BR112020011716A2

BR112020011716A2 - molécula de ácido nucleico, seus usos, vetor, composição, proteína e vacina

Info

Publication number: BR112020011716A2
Application number: BR112020011716-1A
Authority: BR
Inventors: Jian Yan; Anna SLAGER; Bradley GARMAN; Neil COOCH
Original assignee: Inovio Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-11-17
Also published as: CA3083531A1; KR20200096954A; EP3723798A1; RU2021115093A; JP2021506269A; JP7485600B2; AU2018383663B2; AU2024201842A1; US20190175710A1; MX2020006218A; RU2759681C1; CN111479585A; KR102668476B1; WO2019118765A1; RU2021115093A3; EP3723798A4; US11154601B2; AU2018383663A1; US20210401958A1

Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um antígeno BORIS de consenso sintético. São descritos vetores, composições e vacinas compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um antígeno BORIS de consenso sintético. São descritos métodos para tratar um sujeito com um tumor expressando BORIS e métodos para prevenir um tumor expressando BORIS. É descrito um antígeno BORIS de consenso sintético.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, SEUS USOS, VETOR, COMPOSIÇÃO, PROTEÍNA E VACINA". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade e o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos 62/598.274, depositado em 13 de dezembro de 2017, cuja invenção é incorporada no presente documento por referência na sua totalidade. Listagem de Sequências

[002] Este pedido contém uma Listagem de sequências, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 11 de dezembro de 2018, é nomeada 104409_000447_sequence_listing.txt e tem 9.179 bytes de tamanho. Campo Técnico

[003] A presente invenção refere-se a antígenos BORIS e moléculas de ácido nucleico que codificam os mesmos. A presente invenção também se refere a vacinas, incluindo tais antígenos BORIS e/ou moléculas de ácido nucleico. A presente invenção refere-se ainda a métodos de uso de vacinas para indução de respostas imunes e prevenção e/ou tratamento de indivíduos com células cancerígenas e/ou tumores que expressam BORIS. Antecedentes

[004] O câncer está entre as principais causas de morte no mundo. Nos Estados Unidos, o câncer é a segunda causa mais comum de morte, sendo responsável por quase 1 em cada 4 mortes. O câncer surge de uma única célula que se transformou de uma célula normal em uma célula cancerígena. Tal transformação é frequentemente um processo de múltiplos estágios, progredindo de uma lesão pré-cancerígena para tumores malignos. Múltiplos fatores contribuem para essa progressão, incluindo envelhecimento, contribuições genéticas e exposição a agentes externos como cancerígenos físicos (por exemplo, radiação ultravioleta e ionizante), cancerígenos químicos (por exemplo, amianto, componentes do fumo do tabaco, etc.) e cancerígenos biológicos (por exemplo, certos vírus, bactérias e parasitas).

[005] A prevenção, o diagnóstico e o tratamento do câncer podem assumir muitas formas diferentes. A prevenção pode incluir a triagem de fatores predisponentes (por exemplo, variantes genéticas específicas), alteração do comportamento (por exemplo, tabagismo, dieta e quantidade de atividade física) e vacinação contra vírus (por exemplo, vírus do papiloma vírus da hepatite B humana). O tratamento pode incluir quimioterapia, radioterapia e remoção cirúrgica de um tumor ou tecido cancerígeno. Apesar da disponibilidade de numerosos métodos de prevenção e tratamento, tais métodos frequentemente encontram um sucesso limitado na prevenção e/ou tratamento eficaz do câncer.

[006] O fator de ligação ao CCCTC (CTCF) é um fator de 11 dedos de zinco envolvido na regulação gênica. Os 11 dedos de zinco do CTCF ligam diferentes sítios alvo do DNA e agem como repressores transcricionais. O irmão do regulador do sítio impresso ("BORIS") ou do tipo CTCF ("CTCFL") é um paralelo do CTCF e também é um regulador da transcrição. (Loukinov, D. I. et al. O BORIS, uma nova proteína específica da linhagem germinativa masculina associada a eventos de reprogramação epigenética, compartilha o mesmo domínio de 11 dedos de zinco com o CTCF, a proteína isoladora envolvida na leitura de marcas de impressão na soma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 6806-6811, doi:10.1073/pnas.092123699

(2002)). O CTCF e o BORIS têm padrões de expressão mutuamente exclusivos no tecido normal, mas são coexpressos nos tecidos do câncer. Embora a expressão do mRNA do BORIS seja muito baixa ou indetectável no tecido ovariano normal, ela é altamente expressa em muitas células do carcinoma epitelial do ovário ("EOC"). A expressão aberrante do BORIS foi detectada em 67% dos tumores primários do EOC. (Link, P.A., et al. BORIS/CTCFL mRNA isoform expression and epigenetic regulation in epithelial ovarian cancer. Cancer Immunity 13, 6 (2013)).

[007] Existem 23 isoformas distintas de mRNA do BORIS geradas a partir de emenda alternativa, cada uma com junções canônicas éxon-íntron e sinais poli-A, cujas características são conservadas em primatas. Seis famílias diferentes de isoformas BORIS (sf1 a sf6) codificam 17 proteínas BORIS diferentes. Os domínios de dedo de zinco do BORIS mostram homologia com os do CTCF; no entanto, regiões de flanqueamento diferentes entre as duas proteínas indicam consequências funcionais diferentes da ligação ao DNA. (Ver Ohlsson, R., Renkawitz, R. & Lobanenkov, V. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends in genetics: TIG 17, 520-527 (2001).) A isoforma BORIS sf1 é a mais diferencialmente expressa entre amostras normais de tecido de câncer de ovário e EOC.

[008] As vacinas para o tratamento e prevenção do câncer, e a EOC em particular, são de interesse. No entanto, as vacinas existentes direcionadas a antígenos de células tumorais são limitadas por expressão de antígeno deficiente in vivo. Por conseguinte, permanece uma necessidade na técnica de vacinas seguras e eficazes e métodos de seu uso para prevenir e/ou tratar o câncer e reduzir a mortalidade em indivíduos que sofrem de câncer.

Sumário da Invenção

[009] São fornecidos no presente documento:

[0010] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19- 680 da SEQ ID Nº: 2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; e (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2.

[0011] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) nucleotídeos 55-2040 da SEQ ID Nº: 1; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos nucleotídeos 55-2040 da SEQ ID Nº: 1; (c) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55-2040 da SEQ ID Nº: 1; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 55-2040 da SEQ ID Nº: 1.

[0012] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica um comprimento inteiro de SEQ ID Nº: 2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à

SEQ ID Nº: 2; e (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº:

2.

[0013] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQ ID Nº: 1; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID Nº: 1; (c) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID Nº: 1; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1.

[0014] Moléculas de ácido compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID Nº: 1.

[0015] Moléculas de ácido nucleico como no presente documento descritas para uso como um medicamento.

[0016] Moléculas de ácido nucleico como no presente documento descritas para uso como um medicamento no tratamento de câncer.

[0017] Moléculas de ácido nucleico como no presente documento descritas para uso na preparação de um medicamento.

[0018] Moléculas de ácido nucleico como no presente documento descritas para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0019] Vetores compreendendo uma molécula de ácido nucleico como no presente documento descrito, cujo vetor pode ser um plasmídeo ou um vetor viral.

[0020] Composições compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico como no presente documento descrito.

[0021] As composições como no presente documento descritas compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável, cujas composições podem compreender um ou mais vetores como no presente documento descrito.

[0022] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2.

[0023] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID Nº: 2; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2.

[0024] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID Nº: 2.

[0025] Vacinas compreendendo uma molécula de ácido nucleico como no presente documento descrito.

[0026] Vacinas compreendendo um vetor como no presente documento descrito.

[0027] Vacinas como no presente documento descritas, compreendendo ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, cuja vacina pode ainda compreender um adjuvante, em que o adjuvante pode ser IL-12, IL-15, IL-28 ou RANTES.

[0028] Métodos de tratamento de um indivíduo com uma célula cancerígena que expressa BORIS compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina como no presente documento descrito, em que a administração pode incluir uma etapa de eletroporação e em que a administração pode ocorrer em um ou mais locais no indivíduo.

[0029] Métodos de vacinação de um indivíduo contra uma célula cancerígena que expressa BORIS, compreendendo administrar uma quantidade de uma vacina, como descrito no presente documento, eficaz para induzir uma resposta imune humoral ou celular. Breve Descrição dos Desenhos

[0030] O sumário, bem como a descrição detalhada a seguir, é mais bem entendido quando lido em conjunto com os desenhos anexos. Com o objetivo de ilustrar a invenção, são mostrados nos desenhos modalidades exemplificativas da invenção; no entanto, a invenção não está limitada aos métodos, composições e dispositivos específicos descritos. Nos desenhos:

[0031] A Figura 1 mostra um diagrama esquemático da sequência de aminoácidos do antígeno BORIS de consenso sintético. Asteriscos denotam mutações nos domínios de 11 dedos de zinco e no sinal de localização nuclear.

[0032] A Figura 2 mostra uma estrutura geral da proteína BORIS. As esferas indicam alterações em relação ao BORIS nativo.

[0033] A Figura 3 mostra uma comparação do dedo de zinco nativo com a estrutura de dedo de zinco do antígeno BORIS de consenso sintético. A estrutura do dedo de zinco do antígeno BORIS de consenso sintético interrompe a ligação ao DNA.

[0034] A Figura 4 mostra a construção de pGX1440 incluindo o inserto de sequência de antígeno BORIS de consenso sintético.

[0035] A Figura 5 mostra a estratégia de bloqueio da citometria de fluxo.

[0036] A Figura 6 mostra a expressão in vitro do antígeno BORIS de consenso sintético em células de rabdomiossarcoma humano (RD) transfectadas com pGX1440 como determinado por imunotransferência com um anticorpo anti-BORIS humano.

[0037] As Figuras 7A e 7B mostram imunogenicidade do antígeno BORIS de consenso sintético. Camundongos CB6F1 fêmeas foram imunizados 3 vezes, com 3 semanas de intervalo com as doses indicadas de antígeno BORIS de consenso sintético (pGX1440, n = 8/grupo) ou pGX0001 (vetor vazio, n = 4). As respostas de IFNγ específicas do antígeno BORIS de consenso sintético foram avaliadas por ELISpot nas doses indicadas de pGX1440. A Figura 7A mostra respostas individuais de animais e a Figura 7B mostra respostas de grupo.

[0038] As Figuras 8A, 8B, 8C e 8D mostram frequência relativa de células T CD4+ e CD8+. As respostas imunes celulares induzidas por pGX1440 foram predominantemente no compartimento de células T CD8+ em relação ao compartimento de células T CD4+. O antígeno BORIS de consenso sintético induziu frequências de respostas de células T CD4+ específicas de antígeno que foram significativamente mais robustas do que naïve em todos os grupos de doses (Figura 8A). A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno induzida por antígeno BORIS de consenso sintético aumentou significativamente sobre o controle em todos os grupos de doses (Figura 8B). O perfil de citocinas de células T CD4+ específicas de antígeno BORIS de consenso sintético (Figura 8C) e as respostas das células T CD8+ são mostradas na (Figura 8D).

[0039] As Figuras 9A, 9B, 9C e 9D mostram potencial citolítico de células T específicas de antígeno BORIS de consenso sintético. As respostas imunes citolíticas induzidas por pGX1440 estavam predominantemente no compartimento de células T CD8+ em relação ao compartimento de células T CD4+. A frequência de células T CD4+CD107a+ específicas de antígeno foi aumentada em todos os grupos de doses (Figura 9A). Do mesmo modo, a frequência de células T CD8+CD107a+ específicas de antígeno aumentou em todos os grupos de dose, (Figura 9B). O perfil de citocinas das células T CD4+ CD107a+ (Figura 9C) e células T CD8+CD107a+ é mostrado na (Figura 9D). Descrição Detalhada da Invenção

[0040] A presente invenção refere-se a uma vacina compreendendo um antígeno BORIS de consenso sintético. O BORIS é expresso em muitos tumores. Consequentemente, a vacina fornece tratamento para um câncer ou tumores baseados em câncer que expressam BORIS.

[0041] O antígeno BORIS de consenso sintético pode ser um antígeno BORIS de consenso derivado das sequências de BORIS de diferentes espécies ou de diferentes isoformas dentro de uma espécie e, portanto, o antígeno BORIS de consenso sintético não é nativo. O antígeno BORIS de consenso sintético pode ser modificado ainda mais introduzindo uma ou mais mutações na sequência de consenso para gerar a sequência de antígeno BORIS de consenso sintético. As mutações podem interromper ou modificar domínios funcionais específicos da sequência BORIS nativa, interrompendo ou intensificando assim a estrutura ou função dos domínios funcionais. Numa modalidade, são introduzidas mutações na sequência de BORIS de consenso para interromper cada um dos domínios de dedo de zinco do BORIS nativo. Em outras modalidades da sequência de antígeno BORIS de consenso sintético, uma mutação é introduzida na sequência de sinal de localização nuclear do BORIS nativo. Em outras modalidades, mutações são introduzidas na sequência de BORIS de consenso para interromper cada domínio de dedo de zinco e a sequência de localização nuclear.

[0042] O antígeno BORIS de consenso sintético pode induzir respostas de anticorpos de células T específicas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é direcionada ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular induzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-γ) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e/ou interleucina 2 (IL-2). Em outras modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imunossupressão que promovem o crescimento do tumor ou câncer que expressa o antígeno, por exemplo, mas não limitados a fatores que suprarregulam a apresentação de MHC, fatores que suprarregulam as células T reguladoras específicas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL, citocinas, como IL-10 e TFG-β, macrófagos associados a tumores, fibroblastos associados a tumores, fatores solúveis produzidos por células imunossupressoras, CTLA-4, PD-1, MDSCs, MCP-1 e uma molécula de ponto de verificação imune.

[0043] A vacina da invenção pode proporcionar qualquer combinação de antígenos de câncer particulares para a prevenção ou tratamento particular do câncer de um indivíduo que necessite de tratamento.

[0044] Uma maneira de projetar o ácido nucleico e sua sequência de aminoácidos codificada do antígeno de câncer recombinante é através da introdução de mutações que alteram aminoácidos particulares na sequência geral de aminoácidos do antígeno de câncer nativo. A introdução de mutações não altera tanto o antígeno do câncer que ele não possa ser universalmente aplicado em um mamífero e, de preferência, em humanos ou cães, mas altera o suficiente para que a sequência de aminoácidos resultante quebre a tolerância ou seja considerada um antígeno estranho para gerar uma resposta imune.

