BR112020017354A2 - Composição imunológica multivalente, e, método para induzir uma resposta imune contra uma pluralidade de vírus da influenza equina. - Google Patents
Composição imunológica multivalente, e, método para induzir uma resposta imune contra uma pluralidade de vírus da influenza equina. Download PDFInfo
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Abstract
a presente invenção fornece composições e métodos relacionados com vacinas do vírus da influenza equina atenuado vivo.
Description
1 / 119 COMPOSIÇÃO IMUNOLÓGICA MULTIVALENTE, E, MÉTODO PARA
[001] Este pedido reivindica prioridade e o benefício do Pedido de Patente Provisório dos EUA N° 62/635.628, depositado em 27 de fevereiro de 2018, cuja totalidade é incorporada neste documento por referência.
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob HHSN272201400005C concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos sobre a invenção.
[003] A influenza equina, atualmente causada pelo EIV H3N8, é a doença infecciosa respiratória mais comum e importante em cavalos (Daly et al., 2011, Vet J, 189: 7-14; Timoney, 2000, Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 16, 537-551). O EIV H3N8 é altamente contagioso e tem potencial para se espalhar rapidamente através de grupos de cavalos naive em gotículas aerossolizadas dispersas pela tosse (Daly et al., 2011, Vet J, 189: 7-14; Timoney, 2000, Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 16, 537-551). As infecções por EIV H3N8 em cavalos foram responsáveis por interromper grandes eventos equestres e causar perdas econômicas significativas (Daly et al., 2011, Vet J, 189: 7-14; Timoney, 2000, Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 16, 537-551). A população equina é altamente móvel e os cavalos viajam longas distâncias por estrada e/ou ar para fins de competições e de procriação. Quando um cavalo infectado é introduzido em uma população suscetível, a propagação do EIV H3N8 pode ser explosiva. Grandes surtos de EIV H3N8 estão geralmente associados com a congregação de cavalos em
2 / 119 eventos equestres. Sua dispersão após esses eventos pode levar a uma disseminação mais ampla do vírus. Atualmente, estima-se que os surtos de EIV H3N8 resultem em perdas econômicas de centenas de milhões de dólares. Nos países endêmicos, as perdas econômicas significativas causadas pelas infecções por EIV H3N8 podem ser minimizadas pela vacinação de cavalos altamente móveis. De fato, muitas autoridades de corrida e equestres têm políticas de vacinação obrigatórias que servem como seguro para os negócios. Por outro lado, os países não endêmicos dependem da vacinação de cavalos importados e quarentena para evitar uma incursão do EIV H3N8. A maioria desses países não endêmicos também exige a vacinação de sua população de cavalos indígenas para reduzir o impacto potencial de uma incursão pelo EIV H3N8.
[004] As estratégias tradicionais de vacinação apoiam que as cepas de vacina devem representar vírus em circulação, e é somente através da vigilância que as empresas de vacinas decidem quais antígenos devem ser usados. Assim, a vigilância do EIV e a caracterização da cepa são fundamentais para os programas de controle do EIV H3N8 baseados na vacinação. É importante ressaltar que os fabricantes de vacinas precisam ter uma abordagem de vacinação dinâmica que permita que a geração rápida de novas vacinas beneficie a população equina (Cullinane et al., 2010, Influenza Other Respir. Vírus. 4, 339–344; Paillot, 2014, Vaccines 2, 797–831; Paillot et al., 2016, Pathogens 5). Os resultados de estudos de proteção cruzada indicam que a maioria das vacinas inativadas ou a Flu Avert I.N. LAIV atualmente disponível no mercado forneceriam níveis baixos de proteção se usados em face de um surto iminente devido às diferenças antigênicas entre o vírus na vacina e atualmente circulando cepas de EIV H3N8 (Paillot et al., 2016, Pathogens 5). Notavelmente, alguns surtos recentes de EIV H3N8 ocorreram em animais previamente vacinados, onde a cepa da vacina não correspondia ao vírus circulante (Daly et al., 2003, Equine Vet. J. 35, 458–
3 / 119 462; Garner et al., 2011, Prev. Vet. Med. 99, 15–27; Timoney, 2000, Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 16, 537-551). A frequência de surtos do EIV H3N8, a variação antigênica contínua (desvio antigênico) do EIV H3N8 e exemplos de quebra de vacinas devido a uma combinação pouco antigênica demonstram a necessidade periódica de atualizar as vacinas do EIV para prevenir a influenza equina na população equina. Além disso, as vacinas do EIV devem incluir as cepas representativas da clado 1 e da clado 2 da sublinhagem da Flórida, conforme recomendado pela OIE (Paillot et al., 2016, Pathogens 5).
[005] Assim, há uma carência na técnica de vacinas melhoradas contra o EIV. A presente invenção satisfaz essa carência não atendida.
[006] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição imunológica multivalente compreendendo dois ou mais vírus da influenza equina atenuados vivos (LAIV), compreendendo: um primeiro LAIV expressando um ou mais antígenos de um vírus da influenza equina H3N8 do clado 1; e um segundo LAIV expressando um ou mais antígenos de um vírus da influenza equina H3N8 do clado 2, em que cada LAIV compreende uma ou mais mutações em um ou mais dos seguintes: segmento 1 e segmento 2 do genoma viral.
[007] Numa modalidade, o primeiro LAIV expressa HA, NA ou uma combinação destes de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8. Em uma modalidade, o primeiro LAIV expressa HA, NA ou uma combinação destes de A/equine/Texas/6/2017 H3N8. Numa modalidade, o segundo LAIV expressa HA, NA ou uma combinação destes de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8.
[008] Numa modalidade, o segmento 1 compreende a sequência de ácidos nucleicos estabelecida na SEQ ID NO: 1. Numa modalidade, o segmento 2 compreende a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO: 3.
4 / 119
[009] Em uma modalidade, pelo menos um LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1, que codifica a PB2 mutante. Em uma modalidade, a PB2 mutante compreende uma mutação pontual de N265S. Em uma modalidade, a PB2 mutante compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.
[0010] Em uma modalidade, pelo menos um LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 2, que codifica a PB1 mutante. Em uma modalidade, a PB1 mutante compreende um ou mais dentre: mutação pontual de K391E, mutação pontual de E581G e mutação pontual de A661T. Em uma modalidade, a PB1 mutante compreende uma mutação pontual de K391E, uma mutação pontual de E581G e uma mutação pontual de A661T. Em uma modalidade, a PB1 mutante compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4.
[0011] Em uma modalidade, cada LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1, que codifica a PB2 mutante; e uma ou mais mutações no segmento 2, que codifica a PB1 mutante. Em uma modalidade, a PB2 mutante compreende uma mutação pontual de N265S e a PB1 mutante compreende uma mutação pontual de K391E, uma mutação pontual de E581G e uma mutação pontual de A661T.
[0012] Em uma modalidade, a composição é usada para o tratamento da influenza equina em um sujeito.
[0013] Numa modalidade, o segmento 1 de cada LAIV é derivado do segmento 1 de A/equine/Ohio/1/2003; e em que o segmento 2 de cada LAIV é derivado do segmento 2 de A/equine/Ohio/1/2003.
[0014] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para indução de uma resposta imunológica contra uma pluralidade de vírus da influenza equina em um sujeito, o método compreendendo a administração de uma composição imunológica multivalente a um sujeito compreendendo dois ou mais vírus da influenza equina atenuados vivos (LAIV), compreendendo:
5 / 119 um primeiro LAIV expressando um ou mais antígenos de um vírus da influenza equina H3N8 do clado 1; e um segundo LAIV expressando um ou mais antígenos de um vírus da influenza equina H3N8 do clado 2, em que cada LAIV compreende uma ou mais mutações em um ou mais dos seguintes: segmento 1 e segmento 2 do genoma viral.
[0015] Em uma modalidade, o sujeito não tem influenza equina e o método induz imunidade contra a influenza equina. Em uma modalidade, o sujeito está infectado pela influenza equina e em que o método induz uma resposta imunológica terapêutica.
[0016] Em uma modalidade, a composição imunológica é administra por via intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, interaperitoneal, intravenosa ou subcutânea. Em uma modalidade, o sujeito é um cavalo.
[0017] A descrição detalhada das modalidades preferidas da invenção que se segue será melhor entendida quando lida em conjunto com as figuras em anexo. Para a finalidade de ilustrar a invenção, mostram-se nas figuras as modalidades que são preferidas no momento. No entanto, deve-se entender que a invenção não está limitada às disposições e instrumentalidades precisas das modalidades mostradas nas figuras.
[0018] A Figura 1, compreendendo a Figura 1A e a Figura 1B, mostra os resultados de experiências demonstrando o efeito da temperatura na atividade da polimerase da vacina contra influenza atenuada viva (EIV) A/equine/Ohio/1/2003 (LAIV) H3N8. Figura 1A: Representação esquemática dos segmentos 1 (PB2) e 2 (PB1) de WT (preto) e LAIV (branco) EIV (A/Equine/Ohio/1/2003): substituições de aminoácidos nas subunidades PB2 (N265S) e PB1 (K391E, E581G e A661T) de polimerase H3N8 A/equine/Ohio/1/2003 são indicadas. Figura 1B: Atividade do minigenoma: células E. Derm (formato de placa de 12 poços, 5 × 105 células/poço,
6 / 119 triplicados) foram cotransfectadas transitoriamente com 0,25 μg de plasmídeos de expressão de pDZ ambisense que codificam os requisitos mínimos para replicação do genoma viral e transcrição de genes (PB2, PB1, PA e NP), juntamente com 0,5 µg de um plasmídeo de expressão semelhante a vRNA que codifica Gaussia luciferase (Gluc) e 0,1 µg de um plasmídeo pCAGGS Cypridinia luciferase (Cluc) para normalizar as eficiências da transfecção. Seis horas após a transfecção, as células foram colocadas a 33 °C, 37 °C ou 39 °C e, 48 horas após a transfecção, a replicação viral e a transcrição foram avaliadas por luminescência (Gluc). A atividade de Gluc foi normalizada com a de Cluc. Os dados representam os ± DPs médios dos resultados determinados quanto aos ensaios em triplicado. A expressão normalizada de repórter é relativa à atividade do minigenoma na ausência do plasmídeo pDZ NP. Os dados são representados como atividade relativa considerando a atividade da polimerase WT EIV a cada temperatura como 100%. *, P <0,005; **, P <0,001; NS não estatístico usando o teste t de Student.
[0019] A Figura 2, compreendendo a Figura 2A e a Figura 2B, mostra os resultados de experiências que avaliam a caracterização in vitro da EIV LAIV. Figura 2A: Cinética de crescimento multiciclo: células MDCK (formato de placa de 12 poços, 5 × 105 células/poço, triplicados) foram infectadas (MOI, 0,001) com A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT (diamantes pretos) e LAIV (diamantes brancos) e incubados a 33 °C, 37 °C e 39 °C. Como controle interno, as células MDCK também foram infectadas com Flu Avert I.N. (triângulos cinza). Os títulos virais no TCS nos tempos indicados após a infecção foram determinados pelo teste de imunofoco (FFU/ml) usando um mAb anti-NP (HB-65). Os dados representam os +/- DPs médios dos resultados determinados em poços em triplicado. Linhas pretas pontilhadas indicam o limite de detecção (200 FFU/ml). P <0,05: * WT vs. LAIV, ** WT vs. Flu Avert IN usando o teste T de Student. Figura 2B:
7 / 119 Fenótipo de placa: células MDCK (formato de placa de 6 cavidades, 1 × 106 células/poço) foram infectadas com A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e LAIV e revestidas com meio contendo ágar. Células MDCK infectadas com Flu Avert I.N. foram incluídas como controle interno. As placas foram incubadas a 33 °C, 37 °C e 39 °C e três dias p.i., as monocamadas foram imunocoradas com um mAb anti-NP (HB-65).
[0020] A Figura 3, compreendendo a Figura 3A e a Figura 3B, mostra os resultados de experimentos de exemplo que demonstram a atenuação de EIV LAIV em camundongos: Camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (N = 6) foram infectados por via intranasal (in) com 1 × 105 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT ou LAIV. Os camundongos também foram infectados com 1 × 105 FFU com Flu Avert I.N. como controle interno. A presença de vírus nos pulmões (Figura 3A) e mucosa nasal (Figura 3B) de camundongos infectados foi avaliada nos dias 2 (N = 3) e 4 (N = 3) p.i. pelo teste de imunofoco (FFU/ml) usando um anti-NP mAb (HB-65). Os dados representam os ± DPs médios. Linhas pretas pontilhadas indicam o limite de detecção (200 FFU/ml). ND, não detectado. *, P <0,05 usando o teste T de Student.
[0021] A Figura 4, compreendendo a Figura 4A e a Figura 4B, mostra os resultados de experimentos de exemplo que demonstram a indução de respostas humorais pelo EIV LAIV em camundongos: Camundongos C57BL/6 fêmeas com 6 a 8 semanas de idade (N = 6) foram vacinados (i.n.) com 1 × 103 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT ou LAIV. Os camundongos também foram vacinados com mock (PBS) ou vacinados (i.n.) com 1 × 103 FFU de Flu Avert I.N. como controles negativos e positivos, respectivamente. Aos 14 dias após a vacinação, os camundongos foram sangrados e os soros foram coletados e avaliados individualmente quanto à presença de anticorpos totais por ELISA (Figura 4A) e anticorpos neutralizantes por HAI (Figura 4B) contra A/equine/Ohio/1/2003 H3N8. OD,
8 / 119 densidade ótica. Os dados representam +/- DPs médios dos resultados para 6 camundongos individuais. ND, não detectado. *, P <0,05 em peso vs. LAIV; **, P <0,005 em peso vs. Flu Avert I.N. usando o teste T de Student.
[0022] A Figura 5 mostra os resultados de experimentos de exemplo que demonstram a proteção do EIV LAIV contra o desafio do EIV em camundongos: Camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (N = 6) foram vacinados com 1 × 103 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT ou LAIV. Os camundongos também foram vacinados com mock (PBS) ou vacinados (i.n.) com 1 × 103 FFU de Flu Avert I.N. como controles negativos e positivos, respectivamente. Aos 15 dias após a vacinação, os camundongos foram desafiados com 1 × 105 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e os títulos virais nos dias 2 (N = 3) e 4 (N = 4) pós-desafio foram avaliados de homogenatos pulmonares por ensaio de imunofoco (FFU/ml) usando um mAb anti-NP (HB-65). Linha preta pontilhada indica o limite de detecção (200 FFU/ml). Os dados representam os ± DPs médios. ND, não detectado.
[0023] A Figura 6, compreendendo a Figura 6A e a Figura 6B, mostra os resultados de experimentos exemplificativos que demonstram a atenuação do EIV LAIV em cavalos: Cavalos de um a dois anos de ambos os sexos (N = 4) foram inoculados com 4 × 108 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV. Figura 6A: Representação gráfica das temperaturas retais individuais medidas em cada cavalo antes (dia 0) e durante 3 dias após a vacinação. Figura 6B: O conteúdo do vírus nos esfregaços nasofaríngeos foi determinado por RT-PCR quantitativo (q) e representado como limiar do ciclo de quantificação (Ct). Os esfregaços foram colhidos antes (dia 0) e durante 3 dias após a vacinação para cada narina de cavalo. Os dados representam as médias de cada cavalo em cada tempo pós-vacinação ± DP. A linha preta pontilhada indica o limite de detecção (Ct = 40).
[0024] A Figura 7, compreendendo a Figura 7A e a Figura 7B, mostra os resultados de experimentos de exemplo que demonstram a eficácia da
9 / 119 proteção do EIV LAIV contra o desafio do EIV em cavalos: cavalos de um a dois anos de ambos os sexos (N = 4) foram vacinados em intubação i.n. com 4 × 108 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV. Outro grupo de cavalos (N = 2) foi utilizado como controle (não vacinado). Aos 27 dias após a vacinação, os cavalos foram desafiados por aerossol com 1 × 107 unidades de EID50 por m3 de EIV do tipo selvagem (cepa Kentucky/2014) em uma baia de tenda (37,5 m3) durante 45 min. Figura 7A: As temperaturas retais foram medidas diariamente 10 dias após o desafio. Figura 7B: O conteúdo do vírus nos esfregaços nasofaríngeos colhidos durante 7 dias após o desafio foi analisado por (q) RT-PCR e representado como limiar do ciclo (Ct). A linha preta pontilhada indica o limite de detecção (Ct = 40).
[0025] A presente invenção se relaciona a composições e métodos para o tratamento e a prevenção do vírus da influenza equina (CIV) e patologias relacionadas ao EIV. A invenção fornece composições imunológicas multivalentes que fornecem proteção contra uma pluralidade de cepas ou clados de EIV. Por exemplo, em uma modalidade, a composição imunológica multivalente fornece proteção contra o EIV clado 1 H3N8 e o EIV clado 2 H3N8.
[0026] A presente invenção baseia-se, em partes, na descoberta de que várias mutações no segmento 1 e no segmento 2 do genoma EIV, codificando as proteínas PB2 e PB1 mutantes, tornam o vírus sensível à temperatura. Por exemplo, é descrito neste documento que essas mutações resultam na exibição de replicação viral reduzida do EIV em temperaturas corporais normais e elevadas em comparação ao EIV de tipo selvagem. No entanto, o EIV sensível à temperatura é capaz de induzir uma resposta imunológica específica do EIV. Assim, o EIV sensível à temperatura descrito neste documento é uma vacina do vírus da influenza atenuado vivo (LAIV), por vezes referida neste documento como EIV LAIV. É importante destacar que a
10 / 119 EIV LAIV descrita neste documento é mais eficaz no tratamento do EIV em comparação com as vacinas disponíveis no mercado.
[0027] É descrito neste documento o desenvolvimento de uma LAIV segura e eficaz para a prevenção e o controle do EIV H3N8 em cavalos é descrito neste documento. Abordagens genéticas reversas, juntamente com modificações nas subunidades virais da polimerase PB2 (N265S) e PB1 (K391E, E581G e A661T) do vírus influenza A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 foram usadas para produzir uma EIV H3N8 LAIV sensível à temperatura e adaptada ao frio. Em comparação com as vacinas inativadas atuais, a abordagem da LAIV sensível à temperatura e adaptada ao frio descrita neste documento fornece uma proteção maior e mais longa contra a doença causada pelo EIV H3N8, visto que a LAIV induz uma produção mais rápida e forte das respostas imunológicas das células T e humorais inatas e adaptativas nos tecidos alvo do trato respiratório. Além disso, em certos casos, a LAIV é administrada através de pulverização nasal, o que evita o inchaço e a dor muscular associados a infecções intramusculares de vacinas inativadas. Além disso, em algumas modalidades, uma única imunização com LAIV sensível à temperatura e adaptada ao frio é suficiente, em comparação com as várias doses necessárias com as vacinas inativadas atuais, para conferir proteção total contra o EIV H3N8 em um período de tempo mais curto. Além disso, a presente tecnologia de LAIV forneceria uma maior proteção cruzada contra cepas do EIV H3N8 antigenicamente diferentes do que a fornecida pelas vacinas inativadas atuais, diminuindo a chance de surtos do EIV H3N8.
[0028] Em comparação com a única EIV H3N8 LAIV disponível, a presente tecnologia também oferece uma série de vantagens. As mutações introduzidas nas subunidades PB2 e PB1 da polimerase do vírus influenza A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 são diferentes daquelas geradas pela adaptação ao frio da LAIV da influenza atual A/equine/Kentucky/1/91 H3N8, porém é capaz de conferir um fenótipo do vírus sensível à temperatura e adaptada ao
11 / 119 frio. Ademais, o uso de técnicas genéticas reversas de última geração facilita, como no caso da LAIV humana, o desenvolvimento rápido e preciso de candidatos à LAIV para o tratamento dos subtipos circulantes atuais 1 e 2 do clado da Flórida ou das cepas do EIV H3N8 recém-introduzidas. Assim, a presente abordagem da LAIV é mais eficaz do que a LAIV disponível no momento para tratar infecções por EIV H3N8 em cavalos devido à correspondência de cepa.
[0029] Em certas modalidades, a invenção refere-se a composição imunológica multivalente compreendendo duas ou mais EIV LAIVs. Por exemplo, em certas modalidades, a H3N8 LAIV descrita neste documento, com base na influenza A/equine/Ohio/1/2003 (uma cepa clado 1), é usado como um vírus doador principal (MDV) para expressar antígenos de diferentes cepas. Por exemplo, em uma modalidade, a composição imunológica multivalente compreende uma primeira LAIV sensível à temperatura e uma segunda LAIV sensível à temperatura, cada uma compreendendo o segmento mutante 1 e/ou o segmento mutante 2, em que a primeira LAIV expressa um ou mais antígenos de uma primeira cepa de influenza e onde a segunda LAIV expressa um ou mais antígenos de uma segunda cepa de influenza. A invenção também abrange composições imunológicas multivalentes compreendendo 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais ou 10 ou mais LAIVs, cada LAIV expressando um ou mais antígenos de uma cepa de influenza diferente. A composição multivalente pode ser usada para expressar antígenos, tais como glicoproteínas HA e NA, de clados ou cepas antigenicamente diferentes, fornecendo assim ampla proteção contra uma variedade de clados ou cepas circulantes. Definições
[0030] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção
12 / 119 pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são descritos.
[0031] Tal conforme usado neste documento, cada um dos termos seguintes tem o significado a ele associado nesta seção.
[0032] Os artigos "um" e "uma" são usados neste documento para se referir a um ou mais de um (por exemplo, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.
[0033] "Cerca de", conforme usado neste documento, ao se referir a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração de tempo e similares, destina-se a abranger variações de ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ou ±0,1% do valor especificado, uma vez que essas variações são apropriadas para realizar os métodos divulgados.
[0034] O termo "anticorpo", tal conforme usado neste documento, refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos da presente invenção podem estar em uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia simples e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
[0035] O termo "antígeno" ou "Ag", conforme usado neste documento, é definido como uma molécula que provoca uma resposta imunológica. Esta resposta imunológica pode envolver a produção de
13 / 119 anticorpos ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambas. O versado na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo praticamente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Um versado na técnica compreenderá que qualquer DNA, que compreende sequências de nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeo parcial que codifica uma proteína que induz uma resposta imune, portanto, codifica um "antígeno" à medida que esse termo é usado neste documento. Além disso, um versado na técnica compreenderá que um antígeno não precisa ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeo de comprimento completo de um gene. É facilmente evidente que a presente invenção inclui, mas não está limitada a utilização de sequências de nucleotídeo parciais de mais do que um gene e que estas sequências de nucleotídeo estão dispostas em várias combinações para estimular a resposta imunológica desejada. Além disso, alguém versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado por um "gene" de forma alguma. Fica imediatamente evidente que um antígeno pode ser gerado de forma sintetizada ou pode derivar de uma amostra biológica.
[0036] Tal conforme usado neste documento, o termo "autólogo" pretende referir-se a qualquer material derivado do mesmo indivíduo ao qual mais tarde será reintroduzido no indivíduo.
[0037] Conforme usado neste documento, "terapia de combinação" significa que um primeiro agente é administrado juntamente com outro agente. "Juntamente com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento adicionalmente a uma outra modalidade de tratamento. Assim, "juntamente com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a administração de uma outra modalidade de tratamento ao indivíduo. Tais combinações são consideradas como parte de um único regime ou regimes de tratamento.
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[0038] Conforme usado neste documento, o termo "administração concomitante" significa que a administração da primeira terapia e a de uma segunda terapia em uma terapia de combinação se sobrepõem.
[0039] Uma "doença" é um estado de saúde de um animal em que o animal não pode manter a homeostase e, se a doença não for melhorada, a saúde do animal continua a deteriorar-se. Em contraste, um "distúrbio" em um animal é um estado de saúde em que o animal é capaz de manter a homeostase, mas em que o estado de saúde do animal é menos favorável do que seria na ausência do distúrbio. Sem tratamento, um distúrbio não causa necessariamente uma diminuição adicional no estado de saúde do animal.
