BR112020014093A2 - vetores imuno-evasivos e uso para terapia gênica - Google Patents

vetores imuno-evasivos e uso para terapia gênica Download PDF

Info

Publication number
BR112020014093A2
BR112020014093A2 BR112020014093-7A BR112020014093A BR112020014093A2 BR 112020014093 A2 BR112020014093 A2 BR 112020014093A2 BR 112020014093 A BR112020014093 A BR 112020014093A BR 112020014093 A2 BR112020014093 A2 BR 112020014093A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
enveloped
aav
viral vector
vector
viral
Prior art date
Application number
BR112020014093-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Genine WINSLOW
Original Assignee
Chameleon Biosciences, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chameleon Biosciences, Inc. filed Critical Chameleon Biosciences, Inc.
Publication of BR112020014093A2 publication Critical patent/BR112020014093A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/00052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se a um vetor viral envelopado que compreende uma partícula viral circundada por um envelope, em que a partícula viral compreende um transgene heterólogo e o envelope compreende uma bicamada lipídica e uma ou mais moléculas imunossupressoras e métodos para preparar e usar o mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “VETO- RES IMUNO-EVASIVOS E USO PARA TERAPIA GÊNICA”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício prioritário dos Pedidos Provisórios U.S. no.62/616.167, depositado em 11 de janeiro de 2018 e Pedido Provisório U.S. no.62/768.779, depositado em 16 de novembro de 2018, cujas descrições completas estão aqui incorporadas por refe- rência.
SUBMISSÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS NO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da seguinte submissão no arquivo de texto AS- CII está incorporado aqui por referência na sua totalidade: um formulário legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do ar- quivo: 774392000l40SeqList.txt, data da gravação: 11 de janeiro de 2019, tamanho: 29KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se de modo geral a vetores aper- feiçoados para terapia gênica com imunogenicidade reduzida.
ANTECEDENTES
[004] Os ensaios clínicos da Terapia Gênica com AAV mostraram que o AAV pode ser usado com segurança para reverter fenótipos de doenças para várias doenças monogênicas, incluindo Atrofia Muscular Espinhal (SMA) (Meliani et al. (2017) Blood Advances, 1 (23): 2019- 31), Hemofilia B (Nathwani et al. (2011) N Engl J Med, 365: 2357-65) e do- enças hereditárias da retina causadas por mutações no gene RPE65 (Simonelli et al. (2010) Molecular Therapy, 18(3): 643-650). Além de da- dos promissores de ensaios clínicos em humanos, há também outros exemplos de dados pré-clínicos promissores que usam a terapia gênica com AAV; por exemplo, Myotubularin Myopathy (Childers et al. (2014) Sci Transl Med, 6: 220ral0). Apesar dos dados clínicos e pré-clínicos positivos, a resposta imune gerada ao AAV recombinante e/ou à prote- ína terapêutica recém-expressa permanece uma barreira ao uso mais difundido da terapia gênica do AAV para o tratamento de distúrbios mo- nogênicos (Mingozzi et al. (2013) Blood, 122 ( 1): 23-36; Chermule et al. (1999) Gene Therapy, 6, 1574-1583; Masat et al. (2013) Discov Med, 15 (85): 379-389).
[005] Embora tenha se tornado evidente que a terapia gênica ba- seada em AAV promete ser curativa, há questões em torno da longevi- dade de um único tratamento. Há evidências de que a liberação medi- ada por AAV da função terapêutica da proteína por até três anos (Na- thwani et al. (2014) N Engl J Med, 371:1994-2004), mas a expressão do transgene ao longo da vida ainda não foi comprovada e em alguns ca- sos é improvável. Os vetores baseados em AAV persistem como ele- mentos epissomais, estruturas de alça de DNA de fita dupla que não se integram nos cromossomos celulares. Por esse motivo, os genomas de AAV não se replicam e se dividem à medida que a célula se divide e podem ser diluídos pela divisão celular. Para garantir a expressão pro- longada do transgene, os pesquisadores da terapia gênica com AAV têm como alvos tipos de células que se dividem lentamente ou que não se dividem; por exemplo, células musculares, hepáticas ou neuro- nais. Portanto, não se sabe se os genes terapêuticos liberados por AAV serão expressos ao longo da vida do paciente. Isso é especialmente verdadeiro em doenças com risco de vida que afetam crianças peque- nas, como a Atrofia Muscular Espinhal, porque as células musculares das crianças passam por mais divisão celular à medida que a criança cresce do que as células musculares adultas. Embora os dados clínicos sugiram que a liberação de um gene terapêutico pelo AAV pode melho- rar os desfechos definidos da doença SMA, é improvável que os níveis de expressão sejam mantidos durante a vida da criança. De fato, mesmo os adultos que recebem a terapia gênica com AAV para células que se dividem lentamente ou que não se dividem provavelmente expe- rimentarão uma redução nos níveis de proteína terapêutica ao longo da vida do paciente, devido à diluição dos genomas de AAV nas células transduzidas. Portanto, seria vantajoso ser capaz de liberar doses adi- cionais de produtos de terapia gênica com AAV.
[006] A resposta imune do hospedeiro à terapia gênica com AAV continua sendo um obstáculo que deve ser superado antes que a terapia gênica com AAV possa ser usada mais amplamente. Como o AAV é um vírus que ocorre naturalmente, porções da população de pacientes pos- suem anticorpos pré-existentes para diferentes sorotipos do AAV. Por exemplo, anticorpos preexistentes para AAV2, o sorotipo mais comum, podem ser encontrados em até 60% da população (Chiermule et al (1999) Gene Therapy; 6, 1574-1583). Outros sorotipos de AAV são me- nos comuns, mas não podem ser utilizados para atingir todos os tipos de tecido; por exemplo, o AAV5 infecta preferencialmente o fígado e o AAV8 tem como alvo preferencial as células musculares (Asokan et al. (2012) Molecular Therapy, 20 (4) 699-708). Um vetor de AAV da pró- xima geração que pode ser seletivamente direcionado para tecidos es- pecíficos enquanto evita os anticorpos preexistentes contra o AAV au- mentaria a população potencial de pacientes e permitiria o uso de uma única plataforma de fabricação para direcionar os vetores para múltiplas doenças alvos.
[007] As respostas imunes do hospedeiro à terapia gênica com AAV impedem a administração de segundas doses do produto devido a respostas imunes adaptativas específicas do capsídeo. Além disso, uma resposta das células T à nova expressão de uma proteína terapêu- tica pode reduzir a eficácia dos produtos de terapia gênica com AAV (Mingozzi et al. (2013) Blood, 122 (1): 23-36).
[008] Têm sido feitos esforços para reduzir o efeito da resposta imune do hospedeiro na terapia com AAV. Por exemplo, o AAV envelo- pado (também conhecido como “exo-AAV”) mostrou ser mais eficaz do que o AAV não envelopado; acredita-se que seja devido à proteção do vetor, em certa medida, da capacidade dos anticorpos anti-AAV de de- purar o vetor In vivo e in vitro (Gyorgy et al. (2014) Biomaterials, 35 (26): 7598-7609; Hudry et al. (2016) Gene Ther, 23 de abril (4): 380-92; US 2013/020559). Além disso, existem evidências de que a coadministra- ção de um AAV que codifique PD-L1 ou PD-L2 com CTLA-4-Ig prolon- gue a expressão do transgene e resulte em menos células T responsi- vas ao transgene (Adriouch et al. (2011) Front Microbiol, 2: 199). A pre- sente invenção utiliza a tecnologia de AAV envelopado combinada com moléculas que modulam o ponto de verificação imune para criar Vetores Efetores para reduzir a resposta imune e restrições na dosagem e faci- litar a repetição da dosagem de um gene terapêutico.
[009] Ainda existe a necessidade de novos vetores virais e méto- dos que melhorem a liberação e a expressão do transgene enquanto minimizam o efeito da resposta imune do hospedeiro.
[0010] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de pa- tente e publicações, estão incorporadas por referência na sua totali- dade.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] É aqui fornecido um vetor viral envelopado que compreende uma partícula de vetor circundada por um envelope, em que a partícula do vetor compreende um transgene e o envelope compreende uma ou mais moléculas imunossupressoras. Também é fornecida uma compo- sição farmacêutica que compreende o vetor viral envelopado e um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0012] Também é fornecido um método de liberação de um trans- gene para uma célula ou um indivíduo, que compreende a administra- ção do vetor viral envelopado em uma célula ou um indivíduo, assim como um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um in- divíduo através da administração do vetor viral envelopado ao indiví- duo.
[0013] É ainda fornecido um método de produção do vetor viral en- velopado, o método compreendendo (a) cultivar células produtoras vi- rais (isto é, in vitro) sob condições para gerar partículas virais envelopa- das, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana e (b) coletar os vetores virais envelopados.
[0014] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma composição que compreende um vetor viral envelopado, em que o vetor viral enve- lopado compreende uma partícula de vetor envolvida por envelope, em que o envelope compreende uma ou mais moléculas que fornecem fun- ções efetoras imunes. Em algumas modalidades, as funções efetoras imunes reduzem a imunogenicidade do vetor envelopado em compara- ção com um vetor sem moléculas efetoras imunes. Em algumas moda- lidades, as funções efetoras imunes estimulam inibidores imunes. Em outras modalidades, as funções efetoras imunes inibem moléculas esti- muladoras imunes. Em algumas modalidades, o envelope compreende moléculas que estimulam inibidores imunes e moléculas que inibem mo- léculas estimuladoras imunes. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes incluem, mas não se limitam a uma ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD-L1, PD- L2, CD28 ou VISTA. Em algumas modalidades, o envelope compreende CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA-4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2, PD- L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD-L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD-L1 e PD-L2 e VISTA ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes compreendem um do-
mínio transmembrana. Em algumas modalidades, o envelope compre- ende ainda moléculas de direcionamento que direcionam o vetor para um ou mais tipos de células. Em algumas modalidades, as moléculas de direcionamento conferem especificidade de tecido ao vetor envelo- pado. Em algumas modalidades, a molécula alvo é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é o anticorpo 8D7. Em algumas mo- dalidades, a uma ou mais moléculas de direcionamento compreendem um domínio transmembrana.
[0015] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, o vetor viral compreende uma partícula viral. Em algumas moda- lidades, a partícula viral compreende um capsídeo viral e um genoma viral. Em algumas modalidades, o genoma viral compreende um ou mais transgenes heterólogos. Em algumas modalidades, o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o trans- gene heterólogo codifica um polipeptídeo terapêutico ou um polipeptí- deo repórter. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico é Fator VIII, Fator IX, miotubularina, SMN, RPE65, cadeia 4 de NADH- ubiquinona oxidoredutase, CHM, huntingtina, alfa-galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-glicosidase, ornitina transcarbamilase, argi- nino succinato sintetase, β-globina, y-globina, fenilalanina hidroxilase ou ALD. Em algumas modalidades, o transgene heterólogo codifica um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antisenso, RNAzima ou DNAzima. Em algumas modalidades, o transgene heterólogo codifica um ou mais produtos gênicos de edição de genes. Em algumas modali- dades, o um ou mais produtos gênicos de edição de genes é uma CAS nuclease e/ou uma ou mais sequências guia e/ou uma ou mais sequên- cias doadoras.
[0016] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades acima, o vetor viral é um vetor viral adeno-associado (AAV) ou um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor viral adeno- associado. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende um capsídeo do sorotipo de AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 ou AAV12. Em algu- mas modalidades, o vetor de AAV compreende um genoma viral de AAV que compreende sequências de repetição terminal invertida (ITR) do so- rotipo de AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rAAV10. Em algumas modalidades, o capsídeo do AAV e a ITR do AAV são do mesmo sorotipo ou de sorotipos diferentes.
[0017] Em algumas modalidades dos aspectos e modalidades aci- ma, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral é derivado do vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imunodeficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral não é replicável. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral não é integrador.
[0018] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende qualquer uma das composições descritas acima e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitá- veis.
[0019] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método de libe- ração de um transgene para um indivíduo, compreendendo a adminis- tração de uma composição que compreende um vetor viral envelopado para o indivíduo, em que o vetor viral envelopado compreende uma par- tícula de vetor envolvida por envelope, em que o envelope compreende um ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes e em que a partícula viral compreende um genoma viral que compreende o trans- gene. Em alguns aspectos, a invenção fornece um método de trata- mento de um indivíduo com uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma composição que compreende um vetor viral en- velopado para o indivíduo necessitado, em que o vetor viral envelopado compreende uma partícula de vetor envolvida por envelope. Em algu- mas modalidades, as funções efetoras imunes reduzem a imunogenici- dade do vetor envelopado em comparação com um vetor sem moléculas efetoras imunes. Em algumas modalidades, as funções efetoras imunes estimulam inibidores imunes. Em outras modalidades, as funções efe- toras imunes inibem moléculas estimuladoras imunes. Em algumas mo- dalidades, o envelope compreende moléculas que estimulam inibidores imunes e moléculas que inibem moléculas estimuladoras imunes. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes incluem um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD- L1, PD-L2, CD28 ou VISTA. Em algumas modalidades, o envelope com- preende CTLA4 e PD-L1 ou CTLA e PD-L2. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunológicas compreende um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o envelope compreende ainda moléculas de direcionamento que direcio- nam o vetor para um ou mais tipos de células. Em algumas modalida- des, as moléculas de direcionamento conferem especificidade para o tecido ao vetor envelopado. Em algumas modalidades, a molécula de direcionamento é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é o anticorpo 8D7. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de direcionamento compreendem um domínio transmembrana
[0020] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor viral compreende uma partícula viral. Em algumas modalidades, a partícula viral compreende um capsídeo viral e um genoma viral. Em algumas modalidades, o genoma viral compreende um ou mais transgenes hete- rólogos. Em algumas modalidades, o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo terapêutico ou um polipeptídeo repórter. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico é Fator VIII, Fator IX, miotubu- larina, SMN, RPE65, cadeia 4 da NADH-ubiquinona oxidoredutase,
CHM, huntingtina, alfa-galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-gli- cosidase, ornitina transcarbamilase, arginino succinato sintetase, β-glo- bina, y-globina, fenilalanina hidroxilase ou ALD. Em algumas modalida- des, o transgene heterólogo codifica um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antissenso, RNAzima ou DNAzima. Em algumas modalidades, o transgene heterólogo codifica um ou mais produtos gê- nicos de edição de genes. Em algumas modalidades, o um ou mais pro- dutos gênicos de edição de genes é uma CAS nuclease e/ou uma ou mais sequências guia e/ou uma ou mais sequências doadoras.
[0021] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor viral é um vetor viral adeno-associado (AAV) ou um vetor lentiviral. Em algu- mas modalidades, o vetor viral é um vetor viral adeno-associado. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende um capsídeo do so- rotipo AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 ou AAV12. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende um genoma viral de AAV que compreende sequências de repetição terminal invertida (ITR) do sorotipo de AAV hu- mano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, r AAV10. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV e a ITR de AAV são do mesmo sorotipo ou de sorotipos diferentes.
[0022] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral é deri- vado do vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imunodeficiên- cia de símio ou um vírus da imunodeficiência felina. Em algumas moda- lidades, o vetor lentiviral não é replicável. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral não é integrador.
[0023] Em algumas modalidades dos métodos acima, a composição é uma composição farmacêutica que compreende o vetor viral envelo- pado e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0024] Em algumas modalidades dos métodos acima, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é doença monogênica. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é a mio- patia miotobular, atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Le- ber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, do- ença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenilcetonúria (PKU), adrenoleucodistrofia, doença das células falciformes ou beta talassemia.
[0025] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método para produzir um vetor viral envelopado com imunogenicidade reduzida, o método compreendendo a) cultivar células produtoras virais sob condi- ções para gerar partículas virais envelopadas, em que as células produ- toras virais compreendem um ácido nucleico que codifica uma ou mais uma ou mais funções efetoras imunes ligadas à membrana que redu- zem a imunogenicidade do vetor envelopado, e b) coletar os vetores virais envelopados. Em algumas modalidades, as funções efetoras imu- nes reduzem a imunogenicidade do vetor envelopado. Em algumas modalidades, as funções efetoras imunes estimulam inibidores imu- nes. Em algumas modalidades, as funções efetoras imunes inibem mo- léculas estimuladoras imunes. Em algumas modalidades, as células produtoras virais compreendem moléculas que codificam ácido nucleico que estimulam inibidores imunes e moléculas que inibem moléculas es- timuladoras imunes. Em algumas modalidades, a uma ou mais molécu- las que fornecem funções efetoras imunológicas inclui um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD28 ou VISTA. Em algumas modalidades, as células produtoras virais compreendem um ácido nu- cleico que codifica CTLA4 e PD-L1 ou CTLA e PD-L2. Em algumas mo- dalidades, a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes compreende um domínio transmembrana. Em algumas modali- dades, o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que for- necem funções efetoras imunes é transitoriamente introduzido nas cé- lulas produtoras virais. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imu- nes é mantido estavelmente nas células produtoras virais. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes está integrado ao genoma da célula produtora viral.
[0026] Em algumas modalidades dos métodos acima, as células produtoras virais compreendem um ácido nucleico que codifica uma ou mais moléculas de direcionamento que direcionam o vetor para um ou mais tipos de células. Em algumas modalidades, as moléculas de dire- cionamento conferem especificidade de tecido ao vetor envolvido. Em algumas modalidades, a molécula alvo é um anticorpo. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo é o anticorpo 8D7. Em algumas modalidades, a uma ou mais moléculas de direcionamento compreendem um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codi- fica a uma ou mais moléculas alvo é transitoriamente introduzido nas células produtoras virais. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas alvo é mantido estavelmente nas células produtoras virais. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que atingem moléculas é inte- grado ao genoma da célula produtora viral.
[0027] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor viral envelopado é um vetor de AAV envelopado. Em algumas modalidades, as células produtoras virais compreendem a) um ácido nucleico que co- difica genes rep e cap de AAV, b) um ácido nucleico que codifica um genoma viral de AAV que compreende um transgene e pelo menos uma ITR, e c) funções auxiliares de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são introduzidos transitoriamente na linhagem celular produ- tora. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são mantidos de maneira estável na linhagem celular do produtor. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são integrados de maneira estável no genoma da linhagem celular produtora. Em algumas modalidades, o genoma do rAAV com- preende duas ITRs de AAV. Em algumas modalidades, uma ou mais funções auxiliares de AAV são fornecidas por um ou mais de um plas- mídeo, um adenovírus, um ácido nucleico estavelmente integrado no genoma celular ou em um vírus do herpes simplex (HSV). Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções E1A de adenovírus, função E1B de adenovírus, função E2A de adenovírus, função E4 de adenovírus e função VA adenovírus. Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções HSV UL5, função HSV UL8, função HSV UL52 e função HSV UL29.
[0028] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor viral envelopado é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor len- tiviral é um vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imunodefici- ência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina. Em algumas mo- dalidades, as células produtoras virais compreendem a) um ácido nu- cleico que codifica o gene gag lentiviral, b) ácido nucleico que codifica o gene pol lentiviral, c) ácido nucleico que codifica um vetor de transferên- cia lentiviral que compreende um transgene, uma repetição 5’ terminal longa (LTR) e uma 3'LTR, em que toda ou parte de uma região U3 da 3’ LTR é substituída por um elemento regulador heterólogo, um sítio de ligação ao iniciador, todo ou parte do gene GAG, um trato de polipurina central, códons de parada sintéticos na sequência de GAG, elemento responsivo rev e um aceptor de splice env.
[0029] Em algumas modalidades dos métodos acima, o vetor enve- lopado é ainda purificado.
[0030] Em alguns aspectos, a invenção fornece um kit que compre- ende qualquer uma das composições aqui descritas. Em algumas mo- dalidades, o kit compreende ainda instruções de uso.
[0031] Em alguns aspectos, a invenção fornece uma composição para uso na liberação de um ácido nucleico a um indivíduo necessitado, de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição para uso no trata- mento de uma doença ou distúrbio de um indivíduo necessitado, de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos. Em algumas mo- dalidades, a invenção fornece o uso da composição tal como aqui des- crita na fabricação de um medicamento para a liberação de um ácido nucleico a um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, a in- venção fornece o uso da composição tal como aqui descrita na fabrica- ção de um medicamento para o tratamento de um indivíduo com uma doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenilcetonúria (PKU), adrenoleucodistrofia, doença das células falciformes ou beta talassemia.
[0032] Em alguns aspectos, a invenção fornece um artigo de fabri- cação que compreende a composição como aqui descrita.
[0033] São fornecidas composições e métodos adicionais, con- forme descrito na descrição detalhada da invenção a seguir.
