BR112020012028A2 - endófitos de populações selvagens de cevada que aumentam rendimento de cultura - Google Patents

Abstract

Trata-se de uma composição de revestimento de sementes que compreende um endófito fúngico isolado de um tecido da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical.

Description

Relatório da Patente de Invenção para “ENDÓFITOS DE POPULAÇÕES SELVAGENS DE CEVADA QUE AUMENTAM RENDIMENTO DE CULTURA”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Essa invenção refere-se ao uso de endófitos isolados e cultivados de populações selvagens de cevada. Em particular, a invenção refere-se a endófitos isolados e cultivados de populações selvagens de cevada que são competentes em transmissão vertical (TV) e o uso desses endófitos competentes em TV em um método para melhorar o peso seco do broto, o peso seco do grão principal, e a supressão de infecção transmitida por sementes em uma cultura por inoculação com pelo menos uma ou uma combinação dos endófitos competentes isolados de TV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Se um produtor de cereais deseja um maior rendimento de grãos, o curso de ação amplamente aceito é aumentar os insumos químicos. No entanto, isso faz com que dois problemas sérios e vinculados; alto custo econômico e alto custo ambiental. Os custos de fertilizantes químicos podem representar até um quarto dos custos diretos para o lavrador. Esses fertilizantes, e outros tratamentos químicos aplicados regularmente, também podem ter um efeito prejudicial sobre o ambiente em geral e sobre os micro-organismos, que são importantes para a manutenção de um solo saudável. É amplamente reconhecido que o nível atual do uso de fertilizantes é insustentável em muitos sistemas agrícolas e se uma abordagem mais sustentável para manter o rendimento de cultura for desenvolvida, os insumos químicos de fertilizantes podem ser reduzidos. Tem sido cada vez mais demonstrado nos últimos anos que parte da resposta para reduzir esses encargos para o produtor e o meio ambiente será para usar agentes bioativos para ajudar a melhorar a saúde e o rendimento de cultura. Os endófitos são um grupo de agentes bioativos que mostraram a maior promessa. Os endófitos são micro-organismos que passam a vida inteira ou parte dentro de um tecido vegetal sem causar sintomas da doença, eles têm um grande potencial como inoculantes benéficos para as culturas (Murphy et a/. 2014).

[003] Embora grande parte do trabalho experimental com endófitos tenha se concentrado em uma faixa relativamente limitada de espécies endofíticas, endófitos recuperados de parentes selvagens de culturas foram menos estudados e oferecem um potencial amplamente inexplorado e vasto para melhorar os traços agronômicos nas culturas cultivares (Murphy et al. 2015; Murphy et al. 2017b). Os parentes selvagens representam um repositório valioso de micro-organismos simbióticos que podem ser benéficos para os parentes das culturas modernas (Murphy et al. 2014a).

[004] Os genes de parentes selvagens de culturas provaram ser de grande utilidade para os criadores que desejam explorar essa característica para traços genéticos úteis que melhorarão o desempenho das culturas, e há todas as razões para acreditar que a diversidade e traços funcionais de endófitos nos parentes selvagens de culturas serão igualmente úteis. O benefício adicional do uso de inoculantes de culturas microbianas é que eles são mais fáceis de aplicar e desenvolver em comparação com o processo frequentemente caro e demorado de desenvolver um produto geneticamente modificado (GM), e também podem ser mais aceitáveis pelas autoridades reguladoras e pelo público em geral nas jurisdições onde as culturas GM não são amplamente cultivadas.

[005] Os endófitos isolados e cultivados a partir de populações de plantas selvagens provaram ser extremamente diversos, e estes são frequentemente organismos relativamente novos e não descritos previamente com potencial desconhecido como inoculantes das culturas, mesmo dentro de uma única espécie hospedeira (Murphy et al. 2015b). Os trabalhos anteriores dos inventores demonstraram que esses endófitos podem aumentar o rendimento da cevada e outros traços agronômicos em uma faixa de ambientes estressantes, e recentemente demonstraram que esses resultados benéficos se traduzem em cevada cultivada em campo (Murphy et a/. 2017b). Aqueles endófitos são aplicados às culturas como composições de revestimento de sementes e não podem ser repassados para a próxima geração de sementes produzidas pela planta germinada a partir daquelas sementes revestidas.

[006] Na Publicação PCT Nº, WO 2016/030535, os endófitos são descritos como interpretando um papel no aumento do rendimento de grãos e peso seco do broto nas plantas, e melhorando a tolerância ao desenvolvimento de infecções fúngicas por sementes em sementes germinadas e não germinadas. Na Publicação PCT Nº. WO 2014/121366, os endófitos são descritos como interpretando um papel na produção e rendimento da biomassa da planta em plantas como cevada, e também aumentar a tolerância ao estresse ambiental. No entanto, a patente reivindica apenas aumentos da vigor da germinação das sementes e o rendimento e peso fresco das mudas, mas não as plantas ou sementes maduras (isto é, grãos no caso de cereais). Na GB 2490249, são descritas composições que aumentam o vigor e o crescimento das sementes. No entanto, as composições são revestimentos de cera orgânica usados para revestir as sementes, o que aumenta o crescimento e o vigor em monocotiledôneas, atuando como um protetor do estresse ambiental. O documento não faz menção específica ao uso de endófitos como um componente do revestimento.

[007] É um objetivo da presente invenção superar pelo menos um dos problemas acima mencionados.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Endófitos isolados de populações naturais de plantas estimulam um aumento no rendimento de cultura cultivada sem o uso de insumos químicos (como fertilizantes nitrogenados, adubos) quando inoculados nas sementes de uma cultivar de cultura. Uma formulação que contém esporos do(s) endófito(s) é aplicada às sementes da cultivar das culturas antes da semeadura. A formulação aumenta o rendimento de cultura (como o peso seco dos grãos) e biomassa, e promove a resistência ao estresse biótico e abiótico nas culturas. Os endófitos da invenção reivindicada foram isolados das sementes da cevada selvagem (Hordeum murinum), não do tecido da raiz da planta, como é a fonte de endófitos aceitos pelos que trabalham no campo. A fonte dos endófitos mostra que eles têm localização específica no tecido da semente, que é um traço mostrado por agentes que têm propriedades de transmissão vertical.

[009] De acordo com a descrição fornecida no presente documento, é fornecido, conforme estabelecido nas reivindicações anexas, uma composição de revestimento de sementes que compreende um endófito fúngico isolado de um tecido de uma planta, como Hordeum murinum, e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical.

[010] Em uma modalidade, o endófito fúngico é isolado usando iniciadores definidos pelas SEQ ID Ne 1 e 2.

[011] Em uma modalidade, o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12, ou variantes do mesmo, ou uma combinação dos mesmos.

[012] Em uma modalidade, o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3, 6, 11 ou 12, ou variantes do mesmo, ou uma combinação dos mesmos.

[013] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecida uma composição de revestimento de sementes que compreende um ou mais endófitos fúngicos isolados de uma semente ou uma casca da semente de Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que os endófitos fúngicos são competentes para transmissão vertical, e em que os endófitos são caracterizados por serem selecionados a partir de uma Alternaria sp., uma Penicillium sp., ou uma Cladosporium sp. e têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3, 4, 5, 10, 11 ou 12.

[014] De preferência, os endófitos são caracterizados por serem Alternaria alternata, — Penicilium — brevicompactum, — Cladosporium — ramontenellum, ou Cladosporium herbarum.

[015] De preferência, o um ou mais endófitos selecionados são isolados da semente e são caracterizados como Cladosporium herbarum e que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) definido pelas SEQ ID Ne: 11 ou 12. A composição compreende adicionalmente um ou mais endófitos isolados da casca da semente, e em que os endófitos são caracterizados como Penicillium brevicompactum, Cladosporium ramontenellum ou Alternaria alternata e têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3,4 ou 5.

