BR112020011350A2 - aperfeiçoamento da produtividade lipídica de algas através da modificação genética de uma proteína que contém domínio de tpr - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a microrganismos mutantes com expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR em que os microrganismos mutantes têm maior produtividade lipídica e/ou exibem maior particionamento de carbono para lipídio em comparação com microrganismos do tipo selvagem dos quais são derivados. Também são fornecidos métodos de produção de lipídios com o uso de microrganismos mutantes, RNAs-guia e construtos de ácido nucleico usados para a produção de microrganismos mutantes.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para "APER- FEIÇOAMENTO DA PRODUTIVIDADE LIPÍDICA DE ALGAS ATRA-
VÉS DA MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE UMA PROTEÍNA QUE CONTÉM DOMÍNIO DE TPR". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade disposto no Título 35 do USC § 119(e) do documento de Número de Série US 62/596.671, depositado em 8 de dezembro de 2017, cujo conteúdo inteiro é incorporado a título de referência a este documento em sua totalidade. INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊN-
CIAS
[002] O material na listagem de sequências anexa é incorporado a este documento a título de referência no pedido. O arquivo de texto da listagem de sequências anexo, de nome SGI2130_1WO_Sequence_Listing.txt, foi criado em 19 de novembro de 2018 e tem 54 kb. O arquivo pode ser acessado usando o Microsoft Word em um computador que usa o Sistema Operacional Windows.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a microrganismos mutantes, como algas e heterokontas, com aumento da produtividade lipídica e métodos de uso na produção de lipídios.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Várias tentativas para aprimorar a produtividade lipídica aumentando a biossíntese lipídica têm se concentrado na manipulação de genes que codificam enzimas para assimilação de nitrogênio ou metabolismo lipídico bem como genes que codificam polipeptídeos en- volvidos no armazenamento lipídico. Por exemplo, US2014/0162330 divulga uma cepa de Phaeodactylum tricornutum na qual o gene da nitrato redutase (NR) foi atenuado por knockdown baseado em RNAi;
Trentacoste et al. ((2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 19748- 19753) divulgam diatomáceas transformadas com um construto de RNAi visando o gene Thaps3_264297 previsto para estar envolvido no catabolismo lipídico; e WO2011127118 divulga a transformação de Chlamydomonas com genes que codificam oleosinas (proteínas de armazenamento lipídico), bem como com genes que codificam genes de diacilglicerol transferase (DGAT). Embora em cada caso a produ- ção lipídica aumentada tenha sido estabelecida com base em micros- copia ou coloração com corantes lipofílicos, não foi fornecida quantifi- cação da produção lipídica pelas células manipuladas, nem foi deter- minada a relação entre produtividades de biomassa e lipídios ao longo do tempo.
[005] Daboussi et al. 2014 (Nature Comm. 5: 3.881) relatam que a interrupção do gene da UGPase no Phaeodactylum triconornutum, que se acredita fornecer precursores da síntese de laminarina (um carboidrato de armazenamento), resulta em aumento da acumulação lipídica. No entanto, nenhum dado bioquímico mostrou indicar que o conteúdo de laminarina foi afetado (ou mesmo presente) e não foram relatadas produtividades de lipídios e biomassa. Da mesma forma, vá- rios grupos relataram aumentos no acúmulo de lipídios em Chlamydomonas mutantes sem amido (Wang et al. 2009 Eukaryotic Cell 8: 1.856 a 1.868; Li et al. 2010 Metab Eng. 12: 387 a 391), no en- tanto, relatórios sucessivos que realmente mediram a produtividade de lipídios concluiu que essas cepas foram prejudicadas no crescimento quando cultivadas em condições fototróficas (Siaut et al. 2011 BMC Biotechnol. 11:7; Davey et al. 2014 Eukaryot Cell 13: 392 a 400). Es- ses relatórios concluíram que as maiores produtividades lipídicas me- didas como triglicerídeos (TAG) produzidos por litro por dia, foram re- almente alcançadas pela cepa dos pais do tipo selvagem.
[006] Os documentos WO 2011/097261 e US20120322157 rela-
tam que um gene denotado "SN03" que codifica uma proteína arresti- na tem um papel no aumento da produção de lipídios sob condições repletas de nutrientes quando superexpresso em Chlamydomonas. No entanto, observou-se que a superexpressão do gene SN03 resultou no aparecimento de lipídios polares não identificados, que não foram quantificados, e não resultou em um aumento de TAG. Outro polipep- tídeo identificado como potencialmente regulador da biossíntese lipídi- ca induzida por estresse foi descrito por Boyle et al. ((2012) J. Biol. Chem. 287: 15.811 a 15.825). O knockout do gene NRR1 em Chlamydomonas que codifica um polipeptídeo do domínio "SQUA- MOUSA" resultou em uma redução da biossíntese lipídica em relação às células do tipo selvagem sob depleção de nitrogênio; no entanto, não foram obtidos mutantes demonstrando aumento da produção lipí- dica. O documento US 2010/0255550 sugere a superexpressão de fa- tores putativos de transcrição (TF1, TF2, TF3, TF4 e TF5) nas células das algas para aumentar a produção lipídica, mas nenhuma dessas cepas é descrita.
[007] O documento US 2017/005803 divulga um gene regulador ZyCys cuja atenuação resulta em aumento da produtividade lipídica em algas mutantes quando cultivadas em um meio que inclui nitrato. As algas mutantes demonstraram crescimento em cultura, acumulando biomassa a uma taxa de pelo menos 80% em relação às células do tipo selvagem, produzindo até o dobro de lipídios do que a cepa pro- genitora do tipo selvagem. O documento US 2017/0121742 divulga algas mutantes com expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que tem um domínio Bromo e um domínio de dedo de zinco TAZ que demonstram produtividade lipídica elevada com redu- ção mínima na produtividade de biomassa em relação às algas do tipo selvagem.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] Em um aspecto, são no presente documento fornecidos neste documento microrganismos mutantes com expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de re- petição de tetratricopeptídeo (TPR), que produzem mais lipídios que um microrganismo de controle e/ou exibem particionamento aumenta- do de carbono em lipídio em relação ao microrganismo de controle, como quando o microrganismo mutante e o microrganismo de controle são cultivados nas mesmas condições. Em algumas modalidades, o microrganismo de controle é um microrganismo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o microrganismo mutante produz pelo menos cerca de 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, em pelo menos 190% ou pelo menos cerca de 200% mais lipídios derivados de éster metílico de ácidos graxos (FAME) do que um microrganismo de con- trole. Em algumas modalidades, as condições de cultura sob as quais o microrganismo mutante com expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR produz mais lipídios do que um microrganismo de controle podem ser condições de cultura sob as quais o microrganismo mutante e o microrganismo de controle produzem biomassa. Por exemplo, as condições de cultura podem ser repletas de nitrogênio em relação ao microrganismo de controle e podem ser repletas de nutrientes em relação ao microrga- nismo de controle.
[009] Em algumas modalidades, os microrganismos mutantes no presente documento fornecidos exibem uma razão de FAME para car- bono orgânico total (TOC) que é pelo menos cerca de 20%, pelo me- nos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo me- nos 100%, pelo menos 120%, pelo menos 140%, pelo menos160%, pelo menos 180%, pelo menos 200%, pelo menos 220%, pelo menos 240%, pelo menos 260%, pelo menos 280% ou pelo menos 300% maior (por exemplo, 20 a 300% maior) do que a razão FAME/TOC do microrganismo de controle. Em algumas modalidades, as condições de cultura sob as quais o microrganismo mutante que atenua a ex- pressão de um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domí- nio de TPR tem uma razão FAME/TOC mais alta do que um microrga- nismo de controle podem ser condições de cultura sob as quais o mi- crorganismo mutante e o microrganismo de controle produzir biomas- sa. Por exemplo, as condições de cultura podem ser repletas de nitro- gênio em relação ao microrganismo de controle e podem ser repletas de nutrientes em relação ao microrganismo de controle.
[0010] "Expressão atenuada" de um gene, como estabelecido acima, inclui, por exemplo, expressão reduzida do gene, de modo que seja produzido um nível reduzido (que pode ser um nível indetectável) de um polipeptídeo funcional codificado pelo gene. A expressão ate- nuada também inclui a expressão em que é produzido um polipeptídeo mutado (tal como um deletado, truncado ou com deslocamento de quadro), de modo que o polipeptídeo mutado tenha função reduzida ou alterada em relação ao polipeptídeo não mutado. A expressão atenua- da pode ser o resultado da mutação do gene que codifica o polipeptí- deo ou pode ser o resultado da expressão ou entrega de um construto projetado para reduzir a expressão do gene que codifica o polipeptí- deo, como, por exemplo, e o construto de RNAi direcionado ao gene.
[0011] Em algumas modalidades, os microrganismos mutantes são gerados por mutagênese clássica ou por técnicas de engenharia genética. Em algumas modalidades, o microrganismo mutante pode ter uma mutação em um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio GAF (por exemplo, GAF2) ou um gene que afeta sua ex- pressão, o que resulta em uma diminuição no nível de expressão do gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio GAF compa- rado ao nível de expressão do gene em um microrganismo de contro- le. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações são geradas com o uso de um ou mais agentes que induzem uma quebra de fita dupla. Em alguns exemplos, o agente é uma meganuclease, uma nu- clease de dedo de zinco, um sistema Nuclease Efetor do Tipo Ativador da Transcrição (TALEN) e/ou uma nuclease de Cas. Em algumas mo- dalidades, uma mutação que resulta na expressão atenuada de um gene que codifica um domínio GAF é uma mutação insercional.
[0012] Em algumas modalidades, o microrganismo mutante é qualquer microrganismo eucariótico e, nas modalidades ilustrativas, o microrganismo mutante é uma heterokonta ou alga. Em algumas mo- dalidades, os microrganismos mutantes são gerados por mutagênese clássica ou por técnicas de engenharia genética. Em algumas modali- dades, o microrganismo mutante tem uma mutação em um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR, ou um gene que afeta sua expressão, que resulta em uma diminuição da expres- são do gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR em comparação com expressão do gene em um microrganismo de controle. Em algumas modalidades, o microrganismo mutante tem uma mutação em um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR, que resulta em um polipeptídeo truncado, excluído internamente e/ou com desvio de quadros tendo atividade reduzida ou desprezível. Em algumas modalidades, o microrganismo mutante pos- sui uma ou mais mutações pontuais que alteram a sequência de ami-
noácidos do polipeptídeo contendo domínio de TPR, resultando em um polipeptídeo com atividade reduzida ou desprezível. Tais mutações pontuais podem, em algumas modalidades, estar no domínio de TPR. Em diversas modalidades, as uma ou mais mutações são geradas com o uso de um ou mais agentes que induzem uma quebra de fita dupla. Em alguns exemplos, o agente é uma meganuclease, uma nu- clease de dedo de zinco, um sistema Nuclease Efetor do Tipo Ativador da Transcrição (TALEN) e/ou uma nuclease de Cas.
[0013] Em algumas modalidades, o microrganismo mutante é qualquer microrganismo eucariótico e, nas modalidades ilustrativas, o microrganismo mutante é uma heterokonta ou alga. Em algum exem- plo, o microrganismo mutante é uma alga heterokonta, como uma es- pécie de diatomáceas ou eustigmatófito, e pode ser, por exemplo, uma espécie de um gênero de diatomáceas, como Amphiprora, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Fragilaria, Fragilaropsis, Hantzschia, Navicu- la, Nitzschia, Phæodactylum, Phæodactylum, Phæodactylum, Skeleto- nema ou Thalassiosira. Em alguns exemplos, a alga mutante é um eustigmatófito, tal como um eustigmatófito pertencendo a um gênero tal como Chloridella, Chlorobptrys, Ellipsoidion, Eustigmatos, Gonio- chloris, Monodopsis, Monodus, Nannochloropsis, Pseudocharaciopsis, Pseudostaruastrum, Pseudotetraëdriella e Vischeria.
[0014] Também é fornecida neste documento uma biomassa que compreende um mutante como fornecido neste documento. Além dis- so é fornecido um extrato de um mutante como no presente documen- to fornecido. O extrato pode ser um extrato bruto ou um extrato parci- almente purificado, purificado ou refinado que pode incluir qualquer combinação de componentes celulares, incluindo, porém sem limita- ção, membranas, lipídios, proteínas, carboidratos, moléculas solúveis e moléculas insolúveis. Por exemplo, o extrato pode opcionalmente ser um extrato que tenha sido submetido a um ou mais tratamentos, como,
porém, sem limitação, precipitação seletiva, tratamento de alta ou bai- xa temperatura, filtração ou centrifugação.
[0015] Também estão incluídos métodos de produção de lipídios com o uso de microrganismos mutantes descritos neste documento. Por exemplo, um microrganismo mutante, como no presente documen- to fornecido, que atenuou a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR e produz mais lipídios do que uma cepa de controle, pode ser cultivado em cultura descontínua, semicontínua ou contínua para produzir um ou mais lipídios. Os méto- dos podem incluir isolar um ou mais lipídios da cultura (por exemplo, das células, meio de cultura ou cultura inteira). O meio de cultura pode ser repleto de nitrogênio ou pode ser limitado ou esgotado de nitrogê- nio durante o período de produção de lipídios. Em algumas modalida- des, o meio usado para a cultura de um microrganismo mutante, como fornecido neste documento para a produção de lipídios, pode incluir nitrato como substancialmente a única fonte de nitrogênio. Em alguns exemplos, os métodos podem incluir cultivar um mutante de algas sob condições fotoautróficas.
[0016] Também estão incluídas moléculas de DNA para expressar RNAs-guia; RNAs-guia que têm como alvo um gene que codifica uma proteína contendo domínio de TPR que afeta a produção de lipídios; e construtos de ácido nucleico para gerar microrganismos mutantes usando técnicas de engenharia genética. Um RNA-guia que tem como alvo um gene contendo TRP, por exemplo, um gene com pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1 pode ter homologia com uma região de codificação do gene que inclui um domínio de TPR ou pode ter ho- mologia com uma 5' UTR, 3' UTR ou região de um gene a montante da 5' UTR.
[0017] Estes e outros objetos e características dessa invenção se- rão mais evidentes quando a seguinte descrição detalhada for lida em conjunto com os desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0018] A Figura 1 é uma representação esquemática da proteína TPR-6029 codificada pelo gene N. gaditana no local Naga_100148g8 (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 2 representam o gene e a proteína, res- pectivamente). As caixas indicam as posições do domínio de TPR (SEQ ID NO: 1) e do domínio DUF4470 (SEQ ID NO: 3). As setas apontam para a posição desejada pelas sequências-guia do CRISPR para produzir o knockout GE-15360. A figura não está em escala.
[0019] A Figura 2 é um mapa esquemático do vetor pSGE-6206 usado para introduzir Cas9 na cepa WT-3730 do tipo selvagem de N. gaditana para gerar a linha Editor Cas9 GE-13038.
[0020] A Figura 3 é um gráfico que mostra a produtividade média diária da FAME durante o ensaio em lote de sete dias para a cepa N. gaditana GE-15360 (um knockout do gene TPR-6029 no local Na- ga_100148g8) em comparação com a cepa GE-13038 de controle pa- rental (mãe Cas9 tensão). "A" e "B" se referem às duas réplicas de cul- tura.
[0021] A Figura 4 é um gráfico que mostra a quantidade diária de FAME presente nas culturas de N. gaditana cultivadas em batelada no mutante knockout no TPR-6029 e na cepa Cas9 + parental GE-13038 dos pais em meio que incluía apenas nitrato e meio que incluía amônio apenas ou nitrato mais amônio.
[0022] A Figura 5 mostra a produção diária de FAME pelo mutan- te de knockout GE-15360 de N. gaditana TPR-6029 versus estirpe de tipo selvagem WT-3730 no ensaio semicontínuo. O knockout do TPR mostrou níveis mais altos de FAME produzidos em cada dia do ensaio de 8 dias. As cepas GE-15545 e GE15525 foram cepas geneticamente modificadas tendo modificações não relacionadas ao gene TPR-6029.
DESCRIÇÃO DETALHADA DEFINIÇÕES
[0023] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. A menos que estabelecido de outra forma, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.
[0024] Todos os títulos são para a conveniência do leitor e não li- mitam a invenção de forma alguma. As referências a aspectos ou mo- dalidades da invenção não indicam necessariamente que os aspectos descritos não podem ser combinados com outros aspectos descritos da invenção ou características de outros aspectos da invenção. Todas as publicações, patentes e outras referências no presente documento mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
[0025] O termo "e/ou", como usado em uma frase como "A e/ou B" neste documento, pretende incluir "A e B", "A ou B", "A" e "B".
[0026] Os termos "cerca", "aproximadamente" e similares, quando precedem uma lista de valores ou intervalo numéricos, referem-se a cada valor individual na lista ou intervalo independentemente, como se cada valor individual na lista ou intervalo fosse imediatamente precedi- do por esse termo. Os termos significam que os valores aos quais os mesmos se referem são exatamente, próximos ou similares. "Opcio- nal" ou "opcionalmente" significam que o evento ou circunstância des- crito logo a seguir pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui casos em que o evento ou circunstância ocorre e casos em que ele não ocor- re. Por exemplo, a frase opcionalmente, a composição pode compre- ender uma combinação significa que a composição pode compreender uma combinação de moléculas diferentes ou pode não incluir uma combinação de modo que a descrição inclui tanto a combinação quan- to a ausência da combinação (isto é, membros individuais da combi- nação). As faixas podem ser expressas no presente documento como entre cerca de um valor específico e/ou cerca de outro valor específi- co. Quando esse intervalo é expresso, outro aspecto inclui desde um valor em particular e/ou até outro valor em particular. Da mesma for- ma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente cerca de ou aproximadamente, será entendido que o valor específico forma outro aspecto. Será entendido ainda que os pontos finais de cada um dos intervalos são significativos em relação ao outro ponto final e independentemente do outro ponto final. Além disso, um intervalo (por exemplo, 90 a 100%) destina-se a incluir o in- tervalo per se, bem como cada valor independente dentro do intervalo, como se cada valor fosse listado individualmente. Todos os intervalos fornecidos no pedido incluem os valores das extremidades superior e inferior do intervalo, a menos que indicado de outra forma. O termo "combinado" ou "em combinação" ou "em conjunto" pode se referir a uma combinação física de agentes administrados em conjunto ou ao uso de dois ou mais agentes simultaneamente com referência a, por exemplo, tempo e/ou fisicalidade.
[0027] A referência a propriedades "substancialmente iguais" ou "substancialmente idênticas" ou "cerca" sem explicação adicional do significado pretendido significa que as propriedades estão dentro de 10% e, preferencialmente, dentro de 5% e podem estar dentro de 2,5%, do valor de referência. Quando o significado pretendido de "substancialmente" em um contexto particular não é estabelecido, o termo é usado para incluir divergências menores e irrelevantes que não são materiais para as características consideradas importantes no contexto do objeto da invenção.
[0028] O termo "gene" é amplamente usado para se referir a qual- quer segmento de uma molécula de ácido nucleico (normalmente DNA, mas opcionalmente RNA) que codifica um polipeptídeo ou RNA expresso. Assim, os genes incluem sequências que codificam RNA expresso (que pode incluir sequências que codificam polipeptídeos ou, por exemplo, RNAs funcionais, como RNAs ribossômicos, tRNAs, RNAs antissenso, microRNAs, RNAs em formato de grampo, ribozi- mas, etc.). Os genes podem ainda compreender sequências regulado- ras necessárias para ou que afetam sua expressão, bem como se- quências associadas à sequência que codifica a proteína ou RNA em seu estado natural, como, por exemplo, sequências de íntrons, se- quências não traduzidas 5' ou 3', etc. Em alguns exemplos, "gene" po- de se referir apenas a uma parte que codifica a proteína de uma molé- cula de DNA ou RNA, que pode ou não incluir íntrons. Um gene é pre- ferencialmente maior que 50 nucleotídeos de comprimento, mais pre- ferencialmente maior que 100 nucleotídeos de comprimento e pode estar, por exemplo, entre 50 nucleotídeos e 500.000 nucleotídeos de comprimento, como entre 100 nucleotídeos e 100.000 nucleotídeos de comprimento ou entre cerca de 200 nucleotídeos e cerca de 50.000 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 200 nucleotídeos e cerca de 25.000 nucleotídeos de comprimento. Os genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a clonagem de uma fon- te de interesse ou a síntese de informações de sequência conhecidas ou previstas.
[0029] O termo "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a um segmento de DNA ou RNA (por exemplo, mRNA) e também inclui ácidos nucleicos com estruturas principais modificadas
(por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos bloquea- dos e outros ácidos nucleicos modificados ou análogos de ácido nu- cleico (por exemplo, Efimov e Chakhmakhcheva (2005) Methods Mol Biol. 288: 147 a 163)) ou nucleobases modificadas ou de ocorrência não natural. As moléculas de ácido nucleico podem ser de fita dupla, parcialmente fita dupla ou fita simples; uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples que compreende um gene ou uma porção do mes- mo e pode ser um filamento de codificação (senso) ou um filamento não codificante (antissenso). Embora uma sequência dos ácidos nu- cleicos possa ser mostrada na forma de DNA, uma pessoa versada na técnica reconhece que a sequência de RNA correspondente terá uma sequência semelhante com a timina sendo substituída por uracila, ou seja, "t" com "u".
[0030] Uma molécula de ácido nucleico pode ser "derivada" de uma fonte indicada, que inclui o isolamento (total ou parcial) de um segmento de ácido nucleico a partir de uma fonte indicada. Uma molé- cula de ácido nucleico também pode ser derivada de uma fonte indica- da por, por exemplo, clonagem direta, amplificação por PCR ou sínte- se artificial a partir da fonte de polinucleotídeo indicada ou com base em uma sequência associada à fonte de polinucleotídeo indicada, que pode ser, por exemplo, uma espécie de organismo. Os genes ou mo- léculas de ácido nucleico derivados de uma fonte ou espécie específi- ca também incluem genes ou moléculas de ácido nucleico com modifi- cações de sequência em relação às moléculas de ácido nucleico da fonte. Por exemplo, um gene ou molécula de ácido nucleico derivado de uma fonte (por exemplo, um determinado gene referenciado) pode incluir uma ou mais mutações em relação ao gene de origem ou molé- cula de ácido nucleico que não são intencionais ou que são introduzi- das deliberadamente, e se uma ou mais mutações, incluindo substitui- ções, deleções ou inserções, são introduzidas deliberadamente, as alterações na sequência podem ser introduzidas por mutação aleatória ou direcionada de células ou ácidos nucleicos, por amplificação ou ou- tra síntese gênica ou técnicas de biologia molecular, ou por síntese química ou qualquer combinação das mesmas. Um gene ou molécula de ácido nucleico que é derivado de um gene ou molécula de ácido nucleico referenciado que codifica um RNA ou polipeptídeo funcional pode codificar um RNA ou polipeptídeo funcional com pelo menos cer- ca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pe- lo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o RNA ou poli- peptídeo funcional referenciado ou de origem, ou com um fragmento funcional do mesmo. Por exemplo, um gene ou molécula de ácido nu- cleico que é derivado de um gene ou molécula de ácido nucleico refe- rida que codifica um RNA ou polipeptídeo funcional pode codificar um RNA ou polipeptídeo funcional com pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o RNA ou polipeptídeo funcional referido ou de fonte, ou com um fragmento funcional do mesmo.
[0031] Como usado neste documento, uma proteína ou ácido nu- cleico "isolado" é removido de seu ambiente natural ou do contexto em que o ácido nucleico ou proteína existe na natureza. Por exemplo, uma proteína isolada ou molécula de ácido nucleico é removida da célula ou organismo ao qual está associada em seu ambiente nativo ou natu- ral. Um ácido nucleico ou proteína isolado pode ser, em alguns casos, parcial ou substancialmente purificado, mas nenhum nível particular de purificação é necessário para o isolamento. Assim, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser uma sequência de ácido nucleico que foi excisada do cromossomo, genoma ou episódio em que está integrada na natureza.
[0032] Uma molécula de ácido nucleico "purificada" ou sequência de nucleotídeos, ou sequência de proteína ou polipeptídeo, está subs- tancialmente livre de material celular e componentes celulares. A mo- lécula ou proteína purificada de ácido nucleico pode estar substanci- almente livre de produtos químicos além do tampão ou solvente, por exemplo. "Substancialmente livre" não pretende significar que outros componentes além das novas moléculas de ácido nucleico são inde- tectáveis.
[0033] Os termos "ocorrência natural" e "tipo selvagem" se referem a uma forma encontrada na natureza que é mais frequentemente ob- servada em uma população de ocorrência natural e, portanto, é arbi- trariamente designada como "tipo selvagem". Por exemplo, uma molé- cula de ácido nucleico de ocorrência natural ou tipo selvagem, se- quência de nucleotídeo ou proteína pode estar presente e isolada de uma fonte natural e não é intencionalmente modificada por manipula- ção humana. "Tipo selvagem" também pode se referir à sequência em uma posição ou posições específicas de nucleotídeos, ou à sequência em uma posição ou posições de códon específica, ou a sequência em uma posição ou posições de aminoácidos específicas.
[0034] Como usado no presente documento, "atenuado" significa reduzido em quantidade, grau, intensidade ou força. A expressão gê- nica atenuada pode se referir a uma quantidade e/ou taxa de transcri- ção significativamente reduzida do gene em questão, ou de tradução, enovelamento ou montagem da proteína codificada. Como exemplos não limitativos, um gene atenuado pode ser um gene mutado ou inter- rompido (por exemplo, um gene interrompido por deleção parcial ou total, truncamento, troca de quadros ou mutação insercional) que não codifica uma estrutura de leitura aberta funcional completa ou que di- minuiu a expressão devido a alteração ou interrupção das sequências reguladoras de genes. Um gene atenuado também pode ser um gene direcionado por um construto que reduz a expressão do gene, como, por exemplo, um RNA antissenso, microRNA, molécula de RNAi ou ribozima. A expressão gênica atenuada pode ser a expressão gênica que é eliminada, por exemplo, reduzida a uma quantidade insignifican- te ou indetectável. A expressão gênica atenuada também pode ser ex- pressão gênica que resulta em um RNA ou proteína que não é total- mente funcional ou não funcional, por exemplo, a expressão gênica atenuada pode ser expressão gênica que resulta em um RNA truncado e/ou polipeptídeo.
[0035] "Molécula de ácido nucleico exógena" ou "gene exógeno" refere-se a uma molécula ou gene de ácido nucleico que foi introduzi- do ("transformado") em uma célula. Uma célula transformada pode ser referida como uma célula recombinante, na qual gene(s) adicional(is) exógeno(s) pode(m) ser introduzido(s). Um descendente de uma célu- la transformada com uma molécula de ácido nucleico também é referi- do como "transformado" se herdou a molécula de ácido nucleico exó- gena. O gene exógeno ou a molécula de ácido nucleico pode ser deri- vado de uma espécie diferente (e, portanto, "heteróloga"), ou da mes- ma espécie (e, portanto, "homóloga"), em relação à célula que está sendo transformada. Uma molécula, gene ou proteína "endógena" de ácido nucleico é uma molécula, gene ou proteína nativa de ácido nu- cleico, pois ocorre no, ou é produzido naturalmente pelo hospedeiro.
[0036] O termo "nativo" é usado no presente documento para se referir a sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoáci- dos como elas ocorrem naturalmente no hospedeiro. O termo "não na- tivo" é usado neste documento para se referir a sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos que não ocorrem natural- mente no hospedeiro. Assim, uma molécula de ácido nucleico "não nativa" é uma molécula nucleica que não está naturalmente presente na célula hospedeira, por exemplo, a molécula de ácido nucleico não nativa é exógena à célula hospedeira ou microrganismo no qual é in- troduzida e pode ser heteróloga em relação à célula hospedeira ou mi- crorganismo. Além disso, uma sequência de ácido nucleico ou se- quência de aminoácidos que foi removida de uma célula, submetida a manipulação de laboratório e introduzida ou reintroduzida em uma cé- lula hospedeira de modo que difira na sequência ou localização no ge- noma em relação à sua posição em um organismo não manipulado (isto é, justaposto ou operacionalmente ligado a sequências que não é justaposto ou operacionalmente ligado a um organismo não transfor- mado) é considerada "não nativa". Os genes não nativos também in- cluem genes endógenos ao microrganismo hospedeiro operacional- mente ligados a uma ou mais sequências reguladoras heterólogas que foram recombinadas no genoma do hospedeiro.
