BR112020022236A2

BR112020022236A2 - métodos e composições para tratamento de urticária crônica

Info

Publication number: BR112020022236A2
Application number: BR112020022236-4A
Authority: BR
Inventors: Christopher Robert Bebbington; Nenad Tomasevic; Henrik Rasmussen
Original assignee: Allakos Inc.
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2021-02-02
Also published as: JP2024045612A; MX2020011377A; WO2019213468A1; AU2019262167A1; JP2021523117A; CA3099338A1; EP3788078A1; US20210246205A1; SG11202010911WA; KR20210005245A; EP3788078A4; CN112384535A

Abstract

  MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE URTICÁRIA CRÔNICA. A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de urticária crônica. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de urticária crônica através da administração de anticorpos que se ligam a Siglec-8 humana ou composições compreendendo os referidos anticorpos. A presente invenção também se refere a artigos de manufatura ou kits compreendendo anticorpos que se ligam a Siglec-8 humana para o tratamento de urticária crônica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE URTICÁRIA CRÔNICA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S. Serial Nºs. 62/667.242, depositado em 4 de maio de 2018; 62/788.719, depositado em 4 de janeiro de 2019; 62/797.817, depositado em 28 de janeiro de 2019; 62/803.211, depositado em 8 de fevereiro de 2019; e 62/806.657, depositado em 15 de fevereiro de 2019; cada um dos quais é incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência, em sua totalidade.

SUBMISSÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[0002] O conteúdo da seguinte submissão em arquivo de texto ASCII é incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência, em sua totalidade: um formato legível por computação (CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 7017112000940SEQLIST.TXT, data do registro: 2 de maio de 2019, tamanho: 123 KB).

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de urticária crônica por administração de anticorpos que se ligam a Siglec-8 humana e composições compreendendo os referidos anticorpos.

ANTECEDENTES

[0004] As urticárias crônicas são um grupo de doenças inflamatórias de pele que são causadas pela ativação inadequada de mastócitos na pele. As manifestações clínicas incluem urticária (pápulas), angioedema ou ambos, os quais podem ocorrer espontaneamente ou em resposta a alguns gatilhos físicos. As urticárias crônicas são classificadas pelo gatilho específico de ativação de mastócitos. Gatilhos (e tipos de urticárias indutíveis correspondentes) incluem: abrasão física da pele (dermografismo sintomático, urticária dermatográfica, ou urticária factícia), pressão, contato, aumento da temperatura corporal (urticária colinérgica), calor, frio (urticária induzida pelo frio), contato com água (aquagênica), e vibração (urticária vibratória), com algumas urticárias desencadeadas por uma causa desconhecida (urticária idiopática ou espontânea). Vide, por exemplo, Moolani, Y. et al. (2016 Feb. 16) F1000Res. F1000 Faculty Rev-177. A ativação de mastócitos em lesões de pele dos pacientes com urticária também é reforçada pela infiltração de células adicionais dentro das lesões. Em particular, entende-se que os eosinófilos desempenhem uma função importante na urticária crônica, por exemplo, estimulando a cascata de coagulação extrínseca e reforçando a atividade dos mastócitos (vide, por exemplo, Asero et al (2009) WAO Journal 2:213-217).

[0005] Muitos pacientes com urticária são tratados adequadamente pelas terapias atuais, tais como alta dose de anti-histamínicos. A forma mais comum de urticária crônica é urticária espontânea ou idiopática crônica. Acredita-se que este subtipo seja uma doença alérgica, na qual a IgE desempenha um papel importante. O Omalizumab (vendido como XOLAIR®) é um anticorpo anti-IgE aprovado para utilização em urticária espontânea crônica que não pode ser tratada com anti-histamínicos H1 somente, mesmo em doses maiores do que as aprovadas. No entanto, alguns pacientes demonstraram resistência ao omalizumab (vide, por exemplo, Metz, M. et al. (2014) J. Dermatol. Sci. 73:57-62). A taxa de resposta ao omalizumab na urticária espontânea crônica varia de 55%

até 70 a 80%, quando são usadas doses maiores do que as aprovadas. No caso de urticárias físicas, as taxas de resposta são menores. Em particular, Metz et al. descreveram que a taxa de resposta ao omalizumab em pacientes com urticária colinérgica foi baixa, com somente 5/8 dos pacientes com urticária colinérgica apresentando uma resposta completa ao omalizumab (em comparação com 25/30 para urticária espontânea crônica).

[0006] Atualmente, não existe nenhum tratamento biológico aprovado para utilização em urticárias indutíveis. Um número significativo de pacientes não recebe benefício adequado das terapias atuais, tais como tratamento com anti-histamínicos H1 e/ou anti-IgE, e seus sintomas de urticária não controlada podem ter um impacto significativo sobre a qualidade de vida. Deste modo, permanece a necessidade de novas abordagens terapêuticas que visem a inflamação subjacente às urticárias crônicas.

[0007] Todas as referências citadas aqui, neste pedido de patente, inclusive pedidos de patente, publicações de patente, e literatura científica, são incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referência, em suas totalidades, como se cada referência individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por meio de referência.

BREVE SUMÁRIO

[0008] Para satisfazer esta e outras necessidades, a presente invenção refere-se, entre outros, a métodos de tratamento ou prevenção de urticária crônica por administração de anticorpos que se ligam a Siglec-8 humana e/ou composições compreendendo os referidos anticorpos. Em particular, e devido em parte a seu mecanismo de ação único, os métodos e composições descritos aqui, neste pedido de patente, podem encontrar uso no tratamento de indivíduos que são resistentes ou refratários a tratamento com anti-histamínico H1 e/ou anticorpo anti-IgE, os indivíduos com urticária que não é controlada adequadamente ou sintomas de urticária que permanecem apesar de tratamento com anti-histamínico H1, os indivíduos que apresentaram recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti-IgE, os indivíduos que demonstraram uma resposta inadequada para tratamento com um anticorpo anti-IgE, ou os indivíduos cujos sintomas de urticária são controlados inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE. Sem desejar ser limitado pela teoria, imagina-se que o anticorpo anti- Siglec-8 pode inibir as respostas dos mastócitos a autoanticorpos, por exemplo, em pacientes resistentes a anticorpos anti-IgE, tais como omalizumab. Na urticária autoimune, os pacientes afetados produziram autoanticorpos IgG contra FceRI, IgE, ou ambos, os quais podem apresentar ligação cruzada com FceRI não ocupados ou ocupados com IgE para ativar mastócitos na pele (vide, por exemplo, Konstantinou, G.N. et al. (2013) Allergy 68:27-36 e Chang, T.W. et al. (2015) J. Allergy Clin. Immunol. 135:337-342).

[0009] Por conseguinte, alguns aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, em que o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, em que o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, em que a urticária permanece não controlada apesar de tratamento com anti- histamínico H1. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo é não controlada apesar de tratamento com anti-histamínico H1. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não é controlada adequadamente apesar de tratamento com anti-histamínico H1. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, os sintomas de urticária no indivíduo permanecem apesar de tratamento com anti-histamínico H1. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti-histamínico H1.

[0010] Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, em que o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti- IgE ou apresentou recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti- IgE.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, em que o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou apresentou recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti-IgE.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, em que o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou a urticária é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou a urticária no indivíduo é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE.

Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a

Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não é controlada adequadamente apesar de tratamento com um anticorpo anti-IgE. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, sintomas de urticária no indivíduo permanecem apesar de tratamento com um anticorpo anti-IgE. Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com um anticorpo anti-IgE.

[0011] Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para diminuir a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 (Urticaria Activity Score) em um indivíduo tendo urticária crônica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que administração da composição resulta em uma diminuição na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 por 10 ou maior, por exemplo, em comparação com uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 da linha basal no indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, antes da administração da composição, o indivíduo permanece sintomático ou tem urticária que é controlada inadequadamente apesar de tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única ou quatro vezes a dosagem). Em algumas modalidades, antes da administração da composição, o indivíduo permanece sintomático ou tem urticária que é controlada inadequadamente apesar do tratamento com anticorpo anti-IgE.

[0012] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo apresentou recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou a urticária é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, antes da administração da composição, o indivíduo é naive para anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo não foi tratado com um anticorpo anti-IgE antes da administração de composição ou o anticorpo que se liga a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o indivíduo não foi tratado com um anticorpo anti-IgE por pelo menos 2 meses antes da administração de composição ou o anticorpo que se liga a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o indivíduo não foi tratado com um anticorpo anti-IgE por pelo menos 3 meses antes da administração de composição ou o anticorpo que se liga a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE é omalizumab. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE é ligelizumab.

[0013] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1. Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti-histamínico H1. Em algumas modalidades, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não está controlada apesar de tratamento com anti-histamínico H1. Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti- histamínico H1 em dosagem única ou do rótulo. Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti-histamínico H1 em dosagem única ou do rótulo. Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti- histamínico H1 em quatro vezes a dosagem. Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti- histamínico H1 em até quatro vezes a dosagem do rótulo. Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti-histamínico H1 em até quatro vezes a dosagem do rótulo. Em algumas modalidades, um indivíduo com urticária não controlada reporta uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT, Urticaria Control Test) de menos de 12, por exemplo, apesar de tratamento com anti- histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única ou quádrupla).

[0014] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 e é resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 em dosagem única do rótulo ou até quatro vezes a dosagem do rótulo e é resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti-histamínico H1 e tratamento com um anticorpo anti- IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE e tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única ou quádrupla) ou a urticária é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE e tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única ou quádrupla).

[0015] Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com uma urticária crônica. Em algumas modalidades, a urticária crônica é uma urticária crônica indutível.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é uma urticária espontânea crônica.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica colinérgica, dermatográfica ou factícia, urticária induzida pelo frio, vibratória, autoimune ou idiopática.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é dermografismo sintomático, crônica colinérgica, dermatográfica, induzida pelo calor, aquagênica, induzida pelo sol, induzida por pressão ou por contato, urticária induzida pelo frio, vibratória, autoimune ou idiopática.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é uma urticária crônica indutível de múltiplos tipos.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica colinérgica.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica dermatográfica ou dermografismo sintomático.

Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica autoimune, e em que o indivíduo demonstrou um resultado positivo em um ou mais dos seguintes testes antes da administração da composição: teste de liberação de histamina de basófilos (BHRA, basophil histamine release assay), expressão de marcadores de ativação de basófilos, teste cutâneo de soro autólogo (ASST, autologous serum skin test), e imunoensaio para autoanticorpos IgG contra IgE e/ou FceRI.

Em algumas modalidades, o indivíduo demonstrou uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 12 antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, um ou mais sintomas no indivíduo com urticária crônica são reduzidos em comparação com um nível basal antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, a atividade da doença autoavaliada é reduzida em comparação com um nível basal antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, a atividade da doença autoavaliada é avaliada por uma ou mais das seguintes métricas: UCT, UAS7 e CholUAS7. Em algumas modalidades, a pontuação da qualidade de vida autoavaliada é aprimorada em comparação com um nível basal antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, a pontuação da qualidade de vida autoavaliada é avaliada por uma ou mais das seguintes métricas: DLQI, CU-Q2oL, AE-QoL, SD-QoL e CholU-QoL.

Em algumas modalidades, um ou mais dos seguintes são reduzidos em comparação com um nível basal antes da administração da composição: ocorrência de angioedema, número de vergões, e gravidade do prurido.

Em algumas modalidades, número de eosinófilos, IgE total, expressão de triptase, expressão de proteína catiônica eosinofílica, e/ou número de basófilos em uma amostra de soro do indivíduo é reduzido em comparação com um nível basal em uma amostra de soro obtida do indivíduo antes da administração da composição.

Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma resposta sustentada ao tratamento.

Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma diminuição na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de mais de 10. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou acima em 10 semanas depois do tratamento.

Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou acima, 13 ou acima, ou 14 ou acima na semana 22 do tratamento.

Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em um aumento médio na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de cerca de 11, ou um aumento médio na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de cerca de 400%. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma resposta completa ao tratamento.

Em algumas modalidades, uma resposta completa ao tratamento refere-se a uma melhora de 3 ou mais na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) e uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de mais de 12. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma resposta parcial ao tratamento.

Em algumas modalidades, uma resposta parcial ao tratamento refere-se a uma melhora de 3 ou mais na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT). Em algumas modalidades, a composição é administrada por infusão intravenosa.

Em algumas modalidades, a composição é administrada por infusão intravenosa uma vez ao mês por 3 ou mais meses.

Em algumas modalidades, a composição é administrada por injeção subcutânea.

Em algumas modalidades, a composição é administrada por infusão intravenosa em uma ou mais doses compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.

Em algumas modalidades, duas ou mais doses compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo são administradas ao indivíduo em um intervalo de cerca de 28 dias, cerca de 4 semanas, ou mensalmente.

Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma primeira dose compreendendo cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, e uma sexta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.

Em algumas modalidades, a primeira dose é administrada no Dia 1, em que a segunda dose é administrada no Dia 29, em que a terceira dose é administrada no Dia 57, em que a quarta dose é administrada no Dia 85, em que a quinta dose é administrada no Dia 113, e em que a sexta dose é administrada no Dia

141. Em algumas modalidades, o tratamento com o anticorpo, que se liga a Siglec-8 humana, leva a uma maior redução em um ou mais sintomas de urticária (por exemplo, conforme medido pela pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 e/ou do Teste de Controle da Urticária (UCT)), em comparação com tratamento com um anticorpo anti-IgE (por exemplo, omalizumab ou ligelizumab). Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 16 ou mais antes do tratamento com um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana, e tratamento com um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana leva a uma maior redução na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7, em comparação com tratamento com um anticorpo anti-IgE (por exemplo, omalizumab ou ligelizumab). Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 4 ou abaixo na semana 22 do tratamento. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta em uma redução média na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de cerca de 14, ou uma redução média na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de cerca de 75%.

[0016] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de 50% das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição contêm um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, substancialmente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição contém um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende

(i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 67 a 70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 71. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 16 ou 21. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 11 a 14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 23 a 24. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre

SEQ ID Nºs: 2 a 14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 24. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 2 a 10; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 22. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: (a) região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 26 a 29; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 31 a 36; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 38 a 43; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 45 a 46, e/ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 48 a 49; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 51 a 53; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 55 a 58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60. Em algumas modalidades,

o anticorpo compreende: (a) região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 34; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 38; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 55; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: (a) região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 34; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 38; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID Nºs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 88, (ii) HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 97, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 103; uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 89, (ii) HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 98, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 104; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 90, (ii)

HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 105. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 106; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 109; uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 110; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 111. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano. Em algumas modalidades, o primata não humano é um babuíno. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

112. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 3 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo 4F11. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 2 ou no Domínio 3 de Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 113. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo 1C3. Em algumas modalidades, o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo 1H10. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana e compete com o anticorpo 4F11 por ligação a Siglec-8. Em algumas modalidades, o anticorpo não compete com o anticorpo 2E2 por ligação a Siglec-8. Em algumas modalidades, o anticorpo não é o anticorpo 2E2. Em algumas modalidades, o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de IgG humana.

Em algumas modalidades, a região Fc de IgG humana compreende uma região Fc de IgG1 humana.

Em algumas modalidades, a região Fc de IgG1 humana é não fucosilada.

Em algumas modalidades, a região Fc de IgG humana compreende uma região Fc de IgG4 humana.

Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice da União Europeia como em Kabat.

Em algumas modalidades, o anticorpo esgota os eosinófilos do sangue e/ou inibe a ativação de mastócitos.

Em algumas modalidades, o anticorpo foi manipulado para aprimorar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que melhora a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos.

Em algumas modalidades, o anticorpo tem fucosilação reduzida em comparação com uma IgG1 selvagem. Em algumas modalidades, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 76 ou 77. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 que é usado nos métodos descritos aqui, neste pedido de patente, tem uma IgG1 humana e tem fucosilação reduzida em comparação com uma IgG1 humana selvagem. Em algumas modalidades, uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo são não fucosiladas. Em algumas modalidades, o anticorpo é produzido em uma linhagem celular de mamífero tendo um nocaute de alfa 1,6- fucosiltransferase (Fut8). Em algumas modalidades, o anticorpo é produzido em uma linhagem celular superexpressando beta 1,4-N- acetilglicosminiltransferase III (GnT-III). Em algumas modalidades, a linhagem celular adicionalmente superexpressa Golgi μ-manosidase II (ManII). Em algumas modalidades, a linhagem celular é uma linhagem de células CHO. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[0017] Em algumas modalidades, a composição ou anticorpo é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção de urticária crônica. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção de urticária crônica são selecionados entre o grupo que consiste em antagonistas de receptores H-2, anti-histamínicos H1, anti-histamínicos H2, anticorpos anti-IgE, corticosteroides, doxepina, antagonistas de receptores do leucotrieno (LTRAs), ciclosporina, e tacrolímo.

[0018] Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma resposta completa no indivíduo depois da interrupção do tratamento. Em algumas modalidades, um ou mais sintomas no indivíduo com urticária crônica são reduzidos depois da administração da composição em comparação com um nível basal antes da administração da composição. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma resposta completa no indivíduo depois de uma única administração da composição. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em pelo menos uma melhora de 3 pontos na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) no indivíduo, em comparação com pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) no indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma redução na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de pelo menos 50% no indivíduo, em comparação com a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 no indivíduo antes do tratamento.

[0019] Em algumas modalidades, a composição compreende o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0020] Outros aspectos da presente invenção referem-se a artigos de manufatura ou kits compreendendo um medicamento compreendendo uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana e uma bula compreendendo instruções para administração do medicamento em um indivíduo que necessite do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades acima. Outros aspectos da presente invenção referem-se a artigos de manufatura ou kits compreendendo um medicamento compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana e uma bula compreendendo instruções para administração do medicamento em um indivíduo que necessite do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades acima.

[0021] Outros aspectos da presente invenção referem-se a uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana para utilização em um método de tratamento de urticária crônica em um indivíduo de acordo com qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 16 ou 21. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 76 ou 77. Em algumas modalidades, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[0022] Deve ser entendido que uma, algumas, ou todas as propriedades das várias modalidades descritas aqui, neste pedido de patente, podem ser combinadas para formar oitras modalidades da presente invenção. Estes e outros aspectos da presente invenção se tornarão evidentes para um perito na arte. Estas e outras modalidades da presente invenção são adicionalmente descritas pela descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] A Figura 1A ilustra as ferramentas de medição UCT e UAS7 para avaliar os sintomas de urticária. Adaptado das diretrizes sobre Urticária da Academia Europeia de Alergia e Imunologia Clínica (EAACI Urticaria) conforme publicado em Zuberbier et al. (2018) Allergy 73:1393-

1414.

[0024] A Figura 1B mostra o efeito do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 sobre a pontuação média no Teste de Controle da Urticária

(UCT) em pacientes naïve para anti-IgE com urticária crônica.

[0025] A Figura 2A mostra o efeito do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 sobre a pontuação média do Escore de Atividade da Urticária UAS7 em pacientes naïve para anti-IgE com urticária crônica.

[0026] A Figura 2B mostra a proporção de pacientes naïve para anti- IgE reportando UAS7 ≤ 6, ou UAS7 = 0, na semana 22.

[0027] A Figura 2C mostra a proporção de pacientes naïve para anti- IgE reportando Escore de Gravidade da Urticária semanal (HSS, Hive Severity Score) de 0, ou Escore de Gravidade do Prurido semanal (ISS, Itch Severity Score) de 0, na semana 22.

[0028] A Figura 3 mostra o efeito do tratamento com o anticorpo anti- Siglec-8 sobre a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 (alteração a partir da linha basal) em pacientes com urticária crônica refratária a anti-IgE (XOLAIR®, também conhecido como omalizumab).

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Definições

[0029] Deve ser entendido que a presente invenção não é limitada a composições ou sistemas biológicos particulares, os quais, logicamente, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui, neste pedido de patente, é para o fim de descreve modalidades particulares somente, e não se destina a ser limitante. Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexadas, as formas do singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes no plural, a menos que o conteúdo claramente dite de modo diverso. Deste modo, por exemplo, referência a "uma molécula" opcionalmente inclui uma combinação de duas ou mais tais moléculas, e semelhantes.

[0030] O termo "cerca de" conforme usado aqui, neste pedido de patente, refere-se à faixa de erro usual para o valor respectivo prontamente conhecido do perito neste campo técnico. Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui, neste pedido de patente, inclui (e descreve) modalidades que se referem a este valor ou parâmetro per se.

[0031] Deve ser entendido que aspectos e modalidades da presente invenção incluem "compreendendo," "consistindo," e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades.

[0032] O termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos de comprimento total os quais têm uma região Fc de imunoglobulina), composições de anticorposs com especificidade poliepitópica, anticorpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diabodies, e moléculas de cadeia única), bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv). O termo "imunoglobulina" (Ig) é usado de modo intercambiável com "anticorpo" aqui, neste pedido de patente.

[0033] A unidade básica de anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idènticas e duas cadeias pesadas (H) idènticas. Um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas de heterotetrâmero junto com um polipeptídeo adicional denominado uma cadeia J, e contém 10 sítios de ligação ao antígeno, enquanto anticorpos IgA compreendem de 2 a 5 das unidades básicas de 4 cadeias, as quais podem polimerizar para formar montagens polivalentes em combinação com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeis tem geralmente cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações de dissulfeto dependendo do isótipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes de dissulfeto intracadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia H chain tem no N-terminal, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias  e  e quatro CH domínios para os isótipos  e . Cada cadeia L tem no N-terminal, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante em sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácido particulares formem uma interface entre a cadeia leve e domínios variáveis de cadeia pesada. O pareamento de um VH e VL juntos forma um único sítio de ligação ao antígeno. For the structure e properties of the different classes de anticorpos, see e.g., Basic e Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr e Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 e Chapter 6.

[0034] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isótipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas , , ,  e , respectivamente. As classes  e  são adicionalmente dividida em subclasses com base em diferenças relativamente menores na sequência e função do CH, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os anticorpos IgG1 podem existir em múltiplas variantes polimórficas denominadas alótipos (revisado em Jefferis and Lefranc

2009. mAbs Vol 1 Issue 4 1-7), qualquer um dos quais é adequado para utilização na presente invenção. Variantes alotípicas comuns nas populações humanas são as designadas pelas letras a, f, n, z.

[0035] Um anticorpo "isolado" é um anticorpo que foi identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente de ambiente de produção (por exemplo, de forma natural ou recombinante). Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado é livre de associação com todos os outros componentes de seu ambiente de produção. Componentes contaminantes de seu ambiente de produção, tais como os resultantes de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente iriam interferir com os usos de pesquisa, diagnóstico ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é purificado: (1) até mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado, por exemplo, pelo método de Lowry, e em algumas modalidades, até mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácidos interna por uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras usando azul Coomassie ou corante prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não venha a estar presente. No entanto, ordinariamente, um polipeptídeo ou anticorpo isolado é preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0036] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui, neste pedido de patente, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos do indivíduo compreendendo a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorram naturalmente e/ou modificações pós-translacionais (por exemplo, isomerizações,

amidações) que possam estar presentes em quantidades menores. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem do terminal carbóxi na cadeia pesada e/ou na cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no terminal carbóxi de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas modalidades, a clivagem do terminal carbóxi remove uma lisina do terminal carbóxi da cadeia pesada. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem do terminal amino na cadeia pesada e/ou na cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no terminal amino de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra múltiplos sítios antigênicos (tais como um anticorpo biespecífico ou um anticorpo multi-específico). O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, tecnologias de display de fago, e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que tenham partes ou todos os loci de imunoglobulinas humanas ou genes codificando sequências de imunoglobulinas humanas.

[0037] O termo "anticorpo naked" refere-se a um anticorpo que não é conjugado a uma porção citotóxica ou radiomarcador.

[0038] Os termos "anticorpo de comprimento total," "anticorpo intacto" ou "anticorpo inteiro" são usados de modo intercambiável para se referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo. Especificamente, anticorpos inteiros incluem anticorpos com cadeias pesadas e leves incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequências nativas (por exemplo, domínios constantes de sequências nativas humanas) ou variantes de sequências de aminoácidos das mesmas. Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

[0039] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, a região de ligação ao antígeno e/ou a região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diabodies; anticorpos lineares (vide a Pat. U.S. Nº. 5.641.870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multi-específicos formados de fragmentos de anticorpos.

[0040] A digestão de anticorpos por papaína produziu dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflete a capacidade para cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com o domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente com respeito à ligação ao antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação ao antígeno. O tratamento de um anticorpo com pepsina produz um único fragmento F(ab')2 grande, o qual a grosso modo corresponde a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto, tendo atividade de ligação ao antígeno diferente e ainda é capaz de ligação cruzada com o antígeno. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por terem uns poucos resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui, neste pedido de patente, para Fab', no qual o um ou mais resíduos de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo de tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab') 2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab', os quais têm cisteínas de articulação entre os mesmos. Também são conhecidas outras ligações químicas de fragmentos de anticorpos.

[0041] O fragmento Fc compreende as porções de terminal carbóxi de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, a região que também é reconhecida por receptores Fc (FcR) encontrados sobre certos tipos de células.

[0042] "Fv" é o mínimo fragmento de anticorpo, o qual contém um sítio completo de reconhecimento de antígeno e de ligação ao antígeno. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação firme e não covalente. Da dobradura destes dois domínios emanam seis loops hipervariáveis (3 loops cada da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação ao antígeno e conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variávle (ou metade de um Fv compreendendo somente três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade para reconhecer e ligar antígeno, embora em uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.