[016] De preferência, a composição compreende adicionalmente um ou mais endófitos fúngicos isolados de um tecido de Hordeum murinum que não seja a semente ou a casca da semente, em que o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6 a 9 e selecionado a partir de uma Penicillium sp., uma Cladosporium sp., uma Humicola sp., ou uma Talaromyces sp.. Idealmente, o endófito é selecionado de Penicilium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[017] De preferência, a composição compreende endófitos caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6, 8, 11 e 12, e classificado como Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[018] Em um aspecto, é fornecida uma composição de revestimento de sementes que compreende um ou mais endófitos fúngicos isolados de um tecido de uma planta, como Hordeum murinum, e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical; em que o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a

12. De preferência, o um ou mais endófitos são classificados como Alternaria alternata, Penicilium —brevicompactum, Penicilium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[019] De preferência, a composição compreende que os endófitos são caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6, 8, 11 e 12, e classificados como Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[020] Em um aspecto, é fornecida uma composição de revestimento de sementes que compreende um ou mais endófitos fúngicos isolados de uma raiz de Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, e em que o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6,7, 8 ou 9. De preferência, o um ou mais endófitos é Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[021] De preferência, a planta germinada da semente alvo revestida exibe um traço selecionado a partir de um ou mais de um peso seco dos grão aumentado, um aumento no número de cabeças, um número aumentado de grãos e peso seco do broto.

[022] Em uma modalidade, a planta é Hordeum murinum subsp. murinum L. (Hmm).

[023] Em uma modalidade, a planta Hordeum murinum está em condições de baixo teor de nutrientes.

[024] Em uma modalidade, a planta Hordeum murinum está em condições de estresse hídrico. Em uma modalidade, a planta Hordeum murinum está em condições de estresse de luz. Em uma modalidade, a planta Hordeum murinum está em condições de estresse de temperatura. Em uma modalidade, a planta Hordeum murinum está em condições de estresse múltiplo.

[025] Em uma modalidade, a planta germinada a partir da semente alvo revestida exibe um peso de grão aumentado, um aumento no número de cabeças, um aumento no número de grãos e peso seco do broto.

[026] Em uma modalidade, a concentração do isolado de endófito fúngico na composição é entre 0,001% (p/v) a 1,0% (p/v).

[027] Em uma modalidade, o meio carreador é selecionado a partir de água, água destilada, água esterilizada, água destilada esterilizada, uma suspensão emulsificada,

pó molhável, encapsulação de esporos do endófito fúngico em contas de alginato, ou um revestimento de filme.

[028] Também é fornecida uma planta cultivada a partir de uma semente revestida com uma composição de revestimento de sementes que compreende um endófito fúngico isolado de um tecido da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical, e em que a planta cultivada a partir da semente revestida compreende pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste em (i) um endófito isolado que usa iniciadores definidos pelas SEQ ID Ne 1 e 2; (ii) um endófito caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12, ou variantes do mesmo, ou uma combinação dos mesmos.

[029] De preferência, o um ou mais endófitos são Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[030] Em uma modalidade, a planta cultivada a partir da semente revestida exibe um traço selecionado da resistência a doenças, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao frio, tolerância à salinidade, tolerância a um ambiente deficiente em nutrientes, aumento da biomassa, aumento no rendimento de cultura, aumento do peso da semente, uma composição aprimorada de óleo de semente, um aumento na eficiência fotossintética, um aumento na taxa de crescimento, um aumento na massa da raiz.

[031] Em uma modalidade, a planta cultivada da semente revestida é de uma grama.

[032] Em uma modalidade, a grama é uma cultura de cereal selecionada a partir da cevada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum), aveia (Avena sativa), milho (Zea mays), centeio (Secale cereale), espelta (Triticum spelta), arroz (Oryza sativa), painço (Panicum miliaceum, Eleusine coracana, Setaria italica, Pennisetum glaucum), sorgo (Sorgo bicolor), triticale (x Triticosecale), teff (Eragrostis tef), fonio (Digitaria exilis), arroz selvagem (Zizania Spp.), capim-canário (Phalaris sp.), quinoa (Chenopodium quinoa), amaranto (Amaranthus spp.), trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum).

[033] Também é fornecida uma semente que compreende um ou mais endófitos fúngicos selecionados a partir de uma cepa de Cladosporium, uma cepa de Penicillium, uma cepa de Humicola ou uma cepa de Talaromyces, ou uma combinação dos mesmos, e em que os endófitos são originalmente isolados de um tecido da planta Hordeum murinum.

[034] Em uma modalidade, os endófitos são isolados usando iniciadores definidos pelas SEQID Ne 1 e 2.

[035] Em uma modalidade, o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) de acordo com qualquer uma das SEQ ID Ne: 3 a 12, ou variantes dos mesmos.

[036] Em um aspecto, é fornecida uma semente que compreende um ou mais endófitos fúngicos selecionados a partir de uma cepa de Alternaria, uma cepa de Cladosporium, uma cepa de Penicilium, uma cepa de Humicola ou uma cepa de Talaromyces, e em que os endófitos são originalmente isolados de um tecido da planta Hordeum murinum, e são caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12. De preferência, o um ou mais endófitos são Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicilium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[037] Em uma modalidade, o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3, 6, 8, 11 ou 12, ou variantes das mesmas, ou uma combinação dos mesmos.

[038] Também é fornecida uma semente revestida, misturada, ou encapsulada com a composição de revestimento de sementes descrita acima.

[039] Em uma modalidade, o meio carreador são contas de alginato.

[040] Também é fornecida uma planta cultivada a partir da semente descrita acima.

[041] Também é fornecida uma semente obtida a partir da planta acima.

[042] Também é fornecido um método para produzir uma planta a partir de uma semente alvo, sendo que o método compreende as etapas de revestimento da semente alvo com a composição descrita acima; plantar a semente revestida em um meio apropriado; cultivar a planta da semente e colher uma cultura da planta.

[043] Em uma modalidade, o meio é um meio à base de solo, um meio de crescimento artificial, turfa de musgo e turfa de musgo, ou misturas de todo o meio. De preferência, o meio à base de solo é um solo com baixo teor de nutrientes.

[044] Em uma modalidade, onde o método é para uso agrícola, a semente seria plantada em um campo de solo usando equipamento agrícola padrão.

[045] Em uma modalidade, onde o método é para uso ambiental controlado, a semente é plantada manualmente a uma profundidade de 30-40mm no meio escolhido.

[046] Também é fornecido um método para aumentar um ou mais traços selecionados a partir do peso seco do grão, o número de cabeças, o número de grãos por cabeça, e peso seco do broto em uma planta cultivada de uma semente alvo, sendo que o método compreende aplicar uma composição que compreende um endófito fúngico isolado de um tecido da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição à semente alvo; plantar a semente alvo revestida em um meio apropriado e permitir que a planta cresça.

[047] Em uma modalidade, os endófitos são isolados usando iniciadores definidos pelas SEQ ID Nº 1 e 2.

[048] Em uma modalidade, o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) de acordo com qualquer uma das SEQ ID Ne: 3 a 12, ou variantes dos mesmos.

[049] Em uma modalidade, o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir de uma das SEQ ID Ne: 3, 6, 8, 11 ou 12, ou variantes das mesmas, ou uma combinação dos mesmos.

[050] Em um aspecto, é fornecido um método para aumentar um ou mais traços selecionados a partir do peso seco dos grãos, o número de cabeças, o número de grãos por cabeça, e peso seco do broto em uma planta cultivada de uma semente alvo, o método que compreende a aplicação de uma composição que compreende um endófito fúngico isolado de uma semente ou uma casca da semente da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição à semente alvo, em que os endófitos fúngicos são competentes para transmissão vertical, e em que os endófitos são caracterizados por serem selecionados a partir de uma Alternaria sp. uma Penicillium sp., ou uma Cladosporium sp. e que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3, 4, 5, 10, 11 ou 12; plantar a semente alvo revestida em um meio apropriado e permitir que a planta cresça.

[051] Em uma modalidade, o meio é solo, um meio de crescimento artificial, turfa de musgo e misturas de turfa de musgo, ou suas misturas do mesmo. De preferência, o solo é um solo com baixo teor de nutrientes.

[052] Também é fornecido um endófito caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlITS) de acordo com qualquer uma das SEQ ID Ne: 3 a 12, ou variantes dos mesmos.

[053] Em uma modalidade, o endófito é isolado de um tecido da planta Hordeum murinum.

[054] Em uma modalidade, os endófitos são isolados usando iniciadores definidos pelas SEQ ID Nº 1 e 2.