[0037] Uma molécula de ácido nucleico "recombinante" ou "mani- pulada" é uma molécula de ácido nucleico que foi alterada através da manipulação humana. Como exemplos não limitativos, uma molécula de ácido nucleico recombinante inclui qualquer molécula de ácido nu- cleico que: 1) tenha sido parcial ou totalmente sintetizada ou modifica- da in vitro, por exemplo, usando técnicas químicas ou enzimáticas (por exemplo, pelo uso de síntese química de ácido nucleico, ou pelo uso de enzimas para replicação, polimerização, digestão (exonucleolítica ou endonucleolítica), ligação, transcrição reversa, transcrição, modifi- cação de bases (incluindo, por exemplo, metilação), integração ou re- combinação (incluindo recombinação homóloga e específica do local) de moléculas de ácido nucleico); 2) inclua sequências nucleotídicas conjuntas que não são de natureza conjunta; 3) tenha sido modificado usando técnicas de clonagem molecular, de modo que não possua um ou mais nucleotídeos em relação à sequência da molécula de ácido nucleico de ocorrência natural; e/ou 4) tenha sido manipulado com o uso de técnicas de clonagem molecular, de modo a ter uma ou mais alterações ou rearranjos de sequência em relação à sequência de áci- do nucleico que ocorre naturalmente. Como exemplos não limitantes, um cDNA é uma molécula de DNA recombinante, assim como qual- quer molécula de ácido nucleico que foi gerada por reação (ou rea- ções) de polimerase in vitro, ou à qual ligantes foram anexados, ou que foi integrada a um vetor, como um vetor de clonagem ou vetor de expressão.
[0038] O termo "proteína recombinante", como usado neste docu- mento, se refere a uma proteína produzida por modificação genética, independentemente de o aminoácido variar daquele de uma proteína do tipo selvagem.
[0039] Quando aplicado a organismos, o termo recombinante, mo- dificado ou geneticamente modificado se refere a organismos que fo- ram manipulados pela introdução de uma sequência de ácido nucleico recombinante heteróloga ou exógena no organismo (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico não nativa) e inclui knockouts de gene, mutações direcionadas, substituição de genes e substituição, deleção, interrupção ou inserção de promotores, bem como introdução de transgenes ou genes sintéticos ou sequências de ácidos nucleicos no organismo. Ou seja, recombinante, modificado ou modificado geneti- camente se refere a organismos que foram alterados pela intervenção humana. Organismos recombinantes ou geneticamente modificados também podem ser organismos nos quais foram introduzidos constru- tos para "knockdown" de genes. Tais construtos incluem, porém sem limitações, construtos de RNAi, microRNA, shRNA, siRNA, antissenso e ribozima. Também estão incluídos organismos cujos genomas foram alterados pela atividade de meganucleases, nucleases de dedos de zinco, TALENs ou sistemas Cas/CRISPR. Uma molécula de ácido nu- cleico exógena ou recombinante pode ser integrada no genoma do or-
ganismo recombinante/geneticamente modificado ou, em outros ca- sos, não pode ser integrada no genoma do hospedeiro. Como usado neste documento, "microrganismo recombinante" ou "célula hospedei- ra recombinante" inclui progênie ou derivados dos microrganismos re- combinantes da invenção. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tais descendentes ou derivados não podem, de fato, ser idênticos à célula parental, mas ainda estão incluídos no escopo do termo como usado neste documento.
[0040] O termo "promotor" se refere a uma sequência de ácido nu- cleico capaz de ligar a RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência de codificação a jusante (direção 3'). Um promotor inclui um número mínimo de bases ou elementos neces- sários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do plano de fundo. Um promotor pode incluir um local de iniciação da transcri- ção, bem como domínios de ligação a proteínas (sequências de con- senso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Os promotores eucarióticos frequentemente, mas nem sempre, contêm caixas "TATA" e caixas "CAT". Os promotores procarióticos podem conter sequências de consenso dos promotores -10 e -35 procariotas. Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e repres- síveis, de uma variedade de fontes diferentes são bem conhecidos na técnica. As fontes representativas incluem, por exemplo, tipos de célu- las de algas, vírus, mamíferos, insetos, plantas, leveduras e bactérias, e promotores adequados dessas fontes estão prontamente disponíveis ou podem ser feitos sinteticamente, com base em sequências disponí- veis publicamente online ou, por exemplo, de depositários como o ATCC, bem como de outras fontes comerciais ou individuais. Os pro- motores podem ser unidirecionais (iniciar a transcrição em uma dire- ção) ou bidirecionais (iniciar a transcrição em qualquer direção). Um promotor pode ser um promotor constitutivo, um promotor repressível ou um promotor induzível. Uma região promotora pode incluir, além do promotor proximal ao gene, em que a RNA polimerase se liga para ini- ciar a transcrição, sequências adicionais a montante do gene que po- dem estar dentro de cerca de 1 kb, cerca de 2 kb, cerca de 3 kb, cerca de 4 kb, cerca de 5 kb ou mais do local inicial de transcrição de um gene, em que as sequências adicionais podem influenciar a taxa de transcrição do gene a jusante e, opcionalmente, a capacidade de res- posta do promotor a condições de desenvolvimento, ambientais ou bi- oquímicas (por exemplo, metabólicas).
[0041] O termo "heterólogo" quando usado em referência a um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima se refere a um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima que é de uma fonte ou derivado de uma fonte diferente das espécies de organismos hospedeiros. Em contrapartida, um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima "homólogo" é usado nes- te documento para denotar um polinucleotídeo, gene, ácido nucleico, polipeptídeo ou enzima que é derivado da espécie de organismo hos- pedeiro. Ao se referir a uma sequência regulatória de genes ou a uma sequência auxiliar de ácido nucleico usada para manter ou manipular uma sequência de genes (por exemplo, um promotor, uma região não traduzida de 5', região não traduzida de 3', sequência de adição de poli A, sequência de íntrons, local de splice, local de ligação do ribossomo, sequência interna de entrada do ribossomo, região de homologia do genoma, local de recombinação, etc.), "heterólogo" significa que a se- quência reguladora ou auxiliar não está naturalmente associada ao gene com o qual a sequência reguladora ou auxiliar de ácido nucleico é justaposta em um construto, genoma, cromossomo ou epissoma. Assim, um promotor operacionalmente ligado a um gene ao qual não está operacionalmente ligado em seu estado natural (ou seja, no ge-
noma de um organismo não geneticamente modificado) é referido nes- te documento como um "promotor heterólogo", mesmo que o promotor possa derivar da mesma espécie (ou, em alguns casos, do mesmo or- ganismo) que o gene ao qual está ligado.
[0042] Como usado neste documento, o termo "proteína" ou "poli- peptídeo" é destinado a abranger um "polipeptídeo" singular bem co- mo "polipeptídeos" plurais e se refere a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptí- deo" se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoá- cidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "ca- deia de aminoácidos" ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos são incluídos na definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez desses termos ou de forma intercambiável com qualquer um dos mesmos.
[0043] Os números de acesso a genes e proteínas, comumente fornecidos entre parênteses após o nome de um gene ou espécie, são identificadores exclusivos para um registro de sequência disponível publicamente no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov), mantido pelos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (United States National Institutes of Health). O número de identificação da sequência "GenInfo Identifier" (GI) é espe- cífico para uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. Se uma sequência mudar de alguma forma, um novo número de IG é atribuído. Uma ferramenta de Histórico de Revisão de Sequência está disponível para rastrear os vários números de IG, números de versão e datas de atualização para sequências que aparecem em um registro GenBank específico. A pesquisa e obtenção de sequências de ácidos nucleicos ou sequências de genes ou sequências de proteínas com base nos números de acesso e nos números GI é bem conhecida na técnica de, por exemplo, biologia celular, bioquímica, biologia molecular e genéti- ca molecular. Os identificadores de locus de genes se referem ao ge- noma publicado descrito em Corteggiani Carpinelli et al. (2014) Mol Plant 7:323 a 335 e disponível online no portal do genoma CRIBI Ge- nomics Nannochloropsis.
[0044] Como usado no presente documento, os termos "identidade percentual" ou "homologia" com relação às sequências de ácidos nu- cleicos ou polipeptídeos são definidos como a porcentagem de resí- duos de nucleotídeos ou aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos polipeptídeos conhecidos, após o alinhamento das se- quências para porcentagem máxima de identidade e introdução de la- cunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de homolo- gia. Para sequências polipeptídicas, as inserções ou deleções no N terminal ou C terminal não devem ser interpretadas como afetando a homologia, e as deleções e/ou inserções internas na sequência poli- peptídica que são inferiores a cerca de 65, inferiores a cerca de 60, inferiores a cerca de 50, inferiores a cerca de 40, inferiores a cerca de 30, inferiores a cerca de 20 ou inferiores a cerca de 10 resíduos de aminoácidos não devem ser interpretadas como afetando a homologia das sequências de aminoácidos (proteínas) comparadas. Para se- quências de ácidos nucleicos, as inserções ou deleções nas extremi- dades 5' ou 3' não devem ser interpretadas como afetando a homolo- gia, e as deleções e/ou inserções internas na sequência polipeptídica que são inferiores a cerca de 200, inferiores a cerca de 180, inferiores a cerca de 150, inferiores a cerca de 120, inferiores a cerca de 100, inferiores a cerca de 90, inferiores a cerca de 80, inferiores a cerca de 70, inferiores a cerca de 60, inferiores a cerca de 50, inferiores a cerca de 40 ou inferiores a cerca de 30 nucleotídeos não devem ser interpre-
tadas como afetando a homologia das sequências de ácidos nucleicos comparadas. A homologia ou identidade no nível da sequência de nu- cleotídeos ou aminoácidos pode ser determinada pela análise BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) usando o algoritmo empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3.389 a 3.402 e Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 2.264 a 2.268), que são adaptados para pes- quisa de similaridade de sequência. A abordagem usada pelo progra- ma BLAST é considerar primeiro segmentos semelhantes, com e sem gaps, entre uma sequência inserida e uma sequência de banco de da- dos, avaliar, então, a significância estatística de todas as correspon- dências identificadas e, finalmente, sumarizar apenas as correspon- dências que satisfazem um limiar de significância pré-selecionado. Pa- ra uma discussão de questões básicas na busca por similaridade de bancos de dados de sequência, consulte Altschul (1994), Nature Ge- netics 6, 119 a 129. Os parâmetros de pesquisa para histograma, des- crições, alinhamentos, expectativa (ou seja, o limite de significância estatística para relatórios correspondentes às sequências do banco de dados), ponto de corte, matriz e filtro (baixa complexidade) podem es- tar nas configurações padrão. A matriz de pontuação padrão usada por blastp, blastx, tblastn e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10.915 a 10.919), recomendada para sequências de consultas com mais de 85 de comprimento (bases nucleotídicas ou aminoácidos).
[0045] Para blastn, projetado para comparar sequências de nucle- otídeos, a matriz de pontuação é definida pelas razões de M (isto é, a pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes) e N (isto é, a pontuação de penalidade para resíduos de incompatibili- dade), em que os valores padrão de M e N podem ser +5 e -4, respec- tivamente. Quatro parâmetros blastn podem ser ajustados da seguinte forma: Q = 10 (penalidade de criação de gap); R = 10 (penalidade de extensão de gap); wink = 1 (gera ocorrências de palavras em todas as posições de "winkth" ao longo da consulta); e gapw = 16 (define a lar- gura da janela na qual os alinhamentos de gap são gerados). As confi- gurações equivalentes dos parâmetros Blastp para comparação de sequências de aminoácidos podem ser: Q = 9; R = 2; wink = 1; e gapw = 32. Uma comparação Bestfit entre sequências, disponível no pacote GCG versão 10.0, pode usar os parâmetros de DNA, GAP = 50 (pena- lidade de criação de gap) e LEN = 3 (penalidade de extensão de gap), e as configurações equivalentes nas comparações de proteínas po- dem ser GAP = 8 e LEN = 2.
[0046] Assim, quando se refere às sequências polipeptídicas ou de ácido nucleico da presente invenção, estão incluídas identidades de sequência de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, de pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cer- ca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou cerca de 100% (por exemplo, pelo menos qualquer uma de 50%, 75% ou 90%) de identi- dade de sequência com a sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico de tamanho completo, ou fragmentos dos mesmos que compreende uma sequência consecutiva de pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150 (por exemplo, pelo menos 100) ou mais resíduos de aminoácidos de toda a proteína; variantes de tais sequências, por exemplo, em que pelo menos um resíduo de ami- noácido foi inserido no terminal N e/ou C na e/ou dentro da(s) sequên- cia(s) descrita(s) que contém a inserção e substituição. As variantes contempladas podem incluir adicionalmente ou alternadamente aque- las que contêm mutações predeterminadas por, por exemplo, recom-
binação homóloga ou mutagênese por PCR ou direcionada ao local, e os polipeptídeos ou ácidos nucleicos correspondentes de outras espé- cies, incluindo, mas não se limitando aos descritos no presente docu- mento, os alelos ou outras variantes de ocorrência natural da família de polipeptídeos ou ácidos nucleicos que contêm uma inserção e substituição; e/ou derivados em que o polipeptídeo foi modificado co- valentemente por substituição, produto químico, enzimático ou outro meio apropriado com uma fração que não seja um aminoácido de ocorrência natural que contém a inserção e substituição (por exemplo, uma fração detectável, como uma enzima).
[0047] Como usado no presente documento, a frase "substituição conservadora de aminoácidos" ou "mutação conservadora" refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido com uma propri- edade comum. Uma maneira funcional de definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácidos entre proteínas correspondentes de or- ganismos homólogos (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com essas análises, grupos de aminoáci- dos podem ser definidos quando os aminoácidos de um grupo trocam preferencialmente entre si e, portanto, se assemelham mais ao seu impacto na estrutura geral da proteína (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoáci- dos definidos dessa maneira podem incluir: um "grupo po- lar/carregado" incluindo Glu, Asp, Asn, Gln, Lys, Arg e His; um "grupo aromático ou cíclico", incluindo Pro, Phe, Tyr e Trp; e um "grupo alifáti- co", incluindo Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Ser, Thr e Cys. Dentro de ca- da grupo, os subgrupos também podem ser identificados. Por exem- plo, o grupo de aminoácidos carregados/polares pode ser subdividido em subgrupos, incluindo: o "subgrupo carregado positivamente" que compreende Lys, Arg e His; o "subgrupo com carga negativa" que compreende Glu e Asp; e o "subgrupo polar" que compreende Asn e Gln. Em outro exemplo, o grupo aromático ou cíclico pode ser subdivi- dido em subgrupos, incluindo: o "subgrupo anel de nitrogênio" que compreende Pro, His e Trp; e o "subgrupo fenila" que compreende Phe e Tyr. Em outro exemplo adicional, o grupo alifático pode ser subdivi- dido em subgrupos, incluindo: o "subgrupo alifático não polar grande" que compreende Val, Leu e Ile; o "subgrupo alifático levemente polar" que compreende Met, Ser, Thr e Cys; e o "subgrupo de pequenos re- síduos" que compreende Gly e Ala. Exemplos de mutações conserva- doras incluem substituições de aminoácidos com aminoácidos dentro dos subgrupos acima, tais como, porém sem limitação: Lis para Arg ou vice-versa, de modo que uma carga positiva pode ser mantida; Glu para Asp ou vice-versa, de modo que uma carga negativa pode ser mantida; Ser para Thr ou vice-versa, de modo que um -OH livre pode ser mantido; e Gln para Asn ou vice-versa, de modo que um -NH2 livre pode ser mantido. Uma "variante conservadora" é um polipeptídeo que inclui um ou mais aminoácidos que foram substituídos para substituir um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência (por exemplo, um polipeptídeo cuja sequência é descrita em um banco de dados de publicação ou sequência, ou cuja sequência foi determinado por se- quenciação de ácido nucleico) com um aminoácido possuindo proprie- dades comuns, por exemplo, pertencendo ao mesmo grupo ou sub- grupo de aminoácidos delineado acima.
[0048] Como usado neste documento, "expressão" inclui a expres- são de um gene pelo menos no nível da produção de RNA, e um "pro- duto de expressão" inclui o produto resultante, por exemplo, um poli- peptídeo ou RNA funcional (por exemplo, um RNA ribossômico, um tRNA, um RNA antissenso, um micro RNA, um shRNA, uma ribozima etc.) de um gene expresso. O termo "expressão aumentada" inclui uma alteração na expressão gênica para facilitar a produção aumenta-
da de mRNA e/ou expressão aumentada de polipeptídeo. "Produção aumentada" [de um produto gênico] inclui um aumento na quantidade de expressão de polipeptídeo, no nível da atividade enzimática de um polipeptídeo ou em uma combinação de ambos, em comparação com a produção nativa ou atividade enzimática do polipeptídeo.
[0049] Alguns aspectos da presente invenção incluem a deleção parcial, substancial ou completa, silenciamento, inativação ou regula- ção decrescente da expressão de sequências polinucleotídicas especí- ficas. Os genes podem ser parcial, substancial ou completamente de- letados, silenciados, inativados, ou sua expressão pode ser regulada de forma decrescente a fim de afetar a atividade realizada pelo poli- peptídeo que codificam, como a atividade de uma enzima. Os genes podem ser parciais, substanciais ou completamente deletados, silenci- ados, inativados ou regulados de forma decrescente pela inserção de sequências de ácidos nucléicos que interrompem a função e/ou ex- pressão do gene (por exemplo, inserção viral, mutagênese por trans- poson, meganucleases geneticamente modificadas, recombinação homóloga ou outros métodos conhecidos na técnica). Os termos "eli- minar", "eliminação" e "knockout" podem ser usados de forma inter- cambiável com os termos "deleção", "deleção parcial", "deleção subs- tancial" ou "deleção completa". Em certas modalidades, um microrga- nismo de interesse pode ser modificado por recombinação homóloga direcionada ao local ou integração ou mutação direcionada com o uso de um sistema cas/CRISPR para knockout de um gene de interesse específico. Em ainda outras modalidades, a inserção alvejada em ou mutação de uma região reguladora de gene com o uso de um sistema cas/CRISPR, RNAi ou construtos de DNA antissenso (asDNA) pode ser usada para silenciar parcial, substancial ou completamente, desa- tivar ou regular de forma decrescente um gene específico de interesse.
[0050] Essas inserções, interrupções, deleções, modificações de bases ou outras modificações de certas moléculas de ácido nucleico ou sequências polinucleotídicas específicas podem ser entendidas como englobando "modificação(ões) genética(s)" ou "transforma- ção(ões)", de modo que as cepas resultantes dos microrganismos ou as células hospedeiras possam ser entendidas como "geneticamente modificadas", "modificadas geneticamente" ou "transformadas."
[0051] Como usado neste documento, "regulado de forma cres- cente" ou "regulação crescente" inclui um aumento na expressão de um gene ou molécula de ácido nucleico de interesse ou na atividade de uma enzima, por exemplo, um aumento na expressão genética ou na atividade enzimática em comparação com a expressão ou atividade em um gene ou enzima de outra forma idêntico que não tenha sido regulado.
[0052] Como usado neste documento, "regulado de forma decres- cente" ou "regulação decrescente" inclui uma diminuição na expressão de um gene ou molécula de ácido nucleico de interesse ou na ativida- de de uma enzima, por exemplo, uma diminuição na expressão do ge- ne ou atividade enzimática em comparação com a expressão ou ativi- dade em um gene ou enzima que, de outra forma, seria idêntico e que não foi regulado de forma decrescente.
[0053] Como usado neste documento, "mutante" se refere a um organismo que tem uma mutação em um gene que é o resultado da mutagênese clássica, por exemplo, usando irradiação gama, UV ou mutagênicos químicos. "Mutante", como usado no presente documen- to, também se refere a uma célula recombinante que alterou a estrutu- ra ou expressão de um gene como resultado da modificação genética que muitos incluem, como exemplos não limitativos, superexpressão, incluindo a expressão de um gene sob diferentes variáveis temporais, biológicas, ou regulação ambiental e/ou em um grau diferente do que ocorre naturalmente e/ou expressão de um gene que não é expresso naturalmente na célula recombinante; recombinação homóloga, inclu- indo knockouts e knockins (por exemplo, substituição de genes por genes que codificam polipeptídeos com atividade maior ou menor que o polipeptídeo de tipo selvagem e/ou polipeptídeos negativos dominan- tes); atenuação de genes via RNAi, RNA antissenso, ribozimas, ou si- milares; e modificação de genoma usando meganucleases, nucleases de dedos de zinco, TALENs e/ou tecnologias CRISPR e similares.
Um mutante também pode ser produzido por mutagênese de inserção ale- atória ou direcionada, transformando um organismo, tecido ou células com um construto de ácido nucleico e/ou mutagênese por transposon.
Um mutante, portanto, não é um organismo que ocorre naturalmente.
Um organismo mutante de interesse normalmente terá um fenótipo diferente daquele do tipo selvagem ou cepa progenitora corresponden- te que não tem a mutação, em que o fenótipo pode ser avaliado por ensaios de crescimento, análise de produtos, propriedades fotossinté- ticas, ensaios bioquímicos, etc.
Referir-se a um gene "mutante" signifi- ca que o gene tem pelo menos uma alteração, deleção ou inserção de base (nucleotídeo) em relação a um gene do tipo nativo ou selvagem.
A mutação (alteração, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotí- deos) pode estar na região de codificação do gene ou em um íntron, 3' UTR, 5' UTR ou região promotora, por exemplo, dentro de cerca de 1 kb, cerca de 2 kb ou cerca de 3 kb, cerca de 4 kb ou cerca de 5 kb do local inicial de tradução.
Por exemplo, um mutante com expressão atenuada de um gene como descrito neste documento pode ter uma mutação, que pode ser uma ou mais alterações de nucleobases e/ou uma ou mais deleções de nucleobases e/ou uma ou mais inserções de nucleobases na região de um gene 5' do local de início da transcrição, como, em exemplos não limitantes, dentro de 2 kb, dentro de 1,5 kb, dentro de 1 kb, ou dentro de 0,5 kb do local de início transcricional co- nhecido ou putativo, ou dentro de 3 kb, dentro de 2,5 kb, dentro de
2kb, dentro de 1,5 kb, dentro de 1kb ou dentro de 0,5 kb do local inicial da tradução. Como exemplos não limitantes, um gene mutante pode ser um gene que tem uma mutação, inserção e/ou deleção na região promotora que pode aumentar ou diminuir a expressão do gene; pode ser um gene que tem uma deleção que resulta na produção de uma proteína não funcional, proteína truncada, proteína negativa dominante e/ou nenhuma proteína; e/ou pode ser um gene que tem uma ou mais mutações pontuais que levam a uma alteração no aminoácido da pro- teína codificada ou resulta em splicing aberrante da transcrição gené- rica, etc.
[0054] Os domínios conservados de polipeptídeos incluem aqueles identificados no banco de dados "cd" (domínio conservado), no banco de dados COG, no banco de dados SMART, no banco de dados PRK, no banco de dados PRK, no banco de dados TIGRFAM ou em outros conhecidos na técnica. O site do National Center for Biotechnology In- formation, patrocinado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, inclui um banco de dados de domínio conservado (CDD), que descre- ve como "um recurso de anotação de proteínas que consiste em uma coleção de modelos de alinhamento de várias sequências bem anota- dos para domínios antigos e proteínas de comprimento total. Eles es- tão disponíveis como matrizes de pontuação específicas da posição (PSSMs) para identificação rápida de domínios conservados em se- quências de proteínas via RPS-BLAST incluem domínios com curado- ria de NCBI, que usam informações para definir explicitamente os limi- tes do domínio e fornecer insights sobre relações de sequên- cia/estrutura/função, bem como modelos de domínio importados de várias fontes externas (Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM)." As se- quências podem ser pesquisadas para domínios conservados no ban- co de dados cdd do NCBI. Consultar Marchler-Bauer et al. (2015) Nu- cleic Acids Res. 43(D) 222 a 226.
[0055] O termo "Pfam" se refere a uma grande coleção de domí- nios de proteínas e famílias de proteínas mantidos pelo Consórcio Pfam e disponíveis em vários sites patrocinados na Internet.
A versão mais recente do Pfam é o Pfam 31.0 (março de 2017). Os domínios e famílias da Pfam são identificados usando vários alinhamentos de se- quência e modelos de Markov ocultos (HMMs). As atribuições de famí- lia ou domínio Pfam-A são atribuições de alta qualidade geradas por um alinhamento de sementes com curadoria com o uso de membros representativos de uma família de proteínas e a descrição de modelos de Markov ocultos com base no alinhamento de sementes. (Salvo es- pecificado de outro modo, as correspondências de uma proteína con- sultada a um domínio ou família Pfam são correspondências Pfam-A.) Todas as sequências identificadas pertencentes à família são, então, usadas para gerar automaticamente um alinhamento completo para a família (Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320 a 322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263 a 266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138 a D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Database Edição 34, D247 a 251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Database Edição 38, D211 a 222). Ao acessar o banco de dados da Pfam, por exemplo, com uso de qual- quer um dos sites da web mencionados acima, as sequências de pro- teínas podem ser consultadas nos HMMs com uso do software de pesquisa de homologia HMMER (por exemplo, HMMER2, HMMER3 ou uma versão superior, disponível online). Correspondências signifi- cativas que identificam uma proteína consultada como estando em uma família pfam (ou como tendo um domínio Pfam específico) são aquelas nas quais a pontuação de bits é maior ou igual ao limite de coleta para o domínio Pfam.
Os valores de expectativa (valores e) também podem ser usados como critério para inclusão de uma proteí- na inserida em um Pfam ou para determinar se uma proteína inserida tem um domínio Pfam específico, em que valores e baixos (valores inferiores a 1,0, por exemplo, inferiores a 0,1, ou menor ou igual a 0,01) representam baixas probabilidades de uma correspondência ser devida ao acaso.
[0056] Um "cDNA" é uma molécula de DNA que compreende pelo menos uma porção da sequência nucleotídica de uma molécula de mRNA, com a exceção de que a molécula de DNA substitui a uridina, ou U, que ocorre na sequência de mRNA, pela nucleobase timina, ou T. Um cDNA pode ser de fita dupla, fita dupla parcialmente ou fita sim- ples e pode ser, por exemplo, o complemento da sequência de mRNA. Em exemplos preferenciais, um cDNA não inclui uma ou mais sequên- cias de íntrons que ocorrem no gene de ocorrência natural ao qual o cDNA corresponde (isto é, o gene que ocorre no genoma de um orga- nismo). Por exemplo, um cDNA pode ter sequências a montante de um íntron de um gene que ocorre naturalmente justapostas a sequên- cias a jusante do íntron de um gene que ocorre naturalmente, em que as sequências a montante e a jusante não são justapostas em uma molécula de DNA na natureza (isto é, as sequências não são justapos- tas no gene que ocorre naturalmente). Um cDNA pode ser produzido por transcrição reversa de moléculas de mRNA ou pode ser sintetiza- do, por exemplo, por síntese química e/ou com o uso de uma ou mais enzimas de restrição, uma ou mais ligases, uma ou mais polimerases (incluindo, porém sem limitação, polimerases tolerantes a altas tempe- raturas que podem ser usadas em reações em cadeia da polimerase (PCRs)), uma ou mais recombinases, etc., com base no conhecimento da sequência de cDNA, em que o conhecimento da sequência de cDNA pode opcionalmente se basear na identificação de regiões de codificação provenientes das sequências do genoma ou compiladas a partir das sequências múltiplos cDNAs parciais.