[0040] Uma "quantidade eficaz", conforme usado neste documento, denota uma quantidade que fornece um benefício terapêutico ou profilático.
[0041] O termo "expressão", conforme usado neste documento, é definido como a transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos particular conduzida pelo seu promotor.
[0042] "Vetor de expressão" refere-se a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle de expressão ligadas operativamente a uma sequência de nucleotídeo a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, tal como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.
[0043] "Homólogo" refere-se à similaridade de sequência ou identidade de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. Quando uma posição em ambas as duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de
15 / 119 aminoácidos, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA está ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição. A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições coincidentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências, dividido pelo número de posições comparadas X 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas sequências estiverem combinadas ou homólogas então as duas sequências são 60% homólogas. A título de exemplo, as sequências de DNA ATTGCC e TATGGC compartilham 50% de homologia. Em geral, a comparação é feita quando duas sequências estão alinhadas para gerar homologia máxima.
[0044] O termo "imunoglobulina" ou "Ig", conforme usado neste documento, é definido como uma classe de proteínas, que funcionam como anticorpos. Os anticorpos expressados pelas células B são por vezes referidos como o receptor de BCR (receptor de células B) ou antígeno. Os cinco membros incluídos nesta classe de proteínas são IgA, IgG, IgM, IgD e IgE. A IgA é o anticorpo primário que está presente nas secreções corporais, como saliva, lágrimas, leite materno, secreções gastrointestinais e secreções mucosas das vias respiratórias e genitourinárias. A IgG é o anticorpo circulante mais comum. A IgM é a principal imunoglobulina produzida na resposta imune primária na maioria dos sujeitos. É a imunoglobulina mais eficiente na aglutinação, fixação do complemento e outras respostas de anticorpos, e é importante na defesa contra bactérias e vírus. IgD é a imunoglobulina que não tem função de anticorpo conhecida, mas pode servir como um receptor de antígeno. A IgE é a imunoglobulina que medeia a hipersensibilidade imediata causando a liberação de mediadores de mastócitos e basófilos após exposição ao alergênico.
[0045] Conforme usado neste documento, o termo "resposta imunológica" inclui respostas imunológicas mediadas por células T e/ou mediadas por células B. Exemplos de respostas imunológicas incluem
16 / 119 respostas de células T, por exemplo, produção de citocinas e citotoxicidade celular e respostas de células B, por exemplo, produção de anticorpos. Além disso, o termo resposta imunológica inclui respostas imunológicas que são indiretamente afetadas pela ativação de células T, por exemplo, pela produção de anticorpos (respostas humorais) e pela ativação de células responsivas a citocinas, por exemplo, macrófagos. As células imunológicas envolvidas na resposta imunológica incluem linfócitos, tais como células B e células T (células CD4 +, CD8 +, Th1 e Th2); células que apresentam antígeno (por exemplo, células que apresentam antígenos profissionais, como células dendríticas, macrófagos, linfócitos B, células de Langerhans e células que apresentam antígenos não profissionais como queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos); células killer naturais; células mieloides, como macrófagos, eosinófilos, células mastocíticas, basófilos e granulócitos.
[0046] "Isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está "isolado", mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural está "isolado". Uma proteína ou ácido nucleico isolado podem existir em uma forma substancialmente purificada ou podem existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, em uma célula hospedeira.
[0047] A administração "parentérica" de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, injeção subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) ou intraesternal ou técnicas de infusão.
[0048] Os termos "paciente", "sujeito", "indivíduo" e similares são utilizados indiferentemente neste documento e referem-se a qualquer animal, ou suas células, seja in vitro ou in situ, passíveis dos métodos descritos neste documento.
[0049] O termo “administração simultânea”, conforme usado neste
17 / 119 documento, significa que uma primeira terapia e uma segunda terapia em uma terapia de combinação são administradas com uma separação de tempo não superior a cerca de 15 minutos, tal como não superior a cerca de 10 minutos, 5 minutos ou 1 minuto. Quando a primeira e segunda terapias são administradas simultaneamente, a primeira e segunda terapias podem estar contidas na mesma composição (por exemplo, uma composição compreendendo tanto uma primeira quanto uma segunda terapia) ou em composições separadas (por exemplo, uma primeira terapia em uma composição e uma segunda terapia está contida em outra composição).
[0050] Pelo termo "se liga especificamente", tal conforme usado neste documento no que diz respeito a um anticorpo, entende-se um anticorpo que reconhece um antígeno específico, mas não reconhece ou se liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de uma espécie também pode se ligar a esse antígeno de uma ou mais espécies. Mas, tal reatividade de espécies cruzadas não altera a classificação de um anticorpo como específico. Noutro exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno também pode se ligar a diferentes formas alélicas do antígeno. Porém, essa reatividade cruzada não altera por si só a classificação de um anticorpo como específico. Em alguns casos, os termos "ligação específica" ou "que se liga especificamente" podem ser usados em referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, para significar que a interação depende da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante ou epítopo antigênico) nas espécies químicas; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura proteica específica em vez de proteínas em geral. Se um anticorpo é específico para o epítopo "A", a presença de uma molécula contendo epítopo A (ou A livre, não marcado), numa reação contendo "A" marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcada ligada ao anticorpo.
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[0051] O termo "temperatura normal" ou "temperatura corporal normal", tal conforme usado neste documento, refere-se à temperatura de um sujeito saudável. Por exemplo, em certos casos, a "temperatura corporal normal" em um sujeito humano está na faixa de cerca de 36°C a cerca de 38°C. Em certos casos, em um sujeito equino, "temperatura corporal normal" está na faixa de cerca de 37,5°C a cerca de 38,7°C.
[0052] O termo "temperatura elevada" ou "temperatura corporal elevada", conforme usado neste documento, refere-se a uma temperatura em um indivíduo maior do que a "temperatura corporal normal" de um sujeito de um determinado organismo. Em certos casos, a "temperatura corporal elevada" pode ser indicativa de febre, infecção ou outra doença. Em certos casos, a temperatura corporal elevada em um sujeito humano é superior a cerca de 37°C. Em certos casos, a temperatura corporal elevada em um sujeito equino é superior a cerca de 38,9°C.
[0053] O termo "terapêutico", tal conforme usado neste documento, significa um tratamento e/ou profilaxia. Um efeito terapêutico é obtido pela supressão, remissão ou erradicação de um estado de doença.
[0054] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a quantidade do composto sujeito que irá desencadear a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, ou sujeito que está sendo procurada pelo investigador, veterinário, médico ou outro clínico. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" inclui que a quantidade de um composto que, quando administrada, é suficiente para prevenir o desenvolvimento de, ou aliviar, em certa medida, um ou mais dos sinais ou sintomas do distúrbio ou doença a ser tratada. A quantidade terapeuticamente eficaz irá variar dependendo do composto, da doença e sua severidade e a idade, peso, etc., do sujeito a ser tratado.
[0055] Para "tratar" uma doença como o termo é usado neste documento, significa reduzir a frequência ou gravidade de pelo menos um
19 / 119 sinal ou sintoma de uma doença ou distúrbio experimentada por um sujeito.
[0056] O termo "transfectado", ou "transformado" ou "transduzido" conforme usado neste documento refere-se a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula "transfectada", ou "transformada" ou "transduzida" é uma que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula primária e sua progênie.
[0057] Faixas: ao longo de toda esta divulgação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de faixa. Deve-se entender que a descrição em formato de faixa é simplesmente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais nessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6, deve ser considerada como tendo subfaixas especificamente divulgadas, tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., assim como os números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude da faixa. Descrição
[0058] A presente invenção fornece composições imunológicas e métodos úteis para a inibição, a prevenção e o tratamento da influenza equina e doenças e distúrbios relacionados com a influenza equina. Em uma modalidade, a composição imunológica compreende um vírus atenuado vivo (LAV). Em uma modalidade, a composição imunológica é uma composição multivalente compreendendo uma pluralidade de LAVs, cada um expressando um ou mais antígenos de diferentes cepas ou clados de um vírus, por exemplo, diferentes cepas ou clados do vírus influenza.
[0059] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um LAV
20 / 119 sensível à temperatura de um vírus da influenza equina. Por exemplo, é demonstrado neste documento que uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou segmento 2 do genoma do EIV tornam o vírus sensível à temperatura. A EIV LAIV sensível à temperatura da presente invenção apresenta uma replicação viral reduzida em comparação com o EIV de tipo selvagem, tanto à temperatura corporal normal quanto a temperaturas elevadas ou febris. No entanto, a EIV LAIV sensível à temperatura fornece respostas imunológicas específicas de antígeno e proteção contra o EIV. Em uma modalidade, a EIV LAIV fornece pelo menos as mesmas respostas imunológicas específicas de antígeno e proteção contra o EIV em comparação com o EIV de tipo selvagem. Em certas modalidades, a EIV LAIV fornece respostas imunológicas específicas de antígeno maiores e uma maior proteção contra o EIV em comparação ao EIV inativado.
[0060] Em uma modalidade, a composição compreende uma EIV LAIV com uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2 do genoma viral. Por exemplo, em uma modalidade, a EIV LAIV codifica uma PB2 mutante e/ou uma PB1 mutante. Em certas modalidades, a PB2 mutante compreende uma mutação pontual de N265S. Em certas modalidades, a PB1 mutante compreende pelo menos uma dentre uma mutação pontual de K391E, uma mutação pontual de E581G ou uma mutação pontual de A661T.
[0061] Em certas modalidades, a EIV LAIV descrita neste documento é usada como um vírus doador principal (MDV), tendo uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou segmento 2 do genoma viral, para expressar um ou mais antígenos de diferentes cepas ou clados do vírus influenza. Em uma modalidade, o MDV compreende o segmento 1 e/ou o segmento 2 do H3N8 mutante, conforme descrito neste documento. Em certas modalidades, o MDV pode ser usado para gerar uma LAIV que é protetiva contra outros patógenos. Por exemplo, em certas modalidades, uma LAIV contra outra cepa de influenza pode ser gerada usando o MDV para expressar uma ou mais
21 / 119 proteínas virais (por exemplo, HA ou NA) da outra cepa. Por exemplo, em uma modalidade, a composição compreende uma composição imunológica multivalente compreendendo uma pluralidade de LAIVs, cada uma projetada para expressar um ou mais antígenos de um clado ou cepa diferente do vírus influenza.
[0062] Numa modalidade, a composição compreende uma primeira LAIV que expressa um ou mais antígenos de um vírus influenza H3N8 do clado 1 e uma segunda LAIV que expressa um ou mais antígenos de um vírus influenza H3N8 do clado 2.
[0063] Numa modalidade, a composição compreende uma LAIV que expressa um ou mais antígenos do clado 1 A/equine/Ohio/1/2003 H3N8. Numa modalidade, a composição compreende uma LAIV que expressa um ou mais antígenos do clado 2 A/equine/Richmond/1/2007 H3N8. Numa modalidade, a composição compreende uma LAIV que expressa um ou mais antígenos do clado 1 A/equine/Texas/6/2017 H3N8.
[0064] Em uma modalidade, a composição compreende uma primeira LAIV expressando um ou mais antígenos de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 e uma segunda LAIV expressando um ou mais antígenos de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8.
[0065] Em uma modalidade, a composição compreende uma primeira LAIV expressando um ou mais antígenos de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 e uma segunda LAIV expressando um ou mais antígenos de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8.
[0066] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento ou prevenção do EIV ou de uma patologia relacionada ao EIV, compreendendo a administração de uma composição compreendendo a EIV LAIV. Em certas modalidades, o método compreende a administração intranasal da EIV LAIV.
[0067] Em geral, os vírus influenza de tipo selvagem contêm um
22 / 119 genoma segmentado com 8 segmentos, conforme descrito na Tabela 1, abaixo: Tabela 1: Segmento Produto gênico 1 PB2 (proteína polimerase (básica) 2) 2 PB1 (proteína polimerase (básica) 1) 3 PA (proteína polimerase (ácida)) 4 HA (hemaglutinina) 5 NP (nucleoproteína) 6 NA (neuraminidase) 7 M1 (proteína de matriz 1) e M2 (proteína de matriz 2) 8 NS1 (proteína não estrutural 1) e NEP/NS2 (proteína não estrutural 2)
[0068] Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma composição imunológica compreendendo o segmento 1 e/ou segmento 2, em que o segmento 1 e/ou o segmento 2 compreende uma ou mais mutações. Por exemplo, em certas modalidades, a composição imunológica compreende uma LAIV, compreendendo uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2. Em uma modalidade, a composição imunológica compreende uma EIV LAIV, compreendendo uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2.
[0069] A presente invenção também fornece métodos de prevenção, inibição e tratamento de EIV e de doenças e distúrbios relacionados ao EIV. Em uma modalidade, os métodos da invenção induzem imunidade contra o EIV pela geração de uma resposta imunológica direcionada ao EIV. Em uma modalidade, os métodos da invenção induzem a produção de anticorpos específicos do EIV. Em uma modalidade, os métodos da invenção previnem a patologia relacionada ao EIV. Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem administrar uma composição imunológica compreendendo uma LAIV, em que o LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2 a um sujeito em necessidade deste. Em uma modalidade, os métodos compreendem administrar uma composição imunológica a um sujeito em necessidade desta, induzindo a imunidade ao EIV. Composições
[0070] A presente invenção fornece composições imunológicas que,
23 / 119 quando administradas a um sujeito em necessidade destas, desencadeiam uma resposta imunológica direcionada contra o vírus da influenza equina (EIV). Em algumas modalidades, a composição inclui polipeptídeos, nucleotídeos, vetores ou vacinas. Além disso, quando as composições são administradas a um sujeito, elas induzem uma resposta imunológica que serve para proteger o sujeito inoculado contra a influenza equina. Conforme exemplificado neste documento, a composição pode ser obtida em grandes quantidades para uso como vacina.
[0071] Em uma modalidade, a presente invenção fornece composições que são úteis como agentes imunomoduladores, por exemplo, no estímulo de respostas imunológicas e na prevenção da influenza equina e da patologia relacionada à influenza equina.
[0072] Os vírus atenuados vivos podem ser usados como agentes imunoestimuladores para induzir a produção de anticorpos específicos do EIV e proteger contra a patologia relacionada à influenza equina e contra a influenza equina. Por conseguinte, em uma modalidade, a composição da invenção compreende um EIV atenuado vivo (EIV LAIV), em que o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no genoma viral para tornar o EIV LAIV. Por exemplo, em uma modalidade, o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1 do genoma viral. Uma ou mais das mutações no segmento 1 do genoma viral codifica uma proteína PB2 mutante. Em uma modalidade, o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 2 do genoma viral. Uma ou mais das mutações no segmento 2 do genoma viral codifica uma proteína PB1 mutante. Em uma modalidade, o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e uma ou mais mutações no segmento 2.
[0073] Em uma modalidade, o EIV LAIV é baseado no genoma da Influenza A/equine/Ohio/1/2003 H3N8. As sequência de ácidos nucleicos de tipo selvagem de cada segmento da Influenza A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 e
24 / 119 as sequências de aminoácidos de tipo selvagem para as proteínas codificadas estão resumidas na Tabela 2, abaixo: Tabela 2 Sequências de tipo selvagem para a Influenza A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 Segmentos Produtos gênicos Segmento 1 (SEQ ID NO: 5) PB2 (SEQ ID NO: 6) Segmento 2 (SEQ ID NO: 7) PB1 (SEQ ID NO: 8) Segmento 3 (SEQ ID NO: 9) PA (SEQ ID NO: 10) Segmento 4 (SEQ ID NO: 11) HA (SEQ ID NO: 12) Segmento 5 (SEQ ID NO: 13) NP (SEQ ID NO: 14) Segmento 6 (SEQ ID NO: 15) NA (SEQ ID NO: 16) Segmento 7 (SEQ ID NO: 17) M1 (SEQ ID NO: 18) M2 (SEQ ID NO: 19) Segmento 8 (SEQ ID NO: 20) NS1 (SEQ ID NO: 21) NEP/NS2 (SEQ ID NO: 22)
[0074] Em uma modalidade, a composição compreende uma ou mais mutações nas sequências de ácidos nucleicos do segmento 1, codificando a PB2, e/ou do segmento 2, codificando a PB1. Assim, em certas modalidades, a composição codifica a PB1 mutante e/ou a PB2 mutante. Conforme descritas neste documento, uma ou mais mutações tornam o vírus sensível à temperatura, apresentando replicação viral reduzida a temperaturas normais ou elevadas.
[0075] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição que compreende uma ou mais mutações no segmento 1. Por exemplo, em uma modalidade, a composição compreende um segmento 1 com uma ou mais mutações que resultam na produção da PB2 mutante com uma mutação pontual no resíduo de aminoácido 265. Por exemplo, em uma modalidade, a PB2 mutante compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, porém tendo uma mutação pontual no resíduo de aminoácido 265. Por exemplo, em uma modalidade, a PB2 mutante compreende uma mutação pontual N265S, em que a PB2 mutante compreende uma serina no resíduo de aminoácido 265.
[0076] Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma PB2 mutante com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma
25 / 119 PB2 mutante que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 2. Por exemplo, em certas modalidades, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma PB2 mutante que é pelo menos 50% homóloga, pelo menos 60% homóloga, pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95%, pelo menos 98% homóloga, pelo menos 99% homóloga ou pelo menos 99,5% homóloga à SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma PB2 mutante que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 2, em que a PB2 mutante que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 2 compreende a mutação pontual N265S.
[0077] Em uma modalidade, a composição compreende um segmento 1 mutante que compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 1. Por exemplo, em certas modalidades, a composição compreende uma sequência nucleotídica que é pelo menos 50% homóloga, pelo menos 60% homóloga, pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95%, pelo menos 98% homóloga, pelo menos 99% homóloga ou pelo menos 99,5% homóloga à SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 1, em que a PB2 mutante codificada pela sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 1 compreende a mutação pontual de N265S.
[0078] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição que compreende uma ou mais mutações no segmento 2. Por exemplo, em uma modalidade, a composição compreende o segmento 2 com uma ou mais mutações que resultam na produção da PB1 mutante com uma mutação pontual em um ou mais dentre: resíduo de aminoácido 391, resíduo
26 / 119 de aminoácido 581 e resíduo de aminoácido 661. Por exemplo, em uma modalidade, a PB2 mutante compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, porém tendo uma mutação pontual em um ou mais dentre: resíduo de aminoácidos 391, resíduo de aminoácidos 581 e resíduo de aminoácidos
661. Por exemplo, em uma modalidade, a PB1 mutante compreende uma mutação pontual de K391E, em que a PB1 mutante compreende um ácido glutâmico no resíduo de aminoácido 391. Em uma modalidade, a PB1 mutante compreende uma mutação pontual de E581G, em que a PB1 mutante compreende uma glicina no resíduo de aminoácido 581. Em uma modalidade, a PB1 mutante compreende uma mutação pontual de A661T, em que a PB1 mutante compreende uma treonina no resíduo de aminoácido 661.
[0079] Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma PB1 mutante com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma PB1 mutante que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 4. Por exemplo, em certas modalidades, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma PB1 mutante que é pelo menos 50% homóloga, pelo menos 60% homóloga, pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95%, pelo menos 98% homóloga, pelo menos 99% homóloga ou pelo menos 99,5% homóloga à SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a PB1 mutante que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 4, em que a PB1 mutante que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 4 compreende uma ou mais dentre: uma mutação pontual de K391E, uma mutação pontual de E581G e uma mutação pontual de A661T.
[0080] Em uma modalidade, a composição compreende um segmento 2 mutante que compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 3. Em
27 / 119 uma modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 3. Por exemplo, em certas modalidades, a composição compreende uma sequência nucleotídica que é pelo menos 50% homóloga, pelo menos 60% homóloga, pelo menos 70% homóloga, pelo menos 80% homóloga, pelo menos 90% homóloga, pelo menos 95%, pelo menos 98% homóloga, pelo menos 99% homóloga ou pelo menos 99,5% homóloga à SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 3, em que a PB1 mutante codificada pela sequência nucleotídica que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO: 3 compreende uma ou mais dentre a mutação pontual de K391E, a mutação pontual de E581G e a mutação pontual de A661T.
[0081] Em certas modalidades, a composição compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e uma ou mais mutações no segmento 2. Por exemplo, em certas modalidades, a composição compreende o segmento 1 com uma mutação pontual de N265S e o segmento 2 com uma ou mais dentre a mutação pontual de K391E, a mutação pontual de E581G e a mutação pontual de A661T.
[0082] Em certas modalidades, a composição compreende uma ou mais mutações nas sequências de ácidos nucleicos do segmento 1 e/ou do segmento 2, compreendendo simultaneamente as sequências de ácidos nucleicos de tipo selvagem para o resto do genoma segmentado. Por exemplo, em uma modalidade, o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e compreende o segmento 2, o segmento 3, o segmento 4, o segmento 5, o segmento 6, o segmento 7 e o segmento 8 de tipo selvagem. Em uma modalidade, o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 2 e compreende o segmento 1, o segmento 3, o segmento 4, o segmento 5, o segmento 6, o segmento 7 e o segmento 8 de tipo selvagem. Em uma modalidade, o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no
28 / 119 segmento 1 e no segmento 2 e compreende o segmento 3, o segmento 4, o segmento 5, o segmento 6, o segmento 7 e o segmento 8 de tipo selvagem.
[0083] Em certas modalidades, a composição compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2, em combinação com uma ou mais mutações em um ou mais dos outros segmentos do genoma viral.
[0084] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4 e segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, fornecendo proteção contra o clado 1 H3N8.
[0085] A sequência nucleotídica do segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 11. A sequência de aminoácidos da proteína HA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 12.
[0086] A sequência nucleotídica do segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 15. A sequência de aminoácidos da proteína NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 16.
[0087] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e segmento 6, codificando NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, em que HA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 12 e em que NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8compreende SEQ ID NO: 16.
[0088] Em uma modalidade, a composição compreende uma LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e segmento 6
29 / 119 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 11 e em que o segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8compreende SEQ ID NO: 15.
[0089] Em certas modalidades, a composição compreende um segmento mutante 1, um segmento mutante 2, ou uma combinação destes, conforme descrito neste documento, em combinação com uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam outro antígeno. Por exemplo, em certas modalidades, a composição compreende um segmento mutante 1, um segmento mutante 2, ou combinação destes, conforme descrito neste documento, em combinação com uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais antígenos de outro vírus ou outra cepa. Por exemplo, em certos aspectos, o EIV LAIV H3N8 descrito neste documento, compreendendo um segmento 1 mutante, um segmento 2 mutante ou combinação destes pode ser usado como um vírus doador principal (MDV). Por exemplo, um MDV compreendendo um H3N8 que compreende um segmento mutante 1, um segmento mutante 2 ou uma combinação destes descrita neste documento pode ser modificado para compreender uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais dentre: PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M1, M2, NS1 ou NEP/NS2 de outra cepa de influenza. Assim, uma composição que compreende um H3N8 que compreende um segmento 1 mutante, um segmento 2 mutante ou uma combinação destes descrita neste documento pode oferecer proteção contra uma cepa diferente quando a composição expressar um antígeno da cepa diferente. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição compreende a estrutura principal de um EIV LAIV H3N8 compreendendo um segmento mutante 1, um segmento mutante 2 ou uma combinação destes descrita neste documento, compreendendo ainda uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais dentre: PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M1, M2, NS1 ou NEP/NS2 de outra cepa de influenza. Em uma modalidade, a composição compreende a estrutura
30 / 119 principal de um EIV LAIV H3N8 compreendendo um segmento 1 mutante, um segmento 2 mutante ou uma combinação destes descrita neste documento, compreendendo também uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais dentre HA ou NA de uma cepa diferente da influenza. Por exemplo, a composição que compreende a estrutura principal de um EIV LAIV H3N8 descrito neste documento pode ser modificada a fim de expressar uma ou mais proteínas virais de uma cepa recém-administrada, oferecendo proteção contra a cepa recém-emergente.