[0034] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSA FIG. 1 mostra um esquema exemplificador de um vetor efetor. Neste exemplo em particu- lar, um vetor de AAV é envolvido em uma membrana celular manipulada para apresentar funções efetoras imunológicas, assim como funções de direcionamento celular na superfície da partícula viral envelopada.
[0035] A FIG. 2 mostra uma molécula efetora exemplificadora.
[0036] A FIG. 3 mostra a presença de PDL1 de camundongo (painel esquerdo) e CTLA4 de camundongo nos envelopes dos vetores EVA- DER. Os histogramas de FACS mostram Vetores de AAV e EVADER envelopados, corados com anticorpos anti-PDL1 anti-camundongo e anti-CTLA-4 de camundongo. Os histogramas de AAV envelopados são superpostos sobre os histogramas do Vetor Efetor para mostrar os ní- veis elevados de coloração de PDL-1 ou CTLA-4 de vetores purifica- dos. Os Vetores Efetores têm níveis mais altos de PDL-1 e CTLA-4 do que os vetores de AAV envelopados. EVADER são Vetores Efetores.
[0037] A FIG. 4 mostra gráficos que mostram os níveis de FIX hu- mano em camundongos 3 e 6 semanas após a injeção inicial. Para ca- mundongos fêmeas em 3 semanas: *p = 0,036; **p+0,002; ****p <0,0001. Para camundongos machos em 3 semanas: ****p <0,0001. Para camundongos fêmeas em 6 semanas: std vs. evader p=0,0002; exo vs. evader p=0,0006. Evader é mEV-AAV-hFIX. Exo é AAV envelopado.
[0038] A FIG. 5 mostra gráficos de títulos de anticorpos IgG anti- AAV8 no soro de camundongos nas semanas 3 e 6.
[0039] A FIG. 6 mostra gráficos de títulos de anticorpos neutralizan- tes para o AAV8 nas semanas 3 e 6.
[0040] A FIG. 7 mostra gráficos que representam os números de cópias do genoma do vetor (VGCN) de fígados de camundongos ma- chos ou fêmeas nas semanas 3 e 6.
[0041] A FIG. 8 mostra gráficos que representam os números de cópias do genoma do vetor (VGCN) de fígados combinados de camun- dongos machos e fêmeas nas semanas 3 e 6.
[0042] A FIG. 9 mostra gráficos que representam os números de cópias do genoma do vetor (VGCN) de fígados combinados de camun- dongos machos e fêmeas na semana 6, incluindo a análise estatística.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0043] É fornecido aqui um vetor viral envelopado que compreende uma partícula viral parcialmente ou completamente circundada por um envelope, em que o envelope compreende uma bicamada lipídica e uma ou mais moléculas supressoras imunes, tais como reguladores negati- vos de pontos de verificação imunes. Em algumas modalidades, os ví- rus envelopados (por exemplo, AAV ou lentivírus) são produzidos por "brotamento" a partir das membranas celulares produtoras virais. As moléculas de modulação imune incorporadas nas membranas das cé- lulas produtoras são, portanto, transferidas para o vírus envelopado por- que o envelope compreende uma porção da membrana celular produ- tora. Como descrito em detalhes nas seções a seguir, o vetor viral en- velopado é útil para a liberação de um ácido nucleico (transgene) em uma célula ou indivíduo e é considerado ser resistente à resposta imune gerada pelo hospedeiro. O vetor viral envelopado e métodos para seu uso e produção estão descritos em detalhes nas seções a seguir. I. TÉCNICAS GERAIS
[0044] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados aqui são geralmente bem entendidos e comumente usados usando a metod- ologia convencional por aqueles versados na técnica, tal como, por ex- emplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Har- bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Proto- cols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series
Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Ap- proach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); An- tibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Syn- thesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practi- cal Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Anti- bodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Har- low and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The An- tibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publish- ers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011). II. DEFINIÇÕES
[0045] Para os propósitos de interpretação deste pedido, as seguin- tes definições serão aplicadas, salvo indicação em contrário. Sempre que apropriado, as expressões usadas no singular também incluirão o plural e vice-versa. No caso de qualquer definição estabelecida abaixo entrar em conflito com qualquer documento aqui incorporado por refe- rência, a definição estabelecida prevalecerá.
[0046] Como usada aqui, a forma singular "o/a", "um/uma" inclui re- ferências no plural, a menos que indicado de outra maneira.
[0047] O uso da expressão "pelo menos um" seguido de uma lista de um ou mais itens (por exemplo, "pelo menos um de A e B") deve ser interpretado como um item selecionado entre os itens listados ( A ou B) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.
[0048] É entendido que aspectos e modalidades da descrição aqui divulgada incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo es- sencialmente em” tais aspectos e modalidades.
[0049] Para todas as composições descritas aqui e todos os méto- dos que utilizam uma composição aqui descrita, as composições podem compreender os componentes ou etapas listados, ou podem "consistir essencialmente em" ou "consistir" nos componentes ou etapas lista- dos. Quando uma composição é descrita como “consistindo essencial- mente nos” componentes listados, a composição contém os componen- tes listados e pode conter outros componentes que não afetam substan- cialmente os métodos descritos, mas não contêm quaisquer outros com- ponentes que afetam substancialmente os métodos descritos diferentes daqueles componentes expressamente listados; ou, se a composição contiver componentes extras diferentes daqueles listados, que afetam substancialmente os métodos divulgados, a composição não contém uma concentração ou quantidade suficientes de componentes extras para afetar substancialmente os métodos descritos. Quando um método é descrito como "consistindo essencialmente” nas etapas listadas, o mé- todo contém as etapas listadas e pode conter outras etapas que não afetam substancialmente os métodos descritos, mas o método não con- tém outras etapas que afetam substancialmente os métodos descritos diferentes daquelas etapas expressamente listadas. Como um exemplo específico não limitante, quando uma composição é descrita como 'con- sistindo essencialmente em' um componente, a composição pode adici- onalmente conter qualquer quantidade de transportadores, veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e outros componentes que não afetam substancialmente as propriedades de composição ou os méto- dos descritos.
[0050] A expressão "cerca de", como usada aqui, se refere à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido por aquele versado na técnica. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para esse valor ou parâmetro em si.
[0051] A expressão "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", como usada aqui, se refere a uma forma polimérica de nucleotídeos de qual- quer extensão, ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou combina- ção dos mesmos. Assim, esta expressão inclui, mas não está limitada a DNA ou RNA de cadeia simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero que compreende bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, quimicamente ou bio- quimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas. O arcabouço do polinucleotídeo pode compreender açúcares e grupos fosfato (como pode ser tipicamente encontrado no RNA ou DNA), ou grupos de açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. Alternativamente, o arcabouço do polinucleotídeo pode compreender um polímero de subunidades sin- téticas tais como fosforamidatos e, portanto, pode ser um fosforamidato de oligodesoxinucleosídeo (P-NH2) ou um oligômero de fosforamidato- fosfodiéster misto. Além disso, um polinucleotídeo de fita dupla pode ser obtido a partir do produto de polinucleotídeo de fita simples da síntese química, sintetizando a fita complementar e anelando as fitas sob con- dições apropriadas ou sintetizando a fita complementar de novo usando uma DNA polimerase com um iniciador apropriado.
[0052] As expressões "polipeptídeo" e "proteína" são usadas de forma alternativa para se referir a um polímero de resíduos de aminoá- cidos, e não estão limitadas a qualquer extensão mínima ou máxima específica. Tais polímeros de resíduos de aminoácidos podem conter resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais e incluem, mas não estão limitados a peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multí- meros de resíduos de aminoácidos. Ambas as proteínas de extensão completa e seus fragmentos estão abrangidas pela definição. As ex- pressões também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação e simila- res. Além disso, para os propósitos da presente invenção, um "polipep- tídeo" se refere a uma proteína que inclui modificações, tais como dele- ções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade dese- jada. Essas modificações podem ser deliberadas, como por meio de mutagênese direcionada ao sítio, ou podem ser acidentais, tal como por meio de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação por PCR.
[0053] Um "vetor viral" se refere a um vetor de polinucleotídeo que compreende uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico de origem não viral) que são flanqueadas por pelo menos uma ou duas sequências de repetição (por exemplo, sequências de re- petição terminal invertidas (ITRs) para AAV ou repetições terminais lon- gas (LTRs) para lentivírus). O ácido nucleico heterólogo é referido como uma "carga útil" a ser entregue como um "cassete" e é frequentemente flanqueado por pelo menos uma ou duas sequências de repetição (por exemplo, sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) para AAV ou repetições terminais longas (LTRs) para lentivírus). Tais vetores vi- rais podem ser replicados e empacotados em partículas virais infeccio- sas quando presentes em uma célula hospedeira, desde que a célula hospedeira forneça as funções essenciais. Quando um vetor viral é in- corporado em um polinucleotídeo maior (por exemplo, em um cromos- somo ou em outro vetor, tal como um plasmídeo usado para clonagem ou transfecção), o vetor viral pode ser referido como um "pró-vetor" que pode ser "resgatado" por replicação e encapsidação na presença de re- plicação viral e funções de embalagem. Um vetor viral pode ser empa- cotado no capsídeo do vírus para gerar uma "partícula viral". Em alguns aspectos, uma partícula viral se refere a um capsídeo viral juntamente com o genoma viral e a carga útil de ácido nucleico heterólogo.
[0054] "Heterólogo" significa derivado de uma entidade genotipica- mente distinta daquela do restante da entidade à qual é comparada ou na qual é introduzida ou incorporada. Por exemplo, um polinucleotídeo introduzido por técnicas de manipulação genética em um tipo de célula diferente é um polinucleotídeo heterólogo (e, quando expresso, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). Da mesma forma, uma sequência celular (por exemplo, um gene ou uma porção do mesmo) que é incor- porada a um vetor viral é uma sequência de nucleotídeos heteróloga em relação ao vetor. Um ácido nucleico heterólogo pode se referir a um ácido nucleico derivado de uma entidade genotipicamente distinta da- quela do restante da entidade à qual é comparado ou no qual é introdu- zido ou incorporado. Heterólogo também pode ser usado para se referir a outros componentes biológicos (por exemplo, proteínas) que não são nativas das espécies nas quais são introduzidos. Por exemplo, uma pro- teína expressa em uma célula a partir de um ácido nucleico heterólogo poderia ser uma proteína heteróloga em relação à célula. Um ácido nu- cleico introduzido em uma célula ou organismo por técnicas de manipu-
lação genética pode ser considerado "exógeno" para a célula ou orga- nismo, independentemente de ser heterólogo ou homólogo à célula ou organismo. Assim, por exemplo, um vetor poderia ser usado para intro- duzir uma cópia adicional do gene humano em uma célula humana. O gene introduzido na célula seria exógeno para a célula, embora possa conter uma sequência homóloga (nativa) de ácido nucleico.
[0055] Uma molécula (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) ou célula "isolada" significa que foi identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente de seu ambiente natural.
[0056] "Manipulado" ou "geneticamente manipulado" e expressões similares são usadas para se referir a materiais biológicos que são arti- ficialmente modificados geneticamente (por exemplo, usando técnicas de laboratório) ou resultam de tais modificações genéticas.
[0057] Como usado aqui, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os propósitos desta in- venção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a alívio dos sintomas, diminuição da extensão da do- ença, estado de doença estabilizado (por exemplo, não agravado), pre- venção da disseminação (por exemplo, metástases) da doença, retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou atenuação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectá- vel. “Tratamento” também pode significar prolongar a sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não estiver recebendo trata- mento.
[0058] Como usada aqui, a expressão "tratamento profilático" se re- fere ao tratamento, em que um indivíduo é conhecido ou suspeito de ter ou estar em risco de ter um distúrbio, mas não apresentou sintomas ou sintomas mínimos do distúrbio. Um indivíduo em tratamento profilático pode ser tratado antes do início dos sintomas.
[0059] Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos (por exemplo, melhora de sintomas, obtenção de desfechos clínicos e similares). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de um estado de doença, uma quanti- dade eficaz é uma quantidade suficiente para melhorar, estabilizar ou retardar o desenvolvimento de uma doença.
[0060] Para qualquer uma das características estruturais e funcio- nais descritas aqui, os métodos para determinar essas características são conhecidos na técnica. III. Vetores
[0061] É aqui fornecido um vetor viral envelopado que compreende uma partícula viral circundada parcialmente ou completamente por um envelope, em que o envelope compreende uma bicamada lipídica e uma ou mais moléculas imunossupressoras. Uma representação esquemá- tica de um vetor efetor é mostrada na Fig. 1. Em algumas modalidades, os vetores virais envelopados aqui fornecidos podem fornecer uma carga útil de transgene de ácido nucleico mais eficazmente e/ou mais eficientemente do que o mesmo vetor envelopado sem envelope ou com um envelope que não foi manipulado para incluir moléculas imunossu- pressoras no envelope.
[0062] Em algumas modalidades, as partículas virais envelopadas são manipuladas para reduzir a imunidade para a partícula viral em comparação com a partícula viral nativa. Em algumas modalidades, as partículas virais envelopadas são manipuladas para reduzir a imunidade para o produto do transgene viral em comparação com um vetor que compreende uma partícula viral nativa que codifica um produto do trans- gene. Em algumas modalidades, a partícula viral envelopada não é en- velopada em seu estado nativo típico; por exemplo, partículas de vírus adeno-associado (AAV) e partículas adenovirais. Em outras modalida- des, a partícula viral nativa é envelopada; por exemplo, retrovírus e vírus do herpes, em que o envelope é manipulado para modular a imunidade para partícula viral e/ou produto do transgene viral.
[0063] Por exemplo, em algumas modalidades, o vetor viral envelo- pado (por exemplo, AAV envelopado) compreendendo moléculas imu- nossupressoras no envelope, conforme fornecido aqui, fornece níveis de expressão de transgene 3 semanas após a administração como uma dose única (por exemplo, 2 x 1011 para 2 x 1012 vg kg) a um indivíduo, que são aumentados em cerca de 50% ou mais (cerca de 75% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 125% ou mais, cerca de 150% ou mais, cerca de 150% ou mais, cerca de 175% ou mais, ou mesmo cerca de 200% ou mais) em comparação com aquele produzido pela adminis- tração de um vetor viral não envelopado do mesmo tipo sob as mesmas condições (por exemplo, mesmo transgene, mesmo indivíduo, mesma dose e via de administração, etc., com a única diferença sendo o vetor).
[0064] Além disso, em algumas modalidades, o vetor viral envelo- pado (por exemplo, AAV envelopado) que compreende moléculas imu- nossupressoras no envelope, como fornecido aqui, fornece níveis de expressão de transgene 3 semanas após a administração como uma dose única (por exemplo, 2 X 1011 a 2 x 1012 vg/kg) para um indivíduo, aumentados em cerca de 20% ou mais (cerca de 50% ou mais, cerca de 75% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 125% ou mais, cerca de 150% ou mais, cerca de 175% ou mais, ou mesmo cerca de 200% ou mais) em comparação com aqueles produzi- dos pela administração de um vetor viral envelopado do mesmo tipo sem a moléculas imunossupressoras (produzidas a partir do mesmo tipo de célula produtora, com exceção de que a célula hospedeira não foi manipulada para expressar as moléculas imunossupressoras) nas mes- mas condições (por exemplo, mesmo transgene, mesmo indivíduo, mesma dose e via de administração, etc., com a única diferença sendo o vetor).
[0065] É considerado ainda que o vetor envelopado que compre- ende as moléculas imunossupressoras aqui fornecidas minimiza a imu- nossupressão global que resulta da administração de moléculas imu- nossupressoras solúveis (por exemplo, CTLA4/Ig, abatacept). Em algu- mas modalidades, o vetor viral envelopado (por exemplo, AAV envelo- pado) que compreende as moléculas imunossupressoras no envelope, como aqui fornecido, após a administração em uma quantidade eficaz a um indivíduo, particularmente um humano (por exemplo, uma dose de 2 x 1011 vg/kg ou uma dose de 5 x 1011 vg/kg) causa imunossupressão global que é menor do que aquela causada por uma única administração de 10 mg/kg de CTLA4/Ig (ou em algumas modalidades, 2 mg/kg de CTLA4/Ig), como medido dentro de 2 a 3 semanas após a administra- ção, de acordo com um aumento no total de anticorpos anti-IgG circu- lantes, ou um aumento nos anticorpos específicos para o antígeno ou células T CD4+ ou CD8+ ativadas que são estimuladas por antígenos diferentes daqueles derivados do vetor administrado.
[0066] Sem desejar estar ligado a qualquer teoria ou mecanismo de ação particulares, é considerado que o vetor viral envelopado aqui for- necido evite o efeito da resposta imune do hospedeiro ao vetor ou ao produto de transgene viral, pela supressão da resposta imune do hos- pedeiro e/ou blindagem do vetor contra o efeito da resposta imune ge- rada pelo hospedeiro. Por exemplo, o vetor da invenção pode reduzir o número de anticorpos que neutralizam vetores, produzidos pelo hospe- deiro ou reduzir a eficácia desses anticorpos na neutralização do ví- rus. Do mesmo modo, o vetor da invenção pode reduzir o número de anticorpos produzidos pelo hospedeiro para o produto do transgene viral ou reduzir a eficácia desses anticorpos na inibição da expressão do pro- duto do transgene. O vetor da invenção também poderá reduzir a infla- mação tipicamente associada com os vetores da terapia de gene con- vencional, resultando em expressão aumentada do transgene.
[0067] Assim, em algumas modalidades, o vetor viral envelopado tem a imunogenicidade reduzida em um hospedeiro, comparado com uma partícula viral nativa ou não envelopada ou a uma partícula viral envelopada do mesmo tipo, mas com um envelope que não é manipu- lado para incluir imunossupressores moléculas no envelope. Em algu- mas modalidades, o vetor viral envelopado reduz a imunidade do hos- pedeiro ao produto de transgene viral em comparação com um vetor do mesmo tipo que compreende uma partícula viral nativa ou não envelo- pada ou uma partícula viral envelopada do mesmo tipo, mas com um envelope que não é manipulado para incluir moléculas imunossupres- soras no envelope. (A) Vetores Virais
[0068] Qualquer vetor viral que pode se associar com uma bica- mada lipídica de modo a para fornecer um vírus envelopado pode ser usado. Em algumas modalidades, a partícula viral envelopada é um tipo que normalmente não é envelopado em seu estado nativo, tal como par- tículas de vírus adeno-associado (AAV) e partículas adenovirais. Em outras modalidades, a partícula viral nativa é de um tipo que é tipica- mente envelopado, tal como retrovírus e vírus do herpes.
[0069] Em algumas modalidades, o vetor viral compreende uma partícula viral de AAV. AAV é um membro da família dos parvovírus e tipicamente não é usado como um vírus envelopado. Qualquer vetor de AAV adequado para a liberação de um transgene pode ser usado. A partícula de AAV pode compreender uma proteína do capsídeo de AAV e um genoma viral de AAV de qualquer sorotipo. Os sorotipos de AAV incluem, mas não estão limitados a AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou AAV 12. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um capsídeo viral de AAV e um genoma viral de AAV do mesmo sorotipo. Em outras modali- dades, o genoma viral do AAV e o capsídeo do AAV são de diferentes sorotipos. Por exemplo, o capsídeo viral do AAV pode ser um capsídeo viral de AAV6 e o genoma viral de AAV pode ser um genoma viral de AAV2. Em algumas modalidades, o AAV é um AAV auto-complementar (scAAV). Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de AAV8 ou AAV2/8, particularmente scAAV8 ou scAAV2/8).
[0070] Em algumas modalidades, o vetor viral envelopado compre- ende partículas lentivirais. Qualquer lentivírus adequado para a libera- ção de transgene pode ser usado, incluindo, mas não limitado a, vírus da imunodeficiência humana, vírus da imunodeficiência de símio e vírus da imunodeficiência felina. Tipicamente, o vetor lentiviral não é replicável. O vetor lentiviral pode ser um vetor lentiviral integrador ou não integrador. Em algumas modalidades, o genoma lentiviral não pos- sui os genes vif, vpr, vpu, tat, rev, nef. Em algumas modalidades, o ge- noma lentiviral compreende um transgene heterólogo, uma repetição terminal longa 5' (LTR) e uma 3’LTR, em que toda ou parte de uma re- gião U3 da 3’LTR é removida ou substituída por um elemento regulador heterólogo.
