mAb CH2 anti-humano (consultar Exemplo 2.1). Fcabs com separações aprimoradas em comparação com o Fcab parental relevante foram adicionalmente triados quanto à ligação a OX40 humano expresso em célula e para atividade no ensaio de ativação de célula T humana interno. Todos dentre os Fcabs se ligaram a OX40 humano expresso em célula. 10 Fcabs da linhagem FS20- 22 e 18 Fcabs da linhagem FS20-31 mostraram altos níveis de atividade no ensaio de ativação de célula T humano foram selecionados para embaralhamento de alça como descrito abaixo.

[0272] Para a linhagem FS20-22, duas bibliotecas de alça embaralhada foram geradas embaralhando-se três alças CD, seis alças EF e a alça AB parental ou uma alça AB maturada por afinidade. Para a linhagem FS20-31, uma biblioteca de alça embaralhada foi gerada, em que contém quatro alças AB, sete alças CD e sete alças EF.

[0273] As sequências embaralhadas foram expressas como Fcabs solúveis nas células HEK Expi293, como descrito no Exemplo 2.1 acima, e triadas quanto à ligação a antígeno hOX40-mFc biotinilado com o uso de Biossensores de Estreptavidina Dip e ReadTM (Pall FortéBio, 18-5050) em um Octet QKe System (Pall FortéBio). Fcabs com uma separação aprimorada quando ligados a hOX40-mFc em comparação com o Fcab parental foram sequenciados, resultando em 35 Fcab único da linhagem FS20-22 e 62 da linhagem FS20-31. Os Fcabs únicos identificados foram testados quanto à ligação a antígeno hOX40-mFc biotinilado na presença e na ausência de reticulação de CH2 com o uso de clone MK1A6 de mAb CH2 anti- humano com o uso de um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare).

[0274] Para a linhagem FS20-22, 18 Fcabs foram escolhidos para expressão em formato de mAb2 simulado (4420 LALA) e caracterização adicional com base na separação mais lenta com reticulação de CH2 quando ligados a hOX40-mFc, a maior diferença na separação entre separações não reticuladas e reticuladas por CH2 quando ligados a hOX40-mFc e a força de ligação a hOX40-mFc, como acima. Para a linhagem FS20-31, os nove Fcabs com a separação mais lenta quando ligados a hOX40- mFc com reticulação de CH2 e os nove Fcabs com a separação mais lenta quando ligados a hOX40-mFc sem reticulação de CH2 foram escolhidos para expressão e caracterização adicional em formato de mAb2 simulado (4420 LALA). Visto que uma diversidade de Fcabs foram comuns para ambos esses grupos de nove Fcabs, Fcabs adicionais que mostraram separações lentas quando ligados a hOX40-mFc na ausência de reticulação de CH2 foram escolhidos da linhagem FS20-31 para levar o número total de Fcabs dessa linhagem a expressão e caracterização adicional em formato de mAb2 simulado a 18. Com o uso dos dados do ensaio de ativação de célula T, seis Fcabs adicionais da linhagem FS20-22 e oito Fcabs da linhagem FS20- 31 foram identificados, os quais mostraram alta atividade nesse ensaio e que também foram, portanto, expressos em formato de mAb2 simulado (4420 LALA) e adicionalmente caracterizados (consultar o Exemplo 4). Exemplo 3 – Seleção e caracterização de Fcabs OX40 anti- camundongo 3,1. Seleção de naïve de Fcabs OX40 anti-camundongo

[0275] Uma biblioteca de levedura naïve que exibe domínios CH1 a CH3 de IgG1 humano, que contiveram aleatorizações na alça AB (resíduos 11-18 de acordo com o esquema de numeração IMGT) e na alça EF (resíduos 92-101 de acordo com o esquema de numeração IMGT) do domínio CH3 e incluíram uma inserção aleatorizada de cinco resíduos entre resíduos 16 e 17 (de acordo com o esquema de numeração IMGT) da alça AB, foi usada para seleção. A levedura foi incubada com OX40 de murino recombinante biotinilado fusionado a um domínio Fc IgG humana (mOX40-hFc; Tabela 2) e ordenada por MACS com o uso de microesferas revestidas por estreptavidina. Três ciclos de seleções de FACS foram, então, realizados com o uso de concentrações decrescentes de mOX40-hFc biotinilado na presença de um molar excesso de cinco vezes de hFc. As células foram colorizadas com estreptavidina-aloficocianina (APC) (BD Bioscience, 349024) ou anti-Biotin-APC (Miltenyi Biotec, 130-090-856) e ordenadas com o uso de um ordenador de célula FACSAria (BD Bioscience). 182 Fcabs individuais de populações enriquecidas foram triados quanto a ligação a antígeno e dois ligantes positivos únicos foram subclonados e expressos como Fcabs solúveis, como anteriormente descrito no Exemplo 2.1. Fcabs foram caracterizados quanto à ligação a mOX40-hFc por ELISA e para atividade em um ensaio de repórter NF-κB de camundongo interno. Apenas um Fcab, FS20m- 232, foi ativo no ensaio de repórter NF-κB e mostrou ligação a células que expressam OX40 de camundongo, desse modo, esse Fcab foi selecionado para maturação por afinidade.

3.2 Maturação de afinidade de Fcab mOX40

[0276] Três bibliotecas de maturação por afinidade de exibição de fago foram construídas aleatorizando-se sete resíduos na alça AB (resíduos 15 – 16.5, de acordo com o esquema de numeração IMGT) (Biblioteca 1), seis resíduos na alça CD (resíduos 45.1-78 de acordo com o esquema de numeração IMGT) (Biblioteca 2) ou cinco resíduos na alça EF (resíduos 92-94 e 97-98 de acordo com o esquema de numeração

IMGT) (Biblioteca 3) do Fcab FS20m-232 com o uso de iniciadores aleatorizados a partir de ELLA Biotech com o uso de uma distribuição equimolar de aminoácidos excluindo cisteína.

[0277] Três ciclos de seleção foram realizados nas bibliotecas de maturação por afinidade com o uso de mOX40- mFc biotinilado recombinante alternativamente capturado em Dynabeads revestidos com estreptavidina (ThermoFisher Scientific, 11205D) e revestidos com neutravidina (ThermoFisher Scientific, 14203 e A2666). As concentrações decrescentes de antígeno de 50 nM (Ciclo 1) a 10 nM (Ciclo 2), a 1 nM (Ciclo 3) foram usadas para identificar ligantes de alta afinidade. 1655 fagos individuais do terceiro ciclo de seleção foram triados por ELISA de fago quanto à ligação a mOX40-mFc e 98 ligantes positivos únicos foram identificados, subclonados e expressos como Fcabs solúveis nas células HEK Expi293, como descrito no Exemplo 2.1. Os Fcabs foram adicionalmente triados quanto a ligação de célula e atividade em um ensaio de repórter NF-κB de camundongo. Os Fcabs mais ativos foram selecionados para embaralhamento de alça.

[0278] Uma biblioteca de alça embaralhada foi gerada, em que contém 27 alças CD (todas as 26 sequências únicas identificadas a partir da maturação por afinidade e a sequência de WT) embaralhadas com 37 alças EF (aquelas com a melhor ligação a OX40 de camundongo no ELISA de fago e sequência de WT), com todos os clones embaralhados que contém a alça AB do Fcab FS20m-232. 750 sequências embaralhadas foram expressas como Fcabs solúveis (que contém uma dobradiça truncada) nas células HEK Expi293 como descrito acima. Os tensoativos HEK que contêm os Fcabs foram triados quanto a separações aprimoradas medindo-se a ligação dos Fcabs a mOX40-mFc biotinilado (Tabela 2) com o uso de Biossensores de Estreptavidina Dip e ReadTM (Pall FortéBio, 18-5050) em um Sistema Octet QKe (Pall FortéBio). Os 11 Fcabs aleatorizados de alça AB única e 60 Fcabs aleatorizados de alça EF única foram subclonados e expressos como Fcabs solúveis nas células HEK Expi293, como descrito acima. Esses Fcabs foram adicionalmente triados em conjunto com os 43 Fcabs embaralhados com as separações mais lentas para ligação de célula e atividade em um ensaio de ativação de célula T de camundongo. O Fcab FS20m-232-91 teve a separação mais lenta quando ligado a mOX40-mFc biotinilado e a atividade mais alta no ensaio de ativação de célula T de camundongo quando reticulado por clone MK1A6 de mAb CH2 anti-humano e foi, portanto, selecionado como o Fcab (substituto) de camundongo para uso em experimentos subsequentes. Exemplo 4 – Construção, expressão e caracterização de Fcab anti-OX40 em formato de mAb2

4.1 Construção e expressão de mAb2 simulado

[0279] mAb2 “simulado” que compreende o OX40 anti-humano e Fcabs de OX40 anticamundongo identificados foram preparados a fim de permitir a caracterização desses Fcabs em formato de mAb2. Esse mAb2 simulado foi preparado a partir dos Fcabs anti-OX40 e das regiões variáveis de anticorpo anti-FITC 4420 (Bedzyk et al., 1989 e Bedzyk et al., 1990) em uma estrutura principal de IgG1 humano (consultar SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, e SEQ ID NO: 116 para maiores detalhes) ou as regiões variáveis de anticorpo de lisozima branca de ovo anti-hen (HEL) D1.3 (Braden et al., 1996) em uma estrutura principal de IgG1 humano (consultar SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 118 para maiores detalhes) substituindo-se os domínios CH3 dos anticorpos anti-FITC e anti-HEL com os domínios CH3 dos Fcabs anti-OX40 dentro de sítios XhoI e BamHI presentes na sequência do domínio não modificado CH3 de IgG1 humano. Os mAb2 simulados compreenderam a cadeia leve do mAb anti-FITC 4420 (SEQ ID NO: 116) ou do mAb anti-HE D1.3 (SEQ ID NO: 118), respectivamente, e também contiveram a mutação LALA no domínio CH2 da cadeia pesada para reduzir a interação de receptor Fc-gama e reticulação induzida por receptor Fc-gama potencial. A presença da mutação LALA em mAb2 simulados e mAb2 referida nesses exemplos é denotada pelo sufixo “AA” no fim da parte Fcab de seus nomes de clone.

[0280] O mAb2 simulado foi produzido por meio de expressão transiente em células HEK293-6E e purificado com o uso de colunas de proteína A Select SuRe de mAb.

4.2 Afinidade de ligação de Fcabs OX40 anti-humano em formato de mAb2 simulado para OX40 humano expresso em célula e de cinomolgo

[0281] A afinidade dos Fcabs OX40 anti-humano em formato de mAb2 simulado (4420 LALA) quanto à ligação a OX40 humano ou de cinomolgo expresso em célula (células DO11.10 que expressam OX40 humano [DO11.10-hOX40] ou de cinomolgo [DO11.10-cOX40]; consultar a Tabela 2) foi medida com o uso de citometria de fluxo. A ligação não específica também foi avaliada por teste de ligação a células HEK que não expressam OX40 por citometria de fluxo.

[0282] As diluições de mAb2 simulados (4420 LALA) e mAb de controle (2 x de concentração final) foram preparadas em triplicata em 1 x DPBS (Gibco, 14190-094). As suspensões de célula DO11.10-hOX40 ou DO11.10-cOX40 ou HEK foram preparadas em PBS+2 % de BSA (Sigma, A7906) e semeadas a 4 x 106 célula/ml com 50 µl/poço em placas 96 de poços com fundo em V (Costar, 3897). 50 µl dos mAb2 simulados (4420 LALA) ou mAb de controle (mAb OX40 anti-humano, 11D4) diluições foram adicionados aos poços que contém células (volume final de 100 µl) e incubados a 4 °C por 1 hora. As placas foram lavadas e 100 µl/poço de anticorpo secundário (anticorpo Fc-488 anti-humano, Jackson ImmunoResearch, 109- 546-098) diluído 1:1000 em PBS+2 % de BSA foram, então, adicionados e incubados por 30 min a 4 °C no escuro. As placas foram lavadas e ressuspensas em 100 µl de PBS que contêm DAPI (Biotium, nº de catálogo 40043) a 1 µg/ml. As placas foram lidas com o uso de citômetro de fluxo Canto II (BD Bioscience). As células mortas foram excluídas e a fluorescência no canal FITC (488 nm/530/30) foi medida. Os dados foram ajustados com o uso de (agonista) em função da resposta em Software GraphPad Prism.

[0283] Os Fcabs (todos testados em formato de mAb2 simulado [4420 LALA]) e o mAb OX40 anti-humano de controle positivo, 11D4, em uma estrutura principal de IgG1 humano e que contém a mutação LALA no domínio CH2 da cadeia pesada (G1AA/11D4; SEQ ID NOs 173 e 175), ligados a OX40 humano com uma faixa de afinidades. Cinco clones da linhagem FS20-22 e seis da linhagem FS20-31 foram testados quanto às suas habilidades para se ligarem a OX40 humano expresso em célula e de cinomolgo; as afinidades de ligação desses clones são estabelecidas na Tabela 5.

[0284] Tabela 5: Afinidade de ligação de Fcabs anti-OX40 em formato de mAb2 simulado (4420 LALA) para OX40 humano ou de cinomolgo expresso em célula mAb2/mAb simulado Ligação a Ligação a DO11.10- (4420 LALA) DO11.10-hOX40 cOX40 EC50 (nM) EC50 (nM) FS20-22-38AA/4420 0,8315 0,5925 FS20-22-41AA/4420 0,2991 0,1821 FS20-22-47AA/4420 0,7655 0,5809 FS20-22-49AA/4420 0,7412 0,3197 FS20-22-85AA/4420 0,4486 1,058 FS20-31-58AA/4420 0,7466 1,454 FS20-31-66AA/4420 0,2677 2,038 FS20-31-94AA/4420 0,6132 3,52 FS20-31-102AA/4420 0,5366 0,3948 FS20-31-108AA/4420 0,6516 0,3716 FS20-31-115AA/4420 0,7853 1,235 G1AA/11D4 0,8143 0,2126

4.3 Ativação de OX40 in vitro por Fcabs anti-OX40 em formato de mAb2 simulado

[0285] As células T ativadas expressam OX40 em suas superfícies celulares. A ligação do ligante de OX40 trimérico a OX40 resulta em trimerização do receptor. Visto que o ligante de OX40 é expresso como agrupamentos na superfície celular de células que apresentam antígeno, a interação entre o ligante de OX40 e OX40 resulta no agrupamento de OX40, que é conhecido por ser essencial para a sinalização de OX40 e ativação adicional de célula T. Os anticorpos que tornam OX40 em agonista devem imitar essa atividade de agrupamento do ligante de OX40. No caso de anticorpos anti-OX40 monoespecíficos, os receptores Fc gama se ligam aos domínios Fc dos anticorpos e reticulam os mesmos, resultando em agrupamento de OX40.

[0286] Os Fcabs OX40 anti-humano e OX40 anti-camundongo em mutação em formato de mAb2 simulado que contêm LALA (4420) descritos acima foram testados em ensaios de ativação de célula T quanto às suas habilidades para ativar OX40 expresso em células T mediante a reticulação dos Fcabs na presença de um agente de reticulação. O ensaio de ativação de célula T humano para teste dos Fcabs OX40 anti-humano em formato de mAb2 simulado (4420 LALA) envolveram o isolamento de células T de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) e testadas quanto a liberação de IL-2, que é um marcador de ativação de célula T. Os ensaios foram realizados de maneira similar àquela descrita anteriormente no Exemplo 13 e envolveram o uso de clone MK1A6 de mAb CH2 anti-humano ou FITC-dextrano (Sigma) a fim de reticular o anticorpo de controle positivo (11D4) ou os Fcabs em formato de mAb2 simulados (4420 LALA), respectivamente.

[0287] Os Fcabs OX40 anti-humano em formato de mAb2 simulados (4420 LALA), quando reticulados pelo Fab-alvo (FITC-dextrano), mostraram uma faixa de atividades no ensaio de ativação de célula T. Todos os Fcabs tiveram a habilidade para coestimular células T na presença de um anticorpo anti- CD3 e induzir a produção de IL2 humano. Os Fcabs das linhagens FS20-22 e FS20-31 mostraram uma atividade tanto com quanto sem reticulação. Especificamente, os Fcabs dessas linhagens tiveram atividade na ausência de um agente de reticulação que foram significativamente aumentados mediante a reticulação. Visto que esses Fcabs têm reatividade cruzada alta para OX40 de cinomolgo (comparável a ligação de OX40 humano), estudos toxicológicos seriam possíveis nessa espécie. Dos clones na linhagem FS20-22, os clones FS20-22- 41, FS20-22-47, FS20-22-49 e FS20-22-85 tiveram os menores valores de EC50 para suas atividades agonísticas quando reticulados e são, portanto, os clones preferidos dessa linhagem. Dentre esses, o clone FS20-22-49 mostrou o maior aumento em atividade agonista mediante a reticulação e também teve o menor EC50 para sua atividade agonista na presença de reticulação e é, portanto, o clone preferido.

[0288] Como descrito acima, os presentes inventores desejaram gerar mAb2 que têm a capacidade para tornar tanto OX40 quanto CD137 em agonista na ausência de agentes de reticulação adicionais. Os experimentos acima demonstram que o Fcab FS20-22-49 tem a capacidade para ativar OX40 na presença de um agente de reticulação adicional. A fim de gerar um agonista duplo que não exige agentes de reticulação adicionais, os inventores elegeram gerar anticorpos anti- CD137 com a intenção de usar os CDRs desses anticorpos na molécula de mAb2 alveja OX40 e CD137 eventual. Exemplo 5 – Seleção e caracterização de anticorpos CD137 anti-humano

[0289] As bibliotecas de fagemídeo naive sintético que exibem o domínio Fab de linhagens germinais com aleatorização nos CDR1, CDR2 e CDR3 (MSM Technologies) foram usadas para seleções naive de mAbs CD137 anti-humano com os•antígenos CD137 recombinantes e expressos em superfície celular,

descritos no Exemplo 1.2.

[0290] As bibliotecas de Fab foram selecionadas em três ciclos com o uso de Dynabeads de Estreptavidina (Thermo Fisher Scientific, 11205D) e proteína de ligação a Neutravidina acoplada a Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 31000) para isolar o fago ligado um CD137-mFc-Avi humano ou CD137-Avi-His humano biotinilado. Para garantir a ligação de Fab a CD137 expresso em superfície celular, as primeiras saídas de ciclo das seleções com o uso de antígeno CD137 recombinante também foram submetidas a dois ciclos de seleção adicionais com o uso de células DO11.10-hCD137 e um quarto ciclo com células DO11.10-cCD137.

[0291] Cerca de 2200 clones das saídas de ciclo 3 e 4 foram triados por ELISA de fago quanto à ligação a CD137- mFc-Avi humano e de cino. mFc biotinilado foi incluído como um controle negativo. As regiões variáveis dos clones positivos (clones com um sinal de ligação a CD137 pelo menos 4 vezes maior que o sinal de ligação para mFc) foram sequenciados, o que resultou na identificação de 36 combinações de sequência VH/VL única. As sequências identificadas originadas de ambas as seleções com o uso de antígeno CD137 recombinante e antígeno CD137 expresso em superfície celular com diversos clones isolados com o uso de ambas as estratégias de seleção. Com base no ELISA de fago, 22 dentre os 36 clones tiveram reatividade cruzada com macaco cinomolgo (cino), mas a sensibilidade do ELISA de fago pode não ser suficiente para detectar ligantes de reatividade cruzada com cino fracos, em que todos os 36 clones foram levados a diante para reformatação em moléculas IgG1. Para cada clone os domínios VH e VL foram individualmente clonados em vetor de expressão de pTT5 (Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá) que contém CH1, CH2 (com a mutação LALA no domínio CH2 e domínios CH3, ou domínios CL, respectivamente. Os vetores VH pTT5-FS30 com mutação LALA (AA) e VL pTT5-FS30 resultantes foram transientemente co-transfectados em células HEK293-6E. Vinte e oito clones expressos como moléculas IgG1 solúveis. Esses foram purificados por colunas de Proteína A mAb Select SuRe e submetidos a teste adicional.

[0292] A ligação dos mAbs anti-CD137 foi analisada em um ELISA com o uso de CD137-mFc-Avi humano e de cino. Dos 28 clones testados, 10 mostraram ligação dependente de dose a CD137-mFc-Avi humano, e nenhuma ligação a OX40-mFc-Avi humano, mFc ou estreptavidina. Dentro desse grupo, quatro clones, FS30-5, FS30-10, FS30-15 e FS30-16, tiveram reatividade cruzada com CD137-mFc-Avi de cino. Devido ao baixo número de cino clones com reatividade cruzada obtido, clones adicionais foram triados e expressos como descrito acima. Isso resultou no isolamento de um ligante de reatividade cruzada de cino FS30-35 adicional.

[0293] Os mAbs CD137 anti-humano FS30-5, FS30-10, FS30- 15 e FS30-16 foram testados quanto à ligação a células que expressam CD137 humano ou de cinomolgo (DO11.10-hCD137 ou DO11.10-cCD137) com o uso de citometria de fluxo. A ligação não específica também foi avaliada por teste de ligação às células DO11.10 e células HEK293 que carecem de expressão de CD137. As afinidades de ligação foram comparadas àquelas de dois mAbs de controle positivo, MOR7480.1 (Patente nº US 2012/0237498) e 20H4.9 (Patente nº US 7288638), em que os domínios variáveis desses foram clonados e expressos em formato de IgG1 humano que compreende a mutação LALA no domínio CH2 (formato de G1AA).

[0294] Constatou-se que os clones FS30-5, FS30-10, FS30- 15 e FS30-16 se ligam a receptores CD137 humano e de cino expressos em superfície celular com valores de EC50 na faixa de 0,15-0,57 nM, comparável ao mAbs de controle positivo. Nenhuma ligação a células DO11.10 ou HEK293 parentais foi observada, mostrando a especificidade da ligação. Nenhuma ligação do anticorpo anti-CD137 de controle positivo 20H4.9 a CD137 de cino foi observada nessas células. Os dados publicados (Patente nº US 7288638) mostram que 20H4.9 em formato IgG1 não se liga a CD137 de cino em PMA (Acetato Miristato de Forbol) induziu PMBCs de cino. Nas mãos dos presentes inventores, o 20H4.9 em formato de G1AA se ligou a CD137 de cino recombinante, mas a afinidade foi muito menor que para CD137 humano (dados não mostrados), o que pode explicar a ausência de ligação observada com o anticorpo a células DO11.10-cCD137.

[0295] A fim de determinar as características biofísicas dos mAbs FS30, os mesmos foram submetidos a Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) e a porcentagem da fração monomérica analisada. Todos os quatro mAbs FS30 testados mostraram um perfil de pico simples e foram >97 % monoméricos. Esse alto nível de proteína monomérica permitiu que o teste de atividade funcional prosseguisse.

[0296] A atividade funcional dos mAbs anti-CD137 foi, então, analisada em um ensaio de ativação de célula T primário. In vivo, mAbs anti-CD137 induziu o agonismo por recrutamento de receptores Fcy, portanto, causando o agrupamento dos mAbs e do receptor CD137. Para imitar a habilidade máxima dos mAbs para agrupar moléculas de receptor

CD137 de superfície, mAbs FS30 foram reticulados com o uso de um anticorpo CH2 anti-humano (clone MK1A6, produzido internamente) antes do ensaio. A ativação de célula T foi comparada a mAbs não reticulados. O anticorpo de lisozima de ovo branco anti-hen (HEL) D1.3 em uma estrutura principal de IgG1 humano com a mutação LALA (G1AA/HelD1.3) foi incluído como um controle negativo.

[0297] Quando reticulado, os mAbs FS30-5, FS30-10, FS30- 15 e FS30-16 mostraram atividade potente no ensaio de ativação de célula T, com valores de EC50 menores que 10 nM e um nível máximo de IL-2 (Emáx) similar ao mAbs de controle positivo anti-CD137 (mAb anti-CD137 MOR7480.1, 5637 hIL-2 pg/ml; e mAb anti-CD137 20H4.9, 10232 hIL-2 pg/ml). O Emáx do mAb FS30-6 (1512 hIL-2 pg/ml) foi significativamente menor que aquele dos controles positivos e os outros mAbs FS30, indicando um nível de ativação de célula T geral inferior. Diferente do mAb anti-CD137 de controle positivo 20H4.9, que mostrou atividade na ausência de reticulação (produção de hIL-2 de 3174 pg/ml), os mAbs FS30 não mostraram atividade (quando não reticulados como indicado pelos níveis de resposta de fundo de IL-2 medido). Exemplo 6 – Construção e expressão de mAb2 que alveja OX40 humano e CD137 humano

[0298] mAb2 que compreendem um Fcab OX40 anti-humano em pares com Fabs CD137 anti-humano foram preparados. O Fcab que alveja OX40 humano FS20-22-49 foi selecionado para pareamento com os Fabs que alvejam CD137 devido a suas atividades superiores em ensaios de célula T (consultar Exemplo 4.3).

6.1 Expressão e caracterização de mAbs em formato de mAb2

[0299] As moléculas de mAb2 foram preparadas, que consistiram em uma molécula IgG1, que compreende os CDRs dos clones FS30-5, FS30-10, FS30-15, FS30-16 ou FS30-35 e incluindo a mutação LALA no domínio CH2, e o sítio de ligação a receptor OX40 humano FS20-22-49 no domínio CH3. Essas moléculas de mAb2 foram geradas substituindo-se o domínio VH de um mAb2 OX40 anti-humano, FS20-22-49AA/HelD1.3, com os domínios VH correspondentes dos clones FS30 e a co- transfectando-se o VH gerado com a cadeia leve correspondente dos mAbs FS30. A mutação LALA no domínio CH2 da molécula IgG1 foi mantida nas moléculas de mAb2 resultantes. Essas moléculas de mAb2 foram designadas FS20-22-49AA/FS30-5, FS20-22-49AA/FS30-10, FS20-22-49AA/FS30-15, FS20-22- 49AA/FS30-16 e FS20-22-49AA/FS30-35. O mAb2 foi produzido por meio de expressão transiente em células HEK293-6E e purificado com o uso de colunas de proteína A Select SuRe de mAb.

[0300] CD137 pertence à superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFRSF) de receptores de citocina (Moran et al., 2013). Para analisar a especificidade do sítio de ligação de Fab anti-CD137 das cinco moléculas de mAb2, a ligação do mAb2 a CD137 humano e de cinco membros de TNFRSF humano proximamente relacionados (TNFRSF1A, TNFRSF1B, GITR, NGFR e CD40) foi testada com o uso de SPR. O objetivo foi demonstrar especificidade de 1000 vezes mostrando-se nenhuma ligação do mAb2 a antígenos proximamente relacionados em uma concentração de 1 µM, mas mostrando-se a ligação a receptores CD137 em uma concentração de 1 nM.

[0301] Embora os mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5, FS20-22- 49AA/FS30-10, FS20-22-49AA/FS30-16 e FS20-22-49AA/FS30-35 tenham mostrado um alto nível de especificidade (próximo de 1000 vezes), o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-15 mostrou ligação não específica a todos os cinco membros de TNFRSF proximamente relacionados testados. A ligação não específica exibida por esse clone foi de cerca de 5-10 vezes menor em média que a ligação aos receptores CD137 na mesma concentração, e concluiu-se que isso se deve ao sítio de ligação de Fab da molécula de mAb2, visto que o mAb FS30-15 mostrou o mesmo perfil de ligação quando testado quanto à ligação aos mesmos cinco membros de TNFRSF proximamente relacionados a CD137. Com base nesses dados, o clone FS30-15 foi omitido das campanhas de seleção adicionais.

6.2 Otimização de sequência de mAbs anti-CD137

[0302] Embora os mAbs anti-CD137 FS30-5, FS30-10, FS30- 16 e FS30-35 tenham mostrado alta afinidade e especificidade para CD137, e atividade em um ensaio de ativação de célula T, os mesmos contiveram um ou mais sítios de modificação pós-translação potencial (PTM) sem alças CDR. Decidiu-se modificar geneticamente adicionalmente esses clones em uma tentativa de identificar resíduos de aminoácido que podem ser substituídos nesses sítios enquanto mantém ou aprimora a ligação e a atividade. Os sítios PTM potenciais identificados incluíram resíduos de metionina no CDR3 de VH (posição Kabat M100D e M100H em FS30-5, M97 em FS30-10, M100A em FS30-16 e M100F em FS30-35), um motivo de isomerização de aspartato potencial no CDR2 de VH (posição Kabat D54G55 em FS30-16) e um sítio de desamidação potencial no CDR3 de VL (posição Kabat Q90G91 em FS30-16).

[0303] A mutagênese direcionada para sítio foi realizada com o uso dos cinco clones de mAb2 FS20-22-49AA/FS30 como padrão e iniciadores que contiveram o códon degenerado NNK nos sítios que codificam resíduos de metionina, aspartato ou glicina para permitir para todos possíveis substituições de aminoácido. Resíduos de cisteína e aminoácidos com a capacidade para produzir motivos de PTM potenciais inovadores foram excluídos. Clones foram expressos e triados quanto à ligação a células DO11.10-hCD137. Clones com ligação similar (dentro de duas vezes) ou aprimorada a 10 nM em comparação com os clones de mAb2 parentais foram selecionados para expressão a 30-50 ml de escala, purificados em colunas de Proteína A e triados em um ensaio de ativação de célula T com o uso de células DO11.10-hCD137 e o anticorpo CH2 anti- humano MK1A6 como agente de reticulação.

[0304] As células DO11.10-hCD137 foram lavadas uma vez em PBS e ressupensas em meio celular DO11.10 (meio RPMI (Life Technologies) com 10 % de FBS (Life Technologies) e 5 µg/ml de puromicina (Life Technologies, A11113803)) em uma concentração de 1,0 x 106 células/ml. As placas de 96 poços com fundo plano foram revestidas com anticorpo CD3 anti- camundongo (Thermo Fisher Scientific, clone 17A2) por incubação com 0,1 µg/ml de anticorpo CD3 anti-camundongo diluído em PBS por 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 e, então, lavadas duas vezes com PBS. As células DO11.10-hCD137 foram adicionadas às placas a 1 x 105 célula/poço. Uma diluição de 2 µM de cada anticorpo de teste foi preparada em DPBS (Gibco) e adicionalmente diluída a 1:10 em meio celular DO11.10 (30 µl + 270 µl) para obter uma diluição de 200 nM. O agente de reticulação MK1A6 foi adicionado aos poços em uma razão molar de 1:1 com as amostras de anticorpo de teste a serem reticuladas. Em uma placa de 96 poços, as diluições em série de cada anticorpo ou mistura de anticorpo/agente de reticulação foram preparadas. 100 µl de anticorpo diluído ou mistura de anticorpo/agente de reticulação foram adicionados às células DO11.10-hCD137 na placa. As células foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 72 horas. Os tensoativos foram coletados e ensaiados com um kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience ou R&D Systems) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com Software Gen5, BioTek. Os valores de absorbância de 630 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A concentração de IL-2 de camundongo (mIL-2) foi plotada vs a concentração de log de anticorpo e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism.

[0305] Para cada dos clones, um número limitado de aminoácidos que mantiveram ou aprimoraram a ligação a CD137 de superfície celular foram identificados para substituição do resíduo de metionina no CDR3 de cadeia pesada. O clone de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-16 conteve três sítios PTM potenciais e mutação de cada um desses resultou em uma redução pequena em afinidade de ligação. Quando esses foram combinados em uma molécula a ligação reduzida foi aditiva (dados não mostrados) e, consequentemente, esse clone não foi adicionalmente considerado. Constatou-se que algumas mutações aprimoraram a ligação ao CD137 e a atividade funcional, em comparação com o clone parental relevante. Constatou-se que três clones de mAb2 mutantes, todos derivados do clone de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10, aprimoraram a afinidade de ligação e a atividade funcional. Esses mAb2 contiveram um resíduo de asparagina, treonina ou leucina substituído pelo resíduo de metionina na posição 97 nos mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10 parentais e foram designados FS20-22- 49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20-22- 49AA/FS30-10-16, respectivamente. Embora os valores de EC50 para clones mutantes derivados do clone de mAb2 parental FS20-22-49AA/FS30-35 tenham mostrado nenhum aprimoramento em atividade funcional em comparação com o clone parental, um clone mutante, designado FS20-22-49AA/FS30-35-14, que conteve um resíduo de alanina substituído pelo resíduo de metionina na posição 100F no clone parental, no entanto, mostrou ligação aprimorada. No caso do clone de mAb2 parental FS20-22-49AA/FS30-5, tanto o resíduo de metionina na posição 100D quanto o resíduo de metionina na posição 100H foram alterados, respectivamente, para um resíduo de isoleucina e um resíduo de leucina na mesma molécula para resultar em um clone de mAb2 mutante, designado FS20-22-49AA/FS30-5-37. Os clones FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16, FS20-22-49AA/FS30-35-14 e FS20-22- 49AA/FS30-5-37 foram selecionados para caracterização adicional.

6.3 Ensaios de bloqueio de ligante de CD137 humano

[0306] A interação de CD137-CD137L é exigida para ativação do receptor CD137. Os anticorpos anti-CD137 agonísticos podem acionar a ativação de CD137 imitando-se a interação com ligante, dessa forma, bloqueando potencialmente a ligação de ligante, ou acionando o agrupamento e a ativação dos receptores sem interferir com ligação de ligante. Em que o anticorpo imita potencialmente o CD137L, o mesmo pode bloquear a interação do receptor e do ligante. É conhecido na técnica que MOR7480.1 bloqueia a interação de ligante/receptor (documento US 2012/0237498), enquanto o anticorpo 20H4.9 foi anteriormente relatado como não bloqueando a interação entre CD137 e seu ligante (Patente nº US 7288638).

[0307] Os clones de mAb2 CD137 anti-humano FS20-22- 49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30- 10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16 e FS20-22-49AA/FS30-35-14 foram testados quanto às suas habilidades para bloquear a interação de CD137-CD137L com o uso de um método com base em ELISA. mAb anti-OX40 11D4 (Patente europeia nº 2242771) em formato de IgG1 (G1/11D4; SEQ ID NOs 174 e 175) foi usado como um isotipo/controle negativo; o mAb2 FS20-22-49AA/4420 que compreende o clone de Fcab anti-OX40 FS20-22-49AA e região Fab do anticorpo anti-FITC 4420 foi usado como um mAb2 de controle negativo para ligação de OX40; e mAbs anti-CD137 G1/MOR7480.1 (SEQ ID NOs 119 e 120) e G1/20H4.9 (SEQ ID NOs 121 e 122) como controles positivos para ligação a CD137 e atividade de bloqueio de ligante.

[0308] Especificamente, o antígeno CD137-mFc-Avi humano recombinante foi revestido durante a noite a 4 °C em placas 96 de poços Maxisorp em uma concentração de 1 µg/ml em PBS. No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBST (PBS + 0,05 % de Tween20™) e bloqueada com PBS + 1 % de BSA (Sigma, A3059-500G) por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. Após o bloqueio, as placas foram lavadas novamente com PBST. Uma diluição de 100 nM de cada anticorpo de teste foi preparada em PBS + 1 % de BSA e adicionada às placas revestidas com CD137 e incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. Após essa incubação, as placas foram lavadas com PBST e, então, incubadas com 20 ng/ml de CD137L- His (R&D Systems, 2295-4L-025/CF) em PBS por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. As placas foram, então, lavadas com PBST e, então, incubadas com anticorpo anti-his secundário (R&D Systems, MAB050H) a uma diluição de 1 em 1000 em PBS por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. As placas foram, então, lavadas com PBST e incubadas com reagente de detecção de TMB (Thermo Fisher Scientific, 002023) até os poços de controle positivo ficarem azuis e, então, a reação foi interrompida com a adição de 2N H2SO4. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com Software Gen5, BioTek. Os valores de absorbância de 630 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). Os valores de absorbância subtraídos foram plotados vs a concentração de log de anticorpo e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (inibidor) vs equação de resposta em GraphPad Prism. Os valores foram normalizados ajustando-se os mAbs de controle G1/11D4 e G1/MOR7480.1 como valores de bloqueio de 0 e 100 %, respectivamente. Os dados foram analisados com o uso de uma ANOVA de uma por meio de teste e teste de múltiplas comparações de Holm-Sidak com o uso de GraphPad Prism.

[0309] Uma faixa de atividades de bloqueio foi observada para os cinco clones de mAb2 CD137 anti-humano testados. FS20-22-49AA/FS30-5-37 mostrou, como os anticorpos de controle positivo, a inibição completa da interação de receptor-ligante. Todos os clones de mAb2 que contêm as regiões Fab dos mAbs anti-CD137 da linhagem FS30-10 (isto é,

FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20-22- 49AA/FS30-10-16) inibiram a interação entre CD137 e CD137L por 49-54 % e foram, portanto, considerados bloqueadores parciais. Bloqueado-se apenas parcialmente a interação entre CD137 e CD137L, é possível que esses mAbs possam não inibir completamente a interação natural de CD137L com seu receptor, de modo que alguma sinalização de CD137 pode ainda ocorrer por meio desse mecanismo, mesmo se um desses anticorpos estiver ligado. O clone FS20-22-49AA/FS30-35-14, como a molécula de mAb2 de controle negativo FS20-22-49AA/4420, careceu da habilidade para significativamente inibir a interação de receptor-ligante e foi, portanto, considerado como um não bloqueador.

[0310] Em resumo, os resultados desse ensaio com base em ELISA mostraram que o painel de mAbs anti-CD137 testado mostrou uma faixa de habilidades para bloquear ligante, incluindo atividade de bloqueio completo, parcial ou nenhuma atividade de bloqueio. Clones FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20- 22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16 e FS20-22- 49AA/FS30-35-14 mostraram, cada um, uma atividade de bloqueio que foi diferente daquela dos mAbs anti-CD137 de controle positivo. Visto que a faixa de atividades de bloqueio de ligante foi identificada, a atividade funcional de cada um dos anticorpos foi testada.