[0057] Uma "célula de controle" ou "microrganismo de controle" é uma célula ou microrganismo do tipo selvagem a partir do qual o mi- crorganismo mutante (microrganismo geneticamente modificado ou mutagenizado) é derivado direta ou indiretamente, ou é uma célula ou microrganismo substancialmente idêntico à célula mutante ou micror- ganismo referido (isto é, do mesmo gênero e espécie, preferencial- mente da mesma cepa), com a exceção de que a célula ou microrga- nismo de controle não tem a mutação que resulta em aumento da pro- dução lipídica do microrganismo em questão. Por exemplo, onde o mi- crorganismo mutante atenuou a expressão de (1) um gene que codifi- ca um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2); (2) um gene que codifica um polipeptídeo que possui um domínio de TPR com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; (3) um gene que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, em pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (4) um gene que codifica um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; onde a célula de controle pode ser substancialmente idêntica ao microrganismo mutan- te, com a exceção de que o microrganismo de controle não possui ex- pressão atenuada de (1), (2), (3) ou (4).
[0058] "As mesmas condições" ou "as mesmas condições de cul- tura", como usado neste documento, significam substancialmente as mesmas condições, ou seja, quaisquer diferenças entre as condições referenciadas que possam estar presentes são menores e não são re-
levantes para a função ou propriedades do microrganismo que são materiais para a invenção, incluindo produção de lipídios ou produção de biomassa.
[0059] Como usado neste documento, "lipídio" ou "lipídios" se refe- re a gorduras, ceras, ácidos graxos, derivados de ácidos graxos, como álcoois graxos, ésteres de ceras, alcanos e alcenos, esteróis, monogli- cerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídios, esfingolipídios, sa- carolipídios e glicerolípidos. "Lipídios FAME" ou "FAME" se refere a lipídios com porções químicas de acila que podem ser derivatizadas em ésteres metílicos de ácidos graxos, como, por exemplo, monoacil- glicerídeos, diacilglicerídeos, triacilglicerídeos (TAGs), ésteres de ce- ras e lipídios de membrana, como fosfolipídios, galactolipídios, etc.
[0060] Em um exemplo, a produtividade lipídica pode ser avaliada como produtividade FAME em miligramas por litro (mg/l), e para algas, pode ser relatada como gramas por metro2 por dia (g/m2/dia). Em um exemplo, os ensaios semicontínuos no presente documento forneci- dos, os valores de mg/l podem ser convertidos em g/m2/dia, levando em consideração a área de irradiância incidente (por exemplo, a aber- tura do rack do frasco de ensaio de processo semicontínuo (SCPA) pode ser 1½" x 33/8", ou 0,003145m2) e o volume da cultura pode ser 550 ml. Para obter valores de produtividade em g/m2/dia, os valores de mg/l podem ser multiplicados pela taxa de diluição diária (30%) e um fator de conversão de 0,175. Quando lipídios ou subcategorias dos mesmos (por exemplo, TAG ou FAME) são referidos como uma por- centagem, a porcentagem é uma porcentagem em peso, a menos que indicado de outra forma.
[0061] "Biomassa" se refere à massa celular, seja de células vivas ou mortas, e pode ser avaliada em células cultivadas, por exemplo, como peso aspirado de péletes, mas é mais preferencialmente peso seco (por exemplo, liofilado de uma amostra de cultura ou células pe-
letizadas), livre de cinzas peso seco (AFDW) ou carbono orgânico total (TOC), usando métodos conhecidos na técnica. A biomassa aumenta durante o crescimento de uma cultura sob condições permissivas de crescimento e pode ser referida como "acúmulo de biomassa" em cul- turas descontínuas, por exemplo. Em culturas contínuas ou semicontí- nuas que sofrem diluição constante ou regular, a biomassa produzida que se acumularia na cultura é removida durante a diluição da cultura. Assim, a produtividade diária da biomassa (aumentos na biomassa) por essas culturas também pode ser chamada de "acúmulo de bio- massa". A produtividade da biomassa pode ser avaliada como a pro- dutividade do TOC em miligramas por litro (mg/l), e para as algas, po- de ser relatada em gramas por metro2 por dia (g/m2/dia). Nos ensaios semicontínuos fornecidos neste documento, os valores de mg/l são convertidos em g/m2/dia levando em consideração a área de irradiân- cia incidente (a abertura do rack do frasco SCPA de 1½" x 33/8" ou 0,003145 m2) e o volume da cultura (550 ml). Para obter valores de produtividade em g/m2/dia, os valores de mg/l são multiplicados pela taxa de diluição diária (30%) e um fator de conversão de 0,175. Onde a biomassa é expressa como uma porcentagem, a porcentagem é uma porcentagem em peso, a menos que indicado de outra forma.
[0062] No contexto desta invenção, uma "fonte de nitrogênio" é uma fonte de nitrogênio que pode ser absorvida e metabolizada pelo microrganismo em questão e incorporada nas biomoléculas para cres- cimento e propagação. Por exemplo, compostos incluindo nitrogênio que não podem ser absorvidos e/ou metabolizados pelo microrganis- mo para crescimento (por exemplo, tampões biológicos contendo ni- trogênio, como Hepes, Tris, etc.) não são considerados fontes de ni- trogênio no contexto da invenção.
[0063] "Nitrogênio reduzido", como usado neste documento, é ni- trogênio na forma química de sal de amônio, amônia, ureia, amidas ou aminoácido (por exemplo, um aminoácido que pode ser absorvido e metabolizado pelo microrganismo que está sendo cultivado para for- necer uma fonte de nitrogênio para incorporação em biomoléculas, fa- vorecendo o crescimento). Exemplos de aminoácidos que podem ser fontes de nitrogênio podem incluir, sem limitação, glutamato, glutami- na, histidina, prolina, lisina, arginina, asparagina, alanina e glicina. "Ni- trogênio não reduzido" no contexto de uma fonte de nitrogênio que po- de estar presente em um meio de cultura para microrganismos se refe- re a nitrato ou nitrito que deve ser reduzido antes da assimilação em compostos orgânicos pelo microrganismo.
[0064] "A única fonte de nitrogênio (no meio de cultura)" é usada de forma intercambiável com "substancialmente a única fonte de nitro- gênio" e indica que nenhuma outra fonte de nitrogênio que pode ser metabolizada pelo microrganismo (ou seja, a fonte de nitrogênio forne- ce nitrogênio que pode ser absorvido pelo microrganismo e incorpora- do pelo organismo em biomoléculas como proteínas e ácidos nuclei- cos) é intencionalmente adicionado ao meio de cultura, ou que ne- nhuma outra fonte de nitrogênio esteja presente em quantidade sufici- ente para aumentar significativamente o crescimento dos microrga- nismos ou células cultivados no meio referenciado. Ao longo do pre- sente pedido, por questões de brevidade, os termos "somente nitrato" são usados para caracterizar os meios de cultura nos quais o nitrato é a única fonte de nitrogênio disponível aos microrganismos para apoiar o crescimento.
[0065] Da mesma forma, "a única fonte de carbono (no meio de cultura)" é usada de forma intercambiável com "substancialmente a única fonte de carbono" e indica que nenhuma outra fonte de carbono que pode ser metabolizada pelo microrganismo (isto é, usada para energia ou como fonte de carbono para a produção de biomoléculas) está presente em uma quantidade suficiente para aumentar significati-
vamente a produtividade, crescimento ou propagação dos microrga- nismos ou células cultivadas no meio referenciado ou que podem ser incorporados em biomoléculas, como lipídios produzidos por microrga- nismos ou células em uma porcentagem superior a 5% do carbono in- corporado na biomolécula.
[0066] As condições de "repleto de nitrogênio" se referem às con- dições dos meios em que nenhum benefício adicional de crescimento ou propagação é conferido pela adição de nitrogênio adicional (em uma forma que possa ser usada pelo microrganismo) ao meio. Da mesma forma, condições de "repleto de nutrientes" se referem às con- dições dos meios nas quais nenhum nutriente limita o crescimento ou a propagação, ou seja, quando um meio é repleto de nutriente, a adi- ção de nutriente (ou nutrientes) adicional ao meio não resulta em um crescimento ou propagação aprimorada taxa. No contexto de "repleto de nutrientes", "nutrientes" inclui, como exemplos não limitantes, fosfa- to, enxofre, ferro e opcionalmente sílica, mas exclui fontes de carbono como açúcares ou ácidos orgânicos que podem ser usados pelo orga- nismo como fonte de energia.
[0067] São descritos neste documento métodos para manipular, examinar, cultivar e analisar microrganismos. A invenção apresentada neste documento também usa métodos, técnicas e reagentes padrão para cultura de células, transformação de microrganismos, engenharia genética e análises bioquímicas conhecidas na técnica. Embora méto- dos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste do- cumento possam ser usados na prática ou no teste da presente inven- ção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materi- ais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações. MICRORGANISMOS MUTANTES COM AUMENTO DA PRODUTIVI-
DADE LIPÍDICA
[0068] Os domínios de repetição de tetratricopeptídeo (TPR) são motivos estruturais presentes em uma ampla gama de proteínas que servem como módulos de interação e mediadores de complexos de multiproteínas. Polipeptídeos com TPRs regulam diversos processos biológicos, como direcionamento de organelas e importação de proteí- nas, fusão de vesículas e biomineralização (como revisado em Zeytu- ni, N. et al. 2012, Structure 20 (3): 397-405). Um domínio de TPR pode ser caracterizado como pfam13414 "repetição de TPR" ou como domí- nio conservado COG0457, como domínio conservado CDD 290150 ou domínio conservado CDD 276809 ("repetição de tetratricopeptídeo"). Alternativamente ou além disso, um domínio de TPR pode ser caracte- rizado como domínio conservado cl26005, o domínio "SGT1, supres- sor de alelo G2 de SKP1", que é um membro da superfamília PLN03088 de domínios. Uma pesquisa BLAST de sequências de pro- teínas em blast.ncbi.nlm.nih.gov geralmente fornece um sumário dos domínios encontrados na sequência de consulta. As sequências poli- peptídicas podem ser examinadas quanto à presença de um domínio de TPR, por exemplo, pesquisando domínios pfam ou domínios con- servados dentro da sequência em sites publicamente disponíveis, co- mo pfam.xfam.org ou ncbi (blast.ncbi.nlm.nih.gov).
[0069] Em algumas modalidades, esta invenção fornece microrga- nismos mutantes com expressão e/ou função atenuada e/ou alterada de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR, em que os microrganismos mutantes possuem produtividade lipídica aumentada e/ou exibem particionamento aumentado de carbo- no para lipídio em relação a um microrganismo de controle. Também são fornecidos microrganismos mutantes com expressão e/ou função atenuada e/ou alterada de um gene ou proteína que afeta a expressão e/ou função de um polipeptídeo que possui um domínio de TPR.
[0070] Como fornecido neste documento, "expressão atenuada de um gene" ou "um gene atenuado" inclui expressão atenuada devido à inativação de um gene ou deleção de um gene.
Como exemplos não limitativos, um gene com expressão atenuada pode ser um gene inter- rompido, por exemplo, um gene com uma deleção ou uma mutação insercional que interrompe o quadro de leitura por deslocamento de quadro e/ou introdução de um códon de parada para resultar em uma proteína alterada sequência de aminoácidos e/ou um quadro de leitura aberto truncado (ORF), resultando em uma proteína não funcional.
A mutagênese insercional também pode ser por qualquer meio, seja por mutagênese aleatória ou clássica ou por engenharia genética, e em vários exemplos não limitativos a mutação insercional pode ser por meio de uma transposase, inserção aleatória do DNA introduzido, re- combinação homóloga ou inserção do DNA mediado por um sistema Cas/CRISPR.
Mutações insercionais também podem ser inserções que ocorrem por mutagênese e/ou mau funcionamento após a muta- gênese que pode ser via mutagênese clássica (por exemplo, exposi- ção a produtos químicos ou radiação ionizante) ou engenharia genéti- ca, onde uma mutação insercional pode alterar o quadro de leitura ou introduzir um ou mais códons de parada.
Um gene atenuado também pode ser um gene interrompido que possui uma deleção ou inserção que interrompe o quadro de leitura, introduzindo um códon de parada, deslocamento de quadro (que pode resultar em uma sequência de aminoácidos diferente e também pode introduzir um códon de parada) e/ou por deleção de sequências de aminoácidos do polipeptídeo para resultar em uma proteína que possui uma sequência de aminoácidos alterada e/ou um quadro de leitura aberto (ORF) excluído internamente ou truncado no terminal N ou C.
Um gene interrompido pode ter uma deleção ou inserção de um a milhares de pares de bases, por exem- plo.
As deleções ou inserções podem ocorrer via recombinação homó-
loga/substituição de genes, pela atividade de um sistema Cas/CRISPR ou por mutagênese clássica, por exemplo. Um gene atenuado também pode ser um gene que inclui pelo menos uma mutação que altera pelo menos um aminoácido na sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Essa mudança na sequência de aminoácidos pode alterar a atividade da proteína codificada. Alterações na sequência de amino- ácidos com maior probabilidade de atenuar a função de polipeptídeo podem ocorrer em domínios conservados, por exemplo, para os poli- peptídeos no presente documento descritos, uma mutação de altera- ção de aminoácido pode ocorrer no domínio de TPR (por exemplo, um domínio caracterizado como "repetição de TPR" pfam13414 ou como domínio conservado COG0457, como domínio conservado CDD 290150, como domínio conservado CDD 276809 ("repetição de tetra- tricopeptídeo") ou como domínio conservado cl26005; ou pode ocorrer em um domínio DUF4470. A atividade reduzida ou alterada da proteí- na codificada pelo gene pode, em alguns exemplos, ser deduzida por um fenótipo alterado do microrganismo mutante que possui o gene atenuado, como, por exemplo, aumento da produção lipídica e/ou au- mento do particionamento de carbono para lipídio.
[0071] Mutantes que demonstram expressão atenuada de um ge- ne que codifica um polipeptídeo que possui um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470 ou que possui expressão ou função atenuada de uma proteína que possui um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470 podem, em algumas modalidades, ser mutantes que incluem mutações em regiões não codificantes do gene que codificam um poli- peptídeo que possui um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470. Por exemplo, o gene pode incluir um ou mais nucleotídeos alterados, inseridos ou deletados em uma região 5' UTR, 5' a montante (por exemplo, a montante do local de início da transcrição), 3' UTR ou um íntron de um gene que codifica um polipeptídeo que possui um domí-
nio de TPR e/ou um domínio DUF4470. Além disso, "expressão atenu- ada de um gene" em um mutante como no presente documento forne- cido inclui expressão atenuada resultante de RNAi, RNA antissenso, microRNAs ou similares ou ribozimas direcionadas contra o gene.
[0072] Alternativamente ou além de ter a expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que possui um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470, um microrganismo mutante como no pre- sente documento fornecido pode ter expressão e/ou função atenuada e/ou alterada de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% para a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Em várias modalidades, esses microrga- nismos mutantes podem produzir mais lipídios e/ou exibir particiona- mento aumentado de carbono em lipídios em comparação com um mi- crorganismo de controle que não tem expressão ou função atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo com uma sequência de ami- noácidos com pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
[0073] Em algumas modalidades, o gene que codifica um polipep- tídeo que possui um domínio de TPR ou que possui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 está localizado no local Naga_100148g8 no cromos- somo 12 de Nannochloropsis gaditana, ou é um gene sintênico de ou- tra espécie, por exemplo, um gene sintênico de outra espécie de hete- rokonta (stramenopila), eustigmatófito ou Nannochloropsis.
[0074] Em algumas modalidades, o polipeptídeo tendo um domínio de TPR e/ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 também inclui um domínio de função desconhecida caracterizada como DUF4470 e/ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades exemplifi- cadoras, o polipeptídeo que atenuou a expressão ou função de um mutante, como no presente documento fornecido, que produz mais lipídios do que uma célula de tipo selvagem sob condições de cultura substancialmente idênticas, inclui um domínio de TPR (por exemplo, um domínio pfam13414 "repetição de TPR" ou domínio conservado COG0457) e inclui ainda um domínio de função desconhecida, carac- terizado como DUF4470. Em algumas modalidades, um microrganis- mo mutante como no presente documento fornecido atenuou a ex- pressão de um gene que codifica um polipeptídeo que inclui a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma variante conservadora do mesmo ou que inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma variante conservativa do mesmo.
Além disso, o gene que em um mutante, como no presente documento fornecido, atenua a ex- pressão ou codifica um polipeptídeo com expressão ou função atenu- ada pode ser um gene que codifica um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65 %, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a
SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um microrganismo mutante, como no presente documento fornecido, que atenuou e/ou alterou a expressão e/ou a função de um gene que codifica um polipeptídeo que possui um domínio de TPR (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a mesma) e um domínio DUF4470 (por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a mesma) podem ter uma sequência com 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, em identidade de pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3. O gene em alguns exemplos pode ter uma sequência de codificação (quadro de leitura aberta) tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80 %, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
[0075] Assim, em algumas modalidades, um microrganismo mu- tante, como no presente documento fornecido, atenuou a expressão e/ou a função de um gene que codifica um polipeptídeo com um domí- nio de TPR e/ou com um domínio DUF4470, em que a expressão ou função reduzida do gene ou polipeptídeo resulta no mutante produzin- do mais lipídios do que um microrganismo de controle que não possui expressão ou função atenuada de um polipeptídeo que inclui um do- mínio de TPR e/ou um domínio DUF4470. Em algumas modalidades,
em microrganismos mutantes tendo expressão e/ou função atenuada e/ou alterada de pelo menos um gene (incluindo, mas não limitado a, inativação e/ou deleção de tal gene) que codifica um polipeptídeo que possui um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470, o nível de ex- pressão de pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR e/ou domínio DUF4470 é de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% ou mais inferior ao de um microrganismo de tipo selvagem. Em algumas moda- lidades, não há expressão detectável do gene que codifica um polipep- tídeo que possui um domínio de TPR.
[0076] A produção de lipídios e/ou particionamento aumentado de carbono em lipídios pode ser medida com o uso de ensaios de cultura em que o microrganismo pode ser cultivado em condições de cultura descontínua, semicontínua ou contínua. As condições de cultura sob as quais um microrganismo mutante, como no presente documento fornecido, com um gene mutado, interrompido ou atenuado que codifi- ca um polipeptídeo com um domínio de TPR produz mais lipídios do que um microrganismo de controle, podem ser limitadas em nitrogênio (por exemplo, com menos de cerca de 5 mM, menor que cerca de 4 mM, menos de cerca de 3 mM, menos de cerca de 2 mM ou menos de cerca de 1 mM de nitrogênio, por exemplo, entre cerca de 0,1 e cerca de 4 mM, ou entre cerca de 0,2 mM e cerca de 3 mM de nitrogênio, ou entre cerca de 0,3 e cerca de 2,8 mM de nitrogênio, ou entre cerca de 0,3 e 2 mM de nitrogênio, por exemplo, entre cerca de 0,3 mM e cerca de 1,5 mM de nitrogênio ou entre cerca de 0,2 mM e cerca de 1 mM de nitrogênio), ou pode estar repleto de nitrogênio ou pode estar esgotado de nitrogênio, por exemplo, tendo menos que cerca de 0,5 mM, menor que cerca de 0,4 mM, menor que cerca de 0,3 mM ou menor que cer- ca de 0,2 mM ou menor que cerca de 0,1 mM de nitrogênio no meio de cultura.
[0077] Em algumas modalidades, os microrganismos mutantes, como fornecidos nesta invenção (por exemplo, microrganismos obtidos por mutagênese clássica ou engenharia genética) produzem pelo me- nos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo me- nos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo me- nos cerca de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 130%, pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, pelo menos cerca de 170%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 190%, ou pelo menos cerca de 200% mais lipídios do que um microrganismo de controle cultivado sob con- dições substancialmente idênticas, que podem opcionalmente ser condições nas quais a cultura de microrganismos de controle produz biomassa. Por exemplo, o microrganismo mutante pode produzir entre cerca de 25% e cerca de 200% a mais, entre cerca de 25% e cerca de 175% a mais, entre cerca de 25% e cerca de 150% a mais, entre cerca de 25% e cerca de 125% a mais, entre cerca de 50% e cerca de 200% a mais, entre cerca de 50% e cerca de 175% a mais, entre cerca de 50% e cerca de 150% a mais, entre cerca de 50% e cerca de 125% a mais, entre cerca de 75% e cerca de 200% a mais, ou entre cerca de 75% e cerca de 175% a mais, entre cerca de 75% e cerca de 150% a mais, ou entre cerca de 75% e cerca de 125% a mais (por exemplo, 25-250% a mais) de lipídio do que um microrganismo controle quando o microrganismo mutante e o controle os microrganismos são cultiva-
dos sob condições substancialmente idênticas nas quais a cultura de microrganismos de controle produz biomassa. As condições de cultura podem estar repletas de nitrogênio e repletas de nutrientes em relação ao microrganismo de controle. Em algumas modalidades, o microrga- nismo de controle é um microrganismo do tipo selvagem da mesma espécie da qual o mutante é derivado direta ou indiretamente.
[0078] Um microrganismo mutante, como no presente documento fornecido, pode demonstrar maior produtividade lipídica do que um mi- crorganismo de controle durante um período de cultura de pelo menos cerca de um dia, pelo menos cerca de dois dias, pelo menos cerca de três dias, por exemplo, durante um período de cultura de pelo menos cerca de quatro, pelo menos cerca de cinco, pelo menos cerca de seis, pelo menos cerca de sete, pelo menos cerca de oito, pelo menos cer- ca de nove, pelo menos cerca de dez, pelo menos cerca de onze, pelo menos cerca de doze, pelo menos cerca de treze, pelo menos cerca de catorze, pelo menos cerca de quinze, pelo menos cerca de vinte, pelo menos cerca de trinta ou pelo menos cerca de sessenta dias ou durante um período que pode ser inferior a 180 dias, inferior a 120 dias ou inferior a 90 dias, em que o mutante pode ter uma produtividade lipídica diária média mais alta ao longo do período. Em algumas moda- lidades, uma maior produtividade lipídica pode ser demonstrada pelo microrganismo mutante quando o microrganismo mutante e o micror- ganismo de controle são cultivados sob condições substancialmente idênticas que suportam o crescimento e a propagação do microrga- nismo de controle, por exemplo, condições nas quais a cultura de mi- crorganismos de controle produz biomassa. Em alguns exemplos, o período de cultura em que um microrganismo mutante como no pre- sente documento fornecido demonstra que a maior produtividade lipí- dica em relação a um microrganismo de controle pode ser, por exem- plo, um microrganismo mutante como no presente documento forneci-
do pode produzir pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, em pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cer- ca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo me- nos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 130%, pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, pelo menos cerca de 170%, em pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 190% ou pelo me- nos cerca de 200% mais lipídios do que um microrganismo controle durante um período de cultura de três a 90 dias, de três a 60 dias, de três a trinta dias ou de três a quinze dias.
Por exemplo, um microrga- nismo mutante como no presente documento fornecido pode produzir pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo me- nos cerca de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 130%, em pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, pelo menos cerca de 170%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 190% ou pelo menos cerca de 200% mais lipídios do que um microrganismo de controle durante um período de cultura que varia de cerca de cinco a cerca de 90 dias, de cerca de cinco a cerca de 60 dias, de cerca de cinco a cerca de trinta dias, ou de cerca de cinco a cerca de quinze dias, ou de cerca de sete a cerca de 90 dias, de cerca de sete a cerca de 60 dias, de cerca de sete a cerca de dias ruins, de cerca de sete a cerca de vinte dias ou de cerca de sete a cerca de quinze dias. Em algumas modalidades, o mi- crorganismo mutante pode produzir entre cerca de 5% a 200% a mais, cerca de 5% a 175% a mais, 5% a 150% a mais, 5% a 125% a mais, cerca de 25% a 200% a mais, cerca de 25% a 175% a mais, cerca de 25% a 150% a mais, 25% a 125% a mais, 50% a 200% a mais, cerca de 50% a 175% a mais, 50% a 150% a mais, 50% a 125% a mais, 75% a 200% a mais ou 75% a 175% a mais, cerca de 75% a 150% ou cerca de 75% a 125% a mais (por exemplo, 5-200% a mais) de lipídio em relação a um microrganismo controle por um período de cultura de cinco a pelo menos 30 dias em cultura condições em que os microrga- nismos mutante e controle estão produzindo biomassa.
[0079] A quantidade de lipídio produzido por uma cultura pode ser avaliada removendo amostras e analisando lipídios usando métodos conhecidos na técnica. A produtividade pode ser produtividade volu- métrica, por exemplo, a produtividade de uma cultura pode ser expres- sa em peso por mililitro ou litro de cultura, e pode ser uma produtivida- de diária (por exemplo, mg/litro/dia ou g/litro/dia), por exemplo, uma produtividade média diária em vários dias da cultura (por exemplo, pe- lo menos cerca de três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze e quinze ou mais dias) ou pode ser uma quantida- de total produzida por volume de unidade por um período de tempo definido na cultura. A produtividade é preferencialmente medida várias vezes durante o período de cultura, por exemplo, pelo menos cerca de duas ou pelo menos cerca de três vezes, e pode ser avaliada todos os dias, a cada dois dias, a cada três dias, etc.
[0080] A produção da biomassa pode ser avaliada, por exemplo,
pela medição do carbono orgânico total (TOC) ou por outros métodos, como a medição do peso seco, peso seco sem cinzas (AFDW). Os métodos para medir TOC são conhecidos na técnica (por exemplo, Patente de Número US 8.835.149) e são fornecidos neste documento. Os métodos para medir AFDW também são bem conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, na Patente de Número US 8.940.508, incorporada ao presente documento a título de referência na sua tota- lidade.
[0081] Os métodos para medir a quantidade de lipídio produzido por microrganismos também são bem conhecidos na técnica e forne- cidos nos exemplos neste documento. Por exemplo, o lipídio extraível total pode ser determinado de acordo com Folch et al. (1957) J. Biol. Chem. 226: 497 a 509; Bligh e Dyer (1959), Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911 a 917; ou Matyash et al. (2008) J. Lipid Res. 49: 1.137 a 1.146, por exemplo, e a porcentagem de biomassa presente como lipídio também pode ser avaliada usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) (Pistorius et al. (2008) Biotechnol & Bioengin. 103: 123 a 129). Referências adicionais para análise gra- vimétrica de FAME e TAGs são fornecidas na Patente de número US
8.207.363 e no documento WO 2011127118, por exemplo, cada um incorporado ao presente documento a título de referência na sua tota- lidade.
[0082] Um microrganismo mutante como no presente documento fornecido pode produzir, em várias modalidades, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, a pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cer- ca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo me-
nos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 130%, pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, pe- lo menos cerca de 170%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cer- ca de 190% ou pelo menos cerca de 200% mais lipídios em relação a um controle microrganismo. Em algumas modalidades, a produção li- pídica aumentada de um mutante como no presente documento forne- cido pode estar em condições de cultura nas quais o microrganismo de controle está produzindo biomassa. Por exemplo, o microrganismo mutante pode produzir entre cerca de 5% a 200% a mais, cerca de 5% a 175% a mais, cerca de 5% a 150% a mais, cerca de 5% a 125% a mais, cerca de 25% mais a cerca de 200% a mais, cerca de 25% a 175% a mais, cerca de 25% a 150% a mais, cerca de 25% a 125% a mais, 50% a 200% a mais, cerca de 50% a 175% a mais, 50% a 150% a mais, 50% a 125% a mais, 75% a 200% a mais ou 75% a 175% a mais, cerca de 75% a 150% ou cerca de 75% a 125% a mais (por exemplo, 5-200% a mais) de lipídios em relação a um microrganismo de controle sob condições de cultura nas quais o microrganismo de controle está produzindo biomassa, que pode ser, em algumas moda- lidades, condições de cultura nas quais o microrganismo de controle e o microrganismo mutante estão produzindo biomassa.