[0071] A partícula viral, especificamente o genoma viral, incluirá um ácido nucleico heterólogo (por exemplo, um transgene) a ser liberado (a "carga útil") ou pode ser um vetor vazio. A natureza particular do ácido nucleico a ser liberado depende do uso final desejado e o vetor envelo- pado da invenção não está limitado a qualquer uso ou carga útil em particular. Em algumas modalidades, o ácido nucleico da carga útil ex- pressará uma proteína biológica, por exemplo, fator VIII (por exemplo, F8 humano (UniProtKB - Q2VF45), variante SQ-FVIII de um gene de fator VIII humano com deleção do domínio B (BDD) (Lind et al., 1995 Eur J Biochem. Aug 15;232(1):19-27)) ou outras variantes conhecidas), Fator IX (por exemplo, Fator IX humano UniProtKB - P00740; ou Fator IX humano (R338L) “Padua” (Monahan et al., 2015 Hum Gene Ther., 26(2): 69-81, ou outras variantes conhecidas), miotubularina, SMN,
RPE65, cadeia 4 de NADH-ubiquinona oxidoredutase, CHM, hunting- tina, alfa-galactosidase A, acid beta-glicosidase, alfa-glicosidase, Orni- tina transcarbamilase, argininosuccinato sintetase, β-globina, γ-globina, fenilalanina hidroxilase or ALD. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico da carga útil codifica a sequência de aminoácidos do Fator VIII humano da SEQ ID NO.1. Em algumas modalidades, a se- quência de ácido nucleico da carga útil codifica uma sequência de ami- noácidos do Fator VIII humano que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.1. Em outras modalidades, o ácido nucleico da carga útil codifica uma molécula repórter, por exemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha, proteína fluorescente amarela, luciferase, fosfatase alcalina ou beta-galactosidase. Ainda em outras modalidades, a carga útil do ácido nucleico codifica um ácido nucleico terapêutico, tal como um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antissenso, RNA- zima ou DNAzima, Em outras modalidades ainda, a carga útil de ácido nucleico codifica um ou mais produtos de edição de gene, tal como uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9, CPF1, etc.), um ácido nucleico guia para uma endonuclease guiada por RNA, um ácido nucleico doador ou alguma combinação dos mesmos.
[0072] O ácido nucleico heterólogo pode estar sob o controle de um promotor adequado, que pode ser um promotor específico para o te- cido. Por exemplo, se o vetor deve ser liberado no fígado, um promotor específico do fígado (por exemplo, um promotor de α1-antitripsina (hAAT) específico para o fígado humano). Outros elementos regulado- res que possam ser apropriados para uma determinada aplicação tam- bém podem ser incluídos. (B) Envelope Manipulado com Moléculas Imunossupressoras
[0073] O envelope do vetor viral aqui fornecido compreende uma bicamada lipídica que envolve parcialmente ou completamente a partí- cula viral. Qualquer bicamada lipídica pode ser usada, incluindo bica- madas lipídicas naturais ou sintéticas (artificiais). As bicamadas lipídi- cas sintéticas incluem, por exemplo, lipossomas. As bicamadas lipídicas que ocorrem naturalmente incluem qualquer um dos vários tipos de ve- sículas extracelulares (EVs) conhecidas na técnica, incluindo exosso- mas, microvesículas (por exemplo, vesículas de dispersão ou ectosso- mas) e similares. Por exemplo, a bicamada lipídica do envelope do vetor pode ser fornecida por uma porção de uma membrana celular que "bro- tou" de uma célula produtora, particularmente uma célula produtora que tenha sido manipulada para superexpressar uma ou mais moléculas imunossupressoras em comparação com uma célula produtora não ma- nipulada do mesmo tipo. Tal bicamada lipídica compreende uma porção de uma membrana celular da qual é descamada. Em algumas modali- dades, a bicamada lipídica compreende proteínas associadas ao endos- soma (proteínas Alix, Tsg101 e Rab); tetraspaninas (CD9, CD63, CD81, CD82, CD53 e CD37); proteínas associadas a raft lipídica (glicosilfosfa- tidilinositol e flotilina) e/ou lipídeos que compreendem colesterol, esfin- gomielina e/ou glicerofosfolipídeos. Em algumas modalidades, a bica- mada lipídica é uma bicamada lipídica exossômica (por exemplo, a bi- camada lipídica é um exossoma), particularmente a bicamada lipídica exossômica de uma célula produtora (ou seja, destacada de outra ou derivada de outra forma ou produzida por uma célula produtora) que é manipulada para superexpressar uma ou mais moléculas imunossu- pressoras, conforme descrito aqui.
[0074] Embora qualquer tipo de célula possa fornecer EVs, às ve- zes é vantajoso evitar o uso de células tumorais como células produto- ras no contexto da invenção, devido ao potencial de contaminação por agentes (por exemplo, elementos genéticos) que contribuem para a imortalização da célula tumoral e podem ser oncogênicos ou prejudiciais para um indivíduo. Assim, em algumas modalidades, a bicamada lipí- dica é uma bicamada lipídica de EV não tumoral, tal como uma bica- mada lipídica exossômica não tumoral (por exemplo, a bicamada lipídica é de uma EV não tumoral, tal como de um exossoma não tumoral, o que significa que a EV ou exossoma não tem origem em células tumo- rais). Em outras modalidades, a bicamada lipídica é uma bicamada lipí- dica de uma EV (por exemplo, uma bicamada lipídica exossômica ou um exossoma) de uma célula 293 (por exemplo, HEK293 ou HEK293T), particularmente uma bicamada lipídica de EV (por exemplo, uma bica- mada lipídica exossômica ou um exossoma ) de uma célula produtora não tumoral (isto é, destacada de outra célula derivada de outra forma ou produzida por uma célula produtora), tal como uma célula 293, que é manipulada para superexpressar uma ou mais moléculas imunossu- pressoras, como descrito aqui.
[0075] O envelope também compreende moléculas imunossupres- soras. As moléculas imunossupressoras podem ser associadas com a bicamada lipídica do envelope de qualquer maneira. Em algumas mo- dalidades, a molécula imunossupressora está incorporada dentro ou so- bre a bicamada lipídica. Por exemplo, a molécula imunossupressora pode compreender, naturalmente ou sinteticamente, um domínio trans- membrana, que se integra na bicamada lipídica. Os domínios trans- membrana são conhecidos na técnica, incluindo mas não se limitando ao domínio transmembrana PDGR. Os métodos de incorporação de do- mínios transmembrana (por exemplo, pela geração de proteínas de fu- são) são conhecidos na técnica.
[0076] A molécula imunossupressora pode ser qualquer molécula que reduza a resposta imune do hospedeiro ao vetor envelopado da invenção em comparação com o mesmo vetor sem o envelope ou com um envelope que não é manipulado para conter moléculas imunossu-
pressoras.
As moléculas imunossupressoras incluem, mas não estão li- mitadas a moléculas (por exemplo, proteínas) que regulam negativa- mente a função imune de um hospedeiro por qualquer mecanismo, tal como, por exemplo, pela estimulação ou regulação positiva de inibido- res imunes ou pela inibição ou regulação negativa de moléculas estimu- lantes e/ou ativadores imunes, ou pela redução de outra maneira da imunogenicidade do vetor viral envelopado em comparação com um ve- tor envelopado sem as moléculas imunossupressoras.
Moléculas imu- nossupressoras incluem, mas não estão limitadas a receptores e ligan- tes do ponto de verificação imune.
Exemplos não limitantes de molécu- las imunossupressoras incluem, por exemplo, CTLA-4 e seus ligantes (por exemplo, B7-1 e B7-2), PD-1 e seus ligantes (por exemplo, PDL-1 e PDL-2), VISTA, TIM-3 e seu ligante (por exemplo, GAL9), TIGIT e seu ligante (por exemplo, CD155), LAG3, VISTA e BTLA e seu ligante (por exemplo, HVEM). Também estão incluídos fragmentos ativos e deriva- dos de qualquer uma das moléculas de ponto de verificação preceden- tes; agonistas de qualquer uma das moléculas de ponto de verificação precedentes, tais como anticorpos agonistas para qualquer uma das moléculas de ponto de verificação precedentes; anticorpos que blo- queiam receptores imuno-estimulantes (receptores co-estimuladores) ou seus ligantes, tais como anticorpos anti-CD28; ou peptídeos que mi- metizam as funções imunes das moléculas do ponto de verificação imune.
Na medida em que uma molécula imunossupressora desejada não inclui nativamente um domínio transmembrana, as moléculas imu- nossupressoras podem ser manipuladas para incorporar em uma bica- mada lipídica pela criação de moléculas quiméricas que compreendem um domínio extracelular, um domínio transmembrana e, opcionalmente, domínios intracelulares de extensão completa ou qualquer domínio in- tercelular mínimo que possa ser necessário para manter a expressão da molécula quimérica e a ligação ao seu ligante ou receptor; como ilus- trado na Fig. 2. Os domínios transmembrana e domínios intercelulares de moléculas efetoras podem compreender domínios receptores de Fc de imunoglobulina (ou sua região transmembrana) ou qualquer outro domínio funcional necessário para manter as atividades de expressão e ligação ao ligante.
[0077] O envelope pode compreender qualquer um ou mais tipos diferentes de moléculas imunossupressoras; no entanto, em algumas modalidades, o envelope compreende uma combinação de duas ou mais moléculas imunossupressoras diferentes (por exemplo, três ou mais moléculas imunossupressoras diferentes, quatro ou mais molécu- las imunossupressoras diferentes ou até cinco ou mais moléculas imu- nossupressoras diferentes). Assim, por exemplo, em algumas modali- dades, o envelope compreende uma combinação de duas ou mais mo- léculas de ponto de verificação imune diferentes (por exemplo, três ou mais moléculas de ponto de verificação imune diferentes, quatro ou mais moléculas de ponto de verificação imune diferentes ou mesmo cinco ou mais moléculas de ponto de verificação imune diferentes ), op- cionalmente, duas ou mais (por exemplo, três ou mais, quatro ou mais ou mesmo cinco ou mais) moléculas selecionadas entre CTLA-4 e seus ligantes (por exemplo, B7-1 e B7-2), PD-1 e seus ligantes (por exemplo, PDL-1 e PDL-2), VISTA, TIM-3 e seu ligante (por exemplo, GAL9), TI- GIT e seu ligante (por exemplo, CD155), LAG3, VISTA e BLFA e seu ligante (por exemplo, HVEM); fragmentos e derivados ativos de qual- quer uma das moléculas de ponto de verificação precedentes; agonistas de qualquer uma das moléculas de ponto de verificação anteriores, tais como anticorpos agonistas para qualquer uma das moléculas de ponto de verificação precedentes; anticorpos que bloqueiam receptores imu- noestimulantes (receptores co-estimuladores) ou seus ligantes, tais como anticorpos anti-CD28; ou peptídeos que mimetizam as funções imunes das moléculas do ponto de verificação imune.
Em algumas mo- dalidades, o envelope compreende CTLA-4 e PD-L1 e PD-L2 e VISTA, ou qualquer combinação destas, ou outras moléculas supressoras imu- nológicas, isoladamente ou em combinações com até 4 moléculas dife- rentes.
Em algumas modalidades, o envelope compreende CTLA-4 e PD-L1, CTLA-4 e PD-L2, CTLA-4 e PD-1, CTLA-4 e VISTA, CTLA-4 e anti-CD28, PD-1 e VISTA, B7-1 e PD-L1, B7-1 e PD-L2, B7-1e PD-1, B7-1 e VISTA, B7-1 e anti-CD28, B7-2 e PD-L1, B7-2 e PD-L2, B7-2e PD-1, B7-2 e VISTA, B7-2 e anti-CD28, PD-1 e VISTA, PD-1 e anti-CD- 28, VISTA e anti-CD28, PD-L1 e VISTA, PD-L1 e anti-CD-28, PD-L2 e VISTA, PD-L2 e anti-CD-28, ou VISTA e anti-CD28. Em algumas moda- lidades, o envelope compreende CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA- 4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2, PD-L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD-L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD- L1 e PD-L2 e VISTA, ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
Em algumas modalidades, as moléculas imunossupressoras incluem, ou são mani- puladas para incluir, um domínio transmembrana.
A molécula imunos- supressora usada no vetor deve ser aquela da espécie do mamífero ao qual o vetor deve ser administrado.
Assim, para uso em humanos, deve ser usado um ortólogo humano da molécula imunossupressora, cujas proteínas são bem conhecidas na técnica.
Em uma modalidade particu- lar, as moléculas imunossupressoras incluídas no envelope compreen- dem, consistem essencialmente em, ou consistem em, CTLA-4 e PD- L1. CTLA-4 humana é fornecida, por exemplo, pela proteína identificada pela Sequência de Referência NCBI: NP_005205.2, e PD-L1 é forne- cida, por exemplo, pela proteína identificada pela Sequência de Refe- rência NCBI: NP_054862.1. Em algumas modalidades, a molécula imu- nossupressora é (ou é derivada de) uma molécula de CTLA-4 que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a molécula imunossupressora é (ou é derivada de) uma molécula de CTLA-4 que compreende uma sequência de aminoácidos que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas mo- dalidades, a molécula imunossupressora é (ou é derivada de) uma mo- lécula de PDL-1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a molécula imunossupressora é (ou é derivada de) uma molécula de PDL-1 que compreende uma se- quência de aminoácidos que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.4.
[0078] O envelope pode compreender as moléculas imunossupres- soras em qualquer quantidade ou concentração adequadas. Em algu- mas modalidades, o envelope compreende moléculas imunossupresso- ras em uma quantidade suficiente para aperfeiçoar a liberação e a ex- pressão do transgene em comparação com o mesmo vetor envelopado que não é manipulado para conter as moléculas imunossupressoras. Como explicado em mais detalhes em conexão com o método de pro- dução dos vetores envelopados, o vetor envelopado que compreende uma concentração suficiente de moléculas imunossupressoras no en- velope pode ser fornecido pela manipulação da célula hospedeira (pro- dutora) para superexpressar as moléculas imunossupressoras em com- paração com a célula hospedeira nativa. Assim, em algumas modalida- des, o envelope do vetor aqui fornecido compreende uma ou mais (ou todas) das moléculas imunossupressoras em uma quantidade maior que o mesmo vetor envelopado produzido a partir da mesma célula hos- pedeira que não foi manipulada para superexpressar as moléculas imu- nossupressoras. Por exemplo, o envelope do vetor aqui fornecido, em algumas modalidades, compreende uma ou mais (ou todas) das molé- culas imunossupressoras em uma quantidade maior que o mesmo vetor envelopado produzido a partir da mesma célula hospedeira que não foi manipulada para superexpressar o moléculas imunossupressoras em cerca de 2x ou mais, em cerca de 3x ou mais, em cerca de 5x ou mais, em cerca de 10x ou mais, em cerca de 20x ou mais, em cerca de 20x ou mais, em cerca de 50x ou mais, ou mesmo em cerca de 100x ou mais (por exemplo, cerca de 1000x ou mais). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é manipulada para superexpressar uma ou mais (ou todas) das moléculas imunossupressoras em cerca de 2x ou mais, cerca de 3x ou mais, cerca de 5x ou mais, cerca de 10x ou mais, cerca de 20x ou mais, cerca de 50x ou mais, ou mesmo cerca de 100x ou mais (por exemplo, cerca de 1000x ou mais) do que a mesma célula hospedeira que não é manipulada para superexpressar as moléculas imunossu- pressoras. Como explicado acima, em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira não tumoral manipulada para su- perexpressar as moléculas imunossupressoras e o envelope compre- ende uma bicamada lipídica de EV não tumoral, tal como uma bicamada lipídica exossômica não tumoral, de uma célula não tumoral manipulada para superexpressar as moléculas imunossupressoras. Em uma moda- lidade particular, a bicamada lipídica é uma bicamada lipídica de EV (por exemplo, uma bicamada lipossômica exossômica ou um exossoma) de uma célula 293 (por exemplo, HEK293 ou qualquer variação da mesma, tal como HEK293E, HEK293F, HEK293T, etc.) manipulada para supe- rexpressar as moléculas imunossupressoras. A quantidade de molécu- las imunossupressoras na superfície dos vetores (por exemplo, no en- velope do vetor) pode ser determinada usando qualquer uma das várias técnicas conhecidas. Por exemplo, ELISA pode ser usado para medir a quantidade de tais moléculas na superfície dos vetores e determinar as quantidades relativas de tais moléculas em diferentes vetores.
[0079] O vetor viral envelopado aqui fornecido pode ter qualquer ta- manho de partícula adequado. Tipicamente, as partículas virais envelo- padas terão um tamanho na faixa de cerca de 30 a 600 nm, tal como cerca de 50 a 300 nm, com um tamanho médio de partícula na faixa de cerca de 75 a 150 nm, tal como cerca de 80 a 120 nm (por exemplo, cerca de 90-115 nm), conforme medido usando um NANOSIGHT™ NS300 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante. Os vetores virais envelopados podem cada um compreender um único capsídeo ou múltiplos capsídeos dentro de um único envelope. (C) Outras Porções do Envelope
[0080] O vetor viral envelopado aqui fornecido pode ainda incluir porções adicionais no envelope, conforme desejado para fornecer fun- ções diferentes. Por exemplo, o envelope pode ser manipulado para conter proteínas da superfície da membrana que direcionam o vetor para um tipo de célula ou tecido desejado, por exemplo, uma molécula que se liga especificamente a um ligante ou receptor em um tipo de célula desejado. Em alguns vetores virais, tal como AAV, a especifici- dade celular ou tecidual do vetor pode ser determinada, pelo menos em parte, pelo sorotipo do vírus. Pela manipulação dos vetores aqui forne- cidos para conter porções de direcionamento ligadas ao envelope (por exemplo, proteínas de direcionamento) que se ligam a ligantes ou re- ceptores em um tipo de célula desejado, os vetores permitem um dire- cionamento mais preciso, assim como opções para direcionar uma se- leção mais ampla de tipos de células, em comparação com a confiança apenas na especificidade do sorotipo de AAV. Por exemplo, para tratar a hemofilia B usando a proteína do fator IX humano, o envelope do vetor pode ser manipulado para incluir uma porção que se liga especifica- mente ou preferivelmente a uma proteína de superfície expressa espe- cificamente ou preferivelmente nas células hepáticas (por exemplo, uma proteína, tal como um domínio de ligação ao antígeno ligado à mem- brana (por exemplo, domínio do clone 8D7, BD Biosciences), que se liga especificamente ao receptor 1 de asialoglicoproteína (ASGRl)). Outras moléculas de direcionamento que têm como alvo diferentes tipos de cé- lulas ou tecidos podem ser usadas dependendo do destino desejado para o vetor. Exemplos não limitantes incluem um ou mais de fígado, músculo, coração, cérebro (por exemplo, neurônios, células da glia, as- trócitos, etc.), rim, pulmão, pâncreas, estômago, intestinos, medula ós- sea, células sanguíneas (por exemplo, leucócitos, linfócitos, eritrócitos), ovários, útero, testículos ou células-tronco de qualquer tipo. Como ex- plicado em mais detalhes em conexão com o método de produção dos vetores, esse envelope de vetor pode ser fornecido pela manipulação de células hospedeiras (células produtoras) para expressar altos níveis de uma porção de direcionamento ligada à membrana. Assim, em algu- mas modalidades, a invenção fornece um vetor viral que compreende um envelope em que o envelope compreende uma molécula imunossu- pressora e uma molécula de direcionamento.
[0081] O vetor viral envelopado pode ainda compreender elementos adicionais que melhoram a eficácia ou eficiência do vetor ou melhoram a produção. Por exemplo, a expressão exógena de Tetraspanina CD9 em células produtoras pode melhorar a produção de vetores sem de- gradar o desempenho do vetor (Shiller et al., Mol Ther Methods Clin Dev, (2018) 9: 278-287). Assim, o vetor pode incluir CD9 no enve- lope. No entanto, em algumas modalidades, o vetor viral envelopado é substancialmente ou completamente livre de elementos que prejudicam significativamente a eficiência ou a eficácia do vetor na liberação de ácido nucleico para um indivíduo, tornam o vetor inadequado para uso em humanos (por exemplo, sob os regulamentos da FDA) ou prejudicam substancialmente a produção do vetor. IV. Aplicações e Métodos de Uso
[0082] Os vetores virais envelopados aqui fornecidos são úteis para a liberação e expressão de um ácido nucleico (transgene) em uma cé- lula ou indivíduo. Assim, a invenção fornece um método de liberação de um ácido nucleico (transgene) para uma célula ou indivíduo, pela admi- nistração do vetor viral envelopado na célula ou indivíduo.
