BR112020012388A2

BR112020012388A2 - método para a determinação in vitro da potência de um ligante anti-cd26

Info

Publication number: BR112020012388A2
Application number: BR112020012388-9A
Authority: BR
Inventors: Antonio Francesco Di Naro
Original assignee: Adienne S.A.
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-11-24
Also published as: US20200319169A1; MA51309A; CA3085693A1; US11959913B2; MX2020006488A; RU2020120500A; AU2018392227A1; EP3729085A1; TW201930880A; CN111433604A; CN111433604B; WO2019123410A1; JP2021508834A; KR20200103003A; IL275169A; JP2024020200A; JP7366925B2

Abstract

A presente invenção refere-se a um método celular quantitativo para a determinação in vitro do efeito de um ligante anti-CD26, preferivelmente de um anticorpo monoclonal anti-CD26, como begelomabe.

Description

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MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO IN VITRO DA POTÊNCIA DE UM LIGANTE ANTI-CD26

[001] A presente invenção refere-se a um método celular quantitativo para a determinação in vitro do efeito de um ligante anti-CD26, preferivelmente de um anticorpo monoclonal anti-CD26, como begelomabe.

[002] CD26 é uma glicoproteína multifuncional de 110-kDa expressada tanto sobre a superfície da célula quanto sob a forma solúvel. O antígeno CD26 é expressado por vários tecidos e órgãos como os pulmões, o endotélio, o coração, o cérebro, o intestino, os rins, a placenta, o pâncreas e os músculos esqueléticos (Abbott C.A. et al., 1994). Tem sido verificado que, no nível celular, a expressão de CD26 tem uma forte atividade coestimulatória em populações de linfócitos, especialmente em linfócitos-T ativados, em linfócitos-T em repouso e em linfócitos-B (Cordero OJ et al., 2007). Em um subconjunto específico de célula-T de memória, de fato, a expressão de CD26 aumenta após a ativação das próprias células-T (Morimoto C. et al., 1989). A expressão de CD26 sobre células-T tem estado associada com a capacidade destas células para produzirem quantidades altas de IL-2 e fortemente se proliferarem em resposta à estimulação mitogênica. Contudo, a expressão de CD26 tem sido negativamente correlacionada com a atividade de linfócitos-T auxiliares (Mattern T. et al., 1991).

[003] CD26 é distinguido por uma atividade enzimática dipeptidil- peptidásica IV (DPP-IV). A atividade enzimática, acima, especificamente promove a hidrólise da ligação peptídica entre o aminoácido N-terminal em posição X-Pro e aminoácidos adjacentes (Gorrel M.D. et al., 2001). CD26 pertence a um subconjunto de oligopeptidases que pode cortar dipeptídeos N- terminais provenientes de muitos substratos biologicamente ativos como citocinas, polipeptídeos, hormônios, e quimiocinas (De Meester I. et al., 1999; Hildebrandt M. et al., 2000).

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[004] Em seres humanos, CD26 está também envolvido na ligação com adenosina-desaminase (ADA) (Franco R. et al., 1998). A deficiência em ADA predispõe para doenças de imunodeficiência, não apenas mediante os mecanismos gerais de desregulação imune, mas também mediante a acumulação intracelular de metabólitos tóxicos do metabolismo de purina (Sauer A.V. et al., 2012).

[005] Um possível efeito da ligação entre CD26 e ADA é, de fato, a modulação da concentração de adenosina extracelular local que produz sinais negativos dentro de células-T mediante os receptores de adenosina da superfície da célula. Alguns anticorpos monoclonais específicos para CD26 são capazes de transmitir um sinal de ativação para as células-T e de regular as respostas imunes in vitro (Morimoto C. e Schlossman S.F et al., 1998). Por conseguinte, CD26 tem estado associado com a regulação de inflamação, de funções endócrinas imunes e de funções nervosas e também com a patofisiologia da AIDS.

[006] Devido à sua distribuição ubíqua, muitos estados patológicos estão correlacionados com uma expressão e/ou atividade alterada de CD26 em relação à gravidade da condição patológica respectiva. Estas doenças podem ser divididas em pelo menos cinco categorias: doenças autoimunes e inflamatórias, tumores hematológicos malignos, distúrbios psiconeuroendócrinos, doenças infecciosas e tumores sólidos. Muitos pesquisadores têm observado que em várias doenças imunomediadas, o nível sérico de atividade enzimática de CD26 parece estar alterado (Klemann C. et al., 2016). Em estudos clínicos, tem sido observado que variações na expressão/atividade de CD26 estão envolvidas em várias doenças autoimunes como artrite reumatoide, esclerose múltipla, diabetes melito tipo I e doença de rejeição de transplante no hospedeiro (GvHD).

[007] Vários estudos, nos quais inibidores de CD26 elevadamente seletivos foram administrados, mostraram um início de retardo de diabetes,

3 / 33 um decréscimo em insulite, um aumento no número de células-T regulatórias, sugerindo uma função importante de CD26 na regulação imune.

[008] Vários relatórios relacionados aos pacientes sofrendo de artrite reumatoide têm mostrado uma correlação entre as expressão/atividade enzimática de CD26, a gravidade da doença e o tratamento. Estas verificações poderiam superar as dificuldades iniciais para novas abordagens terapêuticas almejadas para a inibição da atividade enzimática de CD26. Além disso, tem sido visto que a expressão de CD26 é mais alta sobre a superfície de células-T no sangue e no fluido cérebro-espinhal de pacientes sofrendo de esclerose múltipla (Ohnuma K. et al., 2011). GvHD é a complicação principal após transplantação de células-tronco hematopoiéticas (HSCT, Haematopoietic Stem Cell Transplantation), uma terapia importante para muitas doenças hematológicas (Ferrara J.L.M. et al., 2009). GvHD pode ser classificada como aguda ou crônica com base no tempo de início e é causada pela transplantação de células-T virgens derivadas da medula do doador, que danifica o tecido do paciente recipiente (Henden A.S., Hill G.R., 2015). GvHD representa uma limitação estrita sobre o uso de transplante de medula óssea como uma terapia de salvamento da vida (Welniak L.A. et al., 2007).

[009] Três condições são geralmente necessárias para o desenvolvimento de GvHD: (1) a medula do doador precisa conter células imunocompetentes, (2) o paciente recipiente precisa expressar antígenos teciduais que não estão presentes no doador e (3) o paciente recipiente não deve ser capaz de disparar uma resposta efetiva que destruiria as células transplantadas.

[0010] A GvHD é distinguida por 3 fases diferentes: 1) em uma primeira fase, os tecidos são danificados no hospedeiro devido à radioterapia ou à quimioterapia, com a liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-alfa e IFN-gama; 2) em uma segunda fase de ativação, as células-T alorreativas do doador são ativadas pelos antígenos expostos pelas células

4 / 33 apresentadoras de antígeno ao paciente (APC, Antigen Presenting Cells), 3) finalmente, a proliferação de células ocorre com secreção adicional de citocinas produzidas tanto por células-T citotóxicas quanto por células-T efetoras (Ferrara J.L.M. et al., 2009).

[0011] A patologia, a gravidade e a especificidade para órgão de GvHD aguda (aGvHD) são determinadas pelo equilíbrio entre as diferentes subpopulações de linfócitos-T: Th1, Th2 e Th17. Tem sido mostrado, de fato, que a prevalência do subtipo Th1 com respeito aos outros subtipos depende do ambiente de citocina no momento da ativação das células-T do doador, após a interação com as células APC do hospedeiro, e a subsequente diferenciação delas em células-T auxiliares.