[0043] "Fv de cadeia única" também abreviado como "sFv" ou "scFv" são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL conectados dentro de uma única cadeia polipeptídica.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo sFv compreende adicionalmente um encadeador polipeptídico entre os domínios VH e VL, o qual permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão do sFv, vide Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Anticorpos, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0044] "Fragmentos funcionais" dos anticorpos da presente invenção compreendem uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo a região variável ou de ligação ao antígeno do anticorpo intacto ou a região Fv de um anticorpo, o qual retém ou modificou a capacidade de ligação ao FcR. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem anticorpo linear, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multi- específicos formados de fragmentos de anticorpos.

[0045] Os anticorpos monoclonais aqui, neste pedido de patente, incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos em particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico com ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de semelhantes anticorpos, contanto que apresentem a atividade biológica desejada (Pat. U.S. Nº.

4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui, neste pedido de patente, incluem anticorpos PRIMATIZED® em que a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, por imunização de macacos macaque com um antígeno de interesse. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "anticorpo humanizado" é usado como um subgrupo de "anticorpos quiméricos."

[0046] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) na qual resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e/ou capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações podem ser feitas para refinar mais a performance dos anticorpos, tais como afinidade de ligação. Em geral, um anticorpo humanizado vai compreender substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os loops hipervariáveis correspondem aos loops de uma sequência de imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as regiões de uma sequência de imunoglobulina humana, embora as regiões FR podem incluir uma ou mais substituições de resíduos de FR individuais que melhorem a performance do anticorpo, tal como afinidade de ligação, isomerização, imunogenicidade, etc. Em algumas modalidades, o número destas substituições de aminoácidos na FR é de não mais de 6 na cadeia H, e na cadeia L, não mais de 3. O anticorpo humanizado opcionalmente também vai compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc),

tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593- 596 (1992). Vide também, por exemplo, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); e Pat. U.S. Nºs. 6.982.321 e 7.087.409. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são direcionados contra um único sítio antigênico. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são direcionados contra múltiplos sítios antigênicos. Um método de humanização alternativo é descrito na Pat. U.S. Nº. 7.981.843 e na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº. 2006/0134098.

[0047] A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se aos domínios de terminal amino da cadeia pesada ou leve do anticorpo. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser referidos como "VH" e "VL", respectivamente. Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação ao antígeno.

[0048] O termo "região hipervariável," "HVR," ou "HV," quando usados aqui, neste pedido de patente, refere-se às regiões de um anticorpo-domínio variável que são hipervariáveis em sequência e/ou formam loops estruturalmente definidos. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3), e três no VL (L1, L2, L3). Nos anticorpos nativos, H3 e L3 apresentam a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3 em particular desempenhe um papel único, conferindo fina especificidade aos anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in

Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). Na verdade, anticorpos camelídeos que ocorrem naturalmente, consistindo em uma cadeia pesada, somente são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) e Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0049] Uma quantidade de delineações de HVRs estão em uso e são englobadas aqui, neste pedido de patente. As HVRs que são regiões determinantes de complementaridade (CDRs) segundo Kabat se baseiam na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). As HVRs de Chothia referem-se ao invés à localização dos loops estruturais (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs de "contato" são baseadas na análise das estruturas cristalinas complexas. Os resíduos de cada uma destas HVRs são anotados abaixo. Loop Kabat Chothia Contato L1 L24-L34 L26-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeração Kabat) H1 H31-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração Chothia) H2 H50-H65 H53-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H93-H101

[0050] A menos que indicado de modo diverso, os resíduos de domínio variável (resíduos de HVR e resíduos de região de estrutura) são numerados de acordo com Kabat et al., supra.

[0051] Resíduos de "estrutura" ou "FR" são os resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de HVR conforme definido aqui, neste pedido de patente.

[0052] A expressão "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Kabat", e variações das mesmas, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois do resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) depois do resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat "padrão".

[0053] Uma "estrutura aceitadora humana" para os fins aqui, neste pedido de patente, é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de VL ou VH derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura aceitadora humana "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos das mesmas, ou pode conter alterações de sequência de aminoácidos pré-existentes. Em algumas modalidades, o número de alterações de aminoácidos pré- existentes são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos.

[0054] "Percentagem (%) de identidade de sequências de aminoácidos" com respeito a uma sequência polipeptídca de referência é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos com os resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídca de referência, depois de alinhamento das sequências e introdução de intervalos, caso necessário, de modo a obter a máxima percentagem de identidade de sequências, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequências.

Alinhamento, para fins de determinar a percentagem de identidade de sequências de aminoácidos, pode ser obtido de vários modos, que estão dentro do conhecimento na arte, por exemplo, usando software de computação disponível publicamente tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na arte podem determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter máximo alinhamento sobre o comprimento total das sequências que estejam sendo comparadas.

Por exemplo, a % de identidade de sequências de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (o que pode ser expresso alternativamente como uma sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequências de aminoácidos para, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue: 100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácidos classificados como correspondências idênticas pela sequência naquele alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B.

Será reconhecido que, onde o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequências de aminoácidos de A para B não será igual à % de identidade de sequências de aminoácidos de B para A.

[0055] Um anticorpo que "se liga a", "se liga especificamente a" ou é "específico para" um polipeptídeo em particular ou um epitopo sobre um polipeptídeo em particular é um anticorpo que se liga àquele polipeptídeo em particular ou epitopo sobre um polipeptídeo em particular sem ligação substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epitopo do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a ligação de um anticorpo anti- Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) a um polipeptídeo não Siglec-8 não relacionado é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo à Siglec-8 conforme medido por métodos conhecidos na arte (por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)). Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a uma Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,7 nM, ≤0,6 nM, ≤ 0,5 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

[0056] O termo "anticorpo anti-Siglec-8" ou "um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana" refere-se a um anticorpo que se liga a um polipeptídeo ou um epitopo de Siglec-8 humana sem ligação substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epitopo de um polipeptídeo não Siglec-8 não relacionado.

[0057] O termo "Siglec-8" conforme usado aqui, neste pedido de patente, refere-se a uma proteína Siglec-8 humana. O termo também inclui variantes de Siglec-8 que ocorrem naturalmente, incluindo variantes de emenda ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma Siglec-8 humana de exemplo é mostrada na SEQ ID Nº: 72. A sequência de aminoácidos de outra Siglec-8 humana de exemplo é mostrada na SEQ ID Nº: 73. Em algumas modalidades, uma proteína Siglec-8 humana compreende o domínio extracelular da Siglec-8 humana fundido a uma região Fc de imunoglobulina. A sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de Siglec-8 humana de exemplo fundido a uma região Fc de imunoglobulina é mostrada na SEQ ID Nº: 74. A sequência de aminoácidos sublinhada na SEQ ID Nº: 74 indica a região Fc da sequência de aminoácidos da proteína de fusão Siglec-8 Fc. Sequência de Aminoácidos de Siglec-8 humana

GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDR PYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKG SYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHS RNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDH GTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALG NGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLEL PRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAA VGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSA

SQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQ GQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG (SEQ ID Nº: 72) Sequência de Aminoácidos de Siglec-8 humana

GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDR PYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKG SYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHP RNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDH GTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALG NGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLEL PRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAA VGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSA

SQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQ GQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG (SEQ ID Nº: 73) Sequência de Aminoácidos de Proteína de fusão Siglec-8 Fc

GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDR PYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKG SYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHS RNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDH GTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALG NGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLEL PRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAA VGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT

KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Nº: 74)

[0058] Anticorpos que "induzem apoptose" ou são "apoptóticos" são anticorpos que induzem morte celular programada, conforme determinado por testes de apoptose de rotina, tais como ligação de anexina V, fragmentação de DNA, encolhimento celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). Por exemplo, a atividade apoptótica dos anticorpos anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) da presente invenção pode ser mostrada por coloração de células com anexina V.

[0059] "Funções efetoras" de anticorpos referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo, e variam com o isótipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente do complementp; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, receptores de células B); e ativação de células B.

[0060] "Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada sobre receptores de Fc (FcRs) presentes sobre certas células citotóxicas (por exemplo, células natural killer (NK), neutrófilos e macrófagos) possibilitam que estas células citotóxicas efetoras se liguem especificamente a uma célula alvo carregando antígeno e em seguida matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são necessários para matar a célula alvo por este mecanismo. As células primárias para mediar a ADCC, células NK, expressam FcRIII somente, ao passo que os monócitos expressam FcRI, FcRII e FcRIII. A expressão de Fc sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 à página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) descrito aqui, neste pedido de patente, reforça a ADCC. De modo a avaliar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos de uma molécula de interesse, pode ser realizado um teste de ADCC in vitro, tal como o descrito na Pat. U.S. Nº. 5.500.362 ou

5.821.337. Células efetoras úteis para os testes referidos incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como o revelado em Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998). Outras variantes de Fc que alteram a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos e outras propriedades dos anticorpos incluem as reveladas por Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997; Duncan et al, Nature 332:563-564, 1988; Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991; Lund et al, Mol Immunol 29:53-59, 1992; Alegre et al, Transplantation 57:1537-1543, 1994; Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995; Jefferis et al, Immunol Lett. 44:111-117, 1995; Lund et al., FASEB J9:115-119, 1995; Jefferis et al, Immunol Lett 54:101-104, 1996; Lund et al, J Immunol 157:4963-4969, 1996; Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999; Idusogie et al, J Immunol 164:4178-4184, 200; Reddy et al, J Immunol 164:1925-1933, 2000; Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000; Idusogie et al, J Immunol 166:2571- 2575, 2001; Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001; Jefferis et al, Immunol Lett 82:57-65. 2002; Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005- 4010, 2006; Pat. U.S. Nºs. 5.624.821; 5.885.573; 5.677.425; 6.165.745;

6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821; 5.648.260; 6.194.551;

6.737.056; 6.821.505; 6.277.375; 7.335.742; e 7.317.091.

[0061] O termo "região Fc" aqui, neste pedido de patente, é usada para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc da sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana geralmente é definida para estirar a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou a partir de Pro230, até o terminal carboxila da mesma. Regiões Fc de sequência nativa adequadas para utilização nos anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Pode ser introduzida uma única substituição de aminoácido (S228P de acordo com a numeração Kabat; designada IgG4Pro) para abolir a heterogeneidade observada no anticorpo IgG4 recombinante. Vide Angal, S. et al. (1993) Mol Immunol 30, 105–108.

[0062] Anticorpo "não fucosilado" ou "deficiente de fucose" refere-se a uma variante de anticorpo de glicosilação compreendendo uma região Fc em que uma estrutura de carboidrato anexada à região Fc reduziu fucose ou carece de fucose. Em algumas modalidades, um anticorpo com fucose reduzida ou carecendo de fucose tem função de ADCC aprimorada. Anticorpos não fucosilados ou deficientes de fucose têm fucose reduzida em relação à quantidade de fucose sobre o mesmo anticorpo produzido em uma linhagem celular. Em algumas modalidades, uma composição de anticorpos não fucosilados ou deficientes de fucose contemplada aqui, neste pedido de patente, é uma composição em que menos de cerca de 50% dos glicanos ligados por N anexados à região Fc dos anticorpos na composição compreendem fucose.

[0063] Os termos "fucosilação" ou "fucosilado" refere-se à presença de resíduos de fucose dentro dos oligossacarídeos anexados à estrutura peptídica de um anticorpo. Especificamente, um anticorpo fucosilado compreende fucose ligada por α (l,6) no resíduo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) mais interno em um ou ambos dos oligossacarídeos ligados por N anexados a região Fc do anticorpo, por exemplo, na posição Asn 297 do domínio Fc de IgG1 humana (numeração da União Europeia de resíduos de região Fc). Asn297 também pode estar localizado cerca de

+ 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência nas imunoglobulinas.

[0064] O "grau de fucosilação" é a percentagem de oligossacarídeos fucosilados em relação a todos os oligossacarídeos identificados por métodos conhecidos na arte, por exemplo, em uma composição de anticorpos tratados com N-glicosidase F avaliada por espectrometria de massa utilizando dessorção-ionização a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-vôo (MALDI-TOF MS). Em uma composição de um "anticorpo totalmente fucosilado", essencialmente todos os oligossacarídeos compreendem resíduos de fucose, isto é, são fucosilados. Em algumas modalidades, uma composição de um anticorpo totalmente fucosilado tem um grau de fucosilação de pelo menos cerca de 90%. Por conseguinte, um indivíduo anticorpo em uma composição semelhante tipicamente compreende resíduos de fucose em cada um dos dois oligossacarídeos ligados por N na região Fc. Ao invés, em uma composição de um anticorpo "totalmente não fucosilado" essencialmente nenhum dos oligossacarídeos são fucosilados, e um indivíduo anticorpo em uma uma composição semelhante não contém resíduos de fucose em qualquer um dos dois oligossacarídeos ligados por N na região Fc. Em algumas modalidades, uma composição de um anticorpo totalmente não fucosilado tem um grau de fucosilação de menos de cerca de 10%. Em uma composição de um "anticorpo parcialmente fucosilado" somente parte dos oligossacarídeos compreendem fucose. Um anticorpo individual em uma composição semelhante pode compreender resíduos de fucose em nenhum, em um ou em ambos os oligossacarídeos ligados por N na região Fc, contanto que a composição não compreenda essencialmente todos os anticorpos individuais que carecem de resíduos de fucose nos oligossacarídeos ligados por N na região Fc, nem essencialmente todos os anticorpos individuais que contêm resíduos de fucose em ambos os oligossacarídeos ligados por N na região Fc. Em uma modalidade, uma composição de um anticorpo parcialmente fucosilado tem um grau de fucosilação de cerca de 10% a cerca de 80% (por exemplo, cerca de 50% a cerca de 80%, cerca de 60% a cerca de 80%, ou cerca de 70% a cerca de 80%).

[0065] "Afinidade de ligação" conforme usado aqui, neste pedido de patente, refere-se à força das interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Em algumas modalidades, a afinidade de ligação de um anticorpo para uma Siglec-8 (que pode ser um dímero, tal como a proteína de fusão Siglec-8-Fc descrita aqui, neste pedido de patente) pode ser representada de modo geral por uma constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na arte, incluindo os descritos aqui, neste pedido de patente.

[0066] "Avidez de ligação" conforme usado aqui, neste pedido de patente, refere-se à força de ligação de múltiplos sítios de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno).

[0067] Uma molécula de ácido nucleico "isolado" codificando os anticorpos aqui, neste pedido de patente, é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual é ordinariamente associada no ambiednte no qual foi produzida. Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é livre de associação com todos os componentes associados com o ambiente de produção. As moléculas de ácidos nucleicos isolados codificando os polipeptídeos e anticorpos aqui, neste pedido de patente, está em uma forma diferente do que na forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácidos nucleicos isolados, portanto, são diferenciadas de ácido nucleico codificando os polipeptídeos e anticorpos aqui, neste pedido de patente, existenets naturalmente em células.

[0068] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em uma forma tal de modo a permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém componentes adicionais, os quais sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação deve ser administrada. As formulações referidas são estéreis.

[0069] "Veículos" conforme usado aqui, neste pedido de patente, incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizantes que são não tóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto a este nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; alcoóis de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra- íons formadores de sais, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS™.

[0070] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "tratamento" ou "tratar" refere-se a intervenção clínica designada para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratado durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado de doença, e remissão ou melhora do prognóstico. Um indivíduo é "tratado" com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados com uma doença (por exemplo, urticária crônica) são mitigados ou eliminados. Por exemplo, um indivíduo é "tratado" com sucesso se o tratamento resultar em aumento da qualidade de vida dos indivíduos sofrendo de um a doença, diminuição da dose de outras medicações requeridas para o tratamento da doença, redução da frequência de recorrência da doença, diminuição da gravidade da doença, atraso do desenvolvimento ou progressão da doença, e/ou prolongamento da sobrevida dos indivíduos.

[0071] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "em conjunto com" ou "em combinação com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento além de outra modalidade de tratamento. Deste modo, "em conjunto com" ou "em combinação com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou depois da administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[0072] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "prevenção" ou "prevenir" inclui proporcionar profilaxia com respeito à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo. Um indivíduo pode ser predisposto para uma doença, suscetível para uma doença, ou em risco de desenvolver uma doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) descritos aqui,

neste pedido de patente, são usadis oara retardar o desenvolvimento de uma doença (por exemplo, urticária crônica).

[0073] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, um indivíduo "em risco" de desenvolver uma doença (por exemplo, urticária crônica) pode ter ou não doença detectável ou sintomas de doença detectáveis, e pode ter ou não apresentado doença detectável ou sintomas de doença detectáveis antes dos de tratamento métodos descritos aqui, neste pedido de patente. "Em risco" denota que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, os quais são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento da doença (por exemplo, urticária crônica), conforme é de conhecimento na arte. Um indivíduo tendo um ou mais destes fatores de risco tem uma maior probabilidade de desenvolver a doença do que um indivíduo sem um ou mais destes fatores de risco.

[0074] Uma "quantidade eficaz" refere-se a pelo menos uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o efeito desejado ou indicado, incluindo um resultado terapêutico ou profilático. Uma quantidade eficaz pode ser proporcionada em uma ou mais administrações. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é pelo menos a concentração mínima necessária para efetura uma melhora mensurável de uma doença em particular. Uma quantidade terapeuticamente eficaz aqui, neste pedido de patente, pode variar de acordo com fatores, tais como o estado de doença, a idade, o sexo e o peso do paciente, e a capacidade do anticorpo para provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também pode ser uma quantidade na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários,

para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desde que uma dose profilática seja usada em indivíduos antes ou no estágio inicial de doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[0075] Administração "crônica" refere-se à administração do(s) medicamento(s) em um modo contínuo em oposição ao modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é tratamento que é feito de maneira não consecutiva sem interrupção, mas ao invés é de natureza cíclica.

[0076] O termo "bula" é usado para referir a instruções habitualmente incluídas em pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, o uso, a dosagem, a administração, a terapia de combinação, as contraindicações e/ou os avisos referentes ao uso de semelhantes produtos terapêuticos.

[0077] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, um "indivíduo" ou um "sujeito" é um mamífero. Um "mamífero" para fins do tratamento inclui seres humanos, animais domésticos e de criação, e animais de zoológico, de competição, ou de estimação, tais como cães, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbils, camundongos, furões, ratos, gatos, etc. Em algumas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um ser humano. II. Métodos

[0078] São proporcionados aqui, neste pedido de patente, métodos para tratamento e/ou prevenção de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, que se liga a Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) ou composições compreendendo os referidos anticorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo está em uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[0079] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente a tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única do rótulo, ou até quatro vezes a dosagem do rótulo). Em algumas modalidades, o indivíduo é refratário a tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única do rótulo, ou até quatro vezes a dosagem do rótulo). Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única do rótulo, ou até quatro vezes a dosagem do rótulo) e resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE (ou apresentou recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti-IgE). Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única do rótulo, ou até quatro vezes a dosagem do rótulo). Em algumas modalidades, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não está controlada apesar de tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única do rótulo, ou até quatro vezes a dosagem do rótulo). Em algumas modalidades, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não é controlada adequadamente apesar de tratamento com anti-histamínico H1 (por exemplo, em dosagem única do rótulo, ou até quatro vezes a dosagem do rótulo). Anti- histamínicos H1 referem-se a compostos que bloqueiam ou inibem a ação da histamina no receptor de histamina H1 e foram descritos como antagonistas ou agonistas inversos do receptor de histamina H1. Em algumas modalidades, o anti-histamínico H1 é um anti-histamínico H1 de primeira geração. Em algumas modalidades, o anti-histamínico H1 é um anti-histamínico H1 de segunda geração. Anti-histamínicos H1 exemplares e exemplos não limitantes de anti-histamínicos H1 incluem acrivastina, alimemazina, astemizol, azelastina, Benadryl®, bilastina, bromodifenidramina, bronfeniramina, buclizina, carbinoxamina, cetirizina (Zyrtec®), clorodifenidramina, clorfenamina, clemastina, ciclizina, ciproheptadina, desloratidina, dexbronfeniramina, dexclorfeniramina, dimenidrinato, dimetidina, difenidramina, doxilamina, ebastina (por exemplo, carebastina), embramina, fexofenadina, hidroxizina, levocetirizina, loratidina, meclizina, mequitazina, mirtazapina, mizolastina, olopatadina, orfenadrina, oxatomida, fenindamina, feniramina, feniltoloxamina, prometazina, pirilamina, quetiapina, rupatidina, terfenadina, tripelenamina, e triprolidina.

[0080] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente a tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo é refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 e resistente ou refratário a tratamento com um anticorpo anti-IgE (ou apresentou recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti-IgE). Em algumas modalidades, o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou tem urticária que é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, o indivíduo permanece sintomático apesar de tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, antes da administração da composição, o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não é controlada adequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE.

[0081] Em algumas modalidades, o indivíduo apresentou recidiva depois de tratamento com um anticorpo anti-IgE. Em algumas modalidades, recidiva refere-se à recorrência de urticária e/ou prurido.

[0082] Em algumas modalidades, o indivíduo não foi tratado previamente com um anticorpo anti-IgE (por exemplo, um indivíduo naïve para anticorpo anti-IgE).

[0083] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE é omalizumab. Omalizumab é um anticorpo IgG1 anti-IgE humanizado que inibe a ligação de IgE ao receptor de IgE de alta afinidade (FcεRI). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE compreende uma sequência de cadeia pesada e/ou de cadeia leve como se segue (SEQ ID Nºs: 125 e 126, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da sequência de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 125 e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia leve da sequência de cadeia leve de SEQ ID Nº: 126. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE compreende 1, 2, ou 3 CDRs da sequência de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 125 e/ou 1, 2, ou 3 CDRs da sequência de cadeia leve de SEQ ID Nº: 126. Cadeia pesada

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLE WVASITYDGSTNYADSVKGRFTISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYC ARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSSGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP

ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPG (SEQ ID Nº: 125) Cadeia leve

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAP KLLIYAASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHED PYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA

KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNR (SEQ ID Nº: 126)

[0084] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE é ligelizumab. Ligelizumab (também conhecido como QGE031) é um anticorpo IgG1 humanizado anti-IgE que se imagina que possua uma maior afinidade para IgE d oque o omalizumab (Arm, J.P. et al. (2014) Clin. Exp. Allergy 44:1371-1385). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE é um anticorpo anti-IgE descrito na Pat. U.S. Nº. 7.531.169. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE compreende uma, duas ou três CDRs da sequência de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 127 e/ou uma, duas ou três CDRs da sequência de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 128. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IgE compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 127 e/ou um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 128.

Domínio VH

QVQLVQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGYTFSWYWLEWVRQAPGHGLE

WMGEIDPGTFTTNYNEKFKARVTFTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CARFSHFSGSNYDYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 127) Domínio VL

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIGTNIHWYQQKPGQAPRLLIYY

ASESISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSWSWPTTFG GGTKVEIK (SEQ ID Nº: 128)

[0085] Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 na dosagem do rótulo (por exemplo, uma dosagem aprovada de anti-histamínico H1, indicada opcionalmente ao tratamento de urticária). Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 em dosagem única. Em algumas modalidades, o indivíduo é resistente ou refratário a tratamento com anti-histamínico H1 em quatro vezes a dosagem (por exemplo, quatro vezes a dosagem do rótulo ou aprovada de anti-histamínico H1, opcionalmente indicada ao tratamento de urticária). A. Urticária crônica

[0086] Certos aspectos da presente invenção referem-se a indivíduos com urticária crônica. As urticárias crônicas são um grupo de doenças de pele inflamatórias, que são causadas pela ativação inadequada dos mastócitos na pele, resultando no aparecimento de vergões ou pápulas sobre a pele, prurido, irritação, e em alguns casos angioedema.

[0087] As urticárias crônicas são classificadas pelo gatilho específico de ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica colinérgica. A urticária colinérgica é desencadeada por aumento da temperatura corporal e/ou suor. Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica dermatográfica, dermografismo sintomático, ou urticária factícia. Dermografismo sintomático ou urticária dermatográfica é desencadeada por abrasão física da pele e recebed esse nome porque os indivíduos afetados podem traçar letras ou números em sua pele (por exemplo, por arranhadura ou abrasão diversa com um objeto), que em seguida apaprecem como pápulas em forma de letras/números sobre a pele. Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica induzida pelo frio (desencadeada por exposição da pele ao frio). Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária crônica vibratória (desencadeada por vibração, frição, e/ou estiramento repetitivo da pele). Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária idiopática crônica ou urticária espontânea crônica. A idiopática crônica, também chamada de urticária espontânea, é desencadeada por uma causa desconhecida e/ou aparece espontaneamente.

[0088] Em algumas modalidades, a urticária crônica é urticária autoimune crônica (desencadeada por resposta autoimune). Foram propostos vários testes clínicos e laboratoriais para o diagnóstico de urticária autoimune. Vide, por exemplo, Konstantinou, G.N. et al. (2013) Allergy 68:27-36. Em algumas modalidades, um indivíduo diagnosticado com urticária autoimune crônica demonstrou um resultado positivo em um ou mais dos seguintes: teste de liberação de histamina de basófilos (BHRA), expressão de marcadores de ativação de basófilos (por exemplo, CD63 e/ou CD203c séricos), teste cutâneo de soro autólogo (ASST), e imunoensaio para autoanticorpos IgG contra IgE e/ou FceRI.

