BR112020013336A2 - produto farmacêutico proteico, métodos para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário, para produção de um anticorpo, e para caracterizar as impurezas de fármaco com variação de carga, anticorpo, e, sistema para caracterizar impurezas de fármaco de alto peso molecular intermediário. - Google Patents

produto farmacêutico proteico, métodos para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário, para produção de um anticorpo, e para caracterizar as impurezas de fármaco com variação de carga, anticorpo, e, sistema para caracterizar impurezas de fármaco de alto peso molecular intermediário. Download PDF

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Abstract

São fornecidos sistemas e métodos para caracterizar impurezas de produto farmacêutico proteico com variação de tamanho e carga.

Description

PRODUTO FARMACÊUTICO PROTEICO, MÉTODOS PARA CARACTERIZAR AS IMPUREZAS DO PRODUTO FARMACÊUTICO PROTEICO DE ALTO PESO MOLECULAR INTERMEDIÁRIO, PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, E PARA CARACTERIZAR AS IMPUREZAS DE FÁRMACO COM VARIAÇÃO DE CARGA, ANTICORPO, E, SISTEMA PARA CARACTERIZAR IMPUREZAS DE FÁRMACO DE ALTO PESO MOLECULAR INTERMEDIÁRIO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção é, de modo geral, direcionada a métodos de separação de proteína e métodos de cultura de células.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Anticorpos monoclonais (mAbs) foram empregados com sucesso para visar uma ampla gama de áreas terapêuticas ao longo das últimas duas décadas (Walsh G., Biopharmaceutical benchmarks 2014, Nature biotechnology 2014; 32:992-1000; Lawrence S. Billion dollar babies--biotech drugs como blockbusters. Nature biotechnology 2007; 25:380-2).
[003] A heterogeneidade dos anticorpos é conhecida na técnica. Por exemplo, espécies de baixo peso molecular (LMW) e espécies de alto peso molecular (HMW) são exemplos de impurezas relacionadas ao produto que contribuem para a heterogeneidade de tamanho dos produtos de mAb. A formação de espécies de HMW dentro de um produto farmacêutico de mAb terapêutico como resultado da agregação proteica pode potencialmente comprometer a eficácia e a segurança do fármaco. Fragmentos proteolíticos também podem contribuir para o perfil de impurezas de um produto.
[004] Embora os mAbs tenham uma estrutura heterotetramérica covalente conservada que consiste em duas cadeias pesadas ligadas a dissulfeto, cada uma ligada covalentemente através de uma ligação dissulfeto a uma cadeia leve, essas proteínas frequentemente contêm baixos níveis de impurezas relacionadas ao produto mesmo após etapas de purificação extensas. Espécies de baixo peso molecular (LMW) (por exemplo, fragmentos Fab e monômero sem um braço Fab) e espécies de alto peso molecular (HMW) (por exemplo, trímero de mAb e dímero de mAb) são ambos exemplos de impurezas relacionadas ao produto que contribuem para a heterogeneidade de tamanho dos produtos de mAb. A formação de espécies de HMW dentro de um produto medicamentoso de mAb terapêutico como resultado da agregação proteica pode potencialmente comprometer a eficácia e a segurança do fármaco (por exemplo, provocando resposta imunogênica indesejada) (Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. The APS journal 2006; 8:E501-7; Moussa EM, Panchal JP, Moorthy BS, Blum JS, Joubert MK, Narhi LO, Blum JS, Joubert MK, Narhi LO, et al. Immunogenicity of Aggregate Protein Aggregates. Journal of Pharmaceutical Sciences 2016; 105:417-30). As espécies de LMW de qualquer proteína terapêutica podem resultar da atividade da protease da célula hospedeira durante a produção. As espécies de LMW muitas vezes têm atividade baixa ou substancialmente reduzida em relação à forma monomérica do anticorpo, ao mesmo tempo em que expõe epítopos novos que podem levar à imunogenicidade ou potencialmente impactar as propriedades farmacocinéticas in vivo (Vlasak J, Ionescu R. Fragmentation of monoclonal antibodies. mAbs 2011; 3:253-63). Como resultado, espécies de HMW e LMW são consideradas atributos críticos de qualidade que são rotineiramente monitorados durante o desenvolvimento do fármaco e como parte do teste de liberação da substância farmacológica purificada durante a fabricação.
[005] A heterogeneidade do peso molecular dos produtos de mAb é tradicionalmente caracterizada por múltiplos métodos analíticos ortogonais (Michels DA, Parker M, Espaço-Solano O. Electrophoresis 2012; 33:815-26). Uma das técnicas mais comumente usadas para avaliar a pureza do produto de mAb é SDS-PAGE, realizada sob condições não redutoras. Durante a análise, bandas menores correspondentes a espécies de LMW podem ser observadas rotineiramente e quantificadas, incluindo H2L (2 cadeias pesadas e | cadeia leve), H2 (2 cadeias pesadas), HL (1 cadeia pesada e 1 cadeia leve), HC (1 cadeia pesada), e espécies LC (1 cadeia leve), em relação aos anticorpos (Liu H, Gaza-Bulseco G, Chumsae C, Newby-Kew A. Biotechnology Letters 2007; 29:1611-22).
[006] Fragmentos proteolíticos também podem ser observados. À identidade proposta de cada banda menor pode ser corroborada por sequenciamento N-terminal através da degradação de Edman, digestão tríptica em gel seguida por análise de espectrometria de massa e análise western blot usando anticorpos anti-Fc e anti-cadeia leve. No entanto, quaisquer estruturas propostas resultantes desses métodos não podem ser confirmadas de forma inequívoca ao nível de proteína intacto. Além disso, as condições de preparação da amostra empregadas em experimentos de SDS-PAGE podem gerar artefatos de LMW através de translocação de ligações dissulfeto, o que pode levar a superestimação de espécies de LMW menores (Zhu ZC, et al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 83:89-95 (2013)).
[007] Mais recentemente, a eletroforese capilar-sódio dodecil sulfato (CE-SDS) emergiu como um equivalente moderno da SDS-PAGE, oferecendo reprodutibilidade, sensibilidade e produtividade superiores (Rustandi RR, Washabaugh MW, Wang Y. Electrophoresis, 29:3612-20 (2013); Lacher NA, et al., Journal of Separation Science, 33:218-27 (2010); Hunt G, et al., Journal of Chromatography A T44:295-301 (1996)). Durante a análise de CE-SDS de produtos de mAb, pequenos picos com tempos de migração menores (formas LMW) do que o anticorpo intacto podem ser observados rotineiramente. Ao contrário da análise SDS-PAGE, estas impurezas LMW não podem ser extraídas ou submetidas a análises adicionais. Como resultado, as identidades das impurezas LMW observadas nos métodos de CE-SDS são frequentemente propostas unicamente com base no conhecimento empírico.
[008] A medição em massa exata das proteínas de mAb intactas por espectrômetros de massa modernos tornou-se cada vez mais popular na indústria biofarmacêutica como uma das técnicas de identificação mais confiáveis (Kaltashov IA, et al., Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 21:323-37 (2010); Zhang H, Cui W, Gross ML. Letras FEBS, 588:308-17/ (2014)). Especificamente, uma variedade de métodos de "cromatografia hifenizada-espectrometria de massa" demonstrou a capacidade de detectar impurezas de baixa abundância em produtos de mAb e fornecer análises altamente detalhadas que não podem ser alcançadas por métodos SDS-PAGE ou CE-SDS (Le JC, Bondarenko PV. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 16:307-11 (2015); Haberger M, et al. mAbs 8:331-9 (2016)). Por exemplo, cromatografia de fase reversa (RPLC) acoplada à espectrometria de massa pode ser usada para detectar a cadeia leve livre e modificações pós-traducionais associadas (por exemplo, cisteinilação e glutationionilação) presentes em produtos farmacêuticos de mAb. No entanto, em comparação com os métodos SDS-PAGE e CE-SDS, o RPLC muitas vezes carece de resolução suficiente para separar espécies de LMW e, assim, não elucida o perfil LMW completo. Por exemplo, a identificação de espécies de H2L em produtos farmacêuticos de mAb nunca foi relatada por análise de massa intacta baseada em RPLC, devido à sua baixa abundância e baixa resolução do anticorpo intacto principal.