[0083] Em algumas modalidades, o vetor viral envelopado, que compreende moléculas imunossupressoras no envelope, pode liberar o ácido nucleico (transgene) para a célula ou indivíduo de forma mais efi- caz ou eficiente do que um vetor viral não envelopado do mesmo tipo ou um vetor viral envelopado do mesmo tipo, mas sem um envelope manipulado para compreender as moléculas imunossupressoras. Em algumas modalidades, a liberação mais eficaz ou eficiente resulta em mais cópias do genoma viral por célula alvo e/ou maior expressão do produto de transgene (como aplicável) na célula ou no indivíduo. Por exemplo, em algumas modalidades, o vetor viral envelopado (por exem- plo, AAV envelopado) que compreende moléculas imunossupressoras no envelope, como aqui fornecido, fornece níveis de expressão de trans- gene 3 semanas após a administração a um indivíduo que estão au- mentados em cerca de 50% ou mais ( cerca de 75% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 125% ou mais, cerca de 150% ou mais, cerca de 175% ou mais, ou mesmo cerca de 200% ou mais) em comparação com aqueles produzidos pela administração de um vetor viral não enve- lopado do mesmo tipo nas mesmas condições (por exemplo, mesmo transgene, mesmo indivíduo, mesma dose e via de administração, etc., com a única diferença sendo o vetor). Além disso, em algumas modali- dades, o vetor viral envelopado (por exemplo, AAV envelopado) que compreende moléculas imunossupressoras no envelope, como aqui for- necido, fornece níveis de expressão de transgene 3 semanas após a administração a um indivíduo que estão aumentados em cerca de 20% ou mais (cerca de 50% ou mais, cerca de 75% ou mais, cerca de 100% ou mais, cerca de 125% ou mais, cerca de 150% ou mais, cerca de 175% ou mais, ou mesmo cerca de 200% ou mais) em comparação com aqueles produzidos pela administração de um vetor viral envelopado do mesmo tipo sem as moléculas imunossupressoras (produzidas a partir do mesmo tipo de célula produtora, com a exceção de que a célula hos- pedeira não foi manipulada para expressar as moléculas imunossupres- soras) nas mesmas condições (por exemplo, mesmo transgene, mesmo indivíduo, mesma dose e via de administração, etc., com a única dife- rença sendo o vetor).
[0084] Em adição ou alternativamente, algumas modalidades do ve- tor viral envelopado que compreendem moléculas imunossupressoras são consideradas reduzir a resposta imune do hospedeiro ao vetor ou produto de transgene, ou o impacto da resposta imune do hospedeiro na liberação e/ou expressão de transgene. Assim, em algumas modali- dades, o vetor viral envelopado aqui fornecido permite a repetição da dosagem do vetor e/ou administração a indivíduos com imunidade pré- existente a um determinado tipo de vírus (por exemplo, AAV de um so- rotipo particular). Consequentemente, em um aspecto, o método com- preende a administração do vetor viral envelopado a um indivíduo pre- viamente exposto a um vírus do mesmo tipo contido no vetor viral enve- lopado (pela exposição natural ao vírus nativo ou pela administração prévia do vetor viral), ou um indivíduo que, de outra forma, possui imu- nidade pré-existente ao vírus (por exemplo, um paciente que possui an- ticorpos pré-existentes para o vírus). Assim, o método pode compreen- der a administração do vetor viral envelopado ao indivíduo em um es- quema de dosagem repetida que compreende duas ou mais administra- ções separadas de uma dose de um vetor viral envelopado separadas por um intervalo de tempo adequado (por exemplo, duas ou mais admi- nistrações de uma dose do vetor viral envelopado separadas por pelo menos um dia, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas ou um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos seis meses, ou pelo menos um ano ou mais).
[0085] Embora o vetor compreenda moléculas imunossupressoras, a quantidade total da molécula imunossupressora em uma dose do vetor será tipicamente menor que a dose da molécula imunossupressora que seria usada quando administrada como um agente imunossupressor so- lúvel. Assim, por exemplo, CTLA4/Ig pode ser usado como um agente imunossupressor na dose de 10 mg/kg. No entanto, em algumas moda- lidades, uma dose única de vetor (por exemplo, 2 x 1011 vg/kg ou até 5 x 1011 vg/kg) terá muito menos do agente imunossupressor (por exem- plo, CTLA4 ligado à membrana), tal como menos do que cerca de 5 mg/kg, menos do que cerca de 2 mg/kg, menos do que cerca de 1 mg/kg ou até menos do que cerca de 0,5 mg / kg (por exemplo, menos do que cerca de 0,1 mg / kg). Consequentemente, em algumas modalidades, o vetor envelopado que compreende moléculas imunossupressoras for- necido aqui minimiza a imunossupressão global que resulta da adminis- tração de agentes imunossupressores solúveis (por exemplo, CTLA4/Ig, abatacept). Em algumas modalidades, o vetor viral envelopado (por exemplo, AAV envelopado) que compreende moléculas imunossupres- soras no envelope, como aqui fornecido, depois da administração em uma quantidade eficaz a um indivíduo, particularmente um humano (por exemplo, uma dose de 2 x 1011 vg/kg ou uma dose de 5 x 1011 vg/kg) causa imunossupressão global que é menor do que aquela causada por uma única administração de 10 mg/kg de CTLA4/Ig (ou, em algumas modalidades, 2 mg/kg de CTLA4/Ig), conforme medido dentro de 2-3 semanas após a administração, de acordo com um aumento no total de anticorpos anti-IgG circulantes ou um aumento nos anticorpos específi- cos para o antígeno, ou células T CD4+ ou CD8+ ativadas que são es- timuladas por antígenos diferentes daqueles derivados do vetor admi- nistrado.
[0086] O vetor viral envelopado pode ser administrado para liberar um ácido nucleico (transgene) para uma célula ou indivíduo para qual- quer objetivo final. Em algumas modalidades, esse objetivo final pode ser expressar o transgene em uma célula in vitro para fins de pesquisa ou para a produção de uma proteína ou outro processo de bioprodu- ção. Em outras modalidades, o vetor viral envelopado é usado para tra- tar uma doença ou distúrbio em um indivíduo. A doença ou distúrbio pode ser qualquer doença ou distúrbio suscetível de tratamento pela liberação e (se aplicável) expressão de um ácido nucleico ou trans- gene. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença monogênica. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença de armazenamento do lisossoma. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença de armazenamento de glicogê- nio. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é um distúrbio da hemoglobina. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é um distúrbio músculo-esquelético. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio do SNC. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é um distúrbio cardiovascular incluindo doença cardíaca ou acidente vascular cerebral. Em algumas modalidades, a do- ença é um câncer.
[0087] Exemplos ilustrativos mais específicos, mas não limitantes de doenças incluem miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, hemofilia A e B, doença de Niemann Pick (por exemplo, Niemann Pick A, Niemann Pick B, Niemann Pick C) , co- roideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), do- enças de armazenamento de glicogênio, doença de Pompe, doença de Wilson, citrulinemia Tipo 1, PKU (fenilcetonúria), adrenoleucodistrofia, distúrbios da hemoglobina, incluindo doença falciforme, beta talasse- mia, distúrbios do sistema nervoso central e distúrbios músculo-esque-
léticos. Assim, em algumas modalidades do método, o vetor viral enve- lopado é administrado a um indivíduo que tem uma doença ou distúrbio ou está em risco de desenvolver a doença ou distúrbio (por exem- plo, carrega uma mutação para a doença ou distúrbio ou tem um histó- rico familiar da doença ou distúrbio). Além disso, quando usado para tratar uma doença ou distúrbio, o vetor viral envelopado compreende um ácido nucleico de carga útil cuja expressão trata a doença do indiví- duo. A título de exemplo não limitante, o ácido nucleico pode codificar um ou mais dos seguintes fatores: Fator VIII, Fator IX, miotubularina, SMN, RPE65, cadeia 4 da NADH-ubiquinona oxidoredutase, CHM, hun- tingtina, alfa-galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-glicosidase, ornitina transcarbamilase, argininosuccinato sintetase, β-globina, y-glo- bina, fenilalanina hidroxilase ou ALD.
[0088] O método também pode ser usado para liberar um ácido nu- cleico terapêutico para uma célula ou indivíduo para o tratamento de doença ou qualquer outro propósito. Em algumas modalidades, o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antisenso, RNA- zima ou DNAzima.
[0089] Também é fornecido um método de utilização do vetor viral envelopado para a liberação de um ácido nucleico que codifica um ou mais produtos gênicos de edição de gene para uma célula in vitro ou in vivo. Em algumas modalidades, o um ou mais produtos gênicos de edi- ção de gene é uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1), uma ou mais sequências de guia para a endonuclease guiada por RNA e/ou uma ou mais sequências doadoras.
[0090] Em qualquer um dos métodos anteriores, a célula pode ser qualquer tipo de célula, particularmente uma célula de mamífero ou cé- lula humana. O indivíduo pode ser qualquer indivíduo, tal como um hu- mano, um primata não humano ou outro mamífero, incluindo um roedor (por exemplo, um camundongo, um rato, uma cobaia, um hamster), um coelho, um cachorro, um gato, um cavalo, uma vaca, um porco, uma ovelha, um sapo ou um pássaro.
[0091] Em qualquer um dos métodos de tratamento anteriores, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vetor viral envelopado é admi- nistrada ao indivíduo por qualquer via de administração adequada. A dose e via de administração eficazes dependerão da indicação e podem ser determinadas pelo médico. Em algumas modalidades, o vetor viral envelopado é liberado sistemicamente; por exemplo, por via intrave- nosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, oral ou por inalação. Em outras modalidades, o vetor viral envelopado é liberado diretamente em um tecido (por exemplo, um órgão, um tumor etc.) ou é administrado ao SNC (por exemplo, por via intratecal, na medula espinhal, em uma parte específica do cérebro tal como ventrículo, hipotálamo, hipófise, cérebro, cerebelo etc.).
[0092] O vetor viral envelopado pode ser usado como parte de uma composição que compreende o vetor viral envelopado e um veículo apropriado, tal como um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina. Veículos adequados, tampões de formulação e outros excipientes para formulação de composições de vetores virais são co- nhecidos na técnica e aplicáveis à composição atualmente fornecida.
[0093] Em uma modalidade específica, é fornecido um método de tratamento da hemofilia B, método esse que compreende administrar a um indivíduo necessitado de tratamento o vetor viral envelopado aqui fornecido, em que o transgene heterólogo codifica uma proteína do Fa- tor IX humano (FIX) (por exemplo, fator IX humano UniProtKB - P00740; fator IX humano (R338L) "Pádua" (Monahan et al., (2015) Hum Gene Ther., 26 (2): 69-81 ou outras variantes conhecidas) e em que o enve- lope do vetor viral tem uma bicamada lipídica manipulada que compre- ende CTLA-4 e PD-L1. Em uma modalidade mais particular, o vetor viral é AAV(por exemplo,AAV8 ou AAV2/8, ou scAAV8 ou scAAV2/8), opcio- nalmente, em que o envelope é fornecido por um exossoma manipulado para conter CTLA-4 e PD-L1 (por exemplo, um exossoma de uma célula produtora (por exemplo, uma célula HEK293) manipulada para superex- pressa rCTLA-4 e PD-L1). Em algumas modalidades, o fator IX humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.1. Em algu- mas modalidades, o fator IX humano compreende uma sequência de aminoácidos que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.2. Em algumas modalidades, CTLA-4 compreende ou é derivado de um CTLA que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, CTLA-4 compreende uma sequência de amino- ácidos que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.3. Em algumas modalidades, PDL-1 compreende ou é derivado de um PDL-1 que compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, PDL-1 compreende uma sequência de aminoácidos com mais de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.4. Em algumas moda- lidades, o vetor viral envelopado é liberado no fígado e o transgene he- terólogo inclui um promotor específico para o fígado.
Em algumas mo- dalidades, o vetor é administrado por via intravenosa, opcionalmente na artéria hepática.
Em algumas modalidades, o vetor será administrado em uma dose de 2 x 1011 a 2 x 1012 genomas de vetor (vg) por quilo- grama de peso corporal do indivíduo (por exemplo, 2 x 1011 a 8 x 1011 ou 3 x 1011 a 6 x 1011 genomas de vetor (vg) por quilograma de peso corporal do indivíduo.) Em algumas modalidades, o método compre- ende administrar 2 ou mais doses (por exemplo, 3 ou mais doses, 4 ou mais doses ou 5 ou mais doses) com um intervalo de pelo menos um dia (pelo menos um dia, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas ou um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos seis meses ou até pelo menos um ano ou mais) entre as doses.
[0094] Em outra modalidade particular, é fornecido um método de tratamento da hemofilia A, cujo método compreende administrar a um indivíduo necessitado de tratamento o vetor viral envelopado fornecido aqui, em que o transgene heterólogo codifica um fator VIII humano (por exemplo, F8 humano (UniProtKB - Q2VF45), variante SQ-FVIII de um gene F8 humano com domínio B deletado (BDD) (Lind et al., (1995) Eur J Biochem. 15; 232 (1): 19-27) ou outra variante conhecida), e em que o envelope do vetor viral é uma bicamada lipídica manipulada que com- preende CTLA-4 e PD-L1. Em uma modalidade mais particular, o vetor viral é AAV (por exemplo, AAV8 ou scAAV8 ou scAAV8 ou scAAV2/8), opcionalmente em que o envelope é fornecido por um exossoma produ- zido a partir de uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula HEK293) manipulada para super-expressar CTLA-4 e PD-L1. Em algu- mas modalidades, o fator VIII humano compreende a sequência de ami- noácidos da SEQ IDNO.1 ou é derivado da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o fator VIII humano com- preende uma sequência de aminoácidos com mais de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Em algumas modalidades, CTLA-4 compreende ou é derivado de um CTLA que compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o CTLA-4 compreende uma se- quência de aminoácidos que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.3. Em algumas modalidades, PDL-1 compreende ou é derivado de um PDL-1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, PDL-1 compreende uma sequência de aminoácidos com mais de 80%, 85%, 90% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO.4. Em algumas moda- lidades, o vetor viral envelopado é liberado no fígado e o transgene he- terólogo inclui um promotor específico para o fígado. Em algumas mo- dalidades, o vetor é administrado por via intravenosa, opcionalmente na artéria hepática. Em algumas modalidades, o vetor será administrado em uma dose de 2 x 1011 a 2 x 1011 genomas de vetor (vg) por quilo- grama de peso corporal do indivíduo (por exemplo, 2 x 1011 a 8 x 1011 ou 3 x 1011 a 6 x 1011 genomas de vetor (vg) por quilograma de peso corporal do indivíduo.) Em algumas modalidades, o método compre- ende a administração de 2 ou mais doses (por exemplo, 3 ou mais do- ses, 4 ou mais doses ou 5 ou mais doses) com um intervalo de pelo menos um dia (pelo menos um dia, pelo menos uma semana, pelo me- nos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro se- manas ou um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses, pelo menos seis meses ou até pelo menos um ano ou mais) entre as doses. VI. Fabricação
[0095] O vetor viral envelopado aqui fornecido pode ser produzido por qualquer método adequado. Um exemplo não limitante é fornecido pela US 2013/020559, aqui incorporada por referência.
[0096] Um método particularmente vantajoso envolve a produção dos vetores envelopados a partir de uma linhagem celular produtora que foi manipulada para superexpressar as moléculas imunossupressoras desejadas para serem incluídas no envelope do vetor. Assim, é aqui fornecido um método de preparação de um vetor viral envelopado com um envelope que compreende as moléculas imunossupressoras, como descrito aqui, pelo (a) cultivo das células produtoras virais sob condi- ções para gerar partículas virais envelopadas, em que as células produ- toras virais compreendem um ácido nucleico que codifica uma ou mais uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana e (b)
coleta dos vetores virais envelopados. (A) Manipulação da Célula Produtora
[0097] Qualquer célula produtora adequada para a produção con- vencional do vírus a ser usado no vetor viral, pode ser usada para pro- duzir o vetor viral envelopado da invenção. As células produtoras ade- quadas incluem, mas não estão limitadas a células 293 (por exemplo, HEK293, HEK293E, HEK293F, HEK293T e similares) e células Hela. As células produtoras podem ser manipuladas para expressar as molécu- las imunossupressoras desejadas por qualquer método adequado. Em algumas modalidades da invenção, as moléculas imunossupressoras são expressas por transfecção, estavelmente ou transitoriamente, de um ácido nucleico exógeno (por exemplo, plasmídeos ou outros vetores) que codifica as moléculas imunossupressoras nas células produto- ras. Pela expressão de tais ácidos nucleicos exógenos, as células pro- dutoras superexpressam as moléculas imunossupressoras em compa- ração com a mesma célula produtora que não tenha sido transfectada com ácidos nucleicos exógenos que codificam as moléculas imunossu- pressoras e vírus envelopados que brotam da célula produtora, por sua vez, aumentaram as quantidades de moléculas imunossupressoras em comparação com um vírus envelopado que brota da mesma célula pro- dutora que não tenha sido manipulada para superexpressar as molécu- las imunossupressoras. Em algumas modalidades, a célula hospedeira que é manipulada para superexpressar as moléculas imunossupresso- ras em cerca de 2x ou mais, cerca de 3x ou mais, cerca de 5x ou mais, cerca de 10x ou mais, cerca de 20x ou mais, cerca de 50x ou mais, ou mesmo em 100x ou mais do que a mesma célula hospedeira que não é manipulada para superexpressar as moléculas imunossupressoras.
[0098] A expressão das moléculas imunossupressoras pode ser conduzida por um promotor, tal como um promotor constitutivo (por exemplo, um promotor de CMV). Em algumas modalidades, o gene que codifica a molécula efetora é seguido pelo sinal de poliadenilação (por exemplo, um sinal de poliadenilação da hemoglobina) a jusante da re- gião de codificação da molécula efetora. Em algumas modalidades, um íntron é inserido a jusante do promotor. Por exemplo, um íntron artificial derivado de hemoglobina a jusante do promotor pode ser empregado para aumentar a produção da molécula efetora. O método para trans- fecções transitórias inclui, mas não está limitado a transfecção com fos- fato de cálcio. O método para produzir linhagens celulares estáveis que expressam moduladores imunes únicos ou combinados inclui, mas não está limitado a transferência gênica retroviral ou transfecção de conca- tâmero seguida pela seleção (Throm et al. (2009) Blood, 113 (21): 5104- 5110). As células produtoras são manipuladas desta maneira para ex- pressar moléculas imunossupressoras individuais, ou para expressar di- ferentes combinações de moléculas imunossupressoras, como pode ser desejado no vetor envelopado. As células produtoras também podem ser manipuladas de outras maneiras conhecidas na técnica para au- mentar a produtividade. Por exemplo, as células produtoras podem ser manipuladas para superexpressar a Tetraspanina CD9 para melhorar a produção de vetor (Shiller et al., (2018) Mol Ther Methods Clin Dev, 9: 278-287). (B) Produção de vetores virais envelopados
[0099] Os vetores envelopados aqui descritos podem ser produzi- dos a partir de células produtoras manipuladas por qualquer técnica adequada. A técnica específica usada dependerá do tipo de vírus usado no vetor viral envelopado. Por exemplo, os vetores de AAV envelopados podem ser produzidos pela co-transfecção de plasmídeos ou outros ve- tores de expressão que codificam os genes de produção viral (por exem- plo, Rep/Cap e genes auxiliares) e um plasmídeo ou outro construto que compreendem a ITR de AAV e o ácido nucleico da carga útil. A trans- fecção pode ser realizada de qualquer maneira, tal como pelo uso da transfecção com fosfato de cálcio, transfecção com polietilenoimina (PEI) ou pelo uso de um sistema de produção baseado em HSV (Booth et al. (2004) Gene Ther, 11(10):829-837). No caso do AAV, os genes virais podem incluir, mas não estão limitados aos genes estruturais Rep e Cap de AAV2, 5, 6, 8 ou 9, flanqueado pelas ITRs de AAV2 e pelos genes auxiliares necessários do vírus (Ayuso et al. (2014) Hum Gene Ther, 25:977-987). A produção pode ser feita de qualquer maneira ade- quada, tal como usando um sistema de produção aderente ou em sus- pensão, com ou sem soro (Ayuso et al. (2014) Hum Gene Ther, 25: 977- 987; Xiao et al. (1998), J Virol, 72 (3): 2224-2232; Ryu et al. (2013) Mol Ther, Volume 21.B, cujos métodos podem incluir opcionalmente a se- guinte modificação: antes da purificação com gradiente de cloreto de césio ou iodixanol, o sobrenadante coletado clarificado será usado em uma coluna de purificação por afinidade para enriquecer quanto ao vírus envelopado). Quando o vetor viral envelopado inclui uma porção de di- recionamento como aqui descrita, a porção de direcionamento pode ser usada como um ligante de afinidade para auxiliar no isolamento/purifi- cação. Outros métodos para produzir vetores de AAV envelopados são conhecidos e podem ser usados, assim como métodos para produzir vírus envelopados de diferentes tipos (por exemplo, lentivírus envelo- pado), desde que a célula produtora seja manipulada para superexpres- sar as moléculas imunossupressoras desejadas. No caso de vetores baseados em lentivírus, os genes virais necessários são fornecidos pela co-transfecção de múltiplos plasmídeos, usando um método de purifica- ção similar.