[0090] Em uma modalidade, a composição compreende o segmento 1, o segmento 2, o segmento 3, o segmento 5, o segmento 7 e o segmento 8 do EIV LAIV H3N8 descritos neste documento, compreendendo uma ou mais mutações pontuais em um ou mais dentre o segmento 1 e o segmento 2, onde a composição também compreende o segmento 4 e o segmento 6 de uma cepa diferente do EIV.
[0091] Em uma modalidade, a composição compreende um segmento 1 mutante do H3N8, um segmento 2 mutante do H3N8 ou uma combinação destes, compreendendo ainda o segmento 4, o segmento 6 ou uma combinação destes de uma cepa diferente do EIV. Em certos aspectos, o segmento mutante 1, o segmento mutante 2 ou uma combinação destes de H3N8 fornece o fenótipo atenuado sensível à temperatura do EIV LAIV, enquanto que o segmento 4, o segmento 6 ou uma combinação sua da cepa diferente do EIV, codifica HA, NA ou uma combinação destas da cepa diferente do EIV para induzir uma resposta imunológica específica à cepa diferente do EIV no sujeito.
[0092] Numa modalidade, a composição compreende uma vacina multivalente compreendendo uma pluralidade do EIV LAIV descrito neste documento. Por exemplo, em uma modalidade, a composição compreende um primeiro EIV LAIV, compreendendo um segmento mutante 1, um segmento mutante 2 ou uma combinação destes do H3N8, onde o primeiro EIV LAIV
31 / 119 compreende o segmento 4, o segmento 6 ou uma combinação destes do H3N8; e a composição compreende também um segundo EIV LAIV, compreendendo um segmento mutante 1, um segmento mutante 2 ou um combinação destes do H3N8, onde o segundo EIV LAIV compreende o segmento 4, o segmento 6 ou uma combinação destes da cepa do EIV. Em certas modalidades, a composição induz uma resposta imunológica contra o H3N8 e outra cepa do EIV.
[0093] As cepas exemplificativas do EIV que podem ser incluídas na vacina multivalente incluem, mas não estão limitadas a, a cepa europeia 2006- 2007 semelhante a Newmarket/2003 e as cepas de clado 1 da Florida semelhantes a South Africa/03, semelhante a Ohio/03 e semelhante a Notss/09, e as cepas de clado 2 da Florida semelhantes a Richmond/07, semelhantes a Lancashire/10 ou semelhantes a Hants/10.
[0094] Em uma modalidade, a composição compreende uma LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4 e segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8, fornecendo proteção contra o clado 2 de H3N8.
[0095] A sequência nucleotídica do segmento 4 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 23. A sequência de aminoácidos da proteína HA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 24.
[0096] A sequência nucleotídica do segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 25. A sequência de aminoácidos da proteína NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 26.
[0097] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e
32 / 119 compreendendo o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8, e segmento 6, que codifica NA de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8, em que HA de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 24 e em que NA de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8 compreende SEQ ID NO: 26.
[0098] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8, e segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 23 e em que o segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2007 H3N8 compreende SEQ ID NO: 25.
[0099] Em uma modalidade, a composição compreende (1) um primeiro LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base no A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo ainda o segmento 4 e o segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 e (2) um segundo LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 e o segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8; fornecendo assim proteção contra o clado 1 e o clado 2 de H3N8.
[00100] Em uma modalidade, a composição compreende um primeiro LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e segmento 6, que codifica NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, em que HA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 12 e em que NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 compreende SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade, a composição compreende um segundo LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma
33 / 119 combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, e segmento 6, que codifica NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, em que HA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 24 e em que NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende SEQ ID NO: 26.
[00101] Em uma modalidade, a composição compreende um primeiro LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 11 e em que o segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 compreende SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, a composição compreende um segundo LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, e segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 23 e em que o segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende SEQ ID NO: 25.
[00102] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo o segmento 4 e segmento 6 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8; fornecendo, dessa forma, proteção contra o clado 1 de H3N8.
[00103] A sequência nucleotídica do segmento 4 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 27. A sequência de aminoácidos da proteína HA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 é fornecida
34 / 119 por SEQ ID NO: 28.
[00104] A sequência nucleotídica do segmento 6 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 é fornecida pela SEQ ID NO: 29. A sequência de aminoácidos da proteína NA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 é fornecida por SEQ ID NO: 30.
[00105] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, e segmento 6, que codifica NA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, em que HA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 28 e em que NA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 30.
[00106] Em uma modalidade, a composição compreende um LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, e segmento 6 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 27 e em que o segmento 6 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 29.
[00107] Em uma modalidade, a composição compreende (1) um primeiro LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo ainda o segmento 4 e o segmento 6 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 e (2) um segundo LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 e o segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8; fornecendo assim proteção contra o clado 1 e o clado 2 H3N8.
35 / 119
[00108] Em uma modalidade, a composição compreende um primeiro LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e compreendendo ainda o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, e segmento 6, que codifica NA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, em que HA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 28 e em que NA de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade, a composição compreende um segundo LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4, que codifica HA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, e segmento 6, que codifica NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, em que HA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 24 e em que NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende SEQ ID NO: 26.
[00109] Em uma modalidade, a composição compreende um primeiro LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, e segmento 6 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 27 e em que o segmento A/equine/Texas/6/2017 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 29. Em uma modalidade, a composição compreende um segundo LAIV compreendendo o segmento mutante 1, segmento mutante 2 ou uma combinação destes com base em A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, mas compreendendo ainda o segmento 4 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, e segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, em que o segmento 4 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende a SEQ ID NO: 23 e em que o segmento 6 de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 compreende
36 / 119 SEQ ID NO: 25.
[00110] Em certas modalidades, a composição compreende um polinucleotídeo que codifica a PB2 mutante e/ou a PB1 mutante. O polinucleotídeo pode ser de RNA ou DNA. Em uma modalidade, a composição compreende uma vacina de DNA.
[00111] As sequências de ácido nucleico incluem tanto a sequência de DNA que é transcrita no RNA como a sequência de RNA que é traduzida em um polipeptídeo. De acordo com outras modalidades, os polinucleotídeos da invenção são inferidos a partir da sequência de aminoácidos dos polipeptídeos da invenção. Como é sabido na técnica, vários polinucleotídeos alternativos são possíveis devido a códons redundantes, ao mesmo tempo em que retêm a atividade biológica dos polipeptídeos traduzidos.
[00112] Além disso, a invenção abrange um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência nucleotídica com homologia substancial com uma sequência nucleotídica de um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo divulgado neste documento. De preferência, a sequência nucleotídica de um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo da invenção é "substancialmente homóloga", ou seja, é cerca de 60% homóloga, mais preferencialmente cerca de 70% homóloga, ainda mais preferencialmente cerca de 80% homóloga, mais preferencialmente cerca de 90% homóloga, ainda mais preferencialmente cerca de 95% homóloga e ainda mais preferencialmente cerca de 99% homóloga a uma sequência nucleotídica de um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo da invenção.
[00113] Ficará entendido explicitamente que o escopo da presente invenção abrange os homólogos, análogos, variantes, fragmentos, derivados e sais, incluindo polipeptídeos e polinucleotídeos mais curtos e mais longos, bem como análogos de polipeptídeo e polinucleotídeo com uma ou mais substituições de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, bem como derivados de aminoácido ou de ácido nucleico, ácidos nucleicos e aminoácidos não-
37 / 119 naturais e ácidos nucleicos e aminoácidos sintéticos conforme são conhecidos na técnica, com a estipulação de que essas modificações devem preservar a atividade imunológica da molécula original. Especificamente, quaisquer fragmentos ativos dos polipeptídeos ativos, bem como extensões, conjugados e misturas, são incluídos e são divulgados neste documento, de acordo com os princípios da presente invenção.
[00114] A invenção deve ser entendida como inclusiva de todo e qualquer ácido nucleico isolado que seja homólogo aos ácidos nucleicos descritos e referenciados neste documento, contanto que esses ácidos nucleicos homólogos codifiquem os polipeptídeos com a atividade biológica dos polipeptídeos divulgados neste documento.
[00115] Uma pessoa versada na técnica compreende que os ácidos nucleicos da invenção abrangem uma sequência de RNA ou de DNA que codifica um polipeptídeo da invenção, e qualquer forma modificada dela, incluindo modificações química do DNA ou do RNA que tornam a sequência nucleotídica mais estável quando está sem a célula ou quando está associada com uma célula. Modificações químicas dos nucleotídeos também podem ser utilizadas para aumentar a eficácia com a qual uma sequência nucleotídica captada por uma célula ou a eficácia com a qual é expressa em uma célula. Toda e qualquer combinação de modificações das sequências nucleotídicas são contempladas na presente invenção.
[00116] Além disso, qualquer quantidade de procedimentos pode ser usada para a geração de formas mutantes, derivadas ou variantes de uma proteína da invenção pelo uso da metodologia de DNA recombinante devidamente conhecida na técnica, como, por exemplo, aquela descrita por Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), e em Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Os procedimentos para a introdução de alterações de aminoácidos em um
38 / 119 polipeptídeo ou em um polipeptídeo pela alteração da sequência de DNA que codifica o polipeptídeo são devidamente conhecidos na técnica e também são descritos nesses e em outros tratados.
[00117] De acordo com outra modalidade, ainda, a composição da invenção, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos ou uma combinação de sequências de ácidos nucleicos da presente invenção, é capaz de gerar uma resposta imunológica específica do EIV. Em outra modalidade, a composição da invenção, compreendendo as sequências de ácidos nucleicos ou uma combinação de sequências de ácidos nucleicos da presente invenção, é capaz de gerar anticorpos específicos do EIV. Em certas modalidades, a composição é capaz de oferecer proteção contra o EIV, incluindo o EIV H3N8. Em certas modalidades, a composição é capaz de proteger contra uma pluralidade de clados ou cepas de EIV.
[00118] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende um polipeptídeo, ou um fragmento de um polipeptídeo, um homólogo, uma variante, um derivado ou um sal de um polipeptídeo com a sequência de uma ou mais dentre a SEQ ID NO: 2 e a SEQ. ID NO: 4.
[00119] A invenção também deve ser entendida como inclusiva de qualquer forma de um polipeptídeo com uma homologia substancial aos polipeptídeos divulgados neste documento. Preferencialmente, um polipeptídeo que é "substancialmente homólogo" é cerca de 50% homólogo, mais preferencialmente cerca de 70% homólogos, ainda mais preferencialmente cerca de 80% homólogos, mais preferencialmente cerca de 90% homólogos, ainda mais preferencialmente, cerca de 95% homólogos e ainda mais de preferência cerca de 99% homóloga à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo descrito neste documento.
[00120] De acordo com outra modalidade, ainda, a composição da invenção, compreendendo o polipeptídeo ou uma combinação de polipeptídeos da presente invenção, é capaz de gerar uma resposta
39 / 119 imunológica específica do EIV. Em outra modalidade, a composição da invenção, compreendendo o polipeptídeo ou uma combinação de polipeptídeos da presente invenção, é capaz de gerar anticorpos específicos do EIV. Em certas modalidades, a composição é capaz de oferecer proteção contra o EIV, incluindo o EIV H3N8.
[00121] A presente invenção também deve ser entendida como abrangendo "mutantes", "derivados" e "variantes" dos polipeptídeos da invenção (ou do DNA que os codifica) cujos mutantes, derivados e variantes são polipeptídeos que são alterados em um ou em outros aminoácidos (ou, quando se refere à sequência nucleotídica que os codifica, são alterados em um ou mais pares de bases) de tal modo que o polipeptídeo resultante (ou DNA) não seja idêntico às sequências citadas neste documento, mas tenha as mesmas propriedades biológicas que os polipeptídeos divulgados neste documento. Vírus atenuado vivo (LAV)
[00122] A invenção refere-se em partes à geração, seleção e identificação de vírus atenuados vivos (LAV) que geram uma resposta imunológica específica do EIV e ao uso desses vírus em formulações de vacina e farmacêuticas.
[00123] Conforme descrito neste documento, em certas modalidades o EIV LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou uma ou mais mutações no segmento 2 que tornam o vírus sensível à temperatura. Por exemplo, em uma modalidade, o EIV LAIV sensível à temperatura apresenta uma replicação viral reduzida a temperaturas normais e elevadas. No entanto, o EIV LAIV sensível à temperatura induz respostas imunológicas específicas do EIV e a produção de anticorpos, sendo assim capaz de oferecer proteção contra o EIV e contra as patologias relacionadas ao EIV.
[00124] Qualquer vírus mutante ou cepa que tenha pelo menos uma mutação pode ser selecionado e usado de acordo com a invenção. Em uma
40 / 119 modalidade, os mutantes ou variantes de ocorrência natural ou os mutantes espontâneos podem ser selecionados, incluindo pelo menos uma mutação no segmento 1 e/ou no segmento 2, conforme descrito em algum outro local neste documento. Em outra modalidade, os vírus mutantes podem ser gerados expondo-se o vírus a mutagênicos, como irradiação ultravioleta, ou mutagênicos químicos, ou por várias passagens e/ou pela passagem em hospedeiros não permissivos. Pode ser usada uma triagem em um sistema de crescimento diferencial para selecionar os mutantes com pelo menos uma mutação no segmento 1 e/ou no segmento 2, conforme descrito em outro local neste documento. Nos vírus com genomas segmentados, o fenótipo atenuado pode ser transferido para outra cepa com um antígeno desejado por reagrupamento (ou seja, pela coinfecção do vírus atenuado e da cepa desejada e pela seleção quanto a reagrupados que apresentam ambos os fenótipos).
[00125] Em outra modalidade, as mutações podem ser manipuladas em um vírus influenza, incluindo, sem limitação, o EIV H3N8, utilizando abordagens de "genética reversa". Desse modo, mutações naturais ou outras mutações que conferem o fenótipo atenuado podem ser manipuladas nas cepas da vacina. Por exemplo, exclusões, inserções ou substituições da região de codificação do segmento 1, codificando a PB2, e/ou o segmento 2, codificando a PB1, podem ser produzidas. Exclusões, substituições ou inserções na região não codificante do segmento 1 e/ou do segmento 2 também são contempladas. Para esse fim, podem ser manipuladas mutações nos sinais responsáveis pela transcrição, replicação, poliadenilação e/ou empacotamento do segmento 1 e/ou do segmento 2.
[00126] Em certos casos, a técnica genética reversa envolve a preparação de RNAs virais recombinantes sintéticos que contêm as regiões não codificantes do RNA do vírus de fita negativa que são essenciais para o reconhecimento por parte das polimerases virais e para o empacotamento dos sinais necessários para gerar o vírion maduro. Os RNAs recombinantes são
41 / 119 sintetizados a partir de um modelo de DNA recombinante e reconstituídos in vitro com o complexo de polimerase viral purificado para formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNPs) que podem ser utilizadas para transfectar células. Em alguns casos, obtém-se uma transfecção mais eficiente se as proteínas de polimerase viral estiverem presentes durante a transcrição dos RNAs sintéticos in vitro ou in vivo. As RNPs recombinantes sintéticas podem ser resgatadas em partículas virais infecciosas. As técnicas anteriores são descritas na Pat. dos EUA Nº 5.166.057, emitida em 24 de novembro de 1992; na Pat. dos EUA Nº 5.854.037, emitida em 29 de dezembro de 1998; na Publicação de Patente Europeia EP 0702085A1, publicada em 20 de fevereiro de 1996; no pedido de patente com o Nº de série 09/152.845; nas Publicações de Patente Internacional PCT WO97/12032, publicadas em 3 de abril de 1997; no documento WO96/34625, publicado em 7 de novembro de 1996; na Publicação de Patente Europeia EP-A780475; no documento WO 99/02657, publicado em 21 de janeiro de 1999; no documento WO 98/53078, publicado em 26 de novembro de 1998; no documento WO 98/02530, publicada em 22 de janeiro de 1998; no documento WO 99/15672, publicado em 1 de abril de 1999; no documento WO 98/13501, publicado em 2 de abril de 1998; no documento WO 97/06270, publicado em 20 de fevereiro de 1997; e no documento EPO 780 47SA1, publicado em 25 de junho 1997, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade.
[00127] Os vírus atenuados gerados pela abordagem de genética reversa podem ser utilizados na vacina e nas formulações farmacêuticas descritas neste documento. Técnicas de genética reversa também podem ser usadas para manipular mutações adicionais para outros genes virais importantes para a produção de vacinas, isto é: os epítopos de variantes de cepas de vacinas úteis podem ser manipulados no vírus atenuado. Em alternativa, epítopos completamente estranhos, incluindo antígenos derivados de outros patógenos virais ou não virais podem ser manipulados na cepa
42 / 119 atenuada.
[00128] Em uma modalidade alternativa, uma combinação de técnicas de genética reversa e técnicas de recombinação podem ser usadas para produzir vírus atenuados com os epítopos desejados. Por exemplo, um vírus atenuado (gerado por seleção natural, mutagênese ou por técnicas de genética reversa) e uma cepa portadora do epítopo da vacina desejado (gerado por seleção natural, mutagênese ou por técnicas de genética reversa) podem ser coinfectados em hospedeiros que permitem o reagrupamento dos genomas segmentados. Assim, os reagrupamentos que exibem tanto o fenótipo atenuado quanto o epítopo desejado podem ser selecionados. O vírus atenuado da presente invenção pode ele próprio ser utilizado como ingrediente ativo em formulações farmacêuticas ou de vacina. Em certas modalidades, o vírus atenuado pode ser usado como o vetor ou como a "estrutura principal" de vacinas produzidas de forma recombinante. Para esse fim, a técnica de "genética reversa" pode ser usada para produzir mutações ou introduzir epítopos estranhos no vírus atenuado, o que funcionaria como a cepa "de origem". Dessa forma, as vacinas podem ser concebidas para imunização contra variantes da cepa ou, em alternativa, contra agentes infecciosos ou antígenos da doença completamente diferentes.
[00129] Por exemplo, em uma modalidade, a composição imunológica da invenção compreende um vírus atenuado vivo, produzido para expressar um ou mais epítopos ou antígenos do EIV, juntamente com epítopos ou antígenos de outro patógeno. Por exemplo, o vírus atenuado pode ser manipulado para expressar epítopos neutralizantes de outras cepas pré- selecionadas. Em alternativa, os epítopos de outros vírus podem ser incorporados no vírus mutante atenuado. Em alternativa, os epítopos de patógenos infecciosos não virais (por exemplo, parasitas, bactérias, fungos) podem ser manipulados no vírus.
[00130] Em uma modalidade, os vírus atenuados selecionados para uso
43 / 119 na invenção é capaz de induzir uma forte resposta anti-EIV no hospedeiro — característica esta que contribui para a geração de uma forte resposta imunológica quando usada como vacina e que tem outras consequências biológicas que tornam os vírus úteis como agentes farmacêuticos na prevenção e/ou no tratamento de outras infecções virais ou outras doenças.
[00131] Os vírus atenuados, que induzem uma resposta imunológica específica do EIV nos hospedeiros, também podem ser usados em formulações farmacêuticas para a profilaxia ou para o tratamento de outras infecções por influenza ou de uma patologia relacionada à influenza. A este respeito, o tropismo do vírus atenuado pode ser alterado para direcionar o vírus para um órgão, tecido ou para células desejadas in vivo ou ex vivo. Usando esta abordagem, a resposta imunológica específica do EIV pode ser induzida localmente, no sítio alvo, evitando ou minimizando os efeitos colaterais dos tratamentos sistêmicos. Para este fim, o vírus atenuado pode ser produzido para expressar um ligante específico para um receptor do órgão, tecido ou células alvo. Vacina
[00132] Em certos aspectos, a composição imunológica é útil como vacina, onde a composição imunológica induz uma resposta imunológica ao antígeno em uma célula, em um tecido ou em um mamífero. De preferência, a vacina induz uma resposta imunológica protetora no mamífero. Conforme usado neste documento, "composição imunológica" pode compreender, por meio de exemplos, um vírus atenuado vivo (LAV), um antígeno (por exemplo, um polipeptídeo), um ácido nucleico que codifica um antígeno (por exemplo, um vetor de expressão de antígeno) ou uma célula expressando ou apresentando um antígeno ou um componente celular. Em modalidades específicas, a composição imunológica compreende ou codifica todo o ou parte de qualquer antígeno polipeptídico descrito neste documento ou um equivalente imunologicamente funcional deste. Em outras modalidades, a
44 / 119 composição imunológica é uma mistura que compreende um agente imunoestimulador adicional ou ácidos nucleicos que codificam esse agente. Os agentes imunoestimuladores incluem, mas não estão limitados a, um antígeno adicional, um imunomodulador, uma célula apresentadora de antígeno ou um adjuvante. Em outras modalidades, um ou mais agentes adicionais são ligados covalentemente ao antígeno ou a um agente imunoestimulador, em qualquer combinação. Em certas modalidades, a composição antigênica é conjugada ou compreende aminoácidos de motivo âncora de HLA.
[00133] No contexto da presente invenção, o termo "vacina" refere-se a uma substância que induz imunidade anti-EIV ou suprime o EIV a partir da inoculação em um animal.
[00134] A invenção abrange formulações de vacinas compreendendo o vírus atenuado vivo (LAV), em que o LAV é um vírus da influenza equina atenuado vivo (referido neste documento como EIV LAIV). Por exemplo, em certas modalidades, o EIV LAIV é sensível à temperatura, apresentando replicação viral reduzida a temperaturas normais e elevadas, em comparação com o EIV de tipo selvagem. Em uma modalidade, a vacina compreende um EIV LAIV compreendendo uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2 e um excipiente adequado. O vírus utilizado na formulação de vacina pode ser selecionado a partir de: mutantes ou variantes de ocorrência natural, vírus mutagenizados ou vírus geneticamente manipulados. Cepas atenuadas de EIV também podem ser geradas através de técnicas de reagrupamento ou pelo uso de uma combinação da abordagem de genética reversa e técnicas de reagrupamento. As variantes de ocorrência natural incluem vírus isolados da natureza, bem como variantes de ocorrência espontânea geradas durante a propagação do vírus. O próprio vírus atenuado pode ser usado como o ingrediente ativo na formulação da vacina. Em alternativa, o vírus atenuado pode ser usado como o vetor ou como a
45 / 119 "estrutura principal" de vacinas produzidas de forma recombinante. Para este fim, técnicas recombinantes como a genética reversa (ou, para vírus segmentados, combinações das técnicas de genética reversa e de reagrupamento) podem ser usadas para produzir mutações ou introduzir antígenos estranhos no vírus atenuado usado na formulação da vacina. Dessa forma, as vacinas podem ser concebidas para imunização contra variantes da cepa ou, em alternativa, contra agentes infecciosos ou antígenos da doença completamente diferentes.
[00135] Em uma modalidade, a formulação da vacina compreende uma pluralidade do EIV mutante. Em uma modalidade, a formulação da vacina compreende uma vacina bivalente compreendendo o EIV LAIV H3N8, descrita neste documento, em combinação com um segundo LAIV, onde o segundo LAIV é baseado na estrutura principal do EIV LAIV H3N8, mas manipulada para expressar proteínas virais de HA e NA de outra cepa. Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro LAIV expressa HA e NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e o segundo LAIV expressa HA e NA de um clado ou cepa diferente do vírus influenza. Numa modalidade, o primeiro LAIV expressa HA e NA de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, e o segundo LAIV expressa HA e NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8, induzindo assim uma resposta imune contra clado 1 A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 e clado 2 A/equine/Richmond/1/2007 H3N8.
[00136] Em uma modalidade, a formulação da vacina pode compreender um ou mais dos EIV LAIVs descritos neste documento, em combinação com outro EIV mutante que induz uma resposta imunológica anti-EIV. Em uma modalidade, a presente invenção compreende um método para gerar um EIV LAIV, compreendendo o contato de uma célula hospedeira com um polinucleotídeo que compreende as sequências de ácidos nucleicos do segmento 1 e/ou do segmento 2, com uma ou mais mutações, descrito em outro local deste documento.