[055] Em um aspecto, é fornecido um endófito isolado de Hordeum murinum e caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) de acordo com qualquer uma das sequências SEQ ID Ne: 3 a 12 e em que o endófito é Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

[056] Em geral, o endófito fúngico é isolado de um tecido da planta Hordeum murinum. O tecido pode ser a raiz, semente, casca da semente ou outras partes apropriadas da planta, como um broto, tecido foliar e meristema. Em uma modalidade, o endófito fúngico é isolado de uma raiz da planta Hordeum murinum. Em uma modalidade, o endófito fúngico é isolado de uma casca da semente da planta Hordeum murinum. Em uma modalidade, o endófito da raiz é isolado de uma semente da planta Hordeum murinum. De preferência, a planta é Hordeum murinum subsp. murinum L. (Hmm).

[057] Em uma modalidade, o endófito fúngico é selecionado com base em ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear selecionado a partir de uma das SEQ ID Ne 3 a 12, ou variantes dos mesmos, ou qualquer combinação dos mesmos.

[058] Em uma modalidade, o endófito fúngico é selecionado com base em ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear com pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nº 3 a 12, ou qualquer combinação dos mesmos.

DEFINIÇÕES

[059] Na especificação, o termo “ruderal” deve ser entendido como uma espécie de planta que primeiro deve colonizar terras perturbadas. A perturbação pode ser natural ou uma consequência da atividade humana.

[060] Na especificação, o termo “endófito isolado” deve ser entendido como emergentes fúngicos do tecido da planta Hordeum murinum, que foram inoculados no meio de cultura e subsequentemente subcultivados individualmente a partir de esporos ou micélios para obter um único organismo não contaminado. Normalmente, o tecido é um pedaço de raiz, uma semente ou uma casca da semente da planta. Normalmente, a planta é Hordeum murinum subsp. murinum L. (Hmm).

[061] Na especificação, o termo “variantes do mesmo”, deve ser entendido como sequências de polinucleotídeos que são substancialmente idênticas ao espaçador transcrito interno ribossômico nuclear completo de um endófito isolado. Assim, por exemplo, o termo deve ser considerado para incluir polinucleotídeos que são alterados em relação a um ou mais ácidos nucleicos. De preferência, essas alterações envolvem a inserção, adição, exclusão e/ou substituição de 15 ou menos ácidos nucleicos, mais de preferência, de 12 ou menos, ainda mais de preferência, de 9 ou menos, mais de preferência, de 3 ou 6 ácidos nucleicos apenas. A variante pode ter alterações conservadoras de ácido nucleico, em que o ácido nucleico que é introduzido não altera a estrutura ou atividade da sequência de ácido nucleico traduzida. Normalmente, qualquer sequência que foi alterada por substituição ou exclusão de ácidos nucleicos cataliticamente importantes será excluída do termo “variante”. Geralmente, a variante terá pelo menos 70% de identidade de sequência, de preferência, pelo menos 80% de identidade de sequência, mais de preferência, pelo menos 90% de identidade de sequência, e idealmente pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o espaçador transcrito interno ribossômico nuclear do tipo selvagem do endófito isolado, conforme descrito na SEQ ID Ne 3 a 12; e em que a variante é capaz de aumentar o rendimento de cultura (como rendimento de grão /peso seco do grão) e/ou peso seco do broto e/ou biomassa e/ou tolerância ao desenvolvimento de infecções fúngicas transmitidas por sementes em sementes germinadas e não germinadas e/ou pode ter seu material genético movido pela transmissão vertical de DNA de uma planta-mãe (por meio de planta cultivada de uma semente alvo revestida) para sua prole. Em outras palavras, onde os endófitos são passados de Fo para F: para F2 e a geração de futuras plantas por transmissão vertical.

[062] Na especificação, o termo “revestido por película” deve ser entendido pelos versados na técnica como um revestimento fino à base de polímero aplicado a uma forma sólida, como uma semente ou um comprimido. O revestimento pode ser de base aquosa ou não aquosa. A espessura desse revestimento é geralmente entre 20 a 100 um. As formulações de revestimento de filme geralmente compreendem um polímero (por exemplo, derivados de celulose ou polímeros acrílicos e copolímeros como :Hipromelose, Hidroxietil celulose, Hidroxietil metil celulose, Carboximetilcelulose sódica, Hidroxipropil celulose, Polietileno glicol, etil celulose, Ftalato de hipromelose, Ftalato de polivinil acetato, Ftalato de acetato de celulose,:Polimetacrilatos,Shellac),

um plastificante (como, por exemplo, glicerol, propilenoglicol, PEG (Polietileno glicol), ésteres de ftalato, dibutil sebacete, ésteres de citrato, triacetina, óleo de mamona, acetilado, monoglicerídeos, óleo de coco fracionado) e um carreador (geralmente, água ou solventes orgânicos, como álcoois, cetonas, ésteres e hidrocarbonetos clorados). A água é o carreador preferido.

[063] Na especificação, o termo condições “estressadas pela luz" deve ser entendido como o local onde as sementes e plantas foram estressadas por muita ou pouca luz. Uma intensidade de luz “ideal' de controle seria de cerca de 420 umol m? Ss no nível da folha; portanto, menos que isso é pouco estressado por luz e maior que isso é muito estressado por luz.

[064] Na especificação, o termo condições “estressadas por temperatura” deve ser entendido como onde as sementes e plantas foram estressadas por temperaturas abaixo de 5 ºC) ou acima de 25 ºC). Isso ocorre em condições controladas em que a disponibilidade de água e a captação pela planta pode ser controlada. O grau de estresse de temperatura está relacionado à disponibilidade de água e sua captação na planta, e à umidade atmosférica.

[065] Na especificação, o termo “estressado múltiplo” deve ser entendido como onde as plantas foram estressadas por vários fatores, como um ou mais dos solos secos, com falta de nutrientes, ou com falta de nutrientes, pouca ou muita luz, infecção por patógeno, frio e calor.

[066] Nesta especificação, o termo “infecção transmitida verticalmente” ou “competente para transmissão vertical” conforme aplicada a um endófito significa que o endófito, quando revestido em uma semente de uma planta-mãe é capaz de transmitir verticalmente da semente revestida da planta-mãe (Fo) para a próxima geração de sementes (F1). Os exemplos incluem os endófitos que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear do tipo selvagem, conforme descrito na SEQ ID Nº 3 a 12, ou variantes dos mesmos que também são competentes para transmissão vertical. É descrito abaixo um teste para identificar um endófito capaz de infecção transmitida verticalmente.

[067] Na especificação, o termo “meio de crescimento artificial” deve ser entendido como vermiculita ou perlita e semelhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[068] A invenção será mais claramente entendida a partir da descrição a seguir de uma modalidade da mesma, dada apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, em que: A Figura 1 ilustra a história evolutiva inferida das cinco cepas de Cladosporium usando o método Maximum Parsimony. É mostrada a árvore mais parcimoniosa com comprimento = 284. O índice de consistência é 0,855634 (0,677165), O índice de retenção é 0,405797 (0,405797), e o índice composto é 0,347214 (0,274792) para todos os sites e sites informativos sobre parcimônia (entre parênteses). As cepas de endófitos que melhoram o rendimento são destacadas em negrito.

A Figura 2 ilustra a história evolutiva inferida de duas cepas de Cladosporium (destacadas em negrito) e 5 acessos ao GenBank escolhidos aleatoriamente usando o método Maximum Parsimony. É mostrada a árvore nº 1 das 2 árvores mais parcimoniosas (comprimento = 48). O índice de consistência é 0,979167 (0,977273), o índice de retenção é 0,976744 (0,976744), e o índice composto é 0,956395 (0,954545) para todos os sites e sites informativos sobre parcimônia (entre parênteses).

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS

[069] Hordeum murinum subsp. murinum L. (Hmm) é uma espécie de gramíneas anual e um ruderal de margens de estradas, prados irregulares e locais de resíduos. Como a espécie geralmente cresce em ambientes estressados, ela pode ter evoluído com tolerância ao estresse conferida simbioticamente associada à infecção por endófitos, e esses endófitos podem ajudar as plantas a crescer em condições estressantes. Endófitos isolados de Hnm podem ter o potencial de beneficiar a cevada cultivada em condições de baixo teor de nutrientes, estressada pela seca e estressada múltipla.

MATERIAIS E MÉTODOS

[070] Ensaios de estufa replicados foram utilizados para examinar os efeitos em uma cultivar de cevada de dez endófitos fúngicos isolados de um parente de cevada selvagem. Para examinar o efeito dos endófitos na cevada cultivada sob diferentes condições de luz e temperatura, um estudo foi realizado de outubro a fevereiro (outono/inverno) e o outro de março a junho (primavera/verão).

