BR112020024587A2 - Marcadores e loci de macho-esterilidade citoplasmática de sorgo - Google Patents

Abstract

marcadores e loci de macho-esterilidade citoplasmática de sorgo. trata-se de vários métodos e composições para identificar e/ou selecionar uma planta de sorgo ou germoplasma com ou sem uma característica de macho- esterilidade citoplasmática (cms). em determinadas concretizações, o método compreende detectar pelo menos um alelo dentre um ou mais loci marcadores dentro de um qtl, ou ligado ao qtl, associados à cms. em concretizações adicionais, o método compreende cruzar uma planta de sorgo selecionada com uma planta progenitora de sorgo recorrente e selecionar a progênie com cms.

Description

MARCADORES E LOCI DE MACHO-ESTERILIDADE CITOPLASMÁTICA DE SORGO REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade sobre o pedido provisório de patente n° U.S. 62/679.361 depositado em 1° de junho de 2018, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO

[0002] A presente revelação se refere a loci mitocondriais que distinguem de citoplasma fértil em sistemas de macho-esterilidade citoplasmática de sorgo e a métodos para implantar os mesmos em melhoria híbrida.

ANTECEDENTES

[0003] A macho-esterilidade citoplasmática (CMS) nativa pode ser útil para a produção comercial de sorgo híbrido (sorgo bicolor L. Moench). Um sistema de CMS conhecido usa um sistema de melhoria de 3 linhagens, envolvendo uma fêmea estéril (linhagem A), uma linhagem mantenedora fêmea fértil (linhagem B) e uma linhagem macho de restauração de fertilidade (linhagem R). As linhagens B e A são linhagens endocruzadas quase geneticamente idênticas, sendo a única diferença substancial na característica de fertilidade/esterilidade. A linhagem B é o parental produtor de semente da linhagem A macho estéril, que é usada no cruzamento com linhagens R para produzir híbridos comerciais. Há uma necessidade em sistemas de CMS de sorgo para manter pureza genética e aprimorar a produtividade.

SUMÁRIO

[0004] A invenção fornece métodos e marcadores mitocondriais para sistemas de CMS de sorgo a fim de manter pureza genética e aprimorar produtividade da produção da semente.

[0005] Em uma concretização, a invenção fornece um método para selecionar uma planta de sorgo ou germoplasma com macho-esterilidade citoplasmática (CMS) que compreende: (a) detectar no tecido de uma planta de sorgo ou germoplasma um marcador ligado a um locus de característica quantitativa (QTL) associado à CMS que compreende um haplótipo: i. marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084; ii. marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950; iii. marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577; iv. marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518; e v. marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170; e (b) selecionar a planta de sorgo ou germoplasma que compreende o marcador ligado ao QTL associado à CMS detectada na etapa (a), desse modo, selecionando a planta ou germoplasma com CMS. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição

72950. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição

347518. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170.

[0006] Em outra concretização, a invenção inclui um método para realizar a introgressão em uma planta de sorgo com macho-esterilidade citoplasmática (CMS) que compreende: (a) cruzar uma planta de sorgo que tem CMS com uma planta de sorgo que não tem CMS para criar uma população de plantas ou germoplasma de sorgo progênitos; (b) detectar nos tecidos da população de plantas ou germoplasma de sorgo progênitos da etapa (a) um marcador ligado a um locus de característica quantitativa (QTL) associado à CMS que compreende o haplótipo: i. marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084; ii. marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950; iii. marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577; iv. marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518; e v. marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170; e (c) dentre a população de plantas ou germoplasma de sorgo progênitos selecionar uma ou mais plantas ou germoplasma de sorgo progênitos que compreende o marcador ligado ao QTL associado à CMS detectada na etapa (b), desse modo, selecionando uma ou mais ou germoplasma com CMS.

O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577. O método pode compreender usar o marcador SEQ

ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170.

[0007] Em outra concretização, a invenção inclui um método para hibridizar produção de semente de sorgo que compreende: (a) detectar no tecido de uma planta de sorgo ou germoplasma um marcador ligado a um locus de característica quantitativa (QTL) associado à CMS que compreende um haplótipo: i. marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084; ii. marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950; iii. marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577; iv. marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518; e v. marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170; e (b) selecionar a planta de sorgo ou germoplasma que compreende o marcador ligado ao QTL associado à CMS detectada na etapa (a), desse modo, selecionando a planta ou germoplasma com CMS; (c) plantar a planta de sorgo ou germoplasma selecionado na etapa (b) nas fileiras que alternam entre plantas ou germoplasma de sorgo sem CMS; (d) fertilizar as plantas ou germoplasma de sorgo selecionada na etapa (c) com pólen das plantas sem CMS plantadas na etapa (c); e

(e) colher sementes das plantas ou germoplasma de sorgo fertilizadas na etapa (d).

[0008] O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518. O método pode compreender usar o marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[0009] A cópia oficial da listagem de sequência é apresentada eletronicamente por meio de EFS-Web como uma listagem de sequência formatada de acordo com ASCII com um arquivo chamado 7779WOPCT_ST25.txt produzido em 20 de maio de 2019 e que tem um tamanho de 44 quilo bytes e é depositado concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequência contida neste documento formatado de acordo com ASCII é parte do relatório descritivo e é incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

DESCRIÇÃO

[0010] A presente invenção aborda dois grandes desafios para a implantação prática de um sistema de CMS de sorgo; os dois relacionados a manter pureza e produtividade aprimorada. Em primeiro lugar, na melhoria para suportar o desenvolvimento de linhagens A endocruzadas de fêmeas puras (macho-estéril) e em seleções de melhoria e caracterização e aprimoramento de germoplasma e, em segundo lugar, na produção de sementes híbridas comerciais.

[0011] Para uso em um sistema de CMS para melhoria, as linhagens B devem ser esterilizadas para gerar linhagens A macho-estéreis incapazes de autopolinização, e que permita que o pólen de uma linhagem macho fértil (R) polinize. Esse processo exige retrocruzamento repetido para recuperar o genoma nuclear parental recorrente ao mesmo tempo que mantém o citoplasma (mitocondrial) estéril. As seleções do retrocruzamento podem ser realizadas por meio de fenotipagem – verificação visual para se certificar que a linhagem estéril (A) não está derramando pólen. Ocasionalmente, durante esse processo de retrocruzamento, esterilidade pode se tornar parcial ou pode ser completamente perdida devido à contaminação (de cruzamentos externos), e fatores ambientais, tais como temperatura, o que pode ocasionar impurezas genéticas e, por fim, o descarte da linhagem. Devido ao fato de que a contaminação não pode ser identificada pela fenotipagem até o estágio de floração, isso também produz ineficiências no processo de melhoria, tal como material em crescimento que, eventualmente, será descartado devido ao fato de que é parcialmente estéril ou não é estéril, conforme esperado. Adicionalmente, o processo visual de verificar a fim de confirmar a esterilidade exige andar por terrenos, o que demanda trabalho e compromissos de tempo, e está sujeito a erro, o que pode resultar na perda de fêmeas parcialmente férteis no processo de triagem.

[0012] A identificação e quantificação precoces da extensão da contaminação A a B é útil para garantir a esterilização bem-sucedida, gerenciamento da pureza de semente endocruzada de elite e “pré-melhorista”/fundacional em pesquisa, e o descarte de lotes de semente contaminadas em multiplicação de semente de CMS e produção híbrida. Antes da presente invenção, não havia ferramentas laboratoriais ou tecnologias para dar suporte a esses aprimoramentos potenciais para sistemas de CMS de sorgo.

[0013] A CMS resulta em diferenças na composição genômica mitocondrial. Em um aspecto, a presente invenção identifica um conjunto de polimorfismos de sequência de DNA mitocondrial que distingue confiadamente as linhagens B férteis das linhagens A estéreis. Outro aspecto da invenção fornece métodos laboratoriais para genotipagem mitocondriais com o uso desses polimorfismos a fim de identificar a contaminação da linhagem B para a linhagem A com o uso de amostras de folhas ou de sementes de um modo com alto rendimento. A constatação ajuda a solucionar os problemas acima com a presença direta de um marcador que associa se fortemente com o citoplasma estéril. Os marcadores têm aparência robusta e são altamente informativos em grande pool de germoplasma. Tal constatação elimina grande parte da tarefa subjetiva de determinar estéril vs. fértil e fornece uma resposta discreta que pode ser incorporada diretamente no processo de melhoria.

[0014] Além disso, um ou mais marcadores associados a citoplasma estéril possibilita a diferenciação de linhagens por tipo de material, e identificação da extensão até a qual as presentes linhagens de restauração portam citoplasma estéril macho, o que é uma parte importante da caracterização de citoplasma. Isso também permite identificar facilmente o tipo de material de novo germoplasma colocado no programa sem ter de fazer um experimento e realizar uma reação de fertilidade. Por fim, a presença de um marcador que possa distinguir fêmeas férteis (linhagens B) de fêmeas estéreis

(linhagens A) funciona para atender à meta de produzir semente de alta qualidade (do inglês pure premium quality seed) que possa ser passada para vendedores de semente e clientes a níveis que seriam difíceis de alcançar sem um marcador genético. Até então, a pureza, relacionada à presença ou ausência de esterilidade, era feita por meio da inspeção visual de panículas em floração de milhares plantas cultivadas em grandes experimentos de uma linhagem particular. Essa avaliação de pureza agora pode ser simplificada por meio da extração de amostras de diferentes lotes de semente antes de sequer cultivar as mesmas no campo e triá-las, a nível genotípico, em busca de esterilidade, em vez da avaliação de fenótipo mais dispendiosa no campo.

[0015] Deve-se entender que essa revelação não é limitada a concretizações particulares, que podem, evidentemente, variar. Além disso, entende-se que a terminologia usada no presente documento serve para descrever concretizações particulares e não deve ser limitativa. Definições

[0016] Na presente revelação, vários termos e abreviações e são usados. Determinadas definições usadas nessa revelação e reivindicações são fornecidas abaixo. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente da revelação e das reivindicações, incluindo o escopo a ser concedido por tais termos, as seguintes definições se aplicam, salvo caso declarado especificamente o contrário.

[0017] Além disso, a revelação de cada referência definida no presente documento é incorporada a título de referência em sua totalidade no presente documento.

[0018] Tal como usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, os termos no singular e as formas singulares "um", "uma" e "o/a", por exemplo, incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo claramente dite o contrário. Desse modo, por exemplo, a referência a "planta", "a planta", ou "uma planta" também inclui uma pluralidade de plantas; além disso, dependendo do contexto, o uso do termo "planta" também pode incluir a progênie geneticamente semelhante ou idêntica dessa planta; o uso do termo "um ácido nucleico" inclui opcionalmente, como um assunto prático, muitas cópias dessa molécula de ácido nucleico; da mesma forma, o termo "sonda", opcionalmente, (e tipicamente) engloba muitas moléculas sonda semelhantes ou idênticas.

[0019] Adicionalmente, tal como usado no presente documento, "compreendendo" é para ser interpretado como especificando a presença das características, números inteiros, etapas ou componentes expressos tal como referidos, mas não exclui a presença ou a adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Desse modo, por exemplo, um kit compreendendo um par de iniciadores oligonucleotídicos pode ter dois ou mais pares de iniciadores oligonucleotídicos. Além disso, o termo “compreendendo” destina-se a incluir concretizações englobadas pelos termos “que consiste essencialmente em” e “que consiste em”. Similarmente, o termo “que consiste essencialmente em” destina-se a incluir concretizações englobadas pelo termo “que consiste em”.