Outra maneira pode ser criar um antígeno de câncer recombinante de consenso que tenha pelo menos 85% e até 99% de identidade de sequência de aminoácidos em comparação ao seu antígeno de câncer nativo correspondente; preferencialmente pelo menos 90% e até 98% de identidade de sequência; mais preferencialmente pelo menos 93% e até 98% de identidade de sequência; ou ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e até 98% de identidade de sequência.

Em alguns casos, o antígeno de câncer recombinante tem identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação com seu antígeno de câncer nativo correspondente.

O antígeno de câncer nativo é o antígeno normalmente associado ao tumor específico de câncer ou câncer.

Dependendo do antígeno de câncer, a sequência de consenso do antígeno de câncer pode ser através de espécies de mamíferos ou dentro de subtipos de uma espécie ou através de cepas virais ou sorotipos.

Alguns antígenos de câncer não variam muito da sequência de aminoácidos do tipo selvagem do antígeno de câncer.

Alguns antígenos de câncer têm sequências de ácidos nucleicos/aminoácidos que são tão divergentes entre as espécies, que uma sequência de consenso não pode ser gerada.

Nesses casos, é gerado um antígeno recombinante do câncer que rompe a tolerância e gera uma resposta imune que possui pelo menos 85% e até 99% de identidade de sequência de aminoácidos em comparação com seu antígeno de câncer nativo correspondente; preferencialmente pelo menos 90% e até 98% de identidade de sequência; mais preferencialmente pelo menos 93% e até 98% de identidade de sequência; ou ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e até 98% de identidade de sequência.

Em alguns casos, o antígeno de câncer recombinante tem identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação com seu antígeno de câncer nativo correspondente. As abordagens acima mencionadas podem ser combinadas de modo a que o antígeno de câncer recombinante final tenha uma porcentagem de similaridade com a sequência de aminoácidos de antígeno de câncer nativo, como discutido acima.

[0045] A vacina pode ser combinada ainda mais com anticorpos para inibidores do ponto de verificação, como PD-1 e PDL-1, para aumentar a estimulação das respostas imunes celular e humoral. O uso de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PDL-1 impede que PD-1 ou PDL-1 suprimam as respostas das células T e/ou das células B. Em geral, ao projetar os antígenos do câncer a serem reconhecidos pelo sistema imunológico, ajuda a superar outras formas de supressão imunológica pelas células tumorais, e essas vacinas podem ser usadas em combinação com terapias de supressão ou inibição (como terapias de anticorpo anti-PD-1 e anti-PDL-1) para aumentar ainda mais as respostas das células T e/ou das células B.

[0046] A vacina pode aumentar a sobrevida livre de tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% e 45%. A vacina pode reduzir a massa tumoral em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60% após a imunização. A vacina pode prevenir e bloquear o aumento da proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP-1), uma citocina secretada por células supressoras mieloides. A vacina pode aumentar a sobrevida do tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60%.

[0047] A vacina pode aumentar uma resposta imune celular num indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes, cerca de 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com uma resposta imune celular num indivíduo não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vacina pode aumentar a resposta imune celular no indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes, 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes, 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com a resposta imune celular no indivíduo não administrado com a vacina.

[0048] A vacina pode aumentar os níveis de interferon gama (IFN- γ) num indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes,

cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com os níveis de IFN-γ em um indivíduo não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vacina pode aumentar os níveis de IFN-γ no indivíduo administrado com a vacina em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes, 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com os níveis de IFN-γ em um indivíduo não administrado com a vacina.

[0049] Como descrito em mais detalhes abaixo, a vacina pode ainda compreender um ou mais inibidores de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (isto é, um inibidor de ponto de verificação imune). As moléculas do ponto de verificação imune são descritas abaixo em mais detalhes. O inibidor de ponto de verificação imune é qualquer ácido nucleico ou proteína que impeça a supressão de qualquer componente no sistema imunológico, tais como apresentação de classe de MHC, apresentação e/ou diferenciação de células T, apresentação e/ou diferenciação de células B e citocina, quimiocina ou sinalização para proliferação e/ou diferenciação de células imunes. Como também descrito abaixo em mais detalhes, a vacina pode ser combinada ainda mais com anticorpos para inibidores do ponto de verificação, como PD-1 e PDL-1, para aumentar a estimulação das respostas imunes celulares e humorais. O uso de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PDL-1 impede que PD-1 ou PDL-1 suprimam as respostas das células T e/ou das células B. Definições

[0050] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado compreendido comumente por versados na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, controlará. Métodos e materiais preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalidades. Os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante. A terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante da invenção.

[0051] Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "ter", "tem", "pode", "contém(êm)", e as variantes destes, como usado neste documento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares "uma", "um" e "a/o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. A presente invenção também contempla outras modalidades "compreendendo", "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" modalidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.

[0052] Para a recitação de faixas numéricas neste documento, cada valor intermediário tendo o mesmo grau de precisão que a faixa recitada mínima e máxima é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para a faixa de 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são contemplados explicitamente.

[0053] "Adjuvante", como usado no presente documento, significa qualquer molécula adicionada às vacinas no presente documento descritas para aumentar a imunogenicidade do antígeno.

[0054] "Anticorpo", tal como no presente documento usado, significa um anticorpo de classe IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmento ou derivado dos mesmos, incluindo Fab, F(ab')2, Fd, e anticorpos de cadeia única, bivalentes, anticorpos biespecíficos, anticorpos bifuncionais e respectivos derivativos. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de um mamífero, um anticorpo policlonal, um anticorpo purificado de afinidade ou qualquer mistura dos mesmos, que apresenta especificidade suficiente de ligação a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada destes.

[0055] "Antígeno" refere-se a: proteínas com sequências de aminoácidos do antígeno BORIS incluindo: (a) aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; (b) fragmentos compreendendo pelo menos 90% dos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; (c) sequências de aminoácidos que são pelo menos 96% idênticas aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; e (d) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 96% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; e proteínas possuindo sequências de aminoácidos do antígeno BORIS incluindo: (a) SEQ ID Nº: 2; (b) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID Nº: 2; (c) sequências de aminoácidos que são pelo menos 96% idênticas à SEQ ID Nº: 2; e (d) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; bem como antígenos BORIS compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID Nº: 2. Os antígenos podem opcionalmente incluir peptídeos de sinal, como os de outras proteínas.

[0056] "Sequência codificante" ou "ácido nucleico codificador", como usado no presente documento, significa os ácidos nucleicos (molécula de RNA ou de DNA) que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína. A sequência codificante pode ainda incluir sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligados a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero ao qual o ácido nucleico é administrado.

[0057] "Complemento" ou "complementar", como usado no presente documento em relação um ácido nucleico pode significar uma base de Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou de Hoogsteen pareando entre os nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico.

[0058] "Consenso" ou "sequência de consenso" ou "sequência de consenso BORIS", como no presente documento usado, significa uma sequência de polipeptídeo com base na análise de um alinhamento de múltiplas sequências para o mesmo gene de diferentes organismos ou de diferentes isoformas dentro de um organismo. As sequências de ácidos nucleicos que codificam uma sequência consenso polipeptídica podem ser preparadas.

[0059] "Corrente constante", como no presente documento usado descreve uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células que definem o referido tecido, durante a duração de um pulso elétrico administrado ao mesmo tecido. O pulso elétrico é administrado a partir dos dispositivos de eletroporação no presente documento descritos. Esta corrente permanece com uma amperagem constante no referido tecido durante a vida de um pulso elétrico, porque o dispositivo de eletroporação no presente documento fornecido possui um elemento de realimentação, preferivelmente tendo realimentação instantânea. O elemento de feedback pode medir a resistência do tecido (ou células) durante toda a duração do pulso e fazer com que o dispositivo de eletroporação altere sua produção de energia elétrica (por exemplo, aumente a tensão), de modo que a corrente no mesmo tecido permaneça constante durante todo o pulso elétrico (ligado a ordem dos microssegundos) e de pulso para pulso. Em algumas modalidades, o elemento de feedback compreende um controlador.

[0060] "Feedback de corrente" ou "feedback", como usado neste documento, pode ser usado de forma intercambiável e pode significar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação fornecidos, que compreendem medir a corrente no tecido entre os eletrodos e alterar a saída de energia fornecida pelo dispositivo EP de acordo, para manter a corrente em um nível constante. Esse nível constante é predefinido pelo usuário antes do início de uma sequência de pulsos ou tratamento elétrico. O feedback pode ser realizado pelo componente de eletroporação, por exemplo, controlador, do dispositivo de eletroporação, pois o circuito elétrico nele é capaz de monitorar continuamente a corrente no tecido entre os eletrodos e comparar essa corrente monitorada (ou corrente no tecido) com uma corrente predefinida e continuamente faz ajustes na produção de energia para manter a corrente monitorada em níveis predefinidos. O loop de feedback pode ser instantâneo, pois é um feedback de loop fechado analógico.

[0061] "Corrente descentralizada", como usado neste documento, pode significar o padrão de correntes elétricas entregues dos vários arranjos de eletrodos de agulha dos dispositivos de eletroporação no presente documento descritos, em que os padrões minimizam, ou preferivelmente eliminam, a ocorrência de estresse térmico relacionado à eletroporação em qualquer área do tecido eletroporado.

[0062] "Eletroporação", "eletropermeabilização," ou "potenciamento eletrocinético" ("EP"), tal como usado permutavelmente no presente documento, significa a utilização de um pulso de campo elétrico transmembrana para induzir caminhos microscópicos (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que biomoléculas como plasmídeos e vetores, oligonucleotídeos, siRNA, drogas, íons e água passem de um lado da membrana celular para o outro.

[0063] "Fragmento", tal como no presente documento usado com relação às sequências de ácidos nucleicos, significa uma sequência de ácido nucleico ou uma porção do mesmo, que codifica um polipeptídeo capaz de provocar uma resposta imune em um mamífero que reage de forma cruzada com um antígeno descrito no presente documento. Os fragmentos podem ser fragmentos de DNA selecionados de, pelo menos, uma das diversas sequências de nucleotídeos que codificam os fragmentos de proteína definidos abaixo. Os fragmentos podem compreender pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de uma ou mais das sequências de ácido nucleico apresentadas abaixo, excluindo um peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de uma ou mais das sequências de ácido nucleico estabelecidas abaixo e adicionalmente opcionalmente compreendem sequência que codifica um peptídeo sinal heterólogo que não é incluído quando se calcula a porcentagem de identidade. Os fragmentos podem ainda compreender sequências de codificação para um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG. A sequência de codificação que codifica uma metionina e/ou peptídeo de sinal do terminal N pode ser ligada a um fragmento da sequência de codificação.

[0064] Em algumas modalidades, os fragmentos podem compreender pelo menos 20 nucleotídeos ou mais, pelo menos 30 nucleotídeos ou mais, pelo menos 40 nucleotídeos ou mais, pelo menos 50 nucleotídeos ou mais, pelo menos 60 nucleotídeos ou mais, pelo menos 70 nucleotídeos ou mais, em pelo menos 80 nucleotídeos ou mais, pelo menos 90 nucleotídeos ou mais, pelo menos 100 nucleotídeos ou mais, pelo menos 150 nucleotídeos ou mais, pelo menos 200 nucleotídeos ou mais, pelo menos 250 nucleotídeos ou mais, pelo menos 300 nucleotídeos ou mais, pelo menos 350 nucleotídeos ou mais, pelo menos 400 nucleotídeos ou mais, pelo menos 450 nucleotídeos ou mais, pelo menos 500 nucleotídeos ou mais, pelo menos 550 nucleotídeos ou mais, pelo menos 600 nucleotídeos ou mais, pelo menos 650 nucleotídeos ou mais, pelo menos 700 nucleotídeos ou mais, pelo menos 750 nucleotídeos ou mais, pelo menos 800 nucleotídeos ou mais, pelo menos 850 nucleotídeos ou mais, pelo menos 900 nucleotídeos ou mais, pelo menos 950 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1000 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1100 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1200 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1300 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1400 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1500 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1600 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1700 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1800 nucleotídeos ou mais, pelo menos 1900 nucleotídeos ou mais, ou pelo menos 2000 nucleotídeos ou mais de pelo menos uma das sequências de ácidos nucleicos estabelecidas abaixo.

[0065] "Fragmento" ou "fragmento imunogênico" com relação às sequências polipeptídicas significa um polipeptídeo capaz de provocar uma resposta imune em um mamífero que reage de forma cruzada com um antígeno descrito no presente documento. Os fragmentos podem ser fragmentos polipeptídicos selecionados de pelo menos uma das várias sequências de aminoácidos. Os fragmentos de proteínas consenso podem compreender pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de uma proteína consenso, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de uma ou mais das sequências amino estabelecidas abaixo e adicionalmente opcionalmente compreendem um peptídeo sinal heterólogo que não precisa ser incluído quando se calcula a porcentagem de identidade. Os fragmentos podem ainda compreender um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG.

[0066] Em algumas modalidades, fragmentos de proteínas de consenso podem compreender pelo menos 20 aminoácidos ou mais, pelo menos 30 aminoácidos ou mais, pelo menos 40 aminoácidos ou mais, pelo menos 50 aminoácidos ou mais, pelo menos 60 aminoácidos ou mais, pelo menos 70 aminoácidos ou mais, pelo menos 80 aminoácidos ou mais, pelo menos 90 aminoácidos ou mais, pelo menos 100 aminoácidos ou mais, pelo menos 110 aminoácidos ou mais, pelo menos 120 aminoácidos ou mais, pelo menos 130 aminoácidos ou mais, pelo menos 140 aminoácidos ou mais, pelo menos 150 aminoácidos ou mais, pelo menos 160 aminoácidos ou mais, pelo menos 170 aminoácidos ou mais, pelo menos 180 aminoácidos ou mais, pelo menos 200 aminoácidos ácidos ou mais,

pelo menos 220 aminoácidos ou mais, pelo menos 240 aminoácidos ou mais, pelo menos 260 aminoácidos ou mais, pelo menos 280 aminoácidos ou mais, pelo menos 300 aminoácidos ou mais, pelo menos 320 aminoácidos ou mais, pelo menos 360 aminoácidos ou mais, pelo menos 380 aminoácidos ou mais, pelo menos 400 aminoácidos ou mais, pelo menos 420 aminoácidos ou mais, pelo menos 440 aminoácidos ou mais, pelo menos 460 aminoácidos ou mais, pelo menos 480 aminoácidos ou mais, pelo menos 500 aminoácidos ou mais, pelo menos 520 aminoácidos ou mais, pelo menos 540 aminoácidos ou mais, pelo menos 560 aminoácidos ou mais, pelo menos 580 aminoácidos ou mais, pelo menos 600 aminoácidos ou mais, pelo menos 620 aminoácidos ou mais, pelo menos 640 aminoácidos ou mais, ou pelo menos 660 aminoácidos ou mais de uma sequência de proteínas no presente documento descrita.