[009] Outra técnica baseada em MS promissora para caracterizar impurezas relacionadas ao produto de mAb é a espectrometria de massa de ionização de eletrospray nativa (ESI-MS Nativa), que é particularmente informativa quando acoplada com cromatografia de exclusão de tamanho (SECY( Haberger M, et al. mAbs 8:331-339 (2016)). No entanto, as espécies de LMW identificadas na análise de SEC-MS nativa muitas vezes não são as identificadas por SDS-PAGE ou CE-SDS, devido a condições experimentais significativamente diferentes usadas entre métodos. Especificamente, a preparação da amostra necessária para SDS-PAGE e CE-SDS muitas vezes começa com a desnaturação da proteína, onde as interações não covalentes entre as regiões N-terminais de pares de HC-LC e as regiões C-terminais dos pares de HC-HC são interrompidas. Como resultado, as impurezas de LMW, tais como H2L, metade anticorpo e espécies de cadeia leve livre são capazes de se dissociar da molécula de mAb se as ligações dissulfeto intercadeia forem quebradas.
[0010] Em comparação, a SEC-MS nativa analisa as amostras de mAb sob condições nativas próximas, permitindo que as interações intercadeia não covalentes fortes sejam preservadas e permitindo que a estrutura de quatro cadeias da molécula de mAb seja mantida mesmo se as ligações dissulfeto intercadeia forem quebradas. Embora os avanços na química da coluna SEC tornem possível usar tampões de desnaturação (por exemplo, 30% de acetonitrila, 0,1% de FA e 0,1% de TFA) que normalmente são usados em cromatografia de fase reversa para separação de SEC e acoplamento direto a análise de espectrometria de massa online (Liu H, Gaza- Bulseco G, Chumsae C. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 20:2258-64 (2009), a resolução LC ainda é sub-ideal para detectar muitas espécies de LMW.
[0011] É um objeto da invenção fornecer sistemas e métodos para a caracterização de variantes de tamanho de impurezas de fármaco proteico.
[0012] É outro objeto da invenção fornecer produtos farmacêuticos proteicos com níveis reduzidos de impurezas.
[0013] Ainda é outro objeto da invenção fornecer métodos para produzir produtos farmacêuticos proteicos com impurezas de produto farmacêutico proteico reduzidas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0014] São fornecidos sistemas e métodos para caracterizar impurezas de produto farmacêutico com variação de tamanho e carga. Uma modalidade usa cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com uma fase móvel aquosa acoplada à análise de espectrometria de massa nativa para detectar e caracterizar impurezas de produto farmacêutico proteico com variação de tamanho. Outra modalidade usa cromatografia de troca iônica (IEX), preferencialmente cromatografia de troca de cátions forte com uma fase móvel aquosa acoplada à análise de espectrometria de massa nativa para caracterizar impurezas de produto farmacêutico proteico. Em uma modalidade, após a remoção dos glicanos N-ligados do produto farmacêutico proteico, por exemplo, um produto farmacêutico de anticorpo, a eluição de impurezas com variação de tamanho ou carga da coluna SEC ou IEX é determinada pelo tamanho e/ou carga das espécies de peso molecular.
[0015] Os sistemas e métodos divulgados podem ser usados para caracterizar variantes de tamanho, variantes de carga, ligações anticorpo- antígeno, —caracterizações de modificação pós-traducional (PTM), caracterização de mAb parcialmente reduzido e alquilado, caracterização de dímero para fármacos co-formulados, caracterização de troca de Fab IgG4 e caracterização de amostra altamente heterogênea usando redução de carga. PTMs exemplificativas que podem ser detectadas e identificadas que contribuem para variantes ácidas incluem, mas não estão limitadas a, glicação, glucuronilação, carboximetilação, sialilação, glicosilação não consenso na região Fab. PTMs que podem ser detectadas e identificadas que contribuem para variantes básicas incluem, mas não estão limitadas a, formação de succinimida, glutamina N-terminal (não convertida em piroglutamato), Lys C-terminal e espécies não/parcialmente glicosiladas.
[0016] Impurezas de produto farmacêuticos proteicos de baixo peso molecular (LMW) exemplificativas que podem ser detectadas e caracterizadas com os sistemas divulgados incluem, mas não estão limitadas a, precursores, produtos de degradação, espécies truncadas, fragmentos proteolíticos incluindo fragmentos Fab, ligante ou receptor ou fragmentos de cadeia pesada, cadeia leve livre, meio-anticorpo, H2L, H2, HL, HC ou combinações dos mesmos.
[0017] Impurezas de alto peso molecular (HMW) exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, trímeros de mAb e dímeros de mAb.
[0018] Impurezas de HMW intermediário exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, monômero com cadeias leves extras (espécies H2L3 e H21I4), monômero mais complexos de fragmento Fab, Fab2-Fab2, Fc-Fc e Fab2-Fe.
[0019] Os sistemas e métodos SEC-MS nativo e IEX-MS nativo divulgados fornecem informações detalhadas de identificação de produto farmacêutico proteico com variação. A identificação confiável e as informações estruturais detalhadas obtidas com os sistemas e métodos divulgados são altamente valiosas para a caracterização profunda das impurezas em produtos farmacêuticos proteicos, que muitas vezes é necessária para o desenvolvimento de moléculas de estágio final. Além disso, devido ao fato de que os sistemas e métodos divulgados usam preparações de amostra mais delicadas do que as de SDS-PAGE ou CE-SDS, é menos provável gerar artefatos. Os sistemas e métodos divulgados podem ser usados como uma análise semiquantitativa para comparar os perfis de impurezas entre as amostras ou simplesmente aplicados qualitativamente.
[0020] Uma modalidade fornece um produto farmacêutico proteico contendo um fármaco proteico e um excipiente, em que o produto farmacêutico proteico compreende entre 0,05 e 30,0% p/p de impurezas de fármaco proteico de baixo peso molecular, alto peso molecular, alto peso molecular intermediário, ou combinações dos mesmos.
[0021] Uma modalidade preferencial! fomece um produto farmacêutico proteico contendo um fármaco proteico e um excipiente, em que o produto farmacêutico proteico compreende entre 0,05 e 30,0% p/p de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
[0022] O produto farmacêutico proteico pode ser um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos.. Em outras modalidades, o produto farmacêutico contém entre 1 a 25%, 1 a 15%, 1 a 10%, ou 1 a 5% p/p de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
[0023] Outra modalidade fornece um método para caracterizar o tamanho ou as impurezas de produto farmacêutico com variação de carga, incluindo as etapas de deglicosilação de uma amostra de produto farmacêutico proteico, separar os componentes proteicos da amostra de produto farmacêutico proteico por Cromatografia SEC ou IEX, e analisar os componentes de proteína separados por espectrometria de massa nativa para caracterizar o tamanho ou as impurezas de produto farmacêutico proteico com variação de carga na amostra do produto farmacêutico proteico. O método fornece ainda uma etapa de redução opcional. A amostra do produto farmacêutico proteico pode ser feita de uma cultura semidescontínua. Como observado acima, o produto farmacêutico proteico pode ser um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos.
