BR112020015588A2

BR112020015588A2 - Molécula de ácido nucleico codificando um ou mais anticorpos sintéticos, composição, anticorpo monoclonal anti-rsv, método para prevenir ou tratar uma doença, e, formulação.

Info

Publication number: BR112020015588A2
Application number: BR112020015588-8A
Authority: BR
Inventors: David Weiner; Kar Muthumani; Jing Chen; Trevor Smith; Katherine SCHULTHEIS
Original assignee: The Wistar Institute Of Anatomy And Biology; Inovio Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2021-01-05
Also published as: SG11202007241WA; WO2019152600A1; MX2020008062A; JP2021512600A; US20210047390A1; KR20200140799A; CN111936513A; EP3746474A4; CA3089717A1; EP3746474A1; AU2019215006A1

Abstract

molécula de ácido nucleico codificando um ou mais anticorpos sintéticos, composição, anticorpo monoclonal anti-rsv, método para prevenir ou tratar uma doença, e, formulação. é divulgada aqui uma composição incluindo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo para um antígeno do vírus sincicial respiratório. também é divulgado neste documento um método para gerar um anticorpo sintético em um sujeito administrando a composição ao sujeito. a divulgação também fornece um método para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus sincicial respiratório em um sujeito usando a referida composição e o método de geração.

Description

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MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO UM OU MAIS ANTICORPOS SINTÉTICOS, COMPOSIÇÃO, ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-RSV, MÉTODO PARA PREVENIR OU TRATAR UMA DOENÇA, E, FORMULAÇÃO CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a uma composição compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante para gerar um ou mais anticorpos sintéticos e fragmentos funcionais dos mesmos, in vivo, e um método para prevenir e/ou tratar infecção viral em um sujeito administrando a referida composição.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido tem direito à prioridade do Pedido Provisório US 62/624.320, depositado em 31 de janeiro de 2018, e Pedido Provisório US 62/749.580, depositado em 23 de outubro de2018, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento em sua totalidade.

FUNDAMENTOS

[003] O Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é uma grande ameaça à saúde de crianças pequenas e adultos idosos, e complicações envolvidas com infecções respiratórias inferiores podem levar à hospitalização e alguns pacientes podem sucumbir à doença. Quase toda a população é infectada com o vírus durante os primeiros anos de vida, mas em muitos casos a imunidade não é mantida nem completamente protege contra infecções seguintes. Muito embora uma vacina permaneça uma necessidade não atendida, imunização passiva com um anticorpo anti-RSV-F imunoprofilático (Pavilizumabe) reduziu com sucesso hospitalizações em pacientes vulneráveis. No entanto, o uso deste Anticorpo monoclonal (mAb) é limitado a ajustes de recursos elevados e indisponíveis para a maioria das populações em risco globais.

[004] Embora mAbs tenham se mostrado eficazes em fornecer proteção contra muitas doenças infecciosas, seu uso generalizado é limitado.

2 / 101 A meia-vida in vivo limitada significa que múltiplas doses são necessárias para manter imunidade e os altos custos e as complexidades envolvidas no desenvolvimento, na fabricação e distribuição também impedem seu uso global. Em resposta, novas estratégias baseadas na distribuição in vivo de genes de anticorpos estão sendo desenvolvidas. Uma dessas plataformas é dMAb, um mAb codificado por DNA sintético distribuído por eletrogenetransferência in vivo e utilizando as próprias células musculares do corpo para gerar e secretar a proteína de imunoglobulina. Além de drogas à base de proteína, DNA de plasmídeo é barato de fabricar e, por causa de sua estabilidade de temperatura, não exigiria uma cadeia fria, o que o torna ideal para distribuição global. Em estudos de prova de princípio, essa plataforma forneceu proteção contra várias doenças infecciosas, incluindo influenza, pseudomonas e Ebola em modelos animais pré-clínicos.

[005] Assim, há necessidade na técnica de terapêutica melhorada que previna e/ou trate infecção de RSV. A presente invenção satisfaz essa necessidade.

SUMÁRIO

[006] A presente invenção é dirigida a uma molécula de ácido nucleico codificando um ou mais anticorpos sintéticos, em que a molécula de ácido nucleico compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em a) uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo sintético do vírus sincicial antirrespiratório (RSV); b) uma sequência nucleotídica codificando um fragmento de um anticorpo sintético anti-RSV; c) uma sequência nucleotídica codificando anticorpo sintético anti-RSV de ScFv; e d) uma sequência nucleotídica codificando um fragmento de um anticorpo sintético anti-RSV de ScFv. Numa modalidade, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico codificando um DMAb anti-RSV de ScFv ou um fragmento ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo anti-RSV ou um

3 / 101 fragmento ou uma variante do mesmo.

[007] Em uma modalidade, o anticorpo sintético liga a um antígeno de RSV. Em uma modalidade, o anticorpo sintético liga a um ou mais antígenos de RSV selecionados de RSV-F, RSV-G, RSV-Ga, RSV-Gb, RSV- M2-1, RSV M2-2 e qualquer combinação dos mesmos.

[008] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende sequência nucleotídica codificando um domínio de clivagem.

[009] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6; ou um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica pelo menos 90% homóloga às SEQ ID NOs: 1-6 ou um fragmento de uma sequência nucleotídica pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NOs: 1-6.

[0010] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codifica uma sequência líder.

[0011] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende um vetor de expressão.

[0012] Em uma modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição compreende hialuronidase.

[0013] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo monoclonal anti-RSV. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal anti-

4 / 101 RSV compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6; ou um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6.

[0014] Em uma modalidade, a invenção fornece uma formulação compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, a formulação compreende hialuronidase.

[0015] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para prevenir ou tratar uma doença em um sujeito. Em uma modalidade, o método compreende administrar uma molécula de ácido nucleico, composição, formulação ou um anticorpo monoclonal anti-RSV ao sujeito. Em uma modalidade, a doença é uma infecção por vírus Sincicial Respiratório.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] Figura 1, compreendendo Figura 1A até Figura 1D, representa o desenho e teste in vitro de construto de RSV-FdMAb de sc-Fv-Fc: Figura 1A representa uma ilustração de formatos IgG1 e scFv-Fc humanos. A dobradiça completa e porções Fc da molécula são retidas no formato scFv-Fc. Figura 1B representa um mapa de plasmídeo de dMAb de RSV-F. Figura 1C representa expressão in vitro de dMAb de RSV-F. Coloração de imunofluorescência foi realizada em células T 293 3 dias após transfecção (DAPI - azul, dMAb de RSV-F - vermelho). Figura 1C representa análise western-blot de sobrenadante de cultura de célula de células HEK293T transfectadas in vitro de dMAb de RSV-F colhidas após 3 dias (faixa 1: dMAb de IgG-RSV, faixa 2: sc-Fv-Fc dMAb de RSV-F).

[0017] Figura 2, compreendendo Figura 2A até Figura 2C, representa aplataforma de distribuição in vivo dMAb de RSV-F. Figura 2A representa

5 / 101 que eletroporação in vivo facilita a distribuição do dMAb ao tecido muscular, miócitos expressam e secretam o MAb codificado. MAb é distribuído sistemicamente. Figura 2B representa um exemplo de expressão de dMAb em miócitos após distribuição de dMAb ao músculo TA de camundongo (DAPI - azul, dMAb - verde). Figura 2C representa concentração de soro de IgG humana após distribuição de dMAb medida por ELISA (+/- SEM, n=7).

[0018] Figura 3, compreendendo Figura 3A até Figura 3D, representa expressão on vivo de dMAbs de RSV-F em camundongos Balb/c. Plasmídeo dMAb de RSV-F foi administrado ao músculo da perna de camundongos Balb/c. Amostras de soro foram tiradas 7 dias após tratamento. Figura 3A representa expressão de soro de dmAb de RSV-F. Construto Sc-Fv-Fc (+/- SEM, n=5-8) Figura 3B representa ligação de antígeno RSV-F de dMAb. Sinal de ligação de RSV-F de amostras de soro (+/- SEM, n=4) Figura 3C representa neutralização de vírus de RSV-A. Título de neutralização (log2 diluição de soro de 60% de redução de formação de placa; +/- SEM, n=3-11, linha pontilhada indica LOD na diluição de soro de 1/20) Figura 3D representa a concentração de dMAb de RSV-F sc-Fv-Fc em amostras de BAL 7 dias após distribuição de pDNA de RSV-dMAb (mol de dMAb sc-Fv-Fc por grama de proteína total na amostra de lavagem).

[0019] Figura 4, compreendendo Figura 4A até Figura 4D, representa a caracterização de dMAb de RSV-F em ratos de algodão. Figura 4A representa expressão local de dMAb demonstrada por coloração de imunofluorescência de dMAb de RSV-F em tecido muscular TA de rato de algodão 7 dias após distribuição de pDNA de dMAb de RSV para o sítio de tecido (DAPI - azul; dMAb de RSV-F - verde; secionado perpendicular a miócitos). Figura 4B representa que os níveis de dMAb de RSV-F (ng/ml) foram medidos por 39 dias após administração IM de 800 µg de plasmídeo de dMAb (+/- SEM, n=5). Figura 4C representa função de neutralização de vírus de dMAb de RSV-F expressa in vivo. Amostras de soro foram colhidas e

6 / 101 testadas 7 dias após distribuição de 2,4 mg de pDNA de DMAb sc-Fv-Fc: título de neutralização (+/- SEM, linha pontilhada indica LOD na diluição de soro de 1/20). Figura 4D representa a concentração de dMAb de RSV-F em amostras de BAL de ratos de algodão tratados.

[0020] Figura 5, compreendendo Figura 5A até Figura 5D, representa resultados experimentais demonstrando que dMAb de RSV-F confere proteção contra Doença Respiratória Inferior em desafio de vírus vivo de ratos de algodão. Figura 5A representa um esquemático de estudo de desafio de rato de algodão: Animais foram tratados com 2,4 mg de dMAb RSV 7 dias antes do desafio, injeção IM de 15 mg/kg de Palivizumabe 1 dia antes do desafio. Figura 5B representa a carga viral de tecido de pulmão de rato de algodão (pfu/g) colhido 5 dias após desafio de vírus vivo intranasal com RSV/A/longo (+/- SEM n=4-5). Figura 5 representa níveis de mRNA de RSV (log2 e normalizados para beta-Actina) de tecido de pulmão de rato de algodão 5 dias após desafio de vírus vivo intranasal com RSV/A/longo (+/- SEM, n=4-5, teste t não paramétrico de Mann-Whitney: p (não tratado vs dMAb de RSV) = 0,0159; p (não tratado vs Palivizumabe) = 0,0079). Figura 5D representa níveis de soro de Palivizumabe e dMAb de RSV-F sc-Fv-Fc em ratos de algodão no dia de desafio (dia 7) e 5 dias após desafio (+/- SEM, n=4-5).

[0021] Figura 6 representa resultados experimentais demonstrando a cinética de expressão de DMAbs de RSV.

[0022] Figura 7 representa resultados experimentais demonstrando a expressão de pico de DMAbs de RSV.

[0023] Figura 8 representa resultados experimentais demonstrando quantidade de DMAbs em amostras de lavagem Broncoalveolar (BAL).

[0024] Figura 9 representa resultados experimentais demonstrando ligação de RSV-F.

[0025] Figura 10 representa os resultados experimentais

7 / 101 demonstrando neutralização.

[0026] Figura 11 representa resultados experimentais demonstrando DMAbs de RSV no rato de algodão.

[0027] Figura 12 representa resultados experimentais demonstrando expressão de pico e funcionalidade de anti-RSV sc-Fv humano em camundongos imunocompetentes. Os ratos foram dosados com 200 µg de dMAb de RSV sc-Fv humano nos músculos das pernas de camundongos balb/c. A distribuição foi assistida por CELLECTRA-3P®. A expressão de nível de soro médio de 13200 ng/ml de sc-Fv humano de proteína foi alcançada 7 dias após tratamento in vivo. sc-Fv humano expresso in vivo liga a Soro de antígeno de RSV-F de camundongos tratados exibe atividade neutralizante de vírus de RSV-A vivo como demonstrado pelo ensaio de redução de placa in vitro e resulta em média de 6,9 log receptores. sc-Fv Humano de título neutralizante está presente no pulmão de camundongos tratados com uma concentração média de 1,1 ng de sc-Fv humano por µg de proteína total em lavagem broncoalveolar (BAL).

[0028] Figura 13 representa resultados experimentais demonstrando expressão mantida de sc-Fv humano em ratos de algodão. 100 µg (azul) e 800 µg (verde) de sc-Fv humano foram distribuídos para o músculo TA de ratos de algodão. Distribuição foi assistida por CELLECTRA-3P®. Expressão máxima no soro é atingida após 7 dias (226 ng/ml e 1.353 ng/ml, respectivamente).

[0029] Figura 14 representa resultados experimentais demonstrando expressão de pico e funcionalidade de sc-Fv humano em ratos de algodão. Distribuição assistida por CELLECTRA-3P® de 2,4 mg de sc-Fv humano em músculos de pernas de ratos de algodão resulta em expressão de soro média de 7030 ng/ml no dia 7. Soro de ratos de algodão tratados é neutralizante em ensaio de redução de placa in vitro resultando em média de 5,4 log de Tít. Neutr. de Recep.

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[0030] Figura 15 representa a plataforma de dMAb de RSV.

[0031] Figura 16 representa resultados experimentais demonstrando que dMAb de RSV protege ratos de algodão de LRI em seguida a desafio de RSV/A.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] A presente invenção se refere a composições compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando um anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. A composição pode ser administrada a um sujeito em necessidade da mesma para facilitar expressão in vivo e formação de um anticorpo sintético.

[0033] Em particular, os polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve expressos das sequências de ácidos nucleicos recombinantes podem se reunir no anticorpo sintético. O polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que o conjunto resulte no anticorpo sintético sendo capaz de ligar ao antígeno, sendo mais imunogênico em comparação com um anticorpo não reunido como descrito aqui e sendo capaz de elicitar ou induzir uma resposta imune contra o antígeno.

[0034] Adicionalmente, esses anticorpos sintéticos são gerados mais rapidamente no sujeito que anticorpos que são produzidos em resposta à resposta imune induzida por antígeno. Os anticorpos sintéticos são capazes de ligar e neutralizar efetivamente uma faixa de antígenos. Os anticorpos sintéticos também são capazes de proteger efetivamente contra e/ou promover sobrevivência de doença.

1. Definições

[0035] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como compreendido comumente por um versado na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo definições, irá prevalecer. Métodos e materiais

9 / 101 preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento são incorporadas por referência em suas totalidades. Os materiais, métodos e exemplos divulgados neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser limitantes.

[0036] Os termos “compreende(m)”, “inclui(em)”, “tendo”, “tem”, “pode”, “contém(êm)”, e variantes dos mesmos, conforme usados neste documento, se destinam a ser frases, termos ou palavras de transição abertas que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares “uma”, “um” e “a/o” incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. A presente divulgação também contempla outras modalidades “compreendendo”, “consistindo em” e “consistindo essencialmente em” modalidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecidos ou não.

[0037] “Anticorpo” pode significar um anticorpo de classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos, fragmentos ou derivados dos mesmos, incluindo Fab, F(ab')2, Fd e anticorpos de cadeia simples e derivados dos mesmos. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de mamífero, um anticorpo policlonal, um anticorpo purificado de afinidade ou misturas dos mesmos, que exibe especificidade de ligação suficiente a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada do mesmo.

[0038] “Fragmento de anticorpo” ou “fragmento de um anticorpo”, conforme aqui utilizado de forma intercambiável, se refere a uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o sítio de ligação a antígeno ou a região variável. A porção não inclui os domínios de cadeia pesada constantes (isto é, CH2, CH3 ou CH4, dependendo do isotipo e anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas sem

10 / 101 limitação, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diabodies, moléculas Fv (scFv) de cadeia simples, polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia simples contendo as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas uma região variável de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia simples contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada.

[0039] “Antígeno” se refere a proteínas que têm a capacidade de gerar uma resposta imune em um hospedeiro. Um antígeno pode ser reconhecido e ligado por um anticorpo. Um antígeno pode se originar de dentro do corpo ou do ambiente externo.

[0040] “CDRs” são definidas como as sequências de aminoácidos da região determinante da complementaridade de um anticorpo que são as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existem três CDRs de cadeia pesada e três de cadeia leve (ou regiões CDR) na porção variável de uma imunoglobulina. Assim, “CDRs”, conforme usado neste documento, se refere a todas as três CDRs de cadeia pesada ou todas as três CDRs de cadeia leve (ou a todas as CDRs de cadeia pesada e todas as cadeias leves, se apropriado). A estrutura e o dobramento de proteína do anticorpo podem significar que outros resíduos são considerados parte da região de ligação ao antígeno e seriam entendidos por um versado. Ver, por exemplo, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.

[0041] “Sequência de codificação” ou “ácido nucleico de codificação”, conforme aqui utilizado, pode significar que se refere ao ácido nucleico (molécula de RNA ou DNA) que compreende uma sequência nucleotídica que codifica um anticorpo, conforme estabelecido neste

11 / 101 documento. A sequência de codificação também pode compreender uma sequência de DNA que codifica uma sequência de RNA. A sequência de codificação pode ainda incluir sinais de iniciação e terminação operavelmente ligados a elementos reguladores, incluindo um promotor e sinal de poliadenilação capaz de dirigir expressão nas células de um indivíduo ou mamífero a quem o ácido nucleico é administrado. A sequência de codificação pode ainda incluir sequências que codificam peptídeos sinal.

[0042] “Complemento” ou “complementar”, como usado aqui pode significar que um ácido nucleico pode significar um emparelhamento de Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou de base de Hoogsteen entre os nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico.

[0043] “Corrente constante”, como aqui utilizado para definir uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células definindo o referido tecido, através da duração de um pulso elétrico distribuído ao mesmo tecido. O pulso elétrico é distribuído dos dispositivos de eletroporação aqui descritos. Esta corrente permanece com uma amperagem constante no referido tecido durante a vida de um pulso elétrico, porque o dispositivo de eletroporação aqui fornecido tem um elemento de realimentação, preferivelmente tendo realimentação instantânea. O elemento de realimentação pode medir a resistência do tecido (ou das células) durante a duração do pulso e fazer com que o dispositivo de eletroporação altere sua produção de energia elétrica (por exemplo, aumente a voltagem), de modo que a corrente no mesmo tecido permaneça constante durante todo o pulso elétrico (da ordem de microssegundos) e de pulso para pulso. Em algumas modalidades, o elemento de realimentação compreende um controlador.