[0083] Em algumas modalidades, um microrganismo mutante co- mo no presente documento fornecido produz uma média de pelo me- nos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo me- nos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo me-
nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo me- nos cerca de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 130 %, pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, pelo menos cerca de 170%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 190% ou pelo menos cerca de 200% a mais (por exemplo, pelo menos 25%, 50%, 100%, 150% ou 200% a mais) de lipídios FAME por dia em relação a um microrganismo de controle, quando o microrganismo mutante e o microrganismo de con- trole são cultivados nas mesmas condições de cultura, onde as condi- ções de cultura são repletas de nitrogênio e preferencialmente são re- pletas de nutrientes, condições de cultura em relação ao microrganis- mo controle, durante um período de pelo menos cerca de um dia, pelo menos cerca de dois dias, pelo menos cerca de três dias, pelo menos cerca de quatro dias, pelo menos cerca de cinco dias, pelo menos cer- ca de sete dias, pelo menos cerca de dez dias, pelo menos cerca de doze dias ou pelo menos cerca de catorze dias. Por exemplo, o mi- crorganismo mutante pode produzir uma média dentre cerca de 5% a 200% a mais, cerca de 5% a 175% a mais, cerca de 5% a 150% a mais, cerca de 5% a 125% a mais, cerca de 25% mais a cerca de 200% a mais, cerca de 25% a 175% a mais, cerca de 25% a 150% a mais, cerca de 25% a 125% a mais, 50% a 200% a mais, cerca de 50% a 175% a mais, 50% a 150% a mais, 50% a 125% a mais, 75% a 200% a mais ou 75% a 175% a mais, cerca de 75% a 150% ou cerca de 75% a 125% a mais (por exemplo, 5-200% a mais) de lipídios FA- ME por dia em relação a um microrganismo de controle em condições de cultura nas quais os microrganismos mutante e de controle estão produzindo biomassa.
[0084] Em algumas modalidades, as condições de cultura podem incluir cultura em um meio de cultura que inclui menos de cerca de 5 mM, menos de cerca de 4,5 mM, menos de cerca de 4 mM, menos de cerca de 3,5 mM, menos de cerca de 3 mM, menos de cerca de 2,5 mM, menos de cerca de 2 mM, menos que cerca de 1,5 mM, menos que cerca de 1 mM, menos que cerca de 0,5 mM (por exemplo, menos que 5 mM), ou substancialmente nenhuma fonte de nitrogênio reduzi- da, como sal de amônio.
Por exemplo, a concentração de amônio po- de estar em uma concentração variando de cerca de 0 a cerca de 5 mM, de cerca de 0 a cerca de 4,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 4,0 mM, de cerca de 0 a cerca de 3,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 3 mM, de cerca de 0 a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 2,0 mM, de cerca de 0 a cerca de 1,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 1,0 mM ou de cerca de 0 a cerca de 0,5 mM (por exemplo, 0 a 5 mM). A concentra- ção de amônio pode estar em uma concentração variando de cerca de 0,2 a cerca de 3 mM, 0,2 a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0,2 a cerca de 2 mM, de cerca de 0,2 a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,2 a cerca de 1 mM, de cerca de 0,3 a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0,3 a cerca de 2 mM, de cerca de 0,3 a cerca de 1,5 mM ou de cerca de 0,3 a cerca de 1 mM (por exemplo, 0,2 a 3 mM). Em outros exemplos, a concen- tração de amônio pode estar em uma concentração que varia de cerca de 0,4 mM a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0,4 a cerca de 2 mM ou de cerca de 0,4 mM a cerca de 1,5 mM (por exemplo, 0,4 a 2,5 mM). Al- ternativamente ou além disso, as condições de cultura podem incluir a cultura em um meio de cultura que inclui nitrato como substancialmen- te a única fonte de nitrogênio.
Em algumas modalidades, um micror- ganismo mutante, como no presente documento fornecido, mais lipídi- co em relação a um microrganismo de controle, quando o microrga- nismo mutante e o microrganismo de controle são cultivados sob as mesmas condições de cultura, onde as condições de cultura são reple- tas de nitrogênio e podem ser condições de cultura repletas de nutrien- tes em relação ao microrganismo de controle.
Em alguns exemplos, o microrganismo mutante pode mais lipídico em relação a um microrga- nismo de controle sob condições de cultura nas quais os microrganis- mos mutante e de controle estão produzindo biomassa. O microrga- nismo de controle em alguns exemplos é um microrganismo do tipo selvagem, por exemplo, um microrganismo do tipo selvagem do qual o microrganismo mutante é derivado de forma direta ou indireta.
[0085] Em algumas modalidades, um microrganismo mutante co- mo no presente documento fornecido, é uma alga que produz pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo me- nos cerca de 30%, a pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo me- nos cerca de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 130%, pelo menos cerca de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 160%, pelo menos cerca de 170%, pelo menos cerca de 180%, pelo menos cerca de 190% ou pelo menos cerca de 200% mais (por exemplo, pelo menos qualquer um dos 25%, 50%, 100%, 150% ou 200% a mais) de lipídios FAME do que uma alga de controle quando cultivados em condições fotoautotróficas. As condições de cul- tura fotoautotróficas podem incluir um meio que inclui menos de cerca de 5 mM, menos de cerca de 4,5 mM, menos de cerca de 4 mM, me- nos de cerca de 3,5 mM, menos de cerca de 3 mM, menos de cerca de 2,5 mM de amônio, menos de cerca de 2,0 mM, menos de cerca de 1,5 mM de amônio, menos de cerca de 1,0 mM de amônio, menos de cerca de 0,5 mM de amônio (por exemplo, menor que 5 mM) ou subs- tancialmente sem amônio e inclui, por exemplo, pelo menos cerca de
1,0 mM, pelo menos cerca de 2,0 mM, pelo menos cerca de 3,0 mM, pelo menos cerca de 4,0 mM, pelo menos cerca de 5,0 mM, pelo me- nos cerca de 6,0 mM, pelo menos cerca de 7,0 mM, pelo menos cerca de 8,0 mM, pelo menos cerca de 9,0 mM ou pelo menos cerca de 10,0 mM de nitrato (por exemplo, pelo menos 1,0 mM). Por exemplo, a con- centração de amônio pode estar em uma concentração variando de cerca de 0 a cerca de 5 mM, de cerca de 0 a cerca de 4,5 mM, de cer- ca de 0 a cerca de 4,0 mM, de cerca de 0 a cerca de 3,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 3 mM, de cerca de 0 a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 2,0 mM, de cerca de 0 a cerca de 1,5 mM, de cerca de 0 a cerca de 1,0 mM ou de cerca de 0 a cerca de 0,5 mM (por exemplo, 0 a 5 mM). A concentração de amônio pode estar em uma concentração variando de cerca de 0,2 a cerca de 3 mM, 0,2 a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0,2 a cerca de 2 mM, de cerca de 0,2 a cerca de 1,5 mM, cerca de 0,2 a cerca de 1 mM, de cerca de 0,3 a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0,3 a cerca de 2 mM, de cerca de 0,3 a cerca de 1,5 mM ou de cerca de 0,3 a cerca de 1 mM (por exemplo, 0,2 a 3 mM). Em ou- tros exemplos, a concentração de amônio pode estar em uma concen- tração que varia de cerca de 0,4 mM a cerca de 2,5 mM, de cerca de 0,4 a cerca de 2 mM ou de cerca de 0,4 mM a cerca de 1,5 mM (por exemplo, 0,4 a 2,5 mM). As condições fotoautotróficas podem estar sob luz constante ou sob um ciclo diel. O período de luz do ciclo diel pode ser de qualquer duração e pode ser, por exemplo, de cerca de quatro horas a cerca de vinte e duas horas e pode ser, por exemplo, de cerca de seis horas a cerca de vinte horas, por exemplo, de apro- ximadamente oito horas a cerca de dezoito horas por ciclo de vinte e quatro horas. O microrganismo pode ser exposto à luz natural ou artifi- cial ou a uma combinação dos mesmos. A luz disponível pode variar em intensidade durante o período da luz.
[0086] Os microrganismos mutantes fornecidos neste documento podem ter uma maior particionamento de carbono para lipídio em rela- ção a um microrganismo de controle cultivado sob condições idênticas nas quais o microrganismo de controle e o microrganismo mutante es- tão produzindo biomassa. Em algumas modalidades, o microrganismo de controle e o microrganismo mutante estão produzindo biomassa. Um mutante com particionamento aumentado de carbono para lipídio em relação a um microrganismo de controle pode ter particionamento aumentado de carbono para lipídio extraível total, para lipídios neutros totais, para triglicerídeos e/ou para lipídios derivados de FAME.
[0087] Em alguns exemplos, um microrganismo mutante, como fornecido neste documento, pode ter uma razão da quantidade de lipí- dios derivados de FAME ("FAME") produzidos para biomassa (TOC ou peso seco sem cinzas (AFDW), por exemplo) produzida que seja pelo menos cerca de 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo me- nos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, em pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 120%, pelo menos 140%, pelo menos 160%, pelo menos 180%, pelo menos 200%, pelo menos 220%, pelo menos 240%, pelo menos 260%, pelo menos 280% ou pelo menos 300% superior ao de um microrganismo de controle quando o micror- ganismo mutante e o microrganismo de controle são cultivados sob as mesmas condições. Por exemplo, o microrganismo mutante pode ter uma razão entre a quantidade de lipídios derivados de FAME ("FAME") produzidos e a biomassa (TOC ou peso seco sem cinzas (AFDW), por exemplo) produzida, que é entre cerca de 25% maior que cerca de 300% superior, cerca de 25% superior a cerca de 275% superior, cer- ca de 25% superior a cerca de 250% superior, cerca de 5% superior a cerca de 225% superior, 25% superior a 200% superior, cerca de 25% superior a cerca de 175 % superior, cerca de 25% superior a cerca de 150% superior, cerca de 50% superior a cerca de 300% superior, cer-
ca de 50% superior a cerca de 275% superior, cerca de 50% superior a cerca de 250% superior, cerca de 50% superior a cerca de 225% superior, cerca de 50% superior a cerca de 200% superior, cerca de 50% superior a cerca de 175% superior, cerca de 50% superior a cer- ca de 150% superior, cerca de 75% superior a cerca de 300% superi- or, cerca de 75% superior a cerca de 275% superior, cerca de 75% superior a cerca de 250% superior, cerca de 75% superior a cerca de 225% superior, cerca de 75% superior a cerca de 200% superior, cer- ca de 75% superior a cerca de 175% superior ou cerca de 75% supe- rior a cerca de 150% superior (por exemplo, 25-300% superior) de produtividade lipídica em relação a um microrganismo de controle quando o microrganismo mutante e o microrganismo de controle são cultivados sob condições substancialmente idênticas, que podem ser condições nas quais a cultura de microrganismos de controle produz biomassa. A produção e/ou produção de lipídios e biomassa pode ser avaliada, por exemplo, por análise gravimétrica, como conhecido na técnica e demonstrado nos exemplos deste documento.
[0088] Em vários exemplos, a razão FAME/TOC de um microrga- nismo mutante como no presente documento fornecido pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 0,30, pelo menos cerca de 0,35, pelo menos cerca de 0,40, pelo menos cerca de 0,45, pelo menos cerca de 0,50, pelo menos cerca de 0,55, pelo menos cerca de 0,60, pelo me- nos cerca de 0,65, pelo menos cerca de 0,70, pelo menos cerca de 0,75, pelo menos cerca de 0,80, pelo menos cerca de 0,85 ou pelo menos cerca de 0,90 (por exemplo, pelo menos, 0,30, 0,50, 0,75, ou 0,80) quando cultivadas sob condições repletas de nitrogênio, por exemplo, repletas de nutrientes, em relação ao microrganismo de con- trole substancialmente idêntico ao microrganismo mutante, exceto que o microrganismo de controle não tem gene mutado que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR. Em vários exemplos, a razão
FAME/TOC de um microrganismo mutante como no presente docu- mento fornecido pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,25 e cerca de 0,80, ou entre cerca de 0,30 e cerca de 0,80, ou entre cerca de 0,25 e cerca de 0,7 ou entre cerca de 0,30 e cerca de 0,70, quando cultivadas sob condições repletas de nitrogênio, por exemplo, repletas de nutrientes, em relação ao microrganismo de controle. As condições de cultura podem incluir, por exemplo, um meio de cultura que inclui menos de cerca de 5 mM, menos de cerca de 4,5 mM, menos de cer- ca de 4 mM, menos de cerca de 3,5 mM, menos de cerca de 3 mM, menos de cerca de 2,5 mM, menos de cerca de 2 mM, menos de cer- ca de 1,5 mM, menos de cerca de 1,0 mM ou menos de cerca de 0,5 mM (por exemplo, menos de 5 mM) de amônio e, em alguns exem- plos, pode incluir pelo menos cerca de 1,0 mM, pelo menos cerca de 2,0 mM, pelo menos cerca de 3,0 mM, pelo menos cerca de 4,0 mM, pelo menos cerca de 5,0 mM, pelo menos cerca de 6,0 mM, pelo me- nos cerca de 7,0 mM, pelo menos cerca de 8,0 mM, pelo menos cerca de 9,0 mM ou pelo menos cerca de 10,0 mM (por exemplo, pelo me- nos 1,0 mM) de nitrato. As condições de cultura podem, em alguns exemplos, incluir substancialmente nenhum amônio e, em alguns exemplos, pode incluir substancialmente nenhum nitrogênio reduzido como fonte de nitrogênio. A cultura, em alguns exemplos, inclui nitrato como fonte de nitrogênio, que pode opcionalmente ser substancial- mente a única fonte de nitrogênio no meio de cultura. Em uma modali- dade ilustrativa, o microrganismo mutante exibe uma razão média de FAME/TOC durante o período de cultura de pelo menos cerca de 0,4.
[0089] As propriedades de um mutante, como fornecido neste do- cumento, com produção aumentada de lipídios, são comparadas às mesmas propriedades de um microrganismo de controle que pode ser um organismo do tipo selvagem da mesma espécie que o mutante, preferencialmente a cepa progenitora do mutante que superproduz li-
pídios. Alternativamente, um microrganismo de controle pode ser um microrganismo que é substancialmente idêntico ao microrganismo mu- tante, com a exceção de que o microrganismo de controle não tem a mutação que leva a uma maior produtividade lipídica. Por exemplo, um microrganismo de controle pode ser um microrganismo geneticamente modificado ou organismo mutado classicamente que foi posteriormen- te mutado ou manipulado geneticamente para gerar um mutante com produtividade lipídica aumentada e/ou particionamento lipídico aumen- tado, como descrito neste documento.
[0090] Em alguns exemplos, um microrganismo de controle pode ser um microrganismo substancialmente idêntico ao microrganismo mutante, com a exceção de que o microrganismo de controle não pos- sui uma mutação em um gene que regula a indução lipídica (ou seja, o gene cuja mutação resulta em aumento produção lipídica). As proprie- dades de um mutante superprodutor de lipídios com um gene inter- rompido, atenuado ou de outro modo direta ou indiretamente manipu- lado geneticamente (resultando em estrutura ou expressão alterada do gene regulador da indução lipídica) também são comparadas com as mesmas propriedades de uma célula de controle que não tem um ge- ne regulador de indução lipídica interrompido, atenuado ou de outra forma direta ou indiretamente manipulado geneticamente resultando em estrutura ou expressão alterada do gene regulador de indução lipí- dica (independentemente de a célula ser do "tipo selvagem"). Por exemplo, uma célula de controle pode ser uma célula recombinante que inclui um ou mais genes não nativos ou uma célula mutada em um gene que não seja o gene regulador de indução lipídica cujos efeitos estão sendo avaliados, etc.
[0091] O microrganismo mutante pode ser de qualquer cepa de microalgas eucarióticas, como, por exemplo, qualquer espécie de qualquer dos gêneros Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistro-
desmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydi- um, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydo- monas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclo- tella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fragila- ropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Mo- noraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pa- vlova, Pelagomonas, Phæodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymo- nas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseu- doneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scene- desmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viri- diella, Vischeria, e Volvox. Exemplos não limitantes de espécies parti- cularmente adequadas incluem, por exemplo, diatomáceas como, por exemplo, uma espécie de qualquer um dos gêneros Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Fragilaria, Fragilaropsis, Hantzschia, Mono- dus, Navicula, Nitzschia, Phæodactylum ou Thalassiosira ou eustigma- tófitos, por exemplo, Eustigmatos, Nannochloropsis, Pseudostauras- trum ou Vischeria.
[0092] Em alguns exemplos, a alga recombinante é uma alga ver- de, isto é, um membro algal da divisão clorófita do reino Viridiplantae, incluindo, sem limitação, uma microalga de qualquer uma das classes Chlorophyceae, Chlorodendrophyceae, Pedinophyceae, Pleurastro- phyceae, Prasinophyceae e Trebouxiophyceae. Em alguns exemplos, uma alga recombinante como no presente documento fornecida pode ser uma espécie que é membro de qualquer uma das classes Chlo-
rophyceae, Prasinophyceae, Trebouxiophyceae, ou Chloroden- drophyceae, como uma espécie de qualquer uma das classes de Aste- romonas, Ankistrodesmus, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chrysosphaera, Desmodesmus, Dunaliella, Haemato- coccus, Monoraphidium, Neochloris, Oedogonium, Pelagomonas, Pleurococcus, Pyrobotrys, Scenedesmus, Volvox, Micromonas, Ostre- ococcus Prasinocladus Scherffelia, Tetraselmis, Botryococcus, Chlorel- la, Eremosphaera, Franceia, Micractinium, Nannochloris, Oocystis, Pa- rachlorella, Picochlorum, Prototheca ou Pseudochlorella. Em vários exemplos, uma alga recombinante como no presente documento for- necida pode ser uma espécie ou cepa da Trebouxiophyceae, tais co- mo, sem limitação, Botryococcus, Chlorella, Eremosphaera, Franceia, Micractinium, Nannochloris, Oocystis, Parachlorella, Picochlorum, Pro- totheca ou Pseudochlorella.
[0093] Em alguns exemplos, a alga recombinante é uma alga hete- rokonta e pode pertencer às diatomáceas (bacilariófitos), eustigmatófi- tos, xantófitos, feófitos, crisófitos ou rafidófitos. Em alguns exemplos, a alga mutante pertence a um gênero bacilariófito ou eustigmatófito, co- mo, sem limitação, Amphiprora, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Fragilaria, Fragilaropsis, Hantzschia, Monodus, Nannochloropsis, Na- vicula, Nitzschia, Phæodactylum, Phæodactylum, Pseudostaurastrum, Vischeria, Phæodactylum, Skeletonema e Thalassiosira. Em alguns exemplos, a alga mutante é um eustigmatófito e pertence a um gênero selecionado do grupo que consiste em Chloridella, Chlorobptrys, Ellip- soidion, Eustigmatos, Goniochloris, Monodopsis, Monodus, Nan- nochloropsis, Pseudocharaciopsis, Pseudostaruastrum, Pseudote- traëdriella e Vischeria. Em alguns exemplos, a célula de alga mutante é uma espécie de Nannochloropsis.
[0094] Como alternativa, um microrganismo mutante, como forne- cido neste documento, pode ser uma heteroconta que é um microrga-
nismo labirintulomiceto, por exemplo, um membro dos Labrinthulids ou Thraustochytrids, como, por exemplo, uma espécie de qualquer um dos gêneros Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schi- zochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japo- nochytrium, Diplophrys e Ulkenia.
[0095] Os mutantes podem ser mutantes espontâneos, mutantes de origem clássica ou mutantes manipulados que atenuam a expres- são de um gene regulador, por exemplo, um gene cuja expressão afe- ta a expressão de muitos outros genes, como um gene que codifica um fator de transcrição ou um ativador da transcrição.
[0096] O microrganismo mutante com expressão atenuada de um gene que regula a produção lipídica pode ser um mutante "knockout", por exemplo, no qual a estrutura de leitura do polipeptídeo é interrom- pida de modo que a proteína funcional não seja produzida. Por exem- plo, o gene pode incluir uma inserção, deleção ou mutação no quadro de leitura que resulta em nenhuma proteína funcional sendo produzi- da. Em vários exemplos, uma mutação knockout pode ser gerada pela inserção de uma sequência, muitas vezes, mas não necessariamente, incluindo um gene marcador selecionável, no gene, por exemplo, na região de codificação do gene. Essa inserção pode ser por meio de um sistema Cas/CRISPR que integra um fragmento de doador em um lo- cal direcionado ou pode ser por recombinação homóloga, por exemplo. Tal inserção pode interromper um quadro de leitura aberto e/ou sinais de splicing, ou gerar proteínas de fusão não funcionais ou proteínas truncadas. Em outros exemplos, o microrganismo mutante pode ser um mutante "knockdown" no qual a expressão do gene é reduzida, mas não eliminada, por exemplo, reduzida de 5% ou menos para 95% ou mais, por exemplo, de 5% para 95%, ou 10% a 90%, em relação aos níveis de expressão de uma célula do tipo selvagem. Os knock- downs podem ser mutantes nos quais uma mutação, inserção ou dele-
ção ocorre em uma região não codificante do gene, por exemplo, na região 5' ou 3' de um gene, ou pode ser efetuada através da expres- são de construtos nas células que reduzem expressão do gene-alvo, como RNAi, ribozima ou construtos antissenso. Em adição aos siste- mas CRISPR, a recombinação homóloga pode ser usada para gerar mutantes de inserção (knockdown ou knockout). Outros métodos tam- bém são conhecidos e amplamente disponíveis para aqueles versados na técnica e podem ser usados com os microrganismos no presente documento descritos.
[0097] Um microrganismo mutante como fornecido neste docu- mento pode ser projetado alvejando-se um gene endógeno de um mi- crorganismo de interesse que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR, como descrito neste documento. Tais genes podem ser identificados em um microrganismo de interesse com o uso de mé- todos de bioinformática, técnicas de biologia molecular e combinações dos mesmos. Por exemplo, um gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR pode ser identificado usando hibridação Southern, triagem de bibliotecas de cDNA por hibridação ou PCR, por exemplo, usando sondas degeneradas e/ou iniciadores. As sequências de genoma disponíveis em bancos de dados públicos ou proprietários podem ser pesquisadas por qualquer um dos vários programas que executam a correspondência de sequências (por exemplo, programas blast como blastp, blastn e tblastn (sequência de proteínas consulta- das contra a sequência nucleotídica traduzida)) ou analisam estruturas de domínio de sequências de aminoácidos codificadas. Por exemplo, HMMER fornece software online para analisar domínios estruturais e funcionais codificados por genes que podem ser usados para subme- ter sequências de genoma à varredura, incluindo, por exemplo, hmmsearch e hmmscan. Essas pesquisas podem ser feitas online. Programas como MUSCLE e hmmalign também podem ser usados para pesquisar ortólogos de proteínas como as no presente documen- to descritas (por exemplo, polipeptídeos com um domínio de TPR (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a mesma) e/ou polipeptídeos contendo DUF4470 (por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com a mesma)), constru- indo árvores filogenéticas para determinar as relações entre as proteí- nas. O alvejamento genético pode fazer uso de sequências identifica- das no genoma do microrganismo de interesse. Não é necessário re- solver a estrutura completa de um gene para atingir o gene para ate- nuação. Por exemplo, o uso de métodos descritos neste documento, incluindo, sem limitação, edição de genoma (usando meganucleases, nucleases de dedo de zinco, sistemas TALENs ou Cas/CRISPR), construtos de RNAi, construtos de antissenso, construtos de recombi- nação homóloga e construtos de ribozima, apenas uma porção de uma sequência de genes pode ser empregada em construtos e técnicas de atenuação de genes.
[0098] Em algumas modalidades, o microrganismo mutante pode ser adicionalmente modificado ou mutagenizado para ter pelo menos uma modificação genética adicional que confere resistência a herbici- das, resistência a toxinas, propriedades de crescimento aprimoradas, eficiência fotossintética aprimorada, produção ou acumulação lipídica aprimorada e produção de lipídios específicos.
[0099] Em um aspecto, são fornecidos lisados de microrganismos mutantes descritos nas modalidades acima. A produção de lisados ce- lulares é conhecida na técnica. Em algumas modalidades, os lisados de microrganismos mutantes podem ser feitos submetendo os micror- ganismos mutantes a detergentes, tampões hipotônicos, agentes cao- trópicos, enzimas, por exemplo, proteases ou uma combinação de qualquer um deles e/ou por sonicação, descongelamento mecânico, meios como bater ou triturar contas em nitrogênio líquido ou qualquer combinação dos mesmos. Um lisado pode ser um lisado bruto que po- de ser processado adicionalmente por, por exemplo, por precipitação, sedimentação, centrifugação, filtração ou diálise.
ATENUAÇÃO DE GENES
[00100] Um microrganismo mutante como no presente documento fornecido com expressão atenuada de um gene que regula a biossín- tese lipídica é um mutante gerado pela intervenção humana, por exemplo, por mutagênese clássica ou engenharia genética. Por exem- plo, um microrganismo mutante, como no presente documento forne- cido, pode ser um mutante gerado por qualquer método de mutagêne- se viável, incluindo, entre outros, irradiação por UV, irradiação gama ou mutagênese química e triagem de mutantes com produção lipídica aumentada, por exemplo, coloração com lipofílicos corantes como Nile Red ou BODIPY (por exemplo, Cabanelas et al. (2015) Bioresource Technology 184: 47 a 52). Os métodos para gerar mutantes de cepas microbianas são bem conhecidos na técnica.
[00101] Um mutante, como no presente documento fornecido, que produz pelo menos cerca de 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo me- nos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pe- lo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais lipídios também podem ser um mutante ge- neticamente modificado, por exemplo, um mutante no qual um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR ou um gene lo-
calizado no local Naga_100148g8 ou um ortólogo do mesmo (por exemplo, um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR que possui pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1; um gene que codifi- ca um polipeptídeo com um domínio de TPR que tem pelo menos cer- ca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio DUF4470 com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98% ou pelo menos cerca de 99% da identidade com a SEQ ID NO: 3) foi alvo de recombinação homóloga para knockout, knockdown e/ou substituição de genes (por exemplo, com forma mutada do gene que pode codificar um polipeptídeo com atividade reduzida em relação ao polipeptídeo do tipo selvagem). Por exemplo, uma cepa microbiana de interesse pode ser modificada por recombinação homóloga direcio- nada ao local para inserir uma sequência em um local genômico e, as- sim, alterar um gene e/ou sua expressão, ou inserir um promotor em um local genético do microrganismo hospedeiro para afetar a expres- são de um determinado gene ou conjunto de genes no local.
[00102] Por exemplo, knockout genético, knockdown genético ou substituição de genes por recombinação homóloga pode ser feito pela transformação de um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, DNA)
que inclui uma sequência homóloga à região do genoma a ser altera- da, em que a sequência homóloga é interrompida por uma sequência estranha, tipicamente um gene marcador selecionável que permite a seleção para o construto integrado. As sequências de flanqueamento homólogas ao genoma em ambos os lados da sequência estranha ou da sequência mutada do gene podem ser, por exemplo, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1.000, pelo menos cerca de 1.200, pelo menos cerca de 1.500, pelo menos cerca de 1.750 ou pelo menos cerca de 2.000 (por exemplo, pelo me- nos, qualquer um de 50, 100, 200, 500, 1.000, 1.500 ou 2.000) nucleo- tídeos de comprimento. Um construto knockout de gene ou "knockin" de gene no qual uma sequência estranha é flanqueada por sequências de genes-alvo, pode ser fornecido em um vetor que pode opcional- mente ser linearizado, por exemplo, fora da região que deve sofrer re- combinação homóloga ou pode ser fornecido como um fragmento line- ar que não está no contexto de um vetor, por exemplo, o construto knockout ou knockin pode ser um fragmento isolado ou sintetizado, incluindo, mas não se limitando a, um produto de PCR. Em alguns ca- sos, um sistema de marcador de divisão pode ser usado para gerar knockouts de genes por recombinação homóloga, onde dois fragmen- tos de DNA podem ser introduzidos que são capazes de regenerar um marcador selecionável e interromper o local de gene de interesse por meio de três eventos de cruzamento (Jeong et al. (2007) FEMS Micro- biol Lett 273: 157 a 163).