[0012] As principais citocinas Th1 são IFN-γ, IL-2 e TNF-alfa. Quantidades aumentadas de citocinas Th1, como TNF e IFN-γ, têm estado associadas com um início mais precoce e grave da doença devido à capacidade delas de induzirem a suprarregulação de quimiocinas e de receptores capazes de promoverem uma reação inflamatória. As citocinas Th2 são IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Tem sido observado que o bloqueio da resposta pelas células Th2 está associado com um aumento em sintomas gastrointestinais e uma redução em níveis de danos hepático e dérmico. IL-6, que é uma citocina pró-inflamatória, controla o equilíbrio entre células Th17 e células-T regulatórias. A inibição de IL-6 poderia ser uma estratégia potencialmente eficaz para reduzir a gravidade de aGvHD em HCT mediante a indução de tolerância imunológica (Henden A.S., Hill G.R., 2015).

[0013] Por conseguinte, o esclarecimento da função de CD26 durante a resposta de células-T e de teores alterados de citocinas indubitavelmente ajudaria a entender o fenômeno inicial e a progressão de GvHD (Henden A.S., Hill G.R., 2015; Yi T. 2009).

[0014] Com base nesta premissa, uma nova abordagem terapêutica para prevenção de GvHD é baseada no uso de anticorpos monoclonais anti-

5 / 33 CD26 (Hatano R., 2013; Bacigalupo A., 2016). Os anticorpos anti-CD26 têm sido recentemente desenvolvidos em modelos pré-clínicos para prevenir o início de GvHD em modelos animais da doença. Embora a função de CD26/DPPIV em GvHD deve ser adicionalmente investigada, tem sido relatado que o tratamento com um anticorpo de camundongo contra CD26 de humano (isto é Begelomabe) é eficaz no tratamento de GvHD em pacientes sofrendo de GvHD aguda resistente a esteroides (Patente US 9.376.498). Dados clínicos, por conseguinte, confirmam que a interação de CD26 por um anticorpo monoclonal representa uma abordagem terapêutica válida para erradicar a subpopulação de células-T autorreativas com a consequente resolução de GvHD.

[0015] Considerando-se a explicação acima, é evidente a importância do receptor CD26 como um alvo molecular em novas abordagens terapêuticas.

[0016] O teste de potência provê uma medição quantitativa da atividade biológica de um fármaco específico e representa um parâmetro de qualidade crucial durante o processo de desenvolvimento de uma molécula farmacêutica.

[0017] Várias abordagens podem ser usadas para desenvolver um teste de potência, incluindo ensaios de ligante-receptor, ensaios com animais, ensaios com células in vitro, ou outros ensaios bioquímicos (por exemplo ensaios enzimáticos). Um teste de potência é particularmente relevante se ele reproduzir o mecanismo de ação de um fármaco específico.

[0018] Para produtos biológicos, é preferível usar um ensaio de ligante-receptor ou experimentos com células in vitro. O primeiro, visto que ele é capaz de prover uma medição direta da afinidade de um fármaco por seu alvo molecular, pode também ser adequado para um teste de potência.

[0019] Contudo, nem sempre é possível usar estes tipos de ensaios, simplesmente porque os testes de potência devem ser desenvolvidos com base

6 / 33 no mecanismo de ação do fármaco, mas esta informação nem sempre está disponível, especialmente para anticorpos monoclonais. Esta abordagem é particularmente complexa porque os fármacos biológicos com frequência têm múltiplos mecanismos de ação in vivo, de modo que é particularmente difícil reproduzir em um sistema in vitro.

[0020] Os autores da presente invenção têm agora verificado que o anticorpo monoclonal anti-CD26 (begelomabe) é capaz de induzir a internalização do receptor CD26 após ligação específica, com um mecanismo de ação conhecido como “capeamento” (capping). O fenômeno de internalização resulta na inibição da liberação de citocinas pró-inflamatórias, que desempenham uma função crucial em processos flogísticos, que é um evento funcional a jusante direto induzido pelo ligante anti-CD26. O mecanismo de ação descrito, portanto, respalda todas as aplicações de anticorpos monoclonais em todas as doenças autoimunes nas quais é essencial desativar os linfócitos-T autorreativos enquanto que preserva a imunocompetência deles.

[0021] Consequentemente, como um teste de potência de um produto farmacêutico que é gerado para o propósito de determinar a quantidade de composto ativo em uma amostra em uma maneira funcional, tanto a internalização de CD26 e quanto a inibição da secreção de citocinas inflamatórias representam um teste novo que pode ser usado para avaliar a potência de um ligante anti-CD26, preferivelmente de um anticorpo monoclonal que é desenvolvido para aplicações terapêuticas e/ou diagnósticas.

[0022] A abordagem descrita pode ser aplicada com o propósito de avaliar a potência de qualquer ligante anti-CD26 com base na verificação revolucionária do mecanismo de ação de begelomabe. Além disso, o uso deste método permite uma medição quantitativa de ambas a internalização de CD26 e a inibição da secreção/produção de catiônicas a serem obtidas.

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[0023] Em conclusão, estas verificações permitem a preparação de um teste de potência extremamente vantajoso em termos de: 1) reprodutibilidade, 2) facilidade de quantificação da atividade do ligante anti-CD26 em uma amostra específica, e 3) medição quantitativa da atividade do ligante anti- CD26, quer seja ele conhecido como Begelomabe quer seja ele recentemente identificado.

[0024] A presente invenção por conseguinte refere-se a um método para a determinação in vitro da potência de um ligante anti-CD26 compreendendo as seguintes etapas: a) incubação a 37°C de uma população de linfócitos-T humanos que expressam o receptor CD26 em uma percentagem maior que 75% com um ligante anti-CD26, em uma concentração na faixa de 0,001 µg/ml e 150 µg/ml; preferivelmente de 0,01 µg/ml a 100 µg/ml, mais preferivelmente de 0,01 μg/ml a 2 μg/ml, ainda mais preferivelmente de 0,01 μg/ml a 0,5 μg/ml; b) incubação com anticorpo anti-CD26 marcado com fluorocromo que reconhece um epítopo sobre o receptor CD26 diferente daquele reconhecido pelo ligante anti-CD26 da etapa a); c) determinação do valor de MFI (Median of Fluorescence Intensity, Média de Intensidade de Fluorescência) de CD26 medido para a amostra de células tratadas com o ligante anti-CD26 (MFIT) e o valor de MFI de células não tratadas (MFINT) por meio de análise citofluorimétrica; d) avaliação da percentagem de internalização do receptor CD26 como RFI (Relative Fluorescence Intensity, Intensidade de Fluorescência Relativa, que é o valor de MFI normalizado com respeito ao valor de MFI basal) calculada como a razão entre o valor de MFI de CD26 medido para a amostra de células tratadas com o ligante anti-CD26 (MFIT) e o valor de MFI de células não tratadas (MFINT), multiplicado por 100 e então subtraído de 100, de acordo com a seguinte fórmula:

8 / 33 em que “%int CD26” ou RFI é a percentagem de internalização de CD26, “MFIT” é o valor de MFI das células tratadas com o ligante anti-CD26 (células de teste) e “MFINT” é o valor de MFI das células não tratadas com o ligante anti-CD26 (células de referência).

[0025] Tal percentagem (%int CD26 ou RFI): se menor que 20%, indica uma potência baixa do ligante anti- CD26; se na faixa de 20% a 30%, indica uma potência média do ligante anti-CD26; se maior que 30%, indica uma potência alta do ligante anti- CD26.

[0026] Na Figura 12, no painel A é enfatizado o raciocínio utilizado para atribuir os critérios de potência “baixa”, “média” e “alta”, respectivamente. Em particular, é observado que a resposta em termos de % de internalização de CD26 é dependente da dose com formato S (sigmoidal), em que em concentração mais baixa do ligante (nesta figura indicado como “RS”) ela tem um valor de “%int CD26” mais baixo e, vice-versa, em concentração mais alta do ligante, ela tem valor de “%int CD26” mais alto até um máximo (platô) de 30% a 35%. Se este platô é considerado como 100% de “%int CD26”, é possível normalizar todos os valores da curva como mostrado na Figura 12, no painel B.