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[00137] A propagação do vírus em cultura é conhecida por aqueles versados na técnica. Em resumo, o vírus é cultivado nas composições de meios em que a célula hospedeira geralmente é cultivada. As células hospedeiras adequadas para a replicação do EIV incluem, por exemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células COS, células 293 e células CEK, incluindo as células 293T e as células COS7. Geralmente, coculturas incluindo duas das linhagens celulares acima, por exemplo: as células MDCK e as células 293T ou COS, são usadas em uma razão, por exemplo, de 1:1, para melhorar a eficácia da replicação. Tipicamente, as células são cultivadas em um meio de cultura comercial convencional, tal como meio Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro (por exemplo, 10% de soro bovino fetal) ou em meio isento de soro, sob umidade controlada e concentração de CO2 adequada para produzir o pH neutro tamponado (por exemplo, a pH entre 7,0 e 7,2). Opcionalmente, o meio contém antibióticos para prevenir o crescimento bacteriano, por exemplo, penicilina, estreptomicina, etc., e/ou nutrientes adicionais, como L-glutamina, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e suplementos adicionais para promover características de crescimento favoráveis, por exemplo: tripsina, p- mercaptoetanol e semelhantes.
[00138] Os procedimentos para manter as células de mamífero em cultura foram extensamente relatados e são conhecidos por aqueles versados na técnica. São fornecidos protocolos gerais, por exemplo, em Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Nova York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5a ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work e Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdã. Detalhes adicionais relativos a procedimentos de cultura de tecidos de interesse particular na produção de vírus influenza in vitro incluem, por exemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in
47 / 119 cell cultures for vaccine preparation. Em Cohen e Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, que é incorporado neste documento na sua totalidade. Adicionalmente, variações nesses procedimentos adaptados à presente invenção são prontamente determinadas através de experimentos de rotina.
[00139] As células para produção de um vírus podem ser cultivadas em meio contendo soro ou isento soro. Em alguns casos, por exemplo, para a preparação de vírus purificados, é desejável cultivar as células hospedeiras em condições isentas de soro. As células podem ser cultivadas em pequena escala, por exemplo, menos de 25 ml de meio, tubos de cultura ou frascos ou em frascos grandes com agitação, em frascos rotativos ou em microesferas (por exemplo, microesferas de DEAE-Dextran, tais como as da Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; esferas de copolímero de estireno-tri-metilamina, tais como as da Hillex, SoloHill, Ann Arbor) em frascos, garrafas ou culturas de reatores. As esferas dos microcarreadores são pequenas esferas (na faixa de 100-200 mícrons de diâmetro) que fornecem uma grande área de superfície para o crescimento de células aderentes por volume de cultura de células. Por exemplo, um único litro de meio pode incluir mais de 20 milhões de grânulos microcarreadores contendo mais de 8000 centímetros quadrados de superfície de crescimento. Para a produção comercial de vírus, por exemplo, para produção de vacina, normalmente é desejável cultivar as células em um biorreator ou em um fermentador. Os biorreatores estão disponíveis em volumes de menos de 1 litro a mais de 100 litros, por exemplo: o biorreator Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, Minn.); os biorreatores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, NJ); os biorreatores à escala laboratorial e comercial da B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemanha).
[00140] Praticamente qualquer sequência genética heteróloga pode ser construída nos vírus da invenção para utilização em vacinas. De um modo
48 / 119 preferido, os epítopos que induzem uma resposta imunológica protetora para qualquer variedade de patógenos ou antígenos que se ligam aos anticorpos neutralizantes podem ser expressos pelos vírus ou como parte deles. Por exemplo, as sequências genéticas heterólogas que podem ser construídas nos vírus da invenção para uso em vacinas incluem, sem limitação, epítopos do vírus da imunodeficiência humana (HIV), como gp120, antígeno da superfície do vírus da hepatite B (HBsAg); as glicoproteínas do vírus do herpes (por exemplo, gD, gE); VP1 do poliovírus; determinantes antigênicos de patógenos não virais, como bactérias e parasitas, para citar alguns. Em outra modalidade, todos os genes de imunoglobulina, ou uma porção deles, podem ser expressos. Por exemplo, regiões variáveis de imunoglobulinas anti- idiotípicas que imitam esses epítopos podem ser construídas nos vírus da invenção. Em outra modalidade, ainda, os antígenos associados a tumores podem ser expressos.
[00141] Pode ser formulada uma vacina viral recombinante viva ou uma vacina viral recombinante inativada. Uma vacina viva pode ser preferida, visto que a multiplicação no hospedeiro leva a um estímulo prolongado de tipo e magnitude similares aos ocorridos em infecções naturais, conferindo uma imunidade substancial e de longa duração. A produção dessas formulações de vacinas do vírus recombinante vivo podem ser obtidas pelo uso de métodos convencionais que envolvem a propagação do vírus na cultura de células ou em alantoides do embrião de galinha seguido de purificação.
[00142] Podem ser utilizados muitos métodos para introduzir as formulações de vacinas descritas acima, estas incluem, sem limitação, a introdução intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea. Pode ser preferível introduzir a formulação de vacina do vírus através da via natural de infecção do patógeno para o qual a vacina é concebida ou pela via natural de infecção do vírus de origem atenuado.
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[00143] Uma vacina da presente invenção, compreendendo um EIV LAIV, pode ser administrada uma vez. Em alternativa, uma vacina da presente invenção, compreendendo um EIV LAIV, pode ser administrada duas vezes ou três ou mais vezes com um intervalo adequado entre as doses. Em alternativa, uma vacina da presente invenção, compreendendo um EIV LAIV, pode ser administrada quantas vezes forem necessárias a um animal, preferivelmente um mamífero. Métodos
[00144] A invenção fornece um método para tratar ou prevenir a infecção pela influenza equina ou uma doença ou distúrbio relacionados ao EIV. Em uma modalidade, o método compreende administrar uma composição imunológica compreendendo um vírus atenuado vivo (LAV), onde o LAV é um EIV LAIV. Em uma modalidade, o método compreende administrar uma composição imunológica compreendendo um EIV LAIV que compreende uma ou mais mutações no segmento 1 e/ou no segmento 2 a um sujeito em necessidade desta. Em uma modalidade, o método compreende administrar uma composição imunológica multivalente compreendendo uma pluralidade de LAIVs, cada um expressando um ou mais antígenos de um clado ou cepa diferente do vírus influenza, tratando ou prevenindo doenças ou distúrbios relacionados ao EIV associados a cada clado ou cepa do vírus influenza.
[00145] Conforme descrito neste documento, em algumas modalidades, o EIV LAIV é sensível à temperatura, exibindo uma replicação viral reduzida a temperaturas normais e elevadas, em comparação ao EIV de tipo selvagem. Por exemplo, em certas modalidades, a replicação viral do EIV LAIV é 2 vezes menor, 3 vezes menor, 5 vezes menor, 10 vezes menor, 15 vezes menos, 20 vezes menos, 50 vezes menos, 100 vezes menor, 500 vezes menos ou 1000 vezes menos do que a do EIV de tipo selvagem a uma temperatura corporal normal ou elevada.
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[00146] Em certas modalidades, o EIV LAIV induz uma resposta imunológica melhorada em comparação com um EIV inativado. Por exemplo, em certas modalidades, a resposta imunológica induzida da EIV LAIV é de 2 vezes mais, 3 vezes mais, 5 vezes mais, 10 vezes mais, 15 vezes mais, 20 vezes mais, 50 vezes mais, 100 vezes mais, 500 vezes mais ou de 1000 vezes mais do que a do EIV inativado. A resposta imunológica induzida pelo EIV LAIV pode ser medida usando ensaios padrão. Por exemplo, em certas modalidades, a resposta imunológica induzida pelo EIV LAIV é medida detectando-se a quantidade de anticorpos específicos do EIV produzida no sujeito depois da administração do EIV LAIV.
[00147] As composições terapêuticas da invenção podem ser administradas profilaticamente ou terapeuticamente a sujeitos que sofrem de ou estão em risco ou são suscetíveis a desenvolver a doença ou condição médica. Esses sujeitos podem ser identificados pelo uso de métodos clínicos convencionais. No contexto da presente invenção, a administração profilática ocorre antes da manifestação de sintomas clínicos evidentes da doença, de modo que a doença ou o distúrbio sejam prevenidos ou retardados na sua progressão. No contexto do campo médico, o termo "prevenir" abrange qualquer atividade que reduza a carga de mortalidade ou morbidade da doença. A prevenção pode ocorrer nos níveis de prevenção primário, secundário e terciário. Enquanto a prevenção primária evita o desenvolvimento de uma doença, os níveis secundário e terciário de prevenção abrangem atividades destinadas a prevenir a progressão de uma doença e o surgimento de sintomas, bem como reduzir o impacto negativo de uma doença já estabelecida restaurando a função e reduzindo as complicações relacionadas com a doença.
[00148] Em certas modalidades, o sujeito é um mamífero. Por exemplo, o sujeito pode incluir, mas não está limitado a um humano, um primata, uma vaca, um cavalo, uma ovelha, um porco, um cão, um gato ou um
51 / 119 roedor. Em uma modalidade, o sujeito é um cavalo. O método pode ser utilizado para tratar ou prevenir EIV ou patologias relacionadas ao EIV em qualquer raça ou espécie de cavalo. Em certas modalidades, a quantidade relativa do ingrediente ativo em uma dose única, ou em outra frequência de dose, varia dependendo da idade, do sexo, do peso ou da raça do sujeito (por exemplo, de um cavalo).
[00149] A composição pode ser combinada com um adjuvante. Um adjuvante refere-se a um composto que aumenta a resposta imunológica quando administrado juntamente (ou sucessivamente) com a composição imunológica. Exemplos de adjuvantes adequados incluem toxina da cólera, toxina de salmonela, alúmen e outros, mas não estão limitados a estes. Além disso, uma vacina desta invenção pode ser combinada apropriadamente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Exemplos desses carreadores incluem água esterilizada, solução salina fisiológica, tampão de fosfato, fluido de cultura e outros. Além disso, a vacina pode conter, conforme necessário, estabilizadores, suspensões, conservantes, surfactantes e outros. A vacina é administrada sistemicamente ou localmente. A administração da vacina pode ser realizada por administração única ou reforçada por várias administrações. Administração
[00150] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção compreendem administrar uma composição imunológica da invenção diretamente ao sujeito em necessidade desta. A administração da composição pode compreender, por exemplo, administração intranasal, intramuscular, intravenosa, peritoneal, subcutânea, intradérmica, bem como tópica.
[00151] Ademais, a dose e programação reais podem variar dependendo se as composições são administradas em combinação com outras composições farmacêuticas ou dependendo de diferenças interindividuais na farmacocinética, disposição da droga e metabolismo. Aqueles versados na técnica podem facilmente fazer qualquer ajuste necessário conforme as
52 / 119 exigências da situação em particular.
[00152] O regime de administração pode afetar o que constitui uma quantidade efetiva. As formulações terapêuticas podem ser administradas ao sujeito antes ou após o diagnóstico da infecção ou doença. Além disso, várias dosagens divididas, bem como dosagens escalonadas, podem ser administradas diariamente ou sequencialmente ou a dose pode ser continuamente infundida ou pode ser uma injeção de bolus. Além disso, as dosagens das formulações terapêuticas podem ser aumentadas ou diminuídas proporcionalmente, conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica ou profilática.
[00153] A administração das composições da presente invenção a um sujeito pode ser feita usando procedimentos conhecidos, a dosagens e por períodos eficazes para prevenir ou tratar a doença. Uma quantidade eficaz do composto terapêutico necessário para se obter um efeito terapêutico pode variar de acordo com fatores tais como a atividade do composto específico utilizado; o tempo de administração; a taxa de excreção do composto; a duração do tratamento; outras drogas, compostos ou materiais utilizados em combinação com o composto; o estado da doença ou do distúrbio, idade, sexo, peso, condição médica, estado geral de saúde e histórico médico anterior do sujeito a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas. Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Um exemplo não limitativo de uma faixa de dose eficaz para um composto terapêutico da invenção é de cerca de 1 e 5.000 mg/kg de peso corporal/dia. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de estudar os fatores relevantes e fazer a determinação quanto à quantidade eficaz do composto terapêutico sem experimentação indevida.
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[00154] O composto pode ser administrado a um sujeito com a frequência de várias vezes por dia ou pode ser administrado com menos frequência, como uma vez por dia, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês ou até com menos frequência, como com uma vez a cada vários meses ou até uma vez por ano ou menos. Composições Farmacêuticas
[00155] A presente invenção visa o tratamento ou a prevenção de uma patologia relacionada com EIV ou do EIV em um mamífero através da administração de uma composição terapêutica da invenção a um mamífero em necessidade desta. A administração da composição de acordo com a presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se o propósito da administração é terapêutico ou profilático e outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. A administração das composições da invenção pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré-selecionado ou pode se dar em uma série de doses espaçadas. A administração local e sistêmica são contempladas. A quantidade administrada varia dependendo de vários fatores, incluindo, mas não limitados a composição escolhida, doença específica, peso, condição física e idade do mamífero, e se a prevenção ou tratamento devem ser alcançados. Tais fatores podem ser prontamente determinados pelo médico utilizando modelos animais ou outros sistemas de teste que são bem conhecidos na técnica.
[00156] A presente invenção abrange composições farmacêuticas compreendendo um EIV LAIV para serem utilizadas como agentes antivirais ou como agentes contra doenças e distúrbios relacionados ao EIV. As composições farmacêuticas têm utilidade como profiláticos antivirais e podem ser administradas a um sujeito em risco de ser infectado ou que se espera que seja exposto a um vírus. Por exemplo, os sujeitos que viajam para partes do mundo onde o EIV seja prevalente podem receber uma administração de uma
54 / 119 composição farmacêutica da invenção. Em certas modalidades, os sujeitos que se espera que entrem em contato com outros sujeitos em risco podem receber uma administração de uma composição farmacêutica da invenção.
[00157] O EIV LAIV da invenção pode ser produzido utilizando os métodos descritos neste documento para expressar proteínas ou peptídeos que direcionam os vírus a um sítio específico. Em uma modalidade, onde o sítio a ser direcionado expressa um receptor para um fator de crescimento, por exemplo: VEGF, EGF ou PDGF, o EIV LAIV pode ser produzida para expressar o fator de crescimento apropriado ou uma porção (ou porções) desta (s). Assim, de acordo com a invenção, o EIV LAIV pode ser produzido para expressar qualquer produto gênico alvo, incluindo peptídeos, proteínas, como enzimas, hormônios, fatores de crescimento, antígenos ou anticorpos, que agem para direcionar o vírus a um sítio em necessidade de atividade antiviral, antibacteriana, antimicrobiana ou anticancerígena.
[00158] Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por injeção de infusão ou em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneas (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser local ou sistêmica. Além disso, em uma modalidade preferida, pode ser desejável introduzir as composições terapêuticas da invenção nos pulmões por qualquer via adequada. A administração pulmonar também pode ser utilizada, por exemplo, pelo uso de um nebulizador ou inalador, e uma formulação com um agente de aerossolização.
[00159] Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente na área em necessidade
55 / 119 de tratamento; isto pode ser obtido através de, por exemplo, e não por meio de limitação, infusão local durante a cirurgia, a aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo após a cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, o referido implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas silásticas ou fibras.
[00160] Em certas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica veterinária adequada para administração a um sujeito veterinário, incluindo, mas não se limitando a, um sujeito equino. Os sujeitos equinos exemplificativos incluem qualquer membro do gênero equus, incluindo, mas não se limitando a, cavalos, zebras, jumentos e burros.
[00161] Em certas modalidades, a composição farmacêutica veterinária é "palatável", o que significa uma composição veterinária oral que é prontamente aceita por equinos, incluindo cavalos, sem nenhuma persuasão ou com ligeira persuasão.
[00162] Em outra modalidade, ainda, a composição farmacêutica pode ser administrada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode ser utilizada uma bomba (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outra modalidade, os materiais poliméricos podem ser usados (ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver também Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade para o alvo da composição, ou seja: o pulmão, exigindo apenas uma fração da dose
56 / 119 sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (Science 1990:249-1527 (1533).
[00163] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus atenuado e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outras farmacopeias geralmente reconhecidas para uso em animais. O termo "carreador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água e semelhantes. Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação contínua e semelhantes. Essas composições podem ser formuladas na forma de um supositório. A formulação oral pode incluir carreadores padrões tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio etc. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz da Terapêutica, de preferência na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada do carreador, a fim de fornecer a forma para uma boa administração ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração.
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[00164] A quantidade da composição farmacêutica da invenção que será eficaz no tratamento ou na prevenção de uma doença ou de um distúrbio em particular dependerá da natureza da doença ou do distúrbio e pode ser determinada por técnicas clínicas convencionais. Além disso, os ensaios in vitro, opcionalmente, podem ser empregados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideal. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e a gravidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com a avaliação do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelo animal.
[00165] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas úteis para a prática dos métodos da invenção podem ser administradas para distribuir uma dose entre 1 ng/kg/dia e 100 mg/kg/dia. Em outra modalidade, as composições farmacêuticas úteis para a prática da invenção podem ser administradas para administrar uma dose entre 1 ng/kg/dia e 500 mg/kg/dia.
[00166] As quantidades relativas do ingrediente ativo, o carreador farmaceuticamente aceitável e de quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica de acordo com a invenção variam, dependendo da identidade, tamanho e da condição médica do sujeito tratado e dependendo também da via pela qual a composição será administrada. A título de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (em p/p) de ingrediente ativo.
[00167] A invenção é adicionalmente descrita em detalhes por referência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não devem ser limitados, a menos que especificado de outra forma. Assim, a invenção não deve de forma alguma ser interpretada como estando limitada aos seguintes exemplos, mas,
58 / 119 em vez disso, deve ser interpretada de forma a abranger quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes como resultado dos ensinamentos fornecidos neste documento.
[00168] Sem descrição adicional, acredita-se que um versado na técnica pode, utilizando a descrição precedente e os exemplos ilustrativos seguintes, fazer e utilizar a presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Os exemplos de trabalho a seguir, portanto, especificam especificamente as modalidades preferenciais da presente invenção, e não devem ser interpretados como limitativos de qualquer forma do restante da divulgação. Exemplo 1: Desenvolvimento de uma nova vacina do vírus da influenza equina atenuado vivo
[00169] O vírus da influenza equina H3N8 (EIV) é um patógeno respiratório importante e significativo de cavalos. O EIV é enzoótico na Europa e na América do Norte, principalmente devido à eficácia abaixo do ideal das vacinas atuais. É descrita neste documento a geração de uma vacina contra influenza atenuada viva (LAIV) EIV H3N8 sensível à temperatura (ts) usando abordagens de genética reversa. O EIV LAIV foi atenuado (att) in vivo e capaz de induzir, mediante uma única administração intranasal, proteção contra o desafio do tipo selvagem (WT) H3N8 EIV (WT) em um modelo de camundongo e no hospedeiro natural, o cavalo. Notavelmente, como o EIV LAIV foi gerado usando genética reversa, a vacina pode ser facilmente atualizada contra cepas flutuantes ou emergentes do EIV usando a estrutura principal de segurança do EIV LAIV como vírus doador principal (MDV). O EIV LAIV foi gerada pela introdução nas proteínas virais da polimerase básica 2 (PB2) e polimerase básica 1 (PB1) de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (clado 1 da sublinhagem da Florida) as mutações responsáveis pelas ts, ca e fenótipo att da A/Ann Arbor/6/60 H2N2 LAIV (Cox et al., 1988; Snyder et al., 1988), o vírus doador principal (MDV)
59 / 119 do LAIV humano (FluMist, MedImmune) e avaliou sua segurança e eficácia em camundongos e cavalos. Esses resultados demonstram a viabilidade da implementação de uma nova abordagem de EIV LAIV para a prevenção e controle de EIVs H3N8 atualmente circulantes em populações de cavalos.
[00170] Os materiais e métodos empregados nessas experiências são agora descritos. Células e vírus
[00171] Células 293 T de rim embrionário humano (293T; ATCC CRL-11268), células renais caninas Madin-Darby (MDCK; ATCC CCL-34) e células dérmicas equinas (E. Derm NBL-6; ATCC CCL-57) foram cultivadas em Dulbecco meio Eagle modificado (DMEM; Mediatech, Inc.) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de PSG (penicilina, 100 unidades/ml; estreptomicina 100 µg/ml; L-glutamina, 2 mM) a 37 °C com 5% de CO2 (Nogales et al., 2014, J. Virol. 88, 10525-10540).