[0020] “Agronomia”, “características agronômicas” e “desempenho agronômico” referem-se às características (e elementos genéticos subjacentes) de uma determinada variedade de planta que contribuem para o rendimento durante o curso da temporada de cultivo. As características agronômicas individuais incluem vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância a tensão, resistência ou tolerância à doença, resistência ou tolerância a inseto, resistência a herbicida, ramificação, florescimento, estabelecimento de semente, tamanho de semente, densidade de semente, capacidade de permanecer suportada, capacidade para debulhar e semelhantes.

[0021] "Alelo" significa qualquer de uma ou mais formas alternativas de uma sequência genética. Numa célula ou organismo diploide, os dois alelos de uma determinada sequência tipicamente ocupam loci correspondentes num par de cromossomos homólogos. Em relação a um marcador de SNP, o alelo se refere à base nucleotídica específica presente nesse locus de SNP nessa planta individual. Um alelo é “favorável” para uma determinada característica fenotípica se esse alelo se correlaciona positivamente com essa característica fenotípica. Um alelo é “desfavorável” para uma determinada característica fenotípica se esse alelo se correlaciona negativamente com essa característica fenotípica.

[0022] O termo “amplificação”, no contexto de amplificação de ácido nucleico é qualquer processo através do qual uma cópia ou cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou uma forma transcrita do mesmo) são produzidas. Um "amplicon" é um ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido amplificando-se um ácido nucleico modelo por qualquer amplificação disponível.

[0023] O termo "associado" ou "associação" quando usado em referência a um marcador, alelo marcador e/ou polimorfismo e uma característica fenotípica e/ou haplótipo se refere a qualquer correlação estatisticamente significativa entre a presença de um determinado alelo de um locus marcador e a característica fenotípica e/ou o haplótipo, que pode ser qualitativo ou quantitativo.

[0024] O "Retrocruzamento" é um processo em que um reprodutor cruza uma variedade de progênie de volta para um dos genótipos parentais uma ou mais vezes.

[0025] O termo "segmento de cromossoma" designa uma extensão linear contígua de DNA genômico que reside na planta de um único cromossoma. "Intervalo de cromossoma" se refere a um segmento de cromossoma definido por loci marcadores específicos de flanqueamento.

[0026] “Cultivar" e "variedade" são usados como sinônimos e significam um grupo de plantas dentro de uma espécie (por exemplo, Sorghum bicolor L.) que partilham certas características genéticas que os separam de outras variedades possíveis dentro dessa espécie. Cultivares de sorgo são linhagens consanguíneas produzidas após várias gerações de autopolinização. Indivíduos dentro de uma cultivar de sorgo são homogêneos, quase geneticamente idênticos, com a maioria dos loci no estado homozigoto.

[0027] Uma "linhagem de elite" é uma linhagem agronomicamente superior que resultou de muitos ciclos de melhoramento e seleção para desempenho agronômico superior. Numerosas linhagens de elite estão disponíveis e são conhecidas dos peritos na técnica de melhoria de sorgo.

[0028] Uma "população de elite" é uma variedade de indivíduos ou linhagens de elite que pode ser usada para representar o estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de cultura, tal como sorgo.

[0029] Um "híbrido" é uma planta progênita obtida cruzando-se pelo menos dois patentes geneticamente dissimilares.

[0030] "Genótipo" é uma descrição do estado alélico em um ou mais loci.

[0031] "Germoplasma" significa o material genético que compreende a fundação física das qualidades hereditárias de um organismo. Tal como usado no presente documento, germoplasma inclui sementes e tecidos vivos a partir dos quais podem ser cultivadas novas plantas; ou, uma outra parte da planta, tal como folha, haste, pólen ou células, que podem ser cultivadas em uma planta inteira. Recursos de germoplasma fornecem fontes de traços genéticos usados por reprodutores de plantas para melhorar cultivares comerciais.

[0032] Um indivíduo é "homozigoto" se o indivíduo tiver apenas um tipo de alelo em um dado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus, para cada um dos dois cromossomas homólogos). Um indivíduo é "heterozigótico" se mais do que um tipo de alelo estiver presente em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia de cada um de dois alelos diferentes). O termo "homogeneidade" indica que os membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos. Em contraste, o termo “heterogeneidade” é usado para indicar que os indivíduos dentro do grupo diferem em termos de genótipo em um ou mais loci específicos.

[0033] "Introgressão" significa a entrada ou introdução de um gene, QTL, haplótipo, perfil de marcador,

locus marcador, alelo marcador, traço ou locus de traço do genoma de uma planta no genoma de outra planta.

[0034] Os termos "identificação" ou "identificação detectável" se referem a uma molécula com a capacidade para detectar. Uma identificação detectável também pode incluir uma combinação de um reporter e um quencher, tais como são empregados em sondas FRET ou sondas TaqMan™. O termo "reporter" se refere a uma substância ou uma porção desse que tem uma capacidade para exibir um sinal detectável, em que o sinal pode ser suprimido por um quencher. O sinal detectável do reporter é, por exemplo, a fluorescência na gama detectável. O termo "quencher" se refere a uma substância ou porção dessa que tem a capacidade para suprimir, reduzir, inibir, etc., o sinal detectável produzido pelo reporter. Conforme usado no presente documento, os termos "extinção" e "transferência de energia de fluorescência" se refere ao processo em que, quando um reporter e um quencher estão próximos, e o reporter é excitado por uma fonte de energia, uma porção substancial da energia do estado excitado é transferida de modo não radiante para o quencher em que essa se dissipa de modo no radiante ou é emitida em um comprimento de onda de emissão diferente que aquele do reporter.

[0035] Uma "linhagem" ou "estirpe" é um grupo de indivíduos de ascendência idêntica que são geralmente consanguíneos, até certo grau, e que geralmente são homozigotos e homogêneos na maioria dos loci (isogênico ou quase isogênico). Uma “sublinhagem” se refere a um subconjunto consanguíneo de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos consanguíneos semelhantes do mesmo progenitor. Tradicionalmente, uma sublinhagem foi derivada por endogamia da semente a partir de uma planta de sorgo individual selecionada na geração F3 a F5 até que os loci segregantes residuais sejam “fixos” ou homozigotos na maioria de ou em todos os loci.

[0036] “Ligação" se refere à tendência dos alelos de se segregarem em conjunto mais frequentemente que o esperado caso sua transmissão fosse independente. Tipicamente, ligação se refere a alelos no mesmo cromossoma. A recombinação genética ocorre com uma frequência aleatória assumida ao longo da totalidade do genoma. Os mapas genéticos são construídos medindo-se a frequência de recombinação entre pares de características ou marcadores. Quanto mais próximos estiverem as características ou os marcadores entre si no cromossomo, menor será a frequência de recombinação, e maior será o grau de ligação. Características ou marcadores são considerados, no presente documento, como estando ligados se eles geralmente co-segregarem. Uma probabilidade de 1/100 de recombinação por geração é definida como uma distância de mapa genético de 1,0 centiMorgan (1,0 cM).

[0037] Os elementos genéticos ou genes localizados em um único segmento de cromossoma estão fisicamente ligados. Em algumas concretizações, os dois loci estão localizados muito próximos de modo que a recombinação entre pares de cromossomos homólogos não ocorra entre os dois loci durante a meiose com alta frequência, por exemplo, de modo que os loci ligados co- segreguem, pelo menos, cerca de 90% do tempo, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,75% ou mais do tempo. Os elementos genéticos localizados dentro de um segmento cromossômico também estão “geneticamente ligados”, tipicamente dentro de uma distância de recombinação genética inferior ou igual a 50 cM, por exemplo, cerca de 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 cM ou menos.

Isto é, dois elementos genéticos dentro de um único segmento cromossômico sofrem recombinação durante a meiose um com o outro a uma frequência inferior ou igual a cerca de 50%, por exemplo, cerca de 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos.

Marcadores “estreitamente ligados" exibem uma frequência de cruzamento com um determinado marcador de cerca de 10% ou menos, por exemplo, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos (o determinado locus marcador está dentro de cerca de 10 cM de um locus marcador estreitamente ligado, por exemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 cM ou menos de um locus marcador estreitamente ligado). Dito de outro modo, loci marcadores estreitamente ligados se co-segregam cerca de 90% do tempo, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,75%, ou mais do tempo.

Os elementos genéticos, tais como marcadores, podem ser considerados "ligados", caso sejam separados em menos de 50 milhões de bases de nucleotídeo(50 Mb), por exemplo,50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 Mb ou menos.

Elementos genéticos podem ser considerados "ligados estreitamente", caso sejam separados por menos que cerca de 10 Mb, por exemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5, 0,25 Mb.

[0038] Ao se referir à relação entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético que contribui para o CMS e um marcador proximal, ligação de fase de "acoplamento" indica o estado em que o alelo associado à CMS está associado fisicamente na mesma fita de cromossoma que o alelo favorável do marcador de locus ligado respectivo. Na fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados juntos pela progênie que gera a fita do cromossomo. Na ligação de fase de “repulsão”, o alelo favorável no locus de interesse (por exemplo, um QTL ou haplótipo associado à CMS) é fisicamente ligado a um alelo favorável no locus marcador próximo, e os dois alelos favoráveis não são herdados em conjunto, isto é, os dois loci são “fora de fase” entre si).

[0039] "Desequilíbrio de ligação" é uma associação não aleatória de alelos em dois ou mais loci em que os dois ou mais alelos ocorrem em conjunto em uma frequência maior que a esperada a partir de suas frequências individuais. “Desequilíbrio de ligação” também pode ocorrer entre marcadores não ligados. Esse é baseado em frequências de alelos dentro de uma população e é influenciado pela, mas não depende da, ligação.

[0040] “Grupo de ligação" (LG) se refere a características ou marcadores que, de modo geral, se co- segregam. Um grupo de ligação geralmente corresponde a uma região cromossômica contendo material genético que codifica os traços ou marcadores.

[0041] "Locus" é um segmento de DNA definido.

[0042] "Marcador" ou "marcador molecular" ou "locus marcador" é um termo usado para denotar um ácido nucleico ou sequência de aminoácido que é suficientemente única para caracterizar um locus específico no genoma. Qualquer característica polimórfica detectável pode ser usada como um marcador contanto que seja herdado de modo diferente e exiba desequilíbrio de ligação com uma característica fenotípica de interesse.

[0043] "Seleção assistida por marcador" se refere ao processo de seleção de uma característica ou características desejadas em uma planta ou plantas detectando-se um ou mais ácidos nucleicos da planta, em que o ácido nucleico é ligado à uma característica desejada, e, então, selecionar a planta ou o germoplasma que possui tal um ou mais ácidos nucleicos.

[0044] Uma “população vegetal definida mista” refere- se a uma população vegetal contendo várias famílias e linhagens de plantas diferentes. Tipicamente, a população vegetal definida exibe uma variabilidade quantitativa para um fenótipo que é de interesse. “Múltiplas famílias de plantas” refere-se a diferentes famílias de plantas relacionadas dentro de uma população.

[0045] "Haplótipo" se refere a uma combinação de alelos particulares presentes dentro de um determinado genoma de planta em dois ou mais loci marcadores ligados, por exemplo em dois ou mais loci em um grupo de ligação em particular. Um "haplótipo de CMS" se refere a uma combinação de alelos particulares que identificam uma fonte particular de CMS.