[0311] Clones FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30- 10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20-22-49AA/FS30-10-16 foram adicionalmente testados quanto às suas habilidades para bloquear a interação de CD137-CD137L com o uso de um método com base em célula. Uma faixa de atividades de bloqueio foi observada, em que FS20-22-49AA/FS30-5-37 mostra, como o anticorpo de controle positivo (G1/MOR7480.1) usado nesse ensaio, inibição completa da interação de receptor-ligante. Todos os três clones de mAb2 que contém as regiões Fab dos mAbs anti-CD137 da linhagem FS30-10 (isto é, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20-22- 49AA/FS30-10-16) inibiram a interação entre CD137 e CD137L em 46-76 % e foram, portanto, considerados como bloqueadores parciais. Os resultados desse ensaio foram, portanto, similares àqueles do ensaio com base em ELISA de bloqueio e mostraram que o painel de mAbs anti-CD137 testado exibiu uma faixa de habilidades de bloqueio de ligante de atividade de bloqueio completa a parcial. Clones FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20-22-49AA/FS30-10-16 mostraram, cada um, uma atividade de bloqueio que foi diferente daquela do anticorpo de controle positivo. Exemplo 7 – Especificidade de ligação e atividade funcional de clones de mAb e mAb2 em um ensaio de ativação de célula T CD137 humano

7.1 Especificidade de ligação de clones de mAb2

[0312] CD137 e OX40 pertencem à superfamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNFRSF) de receptores de citocina (Moran et al., 2013). Para analisar a especificidade do Fab anti-CD137 bem como o sítio de ligação de Fcab OX40 das cinco moléculas de mAb2, a ligação dos mAb2 FS20-22- 49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30- 10-16, FS20-22-49AA/FS30-35-14 e FS20-22-49AA/FS30-5-37 a CD137 humano, OX40 humano e seis membros de TNFRSF humano proximamente relacionados foi testada com o uso de ressonância de plasmon de superfície (SPR). O objetivo foi demonstrar especificidade de 1000 vezes mostrando-se nenhuma ligação do mAb2 a antígenos proximamente relacionados em uma concentração de 1 µM, mas mostrando-se a ligação a receptores CD137 e OX40 em uma concentração de 1 nM. Os mAb anti-CD137 MOR7480.1 e mAb anti-OX40 11D4 foram usados como controles positivos.

[0313] Resumidamente, as células de fluxo em chips CM5 foram imobilizadas com aproximadamente 1000 RU de CD137-mFc- Avi humano (Tabela 3), OX40-mFc (Tabela 2), TNFRSF1A-Fc humano recombinante, TNFRSF1B-Fc humano recombinante, GITR- Fc humano recombinante, NGFR-Fc humano recombinante, CD40- Fc humano recombinante ou DR6-Fc humano recombinante. A célula de fluxo 1 foi deixada para imobilização bruta. Os cinco mAb2 foram diluídos a 1 µM e 1 nM em 1x tampão de HBS- EP (GE Healthcare, código de produto BR100188), permitiu-se que os mesmos fluíssem através do chip por 3 min e, então, permitiu-se que os mesmos se dissociassem por 4 minutos. A injeção de 30 segundos de 10 mM de glicina, pH 1,5 foi usada para regeneração. Os mAbs de controle positivo foram injetados a 50-100 nM para demonstrar o revestimento de cada antígeno. Os níveis de ligação foram determinados no fim da fase de associação e comparados.

[0314] Todos os mAb2 selecionados mostraram um alto nível de especificidade para os receptores CD137 e OX40 humano similares a ou maiores que os controles positivos MOR7480.1 e 11D4, respectivamente.

7.2 Atividade funcional de anticorpos agonistas CD137 em um ensaio de ativação de célula T CD137 humano

[0315] Para entender a atividade de diferentes anticorpos agonistas anti-CD137, um ensaio de ativação de célula T com o uso de células DO11.10-hCD137 foi usado. Os anticorpos agonistas anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 (SEQ ID NOs: 125 e 120), G1AA/20H4.9 (SEQ ID NOs: 165 e 122) e G1AA/FS30-10-16 (SEQ ID NOs: 154 e 97) foram testados, bem como o anticorpo anti- FITC 4420 em formato de IgG1 (G1/4420; SEQ ID NOs: 115 e 116) como um controle negativo de isotipo. As moléculas de anticorpo foram testadas tanto na presença quanto na ausência do anticorpo CH2 anti-humano de reticulação, MK1A6 (consultar o Exemplo 2.1). A produção de IL-2 de camundongo foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0316] As células DO11.10-hCD137 foram lavadas uma vez em PBS e ressupensas em meios celulares DO11.10 (meio RPMI (Life Technologies) com 10 % de FBS (Life Technologies) e 5 µg/ml de puromicina (Life Technologies, A11113803)) em uma concentração de 1,0 x 106 células/ml. As placas de 96 poços com fundo plano foram revestidas com anticorpo CD3 anti- camundongo (Thermo Fisher Scientific, clone 17A2) por incubação com 0,1 µg/ml de anticorpo CD3 anti-camundongo diluído em PBS por 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 e, então, lavadas duas vezes com PBS. As células DO11.10-hCD137 foram adicionadas às placas a 1 x 105 célula/poço. Uma diluição de 2 µM de cada anticorpo de teste foi preparada em DPBS (Gibco) e adicionalmente diluída a 1:10 em meio celular DO11.10 (30 µl + 270 µl) para obter uma diluição de 200 nM. O agente de reticulação MK1A6 foi adicionado aos poços em uma razão molar de 1:1 com os anticorpos de teste quando exigido. Em uma placa de 96 poços, diluições em série do anticorpo ou mistura de anticorpo/anticorpo de reticulação foram preparadas. 100 µl do anticorpo diluído ou mistura de anticorpo/anticorpo de reticulação foram adicionados às células DO11.10-hCD137 na placa. As células foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 72 horas. Os tensoativos foram coletados e ensaiados com um kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience ou R&D Systems) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com o Software Gen5, BioTek. Os valores de absorbância de 630 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A concentração de IL-2 de camundongo (mIL-2) foi plotada vs a concentração de log de anticorpo e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism.

[0317] Os resultados do ensaio são mostrados nas Figuras 2C e D. Os anticorpos anti-CD137 diferiram em suas exigências para o anticorpo de reticulação para sua atividade, em que todos os três anticorpos anti-CD137 mostram uma diminuição dependente de concentração na produção de IL-2 na presença do anticorpo de reticulação, mas apenas o anticorpo G1AA/20H4.9 mostrou atividade na ausência do anticorpo de reticulação. Portanto, G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16 exigiram a adição do anticorpo de reticulação, isto é, suas atividades foram “dependentes de reticulação”, enquanto o G1AA/20H4.9 mostrou atividade tanto na presença quanto na ausência do anticorpo de reticulação, isto é, sua atividade foi “independente de reticulação”.

7.3 Atividade funcional de clones de mAb2 em um ensaio de ativação de célula T CD137 humano

[0318] A atividade funcional dos clones de mAb2 FS20-22- 49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-

10-12 e FS20-22-49AA/FS30-10-16 selecionados foi testada em um ensaio de ativação de célula T com o uso de células DO11.10-hCD137. Anticorpo anti-FITC 4420 em formato de IgG1 (G1/4420; SEQ ID NOs 115 e 116) foi usado como um isotipo/controle negativo; mAb anti-OX40 G1/11D4 (SEQ ID NOs 174 e 175) e clone de mAb2 FS20-22-49AA/4420 (SEQ ID NOs 123 e 116) foram usados como controles negativos; e anticorpo anti-CD137 MOR7480.1 tanto no formato de IgG1 (G1/MOR7480.1; SEQ ID NOs 119 e 120) quanto no formato de IgG2 (G2/MOR7480.1; SEQ ID NOs 124 e 120), em que o formato de IgG2 é o formato no qual o anticorpo foi testado em testes clínicos (Gopal et al., 2017; Tolcher et al., 2017), foi usado como um controle positivo. As moléculas de mAb e mAb2 foram reticuladas com o anticorpo CH2 anti-humano, MK1A6 (consultar Exemplo 2.1), e em um experimento a atividade de moléculas de mAb e mAb2 não reticuladas foi investigada. A produção de IL-2 de camundongo foi usada como uma medida de ativação de célula T. O experimento foi realizado como descrito no Exemplo 7.2.

[0319] Quando reticulados, todos os cinco clones de mAb2 selecionados mostraram atividade potente no ensaio de ativação de célula T, com valores médios de EC50 menores que 15 nM e valores médios de Emáx na faixa de cerca de 16000- 20000 pg/ml de IL-2 (Tabela 6 e Figura 2A). Nenhuma atividade dos clones de mAb2 testados foi observada na ausência de reticulação (Figura 2B). Observou-se que o anticorpo de controle positivo MOR7480.1 é ativado apenas quando reticulado (EC50 de 3,3 nM e Emáx de 12575 pg/ml por G1/MOR7480.1, e EC50 de 2,4 nM e Emáx de 8547 pg/ml para G2/MOR7480.1). A combinação de uma falta de atividade do mAb anti-OX40 reticulado (G1/11D4) e dos sinais de fundo baixos observada para moléculas de mAb2 que contêm Fcab anti-OX40 não reticuladas mostra que os resultados desse ensaio são uma leitura de atividade de CD137 apenas, mais provavelmente devido aos altos níveis de receptor CD137 expressão e níveis não detectáveis de expressão de receptor OX40 pelas células DO11.10 (dados não mostrados).

[0320] Tabela 6: Atividade de mAb2 no ensaio de ativação de célula T CD137 humano mAb/mAb2 Atividade de Atividade de mAbs/mAb2 não mAbs/mAb2 reticulados (n=1) reticulados (Média de n=2) EC50 Emáx (mIL-2 EC50 (nM) Emáx (mIL-2 (nM) pg/ml) pg/ml) G1/4420 N/A N/A N/A N/A G1/11D4 N/A N/A N/A N/A G1/MOR7480.1 NM NM 3,3 12575 G2/MOR7480.1 N/A N/A 2,4 8547 FS20-22- N/A N/A N/A N/A 49AA/4420 FS20-22- N/A N/A 13,4 18129 49AA/FS30-5-37 FS20-22- N/A N/A 6,1 17049 49AA/FS30-10-3 FS20-22- N/A N/A 9,5 17183 49AA/FS30-10-12 mAb/mAb2 Atividade de Atividade de mAbs/mAb2 não mAbs/mAb2 reticulados (n=1) reticulados (Média de n=2) EC50 Emáx (mIL-2 EC50 (nM) Emáx (mIL-2 (nM) pg/ml) pg/ml) FS20-22- N/A N/A 4,7 16310 49AA/FS30-10-16 FS20-22- N/A N/A 5,1 19837 49AA/FS30-35-14 N/A: não aplicável visto que o sinal não permite uma determinação de EC50/Emáx significativa NM: não medido

[0321] Desse modo, mAb2 que compreende CDRs dos anticorpos monoclonais CD137 anti-humano FS30-5-37, FS30-10-3, FS30-10- 12, FS30-10-16 e FS30-35-14 mostraram atividade potente para ter a capacidade para ativar CD137 no ensaio de ativação de célula T DO11.10-hCD137 quando reticulados. Nenhuma atividade significativa foi observada na ausência de reticulação. Esses mAb2 contêm o domínio CH3 do Fcab OX40 anti-humano FS20-22-49, que também mostrou alta atividade quando reticulados em um ensaio de célula T (consultar o Exemplo 4.3). Os mAb2 preparados com uma mutação LALA foram designados FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16.

[0322] Esses mAb2 foram selecionados para análise adicional a fim de determinar se os mesmos tiveram a capacidade para atuar como um agonista duplo que podem tornar tanto OX40 quanto CD137 em agonista autonomamente, com base na expressão dos alvos específicos e sem a necessidade de agentes de reticulação adicionais. Exemplo 8 – Afinidade de ligação de mAb2 para OX40 e CD137 humano e de cinomolgo

[0323] Para determinação de afinidade de CD137, um chip CM5 Biacore (GE Healthcare) foi revestido com Fc anti-humano com o uso de um Kit de Captura de Anticorpo Humano (GE Healthcare) de acordo com as condições do fabricante, a uma densidade de superfície de aproximadamente 4000 RU. Amostras dos anticorpos de teste (mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20- 22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20-22- 49AA/FS30-10-16, controle positivo de anti-CD137 G1/MOR7480.1 e controle negativo de anti-hOX40 G1/11D4) foram capturadas para aproximadamente 80 RU. CD137 humano ou de cinomolgo (hCD137-mFc-Avi ou cCD137-mFc-Avi) flui em uma faixa de concentrações em uma série de diluições de três vezes que começa a 200 nM, a uma taxa de fluxo de 70 µl/min. O tempo de associação foi de 2 min, e o tempo de dissociação foi de 8 min. O tampão de execução foi HBS-EP (GE Healthcare, BR100188). As células de fluxo foram regeneradas injetando- se cloreto de magnésio a 3 M a uma taxa de fluxo de 30 µl/min por 30 segundos.

[0324] Para determinação de afinidade de OX40 um chip CM5 Biacore foi revestido com Fab anti-humano com o uso de um Kit de Captura de Fab Humano (GE Healthcare 28958325), acordo com as condições do fabricante, para uma densidade de superfície de aproximadamente 8000 RU. Amostras dos anticorpos de teste (FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20-22- 49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e mAb2 FS20-22-

49AA/FS30-10-16, G1/MOR7480.1 (controle negativo) e G1/11D4 (controle positivo)) foram capturadas para aproximadamente 80 RU e, então, antígeno OX40 humano ou de cinomolgo (hOX40- mFc ou cOX40-mFc) fluiu em uma faixa de concentrações em uma série de diluições de três vezes que começa a 200 nM a uma taxa de fluxo de 70 µl/min. O tempo de associação foi de 2 min e o tempo de dissociação foi de 8 min. O tampão de execução foi HBS-EP. As células de fluxo foram regeneradas injetando-se glicina-HCl a pH 2,1 a uma taxa de fluxo de 30 µl/min por 30 segundos.

[0325] Os dados foram analisados por referenciação dupla contra uma célula de fluxo que foi intencionalmente deixada em branco (nenhuma ligação de anticorpo). A cinética de ligação foi ajustada com um modelo de 1:1 Langmuir para gerar taxas de associação (ka) e dissociação (kd) de ligação. As constantes de ligação de equilíbrio (KD) foram calculadas dividindo-se a taxa de dissociação pela taxa de associação para cada amostra. A análise de dados foi realizada com o software BiaEvaluation versão 3.2. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

[0326] Tabela 7: Afinidade de ligação de mAb2 ao CD137 humano e de cinomolgo e OX40, como determinado por SPR CD137 OX40 mAb/mAb2 KD KD de KD KD de Humano Cinomolgo Humano Cinomolgo (nM) (nM) (nM) (nM) G1/MOR7480.1 0,127 NM NB NB G1/11D4 NB NB 0,0337 NM

CD137 OX40 mAb/mAb2 KD KD de KD KD de Humano Cinomolgo Humano Cinomolgo (nM) (nM) (nM) (nM) FS20-22-49AA/FS30-5- 3,85 6,42 0,385 1,63 37 FS20-22-49AA/FS30-10- 0,342 0,318 0,285 1,11 3 FS20-22-49AA/FS30-10- 0,255 7,24 0,37 1,02 12 FS20-22-49AA/FS30-10- 0,17 0,15 0,214 0,861 16 NB – Nenhuma ligação detectada. NM – Não medido.

[0327] A ligação afinidades para o mAb2 OX40/CD137 mostra que essas moléculas se ligam com alta afinidade a ambos os receptores. A afinidade dessas moléculas para OX40 humano é similar, o que deve ser esperado visto que essas moléculas todas compartilham o Fcab OX40. A afinidade para OX40 de cinomolgo está dentro de 5 vezes de OX40 humano. A afinidade para CD137 humano está na faixa de 4-0,2 nM e a reatividade cruzada ao CD137 de cinomolgo também é variável visto que os Fabs anti-CD137 são diferentes em cada molécula. FS20-22- 49AA/FS30-10-16 tem afinidade superior para CD137 humano, bem como afinidade similar for CD137 de cinomolgo. A similaridade em ligação a antígenos humano e cino pode ser vantajosa visto que seria esperado que o comportamento do mAb2 nos estudos com macaco cinomolgo pode ser extrapolado para seres humanos.

[0328] Ademais, FS20-22-49AA/FS30-10-16 tem afinidade similar para OX40 humano e CD137 humano, assim, espera-se que o mAb2 deva se ligar igualmente bem a ambos os alvos quando esses são co-expressos.

[0329] Espera-se que um mAb2 que se liga a OX40 e CD137 e aciona o agrupamento e a ativação de ambos os alvos simultaneamente atue como um agonista duplo. Tanto OX40 quanto CD137 são conhecidos por estarem presentes em células T (Ma, et al., 2005). Sem desejar se ligar por teoria, acredita-se que a mAb2 tem afinidade similar quanto à ligação a ambos os alvos pode ser vantajoso como um agonista duplo devido ao mAb2 ser mais propenso a se ligar a células que expressam ambos os alvos. Um mAb2 que se ligou preferencialmente a um alvo com afinidade significativamente maior que o outro pode não ter a capacidade para atuar como um agonista duplo visto que o mesmo pode preferencialmente se ligar a células que não expressa ambos os alvos. Exemplo 9 – Ligação simultânea de mAb2 a OX40 e CD137

9.1 Ligação simultânea de mAb2 a OX40 humano e CD137 humano

[0330] A habilidade dos mAb2 OX40/CD137 FS20-22- 49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3 e FS20-22-49AA/FS30- 10-16 para se ligarem simultaneamente a OX40 e CD137 foi testada por SPR em um Biacore 3000. G1/MOR7480.1 foi usado como um controle. De acordo com as instruções do fabricante, o CD137 humano biotinilado (hCD137-mFc-Avi-Bio) foi diluído a 100 nM em tampão de HBS-EP e imobilizado em um chip de Estreptavidina (SA) (GE Healthcare BR100032) a uma densidade de superfície de aproximadamente 1000 RU, e uma célula de fluxo foi ativada e desativada sem qualquer proteína imobilizada para subtração de fundo. Os anticorpos, diluídos a 100 nM em tampão de HBS-EP, foram co-injetados com 100 nM de OX40 humano (hOX40-mFc) ou tampão de HBS-EP a uma taxa de fluxo de 30 µl/min. Para cada etapa de ligação, a dissociação foi seguida por 3 minutos. O chip sensor foi regenerado após cada ciclo com uma injeção de 15 µl de Glicina 2,5 (GE Healthcare) a uma taxa de fluxo de 30 µl/min. Todos os mAb2 testados foram capazes de se ligar simultaneamente a OX40 e CD137. O mAb de controle, G1/MOR7480.1, se ligou apenas a CD137.

9.2 Ligação simultânea de mAb2 que alveja receptor de murino a OX40 de murino e CD137 de murino

[0331] Um mAb2 que compreende um Fcab OX40 anti-camundongo com um Fab CD137 anti-camundongo foi preparado para testar sua habilidade para se ligar simultaneamente a OX40 de murino e CD137 de murino. O Fcab que alveja OX40 de camundongo FS20m-232-91 foi selecionado devido a sua atividade superior em ensaios de célula T e o Fab do anticorpo CD137 anti- camundongo Lob12.3 (Taraban et al., 2002) em formato de isotipo IgG1 humano (G1/Lob12.3; Universidade de Southampton) foi selecionado para pareamento com o Fcab FS20m-232-91, visto que esse mostrou boa ligação de célula a células que expressam CD137 de camundongo e é amplamente usado na literatura como um anticorpo CD137 agonístico com atividade in vitro e in vivo. O mAb2 que contém o domínio CH3 FS20m-232-91 e o Fab do anticorpo CD137 anti-camundongo Lob12.3 e a mutação LALA foi designado “FS20m-232- 91AA/Lob12.3”, enquanto o mAb2 que contém o domínio CH3 FS20m-232-91 e o Fab do anticorpo CD137 anti-camundongo Lob12.3 sem a mutação LALA foi designado “FS20m-232-

91/Lob12.3”.

[0332] A habilidade de mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 para se ligar simultaneamente a seus dois alvos foi testada por SPR em um instrumento BIAcore 3000 (GE Healthcare). G1/Lob12.3 foi usado como um controle positivo. De acordo com as instruções do fabricante, CD137 de camundongo recombinante (mCD137-hFc; R&D Systems, nº de catálogo 937- 4B-050) foi diluído a 200 nM em Acetato de Sódio, pH 5,0 (GE Healthcare) e imobilizado em um chip CM5 Biacore a uma densidade de superfície de aproximadamente 1000 RU, e uma célula de fluxo foi ativada e desativa sem qualquer proteína imobilizada para subtração de fundo. Os mAb2 e controle positivo, diluídos a 100 nM em tampão de HBS-EP, foram co- injetados com 100 nM de OX40 humano (mOX40-mFc) ou tampão de HBS-EP a uma taxa de fluxo de 30 µl/min. Para cada etapa de ligação a dissociação foi seguida por 3 minutos. O chip sensor foi regenerado após cada ciclo com uma injeção de 30 segundos de glicina-HCl aquosa a pH 1,7 a uma taxa de fluxo de 20 µl/min. O mAb2 teve a capacidade para simultaneamente se ligar a OX40 e CD137. O mAb G1/Lob12.3 se ligou apenas a CD137. Exemplo 10 – Ligação de mAb2 a receptores Fcγ

[0333] É sabido a partir da literatura que os anticorpos agonísticos que alvejam membros da família TNFR exigem reticulação por meio de receptores Fcγ para acionar o agrupamento e a ativação do alvo para atividade in vivo (Wajant, 2015). No entanto, isso pode não ser desejável para um anticorpo que é destinado a ser um agonista duplo. Portanto, decidiu-se reduzir a habilidade do mAb2 para se ligar a receptores Fcγ pela inserção da mutação LALA.

[0334] Os anticorpos IgG1 de isotipo humano têm a capacidade para se ligarem a receptores Fcγ. Isso pode resultar nos mesmos induzirem uma função efetora, como Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo (ADCC), de células que expressam o alvo, quando os mesmos se ligam a receptores Fcγ, resultando em lise celular. Visto que o mecanismo dedicado de mAb2 OX40/CD137 é para ativar células que expressam OX40 e CD137 sem matar as mesmas, a redução de ADCC induzida pelo mAb2 é desejável.

[0335] Ademais, visto que os mAb2 OX40/CD137 são destinados a funcionar como agonistas duplos, seus mecanismos dedicados de ação devem ser sinalizar por meio dos receptores como resultado de reticulação por ligação dupla tanto a OX40 quanto a CD137 quando co-expressos na mesma célula ou expressos em células diferentes, e, assim, não se exige que a habilidade para reticular por meio dos receptores Fcγ funcione.

[0336] Ademais, sabe-se que anticorpos que alvejam CD137 mostraram toxicidade de fígado na clínica (Segal et al., 2017) e, embora o mecanismo de toxicidade não seja conhecido, é possível que o mesmo dependa da reticulação mediada por FcγR de anticorpos anti-CD137 e ativação de células que expressam CD137 no fígado ou na periferia. Impedindo o agonismo de CD137 por meio de reticulação mediada por FcγR pode diminuir qualquer risco de toxicidade do mAb2 OX40/CD137 da invenção, visto que essas moléculas se reticularão apenas por meio de ligação dupla a OX40 e CD137.

[0337] A ligação por SPR foi usada para confirmar que a presença da mutação LALA no mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 reduziu a afinidade de ligação para receptores Fcγ,

especialmente hFcγR1 (R&D Systems, nº de catálogo 1257-FC- 050/CF), hFcγR2a (R&D Systems, nº de catálogo 1330-CD- 050/CF), hFcγR2b (R&D Systems, nº de catálogo 1460-CD- 050/CF) e hFcγR3a (R&D Systems, nº de catálogo 4325-FC- 050/CF). mAbs anti-hOX40 G1AA/11D4 e G1/11D4 (com e sem a mutação LALA, respectivamente) e mAbs anti-CD137 G1AA/20H4.9 e G1/20H4.9 (com e sem a mutação LALA, respectivamente), todos no formato de isotipo hIgG1, e mAb anti-hCD137 G4/20H4.9, em formato de isotipo hIgG4, foram usados como anticorpos de controle.

[0338] A ligação foi testada em um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). Os antígenos etiquetados por his OX40 humano (BPS Bioscience nº de catálogo 71310) e CD137 humano (produzido internamente) biotinilados foram revestidos em um chip SA (GE Healthcare nº de catálogo BR100398) a 2 µM de concentração. OX40 humano e CD137 humano foram revestidos em células de fluxo separadas, enquanto outra célula de fluxo foi deixada em branco para subtração de fundo. As condições de regeneração foram determinadas como 12 µl de 10 mM de glicina-HCl aquosa a pH 2,0 a 20 µl/min de taxa de fluxo. Os anticorpos (consultar a Tabela 8) e FcγRs humanos (consultar a Tabela 8) foram diluídos a 100 nM (anticorpos) ou 500 nM (FcγRs humanos) em HBS-P (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 0,005 % de Tensoativo em v/v P20, GE Healthcare, BR- 1003-68) e co-injetados a 20 µl/min de taxa de fluxo e a dissociação foi seguida por 5 min.

[0339] A análise de dados foi realizada com software BiaEvaluation versão 3.2 RC1 por referência contra a célula de fluxo vazia e alinhando-se as curvas após a associação do anticorpo. Os valores para resposta de ligação no fim da fase de associação foram gerados subtraindo-se a resposta absoluta no fim da fase de associação do FcγR da resposta absoluta no fim da fase de associação do anticorpo para normalizar o efeito da ligação de anticorpo aos receptores OX40 e CD137.

[0340] A medição de valores para resposta de ligação no fim da fase de dissociação de FcγRI foi realizada para demonstrar o efeito da mutação LALA no crescimento da separação de ligação de FcγRI na ausência da eliminação completa de ligação a esse FcγR. Esses foram gerados subtraindo-se a resposta absoluta no fim da fase de associação do FcγR da resposta absoluta no fim da fase de dissociação do FcγR. Os valores para anticorpos anti-CD137 foram tirados da célula de fluxo revestida com antígeno CD137-his, os valores para anticorpos anti-OX40 foram tirados da célula de fluxo revestida com antígeno OX40-his, e para o mAb2 OX40/CD137 tanto da célula de fluxo revestida com antígeno OX40-his quanto da célula de fluxo revestida com antígeno CD137-his. Os resultados são mostrados na Tabela

8.

[0341] Tabela 8: Resposta de ligação de anticorpos a receptores Fcγ humano por SPR mAb/mAb2 Antígeno Resposta de ligação no fim de Diminuição no chip fase de associação de FcγR de resposta (RU) (junção) de ligação no fim de fase de dissociação de FcγR (RU) FcγRIIa FcγRIIb FcγRIIIa FcγRI FcγRI G1/11D4 OX40-his 123 89,7 142,7 370,3 46,4 G1AA/11D4 OX40-his 64,5 60,9 67,3 292,3 202,6 CD137- G1/20H4.9 224,8 158,5 297,4 741 -16,3 his CD137- G1AA/20H4.9 97,5 95,4 129,4 504,6 380,6 his CD137- G4/20H4.9 156 163,9 113,1 693,3 57,1 his FS20-22- 49AA/FS30- OX40-his 37,4 34,3 31,4 237,5 234,8 10-16 FS20-22- CD137- 49AA/FS30- 10,9 9 17,3 245,8 367,3 his 10-16

[0342] Os mAb2 e anticorpos de controle sem a mutação LALA se ligam todos a cada um dos receptores Fcγ, como esperado, tanto no formato de IgG1 quanto de IgG4. Os mAb2 e anticorpos de controle em formato IgG1 que contém a mutação LALA mostraram ligação significativamente reduzida no fim de uma fase de associação (junção) a cada um dos receptores Fcγ testados, exceto para FcγRI, em comparação com os anticorpos de controle em formato IgG1 sem a mutação LALA e o anticorpo de controle em formato de IgG4. A ligação na taxa da alta afinidade de receptor Fcγ, FcγRI, a anticorpos que contêm hIgG1 LALA diminuiu apenas marginalmente em comparação com anticorpos IgG1 que contém não LALA, de modo que não essa não seja significativamente alterada pela introdução da mutação. No entanto, a separação para FcγRI foi mais rápida para os anticorpos que contém a mutação LALA que aqueles sem LALA, como mostrado por uma diminuição maior da resposta de ligação no fim da fase de dissociação de FcγRI (acima de 200 RU para cada um dos anticorpos que contêm LALA em comparação com menor que 60 RU para os anticorpos que contêm não LALA).

[0343] De modo geral, o mAb2 OX40/CD137 que contém a mutação LALA reduziu a ligação a receptores Fcγ quando comparado a um IgG1 humano do tipo selvagem, de maneira similar a outros anticorpos hIgG1 que contêm LALA e a um nível inferior ao anticorpo de controle IgG4. Visto que a ligação de receptor Fcγ é necessária para a atividade de ADCC, espera-se que essa redução em ligação a receptores Fcγ causada por uma mutação LALA também resultará em ADCC reduzido, de modo que as células-alvo não sejam depletadas pela ligação de mAb2. Isso é considerado como importante visto que os mAb2 OX40/CD137 são anticorpos agonísticos e, portanto, a depleção das células-alvo não é desejada, visto que essas são as células que o mAb2 se destina a estimular.

[0344] FcγRIIIa é expresso em células efetoras imunológicas, como células exterminadoras naturais (NK), e mostrou-se ser importante em mediar ADCC (Chan et al., 2015).

Para determinar a possibilidade se a ligação reduzida do mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 a FcγRIIIa, como confirmado pelos dados de SPR, se traduziu em ativação baixa ou dispensável da trajetória de ADCC, foi realizado um bioensaio de ADCC com o uso de células Jurkat geneticamente modificadas que expressam FcγRIIIa como células efetoras, e células Raji que superexpressam OX40 humano ou CD137 humano como células- alvo. Observou-se que o mAb2 não induz a ativação de ADCC nas células Raji que expressam OX40 ou que expressam CD137, como em comparação com as respostas observadas para os anticorpos de controle negativo e positivo usados no ensaio.

[0345] Sabe-se que outros anticorpos agonísticos dependem da reticulação de receptor Fcγ de anticorpos para criar estruturas de ordem superior (Stewart et al., 2014; Wajant, 2015), resultando em agrupamento e ativação de receptores na superfície celular para exercerem suas atividades agonísticas. Visto que a reticulação mediada por receptor Fcγ não é exigida para a atividade do mAb2 da invenção, o agonismo de células será localizado em sítios em que ambos os alvos estão presentes. Visto que a mutação LALA no mAb2 OX40/CD137 resulta em ligação reduzida a receptores Fcγ, não é esperado que a ativação acionada por reticulação de receptor Fcγ por meio de ligação a CD137 por si só seja possível. Consequentemente, os mAb2 não são propensos a ativar células que expressam CD137 na ausência de expressão de OX40. Visto que há um risco de toxicidade de fígado conhecida com CD137 alvo em seres humanos (por exemplo, como observado no tratamento com urelumabe (BMS-663513) (Segal et al., 2017) não é esperado que a redução na probabilidade de reticulação induzida por receptor Fcγ do mAb2 que contém a mutação LALA reduzirá as chances de tal toxicidade de fígado ocorrer mediante o tratamento com o mAb2, visto que CD137 será ativado apenas onde OX40 também for expresso. A teoria atual de toxicidade de fígado induzida por CD137 indica que células mieloides que expressam CD137 são o tipo celular responsável pela inflamação de fígado observada em camundongos tratados com agonistas CD137 (Bartkowiak, et al., 2018).

[0346] Os macrófagos são conhecidos por expressar FcγRI que pode potencialmente mediar a reticulação de um anticorpo que alveja CD137, no entanto, essas células não são conhecidas por expressarem OX40. Portanto, o mAb2 da invenção, que contém a mutação LALA, não deve, em teoria, ter a capacidade para ativar macrófagos de fígado que expressam CD137, mas também não OX40. Isso é considerado para reduzir o risco de toxicidade de fígado do mAb2 OX40/CD137 da invenção quando comparado a um agonista CD137 que exige a reticulação de receptor Fcγ para atividade ou um agonista CD137 que não exige reticulação para atividade. No caso de OX40, embora alguma atividade residual do Fcab tenha sido observada na ausência de reticulação, o que pode resultar em alguma ativação de OX40 na ausência de ligação a CD137, as toxicidades dose-limitantes não foram relatadas até o momento em estudos clínicos com agonistas OX40, isso não pode ser considerado como um risco. Exemplo 11 – Ligação de mAb2 a células que expressam OX40 ou CD137 11,1. Ligação de mAb2 a células que expressam OX40 ou CD137 humano ou de cinomolgo

[0347] A afinidade de ligação do mAb2 FS20-22-49AA/FS30-

5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12 e FS20- 22-49AA/FS30-10-16 para OX40 e CD137 humano ou de cinomolgo expressos em célula foi determinada com o uso de citometria de fluxo.

As diluições (2 x concentração final) desses anticorpos mAb2 e anticorpos de controle G1/4420 (FITC), G1/11D4 (OX40), G1/MOR7480.1 (CD137) e FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) (todos em formato de isotipo IgG1) foram preparadas em 1 x DPBS (Gibco, 14190-094). As suspensões de célula DO11.10-hOX40, DO11.10-cOX40, DO11.10-hCD137, DO11.10-cCD137 ou HEK foram preparadas em PBS+2 % de BSA (Sigma, A7906) e semeadas a 4 x 106 célula/ml com 50 µl/poço em placas 96 de poços com fundo em V (Costar, 3897). 50 µl do anticorpo diluições foram adicionados aos poços que contém células (volume final de 100 µl) e incubadas a 4 °C por 1 hora.

As placas foram lavadas e 100 µl/poço de anticorpo secundário (anticorpo Fc-488 anti-humano, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) diluído 1:1000 em PBS+2 % de BSA foram, então, adicionados e incubados por 30 min a 4 °C no escuro.

As placas foram lavadas e ressuspensas em 100 µl de PBS que contêm DAPI (Biotium, nº de catálogo 40043) a 1 µg/ml.

As placas foram analisadas com o uso de um citômetro de fluxo Canto II (BD Bioscience) e os dados analisados com o uso de FlowJo.

As células mortas foram identificadas por suas fluorescências superiores no canal UV (405 nm/450/50) e excluídas da análise.

A intensidade de fluorescência de média geométrica (GMFI) no canal FITC (488 nm/530/30) foi usado como uma medida de ligação de anticorpo.

Os dados de GMFI foram ajustados com o uso de log (agonista) vs resposta (três parâmetros) em Software GraphPad Prism para gerar valores de EC50.

[0348] Tabela 9: Afinidade de ligação de mAb2 anti- OX40/CD137 para células DO11.10 que expressam OX40 ou CD137 humano ou de cinomolgo, como determinado por citometria de fluxo. OX40 Humano OX40 de cinomolgo CD137 CD137 de HEK Humano cinomolgo mAb EC50 (nM) EC50 (nM) EC50 EC50 (nM) EC50 (nM) (nM) G1/4420 NB NB NB NB NB G1/11D4 0,1248 0,09408 NB NB NB G1/MOR7480.1 NB NB 0,07682 0,06119 NB FS20-22-49AA/4420 0,1619 0,3262 NB NB NB FS20-22-49AA/FS30-5-37 0,2007 0,3552 0,2578 0,1105 NB FS20-22-49AA/FS30-10-3 0,175 0,394 0,1197 0,0682 NB FS20-22-49AA/FS30-10-16 0,1566 0,3798 0,1291 0,08027 NB FS20-22-49AA/FS30-10-12 0,1517 0,3684 0,2899 0,1074 NB NB: nenhuma ligação observada.

[0349] Os resultados confirmam que os mAb2 OX40/CD137 testados se ligam OX40 e CD137 humano e de cinomolgo expressos em células DO11.10. Os mAb2 e os controles positivos (mAb OX40 anti-humano, G1/11D4, em uma estrutura principal IgG1 humano; e mAb CD137 anti-humano G1/MOR7480.1, em uma estrutura principal IgG1 humano) ligados tanto a OX40 quanto CD137 humano e de cinomolgo com uma faixa de afinidades (consultar a Tabela 9). Nenhuma reatividade cruzada com outras proteínas expressas na superfície da linhagem celular HEK foi observada visto que nenhuma ligação pode ser detectada com essa linhagem celular para qualquer um dos anticorpos testados. Portanto, o mAb2 OX40/CD137 especificamente ligado a OX40 humano e CD137 humano, sem ligação não específica observada.

11.2 Ligação de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 e partes componentes dos mesmos a células que expressam OX40 ou CD137 humano ou de cinomolgo

[0350] Para comparar a afinidade do mAb2 FS20-22- 49AA/FS30-10-16 e suas partes componentes, isto é, o Fcab OX40 (no formato de mAb2 simulado OX40/FITC; FS20-22- 49AA/4420) e o Fab CD137 (em formato IgG1; FS30-010-016), for OX40 e CD137 humano ou de cinomolgo expressos em célula, o mesmo método como descrito no Exemplo 11.1 foi usado. No entanto, nesse experimento, em vez de com o uso de HEK células para analisar a ligação não específica, as células DO11.10 não transduzidas foram usadas. O anticorpo anti-FITC G1/4420 foi usado como um controle. O experimento foi repetido três vezes para aumentar a confiabilidade dos valores de EC50 calculados. Os valores médios de EC50 para moléculas testadas são mostrados na Tabela 10.

[0351] Tabela 10: Afinidade de ligação de mAb2 anti- OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16 e suas partes componentes a células DO11.10 que expressam OX40 ou CD137 humano ou de cinomolgo, como determinado por citometria de fluxo. OX40 OX40 de CD137 CD137 de DO11.10 não Humano cinomolgo Humano cinomolgo transduzida EC50 Avg EC50 Avg ± EC50 Avg ± EC50 Avg ± EC50 Avg ± SD mAb ± SD SD (nM) SD (nM) SD (nM) (nM) (nM) G1/4420 NB NB NB NB NB 0,23 ± FS20-22-49AA/4420 0,55 ± 0,14 NB NB NB 0,02 0,10 ± G1/FS30-10-16 NB NB 0,09 ± 0,01 NB 0,05

OX40 OX40 de CD137 CD137 de DO11.10 não Humano cinomolgo Humano cinomolgo transduzida EC50 Avg EC50 Avg ± EC50 Avg ± EC50 Avg ± EC50 Avg ± SD mAb ± SD SD (nM) SD (nM) SD (nM) (nM) (nM) FS20-22-49AA/FS30-10- 0,22 ± 0,11 ± 0,71 ± 0,21 0,12 ± 0,01 NB 16 0,01 0,02 Avg: Média; SD: Desvio padrão; NB: nenhuma ligação observada.

[0352] Os resultados confirmam que o mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) se liga a OX40 e CD137 humano e de cinomolgo expressos em células DO11.10 com afinidade sub- nanomolar, que o componente de Fcab OX40 do mAb2 se liga a OX40 humano e de cinomolgo com afinidade comparável ao mAb2 OX40/CD137, e que o componente de Fcab CD137 do mAb2 se liga a CD137 humano e de cinomolgo com afinidade comparável ao mAb2 OX40/CD137. Nenhuma ligação não específica a células DO11.10 não transduzidas foi observada para o mAb2 OX40/CD137, para qualquer uma de suas partes componentes ou para o anticorpo de controle de isotipo (G1/4420). Os resultados indicam que a afinidade do mAb2 FS20-22-49AA/FS30- 10-16 OX40/CD137 e do Fcab OX40 FS20-22-49AA para OX40 de cinomolgo expresso em célula é maior (como mostrado pelos valores inferiores de EC50) que anteriormente observado (Exemplo 11.1 e Tabela 9) e similares aos resultados de afinidade determinados por SPR (Exemplo 8 e Tabela 7). Visto que os valores médios de EC50 detalhados na Tabela 10 são o produto de três experimentos independentes, esses são uma melhor representação da afinidade das moléculas testadas para OX40 e CD137 humano e de cinomolgo expressos em células DO11.10.

