BR112021000058A2 - USE OF GLYCOSYL TRANSFERASE TO PROVIDE IMPROVED TEXTURE IN FERMENTED MILK PRODUCTS - Google Patents
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Abstract
uso de glicosiltransferase para fornecer textura aprimorada em produtos à base de leite fermentado. a presente invenção refere-se a um método de produção de um produto de iogurte tendo uma espessura aumentada que tem as etapas de fornecer leite; adicionar sacarose ao leite para formar leite adoçado; colocar o leite adoçado com uma glicosil transferase para formar um polímero de glicose insolúvel; inoculação com uma cultura iniciadora; e fermentação para fornecer o produto de iogurte tendo uma espessura aumentada. são providos métodos adicionais.use of glycosyltransferase to provide improved texture in fermented milk products. the present invention relates to a method of producing a yogurt product having an increased thickness that has the steps of delivering milk; adding sucrose to the milk to form sweetened milk; placing the sweetened milk with a glycosyl transferase to form an insoluble glucose polymer; inoculation with a starter culture; and fermentation to provide the yogurt product having an increased thickness. additional methods are provided.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE GLICOSILTRANSFERASE PARA FORNECER TEXTURA APRIMO- RADA EM PRODUTOS À BASE DE LEITE FERMENTADO".Invention Patent Descriptive Report for "USE OF GLYCOSYLTRANSPHERASE TO PROVIDE IMPROVED TEXTURE IN PRODUCTS BASED ON FERMENTED MILK".
[001] A textura é um parâmetro de qualidade e valor principal de produtos lácteos fermentados frescos, como iogurtes e leites fermen- tados. A textura do iogurte em relação à sensação alimentar do con- sumidor tem forte impacto na percepção do consumidor. Atualmente, estabilizantes, como amido são aditivos comuns ao iogurte para me- lhorar a textura. Os iogurtes contendo amido, entretanto, exigem ma- nuseio especial durante o processamento, a fim de não perder a textu- ra criada pelo amido através de forças de cisalhamento. O uso de amido também aumenta o custo do iogurte. Além disso, é bem conhe- cido que o amido afeta negativamente o iogurte de várias maneiras. Primeiro, o amido diminui o "brilho" do iogurte, afetando negativamente a percepção visual do consumidor. Além disso, o amido adicionado leva frequentemente a uma secura sensorial indesejável do iogurte.[001] Texture is a parameter of quality and main value of fresh fermented dairy products, such as yogurts and fermented milks. The texture of the yogurt in relation to the consumer's food sensation has a strong impact on the consumer's perception. Currently, stabilizers such as starch are common additives to yogurt to improve texture. Starch-containing yogurts, however, require special handling during processing, in order not to lose the texture created by starch through shear forces. The use of starch also increases the cost of yogurt. In addition, it is well known that starch negatively affects yogurt in several ways. First, starch decreases the "shine" of yogurt, negatively affecting the consumer's visual perception. Furthermore, the added starch often leads to an undesirable sensory dryness of the yogurt.
[002] Além do amido, os níveis de proteína e gordura no iogurte também contribuem de uma maneira significativa com a textura. Além disso, os níveis de gordura também afetam o sabor. A modificação do nível de proteína ou gordura é uma maneira de trabalhar o perfil de custo e o perfil nutricional do iogurte. Ao reduzir o teor de qualquer um desses, é comum usar outros ingredientes para compensar a perda de textura ou sabor, tipicamente adicionando-se ingredientes, como ami- do.[002] In addition to starch, the levels of protein and fat in yogurt also contribute significantly to texture. In addition, fat levels also affect the taste. Modifying the level of protein or fat is a way of working with the cost profile and nutritional profile of yogurt. When reducing the content of any of these, it is common to use other ingredients to compensate for the loss of texture or flavor, typically by adding ingredients, such as starch.
[003] Há uma necessidade de adicionar textura aos produtos à base de leite fermentado que não inclua a adição de amido ou outros estabilizantes.[003] There is a need to add texture to fermented milk products that does not include the addition of starch or other stabilizers.
[004] De acordo com um aspecto da presente invenção, é apre-[004] In accordance with one aspect of the present invention, it is
sentado um método para produzir um produto de iogurte que tem tex- tura aprimorada, sendo que a textura aprimorada é espessura e/ou sensação bucal aumentada, que tem as etapas de: fornecer leite; adi- cionar sacarose ao leite para formar leite adoçado; colocar o leite ado- çado em contato com uma glicosiltransferase para formar um polímero de glicose insolúvel; inocular com uma cultura inicial; e fermentar para fornecer o produto de iogurte que tem textura aprimorada que é es- pessura aumentada e/ou sensação bucal aumentada.sitting a method to produce a yogurt product that has improved texture, and the improved texture is increased thickness and / or mouthfeel, which has the steps of: providing milk; adding sucrose to the milk to form sweetened milk; placing the sweetened milk in contact with a glycosyltransferase to form an insoluble glucose polymer; inoculate with an initial culture; and ferment to provide the yogurt product that has an improved texture that is increased thickness and / or increased mouthfeel.
[005] Opcionalmente, o leite é leite de vaca. Opcionalmente, o leite é selecionado dentre o grupo que consiste em leite cru, leite pré- pasteurizado, leite integral, leite desnatado, leite reconstituído, leite tratado com lactase, leite com teor de lactose reduzido, leite sem lac- tose e leite condensado. Opcionalmente, o leite é leite cru.[005] Optionally, milk is cow's milk. Optionally, milk is selected from the group consisting of raw milk, pre-pasteurized milk, whole milk, skimmed milk, reconstituted milk, milk treated with lactase, milk with reduced lactose content, milk without lactose and condensed milk. Optionally, milk is raw milk.
[006] Opcionalmente, o método tem as etapas adicionais de ho- mogeneizar e pasteurizar o leite. Opcionalmente, a etapa de colocar em contato com glicosiltransferase é realizada após as etapas de ho- mogeneizar e pasteurizar. Opcionalmente, a etapa de colocar em con- tato com glicosiltransferase é realizada antes das etapas de homoge- neizar e pasteurizar.[006] Optionally, the method has the additional steps of homogenizing and pasteurizing the milk. Optionally, the step of putting in contact with glycosyltransferase is performed after the steps of homogenizing and pasteurizing. Optionally, the step of contacting with glycosyltransferase is performed before the steps of homogenizing and pasteurizing.
[007] Opcionalmente, a sacarose é adicionada para constituir cerca de 0,1 a 12% (p/p). Opcionalmente, a sacarose é adicionada pa- ra constituir cerca de 2 a 8% (p/p). Opcionalmente, a sacarose é adici- onada para constituir cerca de 4 a 6% (p/p).[007] Optionally, sucrose is added to make up about 0.1 to 12% (w / w). Optionally, sucrose is added to make up about 2 to 8% (w / w). Optionally, sucrose is added to make up about 4 to 6% (w / w).
[008] Opcionalmente, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com uma enzima seleci- onada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765[008] Optionally, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 70% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: : 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765
(SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Opcionalmente, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Opcional- mente, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Opcionalmente, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com uma enzi- ma selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Opcionalmente, a gli- cosiltransferase é selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ(SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Optionally, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 80% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO : 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Optionally, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 90% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8) , GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Optionally, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 95% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8) , GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Optionally, glycosyltransferase is selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ
ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Opcional- mente, a glicosiltransferase é GTFJ (SEQ ID NO: 1).ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11) , GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Optionally, the glycosyltransferase is GTFJ (SEQ ID NO: 1).
[009] Opcionalmente, a glicosiltransferase está presente no leite em uma quantidade de cerca de 0,005 mg por 100 ml de leite a 15 mg por 100 ml de leite. Opcionalmente, a glicosiltransferase está presente em uma quantidade de cerca de 0,03 mg por 100 ml de leite a cerca de 12,5 mg por 100 ml de leite.[009] Optionally, glycosyltransferase is present in milk in an amount of about 0.005 mg per 100 ml of milk to 15 mg per 100 ml of milk. Optionally, the glycosyltransferase is present in an amount of about 0.03 mg per 100 ml of milk to about 12.5 mg per 100 ml of milk.
[0010] Opcionalmente, a GTFJ está presente em uma quantidade de cerca de 0,033 mg por 100 ml de leite a cerca de 12,5 mg por 100 ml de leite. Opcionalmente, a GTFJ está presente em uma quantidade de cerca de 0,3 mg por 100 ml de leite a cerca de 5,0 mg por 100 ml de leite.[0010] Optionally, GTFJ is present in an amount of about 0.033 mg per 100 ml of milk to about 12.5 mg per 100 ml of milk. Optionally, GTFJ is present in an amount of about 0.3 mg per 100 ml of milk to about 5.0 mg per 100 ml of milk.
[0011] Opcionalmente, a glicosiltransferase é GTF300 (SEQ ID NO: 2). Opcionalmente, a GTF300 está presente em uma quantidade de cerca de 0,033 mg por 100 ml a cerca de 12,5 mg por 100 ml de leite. Opcionalmente, a GTF300 está presente em uma quantidade de cerca de 1,25 mg por 100 ml de leite a cerca de 5 mg por 100 ml de leite.[0011] Optionally, the glycosyltransferase is GTF300 (SEQ ID NO: 2). Optionally, GTF300 is present in an amount of about 0.033 mg per 100 ml to about 12.5 mg per 100 ml of milk. Optionally, GTF300 is present in an amount of about 1.25 mg per 100 ml of milk to about 5 mg per 100 ml of milk.
[0012] Opcionalmente, a textura aumentada é espessura aumen- tada. Opcionalmente, a espessura é aumentada em 30% ou mais em comparação com uma amostra de controle (sem enzima GTF). Opcio- nalmente, a espessura é aumentada em 50% ou mais. Opcionalmente, a espessura é aumentada em 70% ou mais. Opcionalmente, a espes- sura é aumentada em 90% ou mais. Opcionalmente, a espessura é aumentada em 100% ou mais. Opcionalmente, a espessura é aumen- tada em 110% ou mais. Opcionalmente, a espessura é aumentada em 120% ou mais.[0012] Optionally, the increased texture is increased thickness. Optionally, the thickness is increased by 30% or more compared to a control sample (without GTF enzyme). Optionally, the thickness is increased by 50% or more. Optionally, the thickness is increased by 70% or more. Optionally, the thickness is increased by 90% or more. Optionally, the thickness is increased by 100% or more. Optionally, the thickness is increased by 110% or more. Optionally, the thickness is increased by 120% or more.
[0013] Opcionalmente, a textura aumentada é sensação bucal aumentada. Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 30% ou mais em comparação com uma amostra de controle (sem enzima GTF). Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 50% ou mais. Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 70% ou mais. Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 90% ou mais. Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 100% ou mais. Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 110% ou mais. Opcionalmente, a sensação bucal é aumentada em 120% ou mais.[0013] Optionally, the increased texture is increased mouthfeel. Optionally, the mouthfeel is increased by 30% or more compared to a control sample (without GTF enzyme). Optionally, the mouthfeel is increased by 50% or more. Optionally, the oral sensation is increased by 70% or more. Optionally, the mouthfeel is increased by 90% or more. Optionally, the mouthfeel is increased by 100% or more. Optionally, the mouthfeel is increased by 110% or more. Optionally, the oral sensation is increased by 120% or more.
[0014] Opcionalmente, o método inclui as etapas adicionais de resfriar o iogurte até uma temperatura entre 5 e 10 ◦C para fornecer um iogurte resfriado; e verter o iogurte resfriado em recipientes pré- formados. Opcionalmente, os recipientes fornecem uma porção indivi- dual de iogurte.[0014] Optionally, the method includes the additional steps of cooling the yogurt to a temperature between 5 and 10 ◦C to provide a chilled yogurt; and pour the cooled yogurt into preformed containers. Optionally, the containers provide an individual portion of yogurt.
[0015] Opcionalmente, o leite é leite com baixo teor de gordura para fornecer um iogurte com baixo teor de gordura. Opcionalmente, o leite é leite sem gordura para fornecer um iogurte sem gordura.[0015] Optionally, milk is low-fat milk to provide low-fat yogurt. Optionally, milk is fat-free milk to provide a fat-free yogurt.
[0016] Opcionalmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3% (p/p). Opcionalmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3,5%. Opcionalmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3,7% (p/p). Opcionalmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3,8% (p/p). Opcionalmente, o teor de proteína do leite é ajus- tado em pelo menos cerca de 3,9% (p/p). Opcionalmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 4,0% (p/p).[0016] Optionally, the protein content of milk is adjusted by at least about 3% (w / w). Optionally, the protein content of the milk is adjusted by at least about 3.5%. Optionally, the milk protein content is adjusted by at least about 3.7% (w / w). Optionally, the milk protein content is adjusted by at least about 3.8% (w / w). Optionally, the protein content of the milk is adjusted by at least about 3.9% (w / w). Optionally, the protein content of the milk is adjusted by at least about 4.0% (w / w).
[0017] De acordo com um aspecto da presente invenção, é apre- sentado um iogurte que é produzido de acordo com qualquer um dos métodos anteriores. Opcionalmente, o iogurte contém pectina.[0017] In accordance with one aspect of the present invention, a yoghurt is produced which is produced according to any of the previous methods. Optionally, the yogurt contains pectin.
[0018] A Figura 1 mostra um fluxograma para inoculação de leite com cultura e tratamento com enzima GTF.[0018] Figure 1 shows a flow chart for inoculating milk with culture and treatment with GTF enzyme.
[0019] A Figura 2 representa a espessura e sensação bucal de iogurte tratado com GTF300 e de controle após 5 dias usando três cul- turas iniciais diferentes: A Figura 2A (YO-MIX 860), a Figura 2B (YO- MIX 495) e a Figura 2C (YO-MIX 465).[0019] Figure 2 represents the thickness and mouthfeel of yogurt treated with GTF300 and control after 5 days using three different initial cultures: Figure 2A (YO-MIX 860), Figure 2B (YO-MIX 495) and Figure 2C (YO-MIX 465).
[0020] A Figura 3 representa a espessura e sensação bucal do iogurte tratado com enzima e de controle após 28 dias com adição de GTF300 ao mesmo tempo que a inoculação de cultura usando três cul- turas iniciais diferentes: A Figura 3A (YO-MIX 860), a Figura 3B (YO- MIX 495) e a Figura 3C (YO-MIX 465).[0020] Figure 3 represents the thickness and mouthfeel of yogurt treated with enzyme and control after 28 days with addition of GTF300 at the same time as inoculation of culture using three different initial cultures: Figure 3A (YO-MIX 860), Figure 3B (YO-MIX 495) and Figure 3C (YO-MIX 465).
[0021] A Figura 4 representa um fluxograma para adição de enzi- ma antes da pasteurização e homogeneização.[0021] Figure 4 represents a flowchart for adding enzyme before pasteurization and homogenization.
[0022] A Figura 5 representa a espessura e sensação bucal de iogurte tratado com GTF300 e de controle após 7 dias com adição de enzima antes da pasteurização e homogeneização usando quatro cul- turas iniciais diferentes: A Figura 5A (YO-MIX 495), a Figura 5B (YO- MIX 465), a Figura 5C (YO-MIX 860) e a Figura 5D (YO-MIX 204).[0022] Figure 5 represents the thickness and mouthfeel of yogurt treated with GTF300 and control after 7 days with addition of enzyme before pasteurization and homogenization using four different initial cultures: Figure 5A (YO-MIX 495), Figure 5B (YO-MIX 465), Figure 5C (YO-MIX 860) and Figure 5D (YO-MIX 204).
[0023] A Figura 6 representa a espessura e sensação bucal de iogurte tratado com enzima e de controle após 28 dias com adição de GTF300 antes da pasteurização e homogeneização usando quatro cul- turas iniciais diferentes: A Figura 6A (YO-MIX 860), a Figura 6B (YO- MIX 495), a Figura 6C (YO-MIX 465) e a Figura 6D (YO-MIX 204).[0023] Figure 6 represents the thickness and mouthfeel of yogurt treated with enzyme and control after 28 days with the addition of GTF300 before pasteurization and homogenization using four different initial cultures: Figure 6A (YO-MIX 860), Figure 6B (YO-MIX 495), Figure 6C (YO-MIX 465) and Figure 6D (YO-MIX 204).
[0024] A Figura 7A (2% de sacarose) e 7B (4% de sacarose) es- pessura e sensação bucal conforme avaliado com adição de GTF300 antes da pasteurização e homogeneização.[0024] Figure 7A (2% sucrose) and 7B (4% sucrose) thickness and mouthfeel as assessed with the addition of GTF300 before pasteurization and homogenization.
[0025] A Figura 8 representa o efeito de resfriamento de iogurte a temperaturas diferentes na textura e sensação bucal gerada pela GTF300 após o preenchimento.[0025] Figure 8 represents the cooling effect of yogurt at different temperatures on the texture and mouthfeel generated by GTF300 after filling.
[0026] A Figura 9 representa o efeito de GTFJ na espessura e sensação bucal. A Figura 9A mostra o efeito de GTFJ em função da concentração enzimática e a Figura 9B mostra o efeito de 3,7% de proteína mais GTFJ em comparação com um iogurte com 4% de pro- teína sem enzima.[0026] Figure 9 represents the effect of GTFJ on the thickness and mouthfeel. Figure 9A shows the effect of GTFJ as a function of enzyme concentration and Figure 9B shows the effect of 3.7% protein plus GTFJ compared to a yogurt with 4% protein without enzyme.
[0027] A Figura 10 representa um extrato do cromatograma de 5% de sacarose em água ou 5% de sacarose e 5% de lactose em água com GTF300 em uma dose de 0,2% em água. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE-[0027] Figure 10 represents an extract from the chromatogram of 5% sucrose in water or 5% sucrose and 5% lactose in water with GTF300 in a dose of 0.2% in water. REFERENCE TO THE LIST OF SEQUENCES SUBMITTED
[0028] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida ele- tronicamente via EFS-Web como uma Listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo nomeado 20180703_NB41287_ST25.txt criado em 3 de julho de 2018 e que tem um tamanho de 174 quilobytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo.[0028] The official copy of the sequence listing is submitted electronically via EFS-Web as a sequence listing in ASCII format with a file named 20180703_NB41287_ST25.txt created on July 3, 2018 and which is 174 kilobytes in size and it is deposited simultaneously with the specification.
[0029] A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporada ao pre- sente documento a título de referência em sua totalidade. BREVE DESCRIÇÃO DOS IDs. DE SEQUÊNCIA[0029] The sequence listing contained in this document in ASCII format is part of the specification and is incorporated into this document as a reference in its entirety. BRIEF DESCRIPTION OF IDs. OF SEQUENCE
[0030] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de GTFJ.[0030] SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of GTFJ.
[0031] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos de GTF300.[0031] SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of GTF300.
[0032] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos de GTF0874.[0032] SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of GTF0874.
[0033] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos de GTF6855.[0033] SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of GTF6855.
[0034] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos de GTF2379.[0034] SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of GTF2379.
[0035] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos de GTF7527.[0035] SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of GTF7527.
[0036] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos de GTF1724.[0036] SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of GTF1724.
[0037] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos de GTF0544.[0037] SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of GTF0544.
[0038] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos de GTF5926.[0038] SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of GTF5926.
[0039] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos de GTF4297.[0039] SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of GTF4297.
[0040] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos de GTF5618.[0040] SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of GTF5618.
[0041] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos de GTF2765.[0041] SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of GTF2765.
[0042] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos de GTF2919.[0042] SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of GTF2919.
[0043] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos de GTF2678.[0043] SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence of GTF2678.
[0044] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos de GTF3929.[0044] SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence of GTF3929.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Descrição detalhada das invenções:DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Detailed description of the inventions:
[0045] A prática dos presentes ensinamentos irá empregar, a me- nos que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular e bioquímica, que são abrangidas pela perícia da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura, por exemplo, Molecu- lar Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Proto- cols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990), e The Alcohol Textbook (Ingledew et al., eds., Quinta Edição, 2009), e Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry (Lindhorste, 2007).[0045] The practice of the present teachings will employ, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology (including recombinant techniques), microbiology, cell biology and biochemistry, which are covered by the expertise of the technique. Such techniques are explained fully in the literature, for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, ed., 1984; Current Proto-cols in Molecular Biology (FM Ausubel et al., Eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., Eds., 1994); Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990), and The Alcohol Textbook (Ingledew et al., Eds., Fifth Edition, 2009), and Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry (Lindhorste, 2007).
[0046] A menos que definido de outro modo no presente documen- to, todos os termos técnicos e científicos usados no presente docu- mento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esses ensina- mentos pertencem. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, segunda ed., John Wiley and Sons, Nova Iorque[0046] Unless otherwise defined in this document, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning as commonly understood by a person with common skill in the technique to which these teachings belong . Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York
(1994), e Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NI (1991) proporcionam a um com perícia um dicio- nário geral de muitos dos termos usados em esta invenção. Quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento podem ser usados na prática ou teste dos pre- sentes ensinamentos.(1994), and Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NI (1991) provide an expert with a general dictionary of many of the terms used in this invention. Any methods and materials similar or equivalent to those described in this document can be used in the practice or testing of the present teachings.
[0047] As gamas numéricas proporcionadas aqui incluem os nú- meros definindo a gama. Definições:[0047] The numerical ranges provided here include the numbers defining the range. Definitions:
[0048] Conforme usado no presente documento, "alfa (1-3) gluca- no" se refere a um oligo polissacarídeo contendo ligações alfa 1-3 en- tre monômeros de glicose.[0048] As used herein, "alpha (1-3) glucoin" refers to a polysaccharide oligo containing alpha 1-3 bonds between glucose monomers.
[0049] Os termos "glicosiltransferase", "enzima glicosiltransferase", "enzima GTF" e "GTF" são usados de forma intercambiável no presen- te documento. Glicosiltransferases catalisam a síntese de polímeros de D-glicose de alto peso molecular denominados glucano a partir de sacarose. As enzimas GTF são classificadas sob a família glicosídeo hidrolase 70 (GH70) de acordo com o banco de dados CAZy (Car- bohydrate-Active EnZymes) (Cantarel et al., Nucleic Acids Res. 37:D233-238, 2009).[0049] The terms "glycosyltransferase", "glycosyltransferase enzyme", "GTF enzyme" and "GTF" are used interchangeably in this document. Glycosyltransferases catalyze the synthesis of high molecular weight D-glucose polymers called glucan from sucrose. GTF enzymes are classified under the family glycoside hydrolase 70 (GH70) according to the CAZy database (Carbohydrate-Active EnZymes) (Cantarel et al., Nucleic Acids Res. 37: D233-238, 2009).