[0046] O termo "planta" inclui referência à totalidade de uma planta imatura ou madura, incluindo uma planta a partir da qual as sementes ou grãos ou anteras foram removidos. A semente ou o embrião que vai produzir a planta também é considerado como sendo a planta.

[0047] “Partes de planta" significam qualquer porção ou pedaço de uma planta, que inclui folhas, hastes, brotos, raízes, pontas de raiz, anteras, semente, grãos, embriões, pólen, óvulos, flores, cotilédones, hipocótilos, frutos, flores, rebentos, caules, tecidos, culturas de tecido, células e semelhantes.

[0048] “Polimorfismo” significa uma alteração ou diferença entre dois ácidos nucleicos relacionados. Um "polimorfismo de nucleotídeo" se refere a um nucleotídeo que é diferente em uma sequência em comparação com uma sequência relacionada quando os dois ácidos nucleicos estão alinhados para correspondência máxima.

[0049] "Polinucleotídeo", "sequência de polinucleotídeos", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "sequência de ácidos nucleicos", "fragmento de ácido nucleico" e "olignonucleotídeo" são usados de modo intercambial no presente documento para indicar um polímero de nucleotídeos que tem filamento único ou múltiplos filamentos, que, opcionalmente, contém bases de nucleotídeo de RNA ou DNA sintético, não natural ou alterado. Um polinucleotídeo de DNA pode ser constituído por uma ou mais cadeias de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou misturas dos mesmos.

[0050] "Iniciador" se refere a um oligonucleotídeo que é capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese ou de replicação do ácido nucleico ao longo de uma cadeia complementar, quando colocado sob condições nas quais a síntese de uma cadeia complementar é catalisada por uma polimerase. Tipicamente, os iniciadores têm cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, mas sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregues. Os iniciadores podem ser fornecidos na forma de fita dupla, embora a forma de fita simples seja tipicamente mais usada. Um iniciador pode conter adicionalmente um marcador detectável, por exemplo um marcador de extremidade 5’.

[0051] “Sonda” refere-se a um oligonucleotídeo que é complementar (embora não necessariamente totalmente complementar) a um polinucleotídeo de interesse e que forma uma estrutura em forma de dúplex por hibridização com pelo menos uma fita do polinucleotídeo de interesse. Tipicamente, as sondas são oligonucleotídeos de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento, mas sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregues. Uma sonda pode conter adicionalmente uma identificação detectável.

[0052] “Loci de característica quantitativa" ou "QTL" se referem a elementos genéticos que controlam uma característica quantitativa.

[0053] "Frequência de recombinação" é a frequência de um cruzamento sobre o evento (recombinação) entre dois loci genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada, seguindo a segregação de marcadores e/ou características durante a meiose.

[0054] "Resistência" e "resistência aprimorada" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a qualquer tipo de aumento na resistência ou resistência a, ou qualquer tipo de diminuição na suscetibilidade. Uma "planta resistente" ou "variedade de plantas resistentes" não precisa possuir resistência absoluta ou completa. Em vez disso, uma "planta resistente", "variedade de plantas resistentes" ou uma planta ou variedade de plantas com "resistência aprimorada"

terá um nível de resistência ou tolerância que é maior que aquele de uma planta ou variedade de plantas suscetíveis comparáveis.

[0055] “Tolerância" e "tolerância aprimorada" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a qualquer tipo de tolerância a, ou qualquer tipo de diminuição na suscetibilidade. Uma "planta tolerante" ou "variedade de plantas tolerante" não necessita de possuir tolerância absoluta ou completa. Em vez disso, uma "planta tolerante", "variedade de plantas tolerantes" ou uma planta ou variedade de plantas com "tolerância aprimorada" terão um nível de tolerância que é maior que aquele de uma planta ou variedade de plantas suscetíveis comparáveis.

[0056] "Autocruzamento" ou "autopolinização" ou “autofecundação" é um processo através do qual um melhorista cruza uma planta com a própria; por exemplo, uma segunda geração híbrida de F2 com a própria para render progênie designada F2:3.

[0057] "SNP" ou "polimorfismo de nucleotídeo único" significa uma variação de sequência que ocorre quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) na sequência do genoma é alterado ou variável. “Marcadores de SNP” existem quando os SNPs são mapeados em sítios no genoma do sorgo.

[0058] O termo "rendimento" se refere à produtividade por área unitária de um produto de planta particular de valor comercial. Por exemplo, o rendimento do sorgo é geralmente medido em alqueires de semente por acre ou toneladas métricas de sementes por hectare, por estação. O rendimento é afetado tanto por fatores genéticos quanto ambientais.

[0059] Conforme usado no presente documento, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "isolado" ou "purificado" ou porção biologicamente ativa do mesmo é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou polipeptídeo conforme encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Tipicamente, um polinucleotídeo "isolado" é livre de sequências (idealmente, sequências de codificação de proteína) que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, o polinucleotídeo isolado pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências nucleotídicas que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado. Um polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de polipeptídeos que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína atípica, meios de cultura ou outros componentes químicos. O DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular usados no presente documento são bem conhecidos na arte e são descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (doravante “Sambrook”).

SUMÁRIO DE SEQUÊNCIAS BIOLÓGICAS

[0060] Os SNPs foram identificados alinhando-se os dados de sequenciamento do genoma inteiro das 30 linhagens (15 pares A-B) com sequência mitocondrial de referência. O sequenciamento shotgun Illumina do genoma inteiro foi realizado em 30 linhagens (15 pares A-B) com uma cobertura 20X. Com essa profundidade de sequenciamento, esperou-se a contaminação de DNA de organela e, logo, se pode obter dados de sequência para a mitocôndria também. Para chamada de SNP, as leituras foram alinhadas a um DNA mitocondrial de referência do NCBI com número de acesso DQ984518. Os SNPs identificados foram filtrados em busca de baixos dados ausentes. Cinquenta e cinco marcadores apropriados KASPar foram projetados e usados para genotipar 30 linhagens. Cinquenta desses QC foram aprovados e puderam diferenciar perfeitamente linhagens A de B. A fim de identificar SNPs que tiveram origem exclusivamente mitocondrial, as sequências de SNP (200 pb em qualquer lado do SNP) foram jateadas ao genoma de referência de Sorgo (JGI Sbi v1) para selecionar aqueles que não se alinharam e os marcadores TAQMAN® projetados. Estes foram testados em um painel mais amplo das linhagens A e B (384 linhagens) e o marcador de melhor desempenho foi implantado para genotipagem comercial rotineira. As informações de iniciador e de sonda para um marcador adequado para identificar o germoplasma que tem CMS é fornecido a seguir: Nome do Marcador SEQ ID NO. 63 SEQ_NAME: gi|115278525|ref|nc_008360.1|:373170 PRIMER_F_SEQ: SEQ ID NO. 263 PRIMER_R_SEQ: SEQ ID NO. 264 PROBE_1_SEQ: SEQ ID NO. 265 PROBE_2_SEQ: SEQ ID NO. 266 FULL_SEQUENCE:_ SEQ ID NO. 63

[0061] As chamadas do SNP associados na posição física 373,170 pb para o marcador SEQ ID NO. 63 foram "T" ou "A".

"TT" estabeleceu um fenótipo fértil macho, "AA" estabeleceu um fenótipo macho estéril, conforme a seguir. Tabela 1. Detalhes do marcador de CMS.

Posição Nome do SNP Cromossomo Física (pb) Genótipo Fenótipo Macho SEQ ID No. TT fértil Mitocondrial 373,170 63 Macho AA estéril

[0062] O conjunto completo de sequências de marcadores projetados e testados são listados abaixo: SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, e 64. Métodos de Detecção de Alelo

[0063] Em determinados aspectos descritos no presente documento, o método para selecionar a planta de sorgo ou germoplasma de sorgo que tem CMS incluiu uma etapa de detecção. Embora não se destine a ser limitado por qualquer concretização particular, são fornecidos no presente documento métodos de detecção exemplificativos adequados para o uso com os presentes métodos. Por exemplo, a análise de bancos de dados de sequência de variedades de sorgo (por exemplo, bancos de dados gerados por métodos de genótipo por sequência) em combinação com informações de fenótipo arquivadas é adequada para a identificação de marcadores adequados contidos em um QTL associado à CMS, ou ligados aos mesmos.

[0064] Em outra concretização, o método de detecção compreende sequenciamento de DNA de pelo menos um dentre os loci marcadores fornecidos no presente documento. Conforme usado no presente documento, "sequenciamento" se refere a métodos de sequenciamento para determinar a ordem de nucleotídeos em uma molécula de DNA. Qualquer método de sequenciamento de DNA conhecido na técnica pode ser usado nos métodos fornecidos no presente documento. As concretizações não limitantes de métodos de sequenciamento de DNA úteis nos métodos fornecidos no presente documento incluem as tecnologias de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), por exemplo, conforme descrito em Egan, A.N, et al. (2012) American Journal of Botany 99(2): 175 a 185; métodos de genotipagem por sequenciamento (GBS), por exemplo, conforme descrito em Elshire, R.J., et al. (2011) PLoS ONE 6(5):e19379; Genotipagem por Sonda de Inversão Molecular (MIP), conforme descrito, por exemplo, em Hardenbol, P., et al. (2003) Nature Biotechnology 21(6): 673 a 678; ou genotipagem de alto rendimento por re- sequenciamento de genoma inteiro, conforme descrito, por exemplo, em Huang, X et al., (2009) Genome Research 19: 1.068 a 1.076. Cada uma dentre as referências acima é incorporada a título de referência em suas totalidades no presente documento.

[0065] Em outros aspectos, a detecção pode compreender a concepção de um iniciador ou sonda que é complementar ou parcialmente complementar a pelo menos uma porção do DNA genômico que abrange o locus marcador e que é capaz de se hibridizar de forma específica com o locus marcador de interesse sob condições de estringência pelo menos moderadas. Em tais aspectos, o iniciador ou sonda compreende opcionalmente um marcador detectável. O DNA genômico pode ser extraído do material vegetal com o uso de qualquer técnica adequada na técnica, por exemplo, o método CTAB (brometo cetiltrietilamônio, Sigma H5882) descrito por Stacey & Isaac (Methods in Molecular Biology, Volume 28: Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Editora Isaac, Humana Press Inc, Totowa, NJ, EUA 1994, Capítulo 2, páginas 9 a 15). A detecção pode compreender isolar ácidos nucleicos, amplificar o DNA genômico que abrange o locus marcador ou uma porção do DNA genômico que abrange o locus marcador e detectar o amplicon marcador amplificado resultante.

Em algumas concretizações, a amplificação compreende misturar um iniciador de amplificação ou par de iniciadores de amplificação e, opcionalmente, pelo menos uma sonda de ácido nucleico, com um ácido nucleico isolado da planta de sorgo ou germoplasma de sorgo, em que o iniciador ou par de iniciadores e sonda opcional são complementares ou parcialmente complementares a pelo menos uma porção do DNA genômico que abrange o locus marcador e é capaz de iniciar a polimerização do DNA por uma DNA polimerase com o uso do ácido nucleico da sorgo como um molde; e extensão do iniciador ou par de iniciadores em uma reação de polimerização de DNA compreendendo uma DNA polimerase e um molde de ácido nucleico de modo a gerar pelo menos um amplicon, tal como um amplicon representado por qualquer um de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, ou 64. Em concretizações particulares, a detecção compreende análise de PCR em tempo real.