11.3 Ligação de mAb2 a células que expressam OX40 de camundongo ou CD137

[0353] A afinidade de ligação do mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3 para OX40 e CD137 de camundongo expressos em célula foi determinada com o uso de citometria de fluxo. As diluições (2 x concentração final) de FS20m-232-91AA/Lob12.3 e anticorpos de controle G1/4420 (FITC), G1/Lob12.3 (CD137), G1/OX86 (OX40) e FS20m-232-91AA/HEL D1.3 (mAb2 simulado OX40/HEL) foram preparadas em 1 x DPBS (Gibco, 14190-094). As suspensões de célula DO11.10-mOX40, DO11.10-mCD137 ou HEK foram preparadas em PBS+2 % de BSA (Sigma, A7906) e semeadas a 4 x 106 célula/ml com 50 µl/poço em placas 96 de poços com fundo em V (Costar, 3897). 50 µl do anticorpo diluições foram adicionados aos poços que contém células (volume final de 100 µl) e incubadas a 4 °C por 1 hora. As placas foram lavadas e 100 µl/poço de anticorpo secundário (anticorpo Fc- 488 anti-humano, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) diluído 1:1000 em PBS+2 % de BSA foram, então, adicionados e incubados por 30 min a 4 °C no escuro. As placas foram lavadas e ressuspensas em 100 µl de PBS que contêm DAPI (Biotium, nº de catálogo 40043) a 1 µg/ml. As placas foram analisadas com o uso de um citômetro de fluxo Canto II (BD Bioscience) e os dados analisados com o uso de FlowJo. As células mortas foram identificadas por suas fluorescências superiores no canal UV (405 nm/450/50) e excluídas da análise. A intensidade de fluorescência de média geométrica (GMFI) no canal FITC (488 nm/530/30) foi usado como uma medida de ligação de anticorpo. Os dados de GMFI foram ajustados com o uso de log (agonista) vs resposta (três parâmetros) em Software GraphPad Prism para gerar valores de EC50. Os resultados são mostrados na Tabela 11.

[0354] Tabela 11: Afinidade de ligação de mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo para células DO11.10 que expressam OX40 de camundongo ou CD137, como determinado por citometria de fluxo. OX40 de camundongo CD137 de camundongo mAb EC50 (nM) EC50 (nM) G1/4420 NB NB G1/Lob12.3 NB 0,1206 G1/OX86 0,5381 NB FS20m-232-91AA/HEL D1.3 0,2677 NB FS20m-232-91AA/Lob12.3 0,159 0,118 NB: nenhuma ligação observada.

[0355] Os resultados confirmam que mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3 se ligam a OX40 e CD137 de camundongo expresso em células DO11.10. Os mAb2 e os controles positivos (anti- OX40 de camundongo mAb, OX86, em uma estrutura principal IgG1 humano; e mAb CD137 anti-camundongo Lob12.3, em uma estrutura principal IgG1 humano) ligada a OX40 e/ou CD137 de camundongo com uma faixa de afinidades (consultar a Tabela 11). Nenhuma reatividade cruzada com outras proteínas expressas na superfície da linhagem celular HEK foi observada visto que nenhuma ligação pode ser detectada com essa linhagem celular para qualquer um dos anticorpos testados.

[0356] Portanto, os mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo especificamente ligados a OX40 e CD137 de camundongo de camundongo, sem ligação não específica observada.

Exemplo 12 – Atividade de mAb2 OX40/CD137 que alvejam receptores co-expressos em um ensaio de enterotoxina A estafilocócica (SEA)

[0357] A expressão de OX40 em linfócitos de infiltração de tumor é propensa a ser acompanhada por expressão de CD137 visto que essas duas moléculas são frequentemente co- expressas em células T ativadas (Ma et al., 2005). Tornar OX40 e CD137 em agonista por um mAb2 que alveja esses dois receptores co-expressos pode induzir a proliferação e a produção de citocinas inflamatórias por células T pré- ativadas.

[0358] Para se tornarem completamente ativadas, as células T exigem dois sinais, um primeiro sinal que é específico de antígeno e é fornecido por meio do receptor de célula T que interage com moléculas de MHC (complexo de maior histocompatibilidade) que exibem antígeno peptídico na membrana de células que apresentam antígeno (APCs), e um segundo, sinal não específico de antígeno - o sinal coestimuilatório - que é fornecido pela interação entre moléculas coestimulatórias expressas na membrana da APC e da célula T.

[0359] Para testar a atividade do mAb2 OX40/CD137, um ensaio de ativação de célula T com o uso de super antígeno de enterotoxina A estafilocócica (SEA) como o primeiro sinal foi estabelecido. O SEA reticula moléculas de classe II MHC na superfície de APCs e no TCR de células T, portanto, fornecendo o primeiro sinal para ativação de célula T. Para suas ativações completas, as células T também devem receber o segundo sinal coestimuilatório, pelas moléculas de controle ou mAb2 reticulados, como adequado. Esse ensaio é realizado com PBMCs isoladas do sangue e devem representar mais proximamente o que acontece in vivo em comparação com um ensaio realizado com células T isoladas.

[0360] O ensaio de estímulo de SEA foi usado para estabelecer a atividade de diferentes anticorpos agonistas de OX40 e CD137, e um anticorpo mAb2 OX40/CD137, na presença ou na ausência de agentes de reticulação artificiais, para comparar diferentes clones de mAb2 OX40/CD137, e para estabelecer um valor representativo de EC50 para o clone de mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16 em um grupo de 10 doadores de PBMC.

12.1 Atividade de anticorpos agonistas de OX40 e CD137 em PBMCs estimuladas por SEA

[0361] Para estabelecer a sensibilidade do ensaio SEA para diferentes anticorpos agonistas de OX40 e CD137, o anticorpo mAb2 (FS22-20-49AA/FS30-10-16) e anticorpos de controle listados na Tabela 12 foram testados quanto às suas atividades no ensaio. G1/4420 (anti-FITC), G1AA/MOR7480.1 (anti-CD137), G1AA/FS30-10-16 (anti-CD137), G1AA/20H4.9 (anti-CD137), G1AA/11D4 (anti-OX40), e FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) foram usados como controles. A produção de IL-2 foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0362] Tabela 12: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados Ligação Cadeia Cadeia Ligação Mutação mAb/mAb2 de Fcab Isotipo Reticulador pesada leve de Fab a LALA a SEQ ID SEQ ID G1/4420 FITC- FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1AA/MOR7480.1 hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 125 120

Ligação Cadeia Cadeia Ligação Mutação mAb/mAb2 de Fcab Isotipo Reticulador pesada leve de Fab a LALA a SEQ ID SEQ ID G1AA/FS30-10- hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 154 97 16 G1AA/20H4.9 hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 165 122 G1AA/11D4 hOX40 nenhum hIgG1 Não a-hCH2 173 175 FS20-22- FITC- FITC hOX40 hIgG1 Sim 123 116 49AA/4420 dextrano FS20-22- 49AA/FS30-10- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 95 97 16

[0363] Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de cones de depleção de leucócito (serviço de Sangue e Transplante de NHS), um sub-produto de doações de plaqueta. Resumidamente, teores de cone de leucócito foram lavados com PBS e revestidos em um gradiente Ficoll (GE Lifesciences nº de catálogo 17144002). PBMCs foram isoladas por centrifugação e recuperadas de células que não cruzaram o gradiente Ficoll. PBMCs foram adicionalmente lavadas com PBS e as hemácias restantes foram lisadas através da adição de 10 ml de tampão de lise de hemácias (eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante. PBMCs foram contabilizadas e ressuspensas a 2,0 x 106 células/ml em meio de célula T (meio RPMI (Life Technologies) com 10 % de FBS (Life Technologies), 1x Estreptomicina de Penicilina (Life Technologies), Piruvato de Sódio (Gibco), 10 mM de Hepes (Gibco), 2 mM de L-Glutamina (Gibco) e 50 µM 2- mercaptoetanol (Gibco)). SEA (Sigma nº de catálogo S9399) foi, então, adicionado às PBMCs a 200 ng/ml e as células foram adicionadas às placas a 2 x 105 célula/poço (100 µl/poço).

[0364] As diluições de 2 µM de cada anticorpo de teste

(consultar a Tabela 12 para maiores detalhes) foram preparadas em DPBS (Gibco) e adicionalmente diluídas a 1:10 em meio de célula T (30 µl + 270 µl) para obter diluições de 200 nM. Os agentes de reticulação artificiais (anticorpo CH2 anti-humano (clone MK1A6, produzido internamente) ou FITC- dextrano (Sigma) (consultar a Tabela 12) foram adicionados aos poços em uma razão molar de 1:1 com os anticorpos de teste quando necessário. Em uma placa de 96 poços, diluições em série dos anticorpos de teste foram preparadas e 100 µl do anticorpo diluído mistura foram adicionados às células T ativadas na placa.

[0365] As células foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 120 horas. Os tensoativos foram coletados e liberação de IL- 2 foi medida com o uso de um kit ELISA IL-2 humana (eBioscience ou R&D Systems) seguindo as instruções do fabricante. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com o Software Gen5, BioTek. Os valores de absorbância de 630 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A concentração de IL-2 humana (hIL-2) foi plotada vs a concentração de log dos anticorpos de teste e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism. A Tabela 13 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada no ensaio SEA na presença ou na ausência de reticulação com agentes de reticulação artificiais. A Figura 3A mostra os níveis de liberação de IL-2 induzida pelos anticorpos testados a uma concentração única (3,7 nM) no ensaio SEA. A concentração na qual esses anticorpos induziram os níveis mais altos de produção de IL-2 foi escolhida para essa análise. A análise estatística foi realizada por ANOVA de duas vias e por teste de múltiplas comparações de Tukey. Os asteriscos acima das barras de erro representam a diferença significativa em comparação com amostras tratadas com controle de isotipo (G1/4420) (* p<0,032, ** p<0,0021, *** p<0,0002, **** p<0,0001). A Figura 3B mostra plotagens de liberação de IL- 2 induzida pelo mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) na presença ou na ausência de agente de reticulação artificial no ensaio SEA.

[0366] Tabela 13: Ensaio SEA com anticorpos e mAb2 agonistas de OX40 e CD137 Nenhuma reticulação Reticulação Resposta Resposta mAbs/mAb2 EC50 (nM) EC50 (nM) Máxima Máxima (hIL- 95 % (hIL- 95 % 95 % de 2 de 95 % de 2 de Conf. pg/ml Conf. Conf. pg/ml Conf. (nM) Int. ) Int. (nM) Int. ) Int. G1/4420 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G1AA/MOR7480.1 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G1AA/FS30-10-16 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 0,1224 a 3904 a G1AA/20H4.9 NAD NAD NAD NAD 0,3062 0,7376 4324 4762 0,01113 0,0716 a 3693 a G1AA/11D4 NAD NAD NAD NAD 3 0,2910 4269 4864 0,1377 FS20-22- a 7943 a 49AA/4420 NAD NAD NAD NAD 0,3364 0,7743 8719 9532 FS20-22- 0,1665 49AA/4420 + a 6964 a G1AA/FS30-10-16 NAD NAD NAD NAD 0,3793 0,8578 7644 8358

8028 0,06915 FS20-22- 0,1050 a a a 8920 a 49AA/FS30-10-16 0,2548 0,6082 8931 9877 0,1877 0,4945 9930 10990 NAD = nenhuma atividade detectada.

[0367] Os resultados mostram que apenas o mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) teve a capacidade para aumentar níveis de IL-2 na ausência de agentes de reticulação artificiais e que a adição de agente de reticulação artificial não aumentou a atividade do mAb2 OX40/CD137, em termos de EC50 ou de resposta máxima. A atividade dos anticorpos que alvejam OX40 G1AA/11D4 e FS20-22-49AA/4420 e o anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9 foi observada apenas na presença de agentes de reticulação artificiais, e nenhuma atividade estatisticamente significante foi detectada para os anticorpos anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16, em comparação com o controle de isotipo, mesmo na presença de agente de reticulação artificial. O anticorpo anti-OX40 G1AA/11D4 induziu níveis maiores de IL-2 que os anticorpos anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16, e um nível de IL-2 comparável ao anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9, embora tenha-se observado que o anticorpo G1AA/11D4 tem potência maior que o anticorpo G1AA/20H4.9 como indicado por seu valor notavelmente inferior de EC50. Esses resultados indicam que esse ensaio SEA é mais sensível a agonismo de OX40 que ao agonismo de CD137. Isso é possivelmente relacionado ao fato de OX40 ser preferencialmente expresso em células T CD4+ e CD137 ser preferencialmente expresso em células T CD8+ (Croft, 2014 e dados internos mostrados na Figura 6), e devido ao fato de esses serem tipicamente mais células T CD4+ que células T CD8+ em PBMCs humanas.

[0368] 12.2 Atividade de clones de mAb2 OX40/CD137 diferentes em PBMCs estimuladas por SEA

[0369] Cinco clones de mAb2 OX40/CD137 diferentes foram testados quanto às suas atividades em um ensaio SEA. Os detalhes dos mAb2 e anticorpos de controle usados no ensaio são fornecidos na Tabela 14. G1/4420 (anti-FITC), G1/11D4 (anti-OX40), G2/MOR7480.1 (anti-CD137), G1/11D4 mais G2/MOR7480.1 em combinação, e FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) foram usados como controles. O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 12.1.

[0370] Tabela 14: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Reticulador Cadeia Cadeia de Fab a de Fcab LALA pesada leve a SEQ ID SEQ ID FITC- G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1/11D4 hOX40 nenhum hIgG1 Não a-hCH2 174 175 G2/MOR7480.1 hCD137 nenhum hIgG2 Não a-hCH2 124 120 FITC- FS20-22-49AA/4420 FITC hOX40 hIgG1 Sim 123 116 dextrano FS20-22-49AA/FS30-5-37 hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 109 111 FS20-22-49AA/FS30-10-3 hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 99 97 FS20-22-49AA/FS30-10- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 103 97 12 FS20-22-49AA/FS30-10- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 95 97 16 FS20-22-49AA/FS30-35- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 105 107 14

[0371] A Tabela 15 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada no ensaio SEA na presença ou na ausência de reticulação com agentes de reticulação artificiais. As Figuras 3C e D mostram plotagens de liberação de IL-2 para o ensaio SEA.

[0372] Tabela 15: Ensaio SEA com mAb2 que alveja OX40 e CD137 Nenhuma reticulação Reticulação mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Resposta Máxima 95 % 95 % 95 % 95 % de de (hIL-2 de (hIL-2 de (nM) Conf. (nM) Conf. pg/ml) Conf. pg/ml) Conf. Int. Int. Int. Int. G1/4420 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 0,01 4743 G1/11D4 NAD NAD NAD NAD 0,13 a 6614,00 a 0,77 8561 G2/MOR7480.1* NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 6633 G1/11D4 + NAD NAD NAD NAD 0,11 para 9451,00 a G2/MOR7480.1 0,79 12384 0,15 24885 FS20-22- 0,83 a 328,7 a 8,53 808,70 0,31 a 28603,00 a 49AA/4420 58,93 1602 0,68 32460 0,26 27773 FS20-22- 0,26 a 26131 a 0,51 29242,00 0,50 a 30748,00 a 49AA/FS30-5-37 0,97 32465 0,91 33822 0,20 30775 FS20-22- 0,15 a 31391 a 0,29 34945,00 0,38 a 33919,00 a 49AA/FS30-10-3 0,55 38616 0,69 37170 FS20-22- 1,25 21156 0,73 a 22201 a 49AA/FS30-10- 1,36 24912,00 2,33 a 23721,00 a 2,65 27799 12 4,58 26587 FS20-22- 0,06 31415 0,077 32213 a 49AA/FS30-10- 0,14 35115,00 0,10 a 33761,00 a a 0,25 38074 16 0,18 36145 FS20-22- 0,07 28906 0,021 27164 a 49AA/FS30-35- 0,09 32363,00 0,14 a 32212,00 a a 0,30 37691 14 0,30 35597 NAD = nenhuma atividade detectada

[0373] A Figura 3C e D e a Tabela 15 mostram que nenhuma produção de IL-2 foi observada com o anticorpo anti-FITC G1/4420 não reticulado ou reticulado ou com o anticorpo anti-

OX40 não reticulado (G1/11D4 em separado ou em combinação com G2/MOR7480.1), como esperado. IL-2 foi produzido pelas células T quando OX40 foi ativado por ligação do anticorpo de controle positivo anti-OX40, mas apenas quando o agente de reticulação artificial estava presente (EC50 de 0,13 nM para G1/11D4 por si só, e EC50 de 0,11 nM quando em combinação com G2/MOR7480.1). O Fcab que alveja OX40 em formato de mAb2 simulado (4420 LALA) FS20-22-49AA/4420 mostrou alguma atividade agonística na ausência de reticulação nesse ensaio (EC50 de 8,53 nM), mas quando reticulado por ligação dos braços Fab a FITC-dextrano, teve atividade aumentada como demonstrado pela diminuição em EC50 (0,31 nM) e pelo aumento na quantidade máxima de IL-2 produzida (resposta máxima), como mostrado pela produção aumentada de IL-2.

[0374] Nenhuma atividade foi observada com o anticorpo que alveja CD137 reticulado G2/MOR7480.1 por si só, e a atividade da combinação do anticorpo que alveja OX40 G1/11D4 e anticorpo que alveja CD137 G2/MOR7480.1 quando reticulado foi similar àquela do anticorpo que alveja OX40 reticulado G1/11D4 por si só.

[0375] Nesse ensaio SEA de ativação de célula T, a atividade dos cinco clones de mAb2 OX40/CD137 (consultar Tabela 15) foi comparável independentemente da presença de agente de reticulação artificial. A atividade do mAb2 OX40/CD137 na presença de agente de reticulação artificial também foi comparável ao mAb2 simulado reticulado FS20-22- 49AA/4420. Esses resultados desse ensaio SEA mostram que o mAb2 OX40/CD137 têm a capacidade para sinalizar por meio de OX40, em que nenhum agente de reticulação artificial é exigido, como resultado de reticulação fornecida pelo engate dos braços Fab anti-CD137 do mAb2.

[0376] Embora nenhuma atividade tenha sido detectada para o anticorpo que alveja CD137 reticulado G2/MOR7480.1 nesse ensaio, espera-se que CD137 tenha sido expresso a um nível nas células T para permitir que a reticulação do mAb2 ocorresse. Presumiu-se que essa expressão estivesse em um nível no qual cada um dos cinco clones de mAb2, quando ligados ao CD137, também pudesse se ligar a OX40 e acionar sua ativação a um grau muito maior que o nível baixo de atividade induzida pelo mAb2 simulado não reticulado FS20-22- 49AA/4420.

[0377] A ativação de célula T observada com o mAb2 OX40/CD137 na ausência de agente de reticulação artificial também sugere que essas moléculas terão a capacidade para ativar células T em que tanto OX40 quanto CD137 são expressos in vivo.

12.3 Atividade de clone de mAb2 OX40/CD137 FS20-22- 49AA/FS30-10-16 em PBMCs estimuladas por SEA de 10 doadores de PBMC

[0378] O clone de mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foi testado em um ensaio SEA com PBMCs de 10 doadores diferentes para estabelecer valores de EC20, EC30 e EC50 precisos para sua atividade. O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 12.1 na ausência de um agente de reticulação artificial. Os valores médios mais ou menos de desvio padrão (SD) foram calculados a partir dos dados brutos para cada doador. Para calcular valores de EC50, os dados brutos foram ajustados a uma função logística (4 parâmetros: Top, Fundo, Coeficiente de Hill e EC50):

𝑇𝑜𝑝𝑜 − 𝐹𝑢𝑛𝑑𝑜 𝑦(log 𝑐) = 𝐹𝑢𝑛𝑑𝑜 + 1 + 10(log 𝐸𝐶50 −log 𝑐)∙𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝐻𝑖𝑙𝑙

[0379] O eixo geométrico y mostra a resposta medida (níveis de IL-2), como uma função de log10(c), em que c donata a concentração do artigo de teste.

[0380] Cada estimativa de parâmetro do ajusto tem um erro padrão, que é indicativo da precisão de tal estimativa. Visto que diferentes doadores e/ou replicantes técnicos para um determinado experimento fornecerão diferentes estimativas de parâmetro e níveis diferentes de precisão (dependendo, por exemplo, da qualidade dos dados em cada caso), os parâmetros de cada doador e/ou replicantes técnicos foram incluídos em uma Média Ponderada. Os pesos foram definidos como o inverso do quadrado do erro padrão do parâmetro, sob uma hipótese de normalidade de parâmetro.

[0381] Adicionalmente, os valores de log10(EC20) e log10(EC30) foram calculados ajustando-se os dados a equações similares: 𝑇𝑜𝑝𝑜 − 𝐹𝑢𝑛𝑑𝑜 𝑦(log 𝑐) = 𝐹𝑢𝑛𝑑𝑜 + (log 𝐸𝐶20 −log 𝑐)∙𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝐻𝑖𝑙𝑙 1 + 4 ∙ 10 𝑇𝑜𝑝𝑜 − 𝐹𝑢𝑛𝑑𝑜 𝑦(log 𝑐) = 𝐹𝑢𝑛𝑑𝑜 + 1 + (7/3) ∙ 10(log 𝐸𝐶30 −log 𝑐)∙𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝐻𝑖𝑙𝑙

[0382] Todos os ajustes logísticos foram realizados com o uso de GraphPad Prism, e a média ponderada foi realizada com o uso de Microsoft Excel. As fórmulas usadas para a Média Ponderada e para o erro padrão da Média Ponderada são fornecidas abaixo: ∑ 𝑤𝑖 𝑥𝑖 𝑥̅ = ∑ 𝑤𝑖

∑ 𝑤𝑖2 𝑆𝐸𝑀 = 𝑆𝐷√ (∑ 𝑤𝑖 )2 em que o desvio padrão ponderado foi estimado como: 𝑁 ∑ 𝑤𝑖 (𝑥𝑖 − 𝑥̅ )2 𝑆𝐷 = √ (𝑁 − 1) ∑ 𝑤𝑖

[0383] Os valores de EC20, EC30 e EC50 para a liberação de IL-2 observados para o mAb2 OX40/CD137 no ensaio SEA são mostrados na Tabela 16.

[0384] Tabela 16: Valores de EC20, EC30 e EC50 para o mAb2 OX40/CD137 no ensaio SEA EC50 (nM) EC30 (nM) EC20 (nM) Doador 1 0,21 0,09 0,05 Doador 2 0,38 0,14 0,08 Doador 3 0,34 0,18 0,12 Doador 4 0,36 0,18 0,11 Doador 5 0,30 0,11 0,06 Doador 6 0,41 0,17 0,10 Doador 7 0,44 0,21 0,13 Doador 8 0,29 0,15 0,10 Doador 9 0,17 0,10 0,07 Doador 10 0,04 0,02 0,02 Média Ponderada 0,32 0,14 0,09 95 % de Conf. Int. 0,25-0,41 0,11-0,18 0,07-0,12

[0385] Esses resultados mostram que o mAb2 OX40/CD137 tem atividade comparável com PBMCs de doadores diferentes. Exemplo 13 – Atividade de mAb2 OX40/CD137 humano em um ensaio de ativação de célula pan-T

[0386] O ensaio SEA de ativação de célula T descrito no

Exemplo 12 usou PBMCs e o super antígeno SEA para estimular células T. Para avaliar o efeito de agonistas de OX40 e CD137 em células T isoladas, um ensaio de ativação de célula T foi estabelecido. Nesse ensaio, as células T foram isoladas e estimuladas com o uso de um anticorpo anti-CD3 imobilizado em uma superfície plástica. O anticorpo anti-CD3 imobilizado tem a capacidade para agrupar o TCR de células T, fornecendo o primeiro sinal exigido para ativação de célula T e as moléculas de teste fornecidas para o segundo sinal.

[0387] O ensaio de estímulo de célula T foi usado para estabelecer a atividade de anticorpos agonistas OX40 e CD137 diferentes e um anticorpo mAb2 OX40/CD137 na presença ou na ausência de agentes de reticulação, para comparar clones de mAb2 OX40/CD137 diferentes, e para estabelecer um valor representativo de EC50 para o clone de mAb2 OX40/CD137 FS20- 22-49AA/FS30-10-16 em um grupo de nove doadores de PBMC.

13.1 Atividade de anticorpos agonistas OX40 e CD137 em um ensaio de ativação de célula pan-T

[0388] Para estabelecer a sensibilidade do ensaio de ativação de célula T para anticorpos agonistas OX40 e CD137 diferentes, o anticorpo mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) e anticorpos de controle listados na Tabela 17 foram testados quanto às suas atividades no ensaio. G1/4420 (anti-FITC), G1AA/MOR7480.1 (anti-CD137), G1AA/FS30-10-16 (anti-CD137), G1AA/20H4.9 (anti-CD137), G1AA/11D4 (anti-OX40), e FS20-22- 49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) foram usados como controles. A produção de IL-2 foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0389] Tabela 17: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados

Ligação Cadeia Cadeia Ligação Mutação mAb/mAb2 de Fcab Isotipo Reticulador pesada leve de Fab a LALA a SEQ ID SEQ ID G1/4420 FITC- FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1AA/MOR7480.1 hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 125 120 G1AA/FS30-10-16 hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 154 97 G1AA/20H4.9 hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 165 122 G1AA/11D4 hOX40 nenhum hIgG1 Não a-hCH2 173 175 FS20-22- FITC- FITC hOX40 hIgG1 Sim 123 116 49AA/4420 dextrano FS20-22- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 95 97 49AA/FS30-10-16

[0390] PBMCs humanas foram isoladas como descrito no Exemplo 12.1. As células T foram, então, isoladas das PBMCs com o uso de um Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec Ltd), de acordo com as instruções do fabricante.

[0391] Dynabeads de CD3/CD28 de Ativador T Humano (Life technologies11452D) foram ressuspensos por vortexação. As microesferas foram lavadas duas vezes com meio de célula T (meio RPMI (Life Technologies) com 10 % de FBS (Life Technologies), 1x Estreptomicina de Penicilina (Life Technologies), Piruvato de Sódio (Gibco), 10 mM de Hepes (Gibco), 2 mM de L-Glutamina (Gibco) e 50 µM de 2- mercaptoetanol (Gibco)).

[0392] O número exigido de células T em uma concentração de 1,0 x 106 células/ml em meio de célula T foram estimulados com os Dynabeads CD3/CD28 de Ativador T humano lavados a uma razão de célula para microesfera de 2:1 em um frasco T-25 (Sigma) e incubadas durante a noite a 37 °C, 5 % de CO2 para ativar as células T. As células T ativadas foram lavadas dos Dynabeads e ressupensas em meio de célula T em uma concentração de 2,0 x 106 células/ml. As placas de 96 poços com fundo plano foram revestidas com anticorpo anti-CD3 humano através de incubação com 2,5 µg/ml de anticorpo anti- CD3 humano (clone UHCT1 R&D Systems) diluídas em PBS por 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 e, então, lavadas duas vezes com PBS. As células T ativadas foram adicionadas às placas a 2 x 105 célula/poço.

[0393] As diluições de 2 µM de cada anticorpo de teste (consultar a Tabela 17 para maiores detalhes) foram preparadas e adicionadas aos poços em uma razão molar de 1:1 com agente de reticulação (anticorpo CH2 anti-humano (clone MK1A6, produzido internamente) ou FITC-dextrano (Sigma) (consultar a Tabela 17)) quando exigido, como descrito acima no Exemplo 12.1. Em uma placa de 96 poços, diluições em série dos anticorpos de teste foram preparadas e 100 µl do anticorpo diluído mistura foram adicionados às células T ativadas na placa.

[0394] As células T foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 72 horas. Os tensoativos foram, então, coletados, a liberação de IL-2 foi medida e os dados foram preparados como descrito no Exemplo 12.1. A Tabela 18 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada no ensaio de ativação de célula T na presença ou na ausência de reticulação com agentes de reticulação. A Figura 4A mostra os níveis de liberação de IL-2 induzida pelos anticorpos testados a uma concentração única (3,7 nM) no ensaio de ativação de célula T. A concentração na qual esses anticorpos induziram os níveis mais altos de produção de IL-2 foi escolhida para essa análise. A análise estatística foi realizada por ANOVA de duas vias e por teste de múltiplas comparações de Tukey. Os asteriscos acima das barras de erro representam a diferença significativa em comparação com amostras tratadas com controle de isotipo (G1/4420) (* p<0,032, ** p<0,0021, *** p<0,0002, **** p<0,0001). A Figura 4B mostra plotagens de liberação de IL-2 induzida pelo mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) na presença ou na ausência de agente de reticulação no ensaio de ativação de célula T.

[0395] Tabela 18: Ensaio de ativação de célula T com anticorpos e mAb2 agonistas de OX40 e CD137 Nenhuma reticulação Reticulação Resposta mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Máxima 95 % 95 % de 95 % de 95 % de (hIL-2 de (hIL-2 (nM) Conf. (nM) Conf. Conf. pg/ml) Conf. pg/ml) Int. Int. Int. Int.

G1/4420 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G1AA/MOR7480.1 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G1AA/FS30-10-16 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G1AA/20H4.9 0,04154 4068 a NAD NAD NAD NAD 0,234 a 1,057 5303 6620 G1AA/11D4 0,01642 a 3266 a NAD NAD NAD NAD 0,1301 0,6356 4130 5037 FS20-22- 0,1611 49AA/4420 a 11440 a NAD NAD NAD NAD 0,278 0,4790 12450 13488 FS20-22- 0,05500 49AA/4420 + a 12556 a G1AA/FS30-10-16 NAD NAD NAD NAD 0,1746 0,5209 15001 17552 FS20-22- 14533 0,01737 49AA/FS30-10-16 0,03231 a a 11757 a 0,09306 a 0,2430 16927 19389 0,07916 0,2851 14434 17202 NAD – nenhuma atividade detectada.

[0396] Os resultados mostram que apenas o mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) teve a capacidade para aumentar níveis de IL-2 na ausência de agentes de reticulação artificiais e que a adição de agente de reticulação artificial não aumentou a atividade do mAb2 OX40/CD137, em termos de EC50 ou de resposta máxima. A atividade dos anticorpos que alvejam OX40 G1AA/11D4 e FS20-22-49AA/4420 e o anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9 foi observada apenas na presença de agentes de reticulação artificiais, e na atividade foi detectada para os anticorpos anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16 mesmo na presença de agente de reticulação artificial. O anticorpo agonista OX40 FS20- 22-49AA/4420 induziu níveis de IL-2 maiores que todos os três anticorpos agonistas CD137. O anticorpo anti-OX40 G1AA/11D4 induziu níveis maiores de IL-2 que os anticorpos anti-CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16, e um nível de IL-2 comparável ao anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9, embora tenha-se observado que o anticorpo G1AA/11D4 tem potência maior que o anticorpo G1AA/20H4.9 como indicado por seu valor inferior de EC50. Esses resultados indicam que esse ensaio de ativação de célula T é mais sensível a agonismo de OX40 que ao agonismo de CD137. Como suposto no Exemplo 12.1, possivelmente relacionado ao fato de OX40 ser preferencialmente expresso em células T CD4+ e CD137 ser preferencialmente expresso em células T CD8+ (Croft, 2014 e dados internos mostrados na Figura 6), e devido ao fato de esses serem tipicamente mais células T CD4+ que células T CD8+ em PBMCs humanas.

13.2 Múltiplas análises e citocina da atividade de anticorpos agonistas OX40 e CD137 em um ensaio de ativação de célula pan-T

[0397] Para melhor entender o efeito de estímulo de OX40 e CD137 no ensaio de ativação de célula T, os níveis de múltiplas citocinas foram analisados. Os anticorpos e anticorpo mAb2 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) e anticorpos de controle listados na Tabela 19 foram usados. Os anticorpos de controle G1/4420 (anti-FITC), G1AA/FS30-10-16 (anti- CD137) e FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) foram testados na presença de agentes de reticulação artificiais e o mAb2 OX40/CD137 foi testado na ausência de um agente de reticulação artificial. Todos os anticorpos foram usados em uma concentração única (10 nM). O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 13.1.

[0398] Tabela 19: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados Ligação Ligação Cadeia Cadeia Mutação mAb/mAb2 de Fab de Fcab Isotipo Reticulador pesada leve

LALA a a SEQ ID SEQ ID G1/4420 FITC- FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1AA/FS30- hCD137 nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 154 97 10-16 FS20-22- FITC- FITC hOX40 hIgG1 Sim 123 116 49AA/4420 dextrano FS20-22- 49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim nenhum 95 97 10-16

[0399] Os níveis das citocinas IL-2, IL-6, IL12p70, IL- 13, TNFα, IFNγ e IL-10 nos tensoativos coletados após a incubação foram, então, determinados com o uso do kit Pró- inflamatório V-plex (MSD, K15049D-1) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados mostraram que o mAb2

OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) e o anticorpo que alveja OX40 reticulado (FS20-22-49AA/4420) aumentaram a liberação de IL-2, IL-6, IL-12p70, IL-13 e citocina TNFα e diminuíram a liberação de IL-10 por células T. Nenhuma atividade foi detectada para o anticorpo anti-CD137 (G1AA/FS30-10-16).

13.3 Atividade de clones de mAb2 OX40/CD137 diferentes em um ensaio de ativação de célula pan-T

[0400] Os detalhes das moléculas testadas nesse ensaio e seus respectivos agentes de reticulação, quando aplicável, são fornecidos na Tabela 20 abaixo. G1/4420 (anti-FITC), G1/11D4 (anti-OX40), G2/MOR7480.1 (anti-CD137), G1/11D4 mais G2/MOR7480.1 em combinação, e FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC) foram usados como controles. Todas as moléculas foram testadas na ausência de um agente de reticulação artificial. Os controles de agente único G1/4420, G1/11D4, G2/MOR7480.1 e FS20-22-49AA/4420 foram adicionalmente testados na presença de um agente de reticulação artificial. O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 13.1.

[0401] Tabela 20: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Reticulador Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve a a SEQ ID SEQ ID FITC- G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1/11D4 hOX40 nenhum hIgG1 Não anti-hCH2 174 175 G2/MOR7480.1 hCD137 nenhum hIgG2 Não anti-hCH2 124 120 FS20-22- FITC- FITC hOX40 hIgG1 Sim 123 116 49AA/4420 dextrano mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Reticulador Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve a a SEQ ID SEQ ID FS20-22- 49AA/FS30-5- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim n/a 109 111 37 FS20-22- 49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim n/a 99 97 10-3 FS20-22- 49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim n/a 103 97 10-12 FS20-22- 49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim n/a 95 97 10-16 FS20-22- 49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim n/a 105 107 35-14

[0402] A Tabela 21 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada para todas as moléculas testadas no ensaio de ativação de célula T na ausência de reticulação. A Tabela 22 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada para os controles de agente único G1/4420, G1/11D4, G2/MOR7480.1 e FS20-22-49AA/4420 adicionalmente testados na presença de agentes de reticulação. As Figuras 4C e D mostram as plotagens de liberação de IL-2 para o ensaio de ativação de célula T.

[0403] Tabela 21: Ensaio de ativação de célula T com mAb2 que alveja receptores co-expressos na ausência de agente de reticulação Nenhum Agente de Reticulação mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima (nM) 95 % de Conf. (hIL-2 95 % de Int. pg/ml) Conf. Int.

G1/4420 NAD NAD NAD NAD G1/11D4 NAD NAD NAD NAD G2/MOR7480.1 NAD NAD NAD NAD G1/11D4 +

NAD NAD NAD NAD G2/MOR7480.1 FS20-22-49AA/4420 926,2 a 5,02 0,2478 a 2583 1508 26580 FS20-22-49AA/FS30- 2817 a 1,201 0,1358 a 15,06 3663 5-37 4979 FS20-22-49AA/FS30- 0,01754 a 3204 a 0,2905 4219 10-3 3,867 5408 FS20-22-49AA/FS30- 0,01871 a 2388 a 0,845 3939 10-12 85,72 7001 FS20-22-49AA/FS30- 3012 a 0,2019 0,0108 a 3,071 3873 10-16 4897 FS20-22-49AA/FS30- 2915 a 0,2285 ND para 14,77 4379 35-14 6181 NAD = nenhuma atividade detectada ND = não determinado

[0404] Tabela 22: Controles de agente único na presença de agente de reticulação Com Agente de Reticulação mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima (nM) 95 % de (hIL-2 95 % de Conf. Int. pg/ml) Conf. Int.

G1/4420 NAD NAD NAD NAD G1/11D4 ND para 5385 a 0,05132 6375 0,3545 7400 G2/MOR7480.1 1,231 a 2090 a 2,38 2306 4,754 2545 FS20-22-49AA/4420 0,01408 a 5242 a 0,06129 5806 0,1939 6386 NAD = nenhuma atividade detectada ND = não determinado

[0405] A Tabela 21 e a Figura 4C mostram que o mAb2 OX40/CD137 não reticulado teve atividade (valores de EC50 em uma faixa de 0,2019 a 1,201 nM) e tiveram, portanto, a capacidade para se ligarem a ambos os alvos resultando em agrupamento de um ou ambos para induzir a ativação de célula T. Nenhuma produção de IL-2 foi observada com o anticorpo anti-FITC G1/4420 não reticulado ou reticulado, como esperado, ou com o anticorpo anti-OX40 não reticulado (G1/11D4 em separado ou em combinação com G2/MOR7480.1). IL- 2 foi produzido por células T quando o receptor OX40 foi alvejado pelo anticorpo de controle positivo anti-OX40 na presença de agente de reticulação (EC50 de 0,05 nM para

G1/11D4 por si só, e EC50 de 0,02 nM quando em combinação com G2/MOR7480.1).

[0406] O Fcab que alveja OX40 no formato de mAb2 simulado (4420 LALA) FS20-22-49AA/4420 teve alguma atividade agonística na ausência de reticulação (um EC50 de 5,02 nM e uma resposta máxima de 1508 pg/ml hIL-2), como observado no ensaio SEA, e essa atividade foi adicionalmente melhorada quando o mAb2 simulado foi reticulado por ligação de seus braços Fab para FITC-dextrano.

[0407] Nenhuma atividade foi observada com o anticorpo anti-CD137 G2/MOR7480.1 não reticulado por si só mas, quando reticulado, esse teve a capacidade para induzir a ativação de célula T, indicando que, diferente do ensaio SEA de ativação de célula T (Exemplo 12), esse ensaio tem a capacidade para medir a sinalização de CD137 por esse clone anti-CD137 bem como a sinalização de OX40 confirmada acima. A diferença na atividade observada para esse anticorpo de reticulação em comparação com o mesmo clone anti-CD137 em formato IgG1 (G1AA/MOR7480.1) no Exemplo 13.1, para o qual nenhuma atividade foi detectada na ausência ou presença de agente de reticulação artificial, pode ser explicada pela variabilidade de doador de célula T, em que alguns doadores podem responder melhor ao estímulo de CD137 que outros.