[0089] Em algumas modalidades, o indivíduo tem urticária crônica colinérgica, dermatográfica, induzida pelo frio, vibratória, autoimune, ou idiopática. Em algumas modalidades, o indivíduo foi diagnosticado com urticária crônica colinérgica, dermatográfica, dermografismo sintomático, induzida pelo frio, vibratória, autoimune, ou idiopática. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com urticária crônica colinérgica dermatográfica. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou foi diagnosticado com urticária crônica dermatográfica ou dermografismo sintomático. Em algumas modalidades, a urticária permanece não controlada, ou não controlada adequadamente, apesar de tratamento com anti-histamínico H1 em dosagem única ou quádrupla. B. Resposta ao tratamento

[0090] Em algumas modalidades, a administração a um indivíduo conforme descrito aqui, neste pedido de patente (por exemplo, um indivíduo tendo urticária crônica), de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção ou anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, que se liga a Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) reduz um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) sintomas no indivíduo, em comparação com um nível basal antes da administração do anticorpo.

[0091] A resposta ao tratamento em indivíduos com urticária crônica pode ser avaliada por vários métodos. Por exemplo, o Teste de Controle da Urticária (UCT) pode ser usado para proporcionar resultados reportados pelos pacientes, por exemplo, para o tratamento. O teste UCT é uma pontuação para controle de sintomas na urticária crônica. Vide, por exemplo, Weller, K. et al. (2014) J. Allergy Clin. Immunol. 133:1365-1372. Outras técnicas ou métricas para avaliar resposta ao tratamento adequada para utilização conforme descrito aqui, neste pedido de patente, incluem, sem limitação, o Escore de Atividade da Urticária (UAS, Urticaria Activity Score) ou UAS7 (vide www.itchingforanswers.ca/docs/UAS7-Questionnaire.pdf); o Escore de

Atividade da Urticária Colinérgica (CholUAS, Cholinergic Urticaria Activity Score) ou CholUAS7 (vide Koch, K. et al. (2016) J.

Allergy Clin.

Immunol. 138:1483-1485); número de dias sem sintomas por semana; alteração no escore de qualidade de vida conforme avaliado pelo Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI, Dermatology Life Quality Index; vide www.bad.org.uk/shared/get-file.ashx?id=1653&itemtype=document), Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida na Urticária Crônica (CU-Q2oL, Chronic Urticaria Quality of Life Questionnaire; vide Baiardini, I. et al. (2005) Allergy 60:1073-1078), Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida no Angioedema (AE-QoL, Angioedema Quality of Life Questionnaire; vide Weller, K. et al. (2016) Allergy 71:1203-1209), Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida no Dermografismo Sintomático (SD-QoL, Symptomatic Dermographism Quality of Life Questionnaire), ou Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida na Urticária Colinérgica (CholU-QoL, Cholinergic Urticaria Quality-of-Life Questionnaire; vide Ruft, J. et al. (2018) Clin.

Exp.

Allergy 48:433-444); alteração na ocorrência de angioedema (por exemplo, conforme avaliado pelo Escore de Atividade do Angioedema (AAS, Angioedema Activity Score); vide moxie-gmbh.de/media/pdf/aas_scoringtemplate_moxie.pdf); alteração no número de vergões; alteração no Escore de Gravidade da Urticária (HSS, Hive Severity Score); alteração na gravidade do prurido; alteração no Escore de Gravidade do Prurido (ISS); alteração na avaliação pelo médico; alteração no limiar de gatilho; taxas de resposta completa (CR), resposta parcial (PR), e nenhuma resposta (NR); alterações na triptase sérica, nos eosinófilos séricos, na IgE sérica total, nos basófilos totais, e/ou na proteína catiônica eosinofílica sérica; e taxas de recidiva, rebote, ou efeitos do tratamento contínuo.

O limiar de gatilho e alterações para esse podem ser avaliados, por exemplo e sem limitação, pelo Teste Ergométrico Controlado por Pulso (PCE, Pulse Controlled Ergometry Test; vide Altrichter, S. et al. (2014) J. Dermatol. Sci. 75:88-93), FricTest® (vide moxie-gmbh.de/media/pdf/frictest- instructions-for-use.pdf), ou TempTest® (vide skinobs.com/news/en/suppliers/instrumentation-en/temptest-by-ck-to- determine-cold-and-heat-contact-urticaria/). O Escore de Atividade da Urticária UAS pode ser decomposto em Escore de Gravidade da Urticária (HSS) e Escore de Gravidade do Prurido (ISS), com cada um sendo quantificado em uma escala de 0 (nenhuma) a 3 (intensa/severa). Escores HSS7 e ISS7 semanais podem ser calculados presumindo os escores HSS ou ISS respectivos médios dos 7 dias precedentes.

[0092] Em algumas modalidades, a atividade da doença autoavaliada (por exemplo, conforme avaliado por qualquer uma das métricas exemplares descritas acima) em um indivíduo é reduzida em comparação com um nível basal antes da administração da composição. Em algumas modalidades, a atividade da doença autoavaliada é avaliada por uma ou mais das seguintes métricas: UCT, UAS7, e CholUAS7.

[0093] Em algumas modalidades, um indivíduo demonstrou uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 12 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos, ou 1 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção. Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou acima (por exemplo, 12 ou acima, 13 ou acima, 14 ou acima, 15 ou acima, ou 16) depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento.

Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos, ou 1 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 10 ou acima, 11 ou acima, 12 ou acima, 13 ou acima, 14 ou acima, 15 ou acima, ou 16 depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), incluindo todas as combinações de pares dos mesmos possíveis em que a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) é maior depois do tratamento do que antes do tratamento.

Por exemplo, em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção aumenta a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de um indivíduo por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou 13 (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) do indivíduo antes do tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção aumenta a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de um indivíduo por pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90% (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) do indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção aumenta a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de um indivíduo por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, ou pelo menos 400% (por exemplo, na semana 22 do tratamento), em comparação com a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) do indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 4 ou menos ou cerca de 3 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 14 ou acima depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, na semana 22 do tratamento). Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 6 ou menos ou cerca de 5 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou acima depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, na semana 22 do tratamento). Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de cerca de 6 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 9 ou acima depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, na semana 22 do tratamento).

[0094] Em algumas modalidades, um indivíduo demonstrou uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de mais de 16 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção.

Por exemplo, em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, 20 ou mais, 21 ou mais, 22 ou mais, 23 ou mais, 24 ou mais, 25 ou mais, 26 ou mais, 27 ou mais, 28 ou mais, 29 ou mais, ou 30 ou mais antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção.

Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento.

Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, 20 ou mais, 21 ou mais, 22 ou mais, 23 ou mais, 24 ou mais, 25 ou mais, 26 ou mais, 27 ou mais, 28 ou mais, 29 ou mais, ou 30 ou mais antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 16 ou menos, 15 ou menos, 14 ou menos, 13 ou menos, 12 ou menos, 11 ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), incluindo todas as combinações de pares dos mesmos possíveis em que a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 é maior antes do tratamento do que depois do tratamento.

Por exemplo, em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de um indivíduo por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, pelo menos 30, pelo menos 31, pelo menos 32, pelo menos 33, pelo menos 34, ou 35 (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 do indivíduo antes do tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de um indivíduo por pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90% (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 do indivíduo antes do tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de um indivíduo por pelo menos 75% (por exemplo, na semana 22 do tratamento), em comparação com a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 do indivíduo antes do tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de um indivíduo por 10 ou mais, em comparação com a pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 do indivíduo antes do tratamento. Para uma descrição exemplar da métrica do Escore de Atividade da Urticária UAS, vide, por exemplo, Mathias, S.D. et al. (2012) Ann. Allergy Asthma Immunol. 108:20-24. Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 17 ou mais ou cerca de 18 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 4 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, na semana 22 do tratamento).

[0095] Em algumas modalidades, uma resposta completa refere-se a uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 a 16 e uma alteração de 3 ou superior a partir da linha basal. Em algumas modalidades, a resposta parcial refere-se a uma alteração na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de 3 ou superior a partir da linha basal. Em algumas modalidades, nenhuma resposta refere-se a uma alteração na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 3 a partir da linha basal. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma taxa de resposta completa superior a 80%, 85%, ou 90%, por exemplo, em indivíduos com urticária espontânea crônica naïve para anticorpo anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®, também conhecido como omalizumab). Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma taxa de resposta superior a 80%, 85%, ou 90%, por exemplo, em indivíduos com urticária espontânea crônica naïve para anticorpo anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®, também conhecido como omalizumab). Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma taxa de resposta completa superior a 80%, por exemplo, em indivíduos com urticária colinérgica. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma taxa de resposta superior a 80%, por exemplo, em indivíduos com urticária colinérgica. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma taxa de resposta de pelo menos 70%, por exemplo, em indivíduos com dermografismo sintomático. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma taxa de resposta superior a 50%, por exemplo, em indivíduos com urticária espontânea crônica refratária a anticorpo anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®, também conhecido como omalizumab), (por exemplo, em indivíduos com urticária espontânea crônica em que o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada para o tratamento com um anticorpo anti-IgE ou a urticária crônica é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE).

[0096] Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em um escore HSS e/ou ISS de 0 em um indivíduo com um escore HSS e/ou ISS de 1 a 3 antes do tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em uma redução no limiar de gatilho em um indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em um resultado do FricTest® negativo em um indivíduo com um FricTest® positivo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção resulta em um resultado do teste PCE negativo em um indivíduo com um teste PCE positivo antes do tratamento.

[0097] Em algumas modalidades, a pontuação da qualidade de vida autoavaliada (por exemplo, conforme avaliado por qualquer uma das métricas exemplares descritas acima) em um indivíduo é aprimorada em comparação com um nível basal antes da administração da composição. Em algumas modalidades, a pontuação da qualidade de vida autoavaliada é avaliada por uma ou mais das seguintes métricas: DLQI, CU-Q2oL, AE-QoL, SD-QoL, e CholU-QoL.

[0098] Em algumas modalidades, um indivíduo demonstrou uma pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de mais de 10 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, 20 ou mais, 21 ou mais, 22 ou mais, 23 ou mais, 24 ou mais, ou 25 ou mais antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção. Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento. Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais,

14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, 20 ou mais, 21 ou mais, 22 ou mais, 23 ou mais, 24 ou mais, ou 25 ou mais antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), incluindo todas as combinações de pares dos mesmos possíveis em que a pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) é maior antes do tratamento do que depois do tratamento.

Por exemplo, em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de um indivíduo por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, ou pelo menos 20 (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) do indivíduo antes do tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) de um indivíduo por pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90% (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação do Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI) do indivíduo antes do tratamento.

[0099] Em algumas modalidades, um indivíduo demonstrou uma pontuação do CU-Q2oL de mais de 0,60, mais de 0,65, mais de 0,70, mais de 0,75, mais de 0,80, mais de 0,85, ou mais de 0,90 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção. Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do CU-Q2oL de 0,60 ou menos, 0,55 ou menos, 0,50 ou menos, 0,45 ou menos, 0,40 ou menos, 0,35 ou menos, 0,30 ou menos, 0,25 ou menos, ou 0,20 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento. Em algumas modalidades, um indivíduo tem uma pontuação do CU-Q2oL de mais de 0,50, mais de 0,55, mais de 0,60, mais de 0,65, mais de 0,70, mais de 0,75, mais de 0,80, mais de 0,85, ou mais de 0,90 antes da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção, e tem uma pontuação do CU-Q2oL de 0,60 ou menos, 0,55 ou menos, 0,50 ou menos, 0,45 ou menos, 0,40 ou menos, 0,35 ou menos, 0,30 ou menos, 0,25 ou menos, ou 0,20 ou menos depois da administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), incluindo todas as combinações de pares dos mesmos possíveis em que a pontuação do CU-Q2oL é maior antes do tratamento do que depois do tratamento. Por exemplo, em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do CU-Q2oL de um indivíduo por pelo menos 0,05, pelo menos 0,10, pelo menos 0,15, pelo menos 0,20, pelo menos 0,25, pelo menos 0,30, pelo menos 0,35, pelo menos 0,40, pelo menos 0,45, ou pelo menos 0,50 (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação do CU-Q2oL do indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção diminui a pontuação do CU-Q2oL de um indivíduo por pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou pelo menos 90% (por exemplo, em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 semanas depois do tratamento), em comparação com a pontuação do CU-Q2oL do indivíduo antes do tratamento.

[0100] Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção leva a uma redução em um ou mais entre: ocorrência de angioedema, número de vergões, e gravidade do prurido, por exemplo, em comparação com um nível basal antes da administração da composição ou anticorpo.

[0101] Em algumas modalidades, o tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção leva a um aumento em um ou ambos entre: número de dias sem sintomas por semana e limiar de gatilho, por exemplo, em comparação com um nível basal antes da administração da composição ou anticorpo, ou em comparação com um valor de referência adequado.

[0102] Em algumas modalidades, a resposta ao tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção é avaliada contando o número de eosinófilos e/ou basófilos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de soro) obtida do indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, número de eosinófilos e/ou número de basófilos em uma amostra de soro do indivíduo é reduzido, por exemplo, em comparação com um nível basal em uma amostra de soro obtida do indivíduo antes da administração da composição ou anticorpo, ou em comparação com um valor de referência adequado.

[0103] Em algumas modalidades, a resposta ao tratamento com uma composição ou com um anticorpo da presente invenção é avaliada pelo nível de expressão de um ou mais genes ou polipeptídeos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de soro) obtida do indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, o nível de triptase, proteína catiônica eosinofílica, e/ou IgE total em uma amostra (por exemplo, uma amostra de soro) do indivíduo é reduzido, por exemplo, em comparação com um nível basal em uma amostra de soro obtida do indivíduo antes da administração da composição ou anticorpo, ou em comparação com um valor de referência adequado.

[0104] Em algumas modalidades, a administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção resulta em uma resposta sustentada ao tratamento. Em algumas modalidades, administração de uma composição ou anticorpo da presente invenção resulta em uma resposta completa ao tratamento (por exemplo, depois da interrupção do tratamento, ou depois de uma única dose do anticorpo ou composição).

[0105] Os termos "linha basal" ou "valor basal" usados de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente, podem se referir a uma medição ou caracterização de um sintoma antes da administração da terapia (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8) ou no início da administração da terapia. O valor basal pode ser comparado com um valor de referência de modo a determinar a redução ou melhora de um sintoma de urticária crônica contemplado aqui, neste pedido de patente. Um valor de referência e/ou valor basal pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos).

[0106] Os termos "referência" ou "valor de referência" usados de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente, podem se referir a uma medição ou caracterização de um valor ou sintoma em um indivíduo sem urticária crônica (ou em um grupo de semelhantes indivíduos). Um "valor de referência" pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tenha um limite superior e/ou inferior; uma faixa de valores; um valor médio; um valor mediano; um valor médio; ou um valor em comparação com um valor basal. De modo similar, um "valor basal" pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tenha um limite superior e/ou inferior; uma faixa de valores; um valor médio; um valor mediano; um valor médio; ou um valor em comparação com um valor de referência. Um valor de referência pode ser obtido a partir de um indivíduo, a partir de dois indivíduos diferentes ou a partir de um grupo de indivíduos (por exemplo, um grupo de dois, três, quatro, cinco ou mais indivíduos). Em algumas modalidades, um valor de referência refere-se a um valor de rotina ou padrão no campo. Em algumas modalidades, um valor de referência refere-se a um valor calculado de novo a partir de um ou mais indivíduos (por exemplo, sem urticária crônica). C. Administração

[0107] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um agente ativo vai depender do tipo de doença a ser tratado, conforme definido acima, da gravidade e do curso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, de terapia prévia, do histórico clínico do indivíduo e da resposta ao agente, e do critério do médico assistente. O agente é administrado ao indivíduo convenientemente de uma vez ou durante uma série de tratamentos.

Em algumas modalidades, um intervalo entre as administrações de um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) descrito aqui, neste pedido de patente, é de cerca de um mês ou mais longo.

Em algumas modalidades, o intervalo entre as administrações é de cerca de 1 mês, cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses, cerca de seis meses ou mais longo.

Conforme usado aqui, neste pedido de patente, um intervalo entre as administrações refere-se ao período de tempo entre uma administração do anticorpo e a administração seguinte do anticorpo.

Conforme usado aqui, neste pedido de patente, um intervalo de cerca de um mês inclui quatro semanas.

Por conseguinte, em algumas modalidades, o intervalo entre administrações é de cerca de quatro semanas, cerca de cinco semanas, cerca de seis semanas, cerca de sete semanas, cerca de oito semanas, cerca de nove semanas, cerca de dez semanas, cerca de onze semanas, cerca de doze semanas, cerca de dezesseis semanas, cerca de vinte semanas, cerca de vinte quatro semanas, ou mais longo.

Em algumas modalidades, o tratamento inclui múltiplas administrações do anticorpo, em que o intervalo entre administrações pode variar.

Por exemplo, o intervalo entre a primeira administração e a segunda administração é de cerca de um mês, e os intervalos entre as administrações subsequentes são de cerca de três meses.

Em algumas modalidades, o intervalo entre a primeira administração e a segunda administração é de cerca de um mês, o intervalo entre a segunda administração e a terceira administração é de cerca de dois meses, e os intervalos entre as administrações subsequentes são de cerca de três meses.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado em uma dose fixa.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,1 mg a cerca de 1800 mg por dose.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de qualquer uma de 0,1 mg, 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg, 1000 mg, 1100 mg, 1200 mg, 1300 mg, 1400 mg, 1500 mg, 1600 mg, 1700 mg, e 1800 mg por dose.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 150 mg a cerca de 450 mg por dose.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de qualquer uma de 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, e 450 mg por dose.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg por dose.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg por dose.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, ou cerca de 0,3mg/kg to cerca de 1,0 mg/kg.

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de qualquer uma de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, ou 10,0 mg/kg.

Pode ser usada qualquer frequência de dosagem descrita acima.

Pode ser usada qualquer frequência de dosagem descrita acima nos métodos ou usos das composições descritos aqui, neste pedido de patente.

A eficácia do tratamento com um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) pode ser avaliada usando qualquer uma das metodologias ou testes descritos aqui, neste pedido de patente, em intervalos variando entre a cada semana e a cada três meses.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento (por exemplo, redução ou melhora de um ou mais sintomas) é avaliada em torno de a cada um mês, em torno de a cada dois meses, em torno de a cada três meses, em torno de a cada quatro meses, em torno de a cada cinco meses, em torno de a cada seis meses ou por mais tempo depois da administração de um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana.

Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento (por exemplo, redução ou melhora de um ou mais sintomas) é avaliada em torno de uma vez a cada semana, em torno de a cada duas semanas, em torno de a cada três semanas, em torno de a cada quatro semanas, em torno de a cada cinco semanas, em torno de a cada seis semanas, em torno de a cada sete semanas, em torno de a cada oito semanas, em torno de a cada nove semanas, em torno de a cada dez semanas, em torno de a cada onze semanas, em torno de a cada doze semanas, em torno de a cada dezesseis semanas, em torno de a cada vinte semanas, em torno de a cada vinte e quatro semanas, ou por mais tempo.

[0108] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é administrado a um indivíduo (por exemplo, por infusão intravenosa) em uma ou mais doses compreendendo entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 4,0 mg/kg do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado a um indivíduo por infusão intravenosa em uma ou mais doses compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, por exemplo, em cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, cerca de 0,5 mg/kg do anticorpo, cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, cerca de 1,5 mg/kg do anticorpo, cerca de 2,0 mg/kg do anticorpo, cerca de 2,5 mg/kg do anticorpo, ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, por infusão intravenosa) em duas ou mais doses (por exemplo, compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo) em um intervalo de cerca de 28 dias. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, por infusão intravenosa) mensalmente in duas ou mais doses (por exemplo, compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo). Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, por infusão intravenosa) em duas ou mais doses (por exemplo, compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo) em um intervalo de cerca de 4 semanas. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, por infusão intravenosa) em duas ou mais doses (por exemplo, compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo) mensalmente.

Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo (por exemplo, por infusão intravenosa) de acordo com o seguinte esquema: Dia 1, Dia 29, Dia 57, Dia 85, Dia 113, e Dia 141. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo por infusão intravenosa em uma primeira dose compreendendo cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, e uma sexta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.

Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo por infusão intravenosa em uma primeira dose compreendendo cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, e uma sexta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.

Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo por infusão intravenosa em uma primeira dose compreendendo cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, e uma sexta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado ao indivíduo por infusão intravenosa de acordo com o seguinte esquema: cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo no Dia 1, cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo no Dia 29, cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo no Dia 57, cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo no Dia 85, cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo no Dia 113, e cerca de 1,0 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo no Dia 141. Em algumas modalidades, a dose administrada no Dia 85, 113, ou 141 é selecionada com base no seguinte: 1,0 mg/kg do anticorpo se o indivíduo tiver experimentado melhora dos sintomas e/ou uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de ≥ 12, ou 3,0 mg/kg do anticorpo se o indivíduo tiver uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de < 12.

[0109] Os anticorpos descritos aqui, neste pedido de patente, que se ligam a Siglec-8 humana podem ser usados ou isolados ou em combinação com outros agentes nos métodos descritos aqui, neste pedido de patente. Por exemplo, um anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana pode ser co-administrado com um ou mais (por exemplo, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, etc.) agentes terapêuticos adicionais para o tratamento e/ou prevenção da urticária crônica. Os agentes terapêuticos contemplados aqui, neste pedido de patente, incluem, mas não estão limitados a, antagonistas de receptores H-2, anti-histamínicos H1, anti-histamínicos H2, anticorpos anti-IgE (por exemplo, omalizumab), corticosteroides, doxepina, antagonistas de receptores do leucotrieno (LTRAs), ciclosporina, e tacrolímo. Embora os anticorpos da presente invenção possam encontrar uso, por exemplo, no tratamento de indivíduos que são resistentes ou refratários a (ou apresentaram recidiva depois do tratamento com) anti-histamínicos H1 e/ou anticorpos anti-IgE (por exemplo, omalizumab), o tratamento com anti-histamínicos H1 e/ou anticorpos anti-IgE em alguns casos pode ser usado em combinação com um anticorpo da presente invenção, mesmo se o tratamento com anti-histamínicos H1 e/ou anticorpos anti-IgE na ausência de anticorpo anti-Siglec-8 for efetivo de maneira sub-ótima.

[0110] Tais terapias de combinação mencionadas acima englobam administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos nas mesmas formulações ou em formulações separadas), e administração separada, em cujo caso a administração do anticorpo da presente invenção pode ocorrer antes, simultaneamente, e/ou depois, da administração do um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, e a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de um mês, cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses ou cerca de seis meses uma da outra. Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, e a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de uma semana, cerca de duas semanas ou cerca de três semanas uma da outra. Em algumas modalidades, a administração de um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, e a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ocorrem dentro de cerca de um dia, cerca de dois dias, cerca de três dias, cerca de quatro dias, cerca de cinco dias, ou cerca de seis dias uma da outra.

[0111] Anticorpos anti-Siglec8 e/ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados através de qualquer via de administração adequada conhecida na arte, incluindo, sem limitação, por administração oral, administração sublingual, administração bucal, administração tópica, administração retal, através de inalação, administração transdérmica, injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção intravenosa (IV), injeção intra-arterial, injeção intramuscular, injeção intracardíaca, injeção intra-óssea, injeção intraperitoneal, administração transmucosa, administração vaginal, administração intravítrea, administração intra-articular, administração peri-articular, administração local, administração epicutânea, ou quaisquer combinações das mesmas. D. Anticorpos

[0112] Alguns aspectos da presente invenção proporcionam anticorpos isolados que se ligam a uma Siglec-8 humana (por exemplo, um anticorpo agonista que se liga a Siglec-8 humana). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, tem uma ou mais dos seguintes características: (1) liga-se a uma Siglec-8 humana; (2) liga-se a um domínio extracelular de uma Siglec-8 humana; (3) liga-se a uma Siglec-8 humana com uma afinidade mario do que anticorpo de camundongo 2E2 e/ou anticorpo de camundongo 2C4; (4) liga-se a uma Siglec-8 humana com uma maior avidez do que o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4; (5) tem uma Tm de cerca de 70ºC-72ºC ou superior em um ensaio de mudança térmica; (6) tem um grau de fucosilação reduzido ou é não fucosilada; (7) liga-se a uma Siglec-8 humana expressa sobre os eosinófilos e induz a apoptose de eosinófilos; (8) liga-se a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos; (9) liga-se a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e inibe atividades de mastócitos dependentes de FcɛRI (por exemplo, liberação de histaminas, liberação de PGD2, fluxo de Ca2+, e/ou liberação de β-hexosaminidase, etc.); (10) foi manipulado para aprimorar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos; (11) liga-se a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e mata os mastócitos por atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (in vitro, e/ou in vivo); (12) liga-se a uma Siglec-8 de um primata humano e de um primata não humano; (13) liga-se a um Domínio 1, um Domínio 2, e/ou um Domínio 3 de Siglec- 8 humana, ou se liga a um polipeptídeo Siglec-8 compreendendo o Domínio 1, o Domínio 2, e/ou o Domínio 3 da Siglec-8 humana (por exemplo, proteínas de fusão descritas aqui, neste pedido de patente); e (14) esgota os eosinófilos ativados com uma EC50 menor do que a EC50 do anticorpo de camundongo 2E2 ou 2C4. Qualquer um dos anticorpos descritos na Pat. U.S. Nº. 9.546.215 e/ou WO2015089117 pode encontrar uso nos métodos, composições, e kits proporcionados aqui, neste pedido de patente.