[0024] Ainda outra modalidade fornece um método de produção de um anticorpo, incluindo as etapas de cultivar as células produzindo o anticorpo em uma cultura de células, obter uma amostra da cultura de células, caracterizar e quantificar as impurezas de fármaco proteico com variação de tamanho ou carga na amostra, de acordo com os métodos descritos acima, e modificar uma ou mais condições de cultura da cultura de células para reduzir a quantidade de impurezas de fármaco proteico de baixo peso molecular caracterizadas produzidas durante a cultura de células do anticorpo. Em algumas modalidades, a amostra é tomada durante a cultura de células em qualquer intervalo. Em outras modalidades, a amostra é tomada após a cultura de produção, após a colheita da proteína ou após a purificação. Uma ou mais condições da cultura de células que são alteradas para reduzir a quantidade de impurezas do fármaco proteico de baixo peso molecular podem ser selecionadas dentre o grupo que consiste em temperatura, pH, densidade celular, concentração de aminoácido, osmolalidade, concentração de fator de crescimento, agitação, pressão parcial de gás, surfactantes ou combinações dos mesmos. As células podem ser eucarióticas ou procarióticas. As células podem ser células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), células COS (por exemplo, COS-7), células da retina, células Vero, células CV1, células renais (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), células HeLa, células HepG2, células WI38, células MRC 5, células Colo25, células HB 8065, células HL-60, linfócitos, por exemplo, células T autólogas, Jurkat (linfócitos T) ou Daudi (linfócitos B), células A431 (epidérmicas), células U937, células 3T3, células L, células C127, células SP2/0, células NS-0, células MMT, células-tronco, células tumorais e uma linhagem celular derivada de qualquer uma das células supracitadas. Em uma modalidade, as células são células hibridoma ou quadroma. Ainda outra modalidade fornece um anticorpo produzido pelos métodos descritos neste documento.
[0025] Ainda outra modalidade fornece um sistema para caracterizar impurezas de fármaco com variação de tamanho e carga. O sistema inclui um sistema de cromatografia SEC ou IEX ligado a uma fase móvel aquosa e em comunicação fluida com um sistema de espectrometria de massa nativo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0026] As Figuras 1A e 1B são cromatogramas de separação de SEC- MS nativo online da amostra da substância farmacológica mAb-1. A Figura 1A é o perfil ultravioleta e as Figuras 1B-1E são o perfil de espectrometria de massa do monômero, dímero, trímero e quatrômero, respectivamente.
[0027] A Figura 2A é um perfil de espectrometria de massa do homodímero Fab, da amostra da substância farmacológica mAb-1. A Figura
2B é o perfil de espectrometria de massa do heterodímero Fab2-Fc da amostra da substância farmacológica mAb-1. A Figura 2C é o perfil de espectrometria de massa de um homodímero Fc da amostra de substância farmacológica mAb-l. A Figura 2D é a cromatografia iônica total da separação do mAb-1.
[0028] A Figura 3A mostra um cromatograma de fons total da separação de SEC-MS nativo online da amostra de substância farmacológica mAb-2. A Figura 3B mostra o perfil de espectrometria de massa de baixo peso molecular a partir da fração centrada em 26 min. A Figura 3C mostra o perfil de espectrometria de massa de baixo peso molecular a partir da fração centrada em 31 min.
[0029] A Figura 4 é um cromatograma de corrente de fons total de SEC-MS nativo online da substância farmacológica mAb-1 a partir de uma amostra de LMW enriquecida (deglicosilada).
[0030] A Figura 5A é um cromatograma de corrente de fons total de SEC-MS nativo online da substância farmacológica mAb-3 mostrando detecção de impurezas de dímero, HMW e monômero. A Figura 5B é um cromatograma de corrente de fons total que mostra a detecção de impurezas do monômero. As Figuras 5C-SE são perfis de espectrometria de massa de impurezas de dímero, HMW intermediário e monômero.
[0031] A Figura 6 são os espectros de massa simplificados das espécies de HMW intermediário em mAb-3 mostrando a massa prevista de H2L3 como 167.850 Da.
[0032] A Figura 7A mostra cromatografias de fons extraídos de mAb- 4 mostrando detecção de impurezas com variação de carga. A Figura 7B mostra o perfil de espectrometria de massa das impurezas com variação de carga indicadas.
[0033] A Figura 8 é um cromatograma de fon total de mAb-4 mostrando a caracterização de variantes de carga no nível de subdomínio por SCX-MS nativo.
[0034] A Figura 9A mostra cromatogramas de fons extraídos de fragmentos Fab, caracterizados pela SCX-MS nativa. A Figura 9B mostra perfis de espectrometria de massa de variantes de carga.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições
[0035] O uso dos termos "um", "um", "o(a)" e similares, no contexto de descrever a invenção atualmente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) deve ser interpretado para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contraditório pelo contexto.
[0036] A recitação de intervalos de valores neste documento destina- se apenas a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que caia dentro do intervalo, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado neste documento.
[0037] O uso do termo "cerca de" destina-se a descrever valores acima ou abaixo do valor declarado em um intervalo de aprox. +/- 10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aprox. +/- 5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor ou acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aprox. +/- 2%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor ou acima ou abaixo do valor indicado em um intervalo de aproximadamente + +/- 1%. Os intervalos anteriores se destinam a tornar-se claros através do contexto, e nenhuma outra limitação é implícita. Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma neste documento ou de outra forma contradito de forma clara pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") apresentada neste documento é meramente para esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, à menos que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
[0038] O termo "impureza de fármaco proteico de baixo peso molecular (LMW)'" inclui, mas não está limitado a precursores, produtos de degradação, espécies truncadas, fragmentos proteolíticos incluindo fragmentos Fab, fragmentos de cadeia pesada Fc, ligante ou receptor, H2L (2 cadeias pesadas e 1 cadeia leve), H2 (2 cadeias pesadas), HL (1 cadeia pesada e | cadeia leve), HC (1 cadeia pesada) e LC (1 cadeia leve). Uma impureza de fármaco proteico de LMW pode ser qualquer variante que seja uma versão incompleta do produto proteico, tal como um ou mais componentes de uma proteína multimérica. Impureza de fármaco proteico, impureza de fármaco ou impureza de produto são termos que podem ser usados de forma intercambiável por todo o relatório descritivo. Impurezas de fármaco ou produto LMW são geralmente consideradas variantes moleculares com propriedades tais como atividade, eficácia e segurança que podem ser diferentes daquelas do produto farmacêutico desejado.
[0039] A degradação do produto proteico é problemática durante a produção do produto farmacêutico proteico em sistemas de cultura de células. Por exemplo, a proteólise de um produto proteico pode ocorrer devido à liberação de proteases no meio de cultura de células. Aditivos médios, tais como fontes de ferro solúveis adicionadas para inibir metaloproteases, ou inibidores proteases de serina e cisteína, foram implementados em cultura de células para evitar degradação (Clincke, M.-F., et al, Proc. BMC 2011, 5, P115). Fragmentos C-terminais podem ser clivados durante a produção devido a carboxila peptidases na cultura de células (Dick, LW et al, Biveng Biotechnol 2008; 100:1132-43).
[0040] O termo "impureza de fármaco proteico de alto peso molecular
(HMW)" inclui, mas não está limitado a, trímeros de mAb e dímeros de mAb. As espécies de HMW podem ser divididas em dois grupos: 1) monômero com cadeias leves extras (espécies H21L3 e H214) e 2) monômero mais complexos de fragmento Fab. Além disso, após o tratamento com digestão enzimática de IdeS, diferentes fragmentos dimerizados (Fab7,-Fab,, Fc e Fab7;Fc) são formados.
[0041] "Proteína" refere-se a uma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos um ao outro por uma ligação peptídica. A proteína inclui polipeptídeos e peptídeos e também pode incluir modificações tais como glicosilação, fixação lipídica, sulfatação, gama- carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilacilação, hidroxilação e ADP-ribosilação. As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo fármacos à base de proteína, e proteínas incluem, entre outras coisas, enzimas, ligantes, receptores, anticorpos e proteínas quimérica ou de fusão. As proteínas são produzidas por vários tipos de células recombinantes usando métodos de cultura de células bem conhecidos e são geralmente introduzidas na célula por técnicas de engenharia genética (por exemplo, como uma sequência que codifica uma proteína quimérica, ou uma sequência otimizada por códon, uma sequência sem Ífntrons, etc.) onde pode residir como um epissomo ou ser integradas ao genoma da célula.
[0042] "Anticorpo" se refere a uma molécula de imunoglobulina que consiste em quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada possui uma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve possui um domínio variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por trêê CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo" inclui referência a ambas as imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Anticorpos biespecíficos são geralmente descritos na Publicação de Pedido de Patente US Nº 2010/0331527, que é incorporada por referência neste pedido.