AMOSTRAGEM DE CAMPO

[071] Plantas e sementes inteiras de cevada madura (Hordeum murinum L.) foram coletadas de três populações suburbanas em Dublin, Irlanda. As variáveis ambientais e vegetais foram registradas no momento da coleta e incluíram: pH do solo, salinidade do solo (medida como potencial osmótico em barras), teor de umidade do solo, altura da planta (cm), estágio de crescimento de Zadoks (Zadoks et al., 1974) e fitossanidade (pontuada em uma escala de cinco pontos, com uma pontuação de cinco indicando plantas grandes de excelente saúde, sem doença aparente ou sintomas de estresse fisiológico e uma pontuação de zero indicando plantas com doença grave ou sintomas de estresse). O tipo geral de vegetação e solo para cada local foi avaliado usando um equivalente numérico. Para o tipo de vegetação: 1 = um local sem qualquer solo significativo e sem outra vegetação (por exemplo, a borda de uma calçada à beira da estrada), 2 = um local aberto com grama curta, 3 = um local aberto com vegetação curta e daninha, 4 = um local com sombreamento de árvores de folha caducifólia e grama curta, 5 = um local na base de uma parede sem outra vegetação. Para o tipo de solo: 1 = um lodo arenoso claro, 2 = um barro arenoso claro, 3 = um barro argiloso escuro com poucas pedras.

ISOLAMENTO DE ENDÓFITOS

[072] Raízes, sementes e casca de sementes foram separadas de plantas inteiras e esterilizadas na superfície por imersão em EtOH a 70% por um minuto, em seguida colocadas em NaCIO a 5% por 5 minutos, imersas por mais um minuto em EtOH a 70% e em seguida enxaguadas cinco vezes com água estéril. Dez pedaços de raízes de 5 mm de comprimento e 10 sementes cortadas ao meio e cascas cortadas ao meio de cada planta foram inoculadas em placas de cultura de ágar dextrose de batata (Oxoide CMO0139) e incubadas no escuro a 21 ºC por 28 dias. O meio em pó foi misturado até a metade das recomendações dos fabricantes (para evitar choque osmótico nos endófitos) usando água pura, em seguida esterilizado em autoclave. A partir da experiência anterior dos inventores, 28 dias são considerados tempo suficiente para permitir a recuperação dos endófitos emergentes mais lentos. Os pratos foram inspecionados diariamente e os que continham pedaços de raiz, semente ou casca com crescimento de fungos na superfície foram descartados (isto é, não emergindo da área da raiz cortada). Os endófitos emergentes foram removidos e subcultivados no mesmo meio no escuro a 21 ºC por mais 14 dias. De um total de 82 culturas individuais recuperadas, fez foram selecionadas para sequenciamento de DNA e experimentos em estufa com base em critérios de seleção de esporulação precoce e alto rendimento de esporos à temperatura ambiente (18 a 21 ºC). Três dos endófitos isolados selecionados foram recuperados de sementes, três de cascas e quatro de tecido radicular.

EXTRAÇÃO DE DNA E SEQUENCIAMENTO DE ESPAÇADOR TRANSCRITO INTERNO (ITS)

[073] Para a análise de DNA, 20 mg de material fúngico foram raspados da superfície do ágar e colocados em tubos agitadores. O DNA foi extraído usando um mini kit Qiagen DNeasy, seguindo o protocolo Qiagen, produzindo 200 ul de extrato de DNA para cada isolado. A PCR foi realizada nos extratos de DNA usando os iniciadores espaçadores transcritos internos (ITS) do DNA ribossômico nuclear (rDNA) ITS1 (iniciador direto) (SEQ ID Nº: 1 - & TECGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (iniciador reverso) (SEQ ID Nº: 2- 5 TECTCCGCTTATTGATATGC 3'). A reação de PCR continha 1 ul de extrato de DNA (ca. 20 ng ul-1), 5 ul de 5x tampão (Promega), 0,5 ul de 10 MM dNTPs, 0,25 ul em 20 pmol, 0,25 ul de cada iniciador a 20 pmol ul-1, 2 pl de 25 mM M9gCl2, e 0,125 ul de polimerase de DNA Go Taq Flexi (Promega). À ciclagem térmica em um termociclador ProflexO& da Applied Biosystems incluiu um pré- molde de 94 ºC por 30 segundos seguido de 32 ciclos de 94 ºC por 2 minutos, 57ºC por 1 minuto e 72 ºC por 1 minuto, seguido por uma extensão final de 7 minutos a 72 ºC. Uma PCR adicional foi realizada para aumentar o rendimento de DNA e os produtos foram enviados para sequenciamento para um fornecedor de serviço externo (Macrogen Europa, Holanda). As sequências completas de espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) para os dez endófitos isolados podem ser encontradas como SEQ ID Ne: 3 a 12, da seguinte forma: SEQ ID Nº. 3 >161024-038 G12 195EZAA186.ab1 1973

GGTCATCCTAGTGAAGGCCTCTGGGTCCACCTCCCACCCGTGTTTAT TTTACCTTGTTGCTTCGGCGAGCCTGCCTTTTGGCTGCCGGGGGACATCTGTCC CCEGSGGEGTCCGCGCTCEGCCGAAGACACCTTAGAACTCTGTCTGAAGATTGTAGTCT GAGATTAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCC TGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCCGTCC TCCTTCCGGGGGACGEGGCCCGAAMAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCEGGTCCOTC AAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTTTGTAGGACTGGCCGGCGCCTGCCGAT CAACCAAACTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC

TTAAGCATATCAAAAACTC SEQ ID Nº. 4 >161024-038 A16 195EZAA188.ab1i 1905

GTGGTTATGGTGACAGGACTACGGCCGGGATGTTCATAACCCTTTGT TGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCOTGCCTTCGGGCGGEGECTCCGGÇ GTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAA ATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG

AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCCCTGGTATTCEeGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTC

ACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAA TCGTCCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGG GTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGAT CAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAGCCGGGAAGGAAAAAATT ACCAGGGGACCCAGCAACCGCCGGGAAGCTTCAAAACCCTGTGCTTGTCGGAC

ACTCCTTGCCTCCGGGGGGGÇE SEQ ID Nº. 5>161024-038 114 195EZAA192.ab1 1711

TGGGCAAGCATACAAGCAGGGCTGGACACCCCCCGCTGGGCACTGC TTCACGGCGTGCGCGGCGGGGCCGGCCCTGCTGAATTATTCACCCOGTGTCOTTT TGCGTACTTCTTGTTTCCTGGGTGGGCTCGCCCGCCCTCAGGACCAACCACAAA CCTTTTGCAATAGCAATCAGCGTCAGTAACAACGTAATTAATTACAACTTTCAAC AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTA GTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCT TTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTG CTTGGTGTTGGGCGTCTTTTGTCTCCAGTTCGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTCA TTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCEGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTTTGCCA GCCAAGGTCAGCGTCCAGCAAGCCTTTTTTTCAACCTTTGACCTCGGATCAGGT

AGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATATAAACGCGGAAGGAAAAAA SEQ ID Nº. 6 >161024-038 K14 195EZAA190.ab1 1140

GGGTTCGAGTTGCAACTCCCAACCATTGTGAACATACCTTCAACGTT GCTTCGGCGGGTTEGCCCeGETCTCeGGGGTCCCoGGCCoTACTOGGGCGCC

CGCCGGAGGTATCTAACTCTTGAACTTTTATGGCCTCTCTGAGTCTTTGTACTTA ATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT GAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCOGTCA TTTCAACCATCAAGCCCCCGGCTTGTGTTGGGGACCTGCGGCTEGCCGCAGGCC CTGAAAACCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACTCCGAGCGTAGTAATACATCTCG CTCAGGGCGTGCTGCGGEGTTCEGGCCGTTAAAAAACCTTATTTACCCAAGGTTG

ACCTCGGATCAGGTAGGAAGACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAACC SEQ ID Nº. 7 >161024-038 E16 195EZAA194.ab1 1323 ACCTCCCACCCGTGTTTATTGTACCTTGTTGCTTCGGTGCGCCOGCe TCACGGCCGCCEGGGEGCTTCETECCCcCoGGETCEGCGCGCACCGGAGACACC

ATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCATAAACTAAATAAGTTAAAACTTT CAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA ACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCG

CCCCCTGGTATTCEGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAG CACGGCTTGTGTGTTGGGCTCCGTCCCCceGGGGACGGGTCCGAAAGGCAGC

GGCGGCACCGAGTCCGGTCCTCEGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTA GGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACAACCAATCATCCTTTTTTCAGGTTGACCTCG GATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCTAAAACCGGGAAAAAGAT

CATTACTGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCACCTCCACCCOGTGTTTATTGTACCOTT GTTGCTTCCGTGCGCCGCCTCAGGCCGCeGGGGGGCTTCTGCCCCeGesGtToOÇ

CGCGCACGGAAACCCATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGTCGGAGCATAAACT

AAATAAGTTTAAAACTTT SEQ ID Nº. 8 >161024-038 K12 195EZAA196.ab1 1701

TGGTCTATCEGAGTGCGAGTACTCGTGGCCAACCTCCCACCCOTTGTCOT

CTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACOTGGTCEGCCGGGGGÇ ACATCTGTCCCEGGGCCTGCGCcoGcoGAAGCGCTCTGTGAACCCTGATGAAG

ATGGGCTGTCTGAGTACTATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTG GTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG AATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCEGG

GGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCETGCCOTCAAGCACGGCTTGTGTGETTG GGTGCGETCCCCceGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGG

TCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACTCEGCTCGGGAAGGACTGGCGGGGGETTGE GTCACCACCAAAATTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGC TGAACTTAAGCATATCATAAGCCGGGAGAAAATCATTACCGAGTGCGGGCCCTC

GTGGCCCAACCTCCCACCCTTGGTCTCTATACACCTGGTTGCTGTTGGCCGGGÇ GCCACCGGGGGCCACCTGEGETCEGCCGGGGGGACATCTTGTCCCcGGGGCCTG

CGCCCGCCGAAAGCGCTTTTGTGAACCCCTGATAAAGGATAGGGCTGTTCTGAA GTTACTAATGAAAAAATTTGATCAAAAACTTTTCACAAATGGGAAATCTCTTGGG

GTTTTCCGGCCCTCGAATTAA SEQ ID Nº. 9>161024-038 M14 195EZAA198.ab1 1415

AGGCAACAGTGAGAGGATCTACCACCGGGATGTTCATAACCCTTITTG TTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTEGGGCGGGEGCTCCG GGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATA AATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCECGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTT CACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCEGCCGCGTGCCTCAA ATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCOGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAG GGTGTTCEGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGA TCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAACCGGGAAGAAAATCA

TTACAAGTGGACCCGGTCTAACCACCGGGGATGTTCACAACCCTTTGCTTGTCC GACTCTCTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCeTeGGGCGGGEGCTCCGGGTGGA

CACTTCAT SEQ ID Nº. 10 >161024-038 A14 195EZAA2Z00.ab1 1160

GGGCAATCGTGAGCAGGACTACGGCCGGGATGTTCATAACCCTTTGT TGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCOTTEGGGCGGGEGGCTCCGG GTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAA ATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCG AAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCCCTGGTATTCEGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTC ACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAA TCGTCCEGGCTGGGETCTTCETGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGG GTGTTCEGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGAT CAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAGCCGGGAAGAAAACAAT TACAAGTGACCCCGGCGACCGCCGGGGATGTTCATAACCCTTTGGTTGTCCGA CGCTTTTGCCTCCEGGGEGCGACCCTEGCCGTEGGGCGGGGGCTCCCGGTEGGACA

CTTCATACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAAATTAAAA CcTTIT SEQ ID Nº. 11 >161024-038 E12 195EZAAZ02.ab1 1248

GGGCATAGGACGCCAGGAGCTTCGGCCTGGTTATTCATAACCCTTTG TTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCEGGGCGGGEGGCTCCOGÇ GGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATA AATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCECGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTT CACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAA ATCGTCCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAG GGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGA

TCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC SEQ ID Nº. 12>161024-038 A12 195EZAAZ05.ab1 1371

GGGAGCTCGCCATCCCTACCTGATCCGAGGTCACCTTAGAAATGGG GTTGTTTTACGGCGTAGCCTCCCGAACACCCTTTAGCGAATAGTTTCCACAACG CTTAGGGGACAGAAGACCCAGCCGGACGATTTGAGGCACGCGGCGGACCGCG

TTGCCCAATACCAAGCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGACGCTCGAACAGGCATG CCCCCcGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACT

GAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCA

GAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTAATTTATTAATTAAGTTTACTCAGACT GCAAAGTTACGCAAGAGTTTGAAGTGTCCACCCGGAGCCCCCGCCcGAAGGCA

GGGTCGECCCCGEGAGGCAACAGAGTCGGACAACAAAGGGTTATGAATAACCAGG CCGAAGCCCGGGCETTCTTGTAATGATCCCTCCGCAGTCACCCTTC ANÁLISE DE SEQUÊNCIA

[074] As sequências isoladas foram recuperadas e comparadas com acessos ao GenBank (NCBI) usando a Ferramenta de Busca de Alinhamento Básico Local (megaBLAST), e identificadas usando caracteres morfológicos e de DNA. Os critérios de similaridade do BLAST para atribuir classificação taxonômica às cepas de endófitos foram alocados com base em uma pesquisa inicial dos táxons de fungos existentes no GenBank, como segue: >97% de similaridade foram atribuídas à mesma espécie, 90 a 96% para o mesmo gênero, 85 a 90% para o mesmo pedido e <85% para nenhuma correspondência significativa. Em todos os casos, a atribuição da identidade genética foi confirmada ou avaliada posteriormente através do exame dos caracteres morfológicos dos fungos usando microscopia óptica e referenciando as descrições taxonômicas encontradas em Cannon e Kirk (Cannon, P.F., Kirk, P.M,, editores. 2007. Fungal families of the world. Londres: CABI).

[075] Cada sequência recuperada foi combinada em uma matriz e analisada para detectar eventos de recombinação usando a Ferramenta de Análise de Recombinação RAT, que usa o método com base em distância de detecção de recombinação. O tamanho foi definido para 93 caracteres (0,1 de comprimento da sequência) e o tamanho do incremento foi de 46 caracteres (0,5 do tamanho da janela).

[076] A história evolutiva das cinco cepas de Cladosporium foi inferida pelo método Maximum Parsimony (MP). A árvore MP foi obtida usando o algoritmo Subtree-Pruning-Regrafting (SPR) com nível de busca O em que as árvores iniciais foram obtidas pela adição aleatória de sequências (10 repetições). A análise envolveu sequências nucleotídicas. Todas as posições que contêm lacunas e dados ausentes foram eliminadas. Havia um total de 1015 posições no conjunto de dados final. As análises evolutivas foram realizadas no MEGA? (Kumar et a/. 2016).

[077] As análises acima foram repetidas, usando o mesmo processo e parâmetros, para as duas cepas de Cladosporium que induziram aumentos significativos de rendimento, ao analisá-las em relação a 5 sequências ITS de Cladosporium selecionadas aleatoriamente no GenBank (termo de pesquisa: “Cladosporium sem cultura' e 1TS').

TESTE PARA AVALIAR A TRANSMISSÃO VERTICAL DE ENDÓFITO EM UMA PLANTA CULTIVADA A PARTIR DE UMA SEMENTE REVESTIDA COM A COMPOSIÇÃO DESCRITA AQUI

[078] Para testar se um endófito foi competente para transmissão vertical, são amostradas as sementes das sementes originais ou sementes revestidas com a composição descrita no presente documento (denominada “sementes Fo) e gerações subsequentes. Em resumo, as etapas do teste são: amostras de sementes Fo para a presença de endófito, endófitos recuperados por subcultura de esporos únicos, extrato e sequência do gene nrlTS e comparar com as sequências nrlTS descritas no presente documento. Se forem semelhantes (pelo menos 90% idênticas), então, os endófitos isolados são competentes para transmissão vertical. Quando as sementes Fo são plantadas e cultivadas, as sementes produzidas a partir da planta gerada das sementes FO (sementes F1) são testadas como descrito acima. Se forem semelhantes (pelo menos 90% idênticos), então, os endófitos isolados são competentes para transmissão vertical. Isso conforma que o endófito na composição de revestimento de sementes foi passado da geração Fo para a geração F1, ou seja, o endófito é competente para transmissão vertical.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

[079] Foram realizados dois experimentos repetidos em estufa: um de outubro a fevereiro (outono/inverno) e o outro de março a junho (primavera/verão). O mesmo protocolo foi seguido para cada trilha. Inoculantes de endófitos individuais foram preparados lavando-se placas de cultura maduras das cepas de endófitos com 10 ml de água pura para desalojar os esporos. A solução de esporos foi transferida para tubos de plástico individuais de 50 ml e adicionalmente diluída com água pura para dar concentração final de 1 x 106º esporos/ml (medida com um hemocitômetro). Para o tratamento inoculante de todas as dez cepas de endófitos, alíquotas iguais de cada uma das preparações individuais de solução de esporos foram combinadas.