[0027] Neste sentido, é observada uma curva iniciando desde 0% até 100% de internalização, e portanto, é possível definir três faixas de potência diferentes:

1. “baixa”, que é referida a um ligante tendo uma percentagem de internalização na faixa de 0% a 50% com respeito ao platô,

2. “média”, que é referida a um ligante tendo uma percentagem de internalização na faixa de 50% a 90% com respeito ao platô,

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3. “alta”, que é referida a um ligante tendo uma percentagem de internalização maior que 90% com respeito ao platô.

[0028] Em outros termos este conceito pode ser resumido na seguinte Tabela 1: Tabela 1 Potência RFI % do platô BAIXA 0%-20% 0%-50% MÉDIA 20%-30% 50%-90% ALTA >30% 90%-100%

[0029] Em uma modalidade alternativa da invenção, a população de linfócitos humanos da etapa a) pode ser incubada à temperatura ambiente.

[0030] O dito ligante anti-CD26 é qualquer molécula capaz de se ligar especificamente ao receptor CD26, preferivelmente um anticorpo monoclonal anti-CD26 ou fragmentos do mesmo, mais preferivelmente begelomabe.

[0031] Em uma modalidade preferida do método da invenção, a concentração de ligante anti-CD26 da etapa a) é 0,001 μg/ml, 0,01 µg/ml, 0,5 μg/ml ou 2 μg/ml.

[0032] Em uma modalidade preferida do método da invenção, o anticorpo anti-CD26 da etapa b) é do tipo anticorpo de camundongo anti- CD26-humano conjugado com fluorocromo APC (AlloPhycoCyanin, aloficocianina) (BD Pharmingen; número de catálogo: 563670, número de clone: M-A261) e é incubado a uma concentração de 2,5 μg/ml.

[0033] De acordo com uma outra modalidade preferida do método da invenção, o fluorocromo usado na etapa b) é qualquer fluorocromo que pode ser usado em análise citofluorimétrica selecionado a partir do grupo consistindo em FITC, APC, PE, PE-Cy7, APC-H7, PerCP e PE-Cy5.5. O dito fluorocromo é preferivelmente APC (AlloPhycoCyanin, aloficocianina).

[0034] De novo, de acordo com uma modalidade preferida do método da invenção, a população de linfócitos-T CD26+ da etapa a) é selecionada de uma população de linfócitos-T primários e de uma linhagem de célula tumoral

10 / 33 de linfócitos-T humanos. Preferivelmente, a dita linhagem de célula tumoral de linfócitos-T humanos é a linhagem de célula Karpas 299.

[0035] Em uma modalidade preferida do método de acordo com a invenção, a análise citofluorimétrica da etapa c) é realizada por meio de FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting, separação de células ativadas por fluorescência).

[0036] O método de acordo com a invenção também provê uma etapa de verificação adicional da potência do ligante anti-CD26 que provê um teste de inibição da liberação de citocinas pelo ligante supracitado, as ditas citocinas sendo selecionadas a partir do grupo consistindo em IL-8, IL-1β, IL- 6, IL-2, GM-CSF, IL-6 e TNF-α, realizado sobre a população de linfócitos-T humanos CD26+ da etapa a). Em uma modalidade preferida, as ditas citocinas são IL-8 e/ou IL-1β. A dita população de linfócitos-T humanos CD26+ da etapa a) é selecionada de uma população de linfócitos-T primários e de uma linhagem de célula tumoral de linfócitos-T humanos. Preferivelmente, a dita linhagem de célula tumoral de linfócitos-T humanos é a linhagem de célula Karpas 299.

[0037] Em uma modalidade preferida, o dito teste de inibição da produção de citocinas é realizado por meio do ensaio MesoScale Discovery (MSD).

[0038] A presente invenção será agora descrita para propósitos ilustrativos, mas não limitadores, de acordo com uma modalidade preferida com referência específica às figuras anexadas, nas quais: - A Figura 1 mostra o esquema experimental da cultura de célula para a análise de teores de citocinas pró-inflamatórias com o ensaio MSD; - A Figura 2 mostra a análise citofluorimétrica da percentagem de células CD4+ (coluna escura) e de células CD26+ (coluna clara) em células mononucleares primárias do sangue periférico e células-T CD4+

11 / 33 purificadas (A) e em linhagem de célula-T humana Karpas 299 (B); - A Figura 3 mostra o efeito de Begelomabe sobre a internalização do receptor CD26 em células Karpas 299 após 8 horas de incubação (painel A) e em células-T primárias CD3+, CD4+, CD8+ incubadas a 4°C e a 37°C (painéis B, C, D) após 6 horas e 24 horas; - A Figura 4 mostra a inibição dos teores de citocinas IL-2, IL- 8, IL-1β, GM-CSF, IL-6 e TNF-α induzida por Begelomabe na linhagem de célula-T Karpas 299 (painéis A) e em células-T primárias (painéis B). No gráfico, à esquerda sobre o eixo de ordenada, é indicado o sinal de eletroquimioluminescência, enquanto que no eixo de abscissa, é indicada a concentração correspondente; - A Figura 5 mostra a redução na fluorescência associada com CD26 após 24 horas de tratamento com begelomabe em células Karpas 299; - A Figura 6 mostra a redução em fluorescência associada com CD26 após 24 horas em células Karpas 299 após o tratamento iniciando a partir de uma dose baixa de 0,0005 µg/mL (3x10-12 M) até a concentração mais alta de Begelomabe igual a 150 μg/mL (1x10-6 M); - A Figura 7 mostra as curvas de internalização de CD26 de resposta à dose (RFI) adquiridas mediante a análise por FACS realizada em amostras com begelomabe armazenadas sob diferentes condições de temperatura (SVI-STB é uma amostra com potência reduzida, que é uma amostra posta em estabilidade acelerada a 32,5°C durante 6 meses); - A Figura 8 mostra as curvas de internalização de CD26 (RFI) adquiridas mediante a análise por FACS realizada em citofluorímetros diferentes; - A Figura 9 mostra a potência relativa do anticorpo monoclonal de camundongo anti-hCD26 (clone 202.36) observado com respeito ao begelomabe (WS-BEG-013); - A Figura 10 mostra a potência relativa do anticorpo de

12 / 33 camundongo IgG2b, isótipo K (Clone MG2b-57) observada com respeito ao begelomabe (WS-BEG-013); - A Figura 11 mostra o valor da potência da amostra testada (TEST) calculado com respeito ao padrão de referência (Reference Standard) RS (begelomabe), para demonstrar como a atividade relativa de qualquer amostra desconhecida, chamada de TEST, pode ser quantitativamente medida com respeito ao padrão de referência (RS); - A Figura 12 mostra dois gráficos exemplificadores dos critérios aplicados para determinar a potência baixa, média ou alta;

[0039] Com o propósito de melhor ilustrar a invenção, são agora providos os seguintes exemplos que devem ser considerados ilustrativos e não limitadores da mesma. EXEMPLO 1: Estudo sobre o mecanismo de ação do anticorpo monoclonal begelomabe

[0040] O mecanismo de ação de Begelomabe (anticorpo anti-CD26) foi estudado com o propósito de gerar um teste para avaliar a efetividade do anticorpo in vitro.

[0041] O desenvolvimento deste teste, chamado de teste de potência, é consideravelmente importante para medir a atividade biológica de um dado fármaco, porque esta atividade é um componente essencial do controle de qualidade de uma molécula durante as fases de desenvolvimento inicial, desenvolvimento avançado e comercialização dentro do escopo de Controle de Qualidade como um teste de liberação em batelada.