[00172] Os EIVs H3N8 recombinantes de tipo selvagem (WT) e atenuados vivos (LAIV) foram gerados usando técnicas reversas baseadas em plasmídeo A/equine/Ohio/1/2003 (Martinez-Sobrido e Garcia-Sastre, 2010, J. Vis. Exp.) e cultivado em células MDCK a 33 °C. A LAIV de A/equine/Kentucky/1/1991H3N8 comercialmente disponível (Flu Avert IN, Merck) também foi cultivada em células MDCK a 33 °C. O A/equine/Kentucky/2014 H3N8, usado em experimentos de desafio com cavalos, foi cultivado em ovos de galinha embrionados. Para infecções, as preparações de vírus foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina bovina a 0,3% (BA) e penicilina a 1% e estreptomicina (PS) (PBS/BA/PS). Após 1 hora de adsorção viral à temperatura ambiente (TR), as células MDCK foram mantidas com pós- infecção (p.i.) Meio DMEM suplementado com 0,3% de BA, 1% de PSG e 1 μg/ml de tripsina tratada com N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) (Sigma). Os títulos virais foram determinados pelo teste de
60 / 119 imunofoco (unidades formadoras fluorescentes, FFU/ml) em células MDCK a 33 °C, conforme descrito anteriormente (Nogales et al., 2014, J. Virol. 88, 10525-10540) usando o anticorpo monoclonal anti-NP (mAb) HB-65 (ATCC HB-65, HL16-L10-4R5). Plasmídeos
[00173] Para a geração do EIV LAIV H3N8, os genes PB2 e PB1 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 foram subclonados em um plasmídeo pUC19 (New England BioLabs) para introduzir as mutações ts de PB2 N265S e PB1 K391E, E581G e A661T por mutagênese dirigida ao sítio. A presença das mutações introduzidas foi confirmada por sequenciação. Os segmentos virais PB2- e PB1-LAIV foram subclonados de pUC19 no plasmídeo ambisense pDZ como os outros genes virais A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (PB2- e PB1- WT, PA, HA, NP, NA, M e NS) para resgate viral. pDZ é um vetor ambisense que contém um promotor de RNA polimerase I humana e uma sequência terminadora de camundongo que codifica o RNA genômico de sentido negativo e, em orientação oposta à unidade da polimerase I, contém uma cassete de transcrição da polimerase II (promotor de β-actina de galinha e polyA) que codificam as proteínas virais do mesmo gene viral (Chambers et al., 2009, Equine Vet. J. 41, 87-92.). Ensaio de minigenoma
[00174] Analisar a capacidade das polimerases A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e LAIV de replicar e transcrever em diferentes temperaturas (33 °C, 37 °C e 39 °C) célula E. Derm (formato de placa de 12 poços, 5 × 105 células/poço, triplicados) foram cotransfectadas em suspensão, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), com 0,25 μg de cada um dos A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT ou plasmídeos LAIV ambisense pDZ-PB2 ou PB2-LAIV, pDZ-PB1 ou PB1-LAIV, pDZ-PA e pDZ-NP, juntamente com 0,5 μg de um plasmídeo de expressão viral (v) RNA do minigenoma repórter (MG) (v) que codifica Gaussia luciferase (Gluc) acionado por um promotor
61 / 119 de polimerase I de RNA murino (mpPol-I Gluc) e 0,1 μg de um plasmídeo pCAGGS de expressão em mamífero que codifica Cypridina luciferase (Cluc) para normalizar a eficiência de transfecção (Cheng et al., 2015; Nogales et al., 2016b). As células transfectadas na ausência do plasmídeo pDZ-NP foram incluídas como controle negativo e o plasmídeo pDZ vazio foi usado para manter constante a quantidade de DNA do plasmídeo transfectado no controle negativo. Às 48 h após a transfecção, os níveis de expressão de Gluc e Cluc foram determinados usando os kits de teste Biolux Gaussia e Cypridina Luciferase (New England BioLabs) e quantificados com um luminômetro Lumicount (Packard). A ativação do gene repórter (Gluc) foi normalizada para a de Cluc e é relatada como indução de dobras sobre o nível de indução para o controle negativo (ausência de NP). Os valores médios e desvios padrão (DPs) foram calculados e a análise estatística foi realizada usando um teste t de Student bicaudal com o software Microsoft Excel. Os dados são representados como atividade relativa considerando a atividade da polimerase A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT a cada temperatura como 100%. Resgate viral
[00175] O resgate viral de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e LAIV foi realizado conforme descrito anteriormente (Nogales et al., 2014, J. Virol. 88, 10525-10540). Resumidamente, coculturas (1: 1) de células 293 T e MDCK (formato de placa de 6 poços, 1 × 106 células/poço, triplicados) foram cotransfectadas em suspensão, usando Lipofectamine 2000, com 1 μg dos oito plasmídeos ambisense A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 pDZ-PB2 ou PB2-LAIV, -PB1 ou PB1-LAIV, -PA, -HA, -NP, -NA, -M e -NS. Às 12 h após a transfecção, o meio foi substituído por p.i. DMEM suplementado com 0,5 μg/ml de tripsina tratada com TPCK. Os sobrenadantes da cultura de tecidos (TCS) foram coletados três dias após a transfecção, clarificados e utilizados para infectar monocamadas frescas de células MDCK. Então, aos três dias p.i., os vírus recombinantes foram purificados em placas e aumentados de
62 / 119 escala usando células MDCK a 33 °C (Martinez-Sobrido e Garcia-Sastre, 2010, J. Vis. Exp.). Cinética de crescimento de vírus
[00176] A cinética de crescimento viral multiciclo foi avaliada infectando células MDCK (formato de placa de 12 poços, 5 × 105 células/poço, triplicados) com A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e LAIV a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001. As células MDCK também foram infectadas com o Flu Avert I.N. usando um MOI de 0,001 como controle, porque constitui um EIV H3N8 ts. Após 1 h de adsorção viral a RT, o meio de infecção foi substituído pelo meio p.i. DMEM suplementado com 0,5 μg/ml de tripsina tratada com TPCK e as placas foram incubadas a diferentes temperaturas (33 °C, 37 °C e 39 °C). As TCS foram coletadas nos momentos indicados p.i. e os títulos virais na TCS foram determinados pelo teste de imunofoco (FFU/ml) em células MDCK, como indicado anteriormente (Nogales et al., 2014, J. Virol. 88, 10525-10540). Os valores médios e DPs foram calculados no software Microsoft Excel. Ensaio de Placas
[00177] As monocamadas confluentes de células MDCK (formato de placa de 6 poços, 1 × 106 células/poço) foram infectadas com os vírus indicados por 1 h à temperatura ambiente, sobrepostas com ágar e incubadas a 33 °C, 37 °C ou 39 °C. Aos três dias p.i., as células foram fixadas durante 1 h a RT com paraformaldeído a 4% (PFA) e as sobreposições foram removidas. As células foram então permeabilizadas (Triton X-100 a 0,5% em PBS) por 15 minutos a RT e preparadas para imunocoloração usando o mAb anti-NP HB-65 e kits de vetores (kits de vetores Vectastain ABC e kit de substrato DAB HRP; Vector) de acordo com especificações do fabricante. Experiências com camundongos
[00178] Camundongos fêmeas C57BL/6 de seis a oito semanas de idade foram adquiridos no National Cancer Institute (NCI) e mantidos sob
63 / 119 condições específicas livres de patógenos. Para avaliar a atenuação in vivo da EIV LAIV, seis camundongos foram anestesiados por via intraperitoneal (i.p.) com 2,2,2-tribromoetanol (Avertina; 240 mg/kg de peso corporal) e depois inoculados por via intranasal (i.n.) com 30 μl de uma preparação de vírus contendo 105 FFU de EIV WT ou LAIV diluída em PBS (Rodriguez et al., 2017a). Como controle, um grupo de camundongos (N = 6) também foi inoculado i.n. com 105 FFU de replicação do vírus Flu Avert I.N. foi determinado medindo os títulos virais nos pulmões e mucosa nasal de camundongos infectados nos dias 2 (N = 3) e dia 4 (N = 3) p.i. Para esse fim, os camundongos de cada grupo foram sacrificados pela administração de uma dose letal de Avertina e exsanguinação, e os pulmões e mucosa nasal foram recuperados e homogeneizados (Rodriguez et al., 2017a). Os títulos de vírus em ambos os tecidos foram determinados pelo teste de imunofoco (FFU/ml) como indicado anteriormente (Nogales et al., 2014, J. Virol. 88, 10525– 10540; Rodriguez et al., 2017, J. Vis. Exp.).
[00179] Para as experiências de vacinação e desafio, camundongos fêmeas C57BL/6 de 6 a 8 semanas (N = 6) foram anestesiados e vacinados com PBS ou 103 FFU de EIV WT, LAIV ou Flu Avert I.N. (LAIV de A/equine/Kentucky/1/1991 H3N8). Aos catorze dias após a vacinação, os soros de camundongo foram coletados por sangramento submandibular para avaliar a presença de anticorpos totais por ensaio imunoenzimático (ELISA) e anticorpos neutralizantes por ensaio de inibição de hemaglutinação (HAI). Vinte e quatro horas após o sangramento dos camudongos, os camundongos foram desafiados com 105 FFU de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT. Após o desafio, a replicação viral nos pulmões de camundongo foi avaliada nos dias 2 (N = 3) e 4 (N = 3) p.i., conforme descrito acima (Rodriguez et al., 2017, J. Vis. Exp.). Experiências com cavalos
[00180] Foram utilizados cavalos machos e fêmeas de um a dois anos,
64 / 119 de raça mista (principalmente cruzamentos de um quarto de raça padrão). Os cavalos foram criados como parte de um rebanho fechado e não haviam sido previamente vacinados para EIV. Todos os cavalos eram soronegativos para o EIV H3N8, conforme medido pelo ensaio de inibição da hemaglutinação (HAI) antes do início do estudo (dados não mostrados). Para avaliar a atenuação in vivo do A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV, os cavalos (N = 4) foram inoculados por intubação i.n. com 2 ml de uma preparação de vírus contendo 4 × 108 FFU do A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV diluído em PBS. Esta dose, a máxima disponível e semelhante à utilizada nos estudos piloto do Flu Avert I.N. LAIV da Heska Corp. (Wilson e Robinson, 2000, J. Equine Vet. Sci. 20, 8–10), foi escolhido de modo a fornecer a maior probabilidade de revelar quaisquer sinais clínicos induzidos pelo LAIV. A atenuação viral foi testada diariamente pela observação de sinais clínicos, medição da temperatura retal e determinação da presença de vírus em esfregaços nasofaríngeos que foram tomadas antes da vacinação (dia 0) e diariamente durante três dias depois. A presença de vírus em esfregaços nasais foi determinada por RT-PCR quantitativo (q) conforme descrito anteriormente (Lu et al., 2009, J. Clin. Microbiol. 47, 3907-3913).
[00181] Para as vacinas e experimentos de desafio, os cavalos de um a dois anos (N = 4) foram vacinados por inoculação com 2 ml de uma preparação de vírus contendo 4 × 108 FFU do A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV. Outro grupo de cavalos (N = 2) foi utilizado como controle (não vacinado). Para evitar a exposição dos cavalos de controle ao EIV LAIV excretado, estes foram pastados separadamente. Aos 27 dias após a vacinação, todos os cavalos (N = 6) foram levados para um celeiro de isolamento BSL-2. O vírus de desafio, uma linhagem heterogênea EIV do clado 1 da Flórida, A/equine/Kentucky/2014 H3N8, foi aerossolizado usando um nebulizador DeVillbis Ultra-Neb 99 e bombeado para uma baia de tenda (37,5 m3) até uma densidade de 1 × 107 50% de unidades de dose infecciosa de ovos
65 / 119 (EID50) por m3, onde foi inalada pelos cavalos durante 45 minutos (Mumford et al., 1990, Equine Vet. J. 22, 93–98; Townsend et al., 2001, Equine Vet. J. 33, 637-643). A dose de desafio do vírus foi semelhante à usada na infecção experimental anterior de cavalos (Lunn et al., 2001, J. Am. Vet. Med. Assoc. 218, 900-906.). Os cavalos foram observados diariamente e temperaturas retais, sinais clínicos e esfregaços nasofaríngeos foram coletados antes do desafio viral (dia 0) e diariamente por sete dias. O qRT-PCR foi realizado em cada esfregaço nasofaríngeo conforme descrito acima, e a detecção não quantitativa do vírus também foi realizada em cada esfregaço por injeção em ovos embrionados conforme descrito anteriormente (Chambers et al., 2001, Equine Vet. J. 33, 630-636). O conteúdo de vírus infeccioso nas amostras de esfregaço nasofaríngeo do dia 2 e dia 3 após o desafio foi determinado por titulação EID50.
[00182] Para a avaliação dos níveis de anticorpos específicos para vírus presentes nos soros de camundongos vacinados, os ELISAs foram realizados conforme descrito anteriormente (Nogales et al., 2016, J. Virol., 90: 6291- 6302; Nogales et al., 2017, Virology, 500, 1-10; Nogales et al., 2016, J. Virol, 91; Rodriguez et al., 2017, J. Vis. Exp.; Rodriguez et al., 2017, Virology, 504, 96-106). Resumidamente, placas de 96 poços foram revestidas com lisados celulares de células MDCK infectadas por EIV ou mock e incubadas durante a noite (O/N) a 4 °C. Os soros dos animais foram testados como diluições duplas (diluição inicial de 1:100) e os títulos determinados conforme descrito anteriormente. Ensaio HAI
[00183] Para avaliar a presença de anticorpos neutralizantes do EIV, os soros de camundongos foram tratados com a enzima destruidora de receptores (RDE; Denka Seiken) durante 16 horas a 37 °C e inativados pelo calor durante 30 minutos a 56 °C. Os soros foram então diluídos em série 2 vezes
66 / 119 (diluição inicial de 1:50) em placas de fundo em V de 96 poços e misturados 1:1 com 4 unidades de hemaglutinação (HAU) de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 durante 30 min a RT. Os títulos de HAI foram determinados adicionando glóbulos vermelhos de peru a 0,5% às misturas vírus-anticorpo durante 30 min em gelo (Nogales et al., 2016b). Os títulos médios geométricos e os DPs de camundongos individuais (N = 6) foram calculados a partir do último poço onde a hemaglutinação foi inibida. A HAI para soros equinos foi realizada essencialmente da mesma maneira, exceto que os soros equinos foram pré-tratados com periodato de tripsina conforme descrito (Chambers e Reedy, 2014, Methods Mol. Biol. 1161, 411-422) para remover inibidores inespecíficos da hemaglutinação, e foram utilizados glóbulos vermelhos de galinha.
[00184] Os resultados desses experimentos serão agora descritos. Geração e caracterização do A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV (EIV)
[00185] O EIV LAIV disponível comercialmente (Flu Avert I.N.) é constituído por uma cepa EIV que circulou há mais de 25 anos (A/equine/Kentucky/1/1991 H3N8) e nunca foi atualizada (Youngner et al., 2001, Am. J. Vet. Res. 62, 1290-1294). Para gerar um EIV LAIV atualizado, quatro das cinco mutações responsáveis pelos fenótipos ts, ca e att do A/Ann Arbor/6/60 H2N2 LAIV humano (FluMist) (Cox et al., 1988; Snyder et al., 1988) foram introduzidos nos genes PB2 (N265S) e PB1 (K391E, E581G, A661T) dos genes A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (EIV) (Figura 1A), uma cepa de sublinhagem do clado 1 da Florida recomendada pela OIE a ser incluído na vacina EIV (Paillot et al., 2016, Pathogens, 5). O segmento viral A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 NP já contém um G na posição 43. Um ensaio de replicação de minigenoma foi realizado em células E. Derm a diferentes temperaturas (33 °C, 37 °C ou 39 °C) para analisar se as mutações introduzidas nos genes PB2 e PB1 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 conferiu um fenótipo ts ao complexo da polimerase viral. A 33 °C, as polimerases
67 / 119 A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e LAIV induziram níveis semelhantes de expressão de Gluc (Figura 1B). No entanto, a expressão de Gluc foi significativamente reduzida a 37 °C e ainda mais a 39 °C (Figura 1B).
[00186] Com base no fenótipo ts observado no ensaio de minigenoma (Figura 1), foi avaliado em seguida se as mutações introduzidas na subunidade da polimerase PB2 e PB1 viral de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 resultariam em um vírus com cinética de crescimento prejudicada a temperaturas restritivas (37–39 °C), mas não permissivas (33 °C). Assim, A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT e LAIV (doravante denominados EIV WT e EIV LAIV, respectivamente) foram resgatados usando técnicas de genética reversa descritas anteriormente (Martinez-Sobrido e Garcia-Sastre, 2010, J. Vis. Exp.; Nogales et al., 2014, J. Virol. 88, 10525-10540). A cinética de replicação viral de ambos os vírus foi determinada pela avaliação de títulos virais em células MDCK infectadas com baixa (0,001) multiplicidade de infecção (MOI) a diferentes temperaturas (33 °C, 37 °C ou 39 °C) (Figura 2A). O Flu Avert I.N. também foi incluído como controle. A 33 °C, EIV WT e LAIV e Flu Avert I.N. cresceram com cinética semelhante e atingiram picos de titulação em 48 h p.i. A 37 °C e 39 °C, a replicação de EIV WT foi semelhante à observada a 33 °C. Os títulos de EIV LAIV e Flu Avert I.N. foram significativamente reduzidos ou não detectados a 37 °C e 39 °C, respectivamente, em comparação com o EIV WT (Figura 2A). O fenótipo de placa de EIV WT e LAIV e Flu Avert I.N. também foram analisados nas mesmas temperaturas (33 °C, 37 °C ou 39 °C) (Figura 2B). O tamanho da placa EIV WT foi semelhante a 33 °C e 37 °C e ligeiramente reduzido a 39 °C, de acordo com a redução mínima nos títulos virais observada na cinética a essa temperatura (Figura 2A). No caso de EIV LAIV e Flu Avert I.N., o tamanho das placas a 33 °C foi semelhante ao do EIV WT, mas em altas temperaturas, o tamanho da placa foi fortemente reduzido (37 °C) ou as placas não foram detectadas (39 °C), corroborando os resultados cinéticos do
68 / 119 crescimento (Figura 2A). Em conjunto, estes resultados demonstram que as substituições de aminoácidos nas subunidades da polimerase PB2 e PB1 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 conferem um fenótipo ts. Atenuação do EIV LAIV em camundongos
[00187] Após elucidar que a cinética de crescimento (Figura 2A) e o tamanho da placa (Figura 2B) do EIV LAIV foram afetados em altas temperaturas (37 °C e 39 °C), mas não em baixas temperaturas (33 °C), sua capacidade de se replicar in vivo foi analisada em um modelo de camundongo com infecção por influenza (Figura 3). Para esse fim, os camundongos (N = 3/ponto de tempo) foram infectados com 105 FFU de EIV WT ou LAIV. Os camundongos também foram infectados com 105 FFU com Flu Avert I.N. como controle interno. Como nenhum sinal de infecção foi detectado em camundongos após a infecção com EIV WT, a replicação de EIV WT e LAIVs foi determinada pela avaliação de títulos virais dos pulmões (Figura 3A) e mucosa nasal (Figura 3B) nos dias 2 e 4 p.i. Foi decidido usar essa dose alta (105 FFU) para avaliar melhor o perfil de segurança do novo EIV LAIV em comparação com o seu homólogo WT. Notavelmente, os títulos virais foram detectados apenas nos pulmões de camundongos infectados com EIV WT nos dois momentos p.i. (Figura 3A), mas nenhum vírus foi detectado nos pulmões de camundongos infectados com EIV LAIV ou Flu Avert I.N. (Figura 3A). Por outro lado, a replicação viral foi detectada na mucosa nasal de camundongos infectados com os três vírus (Figura 3B), embora os títulos virais obtidos em camundongos infectados com EIV LAIV e Flu Avert I.N. tenham sido significativamente menores nos dois momentos p.i. em comparação com EIV WT. Estes resultados indicam que o EIV LAIV também foi atenuado in vivo a altas temperaturas (pulmões), mas capaz de se replicar na mucosa nasal, onde a temperatura é mais baixa. É importante ressaltar que o mesmo fenótipo ts in vivo foi observado com o Flu Avert I.N. Camundongos imunizados com EIV LAIV são protegidos contra o desafio
69 / 119 EIV WT H3N8
[00188] Para avaliar a imunidade induzida pelo EIV LAIV, grupos de camundongos (N = 6) foram vacinados com 103 FFU de EIVs WT e LAIV, vacinados com mock PBS ou vacinados i.n. com 103FFU de Flu Avert I.N. como controles negativos e positivos, respectivamente. A dose de 103FFU/camundongo foi escolhida com base nos resultados de segurança (Figura 3). Além disso, são estudos anteriores relacionados ao desenvolvimento de LAIVs contra o H3N8 (Nogales et al., 2016, J. Virol. 91) e (Rodriguez et al., 2017, Virology 504, 96-106) EIVs H3N2, essa dose induziu fortes respostas humorais e celulares, além de proteção completa contra o desafio com os EIVs WT. As respostas imunes humorais foram avaliadas em soros de camundongos coletados 14 dias após a vacinação. As respostas de anticorpos contra proteínas EIV totais foram avaliadas por extratos de células musing ELISA de células MDCK infectadas por vírus (Figura 4A) (Nogales et al., 2016, J. Virol. 91; Rodriguez et al., 2017, Virology 504, 96–106). Os soros de camundongos vacinados com EIV LAIV provocaram altos títulos séricos de IgG contra proteínas EIV, próximos aos obtidos nos soros de camundongos infectados com EIV WT, enquanto um soro de camundongos foi observado nos soros de camundongos imunizados com Flu Avert I.N. (Figura 4A). Além disso, foram realizados ensaios de HAI para avaliar a presença de anticorpos neutralizantes nos soros de camundongos vacinados (Figura 4B). Os títulos de HAI contra EIV foram mais altos nos soros de camundongos vacinados com EIV LAIV do que aqueles observados em camundongos vacinados com Flu Avert I.N. e foram semelhantes aos obtidos em camundongos infectados com EIV WT (Figura 4B).
[00189] Em seguida, foram realizadas experiências para avaliar a eficácia da proteção induzida pela EIV LAIV contra o desafio homólogo WT A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (Figura 5). Os camundongos (N = 6) foram
70 / 119 vacinados i.n. com 103 FFU de EIVs WT e LAIV, Flu Avert I.N., ou vacinados com mock PBS. Quinze dias após a vacinação, os camundongos foram desafiados com 105 FFU WT de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 e os títulos virais nos pulmões dos camundongos infectados (N = 3/grupo) foram determinados 2 e 4 dias após o desafio (Figura 5). Camundongos vacinados com mock (PBS) exibiram títulos virais pulmonares de ~3 × 104FFU/ml nos dias 2 e 4 pós-desafio, enquanto camundongos vacinados com EIVs WT ou LAIV não mostraram vírus detectável nos pulmões naqueles momentos (Figura 5). Por outro lado, WT A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 foi detectado nos pulmões de camundongos vacinados com Flu Avert I.N. no dia 2 após o desafio (~ 1 × 103 FFU/ml), mas não no dia 4 após o desafio (Figura 5). Estes resultados indicam que a EIV LAIV induziu melhor proteção que a Flu Avert I.N. contra um desafio com WT A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 em camundongos, provavelmente por causa da combinação antigênica. Atenuação de EIV LAIV em cavalos
[00190] A segurança e a eficácia da proteção induzidas pela EIV LAIV foram avaliadas em cavalos, seu hospedeiro natural. Para esse fim, quatro cavalos foram infectados com 4 × 108 FFU de EIV LAIV e monitorados quanto a sinais clínicos como tosse, secreção nasal, respiração e depressão, temperatura retal e excreção de vírus durante os primeiros 3 dias após a infecção (Figura 6). Nenhum dos cavalos apresentou efeitos adversos significativos. Três dos quatro cavalos apresentaram uma descarga nasal serosa bilateral leve nos dias 2 e 3 p.i. e uma única incidência de tosse foi observada, no entanto a temperatura retal permaneceu normal (37,5 °C ± 0,2 no dia da vacinação, 37,6 °C ± 0,4 no Dia + 3) (Figura 6A). Para medir a presença de EIV LAIV em esfregaços nasofaríngeos coletados nos dias 0–3 p.i., foi realizado um qRT-PCR em cada esfregaço (um esfregaço para cada narina de cada cavalo por dia). A excreção de vírus foi detectada em todos os esfregaços nasofaríngeos coletados nos dias 1 a 3 p.i., mostrando um pico no
71 / 119 dia 2 p.i. (Figura 6B), indicativo de replicação viral. Os cavalos foram observados diariamente por um período adicional de 25 dias, embora não tenha sido realizada um novo esfregaço no dia 3 p.i. para verificar a duração da excreção. Durante esse período, um cavalo foi sacrificado por um problema não relacionado (mielite protozoária equina). Observações de segurança semelhantes, incluindo descarga nasal serosa leve em 2/4 cavalos, foram obtidas dos cavalos de um ano que foram posteriormente desafiados (Figura 7). Após a vacinação, todos os cavalos apresentaram soroconversão, pois seus títulos de anticorpos HAI aumentaram de não detectados (<10) para 20 (em três cavalos dos ensaios de segurança e de desafio) ou 10 (no 4º cavalo de ambos os ensaios) e, como esperado, nenhum anticorpo HAI foi detectado nos soros do grupo controle não vacinado. Esses resultados demonstram o perfil de segurança da EIV LAIV em cavalos e sua capacidade de se replicar na via respiratória superior, necessária para a indução de imunidade, incluindo respostas de anticorpos específicos para HA. Cavalos imunizados com EIV LAIV são protegidos contra o desafio com EIV WT H3N8 heterólogo
[00191] Para avaliar a eficácia da proteção induzida pela EIV LAIV em seu hospedeiro natural, um grupo de cavalos (N = 4) foi vacinado conforme indicado anteriormente com 4 × 108 FFU da EIV LAIV ou vacinado com mock (N = 2), como controle negativo (Figura 7). Vinte e sete dias após a vacinação, os cavalos foram desafiados pela exposição ao vírus do tipo selvagem em aerossol (1 × 107 EID50 unidades por m3 de A/equine/Kentucky/2014 H3N8 WT em uma baia de tenda (37,5m3)) durante 45 min. Um vírus A/equine/Kentucky/14 (H3N8), uma cepa do clado 1 da Florida é heteróloga, mas antigenicamente semelhante ao EIV LAIV. Durante os primeiros 10 dias após o desafio, os cavalos foram monitorados quanto à temperatura retal (Figura 7A), presença de sintomas clínicos de infecção (tosse, secreção nasal, respiração, depressão e inchaço dos gânglios linfáticos)
72 / 119 e excreção de vírus (Figura 7B). Ambos os controles não vacinados, mas nenhum dos quatro cavalos vacinados com a EIV LAIV exibiram um pico característico de pirexia no segundo dia pós-desafio (Figura 7A), e também um dos cavalos não vacinados (número 2) foi apontado como letárgico no segundo dia -desafio. As temperaturas corporais dos dois cavalos de controle voltaram à faixa normal ou quase normal nos dias três a seis após o desafio, mas o cavalo não vacinado número 2 teve um segundo pico de febre no dia sete após o desafio (Figura 7A). Ambos os cavalos não vacinados tossiram nos dias três (cavalo número 2) e sete (cavalo número 1) dias diferentes após o desafio, enquanto a tosse não foi observada em nenhum dos vacinados. A descarga nasal foi observada em ambos os animais de controle no dia oito (cavalo não vacinado 1) ou no dia dois (cavalo não vacinado 2) após o desafio. Notavelmente, nenhum dos cavalos vacinados tinha tosse ou corrimento nasal. Outro sintoma clínico observado nos cavalos não vacinados foi o chiado inspiratório no sexto dia (cavalo não vacinado 1) e no quarto dia (cavalo não vacinado 2) após o desafio, mas não nos cavalos vacinados. Inchaço dos gânglios linfáticos submandibulares ou parótidos foi observado em três dos quatro vacinados, bem como nos dois controles; no entanto, a gravidade e a duração foram maiores nos controles. No final do estudo (no dia 11 após o desafio), uma avaliação veterinária independente levou a ambos os cavalos de controle, mas nenhum dos vacinados, sendo tratados com antibióticos para promover a recuperação total. Do ponto de vista clínico, portanto, os cavalos vacinados pareciam estar protegidos do desafio com o EIV do tipo selvagem.