[080] As sementes da cultivar de cevada Propino (Goldcrop Ltd., Cork, Irlanda) foram embebidas em água morna por 3 horas. Três sementes por vaso foram semeadas no composto John Innes Nº. 2 (Westland Garden Health) a 20 mm de profundidade em vasos de plástico de 3 litros. Cinco vasos por tratamento foram semeados e os vasos foram rotulados com um número de referência (os números de referência eram anônimos para o cultivador de plantas) As sementes foram inoculadas com 200 ul (-200.000 esporos/semente) do endófito inoculante (10 cepas individuais e uma combinação de todas as cepas) ou 200 ul de água pura para os controles, e as sementes revestidas com o composto. Os vasos foram distribuídos aleatoriamente em dois blocos na estufa e reposicionados semanalmente durante o período experimental. A iluminação aérea suplementar de 6 horas foi usada no primeiro teste, de outubro a fevereiro. As plantas foram regadas à capacidade de campo quando o nível de umidade do composto caiu abaixo de 15%, conforme medido com uma sonda Delta-T Devices (https://www.delta-t.co.uk) WET-2, sensor de umidade a 50 mm de profundidade, e nenhuma alimentação suplementar foi dada durante todo o período de crescimento.

[081] As plantas de cevada foram colhidas após o estágio de crescimento Zadoks 89 (Zadoks et al. 1974) ser atingido (maturidade). O número de perfilhos, o número de cabeças e o número de grãos por planta. Após secagem até 15% de umidade, mediu-se o peso seco de grão e do broto.

[082] A presença dos endófitos nas sementes ou na raiz do tecido das plantas maduras foi testada. Dez sementes de cada planta foram esterilizadas na superfície (conforme cima) e então divididas ao meio. As metades das sementes preparadas foram inoculadas em PDA de meia resistência, com o lado cortado em contato com o ágar, e incubadas a 18ºC. Dez pedaços de tecido de raiz de 10 x 10 mm das mesmas plantas também foram processados de maneira semelhante.

[083] A análise de dados foi realizada usando ANOVA de um e dois fatores com correção de Bonferroni e as análises estatísticas de correlação de Pearson fornecidas com o módulo de Análise de Dados no Microsoft Excel& e Datadesk 6.10.

RESULTADOS

[084] Para as 10 cepas candidatas selecionadas, os três locais de amostragem das plantas hospedeiras foram caracterizados por uma salinidade do solo relativamente alta (média = 1,37 bar), pH alto do solo (média 7,7) e baixo teor de umidade do solo (média 10,7%), com dois locais sem umidade mensurável do solo (Tabela 1). Todos os locais tinham o mesmo tipo de solo, um lodo arenoso claro.

TABELA 1. VARIÁVEIS AMBIENTAIS PARA LOCAIS DE COLETA. PH DO SOLO, % DE UMIDADE, SALINIDADE SÃO VALORES MÉDIOS + ERRO PADRÃO (N = 10).

| = ie [E * Local Salinidade de umidade solo 1 | 2 média 77 so se | *Salinidade é Pressão Osmótica em barras

[085] Os 10 endófitos isolados foram comparados com acessos conhecidos do GenBank, revelando quatro gêneros diferentes, variando de 93% a 99% de similaridade em pares (Tabela 2). TABELA 2. SUBMISSÕES IDÊNTICAS E GenBank ID da cepa de Correspondência | similaridade | Fonte Nº de Endófito mais próxima do de Acessos organismo tecido ao GenBank alternata brevicompactum glabrum Fere E purpureogenus |Hmr161404e jo | ciadosporiumep. or — > ÍRaz —messesn| herbarum herbarum *Cladosporium ramontenellum

[086] Nenhuma diferença foi encontrada entre os tratamentos na porcentagem de germinação de sementes ou no surgimento de plântulas, onde 100% de todas as sementes germinaram dentro de dois dias a partir do dia 4 da semeadura. Nos dois experimentos repetidos, verificou-se que duas cepas de Cladosporium recuperadas das sementes no local 2 (HmS160909G3 e HmS160913G3) aumentaram significativamente o rendimento de grãos (P < 0,05), e no experimento 1, mais que o dobro do controle (Tabela 3).

TABELA 3. VALORES MÉDIOS DOS PARÂMETROS DE COLHEITA DE PROPINO DA CULTIVAR DE CEVADA POR VASO DE TRÊS PLANTAS + S.E.

PARA CEPAS DE ENDÓFITOS DE SEMENTES E TRATAMENTOS DE CONTROLE. DIFERENÇAS SIGNIFICATIVAS COM O CONTROLE SÃO INDICADAS POR TEXTO EM NEGRITO.

[rim tese Experimento 1 30,25 Experimento 2 22,28 | rimiasoaanes Experimento 1 39,19 as 1 EE efe Experimento 2 19,23

Experimento 1 21,98 Experimento 2 20,20 | rimra6oa ze Experimento 1 20,14 Experimento 2 10,08 |rmra6a aee Experimento 1 21,68 Experimento 2 15,20 Experimento 1 12,75 Experimento 2 26,39 | rimraeagoe Experimento 1 42,43 Experimento 2 18,97 Experimento 1 49,10 Lo 1162: lions sl1342107 lares2as |

| Hmstnanaes Experimento 1 43,33 Experimento 2 | Hmst6nartaes Experimento 1 38,23 Experimento 2 | Todas as cepas Experimento 1 32,19 Experimento 2 26,90 Experimento 1 42,50 as EE Experimento 2 10,22

[087] No Experimento 2, o tratamento combinado com endófitos (EE) também aumentou significativamente o peso seco dos grãos (P < 0,05). Embora apenas esses três tratamentos com endófitos tenham aumentado significativamente o peso seco dos grãos (uso de cepas definidas pelas SEQ ID Nº. 11, SEQ ID Nº. 12 e todas as cepas), em ambos os Experimentos o peso seco dos grãos para todos os tratamentos com endófitos foi igual ou maior que os controles. Embora não houvesse diferenças entre os tratamentos no número de perfilhos por planta em qualquer Experimento (dados não mostrados), houve grandes diferenças entre Experimentos nos outros traços agronômicos medidos.

[088] O número de cabeças, número de grãos, peso seco dos grãos e peso seco do broto foram menores no Experimento 1 para todos os tratamentos, exceto as duas cepas de Cladosporium HMmS160909G3 (definidas pela SEQ ID Nº. 11) e HmS160913G3 (definida pela SEQ ID Nº. 12), que manteve valores de parâmetros semelhantes e, em alguns casos, maiores que no Experimento 2. A causa mais provável e imediatamente óbvia para os maiores valores de parâmetros no Experimento 2 foram as condições de crescimento mais favoráveis durante o período de teste primavera/verão, enquanto o Experimento 1 foi realizado durante o período de outono/inverno. As diferenças fundamentais dos parâmetros entre esses dois Experimentos impediram uma análise de variância combinada (ANOVA). No entanto, análises estatísticas correlativas foram possíveis para resultados de Experimentos individuais e combinados.

[089] Nos dois Experimentos, houve uma correlação positiva entre o peso dos grãos e o número de cabeças e o número de grãos (r < 0,05), e para a análise combinada dos Experimentos houve uma correlação positiva entre o peso dos grãos e o número de cabeças, número de grãos e peso seco do broto foi encontrado (r < 0,05).