[0043] "Proteínas de fusão Fc" compreendem parte ou todas as duas ou mais proteínas, uma das quais é uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não são encontradas juntos na natureza. A preparação de proteínas de fusão compreendendo certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; e Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992. "Proteínas de fusão de receptor Fc" compreendem um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc, que em algumas modalidades compreende uma região de articulação seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc compreende duas ou mais cadeias receptoras distintas que se ligam a um ou mais ligante(s). Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma trap, como por exemplo uma trap de IL-1 ou trap VEGF.
[0044] "Cultura de células" refere-se à propagação ou proliferação de células em um recipiente, tal como um frasco ou biorreator, e inclui, mas não está limitada a, cultura semidescontínua, cultura contínua, cultura de perfusão e similares. II. Produtos Farmacêuticos Proteicos A. Proteínas de Interesse
[0045] Um produto de fármaco proteico pode ser qualquer proteína de interesse adequada para expressão em células procarióticas ou eucarióticas e pode ser usado em células hospedeiras manipuladas. Por exemplo, a proteína de interesse inclui, mas não está limitada a, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um ScFv ou fragmento do mesmo, uma proteína de fusão Fc ou fragmento da mesma, um fator de crescimento ou fragmento do mesmo, uma citocina ou fragmento da mesma ou um domínio extracelular de um receptor de superfície celular ou fragmento do mesmo. Proteínas de interesse podem ser polipeptídeos simples consistindo em uma proteina = de subunidade única ou multisubunidades complexas compreendendo duas ou mais subunidades. A proteína de interesse pode ser um produto biofarmacêutico, aditivo alimentar ou conservante, ou qualquer produto proteico sujeito a padrões de purificação e qualidade.
[0046] Em algumas modalidades, o produto proteico (proteína de interesse) é um anticorpo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo de ligação a antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, triacorpo ou tetracorpo, um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2, um fragmento IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IZM, um anticorpo IgG, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IZgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IZGl. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IZgG2. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo I8ZG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/I8G4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IEGIl. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico IgG2/IgG1/IgGA4.
[0047] Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo anti-Protefna de Morte Celular Programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PDI conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº US2015/0203579A1), um anticorpo anti-Ligante de Proteína de Morte Celular Programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nº US2015/0203580A1), um anticorpo anti-DII4, um anticorpo anti- Angiopoetina-2 (por exemplo, um anticorpo anti-ANG2 conforme descrito na Patente Nº 9,402,898), um anticorpo anti-Proteína 3 semelhante à Angiopoetina (por exemplo, um anticorpo anti-AngPtl3 conforme descrito na Patente U.S. Nº 9,018,356), um anticorpo anti-receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR conforme descrito na Patente U.S. Nº 9,265,827), um anticorpo anti-Erb3, um anticorpo anti-Receptor de Prolactina (por exemplo, um anticorpo anti-PRLR conforme descrito na Patente U.S. Nº 9,302,015), um anticorpo anti- Complemento 5 (por exemplo, um anticorpo anti-C5 conforme descrito no Pedido de Patente U.S. Nº US2015/0313194A1), um anticorpo anti-TNF, um anticorpo anti-receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, um anticorpo anti-EGFR conforme descrito na Patente U.S. Nº 9,132,192 ou um anticorpo anti-EGFRvIII conforme descrito no Pedido de Patente U.S. Nº US2015/0259423A1), um anticorpo anti-Pró-Proteéína — Convertase Subtilisina/Kexina 9 (por exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 conforme descrito na Patente U.S. Nº 8,062,640 ou na Publicação de Pedido de Patente
U.S.
Nº US2014/0044730A1), um anticorpo anti-Fator de Crescimento e Diferenciação 8 (por exemplo, um anticorpo anti-GDF8, também conhecido como anticorpo anti-miostatina, conforme descrito nas Patentes U.S.
Nº 8,871,209 ou 9,260,515), um anticorpo anti-Receptor de Glucagon (por exemplo, um anticorpo anti-GCGR conforme descrito nos Pedidos de Patente U.S.
Nº US2015/0337045A1 ou US2016/0075778A1), um anticorpo anti- VEGF, um anticorpo anti-ILIR, um anticorpo anti-receptor de interleucina 4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4R conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S.
Nº US2014/0271681A1 ou nas Patentes U.S.
Nº 8,735,095 ou 8,945,559), um anticorpo anti-receptor de interleucina 6 (por exemplo, um anticorpo anti-IL6R conforme descrito nas Patentes U.S.
Nº 7,582,298, 8,043,617 ou 9,173,880), um anticorpo anti-IL1, um anticorpo anti-IL2, um anticorpo anti-IL3, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti- IL5, um anticorpo anti-IL6, um anticorpo anti-IL7, um anticorpo anti-interleucina 33 (por exemplo, um anticorpo anti-IL33 conforme descrito nas Publicações de Pedidos de Patente U.S.
Nº US2014/0271658Al ou US2014/0271642Al), um anticorpo anti-Vírus sincicial respiratório (por exemplo, um anticorpo anti-RSV conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S.
Nº US2014/0271653A1I), um anticorpo anti-Cluster de diferenciação 3 (por exemplo, um anticorpo anti- CD3 conforme descrito nas Publicações de Pedidos de Patente U.S.
Nº US2014/0088295A1 e US20150266966A1, e no Pedido U.S.
Nº 62/222,605), um anticorpo anti-Cluster de Diferenciação 20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 conforme descrito nas Publicações de Pedidos de Patente U.S.
Nº US2014/0088295A1 e US20150266966A1, e na Patente U.S.
Nº 7,879,984), um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-CD28, um anticorpo anti-Cluster de Diferenciação 48 (por exemplo, um anticorpo anti-CD48 conforme descrito na Patente U.S.
Nº 9,228,014), um anticorpo anti-Fel dl (por exemplo, conforme descrito na Patente U.S.
Nº 9,079,948) um anticorpo anti-
vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (por exemplo, um anticorpo anti-MERS conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S.
Nº US2015/0337029A1), um anticorpo anti-vírus Ebola (por exemplo, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S.
Nº US2016/0215040), um anticorpo anti-Zika vírus, um anticorpo anti-Gene de Ativação de Linfócitos 3 (por exemplo, um anticorpo anti-LAG3, ou um anticorpo anti-CD223) um anticorpo anti-Fator de Crescimento do Nervo (por exemplo, um anticorpo anti-NGF conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S.
Nº US2016/0017029 e nas Patentes U.S.
Nº 8,309,088 e 9,353,176) e um anticorpo anti-Activina A.
Em algumas modalidades, a proteína biespecífica de ligação a antígeno é selecionada dentre o grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (tal como descrito nas Publicações de Pedido de Patente U.S.
Nº US2014/0088295AIl e US20150266966A1), um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Mucina 16 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Mucl6) e um anticorpo biespecífico anti-CD3 x antígeno de membrana específico anti- próstata (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA). Em algumas modalidades, a proteína de interesse é selecionada do grupo que consiste em abciximab, adalimumab, adalimumab-atto, ado-trastuzumab, alemtuzumab, alirocumab, atezolizumab, avelumab, basiliximab, belimumab, benralizumab, bevacizumab, bezlotoxumab, blinatumomab, brentuximab vedotin, brodalumab, canakinumab, capromab pendetide, certolizumab pegol, cemiplimab, cetuximab, denosumab, dinutuximab, dupilumab, durvalumab, eculizumab, elotuzumab, emicizumab-kxwh, emtansinealirocumab, evinacumab, evolocumab, fasinumab, golimumab, guselkumab, ibritumomab tiuxetan, idarucizumab, infliximab, infliximab-abda, infliximab-dyyb, ipilimumab, ixekizumab, mepolizumab, necitumumab, nesvacumab, nivolumab, obiltoxaximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, olaratumab, “omalizumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab,
ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, reslizumab, rinucumab, rituximab, sarilumab, secukinumab, siltuximab, tocilizumab, trastuzumab, trevogrumab, ustekinumab e vedolizumab.