[00100] Os vetores são coletados após um período de tempo deter- minado empiricamente e depois purificados usando qualquer uma das várias técnicas conhecidas, desde que a purificação usada não remova o envelope do vírus. As técnicas de purificação podem incluir, mas não estão limitadas a cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclu- são de tamanho, cromatografia de afinidade e filtração de fluxo tangen- cial. A ultracentrifugação, incluindo a ultracentrifugação contínua, pode ser usada para purificar os vetores virais envelopados.
[00101] As quantidades de vetores virais envelopados produzidos por litro de células produtoras podem ser aumentadas usando vários métodos. Esses métodos podem incluir, mas não estão limitados a adi- ção de moléculas que suprimem a apoptose ou suspendem a divisão celular da célula produtora durante a fermentação. Moléculas ou com- postos que alteram a composição lipídica das membranas celulares pro- dutoras também podem ser utilizados para aumentar a produção de ve- tores por litro. Adicionalmente, os compostos ou moléculas que aumen- tam a produção de exossomas, incluindo moléculas fusigênicas de membrana.
[00102] Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece um método para produzir um vetor viral envelopado, como descrito aqui, o método compreendendo (a) cultivar as células produtoras virais sob condições para gerar partículas virais envelopadas, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos que codificam uma ou mais do que uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à mem- brana e (b) coletar os vetores virais envelopados. O vetor viral envelo- pado pode ter qualquer uma das características e elementos aqui des- critos em relação ao vetor viral envelopado da invenção. Além disso, as células produtoras podem ter qualquer uma das características e ele- mentos descritos nas seções anteriores, e o método de produção do vetor viral envelopado pode ainda incluir etapas de fornecer as células produtoras, por exemplo, transformando as células produtoras com áci- dos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas imunossupresso- ras ligadas à membrana. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é manipulada para superexpressar as moléculas imunossupressoras
(por exemplo, compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam as moléculas imunossupressoras) em cerca de 2x ou mais, cerca de 3x ou mais, cerca de 5x ou mais, cerca de 10x ou mais, cerca de 20x ou mais, cerca de 50x ou mais, ou mesmo cerca de 100x ou mais do que a mesma célula hospedeira que não é manipulada para supe- rexpressar as moléculas imunossupressoras. Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é uma célula não tumoral, tal como uma célula 293 (por exemplo, HEK293, HEK293T, HEK293E, HEK293F, etc.).
[00103] A coleta do vetor viral envelopado pode compreender o iso- lamento do vírus envelopado do fluido de cultura das células produtoras de vírus cultivadas. A coleta pode ser realizada por qualquer método que não remova o envelope do vírus. Assim, por exemplo, a coleta pode compreender a separação do vírus envelopado da cultura celular por ultracentrifugação ou outro método adequado. O método evita preferi- velmente o uso de detergentes. Além disso, o método preferivelmente minimiza ou evita a lise das células produtoras antes da coleta do vírus envelopado, uma vez que a lise das células produtoras liberará vírus não envelopado na cultura.
[00104] Em algumas modalidades, o vetor viral envelopado é um ve- tor de AAV envelopado e as células produtoras virais compreendem (i) um ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV, (ii) um ácido nucleico que codifica um genoma viral de AAV que compreende um transgene e pelo menos uma ITR e (iii) um ácido nucleico que codifica genes auxiliares de AAV. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV é transitoriamente introduzido na linhagem celular produtora. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV é mantido estavelmente integrado no ge- noma da linhagem celular produtora. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV é integrado de maneira estável no genoma da linhagem celular produtora. Em algumas modalidades, o genoma do AAV compreende duas ITRs do AAV (por exemplo, o genoma viral compreende um trans- gene heterólogo flanqueado pelas ITRs de AAV). Em algumas modali- dades, uma ou mais funções auxiliares de AAV são fornecidas por um ou mais de um plasmídeo, um adenovírus, um ácido nucleico integrado estavelmente no genoma da célula ou em um vírus do herpes simplex (HSV). Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV com- preendem uma ou mais funções E1A de adenovírus, função E1B de adenovírus, função E2A de adenovírus, função E4 de adenovírus e fun- ção VA de adenovírus. Em algumas modalidades, uma ou mais funções auxiliares de AAV são integradas de maneira estável no genoma da cé- lula hospedeira e outras funções auxiliares de AAV são liberadas tran- sitoriamente. Por exemplo, em algumas modalidades, o vetor de AAV envelopado é preparado em 293 células que expressam as funções E1A e E1B de adenovírus. As outras funções auxiliares são liberadas transi- toriamente; por exemplo, por plasmídeo ou por adenovírus deficientes em replicação. Em algumas modalidades, as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções UL5 de HSV, função UL8 de HSV, função UL52 de HSV e função UL29 de HSV.
[00105] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para de produção de um vetor lentiviral envelopado como descrito aqui, o método compreendendo (a) cultivar células produtoras virais sob con- dições para gerar partículas virais envelopadas, em que as células pro- dutoras virais compreendem o ácido nucleico que codifica uma ou mais do que uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana e (b) coletar os vetores lentivirais envelopados. Em algumas modalida- des, o vetor lentiviral é um vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imunodeficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina. Em algumas modalidades, as células produtoras virais compreendem (a)
ácido nucleico que codifica o gene gag lentiviral, (b) ácido nucleico que codifica o gene pol lentiviral, (c) ácido nucleico que codifica um vetor de transferência lentiviral que compreende um transgene, uma repetição terminal longa 5' (LTR) e uma 3 'LTR, em que toda ou parte da região U3 da 3’LTR é substituída por um elemento regulatório heterólogo ou como descrito por Ryu et al. (2013) Mol Ther 2013, Volume 21.B; Meliani et al. (2015) Hum Gene Ther Methods, 26:45-53). VI. Kits
[00106] A presente invenção também fornece kits para administrar os vetores virais envelopados aqui descritos a uma célula ou indivíduo de acordo com os métodos da invenção. Os kits podem compreender qualquer vetor viral envelopado da invenção. Por exemplo, os kits po- dem incluir vetores de AAV envelopados ou vetores lentivirais envelo- pados, como descritos aqui.
[00107] Em algumas modalidades, os kits incluem ainda instruções para a liberação de vetores efetores. Os kits aqui descritos podem ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usu- ário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bu- las com instruções para a execução de quaisquer métodos aqui descri- tos. Materiais de embalagem adequados também podem ser incluídos e podem ser quaisquer materiais de embalagem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, frascos para injetáveis (como frascos selados), vasos, ampolas, garrafas, frascos, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico) e similares. Estes artigos de fabrica- ção podem ainda ser esterilizados e/ou selados. Em algumas modalida- des, os kits compreendem instruções para o tratamento de um distúrbio ou doença aqui descrito usando qualquer um dos métodos e/ou vetores efetores aqui descritos. Os kits podem incluir um veículo farmaceutica- mente aceitável adequado para injeção no indivíduo e um ou mais entre: um tampão, um diluente, um filtro, uma agulha, uma seringa e uma bula informativa com instruções para realizar injeções no mamífero.
[00108] Em algumas modalidades, os kits contêm ainda um ou mais dos tampões e/ou excipientes farmaceuticamente aceitável aqui descri- tos (por exemplo, como descrito em REMINGTON’S PHARMACEUTI- CAL SCIENCES (Mack Pub. Co., NJ 1991). Em algumas modalidades, os kits incluem um ou mais excipientes, veículos, soluções e/ou ingredi- entes adicionais farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos. Os kits aqui descritos podem ser embalados em dosagens unitárias ou em for- mas de múltiplas doses. O conteúdo dos kits é geralmente formulado como estéril e pode ser liofilizado ou fornecido como uma solução subs- tancialmente isotônica.
MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS
[00109] As modalidades a seguir são fornecidas apenas para fins de ilustração adicional das composições e métodos aqui fornecidos, e não limitam a invenção. Modalidade 1. Uma composição que compreende um vetor viral envelopado, em que o vetor viral envelopado compreende uma par- tícula de vetor circundada pelo envelope, em que o envelope compre- ende uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes (isto é, moléculas imunossupressoras). Modalidade 2. A composição da modalidade 1, em que as funções efetoras imunes reduzem a imunogenicidade do vetor envelo- pado em comparação com um vetor sem moléculas efetoras imunes. Modalidade 3. A composição da modalidade 1 ou 2, em que as funções efetoras imunes estimulam inibidores imunes. Modalidade 4. A composição da modalidade 1 ou 2, em que as funções efetoras do sistema imune inibem as moléculas estimulado- ras imunes. Modalidade 5. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-4, em que o envelope compreende moléculas que estimulam inibidores imunes e moléculas que inibem as moléculas estimuladoras imunes.
Modalidade 6. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-5, em que a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes incluem um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD- L1, PD-L2, CD28, VISTA TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
Modalidade 7. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-6, em que o envelope compreende CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA-4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2, PD-L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD-L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD-L1 e PD-L2 e VISTA ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
Modalidade 8. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-7, em que a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes compreendem um domínio transmembrana.
Modalidade 9. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-8, em que o envelope compreende ainda moléculas de direcio- namento que direcionam o vetor para um ou mais tipos de células.
Modalidade 10. A composição da modalidade 9, em que as moléculas alvo conferem especificidade de tecido ao vetor envelopado.
Modalidade 11. A composição da modalidade 10, em que a molécula alvo é um anticorpo.
Modalidade 12. A composição da modalidade 11, em que o anticorpo é o anticorpo 8D7. Modalidade 13. A composição de qualquer uma das modali- dades 9-12, em que a uma ou mais moléculas de direcionamento com- preende um domínio transmembrana.
Modalidade 14. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-13, em que o vetor viral compreende uma partícula viral.
Modalidade 15. A composição da modalidade 14, em que a partícula viral compreende um capsídeo viral e um genoma viral, ou um capsídeo envelopado e um genoma viral, tal como um retrovírus.
Modalidade 16. A composição da modalidade 15, em que o genoma viral compreende um ou mais transgenes heterólogos.
Modalidade 17. A composição da modalidade 16, em que o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo.
Modalidade 18. A composição da modalidade 17, em que o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo terapêutico ou um poli- peptídeo repórter.
Modalidade 19. A composição da modalidade 18, em que o polipeptídeo terapêutico é o Fator VIII, Fator IX, miotubularina, SMN, RPE65, cadeia 4 de NADH-ubiquinona oxidoredutase, CHM, hunting- tina, alfa-galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-glicosidase, orni- tina transcarbamilase, argininosuccinato sintetase, β-globina, y-globina, fenilalanina hidroxilase ou ALD.
Modalidade 20. A composição da modalidade 16, em que o transgene heterólogo codifica um ácido nucleico terapêutico.
Modalidade 21. A composição da modalidade 20, em que o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antisenso, RNAzima ou DNAzima.
Modalidade 22. A composição da modalidade 16, em que o transgene heterólogo codifica um ou mais produtos gênicos de edição de genes.
Modalidade 23. A composição da modalidade 22, em que o um ou mais produtos gênicos de edição de genes é uma CAS nuclease e/ou uma ou mais sequências guia e/ou uma ou mais sequências doa- doras.
Modalidade 24. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-23, em que o vetor viral é um vetor viral adeno-associado (AAV)
ou um vetor lentiviral.
Modalidade 25. A composição de qualquer uma das modali- dades 1-24, em que o vetor viral é um vetor viral adeno-associado.
Modalidade 26. A composição da modalidade 25, em que o vetor de AAV compreende um capsídeo do sorotipo de AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 ou AAV12. Modalidade 27. A composição da modalidade 25 ou 26, em que o vetor AAV compreende um genoma viral de AAV que compreende sequências de repetição terminal invertida (ITR) do sorotipo de AAV hu- mano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 , AAV9, r AAV10. Modalidade 28. A composição da modalidade 27, em que o capsídeo do AAV e a ITR do AAV são do mesmo sorotipo ou de diferen- tes sorotipos.
Modalidade 29. A composição da modalidade 1-24, em que o vetor viral é um vetor lentiviral.
Modalidade 30. A composição da modalidade 29, em que o vetor lentiviral é derivado do vírus da imunodeficiência humana, um ví- rus da imunodeficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina.
Modalidade 31. A composição da modalidade 29 ou 30, em que o vetor lentiviral não é replicável.
Modalidade 32. A composição de qualquer uma das modali- dades 29-30, em que o vetor lentiviral não é integrador.
Modalidade 33. Uma composição farmacêutica que compre- ende a composição de qualquer uma das modalidades 1-32 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Modalidade 34. Método de liberação de um transgene para um indivíduo, compreendendo a administração de uma composição que compreende um vetor viral envelopado para o indivíduo, em que o vetor viral envelopado compreende uma partícula de vetor circundada por um envelope, em que o envelope compreende uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunológicas e em que a partícula viral com- preende um genoma viral que compreende o transgene.
Modalidade 35. Um método de tratamento de um indivíduo com uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma composição que compreende um vetor viral envelopado a indivíduo ne- cessitado, em que o vetor viral envelopado compreende uma partícula de vetor envolvida por envelope, em que o envelope compreende uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes e em que a partícula viral compreende um genoma viral que compreende um trans- gene terapêutico.
Modalidade 36. O método da modalidade 34 ou 35, em que as funções efetoras imunes reduzem a imunogenicidade do vetor enve- lopado.
Modalidade 37. A composição de qualquer uma das modali- dades 34-36, em que as funções efetoras imunes estimulam inibidores imunes.
Modalidade 38. O método de qualquer uma das modalidades 34-36, em que as funções efetoras imunológicas inibem moléculas esti- muladoras imunes.
Modalidade 39. O método de qualquer uma das modalidades 34-38, em que o envelope compreende moléculas que estimulam inibi- dores imunes e moléculas que inibem moléculas estimuladoras imunes.
Modalidade 40. O método de qualquer uma das modalidades 34-39, em que a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes incluem um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD-L1, PD- L2, CD28, VISTA, TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
Modalidade 41. O método de qualquer uma das modalidades
34-40, em que o envelope compreende CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA-4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2, PD-L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD-L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD-L1 e PD-L2 e VISTA ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
Modalidade 42. O método de qualquer uma das modalidades 34-41, em que a uma ou mais moléculas que fornece funções efetoras imunes compreendem um domínio transmembrana.
Modalidade 43. O método de qualquer uma das modalidades 34-42, em que o envelope compreende ainda moléculas de direciona- mento que direcionam o vetor para um ou mais tipos de células.
Modalidade 44. O método da modalidade 43, em que as mo- léculas de direcionamento conferem especificidade de tecido ao vetor envelopado.
Modalidade 45. O método da modalidade 44, em que a mo- lécula de direcionamento é um anticorpo.
Modalidade 46. O método da modalidade 45, em que o anti- corpo é o anticorpo 8D7. Modalidade 47. O método de qualquer uma das modalidades 43-46, em que a uma ou mais moléculas de direcionamento compreen- dem um domínio transmembrana.
Modalidade 48. O método de qualquer uma das modalidades 34-47, em que o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo.
Modalidade 49. O método da modalidade 48, em que o trans- gene heterólogo codifica um polipeptídeo terapêutico ou um polipeptí- deo repórter.
Modalidade 50. O método da modalidade 49, em que o poli- peptídeo terapêutico é o fator VIII, fator IX, fator VIII, fator IX, miotubu- larina, SMN, RPE65, cadeia 4 de NADH-ubiquinona oxidoredutase, CHM, huntingtina, alfa-galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-gli-
cosidase, ornitina transcarbamilase, arginino succinato sintetase, β-glo- bina, y-globina, fenilalanina hidroxilase ou ALD.
Modalidade 51. O método de qualquer uma das modalidades 34-47, em que o transgene heterólogo codifica um ácido nucleico tera- pêutico.
Modalidade 52. O método da modalidade 51, em que o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antisenso, RNA- zima ou DNAzima.
Modalidade 53. O método da modalidade 52, em que o trans- gene heterólogo codifica um ou mais produtos gênicos de edição de ge- nes.
Modalidade 54. O método de qualquer uma das modalidades 34-53, em que o um ou mais produtos gênicos de edição de genes é uma CAS nuclease e/ou uma ou mais sequências guia e/ou uma ou mais sequências doadoras.
Modalidade 55. O método de qualquer uma das modalidades 34-54, em que o vetor viral é um vetor viral adeno-associado (AAV) ou um vetor lentiviral.
Modalidade 56. O método de qualquer uma das modalidades 34-55, em que o vetor viral é um vetor viral adeno-associado.
Modalidade 57. O método da modalidade 56, em que o vetor de AAV compreende um capsídeo do sorotipo de AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 ou AAV12. Modalidade 58. O método da modalidade 56 ou 57, em que o vetor de AAV compreende um genoma viral de AAV que compreende sequências de repetição terminal invertida (ITR) do sorotipo de AAV hu- mano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, r AAV10.
Modalidade 59. O método da modalidade 58, em que o cap- sídeo de AAV e a ITR de AAV são do mesmo sorotipo ou de diferentes sorotipos.
Modalidade 60. O método da modalidade 34-55, em que o vetor viral é um vetor lentiviral.
Modalidade 61. O método da modalidade 60, em que o vetor lentiviral é derivado do vírus da imunodeficiência humana, vírus da imu- nodeficiência de símio ou vírus da imunodeficiência felina.
Modalidade 62. O método da modalidade 60 ou 61, em que o vetor lentiviral não é replicável.
Modalidade 63. O método de qualquer uma das modalidades 60-52, em que o vetor lentiviral não é integrador.
Modalidade 64. O método de qualquer uma das modalidades 34-63, em que a composição é uma composição farmacêutica compre- ende um vetor viral envelopado e um ou mais excipientes farmaceutica- mente aceitáveis.
Modalidade 65. O método de qualquer uma das modalidades 34-64, em que o indivíduo é um humano.
Modalidade 66. O método da modalidade 35, em que a do- ença ou distúrbio é uma doença monogênica.
Modalidade 67. O método da modalidade 35, em que a do- ença ou distúrbio é miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenilcetonúria (PKU), adre- noleucodistrofia, doença das células falciformes ou talassemia beta.
Modalidade 68. Método para produzir um vetor viral envelo- pado com imunogenicidade reduzida, o método compreendendo a) cul- tivar células produtoras virais sob condições para gerar partículas virais envelopadas, em que as células produtoras virais compreendem um ácido nucleico que codifica uma ou mais funções efetoras imunes liga- das a membrana que reduzem a imunogenicidade do vetor envelopado e b) coletar os vetores virais envelopados.
Modalidade 69. O método da modalidade 68, em que as fun- ções efetoras imunes reduzem a imunogenicidade do vetor envelopado.
Modalidade 70. O método da modalidade 68 ou 69, em que as funções efetoras imunes estimulam inibidores imunes.
Modalidade 71. O método da modalidade 68 ou 69, em que as funções efetoras imunes inibem moléculas estimuladoras imunes.
Modalidade 72. O método de qualquer uma das modalidades 68-71, em que as células produtoras virais compreendem moléculas de ácido nucleico codificadoras que estimulam inibidores imunes e molé- culas que inibem moléculas estimuladoras imunes.
Modalidade 73. O método de qualquer uma das modalidades 68-72, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais moléculas que for- necem funções efetoras imunológicas inclui um ou mais de CTLA4, B7- 1, B7-2, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD28, VISTA, TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
Modalidade 74. O método de qualquer uma das modalidades 68-73, em que as células produtoras virais compreendem um ácido nu- cleico que codifica CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA-4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2 , PD-L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD- L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD-L1 e PD-L2 e VISTA, ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
Modalidade 75. O método de qualquer uma das modalidades 68-74, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais moléculas que for- nece funções efetoras imunológicas compreende um domínio trans- membrana.
Modalidade 76. O método de qualquer uma das modalidades
68-75, em que o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes é transitoriamente introduzido nas células produtoras virais.
Modalidade 77. O método de qualquer uma das modalidades 68-76, em que o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunológicas é mantido de forma está- vel nas células produtoras virais.
Modalidade 78. O método da modalidade 77, em que o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas que fornecem funções efetoras imunes é integrado no genoma da célula produtora viral.
Modalidade 79. O método de qualquer uma das modalidades 68-78, em que as células produtoras virais compreendem um ácido nu- cleico que codifica uma ou mais moléculas de direcionamento que dire- cionam o vetor para um ou mais tipos de células.