[0050] Os termos "tipo selvagem", "parental" ou "referência", no que diz respeito a um polipeptídeo, se referem a um polipeptídeo ocor- rendo naturalmente que não inclui uma substituição, inserção ou dele- ção feita pelo homem em uma ou mais posições de aminoácidos. Simi- larmente, os termos "tipo selvagem", "parental" ou "referência", no que diz respeito a um polinucleotídeo, se referem a um polinucleotídeo de ocorrência natural que não inclui uma mudança de nucleotídeos feita pelo homem. No entanto, note que um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de tipo selvagem, parental ou de referência não está limi- tado a um polinucleotídeo ocorrendo naturalmente e engloba qualquer polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de tipo selvagem, parental ou de referência.[0050] The terms "wild type", "parental" or "reference", with respect to a polypeptide, refer to a naturally occurring polypeptide that does not include a man-made substitution, insertion or deletion in one or more amino acid positions. Similarly, the terms "wild type", "parental" or "reference", with respect to a polynucleotide, refer to a naturally occurring polynucleotide that does not include a man-made change in nucleotides. However, note that a polynucleotide encoding a wild-type, parental or reference polypeptide is not limited to a naturally occurring polynucleotide and encompasses any polynucleotide encoding a wild-type, parental or reference polypeptide.
[0051] A referência ao polipeptídeo de tipo selvagem é entendida como incluindo a forma madura do polipeptídeo. Um polipeptídeo "ma- duro", ou sua variante, é um no qual uma sequência de sinal está au- sente, por exemplo, clivada a partir de uma forma imatura do polipep- tídeo durante a ou após expressão do polipeptídeo.[0051] The reference to the wild type polypeptide is understood to include the mature form of the polypeptide. A "mature" polypeptide, or its variant, is one in which a signal sequence is absent, for example, cleaved from an immature form of the polypeptide during or after expression of the polypeptide.
[0052] O termo "variante", no que diz respeito a um polipeptídeo, se refere a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo de tipo sel- vagem, parental ou de referência especificado na medida em que in- clui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoá- cido ocorrendo naturalmente ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo "variante", no que diz respeito a um polinucleotídeo, se refere a um polinucleotídeo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo de tipo selvagem, parental ou de referência especifica- do. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo de tipo selvagem, parental ou de referência será aparente a partir do contexto.[0052] The term "variant", with respect to a polypeptide, refers to a polypeptide that differs from a specified wild, parental or reference polypeptide in that it includes one or more substitutions, insertions or deletions of an naturally occurring or man-made amino acid. Similarly, the term "variant", with respect to a polynucleotide, refers to a polynucleotide that differs in sequence from nucleotides to a specified wild-type, parental or reference polynucleotide. The identity of the wild-type, parental or reference polypeptide or polynucleotide will be apparent from the context.
[0053] O termo "recombinante", quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor em questão, indica que o sujeito foi modificado a partir de seu estado nativo. Assim, por exem- plo, as células recombinantes expressam genes que não são encon- trados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expres- sam genes nativos a níveis diferentes ou sob condições diferentes do que encontrado na natureza. Os ácidos nucleicos recombinantes dife- rem de uma sequência nativa por um ou mais nucleotídeos e/ou estão operacionalmente ligados a sequências heterólogas, p. ex., um promo- tor heterólogo em um vetor de expressão. As proteínas recombinantes podem diferir de uma sequência nativa por um ou mais aminoácidos e/ou estão fundidas a sequências heterólogas. Um vetor que compre- ende um ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase é um ve-[0053] The term "recombinant", when used in reference to a cell, nucleic acid, protein or vector in question, indicates that the subject has been modified from its native state. Thus, for example, recombinant cells express genes that are not found within the cell's native (non-recombinant) form or express native genes at different levels or under different conditions than found in nature. Recombinant nucleic acids differ from a native sequence by one or more nucleotides and / or are operationally linked to heterologous sequences, e.g. eg, a heterologous promoter in an expression vector. Recombinant proteins can differ from a native sequence by one or more amino acids and / or are fused to heterologous sequences. A vector that comprises a nucleic acid encoding a glycosyltransferase is a vector
tor recombinante.recombinant factor.
[0054] Os termos "recuperado", "isolado" e "separado" se referem a um composto, proteína (polipeptídeos), célula, ácido nucleico, ami- noácido ou outro material ou componente especificado que é removido de pelo menos um outro material ou componente com o qual está na- turalmente associado como encontrado na natureza. Um polipeptídeo "isolado", portanto, inclui, mas não está limitado a, um caldo de cultura contendo polipeptídeo secretado expresso em uma célula hospedeira heteróloga.[0054] The terms "recovered", "isolated" and "separated" refer to a compound, protein (polypeptides), cell, nucleic acid, amino acid or other specified material or component that is removed from at least one other material or component with which it is naturally associated as found in nature. An "isolated" polypeptide, therefore, includes, but is not limited to, a culture broth containing secreted polypeptide expressed in a heterologous host cell.
[0055] O termo "polímero" se refere a uma série de grupos de mo- nômeros ligados entre si. Um polímero é composto de múltiplas unida- des de um único monômero. Conforme usado no presente documento, o termo "polímero de glicose" se refere a unidades de glicose ligadas entre si como um polímero. Desde que existam pelo menos três uni- dades de glicose, o polímero de glicose pode conter açúcares não gli- cose, como lactose ou galactose.[0055] The term "polymer" refers to a series of groups of monomers linked together. A polymer is made up of multiple units of a single monomer. As used herein, the term "glucose polymer" refers to glucose units linked together as a polymer. As long as there are at least three glucose units, the glucose polymer can contain non-glucose sugars, such as lactose or galactose.
[0056] O termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo dos ter- mos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo" e é usado indistintamente. Onde tais sequências de aminoácidos exibem atividade podem ser re- feridas como "enzima". Os códigos convencionais de uma letra ou três letras para resíduos de aminoácidos são usados, com sequências de aminoácidos sendo apresentadas na orientação terminal amino-para- carbóxi padrão (isto é, N→C).[0056] The term "amino acid sequence" is synonymous with the terms "polypeptide", "protein" and "peptide" and is used interchangeably. Where such amino acid sequences exhibit activity, they can be referred to as an "enzyme". Conventional one-letter or three-letter codes for amino acid residues are used, with amino acid sequences being presented in the standard amino-to-carboxy terminal orientation (ie, N → C).
[0057] O termo "ácido nucleico" engloba DNA, RNA, heteroduple- xes e moléculas sintéticas capazes de codificar um polipeptídeo. Os ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou fita dupla e podem ser modificações químicas. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados indistintamente. Uma vez que o código genético é degene- rado pode ser usado mais do que um códon para codificar um aminoá- cido particular, e as presentes composições e métodos englobam se-[0057] The term "nucleic acid" encompasses DNA, RNA, heteroduplexes and synthetic molecules capable of encoding a polypeptide. Nucleic acids can be single-stranded or double-stranded and can be chemical modifications. The terms "nucleic acid" and "polynucleotide" are used interchangeably. Once the genetic code is degenerated, more than one codon can be used to encode a particular amino acid, and the present compositions and methods encompass
quências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoáci- dos particular. A não ser que de outro modo indicado, as sequências de ácidos nucleicos são apresentadas na orientação 5′-para-3′.nucleotide sequences encoding a particular amino acid sequence. Unless otherwise indicated, nucleic acid sequences are presented in the 5′-to-3 ′ orientation.
[0058] Os termos "transformada", "estavelmente transformada" e "transgênica" usados com referência a uma célula significam que a célula contém uma sequência de ácidos nucleicos não nativa (por exemplo heteróloga) integrada no seu genoma ou transportada como um epissoma que é mantido ao longo de múltiplas gerações.[0058] The terms "transformed", "stably transformed" and "transgenic" used in reference to a cell mean that the cell contains a non-native (for example heterologous) nucleic acid sequence integrated into its genome or transported as an episome that it is maintained over multiple generations.
[0059] O termo "introduzido", no contexto de inserção de uma se- quência de ácidos nucleicos em uma célula, significa "transfecção", "transformação" ou "transdução", como conhecido na técnica.[0059] The term "introduced", in the context of inserting a sequence of nucleic acids into a cell, means "transfection", "transformation" or "transduction", as known in the art.
[0060] Uma "cepa hospedeira" ou "célula hospedeira" é um orga- nismo no qual um vetor de expressão, fago, vírus ou outro construto de DNA, incluindo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de interesse (por exemplo, uma glicosiltransferase), foi introduzido. Cepas hospedeiras exemplificativas são células microbianas (por exemplo, bactéria, fungo filamentoso, e levedura) capazes de expressar o poli- peptídeo de interesse. O termo "célula hospedeira" inclui protoplastos criados a partir de células.[0060] A "host strain" or "host cell" is an organism in which an expression vector, phage, virus or other DNA construct, including a polynucleotide encoding a polypeptide of interest (for example, a glycosyltransferase), It was introduced. Exemplary host strains are microbial cells (for example, bacteria, filamentous fungus, and yeast) capable of expressing the polypeptide of interest. The term "host cell" includes protoplasts created from cells.
[0061] O termo "heterólogo" com referência a um polinucleotídeo ou proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira.[0061] The term "heterologous" with reference to a polynucleotide or protein refers to a polynucleotide or protein that does not occur naturally in a host cell.
[0062] O termo "endógeno" com referência a um polinucleotídeo ou proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre na- turalmente na célula hospedeira.[0062] The term "endogenous" with reference to a polynucleotide or protein refers to a polynucleotide or protein that occurs naturally in the host cell.
[0063] O termo "expressão" se refere ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base em uma sequência de ácidos nu- cleicos. O processo inclui tanto transcrição como tradução.[0063] The term "expression" refers to the process by which a polypeptide is produced based on a sequence of nucleic acids. The process includes both transcription and translation.
[0064] Um "marcador seletivo" ou "marcador selecionável" se refe- re a um gene capaz de ser expresso em um hospedeiro para facilitar a seleção de células hospedeiras carregando o gene. Exemplos de mar- cadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a antimicrobi- anos (por exemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou ge- nes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional, à célula hospedeira.[0064] A "selective marker" or "selectable marker" refers to a gene capable of being expressed in a host to facilitate the selection of host cells carrying the gene. Examples of selectable markers include, but are not limited to, antimicrobials (eg, hygromycin, bleomycin or chloramphenicol) and / or genes that confer a metabolic advantage, such as a nutritional advantage, on the host cell.
[0065] Um "vetor" se refere a uma sequência de polinucleotídeos desenhada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expres- são, vetores vaivém, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e simila- res.[0065] A "vector" refers to a sequence of polynucleotides designed to introduce nucleic acids into one or more cell types. The vectors include cloning vectors, expression vectors, shuttle vectors, plasmids, phage particles, cassettes and the like.
[0066] Um "vetor de expressão" se refere a um construto de DNA compreendendo uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo de interesse, sequência de codificação essa que está operacionalmen- te ligada a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma se- quência codificando locais de ligação a ribossomo adequados no mRNA, intensificadores e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução.[0066] An "expression vector" refers to a DNA construct comprising a DNA sequence encoding a polypeptide of interest, which coding sequence is operationally linked to a suitable control sequence capable of effecting DNA expression in a suitable host. Such control sequences can include a promoter to effect transcription, an optional operator sequence to control transcription, a sequence encoding suitable ribosome binding sites in the mRNA, enhancers and sequences that control the termination of transcription and translation.
[0067] O termo "operacionalmente ligado" significa que os compo- nentes especificados estão em uma relação (incluindo, mas não se limitando a justaposição) permitindo que os mesmos funcionem de uma maneira pretendida. Por exemplo, uma sequência reguladora está operacionalmente ligada a uma sequência codificante tal que a ex- pressão da sequência codificante esteja sob controle das sequências reguladoras.[0067] The term "operationally linked" means that the specified components are in a relationship (including, but not limited to juxtaposition) allowing them to function in an intended manner. For example, a regulatory sequence is operationally linked to a coding sequence such that the expression of the coding sequence is under the control of the regulatory sequences.
[0068] Uma "sequência de sinal" é uma sequência de aminoácidos anexada à porção N-terminal de uma proteína, que facilita a secreção da proteína fora da célula. A forma madura de uma proteína extracelu-[0068] A "signal sequence" is an amino acid sequence attached to the N-terminal portion of a protein, which facilitates the secretion of the protein outside the cell. The mature form of an extracellular protein
lar não tem a sequência de sinal, que é removida por clivagem durante o processo de secreção.home does not have the signal sequence, which is removed by cleavage during the secretion process.
[0069] "Biologicamente ativo" se refere a uma sequência tendo uma atividade biológica especificada, tal como atividade enzimática.[0069] "Biologically active" refers to a sequence having a specified biological activity, such as enzymatic activity.
[0070] O termo "atividade específica" se refere ao número de mols do substrato que podem ser convertidos em produto por uma enzima ou preparação de enzima por unidade de tempo sob condições especí- ficas. A atividade específica é geralmente expressa como unidades (U)/mg de proteína.[0070] The term "specific activity" refers to the number of moles of the substrate that can be converted into product by an enzyme or enzyme preparation per unit of time under specific conditions. Specific activity is usually expressed as units (U) / mg of protein.
[0071] Como usado aqui, "percentagem de identidade de sequên- cias" significa que uma sequência particular tem pelo menos uma certa percentagem de resíduos de aminoácidos idênticos àqueles em uma sequência de referência especificada, quando alinhadas usando o al- goritmo CLUSTAL W com parâmetros padrão. Consultar Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Os parâmetros padrão para o algoritmo CLUSTAL W são: Penalidade por abertura de lacuna: 10,0 Penalidade por extensão de lacuna: 0,05 Matriz de peso de proteína: série BLOSUM Matriz de peso de DNA: IUB % de sequências divergentes de atraso: 40 Distância de separação de lacuna: 8 Peso de transições de DNA: 0,50 Listar resíduos hidrofílicos: GPSNDQEKR Usar matriz negativa: DESLIGADO Alternar Penalidades específicas de resíduo: LIGADO Alternar penalidades hidrofílicas: LIGADO Alternar penalidade de separação de lacuna final: DESLIGADO.[0071] As used here, "percent sequence identity" means that a particular sequence has at least a certain percentage of amino acid residues identical to those in a specified reference sequence, when aligned using the CLUSTAL W algorithm with standard parameters. See Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680. The standard parameters for the CLUSTAL W algorithm are: Gap opening penalty: 10.0 Gap extension penalty: 0.05 Protein weight matrix: BLOSUM series DNA weight matrix: IUB% of divergent delay sequences: 40 Gap separation distance: 8 Weight of DNA transitions: 0.50 List hydrophilic residues: GPSNDQEKR Use negative matrix: OFF Toggle specific waste penalties: ON Toggle hydrophilic penalties: ON Toggle final gap separation penalty: OFF.
[0072] As deleções são contadas como resíduos não idênticos, em comparação com uma sequência de referência. As deleções que ocor-[0072] Deletions are counted as non-identical residues, compared to a reference sequence. The deletions that occur
rem em terminais são incluídas. Por exemplo, uma variante com cinco deleções de aminoácidos do C-terminal do polipeptídeo maduro de 617 resíduos teria uma identidade de sequência percentual de 99% (612/617 resíduos idênticos × 100, arredondado para o número inteiro mais próximo) em relação ao polipeptídeo maduro. Tal variante seria abrangida por uma variante que tem "pelo menos 99% de identidade de sequência" com um polipeptídeo maduro.terminals are included. For example, a variant with five amino acid deletions of the 617-residue mature polypeptide C-terminal would have a 99% percentage sequence identity (612/617 identical residues × 100, rounded to the nearest whole number) with respect to the polypeptide mature. Such a variant would be encompassed by a variant that has "at least 99% sequence identity" with a mature polypeptide.
[0073] As sequências de polipeptídeos "fundidas" estão conecta- das, isto é, operacionalmente ligadas, através de uma ligação de pep- tídeo entre duas sequências de polipeptídeos em questão.[0073] The "fused" polypeptide sequences are connected, that is, operationally linked, through a peptide link between two polypeptide sequences in question.
[0074] O termo "fungos filamentosos" se refere a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina, particularmente a espécie Pe- zizomycotina.[0074] The term "filamentous fungi" refers to all filamentous forms in the subdivision Eumycotina, particularly the species Pizizomycotina.
[0075] O termo "cerca de" se refere a ± 5% em relação ao valor referenciado.[0075] The term "about" refers to ± 5% of the referenced value.
[0076] "Leite tratado com lactase" significa leite tratado com lac- tase para reduzir a quantidade de açúcar de lactose.[0076] "Lactase-treated milk" means milk treated with lactase to reduce the amount of lactose sugar.
[0077] "Leite com lactose reduzida" significa leite em que porcen- tagem de lactose é de cerca de 2% ou inferior.[0077] "Milk with reduced lactose" means milk in which the percentage of lactose is about 2% or less.
[0078] "Leite sem lactose" significa leite em que a porcentagem de lactose é de cerca de 0,5% ou inferior.[0078] "Lactose-free milk" means milk in which the percentage of lactose is about 0.5% or less.
[0079] O termo "GTFJ" significa a enzima glicosiltransferase que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO:1.[0079] The term "GTFJ" means the enzyme glycosyltransferase which has the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0080] O termo "GTF300" significa a glicosiltransferase que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2.[0080] The term "GTF300" means the glycosyltransferase which has the sequence shown in SEQ ID NO: 2.
[0081] O termo "textura" conforme usado no presente documento para se referir a um iogurte ou produtos de leite fermentado significa a espessura do iogurte e/ou a percepção sensorial da sensação bucal ou ambas. Um "aprimoramento" na textura significa um aumento na espessura e/ou um aumento na percepção sensorial da sensação bu-[0081] The term "texture" as used in this document to refer to a yogurt or fermented milk product means the thickness of the yogurt and / or the sensory perception of the mouth sensation or both. An "improvement" in texture means an increase in thickness and / or an increase in the sensory perception of the buoyant sensation
cal ou ambos. A menos que indicado de outro modo, conforme usado no presente documento a "espessura" de um iogurte ou bebida de leite fermentado significa a viscosidade aparente extraída a uma taxa de cisalhamento de 10 Hz. Desse modo, um aumento na viscosidade aparente a uma taxa de cisalhamento de 10 Hz indica um aumento na espessura. A viscosidade aparente extraída a uma taxa de cisalha- mento de 200 Hz está correlacionada à "sensação bucal". Portanto, um aumento na viscosidade aparente a uma taxa de cisalhamento de 200 Hz indica um aumento na sensação bucal. Mutações adicionaislime or both. Unless otherwise stated, as used herein, the "thickness" of a yogurt or fermented milk drink means the apparent viscosity extracted at a 10 Hz shear rate. Thus, an increase in apparent viscosity at a rate 10 Hz shear strength indicates an increase in thickness. The apparent viscosity extracted at a shear rate of 200 Hz is correlated with "mouth feel". Therefore, an increase in apparent viscosity at a 200 Hz shear rate indicates an increase in mouthfeel. Additional mutations
[0082] Em algumas modalidades, as presentes glicosiltransferases incluem adicionalmente uma ou mais mutações que fornecem um be- nefício de desempenho ou estabilidade adicional. Benefícios de de- sempenho exemplificativos incluem, porém sem limitação, estabilidade térmica aumentada, estabilidade em armazenamento aumentada, so- lubilidade aumentada, um perfil de pH alterado, atividade específica aumentada, especificidade de substrato modificada, ligação de subs- trato modificada, atividade dependente de pH modificada, estabilidade dependente de pH modificada, estabilidade de oxidação aumentada e expressão aumentada. Em alguns casos, o benefício de desempenho é realizado a uma temperatura relativamente baixa. Em alguns casos, o benefício de desempenho é realizado a uma temperatura relativa- mente elevada.[0082] In some embodiments, the present glycosyltransferases additionally include one or more mutations that provide an additional performance benefit or stability. Exemplary performance benefits include, but are not limited to, increased thermal stability, increased storage stability, increased solubility, an altered pH profile, increased specific activity, modified substrate specificity, modified substrate binding, dependent activity modified pH, modified pH dependent stability, increased oxidation stability and increased expression. In some cases, the performance benefit is realized at a relatively low temperature. In some cases, the performance benefit is realized at a relatively high temperature.
[0083] Além do mais, as presentes glicosiltransferases podem in- cluir qualquer número de substituições de aminoácidos conservativas. As substituições de aminoácidos conservativas estão listadas na Tabe- la a seguir. Substituições de aminoácidos conservativas[0083] Furthermore, the present glycosyltransferases can include any number of conservative amino acid substitutions. Conservative amino acid substitutions are listed in the Table below. Conservative amino acid substitutions
Para o Aminoáci- Có- Substituir por qualquer um dentre do digo Alanina A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys Arginina R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo- Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn Asparagina N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D- Gln Ácido Aspártico D D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D- Gln Cisteína C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr Glutamina Q D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D- Asp Ácido Glutâmico E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D- Gln Glicina G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, b-Ala, Acp Isoleucina I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Leucina L D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Lisina K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo- Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn Metionina M D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val Fenilalanina F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4 ou 5-fenilprolina, cis-3,4 ou 5-fenilprolina Prolina P D-Pro, ácido L-I-tioazolidina-4-carboxílico, ácido D- ou L-1-oxazolidina-4-carboxílico Serina S D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val Tirosina Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His Valina V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-MetFor Amino Acid- Co- Substitute for any of the Alanine A D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys Arginine R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D- homo- Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn Asparagine N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Aspartic Acid D D-Asp , D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Cysteine C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr Glutamine Q D-Gln, Asn, D -Asn, Glu, D-Glu, Asp, D- Asp Glutamic Acid And D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D- Gln Glycine G Ala, D-Ala, Pro, D- Pro, b-Ala, Acp Isoleucine I D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Leucine L D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Lysine K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo- Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn Methionine M D-Met, S- Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val Phenylalanine F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans -3,4 or 5-phenylproline, cis-3,4 or 5-phenylproline Proline P D-Pro, LI-thioazolidine-4-carboxylic acid, D- or L-1-oxazolidine-4-carboxylic acid Serine S D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met (O), L-Cys, D-Cys Threonine T D-Thr, Ser, D -Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O), D-Met (O), Val, D-Val Tyrosine Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D- His Valina V D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
[0084] O leitor entenderá que algumas das mutações conservati-[0084] The reader will understand that some of the conservative mutations
vas mencionadas acima podem ser produzidas por manipulação gené- tica, ao mesmo tempo que outras são produzidas introduzindo-se ami- noácidos sintéticos em um polipeptídeo por genética ou outro meio.The abovementions mentioned above can be produced by genetic manipulation, while others are produced by introducing synthetic amino acids into a polypeptide by genetics or other means.