[0113] Em um aspecto, a presente invenção proporciona anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 72. Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 73. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma Siglec- 8 humana expressa sobre os mastócitos e esgota ou reduz o número de mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e inibe a atividade mediada pelos mastócitos.

[0114] Em um aspecto, a invenção proporciona anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 72.

Em algumas modalidades, a Siglec-8 humana compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 73. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 2 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 113. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 3 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 116 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 116. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitope linear no domínio extracelular de Siglec-8 humana.

Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitope conformacional no domínio extracelular de Siglec-8 humana.

Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma Siglec-8 humana expressa sobre os eosinófilos e induz a apoptose de eosinófilos.

Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e esgota os mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e inibe a atividade mediada pelos mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma Siglec-8 humana expressa sobre os mastócitos e mata os mastócitos por atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos. Em algumas modalidades, um anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, esgota os mastócitos e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui, neste pedido de patente, esgota os eosinófilos ativados e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 não fucosilado) esgota os eosinófilos do sangue e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, um anticorpo aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-8 não fucosilado) esgota os eosinófilos do sangue periférico e inibe a ativação de mastócitos.

[0115] É proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 isolado que se liga a Siglec-8 humana e a Siglec-8 de primata não humano. A identificação de anticorpos com reatividade cruzada com primatas seria útil para experimentação pré-clínica de anticorpos anti-Siglec-8 em primatas não humanos. Em um aspecto, a invenção proporciona anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 de primata não humano. Em um aspecto, a invenção proporciona anticorpos que se ligam a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano. Em algumas modalidades, a Siglec-8 de primata não humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 118 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, a Siglec-8 de primata não humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 119 ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, o primata não humano é um babuíno (por exemplo, Papio Anubis). Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano, se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana. Em uma modalidade adicional, o Domínio 1 de Siglec-8 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano, se liga a um epitopo no Domínio 3 de Siglec-8 humana. Em uma modalidade adicional, o Domínio 3 de Siglec-8 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, ou um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo murino. Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo IgG1 humano.

[0116] Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, é um anticorpo monoclonal. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, é um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação ao antígeno), por exemplo, um fragmento Fab, Fab′-SH, Fv, scFv, ou (Fab′)2. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, compreende um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação ao antígeno), por exemplo, um fragmento Fab, Fab′-SH, Fv, scFv, ou (Fab′)2. Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em um aspecto, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec-8 descridos aqui, neste pedido de patente, são purificados.

[0117] Em um aspecto, são proporcionados anticorpos anti-Siglec-8 que competem com anticorpo 2E2 murino e anticorpo 2C4 murino ligando a Siglec-8. Também são proporcionados anticorpos anti-Siglec-8 que se ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo 2E2 murino e o anticorpo 2C4 murino. Anticorpos murinos para Siglec-8, anticorpo 2E2 e 2C4 são descritos na Pat. U.S. Nº. 8.207.305; na Pat. U.S. Nº. 8.197.811, na Pat. U.S. Nº. 7.871.612, e na Pat. U.S. Nº. 7.557.191.

[0118] Em um aspecto, são proporcionados anticorpos anti-Siglec-8 que competem com qualquer anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11, 2C4, 2E2) por ligação a Siglec-8. Também são proporcionados anticorpos anti- Siglec-8 que se ligam ao mesmo epitopo que qualquer anticorpo anti- Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11, 2C4, 2E2).

[0119] Em um aspecto da presente invenção, são proporcionados polinucleotídeos codificando anticorpos anti-Siglec-8. Em determinadas modalidades, são proporcionados vetores compreendendo polinucleotídeos codificando anticorpos anti-Siglec-8. Em determinadas modalidades, são proporcionadas células hospedeiras compreendendo os vetores referidos. Em outro aspecto da presente invenção, são proporcionadas composições compreendendo anticorpos anti-Siglec-8 ou polinucleotídeos codificando anticorpos anti-Siglec-8. Em determinadas modalidades, uma composição da presente invenção é uma formulação farmacêutica para o tratamento de urticária crônica. Em determinadas modalidades, uma composição da presente invenção é uma formulação farmacêutica para a prevenção de urticária crônica.

[0120] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo murino 2C4. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo murino 2E2. Em algumas modalidades, a HVR é uma CDR de Kabat ou uma CDR de Chothia.

[0121] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências de HVR do anticorpo murino 1C3. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das sequências de HVR do anticorpo murino 4F11. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo murino 1H10. Em algumas modalidades, a HVR é uma CDR de Kabat ou uma CDR de Chothia.

[0122] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 112. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 2 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 113. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 3 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114.

[0123] Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 116 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 115. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID Nº: 116.

[0124] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 97, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

103. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 2 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

113.

[0125] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 98, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

104. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 3 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

114. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a Siglec-8 humana e a Siglec-8 de primata não humano.

[0126] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 99, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

105. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

112. Em algumas modalidades, o anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a Siglec-8 humana e a Siglec-8 de primata não humano.

[0127] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66.

[0128] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 67 a 70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66.

[0129] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 71.

[0130] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 67 a 70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 71.

[0131] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 97, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

103.

[0132] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 98, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

104.

[0133] Em outro aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 99, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

105.

[0134] Um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, pode compreender qualquer sequência de domínio variável de estrutura adequada, contanto que o anticorpo conserva a capacidade para se ligar a Siglec-8 humana. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, regiões de estrutura de cadeia pesada são designadas "HC-FR1- FR4," e regiões de estrutura de cadeia leve são designadas "LC-FR1- FR4." Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma sequência de estrutura de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 26, 34, 38, e 45 (HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3, e HC-FR4, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma sequência de estrutura de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 48, 51, 55, e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3, e LC- FR4, respectivamente). Em algumas modalidades, o anticorpo anti- Siglec-8 compreende uma sequência de estrutura de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 48, 51, 58, e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3, e LC-FR4, respectivamente).

[0135] Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências HC-FR1-HC-FR4 de SEQ ID Nºs: 26 a 29 (HC-FR1), de SEQ ID Nºs: 31 a 36 (HC-FR2), de SEQ ID Nºs: 38 a 43 (HC-FR3), e de SEQ ID Nºs: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR- H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; a HVR- H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; e a HVR- H3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências HC-FR1-HC-FR4 de SEQ ID Nºs: 26 a 29 (HC-FR1), de SEQ ID Nºs: 31 a 36 (HC-FR2), de SEQ ID Nºs: 38 a 43 (HC-FR3), e de SEQ ID Nºs: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 67 a 70. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências LC-FR1-LC-FR4 de SEQ ID Nºs: 48 ou 49 (LC-FR1), de SEQ ID Nºs: 51 a 53 (LC-FR2), de SEQ ID Nºs: 55 a 58 (LC-FR3), e de SEQ ID Nº: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66. Em uma modalidade, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências LC-FR1-LC- FR4 de SEQ ID Nºs: 48 ou 49 (LC-FR1), de SEQ ID Nºs: 51 a 53 (LC- FR2), de SEQ ID Nºs: 55 a 58 (LC-FR3), e de SEQ ID Nº: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 71. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 2 a 10 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 22. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 2 a 10 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 23 ou 24. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 11 a 14 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 22. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 11 a 14 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 23 ou 24. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16. Em uma modalidade destes anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21.

[0136] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de cadeia pesada compreendem o seguinte: a) HVR-H1 (IYGAH (SEQ ID Nº: 61)); b) HVR-H2 (VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID Nº: 62)); e c) HVR-H3 (DGSSPYYYSMEY (SEQ ID Nº: 63); DGSSPYYYGMEY (SEQ ID Nº:67); DGSSPYYYSMDY (SEQ ID Nº: 68); DGSSPYYYSMEV (SEQ ID Nº: 69); ou DGSSPYYYGMDV (SEQ ID Nº: 70)).

[0137] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de cadeia pesada compreendem o seguinte:

a) HVR-H1 (SYAMS (SEQ ID Nº: 88); DYYMY (SEQ ID Nº: 89); ou SSWMN (SEQ ID Nº: 90)); b) HVR-H2 (IISSGGSYTYYSDSVKG (SEQ ID Nº: 91); RIAPEDGDTEYAPKFQG (SEQ ID Nº: 92); ou QIYPGDDYTNYNGKFKG (SEQ ID Nº: 93)); e c) HVR-H3 (HETAQAAWFAY (SEQ ID Nº: 94); EGNYYGSSILDY (SEQ ID Nº: 95); ou LGPYGPFAD (SEQ ID Nº: 96)).

[0138] Em algumas modalidades, as sequências de FR de cadeia pesada compreendem o seguinte: a) HC-FR1 (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID Nº: 26); EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT (SEQ ID Nº: 27); QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS (SEQ ID Nº: 28); ou QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT (SEQ ID Nº: 29)); b) HC-FR2 (WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID Nº: 31); WVRQAPGKGLEWLG (SEQ ID NO:32); WVRQAPGKGLEWLS (SEQ ID Nº: 33); WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID Nº:34); WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID Nº: 35); ou WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID Nº:36)); c) HC-FR3 (RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 38); RLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 39); RLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 40); RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 41); RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 42); ou RLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 43)); e d) HC-FR4 (WGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 45); ou WGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº:46)).

[0139] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de cadeia leve compreendem o seguinte: a) HVR-L1 (SATSSVSYMH (SEQ ID Nº: 64)); b) HVR-L2 (STSNLAS (SEQ ID Nº: 65)); e c) HVR-L3 (QQRSSYPFT (SEQ ID Nº: 66); ou QQRSSYPYT (SEQ ID Nº: 71)).

[0140] Em algumas modalidades, as sequências de HVR de cadeia leve compreendem o seguinte: a) HVR-L1 (SASSSVSYMH (SEQ ID Nº: 97); RASQDITNYLN (SEQ ID Nº: 98); ou SASSSVSYMY (SEQ ID Nº: 99)); b) HVR-L2 (DTSKLAY (SEQ ID Nº: 100); FTSRLHS (SEQ ID Nº: 101); ou DTSSLAS (SEQ ID Nº: 102)); e c) HVR-L3 (QQWSSNPPT (SEQ ID Nº: 103); QQGNTLPWT (SEQ ID Nº: 104); ou QQWNSDPYT (SEQ ID Nº: 105)).

[0141] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 103; uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 89, (ii) HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 104; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 105.

[0142] Em algumas modalidades, as sequências de FR de cadeia leve compreendem o seguinte: a) LC-FR1 (EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID Nº: 48); ou EIILTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID Nº: 49)); b) LC-FR2 (WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID Nº: 51); WFQQKPGQAPRLWIY (SEQ ID Nº:52); ou WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID Nº: 53)); c) LC-FR3 (GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 55); GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 56); GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 57); ou GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 58)); e d) LC-FR4 (FGPGTKLDIK (SEQ ID Nº: 60)).

[0143] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 (por exemplo, um anticorpo anti- Siglec-8 humanizado) que se liga a Siglec-8 humana, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que o anticorpo compreende: (a) domínio variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 26 a 29;

(2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 31 a 36; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 38 a 43; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 45 a 46, e/ou (b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 48 a 49; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 51 a 53; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 55 a 58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60.

[0144] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado entre SEQ ID Nºs: 2 a 10 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nºs: 16 a 22. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado entre SEQ ID Nºs: 2 a 14 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nºs: 16 a 24. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado entre SEQ ID Nºs: 2 a 10 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nº: 23 ou 24. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado entre SEQ ID Nºs: 11 a 14 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nºs: 16 a 22. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado entre SEQ ID Nºs: 11 a 14 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nº: 23 ou 24. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 6 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nº: 16 ou

21.

[0145] Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecionado entre SEQ ID Nºs: 106 a 108 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado entre SEQ ID Nºs: 109 a 111. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 106 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 109. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 107 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 110. Em um aspecto, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº: 108 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID Nº: 111.

[0146] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 2 a 14. Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 106 a 108. Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições, inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo aquela sequência de aminoácidos conserva a capacidade para se ligar a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, as substituições, inserções ou deleções (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos) ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 106 a 108.

[0147] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 24. Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 109 a 111. Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições, inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, but um anticorpo compreendendo aquela sequência de aminoácidos conserva a capacidade para se ligar a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, as substituições, inserções ou deleções (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos) ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16 ou 21. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 109 a 111.

[0148] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas ou três VH HVRs selecionadas entre as mostradas na Tabela 1 e/ou (b) uma, duas ou três VL HVRs selecionadas entre as mostradas na Tabela 1.

[0149] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas ou três VH HVRs selecionadas entre as mostradas na Tabela 2 e/ou (b) uma, duas ou três VL HVRs selecionadas entre as mostradas na Tabela 2.

[0150] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas ou três ou quatro VH FRs selecionadas entre as mostradas na Tabela 3 e/ou (b) uma, duas ou três ou quatro VL FRs selecionadas entre as mostradas na Tabela 3.

[0151] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e/ou um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo mostrado na Tabela 4, por exemplo, anticorpo HAKA, anticorpo HAKB, anticorpo HAKC, etc.

Tabela 1. Sequências de aminoácidos de HVRs de anticorpos

Cadeia de HVR1 HVR2 HVR3 Anticorpo

Anticorpo 2E2

Cadeia IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYSMEY pesada SEQ ID Nº: 61 SEQ ID Nº: 62 SEQ ID Nº: 63

Cadeia leve SATSSVSYMH STSNLAS QQRSSYPFT

SEQ ID Nº: 64 SEQ ID Nº: 65 SEQ ID Nº: 66

Variantes de Cadeia Pesada Humanizadas 2E2 RHA, 2E2 RHB, 2E2 RHC, 2E2 RHD, 2E2 RHE, 2E2 RHF, 2E2 RHG, 2E2 RHA2, e 2E2 RHB2

Variantes de Cadeia Leve Humanizadas 2E2 RKA, 2E2 RKB, 2E2 RKC, 2E2 RKD, 2E2 RKE, 2E2 RKF, e 2E2 RKG

Cadeia leve SATSSVSYMH STSNLAS QQRSSYPFT

SEQ ID Nº: 64 SEQ ID Nº: 65 SEQ ID Nº: 66

Variantes de Cadeia Pesada Humanizadas 2E2 RHE S-G, 2E2 RHE E-D, 2E2 RHE Y-V, e 2E2 RHE triplo

2E2 RHE S-G IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYGMEY

SEQ ID Nº: 61 SEQ ID Nº: 62 SEQ ID Nº: 67

2E2 RHE E-D IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYSMDY

SEQ ID Nº: 61 SEQ ID Nº: 62 SEQ ID Nº: 68

2E2 RHE Y-V IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYSMEV

SEQ ID Nº: 61 SEQ ID Nº: 62 SEQ ID Nº: 69

2E2 RHE IYGAH VIWAGGSTNYNSALMS DGSSPYYYGMDV triplo SEQ ID Nº: 61 SEQ ID Nº: 62 SEQ ID Nº: 70

Variantes de Cadeia Leve Humanizadas 2E2 RKA F-Y e 2E2 RKF F-Y

2E2 RKA F-Y SATSSVSYMH STSNLAS QQRSSYPYT

SEQ ID Nº: 64 SEQ ID Nº: 65 SEQ ID Nº: 71

2E2 RKF F-Y SATSSVSYMH STSNLAS QQRSSYPYT

SEQ ID Nº: 64 SEQ ID Nº: 65 SEQ ID Nº: 71

Tabela 2. Sequências de aminoácidos de HVRs de anticorpos murinos 1C3, 1H10, e 4F11 Anticorpo Cadeia HVR1 HVR2 HVR3 1C3 Cadeia SYAMS IISSGGSYTYYSDSVKG HETAQAAWFAY Pesada SEQ ID Nº: 88 SEQ ID Nº: 91 SEQ ID Nº: 94 1H10 Cadeia DYYMY RIAPEDGDTEYAPKFQG EGNYYGSSILDY Pesada SEQ ID Nº: 89 SEQ ID Nº: 92 SEQ ID Nº: 95 4F11 Cadeia SSWMN QIYPGDDYTNYNGKFKG LGPYGPFAD Pesada SEQ ID Nº: 90 SEQ ID Nº: 93 SEQ ID Nº: 96 1C3 Cadeia SASSSVSYMH DTSKLAY QQWSSNPPT Leve SEQ ID Nº: 97 SEQ ID Nº: 100 SEQ ID Nº: 103 1H10 Cadeia RASQDITNYLN FTSRLHS QQGNTLPWT Leve SEQ ID Nº: 98 SEQ ID Nº: 101 SEQ ID Nº: 104 4F11 Cadeia SASSSVSYMY DTSSLAS QQWNSDPYT Leve SEQ ID Nº: 99 SEQ ID Nº: 102 SEQ ID Nº: 105 Tabela 3. Sequências de aminoácidos de FRs de anticorpos Cadeia FR1 FR2 FR3 FR4 Pesada 2E2 QVQLKESGPGLVAPSQSLSI WVRQPPGKGLEWLG RLSISKDNSKSQVFLKINS WGQGTSVTVSS

TCTVSGFSLT LQTDDTALYYCAR (SEQ ID Nº: 30) (SEQ ID Nº: 44) (SEQ ID Nº: 25) (SEQ ID Nº: 37) 2E2 RHA EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVS RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 31) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHB EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWLG RLSISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAVSGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 32) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 27) (SEQ ID Nº: 39) 2E2 RHC EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVS RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAVSGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 31) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 27) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHD EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWLS RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 33) (SEQ ID Nº: 45)

(SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHE EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVG RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 34) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHF EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVS RLTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 31) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 40) 2E2 RHG EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVS RFSISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS

LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 31) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 41) 2E2 RHA2 QVQLQESGPGLVKPSETLSL WIRQPPGKGLEWIG RVTISVDTSKNQFSLKLS WGQGTLVTVSS

TCTVSGGSIS SVTAADTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 35) (SEQ ID Nº: 46) (SEQ ID Nº: 28) (SEQ ID Nº: 42) 2E2 RHB2 QVQLQESGPGLVKPSETLSL WVRQPPGKGLEWLG RLSISKDNSKNQVSLKLS WGQGTLVTVSS

TCTVSGFSLT SVTAADTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 36) (SEQ ID Nº: 46) (SEQ ID Nº: 29) (SEQ ID Nº: 43) 2E2 RHE EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVG RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS S-G LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 34) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHE EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVG RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS E-D LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 34) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHE EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVG RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS Y-V LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 34) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38) 2E2 RHE EVQLVESGGGLVQPGGSLR WVRQAPGKGLEWVG RFTISKDNSKNTVYLQMN WGQGTTVTVSS triplo LSCAASGFSLT SLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID Nº: 34) (SEQ ID Nº: 45) (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 38)

Cadeia Leve FR1 FR2 FR3 FR4 2E2 QIILTQSPAIMSASPGEKVSITC WFQQKPGTSPKLWIY GVPVRFSGSGSGTSYSL FGSGTKLEIK

TISRMEAEDAATYYC (SEQ ID Nº: 47) (SEQ ID Nº: 50) (SEQ ID Nº: 59) (SEQ ID Nº: 54)

RKA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDFTLT FGPGTKLDIK

ISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 48) (SEQ ID Nº: 51) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 55)

RKB EIILTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLWIY GVPARFSGSGSGTDYTL FGPGTKLDIK

TISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 49) (SEQ ID Nº: 52) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 56)

RKC EIILTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDFTLT FGPGTKLDIK

ISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 49) (SEQ ID Nº: 51) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 55)

RKD EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLWIY GIPARFSGSGSGTDFTLT FGPGTKLDIK

ISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 48) (SEQ ID Nº: 52) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 55)

RKE EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GVPARFSGSGSGTDFTL FGPGTKLDIK

TISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 48) (SEQ ID Nº: 51) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 57)

RKF EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDYTLT FGPGTKLDIK

ISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 48) (SEQ ID Nº: 51) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 58)

RKG EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WYQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDFTLT FGPGTKLDIK

ISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 48) (SEQ ID Nº: 53) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 55) RKA F-Y EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDFTLT FGPGTKLDIK

ISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID Nº: 48) (SEQ ID Nº: 51) (SEQ ID Nº: 60) (SEQ ID Nº: 55) RKF F-Y EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC WFQQKPGQAPRLLIY GIPARFSGSGSGTDYTLT FGPGTKLDIK

Tabela 4. Sequências de aminoácidos de regiões variáveis de anticorpos Nome do Anticorpo Cadeia Pesada Variável Cadeia Leve Variável ch2C4 ch2C4 VH ch2C4 VK ch2E2 ch2E2 VH (SEQ ID Nº: 1) ch2E2 VK (SEQ ID Nº: 15) cVHKA ch2E2 VH (SEQ ID Nº: 1) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) cVHKB ch2E2 VH (SEQ ID Nº: 1) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HAcVK 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) ch2E2 VK (SEQ ID Nº: 15) HBcVK 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) ch2E2 VK (SEQ ID Nº: 15) HAKA 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HAKB 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HAKC 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HAKD 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HAKE 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HAKF 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HAKG 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HBKA 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HBKB 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HBKC 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HBKD 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HBKE 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HBKF 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HBKG 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HCKA 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HCKB 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HCKC 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HCKD 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HCKE 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HCKF 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HCKG 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HDKA 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HDKB 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HDKC 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HDKD 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HDKE 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HDKF 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HDKG 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HEKA 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HEKB 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HEKC 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18)

Nome do Anticorpo Cadeia Pesada Variável Cadeia Leve Variável HEKD 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HEKE 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HEKF 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HEKG 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HFKA 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HFKB 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HFKC 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HFKD 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HFKE 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HFKF 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HFKG 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HGKA 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HGKB 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HGKC 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HGKD 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HGKE 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HGKF 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HGHG 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HA2KA 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HA2KB 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HB2KA 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) HB2KB 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) HA2KF 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HB2KF 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HA2KC 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HA2KD 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HA2KE 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HA2KF 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) HA2KG 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) HB2KC 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) HB2KD 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) HB2KE 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) HA2KFmut 2E2 RHA2 (SEQ ID Nº: 9) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HB2KFmut 2E2 RHB2 (SEQ ID Nº: 10) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HEKAmut 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKA F-Y mut (SEQ ID Nº: 23) HEKFmut 2E2 RHE (SEQ ID Nº: 6) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HAKFmut 2E2 RHA (SEQ ID Nº: 2) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HBKFmut 2E2 RHB (SEQ ID Nº: 3) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HCKFmut 2E2 RHC (SEQ ID Nº: 4) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24)

Nome do Anticorpo Cadeia Pesada Variável Cadeia Leve Variável HDKFmut 2E2 RHD (SEQ ID Nº: 5) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HFKFmut 2E2 RHF (SEQ ID Nº: 7) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) HGKFmut 2E2 RHG (SEQ ID Nº: 8) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) RHE Y-VKA 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) RHE Y-VKB 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) RHE Y-VKC 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) RHE Y-VKD 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) RHE Y-VKE 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) RHE Y-VKF 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) RHE Y-VKG 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) RHE E-DKA 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) RHE E-DKB 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) RHE E-DKC 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) RHE E-DKD 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) RHE E-DKE 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) RHE E-DKF 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) RHE E-DKG 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) RHE E-DKFmut 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) RHE S-GKA 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) RHE S-GKB 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) RHE S-GKC 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) RHE S-GKD 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) RHE S-GKE 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) RHE S-GKF 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) RHE S-GKG 2E2 RHE S-G (SEQ ID Nº: 11) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) RHE Triplo-KA 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKA (SEQ ID Nº: 16) RHE Triplo-KB 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKB (SEQ ID Nº: 17) RHE Triplo-KC 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKC (SEQ ID Nº: 18) RHE Triplo-KD 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKD (SEQ ID Nº: 19) RHE Triplo-KE 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKE (SEQ ID Nº: 20) RHE Triplo-KF 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKF (SEQ ID Nº: 21) RHE Triplo-KG 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKG (SEQ ID Nº: 22) RHE Triplo-KFmut 2E2 RHE Triplo (SEQ ID Nº: 14) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) RHE Y-VKFmut 2E2 RHE Y-V (SEQ ID Nº: 13) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24) RHE E-DKFmut 2E2 RHE E-D (SEQ ID Nº: 12) 2E2 RKF F-Y mut (SEQ ID Nº: 24)

[0152] Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas , , ,  e , respectivamente.

As classes  e  são adicionalmente divididas em subclasses, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Podem existir anticorpos IgG1 em múltiplas variantes polimórficas denominadas alótipos (revisado em Jefferis and Lefranc 2009. mAbs Vol 1 Issue 4 1-7), quaisquer dos quais são adequados para utilização em algumas das modalidades aqui, neste pedido de patente. Variantes alotípicas comuns nas populações humanas são as designadas pelas letras a,f,n,z ou combinações das mesmas. Em qualquer uma das modalidades aqui, neste pedido de patente, o anticorpo pode compreender uma região Fc de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de IgG humana. Em modalidades adicionais, a região Fc de IgG humana compreende uma IgG1 ou IgG4 humana. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG4. Em algumas modalidades, a IgG4 humana compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice da União Europeia como em Kabat. Em algumas modalidades, a IgG1 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 78. Em algumas modalidades, a IgG4 humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 79.