[0408] No ensaio de ativação de célula T CD137 humano com o uso de células DO11.10-hCD137 descrito no Exemplo 7.1, os mAb2 OX40/CD137 de teste (FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20-22- 49AA/FS30-10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30- 10-16 e FS20-22-49AA/FS30-35-14) e o controle G2/MOR7480.1 potencialmente induziram a produção de IL-2. Portanto, presume-se que os braços Fab anti-CD137 do mAb2 OX40/CD137 também têm a capacidade para tornar CD137 expresso em célula T em agonista para produzir um sinal de IL-2 detectável no ensaio de ativação de célula T primário do presente exemplo.

13.4 Atividade de clone de mAb2 OX40/CD137 FS20-22- 49AA/FS30-10-16 em um ensaio de ativação de célula pan-T com células T de nove doadores de PBMC

[0409] O clone de mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foi testado em um ensaio de ativação de célula T com PBMCs de nove doadores diferentes para estabelecer valores de EC20, EC30 e EC50 precisos para sua atividade. O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo 13.1 na ausência de um agente de reticulação artificial.

[0410] Os valores médios mais ou menos de desvio padrão (SD) foram calculados a partir dos dados brutos como descrito no Exemplo 12.3 para cada doador. Os valores de EC20, EC30 e EC50 para a liberação de IL-2 observada para o mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30-10-16) no ensaio de célula T também foram calculados como descrito no Exemplo 12.3 e são mostrados na Tabela 23.

[0411] Tabela 23: Os valores de EC20, EC30 e EC50 do mAb2 OX40/CD137 em um ensaio de ativação de célula T EC50 (nM) EC30 (nM) EC20 (nM) Doador 1 0,170 0,203 0,280 Doador 2 0,067 0,103 0,153 Doador 3 0,167 0,158 0,193 Doador 4 0,251 0,226 0,223 Doador 5 0,175 0,182 0,222 Doador 6 0,116 0,177 0,264 Doador 7 0,114 0,297 0,467

EC50 (nM) EC30 (nM) EC20 (nM) Doador 8 0,121 0,283 0,448 Doador 9 0,199 0,174 0,194 Média 0,179 0,067 0,040 Ponderada 95 % de 0,154-0,208 0,049-0,090 0,026-0,061 Conf. Int.

[0412] Esses resultados mostram que o mAb2 OX40/CD137 tem atividade comparável em células T de doadores diferentes. Exemplo 14 – Atividade de mAb2 OX40/CD137 humano em ensaios de ativação de célula T CD4+ e CD8+

[0413] As células T podem ser subdivididas em células T CD4+ e CD8+, de acordo com suas funções no sistema imunológico. As células T CD4+ são chamadas células auxiliadoras T e produzem citocinas que modulam a resposta imunológica e células T CD8+ são chamadas células exterminadoras T e eliminam diretamente células-alvo. A expressão de OX40 foi observada como maior que a expressão de CD137 em células T CD4+ e, vice-versa, a expressão de CD137 foi observada como maior que a expressão de OX40 em células T CD8+ (Croft, 2014 e consultar a Figura 6). Independentemente dessa diferença em níveis de expressão, tanto células T CD4+ quanto CD8+ co-expressam os dois receptores (Ma et al., 2005).

[0414] Para explorar adicionalmente a atividade do mAb2 OX40/CD137 nessas duas populações de células T, células T CD4+ e CD8+ foram isoladas para testar a habilidade das moléculas listadas na Tabela 24 abaixo para ativar cada população de célula T em ensaios de ativação de célula T

CD4+ e CD8+ separados. Nesse ensaio, a co-expressão de OX40 e CD137 foi usada para determinar a reticulação do mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16. G1/4420 (anti-FITC), G1AA/11D4 (anti-OX40), G1AA/MOR7480.1 (anti-CD137) G1AA/FS30-10-16 (anti-CD137), FS20-22-49AA/4420 (mAb2 simulados OX40/FITC), e FS20-22-49AA/4420 mais G1AA/FS30-10- 16 em combinação foram usados como controles. A produção de IL-2 foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0415] Tabela 24: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Reticulador Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve a a SEQ ID SEQ ID FITC- G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1AA/11D4 hOX40 nenhum hIgG1 Sim anti-hCH2 173 175 G1AA/MOR7480.1 hCD137 nenhum hIgG1 Sim anti-hCH2 125 120 G1AA/FS30-10-16 hCD137 nenhum hIgG1 Sim anti-hCH2 154 97 G1AA/20H4.9 hCD137 Nenhum hIgG1 Sim anti-hCH2 165 122 FITC- FS20-22-49AA/4420 FITC hOX40 hIgG1 Sim 123 116 dextrano FS20-22-49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim anti-hCH2 95 97 10-16

[0416] Para isolar células T CD4+ e CD8+ humanas, PBMCs foram primeiramente isoladas como descrito no Exemplo 13.1. As células T CD4+ e CD8+ foram, então, separadamente isoladas das PBMCs com o uso de, respectivamente, um Kit de Isolamento Célula T CD4+ (humana) (Miltenyi Biotec, 130-096-533) e um Kit de Isolamento Célula T CD8+ (humana) (Miltenyi Biotec, 130-096-495) de acordo com as instruções do fabricante.

[0417] As células T CD4+ ou CD8+ foram ativadas durante a noite na quantidade exigida em uma concentração de 1,0 x 106 células/ml em meio de célula T com o uso de Dynabeads de CD3/CD28 de Ativador T Humano como descrito no Exemplo 13.1.

[0418] As células T CD4+ ou CD8+ ativadas foram lavadas dos Dynabeads e ressuspensas em meio de célula T em uma concentração de 2,0 x 106 células/ml. As placas de 96 poços com fundo plano foram revestidas com anticorpo anti-CD3 humano por meio de incubação com 2,5 µg/ml (para o ensaio de ativação de célula T CD4+) ou 10 µg/ml (para o ensaio de ativação de célula T CD8+) de anticorpo anti-CD3 humano (R&D Systems, clone UHCT1) diluídas em PBS por 2 horas a 37 °C, 5 % de CO2 e, então, lavadas duas vezes com PBS. As células T CD4+ ou CD8+ ativadas foram, então, adicionadas às respectivas placas a 2 x 105 células/poço.

[0419] As diluições de 2 µM de cada anticorpo de teste (consultar Tabela 24 para maiores detalhes) foram preparadas e adicionadas aos poços em uma razão molar de 1:1 com agente de reticulação (anticorpo CH2 anti-humano ou FITC-dextrano (Sigma) (consultar a Tabela 24)) quando exigido, como descrito no Exemplo 6. Em uma placa de 96 poços, as diluições em série dos anticorpos de teste foram preparadas e 100 µl do anticorpo diluído mistura foram adicionados às células T CD4+ ou CD8+ ativadas nas respectivas placas.

[0420] As células T foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 por 72 horas. Os tensoativos foram coletados, a liberação de IL-2 foi medida e os dados foram preparados como descrito no Exemplo 12.1. A Tabela 25 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada nos ensaios de ativação de célula T separados na presença ou na ausência de reticulação com agentes de reticulação. As Figuras 5A a

C mostram plotagens de liberação de IL-2 para o ensaio de ativação de célula T CD4+ ou CD8+, respectivamente.

[0421] Após os tensoativos serem coletados, as células T foram lavadas em PBS e colorizadas com um anticorpo secundário anti-humano Fc identificado por Alexa Fluor 488 (Jackson Immunoresearch, nº de catálogo 109-546-098) diluído a 1 por 1000 em PBS por 1 hora a 4 °C. As células foram, então, lavadas uma vez com PBS e ressupensas em 100 µl/poço de PBS com DAPI (Biotium, nº de catálogo 89139-054) a 1 g/ml. As células foram, então, analisadas em um citômetro de fluxo BD FACSCanto II (BD Biosciences). A Figura 6 mostra a intensidade de fluorescência de média geométrica no canal 488 de células T CD4+ ou CD8+ tratadas com G1AA/MOR7480.1 ou G1AA/11D4.

[0422] Tabela 25: Ensaio de ativação de célula T CD4+ e CD8+ com mAb2 que alveja receptores co-expressos Células T CD4+ Nenhuma Reticulação Reticulação EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Resposta Máxima mAbs/mAb2 (nM) 95 % de (hIL-2 95 % de (nM) 95 % de (hIL-2 95 % Conf. pg/ml) Conf. Conf. pg/ml) de Int. Int. Int. Conf. Int.

G1/4420 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 7129 0,01883 G1AA/11D4 NAD NAD NAD NAD 0,0813 8817 a a 0,2796 10561 G1AA/MOR7480.1 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD G1AA/FS30-10-

NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 16

Células T CD4+ Nenhuma Reticulação Reticulação EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Resposta Máxima mAbs/mAb2 (nM) 95 % de (hIL-2 95 % de (nM) 95 % de (hIL-2 95 % Conf. pg/ml) Conf. Conf. pg/ml) de Int. Int. Int. Conf. Int.

16200 FS20-22- 0,06536 1578 a 0,06145 0,5641 2242 0,1553 18872 a 49AA/4420 a ND +infinito a 0,3765 21634 FS20-22- 16953 49AA/4420 + 1,881 a 2403 a 0,08648 22,54 3820 0,181 18895 a G1AA/FS30-10- 162,8 8413 a 0,3728 20903 16 FS20-22- 0,04802 14031 14326 a 0,03012 49AA/FS30-10- 0,1131 a 16232 0,08334 16232 a 18191 a 0,2113 16 0,2529 18494 Células T CD8+ Nenhuma Reticulação Reticulação EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Resposta Máxima mAbs/mAb2 (nM) 95 % de (hIL-2 95 % de (nM) 95 % de (hIL-2 95 % Conf. pg/ml) Conf. Conf. pg/ml) de Int. Int. Int. Conf. Int.

G1/4420 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 306,3 0,004042 G1AA/11D4 NAD NAD NAD NAD 0,09964 387,6 a a 1,04 474,2 849,8 0,2837 a G1AA/MOR7480.1 NAD NAD NAD NAD 1,011 1066 a 3,658 1308

2344 G1AA/FS30-10- 2,547 a NAD NAD NAD NAD 3,875 2560 a 16 5,943 2796 1510 FS20-22- 0,1418 a NAD NAD NAD NAD 0,268 1663 a 49AA/4420 0,5024 1821 FS20-22- 2185 49AA/4420 + 0,1721 a NAD NAD NAD NAD 0,4312 2534 a G1AA/FS30-10- 1,081 2905 16 FS20-22- 0,06831 6071 4592 a 0,3441 a 49AA/FS30-10- 0,1183 a 4915 1,98 7397 a 5246 8,779 16 0,2032 9139 NAD = nenhuma atividade detectada ND = não determinado

[0423] A Tabela 25 e a Figura 5B mostram que as células T CD4+ podem ser ativadas pelos controles anti-OX40 reticulados G1AA/11D4 e FS20-22-49AA/4420 (tanto por si só quanto em combinação com G1AA/FS30-10-16) mas não pelos controles anti-CD137 de agente único G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16. A Figura 5C mostra que as células T CD8+, por outro lado, foram ativadas por ambos os controles anti- CD137 G1AA/MOR7480.1 e G1AA/FS30-10-16 quando reticuladas, bem como pelos controles anti-OX40 reticulados G1AA/11D4 e

FS20-22-49AA/4420, embora o nível de resposta ao controle de anti-CD137 de agente único G1AA/FS30-10-16 tenha sido maior para ambos os controles de anti-OX40 de agente único. Como foi observado no ensaio SEA (Exemplo 12.2) e no ensaio de ativação de célula pan-T humano (Exemplo 13.3), o Fcab OX40 em formato de mAb2 simulado (FS20-22-49AA/4420) mostrou alguma atividade na ausência de reticulação na presença de células T CD4+ e essa atividade foi aumentada quando o anticorpo foi reticulado. O mAb2 OX40/CD137 (FS20-22- 49AA/FS30-10-16) mostrou atividade na presença tanto de células T CD4+ quanto CD8+ na ausência de reticulação, como foi esperado a partir dos resultados anteriores (consultar os Exemplos 12 e 13).

[0424] A Figura 6 mostra que as células T CD4+ expressam níveis inferiores de CD137 e níveis superiores de OX40 que as células T CD8+. A ligação de G1AA/MOR7480.1 ao CD137 é uma medição de expressão de CD137 e a ligação de G1AA/11D4 a OX40 é uma medição de expressão de OX40.

[0425] Esse ensaio de célula T com células T isoladas CD4+ e CD8+ foi repetido seguindo o mesmo protocolo como descrito acima, mas com células T isoladas de um doador de PBMC diferente e com a adição do anticorpo anti-CD137 G1AA/20H4.9 (consultar a Tabela 24). De acordo com os resultados mostrados nas Figuras 5A a D, as Figuras 5E e 5F mostram que as células T CD8+ respondem mais ao agonismo de CD137 e as células T CD4+ respondem mais ao agonismo de OX40. Os anticorpos anti-OX40 (G1AA/11D4 e o Fcab anti-OX40 em formato de mAb2 simulado FS20-22-49AA/4420) quando reticulados ativaram as células T CD4+, mas não células T CD8+, e os anticorpos CD137 (G1AA/20H4.9 e G1AA/FS30-10-16) quando reticulados ativaram as células T CD8+, mas não as células T CD4+. O anticorpo G1AA/20H4.9 também ativou células T CD8+ na ausência de anticorpo de reticulação, similar aos resultados obtidos no ensaio de célula DO11.10-hCD137, descritos no Exemplo 7.1. Nesse experimento repetido o anticorpo G1AA/MOR7480.1 não ativa células T CD8+ quando reticulado. Alguns doadores de PBMC podem ser mais suscetíveis ao coestímulo de CD137 que outros e os resultados diferentes obtidos nesse experimento podem ser o resultado dessa variação natural.

[0426] Esses dados indicam que as células T CD4+ are são mais sensíveis a ativação por meio de agonismo de OX40 que as células T CD8+, e, por outro lado, que as células T CD8+ são mais sensíveis a ativação por meio de agonismo de CD137 que as células T CD4+. Isso se correlaciona com as diferenças relatadas in níveis de expressão de receptores OX40 e CD137 em células T células T CD4+ e CD8+, em que o último expressa níveis superiores de OX40 que CD137, e o anterior expressa níveis superiores de CD137 que OX40. A atividade na presença de células T CD8+ do anticorpo de controle anti-CD137 reticulado G1AA/FS30-10-16, os braços Fab os quais estão presentes no mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16, demonstra que o mAb2 tem a habilidade para ativar o receptor CD137 quando reticulado por ligação de seus Fcabs a OX40. Adicionalmente, a atividade na presença de células T CD4+ do Fcab anti-OX40 reticulado em formato de mAb2 simulado (FS20- 22-49AA/4420), que também está presente no mAb2 OX40/CD137 FS20-22-49AA/FS30-10-16, mostra que o mAb2 tem a habilidade para ativar o receptor OX40 quando reticulado por ligação de seus braços Fab ao CD137. Pode-se concluir, desse modo, que o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 tem o potencial para funcionar como um agonista duplo ativando-se as células T CD4+ por meio de agonismo de OX40 e células T CD8+ por meio de agonismo de CD137 e em menor extensão de OX40. A ativação de OX40 pelo mAb2 ocorre por meio de seus Fcabs e é aumentada por reticulação do mAb2 quando ligado a CD137 por meio de seus braços Fab, enquanto a ativação de CD137 ocorre por meio de ligação de seus braços Fab ao CD137 e reticulação do mAb2 quando ligado a OX40 por meio seus Fcabs. Exemplo 15 – Atividade de mAb2 OX40/CD137 de camundongo e anticorpos anti-CD137 de camundongo em ensaios de ativação de célula T

[0427] Visto que o mAb2 OX40/CD137 anti-humano não se liga a proteínas de camundongo, a fim de testar o potencial de um mAb2 OX40/CD137 para ilicitar uma resposta antitumoral mediada por célula T, um reagente paralelo foi produzido para alvejar OX40 de camundongo e CD137 de camundongo (consultar o Exemplo 8.2).

15.1 Atividade de mAb2 OX40/CD137 de camundongo em um ensaio de ativação de célula pan-T

[0428] A fim de testar se o mAb2 OX40/CD137 de camundongo (FS20m-232-91AA/Lob12.3) que alveja esses dois receptores co-expressos pode induzir a produção de citocinas inflamatórias por células T pré-ativadas, foi estabelecido um ensaio de ativação de célula T de camundongo. Os anticorpos G1/4420 (anti-FITC), G1AA/OX86 (anti-mOX40), G1AA/Lob12.30 (anti-mCD137), G1AA/OX86 e G1AA/Lob12.3 em combinação, e FS20m-232-91AA/4420 (mAb2 simulado mOX40/FITC) foram usados como controles (consultar a Tabela 26 para maiores detalhes) e produção de IL-2 foi usado como uma medida de estímulo de célula T.

[0429] Tabela 26: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Reticulador Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve a a SEQ ID SEQ ID FITC- G1/4420 FITC Nenhum hIgG1 Não 115 116 dextrano G1AA/OX86 mOX40 Nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 155 156 Universidade G1AA/Lob12.3 mCD137 Nenhum hIgG1 Sim a-hCH2 de Southampton FS20m-232- FITC- FITC mOX40 hIgG1 Sim 157 116 91AA/4420 dextrano Criação FS20m-232- descrita mCD137 mOX40 hIgG1 Sim a-hCH2 91AA/Lob12.3 acima no Exemplo 9.2

[0430] Para isolar células T, os baços foram coletados de camundongos fêmeas Balb/C de 4-8 semanas de vida (Charles River). Os camundongos foram humanamente eutanasiados e os baços foram isolados por dissecação. Esplenócitos foram isolados empurrando-se os baços através de uma peneira celular de 70 µm (Corning) com o uso do interior de uma seringa plástica de 5 ml. A peneira celular foi lavada 10 vezes com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) (Gibco) e o eluente coletado em um tubo de 50 ml. As hemácias presentes no eluente foram lisadas através da adição de 10 ml de tampão de lise de hemácias (eBioscience), de acordo com as instruções do fabricante. As células T foram isoladas dos esplenócitos presentes no eluente com o uso de um Kit II de Isolamento de célula Pan T (camundongo) (Miltenyi Biotec Ltd), de acordo com as instruções do fabricante, e foram, então, ativadas e usadas em um protocolo essencialmente igual ao ensaio de ativação de célula T humano descrito no Exemplo 13.1, mas em vez disso, com o uso de Dynabeads de CD3/CD28 de Ativador T de Camundongo (Life Technologies) para ativação de células T, anticorpo CD3 anti-camundongo (Biolegend clone 145-2C11) para o revestimento de placas, e um kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience ou R&D systems) para medição de liberação de IL-2.

[0431] A Tabela 27 mostra os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observada no ensaio de ativação de célula T na presença do mAb2 e mAbs testados. As Figuras 7A e B mostram plotagens representativas de liberação de IL- 2 para o ensaio de ativação de célula T.

[0432] Tabela 27: Ensaio de ativação de célula T com mAb2 que alveja receptores co-expressos Nenhuma reticulação Reticulação mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Resposta Máxima (nM) 95 % de (mIL-2 95 % de (nM) 95 % de (mIL-2 95 % Conf. pg/ml) Conf. Conf. pg/ml) de Int. Int. Int. Conf. Int.

G1/4420 NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD NAD 13647 1,730 a G1AA/OX86 NAD NAD NAD NAD 2,413 14544 a 3,365 15441

Nenhuma reticulação Reticulação mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima EC50 (nM) Resposta Máxima (nM) 95 % de (mIL-2 95 % de (nM) 95 % de (mIL-2 95 % Conf. pg/ml) Conf. Conf. pg/ml) de Int. Int. Int. Conf. Int.

139,3 0,001061 G1AA/Lob12.3 NAD NAD NAD NAD 1,179 373,6 a a 1309 607,8 11531 G1AA/OX86 + 0,9596 a NAD NAD NAD NAD 1,722 12834 a G1AA/Lob12.3 3,090 14138 13279 FS20m-232- 0,1181 a NAD NAD NAD NAD 0,2568 14672 a 91AA/4420 0,5585 16065 12485 FS20m-232- 0,01023 6614 a 0,04358 a 0,1141 8750 0,1011 13563 a 91AA/Lob12.3 a 1,273 10885 0,2346 14640 NAD = nenhuma atividade detectada

[0433] A Tabela 27 e a Figura 7B mostram que há um aumento na ativação de células T quando o receptor OX40 é alvejado e os anticorpos anti-OX40 são reticulados. Nenhuma ativação de célula T foi observada com o anticorpo anti-FITC reticulado ou não reticulado G1/4420, como esperado ou com o anticorpo anti-OX40 não reticulado (G1AA/OX86 em separado ou em combinação com G1AA/Lob12.3). IL-2 foi produzido por células T quando o receptor OX40 foi alvejado pelo anticorpo anti-OX40 G1AA/OX86 na presença de agente de reticulação (EC50 de 2,41 nM para G1AA/OX86 por si só, e EC50 de 1,72 nM quando em combinação com G1AA/Lob12.3).

[0434] O Fcab que alveja OX40 em formato de mAb2 simulado

(FS20m-232-91AA/4420) não teve atividade agonística na ausência de reticulação, mas quando reticulado pela ligação dos braços Fab a FITC-dextrano mostrou ativação potente de célula T. Quando o Fcab que alveja OX40 foi pareado com Fab anti-CD137 (Lob12.3), o mAb2 mostrou atividade de célula T na ausência de quaisquer agentes de reticulação adicionais. Isso indica que o mAb2 é reticulado por ligação aos receptores co-expressos na mesma superfície celular.

[0435] A atividade marginal foi observada com o anticorpo que alveja CD137 reticulado G1AA/Lob12.3 por si só, e a atividade da combinação do anticorpo que alveja OX40 G1AA/OX86 e anticorpo que alveja CD137 G1AA/Lob12.3 quando reticulado foi comparável àquela do anticorpo que alveja OX40 reticulado G1AA/OX86 por si só, indicando que o ensaio tem baixa sensibilidade para detecção de agonismo de CD137 por Lob12.3. Isso é em contraste ao ensaio de célula T humana descrito no Exemplo 13.3 no qual um sinal específico de CD137 mais forte (resposta máxima de liberação de IL-2) foi observado para o controle anti-CD137 reticulado G2/MOR7480.1. Essa diferença em atividade funcional observada para os anticorpos de controle CD137 anti- camundongo e CD137 anti-humano pode ser relacionada ao fato de esses terem afinidades diferentes para seus respectivos CD137-alvos. Isso também pode refletir fonte das células (PBMCs humanas versus esplenócitos de camundongo) ou diferenças sutis entre a biologia-alvo em sistemas de camundongo versus humano.

[0436] Esses dados mostram que o mAb2 OX40/CD137 FS20m- 232-91AA/Lob12.3 pode induzir a ativação de célula T sem quaisquer agentes de reticulação adicionais, engatando-se ambos os receptores ao mesmo tempo.

[0437] Visto que as moléculas de mAb2 OX40/CD137 anti- humano não têm reatividade cruzada de camundongo, e os mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo são funcionalmente comparáveis ao humano, resulta em paralelo sistemas experimentais in vitro, em que as moléculas anti-camundongo são consideradas como substitutos adequados para inferir o potencial para um mAb2 OX40/CD137 para induzir imunidade antitumoral in vivo.

15.2 Atividade de anticorpos anti-CD137 de camundongo em um ensaio de ativação de célula T CD137 de camundongo

[0438] Visto que pouca ou nenhuma atividade do clone de Fab anti-CD137 (Lob12.3) do mAb2 OX40/CD137 de camundongo foi detectada no ensaio de célula pan-T de Exemplo 15.1, para entender a atividade de diferentes anticorpos agonistas anti-CD137, um ensaio de ativação de célula T com o uso de células DO11.10-mCD137 foi realizado. Os anticorpos agonistas anti-CD137 G1AA/Lob12.3 (consultar a Tabela 26) e G1AA/3H3 (SEQ ID NOs: 166 e 167) foram testados, bem como o anticorpo anti-FITC 4420 em formato de IgG1 (G1/4420; SEQ ID NOs 115 e 116) como um controle negativo de isotipo. As moléculas de mAb foram testadas tanto na presença quanto na ausência do anticorpo CH2 anti-humano de reticulação, MK1A6 (consultar o Exemplo 2.1). A produção de IL-2 de camundongo foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0439] O ensaio foi realizado como descrito no Exemplo

6.2, mas com o uso de células DO11.10-mCD137 em vez de células DO11.10-hCD137. As placas foram lidas a 450 nm com o uso do leitor de placa com Software Gen5 (BioTek). Os valores de absorbância de 630 nm foram subtraídos daqueles de 450 nm (Correção). A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A concentração de IL-2 de camundongo (mIL-2) foi plotada vs a concentração de log de anticorpo e as curvas resultantes foram ajustadas com o uso do log (agonista) vs equação de resposta em GraphPad Prism.

[0440] Os resultados são mostrados nas Figuras 7C e D. Os anticorpos anti-CD137 diferiram em suas exigências para o anticorpo de reticulação para induzir atividade. Enquanto observou-se que o G1AA/Lob12.3 exigiu a adição do anticorpo de reticulação para atividade, isto é, foi dependente de reticulação para sua atividade, G1AA/3H3 mostrou a atividade tanto na presença quanto na ausência do anticorpo de reticulação e, assim, teve atividade independente de reticulação. Exemplo 16 – Engate duplo de OX40 e CD137 é exigido para a atividade do mAb2 OX40/CD137

16.1 mAb2 OX40/CD137 humano

[0441] Os mAb2 que alvejam OX40/CD137 mostraram atividade na ausência de agentes de reticulação adicionais no SEA (Exemplo 12), ensaios de célula pan-T humana (Exemplo 13) e célula T CD4+ e CD8+ humano (Exemplo 14) nos quais as células T co-expressam OX40 e CD137. A fim de testar se essa atividade exige que o mAb2 OX40/CD137 se ligue simultaneamente aos dois receptores, um ensaio de competição de célula T foi realizado para avaliar a habilidade do mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 para ativar células T isoladas na presença de um excesso de 100 vezes do mAb2 simulado que alveja OX40 FS20-22-49AA/4420, o mAb anti-CD137 G1AA/FS30- 10-16, a combinação do mAb2 simulado FS20-22-49AA/4420 mais o mAb G1AA/FS30-10-16, ou o mAb de controle de isotipo G1/4420. A produção de IL-2 foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0442] As células T foram isoladas como descrito no Exemplo 13. As células T isoladas foram, então, ativadas e as placas foram revestidas com anticorpo anti-CD3 como descrito no Exemplo 13. As células T ativadas foram suplementadas com 2 nM de mAb2 OX40/CD137 (FS20-22- 49AA/FS30-10-16) e adicionadas às placas a 2 x 105 células/poço em 100 µl. A concentração final de mAb2 OX40/CD137 foi, portanto, de 1 nM.

[0443] As diluições de 2 µM de cada anticorpo de teste foram preparadas em DPBS (Gibco) e adicionalmente diluídas a 1:10 em meio de célula T (30 µl + 270 µl) para obter diluições de 200 nM e 100 µl de cada anticorpo diluído foram adicionados às células T ativadas na placa.

[0444] As células T foram incubadas, os tensoativos foram coletados e a liberação de IL-2 foi medida como descrito no Exemplo 13. A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A análise estatística foi realizada com o uso de um teste ANOVA de uma via e teste de múltiplas comparações de Dunnett com o uso de o pacote de software GraphPad Prism.

[0445] A Figura 8 mostra a liberação de IL-2 para o ensaio de competição. A atividade do mAb2 foi amplamente reduzida quando superada tanto pelo mAb2 simulado FS20-22-49AA/4420 para ligação a OX40 quanto pelo mAb G1AA/FS30-10-16 para ligação ao CD137, como em comparação com quando o mAb2 teve a capacidade para se ligar a ambos os receptores na ausência dos anticorpos anti-OX40 e anti-CD137. A combinação do mAb2 simulado que alveja OX40 FS20-22-49AA/4420 e o mAb anti- CD137 G1AA/FS30-10-16 diminuiu adicionalmente a atividade do mAb2 OX40/CD137. Esses resultados indicam que a fim de que o mAb2 induza a ativação de célula T por meio agrupamento e agonismo de OX40 e CD137, em que a ligação dupla do mAb2 a ambos os receptores é exigida.

16.2 mAb2 OX40/CD137 de camundongo

[0446] O mAb2 que alveja OX40/CD137 de camundongo mostra atividade na ausência de agentes de reticulação adicionais no ensaio de célula T em que células T co-expressam os dois receptores. A fim de testar se essa atividade exige que o mAb2 OX40/CD137 se ligue simultaneamente aos dois receptores, um ensaio de competição foi realizado para avaliar a habilidade do mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 para ativar células T isoladas na presença de um excesso de 100 vezes do mAb2 simulado que alveja OX40 FS20m-232-91AA/4420, do mAb anti-CD137 G1/Lob12.3 ou do mAb controle negativo G1AA/4420 (FITC). As células T foram isoladas como descrito no Exemplo 15,1. As células T isoladas foram, então, ativadas e as placas foram revestidas com anticorpo anti-CD3 como descrito no Exemplo 13.1 (ensaio de ativação de célula pan-T humano) mas em vez disso, com o uso de Dynabeads de CD3/CD28 de Ativador T de Camundongo (Life Technologies) para ativação de células T e anticorpo CD3 anti-camundongo (Biolegend clone 145-2C11) para revestimento de placas. As células T ativadas foram suplementadas com 2 nM de mAb2 OX40/CD137 (FS20m-232- 91AA/Lob12.3) e adicionadas às placas a 2 x 105 células/poço.

[0447] As diluições de 2 µM de cada anticorpo de teste foram preparadas em DPBS (Gibco) e adicionalmente diluídas a 1:10 em meio de célula T (30 µl + 270 µl) para obter diluições de 200 nM e 100 µl de cada anticorpo diluído foram adicionados às células T ativadas na placa.

[0448] As células T foram incubadas, os tensoativos foram coletados e a liberação de IL-2 foi medida como descrito no Exemplo 12.1, mas em vez disso, com o uso de um kit ELISA de IL-2 de camundongo (eBioscience ou R&D sistemas) para medição de liberação de IL-2. A curva padrão para o cálculo de concentração de citocina se baseou no ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Software Gen5, BioTek). A análise estatística foi realizada com o uso de um teste ANOVA de uma via e teste de múltiplas comparações de Dunnett com o uso de o pacote de software GraphPad Prism. A Figura 9 mostra una plotagem representativa de liberação de IL-2 para o ensaio de competição.

[0449] A Figura 9 mostra que há uma diminuição na quantidade de produção de IL-2 induzida pelo mAb2 OX40/CD137 quando anticorpos que competem para ligação a OX40 ou CD137 são introduzidos em excesso. Os anticorpos concorrentes usados foram as partes componentes de mAb2(o Fcab em formato de mAb2 simulado (4420) e o Fab sem o Fcab) a fim de garantir que o mesmo epítopo seja alvejado. A adição desses anticorpos concorrentes reduziu a quantidade de liberação de IL-2 induzida pelo mAb2 OX40/CD137 indicando que essa molécula exige ligação dupla para sua atividade. Isso mostra que a atividade de mAb2 OX40/CD137 é dependente do engate tanto de OX40 quanto de CD137 ao mesmo tempo, portanto, agrupando e tornando ambos os receptores em agonistas. Exemplo 17 – Atividade de mAb2 OX40/CD137 em um modelo tumoral singênico CT26

17.1 Comparação de atividade antitumoral de mAb2 OX40/CD137 com ou sem mutação LALA

[0450] Um modelo tumoral colorretal de camundongo singênico Balb/c CT26 foi usado para testar a atividade antitumoral do mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo in vivo. O modelo tumoral CT26 foi mostrado anteriormente como sensível a ambos os anticorpos agonistas OX40 e CD137 (Sadun et al., 2008), e os linfócitos de infiltração de tumor (TILs) isolados de tumores CT26 são antecipados para expressar tanto OX40 quanto CD137. Os anticorpos testados são detalhados na Tabela 28.

[0451] Tabela 28: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve a a SEQ ID SEQ ID G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 G1/OX86 mOX40 nenhum hIgG1 Não 159 156 G1AA/OX86 mOX40 nenhum hIgG1 Sim 155 156 Universidade G1/Lob12.3 mCD137 nenhum hIgG1 Não de Southampton Universidade G1AA/Lob12.3 mCD137 nenhum hIgG1 Sim de Southampton FS20m-232- Criação mCD137 mOX40 hIgG1 Não 91/Lob12.3 descrita mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve a a SEQ ID SEQ ID FS20m-232- acima no mCD137 mOX40 hIgG1 Sim 91AA/Lob12.3 Exemplo 9.2

[0452] A habilidade do mAb2, com ou sem a mutação LALA (FS20m-232-91AA/Lob12.3 e FS20m-232-91/Lob12.3, respectivamente), para inibir crescimento tumoral foi comparada ao mAb de controle de isotipo G1/4420 (anti-FITC), mAb de agente único G1/OX86 (controle anti-OX40 sem a mutação LALA) ou G1/Lob12.3 (controle anti-CD137 sem a mutação LALA), uma combinação de G1/OX86 mais G1/Lob12.3, ou uma combinação de G1AA/OX86 (mAb anti-OX40 com a mutação LALA) mais G1AA/Lob12.3 (mAb anti-CD137 com a mutação LALA).

[0453] Os camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando aproximadamente 20 g, cada, foram aclimatizados por uma semana antes do estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Cada coorte tinha 12 camundongos. A linhagem celular de carcinoma de cólon CT26 (ATCC, CRL-2638) foi expandida, armazenada e, então, pré-triada por meio de IDEXX Bioresearch para patógenos que usam o protocolo IMPACT I e mostraram estar livres de patógeno. As células CT26 (aproximadamente 3-5x106) foram descongeladas do armazenamento a -150 °C e adicionadas a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) com 10 % de FCS (Gibco, 10270-106) em um frasco de cultura de tecido T175. Os camundongos foram anestesiados com o uso de isoflurano (Abbott Laboratories) e cada animal recebeu 1 X

106 células injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo para gerar tumores. No dia 10 após a inoculação de célula tumoral, os tumores foram medidos e os camundongos foram aleatorizados em coortes de estudo com base em volume tumoral. Quaisquer camundongos que não tiveram tumores nesse momento foram removidos do estudo.

[0454] Dentro de 24 horas antes da injeção, os anticorpos foram analisados por perfilagem de SEC-HPLC e verificados quanto impurezas. Os anticorpos foram diluídos a uma concentração final de 0,1 mg/ml em PBS, e 200 µl/camundongo foram injetados intraperitonealmente (IP), gerando uma dose final de 1 mg/kg para um camundongo de 20 g. As injeções foram realizadas nos dias 13, 15 e 17 (três doses a cada dois dias) após a inoculação de tumor. Os animais foram submetidos à triagem de saúde sob anestesia três vezes por semana, durante o tempo em que as medições exatas dos tumores foram realizadas. As medições de volume tumoral foram feitas com compassos para determinar o eixo geométrico mais longo e o eixo geométrico mais curto do tumor. A fórmula a seguir foi usada para calcular o volume tumoral: L x (S2) / 2 (Em que L = eixo geométrico mais longo; S = eixo geométrico mais curto)

[0455] O teste foi interrompido no dia 27 quando o volume tumoral chegou ao ponto final humano, de acordo com o Ato do Reino Animal Unido (Scientific Procedures) e Diretiva EU EU86/609.

[0456] Para teste estatístico os volumes tumorais são analisados na escala de log com o uso de um modelo misto. Um modelo separado foi ajustado para cada par de tratamentos de interesse. O modelo é: log10 (𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒) = 𝐴 + 𝐵 × (𝑑𝑖𝑎 − 𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎) + 𝜀

[0457] A e B são a intercepção e o declínio, respectivamente; esses são diferentes para cada camundongo, e incluem um efeito fixo para o grupo e um efeito aleatório para o animal: 𝐴 = 𝐴0 + 𝐴1 𝑇 + 𝜀𝐴 𝐵 = 𝐵0 + 𝐵1 𝑇 + 𝜀𝐵

[0458] T é uma variável indicatriz que representa o grupo de tratamento com valor 0 em um grupo e 1 no outro. Os efeitos aleatórios são distribuídos com uma distribuição normal: 𝜀A ~𝑁(0, 𝜎A ), 𝜀B ~𝑁(0, 𝜎B ) em que 𝜎A e 𝜎B são os desvios padrão da variabilidade entre animais na intercepção e no declínio, respectivamente. A variabilidade intra animais também normalmente distribuída com desvio padrão𝜎: ε~𝑁(0, σ)

[0459] Para cada para de tratamentos, o modelo acima foi ajusto aos dados. Para 𝐴1 e 𝐵1, o valor p (dois lados) para uma diferença de zero foi calculado; um valor p abaixo de 0,05 é uma evidência estatisticamente significativa para uma diferença entre os grupos de tratamento.

[0460] Os resultados são mostrados na Figura 10A. Os volumes tumorais CT26 médios mais ou menos do erro padrão médio são plotados. Os resultados mostram que tratamento com o mAb2 OX40/CD137 tanto com quanto sem a mutação LALA (FS20m- 232-91AA/Lob12.3 e FS20m-232-91/Lob12.3, respectivamente) resultou em a redução em crescimento tumoral em comparação com o tratamento com o controle anti-OX40 (G1/OX86), o controle anti-CD137 (G1/Lob12.3), a combinação desses dois anticorpos (G1/OX86 + G1/Lob12.3), ou a combinação dos anticorpos anti-OX40 e anti-CD137 que contêm LALA (G1AA/OX86+ G1AA/Lob12.3).

[0461] Os resultados mostram que há um efeito antitumoral estatisticamente significativo do mAb2 OX40/CD137 (FS20m- 232-91AA/Lob12.3 e FS20-232-91/Lob12.3) em comparação com o anticorpo de controle (G1/4420). A atividade da combinação dos anticorpos OX40 e CD137 alvo (G1/OX86 mais G1/Lob12.3, ou G1AA/OX86 mais G1AA/Lob12.3) não suprimiu significativamente o crescimento tumoral e assim como os controles de agente único não suprimiram (G1/OX86 ou G1/Lob12.3).

[0462] Espera-se que a introdução da mutação LALA na região Fc da estrutura principal IgG1 humano de mAb2 OX40/CD137 impeça ADCC e ADCP de células que expressam OX40 ou CD137 e também a reticulação mediada por receptor Fcγ do mAb2 quando ligados a OX40 ou CD137 em células que expressam esses receptores. Dessa forma, acredita-se que a atividade do mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 seja acionada por meio do co- engate de OX40 e CD137 que resulta na sinalização por meio de um ou ambos os receptores, em vez de por meio de função efetora mediada por Fc ou reticulação mediada por receptor Fcγ. Subsequentemente, espera-se que isso resulte na ativação de células T que expressam OX40 e CD137, que resulta, por fim, em atividade antitumoral mediada por célula T.