[0085] As presentes glicosiltransferases podem ser "precursoras", "imaturas" ou "de comprimento total", caso em que incluem uma se- quência de sinal, ou "maduras", caso em que não têm uma sequência de sinal. As formas maduras dos polipeptídeos são geralmente as mais úteis. A menos que indicado de outro modo, a numeração de re- síduos de aminoácidos usada aqui se refere às formas maduras dos respectivos polipeptídeos de glicosiltransferase. Os presentes polipep- tídeos de glicosiltransferase podem ser também truncados para remo- ver os terminais N ou C, desde que os polipeptídeos resultantes rete- nham atividade de glicosiltransferase.[0085] The present glycosyltransferases can be "precursor", "immature" or "full-length", in which case they include a signal sequence, or "mature", in which case they do not have a signal sequence. The mature forms of the polypeptides are generally the most useful. Unless otherwise indicated, the numbering of amino acid residues used here refers to the mature forms of the respective glycosyltransferase polypeptides. The present glycosyltransferase polypeptides can also be truncated to remove the N or C terminals, as long as the resulting polypeptides retain glycosyltransferase activity.
[0086] As presentes glicosiltransferases podem ser um polipeptí- deo "quimérico" ou "híbrido", pelo fato de que inclui pelo menos uma porção de um primeiro polipeptídeo de glicosiltransferase, e pelo me- nos uma porção de um segundo polipeptídeo de glicosiltransferase. As presentes glicosiltransferases podem incluir adicionalmente sequência de sinal heteróloga, um epítopo para permitir rastreamento ou purifica- ção ou similares. Sequências de sinal heterólogas exemplificativas são de amilase de B. licheniformis (LAT), B. subtilis (AmyE ou AprE) e Streptomyces CelA. Produção de glicosiltransferases[0086] The present glycosyltransferases can be a "chimeric" or "hybrid" polypeptide, in that it includes at least a portion of a first glycosyltransferase polypeptide, and at least a portion of a second glycosyltransferase polypeptide. The present glycosyltransferases can additionally include heterologous signal sequence, an epitope to allow screening or purification or the like. Exemplary heterologous signal sequences are B. licheniformis amylase (LAT), B. subtilis (AmyE or AprE) and Streptomyces CelA. Production of glycosyltransferases
[0087] As presentes glicosiltransferases podem ser produzidas em células hospedeiras, por exemplo, por secreção ou expressão intrace- lular. Um material celular cultivado (por exemplo, um caldo de célula total) que compreende uma glicosiltransferase pode ser obtido após a secreção da glicosiltransferases no meio celular. Opcionalmente, a gli- cosiltransferase pode ser isolada das células hospedeiras, ou ainda isolada do caldo de célula, dependendo da pureza desejada da glico-[0087] The present glycosyltransferases can be produced in host cells, for example, by secretion or intracellular expression. A cultured cellular material (for example, a total cell broth) comprising a glycosyltransferase can be obtained after secreting the glycosyltransferases in the cell medium. Optionally, the glycosyltransferase can be isolated from the host cells, or isolated from the cell broth, depending on the desired purity of the glyco-
siltransferase final. Um gene que codifica uma glicosiltransferase pode ser clonado e expresso de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Células hospedeiras adequadas incluem células bacteria- nas, fúngicas (incluindo levedura e fungos filamentosos) e vegetais (incluindo algas). Células hospedeiras particularmente úteis incluem Aspergillus niger, Aspergillus oryzae ou Trichoderma reesei. Outras células hospedeiras incluem células bacterianas, por exemplo, Bacillus subtilis ou B. licheniformis, assim como Streptomyces e E. Coli.final siltransferase. A gene encoding a glycosyltransferase can be cloned and expressed according to methods well known in the art. Suitable host cells include bacterial, fungal (including yeast and filamentous fungi) and plant (including algae) cells. Particularly useful host cells include Aspergillus niger, Aspergillus oryzae or Trichoderma reesei. Other host cells include bacterial cells, for example, Bacillus subtilis or B. licheniformis, as well as Streptomyces and E. Coli.
[0088] A célula hospedeira pode expressar adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase homóloga ou hete- róloga, isto é, uma glicosiltransferase que não é da mesma espécie que a célula hospedeira ou uma ou mais outras enzimas. A glicosil- transferase pode ser uma glicosiltransferase variante. Adicionalmente, o hospedeiro pode expressar uma ou mais enzimas, proteínas ou pep- tídeos acessórios. VetoresThe host cell can additionally express a nucleic acid encoding a homologous or heterologous glycosyltransferase, i.e., a glycosyltransferase that is not the same species as the host cell or one or more other enzymes. The glycosyl transferase can be a variant glycosyltransferase. In addition, the host can express one or more enzymes, proteins or accessory peptides. Vector
[0089] Um construto de DNA que compreende um ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase pode ser construído para ser ex- presso em uma célula hospedeira. Devido à degenerescência bem co- nhecida no código genético, polinucleotídeos variantes que codificam uma sequência de aminoácidos idêntica podem ser projetados e pro- duzidos com habilidades comuns. É também bem conhecido na técni- ca otimizar o uso de códon para uma célula hospedeira particular. Áci- dos nucleicos que codificam glicosiltransferase podem ser incorpora- dos em um vetor. Os vetores podem ser transferidos para uma célula hospedeira com o uso de técnicas de transformação bem conhecidas, tais como aquelas descritas abaixo.[0089] A DNA construct comprising a nucleic acid encoding a glycosyltransferase can be constructed to be expressed in a host cell. Due to the well-known degeneration in the genetic code, variant polynucleotides that encode an identical amino acid sequence can be designed and produced with common skills. It is also well known in the art to optimize the use of codons for a particular host cell. Nucleic acids encoding glycosyltransferase can be incorporated into a vector. The vectors can be transferred to a host cell using well-known transformation techniques, such as those described below.
[0090] O vetor pode ser qualquer vetor que pode ser transformado em e replicado dentro de uma célula hospedeira. Por exemplo, um ve- tor que compreende um ácido nucleico que codifica uma glicosiltrans-[0090] The vector can be any vector that can be transformed into and replicated within a host cell. For example, a vector that comprises a nucleic acid that encodes a glycosyltrans-
ferase pode ser transformado e replicado em uma célula hospedeira bacteriana como um meio de propagar e amplificar o vetor. O vetor também pode ser transformado em um hospedeiro de expressão, de modo que os ácidos nucleicos possam ser expressos como uma glico- siltransferase funcional. As células hospedeiras que servem como cé- lulas hospedeiras podem incluir fungos filamentosos, por exemplo.Ferase can be transformed and replicated in a bacterial host cell as a means of propagating and amplifying the vector. The vector can also be transformed into an expression host, so that the nucleic acids can be expressed as a functional glycosyltransferase. Host cells that serve as host cells can include filamentous fungi, for example.
[0091] Um ácido nucleico que codifica uma glicosiltransferase po- de ser operacionalmente ligado a um promotor adequado, que permite a transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser qualquer se- quência de DNA que mostre atividade transcricional na célula hospe- deira de escolha e pode ser derivado de genes que codificam proteí- nas ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira. Promotores exemplificativos para direcionar a transcrição da sequência de DNA que codifica uma glicosiltransferase, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do operon lac de E. coli, os promotores da- gA ou celA do gene agarase de Streptomyces coelicolor, os promoto- res do gene α-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, os promotores do gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophi- lus, os promotores do gene α-amilase (amyQ) de Bacillus amylolique- faciens, os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis etc. Para transcrição em um hospedeiro fúngico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica amilase TAKA As- pergillus oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, α- amilase neutra de Aspergillus niger, α-amilase estável em relação a ácidos de A. niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor mi- ehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans. Quando um gene que codifica uma glicosiltransferase expressa em uma espécie bacteriana, tal como um E. coli, um promotor adequado pode ser selecionado, por exemplo, a partir de um promotor de bacteriófago que inclui um promotor T7 e um promotor de lambda fago. Exemplos de promotores adequados para a expressão em uma espécie de levedura incluem, porém, sem limitação, os promotores Gal 1 e Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae e os promotores AOX1 ou AOX2 de Pichia pastoris. cbh1 é um promo- tor induzível endógeno de T. reesei. Consultar Liu et al. (2008) "Impro- ved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cello- biohydrolase I gene (cbh1) promoter optimization", Acta Biochim. Bi- ophys. Sin (Shanghai) 40(2): 158-65.[0091] A nucleic acid encoding a glycosyltransferase can be operationally linked to a suitable promoter, which allows transcription in the host cell. The promoter can be any DNA sequence that shows transcriptional activity in the host cell of choice and can be derived from genes that encode proteins or homologues or heterologues to the host cell. Exemplary promoters to direct transcription of the DNA sequence encoding a glycosyltransferase, especially in a bacterial host, are the promoter of the E. coli lac operon, the da gA or celA promoters of the Streptomyces coelicolor agarase gene, the promoters of the α-amylase (amyL) gene of Bacillus licheniformis, the promoters of the maltogenic amylase (amyM) gene of Bacillus stearothermophilus, the promoters of the α-amylase (amyQ) gene of Bacillus amylolique-faciens, the promoters of the xylA and xylB of Bacillus subtilis etc. For transcription in a fungal host, examples of useful promoters are those derived from the gene encoding TAKA amylase As-pergillus oryzae, Rhizomucor miehei aspartic proteinase, Aspergillus niger's neutral α-amylase, α-amylase stable against A. niger, A. niger glycoamylase, Rhizomucor mihei lipase, A. oryzae alkaline protease, A. oryzae triose phosphate isomerase or A. nidulans acetamidase. When a gene encoding a glycosyltransferase expressed in a bacterial species, such as an E. coli, a suitable promoter can be selected, for example, from a bacteriophage promoter that includes a T7 promoter and a lambda phage promoter. Examples of promoters suitable for expression in a yeast species include, but are not limited to, the Gal 1 and Gal 10 promoters of Saccharomyces cerevisiae and the AOX1 or AOX2 promoters of Pichia pastoris. cbh1 is an inducible endogenous promoter of T. reesei. See Liu et al. (2008) "Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei by cello- biohydrolase I gene (cbh1) promoter optimization", Acta Biochim. Bi-ophys. Sin (Shanghai) 40 (2): 158-65.
[0092] A sequência de codificação pode ser operacionalmente li- gada a uma sequência de sinais. O DNA que codifica a sequência de sinais pode ser a sequência de DNA naturalmente associada ao gene glicosiltransferase a ser expresso ou a partir de um Gênero ou espécie diferente. Uma sequência de sinais e uma sequência promotora que compreende um construto ou vetor de DNA pode ser introduzida em uma célula hospedeira fúngica e pode ser derivada da mesma fonte. Por exemplo, a sequência de sinais é a sequência de sinais cbh1 que é operacionalmente ligada a um promotor cbh1.[0092] The coding sequence can be operationally linked to a sequence of signals. The DNA encoding the signal sequence may be the DNA sequence naturally associated with the glycosyltransferase gene to be expressed or from a different Genus or species. A signal sequence and a promoter sequence comprising a DNA construct or vector can be introduced into a fungal host cell and can be derived from the same source. For example, the signal sequence is the cbh1 signal sequence that is operably linked to a cbh1 promoter.
[0093] Um vetor de expressão também pode compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariotas, sequências de poliadenilação operacionalmente ligadas à sequência de DNA que co- difica uma glicosiltransferase variante. As sequências de terminação e poliadenilação podem ser adequadamente derivadas das mesmas fon- tes que o promotor.[0093] An expression vector can also comprise a suitable transcription terminator and, in eukaryotes, polyadenylation sequences operably linked to the DNA sequence that co-complicates a variant glycosyltransferase. The termination and polyadenylation sequences can be adequately derived from the same sources as the promoter.
[0094] O vetor pode compreender adicionalmente uma sequência de DNA que possibilita que o vetor se replique na célula hospedeira. Exemplos de tais sequências são as origens de replicação de plasmí- deos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 e pIJ702.[0094] The vector can additionally comprise a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell. Examples of such sequences are the origins of replication of plasmids pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 and pIJ702.
[0095] O vetor também pode compreender um marcador selecio- nável, por exemplo, um gene que o produto do mesmo complementa um defeito na célula hospedeira isolada, tal como os genes dal de B.[0095] The vector can also comprise a selectable marker, for example, a gene that the product of the same complements a defect in the isolated host cell, such as the B dal genes.
subtilis ou B. licheniformis, ou um gene que confere resistência antibió- tica, tal como, por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, clo- ranfenicol ou tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender mar- cadores de seleção de Aspergillus como amdS, argB, niaD e xxsC, um marcador que dá origem a resistência à higromicina, ou a seleção po- de ser realizada por cotransformação, tal como conhecido na técnica. Consultar, por exemplo, o Pedido PCT Internacional nº WO 91/17243.subtilis or B. licheniformis, or a gene that confers antibiotic resistance, such as, for example, resistance to ampicillin, kanamycin, chloramphenicol or tetracycline. In addition, the vector may comprise Aspergillus selection markers such as amdS, argB, niaD and xxsC, a marker that gives rise to resistance to hygromycin, or the selection may be carried out by cotransformation, as known in the art. See, for example, International PCT Application No. WO 91/17243.
[0096] A expressão intracelular pode ser vantajosa em alguns as- pectos, por exemplo, ao usar certas bactérias ou fungos como células hospedeiras para produzir grandes quantidades de glicosiltransferase para enriquecimento ou purificação subsequente. A secreção extrace- lular de glicosiltransferase no meio de cultura também pode ser usado para produzir um material celular cultivado que compreende a glicosil- transferase isolada.[0096] Intracellular expression can be advantageous in some aspects, for example, when using certain bacteria or fungi as host cells to produce large amounts of glycosyltransferase for subsequent enrichment or purification. The extracellular secretion of glycosyltransferase in the culture medium can also be used to produce a cultured cell material comprising isolated glycosyltransferase.
[0097] O vetor de expressão inclui tipicamente os componentes de um vetor de clonagem, tal como, por exemplo, um elemento que per- mite a replicação autônoma do vetor no organismo hospedeiro seleci- onado e um ou mais marcadores fenotipicamente detectáveis para propósitos de seleção. O vetor de expressão normalmente compreen- de sequências de nucleotídeos de controle, como um promotor, ope- rador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de iniciação de tradução e opcionalmente, um gene repressor ou um ou mais genes ativadores. Adicionalmente, o vetor de expressão pode compreender uma se- quência que codifica uma sequência de aminoácidos com capacidade de alvejar a glicosiltransferase a uma organela de célula hospedeira, tal como um peroxissoma, ou a um compartimento de célula hospedei- ra particular. Tal sequência de alvejamento inclui, porém sem limitação a sequência, SKL. Para a expressão sob a direção de sequências de controle, a sequência de ácidos nucleicos da glicosiltransferase opera- cionalmente ligada às sequências de controle de maneira adequada em relação à expressão.[0097] The expression vector typically includes the components of a cloning vector, such as, for example, an element that allows autonomous replication of the vector in the selected host organism and one or more phenotypically detectable markers for selection. The expression vector normally comprises control nucleotide sequences, such as a promoter, operator, ribosome binding site, translation initiation signal and optionally, a repressor gene or one or more activating genes. In addition, the expression vector may comprise a sequence that encodes an amino acid sequence capable of targeting glycosyltransferase to a host cell organelle, such as a peroxisome, or to a particular host cell compartment. Such a targeting sequence includes, but is not limited to, the sequence, SKL. For expression under the direction of control sequences, the nucleic acid sequence of the glycosyltransferase is operably linked to the control sequences in an appropriate manner in relation to expression.
[0098] Os procedimentos usados para ligar o construto de DNA que codifica uma glicosiltransferase, o promotor, terminador e outros elementos, respectivamente, e para inserir os mesmos nos vetores adequados que contêm as informações necessárias para replicação, são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edição, Cold Spring Harbor, 1989, e 3ª edição, 2001). Transformação e Cultura de Células Hospedeiras[0098] The procedures used to link the DNA construct encoding a glycosyltransferase, the promoter, terminator and other elements, respectively, and to insert them into the appropriate vectors that contain the information needed for replication, are well known to people skilled in the art. technical (see, for example, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition, Cold Spring Harbor, 1989, and 3rd edition, 2001). Transformation and Culture of Host Cells
[0099] Uma célula isolada, que compreende um construto de DNA ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma glicosiltransferase. A célula pode ser transformada com o construto de DNA que codifica a enzima, convenientemente integrando o construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. Essa integração é, de modo geral, considerada como sendo uma vantagem visto que a sequência de DNA tem maior probabilidade se ser mantida estavelmente na célu- la. A integração dos construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exem- plo, por recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão conforme descrito acima em conexão com os diferentes tipos de células hospe- deiras.[0099] An isolated cell, comprising a DNA construct or an expression vector, is advantageously used as a host cell in the recombinant production of a glycosyltransferase. The cell can be transformed with the DNA construct that encodes the enzyme, conveniently integrating the DNA construct (in one or more copies) into the host chromosome. This integration is generally considered to be an advantage since the DNA sequence is more likely to be kept stable in the cell. The integration of the DNA constructs in the host chromosome can be carried out according to conventional methods, for example, by homologous or heterologous recombination. Alternatively, the cell can be transformed with an expression vector as described above in connection with the different types of host cells.
[00100] Exemplos de organismos hospedeiros bacterianos adequa- dos são espécies bacterianas Gram positivas, como Bacillaceae inclu- indo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophilus, Baci- llus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Baci- llus lautus, Bacillus megaterium, e Bacillus thuringiensis; espécies Streptomyces, como Streptomyces murinus; espécies bacterianas de ácido lático incluindo Lactococcus sp., como Lactococcus lactis; Lac- tobacillus sp. incluindo Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp.; Pedio- coccus sp.; e Streptococcus sp. Alternativamente, as cepas de espé- cies bacterianas Gram negativas que pertencem a Enterobacteriaceae incluindo E. coli, ou a Pseudomonadaceae podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro.[00100] Examples of suitable bacterial host organisms are Gram positive bacterial species, such as Bacillaceae including Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (formerly Bacillus) stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amylolique, Bacillus amylolique coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, and Bacillus thuringiensis; Streptomyces species, such as Streptomyces murinus; bacterial lactic acid species including Lactococcus sp., such as Lactococcus lactis; Lac-tobacillus sp. including Lactobacillus reuteri; Leuconostoc sp .; Pedicococcus sp .; and Streptococcus sp. Alternatively, strains of Gram negative bacterial species that belong to Enterobacteriaceae including E. coli, or Pseudomonadaceae can be selected as the host organism.
[00101] Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser selecionado a partir das espécies de leveduras biotecnologicamente relevantes, tais como, mas sem limitação, espécies de levedura tais como Pichia sp., Hansenula sp., ou espécies Kluyveromyces, Yarrowi- nia, Schizosaccharomyces ou uma espécie de Saccharomyces, que inclui Saccharomyces cerevisiae ou uma espécie que pertence a Schi- zosaccharomyces, tal como, por exemplo, espécie S. pombe. Uma ce- pa da espécie de levedura metilotrófica, Pichia pastoris, pode ser usa- da como o organismo hospedeiro. Alternativamente, o organismo hos- pedeiro pode ser uma espécie Hansenula. Os organismos hospedeiros adequados entre fungos filamentosos incluem espécies de Aspergillus, p.ex.Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, As- pergillus awamori, ou Aspergillus nidulans. Alternativamente, cepas de uma espécie de Fusarium, por exemplo, Fusarium oxysporum ou de uma espécie de Rhizomucor, tal como Rhizomucor miehei podem ser usadas como o organismo hospedeiro. Outras cepas adequadas inclu- em espécies Thermomyces e Mucor. Além disso, Trichoderma sp. po- de ser usado como um hospedeiro. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus inclui, por exem- plo, aquele descrito no documento nº EP 238023. Uma glicosiltransfe- rase expressa por uma célula hospedeira fúngica pode ser glicosilada, isto é, irá compreender uma porção química glicosila. O padrão de gli- cosilação pode ser igual ou diferente do presente na glicosiltransferase do tipo selvagem. O tipo e/ou grau de glicosilação pode conferir altera-[00101] A suitable yeast host organism can be selected from biotechnologically relevant yeast species, such as, but not limited to, yeast species such as Pichia sp., Hansenula sp., Or Kluyveromyces, Yarrowinia, Schizosaccharomyces species or a species of Saccharomyces, which includes Saccharomyces cerevisiae or a species that belongs to Schizosaccharomyces, such as, for example, S. pombe species. A strain of the methylotrophic yeast species, Pichia pastoris, can be used as the host organism. Alternatively, the host organism may be a Hansenula species. Suitable host organisms among filamentous fungi include species of Aspergillus, e.g. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori, or Aspergillus nidulans. Alternatively, strains from a species of Fusarium, for example, Fusarium oxysporum or from a species of Rhizomucor, such as Rhizomucor miehei, can be used as the host organism. Other suitable strains include Thermomyces and Mucor species. In addition, Trichoderma sp. it can be used as a host. A suitable procedure for transforming Aspergillus host cells includes, for example, that described in document No. EP 238023. A glycosyltransferase expressed by a fungal host cell can be glycosylated, that is, it will comprise a glycosyl chemical moiety. The glycosylation pattern can be the same or different from that present in wild-type glycosyltransferase. The type and / or degree of glycosylation may confer alterations
ções às propriedades enzimáticas e/ou bioquímicas.tions to enzymatic and / or biochemical properties.