[0044] “Realimentação de corrente” ou “realimentação”, conforme usados neste documento, pode ser usado de forma intercambiável e pode significar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação fornecidos, o que compreende medir a corrente no tecido entre eletrodos e alterar a saída de

12 / 101 energia fornecida pelo dispositivo de EP de modo correspondente a fim de manter a corrente em um nível constante. Esse nível constante é pré-ajustado por um usuário antes do início de uma sequência de pulsos ou um tratamento elétrico. A realimentação pode ser realizada pelo componente de eletroporação, por exemplo, controlador, do dispositivo de eletroporação, pois o circuito elétrico no mesmo é capaz de monitorar continuamente a corrente no tecido entre eletrodos e comparar essa corrente monitorada (ou corrente dentro do tecido) com uma corrente pré-ajustada e continuamente fazer ajustes na produção de energia para manter a corrente monitorada em níveis pré-ajustados. O circuito de realimentação pode ser instantâneo, pois ele é uma realimentação de circuito fechado análoga.

[0045] “Corrente descentralizada”, conforme utilizado neste documento, pode significar o padrão de correntes elétricas distribuídas dos vários arranjos de eletrodos de agulha dos dispositivos de eletroporação aqui descritos, em que os padrões minimizam, ou preferivelmente eliminam, a ocorrência de tensão térmica relativa a eletroporação em qualquer área de tecido eletroporado.

[0046] “Eletroporação”, “eletropermeabilização,” ou “intensificação eletrocinética” (“EP”), como utilizados intercambialmente aqui, pode se referir ao uso de um pulso de campo elétrico transmembrana para induzir vias microscópicas (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que biomoléculas, tal como plasmídeos, oligonucleotídeos, siRNA, drogas, íons e água, passem de um lado da membrana celular para o outro.

[0047] “Anticorpo endógeno”, conforme usado neste documento, pode se referir a um anticorpo que é gerado em um sujeito ao qual é administrada uma dose eficaz de um antígeno para indução de uma resposta imune humoral.

[0048] “Mecanismo de realimentação”, conforme usado neste documento, pode se referir a um processo executado por software ou

13 / 101 hardware (ou firmware), cujo processo recebe e compara a impedância do tecido desejado (antes, durante e/ou após a distribuição do pulso de energia) com um valor presente, preferivelmente corrente, e ajusta o pulso de energia distribuído para atingir o valor pré-ajustado. Um mecanismo de realimentação pode ser realizado por um circuito fechado analógico.

[0049] “Fragmento” pode significar um fragmento polipeptídico de um anticorpo que é função, isto é, pode ligar ao alvo desejado e ter o mesmo efeito pretendido que um anticorpo de comprimento total. Um fragmento de um anticorpo pode ser 100% idêntico ao comprimento total, exceto pela ausência de pelo menos um aminoácido do terminal N e/ou C, em cada caso com ou sem peptídeos sinal e/ou metionina na posição 1. Os fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais por cento do comprimento do anticorpo de comprimento total particular, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento de um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao anticorpo e compreende adicionalmente uma metionina ou peptídeo sinal heterólogo de terminal N que não está incluído ao calcular a identidade percentual. Os fragmentos podem ainda compreender uma metionina e/ou um peptídeo sinal de terminal N, tal como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG. A metionina e/ou peptídeo sinal do terminal N pode estar ligado a um fragmento de um anticorpo.

[0050] Um fragmento de uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo pode ser 100% idêntico ao comprimento total, exceto faltando pelo menos um nucleotídeo da extremidade 5' e/ou 3', em cada caso

14 / 101 com ou sem sequências codificando peptídeos sinal e/ou uma metionina na posição 1. Os fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais por cento do comprimento da sequência de codificação de comprimento total particular, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento que codifica um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao anticorpo e compreende opcionalmente ainda sequência que codifica uma metionina ou peptídeo sinal heterólogo de terminal N que não está incluído ao calcular a identidade percentual. Os fragmentos podem ainda compreender sequências de codificação para uma metionina e/ou um peptídeo sinal do terminal N, tal como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal de IgE ou IgG. A sequência de codificação que codifica a metionina e/ou peptídeo sinal do terminal N pode ser ligado a um fragmento de sequência de codificação.

[0051] “Construto genético”, conforme aqui utilizado, se refere às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína, tal como um anticorpo. O construto genético também pode se referir a uma molécula de DNA que transcreve um RNA. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de dirigir expressão nas células do indivíduo a quem a molécula de ácido nucleico é administrada. Como aqui utilizado, o termo “forma expressável” se refere a construtos de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operáveis ligados a uma sequência de codificação que codifica uma proteína, de modo que quando presente na célula do

15 / 101 indivíduo, a sequência de codificação será expressa.

[0052] “Idêntico” ou “identidade”, como aqui utilizado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, podem significar que as sequências têm uma percentagem especificada de resíduos que é a mesma ao longo de uma região especificada. A percentagem pode ser calculada alinhando de forma ótima as duas sequências, comparando as duas sequências através da região especificada, determinando o número de posições nas quais o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. Em casos em que as duas sequências são de comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades escalonadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos da sequência simples são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar DNA e RNA, timina (T) e uracila (U) podem ser considerados equivalentes. A identidade pode ser realizada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de computador, tal como BLAST ou BLAST 2.0.

[0053] “Impedância”, conforme usado neste documento, pode ser usado ao discutir o mecanismo de feedback e pode ser convertida em um valor atual de acordo com a lei de Ohm, assim permitindo comparações com a corrente pré-ajustada.

[0054] “Resposta imune”, conforme usado aqui, pode significar a ativação do sistema imunológico de um hospedeiro, por exemplo, o de um mamífero, em resposta à introdução de um ou mais ácidos nucleicos e / ou peptídeos. A resposta imune pode ser na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.

[0055] “Ácido nucleico” ou “oligonucleotídeo” ou “polinucleotídeo”,

16 / 101 como usado neste documento, pode significar pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados juntos. A representação de uma fita simples também define a sequência da fita complementar. Assim, um ácido nucleico também engloba a fita complementar de uma fita simples representada. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para a mesma finalidade que um dado ácido nucleico. Assim, um ácido nucleico também engloba ácidos nucleicos substancialmente idênticos e complementos dos mesmos. Uma fita simples fornece uma sonda que pode hibridizar com uma sequência alvo sob condições restritivas de hibridização. Assim, um ácido nucleico também engloba uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização restritivas.

[0056] Ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita dupla, ou podem conter porções de ambas as sequências de fita dupla ou de fita simples. O ácido nucleico pode ser DNA, tanto genômico quanto cDNA, RNA ou um híbrido, em que o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribo e ribonucleotídeos e combinações de bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.

[0057] “Operavelmente ligado”, como usado aqui, pode significar que a expressão de um gene está sob controle de um promotor com o qual ele está espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre o promotor e o gene que ele controla no gene do qual o promotor é derivado. Como é conhecido na técnica, a variação nesta distância pode ser adaptada sem perda de função de promotor.

[0058] Um “peptídeo”, uma “proteína” ou um “polipeptídeo”, conforme usado neste documento, pode significar uma sequência ligada de aminoácidos e pode ser natural, sintética ou uma modificação ou combinação

17 / 101 de natural e sintético.

[0059] “Promotor”, como aqui utilizado pode significar uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou intensificar a expressão de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcricionais específicas para intensificar ainda mais a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal das mesmas. Um promotor também pode compreender elementos intensificadores ou repressores distais, que podem ser localizados, tanto quanto milhares de pares de base do sítio de partida da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo viral, bacteriana, fúngica, vegetais, de insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente ou diferencialmente em relação à célula, ao tecido ou ao órgão no qual a expressão ocorre ou, em relação ao estágio de desenvolvimento no qual a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, tal como tensões fisiológicas, patógenos, íons de metal, ou agentes de indução. Exemplos representativos de promotores incluem o promotor T7 de bacteriófago, promotor T3 de bacteriófago, promotor SP6, promotor-operador lac, promotor tac, promotor tardio SV40, promotor precoce SV40, promotor RSV-LTR, promotor IE de CMV, promotor precoce SV40 ou promotor tardio SV40 e o promotor IE de CMV.

[0060] “Peptídeo sinal” e “sequência líder” são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma sequência de aminoácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabelecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências líderes tipicamente dirigem a localização de uma proteína. Peptídeos sinal/sequências líder usados neste documento preferencialmente facilitam a secreção da proteína da célula na qual ela é produzida. Peptídeos sinal/sequências líderes são frequentemente clivados do restante da proteína, frequentemente referida como a proteína

18 / 101 madura, mediante a secreção da célula. Peptídeos sinal/sequências líderes estão ligados no N terminal da proteína.

[0061] “Condições de hibridização rigorosas”, tal como aqui utilizado, pode significar condições sob as quais uma primeira sequência de ácido nucleico (por exemplo, sonda) hibridizará para uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, alvo), tal como em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. As condições rigorosas são dependentes de sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Condições rigorosas podem ser selecionadas para serem de cerca de 5 a 10°C menores que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a um pH de intensidade iônica definido. A Tm pode ser a temperatura (intensidade iônica subdefinida, pH e concentração nucleica) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à sequência alvo em equilíbrio (pois as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). Condições rigorosas podem ser aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de íon de sódio, tal como uma concentração de cerca de 0,01-1,0 M de íons de sódio (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, cerca de 10- 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior que cerca de 50 nucleotídeos). Também podem ser alcançadas condições restritivas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser de pelo menos de 2 a 10 vezes de hibridização de fundo. Exemplos de condições de hibridização restritivas incluem o seguinte: formamida 50%, 5x SSC e SDS 1%, incubando a 42°C, ou 5x SSC, SDS 1%, incubando a 65°C, com lavagem em 0,2x SSC e SDS 0,1% a 65°C.

[0062] “Sujeito” e “paciente”, conforme aqui utilizados intercambiavelmente, se referem a qualquer vertebrado incluindo, mas não se limitando a, um mamífero (por exemplo, vaca, porco, camelo, lhama, cavalo,

19 / 101 cabra, coelho, ovelha, hamsters, porquinho-da-índia, gato, cachorro, rato e camundongo, um primata não humano (por exemplo, um macaco, tal como um macaco cinomolgo ou rhesus, chimpanzé, etc.) e um humano). Em algumas modalidades, o sujeito pode ser humano ou não humano. O sujeito ou paciente pode estar sofrendo outras formas de tratamento.

[0063] “Substancialmente complementar”, como aqui utilizado, pode significar que a primeira sequência é de pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridização restritivas.

[0064] “Substancialmente idêntico”, como aqui utilizado, pode significar que uma primeira e uma segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas através de uma região de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1.100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou em relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência for substancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.

[0065] “Anticorpo sintético”, conforme usado aqui, se refere a um anticorpo que é codificado pela sequência de ácido nucleico recombinante aqui descrita e é gerado em um sujeito.

[0066] “Tratamento” ou “tratar”, tal como aqui utilizado, pode significar proteger um sujeito de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença

20 / 101 envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito antes do início da doença. Suprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito após indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito após aparecimento clínico da doença.

[0067] “Variante”, tal como aqui utilizado com relação a um ácido nucleico pode significar (i) uma porção ou fragmento de uma sequência nucleotídica referenciada; (ii) o complemento de uma sequência nucleotídica referenciada ou porção da mesma; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico referenciado ou ao complemento do mesmo; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições restritivas com o ácido nucleico referenciado, complemento do mesmo ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma.

[0068] “Variante” em relação a um peptídeo ou polipeptídeo que difere em sequência de aminoácido pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica. Variante também pode significar uma proteína com uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácido que retém pelo menos uma atividade biológica. Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida na técnica como tipicamente envolvendo uma mudança menor. Estas mudanças menores podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga. É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos semelhantes podem ser substituídos e ainda reter a função proteica. Em um aspecto, os aminoácidos

21 / 101 tendo índices hidropáticos de ±2 são substituídos. A hidrofilia dos aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que mantêm a função biológica. Uma consideração da hidrofilia dos aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilia média local desse peptídeo, uma medida útil que foi relatada por se correlacionar bem com a antigenicidade e imunogenicidade. Patente U.S. 4.554.101, incorporada aqui integralmente por referência. A substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade semelhantes pode resultar em peptídeos que retêm a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica. As substituições podem ser realizadas com aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade dentro de ± 2 uma da outra. Tanto o índice de hidrofobicidade quanto o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistente com essa observação, as substituições de aminoácidos que são compatíveis com função biológica são compreendidas como dependerem da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais desses aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.

[0069] Uma variante pode ser uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene total ou um fragmento da mesma. A sequência de ácido nucleico pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento da mesma. Uma variante pode ser uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica através do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento da mesma. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica através do comprimento total

22 / 101 da sequência de aminoácido ou um fragmento da mesma.

[0070] “Vetor”, como aqui utilizado pode significar uma sequência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. Um vetor pode ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico de autorreplicação ou um vetor que se integra a um genoma hospedeiro.

[0071] Para a recitação de faixas numéricas neste documento, cada número interveniente entre as mesmas, com o mesmo grau de precisão, é contemplado explicitamente. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para a escala 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são contemplados explicitamente.

2. Composição

[0072] A presente invenção se refere a uma composição compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando um anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. A composição, quando administrada a um sujeito em necessidade da mesma, pode resultar na geração de um anticorpo sintético no sujeito. O anticorpo sintético pode ligar a uma molécula alvo (isto é, um antígeno) presente no sujeito. Essa ligação pode neutralizar o antígeno, bloquear reconhecimento do antígeno por outra molécula, por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico e elicitar ou induzir uma resposta imune ao antígeno.

[0073] Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo sintético. Em uma modalidade, a composição compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência nucleotídica codificando um primeiro anticorpo sintético e uma segunda sequência nucleotídica

23 / 101 codificando um segundo anticorpo sintético. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica codificando um domínio de clivagem.

[0074] Numa modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-vírus sincicial respiratório (anti-RSV).

[0075] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos otimizadas em códon codificando uma sequência de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6, ou um fragmento de uma sequência de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos otimizadas em códons codificando uma sequência de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO:7, ou um fragmento de uma sequência de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificando a sequência de aminoácido codificada por Uma de SEQ ID NOs: 1-6, ou um fragmento da sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Numa modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificando SEQ ID NO:7 ou um fragmento SEQ ID NO:7.

[0076] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de RNA transcrita de uma ou mais sequências de DNA codificando uma sequência de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6, ou um fragmento de uma sequência

24 / 101 de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA codificando uma sequência de aminoácido que é de pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO:7 ou a um fragmento de SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA codificando a sequência de aminoácido codificada por Uma de SEQ ID NOs: 1-6, ou um fragmento da sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA codificando uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:7 ou um fragmento de SEQ ID NO:7.

[0077] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos otimizadas em códons pelo menos 90% homólogas à SEQ ID NO: 1-6 ou um fragmento de uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO: 1-6. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos otimizada em códon conforme estabelecido em SEQ ID NO: 1-6 ou um fragmento de uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido em SEQ ID NO: 1 -6.

[0078] Em uma modalidade, a sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA pelo menos 90% homólogas à SEQ ID NO: 1-6 ou um fragmento de uma sequência de DNA pelo menos 90% homóloga a SEQ ID NO: 1-6. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica

25 / 101 codificando um anticorpo anti-RSV compreende uma ou mais sequências de RNA transcritas de uma ou mais sequências de DNA, conforme estabelecido em SEQ ID NO: 1-6, ou um fragmento de uma sequência de DNA, conforme estabelecido em SEQ ID NO: 1-6.

[0079] Numa modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica codificando uma cadeia pesada de RSV sintética. Numa modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica codificando uma cadeia leve de RSV sintética. Em uma modalidade, a composição compreende uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo de RSV sintético. Numa modalidade, a sequência codificando um anticorpo de RSV sintético compreende uma primeira sequência codificando uma cadeia pesada de RSV sintética e uma segunda sequência codificando uma cadeia leve de RSV sintética.

[0080] A composição da invenção pode tratar, prevenir e/ou proteger contra qualquer doença, distúrbio ou condição associada à infecção por vírus Sincicial Respiratório. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra infecção viral. Em certas modalidades, a composição pode tratar, prevenir e/ou proteger contra condições associadas à infecção por vírus Sincicial Respiratório.

[0081] A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito dentro de pelo menos cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas ou 60 horas de administração da composição ao sujeito. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito dentro de pelo menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias da administração da composição ao sujeito. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito dentro de cerca de 1 hora a cerca de 6 dias, cerca de 1 hora a cerca de 5 dias, cerca de

26 / 101 1 hora a cerca de 4 dias, cerca de 1 hora a cerca de 3 dias, cerca de 1 hora a cerca de 2 dias, cerca de 1 hora a cerca de 1 dia, cerca de 1 hora a cerca de 72 horas, cerca de 1 hora a cerca de 60 horas, cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, cerca de 1 hora a cerca de 36 horas, cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, cerca de 1 hora a cerca de 12 horas ou cerca de 1 hora a cerca de 6 horas de administração da composição ao sujeito.

[0082] A composição, quando administrada ao sujeito em necessidade da mesma, pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito mais rapidamente que a geração de um anticorpo endógeno em um sujeito ao qual é administrado um antígeno para induzir uma resposta imune humoral. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético pelo menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias antes da geração do anticorpo endógeno no sujeito ao qual foi administrado um antígeno para induzir uma resposta imune humoral.

[0083] A composição da presente invenção pode ter características necessárias para composições eficazes, tal como ser segura, de modo que a composição não cause doença ou morte; ser protetora contra doença; e proporcionar facilidade de administração, poucos efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por dose.

3. Sequência de Ácido Nucleico Recombinante

[0084] Como descrito anteriormente, a composição pode compreender uma sequência de ácido nucleico recombinante. A sequência de ácido nucleico recombinante pode codificar o anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo é descrito em mais detalhes abaixo.

[0085] A sequência de ácido nucleico recombinante pode ser uma sequência de ácido nucleico heteróloga. A sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos.