[0042] Especificamente, muitos produtos biológicos, como anticorpos monoclonais, exercem a função deles mediante a ligação a um alvo celular ou solúvel, subsequentemente disparando eventos celulares apropriados a jusante do alvo molecular.

[0043] Os seguintes foram, portanto, avaliados: • A expressão/superexpressão de CD26 em linhagens de

13 / 33 células-T humanas e células-T primárias humanas • A internalização de CD26 após ligação com begelomabe • O efeito de Begelomabe sobre a produção e a liberação de citocinas inflamatórias.

MATERIAIS E MÉTODOS Células primárias e linhagens de células

[0044] A linhagem de célula-T humana deriva-se de células-T de linfoma Karpas 299 que foram compradas junto à SIGMA (nº de catálogo 06072604-1VL). As células Karpas 299 foram cultivadas em RPMI1640 com GlutaMAX (Gibco, nº de catálogo 72400), suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (Sigma, nº de catálogo F2442, a inativação por calor foi realizada no laboratório), 1UI/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco, nº de catálogo 15140), 2 mM de L-glutamina (Gibco, nº de catálogo 2503) e 50 μM de β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, nº de catálogo M3148). Após descongelamento, as células foram expandidas e crioconservadas.

[0045] A linhagem de célula foi analisada para avaliar a presença de micoplasma (MycoAlert™, Lonza, nº de catálogo LT-07) e foi verificado negativo para o último. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, Peripheral Blood Mononuclear Cells) foram isolada mediante o gradiente de separação Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Fresenius) a partir de cremes leucocitários de três doadores saudáveis obtidos após consentimento informado de acordo com um protocolo aprovado pelo “San Raffaele Ethics Committee” (IRB). Com o propósito de avaliar a viabilidade celular, as PBMCs foram coradas com Azul Tripano e contadas em câmara de Burker. As PBMCs foram cultivadas em um meio completo (RPMI 10% de FBS + 1% de Penicilina/Estreptomicina e Glutamina) com doses baixas de IL-2 (50 UI/mL) e de IL-7 (5 μg/mL) a 37°C durante a noite inteira (dni) antes do início do experimento.

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[0046] Com o propósito de determinar a expressão de CD26 sobre a superfície celular de linhagens de células-T e células-T CD4+ primárias humanas, o anticorpo α-CD26-FITC clone BA5b foi comprado (Biolegend, nº de catálogo 302704). O anticorpo foi testado, em uma faixa de diluição, nos três doadores de células-T primárias e em células Karpas 299 com o propósito de determinar a concentração ótima por citofluorimetria. A concentração ótima será usada para determinar a percentagem de expressão de CD26 sobre células-T CD4+ humanas e linhagens de células-T, e para o ensaio de internalização de CD26. Expressão de CD26 em linhagens de células-T e células-T CD4+ primárias humanas

[0047] Células CD4+ primárias de dois doadores e células Karpas 299 foram plaqueadas em tampão autoMACS (Miltenyi, nº de catálogo 130-091- 222) com a adição de 0,2% de BSA (Miltenyi, nº de catálogo 130-091-376), em uma densidade de 100.000 células/poço em placas de 96 poços de fundo- V (Costar, nº de catálogo 3598). As células foram incubadas durante 15 minutos em uma faixa de concentração de α-CD26-FITC ou de α-IgG2a-FITC (Biolegend, nº de catálogo 400208) na faixa de 2,5 μg/ml a 31,3 ng/ml. As células foram subsequentemente lavadas e fixadas em formaldeído 4%. A percentagem de células positivas para CD26 foi determinada por citofluorimetria usando FACSCanto II. IgG-FITC foi usada para determinar ligações não específicas. Quantificação da expressão de CD26 sobre células primárias humanas e linhagem de célula-T

[0048] Citofluorimetria foi usada para determinar a quantidade de CD26 expressado sobre a membrana celular de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) primárias e de células-T CD4+, e também sobre a linhagem de célula Karpas 299. Um marcador CD4+ foi adicionado como marcador de célula-T. As células-T CD4+ primárias dos três doadores e as

15 / 33 células Karpas 299 foram plaqueadas em um tampão MACS com uma densidade de 100.000 células/poço em placas de 96 poços de fundo-V. As células foram incubadas com 10 μg/ml de α-CD26-FITC e 2,5 μg/ml de α- CD4 durante 15 minutos. 10 μg/ml de α-IgG2a-FITC e 2,5 μg/ml de α-IgG2b- APC (Biolegend, nº de catálogo 400612) foram adicionados para permitir agrupamento de células em janela eletrônica (gating). As células foram subsequentemente lavadas e fixadas em formaldeído 4%. A percentagem de células CD4+ e CD26+ foi determinada por citofluorimetria usando FACSCanto II. Ensaio de internalização de CD26

[0049] A capacidade de Begelomabe para induzir a internalização do receptor CD26 em células-T (tanto em células-T primárias humanas quanto na linhagem de célula-T) foi determinada por análise citofluorimétrica. O ensaio foi realizado em dois experimentos independentes. Células-T CD4+ foram isoladas de três (3) cremes leucocitários por experimento. Subsequentemente, tanto PBMCs quanto as células isoladas foram marcadas com um anticorpo anti-CD4 e um anticorpo anti-CD26 para determinar a pureza da população de células isolada, e também a percentagem de células CD26 antes do experimento. Além disso, um corante de viabilidade foi adicionado para garantir que o experimento fosse realizado em células vivas. As células foram analisadas por citofluorimetria.

[0050] As células CD4+ foram avaliadas como sendo de boa qualidade porque foi verificado que a pureza da população de células CD4+ foi >95%; a percentagem de células CD26+ na população de células CD4+ foi >75%. A linhagem de célula-T foi plaqueada durante a noite inteira (dni) com

100.000 células/poço em placas de 96 poços de fundo plano (Corning Costar, nº de catálogo 3598) revestidas com 2 μg/ml de anticorpo anti-CD3/anticorpo anti-CD28 (eBioscience, nºs de catálogo 16-0037-85 e 16-0289-85, respectivamente), e incubação delas durante 2 horas a 37°C. Após uma

16 / 33 incubação dni, o meio foi trocado e as células foram incubadas com 0,03 mg/ml (2x10-7M) de begelomabe, IgG2b como controle (Sigma-Aldrich, nº de catálogo SAB4700729 ou Biolegend, nº de catálogo 401202) ou PBS (Gibco, nº de catálogo 10010) como um veículo de controle em um volume total de 100 μl. Cada condição foi testada em triplicata (três poços de células/condição). O tratamento foi realizado a 4°C e a 37°C, durante 8 horas. As células foram subsequentemente marcadas e a percentagem de células CD26+ em células CD4+ foi determinada por citofluorimetria. Além disso, um grupo de células foi marcado e analisado antes do início do tratamento para determinar a percentagem de células CD4+ CD26+ no tempo zero. No dia do experimento, as PBMCs foram isoladas por centrifugação a 1.500 rpm durante 5 minutos e incubadas com begelomabe em concentrações diferentes durante 6 horas e 24 horas, respectivamente. Após a incubação com begelomabe, as PBMCs foram lavadas e marcadas com os seguintes anticorpos monoclonais: anticorpos humanos contra CD3, CD4, CD8 e CD26 conjugados com FITC, PE, APC, APC-H7 (Biolegend). Tem sido previamente mostrado que o anticorpo monoclonal contra CD26 pode ligar-se a um epítopo diferente daquele de Begelomabe. O anticorpo conjugado com o fluoróforo contra o isótipo correspondendo àquele de Begelomabe (IgG2b) foi sempre usado como um controle negativo. As amostras foram analisadas usando o citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences). Todos os dados foram analisados com o software Flow Jo (Tree Star Inc.) e expressados como intensidade de fluorescência relativa (RFI, Relative Fluorescence Intensity) de células CD4+ ou CD8+. Este valor é calculado pela divisão da intensidade de fluorescência média da amostra marcada com o anticorpo anti-CD26 com o correspondente isótipo de controle. Ensaio 9-plex MSD para citocinas pró-inflamatórias

[0051] Com o propósito de avaliar o efeito de begelomabe na ativação de células-T, foi avaliada a produção de citocinas pró-inflamatórias.