[00102] É vantajoso deletar genes dos hospedeiros de expressão, em que a deficiência de gene pode ser curada pelo vetor de expressão transformado. Os métodos conhecidos podem ser usados para obter uma célula hospedeira fúngica que têm um ou mais genes inativados. A inativação de gene pode ser realizada por deleção completa ou par- cial, por inativação por inserção ou por qualquer outro meio que dê origem a um gene não funcional para seu propósito previsto de modo que o gene seja impedido contra a expressão de uma proteína funcio- nal. Um gene de um Trichoderma sp. Ou outro hospedeiro fúngico fi- lamentoso que foi clonado pode ser deletado, por exemplo, genes cbh1, cbh2, egl1 e egl2. A deleção de genes pode ser realizada por inserção de uma forma do gene desejado a ser inativado em um plas- mídeo por métodos conhecidos na técnica.[00102] It is advantageous to delete genes from the expression hosts, in which the gene deficiency can be cured by the transformed expression vector. The known methods can be used to obtain a fungal host cell that has one or more inactivated genes. Gene inactivation can be carried out by complete or partial deletion, by inactivation by insertion or by any other means that gives rise to a non-functional gene for its intended purpose so that the gene is prevented against the expression of a functional protein - final. A gene from a Trichoderma sp. Or another filamentous fungal host that has been cloned can be deleted, for example, genes cbh1, cbh2, egl1 and egl2. The deletion of genes can be performed by inserting a form of the desired gene to be inactivated in a plasmid by methods known in the art.
[00103] A introdução de um construto ou vetor de DNA em uma cé- lula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação; eletropora- ção; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, (por exemplo, transfecção mediada por lipofecção e mediada por DEAE-Dextrina); incubação com precipitado de DNA de fosfato de cálcio; bombardea- mento de alta velocidade com microprojéteis de DNA revestido; e fu- são de protoplasto. Técnicas de transformação gerais são conhecidas na área. Consultar, por exemplo, Sambrook et al. (2001), supra. A ex- pressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita, por exem- plo, na Patente nº U.S. 6.022.725. É feita referência também a Cao et al. (2000) Science 9:991-1001 para transformação de cepas de Asper- gillus. Os transformantes geneticamente estáveis são construídos com sistemas de vetor de modo que o ácido nucleico que codifica uma gli- cosiltransferase seja estavelmente integrado em um cromossomo da célula hospedeira. Os transformantes são então selecionados e purifi- cados por técnicas conhecidas.[00103] The introduction of a DNA construct or vector into a host cell includes techniques, such as transformation; electroporation; nuclear microinjection; transduction; transfection, (for example, lipofection-mediated and DEAE-Dextrin-mediated transfection); incubation with calcium phosphate DNA precipitate; high-speed bombardment with DNA coated microprojectiles; and protoplast fusion. General transformation techniques are known in the art. See, for example, Sambrook et al. (2001), supra. The expression of heterologous protein in Trichoderma is described, for example, in U.S. Patent No. 6,022,725. Reference is also made to Cao et al. (2000) Science 9: 991-1001 for transformation of Aspergillus strains. Genetically stable transformants are constructed with vector systems so that the nucleic acid encoding a glycosyltransferase is stably integrated into a host cell chromosome. The transformants are then selected and purified by known techniques.
ExpressãoExpression
[00104] Um método para produzir uma glicosiltransferase pode compreender cultivar uma célula hospedeira, conforme descrito acima, sob condições conducentes para a produção da enzima e recuperar a enzima das células e/ou meio de cultura.[00104] A method for producing a glycosyltransferase can comprise culturing a host cell, as described above, under conditions conducive to the production of the enzyme and recovering the enzyme from the cells and / or culture medium.
[00105] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivo da célula hospedeira em questão e obter expressão de uma glicosiltransferase. Meios e com- ponentes de meios adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com formulações pu- blicadas (por exemplo, conforme descrito nos catálogos da American Type Culture Collection).[00105] The medium used to grow the cells can be any conventional medium suitable for culturing the host cell in question and obtaining expression of a glycosyltransferase. Suitable media and media components are available from commercial suppliers or can be prepared according to published formulations (for example, as described in the catalogs of the American Type Culture Collection).
[00106] Uma enzima secretada a partir das células hospedeiras po- de ser usada em uma preparação de caldo total. Nos presentes méto- dos, a preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um micro-organismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica resultando na ex- pressão de uma glicosiltransferase. A fermentação pode, portanto, ser entendida como compreendendo o cultivo em frasco de agitação, fer- mentação em pequena ou grande escala (incluindo as fermentações em batelada, em batelada alimentada ou de estado sólido) em fermen- tadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que a glicosiltransferase seja expressa ou isolada. O termo "caldo de fermentação inteiro gasto" é definido no presente do- cumento como conteúdo não fracionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo "caldo de fer- mentação inteiro gasto" também abrange biomassa celular que foi li- sada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.[00106] An enzyme secreted from host cells can be used in a total broth preparation. In the present methods, the preparation of an entire spent fermentation broth from a recombinant microorganism can be achieved using any culture method known in the art resulting in the expression of a glycosyltransferase. Fermentation can therefore be understood as comprising shaking flask, small or large scale fermentation (including batch, fed batch or solid state fermentation) in industrial fermenters carried out in a suitable medium. and under conditions that allow the glycosyltransferase to be expressed or isolated. The term "spent whole fermentation broth" is defined in this document as unfractionated content of the fermentation material that includes the culture medium, extracellular proteins (eg, enzymes) and cell biomass. It is understood that the term "spent whole fermentation broth" also encompasses cell biomass that has been lysed or permeabilized using methods well known in the art.
[00107] Uma enzima secretada a partir das células hospedeiras po- de ser convenientemente recuperada do meio de cultura por procedi- mentos bem conhecidos, incluindo separar as células do meio por cen- trifugação ou filtração, e precipitar componentes proteináceos do meio através de um sal, como sulfato de amônio, seguido do uso de proce- dimentos cromatográficos, como cromatografia por troca iônica, cro- matografia por afinidade ou similares.[00107] An enzyme secreted from host cells can be conveniently recovered from the culture medium by well-known procedures, including separating cells from the medium by centrifugation or filtration, and precipitating proteinaceous components from the medium through a salt, such as ammonium sulfate, followed by the use of chromatographic procedures, such as ion exchange chromatography, affinity chromatography or similar.
[00108] O polinucleotídeo que codifica uma glicosiltransferase em um vetor pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de con- trole que tem capacidade de fornecer a expressão da sequência de codificação pela célula hospedeira, isto é o vetor é um vetor de ex- pressão. As sequências de controle podem ser modificadas, por exemplo pela adição de elementos reguladores transcricionais adicio- nais para tornar o nível de transcrição direcionada pelas sequências de controle mais responsivo aos moduladores transcricionais. As se- quências de controle podem compreender, em particular, promotores.[00108] The polynucleotide that encodes a glycosyltransferase in a vector can be operationally linked to a control sequence that has the capacity to provide the expression of the coding sequence by the host cell, that is, the vector is an expression vector. Control sequences can be modified, for example, by adding additional transcriptional regulatory elements to make the level of transcription driven by control sequences more responsive to transcriptional modulators. The control sequences can comprise, in particular, promoters.
[00109] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão de uma glicosiltransferase. A expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que as mesmas sejam continuamente produzidas ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigido, por exemplo, pela adi- ção de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, de- xametasona ou IPTG ou Soforose. Polipeptídeos podem também ser produzidos de modo recombinante em um sistema isento de células in vitro, tal como o sistema de reticulócitos de coelho TNT™ (Promega). Métodos para Enriquecer e Purificar glicosiltransferases[00109] Host cells can be cultured under suitable conditions that allow expression of a glycosyltransferase. The expression of enzymes can be constitutive so that they are continuously produced or inducible, requiring a stimulus to start expression. In the case of inducible expression, protein production can be initiated when required, for example, by adding an inducing substance to the culture medium, for example, dexamethasone or IPTG or Soforose. Polypeptides can also be produced recombinantly in a cell-free system in vitro, such as the TNT ™ rabbit reticulocyte system (Promega). Methods to Enrich and Purify Glycosyltransferases
[00110] As técnicas de fermentação, separação e concentração são bem conhecidas na técnica e métodos convencionais podem ser usa- dos para preparar uma solução contendo polipeptídeo de glicosiltrans-[00110] The fermentation, separation and concentration techniques are well known in the art and conventional methods can be used to prepare a solution containing glycosyltransfer polypeptide.
ferase.ferase.
[00111] Após a fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de sepa- ração convencionais a fim de obter uma solução de glicosiltransferase. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ultrafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cromatografia ou similares são geralmente usadas.[00111] After fermentation, a fermentation broth is obtained, microbial cells and various suspended solids, including residual crude fermentation materials, are removed by conventional separation techniques in order to obtain a glycosyltransferase solution. Filtration, centrifugation, microfiltration, vacuum rotary drum filtration, ultrafiltration, centrifugation followed by ultrafiltration, extraction or chromatography or the like are generally used.
[00112] É desejável concentrar uma solução contendo polipeptídeo de glicosiltransferase a fim de otimizar a recuperação. O uso de solu- ções não concentradas exige tempo de incubação aumentado a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.[00112] It is desirable to concentrate a solution containing glycosyltransferase polypeptide in order to optimize recovery. The use of non-concentrated solutions requires increased incubation time in order to collect the enriched or purified enzyme precipitate.
[00113] A solução contendo enzima é concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima deseja- do ser obtido. A concentração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presente do- cumento. Os métodos exemplificativos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo em tambor giratório e/ou ultrafiltração. Enzimas GTF[00113] The enzyme-containing solution is concentrated using conventional concentration techniques until the desired enzyme level is obtained. The concentration of the enzyme-containing solution can be achieved by any of the techniques discussed in this document. Exemplary enrichment and purification methods include, but are not limited to, rotary drum vacuum filtration and / or ultrafiltration. GTF enzymes
[00114] Os polímeros de glucano produzidos pela adição de uma enzima GTF a uma solução adequada de sacarose podem ser solú- veis ou insolúveis. A solubilidade de glucano depende de vários fato- res, incluindo porcentagem de ligações alfa 1,3, porcentagem de liga- ções alfa 1,6 e comprimento de polímero (DPn). Consultar, por exem- plo, a Patente nº U.S. 8.871.474, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade (a patente 8.871.474).[00114] Glucan polymers produced by adding a GTF enzyme to a suitable sucrose solution can be soluble or insoluble. Glucan solubility depends on several factors, including percentage of alpha bonds 1.3, percentage of alpha bonds 1.6 and polymer length (DPn). See, for example, U.S. Patent No. 8,871,474, incorporated herein by reference in its entirety (patent 8,871,474).
[00115] Outros produtos (subprodutos) de GTF incluem glicose (em que a glicose é hidrolisada a partir do complexo intermediário de enzi- ma glicosil-GTF), vários oligossacarídeos solúveis (DP2-DP7), e leu-[00115] Other GTF products (by-products) include glucose (in which glucose is hydrolyzed from the intermediate glycosyl enzyme-GTF complex), various soluble oligosaccharides (DP2-DP7), and leukemia
crose (em que a glicose do complexo intermediário de enzima glicosil- gtf é ligada à frutose). Leucrose é um dissacarídeo composto de glico- se e frutose ligado por uma ligação alfa-1,5. Formas de enzimas glico- siltransferase do tipo selvagem contêm geralmente (na direção N- terminal para C-terminal) um peptídeo sinal, um domínio variável, um domínio catalítico e um domínio de ligação a glucano.crose (where the glucose of the intermediate glycosylgtf enzyme complex is bound to fructose). Leucrose is a disaccharide composed of glycoside and fructose linked by an alpha-1,5 bond. Wild-type glycosiltransferase enzyme forms generally contain (in the N-terminal to C-terminal direction) a signal peptide, a variable domain, a catalytic domain and a glucan-binding domain.
[00116] As glicosiltransferases em certas modalidades da invenção podem ser derivadas de espécies de Streptococcus, espécies de Leu- conostoc ou espécies de Lactobacillus, por exemplo. Os exemplos de espécies de Streptococcus a partir das quais a glicosiltransferase pode ser derivada incluem S. salivarius, S. sobrinus, S. dentirousetti, S. downei, S. mutans, S. oralis, S. gallolyticus e S. sanguinis. Exemplos de espécies de Leuconostoc a partir das quais a glicosiltransferase pode ser derivada incluem L. mesenteroides, L. amelibiosum, L. argen- tinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum e L. fructo- sum. Exemplos de espécies de Lactobacillus a partir das quais a glico- siltransferase pode ser derivada incluem L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum e L. reuteri.[00116] Glycosyltransferases in certain embodiments of the invention can be derived from species of Streptococcus, species of Leoconostoc or species of Lactobacillus, for example. Examples of Streptococcus species from which glycosyltransferase can be derived include S. salivarius, S. sobrinus, S. dentirousetti, S. downei, S. mutans, S. oralis, S. gallolyticus and S. sanguinis. Examples of Leuconostoc species from which glycosyltransferase can be derived include L. mesenteroides, L. amelibiosum, L. argenetinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum and L. fructo-sum . Examples of Lactobacillus species from which glycosiltransferase can be derived include L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L brevis, L. buchneri, L. fermentum and L. reuteri.
[00117] De acordo com um aspecto da presente invenção, determi- nou-se que as enzimas GTF que produzem glucano insolúvel são par- ticularmente preferenciais. Glucano insolúvel é glucano que não é so- lúvel em soluções aquosas. Conforme apresentado na patente nº[00117] In accordance with one aspect of the present invention, GTF enzymes which produce insoluble glucan have been determined to be particularly preferred. Insoluble glucan is a glucan that is not soluble in aqueous solutions. As presented in patent no.
8.871.474, polímeros de glucano insolúveis tendem a ter uma porcen- tagem relativamente alta de ligações alfa 1,3 a ligações alfa 1,6 e um DPn de pelo menos 100. De acordo com um aspecto da presente in- venção, as seguintes enzimas GTF podem ser usadas para formar po- límeros de glucano insolúveis: GTFJ, GTF300, GTF0874, 6855, 2379, 7527, 1724, 0544, 5926, 4297, 5618, 2765, 0427, 2919, 2678, e 3929.8,871,474, insoluble glucan polymers tend to have a relatively high percentage of alpha 1,3 bonds to alpha 1,6 bonds and a DPn of at least 100. According to one aspect of the present invention, the following GTF enzymes can be used to form insoluble glucan polymers: GTFJ, GTF300, GTF0874, 6855, 2379, 7527, 1724, 0544, 5926, 4297, 5618, 2765, 0427, 2919, 2678, and 3929.
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DANSGERVRIN 9 MVDGKYYYYDADGNVKKNFAVSVGD Streptococ- AIFYFDETGAYKDTSKVDADKTSSSVN cus dentirou- QTTETFAANNRAYSTAAENFEAIDNYL settiDANSGERVRIN 9 MVDGKYYYYDADGNVKKNFAVSVGD Streptococ- AIFYFDETGAYKDTSKVDADKTSSSVN cus toothed- QTTETFAANNRAYSTAAENFEAIDNYL setti
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QWKEVNGQYYYFDNNGVAIYRGWN 10 MIDGKNYYVQDDGTVKKNFAVELNGR Streptococ- ILYFDAETGALVDSNEYQFQQGTSSL cus oralisQWKEVNGQYYYFDNNGVAIYRGWN 10 MIDGKNYYVQDDGTVKKNFAVELNGR Streptococ- ILYFDAETGALVDSNEYQFQQGTSSL cus oralis
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QLEDGSWMYFDRDGRGQNFGRN 11 MIDGKKYYVQDDGTVKKNFAVELNGK Streptococ- ILYFDAETGALIDSAEYQFQQGTSSLN cus sanguinisQLEDGSWMYFDRDGRGQNFGRN 11 MIDGKKYYVQDDGTVKKNFAVELNGK Streptococ- ILYFDAETGALIDSAEYQFQQGTSSLN cus sanguinis
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GWN 12 MIDGKYYYVNEDGSHKENFAITVNGQ espécies de LLYFGKDGALTSSSTYSFTQGTTNIVD Streptococ- GFSINNRAYDSSEASFELIDGYLTADS cus desco- WYRPASIIKDGVTWQASTAEDFRPLL nhecidasGWN 12 MIDGKYYYVNEDGSHKENFAITVNGQ species of LLYFGKDGALTSSSTYSFTQGTTNIVD Streptococ- GFSINNRAYDSSEASFELIDGYLTADS cus desco- WYRPASIIKDGVTWQASTAEDFRPLL nhec
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PPENMN 13 MIDGKYYYVNKDGSHKENFAITVNGQ Streptococ- LLYFGKDGALTSSSTYSFTQGTTNIVD cus salivariusPPENMN 13 MIDGKYYYVNKDGSHKENFAITVNGQ Streptococ- LLYFGKDGALTSSSTYSFTQGTTNIVD cus salivarius
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FDKNGLAYPPENMN 14 MTDGKYYYVNEDGSHKENFAITVNGQ Streptococ- LLYFGKDGALTSSSTHSFTPGTTNIVD cus salivariusFDKNGLAYPPENMN 14 MTDGKYYYVNEDGSHKENFAITVNGQ Streptococ- LLYFGKDGALTSSSTHSFTPGTTNIVD cus salivarius
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SEQ ID Sequência Origem NO: 15 MIDGKYYYVNEDGSHKENFAITVNGQ Streptococ- LLYFGKDGALTSSSTYSFTPGTTNIVD cus salivariusSEQ ID String Source NO: 15 MIDGKYYYVNEDGSHKENFAITVNGQ Streptococ- LLYFGKDGALTSSSTYSFTPGTTNIVD cus salivarius
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NGLAYPPRVLN Modalidades Preferenciais da InvençãoPreferred Modalities of the Invention
[00118] De acordo com um aspecto da presente invenção, é forne- cido um método para gerar polímeros de glicose em um produto lácteo com o uso de uma glicosiltransferase para fornecer textura aumenta- da. O método fornece textura elevada, robusta e lisa a partir dos polí- meros de glicose formados. Conforme apresentado acima, no contexto da presente invenção, textura significa espessura e/ou sensação bu- cal. Conforme discutido acima, há um uso amplamente difundido de amido na indústria de iogurtes para fornecer textura ao iogurte. Os mé- todos da presente invenção fornecem surpreendentemente uma alter- nativa ao amido e outros estabilizantes para adicionar textura ao iogur- te.[00118] In accordance with an aspect of the present invention, a method is provided for generating glucose polymers in a dairy product with the use of a glycosyltransferase to provide increased texture. The method provides a high, robust and smooth texture from the formed glucose polymers. As presented above, in the context of the present invention, texture means thickness and / or a flat feel. As discussed above, there is a widespread use of starch in the yogurt industry to provide texture to yogurt. The methods of the present invention surprisingly provide an alternative to starch and other stabilizers to add texture to yogurt.
[00119] De acordo com um aspecto da presente invenção, a saca- rose adicionada é convertida em polímeros de glicose e frutose. En- quanto os polímeros de glicose aumentam a textura do iogurte, a fru-[00119] In accordance with an aspect of the present invention, the added saccharine is converted into polymers of glucose and fructose. While glucose polymers increase the texture of yogurt, fruit
tose fornece ao iogurte a doçura da frutose. A frutose melhora a pala- tabilidade e o sabor do iogurte além da textura aprimorada.tose provides yogurt with the sweetness of fructose. Fructose improves the palatability and flavor of yogurt in addition to the improved texture.
[00120] Em algumas jurisdições, componentes como enzima exi- gem potencialmente a rotulagem do produto final tendo o componente como um ingrediente. Em um aspecto da presente invenção, a GTF poderia ser considerada um auxiliar de processamento devido ao fato de que o leite pode ser aquecido (incluindo pasteurização), inativando a GTF. Surpreendentemente, constatou-se que a textura aumentada fornecida pela presente invenção não é destruída por aquecimento, mesmo até 95 ◦C por 6 minutos.[00120] In some jurisdictions, components as an enzyme potentially require the labeling of the final product with the component as an ingredient. In one aspect of the present invention, GTF could be considered a processing aid due to the fact that milk can be heated (including pasteurization), inactivating GTF. Surprisingly, it was found that the increased texture provided by the present invention is not destroyed by heating, even up to 95 ◦C for 6 minutes.
[00121] Em outro aspecto da presente invenção, constatou-se que os polímeros de glicose produzidos no leite em um glucose pH neutro podem ter uma aparência não uniforme ou não homogênea. Após a inoculação com cultura durante o processo de fermentação, o pH cai e foi constatado que os polímeros de glicose presentes durante a fer- mentação têm um aspecto brilhante mais homogêneo.[00121] In another aspect of the present invention, it has been found that glucose polymers produced in milk at a glucose neutral pH may have a non-uniform or inhomogeneous appearance. After inoculation with culture during the fermentation process, the pH drops and it was found that the glucose polymers present during fermentation have a more homogeneous shiny appearance.
[00122] Conforme mencionado acima, estabilizantes são frequen- temente adicionados ao iogurte para aumentar a textura. Além da des- pesa crescente devido ao custo do ingrediente, estabilizantes adicio- nados, como amido exigem procedimentos de manuseio especiais quando o iogurte é vertido em recipientes menores para distribuição para os consumidores. Os fabricantes de iogurte precisam resfriar tipi- camente o iogurte a 8 ◦C antes que o mesmo seja transportado para distribuição para lojas. Embora seja possível resfriar em lote rapida- mente o iogurte com o uso de placas de resfriamento, isso não é pos- sível para o iogurte que tem estabilizante. Se o iogurte com estabili- zante for resfriado em lote a 8 ◦C antes do preenchimento em recipien- tes individuais para compra pelo consumidor, a textura fornecida pelo estabilizante será destruída durante o processo de preenchimento por forças de cisalhamento. A textura perdida desse modo não pode ser restaurada, anulando todo o ponto de adição de estabilizante para co- meçar.[00122] As mentioned above, stabilizers are often added to yogurt to increase texture. In addition to the increasing expense due to the cost of the ingredient, added stabilizers, such as starch, require special handling procedures when the yogurt is poured into smaller containers for distribution to consumers. Yogurt manufacturers typically need to cool yogurt to 8 ◦C before it is transported for distribution to stores. Although it is possible to batch cool yogurt quickly with the use of cooling plates, this is not possible for yogurt that has a stabilizer. If the yogurt with stabilizer is cooled in batch to 8 ◦C before filling in individual containers for purchase by the consumer, the texture provided by the stabilizer will be destroyed during the filling process by shear forces. The texture lost in this way cannot be restored, canceling the entire point of adding stabilizer to start.