[0067] Como usado neste documento, o termo "construção genética" refere-se às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codificam uma proteína. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do indivíduo ao qual a molécula de ácido nucleico é administrada. Como usado neste documento, o termo "forma expressável" se refere a uma construção de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operavelmente ligados a uma sequência de codificação que codifica uma proteína, de tal modo que quando presente na célula de um indivíduo, a sequência de codificação será expressa.

[0068] O termo "homólogo", como usado neste documento, refere- se ao grau de complementaridade. Pode haver uma homologia parcial ou uma homologia completa (isto é, identidade). Uma sequência parcialmente complementar que pelo menos parcialmente inibe uma sequência completamente complementar da hibridação com um ácido nucleico alvo é referida usando o termo funcional "substancialmente homólogo". Quando usado em referência a uma sequência de ácido nucleico de fita dupla, como um cDNA ou clone genômico, o termo "substancialmente homólogo" como usado neste documento, refere-se a uma sonda que pode hibridar com uma fita da sequência de ácido nucleico de fita dupla sob condições de baixa estringência. Quando usado em referência a uma sequência de ácidos nucleicos de fita única, o termo "substancialmente homólogo", tal como no presente documento usado, refere-se a uma sonda que pode hibridizar para (isto é, é o complemento de) uma sequência modelo de ácido nucleico de fita simples sob condições de baixa estringência.

[0069] "Idêntico" ou "identidade", tal como no presente documento usado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, podem significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são as mesmas ao longo de uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada por alinhamento ótimo das duas sequências, comparando as duas sequências sobre a região especificada, determinando o número de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade da sequência. Em casos em que as duas sequências são de comprimentos diferentes ou em que o alinhamento produz uma ou mais extremidades espaçadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os resíduos da sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar o DNA e o RNA, timina (T) e uracil (U) podem ser considerados equivalentes. A identidade pode ser executada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de computador, como o BLAST ou BLAST 2.0.

[0070] A "impedância", como usada neste documento, pode ser usada ao discutir o mecanismo de feedback e pode ser convertida em um valor atual de acordo com a lei de Ohm, permitindo comparações com a corrente predefinida.

[0071] "Resposta imune", tal como no presente documento usado, significa a ativação de um sistema imunológico do hospedeiro, por exemplo, o de um mamífero, em resposta à introdução de antígeno. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.

[0072] "Ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo", como usado neste documento, significa pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados entre si. A representação de uma fita simples também define a sequência da fita complementar. Assim, um ácido nucleico também engloba a fita complementar de uma fita simples representada. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para a mesma finalidade que um determinado ácido nucleico. Assim, um ácido nucleico também engloba substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos dos mesmos. Uma fita única fornece uma sonda que pode hibridizar a uma sequência-alvo sob condições restritivas de hibridização. Assim, um ácido nucleico também engloba uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridização rigorosas.

[0073] Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita dupla, ou podem conter porções das sequências de fita dupla ou de fita única. O ácido nucleico pode ser o DNA, genômico e cDNA, RNA ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de deoxirribo- e ribo-nucleotídeos e combinações de bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.

[0074] "Operacionalmente ligado", como usado no presente documento, significa que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual ele está espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre aquele promotor e o gene que ele controla no gene do qual o promotor é derivado. Como é conhecido na técnica, a variação desta distância pode ser ajustada sem perda da função do promotor.

[0075] Um "peptídeo", uma "proteína" ou um "polipeptídeo", como usado neste documento, pode significar uma sequência de aminoácidos ligados e pode ser natural, sintético ou uma modificação ou combinação de natural e sintético.

[0076] "Promotor", tal como no presente documento usado, significa uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou potencializar a expressão de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcricionais específicas para potencializar ainda mais a expressão e/ou para alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor também pode compreender elementos acentuadores distais ou repressores, que podem ser localizados, tanto quanto milhares de pares de base, a partir do sítio de início da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes que incluem vírus, bactérias, fungos, plantas, insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente, ou diferencialmente em relação à célula, ao tecido ou ao órgão em que a expressão ocorre ou,

em relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, tais como estresses fisiológicos, patogênicos, íons metálicos, ou agentes de indução. Exemplos representativos de promotores incluem o promotor do bacteriófago T7, promotor do bacteriófago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor SV40 tardio, promotor SV40 precoce, promotor RSV-LTR, promotor IE de CMV, promotor SV40 precoce ou promotor SV40 tardio e promotor IE de CMV.

[0077] "Peptídeo sinal" e "sequência líder" são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma sequência de aminoácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabelecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências líderes normalmente direcionam a localização de uma proteína. Peptídeos sinal/sequências principais usados neste documento preferencialmente facilitam a secreção da proteína a partir da célula em que são produzidos. Peptídeos sinal/sequências líderes são frequentemente clivados do restante da proteína, frequentemente referidos como a proteína madura, mediante a secreção da célula. Os peptídeos sinal/sequências líderes estão ligados no terminal amino (isto é, terminal N) da proteína.

[0078] "Condições estritas de hibridização", tal como no presente documento usado, significa que as condições sob as quais uma primeira sequência de ácido nucleico (por exemplo, sonda) irá hibridizar para uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, alvo), tal como em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. Condições restritivas são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. As condições restritivas podem ser selecionadas para ser de cerca de 5 a 10°C menor que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a um pH de força iônica definido. A Tm pode ser a temperatura (força iônica, pH e concentração nucleica definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam para a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Condições restritivas podem ser aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de íon de sódio, tal como uma concentração de aproximadamente 0,01-1,0 M de íons de sódio (ou outros sais) a um pH de 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, aproximadamente 10-50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotídeos). As condições restritivas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como a formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser hibridização de fundo pelo menos de duas a 10 vezes. Exemplos de condições restritivas de hibridização incluem o seguinte: formamida a 50%, SSC 5x e SDS a 1%, incubando a 42°C, ou SSC 5x, SDS a 1%, incubando a 65°C, com lavagem em SSC 0,2x e 0,1% De SDS a 65°C.

[0079] "Indivíduo", tal como no presente documento usado pode significar um mamífero que deseja ou que possui necessidade de ser imunizado com a vacina descrita no presente documento. O mamífero pode ser um humano, chipanzé, cachorro, gato, cavalo, vaca, camundongo ou rato.

[0080] "Substancialmente complementar", tal como no presente documento usado, pode significar que a primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100,

180, 270, 360, 450, 540 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridação estritas.

[0081] "Substancialmente idêntico(a)", tal como no presente documento usado, significa que a primeira e a segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou em relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência for substancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.

[0082] "Tratar", "tratamento" ou "tratamento", como usado neste documento, pode significar proteger um animal de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um animal antes da aparição da doença. Suprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um indivíduo após a indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um animal após aparecimento clínico da doença.

[0083] "Variante", como usado neste documento com relação a um ácido nucleico, significa (i) uma porção ou fragmento de uma sequência de nucleotídeos referenciada; (ii) o complemento de uma sequência de nucleotídeos referenciada ou parte da mesma; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico referenciado ou ao complemento deste; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições restritivas para o ácido nucleico referenciado, seu complemento ou uma sequência substancialmente idêntica ao mesmo.

[0084] "Variante", como usado neste documento em relação a um peptídeo ou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo que difere na sequência de aminoácidos pela inserção, exclusão ou substituição conservadora de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica.

Variante também pode significar uma proteína com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácidos que retém pelo menos uma atividade biológica.

Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, a substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição das regiões carregadas) é reconhecida na técnica como normalmente envolvendo uma pequena alteração.

Estas pequenas alterações podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica.

Kyte et al., J.

Mol.

Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga.

É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos semelhantes podem ser substituídos e ainda manter a função proteica.

Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de ±2 são substituídos.

A hidrofilia dos aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que mantêm a função biológica.

Uma consideração da hidrofilia dos aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilia média local desse peptídeo, uma medida útil que foi relatada por se correlacionar bem com a antigenicidade e imunogenicidade.

Patente US 4.554.101, incorporada no presente documento integralmente por referência.

A substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade semelhantes pode resultar em peptídeos que retêm a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica. As substituições podem ser realizadas com aminoácidos com valores de hidrofilicidade dentro de ± 2 um do outro. O índice de hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade dos aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistente com essa observação, as substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica são compreendidas como dependentes da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais desses aminoácidos, como revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.

[0085] Uma variante pode ser uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene total ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácido nucleico pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento do mesmo. Uma variante pode ser uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo.

[0086] "Vetor", tal como no presente documento usado, significa uma sequência de ácido nucleico, que contém uma origem de replicação. Um vetor pode ser um vetor viral, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico autorreplicante e, de preferência, é um plasmídeo de DNA. O vetor pode conter ou incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogas. Vacinas

[0087] São fornecidas no presente documento vacinas compreendendo um antígeno BORIS de consenso sintético, como descrito no presente documento, uma molécula de ácido nucleico que codifica um antígeno BORIS de consenso sintético, uma molécula de ácido nucleico que codifica um fragmento de um antígeno BORIS de consenso sintético, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma variante de um antígeno BORIS de consenso sintético, ou combinações dos mesmos. As vacinas podem ser capazes de gerar em um indivíduo uma resposta imune contra o antígeno. A resposta imune pode ser uma resposta imune terapêutica ou profilática. As vacinas podem compreender um vetor ou uma pluralidade de vetores como descrito em mais detalhes abaixo.

[0088] Em algumas modalidades, a vacina compreende uma molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um antígeno BORIS de consenso sintético. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID Nº: 2; uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% do comprimento da SEQ ID Nº 2; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende a SEQ ID Nº: 1; um fragmento compreendendo pelo menos 90% de todo o comprimento da SEQ ID Nº: 1; um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID Nº: 1;

ou um fragmento compreendendo pelo menos 90% de todo o comprimento de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1. Em algumas modalidades, a vacina compreende um antígeno BORIS de consenso sintético, em que o antígeno compreende a SEQ ID Nº: 2; um fragmento compreendendo pelo menos 90% do comprimento da SEQ ID Nº 2; uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; ou um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº:

2.

[0089] As vacinas podem ser usadas para proteger contra o câncer, por exemplo, um câncer ou tumor expressando BORIS. As vacinas podem ser usadas para prevenir e/ou tratar um tumor que expressa BORIS em um indivíduo em necessidade do mesmo. As vacinas podem induzir respostas celulares e/ou anticorpos contra BORIS e contra tumores que expressam BORIS.

[0090] Em uma modalidade, as vacinas podem ser usadas para proteger, prevenir e/ou tratar ou induzir uma resposta celular e/ou anticorpo contra células cancerígenas do ovário que expressam BORIS, especificamente células epiteliais de câncer de ovário que expressam BORIS, mais especificamente células de câncer de ovário seroso que expressam o BORIS.

[0091] O desenvolvimento de uma vacina contra o câncer, como descrito no presente documento, compreende identificar um antígeno do câncer, por exemplo, BORIS, que não é reconhecido pelo sistema imunológico e é um antígeno associado ao tumor ("câncer/testículo", "C/T"). O antígeno de câncer é alterado de um autoantígeno para um antígeno estrangeiro, a fim de ser reconhecido pelo sistema imunológico. O redesenho do ácido nucleico e da sequência de aminoácidos do antígeno de câncer recombinante de um antígeno para um antígeno estrangeiro, quebra a tolerância do antígeno pelo sistema imunológico. Para quebrar a tolerância, várias medidas de redesenho podem ser aplicadas ao antígeno de câncer como descrito abaixo.

[0092] O antígeno de câncer recombinante da vacina não é reconhecido como auto, quebrando, portanto, a tolerância. A quebra da tolerância pode induzir respostas de anticorpos de células T específicas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é dirigida ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular induzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-γ) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e/ou interleucina 2 (IL-2). Em outras modalidades, a resposta imune induzida ou provocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imunossupressão que promovem o crescimento do tumor ou câncer que expressa o antígeno, por exemplo, mas não limitados a fatores que suprarregulam a apresentação de MHC, fatores que suprarregulam as células T reguladoras específicas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL, citocinas, como IL-10 e TFG-β, macrófagos associados a tumores, fibroblastos associados a tumores, fatores solúveis produzidos por células imunossupressoras, CTLA-4, PD-1, MDSCs, MCP-1 e uma molécula de ponto de verificação imune.

[0093] Numa modalidade particular, a vacina pode mediar a depuração ou impedir o crescimento de células tumorais (1) aumentando o linfócito T citotóxico, como CD8+ e/ou CD107a+ (CTL), para atacar e matar células tumorais; (2) aumentando as respostas das células T auxiliares; e/ou (3) aumentando as respostas inflamatórias via IFN-γ, IL-2, TFN-α, ou preferencialmente todos os itens acima mencionados.

[0094] A vacina pode ser uma vacina de DNA. As vacinas de DNA são descritas nas Patentes US 5.593.972, 5.739.118, 5.817.637,

5.830.876, 5.962.428, 5.981.505, 5.580.859, 5.703.055 e 5.676.594, que são no presente documento incorporadas totalmente por referência. A vacina de DNA pode compreender adicionalmente elementos ou reagentes que a inibem de integrar o cromossomo.

[0095] A vacina pode incluir um RNA que codifica o antígeno do câncer. A vacina de RNA pode ser introduzida na célula.

[0096] A vacina pode ser uma vacina viva atenuada, uma vacina que usa vetores recombinantes para administrar vacinas de antígeno, subunidades e glicoproteínas, por exemplo, mas não limitadas, às vacinas descritas nas Patentes US: 4.510.245; 4.797.368; 4.722.848;

4.790.987; 4.920.209; 5.017.487; 5.077.044; 5.110.587; 5.112.749;

5.174.993; 5.223.424; 5.225.336; 5.240.703; 5.242.829; 5.294.441;

5.294.548; 5.310.668; 5.387.744; 5.389.368; 5.424.065; 5.451.499;

5.453.364; 5.462.734; 5,470,734; 5.474.935; 5.482.713; 5.591.439;

5.643.579; 5.650.309; 5.698.202; 5.955.088; 6.034.298; 6.042.836;

6.156.319 e 6.589.529, que são no presente documento incorporadas por referência.