[0066] Em um determinado aspecto, é fornecido um método para selecionar plantas de sorgo para CMS que compreende extrair DNA genômico de uma população com diversidade genética de plantas de sorgo e misturar por adição um polinucleotídeo isolado com cada amostra de DNA, em que o polinucleotídeo tem capacidade para hibridizar com um alelo favorável de um locus marcador, conforme descrito nas tabelas no presente documento.

Em outra concretização, o polinucleotídeo tem capacidade para hibridizar com um alelo favorável de um locus marcador selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, e uma combinação dos mesmos Em uma concretização preferencial, o polinucleotídeo tem capacidade para hibridizar com um alelo favorável de um locus marcador selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, e uma combinação das mesmas Em determinadas concretizações, o polinucleotídeo isolado é um iniciador ou sonda.

Em uma concretização particular, o método compreende adicionalmente detectar a presença do polinucleotídeo hibridizado em uma ou mais amostras genômicas como uma indicação de uma planta de sorgo ou germoplasma de sorgo com CMS.

Em outras concretizações, uma planta de sorgo ou um germoplasma de sorgo para o qual a presença do polinucleotídeo hibridizado é detectada é cruzado com outra planta de sorgo, tal como um parental de sorgo recorrente, para produzir uma população de germoplasmas de sorgo progênito.

Em tais concretizações, o germoplasma de sorgo progênito pode ser genotipado quanto à presença de um alelo marcador associado à CMS com o uso dos métodos de detecção descritos no presente documento.

[0067] Em determinadas concretizações, é fornecido um método para selecionar plantas de sorgo com ou sem CMS que compreende extrair DNA genômico de uma população com diversidade genética de plantas de sorgo e misturar por adição um polinucleotídeo isolado com cada amostra de DNA genômico, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos identidade de sequência de pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com relação à sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, e 64 desde que a sequência de ácidos nucleicos compreenda um ácido nucleico complementar a um alelo favorável, e que hibridize o mesmo, conforme descrito nas tabelas no presente documento. Em uma concretização preferencial, o polinucleotídeo isolado tem capacidade para hibridizar para os loci marcadores SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, ou 64 e compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos identidade de sequência de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% com relação à sequência de ácidos nucleicos representada pelas SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, ou 64.

[0068] Em algumas concretizações, os marcadores moleculares são detectados com o uso de um método de detecção com base em amplificação adequada. Os métodos de amplificação típicos incluem vários métodos de replicação com base em polimerase, incluindo os métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR), métodos mediados pela ligase, tais como a reação em cadeia da ligase (LCR), e polimerase de RNA com base na amplificação (por exemplo, por transcrição). Nesses tipos de métodos, os iniciadores de ácidos nucleicos são tipicamente hibridados com as regiões conservadas que flanqueiam a região do marcador polimórfico. Em certos métodos, as sondas de ácido nucleico que se ligam à região amplificada também são empregues. Em geral, os métodos sintéticos para fazer oligonucleotídeos, incluindo os iniciadores e as sondas, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser quimicamente sintetizados de acordo com o método de triéster de fosforamidita de fase sólida descrita por Beaucage & Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22: 1.859 a 1.862, por exemplo, com o uso de um sintetizador automatizado comercialmente disponível, por exemplo, conforme descrito em Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 6.159 a

6.168. Os oligonucleotídeos, incluindo os oligonucleotídeos modificados, também podem ser encomendados a partir de uma variedade de fontes comerciais conhecidas pelos especialistas na técnica.

[0069] Será apreciado que iniciadores e sondas apropriados a serem usados podem ser concebidos usando qualquer método adequado. A intenção não é que a invenção seja limitada a qualquer iniciador, par de iniciadores ou sonda particular. Por exemplo, os iniciadores podem ser concebidos com o uso de qualquer programa de software adequado, tal como LASERGENE® ou Primer3.

[0070] Os iniciadores não estão limitados à geração de um amplicon de qualquer tamanho particular. Por exemplo, os iniciadores usados para amplificar os loci e alelos marcadores no presente documento não estão limitados à amplificação da região inteira do locus relevante. Em algumas concretizações, a amplificação do marcador produz um amplicon com pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 200 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 300 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 400 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 1000 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 2000 nucleotídeos de comprimento ou mais.

[0071] PCR, RT-PCR e LCR são métodos comuns de amplificação e de detecção de amplificação para amplificar ácidos nucleicos de interesse (por exemplo, aqueles que compreendem loci marcadores), facilitando a detecção dos marcadores. Detalhes relacionados com o uso desses e de outros métodos de amplificação são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em qualquer um de uma variedade de textos padrão. Os detalhes para essas técnicas podem ser encontrados em inúmeras referências, tais como Mullis et al. (1987) Patente n° U.S. 4.683.202; Arnheim & Levinson (1990) C&EN 36-47; Kwoh et al. (1989) Proc Natl Acad Sci EUA 86:1173; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci EUA 87:1874; Lomell et al. (1989) J

Clin Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:1077- 1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu & Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; e Sooknanan & Malek (1995) Biotechnology 13:563 a 564.

[0072] Essas técnicas de amplificação de ácido nucleico podem ser aplicadas para amplificar e/ou detectar ácidos nucleicos de interesse, tais como ácidos nucleicos compreendendo loci de marcadores. Iniciadores de amplificação para amplificar os loci de marcadores úteis e as sondas adequadas para detectar os loci de marcadores úteis ou para a genotipagem de alelos, tal como os alelos SNP, são proporcionados. Os ensaios de amplificação em tempo real, incluindo os ensaios baseados em MB ou TAQMAN®, são particularmente úteis para a detecção de alelos de SNP. Em tais casos, as sondas são tipicamente concebidas para se ligarem à região de amplicon que inclui o locus de SNP, com uma sonda específica para um alelo sendo concebida para cada alelo de SNP possível. Por exemplo, se existirem dois alelos de SNP conhecidos para um locus de SNP particular, “A” ou “C”, então uma sonda é concebida com um “A” na posição do SNP, enquanto uma sonda separada é concebida com um “C” na posição do SNP. Apesar das sondas serem tipicamente idênticas uma à outra exceto na posição do SNP, elas não precisam ser. Por exemplo, as duas sondas específicas de alelo podem ser deslocadas a montante ou a jusante uma em relação à outra por uma ou mais bases. No entanto, se as sondas não forem idênticas, elas devem ser concebidas de tal modo que se liguem com eficiências aproximadamente iguais, o que pode ser conseguido através da concepção sob um rigoroso conjunto de parâmetros que restringem as propriedades químicas das sondas.

Além disso, um marcador detectável diferente, por exemplo um par reporter-supressor diferente, é tipicamente empregue em cada uma das diferentes sondas específicas de alelo para permitir a detecção diferencial de cada sonda. Em determinadas concretizações, cada uma das sondas específicas de alelo para um determinado locus de SNP tem 13 a 18 nucleotídeos de comprimento, marcada duplamente com um supressor de fluorescência na extremidade 3’ e o fluoróforo 6- FAM (6- carboxifluoresceína) ou VIC (4,7,2'-tricloro-7′-fenil-6- carboxifluoresceína) na extremidade 5’.

[0073] Em determinadas concretizações, a etapa de detecção nos métodos revelados no presente documento compreende detecção por PCR com o uso de iniciadores de amplificação para amplificar pelo menos uma porção de uma ou mais regiões genômicas do genoma de sorgo que tem pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com relação à sequência de ácidos nucleicos selecionados dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, e 64. Em uma concretização preferida, a etapa de detecção nos métodos revelados no presente documento compreende a detecção de PCR com o uso de iniciadores de amplificação para amplificar pelo menos uma porção de uma ou mais regiões genômicas do genoma de sorgo que têm pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência para a sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, e 64 com o uso dos inidicadores de ácido nucleico que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 215, 216, 219, 220, 223, 224, 227, 228, 231, 232, 235, 236, 239, 240, 243, 244, 247, 248, 251, 252, 255, 256, 259, 260, 263, 264, 267, 268. Em alguns aspectos, a etapa de amplificação inclui adicionalmente o uso de sondas de alelo específico com a capacidade para se hibridizarem a um alelo específico do locus marcador.

Por exemplo, uma ou mais sondas que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 217, 218, 221, 222, 225, 226, 229, 230, 233, 234, 237, 238, 241, 242, 245, 246, 249, 250, 253, 254, 257, 258, 261, 262, 265, 266, 269, 270 podem ser usadas nos presentes métodos para detectar um alelo dos loci marcadores associados a características de CMS ou não CMS.

Em outros aspectos, os iniciadores ou as sondas são fornecidos para detectar um polimorfismo de qualquer um dentre os loci marcadores associados à CMS descrita no presente documento.

Em determinadas concretizações, os iniciadores ou as sondas compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156,

157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270 . Os iniciadores e sondas exemplificativos são fornecidos nas tabelas no presente documento.

[0074] Além das sequências de iniciador e sonda descritas no presente documento, uma pessoa versada na técnica reconhecerá imediatamente que outras sequências de iniciador e sonda podem ser usadas. Por exemplo, os iniciadores para qualquer lado dos determinados iniciadores podem ser usados no lugar dos determinados iniciadores, contanto que os iniciadores podem amplificar uma região que inclui o alelo a ser detectado, conforme podem os iniciadores e as sondas direcionadas para outros loci marcadores. Ademais, será observado que a sonda precisa a ser usada para a detecção pode variar, por exemplo, qualquer sonda que possa identificar a região de um amplicon marcador a ser detectada pode ser substituída por tais concretizações fornecidas no presente documento. Além disso, a configuração dos iniciadores e as sondas de detecção de amplificação podem, é claro, variar. Desse modo, as composições e os métodos não estão limitados aos iniciadores e às sondas especificamente citadas no presente documento. Em outras concretizações, os iniciadores e as sondas podem ser projetados para detectar a alelo de SNP em uma sequência de DNA genômico fornecido nas tabelas.

[0075] Em determinadas concretizações, as sondas possuirão um marcador detectável. Qualquer identificação adequada pode ser usada com uma sonda. As identificações detectáveis adequadas para uso com sondas de ácidos nucleicos incluem, por exemplo, qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, radioisotópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. As identificações úteis incluem biotina para coloração com conjugado de estreptavidina identificada, esferas magnéticas, corantes fluorescentes, marcadores radioativos, enzimas e identificações colorimétricas. Outras identificações incluem ligantes que se ligam a anticorpos identificados com fluoróforos, agentes quimioluminescentes e enzimas. Uma sonda também pode constituir iniciadores de PCR radioidentificados que são usados para gerar a amplicon radioidentificado. As estratégias de identificação para identificar ácidos nucleicos e suas estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, por exemplo, em Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sexta Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR); ou Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Oitava Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR).

[0076] As identificações detectáveis também podem incluir pares reporter-quencher como são empregues nas sondas Molecular Beacon e TAQMAN®. O reporter pode ser um pigmento orgânico fluorescente modificado com um grupo de ligação adequado para afixação ao olignonucleotídeo, tal como o carbono 3' terminal ou carbono 5' terminal. O supressor também pode ser um corante orgânico, que pode ou não ser fluorescente. Em geral, se o supressor é fluorescente ou simplesmente libera a energia transferida do reporter por decaimento não radiativo, a banda de absorção do supressor deve, pelo menos substancialmente, sobrepor a banda de emissão fluorescente do reporter de forma a otimizar a supressão. Os supressores não fluorescentes ou supressores escuros funcionam normalmente absorvendo energia a partir de reporteres excitados, mas não liberam a energia radiativamente.