[00123] O iogurte contendo estabilizante precisa ser preenchido em recipientes a 20 a 25 C. Uma vez que o iogurte com estabilizante é preenchido nos recipientes, o mesmo pode ser resfriado a aproxima- damente 8 ◦C e transportado. Entretanto, o resfriamento desse modo é mais lento e causa atrasos no transporte e despesas adicionais em termos de fornecimento de uma instalação de resfriamento.[00123] The yogurt containing stabilizer needs to be filled in containers at 20 to 25 C. Once the stabilized yogurt is filled in the containers, it can be cooled to approximately 8 ◦C and transported. However, cooling in this way is slower and causes transport delays and additional expenses in terms of providing a cooling facility.
[00124] De acordo com um aspecto da presente invenção, consta- tou-se que o iogurte contendo os polímeros de glicose produzidos po- dem ser resfriados a 5 ◦C antes do preenchimento. Esse recurso per- mite economias de custos substanciais.[00124] According to one aspect of the present invention, it has been found that the yogurt containing the glucose polymers produced can be cooled to 5 ◦C before filling. This feature allows for substantial cost savings.
[00125] Em outro da presente invenção, os iogurtes contendo os polímeros de glicose produzidos podem ser combinados com estabili- zantes, como amido ou pectina para fornecer iogurte com prazo de validade longo, altamente estável e textura aumentada. Estabilizantes também podem ser usados para impedir a sedimentação de proteína causada pelo aquecimento do iogurte a baixo pH.[00125] In another of the present invention, yogurts containing the produced glucose polymers can be combined with stabilizers, such as starch or pectin to provide yogurt with long, highly stable and increased texture. Stabilizers can also be used to prevent protein sedimentation caused by heating yogurt to low pH.
[00126] O teor de proteína e gordura do iogurte pode ser modificado por razões de custo e/ou percepção de saúde. Por exemplo, a gordura fornece textura e um sabor desejável ao iogurte. Entretanto, por ra- zões de saúde os consumidores podem preferir iogurte com baixo teor de gordura ou mesmo sem gordura. Os polímeros de glicose produzi- dos de acordo com a presente invenção podem substituir a textura perdida ao reduzir ou eliminar a gordura. Aumentar o teor de proteína do iogurte também é um modo de aumentar a textura. Entretanto, há uma despesa associada ao aumento do teor de proteína do iogurte. De acordo com a presente invenção, constatou-se que os polímeros de glicose da presente invenção podem fornecer textura no lugar de ou em adição à proteína adicionada.[00126] The protein and fat content of yogurt can be modified for reasons of cost and / or health perception. For example, fat provides yogurt with a desirable texture and flavor. However, for health reasons, consumers may prefer low-fat or even fat-free yogurt. The glucose polymers produced in accordance with the present invention can replace the lost texture by reducing or eliminating fat. Increasing the protein content of yogurt is also a way to increase the texture. However, there is an expense associated with increasing the protein content of yogurt. In accordance with the present invention, it has been found that the glucose polymers of the present invention can provide texture in place of or in addition to the added protein.
[00127] De acordo com um aspecto da presente invenção, é apre- sentado um método para produzir um produto de iogurte que tem tex- tura aprimorada, sendo que a textura aprimorada é espessura e/ou sensação bucal aumentada, que tem as etapas de: fornecer leite; adi- cionar sacarose ao leite para formar leite adoçado; colocar o leite ado- çado em contato com uma glicosiltransferase para formar um polímero de glicose insolúvel; inocular com uma cultura inicial; e fermentar para fornecer o produto de iogurte que tem textura aprimorada que é es- pessura aumentada e/ou sensação bucal aumentada.[00127] In accordance with an aspect of the present invention, a method is presented to produce a yogurt product that has improved texture, the enhanced texture being increased thickness and / or mouthfeel, which has the steps of : supply milk; adding sucrose to the milk to form sweetened milk; placing the sweetened milk in contact with a glycosyltransferase to form an insoluble glucose polymer; inoculate with an initial culture; and ferment to provide the yogurt product that has an improved texture that is increased thickness and / or increased mouthfeel.
[00128] De preferência, o leite é leite de vaca. De preferência, o lei- te é selecionado dentre o grupo que consiste em leite cru, leite pré- pasteurizado, leite integral, leite desnatado, leite reconstituído, leite tratado com lactase, leite com teor de lactose reduzido, leite sem lac- tose e leite condensado. Em outras modalidades preferenciais, o leite é leite cru.[00128] Preferably, milk is cow's milk. Preferably, the milk is selected from the group consisting of raw milk, pre-pasteurized milk, whole milk, skimmed milk, reconstituted milk, milk treated with lactase, milk with reduced lactose content, milk without lactose and condensed milk. In other preferred modalities, milk is raw milk.
[00129] De preferência, o método tem as etapas adicionais de ho- mogeneizar e pasteurizar o leite. Em um aspecto preferencial da pre- sente invenção, a etapa de entrar em contato com glicosiltransferase é realizada após as etapas de homogeneização e pasteurização. Em ainda outra modalidade preferencial, a etapa de colocar em contato com glicosiltransferase é realizada antes das etapas de homogeneizar e pasteurizar.[00129] Preferably, the method has the additional steps of homogenizing and pasteurizing the milk. In a preferred aspect of the present invention, the step of coming into contact with glycosyltransferase is carried out after the steps of homogenization and pasteurization. In yet another preferred modality, the step of putting in contact with glycosyltransferase is carried out before the steps of homogenizing and pasteurizing.
[00130] De preferência, a sacarose é adicionada para constituir cer- ca de 0,1 a 12% (p/p). Com mais preferência, a sacarose é adicionada para constituir cerca de 2 a 8% (p/p). Em modalidades ainda mais pre- ferenciais, a sacarose é adicionada para constituir cerca de 4 a 6% (p/p).[00130] Preferably, sucrose is added to constitute about 0.1 to 12% (w / w). More preferably, sucrose is added to make up about 2 to 8% (w / w). In even more preferred modalities, sucrose is added to make up about 4 to 6% (w / w).
[00131] De preferência, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 70% de identidade de sequência com uma enzima seleci- onada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300[00131] Preferably, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 70% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300
(SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Mais preferencialmente, a glicosil- transferase é uma enzima que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Ainda mais preferencialmente, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2) , GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Em modali- dades ainda mais preferenciais, a glicosiltransferase é uma enzima que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13),(SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 ( SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). More preferably, glycosyl transferase is an enzyme that has at least 80% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 ( SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8) ), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Even more preferably, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 90% sequence identity with an enzyme selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8) , GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). In even more preferred modalities, glycosyltransferase is an enzyme that has at least 95% sequence identity with GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3) , GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13),
GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Em modali- dades ainda mais preferenciais, a glicosiltransferase é selecionada dentre o grupo que consiste em GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO: 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), e GTF3929 (SEQ ID NO: 15). Ainda mais preferencialmente, a glicosiltransferase é GTFJ (SEQ ID NO: 1).GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO: 15). In even more preferred modalities, glycosyltransferase is selected from the group consisting of GTFJ (SEQ ID NO: 1), GTF300 (SEQ ID NO: 2), GTF0874 (SEQ ID NO: 3), GTF6855 (SEQ ID NO : 4), GTF2379 (SEQ ID NO: 5), GTF7527 (SEQ ID NO: 6), GTF1724 (SEQ ID NO: 7), GTF0544 (SEQ ID NO: 8), GTF5926 (SEQ ID NO: 9), GTF4297 (SEQ ID NO: 10), GTF5618 (SEQ ID NO: 11), GTF2765 (SEQ ID NO: 12), GTF2919 (SEQ ID NO: 13), GTF2678 (SEQ ID NO; 14), and GTF3929 (SEQ ID NO : 15). Even more preferably, the glycosyltransferase is GTFJ (SEQ ID NO: 1).
[00132] De preferência, a glicosiltransferase está presente no leite em uma quantidade de cerca de 0,005 mg por 100 ml de leite a 15 mg por 100 ml de leite. Mais preferencialmente, a glicosiltransferase está presente em uma quantidade de cerca de 0,03 mg por 100 ml de leite a cerca de 12,5 mg por 100 ml de leite.[00132] Preferably, glycosyltransferase is present in milk in an amount of about 0.005 mg per 100 ml of milk to 15 mg per 100 ml of milk. More preferably, the glycosyltransferase is present in an amount of about 0.03 mg per 100 ml of milk to about 12.5 mg per 100 ml of milk.
[00133] De preferência, a GTFJ está presente em uma quantidade de cerca de 0,033 mg por 100 ml de leite a cerca de 12,5 mg por 100 ml de leite. Mais preferencialmente, a GTFJ está presente em uma quantidade de cerca de 0,3 mg por 100 ml de leite a cerca de 5,0 mg por 100 ml de leite.[00133] Preferably, GTFJ is present in an amount of about 0.033 mg per 100 ml of milk to about 12.5 mg per 100 ml of milk. More preferably, GTFJ is present in an amount of about 0.3 mg per 100 ml of milk to about 5.0 mg per 100 ml of milk.
[00134] Em outras modalidades preferenciais, a glicosiltransferase é GTF300 (SEQ ID NO: 2).[00134] In other preferred embodiments, the glycosyltransferase is GTF300 (SEQ ID NO: 2).
[00135] De preferência, a GTF300 está presente em uma quantida- de de cerca de 0,033 mg por 100 ml a cerca de 12,5 mg por 100 ml de leite. Mais preferencialmente, a GTF300 está presente em uma quan- tidade de cerca de 0,3 mg por 100 ml de leite a cerca de 5 mg por 100 ml de leite.[00135] Preferably, GTF300 is present in an amount of about 0.033 mg per 100 ml to about 12.5 mg per 100 ml of milk. Most preferably, GTF300 is present in an amount of about 0.3 mg per 100 ml of milk to about 5 mg per 100 ml of milk.
[00136] De preferência, a textura aumentada é espessura aumen- tada. De preferência, a espessura é aumentada em 30% ou mais em comparação com uma amostra de controle (sem enzima GTF). Mais preferencialmente, a espessura é aumentada em 50% ou mais. Ainda mais preferencialmente, a espessura é aumentada em 70% ou mais. Em modalidades ainda mais preferenciais, a espessura é aumentada em 90% ou mais. Mais preferencialmente, a espessura é aumentada em 100% ou mais. Ainda mais preferencialmente, a espessura é au- mentada em 110% ou mais. Nas modalidades com máxima preferên- cia, a espessura é aumentada em 120% ou mais.[00136] Preferably, the increased texture is increased thickness. Preferably, the thickness is increased by 30% or more compared to a control sample (without GTF enzyme). Most preferably, the thickness is increased by 50% or more. Even more preferably, the thickness is increased by 70% or more. In even more preferred embodiments, the thickness is increased by 90% or more. Most preferably, the thickness is increased by 100% or more. Even more preferably, the thickness is increased by 110% or more. In the most preferred modalities, the thickness is increased by 120% or more.
[00137] Em outras modalidades preferenciais, a textura aumentada é sensação bucal aumentada. De preferência, a sensação bucal é au- mentada em 30% ou mais em comparação com uma amostra de con- trole (sem enzima GTF). Mais preferencialmente, a sensação bucal é aumentada em 50% ou mais. Ainda mais preferencialmente, a sensa- ção bucal é aumentada em 70% ou mais. Em modalidades ainda mais preferenciais, a sensação bucal é aumentada em 90% ou mais. Ainda mais preferencialmente, a sensação bucal é aumentada em 100% ou mais. Em modalidades ainda mais preferenciais, a sensação bucal é aumentada em 110% ou mais. Nas modalidades com máxima prefe- rência, a sensação bucal é aumentada em 120% ou mais.[00137] In other preferred modalities, the increased texture is increased mouthfeel. Preferably, the mouthfeel is increased by 30% or more compared to a control sample (without GTF enzyme). Most preferably, the mouthfeel is increased by 50% or more. Even more preferably, the oral sensation is increased by 70% or more. In even more preferred modalities, the oral sensation is increased by 90% or more. Even more preferably, the mouthfeel is increased by 100% or more. In even more preferred modalities, the oral sensation is increased by 110% or more. In the modalities with maximum preference, the oral sensation is increased by 120% or more.
[00138] De acordo com um aspecto da presente invenção, o leite é leite com baixo teor de gordura para fornecer um iogurte com baixo teor de gordura. Em um aspecto mais preferencial da presente inven- ção o leite é leite sem gordura para fornecer um iogurte sem gordura.[00138] According to one aspect of the present invention, milk is low-fat milk to provide a low-fat yogurt. In a more preferred aspect of the present invention, milk is fat-free milk to provide a fat-free yogurt.
[00139] Em outro aspecto preferencial da presente invenção, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3% (p/p). Mais preferencialmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo me- nos cerca de 3,5%. Ainda mais preferencialmente, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3,7% (p/p). Em outra mo- dalidade preferencial, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3,8% (p/p). Em modalidades ainda mais preferenciais, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 3,9%[00139] In another preferred aspect of the present invention, the milk protein content is adjusted by at least about 3% (w / w). Most preferably, the milk protein content is adjusted by at least about 3.5%. Even more preferably, the milk protein content is adjusted by at least about 3.7% (w / w). In another preferred mode, the protein content of milk is adjusted by at least about 3.8% (w / w). In even more preferred forms, the protein content of milk is adjusted by at least about 3.9%
(p/p). Em ainda outras modalidades preferenciais, o teor de proteína do leite é ajustado em pelo menos cerca de 4,0% (p/p).(w / w). In yet other preferred embodiments, the milk protein content is adjusted by at least about 4.0% (w / w).
[00140] Em outro aspecto da invenção, o método inclui as etapas adicionais de resfriar o iogurte até uma temperatura entre 5 e 10 ◦C para fornecer um iogurte resfriado; e verter o iogurte resfriado em reci- pientes pré-formados. De preferência, os recipientes fornecem uma porção individual de iogurte. As modalidades preferenciais desse as- pecto da presente invenção são conforme apresentado acima.[00140] In another aspect of the invention, the method includes the additional steps of cooling the yogurt to a temperature between 5 and 10 ◦C to provide a chilled yogurt; and pour the cooled yogurt into preformed containers. Preferably, the containers provide an individual portion of yogurt. The preferred embodiments of this aspect of the present invention are as shown above.
[00141] Em outro aspecto da presente invenção, é apresentado um iogurte que é produzido de acordo com qualquer um dos métodos acima. De preferência, o iogurte tem pectina.[00141] In another aspect of the present invention, there is presented a yogurt which is produced according to any of the above methods. Preferably, the yogurt has pectin.
[00142] Em outro aspecto da presente invenção, o leite compreen- de pelo menos 4% de lactose (p/p). De preferência, o leite compreen- de pelo menos 4,5% de lactose.[00142] In another aspect of the present invention, milk comprises at least 4% lactose (w / w). Preferably, the milk comprises at least 4.5% lactose.
[00143] Em outro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para produzir um produto alimentício com teor de açúcar redu- zido que tem textura aprimorada, sendo que o método tem as etapas de: fornecer uma matriz alimentícia que compreende sacarose e lacto- se; e colocar a matriz alimentícia em contato com uma glicosiltransfe- rase para formar um polímero de glicose insolúvel.[00143] In another aspect of the present invention, a method is presented to produce a food product with reduced sugar content that has improved texture, the method having the steps of: providing a food matrix that comprises sucrose and lactose. if; and placing the food matrix in contact with a glycosyltransferase to form an insoluble glucose polymer.
[00144] De preferência, a sacarose na matriz alimentícia é de cerca de 0,1 a cerca de 12% (p/p). Mais preferencialmente, a sacarose é de cerca de 2 a cerca de 8% (p/p). Ainda mais preferencialmente, a saca- rose é de cerca de 4 a cerca de 6% (p/p).[00144] Preferably, the sucrose in the food matrix is about 0.1 to about 12% (w / w). More preferably, sucrose is from about 2 to about 8% (w / w). Even more preferably, the bag is about 4 to about 6% (w / w).
[00145] De preferência, a lactose na matriz alimentícia é de cerca de 0,1 a cerca de 12% (p/p). Mais preferencialmente, a lactose é de cerca de 2 a cerca de 8% (p/p). Ainda mais preferencialmente, a lacto- se é de cerca de 4 a cerca de 6% (p/p).[00145] Preferably, the lactose in the food matrix is about 0.1 to about 12% (w / w). More preferably, the lactose is from about 2 to about 8% (w / w). Even more preferably, lactose is about 4 to about 6% (w / w).
[00146] De preferência, a textura aprimorada na matriz alimentícia é espessura aumentada e/ou sensação bucal aumentada.[00146] Preferably, the improved texture in the food matrix is increased thickness and / or increased mouthfeel.
[00147] De preferência, a matriz alimentícia é um produto lácteo, uma bebida, uma massa ou pão, um produto de confeitaria, uma bebi- da fermentada, uma cobertura, um molho ou uma carne processada.[00147] Preferably, the food matrix is a dairy product, a drink, a pastry or bread, a confectionery product, a fermented drink, a topping, a sauce or a processed meat.
[00148] As glicosiltransferases preferenciais são conforme apresen- tado acima.[00148] Preferred glycosyltransferases are as shown above.
[00149] Algumas modalidades no presente documento são direcio- nadas a um método conforme descrito, mas em que pelo menos uma enzima frutosiltransferase é usada no lugar de ou em adição a uma glicosiltransferase conforme descrito no presente documento. Uma "frutosiltransferase" (ou "frutanossacarase") no presente documento se refere a uma enzima com capacidade de transferir frutose a partir do substrato de sacarose para um aceitante de sacarídeo, como sacarose ou frutano, produzindo desse modo glicose e um produto de sacarídeo frutosilado (por exemplo, um frutano como 2,1-beta-frutano [inulina] ou 2,6-beta-frutano [levano]). Dado que uma enzima frutosiltransferase é usada, a sacarose de uma composição de leite no presente documen- to é convertida em um frutano, em vez de glucano, e glicose livre é produzida em vez de frutose livre. Exemplos de frutosiltransferases no presente documento são aqueles classificados na Comissão de Enzi- mas (Enzyme Commission (E.C.)) nº 2.4.1.9 (por exemplo, inulossaca- rase) ou 2.4.1.99 (por exemplo, levanossacarase). Exemplos adicio- nais incluem frutosiltransferases conforme descrito em qualquer uma das Patentes nº U.S. 5952205, 5641667 e 6872555, que são incorpo- radas ao presente documento a título de referência. Contempla-se que a produção de frutano em produtos lácteos ou outros produtos alimen- tícios e outros produtos alimentícios usando uma frutosiltransferase in situ permite a produção de produtos pelo menos com textura, fibras dietárias e/ou qualidades prebióticas aprimoradas. Alternativamente, frutano pode ser diretamente adicionado a produtos lácteos ou outros produtos alimentícios; tal frutano pode ser um produto de qualquer uma das frutosiltransferases anteriormente mencionadas, por exemplo.[00149] Some embodiments in this document are directed to a method as described, but in which at least one fructosyltransferase enzyme is used in place of or in addition to a glycosyltransferase as described in this document. A "fructosyltransferase" (or "fructanosaccharase") in this document refers to an enzyme capable of transferring fructose from the sucrose substrate to a sucrose acceptor, such as sucrose or fructan, thereby producing glucose and a fructose saccharide product. (for example, a fructan such as 2,1-beta-fructan [inulin] or 2,6-beta-fructan [levano]). Since a fructosyltransferase enzyme is used, the sucrose of a milk composition in this document is converted to a fructan, instead of glucan, and free glucose is produced instead of free fructose. Examples of fructosyltransferases in this document are those classified by the Enzyme Commission (E.C.) No. 2.4.1.9 (for example, inulossaccharase) or 2.4.1.99 (for example, levanosucrase). Additional examples include fructosyltransferases as described in any of U.S. Patent Nos. 5,952,205, 5641667 and 6872555, which are hereby incorporated by reference. It is contemplated that the production of fructan in dairy products or other food products and other food products using a fructosyltransferase in situ allows the production of products at least with texture, dietary fibers and / or improved prebiotic qualities. Alternatively, fructan can be added directly to dairy products or other food products; such fructan can be a product of any of the aforementioned fructosyltransferases, for example.