[0153] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo anti-Siglec-8 compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 76 ou 77. Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 87; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 76. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 induz a apoptose dos eosinófilos ativados. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 induz a apoptose de eosinófilos em repouso. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota os eosinófilos ativados e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota ou reduz os mastócitos e inibe a ativação de mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 esgota ou reduz o número de mastócitos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 mata os mastócitos por atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo esgota ou reduz os mastócitos expressando Siglec-8 em um tecido. Em algumas modalidades, o anticorpo esgota ou reduz os mastócitos expressando Siglec-8 em um fluido biológico.

1. Afinidade do Anticorpo

[0154] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a Siglec-8 humana com cerca da mesma ou maior afinidade e/ou maior avidez em comparação com o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 proporcionado aqui, neste pedido de patente, tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤ 1 μM, ≤ 150 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10 a 8 M ou menos, por exemplo, a partir de 10 a 8 M até 10 a 13 M, por exemplo, a partir de 10 a 9 M até 10 a 13 M). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, se liga a Siglec-8 humana em cerca de 1,5 vez, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 9 vezes ou cerca de 10 vezes maior afinidade do que o anticorpo de camundongo

2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID Nºs: 16 ou 21.

[0155] Em uma modalidade, a afinidade de ligação do anticorpo anti- Siglec-8 pde ser determinada por ensaio de ressonância de plasmon superficial. Por exemplo, a Kd ou valor da Kd pode ser medida usando um BIAcore™-2000 ou a BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25° C com chips CM5 de antígeno imobilizado em ~10 unidades de resposta (RU). Em resumo, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore® Inc.) são ativados com hidrocloreto de N- etil-N′-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções dos fornecedores. Anticorpos de captura (por exemplo, anti-humano-Fc) são diluídos com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, antes de injeção em uma taxa de fluxo de 30 μl/minuto e posteriormente imobilizados com um anticorpo anti-Siglec-8. Para medições cinéticas, diluições seriais duplas de Siglec-8 dimérica são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C em uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μl/min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de ligação de Langmuir simples de uma para um (BIAcore® Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação (Kd) de equilíbrio é calculada como a proporção koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881.

[0156] Em outra modalidade, pode ser usada interferometria de biocamada para determinar a afinidade dos anticorpos anti-Siglec-8 contra Siglec-8. Em um teste exemplar, proteína marcada com Siglec-8- Fc é imobilizada sobre sensores de captura anti-humanos, e incubada com concentrações crescentes de fragmentos Fab anti-Siglec-8 de camundongo, quiméricos, ou humanizados de modo a obter medições da afinidade usando um instrumento, tal como, por exemplo, o sistema Octet Red 384 System (ForteBio).

[0157] A afinidade de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 também pode ser determinada, por exemplo, pela análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980) usando técnicas de torina de conhecimento geral na arte relevante. Vide também Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1947).

2. Avidez do Anticorpo

[0158] Em algumas modalidades, a avidez de ligação do anticorpo anti-Siglec-8 pode ser determinada por um ensaio de ressonância de plasmon superficial. Por exemplo, a Kd ou valor da Kd pode ser medido usando um BIAcore T100. Anticorpos de captura (por exemplo, de cabra- anti-humano-Fc e de cabra-anti-camundongo-Fc) são imobilizados sobre um chip CM5. Células de fluxo podem ser imobilizadas com anticorpos anti-humanos ou com anti-camunodongo. O teste é conduzido em uma determinada temperatura e taxa de fluxo, por exemplo, a 25°C em uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Siglec-8 dimérica é diluída em tampão de teste em várias concentrações, por exemplo, em uma concentração variando de 15 nM a 1,88 pM. Anticorpos são capturados e são conduzidas injeções de alta performance, seguidas por dissociações. Células de fluxo são regeneradas com um tampão, por exemplo, 50 mM de glicina pH 1,5. Os resultados são blanked com uma célula de referência vazia e múltiplas injeções de tampão de teste, e analisados com parâmetros de ajuste global a 1:1.

3. Ensaios de Competição

[0159] Ensaios de competição podem ser usados para determinar se dois anticorpos se ligam ao mesmo epitopo reconhecendo epitopos idênticos ou se sobrepondo estericamente ou um anticorpo inibe competitivamente a ligação de outro anticorpo ao antígeno. Estes ensaios são conhecidos na arte. Tipicamente, antígeno ou células expressando antígeno são imobilizados sobre uma placa multi-cavidade e é medida a capacidade dos anticorpos não marcados para bloquear a ligação de anticorpos marcados. Marcadores comuns para os ensaios de competição comuns são marcadores radioativos ou marcadores enzimáticos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, compete com um anticorpo 2E2 descrito aqui, neste pedido de patente, por ligação ao epitopo presente sobre a superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, compete com um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, por ligação ao epitopo presente sobre a superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas modalidades, um anticorpo anti- Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, compete com um anticorpo 2C4 descrito aqui, neste pedido de patente, por ligação ao epitopo presente sobre a superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, compete com um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 (conforme encontrado na

Pat. U.S. Nº. 8.207.305), e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4 (conforme encontrado na Pat. U.S. Nº. 8.207.305), por ligação ao epitopo presente sobre a superfície celular de uma célula (por exemplo, um mastócito).

4. Estabilidade Térmica

[0160] Em alguns aspectos, um anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, tem uma temperatura de fusão (Tm) de pelo menos cerca de 70°C, pelo menos cerca de 71°C, ou pelo menos cerca de 72°C em um teste de troca térmica. Em um teste de troca térmica de exemplo, amostras compreendendo um anticorpo anti-Siglec-8 humanizado são incubadas com um corante fluorescenter (Sypro Orange) por 71 ciclos com aumento de 1°C por ciclo em um ciclador térmico de qPCR para determinar a Tm. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 tem uma Tm similar ou superior em comparação com o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou o anticorpo de camundongo 2C4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID Nºs: 16 ou 21. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 tem a mesma Tm ou uma Tm superior em comparação com um anticorpo 2C4 quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-Siglec-8 tem a mesma Tm ou uma Tm superior em comparação com um anticorpo tendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 84 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

85.

5. Ensaios de Atividade Biológica

[0161] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, esgota os eosinófilos e inibe os mastócitos. Ensaios para avaliar a apoptose de células são conhecidos de modo geral na arte, por exemplo, por coloração com Anexina V e o teste TUNNEL.

[0162] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, induz atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, mata os eosinófilos expressando Siglec-8 por atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos. Em algumas modalidades, uma composição compreende anticorpos anti-Siglec-8 não fucosilados (isto é, afucosilados). Em algumas modalidades, uma composição compreendendo não fucosilados anticorpos anti-Siglec-8 descritos aqui, neste pedido de patente, reforça a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos contra Siglec-8 expressando eosinófilos em comparação com uma composição compreendendo anticorpos anti-Siglec-8 parcialmente fucosilados. Testes para avaliar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos são de conhecimento geral na arte e são descritos aqui, neste pedido de patente. Em um teste exemplar, para medir a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, são usadas células efetoras e células alvo. Exemplos de células efetoras incluem células natural killer (NK), linfócitos granulares grandes (LGL), células killer ativadas por linfocinas (LAK) e PBMC compreendendo NK e LGL, ou leucócitos tendo receptores de Fc sobre as superfícies celulares, tais como neutrófilos, eosinófilos e macrófagos. Células efetoras podem ser isoladas a partir de qualquer fobte incluindo indivíduos com uma doença de interesse (por exemplo, urticária crônica). A célula alvo é qualquer célula a qual expresse, sobre a superfície celular, antígenos que os anticorpos a serem avaliados possam reconhecer. Um exemplo de uma célula alvo semelhante é um eosinófilo, o qual expresse Siglec-8 sobre a superfície celular. Outro exemplo de uma célula alvo semelhante é uma linhagem celular (por exemplo, a linhagem celular Ramos), a qual expresse Siglec-8 sobre a superfície celular (por exemplo, Ramos 2C10)). Células alvo podem ser marcadas com um reagente que possibilite a detecção de citólise. Exemplos de reagentes para marcação incluem uma 51 substância radioativa, tal como cromato de sódio (Na 2 CrO4). Vide, por exemplo, Immunology, 14, 181 (1968); J. Immunol. Methods., 172, 227 (1994); e J. Immunol. Methods., 184, 29 (1995).

[0163] Em um teste exemplar para avaliar a ADCC e a atividade apoptótica de anticorpos anti-Siglec-8 sobre os mastócitos, mastócitos humanos são isolados a partir de tecidos ou fluidos biológicos humanos, de acordo com protocolos publicados (Guhl et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011, 75:382-384; Kulka et al., In Current Protocols in Immunology, 2001, (John Wiley & Sons, Inc.)) ou diferenciados a partir de células tronco hematopoiéticas humanas, por exemplo conforme descrito por Yokoi et al., J Allergy Clin Immunol., 2008, 121:499-505. Mastócitos purificados são ressuspensos em meio RPMI Completo em uma placa de fundo em U estéril de 96 cavidades e incubados na presença ou ausência de anticorpos anti-Siglec-8 por 30 minutos em concentrações variando entre 0,0001 ng/ml e 10 g/ml. As amostras são incubadas por um adicional de 4 a 48 horas com e sem células natural killer (NK) purificadas ou PBL fresco para induzir ADCC. A destruição celular por apoptose ou ADCC é analisada por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados a fluorescente para detectar mastócitos (CD117 e FcR1) e Annexin-V e 7AAD para discriminar células vias e mortas ou morrendo. São realizadas colorações com Annexin-V e 7AAD de acordo com as instruções dos fabricantes.

[0164] Em alguns aspectos, um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, inibe atividades mediadas pelos mastócitos. Triptase de mastócitos foi usada como um biomarcador para número e ativação de mastócitos totais. Por exemplo, triptase total e ativa, bem como histamina, N-metil histamina, e 11-beta-prostaglandina F2 podem ser medidas no sangue ou na urina para avaliar a redução nos mastócitos. Vide, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº. US 20110293631 para um teste de atividade dos mastócitos exemplar. E. Preparação de Anticorpos

[0165] O anticorpo descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) é preparado usando técnicas disponíveis na arte para gerar anticorpos, cujos métodos exemplares são descritos em mais detalhes nas seções que se seguem.

1. Fragmentos de Anticorpos

[0166] A presente invenção engloba fragmentos de anticorpos. Fragmentos de anticorpos podem ser gerados por meios tradicionais, tais como digestão enzimática, ou por técnicas recombinantes. Em determinadas circunstâncias, existem vantagens em usar fragmentos de anticorpos, ao invés dos anticorpos interios. Para uma revisão de alguns fragmentos de anticorpos, vide Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134.

[0167] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)).

No entanto, estes fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpos Fab, Fv e ScFv opdem ser todos expressos em e secretados a partir de E. coli, deste modo permitindo a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab′-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab′) 2 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab′)2 podem ser isolados diretamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab′)2 com meia-vida in vivo compreendendo resíduos de epitopo de ligação a receptores selvagens são descritos na Pat. U.S. Nº. 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos vão ser evidentes para o médico versado. Em algumas modalidades, um anticorpo é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Vide WO 93/16185; as Pat. U.S. Nºs. 5.571.894; e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são destituídos de regiões constantes; portanto, podem ser adequados para ligação inespecífica reduzida durante uso in vivo. Proteínas de fusão scFv podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora quer no terminal amino ou no terminal carbóxi de um scFv. Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Pat. U.S. Nº. 5.641.870, por exemplo. Os anticorpos lineares referidos podem ser mono-específicos ou biespecíficos.

2. Anticorpos Humanizados

[0168] A presente invenção engloba anticorpos humanizados. Vários métodos para humanização de anticorpos não humanos são conhecidos na arte. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos dentro do mesmo a partir de uma fonte que seja não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", os quais são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". Essencialmente, humanização pode ser realizada seguindo o método de Winter (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, os anticorpos "humanizados" referidos são anticorpos quiméricos (Pat. U.S. Nº. 4.816.567) em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0169] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na produção dos anticorpos humanizados, pode ser importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de "melhor ajuste" ("best-fit"), a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor (por exemplo, camundongo) é triada contra a biblioteca inteira de sequências de domínios variáveis humanas conhecidas. A sequência humana que for a mais próxima da sequência do roedor é em seguida ace4ita como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Outro método usa uma estrutura particular derivada a partir da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.

[0170] Além disso, geralmente é desejável que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. De modo a atingir este objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processo de analise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão disponiveis comumente e são familiares para os peritos na arte. Estão disponíveis programas de computação, os quais ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destes displays permite a análise da função provável dos resíduos no funcionamento da sequência da imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciem a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar a seu antígeno. Deste modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptoras e de importação, de modo que seja obtida a característica do anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo. Em geral, os resíduos de regiões hipervariáveis estão envolvidos diretamente e mais substancialmente em influenciar a ligação ao antígeno.

3. Anticorpos Humanos

[0171] Anticorpos humanos anti-Siglec-8 da presente invenção podem ser construídos combinando uma ou mais sequências de domínios variáveis de clone de Fv selecionadas entre bibliotecas de display de fago derivadas de seres humanos com uma ou mais sequências de domínios constantes humanas conhecidas. Alternativamente, anticorpos monoclonais anti-Siglec-8 humanos da presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

[0172] É possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, depois de imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção de cadeia pesada (JH) do anticorpo em camundongos quiméricos e mutantes da linhagem germinativa resulta em completa inibição da produção endógeno de anticorpos. A transferência da matriz genética de imunoglobulina da linhagem germinativa humana em semelhantes camundongos mutantes da linhagem germinativa vai resultar na produção de anticorpos humanos depois de estímulo antigênico. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993).

[0173] Também pode ser usado embaralhamento de genes para derivar anticorpos humanos de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores), onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo não humano de partida. De acordo com este método, o qual também é denominado "impressão de epitopos", ou a região variável de cadeia pesada ou leve de um fragmento de anticorpo não humano obtido por técnicas de display de fago conforme descrito aqui, neste pedido de patente, é substituída com um repertório de genes de domínio V humanos, criando uma população de quimeras de scFv ou Fab de cadeia não humana/cadeia humana. A seleção com antígeno resulta no isolamento de um scFv ou Fab quimérico de cadeia não humana/cadeia humana em que a cadeia humana restaira o sítio de ligação ao antígeno destruído depois da remoção da cadeia não humana correspondente no clone de display de fago primário, isto é, o epitopo governa a escolha do parceiro de cadeia humana. Quando o processo é repetido de modo a substituir a cadeia não humana remanescente, é obtido um anticorpo humano (vide a publicação de patente internacional PCT No. WO 93/06213 publicada em 1º. de abril de 1993). Diferentemente da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxerto de CDR, esta técnica proporciona anticorpos completamente humanos, os quais não têm resíduos FR ou CDR de origem não humana.

4. Anticorpos Biespecíficos

[0174] Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em algumas modalidades, uma das especificidades de ligação é para Siglec-8 e a outra é para qualquer outro antígeno. Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epitopos de Siglec-8 diferentes. Os anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células, as quais expressem Siglec-8. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab′)2).

[0175] Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Vide Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983), Patente Internacional Nº. WO 93/08829 publicada em 13 de maio de 1993, e Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991). Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando qualquer método de reticulação conveniente. Agentes de reticulação adequados são de conhecimento geral na arte, e são revelados na Pat. U.S. Nº. 4.676.980, junto com uma série de técnicas de reticulação.

5. Anticorpos de Domínio Único

[0176] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo de domínio único. Um anticorpo de domínio único é uma cadeia polipeptídica de domínio único compreendendo todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em algumas modalidades, um anticorpo de domínio único é anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; vide, por exemplo, a Pat. U.S. Nº. 6.248.516 B1). Em uma modalidade, um anticorpo de domínio único consiste em todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo.

6. Variantes de Anticorpos

[0177] Em algumas modalidades, são contempladas uma ou mais modificações das sequências de aminoácidos dos anticorpos descritos aqui, neste pedido de patente. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes das sequências de aminoácidos do anticorpo podem ser preparadas introduzindo alterações apropriadas dentro da sequência nucleotídeos codificando o anticorpo, ou por síntese de peptídeos. As modificações referidas incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições, de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Pode ser feita qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição para chegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as características desejadas. As alterações dos aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do anticorpo do sujeito no momento em que a sequência é produzida.

[0178] Um método útil para a identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferenciais para mutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina" conforme descrito por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-

1085. Aqui, é identificado um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. As localizações de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional para as substituições são em seguida refinadas, introduzindo variantes adicionais ou diversas em, ou para, os sítios de substituição. Deste modo, enquanto o sítio para a introdução de uma variação da sequência de aminoácidos é predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar a performance de uma mutação em um dado sítio, é conduzida mutagênese de varredura de alanina ou aleatória no códon ou região alvo e as imunoglobulinas expressas são triadas para a atividade desejada.

[0179] Inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena de resíduos ou mais, bem como inserções intra-sequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila no terminal amino. Ourtras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal amino ou carboxila do anticorpo a uma enzima ou um polipeptídeo, o que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

[0180] Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem no terminal carboxila na cadeia pesada e/ou na cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no terminal carboxila de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas modalidades, a clivagem no terminal carboxila remove uma lisina do terminal carboxila da cadeia pesada. Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais têm uma clivagem no amino na cadeia pesada e/ou na cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos são clivados no terminal amino de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas modalidades, formas truncadas de anticorpos monoclonais podem ser produzidas por técnicas recombinantes.

[0181] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão na qual o anticorpo é glicosilado. A glicosilação de polipeptídeos tipicamente ou é N-ligada ou é O-ligada. N-ligada refere-se à anexação de uma porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido com exceção de prolina, são as sequências de reconhecimento para anexação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Deste modo, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora também possa ser usado 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.

[0182] A adição ou deleção de sítios de glicosilação ao anticorpo é realizada convenientemente alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que uma ou mais das sequências tripeptídicas acima descritas (para sítios de glicosilação N-ligados) são criadas ou removidas. A alteração também pode ser feita pela adição, deleção, ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

[0183] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato anexado ao mesmo pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato maduro que carece de fucose anexada a uma região Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº US 2003/0157108 (Presta, L.). Vide também US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Anticorpos com uma N-acetilglucosamina bisseccionando (GlcNAc) nop carboidrato anexado a uma região Fc do anticorpo são referidos na Patente Internacional Nº. WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. e na Pat. U.S. Nº. 6,602,684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo anexado a uma região Fc do anticorpo são reportados na Patente Internacional Nº. WO 1997/30087, Patel et al. Vide, também, a Patente Internacional Nº. WO 1998/58964 (Raju, S.) e na Patente Internacional Nº. WO

1999/22764 (Raju, S.) referente a anticorpos com carboidrato alterado anexado à região Fc do mesmo. Vide também a Patente US 2005/0123546 (Umana et al.) sobre moléculas de ligação ao antígeno com glicosilação modificada.

[0184] Em algumas modalidades, uma variante de glicosilação compreende uma região Fc, em que uma estrutura de carboidrato anexada à região Fc carece de fucose. As variantes referidas têm função de ADCC aprimorada. Opcionalmente, a região Fc adicionalmente compreende uma ou mais substituições de aminoácidos na mesma, as quais aprimoram mais a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos da União Europeia). Exemplos de publicações relacionadas com anticorpos "desfucosilados" ou "deficientes de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares produtoras de anticorpos desfucosilados incluem céllas Lec13 CHO deficientes em fucosilação de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533- 545 (1986); Pedido de Patentes dos Estados Unidos Nº. US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares de nocaute, tais como o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO de nocaute (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)), e células superexpressando β1,4-N-acetilglicosminiltransferase III (GnT-III) e Golgi μ-manosidase II (ManII).

[0185] São contemplados anticorpos aqui, neste pedido de patente, que têm fucose reduzida em relação à quantidade de fucose sobre o mesmo anticorpo produzido em uma célula CHO selvagem. Por exemplo, o anticorpo tem uma menor quantidade de fucose do que teria de modo diverso, caso produzido por células CHO nativas (por exemplo, uma célula CHO que produz um padrão de glicosilação nativo, tal como uma célula CHO contendo um gene FUT8 nativo). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 proporcionado aqui, neste pedido de patente, é um anticorpo em que menos de cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% dos glicanos N-ligados sobre o mesmo compreendem fucose. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Siglec-8 proporcionado aqui, neste pedido de patente, é um anticorpo em que nenhum dos glicanos N-ligados sobre o mesmo compreendem fucose, isto é, em que o anticorpo é completamente sem fucose, ou não tem fucose ou é não fucosilado ou é afucosilado. A quantidade de fucose pode ser determinada calculando a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas anexadas a Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbrida e de alto teor de manose) conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito em WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagine localizado em torno da posição 297 na região Fc (numeração da União Europeia de resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência nos anticorpos. Em algumas modalidades, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[0186] Em uma modalidade, o anticorpo é alterado para aprimorar sua meia-vida sérica. Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo,

pode-se incorporar um epitopo de ligação ao receptor selvagem dentro do anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Pat. U.S. Nº. 5.739.277, por exemplo. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "epitopo de ligação ao receptor selvagem" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável por aumentar a meia-vida sérica in vivo da molécula de IgG (US 2003/0190311, Pat. U.S. Nº. 6.821.505; Pat. U.S. Nº. 6.165.745; Pat. U.S. Nº. 5.624.821; Pat. U.S. Nº. 5.648.260; Pat. U.S. Nº. 6.165.745; Pat. U.S. Nº. 5.834.597).

[0187] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são mostradas na Tabela 5 sob o título de "substituições preferenciais". Se as substituições referidas resultarem em uma alteração desejável na atividade biológica, então podem ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 5, ou conforme adicionalmenter descrito abaixo em referência a classes de aminoácidos, e os produtos triados.

Tabela 5. Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferenciais Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; Ile (I) Leu Norleucina Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Leu (L) Ile Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Val (V) Leu Norleucina

[0188] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas selecionando substituições que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da espinha dorsal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) acidíferos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H)

[0189] Alternativamente, resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos com base em propriedades das cadeias laterais comuns: (1) hidrofóbicos: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutros hidrofílicos: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidíferos: Asp, Glu; (4) ásicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0190] Substituições não conservadoras vão acarretar a troca de um membro de uma destas classes por outra classe. Os resíduos substituídos referidos também podem ser introduzidos dentro dos sítios de substituições conservadoras ou, dentro dos sítios remanescentes (não conservadoras).

[0191] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos de regiões hipervariáveis de um anticorpo parental

(por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a uma ou mais variantes resultantes selecionadas para desenvolvimento adicional vão ter propriedades biológicas modificadas (por exemplo, aprimoradas) em relação ao anticorpo parental a partir do qual foram geradas.

Um modo conveniente para produzir as variantes substitucionais referidas envolve maturação por afinidade usando display de fago.

Em resumo, vários sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada sítio.

Os anticorpos gerados deste modo são apresentados a partir de partículas de fagos filamentosos como fusões para pelo menos parte de uma proteína da capa do fago (por exemplo, o produto genético III de M13) embalada dentro de cada partícula.

As variantes de display de fago são em seguida triadas para sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). De modo a identificar sítios de regiões hipervariáveis candidatos para modificação, pode ser realizada mutagênese de varredura (por exemplo, varredura de alanina) para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para ligação ao antígeno.

Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo de antígeno-anticorpo para identificar opntos de contato entre o anticorpo e o antígeno.

Os resíduos de contato referidos e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com técnicas conhecidas na arte, incluindo as elaboradas aqui, neste pedido de patente.

Assim que as variantes referidas são geradas, o painel de variantes é submetido a triagem usando técnicas conhecidas na arte, incluindo as descritas aqui, neste pedido de patente, e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento posterior.

[0192] Moléculas de ácido nucleico codificando variantes das sequências de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na arte. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos que ocorrem naturalmente) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada ao sítio), mutagênese por PCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo.

[0193] Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos em uma região Fc de anticorpos da presente invenção, deste modo gerando uma variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos incluindo uma posição de uma cisteína de articulação. Em algumas modalidades, a variante de região Fc compreende uma região Fc de IgG4 humana. Em uma modalidade adicional, a região Fc de IgG4 humana compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice da União Europeia como em Kabat.

[0194] De acordo com esta descrição e com os ensinamentos na arte, é contemplado que, em algumas modalidades, um anticorpo da presente invenção pode compreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo homólogo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos, não obstante, iriam reter substancialmente as mesmas características requeridas para utilidade terapêutica, em comparação com seu homólogo selvagem. Por exemplo, imagina-se que podem ser feitas determinadas alterações na região Fc, que resultariam em ligação a C1q alterada (isto é, ou aumentada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade dependente do complementp (CDC), por exemplo, conforme descrito em WO99/51642. Vide também Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Pat. U.S. Nº. 5.648.260; Pat. U.S. Nº.