[0463] Esses resultados demonstram que o anticorpo mAb2 OX40/CD137 tem eficácia antitumoral in vivo contra um tumor que é esperado que compreenda TILs que expressam OX40 e CD137, indicando que a ativação in vivo de OX40 e CD137 mediada pelo engate específico de OX40 e CD137 pelo mAb2 OX40/CD137 seja eficaz em controlar o crescimento tumoral.

[0464] Como descrito na seção de antecedentes acima, observou-se a toxicidade de fígado na clínica com um anticorpo agonista CD137 (Segal et al., 2017). O mecanismo para esse efeito tóxico não foi completamente determinado, mas estudos em modelos pré-clínicos destacaram o papel de células mieloides que expressam CD137 que produzem IL-27 em resposta a anticorpos agonistas CD137 (Bartkowiak et al., 2018). O papel de receptores Fcγ nesse mecanismo de toxicidade de fígado não foi estudo, mas uma possível explicação para a toxicidade observada é que a co-expressão de CD137 e receptores Fcγ nas células mieloides pode resultar em reticulação dos anticorpos agonistas de CD137 nessas células para acionar a produção de citocinas inflamatórias. Portanto, considerou-se desejável incluir a mutação LALA na molécula de anticorpo agonista duplo OX40/CD137 da invenção, no caso de reticulação de receptor Fcγ da molécula pode resultar em qualquer ativação de células que expressam CD137 na ausência de OX40 em locais distantes do microambiente tumoral ou da periferia. Desse modo, modificando-se geneticamente uma molécula de anticorpo agonista duplo que estimula células T que expressam tanto OX40 quanto CD137 engatando-se simultaneamente ambos os alvos, mas que não ativa células que expressam CD137 por meio de reticulação mediada por receptor Fcγ na ausência de OX40 devido à presença da mutação LALA na molécula, acredita-se provavelmente que a molécula de anticorpo da invenção tem um potencial reduzido para toxicidade na clínica.

[0465] Um motivo adicional para incluir a mutação LALA na molécula de anticorpo da invenção é que essa serva para evitar morte mediada por receptor Fcγ do células que expressam OX40 e CD137, em que a molécula é destinada para ativar a supressão de crescimento tumoral. O mecanismo de ação de anticorpos agonistas de OX40 em determinados modelos tumorais pré-clínicos foi descrito por ser por meio de depleção de Tregs mediadas por receptor Fcγ no microambiente tumoral, e a introdução de mutações que desativam a função de receptor Fcγ nessas moléculas prejudicou suas atividades antitumorais (Bulliard et al., 2014). Embora o efeito da mutação LALA possa ser a preservação de células imunológicas benéficas destinadas a serem ativadas pela molécula de anticorpo da invenção acompanhado por uma ausência de depleção de células Treg, observa-se que anticorpos IgG1 humano que alvejam OX40 projetados para elicitar o mesmo mecanismo de depleção de Treg tumoral, como observado em modelos tumorais pré-clínicos não mostraram a mesma habilidade para controlar o crescimento tumoral (Glisson et al., 2016). Outras moléculas projetadas para depletar Tregs também não mostraram altos níveis de atividade clínica (Powell et al., 2007; Tran et al., 2017). Essa ausência de capacidade de tradução clínica dos efeitos de depleção de Treg observada em modelos tumorais de camundongo singênicos pode ser devido a níveis inferiores de células que expressam receptor Fcγ no microambiente tumoral (Milas et al., 1987), a diferenças em biologia de Treg entre seres humanos e camundongos (Liu et al., 2016), ou a outros fatores desconhecidos (Stewart et al., 2014).

[0466] Surpreendentemente, a inclusão da mutação LALA no mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 não prejudicou sua atividade antitumoral no modelo CT26, indicando que esse tem um mecanismo de ação independente de receptor Fcγ que não depende da interação com células que expressam receptor Fcγ. A ausência de depleção observável de tumor Tregs e a indução de proliferação de célula T forte no sangue por esse mAb2 que contêm mutação LALA no estudo de “mecanismo de ação” descrito no Exemplo 19 fornece apoio adicional para um mecanismo de ação independente de receptor Fcγ do mAb2 agonista duplo OX40/CD137 como descrito no presente documento. Dada a atividade clínica insatisfatória observada com anticorpos que dependem da interação de receptor Fcγ para suas atividades, espera-se que o mecanismo de ação independente de receptor Fcγ da molécula de anticorpo da invenção resulte em maior eficácia na clínica.

17.2 Comparação de atividade antitumoral de mAb2 OX40/CD137 e seu Fcab componente e partes de Fab

[0467] No ensaio de ativação de célula pan-T de camundongo (Exemplo 15), o mAb2 OX40/CD137 de camundongo (FS20m-232- 91AA/Lob12.3) mostrou atividade in vitro na ausência de agentes de reticulação adicionais, em contraste com os anticorpos de controle monoespecíficos G1AA/Lob12.3 (mAb anti-mCD137) e FS20m-232-91AA/4420 (mAb2 simulado mOX40/FITC), engatando-se ambos os receptores CD137 e OX40 simultaneamente (Exemplo 16.2). Seguindo a partir do ensaio de ativação de célula pan-T, a atividade antitumoral de FS20m-232-91AA/Lob12.3 foi comparada àquela de suas partes componentes, isto é, ao Fcab FS20m-232-91AA formato de mAb2 simulado (anti-FITC) (FS20m-232-91AA/4420) e o mAb CD137 anti-camundongo monoespecífico sem o Fcab (G1AA/Lob12.3) como agentes únicos ou em combinação, ou de controle de isotipo (G1AA/4420) no modelo tumoral CT26.

[0468] Seguindo o mesmo método como descrito no Exemplo

17.1, os tumores CT26 foram estabelecidos subcutaneamente em camundongos fêmeas BALB/c. No dia 10 após a inoculação de célula CT26, os camundongos que portam tumor foram aleatorizados em coortes de estudo de 25 camundongos por grupo e receberam o anticorpo tratamento.

[0469] Os anticorpos foram diluídos a uma concentração final de 0,3 mg/ml em PBS, e um volume de 200 µl foi injetado intraperitonealmente em cada camundongo para gerar uma dose final de 3 mg/kg para um camundongo de 20 g (dose fixa de 60 µg de cada anticorpo). As injeções foram realizadas uma vez a cada dois dias (Q2D) por um total de três doses começando no dia 10 após a inoculação de tumor. Os volumes tumorais foram determinados por medições de compasso como descrito anteriormente. O estudo foi terminado a 64 dias após inoculação celular, em que os animais foram removidos do estudo quando os pontos finais humanos foram alcançados com base em volume tumoral e condição.

[0470] Os dados de volume tumoral ao longo do tempo para animais individuais são mostrados na Figura 10B, e os resultados médios mostrados na Figura 10C sugerem que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 inibiu a taxa de crescimento tumoral CT26 inicialmente (entre dias 10 e 22) em comparação com o anticorpo de controle de isotipo (G1AA/4420). Nenhuma inibição de crescimento tumoral aparente foi observada nos coortes tratados com o mAb CD137 anti-camundongo, mAb2 simulados OX40/FITC de camundongo ou combinação dos mesmos.

[0471] Seguindo o mesmo método de modelo misto anteriormente descrito, dados de análise de volume tumoral até o dia 22 (após a inoculação celular, Tabela 29) mostraram que FS20m-232-91AA/Lob12.3 resultou em redução estatisticamente significativa (p = 0,003) na taxa de crescimento tumoral média em comparação com controle de isotipo. Em comparação, o tratamento com o mAb CD137 anti- camundongo, mAb2 simulados OX40/FITC de camundongo ou combinação dos mesmos não resultou em taxas de crescimento tumoral significativamente diferentes em comparação com controle de isotipo. A comparação das taxas crescimento tumoral ao longo de toda duração do estudo (64 dias), com o uso do método de modelo misto, mostrou reduções estatisticamente significativas em taxas crescimento tumoral em todos os grupos de tratamento, em comparação com controle de isotipo (análise não mostrada).

[0472] Tabela 29: Comparação em pares de taxas de crescimento tumoral CT26 médias com o uso de análise de Modelo de Efeitos Mistos A vs. B comparação em Log Médio (TGR) Valor Sumário pares [Inferior, Superior P a 95 % de CI]

A B A B Controle FS20m-232- 0,310 0,291 > ns de 91AA/4420 [0,279, [0,244, 0,05 isotipo 0,340] 0,339] Controle G1AA/Lob12.3 0,310 0,281 > ns de [0,279, [0,235, 0,05 isotipo 0,340] 0,327]

A vs. B comparação em Log Médio (TGR) Valor Sumário pares [Inferior, Superior P a 95 % de CI]

A B A B Controle FS20m-232- 0,310 0,277 > ns de 91AA/4420 + [0,279, [0,237, 0,05 isotipo G1AA/Lob12.3 0,340] 0,316] Controle FS20m-232- 0,310 0,205 0,003 *** de 91AA/Lob12.3 [0,279, [0,164, isotipo 0,340] 0,247] ns = não estatisticamente significativo; TGR = taxa de crescimento tumoral; CI = intervalo de confiança

[0473] NOTA: Para comparar taxas de crescimento tumoral iniciais, os dados de volume tumoral para os primeiros 22 dias após a inoculação foram usados no Modelo de Efeitos Misto. Para cada comparação em pares, pelo menos um dentre os grupos envolvidos no cálculo de valores p contém mais que 50 % de taxas de crescimento tumoral distribuído não lognormalmente de modo significativo.

[0474] A análise de sobrevivência mostrou que FS20m-232- 91AA/Lob12.3 resultou em aprimoramento estatisticamente significativo em sobrevivência em comparação com controle de isotipo com o uso de teste de classificação de log (Mantel- Cox) (p ≤ 0,0001) (Figura 10D). Os camundongos que portam tumor que receberam o mAb CD137 anti-camundongo, mAb2 simulados OX40/FITC de camundongo ou combinação dos mesmos mostraram nenhuma diferença estatisticamente significativa em sobrevivência em comparação com controle de isotipo.

[0475] Por fim, os resultados demonstram que o mAb2 FS20m-

232-91AA/Lob12.3 teve atividade antitumoral maior e não equivalente à combinação de seu Fcab componente e partes de Fab, ou qualquer parte componente por si só. Exemplo 18 – Resposta farmacodinâmica de mAb2 OX40/CD137 em um modelo tumoral singênico CT26

18.1 Comparação de resposta farmacodinâmica de mAb2 OX40/CD137 e mAbs de controle de anti-OX40 e anti-CD137

[0476] A resposta farmacodinâmica do mAb2 substituto OX40/CD137 foi avaliada em camundongos que portam tumores singênicos CT26. Para esse fim, amostras sanguíneas foram tomadas de camundongos que portam CT26 inoculados com o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3, controle de isotipo (G1/4420), controle de OX40 anti-camundongo de agente único (G1/OX86), controle de CD137 anti-camundongo de agente único (G1/Lob12.3) ou uma combinação desses controles de anti-OX40 e anti-CD137 (G1/OX86 mais G1/Lob12.3) ao longo de um curso de tempo e analisadas por citometria de fluxo para ativação de célula T e marcadores de proliferação.

[0477] Seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo 17, os camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e com peso de aproximadamente 20 g cada um foram preparados para o início do estudo inoculados com a linhagem celular de carcinoma de cólon CT26 (ATCC, CRL-2638). No dia 10 após a inoculação de célula tumoral, tumores foram medidos e camundongos foram aleatorizados em coortes de estudo de 10 camundongos por grupo com base em volume tumoral. Quaisquer camundongos que não tiveram tumores nesse momento foram removidos do estudo.

[0478] Os anticorpos foram analisados e verificados quanto impurezas como anteriormente descrito, diluídos a uma concentração final de 0,1 mg/ml em PBS, e 200 µl/camundongo foram injetadas, gerando uma dose final de 1 mg/kg para um camundongo de 20 g. Os anticorpos foram administrados aos camundongos por injeção intraperitoneal (IP) nos dias 10, 12 e 14 após a inoculação de tumor.

[0479] O sangue foi coletado em tubos que contêm EDTA da veia de cauda 1 hora após a dosagem no dia 10, no dia 11 (24 horas após a primeira dose), no dia 15 (24 horas após a terceira dose), e por punção cardíaca no dia 17 e dia 24. As hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácia (eBioscience nº de catálogo 00- 4300-54) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colorizadas for citometria de fluxo com o uso de colorizador 1 (CD4-E450 (clone GK1.5), Ki67-FITC (clone SolA15), Foxp3-PE (clone FJK-16s), CD69-PECy5 (clone H1.2F3), CD3-PECy7 (clone 145-2C11), CD8-APC (clone 53-6.7), corante de viabilidade fixável 780, todos fornecidos por eBioscience; e CD45-V500 (clone 30-F11), fornecido por BD Bioscience) ou colorizador 2 (CD49b-E450 (clone DX5), F4/80- PE (clone 6F12), CD69-PECy5 (clone H1.2F3), CD19-PECy7 (clone 1D3), CD3-APC (clone 145-2C11), e corante de viabilidade fixável 780, todos fornecidos por eBioscience; CD45-V500 (clone 30-F11), fornecido por BD Bioscience; e anti-hFc-488 (policlonal), fornecido por Jackson ImmunoResearch) na presença de bloco Fc (eBioscience nº de catálogo 14-0161-86 a 1:100). As células foram, então, lavadas uma vez com PBS e as amostras colorizadas com colorizador 2 foram ressuspensas em 200 µl de PBS e executadas no FACS Canto II. Para amostras colorizadas com colorizador 1, as células foram inicialmente colorizadas com

100 µl de mistura de anticorpos 1 (todas, os anticorpos Ki67 e FoxP3) por 30 minutos a 4 °C. As células foram, então, fixadas e permeabilizadas com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience nº de catálogo 00-5523-00), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 200 µl de solução de fixação foram adicionados a cada poço e deixados durante a noite no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas em tampão de permeabilização de 200 µl. As células foram, então, novamente centrifugadas e ressuspensas em 100 µl de tampão de permeabilização com anticorpos Ki67 e Foxp3 na presença de bloco Fc (todos em diluição de 1:100) e incubadas por 30 minutos no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas uma vez com tampão de permeabilização e ressupensas em 200 µl de PBS. As células foram, então, analisadas em um citômetro BD FACS CantoII. Os dados foram analisados com FlowJoX, Excell e GraphPad Prism. A ativação e a proliferação de célula T observadas ao longo do tempo para células T totais, bem como subpopulações CD4+ e CD8+, foram determinadas.

[0480] Esse experimento mostrou que o mAb2 OX40/CD137 teve um efeito em células T circulantes, aumentando a frequência de células T ativadas (CD45+ CD3+ CD69+) e células T CD4+ (CD45+ CD3+ CD4+ CD69+) e células T proliferantes (CD45+ CD3+ Ki67+), células T CD4+ (CD45+ CD3+ CD4+ Ki67+) e células T CD8+ (CD45+ CD3+ CD8+ Ki67+) em comparação com todos os grupos tratados com controle, e também aumentando a frequência de células T CD8+ ativadas (CD45+ CD3+ CD8+ CD69+) em comparação com o tratamento com o controle anti-OX40 ou o controle anti-CD137 por si só, ou o controle de isotipo. Um aumento similar na frequência de células T CD8+ ativadas

(CD45+ CD3+ CD8+ CD69+) foi observada para o grupo de controle tratado com a combinação dos mAbs de controle de anti-OX40 e anti-CD137. Esses resultados estão de acordo com o os resultados in vitro observados em que o mAb2 OX40/CD137 também mostrou um aumento na ativação de células T como medido pela produção de IL-2, que também é mostrada como uma citocina envolvida na proliferação de células T.

18.2 Comparação de resposta farmacodinâmica de mAb2 OX40/CD137 e seus Fcab componente e partes de Fab

[0481] A resposta farmacodinâmica periférica do mAb2 OX40/CD137 de camundongo (FS20m-232-91AA/Lob12.3) foi comparada àquela de suas partes componentes, especialmente o Fcab FS20m-232-91AA em formato de mAb2 simulado (4420) (FS20m-232-91AA/4420) e o mAb CD137 anti-camundongo monoespecífico sem o Fcab (G1AA/Lob12.3) como agentes únicos ou em combinação, ou de controle de isotipo (G1AA/4420) no modelo tumoral CT26.

[0482] No mesmo estudo descrito no Exemplo 17.2, no dia 16 após a inoculação de célula CT26, amostras sanguíneas foram tomadas das veias de cauda de 10 camundongos por grupo e coletadas em tubos que contêm EDTA. Seguindo os mesmos métodos descritos no Exemplo 18.1, as hemácias foram lisadas, as células restantes foram, então, colorizadas com corante de viabilidade, seguido por colorização de superfície com os reagentes listados no Exemplo 22.2.2 (com a exceção que clone de CD4 anti-camundongo GK1.5 (BD Bioscience, nº de catálogo 563790) foi usado para esse estudo em vez de clone anti-CD4 RM4-5), exceto para anticorpos anti-Ki67 e anti- Foxp3, na presença de bloco Fc. As células foram, então, fixadas e permeabilizadas durante a noite com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram, então, intracelularmente colorizadas com anticorpos anti-Ki67 e anti-Foxp3. Após a lavagem, as células foram, então, analisadas com o uso de um citômetro de fluxo BD Fortessa. Os análise de dados foi realizado com o uso de software FlowJo, Excel e GraphPad Prism 7.

[0483] Observou-se que FS20m-232-91AA/Lob12.3 aumentou significativamente as proporções de células T efetoras CD4+ Ki67+ (como % de células Foxp3- CD4+ totais) e células T periféricas CD8+ Ki67+ (como % de células CD8+ totais) no sangue em comparação com controle de isotipo tratamento. O mAb CD137 anti-camundongo e mAb2 simulado FS20m-232- 91AA/4420, como agentes únicos ou em combinação, também tiveram a capacidade para induzir aumentos significativos em níveis de células T efetoras CD4+ Ki67+ e CD8+ Ki67+ proliferantes relativas a camundongos tratados com controle de isotipo. No entanto, aumentos em níveis de células T proliferantes CD8+ Ki67+ após a dosagem com FS20m-232- 91AA/Lob12.3 foram significativamente maiores aqueles observados para o mAb CD137 anti-camundongo por si só, o mAb2 simulado FS20m-232-91AA/4420 por si só ou outra combinação.

[0484] Por fim, essas constatações demonstram que o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 teve a capacidade para induzir uma resposta farmacodinâmica periférica melhorada, com relação aos aumentos na frequência de células T proliferantes CD8+ Ki67+, em comparação com a combinação de seus Fcab componente e partes de Fab, ou qualquer parte componente por si só. Exemplo 19 – Mecanismo de ação de mAb2 OX40/CD137 em um modelo tumoral singênico CT26

[0485] O modelo tumoral singênico CT26 foi usado para determinar o mecanismo de ação (MOA) da atividade antitumoral do mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo in vivo. O modelo tumoral singênico CT26 foi anteriormente mostrado como sensível a ambos os anticorpos agonistas OX40 e CD137 (Sadun et al., 2008), e espera-se que os linfócitos de infiltração de tumor (TILs) isolados dos tumores CT26 expressem tanto OX40 quanto CD137. Os anticorpos testados são detalhados na Tabela 30.

[0486] Tabela 30. Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação de Ligação Isotipo Mutação Cadeia Cadeia Fab a de Fcab LALA pesada leve a SEQ ID SEQ ID G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 G1/OX86 mOX40 nenhum hIgG1 Não 159 156 Universidade G1/Lob12.3 mCD137 nenhum hIgG1 Não de Southampton G1AA/OX86 mOX40 nenhum hIgG1 Sim 155 156 G1AA/Lob12.3 mCD137 nenhum hIgG1 Sim Criação FS20m-232- mCD137 mOX40 hIgG1 Não descrita 91/Lob12.3 acima no FS20m-232- Exemplo 9.2 mCD137 mOX40 hIgG1 Sim 91AA/Lob12.3

[0487] A habilidade do mAb2,com ou sem a mutação LALA (FS20m-232-91AA/Lob12.3 e FS20m-232-91/Lob12.3, respectivamente), para ativar e induzir a proliferação de células T no sangue e tumor foi comparada ao mAb de controle de isotipo G1/4420 (anti-FITC), mAb de agente único G1/OX86

(controle anti-OX40 sem a mutação LALA) ou G1/Lob12.3 (controle anti-CD137 sem a mutação LALA), uma combinação de G1/OX86 mais G1/Lob12.3, ou uma combinação de G1AA/OX86 (mAb anti-OX40 com a mutação LALA) mais G1AA/Lob12.3 (mAb anti- CD137 com a mutação LALA).

[0488] Os camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando aproximadamente 20 g, cada, foram deixados em repouso por uma semana antes do estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Cada coorte tinha 5 camundongos. A linhagem celular de carcinoma de cólon CT26 (ATCC, CRL-2638) foi inicialmente expandida, armazenada e, então, pré-triada por meio de IDEXX Bioresearch para patógenos que usam o protocolo IMPACT I e mostraram estar livres de patógeno. As células CT26 (aproximadamente 3-5x106) foram descongeladas do armazenamento a -150 °C e adicionadas a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) com 10 % de FCS (Gibco, 10270-106) em um frasco de cultura de tecido T175. Os camundongos foram anestesiados com o uso de isoflurano (Abbott Laboratories) e cada animal recebeu 1 X 106 células injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo. No dia 10 após a inoculação de célula tumoral, camundongos foram monitorados quanto a saúde, os tumores foram medidos com o uso de compassos e camundongos foram aleatorizados em coortes de estudo com base em volume tumoral. Quaisquer camundongos que não tiveram tumores nesse momento foram removidos do estudo.

[0489] Os anticorpos injetados foram analisados dentro de 24 horas de injeção por perfilagem de SEC-HPLC e verificados quanto impurezas. Os anticorpos foram diluídos a concentração final de 0,1 mg/ml em PBS e 200 µl/camundongo foram injetadas, gerando uma dose final de 1 mg/kg por um camundongo de 20 g. Os anticorpos foram administrados aos camundongos por injeção intraperitoneal (IP) nos dias 10, 12 e 14 após a inoculação de tumor. As medições de volume tumoral foram realizadas três vezes por semana com compassos para determinar o eixo geométrico mais longo e o eixo geométrico mais curto do tumor. Sete dias após a terceira dose (dia 21 após a inoculação de tumor) os camundongos foram eutanasiados, os tumores foram isolados por dissecação e o sangue foi coletado por punção cardíaca.

[0490] Os tumores foram dissociados com o uso do kit de dissociação de Tumor de camundongo (Miltenyi 130-096-730) de acordo com instruções do fabricante. Resumidamente, a mistura de enzimas foi preparada adicionando-se 2,35 ml de RPMI 1640, 100 µl de enzima D, 50 µl de enzima R e 12,5 µl de enzima A por tumores e cada tumor foi colocado em um tubo C Gentle MACS e tal tubo foi colocado no dissociador Gentle MACS e executado no programa m_TDK_1 e, então, incubado por 1 h a 37 °C com agitação (200 rpm). A suspensão celular resultante foi peneirada com o uso de uma peneira celular de 70 µM (Corning nº de catálogo 352350), centrifugada (10 minutos a 1500 rpm), lavada uma vez em PBS e ressupensa em 5 ml PBS.

[0491] O sangue foi coletado por punção cardíaca em tubos que contêm EDTA. As hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácia (eBioscience nº de catálogo 00-4300-54) de acordo com as instruções do fabricante.

[0492] As células isoladas dos tumores e do sangue foram colorizadas para citometria de fluxo com o uso dos seguintes reagentes e painel de anticorpo (Colorizador 1): CD4-E450 (clone GK1.1), Ki67-FITC (clone SolA15), Foxp3-PE (FJK-16s), CD69-PECy5 (clone H1.2F3), CD3-PECy7 (clone 145-2C11), CD8- APC (clone 53-6.7), corante de viabilidade fixável 780, e bloco Fc (clone 93), todos fornecidos por eBioscience; e CD45-V500 (clone 30-F11), fornecido por BD Bioscience. As células foram lavadas em PBS e, então, incubadas com 100 µl de mistura de anticorpos 1 (todos exceto os anticorpos Ki67 e FoxP3) por 30 minutos a 4 °C. As células foram, então, lavadas com PBS e, então, fixadas e permeabilizadas com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience nº de catálogo 00-5523-00), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 200 µl de solução de fixação foram adicionados a cada poço e deixados durante a noite no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas em tampão de permeabilização de 200 µl. As células foram, então, novamente centrifugadas e ressuspensas em 100 µl de tampão de permeabilização com anticorpos Ki67 e Foxp3 na presença de bloco Fc (todos em diluição de 1:100) e incubadas por 30 minutos no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas uma vez com tampão de permeabilização e ressupensas em 200 µl de PBS. As células foram, então, analisadas em um citômetro BD FACS CantoII.

[0493] Os dados foram analisados com FlowJoX, Excell e GraphPad Prism. A análise estatística para comparar grupos foi realizado com o uso de ANOVA de uma via seguido por teste de múltiplas comparações de Tukey de cada par com o uso do pacote de software GraphPad Prism.

[0494] A frequência de células T (CD45+CD3+), células T proliferantes (CD45+ CD3+ Ki67+) e células regulatórias T

(CD45+ CD3+ CD4+ FoxP3+) no sangue ou nos tumores de camundongos que foram inoculados com células CT26 após o tratamento com o mAb2 ou controles de OX40/CD137 foi determinada. mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 mostrou um aumento estatisticamente significativo em células T proliferantes bem como um aumento em Tregs no sangue em comparação com o controle de isotipo (G1/4420). No tumor houve uma tendência para o mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3 aumentar a frequência de células T.

[0495] Houve uma diminuição estatisticamente significativa nos níveis de Tregs no tumor em camundongos tratados com o anticorpo anti-CD137 G1/Lob12.3 e a combinação desse anticorpo anti-CD137 com o anticorpo anti-OX40 G1/OX86, em comparação com o tratamento com o controle de isotipo. No entanto, quando a mutação LALA foi introduzida nos anticorpos anti-OX40 e anti-CD137, o tratamento com a combinação desses anticorpos (G1AA/OX86 mais G1AA/Lob12.3) não reduziu mais os níveis de Tregs em tumores. Os mAb2 OX40/CD137 que contêm a mutação LALA (FS20m-232- 91AA/Lob12.3) não reduziram os níveis de Tregs, mas uma versão de IgG1 humano do tipo selvagem dos mAb2 OX40/CD137 sem a mutação LALA (FS20m-232-91/Lob12.3) mostrou uma diminuição estatisticamente significativa nos níveis de Tregs no tumor.

[0496] Esses dados demonstram que a introdução da mutação LALA no IgG1 humano anula a habilidade de um mAb2 OX40/CD137 para depletar Tregs e, portanto, que a atividade antitumoral observada com a variante de LALA IgG1 humano de mAb2 OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3) é independente de depleção de Treg. Adicionalmente, observou-se que o mAb2

FS20m-232-91AA/Lob12.3 induz a proliferação de célula T na periferia no ponto do tempo avaliado que se esperaria expandir o grupamento de células T que elicitam a resposta imunológica antitumoral. Esses dados sugerem que mAb2 OX40/CD137 que contêm LALA IgG1 humano têm o potencial para atividade antitumoral em cânceres na ausência de engate do mAb2 com receptores Fcγ, que pode ou pode não ser prevalente no tumor. Exemplo 20 – Atividade de mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral singênico B16-F10

[0497] O modelo tumoral singênico B16-F10 foi usado para testar a atividade antitumoral dos mAb2 OX40/CD137 anti- camundongo (FS20m-232-91AA/Lob12.3) in vivo. O anticorpo G1/4420 foi usado como um controle no estudo. O modelo tumoral singênico B16-F10 não foi mostrado anteriormente como sensível aos anticorpos agonistas OX40 CD137 (Hirschhorn-Cymerman et al., 2009; Wilcox et al., 2002). No entanto, espera-se que os linfócitos de infiltração de tumor (TILs) isolados de tumores B16-F10 expressem tanto OX40 quanto CD137.

[0498] Os camundongos fêmeas C57BL/6 (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando aproximadamente 20 g, cada, foram aclimatizados por uma semana antes do estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Cada coorte tinha 10 camundongos. A linhagem celular de carcinoma de cólon B16-F10 (ATCC nº de catálogo CRL-6475) foi inicialmente expandida, armazenada e, então, pré-triada por meio de IDEXX Bioresearch para patógenos que usam o protocolo IMPACT I e mostraram estar livres de patógeno.

[0499] As células B16-F10 foram descongeladas do armazenamento a -150 °C e adicionadas a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) com 10 % de FCS (Gibco, 10270-106) em um frasco de cultura de tecido T175. Cada animal recebeu 1x106 células injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo. 7-8 dias após inoculação de célula tumoral, os camundongos que não tiveram tumores nesse momento foram removidos do estudo. Os anticorpos foram analisados e verificados quanto impurezas como anteriormente descrito antes de serem injetados em uma concentração final de 0,1 mg/ml em PBS, em um volume de 200 µl/camundongo, para gerar uma dose final de 1 mg/kg para um camundongo de 20 g. Cada camundongo recebeu os anticorpos por injeção intraperitoneal (IP) nos dias 8, 10, e 12 após a inoculação de tumor. Os volumes tumorais foram determinados por medição com o uso de compassos (como descrito no Exemplo 17) e qualquer dosagem de fármaco devida no dia em questão foi realizada.

[0500] Os camundongos foram sacrificados quando os pontos finais humanos foram alcançados, com base em volume tumoral e condição. A análise estatística do crescimento tumoral foi realizada com o uso da análise estatística de modelo misturado descrito no Exemplo 17. Os resultados do estudo são mostradas na Figura 11.

[0501] O mAb2 OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3) mostrou atividade antitumoral significativa, em comparação com os animais de controle injetados com o anticorpo de controle (G1/4420). Isso é surpreendente visto que esse modelo foi mostrado anteriormente como insensível a estímulo de OX40 ou CD137 (Hirschhorn-Cymerman et al., 2009; Wilcox et al., 2002). De modo importante, a atividade foi observada para o mAb2 OX40/CD137 na presença da mutação LALA e, portanto, não foi dependente de depleção de Treg tumoral. Isso indica que o MOA do mAb2 OX40/CD137 resulta na atividade antitumoral em uma variedade de modelos tumorais singênicos, mesmo aqueles com níveis inferiores de infiltrado imunológico como B16- F10. Exemplo 21 – Caracterização analítica e avaliação de estabilidade preliminar de mAb2 OX40/CD137

21.1 Expressão, purificação e caracterização analítica de mAb2

[0502] Os mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30- 10-3, FS20-22-49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16 e FS20-22-49AA/FS30-35-14 foram produzidos em escala laboratorial, e caracterizados por métodos analíticos padrão com o uso de SE-HPLC e SDS-PAGE.

[0503] As sequências de DNA que codificam o mAb2 foram expressas de modo transiente em HEK293-6E (Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá). Após 5 dias, fluidos de cultura celular foram colhidos, e purificados em colunas pré- embaladas de Proteína A MabSelect com o uso de instrumento AKTAxpress (ambos da GE Healthcare). O equilíbrio das colunas foi realizado em 50 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, pH 7,0 seguido pelo carregamento com fluido de cultura celular colhido. A resina foi, então, submetida a uma lavagem com o uso de 50 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl a pH 7,0 e isso foi seguido por eluição dos mAb2 com o uso de tampão a pH de 3.5. Os mAb2 tiveram tampão trocado em um tampão de pré-formulação com o uso de colunas de dessalinização PD-10 (GE Healthcare, nº de produto 17085101).

[0504] SE-HPLC foi realizado em Sistema de HPLC Série 1100 Agilent (Agilent), ajustado com uma coluna TSK-GEL

SUPERSW3000 4,6 mm ID x 30,0 cm (Tosoh Bioscience) com o uso de 20 mM de fosfate de sódio, 200 mM de cloreto de sódio, pH 6,8 como uma fase móvel. A quantificação da porcentagem de monômero foi realizada com o uso de software Chemstation (Agilent). Os resultados da análise de SE-HPLC são sumarizados na Tabela 31.

[0505] Tabela 31. Caracterização analítica por SE-HPLC mAb2 % de monômero por SE-HPLC FS20-22-49AA/FS30-5-37 98,4 % FS20-22-49AA/FS30-10-3 97,4 % FS20-22-49AA/FS30-10-12 95,9 % FS20-22-49AA/FS30-10-16 97,5 % FS20-22-49AA/FS30-35-14 97,3 %

[0506] A análise de SDS-PAGE foi realizada com o uso de NuPAGE® Novex® 4-12 % de Géis de Proteína Bis-Tris e 1 x de tampão de separação MOPS (Thermo Fisher Scientific), essencialmente seguindo as instruções do fabricante. Para SDS-PAGE de não redução, as amostras foram expostas a reagente de alquilação, N-etilmaleimídeo (Sigma-Aldrich) antes de uma etapa de desnaturação, e 2-mercaptoetanol foi omitido da mistura de desnaturação. As bandas de proteína foram visualizadas por Coomassie InstantBlue (Expedeon).

[0507] Todos os cinco mAb2 mostraram parâmetros de caracterização analítica favoráveis após a purificação de proteína A com pureza de monômero maior que 95 % quando determinado por SE-HPLC. A análise de SDS-PAGE revelou padrões de banda de proteína típicos para IgG1 recombinante.

Desse modo, sob as condições não redutoras, uma banda simples migrou para a região que corresponde ao peso molecular esperado, e sob as condições redutoras, duas bandas migraram próximas dos marcadores de peso molecular de 51 kDa e 28 kDa, que corresponde às cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente. Nenhuma fragmentação foi observada (dados não mostrados).

21.2 Avaliação de estabilidade preliminar de mAb2 OX40/CD137

[0508] Uma avaliação preliminar da estabilidade de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-5-37, FS20-22-49AA/FS30-10-3, FS20-22- 49AA/FS30-10-12, FS20-22-49AA/FS30-10-16 e FS20-22- 49AA/FS30-35-14 foi realizada. Antes de entrar na avaliação de estabilidade preliminar, os mAb2 foram adicionalmente purificados por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) com o uso de uma coluna Superdex HiLoad 26/600 de 200 pg (GE Healthcare) equilibrada com um tampão de pré-formulação. As amostras de estabilidade foram armazenadas a 5 °C e analisadas após 2 e 4 semanas por métodos analíticos padrão com o uso de SE-HPLC e Sulfato Dodecil Sódico de Eletroforese Capilar (CE-SDS).

[0509] SE-HPLC foi realizado em Sistema de HPLC Série 1100 Agilent (Agilent), ajustado com uma coluna TSK-GEL SUPERSW3000 4,6 mm ID x 30,0 cm (Tosoh Bioscience) com o uso de 20 mM de fosfate de sódio, 200 mM de cloreto de sódio, pH 6,8 como uma fase móvel. A aquisição e quantificação de dados de teor de monômero foi realizada com o uso de software Chemstation (Agilent). Os resultados são sumarizados na Tabela 32.

[0510] Após oarmazenado a 5 °C por 4 semanas, o teor de monômero, como determinado por SE-HPLC, para todos os mAb2 testados permaneceucomparável (dentro de ± 0,9 %) ao material de partida (T=0). Portanto, todos os mAb2 testados exibiram um perfil de estabilidade favorável.

[0511] Tabela 32: Análise de estabilidade por SE-HPLC mAb2 % de % de monômero % de monômero monômero T= 2 semanas T= 4 semanas T=0 a 5 °C a 5 °C FS20-22-49AA/FS30- 100,0 99,2 99,1 5-37 FS20-22-49AA/FS30- 100,0 100,0 99,9 10-3 FS20-22-49AA/FS30- 100,0 100,0 100,0 10-12 FS20-22-49AA/FS30- 100,0 100,0 100,0 10-16 FS20-22-49AA/FS30- 99,5 99,2 99,3 35-14

[0512] A análise de CE-SDS foi realizada em um Sistema de Eletroforese Capilar de Bioanalisador 2100 (Agilent, GB), seguindo as recomendações do fabricante. Para reduzir CE- SDS, DTT foi adicionado e as amostras foram desnaturadas a 70 °C por 5 minutos. A aquisição de dados e a quantificação de porcentagem de material de cadeia pesada e cadeia leve foi realizada com o uso de software 2100 Expert (Agilent). A porcentagem de pureza foi calculada como a soma da porcentagem de material de cadeia pesada e a porcentagem de material de cadeia leve. Os resultados da análise são sumarizados na Tabela 33.

[0513] A pureza de todos os mAb2 testados, determinado como a soma da porcentagem de material de cadeia pesada e material de cadeia leve por CE-SDS sob condições redutoras, também permaneceu comparável (em ± 1,0 %) ao material de partida. Portanto, novamente, todos os mAb2 testados mostraram estabilidade favorável.

[0514] Tabela 33. Análise de estabilidade por CE-SDS mAb2 % de pureza % de pureza % de pureza T=0 T= 2 T= 4 semanas semanas a a 5 °C 5 °C FS20-22-49AA/FS30- 99,6 99,7 99,1 5-37 FS20-22-49AA/FS30- 99,5 99,6 99,5 10-3 FS20-22-49AA/FS30- 98,8 99,2 99,5 10-12 FS20-22-49AA/FS30- 99,5 99,1 98,5 10-16 FS20-22-49AA/FS30- 99,6 99,0 100,0 35-14 Exemplo 22 - Atividade de mAb2 OX40/CD137 em combinação com um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1

[0515] A expressão de PD-L1 em células que apresentam antígeno (por exemplo, células dendríticas, macrófagos, células B), células tumorais, e em células no microambiente tumoral é conhecida por inibir a ativação, proliferação e funções efetoras e citotóxicas de células T através da interação de PD-1. Mostrou-se que bloquear essa interação com o uso de anticorpos monoclonais contra PD-1 ou PD-L1 resulta em taxas de sobrevivência aumentada em pacientes com diversos tipos de câncer.

[0516] No entanto, em alguns tumores, anticorpos anti-PD- L1 e anti-PD-1 têm pouco ou nenhum efeito. Os presentes inventores testaram a combinação de um mAb2 OX40/CD137 com um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-1 em estudos in vitro e in vivo para entender a possibilidade do uso da combinação resultar em um efeito aprimorado em comparação com o uso do mAb2 OX40/CD137, anticorpo anti-PD-L1 ou anticorpo anti-PD- 1 por si só.

22.1 Atividade de mAb2 OX40/CD137 em combinação com bloqueio de PD-1 ou PD-L1 em um ensaio de enterotoxina A estafilocócica (SEA)

[0517] A atividade do mAb2 OX40/CD137 foi testada em um ensaio de ativação de célula T com o uso de super antígeno de enterotoxina A estafilocócica (SEA) como o primeiro sinal como descrito no Exemplo 12 acima. Para testar o efeito do mAb2 OX40/CD137 em estímulo de atividade de célula T em combinação com bloqueio da interação entre PD-1 e PD-L1, anticorpos de bloqueio de PD-1 ou PD-L1 foram combinados com o mAb2 OX40/CD137 no ensaio SEA.