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[0086] A sequência de ácido nucleico recombinante pode ser uma sequência de ácido nucleico otimizada. Essa otimização pode aumentar ou alterar a imunogenicidade do anticorpo. A otimização também pode melhorar transcrição e/ou tradução. A otimização pode incluir um ou mais dos seguintes itens: sequência líder de baixo teor de GC para aumentar transcrição; estabilidade de mRNA e otimização de códon; adição de uma sequência kozak (por exemplo, GCC ACC) para elevada tradução; adição de uma sequência líder de imunoglobulina (Ig) codificando um peptídeo sinal; adição de uma sequência IRES interna e eliminação na medida do possível de motifs de sequência de cis ação (por exemplo, caixas TATA internas). Construto de Sequência de Ácido Nucleico Recombinante

[0087] A sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais construtos de sequência de ácido nucleico recombinante. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais componentes, que são descritos em mais detalhes aqui.

[0088] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um sítio de clivagem de protease ou peptidase. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). Um IRES pode ser ou um IRES viral ou um IRES eucariótico. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais

28 / 101 sequências líderes, nas quais cada sequência líder codifica um peptídeo sinal. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais promotores, um ou mais íntrons, uma ou mais regiões de terminação de transcrição, um ou mais códons de iniciação, um ou mais códons de terminação ou parada e/ou um ou mais sinais de poliadenilação. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir uma ou mais sequências de ligante ou tag. A sequência de tag pode codificar um tag de hemaglutinina (HA). (1) Polipeptídeo de Cadeia Pesada

[0089] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir o ácido nucleico heterólogo codificando o polipeptídeo de cadeia pesada, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região variável de cadeia pesada (VH) variável e/ou pelo menos uma região de cadeia pesada (CH) constante. A pelo menos uma região de cadeia pesada constante pode incluir uma região de cadeia pesada 1 (CH1) constante, uma região de cadeia pesada 2 (CH2) constante e uma região de cadeia pesada 3 (CH3) constante e/ou uma região de dobradiça.

[0090] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH e uma região CH1. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3.

[0091] O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VH. Prosseguindo do terminal N do polipeptídeo de cadeia pesada, essas CDRs são denotadas “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo de cadeia pesada podem contribuir para ligação ou reconhecimento do antígeno.

29 / 101 (2) Polipeptídeo de Cadeia Leve

[0092] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de cadeia leve variável (VL) e/ou uma região de cadeia leve constante (CL).

[0093] O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VL. Prosseguindo do terminal N do polipeptídeo de cadeia leve, essas CDRs são denotadas “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia leve podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno. (3) Sítio de Clivagem de Protease

[0094] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir sequência de ácido nucleico heteróloga codificando um sítio de clivagem de protease. O sítio de clivagem de protease pode ser reconhecido por uma protease ou peptidase. A protease pode ser uma endopeptidase ou endoprotease, por exemplo, mas não se limitando a furina, elastase, HtrA, calpaina, tripsina, quimotripsina, tripsina e pepsina. A protease pode ser furina. Em outras modalidades, a protease pode ser uma serina protease, uma treonina protease, cisteína protease, aspartato protease, metaloprotease, protease de ácido glutâmico ou qualquer protease que cliva uma ligação peptídica interna (isto é, não cliva a ligação de peptídeo no terminal N ou terminal C).

[0095] O sítio de clivagem da protease pode incluir uma ou mais sequências de aminoácidos que promovem ou aumentam a eficiência de clivagem. As uma ou mais sequências de aminoácidos podem promover ou

30 / 101 aumentar a eficiência da formação ou geração de polipeptídeos discretos. As uma ou mais sequências de aminoácidos podem incluir uma sequência peptídica 2A. (4) Sequência de Ligante

[0096] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais sequências de ligante. A sequência de ligante pode espacialmente separar ou ligar os um ou mais componentes aqui descritos. Em outras modalidades, a sequência de ligante pode codificar uma sequência de aminoácido que separa espacialmente ou liga dois ou mais polipeptídeos. (5) Promotor

[0097] O construto da sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais promotores. Os um ou mais promotores podem ser qualquer promotor que seja capaz de conduzir expressão de gene e regular expressão de gene. Esse promotor é um elemento de sequência de cis ação necessário para transcrição via uma RNA polimerase dependente de DNA. A seleção do promotor usado para dirigir expressão de gene depende da aplicação particular. O promotor pode ser posicionado aproximadamente na mesma distância do início de transcrição no construto de sequência de ácido nucleico recombinante, uma vez que é a partir do sítio de início de transcrição em seu cenário natural. No entanto, variação nessa distância pode ser acomodada sem perda da função de promotor.

[0098] O promotor pode estar operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico heteróloga codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve. O promotor pode ser um promotor que se mostrou eficaz para expressão em células eucarióticas. O promotor operavelmente ligado à sequência de codificação pode ser um promotor de CMV, um promotor do vírus símio 40 (SV40), tal como promotor precoce de SV40 e promotor tardio de SV40, um promotor de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), um promotor de vírus da imunodeficiência humana

31 / 101 (HIV), tal como o promotor de repetição de terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência bovina (BIV), um promotor de vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do citomegalovírus (CMV), tal como o promotor precoce de CMV, promotor do vírus Epstein Barr (EBV) ou um promotor do vírus do sarvoma de Rous (RSV). O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, tal como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, poliedrina humana ou metalotioneína humana.

[0099] O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor indutível, que inicia transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento particular. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele, natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na publicação de pedido de patente US 20040175727, cujo conteúdo é aqui incorporado na sua totalidade.

[00100] O promotor pode ser associado a um intensificador. O intensificador pode estar localizado a montante da sequência de codificação. O intensificador pode ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou um intensificador viral como um de CMV, FMDV, RSV ou EBV. Os intensificadores da função de polinucleotídeo são descritos nas Patentes US 5.593.972, 5.962.428 e WO94/016737, cujo conteúdo de cada qual está totalmente incorporado por referência. (6) Íntron

[00101] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais íntrons. Cada íntron pode incluir sítios funcionais doadores e aceptores de splice. O íntron pode incluir um intensificador de

32 / 101 splicing. O íntron pode incluir um ou mais sinais necessários para splicing eficiente. (7) Região de Terminação de Transcrição

[00102] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais regiões de terminação de transcrição. A região de terminação de transcrição pode estar a jusante da sequência de codificação para proporcionar terminação eficiente. A região de terminação de transcrição pode ser obtida do mesmo gene que o promotor descrito acima ou pode ser obtida de um ou mais genes diferentes. (8) Códon de Iniciação

[00103] O construto da sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais códons de iniciação. O códon de iniciação pode estar localizado a montante da sequência de codificação. O códon de iniciação pode estar in frame com a sequência de codificação. O códon de iniciação pode ser associado a um ou mais sinais necessários para o início eficiente da tradução, por exemplo, mas não limitado a, um sítio de ligação de ribossomo. (9) Códon de Terminação

[00104] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais códons de terminação ou parada. O códon de terminação pode estar a jusante da sequência de codificação. O códon de terminação pode estar in frame com a sequência de codificação. O códon de terminação pode ser associado a um ou mais sinais necessários para a terminação eficiente da tradução. (10) Sinal de Poliadenilação

[00105] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais sinais de poliadenilação. O sinal de poliadenilação pode incluir um ou mais sinais necessários para poliadenilação eficiente do transcrito. O sinal de poliadenilação pode ser posicionado a jusante da sequência de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de

33 / 101 poliadenilação SV40, sinal de poliadenilação LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGH), sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (hGH) ou sinal de poliadenilação de β-globina humana. O sinal de poliadenilação de SV40 pode ser um sinal de poliadenilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA). (11) Sequência Líder

[00106] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais sequências líderes. A sequência líder pode codificar um peptídeo sinal. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina (Ig), por exemplo, mas não limitado a, um peptídeo sinal de IgG e um peptídeo sinal de IgE. Arranjo do Construto de Sequência de Ácido Nucleico Recombinante

[00107] Como descrito acima, a sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais construtos de sequência de ácido nucleico recombinante, nos quais cada construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais componentes. Os um ou mais componentes são descritos em detalhes acima. Os um ou mais componentes, quando incluídos no construto de sequência de ácido nucleico recombinante, podem ser dispostos em qualquer ordem em relação um ao outro. Em algumas modalidades, os um ou mais componentes podem ser dispostos no construto de sequência de ácido nucleico recombinante, como descrito abaixo. (12) Arranjo 1

[00108] Em um arranjo, um primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir a sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir a sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por exemplo, em uma modalidade, a primeira sequência de ácido nucleico recombinante codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Numa modalidade, a segunda

34 / 101 sequência de ácido nucleico recombinante codifica um polipeptídeo de cadeia leve.

[00109] O primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode ser colocado em um vetor. O segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode ser colocado em um segundo vetor ou em um separado. A colocação do construto de sequência de ácido nucleico recombinante no vetor é descrita em mais detalhes abaixo.

[00110] O primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir o promotor, o íntron, a região de terminação de transcrição, o códon de iniciação, o códon de terminação e/ou o sinal de poliadenilação. O primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode ainda incluir a sequência líder, na qual a sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada. Por conseguinte, o peptídeo sinal codificado pela sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia pesada.

[00111] O segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir o promotor, o códon de iniciação, o códon de terminação e o sinal de poliadenilação. O segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode ainda incluir a sequência líder, na qual a sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o peptídeo sinal codificado pela sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo da cadeia leve.

[00112] Por conseguinte, um exemplo do arranjo 1 pode incluir o primeiro vetor (e, portanto, o primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CH1, e o segundo vetor (e, portanto, o segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante) que codifica o polipeptídeo de

35 / 101 cadeia leve que inclui VL e CL. Um segundo exemplo de arranjo 1 pode incluir o primeiro vetor (e, portanto, o primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante) que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada que inclui VH, CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3 e o segundo vetor (e, portanto, o segundo construto da sequência de ácidos nucleicos recombinante) que codifica o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL. (13) Arranjo 2

[00113] Em um segundo arranjo, o construto da sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. A sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada pode ser posicionada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Alternativamente, a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da cadeia leve pode ser posicionada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada.

[00114] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode ser colocado no vetor como descrito em mais detalhes abaixo.

[00115] O construto da sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o sítio de clivagem da protease e/ou a sequência de ligante. Se incluída no construto da sequência de ácido nucleico recombinante, a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o sítio de clivagem da protease pode ser posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o sítio de clivagem da protease permite a separação do polipeptídeo de cadeia pesada e do polipeptídeo de cadeia leve em polipeptídeos distintos mediante expressão. Em outras

36 / 101 modalidades, se a sequência de ligante for incluída no construto de sequência de ácido nucleico recombinante, a sequência de ligante pode ser posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00116] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir o promotor, o íntron, a região de terminação de transcrição, o códon de iniciação, o códon de terminação e/ou o sinal de poliadenilação. O construto da sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais promotores. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir dois promotores, de modo que um promotor possa ser associado à sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo promotor possa ser associado à sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Em ainda outras modalidades, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um promotor que está associado à sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00117] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode ainda incluir duas sequências líderes, nas quais uma primeira sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e uma segunda sequência líder está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, um primeiro peptídeo sinal codificado pela primeira sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo peptídeo sinal codificado pela segunda sequência líder pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia leve.

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[00118] Por conseguinte, um exemplo do arranjo 2 pode incluir o vetor (e, portanto, a sequência de sequência de ácido nucleico recombinante) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CH1, e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, no qual a sequência de ligação está posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00119] Um segundo exemplo de arranjo de 2 pode incluir o vetor (e, portanto, o construto da sequência de ácido nucleico recombinante) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CH1 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, no qual a sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o local de clivagem da protease está posicionado entre a sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00120] Um terceiro exemplo de arranjo 2 pode incluir o vetor (e, portanto, a sequência de sequência de ácidos nucleicos recombinante) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, em que a sequência ligante está posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

[00121] Um quarto exemplo do arranjo de 2 pode incluir o vetor (e, portanto, a sequência de sequência de ácido nucleico recombinante) que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3, e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, no qual a sequência de ligação está posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de cadeia leve.

38 / 101 (14) Arranjo de ScFv

[00122] Em um arranjo de ScFv, a sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma sequência codificando o domínio VH do polipeptídeo de cadeia pesada e o domínio VL do polipeptídeo de cadeia leve e, opcionalmente, ainda mais uma sequência de ligante posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica o domínio VH e domínio VL.

[00123] Um exemplo de um arranjo de ScFv pode incluir o vetor (e, assim, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante) codificando a VH, o ligante, a VL, a região de dobradiça, CH2 e CH3. A região VH pode ser ligada N terminalmente ou C terminalmente a uma região VL via um lingante. Expressão do Construto de Sequência de Ácido Nucleico Recombinante

[00124] Como descrito anteriormente, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir, dentre os um ou mais componentes, a sequência de ácido nucleico heteróloga codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou a sequência de ácido nucleico heteróloga codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve.

[00125] Quando o arranjo 1, como descrito anteriormente, é utilizado, o primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia leve. Quando o arranjo 2, como descrito anteriormente, é utilizado, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e do polipeptídeo de cadeia leve.

[00126] Mediante expressão, por exemplo, mas sem limitação, em uma

39 / 101 célula, um organismo ou um mamífero, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem se reunir no anticorpo sintético. Em particular, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que o conjunto resulte no anticorpo sintético sendo capaz de ligar ao antígeno. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que o conjunto resulte no anticorpo sintético sendo mais imunogênico em comparação com um anticorpo não montado como descrito aqui. Ainda em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir um com o outro, de modo que o conjunto resulte no anticorpo sintético sendo capaz de elicitar ou induzir uma resposta imune contra o antígeno. Vetor

[00127] O construto da sequência de ácido nucleico recombinante descrito acima pode ser colocado em um ou mais vetores. Os um ou mais vetores podem conter uma origem de replicação. Os um ou mais vetores podem ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Os um ou mais vetores podem ser um vetor extracromossômico de autorreplicação ou um vetor que se integra em um genoma de hospedeiro.

[00128] Os vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombinantes, qualquer forma de vetor de “DNA nu” recombinante e semelhantes. Um “vetor” compreende um ácido nucleico que pode infectar, transfectar, transduzir transientemente ou permanentemente uma célula. Será reconhecido que um vetor pode ser um ácido nucleico nu, ou um ácido nucleico complexado com proteína ou lipídeo. O vetor opcionalmente compreende ácidos nucleicos virais ou bacterianos e/ou proteínas e/ou membranas (por exemplo, uma membrana celular, um envelope lipídico viral, etc.). Vetores incluem, mas não estão limitados a,

40 / 101 replicons (por exemplo, replicons de RNA, bacteriófagos) aos quais fragmentos de DNA podem ser fixados e ficar replicados. Vetores incluem assim, mas não estão limitados a, RNA, DNA ou RNA circular ou linear de autorreplicação autônomo (por exemplo, plasmídeos, vírus e semelhantes, ver, por exemplo, Patente US 5.217.879) e incluem ambos os plasmídeos de expressão e não expressão. Em algumas modalidades, o vetor inclui DNA linear, DNA enzimático ou DNA sintético. Quando um microrganismo recombinante ou uma cultura de células é descrita como hospedando um “vetor de expressão”, isso inclui ambos DNA circular e linear extracromossômico e DNA que foi incorporado no(s) cromossomo(s) hospedeiro(s). Quando um vetor está sendo mantido por uma célula hospedeira, o vetor pode ser replicado de forma estável pelas células durante mitose como uma estrutura autônoma ou é incorporado ao genoma do hospedeiro.

[00129] Os um ou mais vetores podem ser um construto de expressão heterólogo, que geralmente é um plasmídeo que é usado para introduzir um gene específico em uma célula alvo. Uma vez que o vetor de expressão está dentro da célula, o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve que é codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante é produzido peloscomplexos ribossômicos de maquinário de transcrição e traduçãocelular. Os um ou mais vetores podem expressar grandes quantidades de RNA mensageiroestável e, portanto, proteínas. (15) Vetor de Expressão

[00130] Os um ou mais vetores podem ser um plasmídeo circular ou um ácido nucleico linear. O plasmídeo circular e o ácido nucleico linear são capazes de dirigir a expressão de uma sequência de nucleotídeo particular em uma célula de sujeito apropriada. Os um ou mais vetores compreendendo o construto de sequência de ácido nucleico recombinante podem ser quiméricos, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo em

41 / 101 relação a pelo menos um de seus outros componentes. (16) Plasmídeo

[00131] Os um ou mais vetores podem ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfectar células com o construto de sequência de ácido nucleico recombinante. O plasmídeo pode ser útil para introduzir o construto de sequência de ácido nucleico recombinante no sujeito. O plasmídeo também pode compreender uma sequência reguladora, que pode ser bem adequada para expressão de gene em uma célula na qual o plasmídeo é administrado.

[00132] O plasmídeo também pode compreender uma origem de replicação de mamífero, a fim de manter o plasmídeo extracromossomicamente e produzir múltiplas cópias do plasmídeo em uma célula. O plasmídeo pode ser pVAX1, pCEP4 ou pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein- Barr e a região de codificação de EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir alta replicação epissômica de cópia sem integração. A espinha dorsal do plasmídeo pode ser pAV0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus do tipo 5 (Ad5) defeituoso de replicação.

[00133] O plasmídeo pode ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser usado para a produção de proteína em Escherichia coli (E.coli). O plasmídeo também pode ser pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser utilizado para produção de proteína em cepas de levedura de Saccharomyces cerevisiae O plasmídeo também pode ser o sistema de expressão de baculovírus completo MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para produção de proteína em células de insetos. O plasmídeo também pode ser pcDNAI ou pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para produção de proteína em células de mamíferos, tal como células de ovário de hamster chinês (CHO). (17) RNA

[00134] Em uma modalidade, o ácido nucleico é uma molécula de

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RNA.

Em uma modalidade, a molécula de RNA é transcrita de uma sequência de DNA aqui descrita.

Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de RNA é codificada por uma sequência de DNA pelo menos 90% homóloga a uma de SEQ ID NO: 1-6 ou um fragmento de uma sequência de DNA pelo menos 90% homóloga a uma de SEQ ID NO: 1-6. Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeo compreende uma sequência de RNA transcrita por uma sequência de DNA codificando uma sequência de polipeptídeo pelo menos 90% homóloga a uma das sequências de aminoácidos codificadas por uma de SEQ ID NOs: 1-6, um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6, ou uma variante da mesma ou um fragmento da mesma.

Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeo compreende uma sequência de RNA transcrita por uma sequência de DNA codificando uma sequência de polipeptídeo pelo menos 90% homóloga a SEQ ID NO:7, um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga a SEQ ID NO:7, ou uma variante da mesma ou um fragmento da mesma.

Por conseguinte, em uma modalidade, a invenção fornece uma molécula de RNA codificando um ou mais de MAbs ou DMAbs.

O RNA pode ser de fita positiva.

Por conseguinte, em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser traduzida por células sem a necessidade de nenhuma etapa de replicação intermediária, como a transcrição reversa.

Uma molécula de RNA útil com a invenção pode ter um capeamento 5' (por exemplo, uma 7-metilguanosina). Este capeamento pode melhorar a tradução in vivo do RNA.

O nucleotídeo 5' de uma molécula de RNA útil com a invenção pode ter um grupo trifosfato 5'. Em um RNA limitado, isso pode estar ligado a uma 7-metilguanosina por meio de uma ponte 5' a 5'. Uma molécula de RNA pode ter uma cauda de poli-A 3'. Ela também pode incluir uma sequência de reconhecimento de polimerase de poli-A (por exemplo, AAUAAA) próxima à sua extremidade 3'. Uma molécula de RNA útil com a invenção pode ser de fita simples.

Uma molécula

43 / 101 de RNA útil com a invenção pode compreender RNA sintético. Em algumas modalidades, a molécula de RNA é uma molécula de RNA nua. Em uma modalidade, a molécula de RNA está compreendida dentro de um vetor.

[00135] Em uma modalidade, o RNA tem UTRs 5' e 3'. Em uma modalidade, a UTR 5' tem entre zero e 3.000 nucleotídeos de comprimento. O comprimento das sequências UTR 5' e 3' a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterado por métodos diferentes incluindo, mas não limitados a, projetar iniciadores para PCR que emparelham com diferentes regiões das UTRs. Utilizando essa abordagem, um versado na técnica pode modificar os comprimentos de UTR 5' e 3' necessários para alcançar a eficiência ideal de tradução após transfecção do RNA transcrito.

[00136] As UTRs 5' e 3' podem ser as UTRs 5' e 3' endógenas ocorrendo naturalmente para o gene de interesse. Alternativamente, sequências de UTR que não são endógenas ao gene de interesse podem ser adicionadas incorporando as sequências de UTR nos iniciadores diretos e reversos ou por quaisquer outras modificações do modelo. O uso de sequências UTR que não são endógenas ao gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficiência de tradução do RNA. Por exemplo, sabe-se que elementos ricos em AU nas sequências de UTR 3' podem diminuir a estabilidade do RNA. Portanto, UTRs 3' podem ser selecionadas ou projetadas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base em propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.

[00137] Em uma modalidade, a UTR 5' pode conter a sequência de Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando uma UTR 5' que não é endógena ao gene de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito anteriormente, uma sequência de consenso de Kozak pode ser reprojetada adicionando a sequência de UTR 5'. As sequências de Kozak podem aumentar a eficiência de tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parecem ser necessárias para todos os RNAs para permitir tradução eficiente. O requisito

44 / 101 para sequências de Kozak para muitos RNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades, a UTR 5' pode ser derivada de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeo podem ser usados na UTR 3' ou 5' para impedir degradação por exonuclease do RNA.

[00138] Em uma modalidade, o RNA tem um cap na extremidade 5' e uma cauda de poli(A) 3' que determina ligação de ribossomo, início de tradução e estabilidade de RNA na célula.

[00139] Em uma modalidade, o RNA é um RNA modificado por nucleosídeo. O RNA modificado por nucleosídeo tem vantagens particulares sobre o RNA não modificado incluindo, por exemplo, estabilidade aumentada, imunogenicidade inata baixa ou ausente e tradução intensificada. (18) Vetor Circular e Linear

[00140] Os um ou mais vetores podem ser circulares, o que pode transformar uma célula alvo por integração no genoma celular ou existir extracromossomicamente (por exemplo, plasmídeo de replicação autônomo com uma origem de replicação). O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0 ou provax, ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante.

[00141] Também é aqui fornecido um ácido nucleico linear, ou cassete de expressão linear (“LEC”), que é capaz de ser entregue eficientemente a um sujeito por eletroporação e expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto da sequência de ácido nucleico recombinante. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer espinha dorsal de fosfato. O LEC não pode conter nenhum gene de resistência a antibióticos e/ou um espinha dorsal de fosfato. O LEC pode não conter outras sequências de ácidos nucleicos não relacionadas à expressão de gene desejada.

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[00142] O LEC pode ser derivado de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante. O plasmídeo pode ser pNP (Puerto Rico/34) ou pM2 (New Caledonia/99). O plasmídeo pode ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0 ou provax, ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante.

[00143] O LEC pode ser pcrM2. O LEC pode ser pcrNP. O pcrNP e o pcrMR podem ser derivados de pNP (Puerto Rico/34) e pM2 (New Caledonia/99), respectivamente. (19) Vetores Virais

[00144] Em uma modalidade, os vetores virais são aqui fornecidos, os quais são capazes de fornecer um ácido nucleico da invenção a uma célula. O vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia do vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001), e em Ausubel et al. (1997) e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores, incluem, entre outros, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios convenientes de endonucleases de restrição e um ou mais marcadores selecionáveis. (Ver, por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Patente US 6.326.193). Os vetores virais, e especialmente os vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserir genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do herpes simplex I, adenovírus e vírus adenoassociados, e semelhantes. Por exemplo, ver Patentes US

5.350.674 e 5.585.362.

46 / 101 (20) Método para Preparar o Vetor

[00145] É aqui fornecido um método para preparar os um ou mais vetores nos quais o construto de sequência de ácido nucleico recombinante foi colocado. Após a etapa final de subclonagem, o vetor pode ser usado para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação de grande escala, usando métodos conhecidos na técnica.

[00146] Em outras modalidades, após a etapa final de subclonagem, o vetor pode ser usado com um ou mais dispositivos de eletroporação (EP). Os dispositivos EP são descritos abaixo com mais detalhes.

[00147] Os um ou mais vetores podem ser formulados ou fabricados usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas preferivelmente eles são fabricados usando uma técnica de fabricação de plasmídeo que é descrita num pedido provisório US copendente licenciado 60/939.792, que foi depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os plasmídeos de DNA aqui descritos podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além daqueles descritos em US 60/939792, incluindo aqueles descritos em uma patente licenciada, Patente US 7.238.522, expedida em 3 de julho de 2007. O pedido e a patente referenciados acima, US 60/939.792 e a Patente US 7.238.522, respectivamente, são incorporados por meio deste em sua totalidade.

4. Anticorpo

[00148] Como descrito acima, a sequência de ácido nucleico recombinante pode codificar o anticorpo, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo pode ligar ou reagir com o antígeno, o que é descrito em mais detalhes abaixo.

[00149] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”) de cadeia pesada e cadeia

47 / 101 leve, interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pesada e uma framework de cadeia leve (“FR”) que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00150] A enzima proteolítica papaína cliva preferivelmente as moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) compreendem cada qual um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab')2, que compreende os dois sítios de ligação ao antígeno. Por conseguinte, o anticorpo pode ser o Fab ou F(ab’)2. O Fab pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada do Fab pode incluir a região VH e a região CH1. A cadeia leve do Fab pode incluir a região VL e a região CL.

[00151] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode incluir uma região VL e uma região CL.

[00152] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo amadurecido por afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humanizado

48 / 101 pode ser um anticorpo de uma espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana.

[00153] O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico, como descrito abaixo em mais detalhes. O anticorpo pode ser um anticorpo bifuncional, como também descrito abaixo em mais detalhes.

[00154] Como descrito anteriormente, o anticorpo pode ser gerado no sujeito após a administração da composição ao sujeito. O anticorpo pode ter uma meia vida dentro do sujeito. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser modificado para prolongar ou reduzir sua meia vida dentro do sujeito. Tais modificações são descritas abaixo em mais detalhes.

[00155] O anticorpo pode ser desfucosilado como descrito em mais detalhes abaixo.

[00156] O anticorpo pode ser modificado para reduzir ou impedir intensificação dependente de anticorpo (ADE) da doença associada ao antígeno, conforme descrito em mais detalhes abaixo. Anticorpo de ScFv

[00157] Numa modalidade, o DMAb da invenção é um DMAb de ScFv. Numa modalidade, DMAb de ScFv se refere a um fragmento Fab sem as regiões CH1 e CL. Assim, em uma modalidade, o DMAb de ScFv se refere a um DMAb de fragmento Fab compreendendo a VH e VL. Numa modalidade, o DMAb de ScFv compreende um ligante entre VH e VL. Numa modalidade, o DMAb de ScFvé um DMAb de ScFv-Fc. Em uma modalidade, o DMAb de ScFv-Fc compreende as regiões VH, VL e CH2 e CH3. Numa modalidade, o DMAb de ScFv-Fc compreende um ligante entre VH e VL. Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem expressão, estabilidade, meia vida, ligação a antígeno, emparelhamento de cadeia pesada - cadeia leve, penetração de tecido modificadas ou uma combinação dos mesmos em

49 / 101 comparação com um DMAb parental.

[00158] Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 6,5 vezes, em pelo menos 7 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 9,5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou maior que 50 vezes expressão mais alta que o DMAb parental.

[00159] Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 6,5 vezes, em pelo menos 7 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 9,5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou maior que 50 vezes ligação ao antígeno mais alta que o DMAb parental.

[00160] Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4

50 / 101 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 6,5 vezes, em pelo menos 7 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 9,5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou maior que 50 vezes meia vida mais longa que o DMAb parental.

[00161] Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 6,5 vezes, em pelo menos 7 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 9,5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou maior que 50 vezes estabilidade mais alta que o DMAb parental.

[00162] Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes,

51 / 101 pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 6,5 vezes, em pelo menos 7 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 9,5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou maior que 50 vezes penetração de tecido maior que o DMAb parental.

[00163] Em uma modalidade, o DMAb de ScFv da invenção tem pelo menos 1,1 vezes, pelo menos 1,2 vezes, pelo menos 1,3 vezes, pelo menos 1,4 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,6 vezes, pelo menos 1,7 vezes, pelo menos 1,8 vezes, pelo menos 1,9 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,1 vezes, pelo menos 2,2 vezes, pelo menos 2,3 vezes, pelo menos 2,4 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 2,6 vezes, pelo menos 2,7 vezes, pelo menos 2,8 vezes, pelo menos 2,9 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 5,5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 6,5 vezes, em pelo menos 7 vezes, pelo menos 7,5 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 8,5 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 9,5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes ou maior que 50 vezes emparelhamento cadeia pesada - cadeia leve maior que o DMAb parental. Anticorpo Biespecífico

[00164] A sequência de ácidos nucleicos recombinante pode codificar o anticorpo biespecífico, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo biespecífico pode ligar ou reagir com dois antígenos, por exemplo, dois dos antígenos descritos abaixo em mais detalhes. O anticorpo biespecífico pode ser compreendido por fragmentos de dois dos anticorpos aqui descritos, desse modo permitindo que

52 / 101 o anticorpo biespecífico ligue ou reaja com duas moléculas alvo desejadas, que podem incluir o antígeno, que é descrito abaixo em mais detalhes, um ligante, incluindo um ligante para um receptor, um receptor, incluindo um sítio de ligação ao ligante no receptor, um complexo ligante-receptor e um marcador.

[00165] A invenção fornece novos anticorpos biespecíficos compreendendo um primeiro sítio de ligação ao antígeno que liga especificamente a um primeiro alvo e um segundo sítio de ligação ao antígeno que liga especificamente a um segundo alvo, com propriedades particularmente vantajosas, tal como produtividade, estabilidade, afinidade de ligação, atividade biológica , direcionamento específico de certas células T, direcionamento de eficiência e toxicidade reduzida. Em alguns casos, existem anticorpos biespecíficos, em que o anticorpo biespecífico liga ao primeiro alvo com alta afinidade e ao segundo alvo com baixa afinidade. Em outros casos, existem anticorpos biespecíficos, em que o anticorpo biespecífico liga ao primeiro alvo com baixa afinidade e ao segundo alvo com alta afinidade. Em outros casos, existem anticorpos biespecíficos, em que o anticorpo biespecífico liga ao primeiro alvo com uma afinidade desejada e ao segundo alvo com uma afinidade desejada.

[00166] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é um anticorpo bivalente compreendendo a) uma primeira cadeia leve e uma primeira cadeia pesada de um anticorpo ligando especificamente a um primeiro antígeno e b) uma segunda cadeia leve e uma segunda cadeia pesada de um anticorpo ligando especificamente a um segundo antígeno.

[00167] Uma molécula de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ter dois sítios de ligação de qualquer especificidade desejada. Em algumas modalidades, um dos sítios de ligação é capaz de um antígeno de RSV. Em algumas modalidades, o sítio de ligação incluído no fragmento Fab é um sítio de ligação específico para um antígeno de RSV. Em algumas

53 / 101 modalidades, o sítio de ligação incluído no fragmento Fv de cadeia simples é um sítio de ligação específico para um antígeno de RSV, tal como um antígeno de capsídeo de RSV ou um antígeno envelope de RSV, por exemplo RSV-F, RSV-G, RSV-Ga, RSV -Gb, RSV-M2-1 ou RSV M2-2.

[00168] Em algumas modalidades, um dos sítios de ligação de uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção é capaz de ligar uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (célula NK). Um receptor específico de célula T é o chamado “receptor de célula T” (TCRs), que permite que uma célula T ligue e, se sinais adicionais estiverem presentes, seja ativada e responda a um epítopo/antígeno apresentado por outro chamada célula apresentadora de antígeno ou APC. Sabe-se que o receptor de célula T lembra um fragmento Fab de uma imunoglobulina ocorrendo naturalmente. Ele é geralmente monovalente, abrangendo cadeias .alfa.- e .beta., em algumas modalidades, ele engloba cadeias .gama.e cadeias .delta. (supra). Por conseguinte, em algumas modalidades, o TCR é TCR (alfa/beta) e em algumas modalidades, ele é TCR (gama/delta). O receptor de célula T forma um complexo com o correceptor de célula T CD3. CD3 é um complexo de proteína e é composto por quatro cadeias distintas. Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3γ, uma cadeia CD36 e duas cadeias CD3E. Essas cadeias se associam a uma molécula conhecida como o receptor de célula T (TCR) e a cadeia ζ para gerar um sinal de ativação em linfócitos T. Daí, em algumas modalidades, um receptor específico de célula T é o correceptor de célula T CD3. Em algumas modalidades, um receptor específico de célula T é CD28, uma proteína que também é expressa em células T. CD28 pode fornecer sinais coestimuladores, que são necessários para ativação de célula T. CD28 desempenha papéis importantes em proliferação e sobrevivência de célula T, produção de citocina e desenvolvimento tipo 2 de T-helper. Ainda um exemplo adicional de um

54 / 101 receptor específico de célula T é CD134, também denominado Ox40. CD134/OX40 está sendo expresso após 24 a 72 horas após ativação e pode ser assumido como definindo uma molécula coestimulatória secundária. Outro exemplo de um receptor de célula T é 4-1 BB capaz de ligar a Ligante BB 4-1 em células apresentadoras de antígeno (APCs), pelo que é gerado um sinal coestimulador para a célula T. Outro exemplo de um receptor encontrado predominantemente em células T é CD5, que também é encontrado em células B em níveis baixos. Um exemplo adicional de um receptor modificando funções de célula T é CD95, também conhecido como receptor Fas, que medeia sinalização apoptótica por ligando Fas expresso na superfície de outras células. Foi relatado que CD95 modula vias de sinalização acionadas por TCR/CD3 em linfócitos T em repouso.

[00169] Um exemplo de uma molécula receptora específica de célula NK é CD16, um receptor Fc de baixa afinidade e NKG2D. Um exemplo de uma molécula receptora que está presente na superfície de ambas células T e células natural killer (NK) é CD2 e outros membros da superfamília CD2. CD2 é capaz de agir como uma molécula coestimuladora em células T e NK.

[00170] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação da molécula de anticorpo liga um antígeno de RSV e o segundo sítio de ligação liga uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (NK).

[00171] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação da molécula de anticorpo liga um de antígeno de RSV selecionado de RSV-F, RSV-G, RSV-Ga, RSV-Gb, RSV-M2-1 ou RSV M2-2 ou de uma poliproteína compreendendo qualquer combinação dos mesmos, e o segundo sítio de ligação liga uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (NK). Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação da molécula de anticorpo liga a um antígeno de RSV e o segundo sítio de ligação liga um de CD3, do receptor de célula T (TCR),

55 / 101 CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95.

[00172] Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação da molécula de anticorpo liga uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (NK) e o segundo sítio de ligação liga um antígeno de RSV. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação do anticorpo liga uma molécula receptora específica de célula T e/ou uma molécula receptora específica de célula natural killer (NK) e o segundo sítio de ligação liga um de RSV-F, RSV-G, RSV-Ga , RSV-Gb, RSV-M2-1 ou RSV M2-2, ou uma poliproteína compreendendo qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação do anticorpo liga um de CD3, do receptor de célula T (TCR), CD28, CD16, NKG2D, Ox40, 4-1BB, CD2, CD5 e CD95 e o segundo sítio de ligação liga um antígeno de RSV. Anticorpo Bifuncional

[00173] A sequência de ácidos nucleicos recombinante pode codificar o anticorpo bifuncional, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo bifuncional pode ligar ou reagir com o antígeno descrito abaixo. O anticorpo bifuncional também pode ser modificado para conferir uma funcionalidade adicional ao anticorpo, além do reconhecimento e ligação ao antígeno. Essa modificação pode incluir, mas não está limitada a, o acoplamento ao fator H ou um fragmento do mesmo. O fator H é um regulador solúvel da ativação do complemento e, portanto, pode contribuir para uma resposta imune por meio da lise mediada por complemento (CML). Extensão de Meia Vida de Anticorpo

[00174] Como descrito anteriormente, o anticorpo pode ser modificado para prolongar ou reduzir a meia vida do anticorpo no sujeito. A modificação pode prolongar ou encurtar a meia vida do anticorpo no soro do sujeito.