Modalidade 80. O método da modalidade 79, em que as mo- léculas de direcionamento conferem especificidade para o tecido ao ve- tor envelopado.
Modalidade 81. O método da modalidade 80, em que a mo- lécula de direcionamento é um anticorpo.
Modalidade 82. O método da modalidade 71, em que o anti- corpo é o anticorpo 8D7. Modalidade 83. O método de qualquer uma das modalidades 79-82, em que a uma ou mais moléculas de direcionamento compre- ende um domínio transmembrana.
Modalidade 84. O método de qualquer uma das modalidades 79-83, em que o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas alvo é transitoriamente introduzido nas células produtoras virais.
Modalidade 85. O método de qualquer uma das modalidades 79-84, em que o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas de direcionamento é mantido de forma estável nas células produtoras virais.
Modalidade 86. O método da modalidade 85, em que o ácido nucleico que codifica a uma ou mais moléculas direcionadas a molécu- las é integrado ao genoma da célula produtora viral.
Modalidade 87. O método de qualquer uma das modalidades 68-86, em que o vetor viral envelopado é um vetor de AAV envelopado.
Modalidade 88. O método da modalidade 87, em que as cé- lulas produtoras virais compreendem a) um ácido nucleico que codifica genes rep e cap de AAV, b) um ácido nucleico que codifica um genoma viral de AAV que compreende um transgene e pelo menos uma ITR, e c) unções auxiliares de AAV.
Modalidade 89. O método da modalidade 88, em que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são introduzidos transitoriamente na linhagem celular produ- tora.
Modalidade 90. O método da modalidade 88, em que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são mantidos de maneira estável na linhagem de célula produ- tora.
Modalidade 91. O método da modalidade 90, em que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são integrados de maneira estável no genoma da linhagem de célula produtora.
Modalidade 92. O método de qualquer uma das modalidades 88-91, em que o genoma do rAAV compreende duas ITRs de AAV.
Modalidade 93. O método de qualquer uma das modalidades 88-92, em que uma ou mais funções auxiliares de AAV são fornecidas por um ou mais de um plasmídeo, um adenovírus, um ácido nucleico integrado de maneira estável no genoma celular ou em um vírus do her- pes simples (HSV).
Modalidade 94. O método de qualquer uma das modalidades 88-93, em que as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções E1A de adenovírus, função E1B de adenovírus, fun- ção E2A de adenovírus, função E4 de adenovírus e função VA de ade- novírus.
Modalidade 95. O método de qualquer uma das modalidades 88-93, em que as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções UL5 de HSV, função UL8 de HSV, função UL52 de HSV, função UL52 de HSV e função UL29 de HSV.
Modalidade 96. O método de qualquer uma das modalidades 68-86, em que o vetor viral envelopado é um vetor lentiviral.
Modalidade 97. O método da modalidade 96, em que o vetor lentiviral é um vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imunode- ficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina.
Modalidade 98. O método da modalidade 96 ou 97, em que as células produtoras virais compreendem a) um ácido nucleico que co- difica o gene gag lentiviral, b) um ácido nucleico que codifica o gene pol lentiviral, c) um ácido nucleico que codifica um vetor de transferência lentiviral que compreende um transgene, uma repetição terminal longa 5' (LTR) e uma 3’ LTR, em que toda ou parte de uma região U3 da 3’ LTR é substituída por um elemento regulador heterólogo.
Modalidade 99. O método de qualquer uma das modalidades 68-98, em que o vetor envelopado é ainda purificado.
Modalidade 100. Um kit que compreende a composição de qualquer uma das modalidades 1-33. Modalidade 101. O kit da modalidade 100 que compreende ainda instruções de uso.
Modalidade 102. Uma composição para uso na liberação de um ácido nucleico a um indivíduo necessitado, de acordo com as mo- dalidades 34-67.
Modalidade 103. Uma composição para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo necessitado, de acordo com as modalidades 34-67. Modalidade 104. Uso da composição de qualquer uma das modalidades 1-33 na fabricação de um medicamento para liberar um ácido nucleico para um indivíduo necessitado.
Modalidade 105. Uso da composição de qualquer uma das modalidades 1-33 na fabricação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo com uma doença ou distúrbio.
Modalidade 106. O uso da modalidade 105, em que a doença ou distúrbio é a miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amau- rose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Le- ber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenilcetonúria (PKU), adrenoleuco- distrofia, doença das células falciformes ou talassemia beta.
Modalidade 107. Artigo de fabricação que compreende a composição de qualquer uma das modalidades 1-33. Modalidade 108. Um vetor viral envelopado que compreende uma partícula viral envolvida por um envelope, em que a partícula viral compreende um transgene heterólogo e o envelope compreende uma bicamada lipídica e uma ou mais moléculas imunossupressoras.
Modalidade 109. O vetor viral envelopado da modalidade 108, em que o vírus envelopado tem imunogenicidade reduzida em comparação com um vetor do mesmo tipo sem moléculas imunossu- pressoras na bicamada lipídica.
Modalidade 110. O vetor viral envelopado da modalidade 108 ou 109, em que a uma ou mais moléculas imunossupressoras com- preendem uma ou mais proteínas de ponto de verificação imune.
Modalidade 111. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-110, em que a uma ou mais moléculas imunossu- pressoras compreendem um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD- L1, PD -L2, CD28, VISTA, TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
Modalidade 112. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-111, em que o envelope compreende duas ou mais, três ou mais, ou quatro ou mais moléculas imunossupressoras di- ferentes; ou compreende duas ou mais, três ou mais ou quatro ou mais proteínas diferentes de ponto de verificação.
Modalidade 113. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-112, em que o envelope compreende CTLA4 e PD-L1; CTLA e PD-L2; CTLA-4 e VISTA; PD-L1 e PD-L2; PD-L1 e VISTA; PD-L2 e VISTA; CTLA4 e PD-L1 e PD-L2; CTLA4 e PD-L1 e VISTA; CTLA4 e PD-L2 e VISTA; PD-L1 e PD-L2 e VISTA; ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
Modalidade 114. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-113, em que uma ou mais das moléculas imunos- supressoras compreendem um domínio transmembrana.
Modalidade 115. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-114, em que o envelope compreende ainda uma molécula de direcionamento.
Modalidade 116. O vetor viral envelopado da modalidade 115, em que a molécula alvo confere especificidade para a célula ou tecido ao vetor envelopado.
Modalidade 117. O vetor viral envelopado da modalidade 116, em que a molécula alvo é um anticorpo.
Modalidade 118. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 115-117, em que a uma ou mais moléculas de direci- onamento compreendem um domínio transmembrana.
Modalidade 119. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-118, em que o envelope compreende uma porção de uma membrana celular de uma célula que compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais moléculas imu- nossupressoras.
Modalidade 120. O vetor viral envelopado da modalidade 119, em que a partícula viral compreende um capsídeo viral e um ge- noma viral, e o genoma viral compreende o transgene heterólogo.
Modalidade 121. O vetor viral envelopado da modalidade 120, em que o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo.
Modalidade 122. O vetor viral envelopado da modalidade 121, em que o transgene heterólogo codifica um polipeptídeo terapêu- tico ou um polipeptídeo repórter.
Modalidade 123. O vetor viral envelopado da modalidade 122, em que o transgene heterólogo codifica o Fator VIII, Fator IX, mio- tubularina, proteína de sobrevida do neurônio motor (SMN), retinoide isômero-hidrolase (RPE65), cadeia 4 de NADH-ubiquinona oxidoredu- tase, proteína da Coroideremia (CHM), huntingtina, alfa-galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-glicosidase, ornitina transcarbamilase, arginino succinato sintetase, β-globina, y-globina, fenilalanina hidroxi- lase ou proteína da adrenoleucodistrofia (ALD). Modalidade 124. O vetor viral envelopado da modalidade 120, em que o transgene heterólogo codifica um ácido nucleico terapêu- tico.
Modalidade 125. O vetor viral envelopado da modalidade 124, em que o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antisenso, RNAzima ou DNAzima.
Modalidade 126. O vetor viral envelopado da modalidade 120, em que o transgene heterólogo codifica um ou mais produtos de edição de genes.
Modalidade 127. O vetor viral envelopado da modalidade
126, em que o um ou mais produtos de edição de gene é uma nuclease guiada por RNA, um ácido nucleico guia e/ou um ácido nucleico doador.
Modalidade 128. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-127, em que a partícula viral compreende um ve- tor viral adeno-associado (AAV). Modalidade 129. O vetor viral envelopado da modalidade 128, em que o vetor de AAV compreende um capsídeo do sorotipo de AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 ou AAV12. Modalidade 130. O vetor viral envelopado da modalidade 128 ou 129, em que o AAV compreende um genoma viral de AAV que compreende as sequências de repetição terminal invertida (ITR) em que o capsídeo do AAV e a ITR de AAV são do mesmo sorotipo de AAV ou de diferentes sorotipos de AAV.
Modalidade 131. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108 ou 128-130, em que o vetor viral envelopado é um AAV envelopado que compreende um transgene heterólogo que codi- fica o Fator IX humano, e o envelope é um exossoma manipulado para conter CTLA- 4 e PD-L1. Modalidade 132. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108 ou 128-131, em que o envelope é um exossoma de uma célula produtora manipulada para superexpressar CTLA-4 e PD- L1. Modalidade 133. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108 ou 128-130, em que o vetor viral envelopado é um AAV envelopado que compreende um transgene heterólogo que codi- fica o Fator VIII humano e o envelope é um exossoma manipulado para conter CTLA- 4 e PD-L1. Modalidade 134. O vetor viral envelopado da modalidade
133, em que o envelope é um exossoma de uma célula produtora ma- nipulada para superexpressar CTLA-4 e PD-L1. Modalidade 135. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-127, em que a partícula viral compreende um ve- tor lentiviral.
Modalidade 136. O vetor viral envelopado da modalidade 135, em que o vetor lentiviral é um vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imunodeficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina.
Modalidade 137. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108 - 136, em que o vetor, quando administrado em dose única a um indivíduo, fornece níveis de expressão de transgene 3 semanas após a administração a um indivíduo que estão aumentados em cerca de 50% ou mais em comparação com a expressão do trans- gene produzida pela administração de um vetor viral não envelopado do mesmo tipo na mesma quantidade e nas mesmas condições.
Modalidade 138. O vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-137, em que o vetor fornece níveis de expressão de transgene 3 semanas após a administração como uma dose única a um indivíduo que estão aumentados em cerca de 20% ou mais em com- paração com a expressão do transgene produzida pela administração de um vetor viral envelopado do mesmo tipo na mesma quantidade sem as moléculas imunossupressoras sob as mesmas condições.
Modalidade 139. Uma composição que compreende o vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
Modalidade 140. Um método de liberação de um transgene para uma célula ou indivíduo, o método compreendendo a administra- ção, à célula ou ao indivíduo, de um vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138, ou uma composição da modalidade
139. Modalidade 141. O método da modalidade 140, em que o indivíduo tem uma doença ou condição que pode ser tratada pela libe- ração e expressão do transgene.
Modalidade 142. Um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, o método compreendendo a administra- ção ao indivíduo de um vetor viral envelopado de qualquer uma das mo- dalidades 108-138, ou uma composição da modalidade 139. Modalidade 143 O método de qualquer uma das modalida- des 140-142, em que o indivíduo é um humano.
Modalidade 144. O método de qualquer uma das modalida- des 141-143, em que a doença ou distúrbio é uma doença monogênica.
Modalidade 145. O método de qualquer uma das modalida- des 141-143, em que a doença ou distúrbio é miopatia miotobular em atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcar- bamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenilcetonúria (PKU), adrenoleucodistrofia, doença das células falci- formes, doença de Niemann-Pick ou talassemia beta.
Modalidade 146. O método de qualquer uma das modalida- des 141-143, em que a doença ou distúrbio é hemofilia A ou hemofilia B.
Modalidade 147. O método de qualquer uma das modalida- des 141-143, em que o indivíduo tem hemofilia B, o vetor viral envelo- pado compreende um AAV que compreende um transgene heterólogo que codifica o Fator IX e o envelope é um exossoma manipulado para conter CTLA-4 e PD-L1. Modalidade 148. O método de qualquer uma das modalida-
des 141-143, em que o indivíduo tem hemofilia A, o vetor viral envelo- pado compreende um AAV envelopado que compreende um transgene heterólogo que codifica o Fator VIII humano e o envelope é um exos- soma manipulado para conter CTLA-4 e PD-L1. Modalidade 149. O método da modalidade 147 ou 148, em que o envelope é um exossoma de uma célula produtora manipulada para superexpressar CTLA-4 e PD-L1. Modalidade 150. O método de qualquer uma das modalida- des 140-149, em que o método compreende a administração de duas ou mais doses do vetor viral envelopado ao indivíduo com um intervalo de 1 dia ou mais entre cada dose.
Modalidade 151. Método para produzir um vetor viral enve- lopado de qualquer uma das modalidades 108-138, o método compre- endendo cultivar células produtoras virais in vitro sob condições para gerar partículas virais envelopadas, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana e coletando os vetores virais envelopados.
Modalidade 152. O método da modalidade 151, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos exógenos que codificam as moléculas imunossupressoras ligadas à membrana.
Modalidade 153. O método da modalidade 151 ou 152, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos heteró- logos que codificam as moléculas imunossupressoras ligadas à mem- brana.
Modalidade 154. O método de qualquer uma das modalida- des 151-153, em que as moléculas imunossupressoras ligadas à mem- brana compreendem um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD28, VISTA, TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
Modalidade 155. O método de qualquer uma das modalida- des 151-153, em que as moléculas imunossupressoras ligadas à mem- brana compreendem CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA-4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2, PD-L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD- L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD-L1 e PD-L2 e VISTA ou CTLA4 e PD-L1 e PD-Ll e VISTA.
Modalidade 156. O método de qualquer uma das modalida- des 151-155, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos heterólogos que codificam CTLA-4 e PD-L1. Modalidade 157. O método de qualquer uma das modalida- des 151-156, em que os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana são transitoriamente introduzidos nas células produtoras virais.
Modalidade 158. O método de qualquer uma das modalida- des 151-156, em que os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana são mantido deforma estável nas células produtoras virais.
Modalidade 159. O método da modalidade 158, em que os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana são integrados no genoma da célula produtora viral.
Modalidade 160. O método de qualquer uma das modalida- des 151-159, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de direcionamento.
Modalidade 161. O método de qualquer uma das modalida- des 151-160, em que o vetor viral envelopado é um vetor de AAV enve- lopado.
Modalidade 162. O método da modalidade 161, em que as células produtoras virais compreendem um ácido nucleico que codifica genes rep e cap de AAV, um ácido nucleico que codifica um genoma viral de AAV que compreende um transgene e pelo menos uma ITR e funções auxiliares de AAV.
Modalidade 163. O método da modalidade 162, em que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são introduzidos transitoriamente na linhagem de célula produtora.
Modalidade 164. O método da modalidade 162, em que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são mantidos estavelmente na linhagem de célula produ- tora.
Modalidade 165. O método da modalidade 164, em que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral de AAV são integrados de maneira estável no genoma da linhagem celular produtora.
Modalidade 166. O método de qualquer uma das modalida- des 151-165, em que uma ou mais funções auxiliares de AAV são for- necidas por um ou mais de um plasmídeo, um adenovírus, um ácido nucleico integrado de maneira estável no genoma celular ou em um ví- rus do herpes simples (HSV). Modalidade 167. O método de qualquer uma das modalida- des 151-166, em que as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais funções E1A de adenovírus, função E1B de adenovírus, função E2A de adenovírus, função E4 de adenovírus e função VA de adenoví- rus.
Modalidade 168. O método de qualquer uma das modalida- des 151-166, em que as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções UL5 de HSV, função UL8 de HSV, função UL52 de HSV e função UL29 de HSV.
Modalidade 169. O método de qualquer uma das modalida- des 151-160, em que o vetor viral envelopado é um vetor lentiviral.
Modalidade 170. O método da modalidade 169, em que o vetor lentiviral é um vírus da imunodeficiência humana, um vírus da imu- nodeficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina.
Modalidade 171. O método da modalidade 169 ou 170, em que as células produtoras virais compreendem um ácido nucleico que codifica o gene gag lentiviral, um ácido nucleico que codifica o gene pol lentiviral, ácido nucleico que codifica um vetor de transferência lentiviral que compreende um transgene, uma repetição terminal longa 5' (LTR) e uma 3’LTR, em que toda ou parte de uma região U3 da 3’LTR é remo- vida ou substituída por um elemento regulador heterólogo, um sítio de ligação ao iniciador, todo ou parte do gene GAG, um trato central de polipurina, códons de parada sintéticos na sequência GAG, elemento responsivo rev e um aceptor de splice env.
Modalidade 172. O método de qualquer uma das modalida- des 151-171, em que o vetor envelopado é ainda purificado.
Modalidade 173. Um kit compreendendo o vetor viral enve- lopado de qualquer uma das modalidades 108-138 ou composição da modalidade 139. Modalidade 174. O kit da modalidade 173 compreendendo ainda instruções de uso.
Modalidade 175. Um vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138 ou composição da modalidade 139 para uso na liberação de um ácido nucleico a um indivíduo.
Modalidade 176. Um vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138 ou composição da modalidade 139 para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.
Modalidade 177. O vetor viral envelopado ou composição da modalidade 175 ou 176 para uso na liberação de um ácido nucleico a um indivíduo de acordo com qualquer uma das modalidades 140-43. Modalidade 178. Uso do vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138 ou composição da modalidade 139 na fabricação de um medicamento para a liberação de um ácido nucleico para um indivíduo necessitado. Modalidade 179. Uso do vetor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138 ou composição da modalidade 139 na fabricação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo com uma doença ou distúrbio. Modalidade 180. O uso da modalidade 179, em que a doença ou distúrbio é a miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amau- rose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Le- ber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenilcetonúria (PKU), adrenoleuco- distrofia, doença das células falciformes, doença de Niemann-Pick ou talassemia beta. Modalidade 181. O uso da modalidade 180, em que a doença ou distúrbio é hemofilia A ou hemofilia B. Modalidade 182. Artigo de fabricação que compreende o ve- tor viral envelopado de qualquer uma das modalidades 108-138 ou a composição de modalidade 139.
EXEMPLOS Exemplo1: Determinação da redução das respostas imunes anti-
AAV
[00110] Uma série de experimentos são realizados em células para demonstrar a invenção. Uma reação linfocitária mista (MLR) usando PBMCs purificadas de indivíduos positivos para AAV é para determinar quanto vetores efetores podem reduzir as respostas imunes específicas para o capsídeo em comparação com vetores não envelopados com sorotipos correspondentes. Da mesma forma, uma MLR é usada para testar se os vetores efetores podem inibir a resposta das células T à proteína terapêutica, em comparação com os vetores não envelopa- dos. Esta segunda MLR é realizada como se segue: as células que apresentam o antígeno são primeiro incubadas com a proteína terapêu- tica e depois PBMCs (contendo células T e B) são adicionadas na pre- sença de vetores efetores ou vetores não envelopados com sorotipos correspondentes. A ativação das células T é medida usando a análise FACS para contar o total de células T, incluindo CD3+, CD4+, CD8+, CD25+ (IL2R) e FoxP3+. Um ensaio de anticorpo neutralizante é reali- zado usando soro de indivíduos com resultado positivo para anticorpos anti-capsídeo de AAV. O ensaio é realizado como descrito em Meliani et al. (2015) Hum Gene Ther Methods, 26:45-53. Exemplo 2: Produção do Vetor
[00111] AAVs foram produzidos usando células produtoras transfec- tadas com plasmídeos de produção de AAV para expressar o vetor. Os AAVs envelopados são lançados no meio de cultura junto com uma por- ção da membrana celular (envelope) e foram coletados a partir do meio de cultura através de um método que não remove o envelope. AAV não envelopado foi obtido pela lise de células produtoras para coletar as par- tículas virais não envelopadas.
[00112] Em mais detalhes, AAV Padronizado (não envelopado) (re- ferido como vetor "padronizado" ou "std" nos resultados e figuras) e ve- tores de AAV envelopados (referido como vetor "exo" nos resultados e figuras) foram produzidos em células HEK293T como descrito em Simo- nelli et al. (2010) Molecular Therapy, 18 (3):643-650. Os mesmos plas- mídeos de produção de AAV foram usados para ambos os tipos de ve- tores. O plasmídeo do genoma do vetor (pAAV.MCS.cb.Hu FIX) conti- nha o gene do fator IX humano como descrito por Nathwani et al. (2011) N Engl J. Med. 365: 2357-65. Os plasmídeos de embalagem e auxiliares foram aqueles usados anteriormente (id.). Os plasmídeos de produção foram transfectados para células 293T usando PEI como descrito Me- laini et al. (2017) Blood Advances, 1 (23): 2019-31 e purificados como descrito em Nathwani et al. (2011) N Engl J. Med. 365: 2357-65. Essas preparações foram geradas em discos de cultura de tecido de 24 x 150 mm de células T produtoras.