[0097] Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico pode ainda compreender a sequência de codificação para um adjuvante molecular, em alguns casos o adjuvante molecular pode ser IL-12, IL- 15, IL-28, IL-31, IL-33 e/ou RANTES e, em alguns casos, o adjuvante molecular é um inibidor do ponto de verificação, incluindo o antígeno linfocitário T anti-citotóxico 4 (CTLA-4), o receptor de morte anti- programado-1 (PD-1) e o gene de ativação anti-linfócito (LAG-3). A sequência de codificação para IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 e/ou RANTES pode ser incluída em uma ou mais moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de codificação para um ou mais antígenos. A sequência de codificação para IL-12, IL-15, IL-28,

IL-31, IL-33 e/ou RANTES pode ser incluída em moléculas de ácido nucleico separadas, como um plasmídeo separado ou vetor.

[0098] As vacinas da presente invenção podem ter características requeridas das vacinas eficazes, tais como sendo seguras, de forma que a própria vacina não causa doença ou morte; sendo protetora contra doença; induzindo o anticorpo de neutralização; induzindo respostas de célula T de proteção; e fornecendo facilitação da administração, poucos efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por dose. A vacina pode realizar algumas ou todas essas características, contendo a(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica o antígeno do câncer, como discutido abaixo. Vacina Combinada com o Inibidor do Ponto de Verificação Imune

[0099] A vacina pode ainda compreender um ou mais inibidores de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (isto é, um inibidor de ponto de verificação imune). As moléculas do ponto de verificação imune são descritas abaixo em mais detalhes. O inibidor de ponto de verificação imune é qualquer ácido nucleico ou proteína que impeça a supressão de qualquer componente no sistema imunológico, tais como apresentação de classe de MHC, apresentação e/ou diferenciação de células T, apresentação e/ou diferenciação de células B e citocina, quimiocina ou sinalização para proliferação e/ou diferenciação de células imunes.

[00100] Um tal inibidor pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoácidos, uma molécula pequena ou uma combinação das mesmas. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante destes, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O ácido nucleico também pode incluir sequências adicionais que codificam sequências de ligantes ou de etiquetas que estão ligadas ao inibidor do ponto de verificação imune por uma ligação peptídica. A molécula pequena pode ter um baixo peso molecular, por exemplo, menos de 800 Daltons, composto orgânico ou inorgânico que pode servir como substrato enzimático, ligando (ou análogo do mesmo) ligado por uma proteína ou ácido nucleico, ou regulador de um processo biológico. A sequência de aminoácido pode ser uma proteína, um peptídeo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

[00101] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune pode ser uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o inibidor de ponto de verificação imune pode ser um anticorpo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. Molécula do Ponto de Verificação Imune

[00102] O inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoácidos, uma molécula pequena ou uma combinação dos mesmos. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante destes, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O ácido nucleico também pode incluir sequências adicionais que codificam sequências de ligantes ou de etiquetas que estão ligadas ao inibidor do ponto de verificação imune por uma ligação peptídica. A molécula pequena pode ter um baixo peso molecular, por exemplo, menos de 800 Daltons, composto orgânico ou inorgânico que pode servir como substrato enzimático, ligando (ou análogo do mesmo) ligado por uma proteína ou ácido nucleico, ou regulador de um processo biológico. A sequência de aminoácido pode ser uma proteína, um peptídeo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.

PD-1 e PD-L1

[00103] A molécula do ponto de verificação imune pode programar a proteína de morte celular 1 (PD-1), ligando de morte celular programada 1 (PD-L1), um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. PD-1 é uma proteína de superfície celular codificada pelo gene PDCD1. PD-1 é um membro da superfamília da imunoglobulina e é expressa em células T e células pró-B e, portanto, contribui para o destino e/ou diferenciação dessas células. Em particular, PD-1 é uma proteína de membrana tipo 1 da família de reguladores de células T CD28/CTLA-4 e regula negativamente os sinais do receptor de células T (TCR), regulando negativamente as respostas imunes. PD-1 pode regular negativamente as respostas das células T CD8+ e, assim, inibir a citotoxicidade mediada por CD8 e aumentar o crescimento do tumor.

[00104] PD-1 tem dois ligantes, PD-L1 e PD-L2, que são membros da família B7. PD-L1 é regulada em excesso em macrófagos e células dendríticas (DCs) em resposta ao tratamento com LPS e GM-CSF e em células T e células B mediante sinalização de receptores de células B e TCR. PD-L1 é expressa por muitas linhagens de células tumorais, incluindo mielomas, mastocitomas e melanomas. Anticorpo da Molécula do Ponto de Verificação Anti-Imune

[00105] Como descrito acima, o inibidor do ponto de verificação imune pode ser um anticorpo. O anticorpo pode se ligar ou reagir com um antígeno (isto é, a molécula do ponto de verificação imune descrita acima). Por conseguinte, o anticorpo pode ser considerado um anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune ou um anticorpo da molécula de ponto de verificação imune. O anticorpo pode ser codificado por uma sequência de ácido nucleico contida nele

[00106] O anticorpo pode incluir um polipeptídeo de cadeia pesada e um polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou pelo menos uma região constante de cadeia pesada (CH). A pelo menos uma região constante da cadeia pesada pode incluir uma região constante da cadeia pesada 1 (CH1), uma região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e uma região constante da cadeia pesada 3 (CH3) e/ou uma região de dobradiça.

[00107] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH e uma região CH1. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3.

[00108] O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VH. Procedendo do terminal N do polipeptídeo da cadeia pesada, essas CDRs são denotadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia pesada podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno.

[00109] O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de cadeia leve variável (VL) e/ou uma região de cadeia leve constante (CL). O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VL. Continuando do terminal N do polipeptídeo da cadeia leve, essas CDRs são denotadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia leve podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno.

[00110] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve ("CDR"), interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pesada e uma estrutura de cadeia leve ("FR") que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00111] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode incluir uma região VL e uma região CL.

[00112] Adicionalmente, a enzima proteolítica papaína cliva preferivelmente as moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F (ab)) compreendem cada um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F (ab')2, que compreende os dois sítios de ligação ao antígeno. Por conseguinte, o anticorpo pode ser o Fab ou F(ab')2. O Fab pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada do Fab pode incluir a região VH e a região CH1. A cadeia leve do Fab pode incluir a região VL e a região CL.

[00113] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo amadurecido por afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo de uma espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana. Anticorpo PD-1

[00114] O anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune pode ser um anticorpo anti-PD-1 (também no presente documento referido como "anticorpo PD-1"), uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo PD-1 pode ser o Nivolumabe. O anticorpo anti-PD-1 pode inibir a atividade de PD-1, induzindo, provocando ou aumentando uma resposta imune contra um tumor ou câncer e diminuindo o crescimento do tumor. Anticorpo PD-L1

[00115] O anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune pode ser um anticorpo anti-PD-L1 (também no presente documento referido como "anticorpo PD-L1"), uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo anti-PD-L1 pode inibir a atividade de PD-L1, induzindo, provocando ou aumentando uma resposta imune contra um tumor ou câncer e diminuindo o crescimento do tumor. Antígenos

[00116] Como descrito acima, a vacina pode compreender um antígeno ou um ácido nucleico que codifica um antígeno. O antígeno pode ser BORIS, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação de um fragmento e uma variante do mesmo.

[00117] Consequentemente, a vacina pode ser usada para tratar indivíduos que sofrem de cânceres ou tumores que expressam o BORIS. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer de ovário é câncer de ovário epitelial. O câncer de ovário pode ser um câncer de ovário epitelial seroso. A vacina também pode ser usada para tratar indivíduos com câncer ou tumores que expressam BORIS para impedir o desenvolvimento de tais tumores em indivíduos. O antígeno BORIS de consenso sintético pode diferir do gene BORIS nativo e, portanto, fornecer terapia ou profilaxia contra um tumor que expressa o antígeno BORIS. Por conseguinte, são fornecidas no presente documento sequências de antígeno BORIS de consenso sintético que diferem do gene BORIS nativo (isto é, genes ou sequências BORIS mutadas ou sintéticas).

[00118] Os transcritos do gene BORIS nativo são processados em uma variedade de mRNAs. As isoformas de mRNA de BORIS específicas podem ser selecionadas com base, por exemplo, na sua expressão em células cancerígenas. Em modalidades particulares, a isoforma BORIS é selecionada com base em sua expressão em células de câncer de ovário. As sequências de antígeno BORIS de consenso sintético no presente documento descritas evitam processamento alternativo, produzindo um transcrito completo e resultando em indução mais forte de respostas efetoras das células T e B.

[00119] Moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo as sequências heterólogas descritas acima são fornecidas. São fornecidas moléculas de ácido nucleico isoladas que consistem nas sequências heterólogas descritas acima. Moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo as sequências heterólogas descritas acima podem ser incorporadas em vetores como plasmídeos, vetores virais e outras formas de moléculas de ácido nucleico, como descrito abaixo. São fornecidas no presente documento sequências de ácidos nucleicos que codificam antígenos BORIS de consenso sintético. As sequências de codificação que codificam antígenos BORIS de consenso sintético têm as sequências como descrito acima.

[00120] As moléculas de proteína compreendendo as sequências de aminoácidos de antígeno BORIS de consenso sintético heterólogas descritas acima são fornecidas. São fornecidas moléculas de proteína que consistem nas sequências de aminoácidos de antígeno BORIS de consenso sintético heterólogas descritas acima. São fornecidas no presente documento proteínas e polipeptídeos que possuem as sequências de antígeno BORIS de consenso sintético acima descritas. As proteínas e o polipeptídeo podem ser referidos como antígenos BORIS de consenso sintéticos e imunógenos BORIS. Os antígenos BORIS de consenso sintético são capazes de provocar uma resposta imune contra tumores que expressam BORIS.

[00121] Em um aspecto, é desejável que o antígeno BORIS de consenso sintético forneça transcrição e tradução aprimoradas, incluindo um ou mais dos seguintes itens: sequência líder de baixo teor de GC para aumentar a transcrição; estabilidade do mRNA e otimização do códon; e, na medida do possível, eliminação dos motivos de sequência de ação cis (isto é, caixas-TATA internas).

[00122] O antígeno BORIS de consenso sintético pode ser uma sequência de antígeno de consenso (ou imunógeno) derivada de duas ou mais espécies. Numa modalidade, uma sequência de consenso é gerada a partir de isoformas BORIS de diferentes espécies. A sequência de consenso é derivada das sequências BORIS coletadas do GenBank ou outro banco de dados semelhante de sequência de DNA ou proteína. O antígeno BORIS de consenso sintético pode compreender uma sequência de consenso e/ou modificação (s) para melhorar a expressão. A modificação pode incluir otimização de códon, otimização de RNA, adição de uma sequência kozak (por exemplo, GCC ACC) para aumentar a iniciação da tradução e/ou a adição de uma sequência líder de imunoglobulina para aumentar a imunogenicidade do antígeno BORIS de consenso sintético. O antígeno BORIS de consenso sintético pode compreender um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, mas não limitado a um peptídeo sinal imunoglobulina E (IgE) ou imunoglobulina G (IgG). Em algumas modalidades, o antígeno de consenso BORIS pode compreender uma etiqueta de hemaglutinina (HA). O antígeno de consenso BORIS pode ser projetado para obter respostas imunes celulares e/ou humorais mais fortes e mais amplas do que um antígeno BORIS de consenso sintético otimizado por códon correspondente.

[00123] A sequência de consenso BORIS pode ser mutada para interromper e/ou aprimorar estruturas e/ou funções particulares de BORIS nativo para produzir uma sequência de antígeno de BORIS de consenso sintético. Numa modalidade, são introduzidas mutações em cada um dos 11 domínios de dedo de zinco para interromper a estrutura e a funcionalidade do dedo de zinco. As uma ou mais mutações podem ser uma substituição de um ou mais aminoácidos que coordenam o íon de zinco nos um ou mais dedos de zinco. O um ou mais aminoácidos que coordenam o íon de zinco podem ser um motivo CCHH. Por conseguinte, em algumas modalidades, as uma ou mais mutações podem substituir 1, 2, 3 ou todos os 4 aminoácidos de um ou mais motivos CCHH. Numa modalidade preferida, as cisteínas nos onze dedos de zinco no BORIS são mutadas para glicina para interromper a estrutura e a ligação do dedo de zinco. (Ver Stoll, R. et al. Structure of the Wilms tumor suppressor protein zinc finger domain bound to DNA. Journal of molecular biology 372, 1227-1245, doi:10.1016/j.jmb.2007.07.017 (2007)).

[00124] O antígeno BORIS de consenso sintético pode compreender mutações ou deleções para interromper, por exemplo, uma sequência de sinal de localização nativa incluindo, por exemplo, um sinal de localização nuclear para interromper a translocação nuclear após a expressão. Por exemplo, RRRK pode ser substituído por RKRK para impedir a localização nuclear. Numa modalidade particular, são feitas interrupções em cada um dos 11 domínios de dedo de zinco e na sequência do sinal de localização nuclear. Será prontamente apreciado por pessoas versadas na técnica que um antígeno BORIS de consenso sintético recombinante com uma ou mais ou qualquer combinação das mutações no presente documento descritas também terá funcionalidade como um antígeno não próprio para os fins desta invenção, e que cada uma dessas variantes é contemplada pela presente invenção.

[00125] Numa modalidade preferida, a sequência de antígeno BORIS de consenso sintético compartilha 95,0% de identidade com a SEQ ID Nº: 1. Nesta modalidade, a sequência de ácido nucleico da SEQ ID Nº: 1 codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº:

2. Em outras modalidades, a sequência de antígeno BORIS de consenso sintético compartilha 95,0% ou mais de identidade, 95,2% ou mais de identidade, 95,4% ou mais de identidade, 95,6% ou mais de identidade, 95,8% ou mais de identidade, 96,0% ou mais de identidade, 96,2% ou mais de identidade mais identidade, 96,4% ou mais identidade, 96,6% ou mais identidade, 96,8% ou mais identidade, 97,0% ou mais identidade, 97,2% ou mais identidade, 97,4% ou mais identidade, 97,6% ou mais identidade, 97,8% ou mais identidade, 98,0% ou mais de identidade, 98,2% ou mais de identidade, 98,4% ou mais de identidade, ou 98,6% ou mais de identidade, 98,8% ou mais de identidade, 99,0% ou mais de identidade, 99,2% ou mais de identidade, 99,4% ou mais de identidade, 99,6% ou mais de identidade, 99,8% ou mais de identidade ou 100% de identidade com a SEQ ID Nº: 1. Vetores

[00126] A vacina pode compreender um ou mais vetores que incluem um ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno BORIS de consenso sintético. Por exemplo, os um ou mais vetores podem incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica um comprimento inteiro da sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro SEQ ID Nº: 2; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2. Os um ou mais vetores podem incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2. Os um ou mais vetores podem ser capazes de expressar o antígeno BORIS de consenso sintético em uma quantidade eficaz para provocar uma resposta imune no mamífero. O vetor pode compreender ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno BORIS de consenso sintético. O vetor pode ter uma sequência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. O vetor pode ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. O vetor pode ser um vetor cromossômico extra de autorreplicação ou um vetor que se integra ao genoma do hospedeiro.