[00192] A excreção do vírus A/equine/Kentucky/2014 H3N8 WT em esfregaços nasofaríngeos foi avaliado por inoculação de ovos de galinha embrionados e também por qRT-PCR direto (Figura 7B). Quando os esfregaços nasofaríngeos de cavalos vacinados foram inoculados em ovos, o vírus vivo foi detectável pelo menos uma vez após o desafio, com uma média
73 / 119 de 2,25 dias até o máximo de cinco dias após o desafio. As titulações de EID50 do conteúdo de vírus infeccioso no material de esfregaço coletado no dia dois ou três após o desafio mostraram títulos entre 1,7 ×102 e 3,16 × 103 EID50 unidades/ml. Por outro lado, ambos os cavalos não vacinados lançaram vírus vivos detectáveis por cinco e seis dias após o desafio, e os títulos virais no líquido alantoico nos dois dias após a inoculação foram 1,7 × 105 (número 2) e 4,6 × 107 (número 1) EID50 unidades/ml. Assim, a EIV LAIV não alcançou imunidade à esterilização contra um desafio heterólogo após uma dose única, mas a excreção de vírus vivo parecia ter sido reduzida em pelo menos três ordens de magnitude em comparação com os cavalos não vacinados. Esses resultados foram confirmados quando a presença de vírus por qRT-PCR nos esfregaços nasofaríngeos diários foi avaliada (Figura 7B). Nos dois grupos de cavalos (vacinados ou não vacinados) houve amplificação detectável do vírus continuamente desde o primeiro dia pós-desafio (ou segundo dia para o cavalo vacinado 2) até o dia sete, quando o esfregaço foi descontinuado. Os picos de excreção em cavalos não vacinados foram maiores que os valores obtidos em cavalos vacinados, com uma diferença entre 5 e 15 ciclos, sugerindo uma concentração alvo cerca de 500 a 1500 vezes maior que em cavalos vacinados. Aos 14 dias após o desafio viral, todos os cavalos exibiram 16 a 32 vezes aumentos nos títulos séricos de anticorpos HAI. No total, os resultados mostram que a EIV LAIV induziu proteção contra um desafio heterólogo com A/equine/Kentucky/2014 H3N8 WT. EIV LAIV H3N8
[00193] É descrito neste documento o desenvolvimento de uma LAIV mais eficaz para a prevenção e controle da gripe equina usando genética reversa. Esta é a primeira vez que uma LAIV ts competitiva, baseada em técnicas genéticas reversas, foi desenvolvida para a prevenção e controle do EIV H3N8 em cavalos. Para gerar o EIV LAIV H3N8, as mutações responsáveis pelos fenótipos ca, ts e att do MDV A/Ann Arbor/6/60 H2N2
74 / 119
LAIV humano (Cox et al., 1988, Virology 167, 554-567; Snyder et al. 1988, J.
Virol. 62, 488-495) foram introduzidos nos genes virais PB2 e PB1 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8, uma cepa recomendada pela OIE para fazer parte das vacinas EIV (sublinhagem do clado 1 da Florida) (OIE, 2017) (Figura 1). In vitro, o A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV (EIV LAIV) recombinante replicou-se eficientemente a baixa temperatura (33 °C), o que é importante para a produção da vacina, mas foi restrito na replicação a níveis mais altos (37 °C e 39 °C), imperativa para sua implementação segura como LAIV (Figura 2). Em um modelo de camundongo com infecção por influenza, o EIV LAIV foi atenuado no trato respiratório inferior (pulmões), mas não no trato respiratório superior (mucosa nasal) quando comparado ao seu homólogo do WT (Figura 3). É importante ressaltar que o fenótipo observado com o EIV LAIV in vivo e in vitro foi o mesmo que o observado com o EIV LAIV H3N8 atualmente disponível, Flu Avert I.N.
Notavelmente, o EIV LAIV foi capaz de induzir, em uma única dose de imunização, proteção completa contra o desafio com A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT, ao contrário do Flu Avert I.N. que mostrou apenas proteção parcial (Figura 5). Essa proteção parcial observada com o Flu Avert I.N. deve-se provavelmente ao fato de o Flu Avert I.N. se basear em um vírus que é antigenicamente distante das atuais cepas circulantes do EIV, incluindo a utilizada no presente estudo (A/equine/Ohio/1/2003) A análise das respostas humorais mostrou que o título de anticorpos totais (Figura 4A) e neutralizantes (Figura 4B) contra A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 WT foi maior nos soros de camundongos imunizados com EIV LAIV do que em soros de camundongos vacinados com Flu Avert I.N.
Em cavalos, seu hospedeiro natural, o EIV LAIV era seguro, pois os cavalos não apresentavam sintomas de infecção, incluindo febre (Figura 6A), e eram capazes de se replicar na via respiratória superior já que o vírus era detectado em esfregaços nasais (Figura 6B), onde as temperaturas são baixas, o que é essencial para induzir a imunidade da mucosa.
Os títulos
75 / 119 de anticorpos séricos em cavalos após a vacinação foram baixos, o que também foi relatado com a Flu Avert I.N. LAIV em cavalos após uma dose única (Lunn et al., 2001, J. Am. Vet. Med. Assoc. 218, 900-906; Townsend et al., 2001, Equine Vet. J. 33, 637-643). Esses autores argumentaram que outros índices de resposta imunológica, como imunidade local da mucosa, parecem ser mais relevantes que os níveis séricos de anticorpos (Lunn et al., 2001, J. Am. Vet. Med. Assoc. 218, 900-906; Townsend et al., 2001, Equine Vet. J. 33, 637-643). É importante ressaltar que, no experimento de vacinação e desafio com o vírus heterólogo A/equine/Kentucky/2014 H3N8 WT (cepa de clado 1 da Florida), nenhum dos cavalos vacinados com a EIV LAIV apresentou sintomas clínicos de infecção após o desafio, com exceção de inchaço dos gânglios linfáticos submandibulares ou parótidos, mas com menor gravidade e duração do que o observado em equinos não vacinados. É verdade que em todos os cavalos (vacinados ou não vacinados) o vírus A/equine/Kentucky/2014 H3N8 WT desafiado foi detectado em esfregaços nasofaríngeos por qRT-PCR (Figura 7B) e pelo crescimento em ovos de galinha embrionados, mas em ambos os sistemas o vírus detectado foi três ordens de magnitude mais baixo em cavalos vacinados. Todos esses resultados indicam que a EIV LAIV induz proteção contra um desafio heterólogo A/equine/Kentucky/2014 H3N8 WT.
[00194] Comparado aos atuais EIV IIVs H3N8, a abordagem EIV LAIV H3N8 apresenta várias vantagens. Primeiro, o EIV LAIV H3N8 é administrado por via intranasal e imita a via natural da infecção viral, induzindo respostas imunes da mucosa no local da infecção (Kohlmeier e Woodland, 2009, Annu Rev. Immunol. 27, 61-82.; Murphy e Coelingh, 2002, Viral Immunol. 15, 295-323). Em segundo lugar, é necessária uma quantidade significativamente menor de vírus na EIV LAIV H3N8 para induzir proteção superior à exigida pelas EIV IIVs H3N8 (Nogales et al., 2016, J. Virol. 91; Rodriguez et al., 2017, Virology 504, 96–106). Terceiro, foi demonstrado que
76 / 119 as LAIVs estimulam uma resposta humoral sistêmica mais robusta (Cheng et al., 2013, J.
Infect.
Dis. 208, 594–602; De Villiers et al., 2009, Vaccine 28, 228–234; Katsura et al., 2012, Vaccine 30, 6027–6033; Nogales et al., 2016, J.
Virol. 91; Rodriguez et al., 2017, Virology 504, 96-106; Victor et al., 2012, J.
Virol) e provocam imunidade celular (Cheng et al., 2013, J.
Infect.
Dis. 208, 594-602; Katsura et al., 2012, Vaccine 30, 6027-6033), levando ao recrutamento de células T CD8 específicas da influenza nos tecidos alvo do trato respiratório (Baker et al., 2013, J.
Virol. 87, 8591-8605; Guo et al., 2014, J.
Virol. 88, 12006–12016.; Katsura et al., 2012, Vaccine 30, 6027-6033; Nogales et al., 2016, J.
Virol. 91; Powell et al., 2012, J.
Virol. 86, 13397– 13406; Rodriguez et al., 2017; Uraki et al., 2013, J.
Virol. 87, 7874-7881). Quarto, uma única imunização com a EIV LAIV H3N8 seria suficiente para conferir pelo menos proteção parcial contra EIV WT H3N8 em um período mais curto de tempo, em comparação com as doses múltiplas necessárias com as vacinas inativadas atuais.
Finalmente, a EIV LAIV H3N8 forneceria melhor proteção cruzada contra cepas EIV H3N8 distintas do que aquelas fornecidas pelas EIV IIVs, diminuindo a chance de surtos de EIV.
Algumas das vantagens acima são compartilhadas pela única EIV LAIV H3N8 disponível no mercado, Flu Avert I.N. (Chambers et al., 2001, Equine Vet.
J. 33, 630–636.). No entanto, a presente tecnologia também oferece uma série de vantagens adicionais.
Primeiro, as mutações introduzidas nas subunidades de polimerase PB2 e PB1 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 foram descritas anteriormente como responsáveis pelo fenótipo ts, ca e att no MDV do A/Ann Arbor/6/60 H2N2 LAIV humano (FluMist) (Cox et al., 1988, Virology 167, 554-567; Snyder et al., 1988, J.
Virol. 62, 488-495) que têm um histórico comprovado de segurança, imunogenicidade e eficácia de proteção não apenas contra vírus humanos, mas também contra vírus da influenza aviária e equina (Baz et al., 2015, J.
Virol. 89, 1652-1659; Suguitan et al., 2006, PLoS Med. 3, e360.). Segundo, as mesmas mutações ts e ca também foram
77 / 119 introduzidas em outros vírus influenza A, induzindo o mesmo fenótipo atenuado (Cox et al., 2015, J. Virol. 89, 3421-3426.; Jin et al., 2004, J. Virol. 78, 995–998.; Nogales et al., 2016, J. Virol. 91; Rodriguez et al., 2017, Virology 504, 96–106; Zhou et al., 2012, Vaccine 30, 3691–3702). Terceiro, o uso de técnicas genéticas reversas de última geração facilitará, semelhante ao caso da LAIV humana, o desenvolvimento rápido e preciso de candidatos à LAIV para o controle dos clados 1 e 2 em circulação da sublinhagem da Flórida atualmente em circulação, ou cepas EIV recém-introduzidas no caso de um novo surto na população de cavalos. Para esse fim, o A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV sensível à temperatura pode ser usado como MDV para produzir LAIV atualizada pela introdução de HA e NA de cepas de EIV H3N8 circulantes antigenicamente diferentes ou EIVs recém- introduzidos na população de cavalos, incluindo EIVs com potencial panzoótico. Exemplo 2: Desenvolvimento de EIV LAIVs bivalentes e/ou multivalentes
[00195] A abordagem LAIV descrita no Exemplo 1 foi utilizada para desenvolver uma EIV LAIV H3N8 bivalente. A Ohio/03 LAIV foi usada como vírus doador principal (MDV) para gerar um clado recombinante 2 A/Equine/1/2007 H3N8 LAIV (Rich/07 LAIV). Foi gerado um vírus contendo os seis genes internos (PB2, PB1, PA, NP, M e NS) de Ohio/03 LAIV, e os genes HA e NA de A/Equine/1/2007 H3N8 WT (Rich/07 WT). Esta EIV LAIV bivalente é constituída pelos LAIVs monovalentes misturados do clado 1 Ohio/03 e do clado Rich/07. A construção adequada do vírus recombinante Rich/07 foi confirmada por extração do RNA total; seguido de amplificação por PCR dos genes HA e NA; digestão com endonuclease de restrição e separação por gel de agarose de produtos de PCR e sequenciamento (dados não mostrados). Os dois vírus na EIV LAIV bivalente foram caracterizados individualmente in vitro avaliando a cinética de crescimento em células MDCK, bem como por ensaios em placas usando um
78 / 119 anticorpo anti-NP (dados não mostrados). Essa LAIV bivalente segue as recomendações atuais da OIE de incluir linhagens representativas dos clados 1 e 2 das sublinhagens da Flórida dos EIVs H3N8.
[00196] Com base nas múltiplas vantagens sobre as EIV IIVs H3N8, esta nova plataforma representa uma abordagem mais fácil e rápida para a viabilidade de implementar uma LAIV segura e mais eficaz para a prevenção e controle dos EIVs H3N8 na população equina, reduzindo o ônus das doenças atuais e futuras da influenza em cavalos.
[00197] Atualmente, existem dois clados (1 e 2) da sublinhagem da Florida do EIV circulando em cavalos e a OIE recomenda a inclusão de ambos os clados nas vacinas do EIV. Exemplos de cepas de EIV a serem incluídas na vacina, conforme atualmente recomendado pela OIE, incluem a cepa do clado 2 da Florida semelhante a Newmarket/2003 e a cepa do clado 1 da Florida semelhante a South Africa/03, semelhante a Ohio/03 e semelhante a Nottinghamshire/09 e a cepa do clado 2 da Flórida semelhante a Richmond/07, semelhante a Lancashire/10 ou semelhante a Hants/10. Para gerar uma EIV LAIV bivalente, a estrutura principal de segurança da A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (EIV) LAIV como vírus doador principal (MDV) e a hemaglutinina (HA) e Neuraminidase (NA) da outra cepa do EIV foi usada. Para esse fim, abordagens genéticas reversas empregando os genes internos de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (EIV) LAIV (PB2, PB1, PA, NP, M e NS) e os genes de glicoproteínas de superfície (HA e NA) da outra cepa EIV foram utilizados. As abordagens genéticas e experimentais reversas para gerar LAIVs contra outras cepas de EIV são semelhantes aos métodos descritos no Exemplo 1 para a geração de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 LAIV. O EIV do clado 1 de LAIV é combinado com o EIV do clado 2 de LAIV em uma EIV LAIV bivalente mista. EIV LAIVs multivalentes também podem ser desenvolvidas usando a mesma abordagem experimental descrita para a LAIV bivalente, onde a A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (EIV) LAIV é
79 / 119 usada como MDV para expressar HA e NA de outras cepas de EIV. Exemplo 3: Avaliação de uma vacina bivalente EIV LAIV Clado 1 e Clado 2 em cavalos.
[00198] Os cavalos soronegativos de influenza de um a dois anos de ambos os sexos foram vacinados com mock (N = 6) ou vacinados (N = 12) com uma vacina EIV LAIV bivalente (3x108 FFU de cada A/equine/Ohio/1/2003 [Clado 1] e A/equine/Richmond/1/2007 [Clado 2] LAIV) usando um regime de reforço primário com a segunda dose administrada 29 dias após a primeira. O A/equine/Richmond/1/2007 [Clado 2] foi baseado no uso da A/equine/Ohio/1/2003 LAIV sensível à temperatura como um vírus doador principal, onde a A/equine/Richmond/1/2007 [Clado 2] LAIV compreende a estrutura principal A/equine/Ohio/1/2003 sensível à temperatura, mas modificada para expressar A/equine/Richmond/1/2007 HA e NA, conforme descrito acima. Dois cavalos sentinela soronegativos adicionais foram adicionados após as primeiras vacinas. A temperatura retal individual e a excreção viral foram medidos em cada cavalo antes e nos 3 dias seguintes após cada vacinação. Cinquenta e seis dias após a vacinação (prime), amostras de soro foram coletadas e a presença de anticorpos hemaglutinantes e neutralizantes (Ab) foi avaliada pelos testes de HAI e microneutralização, respectivamente. Cinquenta e sete dias pós-vacinação (prime), os cavalos vacinados (N = 12), vacinados com mock (N = 6) e sentinelas (N = 2) foram desafiados com 1x107 EID50 de Richmond/2007 WT (Rich/07 WT; N = 6 vacinado/N = 3 vacinado com mock) ou Kentucky/2014 WT H3N8 (KY/14 WT [Clado 1]; N = 6 vacinado/N = 3 vacinado com mock/N = 2 sentinela) para avaliar a proteção contra o clado 1 e 2 de EIV, respectivamente. Durante 8 dias após o desafio, as temperaturas retais e a excreção do vírus foram avaliadas. Todas as vacinas e todas as inoculações de desafio foram realizadas em cavalos individualmente, usando a máscara/nebulizador Flexi-Neb II.
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[00199] Para o desafio do Clado 2, os 6 vacinados apresentaram um leve aumento de temperatura durante 1 dia, enquanto os 3 controles tiveram febre por 3 dias. Durante o desafio do Clado 1, não foram observados aumentos de temperatura nos 6 vacinados e 1 sentinela, enquanto os 3 controles exibiram febre leve em 2 dias e o segundo sentinela apresentou febre durante 3 dias. Os escores clínicos cumulativos foram computados para cada grupo e foram baseados nos escores atribuídos a cada animal, após observações diárias de frequência respiratória, secreção nasal, tosse e anorexia, com uma pontuação máxima possível de 7. Para o desafio do Clado 2, os 6 vacinados tiveram uma pontuação clínica média de <1, enquanto os 3 controles tiveram uma pontuação média de 3,3 nos dias 2-8 (mínima de 1,7 a máxima de 5). O desafio do Clado 1 mostrou semelhanças em que os 6 vacinados e 1 sentinela tiveram uma pontuação média <1, os 3 controles tiveram uma média de 2,5 para o dia 1-8 (mínima de.3 e máximo de 3,3), e o segundo sentinela teve uma média de 2,7 para o dia 2-8 (mínima de 1 máxima de 5). No geral, esses dados indicam que houve uma diferença observada nas pontuações clínicas entre vacinados e controles para os dois desafios do vírus.
[00200] A excreção do vírus de desafio também foi avaliado através de esfregaços nasofaríngeos e inoculação de ovos de galinha embrionados. Quando os esfregaços nasofaríngeos de cavalos vacinados foram inoculados em ovos, o vírus vivo foi detectável pelo menos uma vez após o desafio em todos os animais, exceto 1 no grupo desafiado com KY/14 WT. As titulações de EID50 do conteúdo de vírus infeccioso no material de esfregaço coletado no dia dois após o desafio de cavalos vacinados mostraram títulos de log entre 1,750 e 4 no grupo desafiado Rich/07 WT e entre 0 e 2 no grupo desafiado KY/14 WT. Por outro lado, os cavalos não vacinados nos dois grupos eliminaram o vírus vivo detectável por seis ou sete dias após o desafio, e os títulos de log no líquido alantoico nos dois dias após a inoculação estavam entre 6,500 e 6,667 no grupo com desafio Rich/07, e entre 4,625 e 7 no grupo
81 / 119 desafiado KY/14 WT. Assim, a excreção de vírus vivo parecia ter sido reduzido em pelo menos três ordens de magnitude ou mais quando os cavalos vacinados foram comparados com os não vacinados. No total, os resultados mostram que a vacina bivalente EIV LAIV induziu proteção em cavalos contra os desafios dos vírus Clado 1 e Clado 2. Exemplo 4: Desenvolvimento de EIV LAIVs bivalentes contendo um vírus recente do clado 1.
[00201] A fim de gerar uma EIV LAIV mais atualizada que atenda às recomendações da OIE, foi gerada uma EIV LAIV bivalente baseada no clado 1 A/equine/Texas/6/2017 (TX/17) HA e NA. Uma estratégia idêntica à descrita no Exemplo 2 é usada - ou seja, um vírus recombinante contendo os seis genes internos (PB2, PB1, PA, NP, M e NS) de Ohio/03 LAIV é usado como um vírus doador principal (MDV), em que os genes HA e NA do clado 1 TX/17 mais recente são clonados separadamente. A geração adequada do vírus recombinante TX/17 é similarmente confirmada como foi feita para os vírus recombinantes Ohio/03 e Rich/07. Esta LAIV oferece uma vantagem adicional, pois contém uma cepa viral circulante mais recente do clado 1 da sublinhagem Florida do EIV H3N8. Exemplo 5: Segurança e eficácia de uma vacina de vírus da influenza equina modificado vivo bivalente administrada a cavalos por via intranasal.
[00202] O objetivo do estudo é avaliar a segurança e eficácia de uma vacina contra o vírus da influenza equina modificado vivo combinado com Clado 1, Clado 2 e Clado 1 e 2, administrada por via intranasal como dose única em cavalos. No dia 28, os cavalos são desafiados com uma cepa virulenta do vírus da influenza equina por nebulização e observados por 21 dias após o desafio. Grupo de Vacinação Desafio Fim do Estudo (Dia Tratamento IVP/CP (Dia 0) (Dia 28) 49) T01 Placebo Esfregaço nasal; Cepa heteróloga T02 Vírus EIV Clado 1 modificado vivo 1 ml; IN temperatura retal; CO; de EIV; IN T03 Vírus EIV Clado 2 modificado vivo coleta de sangue
82 / 119 Grupo de Vacinação Desafio Fim do Estudo (Dia Tratamento IVP/CP (Dia 0) (Dia 28) 49) Vírus EIV Clado 1 e Clado 2 T04 modificados vivos IN = intranasal CO = Observações clínicas Placebo = solução salina tamponada com fosfato (PBS) \
[00203] Os animais são alocados a grupos de tratamento usando um desenho completamente aleatório. Os animais têm um período de aclimatação de pelo menos 7 dias antes da fase de vacinação 1 antes da vacinação. Os animais são realocados para o alojamento da Fase de Desafio pelo menos 2 dias antes do desafio. Os cavalos recebem um antibiótico apropriado (ceftiofur [Excede®] ou equivalente) e anti-helmíntico (moxidectina [Quest®] ou equivalente) antes da chegada, conforme aprovado pelo patrocinador e representante clínico. O estudo é válido se os animais do grupo controle T01 permanecerem soronegativos para EIV (título do teste HAI <8) até o momento do desafio e 75% (6 em 8) dos animais T01 exibirem doença clínica após o desafio (conforme definido abaixo).
[00204] As temperaturas retais de cada animal são obtidas e registradas do dia -3 ao dia 4. Se os animais tiverem temperaturas retais > 102,5 ° F antes do dia 0, o início do estudo será atrasado para permitir que as temperaturas do corpo retornem ao normal (pelo menos 2 dias consecutivos com temperaturas ≤102,5 ° F). Se um animal individual é febril (temperatura retal > 102,5 °F) no dia 4, a temperatura retal é medida e registrada diariamente para esse animal até que a temperatura retorne a ≤102,5 °F. No dia 0, as temperaturas retais são medidas aproximadamente 30 minutos após a vacinação. Todos os cavalos devem ter uma temperatura retal normal (≤102,5 °F) por dois dias consecutivos (dia 26 e 27) antes do desafio.