[00103] Em um aspecto, esta invenção fornece organismos geneti- camente modificados, por exemplo, microrganismos que têm uma ou mais modificações ou mutações genéticas para atenuar a expressão de um gene regulador lipídico, como um gene que codifica um polipep- tídeo com um domínio de TPR que tem pelo menos cerca de 50%, em pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cer- ca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio DUF4470 que possui pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer- ca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e/ou um ge- ne que codifica um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e/ou um gene localizado no local Naga_100148g8 ou local sintênico em uma espécie de hetero- contas ou algas; e/ou um gene com uma região codificante com pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo me- nos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
Como usado neste documento, "atenuando" ou "alterando" a expres- são e/ou função" de um gene (por exemplo, um "gene regulador lipídi- co") significa reduzir ou eliminar a expressão do gene de qualquer ma- neira que reduza a produção, expressão e/ou função da proteína to- talmente funcional normalmente expressa. Os meios para atenuar um gene tal como um gene regulador lipídico incluem, por exemplo, cons- trutos de recombinação homólogos; Sistemas CRISPR, incluindo RNAs- guia, Cas9 ou outras enzimas cas, por exemplo, Cpf1, Cms1, Csm1, ou outros, e, opcionalmente, fragmentos de doadores para in- serção no local-alvo; construtos de RNAi, incluindo shRNAs, constru- tos de RNA antissenso; construtos de ribozimas; TALENS, nucleases de dedo de zinco; e meganucleases. Por exemplo, em algumas moda- lidades, o gene pode ser interrompido por, por exemplo, uma inserção ou substituição de genes mediada por recombinação homóloga e/ou pela atividade de um agente indutor de quebra de cadeia dupla, como meganuclease (consultar, por exemplo, os documentos WO2012017329 (US20130164850 e US20160272980) nuclease de dedo de zinco (Perez-Pinera et al. (2012) Curr. Opin. Chem. Biol. 16:268-277; WO2012017329 (US20130164850 e US20120324603), TALEN (WO2014/207043 (US20160130599); WO 2014/076571 (US20160272980)), ou uma proteína cas (por exemplo, uma proteína Cas9, proteína efetora Cpf1, ou proteína efetora Csm1) de um sistema CRISPR (consultar, por exemplo, US 8.697.359; US 8.795.965; US
8.889.356; US 2016/0304893; US 2016/0090603; US2014/0068797; US 2016/0208243; US 2017/0233756). Outros métodos de interrupção são conhecidos na técnica e seriam adequados no presente documen- to, tal como seria entendido pelos versados na técnica.
[00104] Em algumas modalidades, o microrganismo mutante possui uma ou mais mutações para, ou uma ou mais mutações que afetam a expressão de um gene localizado no local Naga_100148g8 ou local sintênico em uma espécie de heterokonta ou alga. Em algumas moda- lidades, o microrganismo mutante tem uma ou mais mutações em, ou uma ou mais mutações que afetam a expressão de um gene que pos- sui um quadro de leitura aberto com pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo me- nos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, em pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o microrganismo mutante tem uma ou mais mutações que estão pre- sentes ou afetam a expressão de: um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo me- nos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, em pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o microrganismo mu- tante possui uma ou mais mutações na sequência que codifica o do- mínio DUF4470 (por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou uma sequência com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95%). Em algumas modalidades, o microrganismo mutante possui uma ou mais mutações na sequência que codifica o domínio de TPR (por SEQ ID NO: 1 ou uma sequência com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80 %, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95%).
[00105] Um microrganismo recombinante projetado para ter expres-
são atenuada de um gene regulador lipídico pode ter um gene regula- dor lipídico interrompido que inclui pelo menos uma inserção, mutação ou deleção que reduz ou anula a expressão do gene, de modo que um gene regulador lipídico totalmente funcional não seja produzido ou é produzido em quantidades inferiores às produzidas por um microrga- nismo de controle que não inclui um gene regulador lipídico interrom- pido.
Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais mutações (alteração, deleção e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos) podem estar na região de codificação do gene ou em um íntron, 3' UTR, 5' UTR, ou região promotora, por exemplo, dentro de cerca de 1 kb do local inicial de transcrição, dentro de cerca de 2 kb do local inicial de transcrição ou dentro de cerca de 3 kb do local de início de tradução.
Em algumas modalidades, por exemplo, um microrganismo mutante com expressão atenuada de um gene como descrito neste documento pode ter uma ou mais mutações, que podem ser uma ou mais altera- ções de nucleobases e/ou uma ou mais deleções de nucleobases e/ou uma ou mais inserções de nucleobases, na região de um gene 5' do local de início da transcrição, tal como, em exemplos não limitantes, dentro de cerca de 2 kb, dentro de cerca de 1,5 kb, dentro de cerca de 1 kb ou dentro de cerca de 0,5 kb do local de início de transcrição co- nhecido ou putativo, ou dentro de cerca de 3 kb, dentro de cerca de 2,5 kb, dentro de cerca de 2 kb, dentro de cerca de 1,5 kb, dentro de cerca de 1 kb ou dentro de cerca de 0,5 kb do local inicial de tradução.
Como exemplos não limitativos, um gene mutante pode ser um gene que possui uma mutação, inserção ou deleção na região promotora que pode aumentar ou diminuir a expressão do gene; pode ser um ge- ne que possui uma deleção que resulta na produção de uma proteína não funcional, proteína truncada, proteína negativa dominante ou ne- nhuma proteína; pode ser um gene que possui uma ou mais mutações pontuais que levam a uma alteração no aminoácido da proteína codifi-
cada ou resulta em splicing aberrante da transcrição do gene, etc.
[00106] Os sistemas CRISPR mencionados neste documento e re- visados recentemente por Hsu et al. (Cell 157:1.262 a 1.278, 2014) incluem, além do polipeptídeo ou complexo da nuclease de cas, um RNA-alvo, frequentemente designado "crRNA", que interage com o local-alvo do genoma por complementaridade com uma sequência do local-alvo, um RNA de ativação em trans ("tracr") que complexa com o polipeptídeo cas e também inclui uma região que se liga (por comple- mentaridade) ao crRNA-alvo. Esta invenção contempla o uso de duas moléculas de RNA (um "crRNA" e um "tracrRNA") que podem ser co- transformadas em uma cepa hospedeira (ou expressa em uma cepa hospedeira) que expressa ou é transfectada com uma proteína cas para edição do genoma, ou o uso de um único RNA-guia que inclui uma sequência complementar a uma sequência-alvo, bem como uma sequência que interage com uma proteína cas. Ou seja, em algumas estratégias, um sistema CRISPR, como usado neste documento, pode compreender duas moléculas de RNA separadas (polinucleotídeos de RNA: um "RNA tracr" e um "RNA-alvo" ou "crRNA", veja abaixo) e no presente documento referido como um "RNA-alvo de DNA de molécula dupla" ou um "RNA-alvo de DNA de duas moléculas". Alternativamen- te, como ilustrado nos exemplos, o RNA de DNA-alvo também pode incluir a sequência de ativação em trans para interação com a proteína cas (além das sequências-alvo homólogas ("cr")), ou seja, o RNA de DNA-alvo pode ser uma molécula de RNA único (polinucleotídeo de RNA único) e é denominado, neste documento, um "RNA-guia quimé- rico", um "RNA-guia único" ou um "sgRNA". Os termos "RNA de DNA- alvo" e "gRNA" são inclusivos, referindo-se tanto a RNAs de DNA-alvo de molécula dupla quanto a RNAs de DNA-alvo de molécula única (is- to é, sgRNAs). Os RNAs-guia de molécula única e os dois sistemas de RNA foram descritos detalhadamente na literatura e, por exemplo, na
Publicação de Pedido de Patente de Número US 2014/0068797, in- corporada a título de referência ao presente documento na sua totali- dade. Algumas modalidades dos métodos e composições apresenta- dos neste documento incluem um RNA-guia que tenha uma sequência correspondente a uma sequência-alvo em um gene localizado no local Naga_100148g8, como, por exemplo, uma sequência-alvo com a se- quência estabelecida na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o RNA-guia é um guia quimérico. Em outras modalidades, o RNA-guia não inclui uma sequência tracr. Qualquer proteína cas pode ser usada nos métodos deste documento, por exemplo, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecidas co- mo Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Cms1, Cpf1, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, C2c1, C2c2, C2c3, e homólogos das mesmas ou versões modifi- cadas das mesmas. A proteína cas pode ser uma proteína Cas9, como uma proteína Cas9 de Staphylococcus pyogenes, S. thermophilus, S. pneumonia, S. aureus ou Neisseria meningitidis, como exemplos não limitativos. Também são consideradas as proteínas Cas9 fornecidas como SEQ ID NOs: 1 a 256 e 795 a 1.346 na Publicação de Pedido de Patente de Número US 2014/0068797, incorporadas ao presente do- cumento a título de referência na sua totalidade, e proteínas Cas9 quiméricas que podem combinar domínios de mais de uma proteína Cas9, bem como variantes e mutantes das proteínas Cas9 identifica- das. A nuclease guiada por RNA pode ser, por exemplo, uma proteína Cpf1 (ver, por exemplo, US 2016/0208243) ou uma proteína Csm1 (ver, por exemplo, US 2017/0233756).
[00107] A atividade da nuclease Cas cliva o DNA-alvo para produzir quebras de fita dupla. Essas quebras são então reparadas pela célula de uma de duas maneiras: união de extremidades não homólogas ou reparo direcionado à homologia. Na união de extremidades não homó- logas (NHEJ), as quebras de fita dupla são reparadas pela ligação di- reta das extremidades de ruptura entre si. Nesse caso, nenhum novo material de ácido nucleico é inserido no local, embora algum material de ácido nucleico possa ser perdido, resultando em uma deleção ou alteração, geralmente resultando em mutação. No reparo direcionado à homologia, um polinucleotídeo doador (às vezes chamado de "DNA doador" ou "DNA de edição") que pode ter homologia com a sequência de DNA-alvo clivada é usado como um modelo para reparo da se- quência de DNA-alvo clivada, resultando na transferência de informa- ção genética do polinucleotídeo doador para o DNA-alvo. Como tal, um novo material de ácido nucleico pode ser inserido/copiado no local. As modificações do DNA-alvo devido ao NHEJ e/ou reparo direcionado à homologia (por exemplo, usando uma molécula de DNA doadora) podem levar a, por exemplo, correção de genes, substituição de ge- nes, marcação de genes, inserção de transgene, deleção de nucleotí- deos, interrupção de genes, mutação genética, etc.
[00108] Em alguns casos, a clivagem do DNA por um polipeptídeo modificador de sítio-direcionado (por exemplo, uma nuclease de cas, nuclease de dedo de zinco, meganuclease ou TALEN) pode ser usada para deletar material de ácido nucleico de uma sequência de DNA- alvo, clivando a sequência de DNA-alvo e permitindo que a célula re- pare a sequência na ausência de um polinucleotídeo doador fornecido exogenamente. Esses eventos do NHEJ podem resultar em mutações ("reparo incorreto") no local da união das extremidades clivadas que podem resultar em interrupção do gene.
[00109] Como alternativa, se um RNA direcionado a DNA é coad- ministrado a células que expressam uma nuclease de cas junto com um DNA doador, os métodos em questão podem ser usados para adi-
cionar, isto é, inserir ou substituir, material de ácido nucleico a uma sequência de DNA alvo (por exemplo, "knockout" por mutagênese de inserção ou "knockin" de um ácido nucleico que codifica uma proteína (por exemplo, um marcador selecionável e/ou qualquer proteína de interesse), um siRNA, um miRNA, etc., para modificar uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, introduzir uma mutação) e similares.
[00110] Um DNA doador pode, em modalidades particulares, incluir uma sequência reguladora do gene (por exemplo, um promotor) que pode, com o uso do direcionamento CRISPR, ser inserido a montante das regiões codificadoras do gene e a montante da região promotora proximal presumida do gene, por exemplo, pelo menos cerca de 50 pb, pelo menos cerca de 100 pb, pelo menos cerca de 120 pb, pelo menos cerca de 150 pb, pelo menos cerca de 200 pb, pelo menos cerca de 250 pb, pelo menos cerca de 300 pb, pelo menos cerca de 350 pb, pe- lo menos cerca de 400 pb, pelo menos cerca de 450 pb, ou pelo me- nos cerca de 500 pb (por exemplo, 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 bp) a montante do ATG inicial da região codificante do gene regulador lipí- dico. O DNA do doador pode incluir uma sequência, como, por exem- plo, um marcador selecionável ou qualquer sequência conveniente, que possa interferir com o promotor nativo. A sequência adicional inse- rida a montante do ATG de início do quadro de leitura aberto do regu- lador lipídico (por exemplo, na 5' UTR ou a montante do local inicial transcricional do gene regulador lipídico) pode diminuir ou até eliminar a expressão do gene regulador lipídico endógeno. Alternativamente, ou além disso, o gene regulador lipídico nativo pode ter seu promotor endógeno total ou parcialmente substituído por um promotor mais fra- co ou diferentemente regulado ou uma sequência não promotora.
[00111] Em alguns exemplos, uma molécula de ácido nucleico in- troduzida em uma célula hospedeira para gerar uma linha celular de edição de genoma de alta eficiência codifica uma enzima Cas9 que sofre mutação em relação à enzima de tipo selvagem correspondente de modo que a enzima Cas9 mutada não disponha da capacidade de clivar uma ou ambas as cadeias de um polinucleotídeo-alvo contendo uma sequência-alvo.
Por exemplo, uma substituição de aspartato por alanina (D10A) no domínio catalítico RuvCI de Cas9 de S. pyogenes converte Cas9 de uma nuclease que quebra as duas cadeias em uma nickase (uma enzima que quebra uma única fita). Outros exemplos de mutações que tornam Cas9 uma nickase incluem, sem limitação, H840A, N854A e N863A.
Em algumas modalidades, uma nickase Cas9 pode ser usada em combinação com a sequência-guia (ou se- quências-guia), por exemplo, duas sequências-guia, que têm como alvo, respectivamente, as fitas de senso e antissenso do alvo de DNA.
Essa combinação permite que ambos os filamentos sejam cortados e usados para induzir NHEJ.
Dois alvos de nickase (próximos, mas dire- cionados a diferentes filamentos do DNA) podem ser usados para in- duzir NHEJ mutagênico.
Esse alvejamento de um local usando enzi- mas que clivam cepas opostas em posições escalonadas também po- de reduzir a clivagem não segmentada, pois ambas as cadeias devem ser clivadas com precisão e especificamente para alcançar a mutação do genoma.
Em exemplos adicionais, uma enzima Cas9 mutante que é prejudicada em sua capacidade de clivar o DNA pode ser expressa na célula, em que também são introduzidos um ou mais RNAs-guia que têm como alvo uma sequência a montante do local inicial da transcrição ou da tradução do gene-alvo.
Nesse caso, a enzima cas pode ligar a sequência alvo e bloquear a transcrição do gene-alvo (Qi et al. (2013) Cell 152:1.173 a 1.183). Esta interferência de CRISPR na expressão gênica pode ser referida como RNAi e também é descrita em detalhes em Larson et al. (2013) Nat.
Protoc. 8: 2.180 a 2.196. Em alguns casos, um polipeptídeo cas, como um polipeptídeo Cas9, é um polipeptídeo de fusão, que compreende, por exemplo: i) um polipeptí-
deo Cas9 (que pode opcionalmente ser o polipeptídeo Cas9 variante como descrito acima); e b) um polipeptídeo heterólogo ligado covalen- temente (também referido como "parceiro de fusão"). Uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser ligada a outra sequência de áci- do nucleico (por exemplo, por engenharia genética) para gerar uma sequência nucleotídica quimérica que codifica um polipeptídeo quimé- rico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão Cas9 é ge- rado pela fusão de um polipeptídeo Cas9 com uma sequência heteró- loga que fornece localização subcelular (isto é, a sequência heteróloga é uma sequência de localização subcelular, por exemplo, um sinal de localização nuclear (NLS) para direcionar para o núcleo; um sinal de localização mitocondrial para direcionar para as mitocôndrias; um sinal de localização de cloroplasto para direcionar para um cloroplasto; um sinal de retenção de ER; e similares). Em algumas modalidades, a se- quência heteróloga pode fornecer uma etiqueta (isto é, a sequência heteróloga é um rótulo detectável) para facilitar o rastreamento e/ou purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, por exemplo, pro- teína verde fluorescente (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato e similares; uma etiqueta de hemaglutinina (HA); uma etiqueta FLAG; uma etiqueta Myc; e similares).
[00112] As células hospedeiras podem ser manipuladas genetica- mente (por exemplo, transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com, por exemplo, um construto vetorial que pode ser, por exemplo, um vetor para recombinação homóloga que inclui sequências de áci- dos nucleicos homólogas a uma porção de um local de gene regulador lipídico da célula hospedeira ou a regiões adjacentes à mesma, ou po- de ser um vetor de expressão para a expressão de qualquer uma ou uma combinação de: uma proteína cas (por exemplo, uma proteína Cas9), um RNA-guia quimérico do CRISPR, um crRNA e/ou um tracrRNA, um construto de RNAi (por exemplo, um shRNA), um RNA antissenso ou uma ribozima. O vetor pode estar, por exemplo, na for- ma de plasmídeo, partícula viral, fago, etc. Um vetor para expressão de um polipeptídeo ou RNA para edição de genoma também pode ser projetado para integração no hospedeiro, por exemplo, por recombina- ção de homólogos. Um vetor que contém uma sequência polinucleotí- dica como no presente documento descrito, por exemplo, sequências com homologia para hospedar sequências de genes reguladores lipí- dicos (incluindo sequências que estão a montante e a jusante das se- quências codificadoras de reguladores lipídicos), bem como, opcio- nalmente, um marcador ou gene repórter selecionável, pode ser em- pregado para transformar um hospedeiro apropriado para causar ate- nuação de um gene regulador lipídico.
[00113] O microrganismo recombinante em alguns exemplos pode ter expressão reduzida, mas não abolida, do gene regulador lipídico, e o microrganismo recombinante pode ter um aumento na produção lipí- dica de cerca de 25% a cerca de 200% ou mais, por exemplo. Por exemplo, o aumento na produção de lipídios pode estar entre cerca de 25% a 200% a mais, cerca de 25% a 175% a mais, cerca de 25% a 150% a mais, 25% a 125% a mais, cerca de 50% a 200% a mais, cer- ca de 50% a 175% a mais, 50% a 150% a mais, 50% a 125% a mais, 75% a 200% a mais ou cerca de 75% a 175% a mais, cerca de 75% a 150% ou cerca de 75% a 125% a mais (por exemplo, 25 a 200% a mais) em relação a um microrganismo de controle. Um microrganismo geneticamente modificado como no presente documento fornecido po- de, em alguns exemplos, incluir um construto de ácido nucleico para atenuar a expressão de um gene regulador lipídico, como, por exem- plo, um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR, como por exemplo um domínio de TPR que tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,
pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e/ou um gene que codifica um domínio de TPR contendo polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo me- nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo me- nos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO 3; e/ou um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio DUF4470 com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos identidade de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o microrganismo geneticamente modificado como no presente documento fornecido pode incluir um construto de ácido nu- cleico para atenuar a expressão de um polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95% e/ou um polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60 %, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95%. Por exemplo, um microrganismo hospedei- ro pode incluir um construto para expressar uma molécula de RNAi, ribozima ou molécula antissenso que reduz a expressão de um gene regulador lipídico que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470, ou com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos
70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3. Em alguns exemplos, um microrganismo recom- binante como no presente documento fornecido pode incluir pelo me- nos um construto introduzido (exógena ou não nativa) para reduzir a expressão de um gene regulador lipídico.
[00114] Em alguns exemplos, cepas geneticamente modificadas podem ser triadas para a expressão de um gene regulador lipídico que é diminuído em relação a uma célula de controle que não inclui uma modificação genética para atenuar a expressão do gene regulador lipí- dico, mas não eliminada, usando métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, RNA-Seq ou PCR de transcrição reversa (RT- PCR). Uma cepa geneticamente modificada como no presente docu- mento fornecida pode ser manipulada para incluir um construto para atenuar a expressão gênica, reduzindo a quantidade, estabilidade ou traduzibilidade do mRNA de um gene que codifica um regulador lipídi- co. Por exemplo, um microrganismo, como uma cepa de algas ou he- terokontas, pode ser transformado com um construto antissenso de RNA, RNAi ou ribozima visando um mRNA de um gene regulador lipí- dico usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um cons- truto de RNA antissenso que inclui toda ou uma porção da região transcrita de um gene pode ser introduzida em um microrganismo para diminuir a expressão gênica (Shroda et al. (1999) The Plant Cell 11:
1.165 a 1.178; Ngiam et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66: 775 a 782; Ohnuma et al. (2009) Protoplasma 236: 107 a 112; Lavaud et al. (2012) PLoS One 7:e36806). Alternativamente ou além disso, um construto de RNAi (por exemplo, um construto que codifica um RNA em formato de grampo) que tem como alvo um gene que tem um do- mínio de TPR pode ser introduzido em um microrganismo como uma alga ou um heterokonta para reduzir a expressão do gene regulador lipídico (consultar, por exemplo, Cerruti et al. (2011) Eukaryotic Cell (2011) 10: 1.164 a 1.172; Shroda et al. (2006) Curr. Genet. 49: 69-84).
[00115] As ribozimas são complexos de proteína RNA que clivam ácidos nucleicos de uma maneira específica do local. As ribozimas têm domínios catalíticos específicos que têm atividade de endonucleases. Por exemplo, a Patente de Número US 5.354.855 (incorporada ao pre- sente documento na sua totalidade a título de referência) relata que certas ribozimas podem atuar como endonucleases com uma especifi- cidade de sequência maior que a das ribonucleases conhecidas e se aproximando das enzimas de restrição de DNA. Os construtos de RNA catalítico (ribozimas) podem ser projetados para formar pares de ba- ses com um mRNA que codifica um gene como fornecido neste docu- mento para clivar o alvo de mRNA. Em alguns exemplos, as sequên- cias de ribozimas podem ser integradas dentro de um construto de RNA antissenso para mediar a clivagem do alvo. Vários tipos de ribo- zimas podem ser considerados, a concepção e uso das mesmas são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585 a 591. As ribozimas são direcionadas para uma determinada sequência em virtude do anelamento em um local por interações complementares de pares de bases. São necessários dois trechos de homologia para esse direcionamento. Esses trechos de sequências homólogas flanqueiam a estrutura ribozima catalítico definida acima. Cada trecho da sequência homóloga pode variar em comprimento de 7 a 15 nucleotídeos. O único requisito para definir as sequências homólogas é que, no RNA-alvo, as mesmas sejam sepa- radas por uma sequência específica que é o local de clivagem. Para a ribozima cabeça de martelo, o sítio de clivagem é uma sequência de dinucleotídeo no RNA-alvo, é uma uracila (U) seguido por uma adeni- na, citosina ou uracila (A, C ou U) (Thompson et al., (1995) Nucl Acids Res 23: 2.250 a 2.268). A frequência desse dinucleotídeo que ocorre em qualquer RNA é estatisticamente de 3 em 16. Portanto, para um determinado RNA mensageiro-alvo de 1.000 bases, 187 locais de cli- vagem de dinucleotídeos são estatisticamente possíveis.
[00116] O projeto geral e a otimização da atividade de clivagem do RNA direcionado à ribozima foram discutidos em detalhes (Haseloff e Gerlach (1988) Nature 334: 585 a 591; Symons (1992) Ann Rev Bio- chem 61: 641 a 671; Chowrira et al. (1994). J Biol Chem 269: 25.856 a
25.864; Thompson et al. (1995) supra), todos incorporados a título de referência na sua totalidade. A concepção e teste de ribozimas para a clivagem eficiente de um RNA-alvo é um processo bem conhecido dos versados na técnica. Exemplos de métodos científicos para projetar e testar ribozimas são descritos por Chowrira et al., (1994) supra e Lie- ber e Strauss (1995) Mol Cell Biol. 15: 540 a 551, cada um incorporado a título de referência. A identificação de sequências operativas e prefe- renciais para uso na regulação negativa de um determinado gene é uma questão de preparação e teste de uma dada sequência e é um método de "triagem" rotineiramente praticado, conhecido pelos versa- dos na técnica. O uso de construtos de RNAi é descrito na literatura citada acima, bem como nos documentos US2005/0166289 e WO 2013/016267 (ambos os quais são incorporados ao presente docu- mento a título de referência), por exemplo. Um RNA de fita dupla com homologia ao gene-alvo é entregue à célula ou produzido na célula pela expressão de um construto RNAi, por exemplo, um construto em formato de grampo pequeno (sh). O construto pode incluir uma se- quência que é idêntica ao gene-alvo, ou pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cer- ca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo me- nos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de
99% idênticos a uma sequência do gene-alvo. O construto pode ter pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pe- lo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900 ou pelo menos cerca de 1 kb de sequência (por exemplo, pelo menos 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800 ou 1 kb de sequência) homóloga ao gene- alvo. Os vetores de expressão podem ser manipulados usando promo- tores selecionados para expressão contínua ou induzível de um cons- truto de RNAi, como um construto que produz um shRNA.
[00117] Um construto de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, um construto de ribozima, RNAi ou antissenso pode in- cluir pelo menos cerca de quinze, pelo menos cerca de vinte, pelo me- nos cerca de trinta, pelo menos cerca de quarenta, pelo menos cerca de cinquenta ou pelo menos cerca de sessenta nucleotídeos com pelo menos cerca de 80% de identidade, como pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% de identidade ou complementaridade com pelo menos cerca de uma porção da sequência de um gene regulador lipídico en- dógeno do microrganismo a ser modificado. Um construto de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, um construto de ribo- zima, RNAi ou antissenso pode incluir pelo menos cerca de quinze, pelo menos cerca de vinte, pelo menos cerca de trinta, pelo menos cerca de quarenta, pelo menos cerca de cinquenta ou pelo menos cer- ca de sessenta nucleotídeos com pelo menos 80%, como pelo menos 95% ou cerca de 100% de identidade ou complementaridade com a sequência de um gene que ocorre naturalmente, como um gene que codifica um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me-
nos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com um gene regulador lipídico endógeno, como um gene localizado no local Naga_100148g8 ou local sintênico, ou um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR, como por exemplo, SEQ ID NO: 1, ou uma sequência com pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade.
Por exemplo, um construto de ácido nucleico para atenua- ção de genes, por exemplo, um construto de ribozima, RNAi ou antis- senso pode incluir pelo menos cerca de quinze, pelo menos cerca de vinte, pelo menos cerca de trinta, pelo menos cerca de quarenta, pelo menos cerca de cinquenta ou pelo menos cerca de sessenta nucleotí- deos com pelo menos cerca de 80% de identidade ou complementari- dade com a sequência de um gene regulador lipídico de ocorrência natural, como qualquer um fornecido neste documento.
A sequência de nucleotídeos pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 30 nucleotídeos a pelo menos cerca de 3 quilobases, por exemplo, de pe- lo menos cerca de 30 nucleotídeos a pelo menos cerca de 50 nucleo- tídeos de comprimento, de pelo menos cerca de 50 nucleotídeos a pe- lo menos cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de pelo menos cerca de 100 nucleotídeos a pelo menos cerca de 500 nucleotídeos de comprimento, de pelo menos cerca de 500 nucleotídeos a pelo menos cerca de 1 kb de comprimento, de pelo menos cerca de 1 kb a pelo menos cerca de 2 kb de comprimento, ou de pelo menos cerca de 2 kb a pelo menos cerca de 5 kb de comprimento.
Por exemplo, uma se- quência antissenso pode ter pelo menos cerca de 100 nucleotídeos e pelo menos cerca de 1 kb de comprimento.