[0048] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína recombinante que contém uma fração Fc e outro domínio (por exemplo, uma proteína de fusão Fc). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão Fc receptora, que contém um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc. Em algumas modalidades, a fração Fc compreende uma região de articulação seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma IgG. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc do receptor contém duas ou mais cadeias receptoras distintas que se ligam a um único ligante ou múltiplos ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma proteína TRAP, tal como, por exemplo, uma trap IL-1 (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação a ligante IL-IRAcP fundida à região extracelular I|-IR1 fundida a Fc de hIgG1; ver Pat. U.S. Nº 6,927,004, que é incorporada a este documento por referência em sua totalidade), ou uma trap VEGF (por exemplo, aflibercept ou ziv- aflibercept, que compreende o domínio Ig 2 do receptor de VEGF FIkI fundido ao domínio Ig 3 do receptor de VEGF FIK1 fundido ao Fc de hIgG1; ver Pat. US Nº 7,087 411 e 7,279,159). Em outras modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão ScFv-Fc, que contém um ou mais domínios de ligação a antígeno, tais como um fragmento de cadeia pesada variável e um fragmento de cadeia leve variável, de um anticorpo acoplado a uma fração Fc.
B. Cultura de Células
[0049] A proteína de interesse pode ser produzida em uma "cultura de células semidescontínua" ou "cultura semidescontínua", que se refere a uma cultura descontínua em que as células e o meio de cultura são fornecidos ao recipiente de cultura inicialmente, e nutrientes de cultura adicionais são lentamente acrescentados, em incrementos discretos, à cultura durante o cultivo, com ou sem a colheita periódica de células e/ou produtos antes do término da cultura. A cultura semidescontínua inclui "cultura semidescontínua semicontínua" em que a cultura inteira (que pode incluir células e meio) é removida e substituída por meio fresco periodicamente. A cultura semidescontínua difere da simples "cultura descontínua" pelo fato de que todos os componentes para cultivo de células (incluindo as células animais e todos os nutrientes de cultura) são fornecidos ao recipiente de cultura no início do processo de cultura na cultura descontínua. A cultura semidescontínua pode ser diferente da "cultura de perfusão", pelo fato de que o sobrenadante não é removido do recipiente de cultura durante um processo semidescontínuo padrão, enquanto que na cultura de perfusão, as células são restringidas na cultura por, por exemplo, filtragem, e o meio de cultura é continuamente ou intermitentemente introduzido e removido do recipiente de cultura. No entanto, a remoção das amostras para fins de teste durante a cultura de células semidescontínua é contemplada. O processo semidescontínuo continua até que seja determinado que o volume de trabalho máximo e/ou a produção de proteína foi atingida, e a proteína é posteriormente colhida.
[0050] A proteína de interesse pode ser produzida em uma cultura de células contínua. A frase "cultura de células contínua" refere-se a uma técnica usada para cultivar células continuamente, geralmente em uma fase de crescimento particular. Por exemplo, se um fornecimento constante de células for necessário ou a produção de uma proteína específica de interesse for necessária, a cultura de células pode exigir manutenção em uma fase específica de crescimento. Assim, as condições devem ser continuamente monitoradas e ajustadas de acordo para manter as células nessa fase específica.
[0051] Os termos "meio de cultura de células" e "meio de cultura”
referem-se a uma solução de nutrientes usada para cultivar células de mamíferos que normalmente fornece os nutrientes necessários para aumentar o crescimento das células, tais como uma fonte de energia de carboidrato, aminoácidos essenciais (por exemplo, fenilalanina, valina, treonina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina, lisina e histidina) e não-essenciais (por exemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, prolina, serina e tirosina), oligoelementos, fontes de energia, lipídios, vitaminas, etc. O meio de cultura de células pode conter extratos, por exemplo, soro ou peptonas (hidrolisados), que fornecem matérias-primas que promovem o crescimento celular. Os meios podem conter extratos derivados de leveduras ou de soja, em vez de extratos derivados de animais. O meio quimicamente definido refere-se a um meio de cultura de células em que todos os componentes químicos são conhecidos (ou seja, têm uma estrutura química conhecida). O meio quimicamente definido é inteiramente livre de componentes derivados de animais, tais como peptonas derivadas de soro ou animais. Em uma modalidade, o meio é um meio quimicamente definido.
[0052] A solução também pode conter componentes que aumentem o crescimento e/ou sobrevivência acima da taxa mínima, incluindo hormônios e fatores de crescimento. A solução pode ser formulada a uma concentração de pH e sal ideal para sobrevivência e proliferação da célula específica sendo cultivada.
[0053] Uma "linhagem celular" refere-se a uma célula ou células que são derivadas de uma linhagem específica através de passagem serial ou subcultivo de células. O termo "células" é usado de forma intercambiável com "população de células".
[0054] O termo "célula" inclui qualquer célula que é adequada para expressar uma sequência de ácidos nucleicos recombinantes. As células incluem aquelas de procariontes e eucariontes, tais como células bacterianas,
células de mamíferos, células humanas, células animais não humanas, células aviárias, células de inseto, células de levedura ou fusões de células tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em certas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato ou camundongo. Em outras modalidades, a célula é selecionada a partir das seguintes células: Ovário de Hamster Chinês (CHO) (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), células da retina, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHIK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, linfócito, por exemplo, Jurkat (linfócito T) ou Daudi (linfócito D), A431 (epidérmica), U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula-tronco, célula tumoral e uma linhagem celular derivada de uma célula supracitada. Em algumas modalidades, a célula é composta por um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula da retina que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C60). Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO. Em outras modalidades, a célula é uma célula CHO K1. III. Sistemas para caracterizar variantes de impurezas de fármaco proteico
[0055] Proteínas terapêuticas multisubunidades, particularmente proteínas terapêuticas baseadas em anticorpos monoclonais (mAb) são inerentemente heterogêneas em relação ao tamanho devido à sua estrutura complexa de cadeia múltipla e a propensão a acomodar múltiplas modificações pós-traducionais enzimáticas e químicas. Embora os níveis de variantes de tamanho dentro de um produto farmacêutico proteico possam ser facilmente quantificados por uma variedade de métodos biofísicos, a identificação inequívoca dessas impurezas relacionadas ao produto tem sido particularmente desafiadora.
[0056] Embora os mAbs tenham uma estrutura heterotetramérica covalente conservada que consiste em duas cadeias pesadas ligadas a dissulfeto, cada uma ligada covalentemente através de uma ligação dissulfeto a uma cadeia leve, essas proteínas frequentemente contêm baixos níveis de impurezas relacionadas ao produto mesmo após etapas de purificação extensas. Espécies de baixo peso molecular (LMW) (por exemplo, fragmentos Fab e monômero sem um braço Fab) e espécies de alto peso molecular (HMW) (por exemplo, trímero de mAb e dímero de mAb) são ambos exemplos de impurezas relacionadas ao produto que contribuem para a heterogeneidade de tamanho dos produtos de mAb. A formação de espécies de HMW dentro de um produto farmacêutico de mAb terapêutico como resultado da agregação proteica pode potencialmente comprometer a eficácia e a segurança do fármaco (por exemplo, provocando resposta imunogênica indesejada) (Rosenberg AS. The AAPS journal, 8:E501-7 (2006); Moussa EM, et al. Journal of Pharmaceutical Science, 105:417-30 (2016;). As espécies de LMW de qualquer proteína terapêutica podem resultar da atividade da protease da célula hospedeira durante a produção. As espécies de LMW muitas vezes têm atividade baixa ou substancialmente reduzida em relação à forma monomérica do anticorpo, ao mesmo tempo em que expõem epítopos novos que podem levar à imunogenicidade ou potencialmente impactar as propriedades farmacocinéticas in vivo (Vlasak J, Ionescu R. mAbs, 3:253-63 (2011)). Como resultado, espécies de HMW e LMW são consideradas atributos críticos de qualidade que são rotineiramente monitorados durante o desenvolvimento do fármaco e como parte do teste de liberação da substância farmacológica purificada durante a fabricação.