[00175] A modificação pode estar presente em uma região constante do

56 / 101 anticorpo. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região constante do anticorpo que prolonga a meia vida do anticorpo em comparação com a meia-vida de um anticorpo que não contém as uma ou mais substituições de aminoácidos. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos no domínio CH2 do anticorpo que prolongam a meia vida do anticorpo em comparação com a meia vida de um anticorpo que não contém as uma ou mais substituições de aminoácidos.

[00176] Em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante podem incluir a substituição de um resíduo de metionina na região constante por um resíduo de tirosina, um resíduo de serina na região constante por um resíduo de treonina, um resíduo de treonina na região constante com um resíduo de glutamato, ou qualquer combinação dos mesmos, prolongando assim a meia vida do anticorpo.

[00177] Em outras modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante podem incluir a substituição de um resíduo de metionina no domínio CH2 por um resíduo de tirosina, um resíduo de serina no domínio CH2 por um resíduo de treonina, um resíduo de treonina no domínio CH2 com um resíduo de glutamato, ou qualquer combinação dos mesmos, prolongando assim a meia vida do anticorpo. Defucosilação

[00178] A sequência de ácido nucleico recombinante pode codificar um anticorpo que não é fucosilado (isto é, um anticorpo desfucosilado ou um anticorpo não fucosilado), um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. A fucosilação inclui a adição de fucose de açúcar a uma molécula, por exemplo, a ligação de fucose a N-glicanos, O- glicanos e glicolipídeos. Consequentemente, em um anticorpo defucosilado, a fucose não está fixada às cadeias de carboidratos da região constante. Por sua vez, esta falta de fucosilação pode melhorar a ligação a FcγRIIIa e a atividade citotóxica celular direcionada por anticorpo (ADCC) pelo anticorpo em

57 / 101 comparação com o anticorpo fucosilado. Portanto, em algumas modalidades, o anticorpo não fucosilado pode exibir atividade aumentada de ADCC em comparação com o anticorpo fucosilado.

[00179] O anticorpo pode ser modificado de modo a impedir ou inibir a fucosilação do anticorpo. Em algumas modalidades, esse anticorpo modificado pode exibir atividade ADCC aumentada em comparação com o anticorpo não modificado. A modificação pode estar na cadeia pesada, cadeia leve ou uma combinação das mesmas. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia pesada, uma ou mais substituições de aminoácidos na cadeia leve ou uma combinação das mesmas. Resposta de ADE reduzida

[00180] O anticorpo pode ser modificado para reduzir ou impedir intensificação dependente de anticorpo (ADE) da doença associada ao antígeno, mas ainda assim neutralizar o antígeno.

[00181] Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser modificado para incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem ou impedem a ligação do anticorpo a FcγR1a. As uma ou mais substituições de aminoácidos podem estar na região constante do anticorpo. As uma ou mais substituições de aminoácidos podem incluir a substituição de um resíduo de leucina por um resíduo de alanina na região constante do anticorpo, isto é, também conhecido aqui como LA, mutação LA ou substituição LA. As uma ou mais substituições de aminoácidos podem incluir a substituição de dois resíduos de leucina, cada um com um resíduo de alanina, na região constante do anticorpo e também aqui conhecida como LALA, mutação LALA ou substituição LALA. A presença das substituições de LALA pode impedir ou bloquear a ligação do anticorpo a FcγR1a e, assim, o anticorpo modificado não melhora ou causa ADE da doença associada ao antígeno, mas ainda neutraliza o antígeno. Anticorpos Monoclonais

58 / 101

[00182] Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos anti-RSV. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais intactos e fragmentos imunologicamente ativos (por exemplo, um fragmento Fab ou (Fab)2 ), uma cadeia pesada de anticorpo monoclonal ou uma cadeia leve de anticorpo monoclonal.

[00183] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade (“CDR”) de cadeia pesada e cadeia leve, interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pesada e uma framework de cadeia leve (“FR”) que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como “CDR1”, “CDR2” e “CDR3”, respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00184] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode incluir uma região VL e uma região CL.

[00185] Em uma modalidade, o anticorpo anti-RSV compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6 ou um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade, o anticorpo anti-RSV compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO;7 ou um fragmento de uma sequência de

59 / 101 aminoácido pelo menos 90% homóloga à SEQ ID NO:7. Em uma modalidade, o anticorpo anti-RSV compreende a sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6, ou um fragmento da sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em uma modalidade, o anticorpo anti-RSV compreende a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO:7, ou um fragmento da sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO:7.

5. Antígeno

[00186] O anticorpo sintético é direcionado para o antígeno ou fragmento ou variante do mesmo. O antígeno pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoácido, um polissacarídeo ou uma combinação dos mesmos. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. A sequência de aminoácido pode ser uma proteína, um peptídeo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O polissacarídeo pode ser um polissacarídeo codificado por ácido nucleico.

[00187] O antígeno pode ser de um vírus. O antígeno pode estar associado à infecção viral. Numa modalidade, o antígeno pode ser associado à infecção por vírus Sincicial Respiratório. Numa modalidade, o antígeno pode ser uma glicoproteína de RSV ou proteína estrutural de RSV. Numa modalidade, o antígeno de RSV pode ser RSV-F, RSV-G, RSV-Ga, RSV-Gb, RSV-M2-1 ou RSV M2-2.

[00188] Numa modalidade, o antígeno pode ser um fragmento de uma proteína de RSV. Numa modalidade, o antígeno pode ser um fragmento de uma glicoproteína de RSV ou proteína estrutural de RSV.

[00189] Numa modalidade, um anticorpo sintético da invenção tem como alvo dois ou mais antígenos. Em uma modalidade, pelo menos um antígeno de um anticorpo biespecífico é selecionado dos antígenos aqui

60 / 101 descritos. Numa modalidade, os dois ou mais antígenos são selecionados a partir dos antígenos aqui descritos. Antígenos Virais

[00190] O antígeno viral pode ser um antígeno viral ou fragmento ou variante do mesmo. O vírus pode ser um vírus causador de doença. O vírus pode ser um vírus Sincicial Respiratório.

[00191] O antígeno pode ser um antígeno de RSV, ou fragmento do mesmo, ou variante do mesmo. O antígeno de RSV pode ser de um fator que permita ao vírus replicar, infectar ou sobreviver. Fatores que permitem ao RSV replicar ou sobreviver incluem, mas não estão limitados a, proteínas estruturais e proteínas não estruturais. Essa proteína pode ser uma glicoproteína, proteína estrutural ou proteína não estrutural. Em uma modalidade, o antígeno de RSV pode incluir RSV-G, RSV-F, RSV-SH, RSV- N, RSV-P, RSV-M e RSV-L.

6. Excipientes e Outros Componentes da Composição

[00192] A composição pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. O transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser de moléculas funcionais, tal como veículos, transportadores, ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, tal como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos de quinona, vesículas, tal como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico, lipídeos, lipossomas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos.

[00193] O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. O agente facilitador da transfecção é poli-L-glutamato e poli-L-glutamato pode estar presente na

61 / 101 composição a uma concentração inferior a 6 mg/ml. O agente facilitador de transfecção também pode incluir agentes ativos de superfície, tal como os complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freunds, análogos de LPS incluindo o lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos da quinona e vesículas, tal como esqualeno e esqualeno e ácido hialurônico pode ser administrado em conjunto com a composição. A composição também pode incluir um agente facilitador de transfecção, tal como lipídeos, lipossomos, incluindo lipossomos de lecitina ou outros lipossomos conhecidos na técnica, como uma mistura DNA-lipossomo (ver, por exemplo, W09324640), íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions ou nanopartículas ou outros agentes facilitadores da transfecção conhecidos. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. A concentração do agente de transfecção na vacina é de menos de 4 mg/ml, menos de 2 mg/ml, menos de 1 mg/ml, menos de 0,750 mg/ml, menos de 0,500 mg/ml, menos de 0,250 mg/ml, menos de 0,100 mg/ml, menos de 0,050 mg/ml, ou menos de 0,010 mg/ml.

[00194] A composição pode ainda compreender um agente facilitador genético como descrito em US 021.579, depositado em 1 de abril de 1994, o qual é totalmente incorporado por referência.

[00195] A composição pode compreender DNA em quantidades de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou preferivelmente cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou mais preferivelmente cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas. Em algumas modalidades preferidas, a composição de acordo com a presente invenção compreende cerca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 0,1 a

62 / 101 cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a composição pode conter cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas, de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; de cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 1 miligrama a 2 miligramas, de cerca de 5 nanogramas a cerca de

1.000 microgramas, de cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas, de cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas, de cerca de 1 a cerca de 350 microgramas, de cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas de DNA.

[00196] A composição pode ser formulada de acordo com o modo de administração a ser utilizado. Uma composição farmacêutica injetável pode ser estéril, livre de pirogênio e livre de partículas. Uma formulação ou solução isotônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A composição pode compreender um agente de vasoconstrição. As soluções isotônicas podem incluir solução salina tamponada com fosfato. A composição pode ainda compreender estabilizantes, incluindo gelatina e albumina. Os estabilizantes podem permitir que a formulação seja estável à temperatura da sala ou ambiente por longos períodos de tempo, incluindo LGS ou policátions ou poliânions.

7. Método para Gerar o Anticorpo Sintético

[00197] A presente invenção também se refere a um método para gerar o anticorpo sintético. O método pode incluir administrar a composição ao sujeito em necessidade da mesma usando o método de distribuição descrito em mais detalhes abaixo. Por conseguinte, o anticorpo sintético é gerado no sujeito ou in vivo após mediante administração da composição ao sujeito.

[00198] O método também pode incluir introduzir a composição em

63 / 101 uma ou mais células e, portanto, o anticorpo sintético pode ser gerado ou produzido em uma ou mais células. O método pode ainda incluir introduzir a composição em um ou mais tecidos, por exemplo, mas não se limitando a, pele e músculo e, portanto, o anticorpo sintético pode ser gerado ou produzido em um ou mais tecidos.

8. Método para Identificação ou Triagem para o Anticorpo

[00199] A presente invenção se refere ainda a um método de identificação ou rastreamento para o anticorpo descrito acima, que é reativo ou liga ao antígeno descrito acima. O método para identificação ou triagem para o anticorpo pode usar o antígeno em metodologias conhecidas pelos versados na técnica para identificar ou triar o anticorpo. Tais metodologias podem incluir, mas não estão limitadas a, seleção do anticorpo de uma biblioteca (por exemplo, exibição de fago) e imunização de um animal seguida de isolamento e/ou purificação do anticorpo.

9. Método para Distribuição da Composição

[00200] A presente invenção também se refere a um método para distribuição da composição ao sujeito em necessidade da mesma. O método de distribuição pode incluir administrar a composição ao sujeito. A administração pode incluir, mas não está limitada a, injeção de DNA com e sem eletroporação in vivo, distribuição mediada por lipossomas e distribuição facilitada por nanopartícula.

[00201] O mamífero que recebe a distribuição da composição pode ser humano, primata, primata não humano, vaca, gado, ovelha, cabra, antílope, bisonte, búfalo de água, bisonte, bovídeos, veado, ouriços, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos e galinha.

[00202] A composição pode ser administrada por diferentes rotas, incluindo oralmente, parenteralmente, sublingualmente, transdermicamente, retalmente, transmucosamente, topicamente, via inalação, via administração bucal, intrapleuralmente, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal,

64 / 101 subcutânea, intramuscular, intranasal, intranasal, intratecal e intra-articular ou combinações das mesmas. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e a rota de administração que é mais apropriada para um animal particular. A composição pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, “pistolas de bombardeamento de microprojéteis”, ou outros métodos físicos, tal como eletroporação (“EP”), “método hidrodinâmico”, ou ultrassom. Eletroporação

[00203] A administração da composição através de eletroporação pode ser realizada usando os dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para distribuir a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer com que poros reversíveis se formem em membranas de célula, e preferivelmente o pulso de energia é uma corrente constante semelhante a uma entrada de corrente predeterminada por um usuário. O dispositivo de eletroporação pode compreender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodos ou conjunto de alças. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos vários elementos dos dispositivos de eletroporação, incluindo: controlador, gerador de forma de onda de corrente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento de relatório de estado, porta de comunicação, componente de memória, fonte de energia e comutador de energia. A eletroporação pode ser realizada usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, sistema CELLECTRA EP (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) ou eletroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) para facilitar transfecção de células pelo plasmídeo.

[00204] O componente de eletroporação pode funcionar como um elemento dos dispositivos de eletroporação e os outros elementos são

65 / 101 elementos (ou componentes) separados em comunicação com o componente de eletroporação. O componente de eletroporação pode funcionar como mais de um elemento dos dispositivos de eletroporação, que podem estar em comunicação ainda com outros elementos dos dispositivos de eletroporação separados do componente de eletroporação. Os elementos dos dispositivos de eletroporação existentes como partes de um dispositivo eletromecânico ou mecânico podem não ser limitados, pois os elementos podem funcionar como um dispositivo ou como elementos separados em comunicação um com o outro. O componente de eletroporação pode ser capaz de distribuir o pulso de energia que produz a corrente constante no tecido desejado e inclui um mecanismo de retroalimentação. O conjunto de eletrodos pode incluir uma matriz de eletrodos tendo uma pluralidade de eletrodos em um arranjo espacial, em que o conjunto de eletrodos recebe o pulso de energia do componente de eletroporação e distribui o mesmo ao tecido desejado através dos eletrodos. Pelo menos um da pluralidade de eletrodos é neutro durante a distribuição do pulso de energia e mede impedância no tecido desejado e comunica a impedância ao componente de eletroporação. O mecanismo de retroalimentação pode receber a impedância medida e pode ajustar o pulso de energia distribuído pelo componente de eletroporação para manter a corrente constante.

[00205] Uma pluralidade de eletrodos pode fornecer o pulso de energia em um padrão descentralizado. A pluralidade de eletrodos pode fornecer o pulso de energia no padrão descentralizado através do controle dos eletrodos sob uma sequência programada, e a sequência programada é inserida por um usuário no componente de eletroporação. A sequência programada pode compreender uma pluralidade de pulsos entregues em sequência, em que cada pulso da pluralidade de pulsos é entregue por pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância, e em que um pulso subsequente da pluralidade de pulsos é entregue por um diferente de pelo

66 / 101 menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância.

[00206] O mecanismo de retroalimentação pode ser executado por qualquer de hardware ou software. O mecanismo de retroalimentação pode ser executado por um circuito fechado analógico. A retroalimentação ocorre a cada 50 µs, 20 µs, 10 µs ou 1 µs, mas é preferivelmente uma retroalimentação em tempo real ou instantânea (isto é, substancialmente instantânea conforme determinado por técnicas disponíveis para determinar o tempo de resposta). O eletrodo neutro pode medir a impedância no tecido desejado e comunicar a impedância ao mecanismo de retroalimentação e o mecanismo de retroalimentação responde à impedância e ajusta o pulso de energia para manter a corrente constante em um valor semelhante à corrente pré-ajustada. O mecanismo de retroalimentação pode manter a corrente constante continuamente e instantaneamente durante a distribuição do pulso de energia.

[00207] Exemplos de dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem facilitar a distribuição da composição da presente invenção, incluem aqueles descritos na Patente US 7.245.963 por Draghia- Akli et al., Publicação de Patente US 2005/0052630 apresentada por Smith, et al., cujo conteúdo está aqui incorporado por referência na sua totalidade. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser utilizados para facilitar distribuição da composição incluem aqueles fornecidos no Pedido de patente US copendente e de copropriedade, Nº de série 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício de acordo com 35 USC 119(e) do Pedido Provisório US Nº de série 60/852.149, depositado em 17 de outubro de 2006, e 60/978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, todos os quais são por meio deste incorporados neste documento em sua totalidade.

[00208] A Patente US 7.245.963 para Draghia-Akli, et al. descreve sistemas de eletrodos modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma

67 / 101 planta. Os sistemas de eletrodo modular podem compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que fornece uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são distribuídas por meio de agulha hipodérmica para o tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula, entre a pluralidade de eletrodos. Todo o conteúdo da Patente US 7.245.963 é aqui incorporado por referência.

[00209] A Publicação de Patente US 2005/0052630, apresentada por Smith, et al., descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para facilitar efetivamente a introdução de uma biomolécula nas células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. O dispositivo de eletroporação compreende um dispositivo eletrocinético (“dispositivo EKD”), cuja operação é especificada por software ou firmware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante programáveis entre eletrodos em uma matriz com base em controle de usuário e entrada dos parâmetros de pulso e permite o armazenamento e a aquisição de dados de forma de onda de corrente. O dispositivo de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma matriz de eletrodos de agulha, um canal de injeção central para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. Todo o conteúdo da Publicação de Patente US 2005/0052630 é aqui incorporado por referência.

[00210] Os arranjos e métodos de eletrodos descritos na Patente US

7.245.963 e na Publicação de Patente US 2005/0052630 podem ser adaptados

68 / 101 para penetração profunda não apenas nos tecidos, tal como músculo, mas também outros tecidos ou órgãos. Devido à configuração do arranjo de eletrodos, a agulha de injeção (para distribuir a biomolécula de escolha) também é inserida completamente no órgão alvo e a injeção é administrada perpendicularmente ao tecido de alvo, na área que é pré-delineada pelo eletrodos. Os eletrodos descritos na Patente US 7.245.963 e na Publicação de Patente US 2005/005263 são preferivelmente de 20 mm de comprimento e calibre 21.

[00211] Além disso, contemplado em algumas modalidades, que incorporam dispositivos de eletroporação e seus usos, existem dispositivos de eletroporação que são os descritos nas seguintes patentes: Patente US

5.273.525, expedida em 28 de dezembro de 1993, Patentes US 6.110.161, expedida em 29 de agosto de 2000, 6.261.281, expedida em 17 de julho de 2001 e 6.958.060, expedida em 25 de outubro de 2005 e patente US

6.939.862, expedida em 6 de setembro de 2005. Além disso, patentes cobrindo a matéria fornecida na patente US 6.697.669, expedida em 24 de fevereiro de 2004, que envolve a distribuição de DNA usando qualquer de uma variedade de dispositivos e a patente US 7.328.064, expedida em 5 de fevereiro de 2008, voltadas para o método de injetar DNA, são contempladas aqui. As patentes acima são incorporadas por referência em sua totalidade.