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[0052] Para este propósito, foi usado o ensaio MesoScale Discovery (MSD), isto é um ensaio 9-plex para citocinas pró-inflamatórias humanas (nº de catálogo 15007B-2). Ambas as células-T primárias e a linhagem de célula- T Karpas 299 foram plaqueadas com 100.000 células/poço em placas de 96 poços de fundo plano revestidas com anticorpo anti-CD3/anticorpo anti- CD28, conforme descrito acima (seção 4.1.1.2), e incubadas dni.

[0053] As células foram mantidas em um meio RPMI 1640 com GlutaMAX e suplementado com 10% de HI-FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 50 μM de β- mercaptoetanol. As células foram tratadas com IL-12 e Begelomabe conforme descrito na Figura 1. Em resumo, as células foram quer pré-incubadas dni com 20 ng/ml de IL-12 (R&D Systems, nº de catálogo 219-IL-0059) e veículo de controle (0,1% de albumina sérica bovina (Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma-Aldrich, nº de catálogo A2153-1kg)-PBS) ou incubadas dni sem IL- 12/veículo de controle. No dia seguinte, as células sem pré-incubação dni com IL-12 foram incubadas durante 2 horas com 20 ng/ml de IL-12. Subsequentemente todas as células foram incubadas com 0,03 mg/ml (2x10-7 M) de IgG2b (Biolegend), Begelomabe ou veículo de controle PBS durante 6 horas ou 24 horas. Em todos os experimentos, o sobrenadante foi coletado após o período de tempo previsto e congelado a -80°C até novas análises.

[0054] Com o propósito de testar o efeito do “revestimento” com anticorpo anti-CD3 e anticorpo anti-CD28 sobre a secreção de citocinas, as células foram testadas em placas revestidas e não revestidas e pré-incubadas dni com IL-12 e subsequentemente tratadas durante 24 horas com Begelomabe/IgG2b/PBS.

[0055] A análise MSD de citocinas detecta os teores de interleucina 2 (IL-2), IL-8, IL-1β, de fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF, Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor), de interferon-gama (IFN-γ), de IL-6, de IL-10, de fator de necrose tumoral-alfa

18 / 33 (TNF-α, Tumor Necrosis Factor-Alpha) e de IL-12p70. O ensaio MSD de citocinas foi conduzido de acordo com as instruções do fabricante, as placas foram, de fato, bloqueadas dni a 4°C ao invés de 1 hora à temperatura ambiente, para prevenir ligações não específicas potenciais. A curva de estandardização foi preparada usando o meio adotado durante a fase celular do experimento. O software MSD Discovery Workbench 4.0.12 foi usado para gerar as curvas de estandardização e para calcular a concentração de citocinas (pg/ml). Os valores das amostras foram inseridos na curva de estandardização para determinar se estavam dentro de sua faixa. Os gráficos para todas as citocinas foram preparados com GraphPad Prism 6. Inicialmente, uma inibição pelo Begelomabe duas vezes maior que o controle IgG2b para realizar a análise estatística, foi arbitrariamente ajustado como um nível limiar.

[0056] Entretanto, visto que as várias condições mostraram uma inibição de 1,9 vezes, este valor limiar foi modificado para 1,9. Com o propósito de avaliar as diferenças estatisticamente significativas, dentro de uma condição de tratamento, o teste de ANOVA bidimensional foi usado com um teste de Turkey post-hoc em Graph Pad Prism 6.0, obtendo um valor de p ajustado em testes múltiplos.

RESULTADOS Expressão/superexpressão de CD26 em linhagens de células-T humanas e em células-T primárias humanas

[0057] A Figura 2 mostra as percentagens de células CD4+ e CD26+ dentro da população de células mononucleares primárias derivadas de sangue periférico, em células-T CD4+ purificadas e na linhagem de célula Karpas

299. Os resultados obtidos por citofluorimetria mostram que as percentagens de células CD4+ e CD26+ nas células mononucleares primárias são de aproximadamente >45% e >35% respectivamente, após o isolamento de células-T CD4+, estas percentagens tornaram-se >95% e >75%

19 / 33 respectivamente (Figura 2, painel A). Quase todas as células Karpas 299 expressam CD4 (>95%) e, também, teores altos de CD26 (>95%) (Figura 2, painel B). Em conclusão, as percentagens de células positivas para CD26 dentro da população de células-T CD4+ primárias e na linhagem de célula Karpas 299 são de aproximadamente 75% e 95% respectivamente. As percentagens acima são também suficientes para medir as alterações nos teores de CD26 nas etapas experimentais subsequentes. Internalização de CD26

[0058] Análise citofluorimétrica foi usada para determinar a internalização, induzida por begelomabe, de CD26 em célula-T primárias e em linhagens de células-T. A mesma análise foi também usada para identificar a relação dependente da dose entre o decréscimo na presença de CD26 e as concentrações de begelomabe. Na linhagem de célula-T Karpas 299, a percentagem de células CD26+ foi determinada e também a intensidade de fluorescência média (MFI) de células CD26+ na população de células CD4+. Na linhagem de célula-T Karpas 299, foi observada uma redução de MFI de CD26 na população de células CD4+, apenas a 37°C, após 8 horas (uma inibição de 7% após 4 horas - dados não relatados na figura - e 22,3% após 8 horas, respectivamente) (Figura 3, painel A). Esta redução é estatisticamente significativa na MFI de células CD26 na população de células CD4+ medida após 8 horas de incubação com begelomabe a 37°C com respeito à incubação realizada a 4°C, isto é, quando todos os processos biológicos são inibidos pela temperatura baixa. Os dados obtidos indicam que o número de receptores CD26 por célula individual decresce nas células Karpas 299 a 37°C após a ligação com begelomabe. Visto que o mesmo fenômeno biológico não foi observado a 4°C, pode ser concluído que a internalização do receptor CD26 após a ligação com begelomabe representa o mecanismo de ação do anticorpo na linhagem de célula-T Karpas 299. Para garantir que a internalização do receptor CD26 em células Karpas 299

20 / 33 induzida pela ligação com begelomabe poderia ser usada como um teste de potência para liberação em batelada para desenvolvimento clínico, foi realizado um experimento de resposta à dose. No experimento supracitado, células Karpas 299 foram tratadas com concentrações crescentes de begelomabe a 37 graus Celsius e especificamente a 0,5 µg/ml (3x10-9 M), a 5 µg/ml (3x10-8 M) e a 30 µg/ml (2x10-7 M) durante 24 horas (Figura 5). Os resultados obtidos são de grande interesse porque tem sido verificado que concentrações crescentes de anticorpo anti-CD26 são capazes de induzir um aumento progressivo na internalização de CD26 expressado na membrana. Em particular, doses de 0,5 µg/ml, 5 µg/ml e 30 µg/ml de begelomabe, 3x10-9 M, 3x10-8 M e 2x10-7 M respectivamente, correspondem às percentagens de internalização de 26,9%, 34,5% e 43,8%. Este efeito de resposta à dose é uma condição necessária para o desenvolvimento de um teste de potência.