[0057] A heterogeneidade do peso molecular dos produtos de mAb é tradicionalmente caracterizada por múltiplos métodos analíticos ortogonais (Michels DA, Parker M, Salas-Solano O. Electrophoresis, 33:815-26 (2012)). Uma das técnicas mais comumente usadas para avaliar a pureza do produto de mAb é SDS-PAGE, realizada sob condições não redutoras. Durante a análise, bandas menores correspondentes a espécies de LMW podem ser observadas rotineiramente e quantificadas, incluindo H2L (2 cadeias pesadas e | cadeia leve), H2 (2 cadeias pesadas), HL (1 cadeia pesada e 1 cadeia leve), HC (1 cadeia pesada), e espécies LC (1 cadeia leve), em relação aos anticorpos (Liu H, Gaza-Bulseco G, Chumsae C, Newby-Kew A. Biotechnology Letters, 29:1611-22 (2007)).
[0058] Fragmentos proteolíticos também podem ser observados. À identidade proposta de cada banda menor pode ser corroborada por sequenciamento N-terminal através da degradação de Edman, digestão tríptica em gel seguida por análise de espectrometria de massa e análise western blot usando anticorpos anti-Fc e anti-cadeia leve. No entanto, quaisquer estruturas propostas resultantes desses métodos não podem ser confirmadas de forma inequívoca ao nível de proteína intacto. Além disso, as condições de preparação da amostra empregadas em experimentos de SDS-PAGE podem gerar artefatos de LMW através de translocação de ligações dissulfeto, o que pode levar a superestimação de espécies de LMW menores (Zhu ZC, et al. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 83:89-95 (2013)).
[0059] Mais recentemente, a eletroforese capilar-sódio dodecil sulfato (CE-SDS) emergiu como um equivalente moderno da SDS-PAGE, oferecendo reprodutibilidade, sensibilidade e produtividade superiores (Rustandi RR, Washabaugh MW, Wang Y. Electrophoresis, 29:3612-20 (2008); Lacher NA, et al. Journal of Separation Science, 33:218-27 (2010); e Hunt G, Moorhouse KG, Chen AB. Journal of Chromatography A, 744:295- 301 (1996)). Durante a análise de CE-SDS de produtos de mAb, pequenos picos com tempos de migração menores (formas LMW) do que o anticorpo intacto podem ser observados rotineiramente. Ao contrário da análise SDS- PAGE, estas impurezas LMW não podem ser extraídas ou submetidas a análises adicionais. Como resultado, as identidades das impurezas LMW observadas nos métodos de CE-SDS são frequentemente propostas unicamente com base no conhecimento empírico.
[0060] A medição em massa exata das proteínas de mAb intactas por espectrômetros de massa modernos tornou-se cada vez mais popular na indústria biofarmacêutica como uma das técnicas de identificação mais confiáveis (Kaltashov IA, et al., Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 21:323-37 (2010)); Zhang H, Cui W, Gross ML. FEBS Letters, 588:308-17/ (2014)). Especificamente, uma variedade de métodos de "cromatografia hifenizada-espectrometria de massa" demonstrou a capacidade de detectar impurezas de baixa abundância em produtos de mAb e fornecer análises altamente detalhadas que não podem ser alcançadas por métodos SDS-PAGE ou CE-SDS (Le JC, Bondarenko PV. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 16:307-11 (2005); Haberger M, et al. mAbs 8:331-9 (2016)). Por exemplo, cromatografia de fase reversa (RPLC) acoplada à espectrometria de massa pode ser usada para detectar a cadeia leve livre e modificações pós-traducionais associadas (por exemplo, cisteinilação e glutationionilação) presentes em produtos farmacêuticos de mAb. No entanto, em comparação com os métodos SDS-PAGE e CE-SDS, o RPLC muitas vezes carece de resolução suficiente para separar espécies de LMW e, assim, não elucida o perfil LMW completo. Por exemplo, a identificação de espécies de H2L em produtos farmacêuticos de mAb nunca foi relatada por análise de massa intacta baseada em RPLC, devido à sua baixa abundância e baixa resolução do anticorpo intacto principal.
[0061] Outra técnica baseada em MS promissora para caracterizar impurezas relacionadas a produtos de mAb é a espectrometria de massa de ionização de eletrospray nativa (ESI-MS Nativa), que é particularmente informativa quando acoplada com cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)(Haberger M, et al. mAbs, 8:331-9 (2016)). No entanto, as espécies de LMW identificadas na análise de SEC-MS nativa muitas vezes não são as identificadas por SDS-PAGE ou CE-SDS, devido a condições experimentais significativamente diferentes usadas entre métodos. Especificamente, a preparação da amostra necessária para SDS-PAGE e CE-SDS muitas vezes começa com a desnaturação da proteína, onde as interações não covalentes entre as regiões N-terminais de pares de HC-LC e as regiões C-terminais dos pares de HC-HC são interrompidas. Como resultado, as impurezas de LMW, tais como H2L, metade anticorpo e espécies de cadeia leve livre são capazes de se dissociar da molécula de mAb se as ligações dissulfeto intercadeia forem quebradas.
[0062] Em comparação, a SEC-MS nativa analisa as amostras de mAb sob condições nativas próximas, permitindo que as interações intercadeia não covalentes fortes sejam preservadas e permitindo que a estrutura de quatro cadeias da molécula de mAb seja mantida mesmo se as ligações dissulfeto intercadeia forem quebradas. Embora os avanços na química da coluna SEC tornem possível usar tampões de desnaturação (por exemplo, 30% de acetonitrila, 0,1% de FA e 0,1% de TFA) que normalmente são usados em cromatografia de fase reversa para separação de SEC e acoplamento direto a análise de espectrometria de massa online (Liu H, Gaza- Bulseco G, Chumsae C. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 20:2258-64 (2009)), a resolução LC ainda é sub-ideal para detectar muitas espécies de LMW.
[0063] Para enfrentar esses desafios, é fornecida uma plataforma que acopla a separação de SEC e IEX de alto desempenho com detecção de espectrometria de massa Nano-ESI nativa ultrassônica para permitir a caracterização aprofundada e rápida de produtos farmacêuticos proteicos terapêuticos.
A. Sistemas para caracterização de variantes de tamanho e carga em produtos farmacêuticos proteicos
[0064] Em uma modalidade, o sistema inclui uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), ou um sistema de cromatografia de troca iônica (IEX) em comunicação fluida com um sistema de espectrometria de massa nativo. As colunas são adequadas para uso com proteínas deglicosiladas. Em uma modalidade, a coluna SEC é uma Coluna SEC Waters BEHº (4,6 x 300 mm). Em uma modalidade, a coluna IEX é uma coluna de troca de cátions forte. O sistema de espectrometria de massa nativa pode ser um sistema de espectrometria de massa nativo de ionização de eletrospray (ESI). Em uma modalidade, o sistema de espectrometria de massa é um espectrômetro de massa Thermo Exactive EMR. O sistema de espectrometria de massa também pode conter um detector de luz ultravioleta. As colunas SEC e IEX estão em comunicação fluida com o espectrômetro de massa através de um divisor de fluxo analítico que pode ajustar a taxa de fluxo para o espectrômetro de massa.
[0065] Em uma modalidade, a fase móvel é uma fase móvel aquosa. Uma fase móvel aquosa representativa contém 140 mM de acetato de sódio e mM de bicarbonato de amônio. Os traços UV são normalmente registrados a 215 e 280 nm.
[0066] As amostras de fármaco proteico são tipicamente de 5-10 ug/ul. A concentração de injeção é tipicamente de 50-100 ug.
[0067] Em uma modalidade, a separação de exclusão de tamanho é obtida à temperatura ambiente, usando um fluxo isocrático de 0,2 mL/min por 24 minutos.
[0068] Em uma modalidade, a tensão para eletrospray é aplicada através da camiseta de junção de líquido à direita antes do emissor.