[0518] Os anticorpos e mAb2 usados no ensaio SEA são listados na Tabela 34 abaixo. G1/4420 (anti-FITC) em combinação com mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16, G1AA/S1 (anti- PD-L1), G1AA/5C4 (anti-PD-1) em separado ou em combinação com mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foram testados. A produção de interleucina-2 (IL-2) foi usada como uma medida de ativação de célula T.

[0519] Tabela 34: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados mAb/mAb2 Ligação Ligação Isotipo Mutação Cadeia Cadeia de Fab de Fcab LALA pesada leve SEQ a a SEQ ID ID NO

NO G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 FS20-22- 49AA/FS30- hCD137 hOX40 hIgG1 Sim 95 14 10-16 G1AA/S1 PD-L1 nenhum hIgG1 Sim 162 163 G1AA/5C4 PD-1 nenhum hIgG1 Sim 160 161

[0520] As sequências de domínio variável dos anticorpos 5C4 e YW243.55.S1 (S1) também são revelados nos documentos nº US 8.008.449 B2 e US 2013/0045202 A1, respectivamente.

[0521] PBMCs foram isoladas e o ensaio SEA foi realizado essencialmente como descrito no Exemplo 12.1 acima. G1/4420 foi usado como um controle de isotipo e nenhum agente de reticulação foi usado nos ensaios.

[0522] A atividade do mAb2 OX40/CD137 (FS20-22-49AA/FS30- 10-16) em combinação com um anticorpo anti-PD-L1 (G1AA/S1) ou anti-PD-1 (G1AA/5C4) foi comparada à atividade de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 mais controle de isotipo (G1/4420) ou à atividade do anticorpo PD-L1 (G1AA/S1), ou anticorpo PD-1 (G1AA/5C4), ou controle de isotipo (G1/4420) por si só. Os valores de EC50 e a resposta máxima da liberação de IL-2 observados no ensaio SEA são mostrados na Tabela 35. As Figuras 12A e B mostram plotagens de liberação de IL-2 para o ensaio SEA.

[0523] Tabela 35: Ensaio SEA com mAb2 que alveja OX40 e CD137 em combinação com anticorpos que bloqueiam a interação entre PD-1 ou PD-L1 mAbs/mAb2 EC50 (nM) Resposta Máxima (nM) 95 % de Conf. (hIL- 95 % de Int. 2 Conf. pg/ml Int. ) G1/4420 NAD NAD NAD NAD FS20-22-49AA/FS30- 0,04556 a 2394 a 0,1483 2741 10-16 + G1/4420 0,4517 3103 G1AA/5C4 NAD NAD NAD NAD G1AA/S1 NAD NAD NAD NAD FS20-22-49AA/FS30- 4599 a 0,5939 0,1964 a 1,732 5326 10-16 + G1AA/5C4 6116 FS20-22-49AA/FS30- 0,1478 a 5022 a 0,2399 5325 10-16 + G1AA/S1 0,3970 5640 NAD = nenhuma atividade detectada

[0524] Como esperado, nenhuma atividade foi observada com o controle de isotipo (G1/4420). De modo semelhante, bloquear a interação entre PD-1 e PD-L1 por si só não teve atividade nesse ensaio. No entanto, combinar estímulo de receptores OX40 e CD137 (pelo mAb2 OX40/CD137) com bloqueio da interação entre PD-1 e PD-L1 (por um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-

1) resultou em um aumento na atividade máxima de células T, como medido por produção máxima de IL-2, acima daquela observada com o mAb2 OX40/CD137 por si só. O aumento na atividade máxima de células T observado quando o mAb2 OX40/CD137 foi combinado com um anticorpo anti-PD-L1 ou anti- PD-1 foi similar.

22.2 Atividade antitumoral e resposta farmacodinâmica de administração de um mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo e um antagonista PD-1 em um modelo tumoral de camundongo CT26

[0525] O modelo tumoral de camundongo CT26 foi usado para estabelecer a atividade antitumoral e a resposta farmacodinâmica da combinação de FS20m-232-91AA/Lob12.3 e um anticorpo antagonista PD-1 (clone IgG1 de camundongo RMP1- 14) em comparação com qualquer agente único.

22.2.1 Avaliação de atividade antitumoral

[0526] Seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo 17, os camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando aproximadamente 20 g foram preparados para o início do estudo e inoculados com a linhagem celular de carcinoma de cólon CT26. 10 dias após a inoculação de célula tumoral, os tumores foram medidos, quaisquer camundongos que não tiveram tumores foram removidos do estudo e os camundongos restantes foram aleatorizados em 4 grupos de tratamento (Tabela 36) com 15 animais por grupo. Os animais foram injetados intraperitonealmente com: (1) uma combinação de 1 mg/kg de G1AA/4420 e 10 mg/kg de isotipo mIgG1/4420 (Absolute Antibodies, Clone 4420, Número de catálogo Ab00102-1.1) anticorpos de controle, (2) 10 mg/kg de um anticorpo PD-1 anti-camundongo (Absolute Antibodies, clone IgG1 de camundongo RMP1-14, Número de catálogo Ab00813-1.1), (3) 1 mg/kg de mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3, ou (4) 10 mg/kg de anticorpo PD-1 anti-camundongo e 1 mg/kg de mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3 em PBS. Os animais receberam injeções intraperitoneais (IP) de G1AA/4420 ou FS20m-232-91AA/Lob12.3 uma vez a cada 2 dias por um total de 3 doses começando no dia 10 após a inoculação de tumor. mIgG1/4420 ou anticorpo PD-1 anti-camundongo foram dosados IP uma vez a cada 4 dias por um total de 4 doses começando no dia 10 após a inoculação de tumor. Os volumes tumorais foram determinados por medições de compasso (como descrito no Exemplo 17). O estudo foi terminado 60 dias após inoculação de célula tumoral, animais foram removidos do estudo quando os pontos finais humanos foram alcançados com base em volume tumoral e condição. Os grupos de tratamento, moléculas testadas, doses e cronograma de dosagem são sumarizados na Tabela 36.

[0527] Tabela 36. Resumo de grupos de tratamento e moléculas testadas Grupo Nome do mAb e/ou mAb2 Dose Cronograma grupo administrados (mg/kg) de Dosagem Controles de G1AA/4420, 1 1, 10 Q2D, Q4D isotipo mIgG1/4420 Anti-camundongo PD-1 2 Anti-PD-1 10 Q4D mIgG1 (RMP1-14) FS20m-232- FS20m-232- 3 1 Q2D 91AA/Lob12.3 91AA/Lob12.3 FS20m-232- FS20m-232- Q2D, 4 1, 10 91AA/Lob12.3 91AA/Lob12.3, Q4D

Grupo Nome do mAb e/ou mAb2 Dose Cronograma grupo administrados (mg/kg) de Dosagem + anti-PD-1 Anti-camundongo PD-1 mIgG1

[0528] Como mostrado na Figura 13A-D, a combinação de um anticorpo antagonista anti-PD-1 e 1 mg/kg de FS20m-232- 91AA/Lob12.3 resultou na maior proporção de animais, 7 dentre 15 (47 %), com resposta de regressão tumoral completa (definida como um volume tumoral de ≤ 62,5 mm3) no término do estudo (Figura 13D). Os anticorpos de controle de isotipo (Figura 13A), anticorpo anti-PD-1 de agente único (Figura 13B), e 1 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 (Figura 13C) mostraram 0 %, 0 % e 7 % de regressão tumoral no fim do estudo, respectivamente.

[0529] A análise de sobrevivência mostrou que a combinação de FS20m-232-91AA/Lob12.3 com um anticorpo anti- PD-1 resultou em um benefício de sobrevivência estatisticamente significativo em comparação com anticorpos de controle de isotipo (teste de classificação de log (Mantel Cox), p < 0,0001) (Figura 13E). Nenhuma diferença de sobrevivência significativa foi observada entre qualquer um dos tratamentos de agente único em comparação com anticorpos de controle de isotipo. Esses resultados demonstram que nesse modelo, o bloqueio da trajetória inibitória de PD-1/PD-L1 com um antagonista e agonismo duplo de OX40 e CD137 com um mAb2 anti-OX40/CD137 teve a capacidade para aumentar a atividade antitumoral e fornecer um benefício de sobrevivência em comparação com agentes únicos.

22.2.2 Avaliação de resposta farmacodinâmica periférica

[0530] No estudo descrito no Exemplo 22.2.1, a habilidade de um anti-antagonista PD-1 para modular a resposta farmacodinâmica para FS20m-232-91AA/Lob12.3 também foi examinado e comparado a tratamento com agente único. 6 dias após a iniciação de dosagem (16 dias após a inoculação de célula tumoral), o sangue foi coletado em tubos que contêm EDTA das veias de cauda de 6 camundongos aleatoriamente selecionados que portam tumor CT26 dos grupos de tratamento 1, 2, 3 e 5 (Tabela 36). As hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácias (Miltenyi Biotech, nº 130-094-183) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colorizadas para análise citométrica de fluxo com reagentes CD4-BUV395 (clone RM4-5), CD8-BUV737 (clone 53-6.7), CD44-BV510 (clone IM7), e CD3e-BV786 (clone 145-2C11), todos fornecidos por BD Bioscience; CD69-FITC (clone H1.2F3), NKp46-PE (clone 29A1.4), PD-1-APC (clone J43), CD45-Alexa700 (clone 30-F11), e corante de viabilidade fixável 780, todos fornecidos por eBioscience; e CD62L-BV421 (clone MEL-14), fornecido por Biolegend, na presença de bloco Fc (eBioscience, nº de catálogo 14-0161-86 a 1:50) por 30 minutos a 4 °C. As células foram, então, fixadas e permeabilizadas durante a noite com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience nº de catálogo 00-5523-00), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram ressuspensas em 100 µl de tampão de permeabilização com anticorpos Ki67 e Foxp3 (Ki67-PE-Cy7 (clone SolA15) e Foxp3-PerCP-Cy5.5 (clone FJK-16s), ambas fornecidas por eBioscience) e incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. As células foram, então,

lavadas duas vezes com tampão de permeabilização e ressuspensas em PBS + 0,5 % de BSA. As células foram, então, analisadas em um citômetro de fluxo BD Fortessa. A análise de dados foi realizada em software FlowJo, Excel e GraphPad Prism 7.

[0531] As frequências de células T CD4+ Ki67+ proliferantes (de total CD45+ CD3+ CD4+), células T CD8+ Ki67+ (de CD45+ CD3+ CD8+ totais) e células NK NKp46+ Ki67+ (de CD45+ CD3- NKp46+ totais) foram determinadas por análise de citometria de fluxo, como descrito acima. Em comparação com os controles de isotipo, FS20m-232-91AA/Lob12.3 induziu aumentos estatisticamente significativos em células CD4+ Ki67+ e T CD8+ Ki67+ proliferantes, que confirma os resultados anteriores (Exemplo 18), e células NK Ki67+ proliferantes (teste não paramétrico Mann-Whitney de comparação em pares; p ≤ 0,005 para todas as três populações de células imunológicas). O anticorpo antagonista anti-PD-1 de agente único não teve efeito notável nas três populações de células imunológicas em comparação com os controles de isotipo. A combinação de 1 mg/kg FS20m-232-91AA/Lob12.3 e anticorpo anti-PD-1 resultou em níveis estatisticamente superiores significativos de células T CD4+ Ki67+ proliferantes, células T CD8+ Ki67+ e células NK NKp46+ Ki67+ em comparação com agente único ou controles de isotipo (p ≤ 0,005 para todas as comparações estatisticamente significativas, exceto para o efeito da combinação em níveis de células T CD4+ Ki67+ proliferantes em comparação com FS20m-232-91AA/Lob12.3 por si só, para o qual p ≤ 0,05).

[0532] Os efeitos de anticorpo anti-PD-1 de agente único, mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3, e a combinação do anticorpo anti-PD-1 e FS20m-232-91AA/Lob12.3 no células T que expressam PD-1 do sangue periférico (células T CD4+ e CD8+) e as células NK também foram determinadas por análise de citometria de fluxo, como descrito acima. O anticorpo anti- PD-1 de agente único e FS20m-232-91AA/Lob12.3 aumentaram a proporção de células T CD4+ e CD8+ que expressam PD-1 em comparação com controle de isotipo, com frequência média superior de células PD-1+ após o tratamento com FS20m-232- 91AA/Lob12.3 em comparação com anti-PD-1 por si só. FS20m- 232-91AA/Lob12.3 por si só aumentou a frequência de células NK PD-1+ em comparação com controles de isotipo. A combinação resultou em níveis estatisticamente superiores significativos de células T CD4+ e CD8+ que expressam PD-1 (mas não células NK) em comparação com agente único ou controles de isotipo (teste não paramétrico Mann-Whitney de comparação em pares; p ≤ 0,005 para todas as comparações estatisticamente significativas, exceto para o efeito da combinação na frequência de células T CD4+ que expressam PD- 1 em comparação com FS20m-232-91AA/Lob12.3 por si só, para o qual p ≤ 0,05).

[0533] Consistente com as constatações da avaliação de atividade antitumoral, o bloqueio simultâneo da trajetória inibitória PD-1/PD-L1 com um antagonista e agonismo duplo de OX40 e CD137 com um mAb2 anti-OX40/CD137 resultou em modulação farmacodinâmica melhorada de células T e células NK proliferantes que suportam usar a abordagem de combinação para acionar a imunidade antitumoral.

[0534] Por fim, bloquear o eixo geométrico de PD-1/PD-L1 enquanto também torna OX40 e CD137 em agonista resulta em um efeito aumentado através do PD-1/PD-L1 de bloqueio por si só. Em particular, a combinação de um anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1 com um mAb2 anti-OX40/CD137 resultou em um efeito aprimorado através do uso da resposta de um dos anticorpos por si só. No ensaio SEA descrito no Exemplo 22.1, nenhum dos anticorpos anti-PD-1 ou PD-L1 testados tiveram qualquer atividade, em comparação com o mAb2 anti-OX40/CD137 que teve um EC50 de 0,1474 nM. No entanto, quando o mAb2 anti- OX40/CD137 foi testado em combinação com um anticorpo anti PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1, os valores de EC50 foram de 0,2373 nM e 0,5961 nM respectivamente. Adicionalmente, a resposta máxima de IL-2 produzida por qualquer combinação foi mais que o dobro daquela do mAb2 anti-OX40/CD137 por si só. Esses dados in vitro demonstram que em um sistema em que nenhuma atividade é observada com um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-1, a combinação desses anticorpos com um mAb2 anti- OX40/CD137 resulta em um aprimoramento significativo na atividade.

[0535] Essa atividade in vitro foi adicionalmente sustentada por teste in vivo de um mAb2 OX40/CD137 anti- camundongo, em separado ou em combinação com um anticorpo anti-PD-1, em um modelo tumoral CT26, como descrito no Exemplo 22.2. Os resultados para esse estudo mostraram que um grande número de animais foram livres de tumor no fim do estudo do grupo tratado com a combinação do anticorpo anti- PD-1 com um mAb2 OX40/CD137, em comparação com o mAb2 OX40/CD137 ou ao anticorpo anti-PD-1 por si só (em que nenhum animal estava livre de tumor). Ademais, os benefícios de sobrevivência estatisticamente significativos também foram observados (Figura 13E) e a modulação farmacodinâmica de células T e células NK proliferantes foi melhorada por tratamento com a combinação em comparação com o mAb2 ou ao anticorpo anti-PD-1 por si só.

[0536] Visto que nenhuma atividade foi observada nos estudos in vitro ou in vivo para os anticorpos anti-PD-1 ou anti-PD-L1, mas aprimoramentos significativos foram observados quando dosados com mAb2 OX40/CD137, isso pode indicar que um mAb2 OX40/CD137 em combinação com tal anticorpo resultará em eficácia antitumoral melhorada, bem como que tal combinação pode ser adequada para o tratamento de tumores que não são responsivos, por exemplo, são refratários ou resistentes ou têm recorrência após monoterapia com anticorpo anti-PD-1 ou anti-PD-L1. Exemplo 23 - Atividade antitumoral dependente de dose de mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral singênico CT26 e estabelecimento de memória imunológica protetora contra novo desafio com células tumorais CT26

[0537] Para avaliar a relação entre dose e atividade antitumoral do mAb2 substituto OX40/CD137 no modelo tumoral colorretal de camundongo singênico CT26, cinco níveis diferentes de dose de 0,1 a 10 mg/kg foram avaliados.

[0538] Seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo 17, camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8- 10 semanas de vida e pesando aproximadamente 20 g cada um foram injetados subcutaneamente com células de carcinoma de cólon CT26 no flanco esquerdo de cada animal. 10 dias após a inoculação de célula tumoral, os tumores foram medidos e os animais sem um tumor estabelecido foram removidos do estudo. Os camundongos restantes foram aleatorizados em seis grupos de tratamento com 25 animais por grupo.

[0539] O anticorpo de controle de isotipo (G1AA/4420) e mAb2 substituto OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3) foram filtrados e diluídos em PBS antes da injeção. Cada animal foi intraperitonealmente administrado com 200 µl de volume de anticorpo diluído por administração, gerando uma dose final de 10 mg/kg de G1AA/4420 ou 0,1, 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 por administração para um camundongo de 20 g. As injeções foram realizadas uma vez a cada dois dias (Q2D) por um total de três doses começando no dia 10 após a inoculação de tumor. Os volumes tumorais foram determinados por medições de compasso, como descrito no Exemplo 17. O estudo foi terminado 67 dias após a inoculação de célula tumoral, em que os animais foram retirados do estudo quando pontos finais humanos foram alcançados com base em volume tumoral e condição.

[0540] Os volumes tumorais ao longo do tempo para animais individuais tratados com G1AA/4420 ou FS20m-232-91AA/Lob12.3 em níveis diferentes de dose são mostradas na Figura 14A. Os níveis de dose de 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg de FS20m-232- 91AA/Lob12.3 resultaram em regressão tumoral completa (definida como ≤ 62,5 mm3 no dia 60) em 4 % (1/25), 4 % (1/25), 8 % (2/25) e 4 % (1/25) de animais por grupo, respectivamente. Nenhum dos animais no controle de isotipo e 0,1 mg/kg de grupos de mAb2 substituto experimentaram regressão tumoral completa.

[0541] As comparações em pares de taxas de crescimento tumoral médias entre grupos tratados com FS20m-232- 91AA/Lob12.3 e G1AA/4420 foram realizadas com o uso de análise estatística de modelo misturado como descrito in Exemplo 17, e as diferenças estatisticamente significativas (p < 0,01) foram observadas ao longo de todos os níveis de dose testados (0,1, 0,3, 1, 3 e 10 mg/kg) quando comparados ao controle de isotipo (Tabela 37). FS20m-232-91AA/Lob12.3 diminuiu a taxa de crescimento tumoral média (TGR) de maneira dependente de dose quando dosado a 0,1 a 3 mg/kg (Log médio (TGR) de 0,255529 a 0,156767, respectivamente). TGR média para 3 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 não foi significativamente diferente daquela para 1 mg/kg de nível de dose (p = 0,18). No entanto, aumentar o nível de dose para 10 mg/kg resultou em uma TGR mais rápida em comparação com o grupo de dose de 3 mg/kg (p < 0,001).

[0542] Tabela 37: Comparação em pares de taxas de crescimento tumoral de CT26 médias com o uso de análise estatística de modelo misturado A vs. B comparação em Log Médio (TGR) Valor Sumár A > ou ≈ pares [Inferior, P io ou < B Superior de CI] (Log Médio(TGR

A B A B )) 0,314856 0,255529 FS20m-232- [0,28820 [0,22735 Controle 91AA/Lob12 3.63E 7, 6, **** A > B de isotipo .3 de -04 0,339504 0,283703 0,1 mg/kg ] ] 0,313856 0,252407 FS20m-232- [0,28820 [0,21553 Controle 91AA/Lob12 2.24E 7, 4, **** A > B de isotipo .3 de -07 0,339504 0,289281 0,3 mg/kg ] ]

A vs. B comparação em Log Médio (TGR) Valor Sumár A > ou ≈ pares [Inferior, P io ou < B Superior de CI] (Log Médio(TGR

A B A B )) 0,313856 0,219461 FS20m-232- [0,28820 [0,18650 Controle 91AA/Lob12 1.94E 7, 3, **** A > B de isotipo .3 de -07 0,339504 0,252419 1 mg/kg ] ] 0,313856 0,156767 FS20m-232- [0,28820 [0,12041 Controle 91AA/Lob12 2.23E 7, 8, **** A > B de isotipo .3 de -14 0,339504 0,193116 3 mg/kg ] ] 0,313856 0,197003 FS20m-232- [0,28820 [0,15589 Controle 91AA/Lob12 7.50E 7, 8, **** A > B de isotipo .3 de -21 0,339504 0,238107 10 mg/kg ]] ] 0,219461 0,156767 FS20m-232- FS20m-232- [0,18650 [0,12041 91AA/Lob12 91AA/Lob12 1.83E 3, 8, ns A ≈ B .3 de .3 de -01 0,252419 0,193116 1 mg/kg 3 mg/kg ] ] 0,156767 0,197003 FS20m-232- FS20m-232- [0,12041 [0,15589 91AA/Lob12 91AA/Lob12 4.72E 8, 8, **** A < B .3 de .3 de -07 0,193116 0,238107 3 mg/kg 10 mg/kg ] ] Abreviações: ns = não estatisticamente significativo; TGR = taxa de crescimento tumoral

[0543] Nota: Para cada comparação em pares, pelo menos um dentre os grupos envolvidos no cálculo de valores p contém mais que 50 % de taxas de crescimento tumoral distribuído não lognormalmente de modo significativo

[0544] A análise de sobrevivência mostrou que FS20m-232- 91AA/Lob12.3 em todos os níveis de dose testados resultaram em benefício de sobrevivência estatisticamente significativo em comparação com controle de isotipo com o uso de teste de classificação de log (Mantel-Cox) (Figura 14B). A comparação de grupos de 1 mg/kg e 3 mg/kg não mostrou diferença estatística em sobrevivência.

[0545] Por fim, os dados de volume tumoral e sobrevivência mostrados nas Figuras 14A e B e Tabela 37 apóiam a constatação do Exemplo 17 de que o mAb2 substituto OX40/CD137 pode elicitar atividade antitumoral in vivo no modelo tumoral de camundongo CT26. Adicionalmente, a atividade antitumoral observada aumentou com dependência de dose de 0,1 mg/kg a 1 mg/kg e foi mantida nos níveis superiores de dose testados (3 mg/kg e 10 mg/kg).

[0546] Para testar a possibilidade de o mAb2 substituto OX40/CD137 poder induzir memória imunológica protetora contra células tumorais CT26, os animais que experienciaram regressão tumoral completa (com resposta completa) do estudo em uma faixa de dose do presente exemplo descrito acima foram reinoculados subcutaneamente com 1 x 105 células CT26 no dia 84 após a primeira inoculação celular. Os camundongos que não portam tumor BALB/c de tratamento naïve também foram inoculados com células CT26 como um grupo de controle. Os volumes tumorais foram monitorados como descrito acima. O estudo foi terminado no dia 137 após a primeira inoculação celular, com animais retirados do estudo quando pontos finais humanos foram alcançados com base em volume tumoral e condição. No fim do estudo, 0 % (0/4) dos camundongos no grupo de controle sobreviveram, enquanto, por outro lado, 100 % (4/4) de animais de resposta completa sobreviveram. Esses resultados mostram que em um subconjunto de camundongos, o mAb2 substituto OX40/CD137 pode induzir a regressão tumoral completa e o estabelecimento de memória imunológica protetora contra novo desafio com células CT26. Exemplo 24 - Resposta farmacodinâmica dependente de dose de mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral de camundongo CT26

[0547] A relação entre níveis de dose, a frequência de dosagem e a resposta farmacodinâmica periférica do mAb2 substituto OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3) foram avaliadas com o uso do modelo tumoral colorretal de camundongo singênico CT26. As injeções intraperitoneais (i.p.) simples de FS20m-232-91AA/Lob12.3 em níveis de dose diferentes de 1, 3, 10 ou 30 mg/kg, ou três injeções i.p. de FS20m-232-91AA/Lob12.3 a 1 mg/kg determinado uma vez a cada 2 dias (Q2D), foram comparadas. A resposta farmacodinâmica de FS20m-232-91AA/Lob12.3, especialmente o efeito do mAb2 substituto em células T circulantes, foi avaliada por análise de citometria de fluxo de célula imunológica subconjuntos no sangue como descrito no Exemplo 18.

[0548] Seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo 17, camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8- 10 semanas de vida e pesando aproximadamente 20 g cada um foram injetados subcutaneamente com células de carcinoma de cólon CT26 no flanco esquerdo de cada animal. 10 dias após a inoculação de célula tumoral, os tumores foram medidos e os animais sem um tumor estabelecido foram removidos do estudo. Os camundongos restantes foram aleatorizados em seis grupos de tratamento com seis animais por grupo.

[0549] O anticorpo de controle de isotipo(G1AA/4420) e FS20m-232-91AA/Lob12.3 foram filtrados e diluídos em PBS antes da injeção. Cada animal foi intraperitonealmente administrado com 200 µl de volume de anticorpo diluído por administração, gerando uma dose final de 30 mg/kg de G1AA/4420 ou 1, 3, 10 ou 30 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 por administração para um camundongo de 20 g. Os animais receberam uma injeção i.p. Única de G1AA/4420 (a 30 mg/kg) ou FS20m-232-91AA/Lob12.3 (a 1, 3, 10 ou 30 mg/kg) ou um total de 3 doses de FS20m-232-91AA/Lob12.3 (a 1 mg/kg por dose) dadas uma vez a cada dois dias (Q2D) começando no dia 10 após a inoculação de tumor. Os volumes tumorais foram determinados por medições de compasso, como descrito no Exemplo 17. Os animais foram removidos do estudo após seis dias do início de dosagem (16 dias após a inoculação celular).

[0550] O sangue foi coletado em tubos que contêm EDTA por punção cardíaca. As hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácias (Miltenyi Biotech, nº 130-094-183) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colorizadas para análise citométrica de fluxo com os reagentes CD4-BUV395 (clone RM4- 5), CD8-BUV737 (clone 53-6.7), CD44-BV510 (clone IM7), e CD3e-BV786 (clone 145-2C11), todos fornecidos por BD

Bioscience); CD69-FITC (clone H1.2F3), NKp46-PE (clone 29A1.4), CD45-Alexa700, e corante de viabilidade fixável 780, todos fornecidos por eBioscience; e CD62L-BV421 (clone MEL-14), fornecido por Biolegend, na presença de bloco Fc (eBioscience, nº de catálogo 14-0161-86). As células foram, então, fixadas e permeabilizadas durante a noite com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience, nº de catálogo 00-5523-00) de acordo com instruções do fabricante. As células foram ressuspensas em tampão de permeabilização de 100 µl com anti-Gzmb, anticorpos anti-Ki67 e anti-Foxp3 (Gzmb-AF647 (clone GB11), fornecidos por Biolegend, e Ki67- PE-Cy7 (clone SolA15) e Foxp3-PerCP-Cy5.5 (clone FJK-16s), ambos fornecidos por eBioscience) e incubados por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. As células foram, então, lavadas duas vezes com tampão de permeabilização e ressuspensas em PBS mais 0,5 % de BSA. As células foram, então, analisadas em um citômetro de fluxo BD Fortessa. Os análise de dados foi realizado com o uso de software FlowJo, Excel e GraphPad Prism 7.

[0551] As frequências de células T proliferantes CD8+ Ki67+ (de CD8+ total) e CD4+ Ki67+ (de CD4+ total) no sangue periférico, seis dias após a administração da primeira dose, foram determinadas por análise citométrica de fluxo. Os aumentos estatisticamente significativos nas frequências de células T proliferantes CD4+ Ki67+ foram observadas nas doses simples de 1 e 10 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 em comparação com controle de isotipo. Os aumentos estatisticamente significativos nas frequências de células T proliferantes CD8+ Ki67+ foram observadas nas doses simples de 1, 3 e 10 mg/kg de FS20m-232-91AA/Lob12.3 em comparação com controle de isotipo.

[0552] As células T CD8+ Ki67+ proliferantes tenderam para as maiores no nível de dose única de 1 mg/kg, enquanto as células T proliferantes CD4+ Ki67+ tenderam para as maiores nos níveis de dose de 1 e 10 mg/kg. Aumentar o nível de dose a 30 mg/kg não resultou em um efeito significativo em células T CD8+ Ki67+ e CD4+ Ki67+, com relação ao controle de isotipo. De modo notável, nenhuma observação clínica evidente ou perda de peso foi observadas em qualquer dos níveis de dose.

[0553] A comparação do grupo de múltiplas dosagens (FS20m-232-91AA/Lob12.3 a 1 mg/kg de Q2D em três doses), e o grupo de dose única de 1 mg/kg não mostrou significância estatística em níveis de célula T CD8+ Ki67+ e CD4+ Ki67+ (teste de Mann-Whitney não pareado, p = 0,4848 e p = 0,0931, respectivamente). Esses dados sugerem que múltiplas dosagens, pelo menos dento do período de seis dias avaliados nesse estudo, não fornecem efeito adicional em modulação farmacodinâmica Ki67+ periférica.

[0554] Consistente com os resultados do Exemplo 18, esse experimento mostra que o mAb2 substituto OX40/CD137 tem um efeito em células T circulantes, aumentando significativamente a frequência de células T CD8+ proliferantes (Ki67+) em níveis de dose de 1 mg/kg a 10 mg/kg, e de células T CD4+ proliferantes (Ki67+) em níveis de dose de 1 mg/kg e 10 mg/kg. Exemplo 25 - Efeito de depleção de célula T CD4 em resposta farmacodinâmica de mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em um modelo tumoral de camundongo CT26

[0555] Mostrou-se anteriormente que a combinação de anticorpos coestimulatórios que alvejam CD137 e OX40 melhorou sinergicamente expansão clonal de célula T CD8+ específica, em comparação com o agente por si só, seguida pela administração de enterotoxina A estafilocócica em camundongos (Lee et al., 2004). De modo mecanicista, Lee et al. demonstrou que as células T CD4 desempenham um papel no acionamento da resposta de célula T CD8+ específica melhorada. Um modelo tumoral de camundongo CT26 e anticorpo que depleta célula T CD4 de camundongo foram usados para testar a possibilidade de as células T CD4 hospedeiras serem exigidas para, ou contribuírem com, a ativação e proliferação de células T CD8+ periféricas em resposta ao tratamento com o mAb2 substituto OX40/CD137.

[0556] Seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo 17, camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8- 10 semanas de idade e que pesam aproximadamente 20 g foram injetados subcutaneamente no flanco esquerdo de cada animal com células de carcinoma de cólon CT26. Os animais foram aleatorizados em grupos de tratamento no dia sete, com cinco animais por grupo por tempo do tempo.

[0557] Os anticorpos foram analisados e verificados quanto a impurezas, como anteriormente descrito. O anticorpo de controle de isotipo (G1/4420) e mAb2 substituto OX40/CD137 (FS20m-232-91AA/Lob12.3) foram diluídos a uma concentração final de 0,1 mg/ml em PBS. O anticorpo CD4 anti-camundongo (GK1.5; BioXCell, nº de catálogo BE0003-1) foi diluído a uma concentração final de 1 mg/ml em PBS. Cada animal recebeu 200 µl de volume de anticorpo diluído por administração, gerando uma dose final de 1 mg/kg (G1/4420 ou FS20m-232- 91AA/Lob12.3) ou 10 mg/kg (GK1.5) para um camundongo de 20 g.

G1/4420 e FS20m-232-91AA/Lob12.3 foram administrados a animais por meio injeções intraperitoneais (i.p.) nos dias 10, 12 e 14 após a inoculação celular. As injeções i.p. de GK1.5 foram fornecidas nos dias 8, 9, 11, 13 e 15.

[0558] Os animais foram removidos do estudo no dia 16 após a inoculação celular e os tecidos foram coletados para análise citométrica de fluxo. O sangue foi coletado em tubos que contêm EDTA por punção cardíaca. Seguindo o mesmo protocolo como descrito no Exemplo 19, as hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácias (Miltenyi Biotech, nº 130-094-183) de acordo com as instruções do fabricante, e os tumores foram dissociados com o uso do kit de dissociação de Tumor de camundongo (Miltenyi Biotech, 130-096-730) e o Dissociador gentleMACS (Miltenyi Biotech) de acordo com instruções do fabricante. A suspensão de célula tumoral resultante foi peneirada com o uso de uma peneira celular de 70 µm (Corning, nº de catálogo 352350), lavada e ressuspensa em PBS. A suspensão de célula de baços foi preparada empurrando-se os baços através de uma peneira celular de 70 µm (Corning), lisando-se hemácias por incubação em tampão de lise de hemácias (Milteny Biotech), lavando-se os esplenócitos restantes e ressuspendendo-se os mesmos em PBS.

[0559] As células foram primeiro colorizadas com os reagentes CD4-E450 (clone GK1.5), CD69-PE-Cy5 (clone H1.2F3), CD3-PE-Cy7 (clone 145-2C11), CD8-APC (clone 53-

6.7), e corante de viabilidade fixável 780, todos fornecidos por eBioscience; e CD45-V500 (clone 30-F11), fornecido por BD Bioscience, na presença de bloco Fc (eBioscience, nº de catálogo 14-0161-86). As células foram, então, fixadas e permeabilizadas com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience, nº de catálogo 00-5523-00) de acordo com instruções do fabricante. As células foram ressuspensas em tampão de permeabilização de 100 µl com anticorpos anti-Ki67 e anti-Foxp3 (Ki67-FITC (clone SolA15) e Foxp3-PE (clone FJK-16s), ambos fornecidos por eBioscience) na presença de bloco Fc (todos 1:100) e incubadas por 30 minutos no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas uma vez com tampão de permeabilização e ressuspensas em 200 ul de PBS. As células foram analisados em um citômetro BD FACSCanto II. A análise de dados foi realizada com o uso de software FlowJo, Excel e GraphPad Prism. A comparação em pares entre grupos de tratamento foi realizada com o uso de teste de Mann- Whitney de duas caudas no software GraphPad Prism.

[0560] O tratamento com FS20m-232-91AA/Lob12.3 por si só induziu aumentos estatisticamente significativos na proporção de células T ativadas CD69+ e células T CD8+ Ki67+ proliferantes no sangue e no baço, e de células T CD8+ Ki67+ proliferantes no tumor, em comparação com controle de isotipo-animais tratados com.

[0561] Combinar FS20m-232-91AA/Lob12.3 com anticorpo que depleta célula T CD4+ GK1.5 também resultou em um aumento estatisticamente significativo em células T CD8+ Ki67+ proliferantes no sangue, em comparação com controle de isotipo, mas esse aumento foi significativamente menor que aquele observado nos animais tratados com agente único FS20m- 232-91AA/Lob12.3. Nenhuma diferença estatisticamente significativa em níveis de células T CD8+ proliferantes foi observada nos tecidos de baço e tumor após o tratamento com FS20m-232-91AA/Lob12.3 por si só em comparação com o tratamento com FS20m-232-91AA/Lob12.3 mais anticorpo que depleta célula T CD4+ GK1.5.

[0562] Aumentos induzidos por FS20m-232-91AA/Lob12.3 em células T CD8+ CD69+ ativadas no sangue foram inibidas pelo anticorpo GK1.5, visto que não houve diferenças estatisticamente significativas observadas entre o grupo de controle de isotipo e o grupo de depleção mais CD4 FS20m- 232-91AA/Lob12.3 (média de 1,6 % e 2,33 % de células T CD8 totais, respectivamente). A comparação do grupo de agente único FS20m-232-91AA/Lob12.3 e do grupo de depleção mais CD4 FS20m-232-91AA/Lob12.3 mostrou que a frequência de células T CD8+ ativadas reduziu significativamente no baço (29,3 % versus 6,45 % de frequência média, sem e com depleção, respectivamente), e no tumor (86,4 % versus 66,5 % de frequência média, sem e com depleção, respectivamente).

[0563] Consistente com as constatações anteriores como descrito no Exemplo 18, o mAb2 substituto OX40/CD137 aumentou a frequência de células T CD8 ativadas (CD69+) e proliferantes (Ki67+), e os resultados do presente estudo mostram que depleção de célula T CD4+ teve um efeito prejudicial nessa resposta farmacodinâmica periférica mediada por mAb2 OX40/CD137. Além disso, os dados sugerem uma interação potencial de células T CD4+ e CD8+ na mediação de atividade de mAb2 anti-OX40/CD137 in vivo, e que as células T CD4+ podem ser exigidas para coestimulação ideal de imunidade de célula T CD8+ in vivo com um mAb2 anti- OX40/CD137. Exemplo 26 - Atividade funcional de mAb2 OX40/CD137 em ensaio com base em célula de macaco cinomolgo e resposta farmacodinâmica a e tolerabilidade de mAb2 OX40/CD137 em macacos cinomolgo

26.1 Atividade funcional de mAb2 OX40/CD137 em ensaio com base em célula de macaco cinomolgo

[0564] Um ensaio de PBMC primário, similar ao ensaio de célula T primário descrito no Exemplo 13, mas com o uso de PBMCs em vez de células T ativadas e isoladas, foi realizado para estabelecer a potência relativa do mAb2 anti-humano FS20-22-49AA/FS30-10-16 em receptores humano e de macaco cinomolgo expressos endogenamente. Resumidamente, PBMCs de macaco cinomolgo ou humanas foram isoladas e estimuladas com um anticorpo anti-CD3 revestido na presença de concentrações crescentes de mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 ou um controle de isotipo para três (macaco cinomolgo) ou quatro (humano) dias, com liberação de IL-2 que serve como uma medida de ativação de célula T.

[0565] A atividade funcional do mAb2 em PBMCs de macaco cinomolgo (EC50 médio = 0,28 ± 0,15 nM) foi observada como similar a atividade observada em um ensaio humano equivalente (EC50 médio = 0,26 ± 0,1 nM; IL-2). Macacos cinomolgo são, portanto, considerados como uma espécie farmacologicamente relevante para estudos de toxicidade para o mAb2.

26.2 Tolerabilidade e resposta farmacodinâmica a mAb2 OX40/CD137 em macacos cinomolgo

[0566] Um estudo de constatação de faixa de dose preliminar foi conduzido para avaliar a tolerabilidade do mAb2 OX40/CD137 anti-humano FS20-22-49AA/FS30-10-16 e para avaliar alterações farmacodinâmicas potenciais em proporções das maiores populações de leucócito, bem como indução de proliferação e ativação de subconjuntos de célula T específicos em resposta a FS20-22-49AA/FS30-10-16 em macacos cinomolgo.

[0567] Resumidamente, o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foi administrado a macacos cinomolgos por meio de infusão intravenosa como uma dose única ou como administrações de dose. Os parâmetros toxicológicos padrão como massa corporal, consumo de alimentos, observações clínicas, hematologia e química de sangue foram avaliadas para a avaliação de tolerabilidade ao longo da duração do estudo.