[090] A filogenia de Cladosporium reconstruída para as cepas usadas neste experimento revelou que as duas cepas de aumento de rendimento, (HMS160909G3 e HmS160913G3) estavam mais intimamente relacionadas entre si do que com as outras (Figura 1). No entanto, a análise filogenética de Cladosporium para as cepas HmS160909G3, HmMS160913G3 e os 5 acessos ao GenBank selecionados aleatoriamente mostrou que HmMS160909G3 e HmS160913G3 não se agrupavam, mas estavam em dois ramos completamente separados (Figura 2).

DISCUSSÃO

[091] Os resultados deste estudo mostram pela primeira vez que cepas de Cladosporium e um consórcio de dez endófitos fúngicos (que contém cinco cepas de

Cladosporium) podem induzir um aumento significativo no rendimento de uma cultura de cevada. Duas cepas individuais de Cladosporium, e o consórcio no Experimento 2, aumentaram significativamente o rendimento de grãos de cevada nos dois Experimentos. Os aumentos associados às duas cepas individuais foram consistentes nos dois Experimentos, eliminando assim, quaisquer influências ambientais causais e confusas. Essas duas cepas estavam mais intimamente relacionadas a C. herbarum, as quais demonstraram induzir aumentos significativos no rendimento de grãos e palha no trigo quando usadas como parte de um consórcio (Singh e Kapoor 1999).

[092] Mesmo sem testar a significância estatística de rendimento de grãos, houve um aumento induzido por endófitos no peso dos grãos em ambos os Experimentos, com um aumento geral de 50% no Experimento 1 e 11% no Experimento 2.

[093] As diferenças nos traços agronômicos medidos entre o Experimento 1 (outono/inverno) e o Experimento 2 (primavera/verão), onde esses valores foram mais baixos no Experimento 1, provavelmente ocorreram devido às diferenças ambientais nos dois períodos de Experimento. Menos luz e calor estão disponíveis para as plantas durante os meses de inverno no hemisfério norte e isso tem efeitos negativos no crescimento e desenvolvimento das plantas. Embora isso fosse verdade para todos os outros tratamentos, as duas cepas de Cladosporium mantiveram valores de parâmetros semelhantes e, em alguns casos, maiores que o Experimento 2, o que foi notável considerando as condições de crescimento menos favoráveis durante o Experimento 1.

[094] Verificou-se que um número maior de grãos maduros cheios estava correlacionado com um maior rendimento de grãos, indicando que havia menos grãos “vazios” associados às cepas de Cladosporium. Nos dois Experimentos, nem todos os grãos foram cheios e amadureceram, representando, portanto, o baixo número geral de grãos por cabeça (11,36). Isso pode ter sido devido a uma infecção por patógenos, como Fusarium graminearum, que resultou em falha no desenvolvimento do núcleo e em um número reduzido de grãos cheios, embora não houvesse sintomas claros de queimaduras na cabeça do Fusarium. Se fosse o caso, as cepas de

Cladosporium indutoras de rendimento podem até ter um efeito protetor contra o patógeno.

[095] As duas cepas benéficas para o rendimento foram mais estreitamente relacionadas entre si do que as outras cepas de Cladosporium usadas neste experimento, sugerindo uma simbiose coevoluída com o hospedeiro, relacionada às condições ambientais e ao histórico do local de origem (umidade não detectável, umidade do solo alta e salinidade do solo). No entanto, quando comparados com outros acessos de Cladosporium encontrados no GenBank, eles não eram tão importantes relacionados entre si (conforme revelado pela filogenia reconstruída da Figura 2). Eles foram recuperados a partir de sementes em diferentes plantas (embora no mesmo local), portanto, provavelmente são cepas da mesma espécie, e ambas estão relacionadas a C. herbarum.

[096] Os endófitos foram recuperados a partir de sementes e raízes de cevada (Hordeum murinum), mas ainda eram vantajosos quando aplicados na zona de enraizamento de plântulas. Isso sugere que tanto os endófitos da raiz quanto da semente podem ser usados individualmente ou em combinação como um curativo benéfico para as culturas de cevada.

[097] Se esses resultados positivos se traduzem em cevada cultivada em campo, então, existe um grande potencial dessas cepas de endófitos para ajudar a reduzir os insumos das culturas químicas e aprimorar as práticas agrícolas sustentáveis. Aumentos semelhantes na cevada cultivada em campo ao longo de duas estações foram mostrados ao usar cepas de endófitos do mesmo local e hospedeiro que as duas cepas de Cladosporium neste experimento (Murphy et a/. 2017b). Em todos os aumentos significativos no rendimento de cevada dos Experimentos de campo, os aumentos foram correlacionados positivamente com uma precipitação relativamente baixa durante a estação de crescimento, o que resultou em um ambiente seco semelhante ao local da fonte de endófitos.

[098] As plantas podem ser consideradas estressadas em nutrientes, pois não receberam fertilizante extra além do inicialmente disponível no composto, (J.l. Nº. 2).

Trabalhos anteriores demostraram que os endófitos das raízes fúngicas podem aumentar o rendimento em cevada estressada em nutrientes (Murphy et al. 2015a). As plantas de cevada também podem ser consideradas um pouco estressadas por umidade às vezes, pois eram regadas apenas quando o composto em crescimento atingia um nível de umidade de 15%, e similarmente, trabalhos anteriores também mostraram benefícios associados a endófitos para a cevada estressada por umidade (Murphy et a/. 2015b).

[099] Foi demonstrado anteriormente que os esporos de fungos no curativo das sementes penetram nas sementes nas primeiras duas semanas e têm um efeito de aumento de crescimento e estabelecimento iniciais (Murphy et a/. 2017a). No entanto, nenhuma das cepas que induziu um aumento de rendimento foi recuperada das sementes ou raízes no final do experimento, sugerindo um efeito de “iniciador' pelos endófitos.

[0100] Singh e Kapoor (1999) estudaram o efeito da inoculação com o AMF Glomus sp.88 e dois micro-organismos solubilizadores de fosfato (PO43-) (PSM), Bacillus circulans e Cladosporium herbarum, na presença ou ausência de fosfato de rocha em um P natural arenoso deficiente em culturas de trigo. O aumento significativo da produção de grãos e palha devido à inoculação com os consórcios pode ser atribuído a uma alta absorção de nutrientes.

[0101] O Requerente já havia demostrado anteriormente que resultados benéficos de experimentos com ambiente controlado podem ser traduzidos de vaso para plotagem' (Murphy et al. 2017b), e há todos os motivos para esperar que as cepas de endófitos do presente estudo também sejam úteis para a cevada cultivada em campo.

[0102] Na especificação, os termos "compreendem, compreendem, compreendeu e compreender" ou qualquer variação dos mesmos e os termos “incluem, incluem, incluído e incluir" ou qualquer variação dos mesmos são considerados totalmente intercambiáveis e todos devem ter a interpretação mais ampla possível e vice-versa.

[0103] A invenção não é limitada às modalidades descritas anteriormente no presente documento, mas podem variar tanto na interpretação quanto nos detalhes.

REFERÊNCIAS Kumar, S., Stecher, G., and Tamura, K. 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.2 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution 33: 1870 a 1874.

Murphy, B. R., Doohan, F. M., and Hodkinson, T. R. 2014a. Persistent fungal root endophytes isolated from a wild barley species suppress seed- borne infections in a barley cultivar. Symbiosis 60:281 a 292.

Murphy, B. R., Doohan, F. M., and Hodkinson, T. R. 2014b. Fungal endophytes of barley roots. The Journal of Agricultural Science 152:602 a 615.

Murphy, B. R., Doohan, F. M., and Hodkinson, T. R. 2015a. Fungal root endophytes of a wild barley species increase yield in a nutrient-stressed barley cultivar. Symbiosis 65:1 a 7.

Murphy, B. R., Martin Nieto, L., Doohan, F. M., and Hodkinson, T. R. 2015b. Fungal Endophytes Enhance Agronomically Important Traits in Severely Drought-Stressed Barley. Journal of Agronomy and Crop Science 201(6): 419 a 427.

Murphy, B. R., Doohan, F. M., and Hodkinson, T. R. 2016. A seed dressing combining fungal endophyte spores and fungicides improves seedling survival and early growth in barley and oat. Symbiosis 71(1):69 a 76.

Murphy, B. R., Hodkinson, T. R., and Doohan, F. M. 2017. A fungal endophyte consortium counterbalances the negative effects of reduced nitrogen input on the yield of field-grown spring barley. The Journal of Agricultural Science 155(08): 1324 a 1331.