[00205] Animais doentes, feridos ou moribundos podem ser tratados ou removidos, conforme necessário, por um veterinário após consulta ao Investigador e ao Representante Clínico ou Patrocinador. Todos os tratamentos estão documentados. Após o desafio, os cavalos não devem ser tratados com antibióticos, anti-inflamatórios ou outras terapêuticas que
83 / 119 possam mascarar os sinais clínicos ou a progressão da doença. Se um animal se torna moribundo (reclinado e incapaz de se levantar para obter comida e/ou água), ele é sacrificado. Se possível, o Investigador e o Representante Clínico ou Patrocinador são notificados antes da eutanásia de qualquer animal. Se um atraso na consulta do Representante Clínico ou do Patrocinador causar sofrimento ou angústia indevidos ao animal, o Investigador poderá optar por sacrificar o animal imediatamente e informar o Representante Clínico o mais rápido possível (dentro de 24 horas). A eutanásia é realizada de acordo com as diretrizes atuais da AVMA sobre eutanásia (junho de 2007) e está documentada.
[00206] Uma necropsia é realizada em animais que morrem ou são sacrificados durante o estudo e, se possível, a causa da morte é determinada. Os achados da necropsia e as amostras coletadas são documentadas.
[00207] O sangue (1 x 12,5 mL SST) é coletado de animais individuais por punção venosa jugular nos dias -1, 7, 14, 27, 35, 42 e 49. As amostras são rotuladas e processadas em soro. O soro é dividido em alíquotas de 2 x 1 mL, com o saldo restante de soro colocado em uma terceira alíquota. A coleta de amostras é registrada.
[00208] Os esfregaços nasais são coletados de animais individuais nos dias -1, 1-14, 27 (pré-desafio) e 29 até a conclusão do estudo. Um único esfregaço é usado para coletar material de uma única narina e colocado no meio de transporte viral. As amostras são rotuladas com um ID de amostra exclusivo e colocadas no gelo no momento da coleta. As amostras de esfregaço nasal são armazenadas congeladas (≤-70 °C) até serem testadas. A coleta de amostras é registrada.
[00209] Animais individuais são vacinados com sua IVP/CP alocada no dia 0. A IVP/CP é administrada como uma dose de 1 mL em uma única narina, usando uma seringa de tamanho apropriado e cânula nasal. A vacinação é registrada.
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[00210] Animais individuais são observados pelo menos uma vez por dia quanto a sinais clínicos anormais, incluindo, entre outros, corrimento nasal, letargia, taquipneia (respiração rápida; > 40 respirações por min [bpm]) e tremores nos dias -1, 0 (aproximadamente 30 minutos após a vacinação) e 1 a 7. As observações clínicas pós-vacinação são registradas. No dia 0, as observações clínicas pós-vacinação são registradas aproximadamente 30 minutos após a vacinação.
[00211] Animais individuais são desafiados por via intranasal por meio de um nebulizador úmido com máscara de cavalo (Aeromask® ES) no dia 28. Os cavalos podem receber um sedativo, como xilazina ou butorfanol, por rótulo. Cada animal recebe um desafio intranasal com uma cepa de EIV virulenta heteróloga. O desafio é registrado.
[00212] Animais individuais são observados pelo menos uma vez ao dia por pelo menos 30 minutos por pessoal qualificado (ou seja, treinado) para depressão, esforço respiratório, tosse e descarga nasal. Cada sinal clínico é pontuado por um sistema de pontuação clínica. As pontuações clínicas da fase de desafio são registradas nos dias 27 até a conclusão do estudo. No dia 28 (dia do desafio), as observações clínicas da fase de desafio ocorrem aproximadamente 30 minutos após o desafio.
[00213] Se algum animal mostrar sinais clínicos de uma doença não relacionada, o animal poderá ser removido da fase de desafio do estudo mediante recomendação do veterinário ARS após consulta com o Representante Clínico e/ou o Patrocinador.
[00214] A eficácia das vacinas é determinada com base nos seguintes testes laboratoriais: 1) HAI (inibição da hemaglutinação): As amostras de soro são pré-tratadas com periodato de potássio e inativadas pelo calor para remover quaisquer inibidores não específicos. As diluições em série do soro tratado são misturadas com volumes iguais de suspensões virais contendo 8 unidades
85 / 119 de HA e observadas quanto à atividade de HA. 2) VI (Isolamento de vírus): os resultados são relatados como positivos/negativos (qualitativos). Os esfregaços nasais são testadas quanto à presença de EIV por isolamento de vírus. Os esfregaços estão a temperatura ambiente, expressas, e o meio filtrado (usando filtro de seringa de 0,45 mícrons). As alíquotas de esfregaço nasal são testadas usando ovos embrionados. Resumidamente, 100 µL da amostra são inoculados em ovos de galinha embrionados com 9 a 11 dias de idade. Os ovos são incubados a 36 °C durante 72 horas, com observações 1 dia após a inoculação para a morte do embrião. Qualquer ovo que morre nas primeiras 24 horas é descartado. 72 horas após a inoculação, todos os ovos restantes são colocados a 4 °C durante a noite e o fluido alantoico é coletado e testado para HA. 3) qPCR: Os esfregaços nasais são descongelados e o RNA é extraído. O RNA é quantificado usando PCR em tempo real com iniciadores e sonda direcionada para uma região de EIV HA conservada. 4) RIM (Imunomigração rápida): Um kit de teste disponível comercialmente (Kit de teste de Antígeno do Tipo A do Vírus da Influenza Suína FLU DETECT®; Zoetis, EUA) é usado para rastrear cavalos quanto à excreção do Vírus da Influenza Tipo A pós-vacinação. As instruções do fabricante são seguidas. Os resultados são usados para determinar em que momento os cavalos vacinados podem ser tratados durante a fase de desafio. Os resultados são colocados no arquivo de estudo.
[00215] Na conclusão do estudo, os animais são sacrificados humanamente e são enterrados ou digeridos quimicamente por sítios SOPs.
[00216] As distribuições de frequência das pontuações clínicas pós- desafio são calculadas pelo tratamento e pelo momento em que os dados são coletados. A distribuição de frequência de cada uma das observações clínicas pós-desafio é calculada para cada grupo de tratamento.
[00217] Considera-se que um animal tem doença clínica se tiver uma
86 / 119 temperatura retal ≥103,0 °F (qualquer dia após o desafio) e tiver pelo menos uma pontuação clínica para depressão, esforço respiratório, tosse (pontuação 1) ou descarga nasal (pontuação 2) em qualquer dia após o desafio. A pirexia e a pontuação clínica positiva não precisam ocorrer no mesmo dia. A duração e a quantidade de dados de excreção de vírus são analisadas como dados de apoio à eficácia da vacina. As distribuições de frequência de um animal ser considerado doente ou não após o desafio (presença de doença clínica após o desafio) são calculadas por tratamento.
[00218] Doente/não doente é analisado com um modelo misto linear geral com uma distribuição binomial e função de link logit, se possível. O efeito fixo no modelo é o tratamento sem efeitos aleatórios no modelo. As médias dos mínimos quadrados, erros padrão e limites de confiança de 90% são calculados para cada grupo de tratamento e transformados de volta. O teste exato de Fisher é usado para analisar os dados, se não for possível usar um modelo misto generalizado. Os contrastes são usados para comparar o grupo de tratamento T01 com os grupos de tratamento T02-T04.
[00219] No que diz respeito ao isolamento do vírus, as distribuições de frequência de se um vírus derramado em animais é calculado para cada tratamento e ponto de tempo. A duração da excreção de vírus após o desafio é determinada para cada animal e é calculada como (último ponto de tempo presente menos o primeiro ponto de tempo presente) + 1. A duração da excreção do vírus é definida como zero para animais que não têm pontos de tempo com isolamento positivo do vírus. As estatísticas não paramétricas mínimas, máximas, medianas e quartis (resumo de 5 números) são calculadas para a duração do vírus excretado para cada grupo de tratamento.
[00220] A duração da excreção de vírus é analisada com um modelo misto linear geral. O efeito fixo no modelo é o tratamento e o efeito aleatório é o residual. Médias de mínimos quadrados de tratamento, erros padrão, limites de confiança de 90%, mínimos e máximos são calculados. Os
87 / 119 contrastes são usados para comparar o grupo de tratamento T01 com os grupos de tratamento T02-T04.
[00221] Em relação ao qPCR, a área sob a curva (AUC) é calculada para cada animal durante a fase de desafio. Antes da análise com um modelo misto linear geral, as AUCs são transformadas em logaritmo natural. O efeito fixo no modelo é o tratamento e o efeito aleatório é residual. Médias de mínimos quadrados de tratamento, erros padrão e limites de confiança de 90% são transformados de volta. Os mínimos e máximos de tratamento também são calculados.
[00222] Se necessário, os dados do desafio VI são transformados em logaritmo antes da análise com um modelo misto linear geral para medições repetidas. Os efeitos fixos no modelo são tratamento, ponto no tempo e tratamento por interação no ponto no tempo. Os efeitos fixos no modelo são animais em tratamento e residuais. Médias de mínimos quadrados de tratamento, erros padrão e limites de confiança de 90% para cada ponto de tempo são transformados de volta se necessário. Os mínimos e máximos de tratamento também são calculados para cada ponto de tempo. Os contrastes são usados para comparar o grupo de tratamento T01 com os grupos de tratamento T02-T04 em cada ponto de tempo.
[00223] Estatísticas descritivas (média, desvio padrão, mínimo e máximo) das temperaturas obtidas durante a fase de vacinação, incluindo as temperaturas anteriores ao dia do desafio, são calculadas para cada grupo de tratamento e ponto de tempo. As temperaturas da fase de desafio, incluindo o dia do desafio, são analisadas usando o mesmo modelo definido na seção de análise VI. Médias de mínimos quadrados de tratamento, erros padrão, limites de confiança de 90%, mínimos e máximos são calculados para cada ponto de tempo. Os tratamentos são comparados em cada momento usando contrastes.
[00224] As distribuições de frequência das observações clínicas pós- vacinação (depressão, tremores, taquipneia, descarga nasal e outras) são
88 / 119 calculadas para cada grupo de tratamento e ponto de tempo. A distribuição de frequência de cada uma das observações clínicas pós-vacinação é calculada para cada grupo de tratamento. Exemplo 6: Vírus da influenza equina atenuado vivo sensível à temperatura com base no vírus da influenza A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 Segmento modificado 1 ou PB2:
1. Sequência de nucleotídeos modificados do segmento 1 (PB2): São indicados em negrito as alterações de nucleotídeos que resultam na alteração de aminoácidos N265S na proteína PB2. Um sítio de restrição ClaI introduzido no segmento de PB2 modificado encontra-se sublinhado. agcgaaagcaggtcaaatatattcaatatggagagaataaaagaactgagagatctgatgttacaatcc cgcacccgcg agatactaacaaaaactactgtggaccacatggccataatcaagaaatacacatcaggaagacaagag aagaaccctgc acttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatacccaatcacggcagataagaggataatggagatga ttcctgagaga aatgaacagggacaaaccctttggagcaaaacgaacgatgctggctcagaccgcgtaatggtatcacc tctggcagtga catggtggaataggaatggaccaacaacaagcacaattcattatccaaaagtctacaaaacttattttgaa aaggttga aagattgaaacacggaacctttggccccgttcattttaggaatcaagtcaagataagacgaagagttgat gtaaaccct ggtcacgcggacctcagtgccaaagaagcacaagatgtgatcatggaagttgttttcccaaatgaagtg ggagccagaa ttctaacatcggaatcacaactaacaataaccaaagagaaaaaggaagaacttcaggactgcaaaattg ctcccttgat ggtagcatacatgctagaaagagagttggtccgaaaaacaaggttcctcccagtagcaggcggaaca agcagtgtatac attgaagtgttgcatctgactcagggaacatgctgggagcaaatgtacaccccaggaggagaagttag
89 / 119 aaacgatgata ttgatcaaagtttaattattgcagcacgatcgatagtgagaagagcaacagtatcagcagatccactagc atccctact ggaaatgtgccacagtacacagattggtggaataaggatggtagacatccttaagcagaatccaacag aggaacaagct gtggatatatgcaaagcagcaatgggattgagaattagctcatcattcagctttggtggattcaccttcaa aagaacaa gtggatcatcagtcaagagagaagaagaaatgcttacgggcaaccttcaaacattgaaaataagaatg catgagggcta tgaagaattcacaatggtcggaagaagagcaacagctattctcagaaaggcaaccagaagattgattc aattgatagta agtgggagagatgaacaatcaattgctgaagcaataattgtagccatggtgttttcgcaagaagattgca tgataaaag cagttcgaggcgatttgaactttgttaatagagcaaatcagcgtttgaaccccatgcatcaactcttgagg catttcca aaaagatgcaaaagtgcttttccaaaattggggaattgaacccatcgacaatgtaatggggatgattgga atattgcct gacatgaccccaagcaccgagatgtcattgagaggagtgagagtcagcaaaatgggagtggatgagt actccagcactg agagagtggtggtgagcattgaccgttttttaagagttcgggatcaaaggggaaacatactactgtcccc tgaagaagt cagtgaaacacaaggaacggaaaagctgacaataatttattcgtcatcaatgatgtgggagattaatggt cccgaatca gtgttggtcaatacttatcaatggatcatcaggaactgggaaattgtaaaaattcagtggtcacaggaccc cacaatgt tatacaataagatagaatttgagccattccaatccctggtccctagggccaccagaagccaatacagcg gtttcgtaag aaccctgtttcagcaaatgcgagatgtacttggaacatttgatactgctcaaataataaaactcctccctttt gccgct
90 / 119 gctcctccggaacagagtaggatgcagttctcttctttgactgttaatgtaagaggttcgggaatgaggat acttgtaa gaggcaattccccagtgttcaactacaataaagccactaaaaggctcacagtcctcggaaaggatgca ggtgcgcttac tgaggacccagatgaaggtacggctggagtagaatctgctgttctaagagggtttctcattttaggtaaa gaaaacaag agatatggcccagcactaagcatcaatgaactaagcaaacttgcaaaaggggagaaagccaatgtact aattgggcaag gggacgtagtgttggtaatgaaacggaaacgtgactctagcatacttactgacagccagacagcgacc aaaaggattcg gatggccatcaattagtgttgaattgtttaaaaacgaccttgtttctact (SEQ ID NO: 1)
2. Sequência de aminoácidos da proteína PB2 do EIV mutante: A alteração de aminoácido N265S está indicada em negrito.
91 / 119 N (SEQ ID NO: 2) Segmento 2 modificado ou PB1:
1. Sequência de nucleotídeos modificados do segmento 2 (PB1): as alterações de nucleotídeo que resultam nas alterações de aminoácidos K391E, E581G e A661T na proteína PB2 estão indicadas em negrito. O sítio de restrição AatI (denotado por um sublinhado) e o sítio de restrição HindIII (denotado por um sublinhado + itálico) foram introduzidos no segmento da PB1 modificada. Os nucleotídeos modificados da sequência da PB1 original para remover o sítio de restrição BamHI são denotados em sublinhado + negrito. agcgaaagcaggcaaaccatttgaatggatgtcaatccgactctacttttcttaaaggtgccagcgcaaa atgctataa gcacaacattcccttatactggagatcctccctacagtcatggaacagggacaggatacaccatggata ctgtcaacag aacacaccaatattcagaaaaagggaaatggacaacaaacactgagattggagcaccacaacttaatc caatcgatgga ccacttcctgaagacaatgaaccaagtgggtacgcccaaacagattgtgtattggaagcaatggctttcc ttgaagaat cccatcccggaatctttgaaaattcgtgtcttgaaacgatggaggtgattcagcagacaagagtggaca aactaacaca aggccgacaaacttatgattggaccttgaataggaatcaacctgccgcaacagcacttgctaatacgatt gaagtattc agatcaaatggtctgacttccaatgaatcggggagattgatggacttcctcaaagatgtcatggagtcca tgaacaagg aagaaatggaaataacaacacacttccaacggaagagaagagtaagagacaacatgacaaagagaa tggtaacacagag aaccatagggaagaagaaacaacgattaaacagaaagagctatctaatcagaacattaaccctaaaca caatgaccaag gacgctgagagagggaaattgaaacgacgagcaatcgctaccccagggatgcagataagagggttt
92 / 119 gtatattttgttg aaacactagcccgaagaatatgtgaaaagcttgaacaatcaggattgccagttggcggtaatgagaaa aaggccaaact ggctaatgtcgtcagaaaaatgatgactaattcccaagacactgaactctccttcaccatcactggggac aataccaaa tggaatgaaaatcagaacccacgcatattcctggcaatgatcacatacataactagaaaccagccagaa tggttcagaa atgttctaagcattgcaccgattatgttctcaaataaaatggcaagactggggaaaggatatatgtttgaa agcaaaag tatgaaattgagaactcaaataccagcagaaatgctagcaagcattgacctgaaatatttcaatgattcaa caaaaaag aaaattgaagaaataaggcctcttctggttgacgggactgcttcactgagtcctggcatgatgatgggaa tgttcaaca tgttgagcactgtgctgggtgtatccatattaaacctgggccagaggaaatacacaaagaccacatact ggtgggatgg tctgcaatcatccgatgactttgctttgatagtgaatgcgcctaatcatgaaggaatacaagctggagtag acagattc tatagaacttgcaaactggtcgggatcaacatgagcaaaaagaagtcctacataaatagaactggaaca ttcgaattca caagctttttctaccggtatggttttgtagccaatttcagcatggaactacccagttttggggtttccggaat aaatga atctgcagacatgagcattggagtgacagtcatcaaaaacaacatgataaataatgatctcggtcctgcc acggcacaa atggcactccaactcttcattaaggattatcggtacacataccggtgccatagaggtgatacccagatac aaaccagaa gatcttttgagttgaagaagctttgggggcagactcgatcaaagactggtctactggtatcagatgggg gtccaaacct atataacatcagaaacctacacatcccggaagtctgtttaaaatgggagctaatggatgaagattataag gggaggcta
93 / 119 tgcaatccattgaatcctttcgttagtcacaaagaaattgaatcagtcaacagtgcagtagtaatgtctgcg catggcc ctgccaaaagcatggagtatgatgctgttactacaacacattcttggatacccaagaggaaccggtcca tattgaacac aagccaaaggggaatactcgaagatgagcagatgtatcagaaatgctgcaacctgtttgaaaaattcttc cccagcagc tcatacagaagaccagtcggaatttctagtatggttgaggccatggtgtccagggcccgcattgatgca cgaattgact tcgaatctggacggataaagaaggatgagttcgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagct cagacggca aaaatagtgaatttagcttgatcttcatgaaaaaatgccttgtttctact (SEQ ID NO: 3)
2. Sequência de aminoácidos da proteína PB1 do EIV mutante: São indicados em negrito as alterações de aminoácidos K391E, E581G e A661T.