Por exemplo, um construto de ácido nucleico para atenuação de genes, por exemplo, um constru- to de ribozima, RNAi ou antissenso pode incluir pelo menos cerca de quinze, pelo menos cerca de vinte, pelo menos cerca de trinta, pelo menos cerca de quarenta, pelo menos cerca de cinquenta, pelo menos cerca de sessenta ou pelo menos pelo menos cerca de 100 nucleotí- deos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80% ou pelo menos 85%, por exemplo, em pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pe- lo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% ou pelo menos 95% identidade ou complementaridade com um gene regulador lipídico endógeno ou uma porção do mesmo.
[00118] Os promotores usados nos construtos antissenso, RNAi ou ribozima podem ser funcionais no organismo hospedeiro e adequados para os níveis de expressão necessários para reduzir a expressão do gene-alvo para uma quantidade desejada. Os promotores funcionais em algas e heterokontas são conhecidos na técnica e descritos neste documento. O construto pode ser transformado em algas usando qualquer método viável, incluindo qualquer descrito neste documento. Um organismo ou microrganismo recombinante transformado com uma molécula de ácido nucleico para atenuar a expressão gênica do regulador lipídico, tal como, sem limitação, um construto antissenso, RNAi ou ribozima, pode ter as propriedades de um mutante regulador lipídico, como descrito neste documento, incluindo, por exemplo, cloro- fila reduzida, eficiência fotossintética aumentada e produtividade au- mentada em cultura, com relação a um organismo hospedeiro ou mi- crorganismo que não inclui a molécula de ácido nucleico exógena que resulta em expressão gênica atenuada.
CONSTRUTOS E MOLÉCULAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
[00119] Também são no presente documento fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos que incluem sequências de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe-
lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com uma ou mais das SEQ ID NOS: 1-3. Alternativamente ou além disso, uma molécula de ácido nucleico como no presente documento fornecida pode incluir uma sequência com pe- lo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo me- nos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe- lo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da SEQ ID NO:
4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico pode incluir um domínio de TPR e/ou um domínio DUF4470 e pode ter pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo me- nos 99% para SEQ ID NO: 3.
[00120] A molécula de ácido nucleico em vários exemplos pode ser ou compreender um cDNA que não tem um ou mais íntrons presentes no gene de ocorrência natural ou, alternativamente, pode incluir um ou mais íntrons não presentes no gene de ocorrência natural. A molécula de ácido nucleico em vários exemplos pode ter uma sequência que não é 100% idêntica a um gene que ocorre naturalmente. Por exem- plo, a molécula de ácido nucleico pode incluir uma mutação em rela- ção a um gene que ocorre naturalmente que reduz a atividade do poli- peptídeo codificado ou reduz a expressão do mRNA ou da proteína codificada pelo gene.
[00121] A molécula de ácido nucleico em vários exemplos pode compreender um promotor heterólogo operacionalmente ligado à se- quência que codifica um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3; e/ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos cer- ca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4. Alternativamente ou além disso, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um vetor que inclui uma sequên- cia que codifica um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoá- cidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, e/ou SEQ ID NO: 3 (e/ou uma variante conservadora de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3); e/ou uma sequência que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
[00122] Esta invenção também fornece construtos projetados para atenuar a expressão de um gene que codifica um domínio de TPR. O construto pode ser ou compreender, em vários exemplos, uma se- quência que codifica um RNA-guia de um sistema CRISPR, um cons- truto RNAi, um construto antissenso, um construto de ribozimas ou um construto para recombinação homóloga, por exemplo, um construto com uma ou mais sequências de nucleotídeos tendo homologia com um gene que codifica o domínio de TPR, como no presente documen- to descrito e/ou sequências adjacentes a ele no genoma nativo do qual o gene é derivado. Por exemplo, o construto pode incluir pelo menos uma porção de um gene que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR e/ou com um domínio DUF4470, por exemplo, uma sequência homóloga a pelo menos uma porção de um gene que codifica um poli- peptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[00123] O construto para atenuação de genes pode incluir, por exemplo, pelo menos uma porção da região de codificação, íntron, 5' UTR, região promotora ou 3' UTR de um gene que codifica um poli- peptídeo com um domínio de TPR ou DUF4470 (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) e/ou um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3 e/ou pelo menos uma porção de um gene com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75 %, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cer- ca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4, em orientação senso ou antissenso. Além disso, esse construto pode incluir pelo menos uma porção da região de codificação, íntron, 5' UTR, região promotora ou 3' UTR de um gene que codifica um polipeptídeo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-3 e/ou um variante conservadora do mesmo.
[00124] Em outros exemplos, um construto pode ser projetado para a expressão in vitro ou in vivo de um RNA-guia (por exemplo, de um sistema CRISPR) projetado para ter como alvo um gene de ocorrência natural com uma sequência com pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pe- lo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com pelo menos uma por- ção da SEQ ID NO: 4, ou que codifica um polipeptídeo com um domí- nio de TPR com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, em pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo me- nos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e/ou pode incluir uma sequência homóloga a uma porção de um ge- ne que codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR e/ou DUF4470, que inclui, por exemplo, um íntron, uma 5' UTR, uma região promotora e/ou uma 3' UTR.
[00125] Ainda em outros exemplos, um construto para atenuar a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo que contém do- mínio de TPR pode ser um RNA-guia ou oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência com homologia a uma região transcrita de um ge- ne codifica um polipeptídeo com um domínio de TPR em orientação antissenso.
[00126] Construtos de ácido nucleico para atenuar a expressão de um gene que codifica o domínio de TPR e/ou um gene que codifica um polipeptídeo com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe-
lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 2 e/ou 3 podem in- cluem, por exemplo, pelo menos cerca de 17, pelo menos cerca de 18, pelo menos cerca de 19, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 21, pelo menos cerca de 22, pelo menos cerca de 23, pelo menos cerca de 24 ou pelo menos cerca de 25 nucleotídeos de sequência de um gene que codifica um domínio de TPR e/ou um gene que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo me- nos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, 2 ou 3, e/ou um gene com pelo menos cerca de 50%, pelo me- nos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pe- lo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com uma porção da SEQ ID NO: 4.
[00127] Em um exemplo, é fornecida neste documento uma molé- cula de ácido nucleico que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade com pelo menos uma por- ção da SEQ ID NO: 4, em que a molécula de ácido nucleico codifica um RNA-guia de um sistema CRISPR. A molécula de ácido nucleico pode incluir, por exemplo, pelo menos cerca de 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24 ou pelo menos 25 nucleotídeos de sequên- cia de um gene contendo domínio de TPR de ocorrência natural, co-
mo, sem limitação, a SEQ ID NO: 4.
[00128] Além disso, são fornecidas neste documento construtos an- tissenso, ribozima ou RNAi que incluem e/ou são complementares e/ou possuem especificidade para pelo menos uma porção de um ge- ne que codifica um domínio de TPR e/ou um polipeptídeo com pelo menos cerca de 65% de identidade com a SEQ ID NO: 1 e/ou 2, e/ou um gene tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com uma porção da SEQ ID NO: 4, na qual um promotor, como um promotor heterólogo, está operacional- mente ligado à sequência genética que contém o domínio de TPR e a sequência genética que contém o domínio de TPR está na orientação antissenso. Além disso, são fornecidas neste documento construtos antissenso, ribozima ou RNAi que incluem e/ou são complementares e/ou possuem especificidade para pelo menos uma porção de um ge- ne com pelo menos cerca de 65% de identidade com a SEQ ID NO: 4, e/ou um gene tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com uma porção da SEQ ID NO: 4.
[00129] Além disso, são fornecidos neste documento construtos pa- ra recombinação homóloga que incluem e/ou são complementares e/ou possuem especificidade e/ou marcam uma sequência nucleotídi- ca de ou adjacente a um gene algáceo de ocorrência natural que codi- fica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, em pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3; e/ou um gene localizado no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende uma ORF que compreende uma sequência com pelo me- nos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, em identi- dade de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a se- quência nucleotídica é justaposta com uma sequência heteróloga de ácido nucleico que pode ser, em exemplos não limitantes, um marca- dor selecionável ou gene marcador detectável.
Em alguns exemplos, um construto para recombinação homóloga inclui duas sequências de ácidos nucleicos de ou adjacentes a um gene algáceo de ocorrência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoáci- dos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e/ou SEQ ID NO: 3; um gene localizado no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende uma ORF que compreende uma se- quência com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4, em que as duas sequên- cias flanqueiam uma sequência heteróloga para inserção no local do gene.
[00130] Um versado na técnica compreenderá que vários métodos de transformação podem ser usados para transformação genética de microrganismos e, portanto, podem ser usados para os métodos da presente invenção. "Transformação estável" se destina a significar que o construto de ácido nucleico introduzido em um organismo se integra ao genoma do organismo ou faz parte de um construto epissomal es- tável e é capaz de ser herdado pela descendência do mesmo. "Trans- formação transiente" se destina a significar que um polinucleotídeo é introduzido no organismo e não se integra ao genoma ou se estabele- ce e é herdado de maneira estável por gerações sucessivas.
[00131] A transformação genética pode resultar em inserção e/ou expressão estável de transgenes, construtos do núcleo ou do plastídeo e, em alguns casos, pode resultar na expressão transiente de transge- nes. Os métodos de transformação também podem ser usados para a introdução de RNAs-guia ou edição de DNAs. A transformação genéti- ca de microalgas tem sido relatada com sucesso em mais de 30 cepas diferentes de microalgas, que pertencem a pelo menos aproximada- mente 22 espécies de algas verdes, vermelhas e marrons, diatomá- ceas, euglenoides e dinoflagelados (consultar, por exemplo, Radako- vits et al., Eukaryotic Cell, 2010; e Gong et al., J. Ind. Microbiol. Bio- technol., 2011). Exemplos não limitantes de tais métodos úteis de transformação incluem agitação de células na presença de microesfe- ras de vidro ou cristais capilares de carboneto de silício, como relatado por, por exemplo, Dunahay, Biotechniques, 15(3): 452 a 460, 1993; Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990; Michael e Miller, Plant J., 13, 427 a 435, 1998. Técnicas de eletroporação têm sido usadas com sucesso na transformação genética de várias espécies de microalgas, incluindo Nannochloropsis sp. (consultar, por exemplo, Chen et al., J. Phycol., 44: 768 a 776, 2008), Chlorella sp. (consultar, por exemplo,
Chen et al., Curr. Genet., 39: 365 a 370, 2001; Chow e Tung, Plant Cell Rep. Vol. 18, no 9, 778 a 780, 1999), Chlamydomonas (Shimoga- wara et al., Genetics, 148: 1.821 a 1.828, 1998), e Dunaliella (Sun et al., Mol. Biotechnol., 30(3): 185 a 192, 2005), por exemplo. O bombar- deio de microprojéteis, também conhecido como bombardeio de mi- cropartículas, transformação de armas gênicas ou bombardeio biolísti- co, tem sido usado com sucesso para várias espécies de algas, inclu- indo, por exemplo, espécies de diatomáceas, como Phaeodactylum (Apt et al., Mol. Gen. Genet., 252: 572 a 579, 1996), Cyclotella e Navi- cula (Dunahay et al., J. Phycol., 31: 1.004 a 1.012, 1995), Cylindrothe- ca (Fischer et al., J. Phycol., 35: 113 a 120, 1999), e Chaetoceros sp. (Miyagawa-Yamaguchi et al., Phycol. Res. 59: 113 a 119, 2011), bem como espécies de algas verdes, como Chlorella (El-Sheekh, Biologia Plantarum, Vol. 42, no 2: 209 a 216, 1999) e espécies de Volvox (Ja- kobiak et al., Protist, 155: 381 a 393, 2004). Além disso, as técnicas de transferência de genes mediadas por Agrobacterium também podem ser úteis para a transformação genética de microalgas, como foi rela- tado por, por exemplo, Kumar, Plant Sci., 166(3): 731 a 738, 2004, e Cheney et al., J. Phycol., Vol. 37, Suppl. 11, 2001. A conjugação com espécies bacterianas também foi empregada para transferência de genes e construtos para algas, como descrito por exemplo no docu- mento US 2016/0244770, no presente documento incorporado por re- ferência.
[00132] Um vetor ou construto de transformação como descrito nes- te documento tipicamente compreende um gene marcador que confere um fenótipo selecionável ou escorável nas células hospedeiras-alvo, por exemplo, células algáceas ou pode ser cotransformado com um construto que inclui um marcador. Diversos marcadores selecionáveis foram desenvolvidos com sucesso para isolamento eficiente de trans- formantes genéticos de algas. Marcadores selecionáveis comuns in-
cluem resistência a antibióticos, marcadores fluorescentes e marcado- res bioquímicos. Vários genes diferentes de resistência a antibióticos foram usados com sucesso para seleção de transformantes de micro- algas, incluindo blastocidina, bleomicina (consultar, por exemplo, Apt et al., 1996, supra; Fischer et al., 1999, supra; Fuhrmann et al., Plant J., 19, 353 a 361, 1999, Lumbreras et al., Plant J., 14(4): 441 a 447, 1998; Zaslavskaia et al., J. Phycol., 36: 379 a 386, 2000), spectino- mycin (Cerutti et al., Genetics, 145: 97 a 110, 1997; Doetsch et al., Curr. Genet., 39, 49 a 60, 2001; Fargo, Mol. Cell. Biol., 19: 6.980 a
6.990, 1999), estreptomicina (Berthold et al., Protist, 153: 401 a 412, 2002), paromomicina (Jakobiak et al., Protist, supra.; Sizova et al., Ge- ne, 277: 221 a 229, 2001), nourseotricina (Zaslavskaia et al., 2000, su- pra), G418 (Dunahay et al., 1995, supra; Poulsen e Kroger, FEBS Lett., 272: 3.413 a 3423, 2005, Zaslavskaia et al., 2000, supra), higro- micina (Berthold et al., 2002, supra), cloranfenicol (Poulsen e Kroger, de 2005, supra), e muitos outros. Marcadores selecionáveis adicionais para uso em microalgas como Chlamydomonas podem ser marcado- res que fornecem resistência à canamicina e resistência à amicacina (Bateman, Mol. Gen. Genet. 263: 404 a 410, 2000), resistência à zeo- micina e fleomicina (por exemplo, ZEOCIN™ feomicina D1) (Stevens, Mol. Gen. Genet. 251: 23 a 30, 1996) e resistência à paramomicina e neomicina (Sizova et al., 2001, supra). Outros marcadores fluorescen- tes ou cromogênicos que foram usados incluem luciferase (Falciatore et al., J. Mar. Biotechnol., 1: 239 a 251, 1999; Fuhrmann et al., Plant Mol. Biol., 2004; Jarvis e Brown, Curr. Genet., 19: 317 a 322, 1991), β- glucuronidase (Chen et al., 2001, supra; Cheney et al., 2001, supra; Chow e Tung, 1999, supra; El-Sheekh, 1999, supra; Falciatore et al., 1999, supra; Kubler et al., J. Mar. Biotechnol., 1: 165 a 169, 1994), β- galactosidase (Gan et al., J. Appl. Phycol., 15: 345 a 349, 2003; Jiang et al., Plant Cell Rep., 21: 1.211 a 1.216, 2003; Qin et al., High
Technol. Lett., 13: 87 a 89, 2003), e proteína verde fluorescente (GFP) (Cheney et al., 2001, supra; Ender et al., Plant Cell, 2002, Franklin et al., Plant J., 2002; 56, 148, 210).
[00133] Um indivíduo versado na técnica apreciará prontamente que uma variedade de sequências promotoras conhecidas pode ser útil para sistemas de transformação de espécies de microalgas de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os promotores comu- mente usados para acionar a expressão do transgene em microalgas incluem várias versões do promotor do vírus do mosaico de couve-flor 35S (CaMV35S), que tem sido usado tanto em dinoflagelados quanto em clorofita (Chow et al., Plant Cell Rep., 18: 778 a 780, 1999; Jarvis e Brown, Curr. Genet., 317-321, 1991; Lohuis e Miller, Plant J., 13:427- 435, 1998). O promotor SV40 do vírus símio também relatou ser ativo em várias algas (Gan et al., J. Appl. Phycol., 151 345 a 349, 2003; Qin et al., Hydrobiologia 398 a 399, 469 a 472, 1999). Os promotores de RBCS2 (ribulose bisfosfato carboxilase, subunidade pequena) (Fuhr- mann et al., Plant J., 19: 353 a 361, 1999) e PsaD (proteína abundante do complexo fotossistema I; Fischer e Rochaix, FEBS Lett. 581: 5.555 a 5.560, 2001) de Chlamydomonas também pode ser útil. Os promoto- res de fusão de HSP70A/RBCS2 e HSP70A/β2TUB (tubulina) (Schro- da et al., Plant J., 21: 121 a 131, 2000) também podem ser úteis para uma expressão melhorada de transgenes, na qual o promotor HSP70A pode servir como um ativador da transcrição quando colocado a mon- tante de outros promotores. A expressão de alto nível de um gene de interesse também pode ser alcançada, por exemplo, em espécies de diatomáceas, sob o controle de um promotor de um gene fcp que codi- fica uma proteína de ligação a diatomina fucoxantina-clorofila a/b (Fal- ciatore et al., Mar. Biotechnol., 1: 239 a 251, 1999; Zaslavskaia et al. J. Phycol. 36: 379 a 386, 2000) ou o gene vcp que codifica uma proteína de ligação a violaxantina-clorofila a/b eustigmatófito (consultar Patente de Número US 8.318.482, incorporada ao presente documento a título de referência). Se desejado, promotores induzíveis podem fornecer expressão rápida e fortemente controlada de genes em microalgas transgênicas. Por exemplo, as regiões promotoras dos genes NR que codificam a nitrato redutase podem ser usadas como tais promotores induzíveis. A atividade do promotor de NR é tipicamente suprimida pe- lo amônio e induzida quando o amônio é substituído pelo nitrato (Poul- sen e Kroger, FEBS Lett 272: 3.413 a 3.423, 2005), assim a expressão gênica pode ser desativada ou ativada quando células microalgáceas são cultivadas na presença de amônio/nitrato. Um promotor de Nan- nochloropsis reprimível por amônio referido como o promotor "Redu- tase de Nitrito/Sulfito repressível por amônio" é descrito no documento US 2017/0073695, no presente documento incorporado por referência. Promotores de algas adicionais que podem ser usados nos construtos e sistemas de transformação fornecidos neste documento incluem aqueles descritos na Patente de Número US 8.835.419; Patente de Número US 8.883.993; Publicação Pedido de Patente de Número US 2013/0023035; Publicação de Pedido de Patente de Número US 2013/0323780; Publicação de Pedido de Patente de Número US 2014/0363892; Publicação de Pedido de Patente de Número US 2017/0152520; e Publicação de Pedido de Patente de Número US 2017/0114107, todos incorporados ao presente documento a título de referência na sua totalidade.
[00134] As células hospedeiras podem ser células não transforma- das ou células que já estão transfectadas com pelo menos uma molé- cula de ácido nucleico. Por exemplo, uma célula hospedeira de algas que é projetada para ter uma expressão atenuada de um gene regula- dor lipídico pode incluir ainda um ou mais transgenes que podem con- ferir ou contribuir para qualquer característica desejável, como, porém, sem limitação, aumento da produção de biomoléculas de interesse,
como uma ou mais proteínas, pigmentos, álcoois ou lipídios.
MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE LIPÍDIOS
[00135] Também são fornecidos neste documento métodos de pro- dução de lipídios através da cultura de um microrganismo mutante, como proporcionado neste documento, que aumentou a produtividade lipídica em relação a uma célula de controle quando cultivados nas mesmas condições. Os métodos incluem cultivar um microrganismo mutante, como fornecido neste documento, em um meio adequado para produzir lipídios e recuperar biomassa ou pelo menos um lipídio da cultura. O microrganismo pode, em alguns exemplos, ser uma alga, e a cultura pode ser uma cultura fotoautotrófica. A cultura pode ser em modo batelada, contínuo e semicontínuo.
[00136] O microrganismo mutante em alguns exemplos pode ser cultivado em um meio que compreende menos de cerca de 5 mM de amônio, menos de cerca de 4,5 mM de amônio, menos de cerca de 4 mM de amônio, menos de cerca de 3,5 mM de amônio, menos de cer- ca de 3 mM de amônio, menos maior que 2,5 mM de amônio, menor que cerca de 2 mM de amônio, menor que cerca de 1,5 mM de amô- nio, menor ou igual a cerca de 1 mM de amônio, menor ou igual a cer- ca de 0,5 mM (por exemplo, menor que 5 mM), ou substancialmente nenhum amônio. O meio de cultura pode incluir, por exemplo, de cerca de 0 a cerca de 5 mM de amônio, de cerca de 0 a cerca de 4,5 mM de amônio, de cerca de 0 a cerca de 4,0 mM de amônio, de cerca de 0 a cerca de 3,5 mM de amônio, de cerca de 0 a cerca de 3 mM de amô- nio, de cerca de 0 a cerca de 2,5 mM de amônio, de cerca de 0 a cer- ca de 2,0 mM de amônio, de cerca de 0 a cerca de 1,5 mM de amônio, de cerca de 0 a cerca de 1,0 mM de amônio, de cerca de 0 a 0,5 mM de amônio, de cerca de 0,2 a cerca de 3 mM de amônio, de cerca de 0,2 a cerca de 2,5 mM de amônio, de cerca de 0,2 a cerca de 2 mM de amônio, de cerca de 0,2 a cerca de 1,5 mM de amônio, de cerca de
0,2 a cerca de 1 mM de amônio, de cerca de 0,3 a 2,5 mM de amônio, de cerca de 0,3 a cerca de 2 mM de amônio, de cerca de 0,3 a cerca de 1,5 mM de amônio, de cerca de 0,3 a cerca de 1 mM de amônio, de cerca de 0,4 mM a cerca de 2,5 mM de amônio, de cerca de 0,4 a cer- ca de 2 mM de amônio, ou de cerca de 0,4 mM a cerca de 1,5 mM de amônio (por exemplo, 0 a 5 mM). O microrganismo pode ser cultivado em um meio que inclui nitrato, que, em alguns exemplos, pode ser substancialmente a única fonte de nitrogênio no meio de cultura ou pode estar presente além de menos de cerca de 5 mM de amônio, menos de cerca de 4,5 mM de amônio, menos de cerca de 4 mM de amônio, menos de cerca de 3,5 mM de amônio, menos de cerca de 3 mM de amônio, menos de cerca de 2,5 mM de amônio, menos de cer- ca de 2 mM de amônio, menos de cerca de 1,5 mM de amônio, menor ou igual a cerca de 1 mM de amônio, menor ou igual a cerca de 0,5 mM (por exemplo, menos que 5 mM), ou substancialmente nenhum amônio. Alternativamente ou além disso, o meio de cultura pode com- preender ureia, que em alguns exemplos pode ser substancialmente a única fonte de nitrogênio no meio de cultura.
[00137] Os microrganismos produtores de lipídios podem ser culti- vados em qualquer recipiente (ou recipientes) adequado, incluindo frascos ou biorreatores. Em alguns exemplos, o microrganismo mutan- te é uma alga e é exposto à luz por pelo menos uma parte do período de cultura, no qual as algas podem ser expostas à luz artificial ou natu- ral (ou luz natural suplementada com luz artificial). A cultura que com- preende algas mutantes que são desreguladas em resposta à luz fra- ca, pode ser cultivada em um ciclo claro/escuro que pode ser, por exemplo, um ciclo claro/escuro natural ou programado e, como exem- plos ilustrativos, pode fornecer doze horas de luz a doze horas de es- curidão, catorze horas de luz a dez horas de escuridão, dezesseis ho- ras de luz a oito horas de escuridão, etc. Alternativamente, um mutan-
te de algas pode ser cultivado em luz contínua.
[00138] Cultura se refere à promoção intencional de crescimento (por exemplo, aumento no tamanho da célula, conteúdo celular e/ou atividade celular) e/ou propagação (por exemplo, aumento no número de células por mitose) de uma ou mais células pelo uso de métodos selecionados e/ou condições controladas. A combinação de cresci- mento e propagação pode ser denominada proliferação. Um microrga- nismo, como fornecido neste documento, pode ser cultivado por pelo menos cerca de um, pelo menos cerca de dois, pelo menos cerca de três, pelo menos cerca de quatro, pelo menos cerca de cinco, pelo menos cerca de seis, pelo menos cerca de sete, pelo menos cerca de oito, pelo menos cerca de nove, pelo menos cerca de dez, pelo menos cerca de onze, pelo menos cerca de doze, pelo menos cerca de treze, pelo menos cerca de catorze, ou pelo menos cerca de quinze dias, ou pelo menos cerca de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez semanas ou mais. A cultura pode estar opcionalmente em um meio de cultura repleto de nutrientes em relação a uma alga de controle.
[00139] Exemplos não limitantes de condições selecionadas e/ou controladas que podem ser usadas para a cultura do microrganismo recombinante podem incluir o uso de um meio definido (com caracte- rísticas conhecidas como pH, força iônica e/ou fonte de carbono), tem- peratura especificada, tensão de oxigênio, níveis de dióxido de carbo- no, crescimento em um biorreator, ou similares, ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o microrganismo ou célula hos- pedeira pode ser crescido mixotroficamente, usando luz e uma fonte de carbono reduzida. Alternativamente, o microrganismo ou a célula hospedeira pode ser cultivada fototroficamente. Ao crescer fototrofi- camente, a cepa de algas pode vantajosamente usar a luz como fonte de energia. Uma fonte de carbono inorgânico, tal como CO2 ou bicar-
bonato, pode ser usada para a síntese de biomoléculas pelo microrga- nismo. "Carbono inorgânico", como usado neste documento, inclui compostos ou moléculas contendo carbono que não podem ser usa- dos como fonte de energia sustentável por um organismo. Normalmen- te, o "carbono inorgânico" pode estar na forma de CO2 (dióxido de car- bono), ácido carbônico, sais de bicarbonato, sais de carbonato, sais de carbonato de hidrogênio ou similares, ou combinações dos mesmos, que não podem mais ser oxidados por energia sustentável nem usa- dos como uma fonte de redução de poder pelos organismos. Um mi- crorganismo cultivado fotoautotroficamente pode ser cultivado em um meio de cultura em que o carbono inorgânico é substancialmente a única fonte de carbono. Por exemplo, em uma cultura em que o carbo- no inorgânico é substancialmente a única fonte de carbono, qualquer molécula de carbono orgânico (reduzido) ou composto de carbono or- gânico que possa ser fornecido no meio de cultura não pode ser ab- sorvido e/ou metabolizado pela célula por energia e/ou não está pre- sente em quantidade suficiente para fornecer energia sustentável para o crescimento e proliferação da cultura celular.
[00140] Microrganismos e células hospedeiras que podem ser úteis de acordo com os métodos da presente invenção podem ser encon- trados em vários locais e ambientes em todo o mundo. O meio de crescimento específico para a propagação e geração ideais de lipídios e/ou outros produtos pode variar e pode ser otimizado para promover o crescimento, a propagação ou a produção de um produto, como lipí- dios, proteínas, pigmentos, antioxidantes, etc. Em alguns casos, certas cepas de microrganismos podem ser incapazes de crescer em um meio de crescimento específico devido à presença de algum compo- nente inibidor ou à ausência de algum requisito nutricional essencial da cepa específica de microrganismo ou célula hospedeira.
[00141] Os meios de crescimento sólido e líquido estão geralmente disponíveis em uma ampla variedade de fontes, assim como as instru- ções para a preparação de meios específicos adequados para uma grande variedade de cepas de microrganismos. Por exemplo, vários meios de água doce e água salgada podem incluir os descritos em Barsanti (2005) Algae: Anatomy, Biochemistry & Biotechnology, CRC Press para meios e métodos para o cultivo de algas. As receitas de meio de algas também podem ser encontradas nos sites de várias co- leções de culturas de algas, incluindo, como exemplos não limitantes, a Coleção de Cultura de Algas UTEX; Coleta de culturas de Algas e Protozoários; e Katedra Botaniky.
[00142] Os métodos de cultura podem opcionalmente incluir induzir a expressão de um ou mais genes e/ou regular uma via metabólica no microrganismo. A expressão de indução pode incluir adicionar um nu- triente ou composto à cultura, remover um ou mais componentes do meio de cultura, aumentar ou diminuir a luz e/ou temperatura e/ou ou- tras manipulações que promovam a expressão do gene de interesse. Tais manipulações podem depender em grande parte da natureza do promotor (heterólogo) operacionalmente ligado ao gene de interesse.