[0077] A seleção de pares de reporter e supressor adequados para determinadas sondas pode ser realizada de acordo com técnicas conhecidas. Supressores fluorescentes e escuros e as suas propriedades ópticas relevantes a partir das quais os pares de reporter e supressor exemplificativos podem ser selecionados são listados e descritos, por exemplo, em Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2ª ed., Academic Press, Nova Iorque, 1971, o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência. Exemplos de reporteres e supressores modificantes para ligação covalente através de grupos reativos comuns que podem ser adicionados a um oligonucleotídeo na presente invenção podem ser encontrados, por exemplo, em Haugland (2001) Handbook of Fluorescent sondas and Research Chemicals Oitava Edição da Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), cujo conteúdo é incorporado ao presente documento por referência.

[0078] Em determinados exemplos, os pares de reporter e supressor são selecionados dentre corantes de xanteno, incluindo corantes fluoresceína e rodamina. Muitas formas adequadas desses compostos estão comercialmente disponíveis com substituintes nos grupos fenila, os quais podem ser usados como o sítio de ligação ou como a funcionalidade de ligação para ligação a um oligonucleotídeo. Outro grupo útil de compostos fluorescentes para uso como reporteres são as naftilaminas, que têm um grupo amina na posição alfa ou beta. Incluídos entre tais compostos de naftilamina estão 1- dimetilaminonaftil-5 sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno sulfonato e 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato. Outros corantes incluem 3-fenil-7-isocianatocoumarina; acridinas tais como 9-isotiocianatoacridina; N-(p-(2- benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazois; estilbenos; pirenos e similares. Em algumas outras concretizações, os reporteres e quenchers são selecionados dentre corantes de fluoresceína e rodamina. Esses corantes e metodologias de ligação apropriados para ligação a oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica.

[0079] Exemplos adequados de reporteres podem ser selecionados dentre corantes, tais como verde SYBR, 5- carboxifluoresceína (5-FAM™ disponível junto à Applied Biosystems of Foster City, Califórnia, E.U.A.), 6- carboxifluoresceína (6-FAM), tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET), 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxifluoresceína, hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), 6-carboxi-2',4,7,7'- tetraclorofluoresceína (6-TET™ disponível junto à Applied Biosystems), carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4',5'- dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (6-JOE™ disponível junto à Applied Biosystems), produtos corantes VIC™ disponíveis a partir da Molecular Probes, Inc., produtos corantes NED™ disponíveis a partir da Applied Biosystems e semelhantes. Exemplos adequados de quenchers podem ser selecionados dentre 6-carboxi-tetrametil-rodamina, ácido 4-(4-

dimetilaminofenilazo) benzoico (DABYL), tetrametilrodamina (TAMRA), BHQ-0™, BHQ-1™, BHQ-2™, e BHQ-3™, dentre os quais cada um está disponível junto à Biosearch Technologies, Inc. de Novato, Califórnia, E.U.A., QSY-7™, QSY-9™, QSY-21™ e QSY- 35™, dentre os quais cada um está disponível junto à Molecular Probes, Inc e semelhantes.

[0080] Em um aspecto, o LCR ou PCR em tempo real é realizado nas misturas de amplificação descritas no presente documento, por exemplo, usando sinalizadores moleculares ou sondas TAQMAN®. Um modelo molecular (MB) é um oligonucleotídeo que, sob condições de hibridação adequadas, se auto-hibridiza para formar uma estrutura de haste e laço. O MB tem uma identificação e um quencher nos terminais dos oligonucleotídeos; desse modo, sob condições que permitam a hibridação intramolecular, a identificação é tipicamente extinta (ou, pelo menos, alterada na sua fluorescência) pelo quencher. Sob condições em que o MB não apresenta hibridação intramolecular (por exemplo, quando ligado a um ácido nucleico alvo, tal como a uma região de um amplicon durante a amplificação), a identificação MB não é extinta. Detalhes em relação aos métodos convencionais de produção e uso de MBs estão bem estabelecidos na literatura e os MBs estão disponíveis a partir de um número de fontes de reagentes comerciais. Consultar, por exemplo, Leone et al. (1995) Nucl Acids Res 26: 2.150 a 2.155; Tyagi & Kramer (1996) Nat Biotechnol 14: 303 a 308; Blok & Kramer (1997) Mol Cell sondas 11: 187 a 194; Hsuih et al. (1997) J Clin Microbiol 34:501 a 507; Kostrikis et al. (1998) Science 279:1.228 a 1.229; Sokol e al. (1998) Proc Natl Acad Sci EUA 95:11.538 a 11.543; Tyagi et al. (1998) Nat Biotechnol 16:49 a 53; Bonnet et al. (1999)

Proc Natl Acad Sci EUA 96:6.171 a 6.176; Fang et al. (1999) J Am Chem Soc 121:2.921 a 2.922; Marras et al. (1999) Genet Anal Biomol Eng 14: 151 a 156; e, Vet et al. (1999) Proc Natl Acad Sci EUA 96: 6.394 a 6.399. Detalhes adicionais relativos à construção e uso dos MBs também são encontrados na literatura de patentes, por exemplo, nas Patentes dos no U.S. 5.925.517,

6.150.097 e 6.037.130.

[0081] Outro método de detecção em tempo real, é o método de detecção da 5'-exonuclease, também denominado ensaio TAQMAN®, conforme definido nas Patentes dos E.U.A. nos US 5,804,375; US 5,538,848; US 5,487,972; e US 5,210,015, cada uma das quais é incorporada na sua totalidade no presente documento por referência. No ensaio TAQMAN®, uma sonda modificada, tipicamente de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, é empregue durante o PCR que se liga de forma intermediária ou entre os dois membros do par de iniciadores de amplificação. A sonda modificada possui um reporter e um supressor e é concebida de modo a gerar um sinal detectável para indicar que se hibridizou com a sequência de ácido nucleico alvo durante o PCR. Desde que o reporter como o quencher estejam na sonda, o quencher impede que o reporter emita um sinal detectável. No entanto, uma vez que a polimerase estende o iniciador durante a amplificação, a atividade intrínseca da nuclease 5' para 3' da polimerase degrada a sonda, separando o reporter do quencher, e permitindo que o sinal detectável seja emitido. Geralmente, a quantidade de sinal detectável gerada durante o ciclo de amplificação é proporcional à quantidade de produto gerado em cada ciclo.

[0082] É bem conhecido que a eficiência de extinção é uma forte função da proximidade entre o reporter e o quencher,

isto é, à medida que duas moléculas se aproximam, a eficiência de extinção aumenta. Visto que a extinção é fortemente dependente da proximidade física do reporter e do quencher, o reporter e o quencher estão tipicamente ligados à sonda dentro de poucos nucleotídeos um do outro, normalmente dentro de 30 nucleotídeos um do outro, ou dentro de 6 a 16 nucleotídeos. Normalmente, essa separação é obtida fixando-se um membro de um par de reporter-quencher à extremidade 5' da sonda e o outro membro a um nucleotídeo a cerca de 6 a 16 nucleotídeos de distância, em alguns casos, na extremidade 3' da sonda.

[0083] Sondas de detecção separadas também podem ser omitidas em métodos de amplificação/detecção, por exemplo, através da realização de uma reação de amplificação em tempo real que detecte a formação do produto por modificação do iniciador de amplificação relevante após incorporação em um produto, incorporação de nucleotídeos identificados em um amplicon, ou através da monitorização de alterações nas propriedades de rotação moleculares dos amplicons em comparação com precursores sem amplificação (por exemplo, por polarização de fluorescência).

[0084] Uma concretização de uma técnica de detecção em tempo real adequada que não usa uma sonda separada que aglutina o intermediário aos dois iniciadores é o sistema/método de detecção KASPar, que é bem conhecido na técnica. No KASPar, dois iniciadores específicos dos alelos são concebidos de tal modo que o nucleotídeo 3' de cada iniciador hibridiza para a base polimórfica. Por exemplo, se o SNP é um polimorfismo A/C, um dos iniciadores teria um "A" na posição 3', enquanto o outro iniciador teria um "C" na posição 3'. Cada um desses dois iniciadores específicos dos alelos também tem uma sequência final única na extremidade 5' do iniciador. Um iniciador inverso comum é empregue, o qual amplifica em conjunto com qualquer um dos dois iniciadores específicos dos alelos. Dois oligo reporteres identificados com flúor 5' também estão incluídos na mistura de reação, um concebido para interagir com cada uma das sequências finais únicas dos iniciadores específicos dos alelos. Por fim, um oligo quencher é incluído para cada um dos dois oligo reporteres, sendo o oligo quencher complementar ao oligo reporter e sendo capaz de extinguir o sinal de flúor quando ligado ao oligo reporter. Durante a PCR, os iniciadores específicos dos alelos e os iniciadores reversos se ligam a DNA complementar, permitindo que a amplificação do amplicon ocorra. Durante um ciclo subsequente, é criada uma cadeia de ácido nucleico complementar contendo uma sequência complementar para a sequência final única do iniciador específico dos alelos. Em um ciclo adicional, o oligo reporter interage com essa sequência final complementar, agindo como um iniciador identificado. Desse modo, o produto criado a partir desse ciclo de PCR é uma cadeia de ácido nucleico identificada de maneira fluorescente. Uma vez que a identificação incorporada nesse produto de amplificação é específica para o iniciador específico dos alelos que resultou na amplificação, detectar o flúor específico apresentando um sinal pode ser usado para determinar o alelo SNP que estava presente na amostra.

[0085] Além disso, será reconhecido que a amplificação não é um requisito para a detecção do marcador - por exemplo, pode-se detectar diretamente o DNA genômico não amplificado simplesmente através da realização de um Southern blot de uma amostra de DNA genômico. Os procedimentos para a realização de

Southern blot, amplificação por exemplo, (PCR, LCR ou similar), e vários outros métodos de detecção de ácido nucleico estão bem estabelecidos e são ensinados, por exemplo, em Sambrook; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., edições, Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado até 2002) ("Ausubel"); e, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., edições) Academic Press Inc. San Diego, CA, E.U.A. (1990) ("Innis"). Detalhes adicionais relacionados a detecção de ácidos nucleicos em plantas também podem ser constatados, por exemplo, em Plant Molecular Biology (1993) Croy (edição) BIOS Scientific Publishers, Inc.

[0086] Outras técnicas para detectar SNPs também podem empregadas, tais como técnicas de hibridização alelo- específica (ASH) (ASH) ou sequenciamento de ácido nucleico. A tecnologia ASH se baseia no emparelhamento estável de uma sonda pequena, de cadeia simples, de oligonucleotídeo com um ácido nucleico alvo de cadeia simples totalmente complementar. A detecção é efetuada através de uma identificação isotópica ou não isotópica ligada à sonda. Para cada polimorfismo, duas ou mais sondas ASH diferentes são concebidas para terem sequências de DNA idênticas exceto nos nucleotídeos polimórficos. Cada sonda terá homologia exata com uma sequência de alelo de modo a que a faixa de sondas possa distinguir todas as sequências de alelo alternativas conhecidas. Cada sonda é hibridizada com o DNA-alvo. Com condições de concepção de sonda e de hibridização adequadas, uma incompatibilidade de bases simples entre a sonda e o DNA-alvo vai impedir a hibridização.

[0087] O polinucleotídeo isolado ou fragmentos do mesmo, por exemplo, iniciadores e/ou sonda, têm a capacidade para especificamente se hibridizarem com outras moléculas de ácido nucleico sob condições adequadas.