[00127] Os um ou mais vetores podem ser uma construção de expressão, que geralmente é um plasmídeo usado para introduzir um gene específico em uma célula alvo. Uma vez que o vetor de expressão esteja dentro da célula, a proteína que é codificada pelos complexos ribossômicos de máquina de transcrição e tradução celular. O plasmídeo é frequentemente engenheirado para conter sequências reguladoras que atuam como regiões intensificadoras e promotoras e levam à transcrição eficiente do gene transportado no vetor de expressão. Os vetores da presente invenção expressam grandes quantidades de RNA mensageiro estável e, portanto, proteínas.

[00128] Os vetores podem ter sinais de expressão como um promotor forte, um códon de terminação forte, ajuste da distância entre o promotor e o gene clonado e a inserção de uma sequência de terminação de transcrição e uma PTIS (sequência de iniciação de tradução portátil).

[00129] O vetor pode ser um plasmídeo circular ou um ácido nucleico linear. O plasmídeo circular e o ácido nucleico linear são capazes de direcionar a expressão de uma sequência nucleotídica específica em uma célula em questão apropriada. O vetor pode ter um promotor operacionalmente ligado à sequência nucleotídica que codifica o antígeno, que pode estar operacionalmente ligada aos sinais de terminação. O vetor também pode conter sequências necessárias para a tradução adequada da sequência nucleotídica, bem como sequências para clonar e subclonar o vetor e fragmentos dos mesmos. O vetor compreendendo a sequência nucleotídica de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo em relação a pelo menos um de seus outros componentes. A expressão da sequência nucleotídica no cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo específico. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento específico. Numa modalidade preferida, o vetor plasmídeo é pGX1440 no presente documento descrito, compreendendo ainda a sequência de ácido nucleico da SEQ ID Nº: 1.

[00130] O vetor pode ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfectar células com ácido nucleico que codifica o antígeno. As células hospedeiras transformadas podem ser cultivadas e mantidas sob condições em que a expressão do antígeno ocorre.

[00131] O plasmídeo pode compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais dos vários antígenos descritos acima, incluindo sequências de codificação que codificam antígeno de consenso sintético capaz de provocar uma resposta imune contra um antígeno, fragmentos dessas proteínas, variantes dessas proteínas, fragmentos de variantes ou proteínas de fusão que são constituídos por combinações de proteínas de consenso e/ou fragmentos de proteína de consenso e/ou variantes de proteína de consenso e/ou fragmentos de proteínas de consenso de variantes.

[00132] Um único plasmídeo pode conter sequência de codificação para um único antígeno, sequência de codificação para dois antígenos, sequência de codificação para três antígenos ou sequência de codificação para quatro antígenos.

[00133] Em algumas modalidades, um plasmídeo pode ainda compreender a sequência de codificação que codifica o CCR20 sozinho ou como parte de um desses plasmídeos. Da mesma forma, os plasmídeos podem ainda compreender sequências de codificação para IL-12, IL-15 e/ou IL-28.

[00134] O plasmídeo pode ainda compreender um códon de iniciação, que pode estar a montante da sequência de codificação, e um códon de parada, que pode estar a jusante da sequência de codificação. O códon de iniciação e terminação pode estar in frame com a sequência de codificação.

[00135] O plasmídeo também pode compreender um promotor que está operacionalmente ligado à sequência de codificação. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação pode ser um promotor do vírus símio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), um vírus da imunodeficiência humana (HIV ), como o promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imunodeficiência bovina (BIV), um promotor do vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do citomegalovírus (CMV), como o promotor imediato do CMV, vírus Epstein Barr (EBV) ou um promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV). O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou metalotioneína humana. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele, natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na publicação do pedido de patente US Nº US20040175727, cujo conteúdo é no presente documento incorporado na sua totalidade.

[00136] O plasmídeo também pode compreender um sinal de poliadenilação, que pode estar a jusante da sequência de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação SV40, sinal de poliadenilação LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (bGH), sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento humano (hGH) ou sinal de poliadenilação de β-globina humana. O sinal de poliadenilação SV40 pode ser um sinal de poliadenilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).

[00137] O plasmídeo também pode compreender um potenciador a montante da sequência de codificação. O intensificador pode ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou um intensificador viral como um de CMV, FMDV, RSV ou EBV. Os intensificadores da função de polinucleotídeo são descritos nas Patentes US 5.593.972, 5.962.428 e WO94/016737, cujos conteúdos está totalmente incorporado por referência.

[00138] O plasmídeo também pode compreender uma origem de replicação em mamíferos, a fim de manter o plasmídeo extracromossômica e produzir várias cópias do plasmídeo em uma célula. O plasmídeo pode ser pVAXI, pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein-Barr e da região de codificação EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir replicação epissômica de alta cópia sem integração. A espinha dorsal do plasmídeo pode ser pA V0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus do tipo 5 (Ad5) com defeito de replicação.

[00139] O plasmídeo também pode compreender uma sequência reguladora, que pode ser bem adequada para a expressão genética em uma célula na qual o plasmídeo é administrado. A sequência de codificação pode compreender um códon que pode permitir a transcrição mais eficiente da sequência de codificação na célula hospedeira.

[00140] A sequência de codificação também pode compreender uma sequência líder de Ig. A sequência líder pode estar 5' da sequência de codificação. Os antígenos de consenso codificados por esta sequência podem compreender um líder de Ig do terminal N seguido por uma proteína de antígeno de consenso. O líder de Ig do terminal N pode ser IgE ou IgG.

[00141] O plasmídeo pode ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em Escherichia coli (E. coli). O plasmídeo também pode ser p YES2

(Invitrogen, San Diego, Calif.), que pode ser usado para produção de proteínas em cepas de levedura de Saccharomyces cerevisiae. O plasmídeo também pode ser o sistema de expressão baculovírus completo MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de insetos. O plasmídeo também pode ser pcDNA I ou pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO).

[00142] O vetor pode ser circular, o que pode transformar uma célula alvo por integração no genoma celular ou existir extracromossômica (por exemplo, plasmídeo replicador autônomo com origem de replicação).

[00143] O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0 ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antígeno e permitir que uma célula traduza a sequência em um antígeno que seja reconhecido pelo sistema imunológico.

[00144] Também é no presente documento fornecida uma vacina linear de ácido nucleico, ou cassete de expressão linear ("LEC"), que é capaz de ser distribuída de maneira eficiente a um indivíduo por eletroporação e expressar um ou mais antígenos desejados. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer espinha dorsal de fosfato. O DNA pode codificar um ou mais antígenos. O LEC pode conter um promotor, um íntron, um códon de parada e/ou um sinal de poliadenilação. A expressão do antígeno pode ser controlada pelo promotor. O LEC não pode conter nenhum gene de resistência a antibióticos e/ou um espinha dorsal de fosfato. O LEC pode não conter outras sequências de ácidos nucleicos não relacionadas à expressão genética de antígeno desejada.

[00145] O LEC pode ser derivado de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o antígeno. O plasmídeo pode ser pNP (Puerto Rico/34) ou pM2 (New Caledonia/99). O plasmídeo pode ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0 ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antígeno e permitir que uma célula traduza a sequência em um antígeno que seja reconhecido pelo sistema imunológico.

[00146] O LEC pode ser pcrM2. O LEC pode ser pcrNP. O pcrNP e o pcrMR podem ser derivados de pNP (Puerto Rico/34) e pM2 (New Caledonia/99), respectivamente.

[00147] O vetor pode ter um promotor. Um promotor pode ser qualquer promotor que seja capaz de dirigir a expressão genética e regular a expressão do ácido nucleico isolado. Esse promotor é um elemento de sequência de ação cis necessário para a transcrição via RNA polimerase dependente de DNA, que transcreve a sequência de antígeno no presente documento descrita. A seleção do promotor usado para direcionar a expressão de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação particular. O promotor pode ser posicionado aproximadamente na mesma distância do início da transcrição no vetor, uma vez que é a partir do local de início da transcrição em seu cenário natural. No entanto, a variação nessa distância pode ser acomodada sem perda da função do promotor.

[00148] O promotor pode ser operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica o antígeno e os sinais necessários para a poliadenilação eficiente do transcrito, dos sítios de ligação ao ribossomo e da terminação da tradução.

[00149] O promotor pode ser um promotor de CMV, promotor precoce de SV40, promotor posterior de SV40, promotor de metalotioneína, promotor de vírus de tumor mamário murino, promotor de vírus de sarcoma Rous, promotor de poliedrina ou outro promotor mostrado eficaz para expressão em células eucarióticas.

[00150] O vetor pode incluir um intensificador e um íntron com sítios funcionais de doador e aceitador de emenda. O vetor pode conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar uma terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida do mesmo gene que a sequência do promotor ou pode ser obtida de genes diferentes. Métodos de Preparação do Vetor

[00151] São descritos neste documento os métodos para preparação de vetores que compreendem as vacinas de DNA discutidas no presente documento. Os vetores, após a etapa final de subclonagem, podem ser usados para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em grande escala, usando métodos conhecidos na técnica.

[00152] O vetor para uso com os dispositivos EP, que são descritos abaixo em mais detalhes, pode ser formulado ou fabricado usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas de preferência eles são fabricados usando uma técnica otimizada de fabricação, descrita em um pedido provisório US licenciado e copendente, US 60/939.792, depositado em 23 de maio de 2007 (ver Pub. Pat. US 20090004716). Em alguns exemplos, os vetores de DNA usados nestes estudos podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além dos descritos em US 60/939792, incluindo os descritos em uma Patente US

7.238.522, emitida em 3 de julho de 2007. O pedido e a patente mencionados precedentemente, US 60/939.792 e a Patente US

7.238.522, respectivamente, são incorporados na sua totalidade. Excipientes e outros Componentes da Vacina

[00153] A vacina pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser uma molécula funcional, como um veículo, transportador ou diluente. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos de quinona, vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico, lipídeos, lipossomas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos.

[00154] O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. O agente facilitador da transfecção é o poli-L-glutamato, e o poli-L-glutamato pode estar presente na vacina a uma concentração inferior a 6 mg/ml. O agente facilitador de transfecção também pode incluir agentes ativos de superfície, tais como os complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freunds, análogos de LPS incluindo o lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos da quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, e o ácido hialurônico pode ser administrado em conjunto com a construção genética. As vacinas de vetor de DNA também podem incluir um agente facilitador da transfecção, como lipídios, lipossomos, incluindo lipossomos de lecitina ou outros lipossomos conhecidos na técnica, como uma mistura DNA-lipossomo (ver, por exemplo, W09324640), íons cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions ou nanopartículas ou outros agentes facilitadores da transfecção conhecidos. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. A concentração do agente de transfecção na vacina é de menos de 4 mg/ml, menos de 2 mg/ml, menos de 1 mg/ml, menos de 0,750 mg/ml, menos de 0,500 mg/ml, menos de 0,250 mg/ml, menos de 0,100 mg/ml, menos de 0,050 mg/ml, ou menos de 0,010 mg/ml.

[00155] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes podem ser outros genes que são expressos em um plasmídeo alternativo ou vetor são distribuídos como proteínas em combinação com o plasmídeo ou vetor acima na vacina. Os um ou mais adjuvantes podem ser selecionados do grupo que consiste em: CCL20, interferon-α (IFN-α), interferon-β (IFN-β), interferon γ, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), quimiocina cutânea que atrai células T (CTACK), quimiocina epitelial expressa em timo (TECK), quimiocina epitelial associada a mucosas (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-10, IL-18, IL-33, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-selectina, P- selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M- CSF, G-CSF, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblastos, IL-7, fator de crescimento de nervos, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativo, SAP K, SAP-I, JNK, genes de resposta a interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-15 tendo a sequência sinal ou sequência de codificação que codifica a sequência sinal excluída e, opcionalmente, incluindo um peptídeo de sinal diferente, como aquele de IgE, ou a sequência de codificação que codifica um peptídeo de sinal diferente, como aquele de IgE, e fragmentos funcionais dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos. O adjuvante pode ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), TNF, TNF, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10, IL-12, IL-18 ou uma combinação dos mesmos.

[00156] Em algumas modalidades, o adjuvante pode ser uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas selecionadas do grupo que consiste em: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC ou RANTES. Exemplos de construções e sequências de IL-12 são descritos no pedido PCT no. PCT/US 1997/019502 e Pedido US 08/956.865, e Pedido Provisório US 61/569600 depositado em 12 de dezembro de 2011, cada um no presente documento incorporado por referência. Exemplos de construções e sequências de IL-15 são descritos no pedido PCT PCT/US04/18962 e Pedido US correspondente 10/560.650 e no pedido PCT PCT/US07/00886 e Pedido US correspondente 12/160.766, e no pedido PCT PCT/US10/048827, que são cada um no presente documento incorporados por referência. Exemplos de construções e sequências de IL-28 são descritos no pedido PCT PCT/US09/039648 e Pedido US correspondente 12/936.192, que são no presente documento incorporados por referência. Exemplos de RANTES e outros construções e sequências são descritos no pedido PCT Nº. PCT/US1999/004332 e Pedido US correspondente e 09/622.452, que são no presente documento incorporados por referência. Outros exemplos de construções e sequências RANTES são descritos no pedido PCT PCT/US11/024098, que é no presente documento incorporado por referência. Exemplos de RANTES e outras construções e sequências são descritos no pedido PCT Nº. PCT/US1999/004332 e Pedido US correspondente 09/622.452, que são no presente documento incorporados por referência. Outros exemplos de construções e sequências RANTES são descritos no pedido PCT PCT/US11/024098, que é no presente documento incorporado por referência. Exemplos de quimiocinas construções e sequências CTACK, TECK e MEC são descritos no pedido PCT PCT/US2005/042231 e Pedido US correspondente 11/719.646, que são no presente documento incorporados por referência. Exemplos de OX40 e outros imunomoduladores são descritos no Pedido US 10/560.653, que é no presente documento incorporado por referência. Exemplos de DR5 e outros imunomoduladores são descritos no Pedido US 09/622.452, que é no presente documento incorporado por referência.