[00143] Em algumas modalidades da presente invenção, os micror- ganismos com produtividade lipídica aumentada podem ser cultivados em um fotobiorreator equipado com uma fonte de luz artificial e/ou com uma ou mais paredes suficientemente transparentes para a luz, inclu- indo a luz solar, para permitir, facilitar e/ou manter crescimento e proli- feração aceitável de microrganismos. Para a produção de produtos de ácidos graxos ou triglicerídeos, microrganismos fotossintéticos ou célu- las hospedeiras podem ser adicional ou alternadamente cultivados em frascos de agitação, tubos de ensaio, frascos, placas de microtitula- ção, placas de petri ou similares ou combinações dos mesmos.
[00144] Adicional ou alternativamente, microrganismos fotossintéti- cos mutantes ou recombinantes ou células hospedeiras podem ser cul-
tivados em lagoas, canais, recipiente de crescimento à base de mar, valas, canais artificiais, ou calhas, ou similares, ou combinações dos mesmos. Em tais sistemas, a temperatura pode não ser regulada ou vários métodos ou dispositivos de aquecimento ou resfriamento podem ser empregados. Como nos biorreatores padrão, uma fonte de carbo- no inorgânico (tal como, porém, sem limitação, CO2, bicarbonato, sais de carbonato e similares), incluindo, porém sem limitação, ar, ar enri- quecido com CO2, gás de combustão, ou similares, ou combinações dos mesmos, pode ser suprida à cultura. Ao fornecer gases de com- bustão e/ou outras fontes de inorgânicos que possam conter CO além do CO2, pode ser necessário pré-tratar essas fontes de modo que o nível de CO introduzido no (foto) biorreator não constitua um produto perigoso e/ou dose letal em relação ao crescimento, proliferação e/ou sobrevivência dos microrganismos.
[00145] Os microrganismos mutantes podem opcionalmente incluir um ou mais genes não nativos que codificam um polipeptídeo para a produção de um produto, tal como, mas sem limitação, um lipídio.
[00146] Os métodos incluem a cultura de um microrganismo mutan- te como fornecido nesse documento, tal como um microrganismo mu- tante, como fornecido neste documento, que aumentou a produtivida- de lipídica em relação a uma célula de controle quando cultivada nas mesmas condições para produzir biomassa ou lipídio. Os lipídios po- dem ser recuperados da cultura por meios de recuperação conhecidos dos versados na técnica, como por extração total da cultura, por exemplo, usando solventes orgânicos ou primeiro isolando a biomassa da qual os lipídios são extraídos (consultar, por exemplo, Hussein et al. Appl. Biochem. Biotechnol. 175: 3.048 a 3.057; Grima et al. (2003) Biotechnol. Advances 20: 491 a 515). Em alguns casos, a recuperação de produtos de ácidos graxos pode ser aumentada pela homogeneiza- ção das células (Gunerken et al. (2015) Biotechnol. Advances 33: 243 a 260). Por exemplo, lipídios como ácidos graxos, derivados de ácidos graxos e/ou triglicerídeos podem ser isolados de algas por extração das algas com um solvente a temperatura e/ou pressão elevadas, co- mo descrito na Publicação de Pedido de Patente copendente cedido ao mesmo cessionário de Número US 2013/0225846, intitulada "Sol- vent Extraction of Products from Algae", depositada em 29 de fevereiro de 2012, que é incorporada neste documento a título de referência na sua totalidade.
[00147] A biomassa pode ser colhida, por exemplo, por centrifuga- ção ou filtragem. A biomassa pode ser seca e/ou congelada. Outros produtos podem ser isolados da biomassa, como, por exemplo, vários lipídios ou uma ou mais proteínas. Também no presente documento é descrita uma biomassa de algas que compreende biomassa de mutan- te regulador lipídico, como qualquer descrito neste documento, como, sem limitação, um mutante regulador lipídico que inclui uma mutação em um gene que codifica um polipeptídeo que possui um domínio de TPR com pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo me- nos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1 e/ou uma mutação em um gene que codifica um poli- peptídeo tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cer- ca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo me- nos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2. Também no presente documento é descrita uma bio-
massa de algas que compreende biomassa de mutante regulador lipí- dico, como qualquer descrito neste documento, como, sem limitação, um mutante regulador lipídico que inclui uma mutação em um gene que codifica um polipeptídeo que possui um domínio DUF4470 com pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cer- ca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo me- nos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3.
[00148] Os lisados de mutantes de algas, como no presente docu- mento fornecidos, podem ser produzidos usando métodos conhecidos na técnica. Como exemplos não limitativos, esses métodos podem usar enzimas (por exemplo, proteases ou outras enzimas digestivas da parede celular), agentes caotrópicos como guanidínio ou ureia, deter- gentes, por exemplo, em concentrações que variam de 0,1 a 5% ou mais, e/ou interrupção física, incluindo, mas sem limitação a, moagem de um almofariz e pilão (opcionalmente usando células congeladas), degelo por congelamento, lise hipotônica, sonicação, disrupção por esferas, aquecimento, alta pressão, cavitação e similares, ou qualquer combinação dos mesmos. Um lisado pode opcionalmente ser um lisa- do limpo que pode ser um sobrenadante de células lisadas centrifuga- das em qualquer força g, por exemplo, 1 - 100.000 xg ou mais. Alter- nativamente ou além disso, um lisado pode ser um lisado filtrado, diali- sado ou concentrado.
[00149] Alternativamente ou adicionalmente a qualquer uma das modalidades anteriores, a invenção fornece as seguintes modalidades:
[00150] A Modalidade 1 é um microrganismo mutante que atenuou a expressão de um gene ou de um gene interrompido que codifica um polipeptídeo que compreende:
um domínio de TPR, opcionalmente, em que o domínio de TPR tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1; e/ou um domínio DUF4470, opcionalmente, em que o domínio DUF4470 tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pe- lo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; em que o microrganismo mutante produz pelo menos cerca de 25% mais lipídio do que um microrganismo de controle; e/ou exibe particionamento aumentado de carbono para lipídeo em relação ao microrganismo de controle; quando o microrganismo mutante e o mi- crorganismo de controle são cultivados sob condições idênticas, opci- onalmente em que o microrganismo de controle é um microrganismo do tipo selvagem.
[00151] A Modalidade 2 é um microrganismo mutante de acordo com a Modalidade 1, em que o microrganismo mutante compreende uma ou mais mutações ou afetam a expressão de um gene localizado no local Naga_100148g8 ou local sintênico em espécies heterokonta ou algas; e/ou compreende uma ou mais mutações que afetam a ex- pressão de um gene que compreende um quadro de leitura aberto com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
[00152] A Modalidade 3 é um microrganismo mutante de acordo com a Modalidade 1 ou Modalidade 2, em que o microrganismo mu- tante produz pelo menos cerca de 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo me- nos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais lipídios derivados de éster metílico de áci- dos graxos (lipídios FAME) do que um microrganismo de controle quando o microrganismo mutante e o microrganismo de controle são cultivados em condições idênticas e/ou exibe uma razão FAME/TOC de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo me- nos 90%, pelo menos 100 %, pelo menos 120%, pelo menos 140%, pelo menos 160%, pelo menos 180%, pelo menos 200%, pelo menos 220%, pelo menos 240%, pelo menos 260%, pelo menos 280% ou pe- lo menos 300% superior à razão FAME/TOC do microrganismo de controle quando o microrganismo mutante e o microrganismo de con- trole são cultivados em condições idênticas.
[00153] A Modalidade 4 é um microrganismo mutante, em que o microrganismo é uma espécie de algas ou heterokonta, opcionalmente em que o microrganismo mutante é uma espécie de alga selecionada do grupo que consiste em Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankis- trodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Bo- trydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomo- nas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremos- phaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fra- gilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Mo- noraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pa- vlova, Pelagomonas, Phæodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymo- nas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseu- doneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scene- desmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viri- diella, Vischeria, e Volvox, ou opcionalmente, em que o microrganismo mutante é uma heterokonta selecionada do grupo que consiste em ba- cilariófitos, eustigmatófitos, xantófitos, feófitos, crisófitos ou rafidófitos ou, opcionalmente, em que o microrganismo mutante é uma heteroko- nta selecionada do grupo que consiste em uma espécie de Labryinthu- la, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplano- chytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Di- plophrys, ou Ulkenia.
[00154] A Modalidade 5 é um microrganismo mutante de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 4, em que as condições de cultura idênticas incluem: um meio de cultura que compreende menos de 2 mM de amônio, opcionalmente um meio de cultura em que o ni- trato é a única fonte de nitrogênio e/ou as condições de cultura são quaisquer condições de cultura em lote, semicontínuas ou contínuas.
[00155] A Modalidade 6 é um microrganismo mutante de acordo com a Modalidade 5, em que o microrganismo mutante é uma alga e as condições de cultura são fotoautotróficas.
[00156] A Modalidade 7 é um microrganismo mutante de acordo qualquer uma das Modalidades 1 a 6, em que o microrganismo mutan- te é um mutante derivado de forma clássica ou mutante geneticamente modificado, em que qualquer um ou mais dos seguintes itens são ver- dadeiros: o microrganismo mutante é um mutante knockdown, opcio- nalmente gerado usando um sistema Cas/CRISPR, um construto RNAi, um construto ribozima ou um construto antissenso; o microrganismo mutante é um mutante knockdown em que a mutação interrompe o gene por deleção parcial ou total, truncamen- to, deslocamento de quadros e/ou mutação insercional em uma região não codificante do gene; o microrganismo mutante é um mutante knockout, opcio- nalmente produzido por recombinação homóloga direcionada ao local, uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco, um sistema Nu- clease de Efetivador do Tipo Ativador da Transcrição (TALEN) e/ou um sistema Cas/CRISPR; e o microrganismo mutante é um mutante knockout, em que a mutação interrompe o gene por deleção parcial ou total, truncamento, deslocamento de quadros e/ou mutação insercional.
[00157] A Modalidade 8 é um microrganismo mutante, de qualquer uma das Modalidades 1 a 7, em que o microrganismo mutante com- preende pelo menos uma modificação genética adicional que confere resistência a herbicidas, resistência a toxinas, propriedades de cresci- mento aprimoradas, eficiência fotossintética aprimorada, eficiência fo- tossintética aprimorada, produção ou acumulação lipídica aprimorada e/ou produção de lipídios específicos.
[00158] A Modalidade 9 é um método de produção de lipídios, inclu- indo a cultura de um microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 8, em um meio de cultura, em que o micror- ganismo mutante produz lipídios e, opcionalmente, o lipídio isolado do microrganismo, do meio de cultura ou de ambos, opcionalmente, em que o microrganismo é cultivado usando condições de cultura descon- tínua, contínua ou semicontínua.
[00159] A Modalidade 10 é um microrganismo mutante de acordo com a Modalidade 9, em que o microrganismo é uma alga e a cultura está sob condições fotoautotróficas.
[00160] A Modalidade 11 é um microrganismo mutante de acordo com a Modalidade 9, em que o microrganismo é um Labyrinthulomyce- te e a cultura está sob condições heterotróficas.
[00161] A Modalidade 12 é um RNA-guia de um sistema CRISPR, em que o RNA-guia inclui uma sequência correspondente à sequên- cia-alvo estabelecida na SEQ ID NO: 7, em que o RNA-guia é um guia quimérico ou o RNA-guia não inclui uma sequência tracr.
[00162] A Modalidade 13 é um construto de ácido nucleico para re- combinação homóloga, em que o construto inclui uma sequência nu- cleotídica de ou adjacentes a um gene algáceo de ocorrência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e/ou SEQ
ID NO: 3; um gene localizado no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende uma ORF que compreende uma sequência com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identi- dade com a SEQ ID NO: 4.
[00163] A Modalidade 14 é um construto de ácido nucleico para ex- pressão de um RNA, shRNA, microRNA ou ribozima antissenso e in- clui uma sequência nucleotídica complementar a pelo menos uma por- ção de um gene de ocorrência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55 %, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3; um gene localizado no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende uma ORF que com- preende uma sequência com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
[00164] A Modalidade 15 é uma molécula de ácido nucleico que co- difica um RNA-guia de um CRISPR, em que o RNA-guia compreende pelo menos uma porção de um gene algáceo de ocorrência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%,
pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos pelo menos cerca de 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, e/ou SEQ ID NO: 3; um gene localizado no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende uma ORF que compreende uma sequência com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos cerca de 99% de identi- dade com a SEQ ID NO: 4.
[00165] A Modalidade 16 é um método para a produção de um mi- crorganismo mutante descrito neste documento, no qual um microrga- nismo mutante é produzido introduzindo em um microrganismo uma ou mais mutações e/ou um ou mais agentes que atenuam a expressão de um polipeptídeo que compreende um domínio de TPR, em que as uma ou mais mutações afetam a expressão de um polipeptídeo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3; um gene localizado no local Naga_100148g8; ou um gene que compreende um quadro de leitura aberto que compreen- de a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4, opcionalmente em que um ou mais agentes são selecionados do grupo que consiste em RNA antissenso, RNAi, shRNA, microRNA, ribozima, um componente de um Cas/CRISPR e/ou um componente de um sistema Nuclease Efetor do Tipo Ativador da Transcrição (TALEN).
[00166] Outras modalidades também são contempladas no presen- te documento, como seria entendido por um versado na técnica. Cer- tas modalidades são descritas adicionalmente nos exemplos a seguir. Essas modalidades são fornecidas apenas como exemplos e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações de forma alguma.
[00167] Todas as referências no presente documento citadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Todos os títulos são para a conveniência do leitor e não limitam a invenção de forma algu- ma. As referências a aspectos ou modalidades da invenção não indi- cam necessariamente que os aspectos descritos não podem ser com- binados com outros aspectos descritos da invenção ou características de outros aspectos da invenção.
EXEMPLOS MEIO USADO NOS EXEMPLOS
[00168] O meio PM066 inclui nitrato de 8,8 mM como única fonte de nitrogênio e fosfato de 0,417 mM (PO4), juntamente com metais e vi- taminas em sais do Instant Ocean. O meio PM066 foi produzido adici- onando 5,71 ml de uma solução estoque NaNO3 1,75 M (148,7 g/l) e 5,41 ml de uma solução estoque K2HPO4.3H2O 77 mM (17,57 g/l) a 981 ml da solução de sais Instant Ocean (35 g/l) juntamente com 4 ml de Solução Estoque de Metais Quelados e ml de Solução Estoque de Vitamina de 4 ml. A Solução Estoque de Metais Quelados foi prepara- da adicionando a 400 ml de água 2,18 g de Na2EDTA.2H2O; 1,575 g de FeCl3.6H2O; 500 μl de solução estoque 39,2 mM (0,98 g/100 ml) CuSO4.5H2O; 500 μl de solução estoque 77,5 mM (2,23 g/100 ml) ZnSO4.7H2O; 500 μl de solução estoque 42,0 mM (1,00 g/100 ml) CoCl2.6H2O; 500 μl de solução estoque 910,0 mM (18,0/100 ml) MnCl2.4H2O; 500 μl de solução estoque 26,0 mM (0,63 g/100 ml) Na2MoO4.2H2O; atingindo um volume final de 500 ml e esterilizando por filtração. A Solução Estoque de Vitamina foi preparada adicionan- do a 400 ml de água 0,05 g de Tiamina HCl; 500 μl de solução estoque 0,37 mM (0,05 g/100 ml) de cianocobalamina; e 2,5 ml de solução es- toque 0,41 mM (0,01 g/100 ml) de biotina, atingindo um volume final de 500 ml e esterilizando por filtração.
[00169] O meio PM067 não inclui nenhuma fonte de nitrogênio (sem nitrato, amônio ou ureia) e inclui 0,417 mM de fosfato (PO4) junto com metais e vitaminas nos sais do Instant Ocean. O meio PM067 foi pro-
duzido adicionando 5,41 ml de uma solução estoque K2HPO4.3H2O 77 mM (17,57 g/l) a 987 ml de solução de sais Instant Ocean (35 g/l) jun- tamente com 4 ml de estoque de metais quelados Solução e ml de 4 ml de Solução Estoque de Vitamina. A Solução Estoque de Metais Quelados foi preparada adicionando a 400 ml de água 2,18 g de Na2EDTA.2H2O; 1,575 g de FeCl3.6H2O; 500 μl de solução estoque 39,2 mM (0,98 g/100 ml) CuSO4.5H2O; 500 μl de solução estoque 77,5 mM (2,23 g/100 ml) ZnSO4.7H2O; 500 μl de solução estoque 42,0 mM (1,00 g/100 ml) CoCl2.6H2O; 500 μl de solução estoque 910,0 mM (18,0/100 ml) MnCl2.4H2O; 500 μl de solução estoque 26,0 mM (0,63 g/100 ml) Na2MoO4.2H2O; atingindo um volume final de 500 ml e este- rilizando por filtração. A Solução Estoque de Vitamina foi preparada adicionando a 400 ml de água 0,05 g de Tiamina HCl; 500 μl de solu- ção estoque 0,37 mM (0,05 g/100 ml) de cianocobalamina; e 2,5 ml de solução estoque 0,41 mM (0,01 g/100 ml) de biotina, atingindo um vo- lume final de 500 ml e esterilizando por filtração.
[00170] O PM074 é um meio repleto de nitrogênio que inclui nitrato como única fonte de nitrogênio ("somente nitrato") 10X F/2 produzido pela adição de 1,3 ml de parte A de Alimentação de Algas PROLINE® F/2 (Aquatic Eco-Systems) e 1,3 ml de parte B de Alimentação de Al- gas PROLINE® F/2 (Aquatic Eco-Systems) até um volume final de 1 litro de uma solução de sais Instant Ocean (35 g/l) (Aquatic Eco Sys- tems, Apopka, FL). Prolina A e B em conjunto incluem prolina NaNO3 8,8 mM, NaH2PO4.H2O 0,361 mM, vestígios de metais 10X F/2, e Vi- taminas 10X F/2 (Guillard (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Em "Culture of Marine Invertebrate Animals." (eds: Smith W.L. e Chanley M.H.) Plenum Press, New York, USA. pá- ginas 26 a 60).
[00171] O meio PM124 é PM074 suplementado com 5 mM de amô- nio e 10 mM de HEPES, pH 8,0. É feito adicionando 10 ml de HEPES
1 M, pH 8 e 5 ml de NH4Cl à receita PM074 (volume final de 1 l). Meios adicionais com níveis controlados de amônio foram feitos ajustando a concentração de amônio no PM074 e adicionando tampão Hepes adi- cional.
[00172] Os meios PM066, PM074 e PM124 são repletos de nitrogê- nio e repletos de nutrientes em relação a Nannochloropsis do tipo sel- vagem. EXEMPLO 1.
IDENTIFICAÇÃO DE UMA REGULAMENTAÇÃO DECRESCENTE DE POLIPÉPTIDO DURANTE A INANIÇÃO DE NITROGÊNIO.
[00173] Várias cepas de Nannochloropsis acumulam altos níveis de lipídios de armazenamento de triacilgliceróis (TAG) durante a privação de nitrogênio e correlações entre produção aumentada de TAG e cor- relações entre acumulação de TAG e alterações subjacentes na ex- pressão gênica em diferentes vias metabólicas que levam à síntese de TAG foram relatadas (Radakovits et al. (2012) Nat Commun 3: 686; Li et al. (2014) The Plant Cell 26: 1.645 a 1.665; Corteggiani Carpinelli et al. (2014) Mol Plant 7: 1.645 a 1.665). Para identificar genes que codi- ficam reguladores que influenciam a biossíntese e o acúmulo de lipí- dios, foi analisada a resposta transcricional precoce das células de Nannochloropsis submetidas à privação de N (-N). Foi realizado um experimento transcriptômico comparativo, no qual os níveis de trans- crição de RNA dos genes de células de Nannochloropsis gaditana sob inanição de nitrogênio, durante os quais Nannochloropsis induz a bios- síntese de lipídios de armazenamento, foram comparados com os ní- veis de transcritos de RNA da mesma cepa de Nannochloropsis gadi- tana crescidos sob condições idênticas, exceto que a quantidade de nitrogênio no meio de crescimento não era limitativa.
[00174] As células de N. gaditana (WT-3730) do tipo selvagem fo- ram cultivadas em meio repleto de nutrientes sob um ciclo escuro de
16 horas de luz (120 μE)/8 horas de escuridão até a limitação da luz (para OD de 1,25) e no início do fotoperíodo foram centrifugadas e ressuspensas no meio PM066 repleto de nitrogênio ou no meio de cul- tura que não possui uma fonte de nitrogênio (meio "esgotado de nitro- gênio" ou PM067 "-N") e incubado sob as condições de luz fornecidas. O RNA foi isolado das amostras removidas em vários intervalos de tempo após a ressuspensão das células em meio repleto de nitrogênio (+N) ou esgotado de nitrogênio (−N). A acumulação lipídica foi deter- minada a partir de amostras colhidas ao longo do ensaio. A acumula- ção de lipídios (medida como FAME, como descrito no Exemplo 3) foi indistinguível culturas esgotadas e repletas de nitrogênio no período de 3 h, mas às 10 h a acumulação de FAME na cultura esgotada de nitrogênio era o dobro da cultura de nitrogênio. Os tratamentos foram realizados em triplicados biológicos. Sob a suposição de que as alte- rações transcricionais devem preceder as alterações metabólicas, o período de 3 horas foi selecionado para o sequenciamento do mRNA. Duas amostras para cada tratamento foram sequenciadas.
[00175] O RNA foi isolado girando para baixo 10 ml de cada cultura de células de algas (4.000 × g por 5 minutos) e decantando o sobre- nadante. Os péletes foram ressuspensos em 1,8 ml de tampão A (5 ml de tampão de moagem TLE, 5 ml de fenol, 1 ml de 1-bromo-3- cloropropano e 20 mercaptoetanol, em que o tampão de moagem TLE inclui 9 ml de Tris 1M pH 8, 5 ml de 10% SDS, 0,6 ml de 7,5 M LiCl e 450 ml 0,5 M EDTA em um volume final de 50 ml) e transferidos para tubos de microcentrífuga de 2 ml contendo aproximadamente 0,5 ml de esferas de zircônio de 200 μm. Os tubos foram sujeitos a vórtex vi- gorosamente durante 5 min a 4°C e depois centrifugados por 2 min a 11,8 × g. As camadas aquosas foram então removidas e pipetadas em novos tubos de 2 ml, para os quais 1 ml de tampão de extração de fe- nol 25:24:1 (25 ml de fenol pH 8,1; 24 ml de 1-bromo-3-cloropropano e
1 ml de álcool isoamílico) foi adicionado. Os tubos foram agitados vigo- rosamente e centrifugados por 2 min a 11,8 × g. Após centrifugação, a camada aquosa foi removida e pipetada para novos tubos de centrífu- ga de 2 ml, aos quais foi adicionado 1 ml de 1-bromo-3-cloropropano. Os tubos foram agitados e novamente centrifugados por 2 min a 11,8 × g. A camada aquosa foi removida para um novo tubo e foram adicio- nados 0,356 volumes de 7,5 M LiCl. Os tubos foram invertidos 10-12 vezes e armazenados a -20°C durante a noite. No dia seguinte, as amostras foram deixadas atingir a temperatura ambiente sem mistura e foram centrifugadas a 16.000 × g por 30 minutos. Os sobrenadantes foram removidos e os péletes foram lavados com 1 ml de etanol 80% gelado. Os tubos foram centrifugados por 30 min a 16.000 × g e deixa- dos secar ao ar após a remoção dos sobrenadantes. Finalmente, os péletes de RNA foram ressuspensos em 50 μl de água ultrapura. A qualidade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel usando chip Agilent 2100 Bioanalyzer e RNA6000 LabChip de acordo com as ins- truções do fabricante.
[00176] As bibliotecas de sequenciamento de última geração foram preparadas a partir do RNA isolado usando o TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, Califórnia), seguindo as instru- ções do fabricante. As bibliotecas TruSeq foram sequenciadas usando sequenciamento por síntese (Illumina MiSeq) para gerar leituras de extremidade emparelhada de 100 pb usando o procedimento mRNA- Seq (descrito em Mortazavi et al. (2008) Nature Methods 5: 621 a 628). As leituras mapeadas foram alinhadas com a sequência do ge- noma de referência de N. gaditana usando TopHat (to- phat.cbcb.umd.edu/). Os níveis de expressão foram calculados para cada gene anotado usando o componente Cuffdiff do software Cufflinks (cufflinks.cbcb.umd.edu). TopHat e Abotoaduras são descri- tos em Trapnell et al. (2012) Nature Protocols 7: 562-578. A análise da expressão diferencial foi realizada usando o pacote R edgeR (McCar- thy et al. (2012) Nucl. Acids Res. 40: doi:10/1093/nar/gks042)). Os ní- veis de expressão em unidades de fragmentos por quilobase por mi- lhão (FPKM) foram relatados para cada gene em cada amostra usan- do parâmetros padrão. FPKM é uma medida dos níveis transcricionais relativos que normaliza as diferenças no comprimento da transcrição. Um gene que codifica um domínio de TPR contendo proteí- na (no local Naga_100148g8, no presente documento referido como o gene TPR-6029) foi identificado como sendo expresso diferencialmen- te entre as condições de cultura repletas de N e esgotadas de N. Este gene (sequência de cDNA fornecido como SEQ ID NO: 4) codifica um polipeptídeo (SEQ ID NO: 3) com um domínio de TPR (repetição de tripentacopeptídeo) (SEQ ID NO: 1) e um domínio de função desco- nhecida (DUF4470) (pfam IPR027974; SEQ ID NO: 2). Um diagrama do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 é fornecido na Figura 1. EXEMPLO 2.
KNOCKOUT DO GENE QUE CODIFICA UM DOMÍNIO DE TPR CONTENDO PROTEÍNA (NAGA_100148G8) EM NANNOCHLO-
ROPSIS
[00177] Cepas de algas transgênicas de Nannochloropsis gaditana foram criadas nas quais o gene que codifica a proteína contendo o domínio de TPR foi funcionalmente ablado ou submetido a knockout por mutagênese direcionada. A cepa de Nannochloropsis gaditana do tipo selvagem é designada WT-3730. Os mutantes knockout foram ge- rados usando a tecnologia CRISPR.
[00178] Os mutantes knockout foram criados usando uma linha Edi- tor de alta eficiência que expressa Nannochloropsis Cas9, como des- crito na Publicação de Pedido Copendente US 2017/0073695 "Com- positions and Methods for High Efficiency In Vivo Genome Editing", depositada em 31 de dezembro de 2015, nomeando inventores John
Verruto e Eric Moellering. A cepa GE-6791, que expressa um gene que codifica a nuclease Streptococcus pyogenes Cas9, foi usada co- mo hospedeiro para transformação com um RNA-guia quimérico e DNA doador para knockout insercional. A cepa GE-6791 foi produzida transformando a cepa WT-3730 de Nannochloropsis gaditana do tipo selvagem com o vetor pSGE-6206 (SEQ ID NO: 6; Figura 2). incluiu os três elementos a seguir: 1) um cassete de expressão Cas9 que continha um gene Cas9 do códon Streptococcus pyogenes otimizado para N. gaditana (SEQ ID NO: 7) que incluía sequências codificando um sinal de localização nuclear no terminal N (SEQ ID NO: 8), seguido por uma etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 9) e um ligante peptídico (forne- cido em conjunto como SEQ ID NO: 10), impulsionado pelo promotor N. gaditana RPL24 (SEQ ID NO: 11) e terminado pelo terminador bidi- recional 2 da N. gaditana (SEQ ID NO: 12); 2) uma cassete de expres- são do marcador selecionável, o qual continha o gene deaminase blas- ticidina S a partir do códon Aspergillus terreus otimizado para N. gadi- tana (SEQ ID NO: 13), acionado pelo promotor de N. gaditana PTTC (SEQ ID NO: 14) e seguido pelo terminador EIF3 (SEQ ID NO: 15); e 3) uma cassete de expressão repórter GFP, que continha o códon do gene TurboGFP (Evrogen, Moscou, Rússia) otimizado para N. gadita- na (SEQ ID NO: 16), acionado pelo promotor N. gaditana 4A-III (SEQ ID NO: 17) e seguido pelo terminador bidirecional 5 de N. gaditana (SEQ ID NO: 18). A transformação foi essencialmente como descrito no pedido US publicado nº US 2014/0220638 ("Algal mutants having a locked-in high light acclimated phenotype", depositado em 6 de de- zembro de 2013).