Em algumas concretizações, as moléculas de ácido nucleico compreendem qualquer um dentre os loci marcadores da presente invenção.

Será observado que iniciadores e sondas adequados a serem usados podem ser concebidos com o uso de qualquer método adequado.

Estes não se limitam a nenhum iniciador, par de iniciadores ou sondas em específico.

Por exemplo, os iniciadores ou sondas podem ser projetados com o uso de qualquer programa de software adequado, tal como LASERGENE® ou Primer3. Em uma concretização, as moléculas de ácido nucleico compreendem qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266,

267, 268, 269, 270, complementos da mesma e fragmentos da mesma. Em outro aspecto, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção incluem moléculas de ácido nucleico que se hibridizam, por exemplo, sob alta ou baixa estringência, substancialmente sequências homologas, ou que têm ambas dessas moléculas. Condições de estringência convencionais são descritas por Sambrook, e por Haymes et al. em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C., E.U.A. (1985). Desvios de complementaridade completa são, portanto, admissíveis, desde que esses desvios não excluam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de cadeia dupla. Para que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, é necessário apenas que seja suficientemente complementar em termos de sequência para ser capaz de formar uma estrutura de dupla fita estável sob as concentrações particulares de solvente e sal empregues. Condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização de DNA são conhecidas pelos especialistas na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6.

[0088] Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 M de íons Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (por exemplo, superiores a 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. Exemplos de condições de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl a 1 M, SDS (dodecilsulfato de sódio) a 1% a 37 °C, e uma lavagem em SSC 1x a 2x (SSC 20x = NaCl a 3,0 M/citrato trissódico a 0,3 M) a 50 até 55 °C.

Exemplos de condições de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37 °C, e uma lavagem em SSC 0,5x a 1x a 55 até 60 °C.

Exemplos de condições de alta estringência incluem hibridização em 50% de formamida, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37 °C, e uma lavagem em SSC 0,1x a 60 até 65 °C.

A especificidade é tipicamente a função das lavagens de pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final.

Para híbridos de DNA e DNA, o ponto de derretimento térmico (Tm) pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth et al., Anal.

Biochem. 138: 267 a 284 (1984): Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) 4- 0,41 (% de GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; em que M é a molaridade de cátions monovalentes, % de GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base.

A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência- alvo complementar se hibridiza a uma sonda perfeitamente correspondida.

Tm é reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade; desse modo, as condições de hibridização e/ou lavagem de Tm podem ser ajustadas para hibridizar as sequências da identidade desejada.

Por exemplo, se as sequências com ≥ 90% de identidade forem buscadas, a Tm pode ser diminuída em 10 °C.

De modo geral, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C menores que Tm para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e um pH definidos. No entanto, as condições estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 °C menores que a Tm; condições estringentes moderadas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 °C menores que a Tm; condições de estringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 °C menores que a Tm. Com o uso da equação, as composições de hibridização e lavagem, e Tm desejadas, aqueles com competências comuns entenderão que variações na estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Caso o grau desejado de incompatibilidade resulte em uma Tm menor que 45 °C (solução aquosa) ou 32 °C (solução de formamida), prefere-se aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nova Iorque, EUA (1993); e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing e Wiley- Inter-science, Nova Iorque, EUA (1995). As condições de hibridização e/ou lavagem podem ser aplicadas por pelo menos 10, 30, 60, 90, 120 ou 240 minutos.

[0089] Em algumas concretizações, um ácido nucleico, por exemplo, iniciadores e/ou sondas, da presente invenção hibridizará especificamente com uma ou mais das moléculas de ácido nucleico apresentadas em SEQ ID NOs: 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 114,

115, 117, 118, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 136, 138, 139, 141, 142, 144, 145, 147, 148, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 159, 160, 162, 163, 165, 166, 168, 169, 171, 172, 174, 175, 177, 178, 180, 181, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 195, 196, 198, 199, 201, 202, 204, 205, 207, 208, 210, 211, 213, 214, 217, 218, 221, 222, 225, 226, 229, 230, 233, 234, 237, 238, 241, 242, 245, 246, 249, 250, 253, 254, 257, 258, 261, 262, 265, 266, 269, 270 ou complementos das mesmas, ou fragmentos de qualquer uma das mesmas, sob condições moderadamente estringentes. Em um aspecto, um ácido nucleico da presente invenção se hibridizará especificamente a uma ou mais SEQ ID NOs: 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 136, 138, 139, 141, 142, 144, 145, 147, 148, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 159, 160, 162, 163, 165, 166, 168, 169, 171, 172, 174, 175, 177, 178, 180, 181, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 195, 196, 198, 199, 201, 202, 204, 205, 207, 208, 210, 211, 213, 214, 217, 218, 221, 222, 225, 226, 229, 230, 233, 234, 237, 238, 241, 242, 245, 246, 249, 250, 253, 254, 257, 258, 261, 262, 265, 266, 269, 270 ou complementos, ou fragmentos das mesmas, sob condições de alta estringência.

[0090] Em algumas concretizações, um locus marcador dentro de ou ligado a um QTL associado com um fenótipo de crescimento reprodutivo preferencial está localizado dentro de uma região genômica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 108,

109, 111, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 136, 138, 139, 141, 142, 144, 145, 147, 148, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 159, 160, 162, 163, 165, 166, 168, 169, 171, 172, 174, 175, 177, 178, 180, 181, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 195, 196, 198, 199, 201, 202, 204, 205, 207, 208, 210, 211, 213, 214, 217, 218, 221, 222, 225, 226, 229, 230, 233, 234, 237, 238, 241, 242, 245, 246, 249, 250, 253, 254, 257, 258, 261, 262, 265, 266, 269, 270. Em outras concretizações, um locus marcador é localizado em uma região genômica que tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% com relação a qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 66, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 84, 85, 87, 88, 90, 91, 93, 94, 96, 97, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 123, 124, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 135, 136, 138, 139, 141, 142, 144, 145, 147, 148, 150, 151, 153, 154, 156, 157, 159, 160, 162, 163, 165, 166, 168, 169, 171, 172, 174, 175, 177, 178, 180, 181, 183, 184, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 195, 196, 198, 199, 201, 202, 204, 205, 207, 208, 210, 211, 213, 214, 217, 218, 221, 222, 225, 226, 229, 230, 233, 234, 237, 238, 241, 242, 245, 246, 249, 250, 253, 254, 257, 258, 261, 262, 265, 266, 269, 270 ou complementos ou fragmentos dos mesmos. Salvo quando indicado de outra forma, a porcentagem de identidade de sequência é determinada usando os parâmetros padrão do programa GAP para o alinhamento de ácido nucleico (Accelrys, San Diego, CA, E.U.A.)

[0091] Em algumas concretizações, um kit para detectar marcadores ou haplótipos, e/ou para correlacionar os marcadores ou haplótipos com um fenótipo desejado (por exemplo, um fenótipo de CMS), são fornecidos. Desse modo, um kit típico pode incluir um conjunto de sondas e/ou iniciadores marcadores configurados para detectar pelo menos um alelo ou polimorfismo favorável de um ou mais loci marcadores associados à CMS. Essas sondas ou iniciadores podem ser configurados, por exemplo, para detectar os alelos marcadores ou polimorfismos observados nas tabelas e nas concretizações no presente documento, por exemplo, com o uso de qualquer formato de detecção de alelo disponível, tal como uma detecção com base em arranjo de fase sólida ou fase líquida, detecção de amostra à base de microfluido etc. Os kits podem incluir adicionalmente materiais de empacotamento para empacotar as sondas, iniciadores ou instruções; controles, tais como reações de amplificação de controle que incluem ácidos nucleicos de sondas, iniciadores e/ou molde para amplificações; marcadores de tamanho molecular; ou semelhantes.

[0092] As instruções de sistema ou kit que descrevem como usar o sistema ou kit e/ou que se correlacionam com a presença ou ausência do alelo com o fenótipo preferido ou não preferido previsto também são fornecidas. Por exemplo, as instruções podem incluir pelo menos uma tabela de consulta que inclui uma correlação entre a presença ou ausência dos alelos associados à CMS. A forma precisa das instruções pode variar dependendo dos componentes do sistema, por exemplo, as mesmas podem estar presentes como software de sistema em uma ou mais unidades integradas do sistema (por exemplo, um microprocessador, computador ou mídia legível por computador), ou pode estar presente em uma ou mais unidades (por exemplo,

computadores ou mídias legíveis por computador) operacionalmente acopladas ao detector. Seleção e Introgressão de MAS

[0093] É proporcionado o uso da seleção assistida por marcadores (MAS) para selecionar uma planta de sorgo ou germoplasma com base na detecção de um determinado marcador ou haplótipo de interesse. Por exemplo, em determinadas concretizações, uma planta ou germoplasma de sorgo que possui um determinado alelo ou haplótipo marcador favorável será selecionado por meio de MAS. Com o uso de MAS, as plantas ou germoplasma de sorgo podem ser selecionadas para marcadores ou alelos marcadores que se correlacionam positiva ou negativamente com CMS, sem de fato, elevar o sorgo e a fenotipagem para CMS ou falta dos mesmos. A MAS é uma poderosa ferramenta para selecionar fenótipos desejados e para introgressão de traços desejados em cultivares de sorgo (por exemplo, introgressão de traços desejados em linhagens de elite). A MAS é facilmente adaptada aos métodos de análise molecular de elevado rendimento que podem rapidamente pesquisar um elevado número de material genético de plantas ou de germoplasmas para os marcadores de interesse e é muito mais econômico do que cultivar e observar plantas para características visíveis.

[0094] Ainda em aspectos adicionais, as informações reveladas no presente documento em relação a loci marcadores, alelos marcadores, haplótipos, e/ou perfis de marcador podem ser usadas para auxiliar na criação e/ou seleção de plantas de sorgo, germoplasmas de sorgo, progênie de sorgo, plantas de melhoria, linhagens e populações com ou sem a características de CMS. Em um aspecto preferencial, a utilização de marcadores associados a à fonte de CMS possibilita a seleção de plantas de sorgo, germoplasmas de sorgo e progênie de sorgo com ou sem CMS. Em outras palavras, a genotipagem de uma planta de sorgo até mesmo em um locus marcador único, tal como qualquer locus marcador descrito nas tabelas no presente documento, é suficiente para detectar uma planta de sorgo ou germoplasma de sorgo com ou sem CMS a fim de separar plantas de sorgo e germoplasmas de sorgo com CMS de plantas de sorgo e germoplasmas de sorgo sem CMS. Em uma concretização, métodos e kits usados para seleção de plantas de sorgo e germoplasmas de sorgo compreendem detecção de um alelo marcador que se correlaciona positivamente ou está associado com CMS, em que o locus marcador é selecionado dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, e 64, e uma combinação das mesmas. Desse modo, os presentes métodos aprimoram a eficiência e precisão da seleção de plantas de sorgo e germoplasmas de sorgo, até mesmo de populações heterogêneas e/ou dentre diferentes variedades de sorgo, por meio de MAS em comparação a técnicas de genotipagem anteriores que exigem o uso de múltiplos loci marcadores para identificar e/ou selecionar plantas de sorgo e germoplasmas de sorgo com ou sem CMS.