5.624.821; e WO94/29351 com relação a outros exemplos de variantes de região Fc. WO00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpos com ligação aumentada ou diminuída a FcRs. O conteúdo destas publicações de patente é especificamente incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência. Vide, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação aumentada ao receptor de Fc neonatal (FcRn), o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições na mesma, as quais aprimoram a ligação da região Fc ao FcRn. Variantes de polipeptídeos com sequências de aminoácidos de regiões Fc alteradas e capacidade de ligação a C1q aumentada ou diminuída são descritas na Pat. U.S. Nº. 6.194.551B1, e em WO99/51642. O conteúdo destas publicações de patente é especificamente incorporado aqui, a este pedido de patente, por meio de referência. Vide, também, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

7. Vetores, Células Hospedeiras, e Métodos Recombinantes

[0195] Para produção recombinante de um anticorpo da presente invenção, o ácido nucleico codificando o mesmo é isolado e inserido dentro de um vetor replicável para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA codificando o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligarem especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Estão disponiveis muitos vetores. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira a ser usada. De modo geral, as células hospedeiras são de origem ou procariótica ou eucariótica (geralmente de mamífero). Será reconhecido que regiões constantes de qualquer isóitipo podem ser usadas para este fim, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, e que as regiões constantes referidas podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. Produção de Anticorpos Usando Células Hospedeiras Procarióticas: a) Construção de Vetor

[0196] Sequências de polinucleotídeos codificando componentes polipeptídicos do anticorpo da presente invenção podem ser obtidas usando técnicas recombinantes de rotina. As sequências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células produtoras de anticorpos, tais como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados usando sintetizador de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Assim que obtidas, as sequências codificando os polipeptídeos são inseridas dentro de um vetor recombinante capaz de replicação e expressando polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos na arte podem ser usados para os fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado vai depender essencialmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos dentro do vetor e da célula hospedeira em particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambas) e de sua compatibilidade com a célula hospedeira em particular na qual reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação ao ribossoma (RBS), uma sequência de sinalização, a inserção de ácido nucleico heterólogo e uma sequência de terminação de transcrição.

[0197] Em geral, vetores de plasmídeos contendo replicon e sequências de control as quais são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetor ordinariamente carrega um sítio de replicação, bem como sequências de marcação, as quais são capazes de proporcionar seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformada usando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. pBR322 contém genes codificando resistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e portanto proporciona meios fáceis para a identificação de células transformadas. pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago também pode conter, ou ser modificado para conter, promotores os quais podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 usados para expressão de anticorpos particulares são descritos em detalhes em Carter et al., Pat. U.S. Nº.

5.648.237.

[0198] Além disso, vetores de fago contendo replicon e sequências de controle que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser usados como vetores transformante em conexão com estes hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago tal como λGEM.TM.-11 pode ser utilizado na produção de um vetor recombinante, o qual pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como LE392 de E. coli.

[0199] O vetor de expressão da presente invenção pode compreender dois ou mais pares de promotor-cistron, codificando cada um dos componentes polipeptídicos. Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizadas a montante (5′) para um cistron que modula sua expressão. Promotores procarióticos tipicamente se encaixam em duas classes, indutíveis e constitutivos. Promotos indutível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cistron sob seu controle em resposta a alterações na condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura.

[0200] Um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são de conhecimernto geral. O promotor selecionado pode ser ligado operacionalmente a DNA do cistron codificando a cadeia leve ou pesada removendo o promotor do DNA de origem por meio de digestão enzimática de restrição e inserindo a sequência de promotor isolado dentro do vetor da presente invenção. Tanto a sequência de promotor nativo quanto muitos promotores heterólogos podem ser usados para direcionar a amplificação e/ou expressão dos genes alvo. Em algumas modalidades, são utilizados promotores heterólogos, uma vez que geralmente permitem maior transcrição e maiores produções de gene alvo expresso em comparação com o promotor polipeptídico alvo nativo.

[0201] Promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores de β- galactamase e lactose, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac ou o promotor trc. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos ou de fago conhecidos) são também são adequados. Suas sequências de nucleotídeos foram publicadas, deste modo possibilitando a um trabalhador qualificado ligar operacionalmente as mesmas a cistrons codificando as cadeias leves e pesadas alvo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) usando encadeadores ou adaptadores para suprir quaisquer sítios de restrição requeridos.

[0202] Em um aspecto da presente invenção, cada cistron dentro do vetor recombinante compreende um componente de sequência de sinal de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido dentro do vetor. A sequência de sinal selecionada para os fins da presente invenção deve ser uma sequência de sinal que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, entre o grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicillinase, Ipp, ou guias de enterotoxinas termo-estáveis II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma modalidade da presente invenção, as sequências de sinal usadas em ambos os cistrons do sistema de expressão são sequências de sinal STII ou variantes das mesmas.

[0203] Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e, portanto, não requer a presença de sequências de sinal de secreção dentro de cada cistron. A este respeito, cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Algumas cepas hospedeiras (por exemplo, as cepas de E. coli trxB) proporcionam condições do citoplasma que são favoráveis para a formação de ligações de dissulfeto, deste modo permitindo o adequado dobramento e montagem de subunidades de proteínas expressas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

[0204] Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos usando um sistema de expressão no qual a proporção quantitativa de componentes polipeptídicos expressos pode ser modulada, de modo a maximizar a produção de anticorpos secretados e adequadamente montados da presente invenção. A modulação referida é realizada pelo menos em parte por modulação simultaneamente das forças translacionais para os componentes polipeptídicos.

[0205] Uma técnica para modulação de força translacional é revelada em Simmons et al., Pat. U.S. Nº. 5.840.523. A técnica utiliza variantes da região de iniciação translacional (TIR) dentro de um cistron. Para uma dada TIR, pode ser criada uma série de variantes de sequências de aminoácidos ou de ácido nucleicoi com uma gama de forças translacionais, deste modo proporcionando meios convenientes pelos quais adjustar este fator para o nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes de TIR podem ser geradas por técnicas de mutagênese convencionais que resultam em alteraçõs de codons, as quais podem alterar a sequência de aminoácidos. Em algumas modalidades, as alterações na sequência de nucleotideos são silenciosas. As alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento de sequências de Shine-Dalgarno, junto com alterações na sequência de sinal. Um método para gerar sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de codons" no início de uma sequência codificante que não modifique a sequência de aminoácidos da sequência de sinal (isto é, as alterações são silenciosas). Isto pode ser realizado modificando a posição do terceiro nucleotídeo de cada codon; adicionalmente, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina, e arginina, têm múltiplas primeira e segunda posições que podem adicionar complexidade na produção do banco. Este método de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.

[0206] Em uma modalidade, é gerado um conjunto de vetores com uma faixa de forças de TIR para cada cistron nos mesmos. Iste conjunto limitado proporciona uma comparação dos níveis de expressão de cada cadeia bem como a produção dos produtos de anticorpos desejados sob várias combinações de forças de TIR. As forças de TIR podem ser determinadas quantificando o nível de expressão de um gene reporter conforme descrito em detalhes em Simmons et al. Pat. U.S. Nº.

5.840.523. Com base na comparação das forças translacionais, as TIRs individuais desejadas são selecionadas para serem combinadas nos constructos dos vetores de expressão da presente invenção.

[0207] Células hospedeiras procarióticas adequadas para expressão dos anticorpos da presente invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas espécies (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em uma modalidade, são usadas células gram-negativas. Em uma modalidade, células de E. coli são usadas como hospedeiras para a presente invenção. Exemplos de cepas de E. coli incluem a cepa

W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) e derivados da mesma, incluindo a cepa 33D3 tendo o genótipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (Pat. U.S. Nº. 5.63***). Outras cepas e derivados das mesmas, tais como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliλ 1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308 (ATCC 31,608) também são adequados. Estes exemplos são ilustrativos, ao invés de limitanets. Métodos para construir derivados de quaisquer das bactérias acima mencionadas tendo genótipos definidos são conhecidos na arte e estão descritos, por exemplo, em Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bactérias apropriadas levandop em conta a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies de E. coli, Serratia, ou Salmonella podem ser usadas convenientemente como o hospedeiro, quando plasmídeos de conhecimernto geral tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para suprir o replicon. Tipicamente a célula hospedeira vai secretar mínimas quantidades de enzimas proteolíticas, e inibidores da protease adicionais desejavelmente podem ser incorporados na cultura celular. b) Produção de Anticorpos

[0208] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão acima descritos e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas.

[0209] Transformação significa introdução de DNA dentro do hospedeiro procariótico de modo que o DNA seja replicável, quer como um elemento extracromossômico ou por integrante cromossômico. Dependendo da célula hospedeira usada, é feita transformação usando técnicas de rotina apropriadas para as células referidas. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio geralmente é usado para células bacterians que contêm barreiras da parede celular substanciais. Outro método para transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Ainda outra técnica usada é eletroporação.

[0210] As células procarióticas usadas para produzir os polipeptídeos da presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na arte e adequados para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo de luria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Em algumas modalidades, o meio também contém um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas contendo o vetor de expressão. Por exemplo, ampicilina é adicionada ao meio para crescimento de células expressando gene resistente a ampicilina.

[0211] Quaisquer suplementos necessários além de carbono, nitrogênio, e fontes de fosfato inorgânico também podem ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidos isolados ou como uma mistura com outro suplemento ou meio, tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados entre o grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

[0212] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas em temperaturas adequadas. Em algumas modalidades, para o crescimento de E. coli, as temperaturas de crescimento variam de cerca de 20°C. a cerca de 39°C.; de cerca de 25°C. a cerca de 37°C.; ou cerca de 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pH variando de cerca de 5 a cerca de 9,

dependendo essencialmente do organismo hospedeiro. Em algumas modalidades, para E. coli, o pH é de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, ou cerca de 7,0.

[0213] Se um promotor indutível for usado no vetor de expressão da presente invenção, a expressão de proteínas é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção, promotores PhoA são usados para controlar a transcrição dos polipeptídeos. Por conseguinte, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio de limitação de fosfato para indução. Em algumas modalidades, o meio de limitação de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Pode ser usada uma variedade de outros indutores, de acordo com o constructo vetorial empregado, conforme é de conhecimento na arte.

[0214] Em uma modalidade, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados dentro e recuperados do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteínas tipicamente envolve romper o microorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação ou lise. Assim que as células são rompidas, fragmentos celulares ou células inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia por resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para dentro do meio de cultura e isoladas do mesmo. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura sendo filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmente isolados e identificados usando métodos conhecidos comumente, tais como eletroforese por gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot.

[0215] Em um aspecto da presente invenção, a produção de anticorpos é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação em lote de alimentação em larga escala estão disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Fermentações em larga escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, e em algumas modalidades, cerca de 1.000 a

100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores usam impulsores de agitatadores para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose. Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em um fermentador que tem não mais de aproximadamente 100 litros em capacidade volumétrica, e podem variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.

[0216] Em um processo de fermentação, a indução de expressão de proteínas tipicamente é iniciada depois das células terem sido cultivadas sob condições adequadsa até uma densidade desejada, por exemplo, uma OD550 de cerca de 180 a 220, em cujo estágio as células estão na fase estacionária inicial. Pode ser usada uma variedade de indutores, de acordo com o constructo vetorial empregado, conforme é de conhecimento na arte e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células geralmente são induzidsa por cerca de 12 a 50 horas, embora possa ser usado um tempo de indução mais longo ou mais curto.

[0217] Para aprimorar o rendimento da produção e a qualidade dos polipeptídeos da presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para aprimorar a adequada montagem e dobramento dos polipeptídeos de anticorpos secretados, vetores adicionais suprexpressando proteínas chaperone, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis,trans-isomerase com atividade de chaperone) podem ser usados para cotransformar as células procarióticas hospedeiras. Foi demonstrado que as proteínas chaperone facilitam o adequado dobramento e a solubilidade das proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., Pat. U.S. Nº. 6.083.715; Georgiou et al., Pat. U.S. Nº. 6.027.888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

[0218] Para minimizar a proteólise das proteínas heterólogas expressas (especialmente as proteínas heterólogas que são proteoliticamente sensíveis), algumas cepas hospedeiras deficientes para enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, cepas de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar uma ou mais mutações genéticas nos genes codificando proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações das mesmas. Algumas cepas deficientes de protease de E. coli estão disponíveis e são descritas, por exemplo, em Joly et al. (1998), supra; Georgiou et al., Pat. U.S. Nº. 5.264.365; Georgiou et al., Pat. U.S. Nº.

5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

[0219] Em uma modalidade, cepas de E. coli deficientes para enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos superexpressando uma ou mais proteínas chaperona são usadas como células hospedeiras no sistema de expressão da presente invenção. c) Purificação de Anticorpos

[0220] Em uma modalidade, a proteína do anticorpo produzida aqui, neste pedido de patente, é adicionalmente purificada para obter preparações que são substancialmente homogêneas para testes e usos adicionais. Podem ser empregados métodos de purificação de proteínas de rotina conhecidos na arte. Os procedimentos que se seguem são exemplares de procedimentos de purificação adequados: fracionamento sobre colunas de imunoafinidade ou de permuta de íons, precipitação por etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de permuta de cátions tal como DEAE, cromatofocagem, SDS- PAGE, precipitação por sulfato de amônio, e filtração por gel usando, por exemplo, Sephadex G-75.

[0221] Em um aspecto, Proteína A imobilizada sobre uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade dos produtos de anticorpos da presente invenção. Proteína A é uma proteína da parede celular de 41 kD de Staphylococcus áureas, a qual se liga com uma alta afinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fased sólida à qual a Proteína A é imobilizada pode ser uma coluna compreendendo uma superfície de sílica ou vidro, ou uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol, de modo a prevenir possivelmente a aderência inespecífica de contaminantes.

[0222] Como a primeira etapa de purificação, uma preparação derivada da cultura celular conforme descrito acima pode ser aplicada sobre uma fase sólida de Proteína A imobilizada para permitir ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida em seguida vai ser lavada para remover contaminantes ligados inespecificamente à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por elutriação.

Produção de Anticorpos Usando Células Hospedeiras Eucarióticas:

[0223] Um vetor para utilização em uma célula hospedeira eucariótica geralmente inclui um ou mais dos seguintes componentes não limitantes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadorse, um elemento reforçador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição. a) Componente da Sequência de Sinal

[0224] Um vetor para utilização em uma célula hospedeira eucariótica também pode conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sít io de clivagem específico no terminal amino da proteína madura ou do polipeptídeo de interesse. A sequência de sinal heteróloga selecionada pode ser uma sequência de sinal que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em expressão de células de mamífero, estão disponíveis sequências de sinal de mamífero bem como líderes secretores virais, por exemplo, a sequência de sinal gD do herpes simplex. O DNA para uma região precursora semelhante é ligado no frame de leitura ao DNA codificando o anticorpo. b) Origem de Replicação

[0225] Geralmente, um componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem SV40 tipicamente pode ser usada somente porque contém o promotor precoce. c) Componente Genético de Seleção

[0226] Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina,

metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, onde relevante, ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis no meio complexo.

[0227] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína conferindo resistência a fármaco e portanto sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de semelhante seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0228] Outro exemplo de marcadores selecionáveis para células de mamífero são os marcadores selecionáveis que possibilitam a identificação de células competentes para capturar o ácido nucleico do anticorpo, tais como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-I e -II, genes de metalotioneína de primatas, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.

[0229] Por exemplo, em algumas modalidades, células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiro identificadas cultivando todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo da DHFR. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira apropriada, quando se emprega DHFR selvagem, é a linhagem, celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

[0230] Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiras selvagens que contêm DHFR endógena) transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA codificando um anticorpo, proteína DHFR selvagem, e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3′-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Vide a Pat. U.S. Nº.

4.965.199. As células hospedeiras podem incluir NS0, CHOK1, CHOK1SV ou derivados, incluindo linhagens celulares deficientes em glutamina sintetase (GS). Métodos para o uso de GS como um marcador selecionável para células de mamífero são descritos na Pat. U.S. Nº.

5.122.464 e na Pat. U.S. Nº. 5.891.693. d) Componente Promotor

[0231] Vetores de expressão e clonagem teralmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado operacionalmente a ácido nucleico codificando um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um anticorpo). Sequências de promotores são conhecidas para eucariotas. Por exemplo, virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3′ da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda de poli A à extremidade 3′ da sequência codificante. Em algumas modalidades, qualquer uma ou todas estas sequências podem ser inseridas convenientemente dentro de vetores de expressão eucariótica.

[0232] A transcrição de vetores em células hospedeiras de,mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como o polioma vírus, o vírus da varíola, o adenovírus (tal como o Adenovírus 2), o vírus do papiloma bovino, o sarcoma vírus aviário, o citomegalovírus, um retrovírus, o vírus da hepatite B e o Vírus Símio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, contanto que os promotores referidos sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros.

[0233] Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são obtidos convenientemente como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para a expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o papiloma vírus bovino como um vetor é revelado na Pat. U.S. Nº. 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Pat. U.S. Nº. 4.601.978. Vide também Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982), descrevendo a expressão de cDNA de β- interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase do vírus herpes simples. Alternativamente, a repetição de terminal longo do Vírus de Sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor. e) Componente de Elemento Reforçador

[0234] A transcrição de DNA codificando um anticorpo da presente invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência de reforçador dentro do vetor. Atualmente, muitas sequências de reforçador são conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, e insulina). Tipicamente, no entanto, se usaria um reforçador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o reforçador SV40 sobre o lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o reforçador do promotor precoce de citomegalovírus humano, o reforçador do promotor precoce de citomegalovírus de camundongo, o reforçador de polioma sobre o lado tardio da origem de replicação, e reforçadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) descrevendo elementos reforçadores para ativação de promotores eucarióticos. O reforçador pode ser emendado dentro do vetor em uma posição 5′ ou 3′ à sequência codificando o polipeptídeo do anticorpo, mas geralmente está localizado em um sítio 5′ do promotor. f) Componente de Terminação de Transcrição

[0235] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas também podem conter sequências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilização do mRNA. As sequências referidas estão disponíveis comumente nas regiões 5′ e, ocasionalmente 3′, não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA codificando um anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Vide WO94/11026 e o vetor de expressão revelado na mesma. g) Seleção e Transformação de Células Hospedeiras

[0236] Células hospedeiras adequadsa para clonagem ou expressando o DNA nos vetores aqui, neste pedido de patente, incluem células eucariotas superiores descritas aqui, neste pedido de patente, incluindo células hospedeiras de 0vertebrados. A propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linhagem renal embrionária humana (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células renais de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês /-DHFR

(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células renais de camundongo (CV1 ATCC CCL 70); células renais de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de figado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de figado humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; células CHOK1, células CHOK1SV ou derivados e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

[0237] Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem acima descritos para produção de anticorpos e cultivadas em meios nutrientes convencionais, conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. h) Cultura das Células Hospedeiras

[0238] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios disponíveis comercialmente tais como o meio de Ham F10 (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Além disso, quaisquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), nas Pat. U.S. Nº. 4.767.704; 4.657.866;

4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Pat. U.S. Re. 30,985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidermal), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam de conhecimento dos peritos na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são as condições previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expresão, e serão evidentes para o técnico ordinariamente versado. i) Purificação de Anticorpo

[0239] Ao usar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, ou secretado diretamente dentro do meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os fragmentos particulados, quer células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Onde o anticorpo é secretado dentro do meio, os sobrenadantes de semelhantes sistemas de expressão podem ser primeiro concentrados usando um filtro de concentração proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor da protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas precedentes, para inibir proteólise, e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes acidentais.

[0240] A composição de anticorpos preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese por gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo uma técnica conveniente. A conveniência da Proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isótipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Methods 62:1-13 (1983)). A Proteína G é recomendada para todos os isótipos de camundongo e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é anexado pode ser agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos que podem ser obtidos com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fracionamento sobre uma coluna de permuta de íons, precipitação por etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE™ cromatografia sobre uma resina de permuta de ânion ou cátion (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS- PAGE, e precipitação com sulfato de amônio também estão disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[0241] Depois de qualquer etapa ou quaisquer etapas de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a purificação adicional, por exemplo, por cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH usando um tampão de elutriação em um pH entre cerca de 2,5 a 4,5, realizada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0 a 0,25 M de sal).

[0242] Em geral, várias metodologias para a preparação de anticorpos para utilização em pesquisa, experimentação, e uso clínico são bem estabelecidas na arte, consistentes com as metodologias acima descritas e/ou conforme considerado apropriado por um perito na arte para um anticorpo de interesse em particular. Produção de anticorpos não fucosilados

[0243] São proporcionados aqui, neste pedido de patente, métodos para a preparação de anticorpos com um grau de fucosilação reduzido. Por exemplo, os métodos contemplados aqui, neste pedido de patente, incluem, mas não estão limitados a, uso de linhagens celulares deficientes em fucosilação de proteínas (por exemplo, células Lec13 CHO, células CHO de nocaute do gene alfa-1,6-fucosiltransferase, células superexpressando β1,4-N-acetilglicosminiltransferase III e superexpressando adicionalmente Golgi μ-manosidase II, etc.), e adição de um ou mais análogos de fucose em um meio de cultura celular usado para a produção dos anticorpos. Vide Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente dos Estados Unidos No US 2003/0157108 A1, Presta, L; WO 2004/056312 A1; Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); e US Pat. No. 8.574.907. Técnicas adicionais para a redução do teor de fucose dos anticorpos incluem a tecnologia Glymaxx descrita na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0214975. Técnicas adicionais para redução do teor de fucose dos anticorpos também incluem a adição de um ou mais inibidores da glicosidase em um meio de cultura celular usado para a produção dos anticorpos. Os inibidores da glicosidase incluem α- glucosidase I, α-glucosidase II, e α-manosidase I. Em algumas modalidades, o inibidor da glicosidase é um inibidor da α-manosidase I (por exemplo, kifunensina).

[0244] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "fucosilação de núcleo" refere-se à adição de fucose ("fucosilação") a N- acetilglucosamina ("GlcNAc") no terminal redutor de um glicano N-ligado. Tamnbém são proporcionados anticorpos produzidos por métodos semelhantes e composições dos mesmos.

[0245] Em algumas modalidades, a fucosilação de cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexo ligadas à região Fc (ou domínio) é reduzida. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, uma "cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo" é tipicamente ligada à asparagina 297 (de acordo com o número de Kabat), embora uma cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo também possa ser ligada a outros resíduos de asparagina. Uma "cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo" exclui uma cadeia de açúcar do tipo de alto teor de manose, na qual somente manose é incorporada no terminal não redutor da estrutura de núcleo, mas inclui 1) um tipo complexo, no qual o lado do terminal não redutor da estrutura de núcleo tem uma ou mais ramificações de galactose-N-acetilglucosamina (também referida como "gal-GlcNAc") e o lado do terminal não redutor de Gal-GlcNAc opcionalmente tem um ácido siálico, N-acetilglucosamina bisseccionando ou semelhante; ou 2) um tipo híbrido, no qual o lado do terminal não redutor da estrutura de núcleo tem tanto as ramificações da cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo de alto teor de manose quanto da a cadeia de açúcar ligada a N-glicosídeo complexo.

[0246] Em algumas modalidades, uma "cadeia de açúcar ligada a N- glicosídeo complexo" inclui um tipo de complexo no qual o lado do terminal não redutor da estrutura de núcleo tem zero, uma ou mais ramificações de galactose-N-acetilglucosamine (também referida como "gal-GlcNAc") e o lado do terminal não redutor de Gal-GlcNAc opcionalmente tem adicionalmente uma estrutura tal como ácido siálico, N-acetilglucosamina bisesccionando ou semelhante.

[0247] De acordo com os presentes métodos, tipicamente somente uma menor quantidade de fucose é incorporada dentro da uma ou mais cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexo. Por exemplo, em várias modalidades, menos de cerca de 60%, menos de cerca de 50%, menos de cerca de 40%, menos de cerca de 30%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 5%, ou menos de cerca de 1% do anticorpo tem fucosilação do núcleo por fucose em uma composição. Em algumas modalidades, substancialmente nenhum (isto é, menos de cerca de 0,5%) do anticorpo tem fucosilação do núcleo por fucose em uma composição. Em algumas modalidades, mais de cerca de 40%, mais de cerca de 50%, mais de cerca de 60%, mais de cerca de 70%, mais de cerca de 80%, mais de cerca de 90%, mais de cerca de 91%, mais de cerca de 92%, mais de cerca de 93%, mais de cerca de 94%, mais de cerca de 95%, mais de cerca de 96%, mais de cerca de 97%, mais de cerca de 98%, ou mais de cerca de 99% do anticorpo é não fucosilado em uma composição.

[0248] Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo em que substancialmente nenhuma (isto é, menos de cerca de 0,5%) das cadeias de carboidratos ligadas a N- glicosídeo contém um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um anticorpo em que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo são não fucosiladas.

[0249] Conforme descrito acima, pode ser utilizada uma variedade de sistemas de vetores de expressão em hospedeirtos mamíferos para expressar um anticorpo. Em algumas modalidades, o meio de cultura não é suplementado com fucose. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um análogo de fucose é adicionada ao meio de cultura. Neste contexto, uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade do análogo que é suficiente para diminuir a incorporação de fucose dentro uma cadeia de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexo de um anticorpo por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50%. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos pelos presentes métodos compreendem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% de proteína não fucosilada no núcleo (por exemplo, carecendo de fucosilação do núcleo), em comparação com anticorpos produzidos a partir das células hospedeias cultivadas na ausência de um análogo de fucose.