[00150] Algumas modalidades no presente documento são direcio- nadas a um método conforme descrito, mas em que pelo menos uma enzima dextranossacarase é usada no lugar de ou em adição a uma glicosiltransferase conforme descrito no presente documento. A dex- tranossacarase no presente documento se refere a um tipo de enzima glicosiltransferase com capacidade para sintetizar dextrano (por exemplo, alfa-glucano solúvel em água que compreende pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% ligações alfa-1,6 glicosídicas) e fruto- se proveniente de sacarose, e é tipicamente classificada na EC[00150] Some embodiments in this document are directed to a method as described, but in which at least one dextranosucrase enzyme is used in place of or in addition to a glycosyltransferase as described in this document. The dextransaccharase in this document refers to a type of glycosyltransferase enzyme capable of synthesizing dextran (for example, water-soluble alpha-glucan that comprises at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% alpha-1,6 glycosidic bonds) and is fructose from sucrose, and is typically classified in EC
2.4.1.5. Em alguns aspectos, uma dextranossacarase pode produzir dextrano tendo um peso molecular ponderal médio (Mw) de cerca de, pelo menos cerca de, ou não mais que cerca de 25, 50, 100, 200, 500 ou 850 milhões de Daltons. Uma dextranossacarase pode, em alguns casos, produzir dextrano que compreende (i) cerca de 87 a 93% em peso de glicose ligada nas posições 1 e 6; (ii) cerca de 0,1 a 1,2% em peso de glicose ligada nas posições 1 e 3; (iii) cerca de 0,1 a 0,7% em peso de glicose ligada nas posições 1 e 4; (iv) cerca de 7,7 a 8,6% em peso de glicose ligada nas posições 1, 3 e 6; e (v) cerca de 0,4 a 1,7% em peso de glicose ligada nas: (a) posições 1, 2 e 6, ou (b) posições 1, 4 e 6; e tem um Mw de cerca de 50 a 200 milhões de Daltons e um raio de rotação de média z de cerca de 200 a 280 nm. Em alguns ca- sos, uma dextranossacarase pode produzir dextrano tendo um grau de polimerização (DP) ou DP ponderal médio (DPw) de cerca de, pelo menos cerca de, ou não mais que cerca de 10, 25, 50, 75, 100, 105, 110, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, ou 700. Um dextrano, em al- guns casos, pode compreender 1 a 50% de ramificações alfa-1,2 (ca- da ramificação é tipicamente uma única unidade de glicose), em que tais ramificações são adicionadas pela própria enzima dextranossaca-2.4.1.5. In some aspects, a dextranosucrase can produce dextran having an average weight molecular weight (Mw) of about, at least about, or no more than about 25, 50, 100, 200, 500 or 850 million Daltons. A dextranosucrase can, in some cases, produce dextran which comprises (i) about 87 to 93% by weight of glucose bound in positions 1 and 6; (ii) about 0.1 to 1.2% by weight of glucose bound in positions 1 and 3; (iii) about 0.1 to 0.7% by weight of glucose bound in positions 1 and 4; (iv) about 7.7 to 8.6% by weight of glucose bound in positions 1, 3 and 6; and (v) about 0.4 to 1.7% by weight of glucose bound in: (a) positions 1, 2 and 6, or (b) positions 1, 4 and 6; and it has an Mw of about 50 to 200 million Daltons and an average z rotation radius of about 200 to 280 nm. In some cases, a dextranosucrase can produce dextran having a degree of polymerization (DP) or average weight DP (DPw) of about, at least about, or no more than about 10, 25, 50, 75, 100 , 105, 110, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, or 700. A dextran, in some cases, may comprise 1 to 50% of alpha-1,2 branches (each branch is typically a single glucose unit), in which such branches are added by the
rase (uma que tem adicionalmente atividade de ramificação alfa-1,2) durante a síntese de dextrano. Exemplos de dextranossacarases com algumas das capacidades anteriormente mencionadas (por exemplo, GTF 0768, GTF 8117, GTF 6831, GTF 5604, DSR-E) são conforme descrito em qualquer uma das Publicações de Pedido de Patente U.S. nº 2016/0122445, 2017/0145120, 2018/0282385, 2017/0218093 e 2010/0284972, que são incorporadas ao presente documento a título de referência. Contempla-se que a produção de dextrano em laticínios e outros produtos alimentícios usando uma dextranossacarase in situ permite a produção de produtos pelo menos com fibras dietárias e/ou qualidades prebióticas aprimoradas. Alternativamente, dextrano pode ser diretamente adicionado a produtos lácteos ou outros produtos ali- mentícios; tal dextrano pode ser um produto de qualquer uma das dex- tranossacarases anteriormente mencionadas, por exemplo.rase (one that additionally has alpha-1,2 branching activity) during dextran synthesis. Examples of dextranosaccharases with some of the aforementioned capabilities (for example, GTF 0768, GTF 8117, GTF 6831, GTF 5604, DSR-E) are as described in any of the US Patent Application Publications 2016/0122445, 2017/0145120 , 2018/0282385, 2017/0218093 and 2010/0284972, which are incorporated by reference in this document. It is contemplated that the production of dextran in dairy products and other food products using a dextranosucrase in situ allows the production of products with at least dietary fibers and / or improved prebiotic qualities. Alternatively, dextran can be added directly to dairy products or other food products; such dextran can be a product of any of the aforementioned dextransaccharases, for example.
[00151] Algumas modalidades no presente documento são direcio- nadas a um método conforme atualmente descrito, porém em que pelo menos uma enzima glicosiltransferase produtora de alfa-1,3-glucano variante (geneticamente modificada) é usada no lugar de ou em adição a uma glicosiltransferase conforme descrito no presente documento. Tal glicosiltransferase variante pode produzir alfa-1,3 glucano (por exemplo, alfa-glucano insolúvel em água que compreende pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% ligações alfa-1,3 glicosídicas), e em alguns aspectos, o produto de glucano é de peso molecular mais baixo ou mais alto e/ou produzido em rendimento mais alto, em comparação com o alfa-1,3-glucano produzido pela contraparte não variante da en- zima (por exemplo, enzima parental). Exemplos de enzimas parentais adequadas são descritos no presente documento como GTF-J, GTF0874, GTF6855,GTF2379, GTF7527, GTF1724, GTF0544, GTF5926, GTF4297, GTF5618, GTF2765, GTF0427, GTF2919,[00151] Some modalities in this document are directed to a method as currently described, however in which at least one variant alpha-1,3-glucan-producing (genetically modified) glycosyltransferase enzyme is used in place of or in addition to a glycosyltransferase as described in this document. Such variant glycosyltransferase can produce alpha-1,3 glucan (for example, water-insoluble alpha-glucan comprising at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% alpha-1,3 glycosidic bonds), and in some respects, the glucan product is of lower or higher molecular weight and / or produced in higher yields, compared to the alpha-1,3-glucan produced by the non-variant enzyme counterpart (eg, parental enzyme). Examples of suitable parental enzymes are described herein as GTF-J, GTF0874, GTF6855, GTF2379, GTF7527, GTF1724, GTF0544, GTF5926, GTF4297, GTF5618, GTF2765, GTF0427, GTF2919,
GTF2678 e GTF3929; observa-se que GTF300 (SEQ ID NO:2) é uma variante de GTF6855 (SEQ ID NO:4). Uma glicosiltransferase produto- ra de alfa-1,3-glucano variante, em alguns aspectos, pode produzir al- fa-1,3-glucano insolúvel com um DP or DPw de cerca de, ou menor que cerca de, 300, 280, 260, 240, 220, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, ou 11, e/ou pode ser conforme descrito no Pedido de Patente nº U.S. 16/295.423 (conforme originalmente de- positado), que é incorporado ao presente documento a título de refe- rência.GTF2678 and GTF3929; GTF300 (SEQ ID NO: 2) is observed to be a variant of GTF6855 (SEQ ID NO: 4). A variant alpha-1,3-glucan-producing glycosyltransferase, in some respects, can produce insoluble alpha-1,3-glucan with a DP or DPw of about, or less than, about 300, 280, 260, 240, 220, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, or 11, and / or can be as described in US Patent Application 16 / 295,423 (as originally declared), which is incorporated by reference in this document.
Em relação à produção de alfa-1,3-glucano com peso molecu- lar mais baixo (por exemplo, DP ou DPw < 300), sítios de substituição adequados e exemplos de substituições particulares nesses sítios po- dem incluir qualquer um daqueles listados na Tabela 3 ou 4 do Pedido de Patente nº U.S. 16/295.423 que estão associados a uma diminuição no DPw do produto de alfa-1,3-glucano insolúvel em cerca de, ou pelo menos cerca de, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 85%, por exemplo.In relation to the production of alpha-1,3-glucan with lower molecular weight (for example, DP or DPw <300), suitable substitution sites and examples of particular substitutions at those sites may include any of those listed in Table 3 or 4 of US Patent Application No. 16 / 295,423 that are associated with a decrease in DPw of the insoluble alpha-1,3-glucan product by about, or at least about, 10%, 20%, 30% , 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 85%, for example.
Em relação à produção de alfa-1,3-glucano com peso molecular mais alto, sítios de substituição adequados e exemplos de substituições particulares nesses sítios podem incluir qualquer um daqueles listados na Tabela 3, 4 ou 5 da Publicação de Pedido de Pa- tente nº U.S. 2019/0078062 (incorporada ao presente documento a título de referência) que estão associados a um aumento no DPw de produto de alfa-1,3-glucano insolúvel em cerca de, ou pelo menos cer- ca de, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60%, por exemplo.In relation to the production of alpha-1,3-glucan with higher molecular weight, suitable substitution sites and examples of particular substitutions at those sites may include any of those listed in Table 3, 4 or 5 of the Patent Application Publication US No. 2019/0078062 (incorporated by reference in this document) that are associated with an increase in the DPw of insoluble alpha-1,3-glucan product by about, or at least about, 10%, 20 %, 30%, 40%, 50%, or 60%, for example.
Em relação à produção de alfa-1,3-glucano com um rendimento mais alto, sítios de substituição adequados e exemplos de substituições particulares nes- ses sítios podem incluir qualquer um daqueles listados na Tabela 3, 6 ou 7 da Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2019/0078063 (in- corporada ao presente documento a título de referência) que estão as- sociados a (i) uma diminuição na produção de leucrose em pelo me- nos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ouRegarding the production of alpha-1,3-glucan with a higher yield, suitable substitution sites and examples of particular substitutions at these sites may include any of those listed in Table 3, 6 or 7 of the Patent Application Publication US No. 2019/0078063 (incorporated into this document as a reference) which are associated with (i) a decrease in leukrose production by at least about 10%, 20%, 30%, 40% , 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or
95%, e/ou (ii) um aumento no rendimento de glucano em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, ou 150%, por exemplo. Contempla-se que a produção de alfa-1,3-glucano em laticínios e outros produtos alimen- tícios usando uma glicosiltransferase variante in situ permite a produ- ção de produtos pelo menos com textura, fibras dietárias, e/ou quali- dades prebióticas aprimoradas. Alternativamente, alfa-1,3-glucano conforme produzido por (ou produzível a partir de) uma glicosiltransfe- rase variante no presente documento pode ser diretamente adicionado a produtos lácteos ou outros produtos alimentícios.95%, and / or (ii) an increase in glucan yield by at least about 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, or 150%, for example. It is contemplated that the production of alpha-1,3-glucan in dairy products and other food products using a variant glycosyltransferase in situ allows the production of products at least with texture, dietary fibers, and / or prebiotic qualities improved. Alternatively, alpha-1,3-glucan as produced by (or producable from) a variant glycosyltransferase in this document can be directly added to dairy products or other food products.
[00152] Em alguns aspectos, alfa-1,3-glucano sob a forma de um copolímero em bloco de dextrano-alfa-1,3-glucano pode ser diretamen- te adicionado ao leite ou outro produto lácteo. Exemplos de tais copo- límeros em bloco são descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO2017/079595 ou Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2019/0185893, que são aqui incorporados a título de referên- cia. Em alguns aspectos, o componente de dextrano de um copolímero em bloco de dextrano-alfa-1,3-glucano (por exemplo, o dextrano usado para produzir o copolímero em bloco) compreende (i) cerca de 87 a 93% em peso de glicose ligada nas posições 1 e 6; (ii) cerca de 0,1 a 1,2% em peso de glicose ligada nas posições 1 e 3; (iii) cerca de 0,1 a 0,7% em peso de glicose ligada nas posições 1 e 4; (iv) cerca de 7,7 a 8,6% em peso de glicose ligada nas posições 1, 3 e 6; e (v) cerca de 0,4 a 1,7% em peso de glicose ligada nas: (a) posições 1, 2 e 6, ou (b) posições 1, 4 e 6; e tem um Mw de cerca de 50 a 200 milhões de Dal- tons e um raio de rotação de média z de cerca de 200 a 280 nm. Em alguns aspectos, o componente de dextrano de um copolímero em bloco de dextrano-alfa-1,3-glucano pode ser produzido usando GTF 0768 conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2016/0122445. Em alguns aspectos, um copolímero em bloco de dex-[00152] In some respects, alpha-1,3-glucan in the form of a dextran-alpha-1,3-glucan block copolymer can be directly added to milk or other dairy products. Examples of such block copolymers are described in International Patent Application Publication No. WO2017 / 079595 or Patent Application Publication No. U.S. 2019/0185893, which are hereby incorporated by reference. In some respects, the dextran component of a dextran-alpha-1,3-glucan block copolymer (for example, the dextran used to produce the block copolymer) comprises (i) about 87 to 93% by weight of glucose bound in positions 1 and 6; (ii) about 0.1 to 1.2% by weight of glucose bound in positions 1 and 3; (iii) about 0.1 to 0.7% by weight of glucose bound in positions 1 and 4; (iv) about 7.7 to 8.6% by weight of glucose bound in positions 1, 3 and 6; and (v) about 0.4 to 1.7% by weight of glucose bound in: (a) positions 1, 2 and 6, or (b) positions 1, 4 and 6; and it has an Mw of about 50 to 200 million Daltons and an average z rotation radius of about 200 to 280 nm. In some respects, the dextran component of a dextran-alpha-1,3-glucan block copolymer can be produced using GTF 0768 as described in U.S. Patent Application Publication 2016/0122445. In some respects, a dex-
trano-alfa-1,3-glucano compreende cerca de, ou pelo menos cerca de, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90% em peso de dextrano. Contem- pla-se que a adição direta de copolímero em bloco de dextrano-alfa- 1,3-glucano aos produtos lácteos ou outros produtos alimentícios pode fornecer pelo menos textura, fibras dietárias e/ou qualidades prebióti- cas aprimoradas aos produtos.trano-alpha-1,3-glucan comprises about, or at least about, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 or 90% by weight of dextran. It is envisaged that the direct addition of dextran-alpha-1,3-glucan block copolymer to dairy products or other food products can provide at least texture, dietary fibers and / or enhanced prebiotic qualities to the products.
[00153] Algumas modalidades no presente documento são direcio- nadas a um método para reduzir o teor calórico de e/ou aumentar o teor de fibras dietárias de, um produto alimentício ou produto precursor de alimento. Este método pode compreender tratar um produto alimen- tício ou produto precursor de alimento contendo sacarídeo com primei- ra e segunda enzimas fosforilase sob condições adequadas, em que o sacarídeo (presente no produto alimentício ou produto precursor de alimento) é digerível por mamífero (por exemplo, ser humano) (isto é, calórico) e compreende glicose, e a primeira enzima fosforilase con- verte o sacarídeo digerível por mamífero em produtos que incluem al- fa-glicose-1-fosfato (alfa-G1P), e a segunda enzima fosforilase reage a alfa-G1P com um aceitante de sacarídeo para produzir um sacarídeo digerível por mamífero (isto é, não calórico). Esse método reduz o teor calórico do produto alimentício ou produto precursor de alimento e/ou aumenta o teor de fibras dietárias do produto alimentício ou produto precursor de alimento. Recursos desse método podem incluir, por exemplo, qualquer um conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2017/0327857 ou Pedido de Patente nº U.S. 16/383.820 (conforme originalmente depositado), que são incorpora- dos ao presente documento a título de referência. Uma "fosforilase" no presente documento se refere a uma classe particular de enzimas que pertencem à família glicosil hidrolase 94 (GH94) de acordo com o ban- co de dados CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes) (cazy.org website; consultar Cantarel et al., 2009, Nucleic Acids Res. 37:D233-238, incor-[00153] Some modalities in this document are directed to a method to reduce the caloric content of and / or increase the content of dietary fibers in, a food product or precursor product of food. This method may comprise treating a food product or food precursor product containing saccharide with first and second phosphorylase enzymes under appropriate conditions, in which the saccharide (present in the food product or food precursor product) is digestible by mammal (eg example, human) (ie, caloric) and comprises glucose, and the first phosphorylase enzyme converts the mammalian digestible saccharide into products that include alpha-glucose-1-phosphate (alpha-G1P), and the second phosphorylase enzyme reacts to alpha-G1P with a saccharide acceptor to produce a mammal-digestible (i.e., non-caloric) saccharide. This method reduces the caloric content of the food product or food precursor product and / or increases the dietary fiber content of the food product or food precursor product. Features of this method may include, for example, anyone as described in Patent Application Publication No. US 2017/0327857 or Patent Application No. US 16 / 383,820 (as originally filed), which are incorporated into this document by way of reference. A "phosphorylase" in this document refers to a particular class of enzymes that belong to the glycosyl hydrolase 94 (GH94) family according to the CAZy database (Carbohydrate-Active EnZymes) (cazy.org website; see Cantarel et al., 2009, Nucleic Acids Res. 37: D233-238, incor-
porado ao presente documento a título de referência). Em geral, tal fosforilase catalisa a seguinte reação: dissacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo contendo glicose + fosfato livre ↔ alfa-glicose-1- fosfato (alfa-G1P) + aceitante de sacarídeo.this document as a reference). In general, such phosphorylase catalyzes the following reaction: disaccharide, oligosaccharide or polysaccharide containing glucose + free phosphate ↔ alpha-glucose-1-phosphate (alpha-G1P) + saccharide acceptor.
Um sacarídeo digerível por mamífero, que a primeira fosforilase usa como um substrato para produzir alfa-G1P, compreende tipicamente um dissacarídeo, oligos- sacarídeo ou polissacarídeo que tem um ou mais resíduos de glicose; tal um ou mais resíduos de glicose são usados pela primeira fosforila- se para produzir alfa-G1P.A mammal-digestible saccharide, which the first phosphorylase uses as a substrate to produce alpha-G1P, typically comprises a disaccharide, oligosaccharide or polysaccharide that has one or more glucose residues; such one or more glucose residues are used by the first phosphorylate to produce alpha-G1P.
Exemplos de uma primeira fosforilase no presente documento incluem amido fosforilase (EC 2.4.1.1) e sacarose fosforilase (EC 2.4.1.7), que usam amido e sacarose, respectivamente, para produzir alfa-G1P.Examples of a first phosphorylase in this document include starch phosphorylase (EC 2.4.1.1) and sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7), which use starch and sucrose, respectively, to produce alpha-G1P.
Uma segunda fosforilase no presente docu- mento usa alfa-G1P (produzida pela primeira fosforilase) e um aceitan- te de sacarídeo para produzir um oligossacarídeo ou polissacarídeo que é indigerível por um mamífero (por exemplo, ser humano). Um exemplo de tal sacarídeo indigerível é beta-glucano (por exemplo, um oligossacarídeo or polissacarídeo que compreende pelo menos cerca de 90%, 95% ou 100% de ligações beta-glicosídicas). Em alguns as- pectos, um aceitante de sacarídeo no presente documento compreen- de ligações beta-1,4 glicosídicas e/ou a segunda enzima fosforilase é uma celodextrina fosforilase que produz beta-1,4-glucano (por exem- plo, que compreende pelo menos cerca de 90%, 95% ou 100% de li- gações beta-1,4). Em alguns aspectos, um aceitante de sacarídeo compreende ligações beta-1,3 glicosídicas, e a segunda enzima fosfo- rilase é uma beta-1,3-glucano fosforilase que produz beta-1,3-glucano (por exemplo, que compreende pelo menos cerca de 90%, 95% ou 100% ligações beta-1,3). Em alguns aspectos, um produto alimentício ou produto precursor de alimento é tratado com primeira e segunda enzimas fosforilase simultaneamente, ou de uma maneira gradual co- meçando com a primeira enzima fosforilase.A second phosphorylase in the present document uses alpha-G1P (produced by the first phosphorylase) and a saccharide acceptor to produce an oligosaccharide or polysaccharide that is indigestible by a mammal (for example, human). An example of such an indigestible saccharide is beta-glucan (for example, an oligosaccharide or polysaccharide that comprises at least about 90%, 95% or 100% of beta-glycosidic bonds). In some aspects, a saccharide acceptor in this document comprises beta-1,4 glycosidic bonds and / or the second enzyme phosphorylase is a cellodextrin phosphorylase that produces beta-1,4-glucan (for example, which comprises at least about 90%, 95% or 100% of beta-1,4 bonds). In some respects, a saccharide acceptor comprises beta-1,3 glycosidic bonds, and the second phosphorylase enzyme is a beta-1,3-glucan phosphorylase that produces beta-1,3-glucan (for example, comprising at least least about 90%, 95% or 100% beta-1,3 bonds). In some aspects, a food product or food precursor product is treated with first and second phosphorylase enzymes simultaneously, or gradually starting with the first phosphorylase enzyme.
[00154] De acordo com outro aspecto da presente invenção, cons- tatou-se que tratar produtos lácteos contendo sacarose com glicosil- transferase converte a sacarose em poliglicose e frutose. Isso resulta em uma redução da concentração de peso das moléculas de açúcar totais (sacarose, frutose, glicose, etc.) no produto lácteo final. A poligli- cose gerada pode ser uma ligação de glicose alfa ou beta que conecta os carbonos 1 a 6 no anel de glicose. Especificamente, para alfa (1-3) glucano, acima de um grau de polimerização de 5, se torna insolúvel e pode ser usado como uma fibra dietária para benefícios de saúde.[00154] In accordance with another aspect of the present invention, it has been found that treating dairy products containing sucrose with glycosyl transferase converts sucrose into polyglycosis and fructose. This results in a reduction in the weight concentration of the total sugar molecules (sucrose, fructose, glucose, etc.) in the final dairy product. The generated polyglucose can be an alpha or beta glucose bond that connects carbons 1 to 6 in the glucose ring. Specifically, for alpha (1-3) glucan, above a degree of polymerization of 5, it becomes insoluble and can be used as a dietary fiber for health benefits.
[00155] Em outro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para reduzir o teor calórico e/ou aumentar o teor de fibras die- tárias de um produto alimentício ou produto precursor de alimento, sendo que o método tem as etapas de: tratar um produto alimentício ou produto precursor de alimento contendo sacarose com uma glicosil- transferase sob condições adequadas para converter a sacarose do produto alimentício ou produto precursor de alimento em alfa-glucano, de modo que o teor calórico do produto alimentício ou produto precur- sor de alimento seja reduzido e/ou o teor de fibras dietárias do produto alimentício ou produto precursor de alimento seja aumentado.[00155] In another aspect of the present invention, a method is presented to reduce the caloric content and / or increase the content of dietary fibers in a food product or food precursor product, the method having the steps of: treating a food product or food precursor product containing sucrose with a glycosyl transferase under suitable conditions to convert the sucrose from the food product or food precursor product to alpha-glucan, so that the caloric content of the food product or precursor product is food is reduced and / or the dietary fiber content of the food product or food precursor product is increased.
[00156] De preferência, a concentração de peso da sacarose no produto alimentício ou produto precursor de alimento após a etapa de tratamento tem entre 0 e 80% da concentração de peso da sacarose do produto alimentício ou produto precursor de alimento que existia antes da etapa de tratamento. Mais preferencialmente, a concentração de peso da sacarose no produto alimentício ou produto precursor de alimento após a dita etapa de tratamento tem entre 0 e 30% da con- centração de peso da sacarose do produto alimentício ou produto pre- cursor de alimento que existia antes da etapa de tratamento.[00156] Preferably, the weight concentration of sucrose in the food product or food precursor product after the treatment step is between 0 and 80% of the weight concentration of sucrose in the food product or food precursor product that existed before the step of treatment. More preferably, the weight concentration of sucrose in the food product or food precursor product after said treatment step has between 0 and 30% of the weight concentration of sucrose in the food product or food precursor product that existed before treatment stage.
[00157] De preferência, o alfa-glucano tem um DPw de 5 a 5.000.[00157] Preferably, the alpha-glucan has a DPw of 5 to 5,000.
[00158] De preferência, o alfa-glucano é alfa-1,3-glucano.[00158] Preferably, the alpha-glucan is alpha-1,3-glucan.