[0059] Com o propósito de avaliar o efeito de begelomabe sobre células-T primárias, as células mononucleares do sangue periférico foram incubadas com begelomabe sob três condições diferentes (6 μg/ml; 30 μg/ml e 150 μg/ml, 4x10-8 M, 2x10-7 M e 1x10-6 M respectivamente) durante 6 horas e 24 horas a 37°C. Após a incubação, as células foram imediatamente marcadas para avaliar a expressão de CD26 delas. Como controle, as células mononucleares foram incubadas com a concentração mais alta de begelomabe (150 μg/ml, isto é 1x10-6 M) a 4°C. Após 6 horas, foi observada uma redução apreciável, embora não significativa, nos níveis de internalização de CD26 (RFI) em comparação com os níveis de linha basal de CD26 em células-T CD3+, CD4+ e CD8+ (Figura 3, painel B). Resultados estatisticamente significativos (*, P<0,05) foram obtidos, contudo, em 24 horas, em particular para células-T CD8+ (Figura 3, painel C). Como previamente observado para a linhagem de célula Karpas 299, o efeito da infrarregulação de CD26 decresce quando as células mononucleares são incubadas com begelomabe a 4°C (Figura 3, painel D), sugerindo um fenômeno de bloqueio ativo da

21 / 33 internalização do complexo anticorpo-CD26. Em resumo, após 24 horas de incubação com begelomabe, a expressão de CD26 é reduzida para 43,8% em células Karpas 299 quando tratadas com concentrações de 30 μg/ml (2x10-7 M) de begelomabe e este fenômeno é dependente da dose de anticorpo anti- CD26 (Figura 5). Conforme previsto, a 4°C não foram observadas alterações na expressão de CD26 sobre a superfície das células analisadas. Os resultados obtidos indicam claramente que o receptor CD26 é internalizado em resposta à ligação com begelomabe com a consequente eliminação de um sinal de ativação crucial para a subpopulação de células-T CD26+. Liberação de citocinas pró-inflamatórias

[0060] Considerando que a internalização de CD26 poderia ter vários efeitos a jusante sobre a ativação de células-T, os teores de algumas citocinas pró-inflamatórias foram avaliados após o tratamento com begelomabe em células-T primárias e células Karpas 299.

[0061] Citocinas inflamatórias podem ser classificadas em dois grupos: grupo 1) envolvidas em inflamação aguda; grupo 2) responsáveis por inflamação crônica. As citocinas como IL-1, TNF-α, IL-6, IL-11, IL-8 e outras quimiocinas, G-CSF e GM-CSF, pertencem ao primeiro grupo. O segundo grupo pode ser adicionalmente dividido em citocinas que medeiam a resposta humoral como IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 e IL-13 e aquelas que medeiam a resposta celular como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, interferons, fator de crescimento transformante-β e fatores de necrose tumoral α e β (Shaikh PZ, 2011).

[0062] As citocinas pró-inflamatórias são moléculas envolvidas em uma série de doenças autoimunes como artrite reumatoide, esclerose múltipla, GvHD. Na patogênese destas doenças, CD26 desempenha uma função-chave especificamente no processo de inflamação. Por esta razão, foi avaliada a inibição de algumas citocinas pró-inflamatórias pelo begelomabe. Mais especificamente, os teores das seguintes citocinas foram analisados:

22 / 33 Interleucina-2 (IL-2), IL-8, IL-1β, o fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), interferon-gama (IFN-γ), IL-6, IL-10, o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e IL-12p70. Uma série de diluições das amostras de sobrenadante foi realizada como um pré-teste no ensaio e os resultados indicaram que as amostras não diluídas estiveram na faixa da curva de estandardização para todas as citocinas, exceto nos sobrenadantes de células IL-12p70 expostas à IL-12 como um sinal (não mostrado). Por esta razão, 25 μl de um sobrenadante padrão não diluído foi testado no ensaio MSD. Em ambos experimentos, as curvas padrão de todas as citocinas em todas as placas de ensaio mostraram curvas bem calibradas.

[0063] As amostras a serem analisadas foram inseridas nos gráficos padrão para determinar se elas estavam dentro da faixa de detecção. Os teores de todas citocinas, exceto para IL-12p70, foram medidos e analisados, não obstante alterações nos teores de citocinas fossem observadas entre os doadores de células-T primárias e a linhagem de célula-T Karpas 299, com teores abaixo do limite de detecção sob determinadas condições. Os teores de IL-1β e IL-6 foram muito baixos em todas as populações de células analisadas em ambos experimentos. Tratamento das células com IL-12 induz claramente a produção de IL-1β, IFN-γ, IL-6 e IL-10 em múltiplas condições, conforme previamente relatado na literatura (Vacaflores A. et al., 2016). A inibição da produção de citocinas após o tratamento com Begelomabe foi, por conseguinte, observada para IL-2, IL-8, IL-1β, o fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), IL-6 e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) (Figura 4).

[0064] Um decréscimo forte em teores de IL-8 e IL-1β, após incubação com begelomabe, foi observado sob as mesmas condições tanto nas células Karpas 299 quanto nas células-T primárias.

[0065] A seguinte Tabela 2 provê uma visão geral do efeito inibitório de begelomabe na secreção de diferentes citocinas em células-T primárias e

23 / 33 células Karpas 299, mostrando, em particular, inibição dos teores de citocinas pró-inflamatórias induzida pelo begelomabe após incubação das células a 37°C durante 6 horas ou 24 horas. Tabela 2 Tipo de célula Citocinas IL-2 IL-6 IL-8 GM-CSF IL-1β TNFα Células-T primárias + + - + + + Linhagem de célula Karpas 299 - - + + - + - : Sem inibição + : Com inibição

[0066] Além disso, com o propósito de testar o efeito de “revestimento” sobre a secreção de citocinas, as células foram testadas em placas revestidas e não revestidas com anticorpo anti-CD3/anticorpo anti- CD28 e tratadas com IL-12, Begelomabe ou o veículo de controle apropriado, conforme descrito na seção “Materiais & Métodos”. Em geral, foi observado que os teores de citocinas foram não detectáveis ou foi comprovado que são mais baixos em placas não revestidas com respeito às placas revestidas. Isto indica que o revestimento é essencial para criar um janela de ensaio para estudar o efeito de Begelomabe na avaliação dos teores de citocinas. O efeito de Begelomabe sobre a medição dos teores de citocinas usando placas não revestidas foi consequentemente não adicionalmente analisado. Com base neste experimento, os resultados obtidos mostram que begelomabe é capaz de fortemente reduzir a produção de citocinas específicas como IL-8, IL-1β e IL- 6 tanto em células-T primárias quanto em células Karpas 299, realçando o mecanismo de ação do anticorpo anti-CD26 (Begelomabe) no tratamento de doenças autoimunes. EXEMPLO 2: Configuração de ensaio celular para determinação da potência de ligantes anti-CD26

[0067] O objetivo da presente parte experimental é configurar um ensaio celular para a atividade de ligantes anti-CD26, iniciando a partir do conhecido anticorpo monoclonal anti-CD26, begelomabe.

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[0068] Begelomabe é um anticorpo monoclonal anti-CD26 produzido por células de hibridoma cujo alvo clínico é a inibição da ativação de linfócitos-T do doador em transplantes alogeneicos.

[0069] O objetivo do ensaio é medir a variação nos teores de CD26 presente sobre a membrana celular de linfócitos-T humanos (Karpas 299, positivos para CD4) após o tratamento dos últimos in vitro com concentrações crescentes de begelomabe.

[0070] CD26 é uma glicoproteína de membrana envolvida na ativação de linfócitos-T com uma atividade de dipeptidil-peptidase. Dados preliminares demonstram a capacidade de begelomabe para induzir uma internalização de CD26 sobre a superfície de linfócitos-T humanos e células Karpas 299 após um tratamento de 24 horas.