[0095] Em um aspecto, é fornecido um método para selecionar uma planta de sorgo com ou sem CMS de uma população de plantas de sorgo heterólogas e/ou com diversidade genética. Em uma concretização, o método compreende extrair amostras de DNA genômico de cada uma das plantas de sorgo na pulação com diversidade genética e/ou heterogêneas e misturar por adição um primeiro polinucleotídeo isolado com cada uma dentre as amostras genômicas de DNA, em que o primeiro polinucleotídeo tem capacidade para hibridizar com um locus marcador selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, e uma combinação dos mesmos. Em tal concretização, a detecção do primeiro polinucleotídeo hibridizado em uma ou mais das amostras genômicas de DNA indica uma planta de sorgo com ou sem CMS, que é, então, selecionada para uso nos programas endocruzados. Em uma concretização preferida, o primeiro polinucleotídeo é uma sonda; mais preferencialmente, é uma sonda de alelo específico. Além disso, os métodos da presente revelação podem ser usados para selecionar plantas progênitas que têm CMS que são produzidas a partir de um cruzamento entre uma planta de sorgo com CMS e outra planta de sorgo, tal como uma variedade de plantas de sorgo exótica, variedade de planta de sorgo de elite etc.

[0096] A introgressão de CMS em germoplasma de sorgo não CMS é fornecida. Qualquer método para a introgressão de um ou mais loci marcadores em plantas de sorgo conhecido por uma pessoa versada na técnica pode ser usado. Tipicamente, uma primeira germoplasma de sorgo que contém características de CMS derivados de um locus marcador particular, haplótipo, perfil de QTL ou marcador e um segundo germoplasma de sorgo que carece de tal CMS derivado do locus marcador, haplótipo, QTL ou perfil de marcador são fornecidos. O primeiro germoplasma de sorgo pode ser cruzado com o segundo germoplasma de sorgo para proporcionar germoplasma de sorgo progênito. O germoplasma progênito é triado para determinar a presença de CMS derivado do locus marcador, haplótipo, QTL ou perfil de marcador, e progênie que testa positivo para CMS derivada do locus marcador, haplótipo, QTL ou perfil de marcador são selecionados como sendo germoplasma de sorgo no qual o locus marcador, haplótipo, QTL ou perfil de marcador foi intorgredido. Métodos para a realização de tal rastreio são bem conhecidos na técnica e qualquer método adequado pode ser usado.

[0097] Uma aplicação de MAS é usar os marcadores de CMS, haplótipos ou perfis de marcador para aumentar a eficiência de um esforço de introgressão ou retrocruzamento com objetivo de introduzir uma característica de CMS em um fundo desejado (tipicamente, alto rendimento). Em retrocruzamento assistido por marcadores de marcadores específicos a partir de uma fonte dadora, por exemplo, para um antecedente genético de elite, se seleciona entre progênie de retrocruzamento para o traço do dador e, em seguida, se usa retrocruzamento repetido para a linhagem de elite para reconstituir o máximo possível de genoma de antecedentes de elite. Desse modo, os marcadores e métodos podem ser utilizados para guiar a MAS ou melhoramento de variedades de sorgo com o complemento desejado (conjunto) de formas alélicas de segmentos de cromossomo associados à desempenho agronômico superior (resistência, em conjunto com quaisquer outros marcadores disponíveis para rendimento, resistência à doença etc.). Quaisquer um dentre os loci marcadores, alelos marcadores, haplótipos, QTLs ou perfis de marcador revelados pode ser introduzido em uma linhagem de sorgo por meio de introgressão, por melhoramento tradicional (ou introduzido por meio de transformação, ou ambos) para render uma planta de sorgo com desempenho agronômico superior. O número de alelos associados à resistência que pode ser introduzido ou estar presente em uma planta de sorgo está em uma faixa de 1 ao número de alelos revelados no presente documento, em que cada número inteiro é incorporado no presente documento como se fosse explicitamente citado.

[0098] Isso também fornece um método para produzir uma planta progênita de sorgo e essas plantas de sorgo progênitas, por si só. O método compreende o cruzamento de uma primeira planta de sorgo parental com uma segunda planta de sorgo e o crescimento da planta de sorgo fêmea sob condições de crescimento da planta de modo a produzir progênie de plantas de sorgo. Métodos de cruzamento e de crescimento de plantas de sorgo estão bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica. Tal planta progênita de sorgo pode ser submetida a ensaio para alelos associados à CMS, desse modo, a progênie desejada selecionada. Tais plantas ou semente de progênie podem ser comercialmente vendidas para a produção de sorgo, usadas para alimentação, processadas para se obter um componente desejado de sorgo, ou adicionalmente utilizadas em ciclos subsequentes de melhoramento. Pelo menos uma dentre a primeira ou a segunda plantas de sorgo é uma planta de sorgo em que a mesma compreende pelo menos um dentre os loci marcadores ou perfis de marcador, de modo que a progênie tenha a capacidade para herdar o locus marcador ou o perfil de marcador.

[0099] A diversidade genética é importante para ganho genético de longo prazo em qualquer programa de melhoramento genético. Com diversidade limitada, o ganho genético acabará por atingir um patamar quando todos os alelos favoráveis tiverem sido corrigidos no seio da população elite. Um dos objetivos é incorporar a diversidade dentro do agrupamento de elite sem perder o ganho genético que já foi feito e com o mínimo possível de investimento. MAS proporciona uma indicação de quais as regiões genômicas e que alelos favoráveis dos antepassados originais foram selecionados e conservados ao longo do tempo, facilitando os esforços para incorporar a variação favorável a partir de fontes de germoplasma exótico (parentais que não estão relacionados com o agrupamento de genes de elite), na esperança de encontrar alelos favoráveis que atualmente não existem no agrupamento genético de elite.

[0100] Por exemplo, os marcadores, haplótipos, iniciadores, sondas e perfis de marcador podem ser usados para MAS em cruzamentos que envolvem linhagens de soja de elite x exótica submetendo-se a sorgo de segregação a MAS para manter os alelos de rendimento principais, em conjunto com os alelos marcadores de resistência no presente documento.

[0101] Em uma concretização, a planta de sorgo ou germoplasma de sorgo que tem CMS é identificada e/ou selecionada com o uso dos métodos e loci marcadores descritos no presente documento. Em tal concretização, a planta de sorgo ou germoplasma de sorgo selecionada e cruzada com outra planta de sorgo, tal como uma planta de sorgo de elite ou um parental de sorgo recorrente, a fim de produzir uma população de germoplasma de sorgo progênito no qual uma QTL associada à CMS é introgredida em uma subpopulação do germoplasma de sorgo progênito. A subpopulação resultante de germoplasma de sorgo progênito pode exibir CMS.

EXEMPLOS

[0102] Espera-se que as extrações de DNA cru usadas nos exemplos tenham baixas quantidades de contaminação de DNA organela, o que pode contribuir para dados ausente, visto que os marcadores usados são exclusivos para DNA mitocondrial. EXEMPLO 1

[0103] Após a constatação e modelo iniciais do conjunto de marcadores de CMS, os marcadores foram testados em uma faixa mais ampla de germoplasma. A associação de teste à esterilidade usou linhagens endocruzadas classificadas opor um tipo de material (linhagem A, linhagem B, linhagem R). A validação inicial foi feita em um conjunto de 368 linhagens que incluiu 144 linhagens B, 91 híbridos e 133 linhagens R. Essa validação inicial foi feita primariamente para avaliar o desempenho do marcador, e a capacidade de facilmente resolver diferentes classes de marcador. O conjunto completo de 368 indivíduos foi genotipado como 3 replicatas e concordância entre as reps foi avaliado para cada um dentre os 5 marcadores e para cada tipo de material no conjunto de validações (Tabela 2).

[0104] As taxas de concordância para todos os 5 marcadores foram extremamente altas, indicando que realizaram tiveram o desempenho quase idêntico em cada uma das replicatas. Os dois marcadores com a concordância mais alta em todos os 3 tipos de material foram a SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:63 (99,8%). Esperou-se que dentre as linhagens B todas exigissem igualmente cada marcador. Isso foi verídico para todas menos as 2 linhagens B (1,4%). É possível que essas duas exceções tenham sido erros de genotipagem ou que tenham sido verdadeiramente relacionadas em pureza. As duas exceções eram, mais provavelmente, erros de genotipagem relacionados à pureza, visto que tais reps de alta consistência – as mesmas duas linhas foram separadas de outras linhas B em todos os 5 marcadores e todas as 3 reps.

Todos os 5 marcadores também tiveram poucos dados ausentes nas 3 reps devido ou a um baixo sinal ou a uma incapacidade de distinguir a classe de genótipo (% em média: 0,46). A SEQ ID NO:61 teve a maior porcentagem de ausência a %1,36, a SEQ ID NO:62 teve a porcentagem mais baixa a 0,09%. Obtido em conjunto, esse exemplo inicial de validação forneceu boa evidência de que desempenho foi forte.

Tabela 2. A frequência de chamadas do genótipo e concordância nas linhagens B, híbridos e nas linhagens R apresentam no conjunto de validação para cada uma das três reps.

SEQ ID Rep1 Rep2 Rep3 NO:55 (32,084 pb) C G C G C G % de concordânciaϯ Linhagem B 2 142 2 142 2 142 100,0% Híbrido 79 12 79 12 78 12 99,3% Linhagem R 13 119 13 119 13 119 100,0%

SEQ ID Rep1 Rep2 Rep3 NO:59 (72,950 pb) A T A T A T % de concordânciaϯ Linhagem B 142 2 142 2 140 2 99,1% Híbrido 12 79 12 79 11 79 99,3% Linhagem R 120 13 119 13 119 13 99,7%

SEQ ID Rep1 Rep2 Rep3 NO:61 (315,577 pb) A C A C A C % de concordânciaϯ Linhagem B 141 2 140 2 139 2 98,6% Híbrido 12 79 12 79 12 79 100,0% Linhagem R 118 13 117 13 116 13 99,0% SEQ ID Rep1 Rep2 Rep3 NO:62 (347,518 pb) A C A C A C % de concordânciaϯ Linhagem B 2 142 2 142 2 142 100,0% Híbrido 79 12 79 12 79 12 100,0% Linhagem R 13 120 13 120 13 119 99,5% SEQ ID Rep1 Rep2 Rep3 NO:63 (373,170 pb) A T A T A T % de concordânciaϯ Linhagem B 2 142 2 141 2 142 99,5% Híbrido 79 12 79 12 79 12 100,0% Linhagem R 13 119 13 119 13 119 100,0% ϯCom base no número de diferenças de chamada de alelo individuais em todas as replicatas EXEMPLO 2

[0105] Após o ciclo inicial de validação, que provou a robustez e precisão do conjunto de marcadores desenvolvidos, sendo que o painel de marcador foi testado em um conjunto de germoplasma CMS-específicos. O painel de teste inclui um conjunto de endocruzados (linhagens A-B pareadas) que cobriu uma ampla faixa de diversidade nos agrupamentos de melhoria fêmea Pioneira para a capacidade desses marcadores de distinguir tipos de material estéril (linhagem A) vs. fértil (linhagem B). Um total de 368 linhagens endocruzadas (184 pares A-B) foram semeados, a mostra de folha foi coletada, o DNA foi extraído e foram submetidos a ensaio com o uso dos 5 SNPs mencionados acima que foram aprovados na validação de marcador inicial. As chamadas do genótipo, concordância nas reps, e a capacidade de informação desses marcadores é resumida na Tabela

3.