10. Método de Tratamento

[00212] Também é aqui fornecido um método de tratamento, proteção contra e/ou prevenção de doença em um sujeito em necessidade do mesmo gerando o anticorpo sintético no sujeito. O método pode incluir administrar a composição ao sujeito. A administração da composição ao sujeito pode ser feita usando o método de distribuição descrito acima.

[00213] Em certas modalidades, a invenção fornece um método para tratamento proteção e/ou prevenção de uma infecção de RSV. Numa modalidade, o método trata, protege e/ou evita uma doença associada com

69 / 101 RSV.

[00214] Mediante geração do anticorpo sintético no sujeito, o anticorpo sintético pode ligar ou reagir com o antígeno. Essa ligação pode neutralizar o antígeno, bloquear reconhecimento do antígeno por outra molécula, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico e elicitar ou induzir uma resposta imune ao antígeno, desse modo tratando, protegendo e/ou prevenindo a doença associada ao antígeno no sujeito.

[00215] O anticorpo sintético pode tratar, prevenir e/ou proteger contra doença no sujeito administrado com a composição. O anticorpo sintético por ligação ao antígeno pode tratar, prevenir e/ou proteger contra doença no sujeito administrado com a composição. O anticorpo sintético pode promover sobrevivência da doença no sujeito administrado com a composição. Em uma modalidade, o anticorpo sintético pode proporcionar elevada sobrevivência da doença no sujeito em relação à sobrevivência esperada de um sujeito tendo a doença que não foi administrado com o anticorpo sintético. Em várias modalidades, o anticorpo sintético pode fornecer pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% , 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou um aumento de 100% na sobrevivência da doença em sujeitos administrados com a composição durante a sobrevivência esperada na ausência da composição. Em uma modalidade, o anticorpo sintético pode fornecer elevada proteção contra a doença no sujeito em relação à proteção esperada de um sujeito que não foi administrado com o anticorpo sintético. Em várias modalidades, o anticorpo sintético pode proteger contra doença em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% dos sujeitos administrados com a composição em relação à proteção esperada na ausência da composição.

[00216] A dose de composição pode estar entre 1 μg a 10 mg de

70 / 101 componente ativo/kg peso corporal/tempo e pode ser de 20 μg a 10 mg de componente/kg peso corporal/tempo. A composição pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses de composição para tratamento eficaz pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

11. Uso em Combinação com Antibióticos

[00217] A presente invenção também fornece um método para tratamento, proteção contra e/ou prevenção de doença em um sujeito em necessidade do mesmo administrando uma combinação do anticorpo sintético e um agente antibiótico terapêutico.

[00218] O anticorpo sintético e um agente antibiótico podem ser administrados usando qualquer método adequado, de modo que uma combinação do anticorpo sintético e do agente antibiótico esteja presente no sujeito. Em uma modalidade, o método pode compreender administração de uma primeira composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção por qualquer dos métodos descritos em detalhes acima e administração de uma segunda composição compreendendo um agente antibiótico menos de 1, menos de 2, menos de 3, menos de 4, menos de 5, menos de 6, menos de 7, menos de 8, menos de 9, ou menos de 10 dias em seguida à administração do anticorpo sintético. Numa modalidade, o método pode compreender administração de uma primeira composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção por qualquer dos métodos descritos em detalhes acima e administração de uma segunda composição compreendendo um agente antibiótico mais de 1, mais de 2, mais de 3, mais de 4, mais de 5, mais de 6, mais de 7, mais de 8, mais de 9, ou mais de 10 dias em seguida à administração do anticorpo sintético. Em uma modalidade, o método pode compreender administração de uma primeira composição compreendendo um agente antibiótico e administração de uma segunda composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção por qualquer dos métodos

71 / 101 descritos em detalhes acima menos de 1, menos de 2, menos de 3, menos de 4, menos de 5, menos de 6, menos de 7, menos de 8, menos de 9, ou menos de 10 dias em seguida à administração do agente antibiótico. Em uma modalidade, o método pode compreender administração de uma primeira composição compreendendo um agente antibiótico e administração de uma segunda composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção por qualquer dos métodos descritos em detalhes acima mais de 1, mais de 2, mais de 3, mais de 4, mais de 5, mais de 6, mais de 7, mais de 8, mais de 9, ou mais de 10 dias em seguida à administração do agente antibiótico. Em uma modalidade, o método pode compreender administração de uma primeira composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção por qualquer dos métodos descritos em detalhes acima e uma segunda composição compreendendo um agente antibiótico simultaneamente. Em uma modalidade, o método pode compreender administração de uma primeira composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção por qualquer dos métodos descritos em detalhes acima e uma segunda composição compreendendo um agente antibiótico simultaneamente. Numa modalidade, o método pode compreender administração de uma única composição compreendendo um anticorpo sintético da invenção e um agente antibiótico.

[00219] Exemplos não limitativos de antibióticos que podem ser utilizados em combinação com o anticorpo sintético da invenção incluem aminoglicosídeos (por exemplo, gentamicina, amicacina, tobramicina), quinolonas (por exemplo, ciprofloxacina, levofloxacina), cefalosporinas (por exemplo, ceftazidima, cefepima, cefoperazona, cefpirome, ceftobiprole), penicilinas antipseudomonais: carboxifenicilinas (por exemplo, carbenicilina e ticarcilina) e ureidopenicilinas (por exemplo, mezlocilina, azlocilina e piperacilina), carbapenêmicos (por exemplo, meropenem, imipenem, doripenem), polimixinas (por exemplo, polimixina B e colistina) emonobactamas (por exemplo, aztreonam).

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12. Geração de Anticorpos Sintéticos In Vitro e Ex Vivo

[00220] Em uma modalidade, o anticorpo sintético é gerado in vitro ou ex vivo. Por exemplo, em uma modalidade, um ácido nucleico codificando um anticorpo sintético pode ser introduzido e expresso em uma célula in vitro ou ex vivo. Os métodos de introduzir e expressar genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser prontamente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bacteriana, de levedura ou de inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[00221] Os métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e semelhantes. Os métodos para a produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Um método preferido para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira é transfecção de fosfato de cálcio.

[00222] Os métodos biológicos para a introdução de um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Os vetores virais, e especialmente os vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserir genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do herpes simplex I, adenovírus e vírus adenoassociados, e semelhantes. Por exemplo, ver Patentes US

5.350.674 e 5.585.362.

[00223] Os meios químicos para a introdução do polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como

73 / 101 complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas à base de lipídeos, incluindo emulsões óleo em água, micelas, micelas misturadas e lipossomas. Um sistema coloidal exemplar para uso como veículo de distribuição in vitro é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).

[00224] No caso em que é utilizado um sistema de distribuição não viral, um veículo de distribuição exemplar é um lipossoma. O uso de formulações lipídicas é contemplado para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode estar associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossoma, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossoma, fixado a um lipossoma via uma molécula de ligação que está associada tanto ao lipossoma quanto ao oligonucleotídeo, arrastado em um lipossoma, complexado com um lipossoma, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela, ou de outro modo associado a um lipídeo. Composições associadas a lipídeo, lipídeo/DNA ou lipídeo/vetor de expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de duas camadas, como micelas ou com uma estrutura “colapsada”. Eles também podem ser simplesmente intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma. Os lipídeos são substâncias graxas que podem ser lipídeos de ocorrência natural ou sintéticos. Por exemplo, os lipídeos incluem as gotículas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tal como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos.

13. Exemplos

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[00225] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, embora indicando modalidades preferidas da invenção, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão anterior e nesses Exemplos, um versado na técnica pode confirmar as características essenciais desta invenção e, sem afastamento do espírito e escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e várias condições. Assim, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas no presente documento, serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1

[00226] Os dados aqui apresentados demonstram uma plataforma de distribuição de gene de anticorpo empregando um anticorpo monoclonal codificado por DNA anti-RSV-F (dMAb) engenheirado que pode superar muitos dos obstáculos que têm limitado o uso global de anticorpos monoclonais recombinantes (mAb) como profiláticos para atingir doença infecciosa. A distribuição in vivo desse gene de construto de anticorpo resultou em níveis sistêmicos robustos do anticorpo no soro em modelos animais experimentais. Em ratos de algodão, que são os animais padrão ouro para modelar infecção por RSV, expressão sérica sustentada do dMAb e a presença do anticorpo em amostras de lavagem pulmonar foram observadas, demonstrando o potencial para imunidade duradoura e biodistribuição eficaz. Além disso, soro de animais portadores de dMAb de RSV-F era funcionalmente ativo em termos de ligação ao antígeno e neutralização de vírus vivos, e o dMAb de RSV-F conferiu proteção contra desafio de doença. De modo importante, esse dMAb de RSV-F forneceu proteção contra doença respiratória inferior em um estudo de desafio de vírus vivo no substituto animal padrão ouro para modelar a infecção por RSV humana que é o rato de

75 / 101 algodão. Essas descobertas sustentam a significância de dMAb como uma tecnologia de plataforma potencial para ampliar o acesso global a agentes imunoprofiláticos baseados em anticorpo monoclonal e enfrentar a carga de doenças infecciosas.

[00227] Os materiais e métodos são agora descritos. Animais

[00228] Camundongos fêmeas Balb/c entre 4 e 6 semanas de idade e ratos de algodão entre 6 e 8 semanas de idade foram alojados em grupo com acesso ad libitum à alimentação e água. Tratamentos de animais

[00229] Camundongos e ratos de algodão foram raspados sobre os músculos de suas patas traseiras. DNA de plasmídeo de dMAb de RSV-F foi formulado com 117,8- 128,5 U/ml de hialuronidase recombinante humana (Hylenex®, Halozyme, San Diego, CA). Camundongos receberam 30 µl e ratos de algodão 200 µl de injeções intramusculares (IM) de formulação. A profundidade de injeção foi controlada para 2 mm em camundongos e 5 mm em ratos de algodão. EP foi distribuído no sítio de injeção com o CELLECTRA-3P®. Uma matriz de três eletrodos de agulha com profundidade de inserção de 3 mm foi usada para camundongos e profundidade de 6 mm para ratos de algodão. O tratamento de EP consiste em dois conjuntos de pulsos com corrente constante de 0,1 Amp. Os segundos conjuntos de pulsos são retardados em 3 segundos. Dentro de cada conjunto, existem dois pulsos de 52 ms com um retardo de 198 ms entre os pulsos. Coloração de Imunofluorescência

[00230] 7 dias após distribuição IM de pDNA tecido muscular de rato de algodão e camundongos foi colhido, fixado em 10% Formalina tamponada neutra (BBC Biochemical, Stanford, MA) e imerso em 30% (p/v) de sacarose (Sigma, Saint Louis, MO ) em água D.I. para coloração in vivo da expressão de dMAb. Tecidos foram, então, incorporados no composto de O.C.T.

76 / 101 (Sakura Finetek, Torrance, CA) e congelados rapidamente. Blocos de tecido congelado foram seccionados até uma espessura de 18 µm.

[00231] Para coloração in vitro de expressão de dMAb, células 293T transfectadas foram cultivadas em lâminas de câmara e fixadas 3 dias após transfecção com 10% Formalina tamponada neutra (BBC Biochemical) por 10 minutos à temperatura ambiente e, então, lavadas com PBS.

[00232] As lâminas foram incubadas com Tampão Bloqueador (0,3% (v/v) Triton-X (Sigma), soro de burro 2% (v/v) em PBS) por 30 min, cobertas com Parafilm. O anticorpo de fragmento de IgG-Fc anti-humano de cabra (Bethyl, Montgomery, TX) foi diluído 1:100 em tampão de incubação (1% (p/v) BSA (Sigma), 2% (v/v) soro de burro, 0,3% (v/v) Triton-X (Sigma) e 0,025% (v/v) 1 g/ml de Sódio Azida (Sigma) em PBS).Foram adicionados 150 µl de solução de coloração a cada lâmina e incubadas por 2 h. As lâminas foram lavadas 5 minutos em 1xPBS três vezes. AF488 de IgG anticabra de burro (Abcam, Cambridge, UK) foi diluído 1:200 em tampão de incubação e 50 µl foram adicionados a cada seção. Lâminas foram lavadas após 1 hora de incubação e montadas com DAPI-Fluoromount (SouthernBiotech, Birmingham, AL) e cobertas.

[00233] A expressãoin vivo e in vitro de construtos de dMAb foi imageada com um microscópio Fluorescente BX51 (Olympus, Centre Valley, PA) equipado com câmera monocromática Retiga3000 (QImaging, Surrey, Canada). SDS-PAGE e Western Blot

[00234] Kit de transfecção Lipofectamine 3000 (ThermoFisher, Waltham, MA) foi utilizado para transfectar células HEK 293T aderentes (ATCC® CRL11268™) com plasmídeos codificando para IgG de RSV humana e RSV-dMAb de sc-Fv-Fc. Meio foi colhido 72 h pós-transfecção e filtrado usando o sistema de filtração a vácuo stericup-GP 0,22 µm (Millipore, Burlington, MA). O sobrenadante de células transfectadas de dMAb de RSV

77 / 101 de sc-Fv-Fc foi purificado usando colunas de rotação de Proteína A (ThermoFisher) por instruções do fabricante. A proteína eluída foi concentrada por unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 (30 kDa) e quantificada por Nanodrop. O sobrenadante de células transfectadas de IgG de RSV humanas foi purificado usando Protein G GraviTrap (GE Healthcare, Chicago, IL) por instruções do fabricante. A proteína eluída foi concentrada por unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 (30 kDa). 10 µg de cada amostra foram carregados em um gel NuPAGE ™ 4-12% Bis-Tris (ThermoFisher). Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standard (Bio-Rad, Hercules, CA) foi usado como o marcador padrão. O gel foi transferido para membrana de PVDF usando Dispositivo de transferência iBlot™ 2 (Invitrogen, Waltham, MA). A membrana foi bloqueada com tampão histológico de cabra (1% (p/v) BSA (Sigma), 2% (v/v) soro de cabra (Sigma), 0,3% (v/v) Triton-X (Sigma) e 0,025% (v/v) 1 g/ml de Sódio Azida (Sigma) em PBS) por 30 minutos à temperatura ambiente. Conjugado HRP Anticorpo adsorvido de macaco de cadeia pesada e leve anti-IgG humana de cabra (A80-319P, Bethyl) em diluição 1:5.000 em tampão de histologia de cabra foi adicionado e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavar a mancha por 5 minutos em 1X DPBS (HyClone, Logan, UT) três vezes, HRP Anticorpo de Fragmento Fc anti-IgG humana de cabra (A80-104P, Bethyl) em diluição 1:5.000 em tampão histológico de cabra foi adicionado e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. Depois de lavar a mancha por 5 minutos em 1X DPBS três vezes, a membrana foi revelada usando sistema Prime Western Blotting ECL™ (GE Healthcare) e imageada usando Sistema Protein Simple FluorChem. Quantificação de dMAb de RSV-F humano em soro animal e BAL

[00235] Placas de ensaio de 96 poços (Thermo Scientific) foram revestidas com 1ug/poço de anticorpo de fragmento Fc anti-huIgG de cabra (Bethyl) em 1x DPBS (ThermoFisher) durante a noite a 4°C. No dia seguinte,

78 / 101 as placas foram lavadas com TWEEN 0,2% (v/v) em tampão de lavagem 1xPBS e bloqueadas com FBS 10% (v/v) em 1xDPBS por 1 hora à temperatura ambiente. As amostras de soro foram diluídas em 1% (v/v) FBS em 0,2% (v/v) TWEEN-1xPBS e 100 µl desta mistura foram adicionados à placa de ensaio lavada. Adicionalmente, foram preparadas diluições padrão de anticorpo de cadeia simples humano purificado como diluições em série 1:2, começando em 500 ng/ml em tampão de diluição e adicionadas em duplicatas a cada placa de ensaio. As amostras e o padrão foram incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram incubadas com uma diluição 1:10.000 de HRP Anticorpo de Fragmento Fc nati-IgG Humana de Cabra (Betil, A80-104P) por 1 hora à temperatura ambiente. Para detecção foi adicionada solução de substrato SureBlue (Seracare, Milford, MA) às placas lavadas. A reação foi parada por adição de Solução de Parada de TMB (Seracare, Milford, MA) após 6 minutos às placas de ensaio. A O.D. foi lida a 450 nm. A expressão de nível sérico foi interpolada a partir da curva padrão usando uma adequação de curva logística de quatro parâmetros sigmoidal para o log da concentração. ELISA de Ligação a Antígeno

[00236] Placas de ensaio foram revestidas com 1 µg/poço de glicoproteína de Fusão (A2) do vírus sincicial respiratório humano (RSV) (Sino Biological, Wayne, PA) diluídas em 1x DPBS (ThermoFisher) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas com tampão 1xPBS com 0,05% TWEEN. 250 µl/poço de BSA a 3% (p/v) em 1x PBS com 0,05% TWEEN foram adicionados e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Amostras de soro foram diluídas em 1% (p/v) BSA em 1x PBS com 0,05% TWEEN. Após lavar as placas de ensaio, foram adicionadas amostras de soro em diluições em série de três vezes. As placas foram incubadas 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, 100 µl de HRP de Anticorpo de Fragmento Fc anti-IgG humana de cabra diluídos 1:10.000 (Betil, A80-104P)

79 / 101 foram adicionados e incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Para revelação foi utilizada a Solução de Parada SureBlue/TMB (Seracare, Milford, MA) e a O.D. foi registrada a 450 nm. Ensaio de anticorpo neutralizante de RSV (redução de 60%)

[00237] Amostras de soro tratadas termicamente foram diluídas 1:10 com EMEM e diluídas em série adicionalmente 1:4. As amostras de soro diluídas foram incubadas com RSV (25-50 PFU) por 1 hora à temperatura ambiente e inoculadas em duplicatas em monocamadas de HEp-2 confluentes em placas de 24 poços. Após uma hora de incubação a 37°C numa incubadora de 5% de CO2 , os poços foram cobertos com meio de Metilcelulose 0,75%. Após 4 dias de incubação, a camada foi removida e as células foram fixadas com mancha violeta cristal 0,1% por uma hora e, então, enxaguadas e secas ao ar. Os títulos de anticorpos neutralizantes recíprocos correspondentes foram determinados no ponto extremo de redução de 60% do controle de vírus usando o programa estatístico. As médias geométricas ± erro padrão para todos os animais em um grupo foram calculadas. Estudo de desafio de rato de algodão Animais:

[00238] Quinze (15) ratos de algodão fêmeas cossanguíneos Sigmodon hispidus entre 6 e 8 semanas de idade (Fonte: Sigmovir Biosystems, Inc., Rockville MD) foram mantidos e manuseados sob supervisão veterinária de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health e o protocolo de estudo animal aprovado do Sigmovir Institutional Animal Care and Use Committee. Os ratos de algodão foram alojados em gaiolas de policarbonato transparentes individualmente e abastecidos com ração de roedor padrão (Harlan #7004) e água da torneira ad lib. Desafio de Vírus:

[00239] A cepa longa de protótipo de RSV/A (ATCC, Manassas, VA) foi propagada em células HEp-2 após purificação em placa em série para

80 / 101 reduzir partículas interferentes defeituosas. Um grupo de vírus designado como hRSV/A/Long Lot#021413, preparado em meio de estabilização de sacarose e contendo aproximadamente 2 x 107 pfu/ml foi usado para este experimento in vivo . Este estoque de vírus é armazenado em condições de - 80°C e foi caracterizado in vivo usando o modelo de rato de algodão para replicação do trato respiratório superior e inferior. Procedimento:

[00240] 15 ratos de algodão fêmeas adultos (6-8 semanas de idade) foram divididos em três grupos de cinco animais cada. Os animais do grupo de dMAb de RSV foram tratados como descrito acima no dia 0 do experimento. Animais do grupo de controle de Palivizumabe foram injetados IM com 0,1 ml de 15 mg/kg de Palivizumabe no dia 6 do experimento. Um terceiro grupo de animais permaneceu sem tratamento. No dia 7, todos os animais foram desafiados com 105 pfu de RSV/A/Long (IN) em um volume de 0,1 mL. Todos os animais foram sacrificados no dia 12. O pulmão foi colhido em bloco e seccionado em três seções, a seção esquerda foi usada para titulações virais e o lóbulo lingular para qPCR. Titulação viral de pulmão

[00241] Homogenatos de pulmão são clarificados por centrifugação e diluídos em EMEM. Monocamadas de HEp-2 confluentes são infectadas em duplicatas com homogenatos diluídos em placas de 24 poços. Após uma hora de incubação a 37°C numa incubadora de 5% de CO2 , os poços são cobertos com meio de Metilcelulose 0,75%. Após 4 dias de incubação, a camada é removida e as células são fixadas com mancha violeta cristal 0,1% por uma hora e, então, enxaguadas e secas ao ar. As placas são contadas e o título do vírus é expresso como unidades formadoras de placas por grama de tecido. Os títulos virais são calculados como média geométrica + erro padrão para todos os animais de um grupo em um dado tempo. PCR em tempo real do tecido de pulmão

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[00242] RNA total é extraído de tecido de pulmão homogeneizado usando o kit de purificação RNeasy (QIAGEN, Valencia, CA). Um µg de RNA total é usado para preparar cDNA usando Super Script II RT (Invitrogen) e oligo dT primer (1 µL, Invitrogen). Para as reações de PCR em tempo real, o Bio-Rad iQTM SYBR Green Supermix é usado em um volume final de 25 µl, com concentrações de iniciador finais de 0,5 µM. As reações são ajustadas em duplicatas em bandejas de 96 poços. Amplificações são realizadas em um Bio-Rad iCycler por 1 ciclo de 95°C por 3 min., seguidas por 40 ciclos de 95°C por 10 s, 60°C por 10 s e 72°C por 15 s. Os ciclos de linha de base e o limiar de ciclo (Ct) são calculados pelo software iQ5 no modo Adequação de Curva Subtraída da Linha de Base de PCR. A quantificação relativa de DNA é aplicada a todas as amostras. As curvas padrão são desenvolvidas usando amostra de cDNA diluída em série mais enriquecida no transcrito de interesse (por exemplo, pulmões do dia 4 pós- infecção de RSV primária). Os valores de Ct são plotados contra log10 de fator de diluição de cDNA. Essas curvas são usadas para converter os valores de Ct obtidos para diferentes amostras em unidades de expressão relativa. Essas unidades de expressão relativa são, então, normalizadas para o nível de mRNA de b-actina (“gene housekeeping”) expresso na amostra correspondente. Para estudos em animais, os níveis de mRNA são expressos como a média geométrica ± SEM para todos os animais de um grupo em um dado tempo. Estatísticas

[00243] Análise estatística foi realizada com GraphPad Prism v.7 usando o teste t de Mann-Whitney bicaudal não paramétrico.

[00244] Os resultados são agora descritos. Desenho de construto de dMAb de RSV-F

[00245] O dMAb anti-RSV-F foi baseado no mAb anti-RSV aprovado pela FDA, Palivizumabe. Para auxiliar no desenho de molécula, modelos do

82 / 101 dMAb em ambos os formatos de fragmento variável (Fv) e fragmento variável de cadeia simples (scFv) foram gerados usando Discovery Studio 4.5 (Biovia, San Diego, CA). O scFv foi modelado em ambas as orientações VH- VL e VL-VH usando um ligante 3 (G4S). Com base nos resultados de modelagem, a orientação VL-VH foi escolhida, pois foi predito que causaria a menor perturbação aos domínios variáveis de scFv (Figura 1A). O gene para o dMAb de RSV-F de sc-Fv-Fc (dMAb de RSV-F) foi clonado em uma espinha dorsal de pVAX e está sob controle do promotor de CMV humano (Figura 1B). A expressão de dMAb de RSV-F foi confirmada por coloração de imunofluorescência de células 293T transfectadas in vitro com pDNA de dMAb de RSV-F (Figura 1C). A coloração demonstra expressão citossólica do dMAb de RSV-F. A secreção do dMAb de RSV-F por células 293T foi confirmada por análise Western-Blot do sobrenadante da cultura de células (Figura 1D). Como esperado, foram observadas 2 bandas para o Palivizumabe-IgG representando cadeia pesada (57kDa) e leve (26kDa), e uma banda simples (60kDa) foi detectada para o construto de dMAb de RSV- F de cadeia simples. modelo de expressão de dMAb in vivo

[00246] Para expressão in vivo ideal de dMAb um protocolo de distribuição de pDNA intensificada foi desenvolvido. pDNA de dMAb é formulado com a enzima disruptiva de matriz extracelular (ECM), hialuronidase e distribuída ao músculo com eletroporação in vivo . O esquemático apresentado na Figura 2A delineia a plataforma de dMAb destacando a distribuição e expressão in vivo . Resumidamente, o pDNA de dMAb é distribuído para o músculo esquelético com a ajuda de eletroporação. A expressão de dMAb no sítio de distribuição IM pode ser visualizada por coloração para IgG humana em miócitos (Figura 2B). Mediante produção do dMAb, os miócitos secretam o construto de anticorpo para o volume de sangue circulante. O dMAb pode ser medido no soro (Figura 2C). A

83 / 101 expressão do dMAb pode ser sustentada por meses. Expressão in vivo de dMAbs de RSV-F em camundongos BALB/c

[00247] A expressão de dMAbs de RSV-F funcionais foi avaliada in vivo. Camundongos BALB/c foram dosados com 50 µg de pDNA de dMAb de RSV-F administrado ao músculo TA. A concentração sérica de 7 dias de dMAb de RSV-F no dia 7 foi em média de 7.500 ng/ml (Figura 3A). Houve um declínio em concentração sérica após o dia 7 que foi associado a uma resposta de anticorpos antidrogas do hospedeiro (ADA) levantada contra o construto de anticorpo humano xenogênico (dados não mostrados). A capacidade do dMAb de RSV-F expresso para ligar ao antígeno de RSV-F foi confirmada por ELISA de amostras de soro de animais tratados em comparação com animais não tratados (Figura 3B). Soro de animais tratados com o construto de dMAb de RSV mostra um forte sinal de ligação dependente de diluição de soro e está exibindo um 'efeito gancho' em concentrações séricas mais altas. A capacidade de ligação de RSV-F de dMAb de RSV-F expresso in vivo se traduz em funcionalidade de neutralização de vírus. Soro que abriga o dMAb de RSV-F atinge títulos de neutralização de vírus de RSV/A robustos de 7 log2 (Figura 3C). A biodistribuição do dMAb de RSV-F no sítio de infecção de RSV foi confirmada em amostras de lavagem de pulmão. 7 dias após administração de dMAb de RSV-F no músculo TA, o dMAb em amostras de lavagem broncoalveolar (BAL) foi medido com sucesso, 11,25 mol de mAb/g de proteína total +/- SEM 2,65 (Figura 3D). Em resumo, a distribuição IM do dMAb de RSV-F resultou na produção de construto de anticorpo anti-RSV-F funcional que estava presente em circulação sistêmica e no sítio fisiologicamente relevante de infecção de RSV natural. Expressão in vivo de dMAb de RSV-F em ratos de algodão

[00248] Ratos de algodão são considerados o modelo padrão ouro para modelar infecção de RSV e intervenções de drogas. Ratos de algodão são

84 / 101 suscetíveis a RSV humano não adaptado e 100 vezes mais permissivos que camundongos à infecção. Eles também exibem muitas características da patologia de doença humana21,22.

[00249] Inicialmente, a capacidade de miócitos de rato de algodão para expressar construtos de dMAb foi avaliada após distribuição de pDNA de dMAb de RSV-F para o músculo de perna (Figura 4A). Em seguida, foi testado se a expressão local de dMAb levou à expressão sistêmica. Foram medidos níveis sustentados (maior que 5 semanas) (acima de 1.000 ng/ml) do dMAb de RSV-F no soro do rato de algodão (Figura 4B). A funcionalidade do dMAb expresso foi testada em um ensaio de neutralização RSV/A. No ensaio de redução de placa, um título de neutralização médio de 5,4 foi medido (Figura 4C). A biodistribuição do dMAb para o sítio de infecção de RSV foi avaliada no líquido de BAL.

[00250] Níveis médios de dMAb de RSV-F em amostras de BAL desses animais foram de 10,8 mol/g de proteína total (Figura 4D). Em resumo, a distribuição de pDNA de dMAb de RSV-F para os músculos de ratos de algodão levou à produção sistêmica de anticorpos funcionais que neutralizavam vírus de RSV e estavam presentes nos pulmões. dMAb de RSV in vivo expresso confere proteção de doença respiratório inferior

[00251] A capacidade de atingir dMAb anti-RSV-F funcional no rato de algodão nos levou a testar a eficácia da plataforma em um estudo ativo de imunoprofilaxia (Figura 5A). Grupos separados de ratos de algodão foram dosados com dMAb de RSV-F (grupo 1) ou Palivizumabe (grupo 2) ou permaneceram sem tratamento. Todos os grupos foram desafiados intranasal com 105 pfu de RSV/A/Long no dia 0. Cinco dias após desafio, o tecido de pulmão foi colhido e cargas virais medidas. Ambos os grupos 1 e 2 foram protegidos de doenças respiratórias inferiores associadas à infecção de RSV. Os pulmões de ratos de algodão tratados com dMAb continham carga viral

85 / 101 média de 250 pfu (SEM=50) 5 dias após desafio intranasal. Carga viral semelhante foi medida para os pulmões de ratos de algodão tratados com Palivizumabe: 200 pfu (SEM=0). Em comparação, os pulmões de ratos de algodão não tratados continham carga viral alta de 27.520 pfu (SEM=8.408,9) (Figura 5B). O número de cópias de genoma viral significativamente reduzido no tecido respiratório inferior foi medido com PCR em tempo real usando iniciador direcionando a Proteína não Estrutural 1 (NS1) de RSV. Níveis médios de mRNA de RSV em ratos de algodão tratados com dMAb (mRNA de RSV médio=0,181, SEM=0,050) e Palivizumabe (mRNA de RSV médido=0,032, SEM=0,004) foram reduzidos em comparação com animais não tratados (mRNA de RSV médio=1,175, SEM=0,306) (Figura 5C). De notar, ratos de algodão tratados com dMAb foram protegidos de doença Respiratória Inferior, embora os níveis séricos de dMAb de RSV-F fossem aproximadamente 10 vezes inferiores àqueles medidos para Palivizumabe (Figura 5D). Em resumo, esses dados demonstraram a capacidade da plataforma AIP usando um dMAb anti-RSV-F para proteger contra desafio viral em um modelo de doença padrão ouro. DMAb protegido contra Doença Respiratória Inferior em um desafio de vírus vivo

[00252] Existe uma necessidade premente para o desenvolvimento de tecnologias de plataforma que possam ser empregadas para aumentar acesso a anticorpos monoclonais profiláticos e terapêuticos. O trabalho apresentado aqui destaca o potencial da plataforma de distribuição de gene de anticorpo, dMAb, para conseguir isso. Esta é a tecnologia aplicada ao alvo de RSV usando um construto de dMAb baseada no mAb aprovado pela FDA, Palivizumabe. Os dados demonstram a expressão in vivo bem sucedida do construto de dMAb em múltiplos modelos pré-clínicos e a capacidade de conferir proteção de hospedeiro contra desafio de vírus (Figura 5). Os dados apresentados aqui e em outros relatórios recentes10-13,23 destacam as

86 / 101 características e a eficácia da plataforma de dMAb como uma opção profilática para uma miríade de doenças infecciosas.

[00253] O sucesso da tecnologia de dMAb é dependente da distribuição eficaz de pDNA ao hospedeiro. A distribuição in vivo de dMAb direciona os miócitos de hospedeiro em músculo esquelético, que é considerado um órgão endócrino, muito adepto da síntese e secreção de múltiplos fatores24. Além disso, miócitos têm vida extremamente longa e, juntas, essas características tornam o músculo uma fábrica biológica ideal para a expressão de transgene de alto nível poder persistir até a distribuição de vários meses25,26. No entanto, para aproveitar todo o potencial do sítio muscular, como a fábrica biológica produtora de mAb, requer uma distribuição altamente eficiente do pDNA de dMAb aos miócitos. Para otimizar a distribuição do pDNA de dMAb no músculo EP é utilizada e a enzima modificadora de ECM, hialuronidase. Isso destaca como esse protocolo de distribuição alcança expressão de dMAb robusta nos miócitos no sítio de distribuição (Figura 2b), o que leva a altos níveis de dMAb secretados na circulação (Figura 2c). De modo importante, é demonstrado que esta expressão robusta é sustentada. Na ausência de uma resposta imune de hospedeiro adaptativa contra dMAb xenogênico demonstrou expressão de 23 semanas de duração (Figura 2C). Mesmo na presença de um sistema imune funcional em ratos de algodão do tipo selvagem, foram mostrados 39 dias de expressão (Figura 4B). A expressão sustentada é um componente extremamente importante para uma modalidade imune-profilática e uma característica que está faltando nos mAbs recombinantes convencionais. Por exemplo, a administração de Palivizumabe é idealmente iniciada antes do início da temporada de RSV, que tipicamente dura de novembro a abril, com desvio por regiões27. Ele é dosado em 15mg/kg e tem que ser administrado mensalmente por injeção intramuscular durante toda a temporada de RSV. A meia vida sérica foi relatada como 20 dias28,29. Por outro lado, uma

87 / 101 contraparte de dMAb de Palivizumabe é continuamente expressa e secretada e um nível circulante eficaz de mAb em poderia ser mantido. Uma única distribuição de dMAb forneceria mAbs protetores em soro de paciente durante uma temporada de RSV. Em apoio a isso, em um estudo farmacocinético (pK) níveis de dMAb RSV-F humano em circulação para permanecer estáveis por até 6 semanas em ratos de algodão foram observados (Figura 4B) e camundongos depletados em células T por meses (Figura 2C).

[00254] Uma característica de anticorpos sc-Fv é sua excelente biodistribuição. Devido ao seu pequeno tamanho, eles penetram eficientemente no tecido. No entanto, a eficácia é limitada por uma meia vida sérica de apenas várias horas. A fusão com uma proteína Fc aumenta a meia vida sérica da molécula sc-Fv-Fc resultante de horas para múltiplos dias30. Embora não ultrapasse a meia vida de uma molécula de IgG de comprimento total, ela ainda exibe biodistribuição superior devido ao seu tamanho menor31. O dMAb de RSV foi detectado com sucesso nos pulmões de camundongos e ratos de algodão (Figuras 3D e 4D). A capacidade aumentada de a molécula de sc-Fv-Fc menor estar presente no sítio de infecção de RSV pode explicar os níveis semelhantes de proteção contra doença respiratória inferior (Figura 5B e Figura 5C), apesar da concentração sérica 10 vezes mais baixa (Figura 5D ) em comparação com Palivizumabe. Para permitir uma comparação mais precisa das duas moléculas e sua biodistribuição, serão desenhados experimentos futuros para ambos os construtos de mAb estarem em concentrações iguais no soro animal no momento do desafio viral. A importância de biodistribuição de mAbs na prevenção de LRD após desafio de RSV foi relatada anteriormente. Wu et al relatam eficácia in vivo inferior para variantes de Palivizumabe, apesar da alta capacidade de neutralização in vitro devido à baixa biodistribuição32. Tiwari et al relataram resultados promissores ao direcionar o tecido pulmonar diretamente para expressão de RSV-Ab codificado por mRNA33.

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[00255] Embora outras plataformas tenham sido empregadas para fornecer genes de anticorpos, dMAbs possuem múltiplas vantagens sobre outras tecnologias de anticorpos monoclonais baseados em ácidos nucleicos, incluindo vetor viral e distribuição de anticorpos baseados em mRNA. Em primeiro lugar, dMAb é uma plataforma de pDNA nua, portanto, ele evita imunidade antivetor que limita o uso de adenovírus ou distribuição de gene baseada em vírus adenoassociado recombinante e nenhum veículo de plataforma de distribuição de produto químico potencialmente tóxico é necessário. mAbs baseados em mRNA geralmente requerem formulação de 34-36 nanopartículas de lipídeos . Conforme discutido acima e destacado nos dados apresentados neste estudo, há um perfil de expressão sustentado, mas finito, para dMAbs. Os anticorpos codificados por mRNA têm meias vidas séricas mais curtas significativas, combinadas mais intimamente com aquelas de anticorpos recombinantes, enquanto a distribuição de adenovírus ou vírus adenoassociados recombinantes de genes de anticorpos pode levar à expressão infinita, com preocupações de segurança decorrentes da integração em DNA somático e expressão potencialmente irrestrita do transgene37. Adicionalmente, ao contrário de muitos candidatos a anticorpos recombinantes e baseados em mRNA que são distribuídos IV e requerem infraestrutura significativa no local para dosar pacientes, dMAbs podem ser administrados IM no campo. DNA de plasmídeo é relativamente fácil de fabricar, permitindoprodução muito econômica. DNA de plasmídeo formulado é estável em temperatura sem a necessidade de liofilização e seu armazenamento e sua distribuição não requerem uma cadeia fria.