[0071] Especificamente, as células são incubadas a 37°C durante 24 horas com concentrações crescentes de begelomabe e subsequentemente coradas com dois anticorpos, capazes de respectivamente se ligarem ao receptor CD4 e ao receptor CD26, e conjugados com fluoróforos que emitem em diferentes comprimentos de onda. Durante a análise por FACS, para cada concentração de begelomabe testada, a intensidade de fluorescência é medida proporcional à quantidade de CD26 presente sobre a superfície celular de cada célula individual. Este parâmetro é então quantificado pelo instrumento pelo cálculo da média de 20.000 eventos de aquisição de sinal de fluorescência individual, selecionados da população de células positivas para CD4. Protocolo de coloração de amostras de células e análise por FACS

[0072] No término do tempo de incubação pré-estabelecido com begelomabe, as amostras de células são processadas de acordo com o seguinte protocolo de coloração com anticorpos conjugados com fluoróforos e então analisadas por FACS para a expressão de CD26 na superfície: - Transferir os conteúdos de cada poço para tubo Eppendorf de

25 / 33 1,5 mL; - Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos; - Lavar o pélete com 1 mL de DPBS fria; - Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos; - Secar o pélete e corar com os seguintes anticorpos de acordo com o protocolo de incubação para análise por conforme descrito abaixo na Tabela 3. Tabela 3 Anticorpo Fluoróforo Alvo µl/tubo DPBS- Células/tubo Tempo de 5%FBS/ tubo incubação Anticorpo de FITC CD4 20 µ 100 µl 1,00E+06 30 min. camundongo anti-CD- 4-humano conjugado com FITC, Clone RPA- T4 (BD Pharmigen, nº. cat. 555346) Anticorpo de APC CD26 5µ 100 µl 1,00E+06 30 min. camundongo anti- CD26-humano conjugado com APC, Clone M-A261 (RUO) (BD Pharmigen, nº cat. 563670) - Turbilhonar a amostra e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos no escuro; - Adicionar 1 mL de DPBS e centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos; - Separar o sobrenadante e lavar o pélete com 1 mL de DPBS 1X fria; - Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos; - Ressuspender o pélete de células em uma concentração de 0,7-1E6 células/mL em DPBS-5% FBS e armazenar as amostras no escuro a +4°C até a leitura por FACS. Se a leitura não puder ser realizada durante o dia, as células são fixadas com a adição de paraformaldeído na concentração final de 0,36%.

[0073] Durante a análise por FACS, para cada concentração de begelomabe testada, a intensidade de fluorescência é medida relacionada com

26 / 33 a quantidade de CD26 presente sobre a superfície celular de cada célula individual positiva para CD4. Este parâmetro é, então, quantificado pelo instrumento como um valor médio derivado da aquisição da fluorescência de

20.000 eventos, selecionados dentro da população de células positivas para CD4. Para a aquisição das duas fluorescências associadas com FITC e APC, não é necessário realizar a atividade de compensação porque os dois fluoróforos emitem em comprimentos de onda diferentes.

[0074] Os dados são subsequentemente reprocessados usando o programa BD FACS Diva que permite que o nível de expressão de CD26 seja calculado como o valor médio de todos os eventos registrados durante a aquisição (selecionados dentro da população de células positivas para CD4).

RESULTADOS

[0075] A atividade biológica de begelomabe foi medida como a capacidade para induzir a internalização de CD26 presente sobre a superfície da membrana celular de células Karpas 299.

[0076] A quantidade de CD26 internalizado após o tratamento com concentrações crescentes de begelomabe foi medida como um decréscimo no valor médio de fluorescência emitida pelo anticorpo específico (Anticorpo de Camundongo Anti-CD26-Humano Conjugado com APC, Clone M-A261 RUO BD Pharmigen, código 563670) ligado ao CD26 expressado sobre a superfície da membrana celular.

[0077] O objetivo é gerar curvas de resposta à concentração para cada batelada de produto a ser comparada com a curva de resposta à concentração obtida pelo tratamento das células com o Padrão de Trabalho (WS, Working Standard) por meio de um teste de potência comparativo do lote versus WS, em que o paralelismo das curvas é um pré-requisito da adequabilidade do ensaio (Teste de Paralelismo realizado com o Software de Análise PLA.3).

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[0078] Como pode ser visto a partir do gráfico na Figura 5, após 24 horas de tratamento com begelomabe, há uma redução em fluorescência associada com CD26 de cerca de 40% para as células Karpas 299.

[0079] Além disso, é comprovado que este efeito em células Karpas 299 é de resposta à concentração, uma condição considerada essencial para o desenvolvimento de um ensaio celular.

[0080] O efeito observado é específico para begelomabe porque o acervo de IgG2b (classe IgG à qual pertence begelomabe) não induz a internalização de CD26 sob qualquer uma das condições testadas.

[0081] Com o propósito de alcançar ótimas condições de crescimento para avaliar o efeito biológico, foi decidido proceder pela repetição da incubação com begelomabe durante 24 horas e usar linfócitos-T CD3+ após estimulação com “Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28” (Gibco Kit , Life Technologies, código 11131D). Internalização % de CD26

[0082] Conforme pode ser visto a partir do gráfico na Figura 6, após 24 horas de tratamento com begelomabe, há uma redução na fluorescência associada com CD26 de cerca de 48% para células Karpas 299 após o tratamento com a concentração mais alta de Begelomabe (igual a 150 μg/mL, ou 1x10-6 M).

[0083] A expansão da curva de resposta à concentração permitiu que fosse alcançado o limite de resposta mais baixo, que é igual a 0,01 μg/mL (7x10-11 M).

[0084] A falta do efeito do acervo de IgG2b (usado como controle negativo) foi confirmada.

[0085] Os ensaios subsequentes foram planejados para reduzir a complexidade da curva (para verificar se a curva tem um padrão monofásico ou multifásico). Avaliação de potência em diferentes amostras de begelomabe

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[0086] Uma avaliação de potência de três amostras de begelomabe foi, então, realizada, uma das quais foi armazenada sob condições de estabilidade acelerada a 32,5°C durante 6 meses (preparação SVI-STB).

[0087] A partir da análise por FACS, não houve diferenças substanciais entre as preparações independentes de Lote 1 e de Lote 2 em termos de cinética de internalização de CD26.

[0088] A preparação de SVI-STB, uma amostra de begelomabe degradada pela incubação a 32,5°C durante 6 meses, ao contrário, parece ser menos eficaz que as outras na indução da internalização de CD26 (Figura 7). Este resultado respalda a capacidade do método de interceptação de amostras de begelomabe alteradas.

[0089] Como pode ser visto no gráfico na 7, as oito concentrações de begelomabe selecionadas mostram uma variabilidade alta na região central da curva de uma amostra de begelomabe armazenada 4°C e da amostra de begelomabe que foi submetida a uma excursão térmica para 32,5°C durante tempos prolongados.

[0090] As duas amostras de begelomabe, ambas armazenadas sob condições ótimas a 4°C, não mostram variabilidade na região central da curva. Avaliação da potência com diferentes citômetros de fluxo

[0091] Com o propósito de se assegurar que os resultados obtidos para a internalização de CD26 após incubação com anticorpo anti-C26 poderiam ser, também, reproduzidos pela alteração da tecnologia de leitura, nós conduzimos os experimentos de internalização usando dois citofluorímetros de fabricantes diferentes.

[0092] Os resultados obtidos (Figura 8) claramente demonstram que a tecnologia pertencendo aos citofluorímetros diferentes não altera os resultados das curvas de internalização.

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[0093] Especificamente, em ambos experimentos, a amostra de begelomabe que foi conservada sob condições não ótimas (SVI-STB) pode ser facilmente identificada, mostrando uma alta variabilidade na parte central da curva quando comparada com a curva das outra 2 amostras de Begelomabe armazenadas sob condições ótimas.