B. Métodos de caracterização de impurezas do produto farmacêutico proteico
[0069] Os sistemas e métodos divulgados podem ser usados para caracterizar variantes de tamanho, variantes de carga, ligações anticorpo- antígeno, caracterização de PTM, caracterização de mAb parcialmente reduzido e alquilado, caracterização de dímero para fármacos co-formulados, caracterização de troca de Fab IgG4 e caracterização de amostra altamente heterogênea usando redução de carga. Modificações pós-traducionais exemplificativas (PTMs) que podem ser detectadas e identificadas que contribuem para variantes ácidas incluem, mas não estão limitadas a, glicação, glucuronilação, carboximetilação, sialilação, glicosilação não consenso na região Fab. PTMs que podem ser detectadas e identificadas que contribuem para variantes básicas incluem, mas não estão limitadas a, formação de succinimida, glutamina N-terminal (não convertida em piroglutamato), Lys C-terminal e espécies não/parcialmente glicosiladas.
1. Variantes de tamanho
[0070] Uma modalidade fornece um método para caracterizar variantes de tamanho de impurezas de produto de fármaco de proteína, incluindo as etapas de opcionalmente deglicosilar uma amostra de produto farmacêutico proteico, separar os componentes proteicos da amostra de produto farmacêutico proteico por cromatografia de SEC nativa usando uma fase móvel aquosa, e analisar os componentes proteicos separados por espectrometria de massa para caracterizar espécies de alto peso molecular, espécies de baixo peso molecular e espécies de alto peso intermediário de impurezas do produto de produto farmacêutico proteico na amostra do produto farmacêutico proteico. Em uma modalidade, a fase móvel inclui acetato de amônio e bicarbonato de amônio.
[0071] Em uma modalidade, a amostra do produto farmacêutico proteico é retirada de ou purificada a partir de uma cultura de células semidescontínua, uma cultura de células contínua ou uma cultura de células de perfusão.
[0072] Os produtos farmacêuticos proteicos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos.
[0073] Impurezas de produto farmacêutico de proteína de baixo peso molecular exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, precursores,
produtos de degradação, espécies truncadas, fragmentos proteolíticos incluindo fragmentos Fab, ligante ou receptor ou fragmentos de cadeia pesada, cadeia leve livre, meio-anticorpo, H2L, H2, HL, HC ou uma combinação dos mesmos.
[0074] Impurezas de HMW exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, trímeros de mAb e dímeros de mAb.
[0075] Impurezas de HMW intermediário exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, monômero com cadeias leves extras (espécies H2L3 e H21I4), monômero mais complexos de fragmento Fab, Fab2-Fab2, Fc-Fc e Fab2-Fe.
2. Caracterização de variantes de carga
[0076] Uma modalidade fornece um método para caracterizar variantes de carga de impurezas do produto farmacêutico proteico, incluindo as etapas de opcionalmente deglicosilar uma amostra de produto farmacêutico proteico, opcionalmente tratar a amostra com IdeS de Streptocoocus pyogenes, separar componentes proteicos da amostra de produto farmacêutico proteico por cromatografia de troca de cátions forte nativa usando uma fase móvel aquosa, e analisar os componentes de proteína separados por espectrometria de massa para caracterizar espécies com variação de carga de impurezas de produto farmacêutico proteico na amostra do produto farmacêutico proteico. Em uma modalidade, a fase móvel inclui acetato de amônio e bicarbonato de amônio.
[0077] Em uma modalidade, a amostra do produto farmacêutico proteico é retirada de ou purificada a partir de uma cultura de células semidescontínua, uma cultura de células contínua ou uma cultura de células de perfusão.
[0078] Variantes de carga exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, glicação, glucuronilação,y carboximetilação, sialilação, glicosilação não consenso na região Fab. PTMs que podem ser detectadas e identificadas que contribuem para variantes básicas incluem, mas não estão limitadas a, formação de succinimida, glutamina N-terminal (não convertida em piroglutamato), Lys C-terminal e espécies não/parcialmente glicosiladas.
C. Métodos de produção de produtos farmacêuticos proteicos de alta pureza
[0079] Uma modalidade fornece um método de produção de um anticorpo, incluindo as etapas de cultivo de células que produzem o anticorpo, por exemplo, em uma cultura semidescontínua, obtenção de uma amostra da cultura de células, caracterização e quantificação de impurezas de baixo peso molecular, alto peso molecular e de peso molecular intermediário na amostra, utilizando os sistemas e métodos divulgados neste documento, e modificando uma ou mais condições de cultura da cultura de células para reduzir a quantidade de impurezas de fármaco de baixa proteína molecular caracterizadas produzidas durante a cultura de células do anticorpo. Normalmente, as condições são alteradas para manter as impurezas de fármaco proteico em um intervalo de 0,05% e 30,0%, preferencialmente de 0,05% a 15%, 0,05% a 10%, 0,05% a 5%, ou 0,05% a 2% (p/p).
[0080] Uma ou mais condições da cultura de células que são alteradas para reduzir a quantidade de impurezas de fármaco proteico de baixo peso molecular são selecionadas dentre o grupo que consiste em temperatura, pH, densidade celular, concentração de aminoácido, osmolalidade, concentração de fator de crescimento, agitação, pressão parcial de gás, surfactantes ou combinações dos mesmos.
[0081] Em uma modalidade, as células que produzem o anticorpo são células de ovário de hamster chinês. Em outras modalidades, as células são células de hibridoma.
[0082] Outra modalidade fornece um anticorpo produzido de acordo com os métodos fornecidos neste documento com impurezas de fármaco proteico de 1 a 5%, 5 a 10%, 10 a 15%, 15 a 20%.
Exemplos Exemplo 1: Separação HILIC da amostra de substância farmacológica mAb-1 Métodos
[0083] A separação de SEC foi alcançada em uma Coluna SEC Waters BEHº (4,6 x 300 mm) que foi pré-equilibrada com acetato de amônio e fase móvel baseada em bicarbonato de amônio a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. A separação IEX foi alcançada em uma coluna de troca de cátions forte a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min usando sistema tampão baseado em acetato de amônio. Um divisor de fluxo analítico foi conectado após a coluna para reduzir o fluxo para -1 uL/min antes da análise pelo espectrômetro de massa Thermo Exactive EMR, que foi equipado com uma fonte de fons Nanospray FlexTM, Dependendo do tamanho dos analitos, a pressão do gás de aprisionamento, o nível de RF da lente S, a fragmentação na fonte e a energia de colisão de HCD foram ajustados para atingir a dissolução ideal.
[0084] Portanto, introduziu-se uma nova plataforma de tecnologia que acopla a separação de SEC e IEX de alto desempenho com detecção de espectrometria de massa Nano-ESI nativa ultrassônica para permitir a caracterização aprofundada e rápida de mAbs terapêuticos. Resultados
[0085] Uma amostra de substância farmacológica Mab1 recombinante (mAb-1) foi usada como uma molécula modelo. Utilizando SEC-MS, níveis baixos de variantes de tamanho em produtos de mAb podem ser efetivamente separados das espécies principais de monômero e submetidos à detecção sensível de MS. Ambas as espécies de peso molecular mais alto (por exemplo, trímero de mAb e dímero de mAb) e espécies moleculares mais baixas (por exemplo, fragmentos Fab e monômero sem um braço Fab), presentes em <1% de abundância relativa, podem ser rotineiramente observados e monitorados por este método. Em particular, uma categoria interessante de espécies de
HMW que eluem entre um monômero de mAb e um dímero de mAb (denominadas como espécies de HMW intermediário) foram detectadas em muitos produtos de mAb, embora estejam normalmente presentes em níveis extremamente baixos (<0,1%). Através de medição de massa precisa, as identidades destas espécies de HMW intermediário podem ser determinadas e divididas em dois grupos: 1) monômero com cadeias leves extras (espécies H2L3 e H214) e 2) monômero mais complexos de fragmento Fab. Além disso, após o tratamento com digestão enzimática de IdeS, diferentes fragmentos dimerizados (Fab7-Fab,, Fc e Fab;-Fc) podem ser bem separados e detectados por este método, revelando as interfaces de dimerização no nível de subdomínio.