[0106] Todos os 5 marcadores testados puderam solucionar as linhagens A, o que significam que houve uma taxa de erro de 0% na capacidade de os marcadores para detectar com êxito os citótipos estéreis. Portanto, em todos os marcadores e todas as reps, as linhagens A tiveram um único haplótipo solucionável sem tipos fora. Dentre as linhagens B, houve uma taxa de erro em média de 2,2%, então, apenas 8 linhagens dentre as 184 tiveram um genótipo que de fato se agrupou às linhagens A (inferindo um citótipo estéril). Essas 8 exceções foram consistentes em todos os marcadores e em todas as reps. Sob um exame mais minucioso, dentre essas 8 linhagens B, 50% das mesmas tiveram dados de genótipo que indicam que foram homozigotos para o alelo fértil, o que sugere que um problema de pureza ou inventário ocorreu naqueles que foram submetidas para esse projeto. As 4 exceções restante não foram genotipadas, porém também estão propensas a estarem relacionadas à pureza visto que esses pedigrees se sobrepõem estreitamente a outras linhagens B com uma indicação de citótipo fértil confirmada. Os dados ausentes foram novamente muito baixos para todos os marcadores com uma média de 0,07% em todas as três reps.

Obtidos em conjunto, esses dados forneceram forte evidência de que o conjunto de marcadores de CMS foi altamente preciso e informativo na em distinguir citótipos machos estéreis e fêmeas estéreis.

Tabela 3. A frequências das chamadas do genótipo e concordância em um conjunto de 184 linhagens pareadas A-B presentes no conjunto de validações de CMS para cada uma das três replicatas.

Rep1 Rep2 Rep3 SEQ ID NO:55 % de % de (32,084 pb) C G C G C G concordânciaϯ Erro 18 18 18 0 0 0 100,0% 0,0% Linhagem A 4 4 4 17 17 17 8 8 8 100,0% 2,2% Linhagem B 6 6 6 O alelo "C" é estéril

Rep1 Rep2 Rep3 SEQ ID NO:59 % de % de (72,950) A T A T A T concordânciaϯ Erro 18 18 18 0 0 0 100,0% 0,0% Linhagem A 4 4 4 17 17 17 8 8 8 100,0% 2,2% Linhagem B 6 6 6 O alelo "T" é estéril

Rep1 Rep2 Rep3

SEQ ID NO:61 % de % de

A C A C A C (315,577) concordânciaϯ Erro 18 18 18 0 0 0 99,6% 0,0% Linhagem A 3 4 4 17 17 17 8 8 8 99,6% 2,2% Linhagem B 5 6 6 O alelo "C" é estéril Rep1 Rep2 Rep3 SEQ ID NO:62 % de % de (347,518) A C A C A C concordânciaϯ Erro 18 18 18 0 0 0 99,6% 0,0% Linhagem A 4 4 3 17 17 17 8 8 8 100,0% 2,2% Linhagem B 6 6 6 O alelo "A" é estéril Rep1 Rep2 Rep3 SEQ ID NO:63 % de % de (373,170) A T A T A T concordânciaϯ Erro 18 18 18 0 0 0 99,6% 0,0% Linhagem A 4 3 4 17 17 17 8 8 8 100,0% 2,2% Linhagem B 6 6 6 O alelo "A" é estéril ϯCom base no número de diferenças de chamada de alelo individuais em todas as replicatas EXEMPLO 3

[0107] O sorgo tem diversos tipos diferentes de citoplasma estéril (indicado A1, A2, A3 etc.) que foram acompanhados por seu próprio conjunto de linhagens R que podem restaurar fertilidade nos mesmos. Algumas linhagens R restauram a fertilidade em múltiplos citótipos, alguns são restaurados em apenas u. As diferenças de nucleotídeos no genoma mitocondrial são consideradas como sustentando 1 citótipo versus outro. Portanto, é possível que um SNP que diferencia a linhagem A da linhagem B no citótipo A1 também o faz em outros, no entanto, um determinado SNP também pode ser exclusivo a um citótipo particular. Portanto, a capacidade desses marcadores foi testada para distinguir as linhagens B dos equivalentes estéreis da linhagem A convertidos com múltiplos citótipos. Os resultados desse teste são mostrados na Tabela 4.

[0108] Dois dos 4 marcadores triados puderam distinguir completamente cada uma das conversões de linhagem A do equivalente da linhagem B - SEQ ID NO:59 e SEQ ID NO:63, e com o alelo esperado que foi observado no teste de citótipo A1 (Tabela 3). Outro marcador, SEQ ID NO:55 foi informativo na diferenciação entre a linhagem A e a linhagem B, porém teve muitos dados ausentes (33%). O marcador final, SEQ ID NO:62 foi diferente apenas dos citótipos do tipo A2, A4 e A5, porém de A3 e A9 das linhagens B. Esses dados forneceram evidência adicional de que as SEQ ID NO:59 e SEQ ID NO:63 de marcadores podem distinguir o citoplasma estéril do citoplasma fértil, e além disso, funcionam em citótipos exclusivos, o que torna os mesmos ainda mais interessantes de uma perspectiva de melhoria aplicada. Tabela 4. Capacidade que os 4 SNPs de CMS têm para distinguir um conjunto de linhagens B das linhagens A convertidas com o uso de fontes de citoplasmas não A1.

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Origem do DNA Grupo NO:59 NO:63 NO:55 NO:62 Linhagem-A 1 1 T A C A A2 Linhagem-A 1 1 T A EQV C A3 Linhagem-A 1 1 T A C A A4 Linhagem-A 1 1 T A C A A5 Linhagem-A 1 1 T A EQV C A9 Linhagem-B1 1 A T G C Linhagem-A2 A2 2 T A C A Linhagem-A3 A2 2 T A EQV C Linhagem-A4 A2 2 T A C A Linhagem-A5 A2 2 T A C A Linhagem-A9 A2 2 T A EQV C Linhagem-B2 2 A T G C Linhagem-A3 A2 3 T A C A Linhagem-A3 A3 3 T A EQV C

Linhagem-A4 A3 3 T A C A Linhagem-A5 A3 3 T A C A Linhagem-A9 A3 3 T A EQV C Linhagem-B3 3 A T G C Linhagem-A4 A2 4 T A C A Linhagem-A4 A3 4 T A EQV C Linhagem-A4 A4 4 T A C A Linhagem-A5 A4 4 T A C A Linhagem-A9 A4 4 T A EQV C Linhagem B4 4 A T G C EQV: Equívoco (sem pontuação) EXEMPLO 4

[0109] O marcador de CMS de maior desempenho, SEQ ID NO:63, foi incluído em 6 projetos de genética pureza. Esses projetos são usados para avaliar níveis de pureza dentro de uma fonte de semente antes de aumentos parentais para teste híbrido avançado e são uma parte normal de programas de melhoria de planta comercial. A semente precisa ser considerada geneticamente pura antes de transferir a semente da pesquisa até a produção. Os resultados do teste de pureza ao longo de 169 linhagens com o uso do marcador de CMS são exibidos na Tabela 5.

[0110] O marcador de CMS foi altamente informativo na separação das linhagens A vs. B. Mais de 99,7% das amostras de linhagem A triada teve uma chamada de A/A no marcador de CMS, conforme esperado. De modo semelhante, mais de 99,6% das linhagens B tiveram uma chamada T/T nesse marcador. Houve 12 exceções na linhagem A e 10 exceções na linhagem B. Sob mais exames, 10 destas em ambas as classificações foram correspondentes a uma única linha basal, indicando uma mistura potencial de sementes.

Para essa linha basal particular, todas as 10 amostras para a linhagem A teve uma chamada de T/T, ao passo que todas as 10 amostras para a linhagem B teve uma chamada de A/A, e esse foi o único caso dentre todas as linhagens triadas para as quais isso ocorreu.

A investigação no experimento em campo no qual a extração de amostras ocorreu identificou um erro na transferência por upload das informações de origem.

Houve uma mudança na lista de entrada entre as versões macho fértil e macho estéril que não foram atualizadas até o momento posterior.

Portanto, o marcador identificou corretamente essa mudança.

Isso fornece um exemplo excelente de um dentre os usos destinados principais desse marcador, a saber, o teste de pureza genética.

Além dessas 20 exceções, houve apenas 2 amostras adicionais dentre todas as 4,292 amostras de linhagem A e nenhuma dentre as 2,670 amostras de linhagem B.

Adicionalmente, o desempenho do marcador performance nesses projetos de genotipagem foi excepcional com menos de 0,5% de dados ausentes devido a uma incapacidade de separar as chamadas de alelo.

Tabela 5. Número de chamadas estéreis (A/A) e férteis (T/T) no marcador SEQ ID NO:63 por um conjunto de 86 linhagens A e 83 linhagens B triadas ao longo dos 6 projetos de genotipagem.

Tipo de % de Contagem de Linhagem A/A T/T EQV material EQV

4,28 86 12 9 0,21% Linhagem A 0 2,66 83 10 13 0,49% Linhagem B 0

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para selecionar uma planta de sorgo ou germoplasma com macho-esterilidade citoplasmática (CMS) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) detectar no tecido de uma planta de sorgo ou germoplasma um marcador ligado a um locus de característica quantitativa (QTL) associado à CMS que compreende um haplótipo: (c) marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084; (d) marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950; (e) marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577; (f) marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518; e (g) marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170; e (b) selecionar a planta de sorgo ou germoplasma que compreende o marcador ligado ao QTL associado à CMS detectada na etapa (a), desse modo, selecionando a planta ou germoplasma com CMS.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170.

7. Método para realizar a introgressão em uma planta de sorgo com macho-esterilidade citoplasmática (CMS) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar uma planta de sorgo que tem CMS com uma planta de sorgo que não tem CMS para criar uma população de plantas ou germoplasma de sorgo progênitos; (b) detectar nos tecidos da população de plantas ou germoplasma de sorgo progênitos da etapa (a) um marcador ligado a um locus de característica quantitativa (QTL) associado à CMS que compreende o haplótipo: vi. marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084; vii. marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950; viii. marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577; ix. marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518; e x. marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170;

(c) dentre a população de plantas ou germoplasma de sorgo progênitos selecionar uma ou mais plantas ou germoplasma de sorgo progênitos que compreende o marcador ligado ao QTL associado à CMS detectada na etapa (b), desse modo, selecionando uma ou mais plantas ou germoplasma com CMS.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518.

12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170.

13. Método para hibridizar a produção de semente de sorgo caracterizado pelo fato de que compreende: (a) detectar no tecido de uma planta de sorgo ou germoplasma um marcador ligado a um locus de característica quantitativa (QTL) associado à CMS que compreende um haplótipo: vi. marcador SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084;

vii. marcador SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950; viii. marcador SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577; ix. marcador SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518; e x. marcador SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170; e (b) selecionar a planta de sorgo ou germoplasma que compreende o marcador ligado ao QTL associado à CMS detectada na etapa (a), desse modo, selecionando a planta ou germoplasma com CMS; (c) plantar a planta de sorgo ou germoplasma selecionado na etapa (b) em fileiras que alternam entre plantas ou germoplasma de sorgo sem CMS; (d) fertilizar as plantas ou germoplasma de sorgo selecionados na etapa (c) com pólen das plantas sem CMS plantadas na etapa (c); e (e) colher sementes das plantas ou germoplasma de sorgo fertilizadas na etapa (d).

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:55 que tem o alelo C na posição 32084.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:59 que tem o alelo T na posição 72950.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:61 que tem o alelo C na posição 315577.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:62 que tem o alelo A na posição 347518.

18. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o marcador ligado ao QTL é a SEQ ID NO:63 que tem o alelo A na posição 373170.