94 / 119 RQK (SEQ ID NO: 4) Segmento 1 de tipo selvagem ou PB2:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 1 A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 do tipo selvagem (PB2): agcgaaagcaggtcaaatatattcaatatggagagaataaaagaactgagagatctgatgttacaatcc cgcacccgcg agatactaacaaaaactactgtggaccacatggccataatcaagaaatacacatcaggaagacaagag aagaaccctc acttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatacccaatcacggcagataagaggataatggagatga ttcctgagaga aatgaacagggacaaaccctttggagcaaaacgaacgatgctggctcagaccgcgtaatggtatcacc tctggcagtga catggtggaataggaatggaccaacaacaagcacaattcattatccaaaagtctacaaaacttattttgaa aaggttga aagattgaaacacggaacctttggccccgttcattttaggaatcaagtcaagataagacgaagagttgat gtaaaccct ggtcacgcggacctcagtgccaaagaagcacaagatgtgatcatggaagttgttttcccaaatgaagtg ggagccagaa ttctaacatcggaatcacaactaacaataaccaaagagaaaaaggaagaacttcaggactgcaaaattg ctcccttgat ggtagcatacatgctagaaagagagttggtccgaaaaacaaggttcctcccagtagcaggcggaaca agcagtgtatac attgaagtgttgcatctgactcagggaacatgctgggagcaaatgtacaccccaggaggagaagttag aaacgatgata ttgatcaaagtttaattattgcagcacggaacatagtgagaagagcaacagtatcagcagatccactagc atccctact ggaaatgtgccacagtacacagattggtggaataaggatggtagacatccttaagcagaatccaacag aggaacaagct gtggatatatgcaaagcagcaatgggattgagaattagctcatcattcagctttggtggattcaccttcaa
95 / 119 aagaacaa gtggatcatcagtcaagagagaagaagaaatgcttacgggcaaccttcaaacattgaaaataagaatg catgagggcta tgaagaattcacaatggtcggaagaagagcaacagctattctcagaaaggcaaccagaagattgattc aattgatagta agtgggagagatgaacaatcaattgctgaagcaataattgtagccatggtgttttcgcaagaagattgca tgataaaag cagttcgaggcgatttgaactttgttaatagagcaaatcagcgtttgaaccccatgcatcaactcttgagg catttcca aaaagatgcaaaagtgcttttccaaaattggggaattgaacccatcgacaatgtaatggggatgattgga atattgcct gacatgaccccaagcaccgagatgtcattgagaggagtgagagtcagcaaaatgggagtggatgagt actccagcactg agagagtggtggtgagcattgaccgttttttaagagttcgggatcaaaggggaaacatactactgtcccc tgaagaagt cagtgaaacacaaggaacggaaaagctgacaataatttattcgtcatcaatgatgtgggagattaatggt cccgaatca gtgttggtcaatacttatcaatggatcatcaggaactgggaaattgtaaaaattcagtggtcacaggaccc cacaatgt tatacaataagatagaatttgagccattccaatccctggtccctagggccaccagaagccaatacagcg gtttcgtaag aaccctgtttcagcaaatgcgagatgtacttggaacatttgatactgctcaaataataaaactcctccctttt gccgct gctcctccggaacagagtaggatgcagttctcttctttgactgttaatgtaagaggttcgggaatgaggat acttgtaa gaggcaattccccagtgttcaactacaataaagccactaaaaggctcacagtcctcggaaaggatgca ggtgcgcttac tgaggacccagatgaaggtacggctggagtagaatctgctgttctaagagggtttctcattttaggtaaa gaaaacaag
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2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 PB2 do tipo selvagem:
ELSKLAKGEKANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAI N (SEQ ID NO: 6) Segmento 2 de tipo selvagem ou PB1:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 2 A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 do tipo selvagem (PB1): agcgaaagcaggcaaaccatttgaatggatgtcaatccgactctacttttcttaaaggtgccagcgcaaa atgctataa
97 / 119 gcacaacattcccttatactggagatcctccctacagtcatggaacagggacaggatacaccatggata ctgtcaacag aacacaccaatattcagaaaaagggaaatggacaacaaacactgagattggagcaccacaacttaatc caatcgatgga ccacttcctgaagacaatgaaccaagtgggtacgcccaaacagattgtgtattggaagcaatggctttcc ttgaagaat cccatcccggaatctttgaaaattcgtgtcttgaaacgatggaggtgattcagcagacaagagtggaca aactaacaca aggccgacaaacttatgattggaccttgaataggaatcaacctgccgcaacagcacttgctaatacgatt gaagtattc agatcaaatggtctgacttccaatgaatcggggagattgatggacttcctcaaagatgtcatggagtcca tgaacaagg aagaaatggaaataacaacacacttccaacggaagagaagagtaagagacaacatgacaaagagaa tggtaacacagag aaccatagggaagaagaaacaacgattaaacagaaagagctatctaatcagaacattaaccctaaaca caatgaccaag gacgctgagagagggaaattgaaacgacgagcaatcgctaccccagggatgcagataagagggttt gtatattttgttg aaacactagcccgaagaatatgtgaaaagcttgaacaatcaggattgccagttggcggtaatgagaaa aaggccaaact ggctaatgtcgtcagaaaaatgatgactaattcccaagacactgaactctccttcaccatcactggggac aataccaaa tggaatgaaaatcagaacccacgcatattcctggcaatgatcacatacataactagaaaccagccagaa tggttcagaa atgttctaagcattgcaccgattatgttctcaaataaaatggcaagactggggaaaggatatatgtttgaa agcaaaag tatgaaattgagaactcaaataccagcagaaatgctagcaagcattgacctgaaatatttcaatgattcaa caaaaaag aaaattgaaaagatacgaccacttctggttgacgggactgcttcactgagtcctggcatgatgatgggaa
98 / 119 tgttcaaca tgttgagcactgtgctgggtgtatccatattaaacctgggccagaggaaatacacaaagaccacatact ggtgggatgg tctgcaatcatccgatgactttgctttgatagtgaatgcgcctaatcatgaaggaatacaagctggagtag acagattc tatagaacttgcaaactggtcgggatcaacatgagcaaaaagaagtcctacataaatagaactggaaca ttcgaattca caagctttttctaccggtatggttttgtagccaatttcagcatggaactacccagttttggggtttccggaat aaatga atctgcagacatgagcattggagtgacagtcatcaaaaacaacatgataaataatgatctcggtcctgcc acggcacaa atggcactccaactcttcattaaggattatcggtacacataccggtgccatagaggtgatacccagatac aaaccagaa gatcttttgagttgaagaaactgtgggaacagactcgatcaaagactggtctactggtatcagatggggg tccaaacct atataacatcagaaacctacacatcccggaagtctgtttaaaatgggagctaatggatgaagattataag gggaggcta tgcaatccattgaatcctttcgttagtcacaaagaaattgaatcagtcaacagtgcagtagtaatgtctgcg catggcc ctgccaaaagcatggagtatgatgctgttgcaacaacacattcttggatccccaagaggaaccggtcca tattgaacac aagccaaaggggaatactcgaagatgagcagatgtatcagaaatgctgcaacctgtttgaaaaattcttc cccagcagc tcatacagaagaccagtcggaatttctagtatggttgaggccatggtgtccagggcccgcattgatgca cgaattgact tcgaatctggacggataaagaaggatgagttcgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagct cagacggca aaaatagtgaatttagcttgatcttcatgaaaaaatgccttgtttctact (SEQ ID NO: 7)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8
99 / 119 PB1 do tipo selvagem:
YRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGRIKKDEFAEIMKICSTIEELR RQK (SEQ ID NO: 8) Segmento 3 ou PA:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 3 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (PA): agcgaaagcaggtactgatccaaaatggaagactttgtgcgacagtgcttcaatccaatgatcgtcgag cttgcggaaa aggcaatgaaagaatatggagaggacccgaaaatcgaaacaaacaaatttgcagcaatatgcactcac ttggaagtctg cttcatgtactcggatttccactttattaatgaactgggtgagtcagtggtcatagagtctggtgacccaaa tgctctt ttgaaacacagatttgaaatcattgaggggagagatcgaacaatggcatggacagtagtaaacagcatc tgcaacacca
100 / 119 caagagctgaaaaacctaaatttcttccagatttatacgactataaggagaacagatttgttgaaattggtg tgacaag gagagaagttcacatatactacctggagaaggccaacaaaataaagtctgagaaaacacatatccacat tttctcattt acaggagaggaaatggctacaaaagcggactatactcttgatgaagagagtagagccaggatcaaga ccagactattca ctataagacaagaaatggccagtagaggcctctgggattcctttcgtcagtccgagagaggcgaagag acaattgaaga aagatttgaaatcacagggacgatgcgcaagcttgccaattacagtctcccaccgaacttctccagcctt gaaaatttt agagtctatgtggatggattcgaaccgaacggcttcattgagagtaagctttctcaaatgtccaaagaag taaatgcca gaatcgaaccattttcaaagacaacaccccgaccactcaaaatgccaggtggtccaccctgccatcag cgatctaaatt cttgctaatggatgctctgaaactgagcattgaggacccaagtcacgagggagagggaataccactat atgatgcaatc aaatgcatgaaaactttctttggatggaaagagcccagtattgttaaaccacatgaaaagggtataaacc cgaactatc tccaaacttggaagcaagtattagaagaaatacaagaccttgagaacgaagaaaggacccccaagac caagaatatgaa aaaaacaagccaattgaaatgggcactaggtgaaaatatggcaccagagaaagtggattttgaggatt gtaaagacatc agtgatttaaaacagtatgacagtgatgagccagaaacaaggtctcttgcaagttggattcaaagtgagt tcaacaaag cttgtgagctgacagattcaagctggatagagctcgatgaaattggggaggatgtcgccccaatagaat acattgcgag catgaggagaaattattttactgctgagatttcccattgtagagcaacagaatatataatgaaaggagtgt acatcaac actgctctactcaatgcatcctgtgctgcgatggatgaatttcaattaattccgatgataagtaaatgcagg
101 / 119 accaaag aagggagaaggaaaacaaatttatatggattcataataaagggaagatcccatttaagaaatgatactga cgtggtgaa ctttgtaagtatggaattttctctcactgatccaagatttgagccacacaaatgggaaaaatactgcgttcta gaaatt ggagacatgcttctaagaactgctgtaggtcaagtgtcaagacccatgtttttgtatgtaaggacaaatgg aacctcta aaattaaaatgaaatggggaatggaaatgaggcgctgcctccttcagtctctgcaacagattgaaagca tgatcgaagc tgagtcctcggtcaaagaaaaggacatgaccaaagaattttttgagaacaaatcagagacatggcctat aggagagtcc cccaaaggagtggaagagggctcaatcgggaaggtttgcaggaccttattagcaaaatctgtgtttaac agtttgtatg catctccacaactggaagggttttcagctgaatctaggaaattacttctcattgttcaggctcttagggata acctgga acctggaacatttgatattggggggttatatgaatcaattgaggagtgcctgattaatgatccctgggtttt gcttaat gcatcttggttcaactccttccttacacatgcactgaagtagttgtggcaatgctactatttgctatccatact gtcca aaaaagtaccttgtttctact (SEQ ID NO: 9)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 PA do tipo selvagem:
102 / 119
ALRDNLEPGTFDIGGLYESIEECLINDPWVLLNASWFNSFLTHALK (SEQ ID NO: 10) Segmento 4 ou HA:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 4 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (PA): agcaaaagcaggggatatttctgtcaatcatgaagacaaccattattttgatactactgacccattgggcc tacagtca aaacccaatcagtggcaacaacacagccacattgtgtctgggacgccatgcagtagcaaatggaacat tggtaaaaaca ataagtgatgatcaaattgaggtgacaaatgctacagaattagttcagagcatttcaacggggaaaatat gcaacaact catatagaattctagatggaagaaattgcacattaatagatgcaatgctaggagacccccactgtgacgc ctttcagta tgagaattgggacctctttatagaaagaagcagcgctttcagcaattgctacccatatgacatccctgact atgcatcg ctccgatccattgtagcatcctcaggaacattggaattcacagcagagggattcacatggacaggtgtc actcaaaacg gaataagtggagcctgcaaaaggggatcagccgatagtttctttagccgactgaattggctaacaaaat ctggaagctc ttaccccacattgaatgtgacaatgcctaacaataaaaatttcgacaagctatacatctgggggattcatc acccgagc tcaaatcaagagcagacaaaattgtacatccaagaatcaggacgagtaacagtctcaacaaaaagaag
103 / 119 tcaacaaacaa taatccctaacatcggatctagaccgtgggtcagaggtcaatcaggcaggataagcatatactggacca ttgtaaaacc tggagatatcctaatgataaacagtaatggcaacttagttgcaccgcggggatattttaaattgaaaacag ggaaaagc tctgtaatgagatcagatgtacccatagaaatttgtgtgtctgaatgtattacaccaaatggaagcatctcc aacgaca agccattccaaaatgtgaacaaagttacatatggaaaatgccccaagtatatcaggcaaaacactttaaa gctggccac tgggatgaggaatgtaccagaaaagcaaatcagaggaatcttcggagcaatagcgggattcatcgaaa acggctgggaa ggaatggttgatgggtggtatgggttccgatatcaaaactctgaaggaacagggcaagctgcagatcta aagagcactc aagcagccatcgaccagattaatggaaagttaaacagagtgattgaaagaaccaatgagaaattccatc aaatagagaa ggaattctcagaagtagaaggaagaattcaggacttggagaaatatgtagaagacaccaaaatagacc tatggtcctac aatgcagaattgctggtggctctagaaaatcaacatacaattgacttaacagatgcagaaatgaataaatt atttgaga agactagacgccagttaagagaaaacgcagaagacatgggaggtggatgtttcaagatttaccacaaa tgtgataatgc atgcattggatcaataagaaatgggacatatgaccattacatatacagagatgaagcattaaacaaccga tttcagatc aaaggtgtagagttgaaatcaggctacaaagattggatactgtggatttcattcgccatatcatgcttctta atttgcg ttgttctattgggtttcattatgtgggcttgccaaaaaggcaacatcagatgcaacatttgcatttgagtaaa ctgata gttaaaaacacccttgtttctact (SEQ ID NO: 11)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8
104 / 119 HA do tipo selvagem:
GGGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHYIYRDEALNNRFQIKGVELKSG YKDWILWISFAISCFLICVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO: 12) Segmento 5 ou NP:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 5 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (PA): agcaaaagcagggtagataatcactcactgagtgacatcaaagtcatggcgtctcaaggcaccaaacg atcctatgaac agatggaaactgatggggaacgccagaatgcaactgaaatcagagcatctgtcggaaggatggtggg aggaatcggccg gttttatgttcagatgtgtactgagcttaaactaaacgaccatgaagggcggctgattcagaacagcataa caatagaa aggatggtactttcggcattcgacgaaagaagaaacaagtatctcgaggagcatcccagtgctgggaa agaccctaaga aaacgggaggcccgatatacagaaggaaagatgggaaatggatgagggaactcatcctccatgataa agaagaaatcat gagaatctggcgtcaggccaacaatggtgaagacgctactgctggtcttactcatatgatgatctggcac tccaatctc
105 / 119 aatgacaccacataccaaagaacaagggctcttgttcggactgggatggatcccagaatgtgctctctg atgcaaggct caaccctcccacggagatctggagccgctggtgctgcagtaaaaggtgttggaacaatggtaatggaa ctcatcagaat gatcaaacgcggaataaatgatcggaatttctggagaggtgaaaatggtcgaagaaccagaattgctta tgaaagaatg tgcaatatcctcaaagggaaatttcagacagcagcacaacgggctatgatggaccaggtgagggaag gccgcaatcctg gaaacgctgagattgaggatctcattttcttggcacgatcagcacttattttgagaggatcagtagcccat aaatcatg cctacctgcctgtgtttatggccttgcagtaaccagtgggtatgactttgagaaggaaggatactctctgg ttggaatt gatcctttcaaactactccagaacagtcaaattttcagtctaatcagaccaaaagaaaacccagcacaca agagccagt tggtgtggatggcatgccattctgcagcatttgaggacctgagagttttaaatttcattagaggaaccaaa gtaatccc aagaggacagttaacaaccagaggagttcaaatagcttcaaatgaaaacatggagacaatagattctag cacacttgaa ctgagaagcaaatattgggcaataaggaccagaagcggaggaaacaccagtcaacagagagcatct gcaggacagataa gtgtgcaacctactttctcagtacagagaaatcttccctttgagagagcaaccattatggctgcattcactg gtaacac tgaagggaggacttccgacatgagaacggaaatcataaggatgatggaaaatgccaaatcagaagat gtgtctttccag gggcggggagtcttcgagctctcggacgaaaaggcaacgaacccgatcgtgccttcctttgacatgag caatgaagggt cttatttcttcggagacaatgctgaggagtttgacaattaaagaaaaatacccttgtttctact (SEQ ID NO: 13)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8
106 / 119 NP:
ATIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMENAKSEDVSFQGRGVFELSDE KATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEFDN (SEQ ID NO:14) Segmento 6 ou NA:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 6 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (NA): agcaaaagcaggagtttaaaatgaatccaaatcaaaagataatagcaattggatttgcatcattggggat attaatcat taatgtcattctccatgtagtcagcattatagtaacagtactggtcctcaataacaatagaacagatctgaa ctgcaaa gggacgatcataagagagtgcaatgaaacagtaagagtagaaaaaattactcaatggtataataccagt acaattaagt acatagagagaccttcaaatgaatactacatgaacaacactgaaccactttgtgaggcccaaggctttgc accattttc caaagataatggaatacgaattgggtcgagaggccatgtttttgtgataagagaaccttttgtatcatgttc gccctca gaatgtagaacctttttcctcacacagggctcattactcaatgacaaacattctaacggcacagtaaagg accgaagtc cgtataggactttgatgagtgtcagaatagggcaatcacctaatgtatatcaagctaggtttgaatcggta gcatggtc
107 / 119 agcaacagcatgccatgatggaaaaaaatggatgacagttggagtcacagggcccgacaatcaagca attgcagtagtg aactatggaggtgttccggttgatattattaattcatgggcaggggatattttaagaacccaagaatcatca tgcacct gcattaaaggagactgttattgggtaatgactgatggaccggcaaataggcaagctaaatataggatatt caaagcaaa agatggaagagtaattggacagactgatataagtttcaatgggggacacatagaggagtgttcttgttac cccaatgaa gggaaggtggaatgcatatgcagggacaattggactggaacaaatagaccaattctggtaatatcttct gatctatcgt acacagttggatatttgtgtgctggcattcccactgacactcctaggggagaggatagtcaattcacagg ctcatgtac aagtcctttgggaaataaaggatacggtgtaaaaggtttcgggtttcgacaaggaactgacgtatgggc cggaaggaca attagtaggacttcaagatcaggattcgaaataataaaaatcaggaatggttggacacagaacagtaaa gaccaaatca ggaggcaagtgattatcgatgacccaaattggtcaggatatagcggttctttcacattgccggttgaacta acaaaaaa gggatgtttggtcccctgtttctgggttgaaatgattagaggtaaacctgaagaaacaacaatatggacct ctagcagc tccattgtgatgtgtggagtagatcataaaattgccagttggtcatggcacgatggagctattcttccctttg acatcg ataagatgtaatttacgaaaaaactccttgtttctact (SEQ ID NO: 15)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 NA:
108 / 119
NSKDQIRRQVIIDDPNWSGYSGSFTLPVELTKKGCLVPCFWVEMIRGK PEETTIWTSSSSIVMCGVDHKIASWSWHDGAILPFDIDKM (SEQ ID NO: 16) Segmento 7 ou M:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 7 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (M): agcaaaagcaggtagatatttaaagatgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcgtac catcaggc cccctcaaagccgagatcgcgcagagacttgaagatgtctttgcagggaagaacaccgatcttgaggc actcatggaat ggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaagggattttaggatttgtattcacgctcaccgtg cccagtga gcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgcccttagtggaaacggagatccaaacaacatgg acagagcagta aaactgtacaggaagcttaaaagagaaataacattccatggggcaaaagaggtggcactcagctattc cactggtgcac tagccagctgcatgggactcatatacaacagaatgggaactgttacaaccgaagtggcatttggcctgg tatgcgccac atgtgaacagattgctgattcccagcatcgatctcacaggcagatggtgacaacaaccaacccattaatc agacatgaa aacagaatggtattagccagtaccacggctaaagccatggaacagatggcaggatcgagtgagcagg cagcagaggcca tggaggttgctagtagggctaggcagatggtacaggcaatgagaaccattgggacccaccctagctcc agtgccggttt gaaagatgatctcattgaaaatttacaggcctaccagaaacggatgggagtgcaaatgcagcgattcaa
109 / 119 gtgatcctct cgttattgcagcaagtatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttttcttcaaattcattt at cgtcgccttaaatacgggttgaaaagagggccttctacggaaggagtacctgagtctatgagggaaga atatcggcagg aacagcagaatgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagagctggagtaaaaaactacctt gtttctact (SEQ ID NO: 17)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 M1:
AKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASRARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLK DDLIENLQAYQKRMGVQMQRFK (SEQ ID NO: 18)
3. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 M2:
FKFIYRRLKYGLKRGPSTEGVPESMREEYRQEQQNAVDVDDGHFVNI ELE (SEQ ID NO: 19) Segmento 8 ou NS:
1. Sequência de nucleotídeos do segmento 8 de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 (NS): agcaaaagcagggtgacaaaaacataatggattccaacactgtgtcaagctttcaggtagactgttttctt tggcatgt ccgcaaacgattcgcagaccaagaactgggtgatgccccattccttgaccggcttcgccgagaccaga agtccctaagg ggaagaggtagcactcttggtctggacatcgaaacagccactcatgcaggaaagcagatagtggagc agattctggaaa
110 / 119 aggaatcagatgaggcacttaaaatgaccattgcctctgttcctacttcacgctacttaactgacatgactc ttgatga gatgtcaagagactggttcatgctcatgcccaagcaaaaagtaacaggctccctatgtataagaatgga ccaggcaatc atggataagaacatcatacttaaagcaaactttagtgtgattttcgaaaggctggaaacactaatactactt agagcct tcaccgaagaaggagcagtcgttggcgaaatttcaccattaccttctcttccaggacatactaatgagga tgtcaaaaa tgcaattggggtcctcatcggaggacttaaatggaatgataatacggttagaatctctgaaactctacaga gattcgct tggagaagcagtcatgagaatgggagaccttcattcccttcaaagcagaaatgaaaaatggagagaac aattaagccag aaatttgaagaaataagatggttgattgaagaagtgcgacatagattgaaaaatacagaaaatagttttga acaaataa catttatgcaagccttacaactattgcttgaagtagaacaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaa tgata aaaaacacccttgtttctact (SEQ ID NO: 20)
2. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 M1:
RLETLILLRAFTEEGAVVGEISPLPSLPGHTNEDVKNAIGVLIGGLKWN DNTVRISETLQRFAWRSSHENGRPSFPSKQK (SEQ ID NO: 21)
3. Sequência de aminoácidos da proteína A/equine/Ohio/1/2003 H3N8 M2:
GEAVMRMGDLHSLQSRNEKWREQLSQKFEEIRWLIEEVRHRLKNTE NSFEQITFMQALQLLLEVEQEIRTFSFQLI (SEQ ID NO: 22)
111 / 119 Exemplo 7: Segmento 4 (HA) e Segmento 6 (NA) Sequências de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 Sequência de nucleotídeos do segmento 4 (HA) de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 agcaaaagcaggggatatttctgtcaatcATGAAGACAACCATTATTTTTATTT
112 / 119
TTATTATGTGGGCTTGCCAAAAAGGCAACATCAGATGCAACA TTTGCATTTGAgtaaactgatagttaaa Aacacccttgtttctact (SEQ ID NO: 23) Sequência de aminoácidos da proteína HA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8
113 / 119
DMGGGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHYIYRDEALNNRFQIKGVEL KSGYKDWILWISFAISCFLICVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO: 24) Sequência de nucleotídeos do segmento 6 (NA) de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8 agcaaaagcaggagtttaaaATGAATCCAAATCAAAAGATAATAACAAT
114 / 119
ATTGCCAGTTGGTCATGGCACGATGGA GCTATTCTTCCCTTTGACATCGATAAGATGTAAtttacgaaaaaactcctt gtttctact (SEQ ID NO: 25) Sequência de aminoácidos da proteína NA de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8
115 / 119
KDQIRRQVIIDDPNWSGYSGSFTLPIELTKKGCLVPCFWVEMIRGKPEE TTIWTSSSSIVMCGVDHKIASWSWHDGAILPFDIDKM (SEQ ID NO: 26) Exemplo 8. Segmento 4 (HA) e segmento 6 (NA) Sequências de influenza A/equine/Texas/6/2017 H3N8 Sequência de nucleotídeos do segmento 4 (HA) da influenza A/equine/Texas/6/2017 H3N8
116 / 119
ACATTTGCATTTGAGTAGATTAATAGTTAAAAACACCCTTGTTTCT ACT (SEQ ID NO: 27) Sequência de aminoácidos da proteína HA da influenza A/equine/Texas/6/2017 H3N8
117 / 119
GCFKIYHKCNNACIGSIRNGTYDHYIYRDEALNNRFQIKGVELKSGYK DWILWISFAISCFLICVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI (SEQ ID NO: 28) Sequência de nucleotídeos do segmento 6 (HA) da influenza A/equine/Texas/6/2017 H3N8
118 / 119
CTATTCTTCCCTTTGACATCGATAAGATGTAATTTACGAAAAAACT CCTTGTTTCTACT (SEQ ID NO: 29) Sequência de aminoácidos da proteína NA da influenza A/equine/Texas/6/2017 H3N8
SKDQIRRQVIIDDQNWSGYSGSFTLPVELTKKECLVPCFWVEMIRGKP EEKTIWTSSSSIVMCGVDHKIASWSWHDGAILPFDIDKM (SEQ ID NO: 30)
119 / 119
[00225] As divulgações de cada patente, pedido de patente e publicações citadas neste documento são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Embora esta invenção tenha sido descrita com referência a modalidades específicas, é evidente que outras modalidades e variações desta invenção podem ser concebidas por outros versados na técnica sem que se afaste do verdadeiro espírito e escopo da invenção. As reivindicações anexas se destinam a ser interpretadas para incluir todas essas modalidades e variações equivalentes.
Claims (22)
1. Composição imunológica multivalente caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais vírus da influenza equina atenuados vivos (LAIV), compreendendo: um primeiro LAIV expressando um ou mais antígenos de um vírus da influenza equina clado 1 H3N8; e um segundo LAIV expressando um ou mais antígenos de um vírus da influenza equina clado 2 H3N8, em que cada LAIV compreende uma ou mais mutações em um ou mais de: segmento 1 e segmento 2 do genoma viral.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro LAIV expressa HA, NA ou uma combinação destes de A/equine/Ohio/1/2003 H3N8.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro LAIV expressa HA, NA ou uma combinação destes de A/equine/Texas/6/2017 H3N8.
4. Composição de qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que o segundo LAIV expressa HA, NA ou uma combinação destes de A/equine/Richmond/1/2007 H3N8.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que o segmento 1 compreende a sequência de ácidos nucleicos apresentada na SEQ ID NO: 1.
6. Composição de acordo com qualquer reivindicação 1-4, caracterizada pelo fato de que o segmento 2 compreende a sequência de ácidos nucleicos apresentada na SEQ ID NO: 3.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que pelo menos um LAIV; compreende uma ou mais mutações no segmento 1, que codifica a PB2 mutante.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de a PB2 mutante compreender uma mutação pontual de N265S.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-8, caracterizada pelo fato de a PB2 mutante compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada pelo fato de que pelo menos um LAIV; compreende uma ou mais mutações no segmento 2, que codifica a PB1 mutante.
11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a PB1 mutante compreende um ou mais dentre: mutação pontual de K391E, mutação pontual de E581G e mutação pontual de A661T.
12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10-11, caracterizada pelo fato de que a PB1 mutante compreende uma mutação pontual de K391E, uma mutação pontual de E581G e uma mutação pontual de A661T.
13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-12, caracterizada pelo fato de que a PB1 mutante compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4.
14. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada LAIV compreende uma ou mais mutações no segmento 1, que codifica a PB2 mutante; e uma ou mais mutações no segmento 2, que codifica a PB1 mutante.
15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de a PB2 mutante compreender uma mutação pontual de N265S e o mutante PB1 compreende uma mutação pontual de K391E, uma mutação pontual de E581G e uma mutação pontual de A661T.
16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-15, caracterizada pelo fato de que a composição é usada para o tratamento da influenza equina em um sujeito.
17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizada pelo fato de que o segmento 1 de cada LAIV é derivado do segmento 1 de A/equine/Ohio/1/2003; e em que o segmento 2 de cada LAIV é derivado do segmento 2 de A/equine/Ohio/1/2003.
18. Método para induzir uma resposta imune contra uma pluralidade de vírus da influenza equina em um sujeito, caracterizado pelo fato de que o método compreendendo a administração ao sujeito da composição imunológica da reivindicação 1.
19. Método de acordo com a reivindicação de 18, caracterizado pelo fato de que o sujeito não tem influenza equina e o método induz imunidade contra a influenza equina.
20. Método de acordo com a reivindicação de 18, caracterizado pelo fato de o sujeito estar infectado pela influenza equina e de que o método induz uma resposta imunológica terapêutica.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 18-20, caracterizado pelo fato de que a composição imunológica ser administrada por via intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, interaperitoneal, intravenosa ou subcutânea.
22. Método de acordo com qualquer reivindicação de 18-20, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um cavalo.
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