[00179] A mistura de transformação foi semeada em meio de ágar PM074 contendo 100 mg/l de blasticidina. As colônias resultantes fo- ram emplastradas nos meios de seleção para análise e arquivamento. Uma pequena quantidade de biomassa foi retirada dos emplastros e ressuspensa completamente em 300 µl de solução 1x Instant Ocean Salts (Aquatic Eco Systems; Apopka, FL). Teve-se o cuidado de não adicionar muita biomassa para obter uma ressuspensão verde clara. Esta suspensão foi analisada diretamente por citometria de fluxo usando um citômetro de fluxo BD Accuri C6 (BD Biosciences, San Di- ego, CA), usando um laser de 488 nm e um filtro de 530/10nm para medir a fluorescência de GFP por célula. 10.000 a 30.000 eventos fo- ram registrados para cada amostra usando a configuração fluídica len- ta. Uma cepa com um único pico de fluorescência que foi deslocado para um nível de fluorescência mais alto do que o demonstrado por células do tipo selvagem e também demonstrando a expressão da pro- teína Cas9 por Western, referida no presente documento como GE- 13038, foi selecionada como uma cepa Cas9 Editor e usada em gera- ção de mutantes por edição do genoma de CRISPR/Cas9 como no presente documento descrito.
[00180] O gene que codifica a proteína contendo o domínio de TPR (gene "TPR-6029" que codifica SEQ ID NO: 3) foi direcionado para a interrupção usando a edição do genoma mediado por Cas9. Em suma, um cassete de expressão de resistência à higromicina foi direcionado para inserir na porção do gene que codifica o domínio de função des- conhecida (DUF4470) (Figura 1). Para produzir um RNA-guia quiméri- co para direcionamento do gene Naga_100148g8 para interrupção, foram feitos dois construtos de DNA (SGI-DNA, La Jolla, CA) para a produção de RNAs-guia nos quais a molécula de DNA incluía a se- quência de um guia quimérico projetado a jusante de um Promotor T7. No primeiro construto, a sequência-guia quimérica incluía uma se- quência-alvo de 23 pb (SEQ ID NO: 5, que inclui a sequência PAM) homóloga a uma sequência dentro da sequência do gene Na- ga_100148g8 que codificava o domínio de TPR que estava a montante de uma sequência PAM Cas9 de S. pyogenes (NGG) e também incluiu a sequência de ativação em trans de RNA CRISPR (tracr). A sequên- cia-guia quimérica foi sintetizada fazendo primeiro um modelo de DNA composto de oligonucleotídeos de DNA complementares que foram anelados para criar um modelo de DNA de fita dupla que foi usado em reações de transcrição in vitro usando o Kit MEGAshortscript™ T7 (Li- fe Technologies, Carlsbad, CA nº AM1354M) de acordo com as instru- ções do fabricante para sintetizar o RNA-guia. O RNA resultante foi purificado usando colunas V-E Zymo-Spin™ (Zymo Research nº C1024-25) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00181] O fragmento de doador para inserção no local Na- ga_100148g8 direcionado incluiu um cassete marcador selecionável que incluía o gene de resistência à higromicina (HygR, SEQ ID NO: 19) a jusante do promotor EIF3 de N. gaditana (SEQ ID NO: 20) e se- guiu pelo terminador 2 bidirecional N. gaditana (SEQ ID NO: 12), com toda a sequência terminadora de genes de resistência ao promotor e à higromicina, flanqueada por 27 sequências de identificação de pares de bases nas extremidades 5' (SEQ ID NO: 21) e 3' (SEQ ID NO: 22) para produzir o fragmento de DNA referido como "Hyg Resistance Cassette Naga_100148g8" (SEQ ID NO: 23).
[00182] Para knockout direcionado do gene localizado no local Na- ga_100148g8, a linha Cas9 Editor GE-13038 foi transformada por ele- troporação usando 5 µg de RNA-guia quimérico purificado visando o gene e 1 µg do DNA doador selecionável (Hyg Resistance Cassette Naga_100148g8; SEQ ID NO: 23) essencialmente como descrito em US 2014/0220638, incorporado no presente documento por referência. Após a eletroporação, as células foram plaqueadas em meio de ágar PM124 contendo higromicina para selecionar os transformantes que incorporaram o cassete de resistência à higromicina. Os transforman- tes foram emplastrados em uma placa nova e rastreados por PCR de colônia para inserção do fragmento do doador no gene no local Na-
ga_100148g8.
[00183] Para a triagem por PCR de colônia, uma pequena quanti- dade de células de uma colônia a ser rastreada foi suspensa em 100 µl de solução Chelex 100 Resina a 5% (BioRad)/TE e a suspensão foi fervida por 10 minutos a 99°C, após o que os tubos foram girados bre- vemente. Um microlitro do sobrenadante do lisado foi adicionado a uma mistura de reação de PCR, na qual a mistura e as reações de PCR foram configuradas e realizadas de acordo com o Protocolo QI- AGEN Fast Cycling PCR Master Mix do fabricante (Manual disponível em qiagen.com; Qiagen GmbH, Alemanha). Os iniciadores usados pa- ra detectar a inserção do fragmento do doador no local Na- ga_100148g8 direcionado foram SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25. A triagem de colônias baseada em PCR identificou uma cepa knockout do gene TPR-6029, GE-15360, que incluiu a inserção direcionada por cas9 do fragmento do doador inserido no local-alvo (indicado por uma seta na Figura 1). Este mutante de inserção knockout foi ainda testado em ensaios de produtividade. EXEMPLO 3. KNOCKOUT MUTANTE NAGA_100148G8 NO ENSAIO DE PRODU-
TIVIDADE DE BATELADA
[00184] As cepas mutantes foram avaliadas em um ensaio de pro- dutividade de batelada no meio PM074 repleto de nitrogênio que inclu- ía nitrato de 8,8 mM como a única fonte de nitrogênio disponível para as células na ausência de qualquer fonte de carbono reduzida capaz de suportar o crescimento de algas (ou seja, o ensaio de produtividade foi realizado sob condições fotoautotróficas). Após a inoculação, as cepas knockout modificadas e a cepa WT-3730 do tipo selvagem fo- ram cultivadas em culturas triplicadas em um ensaio de batelada em frascos de cultura de tecidos retangulares de 75 cm2 contendo 175 ml de meio PM074 por sete dias. Sob essas condições, o nitrogênio co-
meça a se tornar limitante no meio de cultura aproximadamente no dia 3, com a concentração de nitrogênio no meio de cultura continuando a cair durante todo o restante do ensaio. Os frascos foram posicionados com a menor dimensão de "largura" contra uma luz LED. Os frascos de cultura foram mascarados com um plástico branco opaco para pro- porcionar uma abertura de 21,1 cm2 retangular para irradiância alcan- çar as culturas. A irradiância do incidente foi programada em um ciclo de 16 horas de luz:8 horas escuro, onde um aumento linear de irradiâ- ncia de 0 a 1200 uE e, em seguida, um aumento linear de irradiância de 1200 a 0 uE durante um período de 4 horas. H2O desionizada foi adicionada às culturas diariamente para repor as perdas por evapora- ção. A temperatura das culturas foi regulada por um banho de água a 25 ºC. As culturas foram inoculadas na OD730 de 0,5 no dia 0 e as amostras (5 ml) foram removidas nos dias 3, 5 e 7 para avaliar a den- sidade celular e ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) como uma medida de lipídios. A amostragem foi realizada 30 minutos antes do final do ciclo da luz.
[00185] A análise FAME foi realizada em amostras de 2 ml que fo- ram secas usando um GeneVac HT-4X. A cada um dos péletes secos foram adicionados: 500 µl de KOH 500 mM em metanol, 200 µl de te- tra-hidrofurano contendo 0,05% de hidroxil tolueno butilado, 40 µl de uma mistura padrão interna de 2 mg/ml de ácido graxo C11:0/triglicerídeo C13:0/éster metílico de ácido graxo C23:0 e 500 µl de contas de vidro (425 a 600 µm de diâmetro). Os frascos foram ta- pados com cap de forro de septos de topo aberto de PTFE e coloca- das em um SPEX GenoGrinder a 1,65 krpm por 7,5 minutos. As amos- tras foram então aquecidas a 80°C por cinco minutos e deixadas esfri- ar. Para derivatização, 500 µl de 10% de trifluoreto de boro em meta- nol foram adicionados às amostras antes do aquecimento a 80 °C por 30 minutos. Os tubos foram deixados esfriar antes da adição de 2 ml de heptano e 500 µl de NaCl a 5 M. As amostras foram agitadas em vórtex por cinco minutos a 2K rpm e finalmente centrifugadas por três minutos a 1K rpm. A camada de heptano foi amostrada usando um Autosampler Gerstel MPS. A quantificação usou os 80 µg do padrão interno C23:0 FAME. As amostras foram executadas em um sistema de cromatografia em fase gasosa Agilent 7890A usando uma coluna J&W Scientific 127-3212 DB-FFAP, coluna de 10 m × 100 µm × 100 nm e um detector FID a 260 °C. A taxa de fluxo foi de 500 µl/minuto usando H2 como um carreador com controle de fluxo constante. O for- no foi ajustado a 100 °C por 0,98 min, depois a 15,301 °C/minuto a 230 °C e mantido por 1,66 min. A entrada continha um revestimento de lã de vidro de 4 mm (Agilent P/N 5183-4647) e foi ajustada a 250 °C e uma taxa de divisão de 40:1 foi usada. O volume de injeção foi de 900 nl.
[00186] Os resultados do ensaio de produtividade de batelada são fornecidos na Figura 3. A quantidade de FAME produzida pela cepa mutante GE-15360 foi mais que 2 vezes a quantidade produzida pela cepa de controle parental GE-13038 (cepa Cas9 Editor).
[00187] Um experimento de acompanhamento mostrou que a indu- ção lipídica foi reprimida por amônio (5 mM) no meio de crescimento (Figura 4). Neste ensaio, as culturas descontínuas incluem apenas nitrato, nitrato mais amônio ou amônio apenas como fonte de nitrogê- nio. A cepa Cas9 + parental apresentou quantidades essencialmente idênticas de FAME produzidas nos dias 3-7 do ensaio, independente- mente da fonte de nitrogênio. Em contraste, o mutante knockout TRP- 6029 GE-15360 apresentou uma produção acentuadamente aumenta- da de FAME em relação à linha Editor parental GE-13038 em cada dia do ensaio, quando cultivado em meio somente nitrato. A presença de amônio no meio de cultura suprimiu completamente o aumento da produtividade lipídica do mutante. Onde o amônio estava presente, a produção lipídica da cepa de knockout TRP-6029 GE-15360 era es- sencialmente idêntica à da cepa parental que não incluía um gene TPR-6029 mutado. EXEMPLO 4.
CRESCIMENTO E BIOSSÍNTESE LIPÍDICA DO MUTANTE KNOCKOUT EM CULTURA SEMICONTÍNUA
[00188] A cepa knockout GE-15360 também foi analisada no ensaio de produtividade semicontínua. No meio de ensaio de produtividade contínuo PM074 (apenas nitrato) em um frasco de 225 cm2 foi inocula- do com cultura de semente Nannochloropsis de modo que a cultura inicial de 550 ml (volume final inoculado) tinha um OD730 inicial de 0,15. Uma diluição típica usou aproximadamente 150 ml de cultura ini- cial em meio PM124 (contendo 5 mM de amônio) que foi aumentada para 550 ml usando meio PM074, de modo que a concentração inicial de amônio no ensaio semicontínuo era menor que 1,5 mM. Diluições diárias com meio PM074 reduziram ainda mais a concentração de amônio à medida que o ensaio progredia. Três culturas foram iniciadas por cepa. Os frascos incluíam barras de agitação e tinham rolhas com tubulação conectada com filtros de seringa para fornecer ar enriqueci- do com CO2 (1% de CO2, taxa de fluxo, 100 ml por minuto) que foi borbulhado através das culturas. Os frascos foram colocados em pla- cas de agitação ajustadas a 450 rpm. Os frascos foram alinhados com a largura (dimensão mais estreita) contra um banco de luz de LED que foi programado com um ciclo claro/escuro e perfil de luz que aumentou até o "meio dia solar" e depois declinou até o final do período de luz. A dimensão de "profundidade" dos frascos, que se estendia desde a fon- te de luz, era de 13,7 cm. Tendo em conta o posicionamento dos fras- cos, a maior distância das células nos frascos da superfície da fonte de luz era de aproximadamente 15,5 cm. O perfil de luz foi projetado para imitar um dia de primavera no sul da Califórnia: 16 horas de luz:8 horas de escuridão, com a luz atingindo aproximadamente 2000 uE. As culturas foram diluídas diariamente no meio (pico) do período de luz através da remoção de 30% (150 ml) do volume da cultura e subs- titui-lo por meio fresco PM074 diluído (66 ml de di H2O para 1 l de meio PM074) para ajustar o aumento da salinidade devido à evaporação que ocorre nas culturas. Amostras para análise FAME e TOC foram retiradas da cultura removida para a diluição. Os ensaios contínuos foram tipicamente realizados por 7-14 dias, e foram obtidas médias de três culturas para cada amostra. As Tabelas 1-3 mostram os resulta- dos da análise FAME e TOC das culturas knockout e selvagem, reali- zadas no ensaio semicontínuo. As médias de três culturas são forneci- das com o desvio padrão de cada valor entre parênteses.
[00189] No ensaio semicontínuo, realizado com meio de cultura de apenas nitrato, o mutante knockout GE-15360 demonstrou uma maior produtividade da FAME em relação à cepa do tipo selvagem, com pro- dutividades diárias variando de cerca de 7,4% a cerca de 115,6% a mais que a FAME produtividades das células do tipo selvagem (Tabe- la 1). Isso também pode ser visto no gráfico da Figura 5, no qual o mutante TRP-6029 (GE-15360) tem fame consistentemente mais alta produzida diariamente do que a cepa de tipo selvagem WT-3730. (Du- as outras cepas no ensaio não estão relacionadas ao mutante TRP-
6029.) A acumulação de biomassa (TOC) pelo mutante knockout GE- 15360 foi, no entanto, surpreendentemente maior que as células do tipo selvagem (Tabela 2). O aumento do particionamento de carbono para lipídios ficou claro a partir da razão FAME/TOC do mutante knockout GE-15360 ao longo do ensaio (Tabela 3), que mostrou que o mutante tinha uma razão FAME/TOC de cerca de 0,3 a cerca de 0,7 ao longo do ensaio, enquanto que a razão FAME/TOC do tipo selva- gem analisada sob condições de cultura idênticas variou entre cerca de 0,25 a 0,3.
TABELA 1. PRODUÇÃO DIÁRIA DE FAME (µG/ML) POR CÉLULAS DO TIPO SELVAGEM E KNOCKOUT PARA GE-15360 EM CULTU-
RA SEMICONTÍNUA COM DILUIÇÃO DIÁRIA EM MEIO SOMENTE NITRATO. DIA 1 2 3 4 5 6 7 WT-3730 67,7 61,0 55,4 53,0 52,6 52,2 48,0 (2,3) (2,8) (1,0) (0,1) (3,0) (1,0) (4,8) GE-15360 72,7 111,3 103,3 107,6 113,4 96,5 89,4 (0,9) (0,7) (2,4) (1,0) (3,5) (2,0) (6,5) % De aumento (GE- 7,4% 82,5% 86,5% 103,0% 115,6% 84,9% 86,3% 15360 vs. WT) DIA 8 9 10 11 12 13 WT-3730 48,2 51,6 49,8 51,2 50,5 51,0 (1,7) (3,4) (2,4) (1,2) (2,2) (1,8) GE-15360 85,2 85,3 81,9 76,2 71,1 76,5 (3,6) (2,8) (3,4) (0,3) (3,1) (2,1) % De aumento (GE- 76,8% 65,3% 64,5% 48,8% 40,8% 50,0% 15360 vs. WT) TABELA 2. PRODUÇÃO DIÁRIA DE TOC (µG/ML) POR CÉLULAS DO TIPO SELVAGEM E KNOCKOUT GE-15360 EM CULTURA SE- MICONTÍNUA COM DILUIÇÃO DIÁRIA EM MEIO SOMENTE NITRA- TO. DIA 1 2 3 4 5 6 7 WT-3730 3,55 3,20 2,91 2,78 2,76 2,74 2,52 (4,65) (13,86) (3,03) (2,13) (6,03) (2,36) (2,65) GE-15360 3,82 5,84 5,42 5,65 5,95 5,07 4,70 (5,10) (3,31) (2,05) (3,13) (2,86) (2,97) (2,10) % De aumento 7,61% 82,50%86,25% 103,24 115,58 85,04%86,51% (GE-15360 vs. WT) % %
DIA 8 9 10 11 12 13 WT-3730 2,53 2,71 2,61 2,69 2,65 2,68 (3,08) (2,90) (6,63) (5,73) (5,86) (5,65) GE-15360 4,47 4,48 4,30 4,00 3,73 4,02 (2,74) (3,52) (3,10) (3,77) (0,62) (1,42) % De aumento 76,68% 65,31% 64,75% 48,70% 40,75% 50,00% (GE-15360 vs. WT) TABELA 3. RAZÕES DIÁRIAS DE FAME/TOC DE CÉLULAS DO TI- PO SELVAGEM E KNOCKOUT GE-15360 EM CULTURA SEMICON- TÍNUA COM DILUIÇÃO DIÁRIA EM MEIO SOMENTE NITRATO. DIA 1 2 3 4 5 6 7 WT-3730 0,3 0,258 0,275 0,274 0,279 0,275 0,265 (0,01) (0,01) (0,00) (0,00) (0,01) (0,00) (0,03) GE-15360 0,3 0,5 0,6 0,6 0,7 0,6 0,4 (0,01) (0,01) (0,02) (0,01) (0,02) (0,01) (0,37) % De aumento 0,0% 93,8% 118,2%119,0%150,9%118,2% 50,9% (GE-15360 vs. WT) DIA 8 9 10 11 12 13 WT-3730 0,254 0,270 0,258 0,271 0,280 0,258 (0,01) (0,02) (0,00) (0,01) (0,02) (0,00) GE-15360 0,4 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 (0,36) (0,01) (0,03) (0,02) (0,03) (0,02) % De aumento 57,5% 122,2% 132,6% 121,4% 114,3% 132,6% (GE-15360 vs. WT)
[00190] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, será entendido que modificações e variações estão incluídas no espírito e escopo da invenção. Por conseguinte, a inven- ção é limitada apenas pelas seguintes reivindicações.

Claims (55)

REIVINDICAÇÕES
1. Microrganismo mutante, caracterizado pelo fato de que tem expressão atenuada de um gene que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio de repetição de tetratricopeptídeo (TPR), em que o microrganismo mutante: a) produz pelo menos 25% mais lipídios que um micror- ganismo de controle; e/ou b) exibe particionamento aumentado de carbono para lipí- dio em relação ao microrganismo de controle; quando o microrganismo mutante e o microrganismo de controle são cultivados sob condições idênticas.
2. Microrganismo mutante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de TPR tem pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.
3. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de TPR compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1, ou uma vari- ante conservadora da mesma.
4. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de TPR compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 1.
5. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos estabele-
cida na SEQ ID NO: 3.
6. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou uma vari- ante conservadora da mesma.
7. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende a se- quência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3.
8. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um do- mínio de função desconhecida (DUF4470) com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3.
9. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um do- mínio de função desconhecida (DUF4470) que compreende a sequên- cia de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, ou uma variante conservadora da mesma.
10. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende um do- mínio de função desconhecida (DUF4470) tendo a sequência de ami- noácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3.
11. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante compreen- de uma ou mais mutações em ou que afetam a expressão de um gene no local Naga_100148g8 ou um local sintênico em uma espécie de heterokonta ou alga.
12. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação
11, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante compre- ende uma mutação ou uma mutação que afeta a expressão de um ge- ne que compreende um quadro de leitura aberto com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%, para a SEQ ID NO: 4.
13. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as ditas uma ou mais mutações es- tão presentes ou afetam a expressão de: um ácido nucleico que codifi- ca um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; e/ou que compreende um quadro de leitura aberto que compreende uma sequência de nu- cleotídeos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, em pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos cerca de 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
14. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais mutações estão no domínio DUF4470 do gene na Naga_100148g8.
15. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o microrga- nismo de controle é um microrganismo do tipo selvagem.
16. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o microrga- nismo mutante produz pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo me- nos 35 %, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais lipídios derivados de éster metílico de áci- dos graxos (lipídios FAME) do que um microrganismo de controle.
17. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante produz pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35 %, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo me- nos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170%, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais lipídios derivados de éster metílico de ácidos graxos (lipí- dios FAME) do que um microrganismo de controle quando cultivados em um meio que compreende nitrato como única fonte de nitrogênio.
18. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante é uma alga e pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35 %, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170 %, pelo menos 180%, pelo menos 190% ou pelo menos 200% mais lipídios FAME do que uma alga de controle quando cultivados em condições fotoautotróficas.
19. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o microrga- nismo mutante exibe uma razão FAME/TOC de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pe- lo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 120%, pelo menos 140%, pelo menos 160%, pelo menos 180%, pelo menos 200%, pelo menos 220%, pelo menos 240%, pelo menos 260%, pelo menos 280% ou pelo menos 300% superior à razão FAME/TOC do microrganismo de controle.
20. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante exibe uma razão FAME/TOC 20 a 300% maior que a razão FAME/TOC do mi- crorganismo de controle sob condições que são repletas de nitrogênio em relação ao microrganismo de controle.
21. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante exibe uma razão FAME/TOC entre cerca de 0,25 e cerca de 0,75 ou entre cerca de 0,3 e cerca de 0,7 sob condições que são repletas de nitrogênio em relação ao microrganismo de controle.
22. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a produção ou produtividade de lipídios é determinada usando condições de cultu- ra descontínua, semicontínua ou contínua.
23. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que as ditas con- dições idênticas compreendem a cultura dos ditos microrganismos mu- tantes e de controle em um meio que compreende menos de 2 mM de amônio.
24. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as ditas condições idênticas com- preendem a cultura dos ditos microrganismos mutantes e de controle em um meio que compreende nitrato como substancialmente a única fonte de nitrogênio.
25. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que as ditas con- dições idênticas compreendem a cultura dos ditos microrganismos mu- tantes e de controle em um meio repleto de nutrientes em relação ao microrganismo de controle.
26. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o microrga- nismo mutante é um mutante de origem clássica ou um mutante gene- ticamente modificado.
27. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante tem uma mutação no gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR, ou um gene que afeta sua expressão, que resulta em uma diminuição da expressão do dito gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR comparado à expressão do gene em um microrganismo de controle.
28. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a mutação é uma mutação knock- down.
29. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a mutação knockdown é gerada usando um sistema Cas/CRISPR.
30. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante compre- ende um construto de RNAi, um construto de ribozimas ou um constru-
to antissenso que tem como alvo o gene que codifica o polipeptídeo que possui um domínio de TPR ou um gene que afeta a expressão do mesmo.
31. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante tem uma mutação knockout no gene que codifica um polipeptídeo que inclui um domínio de TPR ou um gene que afeta a expressão do mesmo.
32. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a mutação knockout é produzida por recombinação homóloga direcionada ao local.
33. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que a mutação knockout inter- rompe o gene por deleção parcial ou total, truncamento, deslocamento de quadro ou mutação insercional.
34. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que a mutação knockout é gerada usando meganuclease, nuclease de dedo de zinco, um sistema Nuclease Efetor do Tipo Ativador da Transcrição (TALEN) e/ou um sistema Cas/CRISPR.
35. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29, 31, 33, e 34, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante compreende uma inserção mediada por Cas/CRISPR no gene.
36. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o microrga- nismo mutante compreende pelo menos uma modificação genética adicional que compreende resistência a herbicidas, resistência a toxi- nas, propriedades de crescimento aprimoradas, eficiência fotossintéti- ca aprimorada, eficiência fotossintética aprimorada, produção ou acu- mulação lipídica aprimorada e/ou produção de lipídios específicos.
37. Microrganismo mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o microrga- nismo mutante é uma espécie de algas ou heterokonta.
38. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante é uma espécie de alga selecionada do grupo que consiste em Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bo- lidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogo- nium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustig- matos, Franceia, Fragilaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haemato- coccus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepoci- nclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nan- nochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Para- chlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Phæodac- tylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skele- tonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalas- siosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria e Volvox.
39. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante é uma heterokonta selecionada do grupo que consiste em bacilariófitos, eus- tigmatófitos, xantófitos, feófitos, crisófitos ou rafidófitos.
40. Microrganismo mutante, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o microrganismo mutante é uma heterokonta, além disso, em que o microrganismo mutante é uma es-
pécie de Labyrinthulomycete de um gênero selecionado do grupo que consiste em Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schi- zochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japo- nochytrium, Diplophrys e Ulkenia.
41. Lisado, caracterizado pelo fato de que é do microrga- nismo mutante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
40.
42. Método para produzir lipídios, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microrganismo mutante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, em um meio de cultura para produzir lipídios.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda isolar lipídios do microrganis- mo, do meio de cultura ou de ambos.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42 ou 43, carac- terizado pelo fato de que o microrganismo é cultivado com o uso de condições de cultura descontínua, contínua ou semicontínua.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é uma alga e a cultura está sob condições fotoautotróficas.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é La- byrinthulomycite e a cultura está sob condições heterotróficas.
47. RNA-guia de um sistema CRISPR, caracterizado pelo fato de que o RNA-guia compreende uma sequência correspondente à SEQ ID NO: 5.
48. RNA-guia, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que o RNA-guia é um guia quimérico.
49. RNA-guia, de acordo com a reivindicação 47, caracteri- zado pelo fato de que o RNA-guia não inclui uma sequência tracr.
50. Construto de ácido nucleico para recombinação homó- loga, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nu- cleotídica de ou adjacente a um gene algal de ocorrência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pe- lo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo me- nos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; um gene no local Na- ga_100148g8; e/ou um gene que compreende um quadro de leitura aberto que compreende uma sequência pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, em identidade de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
51. Construto de ácido nucleico para expressão de um RNA, shRNA, microRNA ou ribozima antissenso, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica complementar a pelo menos uma porção de um gene de ocorrência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 55 %, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97 %, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; um gene no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende uma ORF que compreende uma se- quência com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pe- lo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de iden-
tidade com a SEQ ID NO: 4.
52. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um RNA-guia de um sistema CRISPR, em que o RNA- guia compreende pelo menos uma porção de um gene algal de ocor- rência natural que codifica um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo me- nos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; um gene no local Naga_100148g8; e/ou um gene compreende uma estrutura de leitura aberta que compreende uma sequência com pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pe- lo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
53. Método para produzir um microrganismo mutante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pe- lo fato de que compreende introduzir no dito microrganismo uma ou mais mutações e/ou um ou mais agentes que atenuam a expressão de um polipeptídeo que compreende um domínio GAF.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que a uma ou mais mutações ou agentes afeta a ex- pressão de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; um gene no local Naga_100148g8; e/ou um gene que compreende um quadro de leitura aberto que compreende a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 4.
55. Método, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, carac-
terizado pelo fato de que o um ou mais agentes são selecionados do grupo que consiste em RNA antissenso, RNAi, shRNA, microRNA, ri- bozima, um componente de um sistema Cas/CRISPR e/ou um compo- nente de um sistema Nuclease Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN).
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