CONCLUSÕES

[0094] Os testes experimentais realizados demonstraram, mediante o uso da linhagem de célula Karpas 299, que um ensaio celular baseado na internalização de CD26 da membrana induzida por begelomabe tem todas as características para abranger a função de teste de liberação em batelada de um fármaco para uso clínico.

[0095] Em particular, o teste baseado na internalização de CD26 após a incubação de begelomabe permite que quaisquer possíveis desvios nas características do fármaco liberado para uso clínico sejam identificados em uma maneira específica e reproduzível. EXEMPLO 3: Validação do ensaio de potência com outros anticorpos anti- CD26

[0096] O ensaio de potência foi testado com dois outros anticorpos anti-CD26: - mAb (anticorpo monoclonal) de camundongo anti-hCD26, (Clone 202.36) Thermo Fisher, Código: MA1-35147; Lote: 311030F, - IgG2b, Isótipo K de Camundongo (Clone MG2b-57) BioLegend, Código: M1395 como um controle negativo.

[0097] Para a detecção de CD26 na membrana, foi usado o anticorpo de camundongo anti-CD26-humano conjugado com APC (Clone M-A261) BD Pharmingen, Código: 563670; Lote: 8116645.

[0098] As Figuras 9 e 10 mostram a potência relativa observada com respeito ao begelomabe (WS-BEG-013). A partir dos resultados obtidos, o anticorpo clone 202.36 mostra uma potência relativa de cerca de 0,01

30 / 33 enquanto que o anticorpo clone MG2b-57 mostra uma ausência completa de atividade. Como pode ser observado, o teste de potência de acordo com a presente invenção é, por conseguinte, também aplicável a outros ligantes anti- CD26.

[0099] De novo, na Figura 9, em comparação com a internalização de CD26 com uma concentração próxima para alcançar a assíntota para o composto de referência WS-BEG-013 (2 μg/mL), uma internalização máxima de CD26 maior que 30% é observada apenas para WS-BEG-013 (32,5%), enquanto que para o anticorpo especificamente testado, o Clone 202.36, é muito mais baixa que 20% (11,5%), confirmando, de acordo com os critérios declarados, que ele é um anticorpo de potência baixa, isto é < 20% (que é <50% do platô %)

[00100] A Figura 11 ilustra o valor de potência da amostra testada (TEST) calculada com respeito ao padrão de referência (RS), para mostrar como a atividade relativa pode ser medida quantitativamente comparada com begelomabe. Neste caso, o padrão de referência (RS) é begelomabe na concentração de 1,8 mg/mL, enquanto que a amostra TEST é begelomabe em uma concentração de 1,26 mg/mL, que é 70% da concentração de RS, com uma potência relativa prevista em comparação com RS igual à razão de concentrações de TEST/RS (por exemplo 1,26/1,8 = 0,7, isto é 70%). Na Figura 11 é demonstrado como em uma razão de concentrações de 70%, uma potência relativa de 70% é observada conforme prevista (cálculo realizado de acordo com as diretrizes de USP 1034 “Analysis of Biological Assays” mediante o Software PLA 3.0).

[00101] No gráfico da Figura 11, o valor de MFI de 170 representa o valor de expressão máxima do CD26 membranar (assíntota horizontal máxima) enquanto que o valor 110 representa o valor de MFI no qual a internalização máxima de CD26 é alcançada, por conseguinte o valor correspondendo à expressão mínima do CD26 membranar (assíntota

31 / 33 horizontal mínima). Dentro desta faixa, definida em valor absoluto em cada ensaio, as estimativas de potência são realizadas pela medição da distância relativa da curva de teste a partir da curva de referência de begelomabe.

[00102] Os histogramas mostrados no gráfico mostram a percentagem de internalização de CD26 com respeito à sua expressão máxima membranar, representada pelo valor máximo de MFI medido (170). Esta percentagem, quando se refere ao Composto de Teste, é relatada como a potência relativa: - no valor de MFI de 130, RS internaliza 23,1% do CD26 presente na membrana em comparação com o Composto de Teste que apenas internaliza 18,5% (razão de Composto de Teste/Padrão de Referência = 0,80); - no valor de MFI de 110 (presença mínima do CD26 membranar), RS internaliza 12,1% do CD26 presente na membrana em comparação com o Composto de Teste que internaliza apenas 9,9% (razão de Composto de Teste/Padrão de Referência = 0,82).

[00103] Pode ser observado que o valor de potência não é simplesmente uma razão de percentagens de internalização em um ponto, mas é calculado como a razão relativa entre as duas EC50s, 0,04342 μg/mL para o Padrão de Referência e 0,06644 μg/mL para o Composto de Teste, respectivamente.

[00104] A potência calculada no exemplo em questão pode, de fato, ser estimada como EC50 RS/EC50 Test obtendo um valor igual a 0,65, isto é que é capaz de afirmar que a potência do Composto de Teste é cerca de 70% da potência do RS.

[00105] Além disso, pela comparação da internalização de CD26 em uma concentração próxima para alcançar a assíntota horizontal para o RS (2 μg/mL), uma internalização máxima de CD26 maior que 30% é observada para ambos RS (36%) e Composto de Teste (35,9%), confirmando, de acordo com os critérios declarados, que em ambos os casos, é uma potência alta, isto é > 30%.

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76.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a determinação in vitro da potência de um ligante anti-CD26, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) incubação a 37°C ou à temperatura ambiente de uma população de linfócitos-T humanos que expressam o receptor CD26 em uma percentagem maior que 75% com um ligante anti-CD26 em uma concentração na faixa de 0,001 µg/ml a 150 µg/ml; b) incubação com um anticorpo anti-CD26 marcado com fluorocromo que reconhece um epítopo de CD26 diferente daquele reconhecido pelo ligante anti-CD26 usado na etapa a); c) determinação do valor de MFI de CD26 medido para a amostra de células tratadas com o ligante anti-CD26 (MFIT) e o valor de MFI de células não tratadas (MFINT) por meio de análise citofluorimétrica; d) avaliação da percentagem de internalização do receptor CD26 (%int CD26) ou RFI calculada de acordo com a seguinte fórmula: em que se o valor de %intCD26: - é menor que 20%, indica uma potência baixa do ligante anti- CD26; - está na faixa de 20% a 30%, indica uma potência média do ligante anti-CD26; - é maior que 30%, indica uma potência alta do ligante anti- CD26.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita concentração do ligante anti-CD26 da etapa a) está na faixa de 0,01 µg/ml a 100 µg/ml, mais preferivelmente de 0,01 µg/ml a 2 µg/ml, ainda mais preferivelmente de 0,01 µg/ml a 0,5 µg/ml.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o ligante anti-CD26 da etapa a) é um anticorpo ou fragmentos do mesmo.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo anti-CD26 é o anticorpo monoclonal begelomabe.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito fluorocromo da etapa b) é selecionado a partir do grupo consistindo em FITC, APC, PE, PE-Cy7, APC- H7, PerCP e PE-Cy5.5, preferivelmente APC.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a população de linfócitos-T CD26+ humanos da etapa a) é selecionada a partir de uma população de linfócitos-T primários e de uma linhagem de célula tumoral de linfócitos-T humanos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita linhagem de célula tumoral de linfócitos-T humanos é a linhagem de célula Karpas 299.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a análise citofluorimétrica da etapa c) é realizada por FACS.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de ensaio da inibição da produção de citocinas inflamatórias selecionadas a partir do grupo consistindo em IL-8, IL-1β, IL-6, IL-2, GM- CSF, IL-6 e TNF-α, realizada na população de linfócitos-T CD26+ humanos da etapa a).

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita inibição da produção de citocinas é avaliada por meio do ensaio MesoScale Discovery.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a dita população de linfócitos-T CD26+ humanos é a linhagem de célula Karpas 299.

Petição 870200076012, de 18/06/2020, pág. 48/57 Veículo Veículo Veículo Veículo Veículo

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