[00157] Outros genes que podem ser úteis como adjuvantes incluem os que codificam: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L- selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA- 1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento do fibroblasto, IL- 7, IL-22, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor do TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativa, SAP K, SAP-1, JNK, genes de resposta a interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 e fragmentos funcionais dos mesmos.

[00158] A vacina pode ainda compreender um agente facilitador de vacina genético como descrito em US 021.579 depositado em 1 de abril de 1994, o qual é totalmente incorporado por referência.

[00159] A vacina pode compreender o vetor que codifica o antígeno em quantidades de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou preferivelmente cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou mais preferivelmente cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas. Em algumas modalidades preferidas, a vacina de acordo com a presente invenção compreende cerca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas, de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; de cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 1 miligrama a 2 miligramas, de cerca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 microgramas, de cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas, de cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas, de cerca de 1 a 350 microgramas, de 25 a 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas do antígeno ou plasmídeo que codifica os mesmos.

[00160] A vacina pode ser formulada de acordo com o modo de administração a ser usado. Uma vacina injetável pode ser estéril, livre de pirogênio e livre de partículas. Uma formulação ou solução isotônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A vacina pode compreender um agente de vasoconstrição. As soluções isotônicas podem incluir solução salina tamponada com fosfato. A vacina pode ainda compreender estabilizantes, incluindo gelatina e albumina. Os estabilizantes podem permitir que a formulação seja estável à temperatura da sala ou ambiente por longos períodos de tempo, incluindo LGS ou policátions ou poliânions. Composições Farmacêuticas da Vacina

[00161] A vacina pode estar na forma de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode compreender a vacina. As composições farmacêuticas podem compreender cerca de 5 nanogramas (ng) até cerca de 10 miligramas (mg) da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem cerca de 25 ng a cerca de 5 mg da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 50 ng para cerca de 1 mg da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 350 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 5 a cerca de 250 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 10 a cerca de 200 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 15 a cerca de 150 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 20 a cerca de 100 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 75 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades,

as composições farmacêuticas contêm cerca de 30 a cerca de 50 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 35 a cerca de 40 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 10 microgramas a cerca de 100 microgramas de DNA da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 20 microgramas a cerca de 80 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 25 microgramas a cerca de 60 microgramas de DNA da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 30 ng a cerca de 50 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 35 ng a cerca de 45 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 350 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 250 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

[00162] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ng de DNA da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem compreender pelo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 ou 1.000 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender pelo menos 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg ou mais da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

[00163] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ng da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275,

280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 ou 1.000 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

[00164] A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente outros agentes para fins de formulação, de acordo com o modo de administração a ser usado. Nos casos em que composições farmacêuticas são composições farmacêuticas injetáveis, elas são estéreis, livres de pirogênio e livres de material particulado. Uma formulação isotônica é preferencialmente usada. Em geral, aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Em alguns casos, soluções isotônicas, tal como tampão fosfato-salino, são preferenciais. Estabilizadores incluem gelatina e albumina. Em algumas modalidades, um agente de vasoconstrição é adicionado à formulação.

[00165] A composição farmacêutica pode ainda compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, como fornecido acima na Seção 2. Por exemplo, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode compreender as moléculas funcionais, veículos, adjuvantes, transportadores, diluentes ou agentes facilitadores da transfecção, como fornecido na Seção 2.

Indicações

[00166] As vacinas e as composições farmacêuticas compreendendo as vacinas no presente documento fornecidas podem ser usadas no tratamento ou prevenção de células cancerígenas e tumores baseados em câncer que expressam BORIS. Em particular, as vacinas e as composições farmacêuticas compreendendo as vacinas no presente documento fornecidas podem ser usadas no tratamento ou prevenção de câncer de ovário, mais particularmente câncer epitelial de ovário, mais particularmente câncer seroso de ovário. Métodos de Vacinação

[00167] São no presente documento fornecidos métodos para o tratamento e/ou prevenção do câncer usando as formulações farmacêuticas descritas acima. Também no presente documento descritos são métodos de utilização das formulações farmacêuticas descritas acima no tratamento e/ou prevenção de câncer em um indivíduo. Também são no presente documento descritos métodos de vacinar um indivíduo. Também são no presente documento descritos métodos de administração das formulações farmacêuticas no presente documento descritas a um indivíduo em necessidade das mesmas. Os métodos no presente documento descritos coletivamente referidos como métodos de tratamento utilizando as formulações farmacêuticas no presente documento descritas podem compreender administrar uma ou mais vacinas como no presente documento descritas a um indivíduo em necessidade das mesmas para induzir uma resposta imune terapêutica e/ou profilática. A vacina pode ser administrada a um indivíduo para modular a atividade do sistema imune do indivíduo e intensificar a resposta imune. A administração da vacina pode ser a transfecção dos antígenos de câncer como descrito no presente documento como uma molécula de ácido nucleico que é expressa na célula e distribuída à superfície da célula, em que o sistema imunológico reconhece e induz uma resposta celular, humoral ou celular e humoral. A administração da vacina pode ser usada para induzir ou desencadear uma resposta imune em indivíduos contra um ou mais dos antígenos de câncer como descritos no presente documento por administração aos indivíduos da vacina tal como no presente documento discutida.

[00168] A vacina pode ser administrada a um indivíduo para modular a atividade do sistema imunológico do indivíduo, aumentando assim a resposta imune. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Após a administração da vacina ao mamífero, e portanto, a introdução do vetor para as células do mamífero, as células transfectadas expressam e segregam um ou mais dos antígenos de câncer como no presente documento descritos. Estas proteínas secretadas, ou antígenos sintéticos, serão reconhecidos como estrangeiros pelo sistema imune, que ajustarão uma resposta imune que pode incluir: anticorpos produzidos contra um ou mais antígenos de câncer e uma resposta de célula T especificamente contra um ou mais antígenos de câncer. Em alguns exemplos, um mamífero vacinado com as vacinas no presente documento discutidas terá um sistema imunológico iniciado e quando desafiado com um ou mais antígenos de câncer como descrito no presente documento, o sistema imunológico imunizado permitirá a limpeza rápida de antígenos de câncer subsequentes, como descrito no presente documento, seja através das respostas imunes humoral, celular, ou ambas celular e humoral.

[00169] Os métodos de administração do DNA de uma vacina são descritos nas Patentes US 4.945.050 e 5.036.006, ambas as quais são no presente documento incorporadas na sua totalidade por referência.

[00170] A vacina pode ser administrada a um mamífero para provocar uma resposta imune em um mamífero. O mamífero pode ser humano, primata não humano, vaca, porco, ovelha, cabra, antílope, bisonte, búfalo de água, bovídeos, veados, ouriços, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos e, de preferência humano, vaca ou porco. A vacina também pode ser administrada a um indivíduo não mamífero, por exemplo, um frango, para provocar uma resposta imune.

[00171] A dose da vacina pode estar entre 1 micrograma e 10 mg de componente ativo por quilograma (kg) de peso corporal ao longo do tempo (componente/kg de peso corporal/tempo) e pode ser de 20 microgramas a 10 mg de componente/kg de peso corporal/tempo. A vacina pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses da vacina para tratamento eficaz pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais doses. Método de Geração de uma Resposta Imune com a Vacina

[00172] A vacina fornecida pode ser usada para gerar uma resposta imune em um indivíduo mamífero ou não mamífero, incluindo respostas imunes terapêuticas e profiláticas. A resposta imune pode gerar anticorpos e/ou células T assassinas que são dirigidas para um ou mais antígenos de câncer, como no presente documento descrito. Esses anticorpos e as células T podem ser isolados.

[00173] Algumas modalidades fornecem métodos para gerar respostas imunes contra um ou mais dos antígenos do câncer, como descrito neste documento, modalidades que compreendem administrar a vacina a um indivíduo. Algumas modalidades proporcionam métodos de vacinação profilática de um indivíduo contra um câncer ou tumor expressando um ou mais dos antígenos de câncer, como descrito acima, cujas modalidades compreendem administrar a vacina. Algumas modalidades proporcionam métodos de vacinação terapêutica de um indivíduo que vem sofrendo de câncer ou tumor expressando um ou mais dos antígenos de câncer, cujas modalidades compreendem administrar a vacina. O diagnóstico do câncer ou tumor que expressa um ou mais antígenos do câncer, como descrito no presente documento antes da administração da vacina, pode ser feito rotineiramente. Métodos de Tratamento do Câncer com a Vacina

[00174] A vacina pode ser usada para gerar ou desencadear uma resposta imune em um mamífero que é reativo ou direcionado a um câncer ou tumor que expressa BORIS (por exemplo, câncer de ovário) do mamífero ou indivíduo em necessidade do mesmo. A resposta imune provocada pode prevenir o câncer ou o crescimento do tumor.

[00175] A resposta imune provocada pode prevenir e/ou reduzir a metástase de células cancerígenas ou tumorais. Por conseguinte, a vacina pode ser usada num método que trata e/ou previne o câncer ou tumores no mamífero ou indivíduo administrado com a vacina. Vias de Administração

[00176] A vacina ou composição farmacêutica pode ser administrada por diferentes vias, incluindo via oral, parenteral, sublingual, transdérmica, retal, transmucosa, tópica, via inalação, via administração bucal, intrapleural, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal intratecal e/ou intra-articularmente, ou combinações dos mesmos. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação devidamente aceitável em conformidade com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e a via de administração que é a mais apropriada para um animal particular. A vacina pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, biobalística ("microprojectile bombardment gene guns") ou outros métodos físicos, tal como eletroporação ("EP"), "método hidrodinâmico", ou ultrassom.

[00177] O vetor da vacina pode ser administrado ao mamífero por várias tecnologias conhecidas, incluindo injeção de DNA (também conhecida como vacinação de DNA) com e sem eletroporação in vivo, transfecção mediada por lipossomas, transfecção facilitada por nanopartículas e uso de vetores recombinantes, como adenovírus recombinantes, vírus associado a adenovírus recombinante e vaccinia recombinante. O um ou mais antígenos de câncer da vacina podem ser administrados via injeção de DNA junto com eletroporação in vivo.

[00178] A vacina ou composição farmacêutica compreendendo a vacina pode ser administrada por eletroporação. A administração da vacina através de eletroporação pode ser realizada usando os dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para distribuir a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer com que poros reversíveis se tornem em membranas de célula, e preferivelmente o pulso de energia é um similar atual constante a uma entrada corrente predeterminada por um usuário. O aparelho de eletroporação pode compreender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodo ou conjunto de manuseio. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos diversos elementos dos dispositivos de eletroporação, incluindo: controlador, gerador de forma de onda de corrente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento de relatório de status, porta de comunicação, componente de memória, fonte de energia e interruptor. A eletroporação pode ser realizada usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, sistema CELLECTRA® EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) ou eletroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) para facilitar a transfecção de células pelo plasmídeo.

[00179] Exemplos de dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem facilitar a administração das vacinas de DNA da presente invenção incluem aqueles descritos na Patente US

7.245.963 por Draghia-Akli, et al, Pub. de Patente US 2005/0052630 apresentado por Smith, et al., cujos conteúdos estão no presente documento incorporados por referência na sua totalidade. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser usados para facilitar a administração das vacinas de DNA incluem os fornecidos no Pedido de Patente US copendente e coproprietário, 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício em 35 USC 119 (e) a Pedidos Provisórios US 60/852.149, depositado em 17 de outubro de 2006, e 60/978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, todos incorporados neste documento em sua totalidade.

[00180] A Patente US Nº 7.245.963 de Draghia-Akli, et al. descreve sistemas de eletrodo modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Os sistemas de eletrodo modular podem compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que fornece uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia . Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são administradas por meio de agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula, entre a pluralidade de eletrodos. Todo o conteúdo da Patente US 7.245.963 é no presente documento incorporado por referência em sua totalidade.

[00181] Pub. Patente US 2005/0052630 apresentada por Smith, et al. descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para facilitar efetivamente a introdução de uma biomolécula nas células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. O aparelho de eletroporação compreende um dispositivo eletro-cinético ("dispositivo EKD"), cuja operação é especificada pelo software ou firmware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante programáveis entre eletrodos em uma disposição com base no controle de usuário e na entrada dos parâmetros de pulso e permite o armazenamento e a aquisição de dados de forma de onda corrente. O aparelho de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma disposição de eletrodos de agulha, um canal de injeção central para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. Todo o conteúdo da Pub. de Patente US 2005/0052630 é totalmente no presente documento incorporado por referência.

[00182] Os arranjos e métodos de eletrodo descritos na Patente US Nº 7.245.963 e Pedido de patente US 2005/0052630 podem ser adaptados para penetração profunda não apenas nos tecidos tal como o músculo, mas também outros tecidos ou órgãos. Por causa da configuração da matriz de eletrodo, a agulha de injeção é também inserida completamente no órgão-alvo e a injeção é administrada perpendicular ao fator alvo, na área que é previamente delineada por eletrodos. Os eletrodos descritos na Patente US 7.245.963 e Pub. de Patente US 2005/005263 têm preferivelmente 20 mm de comprimento e calibre 21.

[00183] Além disso, contemplado em algumas modalidades, que incorporam dispositivos de eletroporação e seus usos, existem dispositivos de eletroporação que são os descritos nas seguintes patentes: Patente US 5.273.525, emitida em 28 de dezembro de 1993,

Patente US 6.110.161, emitida em 29 de agosto de 2000, 6.261.281, emitida em 17 de julho, 2001 e 6.958.060, emitida em 25 de outubro de 2005 e patente US 6.939.862, emitida em 6 de setembro de 2005. Além disso, as patentes que cobrem o assunto em questão fornecido na patente US 6.697.669, emitida em 24 de fevereiro de 2004, que diz respeito à administração de DNA usando qualquer um de uma variedade de dispositivos, e a Patente US 7.328.064, emitida em 5 de fevereiro de 2008, desenhada para o método de injeção de DNA, são contempladas no presente documento. As patentes precedentes são incorporadas por referência na sua totalidade. Métodos de Preparação da Vacina

[00184] São no presente documento fornecidos métodos para preparar os vetores que compreendem a(s) molécula(s) de ácido nucleico que codificam o antígeno BORIS de consenso sintético discutido no presente documento. Os vetores de DNA, após a etapa final de subclonagem no plasmídeo de expressão de mamíferos, podem ser usados para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em larga escala, usando os métodos conhecidos na técnica.