[00256] Em resumo, aplicando a plataforma de dMAb para direcionar RSV de doença infecciosa em modelos de doenças estabelecidos, esses dados demonstram níveis circulantes robustos do construto de anticorpo de RSV no soro e nos pulmões de animais. Além disso, o construto de anticorpo expresso in vivo foi funcionalmente ativo e forneceu proteção contra Doença

89 / 101 Respiratória Inferior em um estudo de desafio de vírus vivo (Figura 5). Esses achados confirmam a significância da tecnologia de dMAb e seu potencial para combater a mortalidade global causada por doenças infecciosas. Referências

[00257] 1 Nair, H. et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet (London, England) 375, 1545-1555, doi:10.1016/s0140-6736(10)60206-1 (2010).

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[00294] Aqui é descrito um DMAb de fragmento variável anti-RSV-F

94 / 101 de cadeia simples (scFv) engenheirado (Tabela 1). A distribuição in vivo desse gene de construto de anticorpo resultou em níveis sistêmicos robustos do anticorpo no soro de camundongos. Níveis equivalentes foram associados à proteção de doença respiratória inferior de infecção de RSV. Em ratos de algodão, que é o padrão ouro para modelar doença humana em seguida a infecção de RSV, é observada expressão sérica do DMAb até 60 dias após distribuição. O anticorpo também foi detectado em amostras de lavagem de pulmão, demonstrando biodistribuição eficaz. Além disso, soro de animais portadores de DMAb de scFv de RSV-F era funcionalmente ativo em termos de ligação de antígeno e neutralização do vírus vivo. Esses achados confirmam a significância de dMAb como uma tecnologia de plataforma viável para trazer imunoprofilaxia baseada em anticorpos monoclonais como uma opção econômica e eficaz para combater doenças infecciosas. Tabela 1. Plasmídeos de DMAb de RSV DMAb descrição Fc/conformação Protocolo de distribuição 9206 Motavizumab huIgG 30min. pré-tx Sigma-HYA 9368 Palivizumabe huIgG Coformulação Intropharma HYA 9369 Palivizumabe sc-Fv huIgG Coformulação Intropharma HYA 9370 Palivizumabe muIgG Coformulação Intropharma HYA 9371 Palivizumabe sc-Fv muIgG Coformulação Intropharma HYA 9283 ADImab huIgG Coformulação hialuronidase Exemplo 3

[00295] Aqui, os dados apresentam um dMAb anti-RSV-F engenheirado e um protocolo de distribuição otimizado. A cinética e magnitude de expressão sistêmica do dMAb são medidas como concentração do dMAb de IgG de sc-FV em soro animal. A biodistribuição é examinada medindo amostras de lavagem de pulmão de animais tratados. dMAbs expressos in vivo também foram testados quanto à funcionalidade de ligação e neutralização.

[00296] Os dados aqui apresentados demonstram a engenharia de plasmídeo de DNA codificando sc-Fv anti-RSV com um perfil de expressão in vivo melhorado em comparação com a IgG humana de comprimento total. Para intensificar ainda mais a expressão sistêmica, foi empregado um

95 / 101 protocolo de distribuição otimizado. Uma formulação otimizada intensifica a dispersão do DNA de plasmídeo através de modificações na matriz extracelular do tecido alvo. Eletroporação aumenta a captação celular das moléculas de DNA por células alvo. A funcionalidade do sc-Fb\v humano expresso in vivo a partir do soro de camundongos tratados para ligação ao antígeno de proteína de fusão de RSV (RSV-F) e neutralização do vírus de RSV-A vivo foi confirmada in vitro. Além da expressão no nível sérico, o sc- Fv humano expresso in vivo também foi detectado no pulmão, o local de infecção de RSV natural. O método de dosagem e distribuição foi, então, aplicado em ratos de algodão, o modelo pré-clínico padrão para o desenvolvimento de profilaxia de RSV.

[00297] A distribuição in vivo deste dMAb resultou em níveis sistêmicos robustos do anticorpo no soro de camundongos (Figura 12). Níveis correspondentes de Pavilizumabe recombinante fornecem proteção contra doença respiratória inferior após a infecção de RSV. Em ratos de algodão, que é o padrão ouro para modelar doença humana em seguida a infecção de RSV, a expressão sérica sustentada do dMAb foi observada até 60 dias após distribuição (Figura 13). O anticorpo também foi detectado em amostras de lavagem de pulmão, demonstrando biodistribuição eficaz (Figura 12). Além disso, soro de animais portadores de DMAb de RSV-F era funcionalmente ativo em termos de ligação de antígeno e neutralização do vírus vivo (Figuras 12 e 14).

[00298] Estes resultados sugerem que o dMAb de sc-Fv humano anti- RSV poderia ser uma alternativa eficaz a injeções repetitivas de proteína-mAb ao longo da temporada de RSV. RSV-dMAb tem o potencial de superar alguns dos obstáculos associados à imunização passiva. Exemplo 4

[00299] Os dados aqui apresentados demonstram a eficácia de dMAbs de RSV em um modelo de rato de algodão para infecção de RSV humana.

96 / 101

[00300] Os materiais e métodos são descritos. Distribuição de pDNA intramuscular

[00301] Camundongos e ratos de algodão foram raspados sobre os músculos de suas patas traseiras. DNA de plasmídeo de dMAb de RSV-F foi coformulado com 128,5U/ml de hialuronidase para camundongos ou 117,8U/ml para ratos de algodão em 1x SSC.

[00302] Camundongos receberam injeções de 30 µl e ratos de algodão de 200 µl intramusculares (Figura 15). A profundidade da injeção foi controlada para 2 mm em camundongos e 5 mm em ratos de algodão. 60 segundos após injeção de pDNA, EP foi distribuída no sítio de injeção com o CELLECTRA-3P®. Uma matriz de três eletrodos de agulha com profundidade de inserção de 3 mm foi usada para camundongos e profundidade de 6 mm para ratos de algodão. Quantificação de dMAbs de RSV-F de Fc humanos em soro de animais

[00303] Placas de ensaio de 96 poços (Thermo Scientific™ Nunc™) foram revestidas com 1 µg/poço de anticorpo de fragmento Fc anti-huIgG de cabra (Bethyl, TX) em 1x DPBS (Thermofischer, MA) durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as placas foram lavadas com 0,2% (v/v) TWEEN em tampão de lavagem 1xPBS e bloqueadas com 10% (v/v) FBS em 1xDPBS por 1 hora à temperatura ambiente.

[00304] As amostras de soro foram diluídas em 1% (v/v) FBS em 0,2% (v/v) TWEEN-1xPBS e 100 µl desta mistura foram adicionados à placa de ensaio após outra etapa de lavagem. Adicionalmente, diluições padrão de cadeia leve capa humana purificada (Bethyl, TX) foram preparadas em tampão de diluição e adicionadas a cada placa de ensaio. As amostras e o padrão foram incubados por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram incubadas com uma diluição de 1:10.000 de HRP de cadeia leve capa anti-IgG humana de cabra (Bethyl, TX) por 1 hora à temperatura ambiente. Para detecção, foi adicionada solução de substrato SureBlue (KPL,

97 / 101 MD) às placas lavadas. A reação foi parada por adição de Solução de Parada de TMB (KPL, MD) após 6 minutos às placas de ensaio. A O.D. foi lida a 450 nm. A expressão de nível sérico foi interpolada a partir da curva padrão usando uma adequação de curva logística de quatro parâmetros sigmoidal para o log da concentração. Estudo de desafio de rato de algodão Animais:

[00305] Quinze (15) ratos de algodão fêmeas cossanguíneos Sigmodon hispidus entre 6 e 8 semanas de idade (Fonte: Sigmovir Biosystems, Inc., Rockville MD) foram mantidos e manuseados sob supervisão veterinária. Os ratos de algodão foram alojados em gaiolas de policarbonato transparentes individualmente e abastecidos com ração de roedor padrão (Harlan #7004) e água da torneira ad lib. Desafio de Vírus:

[00306] A cepa longa de protótipo de RSV/A (ATCC, Manassas, VA) foi propagada em células HEp-2 após purificação em placa em série para reduzir partículas interferentes defeituosas. Um grupo de vírus designado como hRSV/A/Long Lot#021413, preparado em meio de estabilização de sacarose e contendo aproximadamente 2 x 107 pfu/ml foi usado para este experimento in vivo . Este estoque de vírus é armazenado em condição abaixo de -80°C e foi caracterizado in vivo usando o modelo de rato de algodão para replicação do trato respiratório superior e inferior. Procedimento:

[00307] 15 ratos de algodão fêmeas adultos (6-8 semanas de idade) foram divididos em três grupos de cinco animais cada. Os animais do grupo de dMAb de RSV foram tratados como descrito acima no dia 0 do experimento. Animais do grupo de controle de Palivizumabe foram injetados IM com 0,1 ml de 15 mg/kg de Palivizumabe no dia 6 do experimento. Um terceiro grupo de animais permaneceu sem tratamento.

98 / 101

[00308] No dia 7, todos os animais foram desafiados com 105 pfu de RSV/A/Long (IN) em um volume de 0,1 mL. Todos os animais foram sacrificados no dia 12. O nariz foi colhido para titulação viral. O pulmão foi colhido em bloco e seccionado em três seções, a seção esquerda foi usada para titulações virais e o lóbulo lingular para qPCR. Titulação viral do pulmão e nariz

[00309] Homogenatos de pulmão e nariz são clarificados por centrifugação e diluídos em EMEM. Monocamadas de HEp-2 confluentes são infectadas em duplicatas com homogenatos diluídos em placas de 24 poços. Após uma hora de incubação a 37°C numa incubadora de 5% de CO2 , os poços são cobertos com meio de Metilcelulose 0,75%. Após 4 dias de incubação, a camada é removida e as células são fixadas com mancha violeta cristal 0,1% por uma hora e, então, enxaguadas e secas ao ar. As placas são contadas e o título do vírus é expresso como unidades formadoras de placas por grama de tecido. Os títulos virais são calculados como média geométrica + erro padrão para todos os animais de um grupo em um dado tempo. PCR em tempo real

[00310] RNA total é extraído de tecido de pulmão homogeneizado usando o kit de purificação RNeasy (QIAGEN). Um µg de RNA total é usado para preparar cDNA usando Super Script II RT (Invitrogen) e oligo dT primer (1 µL, Invitrogen). Para as reações de PCR em tempo real, o Bio-Rad iQTM SYBR Green Supermix é usado em um volume final de 25 µl, com concentrações de iniciador finais de 0,5 µM. As reações são ajustadas em duplicatas em bandejas de 96 poços. Amplificações são realizadas em um Bio-Rad iCycler por 1 ciclo de 95ºC por 3 minutos, seguido de 40 ciclos de 95ºC por 10 segundos, 60ºC por 10 segundos e 72ºC por 15 segundos. Os ciclos de linha de base e o limiar de ciclo (Ct) são calculados pelo software iQ5 no modo Adequação de Curva Subtraída de Linha de Base de PCR. A quantificação relativa de DNA é aplicada a todas as amostras. As curvas

99 / 101 padrão são desenvolvidas usando amostra de cDNA diluída em série mais enriquecida no transcrito de interesse (por exemplo, pulmões do dia 4 pós- infecção de RSV primária). Os valores de Ct são plotados contra log10 de fator de diluição de cDNA. Essas curvas são usadas para converter os valores de Ct obtidos para diferentes amostras em unidades de expressão relativa. Essas unidades de expressão relativa são, então, normalizadas para o nível de mRNA de b-actina (“gene housekeeping”) expresso na amostra correspondente. Para estudos em animais, os níveis de mRNA são expressos como a média geométrica ± SEM para todos os animais de um grupo em um dado tempo.

[00311] Os resultados são agora descritos. Expressão in vivo de dMAbs de RSV-F em ratos de algodão

[00312] Ratos de algodão têm aproximadamente 4-5 vezes o tamanho e o peso de um camundongo. Para acomodar esses roedores maiores, o protocolo de tratamento foi modificado para um volume de injeção maior de 200 µl e profundidade de injeção mais profunda e penetração dos eletrodos de eletroporação, conforme descrito em um estudo anterior de vacina de rato de algodão de RSV-F (Smith et al., 2017, Vaccine 35 (21): 2840-47).

[00313] Para atingir níveis sistêmicos mais altos do RSV-dMAb, o número de sítios de tratamento foi aumentado para 6 por animal e uma dose total de 2,4 mg de pDNA de dMAb foi capaz de ser fornecida. 7 dias após a distribuição desta dose ideal e no dia do desafio do vírus vivo, foi medido o nível sérico médio de dMAb de 1.384,5 ng/ml (SD=189,1, n=4). A expressão de RSV-dMAb permaneceu estável até o final do experimento de desafio. No dia 12 após o tratamento, o soro de rato de algodão continha uma concentração média de dMAb de 1.455,5 ng/ml (SD=345,7, n=4) (Figura 15).

[00314] Em comparação, o nível sérico médio de IgG humana um dia após a injeção de 15 mg/kg de Palivizumabe foi de 15.290,3 ng/ml (SD=6.486,7, n=4) e declinou para a concentração sérica média de 10.096,6

100 / 101 ng/ml (SD=2.110,7, n=5) 5 dias após injeção. RSV-dMAbs expresso in vivo confere proteção contra Doenças Respiratórias Inferiores

[00315] Quando desafiados com o vírus vivo de RSV-A, ratos de algodão tratados com dMAb foram igualmente protegidos da Doença Respiratória Inferior, embora o nível de expressão de RSV-dMAb fosse quase 10 vezes mais baixo que os níveis séricos após injeção de Palivizumabe (Figura 16). Os pulmões de ratos de algodão tratados com dMAb continham carga viral média de 250 pfu (SEM=50, n=4) 5 dias após desafio intranasal. Carga viral semelhante foi medida para os pulmões de ratos de algodão tratados com Palivizumabe: 200 pfu (SEM=0, n=5). Em comparação, os pulmões de ratos de algodão não protegidos continham carga viral alta de

27.520 pfu (SEM=8.408,9, n=5).

[00316] A mesma tendência para infecção reduzida de tecido respiratório inferior foi encontrada quando o número de cópias do genoma viral foi medido com PCR em tempo real, usando o iniciador direcionado Proteína não Estrutural 1 (NS1) de RSV. Níveis médios de mRNA de RSV em ratos de algodão protegidos com dMAb- (mRNA de RSV médio=0,181, SEM=0,050, n=4) e Palivizumabe (mRNA de RSV médio=0,032, SEM=0,004, n=5) foram reduzidos em comparação com animais não protegidos (mRNA de RSV médio=1,175, SEM=0,306, n=5). Conclusão

[00317] O rato de algodão é o modelo padrão ouro para infecção de RSV humana. Estes animais são suscetíveis a RSV humano não adaptado e exibem muitas das características da patologia humana específica do vírus, incluindo os sintomas de Doença Intensificada por Vacina (VED) após imunização com a vacina de RSV inativado com formalina dos anos 1960.

[00318] Atualmente, Palivizumabe (Synagis) é a única opção preventiva aprovada pela FDA para proteger bebês de alto risco de LRI

101 / 101 associada a RSV e de hospitalização. Como a maioria das terapias monoclonais baseadas em anticorpos, o tratamento com Palivizumabe é caro e, devido à estabilidade sensível à temperatura, seu emprego é restrito principalmente a ambientes com infraestrutura altamente desenvolvida.

[00319] Proteína-Palivizumabe e o construto de dMAb otimizado à base de Palivizumabe demonstraram proteção semelhante de LRI após infecção de RSV no modelo pré-clínico mais relevante. Em geral, a fabricação de construtos de dMAb é econômica e os plasmídeos de DNA são estáveis em temperatura.

[00320] Anticorpos monoclonais baseados em DNA em combinação com protocolos de distribuição otimizados emergem como uma alternativa vantajosa a anticorpos monoclonais de proteínas.

[00321] Entende-se que a descrição detalhada anterior e os exemplos anexos são meramente ilustrativos e não serão considerados como limitações sobre o escopo da invenção, que é exclusivamente definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

[00322] Várias mudanças e modificações nas modalidades divulgadas serão evidentes para os especialistas na técnica. Tais mudanças e modificações incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas às estruturas químicas, substituintes, derivados, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso da invenção, podem ser feitas sem afastamento do espírito e escopo da mesma.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico codificando um ou mais anticorpos sintéticos, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em a) uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo sintético anti-Vírus Sincicial Respiratório (RSV); b) uma sequência nucleotídica codificando um fragmento de um anticorpo sintético anti-RSV; c) uma sequência nucleotídica codificando anticorpo sintético anti-RSV de ScFv; e d) uma sequência nucleotídica codificando um fragmento de um anticorpo sintético anti-RSV de ScFv.

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os um ou mais anticorpos sintéticos ligam a um antígeno de RSV.

3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o antígeno é selecionado do grupo consistindo em RSV-F, RSV-G, RSV-Ga, RSV-Gb, RSV-M2-1, RSV M2-2 e qualquer combinação dos mesmos.

4. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sequência nucleotídica codificando um domínio de clivagem.

5. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-RSV.

6. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica codificando uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:

7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6; ou um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos 90% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6.

7. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica pelo menos 90% homóloga a SEQ ID NOs: 1-6 ou um fragmento de uma sequência nucleotídica pelo menos 90% homóloga a SEQ ID NOs: 1-6.

8. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência nucleotídica codifica uma sequência líder.

9. Molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende um vetor de expressão.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda hialuronidase.

13. Anticorpo monoclonal anti-RSV, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6; ou um fragmento de uma sequência de aminoácido pelo menos

90% homóloga à sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:7 e uma sequência de aminoácido codificada por uma de SEQ ID NOs: 1-6.

14. Método para prevenir ou tratar uma doença em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1-9 ou uma composição de qualquer uma das reivindicações 10-12.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a doença é uma infecção pelo vírus Sincicial Respiratório.

16. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1.

17. Formulação de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a formulação compreende ainda hialuronidase.