Murphy, B. R., Martin Nieto, L., Doohan, F. M., and Hodkinson, T. R. 2015b. Profundae diversitas: the uncharted genetic diversity in a newly studied group of fungal root endophytes. Mycology 6:139 a 150.

Zadoks, J. C., Chang, T. T., and Konzak, C. F. 1974. A Decimal Code for the Growth Stages of Cereals. Weed Research 14:415 a 421.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de revestimento de sementes que compreende um ou mais endófitos fúngicos isolados de uma semente ou uma casca da semente de Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que os endófitos fúngicos são competentes para transmissão vertical, e em que os endófitos são caracterizados por serem selecionados a partir de uma Alternaria sp., um Penicillium sp., ou um Cladosporium sp. e que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3, 4, 5, 10, 11 ou 12.

2. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 1, em que os endófitos são caracterizados por serem Alternaria alternata, — Penicilium — brevicompactum, —Cladosporium —ramontenellum ou Cladosporium herbarum.

3. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o um ou mais endófitos selecionados são isolados da semente e são caracterizados por serem Cladosporium herbarum e que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) definido por SEQ ID Ne: 11 ou 12.

4. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 3, que compreende adicionalmente um ou mais endófitos isolados da casca da semente, e em que os endófitos são caracterizados por serem Penicillium brevicompactum, Cladosporium ramontenellum ou Alternaria alternata e que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID No: 3,4 ou 5.

5. Composição de revestimento de sementes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a composição compreende adicionalmente um ou mais endófitos fúngicos isolados de um tecido de Hordeum murinum que não seja a semente ou a casca da semente, em que o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ

ID Ne: 6 a 9 e selecionado de um Penicillium sp., um Cladosporium sp., um Humicola sp., ou um Talaromyces sp.

6. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o endófito ser selecionado de Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

7. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que a composição compreende endófitos caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6, 8, 11 e 12, e classificada como Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

8. Composição de revestimento de sementes que compreende um ou mais endófitos fúngicos isolados de um tecido de uma planta, como Hordeum murinum, e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical; em que o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12.

9. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o um ou mais endófitos serem classificados como Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

10. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, em que a composição compreende os endófitos que são caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (NrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6, 8, 11 e 12, e classificado como Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

11. Composição de revestimento de sementes compreende um ou mais endófitos fúngicos isolados de uma raiz de Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, e em que o endófito é caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 6,7,8 ou 9.

12. Composição de revestimento de sementes, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o um ou mais endófitos serem Alternaria alternata, Penicilium —brevicompactum, —Penicilium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, elou Talaromyces DPurpurogenus.

13. Composição de revestimento de sementes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada por a planta Hordeum murinum estar em condições de estresse múltiplo.

14. Composição de revestimento de sementes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada por a planta germinada da semente alvo revestida exibir um traço selecionado de um ou mais pesos seco de grão aumentado, um aumento no número de cabeças, um aumento no número de grãos e peso seco do broto.

15. Composição de revestimento de sementes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por a concentração do endófito fúngico isolado na composição é entre 0,001% (p/v) a 1,0% (p/v).

16. Planta cultivada a partir de uma semente revestida com uma composição de revestimento de sementes compreende um endófito fúngico isolado de um tecido da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical, e em que a planta cultivada a partir da semente revestida compreende pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste em (i) um endófito isolado que usa iniciadores definidos pelas SEQID Nº 1 e 2; ou (ii) um ou mais endófitos caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12.

17. Planta cultivada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o um ou mais endófitos ser Alternaria alternata, Penicilium brevicompactum,

Penicilium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

18. Planta cultivada, de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, caracterizada por a planta cultivada a partir da semente revestida ser uma grama.

19. Planta cultivada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por a grama ser uma cultura de cereal selecionada da cevada (Hordeum vulgare), trigo (Triticum aestivum), aveia (Avena sativa), milho (Zea mays), centeio (Secale cereale), espelta (Triticum spelta), arroz (Oryza sativa), painço (Panicum miliaceum, Eleusine coracana, Setaria italica, Pennisetum glaucum), sorgo (Sorgo bicolor), triticale (x Triticosecale), teff (Eragrostis tef), fonio (Digitaria exilis), arroz selvagem (Zizania spp.), capim-canário (Phalaris sp.), quinoa (Chenopodium quinoa), amaranto (Amaranthus spp.), trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum).

20. Semente que compreende um ou mais endófitos fúngicos selecionada de uma cepa de Alternaria, uma cepa de Cladosporium, uma cepa de Penicillium, uma cepa de Humicola ou uma cepa de Talaromyces, e em que os endófitos são originalmente isolados de um tecido da planta Hordeum murinum, e são caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12.

21. Semente, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por um ou mais endófitos serem Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

22. Semente, caracterizada por ser revestida, misturada ou encapsulada com a composição de revestimento de sementes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

23. Planta cultivada a partir da semente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20, 21 ou 22, em que a planta cultivada a partir da semente revestida compreende pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste em (i) um endófito isolado que usa iniciadores definidos pelas SEQ ID Ne 1 e 2; ou (ii) um ou mais endófitos caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12.

24. Semente obtida a partir da planta, de acordo com a reivindicação 23, em que a semente compreende pelo menos uma característica selecionada do grupo que consiste em (i) um endófito isolado que usa iniciadores definidos pelas SEQ ID Ne 1 e 2; ou (ii) um ou mais endófitos caracterizados por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3 a 12.

25. Semente, de acordo com a reivindicação 24 obtida a partir da planta, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por o um ou mais endófitos serem Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, elou Talaromyces Purpurogenus.

26. Método para produzir uma planta a partir de uma semente alvo, sendo que o método é caracterizado por compreender as etapas de revestir a semente alvo com a composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15; cultivar a semente revestida em um meio apropriado; cultivar a planta a partir da semente e colher uma cultura a partir da planta.

27. Método para aumentar um ou mais traços selecionados a partir do peso seco dos grãos, o número de cabeças, o número de grãos por cabeça, e peso seco do broto em uma planta cultivada a partir de uma semente alvo, sendo que o método compreende aplicar um endófito fúngico isolado a partir de uma semente ou uma casca da semente da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição para a semente alvo, em que os endófitos fúngicos são competentes para transmissão vertical, e em que os endófitos são caracterizados por serem selecionados a partir de um Penicillium sp., ou um Cladosporium sp. e que têm um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS) selecionado a partir da SEQ ID Ne: 3, 4, 5, 10, 11 ou 12; cultivar a semente alvo revestida em um meio apropriado e permitir que a planta cresça.

28. Endófito isolado de Hordeum murinum caracterizado por ter um espaçador transcrito interno ribossômico nuclear (nrlTS), de acordo com qualquer uma das SEQ ID Ne: 3 a 12 e em que o endófito é Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium glabrum, Cladosporium ramontenellum, Cladosporium herbarum, Humicola grisea, e/ou Talaromyces purpurogenus.

29, Endófito, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por a planta Hordeum murinum estar em condições de estresse múltiplo.

Cepa de Cladosporium HmH160902G3 0,57 Cepa de Cladosporium HmS160904G3 Cepa de Cladosporium Hm S160913G3 0,68 Cepa de Cladosporium Hm S160909G3 Cepa de Cladosporium HmR161404F [X) Figura 1

1 LN835958 não cultivado 0,656 HmS160913G3R 0,882 GU327427 não cultivado JX898951 não cultivado HQ645992 não cultivado 0,338 HMS160909G3F KT581653 não cultivado 0,5 Figura 2

Patente de Invenção para “ENDÓFITOS DE POPULAÇÕES SELVAGENS DE CEVADA QUE AUMENTAM RENDIMENTO DE CULTURA”

Trata-se de uma composição de revestimento de sementes que compreende um endófito fúngico isolado de um tecido da planta Hordeum murinum e um meio carreador para aplicação da dita composição a uma semente alvo, em que pelo menos um dos endófitos fúngicos é competente para transmissão vertical.

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.

Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: P5199- Listagem de sequência.txt - Data de Geração do Código: 15/06/2020 - Hora de Geração do Código: 17:19:22 - Código de Controle: - Campo 1: 2B65E9BA1A17697E - Campo 2: 24452571CO5D5D32