[00159] Mais preferencialmente, o alfa-1,3-glucano tem pelo menos 50% de ligações alfa-1,3 e um DPw de 5 a 1.600.[00159] More preferably, alpha-1,3-glucan has at least 50% alpha-1,3 bonds and a DPw of 5 to 1,600.
[00160] De preferência, o produto alimentício ou produto precursor de alimento compreende um ingrediente lácteo.[00160] Preferably, the food product or food precursor product comprises a dairy ingredient.
[00161] As glicosiltransferases preferenciais para esse aspecto da presente invenção são conforme apresentado acima.The preferred glycosyltransferases for that aspect of the present invention are as presented above.
[00162] A presente divulgação é descrita em mais detalhes nos exemplos a seguir, que não pretendem, de modo algum, limitar o âm- bito da divulgação como reivindicada. As figuras anexas são destina- das a serem consideradas como partes integrais da especificação e da descrição da divulgação. Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a divulgação reivindicada.[00162] The present disclosure is described in more detail in the following examples, which are in no way intended to limit the scope of the disclosure as claimed. The attached figures are intended to be considered as integral parts of the specification and description of the disclosure. The following examples are offered to illustrate, but not limit, the claimed disclosure.
EXEMPLOS Exemplo 1 GTFJEXAMPLES Example 1 GTFJ
[00163] GTFJ é uma enzima glicosiltransferase derivada de Strep- tococcus salivarius SK126 que tem a sequência de aminoácidos con- forme apresentado na SEQ ID NO: 1. GTFJ foi recombinantemente produzida em Bacillus subtilis. Exemplo 2 GTF300[00163] GTFJ is a glycosyltransferase enzyme derived from Strepococcus salivarius SK126 that has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1. GTFJ was recombinantly produced in Bacillus subtilis. Example 2 GTF300
[00164] GTF300 tem as seguintes substituições de cadeia principal em relação à GTFJ: A510D:F607Y:R741S:D948G. A sequência de aminoácidos de GTF300 é apresentada na SEQ ID NO: 2. GTF300 também foi recombinantemente produzida em B. subtilis. Exemplo 3: Procedimento de iogurte padrão[00164] GTF300 has the following main chain replacements in relation to GTFJ: A510D: F607Y: R741S: D948G. The amino acid sequence of GTF300 is shown in SEQ ID NO: 2. GTF300 was also recombinantly produced in B. subtilis. Example 3: Standard yogurt procedure
[00165] Leite desnatado misturado a granel pré-pasteurizado (72 °C por 15 s) (0,1% de gordura) (Arla Foods, Dinamarca) armazenado a 4 a 6 °C foi padronizado em um teor desejado de proteína (% p/p), gor- dura (% p/p) e sacarose (% p/p) pela adição de leite em pó desnatado (33% de proteína, 1,2% de gordura, 54% de carboidrato) disponível junto à BBA Lactalis (Laval, Mayenne, França), creme (38% de gordu-[00165] Skimmed milk mixed in pre-pasteurized bulk (72 ° C for 15 s) (0.1% fat) (Arla Foods, Denmark) stored at 4 to 6 ° C has been standardized on a desired protein content (% w / w), fat (% w / w) and sucrose (% w / w) by adding skimmed milk powder (33% protein, 1.2% fat, 54% carbohydrate) available from BBA Lactalis (Laval, Mayenne, France), cream (38% fat)
ra) disponível junto à Arla Foods, Dinamarca), e sacarose (Granulated Sugar 500, Nordic Sugar A/S, Dinamarca). O leite padronizado foi, en- tão, pasteurizado e homogeneizado em um pasteurizador de trocador de calor a placas padrão. A homogeneização foi realiza a 65 °C a 200 bar e a pasteurização a 95 °C por 6 minutos, e então o leite foi resfria- do a 43 °C. O leite foi inoculado com uma cultura inicial termofílica em uma taxa de inoculação de 20 DCU/100 l. A fermentação foi seguida com o uso do sistema de pH multicanal CINAC (Ysebaert, Frépillon, França), que monitorou o desenvolvimento de pH a cada 5 min. A fer- mentação foi conduzida até o pH 4,60 e o produto foi resfriado em um trocador de calor a placas de iogurte (SPX Flow Technology, Sussex, Reino Unido) e sistema de bomba de cisalhamento YTRON-ZP (YTRON Process Technology, Bad Endorf, Alemanha) a 24 °C. Os io- gurtes de estilo agitado resultantes foram armazenados a 4 a 6 °C pa- ra medições de viscosidade adicionais. Exemplo 4: Método para medir viscosidade aparentera) available from Arla Foods, Denmark), and sucrose (Granulated Sugar 500, Nordic Sugar A / S, Denmark). The standardized milk was then pasteurized and homogenized in a standard plate heat exchanger pasteurizer. Homogenization was carried out at 65 ° C at 200 bar and pasteurization at 95 ° C for 6 minutes, and then the milk was cooled to 43 ° C. The milk was inoculated with an initial thermophilic culture at an inoculation rate of 20 DCU / 100 l. Fermentation was followed using the multichannel pH system CINAC (Ysebaert, Frépillon, France), which monitored the pH development every 5 min. The fermentation was carried out to pH 4.60 and the product was cooled in a yogurt plate heat exchanger (SPX Flow Technology, Sussex, UK) and YTRON-ZP shear pump system (YTRON Process Technology, Bad Endorf, Germany) at 24 ° C. The resulting stirred-style yogurts were stored at 4 to 6 ° C for additional viscosity measurements. Example 4: Method for measuring apparent viscosity
[00166] Um teste reológico rotacional foi empregado para avaliar a viscosidade dos iogurtes de estilo agitado. Curvas de fluxo foram obti- das com um reômetro Anton Paar MCR302 (Anton Paar GmbH, Ostfil- dern, Alemanha) com o uso de um sistema de medição de cone e pla- ca. O método de teste foi um teste de taxa de cisalhamento controlada (CSR), em que a taxa de cisalhamento é controlada e a tensão de ci- salhamento resultante é medida. Os intervalos de taxa de cisalhamen- to aplicados às amostras foram 0,1 a 200 s-1, o que define a curva as- cendente, e a operação reversa explica a curva descendente (200 a 0,1 s-1). O valor da duração de ponto de medição foi selecionado para ser pelo menos tão longo quanto o valor da taxa de cisalhamento recí- proca, que é válida para a curva ascendente. Os testes foram realiza- dos sob temperatura constante de 10 °C, e cada amostra foi analisada em duplicatas. Um banho-maria foi conectado ao reômetro para asse-[00166] A rotational rheological test was employed to assess the viscosity of agitated-style yogurts. Flow curves were obtained with an Anton Paar MCR302 rheometer (Anton Paar GmbH, Ostfildern, Germany) using a cone and plate measurement system. The test method was a controlled shear rate (CSR) test, in which the shear rate is controlled and the resulting shear stress is measured. The shear rate intervals applied to the samples were 0.1 to 200 s-1, which defines the ascending curve, and the reverse operation explains the descending curve (200 to 0.1 s-1). The value of the measurement point duration has been selected to be at least as long as the value of the reciprocal shear rate, which is valid for the upward curve. The tests were performed under a constant temperature of 10 ° C, and each sample was analyzed in duplicates. A water bath was connected to the rheometer to
gurar condições isotérmicas.ensure isothermal conditions.
[00167] A partir das curvas de fluxo, a viscosidade aparente foi ava- liada, o que é adequado para fluidos em que a razão entre a tensão de cisalhamento e a taxa de cisalhamento varia com a taxa de cisalha- mento. A viscosidade aparente foi extraída na taxa de cisalhamento de 10 Hz ou 200 Hz. A viscosidade aparente extraída na taxa de cisalha- mento de 10 Hz indica a "espessura" da amostra. A viscosidade apa- rente extraída na taxa de cisalhamento de 200 s-1 (200 Hz) é correla- cionada à percepção sensorial de "sensação bucal". Exemplo 5: Adição de GTF300 na etapa de inoculação[00167] From the flow curves, the apparent viscosity was assessed, which is suitable for fluids where the ratio between the shear stress and the shear rate varies with the shear rate. The apparent viscosity was extracted at the 10 Hz or 200 Hz shear rate. The apparent viscosity extracted at the 10 Hz shear rate indicates the "thickness" of the sample. The apparent viscosity extracted at the shear rate of 200 s-1 (200 Hz) is correlated to the sensory perception of "mouth sensation". Example 5: Addition of GTF300 in the inoculation step
[00168] O efeito de textura de GTF300 foi investigado em uma pro- dução de iogurte configurada em escala de 4 litros. Leite fresco foi pa- dronizado em 4,0% (p/p) de proteína e 1,0% (p/p) de gordura, 8,0% (p/p) de sacarose, que foi homogeneizado e pasteurizado conforme descrito no exemplo 3. GTF300 [2,5 mg/100 g de leite] foi adicionada na etapa de inoculação conforme esquematicamente apresentado na Figura 1. YO-MIX 860, YO-MIX 495 e YO-MIX 465, respectivamente, foram empregados como culturas iniciais (disponíveis junto à DuPont). Após 5 e 28 dias, respectivamente, de armazenamento a 5◦C o efeito de textura de GTF300 foi avaliado por teste reológico rotacional con- forme descrito no exemplo 4. O impacto sobre a viscosidade das amostras de iogurte não enzimáticas e com GTF300 adicionada para as três fermentações de cultura inicial diferentes é apresentado na Fi- gura 2A a 2C (5 dias) e na Figura 3A a 3C (28 dias). A adição de GTF300 forneceu valores de tensão de cisalhamento melhorada ao longo de toda a faixa de cisalhamento para todas as três culturas inici- ais investigadas. A adição de 2,5 mg de GTF300 por 100 ml de leite resultou em uma viscosidade aparente aumentada ( = 200 Hz) em comparação com o controle em 103%, 122%, 116% para YM 860, YM 495, e YM 465, respectivamente, no dia 5. O aumento na textura foi mantido no dia 28 e, de fato, aumentou.[00168] The GTF300 texture effect was investigated in a yoghurt production configured on a 4-liter scale. Fresh milk was standardized at 4.0% (w / w) protein and 1.0% (w / w) fat, 8.0% (w / w) sucrose, which was homogenized and pasteurized as described in example 3. GTF300 [2.5 mg / 100 g of milk] was added in the inoculation step as schematically shown in Figure 1. YO-MIX 860, YO-MIX 495 and YO-MIX 465, respectively, were used as cultures (available from DuPont). After 5 and 28 days, respectively, of storage at 5◦C the texture effect of GTF300 was evaluated by rotational rheological test as described in example 4. The impact on the viscosity of non-enzymatic yogurt samples and with GTF300 added for the three different initial culture fermentations are shown in Figure 2A to 2C (5 days) and in Figure 3A to 3C (28 days). The addition of GTF300 provided improved shear stress values over the entire shear range for all three initial cultures investigated. The addition of 2.5 mg of GTF300 per 100 ml of milk resulted in an increased apparent viscosity (= 200 Hz) compared to the control by 103%, 122%, 116% for YM 860, YM 495, and YM 465, respectively, on day 5. The increase in texture was maintained on day 28 and, in fact, increased.
[00169] Foi determinado que a GTF300 fornece textura adicional àquela criada pela rede de gel formada pela adição das culturas inici- ais durante a acidificação em pH 4,6. Além disso, a textura fornecida pela GTF300 sobrevive às tensões de cisalhamento mecânico causa- das por agitação, bombeamento e resfriamento do leite fermentado e esse aumento de textura é mantido após 5 dias de armazenamento e, além disso, é mantido ao longo de todo o prazo de validade do iogurte. Exemplo 6: Adição de GTF300 antes do tratamento por calor e homogeneização[00169] It was determined that the GTF300 provides additional texture to that created by the gel network formed by the addition of the initial cultures during acidification to pH 4.6. In addition, the texture provided by the GTF300 survives the mechanical shear stresses caused by stirring, pumping and cooling fermented milk and this increase in texture is maintained after 5 days of storage and, in addition, is maintained throughout the entire process. shelf life of the yogurt. Example 6: Addition of GTF300 before heat treatment and homogenization
[00170] O efeito de textura de GTF300 era evidente quando adicio- nado na etapa de inoculação conforme mostrado no exemplo 5. Era de interesse investigar se a adição de GTF300 e o subsequente desen- volvimento de textura poderiam ser estabelecidos antes da pasteuriza- ção e homogeneização do leite de base e mantidos após tal proces- samento.[00170] The texture effect of GTF300 was evident when added in the inoculation step as shown in example 5. It was of interest to investigate whether the addition of GTF300 and the subsequent development of texture could be established before pasteurization and homogenization of the base milk and maintained after such processing.
[00171] Portanto, a enzima GTF300 [3,75 mg por 100 ml de leite] foi adicionada ao leite de base contendo 8% (p/p%) de sacarose, seguido de uma etapa de incubação a 5 °C por 24 horas. Subsequentemente, a pasteurização e a homogeneização foram realizadas conforme des- crito no exemplo 3. O fluxo de produção é esquematicamente apresen- tado na Figura 4. YO-MIX 860, YO-MIX 495, YO-MIX 465 e YO-MIX 204, respectivamente, foram empregados como culturas iniciais. Após 7 e 28 dias de prazo de validade, a viscosidade aparente foi avaliada conforme descrito no exemplo 4. As curvas de fluxo resultantes das amostras não enzimáticas e tratadas com GTF300 são mostradas na Figura 5A a D (7 dias) e Figura 6A a D (28 dias). A adição de GTF300 aumentou a viscosidade aparente ( = 200 Hz) em 72%, 47%, 62%, e 51% para YO-MIX 860, YO-MIX 495, YO-MIX 465 e YO-MIX 204, res- pectivamente, no dia 7. Esse aumento na textura foi mantido no dia 28,[00171] Therefore, the enzyme GTF300 [3.75 mg per 100 ml of milk] was added to the base milk containing 8% (w / w%) sucrose, followed by an incubation step at 5 ° C for 24 hours . Subsequently, pasteurization and homogenization were carried out as described in example 3. The production flow is schematically shown in Figure 4. YO-MIX 860, YO-MIX 495, YO-MIX 465 and YO-MIX 204, respectively, were used as initial cultures. After 7 and 28 days of validity, the apparent viscosity was evaluated as described in example 4. The flow curves resulting from the non-enzymatic samples and treated with GTF300 are shown in Figure 5A to D (7 days) and Figure 6A to D (28 days). The addition of GTF300 increased the apparent viscosity (= 200 Hz) by 72%, 47%, 62%, and 51% for YO-MIX 860, YO-MIX 495, YO-MIX 465 and YO-MIX 204, respectively , on day 7. This increase in texture was maintained on day 28,
consultar a Figura 6A a D (28 dias).see Figure 6A to D (28 days).
[00172] Surpreendentemente, observou-se que o efeito de textura estabelecido pela GTF300 poderia resistir ao cisalhamento mecânico dos processos de homogeneização e pasteurização. A textura formada durante a etapa de incubação tem, desse modo, capacidade de supor- tar as etapas de processamento anteriormente mencionadas e, além disso, o cisalhamento do processo de resfriamento no final da fermen- tação. Exemplo 7: Adição de GTF300 a iogurtes com 2% e 4% de sacaro- se[00172] Surprisingly, it was observed that the texture effect established by GTF300 could withstand the mechanical shear of the processes of homogenization and pasteurization. The texture formed during the incubation step is thus able to withstand the aforementioned processing steps and, in addition, the shear of the cooling process at the end of the fermentation. Example 7: Addition of GTF300 to yoghurts with 2% and 4% saccharose
[00173] No Exemplo 6, o efeito de textura de GTF300 foi investiga- do para iogurtes com um teor de 8% de sacarose. Isso levou à investi- gação do efeito de textura de GTF300 em iogurtes com teores mais baixos de sacarose. Portanto, o desempenho de GTF300 foi investiga- do para iogurtes com 2% e 4% de sacarose.[00173] In Example 6, the texture effect of GTF300 was investigated for yoghurts with an 8% sucrose content. This led to the investigation of the GTF300 texture effect in yoghurts with lower sucrose levels. Therefore, the performance of GTF300 was investigated for yoghurts with 2% and 4% sucrose.
[00174] O leite foi padronizado em 4% (p/p) de proteína, 1% (p/p) de gordura e 2% ou 4% (p/p) de sacarose, respectivamente, e pasteu- rizado e homogeneizado conforme descrito no exemplo 3. A dose de GTF300 foi igual em relação ao teor de sacarose do exemplo 6. Adici- onalmente, a duplicação da dosagem também foi investigada. A adi- ção de GTF300 foi adicionada ao leite seguido de uma etapa de incu- bação a 5 °C por 24 horas antes da pasteurização e homogeneização conforme descrito na Figura 4. O desempenho de textura de GTF300 foi investigado conforme descrito no exemplo 4, e os resultados para o dia 7 são apresentados na Figura 7A a 7B.[00174] Milk was standardized on 4% (w / w) protein, 1% (w / w) fat and 2% or 4% (w / w) sucrose, respectively, and pasteurized and homogenized as described in example 3. The dose of GTF300 was equal to the sucrose content of example 6. In addition, doubling the dosage was also investigated. The addition of GTF300 was added to the milk followed by an incubation step at 5 ° C for 24 hours before pasteurization and homogenization as described in Figure 4. The texture performance of GTF300 was investigated as described in example 4, and the results for day 7 are shown in Figure 7A to 7B.
[00175] O efeito de textura de GTF300 foi evidente tanto para o teor de sacarose de 2% como 4%. A adição de GTF300 aumentou a visco- sidade aparente ( = 200 Hz) em 74% e 61% quando adicionada em 1,88% de sacarose e 3,76% de sacarose para iogurtes com 4% de sa- carose. Para iogurtes com 2% de sacarose, a GTF300 aumentou a viscosidade aparente ( = 200 Hz) em 15% e 30% quando adicionada a 1,88% de sacarose e 3,76% de sacarose, respectivamente.[00175] The texture effect of GTF300 was evident for both the 2% and 4% sucrose content. The addition of GTF300 increased the apparent viscosity (= 200 Hz) by 74% and 61% when added by 1.88% sucrose and 3.76% sucrose for yogurts with 4% sucrose. For yoghurts with 2% sucrose, GTF300 increased the apparent viscosity (= 200 Hz) by 15% and 30% when added to 1.88% sucrose and 3.76% sucrose, respectively.
[00176] Mesmo em níveis de sacarose reduzidos, um aumento substancial na textura pode ser possibilitado pela adição de GTF300. Exemplo 8: Resfriamento de iogurte GTF300 a 5 °C em vez de 24 °C[00176] Even at reduced sucrose levels, a substantial increase in texture can be made possible by the addition of GTF300. Example 8: Cooling GTF300 yogurt to 5 ° C instead of 24 ° C
[00177] Na indústria de iogurtes, o resfriamento do iogurte do tipo agitado contendo estabilizantes, como amido é realizado é realizado em duas fases. Primeiro, o leite fermentado é agitado suavemente pa- ra obter uma matriz homogênea e, então, resfriado tipicamente entre 20 e 24 °C. Os copos de iogurte são, então preenchidos e mantidos em armazenamento a frio ao longo de um período de 10 a 12 horas para ser resfriado abaixo de 8 °C. O preenchimento dos copos de io- gurte com iogurte a uma temperatura entre 20 e 24 °C e, então, o res- friamento é crucial para manter a textura adicionada pelo amido. Nes- se aspecto, o resfriamento do iogurte a 8 °C e, então o preenchimento, particularmente se o resfriamento ocorrer sob o cisalhamento de bom- bas e trocador de calor a placas, poderia resultar em um gel de iogurte fraco. Além disso, a separação do soro de leite poderia ocorrer durante o armazenamento. Portanto, era de interesse testar se a textura for- mada pela GTF300 no leite fermentado poderia resistir ao resfriamento a 5 °C e possível cisalhamento durante o resfriamento e o preenchi- mento.[00177] In the yogurt industry, the cooling of the stirred type yogurt containing stabilizers, as starch is carried out is carried out in two stages. First, the fermented milk is stirred gently to obtain a homogeneous matrix and then cooled typically between 20 and 24 ° C. The yogurt cups are then filled and kept in cold storage over a period of 10 to 12 hours to be cooled below 8 ° C. Filling yogurt cups with yogurt at a temperature between 20 and 24 ° C and then cooling is crucial to maintain the texture added by the starch. In this respect, cooling the yogurt to 8 ° C and then filling, particularly if cooling occurs under shearing pumps and plate heat exchanger, could result in a weak yogurt gel. In addition, whey separation could occur during storage. Therefore, it was of interest to test whether the texture formed by GTF300 in fermented milk could withstand cooling to 5 ° C and possible shear during cooling and filling.
[00178] O leite foi padronizado em 4% (p/p) de proteína, 2% (p/p) de gordura e 8% (p/p) de sacarose e pasteurizado e homogeneizado conforme descrito no exemplo 3. A adição de GTF300 [3,75 mg por 100 ml de leite] foi adição na etapa de inoculação conforme esquema- ticamente apresentado na Figura 1. O efeito de textura de GTF300 no leite fermentado resfriado, respectivamente, a 5 °C e 24 °C, quando preenchido nos copos, foi avaliado após 7 dias conforme descrito no exemplo 4.[00178] The milk was standardized at 4% (w / w) protein, 2% (w / w) fat and 8% (w / w) sucrose and pasteurized and homogenized as described in example 3. The addition of GTF300 [3.75 mg per 100 ml of milk] was added in the inoculation step as schematically presented in Figure 1. The texture effect of GTF300 in the cooled fermented milk, respectively, at 5 ° C and 24 ° C, when filled in the cups, it was evaluated after 7 days as described in example 4.