[0086] Utilizando TEX-MS, uma variedade de PTMs que contribuem para as variantes de carga pode ser detectada no nível de mAb intacto. Através de análises de centenas de amostras de mAb, constatou-se que as PTMSs que contribuem para variantes ácidas incluem glicação, glicuronilação, carboximetilação, sialilação e glicosilação não-consenso na região Fab; constatou-se que as PTMs que contribuem para variantes básicas incluem formação de succinimida, glutamina N-terminal (não convertida em piroglutamato), Lys C-terminal e espécies não-/parcialmente glicosiladas. Em investigações de variantes de carga (por exemplo, estudos de comparabilidade e degradação forçada), esta nova abordagem provou ser muito poderosa na elucidação de formas com variação de carga.
[0087] Embora no relatório descritivo precedente esta invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades da mesma, e muitos detalhes tenham sido apresentados para fins de ilustração, será evidente para aqueles versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que certos detalhes descritos neste documento podem variar consideravelmente sem se afastar dos princípios básicos da invenção.
[0088] Todas as publicações mencionadas ao longo desta divulgação são incorporadas por referência em sua integralidade.
[0089] Todas as referências citadas neste documento são incorporadas por referência em sua totalidade. A presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou atributos essenciais da mesma e, consequentemente, deve-se referir-se às reivindicações anexas, em vez do relatório descritivo precedente, para indicar o escopo da invenção.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Produto farmacêutico proteico caracterizado pelo fato de que compreende: um fármaco proteico e um excipiente, em que o produto farmacêutico proteico compreende entre 0,05% e 30,0% (p/p) de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
2. Produto farmacêutico proteico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico proteico é selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos..
3. Produto farmacêutico proteico de acordo com as reivindicações | ou 2, caracterizado pelo fato de que as impurezas do fármaco proteico de peso molecular intermediário são selecionadas dentre o grupo que consiste em monômero com cadeias leves extras incluindo espécies H2L3 e H2LA, monômero mais complexos de fragmento Fab e combinações dos mesmos.
4. Produto farmacêutico proteico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico compreende entre 0,05% a 25% p/p de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
5. Produto farmacêutico proteico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico compreende entre 0,05% a 15% p/p de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
6. Produto farmacêutico proteico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico compreende entre 0,05% a 10% p/p de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
7. Produto farmacêutico proteico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico compreende entre 0,05% a 5% p/p de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
8. Método para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário, caracterizado pelo fato de que compreende: deglicosilar uma amostra de produto farmacêutico proteico; separar os componentes proteicos da amostra de produto farmacêutico proteico por cromatografia de exclusão de tamanho nativo usando uma fase móvel aquosa; analisar os componentes proteicos separados por espectrometria de massa para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário na amostra do produto farmacêutico proteico.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a amostra do produto farmacêutico proteico é de uma cultura semidescontínua.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico proteico é selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8- 10, caracterizado pelo fato de que a impureza do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário é caracterizada como uma impureza de produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário selecionada dentre o grupo que consiste em monômero com cadeias leves extras incluindo espécies H2L3 e H21LA4, monômero mais complexos de fragmento Fab e combinações dos mesmos.
12. Método para produção de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar as células produzindo o anticorpo em uma cultura de células; obter uma amostra da cultura de células; caracterizar e quantificar as impurezas de alto peso molecular intermediário na amostra de acordo com o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-11, e modificar uma ou mais condições de cultura da cultura de células para reduzir a quantidade de impurezas de fármaco proteico de baixo peso molecular caracterizadas produzidas durante a cultura de células do anticorpo.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma ou mais condições da cultura de células que são alteradas para reduzir a quantidade de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário são selecionadas dentre o grupo que consiste em PH, densidade celular, concentração de aminoácido, osmolalidade, concentração do fator de crescimento, agitação, pressão parcial de gás, surfactantes, ou combinações dos mesmos..
14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que as células são selecionadas dentre o grupo que consiste em células bacterianas, células de levedura, células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie- CHO), células COS (por exemplo, COS-7), células da retina, células Vero, células CVI1, células renais (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), células HeLa, células HepG2, células WI38, células MRC 5, células Colo25, células HB 8065, células HL-60, linfócitos, por exemplo, células T autólogas, Jurkat (linfócitos T) ou Daudi (linfócitos B), células A431 (epidérmicas), células U937, células 3T3, células L, células C127, células SP2/0, células NS-0, células MMT, células-tronco, células tumorais e uma linhagem celular derivada de qualquer uma das células supracitadas.
15. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que as células são células de hibridoma ou células de quadroma.
16. Anticorpo caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 15.
17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende 0,05 e 30,0% (p/p) de impurezas de fármaco proteico de alto peso molecular intermediário.
18. Sistema para caracterizar impurezas de fármaco de alto peso molecular intermediário, caracterizado pelo fato de que compreende: um sistema de cromatografia de exclusão de tamanho nativo compreendendo uma coluna de exclusão de tamanho ligada a uma coluna de fase móvel compreendendo uma fase móvel aquosa, em que a coluna de exclusão de tamanho está em comunicação fluida com um sistema de espectrometria de massa Nano-ESI.
19. Método para caracterizar as impurezas de fármaco com variação de carga, caracterizado pelo fato de que compreende: deglicosilar uma amostra de produto farmacêutico proteico; separar os componentes proteicos da amostra de produto farmacêutico proteico por cromatografia de exclusão de cátions forte nativa usando uma fase móvel aquosa; analisar os componentes proteicos separados por espectrometria de massa Nano-ESI para caracterizar as impurezas do produto farmacêutico proteico com variação de carga na amostra do produto farmacêutico proteico.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a amostra do produto farmacêutico proteico é de uma cultura semidescontínua.
21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o produto farmacêutico proteico é selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21, caracterizado pelo fato de que a impureza do produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário é caracterizada como uma impureza de produto farmacêutico proteico de alto peso molecular intermediário selecionada dentre o grupo que consiste em monômero com cadeias leves extras incluindo espécies H2L3 e H2L4, monômero mais complexos de fragmento Fab e combinações dos mesmos.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8- 11 e de 19-22, caracterizado pelo fato de que a fase móvel aquosa compreende acetato de amônio e bicarbonato de amônio.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3125040A1 (en) 2019-01-25 2020-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Online chromatography and electrospray ionization mass spectrometer
CN115427113A (zh) * 2020-04-09 2022-12-02 西托姆克斯治疗公司 含有可活化抗体的组合物
EP4402475A1 (en) * 2021-09-14 2024-07-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nmass spectrometry-based strategy for characterizing high molecular weight species of a biologic

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US6927004B2 (en) 2002-03-08 2005-08-09 Asml Netherlands B.V. Mask for use in lithography, method of making a mask, lithographic apparatus, and device manufacturing method
DK2374818T3 (da) 2006-06-02 2013-01-21 Regeneron Pharma Højaffinitetsantistoffer mod human IL-6-receptor
EA017733B1 (ru) * 2006-08-28 2013-02-28 Арес Трейдинг С.А. СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СЛИТЫХ БЕЛКОВ
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
ATE526017T1 (de) * 2007-01-22 2011-10-15 Genentech Inc Abscheidung von polyelektrolyten und reinigung von antikörpern
CA2695199C (en) 2007-07-31 2016-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human cd20 and method of using thereof
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
KR20120027055A (ko) 2009-06-26 2012-03-20 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
WO2011133886A2 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
JOP20190250A1 (ar) 2010-07-14 2017-06-16 Regeneron Pharma صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
EP3733711A1 (en) 2010-10-06 2020-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
JO3412B1 (ar) 2011-06-17 2019-10-20 Regeneron Pharma أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها
AU2012339722B2 (en) 2011-11-14 2017-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and/or Activin A
WO2013112438A1 (en) 2012-01-23 2013-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
TWI641619B (zh) 2012-06-25 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
US9540449B2 (en) 2012-08-13 2017-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法
US9637535B2 (en) 2013-03-15 2017-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-33 antagonists and uses thereof
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
WO2015061526A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Medimmune, Llc Antibody purification
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
JP6632984B2 (ja) 2014-03-11 2020-01-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体およびその使用
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3636073B1 (en) 2014-05-05 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized c5 and c3 animals
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
EP3194441A1 (en) 2014-09-16 2017-07-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glucagon antibodies and uses thereof
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體

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