[00113] A cultura de células produtoras foi centrifugada e as células produtoras foram separadas do sobrenadante. O AAV envelopado foi isolado e purificado do sobrenadante usando ultracentrifugação em duas etapas e suspenso novamente em PBS, resultando em uma popu- lação de partículas de AAV Envelopado com um tamanho médio de par- tícula de cerca de 100 nm. O AAV padronizado (não envelopado) foi coletado das células produtoras pela lise das células em um tampão de lise celular seguida de purificação usando um protocolo padronizado de gradiente de iodixanol (Melaini et al. (2017) Blood Advances, 1(23): 2019-31 ) Detalhes adicionais do protocolo e rendimento do vetor são mostrados na Tabela 1. Tabela 1: Produção de vetores Quantidade de Plasmídeo de Produção Transfectado volume to- Quantidade de DNA Total (µg) Título (µg) tal de vetor rendimento Tipo do Vetor Plasmídeo Au- por placa de VG (mistura e alíquota em 12 placas) purificado total xiliar (µg) 150mm (vg/mL) (mL) AAV2/8 hFIX mPDL1 mCTL4 Envelopado 2,39E+ (Exo-AAV8- 600 300 300 0 0 0,5 1,20E+12 12 hFIX) EVADER (EV- 2,70E+ 400 100 100 200 200 0,5 1,35E+11 AAV8-hFIX) 100 11 Padronizado 1,67E+ 600 300 300 0 0 0,5 8,35E+12 (AAV8-hFIX) 13
[00114] Os vetores envelopados com um envelope que compreende CTLA-4 e PD-L1 (referidos nos resultados e figuras como vetores "Eva- der" ou "Efetor" ou com a designação "EF") foram produzidos em dois lotes usando o mesmo método como utilizado para o AAV Envelopado, exceto que as células HEK293T produtoras foram co-transfectadas com os vetores de expressão pCMV.mCTLA-4 e pCMV.mPDL-1, além dos plasmídeos de produção de AAV. pCMV.mCTLA-4 contém a sequência de cDNA CTLA-4 de murino direcionada por um promotor de CMV (ca- tálogo Sino Biological # MG50503-ETT). pCMV.mPDL-1 contém a se- quência de cDNA de PDL-1 de murino direcionada por um promotor de CMV (catálogo Sino Biological # MG50010-M). Um total de 2 prepara- ções de placas de cultura de tecidos de 24 x 150 mm foram prepara- das. Detalhes adicionais do protocolo e do rendimento do vetor são mostrados na Tabela 1.
[00115] Para confirmar se os vetores purificados tinham envelopes, foi realizado um Western blot usando um anticorpo anti-CD9. CD9 é usado como um marcador para indicar a presença do envelope derivado de células produzidas. Os vetores de AAV Envelopado e EVADER con- tinham CD9 no tamanho previsto de cerca de 25 KDa. Como esperado, o AAV8-FIX padronizado (não envelopado) não continha os componen- tes do envelope, como evidenciado pela ausência de CD9.
[00116] Os níveis de CTFA-4 e PDL-1 de murino nos AAVs EVADER e Envelopado foram quantificados usando a análise FACS baseada em esferas que usam anticorpos marcados por fluorescência: anti-CTFA-4 de murino (anti-CTFA-4 PECy7, número de catálogo Abcam abl34090) e anti-PDL-1 de murino (anti-PDL-1- PE-A, número de catálogo Abcam ab213480). A análise FACS revelou que os vetores EVADER apresen- tavam altos níveis de CTFA-4 e PDL-1 (83,6% e 75,3%, respectiva- mente) na superfície, como mostrado na FIG. 3, em que o histograma de EVADER que se desloca para a direita em cada figura indica que a maioria das partículas é positiva para CTFA-4 e PDL-1, respectiva- mente, em comparação com o AAV Envelopado. Exemplo 3: Transferência de genes in vivo em camundongos
[00117] O exemplo a seguir ilustra o uso dos vetores produzidos no Exemplo 2 para transferência de genes in vivo em camundongos C57B1/6.
[00118] Os camundongos C57B1/6 (sete machos e sete fêmeas) fo- ram injetados por via intravenosa com 1 x 109 genomas vetoriais. Os grupos de dosagem incluíram: 1) somente PBS (controle com veículo), 2) AAV8-hFIX, 3) Exo-AAV8-hFIX e 4) EV-AAV8-hFIX.
[00119] Na semana três após a administração, os camundongos fo- ram sangrados e analisados quanto aos (a) níveis de FIX humano (Vi- suLize™ Fator IX (FIX) Antigen Kit, Affinity Biologicals), (b) anticorpos de ligação a AAV8 (BAb) por ELISA usando IgG anti-AAV8 e (c) anticor- pos neutralizantes de AAV8 (NAb) usando um ensaio de anticorpos neu- tralizantes (Meliani et al. (2015) Hum Gene Ther Methods, 26: 45-53). O ensaio de neutralização in vitro é utilizado para medir o título de anticor- pos que impedem o teste de vetores de AAV que infectam as células alvo. Resumidamente, o ensaio implica em incubar uma multiplicidade otimizada de infecção (MOI) do vetor de teste que contém um gene re- pórter tal como a Luciferase, com diluições seriadas de anticorpos de teste, permitindo então que o vetor infecte uma célula alvo permissiva. A quantidade de fluorescência das células infectadas é medida após 24 horas e indica o título de anticorpos neutralizantes. O título neutralizante da amostra é determinado como a primeira diluição na qual é medida 50% ou mais da inibição da expressão da luciferase.
[00120] Também na semana três após a dosagem, dois camundon- gos machos e duas fêmeas de cada grupo foram sacrificados e os fíga- dos dos animais foram analisados quanto ao número de cópias do ge- noma do vetor (VGCN) por célula por qPCR. O DNA do tecido foi extra- ído do órgão inteiro utilizando o kit Magna Pure 96 DNA e NA de pe- queno volume viral (Roche Diagnostics, Indianapolis IN) de acordo com as instruções do fabricante. O número de cópias do genoma do vetor foi quantificado por TaqMan PCR em tempo real com o detector de sequên- cia ABI PRISM 7900 HT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). O gene da titina de camundongo foi usado como normalizador. Os inicia- dores e sondas utilizados para a quantificação foram os seguintes: promotor de hAAT a frente 5’GGCGGGCGACTCAGATC-3’, (SEQ ID NO:5) reverso 5’-GGGAGGCTGCTGGTGAATATT-3’ (SEQ ID NO:6) sonda FAM 5’-AGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTG-3’ (SEQ ID NO:7) Titina: a frente 5’-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3’, (SEQ ID NO:8) reverso 5’-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3’ (SEQ ID NO:9) sonda VIC 5’-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3’ (SEQ ID NO:10)
[00121] Os animais restantes receberam então (três semanas após a administração) 1 x 1010 vg do mesmo vetor de AAV que foi inicialmente administrado para cada grupo de dose. Na sexta semana, os camun- dongos foram novamente sangrados e analisados quanto aos níveis de FIX humano, anticorpos de ligação a AAV8 (BAb) e anticorpos neutrali- zantes de AAV8 (NAb) pelos mesmos protocolos. Todos os animais res- tantes foram então sacrificados e os fígados dos animais foram analisa- dos quanto aos genomas do vetor por célula por qPCR usando o proto- colo anterior.
[00122] Um aumento no nível sanguíneo do Fator IX (FIX) em com- paração com os animais de controle é indicativo de transferência e ex- pressão de genes bem-sucedidas, onde os animais de controle recebe- ram PBS em vez de vetor. Como mostrado na FIG. 4, os níveis sanguí- neos de FIX foram significativamente mais altos em camundongos tra- tados com EV-AAV8-hFIX do que em camundongos tratados com o ví- rus envelopado padronizado ou não envelopado. Isso foi observado nos pontos de tempo de três e seis semanas. A diferença entre os níveis do fator IX em camundongos machos e fêmeas é devida a um artefato do modelo animal bem estabelecido, no qual camundongos machos tradi- cionalmente transfectam com vetores de AAV com maior eficiência no fígado que os camundongos fêmeas. Essa diferença de gênero na efi- ciência da transdução é um artefato do modelo em camundongo e não ocorre em humanos. Para os propósitos destes dados, apenas camun- dongos machos são considerados. A variação nos níveis do Fator IX entre as semanas 3 e 6 entre camundongos de controle que receberam PBS foi devida à variabilidade dia a dia do ensaio próximo ao limite de detecção. Os camundongos de grupos que receberam PBS e AAV pa- dronizado mostraram níveis comparáveis de Fator IX na semana 3, que eram de cerca de 0,1 µg/mL. Na semana 3, os níveis nos camundongos tratados com EV-AAV8-hFIX foram cerca de 22 vezes maiores que os camundongos tratados com AAV padronizado não envelopado e cerca de 5,6 vezes mais altos que o AAV envelopado sem moléculas imunos- supressoras no envelope. Da mesma forma, na semana 6, os níveis de FIX nos camundongos tratados com EV-AAV8-hFIX foram cerca de 20 vezes maiores que os camundongos tratados com AAV padronizado não envelopado e cerca de 5 vezes maiores que o AAV envelopado sem moléculas imunossupressoras no envelope. Estes resultados demons- tram que o vetor EVADER compreendendo moléculas imunossupresso- ras no envelope proporcionou expressão gênica do fator IX significati- vamente aumentada in vivo, em comparação com o AAV padrão ou o AAV envelopado padrão.
[00123] As FIGs 7-9 mostram o número de genomas virais por célula nos fígados de animais sacrificados. Novamente, os camundongos tra- tados com EV-AAV8-hFIX mostraram um número maior de genomas vi- rais no fígado em comparação com outros grupos de tratamento no pe- ríodo de seis semanas, indicando maior eficiência na transdução em comparação com o AAV padronizado.
[00124] As FIGS. 5 e 6 mostram os níveis de anticorpos totais que se ligam a AAV e anticorpos que neutralizam AAV no sangue dos camun- dongos tratados. Foi observado que os camundongos tratados com EV- AAV8-hFIX apresentaram níveis mais altos de anticorpos do que os ca- mundongos tratados com os outros vetores. Os vetores foram analisa- dos quanto aos níveis de endotoxina (TOXINSENSOR™ Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit da Genscript), uma vez que a endotoxina é um potente estimulador da produção de anticorpos e de inflamação e pode causar o aumento observado nos níveis de produção de anticorpos. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. A partir dos resultados na Tabela 2, a quantidade de endotoxina administrada aos camundongos foi calculada pela normalização da quantidade de endotoxina para a dose recebida pelos camundongos AAV8-FIX padronizado. Os níveis relativos de endotoxina administrados para as doses 1 e 2 foram simila- res, portanto, apenas as quantidades relativas para a primeira dose são mostradas na FIG. 4. Foi calculado que os camundongos tratados com o vetor EV-AAV8-hFIX receberam níveis de endotoxina ~ 300 vezes mais altos por dose por animal em comparação com o vetor padronizado AAV8-hFIX, e camundongos tratados com exo-AAV8-hFIX receberam níveis de endotoxina ~50 vezes maior por dose por animal, em compa- ração com camundongos tratados com AAV8-FIX padronizado. Assim, é provável que os títulos mais altos de anticorpos nos camundongos tratados com EV-AAV8-hFIX sejam devidos ao aumento dos níveis de endotoxina neste experimento. Tabela 2 Teste AAV8-FIX Padronizado AAV8-FIX Envelopado EVADER (1ª Dose) EVADER (2ª Dose) Endotoxina (EU/mL) 0,1128 0,9348 0,5840 0,3983 Título VG (VG/mL) 1,67E+13 2,39E+12 2,70E+11 N/A
[00125] Apesar do aumento dos níveis de BAb e NAb nos camun- dongos tratados com EV-AAV8-hFIX, o vetor EV-AAV8-hFIX foi capaz de fornecer o transgene hFIX e aumentar significativamente a expres- são de FIX em comparação com todos os outros grupos de trata- mento. Isto sugere que a presença de moléculas imunossupressoras no envelope do vetor EV-AAV8-hFIX tem um efeito positivo significativo na expressão do transgene.
[00126] A citação de faixas de valores aqui serve apenas como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse citado individu- almente aqui em. Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplificadora (por exemplo, "tal como") aqui fornecida, visa meramente iluminar melhor o assunto des- crito e não representa uma limitação no escopo da descrição, a menos que seja reivindicado de outra forma.
[00127] Modalidades são descritas neste documento, incluindo o me- lhor modo de operação. Variações dessas modalidades podem se tor- nar aparentes para aqueles versados na técnica após a leitura da des- crição anterior e tais variações são contempladas pelo requerente. Por conseguinte, a descrição inclui todas as modificações e equivalentes do assunto em questão citado nas reivindicações em anexo, conforme per- mitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elemen- tos descritos acima em todas as variações possíveis está abrangida pela descrição, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.
[00128] SEQUÊNCIAS
[00129] F8 humano (UniProtKB – Q2VF45), variante SQ-FVIII de um domínio B deletado (BDD) 10 20 30 40 50
MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 110 120 130 140 150
DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 160 170 180 190 200
GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 210 220 230 240 250
GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 260 270 280 290 300
HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 310 320 330 340 350
RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 360 370 380 390 400
EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 410 420 430 440 450
WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 460 470 480 490 500
TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 510 520 530 540 550
DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 560 570 580 590 600
YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 610 620 630 640 650
NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 660 670 680 690 700
HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 710 720 730 740 750
MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 760 770 780 790 800
SKNNAIEPRS FSQNSRHPST RQKQFNATTI PENDIEKTDP WFAHRTPMPK 810 820 830 840 850
IQNVSSSDLL MLLRQSPTPH GLSLSDLQEA KYETFSDDPS PGAIDSNNSL 860 870 880 890 900
SEMTHFRPQL HHSGDMVFTP ESGLQLRLNE KLGTTAATEL KKLDFKVSST 910 920 930 940 950
SNNLISTIPS DNLAAGTDNT SSLGPPSMPV HYDSQLDTTL FGKKSSPLTE 960 970 980 990 1000
SGGPLSLSEE NNDSKLLESG LMNSQESSWG KNVSSTESGR LFKGKRAHGP 1010 1020 1030 1040 1050
ALLTKDNALF KVSISLLKTN KTSNNSATNR KTHIDGPSLL IENSPSVWQN
ILESDTEFKK VTPLIHDRML MDKNATALRL NHMSNKTTSS KNMEMVQQKK 1110 1120 1130 1140 1150
EGPIPPDAQN PDMSFFKMLF LPESARWIQR THGKNSLNSG QGPSPKQLVS 1160 1170 1180 1190 1200
LGPEKSVEGQ NFLSEKNKVV VGKGEFTKDV GLKEMVFPSS RNLFLTNLDN 1210 1220 1230 1240 1250
LHENNTHNQE KKIQEEIEKK ETLIQENVVL PQIHTVTGTK NFMKNLFLLS 1260 1270 1280 1290 1300
TRQNVEGSYD GAYAPVLQDF RSLNDSTNRT KKHTAHFSKK GEEENLEGLG 1310 1320 1330 1340 1350
NQTKQIVEKY ACTTRISPNT SQQNFVTQRS KRALKQFRLP LEETELEKRI 1360 1370 1380 1390 1400
IVDDTSTQWS KNMKHLTPST LTQIDYNEKE KGAITQSPLS DCLTRSHSIP 1410 1420 1430 1440 1450
QANRSPLPIA KVSSFPSIRP IYLTRVLFQD NSSHLPAASY RKKDSGVQES 1460 1470 1480 1490 1500
SHFLQGAKKN NLSLAILTLE MTGDQREVGS LGTSATNSVT YKKVENTVLP 1510 1520 1530 1540 1550
KPDLPKTSGK VELLPKVHIY QKDLFPTETS NGSPGHLDLV EGSLLQGTEG 1560 1570 1580 1590 1600
AIKWNEANRP GKVPFLRVAT ESSAKTPSKL LDPLAWDNHY GTQIPKEEWK 1610 1620 1630 1640 1650
SQEKSPEKTA FKKKDTILSL NACESNHAIA AINEGQNKPE IEVTWAKQGR 1660 1670 1680 1690 1700
TERLCSQNPP VLKRHQREIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1710 1720 1730 1740 1750
EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1760 1770 1780 1790 1800
KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNI MVTFRNQASR 1810 1820 1830 1840 1850
PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1860 1870 1880 1890 1900
CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1910 1920 1930 1940 1950
IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAI NGYIMDTLPG 1960 1970 1980 1990 2000
LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 2010 2020 2030 2040 2050
VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH
IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWI KVDLLAPMII 2110 2120 2130 2140 2150
HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 2160 2170 2180 2190 2200
SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME 2210 2220 2230 2240 2250
SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 2260 2270 2280 2290 2300
VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 2310 2320 2330 2340 2350
VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL Y
[00130] (SEQ ID NO:1)
[00131] Fator IX humano UniProtKB -P00740) 10 20 30 40 50
MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAECTV FLDHENANKI LNRPKRYNSG 60 70 80 90 100
KLEEFVQGNL ERECMEEKCS FEEAREVFEN TERTTEFWKQ YVDGDQCESN 110 120 130 140 150
PCLNGGSCKD DINSYECWCP FGFEGKNCEL DVTCNIKNGR CEQFCKNSAD 160 170 180 190 200
NKVVCSCTEG YRLAENQKSC EPAVPFPCGR VSVSQTSKLT RAETVFPDVD 210 220 230 240 250
YVNSTEAETI LDNITQSTQS FNDFTRVVGG EDAKPGQFPW QVVLNGKVDA 260 270 280 290 300
FCGGSIVNEK WIVTAAHCVE TGVKITVVAG EHNIEETEHT EQKRNVIRII 310 320 330 340 350
PHHNYNAAIN KYNHDIALLE LDEPLVLNSY VTPICIADKE YTNIFLKFGS 360 370 380 390 400
GYVSGWGRVF HKGRSALVLQ YLRVPLVDRA TCLRSTKFTI YNNMFCAGFH 410 420 430 440 450
EGGRDSCQGD SGGPHVTEVE GTSFLTGIIS WGEECAMKGK YGIYTKVSRY 460
VNWIKEKTKL T
[00132] (SEQ ID NO:2)
[00133] CTLA-4 humano: Sequência de Referência NCBI:
NP_005205.2 10 20 30 40 50
MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKAMHV AQPAVVLASS 60 70 80 90 100
RGIASFVCEY ASPGKATEVR VTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD 110 120 130 140 150
SICTGTSSGN QVNLTIQGLR AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY 160 170 180 190 200
VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL LTAVSLSKML KKRSPLTTGV 210 220
YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN
[00134] (SEQ ID NO:3)
[00135] PDL-1 humano: Sequência de Referência NCBI: NP_054862.1 1 MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME 61 DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG
VYRCMISYGG 121 ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS
DHQVLSGKTT 181 TTNSKREEKL FNVTSTLRIN TTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP
LAHPPNERTH 241 LVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET
[00136] (SEQ ID NO:4)
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> WINSLOW, Genine
<120> VETORES IMUNO-EVASIVOS E USO PARA TERAPIA GÊNICA
<130> 77439-20001.40
<140> Ainda Não Atribuída <141> Paralelamente em Anexo
<150> US 62/616,167 <151> 2018-01-11
<150> US 62/768,779 <151> 2018-11-16
<160> 10
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 2351 <212> PRT <213> Sequência Artificial
<220> <223> Construto Sintético
<400> 1 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro 755 760 765 Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp 770 775 780 Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys 785 790 795 800 Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser 805 810 815 Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn 835 840 845 Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly 850 855 860 Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu 865 870 875 880 Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys 885 890 895 Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn 900 905 910 Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met 915 920 925 Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys 930 935 940 Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu 945 950 955 960 Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu 965 970 975 Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe 980 985 990 Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala 995 1000 1005 Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn 1010 1015 1020 Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu 1025 1030 1035 1040 Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr 1045 1050 1055 Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp 1060 1065 1070 Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr 1075 1080 1085 Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile 1090 1095 1100 Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe 1105 1110 1115 1120 Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser 1125 1130 1135 Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly 1140 1145 1150 Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys 1155 1160 1165 Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu 1170 1175 1180 Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn 1185 1190 1195 1200 Leu His Glu Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu 1205 1210 1215 Ile Glu Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln 1220 1225 1230 Ile His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu 1235 1240 1245 Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala 1250 1255 1260 Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr 1265 1270 1275 1280 Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu 1285 1290 1295 Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys 1300 1305 1310 Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln 1315 1320 1325 Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr 1330 1335 1340 Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser 1345 1350 1355 1360
Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr 1365 1370 1375 Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys 1380 1385 1390 Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro 1395 1400 1405 Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr 1410 1415 1420 Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr 1425 1430 1435 1440 Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly 1445 1450 1455 Ala Lys Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr 1460 1465 1470 Gly Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser 1475 1480 1485 Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu 1490 1495 1500 Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr 1505 1510 1515 1520 Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His 1525 1530 1535 Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1540 1545 1550 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val 1555 1560 1565 Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu 1570 1575 1580 Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys 1585 1590 1595 1600 Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr 1605 1610 1615 Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile 1620 1625 1630 Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln 1635 1640 1645 Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg 1650 1655 1660 His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu 1665 1670 1675 1680 Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe 1685 1690 1695 Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys 1700 1705 1710 Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr 1715 1720 1725 Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly 1730 1735 1740 Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly 1745 1750 1755 1760 Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly 1765 1770 1775 Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1780 1785 1790 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu 1795 1800 1805 Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn 1810 1815 1820 Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His 1825 1830 1835 1840 His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr 1845 1850 1855 Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly 1860 1865 1870 Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg 1875 1880 1885 Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu
Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala 1905 1910 1915 1920 Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1925 1930 1935 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val 1940 1945 1950 Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser 1955 1960 1965 Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val 1970 1975 1980 Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly 1985 1990 1995 2000 Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg 2005 2010 2015 Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2020 2025 2030 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser 2035 2040 2045 Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln 2050 2055 2060 Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala 2065 2070 2075 2080 Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala 2085 2090 2095 Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 2100 2105 2110 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly 2115 2120 2125 Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val 2130 2135 2140 Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn 2145 2150 2155 2160 Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 2165 2170 2175 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser 2180 2185 2190 Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln 2195 2200 2205 Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro 2210 2215 2220 Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro 2225 2230 2235 2240 Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr 2245 2250 2255 Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2260 2265 2270 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His 2275 2280 2285 Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly 2290 2295 2300 Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu 2305 2310 2315 2320 Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile 2325 2330 2335 Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 2340 2345 2350
<210> 2 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460
<210> 3 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 3 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220
<210> 4 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 4 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290
<210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial
<220> <223> Construto Sintético
<400> 5 ggcgggcgac tcagatc 17
<210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial
<220> <223> Construto Sintético
<400> 6 gggaggctgc tggtgaatat t 21
<210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial
<220> <223> Construto Sintético
<400> 7 agcccctgtt tgctcctccg ataactg 27
<210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial
<220> <223> Construto Sintético
<400> 8 aaaacgagca gtgacgtgag c 21
<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial
<220> <223> Construto Sintético
<400> 9 ttcagtcatg ctgctagcgc 20
<210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial
<220>
<223> Construto Sintético
<400> 10 tgcacggaag cgtctcgtct cagtc 25

Claims (75)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor viral envelopado, caracterizado pelo fato de compre- ender uma partícula viral circundada por um envelope, em que a partí- cula viral compreende um transgene heterólogo, e o envelope compre- ende uma bicamada lipídica e uma ou mais moléculas imunossupresso- ras.
2. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vírus envelopado possui imunogenici- dade reduzida em comparação com um vetor do mesmo tipo sem mo- léculas imunossupressoras na bicamada lipídica.
3. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais moléculas imunossu- pressoras compreendem uma ou mais proteínas de ponto de verificação imune.
4. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mo- léculas imunossupressoras compreendem um ou mais de CTLA4, B7- 1, B7-2, PD-1, PD-Ll, PD-L2, CD28, VISTA, TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
5. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o envelope compre- ende duas ou mais, três ou mais ou quatro ou mais moléculas imunos- supressoras diferentes; ou compreende duas ou mais, três ou mais ou quatro ou mais proteínas diferentes de ponto de verificação.
6. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o envelope compre- ende CTLA4 e PD-L1; CTLA e PD-L2; CTLA-4 e VISTA; PD-L1 e PD- L2; PD-L1 e VISTA; PD-L2 e VISTA; CTLA4 e PD-L1 e PD-L2; CTLA4 e PD-L1 e VISTA; CTLA4 e PD-L2 e VISTA; PD-L1 e PD-L2 e VISTA; ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
7. Vetor viral envolvido de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das mo- léculas imunossupressoras compreendem um domínio transmembrana.
8. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o envelope compre- ende ainda uma molécula de direcionamento.
9. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a molécula de direcionamento confere especificidade para célula ou tecido ao vetor envelopado.
10. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a molécula de direcionamento é um an- ticorpo.
11. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais moléculas de direcionamento compreende um domínio transmembrana.
12. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o envelope com- preende uma porção de uma membrana celular de uma célula que com- preende um ou mais ácidos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais moléculas imunossupressoras.
13. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a partícula viral compreende um capsí- deo viral e um genoma viral e o genoma viral compreende o transgene heterólogo.
14. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o transgene heterólogo codifica um poli- peptídeo.
15. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o transgene heterólogo codifica um poli- peptídeo terapêutico ou um polipeptídeo repórter.
16. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o transgene heterólogo codifica Fator VIII, Fator IX, miotubularina, proteína de sobrevida do neurônio motor (SMN), retinoide isômero-hidrolase (RPE65), cadeia 4 NADH-ubiqui- nona oxidoredutase, proteína da Coroideremia (CHM), huntingtina, alfa- galactosidase A, beta-glicosidase ácida, alfa-glicosidase, ornitina trans- carbamilase, arginino succinato sintetase, β-globina, y-globina, fenilala- nina hidroxilase ou proteína da adrenoleucodistrofia (ALD).
17. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o transgene heterólogo codifica um ácido nucleico terapêutico.
18. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico terapêutico é um siRNA, miRNA, shRNA, RNA antisenso, RNAzima ou DNAzima.
19. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o transgene heterólogo codifica um ou mais produtos de edição de genes.
20. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o um ou mais produtos de edição de ge- nes é uma nuclease guiada por RNA, um ácido nucleico guia e/ou um ácido nucleico doador.
21. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a partícula viral compreende um vetor viral adeno-associado (AAV).
22. Vetor viral envelopado, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV compreende um cap- sídeo do sorotipo de AAV humano AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 ou AAV12.
23. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o AAV compreende um genoma viral de AAV que compreende as sequências de repetição terminal in- vertida (ITR) em que o capsídeo do AAV e a ITR de AAV são do mesmo sorotipo de AAV ou de diferentes sorotipos de AAV.
24. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o vetor viral envelopado é um AAV envelopado que compreende um transgene he- terólogo que codifica o Fator IX humano e o envelope é um exossoma manipulado para conter CTLA-4 e PD- L1
25. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 21 a 24, caracterizado pelo fato de que o envelope é um exossoma de uma célula produtora manipulada para superexpres- sar CTLA-4 e PD-L1.
26. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o vetor viral envelopado é um AAV envelopado que compreende um transgene he- terólogo que codifica o Fator VIII humano e o envelope é um exossoma manipulado para conter CTLA-4 e PD- L1
27. Vetor viral envelopado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o envelope é um exossoma de uma célula produtora manipulada para superexpressar CTLA-4 e PD-L1.
28. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a partícula viral compreende um vetor lentiviral.
29. Vetor viral envelopado de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o vetor lentiviral é um vírus da imunode- ficiência humana, um vírus da imunodeficiência de símio ou um vírus da imunodeficiência felina.
30. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o vetor, quando administrado em dose única a um indivíduo, fornece níveis de expres- são de transgene três semanas após a administração ao indivíduo que estão aumentados em cerca de 50% ou mais em comparação com ex- pressão de transgene produzida pela administração de um vetor viral não envelopado do mesmo tipo na mesma quantidade e nas mesmas condições.
31. Vetor viral envelopado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o vetor fornece níveis de expressão de transgene 3 semanas após a administração como dose única a um indivíduo que estão aumentado em cerca de 20% ou mais em comparação com a expressão de transgene produzida por administração de um vetor viral envelopado do mesmo tipo na mesma quantidade sem as moléculas imunossupressoras nas mesmas condi- ções.
32. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 31 e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
33. Método de liberação de um transgene para uma célula ou indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender administrar à cé- lula ou indivíduo um vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou uma composição como definida na reivindicação 32.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença ou condição que pode ser tratada pela liberação e expressão do transgene.
35. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender a administração ao indivíduo de um vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou de uma composição como definida na reivindicação 32.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é doença monogênica.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC), doença de Pompe, doença de Fabry, citruline- mia tipo1, fenilcetonúria (PKU), adrenoleucodistrofia, doença falciforme, doença de Niemann-Pick ou talassemia beta.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é hemofilia A ou hemofilia B.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem hemofilia B, o vetor viral envelopado compreende um AAV que compreende um trans- gene heterólogo que codifica o Fator IX e o envelope é um exossoma manipulado para conter CTLA-4 e PD- L1
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem hemofilia A, o vetor viral envelopado compreende um AAV envelopado que compre- ende um transgene heterólogo que codifica o Fator VIII humano e o en- velope é um exossoma manipulado para conter CTLA-4 e PD-L1.
42. Método de acordo com a reivindicação 40 ou 41, carac- terizado pelo fato de que o envelope é um exossoma de uma célula produtora manipulada para superexpressar CTLA-4 e PD-L1.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
33 a 42, caracterizado pelo fato de que o método compreende adminis- trar duas ou mais doses do vetor viral envelopado ao indivíduo com um intervalo de 1 dia ou mais entre cada dose.
44. Método para produzir um vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de compreender: a) cultivar as células produtoras virais in vitro sob condições para gerar partículas virais envelopadas, em que as células produtoras virais compreendem ácidos nucleicos que codificam um ou mais molé- culas imunossupressoras ligadas à membrana, e b) coletar os vetores virais envelopados.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que as células produtoras virais compreendem ácidos nu- cleicos exógenos que codificam as moléculas imunossupressoras liga- das à membrana.
46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou 45, carac- terizado pelo fato de que as células produtoras virais compreendem áci- dos nucleicos heterólogos que codificam as moléculas imunossupres- soras ligadas à membrana.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que as moléculas imunossupresso- ras ligadas à membrana compreendem um ou mais de CTLA4, B7-1, B7-2, PD-1, PD-Ll, PD-L2, CD28, VISTA, TIM-3, GAL9, TIGIT, CD155, LAG3, VISTA, BTLA ou HVEM.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que as moléculas imunossupresso- ras ligadas à membrana compreendem CTLA4 e PD-L1, CTLA e PD-L2 CTLA-4 e VISTA, PD-L1 e PD-L2, PD-L1 e VISTA, PD-L2 e VISTA, CTLA4 e PD-L1 e PD-L2, CTLA4 e PD-L1 e VISTA, CTLA4 e PD-L2 e VISTA, PD-Ll e PD-L2 e VISTA ou CTLA4 e PD-L1 e PD-L1 e VISTA.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, caracterizado pelo fato de que as células produtoras virais com- preendem ácidos nucleicos heterólogos que codificam CTLA-4 e PD-L1.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos que codifi- cam uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana são introduzidos transitoriamente nas células produtoras virais.
51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos que codifi- cam uma ou mais uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana são mantidos estavelmente nas células produtoras virais.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que os ácidos nucleicos que codificam uma ou mais de uma ou mais moléculas imunossupressoras ligadas à membrana estão inte- grados no genoma da célula produtora viral.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 52, caracterizado pelo fato de que as células produtoras virais com- preendem ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de direcionamento.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 53, caracterizado pelo fato de que o vetor viral envelopado é um vetor de AAV envelopado.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as células produtoras virais compreendem c) ácido nucleico que codifica genes rep e cap de AAV, d) ácido nucleico que codifica um genoma viral de AAV que compreende um transgene e pelo menos uma ITR e e) funções auxiliares de AAV.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de
AAV e/ou o genoma viral de AAV são introduzidos transitoriamente na linhagem celular produtora.
57. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral do AAV são mantidos estavelmente na linha- gem celular produtora.
58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica os genes rep e cap de AAV e/ou o genoma viral do AAV são integrados estavelmente no ge- noma da linhagem celular produtora.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 58, caracterizado pelo fato de que uma ou mais funções auxiliares de AAV são fornecidas por um ou mais de um plasmídeo, um adenoví- rus, um ácido nucleico integrado de forma estável no genoma celular ou em um vírus do herpes simples (HSV).
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizado pelo fato de que as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais funções E1A de adenovírus, função E1B de adenovírus, função E2A de adenovírus, função E4 de adenovírus e fun- ção VA de adenovírus.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 59, caracterizado pelo fato de que as funções auxiliares de AAV compreendem uma ou mais das funções UL5 de HSV, função UL8 de HSV, função UL52 de HSV e função UL29 de HSV.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 53, caracterizado pelo fato de que o vetor viral envelopado é um vetor lentiviral.
63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o vetor lentiviral é um vírus da imunodeficiência hu-
mana, um vírus da imunodeficiência de símio ou um vírus da imunode- ficiência felina.
64. Método de acordo com a reivindicação 62 ou 63, carac- terizado pelo fato de que as células produtoras virais compreendem f) ácido nucleico que codifica o gene gag lentiviral, g) ácido nucleico que codifica o gene pol lentiviral, h) ácido nucleico que codifica um vetor de transferência len- tiviral que compreende um transgene, uma repetição longa 5' (LTR) e uma 3’ LTR, em que toda ou parte de uma região U3 da 3’LTR é subs- tituída por um elemento regulador heterólogo, um sítio de ligação ao iniciador, todo ou parte do gene GAG, um trato de polipurina central, códons de parada sintéticos na sequência de GAG, elemento respon- sivo a rev e um aceptor de splice env.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 64, caracterizado pelo fato de que o vetor envelopado é ainda pu- rificado.
66. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou composição como definida na reivindicação 32.
67. Kit de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de compreender ainda instruções de uso.
68. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou composição de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser para uso na distribuição de um ácido nu- cleico a um indivíduo.
69. Vetor viral envelopado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou composição de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.
70. Vetor viral envelopado ou composição de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de ser para uso na libe- ração de um ácido nucleico a um indivíduo como definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 43.
71. Uso do vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou da composição como definida na rei- vindicação 32, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para a liberação de um ácido nucleico a um indivíduo ne- cessitado.
72. Uso do vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou da composição como definida na rei- vindicação 32, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um me- dicamento para o tratamento de um indivíduo com uma doença ou dis- túrbio.
73. Uso de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é miopatia miotobular, atrofia muscular espinhal, amaurose congênita de Leber, hemofilia A, hemofilia B, coroideremia, doença de Huntington, doença de Batten, neuropatia óptica hereditária de Leber, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC) , Doença de Pompe, doença de Fabry, citrulinemia tipo 1, fenil- cetonúria (PKU), adrenoleucodistrofia, doença das células falciformes, doença de Niemann-Pick ou talassemia beta.
74. Uso de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é hemofilia A ou hemofilia B.
75. Artigo de fabricação, caracterizado pelo fato de compre- ender o vetor viral envelopado como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 31 ou a composição como definida na reivindicação 32.
BR112020014093-7A 2018-01-11 2019-01-11 vetores imuno-evasivos e uso para terapia gênica BR112020014093A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862616167P 2018-01-11 2018-01-11
US62/616,167 2018-01-11
US201862768779P 2018-11-16 2018-11-16
US62/768,779 2018-11-16
PCT/US2019/013361 WO2019140311A1 (en) 2018-01-11 2019-01-11 Immuno-evasive vectors and use for gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020014093A2 true BR112020014093A2 (pt) 2020-12-01

Family

ID=65444323

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020014093-7A BR112020014093A2 (pt) 2018-01-11 2019-01-11 vetores imuno-evasivos e uso para terapia gênica

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200338216A1 (pt)
EP (1) EP3737768A1 (pt)
JP (2) JP7406253B2 (pt)
KR (1) KR20200128519A (pt)
CN (1) CN111836896A (pt)
AU (1) AU2019206639A1 (pt)
BR (1) BR112020014093A2 (pt)
CA (1) CA3088897A1 (pt)
CL (1) CL2020001850A1 (pt)
IL (1) IL275951A (pt)
MX (1) MX2020007390A (pt)
RU (1) RU2020126574A (pt)
SG (1) SG11202006298XA (pt)
WO (1) WO2019140311A1 (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021180118A1 (en) * 2020-03-11 2021-09-16 Shanghai Belief-Delivery Biomed Co., Ltd. Novel use of aspirin compound in increasing nucleic acid expression
BR112022026309A2 (pt) * 2020-06-24 2023-01-17 Chameleon Biosciences Inc Vesículas extracelulares com moduladores imune
CN112410304A (zh) * 2020-11-12 2021-02-26 天津大学 一种基因修饰的外泌体及其制备方法和应用
WO2023028035A1 (en) * 2021-08-23 2023-03-02 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Lipid enveloped recombinant aav particles for gene therapy use

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001512142A (ja) * 1997-07-31 2001-08-21 カイロン コーポレイション 宿主の免疫抑制を介するａａｖベクターの再投与を可能にする方法
JP2002514388A (ja) * 1998-04-29 2002-05-21 ユニバーシティー・オブ・サウザーン・カリフォルニア 修飾エンベロープエスコート蛋白質を含むレトロウイルスベクター
DE19827457C1 (de) * 1998-06-19 2000-03-02 Medigene Ag Strukturprotein von AAV, seine Herstellung und Verwendung
WO2006007539A1 (en) * 2004-07-01 2006-01-19 Virxsys Corporation Vector packaging cell line
CA2612355A1 (en) * 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corporation Antibody complexes
JP4691611B1 (ja) 2010-01-15 2011-06-01 富士フイルム株式会社 有機電界発光素子
WO2011106376A2 (en) * 2010-02-23 2011-09-01 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in the treatment of medical conditions
CN106714826A (zh) * 2014-09-07 2017-05-24 西莱克塔生物科技公司 用于减弱基因表达调节抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物
CN104887717B (zh) * 2015-06-04 2019-05-31 爱康得生物医学技术（苏州）有限公司 一种免疫增强试剂
US20190038778A1 (en) * 2016-02-05 2019-02-07 The General Hospital Corporation Hybrid System for Efficient Gene Delivery to Cells of the Inner Ear

Also Published As

Publication number Publication date
EP3737768A1 (en) 2020-11-18
CN111836896A (zh) 2020-10-27
WO2019140311A1 (en) 2019-07-18
RU2020126574A (ru) 2022-02-11
US20200338216A1 (en) 2020-10-29
JP2023160938A (ja) 2023-11-02
AU2019206639A1 (en) 2020-08-20
SG11202006298XA (en) 2020-07-29
KR20200128519A (ko) 2020-11-13
JP7406253B2 (ja) 2023-12-27
CA3088897A1 (en) 2019-07-18
CL2020001850A1 (es) 2020-12-04
IL275951A (en) 2020-08-31
MX2020007390A (es) 2020-10-14
JP2021510522A (ja) 2021-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022200502B2 (en) Adeno-associated virus vector variants for high efficiency genome editing and methods thereof
EP0932418B1 (en) Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
BR112020014093A2 (pt) vetores imuno-evasivos e uso para terapia gênica
US6346415B1 (en) Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors
CA2406745C (en) A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
US20020131961A1 (en) Method for gene transfer using Bcl2 and compositions useful therein
US20010006955A1 (en) Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
CN111356763B (zh) 变体RNAi
US11142775B2 (en) Bocaparvovirus small noncoding RNA and uses thereof
Bertran et al. Recombinant adeno-associated virus-mediated high-efficiency, transient expression of the murine cationic amino acid transporter (ecotropic retroviral receptor) permits stable transduction of human HeLa cells by ecotropic retroviral vectors
US20230174622A1 (en) Epidermal growth factor receptor
KR20210132109A (ko) Dna-결합 도메인 전사활성화제 및 이의 용도
WO2009071679A1 (en) Novel aav vector and uses thereof
US11999965B2 (en) Bocaparvovirus small noncoding RNA and uses thereof
US20230405014A1 (en) Use of an irak4 modulator for gene therapy
RU2789647C2 (ru) ВАРИАНТ СРЕДСТВА ДЛЯ RNAi
KR20230049618A (ko) 면역 조정인자를 갖는 세포외 소포
Reul Viral gene transfer systems for cancer immunotherapy
KR20230083335A (ko) 핵산 구축물, 바이러스 벡터 및 바이러스 입자
KR20230038503A (ko) 샤르코-마리-투스 질환의 치료에 유용한 조성물
Kligman Establishing a stable cell-line for producing Adeno-Associated Virus using CRISPR-Cas9
Best Ongoing cellular responses to transgene products encoded by recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]