[0250] O teor (por exemplo, a proporção) de cadeias de açúcar nas quais fucose não é ligada a N-acetilglucosamina na extremidade retudora da cadeia de açúcar versus cadeias de açúcar nas quaIS fucose é ligada a N-acetilglucosamina na extremidade retudora da cadeia de açúcar pode ser determinado, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos. Outros métodos incluem hidrazinólise ou digestão enzimática (vide, por exemplo, Biochemical Experimentation Methods 23: Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), editado por Reiko Takahashi (1989)), marcação com fluorescência ou marcação com radioisótopos da cadeia de açúcar liberada e em seguida separando a cadeia de açúcar marcada por cromatografia. Além disso, as composições das cadeias de açúcar liberadas podem ser determinadas analisando as cadeias pelo método HPAEC-PAD (vide, por exemplo, J. Liq Chromatogr. 6:1557 (1983)). (vide de modo geral, a Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº. 2004/0110282.). III. Composições

[0251] Em alguns aspectos, também são proporcionadas aqui, neste pedido de patente, composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo quaisquer dos anticorpos anti-Siglec-8 descritos aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8). Em alguns aspectos, é proporcionada aqui, neste pedido de patente, uma composição compreendendo um anticorpo anti- Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, em que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N- glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de cerca de 50% das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo contêm um resíduo de fucose. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, ou cerca de 15% das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo contêm um resíduo de fucose. Em alguns aspectos, é proporcionada aqui, neste pedido de patente, uma composição compreendendo um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, em que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que substancialmente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N- glicosídeo contém um resíduo de fucose.

[0252] As formulações therapêuticas são preparadas para armazenamento misturando o ingrediente ativo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro Ed., Philadelphia, Pa. 2000). Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, antioxidantes incluindo ácido ascórbico, metionina, Vitamina E, metabissulfito de sódio; conservantes, isotonicificantes, estabilizantes, complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn- proteína); agentes quelantes tais como EDTA e/ou tensoativos não iônicos.

[0253] Tampões podem ser usados para controlar o pH em uma faixa que otimize a efetividade terapêutica, especialmente se a estabilidade for dependente do pH. Tampões podem estar presentes em concentrações variando de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM. Agentes de tamponamento adequados para utilização com a presente invenção incluem tanto ácidos orgânicos quanto inorgânicos e sais dos mesmos. Por exemplo, citrato, fosfato, succinato, tartarato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Adicionalmente, tampões podem consistir em sais de histidina e trimetilamina tais como Tris.

[0254] Conservantes podem ser adicionados para prevenir o crescimento microbiano, e tipicamente estão presentes em uma faixa de cerca de 0,2% a 1,0% (em peso/volume). Conservantes adequados para utilização com a presente invenção incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; haletos de benzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de benzetônio; timerosal, fenol, butil ou álcool benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3- pentanol, e m-cresol.

[0255] Agentes de tonicidade, algumas vezes conhecidos como

"estabilizantes" podem estar presentes para ajustar ou manter a tonicidade de líquido em uma composição. Quando usados com biomoléculas biocarregadas e grandes tais como proteínas e anticorpos, frfequentemente são denominados "estabilizantes" porque podem interagir com os grupos carregados das cadeias laterais dos aminoácidos, deste modo reduzindo o potencial interações para inter e intra-moleculares. Os agentes de tonicidade podem estar presentes em qualquer quantidade entre cerca de 0,1% a cerca de 25% por peso ou entre cerca de 1 a cerca de 5% por peso, tendo em contga as quantidades relativas dos outros ingredientes. Em algumas modalidades, os agentes de tonicidade incluem álcoois de açúcares polihídricos, álcoois de açúcares trihídricos ou superiores, tais como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.

[0256] Excipientes adicionais incluem agentes os quais podem servir como um ou mais dos seguintes: (1) agentes de volume, (2) reforçadores da solubilidade, (3) estabilizantes e (4) e agentes prevenindo desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Os excipientes referidos incluem: álcoois de açúcares polihídricos (enumerados acima); aminoácidos tais como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc.; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcares tais como sacarose, lactose, lactitol, trealose, estaqujiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (por exemplo, inositol), polietileno glicol; agentes redutores contendo enxofre, tais como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular tais como albumina sérica humana, albumina sérica bovina, gelatina ou outras imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; monossacarídeos (por exemplo, xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos (por exemplo, lactose, maltose, sacarose); trissacarídeos tais como rafinose; e polissacarídeos tais como dextrina ou dextrano.

[0257] Tensoativos não iônicos ou detergentes (também conhecidos como "agentes umectantes") podem estar presentes para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, bem como para proteger a proteína terapêutica contra agregação induzida por agitação, o que também permite que a formulação seja exposta a tensão superficial de cisalhamento sem provocar desnaturação da proteína terapêutica ativa ou do anticorpo. Tensoativos não iônicos estão presentes em uma faixa de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml ou de cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml. Em algumas modalidades, os tensoativos não iônicos estão presentes em uma faixa de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% em peso/volume ou de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% em peso/volume ou de cerca de 0,01% a cerca de 0,025% em peso/volume.

[0258] Tensoativos não iônicos adequados incluem polissorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), PLURONIC® polyols, TRITON®, monoéteres de sorbitano de polioxietileno (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.), lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol, ester de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Detergentes aniônicos que podem ser usados include lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio. Detergentes catiônicos incluem cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetônio.

[0259] De modo a que as formulações sejam usadas para administração in vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições terapêuticas aqui, neste pedido de patente, geralmente saão colocadas dentro de um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[0260] A via de administração é de acordo com métodos conhecidos e aceitos, tais como por infusão ou bolus único ou múltiplo durante um longo período de tempo em maneira adequada, por exemplo, injeção ou infusão por vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional ou intraarticular, administração tópica, inalação ou por meios de liberação gradual ou de liberação prolongada. Em algumas modalidades, uma composição ou anticorpo da presente invenção é administrada por infusão intravenosa uma vez ao mês por 3 ou mais meses.

[0261] A formulação aqui, neste pedido de patente, também pode conter mais de um composto ativo, conforme necessário para a indicação em particular que estiver sendo tratada, preferencialmente os compostos ativos com atividades complementares que não efetem de maneira adversa uns aos outros. Os compostos ativos referidos convenientemente estão presentes em combinação em quantidades que são eficazeds para a finalidade pretendida. IV. Artigos de Manufatura ou Kits

[0262] Em outro aspecto, é proporcionado um artigo de manufatura ou kit, o qual compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana). O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicionalmente instruções para utilização do anticorpo nos métodos da presente invenção. Portanto, em algumas modalidades, o artigo de manufatura ou kit compreende instruções para o uso de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga a Siglec-8 humana nos métodos para tratamento e/ou prevenção de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti- Siglec-8 que se liga a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o artigo de manufatura compreende um medicamento compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana e uma bula compreendendo instruções para administração do medicamento em um indivíduo que necessite do mesmo para tratar e/ou prevenir urticária crônica. Em algumas modalidades, a bula indica adicionalmente que o tratamento é eficaz na redução de um ou mais sintomas no indivíduo com urticária crônica em comparação com um nível basal antes da administração do medicamento. Em algumas modalidades, o indivíduo é diagnosticado com urticária crônica antes da administração do medicamento compreendendo o anticorpo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[0263] O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicionalmente um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (tais como seringas de câmara única ou dupla) e tubos de teste. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, tais ocmo vidro ou plástico. O recipiente encerra a formulação.

[0264] O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicionalmente um rótulo ou uma bula, o qual está sobre ou associado com o recipiente, pode indicar instruções para reconstituição e/ou uso da formulação. O rótulo ou bula pode indicar adicionalmente que a formulação é útil ou destinada para administração subcutânea, intravenosa, ou outros modos de administração para tratamento e/ou prevenção urticária crônica em um indivíduo. O recipiente que encerra a formulação pode ser um frasco de uso único ou multi-uso, o qual permite administrações repetidas da formulação reconstituída. O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado. O artigo de manufatura ou kit pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial, terapêutico, e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.

[0265] Em uma modalidade específica, a presente invenção proporciona kits para uma unidade de administração de dose única. Os kits referidos compreendem um recipiente de uma formulação aquosa de anticorpo terapêutico, incluindo tanto seringas previamente enchidas únicas ou multi-câmaras. Exemplos de seringas previamente enchidas estão disponíveis em Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha.

[0266] Em outra modalidade, é proporcionado aqui, neste pedido de patente, um artigo de manufatura ou kit compreendendo as formulações descritas aqui, neste pedido de patente, para administração em um dispositivo auto-injetor. Um auto-injetor opde ser descrito como um dispositivo de injeção que depois de ativação, vai liberar seu conteúdo sem ação necessária adicional do paciente ou administrador. São particularmente adequados para auto-medicação de formulações therapêuticas quando a taxa de liberação deve ser constante e o tempo de liberação é superior a uns poucos momentos.

[0267] Em outro aspecto, é proporcionado um artigo de manufatura ou kit, o qual compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana). O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicionalmente instruções para utilização do anticorpo nos métodos da presente invenção. Portanto, em algumas modalidades, o artigo de manufatura ou kit compreende instruções para o uso de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga a Siglec-8 humana em métodos para tratamento ou prevenção de urticária crônica em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti- Siglec-8 que se liga a Siglec-8 humana. Em algumas modalidades, o artigo de manufatura ou kit compreende um medicamento compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana e uma bula compreendendo instruções para administração do medicamento em um indivíduo que necessite do mesmo para tratar e/ou prevenir urticária crônica.

[0268] A presente invenção também proporciona um artigo de manufatura ou kit o qual compreende um anticorpo anti-Siglec-8 descrito aqui, neste pedido de patente, (por exemplo, um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana) em combinação com um ou mais medicamentos adicionais (por exemplo, um segundo medicamento) para tratamento ou prevenção de urticária crônica em um indivíduo. O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicionalmente instruções para utilização do anticorpo em combinação com um ou mais medicamentos adicionais nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o artigo de manufatura ou kit aqui, neste pedido de patente, opcionalmente compreende adicionalmente um recipiente compreendendo um segundo medicamento, em que o anticorpo anti-Siglec-8 é um primeiro medicamento, e cujo artigo ou kit compreende adicionalmente instruções sobre o rótulo ou bula para tratar o indivíduo com o segundo medicamento, em uma quantidade efetiva. Portanto, em algumas modalidades, o artigo de manufatura ou kit compreende instruções para o uso de um anticorpo anti-Siglec-8 que se liga a Siglec-8 humana em combinação com um ou mais medicamentos adicionais em métodos para tratamento ou prevenção de urticária crônica em um indivíduo. Em algumas modalidades, o artigo de manufatura ou kit compreende um medicamento compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana (por exemplo, um primeiro medicamento), um ou mais medicamentos adicionais e uma bula compreendendo instruções para administração do primeiro medicamento em combinação com o um ou mais medicamentos adicionais (por exemplo, um segundo medicamento). Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem incluir, mas não estão limitados a, antagonistas de receptores H- 2, anti-histamínicos H1, anti-histamínicos H2, anticorpos anti-IgE, corticosteroides, doxepina, antagonistas de receptores do leucotrieno (LTRAs), ciclosporina, e tacrolímo.

[0269] Deve ser entendido que os aspectos e modalidades descritos aqui, neste pedido de patente, são para fins ilustrativos somente e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridos para as pessoas versadsa na arte e devem ser incluídas dentro do espírito e do alcance deste pedido e do âmbito das reivindicações anexadas.

EXEMPLOS

[0270] A presente invenção será mais plenamente entendida por meio de referência aos exemplos que se seguem. No entanto, os exemplos não devem ser considerados como limitando o âmbito da presente invenção. Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui, neste pedido de patente, são para fins ilustrativos somente e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas às pessoas versadas na arte e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e do âmbito das reivindicações anexadas.

Exemplo 1: Estrutura de um estudo piloto aberto, para avaliar a eficácia e a segurança do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária crônica resistente a anti-histamínicos

[0271] Urticárias crônicas são um grupo de doenças de pele inflamatórias, que são causadas pela ativação inadequada dos mastócitos na pele. As urticárias crônicas são classificadas pelo gatilho específico de ativação dos mastócitos. Gatilhos (e tipos de urticária correspondentes) incluem: abrasão física da pele (urticária dermatográfica) e aumento da temperatura corporal (urticária colinérgica), com algumas urticárias desencadeadas por uma causa desconhecida (urticária idiopática ou espontânea).

[0272] Muitos pacientes com urticária são tratados adequadamente pelas terapias atuais, tais como alta dose de anti-histamínicos. No entanto, um número significativo de pacientes não recebe benefício adequado das terapias atuais, e seus sintomas de urticária não controlados podem ter um impacto significativo sobre a qualidade de vida. Este estudo é desenhado para testar a segurança e a eficácia do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária crônica resistente a anti-histamínicos.

[0273] O anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (IgG1 não fucosilada) é administrado aos pacientes como uma infusão intravenosa mensal em até 1 mg/kg por 3 doses. Todos os pacientes registrados receberam 3 infusões mensais e em seguida foram acompanhados por outras 8 semanas. Foram registrados um total de 40 pacientes.

[0274] Alternativamente, o anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (IgG1 não fucosilada) é administrado aos pacientes como uma infusão intravenosa. O anticorpo é administrado nos Dias 1, 29, 57, 85, 113, e 141. Os sujeitos são seguidos por um adicional de 8 semanas. Objetivos primários e secundários são avaliados nas semanas 22, 24, e 28. Foi registrado total de aproximadamente 48 pacientes. As coortes incluem aproximadamente 12 pacientes com urticária colinérgica, aproximadamente 12 pacientes com urticária factícia (UF), aproximadamente 12 pacientes que são naïve para tratamento com anti-IgE (por exemplo, omalizumab), e aproximadamente 12 pacientes com urticária espontânea crônica que não obtiveram uma resposta adequada para o tratamento com anti-IgE (por exemplo, omalizumab).

[0275] Os pacientes com urticária colinérgica são testados. Aos pacientes é administrado HEKA (IgG1 não fucosilada) em uma dose de 1 mg/kg por infusão intravenosa. Os sintomas de urtivária são avaliados pelos pacientes, conforme descrito em maiores detalhes abaixo. Aos pacientes é fornecido um diário no qual o número de pápulas e a gravidade do prurido são registrados diariamente por até 4 semanas imediatamente antes do começo da terapia e depois da terapia. As medidas dos resultados primário e secundários são descritas abaixo.

[0276] Os pacientes com urticária espontânea crônica (CSU) também são testados. Aos pacientes é administrado HEKA (IgG1 não fucosilada) em uma dose de 0,3 mg/kg por infusão intravenosa conforme descrito acima. Aos pacientes é fornecido um diário no qual o número de pápulas e a gravidade do prurido são registrados diariamente por pelo menos 27 dias imediatamente antes do começo da terapia e depois da terapia.

[0277] Alternativamente, anticorpo anti-Siglec-8 é administrado aos pacientes de acordo com o seguinte esquema de dosagem: 0,3 mg/kg na semana 0 (dia 1), 1,0 mg/kg na semana 4 (dia 29), 1,0 mg/kg na semana 8 (dia 57), 1,0 ou 3,0 mg/kg na semana 12 (dia 85), 1,0 ou 3,0 mg/kg na semana 16 (dia 113), e 1,0 ou 3,0 mg/kg na semana 20 (dia 141). Nas semanas 12, 16, e 20, a dose é aumentada para 3,0 mg/kg se a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) for inferior a 12 e/ou a critério do pesquisador, ou a dose de 1,0 mg/kg é usada se o paciente tiver experimentado melhora adequada dos sintomas.

[0278] As medidas dos resultados primário e secundário são descritas abaixo.

[0279] Os critérios de inclusão incluem: (a) idade (≥18 e ≤85 anos de idade); (b) peso corporal <185 kg ou <125 kg; (c) diagnóstico de urticária crônica por pelo menos 3 meses, refratária a tratamento com anti-histamínicos em uma dosagem única ou 4 vezes; (d) urticária crônica não controlada (UCT<12) por ocasião do registro; e (e) teste de gravidez negativo (pacientes do sexo feminino).

[0280] Os critérios de exclusão incluem: (a) urticária aguda; (b) tratamento concomitante/em andamento com imunossupressores (por exemplo, ciclosporina, metotrexato, dapsone, etc.) dentro de 4 semanas ou 5 meias-vidas antes da linha basal, o que for mais longo); (c) condição médica importante que torne o paciente imunocomprometido; (d) uso de omalizumab dentro dos últimos 3 meses, ou dentro dos últimos 2 meses; (e) recebimento de terapia com IgG intravenosa 30 dias antes da linha basal; (f) plasmaferese 30 dias antes da linha basal; (g) Uso (diariamente ou dia sim, dia não) de doxepina 14 dias antes da linha basal;

(h) recebimento de vacina atenuada inativa ou viva 30 dias antes da linha basal; (i) uso de anti-histamínico H2 7 dias antes da linha basal; (j) ingestão de antagonista do leucotrieno dentro de 7 dias antes do registro; (k) ingestão de corticosteroide sistêmico (por exemplo, oral ou depósito) dentro de 14 dias antes do registro; (l) triagem positiva para teste de ovos e parasitas na linha basal; (m) sorologia positiva para HIV; (n) tratamento de parasita helmíntico dentro de 6 meses da triagem; (o) sorologia positiva para hepatite na linha basal, exceto para pacientes vacinados ou pacientes com hepatite passada, mas resolvida; e (p) doação ou perda de > 500 mL de sangue dentro de 56 dias antes da administração do fármaco do estudo ou doação de plasma dentro de 7 dias antes da administração do fármaco.

[0281] A medida de resultado primário é alteração no Teste de Controle da Urticária (UCT) depois de tratamento com anticorpo a partir do dia 1 (linha basal) até a semana 10 ou a partir do dia 1 (linha basal) até a semana 22. O Teste de Controle da Urticária é uma pontuação para controle de sintomas na urticária crônica.

[0282] As medidas dos resultados secundários incluem as seguintes: (a) Alteração na atividade de doença conforme avaliado pelo Escore de Atividade da Urticária (UAS, Urticaria Activity Score), o qual se baseia em pontuações de autoavaliação autodocumentadas somadas durante 7 dias consecutivos (UAS7);

(b) Alteração na doença atividade conforme avaliado pelo Escore de Atividade da Urticária Colinérgica (CholUAS, Cholinergic Urticaria Activity Score), o qual se baseia em pontuações de autoavaliação autodocumentadas somadas durante 7 dias consecutivos (CholUAS7); (c) Alteração no número de dias sem sintomas por semana, conforme avaliado pela pontuação com base no diário do paciente); (d) Alteração nas pontuações de qualidade de vida, conforme avaliado pelo Índice de Qualidade de Vida em Dermatologia (DLQI, Dermatology Life Quality Index), pelo Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida na Urticária Crônica (CU-Q2oL Chronic Urticaria Quality of Life Questionnaire), pelo Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida no Angioedema (AE-QoL, Angioedema Quality of Life Questionnaire), SD-QoL, ou pelo Questionário de Avaliação da Qualidade de Vida na Urticária Colinérgica (CholU-QoL, Cholinergic Urticaria Quality-of-Life Questionnaire); (e) Alteração na ocorrência de angioedema (caso presente), conforme avaliado pelo Escore de Atividade do Angioedema (AAS, Angioedema Activity Score); (f) Alteração no número de vergões (do UAS7/ChoUAS7); (g) Alteração na gravidade do prurido (do UAS7/ChoUAS7); (h) Alteração na avaliação global pelo paciente ou pelo médico; (i) Alteração no limiar de gatilho, conforme avaliado pelo Teste Ergométrico Controlado por Pulso (PCE, Pulse Controlled Ergometry Test), pelo FricTest®, ou pelo TempTest®; (j) Taxas de resposta completa (CR), resposta parcial (PR), e nenhuma resposta (NR), com base no QoL, no UCT, ou no UAS7/CholUAS7;

(k) Níveis séricos na linha basal e alteração dos níveis séricos de biomarcadores, incluindo triptase, eosinófilos, IgE total, basófilos, e proteína catiônica eosinofílica; e (l) Taxas de pacientes tratados com recidiva, rebote, ou efeitos do tratamento contínuo. Exemplo 2: Efeito do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 sobre urticária crônica em pacientes naïve para anti-IgE com uma resposta inadequada ao tratamento com anti-histamínico

[0283] O Exemplo 1 descreve o desenho de um estudo clínico desenhado para determinar a segurança e a eficácia do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária crônica resistente a anti-histamínicos. Este Exemplo descreve resultados obtidos a partir do estudo descrito no Exemplo 1, focalizando na coorte de pacientes que eram naïve para terapia cp, anti-IgE (por exemplo, tratamento com omalizumab).

[0284] O estudo registrou 45 pacientes com urticária crônica não controlada com uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) menos de 12 apesar de tratamento com anti-histamínicos H1 em doses até 4x a dosagem do rótulo. Pacientes foram registrados em 4 coortes dependendo da forma de urticária e do tratamento anterior: urticária espontânea crônica naïve para Xolair (N = 13), urticária espontânea crônica falhas com Xolair (N = 11), urticária colinérgica (N = 11), e urticária dermatográfica (N = 10). A medicação com anti-histamínicos foi mantida do ínicio ao fim do período de triagem e do estudo. Pontuações de sintomas na linha basal, incluindo UCT, foram coletadas durante um período de triagem de 4 semanas. Pacientes com pontuações na linha basal do Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 12 foram registrados no estudo e tratados com até 6 doses de anticorpo anti-Siglec-8 administrado mensalmente.

[0285] Os pacientes na coorte naïve para Xolair variaram em idade de 30 a 75 com uma idade mediana de 63,0. Os pacientes foram tratados com anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (IgG1 não fucosilada) de acordo com o seguinte esquema de dosagem: 0,3 mg/kg na semana 0 (dia 1), 1,0 mg/kg na semana 4 (dia 29), 1,0 mg/kg na semana 8 (dia 57), 1,0 ou 3,0 mg/kg na semana 12 (dia 85), 1,0 ou 3,0 mg/kg na semana 16 (dia 113), e 1,0 ou 3,0 mg/kg na semana 20 (dia 141). A eficácia foi avaliada por alteração no Teste de Controle da Urticária (UCT), bem como por alteração na atividade da doença conforme avaliado pelo Escore de Atividade da Urticária (UAS7, Urticaria Activity Score). O desfecho primário foi na semana 22, com seguimentos nas semanas 24 e 28.

[0286] Os pacientes com pontuações na linha basal do Teste de Controle da Urticária (UCT) inferiores a 12, indicativas de urticária mal controlada, foram registrados no estudo. As pontuações do Teste de Controle da Urticária (UCT) variam de 0 a 16 (com 0 sendo mais greave e 16 indicando controle completo da doença). Os pacientes tratados neste estudo tinham todas pontuações do Teste de Controle da Urticária (UCT) de abaixo de 12 na linha basal, com um escore médio de 3,2 e 85% dos pacientes reportando uma pontuação de 6 ou menos. As pontuações do Escore de Atividade da Urticária UAS7 variam de 0 a 42, com pontuações maiores indicando maior gravidade da doença. Os pacientes tratados neste estudo tinham uma pontuação média do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 18,0.

[0287] Conforme mostrado nas Figuras 1A & 1B e Tabela A1, o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 levou a um aumento dramático na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) (refletindo uma diminuição na gravidade da doença) entre pacientes naïve para anti-IgE. A pontuação média do Teste de Controle da Urticária (UCT) aumentou de 3,2 na linha basal para 14,2 na semana 22.

Tabela A1. Respostas ao tratamento com anti-Siglec-8 de coorte naïve para anti-IgE.

Linha Basal Semana 22 Escore UCT Médio 3,2 14,2 Resposta Completa no teste UCT - 12 (92%) Resposta Parcial no teste UCT - 0 (0%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 1 (8%) Pontuação UAS7 Média 17,9 4,0 Pacientes com UAS7 <=6 0 (0%) 9 (69%) Resposta completa do UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal e uma pontuação maior do que 12. Resposta Parcial no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal.

[0288] A análise de pontuações individuais do Teste de Controle da Urticária (UCT) ilustrou mais esta dramática redução na gravidade da doença. Notavelmente, 92% dos pacientes naïve para anti-IgE (12/13) apresentaram uma resposta completa ao tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8.

[0289] Conforme mostrado na Figura 2A, o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 também levou a uma dramática redução na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 (refletindo uma diminuição na gravidade da doença) entre pacientes naïve para anti-IgE. A pontuação média do Escore de Atividade da Urticária UAS7 diminui de 18,5 na linha basal para 4,6 na semana 22. Comparada com a linha basal, foi observada uma redução de 75% na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 depois da administração da dose final na semana 22. O tratamento com anti-Siglec-8 levou ao controle dos sintomas, conforme mostrado pela proporção de pacientes com pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 ou inferior ou igual a 6, ou 0, na semana 22 (Figura 2B), e conforme adicionalmente demonstrado pela proporção de pacientes com uma pontuação do Escore de Gravidade da Urticária semanal (HSS, Hive Severity Score) de 0 ou uma pontuação do Escore de Gravidade do Prurido semanal (ISS, Itch Severity Score) de 0 na semana 22 (Figura 2C). As respostas dos pacientes naïve para anti-IgE para o tratamento com o anticorpo anti- Siglec-8 estão resumidas na Tabela A2.

Tabela A2. Sumário de tratamento com anti-Siglec-8 sobre as respostas e o controle de sintomas em coorte de pacientes naïve para anti-IgE.

Desfecho Linha Basal Semana 22 Resposta Completa no teste UCT - 12/13 (92%) Resposta Parcial no teste UCT - 0/13 (0%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 1/13 (8%) Pacientes com ∆UAS7 ≥10 (MID) - 9/13 (69%) Pontuação UAS7 Média 18,5 4,6 (-75%) Pacientes com UAS7 ≤ 6 0 (0%) 8/13 (62%) Pacientes com UAS7 = 0 0 (0%) 7/13 (54%) Pacientes com ISS7 = 0 0 (0%) 7/13 (54%) Pacientes com HSS7 = 0 0 (0%) 10/13 (77%) Resposta Completa no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal e uma pontuação maior do que 12. Resposta Parcial no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal, porém inferior a 12.