[00185] Os vetores de DNA para uso com os dispositivos EP da presente invenção podem ser formulados ou fabricados usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas preferencialmente são fabricados usando uma técnica de fabricação de plasmídeo otimizada descrita em um pedido publicado US 20090004716, depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os vetores de DNA usados nestes estudos podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além dos descritos em US 60/939792, incluindo os descritos em uma Patente US 7.238.522, emitida em 3 de julho de

2007. O pedido e a patente mencionados precedentemente, US 60/939.792 e a Patente US 7.238.522, respectivamente, são incorporados na sua totalidade.

[00186] A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitativos. Exemplos

[00187] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos. Deve ser entendido que estes exemplos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são providos a título de ilustração apenas. A partir da discussão precedente e nestes exemplos, um versado na técnica pode avaliar as características essenciais da presente invenção e, sem fugir de seu espírito e escopo, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições. Assim, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas no presente documento, serão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição precedentemente mencionada. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1 - Geração de antígeno BORIS de consenso sintético

[00188] Para gerar um BORIS de consenso humano, foram coletadas 7 sequências BORIS do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Os números de acessão do GenBank para as sequências selecionadas da subfamília BORIS 1 são: NP_542185.2, XP_009435727.1, XP_004062465.1, XP_002830505.1, XP_003806212.1, XP_011833550.1, e XP_003253023.1.

[00189] Uma sequência de consenso foi gerada usando o pacote de software DNASTAR® Lasergene (versão 13.0.0.357). As sete sequências listadas acima foram importadas para o MegAlign e alinhadas usando o programa de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW. A sequência de consenso BORIS resultante compartilha 98,6% de identidade com o BORIS nativo humano.

[00190] Para abolir a função biológica potencial da sequência de consenso BORIS, foram introduzidas 22 mutações (duas mutações em cada um dos 11 dedos de zinco) para interromper a estrutura dos dedos de zinco e o potencial de ligação ao DNA. Além disso, como o BORIS é um fator de transcrição, uma mutação foi introduzida para impedir a localização nuclear. A justificativa para a introdução dessas mutações é descrita abaixo. Mutações no Dedo de Zinco

[00191] CTCF e CTCFL (BORIS) são genes paralógicos que possuem os mesmos éxons que codificam o domínio de 11 dedos de zinco (e o mesmo potencial de ligação ao DNA). As cisteínas nos onze dedos de zinco no BORIS de consenso foram mutadas para glicina para interromper a estrutura e a ligação dos dedos de zinco. Mutações no Sinal de Localização Nuclear (NLS)

[00192] Como o BORIS é um fator de transcrição, um sinal de localização nuclear predito foi identificado usando o programa Stockholm Bioinformatics Center NucPred (www.sbc.su.se/~maccallr/nucpred/cgi-bin/single.cgi). O sinal de localização nuclear predito no BORIS possui o tipo de NLS monopartido de classe 1 com quatro aminoácidos básicos consecutivos. Para impedir a localização nuclear, o sinal de localização nuclear foi alterado de RKRK para RRRK.

[00193] Após a geração da sequência de consenso BORIS e as mutações subsequentes no dedo de zinco e nas sequências de DNA NLS, a sequência de proteína de antígeno de consenso sintético resultante BORIS compartilha 95,2% de identidade com a isoforma de proteína BORIS nativa humana "sf1" (isto é, NP_542185.2).

[00194] Uma vez obtida a sequência de DNA de antígeno BORIS de consenso sintético, a fim de obter um nível de expressão mais alto, uma sequência de Kozak a montante e a sequência líder de IgE foram adicionados ao terminal N.

Além disso, o uso de códons desse gene foi adaptado ao viés de códons dos genes do Homo sapiens. (Andre, S. et al.

Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage.

Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al.

Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein.

Journal of virology 75, 10991-11001, doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001 (2001)). Além disso, a otimização do RNA também foi realizada: regiões com teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%) e os motivos de sequência de ação cis como caixas TATA internas, sítios chi e sítios de entrada ribossômicos foram evitadas. (Muthumani, K. et al.

Novel engineered HIV-1 East African Clade-A gp160 plasmid construct induces strong humoral and cell-mediated immune responses in vivo.

Virology 314, 134-146 (2003); Schneider, R., Campbell, M., Nasioulas, G., Felber, B.

K. & Pavlakis, G.

N.

Inactivation of the human immunodeficiency virus type 1 inhibitory elements allows Rev-independent expression of Gag and Gag/protease and particle formation.

Journal of virology 71, 4892- 4903 (1997)). A sequência de DNA do antígeno BORIS de consenso sintético foi digerida com BamHI e XhoIe clonada em um vetor de expressão proprietário pGX0001 com a cassete de expressão colocada sob o controle de transcrição do promotor imediato-precoce do citomegalovírus.

O plasmídeo resultante foi designado pGX1440 e a sequência completa foi realizada e depois analisada e confirmada como correta.

Uma representação esquemática da construção de DNA do antígeno BORIS de consenso sintético é mostrada na Figura 1. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos do antígeno BORIS de consenso sintético da invenção são apresentadas na SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 2, respectivamente.

As características do DNA de antígeno BORIS de consenso sintético e sequências de proteínas estão resumidas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 1. Recursos da SEQ ID Nº: 2 Característica Posição de aminoácido Sequência líder IgE 1-18 Sequência de codificação BORIS 19-680 Mutações para interromper a C276G, C279G, C304G, C307G ligação dos dedos de zinco C332G, C335G, C361G, C364G C389G, C392G, C417G, C420G C447G, C450G, C477G, C480G C505G, C508G, C533G, C536G C565G, C568G Mutação para interromper o anexo K603R da GPI

Tabela 2. Características do antígeno BORIS de consenso sintético Características antígeno BORIS de consenso sintético (SEQ ID Nº: 2) Identidade com o BORIS humano nativo 95,2% Identidade do rhesus nativo BORIS 81,5 a 91,8% Identidade com o BORIS de camundongo nativo 56,5 a 57,4% Número de mutações de aminoácidos (vs 32 humano nativo) Número de mutações inseridas (não derivadas 23 de consenso) Peso molecular 680 aa (75 KDa) Comprimento da sequência de codificação (bp) 2046

Exemplo 2 - Construção de vetores de expressão pGX1440 BORIS

[00195] O pGX0001 (um vetor de expressão pVAX1 modificado) sob o controle do promotor imediato-precoce do citomegalovírus humano (promotor hCMV) foi usado como vetor de espinha dorsal. O pVAX1 original foi obtido da Thermo Fisher Scientific.

[00196] Foram introduzidas modificações no pVAX1 para criar o pGX0001 e são identificadas com base na sequência relatada do pVAX1 disponível na ThermoFisher Scientific. Essas modificações estão listadas abaixo e não foram detectados problemas com relação à amplificação do plasmídeo e à transcrição e tradução do antígeno. Não foram observadas mais alterações na sequência de pGX0001 até à data em qualquer um dos produtos plasmídicos na plataforma utilizando pGX0001 como espinha dorsal. Descrição do Par de Base de Modificação

[00197] C>G 241 no promotor CMV

[00198] C>T 1158 espinha dorsal, a jusante do hormônio de crescimento bovino Sinal de poliadenilação (bGH polyA)

[00199] A> - 2092 espinha dorsal, a jusante do gene de resistência à canamicina

[00200] C>T 2493 na origem de replicação da pUC (pUC ori)>

[00201] G>C 2969 no final de pUC Ori a montante do sítio RNASeH

[00202] Os pares de base 2, 3 e 4 foram alterados de ACT para CTG na estrutura principal, a montante do promotor de CMV.

[00203] O pGX1440 é um plasmídeo de DNA que codifica a proteína do antígeno BORIS de consenso sintético. A produção de mRNA relacionada é conduzida por um promotor de CMV humano (promotor de hCMV) e terminada pelo sinal de poli-adenilação da extremidade 3' do hormônio de crescimento bovino (bGH polyA). A espinha dorsal pGX0001 inclui o gene de resistência à canamicina (KanR) e a origem da replicação do plasmídeo (pUC ori) para fins de produção. Esses elementos não são funcionais nas células eucarióticas. O pGX1440 foi produzido pela clonagem da sequência de DNA do antígeno de consenso sintético BORIS em pGX0001 nos locais BamHI e XhoI, como ilustrado na Figura 4. Exemplo 3 - Imunogenicidade das construções de antígeno BORIS de consenso sintético

[00204] A imunogenicidade da construção da vacina projetada para direcionar o BORIS humano, o antígeno BORIS de consenso sintético (pGX1440), foi avaliada em camundongos. A expressão da proteína antigênica pela construção também foi avaliada in vitro por Western blotting. Materiais e Métodos Plasmídeos

[00205] Para estudos in vitro e in vivo, o plasmídeo (10 mg) foi encomendado do GenScript para pGX1440 (lote # U0638BC040S- 3/G61425). A sequência de antígeno do estoque de plasmídeo de 10 mg foi confirmada pelo sequenciamento de Sanger e confirmada quanto à precisão. Expressão de Antígeno in vitro

[00206] A expressão da proteína antigênica por pGX1440 foi confirmada por western blotting. As células de rabdomiossarcoma humano (RD) (ATCC, CCL-136) mantidas em meio DMEM com 10% de FBS (ThermoFisher) foram transfectadas com pGX1440 ou pGX0001 (prato de 6 µg/10cm2) usando Turbofectina 8 (Origene). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas usando tampão de lise celular RIPA (ThermoFisher) e o lisado celular foi coletado. Após um ensaio de BCA (ThermoFisher) para determinar a concentração total de proteínas, 15 pg de lisado celular foram submetidos a eletroforese em gel de SDS-PAGE 4-12% (ThermoFisher) e a detecção foi realizada com um anticorpo monoclonal anti-BORIS (CTCFL) (AbCam, clone126778) e visualizado com IgG anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Santa Cruz Biotech, sc-2005) utilizando um sistema de análise de western blot ECL (GE Amersham). Como controle de carregamento, as transferências foram novamente sondadas quanto à expressão de actina usando um anticorpo monoclonal anti-β-actina (Santa Cruz Biotech, clone, C4). Animais e Imunizações

[00207] Camundongos fêmeas CB6F1 de 8 semanas de idade foram comprados da Jackson Laboratories. Todos os animais foram alojados em uma instalação com ciclo de luz e temperatura controlada na BTS Research (San Diego, CA). O cuidado com os animais foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e a Proposta de Cuidado e Uso de Animais (ACUP) (BTS ACUP # 15-091). Os camundongos foram divididos em cinco grupos, como detalhado na Tabela 3. Tabela 3. Grupos de Estudo Dose de Volume de Grupo n Construção construção (μg) injeção (µL) 1 4 pGX0001 30 30 2 8 pGX1440 10 30 3 8 pGX1440 20 30 4 8 pGX1440 30 30 5 8 pGX1440 50 30

[00208] Os camundongos nos grupos imunizados foram vacinados com as doses indicadas de pGX0001 ou pGX1440. Resumidamente, os plasmídeos foram formulados em água estéril para injeção

(VetOne) de modo que a dose indicada foi distribuída por injeção intramuscular no músculo tibial precedente em um volume de injeção de 30 µL. Cada injeção intramuscular foi imediatamente seguida por eletroporação (EP) usando o dispositivo de eletroporação por corrente constante adaptativa CELLECTRA® 2000 com uma matriz 3P (Inovio Pharmaceuticals). O dispositivo foi configurado para distribuir dois pulsos de 0,1 Amp de 52 ms de largura de pulso espaçados por um 1 segundo de atraso. Os camundongos receberam 3 imunizações, com 3 semanas de intervalo. Os camundongos foram sacrificados uma semana após a última imunização e os baços colhidos para leituras imunes celulares. Nenhum outro tecido foi coletado. Isolamento Esplênico de Linfócitos

[00209] Os esplenócitos foram isolados assepticamente e colocados em 5 mL de meio R10 (meio 1640 do Rosewell Park Memorial Institute suplementado com soro fetal bovino a 10% e antibiótico-antimicótico a 1%). Os esplenócitos foram isolados por interrupção mecânica do baço usando uma máquina Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.), e o produto resultante foi filtrado usando um filtro de células de 40-μm (BD Falcon). O produto resultante foi centrifugado e o sedimento foi tratado por 5 min com tampão de lise ACK (Lonza) para lise de glóbulos vermelhos. Os esplenócitos foram então centrifugados, lavados em PBS e depois ressuspensos em meio R10 e imediatamente usados para análises posteriores. IFNγ ELISpot

[00210] O teste IFNγ ELISpot de camundongo (MabTech) foi realizado para avaliar respostas celulares específicas do antígeno. Resumidamente, placas de 96 poços pré-revestidas com anticorpo IFNγ anti-camundongo foram lavadas em PBS e bloqueadas por duas horas à temperatura ambiente com meio de cultura completo (RPMI

1640 suplementado com 10% de FBS e antibióticos). Os linfócitos esplênicos foram ressuspensos em meio R10 (e depois adicionados em triplicados a um número de células de entrada de 2 × 10 5 células por poço. Um conjunto de peptídeos foi sintetizado (GenScript), cada um contendo 15 resíduos de aminoácidos sobrepostos por 11 aminoácidos representando toda a sequência de proteínas de antígeno BORIS de consenso sintético. Esses conjuntos de peptídeos foram ressuspensos em DMSO (Sigma) e reunidos em uma concentração de ~ 2 μg/ml de peptídeo em três conjuntos de peptídeos (P1, P2 e P3 na Figura 7B). O conjunto de peptídeos continha os peptídeos correspondentes ao antígeno BORIS de consenso sintético. A concavalina A (Sigma) a 5μg/ml foi usada como controle positivo e o meio de cultura completo foi usado como controle negativo. As placas foram incubadas por 18 horas a 37°C, em uma incubadora de atmosfera de 5% de CO2. Em seguida, foi adicionado um anticorpo biotinilado de detecção de IFNγ anti-camundongo (MabTech) e as placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e o anticorpo Streptavidin-ALP (MabTech) foi adicionado e as placas incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. A detecção do ponto foi concluída de acordo com as instruções do fabricante do kit (MabTech). As manchas nas placas foram contadas usando um leitor ELISPOT automatizado (Cellular Technology). O número médio de unidades formadoras de pontos (SFU) foi ajustado para 1 x 106 esplenócitos para exibição de dados.

[00211] As respostas específicas ao antígeno pelo IFNγ ELISpot são relatadas como o número de unidades formadoras de ponto IFNγ (SFU) por 1 x 106 esplenócitos maiores que o SFU no controle apenas de meio.