[00179] A adição de GTF300 melhorou a viscosidade aparente ( = 200 Hz) em 89% e 92% quando resfriado a 24 °C e 5 °C, respectiva- mente, em comparação com uma amostra de iogurte não enzimática resfriada a 24 °C. A textura fornecida pela GTF300 não é sensível ao resfriamento a 5 °C, e fornece a mesma textura observada para iogur- tes GTF300 preenchidos a 24 °C (consultar a Figura 8). Exemplo 9: Adição de GTF300 a um sistema de modelo de água[00179] The addition of GTF300 improved the apparent viscosity (= 200 Hz) by 89% and 92% when cooled to 24 ° C and 5 ° C, respectively, compared to a non-enzymatic yogurt sample cooled to 24 ° Ç. The texture provided by GTF300 is not sensitive to cooling at 5 ° C, and provides the same texture as observed for GTF300 yogurts filled at 24 ° C (see Figure 8). Example 9: Adding GTF300 to a water model system
[00180] O efeito de GTF300 foi buscado em um sistema de modelo de água com lactose (Variolac® 992 BG100, Arla Foods, Dinamarca) e/ou sacarose (Granulated Sugar 500, Nordic Sugar A/S, Dinamarca) adicionada. Os teores de sacarose e lactose foram dissolvidos na água agitando-se a amostra em um agitador magnético. As amostras foram mantidas a 5 °C até a análise de viscosidade.[00180] The GTF300 effect was sought in a water model system with lactose (Variolac® 992 BG100, Arla Foods, Denmark) and / or sucrose (Granulated Sugar 500, Nordic Sugar A / S, Denmark). The levels of sucrose and lactose were dissolved in water by shaking the sample on a magnetic stirrer. The samples were kept at 5 ° C until the viscosity analysis.
[00181] Após 24 horas a 5 °C, a viscosidade foi avaliada medindo- se a viscosidade Brookfield (fuso S62, 30 rpm, 30 segundos). Tabela 1. Viscosidade Brookfield de sistemas de modelo com GTF300 a uma dose de 2,5 mg por 100 ml de leite. Viscosidade Brookfield (fu- so S61 ou fuso S62, 30 rpm, 30 segundos) foi avaliada após 24 horas a 5 °C.[00181] After 24 hours at 5 ° C, viscosity was assessed by measuring Brookfield viscosity (spindle S62, 30 rpm, 30 seconds). Table 1. Brookfield viscosity of GTF300 model systems at a dose of 2.5 mg per 100 ml of milk. Brookfield viscosity (S61 fuse or S62 spindle, 30 rpm, 30 seconds) was assessed after 24 hours at 5 ° C.
Amostra Viscosidade Brookfield (cP) Amostra 1: 2 cP 5% de lactose + GTF300 2,5 mg/100 ml de leite Amostra 2: 200 cP 5% de lactose + 8% de sacarose + GTF300 2,5 mg/100 ml de leite Amostra 3: 70 cP 8% de sacarose + GTF300 2,5 mg/100 ml de leiteSample Brookfield Viscosity (cP) Sample 1: 2 cP 5% lactose + GTF300 2.5 mg / 100 ml of milk Sample 2: 200 cP 5% lactose + 8% sucrose + GTF300 2.5 mg / 100 ml of milk milk Sample 3: 70 cP 8% sucrose + GTF300 2.5 mg / 100 ml milk
[00182] Conforme mostrado acima, sem sacarose, a GTF300 não tem capacidade para produzir polímero. Conforme esperado, o políme- ro de glucano é formado pela inclusão de 8% de sacarose no meio aquoso. Surpreendentemente, entretanto, determinou-se que a forma- ção de glucano aumentou substancialmente na presença de lactose. Exemplo 10: Adição de GTFJ na etapa de inoculação[00182] As shown above, without sucrose, the GTF300 does not have the capacity to produce polymer. As expected, the glucan polymer is formed by the inclusion of 8% sucrose in the aqueous medium. Surprisingly, however, it was determined that the formation of glucan increased substantially in the presence of lactose. Example 10: Addition of GTFJ in the inoculation stage
[00183] O efeito de textura de GTFJ foi investigado em uma produ- ção de iogurte em escala de 4 litros. Leite fresco e creme foram pa- dronizados em 4,0% (p/p) de proteína e 1,0% (p/p) de gordura, 8% (p/p) de sacarose, homogeneizados e pasteurizados conforme descrito no exemplo 3. GTFJ foi adicionada na etapa de inoculação em várias dosagens (v/w%) [0,33 mg por 100 ml de leite, 0,66 mg por 100 ml de leite, 0,98 mg por 100 ml de leite, 1,31 mg por 100 ml de leite].[00183] The GTFJ texture effect was investigated in a 4 liter scale yogurt production. Fresh milk and cream were standardized at 4.0% (w / w) protein and 1.0% (w / w) fat, 8% (w / w) sucrose, homogenized and pasteurized as described in the example 3. GTFJ was added at the inoculation stage in various dosages (v / w%) [0.33 mg per 100 ml of milk, 0.66 mg per 100 ml of milk, 0.98 mg per 100 ml of milk, 1 , 31 mg per 100 ml of milk].
[00184] A cultura inicial empregada foi YO-MIX 860. Após 7 dias de armazenamento, o efeito de textura de GTFJ foi avaliado pelo teste reológico rotacional conforme descrito no exemplo 4. Os resultados das amostras de iogurte não enzimáticas e com GTFJ adicionada para o dia 7 são apresentados na Figura 9A. A adição de GTFJ melhorou a espessura para todas as dosagens aplicadas. A adição de 0,33 mg por 100 ml de leite (0,05% de enzima), 0,66 mg por 100 ml de leite (0,1% de enzima), 0,98 mg por 100 ml de leite (0,15% de enzima), 1,31 mg por 100 ml de leite (0,2% de enzima) aumentou a espessura em 62%, 92%, 154% e 223%, respectivamente. O efeito de textura de GTFJ foi comparado com o efeito de textura da proteína na Figura 9B. Foi ob- servado que uma adição de GTFJ [0,98 mg por 100 ml de leite/0,15% de enzima] a um iogurte com 3,7% de proteína aumentou a tensão de cisalhamento em relação à toda a faixa de taxa de cisalhamento. A curva de fluxo da amostra de iogurte com 3,7% de proteína com GTFJ adicionada [0,98 mg por 100 ml de leite] foi comparada com uma amostra de iogurte com 4,0% de proteína não enzimática, e observou- se que a adição de GTFJ a uma amostra de iogurte com 3,7% de pro- teína poderia imitar a curva de fluxo da amostra de iogurte com 4,0% de proteína. A viscosidade aparente ( = 200 Hz) da amostra de iogur- te não enzimática de 3,7% foi 67 Pa. A adição de GTFJ aumentou a viscosidade aparente ( = 200 Hz) em 45% a 97 Pa. A viscosidade aparente ( = 200 Hz) da amostra de iogurte não enzimática de 4,0% foi 95 Pa. Exemplo 11: Incorporação de Lactose em Polímeros e Efeito na Taxa de Formação de Polímero Materiais e Métodos Preparação de amostra e medição fotométrica[00184] The initial culture used was YO-MIX 860. After 7 days of storage, the GTFJ texture effect was evaluated by the rotational rheological test as described in example 4. The results of the non-enzymatic yogurt samples and with GTFJ added for day 7 are shown in Figure 9A. The addition of GTFJ improved the thickness for all applied doses. The addition of 0.33 mg per 100 ml of milk (0.05% enzyme), 0.66 mg per 100 ml of milk (0.1% enzyme), 0.98 mg per 100 ml of milk (0 , 15% enzyme), 1.31 mg per 100 ml of milk (0.2% enzyme) increased the thickness by 62%, 92%, 154% and 223%, respectively. The texture effect of GTFJ was compared to the texture effect of the protein in Figure 9B. It was observed that an addition of GTFJ [0.98 mg per 100 ml of milk / 0.15% enzyme] to a yogurt with 3.7% protein increased the shear stress in relation to the entire rate range shear. The flow curve of the yogurt sample with 3.7% protein with GTFJ added [0.98 mg per 100 ml of milk] was compared with a yogurt sample with 4.0% non-enzymatic protein, and it was observed that the addition of GTFJ to a yogurt sample with 3.7% protein could mimic the flow curve of the yogurt sample with 4.0% protein. The apparent viscosity (= 200 Hz) of the 3.7% non-enzymatic yogurt sample was 67 Pa. The addition of GTFJ increased the apparent viscosity (= 200 Hz) by 45% at 97 Pa. The apparent viscosity (= 200 Hz) of the 4.0% non-enzymatic yogurt sample was 95 Pa. Example 11: Incorporation of Lactose in Polymers and Effect on the Rate of Polymer Formation Materials and Methods Sample preparation and photometric measurement
[00185] O efeito de lactose em GTF300 foi investigado em um sis- tema de modelo de água com lactose (Variolac® 992 BG100, Arla Fo- ods, Dinamarca) e/ou sacarose (Granulated Sugar 500, Nordic Sugar A/S, Dinamarca) adicionada. Os teores de sacarose e/ou lactose (5% cada um) foram dissolvidos em 100 ml de água agitando-se a amostra em um agitador magnético. Após todos os açúcares serem dissolvidos, 0,2% de GTF300 foi adicionado às amostras. A amostra foi misturada por 30 s adicionais e incubada sem agitação ou misturação a 25 °C por até 48 h. Adicionalmente, uma amostra de leite (leite UHT, 1,5%[00185] The effect of lactose on GTF300 was investigated in a water model system with lactose (Variolac® 992 BG100, Arla Foods, Denmark) and / or sucrose (Granulated Sugar 500, Nordic Sugar A / S, Denmark) added. The levels of sucrose and / or lactose (5% each) were dissolved in 100 ml of water by shaking the sample on a magnetic stirrer. After all the sugars were dissolved, 0.2% GTF300 was added to the samples. The sample was mixed for an additional 30 s and incubated without shaking or mixing at 25 ° C for up to 48 h. Additionally, a milk sample (UHT milk, 1.5%
de gordura, Arla Foods, Dinamarca) com 5% de sacarose no leite foi preparada igualmente para as amostras com água. Todas as amostras foram ajustadas a um pH de 6,7 com ácido acético, se necessário.fat, Arla Foods, Denmark) with 5% sucrose in milk was also prepared for the samples with water. All samples were adjusted to a pH of 6.7 with acetic acid, if necessary.
[00186] Após 24 e 48 h de incubação, 250 μl das amostras conten- do água foram transferidos para uma placa de microtitulação e a alte- ração na adsorção em comparação com as amostras sem adição de enzima foi medida fotometricamente (Fotômetro de Microplaca Multis- kan™ FC, ThermoFischer Scientific, Estados Unidos) a 340 nm. Medição de açúcares solúveis[00186] After 24 and 48 h of incubation, 250 μl of the samples containing water were transferred to a microtiter plate and the change in adsorption compared to samples without added enzyme was measured photometrically (Multis Microplate Photometer - kan ™ FC, ThermoFischer Scientific, United States) at 340 nm. Measurement of soluble sugars
[00187] Todas as amostras (amostras de água e amostras de leite) foram analisadas em relação à sua composição de açúcares solúveis (lactose e sacarose).[00187] All samples (water samples and milk samples) were analyzed in relation to their composition of soluble sugars (lactose and sucrose).
[00188] A quantificação dos açúcares foi realizada por HPLC. Antes da análise por HPLC, as amostras foram diluídas 10 vezes em água e centrifugadas a 13.000 rpm por 10 min. Subsequentemente, 475 μl do sobrenadante foram misturados com 25 μl de ribose a 20% em água. A ribose atuou como um padrão interno durante a quantificação e a análise. As amostras preparadas foram misturadas com 25 μl de rea- gente Carrez I (15 g de hexacianoferrato de potássio tri-hidratado em 100 ml de água) e 25 μl de Carrez II (30 g de sulfato de zinco hepta- hidratado em 100 ml água). As amostras foram misturadas e subse- quentemente centrifugadas a 13.000 rpm por 10 min. Posteriormente, 280 μl do sobrenadante foram filtrados através de uma placa de filtro de 0,22 μm e usados para injeção na HPLC.[00188] The quantification of sugars was performed by HPLC. Before HPLC analysis, the samples were diluted 10 times in water and centrifuged at 13,000 rpm for 10 min. Subsequently, 475 μl of the supernatant was mixed with 25 μl of 20% ribose in water. Ribose acted as an internal standard during quantification and analysis. The prepared samples were mixed with 25 μl of Carrez I reagent (15 g of potassium hexacyanoferrate trihydrate in 100 ml of water) and 25 μl of Carrez II (30 g of zinc sulphate heptahydrate in 100 ml of water) ). The samples were mixed and subsequently centrifuged at 13,000 rpm for 10 min. Subsequently, 280 μl of the supernatant was filtered through a 0.22 μm filter plate and used for HPLC injection.
[00189] A análise por HPLC foi realizada em um sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fischer Scientific) equipado com uma bomba analítica de Gradiente Dual DGP-3600SD, dispositivo de auto- amostragem com termostato WPS-3000TSL, forno de coluna com ter- mostato TCC-3000SD, e um detector do índice de refração RI-101 (Shodex, JM Science). O software de sistema de dados Chromeleon[00189] HPLC analysis was performed on a Dionex Ultimate 3000 HPLC system (Thermo Fischer Scientific) equipped with a Dual Gradient DGP-3600SD analytical pump, auto-sampling device with WPS-3000TSL thermostat, column oven with ther - TCC-3000SD mostate, and a RI-101 refractive index detector (Shodex, JM Science). The Chromeleon data system software
(Versão 7.2) foi usado para aquisição e análise de dados. O volume de injeção para cada amostra foi definido em 10 μl. As amostras foram mantidas a 20 °C no compartimento de autoamostragem com termos- tato. A cromatografia foi realizada com uma coluna de oligossacarídeo RSO de 200 x 10 mm, Ag+ 4% reticulada (Phenomenex, Países- Baixos) equipada com uma coluna de proteção (coluna de oligossaca- rídeo RSO de 60 x 10 mm, Ag+ 4% reticulada, Phenomenex, Países- Baixos) a 70 °C. A coluna foi eluída com água bidestilada a uma taxa de fluxo d 0,29 ml/min. Um fluxo isocrático de 0,29 ml/min fio mantido ao longo da análise com um tempo de execução total de 65 min. O eluente foi monitorado por meio do detector de índice de refração (RI- 101, Shodex, JM Science) e a quantificação foi realizada pela área de pico em relação à área de pico do dado padrão. Os açúcares a serem quantificados foram usados como um padrão para quantificação. Resultados Tabela 2: Aumento de absorção a 340 nm de sistemas de modelo com GTF300 a uma dose de 0,2% em água. Amostra 24 h de incubação 48 h de incubação 5% de sacarose em água 1,084 ± 0,004 2,001 ± 0,005 5% de lactose em água 0,030 ±0,000 0,030 ± 0,000 5% de sacarose + 5% de 1,776 ± 0,047 1,896 ± 0,101 lactose em água(Version 7.2) was used for data acquisition and analysis. The injection volume for each sample was set at 10 μl. The samples were kept at 20 ° C in the self-sampling compartment with thermostat. Chromatography was carried out with a 200 x 10 mm RSO oligosaccharide column, Ag + 4% cross-linked (Phenomenex, Netherlands) equipped with a protection column (60 x 10 mm RSO oligosaccharide column, Ag + 4% cross-linked , Phenomenex, Netherlands) at 70 ° C. The column was eluted with bidistilled water at a flow rate of 0.29 ml / min. An isocratic flow of 0.29 ml / min wire maintained throughout the analysis with a total run time of 65 min. The eluent was monitored by means of the refractive index detector (RI-101, Shodex, JM Science) and quantification was performed by the peak area in relation to the peak area of the standard data. The sugars to be quantified were used as a standard for quantification. Results Table 2: Increase of absorption at 340 nm of model systems with GTF300 at a dose of 0.2% in water. Sample 24 h incubation 48 h incubation 5% sucrose in water 1.084 ± 0.004 2.001 ± 0.005 5% lactose in water 0.030 ± 0.000 0.030 ± 0.000 5% sucrose + 5% of 1.776 ± 0.047 1.896 ± 0.101 lactose in water
[00190] Conforme mostrado acima, após 24 h a absorção na amos- tra contendo lactose e sacarose foi aumentada em 64% em compara- ção com a amostra contendo apenas lactose. Em contrapartida, ne- nhum aumento na absorção foi detectado com lactose como o único açúcar presente. Portanto, a lactose sozinha não foi convertida pela enzima. Entretanto, a lactose pareceu atuar como um aceitante para o complexo de glicosil-enzima, levando a uma conversão/formação de polímero mais rápida. Entretanto, após 48 h a absorção na amostra contendo sacarose apenas e da amostra contendo sacarose e lactose foi comparável. Tabela 3: Concentração de sacarose e lactose no sobrenadante de sistemas de modelo com GTF300 a uma dose de 0,2% em água ou leite após tempos de incubação variados a 25 °C. Amostra Sacarose Lactose 5% de sacarose em água 0h 4,99% 0,00% 24h 2,59% 0,00% 48h 0,79% 0,00% 5% de lactose em água 0h 0,00% 4,98% 24h 0,00% 4,98% 48h 0,00% 4,97% 5% de sacarose + 5% de lacto- se em água 0h 5,14% 5,02% 24h 2,04% 4,47% 48h 0,00% 4,10% 5% de sacarose leite 0h 5,00% 4,93% 24h 0,20% 3,73% 48h 0,00% 3,68%[00190] As shown above, after 24 h the absorption in the sample containing lactose and sucrose was increased by 64% compared to the sample containing only lactose. In contrast, no increase in absorption was detected with lactose as the only sugar present. Therefore, lactose alone was not converted by the enzyme. However, lactose appeared to act as an acceptor for the glycosyl-enzyme complex, leading to faster polymer conversion / formation. However, after 48 h the absorption in the sample containing sucrose only and the sample containing sucrose and lactose was comparable. Table 3: Concentration of sucrose and lactose in the supernatant of model systems with GTF300 at a dose of 0.2% in water or milk after varying incubation times at 25 ° C. Sample Sucrose Lactose 5% sucrose in water 0h 4.99% 0.00% 24h 2.59% 0.00% 48h 0.79% 0.00% 5% lactose in water 0h 0.00% 4.98 % 24h 0.00% 4.98% 48h 0.00% 4.97% 5% sucrose + 5% lactose in water 0h 5.14% 5.02% 24h 2.04% 4.47% 48h 0.00% 4.10% 5% sucrose milk 0h 5.00% 4.93% 24h 0.20% 3.73% 48h 0.00% 3.68%
[00191] Conforme mostrado acima, o teor de lactose foi estável na amostra contendo apenas 5% de lactose e GTF300. A lactose como o único açúcar presente não foi convertida pela enzima e nenhum polí- mero ou açúcar único foi formado. Em contrapartida, a sacarose em água foi convertida por GTF300. Após 24 h e 48 h, uma concentração restante de 52% e 16% do nível de sacarose inicial, foi detectada, res- pectivamente. Se sacarose e lactose estavam presentes simultanea- mente na amostra de água, o nível de sacarose diminuiu para 40% de seu valor inicial após 24 h e nenhuma sacarose foi detectada na amos- tra após 48 h. Nos mesmos tempos, o nível de lactose no sobrenadan-[00191] As shown above, the lactose content was stable in the sample containing only 5% lactose and GTF300. Lactose as the only sugar present was not converted by the enzyme and no polymer or single sugar was formed. In contrast, sucrose in water was converted by GTF300. After 24 h and 48 h, a remaining concentration of 52% and 16% of the initial sucrose level was detected, respectively. If sucrose and lactose were present simultaneously in the water sample, the sucrose level decreased to 40% of its initial value after 24 h and no sucrose was detected in the sample after 48 h. At the same time, the lactose level in the supernatant
te diminuiu em 11% e 18% após 24 h e 48 h respectivamente. Nenhu- ma glicose ou galactose adicional, que poderia indicar uma hidrólise de lactose foi detectada. Consequentemente, a lactose teve capacida- de para atuar como um aceitante para o complexo de glicosil-enzima. Polímeros de açúcar insolúveis contendo lactose foram formados, e a concentração de lactose no sobrenadante diminuiu. Surpreendente- mente, no leite esse efeito aumentou ainda mais em comparação com uma amostra com lactose e sacarose em água. Aqui, uma concentra- ção de sacarose remanescente de 4% e 0% de seu valor original foi detectada após 24 h e 48 h, respectivamente. A concentração de lac- tose diminuiu em 24% após 24 h e 25% após 48 h. Portanto, uma base de leite promoveu adicionalmente a incorporação de lactose.decreased by 11% and 18% after 24 h and 48 h respectively. No additional glucose or galactose, which could indicate lactose hydrolysis, was detected. Consequently, lactose was able to act as an acceptor for the glycosyl-enzyme complex. Insoluble sugar polymers containing lactose were formed, and the concentration of lactose in the supernatant decreased. Surprisingly, in milk, this effect increased even more compared to a sample with lactose and sucrose in water. Here, a remaining sucrose concentration of 4% and 0% of its original value was detected after 24 h and 48 h, respectively. The lactose concentration decreased by 24% after 24 h and 25% after 48 h. Therefore, a milk base further promoted the incorporation of lactose.
[00192] A incorporação de lactose nos polímeros formados também foi visível nos cromatogramas da HPLC (consultar a Figura 10). Em geral, quantidades mais altas de polímeros solúveis (DP3 a DP7) fo- ram formadas na presença de lactose em comparação com sacarose sem lactose. Além disso, quando a lactose estava presente, os políme- ros solúveis eluíam mais tarde a partir da coluna (até 30 s) e os picos não eram simétricos como para sacarose apenas, porém mostraram um principal e/ou secundário. Portanto, mais de um tipo de polímero de açúcar com graus iguais de polimerização eluíram nos tempos simi- lares a partir da coluna.[00192] The incorporation of lactose in the polymers formed was also visible in the HPLC chromatograms (see Figure 10). In general, higher amounts of soluble polymers (DP3 to DP7) were formed in the presence of lactose compared to sucrose without lactose. In addition, when lactose was present, the soluble polymers eluted later from the column (up to 30 s) and the peaks were not symmetrical as for sucrose only, but showed a main and / or secondary. Therefore, more than one type of sugar polymer with equal degrees of polymerization eluted in similar times from the column.
[00193] Embora a invenção supracitada tenha sido descrita em al- guns detalhes a título de ilustração e exemplo com propósitos de cla- reza de entendimento, certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas. Além disso, cada referência fornecida no presente documento é incorporada a títu- lo de referência em sua totalidade para todos os propósitos com a mesma abrangência como se cada referência fosse individualmente incorporada a título de referência. À medida que o conteúdo de qual-[00193] Although the aforementioned invention has been described in some detail by way of illustration and example for the sake of clarity of understanding, certain changes and modifications may be practiced within the scope of the appended claims. In addition, each reference provided in this document is incorporated into the reference title in its entirety for all purposes with the same scope as if each reference were individually incorporated as a reference. As the content of any
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