[0290] Tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 foi bem tolerado de modo geral. O evento adverso mais comum foi reações brandas a moderadas relacionadas com infusão (rubor, sensação de calor, cefaleia, náusea, e tontura), as quais ocorreram principalmente durante a primeira infusão. IRR's diminuíram ou não ocorreram nas infusões subsequentes.

Exemplo 3: Efeito do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com dermografismo sintomático e colinérgico cujos sintomas não são controlados adequadamente por tratamento com anti-histamínicos

[0291] Apesar de não haver nenhum gatilho identificado para a urticária espontânea crônica, outras urticárias crônicas são causadas por gatilhos tais como contato físico com a pele (referido como dermografismo sintomático ou urticária dermatográfica), ou aumentos passivos ou ativos na temperatura corporal (urticária colinérgica). Estima-se que 0,5 a 1,0% da população dos Estados Unidos sofra de uma forma de urticária crônica.

[0292] O Exemplo 1 descreve o esquema de um ensaio clínico projetado para determinar a segurança e a eficácia do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária crônica resistente a anti-histamínicos. Este Exemplo descreve os resultados obtidos do estudo descrito no Exemplo 1, focando nas coortes de pacientes com urticária colinérgica ou dermatográfica (por exemplo, dermografismo sintomático).

[0293] As coortes de urticária colinérgica e dermatográfica registraram 11 e 10 pacientes, respectivamente, com urticária não controlada apesar de tratamento com anti-histamínicos H1 em doses de até 4 vezes a dosagem marcada. A medicação com anti-histamínicos foi mantida por todo o período de triagem e durante o estudo. Pontuações de sintomas na linha basal, conforme medido pelo Teste de Controle da Urticária (UCT) foram coletadas durante um período de triagem de 4 semanas. Os pacientes com pontuações na linha basal do Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 12, indicativas de urticária mal controlada, foram registrados no estudo e tratados com até 6 doses de anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (IgG1 não fucosilada) administrado uma vez ao mês. Os pacientes receberam uma dose inicial de 0,3 mg/kg na linha basal, seguida por uma dose de 1,0 mg/kg no dia 28, e em seguida receberam mensalmente doses de ou 1,0 ou 3,0 mg/kg, dependendo da resposta, por um total de 6 doses. O desfecho de eficácia primário foi alteração a partir da linha basal no UCT avaliado na semana 22, duas semanas depois da última dose de anticorpo anti-Siglec-8.

[0294] Dados de primeira linha do estudo clínico são apresentados na Tabela B1. As respostas dos pacientes com urticária dermatográfica ao tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 estão resumidas na Tabela B2. As respostas dos pacientes com urticária colinérgica ao tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 estão resumidas na Tabela B3. Tabela B1. Respostas ao tratamento com anti-Siglec-8 de coortes com urticária colinérgica e dermatográfica. Coorte com Urticária Colinérgica Linha Basal Semana 22 Pontuação UCT Média 5,4 11,8 Resposta Completa no teste UCT - 9/11 (82%) Resposta Parcial no teste UCT - 0/11 (0%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 2/11 (18%) Coorte com Urticária Dermatográfica Pontuação UCT Média 5,7 9,1 Resposta Completa no teste UCT - 4/10 (40%) Resposta Parcial no teste UCT - 3/10 (30%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 3/10 (30%) Resposta Completa no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal e uma pontuação de 12 ou superior. Resposta Parcial no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal, porém inferior a 12.

Tabela B2. Sumário do tratamento com anti-Siglec-8 sobre as respostas e o controle dos sintomas em coorte com urticária dermatográfica.

Desfecho Linha Basal Semana 22 Resposta Completa no teste UCT - 4/10 (40%) Resposta Parcial no teste UCT - 3/10 (30%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 3/10 (30%) Resposta de Prurido ao Teste FRIC 0% 5/10 (50%) Resposta de Urticária ao Teste FRIC (CFT) 0% 4/10 (40%) Tabela B3. Sumário do tratamento com anti-Siglec-8 sobre as respostas e o controle dos sintomas em coorte com urticária colinérgica.

Desfecho Linha Semana 22 Basal Resposta Completa no teste UCT - 9/11 (82%) Resposta Parcial no teste UCT - 0/11 (0%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 2/11 (18%) Resposta ao Teste de Exercício 0% 7/7 (100%) Ergométrico de Controle de Pulso (PCE)

[0295] Estes dados, combinados com a taxa de resposta completa de 92% observada no Exemplo 2, mostram que o anticorpo anti-Siglec-8 foi altamente ativo através de múltiplos tipos de urticária e pode representar um novo tratamento promissor para urticárias crônicas espontâneas, bem como indutíveis. Estes dados indicam que o anticorpo anti-Siglec-8 inibe amplamente inflamação causada por mastócitos, o que, junto com sua comprovada atividade contra eosinófilos, sugere que o tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 pode ter ampla utilidade em doenças eosinofílicas e causadas por mastócitos. Exemplo 4: Efeito do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária espontânea crônica refratária a Xolair

[0296] Estima-se que 0,5 a 1,0 porcento da população dos Estados Unidos sofre de uma forma de urticária crônica. Tratamento de primeira linha consiste em medicação anti-histamínica H1; no entanto, um número significativo de pacientes não recebeu benefício adequado mesmo em quatro vezes a dose marcada. XOLAIR® é o único agente aprovado para urticária espontânea crônica refratária a anti-histamínicos, mas não é indicado para outras formas de urticária crônica.

[0297] O Exemplo 1 descreve o desenho de um ensaio clínico of a clinical trial projetado para determinar a segurança e a eficácia do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária crônica resistente a anti-histamínicos. Este Exemplo descreve resultados obtidos do estudo descrito no Exemplo 1, focando na coorte de pacientes com urticária espontânea crônica que não obtiveram uma resposta adequada ao tratamento anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®, também conhecido como omalizumab), bem como resultados adicionais das cooretes naïve para XOLAIR®, com urticária colinérgica, e dermografismo sintomático descritas nos Exemplos 2 e 3.

[0298] A coorte de falha do XOLAIR® registrou 11 pacientes, que não tiveram uma resposta adequada a tratamento com XOLAIR® anterior. A coorte recebeu uma média de 10 meses de tratamento com XOLAIR®, e sua pontuação média no Teste de Controle da Urticária (UCT) em uso de XOLAIR® foi 4,0 em doses tão elevadas quanto 600 mg por mês. Os pacientes tiveram de descontinuar XOLAIR® por pelo menos dois meses antes da triagem, mas puderam continuar os anti-histamínicos H1 em doses de até quatro vezes a dosagem do rótulo do início ao fim do período de triagem e estudo. Escores de sintomas das linhas basais, conforme medido pelo Teste de Controle da Urticária (UCT) e pelo Escore de Atividade de Urticária (UAS7), foram coletados durante o período de triagem de 4 semanas. Pacientes com pontuações do Teste de Controle da Urticária (UCT) da linha basal de menos de 12, indicativas de urticária mal controlada, foram registrados no estudo e tratados com uma dose inicial de 0,3 mg/kg na linha basal, seguida por uma dose de 1,0 mg/kg no dia 28, e em seguida receberam mensalmente doses de ou 1,0 ou 3,0 mg/kg, dependendo da resposta, por até seis doses. O desfecho de eficácia primário foi alteração a partir da linha basal no UCT avaliado na semana 22, duas semanas depois da última dose de anticorpo anti-Siglec-8.

[0299] Dados desta coorte são apresentados nas Tabelas C1 e C2. Tabela C1. Resposta ao tratamento com anti-Siglec-8 de coorte de falha de XOLAIR®.

Coorte com Urticária Crônica Espontânea Linha Semana 22 de Falha de Xolair Basal Pontuação UCT Média 3,7 8,5 Resposta Completa no teste UCT - 4/11 (36%) Resposta Parcial no teste UCT - 2/11 (18%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 5/11 (45%) UAS7 Média 28,7 14,7 (-52%)

Tabela C2. Sumário do tratamento com anti-Siglec-8 sobre as respostas e o controle de sintomas em coorte de pacientes refratários a XOLAIR®.

Desfecho Linha Basal Semana 22 Resposta Completa no teste UCT - 4/11 (36%) Resposta Parcial no teste UCT - 2/11 (18%) Nenhuma Resposta no teste UCT - 5/11 (45%) Pacientes com ∆UAS7 ≥10 (MID) - 8/11 (73%) Pontuação UAS7 Média 28,7 14,7 (-49%)

[0300] Tratamento com anticorpo anti-Siglec-8 apresentou uma taxa de resposta de 55% (6/11) em pacientes desta coorte, com uma redução média na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de 52%. A alteração na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 a partir da linha basal, observada na semana 22 do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8, para cada paciente ensta coorte é mostrada na Figura 3.

[0301] O anticorpo anti-Siglec-8 HEKA (IgG1não fucosilada) foi bem tolerado de modo geal. O evento adverso mais comum foi reações brandas a moderadas relacionadas com a infusão (rubor, sensação de calor, cefaleia, náusea e tontura), as quais ocorreram principalmente durante a primeira infusão. Exemplo 5: Dados adicionais de estudo aberto, Fase 2, sobre os efeitos do tratamento com o anticorpo anti-Siglec-8 em pacientes com urticária crônica não controlada

[0302] Este Exemplo proporciona dados adicionais sobre o estudo descrito no Exemplo 1.

[0303] O estudo registrou 45 pacientes com urticária crônica não controlada com uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 12 apesar de tratamento com anti-histamínicos H1 em doses até quatro vezes a dosagem do rótulo. Os pacientes tinham uma idade mediana de 44 com uma faixa de 18 a 75 anos. 75% dos pacientes eram do sexo feminino.

[0304] Os pacientes foram registrados em quatro coortes dependendo da forma de urticária e do tratamento anterior: urticária espontânea crônica naïve para Xolair (N = 13), urticária espontânea crônica falhas com Xolair (N = 11), urticária colinérgica (N = 11) e dermografismo sintomático (N = 10). A medicação com anti-histamínicos foi mantida por todo o período de triagem e estudo. Pontuações de sintomas na linha basal, incluindo UCT, foram coletadas durante um período de triagem de 4 semanas. Pacientes com pontuações do Teste de Controle da Urticária (UCT) na linha basal de menos de 12 foram registrados no estudo e tratados com até seis doses de anticorpo anti- Siglec-8 HEKA (IgG1 não fucosilada) administradas mensalmente.

[0305] Os pacientes receberam uma dose inicial de 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg no dia 28, e em seguida receberam mensalmente doses de ou 1,0 ou 3,0 mg/kg por um total de seis doses. Para as doses 4, 5, e 6, a dose foi aumentada de 1,0 mg/kg para 3,0 mg/kg se a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) foi inferior a 12. A eficácia foi avaliada na semana 22 usando o teste de controle da urticária (UCT) e UAS7 (para pacientes com urticária espontânea crônica somente). Resposta Completa no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal e uma pontuação maior do que 12. Resposta Parcial no teste UCT foi definida como uma resposta maior do que uma melhora de 3 pontos a partir da linha basal.

[0306] Dados adicionais deste estudo são mostrados na Tabela D.

Pontuações da linha basal do Teste de Controle da Urticária (UCT) e do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de cada coorte são mostradas na Tabela E.

Tabela D.

Resposta ao tratamento com anti-Siglec-8 de 3 coortes de pacientes com urticária crônica não controlada.

Coorte com Urticária Espontânea Crônica Naïve para Xolair (N=13) Linha Basal Semana 22

Pontuação UCT Média 3,2 14,2

Resposta Completa no teste UCT - 12/13 (92%)

Resposta Parcial no teste UCT - 0/13 (0%)

Nenhuma Resposta no teste UCT - 1/13 (8%)

Pontuação UAS7 Média 18,5 4,6 (-75%)

Proporção com UAS7 ≤ 6 0% 8/13 (62%)

Proporção com UAS = 0 0% 7/13 (54%)

Proporção com ISS = 0 0% 7/13 (54%)

Proporção com HSS = 0 0% 10/13 (77%)

Coorte com Urticária Colinérgica (N=11) Linha Basal Semana 22

Pontuação UCT Média 5,4 11,8

Resposta Completa no teste UCT - 9/11 (82%)

Resposta Parcial no teste UCT - 0/11 (0%)

Nenhuma Resposta no teste UCT - 2/11 (18%)

Teste de Exercício Ergométrico de Controle de Pulso (PCE) Negativo 0% 7/7 (100%)

Coorte com Dermografismo Sintomático (N=10) Linha Basal Semana 22

Pontuação UCT Média 5,7 9,1

Resposta Completa no teste UCT - 4/10 (40%)

Resposta Parcial no teste UCT - 3/10 (30%)

Nenhuma Resposta no teste UCT - 3/10 (30%)

FricTest® Negativo para Prurido 0% 5/10 (50%)

FricTest® Negativo para Urticária (Limiar de Fricção Crítico) 0% 4/10 (40%)

Tabela E. Pontuações médias da linha basal do Teste de Controle da Urticária (UCT) e do Escore de Atividade da Urticária UAS7 XN XF ChoIU SDerm (n = 13) (n = 11) (n = 11) (n = 10) UCT 3,2 3,7 5,4 5,7 UAS7 18,5 28,7 n/a n/a

SEQUÊNCIAS

[0307] Todas as sequências de polipeptídeos são apresentadas na ordem N-terminal para C-terminal a menos que observado de modo diverso.

[0308] Todas as sequências de ácido nucleico são apresentadas de 5' para 3' a menos que observado de modo diverso. Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 de camundongo

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWL

GVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCAR DGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSS (SEQ ID Nº: 1) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 2) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHB EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWL

GVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 3)

Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 4) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHD EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEWL

SVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 5) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHE EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 6) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHF EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VSVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 7) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2

RHG EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VSVIWAGGSTNYNSALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 8)

Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 RHA2

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIRQPPGKGLEWIG

VIWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARD GSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 9) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 RHB2

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWL

GVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR DGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº: 10) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 RHE S-G mutante

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYGMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 11) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 RHE E-D

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 12) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 RHE Y-V

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEVWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 13)

Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 2E2 RHE triplo mutante

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW

VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº: 14) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 de camundongo

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYST

SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFG SGTKLEIK (SEQ ID Nº: 15) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKA

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST

SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 16) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKB

EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIYST

SNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 17) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKC

EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST

SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 18) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKD

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIYS

TSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 19)

Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKE

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST

SNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 20) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKF

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST

SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 21) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKG

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYS

TSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 22) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKA F-Y mutante

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST

SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 23) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 2E2 RKF F-Y mutante

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST

SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYTFGP GTKLDIK (SEQ ID Nº: 24)

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada HEKA e cadeia pesada

HEKF EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPG (SEQ ID Nº: 75) Sequência de aminoácidos de cadeia leve HEKA

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV

DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID Nº: 76) Sequência de aminoácidos de cadeia leve HEKF

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFTFGP GTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV

DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID Nº: 77)

Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgG1

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID Nº: 78) Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgG4

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID Nº: 79) Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia leve de Ig kappa

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS

GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC (SEQ ID Nº: 80)

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG1 2C4 e 2E2 murina

QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWL GVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCAR DGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTL GCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSP RPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKP KDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQF NSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAP QVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNT

QPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLS HSPG (SEQ ID Nº: 81) Sequência de aminoácidos de cadeia leve kappa 2C4 murina

EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFG SGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID

GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHK TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID Nº: 82) Sequência de aminoácidos de cadeia leve kappa 2E2 murina

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFG SGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKID

GSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHK TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID Nº: 83)

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG1 2C4 e 2E2 quimérica

QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEWL GVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYCAR DGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG (SEQ ID Nº: 84) Sequência de aminoácidos de cadeia leve kappa 2C4 quimérica

EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFG SGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK

VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID Nº: 85) Sequência de aminoácidos de cadeia leve kappa 2E2 quimérica

QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYST SNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFG SGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK

VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID Nº: 86)

Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG4 HEKA (IgG4 contém uma mutação S228P)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLEW VGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ

PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSLG (SEQ ID Nº: 87) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 1C3 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração Chothia)

EVQVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVRQTPDKRLEW

VAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCA RHETAQAAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID Nº: 106) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 1H10 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração Chothia)

EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYMYWVKQRPEQGLEWI

GRIAPEDGDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCT TEGNYYGSSILDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID Nº: 107)

Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada 4F11 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração Chothia)

QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSWMNWVKQRPGKGLEW

IGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFC ARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA (SEQ ID Nº: 108) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 1C3 de camundongo

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIY

DTSKLAYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPT FGGGTKLEIK (SEQ ID Nº: 109) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 1H10 de camundongo

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYF

TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFG GGTKLEIK (SEQ ID Nº: 110) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve 4F11 de camundongo

QIVLTQSPAIVSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQRPGSSPRLLIYD

TSSLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYCQQWNSDPYTFG GGTKLEIK (SEQ ID Nº: 111)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratamento de urticária crônica em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não é controlada adequadamente, ou sintomas de urticária permanecem, apesar de tratamento com anti- histamínico H1.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou a urticária crônica é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, antes da administração da composição, o indivíduo é naive para anticorpo anti-IgE.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IgE é omalizumab ou ligelizumab.

5. Método para tratamento de urticária crônica em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana; em que, antes da administração da composição, o indivíduo demonstrou uma resposta inadequada a tratamento com um anticorpo anti-IgE ou a urticária no indivíduo é controlada inadequadamente por tratamento com um anticorpo anti-IgE.

6. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-IgE é omalizumab ou ligelizumab.

7. Método, de acordo com a reivindicação 0 ou0, caracterizado pelo fato de que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não está controlada apesar de tratamento com anti-histamínico H1.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0 e 0, caracterizado pelo fato de que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não está controlada apesar de tratamento com anti-histamínico H1 na dosagem do rótulo ou quatro vezes a dosagem do rótulo.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0 e 0, caracterizado pelo fato de que, antes da administração da composição, a urticária no indivíduo não está controlada apesar de tratamento com anti-histamínico H1 em até quatro vezes a dosagem do rótulo.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a urticária crônica é urticária crônica colinérgica, dermatográfica, induzida pelo frio, vibratória, autoimune, espontânea, ou idiopática.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a urticária crônica é urticária crônica autoimune, e em que o indivíduo demonstrou um resultado positivo em um ou mais dos seguintes testes antes da administração da composição: teste de liberação de histamina de basófilos (BHRA), expressão de marcadores de ativação de basófilos, teste cutâneo de soro autólogo (ASST), e imunoensaio para autoanticorpos IgG contra IgE e/ou FceRI.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o indivíduo demonstrou uma pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) de menos de 12 antes da administração da composição.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que um ou mais sintomas no indivíduo com urticária crônica são reduzidos depois da administração da composição, em comparação com um nível basal antes da administração da composição.

14. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a atividade da doença autoavaliada é reduzida em comparação com um nível basal antes da administração da composição.

15. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a atividade da doença autoavaliada é avaliada por uma ou mais das seguintes métricas: UCT, UAS7, e CholUAS7.

16. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a pontuação da qualidade de vida autoavaliada é aprimorada em comparação com um nível basal antes da administração da composição.

17. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a pontuação da qualidade de vida autoavaliada é avaliada por uma ou mais das seguintes métricas: DLQI, CU-Q2oL, AE- QoL, SD-QoL, e CholU-QoL.

18. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos seguintes são reduzidos em comparação com um nível basal antes da administração da composição: ocorrência de angioedema, número de vergões, e gravidade do prurido.

19. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que um ou mais dos seguintes estão aumentados em comparação com um nível basal antes da administração da composição: número de dias sem sintomas por semana e limiar de gatilho.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o número de eosinófilos, a IgE total, a expressão de triptase, a expressão de proteína catiônica eosinofílica, e/ou o número de basófilos em uma amostra de soro do indivíduo é reduzido em comparação com um nível basal em uma amostra de soro obtida do indivíduo antes da administração da composição.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que administração da composição resulta em uma resposta sustentada ao tratamento.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que administração da composição resulta em uma pontuação do Teste de Controle da Urticária (UCT) de 12 ou acima em 10 semanas depois do tratamento.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que administração da composição resulta em uma pontuação do UCT de 12 ou acima em 22 semanas depois do tratamento.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que administração da composição resulta em uma diminuição na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de mais de 10.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por infusão intravenosa.

26. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por infusão intravenosa uma vez ao mês por 3 ou mais meses.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por injeção subcutânea.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada por infusão intravenosa em uma ou mais doses compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que duas ou mais doses compreendendo entre cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo são administradas ao indivíduo em um intervalo de cerca de 28 dias, cerca de 4 semanas, ou mensalmente.

30. Método, de acordo com a reivindicação 0 ou 29, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indivíduo uma primeira dose compreendendo cerca de 0,3 mg/kg do anticorpo, uma segunda dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma terceira dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg do anticorpo, uma quarta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, uma quinta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo, e uma sexta dose compreendendo cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 3,0 mg/kg do anticorpo.

31. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a primeira dose é administrada no Dia 1, em que a segunda dose é administrada no Dia 29, em que a terceira dose é administrada no Dia 57, em que a quarta dose é administrada no Dia 85, em que a quinta dose é administrada no Dia 113, e em que a sexta dose é administrada no Dia 141.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região

Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo ligadas à região Fc, em que menos de 50% das cadeias de carboidratos ligadas a N- glicosídeo do anticorpo na composição contêm um resíduo de fucose.

33. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que substancialmente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo do anticorpo na composição contém um resíduo de fucose.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61, (ii) HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 67 a 70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 71.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 16 ou 21.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 11 a 14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 23 a 24.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 2 a 14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 24.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 2 a 10; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 16 a 22.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende:

(a) região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 26 a 29; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 31 a 36; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 38 a 43; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 45 a 46, e/ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 48 a 49; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 51 a 53; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs: 55 a 58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e

(7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 34; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 38; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65;

(5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 55; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 34; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 38; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 45; e/ou (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo: (1) uma LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 64;

(3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 103; uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº:

101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 104; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 105.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 106; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 109; uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 110; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 111.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a uma Siglec-8 humana e a uma Siglec-8 de primata não humano.

46. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o primata não humano é um babuíno.

47. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec- 8 humana, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 112.

48. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 3 de Siglec- 8 humana, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114.

49. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo 4F11.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 2 ou no Domínio 3 de Siglec-8 humana.

51. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 113.

52. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo 1C3.

53. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 114.

54. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo 1H10.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epitopo no Domínio 1 de Siglec-8 humana e compete com o anticorpo 4F11 por ligação a Siglec-8.

56. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não compete com o anticorpo 2E2 por ligação a Siglec-8.

57. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não é o anticorpo 2E2.

58. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 112.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 0 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo quimérico.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 0 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo esgota os eosinófilos do sangue e inibe a ativação de mastócitos.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de IgG humana.

62. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a região Fc de IgG humana compreende uma região Fc de IgG1 humana.

63. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a região Fc de IgG1 humana é não fucosilada ou tem fucosilação reduzida.

64. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a região Fc de IgG humana compreende uma região Fc de IgG4 humana.

65. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que a região Fc de IgG4 humana compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice da União Europeia como em Kabat.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo foi manipulado para aprimorar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC).

67. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que melhora a atividade de ADCC.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 76 ou 77.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção de urticária crônica.

72. Método, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais para tratamento ou prevenção de urticária crônica são selecionados entre o grupo que consiste em antagonistas de receptores H-2, anti-histamínicos H1, anti-histamínicos H2, anticorpos anti-IgE, corticosteroides, doxepina, antagonistas de receptores do leucotrieno (LTRAs), ciclosporina, e tacrolímo.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em uma resposta completa no indivíduo depois de uma única administração da composição.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em pelo menos uma melhora de 3 pontos na pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) no indivíduo, em comparação com a pontuação no Teste de Controle da Urticária (UCT) no indivíduo antes do tratamento.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em uma redução na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 de pelo menos 50% no indivíduo, em comparação com pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 no indivíduo antes do tratamento.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em uma redução na pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 por pelo menos 10 no indivíduo, em comparação com pontuação do Escore de Atividade da Urticária UAS7 no indivíduo antes do tratamento.

78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 0, caracterizado pelo fato de que a composição compreende o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável.

79. Artigo de manufatura caracterizado pelo fato de que compreende um medicamento compreendendo uma composição compreendendo um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana e uma bula compreendendo instruções para administração do medicamento em um indivíduo que necessite do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 0.

80. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo que se liga a Siglec-8 humana para uso em um método de tratamento de urticária crônica em um indivíduo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 0.

81. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 16 ou 21.

82. Composição para uso, de acordo com a reivindicação 0, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nº: 76 ou 77.

83. Composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 0 a 0, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

Petição 870200137016, de 30/10/2020, pág. 218/309 Urticária bem controlada

Melhora da Melhora da Doença Doença 1/6

Urticária bem controlada

CSU Naïve para Xolair®

14,2

Petição 870200137016, de 30/10/2020, pág. 219/309 2/6

3,2

Pontuação UCT Média (0 a 16) Linha Basal Semana 22 (Desfecho Primário)

Semana 22 4,6

Linha Basal 18,5

Pontuação UAS7 Média

Percentagem de Pacientes na Semana 22

Petição 870200137016, de 30/10/2020, pág. 223/309 a partir da Linha Basal 6/6

UAS7 %D Pacientes Refratários para Xolair® (n = 11)

Semana 22=