Citometria de Fluxo

[00212] As respostas imunes celulares induzidas pelo consenso sintético do antígeno BORIS foram ainda caracterizadas por citometria de fluxo. Resumidamente, 2 x 106 esplenócitos de camundongos vacinados e ingênuos foram imediatamente estimulados após o isolamento com o consenso sintético de peptídeos do antígeno BORIS por 6 horas na presença de Brefeldin A (BD Biosciences), Monensina (BD Biosciences) e anticorpo CD107a anti-camundongo FITC (BD Biosciences). Após estimulação com peptídeos, os esplenócitos foram centrifugados e ressuspensos em 20 μL por poço da solução de BD Fc Block (BD Biosciences) de camundongo. O bloco Fc é usado a uma diluição inicial de 1:40 em PBS e incubado a 4°C por 5 minutos. Após a incubação, os anticorpos extracelulares restantes (em PBS) são adicionados a 30 μL por poço e deixados a incubar a 4°C por 30 minutos. Após a adição da mancha extracelular, o volume final em cada poço é de 50 μL, consistindo em Bloco Fc na diluição final de 1:100 e os anticorpos extracelulares nas suas diluições de trabalho apropriadas. As células foram então coradas com corante de viabilidade (Vivid, Thermo-Fisher) e os seguintes anticorpos extracelulares: CD3e anti-camundongo APC-Cy7, CD4 anti- camundongo PerCP-Cy5.5 e CD8a anti-camundongo APC (BD Biosciences). As citocinas intracelulares foram subsequentemente coradas com os seguintes anticorpos: IFNγ anti-camundongo BV605, IL-2 anti-camundongo APC-R700 e TNF-α anti-camundongo PE (BD Biosciences). Os dados do ICS foram coletados no FACS CANTO de 10 cores (BD Biosciences) e a análise foi concluída usando o FlowJo. A estratégia de bloqueio da citometria de fluxo é mostrada na Figura 5.

[00213] Para que uma célula seja chamada de antígeno específico por citometria de fluxo, a frequência do parâmetro relatado deve exceder a do controle somente de meio. Para que uma célula seja identificada como produtora de CD107a específico de antígeno, a célula também deve ser identificada como positiva para a produção específica de antígeno de IFNγ e/ou IL-2 e/ou TNFα, como identificado pela porta booleana. Análise Estatística

[00214] A análise estatística foi concluída usando o IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corporation). A análise entre os grupos foi realizada usando uma ANOVA com Diferença Significativa Honesta post-hoc de Tukey (HSD) para ajustar as comparações múltiplas. A homogeneidade da variância foi confirmada usando a estatística F antes de comparações múltiplas. Para todas as análises estatísticas, um valor de p de 0,050 foi considerado significativo. Resultados Expressão do antígeno BORIS de consenso sintético

[00215] A expressão do antígeno BORIS de consenso sintético por pGX1440 foi confirmada por western blotting. Resumidamente, as células de rabdomiossarcoma humano (RD) foram transfectadas com os plasmídeos pGX1440 ou pGX0001 (vetor vazio, controle negativo). Os lisados celulares foram sondados quanto à expressão do antígeno BORIS de consenso sintético com um anticorpo BORIS anti-humano (CTCFL). Foi detectada uma banda de proteína do peso molecular esperado para o antígeno BORIS de consenso sintético (76,75 kD) (Figura 6). Uma banda fraca foi detectada no controle negativo (pGX0001) que é provavelmente devido à expressão da proteína BORIS endógena de baixo nível na linhagem celular RD. As bandas anti-β-actina foram detectadas com intensidades semelhantes, indicando que quantidades iguais de proteína foram carregadas em cada faixa. Em resumo, verificou-se que o pGX1440 expressa sua respectiva proteína antigênica.

Imunogenicidade do consenso sintético das construções da vacina de antígeno BORIS IFNγ ELISpot

[00216] A imunogenicidade da construção de antígeno BORIS de consenso sintético foi avaliada em quatro doses (10 μg, 20 μg, 30 μg e 50 μg) por IFNγ ELISpot e citometria de fluxo (n = 8/grupo). Os camundongos foram imunizados com a espinha dorsal vazia do plasmídeo (pGX0001) como controle negativo (n = 4/grupo). A vacinação com antígeno BORIS de consenso sintético (pGX1440) induziu respostas imunes celulares excepcionalmente robustas em comparação com camundongos vacinados com controle negativo. A magnitude da produção de IFNγ específico do antígeno BORIS de consenso sintético, como determinado pelo ELISpot, foi independente da dose (Figura 7A e Figura 7B), com uma resposta máxima semelhante alcançada nas doses de 20 e 50 μg. Especificamente, a SFU de IFNγ específica para antígeno BORIS de consenso sintético foi 10,315 ± 4,093, 13,725 ± 6,151, 8,645 ± 2,304 e 13,600 ± 9,894 nas doses de 10 μg, 20 μg, 30 μg e 50 μg, respectivamente. As respostas de IFNγ de antígeno BORIS de consenso sintético foram significativamente maiores do que inaïve nas doses de 10 μg (p = 0,026), 20 μg (p = 0,002) e 50 μg (p = 0,003) de pGX1440, mas não na dose de 30 μg (p = 0,071). As respostas de IFNγ são resumidas na Tabela 4.

Tabela 4. Respostas de IFNγ induzidas por antígeno BORIS de consenso sintético Antígeno BORIS de consenso sintético (pGX1440) Construção Dose SFU média ± Desvio Padrão valor-p pGX0001 30 µg 50 ± 24 n/a 10 µg 10,315 ± 4,093 0,026 20 µg 13,725 ± 6,151 0,002 pGX1440 30 µg 8,645 ± 2,304 0,071 50 µg 13,600 ± 9,894 0,003 Significância estatística assumida em p≤0,05. Os valores de p reportados são relativos a naïve (camundongos imunizados com pGX0001).

Citometria de Fluxo

[00217] O antígeno BORIS de consenso sintético suscitou respostas mais robustas no compartimento de células T CD8+, em relação às respostas no compartimento de células T CD4+ (Figura 8A, 8B, 8C e 8D). O antígeno BORIS de consenso sintético induziu frequências de respostas de células T CD4+ específicas ao antígeno que foram significativamente mais robustas do que naïve (0,11% ± 0,06%) nos grupos de dose de 10 μg (1,41% ± 0,44%) (p<0,001), 20 μg (1,36% ± 0,42%) (p<0,001), 30 µg (1,50% ± 0,22%) (p<0,001) e 50 µg (1,62% ± 0,66%) (p<0,001) (Figura 8A). As respostas de células T CD4+ T de antígeno BORIS de consenso sintético também foram independentes da dose e consistiam principalmente em células T CD4+ produtoras de IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα+ ou IFNγ+IL-2- TNFα- producing CD4+ T cells (Figura 8C). A frequência de células T CD4+ T específicas de antígeno é mais detalhada na Tabela 5.

Tabela 5. Respostas de células T CD4+ induzidas por antígeno BORIS de consenso sintético Células T CD4+ do antígeno BORIS de consenso sintético Construção Dose % CD4+ ±Desvio Padrão valor-p pGX0001 30 µg 0,11 ± 0,06 n/a 10 µg 1,41 ± 0,44 <0,001 20 µg 1,36 ± 0,42 <0,001 pGX1440 30 µg 1,50 ± 0,22 <0,001 50 µg 1,62 ± 0,66 <0,001 Significância estatística assumida em p≤0,05. Os valores de p reportados são relativos a naïve (camundongos imunizados com pGX0001)

[00218] A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno induzida por antígeno BORIS de consenso sintético aumentou significativamente sobre o controle em todos os grupos de doses (Figura 8B). Especificamente, a frequência de respostas de CD8+ T específica de antígeno nos grupos imunizados com 10 μg (12,45% ± 3,86%) (p=0,002), 20 μg (15,64% ± 5,63%) (p<0,001), 30 μg (14,49% ± 3,58%) (p<0,001), e 50 μg (17,34% ± 8,17%) do pGX1440 foi significativamente mais robusta comparada ao naïve (0,10% ± 0,05%). As respostas das células T CD8+ específicas do antígeno BORIS de consenso sintético também foram independentes da dose e consistiram principalmente em células T CD8+ produtoras de IFNγ+IL- 2-TNFα- e IFNγ+IL-2-TNFα+ (Figura 8D). A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno é mais detalhada na Tabela 6.

Tabela 6. Respostas de células T CD8+ induzidas por antígeno BORIS de consenso sintético Células T CD8+ do antígeno BORIS de consenso sintético Construção Dose % CD8+± Desvio Padrão valor-p pGX0001 30 µg 0,10 ± 0,05 n/a 10 µg 12,45 ± 3,86 0,002 20 µg 15,64 ± 5,63 <0,001 pGX1440 30 µg 14,49 ± 3,58 <0,001 50 µg 17,34 ± 8,17 <0,001 Significância estatística assumida em p≤0,05. Os valores de p reportados são relativos a naïve (camundongos imunizados com pGX0001)

[00219] Todas as doses de antígeno BORIS de consenso sintético induziram uma frequência de células T CD4+CD107a+ maior que a naïve (0,08% ± 0,07%), mas apenas as doses mais altas de 30 μg e 50 μg foram significativamente mais robustas. Especificamente, a frequência de células T CD4+CD107a+ específicas de antígeno foi de 0,37% ± 0,23%, 0,30% ± 0,15%, 0,49% ± 0,20% e 0,50% ± 0,30% nos grupos de dose de 10 μg (p = 0,097), 20 μg (p = 0,256), 30 μg (p = 0,012) e 50 μg (p = 0,010), respectivamente (Figura 9A). O perfil de citocinas das células T CD4+CD107a+ específicas de antígeno BORIS de consenso sintético foi semelhante entre os grupos de dose e foi composto principalmente por células IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2- TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα- (Figura 9C). A frequência de células T CD4+ específicas de antígeno com potencial citolítico é mais detalhada na Tabela 7.

Tabela 7. Potencial citolítico de células T CD4+ específicas do antígeno induzido por antígeno BORIS de consenso sintético Células T CD4+CD107a+ do antígeno BORIS de consenso sintético Construção Dose % CD4+CD107a+ ± Desvio Padrão valor-p pGX0001 30 µg 0,08 ± 0,07 n/a 10 µg 0,37 ± 0,23 0,097 20 µg 0,30 ± 0,15 0,256 pGX1440 30 µg 0,49 ± 0,20 0,012 50 µg 0,50 ± 0,30 0,010 Significância estatística assumida em p≤0,05. Os valores de p reportados são relativos a naïve (camundongos imunizados com pGX0001) +

[00220] Semelhante à magnitude das células T CD8 específicas de antígeno, o antígeno BORIS de consenso sintético induziu uma mudança significativa na frequência de células T CD8+CD107a+ entre todos os grupos em comparação com os naïve (0,02% ± 0,01%) (Figura 9C). Especificamente, a frequência de células T CD8+CD107a+ específicas de antígeno foi de 11,52% ± 3,50%, 14,49% ± 5,22%, 13,57% ± 3,45% e 16,24% ± 7,74% nos grupos de dose 10 µg (p = 0,002), 20 µg (p<0,001), 30 μg (p<0,001) e 50 μg (p<0,001), respectivamente (Figura 9B). O perfil de citocinas das células T CD8+CD107a+ específicas para o antígeno BORIS de consenso sintético foi semelhante entre os grupos de dose e a maioria foi composta por células IFNγ+IL-2-TNFα- com algumas células IFNγ+IL-2- TNFα+ (Figura 9D). A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno com potencial citolítico é mais detalhada na Tabela 8.

Tabela 8. Potencial citolítico de células T CD8+ específicas do antígeno induzido por antígeno BORIS de consenso sintético Células T CD8+CD107a+ do antígeno BORIS de consenso sintético % de CD8+CD107a+ ± Construção Dose Desvio Padrão valor-p pGX0001 30 µg 0,02 ± 0,01 n/a 10 µg 11,52 ± 3,50 0,002 20 µg 14,49 ± 5,22 <0,001 pGX1440 30 µg 13,57 ± 3,45 <0,001 50 µg 16,24 ± 7,74 <0,001 Significância estatística assumida em p≤0,05. Os valores de p reportados são relativos a naïve (camundongos imunizados com pGX0001)

[00221] No geral, não houve diferenças significativas nas respostas entre os grupos imunizados para quaisquer dados relatados (isto é, 10 µg não foi significativamente menor que 50 µg etc.). O antígeno BORIS de consenso sintético aumentou significativamente a frequência de células T CD4+, CD4+CD107a+ e CD8+, CD8+CD107a+ específicas de antígeno, em comparação com naïve, embora a magnitude da resposta fosse muito mais robusta no compartimento de células T CD8+.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica aminoácidos 19-680 de SEQ ID Nº: 2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de aminoácidos 19-680 de SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 de SEQ ID Nº: 2; e (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 de SEQ ID Nº: 2.

2. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) nucleotídeos 55-2040 de SEQ ID Nº: 1; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de nucleotídeos 55-2040 da SEQ ID Nº: 1; (c) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55-2040 de SEQ ID Nº: 1; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 55-2040 de SEQ ID Nº: 1.

3. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em:

(a) uma sequência de ácido nucleico que codifica um comprimento inteiro da SEQ ID Nº: 2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; e (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº:

2.

4. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQ ID Nº: 1; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de SEQ ID Nº: 1; (c) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID Nº: 1; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 1.

5. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID Nº: 1.

6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende um plasmídeo ou um vetor viral.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vetores como definidos na reivindicação 6 ou 7.

11. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 19-680 de SEQ ID Nº: 2; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de aminoácidos 19-680 de SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-680 da SEQ ID Nº: 2.

12. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID Nº: 2; (b) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de SEQ ID Nº: 2; (c) uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2; e (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 2.

13. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID Nº: 2.

14. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

15. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 6 ou 7.

16. Vacina, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

17. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

18. Vacina, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que adjuvante é IL-12, IL-15, IL-28, ou RANTES.

19. Uso da molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para tratar um indivíduo com uma célula cancerosa expressando BORIS.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração por eletroporação.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração em um ou mais sítios no indivíduo.

22. Uso da molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma vacina contra uma célula cancerígena expressando BORIS, em que a vacina é para ser administrada a um indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune humoral ou celular.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração por eletroporação.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para administração em um ou mais sítios no indivíduo.

25. Invenção, caracterizada por qualquer uma das modalidades ou qualquer uma das categorias de reivindicação aplicáveis, por exemplo, produto, processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente revelada, descrita ou ilustrada no pedido de patente.