[0568] O mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 foi bem tolerado em doses de até 30 mg/kg semanalmente, como determinado pelos resultados de química clínica e de histopatologia.

[0569] Consistente com as constatações do estudo para avaliar o efeito do mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em células T circulantes em um modelo tumoral de camundongo singênico CT26 (Exemplo 18), um aumento relacionado a fármaco em proliferação e ativação de célula foi observada em células T CD4+ e CD8+ de memória central e memória efetora, e também nas células NK, que foi medido por uma expressão aumentada de Ki67 e, em alguma medida, CD69.

[0570] Tomados em conjunto, esses resultados indicam fortemente que o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16 anti-humano tem atividade farmacológica in vivo potente nos macacos cinomolgo e é bem tolerado em até 30 mg/kg. Adicionalmente, os dados farmacodinâmicos gerados nesse estudo estão em linha com os dados observados para o mAb2 substituto OX40/CD137 no estudo farmacodinâmico de camundongo descrito no Exemplo 18, e fornece evidência adicional para eficácia antitumoral e tolerabilidade esperadas de mAmAb2 que se liga a OX40 e CD137, como o mAb2 FS20-22-49AA/FS30-10-16, em pacientes humanos com câncer.

Exemplo 27 – Farmacologia de fígado de mAb2 OX40/CD137 em camundongos BALB/c

[0571] Mostrou-se que os anticorpos agonistas CD137 induzem infiltração de célula T de fígado aumentada em camundongo modelos pré-clínicos e um anticorpo agonista CD137 induziu a toxicidade de fígado em doses acima de 1 mg/kg na clínica (Dubrot et al., 2010; Segal et al., 2017). Os efeitos do mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo em camundongos BALB/c foram, portanto, estudados para determinar se há infiltração de célula T de fígado aumentada em comparação com anticorpos agonistas CD137. Os tecidos sanguíneo e de baço foram usados como controles e os níveis de célula T, bem como proliferação e ativação de célula T, foram estudados. Os detalhes dos anticorpos testados são estabelecidos na Tabela 38.

[0572] Tabela 38: Detalhes de anticorpos e mAb2 testados Cadeia Cadeia Ligação Ligação Mutação pesada leve mAb/mAb2 de Fab de Fcab Isotipo

LALA SEQ ID SEQ ID a a

NO NO G1/4420 FITC nenhum hIgG1 Não 115 116 G1/OX86 mOX40 nenhum hIgG1 Não 159 156 Universidade G1/Lob12.3 mCD137 nenhum hIgG1 Não de Southampton G1/3H3 mCD137 nenhum hIgG1 Não 168 167 Criação FS20m-232- mCD137 mOX40 hIgG1 Sim descrita acima 91AA/Lob12.3 no Exemplo 9.2

[0573] A habilidade do mAb2 (FS20m-232-91AA/Lob12.3) para aumentar, ativar e induzir a proliferação de células T no sangue, baço e fígado foi comparada a controles de mAb de agente único (G1/OX86, G1/Lob12.3, G1/3H3 e G1/4420) e combinação (G1/OX86 e G1/Lob12.3). Os camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando aproximadamente 20 g, cada, foram deixados em repouso por uma semana antes do estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Cada coorte tinha 6 camundongos.

[0574] Dentro de 24 horas antes da injeção, os anticorpos foram analisados por perfilagem de SEC-HPLC e verificados quanto impurezas. Os anticorpos foram diluídos a uma concentração final de 1 mg/ml em PBS, e 200 µl/camundongo foram injetados intraperitonealmente (IP), gerando uma dose final de 10 mg/kg para um camundongo de 20 g. As injeções foram realizadas nos dias 0, 2 e 4 (uma dose a cada dois dias) do estudo. Sete e quatorze dias após a terceira dose, 3 camundongos por grupo foram eutanasiados, os baços e fígado foram isolados por dissecação e o sangue foi coletado por punção cardíaca.

[0575] Os fígados e baços foram dissociados com o uso dos kits de dissociação Miltenyi, (Fígado – Miltenyi, 130-105- 807; Baço – Miltenyi, 130-095-926) de acordo com as instruções do fabricante. A suspensão celular resultante foi peneirada com o uso de uma peneira celular de 70 µM (Corning nº de catálogo 352350), centrifugada (10 minutos a 1500 rpm), lavada uma vez em PBS e ressupensa em 5 ml PBS.

[0576] O sangue foi coletado por punção cardíaca em tubos que contêm EDTA. As hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácias (eBioscience, nº de catálogo 00-4300-54) de acordo com instruções do fabricante.

[0577] As células isoladas de tumores e sangue foram colorizadas por citometria de fluxo com o uso do anticorpo painel e reagentes detalhados no Exemplo 19 (Colorizador 1). As células foram lavadas em PBS e, então, incubadas com 100 µl de mistura de anticorpos 1 (todos, exceto pelos anticorpos Ki67 e FoxP3) por 30 minutos a 4oC. As células foram, então, lavadas com PBS e, então, fixadas e permeabilizadas com o kit de colorização Foxp3 eBioscience (eBioscience, nº de catálogo 00-5523-00) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 200 µl de solução de fixação foram adicionados a cada poço e deixados durante a noite no escuro a 4oC. As células foram, então, lavadas em tampão de permeabilização de 200 µl. As células foram, então, novamente centrifugadas e ressupensas em tampão de permeabilização de 100 µl com anticorpos Ki67 e Foxp3 na presença de bloco Fc (todos em diluição de 1:100) e incubadas por 30 minutos no escuro a 4oC. As células foram, então, lavadas uma vez com tampão de permeabilização e ressupensas em 200 µl de PBS. As células foram, então, analisadas em um citômetro de fluxo BD FACSCanto II.

[0578] Os dados foram analisados com software FlowJoX, Excel e GraphPad Prism. A análise estatística para comparar grupos foi realizado com o uso de ANOVA de uma via seguido por teste de múltiplas comparações de Tukey de cada par com o uso do pacote de software GraphPad Prism. Os dados foram expressos como a porcentagem da população parental.

[0579] Os resultados mostraram que o anticorpo agonista CD137 independente de reticulação (G1/3H3) induziu níveis aumentados de célula T no fígado, baço e sangue tanto a 7 quanto 14 dias, e que essas células T mostraram níveis aumentados de proliferação e ativação, em comparação com o anticorpo de controle de isotipo (G1/4420). O anticorpo agonista CD137 dependente de reticulação (G1/Lob12.3) não mostrou aumentos significativos nos níveis de célula T, de proliferação ou ativação em fígado, baço ou sangue.

O anticorpo agonista OX40 (G1/OX86) não induziu níveis de célula T aumentados em qualquer um dos tecidos, mas mostrou níveis de proliferação de célula T aumentados no fígado, baço e sangue no dia 7 do estudo, que voltaram para os níveis de controle de isotipo no dia 14. A combinação de OX40 e anticorpos agonistas CD137 dependentes de reticulação (G1/OX86 e G1/Lob12.3) mostraram um aumento em níveis de infiltração de célula T de fígado no dia 7, proliferação de célula T aumentada no fígado no dia 7 e no baço (não significativo) e sangue nos dias 7 e 14, e ativação de célula T aumentada no fígado e sangue no dia 14 e no baço nos dias 7 e 14. O mAb2 OX40/CD137 mostrou um aumento em níveis de infiltração de célula T de fígado (não significativo) e níveis de célula T de sangue no dia 7, que voltaram para níveis de controle de isotipo no dia 14, e proliferação de célula T aumentada no fígado (não significativo), baço e sangue no dia 7, que também voltaram para níveis de controle de isotipo no dia 14. Esses resultados indicam que apenas o agonista CD137 independente de reticulação (G1/3H3) induziu infiltração, proliferação e ativação de célula T elevadas e mantidas no fígado, e também no baço e sangue, e sugere que as moléculas de anticorpo que alvejam OX40/CD137 da invenção podem ter um risco de hepatotoxicidade menor que anticorpos agonistas CD137 independentes de reticulação.

Esses resultados elevam a possibilidade de uma associação entre o agonismo de CD137 independente de reticulação induzida por clone 3H3 e a inflamação de célula T de fígado aumentada observada para esse clone independente de reticulação no estudo. Exemplo 28 – Comparação de anticorpos mAb2 OX40/CD137 que contêm clones de Fab anti-CD137 diferentes em um modelo tumoral singênico CT26

[0580] No Exemplo 27, observou-se que o anticorpo agonista CD137 independente de reticulação (G1/3H3) foi observada induz níveis de infiltração, proliferação e ativação de célula T elevados em camundongos BALB/c. Para testar a possibilidade dessa atividade aumentada ter uma atividade antitumoral benéfica no contexto de um mAb2 OX40/CD137, o modelo tumoral singênico CT26 foi usado para comparar a atividade de dois mAb2 OX40/CD137 anti-camundongo in vivo diferentes, um no qual o agonista CD137 é o clone dependente de reticulação Lob1.23 e o outro no qual o agonista CD137 é o clone independente de reticulação 3H3. O modelo tumoral singênico CT26 foi anteriormente mostrado como sensível a ambos os anticorpos agonistas OX40 e CD137, e os linfócitos de infiltração de tumor (TILs) isolados de tumores CT26 expressam tanto OX40 quanto CD137.

28.1 Atividade antitumoral de anticorpos mAb2 OX40/CD137 que contém clones de Fab anti-CD137 diferentes em um modelo tumoral singênico CT26

[0581] A atividade antitumoral de dois mAb2 OX40/CD137 diferentes, FS20m-232-91AA/3H3 (SEQ ID NOs: 169 e 167) e FS20m-232-91AA/Lob12.3 (consultar Tabela 38), foi determinada in vivo em um modelo tumoral de camundongo singênico CT26 e comparada à atividade de um anticorpo de controle de isotipo (G1/4420; consultar a Tabela 38). Adicionalmente, os níveis de proliferação e ativação de célula T induzidos no sangue pelos dois mAb2 OX40/CD137 foram analisados e comparados àqueles induzidos pelo anticorpo de controle de isotipo. Os camundongos fêmeas BALB/c (Charles River) com 8-10 semanas de idade e pesando aproximadamente 20 g, cada, foram deixados em repouso por uma semana antes do estudo começar. Todos os animais receberam microchips e um identificador único. Cada coorte tinha 10 camundongos. A linhagem celular de carcinoma de cólon CT26 (ATCC, CRL-2638) foi inicialmente expandida, armazenada e, então, pré-triada por meio de IDEXX Bioresearch para patógenos que usam o protocolo IMPACT I e mostraram estar livres de patógeno. As células CT26 (aproximadamente 3-5 x 106) foram descongeladas do armazenamento a 150 °C e adicionadas a 20 ml de DMEM (Gibco, 61965-026) com 10 % de FCS (Gibco, 10270-106) em um frasco de cultura de tecido T175. Os camundongos foram anestesiados com o uso de isoflurano (Abbott Laboratories) e cada animal recebeu 1 X 106 células injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo. No dia 10 após a inoculação de célula tumoral, os camundongos foram monitorados quanto a saúde e crescimento tumoral e foram ordenados e aleatorizados em coortes de estudo. Quaisquer camundongos que não tiveram tumores nesse momento foram removidos do estudo.

[0582] Dentro de 24 horas antes da injeção, os anticorpos foram analisados por perfilagem de SEC-HPLC e verificados quanto impurezas. Os anticorpos foram diluídos a uma concentração final de 0,1 mg/ml em PBS, e 200 µl/camundongo foram injetados intraperitonealmente (IP), gerando uma dose final de 1 mg/kg para um camundongo de 20 g. As injeções foram realizadas nos dias 10, 12 e 14 (uma dose a cada dois dias) após a inoculação de tumor. Os animais foram submetidos à triagem de saúde sob anestesia três vezes por semana de uma maneira cega, durante o tempo em que as medições exatas dos tumores foram realizadas. Os volumes tumorais foram determinados por medições de compasso (como descrito no Exemplo 17). O estudo foi terminado 35 dias após inoculação de célula tumoral e os animais foram removidos do estudo quando os pontos finais humanos foram alcançados com base em volume tumoral e condição. Os grupos de tratamento, moléculas testadas, doses e cronograma de dosagem são sumarizados na Tabela 39. Os volumes tumorais no dia 21 foram estatisticamente testados por ANOVA de duas vias e teste de múltiplas comparações de Tukey com o uso de software GraphPad Prism. O teste estatístico de sobrevivência foi realizado por teste de classificação de log (Mantel-Cox) com o uso de software GraphPad Prism.

[0583] Tabela 39: Resumo de grupos de tratamento e moléculas testadas Grupo Nome do grupo mAb e/ou mAb2 Dose Cronograma administrados (mg/kg) de Dosagem Controle de 1 G1/4420 1 Q2D isotipo FS20m-232- FS20m-232- 3 1 Q2D 91AA/Lob12.3 91AA/Lob12.3

Grupo Nome do grupo mAb e/ou mAb2 Dose Cronograma administrados (mg/kg) de Dosagem FS20m-232- FS20m-232- 4 1 Q2D 91AA/3H3 91AA/3H3

[0584] Como mostrado nas Figuras 15A e 15B, o tratamento com qualquer um dos dois anticorpos mAb2 OX40/CD137 atrasou o crescimento tumoral e aumentou a sobrevivência em comparação com o tratamento com o anticorpo de controle de isotipo. Nenhuma diferença em crescimento tumoral ou sobrevivência foi observada entre os camundongos tratados com o mAb2 FS20m-232-91AA/3H3 e o mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3, respectivamente. Esses dados sugerem que, independentemente da ativação e da proliferação de célula T aumentadas observadas para o agonista CD137 independente de reticulação (G1/3H3) como descrito no Exemplo 27, não há atividade antitumoral aumentada de um mAb2 OX40/CD137 no qual o clone de Fab anti-CD137 é clone independente de reticulação 3H3 (FS20m-232-91AA/3H3), em comparação com um mAb2 OX40/CD137 no qual o clone de Fab anti-CD137 é clone dependente de reticulação Lob12.3 (FS20m-232-91AA/Lob12.3).

28.2 Avaliação de resposta farmacodinâmica periférica de mAb2 OX40/CD137 que contêm clones de Fab anti-CD137 diferentes em um modelo tumoral singênico CT26

[0585] Em uma extensão do estudo descrito acima no Exemplo

28.1, cinco dias após a administração da terceira dose (isto é, dia 19 após a inoculação de tumor) o sangue foi coletado a partir da veia de cauda de cinco camundongos em tubos que contêm EDTA. As hemácias do sangue não coagulado foram lisadas duas vezes em tampão de lise de hemácias (eBioscience, nº de catálogo 00-4300-54) de acordo com instruções do fabricante.

[0586] As células isoladas do sangue foram colorizadas por citometria de fluxo com o uso do anticorpo painel e reagentes detalhados no Exemplo 19 (Colorizador 1). As células foram lavadas em PBS e, então, incubadas com 100 µl de mistura de anticorpos 1 (todos exceto os anticorpos Ki67 e FoxP3) por 30 minutos a 4 °C. As células foram, então, lavadas com PBS e, então, fixadas e permeabilizadas com um kit de colorização Foxp3 (eBioscience, nº de catálogo 00- 5523-00), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 200 µl de solução de fixação foram adicionados a cada poço e deixados durante a noite no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas em tampão de permeabilização de 200 µl. As células foram, então, novamente centrifugadas e ressuspensas em 100 µl de tampão de permeabilização com anticorpos Ki67 e Foxp3 na presença de bloco Fc (todos em diluição de 1:100) e incubadas por 30 minutos no escuro a 4 °C. As células foram, então, lavadas uma vez com tampão de permeabilização e ressupensas em 200 µl de PBS. As células foram, então, analisadas em um citômetro de fluxo BD FACSCanto II.

[0587] Os dados foram analisados com software FlowJoX, Excel e GraphPad Prism. A análise estatística para comparar grupos foi realizado com o uso de ANOVA de uma via seguido por teste de múltiplas comparações de Tukey de cada par com o uso do pacote de software GraphPad Prism.

[0588] FS20m-232-91AA/3H3 induziu aumentos estatisticamente significativos nos níveis de célula T de sangue em comparação tanto ao anticorpo de controle de isotipo (G1/4420) quanto ao FS20m-232-91AA/Lob12.3. Esses níveis de célula T aumentados induzidos por FS20m-232- 91AA/3H3 foram acompanhados por uma diminuição estatisticamente significativa na porcentagem relativa de células T CD4+ e um aumento estatisticamente significativo na porcentagem relativa de células T CD8+ em comparação com as porcentagens relativas desses tipos de célula observados para controle de isotipo G1/4420 e mAb2 FS20m-232- 91AA/Lob12.3. Ambos os anticorpos mAb2 OX40/CD137 também induziram a proliferação de células T CD4+ e CD8+, mas os níveis induzidos pelo FS20m-232-91AA/3H3 foram significativamente maiores que aqueles induzidos pelo mAb2 FS20m-232-91AA/Lob12.3. O mAb2 FS20m-232-91AA/3H3 induziu níveis aumentados de células T CD4+ ativadas em comparação com o controle de isotipo.

As alterações nos níveis de células T ativadas e células T CD8+ ativadas em camundongos tratados com FS20m-232-91AA/Lob12.3 ou FS20m-232-91AA/3H3, em comparação com o coorte tratado com controle de isotipo, foram modestos e não estatisticamente significativos, como as alterações nos níveis de células T CD4+ ativadas em camundongos tratados com FS20m-232-91AA/Lob12.3. Esses resultados indicam que o clone agonista CD137 independente de reticulação 3H3 está ativo no contexto de um mAb2 OX40/CD137 e tem a capacidade para induzir níveis e proliferação de célula T aumentados em comparação com o clone agonista CD137 dependente de reticulação Lob12.3 no contexto de um mAb2 OX40/CD137, e são, portanto, consistentes com os níveis e proliferação de célula T aumentados induzidos por clone 3H3 como um anticorpo monoclonal (mAb) como foram observadas no estudo de camundongos BALB/c descrito no Exemplo 27.

[0589] Em conjunto com os dados de atividade antitumoral dados, esses resultados sugerem que não há benefício adicional em termos de resposta antitumoral dos níveis de célula T aumentados e proliferação induzida pelo agonista CD137 independente de reticulação no contexto de um mAb2 OX40/CD137. Esses resultados, tomados juntamente com os resultados do Exemplo 27 no qual a inflamação de célula T de fígado aumentada foi observada para agonismo de CD137 independente de reticulação induzida pelo clone 3H3, sugerem que com o uso de um mAb2 OX40/CD137, o agonismo de CD137 que é dependente de ligação a OX40, pode fornecer uma forma segura e eficaz para estimular o sistema imunológico a lutar contra câncer. Listagem de Sequências

[0590] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-10- 16 (IMGT) CDR1 de VH – GFTFSSYD (SEQ ID NO: 1) CDR2 de VH – IDPTGSKT (SEQ ID NO: 2) CDR3 de VH – ARDLLVYGFDY (SEQ ID NO: 3) CDR1 de VL – QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) CDR2 de VL – GAS (SEQ ID NO: 5) CDR3 de VL – QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6)

[0591] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-10- 16 (Kabat) CDR1 de VH – SYDMS (SEQ ID NO: 7) CDR2 de VH – DIDPTGSKTDYADSVKG (SEQ ID NO: 8) CDR3 de VH – DLLVYGFDY (SEQ ID NO: 9) CDR1 de VL – RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10)

CDR2 de VL – GASSRAT (SEQ ID NO: 11) CDR3 de VL – QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6) Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-10-16 (SEQ ID NO: 12)

[0592] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD

YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSS Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-10-16 (SEQ ID NO: 13)

GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGATTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACT GTCTTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGACATGTCCTGGGTCCGACAGG CTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGACATCGACCCCACCGGCTCTAAGACCGAC TACGCCGATTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACCCT GTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAG

ATCTGCTGGTGTACGGCTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCCTCT Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-10-16 (SEQ ID NO: 14)

[0593] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI

PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIK Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-10-16 (SEQ ID NO: 15)

GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGGCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCTAC CCTGTCCTGTAGAGCCTCTCAGTCCGTGTCCTCCTCTTACCTGGCCTGGTATCAGCAGA AGCCTGGACAGGCTCCCCGGCTGTTGATCTACGGCGCTTCTTCTAGAGCCACAGGCATC CCTGACCGGTTCTCCGGATCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCTCGGCT GGAACCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTACAGCTACCCCGTGACCT TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

[0594] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-10-3 (IMGT) CDR1 de VH – GFTFSSYD (SEQ ID NO: 1) CDR2 de VH – IDPTGSKT (SEQ ID NO: 2) CDR3 de VH – ARDLNVYGFDY (SEQ ID NO: 16) CDR1 de VL – QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) CDR2 de VL – GAS (SEQ ID NO: 5) CDR3 de VL – QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6)

[0595] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-10-3 (Kabat) CDR1 de VH – SYDMS (SEQ ID NO: 7) CDR2 de VH – DIDPTGSKTDYADSVKG (SEQ ID NO: 8) CDR3 de VH – DLNVYGFDY (SEQ ID NO: 17) CDR1 de VL – RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) CDR2 de VL – GASSRAT (SEQ ID NO: 11) CDR3 de VL – QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6)

[0596] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-10-3 (SEQ ID NO: 18)

[0597] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLNVYGFDYWGQGTLVTVSS

[0598] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-10-3 (SEQ ID NO: 19)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCAATGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT

[0599] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-10-3 (SEQ ID NO: 14) Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIK

[0600] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-10-3 (SEQ ID NO: 20)

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCAC TCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAA AACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATT CCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCT GGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATCTTATTCTTATCCTGTCACGT TCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

[0601] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-10- 12 (IMGT) CDR1 de VH – GFTFSSYD (SEQ ID NO: 1) CDR2 de VH – IDPTGSKT (SEQ ID NO: 2) CDR3 de VH – ARDLTVYGFDY (SEQ ID NO: 21) CDR1 de VL – QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) CDR2 de VL – GAS (SEQ ID NO: 5) CDR3 de VL – QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6)

[0602] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-10- 12 (Kabat) CDR1 de VH – SYDMS (SEQ ID NO: 7) CDR2 de VH – DIDPTGSKTDYADSVKG (SEQ ID NO: 8) CDR3 de VH – DLTVYGFDY (SEQ ID NO: 22) CDR1 de VL – RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) CDR2 de VL – GASSRAT (SEQ ID NO: 11) CDR3 de VL – QQSYSYPVT (SEQ ID NO: 6)

[0603] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-10-12 (SEQ ID NO: 23)

[0604] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLTVYGFDYWGQGTLVTVSS

[0605] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-10-12 (SEQ ID NO: 24)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCACGGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT

[0606] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-10-12 (SEQ ID NO: 14) Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

[0607] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-10-12 (SEQ ID NO: 20)

[0608] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-35- 14 (IMGT)

CDR1 de VH – GFTFSAYN (SEQ ID NO: 25) CDR2 de VH – ISPYGGAT (SEQ ID NO: 26) CDR3 de VH – ARNLYELSAYSYGADY (SEQ ID NO: 27) CDR1 de VL – QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) CDR2 de VL – GAS (SEQ ID NO: 5) CDR3 de VL – QQYYYSSPIT (SEQ ID NO: 28)

[0609] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-35- 14 (Kabat) CDR1 de VH – AYNIH (SEQ ID NO: 29) CDR2 de VH – DISPYGGATNYADSVKG (SEQ ID NO: 30) CDR3 de VH – NLYELSAYSYGADY (SEQ ID NO: 31) CDR1 de VL – RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) CDR2 de VL – GASSRAT (SEQ ID NO: 11) CDR3 de VL – QQYYYSSPIT (SEQ ID NO: 28)

[0610] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-35-14 (SEQ ID NO: 170)

[0611] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYNIHWVRQAPGKGLEWVSDISPYGGATN YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLYELSAYSYGADYWGQGTL VTVSS

[0612] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-35-14 (SEQ ID NO: 171)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTGCCTATAATATCCATTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTTCTCCGTATGGTGGCGCGACCAAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAA ACCTCTACGAGTTGAGCGCTTACTCTTACGGGGCGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCGTCG

[0613] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-35-14 (SEQ ID NO: 172) Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYYSSPITFGQGTKVEIK

[0614] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-35-14 (SEQ ID NO: 32)

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCAC TCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAA AACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATT CCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCT GGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATATTATTATTCTTCTCCTATCA CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

[0615] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-5-37 (IMGT) CDR1 de VH – GFTFSSYA (SEQ ID NO: 33) CDR2 de VH – ISGSGGST (SEQ ID NO: 34) CDR3 de VH – ARSYDKYWGSSIYSGLDY (SEQ ID NO: 35) CDR1 de VL – QSVSSSY (SEQ ID NO: 4) CDR2 de VL – GAS (SEQ ID NO: 5) CDR3 de VL – QQYYSYYPVT (SEQ ID NO: 36)

[0616] Sequências de aminoácidos de CDR de mAb FS30-5-37 (Kabat) CDR1 de VH – SYAMS (SEQ ID NO: 37) CDR2 de VH – AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 38) CDR3 de VH – SYDKYWGSSIYSGLDY (SEQ ID NO: 39) CDR1 de VL – RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 10) CDR2 de VL – GASSRAT (SEQ ID NO: 11) CDR3 de VL – QQYYSYYPVT (SEQ ID NO: 36)

[0617] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-5-37 (SEQ ID NO: 40)

[0618] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLNCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYDKYWGSSIYSGLDYWGQG TLVTVSS

[0619] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia pesada de mAb FS30-5-37 (SEQ ID NO: 41)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAATTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGCTATGCCATGAGCTGGGTGCGTCAGG CGCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGCGATTAGCGGTAGTGGCGGTAGCACGTAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAT CTTACGACAAATACTGGGGTTCTTCTATTTACTCTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGT

[0620] Sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-5-37 (SEQ ID NO: 42)

[0621] Numeração IMGT de CDRs (negrito e itálico), numeração Kabat de CDRs (sublinhado itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYSYYPVTFGQGTKVEIK

[0622] Sequência de ácidos nucleicos do domínio variável de cadeia leve de mAb FS30-5-37 (SEQ ID NO: 43)

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCAC TCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAA AACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATT CCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCT GGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATATTATTCTTATTATCCTGTCA CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

[0623] Sequências de aminoácidos de alças estruturais de domínio CH3 de WT Alça AB de WT - RDELTKNQ (SEQ ID NO: 44) Alça CD de WT - SNGQPENNY (SEQ ID NO: 45) Alça EF de WT - DKSRWQQGNV (SEQ ID NO: 46)

[0624] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de WT (SEQ ID NO: 47)

[0625] Laços de AB, CD e EF sublinhado

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Sequência de aminoácidos do domínio CH2 (SEQ ID NO: 48)

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

[0626] Sequência de aminoácidos do domínio CH2 com mutação LALA (SEQ ID NO: 49)

[0627] Mutação LALA sublinhado

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

[0628] Sequência de aminoácidos do domínio CH2 com mutação LALA e mutação P114A (SEQ ID NO: 50)

[0629] Mutação LALA sublinhado; Mutação P114A em negrito e sublinhado

APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAK

[0630] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-22-49

[0631] Primeira sequência de FS20-22-49 – YWDQE (SEQ ID NO: 51)

[0632] Segunda sequência de FS20-22-49 – DEQFA (SEQ ID NO: 52)

[0633] Terceira sequência de FS20-22-49 – QYRWNPADY (SEQ ID NO: 53)

[0634] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-49 (SEQ ID NO: 54)

[0635] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0636] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-49 (SEQ ID NO: 55)

GGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACCTTGCCTCCAAGCCGGGACGAGTACTGGGA TCAAGAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGG AATGGGAGAGCAATGGCGACGAGCAGTTCGCCTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGAC TCCGACGGCTCATTCTTTCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACCAGTACAGATGGAACCC CGCCGACTACTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGA AGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGC

[0637] Sequências de aminoácidos de sequências de alça AB, CD e EF de domínio CH3 de Fcab FS20-22-49

[0638] Alça AB de FS20-22-49 – RDEYWDQE (SEQ ID NO: 56)

[0639] Alça CD de FS20-22-49 – SNGDEQFAY (SEQ ID NO: 57)

[0640] Alça EF de FS20-22-49 – DQYRWNPADY (SEQ ID NO: 58)

[0641] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-22-38

[0642] Primeira sequência de FS20-22-38 – YWDQE (SEQ ID NO: 51)

[0643] Segunda sequência de FS20-22-38 – AEKYQ (SEQ ID NO: 59)

[0644] Terceira sequência de FS20-22-38 – QYRWNPGDY (SEQ ID NO: 60)

[0645] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab

FS20-22-38 (SEQ ID NO: 61)

[0646] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGAEKYQYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0647] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-38 (SEQ ID NO: 62)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGA CCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGCAGAAAAATACCAGTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCC AGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

[0648] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-22-41

[0649] Primeira sequência de FS20-22-41 – YWDQE (SEQ ID NO: 51)

[0650] Segunda sequência de FS20-22-41 – DEQFA (SEQ ID NO: 52)

[0651] Terceira sequência de FS20-22-41 – QYRWNPGDY (SEQ ID NO: 60)

[0652] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-41 (SEQ ID NO: 63)

[0653] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDQYRWNPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0654] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-41 (SEQ ID NO: 64)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGA CCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAACCC AGGCGACTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGA

[0655] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-22-47

[0656] Primeira sequência de FS20-22-47 – YWDQE (SEQ ID NO: 51)

[0657] Segunda sequência de FS20-22-47 – DEQFA (SEQ ID NO: 52)

[0658] Terceira sequência de FS20-22-47 – QYRWSPGDY (SEQ ID NO: 65)

[0659] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-47 (SEQ ID NO: 66)

[0660] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

[0661] GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQF

AYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDQYRWSPGDYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0662] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-47 (SEQ ID NO: 67)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGA CCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAGTCC GGGTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGA AGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0663] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-22-85

[0664] Primeira sequência de FS20-22-85 – YWDQE (SEQ ID

NO: 51)

[0665] Segunda sequência de FS20-22-85 – DEQFA (SEQ ID NO: 52)

[0666] Terceira sequência de FS20-22-85 – QYRWNPFDD (SEQ ID NO: 68)

[0667] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-85 (SEQ ID NO: 69)

[0668] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTLDQYRWNPFDDFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0669] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-22-85 (SEQ ID NO: 70)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGA CCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCTTGGATCAGTATAGGTGGAATCC GTTTGATGATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGA AGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0670] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-31-58

[0671] Primeira sequência de FS20-31-58 – YYSGE (SEQ ID NO: 71)

[0672] Segunda sequência de FS20-31-58 – QPEND (SEQ ID NO: 72)

[0673] Terceira sequência de FS20-31-58 – PYWRWGSPRT (SEQ ID NO: 73)

[0674] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-58 (SEQ ID NO: 74)

[0675] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVPYWRWGSPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0676] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-58 (SEQ ID NO: 75)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTC TGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCTTATTGGAGGTGGGGTAG TCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

[0677] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-31-66

[0678] Primeira sequência de FS20-31-66 – YYSGE (SEQ ID NO: 71)

[0679] Segunda sequência de FS20-31-66 – QPEND (SEQ ID NO: 72)

[0680] Terceira sequência de FS20-31-66 – PYWRWGVPRT (SEQ ID NO: 76)

[0681] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-66 (SEQ ID NO: 77)

[0682] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEYYSGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENDYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0683] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-66 (SEQ ID NO: 78)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTACTC TGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACGACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGT TCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

[0684] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-31-94

[0685] Primeira sequência de FS20-31-94 – WEHGE (SEQ ID NO: 79)

[0686] Segunda sequência de FS20-31-94 – IREHD (SEQ ID NO: 80)

[0687] Terceira sequência de FS20-31-94 – PYWRWGGPGT (SEQ ID NO: 81)

[0688] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-94 (SEQ ID NO: 82)

[0689] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEWEHGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIREHDYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVPYWRWGGPGTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0690] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-94 (SEQ ID NO: 83)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGAACA TGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGATCAGAGAACATGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCATATTGGAGGTGGGGCGG CCCAGGCACCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGA AGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0691] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-31-102

[0692] Primeira sequência de FS20-31-102 – WASGE (SEQ ID NO: 84)

[0693] Segunda sequência de FS20-31-102 – QPEVD (SEQ ID

NO: 85)

[0694] Terceira sequência de FS20-31-102 – PYWRWGVPRT (SEQ ID NO: 76)

[0695] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-102 (SEQ ID NO: 86)

[0696] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEVDYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVPYWRWGVPRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0697] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-102 (SEQ ID NO: 87)

GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATC TGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCAGAAGTTGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGT TCCGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

[0698] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-31-108

[0699] Primeira sequência de FS20-31-108 - WASGE (SEQ ID NO: 84)

[0700] Segunda sequência de FS20-31-108 – EKEID (SEQ ID NO: 88)

[0701] Terceira sequência de FS20-31-108 – PYWRWGAKRT (SEQ ID NO: 89)

[0702] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-108 (SEQ ID NO: 90)

[0703] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEKEIDYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0704] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-108 (SEQ ID NO: 91)

GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATC TGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGAAAAAGAAATCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGC TAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

[0705] Sequências de aminoácidos de sequências de alças estruturais de domínio CH3 de Fcab FS20-31-115

[0706] Primeira sequência de FS20-31-115 - WASGE (SEQ ID NO: 84)

[0707] Segunda sequência de FS20-31-115 – EQEFD (SEQ ID NO: 92)

[0708] Terceira sequência de FS20-31-115 – PYWRWGAKRT (SEQ ID NO: 89)

[0709] Sequência de aminoácidos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-115 (SEQ ID NO: 93)

[0710] Primeira, segunda e terceira sequências sublinhadas

GQPREPQVYTLPPSRDEWASGEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEQEFDYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVPYWRWGAKRTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0711] Sequência de ácidos nucleicos de domínio CH3 de Fcab FS20-31-115 (SEQ ID NO: 94)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTGGGCATC TGGTGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGAACAGGAATTCGATTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATTGGAGGTGGGGTGC TAAGCGTACTTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGA AGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0712] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FS20- 22-49AA/FS30-10-16 com mutação LALA (SEQ ID NO: 95)

[0713] Domínio variável (itálico), mutação LALA (sublinhado negrito)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0714] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada de FS20-22-49AA/FS30-10-16 com mutação LALA (SEQ ID NO: 96)

GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGATTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACT GTCTTGTGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGACATGTCCTGGGTCCGACAGG CTCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGACATCGACCCCACCGGCTCTAAGACCGAC TACGCCGATTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACCCT GTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAG ATCTGCTGGTGTACGGCTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTGTCCTCT GCTTCTACCAAGGGACCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGG CGGAACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGT CTTGGAACTCTGGCGCTCTGACATCTGGCGTGCACACCTTTCCAGCAGTGCTGCAGTCC TCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCTGGGAACCCA GACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGG AACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAAGCTGCT GGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCG GACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCAGAAGTGAAGT TCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAA CAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT GAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAA AGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACCTTGCCTCCA AGCCGGGACGAGTACTGGGATCAAGAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTA CCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCGACGAGCAGTTCGCCTACAAGA CAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTTCTGTACTCCAAGCTGACAGTG GACCAGTACAGATGGAACCCCGCCGACTACTTCTCTTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCT GCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGC

[0715] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de FS30- 10-16 (SEQ ID NO: 97)

[0716] Domínio variável (itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSYSYPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0717] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve de FS30-10-16 (SEQ ID NO: 98)

GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGGCACACTGTCACTGTCTCCAGGCGAGAGAGCTAC CCTGTCCTGTAGAGCCTCTCAGTCCGTGTCCTCCTCTTACCTGGCCTGGTATCAGCAGA AGCCTGGACAGGCTCCCCGGCTGTTGATCTACGGCGCTTCTTCTAGAGCCACAGGCATC CCTGACCGGTTCTCCGGATCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCTCGGCT GGAACCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTACAGCTACCCCGTGACCT TTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATC TTCCCCCCAAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAA CAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCG GCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGT GACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC

[0718] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FS20- 22-49AA/FS30-10-3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 99)

[0719] Domínio variável (itálico), mutação LALA (sublinhado negrito)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLNVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0720] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada de FS20-22-49AA/FS30-10-3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 100)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCAATGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT GCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGG GGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGT CCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCC TCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCA GACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCG AGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCC GGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACG GACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAAT TCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAA CAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCT GAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGA AAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0721] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de FS30- 10-3 (SEQ ID NO: 97)

[0722] Domínio variável (itálico)

[0723] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve de FS30-10-3 (SEQ ID NO: 102)

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCAC TCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAA AACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATT CCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCT GGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATCTTATTCTTATCCTGTCACGT TCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATT TTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTCAA CAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGTCCG GAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTGTCC TCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGAAGT GACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

[0724] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FS20- 22-49AA/FS30-10-12 com mutação LALA (SEQ ID NO: 103)

[0725] Domínio variável (itálico), mutação LALA (sublinhado negrito)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLTVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0726] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada de FS20-22-49AA/FS30-10-12 com mutação LALA (SEQ ID NO: 104)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCACGGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT GCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGG GGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGT CCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCC TCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCA GACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCG AGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCC GGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACG GACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAAT TCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAA CAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCT GAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGA AAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0727] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de FS30- 10-12 (SEQ ID NO: 97)

[0728] Domínio variável (itálico)

[0729] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve de FS30-10-12 (SEQ ID NO: 102)

[0730] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FS20- 22-49AA/FS30-35-14 com mutação LALA (SEQ ID NO: 105)

[0731] Domínio variável (itálico), mutação LALA (sublinhado negrito)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYNIHWVRQAPGKGLEWVSDISPYGGATN YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLYELSAYSYGADYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0732] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada de FS20-22-49AA/FS30-35-14 com mutação LALA (SEQ ID NO: 106)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTGCCTATAATATCCATTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTTCTCCGTATGGTGGCGCGACCAAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAA ACCTCTACGAGTTGAGCGCTTACTCTTACGGGGCGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCGTCGGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTC CAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCG AGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCG GCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTC CTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGG TCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCA GCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATAC CCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGG ACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACC AAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCT GCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGC CTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAAC AGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0733] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de FS30-

35-14 (SEQ ID NO: 107)

[0734] Domínio variável (itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYYSSPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0735] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve de FS30-35-14 (SEQ ID NO: 108)

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCAC TCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAA AACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATT CCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCT GGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATATTATTATTCTTCTCCTATCA CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTC ATTTTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCT CAACAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGT CCGGAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTG TCCTCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGA AGTGACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

[0736] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FS20- 22-49AA/FS30-5-37 com mutação LALA (SEQ ID NO: 109)

[0737] Domínio variável (itálico), mutação LALA (sublinhado negrito)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLNCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYDKYWGSSIYSGLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0738] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada de FS20-22-49AA/FS30-5-37 com mutação LALA (SEQ ID NO: 110)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAATTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGCTATGCCATGAGCTGGGTGCGTCAGG CGCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGCGATTAGCGGTAGTGGCGGTAGCACGTAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAT CTTACGACAAATACTGGGGTTCTTCTATTTACTCTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCC ATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACT TTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACT TTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCC TTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACA CCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCT TGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAA GGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCC ACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCC AAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCAC TGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGG CGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGAC CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGG ATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGC CCGGA

[0739] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de FS30- 5-37 (SEQ ID NO: 111)

[0740] Domínio variável (itálico)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYSYYPVTFGQGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0741] Sequência de ácidos nucleicos da cadeia leve de FS30-5-37 (SEQ ID NO: 112)

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCAC TCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAA AACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATT CCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCT GGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATATTATTCTTATTATCCTGTCA CGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTC ATTTTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCT CAACAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGT CCGGAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTG TCCTCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGA AGTGACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

[0742] Sequência de ácidos nucleicos alternativa de domínio CH3 de Fcab FS20-22-49 (SEQ ID NO: 113)

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGA CCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCC TGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGA AGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0743] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb anti-FITC G1AA/4420 que compreende mutação LALA (SEQ ID NO: 114)

[0744] A posição das CDRs está sublinhada. A posição de mutação LALA está em negrito.

EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYE TYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0745] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb anti-FITC G1/4420 sem mutação LALA (SEQ ID NO: 115)

[0746] A posição das CDRs está sublinhada.

EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYE TYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0747] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb 4420 (SEQ ID NO: 116)

[0748] Domínio VL (itálico)

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0749] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo G1AA/HelD1.3 com mutação LALA (SEQ ID NO: 117)

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDY NSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0750] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb HelD1.3 (SEQ ID NO: 118)

[0751] Domínio VL (itálico)

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVP SRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0752] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do G1/MOR7480.1 (SEQ ID NO: 119)

[0753] Domínio VH (itálico)

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTN YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0754] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAbs G1/MOR7480.1, G1AA/MOR7480.1 e G2/MOR7480.1 (SEQ ID NO: 120)

[0755] Domínio VL (itálico)

SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVT LFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAS SYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

[0756] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do G1/20H4.9 (SEQ ID NO: 121)

[0757] Domínio VH (itálico)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTY NPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0758] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAbs G1/20H4.9 e G1AA/20H4.9 (SEQ ID NO: 122)

[0759] Domínio VL (itálico)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0760] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de FS20- 22-49AA/4420 (com mutação LALA) (SEQ ID NO: 123)

[0761] Domínio VH (itálico); Mutação LALA (negrito e sublinhado)

EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYE TYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0762] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do G2/MOR7480.1 (SEQ ID NO: 124)

[0763] Domínio VH (itálico)

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTN YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0764] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada do G1AA/MOR7480.1 (SEQ ID NO: 125)

[0765] domínio VH (itálico) LALA (negrito e sublinhado)

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTN YSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0766] Sequência de aminoácidos de CD137 humano (SEQ ID NO: 126)

[0767] Domínio extracelular (itálico); Domínios transmembrana e intracelular (negrito) lqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecssts naecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsl dgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqIISFFLALTSTALL

FLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0768] Sequência de aminoácidos de domínio extracelular CD137 humano (SEQ ID NO: 127) lqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecssts naecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsl dgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspq

[0769] Sequência de aminoácidos de CD137 de cinomolgo (SEQ ID NO: 128)

[0770] Domínio extracelular (itálico); Domínios transmembrana e intracelular (negrito)

LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTS NAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSL DGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQIIFFLALTSTVVLF LLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0771] Sequência de aminoácidos de domínio extracelular de CD137 de cinomolgo (SEQ ID NO: 129)

LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTS NAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSL DGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ

[0772] Sequência de aminoácidos de domínio extracelular OX40 humano (SEQ ID NO: 130)

LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWC NLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN CTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTR PVEVPGGRA

[0773] Sequência de aminoácidos de domínio extracelular de OX40 de cinomolgo (SEQ ID NO: 131)

LHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTWC NLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN CTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPSTR PVEVPRGPA

[0774] Sequência de aminoácidos de receptor DO11.10-hOX40 e OX40 humano (SEQ ID NO: 132)

LHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWC NLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN CTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTR PVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQ EEQADAHSTLAKI

[0775] Sequência de aminoácidos de receptor DO11.10-mOX40 e OX40 de camundongo (SEQ ID NO: 133)

VTARRLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCHPCETGFYNEAVNYDTCK QCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGNNQ ACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRSLLATLLWETQRPTFRPTTVQSTTVWPRT SELPSPPTLVTPEGPAFAVLLGLGLGLLAPLTVLLALYLLRKAWRLPNTPKPCWGNSFR TPIQEEHTDAHFTLAKI

[0776] Sequência de aminoácidos de receptor DO11.10-cOX40 e OX40 de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 134)

KLHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSAKPCKACTW CNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWT NCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPARPTTVQPTEAWPRTSQRPST RPVEVPRGPAVAAILGLGLALGLLGPLAMLLALLLLRRDQRLPPDAPKAPGGGSFRTPI QEEQADAHSALAKI

[0777] Sequência de aminoácidos de OX40 humano-mFc (SEQ ID NO: 135)

[0778] Sequência líder de IL-2 (sublinhado), domínio extracelular de OX40 (itálico), domínio Fc IgG2a de camundongo (negrito)

MYRMQLLSCIALSLALVTNSLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPC GPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCA PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPAR PITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF IFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTL RVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMT KKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWV ERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

[0779] Sequência de aminoácidos de OX40-mFc de camundongo (SEQ ID NO: 136)

[0780] Sequência líder de IL-2 (sublinhado), domínio extracelular de OX40 (itálico), domínio Fc IgG2a de camundongo (negrito)

MYRMQLLSCIALSLALVTNSVTARRLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDT LCHPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGY KLGVDCVPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRSLLATLLWE TQRPTFRPTTVQSTTVWPRTSELPSPPTLVTPEGPAGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLG GPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED YNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPP EEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVE KKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

[0781] Sequência de aminoácidos de OX40-mFc de cino (SEQ ID NO: 137)

[0782] Sequência líder de IL-2 (sublinhado), domínio extracelular de OX40 (itálico), domínio Fc IgG2a de camundongo (negrito)

MYRMQLLSCIALSLALVTNSLHCVGDTYPSNDRCCQECRPGNGMVSRCNRSQNTVCRPC GPGFYNDVVSAKPCKACTWCNLRSGSERKQPCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCA PCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPPTQPQETQGPPAR PTTVQPTEAWPRTSQRPSTRPVEVPRGPAVAAIGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPS VFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNS TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEE MTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN WVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

[0783] Sequência de aminoácidos de sequência de CD137 humano para uso com antígeno recombinante CD137-mFc-Avi (SEQ ID NO: 138)

SLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSST SNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCS LDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ

[0784] Sequência de aminoácidos de sequência de CD137 cinomolgo para uso com antígenos recombinantes CD137-mFc-Avi e CD137-Avi-His (SEQ ID NO: 139)

SLQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSST SNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCS LDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ

[0785] Sequência de aminoácidos de sequência de CD137 de camundongo para uso com antígeno recombinante CD137-mFc-Avi (SEQ ID NO: 140)

AVQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTH NAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCS LDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVL

[0786] Sequência de aminoácidos de mFc-Avi para uso com antígenos recombinantes CD137-mFc-Avi (SEQ ID NO: 141)

[0787] Domínio Fc de camundongo (itálico) etiqueta Avi (negrito)

PRGPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQ ISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIE RTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYK NTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGL NDIFEAQKIEWHE

[0788] Sequência de aminoácidos da região de dobradiça de Fcab truncada (SEQ ID NO: 101)

TCPPCP

[0789] Sequência de ácidos nucleicos alternativa de domínio CH3 de Fcab FS20-22-49 (SEQ ID NO: 143)

[0790] AA de Cadeia pesada de FS20-22-49/FS30-5-37 (sem LALA) (SEQ ID NO: 144)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLNCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSYDKYWGSSIYSGLDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0791] DNA de Cadeia pesada de FS20-22-49/FS30-5-37 (sem LALA) (SEQ ID NO: 145)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAATTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGCTATGCCATGAGCTGGGTGCGTCAGG CGCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGCGATTAGCGGTAGTGGCGGTAGCACGTAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAT CTTACGACAAATACTGGGGTTCTTCTATTTACTCTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCC ATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACT TTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACT TTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCC TTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACA CCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCT TGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAA GGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCC ACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCC AAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCAC TGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGG CGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGAC CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGG ATGAACAGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGC CCGGA

[0792] AA de Cadeia pesada de FS20-22-49/FS30-10-3 (sem LALA) (SEQ ID NO: 146)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLNVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0793] DNA de Cadeia pesada de FS20-22-49/FS30-10-3 (sem LALA) (SEQ ID NO: 147)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCAATGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT GCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGG GGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGT CCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCC TCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCA GACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCG AGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTG GGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACG GACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAAT TCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAA CAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCT GAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGA AAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0794] AA de Cadeia pesada de FS20-22-49/FS30-10-12 (sem LALA) (SEQ ID NO: 148)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLTVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0795] DNA de Cadeia pesada de FS20-22-49/FS30-10-12 (sem LALA) (SEQ ID NO: 149)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCACGGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT GCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGG GGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGT CCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCC TCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCA GACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCG AGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTG GGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACG GACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAAT TCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAA CAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCT GAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGA AAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0796] AA de Cadeia pesada FS20-22-49/FS30-10-16 (sem LALA) (SEQ ID NO: 150)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0797] DNA de Cadeia pesada FS20-22-49/FS30-10-16 (sem LALA) (SEQ ID NO: 151)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTAGTTACGATATGAGCTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTGATCCGACTGGTAGCAAGACCGAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG ACCTCTTGGTGTACGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT GCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGG GGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGT CCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCC TCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCA GACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCG AGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTG GGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACG GACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAAT TCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAA CAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCT GAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGA AAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAACAGTTCGCATACAAGA CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0798] AA de Cadeia pesada FS20-22-49/FS30-35-14 (sem LALA) (SEQ ID NO: 152)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYNIHWVRQAPGKGLEWVSDISPYGGATN YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLYELSAYSYGADYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDEYWDQEVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGDEQFAYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDQYRWNPADYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0799] DNA de Cadeia pesada FS20-22-49/FS30-35-14 (sem LALA) (SEQ ID NO: 153)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCT GAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCAGTGCCTATAATATCCATTGGGTGCGTCAGG CTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGATATTTCTCCGTATGGTGGCGCGACCAAC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCT GTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAA ACCTCTACGAGTTGAGCGCTTACTCTTACGGGGCGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCGTCGGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTC CAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCG AGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCG GCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTC CTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGG TCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCA GCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATAC CCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGG ACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACC AAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCT GCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGC CTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGTACTGGGACCAGGAAGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGATGAAC AGTTCGCATACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGATCAGTATAGGTGGAATCCTGCTGATTATTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGA

[0800] Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de mAb G1AA/FS30-10-16 (com LALA) (SEQ ID NO: 154)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSDIDPTGSKTD YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLLVYGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0801] Sequência de aminoácidos de cadeia leve de mAb G1AA/FS30-10-16 (SEQ ID NO: 97)

[0802] Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de mAb G1AA/OX86 (com LALA) (SEQ ID NO: 155)

QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTGYNLHWVRQPPGKGLEWMGRMRYDGDTYY NSVLKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTAIYYCTRDGRGDSFDYWGQGVMVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0803] Sequência de aminoácidos de cadeia leve de mAb G1/OX86 e G1AA/OX86 (SEQ ID NO: 156)

DIVMTQGALPNPVPSGESASITCRSSQSLVYKDGQTYLNWFLQRPGQSPQLLTYWMSTR ASGVSDRFSGSGSGTYFTLKISRVRAEDAGVYYCQQVREYPFTFGSGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0804] Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de FS20m-232-91AA/4420 (com LALA) (SEQ ID NO: 157)

EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYE TYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0805] Sequência de aminoácidos de cadeia leve de FS20m- 232-91AA/4420 (SEQ ID NO: 116)

[0806] Sequência de aminoácidos de CD137-Avi-His Humano (SEQ ID NO: 158)

[0807] CD137 de domínio extracelular (negrito); etiqueta Avi (itálico); etiqueta His (sublinhado)

SLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSST SNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCS LDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQGSGGGLNDIFEAQ KIEWHEHHHHHH

[0808] Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de mAb G1/OX86 (sem LALA) (SEQ ID NO: 159)

QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTGYNLHWVRQPPGKGLEWMGRMRYDGDIYY NSVLKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTAIYYCTRDGRGDSFDYWGQGVMVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0809] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb anti-PD-1 G1AA/5C4 (SEQ ID NO: 160)

[0810] Domínio variável (negrito)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRY YADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0811] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb anti-PD-1 G1AA/5C4 (SEQ ID NO: 161)

[0812] Domínio variável (negrito)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0813] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb anti-PD-L1 G1AA/S1 (SEQ ID NO: 162)

[0814] Domínio variável (negrito)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0815] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb anti-PD-L1 G1AA/S1 (SEQ ID NO: 163)

[0816] Domínio variável (negrito)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0817] Sequência de aminoácidos CD137 de camundongo (SEQ ID NO: 164)

[0818] Domínio extracelular (itálico); Domínios transmembrana e intracelular (negrito)

VQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHN AECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSL DGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVLTLFLALTSALLLA LIFITLLFSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYEL

[0819] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb G1AA/20H4.9 (SEQ ID NO: 165)

[0820] Domínio VH (itálico)

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTY NPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0821] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb G1AA/3H3 (SEQ ID NO: 166)

[0822] Domínio VH (itálico)

EMQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAGSGFTLSDYGVAWVRQAPKKGLEWVAYISYAGGTTY YRESVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCTIDGYGGYSGSHWYFDFWGPGT MVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0823] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAbs G1AA/3H3 e G1/3H3 e mAb2 FS20m-232-91AA/3H3 (SEQ ID NO: 167)

[0824] Domínio VL (itálico)

DIQMTQSPSLLSASVGDRVTLNCRTSQNVYKNLAWYQQQLGEAPKLLIYNANSLQAGIP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYYSGNTFGAGTNLELKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0825] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb G1/3H3 (SEQ ID NO: 168)

[0826] Domínio VH (itálico)

EMQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAGSGFTLSDYGVAWVRQAPKKGLEWVAYISYAGGTTY YRESVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCTIDGYGGYSGSHWYFDFWGPGT MVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0827] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada FS20m- 232-91AA/3H3 (com LALA) (SEQ ID NO: 169)

[0828] Domínio VH (itálico)

EMQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAGSGFTLSDYGVAWVRQAPKKGLEWVAYISYAGGTTY YRESVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCTIDGYGGYSGSHWYFDFWGPGT MVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELFDPMYYYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGEPLWDYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVWRDRWEDGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0829] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb anti-OX40 G1AA/11D4 (SEQ ID NO: 173)

[0830] Domínio VH (itálico)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTID YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELRFYQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPDIFPNGLNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVPYPSWLMGTRFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0831] Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb anti-OX40 G1/11D4 (SEQ ID NO: 174)

[0832] Domínio VH (itálico)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTID YADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELRFYQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPDIFPNGLNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVPYPSWLMGTRFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[0833] Sequência de aminoácidos da cadeia leve de anti- OX40 mAbs G1AA/11D4 e G1/11D4 (SEQ ID NO: 175)

[0834] Domínio VL (itálico)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS

TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Referências

[0835] Todos os documentos mencionados neste relatório descritivo estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0836] Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215(3), 403-10 (1990).

[0837] Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-402 (1997).

[0838] Aspeslagh S, Postel-Vinay S, Rusakiewicz S, Soria JC, Zitvogel L, Marabelle A. Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy. Eur. J. Cancer 52, 50-66 (2016).

[0839] Bagshawe KD, Sharma SK, Springer CJ, Antoniw P,

Rogers GT, Burke PJ, Melton R. Antibody-enzyme conjugates can generate cytotoxic drugs from inactive precursors at tumor sites. Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4, 915-22 (1991).

[0840] Bartkowiak T, Curran MA. 4-1BB agonists: multi- potent potentiators of tumor immunity. Front. Oncol. 5, 117 (2015).

[0841] Bartkowiak T, Jaiswal AR, Ager CR, Chin R, Chen C- H, Budhani P, Ai M, Reilley MJ, Sebastian MM, Hong DS, Curran MA. Activation of 4-1BB on liver myeloid cells triggers hepatitis via an interleukin-27 dependent pathway. Clin. Cancer Res. 24(5), 1138-51 (2018).

[0842] Bedzyk WD, Johnson LS, Riordan GS, Voss EW Jr. Comparison of variable region primary structures within an anti-fluorescein idiotype family. J. Biol. Chem. 264(3), 1565-69 (1989).

[0843] Bedzyk WD, Weidner KM, Denzin LK, Johnson LS, Hardman KD, Pantoliano MW, Asel ED, Voss EW Jr. Immunological and structural characterization of a high affinity anti- fluorescein single-chain antibody. J. Biol. Chem. 265(30), 18615-20 (1990).

[0844] Braden BC, Fields BA, Ysern X, Goldbaum FA, Dall'Acqua W, Schwarz FP, Poljak RJ, Mariuzza RA. Crystal structure of the complex of the variable domain of antibody D1.3 and turkey egg white lysozyme: a novel conformational change in antibody CD3-L3 selects for antigen. J. Mol. Biol. 257(5), 889-94 (1996).

[0845] Bremer E. Targeting of the Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily for Cancer Immunotherapy. ISRN Oncol. 2013, 1-25 (2013).

[0846] Bruhns P, Iannascoli B, England P, Mancardi DA, Fernandez N, Jorieux S, Daëron M. Specificity and affinity of human Fcγ receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood 113(16), 3716-25 (2009).

[0847] Bulliard Y, Jolicoeur R, Windman M, Rue SM, Ettenberg S, Knee DA, Wilson DS, Dranoff G, Brogdon JL. Activating Fc γ receptors contribute to the antitumor activities of immunoregulatory receptor-targeting antibodies. J. Exp. Med. 210(9), 1685-93 (2013)

[0848] Bulliard Y, Jolicoeur R, Zhang J, Dranoff G, Wilson NS, Brogdon JL. OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcγRs, leading to antitumor efficacy. Immunol. Cell Biol. 92(6), 475-80 (2014).

[0849] Chan RC, Ong EZ, Mok DZ, Ooi EE. Fc receptors and their influence on efficacy of therapeutic antibodies for treatment of viral diseses. Expert Rev. Anti-infect. Ther. 13(11), 1351-60 (2015).

[0850] Croft M, So T, Duan W, Soroosh P. The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunol. Rev. 229(1), 173–91 (2009).

[0851] Croft M. The TNF family in T cell differentiation and function – unanswered questions and future directions. Semin. Immunol. 26(3), 183-90 (2014).

[0852] Curti BD, Kovacsovics-Bankowski M, Morris N, Walker E, Chisholm L, Floyd K, Walker J, Gonzalez I, Meeuwsen T, Fox BA, Moudgil T, Miller W, Haley D, Coffey T, Fisher B, Delanty-Miller L, Rymarchyk N, Kelly T, Crocenzi T, Bernstein E, Sanborn R, Urba WJ, Weinberg AD. OX40 is a potent immune- stimulating target in late-stage cancer patients. Cancer Res. 73(24), 7189-98 (2013).

[0853] Dubrot J, Milheiro F, Alfaro C, Palazón A, Martinez-Forero I, Perez-Gracia JL, Morales-Kastresana A, Romero-Trevejo JL, Ochoa MC, Hervás-Stubbs S, Prieto J, Jure- Kunkel M, Chen L, Melero I. Treatment with anti-CD137 mAbs cause intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ. Cancer Immunol. Immunother. 59(8), 1223-33 (2010).

[0854] Glisson BS, Leidner R, Ferris RL, Powderly J, Rizvi N, Norton JD, Burton J, Lanasa MC, Patel SP. Phase 1 study of MEDI0562, a humanized OX40 agonist monoclonal antibody (mAb), in adult patients (pts) with advanced solid tumours. Ann. Oncol. 27(suppl_6), 1052PD (2016).

[0855] Gopal A, Levy R, Houot, R, Patel S, Hatake K, Popplewell L, Chen Y, Davis C, Huang, B, Cesari R, Thall A, Woolfson A, Bartlett N. A phase I study of utomilumab (PF- 05082566), a 4-1BB/CD137 agonist, in combination with ritixumab in patients with CD20+ non-Hodgkin’s lymphoma. Hematol. Oncol. 35, 260 (2017).

[0856] Jefferis R, Reimer CB, Skvaril F, de Lange G, Ling NR, Lowe J, Walker MR, Phillips DJ, Aloisio CH, Wells TW. Evaluation of monoclonal antibodies having specificity for human IgG sub-classes: results of an IUIS/WHO collaborative study. Immunol. Lett.1, 223-52 (1985).

[0857] Jefferis R, Reimer CB, Skvaril F, de Lange GG, Goodall DM, Bentley TL, Phillips DJ, Vlug A, Harada S, Radl J. Evaluation of monoclonal antibodies having specificity for human IgG subclasses: results of the 2nd IUIS/WHO collaborative study. Immunol. Lett. 31(2),143-68 (1992).

[0858] Hezareh M, Hessell AJ, Jensen RC, van de Winkel JG, Parren PW. Effector function activities of a panel of mutants of a broadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 75(24), 12161-8 (2001).

[0859] Hirschhorn-Cymerman D, Rizzuto GA, Merghoub T, Cohen AD, Avogadri F, Lesokhin AM, Weinberg AD, Wolchok JD, Houghton AN. OX40 engagement and chemotherapy combination provides potent antitumor immunity with concomitant regulatory T cell apoptosis. J. Exp. Med. 206(5), 1103-16 (2009).

[0860] Holliger P, Hudson PJ. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat. Biotechnol. 23(9), 1126-36 (2005).

[0861] Hu S, Shively L, Raubitschek A, Sherman M, Williams LE, Wong JY, Shively JE, Wu AM. Minibody: A novel engineered anti-carcinoembryonic antigen antibody fragment (single- chain Fv-CH3) which exhibits rapid, high-level targeting of xenografts. Cancer Res. 56(13), 3055-61 (1996).

[0862] Idusogie EE, Presta LG, Gazzano-Santoro H, Totpal K, Wong PY, Ultsch M, Meng YG, Mulkerrin MG. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc. J. Immunol. 164(8), 4178-84 (2000).

[0863] Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º edição. NIH Publicação nº 91-3242. Washington, D.C.: Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA (1991).

[0864] Kjaergaard J, Tanaka J, Kim JA, Rothchild K, Weinberg A, Shu S. Therapeutic efficacy of OX-40 receptor antibody depends on tumor immunogenicity and anatomic site of tumor growth. Cancer Res. 60(19), 5514-21 (2000).

[0865] Klein C, Schaefer W, Regula JT. The use of CrossMAb technology for the generation of bi- and multispecific antibodies. MAbs 8(6), 1010-20 (2016).

[0866] Ledermann JA, Begent RH, Massof C, Kelly AM, Adam T, Bagshawe KD. A phase-I study of repeated therapy with radiolabelled antibody to carcinoembryonic antigen using intermittent or continuous administration of cyclosporin A to supress the immune response. Int. J. Cancer 47(5), 659- 64 (1991).

[0867] Lee SJ, Myers L, Muralimohan G, Dari J, Qiao Y, Li Z, Mittler RS, Vella AT. 4-1BB and OX40 dual costimulation synergistically stimulate primary specific CD8 T cells for robust effector function. J. Immunol. 173(5), 3002-12 (2004).

[0868] Lefranc MP, Pommié C, Kaas Q, Duprat E, Bosc N, Guiraudou D, Jean C, Ruiz M, Da Piédade I, Rouard M, Foulquier E, Thouvenin V, Lefranc G. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains. Dev. Comp. Immunol. 29(3), 185-203 (2005).

[0869] Lefranc MP, Giudicelli V, Duroux P, Jabado- Michaloud J, Folch G, Aouinti S, Carillon E, Duvergey H, Houles A, Paysan-Lafosse T, Hadi-Saljoqi S, Sasorith S, Lefranc G, Kossida S. IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® 25 years on. Nucleic Acids Res. 43 (Emissão de Banco de dados), D413-22 (2015).

[0870] Liu C, Workman CJ, Vignali DA. Targeting regulatory T cells in tumors. FEBS J. 283(14), 2731-48 (2016).

[0871] Ma BY, Mikolajczak SA, Danesh A, Hosiawa KA, Cameron CM, Takaori-Kondo A, Uchiyama T, Kelvin DJ, Ochi A.

The expression and the regulatory role of OX40 and 4-1BB heterodimer in activated human T cells. Blood 106(6), 2002- 10 (2005).

[0872] Mayes PA, Hance KW, Hoos A. The promise and challenges of immune agonist antibody development in cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 17, 509-27 (2018).

[0873] Melero I, Hirschhorn-Cymerman D, Morales- Kastresana A, Sanmamed MF, Wolchok JD. Agonist antibodies to TNFR molecules that costimulate T and NK cells. Clin. Cancer Res. 19(5), 1044-53 (2013).

[0874] Milas L, Wike J, Hunter N, Volpe J, Basic I. Macrophage content of murine sarcomas and carcinomas: associations with tumor growth parameters and tumor radiocurability. Cancer Res. 47(4), 1069-75 (1987).

[0875] Miller L, Rymarchyk N, Kelly T, Crocenzi T, Bernstein E, Sanborn R, Urba WJ, Weinberg AD. OX40 is a potent immune-stimulating target in late-stage cancer patients. Cancer Res. 73(24), 7189-98 (2013).

[0876] Moran AE, Kovacsovics-Bankowski M, Weinberg AD. The TNFRs OX40, 4-1BB, and CD40 as targets for cancer immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 25(2), 230-7 (2013).

[0877] Müller N, Wyzgol A, Münkel S, Pfizenmaier K, Wajant H. Activity of soluble OX40 ligand is enhanced by oligomerization and cell surface immobilization. FEBS J. 275(9), 2296-304 (2008).

[0878] Nizar S, Copier J, Meyer B, Bodman-Smith M, Galustian C, Kumar D, Dalgleish A. T-regulatory cell modulation: the future of cancer immunotherapy? Br. J. Cancer 100(11), 1697-703 (2009).

[0879] Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 12(4), 252–264 (2012).

[0880] Pearson WR, Lipman DJ. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(8), 2444-8 (1988).

[0881] Petty JK, He K, Corless CL, Vetto JT, Weinberg AD. Survival in human colorectal cancer correlates with expression of the T-cell costimulatory molecule OX-40 (CD134). Am. J. Surg. 183(5), 512-8 (2002).

[0882] Powell DJ Jr, de Vries CR, Allen T, Ahmadzadeh M, Rosenberg SA. Inability to mediate prolonged reduction of regulatory T cells after transfer of autologous CD25- depleted PBMC and interleukin-2 after lymphodepleting chemotherapy. J. Immunother. 30(4), 438-47 (2007).

[0883] Qui HZ, Hagymasi AT, Bandyopadhyay S, St Rose M- C, Ramanarasimhaiah R, Menoret A, Mittler RS, Gordon SM, Reiner SL, Vella AT, Adler AJ. CD134 plus CD137 dual costimulation induces Eomesodermin in CD4 T cells to program cytotoxic Th1 differentiation. J. Immunol. 187(7), 3555-64 (2011).

[0884] Rosenberg S. Development of Cancer Vaccines. ASCO Educational Book Spring: 60-62 (2000).

[0885] Ryan JM, Mittal P, Menoret A, Svedova J, Wasser JS, Adler AJ, Vella AT. A novel biologic platform elicits profound T cell costimulatory activity and antitumor immunity in mice. Cancer Immunol. Immunother. 67(4), 605-13 (2018).

[0886] Sadun RE, Hsu WE, Zhang N, Nien YC, Bergfeld SA, Sabzevari H, Lutsiak ME, Khawli L, Hu P, Epstein AL. Fc- mOX40L fusion protein produces complete remission and enhanced survival in 2 murine tumour models. J. Immunother. 31(3), 235-45 (2008).

[0887] Sanchez-Paulete AR, Labiano S, Rodriguez-Ruiz ME, Azpilikueta A, Etxeberria I, Bolaños E, Lang V, Rodriguez M, Aznar MA, Jure-Kunkel M, Melero I. Deciphering CD137 (4-1BB) signaling in T-cell costimulation for translation into successful cancer immunotherapy. Eur. J. Immunol. 46(3), 513-22 (2016).

[0888] Schaer DA, Hirschhorn-Cymerman D, Wolchok JD. Targeting tumor-necrosis factor receptor pathways for tumor immunotherapy. J. Immunother. Cancer 2, 7 (2014).

[0889] Segal NH, Logan TF, Hodi FS, McDermott D, Melero I, Hamid O, Schmidt H, Robert C, Chiarion-Sileni V, Ascierto PA, Maio M, Urba WJ, Gangadhar TC, Suryawanshi S, Neely J, Jure-Kunkel M, Krishnan S, Kohrt H, Sznol M, Levy R. Results from an integrated safety analysis of urelumab, an agonist anti-CD137 monoclonal antibody. Clin. Cancer Res. 23(8), 1929-36 (2017).

[0890] Simpson TR., Li F, Montalvo-Ortiz W, Sepulveda MA, Bergerhoff K, Arce F, Roddie C, Henry JY, Yagita H, Wolchok JD, Peggs KS, Ravetch JV, Allison JP, Quezada SA. Fc- dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti–CTLA-4 therapy against melanoma. J. Exp. Med. 210(9), 1695-710 (2013).

[0891] Smith TF, Waterman MS. Identification of common molecular subsequences. J. Mol. Biol. 147(1), 195-7 (1981).

[0892] Stewart R, Hammond SA, Oberst M, Wilkinson RW. The role of Fc gamma receptors in the activity of immunomodulatory antibodies for cancer. J. Immunother. Cancer 2(29) (2014).

[0893] Takeda I, Ine S, Killeen N, Ndhlovu LC, Murata K, Satomi S, Sugamura K, Ishii N. Distinct roles for the OX40- OX40 ligand interaction in regulatory and nonregulatory T cells. J. Immunol. 172(6), 3580-9 (2004).

[0894] Taraban VY, Rowley TF, O’Brien L, Chan HT, Haswell LE, Green MH, Tutt AL, Glennie MJ, Al-Shamkhani A. Expression and costimulatory effects of the TNF receptor superfamily members CD134 OX40) and CD137 (4-1BB), and their role in the generation of anti-tumor immune responses. Eur. J. Immunol. 32(12), 3617-27 (2002).

[0895] Tolcher AW, Sznol M, Hu-Lieskovan S, Papadopoulos K P, Patnaik A, Rasco DW, Di Gravio D, Huang B, Gambhire D, Chen Y, Thall AD, Pathan N, Schmidt EV, Chow LQM. Phase Ib study of utomilumab (PF-05082566), a 4-1BB/CD137 agonist, in combination with pembrolizumab (MK-3475) in patients with advanced solid tumors. Clin. Cancer Res. 23(18), 5349-57 (2017).

[0896] Tran B, Carvajal RD, Marabelle A, Patel SP, LoRusso P, Ramussen E, Juan G, Upreti VV, Ngarmchamnanrith G, Schöffski P. Dose escalation results from a first-in-human, phase 1 study of the glucocorticoid-induced TNF receptor- related protein (GITR) agonist AMG 228 in patients (Pts) with advanced solid tumours. J. Clin. Oncol. 35(15_suppl), 2521 (2017).

[0897] Vanamee ÉS, Faustman DL. Structural principles of tumor necrosis factor superfamily signaling. Sci. Signal. 11(511), 1-12 (2018).

[0898] Vetto JT, Lum S, Morris A, Sicotte M, Davis J, Lemon M, Weinberg A. Presence of the T-cell activation marker OX-40 on tumor infiltrating lymphocytes and draining lymph node cells from patients with melanoma and head and neck cancers. Am. J. Surg. 174(3), 258-65 (1997).

[0899] Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat. Rev. Immunol. 8(7), 523-32 (2008).

[0900] Wajant H. Principles of antibody-mediated TNF receptor activation. Cell Death Differ. 22(11), 1727-41 (2015).

[0901] Wang X, Mathieu M, Brezski RJ. IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions. Protein Cell 9(1), 63-73 (2018).

[0902] Weigelin B, Bolaños E, Rodriguez-Ruiz ME, Martinez-Forero I, Friedl P, Melero I. Anti-CD137 monoclonal antibodies and adoptive T cell therapy: a perfect marriage? Cancer Immunol. Immunother. 65(5), 493-7 (2016).

[0903] Wen T, Bukczynski J, Watts TH. 4-1BB ligand- mediated costimulation of human T cells induces CD4 and CD8 T cell expansion, cytokine production, and the development of cytolytic effector function. J. Immunol. 168(10), 4897- 906 (2002).

[0904] Wesche-Soldato DE, Chung CS, Gregory SH, Salazar- Mather TP, Ayala CA, Ayala A. CD8+ T cells promote inflammation and apoptosis in the liver after sepsis: role of Fas-FasL. Am. J. Pathol. 171(1), 87-96 (2007).

[0905] Wilcox RA, Flies DB, Zhu G, Johnson AJ, Tamada K, Chapoval AI, Strome SE, Pease LR, Chen L. Provision of antigen and CD137 signaling breaks immunological ignorance, promoting regression of poorly immunogenic tumors. J. Clin. Invest. 109(5), 651-9 (2002).

[0906] Wozniak-Knopp G, Bartl S, Bauer A, Mostageer M,

Woisetschläger M, Antes B, Ettl K, Kainer M, Weberhofer G, Wiederkum S, Himmler G, Mudde GC, Rüker F.

Introducing antigen-binding sites in structural loops of immunoglobulin constant domains: Fc fragments with engineered HER2/neu- binding sites and antibody properties.

Protein Eng.

Des.

Sel. 23(4), 289-97 (2010).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de anticorpo que se liga a CD137 e OX40 caracterizada por compreender (a) um sítio de ligação a antígeno à base de região determinante de complementaridade (CDR) para CD137; e (b) um sítio de ligação a antígeno OX40 localizado em um domínio CH3 da molécula de anticorpo; em que o sítio de ligação a antígeno à base de CDR compreende CDRs 1-6 apresentados em: (i) SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 1, 2, 16, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-3]; (iii) SEQ ID NOs 1, 2, 21, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-12]; (iv) SEQ ID NOs 25, 26, 27, 4, 5 e 28, respectivamente [FS30-35-14]; ou (v) SEQ ID NOs 33, 34, 35, 4, 5 e 36, respectivamente [FS30-5-37]; e em que o sítio de ligação a antígeno OX40 compreende uma primeira sequência, uma segunda sequência e uma terceira sequência localizadas nas alças estruturais AB, CD e EF do domínio CH3, respectivamente, em que as primeira, segunda e terceira sequências têm a sequência estabelecida em SEQ ID NOs 51, 52 e 53, respectivamente [FS20-22-49].

2. Molécula de anticorpo, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: (i) a primeira sequência está localizada nas posições 14 a 18 do domínio CH3 da molécula de anticorpo;

(ii) a segunda sequência está localizada nas posições

3. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por compreender a sequência de domínio CH3 apresentada em SEQ ID NO: 54 [FS20-22-49].

4. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizada pelo fato de que a molécula de anticorpo compreende os domínio VH e domínio VL estabelecidos em: (i) SEQ ID NOs 12 e 14, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) SEQ ID NOs 18 e 14, respectivamente [FS30-10-3]; (iii) SEQ ID NOs 23 e 14, respectivamente [FS30- 10-12]; (iv) SEQ ID NOs 170 e 172, respectivamente [FS30-35- 14]; ou (v) SEQ ID NOs 40 e 42, respectivamente [FS30-5-37].

5. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por compreender a cadeia pesada e a cadeia leve de anticorpo: (i) FS20-22-49AA/FS30-10-16 apresentadas em SEQ ID NOs 95 e 97, respectivamente; (ii) FS20-22-49AA/FS30-10-3 apresentadas em SEQ ID NOs 99 e 97, respectivamente; (iii) FS20-22-49AA/FS30-10-12 apresentadas em SEQ ID NOs

103 e 97, respectivamente; (iv) FS20-22-49AA/FS30-35-14 apresentadas em SEQ ID NOs 105 e 107, respectivamente; ou (v) FS20-22-49AA/FS30-5-37 apresentadas em SEQ ID NOs 109 e 111, respectivamente.

6. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por compreender: (i) CDRs 1-6 apresentadas em SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente [FS30-10-16]; (ii) o domínio VH e domínio VL apresentados em SEQ ID NOs 12 e 14, respectivamente [FS30-10-16]; e/ou (iii) as cadeia pesada e cadeia leve estabelecidas em SEQ ID NOs 95 e 97, respectivamente [FS20-22-49AA/FS30-10- 16].

7. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por se ligar a CD137 humano e OX40 humano.

8. Molécula de anticorpo, de acordo com reivindicação 7, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por ter a capacidade para se ligar a CD137 humano e OX40 humano simultaneamente.

9. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por ter a capacidade para ativar o OX40 em uma célula imunológica na presença de CD137 expresso em superfície celular, e/ou a molécula de anticorpo tem a capacidade para ativar CD137 em uma célula imunológica na presença de OXX40 expresso em superfície celular.

10. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizada pelo fato de que a ligação da molécula de anticorpo a OX40 em uma célula imunológica e a CD137 causa o agrupamento de OX40 na célula imunológica, e/ou em que a ligação da molécula de anticorpo a CD137 na célula imunológica e a OX40 causa o agrupamento de CD137 na célula imunológica.

11. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo a molécula de anticorpo caracterizada por ter sido modificada para reduzir ou anular a ligação do domínio CH2 da molécula de anticorpo para um ou mais receptores Fcγ.

12. Molécula ou moléculas de ácido nucleico caracterizadas por codificarem a molécula de anticorpo conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores.

13. Vetor ou vetores caracterizados por compreenderem a molécula ou as moléculas de ácido nucleico conforme definidas na reivindicação 12.

14. Célula hospedeira recombinante caracterizada por compreender a molécula (ou moléculas) de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 12 ou o vetor (ou vetores) conforme definido na reivindicação 13.

15. Método de produção da molécula de anticorpo conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira recombinante conforme definida na reivindicação 14, sob condições para a produção da molécula de anticorpo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender adicionalmente isolar e/ou purificar a molécula de anticorpo.

17. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a molécula de anticorpo conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

18. Molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por ser para uso em um método de tratamento de câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo.

19. Método de tratamento de câncer ou uma doença infecciosa em um indivíduo caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de anticorpo conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

20. Molécula de anticorpo para uso em um método de tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 18, ou método de tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 19, sendo o método caracterizado por compreender administrar a molécula de anticorpo ao indivíduo em combinação com uma segunda terapia.

21. Molécula de anticorpo para uso ou método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a segunda terapia é um anticorpo que se liga a PD-1 ou PD-L1.